Г Р. КАЛАМКАРОВ М А. ОСТРОВСКИЙ
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЗРИТЕЛЬНОМ РЕЦЕПЦИИ
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
ИНСТИТУТ БИОХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им. Н.М. ЭМАНУЭЛЯ
Г. Р. КАЛАМКАРОВ М. А. ОСТРОВСКИЙ
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЗРИТЕЛЬНОМ РЕИЕПиИИ
МОСКВА «НАУКА» 2002
УДК 612
ББК 28.67
К17
Издание осуществлено при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований по проекту № 01 -04-62048
Каламкаров Г.Р.
Молекулярные механизмы зрительной рецепции / Г.Р. Калам-
каров, М.А. Островский. - М.: Наука, 2002. - 279 с.: ил. ISBN 5-02-006420-3 (в пер.)
Изложены современные представления о преобразовании света в сенсорный сигнал в зрительной клетке сетчатки позвоночных. Описаны механизмы трансдукции сенсорного сигнала, структура и функции зрительного пигмента родопсина, периферических белков зрительной клетки, участвующих в формировании фотоответа, ионных каналов, активируемых циклическими нуклеотидами. Детально обсуждаются молекулярные механизмы взаимодействия белков - участников процесса фототрансдукции. Значительное внимание уделено собственным результатам авторов.
Для биологов - студентов, аспирантов, преподавателей и научных работников, интересующихся проблемами молекулярной сенсорной физиологии.
По сети АК
ISBN 5-02-006420-3
© Российская академия наук, 2002
© Издательство “Наука” (художественное
оформление), 2002
ПРЕДИСЛОВИЕ
В этой книге представлены результаты наших многолетних исследований молекулярных механизмов фоторецепции, проводившихся сначала в Институте химической физики им. Н.Н. Семенова, а затем в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН. При этом предпринята попытка изложить современное состояние этой области знаний.
Междисциплинарный подход к исследованию механизмов зрения традиционен и естествен; он нашел отражение и в наших работах.
Помимо физиологов и биологов различных специальностей, природой зрения горячо интересовались представители других естественных наук, прежде всего физики. Они внесли решающий вклад в понимание оптики глаза (Иоган Кеплер), механизмов цветового зрения (Томас Юнг, Джеймс Максвелл, Герман Гельмгольц), в определение абсолютной световой чувствительности зрительной системы (Самуэль Р. Лэнгли, Ю.Б. Харитон, С.И. Вавилов). Именно из определения минимального числа квантов, падающих на сетчатку и способных вызвать субъективное ощущение световой вспышки, следовал фундаментальный вывод о том, что зрительная клетка сетчатки (палочка) способна детектировать один поглощенный квант. Предметом интенсивных исследований последних двух десятилетий стало выяснение молекулярного механизма, обеспечивающего возникновение фоторецепторного сигнала в ответ на поглощение одиночного кванта видимого света. Проблемы зрения продолжают волновать физиков. Многие из них, обладающие соответствующими методическими возможностями, исследуют, в частности, фотохимические процессы в молекуле родопсина: сверхбыструю (менее 200 фемтосекунд) фотоизомеризацию хромофора и конформационные перестройки белковой части (опсина).
К основным физиологическим феноменам зрения на рецепторном уровне относятся фототрансдукция - преобразование поглощенной энергии кванта в фоторецепторный сигнал, адаптация, спектральная чувствительность фоторецепторов как основа цветового зрения. Поскольку свет в зрении выступает не только как носитель информации, но и как потенциально опасный по-
3
вреждающий фактор, предметом интенсивных исследований в последнее время стали механизмы фотоповреждения структур глаза и многоуровневая система защиты от такого повреждения. Работы в этом направлении представляют также большую важность для офтальмологии и гигиены зрения.
Наряду с изучением функций, большое внимание всегда уделялось структуре зрительной системы на всех ее уровнях. Новейшие методы своего времени - световой и электронной микроскопии, рентгено-структурного анализа, ряд других мощных современных физических методов, как правило, в первую очередь использовались для исследования клеточной и синаптической организации сетчатки, цитологического изучения фоторецепторов и других клеток сетчатки, клеток пигментного эпителия, для исследования светочувствительных родопсинсодержащих мембран, самой молекулы зрительного пигмента. Сетчатка, как известно, была излюбленным объектом световой микроскопии. Достаточно назвать имя великого испанского гистолога Рамон-и-Кахаля. Характерно, что одним из первых объектов электронной микроскопии в начале 50-х годов прошлого века стали зрительные клетки сетчатки. Зрительный пигмент палочек родопсин явился первым мембранным белком животного происхождения, первичная и вторичная структуры которого были установлены (начало 80-х годов). Совсем недавно (в 2000 г.) был сделан следующий важнейший шаг: удалось получить кристаллы бычьего родопсина, провести рентгено-структурный анализ и получить его трехмерную структуру с разрешением 2,8 А (см. ниже). Родопсин, таким образом, стал первым представителем огромного семейства эволюционно родственных мембранных белков (в настоящее время их известно более тысячи), полипептидная цепь которых семь раз пронизывает мембрану и которые взаимодействуют с ГТФ-связывающими белками (G-белками). Этот структурный мотив - семь O'-спиральных трансмембранных тяжей - присущ и обонятельным рецепторным белкам, и многим синаптическим рецепторным белкам, взаимодействующим с нейромедиаторами, например, адренорецептору. Около 5% генома ответственно за кодирование этого семейства сигнальных, G-белок-связывающих, рецепторных белков. Родопсин представляет собой, пожалуй, наилучший модельный белок для изучения структуры и функции этого огромного класса жизненно важных сигнальных белков.
Наконец, в ходе исследования фототрансдукции был открыт молекулярный механизм усиления первичного рецепторного (светового в случае зрения) сигнала, а именно ферментативный каскад усиления, а также был найден новый класс ионных кана
4
лов плазматических мембран, регулируемых непосредственно циклическими нуклеотидами.
Можно было бы назвать еще ряд открытий, сделанных при исследовании структуры и функции зрительной системы вообще, и молекулярных механизмов зрительной рецепции в частности, которые оказали влияние на понимание структуры и функции сенсорных систем других модальностей и нервной системы в целом.
Поэтому традиционно исследования механизмов зрения на всех уровнях организации зрительной системы часто приобретают общебиологическую значимость.
Книга рассчитана как на неподготовленного читателя - биолога или медика, не работающего в области фоторецепции, так и на специалистов в этой области биологии и медицины. Поэтому книга, по существу, содержит три уровня рассмотрения. Во-первых, - популярный, рассчитанный на студентов, аспирантов и молодых научных сотрудников биологического и медицинского профилей, а также любого читателя, имеющего общую медикобиологическую подготовку. Во-вторых, - более глубокий уровень рассмотрения, рассчитанный на специалистов широкого профиля в области молекулярной физиологии, биохимии и биофизики. И, наконец, в-третьих, - на узкий круг специалистов, непосредственно работающих в области фоторецепции.
Авторы приносят глубокую благодарность сотрудникам лаборатории физико-химических основ рецепции Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН - соавторам работ, а также сотрудникам других институтов и лабораторий - нашим соавторам, упомянутым в ссылках. Особая благодарность - к.б.н. Т.Ф. Шевченко, без помощи которой подготовка рукописи книги к печати была бы невозможной.
Г.Р. Каламкаров, М.А. Островский
Глава 1
ФИЗИОЛОГИЯ ЗРИТЕЛЬНОЙ РЕЦЕПЦИИ
Общие свойства сенсорной системы
Сенсорной системой называют часть нервной системы, состоящую из сенсорных рецепторов, нервных путей, передающих информацию в мозг, и частей мозга, которые перерабатывают эту информацию. Работа любой сенсорной системы начинается с восприятия рецепторами внешнего физического или химического стимула, его трансформации в нервные сигналы.
Сенсорная система выполняет следующие основные операции: 1) обнаружение и различение сигнала, 2) его преобразование и передачу, 4) кодирование признаков, 5) детектирование признаков, 6) опознание образов.
Сенсорная трансдукция. Обнаружение и первичное различение сигналов обеспечивается рецепторами - специализированными клетками, воспринимающими сигналы определенной модальности и преобразующими их из физической или химической форм в форму нервного возбуждения. Преобразование энергии внешнего раздражения в рецепторный сигнал и называется трансдукцией сенсорного сигнала. Этот процесс включает в себя три основных этапа: 1) взаимодействие сенсорного стимула, т.е. кванта света (зрение), молекулы пахучего или вкусового вещества (обоняние, вкус) с рецепторной белковой молекулой или механической силы (слух, вестибулярная система, осязание) с мембраной рецепторной клетки; 2) усиление сенсорного сигнала и его передачу внутри рецепторной клетки; и, наконец, 3) увеличение или уменьшение проводимости клеточной (плазматической) мембраны рецепторной клетки (т.е. открывание или блокирование находящихся в ней ионных каналов), что приводит к деполяризации или гиперполяризации этой мембраны. Рецепторным потенциалом, независимо от того, это де- или гиперполяризация, называется изменение потенциала на клеточной мембране рецепторной клетки.
Абсолютная чувствительность специализированных рецепторных клеток сенсорной системы к адекватным стимулам предельно высока. Фоторецепторная клетка (палочка) может быть возбуждена всего одним поглощенным квантом света, обо
6
нятельная клетка - всего одной молекулой пахучего вещества, например, феромона - пахучего сигнала для насекомого.
Ограничение избыточности информации. Информация, поступающая от рецепторов, могла бы очень быстро насытить все информационные резервы мозга. Поэтому сенсорная система пропускает в центральные, мозговые отделы сигналы лишь о начале и конце раздражения (временное преобразование). В случае зрительной рецепции - о предъявлении и исчезновении светового стимула.
Адаптация - общее свойство сенсорных систем - проявляется в снижении абсолютной и повышении дифференциальной чувствительности. Адаптационные процессы начинаются на уровне рецепторов, охватывая затем все нейронные уровни сенсорной системы. Когда действие постоянного раздражителя (света) прекращается, абсолютная чувствительность восстанавливается (темновая адаптация в случае зрения).
Зрительная система. Зрительная система поставляет мозгу более 90% всей сенсорной информации. Зрительный процесс начинается в фоторецепторах с проекции изображения на сетчатке. На пути к фоторецепторам свет проходит через несколько прозрачных оптических сред глаза - роговицу, хрусталик, стекловидное тело, а затем через все слои сетчатки (см. ниже).
Сетчатка - это сложно организованная, многослойная структура, состоящая из слоя фоторецепторных клеток - палочек и колбочек и нескольких видов нервных клеток (рис. 1.1). За слоем фоторецепторов расположен первый (наружный) синаптический слой. Рецепторный сигнал передается от рецепторов в первом синапсе следующим за ними нервным клеткам - биполярным и горизонтальным. Далее, за слоем этих клеток, расположен второй широкий внутренний синаптический слой. Сигналы от биполярных клеток передаются в синапсах этого слоя ганглиозными и амакриновым клеткам. В свою очередь, ганглиозные клетки, образующие последний клеточный слой сетчатки, по своим длинным аксонам передают информацию в виде нервных импульсов в подкорковые и корковые области зрительной системы. Горизонтальные и амакриновые клетки не принимают участия в прямом пути передачи зрительной информации от рецепторов к ганглиозным клеткам, но они играют важнейшую роль в процессах передачи и переработки информации на соответствующих уровнях сетчатки. Сетчатка, по существу, представляет собой сложный нервный центр или “часть мозга, помещенную в глаз” (подробнее о сетчатке см.: Физиология зрения. Глава 2: Нейрофизиология сетчатки. М.; Л.: Наука, 1992).
Рассмотрим клеточную организацию слоев сетчатки, начиная от пигментного эпителия, который находится в тесней-
7
Рис. 1.1. Строение сетчатки глаза позвоночных
Буквами обозначены клеточные элементы сетчатки: К - колбочка, II - палочка, Б - биполярная, Гор - горизонтальная, А - амакриновая, Г - ганглиозная клетки
шей анатомической связи с фоторецепторными клетками сетчатки.
Слой пигментного эпителия образован эпителиальными клетками, содержащими, помимо обычного набора органелл, также пигментные гранулы - меланосомы, придающие пигментному эпителию почти черный цвет, и липофусциновые гранулы (содержащие “пигмент старости”)- Многочисленные отростки клетки пигментного эпителия плотно облегают наружные сегменты фоторецепторов.
Пигментный эпителий играет решающую роль в ресинтезе (регенерации) зрительного пигмента, в фагоцитозе “отработанных” обломков наружных сегментов фоторецепторов - палочек и колбочек, в обеспечении сетчатки кислородом и необходимы
8
ми веществами, наконец, в защите сетчатки, в первую очередь ее фоторецепторов, от опасности светового повреждения.
Слой фоторецепторов (палочек и колбочек) примыкает к пигментному эпителию. В сетчатке глаза человека, например, около 6 -5- 7 млн колбочек и 110 4-125 млн палочек. При этом центральная ямка сетчатки приматов и человека (fovea centralis) содержит только колбочки (до 140 тыс. на 1 мм2), к периферии сетчатки число колбочек уменьшается, а палочек - возрастает; на периферии сетчатки находятся уже только палочки. Палочки почти на два порядка чувствительнее к свету, чем колбочки. Колбочки обеспечивают дневное (фотопическое) и цветовое зрение, палочки - сумеречное (скотопическое).
Фоторецепторные клетки - это вытянутые в длину палочки и колбочки, состоящие из наружного сегмента, внутреннего сегмента, соединительной ножки, ядерной части с крупным ядром и пресинаптического окончания (рис. 1.2). Фоторецепторы сетчатки позвоночных, в отличие от беспозвоночных, обращены своими светочувствительными наружными сегментами от света (как было сказано, они прилегают к клеткам пигментного эпителия). Поэтому на пути к наружным сегментам свет проходит через все нервные слои сетчатки. Эта особенность устройства глаза позвоночных связана, вероятно, с необходимостью эффективного обеспечения как сложного биохимического (темнового) процесса регенерации зрительного пигмента, так и процесса непрерывного обновления наружного сегмента и фагоцитоза его обломков пигментным эпителием.
Наружный сегмент фоторецептора содержит от нескольких сот (у дневных животных) до нескольких тысяч (у животных, обитающих при низких освещенностях) фоторецепторных дисков. Наружный сегмент палочки, как правило, намного длиннее, чем колбочки.
Фоторецепторный диск образован двумя мембранами, соединенными по краям. Мембрана диска - это типичная биологическая мембрана, образованная липидным бислоем, в который погружены молекулы белкой. Особенностью фоторецепторной мембраны диска позвоночных является ее низкая вязкость, подобная вязкости оливкового масла (подробнее о химическом составе и физических свойствах этой мембраны см. ниже). Поэтому молекулы белка испытывают в ней быструю вращательную и более медленную латеральную диффузию.
Наружный сегмент фоторецептора соединен с внутренним модифицированной ресничкой, в которой имеется девять пар фибрилл по периферии, но отсутствуют две центральные. В палочке, как правило, диски отделены от клеточной (плазматической)
9
Плазмати-
мембрана
Митохондрии
Ядро-
Наружный сегмент
Внутренний ‘сегмент
Синаптические везикулы»:
t оединительные реснички
Эндоплазма-тический ретикулум
Рис. 1.2. Строение фоторецепторной клетки палочки (слева), ее наружного сегмента (справа вверху) и молекулы родопсина в фоторецепторной мембране (справа внизу)
Плазматическая мембрана
диски
Гидрофильные петли
мембраны, они как бы “плавают” внутри цитоплазмы наружного сегмента и вместе с тем строго ориентированы перпендикулярно длинной оси клетки. Ориентация дисков в наружном сегменте обеспечивается цитоскелетом.
В колбочке, как правило, диски не замкнуты; они представляют собой впячивания плазматической мембраны наружного сегмента, и, следовательно, внутридисковое пространство “диска” колбочки - это внеклеточное пространство между ее наружным сегментом и отростками клетки пигментного эпителия.
10
Внутренний сегмент содержит метаболический аппарат клетки, в том числе большое скопление митохондрий, обеспечивающих энергетические потребности фоторецептора, и аппарат Гольджи, принимающий участие в активном синтезе белка. Обновление фоторецепторных мембран наружного сегмента палочки происходит примерно за две недели, в колбочках обновление происходит медленнее.
Ядерная часть фоторецепторной клетки содержит крупное ядро.
Пресинаптическое окончание фоторецептора (так называемые ножка колбочки и сферула палочки) содержит синаптическую ленту, вокруг которой локализовано множество синаптических пузырьков, содержащих нейромедиатор (глутамат).
Механизмы фототрансдукции
Общее представление о механизме фототрансдукции. Механизм фототрансдукции обеспечивает преобразование и усиление первичного светового сигнала почти в миллион раз и представляется в настоящее время следующим образом (рис. 1.3). Квант света поглощается молекулой родопсина Р, точнее ее хромофорной группой 11-цпс-ретиналем, что приводит к его изомеризации в полностью-шрамс-форму. Эта реакция происходит менее чем за 200 фемтосекунд, является первой и единственной фотохимической реакцией в зрении. Изомеризация ретиналя вызывает конформационную перестройку белковой части молекулы (опсина). Конформационно измененный родопсин приобретает способность взаимодействовать со следующим белком, а именно с G-белком или, как он называется в зрительной клетке, трансду-цином (Т). Активированный трансдуцин, в свою очередь, активирует следующий белок - фермент фосфодиэстеразу (ФДЭ), который с высокой скоростью гидролизует низкомолекулярный внутриклеточный передатчик - циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ). Падение в цитоплазме зрительной клетки концентрации свободного цГМФ приводит к изменению поляризации ее клеточной мембраны, а именно к ее гиперполяризации. Гиперполяризационный электрический потенциал и представляет собой фоторецепторный сигнал, который передается в первом синапсе сетчатки следующим нервным клеткам - биполярным и горизонтальным.
Таким образом, цепочка процессов: родопсин-трансду-цин-фосфодиэстераза представляет собой каскад ферментативных реакций, обеспечивающих усиление (размножение) светового сигнала в 105—106 раз. Ключевым событием в восстановлении
11
Рис. 13. Упрощенная схема механизма фототрансдукции
Показан один фоторецепторный диск в наружном сегменте палочки. В мембране диска показаны основные белки участники процесса трансдукции: Р - молекула родопсина, J - молекула трансдуцина, или G-белка, и ФДЭ - молеку ла фермента фосфодиэстеразы. В цитоплазме наружного сегмента показан еще один фермент -гуанилатциклаза (ГЦ). В плазматической (клеточной) мембране палочки, окружающей диски, показан ионный канал (белок) в открытом темновом состоянии. Через открытый ионный канал в цитоплазму (внутрь клетки) по градиенту концентрации поступают ионы натрия и кальция
исходного темнового состояния зрительной клетки является активация фермента гуанилатциклазы (ГЦ), функция которого -синтезировать цГМФ из ГТФ.
Более подробно современные представления о механизмах фототрансдукции изложены ниже.
Структура фоторецепторов и свойства зрительного пигмента родопсина. В сетчатке глаза позвоночных содержатся два типа фоторецепторных клеток - палочки и колбочки. Функции этих двух типов фоторецепторов различны. Палочки работают при очень низких (от 1 до 10 000 квантов на палочку) освещенностях; чувствительность же колбочек гораздо ниже, они работают при средних и высоких интенсивностях света и осуществляют восприятие цвета. Палочки и колбочки различаются по форме и структуре. Соотношение числа палочек и колбочек у разных видов животных сильно различается. Так, например, в сетчатке рыб, обитающих на больших глубинах, где освещенности небольшие, преобладают палочки, в то время как сетчатки животных, обитающих в условиях высоких освещенностей, например многих птиц, грызунов (белки), содержат преимущественно колбочки.
Кроме морфологических особенностей, палочки и колбочки различаются содержащимися в них зрительными пигментами.
Наружный сегмент. Рассмотрим подробнее структуру и биохимический состав наружного сегмента. Наружный сегмент палочки (НСП) имеет цилиндрическую форму. Диаметр его у разных видов животных варьирует в пределах 1-6 мкм, длина - в пределах 10-50 мкм. Структурно наружный сегмент палочки представляет собой стопку плотно упакованных замкнутых мембранных образований - фоторецепторных дисков, содержащих большое количество зрительного пигмента родопсина. Диски
12
морфологически и электрически отделены от плазматической мембраны палочки по всей длине наружного сегмента [Говардов-ский, 1978; Govardovsky, 1975; Говардовский, Лычаков, 1975; Cohen, 1968, 1970; Ruppel, Hagins, 1973]. Образуются диски в базальной части наружного сегмента как впячивания плазматической мембраны. Вновь образовавшиеся диски не отделены от плазматической мембраны, но в процессе формирования они отделяются и замыкаются таким образом, что наружная сторона цитоплазматической мембраны оказывается обращенной внутрь диска. “Диски” колбочек, в отличие от палочек, в онтогенезе не отделяются от плазматической мембраны и представляют собой просто складки цитоплазматической мембраны по всей длине наружного сегмента колбочки. Наружный сегмент колбочки в несколько раз короче наружного сегмента палочки и имеет коническую форму.
Наружные сегменты фоторецепторных клеток постоянно обновляются. По мере формирования новых дисков в базальной части наружного сегмента на апикальном конце идет постоянное отщепление и фагоцитоз старых дисков. В ходе этого процесса диск передвигается вдоль фоторецептора. Поэтому в базальной части палочки находятся диски с вновь сформированными мембранами, а по мере удаления от места формирования диски “стареют”. В колбочках вновь образованные мембраны быстро перемешиваются со старой мембраной, и диски не перемещаются вдоль оси колбочки по мере старения. Скорость обновления фоторецепторных мембран измерена для разных видов животных. Она варьирует от 0,9 мкм в день для палочек лягушки до 2,7 мкм в день для колбочек ящерицы. Полное обновление палочки лягушки происходит за 55-80 дней, а палочек кошки и колбочек кошки, ящерицы и белки - за 5-7 дней [Young, Droz, 1968; Young, Bok, 1969; Roof, 1986].
Фоторецепторный диск представляет собой два мембранных бислоя дисковидной формы, соединенных по краю диска. Диски ориентированы перпендикулярно продольной оси палочки. Расположение дисков строго периодично. Расстояние между центрами соседних дисков составляет 300 А, зазор между дисками -150 А, толщина фоторецепторной мембраны - 60-70 А, расстояние между мембранами внутри диска - 10-30 А. Количество фоторецепторных дисков в одной палочке варьирует у разных животных от 500 до 2000 [Blaurock, Wilkins, 1969; Korenbrot et al., 1973; Ostroy, 1977].
Мембрана фоторецепторного диска состоит примерно на 40% из липидов и на 60% - из белка [Borggreven et al., 1970; Daemen, 1973]. Более 80% липидов фоторецепторной мембра
13
ны составляют липиды с полиненасыщенными жирнокислотными остатками (около 70% из них составляют фосфатидилэ-таноламин и фосфатидилхолин). Содержание холестерина в мембране очень низкое (около 2%). Этим обусловлена низкая вязкость (2 Пз) мембраны [Poincelot, Abrahamson, 1970; Andersson, Sperling, 1971; Daemen, 1973; Andersson et al., 1975; Говардовский, 1976]. Коэффициент латеральной диффузии молекулы родопсина в плоскости мембраны составляет 0,5 мкм/с, постоянная времени вращательной релаксации -20 мкс [Cone, 1973; Poo, Cone, 1974; Liebman, Entine, 1974; Омельяненко и др., 1977; Lin et al., 1981].
Зрительные пигменты - мембранные белки, локализованные в фоторецепторной мембране. Они состоят из гликопротеиновой части (опсина) и хромофорной. Опсины фоторецепторных клеток различных типов и видов беспозвоночных и позвоночных животных, а также человека различаются (во всяком случае, в неконсервативных участках опсина), в то время как хромофорная часть у всех зрительных пигментов одинаковая -это 11-цис-изомерная форма ретиналя,, (альдегида витамина А]) или ретиналя2 (альдегида витамина А2). Хромофоры могут быть двух типов - 11-цис-ретиналЬ] и 11-цис-ретиналь2. Рети-наль2 отличается от ретиналя] наличием одной дополнительной двойной связи в р-иононовом кольце. В первом случае зрительные пигменты попадают в класс родопсинов, во втором - в класс порфиропсинов, спектры поглощения которых, как правило, расположены в более длинноволновой области спектра, нежели у родопсинов. Широкий разброс положения максимумов спектров поглощения зрительных пигментов от ультрафиолетовой области (Хмакс = 360 нм) до красной (Хмакс - 620 нм) определяется составом аминокислотных остатков опсина и их расположением относительно 11 -цис-ретиналя в хромофорном центре молекулы. Так, например, в палочках сетчатки человека содержится пигмент родопсин с максимумом спектра поглощения ^макс = 500 нм, а в трех типах колбочек (сине-, зелено- и красночувствительных) содержится соответственно три типа зрительных пигментов с максимумами спектров поглощения в синей (420 нм), зеленой (531 нм) и красной (558 нм) областях видимого спектра. Красный колбочковый пигмент часто называют йодопсином (подробнее о структуре и функции молекулы зрительного пигмента см. ниже).
14
Преобразование света в зрительной клетке и генерация фотоответа
Все процессы, происходящие в зрительной клетке, приводящие к генерации на ее мембране фототока, по их пространственной локализации можно условно подразделить на два относительно независимых процесса. Первый происходит в междисковом пространстве цитоплазмы клетки. Он включает в себя фотовозбуждение родопсина, взаимодействие его с трансдуцином, активацию и соответственно деактивацию фосфодиэстеразы и гуа-нилатциклазы. Заканчиваются эти процессы изменением концентрации цГМФ в цитоплазме зрительной клетки. Условно все эти процессы можно назвать фотоферментативными. Второй этап происходит непосредственно на плазматической мембране зрительной клетки и включает в себя, по существу, только два процесса: взаимодействие цГМФ со специфическими цГМФ-ре-гулируемыми каналами и регуляцию концентрации внутриклеточного кальция через Ка+/Са2+/К+-обменник. Именно на втором этапе происходят изменения внутриклеточного потенциала, которые и являются сенсорным сигналом. Условно процессы, происходящие на втором этапе, можно назвать биоэлектрохимиче-скими. Связь между фотоферментативными и биоэлектрохими-ческими реакциями осуществляется только через изменение концентрации внутриклеточного кальция. Такое условное разделение в сложном механизме фототрансдукции облегчало их изучение и соответственно облегчит нам их изложение.
Фотоферментативные реакции также можно разделить на два этапа: активацию и деактивацию. Активационные процессы приводят к уменьшению концентрации цГМФ в клетке, а деактивационные - к восстановлению его исходной концентрации.
Активация. Активационная часть каскада фототрансдукции представляет собой ряд последовательных реакций. При поглощении кванта света молекула родопсина переходит в активное состояние. Возбужденный родопсин активирует трансдуцин. Трансдуцин, в свою очередь, связывается с фосфодиэстеразой, сильно повышая ее гидролитическую активность в отношении цГМФ. Каталитическая активность комплекса трансдуцин/фос-фодиэстераза приводит к быстрому падению внутриклеточной концентрации цГМФ. Это вызывает закрытие цГМФ-чувстви-тельных мембранных катионных каналов. В результате мембрана гиперполяризуется, что приводит к высвобождению медиатора фоторецепторной клеткой.
Активация родопсина является первым этапом каскада трансдукции. Поглощение фотона вызывает изомеризацию хро-
15
1. Свет активирует молекулу родопсина hu
5. Снижение [цГМФ] закрывает цГМФ - активируемые каналы, блокируя вход Na+ и Са2+ в наружный сегмент
5'ГМФ
Родопсин	/ п
Активированный “°допсин дуфАДФ Арестин mnnnruu киназа	1 ,
родопсин	Фосфат
Фосфорилирование и арестин инактивирует родопсин
цГМФЛ цГМФ канал , (открыт) к.
цГМФ^ v-канал (закрыт)
Внутри
Na*
Снаружи
2. Р* катализирует обмен
ГДФ на ГТФ на трансдуцине (Т).	6. Постоянно работающий Na/Ca - обменник
Образуется активированная Та - ГТФ	поддерживает низкую концентрацию Са2+
Рис. 1.4. Схема взаимодействия белков зрительной клетки, обеспечивающих усиление фоторецепторного сигнала
мофора 11 чщс-рстиналя в полностью-трпнс-форму и запускает цепь последовательных темновых реакций в родопсине - фотолиз родопсина.
Фотолиз родопсина приводит к образованию активированного фотопродукта, который, в свою очередь, активирует G-белок зрительной клетки трансдуцин (рис. 1.4). Показано, что этим активированным фотопродуктом является метародопсин II [Bennett, 1982; Bennett et al., 1982; Emeis et al., 1982; Knowles, Pepe, 1988], причем для образования активированной формы существенно депротонирование Шиффова основания родопсина
16
[Longstaff et al., 1986]. Трансдуцин (T), периферический белок с молекулярной массой около 80 кДа, состоит из трех субъединиц - Та, Тр и Ту. В образовании стабильного комплекса между субъединицами и их последующей диссоциации большую роль играет А1а-23 [Но, Wong, 1999]. Сам трансдуцин является гетеротримером [Seitz et al., 1999]. Трансдуцин содержится в палочке в количестве 1/10 по отношению к родопсину. В темноте с Та связана молекула ГДФ. В результате освещения активированный родопсин связывается с трансдуцином и катализирует замену ГДФ на ГТФ [Godchaux, Zimmerman, 1979; Fung, Stryer, 1980; Baehr et al., 1982]. Затем комплекс диссоциирует на родопсин, Та-ГТФ и Тр7. Одна молекула метародопсина II за время своей жизни успевает катализировать около 500 таких реакций.
Непосредственное измерение скорости активации трансдуци-на проводилось физическими и бихимическими методами, тем не менее полной ясности на сегодняшний день нет.
Исследования, проведенные методом инфракрасного светорассеяния при насыщающей концентрации ГТФ, показали, что активация трансдуцина проходит со скоростью 700-1000 с-' [Kuhn et al., 1981]. С другой стороны, оценки, основанные на биохимических методах, таких как измерение ГТФ-у-8-связывания с нитроцеллюлозными фильтрами, дали существенно меньшие значения. В работах [Dumke et al., 1994; Leskov et al., 2000] были получены величины скорости активации трансдуцина порядка 100 с-1. Ранее считалось, что такие низкие значения скорости активации могли быть следствием разрушения наружного сегмента палочки и растворения некоторых клеточных компонент при проведении биохимических экспериментов. Однако в последних исследованиях было показано, что степень разрушения внешнего сегмента палочки не влияет на наблюдаемую скорость активации трансдуцина родопсином [Leskov et al., 2000]. Таким образом, причина несоответствия наблюдаемых разными методами скоростей активации трансдуцина остается неясной.
После активации молекула трансдуцина связывается с фосфодиэстеразой, обеспечивая полную активацию эффектора при стехиометрическом соотношении 2:1. Образование такого комплекса сильно стимулирует гидролитическую активность фосфодиэстеразы. Фосфодиэстераза (ФДЭ) - фермент, катализирующий гидролиз цГМФ, присутствует в клетке в количестве 1/50-1/100 по отношению к родопсину. В инактивированном состоянии ФДЭ представляет собой комплекс из трех субъединиц, ФДЭа, ФДЭр и ФДЭу, с молекулярными массами соответственно 88, 84 и 110 кДа в бычьих НСП [Baehr et al., 1979; Hurley, Stryer, 1982] и 95, 94 и 130 кДа - в лягушачьих [Miki et al., 1975; Hamm,
17
Bownds, 1986]. ФДЭа содержит 858 остатков [Ovchinnikov et al., 1987], ФДЭу соответственно - 87 [Ovchinnikov et al., 1986]. Одна из этих субъединиц, ФДЭу, ингибирует фосфодиэстеразную активность фермента. Взаимодействие ФДЭ с Та-ГТФ приводит к отщеплению ингибиторной субъединицы ФДЭу. Установлено, что ключевым во взаимодействии с Та является участок 24-45, включающий остатки Arg и Lys.
Освободившаяся от ФДЭу ФДЭар обладает высокой каталитической активностью, позволяющей гидролизовать до 2000 молекул цГМФ в секунду [Hurley, 1980; Yamazaki et al., 1983]. Таким образом, результатом описанного ряда ферментативных реакций является гидролиз около 500 000 молекул цГМФ на 1 поглощенный фотон.
Проведенные сравнения показали близкие значения скоростей образования комплексов Р*-Т и Т-ФДЭ при фотоответе. Это говорит о быстроте протекания реакции между трансдуци-ном и фосфодиэстеразой [Leskov et al., 2000].
Гидролитическая активность фосфо диэстеразы приводит к быстрому падению внутриклеточной концентрации цГМФ. Ранее скорость этого процесса характеризовалась соотношением ккат/Км = 7 х 106 М-1  с-1 (где ккат - максимальная скорость гидролиза цГМФ одной субъединицей при насыщающей концентрации субстрата, а Км - константа Михаэлиса). На основе этих данных был предложен [Pugh et al., 1993] метод количественного расчета скорости активации фосфодиэстеразы (и соответственно транс-дуцина). Используя полученную эмпирически зависимость мембранного тока от концентрации цГМФ, авторы определили скорость падения концентрации цГМФ из кинетики нарастания электрического фотоответа. Далее, из приведенного выше значения ккат/Км была оценена скорость активации каталитических субъединиц фосфодиэстеразы, которая составила -5000 с-1. Полученное таким образом значение позволяло считать результаты экспериментов по светорассеянию более реальными, нежели результаты биохимических экспериментов.
Однако ряд новых данных свидетельствует о том, что скорости активации трансдуцина и фосфодиэстеразы все-таки могут быть ниже, чем предполагалось ранее. Так, последние оценки константы Михаэлиса ФДЭ (около 10 мкМ) оказались существенно ниже используемых в работе [Pugh et al., 1993]. При учете значения ккат равным 2200 с-1 на одну субъединицу, соотношение ккат/Км окажется равным 2 х 108 М-1 • с-1. При внесении соответствующей поправки в модель [Pugh et al., 1993], получим новое значение скорости активации примерно 150 с-> [Bums et al., 2001], что хорошо согласуется с результатами биохимических экспериментов.
18
Итак, последние исследования вносят некоторые изменения в кинетическую картину каскада. Вероятно, скорость активации трансдуцина ниже, чем считалось ранее, а каталитическая активность ФДЭ, напротив, выше, чем предполагалось.
Последний этап процесса активации - это закрытие цГМФ-зависимых катионных каналов в плазматической мембране в ответ на падение внутриклеточной концентрации цГМФ.
То, что цГМФ является основным непосредственным регулятором светочувствительной проводимости плазматической мембраны палочки [Fesenko et al., 1985], не вызывает сомнений. Ряд данных свидетельствует о том, что цГМФ является не единственным регулятором проводимости каналов в плазматической мембране. АТФ, АДФ и цАМФ [Filatov et al., 1989; Furman, Tanaka, 1989], трансдуцин [Krapivinsky et al., 1989] и фосфодиэстераза [Bennett et al., 1989] также могут прямо регулировать проводимость активируемых цГМФ-каналов, однако никаких данных, указывающих на то, что такой механизм реально задействован в процессе фототрансдукции, нет.
Концентрация цГМФ, обеспечивающая открытие половины максимального числа каналов, равна 10-40 мкМ, и эта величина превосходит предполагаемую внутриклеточную концентрацию свободного цГМФ, равную 5 мкМ. А так как коэффициент Хилла для взаимодействия цГМФ с каналами имеет значение от 2 до 3 [Fesenko et al., 1986; Yau, Nakatani, 1985], то относительно небольшое изменение концентрации цГМФ вызывает значительное изменение тока, протекающего через каналы.
В работах [Cobbs et al., 1987; Karpen et al., 1988] было показано, что взаимодействие между цГМФ и соответствующими мембранными каналами занимает несколько миллисекунд. Таким образом, процесс активации фотоответа лимитируется не временем ответа каналов, а скоростью падения концентрации цГМФ и, следовательно. определяющими реакциями при кинетическом рассмотрении активационного каскада являются активация трансдуцина родопсином и гидролиз цГМФ фосфодиэстеразой.
Итак, описанный выше каскад активационных реакций позволяет добиться высокой степени усиления входящего сигнала. При этом каждая фотоизомеризация родопсина приводит к уменьшению входного тока на 105 или даже более катионов. Такое существенное усиление сигнала обеспечивается благодаря трем процессам каскада трансдукции:
1)	каждая возбужденная молекула родопсина активирует множество молекул трансдуцина;
2)	каждый активный комплекс трансдуцин/фосфодиэстераза вызывает гидролиз большого числа молекул цГМФ;
19
3)	на падение концентрации цГМФ отвечает множество специфичных каналов, при этом каждый канал в открытом состоянии позволяет втекать катионам внутрь клетки с достаточно большой скоростью.
Деактивация. Под термином “деактивация” будем понимать совокупность реакций, приводящих к восстановлению мембранного потенциала клетки.
Деактивация обеспечивается тремя основными процессами: а) выключением активной формы родопсина;
б) выключением активного комплекса трансдуцин/фосфоди-эстераза;
в) восстановлением начальной концентрации цГМФ и соответственно открытием специфических каналов.
Время жизни активного продукта фотолиза родопсина - метародопсина И(М1Г) - составляет несколько минут, поэтому для превращения МП* в неактивный продукт (т.е. продукт, который не активирует трансдуцин) необходим специальный механизм. Такими процессами в фототрансдукции являются фосфорилирование родопсина и связывание специфического белка - арестина. В темновом состоянии родопсин является гликопротеидом: к остатку треонина, локализованному на цитоплазматической поверхности, присоединены две олигосахаридные цепи. Освещение родопсина приводит к дополнительному фосфорилированию. Этот процесс носит гетерогенный характер. В родопсин включается от 2 до 8 сахарных остатков. Родопсин фосфорилируется специфической родопсинкиназой. Это фермент с молекулярной массой 62 кДа [Kelleher, Johnson, 1990]. При освещении фосфорилируются два остатка - Треонин-340 и Серин-342, оба локализованы в С-концевом пептиде.
Следует отметить, что и при возбуждении даже единичных молекул родопсина при однофотонных засветках воспроизводимость кинетики фотоответов очень высока и практически не варьирует. Это означает, что механизм деактивации должен обеспечивать такую невариабельность.
Какими же молекулярными механизмами обеспечивается высокая стабильность фотоответов? Очевидно, что критическим звеном воспроизводимости фотоответа является первый этап каскада усиления, т.е. время жизни активной формы родопсина, и важно понять, как стабилизируется время жизни отдельных молекул родопсина. Оказалось, что эта задача решается за счет многоступенчатого механизма деактивации родопсина. Установлено, что С-концевой остаток молекулы родопсина содержит множественные сайты фосфорилирования (6 у мыши и 7 у быка). Последние физиологические эксперименты на трансгенных мы
20
шах показали, что активированный родопсин может фосфорилироваться на всех 6 сайтах во время нормальной деактивации [Mendez et al., 2000].
Таким образом, хотя каждая отдельная реакция фосфорилирования является стохастичной и невоспроизводимой, в целом время жизни активного родопсина оказывается достаточно стабильным [Rieke et al., 1998].
Фосфорилирование родопсина частично предотвращает связывание Т-ГТФ. По-видимому, главную роль в этом процессе играют электростатические взаимодействия. Однако полностью ингибировать процесс активации трансдуцина фосфорилирование родопсина не может [Погожева и др., 1989а]. Фосфорилирование влияет лишь на константу связывания родопсина с Т-ГДФ, но не влияет на процесс активации трансдуцина и переход Т-ГДФ в Т-ГТФ [Fukada et al., 1990].
С фосфорилированным родопсином связывается другой тканеспецифический белок фоторецепторной клетки - арестин [Kuhn et al., 1984; Bennett, Sitaramayya, 1988]. Это белок с молекулярной массой 48 кДа, который связывается преимущественно с фосфорилированным родопсином, препятствуя его взаимодействию с трансдуцином. Арестин ингибирует дефосфорилирование фотолизированного родопсина, но не влияет на фосфорилирование темнового [Palczewski et al., 1989]. Таким образом, вместе оба эти процесса приводят к инактивации трансдуцина [Palczewski et al., 1991].
То, что арестин играет ключевую роль в инактивации, показано и в электрофизиологическом эксперименте. При регистрации фотоответов палочек сетчатки трансгенных мышей, у которых отсутствовал арестин, было установлено, что фотоответ в этом случае сильно затянут во времени [Xu et al., 1997].
Роль кальция в механизме фототрансдукции
Фоновый подсвет уменьшает чувствительность фоторецепторной клетки в соответствии с законом Фехнера [Fain, Matthews, 1990]. Этот феномен, известный как световая адаптация, исследовался, в частности, при регистрации фотоответов палочек и колбочек при фоновом подсвете. Фоновый подсвет приводил к изменениям в параметрах фотоответа зрительных клеток, в частности, к ускорению фотоответа и уменьшению его амплитуды [Tamura, Nakatani, 1989; Nakatani, et al., 1991]. В основе этого явления лежит изменение внутриклеточной концентрации свободного кальция [Pugh, Lamb, 1990; Fain, Matthews, 1990]. В том случае, когда внутриклеточные изменения кальция были сведены к ми
21
нимуму, клетки теряли способность к световой адаптации [Nakatani, Yau, 1988а; Matthews et al., 1988; Matthews et al., 1990].
Введение кальциевого буфера ВАРТА в палочку [Torre et al., 1986] приводило к изменению световой чувствительности и времени восстановления фотоответа, что также подтверждает то, что именно кальций играет ключевую роль в световой адаптации и механизме восстановления светового сигнала.
Изменения концентрации внутриклеточного кальция. Согласно кальциевой гипотезе, предложенной в 1970 г. [Hagins, 1972; Hagins, Yoshikami, 1974; Yoshikami, Hagins, 1975], роль медиатора в палочке играют ионы Са2+. Предполагалось, что диски являются кальциевым депо, в котором в темноте концентрация кальция гораздо выше, чем в цитоплазме. Освещение вызывает высвобождение Са2+ из дисков, причем время, необходимое для выхода Са2+, должно быть сравнимо со временем электрофизиологического ответа палочки, а количество его должно быть достаточным, чтобы заблокировать более 100 каналов на изомеризацию, т.е. обесцвечивание одной молекулы родопсина должно вызывать высвобождение более 100 ионов Са2+ [Kalamkarov et al., 1976; Косолапов и др. 1981; Каламкаров, Островский, 1988]. Однако было установлено, что концентрация кальция при освещении не возрастает, а уменьшается. Так, измерения внутриклеточной концентрации кальция с помощью акварина показали, что она, по разным оценкам, составляет 0,6-0,22 мкМ [McNaughton et al., 1986; Ratto et al., 1988; Korenbrot, Miller, 1989; McNaughton, Perry, 1990]. При освещении эта величина уменьшалась до неизмеримой с постоянной времени 0,5-1,6 с. Минимальная концентрация внутриклеточного кальция может быть оценена теоретически на основании уравнения Ходжкина [Blaustein, Hodgkin, 1969] в предположении, что основным элементом, поддерживающим внутриклеточную концентрацию кальция, является Па+/Са2+/К+-обмен-ник. Такая оценка дает величину 1,8 х 10-10, хотя это можно считать только нижним пределом возможной концентрации. Реально при освещении концентрация кальция падает, по-видимому, до 140 нМ [Ratto et al., 1988]. Сильное освещение вызывает экстракцию внутриклеточного кальция обменником со скоростью 1,7 х 106-2 х 107 ионов в секунду [Gold, 1986; Hodgkin, Nunn, 1987; Miller, Korenbrot, 1987; Nakatani, Yau, 1988b].
Оценки показывают, что внутриклеточное содержание кальция в наружном сегменте значительно больше, чем его внутриклеточная концентрация. Это означает, что большая часть кальция находится в связанном состоянии. Общее содержание кальция в наружном сегменте палочки составляет 0,2-1 моль Са2+/моль родопсина. Небольшая часть кальция находится во
22
внутридисковом пространстве и может быстро обмениваться с цитоплазмой [Fain, Schroder, 1987].
Наружный сегмент фоторецептора содержит два типа каль-ций-связывакнцих центров, различающихся по аффинности. Роль низкоаффинных центров играет, по-видимому, фосфати-дилсерин [McLaughlin, Brown, 1981]. Кроме того, кальций связан с несколькими кальций-связывающими белками в цитоплазме. Так, рекаверин содержит несколько кальций-связывающих центров [Lee et al., 1987; Dizhoor et al., 1991]. Сильным кальций-связы-вающим белком является арестин [Huppertz et al., 1990], концентрация которого в наружном и особенно во внутреннем сегменте фоторецептора достаточно высока. Под действием света концентрация арестина в наружном сегменте возрастает [Шевченко и ДР-, 1988].
Na+ICa2+IK+-обменник. Удаление кальция из наружного сегмента фоторецептора осуществляется Па+/Са2+/К+-обменником [Schnetkamp, 1989; McNaughton 1990; Lagnado, McNaughton, 1990]. Если бы выведение кальция осуществлялось только за счет №+/Са2+-обмена, то градиента ионов натрия было бы недостаточно для поддержания внутри клетки необходимой низкой концентрации кальция (как уже отмечалось, эта концентрация ниже, чем обычно встречается в клетках). Поэтому обменник в фоторецепторной клетке использует также и градиент ионов калия. Такой тип обмена уникален и не встречается в других клетках.
Зависимость обмена от концентрации натрия носит сигмоидный характер с коэффициентом Хилла 2-2,3 [Schnetkamp, 1986; Lagnado et al., 1988]. Это означает, что процесс кооперативный, и для работы обменника необходимо связывание, по крайней мере, трех ионов натрия. Процесс обмена специфичен и может быть активирован только ионами натрия [Schnetkamp, 1986; Cook, Kaupp, 1988].
Обменник локализован только в плазматической мембране с плотностью 200-450 мкм~2 [Cook, Kaupp, 1988; Reid et al., 1990]. Его молекула представляет собой одиночную полипептидную цепь с молекулярной массой 220 кДа [Cook, Kaupp, 1988; Nicoll, Applebury, 1989]. В темноте обменный ток составляет 1 пА, что соответствует переносу 1,7 х 107 ионов кальция в секунду [Hodgkin et al., 1987]. Таким образом, одна молекула обменника переносит примерно 300-600 ионов кальция в секунду [Schnetkamp, 1989]. В основном регуляция обмена осуществляется путем изменения ионной концентрации внутри клетки, однако есть данные, что обменник взаимодействует с ЦН-каналом [Bauer, 1991].
23
Влияние кальция на механизм фототрансдукции. Как обсуждалось, кальций непосредственно не участвует в процессе генерации фототока, но играет регуляторную роль в работе фоторецепторной клетки. Долгое время предполагалось, что кальций может как ингибировать фосфодиэстеразу, так и активировать гуа-нилатциклазу (ГЦ). В электрофизиологических экспериментах было показано, что изменение внутриклеточной концентрации кальция приводит к увеличению темнового тока, и этот эффект сопряжен с ингибированием ГЦ [Rispoli et al., 1988; Koch et al., 1990; Rispoli et al., 1993]. Уменьшение концентрации кальция от 200 до 20 нМ приводит к двадцатикратному увеличению активности гуанилатциклазы [Lolley, Racz, 1982; Pepe et al., 1986; Koch, Stryer 1988]. Процесс активации - кооперативный и характеризуется коэффициентом Хилла 3,9. Активация гуанилатциклазы кальцием происходит при участии активируемого кальцием белка [Dizhoor et al., 1999].
С другой стороны, электрофизиологические эффекты кальция могут быть, в принципе, объяснены и прямым его действием на процесс фототрансдукции. Так, введение в цитоплазму наружного сегмента палочки Са2+-содержащего буфера ВАРТА не влияет на фазу нарастания сигнала, но существенно удлиняет время его восстановления [Torre et al., 1986]. Этот эффект интерпретировался как влияние Са2+ на время жизни одного компонента каскада фототрансдукции (активированного родопсина, трансдуцина или фосфодиэстеразы). В фоторецепторах лягушки 1 мкм Са2+ увеличивал активируемую светом активность ФДЭ на 50%.
При исследовании формирования комплексов родопсин-трансдуцин, проведенных по измерению светорассеяния в растворах изолированных белков, было также показано, что кальций влияет на время жизни комплексов [Kahlert et al., 1990].
Роль кальция в восстановлении фотоответа. Процесс восстановления темнового тока в фоторецепторе (восстановление фотоответа) связан с закрытием ЦН-каналов, вызванным увеличением концентрации цГМФ. Стехиометрия процесса примерно такова: ГЦ и ФДЭ присутствуют в клетке в эквимолярных количествах, в темноте ФДЭ гидролизует 0,8 молекул цГМФ/c, и при насыщающем освещении эта величина возрастает до 5000 [Hurley, 1987]. В темноте ГЦ синтезирует 1 молекулу цГМФ/c, и эта скорость увеличивается в 10 раз при уменьшении концентрации кальция. Принимая среднее значение Км для фосфо диэстеразы ~1 мМ [Hurley, 1987] и концентрацию цГМФ в клетке 2 мкМ, получим, что скорость гидролиза цГМФ при максимальном освещении составляет 0,3 мМ цГМФ/c. Аналогичная величина для
24
синтеза цГМФ гуанилатциклазой при низком содержании кальция составляет 0,23 мМ цГМФ/c. Таким образом, активности ФДЭ и ГЦ примерно одинаковы как в темноте, так и при освещении, и процесс восстановления фототока не может быть обусловлен только активацией ГЦ, а должен быть сопряжен с дезактивацией ФДЭ за времена, характерные для фазы восстановления фототока (~с).
Гуанилатциклаза. Выше мы рассмотрели реакции, ингибирующие процесс фототрансдукции и таким образом прекращающие гидролиз цГМФ в клетке. Ключевым ферментом, обеспечивающим восстановление фотоответа, является ГЦ. Содержание ГЦ в наружном сегменте составляет 1-5% (1 молекула ГЦ на 100 молекул родопсина). Очищенная ГЦ представляет собой белок с молекулярной массой 112 к Да) и активностью 100— 700 нмоль/мин/мг белка. Это соответствует гидролизу 0,2-1,3 молекул цГМФ/с.
В различных клетках встречаются три типа ГЦ: водорастворимая, мембрансвязанная и ассоциированная с цитоскелетом [Schulz et al., 1989]. В работе ГЦ важную роль играет ее ассоциация с аксонемами [Fleischman, 1979]. Поскольку большая часть ГЦ связана с микротрубочками цитоскелета, она очень трудно солюбилизируется [Toibanaetal., 1982; Kawamura, Murakami, 1989; Ertel, 1990]. Для эффективной работы ГЦ необходимо наличие в НСП активной пирофосфатазы (пирофосфат, образующийся при гидролизе ГТФ, является ингибитором активности ГЦ). Действительно, в НСП была обнаружена значительная активность пирофосфатазы [Yang, Wensel, 1991]. Оказалось, что пирофосфатаза НСП является кальций-чувствительным ферментом, и это обеспечивает дополнительную обратную связь между входящим током и активностью ГЦ.
Большая часть цГМФ в фоторецепторе находится в связанном состоянии. Действительно, только 1-2% ЦН-каналов в клетке открыто в темноте, что соответствует свободной концентрации цГМФ 1-4 мкМ. Общая же концентрация цГМФ в клетке составляет 50-60 мкМ.
Цитоскелетная организация фоторецепторной клетки
Механизм ограничения диффузии медиатора в фоторецепторной клетке не ясен. Можно предположить, что в клетке существуют какие-то структуры, затрудняющие диффузию в продольном направлении. С другой стороны, поскольку все процессы синтеза протекают во внутреннем сегменте, должна сущест
25
вовать эффективная система транспорта веществ из внутреннего сегмента в наружный. Так, например, основная часть гуанилатци-клазы в палочке связана с аксонемой [Fleischman, Denisevich, 1979; Fleischman, 1981].
Микротрубочки аксонемы протягиваются от базальной части почти на всю длину палочки у млекопитающих и на 2/3 ее длины у лягушки. Субстрат гуанилатциклазы - ГТФ - синтезируется во внутреннем сегменте палочки, в митохондриях, поэтому для эффективного восстановления концентрации цГМФ после гидролиза ГТФ должен быть транспортирован из внутреннего сегмента с большой скоростью.
Вдоль наружного сегмента транспортируются не только нуклеотиды, но и более крупные молекулы. Так, показано, что аре-стин в темноте в большой концентрации содержится во внутреннем сегменте палочки. При освещении значительная часть его переходит в наружный сегмент [Whelan, McGinnis, 1988]. С другой стороны, ионы Са2+, введенные во внутренний сегмент, по-видимому, не транспортируются в наружный, поскольку такая инъекция не оказывает влияния на ток палочки, хотя инъекция Са2+в наружный сегмент подавляет ток [McLeish et al., 1984].
Таким образом, движение одних веществ в палочке затруднено, в то время как другие переносятся весьма эффективно, т.е. в палочке должна существовать избирательная система транспорта веществ из внутреннего сегмента в наружный. В других клетках, например, в нейронах в системе аксонального транспорта, такими активными переносчиками веществ, по-видимому, являются цитоскелетные структуры [Masumoto, Sakai, 1979].
Морфологическое изучение цитоскелетной организации фоторецепторов началось в конце 70-х годов прошлого века. В работах [Bumside, 1976, 1978; Warren, Bumside, 1978] изучали распределение актина и тубулина во внутренних сегментах палочек и колбочек методом микроскопии тонких срезов. Используя ингибиторы сборки цитоскелета, авторы показали, что цитоскелетные структуры внутренних сегментов играют важную роль в механизме ретиномоторных движений фоторецепторов. Применение электронной микроскопии и глубокого травления позволило обнаружить и частично идентифицировать ряд элементов цитоскелета в НСП [Usukura, Yamada, 1981; Roof, Heuser, 1982; Roof, Applebuiy, 1984 a, b; Chaitin et al., 1984; Kaplan et al., 1986]. Имму-нофлуоресцентное окрашивание показало, что в базальной части НСП локализованы фодрин, актин, микротрубочки и кальмодулин. Все они прокрашиваются в виде отдельных полосок, берущих начало в цилиуме и протягивающихся в наружный сегмент. Актин интенсивно прокрашивается в чашевидных выступах и в
26
цилиуме, а также в цитоплазме под вновь образованными дисками. По всему НСП окрашивается примембранный актин. Функциональная роль этих структур неизвестна. Исходя из их локализации, было высказано предположение, что они играют определенную роль в образовании новых дисков и обновлении мембраны. Наличие кальмодулина и кальмодулин-зависимого кросссшивателя фодрина предполагает участие Са2+в этом процессе. Есть данные, что микрофиламенты необходимы для отщепления дисков на апикальном конце палочки [Berharse, Dunis, 1982].
Вещества, разрушающие актиновые филаменты, ингибировали отщепление дисков in vitro. Вещества, разрушающие микротрубочки, напротив, активировали отщепление дисков, но в специфических условиях, при низкой концентрации бикарбоната в культуральной среде. Роль микротрубочек в отщеплении дисков не ясна. Предполагалось, что длина цилиарных микротрубочек может определять соответствующее положение на оси НСП для отщепления дисков. Однако было показано, что длина цилиарных микротрубочек в НСП лягушки обычно лишь немного превышает 1/2 длины НСП и вряд ли влияет на расположение места нормального отщепления дисков [Kaplan et al., 1986]. Дистальный конец НСП, в отличие от базального, содержит кластеры необычных, похожих на микротрубочки филаментов. Эти филаменты, длиной около 25 нм, протягиваются вдоль оси фоторецепторной клетки под плазматической мембраной пучками по 4-6 филаментов. Антителами к микротрубочкам эти филаменты не окрашиваются. Кроме того, в палочке обнаружено множество коротких филаментов, которые не удалось идентифицировать биохимически.
Тонкие филаменты длиной около 15 нм, соединяющие между собой диски, расположены регулярно, через 14 нм. Филаменты, соединяющие диски с плазматической мембраной, имеют разветвленную структуру, их длина достигает 30 нм. По-видимому, биохимически эти два типа филаментов отличаются друг от друга. Обнаружены также внутридисковые филаменты.
Добавление Mg2+—АТФ к суспензии НСП с разрушенными плазматическими мембранами вызывает рост филаментов из этих НСП [Parker et al., 1987]. Рост филаментов проявлялся в уменьшении околоинфракрасного рассеяния в суспензии НСП. Этот рост филаментов ингибировался ванадатом и дициклокарбодиимидом и был нечувствителен к колхицину, колцемиду и цитохалазинам В и D.
При исследовании цитоскелета колбочек во внутренних сегментах была обнаружена развитая сеть микротрубочек, актиновых и промежуточных филаментов. По-видимому, они участву
27
ют в темновом удлинении и светоиндуцированном сокращении колбочек [Nagle et al., 1986]. В наружных сегментах колбочек ци-тоскелетные структуры не обнаружены.
Функциональная роль цитоскелетных структур фоторецепторной клетки, о которых к настоящему времени накоплено достаточное количество морфологических данных, до сих пор практически не изучалась. Между тем, локализация цитоскелетных структур и их способность связывать и транспортировать вещества предполагают возможность их участия в механизмах трансдукции и адаптации зрительной клетки.
Взаимодействие родопсина с периферическими белками наружного сегмента фоторецептора
Структура родопсина. Зрительный пигмент родопсин является интегральным белком фоторецепторного диска с молекулярной массой 40 кДа. После бактериородопсина зрительный родопсин оказался вторым мембранным белком, полная аминокислотная последовательность которого была расшифрована. Эта работа была проведена коллективом авторов в рамках проекта “Родопсин”, возглавляемого академиком Ю.А. Овчинниковым [Овчинников и др. 1982; Ovchinnikov et al., 1988]. Следует заметить, что, хотя бактериородопсин и был первым исследованным интегральным мембранным белком, в силу особенности строения бактериородопсиновой бляшки его структура оказалась достаточно специфичной. По существу, бактериородопсиновая бляшка - это мембранное образование с жесткой фиксацией каждой единицы белка, что совершенно нетипично для строения большинства биологических мембран. В этом смысле родопсин оказался первым типичным интегральным мембранным белком, который был подвергнут систематическим исследованиям, и представления о его структуре во многом были перенесены в исследования других мембранных белков.
Родопсин из глаз крупного рогатого скота представляет собой полипептид из 347 аминокислот. Первые представления о трехмерной структуре родопсина были получены практически одновременно методом электронной микроскопии в сочетании с малоугловым рентгеновским рассеянием и ограниченным протеолизом, проведенным при определении первичной структуры.
Оказалось, что молекула родопсина состоит из 7 трансмембранных а-спиралей (ТМ1-ТМ7) и соединяющих их 3 внутридис-ковых и 4 цитоплазматических петель. При этом N-концевой
28
участок полипептидной цепи находится во внутридисковом пространстве, а С-концевой пептид обращен в цитоплазму.
Более точно трехмерная структура молекулы родопсина была определена значительно позже двумя способами. Первоначально трехмерная модель родопсина была получена методом электронной кристаллографии [Schertler, Hargrave, 2000; Gebhard et al., 2000] на двумерных кристаллах. Трехмерная модель была реконструирована из последовательности срезов на различных уровнях молекулы. В последующих работах удалось синтезировать классические трехмерные кристаллы родопсина, что позволило изучить его трехмерную структуру методом рентгеновской кристаллографии [Palczewski, 2000]. При этом новейшие исследования полностью подтвердили результаты предшествующей работы. Интересно отметить, что результаты, полученные спустя 20 лет, не входили в противоречие и с первыми данными по ограниченному протеолизу, а лишь значительно их детализировали. Ниже мы опишем наиболее современное представление о структуре белка.
Оказалось, что а-спирали ТМ4, ТМ6, ТМ7 расположены перпендикулярно к дисковой мембране, тогда как спирали ТМ1, ТМ2, ТМЗ, ТМ5 находятся под некоторым углом к мембране [Schertler, Hargrave, 2000; Hargrave, 2001] (рис. 1.5). Кроме того, а-спиральные участки могут значительно выступать над поверхностью мембраны, сохраняя при этом свою периодическую структуру [Altenbach et al., 1999а].
В молекуле родопсина можно выделить цитоплазматическую, внутридисковую и внутримембранную части. Внутридиско-вая часть молекулы родопсина состоит из N-концевого участка и трех петель, экспонированных во внутридисковое пространство. Эта часть родопсина содержит три аминокислотных остатка цистеина (Cys-110, Cys-185 и Cys-187). В нативной форме рецептора Cys-110 и Cys-187 образуют дисульфидный мостик, необходимый для поддержания правильной структуры родопсина и связывания ретиналя [Hwa et al., 1999]. Так, при замене этого дисульфидного мостика на С-185-С-187 (мутации С-110А, С-110F, С-110Y) опсин терял способность к связыванию ретиналя. При образовании мостика С-110—С-185 вместо нативного (мутация С-187А) родопсин хотя и мог связывать ретиналь, но при этом формировался пигмент с аномальным световым поведением [Hwa et al., 1999].
N-концевой участок родопсина гликозилирован по аминокислотным остаткам Asn-2 и Asn-15. Вероятнее всего, как и в случае большинства трансмембранных белков, гликозилирование является необходимым для формирования правильной трехмерной структуры рецептора [Hargrave, 2001]. Таким образом, внутридисковая
29
Рис. 7.5. Расположение ot-спиральных участков молекулы родопсина в фоторецепторной мембране
Участки ГМ1-ТМ7 обозначены как 1-7. Пояснения в тексте
часть молекулы играет важную роль в обеспечении структуры родопсина, хотя и не участвует в прямых взаимодействиях с периферическими белками и, по-видимому, мало затрагивается при фото-индуцированных изменениях родопсина, о чем речь пойдет позже.
Внутримембранная часть родопсина состоит из ретиналя и семи трансмембранных а-спиралей, представляющих собой остов опсина. Еще в первых работах Дж. Уолда было установлено, что 11-цис-ретиналь ковалентно связан с е-аминогруппой лизина через Шиффово основание. Сейчас показано, что это Lys-296, локализованный на спирали ТМ7 [Wald, 1968; Lin et al., 2000].
Остатки внутри трансмембранных спиралей выполняют две основные функции:
1) создают связывающий карман для 11-цис-ретиналя и регулируют его спектральные свойства;
2) участвуют во внутримолекулярных взаимодействиях, которые контролируют третичную структуру белка и динамику его фотоиндуцированных изменений.
Как известно, максимум поглощения свободного ретиналя составляет 380 нм, а максимум поглощения родопсина 500 нм. Чем объясняется подобный батохромный сдвиг максимума поглощения? В основном состоянии родопсина Шиффово основание находится в протонированной форме. Протонирование Шиффова основания увеличивает делокализацию электрона вдоль полиеновой цепи ретиналя и вызывает смещение максимума поглощения родопсина с 380 до 440 нм (Хмакс). Наблюдаемый в родоп
30
сине сдвиг \,акс до 500 нм можно объяснить за счет слабого даль-нодействующего взаимодействия между Шиффовым основанием и его противоионом Glu-113 на ТМЗ. Максимум поглощения хромофора может также варьировать в зависимости от локализации ретиналя в неполярном кармане, образуемом боковыми цепями некоторых аминокислот [Lin et al., 2000]. Эксперименты по исследованию точных сайтов взаимодействия опсина с ретиналем показали, что Gly-121 на ТМЗ и Phe-261 на ТМ6 взаимодействуют с С9-метильной группой ретиналя [Lin et al., 2000]. Таким образом, аминокислотные остатки Glu-113, Glu-121, Phe-261, Lys-296 непосредственно связываются с ретиналем, причем для регуляции спектральных свойств хромофора особенно важны Glu-113, Lys-296, a Glu-121, Phe-261 играют важную роль в эффективной активации родопсина в ответ на фотоизомеризацию ретиналя.
Как поддерживается стабильная трехмерная структура родопсина? Известно, что в отличие от глобулярных водорастворимых белков, структура которых поддерживается за счет водородных связей через молекулы воды, третичная структура интегральных мембранных белков обеспечена в основном гидрофобными взаимодействиями. Тем не менее, как оказалось, вода также играет важную роль в поддержании структуры белка.
Методами инфракрасной спектроскопии было показано наличие как минимум трех молекул воды во внутримембранном пространстве родопсина [Lin et al., 2000]. Эксперименты с использованием мутантных форм родопсина (замена Е-113Q) показали, что одна из молекул воды находится внутри хромофор-связыва-ющего кармана и образует водородные связи с протонированным Шиффовым основанием и его противоионом Glu-113. Вторая молекула воды соединяет ТМ2 и ТМЗ с помощью мостика, образованного водородными связями с карбоксильным карбонилом Asp-83 и с пептидным карбонилом Gly-120.
Следует отметить, что внутримембранная часть молекулы может играть и некоторую роль во взаимодействии родопсина с трансдуцином. Интересно, что ароматические аминокислоты на позиции 261 сохраняются у большинства связывающих трансдуцин рецепторов (82%). Это может свидетельствовать о важной роли ТМЗ-лиганд-ТМб взаимодействия в активации рецептора.
Цитоплазматическая часть родопсина состоит из 4 петель и карбоксильного концевого участка [Овчинников и др., 1982]. Три петли соединяют между собой трансмембранные а-спирали, а четвертая петля расположена между седьмой а-спиралью и двумя пальмитированными цистеинами (Cys-322, Cys-323). На рис. 1.5 показано, что гидрофобные участки пальмитиновых кислот погружены в дисковую мембрану и таким образом прикреп-
31
Возбужденное состояние
- транс - изомеризация
Фотородопсин (585 нм)
| 45 пс
Батородопсин (543 нм)
I 170 нс
h\>
Люмиродопсин (497 нм)
| 120 мкс
Метародопсин 1а (478 нм)
| мс
Метародопсин 1b (458 нм)-связывание с
| 12 мс трансдуцином
Метародопсин II (380 нм)-ГДФ-ГТФ - обмен
Л минуты
опсин + полностью - транс - ретиналь (380 нм)
Рис. 1.6. Схема фотолиза родопсина (А) и структурные формулы изомеров ретиналя (Б)
ляют к ней С-концевой участок родопсина. Основная роль этого участка состоит во взаимодействии с трансдуцином, на чем подробнее мы остановимся ниже.
Фотохимические превращения родопсина. При освещении родопсин обесцвечивается: из пурпурного он становится желтоватым. Собственно говоря, именно это наблюдение на изолированной сетчатке лягушки и привело Франца Болля (1876) к открытию Sehestoff, или светочувствительного вещества сетчатки, названного затем Visual purple, или зрительным пурпуром. Значительно позже зрительный пурпур был назван родопсином, что сначала обозначало зрительный пигмент палочек, содержащий в качестве хромофора альдегид витамина А, - ретиналь,. Сравнительно недавно к семейству родопсинов были отнесены все зрительные пигменты, содержащие в качестве хромофора ретиналь,, в отличие от семейства порфиропсинов, у которых хромофор - ретиналь2. Правда, зрительный пигмент красных колбочек, содержащих в качестве хромофора ретиналь,, продолжают называть йодопсином. За счет добавочной двойной связи в Р-ио-ноновом кольце ретиналя2 порфиропсины, как правило, поглощают в более длинноволновой области спектра, нежели родопсины. Следует подчеркнуть, что природа фотопревращений порфиропсинов и родопсинов одинакова.
32
Итак, фотопревращение, или фотообесцвечивание, родопсина включает собственно фотохимическую реакцию и последующие темновые, зависящие от температуры превращения. Поскольку хромофорную группу родопсина можно рассматривать как естественную хромофорную метку внутри молекулы, то с ее помощью удается спектрально исследовать промежуточные продукты (интермедиаты) фото- и термопревращений родопсина. Франц Болль наблюдал в изолированной сетчатке лягушки, по существу, два продукта: исходный нативный (темновой) родопсин и один из последних, достаточно стабильный продукт фотообесцвечивания, так называемый индикатор желтый, или в современной терминологии метародопсин II. Затем для детального исследования фото- и термопревращений родопсина с успехом были применены методы низкотемпературной спектрофотометрии [Wald, 1968; Yoshizawa, Shihida, 1982]. Вслед за этим получили развитие методы быстрой лазерной спектроскопии, которые позволили при комнатной температуре подробно исследовать кинетику фотохимических и термальных реакций родопсина и, что особенно важно, обнаружить новые самые короткоживущие промежуточные продукты в фемто- и наносекундных диапазонах. На рис. 1.6, А представлена схема фотопревращения родопсина, включая самые ранние продукты.
В отличие от фотоцикла бактериородопсина и фотопревращений родопсина беспозвоночных (см. ниже), зрительные пиг
2. Г.Р. Каламкаров, М.А. Островский
33
менты позвоночных претерпевают при действии света необратимые превращения, или фотолиз. Речь идет о том, что на последних стадиях происходит гидролиз связи Шиффова основания ретиналя с опсином, в результате чего высвободившийся ретиналь теперь уже в полностью транс-форме “уходит” из фоторецепторной клетки (рис. 1.6, Б).
Итак, при поглощении кванта света родопсин переходит в электронно-возбужденное состояние. Эта самая первая фотофи-зическая стадия фотопревращения занимает всего несколько фемтосекунд. Единственная фотохимическая реакция в зрении -фотоизомеризация хромофора (11-цпс-ретиналя) конкурирует с тремя другими процессами, принимающими участие в релаксации синглетного возбужденного состояния родопсина в основное состояние, а именно: внутренней безызлучательной конверсией и флуоресценцией. Поэтому неудивительно, что фотохимическая реакция цпс-транс-изомеризации должна протекать достаточно быстро, чтобы эффективно конкурировать с тремя другими. Методом сверхбыстрой лазерной фемтосекундной спектроскопии было показано, что фотоизомеризация хромофора происходит в пределах 200 фемтосекунд [Schoenlein et al., 1991]. Считается, что изомеризация начинается, примерно, через 60 фемтосекунд после поглощения кванта [Кандори, 2001]. Это одна из самых быстрых химических реакций, известных в настоящее время. Квантовый выход фотоизомеризации 11-цпс-ретиналя равен 0.67.
Таким образом, первым фотохимическим продуктом в процессе фотолиза родопсина является так называемый фотородопсин (см. схему на рис. 1.6, А). Поскольку образование фотородопсина происходит исключительно быстро (менее чем за 200 фс), можно предполагать, что если и могут происходить смещения аминокислотных остатков в ближайшем окружении хромофора, то лишь крайне незначительные. Поскольку цпс-транс-изомери-зация приводит к удлинению вытянутой полиеновой цепи ретиналя, то в ограниченном объеме хромофорного центра он должен находиться в сильно скрученной конформации. Следствием этого должно быть возрастание потенциальной энергии. Действительно, калориметрические исследования показали, что около 60% энергии поглощенного кванта (около 30 Ккал) оказываются запасенными в молекуле родопсина [Cooper, 1979].
• Таким образом, функциональная роль сверхбыстрой фотоизомеризации хромофора состоит в том, чтобы перевести поглощенную энергию кванта света в свободную химическую энергию, запасенную в молекуле родопсина в виде его сильно скрученной конформации. Энергия эта, в свою очередь, вызовет гораздо более медленные конформационные перестройки в белко
34
вой части молекулы (опсине). Конечным же результатом этих перестроек станет образование долгоживущего продукта - метародопсина II, который приобретает способность взаимодействовать с трансдуцином. Взаимодействие метародопсина II или, как его часто называют, активированного родопсина с трансдуцином представляет собой ключевую реакцию в механизме трансдукции светового сигнала.
Конформационные изменения в опсине после изомеризации 11-цпс-ретиналя происходят ступенчато, что отражается на спектрах поглощения промежуточных продуктов фотолиза родопсина.
Изомеризация хромофора начинается с движения той половины полиеновой цепи 11 -цпс-ретиналя, которая содержит протонированное Шиффово основание и ковалентно связана с опси-ном. Таким образом, первые внутримолекулярные смещения аминокислотных остатков опсина происходят вблизи Шиффова основания на стадии перехода от фото- к батородопсину (см. рис. 1.6, Д). Конкурентное движение молекулы воды, связанной с протонированным Шиффовым основанием и Е-113 (Glu-113) может вызывать значительные конформационные изменения в ближайшем окружении протонированного Шиффова основания [Nagata et al., 1997]. Затем, чтобы высвободить часть напряжения все еще скрученного хромофора, вторая половина его полиеновой цепи, содержащая Р-иононовое кольцо, также смещается и меняет свое взаимодействие с ближайшими аминокислотными остатками, теперь уже на стадии перехода бато- в люмиродопсин [Okada et al., 1991].
Отражением фотоиндуцированных конформационных изменений в опсине на стадии образования батородопсина могут служить наблюдавшиеся нами при температуре жидкого азота фотообратимые изменения сверхтонкой структуры мессбауэровской метки, связанной с родопсином в фоторецепторной мембране [Каламкаров и др., 1974].
На стадии перехода от люми- к метародопсину I дальнейшие изменения во взаимодействии с ближайшими аминокислотными остатками наблюдаются вблизи 9-й метильной группы полиеновой цепи [Shihida et al., 1991]. На этой же стадии еще сохраняется возможность фотообратимых превращений родопсина. Действительно, при температуре минус 22 °C, при которой метародопсин I стабилен, можно наблюдать многократный спектральный фотопереход из родопсина в метародопсин I, и обратно [Кронгауз и др., 1975а-в; Protasova et al., 1991]. Интересно, что если спектральные характеристики исходного темнового и фоторегенери-рованного родопсина практически совпадают, то их изомерный
2*
35
состав, суця по результатам, полученным методом хроматографии под высоким давлением, оказывается различным: в исходном родопсине хромофором является, естественно, 11-цпс-рети-наль, однако в фоторегенерированном синим светом продукте это в основном - полностью-трпнс-ретиналь [Protasova et al., 1991]. Эти и целый ряд других данных свидетельствуют о том, что, с одной стороны, произошедшие на стадии метародопсина I конформационные изменения опсина весьма значительны, но с другой стороны, судя по сохранению его способности к фоторегенерации, еще не являются необратимыми. Во всяком случае, на этой стадии все изменения конфигурации хромофора уже полностью завершены и хромофорный центр опсина находится в термодинамически стабильном состоянии. Следует отметить, что перестройки и в хромофоре, и в опсине на стадии образования метародопсина I существенны для последующего взаимодействия с трансдуцином. Так, удаление |3-иононового кольца или 9-й метильной группы ретиналя приводит к падению способности зрительного пигмента активировать трансдуцин [Ganter et al., 1989; Jager et al., 1994]. Интересно, что еще до стадии образования метародопсина II спектрально обнаруживается продукт, названный метародопсин 1b, который способен связывать трансдуцин, но не способен обеспечить реакцию обмена ГДФ на ГТФ [Tachibanaki et al., 1997].
И, наконец, метародопсин 1 переходит в следующий продукт - метародопсин II. Этот переход сопровождается увеличением и энтальпии, и энтропии, что отражает потерю специфических взаимодействий в молекуле зрительного пигмента и соответственно повышение конформационной подвижности всего белка. Наиболее выраженным отличием метародопсина I от метародопсина II является депротонирование Шиффова основания. Подробнее о конформационных изменениях на стадии образования метародопсина II см. ниже.
Метародопсин II затем медленно (в минутном диапазоне) переходит в метародопсин III, и далее происходит реакция гидролиза связи Шиффова основания. Высвободившийся полностью-трпнс-ретиналь активно транспортируется через фоторецепторную мембрану и претерпевает дальнейшие химические изменения. Однако для физиологического акта фототрансдукции образование метародопсина II является последней и ключевой стадией в многоступенчатом внутримолекулярном процессе фотопревращения молекулы зрительного пигмента.
Фотоиндуцированные процессы в родопсине. Основные функциональные процессы, происходящие в родопсине, сводятся к активации трансдуцина и последующему возвращению родоп
36
сина в неактивное состояние. В обоих процессах ключевую роль играют цитоплазматические аминокислотные остатки. При этом для активации родопсина необходимыми являются два процесса: конформационные перестройки во внутридисковой части, вызывающие изменения в цитоплазматических петлях. Процесс деактивации родопсина связан только с цитоплазматическими петлями, где локализованы сайты фосфорилирования и связывания с арестином.
Как показали многочисленные исследования с использованием различных методов ультрафиолетовой спектроскопии, флуоресцентных меток, ЭПР-спектроскопии, фотолиз родопсина сопровождается определенными структурными перестройками в цитоплазматической части рецептора. Эти перестройки начинаются во внутридисковой части молекулы. При поглощении фотона 11-цис-ретиналь переходит в полнэстью-тронс-форму, происходит депротонирование Шиффова основания и разрыв связи ретиналя и Glu-113. Это вызывает перемещение ТМЗ, а разрушение структурного микродомена ТМ2-ретиналь-ТМЗ приводит к изменению взаимного расположения а-спиралей [Lin et al., 2000]. Фотоактивация родопсина приводит к конформационным изменениям и в ТМ6 [Dunham, Farrens, 1999]. В результате происходит относительное перемещение спиралей ТМЗ и ТМ6 и увеличение расстояния между цитоплазматическими концами этих спиралей [Fahmy et al.. 2000]. Кроме того, наблюдается смещение спирали ТМ2, хотя и меньшее, чем у ТМ6 [Allenbach, 1999b]. Таким образом, перемещение а-спиралей является необходимым условием для образования активной формы родопсина. В результате этих перемещений пространственное расположение цитоплазматических петель и С-концевого пептида меняется, что делает возможным связывание цитоплазматических цепей родопсина с трансдуцином и другими цитоплазматическими белками [Погожева и др., 1989а].
Активация трансдуцина фотолизированной формой родопсина носит сложный последовательный характер [Kisselev et al., 1999]. На сегодняшний день установлено, что во взаимодействии с трансдуцином участвуют вторая, третья и четвертая цитоплазматические петли родопсина [Hargrave, 2001]. О том же говорят и наши данные с использованием спиновых меток, подробно рассмотренные ниже [Погожева и др., 1989а, б, 1991].
Специфичность связывания родопсина с трансдуцином определяется третьей цитоплазматической петлей. Так, при замене ее N- и С-концевых участков на соответствующие участки другого трансдуцин-связывающего рецептора мутантный белок активировал не трансдуцин, а G-белок использованного в эксперименте рецептора [Yamashita et al., 2000].
37
Вторая цитоплазматическая петля родопсина является необходимой для перестройки трансдуцина в активную форму. Показано, что в активации трансдуцина принимают участие аминокислоты N-концевого участка этой петли - Glu-134, Vai-138 и Cys-140 [Yamashita et al., 2000]. Эксперименты [Marin et al., 2000] показали, что N-концевой участок четвертой петли непосредственно связывается с а-субъединицей трансдуцина, а замена этого участка замедляет его активацию.
В результате, можно сказать, что специфическое связывание с трансдуцином N- и С-концевых участков третьей петли и неспецифическое взаимодействие с ним N-концевых участков второй и четвертой петель играют определяющую роль в процессе активации трансдуцина родопсином. Определяющую роль в связывании трансдуцина играет отодвигание С-концевой петли. Это следует, в частности, из проведенных нами экспериментов со спиновыми метками, изложенных в главе 3.
Деактивация родопсина - фосфорилирование и взаимодействие с арестином. Рассмотрим молекулярные процессы, происходящие в молекуле родопсина при его деактивации. Первый этап - это реакции фосфорилирования, осуществляемые родоп-синкиназой. С обнаружением родопсинкиназы был открыт новый класс киназ, фосфорилирующих связывающие G-белок рецепторы. Специфика этого класса киназ состоит в том, что они реагируют только с активированной формой рецептора.
Методом отщепления концевых пептидов эндопептидазой Asp-N было показано, что все сайты фосфорилирования находятся на С-концевом участке родопсина [Palczewski et al., 1991]. Всего было обнаружено 7 потенциальных сайтов фосфорилирования, но ключевыми являются аминокислотные остатки: Ser-334, Ser-338, Ser-343 [Ohguro, 2000], а также Thr-336 [McDowell, 2000]. Изучение механизма активации родопсинкиназы показало сложный характер фосфорилирования родопсина. Оказалось, что отщепленный С-концевой пептид родопсина не фосфорилируется [Palczewski, 1991]. Для активации необходимо связывание родопсинкиназы с цитоплазматической частью родопсина, отличной от сайтов фосфорилирования [Pulvermuller et al., 1993], и только в связанном состоянии у киназы появляется способность к фосфорилированию субстрата, причем этим субстратом могут быть и экзогенные пептиды. При детальном рассмотрении механизмов взаимодействия родопсинкиназы с родопсином была выявлена ключевая роль цитоплазматической петли ТМ5-ТМ6 как основного сайта связывания киназы [Palczewski et al., 1988а, Ь]. Таким образом, связывание родопсинкиназы с 3-й петлей родопсина приводит к ее ак
38
тивации и последующему фосфорилированию сериновых и треониновых остатков С-концевого участка родопсина.
Важно отметить, что трансдуцин не может активироваться в момент, когда родопсин связан с киназой, и таким образом ро-допсинкиназа частично ингибирует активацию трансдуцина конкурентным способом еще до того как будет запущен основной механизм ингибирования, т.е. начнет работать арестин [Pulvermuller et al., 1993].
Как было сказано ранее, быстрое выключение каталитической активности родопсина в основном обеспечивается его взаимодействием с арестином. Kuhn и сотр. [Kuhn et al., 1984] впервые обнаружили белок, который может связываться только с фосфорилированным родопсином, и назвали его арестин. После связывания арестина с фосфорилированным родопсином последний полностью терял способность связывать трансдуцин [Погожева и др., 1989]. Таким образом, выключение активности фосфорилированного родопсина есть результат конкуренции между арестином и трансдуцином за сайты связывания на родопсине [Krupnick et al., 1997; Pulvermuller et al., 2000]. Детальное изучение механизма взаимодействия родопсина и арестина выявило его сложный последовательный характер. В основном состоянии молекула арестина имеет низкое сродство к активной форме рецептора. Но после первоначального взаимодействия с фосфорилированием С-концевым пептидом родопсина молекула арестина активируется и приобретает сильное сродство к цитоплазматическим петлям родопсина. Процессы активации и связывания арестина с цитоплазматическими петлями рецептора могут протекать независимо. В экспериментах, где от родопсина протеолитически отщепляли С-концевой пептид, а соответствующий фосфорилированный пептид добавляли в раствор, было обнаружено нормальное связывание арестина с рецептором [Hargrave, 2001], при этом специфичность активированной молекулы арестина к фотолизи-рованной форме родопсина сохранялась.
Исследования механизмов ингибирования активации трансдуцина позволили выделить специфические сайты связывания рецептора с арестином. Удобным методом оказалось изучение конкуренции между нативной формой родопсина и пептидами, соответствующими его отдельным цитоплазматическим петлям [Krupnick et al., 1994]. Оказалось, что пептиды третьей петли сильно ингибировали связывание арестина и родопсина. Некоторый ингибирующий эффект вызывали и пептиды первой петли. Аналогичные исследования проводились методом направленного мутагенеза. Оказалось, что одиночные замещения аминокислот первой и второй петли (Asn-73 в петле I; Pro-142 и Met-143 в пет
39
ле II) на аланин нарушали эффективное связывание арестина и родопсина [Raman et al., 1999]. Таким образом, фосфорилированный С-концевой участок молекулы родопсина в ходе фотолиза отодвигается и, освобождаясь, вызывает активацию арестина. После этого арестин, взаимодействуя с первой, второй и третьей цитоплазматическими петлями рецептора, осуществляет конкурентное ингибирование активации трансдуцина.
Другим подходом к изучению взаимодействия родопсина с арестином и трансдуцином оказалась комбинация ограниченного протеолиза и модификация цистеинов в цитоплазматической части белка. Рассмотрим эти данные подробнее.
Конечно, основной функцией сайтов фосфорилирования С-конца родопсина является образование отрицательно заряженного домена. Но было обнаружено, что существуют сайты, которые не фосфорилируются in vivo, но при этом необходимы для активации арестина [Zhang et al., 1997]. Так, при замене Thr-340 на глутамат арестин связывался с родопсином. Кроме того, замена всех семи потенциальных сайтов фосфорилирования на отрицательно заряженные глутаматы приводила также к связыванию арестина. Это говорит о том, что С-концевой пептид выполняет дополнительную функцию в структурных перестройках арестина.
Трансдуцин - структура, взаимодействие с родопсином и фосфодиэстеразой. В основном, неактивном, состоянии трансдуцин представляет собой гетеротример, в состав которого входят а-, Р- и у-субъединицы. Функционально и структурно в молекуле трансдуцина можно выделить два комплекса, играющих различную роль как в его активации, так и во взаимодействии с эффекторами. Первый комплекс - это ос-субъединица, связанная с гуаниновым нуклеотидом. Второй комплекс представляет собой Р-субъединицу и связанную с ней у-субъединицу, причем, для обеспечения функционирования комплекса С-концевой пептид у-субъединицы должен быть фарнезилирован.
Передача сигнала от родопсина к фосфодиэстеразе обеспечивается Та-субъединицей, поэтому мы начнем рассмотрение с ее структуры.
Та-субъединица состоит из 350 аминокислот и имеет молекулярную массу 40 кДа [Fung, 1983]. Методами рентгеновской кристаллографии была получена детальная картина структуры Та с разрешением 2,2 A [Noel et al., 1993]. Та-ГТФ состоит из 2 доменов, разделенных глубокой щелью. Эта щель представляет собой структурный карман, связывающий гуанозин. Первый домен представлен аминокислотной последовательностью 1-53 и 179-350, и состоит из шести P-листов (Р1-Рб), окруженных пятью ос-спиралями (ос1-ос5). Установлено, что именно этот домен от
40
ветствен за ГТФазную активность ос-субъединицы. Аминокислотная последовательность первого домена высоко консервативна среди всех G-белков и аналогична семейству Ras-белков.
Второй - высокоспиральный домен представлен аминокислотной последовательностью 59-172, и уникален для гетеротри-мерных G-белков. Он соединяется с ГТФазным доменом двумя полипептидами (54-58 linker 1) и (173-179 linker 2).
Домены I и II образуют такую структуру, что ГТФ и ассоциированный ион Mg2+ полностью спрятаны внутри молекулы, и поэтому для обмена нуклеотидов необходимы конформационные изменения в щели между доменами 1 и II. Домен II представляет собой основную ос-спираль (ссА), состоящую из 28 аминокислот, которая поддерживает 5 меньших а-спиралей (aB-ocF) через гидрофобные взаимодействия. Такая устойчивая внутренняя структура домена II может обеспечивать ему роль откидывающейся крышки при конформационных изменениях в linker 1 и linker 2, необходимых для обмена нуклеотидов [Noel et al., 1993].
Связывание гуаниновых нуклеотидов. Положение молекулы ГТФ в структуре субъединицы трансдуцина точно установлено. Фосфатные группы ГТФ, связанные с ионом Mg2+, образуют водородные связи с амидами основной цепи (скелетными) Glu-39, Gly-41, Lys-42, Ser-43, Thr-177 и Gly-199 и с боковыми цепями Lys-42 и Arg-174. 2’- и 3’-гидроксильные группы сахарного кольца связаны водородными связями с карбонильными группами Leu-171 и Arg-172. Азот гуанинового кольца связан через воду с боковыми цепями Ser-147 и Arg-172. Стабилизация гуанинового кольца обеспечивается Ван-дер-Ваальсовым взаимодействием между Lys-266 и метильной группой Thr-323. Сам же Lys-266 фиксируется солевым мостиком с Asp-146, a Thr-323 блокируются с помощью водородной связи с боковой цепью Cys-321 [Noel et al., 1993].
Такое сложное взаимодействие приводит к тому, что гуаниновые нуклеотиды не только играют основную функциональную роль в работе трансдуцина, но и сами по себе участвуют в формировании и поддержании его структуры.
Функции трансдуцина. Как было сказано выше, для активации трансдуцина необходим обмен нуклеотидов ГДФ на ГТФ, который происходит в присутствии активной формы родопсина. Хотя точная картина взаимодействия родопсина и трансдуцина все еще неясна, некоторые аспекты этого взаимодействия изучены детально.
Установлено [Kisselev et al., 1999; Ford et aL, 1998], что 2 пептида, входящих в состав гетеротримера трансдуцина, могут стабилизировать метародопсин II аналогично нативному трансдуцину. Первый пептид - это 10 С-концевых аминокислот ос-субъединицы.
41
Второй пептид является С-концевым фосфорилированным пептидом у-субъединицы (60-71) с присоединенным к концу липидом - фарнезилом. Следует отметить, что наличие фарнезила является необходимым для обеспечения функций. Методом конкурентного ингибирования показано, что оба этих пептида могут ингибировать процесс активации трансдуцина, но способность к ингибированию для первого пептида была парадоксально низкой по сравнению со способностью к стабилизации метародопсина II.
При рассмотрении структуры этих пептидов видно, что они настолько различны, что им должны соответствовать различные сайты связывания на родопсине. Кроме того, следует отметить, что в нативном гетеротримере трансдуцина участки этих пептидов разнесены на 40А, тогда как максимальный линейный размер цитоплазматической части родопсина составляет 35А. Таким образом, одновременное взаимодействие этих пептидных участков с родопсином невозможно без существенных конформационных перестроек. Предложено две модели последовательного взаимодействия трансдуцина с активным родопсином [Kisselev et al., 1999]. В первом случае два родопсин-связывающих сайта взаимодействуют по очереди так, что одновременно с родопсином связан лишь один из сайтов. Предполагается, что взаимодействие первого сайта с родопсином индуцирует связывание с ним и второго сайта; таким образом, оба сайта одновременно участвуют в каталитической реакции. Для такой модели конформационное сближение родопсин-связывающих сайтов является необходимым.
Наряду с участком 340-350 Та во взаимодействии с активным родопсином участвует второй сайт на Та, включающий петлю 305-314. Этот участок также вносит вклад в специфичность распознавания активной формы родопсина. Было показано, что пептид 311-328 обладал способностью к конкурентному ингибированию активации трансдуцина.
Замещение аминокислот показало, что ключевыми являются аминокислоты Arg-309, Asp-311, Val-312 и Lys-313.
Для активации трансдуцина необходимы структурные перестройки, вызываемые каталитическим обменом нуклеотидов ГДФ на ГТФ. Сравнительный анализ трехмерных структур Та-ГДФ и Та-ГТФ выявил три основных области таких структур - это SwI (Ser-173-Thr-183), SwII (Phe-195-Thr-215) и Swill (Arg-227-Arg-238) [Li, Cerione, 1997]. Области SwI и SwII имеют структурные аналоги в Ras-белках, тогда как последовательность Swill уникальна для тримерных G-белков. Рентгеновская кристаллография показала, что изменения в SwI и SwII являются следствием взаимодействия между у-фосфатом ГТФ с Thr-177 в SwI и образованием водородной связи между у-фосфатом ГТФ и
42
Gly-199 в SwII. В отличие от Swl и SwII, Swill не имеет прямых взаимодействий с ГТФ. Структурные изменения в этой области при обмене нуклеотидов обусловлены серией полярных взаимодействий между SwII и Swill, которые индуцированы конформационными изменениями в SwII.
Каким образом обеспечивается активация фосфодиэстеразы? Активный Та-ГТФ комплекс, взаимодействуя с ингибиторными у-субъединицами ФДЭ, освобождает каталитические сайты фосфодиэстеразы на а- и Р-субъединицах.
Исследования, проведенные методом направленного мутагенеза, выявили основные сайты взаимодействия Та с фосфодиэстеразой [Natochin et al., 1998]. Оказалось, что Пе-208 из SwII прямо взаимодействует с эффектором, тогда как остатки Arg-201, Arg-204 и Tip-207 из SWII необходимы для конформационно-зависимого взаимодействия ТГ-ФДЭ.
В активации ФДЭ участвует и SwIII-область [Li, Ceroine, 1997]. Авторы показали, что роль Swill заключается не в связывании с ФДЭТ, а в активации фосфодиэстеразы. При выявлении ключевых аминокислот в Swill оказалось, что одиночное замещение Glu-232 (мутация E-232L) вызывало тот же эффект, что и замена всей области Swill на Ala.
Рассмотрение детальной структуры Swill позволило объяснить критическую роль Glu-232 в активации ФДЭ. Расположение Glu-232 в петле, соединяющей 64-лист и аЗ-спираль, определяет его как основное положение для передачи конформационных изменений между SwII и Swill. Рентгеновская кристаллография показала, что при связывании Та с ГТФ-y-S Glu-232 вовлекается в прямое взаимодействие с Arg-201 и Arg-204 из SwII и опосредованное водой взаимодействие с Gly-199 из SwII. Таким образом, конформационная связь между SwII и Swill есть главное связующее звено между связыванием Та с ФДЭТ и взаимодействием между ФДЭу и остатками петли а4—бб (305-314) Та.
Кроме описанной выше прямой активации ФДЭ через взаимодействие Та с ФДЭу, между Та и ФДЭ существуют и регуляторные связи. Показано, что II высокоспиральный домен Та связывается непосредственно с каталитическими а- и Р-субъединица-ми фосфодиэстеразы, причем для него существует свой сайт связывания на ФДЭар, такой, что это взаимодействие проходит независимо от взаимодействия ФДЭар с ФДЭу. Таким образом, II высокоспиральный домен играет роль модуляторной области, усиливающей эффективность активирующей способности трансдуцина.
Фосфодиэстераза - структура, механизм взаимодействия с трансдуцином. Фосфодиэстераза зрительной клетки является Центральным эффекторным белком в каскаде фототрансдукции.
43
В основном, неактивном, состоянии фосфодиэстераза представляет собой гетеротетрамер, в котооом каталитические сайты на оф-димере блокированы у-субъединицами. Активационное взаимодействие Та-ГТФ с ФДЭар вызывает перемещение у-субъеди-ницы, в результате которого каталитические сайты на осР-субъе-диницах становятся доступными для цГМФ, что запускает механизм его гидролиза. Кроме того, в результате активации ФДЭ происходит высвобождение молекул цГМФ из некаталитических сайтов связывания [Norton et al., 2000], и таким образом запускается механизм ГТФазной регуляции. Последующее взаимодействие Та-ГТФ с ФДЭар играет модуляторную роль. Кинетический анализ показал, что скорость гидролиза у фоторецепторной ФДЭ более чем в 1000 раз превосходит активность других фосфодиэстераз.
Рассмотрим подробнее, как структура ФДЭ обеспечивает передачу сигнала трансдукции от трансдуцина к вторичному мессенджеру - цГМФ.
Структурный состав фоторецепторной ФДЭ уникален среди всего семейства фосфодиэстераз, ФДЭ состоит из четырех субъединиц; каталитическая часть представлена гетеродимером ссР, а ее активационные сайты регулируются двумя ингибиторными у-субъединицами [Baehr et al„ 1979; Deterre et al., 1988]. Первичная структура всех трех субъединиц была определена в работах группы Ю.А. Овчинникова [Ovchinnikov et al., 1986; Ovchinnikov et al., 1987; Lipkin et al., 1990].
Рассматривая каталитическую часть ФДЭ, следует отметить, что а- и Р-субъединицы имеют близкое структурное сходство и выполняют одинаковые функции (у обеих субъединиц общие функциональные сайты), а их аминокислотная последовательность совпадает на 72% [Lipkin et al., 1990]. ос-субъедини-ца представлена последовательностью 859 аминокислот с молекулярной массой 99 кДа [Lipkin et al., 1990]. Р-субъединица состоит из 853 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 98 к Да [Lipkin et al., 1990]. Одно из различий состоит в том, что С-концевой пептид a-субъединицы в отличие от Р-субъединицы фарнезилирован [Ong et al., 1989; Anant et aL, 1992]. Эти концевые модификации обеспечивают фиксацию фосфодиэстеразы на дисковой мембране [Ong et al., 1989; Catty, Deterre, 1991].
Каждая из каталитических субъединиц содержит ряд функциональных доменов. Это каталитический сайт связывания цГМФ, некаталитические сайты связывания цГМФ, представляющие собой две повторяющиеся области, кроме того, имеются сайты связывания у-субъединиц и Та. В связи с высоким сходством катали
44
тических субъединиц структурные свойства можно рассматривать на примере любой из них.
Р-субъединица так же, как и ос-субъединица, содержит в N-концевой половине гомологичные повторения аминокислотных остатков. Эти области (последовательности 89-251 и 295-464 для Р-субъединицы) являются некаталитическими сайтами связывания цГМФ [Lipkin et al., 1990]. Физиологическая роль этих сайтов заключается в регулировании времени жизни активного состояния ФДЭ. В комбинации с RGS9 ФДЭТ может активировать ГТФазу Та-ГТФ, когда некаталитические сайты связывания цГМФ свободны [Не, 1998]. Связывание цГМФ с некаталитическими сайтами понижает ГТФафазную активность, вызывая обратное связывание ФДЭТ с ФДЭар [Norton, 2000; Arshavsky et al., 1992].
Каталитический сайт связывания цГМФ, состоящий из -250 остатков (последовательность 555-790 для Р-субъединицы), расположен в С-концевой половине каталитических субъединиц. Элементы этого сайта сохраняются у всех ФДЭ циклических нуклеотидов. Это богатый глицином регион, который может формировать петлю для связывания циклических нуклеотидов; цинк-связывающий элемент [Artemyev et al., 1998]; 19^2+-связывающий регион DXXG (последовательность 590-593); и элемент NKXD (последовательность 762-765), отвечающий за специфичное связывание гуанинового кольца (аналогичная область ос-субъединицы трансдуцина участвует в связывании гуанинового кольца ГТФ), причем, в отличие от ос-субъединицы, у Р-субъединицы элемент NKXD изменяется до NKXA. Это может свидетельствовать о понижении сродства в цГМФ по сравнению с ос-субъедини-цей, или же этот элемент Р-субъединицы вообще не вовлечен в связывание цГМФ [Lipkin et al., 1990; Artemyev et al., 1998].
Две у-субъединицы связываются с димером оф с очень высоким сродством [Artemyev et aL, 1996, 1998]. При этом гидролитическая активность димера ФДЭар ингибируется более чем в 100 раз. Соответствующие сайты связывания на ос-субъединице соответствуют последовательностям 467-491, 517-541 и 751-763 [Natochin et al., 1996; Artemyev et al., 1998]. При этом если два первых участка не несут дополнительной функции, то третья область является частью каталитического домена на оф-субъеди-ницах. Таким образом, у-субъединицы непосредственно блокируют доступ цГМФ к каталитическим сайтам [Artemyev et al„ 1998]. Кроме того, на оф-субъединицах имеются области, отвечающие за взаимодействие с Та.
у-субъединица состоит из 87 аминокислот и имеет молекулярную массу 11 кДа. При рассмотрении ингибирующего взаимодей
45
ствия ФДЭ., с ФДЭар в у-субъединице было выявлено две основных области. Первый, центральный, поликатионный регион (последовательность 24-45) связывается с соответствующими участками на ссР-субъединицах (последовательности 467-491? и 517-541 для ос-субъединицы) [Artemyev et al., 1996, 1998; Natochin et al., 1996]. Последние 5-7 аминокислотных остатков С-концево-го участка у-субъединицы связываются непосредственно с каталитическими сайтами связывания цГМФ (последовательность 751-763 для ос-субъединицы).
С другой стороны, у-субъединицы отвечают за активацию ФДЭ через взаимодействие с Та-ГТФ. При этом с Та-ГТФ связываются те же области, что и при взаимодействии с сф-димером. Таким образом, у-субъединица является конкурентным ингибитором активности ФДЭ.
При рассмотрении аминокислот центрального поликатион-ного региона, отвечающих за взаимодействие с Та, была выявлена критическая роль положительно заряженных Arg-ЗЗ и Arg-36 [Bondarenko et al., 1997]. Вторым важным участком, реагирующим с Та, является С-концевой участок у-субъединицы (последовательность 46-87). Центральную роль в активации ФДЭ играет Cys-68-Tip-70. Исследование кристаллической структуры показало, что этот участок реагирует с аЗ/ос4ф6-областью Та [Liu et al„ 1999].
Другая физиологическая функция у-субъединицы заключается в регуляции связывания цГМФ с некаталитическими сайтами связывания на сф-димере. Взаимодействие ФДЭТ с Та-ГТФ понижает сродство цГМФ к некаталитическим сайтам связывания [Yamazaki et al., 1996; Norton et al., 2000]. Таким образом запускается описанный выше механизм регуляции ГТФафазной активности для Та-ГТФ, в котором ФДЭТ принимает непосредственное участие [Artemyev et al., 1998].
Информация о структурных перестройках, сопровождающих активационное взаимодействие Та-ГТФ с ФДЭу, была получена в основном методами наблюдения резонансного переноса энергии [Berger et al., 1997]. Для этого Cys-68 метили донорной меткой, тогда как акцепторная метка находилась среди первых семи аминокислот у-субъединицы. Оказалось, что в растворе расстояние между донором и акцептором составило 63А, а при связывании ФДЭу с ФДЭар это расстояние увеличивалось до 77А. Дальнейшее присоединение ГТФу5 не изменяло этого расстояния. Это говорит в пользу того, что взаимодействие Та с ФДЭТ не вызывает значительных конформационных изменений в третичной структуре ФДЭГ а также подтверждает теорию активации ФДЭ, где Ти образует комплекс с голопротеином [Berger et aL, 1997].
46
Арестин. Не менее интересен вопрос, каким образом молекула арестина распознает фосфорилированную форму родопсина и обеспечивает быстрое ингибирование активной формы рецептора.
Арестин состоит из 404 аминокислот. Его неактивная форма имеет двухчастичную архитектуру, состоящую из N- и С-до-менов. N- и С-домены представляют собой относительно изолированные структуры, характеризующиеся высоким содержанием [3-листов. Описанные домены связаны шарнироподобным соединением. В основном состоянии шарнир закрыт, т.е. оба домена максимально сближены [Vishnivetskiy et al., 2000]. Кроме двух описанных доменов в молекуле арестина можно выделять С-концевой участок. В неактивной молекуле арестина он находится в заякоренном состоянии, связанном с обоими доменами.
Проведенные исследования позволили выделить ключевые участки арестина, которые отвечают за стабилизацию его основного состояния. Отщепление С-концевого участка приводило к тому, что арестин связывался с фотолизированной, но нефосфо-рилированной формой родопсина [Gray-Keller, 1997]. Таким образом, арестин без С-концевого пептида самопроизвольно переходит в активную форму. Аналогичный эффект наблюдался при исследовании мутантных форм арестина. Эти исследования позволили выявить основной регион, позволяющий арестину действовать как фосфатному сенсору. Этот регион, названный полярным ядром, представляет собой необычную сеть заряженных аминокислотных остатков, находящихся глубоко внутри молекулы около точки шарнирного соединения N- и С-доменов. Зарядовый баланс в полярном ядре, образованный совокупностью ионных пар, позволяет арестину удерживать N- и С-домены сомкнутыми в базовом состоянии. Основной аминокислотой, ответственной за взаимодействие с фосфорилированным родопсином, является так называемый сенситивный триггер - Arg-175, который взаимодействует в полярном ядре со своим противоионом Asp-296 [Vishnivetskiy et al., 2000]. Так, при его замещении арестин мог связываться с нефосфорилированной фотолизированной формой родопсина [Gray-Keller et aL, 1997]. В целом мутации, изменяющие заряд в полярном ядре путем разрушения критических ионных пар или переустановкой зарядового баланса, приводили к тому, что арестин мог связываться с активированным не-фосфорилированным родопсином. С другой стороны, комбинации мутаций, которые сохраняли общий зарядовый баланс, позволяли арестину работать аналогично нативной форме .Таким образом, сохранение зарядового баланса полярного ядра являет
47
ся ключевым фактором, стабилизирующим неактивное основное состояние молекулы арестина [Vishnivetskiy et al., 2000].
Наиболее интересным представляется вопрос, каким образом происходит взаимодействие между фосфорилированным С-кон-цевым пептидом родопсина и арестином, и какие структурные перестройки в молекуле арестина вызывает это взаимодействие.
Сайт связывания арестина с фосфорилированным С-конце-вым участком родопсина представляет собой подобие чаши, на дне которой находятся ключевые аминокислоты полярного ядра. Взаимодействие с фосфатными группами начинается еще до того как они достигнут дна чаши. Так, на уровне обода чаши находятся две положительно заряженные аминокислоты Lys-14 и Lys-15, причем боковая цепь Lys-15 направлена внутрь чаши, а боковая цепь Lys-14 - наружу. Таким образом, для одновременного связывания фосфатных групп Lys-14 должен перевернуться. Вероятно, фосфатная часть родопсина встречается с Lys-14 и Lys-15 на ободе чаши и, продолжая двигаться внутрь, тянет за собой Lys-15. Далее либо движение Lys-15, дестабилизируя первый P-лист, позволяет Lys-15 перевернуться, либо Lys-14 сам движется за фосфатом, и в результате происходит серьезный изгиб, а, возможно, и полное разрушение первого P-листа. Разрушение первого P-листа приводит к двум последствиям: позволяет занять Lys-14 и Lys-15 предпочтительные места для взаимодействия с фосфатными группами, уже достигшими дна чаши и приводит к смещению гидрофобных элементов Val-Ile-Phe в позицию, исключающую их взаимодействие с гидрофобными Phe-Val- Phe из С-концевого пептида. Как результат С-концевой пептид арестина перестает быть заякоренным и отходит от поверхности N-домена.
Фосфатные группы, достигнув дна чаши, непосредственно взаимодействуют с положительно заряженными аминокислотными остатками полярного ядра. Таким образом, фосфатные группы разрушают зарядовый баланс полярного ядра двумя путями. Во-первых, фосфаты взаимодействуют с Lys-14 и Lys-15, вызывая разрушение первого P-листа, что в свою очередь освобождает С-хвост арестина, и это приводит к отдалению положительно заряженного Arg-382 из полярного ядра. Во-вторых, фосфатные группы сами нейтрализуют другие положительные заряды в полярном ядре, в том числе и сенситивный триггер Arg-175, разрушая его связь с Asp-296.
В результате этих перестроек три отрицательно заряженные аминокислоты, находящиеся на оси шарнира, остаются без стабилизирующих противоионов, и их взаимное электростатическое отталкивание приводит к глобальным перестройкам, включаю
48
щим движение N- и С-доменов относительно друг друга. Эти перестройки переводят аминокислоты, участвующие в связывании рецептора, в положение, соответствующее структуре цитоплазматических петель родопсина.
Сколько фосфатных групп необходимо для эффективной активации арестина? В основном состоянии расстояния между аминокислотными остатками арестина, вовлеченными в связывание с фосфатами родопсина, составляют около 15А° (между Lys-15-Arg-175 - 15А, между Arg-171-Arg-175 - 14,5А). Благодаря описанным выше перемещениям Lys-15 по направлению к полярному ядру расстояние между Lys-15-Arg-175 значительно сокращается. Но сближение Arg-171-Arg-175 невозможно без разру шения P-листа X. Таким образом, одной фосфатной группы оказывается недостаточно, чтобы достигнуть всех сайтов связывания. Количество положительных аминокислотных остатков, вовлеченных во взаимодействие с фосфатами (Lys-14 и Lys-15 на ободе чаши, Arg-171, Arg-175 и Lys-176 - в полярном ядре), также подтверждает эту точку зрения. Эксперименты по прямому связыванию показали, что на одну молекулу арестина требуется по крайней мере две фосфатные группы.
Гпава 2
ГЕНЕРАЦИЯ ФОТОПОТЕНЦИАЛА НА ФОТОРЕЦЕПТОРНОМ ДИСКЕ
В данной главе изложены результаты исследования электрохимических свойств фоторецепторной дисковой мембраны. Начиная это исследование, мы исходили из определенной структурной схожести зрительного родопсина и другого ретиналь-содер-жащего белка - бактериородопсина. Действительно, нам удалось установить, что зрительный родопсин, как и бактериальный, генерирует при освещении электрический потенциал на мембране диска; предполагалось, что именно появление потенциала является одним из факторов усиления сигнала, и появление потенциала приводит к открыванию большого количества кальциевых каналов в диске. Дальнейшие исследования показали, что эта гипотеза неверна, однако фотопотенциал, генерируемый на мембране диска, оказался удобным инструментом для исследования ее электрохимических свойств. В частности, мы попытались выявить наличие ионных каналов в фоторецепторной дисковой мембране. То, что дисковая мембрана должна содержать ионные каналы, представляется совершенно естественным. Действительно, онтогенетически эта мембрана образуется из плазматической мембраны фоторецептора, которая содержит как цГМФ-регули-руемые каналы в наружном сегменте, так и потенциал-регулиру-емые каналы - во внутреннем.
Генерация фотопотенциала родопсином и бактериородопсином
Известно, что основой функционирования родопсин-подоб-ного белка бактериородопсина является генерация им под действием света разности потенциалов на бактериальной мембране [Oesterhelt, Stoeckenius, 1971; Blaurock, Stoeckenius, 1971]. Исторически именно фоторецепция дала первые идеи о функционировании бактериородопсина. Структурно зрительный и бактериальный родопсин близки. Оба белка используют ретиналь в качестве хромофора, оба белка трансмембранны. Ест определенное
50
сходство в первичной структуре. Однако до какой степени эти структурные общие черты существенны при функционировании молекулы? Известно, что функции этих двух фоточувствитель-ных белков различны. Бактериородопсин является типичным фотоэлектрическим генератором, аналогичным фотосинтетической системе и использует энергию света для образования АТФ. Родопсин является сенсорным белком, функция которого - лишь определить существование светового кванта. Фоторецепторная клетка имеет мощную систему усиления сигнала, которая, в противоположность бактериородопсину, использует АТФ и другие источники энергии.
Известно, что фотоцикл бактериородопсина [Oesterhelt, Stoeckenius, 1971; Blaurock, Stockenius, 1971] и фотолиз зрительного родопсина имеют много общего. В связи с этим мы задались вопросом, в какой степени хотя бы фотоэлектрические процессы, протекающие в этих двух системах, сходны и генерируется ли в ходе фотолиза родопсина фотопотенциал на фоторецепторной мембране аналогично тому, как он возникает на бактериальной мембране, содержащей бактериородопсин. Указание на то, что это имеет место, можно найти в работе [Cafiso, Hubbel, 1980].
Известно также, что в фоторецепторной клетке при освещении сильным светом генерируется ранний рецепторный потенциал, постоянные времени которого по порядку совпадают со временем жизни промежуточных продуктов фотолиза родопсина [Toyoda et al., 1969]. Генерация фотопотенциала была также прямо показана при модификации бислойной мембраны родопсином [Fesenko, Lubarsky, 1977].
В группе академика В.П. Скулачева был разработан метод, позволяющий подробно исследовать генерацию фотопотенциала бактериородопсина [Драчев и др., 1977; Drachev et al., 1978; Drachev et al., 1979; Skulachev, 1979a, Ь]. Преимущество этого метода перед бислойными мембранами, используемыми Fesenko, Lubarsky, [1977], состоит в том, то родопсином модифицируется не бислойная мембрана, которая очень нестабильна, а пропитанный липидами мембранный фильтр. Часть мембраны, которая непосредственно взаимодействует с липидами фильтра, растворяется, и между фоторецепторной мембраной и мембранным фильтром образуется водный промежуток. Поскольку сопротивление толстого мембранного фильтра значительно больше, чем фоторецепторной мембраны, то такая система передает фотоэлектрические процессы, происходящие в мембране, без искажений. Фоторецепторные диски, или бляшки, содержащие бактериородопсин, добавляли в один из отсеков тефлоновой кюветы, разделенной коллодиевой
51
Рис. 2.1. Возникновение электрической разности потенциалов при освещении непрерывным светом пропитанных фосфолипидами пленок с инкорпорированным бактериородопсином (А) и родопсином (Б)
Стрелками указаны моменты включения и выключения света
или флуоропоровой пленкой, пропитанной раствором азолектина или яичного лецитина с октадециламином. В течение 2-А ч диски или бляшки встраивали в пленку, затем система подвергалась освещению постоянным светом или лазерной вспышкой. Результаты этих исследований изложены в серии статей [Большаков и др., 1978; Большаков и др., 1979а; Большаков и др., 19796; Bolshakov et al., 1980; Drachev et al., 1980; Drachev et al., 1981].
На рис. 2.1 показана генерация разности электрических потенциалов, индуцированных постоянным светом в системе родопсиновый диск - коллодиевая пленка (рис. 2.1, А) и бактериоро-допсиновая бляшка - коллодиевая пленка (рис. 2.1, Б).
Показано, что бактериородопсин генерирует устойчивый электрический потенциал в течение всего периода освещения, что согласуется с более ранними работами [Драчев и др., 1977; Drachev et al., 1978]. Зрительный родопсин также генерировал фотоэлектрический потенциал, который в данном эксперименте достигал 43 мВ. Однако в этом случае не наблюдалось устойчивого фотопотенциала. Увеличение потенциала спонтанно сменялось падением задолго до выключения света. Повторное освещение системы со зрительным родопсином не вызывало измеримого фотоответа.
На рис. 2.2. приведены эффекты лазерной вспышки. Как видим, при однократном срабатывании два родопсина обнаруживают гораздо больше сходства, чем при освещении постоянным светом. Как в случае бактериального, так и животного родопсинов вспышка индуцирует очень быстрое (t = 200 нс) образование разности потенциалов, направление которой (сторона пленки без родопсина заряжена отрицательно) оказывается противоположным таковому при постоянном освещении. Затем развивается по
52
ложительный ответ, и мембранный потенциал достигает своего максимума в миллисекундной шкале.
Величина отрицательной фазы примерно в 100 раз меньше, чем положительной. Передний фронт ее не разрешен даже примененной нами техникой (рис. 2.2, Б). Разница между величинами фаз может быть искусственно уменьшена, если зашунтировать коллодиевую пленку внешним сопротивлением. На рис. 2.2, А удельное сопротивление коллодиевой пленки, разделяющей отсеки камеры, составляет 50 мОм/см2. Если пленку зашунтировать сопротивлением, соответствующим 2 кОм/см2, что близко к сопротивлению наружной мембраны фоторецептора, то в результате соотношение положительной и отрицательной фаз от 0,014 возрастало до 0,16. Фотоэлектрический ответ такой зашунтиро-ванной системы становится похож на ранний рецепторный потенциал [Brown et al., 1964]. Фронт нарастания фотопотенциала хорошо коррелирует с постоянной времени образования метаро-
Вспышка
Рис. 2.2. Фотопотенциал (А, Б) и образование метародопсина II (В), индуцированные лазерной вспышкой (530 нМ, 15 нс)
53
Рис. 2.3. Спектр действия фотопотенциала, генерируемого родопсином
/ - амплитуда фотопотенциала, полученного при освещении образца светом различной длины волны; 2 - спектр поглощения родопсина
допсина II (рис. 2.2, Б). Спектр действия фотоиндуцированного фотоэлектрического ответа совпадает со спектром поглощения родопсина (рис. 2.3).
Фотоиндуцированный электрический ответ метародопсина. Освещение образца лазерной вспышкой с Хмакс = 347 нм вслед за вспышкой 540 нм приводило к генерации фотопотенциала, имеющего полярность, противоположную фотопотенциалу родопсина. Для получения такого фотоответа критичен интервал между вспышками 530 и 347 нм. Этот интервал должен быть больше 1 мс и меньше 5 мин. Изучение временных и спектральных характеристик фотоответа на вспышку 347 нм позволяет заключить, что он генерируется интермедиатом метародопсином II. На рис. 2.4 для сравнения приведены ответы родопсина и метародопсина II. Первый фотоответ (см. рис. 2.4, А) был получен при освещении родопсина вспышкой 530 нм. Через 2 с образец освещался серией вспышек (30 вспышек 530 нм с интервалом 200 мс между вспышками). Спустя 10 с образец освещался вспышкой 347 нм (см. рис. 2.4. Б). Видно, что величина и форма фотопотенциала метародопсина II сходны с фотоответом родопсина, однако он имеет противоположную полярность (знак плюс внутри диска - для родопсина и минус - для метародопсина II). Более детальное сравнение показало, что у метародопсина II первая электрогенная фаза больше, а последующие фазы несколько меньше, чем у родопсина. Никаких фотоэлектрических ответов не было обнаружено в том случае, когда образец освещался через 7 мин после первоначального освещения, хотя спектральные измерения показали, что в образце содержится большое количество метародопсина III.
Гидроксиламин, как известно, предотвращает образование каких-либо устойчивых интермедиатов фотолиза родопсина. Добавление гидроксиламина приводило к тому, что ответ на вспышку
54
Рис. 2.4. Сравнение фотопотенциалов, генерируемых родопсином (А) и метародопсином (Б, В)
А - результаты трех последовательных вспышек; Б - фотоответ метародопсина II, полученный при освещении вспышкой 347 нм (предварительно родопсин был обесцвечен 28 вспышками с той же энергией, что и в А); В -фотоответ метародопсина II, полученный с высоким временным разрешением
347 нм полностью исчезал. На ответ же собственно родопсина гидроксиламин влияния практически не оказывал. Например, в изложенном выше эксперименте (см. рис. 2.4, А) величина фотоответа на первую вспышку 530 нм без гидроксиламина составляла 18 мВ, а на вспышку 347 нм - 15 мВ. При добавлении 10 мМ гидроксиламина в аналогичный образец ответ на 547 нм составил 16 мВ, в то время как на 347 нм - практически не регистрировался.
Отсутствие трансмембранного переноса протона в фоторецепторном диске при освещении
Как описано выше, освещение фоторецепторных дисков приводит к генерации трансмембранного потенциала, кинетические параметры которого близки характерным временам перехода метародопсин 1-метародопсин II. По аналогии с бактериородопсином фотопотенциал на фоторецепторной мембране диска мог
55
бы возникать вследствие переноса протона, поглощенного из внешней среды, через мембрану внутрь диска. Обратные изменения метародопсина II при фотоиндуцированном переходе в продукт Р460 сопровождаются изменением полярности фотопотенциала. Такое обращение знака фотопотенциала могло бы происходить в результате обратного переноса протона из внутридисково-го пространства во внешнюю среду [Шевченко и др., 1987].
Выяснение природы фотопотенциала требует решения следующих задач.
1.	Сопровождается ли возникновение трансмембранной разности потенциалов переносом Н+ через мембрану фоторецепторного диска, как это происходит в бактериальной мембране, содержащей бактериородопсин?
2.	Сопровождается ли фотоиндуцированный переход метародопсина II в продукт Р460 высвобождением Н+ во внешнюю среду?
3.	С какой из изохромных форм метародопсина II связана генерация фотопотенциала на мембране диска?
Поглощение протона фоторецепторными дисками при освещении и восстановление эффекта после регенерации обесцвеченного родопсина в присутствии 11-цис-ретиналя. Фотоиндуциро-ванные изменения pH исследовались в суспензии фоторецепторньгх дисков и их фрагментов спектрофотометрически с помощью индикатора pH бромкрезолового пурпурного. Освещение образца вызывает быстрое увеличение pH, которое сопровождается затем медленным подкислением средьг. Количественно освещение приводит к поглощению из среды 1,4 ± 0,07 молей Н+ на моль родопсина.
Современные методы не позволяют проводить измерения pH в крайне незначительном внутридисковом пространстве (диаметр меньше 1 мкм). Поэтому в экспериментах мы использовали инвертированные диски. Действительно, в этом случае регистрация изменений pH обычными методами в инкубационной среде, содержащей инвертированные диски, фактически, означала бы измерения pH внутри диска.
Как известно, замораживание суспензии фоторецепторных дисков и последующее нагревание до 4 °C приводит к образованию дисков с обратной ориентацией мембраны: внутридисковая поверхность мембраны оказывается обращенной во внешнюю среду [Adams et al., 1978].
В образцах суспензии после многократного замораживания-размораживания освещение вызывало подщелачивание лишь на 0,27 ± 0,04 моля Н+ на моль обесцвеченного родопсина (средние результаты по 11 опытам), что составило около 20% эффекта, наблюдаемого в суспензии нормально ориентированных дисков. Таким образом, в суспензии после замораживания и оттаивания не происхо-
56
Рис. 2.5. Разделение нормально ориентированных и инвертированных фоторецепторных дисков на колонке с конканавалин А-сефарозой
Концентрация родопсина 40 мкМ. Фракции 1-6 элюировали раствором 1 (115 мМ NaCl, 2,7 мМ КС1. 1 мМ СаС12, 0,5 мМ МпС12, pH 6,0); фракции 7-11 - раствором 2, содержащим все компоненты раствора 1 и а-метил, D-маннопиранозид (500 мМ). I - контроль; 2 - суспензия дисков после замораживания-размораживания. Стрелкой указан момент замены раствора
дит поглощения протона, как в случае дисков с нормальной ориентацией, и не наблюдается фотоиндуцированного изменения pH. Наблюдаемое в опытах небольшое подщелачивание может происходить, например, за счет примеси неинвертированных дисков. Чтобы это установить, необходимо выяснить соотношение дисков с нормальной ориентацией и инвертированных в полученной смеси.
Разделение инвертированных и нормально ориентированных дисков на конканавалин-А-сефарозе. Как отмечалось выше, родопсин является гликопротеидом, к С-концевому пептиду, локализованному с цитоплазматической стороны мембраны, присоединены сахарные остатки. При инвертировании фоторецепторных дисков, например, при их замораживании-размораживании эти остатки остатки оказываются обращенными во внутридисковое пространство. Это обстоятельство и использовалось, чтобы получить раздельно фракции дисков с нормальной ориентацией и инвертированные путем их разделения на конканавалин-А-сефарозе.
Через колонку с конканавалин-А-сефарозой пропускали темновые образцы суспензии фоторецепторных дисков, не подвергавшиеся замораживанию, и аликвоты той же суспензии после замораживания и оттаивания. Результаты разделения представлены на рис. 2.5. В контроле большая часть дисков элюируется
57
Таблица 2.1
Разделение нормально ориентированных и инвертированных дисков на конканавалин-А-сефарозе
Образец	Нанесено на колонку	Элюировано раствором 1	Элюировано раствором 2	Осталось на колонке	Число опытов
Контроль	100%	85 ± 5%	9 ±2%	15 ±5%	6
Суспензия после за -моражива-ния и размораживания	100%	42 ± 3%	35 ± 3%	23 ± 1%	6
раствором 1, т.е. представляет собой диски с нормальной ориентацией. В образцах, подвергавшихся замораживанию и оттаиванию, примерно половина дисков связывается конканавалином и элюируется раствором 2, содержащим метил-ос-О-маннопирано-зид, т.е. имеет обратную ориентацию мембраны.
В табл. 2.1 приведены данные по содержанию фракций, полученных после хроматографии на конканавалин-А-сефарозе в контрольных и подвергавшихся замораживанию образцах, выраженные в процентах к исходному количеству родопсина в суспензии, нанесенной на колонку. Контрольные образцы содержали около 80% нормально ориентированных дисков. В образцах после замораживания и оттаивания около 40% дисков имели нормальную ориентацию, а около 35% - обратную. Около 29% дисков остались необратимо связанными с конканавалином-А в обоих случаях.
Таким образом, суспензия после замораживания-размораживания содержит не только инвертированные диски, но и диски с нормальной ориентацией.
Фотоиндуцированные изменения pH в отдельных фракциях фоторецепторных дисков после хроматографии на конканава-лин-А-сефарозе. В экспериментах использовали фракции 1 и 7, которым соответствовала наиболее высокая концентрация родопсина. В этих фракциях исследовали фотоиндуцированные изменения pH потенциометрическим методом при pH 6,0.
В образцах фракции 1 (нормально ориентированные диски) освещение приводило к поглощению 1,4 ± 0,18 Н+ на моль обесцвеченного родопсина (среднее из 7 опытов). Во фракции 7, содержащей предположительно только инвертированные диски, также наблюдалось подщелачивание (поглощение 0,61 ± 0,08 молей Н+ на моль обесцвеченного родопсина). Такой эффект мог быть вызван примесью нормально ориентированных дис-
58
Таблица 2.2
Зависимость фотоиндуцированиого поглощения Н+ от соотношения нормально ориентированных и инвертированных дисков в суспензии
Образец	Количество поглощенных Н+ на моль обесцвеченного родопсина	% к контролю	Число ОПЫТОВ
Контроль	1.4 ±0,07%	-	11
Диски после за-	0,27 ± 0,04%	20	11
мораживания			
Фракция 1	1,4 ±0,18%	100	7
Фракция 2	0,61 ±0,08%	43	10
ков, которые и могли бы определять эффект подщелачивания. Для проверки этого фракции 7 и 10 объединяли, осаждали и вновь наносили на конканавалин-А-сефарозу. Распределение по фракциям после такой операции оставалось таким же, как и при первом разделении: 46% - диски с нормальной ориентацией, 32% - инвертированных и 22% - необратимо связывалось с конканавалином.
По-видимому, инвертированные мембранные структуры имеют тенденцию к спонтанному возврату к исходной ориентации. Действительно, величина фотоиндуцированиого подщелачивания возрастала по мере хранения образцов и через 2 ч достигала 80% контроля, что свидетельствует о медленном восстановлении нормальной ориентации дисков с течением времени.
В опытах по разделению инвертированньгх и нормально ориентированных дисков на конканавалин-А-сефарозе интервал времени от момента нанесения на колонку раствора 2 до начала регистрации изменений pH составлял 30-40 мин. Как следует из кривой, представленной на рисунке, эффект поглощения протона к этому моменту времени должен был бы составить 35-40% эффекта в контроле. Действительно, в то время как поглощение Н+ во фракции 1 совпадает с эффектом в контроле, поглощение Н+ во фракции 7 составляет около 40% от него (табл. 2.2, рис. 2.6). В тех случаях, когда эффект регистрировали в течение 5 мин после размораживания, он составлял ~ 20% от контроля.
Таким образом, наблюдается корреляция между эффектом поглощения Н+ и количеством дисков с нормальной ориентацией. Такая корреляция, очевидно, отсутствовала бы в том случае, если бы инвертированные диски, содержащиеся во фракции 7, элю-
59
Рис. 2.6. Фотоиндуцированные изменения pH в отдельных фракциях фоторецепторных дисков после разделения на конканавалин А-сефарозе
Стрелками указаны моменты освещения образцов (60% родопсина обесцвечено). А -нормально ориентированные диски (фракция 1), концентрация родопсина - 3 мкМ; Б -инвертированные диски (фракция 7). концентрация родопсина - 9 мкМ
ируемой раствором 2, высвобождали Н+ при освещении. Если бы такой процесс происходил, то при примерно равном содержании дисков с противоположной ориентацией никаких изменений pH в среде не наблюдалось бы, или они были бы очень малы. Следовательно, хотя в наших экспериментах и не удалось получить “чистую” фракцию инвертированных дисков, анализ полученных результатов позволяет сделать вывод об отсутствии фотоиндуци-рованного трансмембранного переноса протона в ходе фотолиза родопсина.
Высвобождение протона фоторецепторными дисками при фотоиндуцированном переходе метародопсина II в метародопсин III. Происходит ли депротонирование метародопсина II при его распаде и образовании долгоживущего продукта метародопсина III. Чтобы выяснить это, суспензию сначала освещали светом с Лмакс = 500 нм, при этом регистрировался эффект быстрого подщелачивания, а затем примерно через минуту после вспышки образец освещали в течение 10 с светом с Лмакс = 365 нм. При этом происходило быстрое снижение оптического поглощения, обусловленное подкислением среды инкубации (рис. 2.7, А). По абсолютной величине эффект составлял 36 ± 4% от эффекта поглощения протона (средние данные по 5 опытам).
Последовательные экспозиции образца к свету с Хмакс = 365 нм вызывали постепенное снижение и исчезновение эффекта подкисления. Если суспензию освещали таким светом через 30 мин после вспышки с Хмакс = 500 нм, т.е. после завершения термального распада метародопсина 1, то эффекта быстрого подкисления не наблюдали (рис. 2.7, Б). Сокращение времени
60
Дб85
0,01
Рис. 2.7. Изменения pH в суспензии фоторецепторных дисков при фотоиндуци-рованном переходе метародопснна II в продукт Р465
Концентрация родопсина - 12-25 мкМ. Стрелками указаны моменты освещения образцов. Длительность освещения для Хмакс = 500 нм - 4 мс, для Хмакс = 365 нм - 10 с. А. Б -100 мМ NaCl, pH 6,0; В - 100 мМ NaCl, 100 мМ гидроксиламина, pH 6,0; Г- 100 мМ NaCl, 100 мМ буфера MES, pH 6,0
жизни метародопсина с помощью гидроксиламина приводило к исчезновению эффекта подкисления при освещении образца светом с Хмакс = 365 нм (рис. 2.7, В).
Чтобы убедиться, что изменения оптического поглощения образца были вызваны изменениями pH, а не спектральными изменениями родопсина в процессе фотолиза, были проведены эксперименты, в которых фоторецепторные диски инкубировались в 0,1 М буфере MES при pH 6,0.
Освещение таких образцов светом с Лмакс = 500 нм приводило к снижению оптической плотности, связанному с обесцвечиванием родопсина. Изменений pH в образце не наблюдали из-за присутствия буфера с высокой ионной силой. Последующее освещение образца светом с Хмакс = 365 нм никаких изменений в поглощении не вызывало (рис. 2.7, Г). Можно полагать, что наблюдаемый эффект отражает обратные изменения конформации молекулы родопсина при переходе в метародопсин III, который спектрально ближе к более раннему продукту фотолиза - метародопсин) I.
Связь поглощения протона с образованием изохромной формы метародопсина II. Как было показано выше, при осве-
61
Рис. 2.8. Кинетика фотоиндуцированиого поглощения Н+ фоторецепторными дисками
Концентрация родопсина - 10 мкМ, концентрация бромкрезолового пурпурного -25 мкМ. Обесцвечено 10% родопсина
Рис. 2.9. Кинетика образования метародонсина II
Концентрация родопсина - 25 мкМ
щении не происходит трансмембранного переноса протона внутрь диска. Однако не исключена возможность переноса поглощенного протона в глубь мембраны. Такой процесс также мог бы привести к генерации фотопотенциала на фоторецепторной мембране. В связи с этим интересно сравнить кинетические характеристики поглощения Н+ с известными параметрами фотопотенциала. При таком сравнении представляется важным также решение вопроса о том, с какой из изохромных форм метародопсина II связаны оба процесса.
Известно, что образование метародопсина II делает альди-минную связь хромофора с опсином доступной для гидроксиламина [Akhtar et al., 1968]. В присутствии гидроксиламина равновесие сдвигается в сторону образования оксима, что существенно сокращает время жизни метародопсина II и препятствует образованию более поздних продуктов фотолиза, и это позволяет исследовать вопрос о том, на какой из стадий образования метародопсина II происходит протонирование. На рис. 2.7 представлен образец записи одного из типичных экспериментов. При освещении суспензии, содержащей избыток гидроксиламина, поглощение протона не происходило, наблюдалось лишь значительное снижение оптического поглощения образца, вызванное вкладом от обесцвечивания родопсина. Таким образом, в присутствии гидроксиламина протонирование родопсина не происходит. Это свидетельствует, по-видимому, о том, что протонирование происходит при образовании более поздней изохромной формы метародопсина II, образование которой блокируется гидроксиламином.
62
Рис. 2.10. tj/2 падения и амплитуда фотопотенциала зрительного (/) и бактериального (2) родопсинов зависимости от номера вспышки (Хмакс = 530 нм)
Эти результаты косвенно указывают на то, что две изохром-ные формы метародопсина II - протонированная и непротониро-ванная - образуются последовательно в ходе фотолиза. О том же свидетельствуют и результаты кинетических измерений с большим временным разрешением (рис. 2.8,2.9). Видно, что т эффекта подкисления составляет -20G мс, а спектральных изменений при образовании метародопсина II ~ 6 мс, что, как указывалось выше, совпадает с постоянной времени генерации фотопотенциала на мембране.
Фотоиндуцированное ускорение спада фотопотенциала; увеличение проводимости мембраны. Существенное отличие в поведении зрительного и бактериального родопсина обнаружилось при исследовании постоянных спада фотопотенциалов. На рис. 2.10 представлены зависимости амплитуды и постоянной времени спада фотопотенциала от номера вспышки. В случае зрительного родопсина оба эти параметра уменьшаются при увеличении числа вспышек. В случае бактериального родопсина ни амплитуда, ни время спада фотопотенциала не изменялись. Уменьшение амплитуды фотоответа обусловлено обесцвечиванием родопсина. Что касается спада фотопотенциала, то его изменения могут быть обусловлены как изменением емкости, так и изменением проводимости дисковой мембраны. Чтобы выбрать из этих двух возможностей, был проделан следующий эксперимент. Во время освещения образца лазерной вспышкой к колло-диевой пленке прикладывалось внешнее поле. Это приводило к
63
Рис. 2.11. Фотоответ, возникающий при освещении пленки, модифицированной родопсином с двух сторон
Система освещалась тремя последовательными вспышками 530 нм (номер вспышки указан над кривой). 1, 2 - к пленке прикладывалось напряжение +350 мВ и -350 мВ соответственно. Приложенное напряжение до освещения пленки соответствует 0 мВ на рисунке
ускорению спада фотопотенциала, что свидетельствует о том, что изменение спада фотопотенциала обусловлено скорее изменением проводимости, чем емкости.
Больший по величине эффект влияния света на проводимость дисковой мембраны был получен в том случае, когда фоторецепторные диски приклеивались к обеим сторонам коллоди-евой пленки. В такой симметричной системе освещение лазером не приводило к генерации фотопотенциала на пленке. Такой подход позволяет более точно регистрировать изменения сопротивления дисковой мембраны (см. рис. 2.11, 1, 2).
Как известно, освещение метародопсина II светом с Лмакс = 380 нм приводит, с относительно низким квантовым выходом, к образованию родопсина (фоторегенерация родопсина). Мы попытались обнаружить обратимость фотопотенциала при фоторегенерации, освещая метародопсин в коллодиевой пленке лазерной вспышкой с длиной волны 347 нм. Освещение в течение 10 с непрерывным светом с Хмакс = 480 нм приводило к сильному увеличению проводимости мембраны. Последующее освещение вспышками 530 и 347 нм оказывалось практически неэффективным. Однако освещение вспышкой с максимумом 530 нм вслед за вспышкой 347 нм приводило к значительному эффекту. Вероятно, фотопревращения родопсина приводят к изменению проводимости, в то время как освещение метародопсина II не влияет на эту величину. Что же касается значительного эффекта вспышки 530 нм вслед за 347 нм, то он обусловлен, по-видимому, частичной фоторегенерацией родопсина.
Ранее в ряде работ было показано, что освещение искусственных мембран, содержащих родопсин, приводит к образованию пор, проницаемых для Na+. Cs+, Са2+, глицерина и глюкозы, но не сахарозы [Fesenko, 1977; Montal, 1979]. В наших экспериментах исключение из среды NaCl приводило к заметному уве-
64
Рис. 2.12. Фотопотенциал, генерируемый сильными и слабыми лазерными вспышками
Энергии вспышек - 5 мкДж (1,2) и 5 мДж (3-12). А - фосфолипидная пленка модифицирована родопсином с одной стороны; Б - то же, что А, но омывающий раствор содержал 10 мМ гидроксиламина
3. Г.Р. Каламкаров, М.А. Островский
личению постоянной времени спада фотопотенциала, что свидетельствует о том, то ускорение спада обусловлено ион-про-ницаемыми структурами. В последующей серии экспериментов была сделана попытка оценить характерные времена ускорения спада фотопотенциала. На рис. 2.12, А представлены отнор-мированные по амплитуде фотоответы на 1-, 2-, 3- и 12-ю вспышки. Энергия 1- и 2-й вспышек была в 1000 раз меньше, чем 3- и 12-й. Как видно, кинетики ответов на 1- и 2-ю вспышки практически совпадают. Кинетика же спада на сильную вспышку существенно отличается: спад фотопотенциала ускоряется. Более того, создается впечатление, что нарастание фотопотенциала также ускоряется. Частично это происходит оттого, что вклад третьей, миллисекундной, фазы уменьшается из-за ускорения спада фотопотенциала. Соответственно вклад второй микросекундной фазы увеличивается, так как даже после 12 вспышек постоянная спада больше, чем характерное время второй фазы нарастания. Что касается спада фотопотенциала, то лаг период между вспышкой и ускорением спада фотопотенциала, если и существует, то менее 50 мс. Это особенно хорошо видно из рис. 2.12, Б, где показано начало регенерации фотопотенциала с лучшим временном разрешением.
Действительно, постоянные времени спада в ответ на первую и вторую слабые вспышки практически совпадают. Это означает, что ускорение спада фотоответа вызвано самой вспышкой, а не предшествующим обесцвечиванием родопсина. Когда в раствор добавлялось 10 мМ NHOH, чтобы предотвратить накопление метародопсина II и других долгоживущих продуктов фотолиза родопсина, эффект ускорения заднего фронта фотопотенциала не зависел от присутствия гидроксиламина в среде. Аналогичный результат был получен и при прямом измерении сопротивления мембраны, т.е. когда коллодиевая пленка модифицировалась фоторецепторными дисками с обеих сторон.
Природа фотоиндуцированных изменений проводимости. Причины изменений проводимости следует искать в изменении тех компонентов мембраны, на которые может воздействовать свет. Известно, что освещение фоторецепторной мембраны приводит к перекисному окислению липидов и окислению SH-rpynn зрительного пигмента [Погожева и др., 1981]. Мы попытались выяснить, не являются ли эти факторы причиной быстрого изменения проводимости мембраны. Для этого в кювету с дисками, встроенными в плоскую мембрану, добавляли прооксиданты [Ре-брик и др., 1987]. В ходе инкубации в темноте регистрировались фотоответы на тестовые вспышки небольшой интенсивности, которые сами по себе не вызывали ускорения заднего фронта
66
100-1
Рис. 2.13. Влияние перекисного окисления липидов на кинетику фотопотенциала
Нормированные фотоответы сразу (/), через 17(2), 27(3) и 60(4) мин после начала инкубации дисков с прооксидантами
фотопотенциала. Нормированные фотоответы представлены на рис. 2.13.
Видно, что перекисное окисление вызывает ускорение спада фотоответа. Чтобы установить количественную связь фотоокисления и изменения проводимости, параллельно на той же порции дисков определялась кинетика накопления продуктов перекисного окисления липидов по малоновому диальдегиду (МДА). Оказалось, что сопротивление мембраны начинает уменьшаться при накоплении в мембране 100 нМ МДА на мг родопсина. В следующей серии была исследована кинетика фотоиндуцированного окисления липидов в мембране при тех же условиях освещения, при которых регистрируется изменение проводимости. Концентрацию МДА определяли в пробах, освещенных 5, 10, 15 и т.д. лазерными вспышками. Оказалось, что количество образующихся при этом перекисей значительно меньше тех, которые вызывают значительное изменение проводимости мембраны. Таким образом, хотя перекисное окисление и может вызывать изменение проводимости в мембране, наблюдаемые нами фотондуцированные изменения не могут быть обусловлены этой причиной.
Существенны ли протонирование родопсина и генерация фотопотенциала для его взаимодействия с трансдуцином? В ходе фотолиза родопсина на стадии образования метародопсина II происходит взаимодействие этого продукта с трансдуцином. Реакция связывания трансдуцина с метародопсином II является первой запускающей реакцией ферментативного каскада, завер
з*
67
шающего падением концентрации цГМФ - предполагаемого внутриклеточного медиатора в фоторецепторной клетке.
В экспериментах, посвященных исследованию фотоиндуци-рованного поглощения протона фоторецепторными дисками, было подтверждено предположение о существовании нескольких изохронных форм метародопсина II и было показано, что прото-нируется более поздняя форма. В связи с этим представлялось весьма важным выяснить, какая из форм метародопсина II - более ранняя, непротонированная или более поздняя, протонированная - образует комплекс с трансдуцином.
Для того чтобы ответить на этот вопрос, мы исследовали взаимодействие родопсина с трансдуцином в присутствии гидроксиламина, поскольку в наших экспериментах было показано, что реакция фотоактивированного родопсина с гидроксиламином предотвращает образование поздней, протонированной формы метародопсина II. Как известно, трансдуцин является водорастворимым белком НСП и легко экстрагируется растворами с низкой ионной силой [Kuhn, 1980]. Такая обработка НСП приводит к лизису цитоплазматической мембраны НСП и экстракции целого ряда водорастворимых белков, локализованных в наружной мембране НСП и цитоплазме. Последующее центрифугирование суспензии НСП в растворе с низкой ионной силой позволят выделить две фракции: осадок чистых фоторецепторных дисков и надосадочную жидкость, содержащуюся в числе других водорастворимых белков и трансдуцин. Дальнейшее фракционирование белков надосадочной жидкости позволяет выделить чистый трансдуцин [Bernard, Fung, 1983]. Характер взаимодействия фотоактивированного родопсина с трансдуцином одинаков как в нативных НСП, так и в суспензии фоторецепторных дисков, к которым добавлен очищенный трансдуцин [Kuhn, 1980; Kuhn et al., 1981; Bennett et al., 1982].
Кинетику взаимодействия трансдуцина с родопсином исследовали методом импульсного фотолиза, регистрируя изменения светорассеяния в образцах. Увеличение светорассеяния, происходящее в процессе взаимодействия родопсина с трансдуцином, объясняют изменением коэффициента преломления фоторецепторных дисков в ходе связывания двух белков, сопровождаемого сдвигом центра тяжести молекулы родопсина на 1А по направлению к внешней поверхности диска, что приводит к кажущемуся утолщению мембраны [Michel-Villaz et al., 1984]. Напротив, уменьшение светорассеяния объясняют распадом комплекса родопсина с трансдуцином, что приводит к уменьшению коэффициента преломления дисков и незначительному его увеличению во внешней среде за счет диссоциировавшего трансдуцина [Vuong et al., 1984].
68
мВ
Рис. 2.14. Образование комплекса родопсина с G-белком при освещении
Среда инкубации: 120 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитол, 20 мМ HEPES, pH 7,5. Концентрация родопсина 0,7 мг/мл. Стрелкой указан момент освещения образцов. а - суспензия фоторецепторных дисков без G-белка; б — после добавления G-белка; в - повторное освещение препарата б; г - препарат б через 60 мин после первой вспышки. Изменение амплитуды сигнала на I мВ соответствовало относительному изменению светорассеяния ДТ/Т = 0,05%
Экспериментальным доказательством прямой связи изменений светорассеяния с образованием комплекса родопсина с трансдуцином является, во-первых, тот факт, что в отсутствие трансдуцина изменений светорассеяния не происходит; во-вторых, при соотношении трансдуцин/родопсин, равном 1 : 10, соответствующем этому соотношению in vivo, обесцвечивание около 10% родопсина вызывает “насыщение” сигнала “связывания”: при последующих вспышках амплитуда сигнала не изменяется, т.е. связывание в комплекс всего имеющегося трансдуцина приводит к изменению светорассеяния [Kuhn et al., 1981]. В наших экспериментах при освещении отмытых от трансдуцина фоторецепторных дисков сетчатки глаза быка изменений светорассеяния также не происходит (рис. 2.14, а). Добавление к аналогичному темновому образцу суспензии экстракта водорастворимых белков НСП, содержащих трансдуцин, и последующее освещение препарата вызывали увеличение светорассеяния (рис. 2.14, б).
Время нарастания полумаксимальной амплитуды сигнала светорассеяния (t1/2) при обесцвечивании 6-8% родопсина в образце составило около 5 мс (см. рис. 2.14, б). При повторном освещении препарата никаких изменений светорассеяния не происходило, что свидетельствует о связывании всего имеющегося трансдуцина с родопсином (рис. 2.14, в). Если же препарат выдерживали в течение часа в темноте, то при последующем освещении снова наблюдали увеличение светорассеяния (рис. 2.14, г) в результате связывания освободившегося из комплекса трансдуцина с новыми фотоактивированными молекулами родопсина. Сходные результаты были получены при исследовании суспензии НСП сетчаток лягушек. Освещение также вызывало увеличение светорассеяния. Время нарастания полумаксимальной амплитуды сигнала составило около 9 мс (рис. 2.15), что по порядку величины совпадает с данными других авторов [Kuhn et al., 1981].
Образование комплекса фотоактивированного родопсина с трансдуцином в присутствии гидроксиламина исследовали в образцах суспензии сетчаток лягушек. Раствор гидроксиламина (pH 7,5) добавляли в кювету с образцом перед освещением. Освещение такого образца вызывало появление сигнала “связывания” (увеличения светорассеяния). Время достижения полумаксимума составляло 11 мс. Однако если в образцах без гидроксиламина за время регистрации (10 с) практически не происходило изменения амплитуды сигнала после достижения максимального уровня, то в опытах с гидроксиламином уже через 100 мс после вспышки света начиналось падение амплитуды. В течение 10 с происходил спад амплитуды сигнала “связывания” до исходного,
70
Рис. 2.15. Образование и распад комплекса родопсина с G-белком в суспензии наружных сегментов палочек сетчатки глаза лягушки в отсутствие (А) и в присутствии (Б) гидроксиламина
Изменение амплитуды сигнала на 1 мВ соответствовало относительному изменению светорассеяния ДТ/Т = 0,05%. Концентрация родопсина - 3 мкМ, концентрация гидроксиламина - 30 мкМ
темнового уровня. Повторное освещение такого образца снова приводило к увеличению и достаточно быстрому падению амплитуды сигнала, причем, с каждой последующей вспышкой максимальная амплитуда сигнала падала. Сигнал исчезал после полного обесцвечивания родопсина в образце. Таким образом, гидроксиламин не влияет на скорость образования комплекса
71
трансдуцина с фотоактивированным родопсином, однако значительно сокращает время его существования.
Это свидетельствует о том, что трансдуцин, очевидно, взаимодействует с более ранней, непротонированной формой метародопсина II. Переход этого продукта в присутствии гидроксиламина в ретинальоксим и опсин способствует распаду комплекса, после чего свободный трансдуцин может вновь реагировать с вновь образующимися молекулами метародопсина II при повторной фотоактивации.
Как известно (см. выше), ключевым этапом трансформации светового сигнала в электрический ответ фоторецепторной клетки является образование метародопсина II. Именно на этой стадии фотолиза зрительного пигмента происходят максимальные изменения в структуре белка. Происходит ли на этой стадии трансмембранный перенос протона так, как это имеет место в другом ретинальсодержащем белке бактериородопсине? Наши косвенные эксперименты с протонным ионофором свидетельствуют об отсутствии трансмембранного переноса протона: 2,4-ди-нитрофенол не влиял на фотоиндуцированное поглощение Н+ фоторецепторными дисками. Аналогичные результаты были получены при исследовании влияния на протонирование грамицидина и нигерицина, NH4C1 и карбонилцианил р-трифлуорометок-сифенилгидразона, также ускоряющих перенос Н+ через мембрану [Bennett, 1980; Bennett et al., 1980].
В описанных выше экспериментах была предпринята попытка оценить изменения pH внутри диска, используя суспензию инвертированных дисков. Действительно, если предположить, что имеет место трансмембранный перенос протона, то в случае нормально ориентированных дисков следовало бы ожидать подщелачивания среды, а в случае инвертированных дисков - ее подкисления. В наших экспериментах не удалось получить суспензию, содержащую только инвертированные диски, однако анализ экспериментальных данных позволяет заключить, что в ходе фотолиза родопсина трансмембранный перенос протона в фоторецепторном диске не происходит.
Интересно провести сравнение зрительного пигмента родопсина с другим ретиналь-содержащим белком - бактериородопсином. Этот белок был впервые обнаружен в мембранах пурпурных бактерий Halobacterium halobium. Основной его функцией в этих бактериях является преобразование энергии света в энергию синтеза АТФ [Oestrechelt, Stoeckenius, 1971, 1973]. Зрительный пигмент родопсин и бактериородопсин обнаруживают много сходных свойств: оба являются интегральными мембранными белками и имеют близкие молекулярные веса (39 и 26 кДА соот
72
ветственно). Аминокислотные последовательности некоторых участков полипептидных цепей совпадают. В обоих случаях структуры белков представляют собой семь ос-спиральных столбов, пронизывающих мембрану. Хромофор обоих пигментов - ретиналь - образует альдиминную связь (Шиффово основание) с е-аминогруппой лизина, локализованного ближе к С-концевому участку полипептидной цепи [Oestrechelt, Stoeckenius, 1971; Овчинников и др., 1982]. В обоих случаях первой и основной фотохимической реакцией является цис-транс-переход ретиналя.
Поглощение света молекулой зрительного и бактериального родопсина приводит сначала к небольшому батохромному сдвигу - образованию продуктов с Лмакс = 543 нм и Хмакс = 610 нм (ба-топродукты зрительного и бактериального родопсинов соответственно), а затем - к значительному (около 100 нм) гипсохромно-му сдвигу с образованием метародопсина П с Хмакс = 380 нм (в случае зрительного родопсина) и М412 с Хмакс = 412 нм (в случае бактериородопсина). Метародопсин II и М412 образуются в миллисекундой временной шкале и являются долгоживущими продуктами фотолиза [Ottolenghi, 1982]. Фотолиз обоих пигментов приводит к генерации разности потенциалов на мембране, причем, постоянные времени нарастания этих потенциалов близки.
Образование метародопсина II и М4|2 сопровождается поглощением протона из внешней среды. С другой стороны, при сравнении зрительного и бактериального родопсинов можно обнаружить очень существенные различия и прежде всего функциональные. Действительно, основной функцией бактериородопсина, как уже отмечалось, является преобразование энергии света в энергию синтеза АТФ. В случае зрительного родопсина квант света является лишь информационным сигналом, при этом его энергия в процессе фототрансдукции, по современным представлениям, не запасается. Свет лишь запускает последующий каскад реакций, что приводит к возникновению гиперполяризационного потенциала, создаваемого изменением натриевого тока через наружную, цитоплазматическую мембрану палочки.
В основе функционирования бактериородопсина лежит создание на мембране электрохимического протонного потенциала, а в основе работы зрительной клетки - каскад ферментативных и ионных процессов, запускаемых светом. Как показано в настоящей работе, освещение не приводит к возникновению протонного градиента на фоторецепторной мембране.
Таким образом, при анализе свойств обоих пигментов оказывается, что основные сходные черты обусловлены одинаковыми физико-химическими и прежде всего фотохимическими свойствами молекул, а именно фотоиндуцированным цис-транс-пере
73
ходом ретиналя. Следствием этой реакции является возникновение разности потенциалов на мембране. Однако если в бактериальной мембране этот процесс сопровождается еще и переносом протона через мембрану, что важно для функционирования всей клетки, то в зрительной клетке, где энергия света не запасается в виде АТФ, такой перенос отсутствует. Именно с этого момента функциональные пути бактериального и зрительного родопсина расходятся. Таким образом, в цепи последовательных фотоинду-цированных реакций отсутствие трансмембранного переноса протона в зрительной клетке является первой принципиальной чертой, отличающей зрительный родопсин от бактериального.
Как известно, функционально наиболее важной стадией фотолиза является образование метародопсина II. В связи с этим интересно выяснить, какова последовательность событий, которые происходят в той же временной шкале, что и физиологический ответ фоторецептора. И прежде всего необходимо рассмотреть процессы, непосредственно связанные с существованием метародопсина II. Одной из таких реакций является поглощение протона из внешней среды.
В наших экспериментах с гидроксиламином было показано, что поглощение протона ограничено временем жизни метародопсина II. Известно, что взаимодействие гидроксиламина с метародопсином II приводит к быстрому образованию ретинальокси-ма, т.е. к сокращению времени жизни метародопсина II. В присутствии избытка гидроксиламина мы не наблюдали поглощения протона. Кроме того, исследования кинетики образования метародопсина II и протонирования методом импульсного фотолиза показали, что время образования метародопсина II составляет около 2 мс, что значительно короче времени протонирования родопсина (около 30 мс).
Таким образом, наши результаты подтверждают представление о существовании двух форм метародопсина II - непротониро-ванной и протонированной [Bennett, 1980; Baumann, Zeppenfeld, 1981]. В ходе фотолиза родопсина сначала образуется непротони-рованная форма, а затем - изохромный ей протонированный продукт. Этот вывод подтверждается также несовпадением рН-зави-симостей образования метародопсина II и поглощения протона.
Термальный распад метародопсина II завершается гидролизом альдиминной связи хромофора с опсином и образованием свободных продуктов - полностью-шранс-ретиналя и опсина непосредственно из метародопсина III. Как было указано выше, освещение метародопсина II в максимуме его поглощения позволяет быстро перевести метародопсин II в фотопродукт Р460. При этом в мембране происходит ряд обратных изменений. Так, фо
74
топотенциал, регистрируемый на фоторецепторной мембране, изменяет полярность. Аналогичное изменение трансмембранного потенциала наблюдается при действии синего света на продукт фотолиза бактериородопсина М412 [Ormos et al., 1978]. Термальный распад метародопсина II и фотоиндуцированное образование Р460 сопровождается уменьшением конформационной подвижности гидрофильных, экспонированных во внешнюю среду, участков полипептидной цепи родопсина, тогда как образование метародопсина II - ее увеличением [Погожева и др., 1985].
Известно, что при термальном распаде метародопсина II происходит медленное высвобождение протона во внешнюю среду. Как было показано в настоящей работе, образование Р460 также сопровождается освобождением протона, однако в этом случае депротонирование метародопсина II происходит быстро. Можно предположить, что поглощение Н+ из внешней среды и его высвобождение из мембраны являются следствием изменения конформационного состояния молекулы родопсина и, в частности, ее гидрофильных участков. Переход к развернутой конформации при образовании метародопсина II сопровождается его протонированием. С другой стороны, образование продуктов Р460 и метародопсина III, спектрально близких более раннему продукту фотолиза метародопсину I, соответствует обратному переходу к более стабильной, исходной конформации и сопровождается высвобождением протона. Как уже указывалось, фотолиз родопсина приводит к генерации разности потенциалов на фоторецепторной мембране. Время нарастания фотопотенциала - 10 мс [Dratz et al., 1979; Drachev et al., 1980], что в несколько раз больше времени образования непротонированной формы метародопсина II, но существенно меньше, чем время образования протонированного метародопсина II.
Таким образом, три процесса: образование метародопсина II, генерация фотопотенциала и поглощение протона происходят в том же временном диапазоне, что и развитие физиологического ответа фоторецепторной клетки. Для понимания функциональной роли этих процессов важно представлять себе их последовательность. Схематично процессы, происходящие в фоторецепторной мембране на стадии образования и за время жизни метародопсина II, изображены на рис. 2.16. Поглощение света и изомеризация ретиналя приводят в ходе фотолиза родопсина к образованию метародопсина II, который сначала находится в непротонированной форме (МП). Затем происходят разделение зарядов в гидрофобной области белковой части молекулы, ее поляризация. Возникает разность потенциалов на фоторецепторной мембране со знаком плюс внутри диска и минус на внешней по-
75
Рис. 2.16. Последовательность процессов, протекающих в фоторецепторной мембране на стадии образования метародопсина II
верхности дисковой мембраны. Практически одновременно с разделением зарядов происходят конформационные изменения в белковой части молекулы родопсина. Вследствие этих изменений в гидрофильной области опсина высвобождаются отрицательно заряженные группы: метародопсин II переходит в новое конформационное состояние (М1Г). В этом состоянии МП' протонирует-ся с образованием протонированной формы метародопсина II -М1ГН+. По-видимому, процесс протонирования ограничивается нейтрализацией заряженных групп у внешней поверхности мембраны, и дальнейшей транслокации протона не происходит. Если бы такой перенос протона происходил, это привело бы к изменению кинетических характеристик фотопотенциала, регистрируемого на дисковой мембране, и появлению компоненты с временем нарастания около 30 мс. Однако такая компонента в фотопотенциале отсутствует (время нарастания фотопотенциала составляют 10 мс, а спада - до секунды). Дальнейшие превращения молекулы М1ГН+ приводят к образованию конформации, близкой к исходной, и эти “медленные” изменения сопровождаются высвобождением протона во внешнюю среду. По-видимому, в поглощении и высвобождении протона участвуют одни и те же аминокислотные остатки, а сам этот процесс, вероятно, является лишь сопутствующей реакцией и самостоятельной роли в функционировании фоторецепторной мембраны не играет.
Образование комплекса фотоактивированного родопсина с трансдуцином также связано с ключевой стадией трансдукции -образованием метародопсина II. До появления этого продукта
76
трансдуцин находится в свободном состоянии и не взаимодействует с более ранними продуктами фотолиза родопсина [Emeis et al.. 1982]. Активатором трансдуцина является уже образовавшийся метародопсин II [Kuhn et al., 1981; Bennett et al., 1982]. В цепи рассмотренных выше реакций, сопряженных с существованием этого продукта фотолиза (генерация трансмембранного фотопотенциала, конформационные изменения белковой части молекулы, поглощение протона из среды), связывание трансдуцина происходит, по-видимому, параллельно с конформационными изменениями, затрагивающими гидрофильный С-концевой участок оп-сина, после генерации фотопотенциала, но несколько раньше протонирования. Начальная, быстрая фаза связывания трансдуцина лежит в 10-миллисекундном временном диапазоне и несколько отстает от начальной фазы образования метародопсина II. К такому же выводу приходят авторы, параллельно исследовавшие кинетику образования метародопсина II и связывания трансдуцина [Kuhn et al., 1981; Bennett et aL, 1982].
Образовавшийся комплекс трансдуцина с метародопсином II существует достаточно долго в отсутствие ГТФ. Было высказано предположение, что в отсутствие ГТФ при обесцвечивании менее 10% родопсина образование комплекса стабилизирует метародопсин II и ускоряет время распада метародопсина III [Pfister et aL, 1983]. С другой стороны, сокращение времени жизни метародопсина II с помощью гидроксиламина сокращает и время существования комплекса. Эти результаты совпадают с результатами исследований Хофманна с соавторами [Hofmann et aL, 1983], которые показали, то присутствие 1 мМ гидроксиламина в 5 раз ускоряет распад комплекса трансдуцина с метародопсином II. Однако результаты нашей работы позволяют более точно определить, с какой формой метародопсина II взаимодействует трансдуцин. Действительно, в экспериментах по исследованию фотоиндуци-рованного поглощения протона в присутствии гидроксиламина протонирования метародопсина II не происходило. Этот эффект является следствием того, что гидроксиламин взаимодействует с более ранней, непротонированной формой метародопсина II (МП), и образования формы МП', способной связывать протон, не происходит. С другой стороны, на постоянную времени образования комплекса метародопсина II с трансдуцином гидроксиламин не влияет, а лишь сокращает время его жизни. Это однозначно свидетельствует о том, что МП' не является необходимым для взаимодействия трансдуцина с фотоактивированным родопсином. Активатором трансдуцина является более ранняя, непрото-нированная форма метародопсин II.
77
Сравнение проводимости диска и плазматической мембраны фоторецептора
Долгое время при исследовании механизмов фототрансдукции доминировала кальциевая гипотеза, предполагавшая, что диски внутри зрительной клетки являются своеобразными депо -структурами, аккумулирующими ионы кальция подобно саркоплазматическому ретикулуму. Сейчас можно считать твердо установленным, что кальций в фоторецепторной клетке не играет той роли, которая предполагалась этой гипотезой. Напротив, концентрация ионов кальция при освещении не увеличивается, а уменьшается. Кальций действует не как ингибитор ионных каналов на плазматической мембране клетки, а как регулятор активности гуанилатциклазы и, возможно, других ферментов цикла фототрансдукции. Роль же дисков как замкнутых структур остается неясной. Есть данные, что они могут тем не менее играть роль кальциевого депо, выполняя функцию кальциевого буфера и связывают цГМФ [Болотовский и др., 1984]. Показано также, что проводимость дисковой мембраны зависит от цГМФ [Ховра-тович и др., 1988]. В связи с этим представляется интересным исследовать электрические свойства дисковой мембраны и, в частности, проводимость.
Как известно, фоторецепторные диски образуются из плазматической мембраны в результате ее инвагинации в базальной части наружного сегмента палочки. Поэтому, казалось бы, структура, состав и функциональные свойства этих мембран не должны были бы различаться. Вместе с тем складывается впечатление, что различия между ними весьма существенны. Биохимия фоторецепторной мембраны диска изучена довольно подробно. Однако получить фракцию цитоплазматических мембран в количестве, достаточном для биохимических исследований, практически невозможно. Помимо родопсина, она содержит фосфорилируемые белки [Miller et al., 1977; Lee et al., 1984], которых, по-видимому, нет в мембране диска.
В то же время накоплена обширная информация об электрических свойствах плазматической мембраны наружного сегмента. С другой стороны, электрофизиологические исследования фоторецепторной мембраны диска при помощи обычных методов невозможны, поскольку его размеры слишком малы и лежат за пределами разрешения светового микроскопа. По той же причине нельзя использовать метод пэтч-кламп.
Хорошую возможность для исследования проводимости дисков дал метод их встраивания в пропитанный липидами мембранный фильтр, использованный нами для исследования фотопотен
78
циалов и подробно описанный в предыдущей главе. При этом сам фотопотенциал является своеобразным толчком тока, по которому и можно измерить сопротивление дисковой мембраны. То, что оно значительно больше, чем сопротивление плазматической мембраны, следует уже из модельных экспериментов, описанных ранее. Сильное шунтирование измерительной мембраны делало этот потенциал похожим на РРП, т.е. приближало дисковую мембрану по своим характеристикам к плазматической. В данном разделе в продолжение этой работы мы измеряли проводимость обеих мембран в одинаковых условиях, т.е. используя метод встраивания дисков [Каламкаров и др., 1981; Ребрик и др., 1986].
На рис. 2.2 представлен фотопотенциал, возникающий в ответ на короткую вспышку, на мембранном фильтре, в который встроены фоторецепторные диски. Регистрируемый фотоответ, как было показано ранее, той же природы, что и ранний рецепторный потенциал, который отводится от плазматической мембраны. Постоянная времени нарастания фотоответа составляет порядка 10 мс и соответствует кинетике перехода метародопсина 1 в метародопсин II. Следует обратить внимание на крайне медленный спад фотопотенциала, который происходит в секундной шкале. Если принять емкость мембраны диска равной 1 мкФ/см, оказывается, что сопротивление мембраны диска очень велико.
В следующей серии экспериментов пропитанный липидами мембранный фильтр модифицировали интактными НСП. В этом случае в ответ на такую же вспышку света регистрируется более сложный фотоответ, быстрый (миллисекундный) компонент которого по временным параметрам соответствует раннему рецепторному потенциалу (рис. 2.17). Второй, гораздо более медленный компонент фотоответа с характерным временем порядка 1 с может быть интерпретирован как ПРП. В отличие от быстрого, медленный компонент может быть зарегистрирован лишь в первые 10 мин после приготовления препарата. Это примерно соответствует времени выравнивания ионных градиентов на плазматической мембране при блокировании №7К+-АТФазы фоторецепторной клетки оуабаином [Winkler, 1981]. Насыщается медленный компонент при значительно меньших энергиях вспышки, чем быстрый.
Как по характерным временам, так и по полярности быстрый компонент фотоответа, представленный на рис. 2.17, может быть интерпретирован как РРП, регистрируемый при обычных электрофизиологических условиях отведения от наружного сегмента палочки.
Для плазматической мембраны фоторецепторной клетки время спада составляет 5 мс и совпадает с характерным временем
79
0,5 мВ
25 мс I 5 с
Рис. 2.17. Фотоответ изолированных наружных сегментов палочек, встроенных в пропитанный липидами фильтр, на лазерную вспышку.
Момент вспышки обозначен стрелкой
спада для РРП, регистрируемого внутриклеточно. Такое совпадение свидетельствует о том, что постоянная спада определяется именно RC биологической мембраны, сорбированной на фильтре, а не переходными процессами на мембранном фильтре. Удельное сопротивление плазматической мембраны фоторецептора в темноте, когда все Na+-каналы открыты, составляет 3 кОм/см [Detwiller et al., 19821. Если считать удельные емкости фоторецепторной и плазматической мембран одинаковыми и равными примерно 1 мкФ/см, то вычисленная, исходя из времени спада, величина удельного сопротивления мембраны диска составляет 1-2 мОм/см2.
Таким образом можно полагать, что величина удельного сопротивления мембраны диска составляет 1-2 мОм/см2. Интересно отметить, что это значение совпадает с сопротивлением плазматической мембраны в условиях действия насыщающего света, когда все светочувствительные каналы закрыты. Поскольку в настоящее время считается, что в плазматической мембране фоторецептора существует только один тип проводимости, а именно регулируемая светом натриевая проводимость [Yau et al., 1981], исходя из наших данных, можно полагать, что в мембране фоторецепторного диска палочки отсутствуют какие-либо ионные каналы. Если принять, исходя из общепринятых представлений о морфогенезе дисков, что свойства плазматической и дисковой мембран одинаковы, то обнаруженное нами отсутствие канальных структур в дисковой мембране представляется удивительным. Наличие в мембране диска хотя бы одного канала с проводимостью 1 пСм, с учетом диаметра диска около 1 мкм и удельной емкости мембраны 1 мкФ/см, давало бы постоянную времени спада около 1 мс, что на три порядка меньше реального параметра. Поэтому можно полагать, что ионные каналы либо утрачиваются в процессе формирования диска из плазматической мембраны, либо встраиваются в плазматическую мембрану уже после отделения дисков. Возможно также, что, вопреки существующим представлениям, дисковая мембрана происходит не
80
из плазматической мембраны, а образуется в базальной части наружного сегмента независимо от нее.
Более поздние работы отчасти подтвердили вывод, сделанный нами. Так, в работе [Cook et al., 1989] гистохимически показано, что цГМФ-регулируемые каналы локализованы только в плазматической мембране фоторецептора. Проводимость фоторецепторной мембраны диска соизмерима с проводимостью сопрягающих мембран митохондрий, хлоропластов, пурпурной (содержащей бактериородопсин) мембраны галобактерий [Drachev et al., 1981а, Ь]. Столь низкая проводимость перечисленных мембран имеет функциональный смысл. Это необходимо для поддержания на них трансмембранного градиента Н+. Однако в случае фоторецепторной мембраны функциональная роль столь низкой проводимости остается неясной.
Крайне незначительное при физиологических условиях освещения увеличение ионной проницаемости мембраны диска, в частности, для ионов кальция [Шевченко и др., 1980, 1981], также указывает на отсутствие в ней ионных каналов. Это предположение подтверждают также результаты наших экспериментов по исследованию влияния цГМФ- и SH-реагентов на проводимость обеих мембран. Концентрация цГМФ, при которой открываются все ионные каналы в плазматической мембране фоторецептора, вызывает лишь незначительное изменение проводимости мембраны диска, хотя при наличии в мембране диска цГМФ-регулиру-емых каналов проводимость изменилась бы на 2-3 порядка.
Гпава 3
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РОДОПСИНА С ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИМИ БЕЛКАМИ (ТРАНСДУЦИНОМ И АРЕСТИНОМ) В ФОТОРЕЦЕПТОРНОЙ КЛЕТКЕ
В предыдущей главе мы рассматривали фотоэлектрические процессы, происходящие в молекуле родопсина и фоторецепторной мембране. Основным следствием этих процессов являются такие изменения в молекуле зрительного пигмента, которые приводят к его взаимодействию со специфическим трансдуцином на этапе активации, фосфорилированию и связыванию с арестином на этапе инактивации. Активация трансдуцина достигается при его взаимодействии с активированным родопсином и обмене в связанном состоянии ГТФ на ГДФ [Fung, Stryer, 1980]. Затем комплекс диссоциирует и активирует фосфодиэстеразу путем замещения ее ингибиторной субъединицы [Fung et al., 1981]. Трансдуцин обладает ГТФазной активностью, и гидролиз ГТФ возвращает молекулу в исходное состояние [Sitaramayya et al., 1988].
Предполагается, что арестин играет важную роль в процессе инактивации родопсина. Установлено, что инактивация фосфодиэстеразы ускоряется в его присутствии [Wilden, Kuhn, 1986; Zuckerman, Cheasty, 1986; Bennett, Sitaramayya, 1988]. Есть две точки зрения на механизм этого процесса. Первая предполагает, что арестин связывается с обесцвеченным и фосфорилированным родопсином и таким образом занимает место связывания трансдуцина [Wilden, Kuhn, 1986]. С другой стороны, есть данные, что арестин прямо действует на фосфодиэстеразу, ингибируя ее активацию трансдуцином [Zuckerman, Cheasty, 1986]. Согласно этой последней схеме, необходимо, чтобы арестин связался с обесцвеченным родопсином и при этом активировался. Для такой активации, согласно этой схеме, необходима одна молекула АТФ, а фосфорилирование родопсина не является обязательным.
В настоящей главе нами были рассмотрены следующие вопросы: (1) какие изменения, происходящие в молекуле родопсина при его переходе в метародопсин II, существенны для его связывания с трансдуцином; (2) где локализовано место связывания трансдуцина и арестина на молекуле родопсина и есть ли это один и тот же центр; (3) какие изменения в конформации молекулы вызывает фосфорилирование родопсина и насколько эти
82
изменения могут препятствовать связыванию с трансдуцином. Результаты этих исследований изложены в серии публикаций [Погожева и др., 1985; Погожева и др., 1989а, б, 1991].
Наиболее адекватным методом для выяснения этих вопросов явилась, по нашему мнению, комбинация ограниченного протеолиза молекулы родопсина в мембране и направленная модификация функциональных групп родопсина в совокупности с методом спиновых меток. Взаимодействие родопсина с периферическими белками исследовалось ранее с помощью светорассеяния [Kuhn, Hargrave, 1981; Bennett, Dupont, 1985; Schleicher, Hofmann, 1987], адсорбционной спектроскопии [Emeis et al., 1982; Bennett et aL, 1982], определения фосфодиэ-стеразной активности [Wilden et aL, 1986; Zuckerman, Cheasty, 1986; Bennett, Sitaramayya, 1988]. Взаимодействие родопсина с трансдуцином исследовалось также методом ограниченного протеолиза [Kuhn, Hargrave, 1981; Sitaramayya, Liebman 1983; Miller, Dratz, 1984], модификацией SH-групп [Reichert, Hofmann, 1984; Колосов, Воейков, 1986], с помощью рекомбинантного родопсина [Kamik et aL, 1988; Franke et aL, 1988; Гуревич и др., 1990; Franke et aL, 1990], по переносу энергии флуоресценции [Borochov-Neori, Montal, 1989], используя пептиды, гомологичные родопсину [Takemoto et aL, 1985; Takemoto et aL, 1986], антитела на пептиды [Weiss et aL, 1988].
В данном исследовании мы использовали ЭПР-спектроско-пию и спиновые метки, которые являются удобным инструментом для исследования функциональных изменений в белках [Jost, Griffith, 1976; Каламкаров и др., 1976]. В настоящей работе использовались три типа спиновых меток, модифицирующих цистеиновые остатки: MSL, MESL, HgSL. Нам удалось селективно пометить цистеиновые остатки, локализованные в разных петлях родопсина, что и позволило выявить их участие в процессах активации и инактивации родопсина.
Модификация родопсина спиновыми метками
Малеимидные спиновые метки. Определение мест связывания меток при помощи протеолиза родопсина папаином. С целью избирательного спинмечения SH-групп родопсина была изучена кинетика связывания MSL, MESL и N-этилмалеимида (НЭМ). Кинетические кривые в условиях реакции псевдопервого порядка описываются суммой трех экспонент с константами скоростей связывания К] = (2,3 ± 1,1)  KF2 с-’, К2 = (1,55 ± 0,23) • HF3 с-1, К3 = (2,36 ± 0,05)  1(F3 с-1. Это означает, что в мембране имеются три типа SH-групп (SH-1, SH-2, SH-3), предельные степени
83
модификации которых спиновыми метками составляют соответственно 0,3, 1 и 1 на молекулу родопсина.
Из полученных констант скорости следует, что инкубация мембран НСП с меткой в течение 2 мин позволяет модифицировать SH-группы 1-го типа (SH-1). Для того чтобы метками модифицировать SH-2-группы, SH-1-группы модифицировали в течение 2 мин НЭМ, а после отмывания НЭМ препарат инкубировали 13 мин с малеимидной меткой. При этом 75% меток оказывались связанными с SH-2-группами.
Для модификации метками SH-групп 3-го типа (SH-3) препарат инкубировался с НЭМ 25 мин, а затем 50 мин - со спиновой меткой. Место ковалентного связывания этих меток можно определить методом ограниченного протеолиза. Известно, что в результате протеолиза родопсина папаином первоначально отщепляется С-концевой пептид и образуется фрагмент с молекулярной массой 36 кДа (F36), а затем выщепляется петля между V и VI ос-спиральными тяжами, и образуются два ковалентно не связанных фрагмента с молекулярными массами 24 и 12 кДа (F24 и Fl3) [Мартынов и др., 1983]. Согласно схеме расположения по-липептидной цепи родопсина в мембране, с цитоплазматической стороны родопсина имеются только 4 остатка цистеина Cys-140, Cys-316, Cys-322 и Cys-323, причем, первые два остатка расположены соответственно во фрагментах F24 и Fl2, а два последние - в С-концевом пептиде, причем известно, что они могут образовывать специфический динитрозильный комплекс [Ванин и др., 1977]. На рис. 3.1 представлена кинетика протеолиза родопсина папаином. Видно, что через 5 мин протеолиза основным промежуточным продуктом является фрагмент F^, который через 30 мин практически полностью расщепляется на два фрагмента. В ходе протеолиза родопсина, меченного MSL или MESL, сигнал ЭПР, представленный на рис. 3.2, сохраняется, хотя фрагмент, содержащий остатки Cys-322 и Cys-323, полностью отщепляется. Это означает, что MSL и MESL локализуются в основном в мем-бран-связанных фрагментах F24 и Fl2 и связываются с остатками Cys-140 и Cys-316, расположенными в этих фрагментах. Данные по распределению MSL по фрагментам протеолитического расщепления родопсина представлены в табл. 3.1. Наиболее реакционноспособные SH-группы 1-го типа, число которых составляет 0,3 моля на моль белка, скорее всего не могут принадлежать основному белку. Возможно, они принадлежат обесцвеченному родопсину или минорным белкам фоторецепторных мембран. Поэтому в дальнейшем все эксперименты проводились для препаратов, спинмеченных по SH-2 и SH-3-группам, a SH-1 -группы всегда предварительно блокировались НЭМ.
84
Рис. 3.1. Кинетика протеолиза родопсина папаином
Количество непротеолизированного родопсина и фрагментов F36, F24, F12 оценивалось по площади соответствующей полосы в гель-электрофорезе
Из сопоставления кинетики связывания MSL с фрагментами F24 и Fi2 кинетики модификации SH-2- и SH-3-групп следует, что более реакционноспособная SH-2 группа, по-видимому, расположена во фрагменте F12 (Cys-316), а наименее реакционноспособная SH-3-группа - во фрагменте F24 (Cys-140). Эти результаты в целом согласуются с данными работы [Fung, Hubbel, 1978].
Было найдено, что кинетика титрования родопсина MSL при 10-кратном избытке по отношению к родопсину практически совпадает с кинетикой модификации родопсина MESL при 20-кратном избытке.
Поэтому можно считать, что модификация родопсина MSL и MESL происходит одинаково.
Основываясь на изложенных выше результатах, для избирательной модификации различных цистеинов использовались следующие схемы.
Схема 1. Мембраны сначала обрабатывались НЭМ (0,3 моль/моль родопсина). Затем отмытые мембраны инкубировались с малеимидной спиновой меткой. При этом 80% меток (MSL или MESL) связывалось с Cys-316 и 20% - Cys-140.
Схема 2. Мембраны обрабатывались НЭМ 15 мин (1,2 моля SH-rpynn на моль родопсина блокировалось), затем мембраны отмывались и обрабатывались спиновой меткой в течение 60 мин. При этом 40% метки связывалось с Cys-316 и 60% - с Cys-140.
Я5
А
О II
C-NHCH2CH2OCH2CH2-N
MESL
СН сн
О
сн3
Vri 3
CH3J
CHj^N’
n о
MSL
сн3 сн3
HgSL
о
Б
2Azz ” 10 G
О
в 10 мМ HEPES, содержащем 0,2 мМ сахароз)', pH 7
Рис. 3.2. Спектры ЭПР спин-меченного родопсина
А - структурные формулы спиновых меток; Б - спектры ЭПР спинмеченного родопсина в фоторецепторной мембране, модифицированного метками MSL (о, б) и MESL (в) по остаткам Cys-316 и Cys-140. Спектры ЭПР регистрировали в суспензии фоторецепторных мембран (концентрация родопсина 2.5 х 1(7- М)
температура 20 °C. а - первая гармоника спектра ЭПР в условиях СВЧ-насыщения (/ - мощность СВЧ-поля Р = 200 мВт, 2 - без насыщения). Амплитуда модуляции Нт = 2 Гс частота модуляций f = 100 кГц, постоянная времени t = 0,128 с, время сканирования спектров Т = 8 мин, коэффициент К = 1,24 х 103 (/) и 2,5 х JO3 (2). б - вторая гармоника спектра ЭПР в условиях ЭПР-насыщения, сдвинутая на 90° относительно фазы модуляции (Р = 5 мВт, Нт = 5 Гс, f = 50 кГц, t = 1 с, Т = 16 мин, К = 103). Стрелками показаны области спектров, в которых регистрировали кинетику изменения амплитуды сигналов при фиксированном значении постоянного магнитного поля
Ртутъорганическая спиновая метка (HgSL). Локализация места связывания метки. При добавлении к суспензии фоторецепторных мембран HgSL в соотношении 2 моля метки на 1 моль
86
Таблица 3.1
Распределение MSL в молекуле родопсина до и после протеолиза папаином
Время инкубации с MSL, мин	моль MSL/моль родопсина*	моль MSL/моль фрагмента**		
			F24	F|2
2	0,40 ± 0,05	0,35 ±0.13	0,19 ±0,12	0,12 ±0,06
15	1,20 ±0,10	1,10 ±0,08	0,32 ± 0.06	0,68 ± 0,08
75	1,90 ±0,10	1,68 ±0,12	0,78 ± 0,06	0,82 ±0.12
* Количество спинмеченных SH-групп на молекулу родопсина определялось как разность между меченными и немеченными образцами. Число немеченых SH-групп в родопсине определяли титрованием ЦТАБ-экстракта с помощью ДТНБ.
Распределение спиновых меток в протеолитических фрагментах (время инкубации с папаином - 5 мин) определялось по результатам электрофореза в полиакриламидном геле. Для определения концентрации спиновой метки в протеолитических фрагментах измерялась интенсивность сигнала ЭПР в высушенных участках полиакриламидного геля, соответствующих каждому фрагменту и нормированных по интенсивности сигнала ЭПР родопсина с известной степенью модификации, не подвергнутого протеолизу. Каждое приведенное значение является средним из четырех различных гелей.
белка она менее чем за 2 мин полностью связывается с молекулой родопсина, о чем свидетельствует появление сигнала ЭПР и отсутствие сигнала свободной метки (рис. 3.3,а).
Эксперименты с ограниченным протеолизом показали, что в этом случае метка связывается с С-концевым фрагментом. Действительно, после 5 мин протеолиза родопсина папаином, т.е. при отщеплении С-концевого фрагмента, форма спектра и амплитуды сигналов ЭПР существенно изменяются (рис. 3.3,6): на 80-85% уменьшается интенсивность сильно иммобилизованной компоненты сигнала и резко возрастает вклад слабоиммо-билизованной компоненты. После двукратного отмывания фоторецепторных мембран в большом объеме среды инкубации расторможенная компонента сигнала в спектре ЭПР исчезает, что указывает на отщепление HgSL в водную фазу. Таким образом, HgSL, по-видимому, связывается с С-концевыми остатками Cys-322 и Cys-323.
Другим подтверждением того, что HgSL и MSL модифицируют разные остатки молекулы родопсина, являются результаты исследования кинетики титрования поверхностных SH-групп родопсина дитионитробензойной кислотой (ДТНБ) до и после модификации родопсина спиновыми метками. Как видно из
87
Рис. 3.3. Влияние протеолиза на спектр ЭПР родопсина, меченного HgSL
а — перед протеолизом; б — через 5 мин после протеолиза. Концентрация папаина -0,02 мМ, протеолиз останавливался добавлением 0,1 М иодацетамида. Условия регистрации спектра: f = 100 кГц, амплитуда модуляции - 2 Гс, мощность - 10,3 мВт, постоянная времени - 0,5 с, время сканирования - 500 с, усиление -4x10
рис. 3.4,а, ДТНБ и MSL модифицируют одни и те же SH-группы после связывания 1,9 моль MESL на 1 моль родопсина. ДТНБ способна модифицировать еще не более 0,4 моль SH-групп на 1 моль белка. В случае же HgSL достижение степени модификации 1,9 не препятствует последующему взаимодействию родопсина с ДТНБ: этот реагент дополнительно модифицирует 2,0-2,3 остатка цистеина на молекулу белка.
Модификация фосфорилированного родопсина спиновыми метками. Кинетические кривые, описывающие взаимодей-стие ДТНБ с SH-группами обесцвеченного фосфорилированного и нефосфорилированного родопсина, практически совпадают (рис. 3.4,6). В обоих случаях общее число SH-групп, доступных ДТНБ, близко как в немеченном белке, так и в родопсине, модифицированном HgSL или MSL. Поэтому можно предположить, что метки, так же как и ДТНБ, одинаковым образом модифицируют тиоловые группы фосфорилированного
88
Рис. 3.4. Кинетика титрования SH-групп обесцвеченного нефосфорилирован-пого (а) и фосфорилированного (б) родопсина ДТНБ
Концентрация родопсина - 5 мкМ ДТНБ - 500 мкМ. I — до модификации родопсина; 2 - после модификации родопсина меткой HgSL (1,9 моль белка); 3 - после модификации родопсина меткой MESL (1,9 моля метки на 1 моль белка). Степень фосфорилирования родопсина - 70%; среда инкубации: 50 мМ трис-НС1-буфер, pH 8; 0,167 М КС1; темпера гура - 20 °C
и нефосфорилированного родопсина, т.е. в обоих случаях MSL и MESL модифицируют остатки Cys-140 и Cys-316, a HgSL - остатки Cys-322 и Cys-323.
Фотоиндуцированные изменения в спектрах ЭПР спинмеченного родопсина
Темноадаптированный родопсин. Как оказалось, параметры спектров ЭПР различаются для меток, связанных с различными цистеинами (Cys-140, Cys-316, Cys-322, 323). Это указывает на различия в структурном окружении этих остатков (табл. 3.2).
Так, при модификации цистеинов по схеме 2 (Cys-316 : Cys-140 = 43/75) величина фактора насыщения Z+l и тс значительно ниже, чем в том случае, когда модифицируется преимущественно Cys-316 (Cys-316 : Cys-140 = 78/22). Например, для MESL в первом случае тс = 0,29 ± 0,03 нс, а во втором случае тс = 0,6 ± 0,06 нс. Такая же корреляция получена и для MSL. Это означает, что увеличение лабильности метки происходит из-за вклада Cys-140.
Абсолютные значения тс были оценены для MSL при мечении в соответствии со схемами 1 и 2, используя параметры L"/L, С /С и Z+l. Величина тс полученная из L”/L, составила 22 и 10 мкс соответственно для схем 1 и 2. Величины, полученные из С'/С, были 0,5 и 0,3 мкс, а из Z+l - 2 и 1 мкс соответственно для схем 1 и 2. В дальнейшем для количественных оценок времени вращательной корреляции мы использовали параметр Z+l.
89
Таблица 3.2
Влияние фосфорилирования родопсина, добавления арестина и трансдуцина к мембранам НС после протеолиза на параметры спектров ЭПР спинмеченного родопсина
Спиновая метка	Модифицированные Cys	Состояние родопсина	Добавленные белки	Тс
MSL	Cys-316	Необесцвеченный	—	22±Звмс
MSL	Cys-140	Необесцвеченный фосфорилированный	-	10 ±2 мс
MSL	Cys-140	Обесцвеченный фосфорилированный	-	
MSL	Cys-140	Обесцвеченный	Арестин8	
HgSL-1	Cys-322(323)	Необесцвеченный	—	
HgSL-1	Cys-322(323)	Необесцвеченный	Трансдуцин6	
HgSL-1	Cys-322(323)	Необесцвеченный фосфорилированный	Трансдуцин +1 мМ ГТФ	
HgSL-1	Cys-322(323)	Обесцвеченный фосфорилированный	-	
HgSL-1	Cys-322(323)	Обесцвеченный	Арестин	
HgSL-2	Cys-322, 323	Необесцвеченный	—	
HgSL-2	Cys-322,323	Необесцвеченный	Трансдуцин	
HgSL-2	Cys-322, 323	Необесцвеченный	Трансдуцин +1 мМ ГТФ	
MESL	Cys-316	Необесцвеченный	—	0,60 ± 0 06 нс
MESL	Cys-316	Необесцвеченный фосфорилированный	Трансдуцин	0,56 + 0,06 нс
MESL	Cys-316	Обесцвеченный фосфорилированный	—	0,68 ± 0,07 нс
MESL	Cys-316	Обесцвеченный	Арестин	0,91 ±0,10 нс
MESL	Cys-140	Необесцвеченный	—	0,29 ± 0,03 нс
MESL	Cys-140	Необесцвеченный фосфорилированный	Трансдуцин	0,26 ± 0,03 нс
MESL	Cys-140	Обесцвеченный фосфорилированный	-	0,39 + 0,04 нс
MESL	Cys-140	Обесцвеченный	Арестин	0,49 ± 0,04 нс
а Спинмеченный фосфорилированный и регенерированный родопсин (12 мкМ, степень фосфорилирования - 80%) добавляли к арестину (5 мкМ) в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, pH 7,0, 170 мМ КС1, освещали 1 мин (100% родопсина обесцвечено) и осаждали центрифугированием. При этом менее 10% арестина оставалось в супернатанте (не связывалось с родопсином). Концентрацию арестина определяли в цветной реакции с кумасси синим [Bradford, 1976]. Регистрировался спектр ЭПР осадка.
Метка HgSL, которая связывается с С-концевым пептидом, сильно иммобилизована на белке, однако параметры сигнала ЭПР зависят от того, одна или две метки связываются с молеку-
90
Г' Параметры спектров ЭПР				
W/S	H+I(G)	Z+l	2А£ (G)	Д1Д %
0,50 ± 0,05 1,94 ±0,05	4,4 ±0,1 4,9 ±0,1	2,30 ± 0,05г 1.75±0,05г	66,25 ±0,25 64,75 ±0,25	6,2 ± 0,3 5.2 ± 0,3
0,86 ± 0,05	5,1 ±0,1	1,68±0,05г	65,00 ± 0,25	
0,78 ±0,05	5,0 ±0,1	1,92±0,05г	65,25 ±0,25	—
0,34 ± 0,05 0,13 + 0,05 0,26 ± 0,05	7,3 ± 0,2 6,8 ± 0,2 7,0 ± 0,2	1,22 ±0.05 1,39 ±0,05 1,17 ±0,05	67,50 ±0,25 67,50 ±0,25 67,50 ±0,25	6,3 ± 0,5 1,3 ±0,8 1,5 ±0,8
0,19 + 0,05	7,6 ± 0,2	1,29 ±0,05	67,50 ±0,25	15.5 ±0.6
0,11 ±0,05	6,5 ± 0,2	1,54 ±0,05	67,50 ± 0,25	-
0,31 ±0,05 0,27 ± 0,05 0,32 ± 0.05	8,9 ± 0,2 8,1 ±0,2 9,1 ±0.2	1,07 ±0,05 1,55 ±0,05 1,15 ±0,05	67,00 ±0,25 67,50 ±0,25 67,00 ± 0,05	17,5 ±0,6 7,1 ± 0,6 7,2 ± 1,2
	1,80 ±0,05 1,75 ±0,05			6,6 ± 1,2 6,0 ±0,8
	1,80 ±0,05			12,6 ± 1,5
	2,00 ±0,05			-
	1,45 ±0,05 1,30 ±0,05			8,0 ± 1,0 6,0 ± 1,2
	1,60 ±0,05			10.4 ± 1,5
	1,80 ±0,05			—
6 Трансдуцин добавлялся к родопсину в молярном отношении родоп-син:трансдуцин = 2:1.
в Определен по L"/L второй гармоники спектра ЭПР.
г И] = 200 мВт, в других случаях ВЦ = 100 мВт.
Примечание. Cys-322 (323)-HgSL добавляли к родопсину в молярном отношении метка:белок = 1:1; Cys-322, 323-HgSL - в отношении 2:1; Cys-316 модифицировали по схеме 1: 75% метки связывалось с Cys-316; Cys-140 модифицировали по схеме 2: 60% метки связывалось с Cys-140.
лой белка (см. табл. 3.2). В последнем случае фактор насыщения Z+I меньше (1,07 ± 0,05 по сравнению с 1,22 ± 0,05), т.е. лабиль-
91

500	400	500	400
Д1/1
= 2%
I___________I
30 с
Рис. 3.5. Изменения во времени низкополевой компоненты (m+1) спектров ЭПР родопсина, меченного MSL
Препарат освещался 5 с светом с максимумом поглощения 500 нм (на оси абсцисс -жирная черта 500) и 400 нм (на оси абсцисс - жирная черта 400). Кривая а получена в отсутствие гидроксиламина; кривая б - в присутствии 50 мМ гидроксиламина
ность метки выше в том случае, когда помечены оба остатка. Известно, что С-концевой пептид соединен тиоэфирной связью с пальмитиновой кислотой [Ovchinnikov et al., 1988] и, следовательно, полная модификация обеих сульфгидрильных групп может приводить к освобождению С-концевого пептида и как следствие - к большей лабильности меток.
Фотоиндуцированные изменения родопсина. При обычной регистрации фотоиндуцированные изменения в спектрах ЭПР не наблюдаются. Значительные изменения в спектрах, как было показано [Погожева и др., 1985], наблюдаются при регистрации спектров в условиях СВЧ-насыщения. В этом случае удается наблюдать изменения всех трех типов меток, которые описаны выше. В качестве примера фотоиндуцированные изменения, полученные таким образом при регистрации спектров метки MSL, представлены на рис. 3.5. Фотоиндуцированные относительные изменения низкопо-
92
Рис. 3.6. Фотонндуцированные относительные изменения низкополевой линии спектра ЭПР MSL (/) и MESL (2) в зависимости от числа меток, связанных с родопсином
Условия записи как на рис. 3.5
левой линии спектра ЭПР MSL и MESL в зависимости от числа меток, связанных с родопсином, представлены на рис. 3.6. При этом изменения первой низкополевой компоненты для сильно иммобилизованных меток (MSL, HgSL) достигали 10-15% (в отсутствие насыщения- 1-2%). В основном фотонндуцированные изменения, полученные в условиях СВЧ-насыщения, были следствием уменьшения времени вращательной корреляции и, следовательно, освещение приводит к “освобождению” участка, где расположены метки.
Как отмечалось выше, различные схемы мечения позволяют избирательно пометить различные сульфгидрильные группы. Так, время корреляции для MSL уменьшалось на 24-30% для Cys-316 и на 21-24% - для Cys-140; при мечении MESL - на 7-8% для Cys-316 и на 12-14% - для Cys-140. Таким образом, можно полагать, что в районе Cys-140 фотонндуцированные изменения - более выраженные. Фотонндуцированные изменения метки HgSL, связанной с С-концевым пептидом, по знаку и величине были аналогичны MESL и MSL в том случае, когда соотношение родопсина и метки составляло 1:1. Однако в том случае, когда оба остатка цистеина (322 и 323) модифицировались меткой, величина эффекта существенно возрастала (от 6 до 17,5%)'.
Влияние протеолиза на спектры ЭПР спинмеченного родопсина. Чтобы понять характер изменений в белке при действии света, оказалось полезно сравнить их с изменениями, индуцируемыми при протеолизе белка, т.е. при последовательном удалении его фрагментов и расщеплении полипептидной цепи. Известно, что
93
Рис. 3.7. Зависимость фактора насыщения (Z+1) (Д) и фотоиндуцированных изменений (Д1/1) (Б) компоненты (m+1) спектра ЭПР MSL-мечеииого родопсина от времени гидролиза папаином
/ - родопсин, меченный по Cys-316; 2 - по Gys-140. Условия протеолиза, как на рис. 3.1
при ограниченном протеолизе многие свойства белка сохраняются, в частности, не изменяются спектр поглощения и фотолиз родопсина. Как оказалось, ограниченный протеолиз влияет как на темновые характеристики спектров ЭПР-меток (рис. 3.7, 3.8,Л), так и на характер фотоиндуцированных изменений в спектрах ЭПР (будем называть в дальнейшем эти изменения фотооткликом (рис. 3.7, 3.8,Б). Удаление С-концевого пептида через 5 мин после начала протеолиза приводит к изменениям в темновых спектрах ЭПР как для меток, связанных cXlys-316, так и для меток, связан-
94
Рис. 3.8. Зависимость времени вращательной корреляции (тс) (Л) и фотоиндуци-рованных изменений (Д1/1) (£) компоненты (ш+1) спектра ЭПР MSL-меченного родопсина от времени гидролиза папаином
/ - меченный по Cys-316; 2 - по Gys-140. Условия протеолиза как на рис. 3.1
ных с Cys-140, хотя в первичной структуре белка Cys-140 значительно удален от Cys-316. Такой результат обнаруживается как для MSL, так и для MESL. Полное удаление С-концевого пептида приводило к практически полному исчезновению фотоотклика MESL. Фотоотклик MSL не изменялся для метки, связанной с Cys-316, и даже возрастал для метки, связанной с Cys-140.
Существенное увеличение фотоотклика в случае MSL наблюдалось не только при удалении С-концевого пептида, но также и при расщеплении молекулы родопсина на два мемб-
95
ран-связанных фрагмента (см. рис. 3.7,Б). В этом случае фотоотклик возрастал в районе обоих остатков (Cys-316 и Cys-140), хотя Cys-140 локализован во фрагменте F24, a Cys-316 - во фрагменте F12.
Взаимодействие родопсина с периферическими белками фоторецепторных мембран
Влияние фосфорилирования родопсина на спектры ЭПР меток. Изменения различных спектральных параметров меток при фосфорилировании родопсина представлены в табл. 3.2. Можно видеть, что хотя фосфорилирование затрагивает непосредственно С-концевой фрагмент, уменьшение подвижности наблюдается для меток, связанных не только с этим фрагментом, но и с другими участками белка.
Этот результат, так же как и данные по влиянию протеолиза на спектры родопсина в темноте и при освещении, свидетельствует о пространственной близости С-концевой области с остатками Cys-140 и Cys-316. Однако, в отличие от протеолиза, фосфорилирование приводит к значительному затормаживанию вращательной подвижности MESL в этих областях.
Фосфорилирование родопсина приводит также к значительному возрастанию фотоотклика, особенно для меток, связанных с С-концевыми парными SH-группами. В этом случае, так же как и при протеолизе, наблюдается корреляция между большей иммобилизацией метки на поверхности родопсина в регенерированном или темновом белке и последующим более сильным "разрыхлением” структуры белка при образовании метародопсина II.
Модификация сульфгидрильных групп арестина ДТНБ и HgSL. При помощи ДТНБ в препаратах арестина можно обнаружить до 3,4 ± 0,2 моль SH-групп на 1 моль белка (рис. 3.9). Таким образом, все три остатка цистеина, имеющиеся в молекуле арестина [Shinochara et al., 1987], доступны модификации, т.е. в этом белке нет дисульфидных связей. Доступность SH-групп существенно зависит от ионной силы среды инкубации. При уменьшении концентрации КС1 от 0,5 до 0,033 М время, необходимое для модификации половины всех доступных титрованию SH-rpynn, возрастает почти в 3 раза: от 60 до 150-180 мин. При низкой ионной силе (0,033 М КС1) даже в присутствии 0,1% ЦТАБ полный титр SH-групп не превышает 2,7 моль SH-групп на 1 моль белка, причем, при добавлении КО эта величина не возрастает. По-видимому, в этом случае происходят необратимая агрегация моле-
96
Рис. 3.9. Кинетика модификации SH-групп арестина ДТНБ в нативных (2-4) и денатурирующих (I) условиях (3 М мочевина, 1% SDS)
Концентрация арестина - 2,4 мкМ, DTNB - 500 мкМ; среда инкубации: 50 мМ трис-НС1, pH 8; концентрация КС1: 0,5 М (/, 2); 0,167 М (.?); 0,033 М (4); температура 20 °C
кул арестина, приводящая к маскированию SH-групп внутри белкового кластера, или образование внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей.
Кинетика титрования SH-групп в нативных условиях в присутствии 0,5 М КО описывается суммой двух экспонент. Найдены следующие значения констант скоростей реакций псевдопервого порядка: к] = (2,7 ± 0,1)  ИТ3 с-' (для 0,7-0,8 моль SH-rpynn на 1 моль белка), к2 = (1,5 ± 0,1)  10~3 с-' (для 2,5-2,7 моль SH-rpynn на 1 моль белка). В денатурирующих условиях (в присутствии 3 М мочевины и 1% SDS), а также в 0,1% растворе ЦТАБ скорость модификации SH-групп существенно возрастает: к] > > 1СМ с-' (для 2,4 молей SH-групп на 1 моль белка), к2 = (7,5 ± ± 1,5) - 10~3 с-1 (для 0,8 молей SH-групп на 1 моль белка).
По отношению к водорастворимым тиоловым реагентам SH-группы арестина менее реакционноспособны по сравнению с SH-группами ос-субъединицы трансдуцина [Но et al., 1984], что может свидетельствовать о более гидрофобном окружении остатков цистеина в молекуле арестина. Если это предположение верно, то скорость модификации SH-групп этого белка гидрофобными тиоловыми реагентами должна быть больше. Действительно, нерастворимая в воде ртутьорганическая спиновая метка при 3-Л-кратном избытке по отношению к арестину и концентрации последнего 2 мкМ через 30 мин инкубации при комнатной температуре модифицирует все свободные SH-группы: они оказываются недоступными для ДТНБ.
При высокой концентрации арестина (50 мкМ) и эквимолярном количестве метки последняя практически полностью связывается с белком уже через 10 мин инкубации при комнатной температуре, о чем свидетельствует отсутствие сигнала свободной метки в спектрах ЭПР спинмеченного арестина (рис. 3.10). При помощи ДТНБ в этих образцах удается обнаружить еще 2,1 моль SH-групп на 1 моль белка. При 1,3-1,5-кратном избытке метки HgSL не происходит дополнительной модификации арестина: да-
4. Г.Р. Каламкаров, М.А. Островский
97
Рис. 3.10. Спектр ЭПР арестина, модифицированного спиновой меткой HgSL по одной SH-rpynne
Концентрация арестина 50 мкМ; среда инкубации: 10 мМ Na-фосфатный буфер, pH 7; 0,5 М KCI, Первая гармоника сигнала ЭПР-поглощения, мощность СВЧ-поля 10 мВт, амплитуда модуляции (Нт) 5 Гс, частота модуляции (<й/2тг) 100 кГц, постоянная времени (t) I с, время сканирования (Т) 16 мин
же при инкубации в течение 2 ч в спектрах ЭПР сохраняется сигнал свободной метки. Недоступность двух SH-групп арестина спиновой метке в концентрированном растворе белка может быть обусловлена его агрегацией. Увеличение светорассеяния концентрированных растворов арестина указывает на это.
Чтобы проверить это предположение, была изучена зависимость спектров ЭПР спинмеченного арестина от вязкости, которую варьировали, добавляя кристаллическую сахарозу. Установлено, что при увеличении вязкости от 1 до 6 сантипуаз параметр 2 А возрастает от 67 до 68,7 Г с. Линеаризация этой зависимости в координатах, используемых при описании броуновского вращения по закону Стокса, дает предельное значение 2А' = 69 Гс, соответствующее отсутствию вращения. Зная предельное значение, можно оценить время корреляции вращения белка [Кузнецов, 1976]. В водном растворе при 20° С оно составляет 63 ± 2 нс. Согласно теоретической оценке, время корреляции вращения
98
для белка с молекулярной массой 46 кДа должно быть равно 19,2 нс. Таким образом, можно заключить, что при концентрации 50 мкМ арестин образует агрегаты, причем, средняя степень агрегации близка к трем.
Влияние модификации сульфгидрильных групп на взаимодействие арестина с родопсином. Молекулу родопсина модифицировали MSL либо HgSL, а SH-группы арестина - HgSL. Фоторецепторные мембраны, содержащие меченный или немеченный фосфорилированный родопсин, инкубировали с нативным или модифицированным арестином 20 мин при 20° С, затем мембраны осаждали центрифугированием и определяли концентрацию не связавшегося арестина. Результаты опытов приведены в табл. 3.3.
Из таблицы видно, что модификация двух остатков родопсина MSL или двух других остатков HgSL практически не влияет на степень связывания арестина с родопсином, а константы диссоциации (Кя) комплексов арестина с родопсином, модифицированным MSL или HgSL, незначительно отличаются от величин Кя, определенных в контрольных экспериментах с немодифициро-ванным родопсином. Таким образом, четыре поверхностных остатка цистеина Cys-140, Cys-316, Cys-322 и Cys-323, по-видимому, не участвуют в формировании центра связывания арестина на фосфорилированном родопсине. Примечательно, что и центр связывания а-субъединицы трансдуцина на родопсине не содержит SH-групп [Hofmann, Reichert, 1985].
Модификация одной SH-группы арестина HgSL также не влияет на его связывание с фосфорилированным родопсином (см. табл. 3.3), а при более глубокой модификации связывание арестина лишь незначительно уменьшается: константа диссоциации возрастает не более чем на 25-30%. По-видимому, остатки цистеина не располагаются в области молекулы арестина, контактирующей с родопсином. Это принципиально отличает арестин от а-субъединицы трансдуцина, модификация одной из SH-rpynn которого нарушает его взаимодействие с родопсином [Но et al., 1984].
Интересно, что в аминокислотной последовательности арестина имеется участок, гомологичный участку а-субъединицы трансдуцина, который, как предполагается, связывается с родопсином [Wistow et al., 1986; Shinochara et al., 1987]. Так, степень гомологии участков 371-391 арестина и 326-350 трансдуцина превышает 50%. Более того, секстапептид 384—389 арестина полностью совпадает с пептидом 343-348 трансдуцина, за исключением остатка Cys-347 трансдуцина, который заменен на А1а-388 в аре-стине. Полученные нами данные не противоречат предположе-
I*
99
Таблица 3.3
Влияние модификации родопсина и арестина спиновыми метками MSL и HgSL на связывание арестина с обесцвеченным фосфорилированным родопсином
Меченый белок	моль метки/ моль белка				 1 Степень связы - । вания арестина	Кл, мкМ	! Число опытов
Контроль	—	70,1 ±2,5	5,3 ± 1,5	4
R-MSL	1,5 ±0,2	70,7 ±2,3	—	2
R-MSL	2,0 ± 0,2	73,1 ±3,0	4,4 ± 1,4	4
R-HgSL	2,0 + 0,2	64,0 ± 1,5	7,0 ± 2,0	4
R-HgSL	4,0 ± 0,2	56,3 + 4,3	—	2
А-HgSL	1,0 ±0.2	59,2 ±2,5	—	2
А-HgSL	2,5 ± 0,2	57,3 ±4,1	7,5 ± 2,7	4
R-MSL	2,0 ± 0,2			
+		75,4 ± 3,6		
А-HgSL	2,5 ± 0,2			2
R-HgSL	2,0 ± 0,2			
		71,0 ±4,0		
А-HgSL	2.5 ± 0.2		-	2
Примечание. R-MSL, R-HgSL - родопсин, меченный MSL и HgSL соответственно. A-HgSL - арестин, меченный HgSL. Условия инкубации: 10 мМ натрий-фосфатный буфер, pH 7.0, 170 мМ КС1, концентрация родопсина - 41 мМ, арестина - 2,8 мМ, степень фосфорилирования родопсина - 85%. Фосфорилированный опсин добавляли к арестину при 20° С. После осаждения мембран количество не связавшегося арестина определяли в супернатанте цветной реакцией с кумасси синим.
нию о том, что именно этот участок арестина может быть центром связывания с родопсином. То обстоятельство, что модификация SH-групп арестина не влияет на его взаимодействие с родопсином, по-видимому, есть результат именно этой аминокислотной замены в структуре арестина, которая может иметь функциональное значение.
Определение Кя комплексов арестина и трансдуцина с фосфорилированными и нефосфорилированными формами родопсина. Чтобы объяснить ингибирующее действие арестина его непосредственным связыванием с фосфорилированным родопсином, следует предположить, что сродство между этими белками достаточно высоко. Нами проведено сравнительное изучение степени связывания арестина с фосфорилированными и нефосфорилированными формами родопсина, метародопсина II и опси-на. Оказалось, что с необесцвеченным родопсином связывается не более 2-5% арестина при концентрациях этих белков соответственно 40 и 2,5 мкМ, т.е. константа диссоциации (Кд) комплекса
100
V
Рис, 3.11. Влияние фосфорилирования родопсина (Р) на связывание арестина и траисдуцина-ГДФ с метародопсином II
Фоторецепторные мембраны, содержащие нативный (1,3) или полностью фосфорилированный (2, 4) родопсин (степень фосфорилирования 90-95%) освещали 1,5 мин при 20 °C в присутствии арестина (1,2) или трансдуцина-ГДФ (3,4). Среда инкубации: 125 мМ КСГ, 10 мМ Na-фосфатный буфер, pH 7; 1 мМ MgCl2; 0,1 мМ EDTA; концентрация арестина 1,6 мМ, трансдуцина - 0,5 мкМ, ГДФ - 50 мкМ; v - степень связывания. [Р] - концентрация родопсина
Рис. 3.12. Связывание арестина с опсином
/ - полностью обесцвеченный родопсин; 2 - обесцвеченный фосфорилированный родопсин (степень фосфорилирования 75-80%); 3 и 4 - фосфорилированный опсин после 5 и 90 мин протеолиза папаином. Фоторецепторные мембраны освещали 30 мин при 30 °C и инкубировали с арестином (2 мкМ) 20 мин при 20 °C в 10 мМ Na-фосфатном буфере (pH 7), содержащем 167 мМ КО, 1 мМ MgCl2 и 0,1 мМ EDTA. [О] - концентрация опсина
составляет 0,7-2 мМ. Фосфорилирование родопсина практически не влияет на сродство к нему арестина: степень связывания арестина с фосфорилированным и регенерированным родопсином не превышает 4-6%.
Образующийся при освещении фоторецепторных мембран метародопсин II существенно лучше связывает арестин (рис. 3.11). Кроме того, эффективность связывания значительно возрастает в результате фосфорилирования родопсина: Кд комплекса уменьшается от 11,7 ± 0,1 до 0,7 ± 0,1 мкМ, т.е. более чем на порядок. При распаде метародопсина II сродство арестина к родопсину снова падает: величины Кд для комплексов с нефосфорилированным и фосфорилированным опсином составляют соответственно 6,3 ± 2,5 и 5,3 ± 1,5 мкМ (рис. 3.12). Кроме того, при связывании с опсином проявляется структурная гетерогенность арестина: если с фосфорилированным опсином связывается до 100% молекул арестина, то с нефосфорилированной формой - не более 30-35%. Такая гетерогенность может быть обусловлена различием физико-химических свойств “популяций” арестина, возможно, наличием агрегированных форм белка. О гетерогенности молекул арестина по заряду свидетельствует картина его изоэлектрофокусирования (рис. 3.13): как отмечалось и ранее [Wilden et al., 1986], обнаруживаются три основные полосы (pH 5,5, 5,65 и 5,7) и 4 минорные полосы (pH 5,43, 5,5, 6,0 и 6,1). Аналогичным образом были определены величины Кд комплексов трансдуцина-ГДФ с метародопсином II в фосфорилированном и нефосфорилированном состояниях (см. рис. 3.11). Для комплекса с нефосфорилированным метародопсином II Кд составила 0,7 ± 0,2 мкМ, что близко к значению, полученному в работе [Bennett, Dupont, 1985] путем измерения светорассеяния. При фосфорилировании метародопсина II его сродство к трансдуцину-ГДФ падает: Кд = 11,2 ± 0,2 мкМ. Таким образом, при фосфорилировании метародопсина II образуется новый высокоаффинный центр связывания арестина, и одновременно уменьшается сродство рецептора к трансдуцину-ГДФ.
Исследование электростатических взаимодействий при связывании арестина с родопсином. На рис. 3.14, а приведены зависимости степени связывания арестина с фосфорилированным и нефосфорилированным опсином от ионной силы среды инкубации. Видно, что при увеличении концентрации КС1 от 30 до 500 мМ степень связывания падает, и в итоге обе формы опсина становятся практически неразличимыми по своему сродству к арестину. Это означает, что взаимодействие между белками носит в значительной степени электростатический характер, т.е. при увеличении концентрации электролита связывание арестина
102
Рис. 3.13. Изоэлектрическое фокусирование арестина
Рис. 3.14. Влияние ионной силы (а) и pH среды инкубации (б) на связывание арестина с опсином
/ - нефосфорилированный опсин; 2 - фосфорилированный опсин (степень фосфорилирования 75-80%). Среда инкубации: а - 10 мМ Na-фосфатный буфер, pH 7; 1 мМ MgCI2; 0,1 мМ EDTA; б-30мМ КО, 100 мМ MES (pH 5-6) или HEPES (pH 6-8). Инкубация 20 мин при температуре 20 °C, концентрация арестина - 2 мкМ, опсина - 35 мкМ
уменьшается за счет экранирования зарядов на молекулах белков. В то же время степень связывания арестина с нефосфорили-рованным опсином слабо зависит от ионной силы среды инкубации (см. рис. 3.14, а, кривая /), что указывает на отсутствие заряженных групп в местах взаимодействия этих белков.
Вывод об электростатической природе взаимодействия арестина с фосфорилированным опсином следует также из рН-зави-
103
симостей степени связывания (см. рис. 3.14, б). При уменьшении pH от 8 до 5 Кд комплекса арестина с фосфорилированным опси-ном уменьшается примерно в 30 раз, причем, наиболее резкие изменения наблюдаются при pH 5,6 и 7,6. Перегибы в этих точках, по-видимому, соответствуют изменению заряда именно молекул арестина, поскольку они наблюдаются как для фосфорилированного, так и для нефосфорилированного опсина. Кроме того, pl основных полос при изоэлектрофокусировании арестина соответствует диапазону 5,6-5,7 (см. рис. 3.13), а рК групп родопсина, обнаруживаемых при титровании фоторецепторных мембран, как известно, равен 6,7 [Uhl, Abrahamson, 1981].
Характер взаимодействия арестина с фосфорилированным и нефосфорилированным опсином. Характер связывания арестина с родопсином был изучен также методом ЭПР при помощи ртутьорганической спиновой метки, ковалентно связанной с одной из наиболее реакционноспособных SH-групп арестина. Введение метки не изменяет степени связывания арестина с родопсином. Спектр ЭПР спинмеченного арестина (рис. 3.15) состоит из двух сигналов, один из которых соответствует иммобилизованному относительно белка состоянию метки (S), а другой (W) -ее достаточно свободному вращению (время корреляции в модели изотропного вращения примерно соответствует 0,3 нс).
Оказалось, что связанный с опсином арестин сохраняет вращательную подвижность, причем она зависит от фосфорилирования: для комплекса с нефосфорилированным и фосфорилированным опсином параметр 2 Azz равен соответственно 64,8 ± 0,2 и 66,8 ± 0,2 Гс. Большее значение 2AZZ для комплекса с фосфорилированным опсином нельзя объяснить большей полярностью окружения метки, поскольку спектр ЭПР этого комплекса характеризуется также и большим значением фактора СВЧ-насыщения Z+l, мало чувствительного к абсолютным значениям тензора СТВ [Лившиц, Кузнецов, 1980]: 2,14 по сравнению с величиной 1,49 для комплекса арестина с нефосфорилированным опсином при мощности поля СВЧ 100 мВт. В обоих случаях различаются и отношения W/S в спектрах ЭПР комплексов: 1,80 и 0,94 соответственно для комплексов с нефосфорилированным и фосфорилированным родопсином. Это свидетельствует о конформационных изменениях в арестине при его связывании с опсином, особенно с его фосфорилированной формой.
Количественную оценку вращательной подвижности арестина, связанного с опсином, можно провести приближенно в рамках модели изотропного вращения [Кузнецов, 1976], используя в качестве предельного (в отсутствие вращения) значение
104
Рис. 3.15. Спектры ЭПР спиимеченного арестина, ассоциированного с родопсином в фоторецепторной мембране
/ - нефосфорилированный опсин; 2 - фосфорилированный опсин (степень фосфорилирования 75-80%). Концентрация опсина - 250 мкМ, арестина - 10 мкМ; состав среды инкубации см. в подписи к рис. 3.12. Первая гармоника сигнала ЭПР-поглощения, мощность СВЧ-поля 10 мВт, амплитуда модуляции (Н1П1) 5 Гс, частота модуляции (со/2л) 100 кГц, постоянная времени (t) 1 с, время сканирования (Т) 16 мин, усиление 6,3 х |05 (/), 104 (2)
2 Azz = 69 Гс, полученное для арестина в агрегированном состоянии при его высокой концентрации в растворе. Время корреляции вращения арестина в комплексе с нефосфорилированным опсином оказалось равным 27 ± 2 нм, а с фосфорилированным опсином - 60 ± 2 нс (расчетное значение для свободного белка с молекулярной массой 48 кДа в водном растворе - 19 нс). Таким образом, место связывания фосфорилированного опсина с арестином отличается от центра нефосфорилированного опсина и большей степенью иммобилизации арестина на белке-рецепторе.
Влияние протеолиза фосфорилированного родопсина на связывание с ним арестина. Связывание арестина с фосфорилированным опсином исследовали через 5 и 90 мин протеолиза, т.е. когда удалялся С-концевой фрагмент или удалялась петля между V и VI «-спиральными тяжами. При этом величина Кд возраста-
105
ла соответственно до 7,6 ± 2,8 и 10,5 ± 3,3 мкМ по сравнению с исходным значением Кд = 5,3 ±1,5 мкМ. Кроме того, уменьшалось также предельное значение доли арестина, способного связываться с родопсином до величины 35—40%, соответствующей связыванию с нефосфорилированным опсином (см. рис. 3.12).
Таким образом, как отщепление С-концевого участка, несущего фосфорилированные аминокислотные остатки [Pugh, Gobbs, 1986а, b], так и удаление петли между V-VI «-спиральными тяжами, снижают эффективность связывания арестина с опсином. По-видимому, оба эти участка играют существенную роль в формировании специфического центра связывания арестина с фосфорилированным рецептором.
Влияние трансдуцина на спектры ЭПР меток, связанных с родопсином. Добавление трансдуцина к суспензии спинмеченных дисков приводит к изменению подвижности меток, связанных со всеми SH-группами. Однако, в отличие от арестина, характер этих изменений другой.
В частности, подвижность MESL увеличивается как для Cys-140, так и для Cys-316: температура существенно снижается (см. табл. 3.3). Метки HgSL на Cys-322, 323, напротив, затормаживаются, о чем свидетельствуют, в частности, уменьшение полуширины линии (ДН+1) и возрастание фактора насыщения (Z+1). Это свидетельствует, во-первых, о том, что и в темноте имеет место связывание трансдуцина с родопсином. Во-вторых, различия в спектральных изменениях при добавлении трансдуцина и арестина позволяют предположить, что сами места связывания этих белков не идентичны. Хотя нельзя не учитывать также, что белки имеют различную форму, размер, субъединичное строение.
Существенное влияние оказывает добавление трансдуцина и на параметры фотоответа. Для меток, связанных со всеми остатками, наблюдается некоторое уменьшение фотоотклика, однако, на Cys-322, 323 этот эффект наиболее ярко выражен (рис. 3.16). При соотношении родопсин/трасдуцин, близком к эквимолярному, фотоотклик практически полностью исчезает. В этих же условиях изменения фотоотклика для меток MESL, связанных с Cys-140,316, составляют не более 30%. Возможно, это изменение связано с ограничением конформационных перестроек на поверхности родопсина при связывании трансдуцина. Добавление ГТФ приводит к восстановлению фотоответа, однако время нарастания его существенно замедляется.
Роль фосфорилирования родопсина в ингибирующем действии арестина на фосфодиэстеразу цГМФ. Нами показано, что арестин способен с достаточно высокой аффинностью связываться не только с фосфорилированным, но и с нефосфооилиро-
106
Рис. 3.16. Влияние трансдуцина на фотоиндуцированные изменения спектров ЭПР меток HgSL, связанных с Cys-322, 323
Над кривыми указано соотношение родопсин/трансдуцин (Р/Г). Стрелками указаны моменты включения и выключения света
Контроль
(Р/Т = 5/1)
(Р/Т = 2/1)
Рис. 3.17. Влияние арестина на скорость гидролиза цГМФ фосфодиэстеразой в присутствии нефосфорилиро-ваиного (7, 2) и фосфорилированного (3, 4) родопсина, регенерированного путем добавления 11-1/ис-ретиналя
Среда инкубации: 10 мМ HEPES. pH 8, 2 мМ MgCl2, 0,1 мМ ЭДТА; концентрация ГТФ 40 мкМ, цГМФ - 140 мкМ, родопсина -2,5 мкМ, трансдуцина - 0,3 мкМ, фосфодиэстеразы цГМФ - 0,02 мкМ. В опытах 2 и 4 в среду инкубации добавлен арестин до концентрации 2,5 мкМ. Вспышка длительностью 10 мкс обесцвечивает 0,002% родопсина. Степень фосфорилирования родопсина - 80%
Включение Выключение
AVI = 6%
I_________
15 с
ванным метародопсином II. Возникает вопрос, приводит ли связывание арестина с нефосфорилированным метародопсином II к ингибированию фосфодиэстеразы цГМФ.
Для ответа на этот вопрос определяли начальную скорость гидролиза цГМФ фосфодиэстеразой наружных сегментов палочек в условиях, когда V < VMaKC (концентрация цГМФ = 140 мкМ). На рис. 3.17 видно, что добавление арестина к нефосфорилиро-ванному родопсину в отсутствие АТФ не влияет на активность фосфодиэстеразы, а в присутствии предварительно фосфорилированного родопсина начальная скорость гидролиза цГМФ падает почти в 2 раза. Отсюда можно сделать вывод, что для проявления ингибирующего действия арестина на фосфодиэстеразу цГМФ необходимо фосфорилирование родопсина. Тот арестин, который связывается с другим центром на нефосфорилирован-ном метародопсине II, не проявляет ингибирующей активности.
Поскольку модификация остатков Cys-322 и Cys-323 существенно влияет на кинетику фотоотклика, можно предположить, что эти SH-группы существенны для связывания трансдуцина. Интересно оценить, в какой степени модификация этих цистеинов влияет на светоиндуцированную фосфодиэстеразную активность НСП (как известно, активация фосфодиэстеразы в НСП происходит при участии трансдуцина).
На рис. 3.18 представлено влияние модификаций SH-rpynn родопсина на фосфодиэстеразную активность. Преимущественная модификация Cys-316 не влияет на скорость гидролиза цГМФ. Модификация же второго остатка родопсина Cys-140 приводит к снижению фосфодиэстеразной активности (рис. 3.18, 3): начальная скорость гидролиза цГМФ уменьшается от 120 до 50 нмолей цГМФ/c. Наибольший эффект был получен при исчерпывающей модификации остатков Cys-322 и Cys-323 (рис. 3.19). Это приводило к снижению начальной скорости гидролиза цГМФ в 3,3 раза. Таким образом, модификация метками Cys-140, а особенно С-концевых цистеиновых остатков, влияет на взаимодействие метародопсина II с трансдуцином, что проявляется в снижении фосфодиэстеразной активности.
В следующей серии экспериментов аналогичный подход был использован для выяснения влияния модификации цистеиновых остатков родопсина на степень ингибирования фосфодиэстеразы арестином (см. рис. 3.18,5, 6). Как известно, добавление арестина и АТФ в среду инкубации, содержащую опсинкиназу, приводит к значительному снижению активности фосфодиэстеразы [Wilden etai., 1986; Miller, Litman, 1986; Bennett, Sitaramayya, 1988]. Это наблюдается и в наших экспериментах. Однако, в отличие от предыдущих экспериментов, модификация остатков Cys-140 и Cys-
108
мкмоль цГМФ
Рис. 3.18. Влияние модификации родопсина MSL и НЭ М на скорость гидролиза цГМФ фосфо диэстеразой и наружного сегмента палочек
Кривая / - контроль; 2 и 5 — родопсин, модифицированный преимущественно по Cys-316; кривые 5 и 6 — родопсин, модифицированный преимущественно по Cys-140; кривая 4 - родопсин, модифицированный по обоим остаткам (Cys-316 и Cys-140). Среда инкубации: 10 мМ HEPES. pH 8; 2 мМ MgCl2; 0,1 мМ EDTA; концентрация ГТФ - 60 мкМ, цГМФ -420 мкМ, родопсина - 4 мкМ, трансдуцина - 0,3 мкМ, фосфодиэстеразы - 0,02 мкМ. Объем среды инкубации - 1,5 мл. В опытах 5 и 6 в среду добавлен арестин - 4 мкМ, АТФ -30 мкМ. Вспышка длительностью 10 мкс (указано стрелкой) обесцвечивает 0.005% родопсина. Температура - 30 °C
Рис. 3.19. Влияние модификации родопсина HgSL на скорость гидролиза цГМФ фосфодиэстеразой
1 - контроль; 2 - родопсин, модифицированный HgSL по Cys-322; 3 - родопсин, модифицированный преимущественно HgSL по обоим остаткам (Cys-322 и Cys-323). Состав среды, как на рис. 3.18
316 не влияла на ингибирование фосфодиэстеразной активности арестином (сравнить кривые 2 и 5, 3 и 6 на рис. 3.18). Добавление арестина и АТФ приводило к снижению начальной скорости гидролиза цГМФ в 2,5-4 раза как для нативного, так и для модифицированного по различным схемам родопсина. Эти результаты
109
согласуются с описанными выше данными о том, что сульфгидрильные группы родопсина не расположены в месте связывания арестина.
Итак, каковы основные выводы из описанных выше исследований? Фотоиндуцированные изменения в спектрах ЭПР спинме-ченного родопсина были показаны ранее только в растворах детергента [Fujimori, 1975; Pontus, Delmell, 1975; Fung, Hubbel, 1978]. В фоторецепторных мембранах такие изменения не были обнаружены ни с использованием обычной ЭПР-спектроскопии, ни с использованием переноса насыщения [Baroin et al., 1977; Baroin et al., 1979]. В данной работе нам удалось наблюдать такие изменения. Для того чтобы описать характер фотоиндуцированных изменений в молекуле родопсина, полезно сравнить изменения в спектрах ЭПР, индуцированные освещением и протеолитическим гидролизом белка. Освещение приводит к увеличению вращательной подвижности метки на Cys-140 и Cys-316, причем, максимальный эффект достигается на Cys-140. С другой стороны, подвижность тех же меток существенно изменяется и в ходе протеолиза. Отщепление С-концевого пептида вызывает такие же изменения как на Cys-140, так и на Cys-316. Таким образом, можно полагать, что С-концевой пептид расположен непосредственно у поверхности белковой глобулы. Это предположение подтверждается также тем, что подвижность меток, связанных с обоими цистеинами, возрастает при удалении С-концевого фрагмента. Таким образом, можно полагать, что в нативном родопсине их подвижность ограничена С-концевым пептидом.
То, что характер изменений одинаков при освещении и удалении С-концевого фрагмента, позволяет предположить, что при фотолизе происходит “отодвигание” С-концевого фрагмента от поверхности белковой глобулы.
Фосфорилирование родопсина приводит к противоположному эффекту - подвижность метки уменьшается, что происходит, по-видимому, вследствие того, что С-пептид оказывается ближе к петлям, содержащим Cys-140 в фосфорилированном родопсине. Хотя нельзя исключить и прямого взаимодействия фосфорилированных остатков со спиновыми метками.
Интересно отметить, что расщепление родопсина на два пептида не приводит к исчезновению фотоэффекта, он даже несколько возрастает. Особенно это касается MSL, связанной с Cys-140. который расположен на фрагменте F24, хотя хромофор расположен во фрагменте FI2. Таким образом, как расщепление белка на два фрагмента, так и удаление гидрофильных петель не нарушают вызываемых светом изменений конформации белка и взаимодействия между тяжами.
110
Арестин обладает достаточно высоким сродством только к обесцвеченным формам родопсина: Кд комплексов арестина с темновым и обесцвеченным рецептором различаются на 2-3 порядка, причем, сродство арестина к метародопсину П выше, чем к продуктам его превращения в ходе фотолиза родопсина.
Хотя арестин способен связываться как с фосфорилированными, так и нефосфорилированными формами обесцвеченного родопсина, характеристики центров связывания в обоих случаях существенно различны.
Во-первых, как для метародопсина II, так и для опсина величина Кд комплексов с арестином у фосфорилированных форм рецептора меньше, что свидетельствует о большей аффинности центров связывания.
Во-вторых, комплексы арестина с нефосфорилированным и фосфорилированным опсином различаются по структурно-динамическим параметрам связанного арестина. Так, подвижность спинмеченного арестина в комплексе с фосфорилированным опсином примерно в 2 раза ниже, чем с нефосфорилированным. Это свидетельствует о большей иммобилизации арестина в центре фосфорилированного рецептора. Кроме того, различия в соотношениях W/S-сигналов ЭПР-метки можно интерпретировать как различия в конформационных состояниях арестина в этих комплексах.
В-третьих, связывание арестина с фосфорилированным опсином является в основном электростатическим, так как существенно уменьшается при высокой ионной силе среды инкубации. В то же время на взаимодействие арестина с нефосфорилированным опсином ионная сила практически не влияет. Можно предположить, что отрицательно заряженные при pH 7 группы ортофосфата, связанные с остатками серина и треонина родопсина [Pugh, Cobbs, 1986а, b], принимают участие в формировании центра связывания арестина. Подтверждает это факт, что уже при 5-минутном протеолизе фосфорилированного родопсина, когда образуется преимущественно фрагмент без С-концевого участка, несущего фосфорилированные остатки, степень связывания арестина изменяется до значений, соответствующих взаимодействию с нефосфорилированным рецептором. При более глубоком протеолизе (через 90 мин), т.е. при выщеплении цитоплазматической петли между V и VI а-спиральными тяжами родопсина, когда преимущественно накапливаются два ковалентно не связанных фрагмента, происходит нарушение связывания арестина. Возможно, этот цитоплазматический участок также формирует центр связывания арестина. Ранее было показано, что именно этот участок существен и для связывания трансдуцина [Pugh, Cobbs, 1986а, Ь].
111
Наконец, наиболее существенно, что связывание арестина с нефосфорилированным метародопсином II, в отличие от связывания с его фосфорилированной формой, не приводит к ингибированию активности фосфодиэстеразы цГМФ, т.е., по-видимому, не препятствует связыванию и активации трасдуцина на рецепторе.
Ранее было показано, что фосфорилирование приводит к инактивации метародопсина II: в присутствии опсинкиназы и АТФ наблюдается быстрый спад ^‘сигнала диссоциации” [Bennett, Sitaramayya, 1988]. Этот эффект может быть обусловлен двумя причинами: либо уменьшением сродства метародопсина II к трансдуцину-ГДФ, либо уменьшением скорости обмена ГДФ на ГТФ на трансдуцине. Наши данные указывают на то, что при фосфорилировании метародопсина II Кд возрастает почти на порядок - до 11,2 ± 0,2 мкМ. Таким образом, фосфорилирование рецептора приводит к нарушению его взаимодействия с трансдуцином.
При фосфорилировании метародопсина II образуется дополнительный высокоаффинный (Кд = 0,7 ± 0,1 мкМ) центр связывания арестина - центр, обеспечивающий сильную иммобилизацию арестина. В формировании этого центра принимают участие фосфорилированные цитоплазматические области родопсина, отщепляемые при протеолизе папаином. Учитывая, что концентрация арестина в наружном сегменте палочки довольно велика и составляет примерно 15-100 молекул арестина на 100 молекул родопсина [Broekhuyse et al., 1985], т.е. примерно в 2-10 раз превышает содержание трансдуцина [Pugh, Cobbs, 1986а, b], можно считать, что фосфорилирование метародопсина II создает эффективные условия для конкурентного вытеснения арестином трансдуцина из комплекса с рецептором. Можно предположить, что этот механизм является основным в ингибирующем действии арестина на фосфодиэстеразу цГМФ.
Эффект влияния трансдуцина и арестина на спектры ЭПР позволяет рассмотреть характер взаимодействия родопсина с этими белками, а избирательная модификация сульфгидрильных групп - также локализовать их центры связывания.
Попытки оценить влияние модификации SH-групп родопсина на его взаимодействие с трансдуцином предпринимались и ранее. Так, в работе [Reichert, Hofmann, 1984] было показано, что модификация родопсина NEM не влияла на связывание родопсина с трансдуцином, наблюдаемое по сигналу “связывания” в светорассеянии. Можно предполагать, что в достаточно мягких условиях, используемых в работе [Reichert, Hofmann, 1984], модификация Cys-140 была неполной. Кроме того, хотя измерение активности фосфодиэстеразы и не является прямым исследованием связыва
112
ния трансдуцина, в действительности оно чувствительнее для определения влияния модификации на образование комплекса ро-допсин-трансдуцин.
С другой стороны, в работе [Колосов, Воейков, 1986] показано, что модификация NEM комплекса родопсин-трансдуцин, затрагивающая SH-группы родопсина, влияет на стабильность комплекса.
Модификация Cys-322 и Cys-323 ранее не проводилась, однако можно сравнить полученные нами данные с результатами протеолитического отщепления С-концевого участка, содержащего эти остатки, что и будет сделано в дальнейшем.
Модификация Cys-316 в наших экспериментах не влияла на активность фосфодиэстеразы и константу связывания с арести-ном. Добавление трансдуцина также не влияло на спектры ЭПР MESL, связанной с Cys-316, однако некоторые изменения наблюдались после добавления арестина к фосфорилированному родопсину. Таким образом, можно заключить, что Cys-316 не включен в центр связывания трансдуцина, но расположен в непосредственной близости от центра связывания арестина. Это предположение согласуется и с результатами работы [Гуревич и др., 1990], в которой замена Cys-316 на серин в рекомбинантном родопсине не влияла на активацию фосфодиэстеразы.
Модификация Cys-140 приводит к значительному ингибированию активности фосфодиэстеразы, хотя и не влияет на спектры ЭПР. Это свидетельствует о том, что центр связывания трансдуцина непосредственно включает этот цистеиновый остаток. Интересно отметить, что действие антител на пептид, содержащий Cys-140, также приводило к ингибированию активности фосфодиэстеразы [Weiss et al., 1988].
Парные С-концевые группы (Cys-322, 323), по-видимому, находятся в непосредственной близости от места посадки трансдуцина: их модификация существенно сказывается на активации фосфодиэстеразы. Однако связывание трансдуцина при спинме-ченьи родопсина, по-видимому, не нарушается, поскольку метки все же чувствуют присутствие трансдуцина (как в темноте, так и при освещении). По-видимому, при модификации метками парных SH-групп может происходить изменение в диссоциации ос-субъединицы трансдуцина от родопсина. Существенное замедление кинетики фотоотклика в присутствии трансдуцина-ГТФ по сравнению с контрольными образцами без трансдуцина может быть проявлением этого факта.
Кроме того, можно предположить также, что при модификации парных SH-групп может измениться конформация всего С-концевого фрагмента, поскольку, как было показано в работе
113
[Ovchinnikov et al., 1988], эти группы в родопсине быка пальмити-рованы и заякоривают тем самым С-концевой участок на мембране. При модификации этих групп алкилирующими ртутьорга-ническими агентами С-конец теряет фиксацию на мембране, и центр связывания трансдуцина может существенно изменить свою конформацию.
Интересно отметить также, что относительное уменьшение величины фотоответа нелинейно зависит от соотношения транс-дуцин/родопсин (при т/р = 0,2 уменьшение интенсивности составляло 50%, а при т/р = 0,5 - примерно 80%). То же касается и замедления кинетики фотоответа. Этот факт предполагает кооперативность во взаимодействии трансдуцина с родопсином, т.е. одна молекула родопсина может взаимодействовать с 2-3 молекулами родопсина. Насыщение сигнала связывания трансдуцина в работе [Borochov-Neori, Montal, 1989] наблюдалось при соотношении т/р примерно 0,25-0,30, что хорошо соотносится с нашими данными.
Для более точного определения мест связывания трансдуцина и арестина интересно сравнить полученные нами данные с эффектами протеолиза [Kuhn, Hargrave, 1981; Sitaramayya. Liebman, 1983; Miller, Dratz, 1984], а также с действием антител [Weiss et al., 1988] на взаимодействие родопсина с трансдуцином.
Отщепление от 12 (348-330) [Kuhn, Hargrave, 1981] до 19 (348-339) [Miller, Dratz, 1984] аминокислот не приводит к ингибированию активности фосфодиэстеразы, в то время, как синтетический пептид, включающий остатки 317—339, конкурирует с трансдуцином [Takemoto et al., 1985; Takemoto et al., 1986]. Результаты, полученные с рекомбинантным родопсином с замененными Asp-330, Asp-ЗЗЗ [Гуревич и др., 1990] и Lys-248 [Franke et al., 1988], показывают, что эти замены сильно снижают функциональную активность родопсина.
Суммируя наши данные с приведенным выше, можно заключить, что центр связывания трансдуцина включает район 317-339, особенно петлю между III и IV тяжами, а также включает Cys-140 и Lys-248 в петле между V и VI тяжами. Заякоривание С-концевого пептида также имеет, по-видимому, важное значение для ГДФ-ГТФ-обмена на трансдуцине.
Хотя удаление пептида 330-348 не влияет на активность фосфодиэстеразы, фосфорилирование этого пептида существенно влияет на константу связывания трансдуцина (см. выше), связывание ГТФ с трансдуцином [Shichi et al., 1984] и активность фосфодиэстеразы [Miller, Dratz, 1984]. Таким образом, хотя этот участок прямо и не входит в центр связывания, однако появление отрицательных зарядов при фосфорилировании серинов и треони
114
нов, локализованных в этой области, оказывает существенное влияние на взаимодействие с трансдуцином.
Модификация малеимидными и ртутьорганическими метками любой из поверхностных SH-групп родопсина, как показано нами, не влияет на связывание его с арестином. К тому же блокирование Cys-140 и Cys-316 не снимает активности арестина как ингибитора фосфодиэстеразы. Можно поэтому заключить, что при связывании арестина с родопсином участки вблизи Cys-140, Cys-316, Cys-322 и Cys-323 не затрагиваются. В то же время фосфорилирование С-конца родопсина существенно увеличивает связывание арестина, а отщепление фосфорилированного С-конца уменьшает его связывание и снимает ингибирующее действие арестина на фосфодиэстеразу. Это указывает на то, что, в отличие от трансдуцина, значительная область С-концевой последовательности родопсина формирует место связывания арестина.
Таким образом, можно полагать, что оба белка связываются с С-концевой областью, однако связывание происходит в разных ее участках. Приведенные нами данные по химической модификации SH-групп родопсина в совокупности с ранее известными данными позволяют предположить, что ингибирующее действие арестина не связано с его конкуренцией с трансдуцином за общие места связывания на родопсине, а осуществляется другим путем.
Гпава 4
НУКЛЕОТИДРЕГУЛИРУЕМЫЕ КАНАЛЫ СЕНСОРНЫХ КЛЕТОК
Основные свойства нуклеотидрегулируемых каналов
Изучению свойств ЦН-каналов посвящено множество публикаций. Систематически современные представления о свойствах этих каналов изложены в обзоре [Каламкаров, Лунгина, 2001]. Можно без преувеличения сказать, что этот тип каналов является одним из наиболее изученных. Структурно и филогенетически ЦН-каналы могут быть отнесены к большой группе потенциалзависимых каналов, и многие их свойства могут оказаться сходными. Целью настоящего раздела является изложение накопившихся сегодня знаний о структуре и функциях ЦН-каналов.
Как уже было сказано выше, впервые прямая активация ионных каналов циклическими нуклеотидами была показана в плазматической мембране наружных сегментов фоторецепторных клеток сетчатки, где эти каналы участвуют в преобразовании света в электрический потенциал [Fesenko et al., 1985; Yau, Baylor, 1989]. С тех пор ЦН-каналы были найдены в разных видах клеток: обонятельных [Nakamura, Gold, 1987; Kaupp, 1991; Firesteine, Zufall, 1994], ганглиозных [Ahmad et al., 1994] и биполярных клетках сетчатки [Nawy, Jahr, 1990], слуховых волосковых клетках [Kolesnikov et aL, 1991], вкусовых рецепторах [Misaka et al., 1998], в печени [Ahmad et aL, 1992], в шишковидной железе [Schaad et al., 1995; Kaupp, 1995], сердце [Ruiz et al., 1997], центральной нервной системе [El-Husseini et al., 1995] и др. [Barnstable, 1993; Yau, 1994; Biel et aL, 1994].
ЦН-канал является гетеротетрамерным мембранным белком, состоящим из четырех субъединиц, по меньшей мере, двух типов, структурно гомологичных субъединицам потенциал-зави-симых каналов. Он активируется в результате прямого связывания с молекулами циклических нуклеотидов. Было найдено, что большинство ЦН-каналов являются катионнеселективными, и их активность слабо зависит от величины мембранного потенциала. Они блокируются двухвалентными катионами, причем некоторые из них проникают сквозь сам канал.
Большинство исследований, посвященных работе ЦН-каналов, выполнены на палочках, колбочках и обонятельных нейро
не
нах. Структура и принципы работы ЦН-каналов в других типах клеток менее изучены, поэтому мы рассмотрим в основном только эти три типа клеток.
Установлено, что в наружном сегменте фоторецепторов ЦН-проводимость является единственным типом проводимости. В темноте ЦН-каналы фоторецепторных клеток активированы, и через них течет так называемый темновой ток. При освещении, в результате понижения концентрации цГМФ, ЦН-каналы закрываются, вызывая гиперполяризацию клеточной мембраны и понижение внутриклеточной концентрации Са2+. В обонятельных нейронах, напротив, ЦН-каналы закрыты в покое и активируются в результате стимуляции ароматическими молекулами, вызывая увеличение внутриклеточной концентрации Са2+, а электрическим сигналом в обонятельном нейроне является деполяризация клеточной мембраны.
Функциональные свойства ЦН-каналов. Все ЦН-каналы отличаются относительно высоким сродством к циклическим нуклеотидам, избирательной проводимостью положительных ионов, низкой единичной проводимостью в присутствии двухвалентных катионов. Однако в разных типах клеток эти свойства ЦН-каналов могут существенно различаться своей ионной селективностью, избирательным сродством и чувствительностью к циклическим нуклеотидам, характером взаимодействия с ионами Са2+. ЦН-каналы бывают катионнеселективными, как в фоторецепторных клетках [Menini, 1990; Torre et al., 1995]. или селективными к К+, как в мышцах дрозофилы [Delgado et al., 1991] или в обонятельных нейронах лобстера [Hatt, Ache, 1994]. Некоторые каналы, например, ЦН-каналы в мышцах дрозофилы [Delgado et al., 1991] или ЦН-каналы волосковых клеток [Kolesnikov et al., 1991], более специфичны к цАМФ, чем к цГМФ. Величина чувствительности к циклическим нуклеотидам ЦН-каналов фоторецепторных клеток на порядок меньше, чем у каналов в обонятельных сенсорных нейронах [Fesenko et al., 1985; Haynes, Yau, 1985; Haynes et al., 1986; Nakamura, Gold, 1987; Altenhofen et aL, 1991].
Важнейшим функциональным свойством ЦН-каналов является осуществление и регуляция диффузии ионов Na+, Са2+, К+ сквозь липидный мембранный барьер. В наружном сегменте фоторецепторных клеток эти каналы осуществляют единственный тип проводимости и, следовательно, определяют величину мембранного потенциала фоторецептора. В результате активации ЦН-канала в ответ на увеличение концентрации цГМФ (в случае фоторецепторных клеток) или цАМФ (в случае обонятельных нейронов) происходят увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ и деполяризация клеточной мембраны.
117
Важной характеристикой всех ЦН-каналов является их крайне низкая единичная проводимость в присутствии двухвалентных катионов [Zufall, Firestein, 1993; Zuffal et al., 1994]. Так, если проводимость ЦН-каналов палочек в бескальциевой среде составляет 20-45 пС [Zufall et al., 1991; Zimmerman et aL, 1986, 1992], то в присутствии двухвалентных катионов она уменьшается до 0,1-0,01 пС [Bodoia, Detwiler, 1985; Matthews, 1986]. Столь низкая проводимость имеет принципиальное значение для функционирования сенсорной клетки. Фоторецептор и обонятельная клетка могут работать в условиях так называемой предельной чувствительности. Важно понимать, что при очень низких значениях порога чувствительности критичным становится не высокий коэффициент усиления, а возможность эффективного выделения сигнала из шума. Ясно, что соотношение сигнал/шум для 1000 флуктуирующих каналов небольшой проводимости выше, чем для одного флуктуирующего канала с большой проводимостью.
Второй важной функциональной особенностью ЦН-каналов является их способность регулировать внутриклеточную концентрацию ионов кальция. Фракция ионов Са2+ составляет в среднем от 12 до 21% [Nakatani, Yau, 1988b; Perry, McNaughton, 1991]. Поскольку внутриклеточная концентрация кальция относительно невелика, его регуляция может осуществляться ЦН-каналами даже в том случае, когда их плотность, как в фоторецепторе или цилии обонятельного нейрона, не так высока. Более того, есть основания полагать, что в этом случае регуляция внутриклеточного кальция становится основной функцией ЦН-каналов.
В фоторецепторных клетках концентрация внутриклеточного Са2+ определяется балансом постоянного входящего темнового тока Са2+ через открытый ЦН-канал и выходом ионов Са2+ через №/Са2+К+-обменник и равна -500 нМ. Когда ток ионов Са2+ внутрь клетки блокируется в результате световой инактивации ЦН-каналов, происходит понижение концентрации внутриклеточного Са2+ до -50 нМ [Gray-Keller, Detwiler, 1994], что является началом фазы восстановления темнового потенциала [Pugh, Lamb, 1990; Fain, Matthews, 1990]. Снижение внутриклеточной концентрации кальция приводит к активации гуанилатциклазы и увеличению концентрации цГМФ в клетке. Таким образом, проникновение ионов Са2+ внутрь клетки через ЦН-каналы вместе с регулированием остальных клеточных функций осуществляет обратную связь в механизме сигнальной трансдукции.
Известно, что в сетчатке колбочки в 30-100 раз менее чувствительны к свету, чем палочки. Фотоответ в колбочках протекает быстрее, чем в палочках. Одной из причин, видимо, является разная скорость и величина изменений внутриклеточной концен
118
трации Са2+, так как относительная проницаемость ионов Са2+ различается в ЦН-каналах разных типов фоторецепторов. Так, в колбочках величина РСа/Рва равна 7,6 ± 0,8, а в палочках - 3,1 ± ± 1,0 [Picones, Korenbrot, 1995]. Блокада ионами Са2+ имеет потен-циал-зависимый характер - она максимальна в палочках и колбочках при равновесном потенциале и ослабевает при гипер- или деполяризации. Таким образом, более слабое взаимодействие с Са2+ в колбочках приводит к более быстрому току ионов Са2+. Подобные результаты были получены при изучении свойств го-момерных каналов, образованных а-субъединицами разных типов. Было обнаружено, что часть тока, переносимая ионами Са2+ (Рг), значительно больше в колбочках и обонятельных каналах, чем в палочковых. Так, фракция Са2+ от полного тока при концентрации Са2+ 0,3 мМ составляет 5,8% в колбочках, 3,9% - в обонятельных клетках и 0,25% - в палочках, а величина РСа/Рк равна 8,0, 4,6 и 1,7 соответственно [Frings et aL, 1995].
В противоположность фоторецепторным клеткам ЦН-кана-лы обонятельных рецепторов закрыты в состоянии покоя и открываются в результате стимуляции ароматическими молекулами, что ведет к увеличению внутриклеточной концентрации Са2+ [Restrepo et aL, 1990; Restrepo et aL, 1993]. Повышение концентрации внутриклеточного Ca2+ одновременно способствует и терминирует ответ обонятельных рецепторов. Са2+ также активирует деполяризующий ток ионов СТ [Kleene, 1993], таким образом существенно усиливая ответ [Lowe, Gold, 1993]. Повышение кон-центпации Са2+ стимулирует гидролиз цАМФ Са2+/кальмодулин-активируемой фосфодиэстеразой [Borisy et aL, 1992] и запускает механизм инактивации ЦН-каналов, также включающий кальмодулин [Chen, Yau, 1994].
Преобладающая роль ЦН-каналов как регуляторов интегрального тока проявляется только в двух случаях: в наружных сегментах фоторецепторных и в цилиях обонятельных клеток, т.е. когда эти каналы являются важнейшими элементами механизма сенсорной трансдукции. Во всех других случаях можно считать, что основная функция этих каналов состоит в регуляции концентрации внутриклеточного кальция. Такова роль ЦН-каналов в нейронах сетчатки второго и третьего уровней: в биполярных и ганглиозных клетках [Ahmad et aL, 1994], а также в других, нерецепторных тканях [Sudlow et aL, 1993; Biel et al„ 1994; Distler et al„ 1994].
В последнее время появились данные, свидетельствующие о широком распространении ЦН-каналов в ЦНС. Например, Шилле с соавторами [Shiells, Falk, 1990] обнаружили, что ЦН-ка-налы оп-биполярных клеток сетчатки участвуют в регуляции
119
мембранного ответа на входящий синаптический сигнал; при этом используется трансдукционный каскад, подобный фоторецепторному. Найдены ЦН-каналы в ганглиозных клетках сетчатки крысы [Ahmad et al., 1994]. Kingston et al. [1996] показали, что в нейронах гиппокампа экспрессируются а-субъединицы обонятельного и палочкового ЦН-каналов. С помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция) показана экспрессия ЦН-каналов в разных отделах мозга [El-Husseini et al., 1995]. Интересно отметить, что в ЦНС ЦН-каналы являются новым, третьим по счету, типом каналов, осуществляющим Са2+-проводимость; первые два - это потенциал-зависимые Са2+-каналы и каналы, взаимодействующие с нейромедиаторами, такими как глутамат и ацетилхолин. Похоже, что в ЦНС, подобно сенсорным нейронам, в механизм регуляции работы ЦН-каналов включены: Са2+, каскад реакций, в котором участвуют G-белки, гуанилат- и аденилатци-клазы, газовые месенджеры NO и СО. ЦН-каналы играют важную роль в нейронной пластичности, так как ток ионов Са2+ через каналы, расположенные в пресинаптической области, влияет на процесс высвобождения нейротрансмиттера. В частности, важную роль в пресинаптической области играют цАМФ, цГМФ и NO, так как Са2+, проникающий внутрь через ЦН-каналы, влияет на процесс экзоцитоза, и этот эффект регулируется NO [Rieke, Schwartz, 1994; Savchenko et al., 1997]. Кроме того, ЦН-каналы экспрессированы на ранних стадиях развития нейронов еще до формирования синапса [Leinders-Zufall et al., 1995] и участвуют в процессе узнавания клетки-мишени конусом роста аксона [Bradley et al., 1997].
Изменение внутриклеточной концентрации кальция существенно не только для механизма трансдукции обонятельного и зрительного сигналов, но и для процессов экзоцитоза в колбочках [Reike, Schwartz, 1994], хемотаксиса сперматозоидов [Weyand et al., 1994] и т.д. Однако в большинстве нерецепторных тканей физиологическая роль ЦН-каналов и особенности их работы остаются не вполне ясными.
Молекулярная структура нуклеотидрегулируемых каналов. ЦН-канал формирует гетеротетрамерный комплекс, состоящий из четырех разных, хотя и гомологичных субъединиц, разделяемых обычно на два типа - а и Р, и структурно относится к семейству потенциал-зависимых каналов. Эти два типа субъединиц имеют общие структурные особенности: они состоят из основной структурной части, состоящей из шести трансмембранных сегментов, части, образующей ионную пору, домена, связывающего циклические нуклеотиды, и части, с которой связывается модулятор канала Са2+/кальмодулин (рис. 4.1).
120
Е-363
Рис. 4.1. Схематическая модель структуры субъединицы ЦН-канала
S1-S6 - трансмембранные сегменты; П - область поры. Номерами обозначены важные аминокислоты, обсуждаемые в тексте
а-субъединица. В каждом из трех видов рецепторных клеток: палочках [Kaupp et al., 1989; Bonigk et al., 1993] и колбочках [Bonigk et al., 1993; Weyand et al., 1994] сетчатки, а также в обонятельных сенсорных нейронах [Dhallan et al., 1990; Ludwig et al., 1990; Goulding et al., 1992] формируется уникальная форма ос-субъединицы канала (ЦНКос), называемая (в разных источниках по-разному) ЦНКа1 (пЦНК, ЦНК1) в палочках, ЦНКосЗ (ЦНКЗ, кЦНК) в колбочках и ЦНКос2 (ЦНК2, оЦНК) в обонятельных клетках. Она является основной субъединицей (молекулярная масса ~63 кДа), которая формирует функциональные свойства и ключевые характеристики ЦН-канала, так как из а-субъединиц, в отличие от Р-субъединиц, может быть сформирован функциональный гомомерный канал, свойства которого отличны от нативного.
Во всех типах клеток ос-субъединицы (ЦНКос1, ЦНКос2 и ЦНКосЗ) обладают общими структурными свойствами, которые также присущи субъединицам потенциал-зависимых каналов, и характеризуются наличием шести трансмембранных ос-спиралей (S1-S6) и шпилькоподобной области, формирующей ионопроницаемую пору. По своим функциональным свойствам ЦН-каналы относятся к лиганд-зависимым каналам.
Во всех тканях, где были найдены ЦН-каналы, обнаружены только эти три (ЦНКос1, ЦНКа2 и ЦНКосЗ) типа ос-субъединиц. Так, клон ДНК, кодирующий ЦНКос1, был выделен из клеток пе
121
чени [Ahmad et al., 1992], ганглиозных клеток сетчатки [Ahmad et al., 1994], биполярных клеток [Nawy, Jahr, 1990] и клеток шишковидной железы [Schaad et al., 1995]; ДНК, кодирующая ЦНКаЗ, была выделена из клеток печени [Biel et al., 1994], яичек [Weyand et al., 1994], клеток шишковидной железы [Kaupp, 1995]. В некоторых из этих тканей соответствующие а-субъединицы были идентифицированы путем наращивания коротких последовательностей ДНК из колбочек. Таким образом, эти субъединицы могут представлять собой сплайс-вариант генов, экспрессивных в фоторецепторах позвоночных или обонятельных нейронах. Помимо сплайс-вариантов, функциональное разнообразие ЦН-каналов может быть расширено в результате использования различных субъединиц и с помощью посттрансляционного процессинга полипептида, образующего канал [Bonigk et aL, 1993].
Дополнительные (модуляторные) субъединицы. Дополнительные субъединицы, в отличие от основных а-субъединиц, не могут формировать функциональный канал сами по себе. Однако, будучи коэкспрессированы с а-субъединицами, они образуют гетеро-олигомерный канал, свойства которого характерны для нативного ЦН-канала.
В настоящее время известны следующие дополнительные субъединицы: ЦНК[31а обнаружена в палочках сетчатки [Chen et al., 1993; Korschen et aL, 1995], ЦНКа4 [Liman, Buck, 1994; Bradley et aL, 1994] и ЦНК[31Ь [Sautter et aL, 1998; Bonigk et aL, 1999] найдены в обонятельных рецепторах Эти субъединицы гомологичны а-субъединицам, они модулируют активность канала, сообщая ему специфические свойства, которые собственно и формируют природный ЦН-канал.
В фоторецепторных колбочках дополнительные субъединицы не найдены; в них экспрессирована только одна ЦНКаЗ субъединица.
Хотя принципиальные структурные особенности обоих типов дополнительных субъединиц схожи с особенностями а-субъединиц, включая шесть трансмембранных сегментов, ионопроницаемую пору и область связывания ЦН, они не экспрессируются как функциональные каналы. Однако, будучи коэкспрессирована с а-субъединицей, [3-субъединица фоторецепторной палочки, ЦНК[31а, образует гетеро-олигомерный канал, подобный природному, обладающий специфическими свойствами, такими как чувствительность к Са2+/кальмодуину [Chen et aL, 1994; [Korschen et aL, 1995] или мерцательный характер работы канала (singlechannel flickering) [Finn et aL, 1996; Biel et aL, 1996]. Эти индуцируемые [3-субъединицей свойства, также характерные для нативного ЦН-канала, могут служить доказательством того, что природ
122
ный ЦН канал состоит из а- и (3-субъединиц. Это наблюдение подтверждается при биохимическом выделении ЦН-канала фоторецепторных палочек, который состоит из ЦНКа1 субъединицы (молекулярный вес 63 кДа) [Kaupp et al., 1989] и ЦНК(31а субъединицы (молекулярный вес 240 кДа) [Korshen et al., 1995]. По своей основной последовательности эти субъединицы отличаются друг от друга намного более существенно, чем разные а-субъединицы, что подтверждает их функциональную неэквивалентность.
В ЦН-канал обонятельного нейрона, в отличие от палочкового канала, включены две разные дополнительные субъединицы: ЦНКа4 и ЦНК(31Ь. Они структурно несколько отличаются от (3-субъединицы канала палочки. Так, вторая субъединица обонятельного ЦН-канала - ЦНКа4 имеет намного более короткий N-конец, чем субъединица фоторецепторной палочки ЦНК(31а [Bradley et al., 1994; Liman, Buck, 1994] и филогенетически намного ближе к а-субъединицам, чем ЦНК(31а [Каирр, 1995]. Подобно ЦНК(31а из фоторецепторной палочки, собственно ЦНКа4 не образует функционального канала, но при коэкспрессии с ЦНКаЗ сообщает образовавшемуся гетеро-олигомерному каналу большую чувствительность к сАМФ и мерцательный (спонтанный) характер открывания канала [Bradley et al„ 1994; Liman, Buck, 1994]. Однако чувствительность гетеромера ЦНКаЗ/ ЦНКа4 более чем в два раза ниже чувствительности природного канала. В настоящее время существуют данные, свидетельствующие о том, что ЦН-канал из обонятельных нейронов состоит по меньшей мере из трех различных, хотя и гомологичных субъединиц [Sautter et al., 1998; Bonigk et al., 1999]. Третья субъединица обонятельного ЦН-канала, ЦНК4.3 [Sautter et al., 1998] или ЦНК[31Ь [Bonigk et al., 1999], представляет собой альтернативную сплайс-форму палочковой ЦНК[31а субъединицы. Хорошее соответствие таких свойств природного обонятельного ЦН-канала и канала, образованного в результате коэкспрессии трех разных субъединиц, как чувствительность к цАМФ, кинетика и проводимость одиночного ЦН-канала позволяют предположить, что природный ЦН-канал из обонятельного нейрона состоит именно из этих субъединиц - ПНК(31Ь, ЦНКаЗ и ЦНКа4.
Согласно последним данным [Не et al„ 2000], по своей структуре ЦН-канал фоторецепторных палочек формируется четырьмя субъединицами, причем одинаковые субъединицы расположены по диагонали напротив друг друга: а-[3-а-[3. Возможно, четыре субъединицы, формирующие канал, могут быть ассоциированы и активируются как два независимых канальных димера [Liu et al., 1998]. Для обонятельного ЦН-канала была предложена
123
[Shapiro, Zagota 1998] другая конформация: a-a-P-P. Однако, учитывая последние данные о существовании в обонятельных клетках двух разных р-субъединиц, следует предположить возможность другой конформации обонятельного канала.
Область связывания циклических нуклеотидов. Областью связывания циклических нуклеотидов называется домен, расположенный в С-концевой части каждой из субъединиц, формирующих ЦН-канал.
Области связывания ЦН обонятельных и палочковых ЦН-каналов отличаются высокой степенью подобия (более 80% аминокислот идентичны), хотя они и имеют разную селективность по отношению к циклическим нуклеотидам. Канал палочки наиболее эффективно активируется цГМФ [Fesenko et al., 1985], тогда как на обонятельный канал цАМФ и цГМФ влияют примерно одинаково [Zufal et al., 1994].
Область связывания ЦН формируется последовательностью примерно 130 аминокислот из С-концевой последовательности белка канала [Kaupp et al., 1989]. Эта последовательность в основном гомологична САР-белку Е. coll и аналогичной последовательности аминокислот протеинкиназы [Shabb, Corbin, 1992] и структурно состоит из двух а-спиралей (В и С) и восьми цепей в Р-конформации (Р-roll) (Р1 —Р8), причем молекула ЦН связывается внутри (P-roll), а его пуриновое кольцо взаимодействует с Т-127 С-спирали САР белка [Shapiro, Zagotta, 2000].
Vamum et al. [1995] исследовали молекулярный механизм способности ЦН-каналов различать цАМФ и цГМФ. Они обнаружили, что фоторецепторные и обонятельные ЦН-каналы по-разному активируются только лигандами, отличающимися по структуре их пуринового кольца. Было найдено, что селективность ЦН-канала (цГМФ > цАМФ) палочки из куриной сетчатки существенно изменяется в результате нейтрализации остатка аспарагиновой кислоты (D-604) в домене, связывающем ЦН (цГМФ > цАМФ). D-604 аналогичен позиции треонина Т-127 в САР-белке. Замена в этой позиции (D-604) на неполярный остаток инвертирует селективность канала к агонисту (цАМФ > цГМФ). Этот эффект связан не с модификацией сродства канала с лигандом, а является результатом изменения относительной способности агониста вызывать изменение аллостерической конформации, связанное с активацией канала. Таким образом, этот аминокислотный остаток (D-604) играет ключевую роль в процессе избирательной активации ЦН-канала палочки в результате связывания с молекулой цГМФ.
По всей видимости, специфичность канала к циклическим нуклеотидам (цАМФ и цГМФ) во многом определяется наличием в аС-спирали отрицательно заряженных остатков D-604 и Y-468.
124
Замена аспарагиновой кислоты D-604 на метионин вызывает существенное уменьшение эффективности цГМФ и увеличение эффективности цАМФ [Varnum et al., 1995; Gordon et al., 1996]. Электрическое взаимодействие между карбоксильной группой и пуриновым кольцом цАМФ энергетически невыгодно, что объясняет столь редкую в норме активацию канала цАМФ. Протонирование в этом месте замещает это невыгодное взаимодействие и позволяет цАМФ действовать как почти полному агонисту.
Протонирование второй аминокислоты - гистидина Н-468 -способствует увеличению нуклеотид-неспецифичной селективности ЦН-канала и, похоже, является элементом механизма открывания канала [Gordon et al., 1996]. Этот эффект протонного взаимодействия проявляется для нативных каналов фоторецепторных палочек в меньшей степени, чем для каналов, состоящих из а-субъединиц. В гетеромультимерных каналах, сформированных в результате коэкспрессии субъединиц аир, наблюдалось подобное уменьшение селективности ЦН-канала. Уменьшение влияния pH на нативные каналы может быть объяснено отсутствием протонируемых аминокислот в Р-субъединице в позициях, соответствующих Н-468 и D-604.
Для обонятельных каналов в работе Shapiro, Zagotta [2000] показано, что замена единственного аминокислотного остатка Р-субъединицы, метионина в позиции 475 на глутамат (М475Е) вызывает изменение селективности канала к циклическим нуклеотидам: увеличивает сродство к цГМФ и уменьшает сродство к цАМФ. Метионин М-475 аналогичен аминокислотному остатку D-604 а-субъединицы палочкового канала.
Таким образом, можно считать, что аспарагиновая кислота D-604 из а-субъединицы палочковых каналов и метионин М-475 из Р-субъединицы обонятельных каналов, расположенные в области связывания ЦН, являются определяющими для селективности канала к циклическим нуклеотидам.
Ц-связывающая область. Ц-связывающей областью называется цепочка, состоящая примерно из 90 аминокислот, которая соединяет сайт связывания ЦН с последним трансмембранным участком канала.
Установлено, что Ц-связывающая область играет решающую роль в процессе активации канала, происходящем после связывания с циклическим нуклеотидом. Она влияет на сродство агониста и эффективность, с которой циклические нуклеотиды открывают канал.
Gordon et al. [1996] обнаружили, что скоординированное связывание Ni2+ между двумя гистидиновыми остатками (Н-420) субъединиц канала фоторецепторной палочки, экспрессирован-
125
него в ооцитах Xenopus, находящегося в открытом состоянии, вызывает увеличение сродства к цГМФ и как следствие увеличение цГМФ-зависимого тока этого канала. Связывание Ni2+ с аналогичными гистидиновыми остатками (Н-396) в обонятельных нейронах вызывает обратный эффект — ингибирование. Таким образом, эта особая Ц-связывающая область, возможно, участвует в движении, происходящем при открывании канала.
Как выяснилось, различие в сродстве и чувствительности к циклическим нуклеотидам определяется не только областью связывания ЦН, но и Ц-связывающей областью. Так, в результате замены трех аминокислот в Ц-связывающей области канала колбочки на соответствующие аминокислоты из обонятельного канала (изолейцина I439V, аспарагиновой кислоты D481А и D494S) существенно увеличилась эффективность цАМФ и повысилось сродство к цАМФ и цГМФ [Zong et al., 1998], а кинетика стала подобна кинетике ЦН-канала из обонятельного нейрона, что объясняет повышение эффективности цАМФ.
Необходимо отметить также ключевую роль нескольких цистеиновых остатков, расположенных около или внутри сайта связывания ЦН [Biel et al., 1996]. Существует мнение, что модификация этих остатков влияет на реакцию открывания канала. Это происходит либо в результате воздействия на каждую из субъединиц, либо в результате влияния на взаимодействие между су бъ-единицами [Vamum et al., 1996; Gordon et al., 1997]. Так, модификация цистеина С-460 из Ц-области обонятельного ЦН-канала вызывает активацию канала в отсутствие циклических нуклеотидов [Broillet, Firestein, 1996, 1997].
Модификация SH-реагентами а-субъединицы канала из сетчатки цыпленка приводила к значительному увеличению чувствительности канала и к цГМФ, и к цАМФ, и, следовательно, к увеличению активации канала [Brown et al., 1998]. Этот эффект отсутствовал при замене цистеинового остатка С-481, соответствующего цистеину С-460 из канала обонятельного нейрона, на неактивный (нейтральный) аланиновый остаток. Увеличение сродства к агонисту происходило быстрее при насыщающей концентрации цГМФ, что свидетельствует о большей доступности этой области, когда канал открыт.
Все эти результаты подтверждают, что Ц-связывающая область подвержена существенному сдвигу во время активации канала и играет ключевую роль в осуществлении опосредованной связи между двумя событиями — связыванием лиганда и открыванием поры.
Область поры ЦН-канала. В настоящее время полагают, что петля между S5 и S6 трансмембранными сегментами (П-об-
126
ласть) потенциал-зависимых каналов и гомологичных им ЦН-ка-налов формирует внутреннюю часть канальной поры. Этот участок канала формирует петлю, вытянутую в направлении центральной оси канала [Sun et al., 1996]. Помимо того, что П-область является ион-селективным фильтром, она функционирует как канальный запирающий механизм, структура которого изменяется, когда канал открывается. Область поры контролирует как проводимость одиночного канала, так и собственно диаметр поры канала [Goulding et al., 1993]. Важной задачей является выяснение того, как ион проникает через канал и каков механизм ионной селективности.
Balasubramanian et al. [1997] считают, что единственное место связывания катионов находится внутри канальной поры. Известно, что движение ионов Са2+ является одной из составляющих ионного тока ЦН-каналов. В то же время Са2+ блокирует ток моновалентных катионов через канал [Zagotta, Siegelbaum, 1995]. Предположительно, такое поведение обусловлено высоким сродством Са2+ к кислому аминокислотному остатку - глутамату, расположенному в области канальной поры (Е-363 для ЦН-канала палочки и Е-333 для обонятельных ЦН-каналов сомика) [Root et al., 1993]. Показано также, что остаток глутаминовой кислоты Е-363 (Е-333) играет ключевую роль при блокаде ЦН-канала внеклеточными протонами [Root et al., 1993], так как два глутамата образуют один сайт связывания протона [Morill, MacKinnon, 1999]. Аналогично, данные, полученные Gavazzo et al. [2000], свидетельствуют о том, то глутамат Е-340 из П-области обонятельного канала цыпленка, эквивалентный Е-363 из канала палочки, контролирует проницаемосгь и блокаду внеклеточными ионами Са2+ и Mg2+.
Как уже было сказано выше, ЦН-каналы палочек и колбочек по-разному блокируются ионами Са2+ и отличаются по своей относительной Са2+-проводимости. Исходя из оценки кинетики проводимости ЦН-каналов, Picones, Korenbrot [1995] полагают, что этот эффект обусловлен наличием двух сайтов связывания Са2+. Первый сайт идентичен в палочках и колбочках, второй же отличается — либо его энергия взаимодействия в ЦН-канале палочки выше, либо он расположен так, что менее подвержен влиянию мембранного потенциала. Такую же модель ионной проницаемости с двумя сайтами связывания предлагают Wells, Tanaka [1997|.
Модуляция внутриклеточными протонами а субъединицы обонятельных и палочковых ЦН-каналов цыпленка вызывает увеличение внутриклеточной концентрации протонов и частичную блокаду тока одиночных каналов, как обонятельных, так и
127
палочковых, что является следствием протонирования единственного кислотного сайта с рК1 в пределах 4,5-4,7 [Gavazzo et al., 1997]. Степень активации ЦН-каналов также зависит от внутриклеточного pH. При низкой концентрации циклических нуклеотидов вероятность открытого состояния ЦН-канала значительно увеличивается при понижении pH, причем увеличение это при активации канала цАМФ больше, чем при активации цГМФ. Таким образом, внутриклеточная концентрация протонов влияет и на проницаемость ЦН-каналов, и на степень активации, вызывая уменьшение тока одиночного канала и увеличение вероятности открытого состояния.
Таким образом, аминокислотная последовательность П-об-ласти ЦН-канала формирует катионселективный фильтр, причем аминокислотный остаток глутамат играет огромную роль в механизме блокирования тока двухвалентными ионами и рН-мо-дуляции проводимости канала.
Сайт связывания С а2Ч кальмодулина. Са2+ играет огромную роль в работе ЦН-каналов: помимо того, что ток ионов Са2+ является существенным компонентом тока ЦН-канала, Са2+ участвует в механизме обратной связи в процессе фототрансдукции: Са2+ связывается с модуляторным белком кальмодулином, который, в свою очередь, связываясь с ЦН-каналом, ингибирует канальный ток [Molday, 1996]. Grunwald et al. [1998], изучая механизм влияния Са2+/кальмодулина на работу ЦН-канала, идентифицировали два независимых сайта (СаМ1 и СаМ2), с которыми связывается кальмодулин. Они расположены в N- и С-концевой областях Р-субъединицы палочкового цГМФ-зависимого канала. Однако только делеция СаМ1 в N-терминальной области лишала ЦН-канал чувствительности к действию Са2+/кальмодулина. Таким образом, можно сделать вывод, что ингибиторное действие Са2+/кальмодулина опосредовано в основном доменом из N-koh-цевой области.
N-С-взаимодействие. Работы последних лет свидетельствуют о том, что взаимодействие N- и С-концевой областей весьма существенно для механизма открывания канала.
Vamum, Zagotta [1996] показали, что внутримолекулярное взаимодействие между N-концевой областью и С-концевым ли-ганд-связывающим доменом ЦН-канала обонятельного нейрона крысы влияет на активацию канала; в свою очередь, Са2+/кальмо-дулин модулируют активность канала, оказывая влияние именно на это внутримолекулярное взаимодействие. Gordon et al. [1997], работая с ос-субъединицей палочкового ЦН-канала, также показали наличие взаимодействия между N- и С-концевыми участками молекулы канала. В этом случае взаимодействие происходило
128
между двумя цистеиновыми остатками: образовывалась дисульфидная связь между С-35 (N-конец) и С-481 (С-связывающая область). Необходимо отметить, что С-481 фоторецепторного канала соответствует С-460 молекулы обонятельного ЦН-канала.
Лиганд-зависимая активация ЦН-каналов. Активация ЦН-канала достигается в результате связывания с несколькими лигандами. Оценить функциональный эффект каждого события связывания молекулы циклического нуклеотида для ЦН-канала, как и для других аллостерических белков, довольно сложно, так как лиганды постоянно находятся то в связанном, то в несвязанном состоянии (спонтанный, мерцательный характер работы канала). Оценки показывают, что ЦН-каналы находятся в состоянии частичного связывания со своими лигандами, и потому важно было определить поведение таких каналов. Ruiz, Кагреп [1997], используя метод высокого разрешения регистрации одиночного канала и фотосвязывающийся аналог цГМФ, который обладает свойством ковалентно связывать цГМФ с его сайтом связывания, показали, что единичный ЦН-канал палочки может связывать до четырех лигандов. Величина канального тока зависит от количества связанных молекул циклических нуклеотидов: минимальна - когда связаны два лиганда (~1% от максимального тока), существенно больше - когда связаны три лиганда (~33% от максимального тока), и максимальна - когда связаны четыре лиганда [Ruiz, Кагреп, 1997]. Более того, в каждом лиганд-связан-ном состоянии существуют два или три различных состояния проводимости: амплитудные гистограммы показывают, что канал свободно переключается и существует в трех состояниях проводимости (10, 18, 29 pS) независимо от количества связанных лигандов. Особенно четко это свойство ЦН-канала палочки проявляется в состоянии неполной активации. Так, результаты исследования ЦН-каналов с одним несвязанным лигандом [Кагреп et al., 2000] показывают, что эти каналы разделяются на два равных класса с константами диссоциации 1,2 и 19 мкМ, что демонстрирует функциональную гетерогенность связывающих сайтов природного ЦН-канала из фоторецепторной палочки, обладающих разным сродством к цГМФ. Дальнейшие исследования позволяют авторам предположить, что подобное поведение канала объясняется, по крайней мере частично, различными свойствами а-и [3-субъединиц, каждая из которых, как было прямо показано с помощью биохимических экспериментов, связывает цГМФ.
Модуляция ЦН-каналов. В настоящее время известно несколько факторов, регулирующих работу ЦН-каналов: Са2+/кальмодулин, двухвалентные катионы, фосфатаза, эндогенные Са2+-связывающие протеины.
э. Г.Р. Каламкаров, М.А. Островский
129
В ЦН-каналах фоторецепторных клеток и обонятельных нейронов Са2+/кальмодулин модулирует чувствительность канала к лиганду. В ЦН-каналах обонятельных нейронов Са2+ в комбинации с кальмодулином связывается с последовательностью из примерно 30 аминокислот в N-концевой области ос-субъединиц [Chen, Yau, 1994; Liu et al.. 1994]. По всей видимости, сайт связывания Са2+/кальмодулина в палочковых ЦН-каналах расположен в N-концевой области р-субъединицы, хотя в С-концевой области р-субъединицы также был идентифицирован потенциальный сайт, участвующий в модуляции Са2+/кальмодулином [Grunwald et al., 1Q98; Weitz et al., 1998]. Для обоих типов ЦН-каналов взаимодействие с Са2+/кальмодулином зависит от состояния канала: связывание осуществляется с высокой степенью сродства, когда канал закрыт.
ос-субъединица ЦН-канала колбо.чки сетчатки человека также имеет сайт связывания Са2+/кальмодулина в N-концевой области, который расположен приблизительно так же, как в обонятельном ЦН-канале, и обладает способностью связывать Са2+/кальмодулин. Однако гомомерный канал, формируемый этой субъединицей, не обладает чувствительностью к функциональной модуляции Са2+/кальмодулином. Этот эффект, по мнению Grunwald et al. [1999], объясняется тем, что на взаимодействие с Са2+/кальмодулином влияет последовательность, расположенная рядом с сайтом связывания Са2+/кальмодулина. В случае обонятельных ЦН-каналов, механизм ингибирования которых Са2+/кальмодулином более понятен, обнаружены два конкурирующих типа связывания, зависящих от состояния канала. Первый тип - взаимодействие Са2+/кальмодулина с N-концевой областью - вызывает ингибирование канала [Liu et al., 1994]. Во втором случае в процесс вовлечена С-концевая область в отсутствие N-концевой. Существует мнение, чго последовательность из 30 аминокислот, называемая сайтом связывания Са2+/кальмодулина, функционирует как самовозбуждающий домен, связывающийся с рецепторной областью в С-концевой части предпочтительнее, когда канал открыт [Liu et al., 1994; Vamum, Zagotta, 1997]. Таким образом, становится ясен механизм ингибирования при связывании ЦН-канала с Са2+/кальмодулином. В результате захвата N-концевой области Са2+/кальмодулин предотвращает ее взаимодействие с С-концевой областью, т.е. Са2+/кальмодулин и С-концевая область осуществляют конкурентное взаимодействие с N-концевой областью. Суммируя сказанное выше, можно заключить, что прямое взаимодействие этих N- и С-концевых областей способствует открыванию ЦН-канала и может считаться компонентом этого механизма.
130
Са2+/кальмодулин модулирует чувствительность ЦН-каналов к лигандам. В палочковых каналах, когда Са2+/кальмодулин взаимодействует с соответствующим связывающим сайтом Р-субъединицы, К1/2 (константа полуактивации канала циклическим нуклеотидом) увеличивается в 2 раза [Nakatani et al., 1995]. В обонятельных каналах эффект воздействия Са2+/кальмодулина значительно больше и выражается в 20-кратном уменьшении сродства к цАМФ [Chen, Yau, 1994].
Следует отметить, что сродство ЦН-канала к Са2+ также зависит от мембранного потенциала и внеклеточного pH. Более того, модуляторные субъединицы, коинтегрированные с основной функциональной субъединицей, изменяют структуру сайта связывания Са2+, находящегося внутри канальной поры.
Механизм работы канала. Подытоживая сказанное, можно полагать, что ЦН-канал является гетероолигомерным белком, состоящим из четырех субъединиц. Несмотря на отличие молекулярных масс а- и Р-субъединиц, принципиально их структуры подобны, в том числе схожи ключевые аминокислоты. Все субъединицы ЦН-каналов обладают общими структурными особенностями - наличием шести трансмембранных сегментов, шпилькообразной области, формирующей канальную пору, домена, связывающего циклические нуклеотиды, Ц-связывающей области и сайта связывания Са2+/кальмодулина.
В результате связывания нескольких лигандов, максимум четырех, происходит аллостерическая трансформация молекулы ЦН-канала, следствием которой является увеличение проводимости. Благодаря изучению молекулярной структуры ЦН-канала стало ясно, что важную роль в этом процессе помимо собственно области связывания ЦН играют N-концевой участок и Ц-связывающая область.
В активированном состоянии через ЦН-каналы течет ток, состоящий в основном из ионов Na+, Са2+ и Mg2+, направленный внутрь клетки и вызывающий ее деполяризацию. Например, для палочковых ЦН-каналов соотношение ионов Na+, Са2+ и Mg2+ при физиологических условиях составляет примерно 1 : 0,15 : 0,05 соответственно [Nakatani, Yau, 1988b]. В области поры ЦН-канала содержится два ион-связывающих сайта: один расположен ближе к внутриклеточной поверхности, другой - остаток глутаминовой кислоты - ближе к внеклеточной поверхности и находится в позиции 363 в ЦН-канале палочки, в позиции 333 в обонятельном ЦН-канале. Видимо, этот сайт ответствен за блокаду двухвалентными катионами, pH-модуляцию и селективность к одновалентным катионам. В отсутствие двухвалентных катионов проводимость канала мало зависит от мембранного потенциала.
5*
131
Регулируемая цАМФ проводимость в мембране слуховых волосковых клеток
Сегодня известно два типа биологических структур, в которых нуклеотидрегулируемые каналы играют ключевую роль в восприятии сигнала - фоторецепторы и обонятельные нейроны. Сходство ионных механизмов генерации сенсорного сигнала в обонятельных и зрительных рецепторах позволяло предположить, что регулируемые циклическими нуклеотидами каналы могут являться универсальным компонентом мембран рецепторных клеток, участвующим в восприятии сенсорного сигнала. В связи с этим возникло предположение, что каналы такого типа могут присутствовать также и в мембранах рецепторных клеток еще одного класса - механорецепторных клетках. Нами были обнаружены и охарактеризованы нуклеотидрегулируемые каналы в волосковых клетках внутреннего уха [Kolesnikov et al., 1991, Ре-брик и др., 1992; Каламкаров и др., 1995].
Проводимость мембран изолированных внутренних и наружных волосковых клеток улитки морской свинки исследовалась методом пэтч-кламп в конфигурации inside-out. После стабилизации тока с цитоплазматической стороны inside-out фрагмента мембраны добавлялся цАМФ. Аппликация 100 мкМ цАМФ в среду инкубации приводила к обратимому увеличению проводимости мембраны волосковых клеток. Результаты одного из таких экспериментов приведены на рис. 4.2. Добавление 1 мМ Mg2+ или Са2+ в присутствии цАМФ приводило к обратимому блокированию проводимости. Аппликация цГМФ в концентрациях до 1 мМ не оказывала влияния на проводимость мембраны. Как и регулируемые циклическими нуклеотидами каналы фоторецепторной и обонятельной клеток, цАМФ-зависимая проводимость волосковых клеток блокировалась 1-щ/с-диалтиаземом в концентрации 0,5 мМ. цАМФ-регулируемая проводимость была зарегистрирована на 18 из 37 фрагментов мембраны наружных волосковых клеток и 9 из 22 исследованных фрагментов мембраны внутренних волосковых клеток.
На рис 4.3, а представлено семейство вольт-амперных характеристик inside-out фрагмента плазматической мембраны волосковой клетки при различных концентрациях цАМФ, а на рис. 4.3, б - соответствующая зависимость проводимости фрагмента мембраны от концентрации цАМФ. Полумаксимальная активация проводимости достигается при концентрации агониста 20 мкМ. Концентрационная зависимость имеет колоколообразную форму, т.е. большие концентрации агониста частично блокируют проводимость (как и для проводимости фоторецептор-
732
В ЗОмкМцАМФ В
I	I
30 мкМ цАМФ 30 мкМ цАМФ +2мМ Mg2+
Рис. 4.2. Влияние цАМФ, цГМФ и Mg2+ на проводимость фрагмента мембраны волосковой клетки
Вертикальными линиями показаны моменты смены раствора. цАМФ, цГМФ и Mg2+ добавляли в раствор В, содержащий (мМ): NaCI, 150; EGTA, 0,5; EDTA, 0,5; HEPES, 10
Рис. 4.3. Зависимость проводимости фрагмента мембраны волосковой клетки от концентрации цАМФ
a - семейство вольт-амперных характеристик, снятых при различных концентрациях цАМФ; б - зависимость нормированной проводимости от концентрации цАМФ
ной и обонятельной клеток). Коэффициент Хилла, определенный по линейному участку кривой (0-100 мкМ), составляет 1,2.
Селективность цАМФ-регулируемой проводимости определяли по сдвигу потенциала реверсии цАМФ-зависимого тока, вызванному заменой NaCI с цитоплазматической стороны мембраны на эквимолярные количества NaCI, CsCl, RbCL Сдвиги потенциала реверсии составили -0,3 ± 0,5; 5,4 ± 0.8 и 7,3 ± 1 мВ для Cs+, Li+ и Rb+ соответственно. Таким образом, проводимость характеризуется слабой селективностью для одновалентных катионов в соответствии с рядом Cs > Na > Li > Rb.
Точно определить сдвиг потенциала реверсии при замене Na+ на К+ не удалось, поскольку мембрана волосковых клеток содержит большое количество К+-каналов. Однако можно утвер-
133
Рис. 4.4. Спектр мощности цАМФ-активируемого шума фрагмента мембраны наружной волосковой клетки при потенциале фиксации 40 мВ
Непрерывная кривая представляет собой сумму двух Лоренцианов
l + (f/170)2 l+(f/1000)2
полученную методом наименьших квадратов. Спектр представляет собой разность флуктуаций тока в присутствии и в отсутствие цАМФ
ждать, что эта величина не превышает 10 мВ, и таким образом проницаемость цАМФ-зависимых каналов для К? - того же порядка, что и для других одновалентных катионов.
К сожалению, не удалось получить контакт, достаточно высокоомный для регистрации одиночных каналов. Поэтому параметры каналов были определены из анализа флуктуаций цАМФ-активируемого тока. На рис. 4.4 представлен спектр мощности флуктуаций цАМФ-зависимого тока. Он представляет собой разность спектров флуктуаций в присутствии и в отсутствие цАМФ. Спектр мощности шума описывается двумя Лоренцианами с характерными частотами 170 и 1000 Гц, что соответствует времени флуктуаций канала около 1 мс. Проводимость одиночного цАМФ-активируемого канала в отсутствие двухвалентных катионов составляла 16 пСм. Поскольку в присутствии Са2+ или Mg2+ цАМФ-активируемая проводимость уменьшалась более чем на порядок, проводимость одиночного канала при физиологической концентрации двухвалентных катионов должна быть не более 1 пСм.
Плотность цАМФ-активируемых каналов на теле волосковой клетки, по нашим оценкам, не превосходит 1 мкм. Известно, что плотность регулируемых циклическими нуклеотидами каналов на теле обонятельной клетки и во внутреннем сегменте фоторецептора также очень низка. Каналы сосредоточены в цилии обонятельной клетки и в наружном сегменте фоторецептора, т.е. там, где локализованы процессы сенсорной трансдукции. Если исходить из аналогии с другими типами рецепторов, то можно
134
было бы ожидать, что плотность цАМФ-регулируемых каналов на мембране стереоцилий будет значительно выше, чем на теле волосковой клетки. Однако пока нам не удалось получить гига-омный контакт на мембране стереоцилий, и вопрос о плотности каналов на стероцилиях остается открытым.
Свойства обнаруженных нами цАМФ-активируемых каналов волосковых клеток (селективность, концентрационная зависимость, проводимость одиночного канала, блокаторы) очень сходны со свойствами регулируемых циклическими нуклеотидами каналов (ЦН-каналов) фоторецепторных и обонятельных клеток. цАМФ-активируемая проводимость волосковых клеток частично блокируется большой концентрацией агониста, как и ЦН-проводимость фоторецепторов и обонятельных клеток [Kolesnikov et al., 1990]. В фоторецепторах активируемые цГМФ каналы непосредственно включены в механизм генерации сенсорного сигнала. Поглощение света в фоторецепторе приводит к гидролизу цГМФ и закрытию цГМФ-ак-тивируемых каналов.
Предполагается, что обнаруженные в мембране обонятельных клеток ЦН-каналы также играют важную роль в механизме трансдукции в этих клетках [Nakamura, Gold, 1987; Kolesnikov et al., 1990]. Б связи с этим представляется интересным обсудить возможную роль цАМФ-активируемых каналов в механизме трансдукции в волосковых клетках.
Механизм механотрансдукции в волосковых клетках, по-ви-димому, принципиально отличается от трансдукции в фоторецепторе и обонятельном нейроне. Трансдукционный ток в волосковых клетках прямо регулируется механочувствительными каналами, которые прямо управляются смещением стереоцилий, причем проводимость этих каналов во много раз выше, чем проводимость ЦН-каналов в фоторецепторах и обонятельных рецепторах [Howard, Hudspeth, 1988]. По разным оценкам, эта проводимость составляет до 100 пС, так что трансдукционный ток может обеспечиваться открыванием нескольких подобных каналов [Fettiplace et al., 1992]. Остается неясным, как при такой высокой проводимости одиночных каналов в волосковой клетке обеспечивается высокое соотношение сигнал-шум.
По некоторым параметрам свойства ЦН-каналов в волосковых клетках блики к свойствам трансдукционных каналов. Показано, что потенциал реверсии трансдукционного тока в волосковой клетке близок к 0 мВ [Lewis, Hudspeth, 1983; Crawford et al., 1989]. Это означает, что трансдукционные каналы должны быть неселективными. Обнаруженные нами цАМФ-активируе-мые каналы неселективны по отношению к одновалентным ка
135
тионам, в отличие от всех других известных в настоящее время ионных каналов в волосковой клетке. Однако другая вычисленная характеристика трансдукционных каналов - единичная проводимость - не совпадает с проводимостью одиночного цАМФ-регулируемого канала при физиологических концентрациях двухвалентных катионов. По нашим оценкам, проводимость одиночного цАМФ-регулируемого канала в присутствии Mg2+ и Са2+ составляет менее 1 пСм, в то время как самая низкая оценка проводимости трансдукционного канала - 12 пСм [Holton, Hudspeth, 1986].
Считается, что трансдукционные каналы должны быть сосредоточены в стеоцилиях волосковых клеток [Holton, Hudspeth, 1986]. К сожалению, нам не удалось получить гигаом-ный контакт на мембране стереоцилий, однако, если исходить из аналогии с фоторецепторами и обонятельными клетками, концентрация цАМФ-регулируемых каналов в стереоцилиях могла бы быть велика, поскольку в фоторецепторах и обонятельных клетках концентрация ЦН-регулируемых каналов в аналогах стереоцилий, наружном сегменте фоторецептора и цилии обонятельной клетки значительно выше, чем соответственно во внутреннем сегменте фоторецептора и теле обонятельной клетки. Возможно, ЦН-каналы играют в клетке регуляторную роль. Например, при увеличении концентрации цАМФ в клетке они могут регулировать входящий кальциевый ток. Известно, что внутриклеточная концентрация кальция играет существенную роль в механизме адаптации механорецеп-торных клеток [Ricci, Fettiplace, 1998]. Подтверждением этого может служить тот факт, что трансдукционный ток в волосковых клетках может регулироваться не только кальцием, но и цАМФ [Ricci, Fettiplace, 1997].
Таким образом, в настоящее время нет достаточных аргументов, чтобы утверждать, что цАМФ-регулируемые каналы включены в механизм трансдукции в волосковых клетках улитки, однако некоторые их свойства соответствуют свойствам трансдукционных каналов. Возможно, механотрансдукция в волосковых клетках осуществляется по нескольким параллельным механизмам, и функционирование цАМФ-регулируемых каналов не исключает присутствия других каналов, проводимость которых непосредственно регулируется механическим смещением стереоцилий [Howard et al., 1988].
136
Действие реагентов, модифицирующих SH-группы, и оксида азота на нуклеотид-регулируемые ионные каналы
Известно, что оксид азота (NO) играет важную роль в работе нервной системы [Moncada et al., 1991; Bredt, Snyder, 1992; Dawson, Snyder, 1994; Garthwaite, Boulton, 1995]. Гистохимические и иммуноцитохимические эксперименты с использованием NADPH-диа-форазы показали, что NO-синтаза - фермент, образующий оксид азота из L-аргинина - широко распространен в разных отделах мозга позвоночных [Bredt at al., 1991]. В сетчатке NO-синтаза была обнаружена в разных слоях: в эллипсоидах фоторецепторных клеток [Yamamoto et al., 1993а; Kim et al., 2000], амакриновых клетках [Yamamoto et al., 1993b], в мюллеровских клетках [Haverkamp et al., 1999], в горизонтальных клетках [Cuenca et al., 2000], в биполярных клетках [Haverkamp, Eldred, 1998].
Существуют свидетельства того, что NO может модулировать работу ионных каналов фоторецепторных клеток. Экзогенный NO влияет на ток кальциевых каналов из внутреннего сегмента палочки и на неселективный, дилтиаземчувствитель-ный ток (возможно, идентичный цГМФ-зависимому току) в наружном сегменте [Kurenny et aL, 1994]. Обнаружено также, что оксид азота действует на цГМФ-зависимый синаптический ток в оп-биполярных клетках [Shiells, Falk, 1992], может активировать цГМФ-зависимый ток катионов в ганглиозных клетках сетчатки [Ahmad et al„ 1994] и в фоторецепторных колбочках [Savchenko et aL, 1997]. В этих случаях эффект NO, по-видимому, обусловлен активацией растворимой гуанилатциклазы, так как увеличение концентрации цГМФ вызывает увеличение тока цГМФ-зависимых каналов.
Однако возможен и другой механизм регуляции оксидом азота. Выяснилось, что действие NO многообразнее и, в частности, он может и прямо активировать ионные каналы нервных клеток. Это было продемонстрировано для НМДА-рецептора [Lee ,et aL, 1992; Lipton, Stalmer, 1994] и для калиевых каналов [Bolotina et aL, 1994].
В рецепторных тканях также обнаружено и прямое действие NO на каналы [Broillet, Firestein, 1996; Каламкаров, Кулагина, 1999]. Таким образом, NO может влиять на величину активации цГМФ-зависимых каналов различными способами. В этом разделе мы остановимся на описании экспериментов по прямому действию оксида азота на нуклеотидрегулируемые каналы. Основанием для такого подхода послужили описанные выше данные по прямой активации цГМФ-регулируемых каналов из зрительных
137
клеток путем модификации их сульфгидрильных групп. Известно, что кроме действия NO как лиганда в гемсодержащих белках, он также хорошо связывается с сульфгидрильными группами, образуя нитрозотиолы.
В описанной ниже серии экспериментов исследовалось прямое действие реагентов, модифицирующих сульфгидрильные группы, и продуцентов оксида азота на одиночные цАМФ-регу-лируемые каналы волосковых клеток и цГМФ-регулируемую проводимость наружного сегмента фоторецепторной клетки.
Влияние реагентов, модифицирующих SH-группы, на фототок в зрительной клетке и цГМФ-регулируемые ионные каналы
Как отмечалось выше, сульфгидрильные группы родопсина функционально важны для активации трансдуцина и, следовательно, непосредственно участвуют в цикле фототрансдукции. Если это так, то их модификация должна приводить к изменениям фототока, регистрируемого в сетчатке или изолированной клетке. В настоящем разделе нами изложены эксперименты, подтверждающие это предположение. Однако оказалось, что при изменении фототока, вызванного модификацией SH-rpynn, обнаруживается компонент, который никак не может быть объяснен ингибированием или активацией ферментов, участвующих в усилении сигнала. Попытка объяснить этот феномен привела нас к исследованию ионных каналов в плазматической мембране клетки. В соответствующем разделе показано, что эти каналы также содержат функционально важные SH-группы, модификация которых может приводить к активации каналов и в отсутствие цГМФ.
Для исследования действия модификации SH-групп на ток изолированной палочки саламандры использовался N-этилмале-имид (НЭМ), иодацетамид (ИАА) и р-гидроксимеркурийбензоат (ПГМБ), которые добавляли в раствор Рингера, омывающий наружный сегмент палочки. Ток изолированной палочки саламандры регистрировался методом всасывающего электрода.
‘ На рис. 4.5, А представлено изменение темнового тока и ответа палочки на свет, вызванное добавлением в проток 0,5 мМ НЭМ. Под действием НЭМ темновой ток палочки начинает возрастать и выходит на новый уровень. Стрелками указаны моменты включения коротких вспышек света. Интенсивность вспышек a-i была одинаковой (log I = 0). Эта интенсивность была насыща-
138
I____I____I_____I____I 1________I____I____I____I
-3 -2 -1	0	1	2	3	4	5	6
Время, мин
Рис. 4.5. Влияние SH-реагентов на темновой ток и фотоответ изолированной палочки саламандры
Начало перфузии SH-реагентами - в момент t = 0. Длительность вспышек - 0,1 с. А -0,5 мМ НЭМ. Фотоответы a-i - на вспышки одинаковой интенсивности (log I = 0), которая была насыщающей до введения SH-реаген' а, фотоответы h и j - на вспышки с log I = 2,8. Б - 0,5 мМ ПГМБ; В - 2 мМ ИАА
ющей для фотоответа палочки до воздействия НЭМ (ответы a-d), т.е. вспышки a-d вызывали полное перекрытие тока палочки, и их пики показывают уровень нулевого тока, а их амплитуда - величину темнового тока палочки, омываемой обычным раствором Рингера без добавления фармакологических агентов. В первые несколько минут после начала действия НЭМ амплитуда ответов, вызываемых вспышками этой же интенсивности (f, g), увеличивалась, однако, несмотря на большую амплитуду, пик фотоответа g уже не достигает уровня нулевого тока. В присутствии НЭМ полного перекрытия тока палочки не удалось достичь даже при увеличении интенсивности вспышки на 2,8 log единицы (вспышка h), хотя пиковое значение тока этого фотоответа близко к нулю. Это, с одной стороны, свидетельствует о том, что относительная чувствительность палочки (часть тока, выключаемая одной фотоизомеризацией) уменьшилась.
С другой стороны, то, что свет очень большой интенсивности не перекрывает всего тока палочки, свидетельствует о том, что в присутствии НЭМ существует остаточная компонента тока, которая не выключается светом. Она составляет около 15 пА в нескольких экспериментах.
При дальнейшей инкубации палочки с НЭМ чувствительность продолжала быстро уменьшаться. Через 5 мин амплитуда фотоответа, вызываемого вспышкой с интенсивностью log 1 = О, значительно уменьшилась (фотоответ i). Величина светочувствительного тока (см. фотоответ j на насыщающую вспышку света с интенсивностью log I = 2,8) несколько уменьшается по сравнению с первыми минутами действия НЭМ (см. фотоответ h), но остается примерно в три раза больше, чем до воздействия НЭМ. Однако в связи со значительным снижением чувствительности для выключения всего светочувствительного тока требуется свет гораздо большей интенсивности.
Результаты аналогичного эксперимента с другим SH-связы-вающим реагентом, ПГМБ, представлены на рис. 4,5, Б. В этих экспериментах, как и в опытах с НЭМ, при действии 0,5 мМ ПГМБ наблюдалось увеличение темнового тока, увеличение амплитуды ответа на насыщающую вспышку света и постепенное снижение чувствительности.
Несколько отличная от этой картина наблюдалась при добавлении в раствор ИАА (рис. 4.5, В). В этом случае не наблюдали снижения чувствительности палочки. Интенсивность насыщающей вспышки в этих опытах не изменялась в течение 12 мин перфузии палочки ИАА даже при повышении концентрации реагента до 2 мМ. Кроме того, при добавлении ИАА, как и в опытах с другими SH-реагентами, наблюдалось увеличение темнового то
140
ка, однако это было кратковременной реакцией на добавление реагента, и уровень темнового тока возвращался к первоначальному через несколько минут.
Таким образом, все исследованные SH-реагенты вызывали: 1) увеличение темнового тока палочки, 2) увеличение амплитуды фотоответа на насыщающую вспышку света на величину, коррелирующую с увеличением темнового тока, однако во всех случаях меньшую, чем увеличение темнового тока, 3) возникновение (во всех случаях) нечувствительной к свету компоненты темнового тока, которая сохранялась даже после насыщающей вспышки света. Кроме того, два из исследованных реагентов, НЭМ и ПГМБ, вызывали снижение чувствительности палочки. Из этих результатов следует, что SH-реагенты влияют, по крайней мере, на два параметра фоторецепторной клетки: во-первых, повышают проводимость каналов в плазматической мембране и, во-вторых, ингибируют цикл фототрансдукции в палочке.
Под действием НЭМ фотоответ интактных палочек через несколько минут замедляется, а кривая ответ-интенсивность становится круче [Donner et al., 1989]. Аналогичные изменения вызывают ингибиторы ФДЭ [Capovilla et al., 1983; Cervetto, McNaughton, 1986]. Отсюда возникло предположение, что вызванное SH-реагентами изменение чувствительности палочки связано с ингибирующим действием SH-реагентов на ФДЭ. При этом следует заметить, что ИАА не оказывал заметного влияния на чувствительность палочки, поэтому интересно сравнить его влияние на активность ФДЭ с действием НЭМ.
Мы оценивали фосфодиэстеразную активность в суспензии бычьих НСП, контролируя изменения pH, вызванные гидролизом цГМФ. На рис. 4.6, а и рис. 4.6, б представлены изменения фосфодиэстеразной активности в суспензии НСП, вызванные добавками 0,1 мМ НЭМ и 0,1 мМ ПГМБ соответственно. НЭМ и ПГМБ быстро и эффективно блокируют фосфодиэстеразную активность в суспензии НСП. Для сравнения были проведены аналогичные эксперименты с широко применяемым известным ингибитором ФДЭ изобутилметилксантином (ИБМК) в концентрации 0,1 и 0,25 мМ. Такие концентрации ИБМК вызывали существенные изменения в электрофизиологии палочек [Cervetto, McNaughton, 1986]. Результаты такого эксперимента представлены на рис. 4.6, г. НЭМ и ПГМБ блокируют фосфодиэстеразную активность в суспензии НСП эффективнее, чем ИБМК. ИАА в концентрации 0,2 мМ также оказывал ингибирующее действие на фосфодиэстеразную активность суспензии НСП, однако менее эффективное, чем НЭМ и ПГМБ (см. рис. 4.6, в).
141
НЭМ
Контроль
ПГМБ
Контроль
1111___I_1	1_I
-10 0 10 20 30 40 50 60
।___।__।____।___।___।__।___।
-10 0 10 20 30 40 50 60
Время, с
Рис. 4.6. Влияние НЭМ ПГМБ, ИАА и ИБМК на гидролиз цГМФ в суспензии НСП in vitro
В момент времени t = 0 давали яркую вспышку света. Перед вспышкой в раствор добавляли 140 мкМ цГМФ. Справа от кривых указано время, прошедшее с момента добавки реагента, а в опыте с ИБМК - концентрация ИБМК
Из описанных выше экспериментов с очевидностью следует, что если плазматическая мембрана проницаема для НЭМ даже в небольшой степени, этого будет вполне достаточно для блокирования цикла фототрансдукции и снижения чувствительности палочки, поскольку НЭМ является эффективным ингибитором
142
ФДЭ. С другой стороны, хотя ингибирующее действие ИАА меньше, чем действие НЭМ, при высокой проницаемости мембраны для ИАА его было бы достаточно для изменения чувствительности палочки.
Однако ИАА не оказывал влияния на чувствительность палочки. Такое несоответствие может быть связано с различием проникающей способности этих реагентов. Кроме
Модификация SH-групп родопсина в ходе инкубации с НЭМ и ИАА
Реагент	Время инкубации, мин	% немодифицированных SH-групп/родопсин
НЭМ	0	100
(10 мМ)	20	85 ± 1
	120	70 ±3
ИАА	0	100
(10 мМ)	20	100
	120	78 + 3
того, проницаемость плазма-
тической мембраны для использованных нами реагентов важно знать также и для выяснения локализации функциональных SH-групп. Поэтому мы провели серию экспериментов по исследованию проницаемости плазматической мембраны НСП для НЭМ и ИАА. Изолированные сетчатки лягушки инкубировали с 10 мМ НЭМ или с 10 мМ ИАА, а затем оценивали проницаемость мембраны палочки для этих реагентов по степени модификации SH-групп родопсина. Результаты этих экспериментов представлены в таблице.
При инкубации с НЭМ количество немодифицированных SH-групп через 20 мин падает до 85% от контрольного, а через 120 мин - до 70%. Иная картина наблюдается при инкубации сетчаток с ИАА. Через 20 мин инкубации с ИАА количество интактных SH-групп в молекулах родопсина не отличается от контрольного, и только через 120 мин модифицируется около 20% SH-rpynn.
Таким образом, даже при концентрации 10 мМ, в 5 раз превышающей максимальную концентрацию ИАА, применявшуюся в электрофизиологических экспериментах, ИАА проникает в клетку очень медленно. Это означает, что в электрофизиологической части этой работы мы наблюдали действие ИАА на палочку только снаружи, на каналы плазматической мембраны, а не на ферменты цикла трансдукции. Кроме того, это свидетельствует о том, что канальный белок содержит SH-группы не только с цитоплазматической, но и с наружной стероны мембраны и модификация как тех, так и других SH-групп приводит к повыше
нию проводимости каналов.
Естественным объяснением того факта, что при действии SH-модификаторов появляется компонента в фотоответе, которая не может быть подавлена даже при насыщающем ответе, со-
143
Рис. 4.7. Вольт-амперные характеристики фрагмента плазматической мембраны
/ — раствор Рингера; 2 — 0,5 мМ НЭМ; 3 — 2 мМ НЭМ
Рис. 4.8. Вольт-амперные характеристики фрагмента плазматической мембраны
/ - контроль; 2-100 мкМ цГМФ; 5-100 мкМ цГМФ + 0,5 мМ НЭМ; 4-100 мкМ цГМФ + 2 мМ НЭМ
стоит в том, что модификация SH-групп приводит к изменению проводимости цГМФ-регулируемых ионных каналов.
Для исследования действия SH-реагентов на проводимость плазматической мембраны фоторецепторов был применен метод локальной фиксации потенциала на фрагменте мембраны (пэтч-кламп). Мы регистрировали ток фрагмента плазматической мембраны палочки, перфузируемого с внутриклеточной стороны раствором Рингера, содержащим НЭМ или ИАА в концентрациях 0,5 или 2 мМ. На рис. 4.7 представлены вольт-амперные характеристики фрагмента мембраны в растворе Рингера (1) и после добавления с внутриклеточной стороны 0,5 мМ (2) и 2 мМ (3) НЭМ. В присутствии 0,5 мМ НЭМ проводимость мембраны увеличилась почти в два раза по сравнению с контролем. При увеличении концентрации НЭМ проводимость мембраны еще несколько возросла.
В следующей серии экспериментов (рис. 4.8) мы добавляли в среду инкубации с внутриклеточной стороны 100 мкМ цГМФ. Известно, что при такой концентрации цГМФ более 80% цГМФ-регулируемых каналов в мембране находятся в открытом состоянии [Fesenko et al., 1985]. Добавка 100 мкМ цГМФ вызывала увеличение проводимости фрагмента мембраны при-
144
Рис. 4.9. Вольт-амперные характеристики фрагмента плазматической мембраны
/ - контроль; 2-2 мМ ИДА;
3 - 2 мМ ИА А + 100 мкМ цГМФ
мерно в 4 раза по сравнению с контролем. Добавка 0,5 и 2 мМ НЭМ на фоне 100 мкМ цГМФ вызывала дальнейшее увеличение проводимости фрагмента мембраны в 1,3 и 1,6 раз соответственно. Абсолютное увеличение проводимости, вызванное добавкой 2 мМ НЭМ, в присутствии цГМФ было в 5 раз больше, чем
1,пА
30 г
без цГМФ, когда все каналы закрыты (130 и 25 пСм соответст-
венно).
Аналогичный результат вызывала аппликация с внутриклеточной стороны ИАА (рис. 4.9). Добавка 2 мМ ИАА повышала проводимость фрагмента мембраны примерно в 2 раза. Добавка цГМФ на фоне 2 мМ ИАА также вызывала увеличение проводимости мембраны. Таким образом, SH-связывающие реагенты вызывают увеличение проводимости плазматической мембраны палочки, однако при этом сохраняется цГМФ-регулируемая проводимость мембраны. По абсолютной величине изменение проводимости, вызванное SH-реагентами в плазматической мембране, значительно превышает изменения проводимости мембраны диска, вызванные модификацией SH-групп родопсина. Следовательно, значительные изменения проводимости плазматической мембраны не могут быть обусловлены модификацией SH-rpynn содержащегося в ней родопсина. По-видимому, канальный белок содержит SH-группы, модификация которых приводит к измене
нию состояния проводимости канала.
В следующей серии опытов для исследования действия модификации SH-групп с наружной стороны плазматической мембраны SH-реагенты добавляли в раствор, омывающий наружный сегмент изолированной палочки саламандры, внутренний сегмент которой затянут во всасывающую пипетку, и регистрировали вызванные этим воздействием изменения тока палочки.
145
Поскольку в экспериментах по измерению тока оценивалось действие SH-реагентов на интегральную проводимость фрагмента мембраны, а не на свойства одиночных каналов, при интерпретации результатов следует рассмотреть все возможные мишени для SH-реагентов в плазматической мембране. Ими могли бы быть канальный белок, На+-Са2+-обменник и родопсин.
В опытах на дисках мы показали, что модификация SH-rpynn родопсина оказывает незначительное действие на проводимость мембраны и вряд ли может вносить существенный вклад в заметное повышение проводимости фрагмента плазматической мембраны.
По-видимому, наблюдаемый нами эффект не связан также и с модификацией SH-групп На+-Са2+-обменника. Известно, что длительное воздействие SH-связывающего реагента дитиотреи-тола подавляет активность Иа+-Са2+-обменника [Nicoll, Applebury, 1989]. Однако известно также, что ингибирование №+-Са2+-обмена приводит к полной потере световой чувствительности палочки [Yau et al., 1991], а в опытах с ИАА, который действует только с наружной стороны мембраны, снижения чувствительности не наблюдалось. Кроме того, если бы имело место ингибирование 1Ча+-Са2+-обменника, наблюдалось бы снижение проводимости, поскольку обменник электрогенный, в то время как в наших экспериментах наблюдалось повышение проводимости. Наконец, в опытах на фрагментах мембраны среда внутри пипетки и в кювете была одинаковой, и на мембране не было каких-либо ионных градиентов, в то время как Na -Са2+-об-менник функционирует в условиях градиента Са2+ на плазматической мембране [Schnetkamp, Szerencsei, 1989] Поэтому скорее всего в экспериментах с мембранными фрагментами Na+-Ca2+-o6-менник вообще не вносил вклада в интегральную проводимость фрагмента мембраны.
Таким образом, есть основания полагать, что проводимость мембраны меняется в результате модификации SH-групп канального белка. Увеличение проводимости мембраны наблюдается как в присутствии насыщающей концентрации цГМФ (“темновое” состояние мембраны), так и без цГМФ (имитация насыщающего света, когда все каналы закрыты). Следовательно, модификация SH-групп приводит к появлению не зависящей от света компоненты проводимости канала.
Влияние NO на цГМФ-зависимый ток. Недавно было обнаружено, что NO может прямо влиять на активность нуклеотидре-гулируемых каналов в других рецепторных тканях. Так, было найдено, что оксид азота активирует каналы обонятельных нейронов [Broillet, Firestein, 1996] и слуховых волосковых клеток
146
[Каламкаров, Кулагина, 1999]. Обнаруженная нами в наружных сегментах фоторецепторов сравнительно высокая активность NO-синтазы позволяла предположить, что если NO подобным образом прямо активирует цГМФ-зависимые каналы фоторецепторов, тогда оксид азота мог бы являться еще одним звеном в механизме модуляции процесса фототрансдукции. Такое предположение выглядит тем более естественным, что ранее нами была обнаружена в отсутствие цГМФ прямая активация нуклеотидре-гулируемых каналов в результате модификации сульфгидрильных групп, эти эксперименты описаны в предыдущем разделе [Donner et al., 1990а].
Для того чтобы понять, существует ли прямое влияние оксида азота на работу цГМФ-активируемых каналов фоторецепторных клеток, исследовалось изменение интегрального тока в ответ на добавление доноров NO в перфузионный раствор. На рис. 4.10 приведены типичные результаты регистрации интегральных токов методом “пэтч-кламп”. Для регистрации использовались наружные сегменты фоторецепторных палочек. Регистрировалась вольт-амперная характеристика пэтча, содержащего цГМФ-активируемые каналы, в интервале от -30 до +40 мВ.
На рис. 4.10, А, Б представлены вольт-амперные характеристики одного пэтча. На рис. 4.10, В изображена соответствующая диаграмма, отражающая изменение проводимости в ходе одного эксперимента в зависимости от добавления в перфузирующий раствор цГМФ, SIN-1 или S-нитрозоцистеина. Как и должно быть, добавление цГМФ в насыщающей концентрации вызывает обратимое увеличение проводимости почти в два раза. Однако добавление в перфузирующий раствор доноров NO - SIN-1 и S-нитрозоцистеина в отсутствие цГМФ не вызывало ощутимого изменения проводимости, как это наблюдалось в случае слуховых волосковых клеток и обонятельных нейронов.
В состав канального белка зрительных клеток входят несколько цистеиновых остатков, причем многие из них являются ключевыми для механизма работы канала. Например, в «-субъединице из фоторецепторной палочки цыпленка есть семь эндогенных цистеинов. Один из них - С-481, вызывающий потенции-рование ЦН-канала [Gordon et al., 1997], модифицируется предпочтительнее в открытом состоянии, другой - С-505, вызывающий ингибирование ЦН-канала [Matulef et al., 1999], модифицируется предпочтительнее, когда с каналом не связаны лиганды. Существенное влияние на механизм открывания ЦН-каналов оказывает взаимодействие между N- и С-концевыми участками субъединиц, причем взаимодействие, видимо, происходит между
147
Рис. 4.10. Влияние NO и нитрозоцистеина на проводимость цГМФ-зависимых каналов
Семейство вольт-амперных характеристик пэтча наружного сегмента фоторецепторной палочкн (Л, Б). Проводимость (AVAL, мкСм) пэтча в зависимости от наличия в перфузионном растворе 100 мкМ цГМФ, 100 мкМ SIN-1 или 100 мкМ S-нитрозоцистеи-на - S-НЦ (В)
в
двумя цистеиновыми остатками, в ос-субъединице палочкового канала это С-35 и С-481.
Модификация цистеинов ЦН-каналов из фоторецепторных клеток приводит к их активации и в отсутствие цГМФ [Donner et al., 1990а]. Более того, было установлено, что интегральный ток зрительной клетки, возникающий вследствие активации цистеинов ЦН-каналов, был на 20% выше, чем цГМФ-активируе-мый ток. В 1996 г. аналогичный эффект был обнаружен в обонятельных ЦН-каналах [Broillet, Firestein, 1996]. Было установлено, что активация канала может вызываться не только модификацией SH-групп, например, малеимидом, но и действием оксида азота. Так, при изучении ЦН-каналов обонятельных рецепторов крысы выяснили, что реагенты, высвобождающие NO, могут прямо активировать канал в отсутствие циклических нуклеотидов, вызывая S-нитролизирование свободных SH-групп цистеиновых остатков. Для нахождения мишени для NO в «-субъединицах ЦН-канала обонятельного нейрона крысы были последовательно произведены замены четырех разных цистеиновых остатков, расположенных во внутриклеточной части канала (С-460, С-484, С-520, С-552), на серин. В результате было выяснено, что только замена C-460S лишает канал чувствительности к NO. Как уже было сказано выше, С-460 расположен в Ц-связывающей об
149
ласти ЦН-канала, которая играет существенную роль в механизме открывания канала [Broillet, Firestein, 1996; Broillet, 2000]. Можно полагать, что обнаруженный нами ранее эффект обусловлен действием на гомологичные цистеины в структуре канала из фоторецепторной клетки.
Действие реагентов, модифицирующих SH-группы, на цАМФ-регулируемые ионные каналы из слуховых волосковых клеток
Итак, модификация SH-групп приводит к активации нуклео-тидрегулируемых каналов как зрительных, так и обонятельных клеток, а оксид азота может активировать только каналы из обонятельных клеток. В этой связи интересно выяснить, как ведут себя цАМФ-регулируемые ионные каналы из слуховых волосковых клеток.
Типичная запись активности одиночных ионных каналов из волосковых клеток морской свинки (inside-out patch) представлена на рис. 4.11. В отсутствие цАМФ в симметричном растворе, не содержащем двухвалентных катионов, не наблюдается никакой активности ионных каналов. Добавление с внешней стороны пэтча 50 мкМ цАМФ приводило к появлению “выбросов”, характерных для активности каналов. Такой эффект в данном исследовании наблюдался в 12 из 43 пэтчей. Эффект был полностью обратим, и отмывание цАМФ приводило к исчезновению характерных “выбросов”.
В случае, когда к тому же препарату добавлялись вещества, продуцирующие оксид азота (100 мкМ SIN-1 или 150 мкМ S-нит-розоцистеин), это приводило к активации каналов, аналогичной той, что наблюдалась при добавлении циклических нуклеотидов. В том случае, когда пэтч не содержал ионных каналов, добавление S-нитрозоцистеина и SIN-1 было неэффективным и напротив, в большинстве случаев, когда пэтч содержал ионные каналы, активируемые цАМФ, они также могли активироваться и донорами оксида азота.
Как SIN-I, так и S-нитрозоцистеин могут продуцировать оксид азота только в течение непродолжительного времени. Мы измеряли содержание оксида азота в растворах этих соединений через 10 ч после их приготовления, и концентрация оксида азота в них падала в 10 раз, а после суток хранения концентрация оксида азота становилась практически неизмеримой. Когда раствор SIN-I или S-нитрозоцистеин после суток хранения добавлялся к пэтчу, содержащему ЦН-каналы, то это не приводило к их акти
150
вации. Такой контрольный эксперимент свидетельствует о том, что каналы активирует именно оксид азота, а не производные его доноров, образующиеся при их разложении.
В отличие от действия цАМФ, эффект оксида азота был слабо обратим. Если отмывание цАМФ приводило практически мгновенно к исчезновению выбросов, характерных для каналов, то отмывание SIN-1 и S-нитрозоцистеина приводило к их медленному исчезновению; полностью эффект оксида азота исчезал только через 20 мин после полного отмывания реагентов.
В том случае, когда SIN-1 и S-нитрозоцистеин добавлялись на фоне цАМФ, это не приводило к каким-либо заметным изменениям в активности каналов, однако в этом случае после отмывания реагентов эффект был плохо обратим.
На рис. 4.11, б представлены амплитудные гистограммы, полученные при обработке результатов регистрации тока через мембранный фрагмент при действии на него цАМФ и SIN-1. Гистограммы хорошо аппроксимируются кривыми Гаусса, что позволяет определить ток одиночного канала. Величины токов оказались достаточно близкими для каналов, активированных цГМФ и SIN-1. Так, в присутствии 50 мкМ цАМФ единичная проводимость составляла 1,5 пА, а в присутствии 100 мкМ SIN-1 -1,7 пА для гистограмм, показанных на рисунке. Величины, усредненные по шести аналогичным опытам, составили 1,62 ± 0,21 и 1,74 ± 0,15 пА для цАМФ и SIN-1 соответственно (хотя величины одиночной проводимости каналов, активированных разными способами и близки, величина проводимости одиночного канала, активированного SIN-1, всегда была несколько выше, чем при активации цАМФ).
Для более точного описания характеристик каналов мы определяли среднее время нахождения канала в открытом и закрытом состояниях для обоих активирующих агонистов. В обоих случаях кривые хорошо аппроксимировались одной экспонентой и давали следующие величины. Постоянная времени открытого состояния для цАМФ составляла примерно 0,45 с, а для SIN-1 -0,55 с.
Для постоянной времени закрытого состояния были получены величины 0,83 и 1,03 с для цАМФ и SIN-1 соответственно (результаты получены при обработке непрерывной записи активности каналов в течение 40 мин).
Реагенты, модифицирующие SH-группы, активируют ЦН-каналы аналогично оксиду азота. Ранее нами было установлено, что реагенты, модифицирующие сульфгидрильные группы (иодацетамид, парахлормеркурийбензойная кислота), будучи добавленными к пэтчу, содержащему ЦН-регулируемые каналы,
151
О мкМ цАМФ
и.
	ill 1 I	мкМ цАМФ
10 мкМ цАМФ
100 мкМ цАМФ
Рис. 4.11. Активация ЦН-каналов цАМФ и оксидом азота
и - активация ионных каналов при аппликации с цитоплазматической стороны различных концентраций цАМФ, а также донора оксида азота - S1N-1; б - амплитудная гистограмма, полученная при аппликации 100 мкМ цАМФ (верхняя кривая; и 100 мкМ SIN-1 (нижняя кривая). Обработка проводилась по анализу 1500 событий, потенциал фиксации — 30 мВ
могли активировать ток и в отсутствие цГМФ. Аналогичный эффект был обнаружен нами и при исследовании цАМФ-регулируемых каналов в волосковых клетках.
На рис. 4.12 показаны результаты такого исследования. Добавление 1 мМ иодацетамида приводило к активации каналов аналогично цАМФ или оксиду азота. Аналогичное действие оказывал также N-этилмалеимид и парахлормекурийбензойная кислота (ПХМБ). Действие всех реагентов, модифицирующих
152
б
SH-группы, более напоминало действие доноров оксида азота, чем цАМФ. Действительно: 1) эффект ИАА, НЭМ и ПХМБ был необратим, и состояние каналов не восстанавливалось после их отмывания (как отмечалось ранее, действие S-нитрозоцистеина и SIN-1 также было слабообратимым); 2) постоянная времени открытого состояния канала под действием ИАА, НЭМ и ПХМБ возрастала существенно больше, чем при действии цАМФ; 3) добавление как SIN-1, так и ИАА на фоне цАМФ приводило к дополнительному возрастанию постоянной времени открытого состояния примерно на 30%. Эти факты позволяют предполагать,
153
Контроль
100 мкМ цАМФ
100 мкМ цАМФ + 100 мкМ SIN-1
 ШыШшнАй
1 мМ ИАА
 ШЛДЙЛ
1 мМ ИАА + 100 мкМ SIN-1
100мкМ НЭМ
100 мкМ ПХМБ

Рис. 4.12. Активация ЦН-каналов реагентами, модифицирующими сульфгидрильные группы
а - запись тока от фрагментов, содержащих ЦН-каналы, при добавлении иодацет-амида (ИАА), N-этилмалеимида (НЭМ) и 2-парахлормеркурийбензойной кислоты (ПХМБ). ИАА и НЭМ добавлялся отдельно и вместе с SIN-1; б - вероятность нахождения каналов в открытом состоянии при аппликации цАМФ, SIN-I, ИАА. НЭМ. ПХМБ
(100 мкМ)	(100 мкМ)
Рис. 4.12. (б)
что механизм действия оксида азота и реагентов, модифицирующих сульфгидрильные группы, одинаков, а именно: добавление NO приводит к S-нитрозилированию SH-групп цистеиновых остатков [Pryor, Lightsey, 1981; Pryor et al., 1982].
NO и цАМФ действуют на разные связывающие центры канала. Для того чтобы выяснить, действуют ли цАМФ и NO на один и тот же сайт в молекуле канала, мы провели эксперименты с аналогом цАМФ - Rp-цАМФ. Это соединение является ингибитором протеинкиназы A [Rothemel, Parker, 1988] и, как показано для ЦН-активируемых каналов из обонятельных нейронов, связывается с каналом, не активируя его [Kramer, Tibbs, 1995]. Таким образом, если бы оксид азота действовал на тот же центр, что и цАМФ, после действия Rp-цАМФ его эффект не проявлялся бы.
Результаты такого эксперимента представлены на рис. 4.13. Эксперимент проводился обычно по следующему протоколу. Вначале регистрировался ток через мембранный фрагмент при добавлении 100 мкМ цАМФ, чтобы убедиться, что фрагмент содержит хотя бы один ЦН-канал. Затем цАМФ отмывался и добавлялось 500 мкМ Rp-цАМФ. Это не приводило к активации ЦН-каналов. Добавление цАМФ на фоне Rp-цАМФ также не приводило к регистрации активных каналов. Однако добавле-
155
a
100 мкМ цАМФ
500 мкМ Rp-цАМФ + 100 мкМ цАМФ
2 пА
цАМФ	SIN-1
(100 мкМ)	(100 мкМ)
Рис. 4.13. цАМФ и оксид азота независимо активируют цАМФ-регулируемые ионные каналы, действуя на различные центры
а - активация ЦН-каналов при аппликации цАМФ и его агониста Rp-цАМФ (цАМФ и Rp-цАМФ добавлялись по отдельности, вместе и одновременно с S1N-I); б - вероятность нахождения ЦН-каналов в открытом состоянии при добавлении цАМФ и Rp-цАМФ
ние на фоне Rp-цАМФ 100 мкМ SIN-1 приводило к регистрации каналов.
В описанных экспериментах показано, что ЦН-каналы из волосковых клеток органа Корти могут быть активированы не только цАМФ, но и веществами, продуцирующими оксид азота. Такая активация не связана, как это наблюдается в большинстве случаев, с активацией циклазы и увеличением концентрации циклических нуклеотидов. Эффект наблюдается на мембранном фрагменте клетки и в отсутствие АТФ,
Оксид азота активирует тот же самый канал, что и цАМФ. Во-первых, действие доноров NO наблюдалось только в тех пэт-чах, в которых присутствовали цАМФ-регулируемые ионные каналы. Во-вторых, основные кинетические характеристики каналов были аналогичными. Существенное отличие наблюдалось только в вероятности открытого состояния канала. Эта величина при активации оксидом азота была обычно на 30% выше, чем при активации цАМФ. Это подтверждено и при исследовании интегрального тока. Вольт-амперные характеристики, полученные на фрагментах, содержащих несколько каналов, демонстрируют большую величину тока при насыщающих концентрациях оксида азота, чем при насыщающих концентрациях цАМФ.
Эффект оксида азота обусловлен прямым его действием на ионный канал, причем наиболее вероятным механизмом такого действия является модификация оксидом азота сульфгидрильных групп в ионном канале. Во-первых, нами показано, что реагенты, модифицирующие SH-группы, сами по себе в отсутствие оксида азота или цАМФ способны активировать канал. Во-вторых, действие всех SH-реагентов (ИАА, НЭМ, ПХМБ) было аналогично действию оксида азота и несколько отличалось от действия цАМФ. SH-реагенты, аналогично оксиду азота, в насыщающих концентрациях вызывали больший интегральный ток через мембранный фрагмент, чем насыщающая концентрация цАМФ.
То, что оксид азота может действовать прямо через модификацию сульфгидрильных групп, не является удивительным. Взаимодействие предельно окисленного оксида азота (NO+) является весьма вероятной химической реакцией (см. обзор Lipton, 1993). Предполагается также, что именно нитрозотиолы служат тем стабильным соединением, которое и позволяет оксиду азота быть таким важным физиологическим соединением. Сам по себе оксид азота является крайне нестабильным соединением и маловероятно, что он может быть эффективным медиатором сам по себе [Stalmer et aL, 1992]. То, что модификация сульфгидрильных групп может активировать канал в отсутствие циклических нуклеотидов, было ранее продемонстрировано нами на примере ка
7.57
налов фоторецепторной клетки [Donner et al., 1990а], а также показано для ЦН-каналов из обонятельных нейронов [Broillet, Firestein, 1996].
Интересным фактом в нашем случае является то, что NO и цАМФ действуют на различные связывающие центры в молекуле ионного канала. Действительно, оксид азота вызывал активацию канала и в том случае, когда цАМФ-сайт был блокирован Rp-цАМФ. Все использованные нами SH-реагенты не проникают через мембрану [Donner et al., 1990а] и взаимодействовали только с цитоплазматической стороной пэтча. Таким образом, можно предположить, что оба связывающих центра ионных каналов, которые могут активировать канал, локализованы с цитоплазматической стороны.
Глава 5
ОКСИД АЗОТА В НАРУЖНОМ СИНАПТИЧЕСКОМ СЛОЕ СЕТЧАТКИ ПОЗВОНОЧНЫХ
Известно, что оксид азота (NO) играет важную роль в работе нервной системы [Moncada et al., 1991; Bredt, Snyder, 1992; Dawson, Snyder, 1994; Garthwaite, Boulton, 1995]. Гистохимические и иммуноцитохимические эксперименты с использованием NADPH-диа-форазы показали, что NO-синтаза - фермент, образующий оксид азота из L-аргинина - широко распространен в разных отделах мозга позвоночных [Bredt at al., 1991]. В сетчатке NO-синтаза была обнаружена в разных слоях: в эллипсоидах фоторецепторных клеток [Kim et al., 2000; Yamamoto et al., 1993a], амакриновых клеток [Yamomoto et al., 1993b], в мюллеровских клетках [Haverkamp et al., 1999], в горизонтальных клетках [Cuenca et al„ 2000], в биполярных клетках [Haverkamp, Eldred, 1998].
NO-синтаза, продуцирующая эндогенный оксид азота, является гемсодержащим металлоэнзимом (см. обзор Groves, Wang, 2000). Существуют несколько разновидностей NO-синтазы: нейронная (160 кДа), эндотелиальная (135 кДа), индуцируемая (130 кДа) и митохондриальная (127 кДа). Этот фермент является гомодимером, каждый мономер которого содержит сайты связывания кофакторов окислительно-восстановительной реакции: никотинамид-аденин-динуклеотид фосфата (НАДФ-Н), флавин мононуклеотида (ФМН), флавин-аденин динуклеотида (ФАД), кальмодулин, тетрагидробиоптерин (Н4Б) и гемовую группу. NO-синтаза катализирует двухстадийную реакцию окисления L-аргинина через N-гидрокси-Е-аргинин до цитруллина и NO. Каждый мономер NO-синтазы содержит оксидазный домен, который связывает гем, Н4Б и аргинин, - он расположен в N-конце, и ре-дуктазный домен, который связывает ФАД, ФМН и НАДФ-Н, он расположен в С-конце. Для активности фермента необходимо димерное взаимодействие между двумя оксигеназными доменами, связанными с редуктазными доменами посредством Са2+/кальмо-дулина, который осуществляет перенос электрона от флавина к гему [Panda et al., 2001].
Есть много данных, свидетельствующих о возможной роли оксида азота и в работе различных элементов сетчатки. Так, су-
759
ществуют свидетельства того, что NO может модулировать работу ионных каналов фоторецепторных клеток [Kurenny et al., 1994]. Установлено, что оксид азота воздействует на цГМФ-зави-симый синаптический ток в оп-биполярных клетках [Shiells, Falk, 1992], может активировать цГМФ-зависимый ток катионов в ганглиозных клетчатках сетчатки [Ahmad et al., 1994] и в фоторецепторных колбочках [Savchenko et al., 1997]. В этих случаях эффект NO, по-видимому, обусловлен активацией растворимой гуанилат-циклазы, так как увеличение концентрации цГМФ вызывает увеличение тока цГМФ-зависимых каналов. Однако в других рецепторных тканях обнаружено также и прямое действие NO на каналы [Broillet, Firestein, 1996; Каламкаров, Кулагина, 1999]. Таким образом, NO может влиять на величину активации цГМФ-зависи-мых каналов различными способами. Нами была обнаружена NO-синтазная активность во внутреннем сегменте фоторецепторных клеток [Kulagina, Shevchenko, 1997]. Существуют и другие работы, подтверждающие наличие NO-синтазы в фоторецепторах, а также в биполярных и горизонтальных клетках [Haverkamp, Eldred, 1998].
Одной из основных известных функций оксида азота является его способность активировать растворимую гуанилатциклазу и таким образом влиять на концентрацию внутриклеточного цГМФ. В фоторецепторных клетках большая часть гуанилатци-клазы является мембрансвязанной, однако в наружных сегментах фоторецепторных палочек быка была обнаружена и растворимая NO-чувствительная фракция [Horio, Murad, 1991; Venturini et al., 1991; Margulis et al., 1992; Margulis et al., 1998]. Так как светочувствительная проводимость фоторецепторов прямо зависит от уровня внутриклеточного цГМФ, наличие в фоторецепторных палочках и NO-синтазы и NO-чувствительной гуани-латциклазы свидетельствует о возможной роли оксида азота в фототрансдукции.
Нами было проведено определение активности NO-синтазы в различных слоях сетчатки. Мы попытались выяснить, находится ли этот фермент в нативных фоторецепторах при физиологических условиях в активной форме и способен ли регулировать концентрацию NO [Каламкаров и др., 2002]. Если же оксид азота синтезируется, может ли он, как это происходит в обонятельных [Broillet, Firestein, 1996] и слуховых клетках [Каламкаров, Кулагина, 1999], прямо влиять на активацию цГМФ-активируемых каналов?
В ряде экспериментов оксид азота измеряли в срезах сетчатки лягушки. Как известно, морфологически клетки сетчатки распределяются в ней слоями. Таким образом, получая срезы, удава
160
лось выделить относительно гомогенную фракцию, соответствующую тому или иному слою сетчатки. Сетчатка замораживалась на микротомном столике рецепторной стороной вверх, и затем срезались горизонтальные слои: первый и второй срезы толщиной 15 ± 3 мкм каждый (наружные сегменты фоторецепторов) и третий - 25 ± 5 мкм (внутренние сегменты фоторецепторов). Подробнее методы приготовления срезов и контроля полученных препаратов описаны в работах Донцова и др. [1978], Зака и др. [1974].
Образование NO регистрировалось в водорастворимой фракции, полученной из срезов соответствующих слоев сетчатки с помощью NO-селективных электродов (ISO-NO, WPI, диаметр электрода - 2 мм).
Для приготовления водорастворимых фракций белков сетчатки объединяли замороженные срезы из 5-6 сетчаток (отдельно наружные и внутренние сегменты) и проводили экстракцию, инкубируя образцы в течение 10 мин при 24 °C в буфере 10 мМ HEPES, 1 мМ MgCl2, pH 7,4. Водорастворимую фракцию отделяли центрифугированием в течение 1 ч при 20 000 об./мин. Реакция образования оксида азота начиналась после добавления к супернатанту 1-500 мкМ субстрата NO-синтазы L-аргинина и эквимолярной концентрации NADPH. Необходимо отметить, что результаты были более стабильными при добавлении 0,5 мкМ кальмодулина, который является кофактором для NO-синтазы.
Концентрация эндогенного оксида азота в интактной сетчатке при физиологических условиях измерялась с помощью NO-селективных микроэлектродов или методом ЭПР. Кончики стеклянных микроэлектродов имели диаметр 50-100 мкм, они покрывались пленкой ионообменника Nafion (Aldrich), обладающего высокой селективностью к NO по сравнению с NO2 [Malinski et al., 1993]. Чувствительность микроэлектродов в калибровочных растворах оставалась стабильной, однако довольно сильно изменялась после погружения электрода в ткань сетчатки или клеточную суспензию. Подобные необратимые изменения, наблюдавшиеся также и при использовании коммерческих электродов [Goligorsky et al., 1994], могут объясняться адгезией и взаимодействием белков с поверхностью электродов. В связи с этим калибровка электродов всегда производилась до и после измерений, и затем использовалась усредненная калибровочная кривая. Однако это могло послужить источником постоянной ошибки, например, в том случае, если необратимые изменения происходили мгновенно в результате контакта электродной поверхности с клетками. Другим источником ошибки могла стать чувствительность электрода, покрытого Nafion, к другим веществам, напри
6. Г.Р. Каламкаров, М.А. Островский
161
мер, к дофамину. Исходя из этих соображений, оптимальной представляется оценка концентрации NO, основанная на измерении фракции микроэлектродного тока, которая подавляется ингибиторами NO-синтазы.
Во время измерений изолированная сетчатка помещалась фоторецепторной стороной вверх на фильтровальной бумаге в чашку Петри, заполненную раствором Рингера так, чтобы он покрывал сетчатку на 2-3 мм. Микроэлектрод опускался вертикально с помощью пошагового манипулятора (Narishige) до момента соприкосновения с поверхностью, затем погружался еще на 60-100 мкм внутрь сетчатки - на этом уровне и производилось измерение тока.
Другим удобным методом измерения эндогенной концентрации оксида азота оказался метод ЭПР. Для измерения концентрации NO использовалась спиновая ловушка - комплекс эндогенного железа (Fe2+) с экзогенным лигандом - диэтилдитиокарбаматом (ДЭТК). Связывание NO с этими ловушками приводит к образованию парамагнитных мононитрозильных комплексов железа с ДЭТК (МНКЖ-ДЭТК), регистрируемых методом ЭПР. Оценка интенсивности сигнала ЭПР этих комплексов позволяет судить о синтезе NO в биосистеме, катализируемой NO-синтазой. МНКЖ-ДЭТК обладает гидрофобными свойствами, и поэтому в живых тканях он накапливается в клеточных мембранах. Основное преимущество такого метода состоит в том, что он позволяет измерять внутриклеточную концентрацию NO in vivo, в интактной сетчатке. Особенности метода описаны Mulsch et al. [1992].
Для введения ловушки сетчатки инкубировались 20 мин в темноте в 1 мл стандартного раствора Рингера с добавлением ДЭТК в концентрации 0,5 мМ при температуре 4 °C. Сетчатки осторожно промывались в новой порции раствора Рингера и инкубировались 5 мин в 1 мл раствора Рингера с добавлением I мкМ супероксид дисмутазы в темноте при температуре 27 °C. Иногда в конце инкубирования в раствор на 2 мин добавлялся дисульфид натрия в концентрации 20 мМ для того, чтобы убрать эндогенный Си2+, который также формирует парамагнитный комплекс с ДЭТК, который дает сигнал ЭПР со сверхтонкой структурой (СТС), частично перекрывающей сигнал МНКЖ-ДЭТК [Mordvintcev et al., 1991; Kubrina et al., 1992]. После этого каждая сетчатка замораживалась на микротомном столике для приготовления срезов наружных и внутренних сегментов фоторецепторов, как это было описано выше. Соответствующие срезы ~20 сетчаток хранились в жидком азоте до измерений.
162
Отсутствие токсичности ДЭТК проверялось по изменению параметров b-волны электроретинограммы [Donner et al., 1992]. Так, добавление в перфузионный раствор ДЭТК в концентрации 0,5 мМ приводило к временному увеличению максимального фотоответа и следующего за этим уменьшением амплитуды не более чем на 20%.
В предварительных экспериментах определялось распределение NO-ловушки в целой сетчатке. После обычной процедуры инкубирования с ДЭТК сетчатка погружалась в раствор с насыщенным содержанием NO, и затем методом ЭПР измерялась концентрация комплекса МНКЖ-ДЭТК в разных слоях сетчатки. После насыщения NO во всех слоях сетчатки регистрировался спектр ЭПР, представляющий собой сумму сигналов ЭПР МНКЖ-ДЭТК и комплексов Си2+-ДЭТК. Об интенсивности сигнала ЭПР МНКЖ-ДЭТК в этом сложном спектре можно было судить по интенсивности его компоненты А, не перекрывающейся сигналом Си2+-ДЭТК. Эта компонента А хорошо видна на рис. 5.5, А, где приведен спектр ЭПР-образца, содержащего срезы внутренних сегментов фоторецепторов. Хорошо видно, что эта компонента пропадает после ингибирования синтеза NO ме-тиларгинином. Таким образом сигнал Си2+-ДЭТК “в чистом виде” представлен на рис. 5.5, Б. Необходимо отметить, что сигнал, полученный после насыщения препарата NO в предварительных экспериментах, был намного выше, чем сигнал, полученный для эндогенного NO. Это означает, что количество ловушек NO (комплексов Ре2+-ДЭТК) в наших экспериментах не лимитировало образования МНКЖ-ДЭТК при участии эндогенного NO.
Регистрация спектров ЭПР проводилась на спектрометре Brucker ER-200 D SRC при температуре 77 °К, микроволновая частота 9,550 ГГц. Замороженные образцы срезов сетчатки помещались в кварцевый сосуд Дьюара (внутренний диаметр 5 мм), заполненный жидким азотом. Сосуд помещался внутрь квадратной кварцевой кюветы ТЕ 102, предназначенной для регистрации спектров ЭПР.
Для оценки концентрации МНКЖ-ДЭТК использовался стандартный образец - раствор МНКЖ-ДЭТК в диметилформ-амиде с известной концентрацией (0,36 мМ): проводилось сопоставление интенсивностей сигнала МНКЖ-ДЭТК в препаратах срезов сетчатки с сигналом стандартного образца. Содержание белка в образцах ЭПР определялось биуретовым методом с использованием раствора бычьего альбумина в качестве стандарта.
Измерение активности NO-синтазы. Добавление L-аргинина (1 ч- 100 мкМ) в препарат, содержащий водорастворимую фракцию наружных или внутренних сегментов, вызывало увеличение
6*
163
Рис. 5.1. Зависимость скорости образования NO в водорастворимой фракции срезов внутренних сегментов фоторецепторов от концентрации L-аргинина в присутствии 100 мкМ NADPH и 0,5 мМ СаС12
Скорость образования NO достигает максимального значения (1.,1акс) при 100 мкМ L-аргинина.
Измерения проводились с помощью NO-селективных электродов (WPI)
1g [метиларгинин]
Рис. 5.2. Ингибирование образования NO метиларгинином в экстрактах внутренних сегментов фоторецепторов
По оси ординат - величина (1ыакс - I) х 100%/1макс, где I - скорость образования NO при соответствующей концентрации метиларгивина, 1макс - скорость образования NO при 100 мкМ L-аргинина и в отсутствие метиларгинина. Измерения проводились при концентрации субстрата (L-аргинина) 100 мкМ и NADPH - 100 мкМ
концентрации NO в препаратах как внутренних, так и наружных сегментов фоторецепторов, причем, зависимости скорости образования оксида азота от концентрации L-аргинина имели сходный характер. На рис. 5.1 показана такая зависимость, являющаяся результатом 5 экспериментов, проведенных на экстрактах
164
внутренних сегментов (концентрация CaCL составляла 0,5 мМ). При этих условиях для NO-синтазы были получены значения VMaKC = 72 ± 20 пмоль NO (мг белка)-1 (мин)-' и Км = 7,4 ± 1,5 мкМ для L-аргинина. Значение VMaKC достигается при насыщающей концентрации субстрата L-аргинина 10 мкМ. В отсутствие L-ap-гинина или при добавлении D-аргинина образование NO зафиксировано не было. Результаты были стабильными и воспроизводимыми в присутствии 0,5 мкМ кальмодулина.
Образование NO ингибировалось метиларгинином (№-ме-тил-Е-аргинин). В присутствии 100 мкМ L-аргинина и 100 мкМ NADPH последовательно добавлялся метиларгинин в разных концентрациях.
На рис. 5.2 отображена зависимость ингибирования NO-син -тазы от концентрации метиларгинина. При концентрации ингибитора 100 мкМ происходило уменьшение активности образования NO в 2 раза. Как и ожидалось в случае конкурентного ингибирования, активность фермента полностью восстанавливалась при добавлении 1 мМ L-аргинина.
Зависимость активности NO-синтазы от концентрации Са2+. Для того чтобы выяснить, будет ли активен фермент при нормальной для фоторецепторных клеток концентрации Са2+, изучалась зависимость активности NO-синтазы от концентрации Са2+.
Концентрация кальция регулировалась Са2+/ЕОТА-буфером. На рис. 5.3 приведена зависимость активности NO-синтазы от концентрации свободного Са2+ в присутствии 10 мкМ L-аргинина (усреднение по результатам 5 экспериментов).
В бескальциевом растворе (1 мМ EGTA) образование NO зафиксировано не было. С повышением концентрации Са2+ увеличивалось образование NO, достигая 50% при 0,4 мкМ и максимального значения активности при 0,7 мкМ свободного Са2+. Соответственно при концентрации Са2+ 0,27 мкМ активность NO-синтазы составляла примерно 25% от максимальной, что хорошо согласуется с данными, полученными для темноадаптированных палочек жабы [Korenbrot, Miller, 1989].
Распределение активности NO-синтазы во внутренних и наружных сегментах фоторецепторов. На рис. 5.4 показано продольное распределение NO-синтазной активности в фоторецепторе по срезам: срез 1 - окончания наружных сегментов, срез 2 - основания наружных сегментов и срез 3 - внутренние сегменты. Измерения проводились с помощью NO-селективных электродов (WPI). Самая высокая активность обнаружена во внутренних сегментах, однако активность NO-синтазы в наружных сегментах оказалась также довольно высокой. Более того, отсут-
165
Рис. 5.3. Зависимость NO-синтазной активности в экстрактах внутренних сегментов от концентрации кальция
Рис. 5.4. Продольное распределение NO-синтазной активности в фоторецептор-
ном слое
Активность измерялась в водорастворимой фракции слоев сетчатки: срез I - внутренние сегменты; срез 2 - основания наружных сегментов; срез 3 - кончики наружных сегментов. Концентрация субстрата (£-api инина) - 100 мкМ
ствие падения градиента активности от основания к окончанию наружного сегмента доказывает, что наличие здесь NO-синтазной активности обусловлено не диффузией из внутреннего сегмента.
Константы Км и VMaKC определялись отдельно для препаратов, содержащих внутренние и наружные сегменты. Оказалось, что существенных различий между срезами нет, отсутствует и ощу
166
тимая разница между константами ингибирования для метиларгинина или зависимостями от концентрации Са2+. Это дает основания полагать, что в обоих исследованных слоях сетчатки фермент идентичен.
Эндогенная концентрация NO в наружном фоторецепторном слое сетчатки. Измерения эндогенной концентрации оксида азота проводились с помощью специальных микроэлектродов на расстоянии 60-100 мкм от окончаний на
Таблица 5.1.
Определение концентрации NO в фоторецепторном слое сетчатки лягушки с помощью микроэлектродов
Концентра-	Концентра	Концентра
	ция NO,	ция NO,
ция NO,	мкМ, COOT-	мкМ, COOT-
мкМ, COOT-	ветствую-	ветствующая
ветствую-	щая оста-	току, подав-
щая под-	точному	ленному ме-
ному току	току	тиларгини-
		ном
2,05 ± 0,47 0,88 ±0,15 1,17 ±0,38
ружных сегментов, при этом кончик электрода достигал уровня ядер фоторецепторных клеток. Как уже было сказано выше, измеряемый ток содержал и другие компоненты, не соответствующие NO. Поэтому после стабилизации электродного тока в перфузионный раствор добавлялся ингибитор NO-синтазы-метил аргинин. Это вызывало постепенное уменьшение тока, который через 15-30 мин стабилизировался на новом уровне, предположительно соответствующем отсутствию NO.
Измерения проводились на 6 сетчатках каждый раз с новым электродом. В табл. 5.1 даны усредненные результаты этих экспериментов. Так как калибровочная кривая зависимости тока от концентрации значительно изменялась от электрода к электроду, в каждом из экспериментов зарегистрированные значения тока сначала переводились в эквивалентные концентрации NO, а уже затем полученные значения усреднялись. Именно эти результаты и приведены в табл. 5.1.
В случае, если полный микроэлектродный ток обусловлен NO, получается наибольшее значение эндогенной концентрации оксида азота, составляющее 2,05 ± 0,47 мкМ (колонка 1). Однако, имея в виду все возможные артефакты, правильнее считать, что NO-сигнал представлен фракцией, подавляемой метиларгинином (колонка 3). Это рассуждение подтверждается и измерениями концентрации NO с помощью спин-ловушки (см. ниже), которые доказывают фактически полное ингибирование эндогенного образования NO после добавления 1 мМ метиларгинина. В итоге, считая наиболее верным расчет концентрации NO по величине тока, подавляемого метиларгинином, получаем, что стационар-
167
A
325	330	335	340	345	350	355 мТ
Рис. 5.5. Спектры ЭПР образцов, содержащих срезы внутренних сегментов фоторецепторов
А - спектр ЭПР образца срезов 20 сетчаток с введенным ДЭТК (0,5 мМ); Б - спектр ЭПР образца срезов 20 сетчаток с введенным ДЭТК (0,5 мМ), предварительно инкубированных с 1 мМ метиларгинина в течение 30 мин
ная концентрация оксида азота в области проксимальных частей фоторецепторов равна 1,17 ± 0,38 мкМ.
Другим подходом к измерению эндогенной концентрации оказался метод ЭПР. Техника ЭПР позволяет в представленных экспериментах измерять внутриклеточную концентрацию NO, накапливающегося в составе МНКЖ-ДЭТК к моменту замораживания препарата в интактной клетке в полностью интактной сетчатке. На рис. 5.5 приведены типичные спектры ЭПР препарата, содержащего срезы внутренних сегментов фоторецепторных клеток. Ни один из возможных источников образования NO добавлен не был. Спектр содержит легко определяемую компоненту сигнала МНКЖ-ДЭТК (на рис. 5.5, А она обозначена А). По величине этой компоненты можно было определить число парамагнитных комплексов и, следовательно, количество NO по отношению к количеству белка в пробе. Калибровка дает среднее значение 25 ± 12 нмоль NO (мг белка)-' для 6 экспериментов.
Однако наиболее интересным результатом, полученным методом ЭПР, является полное исчезновение сигнала МНКЖ-ДЭТК в том случае, если до начала измерений сетчатка была инкубирована в растворе, содержащем 1 мМ метиларгини-на (рис. 5.5, Б). Это позволяет сделать вывод, что ингибитор проникает в интактную клетку достаточно хорошо, чтобы практически полностью подавить образование NO, что и подтверждает выбор истинного NO-сигнала во время измерений с помощью NO-чувствительных микроэлектродов (см. выше).
Действие оксида азота на электрические ответы сетчатки и зрительных клеток. Поскольку в слое фоторецепторов нами обнаружена высокая концентрация оксида азота, интересно посмотреть, действует ли оксид азота на фотоответы зрительных клеток. В первой серии экспериментов было исследовано влияние NO на амплитуды b-волны ЭРГ лягушки [Лунгина и др., 2001]. Рис. 5.6 отражает изменения амплитуды b-волны ЭРГ (Umax) в ответ на насыщающую вспышку в течение одного из шести аналогичных экспериментов. После стабилизации амплитуды ответа сетчатки, перфузируемой стандартным раствором Рингера, была произведена замена на раствор, содержащий SIN-1. В ходе эксперимента наблюдалось стабильное увеличение амплитуды ЭРГ при замене стандартного перфузирующего раствора на раствор с добавлением SIN-1, амплитуда b-волны ЭРГ возрастала в среднем на 30% при добавлении NO. В результате обратной замены раствора, содержащего SIN-1, на стандартный происходило уменьшение UMaKC до начального значения. В дальнейшем характер влияния NO сохранялся - амплитуда ответа сетчатки увеличивалась в среднем на 30% при замене стандартного
169
Время, мин
Рис. 5.6. Влияние оксида азота на ЭРГ лягушки
Изменение во времени амплитуды б-волны ЭРГ (UMalIC) в ответ на насыщающую вспышку. / - перфузия стандартным раствором Рннгера; 2 - перфузия тем же раствором с добавлением 0,1 мкМ SIN-1. Справа - пример регистрации ЭРГ
перфузирующего раствора Рингера на раствор, содержащий SIN-1. Необходимо отметить интересную особенность. Во всех экспериментах при первой замене стандартного раствора на раствор, содержащий SIN-1, происходило лишь незначительное увеличение амплитуды ЭРГ. Однако замена на исходный раствор Рингера вызывала уменьшение амплитуды на 30%, а в результате следующего добавления SIN-1 UMaKC вновь увеличивался на 30%. В дальнейшем характер изменения амплитуды был абсолютно стабильным - увеличение амплитуды b-волны ЭРГ при добавлении NO и уменьшение после замены на стандартный раствор. На рис. 5.6 (в верхнем правом углу) представлен типичный пример регистрации b-волны ЭРГ после насыщающей вспышки.
170
Для контроля был поставлен аналогичный эксперимент с использованием раствора SIN-1, выдержанного в течение 24 ч. В этом случае амплитуда ЭРГ оставалась неизменной до и после замены раствора.
Во второй серии экспериментов подобным образом было исследовано влияние NO на амплитуду аспартат-выделенного потенциала сетчатки лягушки. В этом случае сетчатку перфузировали стандартным раствором Рингера с добавлением аспартата натрия, который блокирует синаптическую передачу между фоторецепторами и нейронами второго порядка. Следовательно, можно полагать, что амплитуда аспартат-выделенного потенциала отражает вклад в ЭРГ фоторецепторной и глиальной компонент.
На рис. 5.7 представлен пример изменения амплитуды аспартат-выделенного потенциала после добавления и отмывания SIN-1 в ходе аналогичного первому эксперимента. Хорошо видно, что NO влияет сходным образом на амплитуду аспартат-выделенного потенциала и ЭРГ. Имеет место такое же стабильное увеличение амплитуды аспартат-выделенного потенциала на 30% в результате замены стандартного перфузирующего раствора на раствор, содержащий SIN-1, и обратное уменьшение амплитуды после отмывания. Интересным является тот факт, что так же, как и в первом случае, при первом добавлении SIN-1 заметного изменения амплитуды не наблюдалось, однако дальнейшие уменьшение и увеличение амплитуды были абсолютно стабильными.
Следующий эксперимент был поставлен для проверки предположения о возможности влияния NO непосредственно на работу фоторецепторов и собственно ЦН-каналов. В данном случае регистрировался фотоответ изолированной палочки саламандры методом всасывающего электрода. Подробно условия измерения описаны нами в главе 6. На рис. 5.8 представлен пример записи ф< »тоответов от одиночной клетки до и после перфузии наружного сегмента раствором, содержащим S-нитрозоцистеин. Как видно в случае изолированной клетки, заметного эффекта оксид азота не дает. (Не было обнаружено эффекта и в том случае, когда в пипетку засасывался наружный сегмент, а внутренний сегмент перфузировался раствором, содержащим NO). Небольшое уменьшение амплитуды фотоответа и скорости восстановления сетчатки после вспышки, вероятно, объясняется естественным ухудшением физиологических свойств выделенной сетчатки с течением времени.
NO-синтаза в наружном и внутреннем сегментах фоторецептора. В результате гистохимических исследований (с использованием NADPH-диафоразы и антител) NO-синтаза была
171
Время, мин
Рис. 5.7. Изменение во времени амплитуды аспартат-выде-ленного потенциала в ответ на насыщающую вспышку.
/ - перфузия стандартным раствором Рингера; 2 - перфузия тем же раствором с добавлением 0,1 мкМ SIN-1
Рис. 5.8. Регистрация фототока от одиночного фоторецептора - палочки лягушки
Контрольные кривые регистрировали в стандартном растворе Рингера. Среднюю кривую (SIN-1) регистрировали после добавления в перфузирующий раствор 0,1 мкМ S1N-1
ранее обнаружена только во внутреннем сегменте фоторецепторов [Liepe et al., 1994; Kurenny et al., 1994]. Однако оказалось, что NO-синтазная активность во внутреннем сегменте наибольшая, однако и в наружных сегментах также было обнаружено существенное образование NO. Поскольку активность NO-син-тазы в апикальной и базальной частях наружных сегментов практически не различалась (см. рис. 5.4), есть основание утверждать, что фермент присутствует в обоих сегментах, а не образуется только во внутреннем сегменте и затем транспортируется в наружный. Важно отметить, что в препаратах срезов слоев сетчатки, содержащих нейроны второго порядка, NO-синтазная активность нами не зафиксирована. Это обстоятельство под
772
черкивает принадлежность этого фермента именно фоторецепторному слою.
Активность фермента зависит от концентрации кальция, причем характеристики этой зависимости в фоторецепторных, эндотелиальных клетках [Palmer, Moncada, 1987; Mayer et al., 1989] и клетках мозга [Bredt et al., 1990] сходны. Эти результаты согласуются с результатами Venturini et al. [1991], полученными на препаратах наружных сегментов палочек быка: схожи Км для L-аргинина и согласуются параметры ингибирования метиларгинином. Отличается лишь полученная величина максимального образования NO - она оказалась примерно в четыре раза больше, но это различие не так уж значимо. Во-первых, ни в одном из случаев фермент не выделялся в чистом виде, поэтому нормализация к общему содержанию белка во фракции условна. Во-вторых, измерения проводились в водорастворимой фракции, на что могли повлиять различия в процедуре приготовления препарата и различия между животными.
Согласно данным Venturini et al. [1991], 50%-ная активность фермента достигается при 600 нМ SIN-1 Са2+, а согласно нашим данным, - при 400 нМ. Существуют и другие данные [Bredt, Hwang, 1990]: 50%-ная активность NO-синтазы, выделенной из мозжечка крысы, достигается при 200 нМ Са2+, а максимальная активность - при 1 мкМ Са2+. Внутриклеточная концентрация свободного Са2+ в наружных сегментах палочек жабы составляет примерно 270 нМ [Korenbrot, Miller, 1989], при освещении, как известно, она может только уменьшаться. Следовательно, согласно данным Venturini et al. [1991], NO-синтаза в наружных сегментах должна быть в значительной мере инактивирована при физиологической концентрации Са2+, тогда как, по нашим данным, активность фермента должна будет составлять -25% при 270 нМ Са2+. Необходимо отметить, что ситуация значительно отличается во внутреннем сегменте, где активность NO-синтазы существенно выше и где концентрация кальция неизвестна.
Эндогенная концентрация NO в фоторецепторном слое. Наиболее интересен результат, свидетельствующий о достаточно высокой постоянной концентрации NO вокруг проксимальных частей фоторецепторов в интактной сетчатке. Однако основной проблемой измерений с помощью NO-селективных электродов остается их чувствительность к другим, отличным от NO веществам, например, дофамину, а также другие артефакты. Поэтому для оценки концентрации NO использовалась фракция электродного тока, подавляемая метиларгинином. Эта фракция составила -1 мкМ NO. Такая оценка кажется обоснованной, так как активность NO-синтазы в растворе блокируется в присутствии 0,1 мМ
173
метиларгинина (см, рис, 5.2). Об этом свидетельствует факт полного исчезновения сигнала ЭПР МНКЖ-ДЭТК в образцах, обработанных в течение 1 ч метиларгинином в концентрации 1 мМ (см. рис. 5.5, Б). Дальнейшие исследования доказали, что способность метиларгинина проникать в клетку достаточна для блокады NO-синтазы in citu. Хотя нельзя полностью исключать и другие, менее очевидные, источники ошибки. Так, например, обусловленное метиларгинином изменение концентрации NO может подействовать на концентрацию дофамина, что в свою очередь повлияет на результаты.
Принципиально важно, что эндогенная концентрация оксида азота, измеренная с помощью NO-электрода, по порядку величины совпадает с оценочным значением, полученным в результате применения принципиально иного метода - метода ЭПР. Такая оценка показала, что за 30 мин во фракции накапливалось 25 пмоль NO/мг белка. 1 мг белка, представленного во фракции в основном родопсином, соответствует количеству вещества ~29 пмоль. Отсюда следует, что 1 молекула NO приходилась на 1000 молекул родопсина. Так как концентрация родопсина в наружном сегменте составляет порядка 1 мМ [Pugh, Lamb, 1990; Pugh, Labm, 1993], получаем примерно микромолярную концентрацию NO.
Интересно сравнить полученную нами концентрацию NO ~ 1 мкМ с данными, полученными для других тканей: максимальная эндотелиальная концентрация NO, зафиксированная в эндокарде кролика, составила 0,95 мкМ [Brovkovych et al., 1999], в почках крысы она оказалась еще меньше -0,11 мкМ [Levine et al., 2001].
Поскольку в зрительной клетке нами обнаружена большая эндогенная концентрация оксида азота, естественно было бы предположить, что NO играет регуляторную роль в процессах фототрансдукции. Но это не так. Обнаружено действие доноров NO на ЭРГ. Но основной вклад при записи b-волны электрорети-нограммы вносят оп-биполярные и глиальные клетки, хотя также существуют данные о влиянии нейронов третьего порядка [Dong, Hare, 2000]. Поэтому влияние NO на амплитуду ЭРГ еще раз подтверждает данные о возможном участии оксида азота в процессе передачи зрительного сигнала на уровне синапса между фоторецепторами и горизонтальными клетками [Savchenko et al., 1997] и на уровне ганглиозных клеток [Ahmad et al., 1994]. К сожалению, этот эффект, наблюдаемый при записи b-волны ЭРГ, не позволяет сделать более точные выводы о том, на каком именно этапе это происходит.
Влияние оксида азота на амплитуду аспартат-выделенного потенциала свидетельствует о чувствительности глиальных
174
и/или фоторецепторных клеток. Однако сравнительно небольшая для физиологии величина эффекта (30%) и отсутствие влияния NO на фотоответ одиночного фоторецептора позволяет предположить, что мы имеем дело с второстепенным или резервным механизмом, в норме не задействованным в процессе фототрансдукции.
Как уже было сказано, влияния NO на мембранные токи наружного сегмента палочки обнаружено не было, хотя наблюдалось 30%-ное увеличение амплитуды аспартат-выделенного потенциала. Существование работы, подтверждающей влияние NO на активность растворимой гуанилатциклазы [Garthwaite et al., 1988], позволяет предположить, что оксид азота, синтезируемый во внутреннем сегменте, участвует в синаптической передаче между фоторецепторами и оп-биполярными клетками. Возможно, NO влияет на величину мембранного потенциала внутреннего сегмента, активируя гуанилатциклазу и таким образом увеличивая уровень цГМФ. Существованием подобного эффекта может объясняться “защита” ЦН-каналов наружного сегмента от влияния оксида азота, имеющего совершенно другую мишень.
Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод, что оксид азота, синтезируемый во внутренних сегментах фоторецепторов, не участвует в процессе преобразования светового импульса в самом фоторецепторе, однако может влиять на работу нейронов второго и третьего порядков.
Оксид азота и цГМФ-активируемый ток. Ранее было обнаружено, что NO может прямо влиять на активность ЦН-зависи-мых каналов обонятельных нейронов [Broillet, Firestein, 1996] и слуховых клеток [Каламкаров, Кулагина, 1999]. Однако вопрос, играет ли такой механизм существенную роль в работе обонятельных или механорецепторных клеток, остался открытым. Ни в обонятельных, ни в механорецепторных клетках существенная концентрация NO не обнаружена. Зарегистрированная нами довольно высокая активность NO-синтазы в препаратах срезов слоя фоторецепторов и в интактной сетчатке позволяла предположить, что NO может играть существенную роль в механизме фототрансдукции, прямо активируя цГМФ-зависимые каналы. Более того, ранее нами было показано, что реагенты, модифицирующие SH-группы, могут прямо активировать цГМФ-регулиру-емые каналы в фоторецепторной клетке [Donner et al., 1990].
В предыдущей главе описано влияние различных доноров NO на величину интегрального тока цГМФ-активируемых каналов наружного сегмента палочки лягушки. В этих экспериментах очевидного прямого влияния на проводимость каналов, аналогичного действию на каналы из слуховых волосковых клеток или
175
обонятельных нейронов, обнаружено не было. Хотя в разных экспериментах модификация SH-групп нуклеотидрегулируемых каналов из фоторецепторных клеток, обонятельных нейронов и слуховых волосковых клеток в одинаковой степени приводила к активации каналов.
Отсутствие влияния NO на проводимость нуклеотидрегулируемых каналов из наружного сегмента фоторецепторных палочек позволяет предположить, что прямое действие оксида азота на ионные каналы вряд ли может играть физиологическую роль во всяком случае в сенсорных клетках. По-видимому, такой механизм является лишь следствием химической природы взаимодействия оксида азота с цистеинами белка, формирующего канал. Вероятно, в клетках, где NO существует in vivo (фоторецепторных клетках), цГМФ-активируемые каналы к нему не чувствительны. Напротив, в том случае, когда нативная концентрация оксида азота в клетке высокая, существует специальный механизм, который препятствует взаимодействию NO с ионным каналом.
Глава 6
РЕГУЛЯЦИЯ pH В ЗРИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКЕ И ЕЕ РОЛЬ В МЕХАНИЗМАХ ФОТОТРАНСДУКЦИИ
Процессы, вызывающие закисление в зрительной клетке
В фоторецепторах постоянно происходят процессы, которые могли бы вызывать быстрое внутриклеточное закисление. Во внутреннем cei менте клетки это интенсивный метаболизм, приводящий к образованию лактата и СО2 [Winkler, 1981, 1986]. В наружном сегменте - процессы синтеза и гидролиза цГМФ. Ниже приводятся оценки интенсивности производства Н+ в ходе этих процессов.
Наружный сегмент. Как при гидролизе, так и при синтезе цГМФ выделяется один протон [Goldberg et al., 1983]. Темновая скорость гидролиза цГМФ составляет, по оценкам, 2,5-3 мМ в секунду [Pugh, Lamb, 1990], что предполагает выделение 5-6 мМ Н+/с в темноте. При интенсивном освещении скорость гидролиза цГМФ возрастает примерно в 10 раз, что приводит к выделению ~50 мМН /с.
Внутренний сегмент. Большая часть АТФ образуется во внутреннем сегменте в результате анаэробных процессов [Winkler, 1981, 1986]. Это подтверждается косвенно и тем, что интактная сетчатка достаточно долго активна в бескислородной среде [Donner et al., 1987]. Здесь мы приведем оценки для двух случаев:
(1) АТФ продуцируется исключительно за счет окислительного фосфорилирования, (2) АТФ производится исключительно вследствие гликолиза.
1. Темновой ток в палочке саламандры составляет 80 рА, что соответствует 80 х 10-'7 молекул/с. Предполагая, что этот ток поддерживается исключительно Ыа+-К+-АТФазой и учитывая, что 1 молекула АТФ обеспечивает перенос 3 ионов Na+, получим 28 х 10-17 молекул АТФ в секунду. При окислительном фосфорилировании 36 АТФ и 6 СО2 генерируется на одну молекулу глюкозы и таким образом должно производиться (28/6) х 10-'8 молекул СО2 в секунду. Учитывая, что объем ВС составляет 1,6 пл, при полностью аэробных условиях скорость производства СО, составит 30 мМ/с.
Конечно, следует учесть, что при низких значениях pH СО, будет легко диффундировать, не гидрируясь, из клетки, однако
177
рК карбоновой кислоты составляет 6,1. Следует также учитывать, что скорость диффузии СО2 зависит от типа клетки.
2. При анаэробных условиях образуются две молекулы АТФ и две молекулы лактата на молекулу глюкозы. Таким образом, лактат продуцируется с скоростью 28 х КТ17 молекул/с, или 170мМ/с.
В стационарном состоянии ресинтез ГТФ из цГМФ должен осущестляться при поглощении Н+, и это должно было бы создавать баланс. Однако следует учесть, что ферменты, осуществляющие эту реакцию, локализованы не в наружном, а во внутреннем сегменте клетки [Berger et al., 1980] и, таким образом, эта реутилизация не может предотвратить ацидоз в НСП.
Существование таких мощных источников закисления требует наличия в клетке специальных механизмов поддержания оптимального внутриклеточного pH. Обычно внутриклеточный pH поддерживается в состоянии выше термодинамического равновесия, и такой механизм должен работать против электрохимического градиента. Предотвратить внутриклеточный ацидоз можно, экстаргируя из клетки Н+ или закачивая в клетку НСО3. В последнем случае НСО3 взаимодействует с протоном, образуя СО2, который может диффундировать из клетки. Соответственно известны два типа обменников: №+/Н+-обменник и НСО3 /С1-обменник.
Па+/Н+-обмен как способ поддержания pH обнаружен в плазматических мембранах многих клеток [Piwnica-Worms et al., 1988]. Одной из характерных черт этого процесса является то, что он ингибируется амилоридом и другими производными пиразина [Benos, 1988]. Па+/Н+-обмен может быть также заингибиро-ван заменой в среде Na+ на К+ [Aronson, 1985; Mahnesmith, Aronson, 1985]. Эти два теста и используются обычно для его обнаружения в клетках.
Существуют три типа НСО3 /СГ-обмена в клетках: Na-неза-висимый НСО3 /СГ-обмен, сопряженный с Na+ HCOj /СГ-об-мен [Thomas, 1984; Boron, Knakal, 1992] и электрогенный Na+/ НСО3 /CL-транспорт [Boron, Boulpaep, 1983; Hughes et al., 1989; La Cour, 1989].
В данном разделе изложены результаты наших исследований механизмов регуляции pH в фоторецепторных клетках и их роли в модуляции процессов фототрансдукции [ Donner et al., 1990b; Каламкаров и др., 1992; Koskelainen et al, 1992, 1994; Kalamkarov et al., 1996].
178
Регистрация внутриклеточного pH в слое фоторецепторов
Для доказательства присутствия в зрительной клетке указанных выше механизмов мы прямо измеряли внутриклеточный pH с помощью флуоресцентных красителей, пытаясь различными способами ингибировать или активировать возможные механизмы поддержания pH - Na+/H+- и НСО3'/СГ-обменники.
Внутриклеточный pH измерялся в фоторецепторных клетках полностью обесцвеченной сетчатки лягушки с помощью внутриклеточного красителя 2,7,-бис(2-карбоксиэтил)-5,6-карбокси-флуоресцеин (БКФ). Флуоресценция в пике эмиссии (525 нм) при возбуждении светом 490 нм линейно зависит от величины pH. Однако эти изменения могут включать также и не зависимые от pH изменения, в частности, утечку красителя из клетки. Эти изменения могут быть учтены при регистрации эмиссии при 440 нм, которая не зависит от pH. Таким образом, измерение отношения I440/I525 обусловлено только изменениями внутриклеточного pH. Подробно детали метода описаны в [Paradiso et al., 1987: De Vries, Schwartz, 1989; Takahashi et aL, 1993].
Флуоресценция измерялась прямо в слое фоторецепторов в интактной сетчатке, что давало определенные преимущества. Во-первых, сигнал флуоресценции, усредненный от мнот их клеток, был значительно интенсивнее, что позволяло получать значительно лучшее отношение сигнал/шум; во-вторых, фоторецепторы в изолированной сетчатке значительно нативнее. Такое измерение удавалось благодаря морфологическим особенностям сетчатки. Слой фоторецепторов занимает всю ее поверхность на глубину 60 мкм, что дает возможность регистрировать флуоресценцию от поверхности при том, что вклад других слоев значительно ниже. Кроме того, и это наиболее важно, добавляя краситель к сетчатке с рецепторной стороны и отмывая его через несколько минут, удалось найти условия, в которых флуоресцентный краситель проникал только в фоторецепторные клетки. Распределение красителя проверялось в специальных экспериментах. Его концентрация определялась в проксимальных срезах толщиной 20 мкм (т.е. в условиях, когда удавалось разделять наружный и внутренний сегменты). Результаты гель-электрофоре-за 6 таких срезов показаны на рис. 6.1. Видно, что в срезах наружных сегментов присутствуют только родопсин, трансдуцин и арестин - характерные белки наружного сегмента. Отсутствие в ощутимых количествах других белков свидетельствует о том, что в срезах наружного сегмента отсутствуют примеси внутреннего сегмента.
179
1
..........L_J___I___I____I	I__ 100.....50______10
Молекулярный вес, кДа
Рис. 6.1. Электрофорез в полиакриламидном геле срезов наружных сегментов палочки лягушки
Основные полосы отмечены буквами: а - арестин; Ъ - родопсин; с - трансдуцин
В срезах внутреннего сегмента, напротив, практически нет родопсина и, кроме других белков, присутствует арестин, значительное количество которого, как известно, локализовано именно во внутреннем сегменте. Кроме того, срезы наружных сегментов не содержали сукцинатдегидрогеназы - маркерного белка митохондрий, которых много во внутреннем сегменте, но которые отсутствуют в наружном.
Раствор, содержащий БКФ, каплями наносился на сетчатку с рецепторной стороны и после трехминутной инкубации сетчатка промывалась чистым раствором Рингера. При таких условиях обработки флуоресценция была обнаружена только в наружных сегментах, и поэтому можно предполагать, что изменения флуоресценции отражают по крайней мере изменения pH в фоторецепторном слое сетчатки. Кроме того, сетчатка помещалась в измерительный отсек так, что к ФЭУ была обращена ее фоторецепторная сторона. Поскольку интенсивность регистрируемой флуоресценции сильно падает с толщиной препарата, то это создавало дополнительные условия для регистрации флуоресценции именно от фоторецепторного слоя. Стационарное значение внутриклеточного pH в начале эксперимента в растворе Рингера, не содержащем бикарбоната, составило 6,68 ± 0,05 (pH 7,5, среднее по 11 экспериментам). Такое значение несколько ниже того, ко
180
торое обычно находят в нейронах, и причины этого будут изложены в обсуждении. На величину внутриклеточного pH существенно влияло присутствие в среде бикарбоната. Так, в 7 случаях сетчатка с самого начала инкубировалась в растворе Рингера, содержащем бикарбонат. Значение pH увеличивалось в этом случае до 6,90 ±0,15.
Na+/H+ и НСО3/С1 -обмен в зрительных клетках
Существуют два, хотя и не очень специфичных, но достаточно достоверных способа выявления На+/Н+-обмена в клетках.
1. Замена экстраклеточного Na+ на К+ или холин должна приводить к внутриклеточному закислению, так как калий не может заменить натрий в процессе обмена.
2. Амилорид - блокатор практически всех трансмембранных процессов, включающих участие натрия, также должен вызывать внутриклеточное закисление.
Na+ на К+ заменялся в растворе Рингера, не содержащем бикарбоната, чтобы свести к минимуму влияние регуляторов pH, использующих градиент бикарбоната в среде. Типичный эксперимент такого рода представлен на рис. 6.2. Замена в растворе 95 мМ Na+, 3 мМ К+ на 98 мМ К+ приводит к медленному монотонному закислению внутриклеточной среды. В восьми подобных экспериментах средняя скорость закисления составила 0,024 единицы pH в минуту. После того как внутриклеточный pH уменьшался на 0,08 единицы, К+ заменяли на Na+, и это приводи-
Na+t К+ ______I_______I_______I________L
0	10	20	30	40
Время, мин
Рис. 6.2. Эффект замены внеклеточного натрия на калий
Через 3 мин после начала регистрации 95 мМ NaCl были заменены на KC1 (отмечено линией). Затем калиевый раствор заменяли на нормальный раствор Рингера
131
6,56
2- 6,54
| 6,52
। 6’50
“ 6,48
_i__________।_________i_________i_________i
0	10	20	30	40
Время, мин
Рис. 6.3. Действие амилорида на внутриклеточный pH в слое фоторецепторов сетчатки
Измерения проводили в фосфатном буфере при pH 7,5. В промежуток времени, отмеченный линией, в буфер был добавлен 1 мМ амилорида
ло к медленному восстановлению внутриклеточного pH. В том случае, когда внутриклеточное закисление не превышало 0,3 единицы pH, эффект обычно был полностью обратим. В тех же случаях, когда pH изменялся на 0,6-0,8 единиц, pH внутри клетки уменьшался необратимо.
Добавление 1 мМ амилорида в раствор, не содержащий бикарбоната, всегда приводило к внутриклеточному закислению (рис. 6.3). Однако замена раствора, содержащего амилорид, на обычный раствор Рингера не приводила к восстановлению исходного pH, а лишь приостанавливала процесс внутриклеточного закисления. Это связано, по-видимому, с тем, что даже при длительной перфузии не удается полностью отмыть амилорид, и значительная часть обменника остается блокированной. В некоторых случаях, когда отмывание амилорида происходило при относительно небольшом изменении внутриклеточного pH (не больше чем на 0,2 ед.), нам удавалось достигнуть практически полного восстановления исходного pH.
Транспорт бикарбоната в фоторецепторах
Добавление бикарбоната увеличивает pH. В экспериментах, представленных на рис. 6.4^4, сетчатка инкубировалась сначала в растворе Рингера, не содержащем бикарбоната (12 мМ фосфатный буфер). После стабилизации pH 6 мМ фосфата в растворе заменялось на 6 мМ бикарбоната. В шести подобных экс-
182
7,1 -
7,0 -
6,9 -
6,8 -
6,7 -
0	10	20	30	40	50
О 10	20	30
Время, мин
40	50
Рис. 6.4. Влияние увеличения концентрации бикарбоната и ДИДС иа внутриклеточный pH
А - регистрацию проводили в 12 мМ фосфатном буфере, не содержащем бикарбонат. В промежуток времени, отмеченный линией, раствор был заменен на бикарбонатный буфер (6 мМ бикарбоната + 6 мМ фосфата). Б - влияние ДИДС на эффект увеличения концентрации бикарбоната В - промежуток времени, отмеченный линией, ДИДС добавлялся в раствор, содержащий 6 мМ бикарбоната и 6 мМ фосфата
периментах эта процедура приводила к внутриклеточному защелачиванию. Эффект был обратимым: при обратной замене на фосфат первоначальное значение pH восстанавливалось. В 10 подобных экспериментах pH увеличивался н? 0,26 ± 0,04 единицы pH.
Следует отметить, что увеличение концентрации НСО3 при постоянном значении внеклеточного pH должно обязательно сопровождаться увеличением концентрации СО2 как снаружи, так и внутри клетки, поскольку СО2 свободно диффундирует через мембраны. Гидрирование внутри клетки должно вызывать осво
183
бождение протона и таким образом уменьшать величину pH. Тем не менее мы наблюдаем подщелачивание, и это является сильным аргументом в пользу того, что в клетке присутствует механизм транспорта бикарбоната. Может показаться странным (см. рис. 6.4,Л), что даже в самой начальной фазе не наблюдается закисления. Это обстоятельство, однако, объясняется медленной скоростью гидрирования СО2 в отсутствие карбоангидразы [Musser, Rosen, 1973; Linser, Moscona, 1984].
Известно, что НСО J/СЕ-обмен ингибируется производными стильбена, такими как ДИДС и СИТС. В наших экспериментах добавление 0,2 мМ ДИДС к раствору, содержащему бикарбонат, приводило к стабильному монотонному закислению (см. рис. 6.4,5). Однако в этом случае, как и с амилоридом, эффект не был полностью обратим. Отмывание ДИДС приводило лишь к предотвращению индуцированного им закисления, но не приводило к восстановлению исходного pH.
Уменьшение концентрации СЕ приводит к росту внутриклеточного pH. В следующей серии экспериментов мы изучали, участвует ли НСОз/С1--обмен в транспорте бикарбоната. Если это так, то снижение внутриклеточной концентрации СЕ должно приводить к ускорению транспорта HCOj и таким образом к внутриклеточному защелачиванию. Замена в среде 95 мМ NaCl на глюконат натрия действительно приводила к существенному снижению внутриклеточного pH (рис. 6.5,Л). Эффект был полностью обратимым при обратной замене в растворе глюконата натрия на хлорид натрия. На одной и той же сетчатке эта процедура может быть повторена несколько раз. Более того, внутриклеточное закисление аддитивно. Так, в том случае, когда сначала только половина хлорида замещалась глюконатом, а затем хлорид замещался полностью, повторное закисление было практически таким же, как и первое.
Защелачивание, индуцированное заменой хлора, чувствительно к ДИДС. Если описанный ранее эффект удаления хлора обусловлен НСОз/СЕ-обменом, то он должен быть чувстителен к ДИДС. Результаты влияния ДИДС представлены на рис. 6.5,5. Эксперимент проводился следующим образом. Сначала, как описано выше, 95 мМ СЕ замещалось глюконатом, что приводило к внутриклеточному защелачиванию. Затем, в момент достижения максимального эффекта, глюконат вновь замещался на хлорид. Последующее добавление ДИДС приводило к сильному ускорению закисления, индуцированного увеличением хлорида в среде. Затем, когда величина pH достигала своего первоначального значения, хлорид натрия вновь заме-
154
Clf	Cl-f
0	10	20	30	40	50	60
Время, мин
Cl-f СГ t
_i______i______।_______i_______i______i______i
0	10	20	30	40	50	60
Время, мин
Рис. 6.5. Влияние замещения ионов хлора иа внутриклеточный pH
А - замена хлорида на глюконат приводит к ДИДС-чувствительному защелачиванию внутри клетки. В моменты времени, указанные линией, 95 мМ NaCI заменялись на эквивалентное количество глюконата натрия. Повторная замена хлорида на глюконат приводила практически к такому же эффекту, как и первая. Б - на рисунке представлен эксперимент, аналогичный описанному в Л, но при повторной замене хлорида на глюконат в растворе присутствовало 0,2 мМ ДИДС. Эффект защелачивания, индуцированный заменой хлорида на глюконат, существенно уменьшался в присутствии ДИДС
щался на глюконат. Эффект защелачивания в этом случае был значительно меньше.
В фоторецепторной клетке существует №а+-зависимый НСО3/СГ-обменник. Чтобы определить тип обменника, работающего в фоторецепторной мембране, описанные выше эксперименты проводились в безнатриевой среде. Сначала NaCI в среде инкубации замещался на К.С1, а затем КО замещался на глюконат. Если бы эти манипуляции приводили к внутриклеточному
185
X 6,90
6,80
0	5	10	15	20
Время, мин
Рис. 6.6. Внутриклеточное защелачивание, вызванное заменой хлора на глюконат, происходит и в растворе, не содержащем натрий (95 мМ NaCl заменялись KCI)
В момент времени t = 0 сетчатка находилась в безнатриевом растворе 2 мин. Линией отмечено время, в течение которого 95 мМ КО было заменено на глюконат калия
защелачиванию, это означало бы, что НСО3 /С1~-обмен не зависит от натрия. Эксперименты, поставленные в соответствии с таким протоколом, представлены на рис. 6.6. Чтобы избежать сильного закисления, вызванного удалением из среды натрия, хлорид замещался на глюконат уже через 3,5 мин после удаления натрия. Защелачивание, индуцированное такой заменой, было достаточно сильным. Это позволяет предполагать, что значительная часть транспорта бикарбоната осуществляется натрий-независимым НСО3 /С1--обменником.
Выше отмечалось, что как в наружном, так и во внутреннем сегментах фоторецепторной клетки происходят процессы, которые могли бы приводить к сильному ацидозу. Очевидно, что pH в фоторецепторе должен поддерживаться в достаточно узком диапазоне значений, так как фоточувствительность клетки зависит от pH [Liebman et al., 1984; Meyertholen et al., 1986]. Механизм поддержания pH, использующий натриевый градиент, который на плазматической мембране достаточно высок, представляется оптимальным путем регуляции pH. Менее очевидна роль натрий-независимого НСО3 /О -обмена. Если хлорид находится в состоянии термодинамического равновесия, то такой обменник будет стремиться сдвинуть pH к состоянию равновесия. Поскольку на-трий-зависимые обменные механизмы поддерживают pH при более низких значениях, то эти два класса обменников будут работать в противоположные стороны [Olsnes et al., 1987]. Такой ме
186
ханизм мог бы более эффективно регулировать гомеостаз pH, так как будет приводить клетку к стационарному значению pH быстрее как в случае внутриклеточного закисления, так и в случае внутриклеточного защелачивания.
Однако возможны и другие причины. Хлорид может и не находиться в зрительных клетках в состоянии термодинамического равновесия. Есть данные, что Ес[_ в палочках положителен даже при темновых значениях потенциала [Bader et al., 1982; Somlyo, Walz, 1985]. In vivo внутриклеточный pH может оказаться достаточно высоким, и На+/Н+-обмен не сможет обеспечить его регуляцию, так как имеет низкий рК [L’Alleman, 1985; Al Awqati, 1986; Chaillet et al., 1986; Tonnessen et al., 1987]. В этом случае pH может снижаться за счет экстракции из клетки НСО3.
Изменения фоточувствтительного тока в палочке при изменении внутриклеточного pH
В предыдущем разделе было показано, что в фоторецепторной клетке содержатся несколько типов ионных обменников, которые в совокупности могут поддерживать внутриклеточный pH в достаточно узком диапазоне значений, обеспечивая оптимальную работу зрительной клетки. Однако сам по себе факт, что в клетке локализованы те или иные обменники, мало говорит о роли этих структур в физиологии фоторецептора. Кроме того, как указывалось выше, фоторецепторная клетка состоит из двух пространственно и функционально разделенных частей. Как источники внутриклеточного закисления, так и процессы, протекающие в этих частях клез ки, существенно различаются.
В настоящем разделе мы опишем возможную физиологическую роль описанных выше механизмов регуляции pH отдельно в наружном и внутреннем сегментах фоторецепторной клетки. Используя метод всасывающего электрода, ток можно одинаково эффективно регистрировать, засасывая в пипетку внешний или внутренний сегмент. При этом воздействию перфузата остается доступной только свободная часть клетки, что и позволяет исследовать отдельно внутренний и наружный сегменты.
Результаты, которые приведены в данной главе, свидетельствуют о том, что pH по-разному воздействует на наружный и внутренний сегмент фоторецепторов. Ввиду этого эффекты, наблюдаемые при перфузии внутреннего (ВС) и наружного (НС) сегментов, описаны отдельно. Существенно то, что как темновой ток, так и фототок уменьшаются, когда ионы Н+ входят в наружный сегмент фоторецептора и, напротив, увеличиваются, когда Н+ удаляется [Liebman et al., 1984].
187
Время, мин
Рис. 6.7. Изменения насыщающего фотоответа вспышки прн перфузии внутреннего сегмента 2 мМ амилоридом
А - раствор Рингера, содержащий бикарбонат; Б - бикарбонатами буфер с низким содержанием кальция. В верхней правой части рисунков А и Б представлены примеры регистрации фотоответов. Время регистрации этих фотоответов указано на рисунках стрелками
Таким образом, когда в экспериментах pH различными способами изменялся, можно было полагать, что, если фототок не изменяется, то и внутриклеточный pH во внешнем сегменте не изменился. Такой подход позволяет использовать фоторецептор в качестве своеобразного pH-электрода и таким образом изучить локализацию обменников в фоторецепторной клетке.
Внутренний сегмент. Эффект амилорида. Чтобы исследовать роль Ыа+/Н+-обмена, мы использовали амилорид (2 мМ). Как показали измерения внутриклеточного pH, амилорид должен вызывать внутриклеточное закисление и соответственно уменьшение фотоответа. Наружный сегмент фоторецептора засасывался в пипетку, и таким образом был защищен от воздействия амилорида. Действие амилорида всегда приводило к подавлению фототока. Во всех случаях, когда амилорид воздействовал на клетки с большим начальным фототоком (порядка 25 рА), в течение 10 мин его добавление приводило к полной и необратимой потере фоточувствительности. Такой же результат был получен и в растворе Рингера, содержащем бикарбонат (6 мМ) (рис. 6.7).
В тех же клетках, где первоначальная величина фотоответа была мала, его уменьшение происходило за существенно больший промежуток времени (обычно более 1 ч). Это может объясняться тем, что в клетках с небольшим значением фототока метаболизм происходит менее интенсивно, и это приводит к более медленному внутриклеточному закислению при ингибировании обменника. Аналогичная закономерность наблюдалась и при действии ДИДС (см. ниже).
Амилорид - не очень специфичное соединение, и наблюдаемый эффект мог бы быть обусловлен действием как на Na 7Н’-обменник, так и на Иа+/Са-+-обменник. Чтобы дифференцировать эффекты, мы провели аналогичные эксперименты в бескальциевой среде, однако не обнаружили существенных различий.
Сохранение темнового тока после потери фоточувствительности. Наиболее интересным результатом при исследовании внутреннего сегмента было то, что даже после полного исчезновения фотоответов темновой ток частично или полностью сохранялся. Это может служить ключом к пониманию механизма действия pH, так как при закислении наружного сегмента происходит подавление и темнового тока [Liebman et al., 1984]. Этот вывод был сделан из следующих экспериментов. Когда фототок полностью пропадал, фоторецептор перемещали вдоль пипетки, засасывая его или, напротив, выталкивая. Если темновой ток отсутствует, то такое перемещение не должно сказываться на величине измеряемого тока. Однако в эксперименте величина измеренного таким образом темнового тока практически не изменялась после воздействия амилорида (рис. 6.8).
189
Время, с	Время, мин
Рис. 6.8. Сохранение темнового тока после потери фоточувствительности при перфузии внутреннего сегмента 2 мМ амилоридом
А - изменения тока при перемещении клетки вдоль пипетки после того как фоточувствительность полностью исчезала. Запись начиналась, когда клетка была полностью вне пипетки и заканчивалась, когда клетка была полностью в пипетке. Наиболее важные точки отмечены стрелками (/) - почти весь наружный сегмент находится внутри пипетки; (2) - почти вся клетка находится вне пипетки, как в начале записи, (3) - весь внутренний сегмент, включая цилиарную часть, находится внутри пипетки. Б — постоянная запись тока другой палочки в момент добавления амилорида (точка - 0 мин)
Подобные манипуляции обычно приводят к изменению давления внутри пипетки, которое могло бы влиять на результаты. Однако это не может объяснить полученный эффект. Во-первых, давление в пипетке изменяется кратковременно и через 5 с становится равным атмосферному. Во-вторых, если клетка с самого начала не обладала световой чувствительностью, описанные манипуляции не приводили к каким-либо изменениям. Сохранение фототока имело место только в тех случаях, когда амилорид приводил к исчезновению фоточувствительности достаточно быстро.
На рис. 6.8, Б приведены результаты другого типа экспериментов, когда темновой ток и насыщающий фотоответ регистрировались одновременно. Это возможно, если базовая линия достаточно стабильна (см. рис. 6.8,Б). В эксперименте, результаты которого представлены на рисунке, амилорид практически мгновенно приводил к падению фототока, однако через 3 мин изменяются как величина фототока, так и нулевая линия, что указывает на то, что значительная часть тока не чувствительна к свету.
Эффект ДИДС. Для исследования роли НСО3 /Cl -обмена в раствор Рингера, содержащий бикарбонат, добавляли ДИДС. Полученные результаты аналогичны описанным ранее с амилоридом, однако ДИДС действовал обычно медленнее. В клетках с большим первоначальным фототоком значительный эффект
190
90
80
70
60
о о о е
50
40
зо
20
ЦИДС
Амил.
11L
ЮГ
О
Рис. 6.9. Изменение во времени амплитуды насыщающего фотоответа палочки при перфузии внутреннего сегмента ДИДС (0,1 мМ) и затем амилоридом (2 мМ)
В нижней части рисунка представлены соответствующие фотоответы, зарегистрированные в моменты времени, указанные стрелками
при добавлении ДИДС наблюдался только через 10-30 мин после начала перфузии (рис. 6.9). Обратимость эффекта зависела от того, насколько долго ДИДС воздействовал на клетку. В том случае, когда ДИДС начинали отмывать до того как фототок существенно падал, удавалось достигнуть практически полного его восстановления. В тех же случаях, когда под действием ингибитора фототок уменьшался почти до нуля, эффект становился необратимым. Как и в случае амилорида, мы обнаружили, что изменения внутриклеточного pH, обусловленные ДИДС, вызывают
191
изменения фототока, однако темновой ток клетки сохраняется. В экспериментах, представленных на рис. 6.9, амилорид добавлялся сразу после отмывания ДИДС. В этом случае его эффект отличался от описанного ранее. Величина фототока сначала уменьшалась примерно на 50%, а затем в течение 10 мин восстанавливалась до уровня несколько меньшего, чем исходный. Это наблюдение также подтверждает высказанное ранее предположение о том, что эффект внутриклеточного закисления зависит от физиологического состояния клетки.
Изменения внеклеточного pH около внутреннего сегмента в диапазоне 7,1-7,8 не влияли на величину фототока. Этот факт может объясняться по крайней мере двумя причинами. Либо регуляция внутриклеточного pH во внутреннем сегменте настолько эффективна, что относительно небольшие изменения внеклеточного pH на нее не влияют, либо на фототрансдукцию оказывают влияние только значительные изменения внутриклеточного pH.
В предыдущей главе мы показали, что замена хлорида на глюконат приводит к внутриклеточному защелачиванию клетки, так как локализованный в клетке НСОз/С1~-обменник увеличивает концентрацию бикарбоната внутри клетки из-за возникновения градиента хлора. Следуя той же логике в экспериментах на внутреннем сегменте, мы заменили 95 мМ NaCl на эквимолярное количество глюконата натрия. Однако такая замена не приводила к значительному и постоянному увеличению фототока, как это следовало бы ожидать.
В целом, можно заключить, что незначительные изменения внутриклеточного pH ВС, вызываемые как изменениями внеклеточного pH, так и заменой хлора на глюконат, по-видимому, носят локальный характер и не приводят к изменению внутриклеточного pH в наружном сегменте, где и происходят процессы фототрансдукции.
Наружный сегмент. Переходные процессы при изменении pH. Либман [Liebman et al., 1984] показал, что снижение экстра-клеточного pH вокруг наружного сегмента фоторецепторной клетки уменьшает темновой ток в течение 1 с. Хотя эти результаты и были интерпретированы в рамках предположения об изменении внутриклеточного pH, их нельзя считать окончательными. В этих экспериментах раствор омывал клетку в относительно небольшие промежутки времени (не более нескольких десятков секунд). В силу этой причины темновой ток полностью подавлялся только при pH 3,5.
На рис. 6.10 представлены результаты эксперимента, в котором внеклеточный pH изменялся сначала от 7,5 до 7,2, а затем - до 7,8. Тот факт, что фототок всегда восстанавливался
192
70
60
50 <
“ 40
g 30
Б е го
U--U I_____________1___I__I___I
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Время, мин
Рис. 6.10. Влияние pH на параметры фотоответов
А — изменение во времени амплитуды насыщающего фотоответа палочки при перфузии наружного сегмента раствором Рингера, содержащим бикарбонат с pH 7,5; 7,2 и 7,8; Б — насыщающие фотоответы другой палочки, зарегистрированные при перфузии наружного сегмента СССР (20 мМ). Каждая запись - среднее от трех фотоответов
35 Г . • •
30 ’
25 -
< с 20 -
о
g 15 -о е
ю -	• •• •"
5 -
oL-----1-----।——।--------1-----1-----1
0	10	20	30	40	50	60
Время, мин
Рис. 6.11. Изменение во времени амплитуды насыщающих фотоответов палочки при перфузии наружного сегмента 2 мМ амилорида
Небольшие изменения, видимые до внесения амилорида, обусловлены небольшим фоновым подсветом
7. Г.Р. Каламкаров, М.А. Островский
до первоначального значения, говорит о том, что в клетке присутствует механизм с обратной связью. Однако даже в этом случае можно создать ситуацию, когда мощность механизма, регулирующего pH, недостаточна для его поддержания на постоянном уровне. На том же рисунке представлены результаты экспериментов, в которых в перфузат добавлялся ионофор СССР (20 мМ), который создает большую протонную проводимость. В этом случае даже в стационарном состоянии удается наблюдать увеличение насыщающего фотоответа при увеличении внеклеточного pH.
Влияние амилорида на наружный сегмент фоторецептора. Амилорид, воздействуя на наружный сегмент зрительной клетки (рис. 6.11), существенно подавляет насыщающий фототок. Эффект слабо обратим. Максимальная величина восстановления фототока после отмывания амилорида не превышала 50%. Воздействие амилорида существенно увеличивалось в тех случаях, когда эксперимент проводился на фоне подсветки, которая увеличивает постоянный гидролиз цГМФ и, следовательно, увеличивает скорость образования Н+. Это подтверждает тот факт, что значительная часть эффекта обусловлена именно воздействием амилорида на Ыа+/Н+-обмен.
Следует отметить, однако, что действие амилорида обычно обратимо [Benos, 1988]. Амилорид и его производные не очень специфичны, и в зрительной клетке могут воздействовать как на цГМФ-регулируемые каналы [Benos, 1988], так и на Na+/Ca2+-o6-менник [Nichol et al., 1987].
Рис. 6.12. Замена хлорида при перфузии внутреннего сегмента увеличивает фотоответ
А - изменения во времени амплитуды насыщающего фотоответа при замене 95 мМ NaCl эквимолярным глюконатом натрия; Б — фотоответы, зарегистрированные в моменты времени, указанные стрелками
194
50
ю-tt t	t tt	t t t
123	456	789
0 -----1----1--1----1-----1---1---1
0	10	20	30	40	50	60	70
Время, мин
Рис. 6.13. Влияние 1 мМ ДИДС на эффект, вызванный заменой 95 мМ NaCl эквимолярным глюконатом натрия
В нижней части рисунка представлены фотоответы, зарегистрированные в моменты времени, указанные стрелками
Транспорт бикарбоната в наружном сегменте. В том случае, когда в пипетку засасывался внутренний сегмент, а наружный омывался раствором, содержащим ДИДС (рис. 6.12), амплитуда фототока всегда возрастала (в среднем на 18% по семи клеткам). Если предполагать, что №+/Н+-обменник поддерживает pH в состоянии термодинамического равновесия, то HCOJ /С1--обменник удаляет из клетки бикарбонат и, следовательно, должен закислять клетку. Эта гипотеза была подтверждена экспериментами двух типов.
1. Замена хлора на глюконат приводит к увеличению фотоответа. При удалении хлора направление работы HCOJ/Cl -обмен-ника должно измениться на противоположное, и это должно привести к защелачиванию внутриклеточной среды. Действительно, в
7*
195
40 r
35 -
30 - -
25
20
15
10
5
Рис. 6.14. Перфузия внутреннего сегмента ДИДС сильно увеличивает фототок в присутствии 100 нМ моненснна
qL----1----1---1---1---1---1---1
0 10 20 30 40 50 60 70
Время, мин
том случае, когда 95 мМ NaCl замещались на глюконат натрия (см. рис. 6.12), амплитуда фотоответа возрастала в среднем на 26% (14-53% на 14 клетках). Аналогичный эффект был получен и в том случае, когда вместо глюконата натрия использовался сульфонат натрия.
Если эффект замены хлора
обусловлен НСО3/С1-обменом, то он должен быть чувствителен к ДИДС. Эти эксперименты, однако, довольно трудно интерпретировать, так как ДИДС сам по себе влияет на фотоответ. Ти-
пичные результаты такого рода экспериментов представлены на рис. 6.13. В этих экспериментах изменения фототока, индуцируемые заменой хлорида на глюконат, составляли 23% в отсутствие ДИДС и 13% - в присутствии ДИДС. Трудность интерпретации состоит в том, что в присутствии ДИДС фотоответ и так значительно увеличен, так что его дальнейший рост, индуцированный заменой хлорида, может быть затруднен по этой причине. ДИДС существенно увеличивает фототок в присутствии моненсина.
Если бикарбонат удаляется из клетки при посредстве НСО3 /С1 -обменника, то эффект должен возрастать при возрастании скорости удаления Н+ из клетки. Чтобы достичь этого, мы добавили в среду искусственный Иа+/Н+-обменник моненсин (0,1 мМ). Добавление моненсина сначала временно увеличило амплитуду фотоответа (рис. 6.14), так как интенсификация Na+/H+ привела к внутриклеточному защелачиванию. Последующее добавление ДИДС приводило к увеличению фотоответа не менее чем на 80%. Эффект, однако, как и в других случаях, был переходным и плохо обратимым. В четырех подобных экспериментах эффект ДИДС составлял в среднем 57% (в аналогичных условиях возрастание фототока при изменении pH от 7,5 до 7,7 составляло 46%). Эта величина существенно больше увеличения фототока, индуцируемого ДИДС в отсутствие моненсина, и таким образом эксперименты подтверждают на
ши предположения о роли НСО3 /С1 -обменника в поддержании pH.
196
Фототрансдукция в палочках сетчатки лягушки модулируется бикарбонатом
Влияние ацетазоламида и ДИДС. В данном разделе рассмотрен вопрос о том, существуют ли в сетчатке позвоночных механизмы, способные модулировать процессы трансдукции путем регуляции внутриклеточного pH и таким образом регулировать световую чувствительность зрительных клеток. Известно, что в органах и тканях регуляция pH тесно связана с метаболизмом СО2. Особенно это важно в нервной системе, где капилляры часто пространственно удалены от нервных тканей, и роль клеток, транспортирующих СО2, выполняют астроциты. Как известно, сетчатка эффективно снабжается кровью, поэтому механизмы метаболизма СО2 и Н+ могут существенно влиять на работу ее элементов, в частности, фоторецепторных клеток.
Мюллеровские клетки обладают несколькими чертами, которые позволяют предположить их важную роль в метаболизме СО2. Это специализированные астроциты, которые пронизывают сетчатку от дистальной до апикальной части. Они занимают существенную ее часть по объему и находятся в контакте с клетками трех ядерных слоев. В различных группах позвоночных большая часть карбоангидразы (КА) сетчатки локализована именно в Мюллеровских клетках, тогда как фермент отсутствует в большинстве нейронов, включая палочки [Musser, Rosen, 1973; Linser, Moscona, 1984; Wistrand et al., 1986]. Это предполагает участие в транспорте СО2, где эффективность зависит от быстрого KA-катализируемого гидрирования.
Задачей описанных выше экспериментов было выяснить важность такого транспорта и показать, что он должен быть блокирован или несколько замедлен при ингибировании активности КА. Для образования двуокиси углерода необходимо снабжение клетки ионами водорода, тогда как СО2 входит в клетку беспрепятственно и после гидратации в основном диссоциирует на Н+ и НСО; . В противовес этому многие нейроны и глиальные клетки имеют НСО3 -зависимый обменный механизм, регулирующий внутриклеточный pH [Russell, Boron, 1976; Thomas, 1977, 1984; Chester, 1986. Schlue, Deitmer, 1988]. Подкисление палочек уменьшает их темновой ток и содержание цГМФ [Liebman et aL, 1984; Meyertholen et al., 1986], а увеличение CO2-HCOJ, как было заявлено, имеет совершенно противоположный эффект [Meyertholen et al., 1980; Meyertholen et al., 1986; Oakley, Wen, 1989]. Поскольку последние работы включали относительно большие изменения буферной емкости, необходимо прежде все
797
го было выяснить, действительно ли СО2 и НСО3 как таковые увеличивают темновой ток и концентрацию цГМФ. Это оказалось действительно так, и позволило предположить, что существует НСО3-зависимый механизм регуляции pH. Такие анионные обменники обычно ингибируются ДИДС, который мы использовали как фармакологический инструмент. Результаты свидетельствуют, что, во-первых, в палочках действительно существует НСО3 -регулируемый, ДИДС-зависимый механизм поддержания внутриклеточного pH и, во-вторых, действительно происходит существенное, катализируемое КА, удаление СО2-НСО3 -Н+ из сетчатки. Подобно другим астроцитам, в этом случае, по-видимо-му, включается выброс протона Мюллеровскими клетками со стороны, обращенной к склере, что приводит к подкислению в дистальной части палочек [Wen, Oakley, 1989].
Бикарбонат и АЛА увеличивают фотоответы. Влияние бикарбоната. Чтобы продемонстрировать влияние внутриклеточной концентрации бикарбоната на фотоответ зрительной клетки в растворе, содержащем вначале 12 мМ фосфатного буфера, 6 мМ фосфата замещалось на 6 мМ бикарбоната. Как показано выше, такая манипуляция должна приводить к возрастанию внутриклеточного pH, хотя экстрак л еточный pH и буферная емкость по Н+ не изменялись. На рис. 6.15 приведены фотоответы зрительных клеток сетчатки лягушки. Под обозначениями А, В и Г приведены группы из трех ответов на стимулы одинаковой интенсивности: А — низкой, В - средней и Г— высокой. Наименьший ответ был зарегистрирован при перфузии фосфатом без бикарбоната. Как только перфузирующий раствор заменяли на раствор Рингера, содержащий бикарбонат, ответ начинал расти. Средний ответ под каждым обозначением был зарегистрирован примерно через 15 мин после замены перфузирующего раствора. Ответ, близкий к насыщающему (Г), возрастал на 40%. Однако ответы, зарегистрированные при низкой интенсивности (А), возрастали относительно больше, что указывало на увеличение относительной чувствительности фоторецепторов.
Влияние ААА. Добавление 0,5 мМ ААА в перфузат в присутствии карбоната приводило к ускорению и увеличению ответа как на слабые, так и на яркие вспышки. На рис. 6.15 наибольший ответ во всех четырех случаях был получен в присутствии ААА. Добавление ААА увеличивало максимальную амплитуду в данном случае в 1,4 раза (в различных экспериментах от 1,1 до 2,0), а фоточувствительность - в 1,6 раза (в различных экспериментах 0,8-3,6). Существенно отметить, что увеличение всегда зависело
198
Рис. 6.15. Действие СО2 -НСО3 и ацетазоламида (А А А) на суммарный рецепторный потенциал изолированной сетчатки лягушки
На каждом фрагменте показано 3 ответа на идентичные по интенсивности стимулы: наименьший получен в фосфате, средний - в бикарбонате и наибольший - в бикарбонате после добавления ААА. Интенсивность вспышек выражена в количестве обесцвеченного родопсина на палочку (R*), А - 1,1R*, В - 23R" T-460R*. На фрагменте Б время показано в растянутой шкале
__|_________1	I	I
0,0	0,2	0,4	0,6
от интервала между заменой фосфата на бикарбонат и последующим добавлением ААА.
Увеличение ответов не обусловлено глиальными токами. Как известно, существенный вклад в суммарные рецепторные фотоответы, регистрируемые в сетчатке, вносят радиальные токи нефоторецепторного происхождения [Sillman et al., 1969; Donner, Hemila, 1985]. Можно было бы предположить, что увеличение фотоответов, полученное в присутствии бикарбоната и ААА, на самом деле отражают не рост фототока палочки, а скорее увеличение вторичных токов (в основном глиального происхождения).
199
Чтобы выявить эту возможность, фазы нарастания насыщающих ответов (см. рис. 6.15, Б) показаны в растянутых временных шкалах. Поскольку синаптическая передача блокирована, то нерецепторные токи, вызванные ионными токами, сопровождающими фоторецепторный ответ, могут давать вклад в фотоответ только после существенной задержки. Однако амплитуды трех ответов возрастают одинаково как в ранней фазе, так и в пике ответа (рис. 6.15, Б и Г). Можно отметить, что в начальный момент возрастание даже больше.
Кинетика фотоответов ускоряется в присутствии ААА. Известно, что как фотоответы палочек на очень слабые вспышки, так и кинетика их нарастания на сильные вспышки, линейно зависят от интенсивности стимула [Baylor et al., 1979; Donner, 1989]. Если бы кинетика фотоответов не изменялась в присутствии бикарбоната и ААА, то семейство ответов на рис. 6.15 отражало бы увеличение абсолютной чувствительности палочек. На самом деле амплитуда фотоответов в присутствии ААА в шесть раз больше, чем в фосфатном буфере, а ответ на сильные вспышки возрастает в 10 раз. Это означает, что как бикарбонат, так и ААА вызывают не только рост амплитуды фотоответа, но и приводят к его ускорению.
Зависимость действия ААА от бикарбонатного режима. Сходное влияние бикарбоната и ААА позволяет полагать, что механизм их воздействия одинаков (например, модуляция pH). Это подтверждается и тем, что эффективность действия ААА зависела от предыстории эксперимента. Если ААА добавляли в раствор Рингера, который с самого начала не содержал бикарбоната, эффекты были меньше или вообще отсутствовали (4 эксперимента в фосфатном буфере и три - в HEPES). Если же ААА добавляли в раствор Рингера, содержащий бикарбонат, некоторое увеличение амплитуды фотоответа наблюдалось во всех случаях, но величина этого эффекта была тем меньше, чем больше времени проходило между добавлением в раствор бикарбоната и ААА. Если сетчатка перфузировалась в содержащем бикарбонат растворе Рингера более 3 мин, то изменения, вызываемые ААА, были малы.
Наиболее примечательным явилось то, что и увеличение концентрации бикарбоната, и добавление ААА действовало, по-видимому, по одинаковому механизму. Во всяком случае, уровень “насыщения эффекта” достигался в обоих случаях через 20 мин. На рис. 6.16 представлены изменения во времени величин фотоответов при добавлении бикарбоната и ААА. Частичное замещение фосфата (Р) бикарбонатом (В) приводило к постепенному росту как максимальной амплитуды фотоответа, так и относительной чувствительности к новому стационарному уровню. Добавле-
200
Время, мин
Рис. 6.16. Изменения во времени величины насыщающего фотоответа UMaKC и относительной световой чувствительности S (в логарифмических единицах), вызванные бикарбонатом и ААА
Условия перфузии изменялись. Р - фосфат, В - бикарбонат, ВА - бикарбонат + ААА. Вертикальными линиями показано время смены растворов
ние через 17 мин ААА приводило к сильному увеличению обоих параметров (UMaKC и S), однако эффект носил переходный характер. Эффект ААА, представленный на рис. 6.15, получен в точке максимального увеличения амплитуды. Переключение с фосфатного раствора Рингера на бикарбонатный приводило к возвращению относительной световой чувствительности к первоначальному уровню, тогда как амплитуда фотоответа продолжала монотонно падать. Последующее включение Рингера, содержащего бикарбонат и ААА, приводило к частичному восстановлению максимальной амплитуды фотоответа. Даже в тех экспериментах, в которых эффект бикарбоната и/или ААА были очень мал, последующее переключение на фосфатный буфер всегда приводило к изменению амплитуды фотоответа, а последующее переключение на бикарбонат-AAA приводило к восстановлению. В большинстве экспериментов восстановление UMaKC было более полным, чем это показано на рис. 6.16.
201
Концентрация цГМФ в слое НС			Бикарбонат и ААА увеличивают концентрацию цГМФ в наружных сегментах палочек. Чтобы понять возможный механизм действия
№ п/п	Среда и время инкубации	Концентрация цГМФ, пмоль/мг белка	
1	30 мин в фосфатном Рингере	45 ±4	бикарбоната и ААА, в дальнейшем исследовалось их вли-
2	15 мин в фосфатном Рингере и 15 мин в бикар-бонатном Рингере	93 ±6	яние на концентрацию внутриклеточного медиатора в фоторецепторах - цГМФ. Эксперименты проводились в соответствии с протоколом,
3	30 мин в бикарбонатом Рингере	94 ±9	описанным в таблице. Каждая точка соответствовала изме-
4	30 мин в фосфатном Рингере, содержащем 0,5 мМ ААА	40 ±3	рениям на 6 сетчатках. Среда инкубации в данном случае была идентична той, которая была в электрофизиологиче-
5	30 мин в бикарбонатом Рингере, содержащем 0,5 мМ ААА	394 ±9	ских экспериментах. Как оказалось, влияние ААА на уровень цГМФ хоро-
6	30 мин в фосфатном Рингере, содержащем 5 мМ ИБМК	698 ±13	шо коррелирует с результатами, полученными в электоро-физиологических экспериментах. В фосфатном Рингере добавление ААА вызывало
небольшое увеличение концентрации цГМФ (которое в представленных данных статистически недостоверно). Замена фосфата на бикарбонат, однако, приводила через 15 мин к 50%-ному увеличению уровня цГМФ, а введение ААА в бикарбонатный Рингер повышало его в 3-4 раза (делая его в 6 раз выше, чем в фосфатном контроле). Для контроля в некоторых экспериментах сетчатку инкубировали с ингибитором фосфодиэстеразы - ИБМК - в течение 30 мин. В палочках, обработанных ИБМК, концентрация цГМФ была в 7 раз выше контроля.
Эти результаты прямо указывают на то, что как бикарбонат, так и ААА прямо или опосредовано воздействуют на механизмы фототрансдукции в фоторецепторах. Наблюдается хорошая количественная корреляция с действием бикарбоната в электрофизиологических экспериментах. Однако увеличение концентрации цГМФ при действии ААА оказалось несколько больше, чем этого следовало бы ожидать из измерений фотоответа. Возможные причины такого расхождения будут рассмотрены в соответствующем разделе обсуждения.
202
Время, с
Б
_i__________।__________।
О	5	10
Время, с
Рис. 6.17. Отсутствие эффекта бикарбоната-AAA на фототок изолированной палочки саламандры
На фрагментах Л и В показаны фотоответы на насыщающую вспышку, зарегистрированные до (А, В) и после (Б, Г) добавления в перфузирующий раствор бикарбоната-ААА. На фрагментах Л и Б представлены результаты регистрации тока изолированной палочки саламандры. На фрагментах В и Г- результаты регистрации суммарного рецепторного фототока от сетчатки лягушки. Фрагмент В - насыщающий суммарный рецепторный потенциал, полученный в растворе Рингера, не содержащем бикарбоната. Для сравнения на рис. Б три фотоответа, полученные при регистрации суммарного рецепторного потенциала от сетчатки саламандры через 1 мин (наименьший). 7 мин (средний) и 15 мин (максимальный) после добавления бикарбоната ААА
Бикарбонат и ААА прямо не влияют на фототрансдукцию. В дальнейшем исследовалось, обусловлены ли наблюдаемые эффекты прямым действием СО2- НСО3и ААА на фототрансдукцию палочки. Для этого эксперименты, аналогичные описанным выше, проводили на изолированных палочках, когда опосредованное влияние других структур сетчатки исключено. Для регистрации использовали палочки тигровой саламандры, так как регистрацию на них проводить легче, чем на палочках Rana tempo-raria [Donner et al., 1989].
На рис. 6.17, А приведены два ответа, полученные до введения AAA-бикарбоната, на рис. 6.17, Б - зарегистрированные после замены раствора, причем, второй ответ - в тот момент времени, когда ожидался максимальный эффект. Очевидно, что суще-
203
Рис. 6.18. Изменения во времени логарифма абсолютной чувствительности фотоответа при замене перфузирующих растворов
Р - фосфат, В А - бикарбонат + ААА, BAD - бикарбонат + ААА + ДИДС, PAD - фосфат + ААА + ДИДС, Р - фосфат, ВА - бикарбонат + ААА. Концентрация ААА - 0,5 мМ, ДИДС - 0,1 мМ. По ординате - логарифм абсолютной чувствительности в относительных единицах, 0,0 соответствует 0,93 мкВ/R*. Интенсивность вспышки - 6R*
ственных изменений в темновом токе не происходило. Более детальное изучение самой ранней фазы фотоответов также не выявило никаких изменений чувствительности (см., например, рис. 6.15, Б).
Для сравнения в нижнем ряду (рис. 6.17, В и Г) приведены соответствующие серии насыщающих ответов от интактной сетчатки тигровой саламандры, зарегистрированные тем же методом регистрации ЭРГ, что и в экспериментах с лягушками. Результаты оказались такими же, как и описанные ранее. И бикарбонат, и ААА вызвали обратимое увеличение фотоответов. Таким образом, отсутствие эффекта на изолированных палочках объясняется не видовыми различиями между лягушками и саламандрами. Эти эксперименты прямо показывают, что эффект ААА не обусловлен прямым действием на фототрансдукцию в палочках. Этот отрицательный результат не представляется удивительным, учитывая, что карбоангидраза не обнаружена в палочках. В биохимических экспериментах мы прямо проверили также, что ААА не влияет на фотоинду-цированный гидролиз цГМФ in vitro.
ДИДС полностью подавляет световую чувствительность. Естественно предположить, что действие бикарбоната и
204
ААА обусловлено работой НСО3/СК-обменника, обнаруженного нами и описанного в предыдущих разделах. Прямое действие ДИДС на ток изолированных фоторецепторов было подробно описано нами ранее. Здесь мы опишем действие ингибитора НСО3/СГ-обмена ДИДС на эффект ААА.
На рис. 6.18 представлены результаты типичного эксперимента. После стабилизации ответов в фосфатном Рингере проток переключался на бикарбонат-AAA. Это приводило к четырехкратному увеличению фотоответа. Когда фотоответ достигал нового стационарного уровня, в проток вводился 0,1 мМ ДИДС. Это приводило к быстрому и монотонному уменьшению фотоответа. Последующая замена в растворе бикарбоната на фосфат еще более ускоряла этот процесс, и фотоответ падал практически до нуля. Примерно на 120-й минуте стимул с интенсивностью 10000 R* вызывал ответ по амплитуде в 100 раз меньше первоначального.
Эффект ДИДС оказался обратимым. Через 35 мин после переключения протока на раствор, содержащий бикарбонат-ААА, величина фотоответа была в два раза больше, чем в фосфатном буфере в начале эксперимента.
Эффект ДИДС зависит от pH. Эксперименты, представленные на рис. 6.19 и 6.20, демонстрируют прямую связь между эффектом ДИДС и изменениями pH. В эксперименте, показанном на рис. 6.19, а, добавление ДИДС в раствор Рингера, содержащий фосфатный буфер, приводило к уменьшению фотоответа, причем последующая замена фосфата на бикарбонат не приводила к его восстановлению. Затем в момент времени, когда амплитуда фотоответа падала до 5% своего первоначального уровня, pH протока изменялся на 1 единицу так, что его величина становилась 8,5. Это приводило к монотонному росту фотоответа в течение часа. Последующее уменьшение pH на 1 единицу (до 7,5) вновь приводило к уменьшению величины фотоответа.
На рис. 6.20 представлены шесть пар фотоответов, полученных в одни и те же моменты времени, отмеченные стрелками на рис. 6.19. Каждая пара содержит фотоответ на слабую (9 R*) и на насыщающую (900 R*) вспышки. Время достижения максимальной амплитуды и максимальная амплитуда на кривых, показанных на рисунке, были соответственно 3,6 и 38 мкВ (1 - фосфат), 4,5 с и 8 мкВ (2 - фосфат-ДИД С), 5,5 си 1,5 мкВ (3 бикарбонат - ДИДС), 3 с и 25 мкВ (4 - бикарбонат - ДИДС, pH 8,5), 4,7 с и 8 мкВ (6 - бикарбонат). В принципе, измерение кинетики фотоответов при регистрации суммарного рецепторного потенциала не совсем корректно. Тем не менее рис. 6.20
205
A	P PD BD BDpH8,5 BD	В
Рис. 6.19. Изменения во времени относительной чувствительности S и UMaKC в логарифмических единицах при замене перфузирующих растворов
Р - фосфат; PD - фосфат + ДИДС, BD - бикарбонат + ДИДС; BD, pH 8,5 - бикарбонат + ДИДС при pH 8,5; BD - бикарбонат + ДИДС; В - бикарбонат. Концентрация ДИДС - 0.1 мМ, Стрелками указаны моменты времени, в которые зарегистрированы фотоответы, представленные на рис. 6.20
демонстрирует, что время достижения максимума отражается с помощью этой методики достаточно хорошо. Сравним фотоответы, полученные в ДИДС, при pH 7,5 и 8,5. Фотоответ с большей амплитудой должен был бы нарастать быстрее. Тем не менее, если мы сравним кинетику “щелочного” и “кислого” ответов на рис. 6.20, где амплитуды отнормированы, то увидим, что
206
Рис. 6.20. Фотоответы, згрегистрир< ванные в моменты времени, указанные стрелками на рис. 6.19
А - фотоответы, полученные на слабую (9R*) и насыщающую (900 R") вспышки; Б - сравнение формы фотоответов, полученных в присутствии ДИДС при pH 7,5 (кривая с большим шумом) и при pH 8.5 (кривая с меньшим шумом). На левой панели - фотоответы на слабую (9R‘), на правой панели - на насыщающую (900 R*) вспышки
“щелочной” ответ нарастает медленнее. Суммируем изложенные выше результаты:
Стационарное значение внутриклеточного pH. Среднее значение внутриклеточного pH в фоторецепторе при внеклеточном pH 7,5 составило в наших экспериментах 6,68. Это довольно низкое значение для возбудимых клеток. Однако величины внутриклеточного pH в различных тканях сильно различаются. Так, Schwiening и Baron [1994] обнаружили, что среднее значение pH в нейронах гиппокампа составило 6,61 в отсутствие бикарбоната, а в присутствии бикарбоната эта величина возрастала до 7,1. В то же время Raley-Susman et al. [1993] показали на тех же нейронах, что внутриклеточный pH составляет 7,76 в присутствии 25 мМ бикарбоната и pH 7,4.
По крайней мере три фактора могли влиять на низкую величину pH в наших экспериментах. Во-первых, сетчатки были обесцвечены, и это могло влиять на внутриклеточный pH по нескольким причинам. Во-вторых, фоторецепторы были не изолированы, а находились в сетчатке и, следовательно, под воздействием кислого окружения соседних фоторецепторов и других клеток сетчатки. В-третьих, значение внутриклеточного pH 6,68 было получено в среде, не содержащей бикарбоната. Добавление 6 мкМ бикарбоната увеличивало pH на 0.26 единицы. In vivo концентрация бикарбоната в крови саламандры составляет 20-25 мМ. Таким образом, можно полагать, что в нативных условиях величина pH в фоторецепторе выше.
Роль регуляции pH в работе фоторецептора. Как указывалось выше, фоторецептор находится в условиях постоянного закисления вследствие протекающих в нем метаболических процессов, происходящих как во внутреннем, так и в наружном сегменте. Поэтому основная функциональная роль описанных нами процессов состоит в предотвращении ацидоза клетки. По крайней мере два из обнаруженных нами механизмов используют для этого натриевый градиент, существующий на мембране фоторецептора, это №+/Н+-обмен и №+-зависимый НСО3/СГ -обмен.
Третий из обнаруженных нами механизмов - натрий-незави-симый, и именно это обстоятельство - присутствие в клетке двух механизмов, работающих в противоположном направлении, и может, по-видимому, наилучшим образом обеспечить в клетке оптимальный гомеостаз по pH.
Наблюдаемые нами изменения тока в фоторецепторе обусловлены изменениями внутриклеточного pH Известно, что во многих типах клеток ДИДС и амилорид блокируют №+/Н+-обмен и НСО3/СГ -обмен. Эти же соединения вызывали соответственно закисление и в наших экспериментах при измерении внутри
208
клеточного pH. Таким образом, есть веские основания полагать, что и в описанных в этом разделе экспериментах, когда на внутренний сегмент клетки воздействовал ДИДС или амилорид, фототок изменялся вследствие внутриклеточного закисления. Существенно отметить, что во всяком случае в отношении ДИДС эффект вызывался именно закислением внутри внутреннего сегмента, а не изменением pH во внешнем сегменте. Это утверждение базируется на том, что при ацидозе во внешнем сегменте как темновой ток, так и насыщающий фотоответ изменяются одинаково [Liebman et al., 1984].
При различных воздействиях на фоторецепторную клетку наружный и внутренний сегменты реагируют по-разному. Это позволяет предположить, что, по крайней мере с точки зрения регуляции pH, эти две части клетки представляют собой относительно независимые образования, разделенные сильным диффузионным барьером. Существование такого барьера вытекает из нескольких морфологических и физиологических свойств зрительной клетки: плотность дисков и малое расстояние между дисками и плазматической мембраной клетки, различные процессы, вызывающие внутриклеточное закисление и т.д. Ниже более подробно изложены причины, которые могут служить базисом для такого предположения.
Внутриклеточное закисление во внутреннем сегменте. Во внутреннем сегменте причиной внутриклеточного закисления являются интенсивные метаболические процессы, и блокирование механизмов экстракции Н+ амилоридом и ДИДС вызывает внутриклеточный ацидоз. Эксперименты, проведенные с амилоридом при низком содержании кальция, свидетельствуют, что амилорид изменяет именно внутриклеточный pH, а не внутриклеточную концентрацию кальция. Интерпретация нескольких экспериментов позволяет нам предположить, что регуляция pH во внутреннем сегменте относительно независима от наружного, и что изменение фототока обусловлено изменением pH именно в этой части клетки.
1.	При перфузии внутреннего сегмента темновой ток может практически не изменяться при воздействии амилорида и ДИДС, в то время как фоточувствительность клетки практически полностью исчезает. При перфузии НС внутриклеточный ацидоз приводит к исчезновению как темнового тока, так и фоточувствительности.
2.	Изменения внеклеточного pH при перфузии внутреннего сегмента должны приводить по крайней мере к кратковременным изменениям во внутриклеточном pH, если имеет место диффузия между двумя частями клетки. Соответственно должен был
209
бы измениться и внутриклеточный pH в наружном сегменте. Однако фоточувствительность НС при изменении внеклеточного pH около внутреннего сегмента не изменялась и, следовательно, можно полагать, что внутриклеточный pH в наружном сегменте также не изменялся.
3.	Действие как ДИДС, так и амилорида при перфузии внутреннего сегмента происходит с большой задержкой, в то время как изменения pH в наружном сегменте происходят практически мгновенно.
Как амилорид, так и ДИДС при перфузии внутреннего сегмента вызывают медленное (в минутной шкале) уменьшение фотоответа. Одним из возможных объяснений этого может служить ингибирование метаболических процессов во внутреннем сегменте, которые, как известно, ингибируются при внутриклеточном закислении. Уменьшение концентрации ГТФ или АТФ может воздействовать на процесс фототрансдукции, подавляя активацию трансдуцина или фосфорилирование родопсина. Поскольку темновой ток при этом не изменяется, можно полагать, что концентрация цГМФ также мало изменяется. Поскольку Кд активации трансдуцина меньше, то уменьшение концентрации ГТФ в первую очередь повлияет именно на световую чувствительность клетки.
То обстоятельство, что темновой ток остается практически неизменным, говорит о том, что не изменяется натриевый градиент и соответственно ни ДИДС, ни амилорид не влияли существенно на активность №+-К+-АТФазы [Pedemonte et al., 1988].
Механизмы транспорта. То, что амилорид и ДИДС независимо могут приводить к потере световой чувствительности, свидетельствует о том, что для поддержания оптимального внутриклеточного pH необходимы как Na+/H+-, так и НСО3/СГ-обмен. Обычно активность обмена в клетках регулируется различными факторами. В нашем случае относительная активность может определяться не только общей метаболической активностью в клетке, но и соотношением анаэробных и аэробных путей и соответственно соотношением лактата и СО2 [Winkler, 1981, 1986]. Тот факт, что во внутреннем сегменте в определенных условиях внутриклеточный pH может поддерживаться даже в присутствии 2 мМ амилорида, совпадает с опубликованными ранее данными о том, что амилорид в этой концентрации существенно влияет на фотоответ, но не приводит к его полному исчезновению [Katz, Oakley, 1990].
В физиологических условиях транспорт бикарбоната может играть более существенную роль, чем в наших экспериментах. Так, содержание бикарбоната в крови саламандры составляет
210
29-25 мМ [Toews, Boutilier, 1986], что примерно в 4 раза выше, чем в наших экспериментах. Тот факт, что ингибирование HCOj/CF ДИДС всегда приводит к внутриклеточному закислению, свидетельствует о том, что транспорт бикарбоната в ВС сопряжен с градиентом Na+. О том же говорит то, что замена хлора на бикарбонат при перфузии ВС мало влияет на фоточувстви-тельный ток [Hughes et al., 1989].
Регуляция pH в наружном сегменте. Основной причиной, вызывающей внутриклеточное закисление в наружном сегменте, является процесс синтеза и гидролиза цГМФ. Поскольку наружный и внутренний сегменты фоторецептора пространственно разделены, поглощение эквивалентного количества Н+ во внутреннем сегменте не повлияет на этот процесс. Темновой ток в НС быстро подавляется при внутриклеточном закислении и по крайней мере кратковременно возрастает при внутриклеточном защелачивании. Ниже обсуждаются основные факторы, вовлеченные в этот процесс.
Обмен бикарбоната. Увеличение фотоответа при перфузии НС ДИДС является по всей вероятности результатом соответствующего внутриклеточного защелачивания. То, что это есть результат ингибирования натрий-зависимого НСО3/СГ -обмена, подтверждается тем, что темновой ток возрастал при замене хлора на глюконат. Как было показано нами в предыдущем разделе, это приводит к инверсии НСОз/СГ-обмена и внутриклеточному защелачиванию. ДИДС не полностью ингибировал этот процесс, однако это может объясняться двумя причинами. Во-первых, замена 95 мМ С1- может создавать такой мощный градиент хлора, что даже если небольшая часть НСО3/СГ остается незаингибирован-ной ДИДС, это может обеспечить некоторую защиту от ацидоза. Во-вторых, pH-зависимость тока палочки довольно крутая.
То, что ДИДС при перфузии НС никогда не снижает фототока, свидетельствует против того, что в НС присутствуют другие, сопряженные с натрием, процессы, которые закачивали бы бикарбонат внутрь клетки. Ингибирование таких процессов приводило бы к ацидозу.
№+/Н+-обмен. То, что ингибирование НСО3/О -обмена ДИДС приводит к защелачиванию, свидетельствует о том, что pH в НС поддерживается несколько выше термодинамического равновесия механизмом, сопряженным с градиентом натрия. Естественно было предположить, что таким механизмом является Na+/H"-обмен. Уменьшение фотоответа и темнового тока при перфузии НС амилоридом в значительной степени обусловлено именно этой причиной, хотя нельзя исключить и вклад других процессов
211
(ингибирование Na+/Ca7+ обмена или прямого действия на цГМФ-регулируемые ионные каналы).
Механизм воздействия pH на фотоответ. Можно представить себе много путей прямого воздействия pH на механизмы фототрансдукции. Перечислим те возможности, подтверждение которым можно найти в литературе: (1) Na+/Ca2+ ослабляется при понижении pH [Hodgkin, Nunn, 1987], что ведет к увеличению внутриклеточной концентрации кальция и таким образом уменьшает фототок [Pugh, Cobbs, 1986]; (2) проводимость плазматической мембраны фоторецептора уменьшается вдвое при снижении pH до 5,5 [Menini, 1989]; (3) наиболее вероятным нам представляется вовлеченность в этот процесс гуанилатциклазы. Активность гуанилациклазы pH-зависима, причем, при увеличении pH активность возрастает, что соответствует знаку описанного нами эффекта. Вполне вероятно, что при изменении pH существенными становятся сразу несколько факторов.
Функциональная роль HCOj/CE- и Na+/Н+-обменников в наружном сегменте. Естественно предположить, что существование в одной мембране обоих типов обменников необходимо для более тонкого поддержания гомеостаза или для контроля клеточного объема [Cala, Grinstein, 1988]. Если речь идет о регуляции pH, то обменники работают в противоположном направлении так, что Na+/H+ стремится поддерживать pH выше термодинамического равновесия, а НСО3/СГ восстанавливает его [Olsnes, 1987]. В НС фоторецепторной клетки такой механизм может эффективно предотвращать как ацидоз, так и внутриклеточное защелачивание клеток, поддерживая оптимальное значение pH [Oakley, Wen, 1989; Borgula et al., 1989]. С другой стороны, при наличии механизма регуляции обмена изменения внутриклеточного pH могут быть фактором, регулирующим чувствительность фоторецепторной клетки.
Транспорт СО- в Мюллеровских клетках и влияние ААА. Ингибирование карбоангидразы (КА) в изолированной сетчатке приводит к более кислому стационарному состоянию во внутреннем объеме сетчатки [Oakley, Wen, 1989]. Это позволяет предположить повреждение системы удаления СО2-НСОз-Н+. В нашей геометрии удаление СО2 может происходить только на рецепторной стороне сетчатки, около наружных сегментов палочек. Поэтому следовало бы ожидать, что ингибирование КА приведет к 1) образованию СО2-НСОз~Н+ в сетчатке; 2) уменьшению концентрации Н+ (подщелачиванию) около наружного сегмента. Это уменьшение может быть кратковременным, хотя в стационаром состоянии все метаболические кислоты, образован-
212
ДИДС
Рис. 6.21. Гипотетическая схема взаимоотношений фоторецепторных и глиальных клеток в сетчатке, объясняющая возможный регуляторный механизм их действия
КА — карбоангидраза
ные в сетчатке, будут проходить один и тот же путь независимо от того, является ли транспорт активным.
На рис. 6.21 представлена гипотетическая схема, учитывающая возможную роль Мюллеровских клеток в транспорте СО2-НСОз-Н+ в сетчатке. Гипотеза основана на двух фактах. Во-первых, Мюллеровские клетки содержат большую часть КА сетчатки [Linser, Moscona, 1984]. Во-вторых, они морфологически близки к астроцитам мозга, которые, по-видимому, участвуют в удалении метаболического СО2 из нейронов, утилизируя его в другом месте через НСОрСГ- и На+/Н+-обменники [Kimelberg et al., 1979; Kimelberg, Norenberg, 1989].
Предполагаемое высвобождение Н+-НСОз Мюллеровскими клетками приведет к созданию эффективного внешнего градиента для этих ионов и для СО2. Эффективность транспорта будет зависеть от катализируемого КА быстрого равновесия в би-карбонатной буферной системе. Предложенная схема, таким образом, указывает две возможные причины роста фотоответов при введении ААА: 1) концентрация НСО3 повышается вблизи проксимальной части палочек, где находятся бикарбонатные обменники, которые увеличивают концентрацию этого иона в клетке; 2) концентрация Н+ вблизи наружного сегмента палочки уменьшается, снижая закисление внутри клетки. Оба процесса приведут к увеличению pH и оценить их относительный вклад сложно.
213
Корреляция между амплитудой ответа и концентрацией цГМФ. Изменения в фотоответах, наблюдаемые при действии бикарбоната и ААА, качественно хорошо коррелировали с изменениями общей концентрации цГМФ (см. таблицу). Наблюдаемое увеличение концентрации цГМФ обусловлено тем, что бикарбонат и ААА нейтрализуют подкисление палочек. Известно [Meyertholen et aL, 1980, 1986], что увеличение концентрации HEPES и/или бикарбонатного буфера в интервале между 1 и 5 мМ примерно вдвое увеличивает концентрацию цГМФ в сетчатках жабы. Поскольку низкая буферная емкость сопровождается подкислением сетчатки [Oakley, Wen, 1989], можно заключить, что концентрация цГМФ уменьшается при подкислении. Интересно, что в этой работе не обнаружили влияния буферов на содержание цГМФ в изолированных инкубированных НСП; это подтверждает наше предположение о том, что подкисление обусловлено прежде всего накоплением кислот в ткани интактной сетчатки.
Не следует ожидать строгой количественной корреляции между величиной фототока (выраженного как амплитуда насыщающего ответа) и концентрацией цГМФ. Натриевая проводимость НСП определяется свободной цГМФ, тогда как наши биохимические методы позволяют измерять общую цГМФ. Однако следует отметить очень высокую концентрацию цГМФ в присутствии ААА (см. таблицу) по сравнению со средним ростом фотоозве-тов. Одним из объяснений может быть то, что сетчатки, инкубированные в биохимических экспериментах, были полностью погружены в среду. Если ААА блокирует прямой транспорт СО2-НСОз~Н+ на рецепторную сторону, то эти вещества в этом случае будут одинаково диффундировать к обеим сторонам сетчатки. Напротив, в соответствии с геометрией электрофизиологического эксперимента ААА может приводить только к кратковременному увеличению кислотного потока около фоторецептора (см. выше).
Многие процессы в фоторецепторах обусловлены pH. В наших экспериментах при пощелачивании происходило увеличение, а при подкислении - уменьшение как относительной чувствительности и амплитуды насыщающего ответа, так и скорости нарастания фотоответов. Это отчасти противоречит данным Liebman et al. [1984], которые нашли, что при перфузии кислым раствором происходит уменьшение насыщающего ответа, но увеличение относительной чувствительности. Однако их эксперименты отличались от наших тем, что включали кратковременные изменения pH (менее 1 мин); можно предположить, что эффект pH на фототрансдукцию внутри палочки не полностью раз
274
вился из-за недостатка времени. Даже полученное нами и на первый взгляд сходное влияние pH на амплитуду насыщающего ответа отличается от результатов Liebman et al. [1984J. Они нашли, что при низких pH происходит быстрое подавление темнового тока, заканчивающееся за 1 с, и не происходит немедленных изменений быстрой фазы нарастания ответа. Эти данные были интерпретированы как задержка №+/Са2+-обмена, приводящего к накоплению Са2+ в палочке [Pugh,, Cobbs, 1986а, Ь]. Напротив, наши эффекты развиваются в минутной временной шкале, включая изменения кинетики нарастания ответов и существенные изменения суммарной концентрации цГМФ.
Гпава 7
ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ЦИТОСКЕЛЕТА В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ФОТОРЕЦЕПТОРНЫХ КЛЕТОК СЕТЧАТКИ
Наружные сегменты палочек сетчатки содержат разветвленную сеть цитоскелетных структур, в то время как в наружных сегментах колбочек цитоскелет гораздо менее развит.
Прежде всего это связано с чисто морфологическими особенностями. Палочки, работающие в условиях низких освещенностей, должны содержать намного больше зрительного пигмента и поэтому они намного длиннее колбочек. Основная функция цитоскелета - поддерживать правильную форму клетки и поэтому в палочках его морфологическая роль существенно выше. Однако как палочки, так и колбочки состоят из двух обособленных частей - наружного и внутреннего сегментов. Все метаболические процессы, необходимые для поддержания жизнедеятельности клетки, сосредоточены во внутреннем сегменте и поэтому их транспорт в наружный сегмент может быть значительно затруднен из-за больших размеров клеток. Существенную роль в этом процессе мог бы сыграть аксональный транспорт. В этом разделе представлены эксперименты, в которых с помощью ингибиторного анализа мы попытались подойти к исследованию вопроса об участии цитоскелета в регуляции процесса фототрансдукции [Ребрик и др., 1989; Каламкаров и др., 1992].
Влияние колхицина на регистрируемый внутриклеточно фотоответ палочек сетчатки лягушки. В этом исследовании фотоответ палочек регистрировался внутриклеточно, что позволяет контролировать как величину фотоответа, так и величину разности потенциалов на плазматической мембране фоторецептора. Эксперименты проводились на препаратах изолированной сетчатки. Колхицин, ингибитор роста микротрубочек, хорошо проникает в клетки через плазматическую мембрану. Поэтому его действие проявляется уже при экстраклеточной аппликации. Результаты такого эксперимента представлены на рис. 7.1. Как оказалось, колхицин оказывает существенное влияние на состояние поляризации мембраны. После удачного проникновения в клетку и регистрации контрольного фотоответа на тестовую вспышку света включали проток с колхицином. Это приводило к
216
Рис. 7.1. Регистрируемый внутриклеточно потенциал палочки
Стрелками указаны моменты вспышек света, черным треугольником показан момент включения протока с 10 мМ колхицина
Рис. 7.2. Влияние колхицина иа регистрируемые внутриклеточно фотоответы палочки лягушки
а - фотоответы палочки лягушки; 1,2 - раствор Рингера; 3,4 - раствор Рингера + 10 мМ колхицина; б - нормированные фотоответы палочки лягушки 1,2 - раствор Рингера: 3,4 - раствор Рин; ера + 10 мМ колхицина
кратковременной гиперполяризации и последующей деполяризации мембраны клетки. При этом амплитуда ответа на свет значительно снижалась. На рис. 7.2 представлены разрешенные во времени фотоответы палочки до воздействия колхицином, контрольные и через 15 мин после введения в проток колхицина, т.е. в момент относительной стабилизации фотоответа. Амплитуда существенно снизилась, кроме того, изменилась кинетика фотоответа. Из рис. 7,2, б, где фотоответы нормированы, видно, что
217
1
Рис. 7.3. Изменение параметров регистрируемых внутриклеточно фотоответов палочки лягушки при действии ванадата
Приведены нормированные по амплитуде фотоответы: / - контроль; 2 - после внутриклеточной инъекции ванадата
спад фотоответа значительно ускорился, в то время как фронт нарастания практически не изменился. Эффект, как и предполагается, практически необратим. При отмывании сетчатки от колхицина раствором Рингера в течение 30 мин амплитуда фотоответа частично восстанавливалась, но кинетика ответа не возвращалась к исходному виду.
Влияние ванадата на фотоответ палочки. Известно, что ванадат является ингибитором АТФаз, связывающих фосфат. Было прямо показано [Parker et al., 1987], что он блокирует 1У^2+-АТФ-зависимый рост филаментов в наружных сегментах палочек быка. В отличие от колхицина, ванадат не проникает в клетки через плазматическую мембрану. Поэтому его вводили в клетку непосредственно через микроэлектрод с помощью ионо-фореза, импульсами тока 1 нА. На рис. 7.3 представлены совмещенные фотоответы, зарегистрированные до и после введения ванадата в клетку. Спад фотоответа под действием ванадата замедляется, в то время как фронт нарастания, как и в опытах с колхицином, практически не меняется. На амплитуду ответа ванадат существенного влияния на оказывал.
Влияние колхицина на суммарный ПРП сетчатки. Поскольку в колбочках не обнаружена столь развитая сеть цитоскелета, как в палочках, интересно было сравнить влияние ингибиторов цитоскелета на фотоответы палочек и колбочек. К сожалению, регистрация внутриклеточных фотоответов колбочек лягушки невозможна технически. Влияние колхицина на колбочки оценивалось по его действию на колбочковый компонент суммарного аспартат-изолированного трансретинального ответа фоторецепторов сетчатки лягушки. Известно, что при низких ин
278
тенсивностях света вклад в этот ответ в основном дают палочки, в то время как при высоких интенсивностях света фотоответ обусловлен в основном колбочками сетчатки. Выяснилось, что влияние колхицина на палочковую оставляющую суммарного фотоответа значительно больше, чем на колбочковую.
Колхицин сильно подавляет ответ палочек и практически не влияет на фотоответ колбочек. Факт различного действия колхицина на палочки и колбочки является дополнительным контролем за тем, что колхицин в этих экспериментах действует специфично на цитоскелет, организация которого в палочках и колбочках различна.
Таким образом, вещества, влияющие на состояние цитоскелета, оказывают заметное влияние на амплитуду и кинетику фотоответа фоторецепторов. При этом и колхицин, который ингибирует рост микротрубочек, и ванадат, ингибирующий рост микрофиламентов, оказывают воздействие только на кинетику спада фотоответа, кинетика же нарастания в обоих случаях практически не меняется. Тот факт, что воздействие на различные элементы цитоскелета приводит к изменению только заднего фронта фотопотенциала, свидетельствует, по-видимому, о том, что цитоскелет задействован в регуляции процессов “выключения” сигнала и в механизме релаксации.
Трудно объяснить факт противоположного действия колхицина и ванадата на кинетику спада фотоответа. Следует заметить, что, хотя и показано прямое действие этих веществ на ци-тоскелетные элементы, не исключена возможность, что они действуют и на какие-то другие белки, участвующие в механизме “выключения” сигнала.
Приведенных данных явно недостаточно для строгого обоснования каких-либо гипотез о механизмах участия цитоскелета в фототрансдукции. Регуляторная функция цитоскелета могла бы состоять в избирательном транспорте белков или метаболитов, или в ограничении их свободной диффузии. Такой транспорт мог бы осуществляться как в радиальном, так и в продольном направлениях (вдоль оси наружного сегмента). Последнее может быть особенно существенно, поскольку, как обсуждалось в гл. 1, структура зрительной клетки такова, что синтез всех необходимых для фстотрансдукции метаболитов осуществляется во внутреннем сегменте, пространственно отделенном от наружного сегмента, где протекают процессы преобразования света.
Гпава 8
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ S-АНТИГЕНА (АРЕСТИНА) ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЛАЗНЫХ ПАТОЛОГИЙ
Одним из ключевых белков участников процесса усиления сигнала в зрительной клетке является арестин. Подробно его свойства и роль в механизме деактивации сенсорного сигнала описаны в первых главах настоящей книги. Однако, как оказалось, арестин участвует и в других процессах, протекающих в сетчатке. Еще в 70-е годы прошлого века было установлено, что введение кролику водорастворимой фракции, полученной из сетчатки, индуцирует аутоиммунный увеит. Фактор, вызывающий аутоиммунный увеит, был назван S-антиген. Позже было установлено, что S-антиген и арестин это один и тот же белок [Pfister et al., 1985]. Дальнейшие исследования показали, что у многих животных, включая приматов, вызванный S-антигеном экспериментальный увеит по своим клиническим проявлениям и гистологически похож на некоторые формы увеита у людей [Nussenblatt et al., 1981; Gregerson et al., 1990]. Известно, что в индукции этого заболевания ключевую роль играет иммунная Т-система [Caspi, 1986; Atalla et al., 1990; Chan et al., 1990]. Это позволяет предположить, что S-антиген играет определенную патогенную роль в индукции увеита. При некоторых формах увеита наблюдался как гуморальный, так и клеточный ответ на S-антиген [Nussenblatt et al., 1989; De Smet et al., 1990].
Совместно с МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца мы попытались системно подойти к исследованию корреляции между общими и местными иммунными реакциями и различными проявлениями увеита [Слепова и др., 1987, 1991, 1992; Slepova, 1996]. Искали корреляцию между содержанием S-антител в крови и слезной жидкости у пациентов с клинической формой увеита. В ходе многолетнего исследования был собран большой клинический материал, который позволяет предложить исследование слезной жидкости пациента на наличие S-антител и S-антигена как перспективную форму диагностики.
220
Выявление S-антител в крови и слезной жидкости больных различными формами увеита
В ходе исследования было обследовано 630 пациентов (средний возраст 29,5 лет): 197 мужчин (31%), 257 женщин (41%), 176 подростков (28%). Обследовались пациенты со следующими заболеваниями: двусторонние увеиты (298), односторонние увеиты (332). 928 глаз было обследовано на кератоувеиты (27), переднекамерные увеиты (83), промежуточные увеиты (331), заднекамерные увеиты (78), хориоретиниты (140), панувеиты (287). 450 пациентов обследовались в течение длительного времени (от 6 мес. до 8 лет). В качестве контрольной группы обследовалось 68 здоровых мужчин в возрасте от 10 до 60 лет (средний возраст - 28 лет). Клеточный ответ на S-антиген исследовался в реакции торможения миграции лейкоцитов (ТМЛ) в периферической крови в присутствии 20 мг/мл S-антигена. Учитывалось как ингибирование (индекс миграции ИМ меньше 0,8), так и стимулирование (ИМ больше 1,2) реакции.
S-антитела определялись в реакции пассивной гемагглютинации (РИГА). Первичное разведение слезной жидкости составляло 1 : 8, сыворотки крови -1:2.
Для обнаружения S-антител, связанных в иммунный комплекс с S-антигеном в крови (S-ИКК), сыворотку обрабатывали ультразвуком [Slepova et al., 1991].
Т-субпопуляцию СД4 (хелпер/индуктор) и СД8 (супрессор/ци-тотоксин) определяли с помощью цитофлуориметра, используя моноклональные антитела ОКТ4 и ОКТ8.
Обследование показало, что наибольший иммунный ответ на антиген наблюдался при увеитах, сопровождавшихся дегенерацией сетчатки. Для кератоувеитов и переднекамерных увеитов наблюдался достаточно слабый ответ (наблюдался редко) (табл. 8.1 и 8.2). В целом S-антитела обнаруживались в слезной жидкости значительно чаще (47%), чем в крови (14%). В 25% случаев в крови больных S-антитела находились в виде циркулирующих иммунных комплексов, т.е. в латентной форме.
Обследование показало, что реакция на S-антиген обычно значительно сильнее у пациентов с часто рецидивирующими и хроническими формами увеита. Наблюдение в динамике выявило три типа иммунограмм, которые типичны для заболеваний на различных стадиях (табл. 8.3).
Для редко рецидивирующих увеитов с благоприятным прогнозом титр антител в слезе был обычно выше, чем 1 : 256, на начальной стадии заболевания и затем падал до среднего уровня (1 : 32-1 : 128).
221
Таблица 8.1
S-антитела в слезе и сыворотке (РПГА-тест) у больных с различными клиническими формами увеита
Клинический диагноз увеита	Слеза				Сыворотка			
	частота			С.Г.Т.	частота			С.Г.Т.
	п	абс.	%		п	абс.	%	
1	2	3	4	5	6	7	8	9
Кератоувеит	27	6	22	1 :49	16	н.о.	Н.О.	<1 :8
Переднекамерный	83	14	17	1 :37	59	2	3	1 :8
Промежуточный	371	201	54в	1 :97а	215	31	14а	1 :24а
Заднекамерный	78	45	58в	1 :84а	43	6	14	1 : 14
Панувеит	128	71	55в	1 :91а	68	10	15а	1 : 17а
Хориоретинит	140	64	46в	1 :91а	100	20	206	1 : 15а
Помутнение хру-	159	60	38в	1 :97а	99	13	13а	1 :24а
сталика, стекловидного тела, роговицы Всего	984	461	47в	1 :84а	600	82	14а	1 : 18а
Контроль	52	5	10	1 :20	68	1	1	1 :8
Примечание, п — число обследованных больных; с.г.т. - среднее геометрическое титров (рассчитано из положительных образцов); н.о. - антитела не были обнаружены.
а - Р < 0,05; б - Р < 0,01; в - Р < 0,001 (по сравнению с контролем).
В случае подострой и часто рецидивирующей формы относительно высокий титр антител (выше чем 1 :256) наблюдался в течение достаточно длительного периода. Низкий титр антител в слезе (меньше 1 : 16) и сильная реакция в крови были типичны для наиболее тяжелых форм с неблагоприятным исходом.
При длительной ремиссии уровень S-антител в слезе достигал 1 : 132-1 : 128 у 75% больных. S-антитела в крови отсутствовали или их уровень приближался к 1 : 16. Клеточный ответ не регистрировался или наблюдалась стимуляция ТМЛ, т.е. средняя местная реакция и ослабление реакции в крови.
Положительная реакция на S-антиген при длительной ремиссии отсутствовала. Увеличение титров S-антител в слезе и/или в сыворотке крови и ингибирование ТМЛ происходили за 1-2 недели до появления признаков рецидива увеита.
222
Таблица 8.2
Клеточный ответ (ТМЛ) на S-антиген у больных с различными клиническими формами увеита
Клинический диагноз увеита	п	Ингибирование ИМ > 0,80		Стимуляция ИМ > 1,20		Всего положительных ответов	
		абс.	%	абс.	%	абс.	%
Кератоувеит и переднекамерный увеит	52	4	7	6	12	10	19
Промежуточный и за дне камерный увеит	48	12	256	4	8	16	33а
Панувеит Хориоретиниты	38	10	26а	8	21	18	47в
Помутнение хрусталика, стекловидного тела и роговицы	20	8	40в	4	20	12	
Всего	201	42	21в	23	11	65	32а
Контроль	30	1	3	2	7	3	10
Примечание, а — Р контролем).	< 0,05;	б - Р <	0,02; в	- Р < 0,01 (по сравнению с			
Таблица 8.3
Реакция на S-антиген при разном развитии увеита
Увеит	S-антитела						Развитие клеточного ответа	
	в слезе			в сыворотке				
	абс./п	%	С.Г.Т.	абс./п	%	С.Г.Т.	абс./п	%
Редко рецидивирующий	37/234	16	1 :32	4/169	2	1 :8	4/40	10
Часто рецидивирующий	135/284	48в	1 :69а	45/180	256	1 :30а	26/77	346
Хронич., длительный	299/466	64в	1 :91а	33/251	13а	1 : 10а	35/84	42в
Контроль	5/52	10	1 : 20	1/68	1	1 :8	3/30	10
Примечание, с.г.т. — среднее геометрическое титров; а — Р < 0,05; б -Р < 0,01; в - Р < 0,001 (по сравнению с контролем).
223
Таблица 8.4
Реакция на S-антиген при одно- и двустороннем увеитах
Тест	Односторонний		Двусторонний	
	п = 218		п = 766	
	частота (%)	с.г.т.	частота (%)	с.г.т.
S-антитела:	44 ± 3	1 :97	48 + 2	1:52 слеза больного глаза слеза второго (здорового)	40 ± 3	1 : 69 глаза сыворотка крови	13 ±2	1 : 17	14 ±2	1 :20 Клеточный ответ на S-анти-	22 ± 7	Р < 0,02	56 + 7 ген: ингибирование (ИМ < 0.8)	19 ±6	Р<0,05	40 ±7 стимуляция (ИМ) <1,2	3 + 3	16 + 5 Примечание, с.г.т. - среднее геометрическое титров.				
Частота определения S-антител в слезе и их уровень были одинаковы при одно- и двусторонних увеитах, однако клеточный ответ и результаты определения ИКК были типичны для двустороннего увеоретинита (табл. 8.4).
При обследовании больных с постувеальными нарушениями оказалось, что развитие вторичной хориоретинальной дистро-
Таблица 8.5
Реакция на S-антиген при постувеальных дистрофиях сетчатки
Клинический диагноз	S-антитела			
	слеза			
	частота			
	п	абс.	%	с.г.т.
Отек сетчатки Отслойка сетчатки:	33	30	91вг	1 :1826г
локальная	18	15	83вд	1 : 158а
субтотальная	10	3	30	1 : 128
тотальная	15	1	7д	1 : 16д
Хориоретинальная дистрофия Контроль:	42	13	316	1 :45г
увеит	984	461	47в	1 : 84а
норма	52	5	10	1 : 20
Примечание, с.г.т. - среднее геометрическое титров
224
фии, отслойка и отек сетчатки коррелируют с иммунным ответом на S-антиген (табл. 8.5). Отек и локальная отслойка сетчатки коррелировали с увеличением титров S-антител в слезе. S-антитела в сыворотке и клеточный ответ регистрировались не всегда, т.е. преобладал местный иммунный ответ. Напротив, общая дистрофия и отслойки сетчатки были связаны с падением титров S-антител в слезе и с увеличением титров в сыворотке и сильным клеточным ответом.
Клеточный ответ на S-антиген (ингибирование ТМЛ), накопление S-антител в слезе и сыворотке могли бы быть свидетельством дистрофии сетчатки при увеите, как это и было продемонстрировано в настоящем исследовании при сравнении больных с тяжелыми формами увеитов и здоровых людей. Положительные реакции на S-антиген также могли бы быть использованы как диагностический тест при помутнении хрусталика, стекловидного тела и роговицы, т.е. когда исследование глазного дна затруднено. Это согласуется с высокой тканеспецифичностью S-антиге-на [De Kozak, 1985; Dua,1989], Было высказано предположение [Doekes, 1988], что только S-антиген человека может быть использован для диагностики заболеваний, однако наши данные свидетельствуют о возможности применения для этих целей S-антигена из сетчатки быка, что существенно облегчает задачу.
Нами впервые показано, что при хроническом увеите, отеке сетчатки и ограниченной отслойке сетчатки преобладает местный иммунный ответ. По-видимому, это объясняется локальным выделением иммуноглобулинов и специфических антител в гла-
S-антитела				Клеточный ответ		
сыворотка						
частота				частота		
п	абс.	%	С.Г.Т.	п	абс.	%
30	3	10±8	1 : 14	30	8	26±8
11	1	9±8	1:8	10	4	40 ± 15а
10	2	20± 12а	1 : И	10	5	50 ± 15
12	4	33 ± 146	1 :23а	15	8	53 ± 126
27	6	22±8а	1:30а	22	12	54 ± 106
600	81	14 ± 1в	1 : 18а	201	65	32±3а
68	1	1 ± 1	1 : 8	30	3	10 ± 5
'/2 8. Г.Р. Каламкаров, М.А. Островский Z25
зу. С другой стороны, для большинства тяжелых увеитов, хориоретинальных дистрофий и полной отслойки сетчатки характерны низкие титры или отсутствие S-антител в слезе и усиление как гуморального, так и клеточного ответов в крови. Это означает, что необходимо исследовать как местные, так и системные реакции, непременно включая тестирование слезы.
Средние титры S-антител в слезе (1 : 32-1 : 128) при отсутствии S-антител в сыворотке (1 : 8) и слабый клеточный ответ (стимуляция ТМЛ), по-видимому, связаны с благоприятным прогнозом течения увеита, и это следует рассматривать как нормальную специфическую тканевую реакцию защитного свойства. Нормальный тип такой реакции сочетается также с нормальным уровнем иммунорегуляторной субпопуляции Т-лимфоцитов крови.
Усиление реакций в крови, т.е. ингибирование ТМЛ, накопление S-антител в сыворотке (больше 1 : 16), циркуляция S-ИКК отражают генерализацию аутоиммунного процесса. Все это указывает на развитие двустороннего рецидивирующего увеита и постувеальных осложнений.
Наиболее интересно отсутствие S-антител в слезах больных с наиболее тяжелыми симптомами увеоретинитов и хориоретинальных дистрофий. Мы предполагаем, что дефицит антител при заболеваниях сетчатки можно считать парадоксальным состоянием, причиной которого является слабый местный иммунный ответ. Однако необходимо принять во внимание и некоторые другие возможные объяснения: образование специфических иммунных комплексов, антиидиотипические антитела и блокирующие факторы.
Иммунопатологическая важность как роста титров S-антител в слезе или сыворотке, так и дефицита S-антител в слезе подтверждается существенным дисбалансом уровня лимфоцитов СД4 и СД8 в крови. Усиление реакций в слезе и сыворотке связано с низким уровнем Т-супрессоров (СД8). Слабый ответ на S-анти-ген, по-видимому, вызван дефицитом Т-хелперов (СД4) и увеличением уровня Т-супрессоров. Такое состояние можно оиреде лить как состояние общего Т-зависимого иммунодефицита и свидетельство связи тканеспецифических реакций (включая и местные реакции) с дисбалансом иммунорегуляторов клеток крови.
Таким образом, наличие антител в слезе больных увеитом указывало на наличие сильной аутоиммунной компоненты заболевания. В этом случае применение иммунодепрессантов оказывается очень эффективным.
Действительно, лечение больных с дефицитом S-антител в слезе кортикостероидами, особенно в комбинации с цитостатика
226
ми, было, как правило, неэффективным. Эти наблюдения позволяют понять, почему малоэффективна иммунодепрессивная терапия увеитов [Belfort et al., 1982].
В целом, как это следует из вышеизложенного, использование такого теста, как определение титра S-антител, оказалось очень эффективным как для определения характера увеита и прогноза течения заболевания, так и для определения метода лечения.
Применение метода выявления S-антител при диагностике и прогнозе развития диабетической ретинопатии
Еще более интересными для перспективы использования выявления S-антител для диагностики и прогноза глазных патологий представляются результаты исследования больных диабетической ретинопатией. Для ранней диагностики ДР применялся как метод выявления антител, так и метод электроретинографии [Щербатова и др., 1990; Зайцева и др., 1991]. В данном разделе представлены результаты, полученные при применении иммуно-ферментного анализа (ИФА). В этом случае антитела - иммуноглобулины IgG и Igtyl - выявлялись в крови и слезной жидкости с использованием античеловеческих антител, конъюгированных с пероксидазой хрена [Зайцева и др., 1997; Kalamkarov, 19971.
Исследованы S-антитела (S-ат) в сыворотке крови (СК) и слезной жидкости (СЖ) у больных инсулин-зависимым сахарным диабетом (ИЗСД) без диабетической ретинопатии (без ДР) на разных стадиях диабетической ретинопатии (ДРО - субклиническая стадия; ДР1 - манифестная стадия, ДР2 - предпрофилеративная стадия; ДРЗ - пролиферативная стадия). Для субклинической стадии характерно то, что явные клинические признаки заболевания еще отсутствуют, однако возможны некоторые изменения в элек-троретинограмме и ангиограмме. Манифестная стадия - начало заболевания, сопровождающееся появлением клинически выраженных изменений глазного дна; предпролиферативная и пролиферативная стадии сопровождаются тяжелым поражением сетчатки. Результаты исследования представлены на рис. 8.1.
Анализ полученных данных показал, что приблизительно у половины пациентов с ИЗСД гуморальный иммунный ответ на S-АГ как в крови, так и в слезе обнаруживался до развития клинически явных признаков ДР. Пик выявления S-ат ассоциировался с манифестацией ДР: на этой стадии (ДР1) S-ат обнаруживались в 100% проб в сыворотке крови (Р < 0,01 по сравне-
‘/28*	227
всего % проб, в которых обнаружены S-ат какого-либо одного
или обоих классов иммуноглобулинов
Рис. 8.1. Частота обнаружения S-ат (IgG и IgM класса) у больных инсулин-зави-симым сахарным диабетом без ДР и на разных стадиях ДР
нию с больными без признаков клинически явной ДР) и в 80% проб слезной жидкости. При развитии ДР S-ат обнаруживались в целом реже, чем в период манифестации. Причем, частота их выявления в СК снижалась постепенно, приближаясь на пролиферативной стадии (ДРЗ) к исходным показателям (у больных без ДР). В слезной жидкости минимальное число положительных результатов отмечалось на предпролиферативной стадии -ДР2, стадия пролиферации - ДРЗ характеризовалась возврат-
228
* р<0,01 по сравнению с предыдущими стадиями
Рис. 8.2. Выявление различных классов S-ат у больных инсулин-зависимым сахарным диабетом
сви-
как
спе-
или
ным повышением частоты обнаружения S-ат. Надо полагать, что на доклинических стадиях отрицательные результаты детельствовали об отсутствии S-аутоиммунизации, тогда при развитой ДР они могли быть следствием образования цифических иммуноциркулирующих комплексов (ЦИК) антиидиотипических антител.
229
Таким образом, выявление S-антител оказывается удобным диагностическим методом именно на тех стадиях заболевания, когда клинические признаки отсутствуют.
Дифференцированный анализ частоты выявления S-ат IgG и/или IgM класса показал, что в отсутствие каких-либо признаков ДР (клинических, функциональных, биохимических - группа “без ДР”) оба класса антител выявлялись примерно с одинаковой частотой. При развитии ДР, начиная с манифестной стадии (ДР1) - в сыворотке крови, а в слезе - раньше (ДРО), S-IgM обнаруживались в обеих пробах примерно на 30% чаще, чем S-IgG, в СЖ в период манифестации - на 56% чаще. Возможно, что явное доминирование S-ат IgM-класса, особенно в стезе при развитой ДР связано с образованием патологических иммунных комплексов, в состав которых, как известно, чаще входят IgG-антитела.
При оценке патогенетического значения каждого из двух классов S-ат был проведен анализ их сочетанного или селективного накопления в разных группах больных (рис. 8.2). У пациентов “без признаков ДР” в сыворотке крови отмечался селективный синтез только S-IgM-ат (15%), что, вероятно, отражало первичность аутоиммунного ответа на S-АГ. Функциональная стадия (ДРО) характеризовалась селективным накоплением только S-IgG, что, возможно, указывало на стабилизацию процесса.
На манифестной стадии вновь преобладают антитела класса IgM. Аналогичная тенденция была отмечена и при исследовании слезной жидкости, причем, доминирование селективной продукции S-IgM-ат проявлялось раньше, чем в сыворотке крови (уже на функциональной стадии ДР-ДРО).
Одновременное накопление S-ат обоих классов было обнаружено и при исследования внутриглазных жидкостей (ВГЖ), полученных во время операций по поводу отслойки сетчатки у боль-
Таблица 8.6
Результаты исследования S-антител ао виутриглазых жидкостях
ВГЖ	Частота выявления									
	S-IgG (всего)		S-IgM (всего)		S-IgG + + S-IgM		ТОЛЬКО S-IgG		только S-IgM	
	абс.	%	абс.	%	абс.	%	абс.	%	абс.	%
ст.т (п = 8)	0	0,0	1	2,5	1	2,5	7	7,5	0	0
СРЖ (п = 8)	7	7,5	4	0	4	0	3	7,5	0	0
230
ных с ДРЗ (табл. 8.6). В стекловидном теле - в 100% и в субретинальной жидкости (СРЖ) - в 87,5% проб выявлялись S-IgG. S-IgM были обнаружены у половины пациентов в СРЖ и в 13% случаев в стекловидном теле. Следует отметить, что и в СРЖ и в СТ.Т. S-lgG выявлялись достоверно чаще (100%), чем в пробах СЖ (24%; Р < 0,01) и СК (35%; Р < 0,01); тогда как IgM в СРЖ -примерно с той же частотой, а в СТ.Т. реже, чем в СК и СЖ.
Неблагоприятная роль аутоиммунизации S-антигеном была подтверждена и при исследовании пациентов с различными исходами лазеркоагуляции (ЛК).
Использование метода обнаружения S-антител оказалось удобным и для прогноза результатов оперативного лечения ДР методом лазеркоагуляции (ЛК).
Анализ показал, что неизменные показатели S-ат наблюдались при благоприятном течении послеоперационного периода; в случае дальнейшего про] рессирования ДРЗ после ЛК сетчатки S-ат обоих классов как в крови, так и в слезе наблюдались значительно чаще, причем, наиболее значимым показателем явилось одновременное накопление S-IgG и S-IgM антител. Эти данные согласовались и с результатами индивидуального анализа. Так, из 14 пациентов, обследованных в динамике до и после ЛК, у 8 человек с успешным исходом лечения существенных сдвигов в характере местного и/или системного иммунного ответа на S-АГ после ЛК не отмечалось. У 6 пациентов с осложнениями после ЛК наблюдалось двукратное усиление синтеза S-ат обоих классов как в СК, так и в СЖ.
Таким образом, обнаружение S-антител различного класса оказалось удобным прогностическим признаком как при ранней диагностике диабетической ретинопатии, так и при прогнозе результата лечения.
Иммуноферментный метод и набор реагентов для определения антител к S-антигену сетчатки глаза в сыворотке крови человека
Опираясь на изложенные выше результаты, нами был разработан метод и набор реагентов для определения антител к S-антигену сетчатки глаза в сыворотке крови человека методом им-му коферментного анализа для:
ранней диагностики вовлечения в патологический процесс сетчатки глаза;
диагностики поражений сетчатки у больных с помутнениями оптических сред глаза,, когда офтальмоскопия глазного дна не
231
возможна или затруднена (катаракта, бельма, помутнение стекловидного тела);
диагностики и прогнозирования течения аутоиммунных увеитов;
прогнозирования развития и прогрессирования диабетической ретинопатии;
прогнозирования осложнений и быстрого прогрессирования близорукости.
Метод и набор прошли все необходимые технические и медицинские испытания и рекомендован к широкому применению М3 РФ.
В обоих случаях критерием обнаружения иммуноглобулинов G (IgG) или иммуноглобулинов М (IgM) служила разность оптической плотности сыворотки крови нормальных доноров и исследуемой сыворотки при исследовании их методом иммунофер-ментного анализа. Если эта разность превышала 0,2, то присутствие IgG или IgM считалось установленным.
Испытание набора показало, что наиболее интересные и значимые для широкого применения результаты получены при исследовании больных монолатеральными увеитами и диабетической ретинопатией. При исследовании более 130 больных было установлено, что обнаружение в крови больных одновременно обоих иммуноглобулинов свидетельствовало о скором вовлечении в патологический процесс второго глаза. Так, при обследовании 130 больных монолатеральным увеитом у 34 в крови были обнаружены одновременно IgG и IgM. У 32 больных в течение полугода при офтальмоскопии было отмечено начало воспаления на втором глазу.
Разработанный нами метод позволяет объективно предсказать переход монолатерального увеита в билатеральный.
При исследовании больных диабетической ретинопатией было установлено, что обнаружение в крови больных иммуноглобулинов обоих типов обычно коррелировало с резким обострением патологического процесса и таким образом явилось дополнительным диагностическим критерием наряду с ангиографией и офтальмоскопией.
В ряде случаев один из иммуноглобулинов обнаруживался в крови больных диабетической ретинопатией (ДР) на самой ранней стадии заболевания. Мы установили, что обнаружение одного из иммуноглобулинов IgG или IgM в крови больных диабетом без видимой глазной патологии свидетельствовало о скором появлении признаков заболевания ДР. Так, нами было обследовано 140 больных инсулин-зависимым сахарным диабетом в течение 3 лет. У 34 в крови были обнаружены IgG или IgM. При последу-
232
ющем наблюдении у 32 больных были отмечены признаки ДР при офтальмоскопии или ангиографии.
Таким образом, обнаружение антител к S-антигену в крови больных диабетом оказалось объективным прогностическим критерием скорого наступления глазной патологии. Использование метода позволяет выявить группу риска глазных осложнений среди больных диабетом, что позволяет как проводить профилактику, так и своевременно начать лечение.
9.	Г.Р. Каламкаров, М.А. Островский
Гпава 9
МЕХАНИЗМЫ ФОТОПОВРЕЖДЕНИЯ СЕТЧАТКИ И ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ И СИСТЕМЫ ЗАЩИТЫ ОТ ОПАСНОСТИ ТАКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ
Сетчатка - это единственная часть нервной системы, доступная свету. Известно, что избыток света способен привести к ее повреждению. Согласно эпидемиологическим данным, существует корреляция между интенсивностью и спектральным составом света, с одной стороны, и с развитием ряда глазных заболеваний, в частности, такого распространенного, как старческая макулярная дегенерация сетчатки, с другой.
Таким образом, свет в зрении выполняет не только функцию носителя информации, но представляет собой также и фактор риска, в первую очередь - для сетчатки. Поэтому в ходе эволюции органов зрения и у беспозвоночных, и у позвоночных совершенствовались две тесно связанные друг с другом функциональные системы: собственно фоторецепции и защиты от опасности светового повреждения.
Световое повреждение достаточно подробно описано у животных и человека [Островский и др., 1979]. Обычно рассматриваются два типа светового повреждения: во-первых, как результат длительного, хронического воздействия света на сетчатку и, во-вторых, как следствие хотя и непродолжительного, но интенсивного воздействия на нее. В первом случае речь идет об относительно низких уровнях освещенностей и, что существенно, - о максимуме спектра действия в области 500 нм, совпадающем со спектром поглощения родопсина. Во втором случае максимум спектра действия фотоповреждения находится в коротковолновой области спектра: синий свет оказывается примерно в 50 раз эффективнее, нежели зеленый или тем более красный.
В основе механизмов светового повреждения сетчатки и пигментного эпителия лежат процессы фотосенсибилизированного свободнорадикального окисления. Как известно, эффективность реакции сенсибилизированного фотоокисления определяется тремя факторами: собственно фотосенсибилизатором, субстратом окисления и кислородом. В сетчатке, в первую очередь в ее фоторецепторных клетках, а также в клетках пигментного эпителия все три фактора присутствуют в полной мере. Остановимся подробнее на этих факторах.
234
Фотосенсибилизаторы
Ими могут служить как эндогенные, так и экзогенные окрашенные соединения. К эндогенным фотосенсибилизаторам сетчатки и пигментного эпителия, в первую очередь, относятся ре-тиналь и продукты его превращения.
Ретиналь представляет собой один из эффективных природных сенсибилизаторов. Как видно из таблицы, его сенсибилизирующая активность лишь вдвое ниже, чем у такого классического фотосенсибилизатора, как рибофлавин [Сапежинский, 1988].
Фотосенсибилизированное ретиналем окисление может идти как по пути физической сенсибилизации с участием кислорода, так и по пути химической сенсибилизации. Это было показано нами в модельной системе, а именно было охарактеризовано фотосенсибилизированное ретиналем окисление трипсина и цистеина [Островский, 1994].
Ретиналь в наружном сегменте фоторецептора высвобождается из молекулы родопсина на последней стадии его фотолиза в результате гидролиза ковалентной связи Шиффова основания, и затем в виде свободного полностью-транс-ретиналя при определенных обстоятельствах может накапливаться в фоторецепторной мембране. Например, такая ситуация вполне реальна в фото-
Относнтельный выход фотоокислення глицинтрнптофана в присутствии различных эндогенных фотосенсибилизаторов (облучение УФ-светом - 313 нм)*
Вещество	Максимум поглощения	Относительный выход
Никотиновая кислота	261,5	9 7
Флавинмононуклеотид	450	1.1
Рибофлавин	372.5	1,0*
Пиридоксин	325	0,74
Ретиналь	380	0,51
надн2	339	0.05
Фолиевая кислота	365	0,05
Кобаламин	361	>0,05
Рутин	362	>0,05
Билирубин	453	>0.05
* За единицу принято значение выхода для рибофлавина. Концентрация глицилтриптофана - 10-3 моль/л, оптическая плотность всех растворов при 313 нм - 0,05; 0,01 моль/л фосфатный буфер pH 7,0; время освещения 2 мин.
9*
235
рецепторной клетке старческой сетчатки. Еще опаснее, если в фоторецепторной мембране наружного сегмента накапливается не сам ретиналь, а его еще более фототоксичный продукт превращения - бис-ретинилиден-фосфатидилэтаноламин. Этот продукт, в свою очередь, может переноситься затем из фоторецепторов сетчатки в клетки пигментного эпителия и там превращаться в следующий продукт - бис-ретинилиден-этаноламин (обозначаемый в англоязычной литературе как А2Е). Этот продукт представляет собой основной флуорофор липофусциновых гранул (подробнее о фототоксичности липофусциновых гранул см. ниже).
Изучая природу эндогенного фотосенсибилизатора при окислении молекулярных компонентов фоторецепторной мембраны, мы, во-первых, исследовали зависимость скорости их окисления от дозы облучения (рис. 9.1, А) и, во-вторых, спектр действия фотоокисления (рис. 9.1, Б) [Погожева и др., 1981]. Объектом исследования в этих опытах служили предварительно обесцвеченные видимым светом образцы суспензии наружных сегментов палочек. Иными словами, фоторецепторные мембраны содержали уже не сам родопсин (Хмакс = 500 нм), а продукт его обесцвечивания видимым светом - метародопсин II (Амакс = 380 нм) или уже высвободившийся полностью-трднс-ретиналь (Амакс = 380 нм). Добавление к такой обесцвеченной суспензии экзогенного ретиналя приводит к пропорциональному увеличению числа фото-окисленных тиоловых групп белка. Уменьшение же концентрации ретиналя в обесцвеченной суспензии (суспензия предварительно обесцвечивалась в присутствии НАДФН с последующим отмыванием пиридиннуклеотида) соответственно уменьшает количество окисленных SH-групп. Из этих опытов следовало, что ретиналь способен выступать в качестве сенсибилизатора фотоокисления белкового компонента (родопсина) фоторецепторной мембраны. Подобные результаты были получены и в отношении липидов этой мембраны.
В этой же работе удалось определить зависимость окисления белков и липидов фоторецепторной мембраны от длины волны облучающего света. Суспензию наружных сегментов фоторецепторов облучали равноквантовыми потоками света разной длины волны в течение 30 мин и затем наблюдали как накопление конечного продукта окисления липидов - малонового диальдегида (МДА), так и уменьшение числа свободных SH-групп белка (см. рис. 9.1, Б). Наиболее выраженное фотоокисление и белков, и липидов наблюдается в области 380 нм. Иными словами, спектр действия их окисления находится в той же области, что и спектр поглощения свободного ретиналя (или метародопсина II).
236
Б
Д [SH]
X, нм
Рис. 9.1. Фотоокисление родопсина и липидов в фоторецепторной мембране
А - зависимое от дозы фотоокисление тиоловых групп родопсина ISHJ/молекулу, кривая / и липидов (малоновый диальдегид, нмоль/мг белка, кривая 2). По оси абсцисс -доза облучения в Дж/см2. Б - фотоокисление тиоловых групп родопсина [SHJ/молекулу, кривая / и липидов (малоновый диальдегид, нмоль/мг белка, кривая 2), зависимое от равноквантового действия света различной длины волны
Липофусциновые гранулы (или “пигмент старости”) представляют собой желтоватые флуоресцирующие включения внутри клеток пигментного эпителия. Они образуются и накапливаются в результате неполной деградации фагоцитированных обломков наружных сегментов фоторецепторов - фагосом. Считалось, что липофусциновые гранулы являются безвредным балластом, накапливающимся в постмитотических клетках по мере старения организма. Оказалось, однако, что при действии света они способны генерировать активные формы кислорода - суперокисные анион-радикалы и синглетный кислород [Островский и др., 1992; Boulton et al., 1992; Boulton et al., 1993; Rozanowska et al., 1998]. Спектры действия генерации этих активных форм кислорода совпадают: коротковолновая часть спектра гораздо эффективнее, нежели средне- и длинноволновая. 11а рис. 9.2 показана зависимость накопления суперокисных анион-радикалов от длины волны облучения суспензии липофусциновых гранул [Boulton et al., 1993]. Липофусциновые гранулы, выступая в роли сенсибилизаторов фотоокисления, способны стимулировать окисление липидов (докозагексаеновой и линоленовой кислот) и кардиолипиновых липосом [Dontsov et al., 1999].
Флавины относятся к другим эндогенным фотосенсибилизаторам, содержание которых в сетчатке и пигментном эпителии достаточно велико. К ним относятся рибофлавин и НАДН.
237
Рис. 9.2. Зависимость скорости генерации суперокнсных радикалов кислорода липофусциновыми гранулами от длины волны действующего света
Предшественник гемоглобина - протопорфирин-IX - это еще один потенциально опасный фотосенсибилизатор, также поглощающий свет в синей области спектра. Находясь в доступных свету хориокапиллярах, он может стать причиной фотодегенера-тивных процессов.
Лекарства, как и другие экзогенные фотосенсибилизаторы, попадающие в доступные свету структуры глаза, в первую очередь сетчатку и пигментный эпителий, а также окрашенные продукты метаболизма могут представлять опасность как фотоповреждающие агенты [Пирузян и др., 1991]. Экзогенные фотосенсибилизаторы особенно опасны для афакичного, а также нормального детского глаза, хрусталик которого пропускает не только видимый, но, частично, и ультрафиолетовый свет [Федорович и др., 1994].
Субстраты фотоокисления
Молекулярные компоненты фоторецепторной мембраны представляют собой, можно сказать, идеальные субстраты для реакции фотосенсибилизированного окисления. Как и любая биологическая мембрана, фоторецепторная мембрана диска состоит из липидного бислоя и пронизывающих его мембранных белков. Основным интегральным белком этой мембраны является родопсин: на его долю приходится до 95-98% всех интегральных белков. В состав оставшихся 2-5% входит белок большой
238
молекулярной массы (220 кДа), ответственный за активный перенос свободного транс-ретиналя из фоторецепторного диска. Этот белок, так называемый ATP-binding cassette transporter, или ABCR, находится в “петле” диска (подробнее об этом белке см. ниже). Основными фосфолипидами фоторецепторной мембраны являются фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и фосфати-дилсерин. Уникальным является жирнокислотный состав этих фосфолипидов: более 60% - это полиненасыщенные жирные кислоты, причем на долю длинноцепочечной докозагексаеновой (С22:6) кислоты приходится около 75% [Островский, 1992]. Благодаря этому фоторецепторная мембрана имеет исключительно низкую вязкость, равную, примерно, 2 пуазам (это вязкость оливкового масла). Такая вязкость обеспечивает довольно быструю вращательную и более медленную латеральную диффузию родопсина и других белков в этой мембране.
Фотосенсибилизированное окисление белков и липидов фоторецепторной мембраны идет параллельно и практически независимо. Действительно, добавление известного ингибитора перекисного окисления липидов - 2,6-ди-трет-бутилокситолуола (ди-бунола) полностью предотвращает фотоокисление липидов в этой мембране и лишь частично снижает скорость окисления тиоловых групп белка (рис. 9.3) [Погожева и др., 1981].
Системы окисления белка и липидов по-разному реагируют и на изменение содержания кислорода в среде инкубации: окисление белка к нему гораздо менее чувствительно. Окисление же липидов идет с большей легкостью с участием активных форм кислорода [Старостин и др., 1985]. Интересно сопоставить в этой связи квантовые выходы фотоокисления родопсина и его обесцвечивания: квантовый выход фотоокисления белка около 0,04, а фотообесцвечивания родопсина 0,7, т.е. почти на порядок выше [Островский, Говардовский, 1992]. Это объясняет, почему физиологические интенсивности света не становятся для сетчатки повреждающими.
Следствием фотоокисления родопсина и липидов в фоторецепторной мембране являются:
образование внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей (“сшивок”) [Погожева и др., 1981; Островский и др., 1996];
образование необратимых белковых агрегатов, подвижность которых в мембране крайне низка;
потеря способности окисленного и агрегированного родопсина к регенерации как in vitro, так и in vivo [Погожева и др., 1981; Островский и др., 1982].
В нашей работе [Погожева и др., 1981] впервые были найдены методические подходы к модификации SH-групп родопсина в
239
20
Рис. 9.3. Влияние антиоксидантов (дибунола) на кинетику фотоокнсления SH-групп родопсина (I, 2) и липидов (3, 4) в фоторецепторной мембране; С _ in-5 м С «	= 1(Н М
^ родопсина	'-"дибунола
мембране спиновыми метками. Тогда это было сделано для оценки изменения поведения в мембране фотоповрежденного родопсина. Однако в дальнейшем этот подход привел к обнаружению функционально важной светоиндуцированной конформационной перестройки молекулы родопсина на стадии метародопсина II, позволяющей ему взаимодействовать с другими белками каскада фототрансдукции (подробнее см. гл. 2).
В этой же работе 1981 г. было показано, что длительное освещение суспензии фоторецепторных мембран (75 мин, 105 лк) приводит:
к заметному замедлению вращательной подвижности спин-меченного белка (Тс/тс0) (при этом анализ спектра ЭПР-метки свидетельствует именно об агрегации молекул белка, во всяком случае о том, что расстояние между ними не превышает 20-30 А), к уменьшению числа свободных SH-групп до 35% от исходного значения,
к существенному накоплению продуктов перекисного окисления липидов (до 30 нмолей МДА/мг белка),
к образованию олигомеров родопсина, как это следовало из картины электрофореза (при этом доля мономерной фракции уменьшалась, а доля димеров, тримеров и олигомерной фракции, остающейся на старте, возрастала).
Было также показано, что агрегация родопсина при повреждающем действии света на фоторецепторную мембрану происхо-
дя
а-волна ЭРГ	Содержание регенерированного
родопсина
Рис. 9.4. Зависимость поведения a-волны электроретннограммы белой крысы и регенерации родопсина от повреждающего действия света при различных концентрациях кислорода
дит главным образом за счет образования межмолекулярных дисульфидных связей между “гидрофобными” SH-группами родопсина.
Анализ поведения спиновых зондов, введенных в липидный бислой фоторецепторной мембраны, показал, что микровязкость мембраны при фотоокислении ее компонентов несколько уменьшается, при этом подвижность липидов в ней увеличивается. Скорее всего это является следствием “сегрегации” родопсина в мембране в результате образования его олигомеров.
Необратимая агрегация родопсина в мембране, вызванная повреждающими дозами света, приводит к потере его нативных свойств и нормальной функциональной активности. Чувствительным тестом на нативность зрительного пигмента является его способность к регенерации при добавлении экзогенного 11 -цнс-ретиналя. И в опытах in vitro на суспензии фоторецепторных мембран [Островский и др., 1982], и в опытах in vivo при облучении глаза белой крысы [Капуста и др., 1987] было показано, что способность родопсина к регенерации уменьшается, а нормальная электрическая активность сетчатки - электроретинограм-ма - подавляется или исчезает (рис. 9.4).
241
Рис. 9.5. Падение флуоресценции межфоторецепторного ретинальсвя-зывающего белка (IRBP), свидетельствующее об уменьшении числа мест связывания ретинола в результате фотоокисления IRBP
/ - нативный необлученный IRBP, 2 — IRBP, облученный в отсутствие ретиналя (неповрежденный); 3 - IRBP, облученный в присутствии ретиналя (поврежденный).
Полностью-гиранс-ретинол
Внутриклеточное
Внеклеточное
11 -цис-ретиналь
Норма
Избыток липофусциновых гранул
Болезнь Штаргардта
Б
Рис. 9.6. Перенос полностью-транс-ретиналя из фоторецепторной мембраны диска в междисковое (цитоплазматическое) пространство
А - участие белка ABCR (ATP-binding cassette transporter) в механизме переноса пол-ностью-тронс-ретиналя; Б — избыточное накопление липофусциновых гранул в клетке пигментного эпителия (ПЭ) вследствие дефекта белка ABCR в наружном сегменте палочки (НСП)
Помимо родопсина, ретиналь выступает фотосенсибилизатором окисления и повреждения ретиналь-связывающих и ретиналь-переносящих белков - ключевых белков зрительного цикла. К важнейшим из них относится ABCR (см. выше) [Sun et al., 2001] и водорастворимый межфоторецепторный ретиналь/ретинол-пе-реносящий белок (IRBP) [Fedorovich et aL, 2001]. Нами было показано, что при действии света в полосе поглощения ретиналя, т.е. в ближней ультрафиолетовой области (X = 380 нм), белок IRBP повреждается: часть его цистеиновых и ароматических аминокислотных остатков окисляется и, что самое важное, снижается его способность связывать ретинол. На рис. 9.5 показано уменьшение числа мест связывания ретинола фотоповрежденным IBRP.
Специфичный для фоторецепторной клетки мембранный белок, активно переносящий (с затратой энергии АТФ) полностью-шранс-ретиналь из фоторецепторной мембраны диска в междисковое цитоплазматическое пространство, это так называемый ABCR, или ATP-binding cassette transporter (рис. 9.6, А). Полно-стью-шранс-ретиналь, перенесенный ABCR, восстанавливается ферментом ретинол-дегидрогеназой в полностью-шранс-рети-нол, который затем переносится во внеклеточное пространство.
ABCR оказался крайне чувствителен к фотоповреждению, вызванному ретиналем как фотосенсибилизатором [Sun et al., 2001]. Как и в случае родопсина, молекулярным механизмом повреждения ABCR является его агрегация, однако не за счет образования дисульфидных связей. Фотоповреждение этого белка, обладающего также АТФазной активностью, приводит к потере способности ретиналя стимулировать эту ферментативную активность.
Интересно, что ABCR гораздо чувствительнее к фотоповреждению, нежели другие мембранные белки фоторецепторной мембраны, а именно: родопсин, а-субъединица трансдуцина, белок цГМФ-регулируемого ионного канала плазматической мембраны наружного сегмента или такие периферические белки фоторецепторной мембраны, как родопсиновая киназа и арестин. Важным для патогенеза дегенеративных заболеваний сетчатки следствием повреждения ABCR является уменьшение или потеря этой его способности активно удалять из фоторецепторной мембраны диска свободной шранс-ретиналь, высвободившийся в результате фотолиза родопсина. Это приводит к накоплению шранс-ретиналя в мембране и последующему взаимодействию двух его молекул с фосфатидилэтаноламином [Sun et al., 2001]. Образовавшийся таким образом бис-ретиналиден-фосфатидил-этаноламин, вероятно, сам по себе фототоксичен, но что более существенно, он служит предшественником основного фототок-сичного флуорофора липофусциновых гранул - А2Е. Показано,
243
что одно из известных наследственных дегенеративных заболеваний сетчатки - болезнь Штаргардта - связана с дефектом ABCR, приводящим, в конечном счете, к избыточному накоплению липофусциновых гранул в клетках пигментного эпителия (рис. 9.6, Б) [Sun et al., 2001; Weng, 1999].
Кислород является третьим необходимым участником реакции фотоокисления. Как нами было показано в опытах на крысах, гипероксия и особенно гипербарическая оксигенация усугубляют повреждающее действие света на сетчатку: как на способность регенерации родопсина в ее зрительных клетках, так и на ее электрическую активность [Капуста и др., 1987]. Следует при этом отметить, что существует градиент повреждения наружного сегмента фоторецепторной клетки: ее дистальная часть, содержащая “старые” диски, намного чувствительнее к такому повреждению, нежели проксимальная [Reme et al., 1991]. Во-первых, это может объясняться накоплением молекулярных дефектов в “старых” дисках, свидетельством чему может служить градиент уменьшения количества способных к титрованию SH-групп вдоль наружного сегмента [Дере-вянченко и др., 1985]. Во-вторых, это может быть связано с большей концентрацией кислорода в дистальной части наружного сегмента по сравнению с проксимальной. Действительно, если в области дистальной части (верхушка наружного сегмента) напряжение кислорода Ро2 составляет около 100 мм ртутного столба, и это эквивалентно концентрации кислорода в артериальной крови, то в области проксимальной части (на границе с внутренним сегментом) Ро2 составляет всего лишь около 10 мм ртутного столба в темноте и около 30 м ртутного столба на свету. Во внутреннем сегменте, как известно, содержится большое скопление митохондрий, которые являются основными потребителями кислорода в зрительной клетке [Ahmed et al., 1993].
Системы защиты структур глаза от фотоповреждения
Итак, сочетание света, кислорода, окрашенных сенсибилизаторов и легко окисляющихся субстратов (липидов и белков) создает реальную угрозу для возникновения и развития в сетчатке и пигментном эпителии фотодеструктивных процессов. Этот парадокс зрения, когда свет выступает и носителем информации, и потенциально опасным повреждающим фактором, был решен в ходе эволюции формированием, наряду с системой фоторецепции, достаточно надежной системы защиты
244
Рис. 9.7. Возрастные спектральные изменения хрусталика глаза человека
а - “УФ-окно” в хрусталике глаза новорожденных и его исчезновение с возрастом. Спектры пропускания хрусталиков детей: 1 - пятимесячного младенца, 3 - восьмилетнего ребенка, 4 - четырнадцатилетнего ребенка, б - Возрастное пожелтение хрусталика человека. Спектры пропускания хрусталиков: 1 - новорожденного младенца (6 хрусталиков), 2 - в возрасте от 8 до 29 лет (10 хрусталиков), 3 - в возрасте от 31 до 49 лет (25 хрусталиков), 4 - в возрасте от 52 до 65 лет (14 хрусталиков)
от опасности фотоповреждения. Эта многоуровневая система включает несколько линий:
обновление фоторецепторных мембран, комплекс эндогенных антиоксидантов, механизм максимально быстрого удаления свободного ретиналя из зрительной клетки,
систему оптических фильтров глаза, в которой ключевую роль играет хрусталик, желтеющий у приматов и человека с возрастом.
Естественно, любые нарушения в этой системе приводят к возрастанию риска светового повреждения. Например, в фоторецепторной клетке старческой сетчатки реальна ситуация, как уже говорилось, когда в ее наружном сегменте накапливается или свободный ретиналь, или, что гораздо опаснее, еще более фототок-
245
Рис. 9.8. Спектры оптического поглощения (D) эндогенных фотосенсибилизаторов - ретинола, ретиналя и липофусцина и спектры пропускания (Т%) хрусталика глаза человека и искусственного хрусталика - интраокулярной линзы (ИОЛ)
сичный продукт его превращения - бис-ретинилиден-фосфатидил-этаноламин (А2Е-РЕ). Этот продукт транспортируется затем в клетку пигментного эпителия и уже там превращается в бис-рети-ноидный аддукт (А2Е), который включается в состав липофусциновых гранул как один из ее основных флуорофоров.
Поскольку и ретиналь, и его бис-ретиноидный продукт (А2Е), как и ряд других окрашенных соединений, поглощают в коротковолновой (синей) области спектра, то окрашенные оптические среды глаза правомерно рассматривать как светофильтры, отсекающие эту опасную для сетчатки часть спектра. В этом отношении возрастное пожелтение хрусталика глаза человека представляет собой один из эффективных физиологических способов оптической защиты сетчатки от опасности фотоповреждения [Островский, Федорович, 1994]. Следует отметить, что хрусталик глаза новорожденного обладает повышенным пропусканием для ультрафиолетового света, так называемым УФ-окном (рис. 9.7, а). С возрастом (примерно к 15 годам) это “окно” исчезает, и затем в течение жизни происходит постепенное пожелтение хрусталика, наиболее выраженное в старческом возрасте (рис. 9.7, 6).
Более того, показано, что катарактальный хрусталик, существенно ухудшая качество изображения на сетчатке, вместе с тем предотвращает развитие некоторых форм дегенерации сетчатки,
246
в том числе старческой макулярной дегенерации. Поэтому хирургическое удаление хрусталика при катаракте имеет своим побочным следствием для афакичного глаза многократное повышение риска повреждения сетчатки ультрафиолетовым и синим светом. Исходя из этих представлений, нами еще в середине 80-х годов был разработан и внедрен в клиническую практику новый окрашенный искусственный хрусталик (интраокулярная линза -ИОЛ) [Линник и др., 1991; 1992]. Подобно естественному хрусталику пожилого человека, этот желтоватый искусственный хрусталик полностью отсекает ультрафиолетовую, и, в значительной мере, коротковолновую (фиолетово-синюю) часть видимого спектра. Важно отметить при этом, что нормальное цветовос-приятие пациента с имплантированным желтоватым хрусталиком не нарушается. На рис. 9.8 сведены спектры поглощения основных эндогенных фотосенсибилизаторов - ретинола, ретиналя, липофусцина, а также спектры пропускания хрусталика глаза пожилого человека и нашего желтоватого искусственного хрусталика. Видно, что и хрусталик глаза пожилого человека, и желтоватый искусственный хрусталик в значительной мере отсекают коротковолновую часть видимого спектра, в которой поглощают опасные для сетчатки фотосенсибилизаторы. К сожалению, эффективных и безопасных лекарственных средств - антиоксидантов, способных предотвратить фотоповреждение сетчатки, пока не найдено.
ЛИТЕРАТУРА
Большаков В.И., Каламкаров Г.Р., Островский М.А. Прямое измерение электрического потенциала на мембране диска фоторецепторной клетки Ц Докл. АН СССР. 1979а. Т. 249, № 6. С. 1485-1488.
Большаков В И , Драчев АЛ., Каламкаров Г.Р. Общность свойств бактериального и зрительного родопсинов: Превращение энергии света в разность электрических потенциалов //Там же. 19796. С. 1462-1466.
Большаков В.И., Каламкаров Г.Р., Островский М.А. Фотоиндуциро-ванная генерация потенциала на мембране диска фоторецепторной клетки //Там же. 1978. Т. 240, № 5. С. 1241-1244.
Ванин А.Ф., Каламкаров Г.Р., Киладзе С.М Островский М.А. О существовании двух близкорасположенных SH-групп в фоторецепторной мембране И Биофизика. 1977. Т. 22, № 3. С. 397-405.
Болотовский И.Д., Баранова Л.А., Шейко Л.М. и др. цГМФ-связываю-щие центры в фоторецепторных мембранах Ц Молекуляр. биология. 1984. Т. 4. С. 1053-1059.
Говардовский В.И., Лычаков Д.В. Некоторые количественные характеристики наружных сегментов палочек лягушки // Цитология. 1975. Т. 17. С. 524-529.
Говардовский В.И. Латеральная диффузия в поверхностной мембране палочки сетчатки крысы // Биофизика. 1976. Т. 21. С. 1019-1023.
Говардовский В.И. Механизм генерации раннего рецепторного потенциала и электрическая модель палочки сетчатки // Там же. 1978. Т. 23. С. 514-519.
Гуревич В.В., Зозуля С.А., Широкова Е.П. и др. Синтез зрительного родопсина в бесклеточной системе трансляции. II. Функциональные свойства рекомбинантного родопсина и его мутантных форм // Биоорган, химия. 1990. Т. 16. С. 303-308.
Деревянченко Т.Г., Федорович И.Б., Островский М.А. Распределение сульфгидрильных групп вдоль оси наружного сегмента палочки сетчатки лягушки // Цитология. 1985. Т. 27. С. 1197-1199.
Донцов А.Е., Зак П.П., Островский М.А. Регенерация АТР в наружных сегментах фоторецепторов лягушки // Биохимия. 1978. Т. 43. С. 592-595.
Драчев Л.А., Каулен А.Д., Скулачев В.П. Временные характеристики бактериородопсина как молекулярного биологического генератора тока // Молекуляр. биология. 1977. Т. 11. С. 1377-1387.
Зайцева Н.С., Дудникова Л.К., Слепова О.С. Манифестация иммунопатологии и применение иммунотерапии при диабетической ретинопатии // Вестник офтальмологии. 1997. Т. 113, № 1. С. 27-31.
Зайцева Н.С., Слепова О.С., Дудникова Л.К. и др. Способ диагностики ретинопатии. А.с. № 1679381 (СССР). Опубл, в 1991 г.
248
Зак П.П.,Лелекова Т.В., Островский М.А. Распределение ацетилхолина в слоях сетчатки глаза лягушки // Физиол. журн. СССР. 1974. Т. 60. С. 1397-1403.
Каламкаров Г.Р., Григорян ГЛ., Федорович П.Б. и др Исследование фотоиндуцированных конформационных переходов солюбилизированного родопсина методом спиновой метки // Докл. АН СССР. 1976. Т. 231, № 3. С. 736-738.
Каламкаров Г.Р., Кулагина О.Г. Модификация сульфгидрильных групп и оксид азота могут активировать нуклеотид-регулируемые каналы слуховых волосковых клеток // Сенсор, системы. 1999. Т. 13, № 3. С. 226-231.
Каламкаров Г.Р., Лунгина О.Г. Ионные каналы, регулируемые циклическими нуклеотидами // Там же. 2001. Т. 15. С. 275-287.
Каламкаров Г.Р., Лунгина О.Г., Шевченко Т.Ф. и др. Оксида азота в наружном синаптическом слое сетчатки позвоночных // Там же. 2002. Т. 16. С. 121-131.
Каламкаров Г.Р., Островский М.А. Роль кальция в механизме активации зрительной клетки Ц Внутриклеточная сигнализация / Под ред. П.Г. Костюка. М.: Наука, 1988. С. 194-204.
Каламкаров Г.Р., Погожева И.Д., Шевченко Т.Ф. и др. Система регуляции внутриклеточного pH в фоторецепторной клетке // Сенсор, системы. 1992. Т. 6, №4. С. 7-12.
Каламкаров Г.Р., Прусаков В.Е., Стукан Р.А. и др. Исследование фотоиндуцированных процессов в фоторецепторной мембране и солюбилизированном родопсине методом гамма-резонансной спектроскопии // Докл. АН СССР. 1974. Т. 219, № 5. С. 1245-1248.
Каламкаров Г.Р., Ребрик Т.П., Островский М.А. Быстрое фотоинду-цированное изменение проводимости плазматической мембраны // Там же. 1981. Т. 258, № 1.С. 229-231.
Каламкаров Г.Р., Ребрик Т.П., Таварткиладзе Г.А. Регулируемая циклическим АМФ проводимость в волосковых клетках улитки // Сенсор, системы. 1995. Т. 8. С. 16-20.
Каламкаров Г.Р., Ребрик Т.П., Шевченко Т.Ф О возможной роли цитоскелета в механизме работы зрительной клетки // Внутриклеточная сигнализация / Под ред. П.Г. Костюка. М.: Наука, 1992. С. 146-152.
Каламкаров Г.Р., Салитра И.С., Ванин А.Ф. и др. Исследование SH-rpynn родопсина в фоторецепторной мембране и экстракте цетилтриметиламмоний бромида Ц Материалы симпозиума “Механизмы сенсорной рецепции”. Л.. 1977.
Кандори X., Шичида И., Иошизава Т. Фотоизомеризация родопсина // Биохимия. 2001. Т. 66, вып. 11. С. 1483-1498.
Капуста Н.В. Зак П.П., Федорович И.Б. и др Усугубляющее действие кислорода при фотоповреждении сетчатки глаза белой крысы // Бюл. экс-перим. биологии и медицины. 1987. Т. 104, № 7. С. 102-104.
Колосов М.И., Воейков В.Д. Химическая модификация нативного комплекса родопсин-трансдуцин N-этилмалеимидом И Биол. мембраны. 1986. Т. 3. С. 661-667.
Косолапов С.С., Каламкаров Г.Р., Шевченко Т.Ф. и др. Выход ионов кальция из нативных наружных сегментов палочек при частичном обесцвечивании родопсина//Биофизика. 1981 Т 26. С. 284—287.
Кронгауз В.А., Федорович И.Б., Шифрина Р.Р., Островский М.А Фотохромия зрительных пигментов. 1. Образование изохромных продуктов
10.	Г.Р. Каламкаров, М.А. Островский 249
при обратимых превращениях родопсина лягушки // Там же. 1975а. Т. 20. С. 219-224.
Кронгауз В.А., Федорович И.Б., Шифрина Р.Р., Островский М А. Фотохромия зрительных пигментов. 2. Кинетика фотопревращений родопсина лягушки //Там же. 19756. Т. 20. С. 419-424.
Кронгауз В.А., Федорович И.Б., Шифрина Р.Р., Островский М.А. Фотохромия зрительных пигментов. 3. Сравнительное исследование фотопревращений родопсина быка и лягушки //Там же. 1975в. Т. 20. С. 426-430.
Кузнецов В.А. Метод спинового зонда. М.: Наука, 1976.
Лившиц В.А., Кузнецов В.А. Изучение “сверхмедленных” вращений спинмеченных глобулярных белков путем использования эффектов сверхвысокочастотного насыщения в спектрах электронного парамагнитного резонанса//Молекуляр. биология. 1980. Т. 14. С. 182-189.
Линник Л.Ф., Островский М.А., Зак П.П. и др. Анализ отдаленных клинико-функциональных результатов имплантации интраокулярной линзы “Спектр”//Офтальмохирургия. 1992. № 1. С. 40-44.
Линник Л.Ф., Островский М.А., Салиев И.М. Искусственные хрусталики, поглощающие ультрафиолетовые лучи: безопасность, эффективность и перспектива использования в офтальмохирургии // Там же. 1991. № 4. С. 3-7.
Лунгина О.Г., Островский М.А., Каламкаров Г.Р. Действие оксида азота на ответы фоторецепторных клеток сетчатки лягушки // Сенсор, системы. 2002. Т. 16. С. 116-120.
Мартынов В.И., Костина М.В., Фейгина М.Ю. и др. Исследование молекулярной организации зрительного родопсина в фоторецепторных мембранах методом ограниченного протсинолиза // Биоорган, химия. 1983. Т. 9. С. 734-745.
Овчинников Ю.А., Абдулаев Н.Г., Фейгина М.Ю. Полная аминокислотная последовательность родопсина //Там же. 1982. Т. 8. С. 1011-1014.
Омельяненко В Г., Михайлов А.И., Каламкаров Г.Р. Исследование динамических характеристик фоторецепторной мембраны рекомбинационнокинетическим методом //Докл. АН СССР. 1977. Т. 237, Ха 6. С. 1498-1501.
Островский М.А., Богословский А.И., Зуева М.В. и др. Исследование механизмов повреждающего действия видимого света на здоровую сетчатку животных // Вести. АМН СССР. 1979. Т. 12. С. 57-63.
Островский М.А., Говардовский В.И Механизмы фоторецепции позвоночных // Физиология зрения. М.: Наука, 1992- С. 5-58.
Островский М.А., Донцов А.Е., Сакина ПЛ. и др. Способность липофусциновых гранул из ретинального пигментного эпителия глаза человека к фотосенсибилизированному перекисному окислению липидов при действии видимого света // Сенсор, системы. 1992. Т. 6, Ха 3. С. 51-54.
Островский М.А.. Федорович И.Б. Механизм повреждающего действия света на фоторецепторы сетчатки глаза // Физиология человека. 1982. Т. 8. С. 572-577.
Островский М.А., Федорович И.Б. Ретиналь как сенсибилизатор фотоповреждения ретинальсодержащих белков сетчатки глаза // Биофизика. 1994. Т. 39. С. 13-25.
Островский М.А., Федорович И.Б. ‘Ьотосенсибилизированное окисление как механизм повреждающего действия света на сетчатку глаза // Хим. физика. 1996. Т. 15. С. 73-80.
250
ПирузянЛ.А„ Островский М. А., Ландау М.А. О “сенсорной” безопасности лекарств: сротосенсибилизированное повреждение структур глаза // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1991. № 1. С. 43-50.
Погожева И.Д., Кузнецов В.А., Лившиц В.А. и др. Обратимая зависимая от pH агрегация молекул родопсина в фоторецепторных мембранах // Докл. АН СССР. 1981. Т. 260. С. 1254-1258.
Погожева И.Д., Кузнецов В.А., Лившиц В А. и др. Фотоиндуцированные изменения в гидрофильной области молекулы родопсина. Исследование методом ЭПР-спектроскопии с переносом насыщения // Биол. мембраны. 1985. Т. 2. С. 880-896.
Погожева И.Д., Кузнецов В.А., Федорович И.Б. и др. Агреоция молекул родопсина при повреждающем действии света на фоторецепторные мембраны // Биофизика. 1981. Т. 26. С. 692-700.
Погожева И.Д., Федорович И.Б., Островский М.А. и др. Фотоповреждение молекулы родопсина: Окисление SH-групп // Там же. 1981. Т. 26. С. 398-403.
Погожева И.Д., Шевченко Т.Ф., Каламкаров Г.Р. Локализация мест связывания трансдуцина методом направленной модификации SH-групп родопсина // Биол. мембраны. 1991. Т. 8, № 1. С. 44-49.
Погожева И.Д.,Лившиц В.А., Каламкаров Г.Р. и др. Механизм взаимодействия арестина с родопсином: Роль фосфорилирования родопсина //Там же. 1989а. Т. 6, № 12. С. 1237-1247.
Погожева И.Д., Лившиц В.А., Каламкаров Г.Р. и др. Влияние модификации сульфгидрильных групп на взаимодействие арестина с фосфорилированным родопсином //Там же. 19896. Т. 6, № 12. С. 1248-1255.
Ребрик Т.П., Каламкаров Г.Р. Возможная роль цитоскелета в функционировании палочек сетчатки // Сенсор, системы. 1989. Т. 3, № 4. С. 347-353.
Ребрик Т.И., Каламкаров Г.Р., Островский М.А. Об отсутствии канальных структур в фоторецепторной мембране диска палочки // Биофизика. 1986. Т. 31, № 6. С. 985-989.
Ребрик Т.П., Каламкаров Г.Р., Островский М.А. Влияние перекисного окисления липидов на проводимость фоторецепторной мембраны диска // Нейрохимия. 1987. Т. 6, № 3. С. 413—417.
Ребрик Т.И., Колесников С.С., Каламкаров Г.Р. Регулируемая циклическим АМФ проводимость в волосковых клетках улитки // Сенсор, системы. 1992. Т. 6, № 3. С. 83-87.
Сапежинский И.И Биополимеры: Кинетика радиационных и фотохимических превращений. М.: Наука, 1988.
Слепова О.С., Зайцева Н.С., Каламкаров Г.Р. и др. Способ прогнозирования воспалительных осложнений у больных после экстракции постувеальной катаракты. А.с. № 1649442 (СССР). Опубл, в 1991.
Слепова О.С., Зайцева Н.С., Каламкаров Г.Р. и др. Аутоиммунные реакции к ретинальному S-антигену у больных с патологией сетчатки различного генеза // Сенсор, системы. 1992. Т. 6, № 3. С. 64-69.
Слепова О.С., Зайцева Н.С., Островский М.А. и др. Способ выявления аутоаллергического компонента при увеитах. А.с. № 1334406 (СССР). Опубл, в 1987 г.
Старостин А.В., Федорович И.Б., Островский М.А. Сенсибилизированное ретиналем фотоокисление родопсина // Биофизика. 1985. Т. 30. С. 995-999.
10*
251
Федорович И.Б., Зак П.П.. Островский М.А. Повышенное УФ-пропускание хрусталика глаза в раннем детстве и его возрастное пожелтение // Докл. РАН. 199 А Т. 336. С. 835-837.
Ховратович В.И., Емельянов ЮЛ., Болотовский ИД. цГМФ-зависи-мое высвобождение Са2+ из фоторецепторных дисков // Биофизика. 1988. Т. 33. С. 613-616.
Шевченко Т.Ф., Каламкаров Г.Р., Косолапов С.С., Островский М.А. Выход ионов кальция из нативных наружных сегментов палочек при частичном обесцвечивании родопсина // Там же. 1981. Т. 26. С. 284-287.
Шевченко Т.Ф., Каламкаров Г.Р.. Островский М.А. Фотоиндуцирован-ный перенос ионов кальция через фоторецепторную мембрану Ц Там же. 1980. Т. 25. С. 426-128.
Шевченко Т.Ф., Каламкаров Г.Р., Островский М.А. Отсутствие переноса Н+ через фоторецепторную мембрану в ходе фотолиза родопсина // Сенсор, системы. 1987. Т. 1, № 2. С. 117-126.
Шевченко Т.Ф., Погожева И.Д., Каламкаров Г.Р. Распределение арестина в зрительной клетке и его взаимодействие с родопсином // Внутриклеточная сигнализация / Под ред. П.Г. Костюка. М.: Наука, 1988. С. 205-210.
Щербатова О.И., Дудникова Л.Д., Каламкаров Г.Р. Природа и клиническое применение La-волны электроретинограммы человека // Сенсор, системы. 1990. Т. 4, № 3. С. 311-320.
Adams A.J., Tanaka М., Shichi Н. Concanavalin A binding to rod outer segment membranes: usefulness for preparation of intact disks // Exp. Eye Res. 1978. Vol. 27. P. 595-605.
Ahmad I., Korbmacher C„ Segal A.S. et al. Mouse cortical collecting duct cells show non-selective cation channel activity and express a gene related to the cGMP-gated rod photoreceptor channel // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1992. Vol. 89. P. 10262-10266.
Ahmad I., Leinders-Zufall T„ Kocsis J.D. et al. Retinal ganglion cells express a cGMP-gated cation conductance activatable by nitric oxide donors // Neuron. 1994. Vol. 12. P. 155-165.
Akhtar G.N., Blosse P.T., Dewhurst P.B. Studies of vision. The nature of the retina-opsin linkage // Biochem. J. 1968. Vol. 110. P. 693-698.
Al-Awqati Q. Proton-translocatinc ATPases // Annu. Rev. Cell. Biol. 1986. Vol. 2. P. 179-199.
Allenbach C.. Cai K.. Khorana H.G.. Hubbell W.L. Structural features and light-dependent changes in the sequence 306-322 extending from helix VII to thq palmitoylation sites in rhodopsin: a site-directed spin-labeling study // Biochemistry. 1999a. Vol. 38. P. 7931-7937.
Altenbach C., Klein-Seetharaman J., Hwa J. et al. Structural features and light-dependent changes in the sequence 59-75 connecting helices I and II in rhodopsin: a site-directed spin-labeling study // Biochemistry. 1999b. Vol. 38. P. 7945-7949.
Altenhofen W., Ludwig J., Eismann E. et al. Control of ligand specificity in cyclic nucleotide-gated channels from rod photoreceptors and olfactory epithelium Ц Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1991. Vol. 88. P. 9868-9872.
Anant J.S., Ong O.C., Xie H.Y. In vivo differential prenylation of retinal cyclic GMP phosphodiesterase catalytic subunits // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267. P. 687-690.
252
Andersson R.E., Maude M.B., Zimmerman W. Lipids of ocular tissues-X. Lipid composition of subcellular fractions of bovine retina // Vision Res. 1975. Vol. 15. P. 1087-1090.
Andersson R.E., Sperling L. Positional distribution of the fatty acids in the phospholipids of bovine retina rod outer segments // Arch. Biochem. and Biophys. 1971. Vol. 144. P. 673-677.
Aronson P.S. Kinetic properties of the plasma membrane NaVHR exchanger Ц Annu. Rev. Physiol. 1985. Vol. 47. P. 545-560.
Arshavsky V.Yu. Bownds M.D. Regulation of deactivation of photoreceptor G protein by its target enzyme and cGMP // Nature. 1992. Vol. 357. P. 416-417.
Artemyev N.O., Archavsky V.Yu., Cote R.H. Photoreceptor phosphodiesterase: interaction of inhibitory gamma subunit and cyclic GMP with specific binding sites on catalytic subunits // Methods. 1998. Vol. 14. P. 93-104.
Atremyev N.O., Surendran R., Lee J.C., Hamm H.E. Subunit structure of rod cGMP-phosphodiesterase //J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 25382-25388.
Atalla L., Linker-Israeli M., Steinman L., Rao NA. Inhibition of autoimmune uvetis by anti-CD4 antibody // Invest. Ophthalmol. Visual Sci. 1990. Vol. 31. P. 1264-1270.
Bader C.R., Bertrand D., Schwartz E.E. Voltage-activated and calcium activated currents studied in solitary rod inner segments from the salamander retina // J. Physiol. 1982. Vol. 331. P. 253-284.
Baehr W Devlin MJ., Applebury M.L. Isolation and characterization of cGMP phosphodiesterase from bovine rod outer segment // J. Biol. Chem. 1979. Vol. 254. P. 11094-11099.
Baehr W., Morita E.A., Swanson RJ., Applebury M.L. Characterization of bovine rod outer segment G-protein // Ibid. 1982. Vol. 257. P. 6452-6460.
Balasubramanian S., Lynch J.W., Barry P.H. Concentration dependence of sodium permeation and sodium ion interactions in the cyclic AMP-gated channels of mammalian olfactory receptor neurons // J. Membrane Biol. 1997. Vol. 159. P. 41-52.
Barnstable CJ. Cyclic nucleotide-gated nonselective cation channels: a multifunctional gene family//EXS. 1993. Vol. 66. P. 121-133.
Baroin A., Bienvenue A., Devau.x P.F. Spin-label studies of protein-protein interaction in rod outer segment membranes. Saturation transfer electron paramagnetic resosnance//Biochemistry. 1979. Vol. 18. P. 1151—1155.
Baroin A., Thomas D.D., Osborne B., Devaux P.F. Saturation transfer electron paramagnetic resonance on membrane-bound proteins. I-Rotational diffusion of rhodopsin in the visual receptor membrane // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1977. Vol. 78. P. 442-147.
Bauer P.J. Mutual interaction between Na/Ca, K-exhangers and cGMP-gated channels of rod photoreceptors // Biophys. J. 1991. Vol. 59. P. 409a.
Baumann C., Zeppenfeld W. Effect of pH on the formation and decay of the metarhodopsins of the frog // J. Physiol. 1981. Vol. 317. P. 347-364.
Baylor D.A., Lamb T.D., Yau K.-W. The membrane current of single rod outer segments // J. Physiol. 1979. Vol. 288. P. 589-611.
Belfort R. Jr., Moura N.C., Mendes N.F. T and В lymphocytes in the aqueous humor of patients with uveitis I I Arch. Ophthalmol. 1982. Vol. 100. P. 465—467.
Bennett N. Optical study of the light-induced protonation changes assotiated with the metarhodopsin II intermediate in rod outer segment membrane // Europ. J. Biochem. 1980. Vol. 111. P. 99-103.
253
Bennett N. Light-induced interactions between rhodopsin and GTP-binding protein: Relation with phosphodiesterase activation // Ibid. 1982. Vol. 123. P. 133-139.
Bennett N.. Dupont Y. The G-protein of retinal rod outer segments (transducin) H J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P. 4156-4168.
Bennett N., Ildefouse M., Croury S. et al. Direct activation of cGMP-dependent channels of retinal rod by the cGMP phosphodiesterase // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1989. Vol. 86. P. 3634-3639
Bennett N., Michel-Villaz M., Dupont J. Cyanine dye measurement of a light-induced transient membrane potential assotiated with metarhodopsin II intermediate in rod outer segment membranes // Europ. J. Biochem. 1980. Vol. 111. P. 105-110.
Bennett N., Michel-Villaz M., Kuhn H. Light-induced interaction betwen rhodopsin and the GTP-binding protein // Ibid. 1982. Vol. 127. P. 97-103.
Bennett N.. Sitaramayya A. Inactivation of photoexcited rhodopsin in retinal rods: The roles of rhodopsin kinase and 48-kDa protein (Arrestin) // Biochemistry. 1988. Vol. 27. P. 1710-1715.
Benos D J. Amiloride: chemistry, kinetics and structure-activity relationships // Na+/H+ Exchange / Ed. S. Grinstein. Boca Raton: CRC press, 1988. P. 121-136.
Berger A.L., Cerione R.A., Erickson J.W. Real time conformational changes in the retinal phosphodiesterase gamma subunit monitored by resonance energy transfer//J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 2714-2721.
Berger SJ., DeVries G.W., Carter J.G. et al. The distribution of the components of the cyclic GMP cycle in retina//Ibid. 1980. Vol. 255. P. 3128—3133.
Bernard K.f Fung K. Separation and reconstitution of subunits // Ibid. 1983. Vol. 258. P. 10495-10503.
Biel M., Zong X., Distler M. et al. Another member of the cyclic nucleotide-gated channel family, expressed in testis, kidney, and heart // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1994. Vol. 91. P. 3505-3509.
Biel M., Zong X., Ludwig A. et al. Molecular cloning and expression of the modulatory subunit of the cyclic nucleotide-gated cation channel // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 6349-6355.
Blaurock A.E., Stoeckenius W. Structure of the purple membrane // Nature New Biol. 1971. Vol. 233. P. 152-155.
Blaurock A.E., Wilkins W.H F. Structure of frog photoreceptor membrane // Nature. 1969. Vol. 223 P. 906-909.
Blaustein M.P., Hodgkin A.L. The effect of cyanide on the efflux of calcium from squid axons // J. Physiol. 1969. Vol. 200. P. 497-527.
Bodoia R.D., Detwiler P.B. Patch-clamp recordings of the light-sensitive dark noise in retinal rods from the lizard and frog // J. Physiol. 1985. Vol. 367. P. 183-216.
Bolotina V.M., Najiibi S., Palacmo J., et al. Nitric oxide directly activates calcium-dependent potassium channels in vascular smooth muscle // Nature. 1994. Vol. 368. P. 850-853.
Bolshakov V.l., Kalamkarov G.R., Ostrovsky M.A Appearance of photoinduced potential on photoreceptor membrane // Frontiers of Bioorganic Chemistry and Molecular Biology / Ed. S.N. Ananchenko. Oxford; N.Y.: Pergamon press, 1980. p. 433-437.
Bondarenko V.A., Desai M.. Dua S. et al. Residues within the polycationic region of cGMP phosphodiesterase gamma subunit crucial for the interaction with transducin alpha subunit. Identification by endogenous ADP-ribosylation and site-directed mutagenesis //J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 15856-15864.
254
Bonigk W., Altenhofen W., Muller F. et al. Rod and cone photoreceptor cells express distinct genes for cGMP-gated channels // Neuron. 1993. Vol. 10. P. 865-877.
Bonigk W., Bradley J., Muller F. et al. The native rat olfactory cyclic nucleotide-gated channel is composed of three distinct subunits // J. Neurosci. 1999. Vol. 19. P. 5332-5347.
Borggreven J.M.P.M., Daemen FJ.M., Bonting S.L. Biochemical aspects of visual process. VI. The lipia composition of native and hexane-extracted cattle rod outer segments // Biochim. et Biophys. Acta. 1970. Vol. 202. P. 374—376.
Borgula G.A., Karwoski C., Steinberg R.H. Light-evoked changes in extracellular pH in frog retina // Vision Res. 1989. Vol. 29. P. 1069-1077.
Borisy F.F., Ronnett G.V., Cunningham A.M. et al. Calcium/calmodulin activated phosphodiesterase expressed in olfactory receptor neurons // J. Neurosci. 1992. Vol. 12. P. 915-923.
Borochov-Neori H., Montal M. Rhodopsin-G-protein interaction by resonance energy transfer // Biochemistry. 1989. Vol. 28. P. 1711-1718.
Boron W.F., Boulpaep E.L. Intracellular pH regulation in the renal tubule of the salamander. Basolateral HCO3 transport // J. Gen. Physiol. 1983. Vol. 81. P. 53-94
Boron W.F., Knakal R.C Na+-dependent CI-HCO3 exchange in the squid axon. Dependence on extracellular pH //Ibid. 1992. Vol. 99. P. 817-837.
Boulton M., Dontsov A., Ostrovsky M.A. et al. Superoxide radical generation by human RPE lipofuscin: a photoinducible effect // Invest. Ophthalmol. Visual Sci. 1992. Vol. 33, N 4. P. 919.
Boulton M., Dontsov A., Ostrovsky M. et al. Lipofuscin is a photoinducible free radical generator // J. Photochem. and PhotobioL 1993. Vol. 19. P. 201-204.
Bradley J., Li J., Davidson N. et al. Heteromeric olfactory cyclic nucleotide-gated channels: a subunit that confers increased sensitivity to camp // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1994. Vol. 91. P. 8890-8894.
Bradley J., Zhang Y., Bakin R. et al. Functional expression of the heteromeric “olfactory” cyclic nucleotide-gated channel in the hippocampus: a potential effector of synaptic plasticity in brain neurons //J. Neurosci. 1997. Vol. 17. P. 1993—2005.
Bredt D.S., Glat C.E., Hwang P.M. et al. Nitric oxide synthase protein and mRNA are discretely localised in neuronal populations of the mammalian CNS together with NADPH diaphorase // Neuron. 1991. Vol. 7. P. 615-624.
Bredt D.S., Hwang P.M., Snyder S.H. Localization of nitric oxide synthase indicating a neural role for nitric oxide // Nature. 1990. Vol. 347. P. 768-770.
Bredt D.S., Snyder S.H. Isolation of nitric oxide synthetase, a calmodulin-requiring enzyme//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1990. Vol. 87. P 682-685.
Bredt D.S., Snyder S.H. Nitric oxide, a novel neuronal messenger // Neuron. 1992. Vol. 8, N 1. P. 3-11.
Broekhuyse R.M., Tolhuizen E.FJ., Janssen A.P.M., Winkens HJ. Light-induced shift and binding of S-antigen in retinal rods // Curr. Eye. Res. 1985. Vol. 4 P. 613-618.
Broillet M.C. A single intracellular cysteine residue is responsible for the activation of the olfactory cyclic nucleotide-gated channel by NO // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, N 20. P. 15135-15141.
Broillet M.C., Firestein S. Direct activation of the olfactory cyclic nucleotide-gated channel through modification of sulfhydryl groups by NO compounds // Neuron. 1996. Vol. 16, N 2. P. 377-385.
255
Broillet M.C.. Firestein S. Beta subunits of the olfactory cyclic nucleotide-gated channel form a nitric oxide activated Ca2+ channel // Ibid. 1997. Vol. 18, N 6. P. 951-958.
Brovkovych V., Stolarczyk E., Oman J. et al. Direct electrochemical measurement of nitric oxide in vascular endothelium // J. Pharm. Biomed. Anal. 1999. Vol. 19. P. 135—43.
Brown K.T., Mukarami M. A new receptor potential of the monkey retina with no detectable latency //Nature. 1964. Vol. 201. P. 626-628.
Brown R.L., Snow S.D., Haley T.L. Movement of gating machinery during the activation of rod cyclic nucleotide-gated channels // Biophys. J. 1998. Vol. 75. P. 825-833.
Burns M.E.. Baylor D.A. Activation, deactivation, and adaptation in vertebrate photoreceptor cells // Annu. Rev. Neurosci. 2001. Vol. 24. P. 779-805.
Cafiso D.S., Hubbell W.L. Interfacial charge separation in photoreceptor membranes // Biophys. J. 1980. Vol. 30. P. 243-264.
Cala P.M., Grinstein S. Coupling between Na+/H+ and СВ/ HCO3 exchange in pH and volume regulation // Na+/H+ Exchange / Ed. S. Grinstein, Boca Raton: CRC press, 1988. P. 201-208.
Capovilla M., Cervetto L., Torre V. The effect of phosphodiesterase inhibitors on the electrical activity of toad rods // J. Physiol. 1983. Vol. 343. P. 277-294.
Caspi R.R. A rapid one-step multiwell tray test for release of soluble mediators // J. Immunol. Meth. 1986. Vol. 93. P. 141-144.
Catty P., Deterre P. Activation and solubilization of the retinal cGMP-specific phosphodiesterase by limited proteolysis. Role of the C-terminal domain of the betasubunit Ц Europ. J. Biochem. 1991. Vol. 199. P. 263-269.
Cervetto L., McNaughton P.A. The effects of phosphodiesterase inhibitors and lanthanum ions on the light-sensitive current of toad retinal rods // J. Physiol. 1986. Vol. 370. P. 91-109.
Chaillet J.R., Amsler K., Boron W.F. Optical measurements of intracellular pH in single LLC-PK] cells: Demonstration of СВ/ HCO3 exchange // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. Vol. 83. P. 522-526.
Chan C.H., Chong Y.W., Sun A.J., Hoheisel G.B. Cutaneous vasulitis associated with tuberculosis and its treatment // Tubercle. 1990. Vol. 71. P. 297-300.
Chen T.-Y., Peng Y.W., Dhallan R.S. et al. A new subunit of the cyclic nucleotide-gated cation channel in retinal rods // Nature/ 1993. Vol. 362. P. 764-767.
Chen T.-Y., Yau K. W. Direct modulation by Ca2+ calmodulin of cyclic nucleotide-activated channel of rat olfactory receptor neurons // Ibid. 1994. Vol. 368. P. 545-548.
Chester M. Regulation of intracellular pH in reticulospinal neurones of the lamprey Petromyzon marinus//J. Physiol. 1986. Vol. 381. P. 241-261.
Cobbs W.H., Pugh E.N., Jr. Kinetics and components of the flash photocurrent of isolated retinal rods of the larval salamander, Ambystoma tigrinum // Ibid. 1987. Vol. 394. P. 529-72.
Cohen A.I. New evidence supporting the linkage to extracellular space of outer segment succles of frog cones but not rods // J. Cell. Biol. 1968. Vol. 37. P. 424-444.
Cohen A.I. Further studies on the question of the potency of succles in outer segment of vertebrate photoreceptor // Vision Res. 1970. Vol. 10. P. 445-453.
256
Cook NJ., Kaupp U.B. Solubilization, purification, and reconstituion of the sodium-calcium exchanger from bovine retinal rod outer segments // J. Biol. Chem. 1988. Vol. 263. P. 11382-11388.
Cook N.J., Molday L.L., Reid D. et al. The cGMP-gated channel of bovine rod photoreceptor is localized exclusively in the plasma membrane // Ibid. 1989. Vol. 264. P. 6996-6699.
Cooper A. Energy uptake in the first step of visual excitation // Nature. 1979. Vol. 282. P. 531-53.
Crawford A.C., Evans M.G., Fettiplace R. Activation and adaptation of transducer currents in turtle hair cells //J. Physiol. 1989. Vol. 419. P. 405—434.
Cuenca N., Haverkamp S., Kolb H. Choline acetyltransferase is found in terminals of horizontal cells that label with GABA, nitric oxide synthase and calcium binding proteins in the turtle retina // Brain Res. 2000. Vol. 878. P. 228-239.
Daemen FJ.M. Vertebrate rod outer segment membranes // Biochim. et Biophys. Acta. 1973. Vol. 300. P. 255-288.
Dawson T.M., Snyder S.H. Gases as biological messengers: Nitric oxide and carbon monoxide in the brain //J. Neurosci. 1994. Vol. 14. P. 5147-5159.
De Kozak Y., Mirshahi M., Boucheix C. et al. Inhibition of experimental autoimmune uveoretinitis in rats by S-antigen-specific monoclonal antibodies // Europ. J. Immunol. 1985. Vol. 15. P. 1107-1 111.
De Smet M.D., Nussenhlatt R.B., Davis J.L., Palestine A.G. Large cell lymphoma masquerading as a viral retinitis // Intern. Ophthalmol. 1990. Vol. 14. P. 413-417.
Deterre P., Bigay J., Forquet F. et al. cGMP phosphodiesterase of retinal rods is regulated by two inhibitory subunits // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1988. Vol. 85. P. 2424-2428.
Delgado R., Hidalgo P„ Diaz F. et al. A cyclic AMP-activated Kr channel in Drosophila larval muscle is persistently activated in dunce // Ibid. 1991. Vol. 88. P. 557-560.
Dhallan R.S., Yau K.-W., Schrader K.A., Reed R.R. Primary structure and functional expression of a cyclic nucleotide-activated channel from olfactory neurons // Nature. 1990. Vol. 347. P. 184-187.
Distler M., Biel M., Flockerzi V., Hofmann F. Expression of cyclic nucleotide-gated cation channels in non-sensory tissues and cells // Neuropharmacology. 1994. Vol. 33. P. 1275-1282.
Dizhoor A.M., Hurley J.B. Regulation of photoreceptor membrane guanylyl cyclases by guanylyl cyclase activator proteins // Methods. 1999. Vol. 19. P. 521-31.
Dizhoor A.M., Ray S., Kumar S. et al. Recoverin: A calcium sensitive activator of retinal rod guanylate cyclase // Science. 1991. Vol. 251. P. 915-918.
Doekes G., de Geus J.P., Banga J.P et al. Immunoreactive epitopes on human retinal S-antigen // Ophthalmic Res. 1988. Vol. 20. P. 257-265.
Dong C.J., Hare W.A. Contribution to the kinetics and amplitude of the elec-troretinogram fe-wave by third-order retinal neurons in the rabbit retina // Vision Res. 2000. Vol. 40. P. 579-89.
Donner K. Visual latency and brightness: an intepretation based on the responses of rods and ganglion cells in the frog retina // Visual Neurosci. 1989. Vol. 3. P. 39-51.
Donner K., Hemila S. Rhodopsin phosphorylation inhibited by adenosine in frog rods: Lack of effects on excitation // Comp. Biochem. and Physiol. 1985. Vol. A81. P. 431-439.
257
Donner К.. Hemila S., Kalamkarov G. et al. Sulfhydryl binding reagents increase the conductivity of the light-sensitive channel and inhibit phototransduction in retinal rods // Exp. Eye Res. 1990a. Vol. 51. P. 97-105.
Donner K., Hemila S., Kalamrakov G. et al. Rod phototransduction modulated by bicarbonate in the frog retina: Roles of carbonic anhydrase and bicarbonate exchange // J. Physiol. 1990b. Vol. 426. P. 297-316.
Donner K., Hemila S., Koskelainen A. Transient sensitivity reduction and biphasic photoresponses observed when frog retinal rods are oxidized // Comp. Biochem. and Physiol. 1987. Vol. A87. P. 749-756.
Donner K., Hemila S., Koskelainen A. Effects of sulfhydryl binding reagents on the photoresponses of vertebrate retinal rods // ibid. 1989. Vol. A94. P. 125-132.
Donner K., Hemila S., Koskelainen A. On the relation between ERG waves and retinal function: inverted rod photoresponses from the frog retina // Vision Res. 1992. Vol. 32. P. 1411-1416.
Dontsov A.E., Glickman R.D., Ostrovsky M.A. Retinal pigment epithelium pigment granules stimulate the photo-oxidation of unsaturated fatty acids // Free Radicals Biol. Med. 1999. Vol. 26. P. 1436-1446.
Drachev L.A., Kalamkarov G.R., KaulenA.D. et al. Fast stages of photoelectric processes in biological membranes. II. Visual rhodopsin //Europ. J. Biochem. 1981. Vol. 117. P. 471-481.
Drachev L.A., Kalamkarov G.R., Kaulen A.D. et al. Animal rhodopsin as a photogenerator of an electric potential that increases photoreceptor membrane permeability//FEBS Lett. 1980. Vol. 119. P. 125-131.
Drachev L.A., Kaulen A.D., Khitrina L.V., Skulachev V.P. Fast stages of photoelectric processes in biological membranes. I. Bacteriorhodopsin // Europ. J. Biochem. 1981a. Vol. 117. P. 461-470.
Drachev L.A., Kaulen A.D., Semenov A.Yu. et al. Lipid-impregnated filters as a tool for studying the electric current-generating proteins // Anal. Biochem. 1979. Vol. 96. P. 250-262.
Drachev L.A., Kaulen A D Skulachev V.P. Time resolution of the intermediate steps in the bacteriorhodopsin-linked electrogenesis // FEBS Lett. 1978. Vol. 87. P. 161-167.
Drachev L.A., Semenov A.Yu., Skulachev V.P. et al. Fast stages of photoelectric processes in biological membranes. III. Bacterial photosynthetic redox system // Europ. J. Biochem. 1981b. Vol. 117. P. 483-489.
Dratz E.A., Miljanich G.P.. Nemes P.P., Gaw J.E. The structure of rhodopsin and its disposition in the rod outer segment disk membrane // Photochem. and Photobiol. 1979. Vol. 29. P. 661-670.
Dua H.S., Liversidge J., Forrester J.V. Immunomodulation of experimental autoimmune uveitis using a rat anti retinal S-antigen specific monoclonal antibody: evidence for a species difference // Eye. 1989. Vol. 3 (Pt 1). P. 69-78,
Dumke C.L., Arshavsky V.Yu., Calvert P.D. et al. Rod outer segment structure influences the apparent kinetic parameters of cyclic GMP phosphodiesterase // J. Gen. Physiol. 1994. Vol. 103. P. 1071-1098.
Dunham T.D., Farrens D.L. Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy //J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. P. 1683-90.
El-Husseini A.D., Bladen C., Vincent S.R. Expression of the olfactory cyclic nucleotide gated channel (CNGI) in the rat brain // Neuroreport. 1995. Vol. 6. P. 1459-1463.
258
Emeis D. Kuhn H., Reichart J.. Hofmann K.P. Complex formation between metarhodopsin II and GTP-binding protein in bovine photoreceptor membranes leads to a shift of the photoproduct equilibrium // FEBS Lett. 1982. Vol. 143. P. 29-34.
Ertel E.A. Excised patches of plasma membrane from vertebrate rod outer segments retain a functional phototransduction enzymatic cascade // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1990. Vol. 8 P. 4226-4230.
Fahmy K., Sakmar T.P., Siebert F. Structural determinants of active state conformation of rhodopsin: molecular biophysics approaches // Meth. Enzymol. 2000. Vol. 315. P. 178-96.
Fain G.L.. Matthews H.R. Calcium and the mechanism of light adaptation in vertebrate photoreceptors // Thends Neurosci. 1990. Vol. 13. P. 378-384.
Fain G.L., Schroder W.H. Calcium in dark-adapted toad rods: Evidence for pooling and cyclic-guanosine-3’-5’monophosphate-dependent release //J. Physiol. 1987. Vol. 389. P. 361-384.
Fedorovich LB.. Semenova E.M., Grant K. et al. Photosensitized light-induced damage of IRBP (interphotoreceptor retinoid-binding protein): Effects on binding properties // Curr. Eye Res. 2000. Vol. 21. P. 975-980.
Fesenko E.E. Kolesnikov S.S., Lyubarsky A.L. Induction by cyclic GMP of cationic conductance in plasma membrane of retinal rod outer segment // Nature. 1985. Vol. 313. P. 310-313.
Fesenko E.E, Lyubarsky A.L. Effect of light on artificial lipid membranes modified by photoreceptor membrane fragments // Ibid. 1977. Vol. 268. P. 562-563.
Fettiplace R., Crawford A.C., Evans M.G. The hair cell’s mechanoelectrical transducer channel // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1992. Vol. 656. P. 1-11.
Filatov G.M., Jainazarov A.B., Kolesnikov S.S. et al. The effect of ATP, GTP, cAMP on the cGMP-dependent conductance of the fragments from frog rod plasma membrane//FEBS Lett. 1989. Vol. 245. P. 185-189.
Finn J.T, Grunwald M.E., Yau K.-W. Cyclic nucleotide-gated ion channels: an extended family with diverse functions // Annu. Rev. Physiol. 1996. Vol. 58. P. 395-426.
Firestein S., Zufall F. The cyclic nucleotide gated channel of olfactory receptor neurons // Semin. Cell Biol. 1994. Vol. 5. P. 39-46.
Fleichman D. Rod guanylate cyclase located in axonemes // Curr. Top. Membrane Transp. 1981. Vol. 15. P. 109-119.
Fleichman D., Denisevich M. Guanilate cyclase of isolated bovine retinal rod axonemes //Biochemistry. 1979. Vol. 18. P. 5060-5066.
Ford C.E., Skiba N.P., Bae H. et al. Molecular basis for interactions of G protein Py subunits with effectors // Science. 1998. Vol. 280. P. 1271-1274.
Franke R.R., Konig B.f Sakmar T.P. et al. Rhodopsin mutants that bind but fail to activate transducin // Ibid. 1990. Vol. 250. P. 123-125
Franke R.R., Sakmar T.P.. Oprian D.D.. Khorana H.G. A single amino acid substitution in rhodopsin (lysine 248-leucine) prevents activation of transducin // J. Biol. Chem. 1988. Vol. 263. P. 2119-2122.
Frings S., Seifert R., Godde M., Kaupp U.B. Profoundly different calcium permeation and blockage determine the specific function of distinct cyclic nucleotide-gated channels //Neuron. 1995. Vol. 15. P. 169-179.
Fujimori E. Spin-labeled rhodopsin // Vision Res. 1975. Vol. 15. P 63-68.
Fukada Y., Yoshizawa T„ Saito T. et al. Binding of GTP to transducin is not inhibited by arrestin and phosphorylated rhodopsin // FEBS Lett. 1990. Vol. 261. P. 419-422.
259
Fung В.В.К., Hubbell W.L. Organazation of rhodopsin in photoreceptor membranes. 2. Transmembrane organazation of bovine rhodopsin: evidence from proteolysis and lactoperoxidase-catalized iodination of native and reconstituted membranes // Biochemistry. 1978. Vol. 17. P. 4396-4402.
Fung B.B.K., Nash C.R. Characterization of transducin from bovine retinal rod outer segments. II. Evidence for distinct binding site and conformational changes revealed by limited proteolisys // J. Biol. Chem. 1983. Vol. 258. P. 10503-10510.
Fung B.B.K., Stryer L. Photolyzed rhodopsin catalyzes the exchange of GTP for bound GDP in retinal rod outer segments // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. Vol. 77. P. 2500-2504.
Furman R.E., Tanaka J.C. Photoreceptor channel activation: interaction between cAMP and cGMP // Biochemistry. 1989. Vol. 28. P. 2785-2788.
Ganter UM., Schmid E.D., Perez S.D. et al. Removal of the 9-methyl group of retinal inhibits signal transduction in the visual process. A Fourier transform infrared and biochemical investigation // Biochemistry. 1989. Vol. 28. P. 5954-5962.
Garthwaite J., Boulton C.L. Nitric oxide signaling in the central nervous system // Annu. Rev. Physiol. 1995. Vol. 75. P. 683-706.
Garthwaite J., Charles S.L., Chess-Williams R. Endothelium-derived relaxing factor release on activation of NMDA receptor suggests role as intercellular messenger in the brain // Nature. 1988. Vol. 336. P. 385-388.
Gavazzo P., Picco C.. Eismann E. et al. A point mutation in the pore region alters gating, Ca2+ blockage, and permeation of olfactory cyclic nucleotide-gated channels //J. Gen. Physiol. 2000. Vol. 116. P. 311-326.
Gavazzo P., Picco C., Menini A. Mechanisms of modulation by internal protons of cyclic nucleotide-gated channels cloned from sensory receptor cells // Proc. Roy. Soc. London. B. 1997. Vol. 264. P. 1157-1165.
Gebhard F.X., Schertler G.F., Hargrave P.A. Preparation and analysis of twodimensional crystals of rhodopsin // Meth. EnzymoL 2000. Vol. 315. P. 91-107.
Godchaux W., Ill, Zimmerman W.F. Membrane-dependent guanine nucleotide binding and GTPase activities of soluble protein from bovine rod outer segments // J. Bio1 Chem. 1979. Vol. 254. P. 7874-7884.
Gold G.H. Plasma membrane calcium fluxes in intact rods are inconsistent with the “calcium hypothesis” // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. Vol. 83. P. 1150-1154.
Goldberg N.D., Ames A., Ill, Gander J.E., Walseth T.F. Magnitude of increase in retinal cGMP metabolic flux determined by '8O incorporation into nucleotide a-phosphoryls correspond with intensity of photic stimulation // J. Biol. Chem. 1983. Vol. 258. P. 9213-9219.
Goligorsky M.S., Tsukahara H. Magazine H. et al. Termination of endothelin signaling: Role of nitric oxide //J. Cell. Physiol. 1994. Vol. 158. P. 485-94.
Gordon S.E., Oakley J.C., Varnum M.D., Zagotta W.N. Altered ligand specificity by protonation in the ligand binding domain of cyclic nucleotide-gated channels U Biochemistry. 1996. Vol. 35. P. 3994-4001.
Gordon S.E., Varnum M.D., Zagotta W.N. Direct interaction between amino and carboxyl-terminal domains of cyclic nucleotide-gated channels // Neuron. 1997. Vol. 19, №2. P. 431-441.
Gouldirg E.H., Ngai J., Kramer R.H. et al. Molecular cloning and singlechannel properties of the cyclic nucleotide-gated channel from catfish olfactory neurons // Ibid. 1992. Vol. 8, № 1. P. 45-58.
260
Goulding E.H., Tibbs G.R., Liu D.. Siegelbaum S.A. Role of H5 domain in determining pore diameter and ion permeation through cyclic nucleotide-gated channels // Nature. 1993. Vol. 364, № 6432. P. 61-64.
Govardovsky V.l. On the sites of generation of the early and late receptor potentials//Vision Res. 1975. Vol. 15. P. 973-981.
Gray-Keller M.P., Detwiler P.B. The calcium feedback signal in the phototransduction cascade of vertebrate rods // Neuron. 1994. Vol. 13. № 4. P. 849-861.
Gray-Keller M.P., Detwiler P.B., Benovic J.L., Gurevich V.V. Arrestin with a single amino acid substitution quenches light-activated rhodopsin in a phosphorylation-independent fashion // Biochemistry. 1997. Vol. 36. P. 7058-7063.
Gregerson D.S., Merryman C.F.. Obritsch W.F., Donoso LA. Identification of a potent new pathogenic site in human retinal S-antigen which induces experimental autoimmune uveoretinitis in LEW rats // Cell. Immunol. 1990. Vol. 128. P. 209-219.
Groves J.T., Wang C.C. Nitric oxide synthase: models and mechanisms //Curr. Opin. Chem. Biol. 2000. Vol. 4. P. 687-695.
Grunwald M.E , Yu W.P., Yu H.H., Yau K.-W. Identification of a domain on the beta-subunit of the rod cGMP-gated cation channel that mediates inhibition by cal-cium-calmodulin // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273, № 15. P. 9148-9157.
Grunwald M.E., Zhong H., Lai J., Yau K.-W. Molecular determinants of the modulation of cyclic nucleotide-activated channels by calmodulin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. P. 13444-13449.
Hagins WA. The visual process: Excitatory mechanism in the primary receptor cells //Annu. Rev. Biophys. and Bioeng. 1972. Vol. 1. P. 131-158.
Hagins W.A., Yoshikami S.A. Role for Ca++ in excitation of retinal rods and cones //Exp. Eye Res. 1974. Vol. 18. P. 299-306.
Hamm H.E., Bownds M.D. Protein complement of rod outer segment of frog retina//Biochemistry. 1986. Vol. 25. P. 4512-4523.
Hargrave PA. Rhodopsin structure, function, and topography the Friedenwald lecture //Invest. Ophthalmol. Visual Sci. 2001. Vol. 42. P. 3-9.
Hatt H., Ache B.W. Cyclic nucleotide- and inositol phosphate-gated ion channels in lobster olfactory receptor neurons Ц Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1994. Vol. 91, № 14. P. 6264-6268.
Haverkamp S., Eldred W.D. Localization of nNOS in photoreceptor, bipolar and horizontal cells in turtle and rat retinas // Neuroreport. 1998. Vol. 9, № 10. P. 2231-2235.
Haverkamp S., Kolb H., Cuenca N. Endothelial nitric oxide synthase (eNOS) is localized to Muller cells in all vertebrate retinas // Vision Res. 1999. Vol. 39. P. 2299-303.
Haynes L.W., Kay A.R., Yau K.-W. Single cyclic GMP-activated channel activity in excised patches of rod outer segment membrane // Nature. 1986. Vol. 321. P. 66-70.
Haynes L., Yau K.-W. Cyclic GMP-sensitive conductance in outer segment membrane of catfish cones //Ibid. 1985. Vol. 317. P. 61-64.
He W., Cowan C.W.. Wensel T.G. RGS9 a GTPase accelerator for phototransduction // Neuron. 1998. Vol. 20. P. 95-102.
Но M.K., Wong Y.H. Alanine-23 of transducin alpha subunit is involved in defining the affinity for betagamma complex // Neuroreport. 1999. Vol. 10. P. 1993-1996.
Ho Y К Fung B.K.K. Characterization of transducin from bovine rod outer segments //J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259. P. 6694-6699.
261
Hodgkin A.L., McNaughton P.A., Nunn В J. Measurement of sodium-calcium exchange in salamander rods // J. Physiol. 1987. Vol. 391. P. 347-370.
Hodgkin A.L., Nunn В J. The effects of ions on sodium-calcium exchange in salamander rods//Ibid. 1987. Vol. 391. P. 371-398.
Hodgkin A.L., Nunn В J. Control of light-sensitive current in salamander rods // Ibid. 1988. Vol. 403. P. 439-471.
Hofmann K.P., Emeis D„ Schnetkamp P.M. Interplay between hydroxy-lamine, metarhodopsin II and GTP // Biochim. et Biophys. Acta. 1983. Vol. 725. P. 60-70.
Hofmann K.P., Reihert J. Chemical probing of the light-induced interaction between rhodopsin and G-protein // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P. 7990-7995.
Holton T., Hudspeth A J. The transduction channel of hair cells from the bullfrog characterized by noise analyses // J. Physiol. 1986. Vol. 375. P. 195-227.
Horio Y„ Murad F. Solubilization of guanylyl cyclase from bovine rod outer segments and effects of lowering Ca2+ and nitro compounds // J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266. P. 3411-3415.
Howard J., Hudspeth AJ. Compliance of the hair bundle associated with gating of mechanoelectrical transduction channels in the bullfrog’s saccular hair cell // Neuron. 1988. Vol. 1. P. 189-199.
Howard J., Roberts W.M., Hudspeth AJ. Mechanoelectrical transduction by hair cells // Annu. Rev. Biophys. and Biophys. Chem. 1988. Vol. 17. P. 99-124.
Hughes B.A., Adorante J.S., Miller S.S., Lin H. Apical electrogenic Na+: HCO3 cotransport. A mechanism for HCO3 absorption across the retinal pigment epithelium // J. Gen. Physiol. 1989. Vol. 94. P. 125-150.
Huppertz B., Weyand I., Bauer PJ. Ca2+ binding capacity of cytoplasmic proteins from rod photoreceptors is mainly due to arrestin // J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 9470-9475.
Hurley J.B. Isolation and recombination of bovine rod outer segment cGMP phosphodiesterase and its regulators // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1980. Vol. 2. P. 505-510.
Hurley J.B. Molecular properties of the cGMP cascade of vertebrate photoreceptors//Annu. Rev. Physiol. 1987. Vol. 49. P. 793-812.
Hurley J B„ Stryer L. Purification and characterization of the gamma regulatory subunit of the cyclic GMP phosphodiesterase from retinal rod outer segment // J. Biol. Chem. 1982. Vol. 257. P. 11094-11099.
Hwa J., Reeves RJ , Klein-Seetharaman J. et al. Structure and function in rhodopsin: further elucidation of the role of the intradiscal cysteines, Cys-110, 185 and 187, in rhodopsin folding and function // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. P. 1932-1935.
Jager F„ Jager S., Krutle 0. et al. Interactions of the beta-ionone ring with the protein in the visual pigment rhodopsin control the activation mechanism. An FTIR and fluorescence study on artificial vertebrate rhodopsins // Biochemistry. 1994. Vol. 33. P. 7389-7397.
Jost P.C., Griffith O.H. // Spin-labelling-Theory and Applications. N.Y.: Acad, press, 1976. Vol. 2.
Kahlert M., Pepperberg D.R., Hofmann K.P. Effect of bleached rhodopsin on signal amplification in rod visual receptors // Nature. 1990. Vol. 345. P. 537-539.
Kalamkarov G„ Slepova 0., Gerasimenko V. et al. Patients with diabetic retinopathy (DR) revealed S-Ag antibodies in tear and serum // Ophthalmic Res. w Vol. 29. P. 64.
262
Kalamkarov G.R., Poeozheva I.D., Shevchenko T.F. et al. pH changes in frog upon manipulation of putative pH-regulating transport mechanisms // Vision Res. 1996. Vol. 36, № 19. P. 3029-3036.
Kalamkarov G., Shevchenko T.F., Grigoryan G.L. et al. Study of mechanism of Ca++ ions transport in rod outer segment suspension // EMBO Workshop on transduction mechanism of photoreceptors, October, West Germany, Julich, 1976. P. 69.
Karnik S.S., Sakmar T.P., Chen H.-В., Khorana H.G. Cystein residues 110 and 187 are essential for the formation of correct structure in bovine rhodopsin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1988. Vol. 85. P. 8459-8463.
Karpen J.W., Ruiz M„ Brown R.L. Cot alent tethering of ligands to retinal rod cyclic nucleotide-gated channels: binding site structure allosteric mechanism // Meth. Enzymol. 2000. Vol. 315. P. 755-772.
Karpen J.W.. Zimmerman A.L.. Stryer L.. Baylor D.A. Gating kinetics of the cychc-GMP-activated channel of retinal rods: flash photolysis and voltage jump studies //Prov. Nat. Acad. Sci. USA. 1988. Vol. 85. P. 1287-1291.
Katz B.J., Oakley В., II. Evidence for Na+/H+ exchange in vertebrate rod photoreceptors // Exp. Eye Res. 1990. Vol. 51. P. 199-207.
Kaupp U.B. The cyclic nucleotide-gated channels of vertebrate photoreceptors and olfactory epithelium //Trends Neurosci. 1991. Vol. 14. P. 150-157.
Kaupp U.B. Family of cyclic nucleotide gated ion channels // Curr. Opin. Neurobiol. 1995. Vol. 5. P. 434-442.
Kaupp U.B., Niidome T., Tanabe T. et al. Primary structure and functional expression from complementary DNA of the rod photoreceptor cyclic GMP-gated channel //Nature. 1989. Vol. 342. P. 762-766.
Kawamura S„ Murakami M. Regulation of cGMP levels by guanylate cyclase in truncated frog rod outer segments // J. Gen. Physiol. 1989. Vol. 94. P. 649-668.
Kelleher DJ., Johnson G.L. Characterization of rhodopsin kinase purified from bovine rod outer segments // J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 2632-2639.
Kim I.B., Oh SJ., Chun M.H. Neuronal nitric oxide synthase immunoreactive neurons in the mammalian retina // Microsc. Res. Technol. 2000. Vol. 50. P. 112-123.
Kimelberg H.K., Biddleccme S., Bourke R.S. SITS-inhibitable Cl- transport and Na+-dependent H+ production in primary astroglial cultures // Brain Research, 1979. Vol. 173. P. 111-124.
Kimelberg H K., Norenberg M.D. Astrocytes // Sci. Amer. 1989. Vol. 260. P. 4452.
Kisselev O.G., Meyer C.K., Heck M. et al. Signal transfer from rhodopsin to the G-protein: evidence for a two-site sequential fit mechanism // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. P. 4898-4903.
Kleene SJ. Origin of the chloride current in olfactory transduction // Neuron. 1993. Vol. 11. P. 123-132.
Knowles A., Pepe I.M. Can metarhodopsin I activate rod outer segment phosphodiesterase? /I Cell Bophys. 1988. Vol. 13. P. 43-53.
Koch K.-W., Stryer L. Highly cooperative feedback control of retinal rod guanylate cyclase by calcium ions // Nature. 1988. Vol. 334. P. 64-66.
Koch К -W.. Eckstein F., Stryer L. Stereochemical course of the reaction catalyzed by guanylate cyclase from bovine retinal rod outer segments //J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 9659-9663.
Kolesnikov S.S., Rebrik T.I., Zhainazarov A et al. A cyclic-AMP-gated conductance in cochlear hair cells // FEBS Lett. 1991. Vol. 290. P. 167-170.
263
Kolesnikov S.S., Zhainazarov A.B., Kosolapov A.V. Cyclic nucleotide-activated channels in frog olfactory receptor plasma membrane // Ibid. 1990. Vol. 226. P. 96-98.
Korenhrot J.1Brown D.T., Cone R.A. Membrane characteristics and osmotic behavior of isolated rod outer segments Ц J. Cell. Biol. 1973. Vol. 56. P. 389-398.
Korenbrot J.I., Miller D.L. Cytoplasmic free calcium concentration in dark-adapted retinal rod outer segments // Vision Res. 1989. Vol. 29. P. 939-948.
Korschen H.G., llling M., Seifert R. et al. A 240 kDa protein represents the complete beta subunit of the cyclic nucleotide-gated channel from rod photoreceptor//Neuron. 1995. Vol. 15. P. 627-636.
Koskelainen A., Donner K., Kalamkarov G. et al. HCO3 /Cl~ exchange counteracts alkalization in rod outer segments // Invest. Ophthalmol. Visual Sci. 1992. Vol. 33, №4. P. 1326.
Koskelainen A., Donner K., Kalamkarov G., Hemila S. Changes in the lightsensitive current of salamander rods upon manipulation of putative pH-regulating mechanisms in the inner and outer segment // Vision Res. 1994. Vol. 34, № 8. P. 983-994.
Krapivinsky G.B., Filatov G.N., Filatova E.A. et al. Regulation of cGMP dependent conductance in cytoplasmic membrane of rod outer segments by transducin //FEBS Lett. 1989. Vol. 247. P. 435-438.
Krupnick J.G., Gurevich V.V., Benovic J.L. Mechanism of quenching of phototransduction. Binding competition between arrestin and transducin for phosphorhodopsin // J, Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 18125-18131.
Krupnick J.G., Gurevich V.V., Schepers T. et al. Arrestin-rhodopsin imterac-tion. Multi-site binding delineated by peptide inhibition Ц J. Biol. Chem 1994. Vol. 296. P. 3226-3232.
Kubrina L., Caldwell IT..S'., Mordvinicev P.I. et al. ESR evidence for nitric oxide production from guanidino nitrogens of L-arginine in animal tissues in vivo Ц Biochim. et Biophys. Acta. 1992. Vol. 1099. P. 233-237.
Kuhn H. Light and GTP-regulated interaction of GTP-ase and other proteins with bovine photoreceptor membrane // Nature. 1980. Vol. 283. P. 587-589.
Kuhn H., Bennett N.f Michel-Villaz M., Chabre M. Interaction between photoexcited rhodopsin and GTP-binding protein. Kinetic and stoichiometric analysis from light-scattering changes // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1981. Vol. 78. P. 6873-6877.
Kuhn H., Hall .S', IT.. Wilden U. Light-induced binding of 48-kDa protein to photoreceptor membranes is highly enhanced by phosphorylation of rhodopsin // FEBS Lett. 1984. Vol. 176. P. 473-478.
Kuhn H., Hargrave P.A. Light-induced binding of GTP-ase to bovine photoreceptor membranes: Effect of limited proteolysis of the membranes // Biochemistry. 1981. Vol. 20. P. 2410-2417.
Kulagina O., Shevchenko T. NO-synthase in photoreceptor layer of frog retina. II Ophthalmic Res. 1997. Vol. 29. P. 51.
Kurenny D.E., Moroz L.L., Turner R.W. et al. Modulation of ion channels in rod photoreceptors by nitric oxide // Neuron. 1994. Vol. 13. P. 315-324.
LaCour M. Rheogenic sodium-bicarbonate transport across the retinal membrane of the frog retinal pigment epithelium // J. Physiol. 1989. Vol. 419. P. 539-553.
Lagnado L., Cervetto L., McNaughton P.A. On transport by the Na-Ca exchange in isolated rod outer segments//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1988. Vol. 85. p. 4548^1552.
264
Lagnado L., McNaughton P.A. Electrogenic properties of the Na:Ca exchange //J. Membrane Biol. 1990. Vol. 113. P. 177-191.
L'Alleman G., Paris S., Pouyssegur J. Role of a Na+-dependent CF/HCO3 exchange in regulation of interacellular pH in fibroblasts // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P. 4877-4883.
Lamb T.D., McNaughton P.A., Yau K.-W. Spatial spread of activation and background desensitization in toad rod outer segments I I J. Physiol. 1981. Vol. 319. P. 463-496.
Lee R.H., Brown B.M., Lolley R.N. Light-induced dephosphorylation of a 33K protein in rod outer segments of rat retina // Biochemistry. 1984. Vol. 23. P. 1972-1977.
Lee S.Z., Pan Z.-H., Aggarwal S.K. et al. Effect of nitric oxide production on redox modulatory site of the NMDA receptor-channel complex // Neuron. 1992. Vol. 8. P. 1087-1099.
Leinders-Zufall T., Rosenboom H., Barnstable CJ. et al. A calcium-permeable cGMP-activated cation conductance in hippocampal neurons // Neuroreport. 1995. Vol. 6. P. 1761-1765.
Leskov LB., Klenchin V.A., Handy J.W. et al. The gain of rod phototranduction: reconciliation of biochemical and electrophysiological measurements // Neuron. 2000. Vol. 27. P. 525-537.
Levine D.Z., lacovitti M.. Burns K.D.. Zhang X. Real-time profiling of kidney tubular fluid nirtic oxide concentrations in vivo // Amer. J. Physiol. Renal Physiol. 2001. Vol. 281.P. F189-F194.
Lewis R.S., Hudspeth A J. Voltage- and ion-dependent conductances in solitary vertebrate hair cells Ц Nature. 1983. Vol. 304. P. 538-541.
Li Q., Cerione R.A. Communication between switch II and switch III of the transducin a subunit is essential for target activation // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 21673-21676.
Liebman P.A., Mueller P., Pugh E.N., Jr. Protons suppress the dark current of frog retinal rods // J. Physiol. 1984. Vol. 347. P. 85-110.
Liebman P.A., Entine G. Lateral diffusion of visual pigment in photoreceptor disc membranes // Science. 1974. Vol. 185. P. 457—459.
Liepe B.A., Stone C., Koistinaho J., Copenhagen D.R. Nitric oxide synthase in Muller cells and neurons of salamander and fish retina // J. Neuroscience. 1994. Vol. 14. P. 7641-7654.
Liman E.R., Buck L.B. A second subunit of the olfactory cyclic nucleotide-gated channel confers high sensitivity to cAMP // Neuron. 1994. Vol. 13. P. 611-621.
Lin S.W., Han M., Sakmar T.P. Analysis of functional microdomains of rhodopsin Ц Meth. Enzymol. 2000. Vol. 315. P. 116-130.
Lin W.C., Cone R.A., Edidin M.A. Lateral diffusion of rhodopsin in photoreceptor cells measured by fluorescens photobleaching and recovery Ц Biophys. J. 1981. Vol. 33. P. 225-232.
Linser P., Moscona A.A. Variable CA II compartmentalization in vertebrate retina // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1984. Vol. 429. P. 430^-46.
Lipkin V.M., Khramtsov N.V., Vasilevskaya LA. et al. Beta-subunit of bovine rod photoreceptor cGMP phosphodiesterase. Comparison with the phosphodiesterase family //J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 12955-12959.
Lipton S.A. Prospects for clinically tolerated NMDA antagonists: Open-channel blockers and alternative redox states of nitric oxide // Trends Neurosci. 1993. Vol. 16. P. 527-532.
265
Lipton S.A., Stalmer J.S. Actions of redox-related congeners of nitric oxide at the NMDA receptor // Neuropharmacology. 1994. Vol. 33. P. 1229-1233.
Liu M., Chen T.Y., Ahamed B., Li J., Yau K.-W. Calcium-clamodulin modulation of the olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel // Science. 1994. Vol. 266. P. 1348-1354.
Liu W„ Clark W.A., Sharma P„ Northup J.К Mechanism of allosteric regulation of the rod cGMP phosphodiesterase activity by the helical domain of transducin alpha subunit//J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 34284-34292.
Liu Y„ Arshavsky V.Yu., Ruoho A.E. Interaction sites of the C-terminal region of the cGMP phosphodiesterase inhibitory subunit with the GDP-bound transducin alpha-subunit Ц Biochem. J. 1999. Vol. 337. P. 281-288.
Lolley R.N., Racz E. Calcium modulation of cyclic GMP synthesis in rat visual cells // Vision Res. 1982. Vol. 22. P. 1481-14S6
Longstaff C., Calhoon R.D., Rando R.R. Deprotonation of the Shiff base of rhodopsin is obligate in the activation of the G protein // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. Vol. 3. P. 4209-4213.
Lowe G., Gold G.Y. Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells // Nature. 1993. Vol. 366. P. 283-286.
Ludwig J., Margalit T.f Eismann E. et al. Primary structure of cAMP-gated channel from bovine olfactory epithelium // FEBS Lett. 1990. Vol. 270. P. 24-29.
Mahnesmith R.I., Aronson P.S. The plasma membrane sodium-hydrogen exchanger and its role in physiological and pathological processes // Circul. Res. 1985. Vol. 56. P. 775-788.
Malinski T., Radomski M.W., Taha Z., Moncada S. Direct electrochemical measurement of nitric oxide released from human platelets // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1993. Vol. 194. P. 960-965.
Margulis A., Pozdnyakov N., Dang L„ Sitaramayya A. Soluble guanylate cyclase and nitric oxide synthase in synaptosomal fractions of bovine retina I I Visual Neurosci. 1998. Vol. 15. P. 867-873.
Margulis A., Sharma R.K., Sitaramayya A. Nitroprusside-sensitive and insensitive guanylate cyclases in retinal rod outer segments // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1992. Vol. 185. P. 909-914.
Marin E.P., Krishna A.G., Zvyaga T.A. et al. The amino terminus of the fourth cytoplasmic loop of rhodopsin modulates rhodopsin-transducin interaction // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 1930 -1936.
Matthews G. Comparison of the light-sensitive and cyclic GMP-sensitive conductances of the rod photoreceptor: Noise characteristics // J. Neurosci. 1986. Vol. 6. P. 2521-2526.
Matthews H.R., Fain G L., Murphy R.L W., Lamb T.D. Light adaptation in cone photoreceptors of the salamander: A role for cytoplasmic calcium // J. Physiol. 1990. Vol. 420. P. 447-469.
Matthews H.R, Murphy R L.W, Fain G.L., Lamb T.D. Photoreceptor light adaptation is mediated by cytoplasmic calcium concentration // Nature. 1988. Vol. 334. P. 67-69.
MatulefK., Flynn G.E., Zagotta W.N. Molecular rearrangements in the ligandbinding domain of cyclic nucleotide-gated channels // Neuron. 1999. Vol. 24. p. 443-452.
Mayer B., Schmidt K., Humbert P., Bohme E. Biosynthesis of endothelium derived relaxing factor: a cytosolic enzyme in porcine aortic endothelial cells Ca2+-dependently converts L-arginine into an activator of soluble guanylyl cyclase // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1989. Vol. 164. P. 678-685.
266
McLaughlin S., Brown J.E. Diffusion of calcium ions in retinal rods // J. Gen. Physiol. 1981. Vol. 77. P. 475-487.
McNaughton P.A Light response of vertebrate photoreceptors // Physiol. Rev. 1990. Vol. 70. P. 847-883.
McNaughton P.A., Cervetto L., Nunn В J. Measurement of the intracellular free calcium concentration in salamander rods // Nature. 1986. Vol. 322. P. 261-263.
McNaughton P.A., Perry RJ. The ionic selectivity of the light-sensitive channel is different in rods and cones isolated from the tiger salamander // J. Physiol. 1990. Vol. 410. P. 24.
Mendez A., Burns M E., Roca A. et al. Rapid and reproducible deactivation of rhodopsin requires multiple phosphorylation sites // Neuron 2000. Vol. 28. P. 153-164.
Menini A. The effect of hydrogen ions on the cyclic GMP-activated currents carried by Na+, K+ or Li+ in excised patches from retinal rods of the salamander // J. Physiol. 1989. Vol. 418. P. 123.
Menini A. Currents carried by monovalent cations through cyclic cGMP-acti-vated channels in excised patches from salamander rods // Ibid. 1990. Vol. 424. P. 167-185.
Meyertholen E.P.. Wilson MJ., Ostroy S.E. Removing bicarbonate/CO2 reduces the cGMP concentration of the vertebrate photoreceptors to the levels normally observed on illumination // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1980. Vol. 96. P. 785-792.
Meyertholen E.P., Wilson MJ., Ostroy S.E. The effects of HEPES, bicarbonate and calcium on the cGMP content of vertebrate rod photoreceptors and the isolated electrophysiological effects of cGMP and calcium // Vision Res. 1986. Vol. 26. P. 521-533.
Michel-Willas M., Brisson A„ Chapron J. Physical analysis of light-scattering changes in bovine photoreceptor membrane suspensions // Biophys. J 1984. Vol. 46. P. 655-662.
Miki N„ Baraban J.M., Keims J J. et al. Purification and properties of the light-activated cyclic nucleotide phosphodiesterase of rod outer segment // J. Biol. Chem. 1975. Vol. 250. P. 6320-6327.
Miller D.L., Korenbrot J.I. Kinetics of light-dependent Ca fluxes across the plasma membrane of rod outer segments // J. Gen. Physiol. 1987. Vol. 90. P. 397-425.
Miller J.A., Paulsen R„ Bounds M D. Control of ligh*-activated phosphorylation in frog photoreceptor membranes // Biochemistry. 1977. Vol. 16. P. 2633-2639.
Miller J.L., Dratz EA. Phosphorylation at sites near rhodopsin’s carboxyl-ter-mrnus regulates light initiated cGMP hydrolysis // Vision Res. 1984. Vol. 24. P. 1509-1521.
Miller J.L., Litman В J. Phosphatidylserine and divalent cations facilitate PDE activation ih rhodopsin containing reconstituted vesicles // Invest. Ophthalmol. Visual Sci. 1986. Vol. 27. P. 216-220.
Misaka T„ Kusakabe Y., Emori Y. et al. Molecular cloning and taste bud-specific expression of a novel cyclic nucleotide-gated channel // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1998. Vol. 855. P. 150-159.
Molday R.S. Calmodulin regulation of cyclic-nucleotide-gated channels // Curr. Opin. Neurobiol. 1996. Vol. 6. P. 445-452.
Moncada S., Palmer R.MJ., Higgs E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology //Pharmacol. Rev. 1991. Vol. 43. P. 109-142.
267
MontalM. Rhodopsin in model membranes I I Biochim. et Biophys. Acta. 1979. Vol. 559. P. 231-257.
Mordvintcev P., Millsch A., Busse R., Vanin A. On-line detection of nitric oxide formation in liquid aqueous phase by electron paramagnetic resonance spectroscopy // Anal. Biochem. 1991. Vol. 199. P. 1-5.
Morrill J.A., MacKinnon R. Isolation of a single carboxyl-carboxylate proton binding site in the pore of a cyclic nucleotide-gated channel // J. Gen. Physiol. 1999. Vol. 114. P. 71-73.
Miilsch A., Mordvintcev P„ Vanin A. Quantification of nitric oxide in biological samples by electron spin resonance spectroscopy // Neuroprotocols. 1992. Vol. 1. P. 165-173.
Musseer G.L., Rosen S. Localization of carbonic anhydrase activity in the vertebrate retina//Exp. Eye Res. 1973. Vol. 15. P. 105-119.
Nagata T„ Terakita A., Kandori H. et al. Water and peptide backbone structure in the active center of bovine rhodospin // Biochemistry. 1997. Vol. 36. P. 6164-6170.
Nagle B.W., Okamoto C., Taggert B., Burnside B. The teleost cone cytoskeleton. Localization of actin, microtubules and intermediate filaments // Invest. Ophthalmol. 1986. Vo. 27. P. 689-701.
Nakamura T., Gold G.H. A cyclic nucleolide-gated conductance in olfactory receptor cilia//Nature. 1987. Vol. 325. P. 442—444.
Nakatani K., Koutalos Y„ Yau K.-W. Ca2+ modulation of the cGMP-gated channel of bullfrog retinal rod photoreceptors//!. Physiol. 1995. Vol. 484. P. 69-76.
Nakatani K., Tamura T., Yau K.-W. Light adaptation in retinal rods of the rabbit and two other nonprimate mammals // J. Gen. Physiol. 1991. Vol. 97. P. 413-436.
Nakatani K., Yau K.-W. Calcium and magnesium fluxes across the plasma membrane of the toad rod outer segment //J. Physiol. 1988a. Vol. 395. P. 695-729.
Nakatani K., Yau K.-W. Calcium and light adaptation in retinal rods and cones // Nature. 1988b. Vol. 334. P. 69-71.
Natochin M., Artemyev N.O. An interface of interaction between photoreceptor cGMP phosphodiesterase catalytic subunits and inhibitory gamma subunits // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 19964-19969.
Natochin M., Granovsky A.E., Artemyev N.O. Identification of effector residues on photoreceptor G protein, transducin Ц Ibid. 1998. Vol. 273. P. 21808-21815.
Nawy S., Jahr C.E. Suppression by glutamate of cGMP-activated conductance in retinal bipolar cells // Nature. 1990. Vol. 346. P. 269-271.
Nichol G.G., Schnetkamp P.P.M., Saimi Y. et al. A derivative of amiloride blocks both the light-regulated and cyclic GMP-regulated conductances in rod photoreceptors // J. Gen. Physiol. 1987 Vol. 90. P. 651-669.
Nicoll D.A., Appleburv M.L. Purification of the bovine rod outer segment Na+/Ca2+ exchanger//J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. P. 16207-16213.
Noel J.P., Hamm H.E., Sigler P.B. The 2.2 A crystal structure of transducin-alpha complexed with GTP gamma S // Nature. 1993. Vol. 366. P. 654-663.
Norton A.W., D’Amours M.R., Grazio H.J. et al. Mechanism of transducin activation of frog rod photoreceptor phosphodiesterase. Allosteric interactiona between the inhibitory gamma subunit and the noncatalytic cGMP-binding sites // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 3861-38619.
Nussenblatt R.B., Kuwabara T., de Monasterio F.M. et al. S-antigen uveitis in primates. A new model for human disease // Arch. Ophthalmol. 1981. Vol. 99. P. 1090-1092.
268
Nussenhlatt R.B., Mittal K.K.. Fuhrman S. et al. Lymphocyte proliferative responses of patients with ocular toxoplasmosis to parasite and retinal antigens // Amer. J. Ophthalmol. 1989. Vol. 107. P. 6326-6341.
Oakley В., 11. Wen R. Extracellular pH in the isolated retina of the toad in darkness and during illumination //J. Physiol. 1989. Vol. 419. P. 353-378.
Oesterhelt D., Stoeckenius W. Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium Ц Nature New Biol. 1971. Vol. 233. P. 149-152.
Oesterhelt D., Stoeckenius W. Function of a new photoreceptor membrane H Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1973. Vol. 70. P. 2853-2857.
Okada T., Kandori H., Shichida Y. et al. Spectroscopicc study of the bato- to lumitransition during the photobleaching of rhodopsin using ring-modified retinal analogues // Biochemistry. 1991. Vol. 30. P. 4796-4802.
Olsnes S., Ludt J., Tonnessen T.I.. Sandvig K. Bicarbonate/chloride antiport in vero cells; I] Mechanisms for bicarbonate-dependent regulation of intracellular pH //J. Cell. Physiol. 1987. Vol. 132. P. 192-202.
Ong ОС.. Ota I.M., Clarke S., Fung B.K. The membrane binding domain of rod cGMP phosphodiesterase is posttranslationally modified by methyl esterification at a C-terminal cysteine // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1989. Vol. 86. P. 9238-9242.
Ormos P„ Dancshazy Zr., Karvaly B. Mecanism of generation and regulation of photopotential by bacteriorhodopsin in bimolecular lipid membrane. The quenching effect of blue light // Biochim. et Biophys. Acta. 1978. Vol. 503. P. 304—315.
Ostroy S.E. Rhodopsin and the visual process // Ibid. 1977. Vol. 463. P. 91-125'
Ottolenghi M. Molecular aspects og the photocycles of rhodopsin and bacteriorhodopsin: A comparative overview // Meth. Enzymol. 1982. Vol. 88. P. 470-491.
Ovchinnikov Yu.A., Abdulaev N.G., Bogachuk A.S. Two adjacent cystein residues in the C-terminal cytoplasmatic fragment of bovine rhodopsin are palmiti-lated // FEBS Lett. 1988. Vol. 230. P. 1-5.
Ovchinnikov Yu.A., Gubanov V.V., Khramtsov N.V. et al. Cyclic GMP phosphodiesterase from bovine retina. Amino acid sequence of the alpha-subunit and nucleotide sequence of the corresponding cDNA // Ibid. 1987. Vol. 223. P. 169-183.
Ovchinnikov Yu.A., Lipkin V.M., Kumarev V.P. et al. Cyclic GMP phosphodiesterase form cattle retina. Amino acid sequence of the gamma-subunit and nucleotide sequence of the corresponding cDNA // Ibid. 1986. Vol. 204. P. 288-292.
Palczewski K., Buczylko J., Kaplan MW. et al. Mechanism of rhodopsin kinase activation // J. Biol. Chem.1991. Vol. 266. P. 12949-12955.
Palczewski K., Kumasaka T., Hori T. et al. Crystal structure of rhodopsin: A G-protein-coupled receptor// Science. 2000. Vol. 289. P. 739-745.
Palczewski K., McDowell J.H., Hargrave P.A. Purification and characterization of rhodopsin kinase // J. Biol. Chem. 1988a. Vol. 263. P. 14067-14073.
Palczewski K., McDowell J.H., Hargrave P.A. Rhodopsin kinase: Substrate specificity and factors that influence activity // Biochemistry. 1988b. Vol. 27. P. 2306-2313.
Palczewski K., McDowell J.H., Jakes S. et al. Regulation of rhodopsin dephosphorylation by arrestin //J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. P.15770-15773.
Panda K„ Ghosh S., Stuehr DJ. Calmodulin activates intersubunit electron transfer in the neuronal nitric-oxide synthase dimer // Ibid. 2001. Vol. 276. P. 23349-23356.
269
Parker K.R., Schaechter L.E.. Lewis J.W. et al. Mg2+-ATP induces filament growth from retinal rod outer segments with disrupted plasma membranes // FEBS Lett. 1987. Vol. 211. P. 35^10.
Pedemonte C.H., Kaplan J.H. Interaction of the Na+-K+-ATPase with H2DIDS // Progr. Clin, and Biol. Res. 1988. Vol. 268A. P. 327-334.
Pepe I.M., Panfoli I., Cugnoli C. Guanylate cyclase in rod outer segments of the toad retina // FEBS Lett. 1986. Vol. 203. P. 73-76.
Perry RJ., McNaughton P.A. Responce properties of cones from the retina of the tiger salamander//J. Physiol. 1991. Vol. 433. P. 561-587.
Pfister C., Chabre M., Plouet Y. et al. Retinal S-antigen idetified as the 48 kD protein regulating light-dependent phosphodiesterase in rods // Science. 1985. Vol. 228. P. 891-893.
Pfister C., Kuhn H., Chabre M. Interaction between photoexcited rhodopsin and peripheral enzimes in frog retina // Europ. J. Biochem. 1983 Vol. 136. P. 489-499.
Picones A., Korenbrot J.I. Permeabilitiy and interaction of Ca2+ with cGMP-gated ion channels differ in retinal rod and cone photoreceptors // Biophys. J. 1995. Vol. 69. P. 120-127.
Piwnica-Worms D., Jacob R., Lieberman M. Properties of Na+/H+ exchange in excitable cells Ц Na+/H+ exchange / Ed. S. Grinstein. Boca Raton: CRC press, 1988. P. 91-101.
Poincelot R P Abrahamson E.W. Phospholipid composition and ecxtractabili-ty of bovine rod outer segments and micells // Biochemistry. 1970. Vol. 9. P. 1820-1825.
Pontus M., Delmell M. Effect of detergents on the conformation of spil-labeled rhodopsin / Exp. Eye Res. 1975. Vol. 20. P. 599-603.
Poo M.M.. Cone R.A. Lateral diffusion of rhodopsin in photoreceptor membranes // Nature. 1974. Vol. 247. P. 438-Л41.
Protasova T.B., Fedorovich LB., Ostrovsky M.A. Retinal isomers in photo- and electro-induced rhodopsin intermediates // Light in Biol, and Med. 1991. Vol. 2. P. 545-556.
Pryor W.A., Church D.F., Godivan C.K. et al. Oxidation of thiols by nitric oxide and nitrogen dioxide: synthetic utility and toxicological implications //J. Org. Chem. 1982. Vol. 47. P. 156-159.
P.yor W.A., Lightsey J.W. Mechanisms of nitrogen dioxide reactions: initiation of lipid peroxidation and the production of nitrous acid // Science. 1981. Vol. 214. P. 435-437.
Pugh E N . Jr.. Cobbs W.H. Properties of cytoplasmic transmitters of excitation in vertebrate rods and evaluation of candidate intermediate transmitters //1 he molecular mechanism of photoreception / Ed, H. Stieve. Berlin: Springer, 1986a. P. 127-159.
Pugh E.N., Jr., Cobbs W.H. Visual transduction in vertebrate rods and cones: A tale of two transmitters, calcium and cyclic GMP // Vision Res. 1986b. Vol. 26. P. 1613-1643.
Pugh E.N , Jr., Lamb TD. Cyclic GMP and calcium: The internal messengers of excitation and adaptation in vertebrate photoreceptors // Ibid. 1990. Vol. 30. P. 1923-1948.
Pugh E.N., Jr., Lamb T.D. Amplification and kinetics of the activation steps in phototransduction // Biochim. et Biophys. Acta. 1993. Vol. 1141. P. 111^49.
Pulvermuller A., Palczewski K., Hofmann K.P. Interaction between photoactivated rhodopsin and its kinase: stability and kinetics of complex formation // Biochemistry. 1993. Vol. 32. P. 14082-14088.
270
Pulvermuller A.. Schroder К., Fischer T„ Hofmann K.P. Interactions of metarhodopsin II. Arrestin peptides compete with arrestin and transducin // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 37679-37685.
Raley-Susman K.M., Sapolsky R.M., Kopito R.R. CE/HCOf exchange function differs in adult and fetal rat hippocampal neurons // Brain Res. 1993. Vol. 614. P. 308-314.
Raman D., Osawa S., Weiss E.R. Binding of arrestin to cytoplasmic loop mutants of bovine rhodopsin // Biochemistry. 1999. Vol. 38. P. 5117-5123.
Ratto G.M., Payne R., Owen W.G., Tsien R.Y. The concentration of cytosolic free calcium in vertebrate rod outer segments measured with Fura-2 // J. Neorosci. 1988. Vol. 8 P. 3240-3246.
Reichert J., Hofmann K.-P. Sulfhydryl group modification of photoreceptor G-protein prevents its light-induced binding to rhodopsin // FEBS Lett. 1984. Vol. 168. P. 121-124.
Reid D.M., Friedel U., Molday R.S., Cook hl J. Identification of the sodium-cal-cium exchanger as the major ricin-binding glycoprotein of bovine rod outer segments and its localization to the plasma membrane // Biochemistry. 1990. Vol. 29. P. 1601-1607.
Restrepo D., Miyamoto T., Bryant B.P., Teeter J.H. Odor stimuli trigger influx of calcium into olfactory neurons of the channel catfish // Science. 1990. Vol. 249. P. 1166-1168.
Restrepo D., Okada Y., Teeter J.H. Odorant-regulated Ca2+ gradients in rat olfactory neurons //J. Gen. Physiol. 1993. Vol. 102. P. 907-924.
Ricci A J., Fettiplace R. The effects of calcium buffering and cyclic AMP on mechano-electrical transduction tn turtle auditory hair cells // J. Physiol. 1997. Vol. 15. P. 111-124
Ricci A.J., Wu Y.C., Fettiplace R. The endogenous calcium buffer and the time course of transducer adaptation in auditory hair cells // J. Neurosci. 1998. Vol. 18. P. 8261-8277.
Rieke F., Baylor D.A. Origin of reproducibility in the responses of retinal rods to single photons //Biophys J. 1998. Vol. 75. P. 1836-1857.
Rieke F., Schwartz E.A. A cGMP-gated current can control exocytosis at cone synapses //Neuron. 1994. Vol. 13, № 4. P. 863-873.
Rispoli G., Sather W.A., Detwiler P.B. Effect of nucleoside triphosphate on the response of detached rod outer segments to low external Ca // Biophys. J. 1988. Vol. 53. P. 338a.
Rispoli G., Sather W.A., Detweiler P.B. Visual transduction in dialysed detached rod outer segments from lizard retina // J. Physiol 1993. Vol. 465. P. 513-37.
Roof D.J. Turnover of vertebrate photoreceptor membranes // The Molecular Mechanism of Photoreception. B.: Springer, 1986. P. 287-302 (Dahlem Konferei.zen).
Root M.J., MacKinnon R. Indentification of an external divalent cation-binding site in the pore of a cGMP-activated channel // Neuron. 1993. Vol. 11. P 459^4-бС
Rothemel J.D., Parker Botello L.H. A mechanistic and kinetic analysis of the interactions of the diastereo isomers of adenosine 3’5’-(cyclic)phosphorothioate with purified cyclic AMP-dependent protein kinase // Biochem. J. 1988. Vol 251. P 757-762.
Rozanowska M., Wessels J., Boulton M. et al. Blue light-induced singlet oxygen generation by retinal lipofuscin m non-polar media // Free Radical Biol. Med. 1988. Vol. 24. P. 1107-1112.
271
Ruiz M.L., Karpen J.W. Single cyclic nucleotide-gated channels locked in different ligand-bound states // Nature. 1997. Vol. 389. P. 389-392.
Ruppel H., Hagins W.A. Spatial origin of the fast photovoltage inretinal rods // Biochemistry and physiology of visual pigments. B.: Springer, 1973. P. 257-261.
Russel J.M., Boron W.F. Role of chloride transport in regulation of intracellular pH // Nature. 1976. Vol. 264. P. 73-74.
Sautter A., Zong X.. Hofmann F., Biel M. An isoform of the rod photoreceptor cyclic nucleotide-gated channel beta subunit expressed in olfactory neurons // Proc. Nat.Acad. Sci. USA. 1988. Vol. 95. P. 4696-4701.
Savchenko A., Barnes S., Kramer R.H. Cyclic-nucleotide-gated channels mediate synaptic feedback by nitric oxide // Nature. 1997. Vol. 390. P. 694-698.
Schaad N.C., VenecekJ., Rodriguez I.R. et al. Vasoactive intestinal peptide elevates pinealocyte intracellular calcium concentration by enhancing influx: Evidence for involvement of a cyclic GMP-dependent mechanism // Mol. Pharmacol. 1995. Vol. 47. P. 923 -933.
Schretler G.F., Hargrave P.A. Preparation and analysis of two-dimensional crystals of rhodopsin // Meth. Enzymol. 2000. Vol. 315. P. 91-107.
Schleicher A., Hofmann K.-P. Kinetic study on the equlibrium between mem-brane-bound and free photoreceptor G-protein //J. Membrane Biol. 1987. Vol. 95. P. 271-281.
Schnetkamp P.P.M. Sodium-calcium exchange in the outer segments of bovine rod photoreceptors // J. Physiol. 1986. Vol. 373. P. 25-45.
Schnetkamp P.P.M. Na—Ca or Na—Ca-K exchange in rod photoreceptors // Progr. Biophys. Mol. Biol. 1989. Vol. 54. P. 1-29.
Schnetkamp P.P.M., Szerencsei R.T. Silver ions induce a rapid Ca++ release from isolated intact bovine rod outer segments by a cooperative mechanism. // J. Membrane Biol. 1989. Vol. 108. P. 91-102.
Schoenlein R.W.. Peteanu L.A., Mathies R.A., Shank C.V. The first step in vision: femtosecond isomerization of rhodopsin // Science. 1991. Vol. 254. P. 412-415.
Schulz S., Chinkers M., Garbers D.L. The guanylate cyclase/receptor family of protein Ц FASEB J. 1989. Vol. 3. P. 2026-2035.
Schwiening C.J., Boron W.F. Regulation of intracellular pH in pyramidal neurones from the rat hippocampus by Na+-dependent CU/HCO3 exchange // J. Physiol. 1994. Vol. 475. P. 59-67.
Seitz H.R., Heck M., Hofmann K.P. et al. Molecular determinants of the reversible membrane anchorage of the G-protein transducin // Biochemistry. 1999. Vol. 38. P. 950-7960.
Shabb J.B., Corbin J.D. Cyclic nucleotide-binding domains in proteins having diverse functions//!. Biol. Chem. 1992. Vol. 267. P. 5723-5726.
Shapiro M.S., Zagotta W.N. Stoichiometry and arrangement of heteromeric olfactory cyclic nucleotide-gated ion channels // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. P. 14546-14551.
Shaprio M.S., Zagotta W.N. Structural basis for ligand selectivity of heteromeric olfactory cyclic nucleotide-gated channels // Biophys. J. 2000. Vol. 78. P. 2307-2320.
Shichi H., Yamamoto K., Somers R. GTP binding protein: Properties and lack of activation by phosphorylated rhodopsin // Vision Res. 1984. Vol. 24. P. 1523-1531.
Shielss R., Falk G. Retinal on-bipolar cells contain a nitric oxide-sensitive guanylate cyclase // Neuroreport. 1992. Vol. 3. P. 845-848.
272
Shiellls R.A., Falk G. Glutamate receptors of rod bipolar cells are linked to a cyclic GMP cascade via a G-protein // Proc. Roy. Soc. London. B. 1990. Vol. 242. P. 91-94.
Shichida Y., Kandori H., Okada T. et al. Differences in the photobleaching process between 7-cis and 11-cis-rhodopsins: a unique interaction change between the chromophore and the protein during the lumi - meta I transition // Biochemistry. 1991. Vol. 30. P. 5918-5926.
Shinochara T., Dietzschold B.. Craft C.M. et al. Primary and secondary structure of bovine retinal S antigen (48 kDa protein) // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1987. Vol. 84. P. 6975-6979.
Shlue W.-R., Deitmer J.W. Ionic mechanisms of intracellular pH regulation in the nervous system // Proton Passsage Across Cell Membranes. Chichester: Wiley, 1988. P. 39 (Ciba Foundation Symposium).
Sillman AJ., Ito H., Tomita T. Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. 1. General properties of the response // Vision Res. 1969. Vol. 9. P. 1435-1442.
Sitaramayya A., Casadevall C., Bennett N., Hakki S.I. Contribution of the guanosinetriphosphatase activity of G-protein to termination of light-activated guanosine cyclic 3’5’-phosphate hydrolysis in retinal rod outer segment // Biochemistry. 1988. Vol. 27. P. 4880-4887.
Sitaramayya A.. Liebman P.A. Phosphorylation of rhodopsin and quenching of cyclic GMP phosphodiesterase activation by ATP at weak bleaches // J. Biol. Chem. 1983. Vol. 258. P. 1205-1209.
Skulachev V.P. Methods for reconstitution of the electrogenic function of membrane proteins // Meth. Enzymol. 1979a. Vol. 55. P. 751-776.
Skulachev V.P. Membrane potential and reconstitution // Ibid. 1979b. Vol. 55. P. 586-603.
Slepova O.S., Kalamkarov G.R.. Shevchenko T.F. Immune response to S-Ag in tuberculine-positive and -negative patients with uveitis // Vision Res. 1996. Vol. 36, № 13. P. 187.
Somlyo A.P., Walz B. Elemental distribution in Rana pipiens retinal rods: quantitative electron probe analysis //J. Phisiol. 1985. Vol. 358. P. 183-195.
Sparrow J.R.,Nakanishi K., Parish C.A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigment epithelial cells // Invest. Ophthalmol. Visual Sci. 2000. Vol. 41. P. 1981-1990.
StalmerJ.S., Singe!D J., Loscaizo J. Biochemistry of nitric oxide and its redox-activated forms // Science. 1992. Vol. 258. P. 1898-1902.
Sudlow L.C., Huang R.C., Green DJ., Gillette R. cAMP-activated Na+ current of molluscan neurons is resistant to kinase inhibitors and is gated by cAMP in the isolated patch //J. Neurosci. 1993. Vol. 13. P. 5188-5193.
Sun H., Nathans J. ABCR, the ATP-binding cassette transporter for Stargardt macular dystrophy, is an efficient target of all-trans retinal-mediated photooxidative damage in vitro // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 11766-11774.
Sun H., Molday R.S., Nathans J. Retinal stimulates ATP hydrolysis by purified and reconstituted ABCR, the photoreceptor-specific ATP-binding cassette transporter responsible for Stargardt disease // Ibid. 1999. Vol. 274. P. 8269-8281.
Sun Z.P., Akabas M.H., Goudhng E.H. et al. Exposure of residues in the cyclic nucleotide-gated channel pore: P region structure and function in gating // Neuron. 1996. Vol. 16. P. 141-149.
Suter M., Reme C., Grimm C. et al. Age-related macular degeneration: the lipofuscin component N-retinyl-N-retiniliedene ethanolamine detaches proapoptotic
273
proteins from mitochondria and induces apoptosis in mammalian retinal pigment epithelial cells // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 39625-39630.
Tachibanaki S., Imai H., Mizukami T. et al. Presence of two rhodopsin intermediates responsible for transducin activation // Biochemistry. 1997. Vol. 36. P. 14173-14180.
Takemoto D.L., Morrison D., Davis L.C., Takemoto LJ. C-terminal peptides of rhodopsin. Determination of the optimum sequence for recognition of retinal transducin // Biochem. J. 1986. Vol. 235. P. 309-312.
Takemoto D.L., Takemoto LJ., Hansen J., Morrison D. Regulation of retinal transducin by C-terminal peptides of rhodopsin // Ibid. 1985. Vol. 232. P. 669-672.
Tamura T., Nakatami K., Yau K.-W. Light adaptation in cat retinal rods. // Science 1989. Vol. 245. P. 755-758.
Thomas R.C. The role of bicarbonate, chloride and sodium ions in the regulation of intracellular pH in snail neurones. // J. Physiol. 1977. V. 273, P. 317-338.
Thomas R.C. Experimental displacement of intracellular pH and the mechanism of its subsequent recovery // Ibid. 1984. Vol. 354. P. 3-22.
Toibona M., Tsukahara L, Ogawa К Cytochemical demonstration of guanylate cyclase activity in retinal photoreceptors with special reference of changes under light and dark adaptation // Acta Histochem. et Cytochem. 1982. Vol. 15. P. 5-20.
Tonnessen T., Ludt J., Sandvig K., Olsnes S. Bicarbonate/chloride antiport in Vero cells: 1. Evidence for both sodium-linked and sodium-independent exchange //J. Cell. Physiol. 1987. Vol. 132. P. 183-191.
Torre V., Ashmore J.F., Lamb T.D., Menini A. Transduction and adaptation in sensory receptor cells // J. Neurosci. 1995. Vol. 15. P. 7757-7768.
Torre V., Matthews H.R., Lamb T.D. Role of calcium in regulating the cyclic GMP cascade of phototransduction in retinal rods // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. Vol. 83. P. 7109-7113.
Toyoda J., Nosaki H., Tomita T. Light-induced resistance changes in single photoreceptors of Necturus and Gecco // Vision Res. 1969. Vol. 9. P. 453-463.
UhlR., Abrahamson E.W. Dinamic process in visual transduction // Chem. Rev. 1981. Vol. 81. P. 291-312.
Varnum M.D., Black K.D. Zagotta W.N. Molecular mechanism for ligand discrimination of cyclic nucleotide-gated channelt // Neuron. 1995. Vol. 15. P. 619-625.
Varnum M.D., Zagotta W.N. Interdomain interactions underlying activation of cyclic nucleotide-gated channels // Science. 1997. Vol. 278. P. 110-113.
Varnum M.D., Zagotta W.N. Subunit interactions in the activation of cyclic nucleotide-gated ion channels // Biophys. J. 1996. Vol. 70. P. 2667-2679.
Venturini C.M., Knowles R.G., Palmer R.M., Moncada S. Synthesis of nitric oxide in the bovine retina // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1991. Vol. 180. P. 920-925.
Vishnivetskiy S.A., Schubert C.. Climaco G.C. et al. An additional phosphate-binding element in arrestin molecule. Implications for the mechanism of arrestin activation //J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 41049^11057.
Vuong T.M., Chabre M., Stryer L. Millisecond activation of transducin in the cyclic nucleotide cascade of vision I I Nature. 1984. Vol. 311. P. 659-661.
Wald G. The molecular basis of visual excitation // Ibid. 1968. Vol. 219. P. 800-807.
Weiss E.R., Kelleher DJ., Johnson G.L. Mapping sites of interaction between rhodopsin and transducin using rhodopsin antipeptide antibodies // J. Biol. Chem. 1988. Vol. 263. P. 6150-6154.
274
Weitz D., Zoche M., Muller F. et al. Calmodulin controls the rod photoreceptor CNG channel through an unconventional binding site in the N-terminus of the betasubunit // EMBO J. 1988. Vol. 17. P. 2273-2284.
Wells G.B., Tanaka J.C. Ion selectivity predictions from a two-site permeation model for the cyclic nucleotide-gated channel of retinal rod cells Ц Biophys. J. 1997. Vol. 72. P. 127-140.
Wen R., Oakley В., II. Extracellular pH in the isolated retina of the toad in darkness and during illumination //J. Physiol 1989. Vol. 419. P. 353-78.
Weng J., Mata N.L., Azarian 3.M. et al. Insights into the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt’s disease from the phenotype in abcr knockout mice // Cell. 1999. Vol. 98. P. 13-23.
Weyand I., Gadde M., Frings S et al. Cloning and functional expression of a cyclic-nucleotide-gated channel from mammalian sperm //Nature. 199ч. Vol. 368. P. 859-863.
Welden U„ Wust E., Weyand I., Kuhn H. Rapid affinity purification of retinal arrestin (48 kDa protein) via its light-dependent binding to phosphorylated rhodopsin //FEBS Lett. 1986. Vol. 207. P. 292-294.
Winkler B.S. Buffer dependence of retinal glycolysis and ERG potentials // Exp. Eye Res. 1986. Vol. 42. P. 585-593.
Winkler B.S Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function //J. Gen. Physiol. 1981. Vol. 77. P. 667-692.
Wistow GJ., Katial A., Craft C., Shinochara T. Sequence analyses of bovine retinal S-antigen I I FEBS Lett. 1986. Vol. 196. P. 23-28.
Wistrand P.J., Schenholm M., Lonnerholm M. Carbonic anhydrase isoenzimes CA I and CA II in the human eye // Invest. Ophthalmol. Visual Sci. 1986. Vol. 127. p. 419-428.
Xu J.D., Makino C.L., Simon M.L. et al. Prolonged photoresponses in trans genic mouse rods lacking arrestin // Nature. 1997. Vol. 389. P. 505-509.
Yamamoto R., Bredt D.S., Dawson T.M. et al. Enhanced expression of nitric oxide synthase by rat retina following pterygopalatine parasympathetic denervation // Brain Res. 1993a. Vol. 631. P. 83-88.
Yamamoto R., Bredt D.S., Snyder S.H., Stone R.A. The localization of nitric oxide synthase in the rat eye and related cranial ganglia // Neurosci. 1993b. Vol. 54. P. 189-200.
Yamashita T.. Terakita A., Shichida Y. Distinct roles of the second and third cytoplasmic loops of bovine rhodopsin in G protein activation Ц J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 34272-34279.
Yamazaki A., Stein P.J., ChernoffN., Bitensky M.W. Activation mechanism of rod outer semgent cyclic GMP phosphodiesterase // Ibid. 1983. Vol. 258. P. 8188-8194.
Yamazaki A., Yamazaki M., Bondarenko V.A., Matsumoto H. Discrimination of two functions of photoreceptor cGMP phosphodiesterase gamma subunit // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1996. Vol. 222. P. 488^493.
Yang Z., Wensel T.G. A Ca2+-sensitive low Km inorganic pyrophosphatase in retinal rod outer segments // Biophys. J. 1991. Vol. 59. P. 535a.
Yau K.-W. Cyclic nucleotide-gated channels: An expanding new family of ion channels // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1994. Vol. 91. P. 3481-3483.
Yau K.-W., Baylor D.A. Cyclic GMP-activated conductance of retinal photoreceptor cells // Annu. Rev. Neurosci. 1989. Vol. 12. P. 289-327.
Yau K.-W., McNaughton P.A., Hodgkin A.L. Effect of ions on the light-sensitive current in retinal rods // Nature. 1981. Vol. 292. P. 502-505.
275
Yau K.-W., Nakatani K. Light-suppressible, cyclic GMP-sensitive conductance in the plasma membrane of a truncated rod outer segment // Ibid. 1985. Vol. 317. P. 252-255.
Yau K.-W., Nakatani K., Tamura T. Sodium-calcium exchange and phototransduction in retinal photoreceptors // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1991. Vol. 639. P. 275-284.
Yoshikami S., Hagins WA. Light enhanced light sensitivity in calcium depleted rods Ц Biophys. J. 1975. Vol. 15. P. 169a.
Youshizawa T., Shihida Y. Low-temperature spectroscopy of intermediates of rhodopsin // Meth. Enzimol. 1982. Vol. 81. P. 333-354.
Young R.W., Bok D. Participation of the retinal pigment epithelium in the rod outer segment renewal process // J. Cell Biol. 1969. Vol. 42. P. 392-403.
Young R.W., Droz B. The renewal of protein in retinal rods and cones // Ibid. 1968. Vol. 39. P. 169-184.
Zagotta W.N., Siegelbaum SA. Structure and function of cyclic nucleotide-gated channels // Annu. Rev. Neurosci. 1996. Vol. 19. P. 235-263.
Zhang L., Sports C.D., Osawa S., Weiss E.R. Rhodopsin phosphorylation sites and their role in arrestin binding // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 14762-14768.
Zimmerman A.L.. Baylor DA. Cyclic GMP-sensitive conductance of retinal rods consists of aqueous pores // Nature. 1986. Vol. 321. P. 70-72.
Zimmerman A.L., Baylor D.A. Cation interactions within the cyclic GMP-acti-vated channel of retinal rods from the tiger salamander // J. Physiol. 1992. Vol. 449. P. 759-783.
Zong X., Zucker H.,Hofmann F., Biel M. Three amino acids in the C-linker are major determinants of gating in cyclic nucleotide-gated channels // EMBO J. 1998. Vol. 17. P. 353-362.
Zuckerman R., Cheasty J.E. A 48 kDa protein arrests cGMP phosphodiesterase activation in retinal rod disk membranes // FEBS Lett. 1986. Vol. 207. P. 35-41.
Zufall F., Firestein S. Divalent cations block the cyclic nucleotide-gated channel of olfactory receptor neurons //J. Neoruophysiol. 1993. Vol. 69. P. 1758-1768.
Zuffal F., Firestein S., Shepherd G.M. Analysis of single cyclic nucleotide-gated channels in olfactory receptor cells // J. Neurosci. 1991. Vol. 11. P. 3753-3580.
Zufall F.. Firestein S., Shepherd G.M. Cyclic nucleotide-gated ion channels and sensor transduction in olfactory receptor neurons // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1994. Vol. 23. P. 577-607.
SUMMARY
The manuscript summarizes the results of the author’s researches for the last few decades in the field of the sensory transduction. The investigation of the processes of transformation of the external stimulus into the sensory signal in the sensory cells resulted in great successes for the last 25 years. The mechanisms of light transformation in the visual cells are on the most advanced stage of development in the field of sensory transduction. The process is as follows: the light is absorbed by the molecule of the rhodopsin and switches it into an excited state, the excited rhodopsin could activate hundreds molecules of the specific G-protein, or transducin, which in turn activates phosphodiesterase. This biochemical stage results in rapid loss of the cGMP and precisely this process provides the high ampliphication factor of the mechanism of phototransduction.
Our results concern all the intermediate processes of the phototransduction in the vertebrates visual cells described above. The technique of the direct measurements of the photopotential on the photoreceptor discs was used to investigate the photochemical and photoelectrical processes in them. It was found that the photopotential was generated on the disc membrane under illumination but it did not result in the proton translocation in the disc. The interaction of the arrestin, transducin and rhodopsin was investigated with the spin labeling technique. The special chapter is dedicated to the investigation of the mechanism of pH regulation in rods and cones.
Though the book is devoted mainly to the results obtained by the authors, it also contains a chapter, which reviews the problem of molecular interaction of the rhodopsin, arrestin and other proteins, which are involved into the phototransduction mechanism. The latest data on the molecular structure of the cyclic nucleotide-gated channels are also discussed in detail.
The manuscript could be interesting for the physiologists and biochemists, who have an interest in the neurosciences and especially in the sensory physiology.
ОГЛАВЛЕНИЕ
ПРЕДИСЛОВИЕ..................................... 3
Глава 1
ФИЗИОЛОГИЯ ЗРИТЕЛЬНОЙ РЕЦЕПЦИИ.................. 6
Глава 2
ГЕНЕРАЦИЯ ФОТОПОТЕНЦИАЛА НА ФОТОРЕЦЕПТОРНОМ ДИСКЕ.......................................... 50
Глава 3
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РОДОПСИНА С ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИМИ БЕЛКАМИ (ТРАНСДУЦИНОМ И АРЕСТИНОМ) В ФОТОРЕ-ЦЕПОТОРНОЙ КЛЕТКЕ.............................. 82
Глава 4
НУКЛЕОТИДРЕГУЛИРУЕМЫЕ КАНАЛЫ СЕНСОРНЫХ КЛЕТОК........................................... 116
Глава 5
ОКСИД АЗОТА В НАРУЖНОМ СИНАПТИЧЕСКОМ СЛОЕ СЕТЧАТКИ ПОЗВОНОЧНЫХ............................. 159
Глава 6
РЕГУЛЯЦИЯ pH В ЗРИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКЕ И ЕЕ РОЛЬ В МЕХА-
НИЗМАХ ФОТОТРАНСДУКЦИИ........................ 177
Глава 7
ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ЦИТОСКЕЛЕТА В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ФОТОРЕЦЕПТОРНЫХ КЛЕТОК СЕТЧАТКИ........... 216
Глава 8
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ S-АНТИГЕН А (АРЕСТИНА) ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЛАЗНЫХ ПАТОЛОГИЙ....................... 220
Глава 9
МЕХАНИЗМЫ ФОТОПОВРЕЖДЕНИЯ СЕТЧАТКИ И ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ И СИСТЕМЫ ЗАЩИТЫ ОТ ОПАСНОСТИ ТА-
КОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ.............................. 234
ЛИТЕРАТУРА................................... 248
CONTENTS
INTRODUCTION............................................. 3
Chapter 1
PHYSIOLOGY OF THE VISUAL RECEPTION....................... 6
Chapter 2
THE GENERATION OF PHOTOPOTENTIAL ON THE PHOTORECEPTOR DISC................................................ 50
Chapter 3
INTERACTION OF RHODOPSIN AND PROTEINS OF THE PHOTORECEPTOR CELL CYTOPLASM (TRANSDUCIN AND ARRESTIN)............ 82
Chapter 4
CYCLIC NUCLEOTIDE-GATED CHANNELS IN THE SENSORY CELLS.... 116
Chapter 5
NO IN THE OUTER SYNAPTIC LAYER OF THE VERTEBRATES RETINA................................................... 159
Chapter 6
pH REGULATION IN THE VISUAL CELLS AND ITS ROLE IN THE PHOTOTRANSDUCTION MECHANISMS................................ 177
Chapter 7
THE ROLE OF THE CYTOSKELETON IN THE PHOTORECEPTOR CELLS FUNCTION............................................... 216
Chapter 8
THE USE OF S-ANTIGENE FROM THE RETINA FOR THE DIAGNOSTICS OF THE EYE PATHOLOGY................................... 220
Chapter 9
THE LIGHT DAMAGE OF THE EYE RETINA AND THE PIGMENT EPITHELIUM AND THE SYSTEM OF THE PROTECTION AGAINST THE
LIGHT DAMAGE........................................... 234
LITERATURE............................................ 248
Научное издание
Каламкаров Григорий Рафаэлевич Островский Михаил Аркадьевич
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЗРИТЕЛЬНОЙ РЕЦЕПЦИИ
Утверждено к печати Ученым советом Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук
Зав. редакцией Н.А. Степанова
Редактор А.М. Гидалевич Художник Е.А. Быкова Художественный редактор В.Ю. Яковлев Технический редактор Т.В. Жмелькова Корректоры Г.В. Дубовицкая, Т.И. Шаповалова
ЛР № 020297 от 23.06.1997
Подписано к печати 18.07.02, Формат 60 х 9О'/]б Гарнитура Таймс. Печать офсетная
Усл.печл. 17,5. Усл.кр.-отт. 18,0. Уч.-изд.л. 20,7 Тираж 400 экз. Тип. зак. 3601
Издательство “Наука” 117997 ГСП-7, Москва В-485, Профсоюзная ул., 90
E-mail: secret@naukaran.ru Internet: www.naukaran.ru
Санкт-Петербургская типография “Наука” 199034, Санкт-Петербург В-34, 9-я линия, 12
Каламкаров Григорий Рафаэлевич
Доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник Института биохимической физики им Н.М. Эмануэля РАН.
Основное направление научной деятельности механизмы сенсорной трансдукции. Им исследованы молекулярные механизмы взаимодействия родопсина с периферическими белками в зрительной клетке, обнаружены
ионные каналы, регулируемые циклическими нуклеотидами в слуховых клетках Обнаружен и исследован механизм регуляции pH в зрительных клетках позвоночных.
Совместно с МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца разработан и внедрен в широкую клиническую практику новый иммунологический метод ранней диагностики заболеваний сетчатки глаза
Островский Михаил Аркадьевич
Действительный член Российской академии наук заведующий лабораторией Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, профессор МГУ.
Основное направление научной деятельности - сенсорная физиология - физиология и патология зрения. При исследовании молекулярных механизмов фоторецепции им была
обнаружена связь между обесцвечиванием родопсина и ферментативными реакциями; пока ,ано изменение конформации
модопсина на ключевой стадии его фотолиза, получены важные
сведения о ферментативных, ионных и электрических процес
сах в зрительной клетке
М А Ос .ювским развито представление об уязвимости пу стур гл? >а к фотопоереждению и о взаимосвязанной эволюции фоти^цетгорной и фотопротектооной систем глаза
Ссвме- two с МНТК «Микрохирургия глаза» создано и внед-ренс в офтальмологическую практику новое поколение окрашенных схкусственных хрусталиков, обеспечивающих надежную защиту сетчатки от опасности повреждения.
<НАУКА»