/
Author: Долгов В.В.
Tags: семиология симптоматология признаки и симптомы заболеваний исследование диагностика пропедевтика общая диагностика клиническая диагностика
ISBN: 978-5-9704-2129-1
Year: 2012
Text
Научное общество специалистов
лабораторной медицины
АСМОГ
АССОЦИАЦИЯ
МЕДИЦИНСКИХ
ОБЩЕСТВ
ПО КАЧЕСТВУ
ИЗДАТЕЛЬСКАЯ ГРУППА
«ГЭОТАР-Медиа»
дсмок
АССОЦИАЦИЯ
МЕДИЦИНСКИХ
ОБЩЕСТВ
ПО КАЧЕСТВУ
КЛИНИЧЕСКАЯ
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
НАЦИОНАЛЬНОЕ РУКОВОДСТВО
В двух томах
Том I
Главные редакторы
д-р мед. наук В.В. Долгов,
чл.-корр. РАЕН, д-р мед. наук В.В. Меньшиков
Подготовлено под эгидой Научно-практического
общества специалистов лабораторной медицины
и Ассоциации медицинских обществ по качеству
Москва
ИЗДАТЕЛЬСКАЯ ГРУППА
«ГЭОТАР-Медиа»
2012
УДК 616-07(035)
ББК 53.4я81
К49
Национальное руководство рекомендовано
Наугно-практигеским обществом спеииалистов лабораторной медицины
и Российской медицинской академией последипломного образования в кагестве
учебного пособия для последипломной подготовки вралей
К49 Клиническая лабораторная диагностика; национальное руководство: в 2 т. — Т. I. /
под ред. В.В. Долгова, В.В. Меньшикова. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. — 928 с.
ISBN 978-5-9704-2129-1 (т. I)
ISBN 978-5-9704-2127-7 (общ.)
Национальное руководство по клинической лабораторной диагностике разработано и
рекомендовано Научно-практическим обществом специалистов клинической лаборатор-
ной медицины. В издании отражены все разделы клинических лабораторных исследо-
ваний, представленные ведущими специалистами научных, образовательных и лечебно-
профилактических учреждений, расположенных в Центральном, Северо-Западном.
Сибирском, Уральском, Северо-Кавказском федеральных административных округах.
В том I включены материалы о научных основах и обшей организации лабораторного
обеспечения медицинской помощи в нашей стране, об аналитических технологиях и диа-
гностическом применении наиболее часто используемых в клинической лабораторной
диагностике биохимических, гематологических, коагулологических, цитологических
исследований. Наряду с этим представлены современные данные о передовых высокотех-
нологичных методах лабораторной диагностики и их применении при ряде состояний —
при беременности, онкологических заболеваниях, эндокринных нарушениях и наслед-
ственных болезнях обмена веществ, отравлениях.
Представленные сведения основаны на данных современной научной литературы,
рекомендациях профессиональных обществ специалистов, стандартах медицинской
помощи, многолетнем научно-практическом опыте авторов.
Руководство предназначено для сотрудников клинико-диагностических лабораторий,
врачей различных клинических дисциплин, студентов медицинских образовательных
учреждений. Материалы руководства могут быть использованы как для базового меди-
цинского образования, так и для последипломной подготовки.
УДК 616-07(035)
ББК 53.4я81
Авторы, редакторы и издатели руководства предприняли максимум усилий, чтобы
обеспечить точность представленной информации, в том числе дозировок лекарствен-
ных средств. Учитывая постоянные изменения, происходящие в медицинской науке, мы
рекомендуем уточнять дозы лекарственных средств по соответствующим инструкциям.
Пациенты не могут использовать эту информацию для диагностики и самолечения.
Права на данное издание принадлежат ООО Издательская группа -«ГЭОТАР-Медиа».
Воспроизведение и распространение в каком бы то ни было виде гасти или целого издания не
могут быть осуществлены без письменного разрешения ООО Издательская группа ^ГЭОТАР-
Медиа».
ISBN 978-5-9704-2129-1 (т. I)
ISBN 978-5-9704-2127-7 (общ.)
© Коллектив авторов, 2012
© ООО Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа», 2012
© ООО Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа»,
оформление, 2012
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие....................................................................................6
Участники издания..............................................................................9
Методология создания и программа обеспечения качества.........................................13
Список сокращений и условных обозначений............................................16
Глава 1. Лабораторное обеспечение медицинской помощи
В.В. Меньшиков, С.В. Цвиренко.................................................................23
Предмет клинической лабораторной медицины..................................................23
Объекты клинических лабораторных исследований..............................................25
Лабораторная аналитика.....................................................................28
Формы организации лабораторного обеспечения медицинской помощи.............................31
Оперативность получения лабораторной информации............................................33
Стандартизация организации лабораторного обеспечения.......................................37
Критерии эффективности работы лабораторий..................................................40
Глава 2. Обеспечение и контроль качества клинических лабораторных
исследований В.В. Меньшиков, Ю.В. Первушин....................................................42
Общие положения............................................................................42
Оценка аналитической надежности методов исследования.......................................47
Основы внутрилабораторного контроля качества ..............................................51
Аналитические характеристики методов.......................................................55
Правила установления референтных интервалов и пределов.....................................58
Выбор отсечных точек и их влияние на характеристику информативности
лабораторных исследований..................................................................66
Внешняя оценка качества клинических лабораторных исследований
В.Н. Малахов...............................................................................68
Обеспечение сопоставимости результатов лабораторных исследований
М.И. Прищепа...............................................................................81
Глава 3. Высокотехнологичные лабораторные исследования........................................84
Лабораторные информационные системы А.А. Кишкун............................................84
Методы видеоцифровой регистрации Ю.Ю. Венгеров, Т.А. Старовойтова.
Н.А. Стериополо, В.В. Зайко................................................................89
Проточная цитометрия С.В. Хайдуков, А.В. Зурогка,
Арег А. Тотолян, Е.В. Наумова.............................................................103
Иммунохимические методы анализа Н.Г. Ракова, Н.С. Рытикова................................135
Мультиплексный иммунный ана низ А. С. Симбирцев, Арег А. Тотолян..........................143
Молекулярная клиническая диагностика А.Б. Чухловин, Л.В. Тумбинская,
В.Е. Колупаев, Н.Г. Ракова ..............................................................................................147
Глава 4. Биохимические исследования..........................................................175
Ферменты С.А. Ельтанинова, А.П. Ройтман...................................................177
Субстраты и продукты биохимических реакций С.А. Ел&ганинова, А.П. Ройтман 192
Индивидуальные белки О.П. Шевъенко........................................................215
Минералы и электролиты С.А. Ельтанинова................................................................240
Витамины, биоактивные медиаторы С.А. Ельганинова, А.П. Ройтман......................253
Маркеры обмена костной ткани В.В. Долгов..................................................259
4 ОГЛАВЛЕНИЕ
Глава 5. Диагностика эндокринных нарушений А.В. Селиванова.........................268
Пшоталамус-гипофиз.....................................................................268
Диагностика заболеваний щитовидной железы..............................................269
Гормональная регуляция репродуктивной функции мужчин...................................281
Гормональная регуляция репродуктивной функции женщин...................................289
Другие гормоны.........................................................................299
Глава 6. Химико-микроскопические исследования биологических
материалов................................................................................312
Исследование мочи И.И. Миронова, Л.А. Романова.........................................312
Исследование кала И.И. Миронова...............................................................................352
Исследование спинномозговой жидкости В.В. Долгов, И.И. Миронова........................372
Исследование синовиальной жидкости В.В, Базарный..............................................398
Исследование выпотных жидкостей И.П. Шабалова, Т.В. Джангирова.........................403
Исследование спермы И.И. Миронова, С.А. Луговская, Н.Г. Ракова.........................432
Исследование мокроты И.И. Миронова, Л.А. Романова.................................... 457
Исследование желчи И.И. Миронова.......................................................467
Глава 7. Лабораторная гематология.........................................................475
Гемопоэз С.А. Луговская................................................................,475
Основные исследования в лабораторной гематологии С.А. Луговская,
М.Е. Погтарь, В.М. Погорелов........................................................................................492
Реактивные изменения крови (лейкемоидные реакции) Т.Н. Соболева........................519
Анемии С.А. Луговская, М.Е. Погтарь, С.Н. Суплотов ...............................................530
Миелодиспластические синдромы Т.Н. Соболева, С.А. Луговская............................567
Лейкозы С.А. Луговская, М.Е. Погтарь................................................. 570
Глава 8. Цитологические исследования в лабораторной диагностике
И.П. Шабалова, Т.В. Джангирова, К.Т. Касоян, В.И. Новик. Н.А. Шапиро......................607
Цитологическое исследование в клинической практике.....................................607
Особенности цитологического исследования заболеваний органов...........................623
Глава 9. Биологические маркеры опухолей Н.Е. Кушлинский, Е.С. Герштейн,
Н.С. Сергеева, Н.В. Любимова.............................................................................................657
Рецепторы стероидных гормонов — критерий чувствительности к эндокринной
терапии................................................................................659
Серологические опухольассоциированные маркеры..........................................665
Молекулярно-генетические онкомаркеры...................................................684
Использование молекулярно-генетических маркеров при некоторых солидных
опухолях...............................................................................689
Иммунохимические и биохимические онкомаркеры ..........................................693
Маркеры костного ремоделирования при обследовании онкологических
больных с поражением скелета...........................................................701
Глава 10. Лабораторная генетика...........................................................705
Цитогенетическая диагностика хромосомных болезней М.А. Ермакова........................705
Наследственные болезни обмена веществ Е.Ю. Захарова Е.Ю. Воскобоева,
Т.В. Байдакова, О.В. Шехтер. Т.М. Букина, А.М. Букина ............................................719
Массовый скрининг новорожденных на наследственные болезни обмена
веществ С.И. Козлова, Н.А. Кузъмигева, С.Г. Калиненкова. А.Н. Прытков..................736
Глава 11. Коагулологическне исследования
А.Ж. Гильманов, Т.В. Вавилова, А.Н. Мамаев................................................749
Основы функционирования системы гемостаза..............................................749
Преаналитический этап исследований гемостаза...........................................751
Тромбоцитарный компонент гемостаза.....................................................756
ОГЛАВЛЕНИЕ 5
Плазменное звено гемостаза............................................................................................. 772
Методы исследования коагуляционного гемостаза.............................. .........775
Глава 12. Лабораторная диагностика неотложных состояний
И.И. Дементьева ............................................................................................................816
Причины нарушения гомеостаза во время операции, диагностика
и методы их коррекции...................................................... .........817
Причины нарушений гомеостаза у больных в отделении интенсивной терапии...............819
Влияние гипоксии на метаболические показатели и водно-электролитный
баланс.................................................................................. 823
Лабораторная диагностика нарушений гомеостаза при острых состояниях,
полиорганной недостаточности, шоке, ДВС .................................................................................826
Глава 13. Лабораторный мониторинг при беременности Н.Д. Фангенко.
Т.Ю. Иванец, М.Л. Алексеева.................................................................................................839
Механизм взаиморегуляции в системе «мать-плацента-плод»..................................................................839
Мониторинг беременности..................................................................................................841
Алгоритм пренатального мониторинга.......................................................................................844
Регуляции метаболизма организмов матери и плода..........................................................................849
Глава 14. Химико-токсикологический анализ С.К. Еремин, Б.Н. Изотов..........................................................854
Общие вопросы химико-токсикологического анализа..........................................................................854
Физико-химические методы исследования....................................................................................858
Химико-токсикологический анализ в клинической токсикологии...............................................................862
Анализ наркотических средств.............................................................................................864
Частные методики обнаружения токсичных веществ...........................................................................870
Глава 15. Терапевтический лекарственный мониторинг С Л. Арсенин...............883
Предметный указатель
918
ПРЕДИСЛОВИЕ
Формирование диагноза и определение лечебных мер для конкретного паци-
ента в сознании врача происходит в результате анализа информации о пациенте и
его состоянии: сбора анамнеза заболевания, данных врачебного осмотра, включая
аускультацию, перкуссию и другие субъективные методы, динамическое наблюде-
ние. Если заболевание имеет типичные проявления, совпадающие с классическими
описаниями соответствующей формы патологии, этой информации оказывается
достаточно для установления диагноза и назначения лечения. Однако в большин-
стве случаев врач нуждается в более полных сведениях о состоянии функций и
структур организма пациента. Выдающийся канадский клиницист XIX в. Вильям
Ослер писал: «Медицина — это наука неопределенности и искусство вероятности.
Одной из главных причин этой неопределенности является возрастающая вариа-
бельность проявлений любой болезни». Эту неопределенность призваны были
уменьшить объективные методы исследования организма пациента.
Еще врачеватели древности обратили внимание на исследование таких био-
материалов, как выделения больных. Органолептически — на цвет, прозрачность,
запах и даже на вкус — оценивали мочу пациентов (болезнь «сладкой мочи», впо-
следствии названную сахарным диабетом, описал в VI веке до нашей эры индий-
ский врач Сашрута). Широко применяли уроскопию: рассматривание лечащим
врачом сосуда с пробой мочи пациента одновременно с подсчетом пульса. Степень
прозрачности и цвет этого биоматериала сравнивали с так называемым колесом
уроскопии — эмпирической шкалой, на которой цвет и характер мочи сопостав-
лялся с перечнем болезней.
Предпосылки научного периода изучения жидкостей человеческого организма
химическими методами зародились в XV-XVI вв. в лабораториях алхимиков, а
затем в трудах Кузанциса и Парацельса, которые пытались использовать химиче-
ские представления в медицинской практике.
Середина XVII в. стала переломным периодом в отношении способов исследо-
вания биологических жидкостей больных — временем перехода от органолепти-
ческого их исследования врачом при осмотре больного к объективным методам.
Создание голландским естествоиспытателем Левенгуком первого оптического
прибора — микроскопа — позволило разглядеть клетки крови, корпускулярные
компоненты мочи, некоторые микроорганизмы и тем самым расширить способ-
ность человека визуально изучать эти объекты, неразличимые простым глазом. В
конце XVII в. английский ученый Роберт Бойль опубликовал исследования крови
человека с помощью доступных в ту пору химических методов дисгилляции,
став, тем самым, одним из основоположников клинической химии. Вслед за тем
Лангриш описал изменения крови больных с лихорадкой. Очевидно, подобные
работы дали М.В. Ломоносову основание заявить: «Врач без довольного знания
химии совершенен быть не может».
Понадобился еще примерно двухвековой путь, чтобы на основе общего раз-
вития естественных наук возникла система объективных методов исследования.
Знаковыми событиями на этом пути стали создание Ю, фон Либихом в 1840 г.
первой аналитической лаборатории, издание им фундаментального труда «Химия
животных», а в 1842 г. создание его учеником И. Шерером в больнице г. Вюрцбурга
(Германия) «клинической химической лаборатории». В 1838 г. были опубликова-
ны таблицы по микроскопии осадка мочи, а в 1844 г. — курс микроскопии для
медицинских исследований (А. Донне). В 1843 г. вышла в свет основанная на кли-
ническом материале монография И. Шерера «Химические и микроскопические
исследования при патологии», явившаяся практически первым руководством по
клинической лабораторной диагностике. С 1843 г. под редакцией И. Симона стал
издаваться один из первых журналов по лабораторной диагностике «Beitragen fur
ПРЕДИСЛОВИЕ
7
physiologische undpathologische Chemie und Mikroscopie», a c 1847 r. — <<Archh>fur physi-
ologische undpathologische Chemie und Mikroscopie». В 1848 г. Г. фон Фелинг разрабо-
тал тест для определения глюкозы. В 1870 г. Ж. Дюбоск предложил колориметр,
ставший на долгие годы одним из основных инструментов клинической химии.
Эти события ознаменовали собой начало существования клинической лаборатор-
ной диагностики как самостоятельной отрасли медицины.
Лабораторные исследования стали первыми объективными диагностическими
технологиями в истории развития медицины, а лабораторная специальность —
первой по объему информации среди профессий специалистов по объективным
методам диагностики — рентгенологов, электрокардиографистов, эндоскопистов,
специалистов по ультразвуковой диагностике. Уже в первые годы существования
клинических лабораторий Вильям Ослер сравнил их роль со значением скальпеля
для врача. За полтора века клинико-лабораторная специальность постоянно нахо-
дилась в процессе развития аналитических возможностей на основе восприятия
все новых и новых открытий и изобретений в области биологии, химии, физики, а
также их прикладных медико-биологических дисциплин — биохимии, цитологии,
микробиологии, иммунологии, молекулярной биологии и др. (табл. 1).
Существенно расширился диапазон технологий, составляющих содержание прак-
тической деятельности в лабораториях. Микроскопия биологических жидкостей и
простые химические методы, с которых начиналась лабораторная деятельность в
середине XIX в., составляют в настоящее время едва лишь десятую часть диапазона
аналитических приемов клинической лабораторной аналитики. В распоряжение
специалиста современной лаборатории предоставлена широкая гамма разнообраз-
ных фото-, Флюоро-, люминометрических, электрохимических, лигандных, хро-
матографических, масс-спектрометрических, молекулярно-биологических методов
исследования. К концу XX в. доступными для качественной и количественной
оценки стали практически все клеточные и химические компоненты биологических
материалов, которые позволяют с той или иной степенью точности характеризовать
состояние органов и физиологических систем организма человека и, следовательно,
представляют определенный клинический интерес.
Таблица 1. Вехи развития лабораторной диагностики в XIX—XX вв. (по Дати, Метцманн, 2007)
Годы Имена исследователей: описание исследования
1830-1840 Юстус Либих: разработка методов количественного химического анализа
1838 Йёнс Берцелиус: применил термин «белок» (от греч. proteios — «из первого разряда»)
1877-1908 Пауль Эрпих: признание тучных клеток, основные принципы иммунитета, теории формиро- вания боковой цепи/антитела, специфичность антител
1883-1908 Илья Мечников: теория фагоцитоза, теория клеточного иммунитета
1885 Луи Пастер: микробиологическая теория инфекции
1891-1905 Роберт Кох: реакция на туберкулин, гиперчувствительность отсроченного типа
1895-1919 Жюль Бордет: комплемент и активность антител при бактериолизе
1897 Рудольф Крауз: токсин и реакция антитоксина, формирование преципитата
1901-1930 Карл Ландштейнер: открытие А, В и 0 групп крови, унитарная концепция антигена и анти- тела, клеточный иммунитет
1907 Сванте Аррениус: ввел термин «иммунохимия»
1926 Лойд Фельтон и Байли: химическая природа антитела как белка и его выделение
1935 Михаэль Гейдельберг и Форрест Кендалл: описание иммунопрецилитиновой реакции
1948 Астрид Фаграуз: демонстрация образования антитела в плазме 8-клетки
1950 Альберт Кунс и Каплан: разработка техники иммунофлюоресценции
1950 Ричард Гершон и Кондо: открытие супрессорной Т-клетки
1950-е Бруце Глик: лимфоцит как тип клетки, ответственной за клеточный и гуморальный иммунитет
1953 Мортон Симонсен и Демпстер: отторжение почки у собак (реакция «имплантат против хозяина»)
8 ПРЕДИСЛОВИЕ
Окончание табл. 1
Годы Имена исследователей: описание исследования
1953-1962 Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик: описание двойной спиральной структуры ДНК
1958-1962 Жан Доссе: идентификация антигенов лейкоцитов человека
1959-1977 Розалин Ялоу: разработка радиоиммунологического исследования
1960-1975 Ренато Дульбекко: разработка современных методов культуры ткани
1961-1969 Родни Портер и Джеральд Эдельман; описание структуры антитела (IgG)
1961-1962 Ноел Вернер с соавторами: различие клеточных и гуморальных иммунных ответов
1965 Джулиана Манчини, Ангела Карбонара и Иозеф Гереманс: иммунохимическое количествен- ное определение антигенов однонаправленной радиальной иммунодиффузией
1971 Ева Ингволл и Пельман: разработка фермент-связанного иммуносорбентного исследования (ELISA)
1975-1984 Георг Кёлер и Сезар Мильштейн: разработка техники гибридомы для производства моно- клональных антител (Mabs)
1977-1980 Фредерик Сенгер и Уолтер Гилберт: методы секвенирования нуклеиновых кислот
1985-1993 Кэри Маллис; разработка цепной полимеразной реакции (PCR) для массового копирования ДНК
2001 Проект «Геном человека»’; публикация последовательности человеческого генома
Настоящее время Генно-инженерные моноклональные антитела
Широко распространены и быстро развиваются исследования гормонов, гемо-
стаза, иммунной системы, молекулярной генетики. Полностью преобразился при-
борный парк современной клинической лаборатории, как по видам инструментов,
так и по степени автоматизации. На службу лабораторной диагностике постоянно
поступают все более мощные технические средства, обладающие высокой чув-
ствительностью, стабильностью, оснащенные роботизированными устройствами,
автоматикой, компьютерами. Расширение рамок лабораторно-аналитической
деятельности, благодаря разнообразию как самих технологий, так и применяемой
аппаратуры, привело к значительному увеличению объема специальных знаний и
умений, которыми должен в настоящее время обладать лабораторный специалист.
В свою очередь, существенно расширился объем и повысилась информативность
тех объективных сведений о состоянии организма обследуемого пациента, которые
лабораторная медицина готова предоставить лечащему врачу. В настоящее время
лабораторные исследования для удовлетворения клинических потребностей полу-
чили прочный научный фундамент лабораторной медицины, а их практическое
выполнение приобрело характер системы лабораторного обеспечения медицин-
ской помоши, осуществляемого в различных формах и объеме, соответствующих
нуждам и возможностям системы здравоохранения.
Настоящее издание, направленное в первую очередь на клиническую аудито-
рию, призвано дать представление о современном состоянии лабораторной меди-
цины, помочь лечащим врачам в подборе наиболее информативных и клинически
значимых лабораторных анализов и обеспечить их диагностическую интерпрета-
цию. В то же время в руководстве приводятся и методические материалы, которые
предназначены для специалистов практических клинико-диагностических лабора-
торий. Такой комплексный подход позволяет рассмотреть представляемый мате-
риал с разных сторон и представить материал как справочно-аналитический.
Главные редакторы
Докт, мед. наук В.В. Долгов
Чл.-корр. РАЕН, докт. мед. наук В.В. Меньшиков
УЧАСТНИКИ ИЗДАНИЯ
ГЛАВНЫЕ РЕДАКТОРЫ
Долгов Владимир Владимирович — д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой
клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская
академия последипломного образования», Москва
Меньшиков Вадим Владимирович — д-р мед. наук, профессор, заслужен-
ный деятель науки РФ, член-корреспондент РАЕН, зав. лабораторией проблем
клинико-лабораторной диагностики НИЦ ГБОУ ВПО « Первый Московский госу-
дарственный медицинский университет им. И.М. Сеченова»
АВТОРЫ И СОСТАВИТЕЛИ
Алексеева Марина Леонидовна — канд. биол. наук, ст. научн. сотр. научно-
диагностической лаборатории ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и
перинатологии им. В.И. Кулакова Минздравсоцразвития России», Москва
Арсенин Сергей Леонидович — канд. мед. наук, руководитель лабораторного
направления ООО «МК», Москва
Базарный Владимир Викторович — д-р мед. наук, профессоц кафедры клини-
ческой лабораторной и микробиологической диагностики ГБОУ ВПО «Уральская
государственная медицинская академия», Екатеринбург
Байдакова Галина Викторовна — ст. научн. сотр. лаборатории наследствен-
ных болезней обмена веществ Медико-генетического научного центра РАМН,
Москва
Белохвостов Александр Сергеевич — д-р мед. наук, профессор, руководитель
генетической службы НПЦ медицинской помощи детям, заведующий лаборатори-
ей молекулярной онкологии и генетики ФГУ «ФНКЦ ДГОИ» Минздравсоцразви-
тия России, Москва
Букина Анна Михайловна — научн. сотр. лаборатории наследственных болез-
ней обмена веществ Медико-генетического научного центра РАМН, Москва
Букина Татьяна Михайловна — канд. биол. наук. ст. научн. сотр. лаборатории
наследственных болезней обмена веществ Медико-генетического научного центра
РАМН, Москва
Вавилова Татьяна Владимировна — д-р мед. наук, профессор кафедры клини-
ческой лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Северо-Западный Государственный
медицинский университет», Санкт-Петербург
Венгеров Юрий Юзефович — д-р биол. наук, профессор, вед. научн. сотр.
лаборатории иммунобиохимии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва
Воскобоева Елена Юрьевна — канд. мед наук, вед. научн. сотр. лаборатории
наследственных болезней обмена веществ Медико-генетического научного центра
РАМН, Москва
Герштейн Елена Сергеевна — д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник
лаборатории клинической биохимии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Гильманов Александр Жане (ич — д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой
лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицин-
ский университет Минздравсоцразвития РФ», Уфа
Дементьева Инна Иосифовна — д-р биол. наук, профессор, зав. лабораторией
экспресс-диагностики ГУ «Российский научный центр хирургии РАМН», Москва
Джангирова Татьяна Владимировна — канд. мед. наук, доцент кафедры
клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская
академия последипломного образования», Москва
Ельчанинова Светлана Александровна — д-р биол. наук, профессор, зав.
кафедрой биохимии и лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Алтайский государ-
ственный медицинский университет». Барнаул
10
УЧАСТНИКИ ИЗДАНИЯ
Еремин Серафим Кузьмич — ст. научи, сотр., ст. преподаватель кафе-
дры аналитической и судебно-медицинской токсикологии ГБОУ ВПО «Первый
Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова »
Ермакова Марина Александровна — канд. мед. наук, ассистент кафедры
медицинской генетики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последи-
пломного образования», Москва
Зайко Виктория Витальевна — канд. биол. наук, мл. научн. сотр. лаборато-
рии иммунобиохимии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва
Захарова Екатерина Юрьевна — канд. мед. наук, зав. лабораторией наслед-
ственных болезней обмена веществ Медико-генетического научного центра РАМН,
Москва
Зурочка Александр Владимирович — д-р мед. наук, профессор, зав. курсом
клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Челябинская государствен-
ная медицинская академия»
Иванец Татьяна Юрьевна — канд, мед. наук, заведующая научно-диаг-
ностической лабораторией ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и пери-
натологии им. В.И. Кулакова Минздравсоцразвития России», Москва
Изотов Борис Николаевич -д-р хим, наук, профессор, зав. кафедрой анали-
тической и судебно-медицинской токсикологии ГБОУ ВПО «Первый Московский
государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова»
Калиненкова Светлана Георгиевна — канд. биол. наук. зав. лабораторией
генетики МОНИКИ им. Владимирского, Москва
Касоян Карине Тимуровна — канд. мед. наук, ассистент кафедры клиниче-
ской лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия
последипломного образования», Москва
Кишкун Алексей Алексеевич — д-р мед. наук профессор кафедры медицин-
ской биохимии ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного
образования», Москва
Козлова Светлана Ивановна — д-р мед. наук, профессор кафедры медицин-
ской генетики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного
образования», Москва
Колупаев Всеволод Евгеньевич — канд. мед. наук, менеджер по продукции
ООО «БИО-РАД лаборатория», Москва
Кузмичева Нелли Алексеевна — канд. биол. наук, доцент кафедры медицин-
ской генетики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного
образования», Москва
Кушлинский Николай Евгеньевич — д-р мед. наук, профессор, член-
корреспондент РАМН, зав. лабораторией клинической биохимии РОНЦ им.
Н.Н. Блохина РАМН; зав. кафедрой биохимии ГБОУ ВПО «Московский государ-
ственный медико-стоматологический университет»
Луговская Светлана Алексеевна - д-р мед. наук, профессор кафедры клини-
ческой лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия
последипломного образования», Москва
Любимова Нина Васильевна — д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник
лаборатории клинической биохимии РОНЦ им.Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Малахов Владимир Николаевич — д-р биол. наук, профессор, руководитель
отдела стандартизации и контроля качества клинической лабораторной диа-
гностики ФГУ ГНИЦ профилактической медицины, генеральный директор НП
«Центр внешнего контроля качества», Москва
Мамаев Андрей Николаевич — д-р мед. наук, зав. лабораторией гемостаза
МУЗ «Городская больница № 11», г. Барнаул, ст. научн. сотр. Алтайского филиала
ГУ «Гематологический научный центр РАМН»
УЧАСТНИКИ ИЗДАНИЯ
11
Миронова Ирина Ивановна — канд. мед. наук, доцент кафедры клинической
лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия после-
дипломного образования», Москва
Наумова Елена Владимировна — канд. мед. наук, ассистент кафедры клини-
ческой лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия
последипломного образования», Москва
Новик Виктор Иванович — д-р мед. наук, профессор, руководитель группы
онкоцитологии ФГУ НИИ онкологии, Санкт-Петербург
Первушин Юрий Владиславович — канд. мед. наук, профессор, зав. кафедрой
клинической лабораторной диагностики Института последипломного и дополни-
тельного образования ГБОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская
академия»
Погорелов Валерий Михайлович — д-р мед. наук, профессор, зав. лаборато-
рией гемоцитологии Гематологического научного центра РАМН, Москва
Почтарь Маргарита Евгеньевна — канд. мед. наук, доцент кафедры клини-
ческой лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия
последипломного образования», Москва
Прищепа Михаил Иванович — канд. техн, наук, президент ЗАО «Аналитика»
Ракова Наталья Геннадьевна — канд. мед. наук, доцент кафедры клинической
лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия после-
дипломного образования», Москва
Ройтман Александр Польевич — канд, мед наук, доцент кафедры клиниче-
ской лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия
последипломного образования», Москва
Романова Людмила Андреевна — канд. мед. наук, доцент кафедры клиниче-
ской лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия
последипломного образования», Москва
Рытикова Наталья Станиславовна — канд. биол. наук, руководитель направ-
ления иммуноферментного анализа ЗАО «БиоХимМак», Москва
Селиванова Анна Владимировна - канд. мед. наук, врач-эндокринолог ГКБ
им. С.П. Боткина, Москва
Сергеева Наталья Сергеевна — д-р биол. наук, профессор, зав. лабораторией
прогноза эффективности консервативного лечения опухолей ФГУ «Московский
научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена»
Симбирцев Андрей Семенович — д-р мед. наук, профессор, зав. лаборатори-
ей фармиммунологии Государственного НИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА
России, Санкт-Петербург
Скуинь Людмила Михайловна — канд. мед. наук, доцент кафедры иммуно-
логии ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образо-
вания», Москва
Соболева Татьяна Николаевна — канд. мед. наук, доцент кафедры клиниче-
ской лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Российский национальный исследо-
вательский медицинский университет», Москва
Старовойтова Татьяна Авенировна — д-р мед. наук, врач высшей категории,
зав. клинико-диагностической лабораторией НУЗ Центральная клиническая боль-
ница № 1 ОАО «Российские железные дороги», Москва
Стериополо Ника Александровна — канд. биол. наук, врач высшей кате-
гории, заведующая клинико-диагностической лабораторией ФГУ «Клиническая
больница» Управления делами Президента РФ, Москва
Суплотов Сергей Николаевич — д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой
клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Тюменская государственная
медицинская академия»
Тарасенко Ольга Анатольевна — канд. мед. наук, зам. главного врача ФГУЗ
«Головной центр гигиены и эпидемиологии» ФМБА России, Москва
12 УЧАСТНИКИ ИЗДАНИЯ
Тотолян Арег Артемович — д-р мед. наук, профессор, зам. директора ФБУН
«Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»
Тумбинская Лидия Викторовна — канд. биол. наук, зам. директора по раз-
витию ЗАО НПФ «ДНК-технология». Москва
Фанченко Николай Дмитриевич — д-р биол. наук, профессор, консультант
научно-диагностической лаборатории ФГУ «Научный центр акушерства, гине-
кологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Минздравсоцразвития России»,
Москва
Хайдуков Сергей Валерьевич — д-р биол. наук, зав. лаб. физиологии и пато-
логии иммунной системы ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и имму-
нологии Росздрава; специалист по проточной цитофлуорометрии ООО «Бекмен
Культер», Москва
Цвиренко Сергей Васильевич — д-р мед наук, профессор, зав. кафедрой
лабораторной и микробиологической диагностики ГБОУ ВПО «Уральская госу-
дарственная медицинская академия», Екатеринбург
Чухловин Алексей Борисович — д-р мед. наук, профессор кафедры клини-
ческой лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины ГБОУ ВПО
«Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика
И.П.Павлова Росздрава»
Шабалова Ирина Петровна — д-р мед. наук, профессор кафедры клинической
лабораторной диагностики ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия после-
дипломного образования», Москва
Шапиро Наум Абрамович — д-р мед. наук, профессор, заслуженный врач
РФ, лаборатория цитологии Центральной клинической больницы №1 ОАО «Рос-
сийские железные дороги», Москва
Шевченко Ольга Павловна — д-р мед. наук, профессор, зам директора ФГУ
«Научный центр трансплантологии и искусственных органов», Москва
Шехтер Ольга Владимировна — канд. хим. наук, ст. научн. сотр. лаборатории
наследственных болезней обмена веществ Медико-генетического научного центра
РАМН, Москва
МЕТОДОЛОГИЯ СОЗДАНИЯ И ПРОГРАММА
ОБЕСПЕЧЕНИЯ КАЧЕСТВА
Национальные руководства — первая в России серия практических руководств
по медицинским специальностям, включающих в себя всю основную информацию,
необходимую врачу для практической деятельности и непрерывного медицинско-
го образования. В отличие от большинства других руководств в национальных
руководствах равное внимание уделено профилактике, диагностике, фармакотера-
пии и немедикаментозным методам лечения заболеваний.
Почему необходимы национальные руководства? Динамичное развитие меди-
цинской науки, быстрое внедрение в клиническую практику новых высокотех-
нологичных методов диагностики и лечения требуют от врача непрерывного
повышения профессионализма и обновления знаний на протяжении всей его про-
фессиональной жизни. Данная задача решается системой последипломного обра-
зования и периодической сертификацией специалистов лишь частично. Быстро
возрастающий объем научной медицинской информации предъявляет особые
требования к качеству используемых учебных и справочных руководств, особенно
с учетом внедрения в широкую клиническую практику достижений медицины,
основанной на доказательствах. Имеющиеся на сегодня руководства для врачей
и фармакологические справочники не в полной мере отвечают современным
потребностям врачебной аудитории.
Ниже приведено описание требований, которые были разработаны при подго-
товке Национального руководства по клинической лабораторной диагностике, и
мероприятий по лабораторному обеспечению медицинской помощи.
КОНЦЕПЦИЯ И УПРАВЛЕНИЕ ПРОЕКТОМ
Для работы над проектом была создана группа управления в составе руководи-
теля и менеджеров проекта.
Для разработки концепции и системы управления проектом его руководители про-
вели множество консультаций с отечественными и зарубежными специалистами —
руководителями профессиональных обществ, ведущими разработчиками аналити-
ческих и диагностических методов, клинических рекомендаций, организаторами
здравоохранения, представителями компаний, производящих лабораторное меди-
цинское оборудование и другие средства клинического лабораторного анализа.
Б результате разработана концепция проекта, сформулированы этапы, опреде-
лены их последовательность и сроки исполнения, выработаны требования к эта-
пам и исполнителям; утверждены инструкции и методы контроля.
ЦЕЛЬ
Обеспечить врача всей современной информацией в области клинической
лабораторной диагностики, необходимой для непрерывного медицинского обра-
зования, что позволит значительно повысить качество специализированной меди-
цинской помощи в Российской Федерации.
ЗАДАЧИ
• Проанализировать все современные источники достоверной высококаче-
ственной информации.
• На основе полученных данных составить обобщающие материалы с учетом
особенностей отечественного здравоохранения по следующим направлениям:
❖ аналитические лабораторные технологии;
❖ клинические рекомендации по применению лабораторных исследований;
❖ алгоритмы лабораторной диагностики;
❖ терапевтический мониторинг лекарственных средств.
14
МЕТОДОЛОГИЯ СОЗДАНИЯ И ПРОГРАММА ОБЕСПЕЧЕНИЯ КАЧЕСТВА
• Подготовить издание, соответствующее всем современным требованиям
к национальному руководству по отдельной специальности.
АУДИТОРИЯ
Национальное руководство по клинической лабораторной диагностике предна-
значено врачам клинической лабораторной диагностики, врачам различных кли-
нических специальностей, интернам, ординаторам, студентам медицинских образо-
вательных учреждений. Составители и редакторы привели авторские материалы в
соответствие с условиями специализированной клинической практики в России.
ЭТАПЫ РАЗРАБОТКИ
Создание команды управления и команды разработчиков, составление концеп-
ции, выбор тем, поиск литературы, разработка авторских материалов, экспертиза,
редактирование, независимое рецензирование с получением обратной связи от
рецензентов (специалисты, практикующие врачи, организаторы здравоохранения,
производители средств лабораторного анализа, медицинского оборудования и
др.), публикация, внедрение, получение обратной связи и дальнейшее улучшение.
СОДЕРЖАНИЕ
Как и все книги серии, Национальное руководство по клинической лаборатор-
ной диагностике включает в себя описание клинико-анатомических форм различ-
ных заболеваний, методов их диагностики и лечения.
РАЗРАБОТЧИКИ
• Авторы-составители — практикующие врачи, сотрудники научно-
исследовательских и образовательных учреждений России, руководители
кафедр;
• главные редакторы — д-р мед. наук, проф. В.В. Долгов, зав. кафедрой кли-
нической лабораторной диагностики Российской медицинской академии
последипломного образования; д-р мед. наук, проф., член-корреспондент
Российской академии естественных наук. В.В. Меньшиков, зав. лабораторией
проблем клинике-лабораторной диагностики Первого Московского меди-
цинского университета им. И.М. Сеченова;
• наушные редакторы и рецензенты — ведущие специалисты различных раз-
делов лабораторной медицины;
• редакторы издательства — практикующие врачи с опытом работы в издатель-
стве не менее 5 лет;
• руководители проекта — с опытом руководства проектами с большим числом
участников при ограниченных сроках создания, владеющие методологией
создания специализированных медицинских руководств.
Всем специалистам были предоставлены описание проекта, формат статьи,
инструкция по составлению каждого элемента содержания, источники информа-
ции и инструкции по их использованию, пример каждого элемента содержания.
В инструкциях для составителей указывалась необходимость подтверждать эффек-
тивность (польза/вред) вмешательств в независимых источниках информации,
недопустимость упоминания каких-либо коммерческих наименований. Приведены
международные (некоммерческие) названия лекарственных препаратов, которые
проверялись редакторами издательства по Государи венному реестру лекарственных
средств (по состоянию на 1 июля 2010 г.). В требованиях к авторам-составителям
было подчеркнуто, что материалы должны кратко и конкретно отвечать на клини-
ческие вопросы. После редактирования текст согласовывали с авторами.
Со всеми разработчиками руководитель проекта и ответственные редакторы
поддерживали непрерывную связь по телефону и электронной почте с целью
решения оперативных вопросов.
МЕТОДОЛОГИЯ СОЗДАНИЯ И ПРОГРАММА ОБЕСПЕЧЕНИЯ КАЧЕСТВА
15
РЕЗУЛЬТАТ
Национальное руководство по клинической лабораторной диагностике в удоб-
ной и доступной форме содержит всю необходимую информацию для практиче-
ской деятельности и непрерывного медицинского образования.
РЕКЛАМА
В инструкциях для авторов, научных редакторов и рецензентов подчеркивалась
необходимость использовать при работе над национальным руководством только
достоверные источники информации, не зависящие от мнения производителей
средств лабораторного анализа и медицинской техники, что в конечном счете обе-
спечило отсутствие информации рекламного характера в авторских материалах
руководства.
КОМПАКТ-ДИСК «КОНСУЛЬТАНТ ВРАЧА. КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ
ДИАГНОСТИКА»
В рамках проекта «Клиническая лабораторная диагностика. Национальное
руководство» также подготовлена электронная информационно-образовательная
система «Консультант врача. Клиническая лабораторная диагностика» (на
компакт-диске). Система содержит текст национального руководства, стандарты,
утвержденные Минздравсоцразвития России, и другие дополнительные материа-
лы. Программа снабжена уникальной системой поиска. Информацию об электрон-
ной информационной системе «Консультант врача. Клиническая лабораторная
диагностика» можно получить по тел.: (495) 921-39-07; по электронной почте:
bookpost@geotar.ru, а также на интернет-сайте: www.geotar.ru.
ОБРАТНАЯ СВЯЗЬ
Замечания и пожелания по подготовке книги «Клиническая лабораторная диа-
гностика. Национальное руководство» можно направлять по адресу: г. Москва,
ул. Садовническая, д. 9, стр. 4; электронный адрес, info@asmok.ru. Таким образом,
Национальное руководство по клинической лабораторной диагностике в удобной
и доступной форме содержит всю необходимую информацию для практической
деятельности и непрерывного медицинского образования по клинической лабора-
торной диагностике. Все приведенные материалы рекомендованы Научным обще-
ством специалистов клинической лабораторной диагностики и ведущими научно-
исследовательскими институтами. Национальное руководство по клинической
лабораторной диагностике будет регулярно пересматриваться и обновляться не реже
одного раза в 3-4 года. Дополнительную информацию о проекте «Национальные
руководства» можно получить на интернет-сайте: http://nr.asmok.ru.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
* — знак лекарственного средства, не имеющего международного непатентованно-
го названия
— лекарственное средство не зарегистрировано в Российской Федерации
® — лекарственное средство в Российской Федерации аннулировано, т.е. исключе-
но из Государственного реестра лекарственных средств
11-ДГТ — 11-дегидротромбоксан
АСТ/ВСКа — activated clotting time, время свертывания цельной крови при актива-
ции контактной фазы
aPCR — activated protein С resistance, резистентность фактора V к активированному
протеину С
аРТТ/АЧТВ — activated partial thromboplastin time, активированное частичное тром-
бопластиновое время
BNP — мозговой натрийуретический пептид
BE — bases excess, избыток буферных оснований
CD — кластер дифференцировки
CDKI — cyclin-dependent kinase inhibitor, ингибитор циклин-зависимых киназ
Cler — внепочечный клиренс
С1г — почечный клиренс
Clt — общий клиренс
Cssmax — максимальная равновесная концентрация
Cssmin — минимальная равновесная концен грация
Со — кажущаяся начальная концентрация
CTAD — цитрат натрия, аденозин, теофилин и дипиридамол
СТАР-Ш — connective tissue-activating peptide III, пептид, активирующий соедини-
тельную ткань
DDU — D-dimers unit, единицы D-димера
dRVVT — diluted Russel Viper Venom Test, тест с разведенным ядом гадюки Рассела
Е2 — эстрадиол
ЕЗ — эстриол
F — биодоступная молярная доля
FEU — fibrinogen equivalent units, фибриногеновые эквивалентные единицы
GP — гликопротеин
GRP — гастрин-рилизинг-пептид
НЬО2, НЬСО, МетНЬ — фракции гемоглобина: окси-, карбокси-, метгемоглобин
НЬА1с — гликированный гемоглобин
hs-СРБ —уровень С-реактивного белка, определенный высокочувствительным
методом
Ig — иммуноглобулин
ISTH — Исследовательская группа по ВА и фосфолипидзависимым антителам
Ка — константа скорости абсорбции
КСТ - kaolin clotting time, каолиновое время
Kel — константа скорости элиминации
МАРК — система митоген-активируемых протеинкиназ
РА1-1/ИАП-1 — plasminogen activator inhibitor 1, ингибитор активатора плазмино-
гена 1
РВ — белковосвязывающая молярная доля
РВР — platelet basic protein, основной пептид тромбоцитов
PC — protein С, протеин С
РСТ — прокальцитонин
PCT —platelet crit, тромбокрит
PDGF — platelet-derived Growth Factor, фактор роста тромбоцитарный
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 17
PDW —platelet distribution width, ширина гистограммы по объему тромбоцитов,
степень тромбоцитарного анизоцитоза
proBNP — прогормон мозгового натрийуретического пептида
РТ/ПВ — prothrombin time, протромбиновое время
рО2 рСО? — напряжение кислорода, углекислого газа
RIA — radioimmunoassay, радиоиммунный анализ
RVV — Russel Viper Venom, яд гадюки Рассела
SCC — антиген плоскоклеточного рака
SHBG — секс-стероидсвязывающий глобулин
SSCP — single strand conformation polymorphism, конформационный полиморфизм
одноцепочечных фрагментов ДНК
SB — стандартный избыток оснований
sO2, svO,, saO2 — насыщение крови (венозной, артериальной) кислородом
TF — tissue factor, тканевой фактор
tPA — tissue plasminogen activator, тканевой активатор плазминогена
UBC — Urinary Bladder Cancer, опухоль мочевого пузыря
Vd — объем распределения
а-ГБДГ — а-гидроксибутиратдегидрогеназа
АпоА-1 — аполипротеин A-I
АпоА-П — аполипротеин А-П
АА — апластическая анемия
АВС — активированное время свертывания
АДГ — антидиуретический гормон
АДФ — аденозиндифосфат
АИГА — аутоиммунная гемолитическая анемия
АНТ — аутоиммунный тиреоидит
АКТГ — адренокортикотропный гормон
АЛТ — аланинаминотрансфераза
Анти-рец.ТТГ, a-RTSH — антитела к рецептору ТТГ
АПГ — анализатор показателей гемостаза
АПТИ — аспирационная пункция тонкой иглой
АПФ — ангиотензин-превращающий фермент
АСА — аргинин-янтарная ацидурия
АСК — анализатор свертывания крови
АСЛ-0 — антистрептолизин-0
ACT — аспартатаминотрансфераза
АТ — антитромбин
АТФ — аденозинтрифосфат
АТППК 1 — аминотерминальные пропептиды проколлагена I типа
АТ-ТГ — антитела к тиреоглобулин)?
АТТК 1 — аминотерминальные телопептиды коллагена I типа
АФА — антифосфолипидные антитела
АФП — O'-фетопротеин
АФС — антифосфолипидный синдром
АХЗ — анемия хронических заболеваний
АЧТВ — активированное частичное тромбопластиновое время
БАЛ — бронхоальвеолярный лаваж
БГЛ — большие гранулярные лимфоциты i’
БОЕ-Э — бурстобразующие единицы эритропоэза \
БТП — бедная тромбоцитами плазма L.,—.. .....
БТЦ — болезнь тяжелых цепей
ВА — волчаночный антикоагулянт
ВКЛ — волосатоклеточный лейкоз
18 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
ВОК — внешняя оценка качества
ВПР — врожденные пороки развития
ВПЧ — вирус папилломы человека
ВС — водные стандарты
ВСК — время свертывания цельной крови
ВФ — внутренний фактор Касла
ВЦР — видеоцифровая регистрация
ВЭЖХ — высокоэффективная газовая хроматография
Г-6-ФД - глкжозо-6-фосфатдегидрогеназа
ГАГ — гликозаминогликаны
ГАЛК — галактокиназа
ГАЛТ — галактозо-1-фосфатур идилтрансфераза
ГАЛЭ — уридилдифосфогалактозо-4-эпимераза
ГГА — гипоталамо-гипофизарно-адреналовая
ГГТ — у-глутамилтранспептидаза
ГЖХ — газово-жидкостная хроматография
Г-КСФ — гранулоцитарный колониестимулирующий фактор
ГМ-КСФ — гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор
ГнРГ — гонадолиберин
ГОЛ — галактозил оксилизин
ГСПГ — глобулин, связывающий половые гормоны
ГТТ — глюкозотолерантный тест
ГФА — гиперфенилаланинемия
ГХ — газовая хроматография
ГХ/МС — газовая хроматография/масс-спектрометрия
ГХ/ПИ — газовая хроматография/плазменная ионизация
ГЦР — гепатоцеллюлярный рак
ГЭБ — гемато-энцефалический барьер
ДВС — диссеминированное внутрисосудистое свертывание
ДГПЖ — доброкачественная гиперплазия предстательной железы
ДГЭА-С — дегидроэпиандростерон-сульфат
ДО2 — доставка кислорода
ДПИД — дезоксипиридинолин
ДТ — детектор термоионный
ДТЗ — диффузно-токсический зоб
ДТП — детектор теплопроводности
ДУ — дискриминационный уровень
ДЭА — дегидроэпиандростерон
ДЭЗ — детектор по захвату электронов
ЖДА — железодефицитная анемия
ЖЖЭ — жидкость-жидкостная экстракция
ЖКТ — желудочно-кишечный тракт
ЖХ-МС — жидкостная хроматография-масс-спектрометрия
ЖХВР — жидкостная хроматография высокого разрешения
ИАП — ингибитор активности плазминогена
ИБС — ишемическая болезнь сердца.
ИВЛ — искусственная вентиляция легких
ИГХ — иммуногистохимический
ИЛ — интерлейкин
ИМА — индекс множественных аномалий
ИМЛ — исследования по месту лечения
ИОХ — ионно-обменная хроматография
ИРТ — иммунореактивный трипсиноген
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 19
ИСН — индекс созревания нейтрофилов
ИСЭ — индекс созревания эритрокариоцитов
ИТЗ — индекс тератозооспермии
ИФ — иммунофлюоресценция
ИФА — иммуноферментный анализ
ИФР-1 — инсулиноподобный фактор роста 1
ИХА — иммунохимический анализ
ИХЛ — иммунохемилюминесцентный анализ
КДЛ — клинико-диагностическая лаборатория
КК — креатинкиназа
КЛ — кардиолипин
КОД — коллоидно-осмотическое давление плазмы
КОЕ — колониеобразующие единицы
КОЕ-Г — колониеобразующая единица гранулоцитопоэза
КОЕ-ГМ — колониеобразующая единица грануломоноцитопоэза
КОЕ-ГЭММ — колониеобразующая единица гранулоцитарно-эритроцитарно-
макрофагально-мегакариоцитарная
КОЕ-Э — колониеобразующие единицы эритроидного ряда
КОС — кислотно-основное состояние
КРР — колоректальный рак
КСФ — колониестимулирующий фактор
КТ — компьютерная томография
КТА — клинике-токсикологический анализ
КТППК 1 — карбокситерминальные пропептиды проколлагена I типа
КТР — копчико-теменной размер
КТТК 1 — карбокситерминальные телопептиды коллагена I типа
КФ — кислая фосфатаза
КЩФ — костный изофермент щелочной фосфатазы
ЛА — латекс-агглютинация
ЛБН — лизосомные болезни накопления
ЛГ — лютеинизирующий гормон
ЛДГ — лактатдегидрогеназа
ЛИС — лабораторная информационная система
ЛП — липопротеин
ЛПВП — липопротеиды высокой плотности
Л ПИП — липопротеиды низкой плотности
ЛПОНП — липопротеиды очень низкой плотности
ЛУ — лимфатические узлы
МА — моноклональные антитела
МАО — моноаминооксидаза
МДС — миелодиспластический синдром
МИН — международный индекс чувствительности
МКРЛ — мелкоклеточный рак легких
ММП — матриксные металлопротеиназы
МНО — международное нормализованное соотношение
МОД — минутный объем дыхания
МПО — миелопероксидаза
МС — детектор масс-селективный
НАД - никотина мидадениндинуклеотид
ИБО — наследственные болезни обмена веществ
НМРЛ — немелкоклеточный рак легкого
НО — нормализованное отношение
НСЕ — нейроспецифическая енолаза
20 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
НТЖ — насыщение трансферрина железом
НФХ — нормально-фазовая хроматография
НХЛ — неходжкинская лимфома
одн — острая дыхательная недостаточность
ОЖСС — общая железосвязывающая способность
ОИМ — острый инфаркт миокарда
ОК — остеокальцин
ОЛ — острый лейкоз
ОЛЖН — острая левожелудочковая недостаточность
ОЛЛ — острый лимфобластный лейкоз
ОМ — опухолевые маркеры
ОМ Л — острый миелолейкоз
ОНМК — острое нарушение мозгового кровообращения
ОП — оптическая плотность
ОПр — оксипролин
ОтП — отношение правдоподобия
ОПеН — острая печеночная недостаточность
ОПЖН - острая правожелудочковая недостаточность
ОПН — острая почечная недостаточность
ОРВИ — острая респираторная вирусная инфекция
ОСН — острая сердечная недостаточность
ОФК — обращенно-фазовая хроматография
ОЦК — объем циркулирующей крови
ПАБК — парааминобензойная кислота
ПАСК — парааминосалициловая кислота
ПВ — протромбиновое время
ПДТ — первичный документ теста
ПДФ — продукты деградации фибрина
ПДФ/ПДф — продукты деградации фибрина и фибриногена
ПИД — пиридинолин
ПНГ — пароксизмальная ночная гемоглобинурия
ПО — протромбиновое отношение
ПО2 — потребление кислорода
ПОЛ — перекисное окисление липидов
ПОН — полиорганная недостаточность
Пр5 — протеин S
ПРЛ — пролактин
ПСА — простатоспецифический антиген
ПСМА — простатоспецифический мембранный антиген
ПТГ — паратиреоидный гормон
ПФ ИА — поляризационный флюороиммунологический анализ
ПЦР — полимеразная цепная реакция
РА — рецептор андрогенов
РА — рефрактерная анемия
РАИБ — рефрактерная анемия с избытком бластов
РАКС - рефрактерная анемия с кольцевидными сидеробластами
РГ — рецептор глюкокортикоидов
РДС — респираторный дистресс синдром
РИА — радиоизотопный анализ
РМЖ — рак молочной железы
РМП — рак мочевого пузыря
РИГА — реакция непрямой гемагглютинации
РНК — рибонуклеиновая кислота
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 21
РНП-плазма — референтная нормальная пулированная плазма
РП — рецептор прогестерона
РПГА — реакция прямой гемагглютинации
РПЖ — рак предстательной железы
РСК — реакция связывания комплемента
РТК — рак толстой кишки
РФМК — растворимые фибрин-мономерные комплексы
РЦМД — рефрактерная цитопения с многоростковой дисплазией
РШМ — рак шейки матки
РЭ — рецептор эстрогенов
РЭА — раково-эмбриональный антиген
РЭС — ретикулоэндотелиальная система
РЭФР — рецептор эпидермального фактора роста
РЯ — рак яичников
СД — сахарный диабет
СЖ — синовиальная жидкость
СЖК — свободные жирные кислоты
СИ — сердечный индекс
СКВ — системная красная волчанка
СКК — стволовые кроветворные клетки
СКФ — скорость клубочковой фильтрации
СМФ — система мононуклеарных фагоцитов
СОЭ — скорость оседания эритроцитов
СПИД — синдром приобретенного иммунодефицита
СРВ — С-реактивный белок
СТГ — соматотропный гормон
СЦК — средний цитохимический коэффициент
ТЗ — трийодтиронин
Т4 — тироксин
ТБГ — трофобластический глобулин
ТВ — тромбиновое время
ТВП — толщина воротникового пространства
ТГ — тиреоглобулин
ТГ — триглицериды
ТКПБ — тонкоигольная капиллярная биопсия
ТЛМ — терапевтический лекарственный мониторинг
ТМБ — тетраметилбензидин
ТПО — тиреопероксидаза
Тр — тропонин
ТРГ — тиреотропин-рилизинг-гормон
TCAt — тиреоид-стимулирующие антитела
ТСГ — тироксинсвязывающий глобулин
ТСИ — тиреоид-стимулирующий иммуноглобулин
ТСПА — тироксинсвязывающий преальбумин
ТСХ — тонкослойная хроматография
ТТГ — тиреотропный гормон
ТТП — тромботическая тромбоцитопеническая пурпура
ТФР — трансформирующий фактор роста
ТЭСГ — тестостерон-эстрадиолсвязывающий белок
УЗИ — ультразвуковое исследование
УО2 — утилизация кислорода
ФАБ-классификация — Франко-Американо-Британская классификация
ФВ — фактор фон Виллебранда
22 список СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
ФДК — фолликулярные дендритные клетки
ФИ — фосфатидилинозитол
ФК — фолиевая кислота
ФКУ — фенилкетонурия
ФМ — фибрин-мономеры
ФНО — фактор некроза опухоли
ФПИА — флюоресцентно-поляризационный иммуноанализ
ФС — фосфатидилсерин
ФСВОК — Федеральная система внешней оценки качества
ФСГ — фолликулостимулирующий гормон
ФСК - фактор стволовых клеток
ФЭА — фосфатидилэтаноламин
ФЭУ — фотоэлектронные умножители
ХГАБ — холодовая гемагглютининовая болезнь
ХГЧ — хорионический гонадотропин человека
ХЛЛ — хронический лимфолейкоз
ХМ — хиломикроны
ХМЛ — хронический миелолейкоз
ХМ МЛ — хронический миеломоноцитарный лейкоз
ХМПЗ — хронические миелопролиферативные заболевания
ХМС — хроматомасс-спектромегрия
ХПН — хроническая почечная недостаточность
ХС-ЛПВП — холестерин липопротеидов высокой плотности
ХЭ — холинэстераза
ЦБ — центробласты
ЦВД — центральное венозное давление
ЦИМ — цитологическое исследование мокроты
ЦМВ — цитомегаловирус
ЦНС — центральная нервная система
ЧСС — частота сердечных сокращений
ЩФ — щелочная фосфатаза
ЭДТА — этилендиаминтетраацетат
ЭКО — экстракорпоральное оплодотворение
ЭПО — эритропоэтин
эЭПО — эндогенный эритропоэтин
р-ТГ — р-тромбоглобулин
Глава 1
Лабораторное обеспечение
медицинской помощи
ПРЕДМЕТ КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ
МЕДИЦИНЫ
Практическая деятельность врача любой специальности связана
с потребностью в сведениях о состоянии процессов жизнедеятель-
ности отдельных органов и тканей, а также организма пациен-
та в целом. Уменьшить имеющуюся неопределенность призваны
объективные методы исследования, которые активно внедряются
в клиническую практику. Выполнение таких исследований, как
правило, требует специального оборудования, профессиональной
подготовки персонала, особой организации работы в учрежде-
нии здравоохранения. В настоящее время многочисленные виды
объективных исследований консолидированы в три направления:
лучевую (интраскопическую), функциональную и клиническую
лабораторную диагностику. Последнюю все чаще определяют как
лабораторную медицину, что, с одной стороны, подчеркивает мас-
штаб и значимость этого направления в современной практике, с
другой — очерчивает область исследований in vitro, включая микро-
биологические, токсикологические, генетические и другие виды
исследований, выполняемые вне человека с материалами от него.
Предмет лабораторной медицины — получение и предос гавление
для клинического использования информации о составе (химиче-
ском и клеточном) биоматериалов и изменениях, доказательно свя-
занных причинно-следственными взаимоотношениями с опреде-
ленными патологическими процессами и состояниями в организме
человека. Эта информация необходима для решения важнейших
медицинских задач:
• оценки состояния здоровья человека при профилактическом
обследовании:
• обнаружения признаков болезней (диагностика и дифферен-
циальная диагностика);
• определения характера (активности) патологического процесса:
• оценки функциональных систем и их компенсаторных воз-
можностей;
• определения эффективности проводимого лечения;
• слежения за концентрацией лекарств (лекарственный монито-
ринг);
• определения прогноза заболевания:
• определения достижения результата лечения.
24 ЛАБОРАТОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ
Лабораторная медицина открывает широкие возможности для точного и ран-
него обнаружения признаков патологических процессов и заболеваний, в ней
используются качественные и количественные показатели, поддающиеся кон-
тролю. Ее методы доступны для большинства учреждений здравоохранения по
финансовым и иным критериям. Лабораторные данные приобретают все большую
значимость как доказательства при решении социальных и юридических вопро-
сов. Общепризнан вклад лабораторной диагностики в развитие доказательности
в медицине. Неотъемлема роль современной лаборатории в обеспечении высо-
ких медицинских технологий, внедрение которых принято как часть программы
модернизации здравоохранения России.
В настоящее время лабораторная информация используется при принятии
до 70% медицинских решений практически во всех клинических дисциплинах.
Лабораторные исследования включены в программу диспансеризации, в стандар-
ты медицинской помощи при большинстве форм патологии. Высокая востребо-
ванность лабораторных исследований демонстрируется ежегодным приростом их
количества по стране. Согласно статистическим данным Минздравсоцразвития
Российской Федерации, только лаборатории учреждений здравоохранения мини-
стерского подчинения (без ведомственных, частных) в течение года выполняют
свыше 3 млрд анализов. На одного больного в стационаре в 2008 г. приходи-
лось в среднем 38,9 анализа, на 100 амбулаторных посещений - 122 анализа.
Лабораторные исследования составляют 89,3% общего количества объективных
диагностических исследований. Анализ отчетов по регионам однозначно свиде-
тельствует о росте количества исследований и увеличении технологичных иссле-
дований. В ведомственных учреждениях здравоохранения обеспечение анализами
пациентов заметно выше, чем в среднем по стране. Это, а также быстрый рост
объема исследований, выполняемых в коммерческих лабораториях, позволяет
говорить о неполном удовлетворении реальной потребности в данном виде меди-
цинских услуг, причем как специализированных, так и массовых рутинных.
Лабораторная информация основана на обнаружении и/или измерении в образ-
цах биоматериалов определенных компонентов (аналитов), которые функцио-
нально или структурно связаны с нарушенной функцией или с пораженным орга-
ном, отражают наличие патологического процесса и характеризуют его причину,
механизмы развития, выраженность и индивидуальную картину заболевания. Для
обеспечения ценности получаемой информации лабораторная медицина решает
следующие задачи:
• определение круга компонентов биологических материалов человека, изме-
нения которых имеют доказанную причинно-следственную связь с возмож-
ными патологическими состояниями;
• разработку методов исследования биоматериалов, применение которых
позволяет обнаружить искомый компонент биоматериала и при необходи-
мости измерить его содержание;
• разработку условий для выполнения исследований биоматериалов и интер-
претации их результатов, обеспечивающих получение достоверной лабора-
торной информации.
При решении этих задач лабораторная медицина:
• опирается на фундаментальные медико-биологические науки — биологию,
физиологию, биохимию, цитологию, микробиологию, иммунологию, моле-
кулярную биологию, общую патологию;
• использует современные возможности химического анализа, биофизики,
электроники, приборостроения, метрологии;
• применяет методы доказательной медицины, математической статистики,
информатики для установления связи между элементами лабораторной и
клинической информации.
ЛАБОРАТОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ 25
Соответственно в рамках лабораторной медицины можно выделить патобиоло-
гию как ее теоретическую основу, лабораторную (клиническую) аналитику — как
совокупность средств и способов выполнения исследований и собственно клинико-
лабораторную диагностику — как совокупность доказательств информативности
лабораторных показателей для конкретных медицинских задач. Эти три раздела
гармонично связаны между собой, причем не только в масштабах отрасли знаний,
но и в рамках практической деятельности конкретных лабораторий и учреждений,
что реализуетсяся через соответствующую профессиональную подготовку кадров
(знания и компетенции), техническое и материальное оснащение, а также анализ
клинического материала.
Лабораторная медицина — медицинская специальность, в которой как никакой
другой активно используют достижения фундаментальных наук для клинической
медицины, способствуя применению фундаментальных разработок в практиче-
ском здравоохранении.
ОБЪЕКТЫ КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Биоматериалы человека (биологические жидкости, ткани и экскреты) представ-
ляют собой сложные системы — смеси различных веществ и клеток. Эндогенные
компоненты биоматериалов, играя определенную функциональную роль, изменя-
ются при нарушениях физиологических процессов под воздействием на организм
патогенных факторов, а также в ходе формирования защитных и компенсаторных
реакций. Именно поэтому исследование эндогенных компонентов может способ-
ствовать выявлению или подтверждению наличия патологических процессов,
установлению их характера. Что касается экзогенных компонентов биоматериалов
(бактерий, вирусов, грибов, паразитарных организмов и продуктов их жизнедея-
тельности), то они обычно играют причинную роль в развитии патологических
процессов.
В аналитике компоненты системы подразделяют на аналиты, конкомитан-
ты и растворители; последние два вида компонентов обозначают как матрицу.
Аналит — компонент пробы, указанный в названии исследуемого свойства или
измеряемой величины.
В клинической лабораторной диагностике аналитами могут быть (табл. 1-1):
• физические свойства;
• химические элементы, ионы, неорганические молекулы;
• органические структуры с малой молекулярной массой;
• макромолекулы с известной или приблизительно установленной структурой
и специфическими биологическими свойствами;
• клетки, их структурные элементы или клеточные системы;
• микроорганизмы, их структуры и свойства;
• паразитарные организмы, их структуры и свойства.
Соответственно характеру и свойствам исследуемых аналитов и особенностям
применяемых аналитических процедур клинические лабораторные исследования
подразделяются на химико-микроскопические, биохимические, гематологиче-
ские, коагулологические, иммунологические, изосерологические, цитологические,
генетические, молекулярно-биологические, бактериологические, вирусологиче-
ские, паразитологические, микологические, токсикологические, лекарственный
мониторинг. Номенклатура клинических лабораторных исследований постоянно
пополняется соответственно развитию медицинской науки.
Таблица 1-1. Виды аналитов — объектов клинических лабораторных исследований
Виды биоматериалов Виды компонентов биоматериалов человека Виды аналитов Отдельные аналиты Применяемые технологии Виды исследований
Кровь Эндогенные химиче- ские компоненты Химические элементы, ионы, неорганические молекулы. Электролиты, микроэлементы. Ионы водорода Электрохимические методы. Свето-эмиссионные технологии Клинико-биохимические
Органические соединения с малой молекулярной массой Субстраты. Метаболиты Химические технологии Клинико-биохимические
Эндогенные гумо- ральные факторы распознавания и защиты Макромолекулы с известной или приблизительно установ- ленной структурой и специфи- ческими биологическими свойствами Ферменты. Транспортные белки. Антигены гистосовместимости. Факторы гемостаза. Антитела Агглютинационные и преципита- ционные технологии. Лигандные технологии. Химические технологии Клинико-биохимические. Иммунологические
Собственные кле- точные элементы организма Клетки крови, их структурные элементы или клеточные системы Мембраны клеток, митохон- дрии, ядра; структурные белки, рецепторы,ферменты Световая микроскопия. Цитохимические технологии. Проточная цитометрия. Иммуноцитофлюорометрия Г ематоцитологические
Собственные кле- точные факторы распознавания и защиты Макрофаги. Т- и В-лимфоциты Мембраны клеток, митохон- дрии, ядра; структурные белки, рецепторы, ферменты Лигандные технологии. Световая микроскопия. Цитохимические технологии Иммунологические
Эндогенные гумо- ральные и кле- точные факторы гемостаза и фибри- нолиза Макромолекулы с известной или приблизительна установ- ленной структурой и специфи- ческими биологическими свойствами. Клетки крови Каскад ферментов и их инги- биторов. Тромбоциты Клоттинговые, хромогенные, иммунологические технологии. Световая микроскопия Коагулологические
Биологические жидкости (помимо крови) и экскреты Собственные клеточные эле- менты организма. Эндогенные химиче- ские компоненты Клеточные элементы. Химические элементы, ионы, неорганические молекулы. Органические соединения с малой молекулярной массой Клетки. Метаболиты. Корпускулярные образования (остатки клеток, соли) Световая микроскопия. Химические технологии Химико-микроскопические
Ткани Собственные кле- точные элементы организма Клетки, формирующие струк- туры тканей и органов; реали- зующие функции органов Мембраны клеток, митохон- дрии, ядра; структурные белки, рецепторы, ферменты Световая микроскопия. Цитохимические технологии. Проточная цитометрия Цитологические
ЛАБОРАТОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ
Окончание табл. 1-1
Виды биоматериалов Виды компонентов биоматериалов человека Виды аналитов Отдельные аналиты Применяемые технологии Виды исследований
Ткани,кровь Носители генетиче- ской информации Макромолекулы с известной или приблизительно установ- ленной структурой и специфи- ческими биологическими свойствами Нуклеиновые кислоты Гибридизационные и амплифика- ционные технологии Молекулярно-биологические
Биологические жид- кости, экскреты Экзогенные патоген- ные организмы Микроорганизмы, их структура и свойства Бактерии, вирусы, грибы. Рост колоний. Антигены Культуральные технологии. Световая микроскопия. Лигандные технологии. Технологии гибридизации и амплификации избранных после- довательностей нуклеотидов Бактериологически.е Вирусологические. Микологические
Паразитарные организмы, их структура и свойства Простейшие, гельминты Световая микроскопия. Лигандные технологии Паразитологические
Биологические жид- кости Экзогенные химиче- ские компоненты Токсины, металлы, спирты Неорганические и органические вещества Химические технологии Токсикологические
Наркотические препараты Химические соединения раз- личной степени сложности Химические технологии Наркологические
Лекарственные препараты Химические соединения раз- личной степени сложности Химические технологии Терапевтический лекар- ственный мониторинг
ЛАБОРАТОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ
М,ъСЛ/
28 ЛАБОРАТОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ
ЛАБОРАТОРНАЯ АНАЛИТИКА
Клинические лабораторные исследования выполняются с применением анали-
тических технологий (методов исследования). Клинико-лабораторная аналитиче-
ская технология основана на взаимодействии используемых для анализа физиче-
ских, химических или биологических факторов с искомым аналитом (табл. 1-2),
что приводит к генерации сигнала, который регистрируется измерительным
прибором. Методика лабораторного анализа проб биоматериалов включает сле-
дующие процедуры:
• сбор, обработку, хранение, транспортировку пробы биоматериала:
• разделение компонентов биоматериалов перед их анализом;
• специфическое взаимодействие химического, биологического или физиче-
ского фактора с искомым аналитом, в результате чего происходят его моди-
фикация, распознавание и генерация сигнала об этом;
• детекцию и/или измерение сигнала, вызванного взаимодействием реагента
с аналитом, с помощью специального устройства или измерительного при-
бора;
• калибровку измерительного прибора для обеспечения правильности измере-
ния сигнала в единицах измеряемой величины;
• оценку рабочих характеристик методики исследования и ее выполнения
(контроль качества проведенного исследования):
• обработку результатов анализов и их сообщение заказчику.
Таблица 1-2. Основные принципы аналитических технологий, применяемых в клинической лабо-
раторной аналитике
Принцип распознавания аналита Генерация сигнала о характеристиках аналита Детекция/измерение сигнала
Химическое сродство молекул реактива к аналиту, химическая реакция Преобразование структуры молекул аналита. Изменение светопропускания раство- ра, содержащего аналит Фотоколориметрия. Абсорбционная фотометрия. Спектрофотометрия
Сродство структуры аналита к структуре фермента, расщепле- ние соединения То же Абсорбционная фотометрия. Спектрофотометрия
То же Расщепление хромогенного субстрата. Изменение светопропускания раство- ра, содержащего аналит То же
Химическое сродство молекул реактива каналиту, химическая реакция Переход молекул аналита в возбуж- денное состояние. Испускание света. Хемилюминесценция Хемилюминометрия
Сродство структуры фибриногена к структуре ферментов — факто- ров свертывания крови, образо- вание фибрина Образование сгустка крови, измене- ние вязкости пробы Клоттинговые методы коагуло- метрии — оптическая, механи- ческая, оптико-механическая регистрация времени образо- вания сгустка
Воздействие возбуждающего света определенной длины волны на аналит Переход молекул аналита в возбуж- денное состояние. Испускание света большей длины волны Флюорометрия
Воздействие химической иони- зации, электронной пушки, тока высокого напряжения, нагрева- ния на молекулы аналита Образование ионов с различными молекулярной массой и зарядом, разделение их с помощью электри- ческих и магнитных полей. Величина сигнала зависит от количества ионов в определенной зоне Масс-спектрометрия
ЛАБОРАТОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ 29
Продолжение табл. 1-2
Принцип распознавания аналита Генерация сигнала о характеристиках аналита Детекцмя/измерение сигнала
Воздействие высокотемпера- турного пламени на молекулы аналита Ионизация молекул. Испускание света специфической длины волны, окра- шивание пламени Пламенная фотометрия
Воздействие высокой температу- ры на молекулы аналита Ионизация молекул. Поглощение света специфической длины волны, излучаемого лампой с полым като- дом, изготовленным из исследуемого элемента Атомно-абсорбционная спек- трофотометрия
Электрохимический процесс на границе раздела фаз на электро- де, погруженном в раствор, содержащий аналит Изменение структуры или концентра- ции аналита. Изменение электрического потен- циала Потенциометрия
То же Изменение силы проходящего тока Полярография, вольт- амперометрия
То же Изменение количества вещества, выделяющегося на электроде. Изменение количества электричества, проходящего между двумя электрода- ми в электрохимической ячейке Кулонометрия
То же Изменение электропроводности между двумя электродами Кондуктометрия
Специфическое связывание аналита лигандами, имеющи- ми к нему высокое сродство. Иммунохимическая реакция свя- зывания белка (антигена) специ- фическим белком (антителом) Образование агглютината. Образование преципитата Радиальная иммунодиффузия. Иммуноэлектрофорез. Электрофорез с иммунофик- сацией. Электроиммунодиффузия. Иммунонефелометрия. Иммунотурбидиметрия
То же Эффект связанной с лигандом метки — фермента, флюорофора, радиоактивного изотопа Иммунофермеитный анализ. Иммунофлюоресцентный анализ. Радиоиммуноанализ. Иммуноблопинг
Спаривание комплементарных последовательностей нуклеоти- дов зонда с однонитевой молеку- лой исследуемой ДНК или РНК Эффект связанной с зондом метки Гибридизация нуклеиновых кислот. Выявление генетических дефектов
Многократная репликация фраг- мента исследуемой ДНК, ограни- ченного комплементарными оли- гонуклеотидными праймерами Образование множества ампликонов (амплификация). Эффект метки Электрофорез в геле. Регистрация флюоресценции. Выявление генетических дефектов
Избирательная реакция красителя с отдельными химическими ком- понентами структур клетки Избирательная окраска компонентов клетки (цитохимия) Визуальная детекция, световая микроскопия
Иммунохимическая реакция связывания белка (антигена) структур клетки специфическим белком (антителом), меченным хромофором или флюорофором Избирательная окраска или свечение компонентов клетки (иммуноцито- химия) Визуальная детекция, световая микроскопия, флюоресцентная микроскопия
То же То же Световая или флюоресцентная микроскопия, цифровая реги- страция изображений клеток, компьютерный анализ изо- бражений
30
ЛАБОРАТОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ
Продолжение табл. 1-2
Принцип распознавания аналита Генерация сигнала о характеристиках аналита Детекция/измерение сигнала
Прохождение клеток через апертуру капиллярной трубки, заполненной электропроводящим раствором, между электродами сети постоянного тока Изменение электропроводности Кондуктометрия. Проточная цитометрия
Прохождение клеток через апер- туру капиллярной трубки, осве- щаемую поляризованным лучом лазера, между электродами сети постоянного тока Изменение электропроводности, рас- сеяние света лазера Радиочастотный анализ. Трехмерный анализ лейко- цитов. Многоугловая система лазер- ного светорассеяния
Прохождение клеток, обработан- ных антителами, связанными с флюоресцентными красителями, через апертуру капиллярной трубки, освещаемую поляризо- ванным лучом лазера, между электродами сети постоянного тока Изменение электропроводности, рас- сеяние света лазера. Специфическое свечение окрашенных структур клеток Проточная иммуноцитофлюо- рометрия. Иммунофенотипирование клеток
Способность микроорганизмов размножаться на питательной среде определенного состава, соответствующей особенностям метаболизма данного вида микроорганизмов Образование растущими микроорга- низмами колоний определенного вида Визуальная оценка, световая микроскопия, счетчики коло- ний. Культуральный метод
Способность микроорганизмов с помощью присущих им фер- ментов вызывать расщепление определенных субстратов Изменение цвета набора субстратов- хромогенов при контакте с образцом из культуры микроорганизма Визуальная оценка цветовой реакции. Фотометрия
Способность микроорганизмов вызывать образование в орга- низме пациента специфических антител Специфическое связывание антител, образовавшихся в организме пациен- та под действием патогена, с антиге- ном или антителом тест-системы. Образование агглюгината или пре- ципитата Иммуносерологические мето- ды. Радиальная иммунодиффузия. Иммуноэлектрофорез. Электрофорез с иммунофик- сацией. Электроиммунодиффузия. Иммунонефелометрия. Иммунотурбидиметрия
То же Специфическое связывание анти- тел, образовавшихся в организме пациента под действием патогена, с меченым антигеном или антителом тест-системы. Эффект метки Иммуноферментный анализ. Иммунофлюоресцентный анализ. Радиоиммуноанализ. Иммуноблоттинг
Способность антител тест- системы специфически связы- ваться с антигенами, свойствен- ными микроорганизму, в образце культуры микроорганизма То же То же
Спаривание комплементарных последовательностей нуклео- тидов зонда с однонитевой молекулой исследуемой ДНК или РНК образца культуры микро- организма Эффект связанной с зондом метки Гибридизация нуклеиновых кислот. Генотипирование микроорга- низма
ЛАБОРАТОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ 31
Окончание табл. 1-2
Принцип распознавания аналита Генерация сигнала о характеристиках аналита Детекция/измерение сигнала
Многократная репликация спе- цифического фрагмента иссле- дуемой ДНК, ограниченного оли- гонуклеотидными праймерами, комплементарными концевым участкам фрагмента-мишени, образца культуры микроорга- низма Образование множества ампликонов (амплификация). Эффект метки Электрофорез в геле. Регистрация флюоресценции. Идентификация микроорга- низма
В процессе лабораторного исследования применяют изделия для диагностики in
vitro, предназначенные для выполнения определенных процедур:
♦ препаративные устройства, используемые для сбора, транспортировки, хра-
нения и подготовки проб биожидкостей человека и создания необходимых
условий для их анализа;
• реагенты и аналитические тест-системы — химические или биологические
вещества и их функционально связанные комплексы, способные участво-
вать в реакциях распознавания искомых аналитов и генерировать сигналы,
используемые для обнаружения или измерения содержания аналитов;
• детекторы и измерительные приборы, предназначенные для измерения
сигналов, возникающих при исследовании аналитов, включая устройства,
совмещающие функции разделения компонентов с их измерением;
• калибраторы и контрольные материалы — изделия, применяемые для кали-
бровки средств измерения (калибраторы) и контроля рабочих характеристик
методик исследования (контрольные материалы);
• средства информатики, программное обеспечение и средства коммуникации,
предназначенные для обработки и передачи лабораторной информации,
получаемой в результате исследования.
В настоящее время разработаны и широко применяют полуавтоматические
и автоматические устройства, называемые автоанализаторами. Различные кон-
структивные варианты этих устройств предусматривают выполнение в одном при-
боре препаративных, дозировочных и измерительных процедур, сопоставления
результатов с референтными пределами, встроенного контроля качества, выдачи
результатов исследований в обработанном виде.
Другое направление развития средств лабораторного анализа представляют
медицинские изделия для самотестирования и исследований in vitro вне лаборато-
рии — портативные аналитические устройства, предназначенные для выполнения
определенных исследований образцов биологических материалов человека вне
лаборатории, в том числе самим пациентом.
ФОРМЫ ОРГАНИЗАЦИИ ЛАБОРАТОРНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ
МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ
Лабораторные исследования проводятся специально организованны-
ми и оснащенными подразделениями медицинских организаций — клинико-
диагностическими лабораториями. Заказчиком исследований является лечащий
врач или врач, организующий диспансерное обследование. Именно врач определя-
ет круг исследований и организует сбор и взятие биоматериала. Ответственность
за соблюдение правил подготовки больного к исследованию, правил взятия, хра-
нения и доставки материала в лабораторию несет персонал клинических подраз-
делений, за исключением случаев взятия крови из пальца. На основе применения
32 ЛАБОРАТОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ
разнообразных средств лабораторного анализа сложились три формы организа-
ции лабораторного обеспечения медицинской помощи.
Традиционная форма, которую можно назвать локальной, возникла с
началом существования лабораторной медицины как самостоятельной сферы
медицинской деятельности. Многое из достигнутого лабораторной медициной
было получено в лабораториях больниц и поликлиник. Лаборатории изначально
создавались как одно из диагностических подразделений медицинского учрежде-
ния, что дало право рассматривать лабораторную диагностику как клиническую
дисциплину. Такое положение лаборатории в составе учреждения позволяет ее
работникам не только выполнять лабораторные исследования, но и участвовать
во всем лечебно-диагностическом процессе, дает им возможность как реализо-
вывать и совершенствовать свои медицинские знания, так и влиять на оказание
медицинской помощи пациентам. Такая связь способствует организации лабора-
торного обследования в интересах решения клинических задач и более глубокой
интерпретации лабораторных результатов применительно к каждому случаю забо-
левания. Лаборатории функционируют в составе примерно 80% государственных
и муниципальных учреждений здравоохранения страны (табл. 1-3) в соответствии
с положением, утвержденным Министерством здравоохранения и социального
развития РФ.
Таблица 1-3. Количество лабораторий учреждений здравоохранения России в 2008 г.
Лаборатория Количество
Клинико-диагностическая 7942
Радиоизотопной диагностики 181
Микробиологическая (бактериологическая). 970
в том числе централизованная 272
Иммунологическая (серологическая), 541
в том числе централизованная 221
Биохимическая, 448
в том числе централизованная 87
Цитологическая, 279
в том числе централизованная 105
Коагулологическая, 66
в том числе централизованная 20
В лабораториях трудятся специалисты с высшим и средним специальным обра-
зованием (табл. 1-4), профессиональная подготовка которых осуществляется в
установленном порядке в соответствии с образовательными стандартами, а долж-
ностные обязанности определены положениями, утвержденными Министерством
здравоохранения и социального развития РФ.
Таблица 1-4. Персонал государственных клинико-диагностических лабораторий (по данным за
2002 г.)
Персонал Должности Количество физических лиц медицинских работников на занятых должностях Всего физических лиц медицинских работников
штатные занятые
Врачи клинической лабора- торной диагностики 39 910 37 116 14 080 16 531
Специалисты со средним медицинским образованием 47 894 44 863 26 643 39 454
ЛАБОРАТОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ 33
Клинико-диагностические лаборатории выполняют широкий круг лабора-
торных тестов (табл. 1-5) в соответствии с номенклатурой, утвержденной феде-
ральным органом исполнительной власти в сфере здравоохранения. Перечень
исследований, выполняемых в конкретной лаборатории, должен соответствовать
лицензионному уровню учреждения, утверждается главным врачом и обеспечива-
ется материально-техническими ресурсами.
Таблица 1-5. Количество анализов, выполняемых в государственных клинико-диагностических
лабораториях (по данным за 2008 г.)
Анализы Всего В том числе амбулаторным бальным (включая больных на дому)
Всего, в том числе: 3 260 965 408 1 828 639 134
гематологические 1 009 780 847 571 493 838
цитологические 45 811 071 35 543 689
биохимические 594 365 031 265 776 040
коагулологические 89 763 839 32 109 353
иммунологические 264 784 375 166 576 549
микробиологические 140 202 000 70 091 778
Удаленная форма лабораторного обеспечения развивается на основе центра-
лизованного выполнения наиболее сложных видов лабораторных исследований и
внедрения автоматизированных аналитических систем. Положительные стороны
работы крупных автоматизированных лабораторий: значительное повышение
производигельности, повышение качества результатов, сокращение удельной
стоимости анализов за счет их выполнения в больших сериях. Однако при этом
нельзя не видеть ослабления связи лабораторного персонала с процессом оказания
медицинской помощи конкретному больному, тенденцию к превращению центра-
лизованных лабораторий в «фабрики лабораторных анализов», к углублению раз-
рыва между достижениями аналитики и их освоением в клинической практике.
Мобильная форма лабораторного обеспечения медицинской помощи полу-
чила распространение за счет разработки, производства и использования порта-
тивных аналитических устройств, свойства которых позволяют их применение
по месту лечения пациента или оказания неотложной помощи нелабораторным
персоналом, а также самими пациентами на дому (табл. 1-6).
Несомненный выигрыш при таком способе выполнения лабораторных иссле-
дований — резкое сокращение сроков получения лабораторной информации
клиницистами. Лабораторное исследование становится частью непосредственного
оказания помощи пациенту. Однако при проведении таких исследований необ-
ходимо сохранять контроль со стороны традиционных стационарных лабора-
торий для обеспечения качества и надежности результатов (ГОСТ Р ИСО 22870
«Исследования по месту лечения. Требования к качеству и компетентности»),
ОПЕРАТИВНОСТЬ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ИНФОРМАЦИИ
Информация о состоянии внутренней среды пациента, получаемая в результате
клинических лабораторных исследований, имеет реальную клиническую ценность
только при условии ее предоставления в сроки, позволяющие принять необхо-
димые лечебные меры. В зависимости от характера и темпа патологического
процесса, от цели назначения лабораторного теста потребность в лабораторной
информации может быть:
• неотложной, т.е. требоваться в течение нескольких минут для принятия сроч-
ных клинических решений в критических ситуациях;
^’n \ Yi ЛИ I'
Таблица 1-6. Основные принципы аналитических технологий, используемые в средствах анализа вне лаборатории
Средства анализа вне лаборатории Детекция сигнала Жидкостный метод
распознавание генерация сигнала формат матрица движущая сила для жидкости
Диагностическая тест- полоска Индикаторы (конъюгация, образование ионов, гидрофобное связывание) Оптическая детекция (индикато- ры, катализ) Абсорбент Бумага Адсорбция
Глюкометр Каталитические реакции (субстрат фер- мента, продукт реакции катализа) Оптическая детекция. Электрохимическая реакция Абсорбент, капилляр- ный эффект Бумага, пластик, пленки Адсорбция, капиллярный эффект
Иммунохроматография Ассоциация совокупности (антитела, селективные мембраны, макромолеку- лы) Оптическая детекция (катализ, частицы) Латеральный поток, кассета Бумага, мембраны Хроматография
Микрокювета Индикаторы (конъюгация). Каталитические реакции (продукт реак- ции катализа) Оптическая детекция (прямая, индикаторы, каталитическая реакция) Капилляр, кассета Пластик Капиллярный аффект
Иммуножидкостная кассета Ассоциация совокупности (антитела, селективные мембраны, макромолеку- лы) Оптическая детекция (катализ, частицы) Кассета Пластик Капиллярный эффект, дей- ствие центрифуги, насоса, вакуума
Кассета для газов крови и электролитов Ассоциация совокупности (селективные мембраны, макромолекулы) Электрохимическая (ампероме- трия, потенциометрия) Кассета, капилляр, трубка Пластик, мембра- ны, пленки Действие насоса, вакуума, нагревания, механика
Кассета для коагуломе- трии Каталитические реакции (субстрат фермента, детекция фермента, продукт реакции катализа) Смещение света (нано-, пара- магнитные частицы, интерфе- ренция света) Латеральный поток, кассета Бумага, пластик Хроматография. Капиллярный эффект
Иммуноволновое измене- ние поверхности Ассоциация совокупности (антитела, макромолекулы) Индукция поверхности (усиле- ние поверхности, распознавание образов) Кассета, волокно, поверхность Пластик, неорга- ническая основа Насос, пипетирование
ЛАБОРАТОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ
ЛАБОРАТОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ 35
• систематической, т.е. требоваться периодически, через строго определенные
промежутки времени (при проведении функциональных тестов, лекарствен-
ном мониторинге);
• плановой, т.е. требоваться в соответствии с общим планом обследования
пациента для осуществления диагностического алгоритма и мониторинга
эффективности лечебных мер.
Требования к своевременности получения лабораторной информации должны
определяться протоколом диагностики и лечения соответствующей болезни с
учетом аналитических возможностей и организации лабораторного обеспечения в
данной медицинской организации. Форма обеспечения лабораторных исследова-
ний (табл. 1-7) в медицинской организации (выполнение анализов в лаборатории
учреждения, централизованной лаборатории, экспресс-лаборатории, лаборатории
приемного отделения или «по месту лечения») должна удовлетворять клиниче-
ским потребностям диагностики и лечения больных в данном учреждении в соот-
ветствии с его медицинским профилем.
Таблица 1-7. Формы лабораторного обеспечения в медицинских организациях различной мощ-
ности
Организационно-кадровая форма Способы лабораторного обеспечения Примерные сроки предоставления лабораторной информации
Отсутствие лаборатории Направление проб в централизован- ную лабораторию Общий оборот теста от 1 до несколь- ких суток в зависимости от рас- стояния, способа доставки проб и передачи результатов
Использование средств «исследова- ний по месту лечения» (НМЛ) клини- ческим персоналом 5-15 мин
Лаборатория, располагаю- щая лишь персоналом со средним образованием, без врача клинической лабора- торной диагностики Предписанный для данного типа учреждений набор лабораторных тестов. В течение дня или на следующий день. Возможно внеочередное выполнение экстренных анализов
Традиционные ручные методы
Использование средств ИМЛ для некоторых тестов клиническим пер- соналом 5-15 мин
Направление проб для анализов в лабораторию, аккредитованную для их выполнения От одних до нескольких суток в зависимости от расстояния, способа транспортировки проб и передачи результатов
Врач + персонал со средним образованием Предписанный для данного типа учреждений набор лабораторных тестов. В течение рабочего дня. Возможно внеочередное выполнение экстрен- ных анализов
Традиционные ручные методы
Малая автоматизация То же
Использование средств ИМЛ для некоторых тестов клиническим пер- соналом 5-15 мин
Направление проб для сложных ана- лизов в более крупную лабораторию От 1 до нескольких суток в зави- симости от расстояния и способа транспортировки проб и передачи результатов
Несколько врачей + био- логи + технолога и другой персонал со средним обра- зованием Возможность выделения отдельных рабочих мест или групп сотрудников по видам исследований. Автоматизация (зависит от общей рабочей нагрузки) В течение рабочего дня. Возможно внеочередное выполнение экстрен- ных анализов
36
ЛАБОРАТОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ
Окончание табл. 1-7
Организационно-кадровая форма Способы лабораторного обеспечения Примерные сроки предоставления лабораторной информации
Специализированная центра- лизованная лаборатория Ассортимент тестов близок к макси- мальному по данной специализации. Автоматизация Собственное время анализа зависит от типа автоанализатора. Общий оборот теста зависит от рас- стояния, способа доставки проб и передачи результатов
Лаборатория клинического диагностического центра Наиболее широкий ассортимент тестов. Несколько специализированных отделов. Автоматизация Собственное время анализа зависит от типа автоанализатора. Общий оборот теста зависит от рас- стояния, способа транспортировки проб и передачи результатов
Сроки получения результатов лабораторных анализов клиницистом, заказав-
шим исследования, обозначаются периодом оборота лабораторного теста и зави-
сят от следующих факторов:
• времени анализа, необходимого для выполнения пробоподготовительных
и аналитических процедур в лаборатории; примерный расход времени на
выполнение основных лабораторных тестов в клинико-диагностических
лабораториях приведен в ГОСТ Р 53022.4-2008 «Технологии медицинские
лабораторные. Требования к качеству клинических лабораторных исследо-
ваний. Правила разработки требований к своевременности предоставления
лабораторной информации»;
• пре- и постаналитического времени, определяемых организацией лабора-
торного обеспечения лечебно-диагностической деятельности в медицинской
организации, в том числе;
4- порядком и сроками выполнения процедур подготовки пациента;
<> длительностью взятия биоматериала и его первичной обработки;
< порядком и способом доставки образца биоматериала в лабораторию;
о порядком и способом доставки результата исследования из лаборатории
врачу, назначившему исследование.
В зависимости от мощности учреждения здравоохранения предусмотрена
различная организация его лабораторного обеспечения: численность и уровень
подготовки лабораторного персонала, оснащение лабораторным оборудовани-
ем, объем исследований, выполняемых непосредственно в учреждении, и т.д.
Поскольку аналитические возможности части учреждений не охватывают всего
спектра анализов, которые могут оказаться необходимыми пациенту, предусмо-
трена возможность выполнения таких анализов в более крупных лабораториях.
На основе учета факторов, влияющих на сроки получения результата лабора-
торного исследования, в медицинском учреждении разрабатываются требования
к срокам выполнения лабораторных исследований, результаты которых имеют
жизненно важное значение для пациентов, находящихся в критических состояни-
ях. Такие требования должны содержать:
• перечень исследований, которые должны выполняться неотложно, с указа-
нием предельного срока, отводимого на собственно аналитическую процеду-
ру (табл. 1-8);
• форму заявки на выполнение таких исследований;
• форму учета соблюдения этих требований.
Соблюдение сроков выполнения неотложных исследований подлежит строгому
контролю со стороны руководства медицинской организации. Порядок и сроки
выполнения исследований, потребность в результатах которых является система-
тической и плановой, определяются руководством медицинской организации и
закрепляются соответствующим внутренним распорядительным документом.
ЛАБОРАТОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ 37
Таблица 1-8. Перечень исследований, результаты которых имеют жизненно важное значение для
пациентов в критических ситуациях, с указанием срока выполнения теста
Виды исследований Рекомендуемые сроки, мин
Показатели газообмена и кислотно-основного равновесия крови (pH, рСО2. BE, S02, pOJ 5
Показатели электролитного баланса (калий, натрий, кальций, хлор) 5
Гемоглобин,гематокрит 5
Основные метаболиты (лактат, глюкоза) 5-10
Показатели функционального состояния почек (креатинин, мочевина) 10
Основные ферменты (ACT, АЛТ, КФК, ЛДГ) 10
Тропонин 10-15
Основные показатели гемостаза (время свертывания, протромбиновое и тромби- новое время, АЧТВ, фибриноген, антитромбин, тромбоциты и их функции, ПДФ, D-димеры) 10-15
Показатели гемореологии (вязкость крови и плазмы, функциональные свойства эритроцитов) 5-7
Осмоляльность крови и мочи 5
СТАНДАРТИЗАЦИЯ ОРГАНИЗАЦИИ ЛАБОРАТОРНОГО
ОБЕСПЕЧЕНИЯ
Содержание деятельности клинико-диагностических лабораторий определя-
ется рядом распорядительных и нормативных документов. Общий перечень
лабораторных тестов содержится в периодически обновляемой «Номенклатуре
лабораторных исследований» (табл. 1-9).
Таблица 1-9. Количество тестов в «Номенклатуре клинических лабораторных исследований»
Виды исследований Количество тестов
1970-е гг. 2000-е гг.
Химико-микроскопические 52 75
Гематологические 32 35
Биохимические 81 170
КОС, газы крови 18 11
Коагулологические 20 130
Гормоны и медиаторы 25 258
Иммунологические 57 287
Токсикология и лекарства 6 195
Примечание. Не приведено количество микробиологических тестов, поскольку для идентифика-
ции одного и того же микроорганизма необходимо выполнить несколько исследований (культу-
ральных, биохимических, микроскопических).
В 2004 г. Минздравсоцразвития РФ утвердил реестр медицинских услуг, в
котором приведено значительное количество лабораторных тестов. Этот реестр
использован при разработке в 2005-2007 гг. и в новой редакции 2010 г. стандартов
медицинской помощи при различных формах патологии.
Стандарты медицинской помощи представляют собой перечни диагностиче-
ских и лечебных услуг (включая лабораторные услуги), признанных ведущими
специалистами соответствующей отрасли медицины минимально необходимыми
и достаточными для оказания медицинской помощи пациенту при определенной
форме патологии в ее типичных вариантах. Стандартам медицинской помощи
38 ЛАБОРАТОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ
придано значение официальных документов. Каждый из них утверждается прика-
зом Минздравсоцразвития Российской Федерации. Они имеют единую структуру,
включающую характеристику модели пациента, формы оказания медицинской
помощи и таблицы медицинских услуг в периоды диагностики и лечения болезни.
Стандарт медицинской помощи является государственным документом, в котором
федеральный орган исполнительной власти в сфере здравоохранения формулиру-
ет перечень медицинских услуг, необходимых для оказания медицинской помощи
при определенной форме патологии. Другими словами, стандарт представляет
собой форму конкретизации прав гражданина на оказание помощи при опреде-
ленном заболевании, что гарантировано Конституцией Российской Федерации и
Основами законодательства Российской Федерации по охране здоровья граждан.
Наряду с этим стандарты медицинской помощи являются для Фонда обязательно-
го медицинского страхования обоснованием минимально необходимого объема
медицинских услуг, оплачиваемых из средств Фонда.
Введение коэффициентов частоты предоставления отдельных услуг дает учреж-
дениям здравоохранения свободу для маневра, необходимость которого может
быть продиктована медицинскими, организационными и экономическими услови-
ями оказания медицинской помощи. Например, известно явление биологической
вариации: в зависимости от влияния многих факторов — генетических, экологиче-
ских, образа жизни — разные люди по-разному реагируют на один и тот же болез-
нетворный агент. Некоторые случаи заболевания могут требовать более широкого,
чем указано в стандарте, перечня медицинских услуг как для точного установления
диагноза болезни и состояния пациента, так и для успешного лечения. Такие слу-
чаи требуют согласованных мер со стороны лечебно-диагностических подразделе-
ний и организационно-финансового руководства учреждения. С другой стороны,
не оправданные клиническими потребностями услуги не должны оказываться,
потому что они не могут принести ни необходимой информации, ни реальной
пользы больному.
Обеспечение медицинской помощи в полном объеме, предусмотренном феде-
ральным стандартом, является целью, к которой обязаны стремиться служба здра-
воохранения каждого региона и каждое медицинское учреждение. Существенным
шагом в этом направлении стало выполнение Национального проекта «Здоровье»,
в рамках которого учреждения здравоохранения были оснащены большим коли-
чеством разнообразного медицинского оборудования.
При всем разнообразии практических форм лабораторного обеспечения меди-
цинской помощи, определяемых конкретными условиями в данном медицинском
учреждении, существуют общие принципы организации деятельности лабора-
торных структур, поставляющих клинически важную информацию о состоянии
внутренней среды пациентов. Эти принципы сформулированы в международных и
национальных стандартах. Стандарт ГОСТ Р ИСО 15189 «Лаборатории медицин-
ские. Частные требования к качеству и компетентности» устанавливает основные
требования к системе менеджмента качества и технические требования ко всем
сторонам деятельности клинико-диагностических лабораторий.
Стандарт ГОСТ Р ИСО 15189 включает следующие разделы.
• Требования к менеджмент у
• Организация и менеджмент,
• Система менеджмента качества.
• Управление документацией.
• Рассмотрение контрактов.
• Исследование во вспомогательных лабораториях.
• Приобретение услуг и запасов.
• Консультативные услуги.
• Претензии.
ЛАБОРАТОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ 39
• Управление при несоответствии требованиям.
• Корректирующие действия.
• Предупреждающие действия.
• Улучшение.
• Управление записями.
• Внутренние проверки.
• Анализ со стороны руководства.
• Технические требования:
❖ персонал;
❖ помещения и условия окружающей среды;
лабораторное оборудование;
❖ преаналитические процедуры.
• Аналитические процедуры (методики).
• Обеспечение качества аналитических процедур.
• Постаналитические процедуры.
• Отчетность о результатах.
• Приложения:
❖ сопоставление со стандартами ИСО 9001 и ИСО 17025;
> рекомендации по защите лабораторных информационных систем;
❖ этика в лабораторной медицине.
Из приведенного перечня разделов стандарта следует, что он затрагивает все
ключевые стороны организации работы клинико-диагностических лабораторий
(КДЛ). Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения и социального
развития рассматривает положения ГОСТ Р ИСО 15189 как основу тех требова-
ний, которые должны предъявляться при добровольной сертификации процессов
выполнения лабораторных исследований. Способствовать внедрению положений
этого основополагающего нормативного документа в отечественную лаборатор-
ную практику призваны материалы стандарта ГОСТ Р ИСО 22869.
Стандарт ГОСТ Р 52905-2007 (ИСО 15190-2003) «Лаборатории медицинские.
Требования безопасности» содержит комплекс требований к обеспечению в дея-
тельности лабораторий мер безопасности по отношению ко всем видам опасности,
начиная с биологической.
Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
утверждены национальные стандарты РФ по медицинским лабопаторным тех-
нологиям. Положения этих стандартов коррелируют с основными положениями
ГОСТ Р ИСО 15189 и конкретизируют применение его требований к различным
сторонам процесса клинического лабораторного исследования.
• ГОСТ Р 53022.1-2008 «Технологии лабораторные медицинские. Требования
к качеству клинических лабораторных исследований». Часть 1 Правила
менеджмента качества клинических лабораторных исследований.
• ГОСТ Р 53022.2-2008 «Технологии лабораторные медицинские. Требования
к качеству клинических лабораторных исследований». Часть 2. Оценка ана-
литической надежности методов исследования.
• ГОСТ Р 53022.3-2008 «Технологии лабораторные медицинские. Требования
к качеству клинических лабораторных исследований». Часть 3. Правила
оценки клинической информативности лабораторных тестов.
• ГОСТ Р 53022.4-2008 «Технологии лабораторные медицинские. Требования
к качеству клинических лабораторных исследований». Часть 4. Правила
разработки требований к своевременности предоставления лабораторной
информации.
• ГОСТ Р 53079.1-2008 «Технологии лабораторные медицинские. Обеспечение
качества клинических лабораторных исследований». Часть 1. Описание
методов исследования.
40 ЛАБОРАТОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ
• ГОСТ Р 53079.2- 2008 «Технологии лабораторные медицинские. Обеспечение
качества клинических лабораторных исследований». Часть 2. Руководство по
качеству исследований в клинико-диагностической лаборатории. Типовая
модель.
• ГОСТ Р 53079.3 -2008 «Технологии лабораторные медицинские. Обеспечение
качества клинических лабораторных исследований». Часть 3. Правила взаимо-
действия персонала клинических подразделений и клинико-диагностических
лабораторий медицинских организаций при выполнении клинических лабо-
раторных исследований.
• ГОСТ Р 53079.4-2008 «Технологии лабораторные медицинские. Обеспечение
качества клинических лабораторных исследований». Часть 4. Правила веде-
ния преаналитического этапа.
• ГОСТ Р 53133.1-2008 «Технологии лабораторные медицинские. Контроль
качества клинических лабораторных исследований». Часть 1. Пределы
допускаемых погрешностей результатов измерения аналитов в клинико-
диагностических лабораториях.
• ГОСТ Р 53133.2-2008 «Технологии лабораторные медицинские. Контроль
качества клинических лабораторных исследований». Часть 2. Правила про-
ведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов
клинических лабораторных исследований с использованием контрольных
материалов.
• ГОСТ Р 53133.3-2008 «Технологии лабораторные медицинские. Контроль
качества клинических лабораторных исследований». Часть 3. Описание
материалов для контроля качества клинических лабораторных исследова-
ний.
• ГОСТ Р 53133.4-2008 «Технологии лабораторные медицинские. Контроль
качества клинических лабораторных исследований». Часть 4. Правила про-
ведения клинического аудита эффективности лабораторного обеспечения
деятельности медицинских организаций.
Ряд положений этих стандартов рассмотрен в главе «Обеспечение и контроль
качества клинических лабораторных исследований».
КРИТЕРИИ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАБОТЫ ЛАБОРАТОРИЙ
Для управления лабораторным процессом и разработки мероприятий по разви-
тию лабораторий могут быть применены критерии эффективности, основанные на
положениях вышеупомянутых стандартов. Несмотря на существенные различия в
масштабах, оснащенности, обеспеченности кадрами и в других параметрах отдель-
ных лабораторий, критерии для них универсальны.
1. Аналитическая надежность (качество) результатов исследований явля-
ется результирующей влияния множества факторов, внешних и внутренних, дей-
ствующих продолжительно и быстро меняющихся. Система обеспечения качества
исследований в лаборатории включает максимально возможные действия персо-
нала, предотвращающие получение ошибочных результатов. Важное место при-
надлежит ежедневному внутрилабораторному и регулярному внешнему контролю
качества исследований (ГОСТ Р 53022.2, ГОСТ Р 53133.1, ГОСТ Р 53133.2).
2. Клиническая информативность выполняемых исследований зависит от
использования современных тестов с установленными клинико-диагностическими
чувствительностью и специфичностью, от применения диагностических алгорит-
мов и исключения дублирующих по содержанию и малоинформативных тестов.
Перечень используемых в лаборатории тестов зависит не только от технического
оснащения и материального снабжения лаборатории, но и от профессионализма
ЛАБОРАТОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ 41
специалистов и степени их взаимодействия с клиницистами (ГОСТ Р 53022.3,
ГОСТ Р 53079.3).
3. Своевременность получения результатов врачами, заказавшими лабора-
торные исследования, обеспечивается рациональной организацией работы лабо-
ратории, рациональным распределением обязанностей персонала, определением
оптимального объема внеочередных (экспресс-) исследований (ГОСТ Р 53022 4).
Ускорение получения результатов обеспечивается техническим оснащением лабо-
ратории, использованием автоматизированных систем анализа, а также средств
исследований по месту;' лечения.
4. Экономическая эффективность — получение ценной клинической инфор-
мации с наименьшими финансовыми и прочими затратами.
Соответствие каждому из критериев зависит от успешности решения задач по
контролю влияющих факторов, главным образом от профессионального уровня
кадров, особенно специалистов клинической лабораторной диагностики.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Меньшиков В.В. Исследования вне лаборатории. Средства, технологии, условия приме-
нения. — М.; Агат-Мед, 2008.
Кишкун А.А., Гузовский А.Л. Лабораторные информационные системы и экономические
аспекты деятельности лаборатории. — М.: Лабора, 2007.
Глава 2
Обеспечение и контроль
качества клинических
лабораторных исследований
ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
Сущность лабораторного исследования — анализ пробы био-
материала, взятой у пациента, с целью обнаружить или измерить
содержание в ней компонентов, имеющих доказанную причинно-
следственную связь с предполагаемым патологическим процессом.
Информация о данных компонентах, представленная в описатель-
ной или количественной форме, составляет результат проведенного
исследования. Потребителю (назначившему данное исследование
врачу или заказавшему анализ пациенту) важно, чтобы представ-
ленная информация обладала следующими свойствами:
• аналитической надежностью, т.е. точно отражала содержание
искомого компонента в пробе;
• клинической информативностью, т.е. точно отражала процес-
сы, происходящие в организме пациента, и отвечала на воп-
росы о наличии и характере предполагаемой патологии;
• оперативностью, т.е. была доступна в сроки, опережающие
темп развития патологического процесса и позволяющие свое-
временно предпринять необходимые лечебные меры.
Лабораторное исследование можно рассматривать как процесс
имеющий вход и выход. Продукт на выходе данного процесса —
информация об исследованных аналитах. Характер входа зависит
от точки отсчета. Ранее за вход в процесс исследования принимали
поступление образца биоматериал в лабораторию и начало собствен-
но аналитических процедур. Однако со временем стало ясно, что для
качества лабораторной информации крайне важны этапы, которые
предшествуют поступлению исследуемого образца в лабораторию,
начиная с момента назначения исследования врачом.
Согласно современной концепции, в процессе клинического
лабораторного исследования выделяют три этапа:
• преапалитический (доаналитический);
• аналитический;
• постаналитический (послеаналитический).
Преаналитический этап включает:
• внелабораторную фазу:
<> выбор и назначение исследования врачом;
•<> подготовку пациента к проведению анализа, взятие образца
биоматериала, чаще всего клиническим медперсоналом;
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 43
< маркировку образца для идентификации его с пациентом;
< > необходимую в ряде случаев первичную обработку, краткосрочное хране-
ние и транспортировку образца биоматериала в лабораторию;
• внутрилабораторную фазу:
< > регистрацию образца биоматериала;
< > идентификацию образца с пациентом;
❖ распределение биопроб или их порций по назначенным видам исследова-
ний;
необходимую дальнейшую обработку проб для подготовки к анализу.
На результаты лабораторных исследований могут влиять следующие факторы
преаналитического этапа:
• ошибки идентификации пациента и образца биоматериала;
• биологические факторы — пол, возраст, этнос, физиологическое состояние
(физическая тренированность, беременность), биологические ритмы, влия-
ния среды обитания;
• устранимые факторы — прием пищи, голодание, положение тела, физическая
активность, курение, употребление алкоголя;
• ятрогенные факторы:
< > диагностические процедуры (пальпация, пункции, биопсии, функцио-
нальные тесты, физический стресс при нагрузках, эндоскопия, введение
контрастных сред, иммуносцинтиграфия);
❖ оперативные вмешательства;
> лечебные процедуры (инъекции и трансфузии, диализ, лучевая терапия);
прием лекарственных препаратов (в том числе без назначения врача);
• условия взятия, временного хранения и транспортировки биоматериала:
< время взятия, срок сбора;
о - подготовка участка тела для взятия материала;
• о- процедуры взятия крови, мочи, других биоматериалов;
посуда (чистота, материал);
воздействие факторов среды (температуры, состава атмосферы);
< консерванты, антикоагулянты;
> процедуры первичной обработки (смешивание, центрифугирование,
охлаждение, замораживание);
• свойства аналита:
биологический полупериод жизни аналита:
<> стабильность в биологическом материале при различных температурах;
❖ метаболизм in vitro, включая чувствительность к свету.
Аналитический этап включает комплекс необходимых для выполнения иссле-
дования аналитических процедур, объединяемых методикой исследования и
завершающихся получением результата в числовой или описательной форме в
зависимости от вида и метода исследования. Основные процедуры методик клини-
ческих лабораторных исследований заключаются в создании условий для выделе-
ния аналита из многообразия других компонентов биоматериала, идентификации
аналита на основе детекции его специфических свойств и (в некоторых случаях)
в количественной оценке его содержания. В процессе лабораторного исследова-
ния используют химические или биологические реагенты, которые избирательно
взаимодействуют с аналитом, преобразуя его в ту форму, которая генерирует соот-
ветствующий сигнал и позволяет осуществить его идентификацию, детекцию или
измерение. Принцип исследования и детали аналитических процедур зависят от
особенностей состава, структуры и свойств определяемого аналита. Регистрация
результата анализа осуществляется на основе субъективной (визуальной) или объ-
ективной (приборной) оценки.
44
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
В рамках аналитического этапа клинического лабораторного исследования на
его результат оказывают влияние условия выполнения анализа и компоненты
аналитической системы:
• состав и свойства исследуемого образца биоматериала:
• точностные характеристики методик исследования;
• свойства различных видов оборудования и расходных материалов, при-
меняемых для взятия образца биоматериала и его первичной обработки и
оказывающих на него влияние;
• метрологические характеристики средств измерения;
• свойства добавок, обеспечивающих временную стабильность образца био-
материала или исследуемого аналита;
• состав и свойства реагентов (преобразователей аналита), специфически
реагирующих с аналитом благодаря своим химическим или биологическим
свойствам, генерирующих соответствующий сигнал и создающих возмож-
ность его обнаружения или измерения;
• состав и метрологические характеристики калибровочных материалов (рабо-
чих стандартных образцов состава или свойств исследуемых аналитов),
используемых для количественной оценки содержания аналита в биопробе;
• точность соблюдения последовательности отдельных аналитических про-
цедур, их длительности, температурного режима и других условий анализа,
предусмотренных установленной методикой;
• состав и свойства контрольных материалов, представляющих собой раз-
новидности рабочего стандартного образца аналита или образца сравнения,
предназначенных для проведения процедур внутрилабораторного контроля
или внешней оценки качества исследований;
• образовательная подготовка, уровень профессиональной квалификации и
дисциплина выполнения методик лабораторными специалистами.
Выполнение исследований клиническим персоналом вне лаборатории с приме-
нением портативных аналитических устройств требует систематического контроля
со стороны компетентного лабораторного персонала за качеством выполнения
внелабораторных процедур с помощью обучения клинического персонала пра-
вилам выполнения исследований средствами анализа по месту лечения, способам
контроля качества и сопоставления результатов исследований, выполненных вне
лаборатории, с лабораторными результатами.
Постаналитический этап включает:
• внутрилабораторную фазу, в рамках которой результат исследования оце-
нивается лабораторным специалистом на предмет его аналитической досто-
верности (по данным внутрилабораторного контроля качества), биологи-
ческой вероятности (правдоподобия), а также путем сопоставления с ранее
проведенными аналогичными исследованиями или другими, параллельно
проведенными исследованиями у того же больного (при цитологических
исследованиях лабораторное заключение может содержать формулировку
вероятного диагноза);
• внелабораторную фазу, в рамках которой врач оценивает клиническую зна-
чимость информации о состоянии определенной сферы внутренней среды
организма пациента, полученной в результате лабораторного исследования,
и сопоставляет ее с данными собственного наблюдения за больным и резуль-
татами других исследований.
Обязательное условие правильного использования лабораторной информации
в клинической диагностике — обоснованная интерпретация результатов исследо-
ваний с учетом влияния биохимических и физиологических механизмов.
При интерпретации результатов лабораторного исследования должны быть
приняты во внимание следующие физиологические и метаболические аспекты:
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 45
• для аналита:
о структура или природа аналита:
< распределение в организме:
❖ способ выведения или экскреции;
< биологический полупериод жизни;
< физиологическая вариация;
• для лекарственных препаратов:
о структура;
❖ объем распределения и фармакокинетика;
< > связывание с белком;
❖ активные метаболиты;
> клиренс:
< взаимодействие с другими лекарственными средствами, которые могут
влиять на биодоступность.
При оценке возможных механизмов отклонения результатов лабораторных
исследований от параметров, свойственных состоянию здоровья, следует учиты-
вать влияние патологических факторов:
• повышение или понижение поступления аналита в данную биологическую
жидкость, которые могут быть обусловлены:
❖ количеством ткани, в которой синтезируется аналит, скоростью синтеза;
❖ изменением доступности субстрата, нарушением пути метаболизма:
< > вторичностью изменений в зависимости от стимулирующих или тормозя-
щих регуляторных механизмов;
п роницаемостью капилляров или клеток (при повреждении мембран);
прямым вливанием (внутривенным введением);
❖ абсорбцией из кишечника или места введения;
❖ сосудистым или лимфатическим дренажем ткани;
• повышение или понижение удаления аналита из биологической жидкости,
в которой проводится измерение, из-за изменений скорости катаболизма
и/или скорости экскреции;
• изменение объема распределения аналита (изменение гидратации тканей);
• изменение структуры или активности аналита, которое сказывается на детек-
ции аналитической системой этого метаболита (например, изменение связы-
вания с белком).
На постаналитическом этапе отрицательное влияние на использование лабора-
торных результатов в клинических целях могул1 оказать;
• непринятие во внимание других исследований у одного и того же больного;
• недоучет результатов внутрилабораторного контроля качества и выдача
результатов с неприемлемыми погрешностями;
• использование для оценки результатов общих популяционных референтных
интервалов без учета возраста или индивидуальных особенностей пациента;
• неучтенные интерференции;
• несвоевременная доставка результатов исследований лечащему врачу;
• игнорирование лечащим врачом результатов лабораторных исследований.
Сравнительная частота ошибок, вызванных факторами различных этапов лабо-
раторного исследования, приведена в табл. 2-1.
При неточности лабораторных данных риск клинических затруднений достига-
ет 26-30%, а риск неоправданных действий врача составляет 7-12%.
Следовательно, важное условие обеспечения качества клинических лаборатор-
ных исследований — учет всех факторов, способных оказать влияние на содер-
жание изучаемых аналитов в организме пациента, содержание аналита в образце
биоматериала, организацию собственно аналитического процесса и на интерпре-
тацию полученного результата. С этой целью разработаны индикаторы качества
46 ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Таблица 2-1. Сравнительная частота лабораторных ошибок, вызванных факторами различных
этапов клинического лабораторного исследования (Р. Bonini et al., 2002)
Авторы наблюдений Срок наблюдения Преаналитический этап Аналитический этап Постаналитический этап
частота ошибок. %
Goldschmidt, Lent 6 лет 53 23 24
Nutting et al. 6 мес 55,6 13,3 30
Plebani, Carraro 3 мес 68,2 13,3 18
Stahl et al. 3 года 75 16 9
Hofgartner, Tait 1 год 60 19 15
для всех этапов исследования, систематическое использование которых позволяет
отслеживать и предотвращать влияние факторов, способных извратить результа-
ты и вызвать неправильные действия врача.
Современные представления о способах обеспечения качества любого процесса
выражены в понятиях системы менеджмента качества.
Менеджмент — скоординированная деятельность по руководству и управлению
процессом.
Менеджмент качества — скоординированная деятельность по руководству и
управлению процессом применительно к качеству, которая обычно включает раз-
работку политики в области качества, планирование качества, управление каче-
ством, обеспечение качества и улучшение качества.
Система менеджмента — система для разработки политики и целей и достиже-
ния данных целей.
Система менеджмента качества — система менеджмента для руководства и
управления организацией применительно к качеству.
На рис. 2-1 представлена схема системы менеджмента качества.
Потре-
бители
(и другие
заинтере-
сованные
стороны)
Потре-
бители
(и другие
заинтере-
сованные
стороны)
Удов-
летво-
ренность
Условные обозначения:
Деятельность, добавляющая ценность
Требо-
вания
Поток информации
Рис. 2-1. Схема системы менеджмента качества.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 47
Система менеджмента качества применительно к деятельности клинико-
диагностических лабораторий установлена в стандарте ГОСТ Р ИСО 15189
«Лаборатории медицинские. Требования к качеству и компетентности».
ОЦЕНКА АНАЛИТИЧЕСКОЙ НАДЕЖНОСТИ МЕТОДОВ
ИССЛЕДОВАНИЯ
Аналитическая надежность клинических лабораторных исследований характе-
ризуется свойствами методов, с помощью которых их выполняют:
• для количественных методов:
о точностью (правильностью и прецизионностью) измерений;
❖ аналитической чувствительностью;
❖ аналитической специфичностью;
• для неколичественных (качественных) методов:
> частотой совпадения обнаружения патологических отклонений изучае-
мого компонента биоматериала с объективно подтвержденным наличием
соответствующего заболевания.
Целевой параметр аналитической надежности клинических лабораторных
исследований — их способность достоверно разграничивать свойственные состоя-
ниям здоровья и патологии значения содержания определенных аналитов в соста-
ве биоматериалов. При дифференциации результатов лабораторных исследований,
характерных для состояния здоровья или патологии, следует учитывать, что дан-
ные исследований проб биоматериалов отражают содержание искомых веществ
или клеток в организме обследуемого с некоторой степенью неопределенности,
т.е. с дисперсией численных значений. Именно поэтому для выявления патологи-
ческих отклонений (патологической вариации) они должны быть дифференциро-
ваны от колебаний результатов, вызванных другими причинами (табл. 2-2).
Таблица 2-2. Вариации лабораторных результатов, вызванные непатологическими факторами
Вариация Причины и механизм возникновения колебаний
Биологическая внутриинди- видуальная (персональная) Колебания проявлений физиологических функций вокруг гомеостатиче- ских точек у обследуемого
Биологическая межиндиви- дуальная (групповая) Интервалы колебаний гомеостатических точек у разных людей, состав- ляющих популяцию
Преаналитическая Влияние условий взятия, хранения и транспортировки в лабораторию образцов биологических материалов, взятых у пациентов
Ятрогенная Влияния диагностических и лечебных воздействий на пациента перед про- ведением лабораторного теста
Аналитическая Колебания результатов измерений содержания аналитов в пробах био- логических материалов, вызванные факторами случайных и систематиче- ских погрешностей аналитических процедур
Для уверенного выявления отклонений, обусловленных патологией и называе-
мых патологической вариацией, они должны быть дифференцированы от анали-
тической вариации.
Биологическая вариация — основной фактор неопределенности лаборатор-
ных результатов, который по своему характеру принципиально отличается от
аналитической вариации. Другими словами, изменения состава биоматериалов
человека, отражающие протекание в организме процессов жизнедеятельности,
характеризуются сочетанием устойчивости в определенных рамках постоян-
ства внутренней среды (гомеостаза) и динамических колебаний вокруг точки
гомеостаза. Персональная биологическая вариация отражает колебания прояв-
лений физиологических функций вокруг гомеостатических точек у обследуемого.
Межиндивидуальная, или групповая, биологическая вариация, подчиняющаяся
статистическим закономерностям, представляет собой интервалы колебаний
48
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
гомеостатических точек групп людей, объединенных по определенному признаку
(полу, возрасту, этнической или профессиональной принадлежности).
Преаналитическая вариация — проявления биологической вариации, отра-
жающие реакцию организма на различные факторы внешней среды, условия под-
готовки обследуемого к лабораторному тесту и на взятие обоазца биоматериала.
Ятрогенная вариация отражает различного рода диагностические и лечебные воз-
действия на пациента перед проведением лабораторного теста.
Влияние преаналитических и ятрогенных факторов вариации может быть
минимизировано или точно охарактеризовано с помощью стандартизованных
правил ведения преаналитического этапа клинических лабораторных исследо-
ваний (ГОСТ Р 53079.4 «Технологии лабораторные клинические. Обеспечение
качества клинических лабораторных исследований». Часть 4. Ведение преанали-
тического этапа). Степень влияния аналитической вариации может быть охарак-
теризована и сведена до допустимого уровня при выборе методов исследования
компонентов с проверенной аналитической надежностью (точностью, чувстви-
тельностью, специфичностью) [ГОСТ Р 53022.2 «Технологии лабораторные
клинические. Требования к качеству клинических лабораторных исследований».
Часть 2. Правила оценки аналитической надежности методов исследования (точ-
ности, чувствительности, специфичности)], соблюдении правил внутрилаборатор-
ного контроля качества методов клинических лабораторных исследований (ГОСТ
Р 53133.2 «Технологии лабораторные клинические. Контроль качества клиниче-
ских лабораторных исследований». Часть 2. Правила проведения внутрилабора-
торного контроля качества количественных методов клинических лабораторных
исследований с использованием контрольных материалов) и применении преде-
лов погрешностей измерений в клинико-диагностических лабораториях (ГОСТ
Р 53133.1 «Технологии лабораторные клинические. Контроль качества клиниче-
ских лабораторных исследований» Часть 1. Пределы допустимых погрешностей
результатов измерения аналитов в клинико-диагностических лабораториях).
В качес гве основы для оценки точности различения патологической и аналити-
ческой вариаций и для установления единых требований применительно к каж-
дому аналиту принято имеющее естественную фундаментальную основу свойство
состава биоматериалов человека — биологическая вариация в различных комби-
нациях ее компонентов, внутрииндивидуальной и межиндивидуальной.
Точность (правильность и прецизионность) количественных клинических лабо-
раторных исследований (измерений), как и любых измерений, характеризуется
размерами случайной и систематической погрешности результатов. Разработка
объективно обоснованных требований к точности клинических лабораторных
исследований заключается в установлении предельно допустимых значений ана-
литических погрешностей количественных методов исследований (измерений)
физических величин (состава и свойств компонентов биологических материалов)
в образцах биологических материалов, взятых у пациентов. В соответствии с ГОСТ
Р ИСО 5725-1 при оценке точности измерений каждый результат измерений рас-
сматривают как сумму трех составляющих:
у - ш + В ± е, (1)
где у — результат измерения; m — общее среднее значение (математическое ожида-
ние); В — лабораторная составляющая систематической погрешности в условиях
повторяемости; е — случайная составляющая погрешности каждого результата
измерения в условиях повторяемости.
Общее среднее значение совокупности результатов измерений или принятое
опорное значение используются в условиях, когда истинное значение измеряемой
физической величины (эталонное значение измеряемой величины в узаконенных
единицах) не может быть установлено из-за отсутствия необходимого эталона.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 49
Оно может быть получено как теоретическое или установленное значение, осно-
ванное на научных принципах, или как приписанное (согласованное) или атте-
стованное значение, основанное на экспериментальных работах, согласно ГОСТ
8.315-91, а также как среднее значение заданной совокупности результатов изме-
рений. Систематическая погрешность (разность между математическим ожидани-
ем результатов измерений и истинным или принятым опорным значением) харак-
теризует правильность измерений, т.е. степень близости результата к истинному
значению измеряемой величины, а на практике — к принятому опорному значе-
нию. Лабораторная составляющая систематической погрешности (смещение) при
использовании конкретного метода измерений в реальных условиях измерений в
клинико-диагностической лаборатории относится к общему среднему результату
или к установленному, аттестованному значению.
Случайная составляющая погрешности результата измерения характеризуется
прецизионностью — степенью близости друг к другу независимых результатов
измерений, полученных в конкретных регламентированных условиях. Она не
имеет отношения к истинному или установленному аттестованному значению
измеряемой величины.
Для количественных методов исследований разрабатываются требования к
характеристикам повторяемости и прецизионности, отражающим размер случай-
ной погрешности, проявляющейся в дисперсии результатов однородных изме-
рений и выражаемой среднеквадратичным отклонением, или коэффициентом,
вариации. ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 устанавливает значения неопределенностей
оценок стандартных отклонений прецизионности (сходимости и воспроизводимо-
сти) и систематической погрешности метода измерений и его реализации в данной
лаборатории, которые приводятся в таблицах указанного стандарта.
При расчете базового (желательного) уровня математически ожидаемого значе-
ния случайной аналитической погрешности (при бесконечно большом количестве
измерений) исходят из того, что предельно допустимая аналитическая погреш-
ность, характеризуемая коэффициентом вариации, должна составлять:
CVa<0,5xCVj, (2)
где CVA — коэффициент аналитической вариации; CVr — коэффициент биологиче-
ской внутрииндивидуальной вариации.
Коэффициент вариации результатов исследований не должен превышать 50%
показателя внутрииндивидуальной вариации.
Требования к правильности, т.е. степени отклонения определяемого значения
величины от его истинного значения, основаны на расчете математически ожидае-
мого (при бесконечно большом количестве исследований) значения систематиче-
ской аналитической погрешности (Bias - В). При расчете базового (желательного)
уровня требований к правильности исследований исходят из того, что предельная
допустимая систематическая аналитическая погрешность, характеризуемая отно-
сительным аналитическим смещением, должна составлять:
В (%) <0,25 х [(CV,)2 + (CVg)2]1/2, (3)
где В (%) — относительное аналитическое смещение; CV, — коэффициент биоло-
гической внутрииндивидуальной вариации; CVG — коэффициент биологической
межиндивидуальной (групповой) вариации.
Рассчитанные на основании данных зависимостей значения предельных допу-
стимых погрешностей представляют базовый (желательный) уровень требований
к точности лабораторных исследований. Реальные аналитические возможности
методов исследований ряда аналитов и характеристики точности доступных изме-
рительных приборов в одних случаях не позволяют обеспечить базовый уровень
точности результатов клинических лабораторных исследований. В иных случаях в
50 ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
отношении других аналитов базовый уровень точности легко превышается. Исходя
из этого во многих случаях в действующих нормативных документах допускается
использование дифференцированных, биологически обоснованных критериев
прецизионности и правильности исследований с применением коэффициентов,
повышающих или понижающих уровень требований аналитической точности.
При повышенном (оптимальном) уровне точности применяют коэффициент
0,25 (вместо 0,5) для расчета общей аналитической вариации и коэффициент 0,125
(вместо 0,25) — для относительного аналитического смещения [см. уравнения (1)
и (2)]. При пониженном (минимальном) уровне точности используют коэффици-
ент 0,75 (вместо 0,5) для расчета общей аналитической вариации и коэффициент
0,375 (вместо 0,25) — для относительного аналитического смещения.
Требования к аналитической точности следует устанавливать с учетом клини-
ческих потребностей. Принимая во внимание особенности требований к правиль-
ности результатов исследований, предназначенных для целей диагностики, и их
прецизионности при мониторинге течения заболеваний, рекомендуют варианты
расчетов предельных допустимых значений погрешностей.
Для диагностических целей предельные значения систематической погрешно-
сти клинике-лабораторных измерений должны соответствовать неравенству:
В <0,25 х [(CVj)2 + (CVg)2P'2, (4)
а предельные значения случайной погрешности — неравенству:
CV^O.SSxt^V^HCV.)2]1/2, (5)
При исследованиях, предназначенных для целей мониторинга заболеваний,
предельное значение систематической погрешности (ASE) должно соответствовать
неравенству:
ASE <0,33 х CV,, (6)
а предельное значение случайной погрешности (CVA) — неравенству:
CVA <0,5 х CV,, (7)
Допустимая разница результатов между двумя методами, используемыми для
исследования одной и той же величины в одной лаборатории (например, в отде-
лении реанимации и интенсивной терапии и в центральной КДЛ), не должна пре-
вышать !/3 размера внутрииндивидуальной вариации для данного аналита (допу-
скаемая разница <J/3 CVt).
Требования по качеству при исследовании лекарственных препаратов в про-
цессе лекарственного терапевтического мониторинга с использованием простой
теории фармакокинетики должны соответствовать неравенству:
CVA (%) <0,25 х [(2T/t - 1)/(2T/t + 1)] х 100, (8)
где Т — интервал между введением доз препарата; t — период полураспада пре-
парата.
Контроль качества аналитического этапа клинических лабораторных исследо-
ваний осуществляется в двух взаимодополняющих формах — внутрилаборатор-
ном контроле и внешней оценке качества.
Комплексная система контроля качества клинических лабораторных исследова-
ний осуществляется с помощью:
• установления единых требований к аналитическому качеству количествен-
ных методов;
• ежесерийного выполнения процедур внутрилабораторного контроля каче-
ства с использованием контрольных материалов (оперативный контроль
качества);
• регулярного участия в программах внешней оценки качества.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 51
ОСНОВЫ ВНУТРИЛАБОРАТОРНОГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА
Наличие системы внутрилабораторного контроля качества — условие полу-
чения достоверной аналитической информации. Организация и обеспечение
внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических
лабораторных исследований — обязанность заведующего лабораторией или
сотрудника, ответственного за обеспечение качества лабораторных исследова-
ний. Внутрилабораторный контроль качества клинических лабораторных иссле-
дований выполняют сотрудники каждой КДЛ в целях поддержания стабильности
аналитической системы. Внутрилабораторный контроль качества обязателен
в отношении всех видов количественных исследований, выполняемых в лабо-
ратории, для которых разработаны контрольные материалы. Если для коли-
чественного метода контрольные материалы недоступны, рекомендуют другие
способы контроля качества с использованием проб пациентов — метод оценки
воспроизводимости измерений аналита по дубликатам и ежедневным средним
значениям.
Статистическая основа оценки погрешностей при внутрилабораторном контро-
ле качества количественных методов лабораторных исследований — допущение,
что частотные распределения результатов многократного измерения одного и того
же контрольного материала одним и тем же аналитическим методом имеют вид
нормального распределения. Для оценки случайных и систематических погреш-
ностей измерения используют статистические характеристики нормального рас-
пределения.
Среднеарифметическое значение (X):
п
(9)
где х. — результат i-ro измерения из п выполненных; п — количество измерений;
п
— сумма результатов измерений хг х.,... хп.
Среднеквадратичное отклонение (S):
(10)
где X(xi-X)2
1=1
сумма квадратов отклонений результатов измерений хг х2...
х от X.
п
Коэффициент вариации (CV):
CV =ЛхЮ0%-
X
(lb
Среднеквадратичное отклонение (S) и коэффициент вариации (CV) характери-
зуются случайными погрешностями и используются для оценки повторяемости и
прецизионности измерений.
Среднеарифметическое значение (X) используется при расчете смещения (В)
в установочной серии измерений. Смещение (В) определяется близостью средне-
арифметического значения результатов установочной серии измерений контроль-
52
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
ного материала (X) к аттестованному значению (АЗ) измеряемой величины и
может быть выражено в абсолютных или относительных величинах.
Относительная систематическая погрешность или смещение (В) рассчитывается
по формуле:
В=Х ЛЗ-хЮ0%-
АЗ
(12)
В полученном результате обязательно указывается знак числа (+/“)•
Выявление недопустимых случайных погрешностей выполняют с помощью
оценки повторяемости и прецизионности результатов измерения аналитов в
контрольном материале (по результатам установочной серии измерений), а
систематических погрешностей — с помощью оценки относительного смеще-
ния.
Систематическое выполнение процедур оперативного контроля качества позво-
ляет на основании контрольных правил и установленных контрольных пределов
для каждого аналита выявить недопустимые погрешности и провести работу по их
устранению.
Порядок проведения внутрилабораторного контроля качества для каждой
выполняемой в лаборатории количественной методики исследования состоит из
трех последовательных стадий:
• I — оценка повторяемости результатов измерения;
• II — оценка прецизионности и относительного смещения по результатам
установочной серии измерений, построение контрольных карт;
• III — ведение оперативного контроля качества.
После выполнения 10 аналитических серий из 10 полученных результатов изме-
рения для каждого контрольного материала следует рассчитать значения CV10 и
В1(1 и сравнить с предельно допустимыми пределами. Если полученные значения
CV и В10 превышают допустимые, выявляют источники погрешностей и проводят
работу по их устранению, затем измерения повторяют. Если полученные значения
не превышают установленных норм, выполняют следующие 10 аналитических
серий.
Указанный расчет по 10 измерениям аналита в контрольных материалах сле-
дует проводить для предварительной оценки погрешностей в установочной серии
измерений (табл. 2-3).
Таблица 2-3. Последовательность процедур при ведении внутрилабораторного контроля качества
(установочная серия измерений)
Процедура Исследуемый материал Количество серий Количество измерений в серии Рассчиты- ваемые показатели
Стадия 1
Оценка повторяемости изме- рений Контрольный материал или проба пациента 1 10 CV
Стадия II
Предварительная оценка отно- сительного смещения Аттестованные контрольные материалы 10 1
Предварительная оценка пре- цизионности измерений Контрольные материалы для текущего ежесерийкого контроля 10 1
Построение контрольной карты Контрольные материалы для текущего ежесерийного контроля 20 1 X. S
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 53
Окончание табл. 2-3
Процедура Исследуемый материал Количество серий Количество измерений в серии Рассчиты- ваемые показатели
Окончательная оценка относи- тельного смещения Аттестованные контрольные материалы 20 1
Окончательная оценка преци- зионности измерений Контрольные материалы для текущего ежесерийного контроля 20 1
ПОСТРОЕНИЕ КОНТРОЛЬНЫХ КАРТ
• Из полученных в установочной серии 20 результатов измерений опреде-
ляемого показателя рассчитывают среднеарифметическое (X) (формула 9),
среднеквадратичное (S) отклонение (формула 10) и контрольные пределы
(X±1S, X±2S и X±3S).
• Если в ряду результатов оказалось значение, выходящее за пределы X±3S, его
отбрасывают, выполняют еще одну аналитическую серию, после чего снова
подсчитывают значения X и S.
• Контрольная карта, построенная по установочной серии измерений, пред-
ставляет собой график, на оси абсцисс которого откладывается номер ана-
литической серии (или дата ее выполнения), а на оси ординат — значения
определяемого показателя в контрольном материале (рис, 2-2).
• Через середину оси ординат проводят линию, соответствующую среднеариф-
метическому (X) значению, и параллельно ей отмечают линии, соответству-
ющие контрольным пределам:
❖ X±1S — контрольный предел «1 среднеквадратичное отклонение»;
❖ X±2S — контрольный предел «2 среднеквадратичных отклонения»;
о X+3S — контрольный предел «3 среднеквадратичных отклонения».
• Контрольные карты строят для каждого лабораторного показателя и для
каждого контрольного материала, предназначенного для опера гивного кон-
троля качества.
Рис. 2-2. Пример контрольной карты.
54 ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
• В каждой аналитической серии проводят однократное (как минимум) изме-
рение показателя в каждом контрольном материале. Количество образцов в
аналитической серии не ограничивается.
• Образцы контрольных материалов равномерно распределяют среди анали-
зируемых проб пациентов при отсутствии иных указаний производителей
приборов и реагентов.
• Наносят точки, соответствующие результатам контрольных измерений, на
соответствующие контрольные карты.
• При отклонении результатов контрольных измерений за контрольные преде-
лы оценивают приемлемость результатов проб пациентов в данной аналити-
ческой серии с помощью контрольных правил.
КОНТРОЛЬНЫЕ ПРАВИЛА
Контрольное правило включает контрольный предел (X+1S, X±2S, X±3S) и
количество контрольных измерений в аналитической серии. Контрольные прави-
ла обозначаются символами типа А где А — количество контрольных результа-
тов; L — контрольный предел.
• 13S — одно из контрольных измерений выходит за пределы X±3S;
• 2 — два последних контрольных измерения превышают предел X+2S или
лежат ниже предела X-2S;
• R4S — два контрольных измерения в рассматриваемой аналитической серии
расположены по разные стороны от коридора X±2S;
• 4 — четыре последних контрольных измерения превышают X+1S или лежат
ниже предела X-1S;
• 10х — десять последних контрольных измерений расположены по одну сто-
рону от линии, соответствующей X.
ПОРЯДОК ОЦЕНКИ КОНТРОЛЬНЫХ КАРТ
• Проверяют присутствие на контрольных картах предупредительного кон-
трольного правила 12$.
• Если один из результатов анализа контрольных материалов выходит за пре-
делы X±2S, последовательно проверяют наличие контрольных правил l,s, 22S,
R4S, 413 и 10х — аналитическая серия признается неудовлетворительной при
наличии одного из них.
• Если в дополнение к нарушению признака l,s обнаруживается хотя бы один
из указанных признаков (13S, 22S, R4S, 4JS или 10x), все результаты, полученные
в данной аналитической серии, следует считать неприемлемыми (рис. 2-3).
-3 s
Ищите случайную или систематическую ошибку
Рис. 2-3. Пример неудовлетворительного результата измерения. Одно значение находится вне
области доверительного интервала результата лаборатории.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 55
• Контрольные признаки 22S, 41S, 1ОК следует проверять на одной или обеих
контрольных картах.
• Проведение анализа приостанавливают, выявляют и устраняют причины
возникновения погрешностей. Все пробы, проанализированные в данной
серии (и пациентов, и контрольные), исследуют повторно.
• Результаты измерения контрольных материалов в серии, признанной непри-
емлемой, не используют при оценке по контрольным правилам повторной и
последующих серий.
• Если ни один из перечисленных выше признаков не обнаруживается ни на
одной контрольной карте, исследования продолжают.
• Решение о приемлемости результатов измерения аналита в биологическом
материале пациентов принимает сотрудник, отвечающий за качество иссле-
дований.
• Если результаты аналитической серии признаются неприемлемыми, делают
соответствующую запись в журнале регистрации отбракованных результатов
внутрилабораторного контроля качества.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДОВ
Аналитическая чувствительность исследования — способность метода выяв-
лять наименьшее различие между двумя концентрациями анализируемого ком-
понента. Она характеризуется степенью зависимости изменения значения резуль-
тата от сигнала, который должен быть измерен, и измеряется отношением
разницы измеренных значений к единице концентрации анализируемого ком-
понента. Аналитическая чувствительность также может быть количественно
выражена наклоном точного калибровочного графика и отношением прироста
значений измерения на единицу анализируемого компонента в диапазоне линей-
ности калибровочного графика. Линейность метода представлена интервалом зна-
чений, в котором ожидаемое и действительное значение различаются случайным
образом.
Нижний предел чувствительности метода характеризуется концентрацией веще-
ства или активностью аналита в отдельной индивидуальной пробе, при которой
исследуемая проба может быть дифференцирована с высокой степенью вероят-
ности от холостой пробы.
Количественным выражением нижнего предела чувствительности может быть
значение измерения холостой пробы по формуле:
xnp = x+3S. (13)
где ХП)1 — предельная величина нижнего порога концентрации вещества или актив-
ности аналита; X — значение измерения холостой пробы; S — среднеквадратичное
отклонение для серии из 20 измерений.
Диапазон измерения метода — интервал значений измерений от нижнего преде-
ла чувствительности на протяжении всего линейного участка калибровочного
графика.
При клинических лабораторных исследованиях анализ исследуемого (искомо-
го) компонента осуществляется в образце биологического материала, представ-
ляющем собой сложную смесь веществ и клеток.
Аналитическая специфичность метода — способность метода обнаруживать
только искомый компонент. Аналитическая специфичность по отношению к
анализируемой величине (компоненту биоматериала) оценивается по степени
влияния различных примесей или матрицы биоматериала на результат анали-
за. Для проверки специфичности метода используют примеси, которые могу'г
служить источником аналитической погрешности. В области верхней и нижней
56 ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
калибровочных точек для исследуемого компонента проводят сравнение между
должным и действительным значением исследуемого компонента при различных
концентрациях примесей. В качестве сравнительного интервала в верхней и ниж-
ней трети диапазона используют соответствующее значение среднеквадратичного
отклонения в серии, умноженное на коэффициент 2.1 для 95% доверительного
интервала или 2,88 — для 99% доверительного интервала. Превышение абсолют-
ного значения разницы между должным и действительным значением анализируе-
мого компонента характеризуется воздействием данной концентрации примеси на
аналитическую специфичность метода исследования.
Для полуколичественных методов оценка прецизионности может быть выраже-
на как пропорция ожидаемых результатов по принятой их классификации — «отри-
цательные», «1+», «2+», «3+». Данные пропорции имеют 95% доверительный
интервал, рассчитываемый на основе статистических таблиц. При сопоставлении
групп с низкой («1+») или среднеповышенной («2+») концентрацией аналитов
могут быть получены более точные результаты, чем при сопоставлении с группой
с высокой концентрацией аналитов («3+»), которая не имеет четко ограниченного
верхнего предела.
Правильность исследований оценивается на основе градации отрицательных и
положительных результатов с установлением порога обнаружения и порога под-
тверждения (на основе сравнения с результатами, полученными при параллельных
исследованиях количественным методом). Приемлемая правильность определе-
ний с помощью полуколичественных тест-полосок характеризуется долей лож-
ноположительных результатов на уровне менее 10% при пороге обнаружения и
долей ложноотрицательных результатов также на уровне менее 10% при пороге
подтверждения. В серой зоне (между порогами обнаружения и подтверждения)
доля ложноотрицательных результатов должна сохраняться на уровне менее
30%.
Требования к аналитической надежности неколичественных методов должны
разрабатываться с учетом специфики их аналитических принципов, биологиче-
ских и морфологических характеристик (особенностей) изучаемых компонентов
биологических материалов. В отношении визуальных неколичественных методов
применяется оценка по частоте обнаружения с их помощью искомых компонен-
тов биоматериалов, включая компоненты, характерные для специфических форм
патологии, для диагностики которых предназначен соответствующий вид иссле-
дования.
При разработке требований к аналитической надежности визуального метода
в качестве ориентира должны использоваться результаты исследования образцов
биоматериалов, проведенного исследователем, имеющим большой опыт визуаль-
ного изучения изображений (не менее 5000 исследований), правильного обнару-
жения и классификации исследуемых компонентов биоматериалов.
Информативность клинигеских лабораторных тестов определяется степе-
нью уменьшения неопределенности представления о физиологическом процессе,
состоянии органа или организма в целом на основе результатов данных тестов.
Для клинической диагностики лабораторная информация представляет ценность
в следующих отношениях:
• как средство выявления патологии, т.е. отклонения от состояния здоровья;
• как способ выявления отличий неодинаковых форм патологии, т.е. как сред-
ство дифференциальной диагностики;
• как средство наблюдения за изменением функций организма в ходе развития
патологического процесса и проведения лечебных мероприятий:
• как средство определения целей лечения и оценки их достижения;
• как средство определения показаний для профилактических мер и оценки их
эффективности.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 57
Информационная ценность результатов лабораторных тестов определяется харак-
тером исследуемых компонентов биоматериалов и возможным информационным
содержанием получаемых с их помощью результатов исследований (табл, 2-4),
Клинигеская информативность — способность лабораторного теста на основе
информации, полученной в результате исследования определенного аналита в
биологическом материале, характеризовать состояние внутренней среды организ-
ма у обследуемого пациента и выявлять патологические отклонения.
Порог клшшгеского решения — числовое значение определенного аналита, при-
нятое на основании экспериментальных данных в качестве критерия наличия или
отсутствия существенных сдвигов в состоянии внутренней среды и соответствую-
щих клинических проявлений у обследуемого человека, и объективного основания
для принятия решения об оценке состояния пациента и применении лечебных
мер. Для более точной диагностики клинических состояний могут быть выделены
несколько порогов решения.
Основная задача при оценке клинической информативности клинических лабо-
раторных исследований — установление достигаемой с их помощью степени точ-
ности разграничения исследуемых и сопоставляемых состояний организма паци-
ента или исследуемых групп пациентов (здоровье или болезнь, реакция на лечение
или отсутствие такой реакции, благоприятный или неблагоприятный прогноз).
Таблица 2-4. Примеры информационного содержания результатов лабораторных тестов
Характер информации Тесты Характер изменений относительно референтного интервала
Общая ори- ентация в состоянии пациента Количество эритроцитов Количество лейкоцитов в крови Повышение или снижение
СОЭ в крови Повышение
Белок Глюкоза Лейкоциты Бактерии в моче Повышение
Оценка остро- ты состояния Белки острой фазы Повышение
Показатели кислотно-щелочного состояния Глюкоза Гемоглобин Повышение или снижение
Оценка лока- лизации пора- жения Системные маркеры (рилизинг-факторы гипо- таламуса, гормоны гипофиза и периферических эндокринных желез) Повышение или снижение
Органные маркеры (сердечные маркеры, функ- циональные печеночные и почечные тесты, панкреатические ферменты, простатический специфический антиген) Повышение
Клеточные маркеры (компоненты клеток, специфически окрашиваемые красителями и флюорохромами; антитела к кластерам диффе- ренцировки — антигенам клеток) Выявление отклонений
Оценка воз- можной этио- логии Тесты на экзогенные патогенные организмы (бак- терии, вирусы, грибы, паразиты) Тесты на аутоантитела Тесты на дефицит экзогенных и эндогенных компонентов Положительный результат — выявление
58 ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Окончание табл. 2-4
Характер информации Тесты Характер изменений относительно референтного интервала
Молекулярно-биологические методы (ДНК- и РНК-зондирование, ПЦР) Обнаружение характерных генетических отклонений
Оценка диагноза определенной болезни Гликированный гемоглобин Повышение — наличие и степень тяжести сахарного диабета
Глюкокортикоиды и АКТГ Повышение — наличие болезни или синдрома Кушинга
Катехоламины и их метаболиты Поеышение — наличие феохромоцитомы
Составляющими решения этой задачи являются:
• вариация лабораторных результатов и ее виды;
• референтные интервалы аналитов и правила их установления;
• индексы индивидуальности аналитов и их влияние на характер применения
соответствующих тестов;
• применение статистических и эпидемиологических методов в лабораторной
информатике;
• отсечные точки и их влияние на характеристику информативности лабора-
торных исследований.
Значения, свойственные состоянию здоровья, могут быть охарактеризованы
референтными интервалами. Они определяются дисперсией значений аналитов,
определенных в группе здоровых референтных индивидуумов. Референтные интер-
валы, установленные в здоровой популяции, отражают групповую биологическую
вариацию и обычно применяются для разграничения патологии от состояния здо-
ровья.
Референтные интервалы ограничены референтными пределами, за которые
при 96% вероятности обычно принимают 2,5 и 97.5 процентили. Возможно при-
менение других процентилей в качестве референтных пределов, но это должно
быть оговорено в условиях определения соответствующего референтного интер-
вала.
Наряду с унивариантными и не зависящими от времени популяционными рефе-
рентными интервалами предусмотрена возможность установления:
• мультивариантных областей, получаемых комбинированной обработкой
нескольких лабораторных показателей в одной и той же группе референтных
индивидуумов;
• референтных интервалов, зависящих от времени взятия материала для иссле-
дования с учетом биоритмов (оценку ритмической вариабельности и расчет
узких повременных референтных интервалов следует проводить адекватны-
ми математическими или статистическими методами):
• индивидуальных референтных интервалов, присущих вариации аналитов у
данного индивидуума.
Правила установления референтных интервалов и пределов
• Референтный интервал — ограниченный референтными пределами и стати-
стически охарактеризованный диапазон значений результатов лаборатор-
ных исследований определенного аналита, полученных при обследовании
одного индивидуума или группы пациентов, отобранных по специальным
критериям.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 59
• Референтный предел — верхний или нижний предел референтного интервала
(не идентичный с порогом клинического решения). Референтные пределы
в здоровой популяции определяются факторами межиндивидуальной био-
логической вариации при соотношении аналитической и биологической
вариации (SaH)2/S6ttwi2 менее 0,4.
• Исходный пункт установления референтного интервала — решение о той
доле ряда референтных значений (действительных значений результатов
лабораторных исследований, полученных при обследовании референтных
индивидуумов), которая должна составить референтный интервал. Обычно
референтный интервал охватывает 95% референтных значений результатов,
полученных в референтной популяции, при этом он ограничивается двумя
значениями (референтными пределами), между которыми расположено 95%
всех референтных значений, а по 2,5% их с каждой стороны отбрасываются.
Следовательно, значения референтного интервала расположены между 2.5 и
97,5% уровнями (процентилями), или 0.025 и 0.975 фрактилями.
• Референтные индивидуумы — пациенты, отобранные из здоровой популя-
ции на основании критериев включения и исключения для формирования
референтной популяции. Референтные значения, полученные в данной попу-
ляции, используют для сравнения с индивидуумом, страдающим специфиче-
ским заболеванием.
• Референтная популяция — контингент референтных индивидуумов, значения
аналитов в котором используют для сравнения со значениями, получаемыми
у больного, страдающего определенным заболеванием. Референтная популя-
ция должна быть подобна по этническ им, возрастным, половым признакам,
насколько это возможно. Она должна включать всех возможных пациентов,
которые могут дать полный комплекс возможных референтных значений,
относящихся к соответствующему аналиту. Для получения референтного рас-
пределения могут быть использованы следующие референтные группы:
❖ сам испытуемый индивид (свойственная ему патология, несколько данных);
< идентичные близнецы (свойственная им патология, несколько данных);
<> амбулаторно отобранные индивиды без признаков патологии (практиче-
ски здоровые люди);
❖ госпитализированные отобранные больные без определенных признаков
патологии;
о отобранные больные с определенными признаками одной болезни:
отобранные индивиды из группы лежачих больных без определенных
признаков патологии.
• Для наиболее эффективного клинического использования референтные
интервалы и референтные пределы должны быть отнесены к различным
субпопуляциям по этническим, возрастным (у пожилых пациентов многие
лабораторные показатели могут отражать процесс старения или наличие
хронического заболевания) или иным признакам. Референтные пределы для
беременных должны быть отнесены к различным триместрам беременности.
У пациентов, постоянно принимающих препараты, регулирующие нарушен-
ные функции, должны быть специально установленные референтные преде-
лы содержания соответствующих аналитов с учетом присутствия постоянно
принимаемых лекарственных препаратов.
• Популяционные референтные интервалы могут быть:
-о унивариантными — относящимися к определению одного аналита и неза-
висящими от времени;
о- мультивариантными — получаемыми комбинированной обработкой
нескольких лабораторных показателей в одной и той же группе референт-
ных индивидов;
60 ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
❖ повременными — зависящими от времени взятия материала для исследо-
вания с учетом биоритмов (оценка ритмической вариабельности и расчет
узких повременных референтных интервалов с использованием адекват-
ных математических методов).
• Всех входящих в референтную группу пациентов следует обследовать с приме-
нением одного и того же аналитического метода, обладающего необходимыми
чувствительностью, специфичностью, стабильностью, хорошо откалиброван-
ного и точно выполняемого лабораторным персоналом с соблюдением всех
методических требований, при условии применения сертифицированных
реагентов, с учетом критериев отбора референтных групп, стандартизованных
условий подготовки обследуемых пациентов к проведению лабораторных
тестов, с помощью единого надежного аналитического метода. Это обеспечи-
вает получение однородного пула результатов — референтных значений, кото-
рые могут служить надежной основой для расчета референтных интервалов.
• Статистический метод расчета референтного интервала обусловлен харак-
тером распределения в ряду референтных значений: при предварительном
предположении о характере распределения данных применяют параметри-
ческие методы, при отсутствии предварительных допущений относительно
распределения данных используют и непараметрические методы.
При нормальном распределении референтные значения характеризуются
среднеарифметическим значением (X) и среднеквадратичным отклонением (S);
последнее позволяет оценить разброс данных, т.е. дисперсию. При нормальном
распределении часть площади между -1S и +1S охватывает 68,3% всех вариантов,
от -2S до +2S — 95,5% всех вариантов, от -3S до +3S — 99,7% всех вариантов.
Центральные 95% находятся в пределах X±1,96S. Именно поэтому для получения
95% референтного интервала необходимо найти среднее значение и две точки,
соответствующие X-1.96S и X+1,96S. При этом одно значение из 20 будет выхо-
дить за пределы референтного интервала.
Для расчета точности определения границ референтного интервала могут быть
определены их доверительные интервалы — интервалы значений, в которых с
определенной вероятностью находится значение данного параметра. Так, при при-
менении параметрического метода Гаусса доверительный интервал с 90% вероят-
ностью рассчитывают по формуле:
А ± 2,81S / V п, (14)
где А — значение границы референтного интервала (нижней или верхней).
Проверка совпадения полученного распределения с нормальным может быть
проведена графически с помощью построения гистограммы. При этом оценивают
наличие асимметрии, т.е. увеличение частоты значений в левой (положительная
асимметрия) или правой (отрицательная асимметрия) половине ряда.
Один из способов оценки распределения — выявление эксцессов по характеру
пиков. Слишком острый пик называют положительным экс цессом, слишком пло-
ский — отрицательным. Наличие двух пиков свидетельствует о бимодальности
распределения, отражающей, скорее всего, недостаточно однородный состав рефе-
рентной группы (по полу, возрасту, физиологическому состоянию).
В качестве математических методов оценки характера распределения использу-
ют статистический тест Lilliefors — адаптированный тест Колмогорова-Смирнова,
тест хи-квадрат. Возможно также математическое преобразование распределения
путем замены полученных значений их логарифмами.
При расчете референтных интервалов для аналитов, которым свойственны рас-
пределения значений в референтных группах здоровых людей, отличающиеся от
нормального распределения, применяют непараметрические методы, в частности
ранговый метод. При использовании рангового метода все результаты исследова-
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
61
ний располагают по порядку увеличения их численных значений, каждой величи-
не присваивают номер от единицы до п, соответствующего числу вошедших в ряд
значений.
Значение нижней границы 95% референтного интервала (2,5 процентиля, или
0,025 фрактиля) соответствует значению, порядковый номер которого определяют
по формуле:
г = 0,025 х (п+1), (15)
где г — порядковое место (ранг) величины; п — численность группы.
Соответственно значение верхней границы 95% референтного интервала (97.5
процентиля, или 0,975 фрактиля) равно значению, порядковый номер которого
0,975х(п+1). Доверительные интервалы для верхней и нижней границ референт-
ного интервала определяют по специальным таблицам. Пользуясь такой таблицей,
можно определить минимальную численность обследуемой группы с 90% довери-
тельным интервалом не менее 120 человек. Поскольку биологическая вариация
аналитов может быть довольно велика, численность референтных групп должна
быть большей.
При обследовании референтной группы значения отдельных результатов могут
оказаться в стороне от основной массы численных значений. Такие результаты
называют выпадающими из ряда (outliers). Для проверки, действительно ли данное
значение выпадает из ряда, применяют следующий критерий: самое большое или
самое маленькое значение может быть отброшено, если расстояние между ним и
ближайшим в ряду значением превышает */3 всего ряда значений.
• Значительная часть лабораторий не имеет возможности самостоятельно
установить референтные пределы для исследуемых в ней аналитов и обра-
щается к сведениям, публикуемым в руководствах и справочниках. При
использовании в исследованиях готовых наборов реагентов применяют
референтные пределы, установленные производителем данных наборов.
Однако, прежде чем ориентироваться на литературные или сообщаемые про-
изводителем набора реагентов референтные пределы, необходимо провести
сравнительную оценку характеристик правильности и воспроизводимости
метода, использованного для установления референтных пределов, и метода,
используемого в лаборатории. На основе такого сравнения значения рефе-
рентных пределов могут быть откорректированы.
• Возможны следующие способы оценки референтных пределов перед их
использованием в лаборатории.
❖ Документированное сравнение всех факторов, которые могут оказывать
влияние на референтный интервал (эндогенных, экзогенных, этнических,
генетических, лабораторных, аналитических, статистических), между соб-
ственной лабораторией и источником референтного интервала.
❖ Тщательный отбор и обследование небольшой референтной группы
(порядка 20 человек), исключение выходящих из ряда значений на осно-
ве критерия Reed’s (У3 ряда) и пополнение группы вновь до 20 человек.
Если при этом не больше 2 значений окажется за пределами референтного
интервала, он может быть принят лабораторией. Если за пределами интер-
вала окаже гея 3 и больше значений, процедура может быть повторно про-
ведена с другой группой из 20 человек.
о Обследование сокращенной референтной группы из 60 человек и сравне-
ние среднеарифметических и среднеквадратичных отклонений опытного
интервала и интервала, предлагаемого для использования.
< > При уверенности в высокой аналитической надежности используемого
метода, переходя к новой технологии или новому прибору, можно приме-
нить уравнение линейной регрессии:
62 ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
новый результат = старый результат х коэффициент + интерсепт.
• Перенос референтных пределов в данную лабораторию из другой может быть
облегчен использованием идентичных калибраторов.
• Референтные интервалы и их пределы, сочетающиеся с подтвержденным
нормальным состоянием здоровья данного индивидуума или группы заведо-
мо здоровых людей одного пола и возрастной группы используют для отне-
сения определенного у данного больного результата лабораторного иссле-
дования к нормальному или патологическому диапазону значений. Обычно
наблюдаемые значения сопоставляют с верхним или нижним референтным
пределом.
При этом следует учитывать степень взаимного перекрывания распределе-
ний значений данного аналита у здоровых людей и у страдающих определенной
болезнью, а также используемую в данном случае отсечную точку. Наблюдаемое
значение может характеризоваться низким, средним или высоким положением в
референтном распределении.
Также возможен расчет наблюдаемой величины по отношению к среднеариф-
метическому значению и среднеквадратичному отклонению по формуле:
Z=(x-X)/S, (16)
где Z — положение наблюдаемой величины в распределении; X — среднеарифме-
тическая величина; х. — наблюдаемая величина, s — среднеквадратическое откло-
нение.
Для более точной характеристики определяемого значения можно использо-
вать не только процентили 2.5 и 97,5, но и 5 и 95, 10 и 90, 15 и 85, 20 и 80, 25
и 75 и т.д. Расчет процентильной оценки определенного значения результата
исследования возможен с использованием уравнения регрессии, что может обе-
спечить более стабильные результаты и возможность получения всех желаемых
процентилей.
• Референтные пределы, установленные в группе пациентов, страдающих под-
твержденным другими способами видом патологии, можно применять для
выявления соответствующей формы болезни
ИНДЕКСЫ ИНДИВИДУАЛЬНОСТИ АНАЛИТОВ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ХАРАКТЕР
ПРИМЕНЕНИЯ СООТВЕТСТВУЮЩИХ ТЕСТОВ
Выход значений содержания аналита у обследуемого пациента за референтные
пределы обычно принято считать признаком патологии. Универсальность такого
подхода может быть ограничена особенностями индивидуальных свойств ана-
литов — размахом вариации результатов их определений. Для аналитов с малым
размахом вариации в состоянии здоровья вероятность выхода патологической
вариации за популяционные референтные пределы меньше, чем для аналитов с
большим размахом вариации. Эти особенности аналитов можно охарактеризовать
количественно с помощью расчета их индекса индивидуальности, представляюще-
го собой соотношение коэффициентов внутри- и межиндивидуальной вариации
аналитов:
II-C^/CV,., (17)
где II — индекс индивидуальности; CVj — коэффициент внутрииндивидуальной
биологической вариации; CVG — коэффициент межиндивидуальной биологиче-
ской вариации.
Диагностическая чувствительность теста тем выше, чем больше значение
индекса индивидуальности.
В простейшем случае (использование одного лабораторного теста и возможное
наличие одной формы патологии) присущие группе здоровых и группе больных с
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 63
Рис. 2-4. Гипотетическое распределение результатов теста среди здоровых и больных.
определенной формой патологии результаты лабораторного теста формируют две
кривые, частично накладываемые друг на друга (рис. 2-4). Соотношение площади,
описанной каждой кривой, с их накладываемыми частями даст количественную
характеристику дискриминирующей (различающей) способности теста по отно-
шению к изучаемой патологии.
При интерпретации результатов лабораторных исследований полученные зна-
чения классифицируют как положительные (подтверждающие патологию) и
отрицательные (не подтверждающие патологию). Под влиянием факторов био-
логической и аналитической вариации может наблюдаться взаимное перекрытие
значений результатов исследований между интервалами, свойственными группам
больных и здоровых людей, что приводит к классификации части полученных
значений как ложноположительных или ложноотрицательных. Истинно положи-
тельный результат подтверждает действительно имеющуюся патологию, истинно
отрицательный результат исключает патологию при действительном ее отсут-
ствии.
Ложноотрицательный результат исключает болезнь при ее действительном
присутствии Ложноположительный результат подтверждает патологию, несмо-
тря на ее отсутствие в действительности. Соотношения данных групп полученных
значений используют для количественной оценки клинической информативности
лабораторных тестов на основе расчетов вероятности определенной категории
значений при состоянии здоровья или болезни, а также при дифференциации
нескольких заболеваний.
При дифференциации нескольких болезней сопоставляют кривые, образован-
ные значениями лабораторных результатов, полученными соответственно при
обследовании пациентов, страдающих данными формами патологии. Сочетание
этих кривых образует многомерное пространство, в котором математически
могут быть определены области, соответствующие определенным видам пато-
логии. Критерий дискриминирующей способности теста может быть определен
расстоянием координат наибольшей частоты показателей теста при данной пато-
логии от центра области пространства, присущего другой патологии. Поскольку
в этой системе важную роль играет реальная вероятность патологии, для обосно-
вания численных значений вероятности привлекают данные клинической эпи-
демиологии, полученные с помощью принципов доказательной медицины. Они
64 ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
должны быть основаны на результатах рандомизированных контролируе;лых
клинических исследований, проведенных на опытной и контрольной группах
обследуемых, отобранных случайным образом, но при строгом соблюдении кри-
териев включения, исключения и равенства по факторам, влияющим на исход
заболевания.
Практически данные характеристики лабораторных тестов определяются на
основании статистического анализа массивов результатов исследований и матема-
тически характеризуются патогмоничностыо лабораторного показателя для диа-
гностики заболевания. В результате накопления данных о реальном применении
лабораторных тестов в группах здоровых людей и пациентов, заведомо страдаю-
щих определенным видом патологии, формируются 4 класса значений результатов
исследований данного аналита:
• истинно положительные;
• истинно отрицательные;
• ложноположительные;
• ложноотрицательные.
Математические соотношения этих групп лабораторных результатов служат
основанием для характеристики параметров клинической информативности лабо-
раторного теста:
• клинической чувствительности;
• клинической специфичности;
• диагностической эффективности;
• предсказательной ценности;
• пре- и посттестовой вероятности;
• отношения правдоподобия.
Клиническая (диагностическая) специфичность лабораторного теста
характеризуется количеством людей, правильно классифицированных по резуль-
татам исследования, как не находящихся в определенном состоянии, деленное на
число всех людей, не находящихся в данном состоянии (табл. 2-5).
Таблица 2-5. Критерии оценки диагностической ценности лабораторного теста
Критерии Болезнь присут ствует Болезнь отсутствует
Результат положительный а — истинно положительный b — ложноположительный
Результат отрицательный с — ложноотрицательный d — истинно отрицательный
Априорная вероятность болезни (a+c)/(a+b+c+d) = доля больных в обследуемой группе
Клиническая чувствительность а7(а+с) - доля истинно положительных результатов в группе больных
Клиническая специфичность d/(b+d) = доля истинно отрицательных результатов в группе здоровых
Предсказательная ценность положительного результата а/(а+Ь) - доля истинно положительных результатов среди всех положи- тельных результатов
Предсказательная ценность отрицательного результата d/(c+d) = доля истинно отрицательных результатов среди всех отрица- тельных результатов
Диагностическая эффектив- ность теста (a+d)/(a+b+c+d) = доля истинных результатов среди всех результатов теста
Отношение правдоподобия поло- жительного результата теста a/(a+c)/b/(b+d)
Отношение правдоподобия отрицательного результата теста c/(a+c)/d/(b+d)
Оценка чувствительности и специфичности важна при выборе лабораторного
теста для его применения в определенных клинических целях. Чувствительность
теста отражает вероятность его положительного результата при наличии патоло-
гии. Высокая чувствительность теста позволяет выявлять с его помощью больных
в общей популяции. Специфичность теста отражает вероятность отрицательного
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 65
результата при отсутствии патологии, что при высокой специфичности позволяет
отсеивать здоровых из популяции с предполагаемой патологией.
Комбинация клинической чувствительности и клинической специфичности
теста характеризует диагностическую эффективность теста. При интерпретации
лабораторных тестов вероятность действительного наличия патологии при поло-
жительном результате или надежность исключения патологии при отрицательном
результате оценивается на основе определения предсказательной ценности поло-
жительных или отрицательных результатов.
Предсказательная ценность (посттестовая вероятность болезни у пациента)
результата лабораторного теста зависит от распространенности болезни в популя-
ции (табл. 2-6), которую иначе можно рассматривать как претестовую вероятность
наличия болезни у пациента.
Таблица 2-6. Взаимосвязь распространенности болезни в популяции и предсказательной цен-
ности положительного результата лабораторного теста
Распространенность болезни в популяции, % Предсказательная ценность положительного результата теста, %
1 16,1
2 27,9
5 50,0
10 67,9
25 86,4
50 95,0
Взаимозависимость пре- и посттестовой вероятности болезни при определен-
ной чувствительности и специфичности теста представлена в табл. 2-7.
Таблица 2-7. Взаимозависимость пре- и посттестовой вероятности патологии у пациента при
использовании лабораторного теста с чувствительностью 90% и специфичностью 90%
Претестовая вероятность Посттестовая вероятность
0,01 0,08
0.5 0,9
0,99 0,999
Для вычисления вероятности болезни (посттестовой вероятности) на основа-
нии положительного или отрицательного результата теста используют отношение
правдоподобия (ОтП), которое обобщает ту же информацию, что и показатели
чувствительности и специфичности. ОтП для конкретного результата диагностиче-
ского теста - отношение вероятности получения данного результата у пациентов
с заболеванием к вероятности получения такого же результата у людей без забо-
левания. ОтП показывает, во сколько раз выше или ниже вероятность получения
данного результата теста у больных по сравнению со здоровыми людьми.
ОтП позволяет выйти за рамки грубой оценки результатов лабораторного теста
(норма или патология) в случае характеристики точности диагностического теста
на основе только понятий чувствительности и специфичности при единственной
точке разделения. В подобных ситуациях положение точки разделения (cut-off) на
непрерывном переходе между нормой и патологией устанавливается произвольно.
ОтП можно определять для любого количества результатов теста по всему диа-
пазону7 допустимых значений. Наличие заболевания более вероятно при крайнем
отклонении результата теста от нормы, чем в случае результата, близкого к грани-
це нормы. При данном подходе формируется информация о степени отклонения от
нормы, а не только о факте наличия или отсутствия болезни.
66 ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
При вычислении ОтП внутри некоторого диапазона значений результатов теста
под чувствительностью понимают уверенность врача при использовании конкрет-
ного результата теста для идентификации пациентов с заболеванием, а не с той
или иной степенью отклонения от нормы. Аналогичный подход применяют при
определении специфичности.
Интерпретация результатов вычисления ОтП:
• ОтП(+) более 10 или ОтП(-) менее 0,1 — основа для окончательного диагно-
стического решения;
• ОтП(+) от 5 до 10 и ОтП(-) от 0,1 до 0,2 — умеренные основания для диа-
гностического решения;
• ОтП(+) от 2 до 5 и ОтП(-) от 0,5 до 0,2 — малые основания для изменения
оценки вероятности болезни;
• ОтП(+) и ОтП(-) от 0.5 до 2 — почти не изменяет вероятность заболевания у
пациента.
С использованием приведенных показателей может быть осуществлен количе-
ственный расчет информативности лабораторного теста (J):
J = log2 (посттестовая вероятность/претестовая вероятность), (18)
где претестовая вероятность — вероятность болезни в популяции; посттестовая
вероятность — предсказательная ценность результата лабораторного теста.
J = log2 [R / (1 + р х (R - 1))] х бит информации, (19)
где R — ОтП; р — претестовая вероятность.
Для точной оценки значимости различия между значениями двух последова-
тельных измерений аналитов у одного и того же пациента применяют коэффици-
ент критической разницы (референтное различие значений).
Расчет данного критерия основан на зависимости:
RCV = К х [(CVj)2+ (CVjJp®, (20)
где RCV — коэффициент критической разницы или референтное различие значе-
ний; К — константа, зависящая от размера риска (при размере риска 0,5 константа
составляет 2,77); CVj — коэффициент внутрииндивидуальной биологической
вариации; CVA — коэффициент аналитической межсерийной вариации.
ВЫБОР ОТСЕЧНЫХ ТОЧЕК И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ХАРАКТЕРИСТИКУ
ИНФОРМАТИВНОСТИ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Классификация значений результатов как истинных или ложных зависит от
выбора отсечной точки — границы раздела между значениями, характерными для
здоровых и больных индивидуумов.
Поскольку от количественных соотношений различных классов значений
результатов зависит оценка клинической чувствительности и специфичности,
выбор отсечной точки должен определяться характером патологического процесса
и вытекающими из установленного диагноза медицинскими последствиями.
На примере рис. 2-4 при выборе в качестве отсечной точки А тест имеет 100%
чувствительность в отношении наличия патологии и низкую специфичность.
Наиболее информативны отрицательные результаты теста с такой чувствительно-
стью, поскольку при этом исключаются здоровые индивидуумы из общей популя-
ции Рекомендуют на ранних стадиях диагностики для сужения рамок исследуемой
популяции.
Выбор в качестве отсечной точки С придает тесту 100% специфичность и снижа-
ет чувствительность. Наиболее информативны положительные результаты такого
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 67
теста, поскольку они позволяют выявить в обследуемой популяции больных и
подтвердить предположительный диагноз. Свойства теста позволяют предотвра-
тить вред ложноположительного результата.
Для большинства клинических ситуаций в качестве отсечной выбирают точку
В как предел референтного интервала, т.е. диапазона значений результатов теста
у здоровых людей, характеризуемого среднеарифметическим значением и интер-
валом, ограниченным среднеквадратичными отклонениями в каждую сторон)'’.
Выход результата за референтные пределы, свойственные здоровым людям, может
свидетельствовать о патологии.
При оценке точности разграничения обследуемых групп по результатам лабо-
раторного теста используют его диагностическую эффективность (дискримини-
рующую способность), которая зависит от соотношения диагностической (кли-
нической) чувствительности и специфичности. Лабораторный тест может иметь
множество пар чувствительности и специфичности и должен быть описан полным
спектром их соотношений для установления точек разделения (уровней решений,
диагностических порогов). Соотношение между чувствительностью и специфич-
ностью теста, разбросы результатов которого в двух альтернативных группах
обследуемых (здоровые и больные) взаимно перекрываются, зависит от критерия
разделения этих групп. Смещение точки разделения в ту или иную сторону приво-
дит к изменению соотношения чувствительности и специфичности в противопо-
ложном направлении.
Для установления точки разделения с учетом последствий ложных решений
используют характеристическую кривую (Receiver Operating Characteristic. Relative
Operating Characteristic — ROC-cnrve) — кривую взаимной зависимости вероятно-
стей ложноположительных и истинно положительных результатов (чувствитель-
ности и специфичности).
ROC-кривая — графическое представление полного спектра чувствительно-
сти и специфичности, поскольку на ней мот быть отображены все возможные
пары «чувствительность-специфичность» для конкретного лабораторного теста.
Поскольку частота истинно положительных и ложноположительных тестов может
быть вычислена исходя из результатов в двух группах (здоровые и больные)
отдельно, ROC-кривая не зависит от распространенности заболевания.
В зависимости от точек разделения и степени их наложения ROC-кривая имеет
разные форму и положение. Желательное соотношение между чувствительностью
и специфичностью теста достигается выбором точки разделения. Наиболее четкое
разграничение между больными и здоровыми обследуемыми достигается при
использовании тестов, которые имеют характеристическую кривую результатов,
сдвинутую в сторону левого верхнего угла графика (рис. 2-5).
Для идеального теста график проходит через верхний левый угол, где доля
истинно положительных тестов составляет 100%, или 1 (идеальная чувствитель-
ность), а доля ложноположительных равна 0 (идеальная специфичность). Именно
поэтому чем ближе кривая к верхнему левому углу, тем выше диагностическая
эффективность (точность) теста, и наоборот, чем меньше изгиб кривой и чем
ближе она расположена к прямой, проходящей под углом 45*. тем менее эффек-
тивно диагностическое исследование. Точки на такой диагонали соответствуют
отсутствию диагностической эффективности.
Метод оценки ROC-кривых — оценка площади под кривыми. Теоретически
площадь изменяется от 0 до 1, однако, поскольку диагностически полезные тесты
характеризуются кривой, расположенной выше положительной диагонали (на
рис. 2-5 она обозначена пунктирной линией), обычно говорят об изменениях от 0,5
(отсутствие диагностической эффективности теста) до 1 (максимальная эффектив-
ность теста). Данная оценка может быть получена непосредственно вычислением
площади под многогранником, ограниченным справа и снизу осями координат и
68 ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Рис. 2-5. ROC-кривая.
слева вверху — экспериментально полученными точками. При визуальной оценке
ROC-кривых расположение относительно друг друга указывает на их сравнитель-
ную эффективность. Кривая, расположенная выше и левее, свидетельствует о
большей диагностической эффективности лабораторного теста.
ВНЕШНЯЯ ОЦЕНКА КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ
ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Внешняя оценка качества (ВОК) исследований, выполняемых в КДЛ, — важ-
нейший элемент системы обеспечения качества клинической лабораторной диа-
гностики. ВОК направлена прежде всего на обеспечение правильности результатов
исследований биологических материалов в КДЛ и соответственно сопоставимости
результатов, получаемых в разных лабораториях. Кроме того, внешняя оценка
служит объективным инструментом оценки соответствия лабораторных результа-
тов установленным нормативам качества.
ЗАРУБЕЖНЫЙ ОПЫТ
Зарубежный опыт построения систем ВОК показал серьезные преимущества
крупных общенациональных систем по сравнению с небольшими региональными
системами. Именно на общенациональном уровне организованы системы ВОК во
многих развитых странах (Австралии. Великобритании, США. Финляндии, ФРГ,
Франции). Некоторые из этих систем стали приобретать черты транснациональ-
ных, привлекая к участию клинические лаборатории других стран.
Основные преимущества общенациональных систем
Создание крупной общенациональной системы ВОК позволяет привлечь к ее
осуществлению ведущих специалистов страны, что необходимо для достижения
высокого научного и методического уровня системы, соответствующего той ответ-
ственной роли, которую ВОК играет в медицине. Контроль качества лабораторных
исследований составляет специальную область знаний, включающую, помимо
методических аспектов лабораторной медицины, современную методологию кон-
троля качества аналитических систем, основы теории ошибок, метрологию и мате-
матическую статистику. Ввиду специфики этой области количество работающих в
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 69
ней специалистов ограничено, что делает возможность объединения их усилий в
таких системах довольно уникальной, недостижимой в других условиях.
Корректная аттестация контрольных образцов (основы любой системы БОК),
прежде всего получение достоверных референтных значений, специфичных для
каждого отдельного метода лабораторного анализа и каждой отдельной серии
контрольного образца, возможна только при наличии в системе большого коли-
чества клинических лабораторий. Для получения достоверных референтных
результатов необходимо минимум 30, желательно более 70 участников в метод-
специфичных группах. Реализация других подходов к аттестации контрольных
образцов в сети аккредитованных экспертных и/или референтных лабораторий,
созданной на базе лучших клинико-диагностических и аналитических лаборато-
рий страны, также доступна только для общенациональных систем ВОК. Ввиду
возможности выделения больших по численности групп лабораторий, исполь-
зующих идентичные средства лабораторной диагностики, крупные системы ВОК
позволяют получать статистически достоверные данные по сравнительной харак-
теристике качества разных наборов реактивов, стандартных образцов, измери-
тельных устройств и т.п.
Привлекая к участию большое количество клинических лабораторий, такие
системы позволяют получать информацию, которая может быть эффективно
использована на разных уровнях принятия управленческих решений. Участвующие
в подобных системах клинические лаборатории получают объективные данные о
качестве выполняемых исследований, на основе которых они принимают реше-
ния о необходимости пересмотра используемых методов, наборов реагентов и
средств измерения, внедрения внутрилабораторных систем обеспечения качества
и их совершенствования. Большой объем данных по используемым в лаборато-
риях методам, наборам реагентов и средствам измерения позволяет оценивать
состояние материально-технической и методической базы лабораторной службы,
определять наиболее актуальные проблемы ее улучшения. Сравнение показате-
лей качества исследований, выполняемых в группах лабораторий, использующих
одни и те же методы, наборы реагентов и средства измерения, позволяет выделять
методы, требующие целенаправленной проверки качества. Получаемые при этом
данные могут быть использованы соответствующими надзорными органами.
Важное обстоятельство — возможность снижения себестоимости ВОК в рас-
чете на одну участвующую лабораторию: при большом количестве участников
стоимость контрольных материалов существенно ниже при их изготовлении или
закупке большими партиями. Это же обстоятельство определяет наличие в круп-
ной системе возможности закупать контрольные образцы, специально приготов-
ленные для системы «на заказ» и отвечающие целям конкретного цикла ВОК.
Серьезное преимущество общенациональных систем ВОК заключается в воз-
можности организации регулярной проверки силами компетентных (экспертных)
лабораторий качества коммерческих контрольных материалов, предполагаемых
для использования в ВОК, без чего невозможно обеспечить правильность оценки
качества исследований в клинических лабораториях.
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СИСТЕМА ВНЕШНЕЙ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ
ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Федеральная система внешней оценки качества клинических лабораторных
исследований (ФСВОК) была создана в нашей стране в 1994-1995 гг. Основные
цели ФСВОК:
• помощь клиническим лабораториям в объективной оценке качества выпол-
няемых исследований и выработке рекомендаций по его повышению;
• информирование лабораторий, главных специалистов по клинической лабо-
раторной диагностике и органов управления здравоохранения о сравни-
70 ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
тельном качестве наборов реактивов, калибраторов и оборудования, при-
меняемых в отечественной практике, а также о новых средствах и методах
исследования.
С самого начала своей деятельности ФСВОК работает не как административно-
разрешительная система, а как часть лабораторной службы страны, позволяющая
выявлять ошибки, возникающие в КДЛ, и оказывать помощь в устранении их
источников. Для обеспечения объективности получаемых из КДЛ результатов
анализа направляемых им контрольных образцов, имитирующих реальные кли-
нические пробы, и в целях исключения подмены административными санкция-
ми помощи, необходимой лабораториям в обеспечении качества выполняемых
исследований, в ФСВОК соблюдается конфиденциальность результатов оценки
качества исследований конкретной лаборатории. Результаты направляют только
ее заведующему под кодом данной лаборатории. Ответственность за использова-
ние результатов внешней оценки качества и принятие по ним решения несет непо-
средственно только заведующий КДЛ.
Работа ФСВОК направлена на выявление реальных погрешностей, присут-
ствующих в рутинной работе лабораторий при анализе реальных проб. С этой
целью в ФСВОК принимаются меры для обеспечения условий, в которых уча-
ствующие лаборатории не видели бы необходимости в создании «особых условий»
при исследовании получаемых контрольных образцов, а также по недопущению
каких-либо прямых административных санкций по результатам оценки качества
анализов. Это обеспечивается, в частности, анонимностью конкретной лаборато-
рии; все лаборатории кодируются, информация о качестве исследований в лабора-
тории сообщается только ее заведующему. В тех случаях, когда такая информация
сообщается главному лаборанту региона или ведомства, строго выполняется тре-
бование использовать указанную информацию только конфиденциально и только
для определения лабораторий, наиболее остро нуждающихся в оказании им мето-
дической помощи. Такой подход стимулирует лаборатории представлять честные
результаты исследований контрольных образцов, выполненные в тех же условиях,
что и анализы проб пациентов, чтобы самим оценить реальную ценность выдавае-
мой врачу диагностической информации.
В то же время нормативные документы Минздравсоцразвития РФ обязывают
каждую клиническую лабораторию к ежегодному участию в ФСВОК. Предъяв-
ление свидетельств об участии в ФСВОК в прошлые годы и письма, подтверждаю-
щего участие в текущем году, необходимо при лицензировании и инспекционных
проверках лабораторий. Нормативные документы Минздравсоцразвития РФ
обязывают региональные и ведомственные органы управления здравоохранения
и главных врачей лечебных учреждений обеспечивать возможность ежегодного
участия подведомственных лабораторий в ФСВОК.
Работу ФСВОК обеспечивает Центр внешнего контроля качества клинических
лабораторных исследований совместно с территориальными организационно-
методическими и контрольными центрами по клинической лабораторной диагно-
стике, Научно-методическим центром по клинической лабораторной диагностике и
экспертными группами ФСВОК.
За годы работы ФСВОК количество ее участников выросло более чем в 4 раза и
к 2010 г. превысило 7000 лабораторий, представляющих все субъекты РФ. ФСВОК
охватывает все виды рутинных клинико-лабораторных исследований и состоит из
более 77 разделов.
Контрольные образцы ФСВОК
Свойства контрольных образцов должны максимально соответствовать свой-
ствам реальных проб, исследуемых в клинических лабораториях, и при этом оста-
ваться однородными и стабильными в процессе транспортировки и хранения. В
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 71
ряде случаев одновременное выполнение всех требований нереально, и это накла-
дывает известные ограничения на методологию внешне оценки качества, делая
невозможным охват всех стадий подготовки пробы и аналитического процесса.
Б ФСВОК применяют следующие виды контрольных образцов:
• контрольные образцы биологических жидкостей человека (крови, сыворот-
ки, плазмы, мочи) и контрольные штаммы микроорганизмов (в виде культур,
лиофилизированных культур и бактериальных суспензий) — внешней оцен-
кой качества охвачены все стадии аналитического процесса, кроме процеду-
ры взятия биологической жидкости у пациента;
• искусственные образцы и смеси (контрольный водный раствор глюкозы,
искусственную мочу, суспензию эритроцитов, штаммы из государственной
коллекции микроорганизмов, образцы бактериальной ДНК) — образец
может не содержать посторонних компонентов, влияющих на результат
исследования реальной пробы;
• окрашенные и неокрашенные микроскопические мазки (см. разделы
«Лейкоцитарная формула», «Микроскопическое выявление микобактерий
с окоаской по Цилю-Нильсену», «Цитология») — контролируется только
стадия окраски препаратов и работы с микроскопом, ошибки на стадии при-
готовления мазка не выявляются;
• микрофотографии и видеоизображения — контролируется только оконча-
тельный этап диагностического исследования (распознавание образов).
• Во многих разделах применяют контрольные образцы промышленного изго-
товления. В этих случаях конкретный производитель (поставщик) контрольных
образцов определяется на конкурсной основе, к конкурсу приглашаются ведущие
отечественные и зарубежные производители. Один из критериев отбора — степень
соответствия свойств контрольного образца свойствам реальных проб, исследуе-
мых в клинических лабораториях. В разных разделах ФСВОК в наборы входят от
1 до 20 контрольных образцов, отражающих разнообразие исследуемых в клини-
ческих лабораториях реальных проб, в том числе нормальные и патологические
пробы.
Алгоритмы работы ФСВОК
Наборы закодированных контрольных образцов с сопроводительной докумен-
тацией, в которой изложен порядок исследования образцов, бланками для записи
полученных результатов и другой необходимой для оценки качества информацией
доставляют из Центра внешнего контроля качества в лаборатории почтой или
курьерской службой. Исследования контрольных образцов должны быть выпол-
нены в рутинной серии исследований обычных проб, поступающих в лабораторию
на анализ, в гех же условиях, с теми же реагентами и на том же оборудовании.
Результаты выполненных по заданной схеме исследований контрольных образ-
цов, внесенные в соответствующие бланки (формы), направляют в ФСВОК для
последующей оценки.
Полученные из лабораторий данные изучают сотрудники Центра внешнего
контроля качества, при этом проверяют их соответствие установленной схеме
анализа контрольных проб, правильность использованных единиц измерения и
т.п., на основе чего делают заключение о возможности их ввода в компьютер и
последующей обработки.
Схемы и алгоритмы внешней оценки качества зависят от формы представления
результата исследования. Результаты количественного анализа, выраженные в
виде числа из непрерывной шкалы измерений (в таких разделах, как «Биохимия
крови», «Ипокоза», «Гемоглобин», «Гемоцитометрия», «Анализ мочи», «Коагуло-
логия», «Гормоны и витамины», «Газы крови», «Липиды и аполипопротеины»
и др.), оценивают с использованием статистики, основанной на распределении
72 ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Гаусса. Для каждого контрольного образца устанавливают целевые значения по
каждому из определяемых в нем показателей. В качестве целевого значения может
быть выбрано среднее значение результатов участников, использующих один и
тот же аналитический метод, среднее значение всех участников, определяющих
один и тот же показатель любым методом, за вычетом 5% крайних результатов,
или же референтное значение, установленное методом высшего порядка точности
(например, в разделе «Глюкоза» — концентрация глюкозы, определенная в водном
стандартном растворе по навеске чистого вещества). Индивидуальные целевые
значения по каждому методу устанавливают только в тех случаях, когда имеются
достоверные различия между средними значениями, заложенные в природе самих
методов. При этом лаборатория, корректно использующая свой метод, не может
нести ответственность за его систематическую погрешность относительно других
методов.
Для оценки приемлемости систематической погрешности результата измерения
вокруг целевого значения откладывают диапазон допустимых значений, который
в большинстве случаев составляет ±l,64s (s — межлабораторное стандартное
отклонение), что соответствует 90% доверительному интервалу вокруг среднего
значения. В разделах «Биохимия крови» и «Глюкоза», «Электрофорез белков
сыворотки крови» и «Коагулология» эксперты ФСВОК установили фиксирован-
ные нормы точности на основе достигнутых в лабораториях аналитических харак-
теристик и с учетом требований, вытекающих из биологической вариации данных
показателей в популяции. Помимо систематической погрешности для результатов
количественного анализа, проводят оценку допустимости случайной погрешности
по величине относительного размаха между двумя параллельными измерениями
одного образца. В качестве нормы точности для воспроизводимости установлены
либо фиксированные критерии, либо величина 2,46R (R — средний относительный
размах в оцениваемой совокупности лабораторий), соответствующая верхней 95%
отрезной точке распределения размахов. Данная схема оценки имеет преимуще-
ства перед рядом зарубежных схем внешней оценки качества, в которых оценку
проводят по единственному результату анализа контрольного образца, поскольку
позволяет выявить источник аналитической погрешности — случайной или систе-
матической. По результатам одного измерения это сделать невозможно. Вместе с
тем эксперты ФСВОК в разделах «Биохимия крови» и «Глюкоза», «Электрофорез
белков сыворотки крови» и «Коагулология» установили нормы точности также и
для ошибки единичного измерения — для случаев, когда лаборатория представля-
ет только один результат анализа.
Помимо методов количественного анализа, для оценки которых применяют
известные статистические методы, в рамках ФСВОК разработаны оригинальные
схемы внешней оценки качества методов лабораторной диагностики, в которых
результат исследования не может считаться измерением. Для оценки результатов
полуколичественного анализа мочи с помощью диагностических полосок, у кото-
рых каждое последующее деление шкалы в несколько раз превышает предыдущее,
используют критерии, основанные на степени точности применяемой дискретной
шкалы: медиана результатов участников, использующих один и тот же тип диа-
гностических полосок, должна укладываться в пределах ±1 деление шкалы изме-
рения.
Подходы к оценке качества методов обнаружения веществ, антигенов, антител,
микроорганизмов и т.п. основаны чаще всего на заранее известных свойствах кон-
трольного образца (дефинитивная оценка). В ряде случаев используют контроль-
ные панели с контрольными образцами различной степени нагруженности (см.
разделы «ИФА-выявление HP Xg», «Микроскопическое выявление микобактерий
с окраской по Цилю-Нильсену», «Культуральное выявление микобактерий тубер-
кулеза», «ПЦР-выявление микобактерий туберкулеза»), что позволяет оценить
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 73
диагностические чувствительность и специфичность методики. В тех случаях,
когда используют контрольные образцы с заранее неизвестным содержанием
компонента, подлежащего обнаружению (качественный анализ мочи), для оценки
качества используют методы непараметрической статистики: не более 20% край-
них результатов признают неудовлетворительными, остальные — правильными.
В ряде разделов ФСВОК лаборатории заранее не сообщают, какое задание
ей предстоит выполнить. Например, в разделе «Микробиология» требуется
определить до рода и вида бактериальный штамм из государственной коллекции
микроорганизмов, а также его спектр лекарственной чувствительности, а в раз-
деле «Цитология» — дать диагностическое описание цитологического препарата.
Оценкой качества такого заключения служит сравнительное заключение комиссии
экспертов, изучивших данный препарат.
РАЗДЕЛЫ ФСВОК
Биохимия крови
Три цикла оценки качества определения в сыворотке/плазме крови на двух
уровнях концентрации АЛТ, альбумина, а-амилазы общей, а-амилазы панкреа-
тической, ACT, белка общего; билирубина, билирубина прямого, глюкозы, гамма-
ГТ, железа, ОЖСС, калия, кальция общего, кальция ионизированного, кислой
фосфатазы, креатинина, креатинкиназы, ЛДГ, липазы, магния, мочевой кислоты,
мочевины, натрия, триглицеридов, фосфора, хлоридов, холестерина, холинэстера-
зы, щелочной фосфатазы. (Цикл — рассылка контрольных образцов участвующим
лабораториям, сбор и обработка результатов их исследования, сообщение лабора-
ториям заключений о качестве выполненных исследований. Указано количество
ежегодно выполняемых циклов активности и массы МВ-креатинкиназы, миогло-
бина, тропонинов I и Т.)
Глюкоза
Три цикла оценки качества определения глюкозы в сыворотке/цельной крови
на двух уровнях концентрации. Для лабораторий, определяющих только этот био-
химический показатель крови.
Анализ мочи
Три цикла оценки качества исследований в моче на двух уровнях концентраций.
Количественное определение а-амилазы, белка, глюкозы, креатинина, альбумина,
мочевой кислоты, мочевины, калия, кальция, натрия, pH, фосфора, хлоридов.
Полуколичественное определение: диагностическими тест-полосками — белка,
билирубина, гемоглобина, глюкозы, pH; химическими методами — белка, глюко-
зы, pH.
Качественное определение белка, билирубина, гемоглобина, глюкозы, pH, нитри-
тов.
Анализ мочи «мини»
Три цикла оценки качества исследований на двух уровнях концентраций: белка,
pH, глюкозы — любыми методами, кроме определения на приборе «Эксан»; нитри-
тов, гемоглобина, удельного веса — диагностическими тест-полосками: кетоновых
тел — качественными и полуколичественными (например, тест-полосками) мето-
дами.
Гормоны и витамины
Три цикла оценки качества определения в сыворотке/плазме крови на двух уров-
нях концентраций АКТГ, витамина В12, ДГЭА-сульфата, инсулина, кальцитонина,
кортизола, лютеинизирующего гормона, паратиреоидного гормона, С-пептида,
74
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
прогестерона, 17 а-ОН-прогестерона, пролактина, тестостерона, свободного тесто-
стерона, тиреотропного гормона. Т3, свободного Т3, Т4, свободного Т„ соматотропи-
на, а-фетопротеина, фолиевой кислоты, фоллитропина, общего [3-Х1 Ч, эстрадиола,
свободного эстриола.
Газы крови
Три цикла оценки качества определения рСО2, рО2 и pH крови на двух уровнях
концентраций.
Гликозилированный гемоглобин
Два цикла оценки качества определения концентрации гликозилированного
гемоглобина крови на двух уровнях концентраций.
Кардиомаркеры
Два цикла оценки качества определения в сыворотке/плазме крови активности
креатинкиназы, активности и массы МВ-креатинкиназы. миоглобулина, тропонина
JhT.
Онкомаркеры
Три цикла оценки качества определения в сыворотке/плазме крови на двух уров-
нях конпентраций СА 15-3, СА 19-9, СА 125, пролактина, ПСА общего, ПСА свобод-
ного, РЭА, тиреоглобулина, а-фетопротеина, ферритина, общего |3-ХГЧ.
Специфические белки
Два цикла оценки качества количественного иммунохимического опреде-
ления в сыворотке/плазме крови концентраций с^-кислого гликопротеина,
с^-антитрипсина, а2-макрогл обул ина, анти стрептолизина-О, [32-микроглобулина,
С-реактивного белка, церулоплазмина, СЗ- и С4-компонентов комплемента, гап-
тоглобина, IgA, IgE, IgG, IgM, легких цепей каппа и лямбда, преальбумина, рети-
нолсвязывающего белка, ревматоидного фактора, трансферрин? ферритина.
Электрофорез белков сыворотки крови
Три цикла оценки качества определения в сыворотке крови двух концентраций
альбумина, -глобулинов, а2-глобулинов, р-глобулинов суммарных, р2-глобу-
линов, [3,-глобулинов, у-глобулинов.
Липиды и аполипопротеины
Два цикла оценки качества определения аполипопротеинов A-I и В, ЛП(а), три-
глицеридов, общего, ЛВП- и ЛНП-холестерина в сыворотке/плазме крови на двух
уровнях концентраций.
Неонатальный скрининг
Три цикла оценки качества определения двух концентраций галактозы, имму-
нореактивного трипсина, 17-оксипрогестерона, тиреотропного гормона и фенила-
ланина в крови новорожденных.
Пренатальный скрининг
Три цикла оценки качества определения двух концентраций биохимических
маркеров наследственных заболеваний плода: а-фетопротеина, хорионического
гонадотропина и свободного эстрадиола в крови беременных.
Гемоцитометрия-8
Два цикла оценки качества определения на гемоцитометрах гематокрита, гемо-
глобина, эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, среднего значения содержания
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 75
гемоглобина в эритроците, концентрации гемоглобина в эритроците, среднего
объема эритроцита (8 показателей, два уровня),
Гемоцитометрия-16
То же, что в разделе «Гемоцитометрия-8», с. добавлением среднего объема тром-
боцита, показателя гетерогенности эритроцитов, абсолютного и относительного
количества лимфоцитов, средних клеток и гранулоцитов, определяемых на «З-diff»
гематологических анализаторах Abacus Junior, Aduia 60, Вс 3000-series. Coulter A c
Tdiff, Erma PCE-210, MEK 6400/6410, Medonic CA 620/530, Medonic M-series. Micros
60, Mythic 18. Swelab AC 920/970EO+, Sysmex KX-21 (16 показателей. 2 уровня).
Лейкоцитарная формула
Два цикла оценки качества подсчета лейкоцитарной формулы в препаратах
крови.
Гемоглобин
Три цикла оценки качества определения гемоглобина на двух уровнях концен-
траций.
Коагулология
Три цикла оценки качества определения протромбинового и тромбинового
вр<мени, процента протромбина по Квику, МНО, АЧТВ и фибриногена на двух
уровнях концентраций.
Коагулологмя-плюс
Три цикла оценки качества определения протромбинового и тромбинового
времени, процента протромбина по Квику, МНО, АЧТВ, фибриногена, активно-
сти факторов VIII, IX, XIII. фактора фон Виллебранда (ристоцетин-кофакторной
активности), антитромбина III, протеина С, плазминогена, ингибитора плазмина
(а,-антиплазмина) и общей системы фибринолиза (ХНа-зависимого фибриноли-
за) на двух уровнях.
Волчаночный антикоагулянт
Два цикла оценки качества выявления волчаночного антикоагулянта.
Контроль гепаринотерапии
Два цикла оценки качества определения АЧТВ и тромбинового времени в гепа-
ринизированной плазме.
Иммуногематология
Два цикла оценки качества определения группы крови, резус-принадлежности,
выявления ауто- и аллосенсибилизации, основанных на типировании антигенов
эритроцитов и антиэритроцитарных антител.
Иммуноглобулин е
Два цикла оценки качества определения общего IgE крови.
Ревматоидный фактор
Два цикла оценки качества определения ревматоидного фактора количествен-
ными. полуколичественными (в том числе агглютинация частиц латекса) и каче-
ственными методами.
Антинуклеарные антитела
Два цикла оценки качества определения антинуклеарного фактора методом
непрямой иммунофлюоресценции с определением титра и типа свечения ядра, а
также антител к экстрагируемому ядерному антигену методом ИФА.
76 ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Антитела к двуспиральной ДНК
Два цикла оценки качества определения антител к двуспиральной ДНК количе-
ственными и качественными методами ИФА.
Антитела к фосфолипидам
Два цикла оценки качества определения антител к фосфолипидам, антител IgG
и IgM к кардолипину, антител IgG к 02-гликопротеи ну методом ИФА.
Антитела к тиреоидпероксидазе и тиреоглобулину
Два цикла оценки качества иммунохимических тестов определения антител к
тиреоидпероксидазе и тиреоглобулину.
Антитела IgG к Helicobacter pylori
Два цикла оценки качества иммуноферментных тестов определения антител IgG
к Helicobacter pylori, в сыворотке крови.
Клиническая микробиология
Два цикла оценки качества идентификации возбудителей гнойно-септических
заболеваний, внутри- и внебольничных инфекций и определения их чувствитель-
ности к антибиотикам.
Микроскопическое выявление микобактерий с окраской по Цилю-Нильсену
Два цикла оценки качества микроскопического выявления кислотоустойчивых
микобактерий в препаратах мокроты.
Выявление микобактерий методом люминесцентной микроскопии
Два цикла оценки качества микроскопического выявления кислотоустойчивых
микобактерий в препаратах мокроты с окраской флюорохромами.
Культуральное выявление микобактерий туберкулеза
Один цикл оценки качества выявления микобактерий культуральными метода-
ми. Десять контрольных образцов. Доставка курьерской почтой.
Определение лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза к
препаратам первого ряда
Один цикл оценки качества определения лекарственной чувствительности мико-
бактерий туберкулеза к изониазиду, рифампицину, стрептомицину и этамбутолу.
Выявление микобактерий туберкулеза и исследование их лекарственной
чувствительности на жидких средах
Один цикл оценки качества выявления микобактерий туберкулеза и определе-
ние их лекарственной чувствительности к изониазиду, рифампицину, стрептоми-
цину, этамбутолу и пиразинамиду на жидких средах.
ПЦР-выявление микобактерий туберкулеза
Два цикла оценки качества выявления ДНК микобактерий туберкулезного ком-
плекса методом ПЦР.
Молекулярно-генетическое выявление лекарственной устойчивости микобактерий
туберкулеза
Один цикл оценки качества выявления мутационных изменений ДНК микобак-
терий туберкулеза, приводящих к их устойчивости к изониазиду и рифампицину.
Микроскопия осадка мочи (микрофотографии)
Три цикла оценки качества микроскопического исследования препаратов осад-
ка мочи.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 77
Микроскопия трихомонад (микрофотографии)
Три цикла оценки качества микроскопического выявления возбудителей три-
хомониаза.
Микроскопия гонококков (микрофотографии)
Три цикла оценки качества микроскопического исследования возбудителей
гонореи.
Микроскопия кала (микрофотографии)
Три цикла оценки качества микроскопического исследования препаратов кала.
Микроскопия вагинальных препаратов (микрофотографии)
Три цикла оценки качества микроскопического исследования микрофлоры ваги-
ны при вагинозах и вагинитах.
Микроскопия клеток периферической крови (микрофотографии)
Три цикла оценки качества микроскопического исследования препаратов пери-
ферической крови при анемиях, гемобластозах и реактивных состояниях.
Микроскопия мокроты (микрофотографии)
Три цикла оценки качества микроскопического исследования препаратов
мокроты.
Микроскопия спинномозговой жидкости (микрофотографии)
Три цикла оценки качества микроскопического исследования препаратов лик-
вора.
Микроскопия эякулята (микрофотографии)
Три цикла оценки качества микроскопического исследования препаратов эяку-
лята.
Люминесцентная микроскопия С. trachomatis (микрофотографии)
Три цикла оценки качества микроскопического выявления С. trachomatis в пре-
паратах соскобов слизистой урогенитального тракта методом РИФ.
Люминесцентная микроскопия С. trachomatis (препараты)
Два цикла оценки качества микроскопического выявления С. trachomatis в
препаратах, имитирующих соскобы слизистой урогенитального тракта методом
РИФ.
Серодиагностика сифилиса
Два цикла оценки качества выявления специфических антител к Treponema
pallidum с использованием фазных серологических методов и тест-систем.
ИФА-выявление HBsAg
Два цикла оценки качества первичного и подтверждающего выявления HBsAg
методом ИФА.
ИФА-выявление и определение концентрации анти-HBs
Два цикла оценки качества выявления антител IgG к вирусу гепатита В и опреде-
ление концентрации методом ИФА.
ИФА-выявление анти-ВГС
Два цикла оценки качества выявления антител IgG к вирусу гепатита С методом
ИФА в скрининговом исследовании и антител к структурным и неструктурным бел-
кам вируса гепатита С методами ИФА или иммуноблота (подтверждающие тесты).
78 ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
ИФА-выявление и определение концентрации анти-ВГА
Два цикла оценки качества выявления антител IgG к вирусу гепатита А.
ИФА-выявление ВИЧ
Два цикла оценки качества серологической диагностики ВИЧ методом ИФА при
скрининговом исследовании.
Серологическая диагностика ВИЧ-инфекции
Два цикла оценки качества выявления серологических маркеров ВИЧ методами
ИФА в скрининговом и подтверждающем исследованиях с постановкой иммуно-
блота.
ИФА-выявление IgG к С. trachomatis
Два цикла оценки качества выявления антител IgG к С. trachomatis методом
ИФА.
ИФА-выявление IgA к С. trachomatis
Два цикла оценки качества выявления антител IgA к С. trachomatis методом
ИФА.
ИФА-выявление антител к роду Chlamydia
Два цикла оценки качества выявления антител IgG к роду Chlamydia методом
ИФА.
ИФА-выявление вируса герпеса
Два цикла оценки качества выявления антител IgG к вирусу простого герпеса I
типа методом ИФА.
ИФА-выявление цитомегаловируса
Два цикла оценки качества выявления антител IgG к цитомегаловирусу (ЦМВ)
методом ИФА.
ИФА-выявление Candida albicans
Два цикла оценки качества выявления антител IgG к Candida albicans методом
ИФА.
ИФА-выявление Mycoplasma hominis
Два цикла оценки качества выявления IgG к Mycoplasma hominis методом ИФА.
ИФА-выявление и определение концентрации ытн-Toxoplasma gondii
Два цикла оценки качества выявления антител IgG к Toxoplasma gondii и опреде-
ление их концентрации методом ИФА.
ИФА-выявление Ureaplasma urealyticum
Два цикла оценки качества выявления антител IgG к Ureaplasma urealyticum
методом ИФА.
Проточная цитофлюориметрия
Два цикла оценки качества определения субпопуляционного состава лимфоцитов
периферической крови методом проточной цитофлюориметрии с использованием
моноклональных антител, меченных флюорохромами.
ПЦР-выявление ВГВ
Два цикла оценки качества выявления ДНК вируса гепатита В методом ППР.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 7Q
Количественное определение ДНК ВГВ методом ПЦР
Два цикла оценки качества количественного определения концентрации ДНК
вируса гепатита В методом ПЦР,
ПЦР-выявление ВГС
Два цикла оценки качества выявления РНК вируса гепатита С методом ПЦР.
Количественное определение РНК ВГС методом ПЦР
Два цикла оценки качества количественного определения концентрации РНК
вируса гепатита С методом ПЦР.
ПЦР-выявление ВИЧ
Два цикла оценки качества выявления РНК вируса иммунодефицита человека
методом ПЦР.
ПЦР-выявление С. trachomatis, М. hominis, U. urealyticum
Два цикла оценки качества выявления ДНК Chlamydia trachomatis, Mycoplasma
hominis, Ureaplasma urealyticum методом ПЦР.
ПЦР-выявление Neisseria gonorrhoeas
Два цикла оценки качества выявления ДНК Neisseria gonorrhoeae методом ПЦР.
ПЦР-выявление ВПЧ
Два цикла оценки качества выявления ДНК вируса папилломы человека высо-
кого канцерогенного риска методом ПЦР.
Оценка качества микроскопических исследований с использованием виртуальных
препаратов
Два цикла оценки качества микроскопических исследований, имитируемых на
экране компьютера:
- осадка мочи,
- кала,
- возбудителей паразитарных заболеваний в кале,
- трихомонад,
- гонококков,
- эякулята,
- лейкоцитарной формулы,
- мазков шейки матки,
- выпотных жидкостей,
- материалов из молочной железы.
Обеспечивается возможность просмотра множественных полей зрения препара-
та, а для препаратов мочи и кала, помимо этого, изменение фокусировки, а также
просмотр виртуальных препаратов с увеличением 100, 200,400,1000, управление
«виртуальным» препаратоводителем, что позволяет выбирать зону для детального
исследования и переключать на большие увеличения.
Исследование подвижности сперматозоидов (виртуальная кинезиограмма)
Два цикла оценки качества определения сперматозоидов разных категорий под-
вижности. Лаборатория получает компакт-диск с четырьмя видеофрагментами
нативных препаратов спермы.
Клиническая цитология
Один цикл оценки качества цитологической диагностики доброкачественных
и злокачественных патологических процессов. Используются окрашенные препа-
раты, подобранные в соответствии с характером цитологических исследований и
80
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
методами окрашивания препаратов в лаборатории, а также цифровые микрофото-
графии с окрашенных препаратов, приготовленных из биоматериала определен-
ной локализации.
Клиническая цитология (цифровые микрофотографии)
Один цикл оценки качества цитологической диагностики с использованием
цифровых фотографий пяти микроскопических полей зрения каждого из двух пре-
паратов, приготовленных из следующего биоматериала:
- шейка матки,
- выпотные жидкости,
- мокрота или биоптат, взятый при бронхоскопии,
- молочная железа,
- желудок,
- щитовидная железа.
Клиническая цитогенетика-1
Один цикл оценки качества идентификации хромосом человека в целях опре-
деления кариотипа. Три контрольных препарата лимфоцитов периферической
крови.
Клиническая цитогенетика-2
Один цикл оценки качества идентификации хромосом человека в целях опреде-
ления кариотипа. Три контрольных препарата костного мозга.
Гистология
Один цикл оценки качества патогистологических исследований. Используются
контрольные окрашенные препараты срезов тканей биопсийного и операционного
материала.
Экспертная оценка качества приготовления и микроскопического исследования
препаратов
Лаборатория пересылает в ФСВОК определенные количества приготовленных и
исследованных ею рутинных препаратов, где их исследуют эксперты. Результаты,
полученные экспертами, заключение о качестве препаратов и рекомендации по
повышению качества исследований направ пяют в лабораторию (по указанию лабо-
ратории препараты ей возвращают).
Выявление трихомонад в отделяемом слизистой урогенитального тракта с окра-
ской метиленовым синим или по Романовскому-Гимзе.
Выявление гонококков в отделяемом слизистой урогенитального тракта с окра-
ской по Граму.
Выявление кислотоустойчивых микобактерий с окраской по Цилю-Нильсену.
Цитогенетическое исследование лимфоцитов периферической крови и костного
мозга, G-окрашивание.
Особенности обработки результатов лабораторий для оценки их качества при-
ведены в табл, 2.8.
Таблица 2-8. Особенности обработки результатов количественных исследований в разных раз-
делах ФСВОК (ЦЗ — целевое значение, s — стандартное отклонение)
Раздел ФСВОК Вид распределения результатов С"особ установления целевого значения (ЦЗ) Способ расчета диапазона допустимых значений
Биохимия крови Нормальное или логнормальное Метод-зависимое среднее участников По установленным группой экс- пертов фиксированным значениям
Электрофорез белков сыворотки крови Нормальное или логнормальное Метод-заеисимое среднее участников По установленным группой экс- пертов фиксированным значениям
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 81
Окончание табл. 2-8
Раздел ФСВОК Вид распределения результатов Способ установления целевого значения (ЦЗ) Способ расчета диапазона допустимых значений
Липиды и аполипо- протеины Нормальное или логнормальное Метод-зависимое среднее участников l|3±1,64s
Анализ мочи Нормальное или логнормальное Метод-зависимое среднее участников ЦЗ+1,64s
Гемоглобин Нормальное Метод-зависимое среднее участников Ц3±1,64з
Гликонизированный гемоглобин Логнормальное Метод-зависимое среднее участников Ц3±1,64з
Газы крови Нормальное Метод-зависимое среднее участников ЦЗ+1,648
Гемоцитометрия Нормальное или логнормальное Метод-зависимое среднее участников ЦЗ+1,64s
Глюкоза Нормальное Значение, рассчитанное по навеске чистого вещества По установленным группой экс- пертов фиксированным значе- ниям
Коагулология Логнормальное Метод-зависимое среднее участников По установленным группой экс- пертов фиксированным значе- ниям
Гормоны и витамины Нормальное или логнормальное Метод-зависимое среднее участников ЦЗ+1,64s
Онкомаркеры Нормальное или логнормальное Метод-зависимое среднее участников U3±1,64s
Неонатальный скри- нинг Нормальное или логнормальное Среднее всех участ- ников ЦЗ+1,64s
Пренатальный Нормальное или логнормальное Метод-зависимое среднее участников Ц3±1,64з
Кардиомаркеры Нормальное Паспортное значение или среднее участников Паспортный диапазон или Ц3±1,64s
Специфические белки Нормальное Паспортное значение или среднее участников Паспортный диапазон или ЦЗ+1,648
Лейкоцитарная фор- мула Полинормальное Значения, полученные экспертами ЦЗ+1,96
Экспертная оценка качества определения лекарственной чувствительности
микобактерий туберкулеза методом абсолютных концентраций
Лаборатория представляет 20 выделенных ею культур микобактерий туберку-
леза на среде Левенштейна-Иенсена и результаты определения их чувствитель-
ности к изониазиду, рифампицину, стрептомицину и этамбутолу методом абсо-
лютных концентраций. Культуры повторно исследуют в экспертных лабораториях
ФСВОК, на основании полученных результатов делают заключение о качестве
исследования лекарственной чувствительности в испытуемой лаборатории.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ СОПОСТАВИМОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Непременным условием обеспечения единства результатов измерений в кли-
нической диагностике является доступность полноценной эталонной базы для
всех клинико-диагностических лабораторий страны. В России, как и в других
странах, для лабораторных исследований такой базы пока не создано, поэтому
обеспечить единство измерений для всех лабораторных показателей на практике
82 ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
не представляется возможным. Тем не менее, даже в отсутствие необходимого
метрологического обеспечения лабораторных измерений, в КДЛ имеется возмож-
ность получения объективных и сопоставимых результатов за счет внедрения в
практику стандартизованных методик, а также внутрилабораторного контроля
качества (ВКК) и внешней оценки качества (ВОК) клинических лабораторных
исследований.
Программы ВКК и ВОК имеют существенные различия в методологии и целях.
При оценке и контроле аналитического качества они друг друга не заменяют, а
дополняют.
В методологии любой программы ВКК предполагается, что лабораторная мето-
дика изначально имеет коэффициент вариации CV и смещение В в пределах допу-
ска, что, таким образом, является гарантией получения правильных результатов.
Пределы допустимых значений CV и В декларируются на основе опыта исследова-
ний биологических вариаций лабораторных показателей, вариаций аналитическо-
го процесса лабораторных исследований и характеристик изделий медицинского
назначения (включая приборы, реактивы, вспомогательные технологии и др.).
Пока CV и смещение В сохраняют свои изначальные значения в течение контроли-
руемого периода, нет оснований считать получаемые результаты неправильными.
Поэтому основной целью любого ВКК является именно контроль во времени над
стабильностью этих двух аналитических характеристик для каждого количествен-
ного лабораторного теста.
Целью любой программы ВОК является предоставление возможности КДЛ
проверить то, что лабораторная мегодика действительно имеет значение смеще-
ния В в пределах допуска. Именно поэтому необходимо регулярное участие КДЛ
в программах ВОК. Если результаты исследования лабораторией образцов кон-
трольного материала находятся в пределах контрольных границ, установленных в
данной программе ВОК на базе среднегруппового значения аналогичных результа-
тов всех лабораторий-участников, то считается, что смещение В данной методики
находится в пределах допуска. Чем стабильней будут располагаться результаты
исследований лабораторией контрольных материалов относительно среднего
показателя группы участников, тем более сопоставимыми будут результаты иссле-
дований этой же КДЛ проб пациентов в динамике. Чем уже будет распределение
контрольных результатов в группе лабораторий — участников данной программы
ВОК, тем выше будет степень сопоставимости результатов исследования проб
пациентов между лабораториями.
Методология контроля аналитического качества в КДЛ России регламенти-
руется ГОСТ Р 53133.2-2008. ГОСТ разработан для нормативного обеспечения
повседневных процедур ВКК, направленных на выявление недопустимых случай-
ных и систематических погрешностей на аналитическом этапе клинических лабо-
раторных исследований, выполняемых количественными методами с помощью
контрольных материалов. Стандарт исходит из того, что КДЛ без использования
контрольных материалов не может обеспечить аналитическое качество результа-
тов и, соответственно, их достоверность.
Из ГОСТ следует, что ВКК обязателен в отношении всех видов количественных
исследований, для которых доступны контрольные материалы с аттестованными
значениями. Положения стандарта требуют, чтобы уровни исследуемых компо-
нентов в контрольном материале соответствовали значениям показателей в нор-
мальном и патологическом диапазонах и для повышенных, и для пониженных
значений. Следовательно, при ведении ВКК для количественного лабораторного
показателя должны обязательно использоваться контрольные материалы и с
нормальными, и с патологическими значениями. Для каждого такого контроль-
ного материала лаборатория должна проводить установочную серию измерений с
целью определения собственных среднеарифметических значений и значений CV.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 83
В соответствии с общемировой практикой, ВКК должен обеспечивать контроль
аналитического качества результатов лабораторных исследований и в нормаль-
ном, и в патологическом диапазонах. Кроме того, стандарт устанавливает, что
контрольные материалы с нормальными и патологическими значениями должны
исследоваться так же, как и пробы пациентов, в одних и тех же аналитических
сериях.
Особо следует отметить, что ГОСТ запрещает использовать контрольный
материал одновременно и в качестве калибровочного, и в качестве контроль-
ного для одной и той же методики. Стандарт допускает, что для одного и того
же лабораторного показателя в паспорте на контрольный материал может быть
указано несколько значений, соответствующих разным методам измерения или
разным аналитическим системам. ГОСТ также устанавливает, что аттестован-
ное значение контрольного материала не предназначено для использования в
качестве среднеарифметического значения при построении контрольной карты.
Среднеарифметическое значение и CV для построения контрольных карт измери-
тельной методики получают в результате проведения установочной серии измере-
ний контрольного материала.
Оперативный контроль качества с использованием контрольного материала
должен выполняться в течение достаточно длительного времени с использова-
нием одного и того же контрольного материала, т.е. с использованием образцов
из одного и того же лота. Для биохимических исследований ГОСТ рекомендует
использовать один тот же контрольный материал на протяжении не менее 200
серий, а для гематологических исследований - на протяжении не менее 40 серий.
В таких условиях существенно возрастает актуальность внедрения в КДЛ средств
автоматизации ведения ВКК - компьютерных программ.
Компания «Аналитика» еще в 1991 году разработала первый в России
| ^омцылтеоньти продут г для ВКК ' ~ трщ дем му На протяжении 20 Л*”
пруирймма мШернизи^п^сстасъв е требованиями времени (нор-
мативных документов). Сегодня “QC“ позволяет проводить автоматический
—«ли.- качества наборо-ирных чсследованийв
^твётствш чтМх>ва««чми пзсТ Р 83133 2 200^ По«™ ?,0 пет .Аналитов»*
является поставщиком высококачественных контрольных материалов для ВКК
(биохимия, гематология, коагулологйя и др.) и представляет в России такие
Зи^честны марки какНншап ДтВакст.Medica tcoag и др. Сртоудникт! компа-
ний I отовы казат бсаврзме злйую помощь специалистам КДЛ в налаживании
процессов ВКК' Л соответствий с действующими стандартами
Дляконтактов:
ЗАО «Аналитика». 129343, Москва, пр, Серебрякова, д. 2, к, 1, а/я 93
:Тел. (495) 737 0363, факс 737 0365. e-roail info@analytka,ru. # w.analvnca.ru
$есйлатная‘ телефонная линия для койсудртадйй — (800) 2001989
Глава 3
Высокотехнологичные
лабораторные исследования
ЛАБОРАТОРНЫЕ ИНФОРМАЦИОННЫЕ СИСТЕМЫ
Современная клинико-диагностическая лаборатория (КДЛ) —
сложная производственная система, в которой реализуются
сотни технологических процессов. Использование лабораторных
информационных систем (ЛИС) в целях создания современной
технологии управления КДЛ, гарантирующей высокое качество
результатов лабораторных исследований при минимальных затра-
тах, — единственный конструктивный путь и один из ключевых
инструментов, позволяющих достичь поставленной цели. ЛИС
предназначены для комплексной автоматизации деятельности
КДЛ. поэтому их называют системами управления лабораторной
информацией. Управление современной КДЛ предусматривает
деятельность но организации непосредственно технологического
процесса производства лабораторных анализов и целого ком-
плекса других процессов, таких как материальное обеспечение,
экономическая и клиническая эффективность. ЛИС позволяют
не только решать многочисленные задачи ввода и хранения
лабораторных данных, но и на базе новейших информационных
технологий интегрироваться с другими системами автоматизации
для участия в решении задач всего лечебно-профилактического
учреждения.
ЛИС состоит из технических средств (центрального процессора,
устройств ввода-вывода, запоминающих устройств, интерфейсов,
автоанализаторов) и программного обеспечения (компьютерных
программных средств, обеспечивающих работу технических средств
и обработку информации).
В функции ЛИС входят:
• регистрация доставленного в лабораторию биоматериала и
заявок на его исследования, их распределение по частным тех-
нологическим процессам выполнения анализов, регистрация и
оформление результатов исследований, оперативный и ретро-
спективный анализ деятельности лаборатории;
• автоматизация выполнения исследований, включая ввод и
обработку данных с автоанализаторов, составление отчетов о
загрузке оборудования;
• контроль качества лабораторных исследований, оперативное
выявление и исправление ошибок, оценка точности и вослро-
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 85
изводимости аналитических результатов, их статистическая обработка и при-
нятие решения по этим данным;
• анализ и выдача результатов исследований;
• составление различных статистических отчетов;
• предоставление информации для принятия управленческих решений по
повышению качества результатов анализов;
• учет поступления и использования реактивов, расходного имущества.
Одной из основных функций ЛИС является обеспечение специалистов лабо-
ратории информацией об исследуемой пробе (данные о пациенте, время взятия
материала, перечень исследований, которые нужно выполнить, диагноз, лечащий
врач, специалист, проводивший взятие биоматериала) на всех этапах единого
технологического процесса производства анализов. Потоки лабораторной инфор-
мации при традиционном лабораторном исследовании должны идти практически
параллельно с движением пробы по различным технологическим процессам и
операциям производства анализов.
Второе направление информатизации деятельности лаборатории — решение
проблемы взаимодействия лабораторий с клиническими отделениями стационара
(поликлиники) на базе единой компьютерной информационной системы учрежде-
ния — включает автоматизацию процессов оформления заявок на лабораторные
исследования, составления списков пациентов для взятия биоматериала, а также
передачу результатов анализов в отделения. Кроме того, единая информационная
система учреждения должна иметь не только базу справочных данных (инструк-
ции для взятия биоматериала, информацию по оценке результатов анализов,
перечень исследований, выполняемых лабораторией, и т.д.), но и доступ к другим
информационным системам справочного или обучающего характера (например,
Интернет). В рамках этого направления решаются следующие задачи;
• составление заявок на лабораторные исследования с терминалов в клини-
ческих отделениях (рабочее место врача-клинициста) и выдача результатов
анализов из ЛИС на эти терминалы;
• составление списка пациентов, заявок на анализы и их распечатка на терми-
налах рабочих станций процедурной медицинской сестры или лаборанта;
• маркировка взятого биоматериала;
• предоставление информации о пациенте, заявке на анализы, о способе мар-
кировки биоматериала в ЛИС;
• создание банка данных с результатами лабораторных исследований, доступ-
ного лечащим врачам для оперативного пользования;
• автоматизированная поддержка врачебных решений: предоставление диа-
гностических карт обследования пациентов, схем назначений анализов,
данных о диагностической чувствительности и специфичности тестов, алго-
ритмов оценки результатов и т.д.
Главной целью информатизации этого направления является уменьшение коли-
чества необоснованных назначений исследований, сокращение времени получе-
ния результатов анализов, более аргументированная интерпретация результатов
и контроль их использования для оказания качественной медицинской помощи
пациенту. В целом лабораторные информационные системы, которые предна-
значены для комплексной автоматизации деятельности КДЛ, позволяют достичь
следующих преимуществ:
• оптимизации и упрощения рабочих процессов лаборатории;
• оптимизации документооборота лаборатории;
• максимально эффективного использования рабочего времени сотрудников
лаборатории;
• максимально эффективного использования технической базы лаборатории
(анализаторов);
86 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
• гарантирования конфиденциальности информации о результатах анализов
пациентов;
• возможности эффективного и легкого масштабирования лаборатории как по
спектру выполняемых исследований, так и по потоку проб без потери каче-
ства;
• улучшения и постоянного контроля качества выполняемых исследований;
• упрощения ведения коммерческой деятельности лаборатории (приема и
учета частных пациентов, введения индивидуальных скидок пациентам,
работы с корпоративными заказчиками).
• простоты интеграции удаленных процедурных кабинетов в единую информа-
ционную систему;
• возможности удаленного доступа лечащих врачей к информации о лабора-
торных анализах пациентов;
• возможности интеграции с внешними системами для получения заявок
(электронной историей болезни, общебольничной системой);
• возможности интеграции с внешними системами для автоматической выгруз-
ки отчетности (системами ОМС, ДМС);
• получения оперативной и ретроспективной информации о деятельности
лаборатории (большом количестве аналитических отчетов и средств для их
визуального представления);
» ведения и контроля использования ресурсов (расходных материалов, реакти-
вов и т.п.), потребляемых лабораторией:
• подсчета себестоимости услуг, выполняемых лабораторией;
• предоставления данных для анализа экономической эффективности деятель-
ности лаборатории.
Ориентированная на технологию ЛИС оказывает благоприятное воздействие
практически на все аспекты технологического процесса производства лаборатор-
ных анализов; устраняется множество рутинных операций, возрастает эффектив-
ность использования современных лабораторных анализаторов, упрощается доку-
ментооборот, обеспечивается принципиально новый уровень информационного
взаимодействия с заказчиками лабораторных исследований, позволяет управлять
качеством результатов лабораторных анализов. Потоки информации на раз-
личных этапах технологического процесса производства лабораторных анализов
представлены на рис. 3-1.
В настоящее время КДЛ (особенно централизованные) все больше превра-
щаются в самостоятельные предприятия. Соответственно КДЛ должны демон-
стрировать свою экономическую эффективность. Б связи с этим ЛИС становятся
мощным инструментом КДЛ, обеспечивая конкурентоспособное преимущество
перед другими лабораториями, экономя время и деньги. ЛИС коренным образом
улучшают взаимодействие КДЛ и клиентов, как физических, так и юридических
лиц. В отношении физических лиц первая и главная задача КДЛ — качественное
обслуживание пациентов. Пациентами процесс обслуживания оценивается по
наличию очереди в процедурный кабинет, качеству взятия проб крови, по тому,
насколько быстро и четко организован прием и насколько удобно для него полу-
чение результата. Эти запросы пациентов должна помочь решить современная
ЛИС. Главной целью информационной поддержки взаимодействия с медицин-
скими учреждениями является обеспечение максимально быстрого и комфорт-
ного для клиента процесса приема заявок на исследования и выдачи результатов.
Ускорение приема заявок достигается за счет тесной интеграции составляющих
процесса приема заказа: регистрации заявок на исследования, забора проб био-
материала.
Изменения условий деятельности КДЛ требуют создания четко отлаженной
системы учета оказанных лабораторией медицинских услуг с выдачей результатов
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
87
Технологическая
операция
подготовки
пациента
Технологическая
операция взятия
и сбора биоматериала
Технологическая
операция доставки
биоматериала
Процедурная
медицинская сестра
или лаборант
Механизм получения
заявки на исследование
Клиницист
(составление заявки)
Единая
компьютерная
система ЛПУ,
обеспечи-
вающая
связь между
отделениями
и ЛИС,
где заявки,
взятые пробы
и результаты
собирают,
регистрируют,
сортируют,
разделяют,
проверяют,
группируют,
приводят
в порядок,
доставляют,
сортируют
вновь,
комбинируют,
сообщают
и т.д.
Результаты
исследований
Компьютерная история
болезни
ЛИС
л
Рис. 3-1. Потоки информации на различных этапах технологического процесса производства
лабораторных анализов (схема).
в виде журналов или с периодической передачей сведений в страховую систему
медучреждения либо непосредственно в страховую компанию в электронном виде.
Внутри самой лаборатории возникла необходимость учитывать услуги в денеж-
ном выражении с периодическим выставлением счетов страховым компаниям и
корпоративным клиентам. Медицинские учреждения (особенно коммерческие)
предъявляют достаточно жесткие требования к исполнителю лабораторных иссле-
дований. Наиболее важные из них следующие.
88 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
• Гибкость механизма ценообразования и условий оплаты услуг. Вследствие
большого разнообразия организационных форм заказчиков лабораторных
исследований возникает соответствующее разнообразие вариантов цено-
образования и условий платежа. Ведение счетов корпоративных клиентов с
учетом индивидуальных вариантов взаимодействия по мере роста количе-
ства клиентов оборачивается серьезной задачей финансового учета.
• Четкое регламентирование обслуживания: соблюдение сроков выполнения
исследований, эффективность технологии приема заказов и передачи резуль-
татов. Пиковые нагрузки при обработке заказов могут в десятки раз превы-
шать среднестатистические. Во избежание нарушений регламента и решения
спорных вопросов необходимо обеспечить учет и контроль длительности
каждого этапа прохождения заказа от забора материала и транспортировки
пробы до получения результата заказчиком.
• «Прозрачность» деятельности лаборатории для корпоративного клиента
(медицинских учреждений). Клиент должен иметь возможность оперативно
получить сведения по широкому кругу вопросов: текущим ценам, детализа-
ции счетов, стадии прохождения конкретного заказа и т.д. В информацион-
ном взаимодействии с медицинскими учреждениями намечается переход от
реагирования на запросы клиентов по телефону к предоставлению им досту-
па непосредственно к информационным ресурсам лаборатории.
С учетом различного уровня информационного обеспечения медицинских
учреждений современная ЛИС должна поддерживать два способа взаимодействия
с ними: традиционный прием пакета заказов и выдачу результатов в Ьумажном
виде, обмен информацией в электронном виде.
Для регистрации заказов, поступающих в виде бланков-заявок, ЛИС должна
иметь механизмы пакетной и многостадийной регистрации, которые позволяют
очень быстро провести первичную регистрацию заказов, достаточную для переда-
чи большого количества проб на исследования. Дальнейшую регистрацию заказов
можно выполнять параллельно с исследованиями. Данный механизм позволяет
одному регистратору передавать на исследования несколько тысяч проб в час.
Обмен данными с медицинскими учреждениями в электронном виде может
осуществляться способом, наиболее подходящим конкретному клиенту: на маг-
нитных носителях, по электронной почте и через Интернет. Для первых двух
случаев клиенту необходимо установить специальное программное обеспечение,
позволяющее самостоятельно регистрировать заказы и передавать их в виде фай-
лов вместе с пробами на магнитных носителях или по электронной почте, затем
таким же образом получать файлы с результатами и выводить их на печать. При
взаимодействии через Интернет клиент регистрирует заказы и просматривает
результаты непосредственно на сайте лаборатории с помощью веб-интерфейса.
ЛИС должна обеспечивать учет оказанных лабораторией медицинских услуг с
выдачей результатов в виде журналов или с периодической передачей сведений в
страховую систему медучреждения либо непосредственно в страховую компанию
в электронном виде. По результатам работы с медицинскими учреждениями за
отчетный период ЛИС должна выдавать полный комплект документов, необходи-
мых для расчета по договорам.
На современном этапе КДЛ из технологического подразделения в составе пред-
приятия становится самостоятельной структурой или отдельным предприятием в
составе ЛПУ. В связи с этим экономическая эффективность становится важнейшей
составляющей функционирования лаборатории. Сам факт существования КДЛ
определяется экономическим расчетом. Новая функция КДЛ — экономически
целесообразное существование на рынке лабораторных услуг. С этой точки зре ния
ЛИС обеспечивает получение всех необходимых данных для эффективного управ-
ления деятельностью КДЛ, включая:
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
89
• определение норм расходования реактивов, калибраторов, контрольных
материалов и другого расходного материала для каждого вида анализов, а
также себестоимость анализов;
• ежедневный учет количества выполненных иссле дований по тестам;
• формирование помесячных заявок на реактивы и расходные материалы;
• получение, учет и контроль расходования реактивов и расходных материа-
лов;
• планирование и контроль бюджетов;
• оптимизацию расходов в целях повышения рентабельности деятельности
лаборатории;
• формирование данных для принятия управленческих решений.
Реальное решение перечисленных задач возможно только при использовании
ЛИС. По своей экономической сущности ЛИС обеспечивает создание прозрачной
модели производства лабораторных исследований в КДЛ для осуществления опе-
ративного контроля над формированием переменных затрат, к которым в лабо-
ратории относятся наборы реактивов, калибраторы, контрольные и расходные
материалы (кюветы, моющий раствор, чистящий раствор, разводящий раствор
и т.д.). Именно уровнем развития информационных технологий в КДЛ опреде-
ляются в настоящее время эффективность обеспечения реактивами, расходными
материалами, бесперебойность снабжения, учета расходования материалов, необ-
ходимых для производства анализов, и соответственно себестоимость анализов и
экономический успех лаборатории.
Современная ЛИС в состоянии обеспечить как безопасность баз данных и поль-
зовательских функций, так и конфиденциальность данных клиента и результатов
исследований. Каждый пользователь ЛИС должен иметь строго определенные
полномочия по работе только с определенными группами данных в ЛИС — это
важнейшее требования по безопасности. Б итоге пользователь имеет возможность
выполнять разрешенные ему функции только с теми данными, к которым он допу-
щен.
Информационные компьютерные технологии находят наибольшее примене-
ние в первую очередь там, где имеется большой объем выполняемой рутинной
работы. КДЛ ежедневно выполняют огромное количество различных видов
исследований. Объем обрабатываемой при этом информации достаточно велик.
Типичная средняя КДЛ насчитывает 15 пользователей (специалистов лаборато-
рии), исследующих примерно 10 000 проб в год и выполняющих по каждой пробе в
среднем 5 тестов с определением 4 параметров в каждом. В крупных лабораториях
одновременно может быть задействовано до 100 пользователей и более, поэтому
информатизация деятельности КДЛ приносит более ощутимую практическую
выгоду. Для КДЛ современная ЛИС является таким же незаменимым производ-
ственным инструментом для выполнения лабораторных анализов, как и автома-
тические анализаторы.
МЕТОДЫ ВИДЕОЦИФРОВОЙ РЕГИСТРАЦИИ
В регистрации результатов биохимических, иммунохимических и других лабо-
раторных исследований доминируют фото- и рефтектометрические системы, что
обусловлено значительным парком фотометрических приборов, отработанными
методическими схемами их применения и производственными мощностями для
производства этого оборудования.
Однако одной из очевидных тенденций модернизации лабораторной диагно-
стики является все более широкое внедрение компьютерных и информационных
технологий, в частности замена традиционных систем регистрации на комплексы,
базирующиеся на подходах видеоцифровой регистрации (ВЦР). Масштабному
90
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
внедрению видеоцифровых систем способствуют многие факторы, среди которых
постоянно улучшающиеся технические характеристики приборов получения изо-
бражений — видеокамер и сканеров, их экономическая доступность, развитие и
массовое использование информационных и коммуникационных технологий.
Помимо факторов, связанных с общими достижениями научно-технического
прогресса, существуют и конкретные аналитические преимущества ВЦР перед тра-
диционной фотометрией, которые позволяют получать дополнительную инфор-
мацию об изучаемых объектах, совершенствовать имеющиеся и создавать новые
лабораторные методики.
Эти преимущества в общем виде проиллюстрированы на рис. 3-2, где представ-
лена схема, сопоставляющая в общем виде возможности технологии видеоцифро-
вой регистрации и обычных фотометрических методов.
Системы ВЦР дают возможность получать изображение образца, представляю-
щее собой совокупность количественно измеряемых сигналов, отвечающих боль-
шому количеству точек — пикселей аналитического объекта (например, лунки
микропланшета или иммунохроматографической тест-полоски). При ВЦР на один
объект приходится большое количество (от сотен до нескольких тысяч) регистри-
руемых цифровых характеристик, которое определяется пространственным раз-
решением соответствующего устройства. В случае однородных объектов при ВЦР
эти характеристики усредняются (обычно берется не менее тысячи значений) и
вычисляется оптическая плотность или коэффициент светоотражения, как и при
обычной фотометрии.
Однородный объект
Неоднородный объект
Фотометрия
ВЦР
Фотометрия
ВЦР
Источник
Источник
света
света
Детектор
ПЗС-линейка,
ПЗС-матрица
Детектор
Одно
числовое
значение
на объект
OD
Количество
численных значений
на объект равно
количеству пикселей
(-22000/лунка)
Изображение
ПЗС-линейка,
ПЗС-матрица
Количество
численных значений
на объект равно
количеству пикселей
(-22000/лунка)
Изображение
Рис. 3-2. Видеоцифровая регистрация и фотометрия применительно к однородным и неодно-
родным объектам.
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
91
Для неоднородных объектов ВЦР позволяет численно охарактеризовать полу-
чаемую картину по степени дисперсии (неоднородности) или другим параметрам,
отражающим интенсивность прохождения аналитической реакции с последующим
представлением результатов в зависимости от поставленных задач. Таким образом,
возможность анализа изображения объекта позволяет либо установить наличие и
исключить влияние артефактов — неоднородностей в однородном образце, либо,
если неоднородность несет диагностически значимую информацию, получить ее
аналитические характеристики, выраженные в численном виде.
Помимо этого, ВЦР обеспечивает сохранение первичного изображения, фик-
сирующего полную информацию об объекте в конкретный, определяемый лабо-
раторной методикой момент времени, которое может быть названо первичным
документом теста (ПДТ), что имеет самостоятельную ценность. Такое докумен-
тирование и архивирование результатов обеспечивают возможность ретроспек-
тивного контроля выполненного исследования, что повышает ответственность
персонала, может придать юридический статус исследованию и ставит барьер на
пути ошибок и фальсификаций. Возможность возвращаться к ПДТ через некото-
рое время позволяет отслеживать динамику изменения лабораторных параметров,
консультироваться при неоднозначных результатах, оценивать эффективность
лечения, сравнивая непосредственно результаты. Немаловажное значение имеет
и возможность передачи первичной информации (ПДТ) через Интернет, в том
числе и при проведении анализов у постели больного и в полевых условиях, когда
в неясных случаях соответствующими специалистами выносится компетентное
заключение.
Системы получения изображений аналитических объектов
В качестве аппаратной части систем ВЦР могут использоваться два типа
устройств — цифровые видеокамеры и сканеры. Каждое из этих устройств имеет
свои достоинства и недостатки.
Видеоцифровые камеры компактны, позволяют получать качественные изобра-
жения, обеспечивают высокую скорость съемки, дают возможность конструировать
малогабаритные мобильные с автономным питанием и более универсальные, чем
сканеры, приборы. К недостаткам систем с видеокамерами относятся небольшое
поле зрения и сложность создания равномерного освещения исследуемого объекта.
Сканеры являются готовым промышленным изделием, доступны по ценам,
дают изображения высокого разрешения, обладают хорошей цветопередачей.
Вследствие больших размеров и требований к электропитанию их используют в
основном только как стационарное оборудование. Существенным достоинством
сканерных систем является возможность работы с широко распространенными
лабораторными тестами, проводимыми в 96-луночных планшетах.
На рис. 3-3 показаны варианты адаптированных к различным аналитическим
объектам видеоцифровых систем получения изображения. Система на основе
видеоцифровых камер «Рефлеком» (а) позволяет регистрировать результаты
иммунохроматографических тестов (ИХ-тестов) в режиме отражения. Система
«Рефлеком-Микро» (в) предназначена для работы с ИХ-тестами в полевых усло-
виях. Система «Эксперт-Лаб» (6) создана на основе промышленного сканера.
ПРИНЦИПЫ ПОСТРОЕНИЯ ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ
СИСТЕМ ВЦР
Программное обеспечение (ПрО) для систем ВЦР разрабатывается на основе
универсальной схемы построения интерфейсов вне зависимости от типа устрой-
ства получения изображения. Алгоритмы обработки информации создаются в
соответствии с характеристиками конечных результатов (изображений аналити-
92
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Рис. 3-3. Модификации регистрирующих видеоцифровых устройств на основе видеоцифровой
камеры: а — «Рефлеком»; б — многофункциональная лабораторная система «Эксперт-Лаб»;
в — анализатор «Рефлеком-Микро».
ческих объектов) для конкретных типов реакций с выдачей результатов с уче-
том специфических требований практических лабораторий. На основе единых
принципов построения ПрО удается создать многофункциональные устройства -
программно-аппаратные комплексы, способные обеспечивать достоверную и объ-
ективную регистрацию результатов различных лабораторных исследований.
В практике лабораторной диагностики можно выделить два типа аналитических
объектов и исследований, требующих различных подходов при регистрации про-
хождения реакции. Это исследования, проводимые на гест-полосках (ИХ-тесты,
тесты «сухой химии»), и исследования, проводимые в матричном формате (имму-
нохимические тесты в 96-луночных микропланшетах и планшетах других форма-
тов, исследования на основе микроматриц — микрочипов).
При использовании ИХ-тест-полосок результатом исследования является появ-
ление нескольких линий: контрольной, обозначающей пригодность теста, и тесто-
вых, обозначающих наличие или отсутствие определяемого аналита. При при-
менении полосок «сухой химии» в ходе исследования регистрируется изменение
цвета расположенных на тест-полоске реагентных зон.
Для ИХ-тестов и полосок «сухой химии» аналитическими зонами (зонами
интереса), в которых необходима оценка интенсивности реакций с помощью ПрО,
являются линии и окрашенные зоны, которые несут значимую информацию.
На рис. З-За показано выделение аналитически значимой зоны ИХ-полоски и
представление в рабочем окне этой программы гистограмм интенсивности линий
на полоске после проведения теста. Интегральная интенсивность линий исполь-
зуется для автоматического определения положительных или отрицательных
результатов теста. ПрО для ИХ-тестов предусматривает сохранение всей анали-
тической информации в цифровом виде в памяти компьютера, включая исходное
изображение аналитической зоны тест-полосок, которое в данном случае является
ПДТ. ПрО является универсальным и может быть адаптировано к любым иммуно-
хроматографическим полоскам.
Тесты «сухой химии» для биохимического анализа крови и мочи широко
используются в клинической лабораторной диагностике и являются традицион-
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 93
ным объектом регистрирующих приборов на основе обычной рефлектометрии.
Для этих объектов ВЦР обладает рядом преимуществ. Каждая зона интереса и
изображение каждой полоски могут обрабатываться одновременно. Это дает систе-
мам ВЦР преимущества перед традиционными рефлектометрическими методами,
такие как сохранение первичного изображения тест-полоски (ПДТ); возможность
работать с произвольным количеством независимых каналов регистрации, т.е.
анализировать несколько полосок одновременно; применимость этого подхода к
различным типам тестов в режиме конечной точки и кинетическом режиме. Таким
образом, гибкое ПрО для полосок «сухой химии» обеспечивает объективную
интерпретацию результатов и получение информации в виде концентраций соот-
ветствующих аналитов.
Для исследований в матричном формате (аналитические объекты — микро -
планшеты или матрицы точек на мембране, стекле и других планарных носителях)
зонами интереса являются отдельные лунки, или элементы, матрицы. Получение
изображений 96-луночных планшетов из-за их значительных размеров и трех-
мерной (неплоскостной) геометрии возможно с помощью сканерной системы
«Экслерт-Лаб». После получения изображения для каждой из лунок микро-
планшета или точек матрицы с помощью разработанных алгоритмов можно в
численной форме определить или оптическую плотность содержимого лунки, или
интенсивность окрашивания индивидуального пятна. По этим численным значе-
ниям можно определить концентрации соответствующих аналитов и представить
их в любом необходимом виде.
Более сложные математические процедуры необходимы в тех случаях, когда в
результате иммунологических реакций возникают неоднородные объекты. Такие
реакции, как пассивная гемагглютинация, латекс-агглютинация, агглютинация
эритроцитов, приводят к формированию в лунках осадков, характерных для
каждого типа исследования, по наличию или отсутствию которых и определяется
положительный или отрицательный результат реакции. Для каждого варианта
таких исследований используется свой алгоритм обработки изображения.
СКАНЕРНАЯ ВИДЕОЦИФРОВАЯ СИСТЕМА ДЛЯ 96-ЛУНОЧНОГО ПЛАНШЕТА
Для оценки иммунохимических реакций (реакции «антиген-антитело» или
более широко — реакции специфического связывания) разработаны и использу-
ются специализированные аналитические технологии, которые условно можно
разделить на три группы.
1. Прямые (непосредственные) методы определения реакции «антиген-
антитело». Образующийся при этом комплекс «антиген-антитело» иден-
тифицируется визуально либо с помощью простых оптических устройств.
К таким методам относятся преципитация в растворе (в том числе реакции
турбидиметрии и нефелометрии), в геле, на полимерной пленке, агглюти-
нация бактериальных клеток, простейших, прямая реакция агглютинации
эритроцитов антителами, вирусами.
2. Реакции агглютинации частиц, с поверхностью которых связаны антигены
или антитела. К этим методам относятся реакции прямой гемагглютинации
(РИГА) и непрямой гемагглютинации (РИГА), латекс-агглютинации (ЛА),
коагглютинации, агглютинации частиц бентонита, желатиновых капсул,
частиц сефарозы и др. Метод регистрации чаще всего визуальный.
3. Индикаторные методы, основанные на использовании различного рода меток
для выявления реакции «антиген-антитело». Наиболее распространены имму-
ноферментный, иммунофлюоресцентный, радиоиммунологический анализы.
Тип регистрирующего устройства определяется используемой меткой.
Из этих методов наиболее востребованы в медицинской лабораторной практике
иммуноферментный анализ, латекс- и гемагглютинация, турбидиметрия и нефело-
94 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
метрия. Во всех этих технологиях используются планшеты для микротитрования.
ВЦР позволяет регистрировать результаты этих исследований с использованием
одной многофункциональной лабораторной сканерной системы. Система пози-
ционирования обеспечивает строгое пространственное расположение планшета и
жестко фиксирует положение зон интереса после настройки. Все настройки скане-
ра, соответствующие геометрическим характеристикам объекта и другим параме-
трам анализа, устанавливаются однократно и сохраняются в памяти компьютера
для данного вида анализа.
Сканерная система «Эксперт-Лаб» является универсальным устройством
и может обеспечивать документирование, объективизацию и интерпретацию
результатов латекс-агглютинационных, гемагглютинационных, изосерологиче-
ских исследований, а также применяться в качестве иммуноферментного ридера.
ПО для всех этих методов построено по единому принципу и обеспечивает:
• получение и архивирование первичного изображения (ПДТ);
• различные алгоритмы визуализации полученных данных программными
методами — увеличение исследуемого изображения (инструмент «лупа»),
контрастирование, инвертирование (обращение цветов для лучшей иденти-
фикации агглютинации), сопоставление увеличенных изображений положи-
тельных и отрицательных образцов;
• объективизацию результатов за счет использования программных методов
математической обработки изображения и возможность автоматической
интерпретации результатов;
• унифицированный интерфейс модульных программ, что облегчает освоение
и рутинное использование всех разнообразных возможностей системы;
• возможность подключения комплекса к ЛИС с автоматической передачей
данных согласно коду пробы пациента, что значительно снижает количество
ошибок, связанных с неправильной идентификацией образца при выдаче
результата.
Единый принцип построения рабочего интерфейса программных модулей про-
иллюстрирован на рис. 3-4 (см. цв. вклейку). Показаны варианты сохраняемых
изображений всего планшета после проведения различных типов реакций.
ПРИМЕНЕНИЕ СИСТЕМЫ ВЦР ДЛЯ ОБЪЕКТИВИЗАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ЛАТЕКС-
АГГЛЮТИНАЦИОННЫХ ТЕСТОВ
Диагностические системы на основе латекс-агглютинации широко распростра-
нены в лабораторной диагностике благодаря простоте и быстроте проведения ана-
лиза. Разработаны методы получения латексных частиц различного состава, раз-
меров, цвета и свойств, а также способы сенсибилизации латексов разнообразными
антигенами и антителами, что позволяет сконструировать практически любой
диагностикум. Биологическая инертность латекса позволяет снизить возмож-
ность перекрестных неспецифических реакций, а также обеспечивает длительную
сохранность готовых реагентов. Однако латексные тесты имеют ряд существенных
недостатков, обусловленных быстрым протеканием и нестабильностью резуль-
татов реакции во времени. Необходимость визуальной регистрации результатов
через строго определенное время, часто составляющее не более 2-3 мин, приво-
дит к субъективности оценки результатов. Эти факторы ограничивают ценность и
сужают область применения латексных тестов.
Задачи документирования результатов тестов ЛА через определенное время и
объективизации интерпретации результатов могут быть решены с привлечением
методов ВЦР. Удобным объектом постановки реакции с применением сканерной
регистрации являются крышки планшетов для титрования с нанесенными на
них конденсационными кольцами, которые представляют собой упорядоченную
матрицу из 96 микролунок. Максимальный объем такой лунки составляет 30 мкл.
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
95
Соотношение реагент/образец определяется производителем и соответствует мак-
симальной линейности системы. Именно поэтому необходимо подобрать объем
реагента, не меняя данное соотношение. Оптимальным является общий объем
20 мкл (при эквивалентном соотношении 10 мкл образца/10 мкл реагента), так как
при меньших объемах возникают трудности при пипетировании. а при больших
объемах возможна кросс-контаминация соседних лунок.
Реакцию ЛА в крышках проводят следующим образом. В лунки помещают по
10 мкл латексного реагента и образца (контрольных сывороток, цельных и раз-
веденных сывороток пациентов). Для полуколичественного определения концен-
трации аналита готовят серию двукратных разведений тестируемой сыворотки
физиологическим раствором. Концентрация определяется как самое большое
разведение тестируемой сыворотки с положительной реакцией (титр сыворотки),
умноженное на чувствительность реагента (например, 6 мг/л — для СРВ).
Тщательно перемешивают и наблюдают отсутствие или наличие агглютинации
при круговом покачивании крышки. Через заданный промежуток времени крышку
помещают в позиционер сканирующего устройства. Полученное первичное изо-
бражение всей крышки сохраняется в памяти компьютера и служит основой для
последующих цифровых операций с конкретными зонами интереса (контрастиро-
вания, увеличения, математической обработки).
Результаты расчета количества агглютинатов в образцах могут быть выражены
с помощью числа, которое тем выше, чем больше обнаруженное количество кон-
гломератов. Математический расчет и численное представление интенсивности
агглютинации дают возможность количественной оценки результата реакции
агглютинации и определения порогового значения для автоматической дискрими-
нации положительных и отрицательных образцов.
Компьютерная программа позволяет также ввести и сохранить протокол анали-
за (расположение контрольных, тестируемых образцов, их разведения и дублиро-
вания). На рис. 3-5 показан вариант заполнения протокола анализа.
4121
Рис. 3-5. Заполнение протокола анализа контрольных и калибровочных образцов, цельных проб,
дублей, разведений исследуемых сывороток пациентов.
96 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
На рис. 3-6 (см. цв. вклейку) представлены результаты цифровой обработки
изображения нескольких лунок с положительными и отрицательными образцами
сывороток при определении СРБ: контрастирование и последующее визуальное
отображение количества конгломератов (агглютинатов) в тестируемых образцах,
рассчитанное с помощью математических методов.
Информация о наличии или отсутствии агглютинации для конкретного образца
с помощью системы ВЦР фиксируется в сттюго определенное, соответствующее
инструкции время и представляется и сопоставляется многократно в различных
видах:
• сопоставление контрастированных и увеличенных изображений образцов и
контролей;
• оценка визуального представления расчетного количества конгломератов;
• численные расчетные значения интенсивности агглютинации;
• дискриминация положительных и отрицательных образцов на основе рас-
чета порогового значения.
Получение объективных цифровых характеристик интенсивности реакции
латексной агглютинации позволяет вести внутрилабораторный контроль этого
типа исследований, что принципиально невозможно при традиционной визуаль-
ной регистрации. Применяются рассчитанное целевое значение интенсивностей
в контрольных материалах и стандартный набор контрольных правил: предупре-
дительный критерий — l.,s, далее — 13с, 22s, R^, 41$, 10х. Пример контрольной карты
для СРБ показан на рис. 3-7.
—♦— Интенсивность агглютинации ——— Xcp+2SD ---- Xcp+SD
Целевое значение —— Xcp-2SD ---- Xcp-SD
Рис. 3-7. Контрольная карта определения СРБ методом латекс-аггл юти нации с ВЦР.
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 97
РЕАКЦИЯ ПАССИВНОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ С ВИДЕОЦИФРОВОЙ РЕГИСТРАЦИЕЙ
РЕЗУЛЬТАТОВ
Реакция пассивной гемагглютинации широко используется в серодиагностике,
по чувствительности этот метод сопоставим с иммуноферментным анализом. Хотя
существуют наборы РПГА различной специфичности (для определения антител к
возбудителю кори, иерсиниоза, бруцеллеза и некоторых других инфекций), одна-
ко наибольшее распространение имеют системы определения антител к Treponema
pallidum для серодиагностики сифилиса, используемые многими лабораториями
как основной тест. Эти системы, как и другие наборы РПГА, предполагают визу-
альный учет результатов, что является их существенным недостатком.
Автоматизированный учет результатов диагностики сифилитической инфек-
ции методом РПГА обеспечивает повышение диагностической специфичности и
чувствительности, позволяет исключить субъективный подход к интерпретации
результатов.
Реакция РПГА основана на регистрации формирования агрегатов сенсибилизи-
рованных эритроцитов («зонтика») в лунках круглодонного планшета при нали-
чии в сыворотке пациента специфических антител.
Программа «Эксперт-Лаб-РПГА» лабораторного комплекса позволяет осу-
ществить дискриминацию результатов по стандартной 4-крестовой шкале. На
рис. 3-8 показано соответствие внешнего вида агглютинации образца и заданного
значения шкалы (составленные по данным экспертной оценки врачей КДЛ, дан-
ным литературы и инструкции производителя тест-систем).
Исследование проводят согласно инструкции производителя эритроцитарного
диагностикума. Для получения воспроизводимых результатов необходимо учиты-
вать результаты реакции через строго заданное время инкубации (для РПГА при
определении антител к Tr. pallidum оптимально — 1ч).
Так же как и для латексных тестов, наличие численной характеристики выра-
женности агглютинации позволяет определить воспроизводимость тестирования
и на основании рассчитанных целевых значений проводить внутрилабораторный
контроль качества.
Существуют разновидности реакции пассивной агглютинации, где вместо эри-
троцитов используются искусственно созданные желатиновые частицы с сорбиро-
ванным на них соответствующим антигеном/антителом.
ПО «Эксперт-Лаб-РПГА» адаптировано к серии тест-систем на основе этого
принципа с разработкой варианта программного обеспечения «Эксперт-Лаб
Serodia». На рис. 3-9 (см. цв. вклейку) представлены положительные, сомнитель-
ные и отрицательные результаты реакции агглютинации желатиновых частиц.
Рис. 3-8. Окно соответствия вариантов исходов реакции РПГА 4-крестовой шкале (по экспертной
оценке врачей КДЛ).
98 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Предложенный алгоритм оценки интенсивности гемагглютинации (образова-
ние «зонтика») может быть использован и для регистрации результатов других
лабораторных методов, где в качестве индикаторных частиц используют эритро-
циты, например реакции торможения агглютинации (иначе — реакции нейтрали-
зации вирусов).
МЕТОДИКИ ИЗОСЕРОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ В ФОРМАТЕ 96-ЛУН0ЧН0Г0
ПЛАНШЕТА
В случае изосерологических анализов (определения группы крови) регистри-
руется агглютинация эритроцитов крови пациента в присутствии специфических
антител, причем для каждого образца ставится несколько реакций с антителами к
групповым антигенам А и В, резус-фактору.
Изосерологические исследования остаются одной из самых консервативных
технологий в клинической лабораторной аналитике, что обусловлено их высокой
значимостью. До сих пор нет однозначного решения вопросов визуализации и
документирования этих тестов. По-прежнему самыми распространенными спо-
собами проведения этих исследований в нашей стране остаются ручные методы.
Их известно три: 1 — на плоскости, 2 — в пробирках, 3 — в планшетах для микро-
титрования,
К недостаткам агглютинации на плоскости следует отнести невозможность
определения слабых антигенов эритроцитов и низких титров гемагглютининов
в сыворотке пациента: для некоторых исследований используют пробирочный
метод и практически никогда — микропланшетную технологию. Во многом это
связано со сложностью визуальной интерпретации агглютинации в этом формате,
отсутствием специальных сканирующих устройств, более длительным временем
проведения исследования, необходимостью предварительной обработки эритро-
цитов для приготовления суспензии.
В то же время микропланшетная технология имеет следующие преимущества:
• использование малых количеств антисывороток и эритроцитов;
• проведение серийных исследований;
• сокращение времени проведения исследования за счет предварительного
внесения реагентов в плашку;
• уменьшение ошибок благодаря внедрению регистрирующих устройств.
Для регистрации результатов изосерологических исследований в круглодонных
планшетах разработана программа «Эксперт-Лаб-Изосерология». Программа
позволяет автоматически фиксировать наличие/отсутствие агглютинации при
взаимодействии тестируемых эритроцитов с цоликлонами в каждой лунке и соот-
ветственно определять группу крови для каждого пациента. Бидеоцифровая реги-
страция позволяет избежать стадии центрифугирования.
По результатам исследований оптимальным следует признать алгоритм про-
ведения изосерологических исследований по системе АВО и Rh в микропланшете с
видеоцифровой регистрацией. Описан вариант постановки, включающий типиро-
вание перекрестным методом (со стандартными эритроцитами).
• Вносят в соответствующие лунки стандартные эритроциты О, А1 и В при-
близительно по 5-10 мкл и цоликлоны анти-А, анти-В, анти-D-cynep, физ-
раствор по 150 мкл.
• Вносят соответственно по 150 мкл исследуемой сыворотки и по 5-10 мкл
исследуемой цельной крови.
• Инкубируют при комнатной температуре на шейкере в течение 5-10 мин.
Агглютинация эритроцитов с цоликлонами обычно наступает в первые
несколько минут. Но считывание следует повторить через 15-20 мин ввиду
более позднего появления агглютинации с эритроцитами, содержащими
слабые разновидности антигенов А или Б. Агглютинация сыворотки со стан-
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
99
дартными эритроцитами может наступить поздно в связи с возможностью
низкого титра содержащихся в исследуемой сыворотке агглютининов.
• Сканируют планшет.
• В случае несовпадения определения групп крови с помощью цоликлонов и
стандартных эритроцитов повторяют процедуру сканирования через 20 мин
для выявления слабых антител и антигенов.
В случае унифицированного расположения цоликлонов в планшете возмож-
на автоматическая интерпретация группы крови для конкретной пробы крови.
Используют алгоритм,, приведенный на рис. 3-10 (см. цв. вклейку). Показаны
увеличенные изображения с выбором зоны интереса в лунках при определении
различных групп крови с использованием цоликлонов в круглодонном планшете.
ПРИМЕНЕНИЕ СКАНЕРНОЙ СИСТЕМЫ ВЦР ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ
ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
Коммерчески доступный сканер может быть использован в качестве вертикаль-
ного фотометра 96-луночных микропланшетов для ИФА. Большинство используе-
мых в настоящее время тест-систем в качестве ферментной метки имеют перок-
сидазу хрена, субстрат — раствор 3,3’, 5,5'-тетраметилбензидина гидрохлорида
(ТМБ), содержащий перекись водорода. Образующиеся окрашенные продукты в
кислой среде имеют максимальное поглощение при 450 нм.
Иммуноферментные исследования проводят согласно инструкциям произ-
водителя. ПО универсально и позволяет настраивать систему регистрации и
дискриминации результатов в соответствии с любыми требованиями методик.
Обеспечиваются варианты в режимах измерений оптической плотности, дискри-
минации по уровню рассчитываемому по различным формулам, количе-
ственных измерений по калибровочной кривой.
На рис. 3-11 (см. цв. вклейку) показано окно регистрации результатов в режиме
измерений по калибровочной кривой. Программа «Эксперт-Лаб-ИФА» позво-
ляет вводить значения калибраторов, строить калибровочную кривую (могут
быть использованы различные алгоритмы: линейно-кусочный, сплайн, линей-
ная регрессия и др.) и выводить на экран значения концентраций исследуемых
веществ.
Помимо оптической плотности, сканерное изображение несет значительное
количество дополнительной информации, недоступной при фотометрировании.
При постановке ИФА возможны ошибки, связанные с неправильным заполне-
нием лунок, наличием пузырьков, случайных загрязнений, выпадением в осадок
субстрата в отдельных лунках. Для их исключения рекомендуют перед измере-
нием просмотреть ИФА-планшет. Анализ сканерного изображения позволяет по
наличию негомогенности окрашивания автоматически выявлять и маркировать
такие лунки, что дает возможность идентифицировать образцы, требующие
повторной постановки. Эта опция принципиально нереализуема для обычных
анализаторов.
Сохранение и возможность повторного анализа изображения планшета дают
возможность ретроспективного анализа неясных случаев и исправления ошибок
интерпретации результатов, что выгодно отличает систему ВЦР от традиционных
ридеров, которые после измерений сохраняют только по одной цифре — значению
оптической плотности для каждого образца.
ВЦР И МИНИАТЮРИЗАЦИЯ ДЛЯ СЕРИЙНЫХ И МУЛЬТИПЛЕКСНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
В МАТРИЧНОМ ФОРМАТЕ
Применение ВЦР открывает возможности миниатюризации тест-систем и
проведения мультианалитических исследований. Достаточно большое разре-
шение сканерной системы позволяет без труда зафиксировать наличие и оце-
1Q0 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
нить интенсивность агглютинации или прохождения других реакций в малых
объемах. Разработаны специальные 12-луночные носители с объемом лунки не
более 15 мкл, форматом матрицы аналитических зон 3x4, шагом, совпадающим с
таковым стандартных микропланшетов. Для реакции ЛА. в этих микропланшетах
используется всего по 3 мкл образца и реактива. Исследования, проводимые в
микропланшетах такого формата, с одной стороны, не требуют дополнительных
приспособлений, с другой — значительно экономят дорогостоящие реактивы.
На рис, 3-12 показан такой 12-луночный микропланшет после проведения реак-
ций ЛА. Программную обработку результатов проводят по тем же принципам, что
и для 96-луночного микропланшета. При сохранении всех преимуществ и анали-
тических характеристик тестов удается снизить потребление реагентов более чем
на порядок.
Дальнейшие перспективы миниатюризации тест-систем предполагают умень-
шение количества реагентов и образцов до десятых долей микролитров. С умень-
шением объема образцов и реагентов встает проблема нанесения микроколичеств
вещества, тем более что с переходом к количественным тестам требуется более
высокая степень точности дозировки жидких объектов и позиционирования
нанесенных линий или точек на носителе, а также высокая воспроизводимость
этих параметров. Для таких целей обычные пипетки неприменимы, требуются
специальные приспособления. В этом плане перспективной является технология
пинового нанесения, т.е. перенос микрокапли, сформировавшейся на пине (микро-
стержне) после погружения в образец, на носитель, где и протекает реакция.
Подбором пинов удается добиться малого разброса объема микрокапель (CV —
0,8-7,8% для различных пинов). Рационально объединять одиночные пины в
многопиновые системы — мультиаппликаторы.
Для различных лабораторных исследований в объемах реакционной смеси
менее 1 мкл разработан полный аналитический комплекс, включающий систему
позиционирования-смешивания и видеоцифровые регистрирующие устройства
с программным обеспечением («Эксперт-Лаб» или «Реф леком»), так как учет
результатов реакции может быть выполнен только с помощью ВЦР. В данном слу-
чае визуальная регистрация неприменима.
Рис. 3-12. Внешний вид 12-луночного микропланшета формата 3x4 с проведенной реакцией
латексной агглютинации.
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 1Q1
Система позиционирования-смешивания состоит из аппликаторов для реаген-
тов и образцов, соответствующих им микропланшетов и позиционера, обеспе-
чивающего фиксированное положение микропланшетов, и носителя, на котором
проводится реакция. При использовании системы после соответствующих анали-
тических реакций на носителе формируются матрицы точек формата 5x6, каждая
из которых соответствует отдельной пробе. Далее проводят компьютерную обра-
ботку результатов по заданным алгоритмам. В подобном миниатюризированном
формате могут быть проведены различные биохимические и иммунохимические
тесты.
Возможны два варианта использования си< темы позиционирования-смешива-
ния для различных лабораторных исследований.
Первый вариант — предполагается только нанесение образца на носитель.
Носитель может содержать реагенты, которые вступают в реакцию с исследуемым
веществом («сухая химия»), либо происходит иммобилизация образца на мем-
брану для дальнейших, например иммунохимических, исследований (иммунодот-
анализ). В этом варианте 30 капель одного объема (менее 0,5 мкл) одномоментно
наносят на мембрану, формируя матрицу аналитических точек образца, имеющих
фиксированное геометрическое положение на носителе.
Например, серийное измерение глюкозы в сыворотке крови с матричным
дот-нанесением образцов проводят следующим образом. В микропланшет вно-
сят образцы сывороток и калибраторы по 10 мкл в каждую лунку. Планшет и
носитель с мембраной помещают в соответствующие отделения системы пози-
ционирования, С помощью аппликатора капли образца переносят на мембрану,
содержащую иммобилизованные реагенты для проведения глюкозооксидазной
ферментативной реакции с формированием цветного пятна, время проявления
которого составляет около 60 с. После этого носитель сразу же помещают в сканер
для регистрации результатов. Вся процедура (после заполнения планшета) зани-
мает не более 3 мин, причем результаты, представленные в электронной форме,
сохраняются в базе данных или их можно распечатать.
Для регистрации результатов дот-анализа в микро матричном формате исполь-
зуют пакет ПО «Эксперт-Лаб-Видеодот» с автоматической геометрической фик-
сацией зон интереса, соответствующих матрице точек, формируемой с помо-
щью системы позиционирования. Применяется система расчета интенсивности
отраженного света от точек объекта для каждой зоны. Принцип «многозонного
анализа» позволяет одновременно регистрировать результаты определений в
каждой отдельной зоне независимо. Принцип организации основного окна ПО
«Эксперт-Лаб-Видеодот» показан на рис. 3-13 (см. цв. вклейку) на примере опре-
деления глюкозы. Калибровочная кривая отражает обратно пропорциональную
зависимость средней интенсивности отраженного света для анализируемой зоны
интереса и концентрации аналита. Концентрации глюкозы, рассчитанные по
калибровочной кривой, представлены в таблице результатов.
Интерфейс предполагает заполнение протокола для каждой серии исследова-
ний и каждого отдельного теста: задается расположение исследуемых образцов,
контролен и калибраторов. На экране отображаются данные автоматической
интерпретации результатов по заданному референсному интервалу.
Другой вариант применения системы позиционирования-смешивания — про-
ведение реакций со смешиванием нескольких реагентов в геометрически фикси-
рованных точках на поверхности носителя. Этот вариант позволяет разработать
новые модификации методов для обнаружения аналитов с помощью реакции
латексной агглютинации или для изосерологических исследований.
В ходе реакции из микропланшета аппликатором переносят капли реагента на
носитель, с помощью позиционера фиксируя их положение. Такую же операцию
проводят и с каплями образца. В результате каждая капля образца смешивается
1 02 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
с каплей реагента, уже находящейся на носителе. Реакция проводится во всех 30
аналитических зонах одновременно, причем объем реакционной смеси не превы-
шает 1 мкл.
Система позиционирования-смешивания позволяет варьировать объемы нано-
симых капель за счет использования аппликаторов с разными размерами пинов и
изменять соотношения и количество реагентов, что открывает новые перспективы
применения этого варианта микроматричного анализа в мультиплексном режиме
для различных методов биохимии и иммунологии.
Примером варианта применения системы позиционирования-смешивания со
смешиванием реагентов является проведение реакции латексной агглютинации
для серийного определения С-реактивного белка в сыворотке крови. В соответ-
ствующие микропланшеты вносят по 10 мкл сыворотки и латексной суспензии.
Затем аппликаторами последовательно переносят капли образцов и реагента на
носитель, перемешивают и фиксируют результаты реакции с помощью анализато-
ра. Результаты реакции упитывают с помощью ПО «Эксперт-Лаб-Агглютинация-
Микро». Принципы построения пользовательского интерфейса и основного окна
аналогичны описанным выше для программы «Эксперт-Лаб-Агглютинация».
Изучение аналитических характеристик миниатюризированных систем, осно-
ванных на применении мультиаппликаторов в различных исследованиях методом
ЛА, показало, что они полностью соответствуют параметрам макрометодов, сохра-
няя все преимущества, которые дает ВЦР.
ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ СИСТЕМ ВЦР ДЛЯ КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ
ИССЛЕДОВАНИЙ
Видеоцифровая регистрация благодаря гибкости подходов при разработке
регистрирующих систем, единым принципам построения программного обеспе-
чения для объектов различных форматов позволяет решать практически любые
задачи лабораторной диагностики. Для сканерных систем дальнейшее развитие
состоит в увеличении разнообразия проводимых исследований в 96-луночных
планшетах. Это иммунотурбидиметрические и биохимические исследования с
вертикальной фотометрией, микробиологические тесты. Также будут развиваться
уже используемые варианты цифровой регистрации разнообразных исследований
на тест-полосках в формате иммуноблота: например, Вестерн-блот или Лайн-блот
(с нанесением реагентов в виде полос).
Системы с видеокамерами развиваются в направлении миниатюризации реги-
стрирующих устройств с разработкой мобильных и даже так называемых карман-
ных форматов с использованием иммунохроматографических тестов для прове-
дения анализов «в месте оказания врачебной помощи» или домашних условиях.
В этой сфере развивается тенденция к использованию встроенных в мобильные
телефоны видеокамер. Для таких внелабораторных систем особую важность при-
обретают сохранение первичной информации (ПДТ) — изображения аналитиче-
ского объекта и возможность дистанционного консультирования, так как иссле-
дования будут проводить люди, не обладающие профессиональными навыками
лабораторных работников.
Развитие подходов ВЦР гармонично вписывается в концепцию бурно разви-
вающейся телемедицины. Это связано с тем. что аналитическая информация при
использовании ВЦР уже имеется в компьютерном виде и легко может передаваться
по современным коммуникационным системам — через Интернет или с помощью
мобильной телефонии. С использованием подобного алгоритма могут быть органи-
зованы профильные лабораторные сети с вертикально интегрированной системой
контроля качества. И в этом случае очевидна важность передачи и сохранения ПДТ.
Кроме того, возможность передачи первичного изображения аналитического
объекта позволяет перейти на следующую ступень, обеспечиваемую развитием
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 1Q3
информационных технологий, — дистанционную обработку изображений. При
этом подходе на месте проведения исследования (в полевых условиях, возле посте-
ли больного) получается только изображение аналитического объекта, которое
передается на сервер, где происходит его обработка и получается результат, кото-
рый, в свою очередь, передается обратно, к месту проведения исследования. В этом
случае может быть обеспечена передача информации и консультативной помощи
из единого центра. Применение современной аналитической технологии — видео-
цифровой регистрации — предоставляет специалистам новые возможности совер-
шенствования качества лабораторного обследования.
ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ
Возможности проточной цитометрии
Проточная цитометрия — высокотехнологичный метод быстрого измерения
характеристик клеток. Проточная цитометрия основывается на арсенале флюо-
ресцентных методов анализа структурных компонентов клеток, их антигенов и
внутриклеточных процессов. Этим методом исследуются выборки от нескольких
тысяч до нескольких миллионов клеток, что гарантирует статистическую досто-
верность результатов. В свою очередь, от классической биохимии и молекулярной
биологии цитометрию отличает возможность анализировать не усредненные
молекулярные характеристики по всей популяции, а индивидуальные параметры
для каждой клетки. Созданная для ускорения анализа в клинической цитологии
и цитодиагностике, эта технология постепенно развилась в эффективный под-
ход к решению многих важных задач биологии клетки, иммунологии, клеточной
инженерии и т.д. В клинической практике наиболее часто проточную цитометрию
используют для исследования клеток крови и костного мозга, их антигенного
состава, функциональной активности, количества ДНК и РНК, определения уров-
ня продукции цитокинов.
Существуют два направления: проточная цитометрия и проточная цитометрия-
сортировка. Первое представляет аналитический подход, второе позволяет ото-
брать интересующие исследователя субпопуляции клеток, основываясь на анали-
тических возможностях первого, и в дальнейшем проводить работу с отобранными
субпопуляциями. В последнее время позиции проточных цитометров как сорти-
ровщиков поколебались за счет появления магнитной сепарации, но целый ряд
научных исследований невозможен без их использования. К таким исследованиям
можно отнести сортировку индивидуальных хромосом, получение тетраном и др.
Две существенные особенности проточной цитометрии делают этот метод осо-
бенно ценным для клинической практики, Во-первых, этот метод позволяет охарак-
теризовать гетерогенные клеточные популяции по фенотипу, а при использовании
ДНК-цитометрии — и по генотипу входящих в них клеток. Анализы такого рода слу-
жат для выявления отклонений, происходящих в ппоцессе онкогенеза. Большинство
современных применений цитометрии связано с анализами именно такого рода.
Во-вторых, это возможность обнаружить и охарактеризовать редкие события, т.е.
встречающиеся с частотой 10 5-10-7, что стало возможным благодаря огромной
производительности. Современные цитометры могут регистрировать несколько
параметров для каждой отдельной клетки со скоростью до 10 тыс. клеток в секунду.
Области применения проточной цитометрии сегодня весьма разнообразны.
Первоначально интенсивно развивались способы количественного анализа вну-
триклеточных компонентов, таких как ДНК и РНК. Работа в данном направлении
привела к созданию методов анализа параметров клеточного цикла. В свою оче-
редь, это послужило фундаментом для разработки методик анализа делящихся
клеток и клеток с аномальным содержанием ДНК. Информация, извлекаемая из
104 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
сигналов светорассеяния и измерения времени пролета клеток через зону ана-
лиза, позволила судить о морфологических характеристиках клеток (размере,
соотношении размеров ядра и цитоплазмы, гранулярности цитоплазмы, степени
асимметрии клеток).
Развитие гибридомной технологии привело к тому, что появился такой инстру-
мент, как моноклональные антитела (МА). МА предоставили возможность типи-
ровать клетки не только по морфологическим различиям, но и за счет набора
поверхностных антигенов и рецепторов, характерных для строго определенных
клеток и их функционального состояния. В различных лабораториях мира были
получены МА к одним и тем же антигенам, авторы присвоили им свои собственные
названия. Это привело к тому, что возникла путаница, исследователи говорили об
одних и тех же антигенах клеточной поверхности, но называли их по-разному.
Во избежание этого в начале 1980-х гг. было созвано Международное рабочее
совещание по антигенам лейкоцитов человека и предложено объединить МА в
группы, или кластеры, исходя из того, какую антигенную структуру на клеточной
поверхности они распознают. Таким образом, первоначальный смысл понятия
«кластер дифференцировки» (Cluster of Differentiation — CD) — это набор моно-
клональных антител, которые распознают одну и ту же структуру на клеточной
поверхности независимо от эпитопной специфичности. Со временем это понятие
видоизменилось, и многие исследователи понимают под CD саму структуру на
клеточной поверхности. Исходя из изложенного выше становится понятно, что
для эффективного использования МА должны быть кластеризованы, т.е. внесены
в реестр известных МА и отнесены к определенному кластеру дифференцировки.
Для этого каждые МА должны пройти проверку в нескольких независимых лабо-
раториях. где должно быть показано, что они взаимодействуют с определенными
клетками и распознают определенную структуру на их поверхности. В настоящее
время известно более 350 основных кластеров дифференцировки клеток челове-
ка. Использование МА изменило подходы к иммунофенотипированию клеток.
Меченные флюорохромами МА позволяют проводить как качественный, так и
количественный анализ поверхностных и внутриклеточных антигенов.
Как отдельное направление развивается исследование активности внутрикле-
точных ферментов. Это направление получило название «проточная цитоэнзимо-
логия». Разработан ряд реагентов, представляющих собой синтетические субстра-
ты для измерения активности внутриклеточных ферментов. Новые флюорогенные
субстраты позволяют оценить активность большего количества ферментов по
сравнению с доступными ранее субстратами. Преимущество данного подхода в
том, что при сопоставлении уровня активности ферментов нормальных клеток с
уровнем активности клеток, вовлеченных в патологический процесс, могут быть
обнаружены различия, позволяющие идентифицировать поврежденные клетки и
исследовать процессы, протекающие в них.
Сочетание различных флюорохромов сделало возможным количественное и
качественное исследование таких физиологичес ких внутриклеточных параметров,
как pH (флюоресцеин и 7-гидроксикумарин), концентрация свободных ионов
кальция (Fura-2, Indo-1, Fluo-З), уровень окислительных процессов, активация
митохондрий, потенциал наружной мембраны клеток, процессы, связанные с
апоптозом, и т.д. Достижения в различных областях молекулярной биологии, био-
химии и медицины позволяют изучать с помощью проточной цитометрии содер-
жание секретируемых цитокинов в сыворотке крови с помощью мультиплексного
анализа, локализацию антигенспецифичных клонов клеток с помощью тетрамгр.
Существуют методы, позволяющие с помощью проточной цитометрии измерять
функциональные показатели, такие как фагоцитарная активность, апоптоз, экс-
прессия цитокинов и др. Все это создает предпосылки для современных исследова-
ний всего комплекса внутриклеточных процессов на уровне отдельных клеток.
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 105
Современные проточные цитометры обладают высокой чувствительностью и
высоким уровнем автоматизации, простотой эксплуатации и имеют небольшие
размеры — все это позволяет рассматривать их не только как исследовательские,
но и как клинико-диагностические инструменты.
Основы проточной цитофлюориметрии
В основе проточной цитофлюориметрии лежат фотометрические и флюорес-
центные измерения отдельных клеток, пересекающих одна за другой вместе с
потоком жидкости лазерный луч монохроматического света (рис. 3-14).
Методом проточной цитометрии можно измерять следующие параметры,
• Рассеяние света под малыми углами (1-19°). Этот параметр используют для
определения размеров клеток.
• Рассеяние света под углом 90°, Использование этого параметра позволяет
судить о соотношении размеров ядра и цитоплазмы, а также о неоднород-
ности или гранулярности цитоплазмы.
• С помощью флюоресцентных каналов изучают клеточные маркеры, для чего
используют моноклональные антитела (МА) к мембранным и внутриклеточ-
ным компонентам клеток, меченные различными флюорохромными краси-
телями.
• Интенсивность флюоресценции изучаемого объекта может служить количе-
ственным критерием, характеризующим экспрессию антигенов (плотность
рецепторов) на клетках.
• Проточные цитофлюориметры оборудованы несколькими фотоэлектрон-
ными умножителями (ФЭУ), что позволяет одновременно регистрировать
несколько типов флюоресценции.
• Существует возможность измерять поляризацию флюоресценции и время
прохождения частицы через зону анализа. Первое позволяет исследователю
Рис. 3-14. При пересечении лазера потоком клеток регистрируются прямое, боковое светорассея-
ние и спектр эмиссии, испускаемый флюоресцентным красителем.
106 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
судить о степени вязкости мембран клеток, которая меняется в зависимости
от их функционального состояния, а второе — о степени асимметричности
клеток или исследуемых органелл.
Фотометрические каналы используются для оценки размеров клетки и внутри-
клеточных структур. Частицы, отличающиеся по размеру, по-разному рассеивают
свет, при этом характер рассеивания зависит от соотношения длины волны света
и диаметра частиц. В том случае, когда длина волны облучения сопоставима с раз-
мерами частиц, характер рассеивания меняется, световая волна огибает частицу,
взаимодействует с ней и отклоняется от прямолинейного распространения на
небольшой угол — малоугловое (1-19°) или прямое (FS или FSC) светорассея-
ние (рис. 3-15, см. цв. вклейку). Такой тип рассеяния при взаимодействии света с
поверхностью клеток позволяет оценит ь их размер.
Если размер частиц меньше длины волны облучающего монохроматического
света лазера (например, внутриклеточные структуры), существенное количество
света рассеивается под углом 90° (боковое светорассеяние, SS или SSC) (рис. 3-16,
см. цв. вклейку).
При одновременной регистрации бокового и прямого светорассеяния можно
выделить все клеточные популяции лейкоцитов. В этом случае удается определить
физические свойства каждой неокрашенной клетки (размер и сложность структу-
ры), таким образом разделить анализируемую клеточную популяцию на отдель-
ные субпопуляции
Основной формой отображения результатов в процессе накопления данных
являются двухпараметрические гистограммы распределения. Чаще всего именно
на гистограммах отмечается гейт (от англ, gate — ворота). Гейт — это логическое
ограничение, используемое для селекции событий при анализе по нескольким
скоррелированным параметрам. Параметры клеток, попавших внутрь отмеченно-
го гейта, будут отображаться на других гистограммах и цитограммах, а данные о
клетках, не попавших в гейт, будут проигнорированы.
Флюоресцентные каналы применяют для изучения клеточных маркеров, для
чего используют моноклональные антитела (МА), меченные различными флю-
орохромными красителями к мембранным и внутриклеточным компонентам
клеток. После окрашивания клеток МА происходят специфическое связывание
последних с клеточными структурами и регистрация флюоресценции, индуци-
рованной излучением лазера. Техника регистрации состоит в следующем. При
облучении меченых клеток лазером с длиной волны, возбуждающей флюоро-
хром, происходит поглощение света. Затем флюорохром испускает свет, но уже
меньшей интенсивности (большей длины волны), чем поглощенный. Кроме того,
флюорохром испускает свет во все стороны, поэтому флюоресценцию можно
регистрировать под любым углом по отношению к облучаемому свету. Как пра-
вило. регистрацию проводят под прямым углом, однако для монохроматического
лазерного облучения это не является обязательным условием, так как испускае-
мый флюоресцентный сигнал всегда имеет большую длину волны, чем возбуж-
дающий свет лазерного облучения. В проточной цитофлюориметрии применяют
множество флюоресцентных красителей. Моноклональные антитела, меченные
различными флюорохромами, различаются как по специфичности их молеку-
лярного связывания, так и по оптическим характеристикам: по спектрам погло-
щения и соответственно возбуждения флюоресценции, величинам молекулярных
коэффициентов экстинкции, спектрам и квантовым выходам флюоресценции.
В зависимости от того, какими лазерами укомплектован прибор, подбирают флю-
оресцентные красители (табл. 3-1).
Количественный анализ интенсивности иммунофлюоресценции служит для
точного подсчета количества определенных молекул внутри клетки или на ее
поверхности. Разработана группа методов, основанных на детекции исследуемых
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 1Q7
Таблица 3-1. Флюорохромы, наиболее часто используемые для прямой конъюгации с монокло-
нальными антителами
Флюорохром Длина волны возбуждения, нм Эмиссия, нм
Флюоресцеинизогиоцианат (FITC) 488 525
Алекса Флюор 488 (А)еха Fluor 488) 488 525
Фикоэритрин (РЕ, R-PE, RD1) 488 575
ECD (PE-Texas Red) 488 610
РС5 (PE/CY5) 488 675
РС5.5 (PE/CY5.5) 488 700
РЕ Alexa Fluor 700 488 725
РС7 (PE/CY7) 488 790
Алофикоцианин (АРС) 633/635 680
Alexa Fluor 647 633/635 680
Alexa Fluor 700 633/635 725
АРС Alexa Fluor 700 633/635 725
АРС7 (APC/CY7) 633/635 790
молекул с помощью меченых моноклональных антител. Количественный анализ
некоторых маркеров раскрывает полезную клиническую информацию. Например,
опухолевые клетки, относящиеся к предшественникам В-лимфоцитов, можно
дифференцировать от нормальных предшественников и зрелых В-лимфоцитов по
высокой плотности экспрессии CD 10 или CD38 соответственно и низкой экспрес-
сии CD24 и CD45; высокая экспрессия CD 10 клетками острого В-клеточного лим-
фобластного лейкоза является полезным признаком для выявления минимальной
остаточной болезни. Количественный анализ флюоресценции — косвенная мера
определения количества антигенных структур, способных связаться с определен-
ным меченым антителом. Калибровка интенсивности флюоресценции связывает
интенсивность сигнала флюоресценции с количеством меченых моноклональных
антител, присоединившихся к клетке.
Учитывая, что интенсивность флюоресценции от каждой конкретной клетки
зависит от количества меченых моноклональных антител, связавшихся со специ-
фическими антигенами на поверхности лимфоцитов, средняя интенсивность флю-
оресценции популяции клеток (MFI — Mean Fluorescence Intensity) может служить
количественным критерием, характеризующим экспрессию антигенов (плотность
рецепторов) на клетках.
С помощью современных проточных цитофлюориметров можно одновременно
измерить спектр эмиссии до десяти различных флюорохромов. Результаты изме-
рений по каналам флюоресценции, как правило, отображаются в виде двухпара-
метрических гистограмм. При анализе двухпараметрического графика по каналам
флюоресценции оценивают процент клеток, несущих тот или иной маркер, одно-
временную экспрессию на клетках двух и более различных антигенов, а также по
средней интенсивности флюоресценции меченых антител, соединенных с клеткой,
можно судить о плотности экспрессии клеточных антигенов (рис. 3-17).
Аналитические характеристики проточной цитофлюориметрии
Материалом для анализа методом проточной цитофлюориметрии могут слу-
жить любые микрочастицы, находящиеся в суспензии. Наиболее часто объектом
исследования являются клетки крови и костного мозга. Также могут быть изучены
клетки выпотных жидкостей, бронхоальвеолярного смыва, ликвора, гомогенизи-
рованные образцы тканей, клеточная суспензия, полученная при аспирационной
108 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Рис. 3-17. Периферическая кровь больного хроническим лимфолейкозом. Слева точечный гра-
фик, отражающий события в лимфоцитарном гейте, характеризующий экспрессию В-клеточного
антигена CD20, меченного фикоэритрином (РЕ), и CD43, меченного флюоресцеинизотиоциона-
том (FITC). В верхнем левом квадранте отображены клетки, которые несут только РЕ, меченные
CD20, — это нормальные В-лимфоциты, их 4,84%. В правом нижнем квадранте — клетки,
экспрессирующие только CD43, — это Т-лимфоциты, их 12,46%. В правом верхнем квадранте
находятся события, позитивные по РЕ и FITC, — это клетки, ко-экспрессирующие CD20 и CD43
(опухолевые клетки В-клеточного хронического лимфолейкоза), их 82,36°Л. Следует обратить
внимание, что средняя интенсивность флюоресценции CD20 РЕ опухолевой популяции значи-
тельно ниже, чем популяции нормальных В-лимфоцитов, что также характерно для В-клеточного
хронического лимфолейкоза.
тонкоигольной пункции лимфатических узлов и селезенки, а также хромосомы и
бактерии. Возможно исследование цитокинов в сыворотке крови и тканях.
Предпочтительнее для исследования клеток крови и костного мозга использо-
вать пробирки с калиевыми солями ЭДТА либо, при необходимости исследования
функциональной активности клеток, гепарин. Существенным этапом подготовки
проб для анализа является выделение из образца только тех клеток, которые
интересуют исследователя. Первое что может помешать анализу чистой лейкоци-
тарной популяции, — это эритроциты. С помощью лизирующих растворов либо
выделения лейкоцитарной фракции на градиенте плотности происходит удаление
эритроцитов из образца, и для анализа становятся доступны только ядросодер-
жащие клетки крови или костного мозга. При исследовании костного мозга и
гомогенизатов тканей важно, чтобы анализу не мешали конгломераты клеток
соединительной ткани, — для этого используют специальные фильтры. При имму-
нофенотипировании клеток костного мозга и периферической крови у больных с
парапротеинемиями важно снизить неспецифическое связывание меченых анти-
тел белками плазмы крови, — для этого используют дополнительное отмывание
клеток фосфатно-солевым буфером.
Метод проточной цитофлюориметрии позволяет одновременно оценивать до
миллиона клеток. Позитивной считается область, насчитывающая не менее 50
событий. Таким образом, чувствительность метода проточной цитофлюориме-
трии — 1 на 20 000 клеток. Метод многоцветовой проточной цитометрии позволя-
ет детектировать до 18 параметров клетки одновременно со скоростью до 10 000
тысяч клеток в секунду. Современные цитометры, как правило, оборудованы
тремя и более ФЭУ (от 3 до 10), что позволяет в одном образце периферической
крови проанализировать экспрессию основных маркеров практически всех клеток
крови и костного мозга. Чем большее количество меченых моноклональных анти-
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ *| 09
тел, связавшихся с клеткой, можно проанализировать в одном образце, тем выше
специфичность метода. Все это привело к формированию многопараметрического
анализа в цитометрии.
Преимущества проточной цитофлюориметрии
Основным преимуществом проточной цитометрии перед морфологическими
методами исследования является возможность оценки большого количества кле-
ток за короткий промежуток времени. Кроме того, проточная цитофлюориметрия
дает возможность выявлять иммунофенотип различных субпопуляций, лимфоци-
тов, линейную принадлежность бластов, прогностические маркеры, определять
аберрантный фенотип опухолевых клеток, чего невозможно добиться при класси-
ческом морфологическом исследовании клеток.
По сравнению с иммуноцитохимическими и иммуногистохимическими иссле-
дованиями проточная цитофлюориметрия является менее трудоемким, более
информативным методом, также преимуществом является быстрота исполнения
(1-3 ч). Кроме того, проточная цитометрия существенно экономичнее иммуноги-
стохимии и иммуноцитохимии.
В сравнении с молекулярными методами диагностики преимущества проточной
цитометрии — скорость исследования и экономичность. Также при определении
минимальной остаточной болезни проточная цитометрия дает возможность
детектировать только жизнеспособные клетки и исключать из зоны анализа мерт-
вые клетки, в то время как методы молекулярной диагностики применительно к
диагностике минимальной остаточной болезни основаны на выявлении ДНК неза-
висимо от того, принадлежит она погибшим или еще жизнеспособным клеткам.
Ограничения проточной цитометрии
Иммунофенотипирование методом проточной цитометрии позволяет охаракте-
ризовать клетки с помощью МА или каких-либо других флюоресцентных зондов
и дает возможность судить об их типе и функциональном состоянии по наличию
набора клеточных маркеров и происходящих в них процессах. Однако многие
маркеры могут экспрессироваться на различных типах клеток, и определять их
наличие следует в режиме не менее чем двухцветного анализа.
Важной проблемой является отсутствие стандартных диагностических пане-
лей, поэтому не всегда при постановке первичного диагноза в одной лаборатории
оценку минимальной остаточной болезни при гемобластозах можно провести в
другой.
Проточная цитометрия уступает в чувствительности и специфичности
молекулярно-генетическим методам исследования в дифференциальной диагно-
стике Т-клеточных опухолевых заболеваний и при оценке минимальной остаточ-
ной болезни при острых лейкозах миелоидной направленности и Т-клеточной
линейности.
Для оценки плотности рецепторов существуют коммерческие наборы для кали-
бровки приборов, однако они дают возможность оценить только один флюоро-
хром и очень дорого стоят. При этом оценка плотности экспрессии отдельных
антигенов повышает информативность метода проточной цитофлюориметрии
в диагностике и дифференциальной диагностике гемобластозов. Интенсивность
флюоресценции от каждой конкретной клетки зависит от количества меченых
моноклональных антител, связавшихся со специфическими клеточными антиге-
нами, следовательно, средняя интенсивность флюоресценции популяции клеток
(MFI) может служить количественным критерием, характеризующим плотность
клеточных рецепторов. Однако средняя интенсивность флюоресценции, детек-
110 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
тируемая прибором, зависит не только от количества меченых моноклональных
антител, присоединившихся к клетке, но и от собственной интенсивности све-
чения флюорохромов, интенсивности лазеров и чувствительности детекторов.
Следовательно, оценку плотности рецрпторов по MFI можно использовать лишь
как сравнительный метод, применяемый только на одном приборе в условиях
конкретной лаборатории.
Б клинической практике проточную цитофлюориметрию применяют:
• для оценки параметров клеточного иммунитета;
• исследования функциональных особенностей клеток иммунной системы;
• оценки абсолютного количества CD4+ Т-лимфоцитов в стадировании течения
ВИЧ-инфекции;
• диагностики острых лейкозов и лимфопролиферативных заболеваний,
пароксизмальной ночной гемоглобинурии;
• оценки минимальной остаточной болезни;
• подсчета гемопоэтических и мезенхимальных стволовых клеток;
• определения клеточного состава выпотных жидкостей и ликвора;
• мониторинга септического состояния;
• диагностики таких генетических патологий, как синдром Вискотта-Ол-
дрича;
• подсчета ретикулоцитов и тромбоцитов (референтный метод);
• оценки функциональной активности тромбоцитов.
Оценка клеточного звена иммунитета
Успехи фундаментальной иммунологии, основанные на достижениях моле-
кулярной биологии и генной инженерии, позволили уточнить иммунопатогенез
аллергических, аутоиммунных, онкологических и инфекционных заболеваний.
В то же время возросшие возможности проточной цитометрии расширили пред-
ставления о необходимом перечне популяций лимфоцитов, исследование которых
целесообразно при оценке клеточного звена иммунитета.
Процесс развития иммунного ответа организма на проникновение инфекции
или какие-либо другие воздействия сопровождается значительными изменениями
субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток. Это относится как к
изменению абсолютного количества иммунокомпетентных клеток, их субпопуля-
ций, так и к появлению на клеточной поверхности определенных функциональных
молекул. Под воздействием различных агентов клетки приспосабливаются и отве-
чают на это изменением экспрессии тех или иных мембранных и внутриклеточных
маркеров. Таким образом, одним из эффективных механизмов иммунорегуляции
является модуляция экспрессии функционально значимых молекул. Не менее важ-
ным является и изменение абсолютного количества иммунокомпетентных клеток
в периферической крови.
Определение субпопуляционного состава, или фенотипа, лимфоцитов как одной
из основных популяций иммунокомпетентных клеток в настоящее время является
важным диагностическим признаком, позволяющим судить о течении процессов,
происходящих в организме. Под фенотипом следует понимать совокупность функ-
ционально значимых маркеров, характерных для определенных стадий диффе-
ренцировки. пролиферации, активации или программируемой клеточной гибели
(апоптоза). Абсолютное и относительное количество клеток, имеющих тот или
иной фенотип, является конечным результатом иммунофенотипирования.
Разработка современных цитометров, успехи в химии флюоресцентных кра-
сителей, открытие новых CD-маркеров, усовершенствование программного обе-
спечения позволили проводить анализ фенотипа иммунокомпетентных клеток как
рутинную процедуру и получать наиболее полную и достоверную информацию.
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 111
Это позволяет локализовать и отследить процессы, протекающие в организме,
изучить их, а значит, адекватно на них реагировать. Как следствие, разрабатыва-
ются новые подходы к коррекции активности патологически измененных клеток
и процессов, которые они определяют.
В течение последних 20 лет в практике КДЛ определение показателей, отра-
жающих количественное содержание пяти основных популяций лимфоцитов в
периферической крови (Т-клеток, Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов.
В-клеток и NK-клеток), проявило недостаточную их информативность. С другой
стороны, интенсивное изучение патогенеза различных заболеваний выявило клю-
чевую роль активированных лимфоцитов, регуляторных Т-клеток, субпопуляций
В- и NK-клеток. В связи с этим для оценки иммунного статута при иммунофеноти-
пировании лимфоцитов наряду с основными пятью популяциями целесообразно
расширить анализ за счет малых субпопуляций лимфоцитов и пулов активиро-
ванных клеток. Технические и методические возможности для этого у практиче-
ских лабораторий появились. Так- если ранее для определения цитотоксических
Т-лимфоцитов считалось достаточным использовать только один маркер — CDS,
согласно современным представлениям необходимо одновременное исследование
четырех маркеров — CD8, CD4, CD3 и CD45. Реализация такого подхода возможна
только при использовании многоцветового цитометрического анализа. Однако
появление новых лабораторных показателей, их внедрение в рутинную практику
требует стандартизации протокола определения показателей и значений нормы.
В-ЛИМФОЦИТЫ И ИХ СУБПОПУЛЯЦИИ
Популяцией лимфоцитов, отвечающей за продукцию антител, являются
В-клетки. Каждый лимфоцит, относящийся к В-клеткам, запрограммирован на
продукцию антител одной-единственной специфичности, и эти антитела присут-
ствуют на его поверхности в качестве рецептора для соответствующего антигена.
Один В-лимфоцит несет на своей поверхности примерно 105 идентичных молекул
антител. Данные антитела называют поверхностными, или мембранными, имму-
ноглобулинами.
Основной формой мембранных иммуноглобулинов являются иммуноглобули-
ны класса М (IgM). Они экспрессируются на мембране всех зрелых В-лимфоцитов,
которые не имели контакта с антигеном. Однако на поверхности В-клеток, диффе-
ренцировка которых уже завершилась, присутствуют и иммуноглобулины класса
D (IgD). В процессе формирования иммунного ответа происходит переключение
изотипов мембранных иммуноглобулинов на IgG, IgA, IgE.
Кроме мембранных иммуноглобулинов, В-лимфоциты экспрессируют целый
ряд мембранных маркеров, которые, во-первых, необходимы для формирования
В-клеточного рецептора и играют важную роль в передаче сигнала в процессе рас-
познавания антигена, во-вторых, являются маркерами линейной принадлежности
В-клеток, что особенно полезно при идентификации данной популяции лимфоци-
тов. К таким маркерам прежде всего относятся CD 19 и CD21. Данные молекулы
формируют ко-рецепторный комплекс, в который вовлечен также и CD81.
СО19-антиген, так же известный как В4, представляет собой мембранный
гликопротеин с молекулярной массой 95 кДа. CD19 участвует в регулировании
развития В-лимфоцитов, активации и их дифференцировке. Эта молекула экспрес-
сируется на всех нормальных В-клетках, включая про-В-лимфоциты, но исчезает у
плазматических клеток. Молекула CD19 отсутствует на мембране нормальных Т-,
NK-клеток. моноцитов и гранулоцитов. В связи с этим данный антиген рекоменду-
ют для количественной оценки общей популяции В-клеток.
СО21-антиген представляет собой трансмембранный гликопротеин с моле-
кулярной массой 145 кДа. Он принадлежит к семейству белков, регулирующих
активность комплемента. CD21 (CR2) является рецептором для СЗб-компонента
112 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
комплемента и вируса Эпштейна-Барр. Данный антиген присутствует на зре-
лых В-лимфоцитах и отсутствует на Т-лимфоцитах, гранулоцитах и моноцитах.
Молекула CD21 вовлечена в активацию и пролиферацию В-лимфоцита.
Кроме перечисленных выше структур, к пан-В-клеточным антигенам относят
такие молекулы, как CD20 и CD22.
СВ20-антиген (Вр35) является интегральным негликозилированным мембран-
ным белком с четырьмя трансмембранными доменами. Существуют три изоформы
CD20 в зависимости от молекулярной массы (33, 35 и 37 кДа), которые являются
результатом дифференцированного фосфорилирования внутри цитоплазматиче-
ских доменов. Данная молекула является Са2’-каналом и участвует в активации и
пролиферации В-клеток за счет регуляции трансмембранной проводимости ионов
Са2+. Молекула CD20 присутствует на всех нормальных В-лимфоцитах перифери-
ческой крови, лимфатических узлов, селезенки, миндалин и костного мозга, но
отсутствует на плазматических клетках. Хотя CD20 первоначально был описан как
В-клеточный линейный маркер, оказалось, что небольшая субпопуляция Т-клеток
человека экспрессирует CD20 в низкой плотности, причем В-клетки экспрессиро-
вали CD20 в высокой плотности (CD20br^ht), а Т-клетки — в низкой (CD20dbn) и
составляли 2,4±1,5% лимфоцитов периферической крови. Хотя оценка экспрессии
CD20 полезна при характеристике В-клеток, необходимо достаточно осторожно
подходить к интерпретации получаемых результатов. Особенно это относится
к случаям иммунофенотипирования клеток костного мозга. Сходная проблема
может возникнуть при изучении клеток периферической крови у пациентов с
ревматоидным артритом, Молекула CD20 является мишенью для терапии неход-
жкинских В-клеточных лимфом.
СО22-антиген (BL-САМ) — трансмембранный гликопротеин, принадлежащий
к суперсемейству иммуноглобулинов. Данная молекула экспрессируется в виде
двух изоформ: а-формы (130 кДа) и р-формы (140 кДа). СО22-антиген экспрес-
сируется в цитоплазме В-клеточных предшественников и на поверхности зрелых
В-лимфоцитов. Экспрессия CD22 исчезает после активации В-клеток предше-
ствующей стадии созревания плазматической клетки. Молекула CD22 отсутствует
на Т-лимфоцитах, гранулоцитах и моноцитах периферической крови.
В настоящее время среди В-лимфоцитов выделяют три основные субпопуляции:
В-1, В-2 и В-клетки памяти. Достаточно важная роль при данном делении отво-
дится молекуле CD5.
Кроме роли, связанной с пеиедачей сигналов при активации, молекула CD5
расценивается как возможный маркер В-лимфоцитов, позволяющий различать
их субпопуляции: CD5+ В-клетки (В-1-клетки) и обычные CD5- В-клетки (В-2-
клетки). В-1-клетки вызывают значительный интерес вследствие ассоциации с
продукцией аутоантител, а также с аутоиммунной патологией. Значительная роль
В-1-клеток была отмечена при ревматоидном артрите, системной красной вол-
чанке (СКВ) и синдроме Шегрена. Увеличение количества CD5+ В-лимфоцитов
наблюдали у пациентов, страдающих миастенией, инсулинозависимым диабетом
и тиреоидитом Хашимото. В табл. 3-2 приведен список заболеваний, при которых
определение относительного уровня В-1-лимфоцитов является диагностически
значимым (рис. 3-18).
Следующей субпопуляцией В-лимфоцитов являются так называемые В-клетки
памяти. Идентификация CD27 как маркера В-клеток памяти позволила надежно
и эффективно идентифицировать в периферической крови нативные В-клетки
(IgM+CD27 ) и В-клетки памяти (CD27+).
СИ27-антиген представляет собой трансмембранный гликопротеин в виде
гомодимера из двух мономеров с молекулярной массой 55 кДа, связанных дисуль-
фидными мостиками. CD27 принадлежит к семейству генов-рецепторов фактора
некроза опухоли, CD27 антиген найден на медуллярных тимоцитах, перифериче-
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 113
CD19-FITC
а
CD19-FITC
б
Рис, 3-18. Гистограмма распределения CD5 и CD19 на лимфоцитах периферической крови.
Субпопуляции В-1-лимфоцитов у пациента с аутоиммунным тиреоидитом: а — до лечения; б — в
процессе лечения.
Таблица 3-2. Заболевания, при которых определение относительного уровня В-1-лимфоцитов
является диагностически значимым
Заболевание Повышение относительного уровня В-1-лимфоцитов
1. Системная красная волчанка +++•+
2. Синдром Шегрена ++++
3. Ревматоидный артрит +++
4. Инсулинозависимый диабет +++
5. Аутоиммунный тиреоидит ++++
6. Миастения +++
7. Неспецифический язвенный колит +++
8. Аутоиммунные поражения при инфекционных заболеваниях (хла- +++
мидиозе, синдроме Рейтера, бруцеллезе и др.)
9. Другие заболевания, имеющие в своей основе аутоиммунные +?
механизмы
ских Т-лимфоцитах, активированных В-лимфоцитах и NK-клетках. Его лигандом
является молекула CD70. Взаимодействие CD27 с его лигандом CD70 на Т-клетках
является одним из условий дифференцировки В-клеток в плазматические клетки.
Отсутствие IgD“CD27+ В-клеток памяти в значительной степени объясняет нару-
шение продукции иммуноглобулинов, несмотря на функциональную передачу
сигналов молекулой CD40 у пациентов с Х-связанным rnnep-IgM-синдромом.
Гуморальный иммунный ответ играет важную, а порой и критическую роль
в устранении внутри- и внеклеточных патогенов. Этот процесс осуществляется
за счет дифференцировки зрелых В-клеток в плазматические клетки, которые
секретируют большие количества иммуноглобулинов. Однако большинство анти-
генов вызывают иммунную реакцию лишь при наличии и участии Т-лимфоцитов.
Это относится к белковым и клеточным антигенам, а также к вирусам, которые
объединяют в понятие «Т-зависимые антигены». Лишь небольшое количество
антигенов способно вызывать иммунный ответ без участия Т-клеток. Некоторые
бактериальные липополисахариды при достаточно высокой концентрации способ-
ны к поликлональной активации значительной части популяции В-лимфоцитов,
т.е. для такой стимуляции антигенная специфичность роли не играет. Линейные
114 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
антигены, медленно распадающиеся в организме и имеющие организованную
определенным образом и часто повторяющуюся детерминанту (полисахарид пнев-
мококков, полимеры D-аминокислот, поливинилпироллидон). также способны
непосредственно стимулировать В-лимфоциты. Индуцируемый Т-независимыми
антигенами иммунный ответ практически не сопровождается формированием кле-
ток памяти. При иммунном ответе на Т-независимые антигены вырабатываются
IgM и эффективность Т-независимого ответа во много раз ниже. В свою очередь,
Т-зависимые антигены при отсутствии Т-клеток лишены иммуногенности. При
ответе на эти антигены требуется подключение Т-лимфоцитов. Т-зависимые анти-
гены обеспечивают и определяют кооперативное взаимодействие В- и Т-клеток, в
результате чего происходит переключение синтеза с IgM на IgG.
Выделяют два пути образования различных фракций антител: Т-зависимый
путь в герминальных центрах и Т-независимый путь вне герминальных центров.
Точная функция второго пути и генерирование IgM'CD27+ В-клеток в настоящее
время окончательно не выяснены. Однако IgM~CD27' В-клеток играют важную
роль в гуморальном ответе против Т-независимых патогенов, например инкапсу-
лированные бактерии.
Активация зрелых В-клеток с Т-зависимым антигеном приводит к образо-
ванию плазматических клеток двумя независимыми путями дифференцировки.
Активированные В-клетки могут войти в экстрафолликулярные пролиферативные
центры, где они быстро дифференцируются в короткоживущие плазматические
клетки, секретирующие IgM. С другой стороны, активированные В-клетки могут
попасть в герминальный центр, где происходят различные молекулярные пере-
стройки: соматические гипермутации, переключение изотипов иммуноглобулинов
и отбор высокоаффинных вариантов. Антигенселективные В-клетки герминаль-
ного центра являются предшественниками двух типов клеток: высокоаффинных
В-клеток памяти и долгоживущих плазматических клеток, которые отвечают за
долгосрочную гуморальную устойчивость.
Помимо перечисленных молекул рецепторного и ко-рецепторного комплекса,
на поверхности В-клеток экспрессируются антигены главного комплекса тканевой
совместимости класса II (HLA-DR). Эти молекулы принимают участие в представ-
лении антигенов, а В-клетки являются антигенпредставляющими клетками. Однако
HLA-DR-антигены также представлены на активированных Т- и NK-клетках, что
объясняется несовпадением относительного количества CD3 CD19+ В-клетки и
СВЗ'НЬА-ВЯ+-клетки при некоторых патологиях.
Оценка относительного количества В-клеток является одним из важных диа-
гностических признаков. При воспалительных заболеваниях наблюдается значи-
тельное снижение количества В-клеток. Особенно ярко это выражено при остром
панкреатите, хроническом пародонтите и тонзиллите, гнойном осложнении травм.
Противоположный эффект наблюдается при острых и хронических формах гепа-
титов В и С.
Развитие и протекание иммунологических процессов в популяции В-клетик
сопровождается количественными и качественными процессами. Активация
В-клеток сопровождается изменением экспрессии антигенов CD80 и CD86.
CDSO-антиген (В7, ВВ1) является высокогликозилированным одноцепочечным
белком, его внеклеточная область состоит из двух иммуноглобулиноподобных
доменов. Эта молекула имеет молекулярную массу 60 кДа, и лигандами для нее
служат две структурно-подобные молекулы, экспрессируемые на Т-лимфоцитах,
а именно CD28 и CD152 (CTLA-4). При активации В-лимфоцитов in vitro антиген
CD80 экспрессируется после 24-часовой стимуляции и достигает максимального
уровня к 48-72 ч. Данный антиген не экспрессируется на большинстве покоящих-
ся В-клеток периферической крови, но определяется на отдельных субпопуляци-
ях активированных В-клеток. Антиген CD80 также экспрессируем я на I1TLV-1
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 115
трансформированных Т-клетках и активированных моноцитах. Контакт CD80 с
лигандами обеспечивает проведение ко-стимуляторных сигналов при активации
Т-клеток.
СЭ86-антиген (В7-2, В70) — также трансмембранный одноцепочечный глико-
протеин, по своей структуре подобный CD80. Его молекулярная масса составляет
80 кДа. Внеклеточная область состоит из иммуноглобулиноподобных доменов:
одного V-типа и одного С-типа, на которых находятся 8 потенциальных сайтов
для N-гликозилирования. Цитоплазматический конец CD86 имеет 3 участка для
фосфорилирования протеинкиназой С. CD86 взаимодействует с теми же самыми
ко-рецепторами на Т-клетках, что и молекулы CD80, CD28 и CD152 (CTLA-4).
Однако взаимодействие CD86 с CD152 в 20-100 раз более высокоаффинно,
чем с CD28. Молекула CD86 экспрессируется в низкой плотности дендритными
клетками периферической крови и очень высокой плотности на моноцитах. На
лимфоцитах CD86 появляется как антиген активации В-клеток, экспрессируется в
основном В-клетками памяти и В-клетками герминального центра, но полностью
отсутствует на плазматических клетках. Его экспрессия может быть повышена
путем активации через поверхностные иммуноглобулины, CD40, молекулы МНС
(главного комплекса гистосовместимости) класса II или действием РМА (ацетата
фарболмиристата) в присутствии иономицина.
При СКВ продукция аутоантител находится в зависимости от Т-клеток. Для
надлежащего взаимодействия Т- и В-клеток необходима передача сигналов
ко-стимуляторными молекулами на этих клетках. Было показано, что экспрессия
CD80 на CD19+ В-клетках низкая и не коррелирует с тяжестью болезни, тогда как
количество CD19+ В-клеток, экспрессирующих CD86, увеличено и коррелирует с
тяжестью заболевания. С другой стороны, продукция аутоантител В-клетками при
СКВ в присутствии активированных Т-клеток может быть подавлена антителами
против CD86, но не против CD80. Таким образом, наиболее полную характеристи-
ку относительного количества В-клеток и их субпопуляционного состава можно
получить при следующей комбинации моноклональных антител: CD5/CD19/
CD27/CD45 (рис. 3-19). Использование морфологических параметров (малоугло-
вого светорассеяния — FS, рассеяния света под углом 90° — SS) для локализации
пула лимфоцитов достаточно часто приводит к получению некорректных резуль-
татов. Это связано, как правило, с неполным лизисом эритроцитов, попаданием
Рис. 3-19. Гистограммы распределения CD19, CD5 и CD27 на лимфоцитах периферической
крови: а — выбор зоны анализа по СО19-позитивным клеткам; б — распределение CD19-
позитивных клеток. Квадрант Е1 —В-1-лимфоциты (CD19+CD5'); квадрант Е4 —В-клетки памяти
(CD19*CD27+).
116 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
базофилов в зону лимфоцитов и т.д. Для определения состояния иммунной систе-
мы и ее аномалий более корректной представляется локализация лимфоцитов
на основе экспрессии панлейкоцитарного антигена CD45. При многоцветовом
цитофлюориметрическом анализе (более трех цветов) и многостадийном выборе
зоны лимфоцитов с использованием CD45 исключается попадание клеток другой
этиологии (не лимфоцитов) в конечный результат исследования. Таким образом,
при иммунофенотипировании В-лимфоцитов предпочтительнее использование
именно CD45 для выбора зоны анализа лимфоцитов.
В связи с тем что молекула CD 19 представляет собой специфический маркер
В-клеток и не встречается на других популяциях клеток периферической крови,
данный антиген рекомендуют для количественной оценки общей популяции
В-клеток. Дополнительное логическое ограничение по СО19-позитивным клеткам
позволяет четко локализовать как В-1-клетки (CD19 CD5*), так и В-клетки памя-
ти (СО19‘С027+).
Таким образом, оценка и характеристика В-клеточной популяции лимфоци-
тов является не только важной задачей с точки зрения научных интересов, но и
позволяет практикующему врачу подтвердить или снять диагноз аутоиммунного
процесса. В свою очередь, качественная оценка изменения количества В-клеток
позволяет не только выявить степень активности процесса воспаления и его адек-
ватности, но и оценить активность самих В-клеток в ходе иммунной реакции.
В то же время современные подходы позволяют оценить эффективность уже сфор-
мировавшегося ответа по наличию В-клеток памяти. Расширение потенциальных
возможностей современной проточной цитометрии значительно увеличивает
вероятность и точность оценки всех этих диагностически значимых моментов.
Многоцветовое окрашивание и многоэтапное гейтирование позволяют провести
многопараметрический анализ клеток периферической крови с высокой точно-
стью и достоверностью в одной пробе крови пациента. Данный подход значитель-
но облегчает интерпретацию полученных результатов анализа и позволяет судить
о функционировании В-клеточного звена иммунной системы пациентов при раз-
нообразных патологических состояниях.
Т-ЛИМФОЦИТЫ И ИХ СУБПОПУЛЯЦИИ
Многие микроорганизмы, обитая внутри клеток организма-хозяина, недо-
ступны для гуморального иммунитета, т.е. антител. В частности, вирусы способны
размножаться только внутри клеток, используя репликационную систему клеток
хозяина. Факультативно внутриклеточные микроорганизмы, такие как микобак-
терии и лейшмании, могут размножаться как в клетках, главным образом в макро-
фагах, так и вне клеток, но внутриклеточный способ существования для них более
предпочтителен, поскольку обеспечивает защиту от иммунной системы. Против
внутриклеточных микроорганизмов в организме действует особый механизм
приобретенного иммунитета, а именно клеточный иммунитет. Он обеспечивается
отдельной субпопуляцией лимфоцитов — Т-клетками. В отличие от В-клеток они
дифференцируются в тимусе, откуда и их название. Т-лимфоциты специализиру-
ются на уничтожении клеток организма-хозяина, которые инфицированы вну-
триклеточно размножающимися возбудителями инфекции. Т-лимфоциты играют
важную роль в элиминации опухолевых клеток, в реакциях «трансплантат против
хозяина» и «хозяин против трансплантата», гяперчувствительности замедленного
типа и других реакциях организма, направленных на поддержание гомеостаза.
Оценка как относительного, так и абсолютного количества Т-клеток и их
основных субпопуляций широко распространена в лабораторной практике. При
иммунофенотипировании лимфоцитов эти данные являются диагностически
значимыми при различных патологических состояниях, включая первичные и
вторичные иммунодефициты. Динамика изменения субпопуляционного состава
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 117
Т-лимфоцитов при некоторых патологиях представляет значительную ценность
для контроля эффективности терапии, прогноза течения заболевания.
К маркерам, характеризующим линию Т-лимфоцитов, в первую очередь отно-
сится Т-клеточный рецептор (T-cell Receptor — TcR). TcR — поверхностный
специфический рецептор для распознавания антигена, является гетеродимером,
состоящим из двух цепей с молекулярной массой 40-50 кДа, которые не явля-
ются продуктами генов иммуноглобулинов. Существует два вида TcR, каждый из
которых ассоциируется с разными типами Т-лимфоцитов. TcRl, состоящий из у- и
8-цепей, появляется на ранних стадиях онтогенеза. TcR2 состоит из ос- и р-цепей.
Каждая цепь образует два домена: один из них имеет относительно неизменную
структуру, гомологичную характерной укладке цепи иммуноглобулинов, а другой
обладает большей структурной изменчивостью, поскольку по своему строению
напоминает вариабельные домены иммуноглобулинов (Tab-фрагмент).
Примерно 81,4 -98.4% Т-лимфоцитов представляют собой вариант оф-TcR и
обозначаются как оф-Т-клетки. Остальные 1.6-8,9% Т-лимфоцитов несут на своей
поверхности уб-TcR и обозначаются как у8-Т-клетки.
оф-Т-клетки подразделяются на две различные неперекрывающиеся субпопу-
ляции. Клетки одной из них несут маркер CD4 и в основном способствуют осу-
ществлению иммунного ответа или индуцируют его. Эта субпопуляция получила
название Т-хелперов. Т-клетки другой субпопуляции несут маркер CD8 и облада-
ют преимущественно цитотоксической активностью.
Небольшая часть оф-Т-клеток и большинство у8-Т-клеток, циркулирующих в
периферической крови, не экспрессируют CD4 и CD8. Однако некоторые из них
в< е же экспрессируют молекулы CD8. Напротив, большая часть уб-Т-клеток в тка-
нях экспрессируют CD8. Кроме молекулы CDS, у8-Т-клетки на своей поверхности
могут экспрессировать CD56, CD94, CD161. В свою очередь, цитотоксическую
активность уЗ-Т-клеток возможно стимулировать через CD 122 (p-цепь рецептора
интерлейкина-2).
Одной из особенностей у8-Т-клеток в отличие от сф-Т-клеток является то, что
они распознают непептидные антигены, полученные из микробных патогенов, неза-
висимо от главного комплекса гистосовместимости (МНС — major histocompatability
complex). Эта субпопуляция выполняет ряд важных функций, так как они могут
усиливать иммунный ответ, производя большие количества интерферона у (IFN-y),
фактора некроза опухоли-а (TNF-a) и хемокинов. Кроме этого, уб-Т-клетки имеют
эффекторную (цитотоксическую) активность. С эволюционной точки зрения уб-Т-
клетки занимают уникальное место между высокоспецифичными сф-Т-клетками и
врожденной иммунной системой для выполнения защиты организма от патогенов.
Доказана существенная роль уб-Т-клеток в устойчивости организма против целого
ряда микроорганизмов, так, функциональную значимость уб-Т-клеток отмечали
в устойчивости к Mycobacterium, Boreilia, Francisella tularensis. Salmonella и вирусам,
включая ВИЧ. Кроме того, уб-Т-клетки играют важную роль и в противоопухолевом
ответе, описало значительное увеличение этих клеток у пациентов с некоторыми
видами лимфом. уб-Т-клетки также участвуют в восстановлении эпителия и поддер-
жании гомеостаза. С другой стороны, уб-Т-клетки могут быть вовлечены в патогенез
некоторых иммунопатологических состояний, таких как сахарный диабет, аутоим-
мунные расстройства, болезнь Бехчета, бронхиальная астма.
Содержание уб-Т-клеток в периферической крови может варьировать, суще-
ствуют половые и возрастные различия. Их количество увеличивается с момента
рождения до половозрелости и в дальнейшем постепенно снижается. У женщин
количество уб-Т-клеток несколько выше и высокий уровень сохраняется значи-
тельно дольше, чем у мужчин.
В ответ на действие специфического антигена уб-Т-клетки обладают быстро-
начинающейся (после 4-6 дней), высокой (в 200 раз) и длительной (более 7 мес)
118 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
пролиферативной способностью. Кроме того, в течение иммунного ответа анти-
генспецифические уб-Т-клетки могут составлять до 48-98% общего количества
циркулирующих уб-Т-клеток. Таким образом, обнаружение увеличенной циркули-
рующей субпопуляции уб-Т-клеток позволяет предположить недавнюю или теку-
щую хроническую антигенную стимуляцию, особенно на слизистых оболочках или
участках кожи, что, в свою очередь, позволяет практикующим врачам заподозрить
медленно прогрессирующее заболевание инфекционной природы (табл, 3-3).
Таблица 3-3. Изменения относительного количества уб-Т-клеток при различных заболеваниях
Изменение относительного количества уб-Т-клеток Заболевание
Повышение относительного уровня уб-Т-клеток Вирусные инфекции ВИЧ Цитомегаловирус Вирус Эпштейна-Барр Бактериальные инфекции Mycobacterium tuberculosis (туберкулез легких) Legionella pneumooie (легионеллез) Francisella tularensis (туляремия) Salmonella enteritidis (сальмонеллез) Boreilia burgdorferi (болезнь Лайма) Атопический дерматит (у детей) Болезнь Крона Болезнь Бехчета Первичные иммунодефициты
Понижение относительного уровня уб-Т-клеток Атопический дерматит (у взрослых) Возрастное снижение относительного уровня уб-Т-клеток
На клеточной поверхности и о.[3-, и у8-антигенраспознающие рецепторы
Т-клеток расположены непосредственно рядом с полипептидным комплексом,
имеющим групповое название CD3. Это соседство и ассоциация с CD3 являются
необходимым условием для экспрессии всего рецепторного комплекса на поверх-
ности клеток.
Антиген СОЗ представляет собой комплекс 5 инвариантных полипептидных
цепей: у, 5, е, С, и ц, молекулярные массы которых составляют соответственно
25-28, 21, 20,16 и 22 кДа. Полипептидная цепь С, находится в СОЗ-комплексе как
гомодимер, связанный дисульфидным мостиком, или как гетеродимер с ц-цепью.
Комплекс CD3, в свою очередь, является частью значительно большего комплекса,
который включает TcR. Этот комплекс экспрессируется зрелыми Т-лимфоцитами
и тимоцитами. Активация Т-клеток может быть вызвана за счет взаимодействия
TcR с антигенпредставляющими клетками, несущими процессированный чужерод-
ный антиген в комплексе с антигенами МНС I и II класса.
СЭЗ^-цепь экспрессируется также NK-клетками и большинством (более 90%)
клонов клеток, являющихся производными децидуальных гранулярных лимфоци-
тов, которые СВЗ-отрицательны.
Приведенные факты свидетельствуют в пользу более полной характеристики
Т-клеток пациента, анализ следует проводить не только по такому линейно-
специфическому маркеру, как CD3, но и по наличию субпопуляций а]3-Т-клеток
и уб-Т-клеток. Определение последних важно для целого ряда заболеваний, в
первую очередь к ним относятся ВИЧ-инфекция, вторичные и первичные иммуно-
дефицитные состояния, сопровождающиеся длительной персистенцией микроор-
ганизмов в организме человека на фоне депрессии Т-клеточного звена иммунной
системы. Особенно важным определение уб-Т-клеток становится при оценке обще-
го количества Т-клеток в тех случаях, когда от их количества зависит доза препа-
ратов, например назначение антиретровирусной терапии ВИЧ-инфицированным
пациентам. Количественный анализ Т-клеток является наиболее востребованным
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 11 9
исследованием для иммунологического контроля состояний приобретенного
иммунодефицита, мониторинга за пациентами после трансплантации костного
мозга и эффективности иммунодепрессивной терапии. Стандартные протоколы
иммунофенотипирования, использующие 4 цвета, позволяют проводить иденти-
фикацию субпопуляций Т-лимфоцитов в одном образце. Этот анализ представляет
исследователю намного больше информации, но до последнего времени она нахо-
дилась вне зоны внимания врачей-клиницистов.
При использовании комбинации моноклональных антител CD3/CD4/CD8/
CD45 при обычном анализе периферических Т-клеток достаточно часто наблю-
дается бимодальное распределение экспрессии CD3, которое предполагает нали-
чие двух субпопуляций Т-клеток. Помимо молекул CD3, антигенспецифический
Т-клеточный рецептор является другим пан-Т-клеточным маркером, который
необходимо использовать при анализе данных пациентов с иммунологическими
расстройствами. Как было описано выше, существует два различных типа TcR:
оф-TcR и уб-TcR, различающихся по онтогенезу и функциональным свойствам.
В медицинской практике, как правило, внимание врачей-клиницистов сосредото-
чено прежде всего на сф-Т-клетках, составляющих большую часть Т-лимфоцитов.
Оставшиеся около 5% у8-Т-клеток. как правило, выпадают из зоны внимания
врачей-клиницистов, их рассматривают исключительно при исследовании имму-
нитета слизистых оболочек и в тимусе.
Однако уб-Т-клетки играют значительную роль в защите организма от различ-
ных типов инфекций, знание об их количественном составе должно быть неотъем-
лемой частью анализа иммунного статуса пациентов.
Комбинация моноклональных антител CD3/CD4/CD8/CD45 дает не только
основную информацию о наличии Т-клеток и их основных субпопуляций, но и
позволяет обратить внимание на неоднородность распределения СПЗ-молекулы,
если она есть. В этом случае необходимо проверить контрольную сумму CD3-
позитивных клеток (CD4++CD8+ должно равняться общему количеству CD3+). В слу-
чае если контрольная сумма не совпадает с общим количеством CD3+-лимфоцитов,
следует проверить субпопуляционный состав Т-клеток на наличие сф-TcR и y5-TcR.
Данный этап необходим, так как большинство у8-Т-клеток, циркулирующих в пери-
ферической крови, дважды отрицательны. Другая их особенность заключается в
том, что они имеют более высокую плотность экспрессии молекулы CD3 на своей
поверхности CD3brighr (рис. 3-20). Все эти признаки характерны для у5-Т-клеток.
Для выявления у8- и сф-Т-лимфоцитов, как правило, используют комбинацию
моноклональных антител ap-TcR/y8-TcR/CD3/CD45 (рис. 3-21).
Рис. 3-20. Однопараметрические гистограммы распределения Т-лимфоцитов по плотности CD3
на их поверхности: а — распределение СОЗ-позитивных Т-клеток у здорового донора; б — рас-
пределение СОЗ-позитивных Т-клеток у пациента с вирусом Эпштейна-Барр.
б
120 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
102
«Г-4
10е'-;
0.2%
F2
11.1%
= F3:$^BF4 '
: 14.47^ 74.3%
ш
Рис. 3-21. Примеры деухпараметрических гистограмм распределения Т-лимфоцитов, полученные
в результате многоцветового анализа лимфоцитов периферической крови пациента с хрониче-
ским носительством вируса Эпштейна-Барр.
Таким образом, для наиболее полной фенотипической характеристики Т-лим-
фоцитов и правильного назначения химиотерапевтических препаратов, направ-
ленных на восстановление нормального функционирования защитных систем
организма, необходимо проводить анализ не только линейно-специфического
маркера Т-клеток CD3, но и определять субпопуляционный состав Т-клеток по
экспрессии Т-клеточного рецептора, а именно и сф-TcR, Для этих целей следует
использовать многоцветовой анализ и следующие комбинации моноклональных
антител: CD3/CD4/CD8/CD45 и a₽-TcR/y§-TcR/CD3/CD45.
Помимо описанных выше популяций Т-клеток, в крови человека можно лока-
лизовать как наивные Т-клетки, так и Т-клетки памяти, различающиеся между
собой по функциональным и фенотипическим признакам. Жизненный цикл
Т-клеток в организме делится на две фазы: независимую от чужеродного антигена
стадию дифференцировки Т-клеток и стадию, связанную с присутствием чуже-
родного антигена. Первая завершается появлением в кровотоке зрелых наивных
Т-лимфоцитов, каждый из которых способен отвечать только на «свой» антиген.
Стимулированные антигеном в ходе первичного ответа Т-клетки проходят даль-
нейшую дифференцировку.
Все Т-клетки памяти появляются в результате дифференцировки активиро-
ванных антигеном наивных предшественников в ходе нормального развития
первичного иммунного ответа in vivo. Экспрессия на клеточной поверхности
различных изоформ молекулы CD45 позволяет разделить CD4~ Т-лимфоциты
человека на наивные Т-клетки и Т-клетки памяти. Принято относить субпопуля-
цию CD4+CD45RA’CD45R0+ Т-лимфоцитов к Т-клсткам памяти и соответственно
CD4*CD45RACD45R0 — к наивным Т-клеткам. Подобное разделение основано
исключительно на способности CD4CD45RACD45R0* Т-клеток, а не наивных
Т-лимфоцитов, интенсивно отвечать на повторный контакт с антигеном in vitro.
В свою очередь, быстрый и усиленный ответ Т-клеток памяти на специфический
антиген является их важнейшим функциональным отличием от наивных пред-
шественников.
Покоящиеся CD4+ Т-лимфоциты памяти также отличаются от наивных пред-
шественников системой внутриклеточной сигнализации, приводящей к резистент-
ности к действию Са21 ионофоров. Чувствительная к действию Са2+ ионофоров
популяция CD4 Т-клеток человека составляет основную часть покоящихся
наивных CD4+CD45RA“CD45R0_ Т-лимфоцитов. В свою очередь, большинство
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 121
резистентных к действию ионофоров CD44 Т-клетки являются покоящимися
CD4+CD45RA CD45R0+ Т-лимфоцитами памяти.
Основная методическая сложность в исследованиях процесса дифференцировки
CD4+ Т-лимфоцитов в периферической крови связана с тем, что активированные
клетки составляют лишь незначительную часть. Как правило, в крови здоровых
доноров доля активированных CD4’ Т-клеток составляет менее 10% общего коли-
чества CD4' Т-лимфоцитов.
Однозначным фенотипическим признаком дифференцировки покоящихся наи-
вных CD4+CD45RA+CD45R0~ Т-лимфоцитов человека в покоящиеся Т-клетки памя-
ти принято считать появление на поверхности клеток молекул CD45R0 взамен изо-
формы CD45RA. Данная особенность позволяет выявить три субпопуляции CD4+
Т-лимфоцитов человека: покоящиеся наивные CD45RA CD45R0 Т-клетки, покоя-
щиеся CD45RA‘CD45R0~ Т-клетки памяти и активированные CD45RA+CD45R0+
Т-клетки. Зрелых CD4+CD45RA CD45R0’ Т-лимфоцитов в периферической крови
человека не существует. Все активированные CD4'CD45RA CD45R0+ Т-лимфоциты
появляются в процессе стимуляции наивных клеток антигеном in vivo.
Определение относительного количества CD4*CD45RA’CD45R0_ и CD4 CD45RA’
CD45R01 -лимфоцитов полезно для диагностических целей. При развитии инфекции
или при хирургическом вмешательстве происходит накопление доли CD4CD45RA’
CD45R0+ клеток и снижение CD4’CD45RA CD45R0‘. Для более точной идентифика-
ции этих субпопуляций Т-клеток, как правило, используют многоцветовой анализ и
комбинацию моноклональных антител CD4/CD45RA/CD45R0/CD45 (рис, 3-22).
Появление молекул CD69 считают основным фенотипическим признаком наи-
более ранней (первые часы) стадии активации наивных CD4+ Т-лимфоцитов. Как
правило, в крови здоровых доноров не удается обнаружить присутствие более чем
1-4% CD4+CD69+ Т-клеток.
Экспрессия молекул CD25 на поверхности CD4~ Т-лимфоцитов обычно рассма-
тривается как специфический признак стадии, зависимой от антигена интенсивной
пролиферации активированных Т-клеток. Отсутствие в крови здоровых доноров
зрелых CD4+CD69’CD25+ Т-клеток позволяет корректно разграничить данную
стадию активации Т-клеток от предыдущей.
Популяция CD4’CD25" Т-лимфоцитов человека гетерогенна по функциональ-
ным свойствам и фенотипическим признакам. Она включает популяции проли-
ферирующих CD4rCD45RA+CD45R0 CD25|,-w Т-клеток и регуляторных (T-reg)
CD4+CD45R0'CD25h,gh Т-лимфоцитов. Являясь супрессорами, они играют ведущую
роль во многих иммунологических процессах (таких как аутоиммунные заболевания,
трансплантационный иммунитет, противоопухолевый ответ и иммуногомеостаз):
регулируют Т-клеточный гомеостаз, предотвращают аутоиммунные заболевания,
аллергии, гиперчувствительноцгь, реакции «трансплантант против хозяина». Однако
регуляторные Т-клетки снижают противоопухолевый иммунитет и иммунитет к
инфекциям.
T-reg-клетки имеют фенотип CD3+CD4+CD25hlshCD45R0+CD95+, но наиболее
важным их маркером является FOXP3, который кодирует фактор транскрипции
и является главным регулирующим геном для развития и функционирования
CD4+CD25hish регуляторных Т-клеток. В настоящее время самым точным маркером
для идентификации T-reg-клеток является фактор транскрипции FOXP3. Однако
идентификация этого маркера требует пермеабилизации клеток, что затрудняет
работу по идентификации T-reg-клеток.
Экспрессия CD 127 на T-reg-клетках снижена или отсутствует. В экспериментах
in vitro показано, что экспрессия CD 127 после активации Т-клеток резко снижает-
ся. CD127 представляет собой a-цепь гетеродимерного рецептора IL-7, который
состоит из CD127 и общей у-цепи, которая представлена и у других рецепторов
цитокинов (IL-2R, IL-4R, IL-9R, IL-15R и IL-21R). CD127 экспрессируется на
122 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
CD45R0-ECD
CD45R9-ECD
Рис. 3-22. Распределение лимфоцитов условно здорового человека (а и в) и пациента в послео-
перационный период (б и г). На гистограммах в и г анализ лимфоцитов проводили только с
гейтированием по CD45. На гистограммах а и б анализировали клетки при помощи многоэтапного
гейтирования по CD45 и CD4.
тимоцитах, Т- и В-предшественниках, зрелых Т-клетках, моноцитах и некоторых
других лимфоидных и миелоидных клетках. Доказано, что IL-7R играет важную
роль в пролиферации и дифференцировке зрелых Т-клеток.
Таким образом, окончательный фенотип T-reg-клеток будет выглядеть сле-
дующим образом: CD3+CD4+CD25brifihtCD127dim t0 nf!gFOXP3+, но для их определения
можно использовать фенотип T-reg без выявления FOXP3. Для более точной
локализации T-reg-клеток предпочтительнее использовать многоцветовой анализ
и многоэтапное гейтирование с использованием набора моноклональных антител
CD45/CD4/CD25/CD127.
NK-КЛЕТКИ и их субпопуляции
К одной из наиболее важных популяций иммунокомпетентных клеток относятся
NK-клетки. Среди больших гранулярных лимфоцитов (Large Granular Lymphocytes —
LGL) выделяют отдельную популяцию клеток, получившую название естествен-
ных киллеров, или NK-клеток (NaturalKiller). За счет цитолитической активности
против клеток-мишеней и способности продуцировать цитокины NK-клетки явля-
ются важным компонентом врожденной иммунной системы. Первоначально они
были описаны на основании их функциональной способности уничтожать клетки
некоторых опухолей гемопоэтического происхождения без предшествующей
стимуляции. Таким образом, одной из основных функций данной субпопуляции
иммунокомпетентных клеток является защита организма от видоизмененного
своего.
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 123
NK-клетки являются носителями двух основных функций: первая — лизис
опухолей и клеток, инфицированных вирусами, вторая — регуляция врожденного
и адаптивного иммунных ответов с помощью секреции хемокинов (CCL3. CCL4,
CCL5 и XCL1) и цитокинов (GM-CSF, TNF-a и IFN-y).
Способность NK-клеток взаимодействовать и ликвидировать опухолевые клет-
ки возможна за счет нескольких специализированных рецепторов, распознающих
молекулы МНС класса I. Эти рецепторы формируются на NK-клетках при ассоциа-
ции молекул CD94 с молекулами семейства NKG2 (CD 159).
В свою очередь, NK-клетки являются субпопуляцией лимфоцитов, наиболее
чувствительной к физиологическим и психологическим стрессам. Доказано выра-
женное воздействие высоких физических нагрузок на NK-клетки. Их цитолити-
ческая активность увеличивается при нарастании физической нагрузки и умень-
шается после ее окончания в течение нескольких часов. Это отражается главным
образом на распределении NK-клеток с небольшими изменениями их цитотокси-
ческой активности.
В периферической крови NK-клетки составляют 5-20% циркулирующих лим-
фоцитов. В табл. 3-4 приведены примеры взаимосвязи изменения активности и
количества NK-клеток с клиническими признаками или увеличением риска забо-
леваний у людей. Относительное количество NK-клеток и их активность суще-
ственно изменяются не только при опухолевых процессах и вирусной инфекции,
но и при гнойном воспалении, нарушении функций ЦНС, аутоиммунных заболева-
ниях и т.д. Вероятно, что в результате применения более тонких и точных методов,
таких как проточная цитометрия и многопараметрический анализ, будут выявле-
ны и другие изменения в субпопуляциях этих клеток при различных патологиях.
Таблица 3-4, Примеры отклонений в активности и количестве NK-клеток, связанные с проявлени-
ем клинических признаков или увеличенным риском заболеваний у людей
Изменение количе- ства и активности NK-клеток Патологические состояния Ассоциированные симптомы и риски
Постоянно низкие активность и количе- ство NK-клеток Приобретенный или врожденный иммунодефицит, включая СПИД. Синдром Чедиака-Хигаси. Дефицит CD11/CD18 молекул семей- ства клеточной адгезии. Онкологические заболевания: онкологические заболевания,связан- ные с наследственностью; лейкемия; Х-связанный лимфопролиферативный синдром; рак молочной железы: рак шеи и головы (до терапии); терапия цитостатиками. Вирусная инфекция (цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр, вирус герпеса). Другие вирусные и бактериальные инфекции. Аутоиммунные заболевания. Психические расстройства: синдром дефицита NK-клеток; синдром хронической усталости; депрессия; хронический стресс Высокий риск возникновения онкологи- ческих заболеваний и достаточно частые инфекционные заболевания. Повышенный риск образования лимфом. Увеличенная восприимчивость к вирус- ным инфекциям. Распространение метастазов. Вероятность появления злокачественно- го образования выше нормального. Предшествует рецидиву. Повышенная чувствительность к вирусу Эпштейна-Барр. Неблагоприятный прогноз. Неблагоприятный прогноз. Более высокая вероятность рецидива. Более высокие частота, серьезность и продолжительность заболевания. Более высокие частота, серьезность и продолжительность заболевания. Возможны более активное течение болезни, увеличенная частота инфекций. Усталость, сниженная восприимчивость, лихорадка. Повышенная утомляемость, апатичность, частые вирусные заболевания. Более серьезные признаки. Неспособность справляться с ежеднев- ными проблемами, усталость
124 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Окончание табл. 3-4
Изменение количе- ства и активности NK-клеток Патологические состояния Ассоциированные симптомы и риски
Постоянно высокие активность и количе- ство NK-клеток Пролиферация NK-клеток: хроническая пролиферация больших гранулярных лимфоцитов (LGL- пролиферация); острая пролиферация больших гранулярных лимфоцитов (LGL- пролиферация), гепатит LGL-лимфоцитоз, цитопения, спленоме- галия. Встречается одновременно с активной лейкемией/лимфомой. Нет данных
Для локализации NK-клеток среди других лимфоцитов используют монокло-
нальные антитела, распознающие различные маркеры, экспрессируемые на их
поверхности. Однако многие поверхностные молекулы NK-клеток представлены и
на других субпопуляциях лимфоцитов, что накладывает свои особенности на иден-
тификацию этих клеток. Для их выявления среди других лейкоцитов используют
уникальную комбинацию из нескольких маркеров, таких как CD56 и CD 16. В то
же время NK-клетки не экспрессируют такие линейные маркеры, как CD3, CD14 и
поверхностные 1g, и это также используется при их локализации.
Одним из основных маркеров, используемых для выявления NK-клеток, явля-
ется молекула CD16. Антиген CD16 представляет собой низкоаффинный рецеп-
тор для IgG (FcyRIII). Данный антиген существует в двух различных формах,
кодируемых двумя различными генами: FcyRIIIA (или Ш-2) и FcyRIIIB (или
III-1). Генетическая разнородность CD 16 приводит к альтернативным путям ассо-
циации молекул с мембраной клеток. Первая, трансмембранная форма (FcyRIIIA,
50-65 кДа) экспрессируется на NK-клетках. моноцитах и макрофагах. Другая
форма (FcyRIIIB. 48 кДа), ассоциированная с мембраной за счет гликозилфосфа-
тидилинозитола (GPI), экспрессируется только на нейтрофилах. Антиген CD16 на
мембране NK-клеток может быть нековалентно связан с гомо- или гетеродимера-
ми, состоящими из СБЗС-цепи и FcrRIy-цепи, которые, в свою очередь, связаны
между собой дисульфидными мостиками.
Другим антигеном является молекула CD56. Данный антиген представляет
собой изоформу N-CAM (Neural Cell Adhesion Molecule) с молекулярной массой
140 кДа. Посттрансляционные модификации полипептида N-CAM включают
N- и О-гликозилирование. ацилирование, сульфатирование и фосфорилиро-
вание. Различные изоформы N-САМ имеют молекулярную массу в пределах
135-220 кДа. СО56-антиген умеренно экспрессируется на субпопуляциях клеток
периферической крови, таких как большие гранулярные лимфоциты, и всех клет-
ках с NK-активностью. Молекула CD56 также экспрессируется отдельными субпо-
пуляциями Т-лимфоцитов.
Циркулирующие зрелые NK-клетки имеют фенотип CD3 CD56+CD16~CD2dim
и отличаются от Т-клеток отсутствием Т-клеточного рецептора и CD3. Отличие
от В-клеток заключается в том, что NK-клетки никогда не экспрессируют мем-
бранные 1g, но за счет экспрессии FcyRIII они могут быть позитивными при
окрашивании антителами. Поверхностные маркеры, экспрессируемые активи-
рованными NK-клетками, включают ряд молекул, таких как CD25, другие типы
Fc-рецепторов, pi (CD29)- и £2 (CD18) интегрины, различные активационные
антигены, включая HLA-DR, CD71 и CD69. В зависимости от степени активации
NK-клеток поверхностные рецепторы могут менять свою экспрессию за счет повы-
шения или понижения.
Популяция NK-клеток обладает достаточной гетерогенностью по составу.
Выделяют несколько подтипов этих клеток, а именно npe-NK-клетки, зрелые
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 125
NK-клетки и активированные NK-клетки, у которых различна экспрессия мар-
керов клеточной поверхности. Среди популяции циркулирующих NK-клеток
выделяют две основные субпопуляции: первая экспрессирует CD16 и низкий
уровень CD56 (CD16*<OThigh>CD56dlin), вторая экспрессирует CD56, но CD16 на них
представлен в низкой плотности или полностью отсутствует (CD16'(Mlow>CD56bliBh’).
Последняя субпопуляция составляет приблизительно 10-20% общего количества
NK-клеток. Они секретируют интерферон у и другие цитокины, имеют мень-
шую цитолитическую активность. В свою очередь, субпопуляция CD16hiellCD56<to
составляет приблизительно 80-90% NK-клеток периферической крови, они слабо
секретируют цитокины, но обладают высокой цитолитической активностью.
NK-клетки экспрессируют на своей поверхности многочисленные маркеры:
CD2, CD5, CD7, CD8, CD94. CD96, CD158, CD159 и др. Однако для локализации
и характеристики NK-клеток наиболее широко используют двухпараметрический
анализ экспрессии CD 16 и/или CD56 на CD3-негативных клетках. Данная ком-
бинация моноклональных антител позволяет локализовать общую популяцию
NK-клеток и количественно охарактеризовать ее, но не подтипы клеток.
Достаточно часто NK-клетки экспрессируют на поверхности a-цепи CD8, но
в более низкой плотности, чем цитотоксические Т-клетки. Показано, что субпо-
пуляции NK-клеток человека, экспрессирующие о/a гомодимер CD8, обладают
большей цитотоксичностью, чем CD8’ NK-клетки. Соединение CD8 а-цепей
в гомо димер индуцирует быстрое повышение внутриклеточных ионов Са2т и
инициированное этим увеличение экспрессии CD69. Хотя секреция цитолитиче-
ских ферментов инициирует апоптоз NK-клеток, приток экзогенных ионов Са2+
защищает CDScx* NK-клетки от этого. Эта защита от апоптоза может быть снята
преинкубацией NK-клеток с антителами против МНС класса I. Таким образом,
данный механизм позволяет CD8a+ NK-клеткам сохранять жизнеспособность и
участвовать в лизисе клеток-мишеней.
Большое внимание уделяют экспрессии CD38 на поверхности NK-клеток.
Молекула CD38 — мембранный гликопротеин, представляющий собой фер-
мент, регулирующий концентрацию цитоплазматического кальция. Кроме того,
данный фермент обладает рядом других активное гей: аденозиндифосфат-рибо-
зил-циклазной, циклической аденозиндифосфат-рибозил-гидролазной и NAD-
гликогидролазной. Данная молекула также выполняет роль рецептора, модулируя
межклеточные взаимодействия, и является переносчиком трансмембранных сиг-
налов. Молекула CD38 экспрессируется на активированных Т-, В-, NК-клетках и
других типах клеток.
Вызванный NK-клетками цитотоксический эффект на клетки-мишени сопро-
вождается тесным контактом между ними, причем этот контакт предшествует
выбросу цитотоксических гранул. Таким образом, ведущую роль в установлении
этого контакта выполняют молекулы клеточной адгезии. Данные молекулы также
вовлечены в сигнальную систему, приводящую к выбросу цитотоксических гранул.
Молекулы LFA-1 на лимфоцитах и ICAM-1 на клетках-мишенях представляют
собой основу для межклеточных взаимодействий цитотоксических лимфоцитов
и реализации их функции. LFA-1 — гетеродимерный рецептор, формирующийся
в результате ассоциации цепи ас-ингегрина (CDlla) с цепью р2-интегрина CD18.
Антитела, взаимодействующие с молекулами LFA-1, блокируют цитотоксичность,
вызываемую NK-клетками. У пациентов с заболеванием, связанным с дефици-
том адгезии лейкоцитов, отмечается недостаток как в LFA-1, так и в активности
NK-клеток. Данная аномалия является генетически обусловленным дефектом
CD18. Для выявления NK-клеток, обладающих цитотоксической активностью и
способных ее реализовать, необходима локализация NK-клеток, экспрессирую-
щих молекулы CDlla, причем необходимо оценивать не только наличие CDlla на
NK-клетках, но и плотность экспрессии данных молекул.
126 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Таким образом, для наиболее полной характеристики NK-клеток необходимо
определить на СЭЗ-негативных клетках следующие поверхностные маркеры:
CD16, CD56, CD38, CD8 и LFA-1. При этом CD38, CD8 и LFA-1 позволяют оце-
нить цитотоксическую активность NK-клеток пациента и, как следствие этого,
более корректно представлять картину, происходящую на данном этапе развития
иммунного ответа. Для этих целей рекомендуют использовать следующие комби-
нации моноклональных антител: CD3/CD16/CD56/CD45, CD3/CD8/CD38/CD45
и CD3/CD1 la/CD56/CD45.
Применение двухцветового окрашивания лимфоцитов с использованием ком-
бинации антител CD3, CD56+CD16 позволяет локализовать NK-клетки и оценить
их абсолютное и относительное количество. Однако в этом случае отсутствует воз-
можность определить их подтипы.
Другим вариантом окрашивания лимфоцитов для выявления NK-клеток явля-
ется использование комбинации антител CD16 и CD56. Но в этом случае результат
получается несколько завышенным, поскольку дополнительный вклад вносят
Т-клетки, так как они могут экспрессировать на своей поверхности CD56 и CD16.
Это особенно ярко проявляется при различных заболеваниях, когда резко возрас-
тает количество Т-клеток, экспрессирующих данные структуры. Задачу разделе-
ния этих типов клеток позволяет решить применение многоцветового анализа и
комбинации моноклональных антител CD3/CD16/CD56/CD45. CD45 используют
для локализации всей популяции лимфоцитов, что является более корректным
по сравнению с гейтированием по морфологическим параметрам FS и SS. В свою
очередь, CD3 позволяет исключить из анализа Т-клетки.
CD38+CD8' NK-клетки обладают высокой цитолитической активностью, поэ-
тому знание о наличии данной субпопуляции, относительном и абсолютном ее
количестве имеет важное диагностическое значение. Для локализации CD38+CD8+
NK-клеток возможно использование двухпараметрического анализа, но более
корректно применять трех- и четырехцветовой анализ (CD3/CD8/CD38 и CD3/
CD8/CD38/CD45).
В случае использования комбинации CD3/CD8/CD38 для выделения лимфо-
цитов используют морфологические параметры, однако существует вероятность
исключения из анализа части больших гранулярных лимфоцитов, которые могут
просто не попасть в выделенную зону при гейтировании. Использование CD45 для
локализации всей популяции лимфоцитов является более корректным.
Комбинация моноклональных антител CD3/CD8/CD38/CD45 и многоэтапное
позитивное и негативное гейтирование позволяют четко выделить активирован-
ные NK-клетки.
Дальнейший анализ проводят на отдельных гистограммах с использованием
логических ограничений по зонам позитивных и негативных по CD3 клеток. На
гистограмме, полученной с использованием гейтирования по CD3+, находят акти-
вированные цитотоксические Т-клетки с фенотипом CD8brishtCD38’ .
Аналогичная процедура, но с гейтированием по зоне СОЗ-негативных клеток,
позволяет выявить активированные NK-клетки с фенотипом CD8(1:n,CD38’. Данное
утверждение правомерно, поскольку CD8 экспрессируется не только на Т-клетках,
но и на части популяции ССЗ-негативных клеток, а именно NK-клетках.
Таким образом, используя комбинации моноклональных антител, можно в
одном образце выявить активированные цитотоксические Т-клетки и активиро-
ванные NK-клетки.
В последние годы становится весьма очевидной необходимость при типировании
NK-клеток выявлять общее количество и содержание отдельных их субпопуляций.
NK-клетки и их цитотоксическая функция имеют ведущее значение при опухо-
левых и вирусиндуцированных процессах.
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 127
Регуляторная функция у отдельных субпопуляций NK-клеток ставит вопрос об
их клиническом и патогенетическом значении.
Данные о наличии активационных рецепторов NK-клеток позволяют по-новому
оценить их функциональную активность, не осуществляя трудоемких и весьма
затратных экспериментов по кил линту клеток-мишеней.
Появилась возможность оценить степень воздействия медикаментозной тера-
пии на собственно NK-клетки как в норме, так и при патологии, как in vivo, так и
in vitro. Это позволяет значительно расширить возможности клинической фарма-
кологии по поиску средств, влияющих непосредственно на данную группу клеток
(химиотерапия опухолей, противовирусная терапия и др.).
Изучение субпопуляций NK-клеток и их функциональной активности может
повлиять на представления о природе патологических процессов. Это весьма
важно как для известных патологий, где значение NK-клеток уже определено, так
и для других процессов, при которых значимость врожденных механизмов имму-
нитета недостаточно изучена. Как следствие, новые данные могут способствовать
более корректной иммунотерапии различных патологических состояний с учетом
ее влияния на данные клетки.
Использование возможностей современной проточной цитометрии позво-
ляет получить более точные данные о протекающих в организме изменениях в
короткие сроки. В свою очередь, применение 3, 4 и более флюоресцентных меток
позволяет более корректно интерпоетировать клинико-лабораторные результаты
обследования пациентов с различными патологиями, в основе которых лежат
механизмы нарушений количества и активности NK-клеток.
Фенотипирование лимфоцитов периферической крови
Для оценки показателей иммунограммы разработана многоцветовая панель
моноклональных антител (табл. 3-5).
Таблица 3-5. Панель моноклональных антител для анализа основных и малых популяций лимфо-
цитов периферической крови
Флюорохромы FITC РЕ ECD РС5
Моноклональные антитела CD19 CD5 CD45 CD27
CD8 CD4 CD3 CD45
CD16 CD56 CD3 CD45
CD8 CD38 СОЗ CD45
CD45RA CD4 CD45R0 CD45
CD4 CD127 CD25 CD45
у5-ТсЯ Сф-TCR СОЗ CD45
CD3 CD25 HLA-DR CD45
Анализ В-1-, В-2-лимфоцитов и В-клеток памяти в периферической крови
человека с использованием этой комбинации моноклональных антител позволил
определить интервалы распределения относительного и абсолютного количества
этих субпопуляций у практически здоровых доноров, результаты представлены в
табл. 3-6. Использование дополнительного логического ограничения по CD19+-
клеткам позволило получить дополнительную информацию по интервалам рас-
пределения В-1-, В-2-клеток и В-клеток памяти внутри популяции В-лимфоцитов
практически здоровых доноров (табл. 3-7).
Для наиболее полной фенотипической характеристики Т-лимфоцитов про-
водили анализ не только линейно-специфического маркера Т-клеток CD3, но
и определяли субпопуляционный состав Т-клеток по экспрессии Т-клеточного
128 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
рецептора, а именно уб- и оф-TcR (см. табл. 3-5). В случае анализа оф-Т-клеток и
уб-Т-лимфоцитов использование дополнительного логического ограничения по
СВЗ+-клеткам позволило получить дополнительную информацию по интервалам
распределения этих клеток в основной популяции Т-клеток (см. табл. 3-7).
Количество наивных Т-лимфоцитов было проанализировано с помощью ком-
бинации моноклональных антител CD4/CD45RA/CD45R0/CD45. Применение
многоцветового анализа и комбинации моноклональных антител CD3/CD16/
CD56/CD45 позволило локализовать не только популяции NK- и T-NK-клеток,
но и отдельные малые субпопуляции NK-клеток, имеющие фенотип CD16*(ur lligh)
CD56dim и CD16‘(or,ow)CD56brisht. Результаты анализа общих NK-клеток, малых суб-
популяций NK-клеток и T-NK-клеток взрослых, практически здоровых доноров
представлены в табл. 3-6 и 3-7.
Таблица 3-В. Интервалы распределения популяций лимфоцитов в зависимости от их фенотипов
практически здоровых доноров
Субпопуляции Содержание
относительное, % абсолютное количество, х10’/л
В-клетки (CD3-CD19+HLA DR CD45") 7-17 0,111-0,376
В-1-клетки (CD19'CD5+CD27 CO45+) 0,5-2,1 0,022-0,115
В-2-кпвтки (CD19+CD5-CD27-CD45") 6,5-14,9 0.081-0,323
В-клетки памяти (CD19tCD5CD27,C D45+) 1,8-6,8 0,012-0,040
NK-клетки (CD3-CD16+CD56+CD45+) 8-18 0,123-0,369
NK-клетки цитолитические (CO3_CD16’(Qrhieh)CD56d'r’CD45‘) 0,2-1,0 0,003-0,022
NK-клетки цитокин продуцирующие (CD3~CD16 CD56br,r'CD45’) 7,8-17,0 0.120-0,347
Т-клетки (CD3+CD19-CD45*) 61-85 0,946-2,079
Т-хелперы (CD3*CD4+CD8"CD45*) 35-55 0,576-1,336
Т-цитотоксические (С03+С08+С04’С045+) 19-35 0,372-0,974
Т-хелперы активированные/памяти (CD4+CD45RCHCD45FWCD45+) 5-25 0,068-0,702
Т-хелперы наивные (CD4+CD45RA*CD45R0-CD45+) 20-40 0.272-1,123
сф-Т-клетки (CD34ap’TcR757cR-CD45’) 60,8-80,2 0,924-1,964
уб-Т-клетки (СОЗ’уб-^сф TcFTCD45‘) 1.8-7,4 0,022-0,115
T-NK-клетки (CD16 CD56‘CD3+CD45+) 0,5-6,0 0.007-0,165
Т-клетки актив. (CD3*HLA‘DR‘CD25’CD45+) 0,5-6,0 0,007-0,165
Регуляторные Т-клетки (CD4*CD25brlEtltCD 127l,eyCD45*) 0,6-1,1 0,009-0,078
Индекс соотношения (Т-хелперыЯ-цитотоксические) 1,5-2.6
Таблица 3-7. Интервалы распределения содержания малых субпопуляций лимфоцитов в пери-
ферической крови взрослых, практически здоровых доноров относительно основных популяций
лимфоцитов
Субпопуляции Содержание клеток, %
В-1-клетки Относительно общих 4,1-17,5
В-2-клетки В-клеток 82,1-96,3
В-клетки памяти 22,8-39,7
уб-Т-клетки Относительно общих 1,7-12,6
сф-Т клетки Т-клеток 87,2-98,4
Рис. 3-4. Схема основного рабочего окна программ сканерной системы «Эксперт-Лаб».
Рис. 3-6. Лунки с тестируемыми положительными (А8) и отрицательными (А9) сыворотками:
а — до программной обработки: б — после контрастирования; в — визуальное представление
результатов математической обработки, отражающее количество конгломератов.
определения антител к Тг. pallidum, HCV и HTLV в тесте агглютинации желатиновых частиц фирмы
Serodia.
Рис. 3-10. Гемагглютинация в лунках круглодонного планшета при определении групп крови с
помощью цоликлонов.
Рис. 3-11. Калибровочная кривая и значения концентрации общего ПСА, рассчитанные при
использовании линейно-кусочной аппроксимации
Рис. 3-13. Окно программы «Эксперт-Лаб-Видеодот» после построения калибровочной кривой и
введения пороговой величины.
Рис. 3-15. Схема канала прямого светорассеяния.
Рис. 3-16. Схема канала бокового светорассеяния.
Рис. 3-30. Стадии реакции ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени.
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 129
Окончание табл. 3-7
Субпопуляции Содержание клеток, %
Регуляторные Т-клетки Относительно Т-хелперов 1,65-5,75
CDi6‘<Qrt,'“ll>C056’li'n NK-клетки цитолитические Относительно общих 2,5-6,25
CDIfi-’oritMCDSe'’* NK-клетки цитокинпродуцирующие NK-клеток 93,75-97,5
Таблица 3-8. Сравнение полученных авторами интервалов распределения основных субпо-
пуляций лимфоцитов в периферической крови взрослых здоровых людей с литературными
данными
Субпопуляции Zirfovec Lepej S. et al. (2003) n=50 Pope V. et al. (1994) P=246 Comans-Bitter WJVl. et aL (1997) n=51 Тотолян AA и др. (1999) Хайдуков С В_ Зурочка АЕЦ Тотолян АА (Л=356)
Т-лимфоциты (CD3+) 73,3 (59,0-88,2) 72,1 (54-85) 72 (55-83) 70 (60-80) 73 (61-85)
Т-хелперы (CD3*. CD4*) 43,8 (34,9-64,3) 44,1 (32-58) 44 (28-57) 41,5 (33-50) 45 (35-55)
Т-цитотоксические (CD3+, CD8+) 23,9 (11,0-37,1) 31,2 (19-44) 24 (10-39) 27,5 (16-39) 27 (19-35)
Т-активированные (CD3\ HLA-DR*) 1,9 (0,5-25,9) Нет данных 5(2-12) Нет данных 3 (0,5-6)
В-лимфоциты (CD19*) 9,7 (4,4-26,4) 13,3 (6-23) 12(6-19) 13,5 (5-22) 12(7-17)
NK-клетки (CD3-, CD16\ CD56*) 3,9 (0,4-19,3) 12,2 (5-23) 13 (7-31) 11,5 (3-20) 15 (12-18)
Литературные источники свидетельствуют о близости референтных интервалов рас-
пределения основных субпопуляций клеток иммунной системы практически здоровых
людей в разных местах проживания (табл. 3-8). Однако остается открытым вопрос о
нормах, связанных с региональными особенностями отдельных областей и этни-
ческими группами населения Российской Федерации. Развитие проточной цито-
метрии в России привело к широкомасштабному применению оценки основных
субпопуляций лейкоцитов и их активационных маркеров в клинической практике,
причем не только в целях выявления количественных дефектов этих клеток, но и
для диагностических целей (диагностики аутоиммунных процессов, септических
состояний и др.). Учитывая насущную необходимость в формировании референт-
ных интервалов нормативных показателей различных клеточных субпопуляций,
была предпринята попытка регламентации нормативных показателей популяций
и субпопуляций лимфоцитов по их фенотипу. Подобранная оптимальная комбина-
ция моноклональных антител и использование многоцветового цитометрического
анализа с многоэтапным гейтированием могут служить основой для исследовате-
лей и врачей-иммунологов при трактовке результатов у пациентов с той или иной
иммунопатологией.
Проточная цитометрия для исследования функциональных
особенностей клеток иммунной системы
Клеткам иммунной системы присущи определенные функции, которые они
выполняют в ответ на внешние раздражители. Наличие или отсутствие такого
ответа может о многом сказать специалисту, например нейтрофилы как эффек-
торы играют важную роль в неспецифическом иммунном ответе для обеспечения
резистентности организма, индуцируют и регулируют деятельность различных
130 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
клеток иммунной системы. Нарушение фагоцитарной активности как одной из
основных функциональных характеристик нейтрофилов является индикатором
снижения устойчивости организма к инфекционным заболеваниям.
Наиболее часто используемые приложения метода проточной цитометрии для
данного рода исследований — измерение фагоцитарной и бактерицидной актив-
ности нейтрофилов, мониторинг септического состояния пациентов, измерение
количества клеток, находящихся на различных стадиях программируемой клеточ-
ной гибели, а также определение пролиферативной активности клеток.
Определение фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов.
Изменение фагоцитарной активности нейтрофилов может стать результатом
разнообразных клинических расстройств. Известны врожденные дефекты, такие
как дисфункция актина и дефицит рецептора комплемента C3bi. В результате
сниженного фагоцитоза нейтрофилов эти дефекты могут привести к повы-
шенной восприимчивости к инфекциям. Приобретенные дефекты, связанные с
изменением фагоцитарной активности, обнаруживают при травмах, сахарном
диабете, почечной недостаточности и инфекциях. Так, снижение фагоцитарной
активности было обнаружено у пациентов с текущими бактериальными инфек-
циями кожи и легочного синуса, при инфицировании ран от ожогов, у пациентов
со СПИДом.
Процесс фагоцитоза разделяют на несколько стадий: хемотаксис (пере-
мещение фагоцитов к воспаленным участкам), адгезию (прилипание частиц к
поверхности фагоцитов), собственно фагоцитоз и внутриклеточное уничтожение
фагоцитированных объектов. Использование метода проточной цитометрии и
флюоресцентно меченных частиц (бактерий, дрожжей, латексных частиц) для
измерения стадии собственно фагоцитоза значительно облегчило анализ этой
важной функции нейтрофилов. Однако данный метод не обеспечивал регистра-
цию различий между частицами, находящимися внутри клеток, и теми части-
цами, которые могли прикрепиться к их поверхности. Эту проблему удалось
преодолеть путем подавления флюоресценции прикрепившихся снаружи частиц
за счет использования витальных красителей, таких как трипановый синий и
кристаллический фиолетовый.
Для регистрации фагоцитарной активности нейтрофилов рядом компаний были
разработаны коммерческие наборы, которые с успехом применяются в настоящее
время. В частности, к ним относится PHAGOTEST'X компании ORPEGEN Pharma
(Германия), который позволяет количественно определить фагоцитарную актив-
ность нейтрофилов. Измеряется процент фагоцитов, поглотивших бактерии, и их
активность (количество бактерий в клетке).
Анализ кислородного взрыва. Нейтрофилы играют важную роль в неспеци-
фическом иммунном ответе и резистентности органи зма, нейтрализуя чужеродные
объекты. Поглощенные микроорганизмы уничтожаются за счет как зависимых,
так и не зависимых от кислорода механизмов. Свободные радикалы кислоро-
да убивают поглощенные бактерии в фагосомах и частично высвобождаются в
окружающую среду, с одной стороны, усиливая уничтожение микроорганизмов,
а с другой — повреждая окружающие ткани. Этот эффект получил название
окислительного, или кислородного, взрыва. Данный процесс усиленно протекает
при ос гром воспалении и в меньшей степени при хроническом течении болезни.
Уничтожение микроорганизмов также возможно за счет белков в азурофильных
гранулах, таких как катепсин G, лизоцим, интерфероны и др.
Снижение или отсутствие кислородного взрыва наблюдается при врожденных
дефектах, например хроническом гранулематозе. Данное заболевание обычно
проявляется в течение первых двух лет жизни и характеризуется клинически
повторяющимися и опасными для жизни инфекциями, вызванными бактериаль-
ными и грибковыми микроорганизмами. Эти инфекции клинически проявляются
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 131
как пневмонии, лимфадениты или абсцессы, которые затрагивают лимфатические
узлы, легкие и печень. Одну из ведущих ролей при этом играет НАДФН+-оксидаза,
которая представляет собой систему ферментов, ответственных за продукцию
супероксид-анионов, которые быстро преобразуются в перекись водорода и
гидроксильные радикалы. Нарушения структуры основных пептидов НАДФН+-
оксидазы являются главной причиной дисфункций при хроническом гранулемато-
зе, так как нейтрофилы у данных пациентов не могут осуществить значительный
окислительный взрыв после активации. Данные нарушения наблюдаются также
при трансплантациях и у пациентов со СПИДом.
Коммерческие наборы для измерения кислородного взрыва, так же как и для
измерения фагоцитарной активности, присутствуют на рынке. Процедура изме-
рения фагоцитоза представляет собой многоэтапный и многофакторный процесс,
специалист должен контролировать его на всех этапах. Высокая производитель-
ность современных цитометров и большие выборки анализируемых клеток делают
этот метод более достоверным по сравнению с микроскопией.
Мониторинг септического состояния Достаточно часто нарушения фаго-
цитарной активности и окислительного взрыва наблюдаются при септическом
шоке. Исследование его патогенеза все более сосредоточивается на роли иммун-
ной системы, поскольку изменения ее функций являются главным фактором
риска для развития серьезных инфекций у пациентов, которые подвергались
хирургическому вмешательству. Так, многочисленные отклонения механизмов
иммунной защиты возникают у тяжелобольных пациентов в послеоперационном
периоде. К ним относятся понижение экспрессии макрофагами антигенов глав-
ного комплекса гистосовместимости класса II (HLA-DR), измененная активация
Т-клеток, пониженный хемотаксис и фагоцитоз нейтрофилов. Данные нару-
шения были описаны также при раневой инфекции и травмах. Снижение экс-
прессии HLA-DR связывают с усилением продукции IL-10, поскольку сыворотка
пациентов с сепсисом снижает экспрессию HLA-DR, а моноклональные антитела
к IL-10 блокируют этот эффект. Активно влияют на снижение экспрессии HLA-
DR-антигенов и глюкокортикоиды. Таким образом, снижение экспрессии моно-
цитами HLA-DR-антигенов, которые играют критическую роль в представлении
антигена Т-хелперам, является признаком развивающейся инфекции в послео-
перационном периоде, а анализ экспрессии HLA-DR в течение первых двух дней
после операции может служить основанием для применения более раннего тера-
певтического вмешательства.
Клинические и экспериментальные данные свидетельствуют о том, что паци-
енты с низкой экспрессией HLA-DR на моноцитах должны получать терапию с
использованием иммуномодуляторов, таких как интерферон у, растворы, обо-
гащенные глутамином, гликопептиды, содержащие мурамил, и другие препараты
для стимуляции иммунной системы.
Все перечисленные выше данные привели к тому, что была предложена мето-
дика мониторинга септического состояния пациентов с открытыми травмами в
послеоперационном периоде.
Принцип оценки септического состояния заключается в измерении экспрессии
HLA-DR-антигенов на поверхности моноцитов, для этого используют цельную
периферическую кровь (рис. 3-23). Анализ проводят на двух окрашенных образ-
цах, один из которых является контрольным. Для локализации моноцитов при-
меняют CD 14, рецептор эндотоксина липополисахарид (LPS), являющийся одним
из основных маркеров для моноцитов. Экспрессию HLA-DR измеряют с помощью
многопараметрического анализа и сравнивают с контрольным образцом, где вме-
сто моноклональных антител к HLA-DR применяют неспецифические антитела
того же изотипа.
132 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Рис. 3-23. Гистограмма распределения моноцитов в зависимости от экспрессии HLA-DR-антигенов:
а — гистограмма пациента с нормальной экспрессией молекул HLA-DR на моноцитах перифери-
ческой крови; б — гистограмма больного с сепсисом на 10-е сутки от начала заболевания.
Критерием оценки состояния пациента при сепсисе служит относительное
количество моноцитов, экспрессирующих HLA-DR; прогноз благоприятен, если
количество позитивных клеток превышает 40% на 5-й день после госпитализации
и проведения соответствующей терапии. Данный критерий был получен на госпи-
тализированных пациентах с септическим шоком. В первые 48 ч госпитализации
экспрессия HLA-DR на моноцитах значительно снижена у пациентов с сепсисом
(25±4%) по сравнению со здоровыми донорами (89+1%). Экспрессия HLA-DR на
моноцитах выживших пациентов в первые 48 ч после госпитализации не отлича-
ется от этого показателя у больных, впоследсз вии погибших. Однако экспрессия
HLA-DR на моноцитах у оставшихся в живых пациентов на 5-й день госпита-
лизации более выраженная (выше 40%), что свидетельствует о восстановлении
иммунного статуса.
Таким образом, в период разгара септического состояния более 50% популяции
моноцитов не экспрессируют HLA-DR-молекулы на своей поверхности. В период
клинической ремиссии заболевания экспрессия данных молекул восстанавлива-
ется практически до нормальных значений. Данный показатель может служить
дополнительным критерием диагностики сепсиса и оценки эффективности прово-
димых лечебных мероприятий. Процедура оценки дефекта презентации антигена
доступна для использования практически в любой клинической лаборатории, обо-
рудованной проточным цитометром.
Таким образом, использование метода проточной цитометрии для оценки функ-
ционального состояния фагоцитов, включая их отдельные субпопуляции, не имеет
технических препятствий в клинической практике. Метод применим для оценки
функций клеток при различных патологиях, в основе которых лежат механизмы
нарушения фагоцитоза.
Оценка апоптоза методом проточной цитометрии. Апоптоз является про-
явлением физиологического процесса — генетически запрограммированной кле-
точной смерти, естественной, закономерной. Апоптоз включает несколько этапов:
во-первых, получение клеткой экзогенного (внешнего, рецепторного) или эндо-
генного (нерецепторного) сигнала, запускающего процесс апоптоза; во-вторых,
характерную для многих биологических процессов каскадную активацию внутри-
клеточных белков, реализующих программу апоптоза (инициирующих и эффек-
торных каспаз), которая регулируется множеством про- и антиапоптогенных
белков; в-третьих, деструктуризацию жизненно важных для функционирования
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 133
клетки белковых субстратов, «запуск» ядерных эндонуклеаз, деградацию ДНК до
олигонуклеосомных фрагментов и формирование «апоптозных телец» с после-
дующим их удалением путем фагоцитоза.
В базовых руководствах по иммунологическим методам выделяют следующие
цитометрические методы документации апоптоза: идентификацию характерных
для апоптотирующих клеток изменений мембраны; идентификацию изменений
структуры и содержания ДНК. К сожалению, большинство этих методов не позво-
ляют использовать цельную кровь, что важно при клинических исследованиях.
Развитие апоптоза уже на ранних этапах сопровождается снижением активности
М^2+-зависимой аминофосфолипидтранслоказы, что приводит к нарушению фос-
фолипидной асимметрии мембраны и появлению фосфатидилсерина на наружном
слое мембраны. Использование меченного флюорохромами (как правило, FITC)
антикоагулянта аннексина V (An V), который специфически связывается с фосфа-
тидилсерином в присутствии ионов Са2’, и последующая цитометрия обеспечива-
ют четкую идентификацию клеток, уходящих в апоптоз. Использование многопа-
раметрического анализа и одновременное докрашивание клеток красителями для
нуклеиновых кислот, которые не проникают в живые клетки, например йодидом
пропидия (PI), позволяют дифференцировать клетки, находящиеся в ранней фазе
апоптоза (Ап УРГ), позднем апоптозе (Ап УРГ-), и мертвые клетки (Ап УРГ)
(рис. 3-24). Весьма ценной является возможность одновременной оценки экспрес-
сии мембранных маркеров и окрашивания An V, что позволяет охарактеризовать
популяцию апоптотирующих клеток.
Довольно распространенными являются методы, основанные на окрашивании
клеток ДНК-флюорохромами, что связано с простотой выполнения, невысокими
затратами и возможностью длительного хранения клеток. Чаще всего используют
йодид пропидия и 7-аминоактиномицин D (7-AAD). В этом случае клетки фикси-
руют этанолом, что обеспечивает, с одной стороны, вымывание низкомолекуляр-
ных фрагментов ДНК, с другой — фиксацию клеток. Затем клетки окрашивают
флюорохромом в присутствии РНКазы и в процессе цитометрии выявляют так
называемый гиподиплоидный (суб-Gl) пик на гистограммах. Существенным
недостатком данного подхода является довольно низкая точность идентифика-
ции апоптоза, однако он оптимален для скрининговых исследований, требующих
анализа большого количества проб и характеризуется хорошей воспроизводимо-
стью.
Рис. 3-24. Гистограмма распределения
клеток при одновременном окрашива-
нии PI и An V: квадрант Е1 — некроти-
ческие клетки; квадрант Е2 — некро-
тические клетки и поздние стадии
апоптоза; квадрант ЕЗ — живые клет-
ки; квадрант Е4 — ранние стадии апоп-
тоза.
Annexin V FITC
134 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Тест на аллергическую реакцию. Продолжительное время работы по лока-
лизации и анализу базофилов находились вне области применения проточной
цитометрии, что было связано с незначительным содержанием этих клеток в пери-
ферической крови (до 0,5%). Однако существует целый ряд специфических пара-
метров, которые можно измерить на базофилах. Это прежде всего мембранный IgE
и экспрессия СЭбЗ-молекулы. Анализ мембранного IgE представляет достаточно
сложную задачу вследствие значительных различий его экспрессии у отдельных
индивидуумов. В связи с этим недавно описанные маркеры базофилов заняли
важное положение среди используемых параметров для анализа аллергической
реакции in vitro — это CD203c и CD294 (CRTH2).
Существенное место в процессе активации базофилов занимают такие антиге-
ны, как CD63 и CD203c. Они отличаются своей экспрессией и местоположением
в клетке. CD63 находится внутри клеток на мембране гранул, которые содержат
гистамин, лейкотриены и цитокины. После стимуляции аллергеном происходит
дегрануляция клеток и CD63 оказывается на поверхности базофилов. Напротив,
CD203c является мембранным антигеном. При активации базофилов аллерге-
ном экспрессия СП63-молекул увеличивается на 100%, тогда как экспрессия
СЭ203с-рецепторов возрастает на 350%. Таким образом, определение CD203c-
рецептора является наиболее информативным маркером для анализа активации
базофилов.
CD294 может экспрессироваться на базофилах и одновременно на ТЬ2-клетках,
поэтому, если локализовать путем гейтирования зону мононуклеаров, фенотип
базофилов можно описать как CD294'CD3~, тогда как активированные базофилы
будут иметь фенотип CD3CD294+CD203c'.
При активировании базофилов т vitro в многопараметрическом анализе можно
увидеть значительное повышение экспрессии молекулы CD203c на их мембране
относительно контрольных образцов.
Для активации базофилов in vitro, как правило, используют агенты, активирую-
щие максимальное количество базофилов, — это анти-IgE, анти-FceRI или синте-
тический пептид FMLP (Formyl Methionyl-Leucyl Phenylalanine). В ходе анализа в
дальнейшем используют различные аллергены. В настоящее время разработаны
наборы, предназначенные для идентификации покоящихся и активированных
базофилов. Они содержат все компоненты, необходимые для проведения анализа,
за исключением аллергенов (исследователи, как правило, сами подбирают необхо-
димый набор аллергенов в зависимости от аллергического анамнеза пациента).
Использование данного подхода предоставило недоступную ранее возможность
определять сенсибилизацию к аллергенам, например лекарственным препаратам,
выявлять не связанные со специфическим IgE-ответом аллергические состояния,
диагностировать и дифференцировать псевдоаллергические реакции.
Таким образом, появление методов, позволяющих объективно оценивать
функциональные параметры клеток в процессе их активации и пролиферации,
выделяя среди совокупности всех лейкоцитов отдельные субпопуляции, значи-
тельно расширяет возможности лаборатооного анализа в клинической практике.
Эти возможности способствуют появлению надежного инструмента для диагно-
стики заболеваний, в основе которых лежат механизмы повреждения иммунного
гомеостаза организма. Формирование же нового подхода к диагностике дефектов
иммунной системы влечет за собой и изменение обоснований для этиотропной и
патогенетической иммунокорригирующей терапии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Вопросы современной проточной цитометрии. Клинические применение / Под ред.
С.В. Хайдукова, А.В. Зурочки. — Челябинск: Челябинская государственная медицинская
академия, 2008. — 196 с.
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 135
Клиническая аллергология и иммунология: Руководство для практикующих врачей / Под
ред. Л.А. Горячкиной, К.П. Кашкина. — М.: Миклош, 2009. —432 с.
Клиническое руководство по лабораторным тестам: Пер. с англ. / Под ред. Н. Тица. — М.:
ЮНИМЕД-пресс/2003. - 960 с.
Луговская С.А., Почтарь М.Е., Тупицын Н.Н. Иммунофенотипирование в диагностике
гемобластозов. — М.: Тверь: Триада, 2005. — 168 с.
Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Расширение возможностей метода проточной цитометрии
для клинико-иммунологической практики // Мед. иммунология. — 2008. — № 10 (1). —
С. 5-13.
Хайдуков С.В., Зурочка А.В., Тотолян А.А., Чсрешнев В.А. Основные и малые популя-
ции лимфоцитов периферической крови человека и их нормативные значения (методом
многоцветного цитометрического анализа) // Мед. иммунология. — 2009. — № 11 (2-3). —
С. 227-238.
Clinical Immunology: Principls and Practice. 3rd ed. / Ed. R.R. Rich et al. — MOSBY, 2008. —
1578 р.
Janevays. Immunobiology. 7th ed. /' K. Murphy, P. Travers, M. Valport. — Garland Science,
2008. - 887 p.
Practical Immunology. 4th ed. / F.C. Hay, O.M.R. Westwood. — Blackwell, 2003. — 400 p.
WHO Scientific Group: Primary immunodeficiency diseases // Immunodeficiency Rev. —
1992. - Vol. 3. - P. 195-236.
ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связыва-
нии определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли
в аналитическую практику и используются в различных областях медицины.
Индикация образующегося комплекса «антиген -антитело» может быть осущест-
влена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку,
которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-
химическим методом. Удобными для этой цели оказались изотопные, фермент-
ные, флюоресцентные, парамагнитные и другие метки, использование которых
дало возможность увеличить чувствительность классических иммунохимических
методов анализа в миллионы раз. Иммунохимические методы анализа можно
использовать в диагностике заболеваний сердечно-сосудистой, эндокринной и
других систем, для установления причин бесплодия, нарушения развития плода, в
онкологии — для определения маркеров опухолей и контроля за эффективностью
лечения, для определения концентрации в крови иммуноглобулинов, ферментов и
лекарственных веществ. В ряде случаев исследования выполняют на фоне нагру-
зочных функциональных проб (например, определение содержания инсулина в
сыворотке крови на фоне пробы на толерантность к глюкозе) либо в динамике
(например, определение в крови половых гормонов на протяжении менструаль-
ного цикла).
Иммуноферментный метод
Иммуноферментный анализ (ИФА) — вид иммунохимического анализа,
основанный на высокоспецифической иммунологической реакции антигена с
соответствующим антителом с образованием иммунного комплекса, для выяв-
ления которого используют в качестве метки фермент или ферментзависимое
вещество.
ПРИНЦИП МЕТОДА
В основе метода ИФА лежит оценка результатов иммунной реакции антигена с
антителом. Полученный комплекс определяется следующим образом: в реакцион-
136 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ную смесь вводят конъюгат, который включает ферментную метку, а также добав-
ляют специальный хромогенный субстрат. Фермент, взаимодействуя с субстратом,
изменяет его окраску. Учет результатов проводят фотометрически.
ХАРАКТЕРИСТИКИ И НАЗНАЧЕНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМ
В современной лаборатории исследования методом ИФА проводят с использо-
ванием коммерческих тест-систем. Основными характеристиками тестов являются
чувствительность и специфичность.
Под гувствительностею понимается процент выявленных тест-системой пози-
тивных образцов из массива положительных образцов, где все результаты были
подтверждены, например сероконверсионные панели позитивных контрольных
сывороток. Таким образом, чувствительность тест-системы является показателем
вероятности появления ложноотрицательного результата. Ложноотрицательный
результат — отрицательный результат, полученный в данной тест-системе для
образца, являющегося на самом деле положительным.
Под специфигностъю понимается процент выявленных негативных обпазцов
из панели негативных контрольных сывороток. Таким образом, специфичностью
тест-системы является показатель вероятности появления ложноположительного
результата, т.е, положительный в данной тест-системе результат, полученный для
образца, являющегося на самом деле отрицательным.
Кроме подразделения тест-систем по исследуемому показателю (инфекционной
диагностике, исследованию эндокринной системы, определению онкомаркеров
и др.), тесты делятся на группы по своему целевому назначению. Так, например,
применительно к диагностике инфекционных заболеваний тест-системы подраз-
деляются:
• на скрининговые, призванные при первичном обследовании выявлять инфи-
цированных;
• диагностические, используемые при обследовании больных, у которых подо-
зревается или имеется определенная инфекция;
• подтверждающие, используемые как дополнительные после получения поло-
жительных результатов скринингового или диагностического теста;
• тесты для мониторинга (оценка эффективности проводимой терапии).
ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЙ ЭТАП
Подготовка пациента
Неправильное выполнение этих процедур является одним из основных источ-
ников (до 20%) ошибок на преаналитическом этапе, поэтому процедура взятия
крови и других образцов в инструкции для персонала должна быть описана всесто-
ронне, включая идентификацию образца, детальное описание технологии и био-
логическую безопасность. Условия подготовки пациента удобно отражать в виде
памятки в направлении на анализ, где следует указать ошибки и рекомендации при
взятии венозной крови — основного материала для ИФА-исследований.
В инструкции по качеству проведения преаналитического этапа необходимо
четко прописать условия взятия биологического материала для исследования.
Следует учитывать, что на результаты исследования влияет набор биологических
факторов, которые описывают состояние организма.
Беременность
Трактуя результаты лабораторных исследований у беременных, необходимо
учитывать срок беременности в момент взятия пробы. При физиологической бере-
менности средний объем плазмы возрастает примерно от 2600 до 3900 мл, причем
в первые 10 нед прирост может быть незначительным, а затем происходит нарас-
тающее увеличение объема к 35-й неделе, когда достигается указанный уровень.
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 1 37
Объем мочи также может физиологически увеличиваться до 25% в III триместре.
В последнем триместре наблюдается 50% физиологическое повышение скорости
клубочковой фильтрации. Хорошо известные свойственные беременности изме-
нения выработки и концентрации в плазме половых гормонов сопровождаются
изменениями различных аналитов, например тиреоидных гормонов.
Влияние суточных колебаний
Некоторые компоненты подвержены влиянию суточных колебаний. Так, содер-
жание кортизола возрастает в течение дня и снижается ночью (табл. 3-9).
Таблица 3-9. Суточные колебания содержания некоторых аналитов в сыворотке крови
Аналит Максимальная концентрация, ч Минимальная концентрация, ч Амплитуда, % средней за сутки
АКТГ 6-10 0-1 150-200
Кортизол 5-8 21-3 180-200
Тестостерон 2-4 20-24 30-50
ТСГ 20-2 7-13 5-15
Т4 8-12 23-3 10-20
пг 21-23 1-21 300-400
Пролактин 5-7 10-12 80-100
Альдостерон 2-4 12-14 60-80
Ренин 0-6 10-12 120-140
Адреналин 9-12 2-5 30-50
Циркадный ритм может изменяться под влиянием индивидуальных ритмов —
еды, сна, физической активности. Эти влияния не следует путать с действительно
циркадными колебаниями.
Влияние фазы менструального цикла
Статистически значимые изменения концентрации могут быть вызваны колеба-
ниями гормонального фона при менструации. Так, концентрация альдостерона в
плазме определяется в два раза выше перед овуляцией, чем в фолликулярной фазе.
Подобным образом ренин может проявить предовуляторное повышение.
Употребление лекарств. Диагностические и лечебные мероприятия
При подготовке обследуемых к биохимическим исследованиям приняты сле-
дующие подходы:
• лекарства, мешающие определению компонентов, исключают до взятия био-
материала, если их дают не по жизненным показаниям;
• утренний прием лекарств проводят только после взятия биоматериала;
• взятие крови с диагностической целью проводят перед инфузией лекарств и
растворов.
Таблица 3-10. Препараты, оказывающие существенное влияние на результаты лабораторных
исследований
Препараты Исследования Влияние
Тироксин ПГ Снижение
Т4 Повышение
Фенотиазины Т4, щелочная фосфатаза Повышение
Эстрогены Тироксин, щелочная фосфатаза Повышение
Алкоголь Щелочная фосфатаза, кортизол Повышение
138 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Загрязнение лабораторных проб инфузионными растворами является самой
обычной и часто встречаемой формой преаналитической интерференции в боль-
ницах. Рекомендуют информировать лабораторию, когда и какое вливание было
проведено пациенту и когда была взята проба крови.
Пробу крови никогда не следует брать из сосуда, расположенного проксимально
месту инфузии. Пробы следует брать из вены другой руки, в которую не проводили
вливание.
Диета
После приема пищи содержание отдельных продуктов обмена в крови может
повышаться или подвергаться изменениям в результате постабсорбционных гор-
мональных эффектов. Определение других аналитов может затрудняться вслед-
ствие мутности, вызванной хиломикронемией в послеобеденных пробах крови.
Для того чтобы исключить влияние данных факторов, рекомендуют соблюдать
8-12-часовой период голодания перед взятием проб для лабораторного исследо-
вания.
Психический стресс и физическая активность
Степень влияния психического стресса (страха перед взятием крови, предо-
перационного стресса и т.д.) на лабораторные результаты часто недооценивается.
Между тем под его влиянием может наблюдаться увеличение секреции гормонов
(альдостерона, ашиотензина, катехоламинов, кортизола, пролактина, ренина,
соматотропина, ТСГ, вазопрессина), а также повышение других показателей (аль-
бумина. фибриногена, глюкозы, инсулина, лактата и холестерина).
Состояние физической активности обследуемого оказывает большое влия-
ние на результаты. При длительном строгом постельном режиме и ограничении
физической активности повышается экскреция с мочой норадреналина, кальция,
хлора, фосфатов, аммиака, повышается активность щелочной фосфатазы в сыво-
ротке крови.
Таким образом, для объективного лабораторного анализа необходимо доби-
ваться стандартизации подготовки пациента перед взятием клинического мате-
риала.
ВЗЯТИЕ ПРОБ У ПАЦИЕНТА
Рекомендации по условиям взятия крови и других биожидкостей для лабора-
торного исследования методом ИФА следующие.
1. По возможности пробы следует брать между 7 и 9 ч утра.
2. Взятие проб следует выполнять через 8-12 ч после последнего приема пищи.
3. Взятие проб следует выполнять до диагностических и лечебных процедур,
способных оказать влияние на результаты теста.
4. В случае проведения лекарственного мониторинга следует учитывать пик
концентрации после введения лекарственного препарата и фазу устойчивого
состояния перед введением следующей дозы препарата.
5. Период воздержания от приема алкоголя должен быть не менее 24 ч до взятия
биожидкости.
6. Кровь для исследования на вещества, концентрация которых в крови изме-
няется циклически, следует забирать в строгом соответствии с физиологиче-
скими циклами. Например, оценка уровня ФСГ и ЛГ привязывается ко дню
менструального цикла.
7. Для исключения влияния изменения положения тела обследуемый должен
находиться в покое, сидеть или лежать не менее 5 мин.
8. При динамическом наблюдении за пациентом взятие материала нужно про-
водить в идентичном положении тела.
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ‘,39
9. Сдавление сосудов (вен) при наложении жгута (манжеты) при взятии крови
должно быть минимальным и не превышать 1 мин.
10. Всегда следует отмечать точное время взятия пробы в соответствующих
документах.
ТРАНСПОРТИРОВКА ОБРАЗЦОВ. ВЛИЯНИЕ ВРЕМЕНИ И ТЕМПЕРАТУРЫ
Полученная кровь должна быть своевременно доставлена в лабораторию.
Согласно рею (мендациям практически всех компаний — производителен иммуно-
ферментных тест-систем, необходимо не позже 1 ч после взятия крови отобрать из
нее сыворотку. В табл. 3-11 приведены временные интервалы, рекомендованные
при проведении процедуры пробоподготовки.
Таблица 3-11. Требования ко времени выполнения некоторых преаналитических этапов для имму-
нологических исследований
Процедура Время выполнения
Центрифугирование для получения сыворотки Не позднее чем через 1ч после взятия крови
Центрифугирование охлажденной крови 30-90 мин после взятия из холодильника
Центрифугирование в пробирках с ускорителями свертывания крови 5-15 мин
Центрифугирование в пробирках с антикоагулянта- ми для получения плазмы Возможно немедленно после взятия крови
Отделение сыворотки от сгустка во вторичную (транспортную) пробирку после центрифугирования Тотчас после центрифугирования
Взятие сыворотки из пробирки с гелевым барьером Не позднее 48 ч после центрифугирования
В пробирках с негелевым барьером Не позднее чем через 1 ч
Сыворотка, плазма, если нельзя выполнить анализ е течение 5 ч Поместить биожидкость в холодильник на 24 ч
Рекомендации по условиям хранения и транспортировке биологического мате-
риала для иммунологических исследований следующие.
1. Быстрая транспортировка и короткий срок хранения улучшают достовер-
ность результатов лабораторных исследований. Следует избегать хранения
цельной крови. Пробы крови должны быть доставлены в лабораторию в
течение 45 мин после взятия крови, чтобы центрифугирование и разделение
пробы было выполнено в течение 1 ч.
2. Образцы и пробы сохраняются тем лучше, чем ниже температура их хранения.
3. Образцы и пробы всегда следует хранить в закрытых сосудах (испарение!).
Испарение/сублимация приводят к заметному повышению концентрации/
активности всех нелетучих компонентов. Это особенно выражено, когда
объем пробы относительно небольшой, а площадь поверхности относитель-
но велика. Опасность испарения существует и в холодильниках (конденсация
влаги на охлаждающих элементах).
4. Проблемы хранения уменьшаются при использовании одноразовых систем
для сбора проб.
5. Разделительные элементы (например, разделительные гели) улучшают выход
сыворотки/плазмы и позволяют оставлять сыворотку в первичных пробир-
ках над сгустком,
6. Избегают встряхивания сосудов с пробами (системы пневматической достав-
ки пробирок!): риск гемолиза увеличивается.
7. Всегда хранят сосуды с кровью в вертикальном положении. Избегают воз-
действия света.
8. Маркируют инфицированный материал и обращаются с ним с особой осто-
рожностью.
140 ВЫСО КОТЕХН ОЛ О Г И Ч Н Ы Е ЛАБОРАТО PH Ы Е ИССЛЕДОВАНИЯ
СТАНДАРТНАЯ КОМПЛЕКТАЦИЯ ИФА-НАБОРА
ИФА-набор, как правило, включает все необходимые для анализа реагенты,
обычно на 96 определений.
В набор, как правило, входят следующие реагенты.
• Стандарты (если это набор для количественного ИФА), 5-7 растворов с раз-
личными концентрациями определяемого аналита.
• Конъюгат (готовый раствор или концентрат), содержащий антитела или
антиген с ферментной меткой.
• 96-луночный микропланшет с иммуносорбентом, упакованный в алюминие-
вую фольгу с осушителем.
• Концентрат промывочного буфера.
• Субстратно-хромогенный реактив — монореагент или состоящий из двух
компонентов: раствора А, обычно содержащего тетраметилбензидин (ТМБ)
в буфере, и раствора В — перекиси водорода в буфере.
• Стоп-раствор, чаще всего это раствор соляной кислоты.
• Контрольная сыворотка (одна или несколько). В некоторые наборы реаген-
тов контрольные сыворотки не входят, их заказывают отдельно.
В набор могут дополнительно входить реагенты для разведения образцов,
конъюгата, субстрата, стандарта.
ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА В МИКРОПЛАНШЕТНОМ ФОРМАТЕ
Объектом исследования в формате ИФА могут быть как антигены, так и анти-
тела. В схемах ИФА для определения антигенов в качестве последнего могут
выступать антиген возбудителя инфекции, регуляторный белок или гормон,
онкомаркер или другое соединение, обладающее иммуногенной активностью,
которое должно быть определено в образце. Существует множество модификаций
метода ИФА, но наибольшее распространение получил гетерогенный (твердофаз-
ный) ИФА в микропланшетном формате. В качестве твердой фазы используется
поверхность лунок полистиролового микропланшета, на которую адсорбированы
входящие в состав тест-системы известные антигены или антитела. Антиген или
антитело, иммобилизованное на поверхности твердого носителя, принято назы-
вать иммуносорбентом. В ходе высокоспецифической реакции иммуносорбента с
определяемыми в исследуемом образце антителами или антигенами образуются
иммунные комплексы, которые также оказываются фиксированными на твердой
фазе. Субстанции, не участвующие в реакции, и избыточное количество реагентов
удаляются при многократной промывке. Такая схема позволяет упростить процесс
разделения компонентов реакции.
В настоящее время получили распространение тест-системы с использованием
стрептавидина и биотинилированных моноклональных антител. В этом случае
стандарты, контроли и пробы пациентов сначала добавляют в микроячейки,
покрытые стрептавидином. Стрептавидин отдаляет реакцию от поверхности
плашки, создавая эффект взаимодействия «антиген-антитело» в объеме, а не на
поверхности, тем самым увеличивая чувствительность диагностической систе-
мы. Затем добавляют биотинилированные антитела (смесь высокоочищенных
специфических моноклональных антител к различным эпитопам), меченные
ферментом антитела (конъюгат), реагенты перемешивают. Результатом реакции
между различными антителами и определяемым антигеном становится образо-
вание «сэндвич»-комплекса, который связывается со стрептавидином в ячейках.
Несвязавшиеся компоненты удаляются промывкой. После инкубации с субстрат-
ным раствором и остановки реакции фотометрически определяют оптическую
плотность растворов в лунках. Тест-системы с использованием стрептавидина и
биотинилированных моноклональных антител являются тестами II поколения,
обладают повышенной чувствительностью.
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 141
ОСОБЕННОСТИ КАЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА
Качественный анализ часто используют при скрининговых исследованиях и
диагностике инфекционных заболеваний. Как правило, для диагностики инфек-
ций используют два вида серологических реакций:
• обнаружение патогенспецифических антител в сыворотке крови обследуемого;
• установление родовой и видовой принадлежности микроорганизма или вируса.
В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Такое
исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными
сыворотками.
В тест-системах для качественного анализа результат исследования определяет-
ся при сравнении его оптической плотности с расчетной величиной критической
оптической плотности (ОПк ит). Для обозначения ОПкри1 могут быть использованы
другие термины — «Cut-off» или «пороговое значение оптической плотности».
Формулу для расчета ОПкрит указывают в инструкции к тест-системе. В расчете
Cut-off могуч участвовать как усредненные значения оптических плотностей поло-
жительных и отрицательных контролей, так и оптическая плотность специального
контрольного образца — контроля уровня среза.
Если оптическая плотность образца выше, чем Cut-off, образец считается поло-
жительным на специфические антитела.
Очень часто в расчетах необходимо учитывать серую зону. Серая зона — это
диапазон концентраций специфических антител, в который с равной вероятно-
стью могут попадать как положительные, так и отрицательные пробы (рис. 3-25).
Границу серой зоны указывают в инструкции к тест-системе, как правило, это 10%
пороговой величины. Результаты анализа, попавшие в серую зону, не могут быть
однозначно интерпретированы, для уточнения результата необходимо повторить
исследование с новой сывороткой, полученной через 1-2 нед.
Для контроля эффективности лечения важно использовать тест-системы, кото-
рые позволяют получать результаты в полуколичественном или количественном
вариантах. Для полуколичественного варианта проведения методики рассчиты-
вают отношение между средней оптической плотностью образца и оптической
плотностью Cut-off. Образцы рассматриваются как:
* положительные, если отношение более 1.1;
• сомнительные, если ±10% Cut-off',
• отрицательные, если отношение менее 0,9.
Рис. 3-25. Серая зона (качественный анализ).
142 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Радиоиммунный анализ
Радиоиммунный анализ (РИА) — метод количественного определения биологи-
чески активных веществ (гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и др.)
в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых
стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфиче-
скими связывающими системами. Последними чаще всего являются специфические
антитела. В связи с тем что меченый антиген добавляют в определенном количестве,
можно определить часть вещества, которая связалась с антителами, и часть, остав-
шуюся несвязанной в результате конкуренции с выявляемым немеченым антигеном.
Для метки антител или антигенов чаще всего используют изотоп йода 1251, который
имеет период полураспада 60 дней и высокую удельную радиоактивность. Для РИА
выпускают стандартные наборы реагентов, каждый из которых предназначен для
определения концентрации какого-либо одного вещества. Исследование проводят
в несколько этапов: смешивают биологический материал с реагентами, инкуби-
руют смесь в течение нескольких часов, разделяют свободное и связанное радио-
активное вещество, осуществляют радиометрию проб, рассчитывают результаты.
Радиоиммунный анализ обладает высокими чувствительностью и специфичностью.
Недостатком метода являются ограничения, определяемые режимом работы с
радиоактивным материалом, и относительно короткий срок годности диагностиче-
ского набора, что связано с распадом радиоактивной метки.
Реакция иммунофлюоресценции
Иммунофлюоресценция — комплекс методов флюоресцентного анализа, при-
меняемых в иммунологии, главным образом в гистохимии, а также в вирусологии,
бактериологии, микологии, паразитологии и т.п. Сочетание иммунохимических
реакций и флюоресцентной микроскопии позволяет выявлять тканевые и клеточ-
ные антигены, в том числе при аутоиммунных заболеваниях и злокачественном
перерождении клеток, изучать закономерности синтеза антител и идентифициро-
вать возбудителей многих вирусных и микробных заболеваний.
Популярность РИФ объясняется экономичностью, наличием широкого спек-
тра диагностических наборов, быстротой получения ответа. В настоящее время в
этой реакции используют как поликлональные сыворотки, так и моноклональные
антитела, меченные флюоресцеина изотиоцианатом (ФИТЦ). Для уменьшения
неспецифического свечения фона применяют обработку мазка бычьим сыворо-
точным альбумином, меченным родамином или голубым Эванса.
Чаще всего РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патоло-
гическом материале. В этом случае из исследуемого материала готовят мазок на
предметном стекле, как для обычной микроскопии. Препарат фиксируют метило-
вым спиртом, ацетоном или другим химическим фиксатором, иногда входящим в
состав диагностического набора. На поверхность фиксированного мазка наносят
меченные ФИТЦ сыворотки или моноклональные антитела (в случае непрямой
РИФ сначала препарат обрабатывают сывороткой против искомого антигена, а
затем мечеными антителами к иммуноглобулинам, использованным на первом
этапе). Поскольку РИФ является разновидностью гетерогенного анализа, один
этап отделяется от другого промывкой.
Учет результатов реакции осуществляют с помощью люминесцентного микро-
скопа, в оптическую систему которого устанавливают набор светофильтров, обе-
спечивающих освещение препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым све-
том с заданной длиной волны. Это заставляет флюорохром светиться в заданном
диапазоне спектра. Исследователь оценивает характер свечения, форму, размер
объектов и их взаимное расположение.
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 143
Наибольшее распространение получили наборы, основанные на прямой реак-
ции иммунофлюоресценции, однако имеются тест-системы, где используется
реакция непрямой иммунофлюоресценции.
Если прямую РИФ можно использовать только для обнаружения антигена, то
непрямой вариант этой реакции может быть использован как для обнаружения
антигена, так и для серодиагностики (например, при болезни Лайма, сифилисе).
В этом случае готовят мазки из эталонного штамма возбудителя. Исследуемую
сыворотку наносят на мазок. Если в ней присутствуют искомые антитела, то они
связываются с антигенами микробных клеток. Промывка препарата буферным
раствором позволяет удалить несвязавшиеся антитела. Затем препарат обрабаты-
вают меченой сывороткой против иммуноглобулинов человека. В случае положи-
тельного результата реакции при микроскопии мазка в люминесцентном микро-
скопе наблюдают специфическое свечение эталонной культуры.
Основным недостатком РИФ является ее субъективность. Классическими кри-
териями специфичности этой реакции являются:
• характерная морфология, размеры и расположение возбудителя в мазке;
• периферический характер свечения объекта;
• цвет флюоресценции;
• интенсивность флюоресценции.
При исследовании крупных объектов (трихомонад, гарднерелл, клеток, пора-
женных вирусами) эти критерии позволяют получить высокодостоверный резуль-
тат. В то же время элементарные тельца хламидий и микоплазмы имеют размеры,
лежащие на пределе разрешающей способности люминесцентного микроскопа.
При этом оценка морфологии микроорганизмов затруднена, а свечение теряет
периферический характер. Оставшихся критериев явно недостаточно для уверен-
ной идентификации наблюдаемого микроорганизма, В связи с вышесказанным
субъективный характер учета реакции предъявляет особые требования к квалифи-
кации персонала, проводящего исследования.
МУЛЬТИПЛЕКСНЫЙ ИММУННЫЙ АНАЛИЗ
Методологическое развитие ИФА позволило создать системы, в которых раз-
ные виды захваченных молекул-мишеней проецируются в разных точках твер-
дой фазы, что и привело к созданию мультиплексных технологий, позволяющих
одновременно определять большое количество (около 100) параметров в одном
биологическом образце. В качестве твердой фазы стали использовать не поверх-
ность лунок полистироловых планшетов, а разнообразные дискретные шарики —
микрочастицы.
Впервые флориметрическая технология на шариках была разработана еще в
1977 г. для определения различных антигенов в одном биологическом образце.
В настоящее время такую оценку часто используют для определения «-фетопроте-
ина, [3,-микроглобулина. иммуноглобулинов и иммунных комплексов.
Технология мультиплексного анализа на шариках постоянно совершенствуется.
Изначально мультиплексный анализ выполняли в разных сочетаниях.
• В ряде тест-систем один шарик покрывали разными антителами, меченными
флюоресцеином.
• В других тест-системах использовали шарики разного размера.
• Шарики могли состоять из различных материалов, таких как латекс, поли-
стирол, полиакриламид, стекло, и соответственно имели разную способность
к адсорбции.
В настоящее время распространенными методами мультиплексного анализа
являются мультиплексные, в основе которых лежит «сэндвич-метод — ИФА в
разных комбинациях: FAST Quant. Search Light и xMAP. Каждый из этих методов
144 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
имеет некоторые различия по ряду параметров: определению доступных анали-
зируемых веществ, возможности использования новых аналитов, динамическому
ряду оценки, чувствительности метода, стоимости оборудования, цене расходных
материалов.
Поскольку результаты определения биологически активных вещее тв в каждом
методе могут существенно различаться, считают, что проводить статистический
анализ данных, полученных с помощью разных методов, нецелесообразно. Для
каждого отдельного исследования следует выбирать только одну технологию, для
того чтобы полученные данные и выводы были репрезентативными и соответство-
вали требованиям доказательной медицины. Так, в анализе, основанном на микро-
шариках, в качестве твердой фазы используют микрочастицы (рис. 3-26).
Их кодируют одинаковыми или разными (красными и оранжевыми) флюорес-
центными метками. В хМАР-системе, например, используют шарики одного раз-
мера, внутри меченные в разных сочетаниях красными и близкими к инфракрас-
ным флюорофорами: 658 и 712 нм. На шариках адсорбированы антитела разной
специфичности, созданные к разным молекулам-мишеням, присутствующим в
биологическом образце, причем возможны варианты: на разных типах шариков
могут быть адсорбированы антитела к разным молекулам-мишеням либо к одной
молекуле-мишени, при этом образуются ковалентные связи. Таким образом, при
Рис. 3-26. х/ИЛР-технология: а —100 различных типов микрочастиц с точным количеством крас-
ного и инфракрасного красителя составляют основу хЛМР-технологии мультиплексного анализа;
б — каждый тип микрочастиц покрывают антителами против конкретного антигена, после этого
проводят классический «сэндвич»-ИФА; в — с помощью проточного цитофлюориметра (Luminex
или Bio-Plex) проводят регистрацию результатов: красным лазером (630 нм) идентифицируют тип
микрочастицы (1), а зеленым (532 нм) измеряют количество связавшегося антигена (2).
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 145
этом типе оценки сами шарики (их поверхность) представляют собой твердую
фазу, на которой и происходят реакции «антиген-антитело» (в ИФА такие реак-
ции осуществляются на поверхности пластика). После захвата соответствующих
молекул-мишеней из биологической пробы различные окрашенные места на
шариках заполняются, при этом оценка разных мишеней осуществляется одно-
моментно в одной биопробе. Детекция интенсивности захвата осуществляется с
помощью считывающей системы, принцип действия которой основан на оценке
интенсивности флюоресценции. Сигнал усиливается и измеряется на флюоци-
тометре, при этом каждая отдельная молекула-мишень определяется с помощью
цветового кода, измеряемого с помощью вторичного флюоресцентного сигнала.
В результате обеспечивается подсчет количества захваченных молекул-мишеней в
каждом отдельном локусе шариков.
Метод позволяет проводить комплексный учет множества различных молекул-
мишеней в одном биологическом образце. Чувствительность, специфичность и
точность анализа при таком мультиплексном определении на шариках превыша-
ют соответствующие характеристики ИФА. В отличие от ИФА, мультиплексный
анализ на микрочастицах позволяет одновременно учитывать до 100 параметров в
одном образце, при этом не требуется проводить этапы отмывок. Согласно мето-
дике проведения мультиплексного анализа, биологический образец инкубируется
вместе с меченными флюоресцеином антителами, а после образования иммунного
комплекса по типу «сэндвича» проводится детекция только тех флюорофоров,
которые связаны с поверхностью шариков.
Как в ИФА, так и в мультиплексном иммунном анализе (МИА) в тест-системах
используется принцип «сэндвича». Если биологические образцы содержат гетеро-
фильные антитела (такие как у больных с аутоиммунными заболеваниями), неспе-
цифическое связывание может приводить к ложноположительным результатам.
В условиях патологии уровни таких аналитов, как, например, цитокины при
воспалении, могут быть существенно повышены в разных биологических жид-
костях и существенно превышать динамические возможности тест-системы.
Анализ стандартных кривых в мультиплексных данных является критичным для
правильной интерпретации полученных данных. Классический иммунофермент-
ный анализ очень удобен для измерения уровней одного какого-либо цитокина в
биологических образцах. Однако измерение уровня одного цитокина для харак-
теристики различных процессов, протекающих в организме, является абсолютно
недостаточным, так как не позволяет полущить более или менее объективную
информацию о комплексных биологических взаимодействиях на клеточном
уровне как в норме, так и при патологии. В последнее время возрастает интерес
к интегральному изучению биологических процессов. Вследствие этого все более
широкое распространение приобретают методы мультиплексного анализа. Роль
повышения или понижения уровня одного какого-либо цитокина в межклеточных
взаимодействиях необходимо рассматривать с учетом изменения уровней других
цитокинов, присутствующих в этом же исследуемом биологическом образце.
Ниже приведен ряд сравнительных характеристик хМАР- и ИФА-методов
определения цитокинов (табл. 3-12).
Срок хранения
В большинстве так называемых home-made ИФА-тест-системах планшеты,
покрытые антителами, используют в тот же день либо их хранят в течение непро-
должительного времени (несколько дней) при температуре +4 °C или заморажива-
ют и хранят при температуре -20 °C (до 2-3 мес). В хЛ/АР-технологии покрытые
антителами микрочастицы остаются стабильными в течение 2 лет. При этом срок
хранения тест-систем скорее ограничивается не этапом напыления антител, а
интенсивностью свечения люминофоров.
146 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Таблица 3-12. Сравнительные характеристики ИФА- и МИА-методов определения цитокинов
Параметры ИФА МИА
Чувствительность Высокая — <10 пг/мп Высокая — несколько пг/мл
Определение Количественное Количественное
Специфичность Высокая Высокая
Выявление Биологически активных и неактив- ных молекул Биологически активных и неактивных молекул
Время проведения ана- лиза Относительно небольшое (день) Более быстрый анализ (часы)
Коэффициент вариации 5-10% 10-15%
Интерференция Отсутствует Отсутствует
Протокол исследования Относительно простой Простой
Объем образца Относительно большой (100- 200 мкл на 1 определение) Небольшой (50 мкл на все определе- ния — до 100 параметров)
Стимуляция детекции Отсутствует Присутствует
Срок хранения тест- системы Небольшой Более продолжительный
Разрешающая способ- ность Определение 1 цитокина в одной биопробе Одновременное определение до 100 цитокинов в 1 биопробе
Производительность
С помощью х МАР-те ст-системы можно одновременно определять до 100 раз-
личных протеинов с широким спектром молекулярной массы — от 6 до 150 кДа
всего лишь в 50 мкл биологической жидкости. ИФА-тест-система позволяет опре-
делить только один белок, причем объем биологической пробы варьирует от 100
до 200 мкл, а в дублях — от 200 до 400 мкл. Нетрудно рассчитать, какое количество
биологического материала необходимо для определения уровней, например, 10
или 20 цитокинов.
Сопоставимость полученных данных
В ИФА для определения нескольких цитокинов каждый раз следует обращаться
к изначальному образцу биологической жидкости. Обычно аликвоты заморажи-
вают и хранят при температуре -20 °C в течение ограниченного срока (до 3 мес).
Недопустимо повторное размораживание и замораживание образцов. Сроки хра-
нения биообразцов до момента постановки ИФА-тест-систем для определения
цитокинов могут существенно различаться и, поскольку определение цитокинов с
помощью этого метода проводят с временным интервалом, невозможно с уверен-
ностью считать, что все условия проводимого анализа и соответственно получен-
ные результаты адекватны и сопоставимы.
хЛ1АР-технология, в отличие от ИФА, позволяет определять целый ряд молекул
одновременно, что снижает вероятность ошибок, связанных с условиями хранения
биологических проб. И, наконец, все антитела, используемые в хЛ/АР-технологии,
в отличие от ИФА, сопоставимы друг с другом.
Стоимость исследования одного параметра
Если использовать МИА-технологии для определения многих цитокинов, стои-
мость одного определения в мультиплексной технологии становится в целом ниже,
чем в ИФА.
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 147
МОЛЕКУЛЯРНАЯ КЛИНИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
Успехи молекулярной и клеточной биологии привели к возникновению новой
клинической дисциплины — молекулярной клинической диагностики, область
интересов которой включает лабораторную диагностику инфекций и многих пато-
логических состояний человека путем детекции генных вариантов, присущих тому
или иному виду организмов.
Молекулярную клиническую диагностику определяют в настоящее время как
науку, занимающуюся выявлением патологий, изучением их причин и механизмов
развития на молекулярном уровне. Преимущество такого подхода заключается в
том, что он дает возможность выявить склонность к тому или иному заболеванию
задолго до его клинических проявлений, вовремя принять профилактические
меры, предотвратив его развитие или облегчив течение, и с учетом индивиду-
альных особенностей применять терапию. При этом молекулярный уровень
исследований включает не только гены и мРНК, но и соответствующие белки,
поэтому исследования в области молекулярной диагностики принято разделять на
геномику и протеомику (рис. 3-27). Используемые в исследованиях современные
молекулярные технологии представлены в табл. 3-13.
Таблица 3-13. Основные методы современных молекулярно-диагностических исследований
Тип технологии Методы
Молекулярно- генетические методы для поиска новых генов или аллелей. Выявление мутаций Секвенирование. Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (SSCP). Гетеродуплексный анализ. Денатурирующий гель-элекгрофорез. Химическое/ферментативное расщепление некомплеменгарных оснований. Масс-спектрометрия. ДНК-чипы
Молекулярно- генетические методы для выявления извест- ных генов или аллелей Аллельспецифическая гибридизация/амялификация (ПЦР, LCR, NASBA). Капиллярный денатурирующий гель-электрофорез. Мини-секвенирование в твердой фазе. Олигонуклеотидлигазный анализ (OLA)
Геномные функциональ- ные методы для опреде- ления генной активности (экспрессия генов) Экспрессионные РНК-чипы. Количественный РТ-ПЦР
Протеомные технологии Двухмерный электрофорез. Многомерная хроматография. Масс-спектрометрия. Белковые чипы (SELDI). Мультиплексный анализ по технологии «Люминекс» («Биоплекс»)
На основе успехов в исследовании молекулярных основ патологии, в част-
ности достижений программы «Геном человека», и с помощью рекомбинантных
ДНК, ПЦР, новейших методов анализа ДНК удается многое узнать о генотипе при
минимальных затратах. Возможности молекулярно-биологических исследований
определяются универсальностью принципов анализа ДНК и РНК любого происхо-
ждения, высокими чувствительностью и специфичностью применяемых ме годов.
Объектом молекулярно-генетического исследования могут служить практически
любые биологические образцы. Проводимое исследование включает подготовку
проб, состоящую из стандартизированного выделения нуклеиновых кислот, детек-
ции искомой генной последовательности, учета результатов исследования и фор-
мулирования заключения с установлением (или подтверждением) нозологической
формы в соответствии с принятыми клиническими классификациями. Комплексы
молекулярно-биологических методов позволяют;
148 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
мРНК
flllHllllininninilininili
Трансляция
Синтез белка
Протеин
Ш]В1Ж1ИШ'1Л|Ц|П1ПШ|1
м, %:!
=£•’ Рибосома
Рис. 3-27. Структура молекулярного уровня исследований: процессы репликации, транскрипции
и трансляции.
• проводить диагностику инфекционных заболеваний по наличию или отно-
сительному содержанию специфических последовательностей ДНК/РНК
патогенных микроорганизмов в биологических образцах;
• осуществлять дифференциальную генную диагностику злокачественных
новообразований с неопухолевыми (предопухолевыми) поражениями,
определять прогностически неблагоприятные генотипы лейкозов, выявлять
минимальную остаточную болезнь и рецидивы злокачественных заболева-
ний:
• осуществлять своевременную диагностику генных мутаций и генных вариан-
тов у больных и их родственников в целях медико-генетического консульти-
рования. а также для идентификации личности и установления родства.
Генную диагностику используют при решении задач скрининга (профилактиче-
ском обследовании), для установления (Уточнения) диагноза, ранней диагностики
заболеваний. На основе генной диагностики проводят:
• установление ориентировочного диагноза для выработки дальнейшей такти-
ки обследования;
• обоснование и планирование специфической терапии;
• установление диагноза, включая исследование интраоперационного мате-
риала (например, генотипирование Н. pylori в образцах слизистой оболочки
желудка);
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 149
• раннюю диагностику заболеваний (в некоторых ситуациях — единственный
возможный метод диагностики на начальном этапе болезни, в частности при
ранней диагностике гепатита С).
Это эффективный метод уточняющей диагностики, а во многих случаях —
основной диагностический метод (например, в выявлении наследственных забо-
леваний и прогнозе развития лейкозов).
Значение результатов генной диагностики отражено в федеральном законе от
05.07.1996 № 86-ФЗ (ред. от 30.12.2008) «О государственном регулировании в
области генно-инженерной деятельности».
Методы молекулярной диагностики
Среди молекулярно-генетических технологий наиболее широко применяются в
рутинной диагностической практике методы для выявления уже известных эндо-
генных и экзогенных ДНК-последовательностей, которые можно разделить на
два класса: гибридизационный анализ нуклеиновых кислот и амплификационные
методы.
В последние годы в практику клинико-лабораторных исследований активно
внедряется метод секвенирования генов, т.е. определения последовательности
нуклеотидов в целевом участке гена.
В основе всех молекулярно-биологических методов лежит представление о том,
что универсальным носителем генетической информации, исключая РНК-вирусы,
является ДНК. ДНК представляет собой двойную цепь, скрученную в спираль.
Каждая цепочка состоит из соединенных последовательно нуклеотидов (рис. 3-28).
Нити ДНК имеют противоположную направленность: 5’-концу одной нити соот-
Рис. 3-28. Структура цепи ДНК. Последовательное соединение нуклеотидов.
150 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ветствует З’-конеи второй нити. Уникальным свойством ДНК является ее способ-
ность удваиваться. В живой клетке этот процесс развивается следующим образом:
с помощью специальных ферментов — гираз происходит расплетание спирали в
том ее участке, где должна наблюдаться репликация. При этом водородные связи
между азотистыми основаниями разрываются и нити расходятся. Одна из цепей
(смысловая) используется в качестве основной матрицы. Построение новой нити
ДНК идет только в одном направлении — от 5’-конца к З'-концу. Данный процесс
осуществляется по принципу комплементарности. Это строгое соответствие соеди-
нения азотистых оснований, занимающих положение в двух цепях ДНК напротив
друг друга и соединенных водородными связями, в котором: аденин соединяется с
тимином (А-Т) и гуанин соединяется с цитозином (Г-Ц).
Г ибридизационный анализ
Исторически метод ДНК- или РНК-гибридизации был внедрен раньше, чем
метод ПЦР. В основе метода лежит способность нуклеиновых кислот к гибри-
дизации — образованию двух цепочечных структур за счет взаимодействия ком-
плементарных последовательностей нуклеотидов. В 1970-е гг. для выявления
инфекционного возбудителя или мутации использовали ДНК-зондовую детекцию,
основанную на гибридизации специфических олигонуклеотидных зондов, мечен-
ных радиоактивным изотопом (или флюорохромом) с образцом выделенной ДНК.
Олигонуклеотидные зонды были синтезированы таким образом, что содержали
последовательности нуклеотидов, коплементарные участку цепи ДНК-мишени с
известной структурой.
Различают два типа гибридизационного анализа:
• методы гибридизационного анализа, проводимые в растворе (гомологич-
ные);
• методы гибридизационного анализа, проводимые на твердом носителе (гете-
рогенные).
Последние получили более широкое распространение в связи с тем, что имеют
большие аналитическую чувствительность и специфичность, являются более тех-
нологичными, их проще стандартизировать и автоматизировать.
Принцип метода основан на гибридизации зонда на твердой поверхности.
В качестве твердой поверхности чаще всего используют полимерную нейлоновую
мембрану.
Протокол анализа состоит из следующих стадий:
• пробоподготовки (выделения ДНК из образца);
• фиксации ДНК-образца на мембране;
• гибридизации с ДНК-зондом, меченным флюорофором или ферментом;
• детекции результата.
Для освобождения нуклеиновых кислот из состава клеточных структур при про-
боподготовке проводят лизис клеток, а в некоторых случаях очищают препарат
ДНК с помощью фенола.
Фиксацию ДНК-образца на твердом субстрате осуществляют в два этапа: вначале
ДНК денатурируют с помощью щелочи, затем образец нуклеиновой кислоты фик-
сируют на носителе — нитроцеллюлозной или нейлоновой мембране, обычно путем
инкубации от 10 мин до 4 ч при 80 иС в вакууме. Для того чтобы олигонуклеотидный
зонд не взаимодействовал с мембраной, свободные точки связывания на мембране
инактивируются. На стадии гибридизации искомые фрагменты ДНК (РНК) компле-
ментарно связываются со специфическим зондом, меченным флюорофором, радио-
активной меткой или ферментом. Избыток зонда удаляется в процессе промывки.
Далее осуществляют детекцию одним из возможных методов (авторадиографиче-
ским, фермен гативно-гибридизационным или флюориметрическим).
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 1 51
Критическим этапом в данном протоколе является неспецифическая фикса-
ция ДНК-мишени на мембране с последующей нейтрализацией свободных точек
связывания- Эффективность этой стадии в большой степени зависит от длины
и структуры нуклеотидной последовательности мишени, поэтому в настоящее
время, преимущественно в научных исследованиях, используют разновидности
данного протокола (саузерн-блот, нозерн-блот).
В лабораторно-клинической практике метод прямого связывания мишени с
твердой фазой уступил место так называемой «сэндвич»-технологии. Протокол,
основанный на принципе «сэндвича», отличается от описанного тем, что уча-
ствуют два зонда, гомологичных различным участкам нуклеотидной цепи ДНК-
или РНК-мишени. Один зонд фиксируют на мембране для того, чтобы связать
искомую мишень, присутствующую в исследуемом образце. Носле гибридизации
мембран)’ отмывают от исследуемого материала и добавляют раствор, содержащий
второй зонд, который представляет собой конъюгат олигонуклеотида и какой-
либо метки. Процесс гибридизации проводят повторно, при этом зонд с меткой
взаимодействует с искомым участком ДНК (РНК). Дальнейший процесс детекции
проводят стандартным методом в зависимости от природы метки (ферментно-
гибридизационным, радиографическим, авторадиографическим, флюоресцент-
ным, хемилюминесцентным).
В настоящее время ведутся интенсивные разработки по совершенствованию
методов гибридизации в следующих направлениях:
• упрощение процедуры генного зондирования до одной-двух стадий процесса;
• отказ от сорбции мишени на мембране;
• повышение чувствительности гибридизационных методов за счет использо-
вания процедуры амплификации сигнала с зонда.
Преимущество этого подхода заключается в том, что практически сведены
к минимуму подготовка клинического материала и очистка нуклеиновых кис-
лот. Описанная схема реализована в нескольких коммерческих тест-системах.
В современных наборах реагентов применяется хемилюминесценция в качестве
процесса, обеспечивающего чувствительную детекцию результатов гибридизации.
Технология автоматизирована, время выполнения анализа составляет 2,5-3 ч.
По мере миниатюризации соответствующих носителей-подложек для гибри-
дизации в практику вошли микрочипы (microarrays) с сотнями и тысячами ДНК-
зондов для выявления практически любых известных генов, их вариантов и
мутаций. Часто для гибридизации применяют не исходные нуклеиновые кислоты,
а продукты амплификации целевых генов. Учет результатов гибридизации на био-
чипах осуществляется посредством оптических устройств, обычно предлагаемых
фирмой-разработчиком.
Метод полимеразной цепной реакции
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — молекулярно-биологический метод
исследования, получивший широкое распространение в современных лаборато-
риях и используемый для диагностики инфекционных, наследственных и онко-
логических заболеваний, а также для исследования состава условно патогенной
флоры.
Метод НЦР основан на принципе естественной репликации ДНК, включающем
денатурацию двойной спирали ДНК. расхождение нитей ДНК и комплементар-
ное удвоение обеих. Ценность метода заключается в многократном копирова-
нии (амплификации) определенных, специфических только для данной мишени
участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом
цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-
полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение концен-
152 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
трации специфических для данной мишени фрагментов ДНК в миллионы раз, что
значительно упрощает дальнейший анализ.
Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо наличие в реакци-
онной смеси ряда основных компонентов.
Праймеры — искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как
правило, размер от 15 до 30 нуклеотидов, идентичные соответствующим участ-
кам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции
амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность
и чувствительность тест-системы.
Taq-полимераза — термостабильный фермент [максимальная активность фер-
мента проявляется при температуре 70-74 °C (хотя фермент может работать
и при более низких температурах)] массой приблизительно 94 кДа. Источник
происхождения этого фермента — микроорганизм Thermus aquaticus, время полу-
жизни которого при 94 °C составляет около 45 мин. Тод-полимераза обеспечивает
достраивание З’-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности,
осуществляя синтез ДНК в направлении 5’->3’ в присутствии ионов Mg2- и при
соответствующем значении pH, а также обладает 5’->3>-экзонуклеазной активно-
стью. Наличие 5’->3'-экзонуклеазной активности делает фермент пригодным для
использования его в ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ): дезоксиаденозинтрифосфата
(дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ). дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ)
и дезокситимидинтрифосфата (дТТФ) — «строительный материал», используе-
мый Тод-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.
Буфер — смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечи-
вающей оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение pH.
Анализируемый образец — подготовленный к внесению в реакционную смесь
препарат, который может содержать искомую ДНК, например ДНК микроорга-
низмов, служащую мишенью для последующего многократного копирования. При
отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.
Для удобства детекции или контроля эффективности амплификации в состав
реакционной смеси могут быть включены следующие дополнительные компо-
ненты.
• Внутренние контроли — гетерологичный специфическому фрагмент ДНК,
как правило, большего размера, ограниченный специфическими праймера-
ми. Фактически представляет собой альтернативную матрицу ПЦР и позво-
ляет контролировать эффективность амплификации в каждой конкретной
пробирке.
• ДНК-зонды — искусственно синтезированные олигонуклеотиды небольшого
размера (приблизительно 30 нуклеотидов), комплементарные специфиче-
ским ампликонам. Благодаря прикрепленным к ним изотопным или флюо-
ресцентным меткам ДНК-зонды могут быть маркерами ПЦР-продуктов.
Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов (рис. 3-29). Переход от
одной стадии реакции к другой достигается изменением температуры инкубаци-
онной смеси.
• Денатурация. На первом этапе необходимо расплести двойную цепь ДНК,
находящуюся в образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95 °C,
в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образова-
нием двух одноцепочечных молекул.
• Отжиг. На втором этапе праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК-
мишени. Праймеры подбирают так, что они ограничивают искомый фраг-
мент и комплементарны противоположным цепям ДНК. Отжиг происходит в
соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа, означающим, что в
двухцепочечной молекуле ДНК напротив аденина всегда находится тимин, а
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 153
А
ПЦР : Полимеразная цепная реакция
Рис. 3-29. Схема реакции и принцип амплификации ДНК-мишени в ПЦР.
напротив гуанина — цитозин. Если это условие не соблюдено, отжига прай-
меров не происходит.
После отжига праймеров Тод-полимераза начинает достраивание второй цепи
ДНК с З’-конца праймера.
• Элонгация (синтез). На третьем этапе температуру в реакционной смеси
доводят до оптимума работы Та^-полимеразы и синтез второй цепи продол-
жается с максимальной эффективностью.
Таким образом, в идеальных условиях проведения реакции за 35 циклов ПЦР
синтезируется несколько миллиардов копий ампликона определенной длины.
Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции фраг-
мента, например, с помощью флюориметрии или методом электрофореза в
геле.
154 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ЭФФЕКТ ПЛАТО
Процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометриче-
ской прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность кри-
тически падает. Это связано с так называемым эффектом плато.
Термин «эффект плато» используют для описания процесса накопления про-
дуктов ПЦР на последних циклах амплификации, когда количество ампликонов
достигает 0.3-1.0 пмоль (ДНК в количестве, необходимом для их дальнейшей
детекции).
В зависимости от условий и количества циклов реакции амплификации на
момент достижения эффекта плато влияют: утилизация субстратов (дНТФ и
праймеров); стабильность реагентов (дНТФ и фермента); количество ингибито-
ров, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы; неспецифические продукты или
праймер-димеры, конкурирующие за праймеры, дНТФ и полимеразу; концентра-
ция специфического продукта и неполная денатурация при высокой концентрации
продуктов амплификации. Чем меньше начальная концентрация ДНК-мишени,
тем раньше происходит выход реакции на плато. Этот момент может наступить
до того, как количество специфических продуктов амплификации будет достаточ-
ным, чтобы их можно было проанализировать.
ПРОТОКОЛ ИССЛЕДОВАНИЯ
ПЦР в диагностической лаборатории является достаточно сложной, многосту-
пенчатой методикой, требующей правильного выполнения всех процедур. Ниже
изложены основные специфические требования к процессам взятия образцов,
выделения наследственного материала, выполнения амплификации и регистрации
результатов, т.е. преаналитической, аналитической и постаналитической стадии
исследования.
ВЗЯТИЕ ОБРАЗЦОВ
Клиническим материалом для исследования методом ПЦР могут служить
соскобы эпителиальных клеток, кровь, плазма, сыворотка, плевральная и спин-
номозговая жидкости, моча, мокрота, слизь и другие биологические выделения,
биоптаты. Однако в большинстве анализов в качестве образца используют соскоб
эпителиальных клеток и сыворотку крови пациента. К особенностям метода сле-
дует отнести то, что материал, необходимый для исследования, должен потенци-
ально содержать искомую ДНК (например, в абсолютном большинстве случаев
невозможно детектировать в крови микроорганизм Chlamydia trachomatis, так как
это внутриклеточный паразит эпителиальных клеток урогенитального тракта).
ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
В зависимости от поставленных задач используют различные методики для
выделения нуклеиновых кислот из биологического материала. Суть методик
заключается в экстракции из исследуемого образца нуклеиновых кислот и нейтра-
лизации ингибиторов ПЦР,
В настоящее время существуют экспресс-методики выделения ДНК, позво-
ляющие за сравнительно небольшое время обрабатывать много образцов с мини-
мальными трудозатратами. Если перед лабораторией стоит задача получить более
чистый препарат ДНК или детектировать низкокопийный образец, существуют
методики, позволяющие провести очистку с высокой чистотой, но требующие
больших трудозатрат.
АМПЛИФИКАЦИЯ (УМНОЖЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ФРАГМЕНТОВ ДНК)
На данной стадии происходит накопление коротких специфических фрагментов
ДНК в количестве, необходимом для их дальнейшей детекции.
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 155
ДЕТЕКЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ
Регистрировать результат ПЦР можно либо по завершении реакции («по конеч-
ной точке»), либо на протяжении всей реакции (в реальном времени). Классическая
ПЦР предполагает анализ результатов реакции по «конечной точке». Для этого
используют методы электрофореза в геле, гибридизационно-ферментный анализ
(ГИФА), флюоресцентную детекцию после ПЦР (FLASH) и др. Различные методы
детекции результатов ПЦР имеют свои преимущества и недостатки (табл. 3-14). и,
как правило, их выбирают в зависимости от задач, решаемых лабораторией. Для
выявления количества ДНК в исходной пробе и наблюдения за кинетикой процес-
са в современных лабораториях используют метод ПЦР с детекцией результатов в
режиме реального времени.
Таблица 3-14. Сравнение методов детекции результатов ПЦР (Ребриков Д.В., Саматов Г.А.,
Трофимов Д.Ю. и др., 2009)
Характеристика метода Электрофорез ГИФА Система Flash и флюормметр *Джин» Система детекции результатов ПЦР в режиме реального времени
Приблизительное время детекции для 30 образцов 40 мин 60 мин 3 мин 0 мин
Контаминация продук- тами ПЦР Высокая Высокая Низкая Низкая
Фиксирование данных Вручную Автоматическое Автоматическое Автоматическое
Возможность исполь- зования метода в роботизированных системах (совмеще- ние с пипетирующими станциями) Отсутствует Отсутствует Отсутствует Присутствует
Особенности Возможность увидеть резуль- тат ПЦР в виде полоски на геле, оценить количе- ство и качество амплификата по нескольким пара- метрам Повышение досто- верности иссле- дования за счет специфичности пробы к целевому амплификагу Повышение досто- верности иссле- дования за счет специфичности пробы к целевому амплификагу Возможность оцен- ки исходного коли- чества копий ДНК в образце
ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ РЕЗУЛЬТАТОВ ПО ОКОНЧАНИИ РЕАКЦИИ
В процессе ПЦР (при наличии в биопробе искомой ДНК) в геометрической
прогрессии происходит увеличение копий ее специфического фрагмента. По
окончании реакции (30-50 циклов) количество таких копий достигает значений,
при которых становится возможной надежная регистрация результатов реакции.
Регистрацию результатов ПЦР «по конечной точке» проводят несколькими спо-
собами:
• методом электрофореза в агарозном геле;
• гибридизацией фрагментов ДНК с меченым зондом, в планшете, на мембране
или микропластинке (биочипы);
• флюоресцентными методами детекции (при использовании технологии раз-
рушающихся ДНК-зондов).
В последние годы ПЦР широко используется в лабораторной практике для
идентификации таких инфекций, как трихомониаз, гонорея, ВИЧ и т.д.
Преимуществом метода является то, что он универсален для диагностики
любых микроорганизмов и поэтому лишен недостатков культивационных мето-
156 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
дов, связанных с высокими требованиями ряда микроорганизмов к условиям
культивирования.
К достоинствам также следует отнести возможность тестирования большого
количества любых клинических образцов.
Диагностическая ценность метода ПЦР признана во всем мире. В соответствии с
данными Европейских стандартов диагностики и лечения заболеваний, передавае-
мых половым путем (2004), чувствительность ПЦР в диагностике хламидийной
инфекции составляет 70-95%, специфичность — 97-99% (Рэдклиф К., 2004).
ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ РЕЗУЛЬТАТОВ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
Метод ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени предусма-
тривает автоматическую регистрацию увеличения флюоресцентного сигнала,
пропорционального количеству синтезированных в ходе реакции специфических
фрагментов ДНК (микроорганизмов, человека, животных и т.д.).
Реакция выполняется и автоматически регистрируется специализированными
приборами для осуществления ПЦР в режиме реального времени. Программное
обеспечение оборудования может автоматически переводить полученные данные
в удобный для чтения врача-лаборанта формат.
В зависимости от исходной концентрации специфических нуклеиновых кислот
(микроорганизмов, человека и т.д.) в исследуемом образце переход из стадии
инициации в экспоненциальную стадию происходит на разных циклах (рис. 3-30
см. цв. вклейку). Чем больше в образце искомой ДНК, тем на более раннем цикле
прибор начнет регистрировать флюоресценцию; чем меньше искомой ДНК, тем на
более позднем цикле начнется автоматическая регистрация флюоресценции.
Метод ПЦР с детекцией результатов в процессе амплификации предоставля-
ет возможность количественно оценивать ДНК микроорганизмов в исходном
материале, а также использовать мультиплексный анализ (анализ результатов по
нескольким каналам детекции), что дает возможность выявлять большее количе-
ство микроорганизмов в каждой пробирке.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПЦР
Чувствительность
Теоретическая чувствительность метода ПЦР — 1 копия искомого гена в иссле-
дуемом образце (5-10 мкл раствора ДНК). Такой результат в идеале можно полу-
чить при минимальных потерях ДНК в процессе выделения, отсутствии факторов,
разрушающих ДНК, и оптимальном режиме амплификации. Однако на практике
максимальная чувствительность метода ПЦР составляет от 5 до 50 генокопий в
образце, что является пороговым значением для обычной (качественной) реакции
с электрофоретическим учетом результатов. На чувствительность метода могут
влиять следующие факторы.
• Качество выделенной ДНК (РНК).
• Примеси и добавки (фенол, муцины и др.).
• Параметры реакции.
Состав реакционного буфера.
❖ Температура и время денатурации.
< > Температура отжига.
> Правильный состав и длина праймеров.
❖ Количество циклов ПЦР.
• Варианты постановки ПЦР («гнездовая», мультиплексная и др.).
Несмотря на то что методики real-time PCR в целом являются намного более
чувствительными, нежели обычные (электрофоретические) способы детекции (в
силу суммирования сигналов на протяжении всей реакции), на их чувствитель-
ность влияют те же факторы, связанные с подготовкой проб, сохранностью ДНК
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 157
и принятым режимом ПЦР. Считается, что минимальное количество генокопий,
выявляемое при real-time PCR. составляет от 2 до 10 в исследуемом образце в
зависимости от оптимальности реакционной смеси и режима ПЦР. В такой ситуа-
ции основной проблемой становится возникновение сигнала в отрицательных
контрольных пробах, который может быть сравним с минимальными значениями
сигнала в испытуемых образцах.
СПЕЦИФИЧНОСТЬ
Специфичность диагностического ПЦР-набора — способность выявлять ДНК
исключительно искомого микроорганизма (микроорганизмов). При разработке
специфической тест-системы на какой-либо микроорганизм выбирают специфи-
ческий участок генома данного вида, имеющий как можно более существенные
отличия среди всех близкородственных видов.
Другой задачей при создании ПЦР-тест-системы является правильный подбор
праймеров, которые должны отвечать ряду критериев.
• Праймеры должны быть специфичными. Особое внимание уделяют З’-концам
праймеров, так как именно с них Tag-полимераза начинает достраивать компле-
ментарную цепь ДНК. Если их специфичность недостаточна, вероятен синтез
неспецифической ДНК (дополнительные полосы, сплошной мазок на электро-
форезе — «шмер»). Оценка результатов реакции становится затруднительной,
легко перепутать специфический продукт амплификации с синтезированной
посторонней ДНК. Часть праймеров и дНТФ расходуются на синтез неспецифи-
ческой ДНК, что приводит к значительной потере чувствительности.
• Праймеры не должны образовывать димеры и петли, т.е. не должно образо-
вываться устойчивых двойных цепей в результате отжига праймеров самих
на себя или друг с другом.
• Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или
инсерций (вставок) в пределах видовой или иной специфичности, взятой
в качестве критерия при выборе праймеров. При попадании на такую зону
отжига праймеров происходить не будет, и, как следствие, — ложноотрица-
тельный результат.
Секвенирование генов
Прямое секвенирование ДНК основано на синтезе in vitro исследуемого участка
гена с применением ДНК-полимеразы, меченых дНТФ и праймеров, после чего
устанавливается позиция меченого нуклеинового основания. Метод определения
последовательностей (сиквенсов) РНК, считываемых с матрицы ДНК, основан на
использовании радиоактивных фрагментов ДНК. Короткие полинуклеотидные
участки подвергаются полимеразной реакции в присутствии или отсутствии каж-
дого из 4 дНТФ (так называемый плюс-минус метод). При отсутствии того или
иного нуклеотида рост цепочки прерывается перед соответствующей позицией его
в цепочке исходной ДНК, а при их наличии идет далее. Продукты реакции фрак-
ционируют путем электрофореза, сравнивают по длине и делают выводы о пози-
циях каждого из 4 нуклеотидов в коротких фрагментах. Этот подход применим для
секвенирования ДНК в небольших участках генов фагов и вирусов.
Современный, более эффективный и быстрый способ секвенирования ДНК
основан на копировании изучаемого участка ДНК посредством ДНК-полимеразы.
Главное отличие от прямого секвенирования состоит в том, что в реакционную
смесь добавляют один из нуклеотидов в форме дидезоксиНТФ (ддНТФ). При
включении его в ДНК рост цепочки прекращается, т.е. тот или иной ддНТФ слу-
жит в качестве «терминатора» синтеза. С изучаемым образцом ДНК ставятся
одновременно четыре реакции с каждым из 4 ддНТФ. Затем продукты реакций
158 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
наносят на полиакриламидный гель, оценивают их относительную длину (т.е.
место прерывания синтеза) и позицию данного нуклеотида в последовательности
участка гена. Именно этот метод в 1980-х гг. получил применение в клинических
исследованиях, в частности при анализе тонких генетических различий (генных
вариантов), что оказалось крайне важным для идентификации индивидуальных
молекулярно-генетических признаков. Данный способ лег в основу углубленного
(high-resolution) типирования генов гистосовместимости (генов системы HLA) у
доноров и реципиентов по мере широкого внедрения в клинику аллогенной транс-
плантации костного мозга.
Преимущества методов молекулярной
клинической диагностики
Основным преимуществом метода ПЦР при диагностике инфекционных аген-
тов по сравнению с классическими микробиологическими методами (культивиро-
ванием и идентификацией клинических изолятов) является быстрота исполнения
(5-6 ч). В сравнении с иммунологическими определениями (например, иммуно-
ферментными или иммунофлюоресцентными методами выявления антигенов)
ПЦР ДНК во многих случаях является более чувствительным и экономичным
методом (по крайней мере, на отечественном рынке соответствующих реагентов).
В частности, при диагностике вирусных инфекций, особенно гепатита С, вирусную
РНК в плазме больных обнаруживают с первых дней заболевания, тогда как спе-
цифические антитела (основной объект иммунологического скрининга при гепа-
тите С) — только спустя 2-7 нец после заражения. При диагностике папилломы
молекулярно-биологические методы позволяют дифференцировать онкогенные и
менее патогенные типы вируса, а также идентифицировать вирус, интегрирован-
ный в хромосомы человека, т.е. предраковые состояния.
При идентификации генетических заболеваний (инактивации белка из-за
генной мутации) ДНК-диагностика стала более практичным методом выявления
больных и членов семей — носителей мутантного гена по сравнению с биохими-
ческими методами определения соответствующих метаболитов. Молекулярно-
биологические методы особенно важны для диагностики наследственных заболева-
ний, для которых неизвестен четкий биохимический субстрат или соответствующая
биохимическая диагностика весьма дорога. Прогресс генной диагностики связан
с успешным завершением проекта «Геном человека», в результате которого стала
известна нормальная последовательность нуклеотидов в 99,9% генов человека.
При подозрении на наличие редких мутаций гена проводят амплификацию и
последующее секвенирование выделенного сегмента. Медико-генетические иссле-
дования касаются в первую очередь наиболее распространенных генетических
заболеваний — муковисцидоза, фенилкетонурии, миодистрофий.
При выявлении онкогенов, специфичных для различных злокачественных
заболеваний, особенно лейкозов и лимфом, ПЦР-диагностика (при необходи-
мости с последующим секвенированием продукта ПЦР) становится методом
диагностики, превосходящим иммунохимические способы диагностики (иммуно-
гистологические, проточно-флюориметрические) по чувствительности и часто по
экономичности исследования.
Приборное оснащение
ТИПЫ АМПЛИФИКАТОРОВ
Для проведения ПЦР используют амплификаторы, или термоциклеры.
В основе устройства прибора для проведения ПЦР лежит принцип циклического
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 159
нагревания-охлаждения. Эти термальные процессы обычно проходят в диапазоне
температур от 95 °C (верхняя граница) до 4 °C (температура хранения проб после
завершения ПЦР). В настоящее время используют приборы для амплификации,
которые имеют матрицу с лунками для стандартных ПЦР-пробирок (на 200 или
600 мкл) и электрический термоэлемент типа Пельтье для последовательного
нагревания-охлаждения этой матрицы. Приборы для ПЦР разных моделей раз-
личаются главным образом емкостью (количеством загружаемых проб), конструк-
тивными материалами (сталь, алюминий, пластик и др.)., элементами дизайна и
интерфейса.
С помощью термоциклеров можно осуществлять размножение нужных участков
молекул ДНК (или кДНК, полученных из РНК) в тысячах копий. Амплификаторы
ДНК можно отнести к специализированным термостатам с температурой, изме-
няющейся во времени согласно заданной программе. В зависимости от количества
ПЦР-программ, проводимых одновременно, амплификаторы можно разделить:
• на моноблочные модели (одна программа в одном термоблоке);
• модели с двумя и более автономно функционирующих блоков;
• модели с возможностью градиента температуры в пределах одного блока
(«Т-градиент»),
В зависимости от задач и методов учета амплификации современные термоци-
клеры можно классифицировать;
• на приборы для качественной ПЦР (только термоинкубация без системы
учета результатов);
• приборы для ПЦР гг учета количества ПЦР-продукта в конечной точке реак-
ции;
• приборы для оценки динамики и учета результатов ПЦР в реальном режиме
времени {real-time ПЦР).
Для многих моделей амплификаторов предусмотрена возможность программи-
рования и управления посредством компьютера.
СИСТЕМЫ ДЕТЕКЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ПЦР
Электрофорез
Классический метод детекции результатов ПЦР — разделение ее продуктов
(ампликонов) методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Этот
способ незаменим при детекции продуктов ПЦР с малыми различиями по моле-
кулярной массе. Однако приготовление ПААГ достаточно трудоемко, что ограни-
чивает его использование при массовых исследованиях. В настоящее время сепа-
рацию продуктов амплификации чаще всего проводят в 1,5-2% агарозном геле.
Учет результатов проводят в гелях, содержащих бромистый этидий, образующий
химические комплексы с ДНК, которые интенсивно флюоресцируют при под-
светке ультрафиолетовым излучением. Для учета результатов реакции применяют
трансиллюминатор. В настоящее время используют системы видеодокументации
изображений, которые включают трансиллюминатор, видеокамеру с высоким
разрешением, персональный компьютер с соответствующим программным про-
дуктом для записи и хранения изображений.
Практическими недостатками такого способа детекции являются:
• высокий риск контаминации продуктами амплификации;
• получение только качественных результатов реакции амплификации (коли-
чественный учет невозможен).
Бесфорезный качественный анализ ПЦР
В настоящее время разработаны приборы, созданные на базе флюориметров, в
которые вместо обычных кювет загружаются пробирки после проведенной ПЦР (в
которой используются специфические флюоресцентные ДНК-зонды). С помощью
160 ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
таких приборов можно определять сигнал ПЦР по наличию специфического све-
чения, сила которого пропорциональна количеству ПЦР-продукта. Метод хорош
тем, что пробирки после ПЦР не надо открывать и анализ целого блока пробирок
(12 шт.) проводится в течение минут. При этом снижается вероятность загрязне-
ния помещений лаборатории продуктами амплификации, как это происходит при
использовании электрофореза.
ПРИБОРЫ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО УЧЕТА ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
(REAL-TIME PCR)
Приборы для оценки ПЦР в режиме реального времени представляют собой
своеобразный гибрид амплификатора и флюориметра и позволяют оценивать
динамику ПЦР прямо в закрытых пробирках по мере накопления продукта ампли-
фикации и проводить количественный ПЦР-анализ. Специфичность сигнала при
ПЦР в реальном времени обусловлена применением специальных ДНК-зондов с
флюоресцентной меткой. В процессе ПЦР по мере синтеза новых и новых копий
искомого участка гена происходят специфическое связывание этой меченой
цепочки нуклеотидов и ее разрушение с выходом красителя в окружающую среду.
По мере протекания ПЦР светочувствительные элементы снимают показатели с
каждой из пробирок и вводят эти данные в память компьютера. При этом строится
динамическая кривая накопления ПЦР-продукта по отдельным пробам.
Объемы анализируемых проб, время анализа и температура измерений соот-
ветствуют таковым для обычной ПЦР. Тем не менее в этом режиме не требуется
дополнительное время на процедуры, связанные с электрофорезом, так как кри-
вые накопления продуктов реакции доступны сразу по окончании real-time PCR.
Калибровка зависит от типа имеющегося прибора. Она требуется для оптимизации
параметров оптического блока и выравнивания показателей по отдельным лун-
кам, осуществляется с теми флюорохромами, которыми помечены применяемые
ДНК-зонды.
Количественная оценка ДНК или РНК патогенного микроорганизма в кли-
нических образцах бывает исключительно важна для прогноза заболевания и
контроля терапии. Эта технология активно внедряется в российские клинико-
диагностические лаборатории.
Кроме возможности количественного учета результатов реакции, к несо-
мненным достоинствам real-rime PCR следует отнести высокую технологичность
исследования и снижение вероятности загрязнения помещений лаборатории про-
дуктами амплификации.
ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ АВТОМАТИЧЕСКОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ ДНК
Автоматическое секвенирование в большинстве приборов для клинических
исследований сводится к использованию метода терминирующих ddNTP. На
первом этапе проводятся терминирующие полимеразные реакции, затем — раз-
деление продуктов реакций методом капиллярного микроэлектрофореза.
Современное приборное обеспечение позволяет автоматизировать процесс раз-
деления флюоресцентно-меченых фрагментов ДНК в полиакриламидном геле,
получение типа и распределения эмиссии флюорофоров, последующий анализ
собранных данных и выдачу готового результата.
Помимо оптимизации полимеразной реации, важнейшим моментом является
мечение определенных нуклеотидов для реакции. Это делают, включая метку в
состав праймера или в нуклеотид, который терминирует реакцию. Например, каж-
дый из четырех терминирующих НТФ метят «своим» флюорофором, что позво-
ляет проводить все четыре реакции в одной пробирке и анализировать продукты
реакции в пределах одной зоны электрофореза. В автоматическом секвенировании
используют флюорофоры, абсорбция и излучение у которых происходят в диапа-
ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 161
зоне длин волн 450-650 нм (видимая область спектра) или 650-825 нм (ближняя
инфракрасная область спектра). Оптические системы и аппаратура для обработки
данных должны минимизировать возможное наложение спектров лучевой эмис-
сии для отдельных флюорофоров. При анализе данных следует учитывать, что
некоторые флюорофорные молекулы могут изменять заряд (и соответственно
подвижность) продуктов реакции в электрофорезе, что может быть причиной
артефактов.
Ферменты, применяемые для секвенирующих процедур, относятся к реком-
бинантным ДНК-полимеразам, не обладающим экзонуклеазной активностью и
толерантностью к включению меченых дезоксинуклеотидов. Выбор термочув-
ствительных или термостабильных полимераз определяется режимами реакции
(обычной или циклической, т.е. типа ПЦР) в зависимости от задач секвенирования
в конкретном случае.
Аппаратура для секвенирующего гель-электрофореза должна обладать доста-
точно высоким разрешением, чтобы разделять фрагменты, различающиеся по
длине лишь на один нуклеотид. Разделяют фрагменты в денатурирующем режиме
(5-8% ПААГ с 7М мочевиной). Обычно электрофорез проводится в трис-боратном
буфере. Важным условием при проведении электрофореза является однородность
температуры геля и заключающих стекол. Прекрасным решением для автоматиче-
ского секвенирования является капиллярный электрофорез в стеклянной трубке
длиной 30-100 см при небольшом диаметре капилляра (50- J 00 мкм), что значи-
тельно ускоряет процедуру разделения.
Основные модели автоматических секвенаторов
Современные секвенаторы можно разделить по типу проводимого электрофо-
реза на капиллярные и с гелевыми пластинами. Последние могут различаться по
количеству детектируемых красителей — один, два или четыре. Капиллярные сек-
венаторы выпускаются только в варианте, использующем детекцию четырех флю-
оресцентных красок, возбуждаемых излучением аргонового лазера. Разделение
фрагментов проводится в геле толщиной 0,4 мм. Возбуждение флюорофора и сле-
дующая за этим эмиссия флюоресценции происходят при прохождении меченым
фрагментом ДНК зоны сканирования. Для уменьшения эффекта перекрывания
спектров эмиссии получаемый сигнал пропускается через колесо с 4 последова-
тельно заменяемыми фильтрами. В результате первичные данные представляют
собой наборы из четырех чисел (в соответствии с сигналом, прошедшим через
каждый из фильтров) для каждой точки сканирования (по ширине геля), собран-
ные через равные интервалы времени в течение всего электрофореза.
Секвенаторы на гелевых пластинках обнаруживают флюоресценцию от одного
до нескольких красителей. Имеется несколько модификаций в зависимости от
типа лазера, направления луча возбуждающего света. В частност