Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. В 2-х книгах. Книга 2 - Гоулдстейн Дж., Ньюбери Д., Эчлин П.

Author: Гоулдстейн Дж. Ньюбери Д. Эчлин П.

Tags: электротехника электроника

Year: 1984

Similar

Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. В 2-х книгах. Книга 1.

Электронные микроскопы

Радиоэлектроника. Конструкции для всех. Книга 2

Электронный микроскоп

Text

< s
xo
Sd LU
PACTPOBAfl
ЭЛЕКТРОННАЯ
МИКРОСКОПИЯ
И РЕНТГЕНОВСКИЙ
МИКРОАНАЛИЗ

Scanning Electron Microscopy
and X-Ray Microanalysis
A Text for Biologists,
Materials Scientists, and Geologists
JOSEPH I. GOLDSTEIN
Lehigh University
Bethlehem, Pennsylvania
DALE E. NEWBURY
National Bureau of Standards
Washington, D. С
PATRICK ECHLIN
University of Cambridge
Cambridge, England
DAVID C. JOY
Bell Laboratories
Murray Hill, New Jersey
CHARLES FIORI
National Institutes of Health
Bethesda, Maryland
ERIC LIFSHIN
General Electric Corporate Research and Development
Schenectady, New York
Plenum Press • New York and London 1981

РАСТРОВАЯ
ЭЛЕКТРОННАЯ
МИКРОСКОПИЯ
И РЕНТГЕНОВСКИЙ
МИКРОАНАЛИЗ
в 2-х книгах
2
Перевод с английского
Р. С ГВОЗДОВЕР И Л. Ф. КОМОЛОВОЙ
под редакцией
канд. физ.-мат. наук В. И. ПЕТРОВА
Москва «Мир» 1984

ББК 32.851.1
Р24
УДК 621.385.833
Гоулдстейн Дж., Ньюбери Д., Эчлин П., Джой Д., Фиори Ч.,
Лифшин Э.
Р24 Растровая электронная микроскопия и рентгеновский
микроанализ: В 2-х книгах. Книга 2. Пер. с англ./Гоулд-
англ./Гоулдстейн Дж., Ньюбери Д., Эчлин П. и ДР- — М.: Мир, 1984. —¦
348 с, ил.
Во второй книге монографии изложена методика проведения количественного
рентгеновского микроанализа с многочисленными примерами и практическими ре-
рекомендациями, а также техника подготовки различных объектов для последующе-
последующего их исследования в РЭМ и РМА. Рассмотрены вопросы нанесения специальных
покрытий, особенности исследования биологических (влагосодержащих) образцов
и т. д.
Книга представляет интерес для физиков, химиков, материаловедов, геологов,
биологов и студентов соответствующих специальностей.
2108000000-393 ББК 32.851.1
Р 041@1)-84 152"84' ч- 1 6ФО.31
Редакция литературы по новой технике
1981 Plenum Press, New York
Перевод на русский язык, «Мир», 1984

Глава 7
КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ РЕНТГЕНОВСКИЙ МИКРОАНАЛИЗ
7.1. ВВЕДЕНИЕ
Используя неразрушающую технику рентгеновского излуче-
излучения, с помощью РМА и РЭМ можно провести количественный
анализ состава области массивного образца размером ~ 1 мкм3.
При исследовании образцов в виде тонких пленок и срезов ор-
органических материалов размер анализируемого объема умень-
уменьшается приблизительно в 10 раз от значения для массивных
образцов. Для анализа металлов и сплавов обычно использует-
используется метод трех поправок. В качестве эталонов можно использо-
использовать чистые элементы или сплавы, причем поверхности образ-
образцов и эталонов должны тщательно готовиться к анализу и ана-
анализироваться в идентичных экспериментальных условиях. Для
анализа геологических образцов обычно используется эмпириче-
эмпирический метод, или метод а-коэффициентов. Для этого класса объ-
объектов вторичная рентгеновская флуоресценция незначительна,
и при анализе используются эталоны из окислов элементов с
близким к образцу атомным номером. Биологические образцы
часто повреждаются бомбардирующим электронным пучком.
Важно обеспечить, чтобы эталоны находились в такой же фор-
форме в матрице, что и образец. Цель настоящей главы состоит в
том, чтобы дать детальное описание различных методов коли-
количественного анализа для неорганических, металлических и био-
биологических образцов различного вида: массивных образцов, ма-
малых частиц, тонких пленок, срезов и поверхностей излома.
Многие аналитические методы количественного анализа объ-
объединены в установках рентгеновского анализа под управлением
мини-ЭВМ. Хотя точность анализа состава обычно достаточно
высокая, исследователь должен представлять, какие методы он
использует и какие у них ограничения. Точность анализа зави-
зависит от эталонов и выбора рабочих условий (тока, ускоряющего
напряжения, рентгеновской линии и т. д.).
Методы трех поправок, а-коэффициентов и анализа тонких
пленок достигли высокой степени развития. Поэтому для каж-
каждого метода будут изложены только используемые чаще всего
приемы. В процессе изложения выражения приводятся таким
образом, чтобы читатель мог сам непосредственно сделать рас-
расчеты. Следует отметить, однако, что метод трех поправок все

6 Глава 7
еще находится на стадии усовершенствования, в особенности
для низких энергий электронов и анализа легких элементов
[117—119]. Методы анализа биологических образцов, а также
частиц и шероховатых поверхностей менее разработаны и на-
находятся все еще в стадии развития. Поэтому для каждого ме-
метода будет обсуждаться несколько приемов реализации с соот-
соответствующими комментариями по выбору оптимального для ис-
использования метода.
7.2. МЕТОД ТРЕХ ПОПРАВОК
7.2.1. Введение
Кастен [120] в своей диссертации описал метод проведения
количественного рентгеновского анализа микронной области
твердотельного образца. Трактовка Кастена может быть изло-
изложена с помощью следующих рассуждений. Среднее число актов
ионизации п элемента i на электрон первичного пучка с энерги-
энергией Ео равно
п = (NopC^At) [Q/(-dE/dx)] dE, G.1)
во
где dEjdx— средние потери энергии электрона на пути dx в об-
образце, Л^о — число Авогадро, р — плотность материала, Лг —
атомный вес элемента i, С*— концентрация элемента i, Екр —
критическая энергия возбуждения интересуемой характеристи-
характеристической рентгеновской линии (К, L или М элемента t), Q — се-
сечение ионизации, определяемое как вероятность ионизации оп-
определенной электронной оболочки атома (К, L или М) образца
электроном данной энергии на единице длины пути пробега
(гл. 3). Член (NopCi/Ai) представляет собой число атомов эле-
элемента в единичном объеме. Влияние эффекта отражения элект-
электронов можно учесть введением коэффициента R, равного отно-
отношению интенсивностей действительно генерируемого рентгенов-
рентгеновского излучения и излучения, которое генерировалось бы в том
случае, если бы все падающие электроны остались в образце.
Средняя интенсивность (I) рентгеновского излучения элемен-
элемента i на падающий электрон пропорциональна п. Следовательно,
Ео
I = const • C,Rp f [QKdEjdx)] dE. G.2)
На практике непосредственно рассчитать абсолютное значение
генерируемой интенсивности очень трудно. На самом деле ин-

Количественный рентгеновский микроанализ
Рис. 7.1. Схема экспери-
эксперимента для измерения отно-
отношения интеисивностей
/i//(/> от образца и этало-
эталона.
/ — детектор с дисперсией по
энергии или по длинам волн.
Образец
Эталон
тенсивность, с которой имеют дело, представляет собой изме-
измеренное значение интенсивности. Измеряемую интенсивность
обычно рассчитать еще труднее. Поэтому, согласно предполо-
предположению Кастена [120], мы выбираем эталон для элемента i и
измеряем отношение 1{/1ц), где U и /(») — измеренные значения
интенсивности рентгеновского излучения на образце и эталоне
соответственно. Методика экспериментального измерения пока-
показана на рис. 7.1. Интенсивность рентгеновского излучения эле-
элемента i с образца и эталона измеряется одним и тем же детек-
детектором, причем Ео, ток электронного пучка и угол между
поверхностью образца и направлением измеряемого рентгенов-
рентгеновского излучения (угол выхода ajj) поддерживаются постоянными.
При использовании отношения измеренных интенсивностей
Ii/Ia) постоянный член в уравнении G.2) исчезает и отношение
интенсивностей принимает следующий вид:
С 1С ОС Г 1 (/¦// ¦) G-3)
где в скобках заключен член, содержащий R, p, Q и dE/dx.
В первом приближении, как это обсуждалось Кастеном [120],
R, р, Q и dE/dx можно принять одинаковыми для образца и эта-
эталона. Если эталон состоит из чистого элемента i, то
С, = /,/',
(i)'
G.4)
где /(г) — интенсивность, измеряемая от чистого элемента i.
Уравнение G.4) известно как первое приближение Кастена, и
его можно использовать для предварительной оценки состава.
Для того чтобы получить отношение генерируемых интен-
интенсивностей рентгеновского излучения и, следовательно, величину
Сг, в большинстве методов анализа измеренные значения ин-
интенсивности излучения с образца и эталона необходимо скор-
скорректировать на различия в значениях R, p, Q, dE\dx и на по-
поглощение в твердом теле. Понимание сложности проблемы ана-
анализа твердого тела привело многочисленных исследователей на
раннем этапе [121—123] к развитию теоретических основ коли-
количественного анализа, предложенных Кастеном.

8 Глава 7
Во всех методиках количественного микроанализа твердых
тел используются эталоны известного состава. Во многих слу-
случаях, особенно для металлов, в качестве эталонов пригодны чи-
чистые элементы. При исследовании минералов и петрологических
образцов обычно выбираются гомогенные сложные эталоны со
средним атомным номером, близким к среднему атомному но-
номеру анализируемого образца. При количественном анализе из-
измеряется отношение относительных интенсивиостей рентгенов-
рентгеновского излучения исследуемого элемента в образце и в эталоне.
Как образец, так и эталон исследуются в одинаковых экспери-
экспериментальных условиях. Отношение измеряемых интенсивностей,
обычно обозначаемое через k, должно определяться точно, ина-
иначе любая методика количественного анализа будет приводить
к погрешности. В данной главе мы предполагаем, что измере-
измерения Ii/I(i) = ki могут быть проведены достаточно точно. В гл. 8
будут детально рассмотрены методы точного измерения значе-
значений h И /(,).
После того как значения ki получены, необходимо провести
коррекцию на несколько эффектов, включающих: 1) различия
в рассеянии и торможении электронов в образце и эталоне, так
называемый эффект атомного номера, выражаемый фактором
Zi\ 2) поглощение рентгеновского излучения в образце Л,;
3) эффекты флуоресценции Fi и в некоторых специальных слу-
случаях флуоресценцию за счет непрерывного рентгеновского излу-
излучения. В общем случае выражение для поправок имеет вид
t, G.5)
где С{ — весовая доля интересуемого элемента. Этот метод ча-
часто называют методом трех поправок (ZAF). Каждый из пере-
перечисленных выше эффектов в последующих разделах обсужда-
обсуждается в деталях.
7.2.2. Фактор поглощения А
7.2.2.1. Вывод формулы
Так как рентгеновское излучение, генерируемое электронным
пучком, возникает на некоторой отличной от нуля глубине в
образце (рис. 7.2), на пути к детектору оно должно пройти оп-
определенный путь в образце. На этом пути часть рентгеновского
излучения претерпевает поглощение из-за взаимодействия с ато-
атомами различных элементов в образце. Поэтому интенсивность
рентгеновского излучения, достигающего детектора, уменьша-
уменьшается по величине. Согласно Кастену [120], интенсивность dl
характеристического излучения, генерируемого в слое толщиной

Количественный рентгеновский микроанализ
0,5 мкм
Рис. 7.2. Схематическое представление траекторий 100 электронов в медном
образце при ускоряющем напряжении 20 кВ. Справа показано распределение
плотности генерации рентгеновского излучения [124].
dz с плотностью р на глубине z под поверхностью образца, без
учета поглощения равна
d/ = cp(pz)d(pz), G.6)
где ф(рг)—распределение генерируемого характеристического
рентгеновского излучения по глубине. Форма кривой cp(pz) для
излучения Сика представлена на рис. 7.3; эта форма типична
для всех элементов. Таким образом, в отсутствие поглощения
полный поток генерируемого и регистрируемого спектрометри-
спектрометрической системой излучения равнялся бы
/=
G.7)
Но из-за поглощения генерируемого рентгеновского излучения
фактический поток излучения /' определяется выражением
f = f Ф (P2) exp {— [ц/р (pz) cosec я|з]} d (pz),
о
G.8)
где ц/р — массовый коэффициент поглощения рентгеновского
излучения данной аналитической линии в образце, ргсоэесф—
длина пути поглощения и я|з — угол между рентгеновским излу-
излучением и поверхностью образца (угол выхода рентгеновского
излучения). Величина %= (ц/р)cosecо|). Филибер [122]1 опреде-
определил /как .F(O) при%=0 и /' как ^(х)- Отношение F(%)IF(O)
называется функцией f{%), которая эквивалентна /'//• Член
/(х) представляет собой обычный фактор поглощения, опреде-
определенный Филибером [122]. Поэтому для определения коэффици-
коэффициента А в выражении G.5) для любого элемента i в любом
сложном образце используется выражение
G.9)

10
Глава 7
J-й-
0,40
2.1
2 40
0,80 1,20 1,60
Глубина , мг/смг
Рис, 7.3. Рассчитанная для меди кривая ф(рг) при ускоряющем напряжении
20 кВ. <p(pz) — число квантов СиКа, генерируемых на указанной глубине в
образце в расчете на один электрон.
где индексы «эт» и «обр» обозначают эталон и образец соот-
соответственно. В дальнейшем все величины, относящиеся к сплаву
или образцу, будут обозначены звездочкой, а все величины, от-
относящиеся к эталону, не будут помечены. Таким образом, мож-
можно записать
7.2.2.2. Выражение для расчета f(%)
Фактор поглощения f(%) любого элемента i зависит от соот-
соответствующего массового коэффициента поглощения ц,/р, угла
выхода рентгеновского излучения а|), энергии электронов пучка
Ео, критической энергии возбуждения_ЕКр К-, L- или М-линий
элемента I, среднего атомного номера Z и среднего атомного ве-
веса образца А. Отсюда можно записать
/(X) = /[G*/P)coseci|>, Ео, ?кр. Z, А]. G.11)
Имеется несколько прямых определений q>(pz) для чистых эле-
элементов. Филибер [122] для эмпирических кривых (^) нашел
выражение
нашел
где h=l,2A/Z\
G-13)

Количественный рентгеновский микроанализ 11
10,5 кВ
' <#:"!F!Vo;
0,5 мкм
,n R Рентгеновское
Электроны 'и кв излучение
Рис. 7.4. Схематическое представление изменения траекторий 100 электро-
электронов в меди в зависимости от ускоряющего напряжения. Обратите внимание
на пространственное разрешение генерируемого этими электронами рентге-
рентгеновского излучения [124].
А и Z — атомный вес и атомный номер элемента i соответствен-
соответственно. Параметр поглощения %=|x/pcosec'i|)) где |х/р — массовый ко-
коэффициент поглощения для чистого элемента L Параметр а
учитывает зависимость поглощения или потерь энергии от уско-
ускоряющего напряжения. Фактор а уменьшается с увеличением
энергии возбуждения Ео [122]'. При более высоких ускоряющих
напряжениях электроны проникают глубже в образец и путь, на
котором происходит поглощение, удлиняется. Это показано на
рис. 7.4, где приведено распределение электронов и рентгенов-
рентгеновского излучения в меди в зависимости от энергии первичного
пучка Ео. Как было показано в гл. 3, при увеличении Ео рент-
рентгеновское излучение генерируется глубже в образце. На рис. 7.5
схематически показана геометрия поглощения рентгеновского
излучения и зависимость пути Р, на котором происходит погло-
поглощение в образце из А1, от энергии первичного пучка Ео и углов
выхода 1|э. Следует заметить, что длина этого пути быстро воз-
возрастает с увеличением ускоряющего напряжения и уменьшени-
уменьшением угла выхода. Величина f(%) будет достигать единицы [урав-
[уравнение G.12)] по мере увеличения а и уменьшения х- Это имеет

12
Глава 7
-0,кэв
10
10
30
30
</;.град
15
60
15
60
у, мим
0,3
0,3
2,0
2,0
р,мкм
1.16
0,35
7,7
2,3
р = у cosec <p
Al(Z = 13) ^ис- ^-5. Схематическое представ-
представление пути, на котором происхо-
происходит поглощение, в алюминиевом
образце в зависимости от энер-
энергии первичного пучка Ео и угла
выхода рентгеновского излуче-
излучения т|з. Глубина у была получена
из уравнения C.42) гл. 3.
место при самых низких значениях Ео, самых высоких значени-
значениях i|5 и минимальных значениях ц/р. Влияние поглощения мини-
минимально, когда }(%) достигает значения 1. Однако, как будет по-
показано позже, работать при Ео, слишком близкой к ?кр, невоз-
невозможно.
Данкамб и Шилдс [123] предположили учитывать в выра-
выражении G.12) зависимость а от .Екр. Позже Хейнрих [125]' на
основании критического анализа имеющихся экспериментальных
данных по f(%) предложил для а следующее выражение:
Такая трактовка уравнений G.12) — G.14) известна как урав-
уравнение Филибера — Данкамба — Хейнриха и в настоящее время
наиболее популярна для определения f(%). Поэтому уравнение
Филибера — Данкамба — Хейнриха обычно используется в ме-
методах количественного микроанализа для расчета f(%).
При использовании уравнения Филибера — Данкамба —
Хейнриха для расчета f(%) или f(%)* для элемента i в много-
многокомпонентных образцах следует учитывать влияние других эле-
элементов в образце или эталоне. Эти элементы оказывают влия-
влияние на величины h, % и о. После расчета h для каждого элемен-
элемента в образце определяют среднее значение
G.15)
где / — номера элементов, присутствующих в образце, включая
элемент i, я Су—¦ массовая доля каждого элемента /. Для полу-
получения % необходимо вычислить массовый коэффициент поглоще-
поглощения элемента i в образце (|х/р)'обр. Массовый коэффициент по-
поглощения определяется выражением

Количественный рентгеновский микроанализ
13
где (|л/р)/ — массовый коэффициент поглощения излучения эле-
элемента i в элементе / и С, — весовая доля каждого элемента в
образце (включая i). Значение а находят с помощью G.14), ис-
используя значения Екр для элемента L
7.2.2.3. Практические советы
Влияние погрешностей начальных параметров \i/p, i|j и Ео
было подробно рассмотрено в [126]. Основные выводы этого
изучения заключаются в следующем:
1. Из-за неопределенности входных параметров могут воз-
возникать серьезные аналитические погрешности.
2. Для уменьшения влияния этих погрешностей значение
функции поглощения f(%) должно быть не менее 0,7.
3. Для снижения до минимума влияния поглощения образ-
образцы следует анализировать при низких значениях перенапряже-
перенапряжения, а приборы должны иметь большие углы выхода рентгенов-
рентгеновского излучения.
10'
Рис. 7.6. Предполагаемые значе-
значения (л/р;1 а для элементов с
атомными номерами 22^Z^3O
из работы [127]. Для сравнения
приведены кривые из других ра-
работ.
-
¦ *
- [127]
-
- [128]
1 1
N
ч
\ [130]
\
Ч
\ \
V ^
V
>
\ [129]
ч
ч
\
131]\
X
1 i
чч
ч
\
4
—г—
\
V
\
\
1
Л
п—|
г
-
V
Т\ V Cr Mn Fe СО Ni Си In
22 2^ 26 28 30
in иомвр Z

14 Глава 7
4. Для дальнейшего повышения точности микроанализа в
особенности при анализе элементов с низкими атомными номе-
номерами или рентгеновских линий с энергиями ^1 кэВ, требуются
более точные экспериментальные измерения коэффициентов
массового поглощения и функции f{%).
В качестве примера трудностей, связанных с неопределен-
неопределенностью коэффициентов массового поглощения, на рис. 7.6 при-
приведены значения коэффициентов ц/р для La-линий элементов с
атомными номерами 22^Z^30 [127]. Видно, что расхождения
очень большие.
Следует рассмотреть случаи анализа при помощи детектора
с дисперсией по энергии или кристалл-дифракционного спектро-
спектрометра, смонтированных в обычном РЭМ. Если поверхность об-
образца плоская и гладкая, следует учесть лишь несколько пре-
препятствий для проведения количественного анализа. Наиболее
важными из них являются коррекция фона, которая будет рас-
рассматриваться в гл. 8, и точное знание угла выхода рентгенов-
рентгеновского излучения i|5. В РЭМ для получения приемлемого угла
выхода рентгеновского излучения образец обычно наклоняют.
Неопределенности в значении ty обычно влияют на расчеты по-
поправки на поглощение; их роль увеличивается с уменьшением
¦ф [126]. Таким образом, необходимо иметь значение ч|з>30°.
Кроме того, исключительно важно, чтобы измерения на образ-
образце и эталоне проводились при одинаковых значениях угла выхо-
выхода рентгеновского излучения.
7.2.2.4. Расчет фактора поглощения А
На величину фактора поглощения Л, влияют три основные пе-
переменные: энергия электронов пучка Ео, угол выхода рентгенов-
рентгеновского излучения i|5 и массовый коэффициент поглощения для ин-
интересуемого элемента i в образце (|х/,р)г'обр. Поскольку At опре-
определяется как отношение f(%)/f(%)*, то, если фактор поглощения
Ai—>-1, обе величины должны быть равны. Когда значение Л{
приближается к единице, отношение измеренных интенсивностей
лучше аппроксимирует отношение концентраций элемента в
образце и эталоне.
Значение учета фактора поглощения можно проиллюстриро-
проиллюстрировать на примере анализа бинарных систем Ni—Fe и Al—Mg.
В обеих системах атомные номера двух входящих элементов
настолько близки, что нет необходимости вводить поправку на
атомный номер Z,. Рассмотрим поглощение линии Nijfa в Fe
и А1ка в Mg. В обоих случаях вторичной флуоресценции не про-
происходит, и можно не учитывать поправку Ft. Для обеих систем
расчеты Л, = /(%)/f(%)* были проведены с использованием по-
поправки Филибера — Данкамба — Хейнриха по уравнениям
G.9), G.12)-G.16).

Количественный рентгеновский микроанализ П>
Таблица 7.1. Поглощение излучения Ni*a в бинарном сплаве Ni—Fe
а) Исходные данные для системы Ni—Fe
Fe
(смУг) [31]
?«р (кэВ)
Л
б) Результаты расчета для системы Ni—Fe
58
28
8
58
,9
,332
,71
379,
26
7,
55,
6
111
85
Образец кэ°в Град t о h П%) f(%)* Ащ
Fe-10%Ni чп с9 с 438 1870 0,0982- 0,794 . „.
Ni-эталон М 5At> 74,2 1870 0,0899 0,959 - 1>л
Fe—10 %Ni оП 1Ч ч 1300 1870 0,982 — 0.5551) , fin
Ni-эталон м 1Ь'Э 220,4 1870 0,0899 0,886 — 'lbu
Fe—10 %Ni ,,- г0 n 438 8310 0,0982— 0,945 , n,
Ni-эталон ° oz>z 74,2 8310 0,0899 0,990 - 'ио
Fe—10 %Ni 1Ч ,,- - 1300 8310 0,0982 — 0,853 , ..
Ni-эталон L0 10>0 220,4 8310 0,0899 0,972 — ''
Fe —50% Ni Ir- ,R ^ 820,4 8310 0,0945 — 0,902 . na
Ni-эталон l0 l0'° 220,4 8310 0,0899 0,972 — 'ue
В табл. 7.1 и 7.2 приведены исходные данные для расчета
поглощения, а также перечень различных параметров %, a, h,
которые вычислялись при расчете. Для системы Ni — Fe рас-
рассматривался сплав, содержащий 10 вес. % Ni (табл. 7.1). Рас-
Расчеты проводились при двух ускоряющих напряжениях 30 и
15 кВ и двух углах выхода 15,5 и 52,5°. Наименьшая поправка
и самые близкие значения f(%) и f{%)* получается при ?0 =
= 15 кэВ и ч|з = 52,5°. Поглощение минимально из-за того, что
рентгеновское излучение генерируется близко к поверхности и
длина пути, на котором происходит поглощение, меньше при
большом угле выхода. В этом случае фактор Ащ равен 1,05, т. е.
требуется коррекция лишь на 5%. С другой стороны, при ?0 =
= 30 кэВ и ij)=15,5o величина поправки на поглощение состав-
составляет 1,60, что требует коррекции на 60%. Фактор f(%)* при та-
таких условиях меньше 0,7 (минимального значения, установлен-
установленного в [126]). Как указывалось в [126], At будет иметь мини-
минимальное значение при низких значениях перенапряжения и
больших значениях угла выхода.

16 Глава 7
Таблица 7.2. Поглощение А1*а в бинарной системе Al—Mg
а) Исходные данные для системы Al—Mg
l-i/P
A
Z
б) Результаты
Образец
Mg-10%
Al-эталон
Mg-10%
Al-эталон
Mg-10%
Al-эталон
Mg—10%
Al-эталон
Mg —50%
Al-эталон
Mg-10%
АЬэталон
Al
Al
Al
Al
Al
Al
') f(X)<0,7.
AUa (см;
(кэВ)
расчета для
Eo.
кэВ
30
30
15
15
15
*.5
'/г)
[31]
системы
Ф.
град
Ер ?
15,5
52,5
15,5
15,5
52,5
5
486
14
1
5
486
14
1
8
1
5
486
385
26
13
1
Al—Mg
t
,013
,884
,443
,013
,884
,143
,910
,443
,013
a
1,657
1,657
1,657
1,657
5,286
5,286
5,286
5,286
5,286
5,286
17,506
17,506
Al
,7
,98
,56
h
0,201
0,192
0,201
0,192
0,201
0,192
0,201
0,192
0.!97
0,192
0,201
0,192
l
4376,
24,
12
1,
Hx)
0,738
0,469
0,902
0,753
0,753
0,969
«g
,5
ЗОЕ
зо;
i
Их)*
0,
0,
о,
0,
0,
0,
,165!'
,04D
.4431'
1781*
291D
742
AM
4,48
11,7
2,04
4,2»
2,58
1,306
Табл. 7.2 иллюстрирует коррекцию на поглощение для линии
А\ка в сплаве Mg— 10% Al. При ?0 = 15 кэВ и 30 кэВ величина
fix)* настолько мала, что необходима коррекция свыше чем на
200%. Большие поправки на поглощение обусловлены высоки-
высокими значениями ц/р для А]Ка в Mg D376,5 см2/г). Поскольку
?КР для А1 составляет лишь 1,56 кэВ, можно проводить рентге-
рентгеновский микроанализ при ускоряющем напряжении ниже 15 кВ.
Область возбуждения будет располагаться ближе к поверхно-
поверхности, и длина пути, на котором происходит поглощение, умень-
уменьшится. При ускоряющем напряжении 7,5 кВ и величине угла
выхода 52,5° (табл. 7.2) поправка на поглощение составляет
лишь 1,306, т. е. реализуется случай достаточно малых попра-
поправок.
Из приведенных здесь расчетов ясно, что следует остерегать-
остерегаться работать при больших значениях ц/р, высоких значениях пе-

Количественный рентгеновский микроанализ 17
ренапряжения и малых-углах i(,\ Фактору поглощения уделяет-
уделяется много внимания в большинстве методик количественного ана-
анализа. Ясно, что разумным выбором рабочих условий РЭМ и
рентгеновских аналитических линий с малыми значениями мас-
массовых коэффициентов поглощения можно свести к минимуму
необходимые поправки.
7.2.3. Фактор атомного номера Z
Так называемый эффект атомного номера в микрорентгено-
спектралыюм анализе обусловлен двумя явлениями, а именно
отражением и торможением электронов, причем оба этих явле-
явления зависят от среднего атомного номера мишени. Таким об-
образом, если имеется различие между средним атомным номе-
номером образца
г % G.17)
и эталона, то необходимо вводить поправку на атомный номер.
Например, для образца А1 — 2 вес. % Си значение Z равно
13,32, и поэтому при использовании эталонов из чистых эле-
элементов следует ожидать значительно большего эффекта атом-
атомного номера при анализе на Си (Z = 29), чем при анализе на
Al (Z=13). В целом, если не вводить поправку на этот эффект,
то при анализе тяжелых элементов в матрице из легких эле-
элементов получают обычно слишком заниженные значения кон-
концентрации, а при анализе легких элементов в тяжелой матри-
матрице— обычно слишком завышенные значения концентрации
исследуемого элемента. Следовательно, при анализе на Si в об-
образце Fe — Si коррекция за счет поправки на атомный номер
противоположна действию поправки на поглощение.
В настоящее время наиболее точным выражением для фак-
фактора атомного номера Zj элемента i является, по-видимому,
формула Данкамба и Рида [15]
Яо -Ео
Zt = (Rt/R*) у (Q/S) dE j J (Q/S*) dEJ, G.18)
где Rt и Ri* — факторы обратного рассеяния для элемента i в
эталоне и образце соответственно; Ri есть отношение общего
числа фотонов, действительно генерированных в образце, к об-
общему числу фотонов, генерированных в образце в отсутствие
отражения электронов; Q представляет собой сечение иониза-
ионизации, которое определяется как вероятность ионизации данной
внутренней электронной оболочки атома в мишени электроном

28 Глава 7
данной энергии на единицу пути пробега (гл. 3), и 5, равная
— A/р) (dE/dx)—тормозная способность электронов (гл. 3) в
интервале 1^?^50 кВ. Тормозная способность S{, по Бете
[56], есть
St = (const) (Z/A) A IE) In (СгЕ/J), G.19)
где C\ = const, / — так называемый средний ионизационный по-
потенциал. При расчете (CiE/J) Ci обычно принимается равной
1166, если Е выражено в килоэлектронвольтах, а / — в элект-
ронвольтах.
Значения R лежат в интервале 0,5—1,0 и приближаются к
единице для элементов с низким атомным номером. Фактор по-
поправки на обратное рассеяние зависит не только от атомного
номера, но и от величины перенапряжения U=E0/EKP. При
уменьшении перенапряжения до единицы меньшее число электро-
электронов рассеивается от образца с энергией >?кр, и, следователь-
следовательно, потери ионизации от таких отраженных электронов меньше.
Имеются таблицы расчетных значений R для различных
атомных номеров чистых элементов Z и U [15, 57, 132]. Однако
экспериментально R определено лишь в работе [ 133]'. В тех
случаях, когда можно провести сопоставление, табличные зна-
значения Данкамба и Рида находятся в хорошем соответствии с
экспериментальными данными. Для таблиц, составленных дру-
другими авторами [134], такого соответствия нет. Таким образом,
чаще всего используются значения R, полученные Данкамбом и
Ридом [15].
В работе [135] была предложена подгоночная формула для
фактора поправки на обратное рассеяние R по значениям, по-
полученным Данкамбом и Ридом [15], с учетом перенапряжения
U и атомного номера Z:
RiJ = Ri'-R2' In (a,'Z,+25), G.20)
где #,' = 8,73- Ю-3 U3—0,1669 ?/2+0,9662 ?/+0,4523, /?2'=2,703х
X 10-3 U3—5,182-10-2 ?/2+0,302 ?/—0,1836, R'3 = @,887 ?/3—
—3,44 ?/2+9,33 U—6,43)/?/3.
Символ i относится к измеряемому элементу, / — к каждому
элементу, присутствующему в эталоне или образце, включая
элемент i. Следовательно, 7?^- представляет собой поправку на
обратное рассеяние для элемента i за счет влияния элемента j
в образце. Подгоночные параметры R/, /?г' и R3' были рассчи-
рассчитаны как функция U!).
') См. «Практическая растровая электронная микроскопия». — М.: Мир,
1978, с. 423. — Прим. ред.

Количественный рентгеновский микроанализ
Данкамб и Рид [15] приняли
для эталона, G.21а)
ц для образца. G.216)
Для того чтобы рассчитать Rt, нужно из таблиц Данкамба —
Рида [15], или из уравнения G.20) получить значение Яц для
каждого элемента, входящего в состав образца или эталона.
Экспериментальные данные, которые опровергали бы уравне-
уравнения G.21), отсутствуют.
Как было указано в гл. 3, имеется несколько выражений для
расчета Q. Несмотря на то что в зависимости от величины кон-
констант значения Q отличаются на несколько процентов, было по-
показано [134], что различия в значениях Q лишь незначительно
влияют на конечное значение концентрации. Часто вводят упро-
упрощающее предположение, что Q — константа и, следовательно,
сокращается в выражении для Zj G.18). Величина /, использу-
используемая в уравнении G.19), является предметом споров, поскольку
J непосредственно не измеряется, а определяется на основе экс-
экспериментальных данных, полученных в диапазоне мегаэлектрон-
мегаэлектронвольт. Наиболее полно этот вопрос обсуждается в работе [14].
Авторы с учетом всех имеющихся данных приняли, что «опти-
«оптимальная» кривая зависимости / от Z описывается выражением
y=9,76Z4-58,8Z-°'10 эВ. G.22)
Другие значения J табулированы Данкамбом и Ридом [15].
На рис. 7.7 приведены кривые зависимости / от Z по данным
различных авторов. Ниже Z=ll кривые существенно различа-
различаются. Значения / в зависимости от Z, по данным Бергера —
Зельцера, приведены в предыдущем издании1'.
Чтобы избежать интегрирования в уравнении G.18), было
предложено [137] принять для средней энергии Е выражение
0,5 (Eo-j-EKp), где Екр — значение для элемента i, которое под-
подставляется вместо Е в выражение G.19) для S, с небольшой по-
потерей в точности. Следовательно,
St, = const [Zj/A, (Я0+?кр)] In [583 (E0+EKp)/J}], G.23)
где i относится к измеряемому элементу, / — ко всем элементам,
присутствующим в эталоне или образце, включая элемент i\
Константу в уравнении G.23) рассчитывать не надо, так как
константа сокращается при сравнении тормозных способностей
Ч См. «Практическая растровая электронная микроскопия». — М.: Мир,
1978, с. 425. —Ярил. ред.

20
Глава 7
юа -
с: —
гд 102 --
I I L_I 1 т т т г i
5
50
100
10 25
Атомный номер 2
Рис. 7.7. Сравнение нескольких выражений'для среднего ионизационного потен-
потенциала /.
4 — Данкамб — Рид [15]; О — Колдуэлл [136]; V — Бергер — Зольцер [14]; ? — 7 = 11,5 2.
образца и эталона G.25). Имеются экспериментальные данные,
согласно которым для расчета 5г- и S,-* можно использовать зна-
значения Sij и Sij*, полученные с учетом весовой концентрации эле-
элемента соответственно:
G.24а)
G.246)
5г = V CjSu для эталона,
5г* = V CjSa* для образна.
Окончательные значения 5, и 5,* получают с помощью уравне-
уравнения G.24).

Количественный рентгеновский микроанализ 21
Если интегрирование в выражении G.18) не требуется и Q =
= const, получаем
/S,). G.25)
Использование выражения G.25) почти всегда приводит к очень
малым ошибкам в определении Zj [134].
Основное, что влияет на фактор атомного номера Z,,— это
различие между средними атомными номерами образца и эта-
эталона. Для иллюстрации этого эффекта в качестве примера мож-
можно рассмотреть анализ меди в сплаве на основе алюминия, со-
содержащего 2 вес. % Си. Средний атомный номер сплава 13,32,
а атомный номер Си — 29. В этом случае можно ожидать зна-
значительной поправки на атомный номер.
Пример расчета поправки на атомный номер для этого спла-
сплава производится в табл. 7.3.
Таблица 7.3. Поправка на атомный номер для сплава А1 — 2 вес. % Си
а) Исходные данные для сплава А1 — 2 вес.% Си
z
A
?кР (кэВ)
б) Результаты расчета сплава
Условия измерения:
Для Си,са
с использованием Си-
эталона
с использованием сме-
смешанного E4 вес.°/о Си,
46 вес.% А1) эталона
AI
13
26,98
1,56
А1 —2 вес.% Си
Яо = 15 кэВ,
UCu= 1,67
/Си = 314,05
SCu = 0,0722
Ях'= 1,641
ЯСи = 0.9Ю
Si* = 0,0891
Я;* = 0,967
S, = 0,0722 |
Я, = 0,910 j
Si = 0,0802 \
Яг = 0,937 j
Си
29
63,55
8,98
/д! =
Sai =
Я2' =
/\ Д1 ==
12,5'
163,0
0,0894
0,1899 Я
0,968
....
1,08
3' = 0,7918

22Глава 7
Для А\Ка
с использовани-
использованием А1-эталона
Условия измерения:
Для С\1Ка
с использованием Си-
эталона
с использованием эта-
эталона 6CuAl2
Для А\Ка
Ua
5а
#i
Ra
s^
Ri'
Si
Ri
?o
St*
, = 9,62
1 = 0,119
' = 2,073
1 = 0,910
* = 0,118
" = 0,909
= 0,119 |
= 0,910 |
=30 кэВ,
= 0,0608
= 0,939
Scu
Rai
2ai =
Hi-
t-
Sf
Rt'
= 0,0944
= 0,332
= 0,823
0,998
=52,5°
= 0,0501
= 0,859
= 0,0551
= 0,0896
}
}
Продолжение
R3' = 0,623
Zcu-Ul
2Cu=l,05
ZM =0,999
Поправки на атомный номер ZCu и ZM получены при двух
значениях ускоряющего напряжения 15 и 30 кВ. Значения /Си
и Ум получены из уравнения G.22). Значения 5Си и SAi для из-
излучения Сика (?Кр = 8,98 кэВ) или А\Ка {Екр= 1,56 кэВ) рассчи-
рассчитывались по уравнению G.23). Константа в G.23) принималась
равной единице, поскольку она в конце концов уходит при по-
последующих расчетах. Поправки на обратное рассеяние RCu и
У?А1 как для СиКа, так и для А1Ка получены из уравнения G.20).
Члены 5,-, 5,-* и Rit Ri* вычислялись по уравнениям G.21) и
G.24). Конечные поправки ZCu и ZA, получены с использовани-
использованием G.25).
Поправка ZCu при 15 кВ уменьшается примерно на 50% —
от 1,16 до 1,08 в случае, когда в качестве эталона вместо чистой
меди (Z = 29) используется эталон, состоящий из 8-фазы, СиА12
(Z=21,6). Поправка ZM пренебрежимо мала (ZAi = 0,998) в
этом примере, так как образец и эталон имеют очень близкие
атомные номера. Как уже ранее обсуждалось, если не вводить
поправку на эффект атомного номера, то при анализе тяжелых
элементов в матрице из легких элементов (Си в А1) обычно по-
получают слишком заниженные (Z{>1) значения, а при анализе

Количественный рентгеновский микроанализ 23
легких элементов в тяжелой матрице (А1 в Си)—слишком за-
завышенные (Zi<l) значения концентрации.
Для обеих линий СиКа и А\Ка в сплаве А1 — 2 вес. % Си
фактор Ft равен 1,0 из-за отсутствия взаимной флуоресценции
элементов. Поправка на поглощение АСа для Си#а в сплаве
А1 — Си равна примерно 1,0 при 15 кэВ и г|) = 52,5°, так как ко-
коэффициент массового поглощения очень мал, |VpcuCUKa=
= 53,7 см2/г, ц/рА1Си^а =49,6 см2/г. Для Сиха в сплаве А1 — Си
полная коррекция по методу трех поправок равна 1,16 для эта-
эталона из чистой меди и обусловлена в основном эффектом атом-
атомного номера. С другой стороны, излучение А1ка в сплаве А1 —•
Си сильно поглощается медью, u./pAiAlA:a = 385,7 см2/г, ц/рсиА1/с«=
= 5377 см2/г. Поправка АА\ была рассчитана для сплава А1 — Си
при Е0 = 15 кэВ, ^ = 52,5° с использованием поправки на погло-
поглощение Филибера — Данкамба —Хейнриха, описанной в разд.
7.22. Расчеты дали /(х) =0,902, /(х)* = 0,880 и АА1 = 1,025. По-
Поправка на поглощение удивительно мала, но это понятно, так
как в образце присутствует лишь 2 вес. °/о сильно поглощающе-
поглощающего элемента Си. Для излучения А\Ка в сплаве А1 — Си полная
поправка равна 1,023 и состоит из малой поправки на погло-
поглощение Aai A,025) и очень малой поправки на атомный номер
ZA1 @,998).
В работе [134]! исследована ошибка определения Z\. Обыч-
Обычно величина Z,- уменьшается с увеличением перенапряжения ?/=
= Е0/Екр, но очень медленно E% для десятикратного увеличе-
увеличения U). Это видно из табл. 7.3, где Rcu уменьшалось от значе-
значения 1,16 при 15 кэВ до 1,11 при 30 кэВ. Неопределенность зна-
значения Zt остается по сути дела постоянной при изменении U,
так как неопределенности в значениях Д и S взаимно компен-
компенсируют друг друга. Таким образом, при низких значениях U не
следует ожидать увеличения ошибки в определении Z*, и, сле-
следовательно, выбор низких ускоряющих напряжений целесооб-
целесообразен для достижения наибольшей точности.
7.2.4. Поправка на флуоресценцию за счет
характеристического излучения F
Если энергия Е характеристического рентгеновского пика
элемента / в образце больше, чем Екр элемента С, то следует
учитывать вторичную флуоресценцию при введении поправок
при определении концентрации элемента i. Поправка пре-
пренебрежимо мала, если (Е—?кр) больше 5 кэВ. Поправка на
флуоресценцию необходима потому, что энергии рентгеновского
излучения от элемента / достаточно для возбуждения вторично-

24 Глава 7
го рентгеновского излучения элемента L Таким образом, интен-
интенсивность рентгеновского излучения элемента i оказывается вы-
выше, чем в случае только электронного возбуждения.
Электроны поглощаются значительно сильнее, чем рентге-
рентгеновское излучение с такой же энергией. Таким образом, флуо-
флуоресцентное излучение может возникать на значительно больших
расстояниях от точки падения электронного пучка, чем первич-
первичное излучение (рис. 3.49, гл. 3). Следовательно, средняя глуби-
глубина выхода флуоресцентного излучения больше, чем первичного.
Поэтому интенсивность флуоресцентного излучения, измеряемо-
измеряемого детектором относительно первичного, возрастает с увеличени-
увеличением угла выхода рентгеновского излучения.
Поскольку за счет флуоресценции интенсивность излучения
элемента i всегда увеличивается, для поправки можно исполь-
использовать следующее выражение:
рг=[ 1 +2 cv'i)]/ [ i+2 <;v'i)]*. G-26>
Поправочный фактор Ihilh представляет собой отношение ин-
интенсивности излучения элемента Пц, вызываемого элементом /
путем флуоресценции, к интенсивности излучения элемента i,
возбуждаемого электронами. Общий фактор поправки получа-
получают суммированием флуоресценции элемента i, вызываемой все-
всеми элементами / в образце. Наибольшее распространение полу-
получило выражение для фактора поправки Vnlh, выведенное Ри-
Ридом [138]. Для элемента i, флуоресцирующего под воздействием
элемента / в образце, содержащем эти или дополнительные
элементы, имеем
/V'* = WWVV G.27)
Здесь Cj — концентрация элемента, возбуждающего паразитную
флуоресценцию; Уо определяется в виде
Y0 = 0,5l(rt—l)/rt](uj(At/Aj),
где Гг—'Величина скачка поглощения для элемента i с неболь-
небольшой ошибкой для /(-линии (п—1)/г* = 0,88; для I-линии (г;—
— 1)/г* = 0,75; со;—'Выход флуоресценции для элемента / (гл. 3);
Аг — атомный вес представляющего интерес элемента; Aj —
атомный вес элемента, вызывающего флуоресценцию; Yi =
= [(?//— l)/(Ut— l)]1-",где ?/ = ?о/?кР; Y2= (n/p)^7(fi/p)W где
(ji/p);' — массовый коэффициент поглощения излучения элемен-
элемента / и ([л/рР'обр — массовый коэффициент поглощения излуче-
излучения элемента /в образце.
Член Уз учитывает поглощение У3= [In A+«)]/«-]-[In A-f-
-\-v)]/v, где M=[((i/p)io6p/(fi/p):'o6p]coseci|5, (м-/р)'обР — массо-
массовый коэффициент поглощения излучения элемента в образце

Количественный рентгеновский микроанализ 25
[уравнение G.16) ]¦ и у = 3,3- 105/(?V'65—Якр1'65) (|i/p)W где
Екр относится к элементу и Наконец, Рц — фактор, учитываю-
учитывающий пик возникающей флуоресценции. Если имеет место К—
—К- (/(-линия возбуждает it-линию) или L—L-флуоресценция,
то Рц=\. Если же возникает L—К- или К—L-флуоресценция,
Pij равен 4,76 и 0,24 соответственно.
Выражение Рида используется в большинстве методов рас-
расчета поправок с помощью ЭВМ. Как было установлено, это вы-
выражение является точным в реальных рабочих условиях микро-
микроанализа [139]. Исследование влияния неопределенности вход-
входных параметров на модель Рида [140] показало, что наибольшее
влияние оказывает неопределенность в со/, неопределен-
неопределенность в остальных переменных вносит незначительные погреш-
погрешности. Уравнение G.26) распространяет расчет поправки на
случай флуоресценции элемента i под влиянием более чем од-
одного элемента /. Величина lUjlh рассчитывается по уравнению
G.27) для каждого элемента /, вызывающего флуоресценцию
элемента I. Влияние всех этих элементов суммируется согласно
уравнению G.26). Если эталон состоит из чистого элемента или
другие элементы, присутствующие в многокомпонентном этало-
эталоне, не вызывают флуоресценцию элемента i, уравнение G.26)
для Fi можно записать в более простой форме:
G-28)
Фактор флуоресценции F{ является обычно наименее важной
поправкой в методе трех поправок, поскольку вторичная флуо-
флуоресценция может и не происходить или концентрация С3 в урав-
уравнении G.27) может быть мала.
Важность поправки на флуоресценцию можно продемонстри-
продемонстрировать на примере бинарной системы Fe — Ni. В такой системе
энергия характеристического излучения Nixa 7,478 кэВ больше,
чем энергия возбуждения Fe /С-излучения, ?# = 7,11 кэВ. По-
Поэтому генерируется избыточное количество квантов Fe^-излу-
чения. Поправка на атомный номер Zj в такой системе меньше
1%, и ею можно пренебречь. Расчеты FFe в сплаве 10 вес. °/о
Fe — 90 вес. % Ni проводились по формулам G.27) и G.28).
В табл. 7.4 указаны входные данные, используемые для рас-
расчета Fi. Величина FFe рассчитывалась для двух значений уско-
ускоряющих напряжений 30 и 15 кВ и для двух значений углов вы-
выхода 15,5 и 52,5°. Величина флуоресценции Fe, определяемая
отношением IfFe~mlhe, приведена в табл. 7.4. Она изменяется
от 16,8 до 34,6% и увеличивается с увеличением угла выхода
рентгеновского излучения и ускоряющего напряжения. Для
уменьшения величины поправки на флуоресценцию желатель-

26
Таблица 7.4. Флуоресценция Fe*a
90 вес.% №
а) Входные данные сплава Fe—Ni
Глава 7
в сплаве,
Fe
содержащем
10
вес.%
Ni
Fe —
ц/р FeKa (см'/г)
и/р Nijfa (см2/г)
(О
Л
?кр (КЭВ)
С ("вес. часть)
71,4
397,6
55,847
7,11
0,1
90
58,9
0,37
58,71
8,332
0,9
б) Результаты расчета для сплава 10 вес.% F — 90 вес.% Ni
•ф. град Ео, кэВ ^pe-Ni^Fe FFe ^Fe ^Ni
52,5
15,5
52,5
15,5
15
15
30
30
0,263
0,168
0,346
0,271
0,792
0,856
0,743
0,787
1,002
1,008
1,011
1,030
1,005
1,015
1,023
1,065
но работать при низких ускоряющих напряжениях. При работе
с низкими ускоряющими напряжениями будет уменьшаться так-
также поправка на поглощение А?е и Лж (табл. 7.4). Хотя поправ-
поправка на флуоресценцию уменьшается при малых углах г|\ ошиб-
ошибка, связанная с членом Fi, не увеличивается с увеличением угла
выхода [140]. Следовательно, требование работы при низких
Ео и больших значениях г|з, рекомендуемое для уменьшения Аи
остается в силе даже в тех случаях, когда требуется вводить
большие поправки на флуоресценцию.
Если концентрация Cj (уравнение 7.27) такова, что флуорес-
флуоресценция уменьшается, ////г также уменьшается. Например, если
концентрация Ni в бинарном сплаве Fe — Ni изменяется от 90
до 50% (сплав 50% Fe — 50% Ni), величина флуоресценции
при ?о=15 кэВ, i|) = 15,5° уменьшается более чем в 2 раза — от
16,8 до 6,5%. Ясно, что относительный эффект флуоресценции
заметно возрастает, если С* уменьшается, а С,- увеличивается.
7.2.5. Поправка на флуоресценцию за счет непрерывного
рентгеновского излучения
Всякий раз, когда для возбуждения рентгеновских спектров
используются электроны, характеристические пики, используе-
используемые в качестве аналитических линий, всегда сопровождаются

Количественный рентгеновский микроанализ 27
непрерывным рентгеновским излучением с энергией в диапазоне
от 0 до Ео. Это непрерывное излучение возникает из-за того, что
входящие электроны замедляются в электрическом поле атомов,
в результате чего по мере их прохождения в твердом теле обра-
образуются кванты различных энергий.
Непрерывное излучение содержит кванты с энергией, доста-
достаточной для возбуждения любого характеристического излуче-
излучения, которое может возбуждаться непосредственно электронным
лучом, в диапазоне от Екр до Ео, поскольку всегда имеется не-
непрерывное излучение. Расчет интенсивности вторичного излуче-
излучения, возбуждаемого непрерывным спектром, сложен по следую-
следующим соображениям:
1. Эффект должен интегрироваться по всему диапазону
энергий от ?кр до Ео- Поперечное сечение возбуждения изменя-
изменяется с энергией непрерывного излучения.
2. Необходимо знать функциональную зависимость интен-
интенсивности непрерывного рентгеновского излучения от атомного
номера образца и энергии пучка.
3. Различие в эффекте флуоресценции из-за непрерывного
рентгеновского излучения между образцом и эталоном сущест-
существенно зависит от величин относительных массовых коэффициен-
коэффициентов поглощения для представляющей интерес линии.
Хенок [64] вывел функциональное выражение для интенсив-
интенсивности флуоресценции /ф', возбуждаемой непрерывным излуче-
излучением:
V = /(Z,©,r,(M>L>), G.29)
где Z — средний атомный номер, ш — выход флуоресценции, г—
отношение скачка поглощения, (ц/р) — массовый коэффициент
поглощения и г|> — угол выхода.
Точные вычисления /ф' требуют значительного объема прог-
программ и затрат машинного времени. Поскольку этим эффектом
во многих случаях допустимо пренебречь, в большинство прог-
программ для коррекции по методу трех поправок не включается
поправка на флуоресценцию за счет непрерывного излучения.
Она учитывается в таких «полных» процедурах коррекции, как
COR [141] и разработанные в [142, 143].
Было проведено исследование поправки на флуоресценцию
за счет непрерывного излучения, чтобы выявить случаи, когда
этой поправкой можно пренебречь [144]. Авторы пришли к сле-
следующим заключениям:
1. Величиной поправки на флуоресценцию за счет непрерыв-
непрерывного излучения нельзя пренебречь в тех случаях, когда f(%)>
>0,95. Это соответствует случаям анализа рентгеновских линий
элементов в легкой матрице, например анализа «тяжелого»
компонента в окисле.

28 Глава 7
2. Изменения ускоряющего напряжения и погрешности в
значениях угла выхода, выходе флуоресценции и отношении
скачка поглощения не оказывают существенного влияния на ве-
величину рассматриваемой поправки.
3. Поправкой на флуоресценцию за счет непрерывного рент-
рентгеновского излучения можно пренебречь, когда
/(Х)<О,95, Сг>0,5, Z3T^Fo6p. G.30)
4. Все полученные результаты подтверждают целесообраз-
целесообразность проведения количественного анализа при низких перена-
перенапряжениях и большом угле выхода рентгеновского излучения
[123].
Возможно, наиболее важное значение имеет первый из этих
выводов о том, что неопределенность может возникать при ис-
использовании жесткого рентгеновского излучения от тяжелых
элементов (Zn, Hg и т. д.), содержащихся в виде следов в лег-
легких матрицах, таких, как В.
При анализе следов меди в биологических объектах наблю-
наблюдаемая интенсивность в основном обусловлена вкладом флуо-
флуоресценции за счет непрерывного излучения. Следовательно, при
анализе малых количеств тяжелых элементов в легких матри-
матрицах необходимо выбирать в качестве аналитической линии по
возможности наиболее длинноволновую линию характеристиче-
характеристического рентгеновского излучения. Если возникает необходимость
использовать жесткое рентгеновское излучение, например Сиха
в биологической матрице, эталон должен содержать разбавлен-
разбавленный раствор меди в подобной легкой матрице, например в ли-
тиево-боратном стекле.
7.2.6. Обсуждение метода трех поправок
Рассмотрим теперь процедуру введения отдельных поправок
в реальном случае расчета состава образца. Обычно в экспери-
эксперименте определяется ряд значений k, но факторы Z, А и F зави-
зависят от истинного состава образца, который неизвестен. Эта
проблема разрешается путем использования значения k в каче-
качестве первого приближения оценки состава образца. Такие пер-
первые приближения для оценки концентрации нормализуются для
того, чтобы в сумме дать 100 % - Полученные массовые концент-
концентрации используются для расчета начальных поправок для каж-
каждого элемента. Итерации продолжаются до тех пор, пока не
будет достигнута сходимость результатов.
Чаще всего применяется метод итераций, предложенный
Криссом и Бирксом [145], основанный на предположении, что
кривые зависимости С от k представляют собой гиперболу

Количественный рентгеновский микроанализ 29
[120, 146]. Эта гиперболическая аппроксимация будет подробно
рассматриваться в разд. 7.3. Для каждого шага в процессе ите-
итераций каждое последующее значение массовой концентрации
Ст, соответствующее измеренной относительной интенсивности
km, может быть рассчитано по формуле
Cm = kmC(l-k)/[km(C-k) + k(l-Q], G.31)
поскольку произведение [A—k)/k]\[C/(l—С)] для гиперболы
есть величина постоянная. Таким образом, для использования
уравнения G.31) задаются разумным значением С в первом
приближении. Значение k, соответствующее этому значению С,
можно вычислить, поскольку можно определить поправки Z, А
и F. Затем измеряют истинное значение km и определяют Ст.
На практике измеренное отношение k обычно используют в ка-
качестве первого приближения С, по нему рассчитывается значе-
значение /г, и затем они используются в качестве С и k в уравнении
G.31).
Эта процедура итераций прошла широкую проверку. Она да-
дает быструю сходимость, так как гиперболическая аппроксима-
аппроксимация в действительности почти всегда с достаточной точностью
представляет аналитическую кривую зависимости С от k. Как
правило, число требуемых итераций редко превышает три.
Прежде чем проводить количественный анализ, желательно
рассчитать величину 2Л/?-факторов. Если поправки для дан-
данного элемента значительны, исследователь до проведения ана-
анализа может попытаться уменьшить их, изменяя рабочие условия.
По необходимости часто оператор может регулировать Ео, иног-
иногда tp, и может использовать эталоны с составом, близким к со-
составу образца. На следующих двух примерах демонстрируются
расчеты поправок и указывается, как их можно минимизиро-
минимизировать.
В качестве первого примера рассмотрим микроанализ семи-
компонентной инструментальной стали М2 состава (вес. %)
0,82С, 6,11W, 4,95Мо, 4,18Сг, 1,88V, 0,26Mn и 81,8Fe. Анализ
всех элементов проводился по линиям Ка, за исключением W
и Мо, для определения которых использовались L-линии. Эта-
Эталоны для каждого элемента состояли из чистых элементов. Рас-
Расчеты поправок и ожидаемых значений отношения интенсивно-
стей в k проводились для двух значений углов выхода 15,5 и
52,5° и ускоряющих напряжений 15 и 30 кВ. Поправка на по-
поглощение рассчитывалась по уравнениям Филибера — Данкам-
ба — Хейнриха, коррекция на атомный номер проводилась по
формуле Данкамба-—Рида и коррекция на флуоресценцию —
по методу Рида, как было описано ранее. Результаты расчета
приведены в табл. 7.5.

30
Глава 7
Таблица 7.5. Расчет поправок для инструментальной стали
а)
б)
в)
г)
от ?о и >|)
>|)=52,5О
?о=15 кэВ
rb=15,5°
?о=15 кэВ
ф=52,5°
?о=ЗО кэВ
Ц)=15,5°
?о=ЗО кэВ
Концентра-
Концентрация, вес. %
0,82 С
6,11 W
4,95 Мо
4,18 Сг
1,88 V
0,26 Мп
81,8 Fe
0,82 С
6,11 W
4,95 Мо
4,18 Сг
1,88 V
0,26 Мп
81.8 Fe
0,82 С
6,11 W
4,95 Мо
4,18 Сг
1,88 V
0,26 Мп
81,8 Fe
0,82 С
6,11 W
4,95 Мо
4,18 Сг
1,88 V
0,26 Мп
81,8 Fe
zi
0,872
1,407
1,12
0,972
0,988
0,995
0,981
0,872
1,407
1,12
0,972
0,988
0,995
0,981
0,907
1,258
1,085
0,983
1,001
1,002
0,986
0,907 /
1,258 1
1,085 1
0,983
1,001
1,002
0,986
Л
},13
,014
,14
1,012
1,019
1,009
1,009
5,2
,041
[,349
1,034
1,053
!,024
1,023
5,32
,074
,374
,043
,065
,030
,032
',62
,196
,77
,116
,173
,084
,088
1,0 :
1,0
0,996
0,836
0,888
0,998
0,997
1,0
1,0
0,998
0,883 (
0,924 (
0,998
0,998
1,0
1,0
0,993
0,786 (
0,843 (
0,996
0,994
1,0 (
1,0
0,995
0,839 (
0,885
0,996
0,995
[ в зависимости
[ZAF\
2,73
1,428
1,277
3,823
3,894
1,002
3,987
1,53
1,465
1,508
3,889
3,962
1,017
1,002
1,83
,351
1,482
3,807
),8Э9
,029
,012
3,91
,505
,912
),921
,041
,083
,068
**
0,0030
0,00428
0,00388
0,0051
0,021
0,0026
0,829
0,0018
0,0417
0,0328
0,0470
0,0195
0,00256
0,816
0,0017
0,0452
0,0334
0,0518
0,0209
0,00253
0,808
0,0012
0,0406
0,0259
0,0454
0,0181
0,0024
0,766
Расчеты показали, что поправка на атомный номер будет
велика для W и Мо, поскольку атомные номера этих элементов
значительно больше атомного номера матрицы. Как и ожида-
ожидалось, для элементов, атомный номер которых выше среднего
атомного номера образца, Zj>l,O, а для элементов, атомный
номер которых ниже среднего атомного номера образца, 1г<.
<1,0. При высоком ускоряющем напряжении и малых углах
выхода величина поправки на поглощение больше 8% для всех
элементов. Однако при работе с низкими ускоряющими напря-
напряжениями и большими углами выхода эта поправка уменьшает-
уменьшается. Для 5 из 7 элементов поправка будет меньше 2 отн. %•

Количественный рентгеновский микроанализ
31
Fex-линии вызывают флуоресценцию как СгКа, так и VKa, при-
причем Сгка возбуждается сильнее. Обычно желательно работать
при низких ускоряющих напряжениях и больших углах выхода
г|з, поскольку при этих условиях величина 2Л/?-поправки ближе
всего к единице.
Наиболее сложен случай анализа углерода С. Величина по-
поправки на поглощение Л составляет от 300 до 800% и слишком
велика для точного анализа. В этом случае следует использо-
использовать эталон с составом, максимально приближающимся к со-
составу образца. Если в качестве эталона на С вместо чистого уг-
углерода использовать соединение Fe3C, Z/l/^-nonpaBKa уменьша-
уменьшается. При ?0=15 кэВ, г|) = 52,5о Z-поправка уменьшается от
0,872 до 0,974, Л-поправка — от 3,13 до 1,07 и общая ZЛF-пo-
правка — от 2,73 до 1,04. Ясно, что следует использовать эталон
из соединений углерода. Более полное обсуждение специальных
аспектов анализа углерода в РЭМ приводится в гл. 8.
В качестве второго примера служит микроанализ семиком-
понентного пироксена из метеорита, содержащего (вес. %)
53,5SiO2) 1,ПА12Оз, 0,62Сг2О3, 9,5 FeO, 14,1 MgO и 21,2 СаО
[147]. Для анализа всех элементов использовались /(а-линии,
концентрация кислорода рассчитывалась из стехиометрического
соотношения катионов и анионов в окислах. Для анализа каж-
каждого металла использовались эталоны, состоящие из чистых
окислов SiO2, А12О3, Сг2О3, FeO, MgO и СаО. ZAF-поправки. и
отношение k вычислялись для значения угла выхода ф = 52,5°
и двух значений ускоряющих напряжений 15 и 30 кВ
(табл. 7.6).
Таблица 7.6. Расчеты 2ЛГ-поправки для пироксена из метеорита при ф=
= 52,5° и ?о=15 и 30 кэВ
Концентрация,
вес. %
a) i|>=52,5° 53
?»= 1
= 15кэВ 0
9
14
21
б) ib=52,5° 53
?0= 1
= 30 кэВ 0
?
14
21
,3 SiO2
,11 А12О3
,62 Сг2О3
,5 FeO
,1 MgO
,2 СаО
,3 SiO,
,11 А12О3
,62 Сг,О3
,5 Fed
,1 MgO
,2 СаО
0
0
I
1
0
1
0
1
1
1
0
1
,980
,995
,106
,14
,971 1
,028 1
,985
,0
,086
,11
,977
,018
At
,11
,19
,019
,01
,20
,033
1,302
,484
1,07
1,033
,47
,11
0,
0,
0,
1,
0,
0,
0,
0,
0,
1,
0,
0,
F. [ZAF]t
998
987
98
0
993
996
997
983
974
0
991
994
,091
,17
,106
,15
,16
,06
1,278
,460
1,13
1,14
1,43
1,124
0
0
0
0
0
0
0
0
0
n
0
0
,489
,00947
,0056
,0828
,122
,200
,417
,0076
,0055
,0832
,0989
,189

32 Глава 7
Расчеты показали, что ощутимый эффект атомного номера
~10% Для Сг и Fe — двух элементов, атомный номер которых
значительно выше среднего атомного номера образца. Поправ-
Поправка на атомный номер несколько меньше при ?0 = 30 кэВ. Эф-
Эффект флуоресценции мал, максимальная поправка изменяется
от 2 до 3% для Сг. Хотя FeK-излучение сильно возбуждает
Сгка-линию, эффект флуоресценции мал из-за относительно ма-
малого содержания Fe, всего ~7,5 вес. %¦ Ясно, что поправка на
поглощение является наиболее важной из трех. Необходимы по-
поправки до 20% при ?0=15 кэВ и до 48% при ?0 = 30 кэВ. Если
угол ф был бы меньше 52,5°, то поправка на поглощение была
бы еще больше. Желательно работать при малых Ео, поскольку
при этом поправка Ai уменьшается. Таким образом, анализ поч-
почти всех силикатов рекомендуется проводить при больших углах
выхода рентгеновского излучения и низких ускоряющих напря-
напряжениях.
Расчеты Z^F-nonpaBKH в двух обсуждаемых примерах вы-
выполнены с помощью мини-ЭВМ. Хотя, по общему признанию,
рассчитывать вручную медленно, начинающему исследователю
может быть полезно самому рассчитать некоторые поправки.
Такая процедура поможет понять как раз то, как происходит
последовательность расчета трех поправок. Формулы, необходи-
необходимые для Z^F-pacyeTa, были приведены в предыдущих разделах.
Все необходимые входные параметры со, /, R/, R2', Кз', ц/р, Z,
Л и т. д. приводятся в предыдущем издании'1.
Метод трех поправок часто используют для получения коли-
количественных результатов, исходя из измеренных значений отно-
относительных интенсивностей. Этот метод, по-видимому, применим
к любому классу образцов. Однако при анализе рентгеновского
излучения с энергией меньше 1 кэВ он не дает хороших резуль-
результатов главным образом из-за отсутствия знания входных пара-
параметров и аппроксимации в моделях, лежащих в основе метода.
По этим причинам анализ с использованием низкоэнергетнче-
ских рентгеновских линий обеспечивает меньшую точность, чем
в случае использования высокоэнергетических. Точность анализа
с использованием низкоэнергетических рентгеновских линий
можно улучшить при использовании правильно подготовленных
(гл. 8) эталонов, близких по составу к образцу.
В качестве примера точности, которую можно ожидать при
хороших образцах, на рис. 7.8 приведены гистограммы, показы-
показывающие распределение относительной погрешности результатов
анализа группы из 264 гомогенных, хорошо исследованных об-
образцов бинарных сплавов металлов. Эти сплавы были исследо-
" См. «Практическая растровая электронная микроскопия». — М.: Мир,
1978. — Прим. ред.

Количественный рентгеновский микроанализ
33
несогласующиеся
данные ( 6 кэв )
-14 -13 -11 -9-7-5-3-10 1 3 5 7
Относительная погрешность, %
11 13
Рис. 7.8. Гистограмма результатов количественного микрорентгеноспектраль-
ного анализа бинарного сплава при расчете поправки на поглощение по Фи-
либеру — Данкамбу — Хейнриху. Результаты 264 анализов, выполненных в
Национальном бюро стандартов США [J4J, 148]. Средний ионизационный
потенциал из [14].
ваны на промышленном микроанализаторе с кристалл-дифрак-
кристалл-дифракционными спектрометрами в различных режимах работы. Зна-
Значения относительных интенсивностей корректировались по тео-
теоретической программе трех поправок COR2 [141]. Некоторые
экспериментальные измерения были проведены при ускоряющих
напряжениях выше оптимальных или когда в качестве анали-
аналитических линий использовалось более длинноволновое рентге-
рентгеновское излучение, чем в оптимальном случае, например Cul
вместо Сия- или ким вместо AuL. Результаты, полученные при
неоптимальных экспериментальных условиях, использовались
Для того, чтобы показать, что получается, когда природа объек-
объекта не позволяет исследователю достичь f(%)>0,7. Поправка на
поглощение является единственным фактором в уравнении
G.5), который оператор может легко контролировать; эффекты
флуоресценции связаны с самим образцом, а поправка на атом-
атомный номер слабо зависит от рабочего режима [134]. Единствен-
Единственный способ уменьшить величину поправки на атомный номер
заключается в выборе эталона, средний атомный номер которо-

34 Глава 7
го почти такой же, как у образца. Однако получить такой эта-
эталон не всегда легко.
Одним из путей суммирования результатов рис. 7.8 является
использование вероятностных терминов: с вероятностями 2 : 1
результаты анализа находятся в пределах 1 отн. % A% от име-
имеющегося количества), большинство даже в пределах 2,5 отн. %,
а при вероятности 7 : 1 результаты анализа лежат в пределах
5 отн. %. Эти вероятности являются оценками точности для поч-
почти оптимальных образцов, т. е. правильно подготовленных и ана-
анализируемых при нормальном падении пучка в стандартном
рентгеновском микроанализаторе.
7.3. ЭМПИРИЧЕСКИЙ МЕТОД
В начале 60-х годов метод трех поправок был разработан
недостаточно полно, как в настоящее время. Следовательно,
гистограммы, подобные представленным на рис. 7.8, давали зна-
значительно больший разброс ошибок. Кроме того, применение ми-
мини-ЭВМ для обработки данных было менее доступно. В связи
с этим Зиболд и Огилви [146] разработали метод, получивший
название гиперболического или эмпирического метода введения
поправок, впервые опубликованный в 1964 г. В действительности
Кастен [120] заложил основы для разработки этого метода в
своей диссертации, где он его называл «вторым приближением».
Это второе приближение гласило, что истинная весовая доля С
и измеренная относительная интенсивность k связаны таким
образом, что график зависимости С от k должен быть гипербо-
гиперболой.
В работе [146] авторы выразили эту зависимость в виде
[С/A-С)][A-*)/*] = а. G.32)
Ясно, если можно приготовить образец, гомогенный на микрон-
микронном уровне и с известной концентрацией С, то по измеренной
величине k можно определить а. Например, Национальное бю-
бюро стандартов США гарантирует, что образец SRM-480 являет-
является гомогенным и содержит 0,215Мо и 0,785W. Значения k, изме-
измеренные при ускоряющем напряжении 20 кВ, составляли 0,143
для Мо и 0,772 для W. Решая уравнение G.32) относительно а,
получаем а =1,649 для Мо в системе Мо — W и а = 1,078 для W
в Мо — W. Эти значения справедливы только для ускоряющего
напряжения 20 кВ. Решение относительно С в случае бинарного
сплава дает
C = ka/[l-]-k(a— 1)]. G.33)
Поэтому образец любого состава системы W — Мо можно про-
проанализировать, тщательно определяя величину k при ускоряю-

Количественный рентгеновский микроанализ
35
1,1 -
5 кВ
¦* 0,7 -
0,5 -
0.4 -
Рис. 7.9. Графики зависимости k/C
от k для серебра в сплавах сереб-
серебро — золото.
Анализ проводился по линии AgL Уско-
Ускоряющее напряжение равно 5. 10. 20, 30, 40
и 48,5 кВ. кок отмечено на рисунке. Дан-
Данные, получеиые при 5 кВ, внутренне не
согласованы, что проявляется в отклонении
от линейности.
щем напряжении 20 кВ и решая уравнение G.33) с помощью
настольного калькулятора.
Следует отметить две основные трудности: во-первых, часто
нелегко получить желаемый эталон и, во-вторых, возможность
распространения метода на случай содержания более чем двух
компонент не является сразу очевидной. Эта возможность, а
также точность гиперболической аппроксимации подробно рас-
рассмотрены в [149], где авторы занимались разработкой быстро-
быстрого и точного метода анализа геологических образцов. Минера-
Минералогические н петрологические образцы могут быть гетерогенны-
гетерогенными и часто содержать 6—8 элементов с весовыми концентраци-
концентрациями, превышающими 1%. Из соображений простоты и эконо-
экономичности при анализе большинства таких образцов метод трех
поправок не применяют. Желательно, чтобы обработка данных
с помощью мннп-ЭВМ занимала реальное время, так как знание
состава и рассчитанная формула фазы часто необходимы опе-
оператору для выбора решения, как проводить последующую ста-
стадию анализа. Как отмечено в [149], график зависимости С//г от
С или k для малых значений С в любой бинарной системе дол-

36 Глава 7
жен быть прямой линией с наклоном а. Между прочим, если
исследуется серия сплавов системы, то график зависимости k/C
от k должен представлять собой прямую линию; в противном
случае данные являются внутренне несогласованными [149].
Такие кривые показаны на рис. 7.9. Приведены графики зависи-
зависимости k/C от k для линии AgLa в четырех сплавах системы се-
серебро— золото при шести значениях ускоряющего напряжения.
Данные для каждого значения ускоряющего напряжения, за
исключением 5 кВ, укладываются на прямые линии. Кроме то-
того, Зиболд и Огилви [146] показали, что для тройной системы
с концентрациями элементов С\, Сг, С3 и относительными ин-
тенсивностями ku k2, k3 справедливы соотношения
[Сх/A -С,)] 1A -kj/kj = аш, G.34)
«123 = (а12С2+а13Сз)/(С2+Сз). G.35)
Иными словами, эмпирический коэффициент для тройной систе-
системы может определяться, исходя из отдельных бинарных систем
A2, 13 и 23). Поэтому необходимо иметь эталоны для каждой
бинарной системы. Расширяя этот формализм на систему, со-
содержащую п компонентов, было показано [149], что для п-ком-
поненты Cn = knfin, где
"lani ~г *2ап2 ~т~ "з^пз Т * *" "г "папп in ос\
п k1+k2+k3+...+kn—• <7-36>
Здесь ап\ — значение а для бинарной системы п\, т. е. для опре-
определения элемента п в бинарной системе, состоящей из элемента
п и элемента 1. Таким образом, an2 — значение а для бинарной
системы, состоящей из элемента п и элемента 2, и т. д. до annt
относящегося к п в п, и, следовательно, равного единице. Анало-
Аналогично а\п должно представлять собой значение а для элемента
1 в бинарной системе, состоящей из 1 и п.
Значение k\ есть найденное отношение относительных интен-
сивностей для элемента 1 в образце и эталоне, используемом
для элемента 1. Такая система обозначений может применяться
и далее, так что kn есть отношение относительных интенсивно-
стей для элемента п в образце и эталоне, используемом для эле-
элемента п.
Для полного решения системы из п компонентов необходимо
иметь п(п—1) значений для а (как отмечено выше, для каждо-
каждого из п чистых элементов а=1). Следовательно, необходимо
иметь п(п—1) эталонов. В работе [149] была приготовлена се-
серия подходящих эталонов геологических образцов и были опре-
определены соответствующие значения а при различных ускоряю-
ускоряющих напряжениях и углах выхода рентгеновского излучения.
Вместо чистых элементов в качестве эталонов использовались

Количественный рентгеновский микроанализ 37
окислы [149]. Так, например, aNiFe представляет собой значение
а для бинарной системы NiO — FeO и используется для опре-
определения Ni в бинарной системе, содержащей NiO и FeO.
Задав матрицу необходимых значений а, исследователь вы-
выбирает эталоны и определяет k\, k2, ..., kn. Затем можно рассчи-
рассчитать рь р2, •••, Рп- По этим первым приближениям определяют-
определяются С/, С2', ..., Сп'. Затем по полученным новым значениям кон-
концентраций С/, С2'... рассчитывается серия новых значений §
(Pi'. $2', —, Рп'):
о / ^1 аПХ т ^2 аП2 ~Т~ * " * т ^-/1 апп /у oy\
р" - d' + cz + .-. + Ce' • ^•0/;
Итерации продолжаются до тех пор, пока различие между вы-
вычисленными значениями р не станет достаточно малым. На
практике результаты в действительности зависят от выбора эта-
эталона, при анализе геологических образцов обычно выбираются
эталоны, средний атомный номер которых почти такой же, как
у образца. Тем самым уменьшается влияние атомного номера.
Эффекты флуоресценции малы в силикатных породах и подоб-
подобных материалах. Следовательно, конечная поправка представ-
представляет собой в основном поправку на поглощение.
Испытания применимости этого метода показали, что резуль-
результаты, полученные с его помощью, сравнимы с результатами, по-
получаемыми с помощью метода трех поправок. Главным препят-
препятствием для более широкого его использования является необхо-
необходимость иметь большое количество гомогенных, хорошо иссле-
исследованных эталонов. Поэтому а-метод иногда используется в
комбинации с методом трех поправок. В этом случае рассчиты-
рассчитывают матрицу нужных значений а по задаваемым значениям С
и используют метод трех поправок для расчета соответствующе-
соответствующего значения k. Затем, конечно, а можно вычислить по уравне-
уравнению G.32). Алби и Рей [150] с помощью метода трех поправок
рассчитали факторы поправок для 36 элементов в виде простых
окислов для Ео, равного 15 и 20 кэВ, и для различных углов
выхода рентгеновского излучения. Более сложные расчеты ко-
коэффициентов а были проведены в работе [151]:, но их использо-
использование ограниченно. Тем не менее вычисленные значения подвер-
подвержены влиянию всех неопределенностей, связанных с методом
трех поправок, указанных прежде. Использование таких кор-
корректирующих процедур, однако, позволяет проводить микроана-
микроанализ при наличии эталонов в виде небольших подходящих кри-
кристаллов простых окислов, причем процедура расчета значитель-
значительно проще, чем в методе трех поправок.
В качестве примера использования эмпирического метода
можно рассмотреть микроанализ семикомпонентного пироксена
из метеорита, рассчитанного ранее (табл. 7.6) методом трех по-

38
Таблица
Элемент
Глава 7
7.7. Эмпирические факторы а для
(i|5=52,50, ?„=15 кэВ)')
Окисел
MgO AIjOj SiO»
анализа
CaO
пироксена из
Crs03
метеорита
FeO
Mg
Al
Si
Ca
Cr
Fe
1,00
1,62
1,292>
1,08
1,13
1,15
,03
,00
,342>
,06
,11
,13
,09
,012>
,00
,08
,12
,15
1,26
1,14
1,05
1,00
1,14
1,14
1,50
1,28
1.12
0,91
1,00
1,08
1,76
1,372>
1,192)
0,92
0,88
1,00
') [1501.
2) Модифицированное Т. Бенцем (частное сообщение, 1978).
Таблица 7.8. Расчет состава пироксена из метеорита с использованием
эмпирического метода при i])=52,5°, ?о=15 кэВ
Концентрация, вес. %
[ZAF]t
53.3 SiO2
1,11 A12OS
0,62 СгаО3
9,5 FeO
14.1 MgO
21.2 CaO
1,074
1,16
1,102
1,133
1,179
1,047
0,496
0,00957
0,00563
0,838
0,120
0,203
1,091
1,17
1,106
1,15
1,16
1,06
0,489
0,00947
0,0056
0,0828
0,122
0,200
правок. Для Si, Al, Cr, Fe, Mg и Са анализ проводили по лини-
линиям Ко, при г|) = 52,5°, ?0 = 15 кэВ. Соответствующие а-факторы
[п(п—1) =30] для таких условий анализа были взяты из [150]
и приведены в табл. 7.7. Параметры р„ и относительные интен-
интенсивности k для пироксена из метеорита, вычисленные по уравне-
уравнению G.36), приведены в табл. 7.8. Кроме того, в табл. 7.8 при-
приводятся значения Zv4.F-nonpaBOK и k из табл. 7.6 (а). Факторы
Р„ и ZAF отличаются самое большее на 2 отн. %. Близость зна-
значений Рп и 2Л^-поправки неудивительна, так как значения а из
[150] рассчитывались с использованием метода трех поправок.
7.4. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ МИКРОАНАЛИЗ ПРИ НАКЛОННОМ
ПАДЕНИИ ЭЛЕКТРОННОГО ПУЧКА НА ОБРАЗЕЦ
В большинстве рентгеновских микроанализаторов пучок па-
падает нормально на плоский образец. В большинстве же растро-
растровых электронных микроскопов для получения соответствующего
угла выхода образец устанавливается в наклонном положении.

Количественный рентгеновский микроанализ
39
Электроны
45°
Рентгеновское
излучение
Рис. 7.10. Схематическое представление траекторий 100 электронов в меди.
Ускоряющее напряжение 20 кВ. Видно влияние наклона образца на траектории электро-
электронов и на соответствующую область генерации рентгеновского излучения (ср. с рис. 7.2).
Влияние наклона образца на точность количественного анализа
было исследовано теоретически путем расчетов взаимодействия
электронов с образцом методом Монте-Карло, которые ясно по-
показали изменения распределения рентгеновского излучения и
его интенсивности в зависимости от наклона образца [124, 152].
Пример влияния наклона приведен на рис. 7.10. Эксперименты
с наклоненными образцами показали, что если образец и эталон
расположены одинаково и угол наклона не является экстремаль-
экстремальным (9<60°), то при количественном анализе не возникает
больших ошибок [153, 154].
Основная трудность при работе с наклоненными образцами
связана с тем, что модель трех поправок справедлива при нор-
нормальном падении пучка. Влияние наклонного падения пучка на
параметры метода трех поправок практически не исследовано.
Рид [155] установил, что для образца, наклоненного под углом
45° относительно падающего пучка электронов, коэффициент от-
отражения изменяется значительно. В случае когда образец и
эталон измеряются при одинаковом угле наклона, влияние на-
наклона на коэффициент отражения одинаково для обоих. Было
установлено [156], что для такой конфигурации изменением в
поправке на обратное рассеяние за счет наклона можно пре-
пренебречь для Z<30. Максимальное влияние оказывается равным

40
Глава 7
Пучок
электронов
Пластина
детектора
V,
I
Рис. 7.11. Геометрическая схема для определения угла выхода рентгенов-
рентгеновского излучения \|) для образца, наклоненного относительно пучка, и фик-
фиксированного положения пластины детектора с дисперсией по энергиям.
лишь 7% даже при больших различиях в атомных номерах об-
образца и эталона.
С другой стороны, поправка на поглощение, по-видимому, в
большей степени зависит от наклона образца. Как показано на
рис. 7.10, область генерации рентгеновского излучения для силь-
сильно наклоненного образца расположена ближе к поверхности.
Поскольку поглощение экспоненциально зависит от длины пу-
пути, под влиянием наклона будет происходить резкое уменьше-
уменьшение поглощения. В литературе нет единого мнения о методе,
компенсирующем влияние наклона на величину поправки на по-
поглощение. Простейший вариант заключается в умножении х на
sin(90c—9), где 8 — угол наклона (рис. 7.11):
X (G) = (ц/р), cosec г|> sin (90°—в). G.38)
Другие исследователи [156, 157] предлагают более сложную
формулу:
X F) = (ц/р), coseci|)[ 1 — 0,5cos2 (90°-6I. G.39)
Чтобы отдать предпочтение какому-либо из этих двух выраже-
выражений, необходимо больше теоретических и экспериментальных
работ.
Наиболее важной проблемой при анализе образцов, накло-
наклоненных относительно пучка, является точное измерение угла вы-

Количественный рентгеновский микроанализ 41
хода рентгеновского излучения. В большинстве растровых элек-
электронных микроскопов пластина Si (Li)-детектора расположена
по отношению к образцу так, как показано на рис. 7.11. Для
этого случая образец наклонен под углом 9, что определяется
по показанию положения столика образца РЭМ. Центр пластин-
пластинки детектора находится на расстоянии х от точки падения элек-
электронного пучка на образец. Смещение точки падения выше (слу-
(случай /) или ниже (случай ///) центра пластинки детектора обо-
обозначено как AZ. Тогда
для случая / 1]5 = Э—arctg(AZ/x), G.40а)
для случая // -ф = в, G.406)
для случая /// ^ = Q-\-arctg(AZ/x). G.40в)
Желательно попытаться отрегулировать положение образца по
высоте таким образом, чтобы свести все к случаю //. Однако
если случай // не удается реализовать, следует тщательно из-
измерить х и AZ и по формулам G.40а) и G.40в) получить значе-
значение угла выхода для расчета по методу трех поправок. Чем
ближе пластина детектора (меньше х), тем больше неопределен-
неопределенность в значении ф. Более того, поскольку телесный угол детек-
детектора увеличивается с уменьшением расстояния х, использовать
положение центра детектора для расчета г|э можно лишь в виде
аппроксимации. В случае когда образец не обращен поверхно-
поверхностью непосредственно к спектрометру, требуется дополнитель-
дополнительная коррекция на азимутальный угол [158]'.
7.5. АНАЛИЗ ЧАСТИЦ И ШЕРОХОВАТЫХ ПОВЕРХНОСТЕЙ
7.5.1. Эффекты, связанные с геометрией
Количественный рентгеновский микроанализ массивных об-
образцов ограничен исследованием образцов с плоской поверхно-
поверхностью, расположенных под известным углом по отношению к
электронному пучку и рентгеновскому спектрометру. При этих
условиях интенсивность рентгеновского излучения, измеренная
на неизвестном образце, отличается от интенсивности рентгенов-
рентгеновского излучения с эталона только различием в составе иссле-
исследуемого образца и эталона. Используя методы, описанные вы-
выше, а именно метод трех поправок и эмпирический метод с а-
коэффициентами, состав неизвестного объекта может быть оп-
определен относительно эталона известного состава.
Существует, однако, широкий класс образцов неправильной
формы, которые не удовлетворяют геометрическим требованиям

¦42 Глава 7
идеального образца. К этому классу относятся микроскопиче-
микроскопические частицы и шероховатые макроскопические образцы, напри-
например поверхности излома. Интенсивности рентгеновского излуче-
излучения, измеряемые на таких образцах неправильной формы,
отличаются от соответствующих интенсивностей на плоских эта-
эталонах как из-за различий в составе, так и вследствие геометри-
геометрических эффектов, описываемых ниже. Обычные схемы обработ-
обработки данных, в которых отсутствует компенсация геометрических
эффектов, приводят к неточностям при анализе таких образцов.
Хотя в некоторых случаях образцы неправильной формы можно
смонтировать, разрезать и отполировать для получения образца
с плоской поверхностью для анализа, во многих случаях исполь-
использование таких деструктивных методов приготовления может при-
привести к потере весьма интересной информации. Следовательно,
необходимо разрабатывать методы, компенсирующие геометри-
геометрические эффекты.
«Геометрические эффекты» можно разделить на две основ-
основные группы: массовый эффект и эффект поглощения; дополни-
дополнительная группа обусловлена эффектом флуоресценции [159].
Природа каждого из этих эффектов будет рассмотрена в от-
отдельности.
7.5.1.1. Массовый эффект
Когда размеры частицы приближаются к размерам области
взаимодействия в объеме твердого тела, электроны могут выхо-
выходить со сторон и нижней части частицы, как показано на
рис. 7.12, в результате чего уменьшается интенсивность генери-
генерируемого рентгеновского излучения по сравнению с объемной ми-
мишенью. Зависимость измеренной интенсивности, отнесенной к
интенсивности от массивного образца, как функция диаметра
сферической частицы показана на рис. 7.13 (кривая для FeKa).
Массовый эффект всегда приводит к понижению измеряемой от
частицы интенсивности и становится значительным для частиц
диаметром от 5 мкм и меньше при энергии пучка ^20 кэВ.
Для массивных образцов с шероховатой поверхностью так-
также наблюдается массовый эффект, который является следстви-
следствием зависимости размера области взаимодействия от угла наклона.
Как было показано в гл. 3, область взаимодействия распола-
располагается ближе к поверхности в наклоненном образце и коэффи-
коэффициент отражения растет, в результате чего уменьшается интен-
интенсивность генерируемого рентгеновского излучения по сравнению
с мишенью, расположенной нормально к пучку. Это приводит
к зависимости интенсивности от угла наклона, показанной на
рис. 7.14.

Количественный рентгеновский микроанализ
43
1 МКМ
Рис. 7.12. Расчеты электронных траекторий в области взаимодействия для
сферической частицы из алюминия в зависимости от энергии пучка, выпол-
выполненные методом Монте-Карло [160].
1,4
1 П
0,4
i '
- /
/ i i i i
17,ч
кэВ
-
1 1 1 I
10
d, мкм
Рис. 7.13. Приведенная интенсивность /,аст//м. обр в зависимости от диамет-
диаметра сферической частицы стекла NBS К-309 A5% АЬАь 40% SiO2, 15%
CaO, 15% FeA, 15% BaO). Расчеты электронных траекторий выполнены
методом Монте-Карло.

20
60
80
40
в , град
Рис. 7.14. Приведенная интенсивность Iq/Iq для плоского массивного образ-
образца из железа в зависимости от угла наклона 9. Расчеты электронных траек-
траекторий выполнены методом Монте-Карло. Е0—20 кэВ.
\
Длина пути
\ поглощения в
\твердом теле
Путь в частице
Рис. 7.15. Схематическая диаграмма для сравнения длины пути, на котором
происходит поглощение, в частице с эквивалентной длиной в массивной ми-
мишени.

Количественный рентгеновский микроанализ
45
7.5.1.2. Эффект поглощения
Вследствие размера и формы частицы длина пути, на кото-
котором происходит поглощение рентгеновского излучения, будет от-
отличаться от пути в массивном образце. Это явление показано
схематически на рис. 7.15, где сравниваются длины путей, на
которых происходит поглощение, в сферической частице и в
массивной мишени. Поскольку поглощение экспоненциально за-
зависит от длины пути [формула C.43), гл. 3], геометрия части-
частицы может оказывать сильное влияние на интенсивность выхо-
выходящего рентгеновского излучения. Имеет смысл особо отметить
два случая.
1. Положение луча. Для частиц, размер которых немного
превышает область взаимодействия, измеряемый спектр может
сильно зависеть от местонахождения точки попадания пучка от-
относительно детектора рентгеновского излучения, как показано
на рис. 7.16. Когда пучок попадает на частицу со стороны, на-
направленной к детектору (рис. 7.16, положение /), длина пути,
на котором происходит поглощение, минимальна; при этом эф-
эффективно регистрируется полный рентгеновский спектр, вклю-
включая низкоэнергетическую часть ниже 3 кэВ (за исключением то-
того, что поглощается в окне). Если пучок располагается симмет-
симметрично на вершине частицы, а угол выхода на детектор большой
(рис. 7.16, положение 2), реализуется ситуация, подобная си-
ситуации с массивной мишенью, и получается приемлемый спектр.
Однако, если луч попадает на сторону частицы, противополож-
противоположную детектору, дополнительный путь, на котором происходит по-
поглощение, будет заметно ослаблять рентгеновское излучение с
малой энергией (рис. 7.16, положение 3). Примеры спектров,
иллюстрирующих это, приведены на рис. 7.17. Следует отметить,
что отношение Si/Ca сильно изменяется при переходе на
рис. 7.17, а к рис. 7.17,6, которые соответствуют спектрам, из-
Рис. 7.16. Схема, поясняю-
поясняющая различие в пути погло-
поглощении, при попадании пуч-
*а на переднюю (по отно-
лению к детектору рент-
рентгеновского излучения) сто-
эону A), на вершину B)
а на заднюю поверхность
частицы C).
длина п\;ти добавочного
поглощения в положении
3

46
Глава 7
Рис. 7.17. Рентгеновские спектры,
полученные с помощью спектромет-
спектрометра с дисперсией по энергии, от сфе-
сферической частицы диаметром 20 мкм
эталонного образца стекла К-411
, A5% MgO, 55% SiO2, 15% CaO,
15% FeO).
Пик золота появляется от напыленного по-
покрытии, а, в — со стороны, обращенном к
детектору; б, г — с противоположной дс-
дектору стороны; 0 — сравнение наложен-
наложенных друг на друга спектров 0 и с\ при-
приведенных к равной интенсивности по Fe^
меряемым с передней и задней поверхностей гомогенной части-
частицы из-за повышенного поглощения низкоэпергетическои §\Ка-
линии. При анализе неизвестных образцов нет смысла использо-
использовать относительные высоты пиков для диагностики сильного по-
поглощения, которое могло бы случайно встретиться. Сильное
поглощение в рентгеновских спектрах, полученных при помощи

Количественный рентгеновский микроанализ
47
Детектор рентгеновско
го излечения
Размер частицы
<1 мкм
Длина п\ти
добавочного
ПОГЛОЩЕНИЙ
У////////////////
б
Размер
частицы
Рис. 7.18. Схематическая диаграмма для иллюстрации влияния размера ча-
частицы и положения детектора или длины пути, на котором происходит по-
поглощение рентгеновского излучения.
о — детектор с малым углом выхода, пучок падает симметрично нп частицу: б — детек-
детектор с большим углом выхода, пучок расположен симметрично нп частице; в — детектор
с малым углом выхода, частица возбуждается целиком; „> — детектор с малым углом вы-
выхода, размер области взаимодействия меньше размера частицы.
спектрометра с дисперсией по энергии, можно легко распознать
по смещению резкого спада измеряемой интенсивности в об-
область энергий выше 2 кэВ (?0 = 20 кэВ), как это видно в спект-
спектрах, приведенных на рис. 7.17,6—д. Для сведения к минимуму
эффекта, связанного с положением луча, при анализе малых
частиц можно проводить анализ частицы растром при быстром
сканировании, в результате чего возбуждается спектр при всех
положениях зонда.
Влияние такого дополнительного пути на ослабление спект-
спектра усиливается при обычной геометрии детектора рентгеновско-

48
Глава 7
1.3
1.2
1,1
1.0
0,9
0.8
.0.7
0.6
0.5
0,ч
0.3
0,2 -
0,1
о
Si
C,2
В Fg
вес
% Si
\
)
Ф - 52.5
О
0°
1
Детектор
V
П\чОк
J -
... :
<:
0,5
1,5 2,0
2.5
3.0
3.5
i,0
5.0
Рис. 7.19. Приведенная интенсивность рентгеновского излучения в зависимо-
зависимости от диаметра частицы для частиц, измеряемых при больших углах выхо-
выхода (угол между осями детектора и пучка 47,5°) и малых углах выхода
(угол между осями детектора и пучка 90D).
Следует отметить, что для детектора с малыми углпми отбора наблюдается быстрое па-
падение интенсивности для частиц большего размера, что обусловлено аномальным погло-
поглощением. (По оси абсцисс должно быть: диаметр частицы. — Прим. ред.)
го излучения в РЭМ. Ось детектора обычно располагается под
прямым углом к пучку (рис. 7.11). Для плоского образца, уста-
установленного нормально относительно пучка, угол выхода равен
нулю, и, следовательно, для получения необходимого угла выхо-
выхода плоский образец следует наклонять. Если анализируется сфе-
сферическая частица и пучок падает на центр частицы, то имеет
место ситуация, показанная на рис. 7.18, о. Хотя для подложки
получается и необходимый угол выхода, при падении пучка на
центр частицы эффективный угол выхода остается равным 0°.
Для малых частиц, которые целиком возбуждаются пучком
(рис. 7.18,б), измеряется адекватная интенсивность рентгенов-
рентгеновского излучения. Для больших частиц размером более 5 мкм
(рис. 7.18, г) область взаимодействия находится в центре части-
частицы, и выходящее рентгеновское излучение должно пройти через
боковую сторону частицы, чтобы достичь детектора. Кривые за-
зависимости приведенной интенсивности (& = /Част//м. обр) от раз-
размеров частицы для случая г|) = 0 проходят через максимум, а за-
затем быстро спадают с увеличением диаметра (рис. 7.19). Избе-

Количественный рентгеновский микроанализ
49
Рис. 7.20. Схематическое представление процессов, которые могут происхо-
происходить при анализе образцов с грубой поверхностью.
1 — рентгеновское излучение, генерируемое первичным пучком; 2 — рентгеновское излуче-
излучение, генерируемое отраженными электронами; 3 — поглощенное рентгеновское излучение^
4 — флуоресцентное излучение.
жать.такой ситуации можно в том случае, если пучок попадает
на обращенную к детектору поверхность частицы "или если про-
проводить анализ растром. Для детектора с большим углом выхода,
показанным на рис. 7.18,6, не наблюдается резкого уменьшения
интенсивности с увеличением диаметра (рис. 7.19, г|) = 52,5°).
2. Размер частиц. Другой эффект поглощения проявляется в
зависимости измеряемого значения k от диаметра частицы. Име-
Имеется диапазон размеров частиц, область генерации в которых
почти идентична области генерации в массивной мишени. Одна-

50 Глава 7 __
ко из-за кривизны поверхности частицы длина пути, на котором
происходит поглощение, уменьшается по сравнению с массив-
массивным объектом, как показано на рис. 7.15. Если поглощение ин-
интересуемого рентгеновского излучения для массивного образца
велико, как для случая низкоэнергетического рентгеновского
излучения, то снижение поглощения в частице приводит к то-
тому, что интенсивность рентгеновского излучения, измеренного от
частицы, может быть больше, чем от массивного образца того
же состава, т. е. k>\. Такой случай показан на рис. 7.13, где
пониженное поглощение Siica рентгеновского излучения (Е =
= 1,49 кэВ) в частице приводит к тому, что А>1 для частиц
размером 2—6 мкм. В конечном счете по мере дальнейшего
уменьшения различия частицы массовый эффект доминирует и
значение k становится меньше единицы.
Для массивных образцов с грубой поверхностью эффект по-
поглощения может проявляться еще сильнее. Для поверхности,
случайным образом ориентированной относительно детектора
рентгеновского излучения, путь, на котором происходит погло-
поглощение рентгеновского излучения, может сильно отличаться от
аналогичного пути при стандартной установке детектора нор-
нормально к пучку. Такая ситуация схематически представлена на
рис. 7.20. И снова низкоэнергетическое рентгеновское излучение
подвержено влиянию появления этого добавочного пути значи-
значительно сильнее, чем высокоэнергетическое.
7.5.1.3. Эффект флуоресценции
Явление флуоресценции от характеристического рентгенов-
рентгеновского излучения, вызываемое высокоэнергетическим характери-
характеристическим и/или непрерывным рентгеновским излучением, гене-
генерируемым непосредственно пучком электронов, происходит в
объеме, большем чем область взаимодействия электронов. Эта
область флуоресценции, радиус которой может составлять 10—
100 мкм для содержания 99% флуоресцентного излучения, воз-
возбуждается вследствие малости значения коэффициентов массо-
массового поглощения рентгеновского излучения по сравнению с вы-
высокой тормозной способностью электронов из-за эффективного
расстояния. Массивная мишень по определению будет достаточ-
достаточно велика и будет содержать всю область флуоресцентного воз-
возбуждения, а частица в зависимости от ее размеров может те-
терять значительную часть флуоресцентного рентгеновского излу-
излучения. Измеренное значение k будет поэтому ниже ожидаемого
по сравнению с массивным эталоном.
Как указывалось в разд. 7.2.4 этой главы, флуоресценция за
счет характеристического излучения значительна тогда, когда
образец содержит элементы, рентгеновские линии которых ле-

Количественный рентгеновский микроанализ 51
жат вблизи краев поглощения других элементов. Флуоресцен-
Флуоресценция за счет непрерывного рентгеновского излучения наиболее
существенна для тяжелых элементов в легкой матрице, где флуо-
флуоресцентное излучение может составлять 20% наблюдаемой ин-
интенсивности. Матрицы макрочастиц окружающей среды часто
состоят из легких элементов, например С, О, Al, Si. Потери
флуоресценции за счет непрерывного излучения из частицы мо-
могут быть серьезным источником ошибок, если анализируются
мелкие добавки тяжелого элемента. Грубые массивные мишени
более близки к плоским массивным эталонам с точки зрения со-
содержания всей флуоресцентной области, поэтому потери флуо-
флуоресценции в таких образцах незначительны.
7.5.2. Компенсация геометрических эффектов
Имеется несколько способов учета влияния на интенсивности
рентгеновского излучения геометрических эффектов, встречаю-
встречающихся при анализе частиц и поверхностей излома: а) игнориро-
игнорирование геометрических эффектов; б) нормировка; в) использо-
использование эталонов в виде частиц; г) аналитические решения для
частиц специальной формы; д) метод отношения пик/фон. Эти
способы обсуждаются ниже.
7.5.2.1. Игнорирование геометрических эффектов
Некоторые исследователи предпочитают прямо описывать
результаты анализа частиц или грубых образцов, используя
стандартные количественные методы введения поправок, при-
принятые для массивных образцов, например метод трех поправок
и метод а-коэффициентов. Хотя это может звучать несерьезно
с точки зрения того, что говорилось в предыдущих разделах о
геометрических эффектах, нескорректированный анализ дает от-
отклонение от случая анализа плоского массивного образца
вплоть до 100% по концентрациям. Как будет показано в сле-
следующих разделах, при случайных попытках скорректировать
геометрические эффекты можно ввести значительные ошибки.
Поэтому может быть лучше иметь необработанные грубые ре-
результаты анализа, поскольку последующая обработка может
скрыть величину поправки и внушить ложное чувство доверия
к полученным результатам.
7.5.2.2. Нормировка
Поскольку геометрические эффекты обычно приводят к тому,
что суммарная концентрация отличается от единицы, часто ис-
используется простая нормировка результатов. Так, если общая

52 ^^ Глава 7
массовая доля, рассчитанная методом трех поправок или мето-
методом а-фактора, включая стехиометрнческий кислород, равна f,
то результаты можно нормировать к единице, если все значения
умножить на 1/f.
Простая нормировка наиболее эффективна при анализе ча-
частиц размерами менее 3 мкм. Для таких частиц массовый эф-
эффект доминирует и влияет на все элементы одинаково. Напри-
Например," на рис. 7.1'3"~ начальный участок кривой зависимости
/част//м. обр от диаметра частицы идентичен и для /Са-излучения
кремния, и для /Са-нзлучепия железа. В этой ситуации норми-
нормировка результатов может быть эффективной. Пример анализа с
использованием нормировки, в которой ошибки малы, приво-
приводится в табл. 7.9 (пирит). Однако с нормализацией могут быть
связаны большие ошибки, в частности если измеряются как низ-
низкоэнергетические, так и высокоэнергетические рентгеновские
линии.
Нормировка приводит к непригодным и совершенно бес-
бессмысленным результатам, когда проявляются эффекты, свя-
связанные с поглощением, как, например, при анализе больших ча-
частиц или грубых, массивных образцов, поскольку на низкоэнер-
низкоэнергетические линии они влияют сильно, а на высокоэнергетиче-
высокоэнергетические—слабо. Примеры случаев получения больших
относительных ошибок при простой нормировке в таких случа-
случаях приведены в табл. 7.9 для оливина и в табл. 7.11 для сплавов
Аи — Си. Поскольку при анализе образцов с грубой поверхно-
поверхностью почти всегда имеют место эффекты, связанные с поглоще-
поглощением, в таких случаях нормировку использовать не следует.
Таблица 7.9. Ошибки, получаемые при анализе частиц стандартными
методами с нормировкой и аналитическим методом1'
Истинная ныд адалТ,, Относи- Аналнтиче- Отиоси-
Состав концентра- «опмиппв- тельиая ский' анализ тельная
ция L кой ошибка, % частицы ошибка, %
Пирит (усреднен по
140 частицам)
S
Fe
Оливин (усреднен по
104 частицам)
MgO
SiO2
FeO
') Данные работы 1162;
53,45
46,55
43,94
38,72
17,11
54,
45,
со ел
to too
оо см
7
3
7
+2
—2
+15
+1
—43
,5
,9
,5
53
46
43
38
17
СЛ СЛ
—- to оо
+0,1
-0,1
—0,3
+0,5
0

Количественный рентгеновский микроанализ 53
В работе [161] процедура простой нормировки модифици-
модифицирована для анализа частиц микронных размеров. Отмечено, что
массовый эффект пропорционален части площади сканируемого
растра, занятой интересуемой частицей. Измеряемая интенсив-
интенсивность /Изм умножается на нормировочный множитель:
G.41)
где /о—-нормированная интенсивность, 5Р — площадь сканируе-
сканируемого растра и 5Част—-проектированная площадь частицы в ска-
сканируемом растре.
7.5.2.3. Эталоны в виде частиц
Совершенно отличный подход к измерению значения k за-
заключается в использовании эталонов в виде частиц известного
состава и известной формы вместо плоских, массивных этало-
эталонов. В идеале эталонные частицы должны иметь простую фор-
форму, например сферическую или цилиндрическую (волокно), хо-
хотя можно использовать и частицы случайной формы, получен-
полученные диспергированием массивного эталона. Затем к значениям
k, определенным по отношению к эталонам в виде частиц, мож-
можно применить метод а-коэффициентов. Имеются подходящие
эталоны многокомпонентных стекол в виде массивных образ-
образцов, волокон и сфер [163]; с другой стороны, гомогенные кри-
кристаллы минералов можно проанализировать сначала в виде
массивных образцов, а затем измельчить для получения мелких
частиц.
7.5.2.4. Аналитические решения
В работе [164] показано, что могут быть использованы ана-
аналитические решения для получения кривых зависимости значе-
значения k от диаметра частиц, которые затем могут использоваться
для количественного анализа неизвестных образцов. Детали рас-
расчетов слишком сложны, чтобы обсуждать их здесь, и читатель
может обратиться к этой работе. Пример серии рассчитанных
кривых для определенного состава и различной формы частиц
приведен на рист7.21. По оси ординат на нем отложен фактор
R = kca/ksi, где значения k для каждого элемента измерены от-
относительно значения для массивного эталона. При использова-
использовании этого метода для анализа неизвестного образца исследова-
исследователь должен предварительно хорошо оценить размер и форму
частиц измеряемого образца, чтобы выбрать соответствующую
кривую. В табл. 7.9 иллюстрируется применение аналитических
решений для минералов известной формы и состава. Относи-

54
Глава 7
Рис. 7.21. Нормированная интенсивность рент-
рентгеновского излучения в зависимости от раз-
размера частиц d, рассчитанная аналитически
[164].
На обеих кривых заметны экстремальные пределы
зависимости от формы. Рассматриваемые частицы мо-
могут иметь форму сфер, полусфер, прямоугольников,
четырехугольников, цилиндров, прямоугольных трех-
трехгранных призм и прямоугольной пирамиды [162].
тельные ошибки, получаемые в этом случае, значительно мень-
меньше, чем те, которые получаются при использовании метода нор-
нормировки.
7.5.2.5. Метод отношения пик/фон
В основе метода отношения пик/фон [159, 165, 166, 167] ле-
лежит то обстоятельство, что, хотя причиной возникновения харак-
характеристического и тормозного рентгеновского излучения служат
совершенно различные процессы (ионизация внутренних элект-
электронных оболочек и кулоновское взаимодействие), оба типа из-
излучения генерируются почти в одном и том же объеме. Более
того, при возбуждении образца оба типа излучения будут оди-
одинаково поглощаться. Следовательно, при данной энергии мас-
массовый эффект и эффект поглощения будут одинаковы как для
характеристического, так и для тормозного излучения. Интен-
Интенсивность тормозного излучения /в можно поэтому использовать
в качестве нормировки для основных геометрических эффектов.
Таким образом, хотя k = I4aCT/IM.06p сильно зависит от размера
частиц, величина GЧаст//в част)/(/м.обР//вм. обр) практически не
зависит от размера частиц, за исключением очень малых .[168].
Этот экспериментальный факт, который подтверждается тео-
теоретическими расчетами, можно использовать различными спо-
способами [167]. Один способ — это включить следующую схему
коррекции в стандартный метод трех поправок [165, 159]. Учи-
Учитывая, что
— Ли.обр'-' ? м.обр»
G-42)
можно рассчитать модифицированную интенсивность излучения
частицы Р*част, которая была бы эквивалентна интенсивности,
измеряемой от частицы, которую можно было бы представить
как полированный плоский образец:
G.43)
р# г
* част 'м.обр — '
/в
? м.обр
част
В уравнении G.43) /част и /в част измерены непосредственно из
спектра частицы, /вм.обр обычно не измеряется, поскольку труд-

Количественный рентгеновский микроанализ
55
Таблица 7.10. Ошибки, получаемые при анализе частиц методом отношения
пик/фон1'
Состав
Истинная
концентра-
концентрация
Стандарт-
Стандартный метод
трех попра-
поправок
Ошибка, %
Р/В, ZAF
Ошибка,
Пирит
S
Fe
Тальк
Mg
Si
53,4
46,6
19,3
29,8
39,9
35,8
10,3
15,8
—25
-23
—47
—47
52,9
46,4
18,5
29,0
— 1,0
—0,5
—4
—3
') По данным [159]; единичные анализы с известными эталонами.
Таблица 7.11. Ошибки, получаемые при анализе объектов с грубой
поверхностью (поверхностей излома гомогенных сплавов
Аи—Си) с помощью метода трех поправок, модифицированного
методом пик/фон1»
Состав
Анализ № 1
Аи
Си
Анализ № 2
Аи
Си
Анализ № 3
Аи
Си
') Данные
Истинная кон-
концентрация
60,3
39,6
60,3
39,6
80,1
19,8
[159].
Стандартный
метод трех
поправок
28,2
28,7
1,08
2,63
95,8
34,0
Относитель-
Относительная ошибка,
%
—53
—28
—98
—93
+20
+ 72
Нормирован-
Нормированный метод
трех поправок
49,6
50,4
29,1
70,8
73,8
26,2
Относительная
ошибка, %
— 18
+27
—52
+79
—8
+32
и.
N
58
44
52
41
76
19
,0
,0
,0
,0
,9
,1
Относитель-
Относительная ошибка,
—4
+ 11
— 14
+3
—4
—3
но достать эталон, идентичный по составу неизвестному образ-
образцу, а определяется по следующей формуле:
ih (Вм.обр)» G-44)
где 1цвш. обр) — интенсивность тормозного излучения чистого
элемента при рабочей энергии и С, — весовая доля элемента.
Значение С* в уравнении G.44) обычно получают из расчета по
ZAF.
Примеры анализов методом отношения пик/фон (Р/В, ZAF)
приведены в табл. 7.10. Поскольку в этом методе можно учиты-

56 Глава 7
вать эффект поглощения, он особенно перспективен для анализа
грубых массивных образцов (табл. 7.11), анализ которых явля-
является наиболее трудным. Из табл. 7.11 видно, что использование
простой нормировки в анализе поверхности излома приводит к
ошибкам, в то же время применение Р/В-метода уменьшает от-
относительную ошибку до приемлемого уровня.
7.5.3. Обсуждение
Методы анализа частиц и грубых поверхностей — это об-
область, которая еще продолжает свое развитие. Метод отношения
пик/фон подает большие надежды, но необходимы дополнитель-
дополнительные исследования, в частности определение гистограммы оши-
ошибок, получаемых при анализе образцов известного состава с гру-
грубой поверхностью. Даже в том случае, если разработан «совер-
«совершенный» метод анализа, при анализе грубых образцов и частиц
исследователя подстерегают ловушки, которые он практически
не может контролировать. Если вернуться к рис. 7.20, становит-
становится очевидно, что могут возникнуть ситуации, в которых элект-
электрон, рассеянный исследуемой областью, может возбуждать
близлежащие области с другим составом, так что в спектре при-
присутствует рентгеновское излучение от двух разнородных по со-
составу областей. Такой спектр нельзя подвергнуть обработке,
обратной свертке, поскольку неизвестны относительные вклады
компонентов. Аналогично при анализе негомогенных частиц, ко-
которые часто наблюдаются на практике, область взаимодействия
электронов может распространяться из интересуемой области
в соседние области с другим составом, приводя к появлению
сложного спектра, не поддающегося анализу.
Для очень малых частиц (толщиной менее 0,2 мкм) умест-
уместна другая стратегия анализа. Для анализа таких тонких ча-
частиц лучше всего использовать методы, разработанные для ана-
анализа тонких пленок, которые будут обсуждаться в следующем
разделе.
7.6. АНАЛИЗ ТОНКИХ ПЛЕНОК И ФОЛЫ"
Образец считается тонкой пленкой, если его толщина мень-
меньше продольного размера области взаимодействия электронов в
массивном объекте одинакового состава. Поперечные размеры
пленки практически бесконечны по сравнению с поперечным
размером пучка. Тонкие слои на толстой непрозрачной для
электронов подложке принято называть пленками, а слои без
подложки — фольгами. Если пленка или фольга анализируется
при стандартных энергиях пучка A5—30 кэВ) с использовани-
использованием массивных эталонов и если состав рассчитывается методом
трех поправок или методом а-коэффициентов, то суммарная кон-
концентрация будет меньше 100%. Нормировка результатов к

Количественный рентгеновский микроанализ 57
100% может привести к значительным относительным ошибкам
и поэтому нецелесообразна. Для фольги или пленок промежу-
промежуточной толщины может быть эффективным использование более
низких энергий пучка, например 10 кэВ, так как этим можно
уменьшить глубину проникновения пучка для того, чтобы объ-
объем взаимодействия находился полностью в тонком объекте. Для
очень тонких образцов стандартные методы анализа массивных
образцов непригодны и необходима разработка соответствую-
соответствующих аналитических методов. Методы анализа значительно от-
отличаются в зависимости от того, что представляет собой обра-
образец— фольгу или пленку.
7.6.1. Тонкие фольги
Анализ образцов в виде тонкой фольги представляет собой
простейшую аналитическую проблему. До некоторой степени
микрорентгеноспектральный анализ образцов в виде тонкой
фольги проще, чем анализ плоских массивных образцов. Когда
образец очень тонкий, упругое рассеяние и потери энергии
уменьшаются до такой степени, что эффекты атомного номера
исключаются или в лучшем случае оказываются второстепен-
второстепенными. Поскольку сечения как упругого, так и неупругого рассе-
рассеяния уменьшаются с увеличением энергии пучка, образцы в ви-
виде тонкой фольги лучше всего анализировать с помощью ана-
аналитического электронного микроскопа (АЭМ), который обычно
представляет собой комбинацию просвечивающего и просвечи-
просвечивающего растрового электронных микроскопов, работающих при
ускоряющем напряжении 100 кВ и снабженных рентгеновским
спектрометром с дисперсией по энергии. В случае отсутствия
АЭМ можно использовать РЭМ или рентгеновский микроана-
микроанализатор, работающий при ускоряющем напряжении 40—60 кВ,
хотя роль эффектов атомного номера в зависимости от состава
фольги или ее толщины может стать значительной. Как погло-
поглощение, так и флуоресценция также становятся незначительны-
незначительными для тонкой фольги в зависимости только от толщины фоль-
фольги и независимо от энергии пучка. Таким образом, при анализе
образцов в виде тонкой фольги можно пренебречь всеми мат-
матричными эффектами — влиянием атомного номера, поглощени-
поглощением и флуоресценцией, на которые должна вводиться поправка
при анализе массивных образцов. В результате анализ тонкой
фольги можно провести при помощи простого метода относи-
относительной чувствительности [169, 170].
Фактор относительной элементарной чувствительности kAB
(фактор Клиффа — Лоримера) для элемента А по отношению
к элементу В есть
kAB = (CA/CB)(IB/IA), G.45)

58 Глава 7
где С а — весовая доля элемента А, 1А — скорректированная на
фон интенсивность рентгеновского излучения, В— сравнитель-
сравнительный элемент, за который обычно принимается кремний, хотя
можно использовать любой другой элемент. Значения kAB для
всех интересуемых элементов измеряются на эталонах в виде
тонкой фольги известного состава. Соответствующие значения
клв затем используются для пересчета относительных интенсив-
ностей Ja/Jb, измеренных на неизвестной тонкой фольге, в от-
отношение концентраций элементов СА/СВ преобразованием урав-
уравнения G.45):
Сд/Св = кдв(Гд/1в). G.46)
Более того, если концентрация С в известна, то
CA = kAB{IAIIB)CB. G.47)
Если такая процедура выполняется для всех элементов в об-
образце, то, предполагая, что общая концентрация С=1, получим
Все kiB известны и отношения /г//в измерены, поэтому в урав-
уравнении G.48) содержится только одно неизвестное Св, и потому
его значение можно определить. Используя найденное значение
Св и уравнение G.47), можно определить все значения Сг для
всех элементов в образце. Если в образце имеется кислород, то
стехиометрическое содержание его можно включить в общую
концентрацию в уравнение G.48). Однако в случае присутствия
других неизмеряемых элементов, например углерода, вынужден-
вынужденная нормировка уравнения G.48) будет смазывать присутствие
других элементов.
Фактор относительной чувствительности \iab обязательно со-
содержит факторы, характеризующие образец, например сечение
ионизации, тормозную способность и поглощение образца для
элементов А я В, а также факторы, характеризующие прибор,
как, например, поглощение рентгеновского излучения окном и
эффективность детектора. Хотя такие &дВ-факторы можно рас-
рассчитать, неопределенности в параметрах окна спектрометра при-
приводят к неприемлемым ошибкам в значениях kAB для энергий
рентгеновского излучения ниже 2 кэВ [170], и, таким образом,
значения kAB должны определяться на конкретных приборах,
используемых для анализа.
В конечном счете поглощение в образце накладывает предел
на максимальную толщину образца, при которой может исполь-
использоваться аналитический расчет по формулам G.45) — G.48).
В работе [171], было установлено, что предельная толщина, вы-

Количественный рентгеновский микроанализ 59
ше которой необходимо вводить поправку на поглощение, опре-
определяется выражением
0,1, G.49)
где %i= (fi/p)iCosecip, (ц/р),- —массовый коэффициент поглоще-
поглощения для элемента i в образце и г|э — угол выхода. Вид соответ-
соответствующей поправки на поглощение для образцов в виде тонкой
фольги обсуждался в [170]. В случае когда флуоресценция в
объеме велика, например для сплавов Fe — Сг, необходимо вво-
вводить также поправку на флуоресценцию в фольге, толщина ко-
которой превышает критерий поглощения в уравнении G.49).
7.6.2. Тонкие пленки на подложках
Ситуация, в которой может происходить генерация рентге-
рентгеновского излучения для тонкой пленки на подложке, приведена
на рис. 7.22. Электроны могут генерировать рентгеновское из-
излучение сразу в пленке A) или после рассеяния от подложки
B), могут рассеяться от пленки, пройти сквозь пленку и рас-
рассеяться от подложки, а также могут неоднократно пересекать
границу раздела пленка — подложка, прежде чем потеряют всю
свою энергию. Частота каждого из этих процессов будет зави-
зависеть от толщины и состава пленки, а также от состава подлож-
подложки. Идеальным средством изучения эмиссии рентгеновского из-
излучения из пленки на подложках является моделирование тра-
траекторий электронов методом Монте-Карло, так как все случаи,
показанные на рис. 7.22, можно легко смоделировать. Некото-
Некоторые авторы успешно применяли метод Монте-Карло в случае
тонких пленок [172, 173].
Другие авторы [174, 34, 175, 130]! вывели математические
выражения для отношения интенсивностей рентгеновского излу-
излучения от тонкой пленки на подложке и массивного эталона. Эти
выражения имеют вид
CAR* J (Q/S*) dE + T)ss J (Q/S*) dE
. __ /пл _ EL Ejj
Ra J
dE
где R* — фактор обратного рассеяния, S* — тормозная способ-
способность для фольги, r\ss — коэффициент отражения электронов от
подложки, EL — средняя энергия электронов на границе разде-
раздела пленка — подложка и EL> — средняя энергия электронов, от-
отраженных от подложки. Кроме того, в выражение G.50) следу-
следует ввести соответствующую поправку на поглощение [175].

60
Глава 7
Падающий
электронов
Подлетка
Рис. 7.22. Возможные траектории электронов в тонкой пленке на подложке.
Траектории 1 и 6 соответствуют отраженным электронам; траектории 2—5 — электронам,
остающимся в пленке нли подложке.
Каждый из вышеописанных методов был испытан, и, как бы-
было показано, в определенных аналитических ситуациях они да-
дают полезные результаты. Эти методы достаточно сложные, и
трудно изложить их соответствующим образом в тексте книги,
чтобы читатель мог непосредственно применить их для расче-
расчетов. Те, кого это интересует, должны обратиться для уточнения
деталей к статьям, посвященным методу Монте-Карло и ана-
аналитическим методам, ссылки па которые приведены выше.
Яковиц и Ньюбери [176] разработали эмпирическое при-
приближение, в основе которого лежит подгонка кривых распреде-
распределения рентгеновского излучения по глубине <p(pz). Этот метод
позволяет быстро определить толщину и состав тонких пленок
с помощью настольного калькулятора или небольшой вычисли-
вычислительной машины, и он более прост в использовании, чем ранее
описанные. Он предлагается для анализа тонких пленок на под-
подложках, и обсуждение его приводится ниже.
к
<PU)
Г
i
k
\
Рис. 7.23. Схематическая диаграмма для ап-
аппроксимации кривой ф(рг), состоящей из па-
Z раболы на участке с координатами @, ср0)
i T до 1,5 h и экспоненциально спадающей на
Массовая толщина участке от 1,5 h до рг„

Количественный рентгеновский микроанализ (И
В основе метода Яковица — Ньюбери лежит простое модели-
моделирование кривой ф(рг), показанной на рис. 7.23. Кривая ф(рг)
моделируется параболой, простирающейся от значения сро (при
pz = 0) и проходящей через максимум с координатами (h, k)
до значения pz=l,5/i. Таким образом, в области 0^p2^1,5/i
ф (рг)г<1,5А = Л~2 (pz— hf (ф0—k) -\-k. G.51)
В области pz>l,5/i кривая ф(рг) моделируется функцией, спа-
спадающей по экспоненте:
G.52)
где 8 — угол наклона образца.
Параметры ф0, k, h и pz,. определяются следующим образом
[34]:
—0,9ш»), G.53)
где 1] — коэффициент отражения и w = EK?/E0. Если образец на-
наклонен, то
4F)= 1/A-f cos еу>, p^Q/z1': G.54)
Величина глубины генерации рентгеновского излучения опреде-
определяется по формуле Хейнриха [61]
azr= 0,007(^о1-66 —?кр'-66) мг/см2. G.55)
Значение h задается выражением
/t = pzr@,49— 1,6т1-)-2,4лг— 1,3ti3), G.56)
а значение k — выражением
k = ф0 A + 0,35 cos9 In U), где U = E0/EKf. G.57)
Сравнение эмпирической кривой ф(рг), полученной с исполь-
использованием вышеприведенных выражений, с экспериментальной
показано на рис. 7.24.
Общую интенсивность рентгеновского излучения, генерируе-
генерируемого в массивной мишени, находят интегрированием уравнений
G.51) и G.52):
о'
где
М= 0,865 (pzr— 1,5/1). G.58)

62
Глава 7
3
2,5
2
9B)
1,5
1
0.5
0
/
-
-
Al(MgKa)
N. 29 кэВ
\
\
^V A
X
1 1 1
л
0,25 0,5
0,75 1
z, мг/см2
1,25
1.5
175
Рис. 7.24. Сравнение экспериментальной кривой (p(pz) для алюминия (сле-
(следы магния) [62] и эмпирической кривой, рассчитанной по формулам G.51)
и G.52) (сплошная кривая).
Чтобы модифицировать уравнения G.51) и G.52) примени-
применительно к тонким пленкам, необходимо ввести модифицирован-
модифицированный коэффициент отражения
*. G-59)
Коэффициент отражения от пленки г|опл равняется
о ) G.60)
где Tiz — коэффициент отражения от массивного образца из чи-
чистого элемента и RK0 — максимальный пробег из модели Ка-
найя — Окаяма [23]:
/?ко = 2,76-10-2Eow A[Z°>88Sp мкм. G.61)

Количественный рентгеновский микроанализ
63
1,2
0,8
0,4
пленка Аи о
@.25 иг/см2, 1300 А)
0,4
0,8
z, мг/см2
0,8
1,0
1,2
1.4
нис. 7.25. Распределение ф(рг) по глубине рентгеновского излучения АимЛ
для массивной мишени из золота и тонкой пленки на подложке из А^Оз,
рассчитанной при соответствующих параметрах по уравнениям G.51) и
G.52) при энергии первичного пучка 20 кэВ.
О й 036 / //
() ри рг ри у 0 э.
Отношение площадей равно 0,36; /плАид{ //"¦
0,49.
Коэффициент прохождения через тонкую пленку Т1ППЛ выража-
выражается в виде
V* = ехр { - @,03 + 2-10-* Ео) Z (pz/RK0) [1 + 4 (pz/RK0)}}. G.62)
После подстановки этих выражений в формулу для (p(pz) для

0.0025 с-
0.001
100
250
2500
503С
500 1000
Толщина пленки , А
Рис. 7.26. Кривые зависимости knit от толщины пленки.
a-SiK /SI njI//si мобР=Лг3[; б-Аид, на подложке из АЬОз, /Лцпл//\,1М-обР = *Аи-
Сплошная линия —расчет эмпирическим методом Яковицп — Ньюбери; (g) — эксперимен-
экспериментальные результаты Кайзера и Мураты [172]. ф=52,5°; 9=0°.

Количественный рентгеновский микроанализ
65
1.0
100
Рис. 7.266.
500 1000 Z500
о
Толщина пленки, а
5000
10000
массивного образца рассчитывается кривая <р(р2), вид которой
в сравнении для массивного образца приведен на рис. 7.25. Ин-
Интенсивность рентгеновского излучения, генерируемого в пленке,
определяется выражением
I ПЛ J ПЛ
? =/?1
рг<1,5Апл
= [рг(Фопл-;
ргг
G.63)
G.64)
1.5ft
где Д4 = (ргг— 1,5/гпл){1 — ехр[ — Bрг—3/i™)/(pzr— 1,5ЯПЛ)]>. G.65)
F= ипл
1.5Л

66
Глава 7
U,ID
0.16
/lpt-
0,14
0,12
'"
0,1
пл
0,08
0,06
0,0^
0,02
20 нэв
подложка А1 г0з
/-
///
"" 1 Зкспер У///
W
/
-)
-
-
25
50
75
Co
Pt
I
20
99
} Чистый
злемен ,
Z=99 иг/см2
100
Рис. 7.27. Рассчитанные
значения А11Л в зависимости
от толщины пленки, ис-
используемые для получения
данных табл. 7.12.
Отношение k интенсивностей от пленки из чистого элемента к
интенсивности от массивной мишени из чистого элемента рав-
равняется
G.66)
где /(х)= 1/A + 1,2-10-вх7J, G.67)
%= (ji/p)cosec \J\ ц/р — массовый коэффициент поглощения, г|з —
угол выхода и у = Е01-в5— ?кр''65 [177]. Для тонкой пленки fnjl(%)
аппроксимируется выражением
1]}. G.68)
Уравнение G.66) можно использовать для получения кривых
зависимости fenJI от толщины пленок из чистых элементов по
сравнению с массивными мишенями. Такие графики зависимо-
зависимости кпл от толщины сравниваются на рис. 7.26 с эксперименталь-
экспериментальными данными.

Количественный рентгеновский микроанализ 67
Для анализа многокомпонентных пленок неизвестного соста-
состава и толщины сначала следует рассчитать кривые, подобные
приведенным на рис. 7.26. Такая процедура для бинарных пле-
пленок марганец — висмут будет проиллюстрирована на рис. 7.27.
Для тонких пленок снова предполагается, что межэлементные
эффекты пренебрежимо малы (атомный номер, поглощение и
флуоресценция). По измеренному в эксперименте значению
kinJl для каждого элемента i массовая толщина для данного ком-
компонента определяется из графиков зависимости knjl от рг (на-
(например, рис. 7.27). Полная толщина пленки определяется как
G-69)
Концентрация каждого элемента i в пленке неизвестного со-
состава представляет собой
С!=с/.пл//гпл'р2, G.70)
где /,"•" — истинная генерируемая интенсивность излучения эле-
элемента i и Дпл' pz— интенсивность, которая генерировалась бы,
если бы исследуемый образец состоял из чистого элемента L
Следовательно,
-Обр) = k^jk?*- Р*. G.71)
Таким образом, в серии графиков, приведенных на рис. 7.27, из-
измеренные для каждого элемента значения ?пл используются для
определения неизвестной толщины пленки р2ОбЩ. Полученное
значение ргОбЩ используется для нахождения значений кгпЛ- р
для каждого элемента, а концентрации определяются по урав-
уравнению G.71). Концентрации для образцов Мп — Bi и Со — Pt,
определенные этим методом, представлены в табл. 7.12, где при-
приведены дл-я сравнения результаты независимых измерений.
Метод Яковица — Ньюбери дает разумную точность для пле-
пленок с массовой толщиной, составляющей до 30% объема взаи-
взаимодействия в массивном образце. При анализе более толстых
пленок из-за появления межэлементных эффектов, особенно по-
поглощения, ошибки увеличиваются. Для коррекции этих эффек-
эффектов следует применять дополнительную процедуру методом ите-
итераций, вводя поправку на поглощение, основанную на использо-
использовании всех коэффициентов массового поглощения путем исполь-
использования уравнений G.68) и G.69). Однако тщательная провер-
проверка в этой области толщин для многокомпонентных пленок пока
не проведена.
Метод Яковица — Ньюбери является простым эмпирическим
приближением, которое можно использовать в практическом
анализе тонких пленок. Если исследователь сталкивается с
проблемой анализа большого количества тонких пленок на раз-

68 Глава 7
Таблица 7.12. Анализ бинарных пленок Со—Pt на S1O2, Мп—Bi иа S1O2.
Экспериментальные результаты Кайзера и Мураты (КМ)
сравниваются с результатами расчета, проведенного
Национальным бюро стандартов (НБСI*
*Со
0,0177
0,0305
0.0148
0,0067
*Mn
0,0226
0,0293
0,0329
0,061
') Значения ;
0,0581
0,114
0,0675
0,0465
*Bi
0,0766
0,0515
0,0220
0,00668
—
г в мг/см2, 9 = 0°,
-) Метод ядерного рассеяния
ZKM
53
89
56
40
гкм
54
53
38
29
42
U =.52,5°.
дает z~l
гНБС
51
99
60
41
2НБС
60
59
41
30
41
13 мг/см2, ССо=0,194.
С
0
0.
0
0
с
0
0
0
0
1
км
Со
,185
,163
,140
,101
Мп
,255
,510
,800
,0
Л-1БС
ССо
0 1992>
0,179
0,154
0,103
СНБС
0
0,263
0,518
0,769
1,0
нообразных системах и необходимо достижение наилучшей точ-
точности, то оптимальным методом анализа, в особенности для бо-
более толстых пленок, будет моделирование электронных траек-
траекторий методом Монте-Карло.
7.7. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ МИКРОАНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ
МАТЕРИАЛОВ
7.7.1. Введение
Большинство результатов рентгеновского микроанализа в
биологии можно обрабатывать полуколичественно, не прибегая
к каким-либо численным схемам, и полезную информацию мож-
можно получать простым сравнением различных рентгеновских
спектров. Такие спектры имеют вид либо полученных на само-
самописце графиков, либо фотографий с экрана видеоконтрольного
устройства спектрометров с дисперсией по энергии, которые яв-
являются основной частью современных рентгеновских аналитиче-
аналитических систем. Можно также получить распределение элементов
вдоль линии на образце или построить карту распределения
элементов по образцу. Однако такие полуколичественные ме-
методы позволяют лишь обнаружить возможное присутствие от-
отдельных элементов в образце и в лучшем случае установить,

Количественный рентгеновский микроанализ 69
что в некоторых областях образца содержание определенного
элемента выше, чем в других.
В настоящее время установлено, что с помощью рентгенов-
рентгеновского микроанализа можно надежно измерять концентрации
элементов в микрообъемах клеток, тканей и срезах тканей, хотя
понятие «количественный» в биологии используется менее стро-
строго, чем в материаловедении. При идеальных условиях в уль-
ультратонких срезах можно обнаружить 10~18—10~19 г элемента с
пространственным разрешением около 25 им [178]. Для прове-
проведения такого количественного анализа требуются применение
математических формул и четкое представление обо всем, что
может вносить ошибки в процессе приготовления образца, ана-
анализа и последующей обработки данных.
Хотя рентгеновский микроанализ может быть определенным
и точным, свойства биологических материалов часто приводят к
ограничению точности анализа величиной, составляющей
+10 отн. % истинного значения. Такая неопределенность обу-
обусловлена тем, что биологические материалы являются далеко не
идеальными образцами, имеют различную геометрию и шеро-
шероховатость поверхности, часто для их приготовления используют-
используются сомнительные методы, и они могут явиться эффективным ис-
источником загрязнений чистой в других отношениях окружаю-
окружающей среды. Другая проблема, специфическая для количествен-
количественного анализа биологических систем, заключается в том, что
большинство элементов в образце, например углерод, кислород,
азот и водород, трудно точно измерять. В отличие от анализа в
материаловедении в большинстве случаев использования рентге-
рентгеновского микроанализа в биологии требуется измерить концепт-
рацию элементов B>10), содержащихся в малом количестве
в плохо известной органической матрице. Следует также
напомнить, что рентгеновские спектрометры регистрируют
только вышедшее рентгеновское излучение, а оно не всегда
полностью соответствует рентгеновскому излучению, генерируе-
генерируемому в образце. Эта проблема усугубляется тем, что в биоло-
биологических материалах электроны проникают более глубоко,
вследствие чего возрастает поглощение генерируемого рентге-
рентгеновского излучения. Попытки впоследствии скорректировать по-
поглощение затрудняются отсутствием полной характеристики
органической матрицы и точных значений массовых коэффици-
коэффициентов поглощения для элементов с низкими атомными номера-
номерами. Поэтому центром обсуждения этого раздела являются по-
поправки, которые можно ввести, чтобы сузить разрыв между
численными значениями интенсивностей рентгеновского излуче-
излучения, генерируемого в образце, и регистрируемого и измеряемо-
измеряемого. Рассмотрение вопроса, что меряет рентгеновский микро-
микроанализатор в биологических системах [179], показывает, что

70 Глава 7
термин «концентрация» лучше всего трактовать как локальную
массовую долю. Локальная массовая доля определяется как
масса элемента в анализируемом микрообъеме, деленная на
общую массу образца в том же микрообъеме. Удобнее выра-
выразить эту локальную массовую долю либо в виде вес/вес, т. е.
количество миллиграммов элемента на килограмм локальной
сухой массы, либо как количество миллимолей элемента на ки-
килограмм образца. Последнее выражение чаще используется Фи-
Физиологами, хотя следует понимать, что результаты относятся к
образцу в момент анализа. Таким образом, локальная массовая
доля, выраженная в единицах мМ/кг, является мерой общего
количества элемента в анализируемом микрообъеме без разли-
различия между связанной и несвязанной формами. В то время как
результаты рентгеновского микроанализа можно представить
в единицах мМ/кг, часто возникает необходимость комбиниро-
комбинировать данные рентгеновского микроанализа с результатами пря-
прямых (микроэлектроды с селективностью по ионам) и непрямых
(экстракция микропипеткой с последующим атомно-абсорбци-
онным анализом) измерений жидкой фазы для того, чтобы вы-
выразить результаты измерения в единицах мМ/л. Хотя в водных
внеклеточных средах, где доля сухой массы равна нулю, срав-
сравнительно просто точно измерить^ концентрацию несвязанных эле-
элементов, провести такие измерения во внутриклеточных ячейках
значительно труднее.
При обсуждении методов количественного анализа удобно
рассмотреть по отдельности различные типы образцов. Массив-
Массивными образцами являются такие, толщина которых значитель-
значительно превышает глубину проникновения падающих электронов;
толстые среды на массивных подложках — это такие образцы,
толщина которых немного меньше глубины проникновения элек-
электронов, а тонкие образцы на очень тонких подложках — это об-
образцы, толщина которых много меньше глубины проникновения
падающих электронов. К этим трем категориям можно добавить
еще два рода образцов, требующих краткого рассмотрения:
толстые образцы на очень тонких подложках и микрокапеаьки.
Следует, однако, напомнить, что в основном рентгеновский мик-
микроанализ биологических материалов производится на срезах,
монтируемых на тонких подложках.
7.7.2. Потери массы и артефакты, возникающие
в процессе анализа
Прежде чем приступить к обсуждению различных методов
количественного анализа, уместно вначале рассмотреть основ-
основные ошибки и артефакты, которые могут возникнуть в процессе
накопления рентгеновского спектра. Проблемы, связанные с на-

Количественный рентгеновский микроанализ 74
ложением спектров, с появлением фиктивных сигналов рентге-
рентгеновского излучения от окружающей держатель образца среды
и прибора и с поглощением рентгеновского излучения самим
образцом, уже обсуждались. В этом разделе мы рассмотрим
способы устранения этих посторонних сигналов и введения не-
несложных процедур коррекции для оценки рентгеновского сиг-
сигнала от образца с разумной точностью.
В настоящее время установлено, что пучки высокоэнергети-
высокоэнергетических электронов, используемые в электронной микроскопии и
микроанализе, могут разрушающе действовать на образец. Та-
Такое повреждение пучком обычно более значительно в органиче-
органических и биологических образцах [180], и важно знать о таких
вызываемых пучком изменениях, как большие разрушения об-
образца, потери органического материала и испарение летучих
элементов. Хотя в настоящее время возможно проводить ана-
анализ при низких токах пучка @,1—5 нА), при этом все же име-
имеют место значительные потери материала. Естественно, количе-
количество теряемого из образца материала зависит как от образца,
так и от тока пучка, но обычно оно составляет около 30%
[181], хотя в литературе имеются данные о потерях, составля-
составляющих почти 90% [182]. Потеря массы органического материала
является серьезной проблемой, особенно в случаях, когда коли-
количественные измерения выполняются с использованием спектра
непрерывного излучения (см. разд. 7.7.6) и все зависит от точ-
точной меры локальной массы в процессе анализа. Потери массы
органического материала в любых типах электронно-зондовых
приборов можно уменьшить за счет охлаждения образца. В ра-
работе [183] и позднее в {181 и 180] было показано, что потери
массы значительно уменьшаются, если образец находится при
низких температурах. В этом заключается другое преимущест-
преимущество использования замороженных в гидратированном состоянии
образцов, хотя последние исследования показали, что даже ох-
охлаждение образца до температур жидкого азота недостаточно
для полного исключения потерь массы.
По-видимому, невозможно заранее предсказать, будет ли
данная система испытывать потери массы в процессе анализа,
и лучше рассчитать, произошла ли потеря массы на основании
стабильности счета при регистрации непрерывного излучения
до, в процессе и после проведения эксперимента. Действитель-
Действительно, постоянство счета от непрерывного излучения является чув-
чувствительным индикатором потери массы (пониженная скорость
счета), а также другого артефакта — загрязнения (повышенная
скорость счета).
Другим артефактом, близко связанным с потерей массы, яв-
является потеря конкретных элементов из образцов в процессе
микроанализа. Для биологических образцов имеется очень ма-

72 Глава 7
ло экспериментальных данных, но для модельных систем име-
имеются данные, указывающие на потери хлора, натрия, калия,
фосфора и серы; таким образом, есть основания ожидать, что
это явление также имеет место в биологических образцах. Не-
Недавний обзор [184] этого вопроса показал, что потеря анализи-
анализируемых элементов из образцов представляет серьезную пробле-
проблему. Единственным проблеском является надежда на то, что по-
потери элементов, подобно потере массы, значительно уменьша-
уменьшаются при низких температурах, хотя и полностью не исключа-
исключаются. Кроме того, покрытие тонкой проводящей пленкой может
уменьшить подвод тепла к образцу, а также удержать подвиж-
подвижные фрагменты органического материала, которые в противном
случае испаряются в микроанализаторе [180]. Проводящие по-
покрытия следует использовать с осторожностью, так как осаж-
осажденный проводящий слой может поглощать испускаемое рент-
рентгеновское излучение, ослаблять первичный пучок и во многих
случаях приводить к появлению рентгеновских линий, которые
влияют на интересуемый сигнал.
7.7.3. Массивные образцы
Если проводится анализ массивных образцов, необходимо
вводить ряд поправок в классическое уравнение Кастена для
количественного анализа:
С, = /»//(,„ G.72)
где С, — локальная массовая доля элемента i в анализируемом
микрообъеме образца, /(,-> — измеряемая интенсивность характе-
характеристического излучения от эталона, состоящего исключительно
из элемента /. Интенсивности /; и /(i) измеряются при идентич-
идентичных экспериментальных условиях. Имеются три основных ме-
метода, которые можно использовать в анализе массивных биоло-
биологических систем: метод трех поправок BЛ/7-коррекция), метод,
предложенный Кобе ;[185]i и Кобе и Милнером [186], и метод
отношения пик/фон [165, 166].
7.7.3.1. Метод трех поправок
Он уже описан в разд. 7.1 данной главы, и мы не будем по-
повторять его здесь, приведем лишь уравнение введения поправок
,.//(П, G.73)
где Z — поправочный фактор, учитывающий различия в среднем
атомном номере образца и эталона; А учитывает внутреннее по-
поглощение генерируемого в образце рентгеновского излучения,
F — поправка на рентгеновское излучение, генерируемое в об-

Количественный рентгеновский микроанализ 73
разце другим излучением. Флуоресценция, вызываемая непре-
непрерывным излучением, также должна учитываться для биологи-
биологической матрицы с помощью фактора Ес. В недавно опубликован-
опубликованной работе [187] обсуждается возможность применения про-
процедуры метода трех поправок в анализе биологических образ-
образцов.
7.7.3.2. Метод Кобе
Кобе [185] предложил другой способ анализа массивных
биологических материалов. Он вывел уравнение
Сг=/гш(/г//в), G.74)
где /в — интенсивность непрерывного рентгеновского излучения
из образца в области энергии, соответствующей пику h, и kiB—
константа, определяемая с помощью эталона.
В методе Кобе необходимость использования поправочных
факторов Z, A, F и фактора, обусловленного флуоресценцией,
вызываемой непрерывным излучением, сведена к минимуму, по-
поскольку близость значений энергий для /, и 1В приводит к от-
отсутствию необходимости вводить поправку на поглощение А, а
использование отношения IJIb — вводить поправку на атомный
номер Z. Поправка F, обусловленная флуоресценцией под дей-
действием характеристического излучения, пренебрежимо мала в.
большинстве случаев микроанализа биологических образцов, за
исключением тех случаев, когда в матрице с низким Z присут-
присутствуют элемент с высоким значением Z (флуоресценция за счет
непрерывного излучения). Константа kiB определяется с по-
помощью эталонов с известной концентрацией.
Член /в (интенсивность непрерывного или белого излучения)
является мерой взаимодействия электронов с образцом и про-
пропорционален плотности и толщине образца (массовой толщине).
Интенсивность непрерывного излучения может быть представле-
представлена также следующим уравнением, полученным из соотношения
Крамерса:
ед, G.75)
где /V,- — количество атомов элемента ? в анализируемом микро-
микрообъеме и Zj — атомный номер. Для точного использования этого
выражения необходимо знать все элементы, присутствующие в
биологическом материале. В контексте метода Кобе член /,-//д
в первом приближении эквивалентен интенсивности пика минус
фон (/,- — 1В), деленной на интенсивность фона 1В (т. е. (/,-—
—/в)//в), при энергии, соответствующей энергии выбранной
характеристической линии элемента ?.

74 Глава 7
Член kiB, который для чистого эталона можно вычислить, по-
получается из уравнения
G.76)
где C(j) — известная локальная массовая доля в эталоне (для
эталона из чистого элемента она должна равняться 1,0). Про-
Проведя коррекцию по Z и А на эталоне из чистого элемента, мож-
можно рассчитать kiB (для чистого элемента поправку F можно не
учитывать, поскольку эффекты флуоресценции, за исключением
небольшого вклада от непрерывного излучения, пренебрежимо
малы).
7.7.3.3. Метод отношения пик/фон
Новый подход к количественному анализу частиц, развитый
в [165, 166], который обсуждался в разд. 7.5.2.5, можно приме-
применить также и к анализу массивных материалов. В основе ме-
метода лежит использование отношения интенсивностей характе-
характеристического и непрерывного излучений при одной и той же
энергии. Отношение пик/фон Р/В определяется как (/;—/в)//«.
Хотя метод разработан главным образом для анализа малых
A,0—10 мкм) частиц, нанесенных на тонкие пленки-подложки,
в [159] было показано, что метод эффективен при определении
элементного состава массивных образцов. Методы, изложенные
в работах [165, 166], схожи во многих отношениях и в основе
их лежит предположение, что характеристическое и непрерыв-
непрерывное рентгеновское излучения, генерируемые в одной и той же
области образца, имеют одинаковые поправки на поглощение и
атомный номер и что в первом приближении отношения пик/фон
для частиц эквивалентны отношениям пик/фон для массивного
образца такого же состава. Различие этих методов состоит в
том, что в методе из [165] результаты выражаются в виде отно-
отношения концентраций, а в методе из [166]—в виде концентра1
ции элементов. Подробное описание этих методов приведено в
соответствующих статьях, но основные черты процедуры заклю-
заключаются в следующем.
Наиболее критичным шагом в процедуре является точное
измерение отношения Р/В из рентгеновского спектра. Это не яв-
является проблемой при хорошем разделении пиков, и фон мож-
можно измерить непосредственно с низкоэнергетической стороны
каждого пика. Трудности возникают при наложении пиков.
В таком случае следует применять методы, описанные в гл. 8.
Как только получены точные значения Р/В, их можно исполь-
использовать для количественного анализа различными способами.
Значение Р/В для одного элемента можно сравнить со зна-

Количественный рентгеновский микроанализ 75
чением Р/В для другого элемента в одном и том же образце и
в первом приближении:
Ci/Cj^ktjKP/fyt/iP/B),], G.77)
где Cj и Cj — концентрации элементов i и / в процентах и ka —
фактор поправки, который можно либо рассчитать для двух рас-
рассматриваемых элементов, либо получить из измерений на этало-
эталонах известного состава. Или же значение Р/В для элемента в
образце можно сравнивать со значением Р/В того же элемента
в эталоне при условии, что по составу матрицы образца и эта-
эталона не слишком различаются. Такую процедуру можно исполь-
использовать при анализе замороженного в гидратированном состоя-
состоянии массивного материала, когда образцы обычно содержат
75% воды, а эталон представляет собой замороженный раствор
соли известной концентрации, содержащий 25% углеродистого
материала, такого, как полимерный криопротектант. В работе
[ 166j: предложен другой метод, который можно использовать,
если средний атомный номер частиц всегда одинаков — обычн-ая
ситуация с большинством биологических материалов. Согласно
соотношению Крамерса (гл. 3), интенсивность излучения фона
пропорциональна атомному номеру. Если средний атомный но-
номер материала всегда одинаков, то
Ct = kt(P/B)t, G.78)
где ki — величина постоянная для каждого элемента. Если есть
возможность проанализировать все элементы и рассчитать по
стехиометрии концентрации таких элементов, как С, Н, О и N,
то относительные концентрации можно легко превратить в аб-
абсолютные.
Достоинство метода отношения Р/В в применении к биоло-
биологическим материалам заключается в том, что различные по-
поправки, используемые в методе трех поправок, играют значи-
значительно менее важную роль. Поскольку предполагается, что про-
процентная доза характеристического рентгеновского излучения,
поглощенного в образце, такая же, как и для излучения фона,
фактор поглощения (А) отпадает. В биологическом материале
эффект атомного номера (Z) мал, и в любом случае им прене-
пренебрегают, так как он по предположению оказывает одинаковое
влияние на пик и непрерывное излучение. Поскольку у биоло-
биологического материала низкий атомный номер, эффект вторичной
флуоресценции (F) мал и его можно рассматривать как поправ-
поправку второго порядка. Как в [165], так и в [166] показано, что
результаты измерения Р/В нечувствительны к эффективности
детектора, флуктуациям тока пучка и неточностям коррекции
«живого» времени. Кроме того, результаты измерения Р/В ме-
менее чувствительны к изменениям геометрии поверхности, часто

76 Глава 7
наблюдаемой у массивных образцов, особенно в аналитической
системе с большим углом выхода. Оценка показала, что на
сравнительно плоских образцах, например гладких поверхно-
поверхностях излома, можно получить точность ±10%.
7.7.3.4. Заключение
Несмотря на встречающиеся трудности, некоторые исследо-
исследователи пытались провести количественный анализ массивных
биологических материалов с использованием одной или более из
трех процедур коррекции, которые были изложены. Однако не-
неизбежная шероховатость поверхности образца, повышенная глу-
глубина проникновения пучка, низкое пространственное разрешение
E—10 мкм) и относительно низкая точность метода A0—20%)
в сочетании с сомнительной справедливостью техники введения
поправок для легких элементов в органической матрице приво-
приводят к тому, что обычный анализ массивных биологических мате-
материалов используется значительно реже других количественных
методов, описываемых ниже. Единственным исключением мо-
может служить применение процедур при анализе замороженных
в гидратированном состоянии тканей с использованием в каче-
качестве эталонов замороженных растворов солей.
7.7.4. Толстые срезы на массивных подложках
Анализ срезов на толстых подложках требует особого вни-
внимания, если необходимо сравнивать интенсивности рентгенов-
рентгеновского излучения от среза плюс подложка с интенсивностью рент-
рентгеновского излучения от массивного эталона. Имеются две ме-
методики коррекции—BICEP и BASIC [188, 189], которые можно
использовать для количественного, анализа срезов на массив-
массивных подложках. В основе метода BICEP лежит топкопленочная
модель [130], и он разработан для расчета отношений кон-
концентраций присутствующих элементов, в то время как метод
BASIC можно использовать для получения локальных массовых
долей элементов. Эти методы, однако, имеют ограниченное при-
применение в анализе биологических объектов из-за трудности при-
приготовления образцов равной толщины и того факта, что в раз-
различных частях образца имеются значительные вариации плот-
плотности биологического материала. Другие недостатки заключа-
заключаются в том, что органическая матрица предполагается целиком
состоящей из углерода (это не имеет места в замороженных в
гидратированном состоянии срезах) и что требуется проводить
измерения всех элементов, присутствующих в концентрациях
более 1—2%. Оба метода сложны в использовании, для реал i-

Количественный рентгеновский микроанализ 77
зации требуются большие вычислительные машины; наметилась
тенденция к постепенному вытеснению их методами, использу-
использующими срезанный материал на тонких подложках.
7.7.5. Тонкие образцы
Использование тонких срезов значительно упрощает коли-
количественный анализ биологических материалов. Электроны теря-
теряют лишь малую часть своей энергии при прохождении через об-
образец, и отражение электронов от образца настолько мало, что
им можно пренебречь. Вторичная флуоресценция рентгеновско-
рентгеновского излучения пренебрежимо мала, и поглощение рентгеновского
излучения мало, за исключением очень Легких элементов, таких,
как натрий.
Единственный эффект генерации рентгеновского излучения,
который необходимо рассмотреть,— это вероятность ионизации
атома данного элемента, описываемая сечением ионизации:
Qa(l/?0?Kp)log(?0/?Kp), G.79)
где ?кр — критическая энергия возбуждения данной рентгенов-
рентгеновской линии и Ео— энергия первичного пучка. Максимальная
эффективность генерации рентгеновского излучения достигает-
достигается в том случае, когда энергия электронов примерно в 3 раза
выше критической энергии возбуждения данной рентгеновской
линии. Поскольку критические энергии возбуждения рентгенов-
рентгеновских линий большинства элементов в тонких срезах биологиче-
биологического материала лежат между 1 и 10 кэВ, энергии электронов,
применяемых в растровых C0—50 кэВ) и просвечивающих
G5—200 кэВ) электронных микроскопах, значительно выше
3 Ькр.
Удобно разделить количественные методики для анализа тон-
тонких биологических образцов на две части. В первой части мы
рассмотрим методы, которые дают отношение концентраций
элементов в образце, во второй будут рассмотрены методы, по-
позволяющие измерять концентрации элементов.
7.7.5.1. Метод получения отношения элементов
В ряде биологических исследований бывает обычно доста-
достаточно измерять относительные массовые доли элементов в об-
образце, а не их абсолютные концентрации. В тонких образцах
отношение рентгеновских интенсивностей двух элементов про-
пропорционально их относительной концентрации, так что
CA/CB^kAB(IA/IB), G.80)
где С А и С в — локальные массовые доли элементов А и Я1 в од-
одном и том же образце, а 1А и /в — одновременно измеренные ин-

78 Глава 7
тенсивности характеристического излучения двух элементов.
Фактор кАв — константа, которая учитывает относительные эф-
эффективности генерации и детектирования рентгеновского излу-
излучения в аналитической системе для двух рассматриваемых эле-
элементов, и ее можно измерить на тонком эталоне, состоящем из
двух элементов в известной пропорции.
Если относительная эффективность обнаружения известна
для всех анализируемых элементов в системе, то можно сравни-
сравнивать относительные массовые доли ряда элементов в образце
по соотношению
СА:СВ:СС = AД/РА): AВ/РВ): (Гс/Рс), G.81)
где РА, Рв, Рс — факторы пропорциональности для каждого
элемента. Следует отметить, что kAB в уравнении G.80) пред-
представляет собой отношение Рв/Ра- Другие эталоны не требуются,
и нет необходимости измерять непрерывное излучение, посколь-
поскольку для достаточно тонких образцов анализируемый объем оди-
одинаков для каждого элемента. Константу Р можно вывести тео-
теоретически [190]. Подробные детали метода получения отноше-
отношений элементов приведены в [169]i и в разд. 7.6.1 данной главы.
Хотя метод позволяет получить относительные концентрации
элементов в гомогенных тонких образцах, он имеет ряд ограни-
ограничений в применении к биологическому материалу. Биологиче-
Биологические образцы редко бывают гомогенными и однородными по
толщине, что создает трудности при сравнении относительных
концентраций элементов в различных частях образца. Точность
метода в анализе биологических образцов обычно от 10 до 20%.
7.7.5.2. Измерение концентрации элементов
В основе простейшего метода количественного анализа тон-
тонких образцов [191, 192] лежит простое уравнение Кастена
G.22). Авторы работ [191, 192] использовали этот простой ме-
метод для измерения концентраций натрия и калия в эритроци-
эритроцитах. Эталоны были приготовлены из растворов желатины с из-
известным содержанием натрия и калия. Эритроциты и желатина
были приготовлены в виде срезов одинаковой толщины, и на них
сравнивались интенсивности рентгеновского излучения. Досто-
Достоинство и точность этого метода значительно зависят от того,
имеются ли селективные потери элементов в образце пли эта-
эталоне.
Преимуществом метода является то, что не требуется много
вычислений и обширных теоретических обоснований. Кроме то-
того, в простейшей своей форме он не требует введения какой-ли-
какой-либо поправки на отражение электронов, поскольку эффект оди-
одинаков как для образца, так и для эталона. Недостатки метода

Количественный рентгеновский микроанализ 79
заключаются в том, что его применение ограничено образцами,
которые можно было бы описать как монофазные системы, на-
например эритроциты, изолированные вакуоли растений и выражен-
выраженные микрокапли, и что формулировка уравнения G.72) являет-
является относительно неточной при сравнении с результатами недав-
недавно разработанных методов. Наибольшая точность достигается
при близком подобии образца и эталона. Большинство биоло-
биологических образцов, по-видимому, нельзя отнести к гомогенным,
и они содержат много элементов. Более того, трудно подобрать
эталоны, которые имели бы матрицу, идентичную матрице био-
биологического материала.
Полезное развитие указанного метода заключается в том, что
образец с эталоном помещаются в капсулу подходящей органи-
органической матрицы из желатины, альбумина, декстрана, поливинил-
пиролидона (ПВП) и т. д. и срезы готовятся одновременно
[ 193]'. Масса элемента, приходящаяся на единичный объем
(Сг), рассчитывается умножением отношения интенсивностей
элементов в образце (/j) и эталоне (/(*>) на известную весовую
концентрацию элемента в растворе эталона (Q,-)).
С, = [Л//@] С(|). G.82)
В работе [194] было показано, что интенсивность рентгенов-
рентгеновских сигналов от высушенных в замороженном состоянии сре-
срезов мягкого биологического материала прямо пропорциональна
толщине среза вплоть до толщин от 1 до 2 мкм. В более ран-
ранних исследованиях Ингрэм показал, что точность метода зави-
зависит от того, насколько близка толщина образца и эталона. Это
условие может быть трудно выполнимым в замороженных сре-
срезах, которые в процессе их приготовления могут коробиться,
ломаться или даже плавиться, и маловероятно, что усадка про-
произойдет равномерно в процессе лиофильной сушки.
7.7.6. Метод с использованием непрерывного излучения
Это, несомненно, один из наиболее полезных для биологов
методов [195—197, 181]. Метод с использованием непрерывного
излучения основан на обобщении соотношения Крамерса, кото-
которое гласит, что между* интенсивностью непрерывного излучения
и массовой толщиной имеется пропорциональность [уравнение
G.75)}. Это соотношение, которое, по-видимому, выполняется к
для легких элементов, очень важно, так как означает, что из-
измерение интенсивности непрерывного спектра обеспечит конт-
контроль изменений плотности и толщины от места к месту в образ-
образце. Большинство методов, разработанных первоначально для
анализа тонких металлических фольг, нельзя удовлетворитель-
удовлетворительно использовать в анализе биологических материалов, так как*

80 Глава 7
количество основных составляющих, т. е. С, Н, О, N, P, S, ве-
велико и характеристическое рентгеновское излучение элементов,
за исключением S и Р, имеет энергию, слишком низкую для точ-
точного измерения. Для выполнения метода с использованием не-
непрерывного излучения тонкие срезы залитого смолой высушен-
высушенного в замороженном состоянии или замороженного в гидрати-
рованном состоянии биологического материала помещаются на
тонкие A00—200 нм) пленки-подложки, непрерывное излучение
которых имеет очень низкую интенсивность. Для элементов
вплоть до Z = 20 точность метода составляет 5—10% от измеря-
измеряемой концентрации.
Удобно рассмотреть три различных аспекта метода с исполь-
использованием непрерывного излучения: 1) измерение относительных
концентраций элемента; 2) измерение массовой доли элемента;
3) применение этих методов к исследованию замороженных в
гидратированном состоянии образцов.
7.7.6.1. Относительные концентрации элементов
Комбинируя соотношение Крамерса с уравнением Кастена,
которое гласит, что интенсивность характеристического излуче-
излучения пропорциональна концентрации интересуемого элемента в
образце, можно получить уравнение, позволяющее рассчитать
относительные массовые доли элементов:
/,//вОССг/р*, G.83)
где /, — интенсивность характеристического излучения от эле-
элемента i в анализируемом микрообъеме образца, 1В — интенсив-
интенсивность непрерывного излучения от образца в выбранной области
спектра, С, — локальная массовая доля элемента ? в анализи-
анализируемом микрообъеме и pt— массовая толщина (р — плотность
и t—толщина среза). При этом предполагается, что коэффици-
коэффициент пропорциональности между 1В и pt будет одним и тем же,
если средние атомные номера образца и эталона близки. Для
срезов биологических материалов, состоящих из легких элемен-
элементов, соотношение Крамерса оказывается линейным вплоть до
толщины 4 мкм. В работах [196, 183, 198] было показано, что
для более тяжелых элементов с Z выше 20, вводимых в образец
при гистохимической обработке или при окрашивании, зави-
зависимость не является больше линейной и что количество импуль-
импульсов непрерывного излучения изменяется также с изменением
среднего значения Z2/A, где Z — атомный номер, А — атомный
вес.
Если, однако, аналитический метод используется для изме-
измерения отношений интенсивностей рентгеновского излучения в

Количественный рентгеновский микроанализ 81
одной и той же анализируемой области, влияние массовой тол-
толщины не проявляется. В этом случае уравнение G.80) можно
использовать непосредственно.
7.7.6.2. Массовые доли элементов
Для измерения массовой доли элемента в микрообъеме необ-
необходимо измерить полную массу образца в единице объема. Ин-
Интенсивность непрерывного излучения (обычно измеряемая спект-
спектрометром с дисперсией по энергии) можно использовать для из-
измерения общей массы образца в единице объема и массовую
долю элемента можно определить по следующей формуле:
С; = [(/,//в)/(/(„//(В))| C(f) (G,/G(i)), G.84)
где Cj и C(i} — массовые доли элемента i в анализируемом мик-
микрообъеме тонкого образца и эталона соответственно, /* — изме-
измеренная интенсивность характеристического рентгеновского из-
излучения, /в — измеренная интенсивность непрерывного излуче-
излучения, и отношение G-факторов является поправкой, учитыва-
учитывающей тот факт, что в эталоне и образце не обязательно может
генерироваться одинаковая интенсивность непрерывного излу-
излучения на единицу массы в единичном объеме. Интенсивность не-
непрерывного излучения (/в) следует измерять в полосе энергий
вдали от характеристических линий интересующих элементов;
вопрос же о выборе оптимального диапазона энергий для окна
при изменении непрерывного излучения пока еще дискутирует-
дискутируется. Например, в работе [199] интенсивность непрерывного из-
излучения измерялась в диапазоне 1,34—1,64 кэВ в просвечива-
просвечивающем микроскопе с ускоряющим напряжением 80 кВ. В мик-
микроанализаторе с напряжением 50 кэВ [181]! был выбран
диапазон энергий между 10 и 16 кэВ, а авторы i[200] в растро-
растровом электронном микроскопе с напряжением 30 кэВ измеряли
непрерывное излучение в диапазоне энергий 4,6—6 кэВ. По-ви-
По-видимому, выбор энергетического диапазона зависит в большей
степени от интенсивности и энергетического распределения
внешнего фона.
В величины /, и 1В следует ввести поправку, обусловленную
вкладом постороннего внешнего фона. Вклады в него от под-
поддерживающей пленки, держателя образца и от самого прибора
можно измерить (детально это см. в приложении А к этой гла-
главе).
Фактор G (иногда обозначаемый как Z2jA) как для образ-
образца, так и для эталона можно рассчитать по формуле
О=2(ед7Д-), G-85)

82 Глава 7
где Zt и Ai — атомный номер и атомный вес элемента i соответ-
соответственно, d — его массовая доля. Суммирование ведется по всем
элементам, входящим в состав образца, и в случае эталонов,
где все элементы известны, уравнение G.85) можно записать
в более удобной форме:
iAi), G.86)
где iV,- — количество атомов элемента i в химической формуле.
Значительно труднее рассчитать G для образца, и здесь реко-
рекомендуется делать оценки состава анализируемого микрообъема,
исключая элементы, которые должны анализироваться [181].
Для биологических тканей, которые состоят главным образом из
С, Н, О и N, такая процедура не слишком трудна. Для G полу-
получены следующие типичные значения [181]: 3,28 для протеина,
3,0 для липидов, 3,4 для карбогидрата, 3,41 для нуклеиновой
кислоты (меньше Р излучения, которое регистрируется отдель-
отдельно) и 3,67 для воды. Ввиду близости этих значений на практике
обычно можно либо использовать среднее значение G, либо, ес-
если известно, что биологический материал содержит более одно-
одного компонента, взвешенное значение соответственно. Когда в
биологическом материале содержится непропорционально боль-
большое количество элемента, предлагается [181] (как наиболее
точная процедура) проводить расчет значения G из органиче-
органического анализа образца, но в отсутствие исследуемого элемента,
а затем вводить поправки на основе измеренной интенсивности
характеристического излучения этого элемента. Если эталоны
находятся в такой же матрице, что и образцы, фактор Gi/Gt!)
близок к единице и его можно исключить из уравнения.
Уравнение G.84) имеет обычно размерность мМ/кг при усло-
условии, что концентрации в эталонах выражены в тех же единицах.
Иногда, однако, полезнее выражать массовую концентрацию в
¦единицах мМ/л, в таких случаях массовые доли должны отно-
относиться к полностью гидратированпому состоянию.
7.7.6.3. Массовые доли элементов в замороженных
в гидратированном состоянии срезах
Вследствие повышенного интереса к анализу замороженных
в гидратированном состоянии срезов кажется уместным рас
смотреть методы анализа образцов такого типа. Был разрабо-
разработан специальный метод, детали которого приведены в приложе-
приложении к работе [201].
Для любых измерений на образце или на эталоне подсчиты-
вается количество импульсов непрерывного излучения, генери-
генерируемого в образце (/s) или эталоне (/(в>)> и в полученное значе-

Количественный рентгеновский микроанализ 83
ние вводятся поправки на вклады от пленки-подложки, держа-
держателя образца и прибора. В этом методе образец окружен с пе-
периферии эталоном и предполагается, что в любом срезе они оба
имеют как одинаковую толщину, так и/или примерно подобный
состав матрицы.
Члены /в и /(в) пропорциональны массе анализируемого объ-
объема, в то время как член /,, который представляет собой ско-
скорость счета характеристической линии интересуемого элемен-
элемента, пропорционален массе элемента в том же анализируемом
объеме. Сравнением измерений в областях объекта и эталонов
можно исключить неизвестные коэффициенты пропорциональ-
пропорциональности и получить массовую долю элемента С, в мМ/кг из урав-
уравнения
C, = [(/,//a)/(VWIC<i>. G-87)
Если образец и его периферийный эталон полностью гидра-
тированы и используется значение концентрации элемента в
эталоне в мМ/кг во влажном состоянии, то концентрация в об-
образце также будет выражена в мМ/кг для влажного состояния.
Однако это соотношение становится менее точным при обезво-
обезвоживании образца, поскольку доли остающейся массы в образ-
образце и эталонах, по-видимому, могут сильно различаться.
Концентрации, измеренные в микроанализаторе в единицах
мМ/кг для влажного состояния, можно пересчитать в мМ/кг
Н2О. Такой переход можно произвести путем измерения изме-
изменений отношения скоростей счета характеристического и непре-
непрерывного излучения для данного элемента в различных частях
образца по мере его дегидратации. Эти измерения сравнивают-
сравниваются с изменением отношения скорости счета характеристическо-
характеристического излучения и непрерывного в периферийном эталоне, содер-
содержащем известное количество воды, также по мере его дегидра-
дегидратации [201]. Значения, полученные для калия и хлора с
использованием микроанализа (выраженные в мМ/кг для влаж-
влажного состояния), близки к значениям, полученным для тех же
элементов в таких же ячейках с помощью ионно-селективных
микроэлектродов (выраженным в мМ/л).
В работе [202] разработаны подобные методы, посредством
которых концентрации для влажного состояния могут быть по-
получены на подвергнутых лиофильной сушке образцах. Однако
обе эти процедуры справедливы только для тех случаев, если
в процессе нарезки или лиофильной сушки нет поперечно-
поперечного перемещения элементов, если срезы до сушки одинаковы по
толщине и если сушка происходит одинаково для образца и
эталона. Только при выполнении этих условий концентрации
для влажного состояния будут прямо пропорциональны числу
импульсов характеристической линии. Хотя такие предположе-

84 Глава 7
ния и могут быть справедливы для тканей и клеток с большим
содержанием органической матрицы, нет причины полагать, что
любое из этих предположений должно быть справедливым для
клеток и тканей, внеклеточное пространство которых содержит
изменяющиеся количества воды и органической матрицы, а
внутриклеточное пространство содержит мало либо вообще не
содержит органической матрицы.
Дальнейшие исследования [201] установили связь между
массовыми долями в сухом состоянии и во влажном. Массовая
доля в сухом состоянии (Сг)сух выражается в виде
вл/('в)суХ]-5}], G-88)
где (/в) сух и Aв)вл — интенсивность непрерывного излучения в
сухом и влажном состоянии соответственно. Фактор 5 — фак-
фактор усадки, который можно рассчитать как
*. G-89)
где (/г)вл и (/,•)сух — интенсивности характеристического рентге-
рентгеновского излучения любого элемента до и после сушки. Фактор
усадки включается в уравнение, поскольку в процессе сушки мо-
могут происходить значительные (до 40%) изменения размеров
тканей. Такая сушка будет приводить к увеличению массы на
единицу площади и, следовательно, к увеличению сигнала не-
непрерывного излучения.
Фактор У вносит поправку па любые различия в значениях
G(Z2/A) между влажным и высушенным состояниями, и его
можно рассчитать делением значения G для сухой органической
матрицы (обычно 3,2) на значение G для воды C,67). Были
проделаны различные измерения до и после обезвоживания на
соседних участках объекта, так как было обнаружено, что при
повторном анализе уже облученных областей пучок может при-
приводить к сильному их повреждению. Массовая доля во влажном
СОСТОЯНИИ (Сг)вл ПОЛучаеТСЯ ИЗ СООТНОШеНИЯ (С;)вл=1 — (Ci)cyx-
Схема расчета по методу с использованием непрерывного излу-
излучения приводится в приложении А. Различные рабочие примеры
даются в приложении В.
7.7.7. Толстые образцы на очень тонких подложках
Для тонких образцов на очень тонкой подложке, при воз-
возможном исключении для некоторых легких элементов, поглоще-
поглощение рентгеновского излучения в образце обычно пренебрежимо
мало, поскольку средний атомный номер и сечение поглощения
рентгеновского излучения для мягких тканей низки. Было об-
обнаружено [178, 183], что низкоэнергетическое непрерывное из-
излучение поглощается в срезах подвергнутого лиофильнои сушке

Количественный рентгеновский микроанализ 85
материала толщиной более 1,0 мкм и для учета этого в количе-
количественном расчете были введены небольшие поправки. Эти дан-
данные и тот факт, что толщина высушенных мофильной сушкой
срезов составляет примерно '/з толщины их замороженного в
гидратированном состоянии аналога, накладывает верхний пре-
предел на толщины, когда можно пренебречь поглощением: около
4 мкм для замороженных в гидратированном состоянии срезов
и около 1,5 мкм для высушенных лиофильной сушкой и за-
залитых смолой материалов. Было найдено [201], что для кор-
коррекции поглощения в полностью гидратированном срезе тол-
толщиной 1 мкм всю регистрируемую интенсивность излуче-
излучения натрия необходимо умножить на фактор 1,3. Там же
был разработан простой способ расчета поправок на погло-
поглощение, а также метод оценки массы на единицу площади при
использовании тонкой пленки известного состава и толщи-
толщины. Используемый эталон представлял собой пленку поликар-
поликарбонатной пластмассы, поставляемой фирмой «Сименс», толщи-
толщиной 2 мкм, покрытую слоем алюминия известной толщины.
Были выполнены раздельные измерения на образце и эта-
эталоне при постоянных токах пучка и временах счета. Массу на
единицу площади Mt в образце можно измерить, используя сле-
следующее уравнение:
Ml = {IB/I(B))(M)(G(t)/Gi), G.90)
где /в и /(В) — исправленные интенсивности непрерывного излу-
излучения от образца и эталона, (М)—масса на единицу площа-
площади в эталоне, a G<i> и G, определены в уравнении G.82) как по-
поправочные факторы, учитывающие различия в генерации непре-
непрерывного излучения в образце и эталоне. Другая процедура для
расчета массовой толщины приводится в [189]. В [203, 204]
предлагается отчасти более простой способ, основанный на из-
измерении интенсивности характеристического пика и степени
ослабления первичного пучка после прохождения сквозь обра-
образец. В этом методе интенсивность /„ электронного пучка, про-
проходящего через объект с массовой толщиной р^, связана с на-
начальной интенсивностью /0 следующим выражением:
/„ = /оехр(—So6li;frf), G.91)
где 5Общ — общее сечение рассеяния электронов, которое посто-
постоянно в ограниченном диапазоне массовых толщин. Если только
можно независимым способом измерить 5Общ, измерения интен-
сивностей падающего и прошедшего электронных пучков позво-
позволяют рассчитать массовую толщину из соотношения
frf=:ln(/0//n)/So64. G.92)
Эти интенсивности могут быть легко измерены с помощью
экспонометра/фотометра, имеющегося в большинстве просвечч-

S6 Глава 7
вающих микроскопов и/или детекторов прошедших электронов,
установленных в растровых электронных микроскопах. В не-
недавно опубликованной работе [205] описывается, каким обра-
образом можно количественно измерить массовую толщину. Этот
метод измерения толщины срезов дополняет метод с использо-
использованием непрерывного рентгеновского излучения, в то время как
последний полезен для анализа срезов толщиной вплоть до
3 мкм (в зависимости от ускоряющего напряжения пучка) и не
дает хороших результатов при анализе очень тонких срезов,
тогда как метод ослабления пучка хорошо работает при ультра-
ультратонких срезах.
Выход рентгеновского излучения для биологических матери-
материалов прямо пропорционален толщине вплоть до толщины около
4 мкм [197]. Для больших толщин линейность эмиссии наруша-
нарушается и может возникнуть необходимость введения коррекций
либо методом трех поправок, описанным ранее, либо методом,
предложенным в [189]. Использование толстых B—10 мкм)
срезов на очень тонких подложках уже не является распростра-
распространенным способом микроанализа из-за ограниченного простран-
пространственного разрешения и проблем, связанных с количественны-
количественными расчетами.
7.7.8. Микрокапли
Рентгеновский микроанализ применялся для исследования
очень малых объемов жидкости, полученной микропункцией из
тканей и помещенной либо на отполированную поверхность бе-
бериллия, либо на тонкую пленку-подложку и затем высушенную
в замороженном состоянии. В недавно опубликованных работах
[206, 207] приводятся детали метода и процедура количествен-
количественного расчета, связанная с ним. Обычно при количественных рас-
расчетах не возникает проблем, поскольку физические и химиче-
химические свойства высушенных мофильной сушкой жидких образ-
образцов и эталона достаточно близки, поэтому необходимость вве-
введения поправок отпадает. Калибровочные кривые эталонов
обычно представляют собой графики зависимости скорости сче-
счета интенсивности характеристической рентгеновской линии от
концентрации и в исследуемом диапазоне концентраций явля-
являются неизменяющимися прямыми линиями. Все, что должен
сделать исследователь,— это сравнить скорости счета характе-
характеристического рентгеновского излучения от образца и эталона и
по калибровочным кривым определить концентрацию. Присут-
Присутствие малых количеств органического материала, такого, как
протеин, может сказаться на результатах количественного ана-
анализа. Протеин может влиять на точность воспроизведения мик-
микрокапель, на процесс формирования кристаллов льда при при-

Количественный рентгеновский микроанализ 87
готовлении образцов и после сушки может поглощать значи-
значительную часть сигнала натрия. При анализе жидкостей, содер-
содержащих органический материал, эти составляющие удаляются
наилучшим образом путем ультрафильтрации до анализа [206].
7.7.9. Эталоны
Успех любой количественной обработки зависит от того, на-
насколько удачно подобраны эталоны, интенсивность счета харак-
характеристического рентгеновского излучения которых можно срав-
сравнивать с интенсивностью счета от образца. Хотя количествен-
количественный анализ можно проводить с помощью эталонов, состав
которых неточно повторяет состав образца, в биологических при-
применениях обычно желательно использовать эталоны, природа
которых подобна природе образца. По мере возможности этало-
эталоны должны иметь сходную с образцом текстуру поверхности,
одинаковые толщину и внутреннюю гомогенность. Кроме того,
следует направить усилия на то, чтобы иметь эталон приблизи-
приблизительно с такой же органической матрицей и, следовательно, с
такими же весовыми долями в сухом состоянии, что и образец.
В настоящее время наметился отказ от использования массив-
массивных неорганических эталонов из-за всех присущих им проблем
коррекции на поглощение, флуоресценцию и атомный номер, и
биологи стремятся использовать эталоны в виде тонких пленок.
Имеются четыре основных типа эталонов: а) неорганический ма-
материал внутри естественной органической матрицы, т. е. желати1
ны, альбумина и т. д.; б) электролиты, заключенные в искусст-
искусственную органическую матрицу, т. е. макроциклические поли-
полиэфиры, эпоксидная смола и т. д.; в) электролиты, помещенные
в высушенную мофильной сушкой или замороженную в
гидратированном состоянии искусственную органическую мат-
матрицу, т. е. декстрап, гидроэтил или поливинилпиролидон, кото-
которые образуют периферийный эталон вокруг образца, и г) быст-
быстро замороженные водные растворы неорганических ионов. Все
четыре типа эталонов можно приготовить тем или иным спосо-
способом в виде тонких срезов. Отличный обзор методов приготовле-
приготовления эталонов приводится в [208 а—в]. Дополнительный обзор
эталонов, используемых в микроанализе биологических образ-
образцов, приводится в табл. 7.13 [208а].
7.7.10. Заключение
Было проведено обсуждение некоторых методов, которые мо-
могут использоваться для количественного рентгеновского микро-
микроанализа биологических материалов. Успешное применение и от-
относительная точность этих методов зависят в значительной сте-

Таблица 7.13. Эталоны для микроанализа в биологии1'
Тип
Образец
Материалы Способ приготовления
1. Неорганиче- Толстый/
ский тонкий
2. Органическая Тонкий
матрица и
смесь солей
3. Таблетки Массивный
4. Комплексы
соли макроцик-
лического по-
полиэфира в эпо-
эпоксидной смоле
5. Гомогенные Толстый
ткани
6. Растворы со- Массивный
лей
7. Подложки, про- Массивный
питанные
солями
8. Монокристал- Толстый/
лы тонкий
9. Микрокапли Массивный
10. Тонкие
пленки
Тонкий
11. Тонкие метал- »
лические слои
12. С1-эпоксидиая »
смола
Чистые металлы,
стекла, минера-
минералы известного
состава, соли
Альбумин или же-
желатина, агар —
агар или смеси,
соли
Органические со-
соли, органоме-
таллы
Полиэфиры, соли
ангидридов, эпо-
эпоксидная смола
Ткани (почки и
др.), соли
Водные растворы
электролитов
Фильтровальная
бумага/мембра-
бумага/мембрана, соли
Органические i
оргаиометалли-
ческие соли
Капли объемом в
пико- и нанолит-
ры, соли
Раствор щелочных
галоидов в эта-
этаноле и коллоиде
Металлы на глад-
гладких подложках
Смола, содержа-
содержащая С1
Различные
Быстрое заморажива-
замораживание, лиофильная
сушка, смеси обра-
обрабатываются как
тонкие срезы
Прессование в таб-
таблетки или в стан-
стандартные держатели
Растворенные комп-
комплексы солей макро-
циклического поли-
полиэфира в эпоксидной
смоле, заполимери-
зованные
Обработка гомогена-
тов и солей как
тканей
Быстрое заморажива-
замораживание для получения
капель
Капля раствора соли
помещается на
фильтрованную бу-
бумагу, быстро замо-
замораживается и под-
подвергается лиофиль-
ной сушке
Измерение мельчай-
мельчайших кристаллов в
оптическом микро-
микроскопе, покрытие уг-
углеродом
Нанесение капель на
держатели, различ-
различные способы обес-
обеспечения постоянст-
постоянства толщины пятна
Поместить капли на
покрытое углеродом
покровное стекло и
испарять этанол
Вакуумное напыление
металла на под-
подложку
Как обычно, для тон-
тонких образцов
') Данные из [208].

Количественный рентгеновский микроанализ 89
пени от способа приготовления образцов, а также от того, будет
ли получено хорошее отношение пик/фон для характеристиче-
характеристических рентгеновских линий. За способ приготовления образца
отвечает непосредственно экспериментатор, и хотя хорошие от-
отношения пик/фон легко получают с помощью спектрометра с
дисперсией по длинам волн, это требование реализовать не так
легко при использовании спектрометра с дисперсией по энергии,
особенно для легких элементов. В других главах этой книги
рассматриваются различные вычислительные методы, которые
могут использоваться для решения проблем спектрального на-
наложения и коррекции фона, встретившихся при использовании
спектрометров с дисперсией по энергии. Следует напомнить,
что такие программы обеспечивают точность результатов не вы-
выше той, которую можно получить трудоемкими расчетами; они
лишь ускоряют получение результатов. Такое увеличение скоро-
скорости обработки данных означает, что можно получить больше
данных, которые в свою очередь можно подвергнуть строгому
статистическому анализу и, таким образом, повысить вероят-
вероятность того, что отдельные серии количественных данных пра-
правильно отражают элементные концентрации в биологическом
материале, на котором были выполнены измерения.
ПРИЛОЖЕНИЕ А. МЕТОД С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
НЕПРЕРЫВНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ
Схема расчета, основанного на методе с использованием не-
непрерывного излучения (разд. 7.7.6), предназначена для расчета
относительных и абсолютных массовых долей для элементов в
тонких срезах биологического материала. Предлагаемый расчет
можно выполнить с использованием небольшого настольного
калькулятора. Система обозначений, используемых в схеме рас-
расчета, приводится после этого приложения. В основе процедуры
лежат следующие предположения, касающиеся приготовления
образца, прибора и метода анализа:
а. Срезы, которые могут представлять собой замороженный
в гидратированном состоянии, высушенный в замороженном со-
состоянии или залитый смолой материал, имеют максимальную
толщину 1,0 мкм. Для фиксации или окрашивания не следует
использовать тяжелые металлы.
б. Ток пучка, размер растра или пятна и время счета оста-
остаются постоянными в течение серии экспериментов.
в. Прибор имеет исключительно низкую скорость загрязне-
загрязнения.
г. Предварительно выбранная область непрерывного или бело-
белого излучения измеряется с помощью рентгеновского детектора с
дисперсией по энергии, а характеристические пики измеряются

90 Глава 7
с помощью детектора с дисперсией по длинам волн или по энер-
энергии.
д. Значения интенсивности (пика за вычетом фона) измеря-
измеряются точно с помощью соответствующих методов измерения пи-
пика за вычетом фона, техники спектрального анализа и процедур
коррекции фона (гл. 8).
А.1. Измерение и коррекция изменяющегося побочного
излучения фона от прибора
Если держатели подложки и образца изготовлены из легких
элементов, т. е. Al, Be и С, то они будут давать лишь малый
вклад в фоновое излучение. Однако детали, окружающие обра-
образец, т. е. столик образца, камера образцов, полюсные наконеч-
наконечники и т. д., могут дать значительный вклад в фон, особенно
если рентгеновский источник плохо коллимирован. Важной осо-
особенностью метода с использованием непрерывного излучения яв-
является то, что измерение массы образца производится по ин-
интенсивности счета непрерывного излучения, взятого в выбранной
области спектра, не содержащей пиков элементов. Побочное ха-
характеристическое излучение может дать вклад в эту выбран-
выбранную область спектра; следовательно, необходимо рассчитать
величину этого вклада и ввести необходимые поправки.
Фон от прибора. Для получения фона от прибора пучок на-
направляется на диск из спектроскопически чистого углерода тол-
толщиной приблизительно 2 мм, и с помощью спектрометра с дис-
дисперсией по энергии регистрируется полный спектр. Диаметр ди-
диска должен на несколько миллиметров превышать размер пло-
площадки, которую предполагается исследовать и анализировать в
микроскопе. Значения ускоряющего напряжения и тока пучка
должны выбираться такими, какие обычно используются в экс-
эксперименте, т. е. 10—20 кВ и 0,1—5 нА, а живое время должно
составлять 100—200 с. При тщательном исследовании в спектре
будут обнаруживаться характеристические пики элементов, да-
дающих вклад в фоновое излучение. Наиболее часто присутству-
присутствующими элементами являются медь и железо — основные состав-
составляющие материалов, использующихся при изготовлении прибо-
прибора. В большинстве современных приборов, пучок в которых
хорошо коллимирован, эти пики будут отсутствовать или интен-
интенсивность их будет очень низкой, но если имеются рентгеновские
линии, необходимо предпринять попытки для удаления этих
сигналов из регистрируемого спектра. Детали того, как это
можно сделать, приведены в гл. 5.
Если образец должен исследоваться в режиме на просвет,
рекомендуется выполнить точно такие же измерения и введение
поправок с углеродным диском, имеющим отверстие того же дн-

Количественный рентгеновский микроанализ 91
аметра, что и подложка образца. Это дает вклад излучения фо-
фона от частей столика, лежащих ниже образца и выше детектора
прошедших электронов.
Однако, несмотря на тщательные попытки убрать постоян-
постоянное рентгеновское излучение, идущее от прибора, часть посто-
постороннего фонового излучения все же может существовать. Мож-
Можно рассчитать степень вклада этого излучения в сигнал непре-
непрерывного излучения по следующей формуле:
+---). (АЛ)
которое просто гласит, что для данного анализируемого элемен-
элемента входящий в детектор полный сигнал рентгеновского излуче-
излучения /полн эквивалентен сумме сигнала характеристического
излучения от рассматриваемого элемента U, непрерывного излу-
излучения от подложки и образца Ib(S) и вклада в непрерывное из-
излучение, обусловленного электронами, взаимодействующими с
деталями прибора, содержащими элементы 1, 2, 3, и т. д.
Предположим, что в излучении фона от прибора содержится
характеристический пик меди.
1. Помещаем пучок на эталон из меди (может использовать-
использоваться медная сетка для электронного микроскопа) и измеряем ха-
характеристическое излучение Сияа (пик минус фон) при стан-
стандартных параметрах прибора и получаем значение /(,¦>. Одно-
Одновременно измеряем непрерывное излучение в каналах, выбран-
выбранных для измерения непрерывного излучения (например, в
диапазоне 4,6—6 кэВ), и получаем значение /в-
2. Рассчитываем /B//(i) = /ji. Повторяем измерения для /(;> и
/в для получения среднего значения k\.
3. Повторяем операции 1—2 с использованием эталонов из
чистых элементов и получаем значения k2, kz— и т. д., т. е. для
любых других элементов, которые, как выяснилось, дают значи-
значительный вклад в побочный фон от прибора.
4. Сумма этих различных значений k\ представляет собой
вклад в сигнал в каналах, выбранных для измерения непрерыв-
непрерывного излучения от различных элементов, дающих вклад в излу-
излучение фона от прибора.
5. Константа ki будет использована в последующих расче-
расчетах.
А.2. Излучение фона от держателя образца
и пленки-подложки
Хотя посторонний фон от прибора можно измерить и можно
надеяться уменьшить его до приемлемого низкого уровня, дер-
держатель образца и пленка-подложка также могут давать вклад
в сигнал фона. Если образец монтируется на бериллиевых сет-

92 Глава 7
ках или на покрытой углеродом тонкой пластиковой пленке,
этот фон будет очень низким. Однако, если подложка образца
сделана из меди, титана, никеля и т. д., этот фон может быть не-
неприемлемо высоким, и его можно измерить следующим образом.
Поместим пучок на держатель образца и зарегистрируем
полный спектр при помощи спектрометра с дисперсией по энер-
энергии, используя ток пучка, напряжение и время счета, которые
используются для измерения на образце. Зарегистрированный
спектр покажет, какие элементы из держателя образца и при-
прибора дают вклад в спектр фона. Если используется медная сет-
сетка, основным будет пик меди, титановая сетка — пик титана и
т. д. Это побочное излучение также будет давать вклад в не-
непрерывное излучение, на него следует вводить поправку при
расчетах. Рассмотрим два условия, которые, вероятно, имеют
место.
А. Излучение фона от прибора низкое, и образец находится
на покрытой углеродом нейлоновой пленке на бериллиевом дер-
держателе.
Б. Излучение фона либо от прибора, либо от подложки об-
образца, т. е. медной или никелевой сетки, или как от прибора,
так и от подложки образца, достаточно высокое.
Маловероятно, что при выполнении условия А будет побоч-
побочный фон. При выполнении условия Б побочные рентгеновские
сигналы от прибора и/или от подложки образца могут давать
вклад в непрерывное излучение, которое используется для из-
измерения массы образца.
Условие А. В этом случае имеется незначительный фон от
прибора и незначительное постороннее излучение от подложки
образца.
1. Рассчитываем k\ способом, описанным выше.
2. Помещаем электронный пучок на держатель образца и по-
получаем значение интенсивности непрерывного излучения в ка-
каналах, выбранных для его измерения, т. е. 4,6—6,0 кэВ. Повто-
Повторяем несколько раз, чтобы получить среднее значение 1в{Н).
3. Рассчитываем IB(H)y^k\ = IB(B). (Если химический состав
держателя образца остается неизменным и побочное излучение
от прибора не изменяется, то выражение для 1в(В) будет кон-
константой и нет необходимости рассчитывать его каждый раз.)
4. Помещаем пучок на пленку-подложку и получаем значе-
значение интенсивности непрерывного излучения в тех же самых ка-
каналах (т. е. 4,6—6,0 кэВ). Повторяем несколько раз для полу-
получения среднего значения Ib(F). Если толщина пленки-подлож-
пленки-подложки не изменяется, то величина Ib(F) остается более или менее
постоянной. Если значение Ib(F) отличается более чем на 5—
10%, это, вероятно, обусловлено флуктуациями тока пучка, ко-
который следует проверить.

Количественный рентгеновский микроанализ 93
5. Помещаем пучок на образец и получаем значение IB(S)
для непрерывного излучения от образца плюс поддерживающая
пленка в тех же самых каналах.
6. Рассчитываем Ib(S)—1B(F)=IB(P), интенсивность непре-
непрерывного излучения от образца минус излучение пленки-под-
пленки-подложки.
7. Рассчитываем 1В(Р)—1в(В)=1в, где /в — величина непре-
непрерывного фонового излучения от образца, в которую введена по-
поправка на вклад от любого побочного источника фонового из-
излучения от прибора, держателя образца и пленки-подложки.
Член /в будет использоваться в дальнейших расчетах.
Условие Б. В этом случае наблюдается побочное излучение
от прибора и/или побочное излучение от подложки образца.
1. В случае необходимости рассчитываем k\, как было опи-
описано выше.
2. Перед началом эксперимента помещаем электронный пу-
пучок на держатель образца, измеряем характеристическое излу-
излучение от соответствующих элементов держателя образца и по-
получаем значение h{H). Одновременно измеряем интенсивность
непрерывного излучения в каналах, выбранных для его измере-
измерения (например, 4,6—6,0 кВ) и получаем значение 1В{Н).
3. Рассчитываем IB(H)/Ii(H) —kH- Повторяем измерения
IB(Я) и Ii(H) и получаем среднее значение kH.
4. Рассчитываем ki = kH'-\-kB, где kB — константа для учета
вклада от держателя образца и прибора в непрерывное излуче-
излучение. (Если химический состав держателя образца остается по-
постоянным и побочное излучение от прибора не изменяется, зна-
значение kB будет постоянным и нет необходимости рассчитывать
его каждый раз.)
5. В начале (или в конце) эксперимента помещаем пучок на
поддерживающую пленку, измеряем характеристическое излуче-
излучение от соответствующих элементов держателя образца и полу-
получаем среднее значение Ii{F). Одновременно измеряем интенсив-
интенсивность непрерывного излучения в тех же самых каналах (т. е.
4,6—6,0 кВ) и получаем среднее значение lB(FH), интенсивно-
интенсивности непрерывного излучения от поддерживающей пленки и дер-
держателя образца.
6. Рассчитываем IB(F) = IB(FH) — [kBXh{F)}.
7. Помещаем пучок на образец, измеряем интенсивность не-
непрерывного излучения от образца и поддерживающей пленки в
тех же самых каналах, т. е. 4,6—6,0 кВ, и получаем среднее
значение IB(S). Одновременно измеряем интенсивность характе-
характеристического излучения от соответствующих элементов держа-
держателя образца и получаем среднее значение.
8. Рассчитываем /B = /B(S) — [kBXh{S)]— IB(F).

34 Глава 7
А.З. Расчет относительных и абсолютных массовых
долей элементов
1. Помещаем пучок на интересуемую область образца, из-
измеряем интенсивность характеристического излучения (пик ми-
минус фон) для каждого интересующего нас элемента и получаем
значения /,-. Одновременно измеряем непрерывное излучение в
каналах, предназначенных для его измерения (т. е. 4,6—6,0 кВ),
и получаем значения /в(S) и, если возможно, Ii(S).
2. Используя /в(S) и Ii(S), рассчитываем непрерывное излу-
излучение от образца /в.
3. Рассчитываем /j//B = Cj для каждого из интересующих нас
элементов, где С,- — относительная массовая доля рассматрива-
рассматриваемого элемента.
4. Помещаем пучок в другую область образца, повторяем
пп. 1—3 и получаем еще ряд значений С,. Каждый раз для ин-
интересующего нас элемента набирается ряд отсчетов «характе-
«характеристический пик минус фон», измеряется величина /s(S) и по-
возможности Ii(S). Важно периодически измерять интенсив-
интенсивность непрерывного излучения от поддерживающей пленки
/в(/?), поскольку это будет являться проверкой стабильности
тока пучка в предположении, что поддерживающая пленка име-
имеет постоянную толщину и состав. Ib(F) обычно измеряется пос-
после каждой третьей серии отсчетов интенсивностей характери-
характеристического излучения элементов и непрерывного излучения.
5. Повторяем п. 4, пока не закончим анализ.
6. Заменяем образец. Если используется тот же самый дер-
держатель образца, повторяем пункты условия А или пп. 5—8 усло-
условия Б и пп. 1—5 и получаем значения С,.
7. Заменяем образец тонким эталоном и повторяем пп. 4—7
условия А или пп. 5—8 условия Б и пп. 1—5 и получаем значе-
значения C(i).
8. Рассчитываем абсолютную массовую долю данного эле-
элемента в образце:
где С(А) — концентрация в мМ/кг сухого веса эталона в слу-
случае дегидратированного материала или мМ/кг веса эталона во
влажном состоянии в том случае, когда образец и эталон во
времч анализа находятся в полностью замороженном гидратиро-
ванном состоя н.и и.
9. Если эталон тщательно подобран, так что его органиче-
органическая матрица близка по составу к биологическому материалу,
то неизвестную константу пропорциональности G,7G(,-) [см. урав-
уравнение G.84)] можно исключить. Если G,7G(,-) не равно единице,

Количественный рентгеновский микроанализ 95
то для получения точного значения абсолютная массовая доля
Са должна умножаться на G,7G(,-).
10. Концентрации во влажном состоянии можно получить из
измерений обезвоженных срезов при условии, что толщина сре-
срезов остается постоянной, что в процессе сушки образца не про-
происходит усадки и что в процессе обезвоживания происходит
незначительное перераспределение элементов.
11. Или же, концентрации во влажном состоянии могут быть
рассчитаны из измерений обезвоженных срезов с использова-
использованием внутреннего эталона с известной концентрацией воды.
Образцы можно поместить в капсулу с известной концентра-
концентрацией, т. е. 25% полимерных криопротектантов, таких, как гидр-
оксиэтилкрахмал, растворенный в физиологически совместимых
растворах солей также с известными концентрациями. Заморо-
Замороженные в гидратированном состоянии срезы делаются из об-
образца плюс окружающий криопротектант, и прежде чем образец
начнет терять воду, быстро выполняется несколько измерений
интенсивности непрерывного излучения от интересуемой обла-
области образца и окружающего криопротектанта с помощью ра-
ранее описанных методов. Образец затем можно аккуратно высу-
высушить лиофильной сушкой в колонне микроскопа, после чего
можно произвести элементный анализ ранее описанными мето-
методами. Так как интенсивность непрерывного излучения пропор-
пропорциональна суммарной массе анализируемого объема, разница
в интенсивности непрерывного излучения образца, заморожен-
замороженного в полностью гидратированном состоянии и высушенного
в замороженном состоянии, обусловлена главным образом во-
водой. Могут иметься небольшие отклонения из-за различий в
способности связывать воду различными частями клеток матри-
матрицы и криопротектанта, но эти ошибки малы по сравнению с
большими ошибками, получаемыми при анализе образцов с не-
неопределенным содержанием воды.
Полимерный криопротектант имеет дополнительное преиму-
преимущество, которое заключается в том, что он физиологически сов-
совместим с большинством тканей и при использовании в концент-
концентрациях 20—25% будет стекловаться при быстром заморажива-
замораживаний с минимальным разделением фаз растворенных электроли-
электролитов. Они представляют собой идеальный внутренний эталон для
рентгеновского микроанализа.
Расчет относительных весовых концентраций в сухом и влаж-
влажном состояниях производится по формуле
C,(IU1)> (A.2)
где h(D) и Ib(W) —интенсивности непрерывного излучения от
высушенного в замороженном состоянии и замороженного в гид-
гидратированном состоянии образцов соответственно.

96 Глава 7
Процентное содержание воды в образце определяется вы-
выражением
1 — [т^т^г] X 100% = % содержание воды. (А.З)
ПРИЛОЖЕНИЕ Б. РАБОЧИЕ ПРИМЕРЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО
АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Пример А. Расчет относительных массовых долей в образце.
Образец представляет собой высушенный замораживанием срез
ткани корня растения толщиной 0,5 мкм, укрепленный на ней-
нейлоновой пленке толщиной 70 'нм, покрытой слоем алюминия
толщиной 15 нм. Поддерживающая пленка натягивается на бе-
риллиевый держатель, и анализ выполняется в приборе с пре-
пренебрежимо малым побочным фоном. Анализ на калий и хлор
в клетках верхушки корня производился с помощью детектора
-с дисперсией по энергии (разрешение 150 эВ). Отношения
пик/фон были 'измерены для хлора в диапазоне 2,52—2,68 кэВ,
а для калия в диапазоне 3,24—3,40 кэВ. Непрерывное излуче-
излучение измерялось в интервале 4,60—6,00 кэВ. Условия измерения
в приборе были следующими: ускоряющее напряжение 30 кВ,
ток пучка 1,0 мА, размер зонда на образце 2 мкм2, температура
образца, —100 К.
1) Среднее значение ^i = 0,293.
2) Среднее значение/в(Я) =79.
3) Рассчитываем IB(H)k1 = IB(B) : 0,293x79 = 23.
4) Данные в табл. 7.14 получены из анализа клеток в об-
.ласти верхушки корня.
5) Среднее значение интенсивности непрерывного излучения
в пленке Ib{F) =2145.
6) Для клетки 1 рассчитываем Ib(S)—Ib(F) =Ib(P) =4458—
—2145=2313.
7) Для клетки 1 рассчитываем 1в{Р)—1в(В) =/в = 2313—
—23 = 2290.
8) Для клетки 1 рассчитываем /Ci//b = 355/2290 = 0,155 = СС|.
9) Для клетки 1 рассчитываем hlh = 2771/2290= 1,21 =СК.
10) Повторяем пп. 6—9 для клеток 2—18 и получаем относи-
относительные массовые доли С1 и К, как показано в табл. 7.15.
11) Относительные массовые доли для двух элементов в ва-
вакуолях клеток верхушки корня составляют 0,146 для хлора и
1,14 для калия.
Пример Б. Расчет абсолютных массовых долей в образце.
Образец представляет собой замороженный в гидратированном
состоянии срез ткани корня растения толщиной 1,0 мкм, укреп-
укрепленный на нейлоновой пленке толщиной 70 нм, покрытой слоем

Количественный рентгеновский микроанализ 97
Таблица 7.14.
Клетка 1
Клетка 2
Клетка 3
Пленка 1
Клетка 4
Клетка 5
Клетка 6
Пленка 2
Клетка 7
Клетка 8
Клетка 9
Пленка 3
Клетка 10
Клетка 11
Клетка 12
Пленка 4
Клетка 13
Клетка 14
Клетка 15
Пленка 5
Клетка 16
Клетка 17
Клетка 18
Пленка 6
Анализ клеток
КаС\{Р-В)
355
365
446
353
583
501
336
237
763
420
447
168
404
256
385
355
523
277
в области
/.,
К
2771
2968
3669
2701
5211
3412
2640
1820
5104
3211
3799
1383
2895
2404
2917
2726
4022
2208
верхушки корня
IB(S)
непрерывное
5) излучение (об-
(образец и пленка)
4458
4842
5503
4669
6622
5258
4584
3739
6851
4954
5406
3330
4899
4010
4686
4384
5606
4122
1B(F)
непрерывное
излучение
(пленка)
2167
2139
2151
2120
2153
2140
алюминия толщиной 10 <нм. Поддерживающая пленка помеща-
помещалась на медной сетке G5 меш), которая в свою очередь крепи-
крепилась к концу бериллиевого держателя. Анализ проводился в
приборе с пренебрежимо малой интенсивностью побочного фона.
Анализ клеток паренхимы флоэмы проводился с помощью спек-
спектрометра с дисперсией по энергии (разрешение 150 эВ). Отно-
Отношения пик/фон для фосфора измерялись в диапазоне 1,92—
2,08 кэВ, для серы — в диапазоне 2,24—2,40 кэБ и для хлора —
в диапазоне 2,52—2,68 кэВ. Непрерывное излучение измерялось
в области 4,60—6,00 кэВ, а отношение пик/фон для пика изме-
измерялось в диапазоне 7,88—8,16 кэВ. Рабочие условия в дриборе
были следующими: ускоряющее напряжение 30 кВ, ток пучка
2,0 нА, размер зонда на образце 2 мкм2 и температура образ-
образца 100 К.
1) Среднее значение ^i = 0,06.
2) Среднее значение /,(#) для Си= 151 764.
3) Среднее значение /в(#) для Си = 51 600.
4) Рассчитываем /в(Я)/Д(Я) =/гя = 51 600/151 764 = 0,340.
5) Рассчитываем k\ + kH = kB = 0,06+0,340 = 0,400.

98
Таблица
Номер
клетки
7.15.
Относительные
верхушки корня
Глава 7
массовые доли С1
С Номер
^ клетки
и К
для клеток
в области
ск
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0,155
0,136
0,134
0,141
0,131
0,162
0,139
0,151
0,163
,21
,11
,10
,08
,17
,10
,09
,16
,09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Среднее:
0,150
0,138
0,145
0,148
0,139
0,152
0,160
0,152
Л, 142
0,146
,15
,17
,19
,06
,31
,15
,08
,17
,13
,14
Данные, приведенные в табл. 7.16, были получены из анали-
анализа клеток паренхимы флоэмы на Р, S и К в области кончика
корня.
6) Среднее значение Ii(F) =41 760.
7) Среднее значение IB(FH)=2\ 608.
8) Рассчитываем IB{F) = IB{FH)~[kBh(F)] =21 608— @,4X
Х41 760) =4904.
9. Для клеток 1 рассчитываем Ib = Ib(S) — [kBIi(S)]—Ib(F) =
= 52 001 —@,4X72 000)—4904 = 18 297.
10) Для клетки 1 рассчитываем С, = /я//в = 4020/18 297 =
= 0,219; С, = /5//в= 1100/18 297 = 0,060; С,- = /*//* = 7500/18 297=
= 0,410.
11) Повторяем пп. 9 и 10 для клеток 2—12. Полученные ре-
результаты представлены в табл. 7.17.
12) Относительные массовые доли трех элементов в цитоплаз-
цитоплазме клеток паренхимы флоэмы равны С(Р) = 0,252, C(S) = 0,067 и
С(К) = 0,438.
13) Для того чтобы преобразовать относительные массовые
доли в абсолютные, повторяем пп. 6—11 с использованием со-
соответствующих эталонов, в данном случае замороженные в гид-
ратированном состоянии эталонные растворы соли в 25%-ном
ПВП, и получаем значения С(().
14) Рассчитываем значения Сцу.
C(S) = 0,308 для 250 мМ/кг чистого веса, С(К) = 0,325 для
150 мМ/кг чистого веса, С(я> = 0,273 для 150 мМ/кг чистого веса.
15) Рассчитываем СА= (C,-/C«))CW
а) для серы СА= @,067/0,308) @,250) =54 мМ/кг чистого веса;
б) для калия Сд= @,438/0,325) @,150) =202 мМ/кг чистого ве-
веса; в) для фосфора Сд= @,252/0,273) A,5) = 138 мМ/кг чистого
веса.

Количественный рентгеновский микроанализ
99
Таблица 7.16. Анализ клеток паренхимы флоэмы
Ка.
1B(S)
непрерывное
излучение
(образец и
пленка)
непрерывное
излучение
(пленка)
1AF)
Клетка
Клетка
Клетка
Пленка
Клетка
Клетка
Клетка
Пленка
Клетка
Клетка
Клетка
Пленка
Клетка
Клетка
Клетка
Пленка
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
4020
4564
3819
4721
4319
4628
4324
4432
4518
3997
4318
4419
1100
1147
1067
1128
1201
1183
1231
1168
1114
1190
1107
1153
7500
7559
7620
7489
7496
7516
7590
7601
7570
7532
7488
7521
52 001
53 190
50 170
49 601
52 116
53 001
53 681
51816
52 455
52 106
49 970
53 141
21 000
22 861
20 963
21 263
72 000
71680
71346
78 121
74 286
75 863
76129
72 691
71908
74 612
76 121
73 118
41966
42 69с
40 281
42 ЮС
Таблица 7.17. Расчет Ср, Cs и
паренхимы флоэмы
Ск для клеток
Номер
клетки
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Среднее
0,219
0,233
0,234
0,351
0,247
0,261
0,236
0,248
0,241
0,230
0,295
0,233
0,060
0,058
0,065
0,084
0,069
0,067
0,067
0,065
0,059
0,069
0,076
0,061
0,410
0,385
0,467
0,557
0,428
0,423
0,414
0,426
0,403
0,434
0,512
0,396
0,252
0,067
0,438
Обозначения
С,
сЛ
— относительная массовая доля элемента в образце.
— относительная массовая доля элемента в эталоне.
— абсолютная массовая доля (концентрация) элемента
в микрообъеме анализируемого образца.

100 Глава 7
С (А) — абсолютная массовая доля (концентрация) элемента
в микрообъеме анализируемого эталона.
/в — интенсивность непрерывного излучения от образца.
/(В) — интенсивность непрерывного излучения от эталона.
Ib(D) — интенсивность непрерывного излучения от образца,
высушенного лиофильной сушкой.
1в(В) — интенсивность непрерывного излучения от держате-
держателя образца и прибора.
Ib(F) — член, учитывающий непрерывное излучение от под-
поддерживающей пленки.
Ib(FH) — интенсивность непрерывного излучения от поддержи-
поддерживающей плевки плюс держатель образца.
/в(Я) — член, описывающий непрерывное излучение от дер-
держателя образца.
/в(Р) — интенсивность непрерывного излучения от образца
минус поддерживающая пленка.
/вE) — член, описывающий непрерывное излучение от под-
поддерживающей пленки плюс образец.
Ib(W) — интенсивность излучения от замороженного в гидра-
тированном состоянии образца.
/,¦ — интенсивность характеристического излучения анали-
анализируемого элемента.
Ii(F) — интенсивность характеристического излучения от эле-
элемента в держателе образца, которое дает вклад в
сигнал от поддерживающей пленки, обусловленный
рассеянием электронов.
/;(#) — интенсивность характеристического излучения от эле-
элемента в держателе образца, который, возможно,
дает вклад в непрерывное излучение или в каналы
регистрации непрерывного излучения.
Ii(S) — интенсивность характеристического излучения эле-
элемента в держателе образца, в которой учитывается
вклад в сигнал от поддерживающей пленки плюс
образец, обусловленный рассеянием электронов.
/(,-) — интенсивность характеристического излучения эле-
элемента в чистом эталоне.
кв — константа, учитывающая вклад в непрерывное излу-
излучение от держателя образца и прибора.
ки — константа, учитывающая вклад в непрерывное излу-
излучение или в каналы регистрации непрерывного излу-
излучения от держателя образца.
k\ — константа, учитывающая фоновое излучение в при-
приборе.
1т — полный рентгеновский сигнал, входящий в детектор.
ktB — константа в методе Кобе.

Количественный рентгеновский микроанализ
101
Ni — число атомов элемента i в анализируемом микро-
микрообъеме.
Z — атомный номер.
А — атомный вес.
Р/В — отношение пик/фон, (/,¦—1в)/1в-
kij — константа для элементов i и / в методе, использую-
использующем отношение пик/фон для расчета относительной
концентрации.
kt — константа для элемента i в методе, использующем
отношение пик/фон для расчета абсолютной концент-
концентрации [166].
Q — сечение ионизации.
Ео — энергия электронов в пучке.
?кр — критическая энергия возбуждения данной рентгенов-
рентгеновской линии.
Pi — факторы пропорциональности в методе, использую-
использующем отношение элементов.
р — плотность образца.
t — толщина образца.
d — фактор поправки на непрерывное излучение ~Z2/A
для образца.
G(i) — фактор поправки на непрерывное излучение ~Z2[A
для эталона.
S — фактор усадки.
Y — фактор G-коррекции.
М — масса на единицу площади образца.
(М) — масса на единицу площади эталона.

Глава 8
ПРАКТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ РЕНТГЕНОВСКОГО АНАЛИЗА
8.1. ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ ОБ ОБРАБОТКЕ ДАННЫХ
В гл. 6 уже было показано, что в основе качественного ана-
анализа лежит способность спектрометрической системы измерять
энергии характеристических линий и связывать эти энергии
с наличием определенных элементов. Этот процесс сравнительно
прост, если: 1) спектрометрическая система правильно откали-
брована; 2) рабочие условия обеспечивают достаточное коли-
количество фотонов рентгеновского излучения, так что данный пик
можно легко различить на соответствующем уровне фона, и
3) отсутствуют эффекты значительного наложения пиков.
Количественный анализ, с другой стороны, включает в себя:
1) точное .измерение интенсивности спектральных линий, соот-
соответствующих заранее выбранным элементам в образцах и в эта-
эталонах цри идентичных условиях измерения; 2) расчет отноше-
отношений интенсивностей и 3) преобразование их в значения химиче-
химической концентрации с помощью методов, изложенных в гл. 7.
Поскольку в настоящее время количественный анализ можно
выполнить с относительной точностью 1—5%, то, очевидно, не-
необходимо тщательно позаботиться о том, чтобы была обеспече-
обеспечена линейность характеристики системы детектора рентгеновско-
рентгеновского излучения в широком диапазоне скоростей счета и чтобы
полезный сигнал можно было легко выделить из фона. На прак-
практике обычно не требуется знание абсолютной эффективности
счета спектрометра, так как ее влияние исключается из-за ис-
использования относительных интенсавностей. Необходимо прово-
проводить подрегулировки для изменения эффективное™, спектромет-
спектрометра при измерении скорости счета, следовательно, необходимо
вводить поправки на мертвое время для пропорциональных
счетчиков и поправки на живое время для Si (Li)-детекторов.
Как и следовало ожидать, измерения фона по мере уменьшения
отношения пик/фон приобретают исключительно важное значе-
значение. Например, ошибка измерения фона на 100% при отношении
пик/фон, равном 100, приводит к ошибке измеренного значения
интенсивности пика в 1%, в то же время такая же ошибка при
отношении пик/фон, равном 2, приводит к ошибке определения
величины интенсивности сигнала на 50%. Большие отношения
пик/фоад не всегда получаются даже при использовании крис-

Практические методы рентгеновского анализа
103
Рис. 8.1. Метод измерения фона
с помощью спектрометра с дис-
дисперсией по длинам воли.
Этот метод использует линейную ин-
интерполяцию между измеренными зна-
значениями уровня фона в положениях А
и В. Положение кристалла на этом ри-
рисунке эквивалентно длине волиы.
133 134 135 136
Положение кристалла, мм
137
талл-дифракционных спектрометров, и точное измерение уровня
фона становится важной задачей, особенно при низких концент-
концентрациях элементов.
Как шжазано 'на рис. 8.1, наиболее часто используемый ме-
метод измерения фона с помощью кристалл-дифракционного спек-
спектрометра заключается в расстройке спектрометра, измерении
уровня фона справа и слева от пика характеристической линии
и определении уровня фона в месте расположения пика линей-
линейной интерполяцией. В более старых приборах расстройка спек-
спектрометра между измерениями на образце и эталоне обычно не-
нежелательна, поскольку положение спектрометра точно воспроиз-
воспроизвести невозможно. Точному воспроизведению ранее найденного
положения, соответствующего пику интенсивности, препятству-
препятствует обычно «свободный» ход в механической системе. Также
трудно получить воспроизводимость значений интенсивности
лучше чем <2°/о, определяя максимум сигнала по интенсимет-
ру, регулируя спектрометр вручную. Для избежания перемеще-
перемещения спектрометра при измерении фона иногда возможно уста-
установить материал, имеющий приблизительно тот же средний
атомный номер, что и исследуемый, но .не содержащий анализи-
анализируемого элемента. Поскольку при прочих равных условиях фон,
генерируемый на любой энергии, приблизительно пропорцио-
пропорционален среднему атомному номеру, таким способом можно изме-
измерить фан на энергии характеристического пика. Например, для
измерения фона для Ni*a можно использовать медный эталон.
Однако этот способ следует применять с осторожностью. Иног-
Иногда невозможно подобрать материал со средним атомным номе-
номером, достаточно близким к атомному номеру неизвестного об-
образца, о составе которого вначале имеются лишь неясные пред-
предположения. Этот метод не следует использовать при низком

104
I лава в
600
500 -
400 -
5 зоо -
? 200
1 1
7410-
-
fir » wfiW
~ А В
J
\* C
край поглощения ^
Cr .
l i 1
! 1 1
—1049
-
-
D \
1 1 1
100 -
4 5 6 7 8 9
Энергия , кэ8
Рис. 8.2. Подгонка фона в спектре образца из хрома, полученном при по-
помощи спектрометра с дисперсией по энергии, линейной интерпо^яцигй (точ-
(точки В — С или В — D) или экстраполяцией (точки А — В) [209].
отношении пик/фон, например при анализе элементов с кон-
концентрациями ниже 1%- К счастью, в более новых приборах
можно точно определить положение пика, расстроить спектро-
спектрометр для получения показания фона и возвратить его в место
положения пика простым набором значений длины волны.
В современных приборах можно осуществлять под контролем
мини-ЭВМ шаговое сканирование по длинам волн для повтор-
повторной установки на пик, хотя при этом будут иметь место некото-
некоторые потери времени набора данных.
Измерения уровня фона с помощью детекторов с дисперсией
по энерпии обычно значительно более критичны, чем при иеполь
зовании кристалл-дифракционных спектрометров из-за более
низких отношений пик/фон и трудностей, связанных с выбором
спектральных участков фона, прилежащих к измеряемому пику.
На рис. 8.2 показана часть спектра чистого хрома. Значение
фона в соответствующем пику канале, определяемое путем ин-
интерполяции, составляет ~100 имп./с, если используются точ-
точки В in D, и ~ 130 имп./с, если используются точки В и С. Луч-
Лучше использовать последнюю пару точек, поскольку наличие края
поглощения хрома при 5,989 кэВ приводит к резкому спаду

Практические методы рентгеновского анализа
105
6 7 8 9
Энергия, кэВ
Рис. 8.3. Подгонка фона в сложном спектре образца из нержавеющей ста-
стали, полученном при помощи спектрометра с дисперсией по энергии.
фона при более высоких энергиях, который затеняется из-за
прв'.упмвия СгКр пика. Если бы накопление спектра происходи-
происходило с помощью детекторной системы с разрешением, худшим
того, которое имело место при получении спектра, представлен-
представленного на рис. 8.2 A65 эВ при 6,4 кэВ), точку С вообще нельзя
было бы использовать. В этом случае предпочтительнее было
бы определять уровень фона экстраполяцией от низкоэнергети-
низкоэнергетических точек А я В к точке С, а не интерполяцией между точка-
точками В и D. Ошибка измерения, связанная с использованием это-
этого приближения, составила бы меньше 1 % на этало,ие из хрома.
На рис. 8.3 показан спектр образца мз нержавеющей стали,
полученный при тех же условиях измерения, что и спектр на
рис. 8.2. В спектре имеется значительное число Ка- и /С3-пиков,
так что использование экстраполяции для Fe и Ni сомнитель-
сомнительно, тогда как интерполяция между точками А я В должна про-
проводиться в диапазоне энергий 3 кэВ. Поскольку истинный фон
из-за присутствия краев поглощения Сг и Fe не является ре-
регулярным, при измерении интенсивности Ni в этом образце с
линейной экстраполяцией фона ошибка составила бы ~3%.
Хотя такие ошибки (в несколько процентов от величины
присутствующих основных компонентов) немного больше оши-

106 Глава 8
бок, которые можно ожидать при измерениях с помощью кри-
кристалл-дифракционного спектрометра, значительно большие труд-
трудности в цитируемом примере встретились бы при определении Мп
(МпК(Х = 5,898 кэВ) или Со (Со*а = 6,924 кэВ), присутствующих
в концентрации в несколько процентов. Сигналы Мп и Со не
только то порядку величины могут быть ,на уровне фона, но
были бы искажены за счет наличия пиков основных компонен-
компонентов (Сг*0 и
8.2. ФОРМА ФОНА
Поскольку проблема компенсации фона вычитанием или дру-
другими способами является критичной дри всех измерениях с
помощью спектрометра с дисперсией по энергии, имеет смысл
уделить внимание обзору того, что известно по этому вопросу,
а также того, какие способы вычитания фона используются в
настоящее время. В общем имеются два подхода к решению
этой проблемы. В одном из иих измеряется или -рассчитывается
функция энергетического распределения непрерывного излуче-
излучения, и ее комбинируют затем математически с передаточной
характеристикой детектора. Полученная в результате функция
используется затем для расчета спектра фона, который можно
вычитать из экспериментального 'Спектрального распределения.
Этот метод можно называть моделированием фона. В другом
подходе обычно не касаются физики генерации и эмиссии рент-
рентгеновского излучения и фон рассматривается как нежелатель-
нежелательный сигнал, от воздействия которого можно избавиться матема-
математической фильтрацией или модификацией частотного распреде-
распределения спектра. Примерами последнего способа являются цифро-
цифровая фильтрация .и фурье-анализ. Этот метод можно назвать
фильтрацией фона. Следует напомнить здесь, что реальный
рентгеновский спектр состоит из характеристического и непре-
непрерывного излучений, интенсивности которых промодулированы
эффектами статистики счета. При вычиталии фона из спектра
любым способом остающиеся интенсивности характеристических
лилий все еще промодулированы обеими неопределенностями.
Мы можем вычесть среднюю величину фона, но эффекты, свя-
связанные со статистикой счета, исключить невозможно. На прак-
практике успешно применяются оба вышеописанных метода вычита-
вычитания фона. Эти методы будут обсуждаться в следующих двух
разделах.
8.2.1. Моделирование фона
Моделированию фона посвящен ряд работ [210—213]. Мы
рассмотрим только подход, развитый в [211], для рассмотрения
сущности метода. Ранее в теоретической работе Крамерса [49]

Практические методы рентгеновского анализа 107
было показано, что распределение интенсивности непрерывного
рентгеновского излучения в зависимости от энергии испускае-
испускаемых фотонов описывается выражением
1ЕАЕ = kF2 (Ео ~ Е) АЕ. (8.1)
В этом выражении IeAE— средняя энергия непрерывного излу-
излучения, генерируемого одним электроном в интервале энергий от
Е до Е-)-АЕ; Ео — энергия падающего электрона, кэВ; Е — энер-
энергия рентгеновского фотона, кэВ; Z — средний атомный «омер
образца и &?— постоянная, часто называемая постоянной Кра-
мерса, которая считается не зависящей от Z, Ео и Ео—Е. Тер-
Термин интенсивность 1Е в выражении (8.1) относится к энергии
рентгеновского излучения. Число фотонов Л^? в интервале энер-
энергий от Е до Е-\-АЕ на один падающий электрон определяется
из выражения
NEAE = kEZ[(E0 — E)/E] AE. (8.2)
Это обстоятельство явилось причиной значительной путаницы
в литературе, так как уравнение (8.1) часто неправильно при-
применяют для описания формы спектрального распределения
фона, генерируемого в объеме образца. Уравнение (8.2), опи-
описывающее интенсивность непрерывного излучения, обсуждалось
в гл. 3. Неясность в определении интенсивности усугубилась не-
несомненно тем, что первые иомизационные детекторы суммиро-
суммировали полную собранную энергию излучения, а не проводили сче-
счета отдельных рентгеновских фотонов. Такой ионизационный де-
детектор давал бы одинаковый выходной сигнал как для одного
фотона с энергией IE, так .и для двух фотонов с энергией Е,
одновременно входящих в детектор. Различие в форме двух кри-
кривых, описываемых выражениями (8.1) и (8.2), показано на
рис. 8.4.
Измеренное число фотонов N(Е) в энергетическом интерва-
интервале от Е до Е-\-АЕ, генерируемое за время t пучком электро.но:в
с toikom i (электродам в секунду) и собираемое детектором !с
эффективностью Ре в телесном угле Q, равно
N (Е) = (Й/4я) itfHPhkrZ{(E0~E)/E] AE. (8.3)
Здесь 1е (фактор поглощения для непрерывного излучения)
представляет собой вероятность поглощения фотона с энер-
энергией Е внутри мишени. В уравнении (8.3) член Q/4n, который
представляет собой часть сферы, находящейся в поле зрения
детектора, равен доле фотонов, испускаемых только в направ-
направлении к детектору, если генерация непрерывного излучения изо-

108
Глава 8
Энергия фсгоноз Е
Рнс. 8.4. Форма теоретического
:пектра непрерывного рентгенов-
рентгеновского излучения, рассчитанная по
уравнению Крамерса [65].
тропна. Предположение об изотропии является разумным для
толстой мишени, несмотря на то что имеется слабая степень
анизотропии. Если обозначим а= (Q14я)it&E, то получим
)r afEPEkEZ[{E-E)lE\.
(8.4)
Для определения значения постоянной Крамерса ke необхо-
необходимо выполнить абсолютные измерения спектрального распре-
распределения непрерывного рентгеновского излучения. Выполнить
такие измерения на микроанализаторе с кристалл-дифракцион-
кристалл-дифракционным спектрометром чрезвычайно трудно, так как эффективность
спектрометра изменяется с энергией и, более того, обычно не-
неизвестным образом. В дисертации Грина [65], опубликован-
опубликованной за несколько лет до появления детекторов с дисперсией по
энергии, описал ряд измерений эффективности генерации как не-
непрерывного, так « характеристического рентгеновского излуче-
излучений, в которых для прямого измерения спектров рентгеновского
Рис. 8.5. Кривая распределения
импульсов меди для измерения
эффективности генерации рент-
рентгеновского излучения, получен-
полученная с помощью пропорциональ-
пропорционального счетчика. Е0=27 кэВ [65].

Практические методы рентгеновского анализа
100
Рис. 8.6. Постоянная Крамерса
(к/2) в зависимости от атомного
номера.
• по данным [215]; по данным
[216]; доверительный интервал по дан-
данным [217]; ф по данным [214].
1.5 -
1.0 -
0.6 -
: * \
-
iii iii.
* —
Mo #Ag J
I I | I I I
20 40 60 80
/Атомный номер Z
излучения использовался пропорциональный счетчик с извест-
известной эффективностью сбора. На рис. 8.5, взятом из этой работы,
представлен спектр, полученный для медного образца. Из-за
того, что широкие пики характеристической линии я пик потерь
маскируют большую часть распределения фона, Грин не пытал-
пытался измерить это распределение .и предположил, что уравнение
Крамерса является корректным, и рассчитал kE, приравнивая
площадь А под штриховой кривой к проинтегрированному вы-
выражению (8.2), а именно
А « 1/2??Z?02- (8.5)
Как показано на рис. 8.6, значения kE, полученные разными
авторами, зависят от атомного номера. В [214] этот экспери-
эксперимент был повторен с использованием Si (Li)-детектора, обла-
обладающего лучшим энергетическим разрешением и более высокой
эффективностью сбора. На рис. 8.7 показан подобный спектр,
полученный для медного образца с использованием Si (Li)-де-
(Li)-детектора толщиной 3 мм .и диаметром 6 мм с разрешением
165 эВ («а линии Fe/ca). Максимальные значения пиков Си*
и Си*р не показаны с целью выявления тонкой структуры фана.
Понижение интенсивности в области низких энергий обусловле-
обусловлено поглощением в окне детектора. Резкий перепад в интенсивно-
интенсивности фона гори энергии около 9 кэВ обусловлен явлениями само-
самопоглощения в образце из-за скачкообразного изменения коэф-
коэффициента массового поглощения меди при энергии, равной
потенциалу возбуждения /С-серии меди. Однако значение интен-
интенсивности фона точки в месте края поглощения (8,979 кэВ)
маскируется из-за расширения детектором пика Си^. Здесь
уместно указать, что при любой попытке применить методы
подгонки с помощью ЭВМ для описания формы наблюдаемого

по
Глава 8
О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
Энергия . кэВ
Рис. 8.7. Спектр эталона из чистой меди при ?а=40 кэВ, полученный с по-
помощью Si (Li)-детектора.
спектр>а для целей последующего его вычитания следует учиты-
учитывать такие детали, которые в случае многокомпонентных образ-
образцов могут быть весьма сложными. Как было указано ранее,
уравнение Крамерса применимо не к наблюдаемому распределе-
распределению фона, а скорее к генерируемому в образце непрерывному
рентгеновскому излучению.
В работах [212, 218—220] было показано, что зависимость
N(E) от энергии и атомного номера, описываемая уравнением
(8.4), имеет всего лишь приближенный характер. Конечная по-
поправка может быть введена по крайней мере двумя способами:
1) применением более усовершенствованных теоретических рас-
расчетов и введением в уравнение Крамерса показателя степени,
отличного от единицы для энергии и атомного номера Z, или
2) использованием в уравнении (8.4) аддитивно зависящего от
энергии поправочного члена, как было предложено в [210],
.V (?) = a {fEPEZ[(E0~ E)/E] -)¦ F (?)}, (8.6)
где значение F (Е) берется из эмпирически полученных таблиц;
авторы показали, что для непрерывного излучения с энергией
фотонов свыше 3 кэВ нет необходимости вводить аддитивную
поправку. В [218] было эмпирически получено и проведено бо-
более общее выражение для N(E):
N (Е) = fEPEZ{a [(Е0-Е)/Е] + Ь[(Е0-Е)*/Е]}, (8.7)
в котором а и Ь — подгоночные параметры, а остальные чле-
члены — те же, ЧТО' и в уравнении. (8.4).
Было показано [211], что можно определить а и Ъ для лю-
любой мишени путем измерения N(E) при двух различных энер-
энергиях фотона и решения двух полученных уравнений с двумя не-

Практические методы рентгеновского анализа 111
известными. При этом предполагалось, что /е и Ре в уравнении
(8.7) известны. Поскольку N(E) определяется из измерений
только мишеней, представляющих интерес, неточности закона
Крамерса относительно атомного номера не оказывают влияния
на метод. Места спектра, выбираемые для измерения N(E), не
должны содержать взаимно влияющих пиков и артефактов де-
детектора (¦неполного сбора зарядов, наложения пиков, пиков с
удвоенной энергией и пиков потерь).
8.2.1.1. Фактор поглощения /в
Для фотонов первичного рентгеновского характеристического
излучения поглощение -внутри мишени учитывается фактором
}(%)¦ Фактор f(%) может быть рассчитан по уравнениям G.12) —
G.14) (уравнение Филибера— Данкамба — Хейнриха) или
может использоваться в более простом виде [135]:
l//(x)=l+OiTX+<V?Y. (8-8)
где y = ?o''65—?кр''65. ?кр — потенциал возбуждения соответст-
соответствующей электронной оболочки в кэВ, %= ((i/p)'coseci|>(|i/p)' —
массовый коэффициент поглощения интересующего элемента
в мишени, 1|з — угол выхода рентгеновского излучения. Исполь-
Используемые сейчас значения для коэффициентов а.\ « а2 равны
ai = 2,4-10-6 г-см-2кэВ-'.65 и а2= 1,44-102 г2-см-4кэВ-2'7.
Если предположить, что функция генерации .непрерывного
излучения имеет распределение по глубине такое же, как и ха-
характеристическое излучение, и если ?ж?кр, то уравнение (8.8)
можно модифицировать следующим образом:
?0'.вь_?1,.5)* &Д (8.9)
где %с= (|i/p?co&ec ^>(\i/p)E — массовый коэффициент поглоще-
поглощения для фотонов непрерывного излучения с энергией Е в мише-
мишени и (е — фактор поглощения для этих фотонов. Подобные
предположения и выражения использовались и в других рабо-
работах [210, 218, 219].
Критерием применимости уравнения (8.7) служит тот факт,
что при его использовании должно исчезать влияние всех краев
поглощения в интересуемом интервале энергий. Успешное при-
применение этого метода при наличии больших краев поглощения
продемонстрировано на рис. 8.8 на примере спектра мишени
из чистого кремния, измеренного при 20 кэВ.
Как было указано в [210], фактор поглощения зависит от
состава мишени. Следовательно, в случае, когда состав мишени
неизвестен, необходимо включить уравнение (8.7) в итерацион-
итерационный процесс при использовании метода трех поправок.

Число импульсов на канал , 10 3
Число импульсов на канал ,

Практические методы рентгеновского анализа ИЗ
8.2.1.2. Эффективность детектора
Непрерывное излучение, испускаемое мишенью по направлению
к детектору, проникает сквозь бериллиевое окно толщиной
обычдО' 8 мкм, поверхностный барьерный контакт (~20 ,нм Аи)
и неактивный слой кремния, простирающийся в глубь детектора
на 200 нм. Затем излучение попадает в активную (собственную)
область детектора, толщина которой обычно составляет от 2
до 5 мм. При энергии, равной энергии Af-края поглощения золо-
золота, влияние поглощения в слое золота обычно незначительно.
Следовательно, влияние золота и бериллия, становящееся зна-
значительным при низких энергиях, можно описать с помощью
эквивалентной толщины /ве, представляющей собой слой берил-
бериллия, который оказывал бы такое же влияние, как и золото с
бериллием вместе. Потери «а поглощение в бериллиевом окне,
золоте, мертвом слое кремния и при прохождении через актив-
активную зону кремния можно поэтому рассчитать из выражения
РЕ = exp- [(ti/p)?BAe+(^/P)VDsi] {I -exp-[(|x/p)Vsil>- (8-l°)
В этом уравнении /siD и tsi — толщины мертвого слоя кремния
и активной области детектора соответственно (в г/см2). Коэффи-
Коэффициенты массового ослабления бериллия и кремния при энер-
энергии, Е (ji/p)?Be и (ji/p)?Si рассчитываются способом, предложен-
предложенным в f 144]. Так как получить достаточно точные значения от
изготовителя обычно не представляется возможным, оценки тол-
толщин бериллиевого окна и мертвого слоя детектора можно про-
провести оптиматизадией подгонки рассчитанного и эксперимен-
экспериментального спектров пр;и энергиях ниже 2 кэВ.
Пример использования этого метода для подгонки формы
непрерывного спектра сложного образца представлен на
рис. 8.9. Образец представляет собой минерал, химический со-
состав которого приводится в табл. 8.1. Общий счет составлял
1,4-107 импульсов, что дает возможность обнаружить даже Мп
с концентрацией менее 0,07%. Такой метод моделирования и
вычитания фона используется в нескольких процедурах коррек-
коррекции данных методов трех поправок, включая 'FRAME В [211]
и FRAME Ci[144].
Рис. 8.8. Коррекция фона в кремнии.
а — подгоночная кривая непрерывного излучения, рассчитанная по формуле (8.7); точки
подгонки уровня фона отмечены треугольниками. Наблюдаемый спектр наложен на кри-
кривую. Интенсивность Ка-пика кремния составляет 53 200 имп./с в канале, соответствующем
пику; б — разностный спектр, полученный вычитанием подгоночного спектра непрерывно-
непрерывного излучения из наблюдаемого Общее количество импульсов на спектр составляет
9-10s.

50
Mg Al Si
Ca -л Fe
30
20
10
0 2
Mq Ai Si
30
20
10
fn"
Энергия , кэВ
Ca Fe
'uyA.
Ti
Mn
Cu
Cu
I I I I I I I I
Энергия , «эВ

Практические методы рентгеновского анализа
115
Таблица 8.1. Химический анализ минерала
Элемент
Концентра-
Концентрация, вес. %
Элемент
Концентрация, вес.
Na
Mg
Al
Si
К
1,93
7,72
7,88
18,87
1,17
Ca .
Ti
Mn
Fe
0
7,36
2,62
0,0697
8,49
Равновесная до 100%
8.2.2. Фильтрация фона
В этом методе снижения уровня фона непрерывная состав-
составляющая рентгеновского спектра .рассматривается как нежела-
нежелательный сигнал, влияние которого можно уменьшить математи-
математической фильтрацией или модификацией частотного распреде-
распределения спектра. Знания физики генерирования, эмиссии и детек-
детектирования рентгеновского излучения не требуется.
В методе фильтрации используется то, что непрерывная со-
составляющая спектра рентгеновского излучения является глад-
гладкой и медленно изменяется в зависимости от энергии по срав-
сравнению с пиками рентгеновского характеристического излуче-
излучения, за исключением краев поглощения. Если мы математически
преобразуем рентгеновский спектр из пространства энергий в
частотное пространство, результирующий спектр «мел бы вид,
показанный на рис. 8.10. На горизонтальной оси отложена час-
частота эквивалентной гармонической составляющей. Например,
гармоническая волна с полным периодом 0—10 кэВ попала бы
в канал 1, а гармоническая волна с периодом 10 зВ — в канал
1000. По вертикальной оси (F) отложена интенсивность каждой
гармонической волны. В таком представлении непрерывный фон,
имеющий большой период изменения, находится в низкочастот-
низкочастотной области. Характеристические пики изменяются быстрее фо-
фона и находятся в более высокочастотной области. Шум имеет-
имеется на всех частотах.
Мы можем теперь математически подавить частотные сос-
составляющие, обусловленные медленно изменяющимся непрерыв-
непрерывным излучением, и дополнительно подавить часть частотных
составляющих статистического шума. Затем, выполняя обратное
фурье-преобразование, возвращаемся к спектру в пространстве
энергий, который теперь должен содержать лишь пики харак-
Рис. 8.9. Коррекция фона в минерале (табл. 8.1).
а — подгоночная кривая для непрерывного излучения, рассчитанная по уравнению (8.7)',
точки подгонки фона отмечены треугольниками. Наблюдаемый спектр наложен иа кри-
кривую. Отметим присутствие пика Мп^ при энергии 5,9 кэВ. Концентрация Мп составля-
составляет меньше 0,07%. Общее число импульсов иа спектр 1,4-107; б — спектр с вычтенным
фоном.

116
Глава 8
t
IFI
Фон
частота
i пики
Шум
Рис. 8.10. Представление воз-
возбуждаемого электронами
спектра рентгеновского излу-
излучения в частотном простран-
пространстве (фурье-преобразоваиие).
теристического излучения без непрерывного и который сглажен
относительно статистических флуктуации. К 'Несчастью, тща-
тщательное исследование рис. 8.10 показывает, что эти три глав-
главные составляющие фурье-преобразования перекрываются. Сле-
Следовательно, невозможно подавить нежелательные составляю-
составляющие, не теряя при этом части составляющих пика. Аналогично
невозможно сохранить все составляющие пика, не включив
часть нежелательных составляющих. В результате в любом слу-
случае спектр будет иметь нежелательные искажения.
Хотя такой подход успешно применялся в ряде конкретных
систем, вопрос о том, что происходит с уширенными прибором
краями поглощения и общими частотными составляющими фона
и пиков, не был изучен достаточно полно для обеспечения точ-
точного анализа для всех систем.
Другой метод фильтрации, который в настоящее время ши-
широко используется, был предложен в [221]. Он был успешно
применен в разнообразных системах и использует так называе-
называемый интегрирующий цифровой фильтр. Интеприрующий фильтр
является простым и элегантным алгоритмом; этот факт может
быть легко скрыт математическим формализмом, требуемым
для его полного описания. Попросту говоря, интегрирующий
фильтр представляет собой специальный способ усреднения
группы смежных каналов спектра, в котором среднее значение
присваивается центральному каналу фильтра и помещается в
канал в новом спектре, который мы будем 'называть фильтро-
фильтрованным спектром. Фильтр перемещается затем на один канал,
и получается новое «среднее». Процесс повторяется до тех пор,
пока «е будет пройден весь спектр. Фильтр не изменяет исход-
исходный спектр; данные из исходного спектра лишь используются
для получения нового спектра. «Усреднение» происходит сле-
следующим образом. Фильтр (рис. 8.11) делится на 3 части: цент-
центральная часть, или положительный (+) лепесток, и две боко-

Практические методы рентгеновского анализа
117
1+)
(-)Г
I i
Рис. 8.11. Влияние интегрирующего цифрового фильтра на спектр, состоя-
состоящий из гауссова пика и фона с линейным наклоном.
Фил1 гроваиный спектр построен ниже истинного спектра; показано соответствие каналов
для расчета с помощью интегрирующего фильтра.
/ — фильтрованный спектр; 2 — гауссов пик с линейным фоном; 3 — интегрирующий
фильтр.
вые части, или отрицательные (—) лепестки. Содержимое
группы соседних каналов в исходном спектре, попадающих в
центральный лепесток, суммируется, и сумма делится на число
каналов в центральном лепестке. Содержимое двух групп близ-
близлежащих каналов, попадающих в боковые лепестки, аналогично
суммируется, и сумма делится на общее число каналов в обоих
лепестках. «Среднее» боковых лепестков затем вычитается из
«среднего» центрального лепестка, и полученное значение поме-
помещается в новом спектре в канале, соответствующем централь-
центральному каналу фильтра.
Действие такой отдельной процедуры усреднения заключа-
заключается в следующем. Если исходный спектр представляет собой
прямую линию по ширине фильтра, то «среднее» равно нулю.
Если исходный спектр представляет собой вогнутую кривую по
ширине фильтра, «среднее» будет отрицательным числом. Ана-
Аналогично, если спектр представляет собой выпуклую кривую,
«среднее» будет положительной величиной. Чем больше кривиз-
кривизна, тем больше будет значение «среднего». Это влияние для
гауссовой кривой, наложенной на линейный фон, можно наблю-
наблюдать на рис. 8.11. Для того чтобы фильтр реагировал наиболь-
наибольшим образом на кривизну в спектральных пиках и наименьшим

118 Глава 8
образом на кривизну в спектральном фоне, следует тща-
тщательно подбирать ширину окна фильтра. Детальное описание
проблемы приведено в [221, 222]. В общем, ширина окна фильт-
фильтра для любой данной спектрометрической системы выбирается
равной удвоенной полуширине Мпка-пика, причем число кана-
каналов в верхнем лепестке равно или немного больше общего числа
каналов в боковых лепестках.
Поскольку интегрирующий фильтр ведет усреднение по со-
соседним каналам, влияние статистики счета в любом отдельном
канале заметно уменьшается. Следовательно, кроме подавления
фона под спектральными пиками цифровой фильтр также и
сглаживает спектр. Отметим, что на р«с. 8.11 интегрирующий
фильтр преобразует фон с наклоном в ровный фон.
В заключение отметим, что воздействие интегрирующего
цифрового фильтра, проходящего по спектру рентгеновского из-
излучения, зарегистрированного Si (Li)-спектрометром, проявляет-
проявляется в сильном подавлении фона и статистического разброса и
в заметном изменении формы спектральных пиков. Результи-
Результирующий спектр сильно похож да сглаженную вторую производ-
производную; однако это искажение не оказывает каких-либо существен-
существенных отрицательных статистических или математических воздей-
воздействий. Явными достоинствами метода являются его простота и
тот факт, что не требуется явной модели для непрерывного излу-
излучения. Однако, поскольку непрерывное излучение подавляется,
информация, которую оно несет (т. е. средний атомный номер,
массовая толщина и т. п.), становится недоступной.
8.3. НАЛОЖЕНИЕ ПИКОВ
Для измерения интенсивности рентгеновской линии в спектре
мы должны отделить эту линию от других 1й от непрерывного
излучения. В предыдущем разделе обсуждалось, как устранить
средний уровень фона. В этом разделе мы обсудим различные
способы отделения рентгеновской линии от влияния других ли-
линий, когда имеет место наложение пиков в спектре. Будем пред-
предполагать в дальнейшем обсуждении, что в спектре проведена
коррекция фона.
Разрешение определяется способностью спектрометра раз-
разделить пики, близкие по энергии или длине волны. Его удобно
характеризовать полушириной пика (шириной пика на поло-
половине максимальной высоты). Разрешение детектора с дисперсией
по энергии обычно определяется при энергии, соответствующей
Мп/га-пику E,895 кэВ). Разрешение обычных детекторов такого
типа составляет от 140 до 155 эВ. Разрешение же детекторов
с дисперсией по длинам волн составляет, однако, 10 эВ при
энергии,, соответствующей Мп/са-пику (при собственной ширине

Практические методы рентгеновского анализа
5,0 5,05
Энергия , кэВ
Рис. 8.12. Рассчитанные на мини-ЭВМ два спектральных пика и их свертка.
линии около 2 эВ). Следовательно, взаимное влияние пиков
является проблемой, редкой для спектрометров с дисперсией по
длинам волн, но довольно часто встречающейся для детектора
с дисперсией по энергии. Следовательно, мы рассмотрим здесь
явление наложения пиков при использовании только детектора
с дисперсией по энергии. Детальное рассмотрение методов кор-
коррекции взаимного влияния линий в криеталл-дифракцион'ном
спектрометре приводится в [223]. '
Когда разрешающая способность спектрометра с дисперсией
по энергии в данном конкретном случае недостаточна, /необхо-
/необходимо рассмотреть методы, позволяющие при помощи какой-либо
математической операции изолировать пик характеристического
рентгеновского излучения от усредненного влияния других пи-
пиков.
Целью этого раздела, является обсуждение различных ме-
методов, используемых в настоящее время. Приведенные - на
рис. 8.12 рассчитанные «а мини-ЭВМ сплошные кривые иллю-
иллюстрируют проблему. Верхняя кривая, состоящая из двух приве-
приведенных внизу кривых, является примером спектра, который мы
могли бы получить с помощью спектрометра с дисперсией по
энергии, если бы отсутствовали фон или статистическая моду-
модуляция и горизонтальная (энергетическая) ось была бы по су-
существу непрерывной, а не дискретной. Нижние кривые — это то,
что мы должны восстановить, имея лишь информацию, содер-
содержащуюся в верхней кривой. Площадь под каждой нижней кривой

120 Глава 8
представляет собой количество фотонов характеристического
рентгеновского излучения, регистрируемого детектором с дис-
дисперсией по энергии, и является одной из величин, которые тре-
требуются в любом методе восстановления количественных дан-
данных, например в методе трех поправок.
Процедуры, которые подводят к решению этой проблемы,
имеют различные названия, например метод подбора кривых,
процедура, обратная свертке, обнажение пика, разделение пи-
пиков, многократный линейный подбор кривой методом наимень-
наименьших квадратов и т. д. Мы попытаемся пояснить их различия.
Все только что указанные процедуры начинаются с серии
данных, полученных обычно с помощью многоканального анали-
анализатора. Серия полученных данных в виде одномерного ряда на-
находится в памяти мини-ЭВМ. Следовательно, данные представ-
представлены в дискретной форме. Здесь нам необходимо согласовать
возможные трудности с терминологией. В номенклатуре много-
многоканального анализатора каждая «точка» называется «каналом»,
а «абор соседних каналов назывался бы спектром. В номенк-
номенклатуре описываемых математических методов каждый канал
называется «элементом», а набор соседних элементов называл-
назывался бы рядом или, вектором. Однако .как прецедент мы будем ис-
использовать термины «канал» и «спектр» независимо от контек-
контекста. Теяерь рассмотрим другой, ,но аналогичный спектр, также
представленный в виде одномерного ряда. Мы будем .называть
его «рассчитанным» спектром. Этот спектр можно создавать
несколькими способами. Один из них заключается в использо-
использования математической модели для раздельного описания каж-
каждого пика в спектре. В каждом канале рассчитанного спектра
вклады всех пиков в данный канал суммируются. Этот процесс
называется сверткой, и именно с помощью этого процесса мы
можем создать спектр. Математическая модель, используемая
для описания формы каждого пика, содержит, как правило, ми-
минимум 3 параметра, один — для определения амплитуды пика,
другой — для описания его ширины и третий — для описания
его положения (энергии). Чаще всего для моделирования таких
пиков используется гауссова (нормальная) кривая.
Другой способ создания спектра — соединение вместе более
простых спектров (с поправкой на средний уровень фона), по-
полученных непосредственно при измерении образцов известного
состава в известных условиях. Каждый из этих спектров назы-
называется справочным спектром. Например, если бы неизвестный
спектр получали от латуни, содержащей медь и цинк, были бы
получены два справочных спектра путем измерения образцов из
чистой меди и чистого цинка. В этом случае единственным па-
параметром, который мы должны отрегулировать, является амп-
амплитуда каждого из двух относительных спектров.

Практические методы рентгеновского анализа 121
Независимо от того, как мы получим рассчитанный спектр —
либо с использоваиием математической модели для каждого
входящего в состав спектра пика и последующего их сложения,
либо регистрируя несколько более простых спектров, каждый
из которых пересчитывается в масштабе и затем складывает-
складывается, — необходимо выработать критерий того, насколько близко
соответствие рассчитанного спектра и неизвестного. Кроме того,
необходима процедура для регулирования различных парамет-
параметров, чтобы обеспечить «наилучшую» подгонку. Именно по этой
процедуре, посредством которой регулируются параметры, от-
отличаются главным образом различные методы, используемые
для обеспечения спектральных наложений. Мы подробно обсу-
обсудим 'несколько наиболее широко используемых методов и общие
для всех методов проблемы. Прежде чем приступить к изложе-
изложению отдельных методов, сначала дадим определение линейно-
линейности, а затем обсудим критерий, чаще всего используемый для
решения вопроса о том, является ли данный метод подгонки
к серии спектральных пиков «наилучшим».
8.3.1. Линейность
Все процедуры, относящиеся к проблеме изоляции одного
пика от эффектов влияния других пиков, можно разделить на
две категории: линейные и нелинейные. Нам требуется дать
определение линейности, так как оно используется в вышеопи-
вышеописанной проблеме. Линейность (или нелинейность) — это свой-
свойство подгоночных параметров. Если все параметры, которые из-
изменяют для получения наилучшей подгонки в данной процедуре,
используются мультипликативно или аддитивно, то процедура
является линейной. Такое определение применимо только к дей-
действительно изменяемым параметрам. Могут быть другие пара-
параметры, используемые нелинейным образом, но, пока они остают-
остаются фиксированными в процессе подгонки к истинному пику, про-
процедура остается линейной. Пример поможет объяснить это
утверждение.
Профиль характеристического рентгеновского пика, получен-
полученного с помощью спектрометра с дисперсией по энергии, хорошо
аппроксимируется гауссовой (нормальной) функцией распреде-
распределения вероятности. То есть содержимое У< любого данного ка-
канала, включающего данную гауссову кривую, можно рассчитать
по формуле
Yt = Лп ехр [ -A /2) (Еп- ?,.J/а21, (8.11)
где Ei — энергия (выраженная в соответствующих энергетиче-
энергетических единицах, например электронвольтах) 1-го канала; Е„ —
энергия (в тех же единицах) центра кривой и А„ — ампли-
амплитуда кривой в центре. Следует отметить, что центр кривой

122 Глава 8
не должен совпадать по энергии со средней энергией любого
данного канала. Параметр а представляет собой ширину кривой
(снова в тех же единицах, что и ?,). Из трех параметров Ап, Е„
и а линейным является только А„, так как он является предэкс-
поненциальным членом. Следовательно, любая процедура, в ко-
которой используется гауссова кривая я изменяются ширина и/или
положение центра кривой в процессе подгонки, является нели-
нелинейной. Имеет смысл отметить одно исключение. Если ведется
подгонка только одного пика, можио взять натуральный ло-
логарифм как от неизвестного спектра, так и от уравнения (8.11)
и после соответствующих алгебраических манипуляций полу-
получить новую совокупность параметров, которые являются линей-
линейными. Эти параметры можно снова преобразовать в исходные
после того, как подгонка будет закончена.
8.3.2. Качество подгонки
Нам нужен критерий качества для процедуры подгон-
подгонки к данному пику в конкретном применении. Иначе го-
говоря, необходима величина, которая даст ответ на вопрос, на-
насколько близко рассчитанные нами пики соответствуют пикам
неизвестного спектра? Широко используется критерий %2. Сово-
Совокупность параметров, используемых в данной процедуре под-
подгонки, которая заставляет %2 принимать минимальное значение,
будет представлять собой совокупность с максимальным прав-
правдоподобием того, что эти параметры являются точными. Кри-
Критерий х2 можно разумно аппроксимировать следующим функ-
функциональным выражением:
f ^^(Yt-Xy/Xi, (8.12)
где У,- —• содержимое t-ro канала неизвестного спектра и Xt —
объем i-ro канала рассчитанного спектра. Чтобы уравнение та-
такого вида описывало собственно %2. требуется: 1) чтобы повтор-
повторные измерения У, для данного канала i были распределены «ор-
мально с истинной дисперсией Хг, 2) чтобы уравнение, которое
мы выбрали для описания пика (ов) (или справочного спектра,
который мы выбрали), являлось точным представлением во всех
аспектах (например, математическая функция должна вклю-
включать любые искажение пика, например из-за неполного заряда
и т. д.). При многих условиях подгонки пика вышеуказанные
условия достигаются с достаточной точностью, так что минималь-
минимальное значение уравнения (8.12) будет означать, что совокупность
подгоночных параметров, которые обеспечивают минимум, будет
представлять собой наилучшим образом выбранные параметры.
Заметим, что, поскольку мы возводим в квадрат разность двух

Практические методы рентгеновского анализа 123
спектров, значение х2 более чувствительно к большим разно-
разностям, чем к малым.
Полезной модификацией уравнения (8.12) является норми-
нормированная %2:
1=1
где М — число каналов, используемых при подгонке, и f — чис-
число параметров, используемых три подгонке (т. е. А„, а, Ев).
Сравнение (8.13) применимо для области значений %2, которые
будут получены с его помощью. При х2«1 подгонка по суще-
существу оптимальная, а для значений %2^>1 подгонка неудовлет-
неудовлетворительна. Для высококачественного спектра с низким уров-
уровнем шума значение х2 больше 100 означало бы неудовлетвори-
неудовлетворительную подгонку.
8.3.3. Линейные методы
Как сказано ранее, линейность требует, чтобы в процессе
подгонки изменялись только те параметры, которые использу-
используются мультипликативно или аддитивно. Простой аддитивный
параметр перемещает пик или спектр относительно вертикаль-
вертикальной оси (амплитуды) и, следовательно, используется главным
образом для приведения в соответствие среднего уровня фона,
если фон был бы включен в процедуру подгонки. Хотя и можно
включить фон вместе с рентгеновскими пиками, однако это
приведет к чрезмерному усложнению математических расчетов
и, кроме того, может вызвать проблему в сходимости и суще-
существенно увеличить время вычислений. Следовательно, как сказа-
сказано ранее, мы предполагаем, что средний уровень фона сначала
вычитается из спектра, прежде чем мы попытаемся избавиться
от спектральных наложений.
Кроме сложения другим возможным методом, которым мож-
можно ввести параметр в выражение и- сохранить свойство линейно-
линейности, является умножение. Практическое следствие умножения
состоит в том, что в процедуре линейной подгонки могут быть
определены только амплитуды пиков. На первый взгляд кажет-
кажется, что это строгое ограничение, так как оно требует от нас за-
заранее знать точную калибровку по энергии нашей спектромет-
спектрометрической системы (т. е. точное положение каждого пика в спек-
спектре) и точную ширину каждого пика.
Приписывание значений любому из этих параметров (осо-
(особенно положению пика), которые отличаются от соответствую-
соответствующих значений в нашем рассчитанном спектре, приводит к тому,
что амплитуды некоторых или всех пиков будут определены не-

Ш Глава 8
точно в процессе подгонки. К счастью, стабильность, линейность
и скорость счета в современных спектрометрических системах
в основном отвечают высоким требованиям, если принять опре-
определенные меры предосторожности (гл. 5).
8.3.3.1. Многократный линейный подбор методом
наименьших квадратов
Наиболее популярным линейным методом является много-
многократный линейный подбор методом (Наименьших квадратов.
Предположим, что у нас есть .некоторое количество каналов i,
содержащих измеренный, скорректированный на фом спектр, со-
состоящий из N перекрывающихся пиков и содержащий У, им-
импульсов в каждом канале. Далее предположим, что «рассчи-
«рассчитанный спектр» состоит из N соответствующих пиков. Каждый
пик описывается гауссовой кривой (8.11), для которой мы
должны оценить наилучшим образом ширину и энергию. Рас-
Рассчитанный спектр математически можно описать выражением
---?г)/а„]2}, (8.14)
где AN — амплитуда, EN — энергия и а# — параметр ширины
для каждого пика N и ?,—энергия каждого t-ro канала в рас-
рассчитанном спектре. EN, Ei я on имеют размерности энергии
(обычно эВ и кэВ). Нам нужно найти совокупность амплитуд
An, таких, чтобы имело место максимально близкое соответст-
соответствие между рассчитанным и измеренным спектрами. Содержание
Yi каждого канала в измеренном спектре будет иметь ошибку
А У;, обусловленную статистикой счета Пуассона. Эта ошибка
пропорциональна (У,-I'2. Так как каналы, расположенные близ-
близко от центра пика, могут содержать значительно большее коли-
количество импульсов, чем каналы, расположенные на спадах пика,
на практике обычно результат каждого канала вводится с ко-
коэффициентом, так что любой канал имеет приблизительно оди-
одинаковое влияние в процедуре подгонки. Весовой коэффициент Wi
обычно выбирается таким образом, чтобы он был пропорциона-
пропорционален величине 1/(АУ,J, которая равна 1/У<\ Принцип наимень-
наименьших квадратов гласит, что «наилучшей» совокупностью пара-
параметров An будет такая, которая минимизирует величину
*" (8.15)
где GNi—гауссова кривая — экспоненциальная часть в (8.11).
Желаемую совокупность AN можно найти следующим способом.
Последовательно продифференцируем уравнение (8.15) относи-

Практические методы рентгеновского анализа 125
тельно каждого AN. В результате получим совокупность N урав-
уравнений вида
2M°*'^'l. (8Л6)
Приравнивая каждое из них нулю, получим систему уравнений
(которые можно назвать «совместными» уравнениями), что
позволяет нам найти желаемый минимум. Одним из способов
решения системы уравнений является обратное преобразование
матрицы. Уравнение (8.16) можно записать в матричном виде
[В]Х[А] = 1С], (8.17)
где Bmn='2iGmiGniWi и Cm = y\GmiYiWi. Индексы тип относят-
i i
ся к строкам и столбцам матрицы. Следовательно, мы можем
найти «наилучшую» совокупность амплитуд AN из выражения
Следует отметить, что совокупность An получена аналитиче-
аналитически. То есть мы определили совокупность уравнений, дающих,
после решения единственный ответ, который «с наибольшей
вероятностью» (в статистическом смысле) является правиль-
правильным. Свойство' аналитичности является основным различием
между линейными и нелинейными методами подгонки пиков.
В нелинейных методах у нас нет замкнутой системы уравнений,
которую нужно решить. Мы должны прибегать, например, к ме-
методам итераций или к поисковым процедурам, чтобы получить,
нужный ответ. Следует, однако, всегда помнить, каким образом
достигнута линейность. Мы сделали довольно четкое предполо-
предположение о том, что хорошо известны ширина и положение каж-
каждого пика в наблюдаемом спектре. Определение этих параметров
с требуемой точностью вполне возможно, но это далеко не три-
тривиальная задача.
В данном описании «рассчитанный» спектр строится из про-
простых гауссовых кривых. Можно было бы использовать и другие-
функции, например слегка модифицированную гауссову кривую,
для учета небольших отклонений от истинно гауссовой формы
низкоэнергетичеекой стороны наблюдаемых рентгеновских пи-
пиков (описано в следующем разделе). Для построения «рассчи-
«рассчитанного» спектра можно было бы использовать справочные (из-
(измеренные на образцах) спектры, а не функции. Наконец, как
измеренные, так и рассчитанные спектры можно было бы ис-
использовать после проведения цифровой фильтрации. Основная
цель в применении цифрового фильтра заключается в том, что-
чтобы избавиться от среднего фона. При применении цифрового-
фильтра к спектру форма рентгеновских пиков изменяется or

126 Глава 8
почти гауссовой до кривой, описываемой сглаженной второй
производной гауссовой кривой (рис. 8.11). Ни применение
цифрового фильтра, ни использование функций, отличных от
гауссовой, не влияют на «линейность» обсуждаемого здесь ме-
метода. Во всех случаях определяемым параметром является ам-
амплитуда п»ка, и она представляет собой линейный параметр
даже в случае спектров после цифровой фильтрации.
8.3.3.2. Метод коэффициентов перекрытия
Одним «з простейших линейных методов является метод ко-
коэффициентов перекрытия. В этом методе мы не используем
весь спектр канал за каналом, как это делали, например, при
многократном линейном подборе кривой по методу наименьших
квадратов. Вместо этого мы суммируем содержание группы со-
соседних каналов, которые несут рентгеновский пик. Эту группу
каналов мы будем называть «интересующей нас областью».
Большинство многоканальных анализаторов обеспечивает спо-
способ (либо заложен в самом приборе, либо за счет программи-
программирования) прямого разделения таких интересующих нас обла-
областей. Расчет суммарной интенсивности в интересующей обла-
области эквивалентен численному интегрированию методом Симп-
сона по области спектрального пика. Следовательно, каждый
рентгеновский пик можно полностью охарактеризовать тремя
числами — нижним и верхним пределами области интегрирова-
интегрирования и просуммированным содержанием. Всего три числа! вместо
20—40 чисел (местоположение каналов и их содержание), тре-
требуемых для описания одного пика при многократном линейном
подборе методом наименьших квадратов.
Метод коэффициентов перекрытия был разработан первона-
первоначально в [224] для разрешения перекрывающихся кривых на
выходе пропорционального счетчика. Принцип его действия за-
заключается в следующем. Сначала предположим, как объясня-
объяснялось ранее, что в нашем спектре проведена коррекция «а сред-
средний уровень фона. Если у 1нас имеется i взаимно накладываю-
накладывающихся спектральных пиков и jV,-7" есть общее количество: импуль-
импульсов, обусловленное вкладом всех пиков в интересуемой обла-
области i, то мы можем записать систему совместных уравнений
вида
WC*. (8-19)
В этом уравнении Nf — количество импульсов в t-й области,
обусловленное измерением на чистом элементе i\ kt и к,- — отно-
относительные интенсивности от элементов i, / и т. д. в нашем неиз-
неизвестном образце; Njp — количество импульсов в /-й области,

Практические методы рентгеновского анализа
127
5,875
6,000
Энергия, кэв
6.125
Рис. 8.13. Рассчитанные на мини-ЭВМ три спектральных пика (штриховые
линии) и их свертка (сплошные линии).
Жирными линиями отмечены соответствующие области (см пйъисчение в тексте).
обусловленное измерением на чистом элементе /, и С;,- — «ко-
«коэффициент перекрытия» или часть числа импульсов в t'-й обла-
области, определяемая из измерения на чистом элементе /. Величи-
Величины ki, kj и т. д. представляет собой относительные интенсивно-
интенсивности k, требуемые в программе коррекции данных методом трех
поправок. Система совместных уравнений (8.19) может быть
решена для данной совокупности значений алгебраическими
методами. Следующий пример продемонстрирует простоту и
эффективность этого метода.
Предположим, что у нас есть три взаимно влияющих друг
на друга гауссовых пика, отстоящих друг от друга «а 125 эВ.
Цеитры пиков 'расположены три анергиях 5875, 6000 и 6125 эВ
соответственно, и пики имеют соответствующую ширину при ре-
регистрации их детекторов с разрешением 160 эВ на линии МпКсг.
Эти пики (штриховые линии) и их свертка (сплошная линия)
показаны на рис. 8.13. Жирными линиями отмечены области,,
представляющие интерес. Пусть центр интересуемой области
для каждого пика расположен под центром пика, и ее ширина
составляет 100 эВ. Предположим, что при измерении на каждом
чистом элементе и на неизвестном материале получаем такое
количество импульсов в трех областях, которые приведены в

128 Глава 8
Таблица 8.2. Содержание
Количество импульсов от
Чистого элемента 1
Чистого элемента 2
Чистого элемента 3
Неизвестного образца
интересуемых областей, показанных
Диапазон энергий.
5825—5925
17466
4 454
68
6 598
5955—6055
3 941
17 344
4 998
6 704
на
эВ
рис. 8.13
6075—6175
61
4 454
17 298
9412
табл. 8.2. Используя давиые табл. 8.2, можем переписать си-
систему (8.19) в виде
(элемент 1) 6598 =
= &J ¦ 17 466+?2 ¦ 17 344- 0,257 -j-&3•17 298- 0,0039,
(элемент 2) 6704 =
(элемент 3) 9412 =
= &! • 17 466 ¦ 0,0035+&2 ¦ 17 344 ¦ 0,257-{-kr 17 298.
¦Совместное решение этих уравнений дает ki = 0,333 k2 = 0,167 и
из = 0,5.
На практике взаимное влияние в спектре часто является зна-
значительно более сложным, чем в предыдущем примере. Рентге-
Рентгеновские линии обы.чно состоят из серий, и часто имеется ие
просто пик, который мы измеряем и на который влияет дру-
другой интересующий вас пик, а другой член серии первого пика.
Более того, иг всегда возможно получить чистые элементы или
простые эталоны, по которым можно определить коэффициенты
перекрытия. К счастью, метод может быть развит далее с целью
преодоления этих трудностей [211, 225]. Описанный в [211] ме-
метод используется в программе FRAME С для восстановления
данных, полученных с помощью спектрометра с дисперсией по
энергии [144], которую мы кратко изложим здесь.
В основе метода FRAME С лежит [расчет коэффициентов
перекрытия, а не измерение их. Преимущество расчета заклю-
заключается в его гибкости, поскольку ширину и положение каждой
интересуемой области можно изменять без необходимости по-
повторных измерений. Наиболее важным является то, что этало-
эталонов не требуется. Коэффициенты расчитываются путем фор-
формального интегрирования функции Гаусса, которая модифици-
модифицирована с тем, чтобы учесть эффекты, обусловленные неполным
¦сбором заряда. Одна рентгеновская линия (котирую мы будем
называть аналитической линией) от каждого элемента сосредо-
сосредоточена в определенной области и используется в расчете по ме-

Практические методы рентгеновского анализа
129
канала —»•
Рис. 8.14. Два неразрешенных спектральных пика, демонстрирующих пере-
перекрытие.
Перекрытие пика Л в области пика В представлено заштрихованной площадью.
тоду трех поправок для определения состава образца. Вое ли-
линии других серий данного элемента в любой последовательности
рассматриваются для того, чтобы определить, есть ли наложе-
наложение линий с соответствующими областями аналитических линий
других интересуемых элементов.
Если рентгеновский пик расположен близко от соответствую-
соответствующей области другого пика, то часть пика, попадающая в эту
область, будет зависеть только от относительного положения
пиков и области и среднеквадратичного отклонения пика. Эта
часть не зависит от состава образца. Если пик, оказывающий
влияние, также является аналитическим пиком и, следователь-
следовательно, имеет собственную представляющую интерес область, то
часть этого пика, находящаяся в пределах его собственной об-
области, также не зависит от состава. Следовательно, отношение
этих двух частей (коэффициент перекрытия) .рассчитывается
один раз в начале процедуры ,и запоминается для всех после-
последующих измерений. Мы будем развивать аргументацию на при-
примере двух неразрешенных пиков А я В (рис. 8.14). Опишем
только расчет коэффициента перекрытия, обусловленного влия-
влиянием пика А иа интенсивность под шиком В, но метод можно
было бы повторить и для пика В.
Пусть Еа — энергия, соответствующая центру пика А, я Ев —
энергия, соответствующая центру пика В. Мы можем рассчитать

130 Глава 8 >___
среднеквадратичные отклонения оа и вв в зависимости от Ед и
Ев [109], если полуширина пика была измерена для пика с
любой энергией (например, Мпка). Количество импульсов, обус-
обусловленное вкладом пика А в любой канал ?;, равно
h\ = АА ехр{-A/2) ЦЕЛ-Е,уаА]Л}, (8.21)
где ЕА — энергия, соответствующая центру пика А, а Ад — ко-
количество импульсов в узком канале (шириной ^10 эВ), содер-
содержащем ЕА.
Следовательно, количество импульсов Na в интервале от Е\
до Е2, определяющих область для элемента А, равно
<Ш„ (8.22)
в то время как количество импульсов пика А в интервале энер-
энергий от Е3 до Еа внутри области для элемента В равно
Е\
NAB = AA |'ехр{^A/2)[(?л-?0^л12}^- (8-23)
Е»
Коэффициент перекрытия Я пиков А я В определяется из вы-
выражения
HAB = NABlh\. (8.24)
Для того чтобы определить количество импульсов, обусловлен-
обусловленных вкладом пика А в область пика В, число импульсов пика А
в интервале энергий от Е\ до Е2 умножаетося на этот фактор.
Другой тип вза.им«ого влияния имеет место в том случае,
когда пик от элемента А, не используемый для восстановления
данных, например Кр-линия, попадает в область, выбранную
для элемента В (рис. 8.15). В этом случае для определения ин-
интенсивности пика элемента А, оказывающего влияние на пик В,
следует использовать число импульсов в пределах области ана-
аналитического пика элемента А. Если аналитическая линия эле-
элемента А и оказывающая влияние линия элемента А обе генери-
генерируются в результате ионизации одной и той же оболочки или
подоболочки, их генерируемые интенсивности относятся как со-
соответствующие относительные вероятности переходов (или ста-
статистические веса линий). Вероятность перехода ф есть интенсив-
интенсивность интересуемой линии /, деленная на сумму интенсивностей
S/ всех остальных линий серии, имеющих один ,и тот же край
поглощения. На величины детектируемых интенсивностей ока-
оказывают влияние относительные коэффициенты поглощения и эф-

Практические методы рентгеновского анализа
131
Рис. 8.15. Пример взаимного влияния пиков, которое может иметь место,
когда пик от элемента А попадает в область (от Еъ до ?4), выбираемую
для элемента В.
фиктивность детектора при соответствующих энергиях. Отноше-
Отношение величин детектируемых интенсивностей Di равно
/ = (Флр/Фа,)
э)// (АКа)} [{РЕ (АЧIРЕ (АКа)} > (8.25)
где флр=/(Лка3)/2/(Лк)—вероятность перехода для Ака^ -линии,
}{Акао)—соответствующий фактор поправки на поглощение и
Ре — эффективность детектора при энергии Е. Так как коэффи-
коэффициент поглощения / является функцией состава образца, проце-
процедуру коррекции перекрытия следует включить в 'Итеряциоиную
схему метода трех поправок. Число импульсов в области
пика В, обусловленное дополнительным шиком элемента Л,
¦Млр.в можно рассчитать по формуле
G4
jexp{-0/2)
E3
(8.26)

132 Глава 8
где значения всех членов были описаны выше. Пределы .инте-
.интегрирования ?V—Е4 обозначают область для пика В. Заштри-
Заштрихованная область на рис. 8.15 представляет собой интенсивность
Na$,b, которую следует вычитать из интенсивности в области
пика В. Для расчета коэффициента перекрытия Нла, В значение
Na p, в из уравнения (8.26) подставляется в уравнение (8.24).
Имеется еще несколько случаев перекрытия пиков, которые
встречаются в анализе. Эти случаи включают: 1) 'наложение ли-
линий, когда дополнительная линия элемента А, влияющая на
элемент В, возникает в .результате возбуждения другой подо-
болочки, отличной от анализируемой линии элемента А, напри-
например Lai-—Lpx; 2) наложение линий, когда линия (и) другой серии
элемента А влияет на элемент В, например измеряемая линия
Ziua, но Zrua влияет на Na^, и 3) пик потерь кремгаия анали-
анализируемой линии элемента А влияет .на линии элемента В. Мате-
Математические методы для решения таких случаев описаны в [144].
В начале обсуждения метода коэффициентов перекрытия мы
отметили, что каждый рентгеновский пик можно охарактеризо-
охарактеризовать тремя величинами: нижним и верхним пределами области
и ее содержанием. Этот факт, а также дополнительное свойство,
заключающееся в том, что в методе коэффициентов перекрытия
требуется относительно малое число простых арифметических
действий, обеспечивают наиболее привлекательные характери-
характеристики метода: простоту и скорость. Для метода коэффициентов
перекрытия требуется минимальный объем памяти мини-ЭВМ,
и его действие минимум в десять раз быстрее, чем любого дру-
другого описанного метода. Как и для всех линейных методов,
для него необходимо, чтобы спектрометрическая система была
хорошо откалибрована. Для рентгеновских ликов, которые пере-
перекрываются значительно (например, РЬмаи SKa), метод дает худ-
худшие результаты применительно к тем процедурам, которые ис-
используют информацию в каждом канале по перекрывающейся
части спектра.
8.3.4. Нелинейные методы
В предыдущем разделе мы видели, что главным достоинст-
достоинством линейных ^методов является их аналитичность. Для полу-
получения требуемой информации нам надо только решить систему
уравнений. Восстановленные с помощью процедуры линейной
подгонки значения амплитуд являются единственными и наибо-
наиболее вероятными правильными значениями. Как и, всюду, за все
приходится платить, и исследователь платит за линейность ко-
коэффициента усиления тем, что должен обеспечить процедуру
подгонки информацией о ширине и положении всех пиков, а не

Практические методы рентгеновского анализа 133
наоборот. В линейной процедуре эта информация используется
без изменений, так как она по определению является точной.
Однако следует допустить, что 'исследователь не может быть
воегда уверен в своем точном знании ширины «¦ положения пика,
и эти величины наряду с амплитудой следует отнести к величи-
величинам, которые должны быть определены с помощью процедуры
подгонки. Обычно как линейная, так и нелинейная подгонки
действуют хорошо и каждая имеет области наилучшего приме-
применения. Хотя нелинейные методы и дают возможность определить
иные подгоночные параметры кроме амплитуды, однако за это
приходится платить тем, что- здесь мы имеем дело с процедурой,
которая не является аналитической, и можно получить ответ,
который будет неверным, если не соблюдать определенные меры
предосторожности. В следующем разделе мы более детально
опишем один из методов, используемых в настоящее время, —
последовательвый оимплекс-метод.
Последовательный симплекс-метод является процедурой, ко-
которая может использоваться для выбора серии независимых
переменных в математическом выражении, которые делают вы-
выражение «наилучшей» подгонкой (в статистическом смысле)
к серии точек данных [226, 227].
В этой процедуре каждая из п независимых переменных в
функции, которая подгоняется, приписывается оси в и-мерной
системе координат, и симплекс определяется как геометриче-
геометрическая фигура, состоящая из (я+1) векторов [мы будем исполь-
использовать чисто математическое определение вектора, т. е. упо-
упорядоченного /г-мерного набора действительных чисел (Хи Х2, ...
..., Хп)]. В одномерном случае симплекс представляет собой отре-
отрезок линии, в двумерном — треугольник и в случае трех или бо-
более измерений — полиэдр, вершинами которого являются выше
отмеченные (я+1) векторы. Симплекс перемещается относи-
относительно системы независимых переменных, которые оптимизиру-
оптимизируют подгонку согласно совокупности специальных правил. Функ-
Функция, используемая для определения качества подгонки для
любой совокупности независимых переменных, называется
«функцией отклика».
Для демонстрации сущности метода приведем простой при-
пример. Рассмотрим задачу о проведении кратчайшей прямой через
совокупность точек данных. Прямая линия определяется двумя
числами: m — наклоном линии и Ь — пересечением линии с
осью у. Уравнение прямой
y = mxjrb. (8.27)
Величины, которые мы хотим оптимизировать с помощью симп-
симплекса, — m и Ъ. Начнем процесс с оценки в лучшем случае трех

134
Глава 8
Рис. 8.16. Иллюстрация процедуры симплекса.
Графически построены «истинная» прямая и три оценочные прямые. Каждая линия ха-
характеризуется собственным наклоном т и пересечением с осью у—b. y = mx+b; R =
у 2
линий, каждая из которых имеет свой собственный .наклон mi
и пересечение с осью у—hi (рис. 8.16). Каждую из этих трех
прямых можно охарактеризовать вектором (аи,-, Ы) в плоскости
т, Ъ. Три вектора образуют на плоскости симплекс — треуголь-
треугольник в даяном случае. Если провести третью ортогональную ось,
представляющую «функцию отклика», поиск симплекса можно
визуализировать (рис. 8.17). Поиск происходит путем рас-
расчета отклика над каждым полюсом симплекса, отбрасыванием
полюса, имеющего максимальный (наихудший) отклик, и отоб-
отображением этой точки через линию, соединяющую оставшиеся два
полюса. Этим определяется новый симплекс, и процесс повторя-
повторяется до тех пор, пока не будет достигнут главный минимум иа
поверхности отклика.

Практические методы рентгеновского анализа
135
Рис. 8.17. Поверхность отклика, показывающая симплекс и его проекцию в
пространстве факторов.
Главный минимум находится в точке, отмеченной звездочкой.
Проблема подгонки прямой линии к совокупности точек
данных является, конечно, проблемой линейной. Однако метод
последовательного симплекса представляет собой организован-
организованную процедуру для поиска минимума на поверхности отклика
и применяется независимо от того, линейна ли функция, описы-
описывающая совокупность данных, относительно своих коэффициен-
коэффициентов или нет. Если коэффициенты являются линейными или их
можно сделать линейными с помощью соответствующих преоб-
преобразований, процедура метода .наименьших квадратов может
быть выполнена аналитически. В этом случае процедуру поиска
можно было бы те использовать, и она приводится здесь толь-
только с целью объяснения.

136 Глава 8
Сейчас нам требуется функциональное описание рентгенов-
рентгеновского пика точно такое, как требовалось в лилейной процедуре.
Мы можем снова (использовать аддитивную комбинацию N гаус-
гауссовых кривых (8.14). Процедура подгонки включает в себя рас-
расчет функции, которая сравнивается затем с экспериментальными
точками. Цель использования функции отклика заключается в
том, чтобы обеспечить меру качества подгонки к эксперимен-
экспериментальным данным. В качестве функции отклика можно использо-
использовать .нормализованную функцию х2 [уравнение (8.13)].
Из выражения (8.11) видно, что 'независимые переменные
(коэффициенты) Ап, Е„, ап следует определять для каждого
пика. Следовательно, общее число коэффициентов п в три раза
больше числа пиков N. В данном случае для создания началь-
начального симплекса выбираются значения для (п+1) -совокупности
коэффициентов, и отклик R (рис. 8.17) определяется для каж-
каждой совокупности.
В [228] были разработаны различные упрощения, позволяю-
позволяющие уменьшить количество подгоночных коэффициентов. По-
Поскольку энергии рентгеновских линий хор-ошо известны, они вво-
вводятся как известные величины и излишне вводить все центры
пиков как коэффициенты. Как коэффициент используется только
энергия главного пика для того, чтобы скорректировать малые
сдвиги в энергии, обусловленные неправильной калибровкой
электронной системы спектрометра с дисперсией по энергии.
Стабильность и линейность современных усилителей допускают
такое предположение. Кроме того, следует учитывать ширину оп
главного пика, так как значения ширины других пиков at связа-
связаны с стп (для Si (Li)-детектора [109]):
?п) + B355стпJ]1/2/2,355 (КЭВ). (8.28)
Число требуемых коэффициентов поэтому уменьшается от 3N
до N-\-2. Следовательно, для каждого дополнительного пика, ис-
используемого в подгонке, следует рассматривать только на один
коэффициент (амплитуду) больше. Поскольку значения энергии
и ширины для малых неразрешенных пиков определяются как
функции главного пика, вероятность получения ложного мини-
минимума значительно уменьшается. Кроме того, достигается суще-
существенная экономия расчетного времени.
Трудности, обычные для всех методов минимизации, заклю-
заключаются в том, что существует вероятность получения локаль-
локального минимума прежде главного. С увеличением числа подгоняе-
подгоняемых пиков появляется вероятность нахождения ложного мини-
минимума. Следовательно, симплекс следует 'начинать ближе к един-
единственной совокупности коэффициентов, определяющих главный
минимум, чем к совокупности, определяющей локальный (лож-
(ложный) минимум.

Практические методы рентгеновского анализа
8.3.5. Оценка ошибок
Целью этого раздела является краткое обсуждение различ-
различных ошибок, которые встречаются при коррекции спектральных
наложений. Под «ошибкой» мы понимаем различие между
истинной и рассчитанной амплитудами. Мы должны рассмотреть
два типа ошибок. Во-первых, имеются неизбежные ошибки,
обусловленные фундаментальными статистическими ограниче-
ограничениями и неадекватностью наших алгоритмов. Этих ошибок, в
общем, избежать нельзя, но часто можно их рассчитать или по
крайней мере оценить. Второй тип ошибок — эксперименталь-
экспериментальные ошибки. Этих ошибок часто можно избежать, но, вообще
говоря, нельзя рассчитать. Примерами второго типа ошибок
являются несовершенное вычитание среднего уровня фона, ис-
искажение спектральных пиков за счет электрических наводок за-
заземления, прямое попадание отраженных электронов в детектор
и т. д.
Информация об амплитуде, которую мы получаем, редко
является конечным результатом. Эта информация передается дру-
другой процедуре, кото-рая принимает во внимание матричные эф-
эффекты в образце и эталоне (например, программа восстановле-
восстановления данных методом трех поправок). Как мы видели в гл. 7,про-
7,программы коррекции матричных эффектов сами имеют собственные
ошибки, которые квадратурно складываются с ошибками изме-
измерения амплитуды шика. Вклад коррекции спектральных нало-
наложений в ошибку измерения амплитуды пика всегда будет больше,
чем тот, который ожидается на основании только статисти-
статистики счета. Дополнительная ошибка, обусловленная только про-
процессом выделения, часто может подавить все остальные ошибки
в количественном рентгеновском микроанализе. Можио, без сом-
сомнения, утверждать, что при прочих равных условиях количест-
количественный анализ с использованием спектров без спектральных
наложений всегда лучше .анализа по спектрам, в которых при-
присутствуют спектральные наложения. Теоретическое описание
ошибок, связанных с выделением пика, приведено в [229].
При обсуждении многократного линейного подбора методом
наименьших квадратов мы отмечали, что одним из способов
найти «наилучшую» совокупность амплитуд Ап являлось реше-
решение матр-ичного уравнения
[В]Х[Л| = [С] (8.29)
методом инверсии матрицы
[Л] = [5-»]х[С]. (8.30)
Матрицу [В1] часто называют матрицей ошибок, поскольку
ее диагональные члены, обозначаемые Вц-\ обладают полезным

133 Глава 8
свойством:
огм~Вп-\ (8.31)
где e2Ai — среднеквадратичное отклонение для t-й амплитуды.
Следовательно, у нас есть простой способ оценки качества .на-
.нашей подгонки на примере каждого пика. Если имеется N пиков,
у нас будет N оценок неопределенности, по одной для каждой
амплитуды, восстановленной с помощью подгонки. Обычно не-
неопределенность, связанная с выделением наложенных спектраль-
спектральных пиков, быстро увеличивается по мере уменьшения количе-
количества импульсов под любым даиным пиком ,и/иди по мере умень-
уменьшения расстояния между пиками. В некоторый момент неопре-
неопределенность становится такой большой, что спектральное выделе-
выделение становится опасным.
Рассмотрим проблему определения истинной высоты пика
для двух близко расположенных перекрывающихся пиков, та-
таких, как показало на рис. 8.12. Исследователь, пользующийся
одним из методов выделения, получит в результате совокуп-
совокупность рассчитанных значений амплитуд и связанное с ними зна-
значение х2- Поскольку это значение х2 является предположительно
минимальным в совокупности х2, это указывает на то, что амп-
амплитуды пиков должны быть подобраны наилучшим образом. Мы
можем рассчитать %2 для ряда амплитуд пиков, а затем иссле-
исследовать так называемую • поверхность %2 для определения того,
«насколько чувствителен параметр х2 к выбору истинной ампли-
амплитуды пика. На рис. 8.18 и 8.19 показаны такие поверхности %2,
рассчитанные для случая двух пиков, отстоящих друг от друга
на 50 эВ, центры которых находятся при энергиях 5,0 и 5,05 кэВ,
полученных с помощью детектора с разрешением 150 эВ на ли-
линии Mn*a. R представляет собой значение х2. которое получает-
получается для таких выбранных значений амплитуд пиков А и В. На
рис. 8.18 истинные амплитуды пиков равны и составляют
1000 импульсов, а на рис. 8.19 отношение истинных амплитуд
равно 5:1 A000 импульсов : 200 импульсов). Значение х2> об-
обложенное по оси Я на этих рисунках, определено сравнением
значений кривой гипотетического состава, полученной для каж-
каждого выбора амплитуд А и В. Из обоих графиков можно ви-
видеть, что четко выраженный минимум в поверхности отклика
отсутствует. Вблизи от истинного решения находится длинная
плоскодонная долина. Таким образом, используя критерий мини-
минимизации х2. невозможно определить с достаточной достоверно-
достоверностью истинное решение. С учетом неопределенности, обуслов-
обусловленной статистикой счета, поверхность х2 имела бы выемки с
локальными ложными минимумами, делая тем самым выбор
истинного решения еще более трудным.

Практические методы, рентгеновского анализа
139
Рис. 8.18. Псевдотрехмериое изобра-
изображение поверхности отклика %2 для
проведения процедуры обратной
свертки для двух пиков равной ам-
амплитуды.
Пикн отстоят друг от друга на 50 эВ. Ие-
тиииое решение обозначено жирной точкой.
Расчет выполнялся варьированием ампли-
амплитуды пика при постоянных значениях СУ и
энергии пика.
Рис. 8.19. Псевдотрехмерное изобра-
изображение поверхности отклика %2 для
проведения процедуры обратной
свертки для двух пиков с отношени-
отношением амплитуд 5:1.
Пики отстоят друг от друга иа 50 эВ. Ис-
Истинное решение обозначено жирной точкой.
Расчет выполнялся варьированием ампли-
амплитуды при постоянных з-иачеииях а и энер-
энергии пика.
Эта дискуссия демонстрирует, что методы спектрального вы-
выделения не имеют широких возможностей. Проблема разделения
перекрывающихся пиков, таких, как SKa B,308 кэВ) и РЬма
B,346 кэВ), является исключительно трудной и вообще нере-
шаемой. Существует, к сожалению, общепринятое мнение, что
методы, которые мы обсуждали, имеют неограниченные возмож-
возможности для точного определения амплитуды пика независимо от
того, насколько велико перекрытие и/или насколько мало коли-
количество импульсов в пиках. Имеиво по этой причине некоторая
мера ожидаемой ошибки (такой, как матрица ошибок) для от-
отдельных пиков имеет такое важное значение.
Обычно вое линейные методы обеспечивают простое средство
для опенки ошибки, связанной с подгонкой, для каждого пика
посредством матрицы ошибок. Нелинейные методы, с другой
стороны, не имеют подходящей методики для оценки ошибок
отдельных пиков. Следует отметить, что как линейные, так и не-
нелинейные методы дают единственную меру ошибки, связанной
с общей подгонкой по всем пикам. Этой мерой является просто
нормализованная функция %2n. Однако х2лг не несет информации
об ошибках, связанных с отдельными пиками, которые, нала-
гаясь друг на друга, создают спектр. Надо отметить, однако, что
матрица ошибок в линейных методах обоснованна только тогда,
когда удовлетворяются условия, допускающие предположение
о линейности. То есть мы точно знаем ширину каждого пика и

ЙО Глава S
положение его в нашем спектре. Если мы ошибочно определяем
одну или обе <из этих величин, величины амплитуд, определяе-
определяемые в процессе подгонки, будут иметь ошибку, и матрица оши-
ошибок не отразит это отклонение.
В заключение в этом разделе обсуждались (некоторые ошиб-
ошибки, связанные с выделением спектральных перекрытий. Несколь-
Несколько методов, (Имеющихся в настоящее время, дают хорошие ре-
результаты при умелом использовании, но вое они имеют о грани-
чадные возможности. Исследователь должен змать об этих
ограничениях.
8.4. КОРРЕКЦИЯ МЕРТВОГО ВРЕМЕНИ
Для получения точных значений идтенсивностей пиков сле-
следует вводить коррекцию на мертвое время, связанное с измере-
измерением рентгеновского излучения. Мертвое время представляет
собой интервал времени после попадания фотона в детектор,
в течение которого система зде может реагировать на другой им-
импульс. Мертвое время для спектрометра с дисперсией по энер-
энергии корректируется непосредственно электронными схемами об-
работки импульса в процессе спектральных измерений, как опи-
описано в гл. 5. Исследователю следует соблюдать указанные там
предосторожности для проверки я выбора необходимых условий
работы системы коррекции мертвого времени.
В спектрометре с дисперсией по длинам волн коррекция
мертвого времени производится после того, как измеряется ин-
интенсивность. В работе [31] показано, что для пропорционально-
пропорционального счетчика, работающего с кристалл-дифракционным спектро-
спектрометром, можно использовать соотношения Руар-ка — Браммера
вплоть до скоростей счета по крайней мере 5-104 имл./с:
N = N'/A—tN'), (8.32;
где N' — измеренная скорость счета, N — истинная скорость,
которую мы хотим рассчитать, и т — мертвое время, с. Для ис-
использования уравнения (8.32) следует знать величину мертвого
времени т. Один из методов определения т заключается в том,
что строится график зависимости N' от измеренного тока пучка,
который прямо пропорционален N. Путем сопоставления откло-
отклонения этого графика от линейности с уравнением (8.32) можно
определить т. Другие методы определения т обсуждались в
[31].
Любое значение (интенсивности, измеренное с помощью кри-
кристалл-дифракционного спектрометра, прежде чем может быть
¦использовано для получения относительной интенсивности k,
должно быть скорректировано на мертвое время с помощью
уравнения (8.32). В обычном кристалл-дифракционном спектро-

Практические методы, рентгеновского анализа 141
метре т составляет приблизительно 2 мкс, так что поправка на
мертвое время составляет не более 2% при скоростях счета
ниже 1 • Ю4 имп./с.
8.5. ПРИМЕР КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА
Анализ вольфрамата цинка ZnWO4 представляет собой при-
пример ситуации, в которой количественный анализ с помощью
спектрометра с дисперсией по энергии требует введения поправ-
поправки на перекрытие тиков. Приведенный на рис. 8.20 спектр, по-
полученный с помощью спектрометра с дисперсией по энергии,
показывает, что линии Wz.a (8,396 кэВ) и Zn^a (8,638 кэВ)
достаточно близки B42 эВ) по энергии, так что области двух
пиков перекрываются и пики оказывают взаимное влияние друг
на друга (рис. 8.20,а). Кроме взаимного влияния Wz.a- и
2пка-п'иков на рис. 8.20, г видно, что пик Zn^o подвергается
влиянию второго пика Wl^-линии с энергией 8,720 кэВ, находя-
находящейся в пределах 82 эВ от Zn^a. Для получения точного ре-
результата следует исключить эффекты взаимного перекрытия.
Анализ был проведен с помощью процедуры FRAME С, в ко-
которой используются метод коэффициентов перекрытия для кор-
коррекции взаимного влияния и метод моделирования для вычита-
вычитания фона [144]. Первым шагом процедуры является определе-
определение областей для подгонки фона!, которые показаны и а
рис. 8.20,6. Метод моделирования фона, описанный в разд. 8.2.1,
применяется затем для получения первой оценки фона в соот-
соответствующей аналитической области. Аналитические области ис-
исследуются на присутствие возможных взаимных перекрытий, и
рассчитываются соответствующие коэффициенты перекрытия
(WiaHa Zn/ca, Ziua на WLa и Wl^ на ZnKa), как это описано
в разд. 8.3.3.2. Затем с помощью этих коэффициентов вводится
поправка в аналитические области для получения первого при-
приближения для интенсивнюстей характеристических линий. Ана-
Аналогичные коррекции фон» и перекрытия проводятся в спектрах
эталонов из чистых элементов для получения иятеноивиостей
с эталонов. По полученной совокупности величии интеноив-
ностей рассчитываются значения k. Значения k используются в
методе трех поправок (гл. 7) для получения первого прибли-
приближения для концентраций. Уровень фона и спектральные пере-
перекрытия, так же как и сами поправки, зависят от состава, поэто-
поэтому процедура повторяется методом итераций до тех пор, пока
не будет получен окончательный набор значений концентраций.
Величины коэффициентов перекрытия можно найти в
табл. 8.3. Значения k после введения поправки на перекрытие
примерно на 8% ниже неоткорректированных значений k. Такие

142
Глава 8
Рис. 8.20. Рентгеновский спектр ZnWO4, полученный с помощью спектромет-
спектрометра с дисперсией по энергии.
а — спектр в диапазоне энергий от 0 до 20,48 кэВ, демонстрирующий К- и L-серии линии
Zn и L- и Af-серии линий W; б — спектр после расширенной подгонки по методу FRAME С;
в — растяжка по горизонтальной шкале, выделяющая области Wio и Znx для количе-
количественного анализа; г — маркеры W L-серин, показывающие взаимное влияние W I-линии
(обозначенной на дисплее LN) на Znv .
скорректированные на перекрытие значения k, полученные с по-
помощью спектрометра с дисперсией по энергии, очень близки
к значениям k, определяемым с помощью спектрометра с дис-
дисперсией по длинам волн. Вследствие более высокого раврешения
кристалл-дифракционного спектрометра пики ZnKa и Wia в дам
адекватно разрешаются при анализе, как показано на рис. 8.21,
и поэтому значения k можно измерять в нем, не вводя поправку
на перекрытие. На рис. 8.21 указано также место положения то-
точек измерения фона, поскольку при измерении интенсивности
кристалл-дифракционным спектрометром необходима коррекция
уровня фона путем интерполяции.
Этот пример специально был выбран для иллюстрации про-
процедур, которым следуют в анализе при наличии перекрытия пи-
пиков. Для данного конкретного материала ZnWO4 возможна дру-

Практические методы рентгеновского анализа
14-1
Рис. 8.21. Рентгеновский спектр ZnWO4, полученный с помощью кристалл-ди-
кристалл-дифракционного спектрометра при Ео=20 кэВ.
Показано положение пиков Zn^ н Wf для измерения иитенсивностей. Указаны также
положения, в которых брались отсчеты интенсивности фона для интерполяции под пи-
пиками.
гая аналитическая стратегия, гири которой перекрытие пиков
бы отсутствовало. Как показано на рис. 8.20, существуют дру-
другие аналитические линии, а именно Zrua A,009 кэВ) и Wm№
A,775 кэВ), которые достаточно разделены по энергии. Однако
Таблица 8.3. Сравнительный анализ вольфрамата цинка ZnWCV
w,
Zn
Ко.
Относительные интенсивности (^-отношении)
кристалл-дифракциоиныи спектрометр
спектрометр с дисперсией по энергии
без коррекции перекрытия
с коррекцией перекрытия
Рассчитанные массовые доли
кристалл-дифракционный спектрометр
спектрометр с дисперсией по энергии
с коррекцией перекрытия
0,503
0,230
0,532
0,498
0,587
0,580
0,255
0,236
0,221
0,227
') Ускоряющее напряжение 20 кВ. Угол падения электронного пучка 90°, и угол вы-
выхода рентгеновского излучения 52,5°.

144 Глава 8
при выборе таких низкоэнергетических линий для анализа тре-
требовалось бы, чтобы использовались энергии щучка ниже 10 кэВ
для уменьшения поглощения в образце до приемлемого уровня
и, более того, образец и эталоны должны были бы готовиться
в идентичных условиях, включая одновременное нанесение угле-
углеродного покрытия.
8.6. ТОЧНОСТЬ И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ
В РЕНТГЕНОВСКОМ МИКРОАНАЛИЗЕ
Вплоть до данного момента мы обсуждали поправки, исполь-
используемые в количественном рентгеновском микроанализе, и ошиб-
ошибки, связанные с процедурами расчета и восстановления данных.
Кроме того, нужно рассмотреть точность или чувствительность
данного анализа. Под точностью или чувствительностью аиали-
за понимается разброс результатов, обусловленный самой при-
природой процесса измерения рентгеновского излучения. Для того
чтобы определить химическую гомогенность образца, изменение
состава от одной анализируемой точки до другой и минималь-
минимальную обнаружимую концентрацию данного элемента, можно вос-
воспользоваться статистическими уравнениями, которые описывают
точность или чувствительность.
8.6.1. Статистическая основа расчета точности
и чувствительность
Генерация рентгеновского излучения — процесс статистиче-
статистический по природе. Число рентгеновских фотонов, генерированных
данным образцом и взаимодействующих с детекторами излуче-
излучения, является полностью случайной функцией по времени, на
имеет фиксированное среднее значение. Распределение или ги-
стО'Грамма количества регистрации данного числа импульсов
рентгеновского излучения от одной точки образца в зависимости
от числа импульсов за фиксированный интервал времени может
хорошо аппроксимироваться непрерывным нормальным (гаус-
(гауссовым) распределением. Результаты счета отдельных рентгенов-
рентгеновских импульсов при каждом измерении лежат на характерной
гауссовой кривой, среднеквадратичное отклонение для которой
равняется корню квадратному из среднего значения ac = N1/2.
На рис. 8.22 приведена такая гауссова кривая для рентгенов-
рентгеновской эмиссионной спектрографии и показано среднеквадратич-
среднеквадратичное отклонение ac = N /2, полученное в идеальных условиях.
Здесь N представляет собой наиболее вероятное значение N —
полного числа импульсов за данный период времени t. Ввиду
того что (Ус является результатом флуктуации, которые не могут

Практические методы рентгеновского анализа
145
Рис. 8.22. Кривая гауссова распределения
для рентгеновской эмиссионной спектро-
спектрографии н среднеквадратичное отклонение
Ос полученное в идеальных условиях [230].
Счет рентгеновских (ротонов
быть исключены, пока идет процесс счета квантов, это средне-
среднеквадратичное отклонение ас в рентгеновской эмиссионной спек-
спектрографии является предельным минимумом. Но это не только
минимум, но, к счастью, предсказуемый минимум. Вариацию
полного числа импульсов в проценггал можно дать в виде
(вс/N) ¦ 100. Например, для получения минимального отклонения
от N на 1 % должно быть зарегистрировано по крайней мере
10 000 импульсов.
Как указано' в работе [230], действительное среднеквадра-
среднеквадратичное отклонение в эксперименте Sc определяется соотноше-
соотношением
11/2
S,=
(8.33)
где Ni — число рентгеновских импульсов в каждой t-й регистра-
регистрации:
п,
(8.34)
а п — количество регистрации i. Среднеквадратичное отклоне-
отклонение Sc равно (те только тогда, когда рабочие условия оптимизи-
оптимизированы. В большинстве РЭМ дрейф в электронных схемах и
изменение положения образца (механические сдвиги столика
образца) создают рабочие условия, которые ие являются
идеальными. Дрейф во времени может иметь место в в.ысоко-
йольтном источнике питания нити катода, источниках питания
линз и другом используемом электронном оборудовании. После
того как образец повторно устанавливается в то же самое по-
положение под электронным пучком, может иметь место измене-
изменение измеренной интенсивности рентгеновского излучения, если
образец вышел из круга фокусировки рентгеновского спектро-
спектрометра или когда изменился угол выхода г|> с образца, при ис-
использовании детектора с дисперсией по энергии. На практике
для типичного времени счета 10^—-100 с на точку реальное сред-

146 Глава 8
неквадратичное отклонение Sc часто примерно в два раза пре-
превышает (Те- При использовании более длительных времен счета
SJoc увеличивается из-за дрейфа прибора. Только при коротких
временах счета и стабильных электронных схемах прибора зиа-
чение Sc приближается к ас. В том случае, когда необходимы
данные измерений с рабочих эталонов и/или эталонов фона
[231], помимо сигнала с образца могут возникать другие источ-
источники вариаций. Они, так же ка>к ,и .неудовлетворительная подго-
подготовка, образцов, могут влиять на точность .анализа. Поэтому при
определении точности .анализа следует учитывать как связанные
с прибором факторы, та>к и вариации в сигнале.
8.6.2. Гомогенность образца
Исследователя часто интересует вопрос, являются ли образец
и/или фаза гомогенными. Для ответа на это необходимо полу-
получить данные рентгеновского микроанализа и рассмотреть этот
вопрос со статистических позиций. Можно либо установить кри-
критерии гомогенности и применять их, либо измерить .пределы
изменения состава образца с определенной степенью достовер-
достоверности и привести это значение. Любой метод на вопрос о гомо-
гомогенности позволяет сделать заключение с большим количест-
количественным содержанием, чем «да» или «нет». Последующий мате-
материал посвящен обсуждению критериев гомогенности, которые
можно использовать, и вычислению степени и уровня гомогенно-
гомогенности.
Упрощенный критерий, который был использован для уста-
установления гомогенности фазы или образца, заключается в том,
что все л точек данных должны попадать в пределы 7V+3W1/2
[232а]. Если этот критерий удовлетворяется, то данный обра-
образец считается гомогенным. Изменение
(±ЗЛГ1/2/Л0-ЮО% (8.35)
для анализируемого элемента в образце представляет собой
уровень гомогенности в процентах, который измерен для образ-
образца с учетом того, что должен существовать неподдающийся
снижению минимальный уровень, обусловленный статистической
природой генерации рентгеновского излучения. Если в каждой
точке образца накоплено 100 000 импульсов и все эти точки
попадают в пределы ЛГ±ЗЛГ1/2. образец является гомогенным и
уровень гомогенности, согласно уравнению (8.35), равен
±0,95%- Часто желателен уровень гомогенности =^1%. Если
концентрация в образце составляет 10 вес. %, то степень гомо-
гомогенности, т. е. минимальное изменение концентрации, которое
может быть корректно измерено, составляет ±0,1 вес. %.

Практические методы рентгеновского анализа 147
Более точное определение степени (вес. %) и уровня (%)
гомогенности связаио с использованием среднеквадратичного
отклонения Sc измеренных значений и степени статистической
доверительной вероятности при определении ЛЛ Среднеквадра-
Среднеквадратичное отклонение учитывает эффекты, обусловленные измене-
изменением условий эксперимента1, например дрейф в приборе, погреш-
погрешности фокусировки рентгеновского излучения, процесс генерации
рентгеновского излучения. Доверительная вероятность, исполь-
используемая в измерениях, означает, что мы хотим избежать риска
(а) исключения хорошего результата в большом числе случаев
(скажем, 95 или 99%). Доверительная вероятность выражается
как 1—а и обычно выбирается равной 0,95 или 0,99, т. е. 95 или
99%. Использование доверительной вероятности означает, что
мы можем определить степень гомогенности в весовых процен-
процентах, для которой ожидаем, что в среднем только а E или 1 %)
повторных случайных результатов будут лежать за пределами
этой области.
Степень гомогенности (в вес. %) для доверительной вероят-
вероятности 1—а есть
№,_« = + С ( О1/8) (SJN), (8.36)
где С — истинная весовая доля интересуемого элемента; га —¦
число измерений; N — среднее число импульсов, накопленных в
каждом измерении, и tn-\l~a — коэффициент Стьюдента t для
доверительной вероятности 1—а и п—1 степеней свободы. Зна-
Значения коэффициентов Стьюдента t для t95n-\ и t"n~i и различ-
различных степеней свободы п—1 приведены в табл. 8.4 [2326]. Из
табл. 8.4 ясно, что. для установления степени гомогенности тре-
требуется по крайней мере четыре измерения, т. е. п = 4. Если число
выполненных измерений меньше 4, значение Wi-a слишком ве-
велико.
Таблица 8.4. Значения распределения коэффициентов
Стьюдеита для доверительной
вероятности 95 и 99% [2326]
п
2
3
4
8
12
16
30
со
п—\
1
2
3
7
11
15
29
ОО
.95
12,71
4,304
3,182
2,365
2,201
2,131
2,042
1,960
,99
63,66
9,92
5,841
3,499
3,106
2,947
2,750
2,576

Ш Глава 8
Уровень гомогенности в процентах для данной доверительной
вероятности 1—а дается выражением
± (Wr-jC) - ± ( ?3) Sc A00)/п1/2лГ %. (8.37)
Значительно труднее измерить эквивалентный уровень гомо-
гомогенности, когда концентрация элемента в образце уменьшается.
Хотя Wi-a прямо пропорционально С, значение Sc/N будет воз-
возрастать, когда С и число импульсов рентгеновского излучения
Hia точку уменьшаются. Для получения одинакового числа им-
импульсов рентгеновского излучения на точку следует увеличи-
увеличивать время анализа.
8.6.3. Аналитическая чувствительность
Аналитическая чувствительность — это способность разли-
различать для данного элемента две почти равные концентрации С и
С. Число импульсов N ш N' для обеих концентраций поэтому
имеет одинаковую статистическую вариацию. Если обе концент-
концентрации С и С определяются повторениями п раз каждого изме-
измерения, проводимого в течение одного и того же фиксированного
временного интервала, то эти два значения существенно разли-
различаются при определенной доверительной вероятности 1—.а, если
tf-ЛГ > 21'2 ( ?:?) 5с/п1/2 (8.38)
и
ДС = С-С > [21!tC( #1?) Sc]/[n^(N-NB)}, (8.39)
где С — концентрация одного элемента в образце, N и NB —
среднее число импульсов рентгеновского 'излучения 'интересуе-
'интересуемого элемента в образце » фона непрерывного рентгеновского
излучения соответственно, tn-\'i~a — коэффициент Стьюдента, за-
зависящий от доверительной вероятности 1—а (табл. 8.4), и
л — число измерений. Как показано в [231], аналитическую чув-
чувствительность для доверительной вероятности 95% можно ап-
аппроксимировать выражением
ДС = С— С > B,33/п1'2) [Caj(N~NB)]. (8.40)
Вышеприведенное выражение представляет собой .оценку макси-
максимальной чувствительности, которая может быть достигнута,
когда сигналы от обеих концентраций имеют свои собственные
ошибки, но приборные ошибки во внимание не принимаются.
Поскольку истинное среднеквадратичное отклонение обычно
приблизительно в 2 раза больше ас, АС практически приблизи-
приблизительно вдвое больше величины, вычисляемой по формуле (8.40).

Практические методы рентгеновского анализа 149
Бели N значительно превышает NB, уравнение (8.40) можно
переписать в виде
АС = С—С ^ 2,33C/(nN)ll\ (8.41)
тогда предельная аналитическая чуствительность в процентах
выразится как
ДС/С(%) = 2,33 AОО)/(пЛ01/2. (8-42)
Из выражения (8.42) следует, что для получения аналитиче-
аналитической чувствительности в 1 % от образца должно быть зарегист-
зарегистрировано ^54 290 импульсов (т. е. nN). Если концентрация С
составляет 25 вес. %, АС = 0,25 вес. %, если концентрация С =
5 вес. %, то ДС=0,05 вес. %. Хотя аналитическая чувствитель-
чувствительность улучшается с уменьшением концентрации, следует отме-
отметить, что интенсивность рентгеновского излучения уменьшается
пропорционально убыванию концентрации. Поэтому для под-
поддержания уровня чувствительности в 1 % необходимо увеличи-
увеличивать .время счета.
Уравнение (8.42), в частности, полезно для предваритель-
предварительного выбора 'необходимых условий с целью достижения желае-
желаемой чувствительности bi данном анализе. Если в пределах дан-
данного расстояния в образце необходимо контролировать гра-
градиент концентрации, важно предварительно рассчитать, в сколь-
скольких точках нужно провести анализ и сколько импульсов рентге-
рентгеновского излучения нужно получить в каждой точке. Например,
если в пределах области. 25 мкм имеет место градиент концент-
концентрации от 5 до 4% и в направлении градиента берутся 25 шагов^.
по 1 мкм, то изменение концентрации, на шаг составляет
0,04 вес.%. Поэтому аналитическая чувствительность при довери-
телыной вероятности 95% должна быть ^0,04 вес._%. Исполь-
Используя уравнение (8.41), поскольку N намного больше Л/д^получим,
что число зарегистрированных импульсов на шаг nN должно
составлять по крайней мере 85 000. Если вдоль градиента дела-
делается только 10 шагов по 2,5 мкм, изменение концентрации .на
шаг составляет 0,1 вес. %, и число зарегистрированных импуль-
импульсов яа шаг nN теперь составляет ^13 600. Проводя измерения
в 10, а не в 25 точках, можно уменьшить продолжительность
анализа гораздо больше, чем в ожидаемые 2,5 раза, поскольку
число регистрируемых импульсов на шаг, требуемое для дости-
достижения нужной чувствительности,1 также уменьшается.
8.6.4. Анализ следов элементов
Как только концентрация С в рентгеновском микроанализе
достигает порядка 0,5 вес. %, N уже ненамного превышает ве-
величину NB. Эту область концентраций ниже 0,5 вес. % часто

150 Глава 8
называют областью анализа следов элементов. Для легких эле-
элементов или для линий рентгеновского излучения с энергиями
=ST 1 кэВ область следов элементов начинается примерло на
уровне 1 вес. % • При анализе следов элементов требование
к анализу заключается в том, чтобы обнаружить существенные
различия между интенсивностью характеристического излучения
и фоном из образца.
Для того чтобы разработать полезную процедуру обнаруже-
обнаружения следов, нам нужен критерий, который гарантировал бы,
что данный элемент присутствует в образце. Этот критерий мож-
можно назвать пределом обнаружения (ПО). Так называемый пре-
предел обнаружения зависит от минимального значения разности
N—NB, которая может быть измерена в статистическом смысле.
Расчет предела обнаружения обсуждался в [232в]. Авторы
предположили, что элемент можно считать присутствующим,
если значение N превышает фон NB на величину 3(JVbI/». При
более глубоком анализе следует рассматривать измеренное
среднеквадратичное отклонение, число измерений и желаемую
доверительную вероятность. По аналогии с уравнением (8.38)
мы можем определить предел обнаружения (N—Л^в)по при ана-
анализе следов в виде
{N-NB)no > 21'* ( ?:?) Scln4\ (8.43)
где Sc — имеет по существу одно и то же значение как для
измерения интенсивности характеристического излучения, так и
для измерения фона. В этом случае мы можем определить пре-
предел обнаружения с любой выбранной исследователем довери-
доверительной вероятностью 1—а (та;бл. 8.4). На практике обычно вы-
выбирается доверительная вероятность 95 или 99%. Если пред-
предположить, что при анализе следов элементов калибровочная
кривая зависимости интенсивности рентгеновского излучения
от состава является линейной функцией, то неизвестная кон-
концентрация С может быть связана с N выражением
С = [(N- NB)/(NS-NSB)] Cs, (8.44)
где Ns и NSb — средние значения числа импульсов характери-
характеристического рентгеновского излучения для эталона и фона соот-
соответственно, Cs — концентрация (вес. %) анализируемого эле-
элемента в эталоне. Предел обнаружения Спо (т. е. минимальная
концентрация, которая может быть измерена) можно вычис-
вычислить, комбинируя уравнения (8.43) и (8.44):
Спо = [CS/(NS-NSB)] {2^tln-iSc/n^). (8.45)

Практические методы рентгеновского анализа 15J
Относительная погрешность иди точность при анализе сле-
следов элементов равна С/Спо и достигает ±100%, когда С приб-
приближается к Спо.
Интенсивность фона NB должна измеряться точно, чтобы
можно было определить 'неизвестную концентрацию С из (8.44).
Обычно лучше всего измерять интенсинность непрерывного фона
прямо на анализируемом образце. Другие эталоны фона могут
иметь различные добавочные элементы или другой состав, что
будет приводить к изменению поглощения по сравнению с ана-
анализируемым образцом. Такие эталоны фона могут иметь различ-
различные количества остаточных загрязнений на поверхности, что
особенно вредно при измерении рентгеновских линий с энергия-
энергиями =ST1 кэВ. С помощью кристалл-дифракционного спектрометра
интенсивность фона измеряется после тщательного сканирова-
сканирования основного пика по длинам волн, чтобы точно установить
интенсивность фона на обеих сторонах пика. Сканирование спек-
спектрометра для всех анализируемых образцов должно дать ответ,
свободен ли фоновый спектр от влияния других пиков. Измерить
интенсивность фана с помощью спектрометра с дисперсией по
энергии с точностью, необходимой для выполнения анализа сле-
следов элементов, затруднительно. Измерение непрерывного фона
с помощью спектрометра с дисперсией по энергии обсуждалось
ранее в этой главе. Если в интересуемой области энергий отсут-
отсутствуют наложение пиков и артефакты, связаиные с детектором,
и можно определить непрерывный фон, то анализ следов эле-
элементов может быть выполнен с помощью спектрометра с дис-
дисперсией по энергии.
В [231] было показано, что чувствительность при анализе
следов элементов, или предел обнаружения, определяется по
формуле
Спо > 3,29а/(птР ¦ Р/ВI», (8.46)
где т — время каждого измерения, п — число повторений каж-
каждого измерения, Р — скорость счета на чистом элементе, Р/В —
отношение пик/фон на чистом элементе, т. е. отношение скоро-
скорости счета на чистом элементе к скорости счета фона на чистом
элементе, и а — коэффициент, связывающий концентрацию и
интенсивность анализируемого элемента по эмпирическому соот-
соотношению Зиболда — Огилви [146] (гл. 7).
Чтобы проиллюстрировать использование этого соотношения
для расчета предела обнаружения Ge в железных метеоритах
[233] при помощи кристалл-дифракционного спектрометра,
были выбраны следующие значения параметров: ускоряющее
напряжение 35 кВ, т=100 с, ток образца 0,2 мкА, я=16, Р =
= 150 000 имп./с, а=1, Р/В = 200. При этих значениях из урав-
уравнения (8.46) получается Спо>0,0015%. Истинный предел обна-

152 Глава 8
Таблица 8.5. Сравнение минимальных пределов обнаружения для Si и Fe1'
прн использовании систем детектирования с дисперсией по
энергии н по длинам волн при одинаковом токе пучка [112]
Элемент Способ анализа Р'-Ю-*А р1в СПО' вес- °'°
Si*a Спектрометр с дисперси- 5400 97 0,E8
ей по энергии
Спектрометр с дисперси- 40,87 1513 0,171
ей по длинам волн
Fe/(a Спектрометр с дисперси- 3000 57 0,10
ей по энергии
Спектрометр с дисперси- 12,3 614 0,49
ей по длинам волн
кэВ, время счета импульсов 60 с.
ружения, полученный путем расчета Sc и решения уравнения
(8.45), равнялся 0,0020% [233]. Установлено, что для достиже-
достижения этого предела обнаружения необходимо время счета им-
импульсов порядка 30 мин. При измерении содержания углерода
в сталях с помощью кристалл-дифракционного спектрометра
предел обнаружения составляет обычно 0,03% при времени сче-
счета импульсов порядка 30 мин, ускоряющем напряжении 10 кВ
и токе образца 0,05 мкА.
Критерием, который часто используется для сравнения чув-
чувствительности детекторов с дисперсией по длинам волн и по
энергии, является произведение Р-Р/В в (8.46). Сравнение де-
детекторов обоих типов производится при одинаковых токах пуч-
пучка /на образец [234, 112]. В качестве примера такого сравнения
в табл. 8.5 из [112] приведены значения Спо (вес. %), опреде-
определенные для чистых Si и Fe при ускоряющем напряжении 25 кВ,
времени счета импульсов 60 с и токе образца 10~п А. Величина
Спэ для Si в случае кристалл-дифракционного спектрометра в
три раза хуже, чем в случае детектора с дисперсией по энергии.
Для Fe различие даже больше. Произведение Р-Р/В больше
для детектора с дисперсией по энергии из-за более высокой
(~20Х) геометрической эффективности детектора с диспер-
дисперсией по энергии по сравнению с детектором с дисперсией по
длинам волн. Следовательно, при одном и том же токе пучка
интенсивность пика Р значительно выше у детектора с диспер-
дисперсией по энергии. Более высокие значения Р/В в спектрометре
с дисперсией по длинам волн немного компенсируют это раз-
различие.

Практические методы рентгеновского анализа
153
Из предыдущей дискуссии, приведенной в гл. 5, понятно, что
спектрометр с дисперсией по длинам воля 'нормально функцио-
функционирует при токах пучка 10~8-—10~7 А. В этой области токов
детектор спектрометра .находится в оптимальных условиях для
получения высокой скорости счета импульсов Р, если только
образец не разрушается под воздействием больших токов пучка.
Поэтому правильнее сравнивать чувствительности детекторов с
дисперсией по длинам волн и по энергии в том случае, когда
каждый из детекторов в отдельности (находится в оптимальных
условиях для анализа следов элементов. В [112] было проведе-
проведено сравнение детекторов обоих типов, причем каждый детектор
был оптимизирован для получения максимального значения
Р2/В. Используемый для анализа образец представлял собой
синтетический минерал D1-JD-35, содержащий Na, Mg, Si и Са,.
Измерения с помощью спектрометра с дисперсией по энергии
проводились при токе пучка 1,75-10"9 А щ ускоряющем маир'Я-
жении 15 кВ. Полученная оптимальная скорость счета составля-
составляла 2000 «мп./с, так чтобы интенсивность суммарных пиков при
анализе была бы незначительной. Измерения с помощью кри-
кристалл-дифракционного спектрометра проводились при токе пуч-
пучка 3-10~8 А при ускоряющем напряжении 15 кВ. Оптимальная
Таблица 8.6. Сравнение минимальных пределов обнаружения различных
элементов при использовании систем детектирования с дисперси-
дисперсией по энергии и по длинам волн в оптимальных рабочих усло-
условиях» [112]
Способ анализа
Элемент
Р. €В,
ИМП./С ИМП./С
Р/В Вес. % веПО.
Спектрометр
по энергии
с дисперсией
Спектрометр с дисперсией
по длинам волн
32,
111,
103,
623,
169,
549
2183
2063
13390
2415
2
6
9
5
5
11,5
17,3
18,2
27,3
19,9
6,6
8,9
16,1
37,0
8,2
2
6
5
22
8
83
135
128
362
295
,8
,4
,7
,8
,5
3,97
7,30
4,67
26,69
12,03
3,97
7,30
4,67
26,69
12,03
0,195
0,102
0,069
0,072
0,085
0,0021
0,012
0,008
0,009
0,009
') Анализ D1-JD-35: данные, полученные с помощью спектрометра с дисперсией
по энергии, набирались в течение 180 с при скорости счета 2000 имп./с с коррекцией
мертвого времени B5%;. ускоряющем напряжении 15 кВ, токе пучка 1,75 нА. Данные,
полученные с помощью кристалл-дифракционного спектрометра, набирались для каждого
элемента в течение 30 с, общее время анализа 180 с, ускоряющее напряжение 15 кВ,
ток пучка 30 нА.

154 Глава 8
скорость счета импульсов на Si устанавливалась ~13 000имп./с
с тем, чтобы при максимальной скорости счета мертвое время
в детекторе конкретного спектрометра было бы меньше 1%-
В табл. 8.6 приведены значения Спо для присутствующих в об-
образце элементов. При оптимальных рабочих условиях мини-
минимальный предел обнаружения, получаемый при использовании
кристалл-дифракционного спектрометра, почти в 10 раз лучше
для всех элементов. Поэтому, если на твердотельный образец не
влияет большой ток пучка, при анализе с использованием кри-
кристалл-дифракционного спектрометра чувствительность часто мо-
может быть улучшена в 10 раз по сравнению со спектрометром с
дисперсией по энергии.
8.7. АНАЛИЗ ЛЕГКИХ ЭЛЕМЕНТОВ
Количественный рентгеновский микроанализ длинноволно-
длинноволновых Ка-линий легких элементов. (Be, В, С, N, О ,» F), а также
длинноволновых La-линий (Ti, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn) пред-
представляет собой трудную задачу. При измерении длинноволново-
длинноволнового (^12А) низкоэнер'гетичеокого (^1 кэВ) рентгеновского
излучения велико поглощение первичного излучения, и модели
поправок, разработанные для количественного анализа в обла-
области легких элементов, могут оказаться 'неприемлемыми. Обычно
необходимо вводить значительную поправку на поглощение, а
значения массовых коэффициентов поглощения для длинновол-
длинноволнового рентгеновского излучения известны, к сожалению, недо-
недостаточно точно. Такое низкоэнергетическое рентгеновское излу-
излучение регистрируется с помощью кристалл-дифракционных
спектрометров при использовании кристаллов с большим меж-
межплоскостным расстоянием d. Детектор с дисперсией по анергии
не может зарегистрировать такое (с энергией ^1 кэВ) излу-
излучение из-за поглощения рентгеновского излучения в Ве-окне
детектора (гл. 5).
Влияние эффекта поглощения может быть уменьшено при
проведении анализа при низких энергиях электронов пучка Ео
и больших углах выхода рентгеновского излучения ф. Чем боль-
больше угол выхода, в приборе, тем короче длина пути, на, котором
рентгеновское излучение испытывает поглощение в образце. При
низких ускоряющих напряжениях уменьшается глубина проник-
проникновения электронного' пучка^ и рентгеновское излучение генери-
генерируется ближе к поверхности (гл. 3). На рис. 8.23 показано из-
изменение интенсивности излучения Вка с напряжением для раз-
различных боридов [235]. Максимум интенсивности линии В*а име-
имеет место при ускоряющем напряжении 10—15 кВ в зависимо-
зависимости от образца. Появление максимума обусловлено действием
двух противоположных факторов: во-первых, повышением ин-

Практические методы рентгеновского анализа
155
Рис. 8.23. Зависимость интенсивности из-
излучения ВКа от ускоряющего напряжения
для различных боридов [235].
О 5 10 15 20 25 30
"Ускоряющее напряжение,«в
тенсивности рентгеновского излучения с возрастанием ускоряю-
ускоряющего напряжения и, во-вторых, усилением поглощения из-за
того, что с возрастанием энергии электронов пучка рентгенов-
рентгеновское излучение генерируется глубже в образце. В максимуме
интенсивности эти факторы взаимно компенсируют друг друга.
Анализ легких элементов, юли низкоэмергетический микроана-
микроанализ, выбранного образца выполняется обычно п,ри ускоряющем
напряжении, соответствующем максимуму интенсивности. Одна-
Однако даже п,ри выборе огатим/альных значений Яо и ф эффект по-
поглощения в образце все еще остается значительным. При анали-
анализе легких элементов следует учитывать также .наложение рент-
рентгеновских линий, смещения линий за счет химической связи, на-
наличие эталонов и загрязнение поверхности образца. Эти проб-
проблемы подробно будут рассмотрены ниже.
Сложности при анализе легких элементов могут возникать
из-за присутствия в спектре линий более'тяжелых элементов.
В работе [236] показано, что даже если такое .наложение имеет
место, то качественный анализ проводить можно. Например,
в сталях были обнаружены включения карбонитрида титана
TiNC, которые, по-видимому, представляют собой твердые рас-
растворы TiN и TiC. На рис. 8.24 сравниваются спектры Тц-шлу-
чения для соединений TiN, TiC и чистого Ti. Интенсивность ли-
линии TiL[ от фазы карбонитрида титана больше, чем от чистого
Ti. Этот пик (рис. 8.24) состоит в основном из Тц; при 31,4 А
(8 = 18,3°) с наложенным небольшим неразрешаемым пиком
N*anpH 31,6А (9 = 18,5°). Линия ТЦО при 27,4 А (9 = 16,0°)
сильно поглощается «зотом, и ее 'интенсивность составляет одну

156
Глава 8
80
60
40
го
20
18"
в
IB"
10°
18°
16ю
20"
/8°
в
F°
Рис. 8.24. Сравнение Tii-спектров (интенсивность излучения в зависимости
от угла дифракции 0), полученных на образцах чистого Ti (слева), TiN
(в центре) и TiC (справа) при ускоряющем напряжении 10 кВ [236].
треть интенсивности этой же линии от чистого Ti. Однако излу-
излучение T\l1 поглощается азотом лишь незначительно. Анализ
включений такого типа может оказаться невозможным, но в
работе [236] содержание Ti определялось путем анализа /Ск-излу-
чевдия, а содержание углерода определялось с помощью эталона
TiC (рис. 8.24). Результаты показывают, что содержание Ti со-
составляет ~80 вес. %, а С ~4 вес. %. По уже изложенным при-
причинам корректный анализ на азот был невозможен. Содержание
азота определялось вычитанием из 100%-«ой суммарной кон-
концентрации остальных элементов. Такая процедура анализа мо-
может использоваться в том случае, если имеется наложение ли-
линий и если такие помехи нельзя исключить при анализе импуль-
импульсов по амплитуде (гл. 5).
Рентгеновские эмиссионные спектры для легких элементов
состоят главным образом из одной полосы, обусловленной пере-
переходом валентного электрона на вакансию в /(-оболочке. Как
показано в [237], валентные электроны в наибольшей степени
подвержены влиянию того, в какой комбинации находятся хи-
химические элементы, и эмиссионная полоса может и действитель-
действительно отражает часто большие эффекты изменений в химических
связях между атомами. Эти изменения проявляются в сдвигах
по длинам волн максимума излучения, в увеличении или умень-
уменьшении относительных интенсивностей различных линий или по-

Практические методы рентгеновского анализа
157
Уг.чсрсдиая пленка загрязнения
48А
Рис. 8.25. Спектры Ск, полученные для различных углеродсодержащих со-
соединений при ускоряющем напряжении 4 кВ.
Пленка углеродного загрязнения образовалась под влиянием электронного пучка [238].
лос «ли в изменении их формы. Такие сдвиги могут создавать
проблемы при количественном анализе легких элементов.
На рис. 8.25 приведена. С ^полоса от углеродной пленки,
осажденной под влиянием электронного пучка, а также С^-по-
лоса электродного графита и различных карбидов [238]. Сдвиг
длины волны максимума излучения в карбидах относительно
углерода значителен и может легко наблюдаться с помощью
кристалл-дифракционного спектрометра. Подобный эффект гаа-
блюдался для линии В*, как показано на рис. 5.13 в гл. 5.
Сдвиг длины волны максимума излучения имеет важное значе-
значение, так как для проведения количественного анализа измере-
измерение интенсивности Ла-пика должно осуществляться в положении
максимума ¦ интенсивности как для образца, так и для эталона.
Поэтому эталон должен иметь пренебрежимо малый сдвиг мак-
максимума излучения относительно других эталонов и анализируе-
анализируемых образцов. Если это невозможно, настройку спектрометра
следует изменять при измерении на образцах и эталонах с тем,.
чтобы в каждом случае обеспечить получение максимальной ин-
интенсивности.

158
Глава 8
0,10
0,08
Fe- 0% Ni
o--q Fe-10% Ni
l.-—д Fe-20%Ni
0
0,1
',2
0,4 0,6 0,8 1,0
Содержание углерода в спали, %
Рис. 8.26. Калибровочные кривые для микрорентгеноспектрального анализа
углерода в сталях, содержащих никель [239].
Выбор первичного эталона для анализа легких элементов
должен основываться не только на том, чтобы сдвиг длины
волны максимума интенсивности был пренебрежимо .мал, ню и
на том, что эталон должен давать линию с большой, стабильной
и воспроизводимой интенсивностью. Например, при анализе
углерода ни спектрографический, ни пиролитический графит не
являются воспроизводимыми эталонами рентгеновского излуче1-
¦ния углерода. Однако различные металлические карбиды явля-
являются адекватными эталонами на углерод. Для сталей удовлет-
удовлетворительным стандартом является цементит ИезС.
Надежные количественные результаты могут быть получены
при проведении анализа с эталонами, состав которых близок
к составу образца. На рис. 8.26 показаны калибровочные кри-
кривые для рентгеновского микроанализа углерода по линии Ко.
при ускоряющем напряжении 10 кВ в эталонных сплавах Fe,
Fe — 10% Ni и Fe — 20% Ni с определенным содержанием угле-
углерода [239]. В качестве анализирующего кристалла использовал-
использовался додеценоатстеарат свинца с межплоскостным расстоянием
d = 50,15 А. Относительная интенсивность углерода представ-
представляет собой отношение интенсивности Ска-линии от данного эта-
эталонного сплава с вычетом фона к интенсивности линии от эта-
эталона углерода Сг3Сг также с вычетом фона. При данной кон-
концентрации углерода введение Ni в сталь приводит к уменьше-
уменьшению относительной интенсивности С. Наличие Ni в Fe, возмож-
возможно, снижает интенсивность линии Ска из-за того, что массовый
коэффициент поглощения для излучения у никеля выше, чем

Практические методы рентгеновского анализа
у железа. В работе [239] такие FeNiC-эталомы использовались
для исследования распределения углерода в цементованной
конструкционной стали, содержащей никель.
Следует рассмотреть также вопросы соответствующей под-
подготовки образцов, что будет показано в гл. 9. В процессе подго-
подготовки поверхности образцов необходимо либо избегать приме-
применения абразивных материалов, содержащих легкие элементы,
либо, если это на практике неосуществимо, тщательно очищать
о&разец для полного удаления остатков этих материалов. После
окончательной полировки полирующий материал можно удалить
ультразвуковой очисткой.Травление образца может быть неже-
лате'льным, так как после травления на поверхности может ос-
остаться слой остаточных загрязнений. В идеальном случае образ-
образцы следует помещать в прибор непосредственно после их подго-
подготовки. Если это неудобно, достаточно бывает хранить их в ва-
вакуумном эксикаторе.
Образец, подвергаемый электронной бомбардировке в ва-
вакуумной камере, откачиваемой диффузионным насосом, постепен-
постепенно покрывается слоем загрязнений в результате полимеризации
органических веществ, адсорбированных на поверхности под
действием пучка [240]. Источниками органических молекул
являются пары масла от вакуумных насосов и гажение любого'
органического материала, имеющегося в приборе. Этот эффект
не вызывает затруднений, пока образующийся слой не слишком
поглощает рентгеновское излучение. Для низкоэнергетического
рентгеновского излучения (^1 кэВ), особенно для Be, В и С,
поглощение рентгеновского излучения может быть значитель-
значительным. В случае анализа углерода проблема осложняется, так как
слой загрязнений содержит большое количество углерода. Это
обстоятельство приводит к наблюдаемому увеличению интенсив-
интенсивности линии Ка углерода с увеличением времени электронной
бомбардировки.
Для предотвращения образования слоя загрязнений исполь-
использовалось два метода. В работе [241] было показано, что обра-
образование загрязнений подавляется, если направлять непосредст-
непосредственно «а образец в область, бомбардируемую электронным
пучком, струю газа под низким давлением. Если к образцу под-
подводится воздух, кислород окисляет горячие продукты осаждения
углерода и пучок электронов с высокой энергией создает усло-
условия для распыления подобно катодному распылению при ион-
ионной бомбардировке. Сопла подачи воздуха были установлены
на различных РЭМ, и их установка может быть произведена в
любой лаборатории без больших затрат [242]. Другой метод
заключается в том, чтобы внутри РЭМ создать поверхность,
температура которой была бы ниже температуры поверхности
образца. Органические молекулы будут стремиться собираться

160 Глава 8
Таблица S
'.7. Массовые
для Ска
[2451
Fe
W
Mo
Cr
V
С
15 000
18 000
19 0001)
10 000
15 000
2 300
') Оценочное значение.
коэффициенты поглощения
ц/р для С^ , г/см2
!235]
14 300
_
11 000
9 300
2 270
[128]
13 300
18 750
32 420
10 590
8 840
2 373
на более холодной поверхности, а не н>а образце. Холодную
поверхность или холодный стержень следует, однако, размещать
очень близко к образцу. Холодные стержни были установлены
в различных приборах и эффективно снижали скорость образо-
образования загрязнений почни до нуля [243]. В одном случае [244]
использовались как подача воздуха, так и охлаждаемый жидким
азотом стержень. Количественный анализ легких элементов,
вероятно, следует проводить при .наличии какого-либо противо-
загрязняющего устройства или работая в сверхвысоковакуум-
ных условиях. Рассмотренные методы борьбы с загрязнениями
можно использовать для уменьшения загрязнения образца угле-
углеродом при работе на РЭМ.
Линия, соединяющая точки на рис. 8.26 для эталонов Fe—
Ni—С, не проходит через ,нача,ло координат (при нулевой кон-
концентрации углерода). Относительная интенсивность углерода
(после вычитания фона) не равна нулю, как ожидалось, не-
несмотря на то что появления слоя загрязнений не наблюдалось.
По-видимому, очень тонкая углеродная пленка присутствовала
на эталоне до анализа. Такая присущая образцу пленка загряз-
загрязнений может возникать под влиянием различных факторов, как,
например, при приготовлении и хранении, образца в лаборатор-
лабораторной атмосфере. Слои загрязнений на образцах имеются даже в
приборах с откачкой ионным насосам. Понятно, что появление
таких слоев обусловлено ве влиянием прибора, а. мобилизацией
присущих образцу загрязнений. Если слои загрязнений такого
рода можно охарактеризовать и они воспроизводимы, вклад их
при анализе за соответствующее время можно вычесть.
В многокомпонентных сплавах точное определение содержа-
содержания легких элементов все еще сопряжено с трудностями, даже
если нет наложения пиков, учтены сдвиги, обусловленные хими-
химическими связями, имеются эталоны и контролируется рост за-

Практические методы рентгеновского анализа 161
грязнений. К сожалению, недостаточно хорошо известны основ-
основные входные параметры для проведения схем расчета, например
массовые коэффициенты поглощения легких элементов в матри-
матрицах из тяжелых элементов. В качестве примера такой проблемы
в табл. 8.7 приведены значения массовых коэффициентов погло-
поглощения Ска, используемых при исследоваиии карбидов в инстру-
инструментальных сталях [245], бинарных карбидов [235], и значения
массовых коэффициентов поглощения из таблиц [129]. Расхож-
Расхождения значительны, в особенности для Мо и V. Неопределенно-
Неопределенности массового поглощения для линий La с энергией ^1 кэВ
уже обсуждались и иллюстрировались рис. 7.6. В свете сказан-
сказанного при расчете состава большинства сложных сплавов с ис-
использованием низкоэнергетического рентгеновского излучения
редко можно получить точность лучше ±10%. Однако погреш-
погрешности 'расчета можно свести к минимуму, если использовать
эталоны, близкие по составу к образцу.
В работе [246] описан, метод трех поправок для анализа
углерода, в основе которого лежит обобщенная функция рас-
распределения генерированного рентгеновского излучения по глу-
глубине tp(pz). В этой работе получили хорошее совпадение при
анализе карбидов известного стехиаметрического состава при
условии, что были только использованы разумные значения
массовых коэффициентов поглощения для С^-излучения. Метод
трех поправок (гл. 7), усовершенствованный для анализа лег-
легких элементов, был также описан в [118].

Глава 9
ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛОВ
И ОБРАЗЦОВ ДЛЯ РЭМ И РМА
9.1. МЕТАЛЛЫ И КЕРАМИКА
9.1.1. Растровая электронная микроскопия
Одно из больших преимуществ растровой электронной микро-
микроскопии заключается в том, что многие образцы могут исследо-
исследоваться фактически без предварительной подготовки. Толщина
образцов не имеет значения в противоположность просвечиваю-
просвечивающей электронной микроскопии. Поэтому в РЭМ можно иссле-
исследовать массивные образцы, размер которых ограничен только
тем, чтобы они разместились «а столике образца. Для получе-
получения картины топографического контраста на металлических и
керамических образцах единственно необходимая подготовка
образца заключается в тщательном обезжиривании его во из-
избежание загрязнения углеводородами и в случае непроводящих
образцов в нанесении проводящего покрытия. Методы очистки
поверхности заключаются в промывке растворителями и обез-
обезжиривании при ультразвуковой очистке, механической чистке,
снятии -реплик и химическом травлении. Эти методы следует
использовать, начиная с тех, которые вносят наименьшие по-
повреждения, и проводя минимально возможную необходимую
очистку. Обьгано на первом этапе используется промывка рас-
растворителем, .например ацетоном, толуолом или спиртом в уль-
ультразвуковом очистителе. Некоторые специальные методики
очистки' металлических поверхностей описаны в [247].
Поскольку мы хотим исследовать поверхность материала,
важно удалить примеси, которые оказывают вредное влияние
на вторичную электронную эмиссию. Под воздействием элек-
электронного пучка может происходить растрескивание пленки угле-
углеводородов, приводя к осаждению углерода и других продуктов
разрушения на поверхность образца в процессе исследования.
Появление загрязнений в процессе исследования часто можно
обнаружить, получая серию изображений с разным увеличе-
увеличением— от высокого (малая площадь сканирования) до низкого
(большая площадь сканирования). Слой загрязнений быстро
образуется при работе с большим увеличением из-за повышен-
повышенной степени облучения. При переходе к низкому увеличению на
изображении виден «квадрат растра» загрязнений (рис. 9.1).
Таким образом, важно избегать попадания летучих соединений
в РЭМ. Наличие остаточных углеводородов от масла диффузи-

Подготовка материалов и образцов для РЭМ и РМА
163
ill!
Рис. 9.1. Образование слоя загрязнений при электронной бомбардировке.
Темный квадрат на изображении появился в результате растрескивания углеводородного
слоя, созданного при сканировании при более высоком увеличении. Наличие слоя углево-
углеводородов приводит к изменению характеристик вторичной электронной эмиссии. Образец
YFeOa, ускоряющее напряжение 30 кВ.
омного «aooca также может привести к образованию загрязне-
загрязнений под действием электронного пучка. Эта проблема -решается
в большинстве случаев использованием охлаждаемых жидким
азотом ловушек для конденсации паров углеводородов.
В некоторых случаях, однако, подготовка образца становится
предметом особого рассмотрения. Как указывалось в гл. 4, сла,-
бый контраст, например за счет каналирования электронов, час-
часто-невозможно обнаружить при действии силыного контраста,
например топографического. Таким образом, если желательно
наблюдать картину электронного каналирования, 1-й .и Н-й ти-
типы магнитного контраста и другие механизмы слабого контра-
контраста, необходимо устранить наличие топографии на поверхности.
На металлических образцах можно получить зеркальную по-
поверхность почти без топографии с помощью химической поли-
полировки или электрополировки. Для металлов и сплавов опубли-
опубликовано большое количество работ с описанием методов поли-
полировки [248]. Металлографическая механическа-я полировка так-
также способствует удалению топографии и обеспечивает высоко-
высококачественную зеркальную поверхность, но в" результате механи-
механической полировки на поверхности большинства* металлических и
керамических образцов образуется нарушенный слой толщиной
~100 над A000 А), содержащий большое количество дефектов.
Наличие такого слоя приводит к потере контраста за счет кана-

164 Глава 9
лирования электронов, а в магнитных материалах остаточные
напряжения в слое приводят к образованию поверхностных маг-
магнитных доменов, характерных дл(я этого специфического напря-
напряженного состояния. Если для нас представляют интерес домены,
характерные для объема материала, появления слоя остаточных
напряжений следует избегать. Часто оптимальные результаты
получают сочетанием механической полировки для получения
плоской поверхности с последующей электрополировкой «ли
химической обработкой для удаления нарушенного слоя. Приме-
Применение одной электрололировки может иногда давать полирован-
полированную, но волнообразную поверхность. В общем проблема подго-
подготовки образцов остается искусством, где каждый материал пред-
представляет для исследователя каждый раз новую проблему.
Если электронный пучок бомбардирует непроводящие мате-
материалы, например силикаты, окислы или включения в металличе-
металлическом образце, поглощенные электроны собираются на поверхно-
поверхности из-за отсутствия стока заряда к земле. Накопление элек-
электронов приводит к созданию области пространственного заряда.
Проблема зарядки и методы ее преодоления обсуждаются де-
детально в гл. 10.
9.1.2. Рентгеновский микроанализ
9.1.2.1. Шероховатость поверхности и полировка
Так как рентгеновский микроанализ является в сущности
анализом подготовленной поверхности образца-, необходимо,
чтобы подготовленная поверхность точно отражала образец. Со
временем был разработан ряд качественных критериев для оцен-
оценки качества подготовки поверхности. Они заключаются в том,
что поверхность образца после полировки должна быть плоской,
не иметь царапин и перед анализом не должна подвергаться
травлению, чтобы не изменить топографию и химию поверхност-
поверхностного слоя. Такие критерии были разработаны первоначально
для металлургических образцов, но их можно применять непо-
непосредственно и к петрографическим образцам. Однако для био-
биологических образцов и влагосодержащих материалов такие кри-
критерии фактически не имеют смысла, поскольку «полированные»
образцы в такого рода анализах используются редко (гл. 12).
Наличие плоской поверхности у образца и эталона — это
первое требование. Для чистых элементов и гомогенных мате-
материалов можно приготовить образцы со сравнительно плоскими
поверхностями, поскольку твердость по образцу изменяется не-
незначительно. В результате при шлифовке и полировке происхо-
происходит почти равномерное удаление материала. К сожалеиию, боль-

Подготовка материалов и образцов для РЭМ и РМА 165
шинство рассматриваемых образцов те относится к этим двум
категориям. В случаях когда в образце имеются фазы с различ-
различной твердостью, на границах фаз могут появляться резко вы-
выраженные ступени. Наличие таких ступеней может приводить
к аномальному поглощению, и это следует учитывать, если
необходимо провести анализ участков вблизи границ. Один из
способов убедиться в наличии ожидаемого эффекта поглощения
состоит в том, что образец поворачивают на 180° и повторно из-
измеряют интенсивность. Если эффект поглощения имеет место,
его можно сделать минимальным поворотом образца так, чтобы
рентгеновское излучение регистрировалось бы в *направлении,
параллельном ступени.
. Если поверхность образца отличается от плоской, различия
в наклоне локальных участков поверхности влияют на результа-
результаты рентгеновского микроанализа и суммируются со статисти-
статистической неопределенностью процесса генерации рентгеновского
излучения. Показано [128], что для минимизации влияния на-
клона локальных участков поверхности Д\)з следует использовать
высокие значения угла выхода г|э. Также было продемонстриро-
продемонстрировано, что эффекты, связанные с различиями в приготовлении
поверхности образца и эталона, будут давать вклад в ошибки
измеренной относительной интенсивности k.
Более сложной и более общей проблемой, чем образование
ступеней, является проблема рельефа, возникающего при поли-
полировке, травлении и переполировке. Это приводит к переменному
профилю поверхности вдоль образца, т. е. к формированию не-
неровной поверхности. Эти профили могут существовать как в
одной и той же фазе, так и поперек границ фаз. Хотя иа грани-
границах зерен этот эффект выражен наиболее заметно, изменения
в пределах зерна могут быть такими же большими и даже боль-
больше, чем на границах зерен. Рельеф от полировки часто сводит-
сводится к минимуму при использовании полировальных полотен с
низким ворсом и при больших скоростях вращения диска. Если
используется процедура полировка — травление—¦ полировка,
то наиболее целесообразно применять хранитель, создающий
наименее выраженный рельеф. Количественный .анализ таких
образцов может быть сопряжен с трудностями, так как нельзя
исключить возможность ошибок за счет топографии.
Другой проблемой является анализ образцов, содержащих
включения в различных матрицах. В действительности эта проб-
проблема аналогична проблеме полировви двух фаз различной твер-
твердости, расположенных по соседству одна, от другой. Основное
отличие заключается в том, что включение мало по размеру и,
следовательно, может быть вырвано при подготовке образца.
Общепринятым способом сохранения включений является ис-
использование при полировке образца возможно меньшего коли-

166 Глава 9
чества поли ров а иной пасты или использование электрополиров-
ки образца. Всю область перехода между матрицей и вклю-
включением обычно можно исследовать с помощью оптического мик-
микроскопа при большом увеличении. Если образец подготовлен
правильно, как матрица, так и включение находятся точно в
оптическом фокусе. Детальное обсуждение проблемы полировки
и идентификации включений приводится в [249].
Дополнительной проблемой является внедрение полироваль-
полировального абразива в исследуемый материал. Следует подозрительно
относиться к аномальным включениям, содержащим элементы,
используемые для приготовления полировочных материалов. Это
особенно важно при исследовании образцов с трещинами или
пористых образцов. В таких случаях часто оправданно приме-
применение другого способа подготовки поверхности для того, чтобы
определить, являются ли такие включения артефактами или
нет. Для исключительно мягких материалов, таких, как сплавы
на основе свинца- или индия, где локальное намазывание компо-
компонентов может привести к ошибочным результатам микроанали-
микроанализа, возможно, предпочтительна электрополировка. Снова следу-
следует быть внимательным для того, чтобы получить возможно бо-
более плоскую поверхность. Что касается специальных методов
приготовления металлографических и петрографических
шлифов, в литературе имеется целый ряд ссылок [136, 248,
250—253]. Фактически существует столько методов приготовле-
приготовления микрошлифов, сколько самих микрошлифов.
Еще раз подчеркнем необходимость иметь действительно
плоскую поверхность образцов для всех случаев линейного или
шагового сканирования, а также в случае их комбинации, когда
образец механически перемещается относительно пучка электро-
электронов. В таких случаях регистрируемый поток рентгеновского из-
излучения может меняться как с уровнем фокусировки образца,,
так и из-за -неровности его поверхности. При некоторых схемах
геометрического расположения спектрометра и образца этот
эффект может привести к аномальным изменениям потока рент-
рентгеновского излучения для анализируемых элементов и затруд-
затруднить интерпретацию полученных результатов.
9.1.2.2. Приготовление эталонов для рентгеновского
микроанализа
Как указывалось в гл. 7, в основе количественного рентге-
рентгеновского микроанализа лежит измерение интенсивности рент-
рентгеновского излучения, испускаемого анализируемым образцом,
относительно [Интенсивности рентгеновского излучения с эталона
известного состава. Легче всего получить эталоны, состоящие

Подготовка материалов и образцов для РЭМ и РМА 167
из чистых элементов. Затем можно применить процедуры вве-
введения поправок, чтобы получить из отношения -измеренных ин-
тенсивностей состав образца. Однако модели поправок являют-
являются спорными. Иногда входные параметры, как, например, массо-
массовые коэффициенты поглощения и выход флуоресценции, извест-
известны с .недостаточной точностью. Более того, даже если имелись
бы идеальные процедуры введения поправок, некоторые элемен-
элементы, 'например сера, хлор, калий, галлий и т. д., -нельзя было бы
получить в чистом виде для использования в рентгеновском
микроанализе.
По этим причинам широкое распространение получило ис-
использование эталонов промежуточного состава. Имеются три
основных подхода: 1) приготовление полной серии эталонов,
чтобы можно было построить эмпирическую калибровочную
кривую для исследуемой системы; 2) получение одного эталона
для характеристики определенного соединения; 3) получение от-
отдельных эталонов для контроля работы прибора или использо-
использования в качестве «реперных точек» для процедур введения по-
поправок в применении к подобным системам.
Основные требования, предъявляемые ко всем таким этало-
эталонам, заключаются в следующем: они должны быть гомогенными
на микронном уровне пространственного разрешения, стабиль-
стабильными во времени, правильно подготовленными- для использова-
использования в РЭМ и тщательно про.а,нали13иров.анныМ:И независимыми
методами. Обычно наиболее строгим требованием является тре-
требование гомогенности. Это должно тщательно контролироваться
с помощью линейного сканирования, сканирования по площади
и анализа по точка-м. При подборе соединений для1 использо-
использования в качестве эталонов в рентгеновском микроанализе важ-
важно выбирать по возможности окислы с ковалевтными химиче-
химическими связями, так как наименее вероятно, что таясие материа-
материалы будут повреждаться электронным пучком. В случае анализа
щелочных металлов и галогенов исследователь вынужден обыч-
обычно использовать в качестве эталонов соли, например NaCl или
KI. Эти материалы повреждаются электронным пучком, и их
следует использовать только при низких плотностях тока. Оче-
Очевидно, что готовить полированную поверхность эталонюв из со-
солей следует в отсутствие воды и защищать отполированные эта-
эталоны от контакта с влажной атмосферой.
Приготовление полной серии эталонюв для анализа образцов
одной системы обычно требуется при применении микроанализа
в металлургии. Это оправданно, если требуется провести де-
детальное исследование системы, например, в случае определения
фазовой диаграммы состояния. При использовании надлежащих
эталонов точность анализа может достигать пределов, обуслов-
обусловленных статистикой рентгеновского излучения для таких систем.

Глава 9
0,2 0,4 0,6 0,8
Весовая доля Ni
1,0
-0,8
-о,в 1
-0,4 =
3 Рис. 9.2. Калибровочные кри-
0,2 g вые зависимости к от С для
|= системы Fe—Ni.
/ — для Ni; 2 —для Fe. Эксперн-
0 ментальные точки былн получены
\Q на девяти тщательно проаналнзи-
' рованных гомогенных эталонах
[254]: Д Ni, О Fe.
На рис. 9.2 приведены эмпирически определенные калибровоч-
калибровочные кривые для Fe и Ni в бинарных сплавах Fe—Ni при уско-
ускоряющем напряжении 30 кВ и угле выхода г|э = 52,5°. Кривые
были получены с помощью девяти тщательно проанализирован-
проанализированных гомогенных эталонов [254]. Излучение NUa сильно по-
поглощается в железе, а излучение Fexa возрастает за счет вто-
вторичной флуоресценции, обусловленной излучением Ni/<a.
Метод получения одного эталона для анализа определенного
соединения можно использовать в том случае, когда нельзя при-
приготовить подходящий эталон, из чистого элемента. Прежде чем
использовать имеющийся материал в качестве эталона, следует
определить его гомогенность и состав. Обычно да.ниые, полу-
полученные при использовании таких эталонов, требуют введения
поправок таким же способом, как и данные, полученные при
использовании эталонов из чистых элементов.
В Национальном бюро стандартов США были приготовлены
¦несколько бинарных сплавов и один тройной металлический
сплав, пригодных для использования в качестве эталонов [163].
В настоящее время среди стандартных эталонов имеются иизко-
легированиые стали [255], сплавы Аи—Ag и Аи—Си [256],
сплав W— 20% Мо [257], сплав Fe — 3,22% Si [258], две
марки патронной латуни [259] и сплав Fe—Си—Ni [260].
Принципиальная ценность этих эталонов заключается в том,
что они представляют собой тестовые образцы для развития,
проверки и усовершенствования методов анализа. Кроме того,
были выпущены многокомпонентные стекла, которые могут слу-
служить эталонами для анализа образованных извержением мине-
минералов (базальта, гранита) [261].

Подготовка материалов и образцов для РЭМ и РМА
169
9.2.
ЧАСТИЦЫ И ВОЛОКНА
Образцы микрочастиц можно исследовать обычно при мини-
минимальной подготовке. В общем мы будем предполагать, что ис-
исследуемые частицы надлежащим образом собраны, и их необ-
необходимо только скомпоновать для анализа в РЭМ. Полное об-
обсуждение методов собирания частиц приведено в работе [262].
Для компоновки некоторое количество сухих частиц наносится
на одноразовую липкую с обеих сторон, клейкую ленту, кото-
которая предварительно приклеивается к держателю образца РЭМ.
Следует отметить, что в процессе обращения сухие частицы
стремятся образовать агломераты. Если такие агломераты до-
допустимы, можно использовать процесс, проиллюстрированный
на рис. 9.3 [263]. Достоинство липкой ленты заключается в том,
что липкий материал имеет достаточно высокую вязкость, так
что ой не поглощает частицы и не наползает н>а иих гари их
креплении, однако является достаточно лип/ним, чтобы удер-
(а) Двухсторонняя клейкая лента
@,8 * 1,0 см)
(б) Двусторонняя клейкая
лента с удаляемой
Сетка размером 1 мм
с размеченными колон-
колонками и рядами
Полированная берилпиевая плас-
пластинка толщиной 0,8 мм,
приклеенная цементом
Рис. 9.3. Подготовка держателя из алюминия к нанесению малых частиц.
a — метод, в котором используется двусторонняя клейкая целлофановая лента; б — ме-
метод, в котором используется двусторонняя клейкая лента с удаляемой бумагой [263J.
/ — ленту изогнуть, чтобы исключить образование пузырьков воздуха; 2 — смазать со
всех сторон серебряной пастой; 3 — наложить на края ленты 1 мм пасты; 4 — сильно
прижать для удаления пузырьков воздуха, затем удалить бумагу пинцетом.

170 Глава 9
жать частицы. Частицы .наносятся на ленту либо с помощью
шпателя для осаждения холмика из частиц, либо они насыпают-
насыпаются из колбы. Лишние частицы стряхиваются с ленты, так как
наличие их приводит к значительному эффекту зарядки в РЭМ,
даже если они покрыты углеродом или металлом. Лента часто
замазывается углеродной пастой для обеспечения хорошего
электрического контакта с металлическим держателем образца
РЭМ.
Частицы можно прикреплять к держателю образца РЭМ,
покрывая последние вначале аквадагом (углеродной пастой)
или тонким слоем парлодия или коллодия. Частицы износятся,
как только паста или полимерное покрытие начнут подсыхать.
Если наносить частицы слишком рано, они погружаются в
«жидкое» покрытие и поверхность их станет непригодной для
исследования в РЭМ. Если частицы находятся в виде жидкой
суспензии, их следует отделить от жидкости и поместить «а
соответствующую подложку. Если концентрация частиц относи-
относительно высока, суспензию частиц можно прямо наносить на
подложку либо пипеткой в виде одной или 'нескольких микро-
капель, либо распыляя смесь на подложку, либо фильтруя
жидкость [262]. Жидкость удаляется затем иагревааием, от-
откачкой, заменой растворителя или высушиванием лиофильной
сушкой.
Проблема крепления одиночных частиц является более слож-
сложной, особенно из-за 'необходимости наблюдать З'а каждой анали-
анализируемой частицей. Частицы размером >50 мкм можно при-
прикреплять прямо к обычному держателю образца. Их можно
выбирать и помещать на него, наблюдая этот процесс в стерео-
микроскоп. Манипулировать с частицами можмо с помощью
пинцета из нержавеющей стали или остро заточенной итлы. Для
манипуляции с большими частицами можно также использовать
вакуумную присоску. Для присоединения частиц к держателю
образца можно использовать тонкие покрытия полимера, пар-
лодия или коллодия. Можно использовать также аквадаг или
даже цемент Дако. Из-за малой площади контакта нужно быть
очень внимательным, чтобы не исказить или сломать частицы
при креплении. Частицы размером более 50 мкм будут крепко
прикреплены в том случае, когда любая из этих сред .находит-
.находится в липком, частично затвердевшем состоянии. Необходимо от-
отметить положение частицы и ее 'относительные размеры с по-
помощью рисунков или оптических фотографий.
Частицы размером меньше 50 мкм крепить значительно труд-
труднее. Кроме того, рентгеновское излучение часто генерируется в
области внутри образца, отстоящей до 10 мкм от точки попада-
попадания электродного пучка. В частности, для частиц размером
^10 мкм рентгеновское излучение может вызывать флуорес-

Подготовка материалов и образцов для РЭМ и РМА
171
Вспомогательный объектив.2"
Минропипетка
с растворителем
- Цилиндрический держатель
Прозрачная стеклянная/
пластинка
Схематическое изойра-
Поле зрения сте - \ кение ориентире -
скопа. 50х \ ванной -а
капля амилацетата,~500 мкм
частица.~5 -юОмкм
высушенная
капля
коллодия
-Капля раство-
растворителя,~600 мкм
Первый шаг
Второй шаг
.Рис. 9.4. Установка одной частицы размером 5—50 мкм иа держателе об-
образца РЭМ под стереомикроскопом [263].
Первый шаг: конец иглы с частицей помещается в центр капли растворителя. Второй
шаг: вторая капля растворителя перемещается с помощью иглы через коллодий, затем
через частицу.
цевцию в держателе образца РЭМ, приводя к нежелательному
излучению. Явление такого постороннего рентгеновского излу-
излучения может приводить к некорректному определению химиче-
химического состава частицы. Не (рекомендуется использовать подлож-
подложки, состоящие из более тяжелых металлов, отличных от эле-
элементов, найденных в частицах, из-за появления линий рент-
рентгеновского излучения более высоких порядков [262]. Поэтому
следует использовать столики образца, ивготовлеиные из хоро-
хорошо отполированного графита или Be, которые ие дают вклад
в регистрируемый сигнал характеристического рентгеновского
излучения. Поверхности их должны быть гладкими, чтобы
наблюдатель «е запутался при поиске малых частиц. Основным

172
Глава 9
КЭВ
Рис. 9.5. Улучшение отношения сигнал/шум на частицах СаС18 размером
2 мкм.
Улучшение достигается при использовании в качестве подложки тонкой пленки углерода
(верхний спектр) по сравнению с массивной графитовой подложкой (нижний спектр) ?0=
= 16 кэВ [267].
недостатком при использовании Be является токсичность окиси
бериллия, которая образуется при полировке диска. На поверх-
поверхность пол и ров а иных пластин часто наносятся метки или цара-
царапины с помощью танкой вольфрамовой иглы для того, чтобы
л«гко определить положение частицы. Подложки следует гото-
готовить из материала с другим атомным номером, чем у частиц,
так как тогда образцы можно легко наблюдать, например, с по-
помощью сигнала отраженных электронов. Особой проблемой яв-
является получение подходящей среды для прикрепления угольных
частиц [264].
Для захвата частиц малого размера A0—50 мкм) использу-
используются тонкие вольфрамовые иглы. Та>кие частицы захватывают
иглой сухими и помещают в микрокаплю растворителя, напри-
например амилацетата, этанола, дистиллированной воды и т. д., ко-

Подготовка материалов и образцов для РЭМ и РМА Г73
торая наносится «а держатель образца микропипеткой (рис. 9.4).
После высушивания первой капли вторая капля растворителя
перемещается с помощью иглы ада каплю коллодиевого полиме-
полимера, которая была предварительно наиесена на столик. Смесь
растворителя и коллодия перемещается через частицу. При этом
малая пленка коллодия толщиной 20—50 ,нм скрепляет все во-
вокруг частицы и крепко удерживает частицу на столике. Если
все выполнено правильно, детали поверхности частицы не за-
закрываются. Частицы размером от 3 до 10 мкм также можно за-
захватывать иглой сухими .и помещать в микрокаплю растворите-
растворителя на столик образца РЭМ. Адгезия обычно осуществляется
путем электростатического притяжения.
Для осаждения частицы диаметром менее 50 мкм можно ис-
использовать метод, предложенный в [265]. Небольшое количе-
количество влажного >или сухого осадка помещается в деионизованную
воду и тщательно перемешивается. Приблизительно 0,2 мл рас-
раствора помещается на поверхность держателя образца РЭМ.
После этого образец, можно сушить, предпочтительно в экси-
эксикаторе. ,
Частицы размером меньше 3 мкм захватывать иглой нельзя.
Поэтому используется более сложная процедура их крепления.
Сначала частицы вводятся в плевку коллодия, затем пленка
снимается, промывается водой и переносится на держатель об-
образцов РЭМ. Коллодий затем растворяется растворителем, а
частицы остаются на столике. Этот процесс подробно описал
в [263, 265]. Мелкие частицы можно также наносить в сухом
виде или в виде жидкой суспензии зда кусочки покровных сте-
стекол, прикрепляемых к держателю образцов. Прилипание сухих
частиц обусловлено электростатическим притяжением.
Альтернативный метод крепления малых частиц (<10 мкм)
заключается в использовании подложек диаметром 3 мм, пред-
предназначенных для исследования в просвечивающем электронном
микроскопе, например тонкой углеродной пленки та сетке.
Частицы обычно наносятся на углеродную пленку с помощью
микрокапель растворителя, например амилацетата или этилово-
этилового спирта. При таком способе реализуется повышение чувст-
чувствительности рентгеновского микроанализа из-за того, что рент-
рентгеновское излучение, выходящее из частицы, не может больше
вызывать флуоресценцию рентгеновского излучения из подлож-
подложки. Как показано в [267], интенсивность непрерывного излуче-
излучения, генерируемого в подложке в виде тонкой пленки, значи-
значительно меньше интенсивности', генерируемой в обычшй угле-
углеродной подложке. С уменьшением интенсивности иепрерьгоного
излучения чувствительность к линиям характеристического рент-
рентгеновского излучения повышается. На рис. 9.5 показано, что
отношение сигнал/фон для частицы СаСЬ размером 2 мкм згаа-

174 Глава 9
чительно улучшается при использовании в качестве подложки
тонкой углеродной пленки вместо массивного держателя из
графита [267]. Недостаток, связанный с использованием в каче-
качестве подложки тонкой пленки, обусловлен возможностью полу-
получения в рентгеновском спектре пиков характеристического излу-
излучения от материала сетки. Для тех исследований, где эти побоч-
побочные пики рентгеновского излучения являются серьезной проб-
проблемой, можно использовать углеродные пленки .на, сетках лз Be.
Во избежание генерации рентгеновского излучения под дейст-
действием электронов пучка, проходящих сквозь тонкую углеродную
пленку, сетка от просвечивающего электронного микроскопа
монтируется та специальном графитовом держателе в РЭМ.
Для крепления субмикрощных частиц вначале готовят тща-
тщательно перемешанную водную суспензию из частиц или волокон.
Суспензию затем фильтруют через мембраны толщиной
~0,1 мкм. После фильтрации фильтр во влажном состоянии
разрезается иа части, которые прикрепляются к держателям
образца РЭМ целлофановой лентой, и выдерживаются в термо-
термостате в течение 4 ч при температуре 40 °С [268]. После этого
образцы гото-вы к нанесению проводящего покрытия.
Если неметаллические включения размером <5 мкм анали-
анализируются непосредственно в матрице, в спектре рентгеновского
излучения частицы будет содержаться информация от матрицы.
Поэтому при исследовании неметаллических включений наибо-
наиболее важным методом приготовления образца для анализа явля-
является метод снятия .реплик. В случае металлических матриц ме-
металл полируют и травят так, чтобы неметаллическое включение
выступало 1над поверхностью, но оставалось присоединенным к
металлу. Затем на поверхность образца напыляют углерод. Ме-
Металл снова стравливают, а неметаллические включения оста-
остаются в углеродной реплике в тех же положениях, которые они
занимали в металле. На рис. 9.6 показан этот двухстадийный
процесс [266]. Следующей стадией являются установка углерод-
углеродной пленки на сетке просвечивающего микроскопа и исследова-
исследование частиц в РЭМ.
Для определения состава и микроструктуры частиц размером
>10 мкм можно приготовить полированную оправку для иссле
Травленая
Углерод поверхность
' ,ш\ дд Д. \
угольная
эеплика с
"асицами
т
Повторное
длительное
¦'раален.'е
Ш & —
а Металл 6
Рис. 9.6. Две ступени снятия реплики.
а — вакуумное напыление углерода на сильно протравленную поверхность образца; б -*
повторное травление, после которого частицы остаются в углеродной пленке (рис. 111.
из [266]).

Подготовка материалов и образцов для РЭМ и РМА 175
дования в РЭМ. Для этого частицы монтируются ща обычном
держателе образцов РЭМ способом, описанным ранее. Держа-
Держатель с укрепленными на .нем частицами погружается со стороны
частиц в эпоксидную смолу. После полировки самой тонкой
абразивной бумагой внедренные частицы появятся на поверхно-
поверхности. Следует тщательно определить местонахождение и зафик-
зафиксировать расположение частиц, которые должны анализировать-
анализироваться в. РЭМ.
Если количество частиц достаточно большое, их можно сме-
смешать с 'небольшим количеством проводящей эпоксидной смолы
с серебром. Полученная смесь запрессовывается в глухое от-
отверстие, просверленное в графитовом или металлическом блоке.
После затвердевания образец можно отшлифовать и отполиро-
отполировать. Этот метод пригоден для анализа частиц размером
~ 1 мкм [165].
9.3. ВЛАЖНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
9.3.1. Почвы и глины
При изучении структуры почвы в РЭМ требуется, чтобы
жидкость, которая содержится в виде водного раствора, была
удалена из образца, прежде чем он помещается в прибор. Если
образец почвы имеет высокое содержание влаги и/или имеется
тенденция к усадке его при потере вла>ги, то высушить образец,
не нарушая ело исходной структуры, оказывается затруднитель-
затруднительным [269]. Для удаления воды из пор разработано шесть мето-
методов [270]. Эти методы следующие: 1) сушка в печи, 2) сушка
на воздухе, 3) сушка во влажной среде, 4) сушка замеще-
замещением, 5) лиофильная сушка и 6) сушка в критической точке.
Первые два метода просты и понятны. Сушка во влажной
среде представляет собой процесс обезвоживания образца
при контролируемом уровне влажности. При сушке заме-
замещением перед высушиванием производят замену жидкости,
имеющейся в порах почвы, жидкостью с низким поверхност-
поверхностным натяжением, такой, как метанол, ацетон или изо-
пентан [269]. Последние два метода являются теми же, что
используются биологами, и описаны в гл. 11. В основном для
твердых почв с низкой влажностью наиболее часто применяет-
применяется метод сушки на воздухе, в то время как почвы, имеющие
хрупкую структуру, могут быть высушены лиофильной сушкой
при быстром замораживании [269].
После того как образец высушен, необходимо получить нена-
ненарушенную поверхность его, разрушая и/или отслаивая поверх-
поверхностный слой. Для того чтобы разломать образец, на ием де-
делают зазубрину, а затем изгибают или тянут его для того,

176 Глава 9
чтобы создать р а стягивающие напряжения «а поверхности. От-
Отслаивание заключается в том, что на поверхность образца нано-
наносится липкий материал, а затем отрывается вместе с нарушен-
нарушенным поверхностным слоем частиц образца. Этот процесс повто-
повторяется несколько раз. Для получения более полного представле-
представления о подготовке образцов почв для анализа в РЭМ читатель
отсылается к обзорной статье [269]. В работе [271] описан ме-
метод ионной обработки, который используется для выявления
микроструктуры матрицы.
9.3.2. Полимеры
Многие промышленные полимеры содержат воду. При изу-
изучении характеристик поверхностного слоя этих полимеров тре-
требуется, чтобы процесс подготовки образцов для анализа в РЭМ
не внооил искажения в повержностный слой. Различные способы
приготовления образцов включают сушку на воздухе, сушку
в критической точке, излом при низкой температуре и лиофиль-
ную сушку. Простейшим из всех является сушка на воздухе.
Обычно используемые для подготовки полимеров методы очень
похожи на методы, используемые для подготовки биологических
материалов, и обсуждаются они в гл. 11 и 12.

Глава 10
МЕТОДЫ НАНЕСЕНИЯ ПОКРЫТИЙ
ДЛЯ ОБЪЕКТОВ РАСТРОВОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
И РЕНТГЕНОВСКОГО МИКРОАНАЛИЗА
10.1. ВВЕДЕНИЕ
Почти все 'Вепроводящие образцы, которые исследуются в
растровом электронном микроокопе «ли анализируются в рент-
рентгеновском микроамализаторе, необходимо покрывать тонкой
пленкой проводящего материала. Такое покрытие необходимо
для того, чтобы исключить или уменьшить электрический заряд,
который быстро скапливается яа .непроводящем образце при
сканировании его пучком электронов с высокой энергией. На
рис. 10.1 показаны примеры эффектов резко выраженной и не-
незначительной зарядки, наблюдаемых в РЭМ. При [исследовании
непроводящих образцов без покрытия в РЭМ при оптимальных
параметрах прибора неизменно проявляется явление зарядки,
которое приводит к искажению изображения и к термическому
¦и радиационному повреждению образца, что может повлечь за
собой значительную потерю материала из образца. В не ключи-
¦ тельных случаях на образце может накопиться достаточно высо-
высокий заряд и образец может действовать как электронное зерка-
зеркало, затормаживая первичный пучок. Было предложено множе-
множество альтернативных покрытиям методов-, некоторые из которых
будут обсуждаться в этой главе. Большая часть того, что будет
обсуждаться, относится к биологическим материалам и органи-
органическим образцам просто потому, что образцы такого типа не-
неизменно являются плохими проводниками и повреждаются элек-
электронным пучком значительно легче большинства неорганиче-
неорганических материалов. Однако естественно предположить, что мето-
методы, которые будут описаны для органических образцов, будут
одинаково эффективны при исследовании непроводящих 'неорга-
'неорганических образцов.
В этой главе внимание будет сконцентрировано «а практи-
практических аспектах некоторых наиболее широко используемых ме-
методов нанесения покрытий: термического испарения в вакууме
и катодного распыления, которые в настоящее время являются
обычными операциями в большинстве электронно-микроскопи-
электронно-микроскопических и аналитических лабораторий. Входить в детальное об-
обсуждение теоретических аспектов, тонкопленочвой технологии
не предполагается, и читатели, интересующиеся этим аспектом
предмета, отсылаются к работе [272].

••4* f -¦
ч.-*
. i-Йж.
Рис. 10.1. Эффекты зарядки при исследовании диэлектриков.
« — сильная зарядка при исследовании ненапыленного тефлона, энергии пучка 30 кэВ;
6 — незначительные эффекты зарядки. Образец: покрытое углеродом стекло с процара-
процарапанным проводящим слоги. Видны эффекты локальной зарядки (обведено кружком),
обусловленные облучением нсзапыленного стекла в трещине.

Методы нанесения покрытий
179
10.1.1. Характеристики образца
10.1.1.1. Проводимость
Единственным «.а-и более важным доводом в пользу нанесения
покрытия является увеличение электрической проводимости об-
образца. Материалы, обладающие высоким сопротивлением, т. е.
выше 1010 Ом-м, будут быстро заряжаться под падающим
пучком 'И могут зарядиться до потенциала, достаточного для
того, чтобы вызвать пробой диэлектрика в некоторых областях
образца. Это приводит к изменению поверхностного потенциала,
вызывающего сложные артефакты на изображении, обычно на-
называемые «зарядкой». Эти артефакты проявляются в виде откло-
отклонения визкоэиер'гети'чесних вторичных электронов, повышения
20
Рис. 10.2. Артефакты,
в РЭМ.
наблюдаемые на изображении при исследовании
поверхности пыльцы 1ро-
¦»«л шп у рии
сдвиг нзобра

1зО Глава 10
вторичной электронной эмиссии из трещин? на образце с гру-
грубым рельефом, периодических всплесков вторичной электронной
эмиссии и отклонения первичного электронного пучка и приво-
приводят к ухудшению разрешающей способности и аналитических
возможностей системы из-за иестабильноетей, связанных с
астигматизмом, чрезмерной яркостью ih ложным сигналом рент-
рентгеновского .излучения (рис. 10.2). Такая (нежелательная ситуа-
ситуация часто встречается, поскольку многие клейкие вещества, ис-
используемые для укрепления образца- на подложке, сами не яв-
являются проводниками и могут являться препятствием для стока
любого электрического заряда даже от проводящих образцов.
Подходящий канал стока для тока можно создать с помощью
¦серебряной или углеродной пасты. Если касаться только элек-
электрической дроводимости, то тонкого слоя золота, серебра или
меди будет достаточно для исключения проблем, связанных
с зарядкой. Даже если металлические образцы обычно являют-
являются проводящи-ми, возникают ситуации, в которых желательно
исследовать непроводящие области, например включения, и в
этих случаях необходимо наносить тонкие проводящие слои.
Проводимость тонкой пленки должна быть достаточной для
того, чтобы обеспечить отвод тока с образца на землю, ,ве заря-
заряжая поверхность до значительного потенциала.
10.1.1.2. Термическое разрушение
Нагрев образца обычно не является проблемой для боль-
большинства образцов, исследуемых в РЭМ, поскольку величина, то-
тока пучка обычно лежит в диапазоне пикоампер. Хотя для теле-
телевизионной развертки часто требуются более высокие токи,
маловероятно, чтобы это привело к заметному разрушению образ-
образца. Термические эффекты потенциально значительно более серь-
серьезны в режимах катодолюминесценции и рентгеновского микро-
микроанализа, когда величина тока пучка лежит в диапазоне нано-
ампер и даже микроампер. Избыточный нагрев в РЭМ может
вызвать смещение образца и нестабильности, а в исключитель-
исключительных ситуациях пробой и разрушение объекта. Явление, описы-
описываемое как повреждение под пучком, является, конечно, в наи-
наибольшей степени тепловым эффектом и проявляется в виде
пузырей, трещин и даже дььрок внутри и на поверхности образ-
образца (рис. 10.2, а). В рентгеновском ми кро анализ а торе использо-
использование более высоких токов пучка может вызывать быструю по-
потерю органического материала из пластиков, полимеров и био-
биологических образцов и даже приводить к существенным потерям
элементов.
Термическое разрушение можно уменьшить, работая с низ-
низкими токами пучка и используя тонкие образцы, находящиеся

Методы нанесения покрытий 181
в хорошем тепловом контакте с хорошим проводником тепла
или же образцы можно покрывать тонкой пленкой хорошо про-
проводящего тепло материала, например меди, алюминия, серебра
или золота.
10.1.1.3. Эмиссия вторичных и отраженных электронов
Тонкий слой металла, который обычно используется для соз-
дамия электрической и термической проводимости у изоляторов,
является также источником общей массы вторичных электронов.
Слой металла, например золота толщиной 10 нм, ковеч,но, повы-
повышал бы коэффициент вторичной электронной эмиссии б для ор-
органического образца., исследуемого при «изком ускоряющем на-
напряжении, -но мог бы сильно снижать б для керамики, содержа-
содержащей значительное количество окислов щелочноземельных эле-
элементов.
Отраженные электроны также используются в сочетании с
обычными цитологическими методами для локализации в био-
биологических тканях областей, представляющих интерес для фи-
физиологов. Так, если нахождение отложений свинца или серебра
в специфических местах кусочков ткани сопряжено со значи-
значительными усилиями, по-видимому, нецелесообразно покрывать
образцы слоем тяжелого металла и маскировать контраст за
счет атомного 'номера, который будут давать эти области. Под-
Подходящим методом в этом случае является нанесение тонкого
слоя проводящего материала с ^низким атомным номером, на-
например углерода, который не должен заметно рассеивать па-
падающий пучок, позволяя ему достигать образец.
Для растровой электронной микроскопии высокого разреше-
разрешения, использующей электроны, потерявшие малую часть энер-
энергии, где контраст зависит от рассеяния высокоэнергетических
электронов от поверхности образца, образец следует покрывать
тонким слоем тяжелого металла,, который ие дает структуры
на уровне разрешения 1 нм. Экспериментальная проверка под-
подтверждает, что тугоплавкие металлы, такие, как тантал или
вольфрам, обеспечивают такое покрытие.
10.1.1.4. Механическая стабильность
Микрочастицы и хрупкий органический материал более проч-
прочно закрепляются в определенном положении на держателе об-
образца после покрытия их тонким слоем углерода. Во многих
случаях можно помещать такой материал прямо «а держатель
и фиксировать его очень тонким слоем углерода, наносимого с
двух 'направлений. Такой простой метод позволяет избежать ис-
использования клейких веществ, большинство из которых являют-

182
Глава 10
ся непроводящими. Металлические покрытия, в частности те,
которые наносятся катодным распылением, являются достаточ-
достаточно прочными и способствуют повышению механической прочно-
прочности любого хрупкого материала.
10.1.1.5. Образцы без покрытия
Для исследования образцов без покрытия в РЭМ можно при-
применять [несколько методов, включая работу при низких энергиях
пучка, использование второго пучка электронов или ионов для
снятия заряда с образца и исследование образца в присутствии
воды.
Уменьшение зарядки при низких ускоряющих напряжениях
связано с особенностями электронной эмиссии с твердых тел и
может быть объяснено следующими соображениями [68]. Если
коэффициент электроивой эмиссии, включающий как отражен-
отраженные первичные, так и вторичные электроны, построить как функ-
функцию энергии падающего пучка Ео, то получим график, показан-
показанный на рис. ,10.3. Для диэлектриков существует область, где
количество испускаемых электронов превышает количество па-
падающих электронов, т. е. б + -п>1. Эта область ограничена дву-
двумя значениями энергии Е\ и Ей, для которых 6+г|=1; эти зна-
значения называются первой и второй характерными точками. Зна-
Значения Ei по порядку составляют несколько сотен электроивольт,
Ец лежат в диапазоне 1—5 кэВ в. зависимости от материала.
Если энергия падающего пучка электронов меньше Еи то
6+Ti<l, и образец покидает меньшее число электронов, чем
попадает на него, приводя к накоплению отрицательного заря-
заряда. Этот заряд понижает эффективную энергию падающего пуч-
пучка, приводя к дальнейшему понижению б+т]. Такая ситуация
продолжается до тех пор, пока образец не зарядится до такой
Рис. 10.3. Зависимость полною ко-
коэффициента вторичной электронной
эмиссии (отраженные и вторичные
электроны) от энергии первичных
электронов Ео.
Я| и Яг1 — первая и вторая характерные
точки.

Методы нанесения покрытий 183
величины, чтобы полностью отразить первичный пучок. Если
энергия пучка заключена м<ежду Е{ и Еп, то образец покидает
большее число электродов, чем попадает на .него, т. е. б+<п>1.
При этом образец заряжается положительно и положительный
заряд приводит к уменьшению эффективного значения б, так
как визкоэяергетические вторичные электроны притягиваются
обратно к образцу. Благодаря этим процессам эффективное
значение Ь+ч\ стремится к единице и устанавливается динами-
динамическое равновесие, три котором эмитируемый ток равен току
падающих электронов, при этом «а поверхности образца уста-
устанавливается малый постоянный положительный поверхмостн'ый
заряд. Небольшие отклонения от кривой рис. 10.3 в разных мес-
местах поля зрения ;не имеют значения, TaiK как они будут приво-
приводить к слабым различиям в значениях равновесного потенциала
поверхности. Работа при Е>Ец снова приводит к образованию
отрицательного поверхностного заряда, который снижает эффек-
эффективное значение Е, повышая б+т) до тех пор, пока ¦не устано-
установится равновесие с эффективным значением Е, равным Ец. Как
указывается в [68], такое равновесие не является удовлетвори-
удовлетворительным, так как Ец может существенно меняться по поверхно-
поверхности, приводя к большим вариациям конечного потенциала по-
поверхности от места к месту. Небольшие утечки за- счет поверх-
поверхностной проводимости могут оказывать сильное влияние в таких
ситуациях, приводя к сложному поведению картины ;на изобра-
изображении во времени. Поэтому желательно работать в диапазоне
энергий Ei<iE<cEii, чего часто достигают, выбирая значение Е
равным приблизительно-1 кэВ. При этих условиях диэлектрики
можно исследовать без покрытия. Однако при низких ускоряю-
ускоряющих напряжениях рабочие характеристики РЭМ обычно значи-
значительно ухудшаются из-за значительного понижения яркости
источника. РЭМ с автоэмиссионной электронной пушкой обла-
обладают высокой яркостью и позволяют получать изображения с
хорошим разрешением даже при низких энергиях пучка [273].
Низкая энергия пучка является препятствием при проведе-
проведении рентгеновского микроанализа, так как перенапряжение
является .недостаточным, за исключением рентгеновского излуче-
излучения с крайне низкой энергией. Для избежания этого ограниче-
ограничения несколько авторов предложили методы, в которых для сня-
снятия заряда с образца, возникающего в процессе бомбардировки
высокознергетическим электронным пучком, используется второй
пучок низкоэнергетических электронов или ионов.
Авторы [274] использовали импульсный пучок низкоэнерге-
ти'ческих электронов для бомбардировки образца во время об-
обратного хода строчной развертки. Принцип снятия заряда с об-
образца тот же, что показан ш рис. 10.3. В [275] описан метод
нейтрализации заряда, основанный на использовании низкоэнер-

184 Глава 10
гетического пучка положительных щелочных ионов, которые
притягиваются к областям, имеющим отрицательный поверхност-
поверхностный заряд.
Если образец содержит воду, то его проводимость будет до-
достаточной для стекания заряда. Значительные успехи были до-
достигнуты nipiH исследовании и анализе при «изких температурах
биологических материалов без нанесения покрытий [276].
В условиях, когда вода находится в замороженном состоящий,
также имеются ионы и электролиты [277], которые обеспечива-
обеспечивают проводимость. Если образец можно исследовать в камере,
контролируемой окружающей средой, вода может оставаться
в жидком состоянии и способствовать снятию заряда, обус-
обусловленного первичным пучком [278].
10.1.2. Методы, исключающие нанесение покрытия
Одним из наиболее полезных методов, которые были разра-
разработаны, является повышение объемной проводимости образца
в-отличие от поверхностной проводимости. Увеличение объемной
проводимости может быть достигнуто введением металлов пу-
путем пропитки фиксирующими растворами осмия и марганца
с использованием или без использования органических лига-в-
лига-вдов с металлами или закрепителей, та-иих, как тиокарбогидра-
зид, галлоглюкоза, парафенилендиамин, путем выдержки образ-
образцов в парах OsCU или объемного окрашивания образцов после
фиксации металлическими солями. В [279] была предложена
полезная модификация метода паров осмия, заключающаяся
в выдержке образца также в парах гидрата гидразина, которая
приводит к осаждению металлического осмия. Сравнительные
достоинства этих методов обсуждаются в недавно опубликован-
опубликованных обзорных статьях [280—282].
Другим способом зарядка образца может быть уменьшена
распылением или пропиткой органическими антистатическими
веществами, получаемыми из поли аминов, т. е. дюроном, денки-
лом или алкилбевзолсульфонатом натрия, вымачиванием в про-
проводящих коллоидах благородных металлов или графита или
покрытием образца тонкой (~1,0—20,0 нм) полимерной плен-
пленкой, например формваром или вииилпиридинстиролом [283].
Ни один из методов повышения объемной проводимости об-
образца, за некоторым исключением, не позволяет ничего полу-
получить дополнительно ни по разрешению, ни по информации к то-
тому, что получается ва образцах с правильно нанесенным покры-
покрытием.
Действительно, использование этих -исключающих напыление
методов в настоящее время ограничено, что было показано в
[284], поскольку сейчас возможно наносить соответствующее

Методы нанесения покрытий 185
покрытие в вакуумной камере даже на самые -неустойчивые и
чувствительные к термическому воздействию образцы. К тому
же, по-видимому, если образец .не может выдержать среднего
вакуума в камере для распыления, вряд ли он выдержит высо-
высокий вакуум в электронно-зондовом приборе.
Методы, разработанные для повышения объемной проводи-
проводимости, особенно полезны в сочетании с методами занесения по-
покрытий и часто используются при исследовании внутренней мор-
морфологии поверхностей излома трехмерных образцов. Например,
субструктуру поверхностей излома можно выявить при обработ-
обработке осмием за счет контраста, зависящего от атомного номера,
а не за счет топографического контраста, обусловленного по-
поверхностны ми неодаородностями.
10.1.3. Тонкопленочная технология
Тонкие пленки получаются многими способами [272], но из
всех этих методов для нанесения покрытий на образцы, пред-
предназначенные для РЭМ я РМА, пригодны только термическое
напыление в вакууме и катодное распыление. Прежде чем об-
обсуждать эти методы, нужно рассмотреть свойства идеальной
пленки. Такая пленка не должна обладать какими-либо струк-
структурными особенностями на уровне разрешения 3—4 им, для того
чтобы не создавать нежелательных артефактов на изображении.
Идеальная пленка должна быть однородной по толщине неза-
независимо от топографии образца и не должна вносить изменений
в измеряемый химический состав образца или ощутимо влиять
на интенсивность рентгеновского излучения, испускаемого об-
образцом.
10.2. ТЕРМИЧЕСКОЕ НАПЫЛЕНИЕ
Многие металлы и некоторые органические диэлектрики при
нагревании тем или иным способом в вакууме начинают быстро
испаряться в виде моноатомных слоев, когда их температура
становится достаточной для того, чтеобы давление пара достиг-
достигло величины свыше 1,3 Па A0~2 Торр). Высокие температуры,
необходимые для испарения материалов, могут быть достигну-
достигнуты тремя различными способами.
В методе резистивного иагрева электрическим током разо-
разогревается контейнер, сделанный из огнеупорного материала,
например одного из окислов металла, или проволочный держа-
держатель из тугоплавкого металла, такого, как вольфрам, молибден
или тантал. Испаряемый материал помещается в контейнер,
который постепенно нагревается до тех пор, пока материал ;не
расплавится и испарится. В методе электрической дуги дуга

186 Глава 10
зажигается между двумя электродами, разделенными проме-
промежутком в несколько миллиметров. Происходит быстрое испа-
испарение поверхности электрода'. Именно этот способ обычно ис-
используется для испарения ««которых тугоплавках металлов.
Для большинства тугоплавких металлов, таких, как вольфрам,
тантал и молибден, ©аиболее эффективным способом нагрева
материала является использование эле стройного пучка. В этом
методе испаряемый металл является анодной мишенью, которая
нагревается электровным потоком с катода, находящегося под
потенциалом 2—3 кВ. Это является очень эффективным мето-
методом нагрева, так как наиболее высокотемпературной областью
является испаряющаяся поверхность, а -не сам материал испа-
испаряемого источника. Преимущество метода заключается в том,
что испаряемый металл при осаждении дает зерна очень малых
размеров. Испарение с помощью электронной пушки может
также использоваться для 'напыления некоторых более легко-
легкоплавких металлов, например хрома и платины, которые имеют
частицы очень малых размеров.
Методы испарения удобно рассматривать в двух аспектах —
требующие высокого вакуума и низковакуумные.
10.2.1. Высоковакуумное испарение
Высоковакуумным мы .ниже будем считать методы работы
при вакууме от 10 мкПа до 100 мПа (~10~7—10~3 Торр).
В электронно-микроскопических лабораториях обычно применя-
применяются именно методы высоковакуумного испарения.
Образование тонкой пленки представляет собой сложный
процесс и проходит последовательно через характерные стадии
зародышеобразования и коалесцеадии к формированию сплош-
сплошной пленки. Приходящие на поверхность образца первые 'атомы
будут оставаться на ней, диффундируя, сталкиваясь и слипаясь
друг с другом, с образованием на поверхности зародышей кри-
критического размера. Чем сильнее связь между адсорбированны-
адсорбированными атомами -и подложкой, тем выше вероятность образования
зародышей я тем меньше их критический размер. По-видимо-
По-видимому, у большинства биологических и органических образцов
имеют место вариации энергии связи по поверхности, что влечет
за собой вариацию критического размера, зародыша на поверх-
поверхности и приводит к осаждению неравномерной пленки. Поэтому
для получения более мелких и более однородных зародышей
металлической пленки используют предварительное покрытие
образца гомогенным слоем путем нанесения углерода, в усло-
условиях низкого вакуума. Например, плотность зародышеобразова-
ния для золота может быть значительно повышена при предва-
предварительном нанесении слоя углерода толщиной 5—10 нм. По

Методы нанесения покрытий
187
Поддонка
Островки
Л
Подложка
Островки
атомов
Рис. 10.4а. Последовательные стадии образования тонкой пленки [285].
/ — приход отдельного атома; 2 — миграция и повторное испарение; 3 — столкновение и
объединение отдельных атомов; 4 — образование зародышей; 5 — рост; в — форма остров-
островков (поперечный разрез); 7 — коалесценция; 8 — образование сплошной пленки.
мере продолжения осаждения за счет трехмерного роста цент-
центров за/родышеобразования происходит возникновение островков,
которые постепенно коалесвдруют и приводят к образованию
сплошной пленки (рис. 10.4а и 10.46). Скорость образования
сплошной пленки и средняя толщина, при которой даниая плен-
пленка становится сплошной, зависят от многих факторов. Они
включают в себя материал испаряемого вещества и подложки,
их относительные температуры, скорость осаждения и конечную
толщину пленки, а также топографию поверхности образца.
10.2.1.1. Аппаратура
ВысокО'вакуумпый 'испаритель должен удовлетворять следую-
следующим основным требованиям: 1) высокая скорость откачки при

188 Глава 10
Рис. 10.46. Электронно-микроскопические изображения ультратонких пленок
золота, испаряемых со скоростью 0,05 нм/с [286].
Толщины пленок составляют 1 нм (а), 4 км (б), 6 нм (в) а 15 нм (г).
низком давлении газа для того, чтобы обеспечить быстрое уда-
удаление газов, освобождаемых ,из испаряемого источника и образ-
образца в процессе «анесения покрытия; 2) минимальный обратный
поток паров из насосов в камеру для напыления; 3) простота и
легкость ,разбор.юи системы для чистки и ремонта; 4) тааличие
электрических вводов для возможности проведения многократ-
многократного напыления и манипуляции с образцом.
Большинство приборов откачивается с помощью диффузион-
диффузионного насоса в сочетании с механическим форвакуумяым васо-
сом. Чем больше размер горловины диффузионного «асоса, на-
например 150цМ!м вместо 75 мм, тем меньше время откачки иа-
пылительной камеры, хотя при этом будет иметь место лишь не-
незначительное улучшение получаемого предельного вакуума. Не-
Некоторые устройства снабжены турбомолекулярными насосами
в сочетании с механическими форвакуумными. Такие устройства
обеспечивают более быструю откачку и более чистые ва-
вакуумные условия, однако создаваемое ими предельное

Методы нанесения покрытий
давление не лучше . того, которое получается с помощью
диффузионного насоса. Форвакуумный насос должен быть
двухступенчатым с возможностью применения метода балла-
балласта. Использование газового балласта является наиболее
эффективным средством предотвращения конденсации паров
в форвакуумном насосе. Метод заключается в напуске
небольшого количества воздуха, в механический форва-
форвакуумный насос во время цикла сжатия, чтобы выхлопные пары
смешивались с -нгконденюировамным газом. Это уменьшает сжа-
сжатие, 'необходимое для поднятия выхлопного клапана, « препят-
препятствует конденсации пара. Конденсацию пара в форвакуумном
насосе можио также уменьшить, поднимая температуру -насоса
и помещая осушитель, например Р2О5, в выхлопной линии. Во
избежание обратного потока одним форвакуумным насосом си-
систему не следует откачивать .ниже давления 10 ПА A0 х Торр).
Выхлоп фор вакуумного насоса >не должен проводиться в лабо-
лабораторию, его нужно выводить либо в вытяжной шкаф, либо на-
наружу. По-видимому, нет необходимости прибегать к ионным и
сублимационным насосам или к экзотическим системам с крио-
откачкой, так как обычно используемые методы напыления не
требуют сверхвысокого вакуума (от 1,3-10~7 до 1,3-10~10 Па).
Какая бы система не использовалась, выооковакуумная и
форвакуумная линии откачки от насосов к камере должны быть
оборудованы жалюзями и/или ловушками с активированной
окисью алюминия в форвакуумной линии для сведения к мини-
минимуму обратного потока масла из насосов. Жалюзи, охлаждае-
охлаждаемые водой, достаточно эффективны, ,но лучший эффект дости-
достигается при применении жалюзи, охлаждаемых жидким азотом.
Охлаждаемая жидким азотом ловушка в форвакуумной линии
сведет до минимума диффузию масла из форвакуумного насоса
в камеру для напыления во время форвакуумной откачки и
позволит поддерживать предварительный вакуум в диффузион-
диффузионном иасосе на уровне приблизительно 10^2 Па. Полезно также
иметь охлаждаемую жидким азотом ловушку после диффузион-
диффузионного насоса, между ним и испарительной камерой. Следует вни-
внимательно проследить за тем, где измеряется вакуум в системе.
Если вакуум измеряется вблизи от насосов, то, по всей вероят-
вероятности, он будет в 10 раз лучше, чем вакуум в испарительной:
камере. Испарительную камеру следует делать из стекла, и она
должна быть как можно меньших размеров, лишь бы было-
удобно работать. Испарительная камера должна иметь защит-
защитный экран для предохранения от осколков при взрыве. В каме-
камере должно быть по крайней мере четыре штекера с электриче-
электрическими контактами для того, чтобы можно было испарять два
разных материала, вращать образец и измерять толщину плен-
пленки. Электрическая мощность, подводимая к источнику «спаре-

190 Глава 10
ни я, должна быть регулируемой, и полезно иметь кнопку, с по-
помощью которой можно было бы на короткие периоды подводить
к испарителю максимальную мощность. Атмосферное давление
в приборе должно устанавливаться с помощью 'регулируемого
игольчатого клапана, который можно было бы подсоединить
к баллону с сухим инертным газом.
10.2.1.2. Выбор вещества для напыления
Выбор материала для напыления и режим его нанесения
зависит в значительной мере от того, что есть конкретно под
рукой. В большинстве случаев при подготовке объектов для
РЭМ используются золото, сплавы золота с палладием «ли
платины с углеродом. Серебро имеет высокий коэффициент
вторичной электронной эмиссии и является наилучшим среди
материалов для точного воспроизведения профиля поверхности.
К сожалению, серебро обладает тем (недостатком, что легко
тускнеет и образует зерна значительно большего размера, чем
у других металлов. Золото обладает высоким коэффициентом
вторичной эмиссии, легко испаряется из вольфрамовой спирали,
но оно имеет тенденцию к образованию в процессе напыления
зерен и агломератов, в результате чего для получения сплош-
сплошной шгоики требуется напылять более толстый слой. Меньшей
зернистостью, чем золото, обладает сплав 60% золота —40%
палладия или только палладий, и он позволяет получить наибо-
наиболее тонкие сплошные пленки. К сожалению, оба металла, легко
образуют сплав с вольфрамовым держателем. Пленки платины
с углеродом при одновременном -напылении имеют зерна малых
размеров, но проводимость их довольно низкая. В [287] пока-
показано, что оттепешие образца, при низких углах (~30°) напыле-
напылением хрома перед нанесением пленок углерода и сплава золота
с палладием улучшает изображение образцов в РЭМ. Наимень-
Наименьшая зернистость получается на пленках из тугоплавких метал-
металлов, но их можно распылять только при нагреве электронным
пучком. На рис. 10.5 и 10.6 показаны различия в деталях по-
поверхности тонких пленок некоторых металлов, напыленных на
непроводящие образцы. Обычное эмпирическое правило для
рентгеновского микроанализа: желательно иметь тончайшее
покрытие, обеспечивающее стабильные ток образца и поток
рентгеновского излучения. Это справедливо, так как чем тоньше
покрытие, тем меньше поглощение рентгеновского излучения в
нем и тем меньше потери энергии первичного электронного пуч-
пучка при входе в обоазец. Кроме того, чем тоньше покрытие, тем
меньше будет генерация рентгеновского излучения «з самого
покрытия. Для пленок из золота и золота с палладием, которые
часто используются в растровой электронной микроскопии для

Методы нанесения покрытий
191
Рис. 10.5. Изображение очищенных диатомовых водорослей, покрытых
10 им-слоем различных металлов.
а —золото; б —алюминий; а — медь; г — серебро; д — хром; е — сплав золота с палла-
палладием; ж —титан; з — олово; и — кальций. Энергия пучка ?0 = 20 кэВ.
получения достаточно высокой вторичной электронной эмиссии,,
генерируемое характеристическое и/или непрерывное излучения
могут налагаться и взаимодействовать с анализируемыми ли-
линиями исследуемого характеристического рентгеновского излу-
излучения. Особые проблемы могут возникать в том случае, если
анализируемый элемент присутствует в малых количествах или
в виде следов. Обычно используемые толщины лежат в диапа-
диапазоне от 5 до 50 нм E0—500 А). Для пленок углерода,, алюми-
алюминия, золота и золота с палладием толщиной 5—10 нм E0—
100 А) потери энергии первичного пучка оказываются малыми
. даже при низких ускоряющих напряжениях. Однако первичный

'92 Глава 10
4.
р*' %
й'-
V
'V*
^
I %" "¦ *.
К"
1к 'V "*'-.' j - t Q.5
Рис. 10.6. Изображение полистирольных латексных сфер диаметром
0.109 мкм, покрытых 10 нм-слоем различных металлов.
о — золото; б —алюминий; а — медь; г — серебро; д — хром; с — сплав золота с палчади-
ем; ж — тнтан; з — олово; и — кальций. Энергия пучка ?о = 2О кэВ.
пучок и отраженные от образца электроны могут возбуждать
рентгеновское излучение из пленки. Это может оказаться суще-
существенным для покрытий «з золота и золота с палладием на об-
образцах со средними атом'ными номерами больше 10.
Исследование массовых коэффициентов ослабления jx/p по-
казыва!ет, что для линий рентгеновского ¦излучения с длинами
волн от 8 до 40 А алюминий имеет наиболее низкий коэффи-
коэффициент из четырех материалов, за ним по порядку следуют угле-
углерод, золото и сплав золота с палладием. В области длин волн

Методы нанесения покрытий 193
¦даже 8 А значение ц./р для углерода «иже, чем у алюминия, зо-
золота и сплава золота с палладием. Однако золото является наи-
наилучшим материалом с точки зрения электро- и теплопроводно-
теплопроводности; эти параметры для алюминия составляют 7з величины па-
параметров золота, а у углерода эти показатели плохие. По-види-
По-видимому, в общем случае алюминий по его физическим свойствам
предпочтительно 'использовать при длинах волн рентгеновского
излучения в диапазоне 0,8—4 нм (8—40 А), а углерод — вне
этого диапазона.
Обычно для напыления используются материалы в виде про-
проволоки. Рекомендуется использовать толстую проволоку диамет-
диаметром 0,5—1,0 мм, так как короткие куски можно легко закре-
закрепить петлей на соответствующей нити из тугоплавкого мате-
материала.
Вещества, не существующие в виде проволоки, бывают в ви-
виде порошков или стружки, и их удобно испарять из тиглей, из-
изготовленных из огнеупорного материала, или >из лодочек, сде-
сделанных из тугоплавких металлов. Следует тщательно следить
за тем, чтобы испаряемое вещество не сплавлялось или не обра-
образовывало соединений с огнеупорным материалом. Большинство
металлов, имеющих точку плавления ниже 2000 К, можно ис-
испарять из проволочного держателя или лодочки, сделанных из
тугоплавких металлов, таких, как вольфрам, молибден или тан-
тантал. Такие держатели должны быть хорошими проводниками,
иметь очень низкое давление паров и быть механически ста-
стабильными.
10.2.1.3. Способы напыления
Когда давление достигнет значения около 10~2 Па, поддер-
поддерживающая проволока из тугоплавкого материала и, где умест-
уместно, угольные стержни могут быть разогреты до слабого красно-
красного цвета. Слабый нагрев будет приводить к резкому ухудшению
вакуума за счет обезгаживания и удаления остаточных загряз-
загрязнений. Как только обезгаживание прекратится, уменьшают ток
и продолжают откачку. Если на образец .необходимо нанести
углеродное покрытие прежде, чем напылять металл, это лучше
всего сделать при давлении около 10~2 Па.
Во время напыления образцы вращают и наклоняют, чтобы
получить ровное покрытие на всех поверхностях. После осаж-
осаждения пленки углерода вакуум улучшается до 10~3—10~4 Па.
Теперь можно пропустить электрический ток через вольфрамо-
вольфрамовую проволоку держателя, чтобы испарить металл. Эту опера-
операцию следует выполнять с осторожностью, и лучше всего увели-
увеличивать ток постепенно до момента, когда вольфрамовая прово-
проволока начнет светиться, а затем немного уменьшить ток. При

194 Глава 10
этом испаряемый металл постепенно нагревается и испаряется
по мере плавного увеличения тока, текущего через вольфрамо-
вольфрамовую проволоку.
Обычно испаряемый металл образует расплавленные шармки
внутри V-образной вольфрамовой спирали. В таком состоянии
его следует оставить на некоторое время для удаления остаточ-
остаточных загрязнений. Затем ток следует увеличивать до тех пор,
пока шарики расплавленного металла не начнут мерцать и
«вращаться». С этого момента начинается испарение, можно
убрать заслонку и открыть вращающийся образец источнику
испарителя. Для получения равномерного покрытия на образцах
со сложным рельефом поверхности валено, чтобы он,и в процессе
нанесения покрытия вращались достаточно быстро F—8 об/с).
Идеальным в это-м случае оказывается вращение образца в пла-
планетарном движении при непрерывном наклоне его в пределах
180°. Наиболее важными моментами являются медленный на-
нагрев, плавление и испарение металла, особенно при использова-
использовании алюминия, который образует сплав с вольфрамом. Если
нагрев источника происходит слишком быстро, испаряемый ме-
металл плавится в точке соприкосновения с вольфрамовой прово-
проволокой и выпадает. Однако для получения пленок хорошего ка-
качества важным параметром является скорость нанесения по-
покрытия, и, чем больше скорость испарения, тем мельче структу-
структура слоя. Эта оптимальная высокая скорость нанесения покры-
покрытия должна быть сбалансирована с повышенной тепловой отда-
отдачей источника и повышенной вероятностью того, что проволока
держателя может образовать сплав с материалом и расплавить-
расплавиться. Толщину напыленной пленки можно измерить различными
методами, которые будут описаны позже, при этом наиболее
удобным из них является устройство для измерения тонких
пленок с помощью кварцевого кристалла, смонтированного внут-
внутри вакуумной камеры. Толщина осаждаемой пленки зависит
также от конкретного исследуемого образца и от того, какого
рода информацию требуется получить от него. Обычно пола-
полагалось необходимым использовать достаточное количество ме-
металла для получения сплошной пленки, так как считалось, что
только сплошная пленка должна приводить к образованию про-
проводящего слоя на поверхности непроводящего образца. Хотя
физическая природа механизма переноса заряда в островковых
пленках до сих пор не ясна, последние работы позволяют счи-
считать, что островковые слои можно -использовать в качестве по-
покрытия образцов, предназначенных для исследования в РЭМ,
поскольку несплошпые металлические плевки обладают доста-
достаточной проводимостью на постоянном токе. В [288] было пока-
показано, что несплошные пленки могут иметь конечную проводи-
проводимость, обусловленную туннелированием электронов между на-

Методы нанесения покрытий
195
Рис. 10.7. Вторично-эмиссионные изображения очищенных диатомовых во-
водорослей, поверхность которых покрыта слоем золота различной толщины.
а- 2,5 нм; 6—5.0 им; в — 10 нм; г — 20 нм; 5 — 50 им; с—100 нм. Энергия пучка
30 кэВ. Видно, что очень тонкие слои дают оптимальную информацию о поверхности об-
образца, тогда как более толстые слон маскируют топографию поверхности.

196 Глава 10
пыленными островками, и было высказано предположение, что
такие несплошные пленки могут быть полезными для исследо-
исследования непроводящих образцов при очень низком токе зонда.
Так, образцы, на которые было нанесено покрытие из золота
толщиной всего лишь 2,5 ,нм, успешно исследовались при уско-
ускоряющем ¦напряжении 20 кВ (рис. 10.7).
На практике для быстрой оценки толщины пленки может
служить цвет слоя на белой картонке или полоске стекла. Для
большинства образцов слой углерода шоколадного цвета и слой
золота, который в отраженном свете имеет краоню-рыжий цвет
и в проходящем свете — зелено-голубой, будут иметь достаточ-
достаточную толщину. При занесении покрытия из алюминия о доста-
достаточном количестве осажденного металла свидетельствует слой,
имеющий глубокую голубую окраску в проходящем свете.
Как только эти параметры найдены для конкретной напыли-
тельной установки с фиксированной геометрией образца и ис-
источника, для каждого напыления необходимо лишь отрезать
стандартную длину проволоки испаряемого металла.
10.2.1.4. Артефакты, связанные с процедурой нанесения
покрытия
Если процедура нанесения покрытия выполнена правильно,
артефакты наблюдаются редко. Некоторые из возможных при-
причин появления артефактов обсуждаются ниже.
а. Нагрев излучением. Интенсивность термического облуче-
облучения образца зависит от температуры источника и расстояния
от источника до образца. Радиационный нагрев можно умень-
уменьшить путем использования источника малых размеров или ото-
отодвигая образец дальше от источника. Оптимальное практиче-
практическое решение заключается в использовании малого источника с
высокой температурой при расстоянии между источником и об-
образцом по крайней мере 150 мм. Если образец соответствую-
соответствующим образом экранирован от мишени и заслонка открывается
только при рабочей температуре, по-видимом у, воздействие на
объект будет незначительным.
Термические артефакты проявляются как гладкие области
микросплава на поверхностях наклонных изломов биологических
материалов, которые бомбардируются вертикально, ка'К мелкие
отверстия и поверхностные искажения. Если образцы повреж-
повреждаются радиационным нагревом, то повреждение можно умень-
уменьшить, если помещать охлаждаемую пластину с отверстием
перед образцом.
б. Образование пленок загрязнений. Образование пленок за-
загрязнений в вакуумной системе обусловлено главным образом
грязью и присутствием летучих веществ, которые оседают на

Методы нанесения покрытий 197
образце, и именно по этой причине необходимо тщательно^
чистить систему, прежде чем ее использовать. Наиболее эффек-
эффективный способ решения этой проблемы — окружить образец ох-
охлаждаемой поверхностью. Однако, по-видимому, эта процедура
является излишней, за исключением исследований, для которых
требуется сверхвысокое разрешение. Пленки загрязнения могут
приводить к неровному покрытию и, следовательно, зарядке в
виде малых случайно расположенных частиц, а в наиболее экст-
экстремальных случаях в виде нерегулярных темных областей на
образце.
в. Эффекты декорирования. Декорирование, или агломера-
агломерация испаряемого металла, происходит до некоторой степени
с большей частью металлических покрытий и является резуль-
результатом неравномерного осаждения испаряемого металла. Агло-
Агломерация происходит тогда, когда когезионные силы (силы сцеп-
сцепления) в материале пленки больше, чем силы между молекула-
молекулами пленки и подложки. Из-за геометрических эффектов шерохо-
шероховатые поверхности особенно трудно покрыть ровно, и при этом
неизбежно на выступающих частях покрытие будет толще, чем
в трещинах и углублениях.
г. Адгезия пленки. Плохая адгезия пленки связана с за-
загрязнением поверхности углеводородной пленкой и водой, а
в случае пластмасс — с присутствием тонкого жидкого слоя вы-
выделяющегося пластификатора. Разрывы сплошности и плохая
адгезия пленок распознаются по появлению «волосных» трещин
и по тенденции к легкому образованию чешуек. При наблюде-
наблюдении в микроскопе видны различия в яркости изображения и
имеет место зарядка изолированных островков материала, не
находящихся в контакте с остальной пленкой.
10.2.2. Низковакуумное испарение
При низком вакууме углерод испаряется в атмосфере арго-
ка при давлении около 1 Па. Атомы углерода претерпевают
многократные соударения и рассеиваются во всех направлениях.
Этот метод полезен для получения прочных пленок угле-
углерода и для нанесения покрытий на образцы со сложным релье-
рельефом поверхности перед анализом в режимах рентгеновского
микроанализа, катодолюминесценции и отраженных электронов.
Однако в общем случае полезность этого способа для образцов,
предназначенных для анализа в РЭМ, сомнительна, в частности,
потому, что коэффициент вторичной эмиссии для углерода очень
мал. Несомненно, что многократное рассеяние и поверхностная
диффузия углерода позволяют с большей эффективностью на-
наносить покрытие на шероховатые образцы, и по этой причине
этот метод целесообразно применять в тех случаях, когда нель-
нельзя наносить покрытие катодным распылением.

198
Глава 10
10.3. КАТОДНОЕ РАСПЫЛЕНИЕ
Хотя способ нанесения покрытия с помощью катодного рас-
распыления был известен давно, только недавно он стал более ши-
широко использоваться для получения тонких пленок. В процессе
распыления высокоэнергетический ион или нейтральный атом
бомбардирует поверхность мишени и передает свой импульс
атомам на расстояние в несколько нанометров. Некоторые ато-
атомы получают при соударении энергию, достаточную для разры-
разрыва связей с ближайшими соседями, и выбиваются из узлов ре-
решетки. Если переданная им скорость достаточна, они выходят
за пределы твердого тела [289].
Тлеющий разряд, в котором обычно идет покрытие при ка-
катодном распылении, возникает при испускании электронов из
отрицательно заряженной мишени. Под действием приложенно-
приложенного напряжения электрон, ускоряясь, движется к положительно-
положительному аноду и может столкнуться с молекулами газа, оставляя на
своем пути ионы и избыточные свободные электроны. Тлеющий
разряд располагается на некотором расстоянии от мишени. По-
Положительные ионы движутся затем к мишени, находящейся под
отрицательным потенциалом, и вызывают ее распыление. При
высоких значениях ускоряющего напряжения бомбардирующий
ион освобождает много электронов, которые имеют энергию,
достаточную для повреждения непрочной мишени.
На скорость осаждения влияет несколько факторов. Коэф-
Коэффициент распыления медленно увеличивается с энергией бом-
бомбардирующих ионов газа (рис. 10.8). Плотность тока влияет на
количество ионов, бомбардирующих мишень, сильнее, чем на-
напряжение, и, следовательно, является более важным парамет-
параметром, определяющим скорость осаждения (рис. 10.9). Изменение
подводимой мощности может оказать решающее влияние на
свойства и состав распыленных пленок, например, при увели-
12 5 10 «В
Энергия бомбардирующих ионов
аргона , кэВ
Рис. 10.8. Относительный коэффи-
коэффициент распыления некоторых метал-
металлов в зависимости от энергии бом-
бомбардирующих ионов аргона.

Методы нанесения покрытий
199
15 мА
Рис. 10.9. Изменение толщины плен-
ки в зависимости от тока и напря-
жения при распылении.
напряжений г01 распылении «R
чении мощности алюминиевые пленки становятся более глад-
гладкими и содержат меньшее количество окисленных частиц. При
увеличении давления в распылительной системе плотность ио-
ионов тоже растет. При величинах давления от 3 до 20 Па на-
наблюдается линейный рост тока и, следовательно, скорости рас-
распыления. Но из-за того, что при более высоких давлениях по-
повышается тенденция к возвращению на мишень распыленного
материала, обычно используются промежуточные величины дав-
давлений— от 3 до 10 Па.
Наличие примесей в бомбардирующем газе может заметно
уменьшать скорость осаждения. Такие газы, как СО2 и Н2О,
в тлеющем разряде разлагаются с образованием Ог, а присут-
присутствие этого газа может уменьшить скорость осаждения вдвое.
Скорость осаждения уменьшается с увеличением температуры
образца, хотя это явление может быть нехарактерным для по-
покрытия катодным распылением. Наконец, скорость осаждения
тем выше, чем ближе расположена мишень к образцу, однако
при этом увеличивается также тепловая нагрузка на образец.
Распыленные частицы попадают на поверхность подложки с
высокими кинетическими энергиями в виде либо атомов, либо
кластеров атомов, но не в виде пара. Имеются данные о том,
что распыляемые атомы обладают энергией, достаточной для
того, чтобы проникнуть на один или два атомных слоя поверх-
поверхности, на которой они оседают.
Существует несколько различных способов реализации про-
процесса катодного распыления, включающих распыление ионным
пучком, плазменное распыление, радиочастотное распыление,
триодное, диодное (при постоянном токе) распыление и диод-
диодное распыление с охлаждением. В настоящее время для нанесе-
нанесения покрытия на образцы для РЭМ и рентгеновского микроана-
микроанализа обычно используются лишь распыление ионным пучком,
диодное распыление и диодное распыление с охлаждением.

200
Глава 10
40.3.1. Распыление ионным пучком
Способ распыления ионным пучком показан на рис. 10.10, а.
Инертный газ, например аргон, ионизируется в холодном катод-
катодном разряде, и полученные ионы ускоряются в ионной пушке до
энергии 1—30 кэВ. Ионный пучок для бомбардировки мишени
можно создать либо с помощью коллимации, либо путем фоку-
фокусировки с помощью обычной системы линз. Высокоэнергетичес-
Высокоэнергетические ионы бомбардируют атомы мишени и передают импульс
при упругом столкновении, в результате чего лежащие вблизи
поверхности мишени атомы выходят из мишени с энергиями от
0 до 100 эВ. Такие распыленные атомы затем осаждаются на
образце и на всех поверхностях, лежащих в пределах прямой
видимости с мишени. Достоинством такой схемы является то,
—в
Рис. 10.10. Способы катодного распыления при нанесении покрытий.
а —распыление ионным пучком; б — диодное распыление; в — диодное распыление с
охлаждением.
1 — образец; 2— мншеиь илн источник испарения; 3 — атомы мишени; 4 — разряд в арго-
аргоне при низком давлении; 5 —высокий вакуум; 6 — стеклянный колпак вакуумной каме-
камеры; 7 — аиод; 8 — постоянный магнит; 9 — к трубопроводу вакуумной откачки; 10 — ион-
ионная пушка; ;/ —напуск инертного газа; 12 — к высоковольтному источнику питания; 13 —
изолятор; 14 — к источнику постоянного тока A—3 кВ); 15 — алюминиевый экран; 15 —
железный полюсный наконечник; 17 — модуль охлаждения; 18 — магнитные силовые
лннин.

Методы нанесения покрытий 201
что между мишенью и подложкой существует область, в кото-
которой нет поля, так что отрицательные ионы и электроны не ус-
ускоряются по направлению к подложке. Этим методом можно
наносить сложные покрытия от нескольких мишеней при усло-
условии, что предприняты меры предосторожности для того, чтобы
избежать перекрестного загрязнения мишеней во время распы-
распыления. Если используется непроводящая мишень, появляющий-
появляющийся положительный заряд можно снимать облучением из элект-
электронной пушки. Распыление ионным пучком использовали авто-
авторы [290, 291] для оттенения с высоким разрешением. Применяя
распыленные пленки из сплава вольфрам-—тантал, вольфрама
и углерода, они смогли рассмотреть детали меньше 1,0 нм
в размере.
10.3.2. Диодное распыление, или распыление
при постоянном токе
Этот способ распыления является наиболее простым, надеж-
надежным и экономичным, и на нем основана работа ряда выпускае-
выпускаемых промышленных сложных приборов, а также приставок для
катодного распыления для вакуумных термических испарителей.
Такие приборы, которые работают при энергиях от 1 до 3 кэВ,
иногда называют установками для диодного распыления, а так-
также установками для распыления при постоянном токе. Установ-
Установка для распыления при постоянном токе состоит из небольшого
стеклянного колпака, в котором находится мишень — катод и
охлаждаемый водой держатель образца — анод и который по-
помещается на контрольном блоке, включающем измеритель ва-
вакуума, высоковольтный источник питания, клапан напуска воз-
воздуха и небольшое реле времени (рис. 10.10,6). Детальное опи-
описание режима работы этого устройства и его использование
описано в i[292]. Одна из возможных проблем, связанная с рас-
распылителем такого типа, заключается в том, что непрочные об-
образцы могут термически повреждаться.
10.3.3. Диодное распыление с охлаждением
Проблема нагрева при диодном распылении была решена
путем некоторого изменения устройства диодного распыления
таким образом, чтобы в процессе нанесения покрытия образец
поддерживался в охлажденном состоянии [284], как показано
на рис. 10.10, в. Электронную бомбардировку образца удалось
заметно уменьшить, заменив дисковую мишень диодного распы-
распылителя на кольцевую. Термическое повреждение образца умень-
уменьшается еще больше, если поместить постоянный магнит в центр
мишени и кольцевой полюсный наконечник вокруг мишени. Та-

202 Глава 10
кое приспособление отклоняет электроны за периферию держа-
держателя образца. В качестве дальнейшей меры предосторожности
держатель образца охлаждается с помощью небольшого охлаж-
охлаждающего модуля, использующего эффект Пельтье. С помощью
такого усовершенствованного прибора стало возможным нанес-
нанести покрытие на кристаллические углеводородные парафины,
имеющие температуру плавления 305 К, и на термически не-
неустойчивые чувствительные пленки пластиков, на которые
прежде не удавалось нанести- покрытие ни одним из известных
методов.
10.3.4. Методы распыления
Очень важно обеспечить условия, при которых распылитель
подсоединяется к соответствующему источнику чистого сухого
аргона или другого подходящего благородного газа. Небольшие
следы азота в аргоне, по-видимому, не имеют значения, но важ-
важно, чтобы в газе не содержались примеси воды, двуокиси угле-
углерода и кислорода. Следы паров воды, о присутствии которых
узнают по голубому оттенку в тлеющем разряде, можно легко
удалить, пропуская газ через колонку с осушителем. Остаточ-
Остаточные следы летучих материалов можно удалить из мишени, бом-
бомбардируя ее при токе 20 мА, напряжении 2,5 кВ и давлении
от 2 до 8 Па. Мишень считается чистой тогда, когда при вклю-
включении высоковольтного разряда не происходит ухудшения ваку-
вакуума.
Образцы помещаются на столик образцов и устройство от-
откачивается до вакуума ~10—15 Па A0~' Торр) с помощью
двухступенчатого механического форвакуумного насоса, имею-
имеющего в тракте откачки ловушку из активированной окиси алю-
алюминия для предотвращения обратного потока паров масла в
камеру. Самое главное нельзя допускать, чтобы прибор отка-
откачивался в течение длительного времени при предельном ваку-
вакууме, который может быть получен с помощью форвакуумного
насоса, так как это будет вызывать обратный поток масла и
приводить к загрязнению камеры. Из-за этого целесообразно
держать клапан натекателя аргона слегка открытым, чтобы
происходило непрерывное протекание инертного газа через си-
систему, обеспечивая тем самым давление около 6—7 Па. Если
устройство оборудовано водяным охлаждением и еще лучше
модулем охлаждения Пельтье, то они должны быть включены
и образцы должны охлаждаться до рабочей температуры.
Одной из наиболее общих причин плохой работы откачива-
откачивающей системы в установках для распыления и испарения явля-
является продолжительное обезгаживание образца и клейкой ленты,
используемой для прикрепления его к держателю. Биологичес-

Методы нанесения покрытий 203
кие и органические материалы рекомендуется (после того, как
они высушены и укреплены на держателе образцов) поместить
в вакуум при 310 К на всю ночь для гарантии, что все летучие
вещества удалены перед нанесением покрытия.
Как только образец охладился и достигнут адекватный ваку-
вакуум, можно приступить к процессу распыления. Система откачи-
откачивается до давления ~2 Па, и включается высокое напряжение
B кВ). Клапан натекателя аргона открывается до тех пор, по-
пока ток плазменного разряда не достигнет значения 12—15 мА
при давлении 6—7 Па. Устанавливается таймер, и покрытие на-
наносится до тех пор, пока пленка на образце не достигнет же-
желаемой толщины.
Вместо аргона можно использовать азот. Однако в этом
случае для получения покрытия такой же толщины необходимо
увеличить продолжительность распыления и/или ток разряда.
Следует избегать наносить покрытие распылением на воздухе,
так как присутствие паров воды, двуокиси углерода и кислоро-
кислорода вызывает появление сильно реактивных ионов, которые мо-
могут приводить к быстрой деградации образца.
10.3.5. Выбор мишени
Как было установлено, мишени из платины или сплава зо-
золота с палладием удовлетворяют требованиям обычной прак-
практики приготовления образцов для РЭМ. Можно использовать
мишени из большинства других благородных металлов и их
сплавов, а также из таких элементов, как никель, хром и медь.
Коэффициенты распыления разных элементов различны, и это
следует иметь в виду при расчете толщины покрытия. При рас-
распылении мишени из углерода возникают трудности, так как, хо-
хотя и возможно очень медленно распылять мишень ионами арго-
аргона, скорость распыления падает довольно быстро. Такое умень-
уменьшение обусловлено либо присутствием форм углерода, имеющих
энергию связи выше энергии ионов аргона, либо тем, что худ-
худшая проводимость углерода приводит к зарядке и понижению
скорости распыления. Утверждение, что углерод можно рас-
распылять при низких напряжениях в диодном распылителе, по-
видимому, является ошибочным. Осадки «углерода», которые
получаются, вероятнее всего, представляют собой углеводород-
углеводородные загрязнения, разлагаемые в плазме, а не материал, распы-
распыляемый из мишени. По-видимому, вероятность того, что будет
разработан простой метод получения покрытия из алюминия
распылением, мала. Окисный слой, который быстро образуется
на поверхности алюминия, препятствует распылению при низ-
низких ускоряющих напряжениях, а довольно плохой вакуум за-
затрудняет осаждение металла. Для получения детальной инфор-

204 Глава 10
мации о других мишенях, в частности изготовленных из непро-
непроводящих материалов, и бомбардирующих газах читатель отсы-
отсылается к работе [272].
10.3.6. Толщина покрытия
Для данных условий эксперимента имеется линейная связь
между скоростью осаждения и подводимой мощностью. На
практике это означает, что толщина покрытия зависит от дав-
давления газа, тока разряда, напряжения и длительности разряда.
Тонкие пленки (толщиной менее 10 нм) точно нанести трудно,
и для получения таких пленок следует использовать методы ис-
испарения. Однако для большинства биологических материалов
требуются металлические покрытия толщиной 15—25 нм, и, как
только установлена оптимальная для данного образца толщина
пленки, легко точно воспроизвести такую толщину на других
образцах.
10.3.7. Преимущества метода катодного распыления
Одно из главных достоинств метода заключается в том, что
он обеспечивает сплошной слой покрытия даже на тех частях
образца, которые не находятся на линии прямой видимости от
мишени. На рис. 10.11 сравниваются главные способы нанесе-
нанесения покрытий. Сплошной слой получается, поскольку распыле-
распыление происходит при сравнительно низком вакууме. В этом слу-
случае атомы мишени испытывают множественные соударения и
двигаются во всех направлениях по мере того, как достигают
поверхности образца. При этом структуры с глубоким релье-
рельефом или с явно выраженной сетчатостью поверхности покрыва-
покрываются адекватно. Такая способность атомов мишени «заворачи-
«заворачивать за угол» особенно важна при нанесении покрытий на не-
непроводящие биологические материалы, пористые керамические
образцы и волокна. Полное покрытие достигается без вращения
или наклона образца и при использовании лишь одного источ-
источника напыляемого материала. При условии, что ускоряющее на-
напряжение имеет достаточно высокое значение, можно распы-
распылить слой ряда непроводящих материалов, например щелочно-
галоидных соединений, и окислов редкоземельных металлов,
имеющих высокие коэффициенты вторичной электронной эмис-
эмиссии. Подобным образом можно распылять вещества, которые
диссоциируют при испарении. Контроль толщины пленки срав-
сравнительно прост, и можно проводить распыление мишеней боль-
большой площади, которые содержат достаточное количество мате-
материала для многих серий осаждения. Не возникает трудностей
с большими скоплениями материала, оседающего на образце, и
образцы можно с большим удобством покрывать сверху. По-
Поверхность образца можно легко очистить перед нанесением по-

Методы нанесения покрытий
205
Рис. 10.11. Сравнение изображений поверхности диэлектриков без покрытия
и с покрытием, полученным термическим испарением и катодным распыле-
распылением.
А1гОз (слева), хлопковые волокна (в центре), латексные сферы из полистирола (справа).
Верхний ряд без покрытия, средний ряд — покрытие из золота толщиной 10 ны нанесено
термическим испарением, нижний ряд — покрытие из золота толщиной 10 нм нанесете
катодным распылением; маркер 1 мкм.
крытия либо ионной бомбардировкой, либо изменением поляр-
полярности электродов. Плазмой можно управлять с помощью маг-
магнитных полей, что обеспечивает большую однородность пленки
и уменьшает нагрев образца.
10.3.8. Артефакты, возникающие при нанесении
покрытия катодным распылением
Нанесение покрытия на образцы для РЭМ катодным распы-
распылением вызвало некоторые неблагоприятные отзывы, так как
у некоторых пользователей это приводило к термическому пов-
повреждению требующих осторожного обращения образцов и к
артефактам поверхностного декорирования. Нет сомнения в том,

206 Глава 10
что в ранних устройствах для нанесения покрытия диодным рас-
распылением могло иметь место повреждение чувствительных к
нагреву образцов, особенно если покрытие наносилось в течение
долгого времени при высоких токах разряда и неохлажденных
образцах. Проблема термического повреждения была в значи-
значительной степени преодолена с появлением новой серии распыли-
распылителей с охлаждением. Подробное исследование примеров арте-
артефактов декорирования, которые были описаны в литературе,
показывает, что в большинстве случаев недостаточное внимание
было уделено чистоте в процессе нанесения покрытия и что ар-
артефакты были обусловлены загрязнением из-за обратного пото-
потока паров масла и/или использованием неочищенных или непод-
неподходящих бомбардирующих газов. Тем не менее было бы непра-
неправильно считать, что артефакты никогда не появляются в ма-
материалах, нанесенных распылением, и некоторые из наиболее
часто встречающихся при этом проблем обсуждаются ниже.
10.3.8.1. Термическое повреждение
В процессе нанесения покрытия катодным распылением мо-
может происходить значительное повышение температуры образ-
образца. Источниками тепла служат излучение от мишени и элект-
электронная бомбардировка образца. Вначале происходит быстрое
повышение температуры, которая затем выравнивается и в за-
зависимости от природы покрываемого материала может вызы-
вызывать термическое повреждение. В зависимости от ускоряющего
напряжения и тока разряда температура может стать до 40 К
выше температуры окружающей среды. Однако, как указано
ранее, эффекта нагрева можно полностью избежать при исполь-
использовании модифицированного диодного распылителя с охлажде-
охлаждением, где подвод тепла, обусловленный электроцной бомбарди-
бомбардировкой, составляет лишь 200 мВт, или частично его уменьшить,
работая с обычным диодным распылителем в импульсном режи-
режиме при низкой входной мощности.
Термическое повреждение проявляется как расплав, углуб-
углубление и в исключительных случаях как полная деструкция об-
образца. Если признать, что термическое повреждение может
создавать проблему при нанесении распылением покрытия, то
почти во всех описанных случаях это было обусловлено тем,
что образец подвергался воздействию необычно высоких пото-
потоков мощности.
10.3.8.2. Травление поверхности
Это является потенциальной опасностью при нанесении по-
покрытия распылением и может быть вызвано либо бомбардиров-
бомбардировкой ионами паразитного газа, либо, что более вероятно, метал-

Методы нанесения покрытий 207
лическими частицами, ударяющими на поверхность образца
с силой, достаточной для ее эрозии. При исследовании с высо-
высоким разрешением образцов с покрытиями, нанесенными распы-
распылением на поверхности, можно обнаружить очень маленькие уг-
углубления. Однако непонятно, появляются ли они в результате
травления поверхности или просто вследствие термического пов-
повреждения.
10.3.8.3. Адгезия пленки
Для пленок, полученных распылением, адгезия представляет
собой значительно меньшую проблему, чем для пленок, получен-
полученных испарением, и это, вероятно, обусловлено тем, что метал-
металлические частицы проникают через поверхность образца, обра-
образуя сильную связь. Однако образцы с покрытием, полученным
распылением, не должны подвергаться воздействию значитель-
значительных колебаний температуры или влажности, которые могут при-
привести к расширению и сжатию и последующему разрыву по-
поверхностной пленки.
10.3.8.4. Загрязнения
Из-за невысокого вакуума в большинстве устройств для на-
нанесения покрытия катодным распылением, наличия обратного
потока масла из механического форвакуумного насоса и труд-
трудностей, связанных с размещением эффективных охлаждаемых
ловушек в тракте откачки, проблема загрязнения может стать
потенциально серьезной, особенно если в форвакуумной линии
не установлено ловушек. Многие описанные артефакты, по-ви-
по-видимому, обусловлены загрязнениями, и необходимо соблюдать
предосторожность при установке режима работы и использова-
использовании распылительной установки для нанесения покрытия.
10.4. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ НАНЕСЕНИЯ ПОКРЫТИЙ
Выше было приведено описание общих принципов методов
нанесения покрытий испарением и катодным распылением. По-
Помимо них существует ряд. специальных методов нанесения по-
покрытий, которые необходимо обсудить, поскольку они примени-
применимы как для целей растровой электронной микроскопии, так и
рентгеновского микроанализа.
10.4.1. Покрытие высокого разрешения
По мере повышения разрешения растрового электронного
микроскопа нужно уделять большее внимание ограничению
разрешения, накладываемому наносимым покрытием. Для мно-

208 Глава 10
гих приборов, разрешение которых может составлять около
10 нм, при возможном исключении агломерации частиц золота
зернистость пленки малосущественна. Ряд микроскопов обычно
работает в диапазоне разрешений 5—10 нм, в просвечивающем
РЭМ можно получить в режиме вторичной эмиссии разрешение
от 2 до 5 нм. Специалистов в области просвечивающей элект-
электронной микроскопии давно интересовали пленки высокого раз-
разрешения, так как они необходимы в качестве поддерживающей
образец пленки, для оттенения и получения реплик сколов за-
замороженного или находящегося при обычной температуре ма-
материала. Интересно отметить, что один из наиболее подходящих
материалов покрытия с точки зрения специалистов в области
растровой электронной микроскопии, золото, имеет крупную
зернистость, которая была обнаружена при исследовании с вы-
высоким разрешением с помощью просвечивающего электронного
микроскопа (ПЭМ). При исследовании в ПЭМ было установ-
установлено, что хром, сплав золота с палладием, платина и цирконий
имеют зерна значительно меньшего размера, а углерод, смесь
платины с углеродом, вольфрам и тантал фактически не обна-
обнаруживают зернистой структуры. Зернистость осажденных пле-
пленок в общем уменьшается с увеличением температуры плавле-
плавления. Исследования, проведенные в [290, 291], показали, что
пленки тантала и вольфрама, полученные распылением, имеют
зерна очень малых размеров и с этой точки зрения наиболее
пригодны для проведения в РЭМ исследований с высоким раз-
разрешением.
В [293] было найдено, что, когда речь шла о разрешении и
о гладкости покрытия поверхности образца, наилучшие резуль-
результаты были получены при термическом испарении сплава золота
с палладием и смеси углерода, золота и палладия. Золото, нане-
нанесенное термическим испарением и катодным распылением, име-
имело значительно большую зернистость, и на поверхности образ-
образца можно было наблюдать сетку трещин. Предельный размер
частиц зависит также от природы подложки. Авторы [294, 295]
установили, что для РЭМ высокого разрешения B—3 нм) наи-
наилучшие результаты обеспечивает электронно-лучевое испарение
тугоплавких металлов (W, Та) или сплава углерода с плати-
платиной. Наиболее удобным способом получения пленок для работы
на РЭМ со средним разрешением E—8 нм) является распыле-
распыление покрытий из платины или платины с палладием на образ-
образцы, поддерживаемые при температуре ниже комнатной. Распы-
Распыление с меньшей скоростью также приводит к уменьшению раз-
размеров частиц. Преимуществом может также служить проводи-
проводимость дисперсных металлических пленок, которую могут
обеспечить эффективные слои покрытий толщиной всего лишь
в несколько нанометров. В [296] описан другой способ распыле-

Методы нанесения покрытий
209
??ti -\_\s -f',i- "A* :¦. *
50
Рис. 10.12. Сравнение различных
методов нанесения покрытий.
а — термическое испарение; 6 — диод-
диодное распыление; в — распыление ион-
ионным пучком. Каждый образец покрыт
примерно одинаковым количеством зо-
золота. Образец представляет собой кри-
кристаллы копировальной бумаги. В то
время как на изображениях образцов
с покрытиями, нанесенными термиче-
термическим испарением н катодным распыле-
распылением, при таких высоких увеличениях
наблюдаются артефакты, на изображе-
изображении образца с покрытием, нанесенным
распылением ионным пучком, проявля-
проявляется лишь дробовой шум электронов
[296].
50 им
ния, в котором для получения ионного пучка использовался ка-
катодный источник с седлообразным полем. Для бомбардировки
мишени использовался высокоэнергетический пучок ионов, и
нанесение покрытий производилось при давлении 10 Па. Пу-
Пучок направляется на мишень с подложкой, расположенной под
фиксированным или меняющимся углом, получающиеся покры-
покрытия имеют очень мелкую зернистость. Хотя время нанесения
покрытий довольно длительное A0—15 мин), получающиеся
пленки идеальны для исследования в РЭМ с высоким разреше-
разрешением. На рис. 10.12 сравниваются результаты, полученные при
нанесении покрытия испарением, при распылении ионным пуч-
пучком и при диодном распылении с охлаждением. Тогда как на
материалах, нанесенных катодным распылением и испарением,
наблюдаются при высоком разрешении артефакты, на материа-

210
Глава 10
100
100 ни
Рис. 10.13. Изображение бактерии Pseudoinonas fluorescens.
а — покрытие из сплава золота с палладием, нанесенное диодным распылением с охлаж-
охлаждением; б — покрытие из золота, нанесенное распылением ионным пучком. В а видна
зернистость покрытия, которая отсутсчвует па ооразце с покрытием, нанесенным ионным
распылением [297].
ле, распыленном ионным пучком, проявляется лишь электрон-
электронный дробовой шум. В недавно опубликованной работе [297]
распыление ионным пучком использовалось для получения по-
покрытия на биологических образцах. В этом случае отмечалось
значительное уменьшение количества поверхностных артефактов
по сравнению с образцом, покрытие которого было получено
диодным распылением (рис. 10.13). В [298] использовался пен-
нинговый разряд, при котором появляются высокоэнергетичес-
высокоэнергетические атомы мишени, приводящие к образованию очень маленьких
кристаллитов. Этот метод позволяет получать очень тонкие

Методы нанесения покрытий 211
(толщиной 1—2 нм) пленки с малыми размерами частиц. В бо.-
лее ранней работе [299] было показано, что при соблюдении
мер предосторожности с целью уменьшения загрязнений пленки
для исследований с высоким разрешением можно получать так-
также и при термическом испарении тугоплавких металлов.
10.4.2. Низкотемпературный способ нанесения покрытий
Преимущества исследования и анализа замороженных объ-
объектов в растровой электронной микроскопии и рентгеновском
микроанализе обсуждались в работах [200, 276, 277]. Основны-
Основными проблемами, связанными с низкотемпературным способом
нанесения покрытий, являются проблемы загрязнения и под-
поддержания температуры образца ниже 143 К в процессе нанесе-
нанесения покрытия. Основным источником загрязнений являются
остаточные пары воды, которые легко взаимодействуют с ме-
металлами при нанесении покрытия. Как было установлено [300],
если только не соблюдать меры предосторожности в процессе
нанесения покрытия, испаряемый алюминий осаждается в виде
серого зернистого слоя на тонкие срезы замороженного биологи-
биологического материала, находящиеся при температуре ниже 123 К-
Подобное явление иногда наблюдалось при нанесении покрытия
из золота на поверхность разлома замороженного массивного
материала. Такие эффекты полностью исключаются, если нане-
нанесение покрытия происходит в устройстве, соединенном с микро-
микроскопом через шлюз [301—303, 295].
Низкотемпературный способ нанесения покрытий успешно
реализуется при нанесении покрытия методом испарения, и при
нанесении покрытия следует тщательно следить за тем, чтобы
не расплавить поверхность образца. В [304] с помощью тонко-
тонкопленочных термопар было зарегистрировано незначительное по-
повышение температуры на тонкопленочной подложке, покрытие
на которую наносилось с помощью коллимированного и экрани-
экранированного источника испарения. Хотя и были предприняты по-
попытки распылять покрытия на замороженные образцы [305],
результаты не выдерживают сравнения с тем, что может быть
получено с помощью методов испарения.
10.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОЛЩИНЫ ПОКРЫТИЯ
Имеется несколько способов измерения толщины покрытия,
которые рассмотрены в недавно опубликованном обзоре [306].
Однако все эти методы дают среднее значение на плоской по-
поверхности, и необходимо кратко рассмотреть, что можно ожи-
ожидать при использовании этого метода для измерений на шеро-
шероховатых поверхностях. Если покрытие слишком тонкое, оно бу-

212 Глава 10
дет мало эффективным для снятия заряда, если оно слишком
толстое, то будет скрывать детали поверхности. Для образова-
образования сплошного слоя необходимо покрытие определенной мини-
минимальной толщины, и эта толщина различна для разных элемен-
элементов и для разной относительной шероховатости поверхности.
На абсолютно плоской поверхности слой углерода толщиной
0,5 нм будет образовывать сплошное покрытие. Для получения
сплошного покрытия на неоднородной поверхности требуется
слой в 10 раз толще. Как общее правило для неоднородных по-
поверхностей требуются более толстые покрытия, чтобы гаранти-
гарантировать сплошную пленку на всех краях, выступах и углубле-
углублениях.
Ясно, что толщина пленки, которую мы можем измерить на
плоской поверхности, имеет малое отношение к толщине, полу-
получаемой на неоднородной поверхности, которая, возможно, вра-
вращалась и наклонялась в процессе нанесения покрытия. Для
практических целей данная серия образцов с шероховатой по-
поверхностью должна покрываться пленками различной толщины
в стандартных условиях, причем толщина слоя каждой пленки
измеряется и регистрируется на эталонной плоской поверхнос-
поверхности, например стеклянной пластинке. Образцы нужно исследо-
исследовать в микроскопе, и можно считать, что тот из них, который
позволяет получить оптимальное в смысле разрешения и инфор-
информативности изображение, имеет наиболее оптимальную толщи-
толщину покрытия.
10.5.1. Оценка толщины покрытия
Можно предположить, что при термическом испарении в вы-
высоком вакууме все молекулы пара выходят из любого участка
поверхности испарителя, не имея преимущественного направле-
направления, и проходят к поверхности подложки без соударения с мо-
молекулами остаточных газов. Вводя для частиц пара угол паде-
падения на образец и предполагая, что все падающие молекулы
пара имеют одинаковый коэффициент конденсации, можно рас-
рассчитать распределение толщины покрытия. Формулу, приведен-
приведенную ниже, можно использовать для расчета толщины покрытия
на плоской невращающейся поверхности, расположенной под уг-
углом 6 относительно источника, по известному количеству испа-
испаряемого материала:
T = McosQ/4nR*p, A0.1)
где Т — толщина, см; М — масса испаряемого вещества, г; р —
плотность, г-см~3, R — расстояние от источника до образца, см
и Q — угол между нормалью к образцу и направлением испаре-
испарения. Если геометрическое расположение испарительного устрой-

Методы нанесения покрытий 213
ства и подложки известно и если интересуемый материал испа-
испаряется медленно и не образует сплава с нагревателем, то по
уравнению A0.1) с точностью ±50% можно рассчитать толщи-
толщину. Предполагается, что испарение идет из точечного источника
и происходит одинаково во всех направлениях. Погрешность в
значении Т обусловлена частично неопределенностью коэффи-
коэффициента прилипания атомов испаряемого вещества на подложке.
Эффективность прилипания зависит от материала и редко бы-
бывает лучше 75%. Следовательно, значение толщины, рассчитан-
рассчитанное по формуле A0.1), следует уменьшить, умножив на коэффи-
коэффициент прилипания (приблизительно 0,75).
Толщина покрытия в нанометрах, которая может быть по-
получена при нанесении покрытия диодным распылением, дается
выражением
T = CVtk/lO, A0.2)
где С — разрядный ток плазмы в мА, V—ускоряющее напря-
напряжение в кВ, t — время в мин и k — постоянная, зависящая от
бомбардирующего газа и материала мишени. Постоянную k
можно рассчитать для каждого устройства для нанесения по-
покрытия распылением, материала мишени и бомбардирующего
газа по данным экспериментальных измерений.
10.5.2. Контроль толщины в процессе нанесения покрытия
В настоящее время имеется ряд различных методов измере-
измерений, отличающихся по чувствительности и точности. Измери-
Измерительные устройства размещаются в камере, предназначенной
для нанесения покрытий, близко к образцу, и с их помощью из-
измеряют толщину в процессе нанесения покрытия. Можно изме-
измерять плотность потока пара испаряемого вещества, либо изме-
измеряя количество актов ионизации, которая имеет место, когда
молекулы пара соударяются с электроном, либо измеряя силу,
с которой налетающие частицы действуют на поверхность. Для
всех испаряемых материалов можно использовать массочувстви-
тельные устройства. В основе их действия лежит определение
веса осаждаемого вещества на микровесах или регистрация из-
изменения частоты колебаний маленького кварцевого кристалла,
на который осаждается испаряемое вещество. В контрольном
устройстве для измерения толщины тонких пленок с помощью
кварцевого кристалла резонанс имеет место при частоте, зави-
зависящей от массы материала, осаждаемого на поверхность. Часто-
Частота колебаний «нагруженного» кристалла сравнивается с часто-
частотой чистого кристалла, и уменьшение частоты является мерой
толщины пленки. Типичное значение чувствительности для конт-
контрольного устройства с кристаллом составляет изменение часто-

214 Глава 10
ты в 1 Гц для эквивалентной пленки углерода толщиной 0,1 нм,
алюминия — 0,13 нм и золота — 0,9 нм. Величина погрешности
для таких устройств составляет примерно ±0,1 мкг/см2. Умно-
Умножая эту погрешность на плотность испаряемого вещества, мож-
можно определить погрешность определения толщины пленки.
Можно также контролировать специфические свойства пле-
пленок, например поглощение, пропускание и отражение света и
интерференционные эффекты, используя оптические измеритель-
измерительные устройства. Толщину пленок проводящих материалов мож-
можно контролировать по измерению сопротивления in situ, а тол-
толщину покрытий из диэлектрических материалов — по измерению
емкости. Дальнейшее усовершенствование большинства таких
методов in situ заключается в том, чтобы использовать их для
контроля процесса нанесения покрытий.
10.5.3. Измерение толщины после нанесения покрытия
Наиболее точные измерения толщины пленки производятся
на самих пленках. В основе таких методов лежат оптические
и гравиметрические измерения, а также поглощение и эмиссия
рентгеновского излучения. Наибольшую точность обеспечивает
многолучевая интерферометрия, и в зависимости от используе-
используемого метода можно получить точность в пределах 1 или 2 нм.
Для проверки толщины пленки можно использовать метод Фи-
зо, который заключается в нанесении отражающего покрытия
поверх ступеньки осажденной пленки и в измерении серии ин-
интерференционных полос. Толщину пленки можно измерить так-
также, делая срезы плоских кусков смолы, на которые было нане-
нанесено покрытие, и измеряя толщину слоя металла с помощью
просвечивающего электронного микроскопа. Погрешность этого
метода зависит от того, насколько точно под прямым углом к
металлическому слою можно сделать срез смолы и фотографии
среза. Простой метод точного определения толщины пленки и
размеров зерна был описан недавно в [307]. Было установлено,
что в линейных агрегатах латексных сфер материал покрытия
накапливается только на свободной поверхности сфер. Увеличе-
Увеличение толщины поперечного по отношению к линейному агрегату
диаметра сферы будет равно удвоенной толщине пленки, в то
время как толщина диаметра, параллельного агрегату, будет
соответствовать толщине пленки. С помощью такого метода
были измерены толщины пленок, полученных при различных
способах их нанесения, с точностью ± 2 нм. Толщину пленки
можно оценить по цветам интерференции или в случае углеро-
углерода по плотности осадка на белой керамической плитке.

Методы нанесения покрытий 215
10.5.4. Удаление слоев нанесенных покрытий
Несмотря на трудности, возникающие при нанесении слоя
покрытия на образец, иногда необходимо удалить его.
При соблюдении необходимой осторожности твердые образцы
можно восстановить до их исходного состояния перед нанесе-
нанесением покрытия.
Если образец представляет собой полированный шлиф, по-
покрытие можно легко удалить, подвергая образец одной из окон-
окончательных операций полировки (алмазным порошком разме-
размером ~6 мкм или порошком А12О3 с размером зерна ~1 мкм).
Если поверхность образца шероховатая или плоский образец
нельзя подвергнуть повторной полировке, для удаления покры-
покрытия следует применять химические методы.
Если известно, что слой покрытия необходимо удалить с по-
поверхности шероховатого образца после исследования, то в ка-
качестве материала покрытия предпочтительно использовать алю-
алюминий из-за легкости его удаления. В [308] алюминий удалялся
с поверхности геологических образцов погружением их на не-
несколько минут в свежеприготовленный раствор разбавленной
щелочи. Авторы [309] описали способ удаления золотых пленок
с поверхности минерализованных образцов погружением их в
раствор цианида. Покрытие из золота с палладием можно лег-
легко удалить за 1—8 ч с помощью раствора 10%-ного FeCl в эта-
этаноле [310].
Слои углерода можно удалить, изменяя полярность в рас-
распылителе устройства для нанесения покрытий, позволяя тем са-
самым ионам аргона бомбить поверхность образца. Следует со-
соблюдать осторожность, чтобы только удалить слой углерода и
не нарушить находящийся под ним образец. Слои углерода на
неорганических образцах, таких, как горные породы, порошки
и частицы, можно эффективно удалять в радиочастотной обога-
обогащенной кислородом плазме.

Глава 11
ПРЕПАРИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
ДЛЯ РАСТРОВОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
11.1. ВВЕДЕНИЕ
В этой и следующей главах мы рассмотрим практические
аспекты препарирования образцов как для растрового электрон-
электронного микроскопа, так и для рентгеновского микроанализатора,.
Хотя эти приборы очень сходны и во многих случаях могут
быть взаимозаменяемыми с точки зрения биолога, полезно рас-
рассмотреть методики препарирования раздельно. Растровый элек-
электронный микроскоп дает информацию о морфологии объекта, в
то время как рентгеновский микроанализатор дает аналитичес-
аналитическую информацию об образце. Для исследователя важно полно-
полностью осознать это различие, так как оно существенно для выбо-
выбора метода препарирования. Способы и методики, которые при-
приводятся в этих двух главах, обеспечат оптимальные условия
препарирования объекта для растровой электронной микроско-
микроскопии или рентгеновского микроанализа. Следует иметь в виду,
что любые неоптимальные условия подготовки объекта будут
приводить к потере передаваемой с образца информации. Далее
также станет очевидным, что зачастую будет необходимо при-
прибегать к некоторому компромиссу между двумя подходами, ко-
которые могут привести к потере информации с объекта.
Особое внимание будет уделено практическим, самостоя-
самостоятельным методам препарирования, и, хотя показано, что пони-
понимание некоторых теоретических аспектов может оказаться по-
полезным, они будут сведены к минимуму, а читателям будут ука-
указаны ключевые обзорные статьи по данной тематике. Мы не
стремимся снабжать биологов набором рецептов. Они уже
описаны в литературе, и лишь немногие из них могут привести
к оптимальному препарированию объекта, за исключением тех
объектов, для которых они разработаны. Обзор современных
специальных методик препарирования для широкого класса
биологических объектов можно составить по серии общеобразо-
общеобразовательных статей в [сб. SEM/1980]. В главах будет сделана
попытка обоснования метода и практического выполнения пре-
препарирования образца, но фактически выбор способа будет пред-
представлен экспериментатору. Рекомендуется внимательно проду-
продумать, какую информацию можно получить с объекта. Например,
методики препарирования, призванные обеспечивать защиту ма-

^ Препарирование биологических объектов для РЭМ 217
лого участка клеточной ультраструктуры для последующего ис-
исследования с высоким разрешением, совершенно отличаются от
методик, необходимых для сохранения топографии поверхности
того же самого объекта, исследуемого при малом увеличении
и большой глубине фокуса. Такой целенаправленный подход
должен быть связан со средствами, имеющимися в распоряже-
распоряжении, и с особенностями объекта.
Достижению конечнбго результата мешают огромные техни-
технические трудности. С одной стороны, у нас имеется электронно-
зондовый прибор, а с другой, мы имеем живые биологические
организмы. Взаимодействие пучка электронов с образцом мо-
может легко вызвать как тепловые, так и радиационные повреж-
повреждения, а большие отношения сигнал/шум получаются с плоских
или тонких термодинамических стабильных образцов с большим
атомным номером. Рассмотрим теперь типичные материалы, яв-
являющиеся результатом биологической деятельности. Они неиз-
неизменно мягкие, влажные и трехмерные и состоят из элементов
с низким атомным номером и всегда с низкой плотностью, тер-
термодинамически неустойчивы и требуют непрерывного притока
энергии, чтобы поддерживать свою форму и функциональную
активность, а также имеют низкую тепло- и электропровод-
электропроводность и очень чувствительны к радиационным повреждениям.
Совершенно очевидно, что биологический материал и элект-
электронно-лучевой прибор не соответствуют друг другу, и необхо-
необходим некоторого рода компромисс для объединения этих двух
экстремальных ситуаций. Имеются две альтернативы. Можно
идти на компромисс либо за счет прибора, либо за счет биоло-
биологического материала. Будут рассмотрены оба подхода.
11.2. КОМПРОМИСС ЗА СЧЕТ МИКРОСКОПА
Для того чтобы приспособить микроскоп для использования
биологического материала без препарирования, есть два пути:
1) установить в системе камеру объекта с контролируемой сре-
средой (газовую камеру) и 2) использовать необычный режим ра-
работы микроскопа.
11.2.1. Камеры с контролируемой средой
В последних работах [311, 312] сделан обзор некоторых до-
достижений в конструировании для электронных микроскопов ка-
камер с контролируемой средой. В таких устройствах стараются
обеспечить внутри колонны микроскопа микроклимат, подобный
естественной среде, окружающей объект. Контролируемая среда
может быть достигнута за счет размещения образца в малень-
маленькой камере, которая либо имеет окна, прозрачные для электро-
электронов, либо отсекается от оставшейся части колонны небольшими

218
Глава 11
Рис. 11.1. Схематическая иллюстрация расположения детектора н образца
для микроскопии влажных объектов в РЭМ [311].
диафрагмами, через которые проходит постоянный, но слабый
поток газа. Внутренняя часть камеры заполняется водной сре-
средой или постоянно заполняется насыщенным парами воды
инертным газом под давлением 30—50 кПа. В любом случае,
прежде чем провзаимодействовать с поверхностью образца,
электронный пучок проходит отрезок пути в несколько милли-
миллиметров или менее в неоптимальных вакуумных условиях. На
рис. 11.1 показано такое устройство, а на рис. 11.2 приведено
изображение шерстяных волокон, которые исследовались по-
погруженными в воду. Средняя длина свободного пробега элект-
электрона с высокой энергией в воде или в парах чрезвычайно мала,
и неизбежное рассеяние электронов может привести как к пов-
повреждению образца, так и к деградации изображения. Критичес-
Критический подход к результатам, которые "были получены при исполь-
использовании камер с контролируемой средой, показывает, что в этом
случае мы либо получаем дополнительно очень мало новой ин-
информации биологического характера, либо не получаем ее
вообще.
Реальное преимущество такого подхода — в возможности на-
наблюдения динамических клеточных процессов, таких, как деле-
деление клетки. Этот результат не был достигнут, и доказательства,
приведенные в работах [313—315], убедительно демонстриру-
демонстрируют, что радиационные повреждения, имеющие место во время
наблюдения даже наиболее быстро размножающихся бактерий,
свели бы на нет ценность любых наблюдений с точки зрения
биологии.
11.2.2. Неоптимальный режим работы микроскопа
Можно использовать микроскоп в не самых оптимальных ре-
режимах работы и все же получать полезную информацию о не-
необработанных биологических объектах. Не самые оптимальные

Препарирование биологических объектов для РЭМ
219
Рис. 11.2. Нснапыленные обработанные параформальдегидом волокна шер-
шерсти, частично погруженные в воду при 273 К. Ускоряющее напряжение
17 кВ. Маркер соответствует 20 мкм [311].
режимы работы включают работу при низком напряжении, с
малым током пучка, с малым временем регистрации изображе-
изображения, с худшим отношением сигнал/шум и при худшем вакууме
в колонне. При таких условиях снижается вносимая в образец
энергия и становится возможным изучение необработанных об-
образцов почти в естественном состоянии, хотя и при сильном
ухудшении разрешения. Такой подход, в частности, полезен при
изучении растительных материалов, клетки которых, несмотря
на то что содержат большую долю воды, неизменно окружены
целлюлозной стенкой, часто покрытой водонепроницаемым или
-пробковым слоем. В чистом виде эффект состоит в уменьшении
скорости потери воды из тела растения, что позволяет наблю-
наблюдать его в течение нескольких минут до того, как эффекты яв-
явного обезвоживания станут очевидными. Таким же образом
можно наблюдать твердые ткани, такие, как зубы, кости, хитин,
семена, споры, а также древесину и пыльцу, которые все обла-
обладают низким содержанием воды. Исследование без применения
препарирования гораздо менее успешно с большинством тканей
животных, водяных растений и микроорганизмов, у которых тка-
ткани и клетки очень быстро сморщиваются в процессе высушива-

220 Глава 11
ния. Однако даже такой подход не следует упускать из виду,
так как полезную информацию можно получить даже с очень
сильно деформированных образцов.
Теперь становится ясным, что, идя на компромисс за счет при-
прибора, нельзя достичь очень многого в смысле получения инфор-
информации с биологических объектов, и нам следует искать пути
компромиссного подхода за счет образца, позволяя ему выжить
в колонне микроскопа.
11.3. КОМПРОМИСС ЗА СЧЕТ ОБРАЗЦА
Много усилий в развитии методов препарирования биологи-
биологических объектов для электронной микроскопии было сконцент-
сконцентрировано на разработке способов удаления или иммобилизации
воды, где были достигнуты значительные успехи. Следовало бы
отметить, что не все проблемы препарирования возникают из-за
воды. Была предпринята попытка разделить процедуры препа-
препарирования для РЭМ на ряд определенных, но взаимосвязанных
операций. Эти операции обсуждаются приблизительно в хроно-
хронологическом порядке по мере того, как они бы использовались в
процессе препарирования объекта. Для конкретной задачи важ-
важно четко представлять, что некоторые операции могут быть вов-
вовсе не нужными, взаимоисключающими друг друга или могут вы-
выходить из этой последовательности.
11.3.1. Сравнительная микроскопия
При любом детальном исследовании биологического мате-
материала следует сравнивать информацию, получаемую с помощью
широкого набора приборов. Во многих случаях полезно начи-
начинать исследования с РЭМ, поскольку его диапазон увеличений
включает в себя область увеличений от получаемых с хорошей
лупой до получаемых в просвечивающем электронном микро-
микроскопе высокого разрешения. В РЭМ также мы получаем при-
привычное нам изображение. Сравнительные исследования относи-
относительно просто выполнять, подготавливая образец либо для про-
просвечивающего электронного микроскопа, либо для оптического
микроскопа после изучения образца в РЭМ. Пример сравнитель-
сравнительного исследования приведен на рис. 11.3, а дальнейшие подроб-
подробности можно найти в статьях [316—319] и в книге [320]. В ра-
работе [321] подробно описываются методы, которые могут быть
использованы для сравнения всех трех типов изображений с ги-
гистохимическими данными, а в статье [322] дается подробное
описание сравнительных исследований в световом микроскопе
методом авторадиографии и в РЭМ.

Препарирование биологических объектов для РЭМ
221
2.1 rr,
Рис. 11.3. Корреляция изображений, полученных в РЭМ и ПЭМ [325].
а — изображение в РЭМ изолированного комплекса Гольджи печени крысы; б — изобра-
изображение в ПЭМ негативно окрашенного комплекса Гольджи печени крысы.

222 Глава И
Другой аспект процедуры препарирования, который необхо-
необходимо обсудить, — это понимание того, что биологические объек-
объекты, которые мы наблюдаем и изображение которых мы регист-
регистрируем в РЭМ, являются артефактами. Процедуры препариро-
препарирования были описаны как искусство создания артефактов, и до
некоторой степени это справедливо. Вообще говоря, мы пытаем-
пытаемся преобразовать нестабильный органический образец в стабиль-
стабильное, сугубо неорганическое состояние. Окончательный резуль-
результат представляет собой серию амплитудно-контрастных изобра-
изображений, на которых очень трудно связать данный уровень
сигнала с характеристикой живой клетки. Очень важно понять,
что наблюдаются лишь изображения, которые, хотя и представ-
представляют живой биологический материал, но в действительности
очень далеки от него. Эта сторона электронной микроскопии
убедительно доказана в исследованиях нефиксированных и не-
неокрашенных образцов, замороженных в гидратированмом со-
состоянии и высушенных в замороженном состоянии образцов. На
таких образцах уже нельзя наблюдать знакомые нам изобра-
изображения, получаемые более обычными методами, и может быть
хорошо, что мы начинаем переучиваться для распознавания кле-
клеточных структур в замороженных в гидратированном состоянии
средах. Принятие того факта, что все, что мы наблюдаем в
РЭМ, является в большей или меньшей степени артефактом, ни
в коем случае не уменьшает значения этого прибора в биоло-
биологических исследованиях.
11.3.2. Отбор образцов
Выбор образца должен производиться с некоторой осторож-
осторожностью. Образец должен быть наименьших размеров, сравни-
сравнимых с размерами деталей, которые нужно исследовать. С об-
образцами малых размеров проще обращаться, и они более адек-
адекватно обрабатываются в процессе фиксации и обезвоживания.
Одним из наихудших источников загрязнения в РЭМ является
сам образец. Образцы малых размеров могут быть наиболее
адекватно застабилизированы и обезвожены, что уменьшает ве-
вероятность выделения летучих компонент внутри микроскопа.
Частицы ткани размером до 1—2 мм3 могут быть извлечены
хирургическим путем из многоклеточных организмов; было бы
желательно получать более мелкие частицы растительного ма-
материала. Культура ткани, одиночные клетки, микроорганизмы
и органеллы изолированных клеток либо могут быть собраны,
переработаны в суспензии и помещены в капсулы из агара до
обработки, либо их можно осадить и прикрепить на подходя-
подходящую подложку, например стекло, свежий скол слюды или на
диски из металла, совместимого с тканью, с пластмассовым по-

Препарирование биологических объектов для РЭМ 223
:- ; • *-. ' ' .*% .' •-, :?f****-~
?o,CQ11L4' Мон°Циты человека на стекле. Маркер соответствует 10 мкм
крытием или без него. Другими словами, микроорганизмы мож-
можно изучать in situ на поверхности ткани (естественно или искус-
искусственно вскрытой), ИСПОЛЬЗУЯ недавно описанную методику
[323\. Прикрепленные образцы затем могут быть подвергнуты
препарированию. Стеклянные и слюдяные подложки имеют до-
дополнительное преимущество, так как сравнительные исследова-
исследования, как показано на рис. 11.4, могут быть выполнены с по-
помощью светового микроскбпа.
Для культуры тканей пластиковая посуда должна использо-
использоваться лишь в том случае, если исследователь совершенно уве-
уверен, что она нерастворима в органических растворителях ис-
используемых для препарирования ткани. Этот способ является
наилучшим для обращения со многими культурами клеток тка-
тканей млекопитающих, и такие клетки относительно просто при-
прикреплять на стеклянные покровные стекла, покрытые монослоем
полилизина [324]. Метод покрытия может быть использован
и для других клеток, таких, как микроорганизмы и однокле-

224
Глава 11
•t
' * * •• --ч . '
¦• "*
Рис. 11.5. Культура клеток СНО-ткани на фильтре. Маркер соответст
10 мкм [318].

Препарирование биологических объектов для РЭМ 225
точные морские водоросли, а также для частиц материи. Не-
Небольшие частицы материи могут быть также собраны на покры-
покрытые пластиком микроскопические сеточки, тонкие металличес-
металлические^ сетки либо, как показано на рис. 11.5, на один из имею-
имеющихся многочисленных коммерческих мембранных фильтров
(Millipore, Nuclepore, Flotronic и т. д.). Если должны использо-
использоваться мембранные фильтры, то важно проверять их раствори-
растворимость в различных жидкостях, используемых для обработки, и
понимать,'что мембрана, которая представляется гладкой нево-
невооруженному глазу, при наблюдении в РЭМ часто оказывается
очень грубой и рифленой. Такие сильно нерегулярные поверх-
поверхности не пригодны для таких образцов, как клеточные органел-
лы и вирусы. В работах i[326, 327] опубликован полезный об-
обзор по методам препарирования, которые могут быть использо-
использованы для таких микроорганизмов, как бактерии и грибы. В ра-
работах [262, 328] подробно описываются способы, с помощью
которых можно манипулировать с частицами, собирать и мон-
монтировать их для исследования в РЭМ.
11.3.3. Очистка образца
Важно быть уверенным, что исследуемая поверхность явля-
является чистой и свободной от внеклеточного материала. Некото-
Некоторые внеклеточные материалы, такие, как слизь, кровь или жид-
жидкости, выделяемые организмом, могут загородить всю исследуе-
исследуемую поверхность; другие, такие, как пыль, фрагменты клетки
и ткани, могут загораживать части поверхности, и в результате
мы получим неполное изображение. Очистка вырезанных частей
ткани в пределах возможного должна быть выполнена как мож-
можно быстрее, чтобы уменьшить вероятность посмертных и вызван-
вызванных кислородным голоданием (аноксией) изменений, которые,
в частности, повреждают ткани млекопитающих.
Загрязнения, вносимые водой, обычно связанные, как уста-
установлено, с многоклеточной тканью животных, зачастую могут
быть удалены путем осторожного промывания или орошения
образца буферным раствором такой же концентрации и соста-
состава, как и клеточные жидкости, который поддерживается при
температуре, соответствующей естественному окружению образ-
образца. Внутренние пространства могут быть дочиста промыты с по-
помощью непрерывного внутреннего промывания. Если осторож-
осторожное промывание оказывается недостаточным, тогда нужно ис-
использовать более бурное промывание с применением или без не-
небольшого количества поверхностно-активного вещества. Если
известен биохимический состав загрязняющего вещества, то мо-
может быть применена энзимная обработка.
В основном использовались энзимы протеолитического, гли-

226
Глава 11
to
Рис. 11.6. Удаление загрязнений с поверхности [329].
а —часть изолированной проксимальной трубки. Обработка почки одной НС1 позволяет
проводить микродиссекцию отдельного нсфрона, В растровом электронном микроскопе
выявляется гладкая базальная поверхность этой трубки, так как основание мембраны
еще не повреждено; 6 — часть изолированном проксимальной трубки, которая была обра-
обработана НС1 и коллагеназой. Коллагепаза сетективно удаляет трубчатое основание мем-
мембраны, выявляя складки или бороздки на трубке (указаны стрелками). Эти складки
соответствуют расположенным вблиз i основания зубчатым отросткам, которые наблюда-
наблюдаются как в просвечивающем *лек:ронноч микроскопе, так н в оптическом микроскопе.

Препарирование 'биологических объектов для РЭМ 227
политического и муколитического типов, включая коллагеназу,
гиалуронидазу, нейраминидазу, эластазу, химотрипсин, проназу
и некоторые другие типы амилаз. Пример материала, очищен-
очищенного с помощью коллагеназы, показан на рис. 11.6. При иссле-
исследовании некоторых твердых тканей представляет интерес лишь
неорганическая матрица. Органический материал обычно может
¦быть удален с помощью осторожного промывания в 2—5%-ном
растворе гипохлорита натрия при комнатной температуре. Орга-
Организмы с характерным кремнистым или известковым скелетом,
такие, как диатомеи, фораминифоры и глобигерины, могут быть
«чищены с помощью таких окислителей, как марганцовокислый
калин или персульфат натрия. Во всех случаях должна соблю-
соблюдаться большая осторожность для того, чтобы быть уверенным,
что удаляются лишь загрязнения, а поверхности остаются не-
неповрежденными. Образцы из больших многоклеточных объек-
объектов, вероятно, лучше всего промывать до, в процессе и после
иссечения, чтобы избежать загрязнения внеклеточными жидко-
жидкостями.
Водные образцы, такие, как одноклеточные водоросли, про-
простейшие и мельчайшие беспозвоночные, несмотря на то что хра-
хранятся в чистой культуре, часто смешаны с широким кругом
организмов и других растительных и животных остатков. Диф-
Дифференциальное центрифугирование и повторная промывка в
подходящем изотоническом буферном растворе обычно приво-
приводят к выделению организмов из остатков или наоборот, что
позволяет получить относительно чистую суспензию. Для сухих
образцов, таких, как кальцинированные и хитиновые ткани, се-
семена, древесина, споры, пыльца и надземные части растений,
обычно требуется лишь очистка от пыли предпочтительно чи-
чистым воздухом, но может быть также использован фреоновый
распылитель. Такие процедуры не должны нарушать микро-
микрофлору и грибную флору, которые являются общими чертами
многих растительных поверхностей. Недавно в работе [265] был
дан обзор некоторых методик, которые могут быть использова-
использованы при препарировании геологических образцов, включая ис-
ископаемые растения и образцы животного происхождения.
Крепкие образцы, такие, как ткани растений и животных, мо-
могут быть очищены в установке для катодного распыления или
в холодной плазме газового разряда.
В некоторых установках для катодного распыления можно
изменять полярность образца и мишени, что позволяет произ-
производить плазменное травление, а возможно, и очистку поверхнос-
поверхности. Подобным образом в кислородной плазме газового разряда
можно быстро удалять органические материалы с поверхности
неорганического образца. Такие методики следует использовать
с крайней осторожностью на соответствующим образом стаби-

228 Глава 11
лизированной ткани со скоростью травления, при которой не
изменяется поверхность образца.
Очистка поверхности не должна ограничиваться только на-
начальными стадиями препарирования образца, ее следует произ-
производить в любом случае, когда это оказывается необходимым.
Например, фиксация и обезвоживание могут также изменять
природу поверхностного загрязнения, поэтому проще его уда-
удалить после этих процедур, чем до них. Многие из методов по-
получения изломов (см. далее), в особенности те, которые выпол-
выполняются на сухих тканях, приводят к появлению мелких фраг-
фрагментов, затеняющих образец. Такие фрагменты необходимо уда-
удалять до перехода к следующему этапу процесса препарирова-
препарирования. Теперь очищенный образец готов для проведения следую-
следующей операции — стабилизации клеток и тканей.
11.3.4. Стабилизация образца
Стабилизация образца, или фиксация, представляет собой
процесс, при котором цитоплазма, находящаяся в весьма по-
подвижном растворенном состоянии, переводится в фиксированное
состояние за счет процессов осаждения и денатурации, а также
за счет образования поперечных связей. В процессе фиксации
из клетки безвозвратно удаляется большая часть ионов и элек-
электролитов, а также большое число молекул с низким молекуляр-
молекулярным весом, таких, как сахара и аминокислоты, остаются лишь
большие макромолекулярные комплексы.
Многие из фиксаторов, используемых для растровой элект-
электронной микроскопии, были заимствованы из просвечивающей
электронной микроскопии. Однако имеется много важных прин-
принципиальных моментов, которые нужно иметь в виду при выбо-
выборе фиксатора. Если исследователь собирается изучать естест-
естественную поверхность объекта или ткани или поверхность, кото-
которая была открыта и очищалась перед фиксацией, тогда важно,
чтобы фиксирующий раствор был приблизительно изотоничес-
изотоническим жидкостям клетки или ткани. В данном контексте термин
«фиксирующий раствор» относится ко всем другим компонен-
компонентам, нежели сам фиксатор. Он включает компоненты водного
буфера, компенсирующие ионы, электролиты и неэлектролиты,
такие, как сахароза. В работе [330] показано, что осмотичность
фиксирующего раствора также важна при получении удовлетво-
удовлетворительной фиксации, как и реальная концентрация фиксатора.
Если образец или блок ткани после фиксации должен разре-
разрезаться или разламываться, то фиксирующий раствор должен
быть гипертоническим. Время фиксации в первом случае обыч-
обычно может быть достаточно коротким, но во втором случае оно
должно быть достаточно продолжительным, чтобы фиксатор
мог проникнуть в центр образца. Более продолжительные вре-

Препарирование биологических объектов для РЭМ 229
мена фиксации обладают дополнительным преимуществом, за-
заключающемся в упрочнении ткани, что несколько облегчает из-
изготовление излома на последней стадии препарирования.
Другими факторами, которые должны учитываться при со-
составлении фиксирующего раствора, являются рН, компенсирую-
компенсирующие ионы и температура. Первые два фактора должны быть
насколько можно ближе к исходным жидкостям, окружающим
клетку и ткань. Фиксирование ткани млекопитающих обычно
производится при температуре около 277 К. Необходимо также
соблюдать осторожность при выборе буфера, так как важно,
чтобы он был достаточно эффективным в диапазоне рН образ-
образца. Имеется несколько путей проведения фиксации: образец мо-
может выдерживаться в паровой фазе фиксатора, погружаться
или плавать на поверхности в фиксирующем растворе, а в слу-
случае больших животных опрыскиваться in vivo фиксирующим
раствором. Фиксация в парах используется для сохранения
хрупких воздушных структур, в то время как фиксация с по-
помощью погружения и опрыскивания дает гарантию того, что
фиксатор достигнет соответствующих частей образца настоль-
настолько быстро, насколько это возможно, фиксация при плавании на
поверхности оказывается эффективной для листьев, лепестков
и кожи.
Несмотря на то что имеется целый ряд химикатов, которые
могут быть использованы в качестве фиксаторов для биологи-
биологических объектов [331], обычно полагают, что для большинства
тканей пригодной была бы двойная фиксация в органическом
альдегиде и далее в четырехокиси осмия (оба в идентичных
фиксирующих растворах). Наиболее часто используемым альде-
альдегидом является глютаральдегид B—5%), но он должен быть
смешан с 1—2%-ным формальдегидом и/или акролеином, кото-
который проникает в ткани быстрее, чем диальдегид. Такая комби-
комбинация, в частности, является полезной для сохранения расти-
растительных тканей. При использовании акролеина необходимо
предпринимать меры предосторожности, так как он представ-
представляет собой летучую, легко воспламеняющуюся и токсическую
жидкость. Конечная концентрация фиксирующего химиката
диктуется образцом и составом фиксирующего раствора, но
редко превышает 5°/о по отношению ко всему фиксирующему
раствору. Большинство тканей удобно фиксировать в течение
ночи при комнатной температуре, и в течение этого времени
полезно поддерживать фиксирующий раствор перемешанным.
После первоначальной фиксации ткань должна быть промы-
промыта в изотоническом буферном растворе и окончательно отфикси-
рована в течение 4 ч в 1—2%-ном растворе четырехокиси осмия
при той же температуре, при которой производилась фиксация
в альдегиде. Образцы должны быть хорошо отмыты от избыточ-

230 Глава 11
ного осмия и быстро прополоснуты в буферном растворе. Боль-
Большинство тканей фиксируется погружением, либо помещением
извлеченного из ткани небольшого кусочка в большой объем
фиксатора, либо непрерывной промывкой образца in situ в
большом объеме фиксатора с последующим его иссечением и
погружением в фиксатор. Альтернативный способ опрыскива-
опрыскивания лучше всего пригоден для тканей млекопитающих, и под-
подробности этой методики описаны в книге [331]. Для хрупких
образцов описан обменный метод препарирования [332], исклю-
исключающий полностью повреждение образца за счет предотвраще-
предотвращения внезапных изменений концентрации и состава.
Считается, что криофиксация является весьма важной мето-
методикой препарирования для РЭМ. Ткань стабилизируется путем
быстрого замораживания и разрезается или разламывается в
замороженном состоянии. Полученные таким образом материа-
материалы исследуются и анализируются либо высушенными в замо-
замороженном состоянии, либо замороженными в гидратированном
состоянии. Такие методики, в частности, полезны при препари-
препарировании материалов для рентгеновского микроанализа ионов
и электролитов, и дальнейшие подробности представлены в гла-
главе по препарированию образцов для микроанализа (гл. 12).
Криофиксация и исследование тканей, замороженных в гидра-
гидратированном состоянии, также являются потенциально полезны-
полезными для изучения трехфазных систем газ — жидкость — твердое
тело, какими являются легочная ткань, воздушная пена и про-
продукты брожения хлебопекарной промышленности, или та-ких
веществ, как масла, жиры, смазки, которые являются летучими
при обычной температуре. Препарирование .таких объектов
обычными методами приводит к полному удалению клеточных
жидкостей, из-за чего невозможно провести различие между
спорными структурами газовой и жидкой фаз. Обзор методов,
включая и некоторые применения к биологическим материалам,
дается в недавно изданной книге [333]. Следует, однако, пони-
понимать, что для большинства морфологических исследований
криофиксация не является лучшим способом препарирования,
и здесь лучше использовать более распространенные методы.
Необходимо подчеркнуть, что каждый образец уникален сам
по себе и требует своего специфического способа фиксации.
Важно экспериментировать, производя фиксацию новой ткани,
изменяя размер образца, время и температуру фиксации, тип,
концентрацию и рН конечного фиксатора и сопоставлять с на-
наблюдениями в оптическом микроскопе и ПЭМ. Наконец, необ-
необходимо помнить, что стабилизация ткани является одним из
многих различных процессов препарирования тканей, которую
лучше производить в непрерывной последовательности собы-
событий. Важно, чтобы за фиксацией следовало либо обезвожива-

Препарирование биологических объектов для РЭМ 231
ние, либо окрашивание с последующим обезвоживанием. Про-
Процесс может быть временно приостановлен либо когда образец
находится в 70%-ном этаноле, либо когда образец пол-
полностью обезвожен и перед нанесением покрытия хранится в эк-
эксикаторе.
Как только фиксация завершена, для дальнейшей обработки
образца имеется много различных возможностей. Можно сразу
начать обезвоживание, попытаться выявить внутренние части
образца или попытаться локализовать области со специфичес-
специфическими физиологическими функциями.
11.3.5. Вскрытие внутренних поверхностей
Одним из удивительных свойств биологического мате-
материала является наличие очень большой площади внутренней
функциональной поверхности. Был разработан ряд методик,
позволяющих изучать эти внутренние поверхности: нарезка, ког-
когда происходит направленная обработка затвердевшего образца
с помощью широких ножей; излом, при котором образец разла-
разламывается предположительно вдоль поверхности структурной не-
непрерывности, но часто в некоторой случайной точке с выявле-
выявлением двух сильно изрезанных поверхностей; получение реплик,
когда изготавливается пластиковый слепок с исследуемой
структуры, выявляемой после того, как биологически» материал
удаляется химическим растворением.
Внутреннее содержимое может быть обнаружено в большей
или меньшей степени на любой стадии процесса препарирова-
препарирования даже в микроскопе с помощью микродиссекции. Однако
большинство биологических тканей являются очень мягкими, и
более общепринято получение срезов и изломов после стабили-
стабилизации и обезвоживания.
11.3.5.1. Получение срезов
Срезы тканей могут быть изготовлены с помощью стандарт-
стандартных методик, используемых в обычной оптической и просвечи-
просвечивающей электронной микроскопии, и рассмотрены в РЭМ либо
в режиме на просвет, либо на отражение. Одно из преимуществ
РЭМ состоит в том, что в просвечивающем режиме в нем при
данном ускоряющем напряжении можно исследовать срезы в
20 раз большей толщины, хотя и с несколько худшим разреше-
разрешением. На срезах, исследованных в режиме на отражение, обна-
обнаруживается больше деталей, если перед исследованием удаляет-
удаляется заливочная среда и обнажается биологический материал.
В случае тонких срезов B0—200 нм) материал подвергается
фиксации, обезвоживанию и заливхе в одну из эпоксидных

232
Глава 11
:? -Л--.У
Рис. 11.7. Микрофотография в растровом электронном микроскопе среза
толшиной 1 мкм свернутой трубочки почки мыши, залитого смесью аралдита
и эпона [336].
Поверхность срезл подвергалась травлению в кислородной плазме, оттенялась сплавом
платина — палладии я затем на нее распылялось золото. Внутриклеточные структуры
идентифицировались по резистентным к травлению остаткам, образующим структуры на
поверхности среза после травления. На поверхностях клеток, выстилающих полость тру-
трубочки (L), между соседними клетками и в правом верхнем углу микрофотографии, охва-
охватывающими базальиую ламину, видны мембраны плазмы (Р); N — ядра; AI — митохонд-
митохондрии; MQ — гранулы митохондрнального матрикса.
смол. Срезы нарезаются на ультрамикротоме, а смола удаляет-
удаляется с помощью органических растворителей, метилата натрия и
с помощью контролируемого стравливания ионным пучком или
в низкотемпературной плазме газового разряда ,[334]. С дру-
другой стороны, тонкие срезы могут быть непосредственно смон-
смонтированы на твердой подложке и исследованы в РЭМ без даль-
дальнейшей обработки. На кажущихся плоскими срезах, в особен-
особенности на срезах, высушенных в замороженном состоянии, может
быть обнаружено значительное количество деталей.
Более толстые срезы @,2—5,0 мкм) могут быть также выре-
вырезаны из залитого в смолу материала, а смола может быть уда-
удалена с помощью методики, описанной в работе [335]. Срезы
толщиной от 2 до 10 мкм могут быть вырезаны из залитых смо-

Препарирование биологических объектов для РЭМ 233
лой или твердым парафином материалов на обычных микрото-
микротомах, парафин затем может быть удален с помощью ксилола,
а смола — с помощью вышеупомянутых методов. Срезы либо
укрепляются на маленьких покровных стеклах с помощью клея
Хаупта для проведения сравнительных исследований в оптичес-
оптическом микроскопе и РЭМ или они вылавливаются на прозрачные
для электронов подложки для проведения сравнительных иссле-
исследований в РЭМ/ПЭМ.
В работе [336] использовалась кислородная плазма для трав-
травления поверхности толстых @,1 мкм) залитых смолой срезов
ткани, почки, изготовленных с помощью стандартных методик,
используемых в ПЭМ, в результате чего были обнаружены суб-
субструктурные детали субклеточных органелл (рис. 11.7).
11.3.5.2. Получение изломов
Иногда лучше вскрывать внутренние детали объекта, ис-
используя метод изломов. Твердые ткани могут разбиваться до
фиксации. Используя лезвие бритвы, легко получить чистые сре-
срезы поверхностей древесных образцов. В работах [337, 338]
рекомендуется древесину с низкой плотностью разрезать в све-
свежем виде либо после вымачивания в холодной воде, в то время
как более плотную древесину, прежде чем ее чисто разрезать,
необходимо размягчать в горячей воде. Остатки цитоплазмы
могут быть удалены с помощью 20%-ного раствора гипохлори-
та натрия, а после обезвоживания и нанесения покрытия не-
небольшие блоки древесины крепятся таким образом, чтобы край
между двумя подготовленными для исследований поверхностя-
поверхностями был бы направлен к коллектору, как показано на рис. 11.8.
Несколько более мягкие ткани могут быть разделены с по-
помощью препаровальных игл до или после фиксации, но более
удовлетворительные изломы получаются из хрупкого мате-
материала.
В работах ;[339, 340] был предложен метод сухого излома,
в котором кусочек липкой ленты осторожно прижимается к
обезвоженным и высушенным в критической точке тканям. При
удалении этого кусочка ленты происходят отрыв некоторой час-
части ткани и обнажение внутренней структуры. Взаимодополняю-
Взаимодополняющие изломы могут быть получены при отрыве друг от друга
двух кусочков липкой ленты с небольшим кусочком ткани меж-
между ними; далее для наблюдения они располагаются рядом на
объектодержателе. Кусочки ткани больших размеров могут
быть разломаны в сухом виде либо путем разрезания и разде-
разделения маленьким скальпелем, либо надрезом образца, оба края
которого удерживаются миниатюрным пинцетом, а затем раз-
разделяются. Примеры препарирования таких объектов этим мето-

234
Глава 11
Рис. 11.8. Поперечные и радиальные продольные поверхности древесины
Notojagus fitsca [337j.
„ *
. -I
Рис. 11.9. Уплощенная эпителиоидальная клетка Хела, оголенная в сухом
виде методом липкой ленты и демонстрирующая нижнюю поверхность вы-
выращенных краев (а), и оголенная методом липкой леиты поверхность клетки
Хела, на которой видны округлые органеллы (б) [340].

Препарирование биологических объектов для РЭМ
235
Рис. 11.10. Растровая электронная микроскопия при низких температурах.
а—полученный при низкой температуре излом обработанных этанолом клеток корня
Lemna minor; б — нефиксированная поверхность излома клеток корня Zea mais, получен-
полученная в гидратированном состоянии замораживанием: в- полученный при низкой темпе-
температуре излом обработанных глицерином клеток корня Lemna minor; г — полученный
при низкой температуре нзлом залитых смолой клеток корня Lemna minor.
дом показаны на рис. 11.9. Метод липкой ленты может быть
одинаково хорошо использован для одиночных клеток, закреп-
закрепленных на стеклянной подложке с помощью полилизина, выяв-
выявляя органеллы и клеточную субструктуру.
Другой подход состоит в использовании метода излома в за-
замороженном состоянии, при котором, чтобы превратить жид-
жидкость в хрупкую твердую массу, материал погружается в жид-
жидкий азот в нефиксированном, фиксированном i[341], замещенном
этанолом [342] или смолой-мономером [343] состояниях. Этот
ставший хрупким материал затем разламывается в жидком азо-
азоте с использованием тупого скальпеля, а разломанные кусочки
вновь возвращаются в соответствующую позицию процесса под-

236
Глава 11
?• '•- , * >—"s '»
". ' I .'
i .
Рис. 11.11. Целый эритроцит цыпленка с выступающим разорванным ядром,
волокнами цитоплазмы (слева) и микротрубочками (справа). Маркер соот-
соответствует 1 мкм [334].
готовки ткани, и препарирование доводится до конца. Результа-
Результаты, полученные при использовании данной методики, в качестве
примеров приведены на рис. 11.10. В недавно опубликованной
работе [347] метод излома в замороженном состоянии с боль-
большим успехом был использован для изучения хроматина эритро-
эритроцита цыпленка. Процедура заключается в быстром заморажи-
замораживании пропитанных глицерином образцов, которые разламыва-
разламываются в жидком азоте. После излома в замороженном состоянии
клетки тканей оттаивают в фиксаторе. Фиксация происходит
очень быстро , поскольку фиксатор быстро диффундирует в раз-
разломанные клетки, ив то же время имеется достаточно времени
для выхода растворяющих составляющих, позволяя за счет это-
этого глубоко «заглянуть» в клетку, как показано на рис. 11.11.
Методы изломов в замороженном состоянии имеют много пре-
преимуществ по сравнению с изломом в сухом состоянии, не по-
последним из которых является уменьшение количества остатков
на поверхности образца, которые могут не только завуалиро-
завуалировать поверхность, но и заряжаться под электронным пучком.

Рис. 11.12. Схема биокамеры AMRAY для получения излома в замороженном состоянии [302].
/ — колонна РЭМ; 2 — охлаждаемая пластина; 3 — охлаждающий элемент Джоуля — Томпсона; 4—жидкий азот; 5 — изолирующий кла-
клапан; 6 — установка ножа по высоте; 7 — перемещение ножа; 8 —- увеличение ХЮ—100; 9 — охлаждаемый экран; 10 — металлический ис-
источник; //~ угольный источник; 12 — модуль для панссеиии покрытия; 13 — модуль для смены образца; 14 — держатель образца;
/5 — коллимирующая диафрагма; 16 — вакуумный клапан; 17 — держатель с возвратно-поступательным перемещением; 78 — стержень
управления держателем; 79 — рычаг наклона вращения; 50 — нить нагревателя; 2/— блок загрузки и нанесения покрытия; 22 — салазки
перемещения блока; 23 — вакуумный насос; 24 — жалюзи, охлаждаемые жидким азотом.

238
Глава 11
Рис. ' 1.13. Поверхности излома замороженных в гидратироваином состоянии
кончиков корня Lenma minor.
Корни были инкапсулированы либо в 25%-ном поливикилпирролидоне (в), либо в 25%-ном
оксиэтиловом ксилэтиловом крахмале [а, б, г) и быстро заморожены в кипящем
азоте. Замороженные корни переносились в жидком азоте в биокамеру AMRAY, где про-
производились излом, травление и нанесение пленки золота толщиной 20 им при J03 К и
давлении 50-Ю-6 Па. Замороженные образцы изучались при 93 К и давлении 20-Ю-6 Па
в РЭМ AMR I000 А. На снимке а показано кольцо, состоящее из восьми клеток лубяной
паренхимы, окружающих центральную клетку ксилемы. Метка соответствует 10 мкм.
На снимке б показаны полностью замороженные наружные клетки корневого чехлика.
на которых отсутствуют повреждения за счет кристаллов льда. Метка соответствует
20 мкм. На снимке в показано кольцо, состоящее из клеток лубяной паренхимы с одной
клеткой, выделенной в трубке сита, и соседней клеткой. Маркер составляет 10 мкм. На
снимке г видно ядро из трубки сита. Метка составляет 5 мкм.
Вообще говоря, излом в замороженном состоянии наиболее
просто производить на материале животного, а не растительно-
растительного происхождения из-за более однородной плотности мягкого
материала и наличия целлюлозных и одревесневших стенак кле-
клеток в растительном материале, приводящих к более быстрому
расщеплению растительного материала и создающих весьма
нерегулярные поверхности излома.
В работе [302] описано очень сложное оборудование
(рис. 11.12), которое является приставкой к микроскопу и по-
позволяет неоднократно делать изломы замороженных в гидрати-
рованном состоянии образцов, наносить покрытие и наблюдать
при низких температурах в микроскопе. С помощью этого при-

Препарирование биологических объектов для РЭМ 239
бора были получены взаимодополняющие реплики с дрожжей
с разрешением 10—15 нм [302] при использовании метода за-
замораживания— скалывания. Совсем недавно этот прибор был
использован для исследования поверхностей излома, высушен-
высушенных в замороженном состоянии развивающихся корней Lemna
minor [303]. Разрешение достаточно высоко и можно наблю-
наблюдать субклеточные органеллы и перегородки внутри клеток ви-
видоизменяющейся лубяной паренхимы (рис. 11.13). Поверхности
излома обычно исследуются в РЭМ непосредственно, хотя воз-
возможно также проводить исследование на изготовленных из теп-
лочувствительного материала репликах, на которые предвари-
предварительно наносится покрытие.
11.3.5.3. Изготовление реплик
В недавно опубликованной работе [345] дается подробное
описание большого числа методов получения реплик, пригод-
пригодных для изучения естественных наружных поверхностей, как
показано на рис. 11.14, где проводится сравнение исходной по-
поверхности и реплики. Реплики могут быть также изготовлены
с внутренних поверхностей путем инфильтрации органа пласти-
пластиком с низкой вязкостью и его полимеризации, после чего ткань
удаляется, оставляя чистый отпечаток поверхностей. Такие реп-
реплики особенно полезны для интерпретации областей с большой
внутренней поверхностью, таких, как легкие или почки, и для
исследования микрососудистой системы многих органов [346—
348]. На рис. 11.15 показаны детали капиллярной сети ворси-
ворсинок, полученной при использовании латексного метода, описан-
описанного в [346]. Использовался также метилметакрилат; в работе
[349] это вещество использовалось для получения подробных
отпечатков микрососудов яичника крысы. В работе [350] была
введена модификация метилметакрилатовой среды, в которую
был добавлен пластик с низкой вязкостью (Serviton), в резуль-
результате чего получилась смесь, примерно в 10 раз менее вязкая,
чем метилметакрилат. Используя эту смесь, авторы получили
стабильные отпечатки микрососудов желудочно-кишечного трак-
тракта ряда животных. Попытки использовать методы получения
реплик с последующим химическим растворением биоматериа-
биоматериала растительной ткани не увенчались успехом, по-видимому, за
счет того, что растения не обладают механизмом пропускания
жидкостей сквозь их структуру.
11.3.6. Локализованные области с известной
физиологической активностью
Объем биологического материала состоит из элементов с
низким атомным номером, коэффициент отражения электронов
для которых достаточно мал, и поэтому, для того чтобы увели-

240
Глава 11
, •*
T
Рис. 11.14. Изображение в РЭМ исходной поверхности излома зуба челове-
человека с металлической пломбой; метка составляет 2 мкм (а), и изображение в
PdM ацетатной ленты и реплики на силиконовой резине поверхности излома
зуба человека с металлической пломбой (б) [345]

Препарирование биологических объектов для РЭМ
241
Рис. 11.15. Реплика разветвленной капиллярной сети собаки, полученная введе-
введением латекса [346].
чить сигнал, необходимо вводить по возможности более тяже-
тяжелые элементы. Обычно это достигается добавлением смеси таких
элементов, как серебро, осмий, свинец, уран и золото, которые
являются умеренно специфичными для определенных биологи-
биологических структур, когда они применяются либо для окрашивания
блоков, либо к срезам тканей. В работах [351, 352] дается об-
обзор методов получения изображения биологических объектов в
режиме отраженных электронов и приведены ссылки на рецеп-
рецепты для специальных красителей. Окрашивание повышает как
коэффициент вторичной электронной эмиссии, так и коэффи-
коэффициент отражения. Одна из проблем, связанная с этим методом,
состоит в необходимости отличать топографический контраст
от контраста, зависящего от атомного номера, а также в устра-
устранении ярких областей, обусловленных зарядкой. Сложностей,
связанных с топографическим контрастом, можно до некоторой
степени избежать, изучая либо срезы тканей, либо плоские по-
поверхности массивных образцов. Контраст образцов, зависящий
от атомного номера, из-за окрашивания усиливается за счет
топографического контраста, что делает более затруднительной
однозначную идентификацию морфологических особенностей в
клетках и тканях.

242
Глава 11
Рис, 1JJ6. Изображение во вторичных электронах (а) и в отраженных
электронах (б) культуры клеток ткани Хела, окрашенных серебряным кра-
красителем Вильдера. (Углеродное покрытие.) Маркер составляет 10 мкм [353].
к
,-Г
4
1
Рис, 11.17. Пример применения специфических гистологических методик.
й — изображение в ПЭ.М костного мозга кт
красителем DAB без эндогенной активности к
ного мозга крысы, содержащего краситель.
и окрашенного осьмиевым красителем DAB д
мозга крысы, содержащего осьмневып кроечтр.
сидазе. полученное во вторичных электрона
на рис, в в отраженных электронах [356].
трольной крысы, окрашенного осьмиевым
|ерокспдазе: о — изображение в ПЭМ кост-
бладагощпп активность» к перокендаэе,
н перокендлэы: в — тображенис костного
ь DAB, обладающий активностью к перок-
: г — изображение образца, показанного

Препарирование биологических объектов для РЭМ
пз.
Рис. 11.18. Красные кровяные тельца человека, меченные T4-igG; ясно видны
части головы и хвоста фага (а), и красные кровяные гельца человека, мечен-
меченные T4-lgG в смеси с красными кровяными тельцами человека и цыпленка
(б) [365].
'Ч
Рис. 11.19. Красные кровяные тельца человека, контрольный эксперимент в
присутствии ингибитора для защиты от адсорбирования гранул золота по-
поверхностью (а), и красные кровяные тельца человека, маркированные гра-
гранулами золота и меченные агглютинином соевых бобов и агглютинином се-
семени пшеницы (б) [362].
Есть много способов применения красителей. В работах
[352, 353], как показано на рис. 11.16, окрашивание тканей
производилось непосредственно аммиачным серебром Уилдера
и метанамидом серебра Гомори, каждый из которых обладает
сродством к ядрам и сетке нервных волокон. В работе [354]
для окрашивания тканей млекопитающих использовался нитрат
серебра, а в неопубликованной работе Эчлина в качестве неспе-
неспецифического красителя для исследуемого в РЭМ растительного
материала использовался краситель в виде насыщенного вод-
водного раствора уранилацетата. В работе ;[355] описываются три
методики окрашивания тканей солями урана, свинца, серебра
и вольфрама. В противоположность этому можно, как показа-
показано в [356] (рис. 11.17), применять более специфические гисто-
гистохимические методики, в которых конечный продукт энзимной

244 Глава 11
или биохимической реакции выпадает в осадок в виде тяжелого
металла, такого, как соли свинца, урана или висмута. Большин-
Большинство окрашивающих и гистохимических методов, которые ис-
используются в РЭМ, является модификацией методов, используе-
используемых в оптической и просвечивающей электронной микроско-
микроскопии, и читателю рекомендуется просмотреть эти источники для
выявления методик, которые можно приспособить для растро-
растровой электронной микроскопии. Метод авторадиографии может
быть использован для локализации областей со специфической
физиологической активностью, в то время как проявленные зер-
зерна серебра можно отобразить в режиме отраженных электро-
электронов. В работе [357] при изучении клеточного цикла культуры
тканей с успехом использовались в совокупности оптический
микроскоп, метод авторадиографии и РЭМ. Обзор этих методов
представлен в работе [358],
Один метод локализации со специфической физиологической
активностью был позаимствован нз ПЭМ. Этот метод меток
поверхности клетки, который, будучи применен к образцам для
РЭМ, приводит к образованию на поверхности клетки морфо-
морфологически различаемых или аналитически идентифицируемых
структур. Такие методики в сочетании с растровой электронной
микроскопией высокого разрешения позволяют изучать приро-
природу, распределение и динамические свойства антигенных и ре-
цепторных состояний на поверхности клеткн. Методы нанесения
меток на поверхность клетки в общем случае достаточно слож-
сложны и включают процедуры иммунохимической и биохимической
очистки. Подробные ссылки на них можно найти в работах
[359—361], но сущность методик состоит в следующем. Для
крепления антител в определенных антигенных состояниях на
поверхности клетки используются стандартные иммунологичес-
иммунологические процедуры. Хитрость состоит в том, чтобы модифицировать
антитела таким образом, чтобы они также несли морфологи-
морфологически различимую метку, такую, как латексные шарики или
сферы из двуокиси кремния, распознаваемый вирус, как, напри-
например, вирус табачной мозаики, или один из Т-четных фагов, как
показано на рис. 11.18, илн белковая молекула известных раз-
размеров, как ферритин илигемоцианин. В работе [362] (рис. 11.19)
использовались гранулы золота, которые имеют большой коэф-
коэффициент вторичной электронной эмиссии. Одна часть антитела
имеет средство для специфичного антигенного закрепления на
поверхности клетки, в то время как другая часть несет морфо-
морфологически различимые структуры. В настоящее время иммуно-
иммунологические методы достигли такого уровня, когда они не могут
быть использованы для изучения как качественных, так и коли-
количественных характеристик поверхности клетки [363, 364].

Препарирование биологических объектов для РЭМ 245
Хотя методы окрашивания, гистохимические и иммунологи-
иммунологические методы не обладают специфичностью и разрешающей
способностью рентгеновского микроанализа, проводить их го-
гораздо проще, и они не требуют сложного и дорогостоящего обо-
оборудования.
11.3.7. Обезвоживание образца
Как указывалось ранее, одной из центральных проблем пре-
препарирования биологических тканей является удаление или им-
иммобилизация воды. Процедуры для иммобилизации воды осно-
основываются на методиках замораживания и рассматриваются в
следующей главе, посвященной микроанализу. Методы обезво-
обезвоживания для РЭМ могут быть теми же, что и для ПЭМ, и
включают либо пропитку ткани этанолом, метанолом или аце-
ацетоном с возрастающей концентрацией и последующую сушку
в критической точке, либо лиофильную сушку при низком дав-
давлении. Какой из этих двух методов лучше, является спорным
вопросом, и необходимо делать компромисс между экстракцией
ткани и ее усадкой, возникающими в первом случае, и повреж-
повреждениями, причиняемыми кристаллами льда, в последнем случае.
Какой бы из двух методов не использовался для обезвожива-
обезвоживания, следует ясно представлять, что неизбежно должны иметь
место некоторые изменения объема ткани. Бойд с сотрудниками
проделали серию тщательных исследований по изменению объе-
объема, которое происходит в различных растительных и животных
тканях после различных режимов обезвоживания. Они устано-
установили, что материал, подвергавшийся сушке в критической точ-
точке, может дать усадку вплоть до 60%; материал, подвергавший-
подвергавшийся лиофильной сушке, — вплоть до 15%, а материал, высушен-
высушенный от летучих жидкостей на воздухе, теряет около 80% исход-
исходного объема. Несмотря на то что растительный материал
обычно имеем меньшую усадку, чем материал животного проис-
происхождения, каждый образец должен рассматриваться отдельно.
При условии, что измеряемое изменение объема однородно во
всех направлениях и одинаково во всех частях образца, можно
производить коррекцию любых измерений, производимых на
образце.
Прежде чем приступить к обсуждению двух методов, воз-
возможно, было бы полезным рассмотреть другие методы сушки
тканей. Сушка на воздухе не является удовлетворительной про-
процедурой, так как она вследствие сильного поверхностного на-
натяжения воды приводит к такому сильному искажению ткани,
которое может создать напряжения свыше 20—100 МПа на по-
последних стадиях ускорения. Эти силы становятся существенно
больше по мере того, как уменьшается высушиваемая структу-
структура (рис. 11.20). Быстрое высушивание водной фазы образцов

246 Глава И
>\' V
Рис. 11.20. Примеры деформации за счет сушки образцов иа воздухе.
а — ископаемое жгутиковое Prorocentrum microns; 6 — эвгленовидлос жгутиковое Pliacus
sp.; в — ворсинки листа Solatium sarrachoides; г — пыльцевые зерна Роа pratenae.
путем помещения их в вакуум имеет дополнительный недоста-
недостаток, связанный с образованием кристаллов льда в процессе ис-
испарения воды при пониженном давлении. Образование кристал-
кристаллов льда может серьезно деформировать образец. Высушива-
Высушивание тканей от летучих органических жидкостей с низким
поверхностным натяжением, таких, как диэтиловый эфир или
эпоксидпропан в соотношении 1 : 2, или летучих органических
твердых веществ, таких, как камфора, лишь немногим лучше,
и это должно использоваться лишь в крайних случаях.
Химическое обезвоживание может быть достигнуто пропус-
пропусканием фиксированных тканей через несколько смен метилового
или этилового спирта или ацетона. Это может быть сделано
либо полной заменой одной концентрации на другую, либо мед-
медленным, но непрерывным закапыванием большого объема

Препарирование биологических объектов для РЭМ
247
5 мс к
Рис. 11.21. Культура клеток фибропласта мыши [366].
а — обезвоженные (дегидратированные) этанолом; б — обезвоженные (дегидратированные)
2,2-диметоксипропаиом.
100%-ного спирта или ацетона в маленький контейнер, содер-
содержащий образец. Преимущество последнего метода в том, что
образец не подвергается внезапным изменениям концентрации.
Должны быть приняты меры предосторожности, чтобы не были
использованы денатурированные спирты и ацетон, так как это
может привести к возникновению на поверхности образца ма-
маленьких иглообразных загрязнений. Температура обезвоживания
неважна, хотя обычно обезвоживание производится при той же
температуре, что и фиксация. Важно помнить, что 100%-ный

248
Глава 11
Рис. 11.22.
а—клетки опухоли мастоцитома (на которых видны ворсинки), изготовленные сушкой в
критической точке; б — те же клетки, изготовленные непосредственной сушкой с исполь-
использованием фреона-113. Поверхность клетки опухоли мастоцитома, исследованной в РЭМ с
полевой эмиссией (б, г): в — изготовленная сушкой в критической точке. Отметим здесь
пористость мембран поверхности клетки; г — изготовленная методом непосредственной
сушки. Отметим, что отверстия иа мембранах поверхности клетки видны [367].
спирт или ацетон является очень гигроскопичным, и может ока-
оказаться необходимым производить последнюю стадию обезвожи-
обезвоживания либо в сухой атмосфере, либо в присутствии подходяще-
подходящего влагопоглощающего вещества. Быстрое химическое обезво-
обезвоживание может достигаться при использовании 2,2-диметокси-

Препарирование биологических объектов для РЭМ
249
Рис. 11.22 (продолж.).
пропана. Образцы ткани помещаются в подкисленные растворы
2,2-диметоксипропана, который быстро превращает воду ткани
в ацетон и метиловый спирт. Так как протекает эндотермичес-
эндотермическая реакция, ткани затем проходят через три смены этанола,
метанола или ацетона. Если необходимо произвести быстрое

250 Глава 11
препарирование, тогда этот способ обезвоживания является эф-
эффективным. Более предпочтительными являются медленные
способы, так как при более быстром методе, возможно, сущест-
существует опасность деформирования ткани, в частности больших
размеров образцов. В работе [366] проделано тщательное срав-
сравнение сохранности культур тканей при использовании методов
обезвоживания с помощью метанола и диметоксипропана
(DMP), и оказалось, что большой разницы между двумя спосо-
способами нет (рис. 11.21). Деформирование ткани в процессе обез-
обезвоживания может быть уменьшено, если на ранних стадиях осу-
осушитель (этанол, ацетон и т. д.) разбавляется буфером, исполь-
использованным для фиксации.
В работе [367] показано, что отдельные клетки культуры
ткани можно высушить в эксикаторе с помощью фреона-113
при комнатной температуре. Клетки, укрепленные на покровных
стеклах, фиксируются и проходят обезвоживание в 100%-ном
этаноле, а затем проходят через постепенные изменения кон-
концентрации фреона-113 вплоть до 100%• Образцы, погруженные
в фреон-113, переносятся в эксикатор, содержащий Drierite, и
откачиваются до давления 3 Па C-10~2 Торр). Жидкая фаза
фреона-113 испаряется в течение нескольких минут, оставляя
клетки, ультраструктура которых сравнима со структурой кле-
клеток, высушенных методом сушки в критической точке (рис.
11.22). Дальнейшие исследования должны показать, может ли
эта методика быть эффективно использована для кусочков тка-
тканей. В работе [368] разработан метод, который позволяет высу-
высушивать образцы от этанола в струе сухого аргона без использо-
использования сушки в критической точке. Методика дает столь же хо-
хорошие результаты, как и другие методы, хотя на чувствитель-
чувствительных образцах, таких, как мерцательный эпителий, метод сушки
в критической точке дает лучшие результаты.
Трудно указать промежуток времени для проведения эффек-
эффективного обезвоживания, потому что, как и фиксация, обезвожи-
обезвоживание очень сильно зависит от размера образца, пористости и
от того, должны ли исследоваться внутренние и/или внешние
характеристики клетки.
Ориентировочно большинство блоков ткани размером 1 —
2 мм3 эффективно обезвоживается через 15 мин в 15-, 30-, 50-,
70-, 95 и 100%-ном этаноле или ацетоне с последующими тремя
10-минутными сменами в безводном растворителе, а вся проце-
процедура выполняется примерно в течение 2 ч. В работе [369] пока-
показано, что структура лучше сохраняется, если обезвоживание
производится непрерывно, а не последовательно в несколько
ступеней.
Время процесса препарирования является достаточно важ-
важным, чтобы можно было избежать незапланированных задер-

Препарирование биологических объектов для РЭМ 251
жек в течение этого процесса. Так, обычно удобно выбирать и
очищать образцы ткани во второй половине первого дня; фикси-
фиксировать в альдегиде в течение ночи, промывать и производить
последующую фиксацию в осмии, обезвоживать и монтировать
образец на объектодержателе на второй день; наносить покры-
покрытия на образец в первую очередь на третий день и проводить
остаток этого дня за исследованием образца в микроскопе. По-
Последней стадией обезвоживания, если не собираются исследо-
исследовать разрезанный или разломанный материал, является про-
процедура сушки в критической точке.
11.3.7.1. Сушка в критической точке
Специалисты в области растровой электронной микроскопии
вновь открыли для себя метод сушки .в критической точке, кото-
который был впервые разработан тридцать лет назад для изучения
бактериальных жгутиковых [370]. Основная идея метода состо-
состоит в том, что двухфазные состояния (пар и жидкость) большин-
большинства летучих жидкостей исчезают при некоторой температуре и
давлении — в так называемой критической точке. В критической
точке две фазы находятся в равновесии, фазовая граница исче-
исчезает и, следовательно, отсутствует поверхностное натяжение.
Уже было много написано о теории и практике сушки в крити-
критической точке, и подробности методики можно найти в работах
[371, 372].
Практические аспекты метода включают перенесение тканей
из обезвоживающих жидкостей (метанол, этанол, ацетон) через
промежуточные жидкости (амилацетат, фреон-TF) в переход-
переходную жидкость (жидкая двуокись углерода СО2 или фреон-13)
в приборе для сушки в критической точке или контейнере.
В идеальном случае было бы желательным высушивать в кри-
критической точке воды, но критическая температура воды F48 К)
¦столь велика, что пришлось бы совершенно загубить образец.
Мы уже обсуждали значение обезвоживающих жидкостей.
Переходные жидкости являются химическими препаратами, в
которых происходит сушка в критической точке. Критическая
температура СО2 составляет 304 К, критическое давление рав-
равно 7,39 МПа, а для фреона-13 (монохлортрифторметана) —
311 К и 3,87 МПа соответственно. Промежуточные жидкости
используются, если обезвоживающие жидкости не смешиваются
с переходной жидкостью. Такая проблема не возникает при ис-
использовании этанола или ацетона и жидкой углекислоты СО2,
но необходимо вводить промежуточную жидкость между этано-
этанолом — ацетоном и фтористым углеродом — фреоном-13.
Амилацетат может использоваться в качестве промежуточ-
промежуточной жидкости между этанолом — ацетоном и СОг, так как он

252 Глава 11
несколько менее летуч и уменьшает вероятность того, что обра-
образец будет высушен при переносе образца в аппарат для сушки
в критической точке. Другим преимуществом амилацетата яв-
является отчетливый (но токсичный) запах, и отсутствие его в
атмосфере переходных жидкостей является точным индикато-
индикатором того, что перенос успешно осуществлен. В работе [373] по-
показана важность полного удаления промежуточной жидкости
перед выполнением сушки.
Хотя процедура сушки в критической точке приблизительно
одинакова для всех видов оборудования, в действительности
существуют важные отличия между различными имеющимися
камерами сушки в критической точке, и важно выполнять рабо-
работу в соответствии с рекомендациями конкретного изготовителя.
До тех пор пока оператор помнит, что процесс происходит внут-
внутри камеры, в которой достигаются высокие давления, и исполь-
использует технику с осторожностью, сушка в критической точке мо-
может выполняться надежно и эффективно. Важно регулярно про-
проверять клапаны, уплотнения и, где это возможно, смотровые
окна. Дальнейшие меры предосторожности по технике безопас-
безопасности описаны в статьях [372, 374]. В большинстве случаев
сушка в критической точке производится с использованием жид-
жидкого СО2, та как он дешевле и доступнее фреона-13. Углекисло-
Углекислота СО2 должна быть безводной, не содержать частицы и для
удобства должна поставляться в цилиндре с сифоном. Если это
важно, то цилиндр должен крепко закрываться изнутри для
удаления любых следов ржавчины, которая могла бы загряз-
загрязнять поверхность образца. Образец до конца обезвоживания
следует помещать в контейнере с предохранительной сеткой и с
уплотнением.
В камере создается турбулентность жидкости, и, поскольку
обычно подвергается сушке сразу несколько различных образ-
образцов, эти контейнеры предотвращают смешивание образцов.
Единственное требование ко всем контейнерам и подложкам
состоит в том, чтобы они не препятствовали потоку переходной
жидкости и оставались погруженными внутрь обезвоживающей
жидкости до тех пор, пока камера заполнится под давлением.
Как только сушка в критической точке закончена, образцы
должны быть немедленно перенесены в эксикатор, где могут
храниться до монтажа и нанесения покрытия.
11.3.7.2. Лиофильная сушка
Лиофильная сушка является другим по отношению к сушке
в критической точке эффективным методом обезвоживания, хо-
хотя всегда имеется опасность повреждения образца кристаллами
льда. Замещение объекта проникающими криопротектантами,
такими, как глицерин или диметилсульфоксил, приводит к не-

Препарирование биологических объектов для РЭМ 253
которому уменьшению усадки объема, но в свою очередь созда-
создает другие проблемы. Криопротектанты остаются в образце пос-
после сушки и будут медленно газить во вне и затенять образец,
а также загрязнять колонну микроскопа. Гажение можно умень-
уменьшить, исследуя образцы при низкой температуре или используя
непроникающие высокомолекулярные полимерные криопротек-
криопротектанты, такие, как поливинилпирролидон или оксиэтиловый крах-
крахмал (см. гл. 12). Практические рекомендации относительно то-
того, как лучше выполнить эту процедуру, даны в гл. 12 по пре-
препарированию образцов для микроанализа и в недавно вышедшем
обзоре [375], но вкратце процедура происходит следующим об-
образом: маленькие кусочки образца быстро замораживаются в
подходящей охлаждающей смеси, такой, как плавящийся фре-
фреон-13, и переносятся в жидком азоте на предварительно охлаж-
охлажденный столик аппарата для лиофильной сушки. Камера аппа-
аппарата для лиофильной сушки откачивается до рабочего вакуума
порядка 20—100 МПа, при котором происходит сублимация
льда из образца. Сублимация льда является функцией темпе-
температуры и давления: чем меньше температура, тем выше
требуется вакуум для того, чтобы вода могла испариться из
образца. В большинстве случаев лиофильная сушка произ-
производится приблизительно при 200 К и давление 20—100 мПа.
При более низких температурах рекристаллизация льда
уменьшается, но при этом требуется более высокий ва-
вакуум и/или большее время сушки. Важно создать кон-
конденсирующую поверхность для молекул воды, которые вышли
из образца. Это достигается с наибольшей эффективностью ус-
установкой на расстоянии в несколько миллиметров от образца
охлаждаемой жидким азотом ловушки, однако может быть до-
достаточно использования химических осушителей, таких, как фос-
фосфорный ангидрид или один из цеолитов. Реальное время, затра-
затрачиваемое на лиофильную сушку, очень сильно зависит от таких
свойств образца, как размер, форма, количество свободной и
связанной воды и относительные соотношения исходного и су-
сухого веса. Процедуры сушки должны разрабатываться для каж-
каждого образца, и важно, чтобы образец постепенно достигал
температуры окружающей среды в вакууме прежде, чем он бу-
будет удален из аппарата для лиофильной сушки. До сих пор еще
имеются значительные разногласия относительно преимуществ
метода лиофильной сушки по сравнению с сушкой в критичес-
критической точке. С учетом вышесказанного в целом оказалось, что ме-
методом лиофильной сушки лучше сохраняются детали клеточной
структуры. Метод сушки в критической точке обеспечивает по-
получение большей информации об образце в целом. Хорошая
демонстрация результатов, полученных обоими методами, пока-
показана на рис. 11.23.

254
Глава 11
Рис. 11.23. Сравнение результатов, полученных-после сушки в критической
точке и лиофильиой сушки замораживанием [377].
а и б — изображения лимфоцитов, высушенных в критической точке, демонстрирующие
тонкие микроворсиики и относительно гладкую поверхность, лежащую под ними. Метки
соответствуют 1 мкм (а) п 0,2 мкм (б); виг показывают образцы после лиофильиой
сушки. Микроворсинки намного толще, а поверхность клетки более сложная. Маркер
составляет 1 мкм (8) и 0,2 мкм (г).
Можно также высушивать ткани, прошедшие обезвоживание
в этаноле или ацетоне, а затем быстрое замораживание прибли-
приблизительно до 163 К. Образцы обезвоживаются в холодном рас-
растворе, а затем высушиваются при температуре 243—253 К и
давлении от 1,0 до 0,1 Па. В работе [376] в деталях описывает-
описывается подробная схема, по которой образцы фиксируются, обезво-
обезвоживаются в этаноле, а затем постепенно замещаются фрео-
ном-TF. Далее холодный образец размещается на большом
алюминиевом блоке, и оба быстро замораживаются в жидком
азоте. Охлажденный образец и металлический блок помещают-
помещаются в вакуумный эксикатор, и образец высушивается в вакууме
при давлении порядка 1 Па, во время чего металлический
блок медленно нагревается. Поскольку можно подвергать лио-

Препарирование биологических объектов для РЭМ 255
фильной сушке нефиксированную ткань, такая процедура вдвой-
вдвойне полезна тем, что при этом получают образцы, пригодные для
морфологических исследований и для анализа. Так же как и
для метода сушки материала в критической точке, образцы пос-
после лиофильной сушки должны храниться в эксикаторе, посколь-
поскольку они могут легко поглощать воду.
11.3.8. Подложки для образцов
Одно из первейших соображений при выборе подложки со-
состоит в том, что она должна создавать некоторого рода прово-
проводящий мостик, так как даже наиболее удачным образом покры-
покрытый металлом образец будет быстро заряжаться, если будет
электрически изолирован от столика микроскопа. Как обсужда-
обсуждалось ранее, образец может быть уже закреплен на такой под-
подложке, как стекло, пластмасса, слюда, или на одном из мемб-
мембранных фильтров. В этих случаях необходимо только прикре-
прикрепить подложку к объектодержателю, используя один из видов
проводящей краски, как, например, серебряная паста или кол-
коллоидный углерод. Важно закрасить маленькую область на
подложке образца и провести краской по ее краю и объектодер-
объектодержателю. Затем образец нужно поместить на несколько часов в
печку с температурой 313 К или в эксикатор-с низким давлени-
давлением, чтобы быть уверенным в том, что растворитель проводящей
краски полностью испарился до нанесения на образец подходя-
подходящего покрытия. При монтаже мембранных фильтров необходи-
необходимо принимать меры предосторожности, так как проводящая
краска может проникнуть в фильтр под действием капиллярных
сил и завуалировать образец и/или растворители краски могут
растворить пластмассовые подложки образцов. Поскольку из
аппарата для сушки в критической точке или из камеры для
лиофильной сушки образцы выходят сухими, их можно непо-
непосредственно закреплять различными методами на металличес-
металлическом держателе. Одним из самых простейших способов является
использование двусторонней липкой ленты. Образцы .насыпают-
.насыпаются или осторожно наносятся на клей, а в случае больших образ-
образцов проводящая паста легким мазком наносится от основания
образца через липкую часть на металлический объектодержа-
тель. Так как двухсторонняя липкая лента является плохим
проводником, важно создать проводящий мостик между образ-
образцом и металлической подложкой.
Образцы могут крепиться к объектодержателям с помощью
различных клеев, липких элементов и проводящих паст. В ра-
работах [378, 379] проделано тщательное изучение различных
имеющихся клеев и даны соответствующие рекомендации. Без-
Безотносительно к тому, какой липкий элемент используется, важ-

256 Глава И
но, чтобы он не загрязнял образцы, не оставлял пластик, в ко-
который мог бы погрузиться образец, и содержал легко удаляе-
удаляемые летучие растворители. Он должен быть также стойким к
умеренному нагреву и облучению электронным пучком.
Металлическая подложка для образца должна быть чистой
и иметь хорошую поверхность, что позволило бы легко крепить
образцы. Без особого труда на один и тот же объектодержатель
можно помещать несколько различных образцов. Индикаторные
метки можно просто нацарапать на поверхности, а различные
образцы надо крепко закрепить во избежание взаимного загряз-
загрязнения и ложной интерпретации.
После того как высушенные образцы смонтированы и лип-
липкое вещество высохло, через тонкую трубку полезно обдуть по-
поверхность образца чистым воздухом, чтобы удалить потерянные
кусочки и загрязняющую пыль. Затем либо на образец наносит-
наносится покрытие и он изучается в РЭМ, либо его помещают в сухой
контейнер без пыли.
11.3.9. Проводимость образца
Биологический материал обладает высоким электрическим
сопротивлением порядка 108 Ом/м и быстро заряжается под
действием облучения электронным пучком высокой энергии.
Проводимость биологического материала может быть сущест-
существенным образом повышена за счет добавки тяжелых материа-
материалов или неметаллических проводящих материалов либо в виде
тонкого слоя на поверхности образца, либо заполнением всего
материала солями тяжелых металлов. Методики нанесения по-
покрытий достаточно подробно обсуждались в гл. 10, здесь же бу-
будут кратко изложены альтернативные методы.
11.3.10. Заполнение тяжелыми металлами
Каждый акт заключительной фиксации, когда образец в те-
течение пары часов находится в четырехокиси осмия, повышает
содержание тяжелого металла в образце. Как указывалось ра-
ранее, полезно также разделить на блоки окрашенные образцы
после фиксации солями таких тяжелых металлов, как свинец,
висмут, уран и т. д. Свойства блоков тканей или больших об-
образцов, оказывающие влияние на формирование изображения,
улучшаются, если поместить эти блоки или образцы на 2 ч в
свежеприготовленный насыщенный раствор уранилацетата при
комнатной температуре. Перед обезвоживанием блоки тщатель-
тщательно промываются в дистиллированной воде и могут быть исполь-
использованы как для просвечивающей, так и растровой электронной
микроскопии.

Препаривание биологических объектов для РЭМ 257
. %
Рис. 11.2-1. lljoopajKcime в РЭМ обработанной четырехокисью осмия ткани
Г/,™**1™ блочным окрашиванием уранилацетатом и покры
таем Au/Pd толщиной 5 нм. Фотография получена при 18 кэВ (а). Изобра-
cnnZ а тл обработанной четырехокисью осмия ткани печени, покрытой
слоем Ан/Pd толщшюн 5 мкм. Фотография получена при 20 кэВ (б) [384]

258
Глава 11
нанесения покрытия; метка составляет 2 мкм
высушен в критической точке; без
Количество тяжелого металла в образце может быть суще-
существенно увеличено путем добавления лигандсвязывающего аген-
агента, который увеличивает осаждение тяжелых металлов в образ-
образце. Впервые этот метод был предложен в работе Г3801 а позд-
позднее был видоизменен в [381]. Прошедший фиксацию в альдегиде
и осмии образец обрабатывается лигандсвязывающим агентом
таким, как тиокарбазид, который связывает имеющийся в тка-
ткани осмии в одной из конечных аминогруппах, а другие конечные
аминогруппы теперь имеют возможность связать дополнитель-
дополнительный осмии, который добавляется после удаления избытка тио-
кароазида. Обычно этот метод называется методом ОТО (ос-
(осмии-тиокарбазид—осмий); изображение, полученное этим
методом, показано на рис. 11.24. До тех пор пока осмий оста-
остается неокисленным, последовательность операций может повто-
повторяться несколько раз, чтобы быть уверенным в большем осаж-
осаждении. В работах [382, 383] приводится полезная модификация
этого метода для растительного материала. Пример клетки,

Таблица 11.1. Артефакты за счет ошибок препарирования образца
Пузыри и раковины на поверхно-
поверхности
Лопнувшие пузыри
Сплющивания поверхности клетки
Кристаллы на поверхности
Отслаивание клеток
Образование направленных скла-
складок на поверхности
Повреждение клеток
Повреждение поверхности клетки
Искажение формы клетки
Мелкие частицы на поверхности
Общая усадка
Сильное повреждение
Увеличенные размеры клетки
Обособление и коагуляция внут-
внутреннего содержимого
Большие частицы
Большие регулярные отверстия
Большие поверхностные трещины
Микрокристаллические осадки
Завуалированные детали поверх-
поверхности
Пластические деформации
Регулярные щели и разрезы
Прободение содержимого клетки
Разделение клеток
Сморщенные отростки
Сморщивание клеток
Незначительное сморщивание
Маленькие дырки на поверхности
Гладкие поверхности перекрыва-
перекрываются с участками с выраженны-
выраженными деталями.
Пятнистая поверхность
Растянутая поверхность клетки
Волокна и кусочки материала на
поверхности
Трещины и следы травления
Изгибы и/или складки на поверх-
поверхности
Оплавление поверхности
Шелушение поверхности
Разбухание образца
- неправильное начальное промывание,
гипертонический фиксатор
- гипертонический фиксатор
- начальная сушка на воздухе
¦ буферные электролиты, умеренные
электролиты
- плохое замораживание
артефакт резки замороженного мате-
материала
плохая фиксация, плохое заморажи-
замораживание, начальная сушка на воздухе
плохая промывка, плохая фиксация
¦ сушка на воздухе
слишком толстое или неправильно
нанесенное покрытие
гипотонические фиксаторы и промы-
промывочные среды
неправильная обработка препарируе-
препарируемого материала, микробный распад
слишком толстое покрытие
плохая фиксация (обезвоживание)
дезинтеграция образца, пыль, грязь
повреждение при замораживании
движение слоя покрытия
неправильный буфер, фиксатор или
краситель
слишком толстое покрытие
неправильные резка, излом
термическое сжатие между клетками
плохая сушка в критической точке
неправильная фиксация
гипотоническая фиксация
перегрев в процессе фиксации
плохая сушка в критической точке
неправильно распыленное покрытие
неправильная сушка
— загрязнения в вакуумном испарителе
— гипотоническая фиксация
— неправильная промывка
— неправильное нанесение покрытия
распылением
— неправильное рН фиксатора
— перегрев в процессе нанесения покры-
покрытия
— сушка на воздухе органической жид-
жидкости, медленное применение фикса-
фиксатора
— гипертонические буферы и фиксато-
фиксаторы, плохая лиофильная сушка

260 Глава 11
препарированной методом [384], приведен на рис. 11.25. В каче-
качестве лигандсвязывающего агента была также использована ду-
дубильная кислота. Другие менее специфические химические об-
обработки образцов, повышающие их проводимость, включают
использование паров осмия, йодистого калия и уксуснокислого
ацетата и нитрата серебра. Эта и другие методики заполнения
металлами были недавно обобщены в работах [384, 281, 282].
Общий эффект всех этих химических обработок заключается в
увеличении объемной проводимости и эмиссионной способности
образцов, что позволяет наблюдать их в РЭМ без нанесения по-
покрытия, хотя и не при максимальных рабочих возможностях
прибора.
11.3.11. Интерпретация результатов и артефакты
Несмотря на то что довольно тщательно разработано боль-
большинство методов препарирования, случаются ошибки, и важно
уметь распознать артефакты на конечном изображении. В про-
процессе препарирования или в процессе наблюдения может про-
произойти повреждение образца, и часто бывает трудно отличить
одно повреждение от другого. Именно по этой причине так важ-
важны сравнительные исследования, так как каждый из разных
методов позволит перекрестно отображать весь процесс препари-
препарирования. Ряд наиболее часто встречающихся артефактов, а так-
также предполагаемая причина каждого вида повреждений приве-
приведены в табл. 11.1 и 11.2.
В работе [385] представлены подобные результаты в виде
изображений, которые должны изучать все пользователи РЭМ.
Таблица 11.2. Вносимые при наблюдении образца артефакты, как они
проявляются на изображении
Искажение фона — зарядка
Яркие области — зарядка
Яркие области в полостях — зарядка
Яркие полосы — зарядка
Пузыри на поверхности — повреждение пучком
Кратеры на поверхности — повреждение пучком
Темные области на образце — зарядка
Темный квадрат растра — загрязнение
Дисторсия изображения — зарядка
Сдвиг изображения — запяткя
Светлые и темные квадраты — повреждение пучком
растра
Утрата частей образца — повреждение пучком
Квадраты растра на поверхности — повреждение пучком
Движение образца — плохое крепление, зарядка
Сморщивание поверхности образ- — повреждение пучком
ца

Препаривание биологических объектов для РЭМ
261
а
0-2 м км
Шмкм
в
Юмкм />?:
Рис. 11.26.
а — язык новорожденного теленка, отфик-
сированный с помощью нейтральной соли
формалина. Изгиб за счет сильного
сморщивания менее ороговевшей сто-
стороны сосочка; б — трахея теленка с во-
волокнами слизистой оболочки за счет недо-
недостаточной промывки перед фиксацией.
Обезвожен замораживанием; в — желудо-
желудочек сердца обезьяны (макаки). Пятимин> г-
ная обработка в ацетоне, L-цистине до
фиксации, приводящая к утрате поверх-
поверхностного эпителия. Ацетон высушен суш-
сушкой на воздухе; г — К4-клетки, отфикснро-
ванные гипотоническим какодилатпым бу-
буфером в сочетании с 1%-ным формальде-
формальдегидом и 1,9%-ным глутаральдегидом. Отме-
Отмечаются лопнувшие пузыри; д — быстро за-
замороженная клетка Кг и оттаянная до фик-
фиксации в глутаральдегиде с последующей
сушкой в критической точке. Сильное об-
образование пузырей [385].

262
Глава 11
Ряс. 11.27. Артефакты, возникающие в процессе препарирования образца
для РЭМ.
а — повреждение кристаллом льда плохо высушенного зерна пыльцы Ctarkia spp; в —
неполное удаление материала капсулы с поверхности высушенной замораживанием водо-
водоросли Chroococcus turgidus: в — частичный коллапс высушенной сушкой в критической
точке водоросли Lyngbia majuscula; г — слои слизи, облитерирующий поверхность бакте-
бактерии Bacillus megatherium.
Пример некоторых типов повреждений, которые происходят в
процессе препарирования, показан на рис. 11.26. Для различ-
различных типов образцов возникают различные типы артефактов.
Для объяснения деталей физической природы повреждений, вы-
вызываемых пучком, можно сослаться на работу [186]. Наиболее
очевидным проявлением повреждения объекта, возникшего из-
за неверного препарирования, являются сморщивание за счет
экстракции и сушки, искажения за счет сушки и повреждения

Препарирование биологических образцов для РМА
263
Рис 11.28. Артефакты, наблюдаемые в процессе исследования образцов
РЭМ.
под действием кристаллов льда, связанные с криобиологически-
криобиологическими методиками, и изменения свойств поверхности в результате
неправильных способов нанесения покрытий (рис. 11.27)
На рис. 11.28 показаны некоторые повреждения, которые
могут произойти в микроскопе. Повреждения удобно подразде-
подразделить на ряд различных типов, хотя иногда бывает трудно отли-
отличить один тип от другого. На образцах, в частности на тех из
них, на которые не наносилось покрытие, могут случайно обна-
обнаружиться повреждения, связанные с вакуумом Это проявляет-

264 Глава 11
ся в виде разрыва структуры. Повреждения под действием пуч-
пучка могут произойти, когда облучение электронным пучком вы-
вызывает нежелательный локальный нагрев. Когда это происходит
на образце, могут возникнуть пузыри, блистеры или трещины,
можно заметить движение или даже дезинтеграцию. В простей-
простейшем виде такое повреждение проявляется в виде светлого и тем-
темного квадрата на поверхности образца, обусловленного раст-
растром. Это проявление не следует смешивать с загрязнением, ко-
которое может вносить свой собственный набор артефактов и
проблем в интерпретации. Разрушение под действием пучка
можно уменьшить за счет снижения энергии, поступаемой в об-
образец, хотя это может также ухудшить оптимальные рабочие
параметры прибора. Другим обычным артефактом является за-
зарядка образца; несмотря на то что обычно это явление прояв-
проявляется в виде аномально ярких областей на образце, эффект
пробегает всю гамму от маленьких вспышек на изображении до
сильно искаженных и неузнаваемых изображений. В работе
[386] приводится полезное обсуждение связанных с зарядкой
артефактов, дается объяснение того, как они возникают, и пред-
предлагаются способы, с помощью которых их можно избежать.
Парадокс, связанный с реальной интерпретацией изображе-
изображений, получаемых с помощью РЭМ, состоит в том, что это явля-
является как самой простой, так и самой сложной частью всего
процесса. Это очень просто, потому что изображения знакомы
нам, и при малых увеличениях мы легко узнаем изображения,
которые мы наблюдаем в стереоскопическом бинокулярном мик-
микроскопе. Это трудно, в частности, если новая деталь проявляет-
проявляется при высоком разрешении, так как необходимо четко разде-
разделять артефакты, которые возникают в любом препарированном
для электронного микроскопа образце, от структуры биологи-
биологического происхождения, которую мы пытаемся выявить.

Глава 12
ПРЕПАРИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ
ДЛЯ РЕНТГЕНОВСКОГО МИКРОАНАЛИЗА
12.1 ВВЕДЕНИЕ
Любой метод препарирования для рентгеновского микроана-
микроанализа должен приводить к четко распознаваемой структурной
неоднородности, в то же время сохраняя in situ элементные со-
составляющие, которые собираются проанализировать. Часто это
бывает затруднительным, и для достижения этой цели были
разработаны тончайшие методы препарирования. Во многих от-
отношениях принципы методов препарирования для рентгеновско-
рентгеновского микроанализа не отличаются от методов, используемых в
растровой электронной микроскопии. Важное различие состоит
в том, что методы препарирования, хотя и призваны сохранять
ультраструктуру, не должны достигать этой цели за счет раст-
растворимых составляющих клетки. В последующем изложении мы
не намереваемся давать бесчисленные рецепты, котроые могли
бы быть применены к специфическим биологическим системам,
а, наоборот, рассмотрим принципы, подчеркивающие методоло-
методологию и, таким образом, позволяющие экспериментаторам разра-
разрабатывать свои собственные методы для конкретного исследуемо-
исследуемого образца. Предмет не является новым, и, хотя будет сделана
попытка привести детали некоторых наиболее новых достиже-
достижений, ссылки следует сделать на более ранние исследования и
коллективные статьи [387, 320, 208, 388, 184, 206], в которых
даются рецепты для специфических биологических образцов.
12.1.1. Природа и широта проблемы
Микроанализ в биологических образцах может быть опреде-
определен как нахождение и измерение малых количеств элементов,
молекул и даже макромолекул с высоким пространственным
разрешением в биологических матрицах, обладающих обычно
малой плотностью. Термин «микроанализ» обычно связан с
рентгеновским микроанализом-—методом, в котором локализу-
локализуется и измеряется элементный состав образцов. С помощью
имеющихся в настоящее время детекторов минимальное коли-
количество элемента в биологической ткани, которое может быть
измерено с помощью рентгеновского микроанализа, составляет
приблизительно 10~19 г при пространственном разрешении 20—

266 Глава 12
30 нм и пределе разрешения в массовых долях порядка 1 мМ/кг
[179]. Биологи предпочитают термин «локальная массовая фрак-
фракция» для определения концентрации элемента. Массовая фрак-
фракция определяется как отношение массы элемента в анализируе-
анализируемом микрообъеме к общей массе образца в том же самом мик-
микрообъеме. Объяснение того, что измеряется в микроанализато-
микроанализаторе, включая более точное определение термина «локальная
массовая фракция» и измерение по отношениям элементов,
дается в статьях [389 и 179].
Идеальным образцом для рентгеновского микроанализа был
бы тонкий, гладкий срез стабильного материала с низким атом-
атомным номером, с хорошими тепловыми и электрическими свойст-
свойствами, содержащий включения с высокой локальной концентра-
концентрацией элементов. Тонкая алюминиевая фольга толщиной
~200 нм, содержащая включения золота, вероятно, была бы
наилучшим приближением к такому образцу. К сожалению,
биологический материал находится весьма далеко от этого
идеала.
Биологические объекты являются трехмерными нестабильны-
нестабильными влажными изоляторами. В основном они состоят из органи-
органических молекул и макромолекул, окруженных ионами и электро-
электролитами с малой концентрацией. Степень связи компонент
элементов простирается от относительно сильных ковалентных
связей, обнаруженных в содержащих серу белках, до свободно
диффундирующих в цитозоле ионов калия.
Характерным свойством живого материала является то, что
он движется. Степень движения меняется от явного перемеще-
перемещения в потоке цитоплазмы до движения ионов, электролитов, мо-
молекул и макромолекул относительно друг друга внутри клетки.
В результате обмена веществ биологический материал постоян-
постоянно изменяется, разрушая и перестраивая функциональную ар-
архитектуру клетки. Эта выраженная нестабильность мешает про-
проведению рентгеновского микроанализа, если не найдены пути
мгновенного сдерживания активности клетки и удержания ее
в этом состоянии до тех пор, пока выполняются исследования.
Если бы это было сделано, то окружающая среда, в которой
должен производиться рентгеновский микроанализ, полностью
была бы лишена жизненных процессов. Типичный одноклеточ-
одноклеточный организм менее 2 мкм в поперечнике синтезирует много со-
сотен соединений путем тонкого регулируемого процесса, способен
воспроизводить сам себя и генетически эволюционировать и
видоизменять эти процессы. Если захотелось бы найти быстрый
способ разрушения этого уникального тончайшего механизма,
то, вероятно, не нашлось бы ничего лучше потока быстрых
электронов, который за одну секунду смог бы испарить количе-
количество воды, во много раз превышающее вес образца.

Препарирование биологических образцов для РМЛ 267
Как указывалось ранее, биолог должен выбрать компромисс
между свойствами образца и условиями, в которых должен
проводиться анализ. Оказывается, компромисс за счет рабочих
характеристик приборов дает малый выигрыш, и это означает,
что мы должны внимательно рассматривать способы препари-
препарирования биологического материала. Большая часть разработан-
разработанных процедур основывается на методах, используемых в просве-
просвечивающей электронной микроскопии. Это неоптимальное насле-
наследие, так как просвечивающая электронная микроскопия
полагается на адекватную сохранность макромолекул, в то
время как в рентгеновском микроанализаторе определяются
элементы и он, таким образом, лучше всего подходит для ана-
анализа неорганических материалов. Тщательные исследования,
проведенные в работе [184], показывают, что на всех этапах
стандартных гистологических методов имеют место огромная
потеря и перераспределение почти всех элементов. Потеря ве-
вещества также далеко неоднородна, например, большое количе-
количество калия удаляется, а количество удаляемого фосфора раз-
различно и зависит от строения ткани. Концентрации элементов,
которые могут быть введены в ткань в процессе препарирова-
препарирования, должны быть одинаковы. Методы препарирования при рас-
рассмотрении делятся на две группы (проводимые при обычной
температуре и проводимые при низкой температуре) и пред-
представлены в поряде проведения процедуры препарирования от
живого объекта до образца, исследуемого внутри рентгеновско-
рентгеновского микроанализатора. Мы кратко обсудим высокотемператур-
высокотемпературный метод препарирования — «микроозоление». Для достижения
необходимого представления о состоянии и перспективе мето-
методов препарирования мы в первую очередь рассмотрим виды
аналитических исследований в применении к биологическим си-
системам, типы исследуемых образцов, а также стратегию и кри-
критерии препарирования.
12.1.2. Применения рентгеновского микроанализа
Полезно кратко рассмотреть основные виды исследований,
которые выполняются с помощью рентгеновского микроанали-
микроанализа. Хотя ниже приводится разбиение исследований по категори-
категориям, необходимо согласиться с тем, что имеет место явное и ча-
частое их перекрытие.
а. Локализация ионов и электролитов известных физиологи-
физиологических функций.
б. Изучение систем, которые подвергались искусственно выз-
вызванным или естественным изменениям, например лекарствами,
болезнью, гистохимическими красителями и преципитирующими
агентами.

268 Глава 12
в. Локализация энзимной активности.
г. Микрохимический анализ очень малых объемов выжатых
или извлеченных физиологических жидкостей.
д. Взаимосвязь элементного состава с конкретной морфоло-
морфологической особенностью.
е. Общее распределение ионов и элементов в нормальных
растительных и животных клетках.
Во всех этих шести категориях анализируемый элемент (эле-
(элементы) может находиться в виде различных форм: в качестве
аморфных или кристаллических осадков, молекул или макромо-
макромолекул с ковалентной связью, молекул или макромолекул с ион-
ионной связью, в качестве несвязанного иона или растворимого
элемента, свободно распределенного в клеточной и тканевой
жидкости.
12.1.3. Виды рентгеновских аналитических исследований
Исследования могут производиться на двух уровнях по слож-
сложности. В качественном анализе пытаются определить, присут-
присутствует ли данный элемент в клетке или ткани. На рис. 12.1 по-
показан пример качественного анализа, выполненного на куске
древесины, пропитанной защитным средством, содержащим
медь. В количественном анализе пытаются измерить, содержит-
содержится ли в одной части клетки или ткани больше или меньше дан-
данного элемента, чем в другой. Конечная цель количественного
анализа — определить настолько точно, насколько это возмож-
возможно, какое количество данного элемента присутствует в данном
объеме ткани. Большинство опубликованных работ по рентге-
рентгеновскому микроанализу относится к первой категории, и при
условии, что приняты соответствующие меры в процессе препа-
препарирования образца, эта методика может дать ценную биологи-
биологическую информацию. Вторая категория точного количественного
анализа является в какой-то мере более сложной и требует го-
гораздо больше, чем просто оптимального препарирования образ-
образца. Необходимо, например, иметь точные стандарты, высокую
стабильность прибора и электронно-вычислительные средства,
способные анализировать большое количество повторяющихся
данных.
12.1.4. Типы биологических образцов
Образцы для рентгеновского микроанализа удобно разбить
на шесть различных типов. Различные типы образцов имеют
разное пространственное разрешение в рентгеновском микроана-
микроанализе, зависящее от объема области генерации излучения в об-
образце. Этот объем является как функцией диаметра пучка и
глубины проникновения электронов, так и рассеяния электронов
и рентгеновского излучения внутри образца.

Препарирование биологических образцов для РМА 269
Рнс. 12.1. Кусочек сосновой дре-
древесины, пропитанный защитным
веществом, содержащим медь.
*„* „ а — изображение во вторичных электро-
*. * ! нах. Маркер соответствует 40 мкм; б—
карта распределения рентгеновского из-
излучения для той же области, что и на
^ - снимке а; в — осциллограмма, снятая
С _ поперек кусочка древесины, иа кото-
которой внден пик Си^. в области лучево-
лучевого сосуда, как на снимке а, так и на
снимке б.
12.1.4.1. Массивные образцы
Так называются образцы, которые слишком толсты для про-
прохождения или фотонов, или электронов и для которых морфо-
морфологическая информация может быть получена лишь в режиме
на отражение. Несмотря на то что массивные образцы все
меньше используются в рентгеновском микроанализе из-за пло-
плохого пространственного разрешения в этом режиме E—8 мкм),
все же в ряде случаев на них молено получать полезную инфор-
информацию [390, 391, 301]. Твердые ткани, такие, как кости, рако-
раковины, древесина и ископаемые, могут быть разломлены, и эти
образцы пригодны для качественного анализа. Однако их по-
поверхности настолько нерегулярны, что производить точный ко-
количественный анализ практически невозможно. Эту проблему
молено частично преодолеть полировкой поверхности, но во из-
избежание загрязнений нужно пользоваться чистыми абразивами.

! МКМ
а
Рис. 12.2.
а — высушенная на воздухе
клетка спермы человека, проана-
проанализированная в ЭММА. Субкле-
Субклеточные области анализа указа-
указаны кружками.
/ — субклеточный остаток; 2 —
акросома; 3 — ядро; 4 — средняя
часть; 5 — хвост; б — элементный
состав высушенных на воздухе
клеток спермы человека от
20 доноров. Маркеры показыва-
показывают стандартное отклонение от
среднего [208].
2.0 г
Мд Си
| I Область ядра
2n P
§§53 Область акросор.ы
Средняя часть

Препарирование биологических образцов для РМА 271
Можно также анализировать поверхности излома мягкого ма-
материала, но лишь после того, как либо ткань пройдет стабили-
стабилизацию, обезвоживание, укрепление, либо будет изготовлен из-
излом ткани при низкой температуре и она будет исследована и
проанализирована высушенной в замороженном состоянии или
замороженной в гидратированном состоянии. Последние иссле-
исследования |[303, 295] показали, что можно получать большие пло-
площади гладких изломов поверхностей на замороженных в гидра-
гидратированном состоянии массивных образцах и что при условии
оптимальной геометрии образец — детектор методика может
дать полезную аналитическую информацию об образцах, с ко-
которых трудно делать срезы при низких температурах, т. е. с
самых молодых растительных тканей.
12.1.4.2. Микроорганизмы, изолированные клетки
и органеллы
В настоящее время имеется много надежных биохимических
и механических методов, которые дают возможность изолиро-
изолировать отдельные клетки и органеллы. Эти методы не будут об-
обсуждаться, но будет рассмотрено, как такие клетки и фрагмен-
фрагменты тканей можно изучать в рентгеновском микроанализаторе.
В качестве примера плодотворного исследования одиночной
клетки служит рис. 12.2, на котором представлены результаты
исследований и анализа клеток спермы человека в электрон-
электронном микроскопе-микроанализаторе [208]. В некоторых отноше-
отношениях изолированные клетки и органеллы, толщина которых со-
составляет всего лишь несколько микрон, можно рассматривать
как самостоятельный объект исследования, но их чрезвычай-
чрезвычайная мягкость и высокое содержание воды налагают серьезные
¦ограничения на возможные используемые способы препарирова-
препарирования. В зависимости от их размера изолированные клетки и ор-
органеллы, а по этой причине неорганические материалы в виде
частиц для аналитических целей могут рассматриваться либо
как массивные образцы, либо как срезы. Некоторые примеры
препарирования изолированных клеток приведены в недавно
опубликованных работах [392, 393].
12.1.4.3. Неорганические частицы и волокна
Иногда бывает полезно проводить анализ на частицах мате-
материи, которые были либо выведены из тканей физиологическим
раствором, собраны в виде сухого порошка по типу метода
¦фильтрации, либо по отдельности были изолированы из матри-
матрицы ткани методом микроманипуляции. В работе [394] разрабо-
разработана простая методика получения реплик экстракцией, с по-

272 Глава 12
мощью которой с исходной поверхности или поверхности изло-
излома изготавливается пластиковая реплика. Имевшиеся на по-
поверхности образца частицы удаляются с репликой и могут быть
проанализированы. Сухие частицы могут быть проанализирова-
проанализированы in situ на фильтре, если только они достаточно хорошо дис-
диспергированы, иначе их заливают смолой, которую затем либо
разламывают и полируют, либо разрезают на части. Альтерна-
Альтернативным методом является приготовление на основе водного
раствора суспензии из частиц и распыление ее тонким слоем на
подходящей подложке. Частицы также встречаются в матрице
органического материала, откуда они могут быть удалены про-
промыванием в растворе гипохлорита натрия, кипячением в силь-
сильных растворах КОН или озолением в плазме газового разряда
низкого давления. Пример такого типа анализа чужеродных тел
в ткани дан в недавно опубликованной работе [395], где выяв-
выявлялось наличие асбеста в легочной ткани.
12.1.4.4. Жидкие образцы
Наибольший интерес в биологическом рентгеновском микро-
микроанализе сконцентрирован на изучении физиологически активных
жидкостей, которые могут быть получены из одиночных клеток
или из пространства, окруженного несколькими клетками. Были
разработаны методы извлечения таких жидких образцов микро-
микропункцией и определения элементного состава и концентрации
жидкостей в объеме всего лишь в несколько пиколитров. В раз-
разработанных методах [396—398] маленькие капли помещают на
очень хорошо отполированную поверхность бериллия, погружен-
погруженного в ванну с вазелиновым маслом. Капли воды не смешива-
смешиваются с гидрофобным вазелиновым маслом и остаются в виде
отдельных капель на бериллиевой подложке.
Вазелиновое масло удаляется с помощью ксилола или хло-
хлороформа, а капли высушиваются в замороженном состоянии,
оставляя нелетучий материал в микрокристаллической форме.
За одно и то же время могут быть обработаны сотни образцов,
поскольку поверхность бериллиевого блока размечается с по-
помощью сетки для облегчения идентификации образцов. Лешен
с сотр. автоматизировали многие из аналитических методик, и в
настоящее время этот метод является одновременно точным и
воспроизводимым. Несколько отличающийся способ был недав-
недавно описан в [399, 400], в котором микрокапли наносятся на тон-
тонкую пленку-подложку из парлодия и высушиваются не лио-
фильной сушкой, а выпариванием при вспышке. Метод микро-
микрокапель был распространен на анализ органических образцов пу-
путем осаждения очень малых количеств мочевины с помощью
тиоксантена-9-ол, а затем произведения анализа осадка на се-
РУ [401].

Препарирование биологических образцов для РМА 273
12.1.4.5. Толстые срезы
Толстые срезы (т. е. между 0,2 и 2,0 мкм) являются полез-
ным компромиссом, поскольку при использовании растровых
изображений на просвет может быть получена достаточно хо-
хорошая морфологическая информация, а образцы являются до-
довольно толстыми и содержат достаточное количество материа-
материала, который можно проанализировать с хорошим пространствен-
пространственным разрешением. Поскольку большинство растительных и жи-
животных тканей являются очень мягкими, перед изготовлением
срезов их прежде всего нужно стабилизировать и упрочнить.
Как будет обсуждаться ниже, большинство из этих способов
препарирования может привести к серьезным потерям из тканей
растворимых субстанций и должно использоваться с большой
осторожностью. Альтернативный путь — производить анализ
срезов, высушенных лиофильной сушкой или замороженных в
гидратированном состоянии.
12.1.4.6. Тонкие срезы
На тонких срезах толщиной менее 200 нм обычно обнаружи-
обнаруживается огромное количество морфологических деталей, и им по-
потенциально присуще самое высокое пространственное разре-
разрешение в режиме рентгеновского микроанализа. Однако за счет
их малой толщины количество анализируемого материала мо-
может уменьшиться до очень низкого уровня вследствие малости
микрообъема исследуемого среза. Тем не менее исследователь
сталкивается с теми же проблемами препарирования, которые
существуют при препарировании толстых срезов, . и единствен-
единственную заметную помощь дает использование тонких срезов мате-
материала, который подвергался лиофильной сушке или заморажи-
замораживанию замещением.
Преимущества и недостатки различных типов образцов
подытожены в недавно опубликованной статье по визуализации
объектов [402]. Визуализация объекта является важной осо-
особенностью рентгеновского микроанализа, поскольку зонд необ-
необходимо точно устанавливать на клетках и/или тканях.
12.1.5. Стратегия
Прежде чем предпринимать любую попытку препарирова-
препарирования образца, необходимо четко уяснить ответы на пять пунктов:
1) тип исследования, 2) степень сложности анализа, 3) тип обо-
оборудования, 4) тип визуализации образца и 5) природа объекта.
Например, нужен совершенно другой подход к препарированию
объекта для качественного анализа ковалентно связанного эле-
элемента в образце, представляющем собой биопсию печени, с по-
помощью растрового электронного микроскопа, работающего в ре-

274 Глава 12
жиме на отражение, со спектрометром с дисперсией по энергии
и для количественного анализа способных диффундировать ио-
ионов в тонком срезе корня растения с помощью рентгеновского
микроанализатора, работающего на просвет, с кристалл-диф-
кристалл-дифракционными спектрометрами. Следует сделать перечень этих
пяти параметров, и, уточнив условия проведения анализа, иссле-
исследователь должен решать, какие из методов препарирования об-
образца являются оптимальными.
12.1.6. Положения, которым нужно следовать
для достижения удовлетворительного препарирования
объекта
Существует ряд положений, которые должны выполняться
при применении методов препарирования для биологического
микроанализа. В работе [403] предложено пять таких положе-
положений:
1) Необходимо, сохранять адекватными нормальные струк-
структурные взаимосвязи объекта. Трудно установить пределы со-
сохранения морфологии, но хорошим требованием было бы дости-
достижение морфологического пространственного разрешения по ве-
величине на порядок лучше, чем ожидаемое пространственное
разрешение в режиме рентгеновского микроанализа.
2) Необходимо знать количество утраченного или приобре-
приобретенного образцом материала. Это может быть достигнуто при
выполнении объемного химического анализа на одной половине
идентичного объекта до препарирования. Хотя такой способ
дает лишь общую элементную концентрацию образца, он реаль-
реально показывает, были ли основные изменения результатом дан-
данной процедуры препарирования.
3) Необходимо знать химический состав утраченного или
приобретенного образцом материала. Важно знать не только,
произошли ли изменения концентрации элементов в образце, но
и являются ли эти изменения селективными. Элементы в биоло-
биологических образцах обычно размещаются в различных фрагмен-
фрагментах, каждый из которых имеет различный состав. Внутри любой
перегородки одного фрагмента элементы могут быть слабо или
сильно связаны, и процедура препарирования может селективно
воздействовать на концентрацию определенного элемента.
4) Необходимо знать количество перераспределенных и пе-
перемещенных внутри образца элементов. Несмотря на то что
данная методика препарирования может не изменять общую
концентрацию элементов в системе, она может вызвать сильное
перераспределение элементов внутри ткани. Искусственное дви-
движение материала в образце является самым сложным явлени-
явлением, которым надо управлять. Наблюдение необычайно высоких

Препарирование биологических образцов для РМА 275
концентраций элементов как в кристаллах, так и в осадках под-
подтверждает наличие перераспределения.
5) Элементы, используемые для препарирования образцов,,
не должны маскировать элементы, подлежащие анализу. Если
исследуются спектры характеристического рентгеновского излу-
излучения элементов, то возможно увидеть перекрывание линий их
К-, L- и М-излучения, в особенности в спектрах, полученных с
помощью рентгеновского спектрометра с дисперсией по энергии
с его плохим разрешением по энергии. Пока не приняты соот-
соответствующие меры L- или М-излучение одного элемента может
перекрываться и маскировать /(-излучение анализируемого эле-
элемента. В табл. 6.1 гл. 6 указывается тип перекрытий, который
может случиться для некоторых элементов, используемых при
препарировании объекта, и некоторых из наиболее легких эле-
элементов, представляющих интерес для биологии.
Во многих случаях нет необходимости подвергать образцы
сложному предварительному тестированию или процедурам пре-
препарирования, так как параллельные физиологические и биохи-
биохимические исследования покажут, вызывают ли процедуры пре-
препарирования изменения. В связи с тем что не существует другой
надежной аналитической процедуры для подтверждения точно-
точности микроанализа на этом уровне, независимую оценку точно-
точности анализа получить трудно.
12.2. МЕТОДЫ ПРЕПАРИРОВАНИЯ ПРИ ОБЫЧНОЙ
ТЕМПЕРАТУРЕ
12.2.1. Перед фиксацией
В общем задержка по времени при получении кусочка ткани
или клеток из экспериментального организма должна быть ми-
минимальной. Имеется достаточно сведений о морфологических
эффектах аноксии, стресса и посмертных изменений, чтобы
предположить, что, по-видимому, также изменяются локальные
концентрации элементов. Необходимо предпринимать также
меры предосторожности при удалении всех загрязняющих орга-
организм жидкостей, таких, как кровь, слизь, межклеточные жид-
жидкости, которые могут собираться в организме и привести к
возникновению ложных сигналов рентгеновского излучения.
Подробности необходимых процедур приведены в гл. 11 по пре-
препарированию образцов для растровой электронной микроско-
микроскопии.
12.2.2. Фиксация
Вопросом первостепенной важности является выбор фиксато-
фиксатора, который не вызывает потерь, перераспределения или маски-
маскирования анализируемых элементов. Это является одним из пер-

276
Глава 12
г;
А В
Заливка эпоном
D E F G
Выс>^шеннь1й заморамива -
нием и лиосрильной сушкой
Рис. 12.3. Электронные микрофотографии и гистограммы отношений
пик/фон, в которых сравнивается количество серы, сохранившейся в клетках
рогового слоя человека, подвергавшихся различным экспериментальным про-
процедурам препарирования [406].
иа а—д маркер соответствует 5 мкм; на е, ж маркер соответствует 2 мкм. Обозначения
А — G на гистограммах соответствуют обозначениям а—ж на микрофотографиях.
а — фиксация в осмии, заливка эпоном; б — фиксация в глутаральдегиде, заливка эпоиом;
в — фиксация в глутаральдегиде и осмии, заливка эпоном; г — фиксация в осмии, лио-
фильная сушка; 3 — фиксация в глутаральдегиде, лиофильная сушка; е — фиксация в
глутаральдегиде и осмии, лиофильиая сушка; ж — без фиксации, лиофильная сушка.
Отметим, что лучшей сохранности элементов соответствует худшая сохранность морфо-
морфологии.
вых пунктов, которые должны проверяться с помощью, напри-
например, спектрометрии в пламени на фиксирующих жидкостях до
и после фиксации. Было проведено очень мало систематических
исследований для изучения влияния препарирования образца
на концентрацию элементов тканей. В работе [404] исследова-
исследовались воздействия ряда разнообразных фиксаторов на концент-
концентрацию ионов мышцы лягушки и ткани крысы [405]. Подобные
исследования на коже человека были проведены в работе [406],
основные результаты которой показаны на рис. 12.3. Эти иссле-
исследования являются убедительной демонстрацией того, что все
методы фиксации оказывают некоторое воздействие на исход-

Препарирование биологических образцов для РМА 277
ные распределения элементов в тканях. В то время как крио-
криобиологические методики незначительно влияют на концентра-
концентрацию электролита ткани, влажные химические методы оказыва-
оказывают весьма пагубное влияние. Все фиксаторы оказывают небла-
неблагоприятное воздействие на диффундирующие несвязанные
элементы и могут влиять различным образом на связанные эле-
элементы. В недавно опубликованной обзорной статье [184] содер-
содержится краткий перечень потерь элементов, обнаруженных при
различных способах фиксации, выполненных на широком набо-
наборе типов ткани. Вырисовывается довольно мрачная картина,
достаточная, чтобы разочароваться в использовании фиксато-
фиксаторов, особенно когда подлежат анализу диффундирующие эле-
элементы. Было показано, что обычно используемые фиксаторы,
такие, как органические альдегиды, вызывают значительную по-
потерю растворимого материала из клеток. На рис. 12.4, взятом
из работы [407], продемонстрировано, как фиксаторы и краси-
красители могут изменять аналитическую информацию от образцов.
Быстрая фиксация приводит к огромным ионным изменениям,
а получение срезов с вытеканием жидкости приводит к экстрак-
экстракции элементов. Если в качестве фиксаторов используются аль-
альдегиды, то важно проверить, не накопились ли они в углекис-
углекислом барии. Вероятно, лучше использовать свежий дистиллиро-
дистиллированный материал. Потеря растворимых элементов усиливается
в процессе последующей фиксации в осмии и перманганате, ко-
которые вносят дополнительные сложности, маскируя анализируе-
анализируемые элементы. Если совершенно ясно, что для некоторого рода
ткани необходима стабилизация и если должны быть использо-
использованы фиксаторы, то время фиксации должно быть как можно
короче, и предпочтительнее использовать фиксаторы в газовой
фазе, а не в более обычном жидком состоянии, чтобы умень-
уменьшить перераспределение растворимых элементов. Использова-
Использовались пары четырехокиси «осмия и формальдегида, но глубина
проникновения фиксатора ограничена, и лишь маленькие образ-
образцы можно успешно обрабатывать таким образом. В работе
[396] обработка в парах осмия применялась к блокам ткани,
высушенным в замороженном состоянии, а в работе [199] обра-
обрабатывались срезы, высушенные в замороженном состоянии. Ос-
Основное преимущество обработки осмием заключается в том, что
он улучшает контраст ткани, но ткань должна использоваться
лишь в том случае, если наличие осмия не влияет на анализ.
Органические буферы, такие, как бикарбонат, пиперазин-
Ы,Ы/-бис-2-этанолсульфокислота, ацетат веронала и коллидин,
являются более предпочтительными по сравнению с большинст-
большинством обычно используемых неорганических буферов, так как
всегда имеется опасность, что последние могут вносить нежела-
нежелательные элементы в клетки (например, какодилатный буфер

П ре парирование биологических образцов для РМА
279
* 4 * » A. * «^
1 Mi-.
Vq S = SO KCS
Рис. 12.4. Изменения элементного состава тканей за счет различий в мето-
методах препарирования [407].
Продольные срезы волокон скелетной мышцы. Митохондрия (т), толстые и тонкие мио-
филаменты, заключенные в А(А). /(/) и 2-полосах (Z), части саркоплазматического ре-
тикулума (стрелки н tc означают терминальные цистерны). Все криосрезы были неокра-
неокрашены. Спектры получены при анализе срезов. Анализ проводился в середине Л-полосы.
Диаметр пятиа пучка составлял 0,5 мкм. Под спектрами стрелки указывают ожидаемые
положения линий, возникающих при излучении определенного элемента.
а — стандартное влажное химическое препарирование. Реактивы, использованные для
фиксации и окрашивания, препятствовали идентификации в действительности имеющих-
имеющихся ионов из-за перекрытия энергетических пиков. Здесь появился необъяснимый пик алю-
алюминия; б — срезы, нарезанные с использованием раствора 50%-ного DMSO в дистиллиро-
дистиллированной воде в качестве переходной жидкости; волокно стабилизировано в глутаральде-
гиде E мии) и заморожено. После резки срез промывался в дистиллированной воде и
высушивался иа воздухе. Обнаружено лишь несколько элементов; в — нефиксированное,
замороженное и разрезанное во влажном состоянии E0%-ного диметилсульфоксида в ди-
дистиллированной воде) мышечное волокно. Срез затем промывался в дистиллированной
воде и высушивался ча воздухе. Присутствует пик калия, а также относительно интен-
интенсивный пик хлора. Часто появлялся пик серы, хотя здесь его иет; г — обработанное
глицерином мышечное волокно C0%-ного глицерина в дистиллированной воде), заморо-
замороженное без фиксации и разрезанное в высушенном виде. Срез подвергался лиофильной
сушке. Признаков повреждений из-за образования кристаллов льда в процессе замора-
замораживания не наблюдалось. Обнаружено лишь несколько элементов; д — разрезанный в вы-
высушенном состоянии и высушенный лиофильной сушкой срез стабилизированного глу-
таральдегидом и замороженного волокна. Интенсивные пики натрия и хлора. Эти эле-
элементы, вероятно, возникли из используемых растворов; е — нефиксированное, заморожен-
замороженное и разрезанное в высушенном состоянии мышечное волокно. Срез подвергался лио-
лиофильной сушке и хранился высушенным до проведения исследования. Видно много пи-
пиков. Доминирует пик калия. Наличие пика кальция могло быть из-за высокой концент-
концентрации этого элемента в компонентах саркоплазматического ретнкулума. присутствующих
в анализируемой колонке.

280
Глава 12
содержит мышьяк). Однако интересные и безусловно полезные
вариации по этому вопросу были недавно опубликованы в [408],
где смогли идентифицировать состояние с высоким сродством
кальция в Paramecium фиксацией клеток при наличии высоких
концентраций кальция. Важно также проверить, что рН жид-
жидкостей, используемых при препарировании, не приводит к изме-
изменениям растворимости элементов. Исследователям, интересую-
интересующимся «влажными химическими» методами препарирования для
микроанализа, мы рекомендуем прочитать недавно опубликован-
опубликованную обзорную статью [409].
В качестве альтернативы химической фиксации существует
горячая фиксация. Клетки или тонкие срезы ткани помещаются
на подходящую подложку, освобождаются от избыточной жид-
жидкости, а затем помещаются в пламя газовой горелки. Такая
драконовская мера хотя и является разрушающей и вызывает
морфологическое изменение и химическое перераспределение,
тем не менее использовалась для успешного препарирования об-
образцов для рентгеновского микроанализа.
12.2.3. Гистохимические методы
Специалистам, работающим в области оптической и элект-
электронной микроскопии, было давно известно, что можно локали-
локализовать области со специфической физиологической и/или мета-
метаболической активностью, используя строго определенные краси-
красители и гистохимические агенты. Та же самая идея может в
Рис. 12.5. Пример применения модифицированного метода Гомори.
о — полученная в ПЭМ микрофотография среза клеток пленарного ацидофича подвергну
того тесту Гомори на свинец для кислой фосфатазы. Виден осадок свинца х'|5 000 Мар-
Маркер соответствует | мкм; б — рентгеновские спектры видимых иа рис а окрашенных
ядер, полученных с помощью спектрометра с дисперсией по энергии и демонстрирующие
наличие пика Л «для фосфора. Видны пики Ма La и L/з для свинца и Л-пики меди
[410].

Препарирование биологических образцов для РМА
281
принципе быть использована в рентгеновском микроанализе. На
рис. 12.5, взятом из работы ([410], показаны плотные для элек-
электронов осадки, полученные с помощью модифицированного ме-
метода Гомори для кислой фосфатазы; рентгеновские спектры
подтверждают наличие свинца. В отличие от электронной мик-
микроскопии вовсе не обязательно, чтобы конечный продукт был
тяжелым металлом, если он существенно отличается от объема
матрицы образца. Например, голубой алциан для муцина со-
содержит медь, серу и хлор, которые легко определяются с по-
помощью рентгеновского микроанализа. В работе [410] была ло-
локализована активность фосфатазы с помощью азокрасителя, ко-
который имеет три ковалентно связанных «меченых» атома
хлора. В работах [411—413] дается обзор применения гистохи-
гистохимических методов в микроанализе. В недавно опубликованной
работе [414] приводится обширный обзор гистохимических ана-
аналитических методов, которые могут быть применены для расти-
растительного материала. Подобный обзор, имеющий дело в основ-
основном с тканью животных, был опубликован в работе [415].
12.2.4. Методы осаждения
Многие исследователи пытались осаждать диффундирующие
элементы in situ до того, как произойдет фиксация. Этот метод
основан на реакции иона с соединением тяжелого металла для
создания плотного для электронов осадка, который можно либо
наблюдать в просвечивающем электронном микроскопе, либо
обнаруживать в рентгеновском микроанализаторе. В табл. 12.1
Таблица 12.1. Реакция осаждения для in situ демонстрации неорганических
ионов и АТФ-азы в растительных и животных тканях
Животные образцы
Растительные образцы
Ион или АТФ-азы
Осаждающий
реактив
Ион или АТФ-азы
Осаждающий
реактив
С1-
Ag-ацетат
Ag-лактат
К-пироантимонат
К-пироантимонат
или С1~
Na+
Na+, Mg2+, Ca2+ r
Na+, K+, Mg2+, К-пироантимонат
Cas+, Mn2+
Ca2+ К-пироантимонат
К-пироантимонат
или оксалат
К-оксалат
РО4- РЬ-ацетат
АТФ-азы Pb(NO3J
или Са2+
Na+
Na+, Mg2+, Ca2+
Na+, Ca2+
Са2+
ро4-
АТФ-азы
Ag-ацетат или
Ag-лактат
К-пироантимонат
К-пироантимоиат
Бензамид
NHi-оксалат
РЬ-ацетат
Pb(NO3J

282
Глава 12
¦ .¦!
Л
Рис. 12.6. Локализация натрия и кальция в нервной ткани методом осаж-
осаждения с использованием пироантимоната осмия [417].
а — изображение неокрашенного перехвата Ранье, полученное в ПЭМ. на котором видно-
распределение пироантимоначных осадков. Большие зерно встречаются в аксоплазме (бе-
(белая стрелка), а зерна меньших размеров ограничены цитоплазмой паранодальчык нетель
('.;ерчые стрелки). Маркер соответствует 0,5 мкм; 6 — изображение паранодальной о5ла"ти
перехвата Ранье, полученное в ПЭМ, на котором иидны пироантимонатные осадки Осад-
Осадки в виде маленьких зерен видны в цитоплазме паранодальных петель (белые С1релки),
а бочьшие зерна ос.иков находятся внутри аксоплазмы (черные стрелки). Маркер соот-
соответствует В.о мкч. Рентгеновский микроанализ, проведенный с помощью крисгалл-ди-
фракционных спектрометров показал, что гранулярные осадки содержат как Na+, так и
Са++.
приведены некоторые из осаждающих реагентов, которые ис-
использовались с биологической тканью. Другими словами, если
ион сам является тяжелым элементом, то в качестве осаждаю-
осаждающих агентов могут использоваться органические реагенты. Тот
же принцип может быть положен для внутриклеточной локали-
локализации некоторых энзимов, продукты реакции которых являются
неорганическими ионами.
В работах [416, 414] был дан критический обзор методов
осаждения для диффундирующих веществ (табл. 12.1), а на
рис. 12.6, взятом из работы [417], приводятся способы приме-
применения этого метода для биологических тканей. Важно, что спе-
специфичность реакции адекватно проверяется. Так, метод осаж-
осаждения органической соли серебра для хлорида будет также да-
давать осадок с бромидом, а широко используемая пироантимо-
натная методика для натрия приведет также к появлению осад-
осадка с калием, магнием, кальцием и марганцем. В недавно опуб-
опубликованной работе [418] приводится обзор пироантимонатных
методов осаждения и представлен ряд критериев, которые по-
полезно применять, когда этот метод используется для анализа

Препарирование биологических образцов для РМА 283
катионов. Важно знать величину потерь из образца в процессе
препарирования объекта. Авторы работы [419] сумели пока-
показать, что после предварительной нагрузки ткани изотопом
36С1 утрачивается лишь около 4% хлора в использующем се-
серебро методе осаждения хлора. Необходимо учитывать локали-
локализацию артефактов, происходящую до применения метода осаж-
осаждения, в процессе метода или после него. В работе [405] про-
продемонстрировано, что осажденный с помощью пироантимоната
кальций исчезает из ткани в процессе обезвоживания спиртом.
Авторы работы i[420] сумели показать методом рентгеновского
микроанализа, что осажденные серебром осадки хлора были
¦относительно стойкими при последующей фиксации в осмии.
12.2.5. Обезвоживание
Так как образец в конечном итоге исследуется в микроскопе
в вакууме, вода либо должна быть удалена, либо давление ее
паров должно быть уменьшено понижением температуры образ-
образца. Нет сомнения в том, что химическое обезвоживание приво-
приводит к потере легко диффундирующих веществ из клеток и тка-
тканей, вызванной химической фиксацией. Хотя критические срав-
сравнительные исследования не производились, оказалось, что не
существует большой разницы в воздействии этанола, метанола
или ацетона в качестве обезвоживающих реактивов. Однако в
работе [421] было установлено, что в растительном материале,
обезвоженном диметоксипропаном, обнаружена существенно
лучшая сохранность ионов (Na+, K+, С1~) по сравнению с обез-
обезвоживанием в ацетоне. Можно обойтись без классических про-
процедур обезвоживания, используя инертные процедуры обезво-
обезвоживания, предложенные в [422], водно-растворимые смолы, ме-
метод заливки в глутаральдегиде-мочевине [423] или пропускание
материала, прошедшего фиксацию в глутаральдегиде, через
глутаральдегид с возрастающими концентрациями вплоть до
50%, после чего ткань переносится прямо в эпон-812 [404].
Другая процедура [424] заключается в инфильтрации фиксиро-
фиксированных образцов раствором поливинилового спирта
(MW 14 000) с возрастающими концентрациями вплоть до ко-
конечной 20%-ной концентрации. Вода затем удаляется путем
диализа, а образовавшийся твердый гель связан поперечными
связями с глутаральдегидом. Однако оказывается, что эти про-
процедуры незначительно снижают потерю растворимых материа-
материалов из исследуемых образцов. Простая сушка образца на воз-
воздухе также вызывает перераспределение элементов. Таким же
образом процедура сушки в критической точке, которая обыч-
обычно проводится в конце фиксации и обезвоживания, по всей ви-
видимости, приведет к слабому различию в концентрации раство-
растворимых веществ, которые давно уже были удалены в процессе

284 Глава 12
обезвоживания. Сушка в критической точке может оказывать
существенное влияние на связанные элементы, особенно когда
в качестве переходной жидкости используются фтористые угле-
роды. Имеется, к сожалению, мало результатов, позволяющих
с определенностью судить о влиянии метода сушки в критичес-
критической точке на эффект растворимости. Процедура сушки испаре-
испарением растворителя, описанная в [425], может быть также по-
полезной при препарировании образцов, если можно было бы по-
показать, что во время этой обработки происходит минимальная
экстракция элементов. В фиксированных и химически обезво-
обезвоженных образцах проводится замещение фреоном-113, а затем
они быстро помещаются в вакуум при давлении 1—10 Па. На-
Начальная высокая скорость испарения фреоиа-113 охлаждает
оставшийся фреон, который затвердевает и сублимируется
с меньшей скоростью. Полное отсутствие воды снимает пробле-
проблему повреждения кристаллическим льдом, и получаются столь
же хорошие морфологические результаты, как и при сушке в
критической точке.
12.2.6. Заливка
Большинство фиксированных и обезвоженных биологических
тканей необходимо заливать либо смолой, либо парафином, что-
чтобы иметь возможность изготовить срезы. Смола, однако, суще-
существенно разбавляет содержимое клеток, увеличивая общую мас-
массу образца. Этот этап в процедуре препарирования можно опу-
опустить, если должны исследоваться очень тонкие образцы или
хорошие суспензии либо если образцы должны исследоваться
в отраженных фотонах или электронах.
Смолы могут удалять и перераспределять элементы, и нет
сомнения в том, что процедура заливки может внести элементы
в анализируемые материалы. Некоторые из эпоксидных смол
могут содержать относительно большое количество серы, в то
время как смолы на основе эпихлоргидрина содержат малое
количество хлора. Низкий уровень хлора @,73%) в смоле
Спурра с низкой вязкостью все еще слишком велик, когда
должны проводиться критические исследования хлора. Жела-
Желательно проводить элементный анализ всех заливочных химика-
химикатов перед их употреблением для препарирования образца. Ме-
такрилатные смолы теоретически свободны от минеральных
элементов, но вызывают сильную усадку при полимеризации
и нестабильны под электронным пучком.
12.2.7. Получение срезов и изломов
Трудно представить, как изготовление срезов и изломов
могло бы влиять на аналитические результаты, но необходимо
рассмотреть ряд эффектов. Режущие кромки ножей не остают-

Препарирование биологических образцов для РМА 285
ся все время острыми и постепенно изнашиваются при взаимо-
взаимодействии с образцом. Следует учитывать, куда исчез материал
с острия ножа в процессе изготовления среза. Стекло обычно
содержит бор, кремний, натрий и калий вместе со следами дру-
других элементов. Алмазные ножи состоят из чистого углерода, и
мало вероятно, что они внесут существенное загрязнение в объ-
объект. Стальные ножи часто используются для нарезки срезов и,
вполне возможно, загрязняют образцы. Очень важно тщатель-
тщательно после заточки очищать стальные ножи для того, чтобы уда-
удалить все хонинговые соединения. Это лучше всего достигается
путем использования мягкой тряпочки и органической жидко-
жидкости, например ацетона. Необходимо обратить внимание на чи-
чистоту промывочной жидкости, если она использовалась, и на
обработку среза после нарезки. Например, если необходимо
выровнять срезы из смолы, лучше, вероятно, избегать паров
хлороформа, которые могут легко поглощаться срезами из смо-
смолы, что приводит к большому загрязнению хлором.
12.2.8. Подложки образца
В идеальном случае подложка для образца должна быть
хорошим проводником и быть сделана из материала, который
не давал бы вклада в рентгеновский сигнал, идущий с образ-
образца. Для массивных образцов или срезов, изучаемых в режиме
вторичных электронов, образцы обычно помещают на хорошо
отполированные сверхчистые углеродные, алюминиевые или бе-
риллиевые диски. Подходит также для этого легированный бо-
бором монокристаллический кремний. Эти материалы являются
достаточно хорошими проводниками и дают только малый
вклад в рентгеновский фон. Материалы, которые нужно иссле-
исследовать с помощью световой оптики, должны монтироваться на
кварцевых или прозрачных пластиковых пленках, которые для
создания проводимости дол!жны покрываться тончайшим слоем
(~5—7 нм) алюминия. Для материалов в виде среза пригоден
целый ряд подложек, в основном на основе стандартной сетки
C,08 мм) для просвечивающего электронного микроскопа.
Можно применять сетки, изготовленные из меди, титана, нике-
никеля, алюминия, бериллия, золота, углерода и нейлона. Они мо-
могут использоваться с пластиковой поддерживающей пленкой и
без нее. Имеется тенденция использовать сетки, изготовленные
из материалов с низким атомным номером, таких, как алюми-
алюминий, углерод или бериллий, так как они дают значительно мень-
меньший вклад в рентгеновский фон. В качестве подложек для об-
образца использовались нейлоновые пленки с алюминиевым или
углеродным покрытием [300, 426], преимущество которых со-
состоит в том, что они являются более прочными и прозрачными

286 Глава 12
для электронов, хотя и вносят вклад в фон. Массивные образ-
образцы должны закрепляться на подложке для образца проводя-
проводящей пастой высокой чистоты, такой, как коллоидный углерод,
и важно проверять, чтобы рентгеновское излучение клеящего
вещества не было бы помехой при исследованиях.
12.2.9. Окрашивание образца
Предупреждения относительно использования фиксаторов в
равной степени применимы к окрашиванию. В связи с опас-
опасностью экстракции содержащихся растворимых веществ и ве-
вероятности внесения тяжелых элементов, рентгеновские пики ко-
которых могут маскироваться или налагаться на излучение инте-
интересуемых элементов, по-видимому, лучше всего избегать окра-
окрашивания. Если контраст изображения образца неприемлемо
мал, тогда надо идти на некоторый компромисс, объект должен
исследоваться либо в просвечивающем растровом электронном
микроскопе, который дает наиболее высококонтрастные изобра-
изображения, либо в режиме вторичной электронной эмиссии, кото-
который дает удивительно хорошую информацию с тонких срезов.
12.2.10. Нанесение покрытия на образец
Обычно перед исследованием принято покрывать образцы
тонким проводящим слоем, чтобы минимизировать нежелатель-
нежелательный нагрев и предотвратить возникновение локального заряда.
Однако при условии, что образец находится в хорошем кон-
контакте с подложкой, без процедуры покрытия в основном обхо-
обходятся тогда, когда образец должен анализироваться рентгенов-
рентгеновским спектрометром с дисперсией по энергии. Более высокие
токи образцов и более продолжительные времена счета, обычно
необходимые для анализа с кристалл-дифракционными спектро-
спектрометрами, могут вызвать необходимость нанесения покрытия на
образец до того, как он будет помещен в микроанализатор.
Процедуры нанесения тонких слоев покрытий на образцы рас-
рассматривались в гл. 10 и не будут здесь указаны.
Другими процедурами препарирования образцов для РЭМ,
чем нанесение покрытий, которое обсуждалось в гл. 11, обычно
не пользуются для анализируемых тканей. Работа при низком
ускоряющем напряжении с целью уменьшения эффекта заряд-
зарядки не находит применения в практике рентгеновского микроана-
микроанализа, так как требуется выполнять условие, чтобы ускоряющее
напряжение было примерно в три раза больше, чем критичес-
критический потенциал возбуждения анализируемого элемента. Боль-
Большинство приборов, в которых анализируются срезы, работает
при 20—50 кВ. Инфильтрация образца такими химикатами, как

Препарирование биологических образцов для РМА 287
тиокарбазид или дубильная кислота, которые обладают силь-
сильным сродством с металлическими носителями заряда, такими,
как осмий, продолжительная фиксация в четырехокиси осмия
или в уранилацетате, а также заключительное окрашивание со-
солями серебра, золота или свинца, по всей вероятности, по
указанным ранее причинам не пригодны для микроаналитичес-
микроаналитических методов препарирования.
12.3. СПОСОБЫ ПРЕПАРИРОВАНИЯ ПРИ НИЗКИХ
ТЕМПЕРАТУРАХ
Многие, хотя и не все, проблемы, связанные со «стандарт-
«стандартным» препарированием образца, практически устраняются при
выполнении процедур с использованием низкотемпературных
методик. Полезный обзор низкотемпературных методик можно
найти в сборнике статей Первой международной конференции
по микроскопии при низких температурах для биологов, кото-
который недавно был издан в виде книги ;[333].
Криобиологические методики приобретают возрастающее
значение в рентгеновских аналитических исследованиях биоло-
биологических объектов. Они, вероятно, являются единственным спо-
способом, когда можно надеяться проанализировать растворен-
растворенные ионы и элементы. Криофиксация является целиком физи-
физическим процессом и создает значительное механическое напря-
напряжение на иную мягкую биологическую ткань. Превращение во-
воды из жидкого в твердое состояние останавливает физиологи-
физиологические процессы и сильно уменьшает движение растворенных
веществ. Вероятно, это единственная процедура, в результате
которой биологическая ткань сохраняется в почти естественном
состоянии. Дополнительные преимущества, которые имеют мес-
место при работе с образцами при низкой температуре, заключают-
заключаются в заметном уменьшении скорости загрязнений и уменьшении
теплового повреждения образца под электронным пучком.
В работе [277] сделан обзор некоторых низкотемпературных
методик, используемых в растровой электронной микроскопии,,
многие из которых пригодны для рентгеновского микроанализа.
Необходимо также сделать ссылки на обзоры [427, 201] и кни-
книги [387, 320, 388, 205], каждая из которых содержит много ста-
статей, описывающих низкотемпературные методики. Теперь крио-
криобиологические процедуры будут рассмотрены в порядке их
применения в процессе препарирования.
12.3.1. Предварительная обработка образца
Фиксация. Вероятно, нецелесообразно производить фиксацию
в любом виде, так как теперь совершенно ясно, что даже, по-
видимому, самая осторожная фиксация может вызвать огром-

288
Глава 12
Таблица 12.2. Относительные массовые фракции элементов, полученные
срезах, замороженных в гидратированном состоянии
и вырезанных из различных областей вдоль корня
Lemna mino1'1
на
Морфологическая
область корня
Неупорядо-
Неупорядоченная ме-
меристема
корня
Меристема
корня
Меристема
корня
Корень, про
шедший
дифферен-
цировку
50-60
60—80
120-150
Расстояние от кончика, 40—50
мкм
Фосфор 0,93±0,132> 1,46±0,06 3,66±0,15 1,16+0,12
Сера
Хлор
Калий
Кальций
A2) (9) A7) A2)
1,63+0,28 0,25±0,02 0,59±0,03 0,44+0,11
A2) (9) A7) A2)
1,60±0,23 0,21±0,02 0,45±0,03 1,31±0,10
A3) (9) A7) A2)
3,95±0,66 2,06±0,06 5,71±0,25 8,49±0,41
A3) (9) A7) A2)
0,34±0,05 0,06+0,01 0,23+0,04 0,37+0,09
A3) (9) A7) A2)
') Анализ проводился на клетках кольца луба, подобных приведенным на рис. 12.7,5
и е. Изменения концентраций элементов могут быть связаны с изменениями при диф-
ференцировке клеток лубяиой паренхимы.
2) ± означает среднюю квадратичную ошибку. Анализ в каждой области проводил-
проводился на двух или трех срезах.
ные изменения проницаемости мембраны. Если необходимо ис-
использовать фиксацию для сохранения морфологии, то целесооб-
целесообразно параллельно проводить исследования, в которых одна по-
половина образца подготавливается для изучения деталей морфо-
морфологии, а другая половина —для анализа.
Инкапсуляция. Если из образца будут изготавливаться сре-
срезы или изломы, то может оказаться необходимой инкапсуляция
в инертном веществе, растворимом в физиологически совмести-
совместимой жидкости. Инкапсуляция накладывает дополнительные ме-
механические напряжения на образец при замораживании. Эта
процедура особенно важна для небольших мягких биологичес-
биологических образцов и для растительного материала с его толстыми
целлюлозными стенками. Типы материалов, которые могут
быть использованы, включают агар, сыворотку бычьего альбу-
альбумина, декстран, поливинилпирролидон, оксиэтилированный
крахмал в концентрации 10—30%. Наиболее важной является
проверка того, какое физиологическое воздействие эти вещества
могут оказать на функциональную активность исследуемой
ткани.
Криозащита. Фактически невозможно заморозить любой, да-
даже самый маленький, кусочек биологической ткани без повреж-
повреждения кристаллом льда в той или иной форме. Такое поврежде-

. •¦'•...,.••
Рис. 12.7. Замороженные в гидратированном состоянии и высушенные ме-
методом лиофилыюй сушки срезы ткани корня Lemna, залитого полимерными
криопротектантами, нарезанные при температуре 200 К и исследованные при
lid К на столике с охлаждением растрового электронного микроскопа.
™ б ~ Сре1Ы ЛИ°ФИЛЬНОЙ сушки, залитые в ПВП. Маркер соответствует 20 мкм- в г~
срезы лиофильной сушки, залитые в HES. Маркер соответствует 100 мкм д е-срезы
20МмкмЖ(аГиТо мкм'™аТИР°ВаНН0М С0СТ0ЯНИИ' залитые в HES. Маркер' соответствует

230 Глава 12
ние может быть существенно уменьшено при замещении крио-
протектантом в образце перед замораживанием. Исследования
показали, что обычно используемые проникающие криопротек-
танты, глицерин и диметилсульфоксид хотя и обеспечивают хо-
хорошую структурную сохранность, но приводят к огромному фи-
физиологическому повреждению клеток, и их не следует использо-
использовать при микроаналитических исследованиях. Непроникающие
криопротектанты с высоким молекулярным весом, такие, как по-
ливинилпирролидон (ПВП) и оксиэтилированный крахмал
(HES), могут обеспечить хорошую сохранность морфологии, в
тоже время приводя к минимальным возмущениям функцио-
функциональной физиологии ткани. В ряде статей [428—433, 295] пока-
показано, что криопротектанты с высоким молекулярным весом,
по всей видимости, могут безопасно использоваться в сочетании
с рентгеновским микроанализом тканей. Это заключение под-
подтверждается в работе [434], в которой продемонстрировано,
что растворы ПВП обеспечивают эффективную криозащиту без
ухудшения нормальных электрофизиологических функций дви-
двигательной нейронной ткани лягушки. В недавно опубликованном
исследовании [435] ткани крысы показано, что использование
таких высокомолекулярных криопротектантов является практи-
практическим путем препарирования материала для рентгеновского
микроанализа диффундирующих элементов. На рис. 12.7 пока-
показано морфологическое изображение, а в табл. 12.2 содержится
соответствующая аналитическая информация, которая была по-
получена на корнях Lemna, инкапсулированных в ПВП и HES.
Оба полимера значительно уменьшают в клетках повреждение
за счет кристаллов льда, а также улучшают нарезку и излом
инкапсулированных тканей. Очевидно, что введение в образец
искусственных центров кристаллизации может уменьшить пов-
повреждение кристаллами льда. Эти вещества, например хлоро-
хлороформ, являются весьма токсичными для клеток и не должны
без учета этого обстоятельства применяться в исследованиях,
включая рентгеновский микроанализ.
12.3.2. Способы замораживания
Различные способы замораживания биологических материа-
материалов содержатся в обзоре i[436]. В работе [296] содержатся по-
полезные физико-химические основы способов замораживания
биологических систем. Важный момент всех этих методов со-
состоит в том, что образец должен быть охлажден так быстро,
как это только возможно, хотя все еще продолжаются большие
споры относительно того, как наилучшим образом можно до-
достичь этого быстрого охлаждения.
Существуют четыре основных способа, с помощью которых
образцы могут быть быстро охлаждены:

Препарирование биологических образцов для РМА
291
Отверстие для
штифта -^
Рис. 12 8. Механическое устройство Н8правпяК1щая
: шайба
Положение
отверстия для
_.——штифта в
вытянутом
положении
Верхняя
б
ввода объекта для быстрого замора-
замораживания.
Стержень держателя образца вставлен в
верхнюю трубку и удерживается в опреде-
определенном положении с помощью маленького
штифта. Устройство располагается над со-
сосудом Дьюара, в котором находится жид-
жидкая криогенная смесь, и крепежный штифт
аынимается. Получаемые скорости ввода
объекта в 3—4 раза больше чем те, кото-
которых можно достичь при ручной подаче.
Образец легко освобождается от стержня,
находясь уже в криогенной смеси.
1. Образец может быть быстро прижат к материалу с высо-
высокой теплопроводностью, находящемуся при низкой температуре.
Метод с использованием медного блока при температуре 4 К,
описанный в [437], является хорошим примером такого типа
скоростного охлаждения.
2. Струя жидкого пропана при температуре 83 К может
быстро поливать неподвижный образец [438].
3. Микрокапли клеток в виде суспензии могут распыляться
на холодную поверхность [439].
4. Образцы могут погружаться механически или вручную в
плавящийся криагент, такой, как один из фтористых углеродов,
азот, изопентан и т. д.
Первые три метода использовались с образцами малых раз-
размеров, обычно на одиночных клетках или очень маленьких ку-
кусочках ткани и, как следует из изображений, полученных трав-
травлением в замороженном состоянии, достигались очень высокие
скорости охлаждения. В большинстве случаев биологический
микроанализ при низких температурах выполнялся на кусочках
тканей больших размеров A—3 мм3), которые часто разреза-
разрезались или разламывались после быстрого охлаждения. При та-
таких обстоятельствах сомнительно, что первые три метода ох-

292 Глава 12
лаждения обладают преимуществом по сравнению с хорошо
разработанными методами погружения образца в жидкий кри-
агент. На рис. 12.8 показан пример устройства, которое было
использовано для быстрого введения маленьких образцов ткани
в жидкий криагент. Аналогичное устройство было описано
в i[440].
Образец должен быть как можно меньше при сохранении
физиологической активности, и как можно больше должно быть
удалено поверхностных жидкостей, по возможности без наруше-
нарушения баланса внутренних электролитов клеток. Несмотря на то
что в литературе имеется много данных по скоростям замора-
замораживания для различных охлаждающих смесей, следует помнить,
что эти скорости были измерены термопарами, размеры кото-
которых много меньше, чем образец, который мы пытаемся охла-
охладить. Хотя измеренные скорости охлаждения для охлаждающих
смесей являются полезным индикатором, лучшей мерой эффек-
эффективности данного охлаждающего режима является размер кри-
кристаллов льда, а следовательно, величина повреждений и пере-
перераспределения элементов в анализируемой части образца. Даже
при ступенчатом охлаждении любой образец диаметром более
250 мкм мог бы перейти в стекловидное состояние на внешней
поверхности, в то время как в центре его могли бы находиться
кристаллы льда.
В большинстве случаев при рентгеновском микроанализе
биологических объектов, вероятно, наиболее адекватным яв-
является охлаждение образцов в затвердевающем азоте F3 К),
монофтортрихлорметане (84 К) или 8%-ном метилциклогексане
в изопентане A00 К). Если проверить микроанализ на хлор
замороженных в гидратированном состоянии образцов, то, ве-
вероятно, лучше избегать фтористых углеродов, так как следы
галогена могут остаться в замороженном образце.
Как только ткань заморожена, важно, чтобы она хранилась
либо в жидком азоте, либо оставалась при как можно меньшей
температуре во избежание рекристаллизации льда. В чистой во-
воде рекристаллизация льда может происходить при 143 К, хотя
в биологических системах имеется очень мало доказательств
роста кристаллического льда вплоть до температур свыше
173 К- В недавно опубликованной статье [441] показано, что
отсутствие внутриклеточного замораживания во время охлаж-
охлаждения не является гарантией того, что вымораживание не прои-
произойдет во время нагревания. В тканях, медленно нагревавшихся
после замораживания до 77 К, внутриклеточный лед сначала
появлялся при 188 К, и считается, что это явление связано с
расстекловыванием, так как обширная мигрирующая рекристал-
рекристаллизация (и повреждение клетки) не происходила вплоть до
208 К.

Препарирование биологических образцов для РМА
293
Рис. 12.9. Замороженный срез печени мыши, на котором видны многочис-
многочисленные маленькие прозрачные для электронов кристаллы льда, наблюдаемые
в просвечивающем растровом режиме.
Можно различить основные фрагменты гепатоцитов (ядро и цитоплазму). Маркер соот-
соответствует 1 мкм.
Очень мало известно о том, может ли процесс заморажива-
замораживания влиять на результаты рентгеновского микроанализа. По ме-
мере охлаждения ткани фронт замораживания проходит через об-
образец, а кристаллы льда образуются из чистой воды за счет
клеточных жидкостей. При изучении замороженной в гидрати-
рованном состоянии ткани (см., например, рис. 12.9) обнаружи-
обнаруживаются кристаллы льда различных размеров. Несомненно, что
растворимые элементы устремляются к краям кристаллов льда
или прикрепляются к макромолекулам, которые в большом
количестве имеются в цитоплазме. Было бы неверным предпо-
предположить, что растворимые элементы не движутся, потому что сам
процесс замораживания должен вызвать некоторое перемеще-
перемещение. В процессе образования льда в клетке имеется определен-
определенный период времени, когда вместе присутствуют как жидкая, так
и твердая фазы воды. В это время концентрация электролитов
в жидкости будет значительно возрастать и вызывать изменения
электрохимических градиентов в мембранах, которые в свою
очередь могут привести к некоторому увеличению ионного
перераспределения. Этот процесс протекает более интенсивно

294 Глава 12
в клетках и тканях с большими занятыми водой полостями,
поэтому образование кристаллического льда может быть более
быстрым в межклеточном пространстве, чем внутри клеток, что
приводит к возрастанию концентрации электролита в межкле-
межклеточных фрагментах. Чем быстрее происходит замораживание,
тем меньше могут продвинуться электролиты от их исходного
положения в клетке (растворимые ионы чрезвычайно подвиж-
подвижны в клетке).
12.3.3. Движение элементов внутри данного клеточного
фрагмента
В настоящее время это может не иметь очень большого зна-
значения для рентгеновского микроанализа, так как большая
часть исследований проводится на локализованных элементах
внутри и вне естественных фрагментов клетки, как на ядре
(рис. 12.9), где, по-видимому, рост кристаллов льда ограничи-
ограничивается клеточными мембранами. Рост кристалла льда является
проблемой, когда исследования проводятся по определению рас-
распределения и концентрации элементов внутри клеточного фраг-
фрагмента. Является сомнительным, можно ли возложить большие
надежды на аналитические результаты, полученные из различ-
различных областей внутри данного клеточного фрагмента из заморо-
замороженных тканей, в которых легко видны кристаллы льда.
12.3.4. Процедуры после замораживания
Как только произошло замораживание ткани и клеточные
жидкости иммобилизированы, открывается много возможностей
как в отношении дальнейшей обработки ткани, так и в вопросе
ее непосредственного исследования и анализа.
12.3.5. Замороженный в гидратированном состоянии
и частично замороженный в гидратированном
состоянии материал
При условии, что микроскоп или рентгеновский микроанали-
микроанализатор оснащены приставкой для охлаждения, в нем можно ис-
исследовать и анализировать массивные образцы и срезы, в ко-
которых некоторая часть или вся вода находится в твердом со-
состоянии. Эти исследования связаны с большими техническими
трудностями, не последней из которых является уверенность в
том, что образец остается в замороженном из гидратированно-
го состояния в незагрязненном виде в течение всего процесса
препарирования и проведения исследований. Объем книги не
позволяет подробно обсудить эти методики, поэтому мы даем

Препарирование биологических образцов для РМА 295
ссылки на недавно опубликованные обзоры [277, 201], в кото-
которых приводятся как разумное объяснение рентгеновского мик-
микроанализа замороженных в гидратированном состоянии образ-
образцов, так и подробности некоторых разрабатываемых в настоя-
настоящее время методов.
12.3.6. Лиофильная сушка
Метод лиофильной сушки заключается в сублимации льда
из клеток и тканей в вакууме и, таким образом, является важ-
важным способом препарирования для микроанализа биологичес-
биологических объектов. Этот способ отнюдь не является идеальным, и
необходимо находить компромиссное решение проблем, связан-
связанных с неизбежным образованием и ростом кристаллов льда и с
преимуществом, заключающимся в том, что имеется возмож-
возможность избежать контакта ткани с любыми химикатами во время
процесса препарирования. Более того, это не самый лучший спо-
способ для всех образцов. Оптимальная сохранность получалась
только на образцах, в которых оставалась матрица ткани после
завершения процесса сушки. Метод лиофильной сушки в сочета-
сочетании с микроаналитическими исследованиями, вероятно, лучше
всего применим к средам материалов, клеточным монослоям,
изолированным клеткам и тонким жидким образцам. Высушен-
Высушенные в замороженном состоянии массивные материалы могут
быть заполнены воском или смолой, и заполимеризовавшийся
материал может нарезаться. Для анализа4 массивных объектов,
по-видимому, лучше не использовать высушенные в заморожен-
замороженном состоянии объекты из-за возрастания размера области гене-
генерации рентгеновского излучения [295]. Метод лиофильной суш-
сушки, вероятно, не является наилучшим методом препарирования
для анализа in situ межклеточных жидостей — такие исследова-
исследования более правильно проводить при замораживании из гидрати-
рованного состояния. Метод лиофильной сушки биологических
образцов для микроскопии и анализа является в общем эмпи-
эмпирическим процессом, и невозможно выработать правила, кото-
которые были бы применимы ко всем образцам, — для каждого об-
образца требуется своя собственная процедура. Такие процедуры,
вероятно, лучше описать после рассмотрения некоторых физи-
физико-химических аспектов замораживания и лиофильной сушки.
Поэтому предлагается сначала рассмотреть некоторые теорети-
теоретические аспекты лиофильной сушки и перейти к обсуждению
некоторых практических аспектов, применимых ко всем образ-
образцам. Несмотря на то что о методе лиофильной сушки было уже
много написано, недавно опубликованные статьи {442—445]
содержат строгую теоретическую основу метода.
Замороженный биологический образец состоит из смеси чис-
чистой воды (льда) и биологической матрицы, так называемой

Время испарения
на I г/см2
1,2 с
4,8 мин
72 мин
33,5 ч
20 дней
Давление пара
льда, Па
595
13
2,6
0,052
1,3-Ю-3
293 Глава 12
Таблица 12.3. Давление пара, скорость испарения и продолжительность
испарения кристаллического льда при различных температурах
Максимальная ско-
Температура, К рость испарения,
г/(см2-с)
273 8,3-Ю-2
233 3,4-Ю-3
213 2.3-10
193 8,3-Ю-6
173 5,0-10~7
замороженной эвтектической смеси. Фаза льда состоит главным
образом из несвязанной воды, которая является важной частью
всех биологических систем, в то время как биологическая мат-
матрица состоит из гетерополимеров, которые соединяют живую
материю с изменяемым количеством связанной воды. С по-
помощью стандартных методов лиофильной сушки можно легко
удалить несвязанную воду, но гораздо труднее удалить связан-
связанную воду, которая неизбежно составляет основу биологических
полимеров — белков, углеводов и нуклеиновых кислот.
Сублимация водяного пара из чистых кристаллов льда в
эвтектической смеси происходит тогда, когда парциальное дав-
давление водяного пара замороженной поверхности больше, чем
атмосферное давление у поверхности. Скорость сублимации
кристалла льда является лишь функцией температуры. В табл.
12.3 показано, как эта скорость изменяется в диапазоне темпе-
температур 173—273 К- Следует помнить, что во время лиофильной
сушки образец может хорошо охладиться при сопутствующем
уменьшении скорости сублимации льда из-за отвода скрытой
теплоты испарения. Однако обычно достаточно теплоты за счет
лучеиспускания и теплопроводности от оборудования и окружа-
окружающей среды, уравновешивающих эффекты охлаждения при суб-
сублимации воды.
Имеется целый ряд различных приборов для лиофильной
сушки. Приведем основные черты этих приборов:
1. Имеется камера сушки с охлаждаемым столиком. Он дол-
должен находиться при достаточно низкой температуре во избежа-
избежание рекристаллизации льда, если во время охлаждения происхо-
происходит остекловывание, и для предотвращения роста кристалла,
если при охлаждении образуются лишь маленькие кристаллы
льда. Камеру можно заполнять сухим инертным газом, напри-
например азотом. В некоторых случаях полезно иметь запорный кран
для пропускания жидкой смолы в камеру для инфильтрации вы-
высушиваемого образца.
2. Вакуумная система должна обеспечивать давление в ка-
камере от 10 до 100 мПа. При высоком вакууме средняя длина

Препарирование биологических образцов для РМА 297
свободного пробега молекул сублимирующей воды возрастает, а
теплопередача между тканью и поверхностью, на которой про-
происходит конденсация, достигает минимального значения. Обыч-
Обычно вакуум достигается с помощью диффузионного и механичес-
механического форвакуумного насосов, хотя, если лиофильная сушка
производится при более высоких температурах, диффузионный
насос может и не понадобиться. В вакуумпроводе должна
иметься либо химическая, либо охлаждаемая ловушка для во-
водяного пара.
3. В системе необходимо поддерживать высокий градиент
водяного пара на границе твердой фазы. Это лучше всего до-
достигается с помощью молекулярной дистилляции водяного пара
на охлаждаемой жидким азотом ловушке внутри камеры, по-
поскольку 1 см2 поверхности при 77 К осаждает водяной пар со
скоростью 15 л/с.
Как альтернативное решение можно использовать химичес-
химические осушители, такие, как фосфорный ангидрид, или один из
цеолитов, но они не столь эффективны, как ловушка, охлаждае-
охлаждаемая жидким азотом. Важно, чтобы охлаждаемая ловушка на-
находилась при температуре по крайней мере на 20° холоднее, чем
образец. Чем выше разность температур между высушиваемым
образцом и -конденсатором, тем более эффективно удержание
водяного пара от образца. Расстояние между высушиваемым
образцом и ловушкой для водяного пара должно быть меньше,
чем длина свободного пробега молекул остаточного водяного
пара. В табл. 12.4 приведена длина свободного пробега моле-
молекул воды в воздухе при различных давлениях.
Таблица 12.4. Средняя длина свободного
пробега молекул воды
в воздухе при разной сте-
степени вакуума
Средняя длина
Давление, Па свободного пробега
1
1
13
1
0
0
,3-
,3-
,3
,13
,013
ю-3
ю-4
500
5
50
500
5
50
мкм
мм
мм
мм
м
м
Скорость сушки зависит от многих факторов, в том числе
от температуры, размера и формы образца, относительных ко-
количеств связанной и свободной воды в нем и в некоторой степе-
степени от вакуума в камере. Самым большим препятствием для
быстрого высушивания является сам образец, и в частности со-

298 Гласа 12
противление высушиваемой оболочки. Ткани сохнут от наруж-
наружной оболочки внутрь образца, и молекулы воды, сублимирую-
сублимирующие внутри образца, перед попаданием в вакуум должны прохо-
проходить через высушенные участки, занятые кристаллами льда. Эта
сухая органическая оболочка утолщается по мере того, как
фронт сушки движется сквозь образец, и оказывает все большее
и большее сопротивление молекулам воды, которые испытывают
большое число соударений, прежде чем достигнут поверхности.
В табл. 12.3 приведены некоторые цифры для скоростей высу-
высушивания чистого кристаллического льда при различных темпе-
температурах. Эти скорости больше для остеклованного льда, но зна-
значительно меньше для льда, внедренного в биологическую
матрицу.
Температура, при которой должна происходить сушка, яв-
является весьма спорным вопросом. Если образец находится при
низкой температуре, то рекристаллизация уменьшается, но вре-
время сушки становится нереально долгим. Тем не менее малень-
маленькие образцы, такие, как одиночные клетки, первоначально вы-
высушивались замораживанием при 173 К, после чего в течение
трехнедельного периода температура постепенно повышалась.
Сушка при более высокой температуре повышает риск рекри-
рекристаллизации льда, но приводит к более быстрому удалению во-
воды, и это является более приемлемым с практической точки
зрения подходом. Лиофильная сушка при более высоких темпе-
температурах также повышет риск «разрушения» (коллапса) раство-
растворимой матрицы с сопутствующей потерей структурной целост-
целостности образца. Явление коллапса характерно для многих вод-
водных растворов, и наилучшим образом его можно избежать
лишь при лиофильной сушке маленьких образцов при низких
температурах [444]. Парадоксальной здесь является большая
вероятность коллапса при тонкой структуре замороженных об-
областей— той структуре, которая нам нужна, но которую редко
получают при быстром охлаждении биологической ткани.
В большинстве процессов лиофильной сушки замораживание
производится в интервале температур между 213 и 203 К, и при
таких условиях монослой клеток высыхает в течение несколь-
нескольких часов, в то время как высушивание кусочка ткани толщи-
толщиной в несколько миллиметров может занять несколько дней.
Хотя не существует единственного режима лиофильной сушки,
который можно было бы одинаково хорошо применять ко
всем образцам, имеется целый ряд практических рабочих сооб-
соображений, которые могут быть использованы для всех образцов.
Образцы должны быть как можно меньше и, насколько это
возможно, должно быть удалено как можно больше воды. Оба
этих требования накладывают жесткие ограничения на образец,
и часто бывает затруднительным удалить поверхностный слой

__ Препарирование биологических образцов для РМА 299
воды из водяных образцов, не вызвав необратимого поврежде-
повреждения образца. Если образец необходим лишь для морфологичес-
морфологических исследований, то полезно использовать предварительную
фиксацию в одном из органических альдегидов. Такая обработ-
обработка помогает связать и укрепить биологическую матрицу и
уменьшает количество повреждений под действием кристаллов
льда.
Проникающие криопротектанты не следует использовать,
потому что, хотя эти вещества уменьшают величину кристалли-
кристаллитов льда, они обладают гораздо меньшей летучестью, чем вода,
и их очень трудно удалять в процессе сушки. Непроникающие
криопротектанты, однако, являются самыми полезными, так как
легко отдают воду в процессе высушивания и образуют ста-
стабильную матрицу вокруг образца. Для образцов, подлежащих
анализу, не должны использоваться ни фиксация, ни проникаю-
проникающие криопротектанты. Непроникающие криопротектанты могут
использоваться при последующем микроанализе, поскольку, как
оказалось, они не вызывают существенного перераспределения
электролитов.
При быстром замораживании образцов важно быть уверен-
уверенным, что образец не плавает на поверхности жидкого охлажда-
охлаждающего вещества. Эта проблема обычно не возникает при изуче-
изучении образцов больших размеров, а маленькие образцы необхо-
необходимо помещать в перфорированные контейнеры или держать их
маленькими щипчиками и погружать под поверхность. Очень
мелкие частицы материи, например одиночные клетки, могут
быть либо разбрызганы на холодную поверхность, либо осажде-
осаждены на тонкие металлические фольги перед быстрым заморажи-
замораживанием. Будучи замороженными, образцы как можно быстрее
должны быть перенесены на платформу аппарата для лиофиль-
ной сушки. Это достигается наилучшим образом при помеще-
помещении образцов в мелкую металлическую тарелку глубиной около
5 мм, которая может быть заполнена жидким азотом. Тарелка
с находящимися в жидком азоте образцами быстро переносится
на предварительно охлажденный столик в камеру для лиофиль-
ной сушки, заполненную сухим азотом. Как только азот выки-
выкипит, камеру можно откачать до рабочего вакуума. Эта про-
процедура уменьшает образование кристаллов льда на поверхно-
поверхности образца, которые при некоторых обстоятельствах могут
скапливаться и вызывать перераспределение элементов внутри
образца. Несмотря на то что невозможно установить строгое и
определенное правило для определения времени и температуры
сушки, последняя должна производиться при как можно более
низкой температуре в соответствии с размером и формой образ*"
ца и возможностями экспериментальной системы. В процессе
сушки обычно постепенно повышают температуру образца. Это

300 Гласа 12
необходимо производить медленно, иначе вода, содержащаяся
в образце, может начать таять и вызвать перераспределение
электролитов. К концу процесса сушки температура образца
должна быть на несколько градусов выше температуры окру-
окружающей среды, в то время как в камере поддерживается все
еще высокий вакуум. Это будет гарантией того, что последние
остатки свободной воды сублимируют из образца. Как только
температура образца достигнет температуры окружающей сре-
среды, удобно начать нагрев конденсатора и/или удалить образец
с конденсатора. Самое важное быть уверенным в том, что ло-
ловушка для водяного пара в вакуумпроводе работает эффектив-
эффективно, чтобы иметь гарантию, что высвобожденная с конденсатора
вода попадет в ловушку и не сможет снова осесть на образце.
После завершения сушки установка должна быть заполнена
сухим инертным газом, а образец помещен в эксикатор. Боль-
Большинство высушенных в замороженном состоянии образцов яв-
являются очень гигроскопичными и быстро снова абсорбируют
воду из атмосферы.
Альтернативная процедура включает заливку высушенного
образца смолой или воском и нарезку из него тонких срезов
для аналитических исследований. Для консультаций относитель-
относительно последних достижений этого метода может быть рекомендо-
рекомендован обзор [446].
Общим способом, который, кажется, оказался пригодным
для большинства образцов, является сушка, начинающаяся при
температуре 190 К и давлении 1—2 нПа с последующим посте-
постепенным увеличением температуры до температуры окружающей
среды в течение 24—48-часового периода. Конденсатор поддер-
поддерживается при температуре 77 К- Некоторые аппараты для лио-
фильной сушки основаны на использовании элемента Пельтье
в качестве охлаждающего столика. В этом случае сушка начи-
начинается при температуре около 210 К и давлении 1 Па, и для
маленьких образцов сушка заканчивается за 24 ч. В аппаратах
для лиофильной сушки, работающих на эффекте Пельтье, в ка-
качестве наполнителя ловушки для сублимированной воды более
удобно использовать фосфорный ангидрид.
В работе [447] рекомендуется гораздо более быстрый метод
лиофильной сушки. Следует подчеркнуть, что эти процедуры
можно лишь использовать при морфологических исследованиях
поверхностных деталей образцов, и необходимо убеждаться, что
не происходит плавления внутреннего льда. Альтернативный
метод лиофильной сушки состоит в погружении тонких срезов
замороженного материала в медленный поток сухого холодного
азота при атмосферном давлении и температуре от 200 до
170 К-
Сушка обычно завершается в течение часа.

Препарирование биологических образцов для РМА 301
Лиофильная сушка может привести к ряду артефактов, и их
важно распознавать. Жалоба [448] на то, что материал может
«взрываться» в процессе сушки, является самым необычным
наблюдением, и причиной было то, что сушка выполнялась при
слишком высокой температуре. Из-за этого внутренний лед рас-
расплавился и быстро испарился, произведя взрыв. В работе [447]
показано, что лиофильная сушка сопровождается некоторой
усадкой, но эта усадка намного меньше, чем наблюдаемая в
материале, высушенном методом сушки в критической точке.
Является ли лиофильная сушка наилучшим методом, пред-
предотвращающим перераспределение растворимого материала, все
еще представляется спорным вопросом. Вероятно, что в процес-
процессе сушки кристаллы соли могут перемещаться внутри клеточ-
клеточной матрицы за счет электростатического притяжения и грави-
гравитационных сил. В работах [183, 199, 449, 193, 450, 202, 451] при-
ьодится убедительное доказательство того, что на образцах,
высушенных в замороженном состоянии, с помощью количест-
количественного рентгеновского микроанализа могут быть получены фи-
физиологически важные результаты. В работе [183] аналитические
результаты, полученные с помощью рентгеновского микроана-
микроанализатора, находятся в соответствии с результатами, полученны-
полученными чисто физиологическими средствами. Эти и другие исследо-
исследования проводились на образцах ткани, которые содержат зна-
значительное количество органической матрицы. Как только содер-
содержащая воду матрица сублимирует, растворенные компоненты
должны быть перераспределены в тканях таким же образом,
как кристаллы соли осаждаются на поверхности и дне посуды
с морской водой, выставленной на яркое солнце.
В клетках с большим количеством биологической матрицы,
т. е. клетках многих животных и меристематических раститель-
растительных клетках, перераспределение может иметь место лишь на
коротких расстояниях, потому что растворенные вещества сме-
смешиваются с высушенной клеточной матрицей. Для сильно гид-
ратированных тканей миграция может простираться на большие
расстояния, за счет чего уменьшилась бы точность любых ана-
аналитических исследований, и во всех случаях необходимо призна-
признавать, что может иметь место некоторое перераспределение рас-
растворимых элементов [449].
Наконец, процедура, противоположная лиофильной сушке,
включающая криосорбцию, может иметь полезное применение
при препарировании биологического материала для микроана-
микроанализа. В работе [452] описывается простое оборудование, в кото-
котором охлажденный держатель образцов с замороженными образ-
образцами герметически закрывается в замкнутом сосуде, содержа-
содержащем 50 г молекулярного сита марки Zeolite 13 X либо Linde ЗА.
Герметический контейнер погружается в жидкий азот, и по-

302 Глава 12
следующая лиофильная сушка производится в течение 3 дней
при температуре 203 К и 6 дней при температуре 213 К. Высу-
Высушенные ткани затем могут быть залиты в смолу при 258 К или
контейнер нагревают до температуры окружающей среды, а за-
затем заполняют сухим азотом. Не требуется никакого вакуума,
а система работает благодаря высокой поглощательной способ-
способности молекулярного сита, которое при 77 К может создавать
вакуум, равный 6,5 нПа.
12.3.7. Замораживание-замещение
Замораживание-замещение является полезным методом пре-
препарирования образцов для получения тонких срезов. Несмотря
на то что основное усилие исследований было направлено на
защиту морфологической целостности образцов, в настоящее
время имеется достаточно оснований, чтобы предполагать, что
замораживание-замещение может также быть полезным мето-
методом препарирования для микроанализа биологических объек-
объектов. Мы отправляем читателя к недавно опубликованным обзо-
обзорам [453, 454], в которых обсуждается целый ряд методов в
применении для растительных и животных тканей.
Процедура представляет собой относительно медленный про-
процесс и состоит просто в замене льда в быстро замороженном
образце безводным растворителем при низкой температуре с
последующей низкотемпературной инфильтрацией ткани соот-
соответствующей заливочной средой. Все замещение, инфильтрация
смолой, полимеризация и изготовление срезов должны выпол-
выполняться в строго безводных условиях и при низких температурах.
Эти требования могут создать технические трудности, так как
пар атмосферной воды очень быстро поглощается осушителя-
осушителями при низкой температуре. По этой причине изменения и пере-
ьос производятся либо в перчаточном боксе с сухим азотом при
небольшом положительном давлении, либо в герметических кон-
контейнерах с люками для ввода и вывода.
Для большей эффективности замораживание-замещение
должно производиться при температуре ниже температуры ре-
рекристаллизации льда, которая для большинства биологических
тканей лежит в пределах от 163 до 193 К. Использовался ряд
органических жидкостей, а температуры и времена замещения
даны в табл. 12.5. Как и в случае лиофильной сушки, не могут
быть указаны точные времена, и необходимо для различных
образцов варьировать процедуры. Времена, приведенные в
табл. 12.5, являются средними для образцов размером 1—•
2 мм3, а температуры представляют температурный диапазон
проведения замещения. С целью сохранения структуры объекта
в замещающую жидкость могут быть добавлены такие фикса-

200—233
190-233
193—233
200—233
163—233
158—233
200—233
178—243
193—233
200—273
3—4
1-2
Более 14
20
6-20
28
3-4
]
Более 14
10-15
[4551
[483]
[455]
[484]
[455]
[482]
Г 239]
Препарирование биологических образцов для РМА 303
Таблица 12.5. Органические растворители, используемые
при замораживании-замещении
т- ,, Литератур-
Замещающая жидкость Температура, К Время, дни 1ше ссилки
Ацетон
Ацетон + акролеин
Бутанол
Диэтиловый эфир
Диэтиловый эфир и акролеин
Диметиловый эфир
Этанол
Метанол
Пропанол
Окись пропилена
торы, как OsO4 или уранилацетат, но присутствие тяжелого ме-
металла может серьезно исказить аналитические измерения.
Чем ниже температура замещения, тем продолжительнее
время замещения, что делает в какой-то мере нереальным ис-
использование бутанола, пропанола, диэтилового и диметилового
эфиров. Как было показано рядом исследователей, потери эле-
элементов существенно уменьшаются при более низких темпера-
температурах. Наиболее распространенным является использование ли-
либо этанола и метанола, либо ацетона. Типичная процедура за-
замещения дана в [455] и описывается ниже.
Небольшие кусочки ткани, помещенные в корзиночку из про-
проволочной сетки, быстро замораживаются в жидкой смеси 8%-
ного метилциклогексана в изопентане, охлажденной до темпе-
температуры 100 К в жидком азоте. Замороженные образцы пере-
переносятся в безводный ацетон при температуре 193 К, и холодный
ацетон меняется каждый день в течение 3 или 4 дней. Удобно
использовать стеклянные бутылочки 20X50 мм со съемными
пластиковыми крышками, так как они легко удаляются даже
при низкой температуре с помощью ключа для откупоривания
бутылок. Удобно также хранить бутылочки в отверстиях, про-
проделанных в большом металлическом блоке, так как за счет это-
этого обеспечивается большая тепловая масса, когда бутылочки
вынимаются из холодильника во время переноса. Наиболее
удобным сушильным агентом для замещающей жидкости явля-
являются гранулы молекулярного сита Linde ЗА или 4А. Они могут
быть высушены нагреванием до температуры около 900 К в ва-
вакууме с последующим их охлаждением в инертной сухой атмо-
атмосфере. Стеклянные бутылочки заполняются наполовину высу-
высушенным молекулярным ситом, а затем заполняются безводной
замещающей жидкостью. Во время переноса, который выполня-
выполняется в перчаточном боксе под давлением сухого азота, контей-

304 Глава 12
неры, изготовленные из сеточки, могут быть быстро и удобно
перенесены из одной бутылочки в другую без образовавшегося
на их поверхности льда.
После замещения при 193 К образцы медленно нагреваются
до 233 К в течение 4 ч, а затем переносятся в свежий безвод-
безводный ацетон при 233 К. Только что высушенные образцы посте-
постепенно заполняются смолой в ацетоне в возрастающих концент-
концентрациях, такой, как обладающая низкой вязкостью среда Спур-
ра, в которой хлорсодержащая компонента DER 736 заменяется
на DYO64 [456]. Безводные условия должны сохраняться в те-
течение 3 дней инфильтрации, и за этот период температура об-
образцов медленно повышается до 293 К. Смола полимеризуется
при температуре 333 К-
Срезы могут быть вырезаны из блоков заполимеризованной
смолы, и в качестве кюветной жидкости не должна использо-
использоваться никакая водная среда, так как из тонкого среза при за-
замещении могут произойти потери элементов. В кювете для рез-
резки использовались различные жидкости, включая ацетон, ди-
метилсульфоксид, гексиленгликоль, глицерин и силиконовые
жидкости [455], но все с ограниченным успехом. Сухие срезы
толщиной около 2 мкм можно нарезать в атмосфере сухого азо-
азота и собирать каждый срез с помощью вольфрамовой иглы. Та-
Такие срезы могут заключаться между напыленными угольными
пленками, и они достаточно тонки для исследования и анализа
в РЭМ, работающего в просвечивающем режиме при напряже-
напряжении 20—30 кВ.
Так как эти процедуры разработаны для микроанализа, то
контраст от объекта обычно очень слабый. Тем не менее воз-
возможно ориентироваться при наблюдении клеток и тканей. При
наличии небольшого опыта и с помощью сравнительных иссле-
исследований, использующих материал, препарированный стандарт-
стандартным способом, может быть проведен анализ различных участ-
участков в клетке с пространственным разрешением 0,1—0,2 мкм.
Процесс изотермической фиксации [457, 458]—разновидность
высокотемпературного замораживания-замещения — использо-
использовался для фиксации биологического материала при относитель-
относительно высоких температурах B53 К) без нарушения конфигурации
льда или гидратированного состояния кристаллической матри-
матрицы. Несмотря на то что структурная сохранность оказывается
достаточно хорошей, использование высоких концентраций NaCl
и DMSO в фиксирующей жидкости для получения необходимо-
необходимого согласованного локального прогиба помешало бы использо-
использованию этой методики в препарировании образцов для рентге-
рентгеновского микроанализа.
Многообещающие аналитические результаты, полученные
рядом исследователей, не означают, однако, что заморажива-

Препарирование биологических образцов для РМА 305
ние-замещение является идеальным методом консервации. Име-
Имеется, например, значительная вариация в растворимости (а сле-
следовательно, в экстракции) электролитов в замещающих жид-
жидкостях. Минимальная экстракция происходит тогда, когда
используются эфиры (следующий лучший — ацетон), в то время
как при использовании спиртов имеет место значительная экст-
экстракция ткани. В работах [459, 460] показано, что в процессе за-
замораживания и замещения может происходить смещение эле-
элементов. В работе [[184] дан длинный перечень изменений в рас-
распределении элементов, которые могут происходить при приме-
применении разных режимов замораживания-замещения в ряде раз-
различных тканей.
Несмотря на эти недостатки, замораживание-замещение яв-
является полезным методом препарирования, и, вероятно, его луч-
лучше всего применять для клеток и тканей с плотной матрицей.
Это могло бы ограничить количество растущих кристаллов
льда во время замораживания и замещения и свести к миниму-
минимуму расстояния возможного движения электролитов.
12.3.8. Изготовление срезов
Замороженный биологический материал можно нарезать и
изучать толстые @,2—2 мкм) или тонкие E0—100 нм) срезы,
замороженные в гидратированном состоянии или после лио-
фильной сушки. Приготовление тонких срезов адекватно описа-
описано в ряде статей [407, 450, 461, 462], в каждой из которых ста-
старательно излагаются процедуры, которые необходимо выпол-
выполнить для этой методики. В работах [450, 463, 407] производился
рентгеновский микроанализ на тонких срезах, подвергавшихся
лиофильной сушке, и был локализован ряд растворимых эле-
элементов. В работах [461, 462, 464] недавно был расширен диапа-
диапазон температур криоультрамикротомии — нарезка тонких срезов
E0—100 нм) производилась при температурах от 148 до 123 К-
Во всех этих работах предполагалось, что нужно изготавли-
изготавливать срезы при более низких температурах, чтобы быть уверен-
уверенным, что не происходит случайного оттаивания во время резки.
Более толстые срезы @,5—1 мкм) также использовались для
микроанализа, но в противоположность тонким срезам, которые
обычно анализируются после лиофильной сушки, толстые сре-
срезы обычно препарируются и анализируются замороженными в
гидратированном состоянии. В оригинальных процедурах, раз-
разработанных в [465, 300, 426], имелась значительная неопреде-
неопределенность относительно степени гидратации срезов во время пре-
препарирования и анализа. Несмотря на то что можно изготавли-
изготавливать замороженные в гидратированном состоянии срезы, после
первого анализа срезы были в значительной степени обезвоже-

306
Глава 12
Сетка ИЗ Be
цилиндр из Be
Держатель для
переноса с
пазом
Рис. 12.10. Трехмерное изображение
всего узла объектодержателя, при-
пригодного для срезов, замороженных в
гидратированном состоянии [200].
Отверстие с резьбой на бериллиевом дер-
держателе для переноса с пазом позволяет
осуществить контакт для отвода тепла в
системе переноса. Пазы на держателе поз-
позволяют осуществить хороший тепловой
контакт с охлаждаемым столиком для
охлаждения в микроскопе.
ны, и единственным способом, при котором можно было наде-
надеяться связать аналитические данные с весом ткани во влажном
состоянии, был тщательный и быстрый расчет количества воды
в ткани измерением в микроанализаторе выбранных участков
спектров непрерывного излучения. Единственная надежда на со-
содержание полностью гидратированных образцов в течение дли-
длительных периодов времени — это иметь срезы в тесном контак-
контакте с пленкой-подложкой высокой проводимости.
В последних исследованиях [200] были усовершенствованы
методика получения срезов при низких температурах, методы
монтажа и переноса образца и режим анализа, так что рутин-
рутинным образом можно было изготавливать срезы множества тка-
тканей, которые остаются замороженными в гидратированном со-
состоянии после 3—4 ч пребывания в микроскопе. При такой про-
процедуре маленькие кусочки ткани помещаются на конце медных
брусков и быстро охлаждаются в жидком фреоне-12. Изготовле-
Изготовление срезов производится в диапазоне температур, используемых
в новом устройстве для изготовления срезов при низких тем-
температурах, установленном на микротоме, в котором большая
камера для нарезки охлаждается поступающим в камеру непре-
непрерывным потоком газообразного сухого азота. Температура газа,
а следовательно, и температура ножа и образца могут контро-
контролироваться пропусканием азота через изолированный резистор.
Непрерывный направленный поток сухого азота предотвращает
любое образование льда в камере нарезки.
Срезы нарезаются поодиночке и переносятся на охлаждае-
охлаждаемый жидким азотом до температуры 123 К держатель. Держа-
Держатель (рис. 12.10) и срезы, находящиеся при температуре
~ 123 К, переносятся из камеры микротома на предварительно
охлажденный столик растрового микроскопа на стержне в ва-
куумно-плотной камере на предварительно охлажденном мед-
медном массивном держателе (рис. 12.11).

Препарирование биологических образцов для РМА 307
Вакуумный фланец
Камера образца
Скользящий стержень
Теплаотвод
Крышка
Рис. 12.11. Схематическое изображение герметической системы переноса с
теплоотводом в вытянутом положении [200].
Предварительно охлажденный G7 К) теплоотвод ввертывается в держатель для переноса
с пазом и оба втягиваются в камеру образца, которая затем закрывается. Это позволяет
осуществлять перенос образцов в шлюз камеры объектов растрового электронного мик-
микроскопа.
Основным фактором для успешного изготовления толстых
срезов при низкой температуре является температура блока
ткани. В работе [300] считается, что толстые срезы, нарезан-
нарезанные при низких (~193 К) температурах, образуются путем
множественных изломов, так как срез имеет грубую поверх-
поверхность. Гладкая поверхность среза означала бы, что во время
процесса резки могли иметь место переходное плавление и тая-
таяние. С точки зрения микроанализа важно знать, имело ли мес-
место начальное оттаивание в процессе резки. Наличие зоны тая-
таяния в срезе и/или в блоке ткани могло бы привести к перерас-
перераспределению растворимых элементов как за время плавления
льда, так и во время быстро наступающей за этим фазы рекри-
рекристаллизации. Перемещение было бы минимальным в случае
плотной клеточной матрицы с однородным распределением, но
могло бы быть весьма серьезным во фрагментах без матрицы,
которые содержат лишь воду и молекулы малых размеров.
В работах [466, 467, 200] была более подробно рассмотрена
физическая природа процесса резки на замороженной ткани и
измерена тепловая энергия, образовавшаяся при низкотемпе-
низкотемпературной нарезке. Авторы считают, что. теплота, выделявшаяся

¦s
*7
¦- ч • 4
• ¦ =¦* -.- ¦
' *:"'¦-. .!:- -
Рис. 12.12. Изображения замороженного в гидратированном состоянии (сле-
(слева) и высушенного лиофильной сушкой (справа) срезов ткани почечных клу-
клубочков крысы во вторичной электронной эмиссии (о) ив прошедших элект-
электронах (б) [200].
Отсутствие отчетливой морфологии и почти однородная плотность срезов, замороженных
в гидратированном состоянии, затрудняют абсолютную идентификацию ткани. Идентич-
Идентичность фрагментов ткани подтверждается после анализа образца, замороженного в гидоа-
тированном состоянии, что позволяет частично высушивать образец внутри микроскопа
Маркер соответствует 300 мкм.

и
Рис. 12.13. Изображения сре-
срезов почечного клубочка кры-
крысы, полученных методом лио-
фильной сушки, в ПРЭМ
[468].
а — изображение среза вблизи кон-
кончика бугорка при малом увеличе-
увеличении; б — при большой увеличе-
увеличении на изображении наверху спра-
справа собирательный проток, слеза
внизу виден папиллярный эпителий.
Сетчатый вид тканей за счет кри-
кристаллов льда, образовавшихся на
начальном этапе лиофильной сушки.

Таблица 12.6. Фрагментные фракции воды и концентрации элементов в замороженных срезах почечного клубочка
крысы1'
Фрагмент
Клетки выводящего протока
мМ/кг сух. веса
мМ/кг влажн. веса
г/кг влажи. веса
Клетки папилляриго эпите-
эпителия
мМ/кг сух. веса
мМ/кг влажн. веса
г/кг влажн. веса
Межуточная клетка
мМ/кг сух. веса
мМ/кг влажн. веса
г/кг влажн. веса
Межуточное пространство
мМ/кг сух. веса
мМ/кг влажн. веса
г/кг влажи. веса
Вода. %
56,7±5,6
59,5±10,8
59,9+6,5
77,4+2,3
Na
795+293
344±127
7,9+2,9
708±261
287+.106
6,6+2,4
2236±483
898+194
20,7+4,5
2609+526
590+119
13,6+2,7
р
581±46
252±20
7,8±0,6
597+133
242+54
7,5+1,7
361±65
14б±26
4,5±0,2
172+52
40±15
1,20±0,4
S
67+15
29±6
0,9+0,2
93+39
39+16
1,2±0,5
64+15
26±6
0,8±0,2
120+40
27+9
0,9±0,3
С1
765±249
331±108
П,8±3,8
785±196
318±79
П,3±2,8
1805±348
725+140
25,7±5,0
1966±508
445±115
15,8±4,1
К
360±125
156±54
6,1±2,6
348+90
141±36
5,5±1,4
197±40
79±16
3,1±0,6
186+35
42+8
1.6±0,3
') Процент воды выражался как среднее эначенне±среднеквадратичное отклонение измерений, проделанных на пяти животных. Концент-
Концентрации элементов (среднее±среднеквадратичное отклонение) основаны на фракциях сухого веса, содержании воды и на калибровочных эле-
элементах, базирующихся на анализе стандартных растворов [468].

Препарирование биологических образцов для РМА
311
Рис. 12.14. Рентгеновские спектры, полученные во время микроанализа опре-
определенных участков почечного клубочка крысы [468].
а —цитоплазма клетки выводящего протока; б — цитоплазма клетки папиллярного эпи-
эпителия; е — цитоплазма межуточной клетки; г — межуточное пространство- д — полость
выводящего канала; е— плазма в полости капиллярного сосуда Стрелка' иа снимке д
указывает поюжсние пика железа. Отсутствие пика в этом положении означает слабый
или отс;:сгв\ющии гемолиз и свидетельствует о том, что произошло загрязнение

3!2 Глава 12
при нарезке, в основном рассеивается в металлическом ноже
и что при изготовлении толстых срезов, замороженных в гидра-
тированном состоянии, маловероятно, что состояние таяния яв-
является проблемой.
В работе [200] в РЭМ исследовали замороженные в гидра-
тированном состоянии срезы, используя для получения изобра-
изображения как просвечивающий режим, так и режим вторичной
электронной эмиссии. Нарезанные при температуре 193 К сре-
срезы являются неровными, что отражает существование много-
• кратных изломов. Морфология искажается, и трудно распознать
клеточные компоненты. В нарезанных при температуре 223 К
срезах были видны основные клеточные фрагменты, в то время
как срезы, нарезанные при температуре 243 К, были гладкими
и плоскими, а основные компоненты клетки легко распознава-
распознавались (рис. 12.12). Кроме того, в работах [200, 468] было доста-
достаточно убедительно показано, что известные ионные градиенты,
создаваемые внутри систем in vitro, и концентрации электроли-
электролита из систем in vivo сохраняются в замороженных в гидрати-
рованном состоянии средах, нарезанных при температурах от
233 до 244 К (рис. 12.13 и 12.14 и табл. 12.6).
Нужно идти на компромисс при выборе конечной температу-
температуры резки для толстых срезов. При низких температурах невоз-
невозможно различать отличительные клеточные детали. Любые ана-
аналитические результаты, вероятно, остаются под вопросом, по-
поскольку процесс резки при низких температурах приводит к об-
образованию серии накладывающихся друг на друга пластинок
льда. Однако то, что может произойти какое-либо промежуточ-
промежуточное таяние, является маловероятным. При более высоких тем-
температурах срезы бывают плоскими и характерные клеточные
детали могут легко идентифицироваться, и, хотя все еще оста-
остается риск промежуточного таяния, новые результаты позволили
бы предположить, что это не может представлять серьезную
проблему.
Проблема промежуточного таяния во время процесса изго-
изготовления тонких срезов остается нерешенной. Она усложняется
еще и тем, что стеклянные ножи, используемые для нарезки
тон:их срезов, исключают потенциальный отток тепла при вся-
всяком нагреве, создаваемом в процессе резки. В работе [469] счи-
считается, что зона таяния ограничена слоем толщиной 60 нм, хо-
хотя это оспаривается другими исследователями. Зона плавления
таких размеров не представляла бы серьезной проблемы для
толстых срезов (толщиной 1—2 мкм), но, конечно, представля-
представляла бы важную проблему для тонких (толщиной 50—100 нм)
срезов. В работе [464] считается, что эта проблема может быть
устранена путем резки при температуре ниже 173 К при исполь-
использовании сухого ножа и очень низких скоростей нарезки. Другая

Препарирование биологических образцов для РМА 313
потенциальная проблема, связанная с изготовлением срезов при
низких температурах, — это мигрирующая рекристаллизация
льда, которая в свою очередь могла бы привести к перераспре-
перераспределению электролитов. В работе [470] было показано, что при
193 К рост кристалла льда не дает существенного вклада в пов-
повреждение под действием ледяных кристаллитов в заморожен-
замороженных тонких срезах. Данных о срезах, нарезанных при более вы-
высоких температурах, не имеется.
Изготовление срезов при низких температурах является не-
непростой процедурой, будучи даже более сложной для расти-
растительного материала, и рабочие параметры должны быть оптими-
оптимизированы для каждого образца. Контраст изображения нефик-
нефиксированного материала является слабым, и часто бывает труд-
трудно распознать знакомые клетки и ткани. Эти обескураживаю-
обескураживающие замечания не должны, однако, удерживать людей от по-
попыток использования этого метода, потому что, несомненно, ана-
анализ срезов, и в частности толстых, замороженных в гидратиро-
ванном состоянии срезов, дает количественно аналитические
результаты, наиболее точно напоминающие условия, существу-
существующие в живой ткани. Важно распознавать артефакты, связан-
связанные с переходным таянием или полным оттаиванием, случай-
случайной регидратацией срезов, полученных лиофильной сушкой, пе-
перераспределением электролитов за счет мигрирующей рекри-
рекристаллизации льда и загрязнением замороженных срезов.
12.3.9. Получение изломов
Другим способом вскрытия внутренней поверхности гидра-
тированного или высушенного лиофильной сушкой биологичес-
биологического материала для микроанализа является разламывание об-
образца при низкой температуре и исследование и анализ либо
высушенной лиофильной сушкой, либо замороженной в гидра-
тированном состоянии поверхности. Несмотря на ограничения,
накладываемые рентгеновским микроанализом массивных об-
образцов, ряд исследователей использовали эту методику для ана-
анализа. В работе [471] подвергали анализу ионы, продиффунди-
ровавшие в массивную замороженную личиночную ткань; в
[308] анализировалось содержимое кишки личинки Chironotnus;
в [472] измерялись концентрации электролитов в поперечном
сечении корней береговых растений. В работе [295] проводился
анализ замороженной в гидратированном состоянии дифферен-
дифференцированной ткани корня Lemna minor. На рис. 12.15 показаны
некоторые предварительные результаты, и, хотя ясно, что разре-
разрешение в рентгеновских лучах не лучше 5 мкм, метод обеспечи-
обеспечивает простой и конкретный путь анализа замороженных в гид-
гидратированном состоянии тканей. Образцы препарировались пу-

314
Глава 12
-LA
3 «.
..С
Рис. 12.15. Рентгеновский микроанализ со спектрометром с дисперсией по
энергии поверхности скола замороженного корня Lemna minor.
Молодые корни были обработаны для криозащиты 25%-ным гидрооксиэтиловым крахма-
крахмалом, смонтированы на бериллиевых объектодержатслях. быстро заморожены в жидком
азоте, сколоты и слегка протравлены в биокамере AMRAY при температуре 100 К. По-
Поверхность излома была покрыта слоем углерода толщиной 20 нм и анализировалась пру
температуре 120 К в .растровом электронном микроскопе AMR 1000, оснащенном детек-
детектором фирмы Kevex. Лнализ проводился при использовании уменьшенного растра раз-
размером 1 мкм2 при 20 кэВ, токе пучка 0,5 нА и времени счета 100 с. В верхнем левом
углу изображение во вторич-ных электронах поверхности скола корня, замороженного в
гидратированном состоянии, на котором видно кольцо клеток лубяной паренхимы, окру-
окружающее центральную клетку ксилемы. Одна из клеток лубяной паренхимы была раз-
разделена на элемент сита А и сопутствующую клетку В, и аналитические результаты были
получены с этих двух клеток вместе с результатами клетки лубяной паренхимы С, от-
относительно которой предполагалось, что оиа прошла диффереицировку для формирова-
формирования второй пары элемента сита и соседних клеток, обычно обнаруживаемых в этом
растении. А—В — аналитические результаты, полученные с этих клеток. Во всех клетках
обнаружено большое количество фосфора и серы, обычно обнаруживаемых в меристе-
матических клетках меристемы. Содержания калия, хлора и магния приблизительно оди-
одинаковы во всех трех клетках, ио в элементе сита А отсутствует кальций, который при-
присутствует как в сопутствующей клетке В, так н в лубяной паренхиме С. Следует отме-
отметить, что результаты, представленные здесь, являются лишь визуальным представлением
спектров, которые претерпели обработку, обратную свертке, и которые показывают, что-
относительные элементные концентрации существенно различаются. Маркер на микрофо-
микрофотографии соответствует 10 мкм.

Препарирование биологических образцов для РМА ЗН5
тем монтажа подвергнутого быстрому воздействию непроника-
непроникающего полимерного криопротектанта объекта в маленький
(~1 мм) держатель и быстрого замораживания в жидком азо-
азоте. Замороженные образцы переносятся в жидком азоте на
предварительно охлажденный столик специальной биологичес-
биологической камеры образцов РЭМ. Это специально сконструированное
устройство является приставкой для растрового электронного
микроскопа, позволяет производить разламывание образца, тра-
травить и наносить покрытие на образцы в строго контролируемых
условиях низкой температуры и высокого вакуума [302]. Мож-
Можно многократно разламывать образцы с помощью установленно-
установленного под фиксированным углом холодного ножа, высота которого
устанавливается с- помощью микрометра. Процесс излома мо-
может наблюдаться в бинокулярный микроскоп. Поверх-
Поверхности излома могут протравливаться в контролируемых услови-
условиях с помощью теплового излучателя и покрываться углеродом
или металлической пленкой до переноса образцов на охлаждае-
охлаждаемый столик микроскопа, где они исследуются и анализируются
при низких температурах. Все препарирование проводится при
низких температурах (<~100 К) в чистом высоком вакууме
E0 мкПа) с гарантией того, что образец остается полностью
замороженным в гидратированном состоянии. Возможность
контроля уровня плоскости разлома означает, что можно полу-
получать гладкие поверхности излома, необходимые для анализа
массивных объектов. Дополнительная возможность проведения
поверхностного травления образцов означает, что с поверхности
излома может сублимировать тонкий, т. е. толщиной 0,1-—
1,0 мкм, поверхностный слой воды, выявляя морфологию образ-
образца, в то время как образец в массе остается полностью заморо-
замороженным в гидратированном состоянии.
12.3.10. Обращение с образцом
Существуют специальные вопросы, как обращаться с замо-
замороженным биологическим материалом, в частности, при пере-
переносе образцов из одного прибора в другой. В работе [450] бы-
было показано, что наиболее важно проводить лиофильную сушку
срезов строго контролируемым образом. В этой работе срезы
собирались на сеточках для электронного микроскопа и медлен-
медленно высушивались при низкой температуре в течение нескольких
часов. В работе [449] замороженные срезы помещались между
двумя сеточками, покрытыми углеродом, а затем медленно вы-
высушивались в потоке сухого азота. Если процесс лиофильной
сушки происходит слишком быстро, то начнется рост кристал-
кристаллов льда с последующим перераспределением растворимых эле-

316 Глава 12
ментов. Как только сушка образца окончена, важно, чтобы они
не смогли снова поглотить воду, так как это может вызвать
значительные изменения в морфологии клетки, также вызывая
перераспределение электролитов.
Если проводится исследование замороженных в гидратиро-
гидратированном состоянии образцов, то необходимо вносить срезы в
микроанализатор в состоянии, когда есть уверенность, что они
не утеряли воду (за счет плавления или сублимации) и не на-
накопили ее (за счет конденсации из загрязненной атмосферы).
Был разработан целый ряд переносных устройств, и все они
служат одной и той же цели — сохранить образец холодным
(~123 К) и не загрязненным. В работе i[473] была разработав
на полезная и простая методика, в которой образцы до препа-
препарирования и переноса заключались в формваровый контейнер.
Наконец, важно рассмотреть сложный вопрос, остается ли
замороженный в гидратированном состоянии образец в таком же
состоянии во время препарирования, исследования и анализа.
В работах [465, 300, 277, 201] был предложен целый ряд кри-
критериев, которые могли бы быть полезными в определении того,
остается ли образец замороженным в гидратированном состоя-
состоянии во время анализа. В работах [304, 474, 475] было показано,
что тонкие срезы не плавятся под электронным пучком, что яв-
является доказательством того, что они остаются достаточно хо-
холодными. Все эти критерии, по-видимому, не могут быть приме-
применимыми во всех условиях.
Количественный анализ замороженных в гидратированном
состоянии и частично замороженных в гидратированном состоя-
состоянии срезов, вероятно, представляет собой кульминационный
пункт биологического микроанализа, так как в настоящее вре-
время представляется, что это единственный путь, позволяющий
определить низкие концентрации растворимых элементов внут-
внутри различных клеточных фрагментов и в межклеточных прост-
пространствах.
12.4. МИКРООЗОЛЕНИЕ
С некоторых пор известно, что можно удалять органический
материал из биологического материала, помещая его в муфель-
муфельную печь при температуре 773 К или низкотемпературным озо-
лением в дуге реактивной кислородной плазмы [476]. Микро-
озоление, хотя и не является идеальным методом, находит, одна-
однако, ограниченное применение в микроанализе. В работе [477]
определены Fe и Си в бактериях, а в работе [478] этот метод
использовался как часть процедуры препарирования для анали-
анализа ткани образцов, и установлено, что с его помощью можно
было бы надежно контролировать наличие некоторых летучих

Препарирование биологических образцов для РМА 317
веществ, таких, как сера и хлор. В работе [479] этот метод был
также применен к растительному материалу. В работе [480]
описываются способы, с помощью которых ультрамикроозоле-
ние может быть использовано для тонких срезов ткани. Хотя
эта методика потенциально является полезным методом удале-
удаления фонового материала, когда содержание минерала мало, в
работе [481] при исследовании микроозоленных срезов смол
показали, что в то время, как чувствительность рентгеновского
микроанализа к сере, кальцию и фосфору увеличилась, происхо-
происходила потеря хлора из образца.
Так как имеется вероятность того, что некоторые элементы
смещаются в процессе микроозоления, применение этих мето-
методов было бы оправданным для связанных элементов и элемен-
элементов с низкой летучестью.

ЛИТЕРАТУРА
1. Smith К- С. А. A956). Ph. D. Dissertation, Cambridge University.
2. Pease R. F. W., Nixon W. С A965). /. Sci. lnstr., 42, 81.
3. Mulvey T. A974). SEM/74, IIT Research Institute, Chicago, Illinois, p. 44.
4. Joy D. С A974). SEM/74/I, IIT Research Institute, Chicago, Illinois,
p. 327.
5. Joy D. C, Maher D. M. A976). SEM/1976/H, IIT Research Institute,
Chicago, Illinois, p. 361.
6. a. Broers A. N. A974). «8th Int'l Congr. on Electron, Microscopy, Canber-
Canberra», vol. 1, p. 54. 6. Broers A. N. A974). SEM/74 IIT Research Institute,
Chicago, Illinois, p. 9.
7. Broers A. N. A973). Microprobe Analysis, ed С A. Andersen, J. Wiley,
New York, p. 83.
8. a. Broers A. N. A969). Rev. Sci. lnstr^ 40, 1040. 6. Broers A N. A969).
J. Phys. E, 2, 273.
9. Considine D. M. A976). Van Nostrand's Scientific Encyclopedia. 5th ed,
Van Nostrand, New York, p. 710.
10. Evans R. D. A955). The Atomic Nucleus, McGraw-Hill, New York.
11. Kittel С A956). Introduction to Solid State Physics, Wiley, New York.
[Имеется перевод: Киттель Ч. Введение в физику твердого тела. — М.:
Физматгиз, 1963.]
12. Shimizu R., Kataoka Y., Ikuta Т., Koshikawa Т., Hashimoto H. A976).
J. Phys. D., Appl. Phys., 9, 101.
13. Bethe H. A. A933). In Handbook of Physics, vol. 24, Springer, Berlin,
p. 273.
14. Berger M. J., Setzer S. M. A964). Nat. Acad. Sci./Nat. Res. Council. Publ.
1133, Washington, 205.
15. Duncumb P., Reed S. J. B. A968). In Quantitative Electron Proble Micro-
analysis, ed. K. F. J. Heinrich, National Bureau of Standards Spec. Pub. 298,
p. 133.
16. Cosslett V. E., Thomas R. N. A966). In the Electron Microprobe, eds.
T. D. McKinley, K. F. J. Heinrich, D. B. Wittry, John Wiley, New York,
p. 248.
17. Everhart T. E., Herzog R. F., Chang M. S., De Vore W. J. A972). Proc.
6th Intl. Conf. on X-Ray Optics and Microanalysis, eds. G. Shinoda,
K. Kohra, T. Ichinokawa, Univ. of Tokyo, p. 81.
18. Berger M. J. A963). Methods in Computational Physics, Vol. 1, eds.
B. Adler S. Fernback, M. Rotenberg, Academic, New York.
19. Shimizu R., Murata K. A971). /. Appl. Phys., 42, 387.
20. Heinrich K. F. J., Newbury D. E., Yakowitz H. A976). National Bureau
of Standards Spec. Pub. 460, Washington, DC.
21. Shimizu R., Ikuta Т., Everhart T. E., De Vore W. J. A975). /. Appl. Phys.,
46, 1581.
22. Henoc, J., Maurice F. A976). In «Use of Monte Carlo Calculations in
Electron Probe Microanalysis and Scanning Electron Microscopy», eds.
K. F. J. Heinrich, D. E. Newbury, H. Yakowitz, National Bureau of Stan-
Standards Spec. Pub. 460, Washington, DC, p. 61.

Литература Я19
23. Kanaya К., Okayama S. A972). /. Phys. D. Appt. Phys., 5, 43.
24. Cosslett V. E., Thomas R. N. A964a). Brit. I. Appl. Phys., 15, 883.
25. Cosslett V. E., Thomas R. N. A964b). Brit. J. Appt. Phys., 15, 1283.
26. Cosslett V. E., Thomas R. N. A965). Brit. J. Appl. Phys,, 16, 779.
27. Cosslett V. E. A966). X-Ray Optics and Microanalysis, 4th Intl. Cong, on
X-Ray Optics and Microanalysis, eds. Castaing, P. Deschamps, J. Philibert,
Hermann, Paris, p. 85.
28. Newbury D. E., Yakowitz H. A976). National Bureau of Standards Spec.
Pub. 460, eds, K. F. J. Heinrich, D. E. Newbury, H. Yakowitz, Washington,
DC, p. 15.
29. Wells О. С A977) SEM/1977/I, IIT Research Institute, Chicago, Illinois,
p. 747.
30. Niedrig H. A978). Scanning, 1, 17.
31. a. Heinrich K. F. J. A966). X-Ray Optics and Microanalysis 4th Intl.
Cong, on X-Ray Optics and Microanalysis, eds. R. Castaing, P. Deschamps,
J. Philbert, Hermann, Paris, p. 1509. b. Heinrich K. F. J. A966). The Elec-
, tron Microprobe, eds. T. D. McKinley, K. F. J. Heinrich, D. B. Wittry, Wiley,
New York, p. 296.
32. Bishop H. A966). X-Ray Optics and Microanalysis, 4th Intl. Cong, on
X-Ray Optics and Microanalysis, eds. R. Castaing, P. Deschamps, J. Phili-
Philibert, Hermann, Paris, p. 153.
33. Heinrich K. F. J. (ed.) A968). «Quantitative Electron Probe Microanalysis»,
National Bureau of Standards Spec. Pub. 298, Washington, DC, p. 5.
34. Reuter W. A972). In Proc. 6th Intl. Conf. X-Ray Optics and Microanalysis,
eds. G. Shinoda, K. Kohra, T. Ichinokawa, Univ. Tokyo Press, Tokyo, p. 121.
35. Newbury D. E., Yakowitz H., Myklebust R. L. A973). Appl. Phys. Lett.,
23, 488.
36. Arnal F., Verdier P., Vincinsini P. P. A969). С R. Acad. Sci. Paris, 268,
1526.
37. a. Wells О. С A974). Scanning Electron Microscopy, McGraw-Hill, New
York. 6. Wells О. С A974). SEM/1974, IIT Research Institute, Chicago,
Illinois, p. 1.
38. Murata K. A973). SEM/1973, IIT Research Institute Chicago, Illinois,
p. 268.
39 Murata K. A974). /. Appl. Phys., 45, 4110.
40. Seiler H. A967). Z Angew, Phys., 22, 249.
41. Bruining H. A954). Physics and Application of Secondary Emission Pro-
Process, Pergamon, London. [Имеется перевод: Брюининг Г. Физика и приме-
применение вторичной электронной эмиссии. — М.: Сов. радио, 1958.]
42. Streitwolf H. W. A959). Ann. Phys. (Leipzig), 3, 183.
43. Koshikawa Т., Shimizu R. A974). /. Phys. D.: Appl. Phys., 7, 1303.
44. Everhart T. E., Wells O. C, Oatley С W. A959). J. Electron Control, 7,.
97.
45. Wittry D. B. A966). In X-Ray Optics and Microanalysis, 4th. Intl. Cong,
on X-Ray Optics and Microanalysis, eds. R. Castaing, P. Deschamps, J.
Philibert, Hermann, Paris, p. 168.
46. Dawson P. H. A966). /. Appl. Phys., 37, 3644.
47. Reimer L., Tollkamp С A980). Scanning, 3, 35.
48. Ranter H. A961). Phys. Rev., 121, 677.
49. Kramers H. A. A923). Phil. Mag., 46, 836.
50. Bertin E. P. A975). Principles and Practice of X-Ray Spectrometric Analy-
Analysis, Plenum, New York.
51. Bearden J. A. A964). «X-Ray Wavelengths» Report NY0 10586, US Ato-
Atomic Energy Commission, Oak Ridge, Tennessee.
52. Moseley H. G. J. A913). Phil. Mag., 26, 1024.
53. Moseley H. G. J. A914). Phil. Mag., 27, 703.
54. Woldseth R. A973). X-Ray Energy Sectrometry, Kevex Corp., Foster City,..
California.

320 Литература
55. Powell С. J. A976).'National Bureau of Standards Spec. Pub. 460, eds.
K. F. J. Heirich, D. E. Newbury, H. Yakowitz, p. 97.
56. Bethe A930). Ann. Phys. (Leipzig), 5, 325.
57. Green M. A963). X-Ray Optics and Microanalysis, 3rd Intl. Symposium,
eds. H. A. Patee, V. E. Cosslett, A. Engstrom, Academic, New York, p. 361.
58. Lifshin E., Ciccarelli M. F., Bolon R. A980). Proc. 8th Intl. Cong, on X-Ray
Opics and Microanalysis, eds. D. R. Beaman, R. E. Ogilvie, D. B. Wittry,
Pendell, Midland, Michigan, p. 141.
59. Reed S. J. B. A966). In X-Ray Optics and Microanalysis, 4th Intl. Cong,
on X-Ray Optics and Microanalysis, eds. R. Castaing, P. Deschamps, J.
Philibert, Hermann, Paris, p. 339.
60. Andersen С A., Hasler M. F. A966). X-Ray Optics and Microanalysis, 4th
Intl. Cong, on X-Ray Optics and Microanalysis, eds. R. Castaing, P. De-
scha-mps, J. Philibert, Hermann, Paris, p. 310.
€1. Heinrich K. F. J. A981). Electron Probe Microanalysis, Van Nostrand,
New York.
62. Castaing R., Henoc J. A966). X-Ray Optics and Microanalysis, 4th Intl.
Cong, on X-Ray Optics and Microanalysis, eds. R. Castaing, P. Deschamps,
J. Philibert, Hermann, Paris, p. 120.
¦63. Nagel D. A968) National Bureau of Standards Spec. Pub. 298, ed.
K. F. J. Heinrich, Washington, DC, p. 189.
64. Henoc J. A968). «Quantitative Electron Probe Microanalysis» ed
K. F. J. Heinrich, National Bureau of Standards Spec. Pub. 298, Washing-
Washington, p. 197.
65. Green M. A962). Ph. D. thesis, University of Cambridge.
66. Green M. Cosslett V. E. A961). Proc. Phys. Soc, 78, p. 1206.
67. Petroff P. M., Long D. V., Strudel J. L., Logan R. A. A978). SEM/1978/I,
SEM. Inc. AMF O'Hare, Illinois, p. 325.
68. Oatley С W. A972). The Scanning Electron Microscope, Part 1, The Inst-
Instrument, Cambridge University Press, Cambridge.
69. Lane W. С A970). Proc. 3rd Ann. Stereoscan Coll., Kent Cambridge
Scientific, Morton Grove, p. 83.
70. Dinnis A. R. A971). SEM/1971, I IT Research Institute, Chicago, Illinois,
p. 41.
71. Dinnis A. R. A972). Electron Microscopy 1972, Proc. 5th European Cong,
of Electron Microscopy, Institute of Physics, London, p. 178.
72. Dinnis A. R. A973). In Scanning Electron Microscopy: Systems and Appli-
Applications, 1973, Institute of Physics, London, Conf. Ser., Vol. 18, p. 76.
73. Howell P. G. T. A975). SEM/1975, IIT Research Institute, Chicago, Illi-
Illinois, p. 537.
74 Wells О. С A960). BriU J. Appl. Phys., 11, 199.
75. Lane W. С A969). /. Phys. E, 2, 565.
76. Boyde A. A973). /. Microsc, 98, 452.
77. a. Boyde A. A974). SEM/1974, IIT Research Institute, Chicago, Illinois,
p. 101. 6. Boyde A. A974). SEM/1974, IIT Research Institute, Chicago,
Illinois, p. 93.
78. Everhart T. E., Thornley, R. F. M. A960). /. Sci. Instr., 37, 246.
79. Pawley J. B. A974). SEM/1974/I, IIT Research Institute, Chicago, Illinois,
p. 27.
80. Robinson V. N. E. A980). Scanning, 3, 15.
81. Robinson V. N. E. A975). SEM/1975, IIT Research Institute, Chicago,
Illinois, p. 51.
82. Jackman J. A980). Ind. Res. Dev., 22, 115.
83. Moll S. H., Healy F., Sullivan В., Johnson W. A978). SEM/1978, SEM
Inc., AMF O'Hare, Illinois, p. 303.
84. Reimer L. Volbert B. A979). Scanning, 2, 238.

Литература 321
85. Kimoto S., Hashimoto H. A966). In The Electron Microprobe, John Wiley,
New York, p. 480.
86. Gedcke D. A., Ayers J. В., DeNee P. B. A978). SEM/1978, SEM Inc.,
AMF O'Hare, Illinois, p. 581.
87. Wells О С. A978). SEM/1978, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois, p. 293.
88. Crewe A. V., Isaacson M., Johnson D. A970). Rev. Sci. Instr., 41, 20.
89. Fiori C. E., Yakowitz H., Newbury D. E. A974). SEM/1974, IIT Research
Institute, Chicago, Illinois, p. 167.
90. Horl E. M., Mugschl E. A972). Proc. 5th Cong, on Electron Microscopy,
Institute of Physics., London, Conf. Ser. Vol. 14, p. 502.
91. Van Essen С G. A974). Л Phys. E, 7, 98.
92. Lifshin E., DeVries R. С A972). «Proc. 7th Conf. Elect. Probe Anal. Mic-
robeam Analysis Society», San Francisco, California, Paper 18.
93. Sawyer G. R., Page T. F. A978). /. Mat. Sci., 13, 885.
94. Oatley С W., Nixon W. C, Pease R. F. W. A965). In Advances in Electro-
Electronics and Electron Physics, ed. L. Marton, Academic, New York, p. 181.
95. Rose A A948). In Advances in Electronics, ed. A. Marton, Academic, New
York, p. 131.
96. Broers A. N., Panessa B. J., Gennaro J. F., Jr. A975). Science, 189, 637.
97. Broers A. N. A975). SEM/1975, IIT Research Institute, Chicago, Illinois,
p. 662.
98. Jones A. V., Smith К. С. А. A978). SEM/1978, SEM Inc., AMF O'Hare,
Illinois, p. 13.
99. Smith К. С A., Unitt B. M., Holburn D. M., Tee W. J. A977). SEM/1977/1,
IIT Research Institute, Chicago, Illinois, p. 49.
100. Goldmark P. C, Hollywood J. J. A951). Proc. IRE, 39, p. 1314.
101. Heinrich К. Т. J., Fiori С. Е., Yakowitz H. A970). Science, 167, 1129.
102. Oron M., Tamir V A974). SEM/1974, IIT Research Institute, Chicago,
Illinois, p. 207.
103. Hendee С F., Fine S., Brown W. D. A956). Rev. Sci. Instr., 27, 531.
104. Holliday J. E. A963) In the Electron Microprobe, eds. T. D. McKinley,
K. F. J. Heinrich, D. B. Wittry, Wiley, New York, p. 3.
105. Fitzgerald R., Keil K., Heinrich K. F. J. A968). Science, 159, 528.
106. Freund H. V., Hansen J. S., Karttunen E, Fink R. W. A972). Proceedings
of the 1969 International Conference on Radioactivity and Nuclear Spectro-
scopy, eds. J. H. Hamilton, J. С Manthurthil, Gordon & Breach, New York,
p. 623.
107. Elad E., Inskeep С N., Sareen R. A., Nestor P. A973). IEEE Trans. Nucl.
Sci., 20, 354.
108. Reed S. J. В., Ware N. G. A972). /. Phys. E. Sci. Instr., 5, 582.
109. Fiori С E., Newbury D. E. A978). SEM/1978/I, SEM Inc, AMF O'Hare,
Illinois, p. 401.
110. Lifshin E., Ciccarelli M. F. A973). SEM/1973, IIT Research Institute, Chi-
Chicago, Illinois, p. 89.
111. Bolon R. В., McConnell M. D. A976). SEM/1976/1, IIT Research Institute,
Chicago, Illinois, p. 163.
112. Geller J. D. A977). SEM/1977/I, IIT Research Institute, Chicago, Illinois,
p. 281.
113. Bearden J. A. A967). «X-Ray Wavelengths and X-Ray Atomic Energy Le-
Levels», NSRDS-NBS 14, National Bureau of Standards, Washington.
114. Heinrich K. F. J. A967). National Bureau of Standards, Technical Note 278.
115. Yakowitz H., Heinrich K. F. J. A969). /. Res Natl. Bur. Stand A. Phys.
Chem., 73A, 113.
116. Ficca J. F. A968). «Proc. 3rd Natl. Conf. Elect. Prob. Anal. EPASA», Chi-
Chicago, Illinois, Paper 15.
117. Parobek L., Brown J. D. A978). X-Ray Spectrom., 7, 26.
118. Love G., Scott V. D. A978). J. Phys. D. Appl. Phys., 11, 1369.
119. Love G., Scott V. D. A980). Electron Microsc, 3, 146.

322 Литература
120. Castaing R. A951). Ph. D. thesis, University of Paris.
121. Wittry D. B. A963). ASTM STP 349, Philadelphia, Pennsylvania, p. 128.
122. Philibert J. A963). Proc. 3rd Intl. Symp. X-Ray Optics and X-Ray Micro-
analysis, Stanford University, eds. H. H. Pattee, V. E. Cosslett, Engstrom,
Academic, New York, p. 379.
123. Duncumb P., Shields P. K. A966). In the Electron Microprobe, eds.
T. D. McKinley, K., F. J. Heinrich, D. B. Wittry, John Wiley, New York,
p. 284.
124. Curgenven L., Duncumb P. A971). Tube Investments Res. Labs. Report 303.
125. Heinrich K. F, J. A969). National Bureau of Standards, Technical No-
Note 521.
126. Yakowitz H.( Heinrich K. F. J. A968). Microchim Ada, p. 183.
127. Kyser D. F. A972). In Proc. 6th Intl. Conf. X-Ray Optics and Microanaly-
sis, eds. G. Shinoda, K. Kohra, T. Ichinokawa, Univ. Tokyo Press, Tokyo,
p. 147.
128. Henke B. L., Ebisu E. S. A974). In Advances in X-Ray Analysis, Vol. 17,
Plenum, New York, p. 150.
129. Bracewell B. L, Viegele W. J. A971). Developments in Applied Spectro-
scopy, Vol. 9, Plenum, New York, p. 357.
130. Colby J. W. A968). «Quantitative Microprobe Analysis of Thin Insulating
Films» in Advances in X-Ray Analysis, Vol. 11, eds. J. B. Newkirk,
G. R. Mallett, H. G. Pfeiffer, Plenum, New York, p. 287.
131. Cooke B. A.. Stewardson E. A. A964). Brit. I. Appl. Phys., 15, 1315.
132. Springer G. A966). Microchim. Ada, 3, 587.
133. Derian J. D., Castaing R. A966). In Optique des Rayons X et Microana-
lyse, eds. R. Castaing, P. Deschamps, J. Philibert, Hermann, Paris, p. 193.
134. Heinrich K. F. J., Yakowitz H. A970). Microchim. Ada, 1, 123.
135. Yakowitz Hr, Myklebust R. L., Heinrich K. F. J. A973). National Bureau
of Standards, Tech. Note 796.
136. Caldwell D. E., Weiblen P. W. A965). Economic Geology, 60, 1320.
137 Thomas P. M. A964). UK Atomic Energy Auth. Rept. AERE-R 4593.
138. Reed S. J. B. A965). Brit J. Appl. Phys.t 16, 913.
139. Colby J. W. A965). National Lead Co., Ohio Report NLCO-969.
140. Heinrich K. F. J., Yakowitz H. A968). Microchim. Ada, 5, 905.
141. Henoc J., Heinrich K. F. J., Myklebust R. L. A973). National Bureau of
Standards, Technical Note 769, Washington, DC, p. 127.
142. Springer G. A972). In Proc. 6th Intl. Conf. X-Ray Optics and Microanaly-
sis, eds. G. Shinoda, К Kohra, T. Ichinokawa, Univ. Tokyo Press, Tokyo,
p. 141.
143. Springer G. A973). In Quantitative Analysis with Electron Microprobes
and Secondary Ion Mass Spectrometry, ed. E. Preuss, Kernforschung Jue-
lich, West Germany.
144. Myklebust R. L., Fiori C. E., Heinrich K. F. J. A979). National Bureau of
Standards, Tech. Note 1106.
145. Criss J. W., Birks L. S. A966). In The Electron Microprobe, eds.
T. D McKinley, K. F. J. Heinrich, D. B. Wittry, John Wiley, New York,
p. 217
146. Ziebold T. O., Ogilvie R. E. A964). Anal. Chem., 36, 322.
147. Hewins R. H. A979). Proc. 10th Lunar Sci. Conf., Pergamon, New York,
p. 1109.
148. Myklebust R. L., Yakowitz H., Heinrich K. F. J. A973). <Proc. 8th Nat.
Conf. Elect. Probe, Anal.», New Orleans, Louisiana, Paper 26.
149. Вепсе А. Е. Albee, A. A968). /. GeoL, 76, 382.
150. Albee A. L., Ray L. A970). Anal. Chem., 42, 1408.
151. Laguitton D., Rousseau R., Claisse F. A975). Anal. Chem., 47, 2174.
152. Duncumb P. A971). Proc. EMAG, Institute of Physics, London, Conf.
Ser, Vol. 10, p. 132.

Литература 323
153. Bolon R. В., Lifshin E. A973). «Proc. 8th Nat. Conf. Elect. Probe Anal.
EPASA, New Orleans», Paper 31.
154. Colby J. W.. Wondisler D. R., Conley D. K. A969). «Proc. 4th Nat. Conf.
Elec. Prob Anal.». EPASA, Pasadena, California, Paper 9.
155. Reed S. J. B. A971). /. Phys. D. (Appl. Phys.), 4, 1910.
156. Reed S. J. B. A975). Electron Microprobe Analysis, Cambridge University
Press, Cambridge. [Имеется перевод: Рид С. Электронно-зондовый мик-
микроанализ. — М.: Мир, 1979.]
157. Bishop Н. Е. A965). Proc. Phys. Soc, 85, p. 855.
158. Moll S. H., Baumgarten N., Donnelly W. A980). Proc. 8th Int'l Cong, on
X-ray Optics and Microanalysis, eds. D. R. Beaman, R. E. Ogilvie,
D. B. Wittry, Pendell, Midland, Michigan, p. 87.
159. Small J. A., Heinrich K- F. J., Newbury D. E., Myklebust R. L. A979).
SEM/1979/11, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois, p. 807.
160. Newbury D. E., Greenwald S. A980). «Observations on the Mechanism of
High Resistance Junction Formation in Aluminium Wire Connections», J.
Res. Natl. Bur. Stand., Washington, DC.
161. Gavrilovic J. A980). National Bureau of Standards Spec. Pub. 533, Wa-
Washington, DC, p. 21.
162. Armstrong J. T. A978). SEM/1978/I, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois,
p. 455.
163. National Bureau of Standards A979). «Standard Reference Materials Ca-
Catalog», National Bureau of Standards Spec. Pub. 260.
164. Armstrong J. Т., Buseck P. R. A975). Anal. Chem., 47, 2178.
165. Small J. A., Heinrich K. F. J., Fiori С E., Myklebust R. L., Newbury D. E.,
Dilmore M. F. A978). SEM/1978/I, SEM Inc.. AMF O'Hare, Illinois,
p. 445.
166. Statham P. J., Pawley J. B. A978). SEM/1978/I, SEM Inc., AMF O'Hare,
Illinois, p. 469.
167. Statham P. A979). Microchim Ada, (Wien) Suppl., 8, 229.
168. Newbury D. E., Myklebust R. L., Heinrich K. F. J., Small J. A. A980).
National Bureau of Standards Spec. Pub. 533, p. 39.
169. Cliff G., Lorimer G. W. A975). /. Microsc, 103, 203.
170. Goldstein J. I. A979). In Introduction to Analytical Electron microscopy,
eds. J. J. Hren. J. I. Goldstein, D. С Joy. Plenum, New York, p. 83.
171. Goldstein J. I., Costley J. L., Lorimer G. W., Reed S. J. B. A977). SEM/
/1977, IIT Research Institute, Chicago. Illinois, p. 315.
172. Kyser D. F., Murata K. A974). IBM I. Res. Dev., 18, 352.
173. Bolon R. В., Lifshin E. A973). SEM/1973, IIT Research Institute, Chicago,
Illinois, p. 285.
174. Sweeney W. E., Seebold R. E., Birks L. S A960). /. Appl. Phys., 31,
1061.
175. Oda Y., Nakajima K. A973). /. In. Inst. Met., 37 673.
176. Yakowitz H Newbury D. E. A976). SEM/1976/I, IIT Research Institute,
Chicago, Illinois, p. 151.
177. Heinrich K. F. J., Yakowitz H. A975). Analyt. Chem., 47, 2408.
178. Schuman, H., Somlyo, A. P. A976). Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 73, 1193.
179. Hall T. A. A979). /. Microsc., 117, 145.
180. Issacson M. S. A979). Ultramicroscopy, 4, 193.
181. Hall T. A. A979). In Microbeam Analysis in Biology, eds. С Lechene,
R. Warner. Academic, New York, p. 185.
182. Bahr G. F., Johnson F. В., Zeitler E. A965). Lab. Invest., 14, 1115.
183. Schuman H., Somlyo A. V., Somlyo A. P. A976). Ultramicroscopy, 1,
Oil.
184. Morgan A. J., Davies T. W., Erasmus D. A. A978). In Electron Microscope
Analysis in Biology, Chap. 4, ed. D. A. Erasmus, Chapman Hall, London.
185. Cobet U. A972). «3rd Int. Conf. Med. Phys. Goeteborg, Sweden» p. 324.

324 Литература
186. Cobet U., Millner R. A973). Wiss. Z. Univ. Hall, 22, 127.
187. Barbi N. С A979). SEM/1979/II, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois, p. 659
188. Warner R. R., Coleman J. R. A973). Micron, 4, 61.
189. Warner R. R., Coleman J. R. A976). Micron, 6, 79.
190. Russ J. С A974). In Microprobe Analysis Applied to Cells and Tissues,
eds. T. A. Hall, P. Echlin, R. Kaufmann, Academic, New York, p. 269.
191. Ingram F. D., Ingram M. J., Hogben С A. M. A972). /. Histochem. Cyto-
cheni., 20, 716.
192. Ingram F. D., Ingram J. J., Hogben С. А. М. A973). In Proc. of the 8th
National Conference on Electron Probe Analysis, EPASA. p. 62A.
193. a. Rick R., Dorge A., von Arnim E. A978). Microscopica Ada SuppL, 2,
156. 6. Rick R., Dorge A., von Arnim E., Thurau K. A978). /. Membrane
Biol, 39, 313.
194. Dorge A., Rick R., Gehring K-, Thurau K. A978). Pfltigers Arch. Euro-
European J. Physiol., 373, 85.
195. Hall T. A., Werba P. A969). Proc. 5th Intl. Cong. X-Ray Optics and Micro-
analysis, Tubingen, eds. G. Mollenstadt, К. Н. Gaukler, Springer, Berlin,
p. 93.
196. Hall T. A. A971). In Physical Techniques in Biological Research, Vol. 1A.
ed. G. Oster, Academic, New York.
197. Hall T. A. A975). /. Microsc. Biol. Cell., 22, 271.
198. Sumner A. T. A978). /. Microsc, 114, 19.
199. Somlyo A. V., Shuman H., Somlyo A. P. A977). J. Cell. Biol., 74, 828.
200. Saubermann A. J., Echlin P., Peters P. D., Beeukes R. A981). «Application
of Scanning Electron Microscopy to Handling Techniques», /. Cell. Biol.,
88, 257.
201. Hall T. A., Gupta B. L. A979). In Introduction to Analytical Electron
Microscopy. Chap. 5, eds. J. J. Hren, J. I. Goldstein, D. C. Joy, Plenum,
New York.
202. Appleton Т. С, Newell P. F. A977). Nature, 266, 854.
203. Eshel A., Waisel Y. A978). Micron, 9, 155.
204. Halloran B. P., Kirk R. G., Spurr A. R. A978). Ultramicroscopy, 3, 175.
205. Halloran B. P., Kirk R. G. A979). In Microbeam Analysis in Biology,
eds. C. P. Lechene, R. Warner, Academic, New York, p. 571.
206. Lechene C. P., Warner R. R. (eds.) A979). Microbeam Analysis in Biology,
Academic, New York.
207. Garland H. O., Brown J. A., Henderson I. W. A978). In Electron Micro-
probe Analysis in Biology. Chap. 7. ed. D. A. Erasmus, Chapman Hall,
London.
208. a. Chandler J. A. A977). «X-Ray Microanalysis in the Electron Microscope»,
in Practical Methods in Electron Microscopy, Vol. 5, ed. A. M. Glauert,
* North-Holland, Amsterdam. 6. Spurr A. R. A975). /. Microsc. Biol. Cell.,
22, 287. в. Roomans G. M. A979). SEM/1979/II, SEM Inc., AMF O'Hare,
Illinois, p. 649.
209. Lifshin E. A975). In Advances in X-Ray Analysis, eds. R. W. Gould,
С S. Barrett, J. B. Newkirk, С. О. Roud, vol. 19, Kendall/Hunt Pub., Du-
buque, Iowa, p. 113.
210. Ware N. G., Reed S. J. B. A973). J. Phys. E: Sci. Inst., 6, 286.
211. Fiori С E. Myklebust R. L., Heinrich K- F. J., Yakowitz H. A976). Anal.
Chem., 48 A), 172.
212. Rao-Sahib T. S., Wittry D. B. A975). /. Appl. Phys., 45, 5060.
213. Smith D. G. W., Gold С M., Tomlinson D. A. A975). X-Ray Spectrom,
4 C), 149.
214. Lifshin E., Ciccarelli M. F., Bolon R. B. A973). «Proc. 8th Nat. Conf.
Elect. Probe Anal.». New Orleans, Lousiana, Paper 29.
215. Dyson N. A. A956). Ph. D. thesis, University of Cambridge.

Литература 325
216. Compton, A. H., Allison, S. К. A943). X-Ray in Theory and Experiment,
Van Nostrand, New York, p. 106.
217. Green M., Cosslett V. E. A968). /. Phys. E, 1, 425.
218. Lifshin E. A974). «Proc. 9th Annual Conf. Microbeam Analysis Society»,
Ottawa, Canada, Paper 53.
219. Rao-Sahib T. S., Wittry D. B. A972). In Proc. 6th Intl. Cong, on X-Ray
Optics and Microanalysis, eds. G. Shinoda, K. Kohra, T. Ichinokawa, Univ.
Tokyo, p. 121.
220. Hehenkamp Th., Bocher J. A974). Microchim. Ada Suppl., 5, 29.
221. Schamber F. H. A977). In X-ray Fluorescence Analysis of Environmental
Samples, ed. T. G. Dzubay, Ann. Arbor Science, p. 241.
222. Statham P. J. A977). Anal. Chem., 49, 2149.
223. Gilfrich J. V., Birks L. S., Criss J. W. A978). In X-Ray Fluorescence Ana-
Analysis of Environmental Samples, ed. T. G. Dzubay, Ann. Arbor Science Publ.,
p. 283.
224. Dolby R. M. A959). Proc. Phys. Soc, 73, 81.
225. Smith D. G. W. A975). «Proc. 10th Ann. Conf. of the Microbeam Analysis
Society», Las Vegas, Nevada, Paper 21.
226. Nelder J. A., Mead R. A965). Computer L, 7, 308.
227. Deming S. N., Morgan S. L. A973). Anal. Chem., 45C), 278A.
228. Fiori С. Е., Myklebust R. L. A979). «Proc. American Nuclear Society Topi-
Topical Conference, Mayaquez, Puerto Rico. April-May 1978», p. 139.
229. Ryder P. L. A977). SEM/1977/I, IIT Research Institute, Chicago, Illinois,
p. 273.
230. Liebhafsky H. A., Pfeiffer, H. G., Zemany, P. D. A955). Anal. Chem., 27,
1257.
231. Ziebold T. O. A967). Anal. Chem., 39, 858.
232. a. Yakowitz H., Vieth D. L., Heinrich K. F. J., Michaelis R. E. A965).
National Bureau of Standards Spec. Pub. 260-10. 6. Bauer E. L. A971).
A Statistical Manual for Chemists, 2nd ed.. Academic, New York, p. 189.
в. Liebhafsky H. A., Pfeiffer H. G., Zemany P. D. A960). In X-Ray Micro-
Microscopy and X-Ray Microanalysis, eds. A. Engstrom, V. Cosslett, H. Pattee,
Elsevier/North-Holland, Amsterdam, p. 321.
233. Goldstein J. I. A967). /. Geophys. Res., 72, 4689.
234. Beaman D., Isasi J. A972). «Electron Beam Microanalysis», ASTM STP
506, Philadelphia, Pensylvania, p. 27.
235. Shiraiwa Т., Fujino N., Murayama J. A972). In Proc. 6th Intl. Conf. on
X-Ray Optics and Microanalysis, eds. G. Shinoda, K. Kohra, T. Ichinokawa,
Univ. Tokyo Press, Tokyo, p. 213.
236. Duncumb P., Meldford D. A. A966). X-Ray Optics and Microanalysis, 4th
Intl. Cong, on X-Ray Optics and Microanalysis, eds. R. Castaing. P. De-
schamps, J. Philibert, Hermann, Paris, p. 240.
237. Fisher D. W., Baun W. L. A967). Norelco Reporter, 14, 92.
238. Holliday J. E. A967). Norelco Reporter, 14, 84.
239. Fisher G. L., Farningham G. D. A972). «Quantitative Carbon Analysis of
Nickel Steels with the Electron Probe Microanalyzer». ASM Materials Engr.
Cong., Cleveland, Ohio, October.
240. Castaing R. (I960). In Advances in Electronics and Electron Physics,
Vol. 13, ed. L. Marton, Academic, New York, p. 317.
241. Castaing R., Deschamps J. A954). С R. Acad. Sci. Paris, 238, 1506.
242. Duerr J. S.. Ogilvie R. E. A972). Anal. Chem., 44, 2361.
243. Borile F., Garulli A. A978). X-Ray Spectrometry, 7, 124.
244. Kohlhaas V. E., ScheidJing F. A969). Arch. Eisentmttenwessen., 40, 1.
245. Barkalow R. H., Kraft R. W., Goldstein J. I. A972). Met. Trans., 3, 919.
246. Brown J. D., von Rosenstiel A. P., Knsh T. A979). Microbeam Analysis.
1979, ed. D. E. Newbury, San Francisco Press, San Francisco, p. 241.

326 Литература
247. Dahlberg E. P. A976). SEM/1976/I, IIT Research Institute, Chicago, Illi-
Illinois, p. 715.
248. Kehl G. L. A949). Principles of Metallographic Laboratory Practice, 3rd.,
McGraw-Hill, New York.
249. Kiessling R., Lange N. A964). «Non-Metallic Inclusions in Steel», Special
Report 90, The Iron and Steel Institute, London.
250. ASTM A960). «Methods of Metallographic Specimen Preparation», ASTM
STP 285, Philadelphia, Pennsylvania.
251. Anderson R. L. A961). «Revealing Microstructures in Metals», Westinghou-
se Research Laboratories, Scientific Paper 425-COOO-P2.
252. Taylor С. М., Radtke A. S. A965). Economic Geology, 60, 1306.
253. Tegart W. A959). Electrolytic and Chemical Polishing of Metals in Re-
Research and Industry, 2nd rev. ed., Pergamon, New York.
254. Goldstein J. I., Hanneman R. E., Ogilvie R. E. A965). Trans. Met. Soc.
AIME, 233, 812.
255. Michaelis R. E., Yakowitz H., Moore G. A. A964). /. Res. Natl. Bur. Stand:
(US), 68A, 343.
256. Heinrich K. F. J., Myklebust R. L., Rasberry S. D., Michaelis R. E. A971).
National Bureau of Standards Spec. Pub. 260-28.
257. Yakowitz H., Michaelis R. E., Vieth D. L. A969). In Advances in X-Ray
Analysis, Vol. 12, Plenum Press, New York, p. 418.
258. Yakowitz H., Fiori С E., Michaelis R. E. A971). National Bureau of Stan-
Standards Spec. Pub. 260-22.
259. Yakowitz H., Veith D. L., Heinrich K. F. J., Michaelis R. E. A966). In Ad-
Advances in X-Ray Analysis, Vol. 9, Plenum, New York, p. 289.
260. Yakowitz H., Ruff A. W., Jr., Michaelis R. E. A972). National Bureau of
Standards Spec. Pub, 260-43.
261. Marinenko R. В., Heinrich K. F. J., Ruegg F. С A979). Microbeam Analy-
Analysis, 1979, ed. D. E. Newbury, San Francisco Press, San Francisco, Califor-
California, p. 221.
262. De Nee P. B. A978). SEM/1978/I, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois, p. 479.
263. Brown J. A., Teestsov A. A976). SEM/1976/I, IIT Research Institute, Chi-
Chicago, Illinois, p. 385.
264. Moza A., Strickler D. W., Austin L. G. A978). SEM/1978/I, SEM Inc. AMF
O'Hare, Illinois, p. 289.
265. Walker D. A. A978). SEM/1978/I, IIT Research Institute, Chicago, Illinois,
p. 185.
266. McCrone W. C, Delly J. A973). The Particle Atlas Two, Vol. I, Ann. Arbor
Science Publishers, Ann. Arbor, Michigan.
267. Barbi N. C, Scinner D. P. A976). SEM/1976/I, IIT Research Institute,
Chicago, Illinois, p. 393.
268. Millette J. R., Clark P. J., Pansing M. F. A978). SEM/1978/I, SEM Inc.,
AMF O'Hare, Illinois, p. 253.
269. Lohnes R. A., Demirel T. A978). SEM/1978/I, SEM Inc., AMF O'Hare,
Illinois, p. 643.
270. Tovey N. K., Wong K. Y. A973). In «Proc. Intl. Symp. on Soil Structure»,
Swedish Geotechnical Society, Stockholm, Sweden, p. 59.
271. Dengler L. A. A978). SEM/1978/I, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois, p. 603.
272. Maissel L. I., Glang R. (eds.) A970). Handbook of Thin Film Technology,
McGraw-Hill, New York.
273. Welter L. M., Coates V. J. A974). SEM/1974/1, IIT Research Institute.
Chicago, Illinois, p. 59.
274. Spivak G. V., Rau E. I., Lukianov A. E., Petrov V. I., Bicov M. V. A972).
In «Proc. 5th Eur. Cong. Electron Microscopy», Manchester, England, p. 92.
275. Crawford С К A979). SEM/1979/II. SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois,
p. 31.

Литература 327
276. Echlin P., Saubermann A. J. A977). SEM/1977/I, 1ST Research Institute,
Chicago, Illinois, p. 621.
277. Echlin P. A978). /. Microsc, 112, 47.
278. Robinson V. N. E., Robinson B. W. A978). SEM/1978/I, SEM Inc., AMF
O'Hare, Illinois, p. 595.
279. Kubotsu A., Veda M. A980). /. Elect. Microsc, 29, 45.
280. Munger B. L. A977). SEM/1977/I, IIT Research Institute, Chicago, Illi-
Illinois, p. 481.
281. Murphey J. A. A978). SEM/1978/II, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois,
p. 175.
282. Murphey J. A. A980). SEM/1980/I, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois,
p. 209.
283. Pease R. W., Bailey J. F. A975). /. Microsc, 104, 281.
284. Panayi P. N.. Cheshire D. C, Echlin P. A977). SEM/1977/I, IIT Research
Institute, Chicago, Illinois, p. 463.
285. Leaver C, Chapman B. A971). Thin Films, Wykeham, London.
286. Kazmerski L. L., Racine D. M. A975). /. Appl. Phys., 46, 791.
287. Maeki G., Benoki M. A977). /. Electron Microsc, 26, 223.
288. Paulson G. G., Pierce R. W. A972). Proc. 30th Ann. EMSA, Claitors
Publishing, Baton Rouge, Lousiana, p. 406.
289. Wehner G. K-, Anderson G. S. A970). «The Nature of Physical Sputtering»,
in Handbook of Thin Film Technology, eds. L. I. Maissel, R. Glang, McGraw-
Hill, New York.
290. Adachi K., Hojou K., Katoch M., Kanaya K. A976). Ultramicroscopy,
2, 17.
291. Hojou K-, Oikawa Т., Kanaya K-, Kimura Т., Adachi K. A977). Micron, 8,
151.
292. Echlin P. A975). SEM/1975, IIT Research Institute, Chicago, Illinois,
p. 217.
293. Bratan T. A978). /. Microsc, 113, 53.
294. Echlin P., Kaye G. A979). SEM/1979/II, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois,
p. 21.
295. Echlin P., Pawley J. В., Hayes T. L. A979). SEM/1979/III, SEM Inc.,
AMF O'Hare, Illinois, p. 69.
296. Franks F. A980). SEM/1980/II, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois, p. 349.
297. Clay С S., Peace G. W. A981). «Ion Beam Sputtering: An Improved Me-
Method of Metal Conting SEM Samples and Shadowing CTEM Samples»,
/. Microsc, 122, 281.
298. Peters K. R. A980). SEM/1980/I, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois, p. 143.
299. Peters K. R. A979). SEM/1979/II, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois, p. 133.
300. Saubermann A. J., Echlin P. A975). /. Microsc, 105, 155.
301. Fuchs W., Lindemann В., Brombach J. D., Trosch W. A978). /. Microsc,
112, 75.
302. Pawley J. В., Norton J. T. A978). /. Microsc, 112, 169.
303. Echlin P., Pawley J. В., Hayes T. L. A979). SEM/1979/III, SEM Inc.,
AMF O'Hare, Illinois, p. 69.
304. Clark J., Echlin P., Moreton R., Saubermann A., Taylor P. A976). SEM/
/1976/1, IIT Research Institute, Chicago Illinois, p. 83.
305. Robards A. W., Crosby P. A979). SEM/1979/II, SEM Inc. AMF O'Hare,
Illinois, p. 325.
306. Flood P. R. A980). SEM/1980/I, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois, p. 155.
307. Roli J., Flood P. R. A978). /. Microsc, 112, 359.
308. Sylvester-Bradley P. С A969). Micropaleontology, 15, 366.
309. Sela J., Boyde A. A977). /. Microsc, 111, 229.
310. Crissman R. S., McCann P. A979). Micron, 10, 37.
311. Robinson V. N. E. A978). Scanning, 1, 149.
312. Valdre U. A979). /. Microsc, 117, 55.

328 Литература
313. Reimer L. A975). In Physical Aspects of Electron Microscopy and Micro-
beam Analysis, eds. B. M. Siegal, D. R. Beamon, John Wiley, New York,
p. 231.
314. Glaeser R. M., Taylor K- A. A978). /. Microsc, 112, 127.
315. Glaeser R. M. A980). In Introduction to Analytical Electron Microscopy,
eds. J. J. Mren, J. I. Goldstein, D. С Joy, Plenum, New York, p. 423.
316. Barber T. A. A976). In Principles and Techniques of SEM: Biological
Applications, Vol. 5, ed. M. A. Hayat, Van Nostrand Reinhold New York
317. Barber V. C. A972). SEM/1972, IIT Research Institute Chicago, Illinois,
p. 321.
318. Wetzcl В., Cannon G. В., Alexander E. L., Erickson B. W., Westbrook E. W.
A974). SEM/I974/I, IIT Research Institute, Chicago, Illinois, p. 581.
319. Lytton D. G., Yuen E., Richard K. A. A979). /. Microsc, 115, 35.
320. Echlin P., Galle P. A976). Biological Microanalysis, Pub. Societe Francaise
de Microscopie Electronique, 24 rue Lhomond 75231 Paris.
321. Albrecht R. M., Wetzel B. A979). SEM/1979/III, SEM Inc., AMF O'Hare,
Illinois, p. 203.
322. Junger E., Bachmann L. A980). /. Microsc, 119, 199.
323. Garland С D., Lee A., Dickson M. R. A979). /. Microsc, 116, 227.
324. Sanders S., Alexander E., Braylan R. A975). /. Cell. Bid., 67, 476.
325. Sturgess J. M., Moscarello M. A. A976). SEM/1976/II, IIT Research Insti-
Institute, Chicago, Illinois, p. 145.
326. McKee A E. A977). SEM/I977/II, IIT Research Institute, Chicago, Illinois,
p. 239.
327. Drier T. M., Thurston E. L. A978). SEM/1978/II, SEM Inc., AMF O'Hare,
Illinois, p. 843.
328. Chatficld E. J., Dillon M. J. A978). SEM/1978/1, SEM Inc., AMF O'Hare,
Illinois, p. 487.
329. Eisenstadt L. F., Levin В., Golomb H. M., Riddell R. H. A976). SEM/1976/
/II, IIT Research Institute, Chicago, Illinois, p. 263.
330. Hayat M. A. A970). Principles and Techniques of Electron Microscopy:
Biological Applications, Vol. 1, Van Nostrand Reinhold, New York.
331. Glauert A. M. (ed.) A974). Practical Methods in Electron Microscopy,
North Holland, Amsterdam.
332. Peters K. R. A980). /. Microsc., 118, 429.
333. Echlin P., Ralph В., Weibel E. (eds.) A978). Low Temperature Biological
Microscopy and Microanalysis, Royal Microscopical Society, Oxford.
334. Steffens W. L. A978). J. Microsc, 113, 95.
335. Thurley K. W, Mouel W. С A974). /. Microsc, 101, 215.
336. Humphreys W. J., Henk W. G. A979). Л Microsc, 116, 255.
337. Exley R. R., Butterfield B. G., Meylan B. A. A974). /. Microsc, 101, 21.
338. Exley R. R., Meylan B. A., Butterfield B. G. A977). /. Microsc, 110, 75.
339 Flood P. R. A975). SEM/1975, IIT Research Institute, Chicago, Illinois,
p. 287.
340. Watson J. H. L., Page R. H., Swedo J. L. A975). SEM/1975, IIT Research
Institute, Chicago, Illinois, p. 417.
341. Haggis G. H., Bond E. F., Phipps B. A976). SEM/1976/I, IIT Research
Institute, Chicago, Illinois, p. 281.
342. Humphreys W. J., Spurlock B. O., Johnson J. S. A977). Principles and
Techniques of SEM: Biological Applications, Vol. 6, ed. M. A. Hayat, Van
Nostrand Reinhold, New York.
343. Tanaka K. A974). In Principles and Techniques of SEM: Biological Appli-
Application, Vol. 1, ed. M. A. Hayat, Van Nostrand Reinhold, New York.
344. Haggis G. H., Bond E. F. A979). /. Microsc, 115, 225.
345. Pameijer С. Н. A979). SEM/1979/II, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois,
p. 571.
346. Nowell J. A., Lohse С L. A974). SEM/I974, IIT Research Institute, Chi-
Chicago, Illinois, p. 267.

Литература
347. Irinc S., Оно Т., Watanabe К., Toyotta К., Uno J., Takasugi N., Muraka-
Murakami T. A975). SEM/1975, ЦТ Research Institute, Chicago, Illinois, p. 267.
348. Frasca J. M., Carter H. W., Schaffer W. A. A978). SEM/1978/II, SEM
Inc. AMF O'Hare, Illinois, p. 485.
349. Kardon R. H., Kessel R. G. A979). SEM/1979/III, SEM Inc., AMF O'Hare,
Illinois, p. 743.
350. Nopanitaya W., Aghajanian J. G., Gray L. D. A979). SEM/I979/III, SEM
Inc., AMF O'Hare, Illinois, p. 751.
351. Abraham J. L., De Nee P. B. A974). SEM/1974, IIT Research Institute.
Chicago, Illinois, p. 251.
352. De Nee P. В., Abraham J. L. A976). In Principles and Techniques of SEM:
Biological Applications, Vol. 5, Van Nostrand, N. Y., Chap. 8, p. 144.
353. Abraham J L. A977). SEM/1977/II, IIT Research Institute, Chicago,
Illinois, p. 119.
354. Geissinger H. D. A972). /. Microsc, 95, 471.
355. De Nee P. В., Frederickson R. G., Pope R. S. A977). SEM/1977/II, IIT
Research Institute, Chicago, Illinois, p. 83.
356. Becker R. P., De Bryun P. P. H. A976). SEM/1976/II, IIT Research
Institute. Chicago, Illinois, p. 171.
357. Wetzel В., Jones G. _M., Sanford К. К. A977). SEM/1977/I, IIT Research
Institute, Chicago, Illinois, p. 545.
358. Hodges G. M., Muir M. D. A976). Principles and Techniques of Scanning
Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 5, ed. M. A. Hayat, Van
Nostrand Reinhold, New York.
359. Kay M. M. B. A978). In Principles and Techniques of SEM: Biological
Applications, Vol. 6, ed. M. A. Hayat, Van Nostrand Reinhold, New York.
360. Molday R. S. A977). Principles and Techniques of SEM: Biological Appli-
Applications, Vol 5, ed. M. A Hayat, Van Nostrand Reinhold, New York.
361. Wofsy L A979). SEM/1979/1II, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois, p. 565.
362. Horisberger M, Rossett J. A977). SEM/1977/II, IIT Research Institute,
Chicago. Illinois, p. 75.
363. Nemanic M K. A979) SEM/1979/III, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois,
p. 537.
364. Lotan R A979). SEM/1979/III, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois, p. 549:
365. Kumon H., Uno F.. Tawara J. A976). SEM/1976/II, IIT Research Institu-
Institute, Chicago, Illinois, p. 85.
366. Kahn L. E., Frommes S. P., Cancilla P. A. A977). SEM/1977/1, IIT Re-
Research Institute, Chicago, Illinois, p. 501.
367. Liepins A., de Harven E. A978). SEM/1978/II, SEM Inc., AMF O'Hare,
Illinois, p. 37.
368. Lamb J. C, Ingram P. A979). SEM/1979/II, SEM Inc., AMF O'Hare, Illi-
Illinois, p. 459.
369. Rostgaard J., Tranum-Jensen J. A980). J. Microsc, 119, 213.
370. Anderson T. E. A951). Trans. N. Y. Acad. Sci., 13, 130.
371. Bartlett A. A., Burstyn H. P. A975). SEM/1975, IIT Research Institute,
Chicago, Illinois, p. 305.
372. Cohen A. L. A979). SEM/1979/II, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois, p. 303.
373. Pawley J. В., Dole S. A976). SEM/1976/I, IIT Research Institute, Chicago,
Illinois, p. 287.
374. Humphreys W. J. A977). SEM/1977, IIT Research Institute, Chicago, Illi:
nois, p. 537.
375. Boyde A. A978). SEM/1978/11, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois, p 203
376. Katoh M. A978). /. Electron Microsc, 27, 329.
377. Schneider G. В., Pockwinse S. M., Billings-Gagliardi S. A978). SEM/
/1978/11, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois, p. 77.
378. Rampley D. N. A976). /. Microsc, 107, 99.
379. Witcomb M. J. A981). I. Microsc, 121, 289.

330 Литература
380. Kelley R. О., Dekker R. A., Bluemink J. G. A973). /. Ultrastruct. Res., 45,
254.
381. Malick L. E., Wilson R. B. A975). Stain Technol, 50, 265.
382. Woods P. S., Ledbetter M. E. A976). /. Cell Sci, 21, 47.
383. Postek M. Т., Tucker S. С A977). /. Microsc, 110, 71.
384. Munger B. L., Mumaw V. R. A976). SEM/1976/I, IIT Research Institute,
Chicago, Illinois, p. 275.
385. Boyde A. A976). SEM/1976/I, IIT Research Institute, Chicago, Illinois,
p. 683.
386. Pawley J. B. A972). SEM/1972, IIT Research Institute, Chicago, Illinois,
p. 153.
387. Hall T. A., Echlin P., Kaufmann R. (eds.) A974). Microprobe Analysis as
Applied to Cells and Tissues, Academic, New York.
388. Echlin P., Kaufmann R. (eds.) A978). Microscopita Acta Suppl. 2, S. Hir-
zel Verlag, Stuttgart.
389. Coleman J R. A978). SEM/1978/II, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois,
p. 911.
390. Marshall A. T. A975). «Electron Probe X-Ray Microanalysis», in Principles
and Techniques of Scanning Electron Microscopy, vol. 4, ed. M. A. Hayat,
Van Nostrand Reinhold, New York.
391. Nagy I. Z., Pieri C, Giuli C, Bertoni-Freddrari C, Nagy V. A977). /.
Ultrastruct. Res., 58, 22.
392. Masters S. K., Bell S. W., Ingram P., Adams D. O., Shelburne J. D. A979).
SEM/1979/III, SEM Inc.. AMF O'Hare, Illinois, p. 97.
393. Cameron I. L., Smith N. K- R. A980). SEM/1980/II, SEM Inc., AMF
O'Hare, Illinois, p. 463.
394. Henderson W. J., Griffith K. A972). In Principles and Techniques of
Electron Microscopy, Vol. 2, ed. M. A. Hayat, Van Nostrand Reinhold,
New York.
395. Champness P. E., Cliff G., Lprimer G. W. A976). /. Microsc, 108, 23).
396. Ingram M. J., Hogben С. А. М. A967). Anal. Biochem., 18, 54.
397. Morel F., Roinel N. A969). /. Chem. Phys., 66, 1084.
398. Lechene С A978). Microscopia Acta Supp., 2, S. Hirzel Verlag, Stuttgart,
p. 228.
399. Quinton R. M. A978). SEM/1978/II, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois,
p. 391.
400. Van Eekelen С A. G., Boekestein A., Stols A. L. H., Stadhouders A. M.
A980). Micron, 11, 137.
401. Beeuwkes R. A979). SEM/1979/II, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois,
p. 767.
402. Echlin P. A975). /. Microsc. Biol. Cell., 22, 129.
403. Coleman J. R., Terepka A. R. A974) «Preparatory Methods for Electron
Probe Analysis in Principles and Techniques of Electron Microscopy, Vol. 4,
ed. M. A. Hayat, Van Nostrand Reinhold, New York, Chap. 8.
404. Yarom R., Maunder C, Scripps M., Hall T. A., Dubowitz V. A975). Histo-
chemistry, 45, 59.
405 Yarom R., Hall T. A., Peters P. D. A975). Experientia, 31, 154.
406. Holbrook K. A., Holbrook J. R., Odland G. F. A976). SEM/1976/I, IIT
Research Institute, Chicago, Illinois, p. 266.
407 Siostrom J., Thornell L. E. A975). /. Microsc, 103, 101.
408 Fisher G., Kaneshiro E. S., Peters P. D. A976). /. Cell. Biol., 69, 429.
409 Morgan A. J. A979). SEM/1979/II, SEM Inc., AMF O'Hare, Illinois,
p. 635.
410 Ryder T. A., Bowen I. D. A974). /. Microsc, 101, 143.
411 Martoja R, Szollosi A., Truchet M. A975). T. Microsc. Biol. Cell., 22,
247.
412. Vallyathan N. V., Brody A. R. A977). SEM/1977/H, IIT Research Institute,
Chicago, Illinois, p. 93.

Литература 331
413. Okagaki Т., Clark В. A977). SEM/1977/II, IIT Research Institute, Chica-
Chicago, Illinois, p. 153.
414. Van Steveninck R. F. M., Van Steveninck M. E. A978). Ion Localization in
Electron Microscopy and Cytochemistry of Plant Cells, Chap. 4, ed.
J. L. Hall, Elsevier/North Holland, Amsterdam.
415. Bowen I. D., Ryder T. A. A978). «The Application of X-Ray Microanalysis
to Histochemistry», in Electron Microprobe Analysis in Biology, ed.
D. A. Erasmus, Chapman Hall, London.
416. Lauchli A. A975). Л Microsc. Biol. Cell, 22, 239.
417. Ellisman M. H., Friedman P L., Hamilton W. J. A980). /. Neurocytoi, 9,
185.
418. Simpson J. A. V., Bank H. L, Spicer S. S. A979). SEM/1979/II, SEM Inc.,
AMF O'Hare, Illinois, p. 779.
419. Lauchli A., Stelzer R., Guggenheim R., Henning L. A978). «Precipitation
Techniques as a Means of Intracellular Ion Localization by Use of Electron
Probe Analysis», in Microprobe Analysis as Applied to Cells and Tissues,
eds. T. A Hall, P. Echlin R. Kaufmann, Academic, New York.
420. Van Steveninck R. F. M., Bailment В., Peters P. D., Hall T. A. A976).
Aust. J. Plant. Physiol., 3, 359.
421. Thorpe J. R., Harvey D. M. R. A979). /. Ultrastruct. Res., 68, 186.
422. Pease D. С A974). «Proa 8th Intl. Cong. Electron Microscopy, Canber-
Canberra», vol. 2, p. 126.
423. Pease D. C, Peterson R. G. A972). J. Ultrastruct. Res., 41, 133.
424. Munoz-Guerra S., Subirana J. A. A980). Proceedings of the Seventh Euro-
European Congress on Electron Microscopy. Seventh European Congress on
E. M. Foundation, Leiden, The Netherlands, Vol. 2, p. 724.
425. Boyde A., Maconnachie E. A979). Scanning, 2, 164.
426. Gupta B. L., Hall T. A., Moreton R. B. A977). In Transport of Ions and
Water in Animals, Chap. 4, eds. B. L. Gupta, R. M. Moreton, J. L. Osch-
man, B. J. Wall, Academic, New York.
427. Saubermann A. J. A978). Microscopica Ada Suppl, 2, 130.
428. Franks F., Asquith M. H., Hammond С. С, Scaer H. le В., Echlin P.
A977)./. Microsc, 110,223.
429. Echlin P., Skaer H. Le В., Gardiner B. O. C, Franks F., Asquith H. M.
A977). Л Microsc, 110,239.
430. Skaer H. le В., Franks F., Asquith M. H., Echlin P. A977). J. Microsc,
110, 257.
431. Skaer H. le В., Franks F., Echlin P. A978). Cryobiology, 15, 589
432. Saubermann A. J., Riley W., Echlin P. A977). SEM/1977/I, IIT Research
Institute, Chicago, Illinois, p. 347.
433. Echlin P., Sauberman A. J., Franks F., Skaer H. le B. A978). Microscopia
Ada Suppl. 2, S. HirzeJ Verlag, Stuttgart, p. 64.
434. Schiller A., Sonnhof U , Taugner R. A979). Microskopie, 35, 23
435. Barnard T. A980). Л Microsc, 120, 93.
436. Costello M. J., Cortess J. M. A978). /. Microsc, 112, 17.
437. Heuser J. E., Reese T. S., Dennis M. J., Jan J, Jan L., Evans, L. A979).
/. Cell ВЫ., 81, 275.
438. Moor H., Kistler J., Mutler M. A976). Experientia, 32, 805.
439. Buchheim W., Welsch U. A977). /. Microsc, 111, 339.
440. Chang S. H., Mergner W. J., Pendergrass R. E., Bulger R. E., Berezes-
ky I. K., Trump, B. F. A980). /. Histochem. Cytochem., 28, 47.
441. Rail W. F., Reid D. S., Farrant J. A980). Nature, 286, 511.
442. Meryman H. A966). In Gryobiology, Chap. 13, ed. H. Meryman, Academic.
New York.
443. Burstone M. S. A969). Phys. Tech. Biol. Res., Illc, 1.
444. MacKenzie A. P. A976). Dev. Biol. Stand., 36, 51.
445. Franks J., Clay С S., Peace G. W. A980). SEM/1980/I, SEM Inc. AMF
O'Hare, Illinois, p. 155.

332 Литература
446. Ingram F. D., Ingram M. J. A980). SEM/1980/IV, SEM Inc., AMF O'Hare,
Illinois, p. 147.
447. Boyde A. A980). «Proc. 7th European Cong, of Elec. Microscopy», Vol. II,
Den Haag, Netherlands, p. 768.
448. Lechene С P., Bonventre J. V., Warner R. R. A979). In: Microbeam Ana-
Analysis in Biology, eds. С. Р. Lechene, R. R. Warner, Academic, New York,
p. 409,
449. Dorge A., Rick R., Gehring K., Mason J., Thurau K. A975). /. Microsc.
ВЫ. Cell, 22, 205.
450. Applelon Т. С A974). J. Microsc, 100, 49.
451. Barnard Т., Seveus L. A978). J. Microsc., 112, 281.
452. Edelman L. A979). Microscopie. 35, 31
453. Harvey D. M. A980). SEM/1980/II, SEM Inc. AMF O'Hare, Illinois,
p. 409.
454. Marshall A. T. A980). SEM/1980/II, SEM Inc. AMF O'Hare, Illinois,
p. 395.
455. Harvey D. N. R., Hall J. L., Flowers T. J. A976). J. Microsc, 107, 189.
456. Pallaghy С. К. A973). Aust. I. ВЫ. Sci., 26, 1015.
457. Mac Kenzie A. P, Kusler T. A., Luet B. J. A975). Cryobiology, 12, 427.
458. Asquith M. H., Reid D. S. A968). Cryoletters, 1, 352.
459. Lechene С P., Warner R. R. A977). Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 6, 57.
460. Chandler J. A., Battersky S. A979). «X-Ray Microanalysis of Diffusible
and Non-Diffusible Elements in Ultra Thin Biological Tissues Using Hu-
Human Sperm Cells as a Model for Investigating Specimen Preparation», in
Microbeam Analysis in Biology, eds. С Lechene, R. Warner, Academic,
New York.
461. Hodson S., Williams L. A976). J. Cell Sci., 20, 687.
462. Spriggs T. L. B, Wynne Edwards, D. A976). Л Microsc, 107, 35.
463. Appleton Т. С A978). In Electron Microprobe Analysis in Biology, Chap 5,
ed. D. A. Erasmus, Chapman Hall, London.
464. Roomans G. M., Seveus L. A. A976). I. Cell Sci., 21, 119.
465. Moreton R. В., Echlin P, Gupta B. L., Hall T. A., Weis-Fogh T. A974).
Nature, 247, 113.
466. Saubermann A. J. A980). SEM/1980/II, SEM Inc. AMF O'Hare, Illinois,
p. 421.
467. Saubermann A. J., Riley W., Becukes R. A977). /. Microsc, HI, 39.
468 Bulger R. E., Beenwkes R, Saubermann A. J. A981). /. Cell Biol., 88,
274.
469 Hodson S., Marshall J. A972). I. Microsc, 95, 459.
470. Frederik P. M., Busing W. M. A981). J. Microsc, 122B), 217.
471. Marshall А. Т., Wright A. A973). Micron, 4, 31.
472. Yeo A. R., Lauchli A., Kramer D., Gullasch J. A977). Planta, 134. 35.
473. Hutchinson T. E., Borek J. R. A979). Ultrarnicroscopy, 4, 233.
474. Talmon Y., Thomas E. L. A977). SEM/1977/I, IIT Research Institute, Chi-
Chicago, Illinois, p. 265.
475. Talmon Y., Thomas E. L. A977). J. Microsc, 111, 151.
476. Thomas R. S. A969). Adv. Opt. Electron Microsc, 3, 99.
477. Albright J. Lewis R. A965). /. Appl. Phys., 36, 2615.
478. Davis T. W., Morgan A. J. A976). J. Microsc, 107, 47.
479. Meyer G. W., Stewart W. A977). SEM/1977/I, IIT Research Institute,
Chicago, Illinois, p. 341.
480. Holman W. R. A974). In Principles and Techniques of Electron Micro-
Microscopy, vol. 4, ed. M. A. Hayat, Van Nostrand Reinhold, New York.
481 Barnard Т., Thomas R. S. A978). I. Microsc, 113, 269.
482. Muller M., Marti Т., Kriz S. A980). Proceedings of the Seventh European
Congress on Electron Microscopy. Seventh European Congress on EM
Foundation, Leiden, The Netherlands, Vol. 2, p. 720.

Литература 333
483. Steinbiss H., Schmitz К. A973). Algen Planta, 112, 253.
484. Van Zyl J. Forrest Q C, Hocking C, Pallaghy С. К. A976). Micron, 7,
213.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА1»
В дополнительную литературу включены публикации, вышедшие с кон-
конца 1978 г. по конец 1983 г. Литература до 1978 г. имеется в книге «Практиче-
«Практическая растровая электронная микроскопия», выпущенной издательством «Мир»
в 1978 г.
Литература по растровой электронной микроскопии
1. Приборостроение, электронная оптика, методы
1. Wetzid К., Edelmann J., Erler E Exp. Techn. Phys., 216, 589 A978).
2. Comins N. R., Hegstberger M. M. E., Thirlwall H. /. Phys., Ell, 1041
A978).
3. Unitt B. M., Jones A. V. SEM/1978/1, SEM Inc., AMF OTIare, 111., p. 27.
4. Pawley J. В., ibid., p. 157.
5. Sewell P. B, Ramachandran K- N., ibid., p. 221.
6. Bludorn J., ibid., p. 283.
7. Arrowsmith H. W. et al., ibid., p. 311.
8. Moncrieff D. A., Robinson V. N. E., Harris L. /. Phys., Dll, 2315 A978).
9. Tovey N. K., Wang K. Y. SEM/1978/1, SEM Inc., AMF O'Hare, III., p. 381.
10. Miller D. E., ibid., p. 513.
11. Reimer L., Popper W., Brocker W., ibid., p. 705.
12. DeNee P В., ibid., p. 741.
13. Wang D. N. K., Miller D. J., Fulrath R. M., ibid., p. 777.
14. Ward С M., Hendricks С D., Weinstein B. W., ibid., p. 783.
15. Bushbeck F., Horl E. M., ibid., p. 835.
16. Ncidrig H., ibid., p. 841.
17. Robinson V. N. E., George E. P., ibid., p. 859.
J8. Васичев Б. Н. — Оптико-мех. пром., № 11, 30 A978).
19. Howell P. G. T. Scanning, 1, 118 A978).
20. Arndt J., Hantsche H., Schmidt D. Scanning, 1, 125 A978)
21. Boyde A. Scanning, 1, 157 A978).
22. Moncrieff D. A., Barker P. R. Scanning, 1, 195 A978).
23. Седов Н. Н., Дюков В. Г., Гавриков С. И. — Радиотехника и электрони-
электроника, 24, 138 A979).
24. Stohr P. L., Huabener R. P. Cryogenics, 19, 472 A979).
25. Hiroyoshi S. Surface Sci., 86, 610 A979).
26. Broers A. N. SEM/1979/1, SEM Inc., AMF O'Hare, 111., p. I
27. Holburn D. M., Smith К. С A. SEM/1979/2, SEM Inc., AMF O'Hare,
111., p. 47.
28. Davidson D. L., ibid., p 79.
29. Moll S. H., ibid., p. 149.
30. Schauer P., Autrata R. /. microsc. et spectrosc. electron., 4, 633 A979)
31. Manning M. I., Goodhew P. J. /. Phys., E12, 464 A979).
32. Hantsche H. Scanning, 2, 20 A979)
'' Составлена титульным редактором.

334 Литература
33. Danilatos G. D., Robinson V. N. E. Scanning, 2, 72 A979).
34. Klaffke D., Maennig W. W., Westphal K. Scanning, 2, 129 A979).
35. Wells О. С Scanning, 2, 199 A979).
36. Тупик А. А., Васичев Б. Н. Оптико-мех. пром., № 8, 57 A979).
37. Сасов А. Ю., Спивак Г. В., Pay Э. И. — Изв. АН СССР, сер. физич., 44,
1138 A980).
38. Бочаров Е. П. — Оптико-мех. пром., № 3, 27 A980).
39. Sogard M. R. Scanning, 3, 210 A980).
40. Parker В. A. Micron, 11, 331 A980).
41. Danilatos G. D. Micron, 11, 335 A980); Scanning, 3, 215 A980).
42. Гелевер В. Д., Ченцов Ю. В. —Изв. АН СССР, сер. физич., 44, 1149
A980).
43. Howell P. G. Т., Boyde A. Scanning, 3, 218 A980).
44. Barber V. С, Emerson С. J. Scanning, 3, 202 A980).
45. Stolz W. Prakt. Metallogr., 17, 554 A980).
46. Голубев В. П., Силаев Л. Н. — Изв. АН СССР, сер. физич., 44, 2200
A980).
47. Pawley J. В., Hayes Th. L. Scanning, 3, 161 A980).
48. Crewe A. V. Scanning, 3, 176 A980).
49. Obyden S. K-, Saparin G. V., Spivak G. V. Scanning, 3, 181 A980).
50. Tanaka K. Scanning, 3, 206 A980).
51. Абрамов Г. Л., Васичев Б. Н. — Оптико-мех. пром., № 1, 60 A980).
52. Rau E. I., Sasov A. Yu., Spivak G. V. Scanning, 3, 242 A980).
53. Невзорова Л. Н., Фаворская Л. П. — Изв. АН СССР, сер. физич., 44,
1152 A980).
54. Дер-Шварц Г. В. —Изв. АН СССР, сер. физич., 44, 1165 A980).
55. Neal R. J., Mills A. Scanning, 3, 292 A980).
56. Zeitler E. Led. Notes Pays., 112, 513 A980).
57. Wergin W. P., Pawley J. B. SEM/1980/1, SEM Inc., AMF O'Hare, 111.,
p. 239.
58. Pfefferkorn G., Brocker W., Hastenrath M., ibid., p. 251.
59. Holt D. В., Datta S., ibid., p. 259.
60. Volbert В., Reimer L. SEM/1980/4, SEM Inc., AMF O'Hare, 111., p. 1.
61. Crawford С. К., ibid., p. 11.
62. Duraud S. E. M. et al., ibid., p. 49.
63. Panessa B. J. et al. Scanning, 4, 21 A981).
64. Howell P G. T. Scanning, 4, 40 A981).
65. Huang L. Y. SEM/1981/1, SEM Inc., AMF O'Hare, 111., p. 21.
66. Niedrig N., ibid., p. 29.
67. Kyser D. F., ibid., p. 47.
68. Newbury D. E., ibid., p. 71.
69. Boyde A., ibid., p. 91.
70. Hart R. K. et al., ibid., p. 97.
71. Le Gressus C. Okuzumi H., Massignon D., ibid., p. 251.
72. Love G. et al. Scanning, 4, 32 A981).
73. Krakow W. Ultramicroscopy, 6, 387 A981).
74 Baumann W., Reimer L. Scanning, 4, 141 A981).
75. Kotera M., Murata K., Nagami K. /. Appl. Pays., 52, 7403 A981).
76. Balladore et al. /. microsc. et spectrosc. electron., 5, 371 A981).
77. Danilatos G. D. Scanning, 4, 9 A981).
78. Lewis E. R., Pawley J. B. Scanning, 4, 131 A981).
79. Hall J. В., Hruskoci P. P. Scanning, 4, 175 A981).
80. Kammrath W. Scanning, 4, 204 A981).
81. Спивак Г. В., Pay Э. И., Сасов А. Ю. — УФН, 139, в. 1, 165 A981).
82. Филиппов М. Н., Спивак Г. В., Pay Э. И. — Поверхность, № 12, 77
A982).
83. Голубев В. П. — Радиотехника и электроника, 26, 826 A981).

Литература 335
84. Обыден С К-, Попов С. И., Сапарин Г. В. — Поверхность, № 11, 97
A982).
85. Васичев Б. Н. Абрамов Г. Л. — Оптико-мех. пром., № 7, 21 A982).
86. Васичев Б. Н., Рыбаков Ю. Л. — Оптико-мех. пром., № 8, 44 A982).
87. Рыбаков Ю. Л., Васичев Б. Н., Шашин Е. П. —Изв. АН СССР, сер. фи-
зич, 46, 2373 A982).
¦88. Егоров В. Л., Иванов М. М., Ченцов Ю. В. —Изв. АН СССР, сер. фи-
зич., 46, 2376 A982).
«9. Vicario Е. /. microsc. et spectrosc. electron., 7, 91 A982).
•90. Werner U, Bethge H., Heydenreich H. Ultramicroscopy, 8, 417 A982).
91. Hobbs S. Y. Rev. Sci. lnstr., 53, 1097 A982).
S2. Hobburn D. M., Smith К. С A. /. Microsc. (Gr. Brit.), 127. Pt. 1, 93
A982).
93. Martin J P Prakt. Metallogr., 19, 224 A982).
94. Walker С. Т., Giacchetti G., Ransch J. /. Phys., E15, 1235 A982).
95. Seifert H. Cryogenics, 22, 657 A982).
96. Иванов М. М. и др. —Изв. АН СССР, сер. физич., 46, 2379 A982).
97. Дюков В. Г., Коломейцев М. И., Петров В. И. — Изв. АН СССР, сер. фи-
физич., 46, 2384 A982).
98. Дицман С. А. и др. —Изв. АН СССР, сер. фнзич., 46, 2388 A982).
99. Ikuta Т. Appl. Phys. Lett., 42, 533 A983).
100. Campbell E. R., Reisner J. H., Chung К- Т. /. Appl. Phys., 54, 1133 A983).
101. Олейник А. С, Орловский Р. М., Потахин В. В. —Изв. АН СССР, сер.
физич., 47, 1063 A983).
102. Крапухин В. В. и др. — Изв. АН СССР, сер. физич., 47, 1070 A983).
103. Веприк В. Г. и др. — Изв. АН СССР, сер. физич., 47, 1073 A983).
104. Смирнов Ю. С, Васичев Б. Н., Камунин А. А. — Изв. АН СССР, сер. фи-
физич., 47, 1078 A983).
105. Стоянов П. А. и др. — Изв. АН СССР, сер. физич., 47, 1100 A983).
2. Обработка изображения, работа с мини-ЭВМ
1. Vicario E., Escudie В, Hellion A. /. microsc. et spectrosc. electron., 4, 341
A979).
2. Lebiedzik J. et al. SEM/1979/2, SEM Inc., AMF O'Hare, 111., p. 61.
3. Dixon R. N., Taylor С J., ibid., p. 361.
4. Lebiedzik J. Scanning, 2, 230 A979).
5. Васичев Б. Н. — Оптико-мех. пром., № 7, 49 A980).
6. Кузьмин В. А., Бочко Р. А. — Изв. АН СССР, сер. фнзич., 44, 2154
A980).
7. Jones A. J., Unitt В. М. SEM/1980/1, SEM Inc., AMF O'Hare, III., p. 113.
8. Lee R. J., Kelly J. F., ibid., p. 303.
9. Kelly J. F., Lee R. J, Lentz S., ibid., p. 311.
10. Jones A. V. /. microsc. et spectrosc. electron.,, 5, 595 A980).
11. Сасов А. Ю Спивак Г. В. Pay Э. И.—-Радиотехника и электроника, 26,
652 A981).
12. Jeulin D. /. microsc. et spectrosc. electron., 7, 101 A982).
13. Sasov A. Yu., Sokolov V. N.. Rau E. I. SEM/1982/1, SEM Inc., AMF
O'Hare, III., p. 17.
14. Sasov A. Yu., Osipov V. I., Sokolov V. N. In «Proc. 10th Internat. Cong.
Electron Microscopy», Hamburg, BRD, 1982, p. 537.
15. Соколов В. Н., Дементьева О. В., Сасов А. Ю. — Поверхность, № 11, 111
A982).
16. Artz В. Е. Scanning, 5, 129 A983).
17. Дайн Б. Н. и др.— Изв. АН СССР, сер. физич., 47, 1103 A983).
18. Куляс О. Л. — Изв. АН СССР, сер. физич., 47, 1095 A983).

336 Литература
3. Применение в материаловедении
1. Mah M, Boatman E. S. SEM/1978/1, SEM Inc., AMF O'Hare, 111., p. 85.
2. Bishop К. et al., ibid., p. 207.
3. Hayes Т. L., Tobias С. A., Yang Т. С, ibid., p. 233.
4. Whalley W. В., ibid., p. 353.
5. Grant P. R., White S. H., ibid., p. 789.
6. Bull P. A., ibid., p. 821.
7. Krinsley D., Tovey N. К-, ibid., p. 887.
8. Ihrig H., Klerk M Appl. Phys. Lett., 35, 307 A979).
9. Datta S., Boswarva I. M., Holt D. B. Phys. and Chem. Solids, 40, 567
A979).
10. Schmidt P. F., Grewe H. G., Pfefferkorn G. Scanning, 1, 174 A978).
11. Степанов Г. В. и др. — Изв. АН СССР, сер. физич., 43, 1865 A979).
12. Osterlund R., Vingsbo О. Ultramicroscopy, 4, 155 A979).
13. Morin P. et al. Scanning, 2, 217 A979).
14. Лукьянов А. Е. и др. — Изв. АН СССР, сер. физич., 44, 1285 A980).
15. Бороздин В. К-, Лукьянов А. Е., Бутылкина Н. А. — Изв. АН СССР, сер.
физич., 44, 1308 A980).
16. Tovey N. К-, Krinsley D. H. J. Microsc. (Gr. Britain), 120, Pt. 3, 279
A980).
17. Roberts S. H., Steeds J. W. Scanning, 3, 165 A980).
18. Акчурин М. Ш., Галстян В. Г. — Изв. АН СССР, сер. физич., 44, 2134
A980).
19. Галстян В. Г. и др. — Изв. АН СССР, сер. физич., 44, 1235 A980).
20. Fourie J. T. SEM/1981/I, SEM Inc., AMF O'Hare, 111., p. 127.
21. Uchikawa Y., Ikeda S., ibid., p. 209.
22. Sprunt E. S., ibid., p. 525.
23. Schmidt R. F., Grewe H. G., ibid., p. 367.
24. Davidson D. L., ibid., p. 403.
25. Hall M. G., ibid., p. 409.
26. Akhter P., Venables J. A. Surface Sci., 103, 301 A981).
27. Glaeser W. A. Wear, 73, 371 A981).
28. Meyer K. P., Blumtritt H., Szczesniak L. Ultramicroscopy, 6, 67 A981).
29. Брук А. С. и др. — Физика и техн. полупроводн., 16, 1510 A982).
30. Брук А. С. и др. — Поверхность, № 10, 107 A982).
31. Ballesteros С, Llopis J., Piqueras J. Solid State Commun., 43, 739 A982).
32. Степанов Г. В. и др. — Изв. АН СССР, сер. физич., 46, 2399 A982).
33. Бузынин А. Н. и др. — Изв. АН СССР, сер. физич., 47, 1136 A983).
34. Вдовин В. И., Говорков А. В. — Изв. АН СССР, сер. физич., 47, 1205
A983).
35. Bast G., Haase G., Zorgiebel F. Scanning, 5, 84 A983).
36 Брук А. С. Говорков А. В. — Изв. АН СССР, сер. физич., 47, 1202
A983).
37 Комолова Л. Ф. и др. — Изв. АН СССР, неорг. материалы, 19, 1802
A983).
4. Применение в геологии
1. Mehta A. et al. SEM/I978/1, SEM Inc., AMF O'Hare, 111., p. 171.
2. Burns V. M., Burns R. G., ibid., p. 245.
3. Alexandersson E. Т., ibid., p. 500.
4. Harris L. A., Yust С S., ibid., p. 537.
5. Greer R. Т., ibid., p. 621.
6. Rebagay T. V., Mori S., ibid., p. 663.
7. Zewin S. Z., Charola A. E., ibid., p. 695.
8. Rebagay T. V, Shou J. K., ibid., p. 669.
9. Osipov V. I., Sokolov V. N. Bull, of the I.A.E.G., No. 17, 91 A978).

Литература 337
10. Green D A., DeNee P. В., Frederickson R. G. SEM/1979/1, SEM Inc., AMF
O'Hare, III, p. 495.
П. Сергеев Е М. и др. — Инженерная геология, № 2, 48 A979).
12. Sergeyev E. M. et al. /. Microsc. (Gr. Britain), 120, Pt. 3, 237 A980).
13. Соколов В. Н. и др. — Геология и геофизика, № 7, 20 A980).
14. Le Gressus С, Massignon D., Remond R. SEM/1980/4, SEM Inc., AMF
O'Hare, 111., p. 85.
15. Сергеев Е. M. и др. — Инженерная геология, № 4, 92 A980).
16. Sergeyev E. M. et al. Scanning, 3, 262 A980).
17. Sokolov V. N., Osipov V. I., Tolkachev M. D. /. Microsc. (Gr. Britain), 120,
Pt. 3, 363 A980).
18. Pesheck P. S., Seriven L E., Davis H. T. SEM/1981/1, SEM Inc., AMF
O'Hare, III., p. 515.
19. Tovey N. K., Sokolov V. N., ibid, p. 537.
20. Lewin S. Z., Charola A. E., ibid., p. 555.
21. Lewin S. Z., Charola A. E., ibid., p. 563.
22 O'Brien N R., ibid., p. 569.
23. Wise W. S. et al., ibid., p. 577.
24. Durham W. В., ibid., p. 585.
25. Gantt D G., Cring F. D., ibid., p. 595.
26. Peters Th. A., ibid., p. 603.
27. Nuhfer E. B. et al., ibid., p. 625.
28. Wise W. S., Pierce D., ibid., p. 633.
29. Gibbons D. L. et al., ibid., p. 641.
30. Calvo F. A. et al. Scanning, 5, 32 A983).
5. Применение в биологии
1. Scanning Electron Microscopy, 1978, part 2, ed. Om Joliari, SEM Inc., AMF
O'Hare, III, 1978, p. 1152.
2. Roath S. et al. Nature, 273, No. 5657, 15 A978).
3. Jones D. Micron, 9, 95 A978).
4. Brocker W., Pfefferkorn G. SEM/I979/2, SEM Inc., AMF O'Hare, 111.,
p. 125.
5. Peters K. R-, ibid., p. 133.
6. Humphreys W. J., Henk W. G., Chandler D. В., ibid., p. 345.
7. Boyde A., Jones S. J., ibid., p. 394.
8. Becker R. P., Sogard M., ibid., p. 835.
9. Draenert Y., Draenert K. Scanning, 2, 57 A979).
10. Ровенский Ю. А. «Растровая электронная микроскопия нормальных и опу-
опухолевых клеток». — М.: Медицина, 1979, с. 154.
П. «Biomedical Research Applications of Scanning Electron Microscopy», ed.
J. M Hodges and R. F. Hallowes, Academic Press, London — New York,
v. 1, 1979, p. 363.
12. «Biomedical Research Applications of Scanning Electron Microscopy», ed.
R. F. Hallowes and*J. M. Hodges, v. 2, Academic Press, London — New York,
1980, p. 316.
13. Мишустина И. Е. и др. — Изв. АН СССР, сер. биолог., № 3, 395 A980).
14. Ogura К., Laudate A. SEM/1980/1, SEM Inc., AMF O'Hare, 111., p. 233.
15. Pawley J. B. et al. Scanning, 3, 219 A980).
16. Collins V. P., Brunk U. T. Scanning, 3, 153 A980).
17. Jablonski W., Lytton D. G. Scanning, 3, 288 A980).
18. Scanning Electron Microscopy, 1980, part 2, ed. R. P. Becker and Om Joha-
ri, SEM Inc., AMF O'Hare, III, 1980, p. 658.
19. Scanning Electron Microscopy, 1980, part 3, ed. Om Johari and R P. Be-
Becker, SEM Inc., AMF O'Hare, 111., p. 670.
20. Scanning Electron Microscopy,' 1980, part 4, ed. Om Johari, SEM Inc., AMF
O'Hare, 111., p. 312.

338 Литература
21. Echlin P. SEM/1981/1, SEM Inc., AMF O'Hare, 111., p. 1.
22. Raymond R., Davies Th. D., ibid., p. 651.
23. Scanning Electron Microscopy, 1981, part 2, ed. Om Johari, SEM Inc., AMF
O'Hare, 111., 1981, p. 576.
24. Scanning Electron Microscopy, 1981, part 3, ed. Om Johari, SEM Inc., AMF
O'Hare, 111., 1981, p. 500.
25. Ровенский Ю. А. и др. — Экспериментальная онкология, 3, № 4, 30
A981).
6. Подготовка образцов
1. Echlin P. SEM/1978/1, SEM Inc., AMF O'Hare, 111., p. 109.
2. de Harven E., Lampen N.. Pla D., ibid., p. 167.
3. Tovey N. K., Eyles N., Turner R., ibid., p. 393.
4. Greer R. Т., Vale B. H., Knoll R. L., ibid, p. 633.
5. Scanning Electron Microscopy, 1978, part 2, ed. Om Johari, SEM Inc., AMF
O'Hare, 111, p. 1152.
6. Murakami T. Scanning, 1, 127 A978).
7. Shalton P. F., Mowezko W. E. Scanning, 1, 166 A978).
8. Ровенский Ю. A. — Цитология 20, № 3, 365 A978).
9. Boyde A., Maconnachie E. Scanning, 2, 149 A979).
10. Moncur M. W. Scanning, 2, 175 A979).
11. Rosenberg W. Scanning, 2, 178 A979).
12. Zipp R. D. SEM/1979/1, SEM Inc., AMF O'Hare, 111, p. 355.
13. Schiff P. F, Gennaro J. F. Scanning, 2, 135 A979).
14. Gantt D. G. SEM/1979/2, SEM Inc., AMF O'Hare, 111, p. 491.
15. Geller J. D., Voshioka Т., Hurd D. A, ibid., p. 355.
16. Караганов Я. Л. и др. — Архив анатомии, № 6, 111 A979).
17. Караганов Я. Л, Гусев С. А, Миронов В. А. — Архив анатомии, № 6, 90
A980).
18. Gunji Т., Wakita M, Kobayashi S. Scanning, 3, 227 A980).
19. Broers A. N., Spiller E. SEM/1980/1, SEM Inc., AMF O'Hare, III., p. 201.
20. Ross R C, Blanchard D. B. Scanning, 3, 300 A980).
21. Pohl M, Burchard W. G. Scanning, 3, 251 A980).
22. Hollweg H. G, Buss H. Scanning, 3, 3 A980).
23. Reimer L, Tollkamp С Scanning, 3, 35 A980).
24. Scanning Electron Microscopy, 1980, part 2, ed. R. P. Becker and Om Joha-
Johari, SEM Inc., AMF O'Hare, 111, 1980, p. 658.
25. Scanning Electron Microscopy, 1981, part 2, ed. Om Johari, SEM Inc., AMF
O'Hare, 111, 1981, p. 576.
26. Scanning Electron Microscopy, 1981, part 3, ed. Om Johari, SEM Inc., AMF
O'Hare, 111, 1981, p. 500.
27. Vesely P. Scanning, 4, 3 A981).
28. Rosowski J. K- et al. Scanning, 4, 181 A981).
29. Campbell G. J, Roach R. Scanning, 4, 188 A981).
30. Evans A. C, Franks J. Scanning, 4, 169 A981).
31. Echlin P. SEM/1980/1, SEM Inc., AMF O'Hare, 111, p. 79.
32. Dahlberg E. P, Zipp R. D, ibid, p. 423.
33. Chafouri S. N, Fitch R. K, Ball P. С Vacuum, 31, 33 A981).
34. Караганов Я. Л. и др. Архив анатомии, № 8, 5 A981).
35. Свипкина Т. М. и др. В сб.: «Немышечные двигательные системы». — М.:
Наука, 1981, стр. 76.
36. Becke A, Porter R, Reed N. D, /. Microsc. (Gr. Britain), 125, Pt. 2, 193
A982).
37. Campbell G. J, Roach M. R. Scanning, 5, 137 A983).
38. Рикберг А. Б, Кацен А. Д, Чумяк С. М. — Препринт ин-та физики АН
УССР (Киев),№ 17, 1983.

Литература 339
Литература по рентгеновскому микроанализу
1. Приборостроение, электронная оптика, методы
1. Lodding В., Reimer L. Scanning, I, 225 A978).
2. Geller J. D. SEM/1978/1, SEM Inc., AMF O'Hare, 111., p. 201.
3. Barbi N. C, Giles M. A., Skinner D. P., ibid., p. 193.
4. Deinwiebel I., ibid., p. 807.
5. Bolon R. ?., ibid., p. 813.
6. Reuter W. et al. /. Phys., Dll, 2633 A978).
7. Newbury D. E. SEM/1979/2, SEM Inc., AMF O'Hare, 111., p. 1.
8. Белькинд Г. Л. В сб.: «Аппаратура и методы рентгеновского анализа»,
вып. 22. — Л.: Машиностроение, 1979, с. 105.
9. Гимельфарб Ф. А., Бернер А. И., Ухорская Т. А. — Ж. аналит. химии, 34,
10 A979).
10. Гимельфарб Ф. А., Бернер А. И. —Ж. аналит. химии, 34, 42 A979).
11. Васичев Б. Н. — Оптико-мех. пром., N° 11, 50 A979).
12. Крзленков А. И. — Оптика и спектроскопия, 46, 579 A979).
13. Козленков А. И., Белов Ю. И., Богданов В. Г. — Письма в ЖТФ, 5, 363
A979).
14. Beswick J. M. Scanning, 2, 171 A979).
15. Козленков А. И. — Оптика и спектроскопия, 48, 390 A980).
16. Козленков А. И. и др.— Зав. лаб., 46, 313 A980).
17. Гнманов В. П. и др. — Приборы и техн. экспер., № 3, 217 A980).
18. Гиманов В. П. и др. В сб.: «Аппаратура и методы рентгеновского анализа»,
вып. 24. — Л.: Машиностроение, 1980, с. 174.
19. Adesida I., Shimizu R., Everhart T. E. /. Appl. Phys., 51, 5962 A980).
20. Statham P. J., Jones M. Scanning, 3, 168 A980).
21. Bank H. L., Forst A. J., Lam Ch. F. Ultramicroscopy, 5, 153 A980).
22. Васичев Б. Н. и др. — Изв. АН СССР, сер. фнзич., 44, 1275 A980).
23. Conjeaun М. /. microsc. et spectrosc. electron., 5, 147 A980).
24. Bishop H. E. /. microsc. et spectrosc. electron., 5, 341 A980).
25. Henoc J., Maurice F. /. microsc. et spectrosc. electron., 5, 347 A980).
26. binders P. W. J., Stols A. L. H., Stadhouders A. M. Micron, 12, 1 A981).
27. Chaari X., Landron C. /. microsc. et spectrosc. electron., 6, 545 A981).
28. Landron С Vacuum, 31, 291 A981).
29. Love G., Scott V. D. Scanning, 4, 111 A981).
30. Гайдукова И. С, Ильина О. Ю., Ярмусевич Я- С. — Изв. АН СССР, сер.
физич., 44, 1294 A980).
31. Sandborg А. О., Merkle А. В. SEM/1981/1, SEM Inc., AMF O'Hare, 111.,
p. 63.
32. Small J. A., ibid., p. 447.
33. Johnson D. L. et al., ibid., p. 469.
34. Myklebust R. L., Small J. A., Newbury D. E., ibid., p. 477.
35. Daguet C, Henoc J. /. microsc. et spectrosc. electron., 6, 77 A981).
36. Гимельфарб Ф. А. и др. — Зав. лаб., 47, № 9, 48 A981).
37. Дедегкаев Т. Т., Рыбников А. И., Крюков И. И. В сб.: «Аппаратура и
методы рентгеновского анализа», вып. 27. — Л.: Машиностроение, 1982,
с. 10.
38. Гимельфарб Ф. А., Бернер А. И., Ухорская Т. А. — Ж. аналит. химии, 37,
338 A982).
39. Васичев Б. Н., Рыбаков Ю. Л. Оптико-мех. пром., № 5, 15 A982).
2. Обработка информации и работа с мини-ЭВМ
1. Legge G. J. F., Hammond I., /. Microsc. (Gr. Britain), 47, Pt. 2, 201
A979).

340 Литература
2. Scott W. R., Chatfield E. J., SEM/1979/2, SEM Inc., AMF O'Hare, 111.,
p. 53.
3. Hanna R. В., Karcich K. J., Johnson D. L, SEM/1980/1, SEM Inc., AMF
O'Hare, 111., p. 323.
4. Сидоров А. Ф., Рудашевскин Н. С. В сб.: «Аппаратура и методы рентге-
рентгеновского анализа», вып. 23. — Л.: Машиностроение, 1980, с. 189.
5. Боронихнн В. А., Целин А. И., там же, с. 204.
6. Лаврентьев Ю. Г. и др., там же, с. 217.
7. Лукьянченко Е. М. и др., там же, с. 225.
8. Тронева Н. В., Падчин Ю. Г., там же, с. 232.
9. Ходан А. Н., Вечканов В. Н., там же, с. 242.
10. Лукьянченко Е. М. н др. В сб.: «Аппаратура и методы рентгеновского ана-
анализа», вып. 24. — Л.: Машиностроение, 1980, с. 189.
11. Вайншенкер И. А. и др. В сб.: «Аппаратура и методы рентгеновского ана-
анализа», вып. 25. — Л.: Машиностроение, 1981, с. 21.
12. Skarnulis A. J. /. Microsc. (Gr. Britain), 127, Pt. 1, 39 A982).
3. Применение в материаловедении
1. Raymond R., Gooley R. SEM/1978/1, SEM Inc., AMF O'Hare, 111., p. 93.
2. Finkelman R. В., ibid., p. 143.
3. Hayes T. L., Pawley J. В., Fisher G. L., ibid., p. 239.
4. Гимсльфарб Ф. А., Шварцман С. Л. «Современные методы контроля ком-
композиционных материалов».—М.: Металлургия, 1979, с. 248.
5. Mogami К- et al. SEM/1979/1, SEM Inc., AMF O'Hare, 111., p. 433.
6. Wieser P., Wurster R. Scanning, 2, 29 A979).
7. Вишневский А. С, Делсвн В. Г., Никитюк А. Ф. В сб.: «Аппаратура и ме-
методы рентгеновского анализа», вып. 24. — Л.: Машиностроение, 1980 с. 115.
8. Venables J. A. et al. /. Microsc. (Gr. Britain), 118, Pt. 3, 351 A980).
9. Антошин М. К. и др.— Изв. АН СССР, сер. физич., 44, 1290 A980).
10. Morlevat J. P. /. microsc. et spectrosc. electron., 6, 607 A981).
11. Stocker H. J. et al. /. Electrochem. Soc, 128, 746 A981).
12. Гимельфарб Ф. А., Бочкарев Э. П., Мильвидский M. Г. — Кристаллогра-
Кристаллография, 26, 235 A981).
13. Бочкарев Э. П. и др. — Поверхность, № 2, 115 A982)..
14. Крюков Ф. Н., Голованов В. Н. В сб.: «Аппаратура и методы рентгенов-
рентгеновского анализа», вып. 27. — Л.: Машиностроение, 1982, с. 22.
15. Сахаров В. В. и др. — Изв. АН СССР, сер. неорг. материалы, 19, 26
A983).
4. Применение в геологии
1. Moza А. К., Austin L. G., Johnson G. G. SEM/1979/1, SEM Inc., AMF
O'Hare, 111., p. 473.
2 Jeanrot P. J. microsc. et spectrosc. electron., 5, 99 A980).
3 Schwander H., Gloor F. X-Ray Spectrom., 9, 134 A980).
4. Moza A. K., Strickler D. W., Austin L. G. SEM/1980/4, SEM Inc., AMF
O'Hare, 111., p. 91.
5. Kramers J. W., Rottenfusser B. A., ibid., p. 97.
6. Барсанов Г. П., Кудрявцева Г. П. В сб.: «Неоднородности минералов». —
М.: Наука, 1980, с. 39.
7. Henstra S., et al. SEM/1981/1, SEM Inc., AMF O'Hare, 111., p. 439.
8. Gooley R. ibid., p. 493.
9. Гараннн В. К., Кудрявцева Г. П., Пермитова М. С. — Записки Всесоюзн.
минералог, об-ва, вып. 110, 613 A981).

Литература 341
10. Афанасьев В. П., Гаранин В. К., Кудрявцева Г. П. — Геол. рудн. место-
месторождений, № 2, 12 A981).
11. Гаранин В. К., Кудрявцева Г. П. «Применение электронно-зондовых при-
приборов для изучения минералогического вещества». — М.: Недра. 1983,
с. 216.
5. Применение в биологии
1. Scanning Electron Microscopy, 1978, part 2, ed. Om Johari, SEM Inc., AMF
O'Hare, 111., 1978, p. 1152.
2. Davis D. Micron, 9, 175 A978).
3. Quinton P. M. Micron, 9, 57 A978).
4. Landis W. J. SEM/1979/2, SEM Inc., AMF O'Hare, 111., p. 555.
5. Chandlen J. A., ibid., p. 595.
6. Saubermann A. J., ibid., p. 607.
7. Panessa-Warren B. J., ibid., p. 691.
8. Galle P., Berry J. P., Lefevre R., ibid., p. 709.
9. Somlyo A. P. et al., ibid., p. 711.
10. Scanning Electron Microscopy, 1980, part 2, ed. R. P. Becker and Om Joha-
Johari, SEM Inc., AMF O'Hare, 111., 1980, p. 658.
11. Scanning Electron Microscopy, 1980, part 4, ed. Om Johari, SEM Inc., AMF
O'Hare, 111., 1980, p. 312.
12. Scanning Electron Microscopy, 1981, part 2, ed. Om Johari, SEM Inc.,
AMF O'Hare, 111., 1981, p. 576.
13. Втюрин Б. В., Каем Р. И. — Бюлл. эксп. биол. и мед., № 9, 117 A982).

ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
Аберрация 13A)
Абсолютное значение генерируемой
интенсивности 6B)
Абсолютная массовая доля 89, 94,
96B)
Автоэмиссионная пушка 183B)
Агломерация 169B)
Анализатор многоканальный 211,
247A), 119B)
— одноканальный 190, 201, 296A)
Анализ биологических объектов с по-
помощью спектрометра с дисперсией
по энергии 284A)
— импульсов по амплитуде 198,
201A)
— качественный с помощью кри-
кристалл-дифракционного спектромет-
спектрометра 286A)
— качественный с помощью спект-
спектрометра с дисперсией по энергии
282, 285A)
— качественный рентгеновский
269A)
— количественный, рабочие парамет-
параметры 96B)
— количественный рентгеновский 5,
6, 68, 96, 141B)
— легких элементов 154, 161B)
— следов элементов 149B)
Аналитическая чувствительность 148,
149B)
Аналитический электронный микро-
микроскоп 57A)
Аналого-цифровой преобразователь
247A)
Артефакты 215, 254, 280 A), 70, 196,
205, 206, 260B)
Атомный номер 135, 136A), 185B)
Бериллиевое окно 255A), 113B)
бериллиевые поверхности 86B)
— сетки 91B)
Бете закон торможения 27A)
Бете формула 41A)
Брэгга закон 287A)
Величина потерь 204, 221, 256, 272,
281, 289A)
Вещество для напыления 190, 193B)
Взаимное влияние при исследовании
материалов в рентгеновском мик-
микроанализе 284A)
— в рентгеновском микроанализе
биологических объектов 283A)
Влажные материалы 175B)
Внутренний эталон 95B)
Волокна 169, 271B)
Вскрытие внутренних поверхностей
231B)
Вторичные электроны 58—66A)
глубина выхода 59A)
— — длина пробега 59A)
— — зависимость от наклона объек-
объектов 64A)
состава объекта 63A)
энергии 64A)
обусловленные неупругим рас-
рассеянием 57A)
созданные отраженными элект-
электронами 61 A)
— первичным пучком 61A)
Высоковакуумное испарение 186B)
Газовый пропорциональный счетчик
196A)
Галогены 167B)
Гауссовский зонд, диаметр 13, 15,
17A)
Геометрическая эффективность сбора
265A)
Геометрические эффекты, компенса-
компенсация 51B)
Гиперболический метод 29, 34B)
Гистохимические методы 280B)
Глины 175B)
Глубина выхода 57, 59, 160A)
— генерации рентгеновского излуче-
излучения 80A)
— пробега, экстраполированная
44A)
— фокуса 109A)

Предметный указатель
343
Гомогенности степень 147B)
Гомогенность 146, 167B)
Градиент концентрации 149B)
Детектор
— артефакты 151B)
— ионизационный 147B)
— катодолюминесцентного излучения
133A)
— комбинации 184A)
— окно 109B)
— окружающая среда 232A)
— передаточная характеристика
106B)
— проверка 265A)
— разрешение 210A)
— с преобразованием 128A)
— типа сцинтиллятор-фотоумножи-
тель 124A)
— установка 265A)
— широкоугольный сциннтилляцион-
ный 127A)
— электронов 124A)
— эффективность 199A)
Детекторная электроника 199A)
Диафрагма 240A)
Динамическая фокусировка 116A)
Динамическое восстаиовленне заряда
215A)
Диодное распыление 201B)
с охлаждением 201 B)
Дискриминатор импульсов по ампли-
амплитуде 290A)
Дифференциальное усиление 170A)
Дифференцирование сигнала 174A)
Диэлектрическая пленка, покрытая
углеродом 92B)
Длина пробега электронов 41A)
— пути поглощения 9, 45B)
Доверительная вероятность 147,
148B)
Дрейф усилителя 280A)
Жидкие образцы 272B)
Загрязнения 71, 159, 160B)
— борьба 160B)
Заливка 284B)
Замораживание — замещение 302B)
— способ 290B)
Заполнение тяжелыми металлами
256B)
Идентификация пика 272A)
Изготовление реплик 239B)
— срезов 305B)
Измерение тока падающего пучка 15,
16A)
— толщины пленок с помощью квар-
кварцевого кристалла 194, 213B)
Импульсная оптическая обратная
связь 215A)
Инкапсуляция 288B)
Интенсивность характеристического
рентгеновского излучения 77A)
Интерполяция линейная 103B)
Интерференционные эффекты 214B)
Иоганна оптика 194A)
Иоганссона оптика 193A)
Ионизационный потенциал 18B)
Иоииая пушка 200B)
Искажение изображения 111 A),
177B)
— растра 116A)
Итераций метод 28B)
Калибровка по энергии 123B)
Калибровочные кривые 86, 150B)
Камера с контролируемой средой
217B)
Канайя и Окаяма длина пробега
электронов 42A)
Кастена первое приближение 6B)
Катодолюминесценция 94A)
Качество изображения 152A)
Клетки изолированные 271B)
Кобе метод 73B)
Контраст в режиме поглощенного то-
тока 132, 148A)
— зависящий от атомного номера
135A)
— компонента, обусловленная коли-
количеством вылетающих частиц 143A)
— компонента, обусловленная траек-
торными эффектами 143A)
— обращение 169A)
— расширение диапазона 170A)
с детектором Эверхарта — Торнли
124, 126, 144A)
— с твердотельным детектором 129,
148A)
— топографический 144A)
— электронного каналирования
163B)
— энергетическая компонента 143A)
Концентрация элементов 78B)
Коррекция
— мертвого времени 236A), 140B)
— на атомный номер 17—23B)
побочный фон 90B)
поглощение 8—17, 28, 38, 59,
72, 85B)
поглощение, тонкие пленки
59B)
— угла наклона 112A)

344
Предметный указатель
Коэффициент вторичной электронной
эмиссии 59A), 182B)
— газового усиления 197, 199A)
— отражения 44—47A)
— перекрытия 126—128, 130B)
Крамерса соотношение 73, 74, 79B)
Края поглощения 222A)
Кристалл LiF 194, 196A)
— PbSt 196A)
— PET 196A)
— RAP 196A)
Критерий х2 122B)
-- перекрытия 282A)
Критическая энергия ионизации
71A)
Круг фокусировки 193—195A)
Линейность 121 B)
Лиофильная сушка 252, 295B)
Локализованные области с известной
физиологической активностью
239B)
Магнитные материалы 162B)
Массивная мишень (эксперимент)
78A)
Массовая доля во влажном состоя-
состоянии 84B)
Массовая толщина 79, 86B)
Массовые доли 29, 80, 83B)
— коэффициенты поглощения, легкие
элементы 160B)
— эффект, частицы 42B)
Мертвый слой 113B)
— кремния 222, 255B)
Металлы 162B)
Метод отношения пик/фон 54, 55,
74B)
— ослабления пучка 85B)
— подгонки пика 122B)
— получения отношения элементов
77B)
— с использованием непрерывного
излучения 79, &9B)
— ZAF, второе приближение 34B)
Методы линейные 123B)
— нанесения покрытий 177B)
— нелинейные 132B)
— подгонки с помощью ЭВМ 109B)
— фильтрации 113, 114B)
Микробзоление 316B)
Микроорганизмы 271B)
Микрофонный эффект 232A)
Модуляция интенсивности 101A)
Мозли закон 73A)
Монте-Карло метод моделирования
29A)
Муаровые эффекты 111A)
Наводка заземления 234A)
Наклонное падение электронного
пучка 38B)
Накопление льда — масла 328A)
Наложение импульсов 223A)
Нанесение покрытия 286B)
Неоптимальный режим работы мик-
микроскопа 218B)
Неупругое рассеяние 25A)
Обезвоживание 245, 283B)
Область взаимодействия 28—41A),
45, 48B)
Л'-оболочка 69A)
L-оболочка 69A)
Обработка данных 102B)
— сигнала 164A)
Образцы массивные 269B)
— биологические 72B)
— шероховатые 41, 54B)
Ограничения, накладываемые элект-
электронной оптикой 157A)
Оясе-электроны 92A)
Оконтуривание по интенсивности
182A)
Окрашивание образца 286B)
Определение фазовой диаграммы
167B)
Органеллы 271B)
Органические материалы 86B)
матрица 79, 84B)
Осаждения методы 281B)
Основные указания для проведения
качественного анализа с помощью
спектрометра с дисперсией по энер-
энергии 279A)
Отбор образцов 222B)
Отклоняющие катушки 99A)
Отношение пик/фон 217, 259, 294A),
74, 75B)
— сигнал/шум 224B)
Отображение с «малыми потерями»
162A), 181B)
Отраженные электроны, глубина вы-
выхода 57A)
зависимость от атомного номе-
номера 46A)
— — состава объекта 46A)
энергии 47A)
угла наклона образца
48A)
измерение 46A)
коэффициент 45A)
пространственное распределе-
распределение 55A)
распределение по энергиям
51A)

Предметный указатель
345
угловое распределение 49A)
фактор обратного рассеяния R
17B)
Оценка ошибок 137B)
Ошибка определения 23B)
Ошибки в определении фактора атом-
атомного номера Z 23B)
Пара Ni — Fe 14B)
Перенапряжение 77A)
Пик внутренней флуоресценции
223A)
Пироксен 31B)
Плотность 62A)
Поверхности излома 42B)
— отклика 135B)
— X2 '138B)
Повреждение пучком 71, 84, 167,
181B)
Поглощение рентгеновского излуче-
излучения 89—92A)
Поглощенный ток, электроны 131A)
Поглощения фактор 14, 76, 107,
110B)
— эффект 45, 54, 164B)
Подгонка параметров 132B)
Подготовка образцов, материалы
163—176B)
Подложки образца 255, 285A)
Покрытие высокого разрешения
207B)
Полимерные криопротектанты 96B)
Полимеры 176B)
Полировка 164, 165B)
— механическая 163B)
— химическая 163B)
Получение изломов 284, 313B)
— — биологических объектов 233B)
— срезов 284B)
биологических объектов 231B)
Поправка на флуоресценцию за счет
характеристического излучения F
23B)
Последовательность большого числа
сцинтилляторов 128A)
Посторонний внешний фон 81, 90,
91B)
Построение изображения 100A)
Потенциал ионизации, средний 27A)
Потери конкретных элементов 71B)
— энергии непрерывные 27A)
Почвы 175B)
Предел обнаружения 150—152B)
— минимальный 259A)
Препарирование биологических об-
образцов для рентгеновского микро-
микроанализа 265B)
— при низких температурах 287B)
Проводимость 179B)
— образца 256B)
— объемная 184B)
Проекционные искажения 111A)
Произведение Р2/В 152B)
Пропорциональный счетчик 191A)
Пространственное разрешение рентге-
рентгеновского излучения 80—86A)
— распределение 55A)
Проточный пропорциональный детек-
детектор рентгеновского излучения
294A)
— счетчик 204A)
Пространство энергий 115B)
Радиационные повреждения 177B)
Разрешение 157, 258A)
Распределение по энергиям 51, 57A)
Распыление ионным пучком 200B)
— при постоянном токе 201B)
Рассеяние 22A)
— упругое 23A)
Резерфорда формула 23A)
Рентгеновский спектрометр с диспер-
дисперсией по энергии 210A), 140B)
Ро(/за-критерий 154A)
Руарка—Браммера соотношение
140B)
Самопоглощение 109B)
Свертка 119B)
Светоднод 215A)
Светооптическая аналогия 147A)
Сдвиг пиков 206A)
Сечение ионизации 17, 18B)
Симплекс 133B)
Сканирование 98A)
— вдоль строки 100A)
— по площади 101 (П
Скорость счета, максимальная
261A)
— осаждения 198B)
Смещение сигнала 181A)
Спектральное распределение непре-
непрерывного рентгеновского излучения
108B)
Спектрометр вертикальный 195A)
— горизонтальный 195A)
— имеющий плоский кристалл 193A)
— с дисперсией по длинам волн 190,
295A), 103B)
— с полной фокусировкой 192A)
Сплав алюминия с магнием 14B)
— А1 —2 вес. % Си 21B)
— золота с палладием 193B)
— Fe —Ni 15B)
— Fe—Si 17B)

346
Предметный указатель
— платины с углеродом
Способ напыления 193B)
Сравнительная микроскопия 220B)
Средняя длина свободного пробега
22A)
Срезы образцов толстые 84, 273B)
тонкие 273B)
Стабилизация образца 228B)
Стабильность механическая 1&1B)
Степень достоверности 146B)
Стереомикроскопия 118, 120A)
Стьюдента коэффициент 148B)
Сушка в критической точке 175,
251B)
— на воздухе 245B)
Сходимость пучка, измерение 17A)
Термическое разрушение 178, 180,
Типы биологических образцов 268B)
Ткань корня растения 96, 97B)
Тонкие пленки на подложках 59,
60B)
— фольги 78A), 57B)
Ток зонда, максимальный 13A)
Толщина покрытия 194, 204, 211,
212B)
Торможение электронов 17B)
Тормозная способность 18B)
Точность 144B)
Увеличение 103A)
Углерод 190B)
Углеродная подложка 173B)
Углеродный анализ 157B)
Угловое распределение электронов
49, 65A)
Угольные частицы 172B)
Уровень серого 182A)
— темного 168A)
— черного 170A)
Усиление 172A)
Усилитель, главный 211, 223, 247A)
Уширение линии 272A)
Фактор атомного номера Z 17, 18B)
— относительной элементарной чув-
чувствительности 57B)
Фано коэффициент 216A)
Фиксация 275B)
Фарадея цилиндр 16A)
Филибера—Данкамба—Хейнриха
уравнение 14B)
Флуоресценция, биологический мате-
материал 75B)
— вторичная 89—92A), 25B)
— за счет непрерывного излучения
90A), 26, 27B)
— поправка на 23, 24, 25B)
Флуоресцентное излучение 24B)
Фон, вычитание 110B)
— излучение 91B)
— измерение 102, 103B)
— коррекция 78, 124B)
— моделирование 106, 111B)
— от прибора 90B)
—¦ пьедестал 219A)
— форма 106B)
Форма импульса 200A)
Функция отклика 134, 135B)
Фурье-акалт 106B)
f(x) 9, 10, 13B)
Характеристическое рентгеновское
излучение 69, 272, 289A)
Химическая связь 206A)
сдвиг 156B)
Холодный катодный разряд 200B)
— стержень 160B)
Цветные фотографии 301D)
Цитологические методы 181B)
Цифровая фильтрация 106, 117,
125B)
Частицы 21, 42, 51, 169B)
— микроскопические 41B)
— неорганические 271B)
— размер 49B)
— сухие 169B)
Частотное пространство 115B)
Чувствительность 144B)
— максимальная 148B)
Шумы электрические 216A)
Щелочные металлы 167B)
Эверхарта—Торнли детектор 124A)
Электрона отражение 17, 18B)
Электронно-дырочные пары 210,
213A)
Электрополировка 163B)
Эмпирический метод коэффициента а
34—38B)
Энергия пучка 37, 64, 187A)
Эталоны 87, 166, 167B)
— в виде частиц 53B)
Эталоны для биологических объек-
объектов 83, 87, 88B)
тонких пленок 87B)
— многокомпонентных стекол 53B)
FeNiC 159B)
Эффективность детектора 113B)
— зарядки 177B)
Яковица—Ньюбери метод 60, 67B)

ОГЛАВЛЕНИЕ
Глава 7. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ РЕНТГЕНОВСКИЙ МИКРОАНАЛИЗ . . 5
7.1. Введение 5
7.2. Метод трех поправок 6
7.3. Эмпирический метод 34
7.4. Количественный микроанализ при наклонном падении
электронного пучка на образец 38
7.5. Анализ частиц и шероховатых поверхностей 41
7.6. Анализ тонких пленок и фолы 56
7.7. Количественный микроанализ биологических материалов 68
Приложение А. Метод с использованием непрерывного излу-
излучения 89
Приложение Б. Рабочие примеры количественного анализа
биологических материалов 96
Глава 8. ПРАКТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ РЕНТГЕНОВСКОГО АНАЛИЗА . . 102
8.1. Общие замечания об обработке данных 102
8.2. Форма фона 106
8.3. Наложение пиков 118
8.4. Коррекция мертвого времени 140
8.5. Пример количественного анализа 141
8.6. Точность и чувствительность в рентгеновском микроана-
микроанализе 144
8.7. Анализ легких элементов 154
Глава 9. ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛОВ И ОБРАЗЦОВ ДЛЯ РЭМ И РМА 164
9.1. Металлы и керамика 164
9.2. Частицы и волокна 169
9.3. Влажные материалы 175
Глава 10. МЕТОДЫ НАНЕСЕНИЯ ПОКРЫТИЙ ДЛЯ ОБЪЕКТОВ РАСТРО-
РАСТРОВОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ И РЕНТГЕНОВСКОГО
МИКРОАНАЛИЗА 177
10.1. Введение 177
10.2. Термическое напыление 185
10.3. Катодное распыление 198
10.4. Специальные методы нанесения покрытий ..... 207
10.5. Определение толщины покрытия . 211
Глава 11. ПРЕПАРИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ ДЛЯ РАСТ-
РАСТРОВОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ 216
11.1. Введение 216
11.2. Компромисс за счет микроскопа 217
11.3. Компромисс за счет образца 220

348 Оглавление
Глава 12. ПРЕПАРИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ ДЛЯ РЕНТ-
РЕНТГЕНОВСКОГО МИКРОАНАЛИЗА 265
12.1. Введение 265
12.2. Методы препарирования при обычной температуре . . 275
12.3. Способы препарирования при низких температурах . . 287
12.4. Микроозоление 316
Литература 318
Дополнительная литература 333
Предметный указатель 342

Джозеф Гоулдстейн, Дэйл Ньюберн, Патрнк Эчлин.
Дэвид Джой, Чарлз Фиори, Эрик Лифшии
РАСТРОВАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ
И РЕНТГЕНОВСКИЙ МИКРОАНАЛИЗ
Книга 2
Старший научный редактор Н. Серегина
Младший научный редактор Е. Орлова
Художник Н. Василевская
Художественый редактор В. Прищепа
Технический редактор А. Резоухова
Корректор В. Соколов
ИБ № 3823
Сдано в .набор 26.01.84. Подписано к печати 07.06.84.
Формат 60X90Vie. Бумага типографская № 1.
Гарнитура литературная. Печать высокая.
Объем 11 бум, л. Усл. печ. л. 22. Усл. кр.отт. 22.
Уч.-изд. л. 22,59. Изд. № 20/3035. Тираж 3400 экз.
Зак. 1943. Цена 3 р. 10 к.
ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР»
129820, ГСП, Москва, И-110, 1-й Рижский пер., 2.
Московская типография N? П Союзполиграфпрома
прн Государственном комитете СССР по делам издательс
полиграфин и книжной торговли. Москва, 113105,
Нагатинская ул., д. 1.