/
Author: Петров В.И. Сергеев П.В. Шимановский Н.Л.
Tags: лекарственные средства в соответствии с их активным веществом биофизика, биохимия и физиология животных и человека биохимия физиология монография фармакология лекарственные средства
ISBN: 5-88928-001-1
Year: 1999
Text
П.В. Сергеев, Н.Л. Шимановский, В. И. Петров
РЕЦЕПТОРЫ физиологически активных веществ
Издание второе, переработанное и дополненное
Москва - Волгоград
1999
УДК 615.2/3.033 + 612.014.467:615.2/ .3
ББК 28.992.8
28.903
Р45
Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.Н.
Р45 Рецепторы физиологически активных веществ: Монография. — Волгоград: Издательство "Семь ветров”, 1999. — 640 с.
ISBN 5-88928-001-1
В монографии изложены теории фармакологичесюл! рецепции. Дан анализ рецепторных механизмов реализации биологической активности многих физиологически активных веществ. Подробно рассмотрены рецепторы как мишени действия лекарственных средств.
Книга предназначена для фармакологов, биохимиков, физиологов, эндокринологов и клиницистов.
ББК28.992.8
28.943
О Сергеев П.В., 1999.
О Шннаиовскнй Н.Л., 1999.
С Петро* В.И., 1999.
28-001-1
ПРЕДИСЛОВИЕ К ПЕРВОМУ ИЗДАНИЮ
Учение о рецепторах стало в последнее время одним из важнейших разделов молекулярной биологии. Оно играет исключительно важную роль в изучении процессов жизнедеятельности, в понимании механизмов гомеостаза и патогенеза различных заболеваний. Особешю важное значение имеет учение о рецепторах для фармакологии, для объяснения механизмов действия эндогенных и экзогенных физиологически активных веществ, различных лекарственных средств, для направленного поиска новых лекарственных веществ.
В последние годы учение о рецепторах обогатилось новыми фундаментальными данными, получены важные сведения о природе рецепторов и их функциональной активности, об их взаимодействиях с эндогенными и экзогенными лигандами, обнаружен ряд новых рецепторов (опиатные, бензодиазепиновые, ГАМК-ер-ГИческие, рецепторы гормонов и др.), выявлено наличие рядасуб-ПОиуляций холинергических, адренергических, дофаминергических, гистаминовых и других рецепторов.
Все это требует критического анализа и глубокого обобщения накопленного материала, предвидения дальнейших путей развития рецепторологии.
Предлагаемая книга является фундаментальным трудом, в котором впервые в отечествешюй литературе на современном уровне освещены наиболее актуальные проблемы учения о рецепторах. Авторы на протяжении многих лет занимаются исследованием молекулярных механизмов действия различных физиологически активных веществ, особенно гормональных. Им Принадлежит ряд публикаций но проблемам молекулярной фармакологии и рецепторных механизмов действия лекарственных веществ. Естественным поэтому является их обращение к Одному из центральных вопросов молекулярной фармакологии и биологии— проблеме рецепции.
Книга знакомит читателя как с общими вопросами учения о рецепторах (теории рецепции, математический аппарат описания кинетики взаимодействия лигандов с рецепторами, методы изучения рецепторов), так и со структурно-функциональными особенностями отдельных видов рецепторов (химическая структура лигандов, молекулярные механизмы их взаимодействия с рецепторами, биохимическая характеристика разных рецепторов, классификация, топография, молекулярные механизмы преобразо-
3
ваиия рецепторами сигнала взаимодействия с лигандами в биологический ответ клетки и системы и др.). Специальные главы посвящены ацетилхолиновым рецепторам, адренорецепторам, дофаминовым, гистаминовым, серотониновым, ГАМК-рецепторам, пуриновым рецепторам, рецепторам белково-пентидных и стероидных гормонов и др. Рассмотрена проблема онтогенеза и филогенеза рецепторов. Наряду с данными о рецепторах для наиболее изученных эндогенных физиологически активных соединений представлена также информация о ряде экзогенных низкомолекулярных соединений, обладающих высокой биологической активностью и широко применяемых в качестве лекарственных средств, в том числе трициклических антидепрессантов, бензоди азепинов и др. Авторами приведена подробная характеристика всех этих и других рецепторов, подробно анализируются вопросы, связанные с разными особенностями их структуры, локализации, функции. Материал в целом носит многогранный междисциплинарный характер, что делает книгу весьма полезной не только для фармакологов, но и для биологов и медиков разных специальностей.
По постановке вопроса, методологическим подходам, полноте освещения книга является уникальной. Опа не только характеризует состояние проблемы, по и намечает новые перспективы развития рецепторологии. В монографии анализируется в том числе возможность использования имеющейся информации о ли-гавд-рецентор-эффекторных взаимоотношениях для совершенствования фармакотерапии. В этом смысле опа представляет также интерес для практической медицины.
Книга является ценным вкладом в литературу ио наиболее актуальным проблемам современной биологии и медицины.
Академик АМН СССР М, Д. МАШКОВСКИЙ
ВВЕДЕНИЕ К ПЕРВОМУ ИЗДАНИЮ
|'еория рецепторов физиологически активных веществ, воз-пик-в конце XIX — начале XX веков при попытках выяснить шия гистиотропизма, паразитотропизма и органотропизма(Р. lich), приобретает в настоящее время в фармакологии все боль-значение. Мы убеждаемся в правильности высказывания В. Скворцова (1948): “Понятие о специфическом рецепторе вполне гожпо связать с теориями о действии лекарственных веществ", сте с тем рецепторную теорию нельзя считать прерогативой >ко фармакологии; она имеет исключительное значение для щтия всех дисциплин медико-биологического профиля. Благо-1 созданию и использованию большого арсенала физико-хими-3ix методов удалось выяснить,что является материальным суб-"Игратом многих видов рецепторов, и приблизиться к пониманию Кинических принципов их функционирования.
Учение о рецепторах физиологически активных веществ представляется нам составной частью теории гомеостаза Клода Бер-liapa и Уолтера Кениона. Рассматривая механизмы автоматиче-i g&pro поддержания постоянства внутренней среды организма,уче-‘ 11Ые пришли к заключению, что для них необходимо существова-11Ые безупречно действующей сигнализации, информирующей цеп-таальные и периферические регуляторные органы о любых изме-'Ц^ниях, угрожающих гомеостазу, а также корригирующих устройств, которые своевременно вступают в действие и задерживает наступление этих изменений.
На страницах данной книги неоднократно будет продемонстрировано, что в качестве материализаторов этой сигнализации ЙЬжно рассматривать рецепторы физиологически активных веществ, которые, по словам В. М. Бехтерева (1928), “являются не ЮЛько трансформаторами, по и первичными анализаторами впеш-)ЩХ воздействий и в то же время их комбинаторами". Рецепция, обеспечивающая восприятие и передачу информации клетке для ^юрмирования адекватной ответной реакции при воздействии Какого-либо химического сигнала, является одним из важнейших гомеостатических механизмов на клеточном и субклеточном уровне, имеющем несомненное значение для организма в Целом.
В настоящее время можно утверждать, что сформировалась Новая наука — рецепторология, область исследований которой 1чрезвычайно широка. Эта паука изучает рецепторы химических
5
передатчиков, таких как нейромедиаторы, гормоны, аллостерические активаторы и инактиваторы ферментов, факторы, инициирующие процессы репрессии и деренрессии па уровне генома, иммунорецепторы, механизмы рецептор-эффекторпого сопряжения и др. Иными словами,.все молекулярные механизмы, обеспечивающие получение и обмен информации, меж- и внутриклеточную коммуникацию и интеграцию.
Предлагаемая читателю книга посвящена анализу имеющихся многочисленных сведений о строении и функции рецепторов для большинства из известных в настоящее время физиологически активных веществ — катехоламинов, ацетилхолина, гистамина, серотонина, гормонов, нейропентидов и др. Несмотря па большой объем материалов но указанным вопросам, мы не встретили работ, в которых бы в едином ключе была рассмотрена биохимическая фармакология рецепторов различных классов,что необходимо для создания обобщенной концепции регуляторных механизмов функций клетки.
Специальная глава в книге посвящена проблемам онтогенеза и филогенеза рецепторов физиологически активных веществ.
Учение о рецепторах можно разделить па две части. Предметом первой из них — общей — является изучение методологических и методических подходов к изучению рецепторов физиологически активных веществ и общих принципов “работы” рецепторов. Во второй — частной—приведены сведения о фармакологических, биохимических и биофизических характеристиках каждого вида рецепторов. Поэтому считаем логичным рассмотреть вначале общие, а затем частные вопросы рецепторологии.
В каждой главе монографии особое внимание уделено рассмотрению рецепторов как молекул — мишеней лекарственных веществ (ЛВ). По нашему мнению, эти данные помогут не только научно объяснить механизмы действия многих ЛВ, но и наметить пути создания новых соединений с улучшенными терапевтическими свойствами.
ВВЕДЕНИЕ КО ВТОРОМУ ИЗДАНИЮ
Со времени написания первой книги “Рецепторы" прошло более 10 лет. За это время, как мы и предполагали, получены многочисленные новые данные как о структуре и функции уже известных рецепторах физиологически активных веществ, так и об их новых типах и подтипах. В первую очередь это обусловлено разработкой новых методов изучения рецепторов, в частности, метода генетической рекомбинации, позволяющего определить химическую структуру того или иного рецептора и его топографию в клетке. По сравнению с предыдущим изданием переработке подверглись практически все главы книги, а также добавлены новые материалы, в частности, глава “Рецепторы возбуждающих аминокислот", которые привлекают все большее внимание исследователей в связи с их важностью в развитии дегенеративных изменений в центральной нервной системе и перспективами в создании избирательных нейротропных лекарственных средств, мищепыо действия которых являются рецепторы возбуждающих аминокислот, для лечения ишемических заболеваний головного мозга.
Мы считаем своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность всем сотрудникам кафедры молекулярной фермако-Логии и радиобиологии медико-биологического факультета Российского государственного медицинского университета, в особенности Комогоровой Е. и Царевой О., за помощь в подготовке Книги к изданию, ведущему научному сотруднику Пухальской Т.Г., (г, Москва), совместно с которой написана глава "Серотониновые рецепторы" и сотруднику кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ Гуревичу К.К., совместно с которым написаны главы “Закономерности рецепторного действия лекарственных веществ в сверхмалых дозах" и “Опиоидные рецепторы”.
Выражаем признательность доктору биологических паук Пиотровскому Л. Б. (г. Санкт-Петербург) и доктору медицинских наук Григорьеву И. А. (г. Волгоград), участвовавшим в написании главы “Возбуждающие аминокислоты”.
7
Второе издание монографии «Рецепторы* существенно переработано и дополнено новыми данными о структурно-функциональных особенностях рецепторов физиологически активных веществ и способах их фармакологической регуляции. Включена глава о рецепторах возбуждающих аминокислот. Представлены новые принципы классификации рецепторов в соответствии с данными об их химической структуре, полученными с помощью методов молекулярной биологии. Механизм действия современных фармакологических веществ рассматривается па основе последних достижений в области рецепторологии, как междисциплинарной медико-биологической пауки.
Предназначена студентам, аспирантам, преподавателям высших медицинских учреждений и всем специалистам, работающим в области биохимической фармаколоиш.
ЧАСТЬ I
ОБЩИЕ ВОПРОСЫ РЕЦЕПТОРОЛОГИИ
Глава 1
Hi*---------------------------------------------
ПОНЯТИЕ РЕЦЕПЦИИ ЛВ
-г (История развития представлений ‘‘ о рецепции физиологически активных веществ)
Еще в глубокой древности учеными-медиками при анализе ос-1ЮВИЫХ механизмов адаптации живых существ к окружающей Среде было отмечено наличие у них специальных систем, воспринимающих внешние сигналы, что позволяет им адекватно реагиро-i вать на те или иные воздействия. Впоследствии с развитием физиологии эти системы стали называть органами чувств или рецепторами (от лат. receptio — восприятие).
Долгое время существовало убеждение в отсутствии органов к^вств внутри живых организмов. Только один факт, казалось, ШОДрывал эту уверенность. Это был депрессорный эффект, возникающий при раздражении дуги аорты и сопровождающийся Повышением давления крови в ней, эффект, открытый в середине прошлого века русским физиологом Иваном Фадеевичем Цио-Цом и немецким ученым К.Ludvig. Однако понадобилось более Волу века, чтобы почти одновременно и независимо друг от друга Юрфолог J. A.de Castro и физиолог К.Е.Hering обнаружили вто-ую рецепторную зону в сонной артерии. Открытие каротид-ЮГО синуса и вслед за ним каротидного клубочка вызвало к себе бромный интерес. Вскоре в физиологических и фармакологических лабораториях вплотную занялись поиском и изучением вггероре центе ров в различных системах. Чувствительность этих Ццепторов огромна и часто не уступает чувствительности Кстерореценторов. С помощью иптерорецепторов осуществ
9
ляется местная регуляция кровообращения в тканях, обмена веществ и в конечном счете постоянство внутренней среды организма [Кекчеев К.Х., 1946].
Параллельно с развитием физиологии интерореценторов в конце XIX, начале XX века возникла теория рецепторов ЛВ.
Изучая действие атропина и пилокарпина на секрецию слюны, никотина на сокращение скелетных мышц, J.N. Langley (1878, 1905) обнаружил, что фармакологический эффект имеет место только при аппликации ЛВ на участки клеточной поверхности с небольшой площадью, а кураре блокирует данный эффект никотина. В связи с этим он постулировал существование на этих клетках рецепторных субстанций (receptive substances), с которыми взаимодействуют ЛВ. В 1906 г. H.H.Dale применил эту концепцию для объяснения фармакологической активности алкалоидов спорыньи. Однако основоположником рецепторной теории действия ЛВ следует признать Р.Ehrlich, впервые предложившего термин «рецепторы». В результате анализа избирательности действия различных красителей и мышьяксодер-жащих соединений на живые клетки он сформулировал основной постулат: «corpora non agun nisi fixata» — «вещества не действуют, если не фиксируются». Данное обобщение стало теоретической базой химиотерапии (за развитие этой науки Р. Ehrlich получил Нобелевскую премию в 1908 г.).
P.Erhlich предполагал, что клетки содержат так называемые боковые ветви, или рецепторы, в результате селективного взаимодействия с которыми ЛВ индуцируют свой эффект. Согласно теории Эрлиха, низкомолекулярные лиганды, например ЛВ, имеют два структурных детерминанта, один из которых — ган-тофорвая область — соединяясь с рецептором, позволяет тем свмым другому детерминанту — эргофориой или токсофорной области — инициировать биологический ответ. Хотя детали этой концепции были пересмотрены и уточнены (в настоящее время эргофорный детерминант рассматривается не как лиганд, а как часть молекулы рецептора), многочисленные исследования подтвердили правильность теории Эрлиха о рецепторах как участках, селективно связывающих лекарства и опосредующих реализацию их фармакологических эффектов. В то же время следует отметить, что до 60-х годов XX века представления о рецепторах основывались па косвенных данных, получаемых при анализе действия ЛВ, а именно при таком впализе изучали зависимость величины биологического эффекта
10
лекарства от его структуры, дозы или концентрации в интактном организме и в условиях применения антагонистов и тем самым оценивали сродство ЛВ к тому или иному рецептору, хотя химическая природа рецептора и механизм его функционирования оставались неизвестными. Только с появлением физиологически активных веществ, меченных радиоактивными атомами, с развитием физико-химических методов структурного и количественного анализа макромолекул и метаболитов удалось в ряде случаев выяснить, что же представляют собой рецепторы и какую роль они играют в трансформации молекулярного сигнала в физиологический ответ клетки, ткани, органа. В настоящее время Можно утверждать, что теория Эрлиха обрела материальную основу.
Прежде чем подвергнуть анализу имеющиеся сведения о биохимической фармакологии тех или иных видов рецепторов физиологически активных соединений, мы считаем целесообразным рассмотреть общие вопросы реценторологии, являющиеся базой изучения рецепторов.
Глава 2
КИНЕТИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛВ С РЕЦЕПТОРОМ
Впервые попытку математически описать кинетику взаимодействия ЛВ с рецепторами, основываясь на данных фармакологического эксперимента (влияние ацетилхолина па мышечшяе клетки), предпринял A.J.Clark (1926). Он предположил, что существует прямо пропорциональная зависимость между частью рецепторов, связавшихся с веществом, и ответом ткани на это вещество (т.е. взаимодействие ЛВ с рецептором есть простая бимолекулярная реакция). Иными словами, при оккупации ЛВ 50% рецепторов развивается нолумаксимальный биологический эффект. В литературе теория Кларка известна как простая оккупационная теория. Однако оказалось, что некоторые вещества, хотя и Связываются с рецепторами (антагонисты), но не вызывают эффекта. Учитывая этот факт, E.J.Ariens усовершенствовал Концепцию, предложенную AJ.Clark, и создал сложную оккупа-Срюнную теорию. Обобщенные положения AJ.Clark и E.J.Ariens
11
носят в настоящее время название «классическая теория действия ЛВ» .
Для математического описания взаимодействия ЛВ(Л) с рецепторами (P)A.J.Clark использовал закон действия масс, предполагая, что ЛВ и рецепторы аналогичны субстратам и ферментам.
К,
[Л]+[Р]^[ЛР] •
к_,
При достижении равновесия справедливо следующее уравнение:
„ К., _ [л]-[Р]
д к, [лр]
где Кд — константа диссоциации, К, и К, — константы скоростей диссоциации и ассоциации соответственно.
Итак, можно заключить, что классическая теория основана на двух постулатах:
1. Величина фармакологического эффекта (Е) прямо пропорциональна концентрации комплексов ЛВ — рецептор (ЛР)
Е = а[ЛР]. (1)
2. Максимальный эффект имеет место при оккупации всех рецепторов, т.е. когда ЛР=ч;
Е = аг. (2)
махе t '
При объединении этих уравнений с учетом того, что общая концентрация ЛВ, обозначенная [Ло], равна [ЛР]+[Л], а r^tPJ+ЕЛР] и [ЛР] намного меньше [Ло], получается:
а[Л0] • rt Емдке[Л0] z о j
[л.]+к,"[л0]+кд
где Кд — константа диссоциации комплекса ЛР (более точ-
12
Рис. 1
Рис. 2
Рис. 1. Зависимость величины эффекта (Е) от концентрации лекарственного вещества (Л).
Рис. 2. График Хилла. Е
По оси ординат — величина log(p _ ё )>’ 170 оси абсцисс — величина log 1Л]; [Л] — концентрация лекарственного вещества; Е — величина эффекта лекарственного вещества. При отсутствии кооперативности п=1; при положительной кооперативности п-2, при отрицательной кооперативности п=0,5.
но Кд — это кажущаяся константа диссоциации, так как истинная концентрация комплексов ЛР неизвестна). Величина, обратная К1 (константа ассоциации), отражает сродство (аффинитет) ЛВ к рецептору. Согласно уравнению (3), зависимость ЛР или Е от дозы ЛВ описывается гиперболой (экспериментальные кривые доза—эффект во многих случаях имеют имешю такой вид) (рис. 1).
Другая возможность графического представления уравнения (3) — график Хилла (зависимость logE/E^—E) против от 1о£[Л]. В преобразованном виде уравнение имеет вид:
МЛо]-ИКд
. (4)
С помощью графика Хилла (рис.2) можно определить, взаимодействуют ли между собой рецепторы или пет. Тангенс угла наклона линии на этом графике равен величине п (количество взаимодействующих рецепторов).
Если и — i, значит взаимодействие ЛВ с рецептором не кооперативно, если и > 1, оно имеет положительную, a n < 1 — отрицательную кооперативность.
Константу пропорциональности а в уравнении (1) E.J.Ariens назвал внутренней активностью; величина этой константы отражает величину эффекта относительно количества комплексов
13
Рис. 3
Рис. 3. График Л айну и вера—Берка. п (
По оси ординат — — (обратная величина эффекта) (.EajpJ ; по оси абсцисс—J— (обратная 1&нцснтрацйя лекарственного вещества); 1 — в отсутствие антагониста; 2 — в присутствии конкурентного антагониста.
Рис. 4. График Скэтчарда.
По оси ординат — величина по оси абсцисс — величина Л; Е —
эффект лекарственного вещества; л—его концентрация; ЛР — концентрация
Рис. 4
комплекса лекарственного вещества с рецептором.
[ЛР]. Отсюда следует, что для того, чтобы вещество действовало на ткань, оно должно обладать как сродством к рецептору, так и внутренней активностью (иными словами,взаимодействовать с рецепторами эффективно).
Как видно из представленных уравнений, классическая теория действия ЛВ основывается на законе действия масс и описывается уравнениями, аналогичными описанию кинетики взаимодействия субстрата с ферментом, если продукт не образуется. Действительно, известное уравнение Михаэлиса — Ментен имеет
вид:
[ФС] =
[ф,][с] к.+(с]
(5)
где Ф — фермент, [С] — концентрация субстрата, [Фо] — общая концентрация фермента, [ФС] — концентрация фермеит-субстратиого комплекса, Ks — константа диссоциации фермент-субстратного комплекса (сходство уравнений (3) и (5) очевидно).
Следовательно, если рецептор функционирует аналогично ферменту, то классическая теория адекватно описывает лиганд-реценторные взаимоотношения.
Исходя из уравнения (3) и (рис.1), Кд количествешю равна Лм — концентрации, вызывающей полумаксимальиый эффект.
Данное уравнение математически описывает процесс насыщения, который также называют изотермой сорбции или изотер
14
мой Ленгмюра. Для удобства определения Кч можно использовать преобразование Лайнуивера — Берка (рис.З)
Кл 1 1
1/Е = ——. —+----------
17 С Е ЛЕ макс ыажс
или преобразование Скэтчарда (рис.4)
Е 1 Емакс
л“кд Кд
Заметим сразу, что эти преобразования (особенно Скэтчарда) нашли широчайшее применение в современных фармако-био-химнческих исследованиях при определении К1 взаимодействия ЛВ с рецептором (в экспериментах такого рода биохимическими методами определяют количество комплексов ЛВ —рецептор ЛР и общее количество рецепторов (Ро), которые, согласно уравнениям (1) и (2), пропорциональны Е и Ема1К соответственно). В данном случае уравнения Лайнуивера — Берка и Скэтчарда имеют вид:
_1___к, J_______1_.
[ЛР] [р.][л] [р.]’
[ЛР] [ЛР] [р„: [л] [к,] [к.
Методы количественного анализа подтипов рецепторов при использовании лигандов описаны P.B.Molinoff и соавт. (1981).
В биохимических экспериментах определяется истинная Кд, а в фармакологических экспериментах — кажущаяся Ка, которые могут совпадать, а могут на несколько порядков отличаться между собой.
Такое несоответствие следует из того, что максимальный эффект ЛВ часто наблюдается при оккупации лишь небольшой части рецепторов. Это привело к возникновению идеи свободных рецепторов и попыткам модификации классической теории. Дальнейшее развитие классическая теория получила в работах R.B.Stephenson (1956). Его концепция базируется па трех положениях:
15
1. Максимальный эффект, вызываемый агонистами, имеет место при оккупации лишь части рецепторов.
2. Величина эффекта есть некая неизвестная функция числа занятых рецепторов; она прямо не пропорциональна числу занятых рецепторов, как следует из классической теории.
3. Образование лиганд- рецепторного комплекса приводит к возникновению стимула S; величина этого стимула прямо пропорциональна количеству оккупированных рецепторов (Y); S = EY-Коэффициент е по теории Стефенсона есть эффективность. В таком случае эффект Е будет неизвестной функцией стимула:
E = f(S):
[ЛР]_ [Л] rt [Л] + Кд
Таким образом, R.B.Stephenson выделил линейную дозозавйси-мую часть S = eY 11 неизвестную, возможно, нелинейную, дозоиезависимую часть E=f(S). Следствием этой теории является то, что из кривых доза—ответ нельзя непосредственно определить величину Кд как Лм, если £ # а. Согласно теории Стефенсона, для сильных агонистов эффективность очень велика, хотя величина Y мала. В отличие от внутренней активности, которая связывает величину эффекта с оккупацией рецепторов, эффективность связывает величину стимула с оккупацией рецепторов. Поэтому ЛВ с разной эффективностью вызывают различные стимулы, по связь между стимулом и эффектом есть свойство ткани, а не ЛВ (по теории Стефенсона).
Вещество с низкой эффективностью может индуцировать ответ, который может быть меньше максимально возможного ответа ткани даже при оккупации всех рецепторов. Такие вещества называются частичными антагонистами. Они взаимодействуют с теми же рецепторами, что и полные агонисты, и вследствие конкуренции за связывание с рецептором уменьшают эффект чистых агонистов, т.е. частичные агонисты обладают свойст-вами как агонистов, так и антагонистов. Однако нельзя не сказать, что данная теория не отвергает возможности для некоторых агонистов вызывать максимальный эффект при оккупации только всех рецепторов (граничное условие, когда понятия агонистов и частичных агонистов тождественны). R.B. Stephenson предложил счи
16
тать величину стимула S=1, когда Е=Емпкс/2.Так как s = gY > то для ЛВ А с эффективностью Еа и константой диссоциации Кщ
еаЛа .
Ла + Кда ’
в случае S=1 и получаем:
_ Дм) Кда .
а Д50
Величину Л^ можно определить непосредствешю из зависимости доза—ответ, Ки можно найти разными способами (будут описаны ниже). В случае сильных агонистов Л^ « Kw
Кд. е - — • а
Один из способов определения Кч заключается в использовании конкурентного антагониста и кинетических уравнений, предполагая, что рецептор ц антагонист взаимодействуют между собой аналогично ферменту с субстратом:
Д+Р ДР ;
Лв+Р ДР
Общую популяцию рецепторов обозначили г . В данный момент времени t число комплексов ЛаР — X, а комплексов ЛвР — Y. В соответствии с законом действия масс имеем:
^ = K,.(r,-X-Y)-K„X ;
^ = K„(r,-X-Y)-K„Y •
13aicJ27
17
При равновесии
dx/dt = dy/dt = О
A (rt — X - Y) = КХ; В <rt - X - Y) = K^Y,
где Кда»Ки /К)ан Кда=К1ш /К„.
Отсюда:
В(г.-Х) в+к„
(6)
При отсутствии антагониста В=0 уравнение (6) имеет вид:
да
и
а
Х =
Следовательно, в присутствии В для получения той же величины X концентрация Ла должна быть увеличена до значения Л’а.
и
(7)
Из уравнения (7) можно рассчитать К н.
На практике Кдв рассчитывают не для одной, а для нескольких (п) концентраций антагониста. Имея значения Лп/Ла' при различных концентрациях В, строят график зависимости 1ой(Лл/ Ла’ — 1) от log В (график Шилда) (рис.5). Кривая па оси абсцисс отсекает величину log Кдн [Arunlakshana О., Schild Н.О., 1959]. Отрицательный логарифм обозначают рА^
рА, = -log Кд, .
18
Рис. 5. График Шилда.
По оси абсцисс — отрицательный логарифм концентрации антагониста В: по осн ординат—логарифм Ло’/Ла— 1, где Л’ — концентрация агониста в присутствии антагониста, при которой он
вызывает такой же эффект, как и при t
концентрации Ла в отсутствие антагониста.
Как пример ценности такого подхода, можно привести исследования R.F.Furchgott (1967), в которых ои определил величины рА2 для р-аптагописта пронеталола на аорте и подвздошной кишке кролика (7,5 и 6,4 соответственно). R.F.Furchgott удалось впервые количественно доказать существование двух видов [J-адрепореценторов.
Отметим, что па практике график Шилда не всегда имеет прямой вид, что бывает связано, как, например, в случае антагонизма пропранолола с изопротеренолом на препарате изолированного отрезка морской свинки с активным экстраиейро-иальпым поглощением изопротеренола [Furchgott R.F., 1978]. Следует указать, что описанный подход дает возможность находить константу диссоциации (ее кажущуюся величину) независимо от того, существует или нет прямо пропорциональная зависимость между эффектом Е и количеством агонист-рецепторных комплексов X. Однако, если такая пропорциональность имеет место (для агонистов это бывает только в узком диапазоне концентраций), то можно пользоваться двойными обратными координатами Лайнуивера —Берка, применяя урав-лешге:
Тогда из графика можно определить значения и (рис .6).
Для определения К1 для агонистов R.F.Furchgott и P.Bursztyn (1967) предложили использовать метод частичного необратимого блокирования рецепторов. При этом имеет место уравнение: / Л
(8)
19
Рис. 6. Зависимость эффекта (Е) от концентрации агониста (Лл) в двойных обратных координатах.
Прямая 1 — в отсутствие агониста; прямая 2 — агонист в присутствии антагониста (Лв). В присутствии антагониста наклон кривой увеличивается; увеличение наклона кривой определяется фактором (1+Л /К,,).
Рис. 7. График определения К, взаимодействия агониста с рецептором методом частичного необратимого блокирования рецептора.
По оси ординат — обратная концентрация агониста (Л₽); по оси абсцисс — обратная концентрация агониста (Лв’), при которой в присутствии антагониста он вызывает такой же эффект, как и при его концентрации (Лв) в отсутствие антагониста.
где q-фракция оставшихся свободных рецепторов. Поэтому из графика зависимости 1/Л^ от 1 /Л.т’ (рис.7) можно определить величину следующим образом:
к tee-1
Отрезок, отсекаемый на оси ординат
Данный метод с успехом был применен для определения Кда для агонистов и адренорецепторов, и холшюреценторов [Tallarida R.J., 1979].
Как указывает A.Gero (1978), с помощью этого метода, зная Кд, можно найти величину эффективности по уравнению:
£ = 1 + 1/ К Л , дй а
а затем величину стимула
s=_______й_______
1+1/К.Л.
Такой подход дает возможность эмпирически оценить взаимоотношения между стимулом и эффектом. A.Gero (1978) рассчитал, что для данных R.F.Furchgott и P.Burnsztyn как стимул, так и эффект пропорциональны оккупации рецепторов в случае М-холинергических веществ.
20
Рис. 8. График определения Кд для частичного агониста Р.
По оси ординат — обратная концентрация чистого агониста (Лд);
по оси абсцисс — обратная концентрация частичного агониста, при которой он вызывает такой же эффект, как н чистый агонпст.
Другой метод определения Кд для агонистов, который не требует необратимого блокирования рецепторов антагонистами, был предложен R.В.Barlow и соавт. (1967) и D.R.Wand (1969).
Метод заключается в следующем: строят кривые доза — ответ для частичного и полного агонистов, затем, определив концентрации агониста (Ла) и частичного агониста (Лр), при которых они вызывают одинаковые эффекты, строят график зависимости 1 /Лп от 1 /Лр. Величину Кд для частичного агониста находят как отношение тангенса угла наклона прямой к отрезку, отсекаемому на оси ординат (рис.8).
tga
К =
д Отрезок, отсекаемый па оси ординат
(9)
Математический вывод такого способа определения Кд приведен в работе R.J.Tallarida (1979).
Следует также заметить, поскольку Км н Кдр связаны между собой уравнением:
_к.(лр-л.,)-лр, " (л.р+кД-л^
то, зная К , можно найти К . г ла’ лл
Кроме того, существуют другие способы определения Кд1 называемые методами возмущения, или релаксационными методами, широко применяемыми в химии [Faller L., 1969] и в ряде случаев адаптированные к фармакологическим системам [Tallarida R.J. et al., 1970]. Хотя найденные в некоторых работах Кд для агонистов [Tallarida R.J. et al., 1975] совпадают со значениями Кд, определяемыми методами необратимого блокирования рецепторов [Tallarida R. et al., 1979], его нельзя часто использовать в связи с трудностями поиска соответствующего возбуждаю
21
щего стимула, после воздействия которого можно определить время релаксации (в случае норадреналина таким возбуждающим стимулом являются ультрафиолетовые лучи, вызывающие расслабление изолированного отрезка аорты кролика и нарушающие взаимодействие агониста с рецептором).
Для сравнения величины К какого-либо ЛВ, определяемой фармакологическими методами и с помощью радиолигандной методики, пользуются следующим подходом.
•Радиолиганд А с константой диссоциации Кда используется в концентрации А намного меньшей, чем К^. Как следует из уравнения (3), фракция лиганда, связанного с рецептором, определяется величиной А/(А+КЩ). При определении константы диссоциации немеченого лиганда В, имеющего сродство к тем же связывающим участкам, что и радиолигаид, т.е. конкурентного антагониста по отношению к лиганду А, следует воспользоваться уравнением (6), из которого вытекает, что связанная фракция радиолиганда уменьшается на величину:
А
А + К_(1 + В/К,) '
где В — концентрация немеченого ЛВ.
При концентрации В, связывание А при которой уменьшается на 50%, можно зашшать:
А 1 А
А + К„(1+В/К„) 2 А + К„
(B/K„-1> = A/K„.
Если А намного меньше К^, то правая часть последнего уравнения равна 0 и В равняется К^. Следовательно, эта концентрация В, обозначаемая С^, численно равна К1 для немеченого ЛВ, являющегося конкурентом.
В эксперименте используют немеченое ЛВ, уменьшающее связывание радиолигапда с рецептором. Если концентрация радиолиганда меньше значения его собственной Kv то константа диссоциации для немеченого ЛВ будет равна его концентрации, при которой связывание радиолигапда уменьшается па 50%.
С помощью этого подхода R.F. Furchgott (1978) выявил корреляцию между величинами Кд, определяемыми фармако
22
логическим и радиолигапдпым методами для лигандов М-холино-реценторов и а-адрепореценторов.
Классическую теорию действия ЛВ развивали многие авторы, среди которых можно отметить D.Culguhuon (1973), A.De Lean и соавт. (1979), А.С.V.Burgend981), A.Rescigno и соавт. (1982), A.Gero (1983). Однако, но нашему мнению, наибольшее значение имеют работы A.T.Karlin (1967) и W.D.Paton (1961), основные положения которых получили названия аллостерической и скоростной теории соответственно.
Суть аллостерической теории состоит в постулировании существования рецепторов в двух конформационных состояниях, называемых Р и Т [Karlin A.J., 1967]. P-форма соответствует активному состоянию, аТ-форма — неактивному. При отсутствии ЛВ эти формы находятся в состояшш равновесия
Т #R
и при равновесии отношение T/R=L, где L — аллостерическая константа. Взаимодействие ЛВ с рецептором, находящимся в этом состоянии, можно записать следующим образом:
Л + Т <3 ЛТ
К„ ЛТ
КЛЙ
Л + R ё» ЛИ
При этом ЛВ в соответствии со сродством к R или Т являются агонистами или антагонистами. По нашему мнению, такое предположение оправдано, поскольку рецепторы как белковые структуры должны иметь динамическую водно-белковую матрицу (движение боковых белковых цепей происходит со временем корреляции 10й — 10 to с) [Лихтенштейн Г.И., 1974], т.е. какое-то время рецептор находится в конформации, комплементарной агонисту, а в другой промежуток времени — антагонисту. При связывании агонисты и антагонисты «фиксируют» эти конформации (при этом по аллостерическому механизму изменяется вся конформация рецептора по аналогии с известными трапсглобулярпыми эффектами в структуре ферментов).
Согласно аллостерической теории, эффективность Стефенсона определяется относительным сродством агониста к R- и Т-формам: у.
23
Для антагонистов эффективность будет определяться ио уравнению:
е . в К
н
В соответствии с этим Кд, определяемые для частичных агонистов по уравнению (9) и для конкурентного антагониста по уравнению (7), по аллостерической и оккупационной теориям одинаковы. В то же время при определении Кд методом необратимой инактивации рецепторов данные модели дают различные величины К . Согласно оккупационной модели в уравнении (8) К заменяется К : дл лт
1 1-д 1 A“q А' + q К,
Согласно аллостерической модели это уравнение неверно и справедливо следующее:
1JJ l-q[~ 1 1
Л q Л q -Kjy
Следовательно, К , определяемая методом частичного необратимого блокирования, есть не К^, а [К1Т' + (K^L)1]1. Таким образом, аллостерическая теория дает возможность оцепить правильность определения Кд разными способами.
Если ЛВ является слабым агонистом, то оно может быть использовано в качестве антагониста по отношению к полному агонисту. Для частичного агониста К может быть определена, исходя из уравнения (9). При этом аллостерическая теория предсказывает, что данная К отражает сродство этого частичного агониста к Т-форме.
Если это же ЛВ используется как агонист и его агонистическое действие сравнивается с действием чистого агониста, его Кдопределяется по уравнению (9), т.е. аллостерическая теория предсказывает, что Кд определена для Т-формы.
В то же время при использовании метода частичного необратимого блокирования, исходя из аллостерической теории, следует, что определяется не Клт, а (1/К^ + 1/(K4R-L) ’, величина которой меньше.
Оригинальную теорию рецепции предложил профессор
24
Оксфордского университета W.D.Paton (1961). Он считает, что величина эффекта ЛВ определяется скоростью ассоциации ЛВ с рецептором. Реакция
К+1
Л + Р^ЛР К| характеризуется специфическими константами скоростей К , й К+|. Свойства ЛВ зависят от константы скорости ассоциации К+1 и константы скорости диссоциации К,,. Если К, велика, то ЛВ является сильным агонистом, если имеет промежуточное значение — частичным агонистом и, наконец, если мала — антагонистом. Следовательно, согласно теории Пейтона, антагонистом является вещество, которое образует долгоживущий комплекс с рецептором, а агонистом — короткоживущий комплекс. Теория объясняет наличие постоянного эффекта антагонистов и снижение ответа ткани при воздействии агонистов.
В соответствии с кинетическими уравнениями для простой бимолекулярной реакции скорость ассоциации ЛВ в концентрации А с рецептором есть величина К+)А (rt —X), где X — фракция занятого рецептора. Так как при равновесии скорость ассоциации К+1 (rt —X) равна скорости диссоциации К ,Х и так как Х=г А/СА+К, /К+]), скорость ассоциации V^. определяется уравнением:
у _ К-1 ‘ ri ~А
асс А + Ки/К+1
Ответ ткани Е в таком случае прямо пропорционален скорости ассоциации с константой пропорциональности Ф (одинаковой для всех ЛВ). Таким образом, по теории Пейтона равновесный эффект Е определяется уравнением
Е= ФК-| :гуА_ , do)
А + / К+1
Как видно, существует формальное сходство между уравнением (10) и уравнением (3) классической оккупационной теории. Согласно последней, различные ЛВ имеют неодинаковую константу а, а согласно уравнению (10) различные ЛВ имеют разную константу . Отношение K j /К+1=К , а К количественно равна концентрации агониста, при которой
25
он вызывает эффект, равный Е^/2 (такое же соотношение дает оккупационная теория).
Характерной чертой ^теории скорости» является то, что при использовании констант К+1 и К., отпадает необходимость вводить третью, независимую от природы ЛВ константу, такую как а. Эта теория объясняет различия в скорости действия между агонистами и антагонистами.
По нашему мнению, теория Пейтона может быть с успехом применена к веществам нейромедиаторного типа действия, эффекты которых связаны с изменением проницаемости плазматических мембран для ионов и в том случае, когда агонисты и антагонисты взаимодействуют с одними и теми же участками связывания (т.е. в случае прямом конкуренции между агонистами и антагонистами). Однако мы не можем считать, что другого механизма блокирования антагонистом действия агонистов быть не может, так как из теории ферментативного катализа (напомним, что все рассматриваемые теории основываются на предположении, что рецепторы по своим связывающим и феноменологическим характеристикам аналогичны ферментам) конкуренция между субстратом и ферментом может идти но неконкурентному и бесконкурентному механизму. Иными словами, антагонист может взаимодействовать с участками, отличными от участков связывания агонистов, и аллостерически изменять их структуру, а, следовательно, и эффект. В таком случае, по-видимому, ближе к истине аллостерическая теория. Поэтому антагонист не обязательно должен иметь низкую величину К t (понятно, если антагонист взаимодействует с аллостерическим участком, то неважно, как долго он с ним связан). Важно, чтобы его концентрация была достаточно высока, и он индуцировал такое изменение конформации рецептора, при котором рецептор не может взаимодействовать с агонистом. Кроме того, теоретически можно предполагать, что если эффект ЛВ связан с изменением какого-либо метаболического процесса, продолжительность которого исчисляется часами или минутами (например, стероидные или белково-лептидные гормоны), то для агонистов также характерны низкие значения К, [Jones T.R., Bell Ph. А., 1982].
В дополните к изложенному необходимо добавить, что один из основных постулатов классической оккупационной теории и ее модификаций — лигапд-реценторпые взаимоотношения есть простая бимолекулярная реакция — не всегда обоснован. Несомненно, что современные представления о взаимодейст-
26
Рис. 9. Схематическое изображение взаимодействия двухвалентного лиганда с двумя субучастками рецептора [De Lean A. ct al,, 1979.],
Микроскопические равновесные константы Lp относятся к каждой индивидуальной реакции. Пулы в каждом горизонтальном ряду, связывающие одинаковое число лигандов, сгруппированы в пулы класса Ср
вии ЛВ с рецепторами должны учитывать тот факт, что практически все ЛВ — поливалентные соединения и для каждой части молекулы лиганда существует комплементарный участок рецептора, т.е. следует рассматривать рецептор как «мультисубучаст-ковую» макромолекулу. В этом плане интересна работа A.De Lean и соавт.(1979), в которой авторы предложили теорию связывания гибких по ливалентных лигандов с рецепторами. Основные положения этой теории следующие:
1. Субучасток представляет собой функциональную часть рецептора, способную взаимодействовать с лигандом. Рецепторная область состоит из нескольких таких субучастков. Лиганд содержит специфические функциональные области или группы, которые «узнаются» соответствующими специфическими субучастками рецепторной области на поверхности клеток. В общем случае эти функциональные области отличаются между собой (исключение составляют иммуноглобулины).
2. Взаимодействие функциональных сегментов лиганда с соответствующими субучастками должно происходить одновременно (это справедливо также для взаимодействия жестких молекул по типу ключ-замок). В большинстве случаев лиганд обладает гибкостью и может находиться в нескольких конформациях как в свободном, так и в связанном состоянии. В свою очередь рецепторная область также обладает гибкостью и характеризуется изменением конформации при ( связывании жесткого лиганда.
3. Величина ответа па ЛВ не определяется оккупацией всех
27
рецепторов, а зависит от концентрации активных рецепторов, спо* собных стимулировать эффектор.
4, Вследствие гибкости лигандов с одним и тем же рецептором могут связываться несколько веществ. При высокой концентрации лигандов каждый из них мешает полностью связаться с рецептором и тем самым вызвать активацию эффекторной системы. В качестве примера можно привести множественную оккупацию a-бунгаротоксином очищенных холинорецешоров [Maelicke A. et al., 1977].
5. Несмотря на то, что истинное число физико-химических взаимодействий (число контактов) лиганда с рецептором может быть довольно велико, только небольшое количество функциональных областей имеет определяющее значение в комплексообразовании. Функциональные области лиганда отличаются по способности связываться с соответствующими субучастками рецептора (рис.9). Каждый этап взаимодействия между связывающими пулами характеризуется микроскопической равновесной константой L.. Связывающие пулы Р} можно разделить на классы С! в соответствии с числом лигандов, связанных с рецепторной областью. На рис.9 Cf состоит из трех пулов, включая активный Р3. Равновесная концентрация пулов О-хо класса определяется микроскопической стехиометрической константой Kit которая в свою очередь определяется константами микроскопических реакций Ц. Экспериментально можно определить только общее число связавшегося лиганда и активного пула(ов). Это ограничение связало с тем, что микроскопические константы L. экспериментально не определяются. Однако из экспериментальных данных можно найти величину макроскопических констант К. Формулы расчета этих параметров даны A. De Lean н соавт. (1979).
Когда число субучастков равно 1, рецепторы представляют собой гомогенную систему, подчиняющуюся закону действия масс. При этом существует только один связывающий пул (активный пул). Данная простая модель не способна объяснить феномен конкурентного антагонизма и существование частичных агонистов.
При наличии двух субучастков у рецептора (см. рис.9) концентрация каждого пула Р есть функция концентрации свободных рецепторов Е и концентрации свободного лиганда F:
Р, = L-E-F Р3 = L.L..-E-F
p2 = l2-e-f p4 = l,l4.e.f
28
a
Рис. Ю. Изотермы связывания лиганда при наличии у рецептора двух субучастков [De Lean A. et al., 1979].
Общая концентрация рецепторов I? равна I. Макроскопические стехиометрические константы 1<ь определяются по уравнениям 11, 12. Когда равна 0, пул класса С2 нс оккупирован и вследствие стеричсских препятствий отсутствует множественная оккупация рецепторов. При увеличении значение сродства лиганда к рецептору повышается и кривая сдвигается влево. По оси абсцисс — log общей концентрация лиганда в молях; по осн ординат— log связанной концентрации лиганда в молях.
Связывающие пулы разделяют па три класса, содержащие О, 1 или 2 лигацда.
Типичные примеры изотерм связывания, представленные па рис. 10, соответствуют случаю, когда Со = Ро.
С, = Р+Р2+Р =К,ЕТ
С2=Р4 = К2Е.Р,
где макроскопические стехиометрические константы К,, представляют собой комбинации констант L
К, = ; (И)
= . (12)
Когда активен только иул Р3, концентрация активного пула А и его стехиометрическая константа выражаются уравнениями:
А = Р. = К -E F, ка = цц, а общая концентрация связанного лиганда В
В = С,+ 2С2 .
Если только одна молекула способна связаться с рецепторной областью, то класс С2 будет свободным и К,= 0. В таком случае только пул класса С; принимает участие в связывании лигандов. Максимальное связывание В равно Р — общей концентрации рецепторов. Если имеется возможность двум лигандам связаться одновременно с одной рецепторной обла-
29
Рис. if. График Скэтчарда результатов, представленных парис. 10. При неполном предотвращении множественной оккупации рецепторов равна 0,01 или 0,1 и кривая изогнута вниз. При Кг равной 1, наблюдается орева-лирование множественной оккупации и кривая изогнута вверх. Если К3 равна 0, имеет место линейный график Скэтчарда; по оси абсцисс — log концентрации связанного лиганда; по оси ординат — отношение концентрации связанного лиганда к концентрации свободного лиганда.
стыо, то для рецепторов класса С2К,>0 и изотерма связывания (рис.10) имеет два компонента (при этом общая связывающая емкость равна 2Р и график Скэтчарда искривляется) (рис.И). Вогнутость кривой на трафике Скэтчарда зависит от того, какой класс рецепторов превалирует — С, или С2. Если класс Сэимеет преимущество, то К2=1 и вогнутость на кривой графика Скэтчарда направлена вниз. Искривление прямой па графике Скэтчарда свидетельствует о наличии кооперативного эффекта, механизм которого заключается в изменении сродства лиганда к одним субучасткам при оккупации других субучастков. Отсутствие кооперативности в данной модели означает также и отсутствие стериче-ских препятствий (Ц=Ь4).
Величина активного пула по отношению к другим пулам класса С, определяется отношением КА/К,_ Отношение КА/К, можно назвать коэффициентом внутренней активности для агониста. Если Кд/К =1, лиганд является полным агонистом. Если же KA/Kt=0, лиганд связывается с рецепторной областью, но активности не наблюдается (лиганд является антагонистом).
В присутствии антагониста наблюдается как увеличение величины ЕДМ для агониста, так и уменьшение максимальной
30
Агонист
Антагочмсг
Рис. 12. Взаимодействие двухвалентного агониста и двухвалентного антагониста с рецептором, состоящим из двух субучастков активной области рецептора и одного добавочного участка, специфичного для антагониста [De Lean A. ct al., 1979].
концентрации активного пула. Следовательно, одновалентный неактивный лиганд может быть как конкурентным, так и неконкурентным антагонистом. Такой двойственный эффект антагонистов известен для ряда фармакологических систем [van Rossum J.M., Aliens E.J.,1962].
В то же время могут иметь место и более сложные агопист-ацтагопистическне взаимоотпошешгя. Например, антагонист может связываться с третьим, дополнительным, субучастком [Aliens E.J., Simonis А.М., 1967] (рис. 12). Этот дополнительный участок может обусловливать более сильное связывание антагониста, чем агониста.
Анализ лиганд-рецепторных взаимодействий будет более полным ирн детальном рассмотрении механизмов связывания. Большинство теоретических моделей рассматривает взаимодействие ЛВ с рецептором как простую бимолекулярную реакцию. Такое рассмотрение представляет лишь частный случай мультисуб-участковой модели, цредложешюй A. De Lean и соавт. (1979), согласно которой активный, полностью участвующий в связывании пул рецепторов (Р3) более стабилен, чем рецепторные пулы, частично участвующие во взаимодействии; следовательно, множественная оккупация рецепторной области невозможна.
В связи с этим более правильно при количественном анализе взаимодействия лигацд-рецецториых взаимоотношений использовать модель множественных участков. Вместе с тем, невидимому, ее необходимо дальше совершенствовать, чтобы можно
31
было описать временную зависимость процесса активации рецепторов.
К сожалению, данная модель является достаточно сложной и требует детального изучения механизма взаимодействия лигандов с рецепторами. В то же время во многих случаях зависимость доза—эффект достаточно хорошо подчиняется закону действия масс. Практически все исследователи, изучающие кинетику ли-ганд-рецепториых взаимоотношений, пользуются пока именно этим подходом.
В обобщенном виде эта кинетика может быть представлена следующим образом:
к, к2 к3 к4 к5
D+R # DRt^ DR't; D+R't^R f^R, ki k, k,. ki кз
где D — фармакологическое вещество, R — рецептор в неактивном состоянии, R‘ — рецептор в активном состоянии и R — рецептор в нереагирующем (регенерирующем) состоянии [Arlens E.J. et al., 1979; Arlens E., 1982, 1983]. Равновесные константы взаимоотношений между рецепторами в различных состояниях К, равны отношению k./k.. Активированные рецепторы в момент оккупации и после нее обозначены DR’ и R‘. Для агонистов, как правило, константы скорости кр к2 и, возможно, к3 относительно велики. Для конкурентных антагонистов к2 по сравнению с kt и к ( очень мала (случай обратимой оккупации рецепторов без их активации). Внутренняя активность определяется величиной k2/kp отражающей переход оккупированных рецепторов в состояние DR' и/или R‘. Переход рецепторов в дезактивированное состояние R в ряде случаев обусловлен агрегацией рецепторов и интернализацией (эндоцитозом) мембранных рецепторов [Middlebrook J.L., Kohn L.D., 1980; Schlessinger J., 1980].
Однако следует отметить, что данную модель Ариепса [Ariens E.J., 1983] нельзя признать полной в отношении процесса потери чувствительности у рецептора, поскольку, кроме дезактивации рецепторов, связанной с их интернализацией, существует феномен десенситизации рецепторов, суть которого заключается в снижении первоначального эффекта ЛВ при его повторных воздействиях. Классическая теория десенситизации была предложена в работах Катца [Del Castillo J., Katz В., 1957; Katz Br, Thesleff S., 1957], впоследствии расширенной A.Gero (1983).
32
Основная теоретическая проблема процесса десепситизации заключается в выяснении причины перехода рецептора в десеисити-зироваппое состояние. Ответить на этот вопрос можно, исходя из теории активации рецепторов, согласно которой лекарственное вещество, воздействуя на рецептор (изменяя, например, его конформацию), вызывает увеличение свободной энергии [Gero А., 1973]. Данная теория подтверждена многими исследователями [Gero А., 1978,1979; RaffaR,В. et al., 1979; Weiland G,A. et al., 1979; Franklin T.F., 1980]. Она предполагает не только простое конформационное изменение молекулы рецептора, по и увеличение свободной энергии и уменьшение стабильности лнгапд-реценторпого комплекса в процессе комплексообразования молекул-партнеров. Отсюда следует, что если взаимодействие ЛВ с рецептором не сопровождается конформационным изменением или таким изменением, которое недостаточно для увеличения свободной энергии на критическую величину, то ЛВ не вызывает эффекта, т.е. данное вещество представляет собой конкурентный антагонист. В свете этой теории де-сепептизация происходит вследствие перехода комплекса агонист — рецептор с высокой энергией в состояние с более низкой энергией. При этом, несмотря ла то, что агонист может диссоциировать или не диссоциировать (соответствующие модели рассмотрены A.Gero), рецептор находится в таком критическом состоянии, которое не может обеспечивать передачу молекулярного сигнала на эффектор.
Как вытекает из гипотезы A. Gero (1983), рецептор может находиться в двух конформационных состояниях — способном и неспособном к активации, между которыми пет большого энергетического барьера и которые могут связываться с одними и теми же ЛВ. Данная теория объясняет метафильный эффект лигандов, выражающийся в увеличении аффинитета рецептора по отношению к необратимым антагонистам после воздействия на них агонистов [Rang Н.Р., Ritter R.J., 1969, 1970].
Скорость десепситизации зависит от концентрации агониста, по исчезновение десепситизации (восстановление исходного состояния рецепторов) после удаления всех лигандов подчиняется кинетике первого порядка, зависящей только от концентрации инактивированных рецепторов (это было выявлено в экспериментах H.P.Rang и R.J.Ritter),
Отметим также, что данная теория позволяет объяснить це только «затуханием эффекта агонистов (этот феномен объясняет также теория скоростей Пейтона), но и
3. Зак. 227
33
антагонистов при их повторных воздействиях.
Однако нельзя забывать, что действие ЛВ представляет собой сложный многоступенчатый процесс, в котором ассоциация ЛВ с рецептором является лишь начальным этапом реализации биологической активности ЛВ, за которым следуют дальнейшие события, в конечном счете, проявляющиеся в виде вторичной фармакологической реакции. Поэтому десенситизация может быть связана не только с изменением конформации рецептора, о чем шла речь, но также обусловлена какими-либо другими событиями, «спрятанными» в «черный ящик» между комплексообразованием ЛВ с рецептором и наблюдаемым эффектом.
Заканчивая данный раздел, еще раз следует подчеркнуть, что именно с данными событиями связаны основные сложности описания кинетики реализации ЛВ фармакологических эффектов, опосредуемых рецепторами, разрешить которые нельзя без детального изучения всех этапов трансформации молекулярного сигнала в физиологическую реакцию.
Глава 3
ЗАКОНОМЕРНОСТИ РЕЦЕПТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ
В СВЕРХМАЛЫХ ДОЗАХ
В последние годы наблюдается возрастающий интерес исследователей к действию сверхмалых доз биологически активных веществ. Например, в базе данных MEDLINE за период с 1994 г. по начало 1999 г., можно найти более 1000 ссылок на публикации, посвященные действию сверхмалых доз и их эффектам. Данные эффекты описаны для разнообразных групп биологически активных веществ: гормонов, эндогенных регуляторных пептидов, некоторых ненентидных веществ и т.д.
При этом следует отметить, что общепринятого определения сверхмалых доз нет — и различные авторы указывают разные диапазоны концентраций. Так, согласно Бурлаковой Е. Б. и соавт. (1990) к сверхмалым относятся дозы, при которых имеют место концентрации ЛВ ниже 10'2 М, а по определению Сазанова Л.А. и Зайцева С.В. (1992) сверхмалымн считаются дозы, при которых
34
- 1g 1Б₽уф*к. ML
Рис, 13. Влияние бруфева в широком диапазоне концентраций на высвобождение [эН]-метаболитов арахидоновой кислоты перитонеальными макрофагами мыши (Сергеева М,Г. и соавт,, 1997). За 100% принят выброс метки в отсутствие бруфеиа.
концентрация ЛВ находится в диапазоне 10’1®—10’14 М. С нашей точки зрения, правильней относить к сверхмалым дозы с концентрацией ниже 10 й М, т.к. они па несколько порядков меньше константы связывания лигандов с рецепторами (порядка 10-9—10 l! М (Варфоломеев С. Д., Гуревич К.Г., 1999)). Однако, необходимо оговориться, что при концентрациях ниже 10‘20М вероятность нахождения хотя бы одной молекулы ЛВ в 100 мл жидкости близка к нулю, поэтому для объяснения подобных эффектов ЛВ в столь низких концентрациях приходится использовать такие понятия как «активированная вода», «намять молекул» (Шангин-Березовский Г.Н. и соавт., 1986; Беккель В.А., Киркель А.З., 1988). Мы не будем их рассматривать, так как ошт лишены физического смысла,
Исследование действия малых и сверхмалых доз веществ представляет значительный интерес, т.к. может привести к новому пониманию особенностей действия ЛВ. В частности, в работе М. Г. Сергеева и соавт. (1997) показано, что бруфеп в концентрации от 1014 до 10'10 М оказывает стимулирующее воздействие па простагландии-Н-синтазу перитонеальных макрофагов мыши, в диапазоне от 10’!0 до 10’7 М не влияет на фермент и в диапазоне 10'7 —10'4 М угнетает его (рис, 13), При этом традиционно бруфеп в медицинской практике применяется для ингибирования простагланди и-Н-синтазы. Изучение действия малых доз бруфеиа может служить ключевым моментом для понимания ряда побочных эффектов этого препарата.
j*
35
Кроме того, изучение действия сверхмалых доз биологически активных веществ может помочь объяснить эффекты ряда гомеопатических препаратов.
Многие авторы расценивают действие сверхмалых доз как парадоксальное, потому что эффекты наблюдаются в области концентраций, которые на несколько порядков меньше константы связывания лигандов с рецепторами (Сазанов Л,А,, Зайцев С,В,, 1992). В этих условиях только единичные молекулы лиганда могут связаться с рецепторами. В частности, в работе (Dover S.K. et al., 1985) описаны достоверные эффекты интерлейкина-1 па продукцию интерлейкина-2 Т-лимфоцитами при связывании порядка 10 молекул иа 1 клетку. С другой стороны, многие эксперименты оказываются невоспроизводимыми, п в одних и тех же условиях эффекты малых доз могут различаться не только по силе, цо и но знаку (Бурлакова Е.Б, и соавт., 1990; Сазанов Л.А., Зайцев С.В., 1992), Это дает основание многим авторам сомневаться в достоверности эффектов сверхмалых доз биологически активных веществ.
В доступной литературе до сих пор нет теории, которая бы полностью объясняла все эффекты действия сверхмалых доз биологически активных веществ. Наблюдаемые эффекты пытаются объяснить при помощи следующих гипотез: концентрирование ЛВ , наличие высокоэффективных систем проведения и усиления рецепторного сигнала, «адаптации» рецепторов к действию сверхмалых доз (Сазанов Л.А., Зайцев С.В., 1992),
С нашей точки зрения, наиболее вероятным объяснением эффектов сверхмалых доз биологически активных веществ представляется существование высокоэффективных систем проведения и усиления клеточного сигнала. Действительно, один G-белок сопряженный рецептор, находясь в активном состоянии, может взаимодействовать с 10 — 100 G-белкамн. G-белок способен ироактивировать 10 — 100 адепилатциклаз. Одна активная аденилатциклаза способна катализировать образование до 1000 молекул цАМФ, Тем самым рецепторный сигнал можег быть усилен в 10е—1010 раз (Альбертис Б. п соавт., 1996; Варфоломеев С.Д,, Гуревич К.Г., 1999). Существование столь мощных систем проведения и усиления рецепторного сигнала способно объяснить действие сверхмалых доз биологически активных веществ.
Таким образом, биологический ответ может быть получен при
36
р
J
Рисунок 14. Влияние пероксида янтарной кислоты (а), трет-бутилнсрбаЕЗоата (б), трст-бутплгидропсроксида (в), поитела (г) на рост (Р) биомассы культуры клеток табака (Богатырепко Т.Н. и соавт., 1989), С — концентрация добавленных веществ,
оккупации незначительной части рецепторов. Данное предположение перекликается с «классической* теорией «свободных рецепторов* Стефенсона (Stephenson R.B., 1956), согласно которой максимальный эффект агонистов наблюдается при оккупации части рецепторов, Тем самым рассуждения, приведенные выше, дают обоснование теории Стефенсона, исходя из современных представлений о молекулярных механизмах проведения и усиления рецепторного сигнала.
Другой проблемой, возникающей при изучении
37
закономерностей действия сверхмалых доз биологически активных веществ и требующей своего объяснения, является нестабильность эффектов, иевосироизводимость результатов экспериментов со сверхмалыми дозами, С пашей точки зрения, их можно было бы объяснить, исходя из следующих представлений. Эффекты сверхмалых доз индуцируются связыванием единичных молекул лигандов с клеточными рецепторами, В этих условиях лиганд-рецепторное взаимодействие описывается законом редких событий (Пуассона) с математическим ожиданием N (число лигапд-реценторных комплексов) и дисперсией Jv (Варфоломеев С,Д., Гуревич К.Г,, 1999). Это означает, что наблюдаются случайные флюктуации числа связанных с рецепторами лигандов порядка 1 /JN . Аналогичные флюктуации эффектов малых доз были получены во многих экспериментах н суммированы в обзоре (Сазанов Л.А., Зайцев С.В., 1992), При увеличении числа лигаид-реценторпых комплексов величина 1 / убывает — и ири W > 1000 лиганд —рецепторное взаимодействие может быть описано с использованием закона действующих масс (т.к, дисперсия числа лиганд-рецепторных комплексов становится мала ио сравнению с их математическим ожиданием). Таким образом, можно ожидать, что с развитием вероятностных представлений о механизмах лнганд-рецепторного взаимодействия будут получены новые данные для объяснения эффектов действия малых и сверхмалых доз биологически активных веществ,
Еще одной пеобъяснеипой закономерностью эффектов действия малых доз является отсутствие или большая изменчивость биологического ответа в области 1О'*Э— 1О’Н М (Сазанов Л.А., Зайцев С,В., 1992), наблюдаемое практически во всех экспериментальных работах. При этом кривые «доза-эффект» имеют полимодальиый характер (рис, 14). С нашей точки зрения, объяснение этому феномену может быть дано исходя из предположения о существовании систем с отрицательной обратной связью, например, с субстратным торможением. На кривых «доза — эффект» для таких систем наблюдается максимум. К примеру, на рис. 15 (а) приведены кривые «доза — эффект» для схемы:
Rf + L L —> синтез субстрата S
R2 + Lh R;L~) угнетение синтеза субстрата S,
где Rt,R2— рецепторы 1-го и 2-го типа, L— лиганд, RtL, R^L — лигаид-рецепторвые комплексы 1-го я 2-го типов.
38
Рисунок 15. Возможное объяснение формирования полцмодалыюй зависимости “доза—эффект" (комментарии в тексте).
На кривой «доза —эффект» для схемы (1) наблюдается максимум рис. 15 (а), Субстрат S может вступать в процесс ферментативных превращений. При этом, если кинетическая схема ферментативного превращения описывается следующим образом (субстратное угнетение);
Е + S « ES ->Р
ES + S « ES, ,
то на кривой «доза —эффект» будет максимум рис. 15 (б). При этом на схеме (2): Е — фермент, ES,ES3 — активные п неактивные фермент-субстратные комплексы, Р— продукт.
Если точка максимума кривой «доза —эффект» схемы (2) приходится на возрастающий участок схемы (1), то суммарная кривая «доза—эффект» будет иметь иолимодальный характер рис.15, (в).
Иными словами, если образуется в результате активации рецептора промежуточный продукт (субстрат S), который будет оказывать ингибирующее действие па рецептор, то ири определенных условиях будет наблюдаться снижение образования конечного продукта Р,
Приведенные факты и рассуждения указывают на необходимость более внимательного рассмотрения анализа зависимости активации
39
рецепторов от концентрации ЛВ, особенно в области малых и сверхмалых концентраций ЛВ, Прогресс в згой области может дать новые рекомендации использования многих известных ЛВ,
Глава 4
ХИМИЧЕСКАЯ ПРИРОДА РЕЦЕПТОРОВ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
Исходя нз определения рецепторов физиологически активных веществ, можно полагать, что реализовать специфическое связывание лиганда и преобразование полученного сигнала (результат специфического связывания) в изменение функции эффекторной системы могут лишь высокомолекулярные, кои-формационно подвижные структуры. К таким макромолекулам живых организмов относятся белки и нуклеиновые кислоты, для которых характерно наличие трехмерной структуры. Действительно, имеющиеся сведения о химической природе рецепторов физиологически активных веществ свидетельствуют о том, чти пет рецепторов, в структуру которых бы не входили эти биополимеры. Вместе с тем в структуру рецепторов могут быть включены углеводы (например, сиаловые кислоты), ковалентно связанные с аминокислотами белков, липиды, ионы, нуклеотиды, вековалеитцо, обратимо связанные с макромолекулами и участвующие как в специфическом взаимодействии рецептора с лигандом, так п в функционировании рецептора.
Большинство рецепторов представляют собой белки, их агрегаты и комплексы с нуклеиновыми кислотами и ранее перечисленными низкомолекулярными веществами. Рассматривая клетку как ячейку биологических организмов, снабженную рецепторами, необходимыми для поддержания постоянства ее внутренней среды и обеспечивающими адекватное реагирование па изменение внешних условий, становится очевидным, что рецсчгшры, как правило, располагаются па цитоплазматической мембране — границе, разделяющей внутреннюю часть клетки от ее окружения н осуществляющей передачу ннформашш окружающей среды во внутрь клетки.
Проведенные .эксперименты но связыванию лигандов показали, что связывающие участки рецепторов для различных ЛВ,
40
гормонов н гормонопдов локализованы в плазматических мембранах [de Robertis Е., 1976].
В соответствии с современными представлениями об асси-метрнческом строении плазматических мембран рецепторные макромолекулы могут находиться на их поверхности, пронизывать всю толщу мембраны пли находиться с внутренней стороны мембраны. В любом случае гидрофобные области рецепторных белков контактируют с липидами и от характера этих контактов может в значительной степени зависеть конформация рецептора и, следовательно, характер его функционирования [Перцева М.Н., 1982], Если лиганды рецепторов представляют собой гидрофильные молекулы, то связывающие участки рецептора должны быть обязательно обращены к окружающей среде (такими лигандами являются практически все нейромедиаторы). Если лиганды являются гидрофобными соединениями (например, стероидные и тиреоидные гормоны), то связывающие участки рецепторов могут находиться в гидрофобной области или па внутренней стороне мембраны,
Эксперименты но выделению и идентификации рецепторов позволили установить, что рецепторы для нейромедиаторов являются белками, прочно связанными с мембранами; для их солюбилизации необходимо использовать детергенты. В то же время рецепторы для стероидных гормонов, по-видимому, слабо связаны с плазматическими мембранами и, образуя комплекс с лигандом, могут выходить из мембраны в цитоплазму.
В процессах рецепции важная роль принадлежит мембранным липидам, образующим более пли менее прочные связи с рецепторными белками. Роль липидов как модуляторов п регуляторов редепторов хорошо известна (например, в случае участка узнавания гликопротеиновым рецептором тиреотропного гормона, серотонина и др.). Более того, ганглиозиды проявляют высокое сродство к этим веществам п ряду гоиадотрошшов и конкурируют с мембранными рецепторами за связывание этих лигандов, а цереброзпдсульфат насыщаемым образом н стереоснецифично связывает опиаты [Loh Н.Н., Law P.V., 1980]. При химическом анализе опиатного рецептора оказалось, что в его состав входит цереброзпдсульфат, Однако следует отметить, что корреляции между содержанием данного цереброзида и распределением опиатных рецепторов в различных областях головного мозга пет, поэтому маловероятно участие каждой
41
молекулы цереброз ид сульфата в механизмах опиатной рецепции. Данные J.Traber и соавт. (1975), S.K.Sharma и соавт. (1975, 1977) говорят о том, что без цереброзидсульфата нет сопряжения опиатных рецепторов с адепилатцпклазой, по без белковой части опиатных рецепторов сами цереброзидсульфаты не способны трансформировать молекулярный сигнал.
Таким образом, можно считать, что липиды принимают участие в узнавании рецепторами некоторых лигандов и оказывают регулирующее влияние на конформацию рецепторов. Липиды могут быть ответственны за сопряжение рецепторов с эффекторными системами. Данных о том, что липиды могут быть рецепторами, мы не встретили.
В то же время мы должны отметить, что хотя и в меньшем количестве, чем па плазматических мембранах, в процессе эволюции образовались рецепторы для физиологически активных веществ, локализованные внутри клеток. Лиганды этих рецепторов обладают способностью проникать через биомембрапы за счет своих гидрофобных свойств путем пассивной диффузии или вследствие функционирования специальных систем переноса (например, пипоцитоза или эидошггоза; часто с участием рецепторов плазматических мембран). Структура п функция внутриклеточных рецепторов менее изучена, чем рецепторов плазматических мембран, поскольку их труднее выделить, не изменив при этом нативную структуру. Хорошо известно присутствие рецепторов для различных лигандов на рибосомах (например, к антибиотикам), в ядре (к гормонам, антибиотикам), комплексе Гольджи (к гормонам), микросомах (к гормонам) и др. По-видимому, биологический смысл такой внутриклеточной рецепции заключается в более глубоком н продолжительном изменении функции клетки в ответ на получение внешнего сигнала.
Роль нуклеиновых кислот в рецепции физиологически активных веществ подтверждается известными фактами их участия в специфическом связывай ил гидрофобных, проникающих через мембраны молекул (например, стероидные и тиреоидные гормоны). Участки хроматина, специфически связывающие комплексы стероидов с их цитозольными рецепторами, называют акцепторами. Нуклеиновые кислоты могут быть точкой приложения действия некоторых антибиотиков, таких как актиномицин D, для которого рецептором являются ГЦ пары ДНК. Отметим, что в данном случае рецепторные участки
42
могут образовываться непосредственно нуклеиновыми кислотами и комплексами нуклеиновых кислот с белками или другими молекулами.
Резюмируя краткое рассмотрение химической природы рецепторов физиологически активных веществ, следует указать, что и разделе частной реце]иологии читатель может найти конкретные, более подробные сведения о тех или иных видах рецепторов. Вместе с тем мы считаем необходимым подчеркнуть, что еще не располагаем точными данными о структуре не только всех рецепторных макромолекул, по и их узнающих участков. В этом плане чуть ли не единственным исключением являются полученные с помощью рештепострук-турпого анализа сведения о структуре комплекса актиномицина D со спиралью ДНК. Однако можно надеяться, что совершенствование методических подходов позволит получить аналогичные данные и о других рецепторах п не только в кристаллическом состоянии, но и в водной среде. В этом аспекте, но всей видимости, окажется полезным моделирование л и ran д-рецепторных взаимодействий с помощью компьютеров и методов квантовой механики. Читателям, интересующимся данной проблемой, можно порекомендовать работы A.S.Koch (1980), P.M.Deon (1982) и др.
Глава 5
ЧТО ТАКОЕ СПЕЦИФИЧНОСТЬ РЕЦЕПТОРОВ?
Наличие у рецепторов физиологически активных веществ специфичности было постулировано еще Р.Ehrlich. На основании изучения избирательности действия ЛВ он сделал вывод: «только те вещества, которые могут связываться («заякориться») в данном участке организма, представляют собой вещества, которые соответствуют (говоря современным языком, комплементарны) молекуле рецептора как элемент в мозаике определенной картины». Дальнейшие фармакологические исследования, направленные па выяснение зависимости эффектов ЛВ от их структуры, подтвердили наличие специфичности в ряде случаев стереоспецифичности в действии ЛВ [Голиков С.Н. и др., 1973,
43
1985; Ariens E.J., 1981]. Большая избирательность в действии характерна для ЛВ с жесткой структурой, чем с гибкой, так как они комплементарны только к одному определенному виду рецепторов, Отражением специфичности рецепторов является их гетерогенность, выявляемая фармакологически. Вместе с тем мы должны отметить, что с помощью фармакологических экспериментов можно получить лишь косвенные сведения о специфичности рецепторов. Непосредственно изучить эту специфичность можно лишьнутемприменения физико-химических методов. Биологическая специфичность межмолекулярных взаимодействий вначале была продемонстрирована не для лпганд-рецепторпых комплексов, а для фермеит-субстратпых взаимодействий, koi да с помощью рептгеноструктуриого анализа была показана высокая комплементарпость активного центра ряда ферментов к их субстратам и ингибиторам [Pauling L,, 1946]. В результате этих экспериментов были сформулированы гипотезы ферментативной специфичности, такие как «замок-ключ^ Фишера н индуцированного соответствия Кошлапда. Основой специфичности связывания малых молекул с биополимерами является их взаимная ком-нлементарцость. Для биологической специфичности можно выделить два компонента: термодинамический (связывание за счет простых молекулярных взаимодействий) и кинетический (проявление некоторой реакции как результат взаимодействия молекул-партнеров).
В простых случаях процессы связывания и проявления биологического эффекта сопряжены между собой и происходят практически одновременно, однако они могут иметь временные различия (например, реакции, связанные с биосинтезом белка).
После успеха в и идентификации рецепторов физиологически активных веществ и развития радиолцгаидной техники стало ясно, что все положения о специфичности ферментов относятся также и к рецепторам физиологически активных веществ.
Рассмотрим более подробно те методические подходы, которые применяются для выявления специфичности рецепторов.
Прежде всего, нужно указать, что любые радиол]п анды (особенно липофильные) могут связываться не только с рецепторами, по и с другими биоструктурами. При этом число специфически связывающих участков (рецепторов), как правило, меньше числа иеспецифически связывающих участков (гидрофоб-
44
50Q иигт,
Рис. 16. Определение специфического и нес пецпфп чес кого связывания [Titeler М., 198Ц.
Звездочками обозначены молекулы радио лиганд а. Специфические связывание определяется путем вычитания величины связывания радиолнганда в при-сучствпп избытка немеченого лиганда из величины связывания рад г юл ига и да при отсутствии немеченого лиганда.
пых областей мембран н белков).
Чаще всего изучается связывание радио лигандов с мембранными структурами, содержащими рецепторы. При этом пользуются следующим приемом определения специфического п песпецпфнческого связывания. В пробирках инкубируют мембраны с радиол!п'апдом. Для отделения мембран, связавших радполпгаид, содержимое пробирок фильтруют н затем определяют величину радиоактивности мембран, задержанных па фильтре (при этом величина связанного радиолигапда отражает общее число связывающих участков как специфических, так п песпецпфических). В другой серии пробирок радполпгаид и мембраны инкубируют в присутствии большого избытка немеченого лиганда (в примере, приведенном па рис. 16, избыток равен 100). Избыток немеченого лиганда приводит к уменьшен!по специфической радиоактивности радиолигапда па 99% и увеличению общей концентрации лиганда в 100 раз. Исходя из того, что количество специфических участков намного меньше неспец!]фпческнх в присутствии избытка немеченого лиганда, они полностью оккупируются им. Основной эффект 100-кратного избытка немеченого лиганда на специфическое связывание радио-лиганда — это уменьшение специфической радиоактивности свя-
45
заипого лиганда на 1% от исходного уровня. Количество песне’ пифически связанного ЛВ при этом увеличивается в 100 раз, поскольку общая концентрация Л В увеличивается и неспецифическая абсорбция ЛВ при данных концентрациях практически является ленасыщаемым процессом. Следовательно, в присутствии немеченого лиганда неспецифическое связывание радиолиганда изменяется незначительно. Таким образом, различие между специфическим связыванием радиолигаида (определяется в присутствии избытка немеченого лиганда) и общим связыванием (определяется при отсутствии немеченого лиганда) представляет собой величину насыщаемого, специфического или вытесняемого конкурентом связывания лиганда с мембранами.
При очень высоком сродстве лиганда к рецептору (К.=10^ М) используются низкие концентрации радиолигапда для сведения к минимуму величины неспецнфического связывания. Если лиганд имеет не слишком высокое сродство к рецепторам, то для определения связывания необходимо использовать более высокие концентрации радиолнгаида, что обычно приводит к повышению неспецнфического связывания.
Другой важный фактор, который необходимо учитывать при работе с радиола raj щами — это коэффициент распределения ЛВ между мембраной и буфером. При высоком коэффициенте радиолнганд значительно абсорбируется липидным бислоем мембран, В идеальном случае радиолнганд имеет высокое сродство к рецептору и низкий коэффициент распределения. Неспецифнческое связывание радиолигаида можно уменьшить путем промывания лнгапд-рецепториого комплекса холодным буфером. Такое отмывание может значительно уменьшить неслецифическое связывание без влияния па специфическое связывание радиолиганда, поскольку холодный буфер проходит через фильтр в течение нескольких секунд, а время жизни комплекса лиганда с высокоаффщщыми участками обычно составляет несколько минут или более.
Необходимо отметить, что отделите бноструктур, содержащих рецептор в комплексе с радиолигавдом, от среды инкубации возможно не только с помощью описанного способа фильтрации, но и путем осаждения этих структур центрифугированием или сорбцией на каких-либо индифферентных материалах, например, покровных стеклах.
Важной характеристикой рецепторов является их способность
46
СХЕМА 1. Модель прямого фармакологического антагонизма [TitelerM., 1981].
I--------
Агонист
Антагоннст
Мембрана Мембрана
Рецептор
стереослецифпчно взаимодействовать сЛВ. Если один оптический изомер какого-либо Л В обладает большей активностью, чем другой изомер, то первый из них должен иметь больший аффинитет к специфически связывающим участкам, чем второй.
Следует всегда помнить, что наличие только участков, специфически связывающих то или иное ЛВ, еще не доказывает, что эти участки являются рецепторами данного ЛВ. Последнее доказывается только при наличии корреляции между связыванием ЛВ с данными участками и выраженностью их фармакологической активности.
В разделе о кинетике лнгапд-рецепториых взаимодействий приведены примеры такой корреляции для некоторых холинергических и адренергических средств. Отметим также, что в ряде случаев (см. главы 1,2 частной рецецтороло-гин) имеет место корреляция между связыванием и активностью ЛВ в том случае, если в качестве радиолиганда используется антагонист, а активность изучается для агонистов (условием наличия такой корреляции, по-видимому, является взаимодействие агонистов и антагонистов с одним и тем же связывающим участком рецептора), т.е. наличие прямого фармакологического антагонизма (схема 1).
Проведенный С.В.Зайцевым и соавт. (1985) математический анализ влияния сродства лигандов к рецепторам, относительного вклада песлецнфи веского связывания и концентрации лигандов па точность радиорецеп торн ого метода, его чувствительность, па максимальную определяемую из калибровочной кривой концентрацию и на диапазон достоверно определяемых концентраций исследуемого соединения показал, что характеристики радиорецел-
47
торного метода тем лучше, чем меньше ошибки определения концентрации связанного меченого лш'анда, чем меньше концентрация меченого соединения, больше его сродство к рецепторам, меньше вклад неспецнфического связывания.
Следует отметить, что, несмотря на широкое использование радиорецен торн ого метода в реценторологин, стандартный Скэт-чардовскпй анализ при существовании более чем одного центра связывания лиганда не позволяет точно определить параметры связывания лигандов с каждым из связывающих участков. Поэтому использование разного диапазона концентрации исследуемых лигандов может приводить к некоторым различиям в определяемых параметрах связывания.
Рассматривая проблему специфичности фармакологических рецепторов, мы не можем обойти такое понятие, как «молчащие» рецепторы. Такие рецепторы могут связывать ЛИ неснецнфичло, а могут и специфично, по при этом не опосредуют реализацию его физиологической активности. Поэтому «молчащие» рецепторы, по нашему мнению, неверно называть неспецн фи вескими рецепторами. В качестве примера «молчащих» рецепторов можно привести белки плазмы крови, которые специфично связывают некоторые эндогенные и экзогенные физиологически активные вещества, но при этом непосредствен по не участвуют в реализации их биологической активности, хотя и играют важную роль в биодос-тунпости, транспорте веществ п определении пути их экскреции из организма, т.е. плазменные белки количественно, а не качест-вешю влияют па проявление эффектов ЛВ. [Шимановский Н.Л., 1982, 1984].
Вместе с тем нужно отметить, что большинство ЛВ связываются с составными компонентами крови (особенно это относится к мембранам эритроцитов) песпеццфичио в соответствии с их коэффициентом распределения липид/вода. По нашему мнению, белки плазмы крови для некоторых групп ЛВ (рентгеноконтрастные вещества, бензодиазепиновые транквилизаторы и др.) и гормонов (стероидные, тиреоидные) можно рассматривать как специфическое транспортные системы. Кроме того, с помощью белков или клеток крови как моделей рецепторов можно изучать молекулярные механизмы комплексообразования Л В с рецепторами и конформационные изменения биоструктур, возникающих'в результате этого комплексообразования.
Таким образом, говоря о специфичности рецепторов как об
43
одной из важнейших характеристик, по нашему мнению, всегда следует иметь в виду только первый этан их функционирования (связывание лиганда) и отличать структуры, которые специфически связывают ЛВ и опосредуют проявление их фармакологической активности (истинные рецепторы), от структур, которые тоже могут специфически связывать лекарства, но при этом пе опосредовать видимых эффектов (ложные, или «молчащие» рецепторы).
Учитывая своеобразную роль транспортных бнострукгур (белки it форменные элементы крови, внутриклеточные транспортные белки, такие как Х-, Y-, Z-белки, белок, связывающий органические анионы) [Сергеев П.В. и др., 1983; Stolz A. et al., 1984], их следует отнести к специфическим транспортным системам.
Глава 6
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ РЕЦЕПТОРОЛОГИИ
Как и в других областях меднко-бпологпческой науки, прогресс учения о рецепторах определяется успехами в разработке новых методических подходов в исследовании структурно-функциональных особенностей того или иного вида рецепторов. В предыдущих разделах были рассмотрены различные аспекты использования фармакологических (вернее, физиологических с применением фармакологического анализа) и раднолигапдпых методик в рецепторологии. Эти методы являются основными: первый из них дает возможность выявить характер биологической активности ЛВ па организменном, тканевом, органном и иногда па клеточном уровнях, а второй — па клеточном, субклеточном и молекулярном. Однако в последние годы в результате прогресса биофизики, биохимия н иммунологии появились новые методы, о которых следует сказать особо.
Уже более 20 лет с успехом используются спектральные методы: ЭПР, ЯМР, флюоресценции и их модификации для получения уникальной информации о деталях взаимодействия низкомолекулярных соединений с рецепторами. В последние годы особенно перспективным для изучения рецепторов оказалось новое
4. Jas.227
49
направление иммуиофармакологии ~ моноклональные антитела [ObristR., ПетковВ., 1984], Гнбрлдомпая техника дает возможность получить данные относительно числа п локализации рецепторов, выяснить, как эти параметры рецепторов изменяются в различных условиях, таких кактахифплаксня, кооперирование иля формирование новых рецепторов, сравнивать подтипы рецепторов в различных органах, подробно изучить структуру активного центра рецепторов без синтеза большого числа аналогов агонистов п антагонистов и без проведения многочисленных п трудоемких экспериментов по выявлению зависимости активности ЛВ от пх структуры.
Активное использование компьютерной техники должно дать возможность программировать специфические для данного рецептора ЛВ таким образом, что большая часть пли даже все нежелательные эффекты будут элиминированы наряду с созданием неизвестной до настоящего времени селективности действия.
Успехи химии позволили создать лиганды, меченные фоторе-актиниыми соединениями, при одновременном шь..ни у лиганда
радиоизотопной метки; после взаимодействия молекул-партнеров воздействие ультрафиолетовыми лучами приводит к образованию ковалентной связи между лигандом и рецептором, значи т, появляется возможность выделить рецептор в чистом виде и изучить его физико-химические свойства с помощью различных хроматографических и электрофоретических методов. Определить размеры и молекулярную массу рецепторов без выделения их биимембрап даст возможность метод радиационной инактивации. Другой иллюстрацией успехов химии в рецепторологин является создание ЛВ, гормонов, пейромещшоров, ковалентно связанных с полимерами [Veuter J.C., 1982]. Такие иммобилизованные лиганды помогают выяснить локализацию рецепторов в клетке п выделить их. Опп обладают специфической биологической активностью и уже начинают использоваться в терапевтической практике.
Диалектика развития современной науки свидетельствует о том, что появятся новые еще более совершенные методы, способствующие дальнейшему развитию учения о рецепторах. Однако перечисленные и уже существующие методы, применение которых будет проиллюстрировано во второй части книги, еще далеко себя пе исчерпали. * * *
В данной части мы рассмотрели лишь некоторые, по нашему мнению, наиболее важные общие вопросы реценторологли, знание
50
СХЕМА 2. Основные этапы фармакодинамической фазы действия ЛВ [Ariens Е. J., 1983].
ЛВ
Рецептор
Начальный
стимул
Эффеит
(Передача
Получение-------------------Сигнал I Усиление
сигнала | Модуляция
Выход сигнала
которых необходимо для подлого понимания частных вопросов функционирования тех пли иных видов рецепторов.
Из представленных сведений видно, что если этап связывания ЛВ с рецептором может быть изучен достаточно подробно, то последующие этаны трансформации молекулярного сигнала н биохимическую и биохимической в физиологическую реакцию протекают значительно сложнее н только начинают изучаться. Болес того, в каждом случае эти. реакции в связи со специализацией. различных тканей и органов могут быть в различных случаях разными и общую теорию функционирования рецепторов создать, ио-видимому, будет трудно. Вместе с тем некоторые общие черты функционирования всех рецепторов можно сформулировать уже па современном этане рецепторологии.
1. Можно постулировать, что для регуляции биологических систем посредством рецепторов обязательно должны возникнуть конформационные перестройки биологических структур (ври этом меняется конформация как самого рецептора, так и со и ряженных с ним эффекторных систем). Данный вывод вытекает из физико-химических механизмов взаимодействия любых лигандов с макромолекулами, согласно которым прочное белковое связывание обязательно сопровождается изменением конформации белка.
Принимая во внимание конформационную подвижность рецепторов, можно объяснить многие феномены рецепторологии, такие как десепситизацля, положительный и отрицательный кооперативный эффект, модуляция функции рецепторов аллостерическими регуляторами, сопряжение рецепторов с ферментами, иои-цьь'ш каналами и др.
2. Для многих рецепторов существует система усиления получен того сигнала (например, циклазная система), представленная па
4*
51
Рис. 17. Возможные механизмы рецепции.
Клетка содержит рецепторы (Rt, R2, R., пли R,), специфически связывающие лиганд и опосредующие индукцию одного или более "ответов" (от А до Н). Рецепторы R и R, сопряжены с эффектором в мембране. Один или более “ответов" (Е — Е3) реализуются вне клетки, а другие — внутри клетки (F, G и Н) |SehafcrD. Е. et al., 1983].
схеме 2. (На страницах этой книги в разделе частной рецентороло-пш читатель ие раз сможет найти подтверждение такого механизма функционирования рецепторов, характерного для многих веществ нейромедиаторного типа действия).
3. Рецепторы могут располагаться на плазматической мембране илн внутри клеток, но во всех случаях в их состав входит полимерная молекула как носитель биологической специфичности н как коиформациоипо подвижная структура, способная за счет изменения конформации трансформировать молекулярный сигнал в биохимическую реакцию.
Обобщая концепцию рецепторов, можно заключить, что рецептором может быть любая биомолекула, специфически связь|кающая химическое соединение (лиганд, ЛВ, агонист, антагонист) на поверхности или внутри клетки и трансформирующая полученную информацию в биологический ответ (рис. 17). Одна клетка, как правило, содержит множество рецепторов.
Рецепторы физиологически активных веществ необходимы клеткам Для нормального функционирования н адекватного реагирования на изменения внешней н внутренней среды и, в конечном
52
счете, для поддержания гомеостаза всего организма. В одной книге невозможно рассмотреть принципы функционирования рецепторов всех видов. Мы дадим анализ имеющихся сведении о механизмах функционирования только рецепторов, высокочувствительных к химическим соединениям как природным, так и синтезированным в лабораторных условиях.
ЧАСТЬ II
ЧАСТНЫЕ ВОПРОСЫ РЕЦЕПТОРОЛОГИИ
Глава1
АЦЕТИЛХОЛИНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ
Еще со времен J. Langley (1907) было известно, что мышцы чувствительных лекарственным препаратам, наносимым в область нервно-мышечных соединении (синапсов). С тех нор механизмы функционирования нервно-мышечных соединений исчерченных (поперечнополосатых) мышц позвоночных явились предметом многочисленных нсследовашгй н в настоящее время изучены наиболее подробно. Хорошо известно, что «приход» потенциала действия до окончания мотонейрона приводит к высвобождению ацетилхолина, который, действуя на наружную поверхность постсииап-тической мембраны (т.е. мембраны миоцита), вызывает увеличение ее проницаемости для Na"1, К+ и Са2+ [Катц Б., 1969]. Тончайшее нервное волокно может возбудить значительно более крупное мышечное волокно, потому что одна молекула ацетилхолина индуцирует перенос через постеипиитическую мембрану заряд приблизительно 10 000 ионов. Вначале было предположено, а затем доказано, что механизм данного усиления заключается во взаимодействии агониста с ацетилхолиновыми рецепторами, которые не только узнают ацетилхолин на наружной поверхности пост-еннантнческих мембран, по и обеспечивают также захват и перепое катионов через мембраны [Поттер П., 1979],
Кроме того, рецепторы, чувствительные к ацетилхолину, были найдены во многих гладкомышечных органах и в ЦНС [Михельсон М.Я., ЗенмальЭ.В., 1970; ЗакусовВ.В., 1977; Аничков С.В., 1982; Демушкин В.П. it др., 1984, Bruning Т.А., et al., 1994]. Используя различные фармакологические и биохимические подходы, многими исследователями получены дан-
54
иые о гетерогенности, локализации н физико-химических свойствах холииорецеиторои. Общепринято, что ацетилхолин как нейромедиатор периферической и центральной нервной системы взаимодействует с двумя видами холинорсценто-ров: мускариновыми и никотиновыми, отличающимися между собой специфичностью и способностью отвечать иг» воздействие ряда агонистов и антагонистов (М-холнпорецеиторы избирательно возбуждаются мускарином, а Н-рецепторы —никотином).
При возбуждении М-холииоренекторов развиваются такие эффекты, как сокращение ресничной мышцы, миоз, снижение внутриглазного давления, активация перистальтики желудка и кишечника, стимуляция секреции слезных, слюнных, желудочных и поджелудочной желез, сокращение иеисчерчеиных (гладких) мышц бронхов и мочевого пузыря, брадикардия, уменьшение сердечного выброса, гипотензия, деышхроиизацня ЭЭГ, а при возбуждении Н-холшюреденторов — возникновение потенциала действия в концевой пластинке и в ганглиях, стимуляция дыхательного и сосудодвцгателыюго центров, высвобождение катехоламинов и др.
По мнению Р.Д.Пурвеса (1983), физиологически важным различием между М- и Н-холинореце!порами является скорость их ответа. Считается, что никотиновые рецепторы предназначены опосредовать быстрые и непродолжительные эффекты и не способны суммировать во времени ответы па последовательные нервные импульсы, а мускариновые рецепторы, наоборот, реагируют длительно и медленно. Продолжительность реакции превосходит интервал между последовательными импульсами, осуществляя тем самым суммировать ответов во времени, которое исключительно важно для обеспечения равномерного управления, например, скоростью сердечных сокращений.
В дайной главе мы не будем подробно рассматривать хорошо известные, ставшие уже классическими и часто имеющие лишь исторический интерес работы но холипорецепции, а попытаемся проанализировать новые сведения о функциональной активности холипореценторов с позиции не только их теоретической, ио и практической значимости.
55
1.1. Лиганды холинорецепторов
Большую роль в выяснении нейрохимических механизмов функционирования холинорецепторов играют эксперименты по изучению зависимости активности агонистов и антагонистов от их структуры. В связи с этим приведем химическую структуру наиболее часто используемых лигандов холииорецеиторов.
Ацетилхолин и ареколин возбуждают М- и Н-холипорецецто-ры, а мускарин, диметилацетнлхолип, 5-метилфурметид, АСТМ, пилокарпин, F2268, метахолин, бетанехол, оксотреморин и ацекли-дин -М-холинорецепторы, в то время как никотин, лобелии, фепилтриметиламмО1шй, эпибутидии и диметплфенилниперазин (ДМПП) — только Н-холицорецепторы. Атропин, нинеразии и платифиллии блокируют М-холинорецеиторы, б-тубокурарип и де-каметопий — Н-холинореценторы скелетных мышц, нирилеп, триметафан и гексаметопий — Н-холииореценторы ганглиев. Дити-лин является деполяризующим миорелаксантом, а нолипеитнд а-бунгаротоксин — необратимым блокатором Н-холинорецепто-ров скелетных мышц.
1.2. Фармакологическая и биохимическая характеристика Н-холинорецепторов
Известно, что Н-холинореценторы гетерогепны. Можно выделить три подкласса этого рода рецепторов: 1) Н-холииоре-цепторы ганглиев вегетативной нервной системы; блокируются гексамето]шем в низких концентрациях и слабо чувствительны кдекаметопню; 2) Н-холипореценторы нервно-мышечногосн-иаттса; блокируются декаметонием и ot-бунгаротоксипом в низких концентрациях и гексаметоиием в высоких концентрациях; 3) Н-холицорецепторы хромаффинных клеток надпочечников; в равной степени блокируются гексаметоиием и декаметонием, а также тубокурарипом и атропином в высоких концентрациях, по не а-бунгаротоксином [Kilpatrjk D.L., 1981], Н-холшюрецеи-торы надпочечников и ЦНС блокируются триметафапом [Harper N„ 1994].
Н-холинорецеиторы электрических органов рыб и нервно-мышечных синапсов, кроме участков, связывающих ацетилхолин, имеют также участки связывания для местноапастезирующнх препаратов или так называемые регуляторные участки.
С.Larsson и соавт. (1982) показали, что в головном мозге
56
Агонисты холинорбцвпторов
о
снэ
СН3—N—сна—СНа—О—С—СН3 £н3
Ацетилхолин
СН-1
I 0
СН3—СО-О-СН—СН2—N {СН3)3
Метбхолкн
(altOTHA'p' метилхолнн)
О
СН3
СНз—N—СН2----CHs—О—С—NKa
сн3
Нар бах ол (карбамоил юл инг карбахолнм)
о
Г3 ®
HaN—G—О—CH—CH2~N (СН3)3
Бетанехоя (карбаиоил-р-^етялхолйн, урекОямн)
ОН-„
GH2-N®(CH3}3
2S. 3R, 5S (г}-Мус нар и и
GH3 СН3 О | | Димет ила цетил холи к
сн3—N—й н—с н—о-с—с н3
снэсн3
Ареколин
Оксотреиории Пилокарпин
5*Метилфур«*тид
СН3 -----Q
сн3—N—CH2-L0^Lch
СНЭ
2268
57
сн3
AGTM
CH2—-CH2 Q /СНз г/
ЧСН2-СН2 CH3
Либ&пмч
I ^Диив1ил’4-4еиилггмпепааьн (ДМПП)
мышей существуют два связывающих участка для 3Н-тубоку-рарииа и один связывающий участок для ЭП- а-бупгароток-сииа. Немеченые тубокурарин и никотин имели большее сродство к участкам, свя з ыв ающим 3II- а-бу 11 гаротоксин. У в зрос-лых животных но сравнению с мышами, находящимися в раннем пос гнатальном периоде развития, число мускарнноподобных связывающих участков и активность маркерного пресп-иаитического фермента холннацетилтрансферазы в головном мозге были больше, а число никотииоподобных связывающих участков — меньше.
Во всех современных отечественных руководствах ио фармакологии при рассмотрении вопроса о Н-холинореценто-рах приводятся сведения об их локализации иа постсииан-тических мембранах нейронов вегетативных ганглиев клеток, скелетных мышц, нейронов ЦНС, хромаффинных клеток надпочечников и на клетках синокаротидной зоны, которые опосредуют влияние ацетилхолина и его аналогов на ионную проницаемость поетелпаитических мембран и тем самым на возникновение потенциала действия, сокращение мышечного волокна, высвобождения катехоламинов и др. Однако, в последнее десятилетне появилось большое число работ, доказывающих существование Н-холвнорецеиторов также ца иресц-наптических мембранах ностганглиоиарных волокон синаптической нервной системы, взаимодействуя с которыми Н-холи-цомиметики вызывают высвобождение адренергических нейромедиаторов [Лоффелхолз К., 1982], Согласно данным K.Loffelholz (1970) и К.Starke (1977), ацетилхолин высвобождает эндогенный норадреналин из тканей сердца и селезенки в таком количестве, которое можно измерить с помощью
58
Антагонисты холинарецедтрров
О ю
соответствующих биохимических методов. В то же время «истечение» медиатора из изолированных препаратов мышечной оболочки артерии и вены собаки и кролика, кишечника морской свинки или ее семявыносящего протока можно определить только в том случае, если предварительно вводят радиоактивную метку в норадреналин, который накапливается в нервных окончаниях. Действуя через высвобождение катехоламинов, Н-холипомиметики вызывают увеличение частоты и силы сердечных сокращений, сокращений центральной артерии уха кролика, легочной артерии кролика. Таким образом, прямое действие ацетилхолина и его аналогов па гладкомышечные органы может маскироваться действием па них норадреналина, высвобождаемого ацетилхолином из синаптических нервных окончаний. Этот феномен необходимо учитывать при оценке спектра фармакологических реакций, индуцируемых Н-холиномиметнками.
Важно отметить, что никотиновые антагонисты могут влиять также на обмен катехоламинов в синаптическом ганглии.
N.Ip и соавт. (1982) обнаружили, что холинергические агонисты вызывают быстрое и обратимое увеличение синтеза ДОФА в верхнем шейном ганглии крыс. Карбахол увеличивал этот синтез в 5 — 6 раз. Дагщый эффект карбахола сильно ингибировался никотиновым антагонистом гексаметонием.
Специфический никотиновый агонист диметил фенил ни иера-зиний увеличивал синтез ДОФА в 4 раза; описанный эффект также блокировался гексаметонием. Эти данные дают основание считать, что увеличение активности тирозин-З-мопоокснгеназы происходит за счет стимуляции Н-холинореценторов и что ацетилхолин, высвобождаемый in vivo из преганглиопарных волокон, может активировать данный фермент и тем самым регулировать синтез катехоламинов в синаптическом ганглии.
Широкое распространение никотиновых холилореценторов, которые локализуются па эфферентных и афферентных нейронах, в пре- и ноете и пиитических отделах, а также вне синапсов, свидетельствует о том, что этого рода рецепторы, возможно, представляют собой неотъемлемую часть мембраны аксона. Однако физиологическая роль нресниантических Н-холннорецепторов в синаптической нервной системе пока не выявлена, несмотря па большое число попыток ее найти. Согласно существующей ио этому вопросу гипотезе «холинергического звена» [Burn J.N.,1977], ацетилхолин является первичным стимулом (холинергическое звено) высвобождения медиатора, который в итоге приводит к
60
иадпороговой постси найти ческой стимуляции. Аргументами против этой теории служат следующие факты: ни блокада Н-холинорецеиторов антагонистами никотина, пи отсутствие самих Н-холинорецепторов (опыты на сердце цыпленка) не подавляют постганглионарную передачу. По нашему мнению, пре-синаптические Н-холицорецеиторы не являются главными детерминантами ганглионарной передачи или функции адренергического синапса, а оказывают модулирующее, регуляторное влияние на эти структуры. В пользу этого предположения говорят данные о том, что гексаметоний частично тормозит нейрональную передачу через цилиарный [Martin R., Pillax G., 1963] и сердечные парасимпатические ганглии птиц [Diertich Н. et al., 1976] и что при отравлении фосфорорганическими препаратами у больных, несмотря па лечение атропином, значительно повышена экскреция с мочой катехоламинов [О’Копек S., 1975].
Кроме того, необходимо указать, что Н-холипорецепторы, локализованные в ЦНС (полосатом теле крыс), высвобождают дофамин и серотонин [Westfall Т.С. et al., 1983].
Предполагается, что Н-холинореценторы, присутствующие па дофаминергических и серотонинергических нервных окончаниях, модулируют процесс высвобождения этих нейромедиаторов.
Пока еще не известна локализация Н-холипорецепторов ЦНС, опосредующих рвотный эффект никотина. Данный эффект не обусловлен высвобождением ацетилхолина, так как па его выраженность не влияет атропин.
При введении в желудочки головного мозга Н-холипомимети-кн вызывают также каталепсию [Beleslin D.B., Malobabic Т., 1972] и агрессивное поведение [Beleslin D.B., Samardzic С., 1979]. Все это указывает на присутствие Н-холинорецецторов в ЦНС и на необходимость дальнейшего изучения их физиологических н фармакологических свойств.
При изучении биохимических свойств Н-холипорецепторов полезной оказалась способность а-пейротоксинов змей необратимо с высокой специфичностью связываться с этими рецепторами. Эксперименты но изучению связывания а-бупга-ротокснна, меченного флюоресцентной или радиоизотопной меткой, позволили установить, что в каждой концевой пластинке нормальной мышцы расположено от 10 до 20 млп.молекул рецепторов [Поттер П., 1979]. Плотность их упаковки па выступах складок иостсинаптической мембраны составляет нри-
61
мерно 10 000 молекул на 1 мкм3. В электрических органах плотность упаковки Н-хол ни «рецепторов равна 5000 па 1 ,мкм3,
Макромолекулу, связывающую сс-бупгаротоксин из исчерченных мышц позвоночных, в водной среде растворить не удается, однако ее можно легко отделить от мембран с помощью практически любого детергента [Karlin А., 1974; Landowne D, et al., 1975]. Оказалось, что данная макромолекула, прочно встроенная в мембрану, имеет белковую природу, а в ее активном центре содержатся SH-rpynnw [Туриасв Т.М., 1962].
Было обнаружено, что введение ингибиторов протеаз в процессе очистки белка Н-холипорецепторов приводит к существенному увеличению молекулярной массы выделенных молекул. Для получения воспроизводимых результатов ври изучении этих белков методом электрофореза в полиакриламидном геле оказалось необходимым также добавлять реагенты (в частности, феннл-метнлеульфопилфторпд), предотвращающие сшивку субъединиц под действием тканевых ферментов [Riet R.P. et al., 1973]. В электрическом органе скатов Torpedo и Larcino а-бупгароток-сии связывался с субъединицами с молекулярной массой около 42 000, 48 000, 59 000 и 65 000. Молекулярная масса рецепторной молекулы была равна 400 000 — 500 000 [Поттер Л., 1979]. По данным Р.Taylor и M.S.Steven (1982), в состав рецепторной молекулы входят две «-субъединицы с молекулярной массой - 40 000, одна Р-суб ьедипнца (мол.масса -49 000), одна у-субъсдпница (мол.масса - 60 000) и одна 8-субъедици-ца (мол.масса ~ 67 000). Получается, что Н-холипорецеитор состоит нз пяти субъединиц, объединенных в олигомер.
Дальнейшие исследования, проведенные Д.И.Рашом и соавт? (1983) методом замораживания —скалывания, показали, что in vivo молекулярная масса Н-холииорецентора намного больше; он представляет собой шестиугольник или пятиугольник размером =10 им, с молекулярной массой 900 000,
В дополнение к белку, связывающему ацетилхолин, рецептор цз электрического органа Torpedo, но данным A.T.Eldefrai н соавт. (1977), содержит также другой класс макромолекул — модуляторов нонпой проводимости. При изучении связывания специфического лиганда и on noli проводимости 3Н-11ергидрогистрии11котоксипа было обнаружено, что белок-модулятор тесно ассоциирован с Н-холиноре-центорами, но обычно отделяется от них при действии трито-
62
па X-100. Таким образом, Н-холипорецептор, выделяемый с помощью этого детергента, ио-видимому, представляет собой только часть природного комплекса холи пореде: пора и модулятора ионной проводимости. По мнению Д.И.Раша и соавт. (1983), функциональный комплекс Н-холипорецецтора и модулятора ионной проводимости представляет собой у млекопитающих in situ мульт! [молекулярный комплекс в соотношении 8:1 (пли 9:1). Каждая периферическая субъединица может соответствовать единичному центру связывания а-буп-гаротоксипа и имеет молекулярную массу 80 000 — 90 000.
Химический анализ рецепторных молекул показал, что в их состав входят сахара, в частности манноза [de Robertis Е., Schaebt J., 1974], поэтому рецепторный белок следует' рассматривать как гликонротеид.
По существующим представлениям, в рецепторной молекуле имеется четыре места связывания для а-буцгаротоксииа и ацетилхолина [Eldcfrawi М., Eldefrawi А., 1973].
Отметим, что П-холииореценторы из тканей беспозвоночных — мозга мух и головоногих [O’Brien R.D. et. al., 1972; Kato G., Tattrie B., 1974] имеют те же фармакологические и биохимические свойства, что и белки, связывающие а-буцга-ротокснн из исчерченных мышц и электрических органов позвоночных. Однако в отличие от позвоночных комплексы белка с токсином из тканей беспозвоночных могут быть легко вроэкстрагнрованы солевыми растворами при относительно нейтральных значениях pH. Этим объясняется причина того, что исследователи в основном изучают физико-химические свойства Н-холшюрсцеиторов из указанных источников, так как их молекулярную массу и другие параметры можно определить с большей точностью, чем параметры покрытых детергентами комплексов из тканей позвоночных.
1.3. Молекулярные механизмы взаимодействия лигандов с Н-холинорецепторами
Как и следовало ожидать, исходя из структуры ацетилхолина, нейромедиатор действует лишь на структуры, обращенные в сторону синаптической щели. Эксперименты с заполненными ацетилхолином микроэлектродами показали, что деполяризация возникает только в том случае, если ацетилхолин вводят снаружи, а не внутрь мышечного волокна [Катц Б., 1969].
63
Пока мы еще не располагаем точными данными о структуре Н-холинорецептора. Тем не менее, имеются некоторые сведения по этому вопросу. A.Karlin (1974) и A.Karlin D.Cowbum (1974) установили, что восстановители типа дитиотрейтола заметно снижают влияние холиномиметиков на рецепторы мышечных тканей, а окислители восстанавливают чувствительность Н-холинорецепторов. Эти данные и алкилирование свободных SH-групп Н-холииореценторов, находящихся в заблокированном состоянии, производными N-этилмалеимида с четвертичной аммониевой группой, которая расположена ла расстоянии около 1,2 им от реакционноспособной двойной связи, дают основание предполагать, что в состав активного центра Н-холииорецецторов входит S—S-связь, расположенная па расстоянии 1,2 им от места (карбоксильная или фосфатная группа), взаимодействующего с четвертичной аммониевой группой агонистов [Вульфиус Е.А., 1975].
Как следует из квантово-химических расчетов, проведенных И.Б.Головановым и соавт. (1975), положительный заряд ацетилхолина «размазан» ио всем атомам катионной головки, причем положительный заряд атомов водорода, контактирующих с молекулами окружения в холипореценторе, несколько больше, чем заряд атомов водорода в углеводородах. Поэтому при взаимодействии катионной головки ацетилхолина с анионным центром ацетилхолинового рецептора, представляющим собой гидрофобную область с отрицательно заряженными группами, определяющую роль играют кулоновские и вандерваальсовы силы.
Исходя из представлений о структуре Н-холипорецепторов и данных о взаимодействии дикатионов, имеющих различные N —N-расстоянпя, с Н-холииорецепторами нервно-мышечного синапса, предложена топография расположения субъединиц в тетрамерном холипореценторе (рис. 18) [Хромов-Борисов Н.В.:; 1982]. Считается, что в образовании комплекса агонистов с Н-холипорсцепторами большое значение имеет ионное электростатическое притяжение четвертичного атома азота к анионному центру холинорецептора. Дополнительную прочность этому комплексу придают ван-дер-ваальсовы контакты и ди-поль-дипольпые связи с эстерофильпыми участками холинорецептора (5+ &’) Согласно предложенной схеме (см.рис.18), дикатионы с N—N-расстоянием порядка 2 нм (структура С-16) реагируют по диагонали квадрата. Здесь имеется возможность образовывать контакты как с анионными, так и с гетерофильными участками холинорецептора. В то же время дикатионы с N—N-расстояпнем порядка 1,4 нм (структура С-10) реагируют по сторонам квадрата, а с эстерофильпыми участками контактов образовывать ие могут.
64
1.4 ны
Рис. 18. Расположение субъединиц в тетрамерном Н-холпиорецепторс скелетных мышц [Хромов-Борисов Н. В., 1982].
В нашей стране с помощью аналога а-бунгаротоксина нейротоксина II из яда среднеазиатской кобры Naja naja oxiana н его сцип-мечепых производных впервые удалось получить прямые экспериментальные данные об особенностях пространственного строения не только самого токсина, по и ацетилхолинового рецептора, выделенного из электрического органа ската Torpedo mormorata [Овчинников Ю.А., 1981]. Данные ЭПР показали, что спиновая метка, связанная с остатком лизина в положении 44 (рис. 19), экспонирована во внешнюю среду и не участвует в образовании токснн-рецепторного комплекса, по в связывании нейротоксина с рецептором принимает участие большое число заряженных и гидрофобных группировок нейротоксина. Связывание не сводится к проникновению центральной петли нейротоксина в некую полость в рецепторе, как это предполагали ранее. Напротив, нейротоксин накрывает рецептор значительной частью своей поверхности.
Благодаря жесткости молекулы нейротоксина та часть молекулы, которая связывается с рецептором, может рассматриваться как «отражение» соответствующей поверхности рецептора, что дает возможность оценить размеры участка рецептора, связывающего токсин. Эти размеры достаточно велики, учитывая, что расстояние между отдельными связывающими группировками токсина лежат в интервале 1,5 — 3,5 им, а диаметр одной молекулы ацетилхолинового рецептора составляет -7,5
1.3Ж.227
65
Рис. 19. Связывание нейротоксина с ацетилхолиновым рецептором по данным ЭПР [Овчинников Ю. А., 1981]
Uys 15
Ацетилхолиновый рецептор
6
Lys 36
Lys 46
Lys 25
His
Lyt 44
им и на ней связываются две молекулы нейротоксина. Дальнейшие исследования были направлены па выяснение химической структуры субъединиц (a, b, g, d), образующих Н-холи-норецеитор, и их топографию. Оказалось, что Н-холинорецец-тор электрического органа и скелетных мышц представляет собой пептамер, состоящий из a, b, g и d-субъединиц в соотношении 2:Г.1:1 соответственно. С возрастом выявлена возможность замены гамма-субъедипицы на е-субъедииицу, что изменяет биофизические свойства Н-холинореценторов. У a, b, g, d-субъедипиц сходство в аминокислотной последовательности составляет около 40%, что свидетельствует о существовании одного общего исходного гена, которые в процессе инволюции превратились в четыре разных, но близких но своему строению генов, которые кодируют Н-холннорецепторы. Есть предположения, что Н-холипорецепторы представляют собой прототипы других рецепторов (возбуждающих и ингибирующих аминокислот, 5-НТ3-серотониновых рецепторов), которые формируют ионные трансмембранные каналы. Молекулярная структура Н-холинорецептора представлена на рис. 20.
Нейрональные Н-холинорецепторы в ЦНС также состоят из 5 субъединиц. С помощью метода клонирования их генов выявлена гетерогенность альфа-субъединиц (их обнаружено 8) и бета-субъединиц (их обнаружено 3). Нейрональные Н-холипорецепторы имеют пре- и ностсицацтическую локализацию. Они характеризуются различиями в селективности по отпошешш к проницаемости для ионов натрия и кальция и не исключено, что их функция в ЦНС может заключаться не только в опосредовании быстрой трансси паити ческой передачи информации.
66
Н-хол инорецептор
а,— субъединица нгЫ а — не субъединица H2N
±1 S-S -1-—L
CZJ-COOH
-----CZ3-COOH
Рис. 20. Молекулярная структура Н-холинорецептора.
А —гипотетическая схема Н-холинорецептора без у-субъединицы. Все субъединицы образуют канал, проницаемость которого регулируется ацетилхолином. Участки связывания ацетилхолина показаны стрелками.
Б — продольный срез Н-холинорецептора. Изображение получено с помощью электронной микроскопии.
В — поперечный срез Н-холинорепептора, полученный на расстоянии 30 А от плоскости мембраны.
Г — линейное строение субъединиц Н-холинорецептора.
В каждом случае N-коицсвая часть, состоящая из 200 аминокислотных остатков, формирует внеклеточную часть рецептора. Далее следуют гидрофобные домены Н-холинорецептора М.М4, которые находятся внутри плазматической мембраны М2-область образования а-спиралыо. М2-области 5 субъединиц формируют внутреннюю часть ионного канала рецептора.
Величина Кд взаимодействия ацетилхолина с Н-холиноре-цепторами, находящимися в составе постсииаптических мембран, ио данным Е. de Robertis и J.Schcaht (1974), близка к Ю'6 М, а очищенные рецепторы обладают сродством к ацетилхолину в 10 —100 раз более низким [Meunier J.C. et al., 1974].
Биологическое значение олигомеризации холинорецептора, но-видимому, заключается в кооперативном характере его взаимодействия с ацетилхолином (облегчение связывания ацетилхолина с одной субъединицей после взаимодействия ацетилхолина с другой субъединицей).
S*
67
Кинетика взаимодействия веществ с холииорецеиторами постоянно привлекает внимание исследователей. Ее изучают пока в основном косвенными методами. При этом интерпретация результатов, получаемых при изучении действия холино-миметиков, затруднена тем, что в соответствии с теориями Ариепса и Стефенсона (см.главу 2) нет линейной зависимости между концентрацией комплекса вещество — Н-холицоре-центор, определяемой по величине фармакологического ответа, и величиной этого ответа [Зеймаль Э.В., 1975]. Исследование кинетики взаимодействия Н-холиномиметиков с рецепторами возможно, так как блокирующее действие, по-видимому, определяется только концентрацией комплекса вещество — рецептор. Различия в характере действия Н-холиномиметиков и Н-холинолитиков можно объяснить с помощью теории Пейтона (см.главу 2), а именно, чем прочнее соединяется вещество с Н-холинорецепторами (при малых Ктем сильнее выражены его холинолитические свойства.
1.4, Н-холинергические механизмы
Н-холипорецепторы локализованы в различных клетках с неодинаковой функцией и опосредуют трансформацию молекулярного сигнала ацетилхолина в каждом случае в специфический определенный физиологический ответ той или иной клетки. В иервпо-мышечиом синапсе Н-холииорецепторы опосредуют деполяризацию постсилаптической мембраны вследствие увеличения проницаемости для катионов и таким обра
68
зом — сокращение скелетных мышц. В ЦНС Н-холинорецец-торы регулируют функцию нейронов, в вегетативных ганглиях —опосредуют деполяризацию постгацглиоцарных нейронов, а в мозговом слое надпочечников — секрецию катехоламинов (Сергеев П.В. и др., 1996).
Образование комплекса агоиист-Н-холинорецептор сопровождается изменением проницаемости мембран для катионов.
Проведение целого комплекса фармакологических, биохимических и электрон ио-микроскопических исследований дало возможность постулировать, что белковые субъединицы Н-холипорецепторов перекрывают всю толщу мембраны, значительно выступают над обоими слоями мембраны и образуют каналы, способные пропускать ионы (рис. 21). Гидрофобной поверхностью Н-холицорецептор контактирует с белками и липидами мембраны, а центральная часть рецепторов образована гидрофильными аминокислотными остатками и легко пропускает ионы [Allen Т. etal., 1974, 1975; Поттер Л., 1978; Morley D, J., 1981]. Считается, что в состоянии покоя ионные каналы, образуемые Н-холииореценторами, закрыты. Для активации одного Н-холинорецецтора необходимы, ио крайней мере, две молекулы агониста, которые взаимодействуют с ним кооперативным образом. Вследствие конформационной перестройки, возникающей при взаимодействии ацетилхолина с выступающими из наружной поверхности клеток концами рецепторных молекул, каналы па несколько миллисекунд открываются для Na+, К+ и Са2+, что обеспечивает прохождение нескольких десятков тысяч иолов за одну миллисекунду. После активации рецепторные молекулы теряют па некоторое время чувствительность к агонистам (явление десепситизации).
Было замечено, что скорость исчезновения чувствительности зависит от концентрации действующего агониста. Этот процесс может протекать намного быстрее восстановления чувствительности [Rang N., Ritter J., 1970; Rang N.P., 1973]. Одиако скорость восстановления не зависит пи от концентрации агониста и его эффективности, пи от скорости и величины исчезновения чувствительности. В связи с этим предполагается, что для комплексов агонистов (А) с инактивированными рецепторами ( *Рц) характерна низкая скорость диссоциации, а свободные, по лишенные чувствительности рецепторы, подвергаются реактивации в исходную форму (Рц) с постоянной скоростью:
69
ki
А+*РЦ <->A*PL
где
к2,
>К. I
1с 1с
*2' х2
кг+к2-к2 + к, кг
Несомненно, что помимо этих реакций, происходящих на уровне агонист-рецепторных взаимодействий, на процесс исчезновения чувствительности могут влиять другие факторы, такие как поляризация мембраны и концентрация иолов,
В этой связи важно отметить, что 4-амицониридин концентрационно-зависимым образом ингибирует десепситизацию рецепторов концевой пластинки диафрагмы крыс, вызываемую карба-холом [Vital В.О. et al., 1982]. Кальций подавлял эффект 4-аминопиридина. Можно полагать, что 4-амицопиридин влияет на комплекс ацетилхолиновый рецептор - ионный канал или па липиды, окружающие этот капал в постсипаптической мембране концевой пластинки.
Как уже отмечалось, Н-холипорецепторы, кроме участков связывания агонистов, содержат другие регуляторные участки связывания, поэтому изучение влияния холинергических антагонистов и нейротоксинов на функцию Н-холипореценторов позволяет получать новую информацию об Н-холииергаческих механизмах. Выявлено, что холинергические антагонисты, такие как атропин, гексаметоний и декаметоций, по неконкурентному механизму ингибируют Н-холицорецеиторы вегетативных ганглиев [Ascher P. et al., 1979], нервно-мышечных синапсов [Mannalis R.S., 1977; Katz В., Miledi R., 1978; Colquhoin D., Sheridan R., 1979; Colquhojn D. et al., 1979] и хромаффинных клеток надпочечников [Kilpatrick D.L. et al., 1981]. Гистрицикотоксиц, связываясь с Н-холи иорецептором в участках, отличных от участков связывания агонистов, уменьшает ток ионов через рецепторные каналы [Hoidmann Т., Changeux J.-P., 1978]. Этот агент неконкурентно ингибировал активацию Н-холинорецепторов нервно-мышечного синапса [Dolly J.O. et al., 1977], выделенных из электрических органов рыб [Kato G., Changeux J.P., 1976], и клеток мозгового вещества надпочечников быка [Kilpatrick D.L. et al., 1981].
70
Батрахотоксип, аконитин и вератридиц в присутствии тет-родотоксипа ингибировали никотинстимулируемую секрецию катехоламинов из хромаффинных клеток надпочечников [Kilpatrick D. et al., 1981] и проведение импульсов в нервно-мышечном синапсе [Albuqueque Е., Daly J., 1977]. В норме никотин, взаимодействуя с Н-холицорецепторами, увеличивает ток Na+ в клетку через тетродотоксиичувствительцые каналы. Это приводит к деполяризации мембраны и активации входа Са2* в клетки. В среде без ионов Na+ нейротоксины стимулируют секрецию катехоламинов и при отсутствии тет-родотоксина. Яд скорпиона, который увеличивает вход Ыа+ через тетродотоксиичувствительцые каналы, не ингибирует стимулирующее действие никотина па секрецию катехоламинов. Поэтому можно считать, что ингибирующее влияние нейротоксинов на секрецию катехоламинов не обусловлено их взаимодействием с тетродотоксиинечувствительпыми натриевыми каналами, а связано с их действием на ионные каналы Н-холино-рецентора.
Кроме того, эти эксперименты показали, что лимитирующим этапом эффекта никотина в данном случае является вход Са2+ в клетку. Отметим, что зависимость от Са2+ — непременное условие сопряжения активации Н-холинорецептора с физиологическим эффектом. Она обусловлена повышением проницаемости мембран для Са2+. Это справедливо и для препаратов двигательный нерв— скелетная мышца, и для ностсипанти-ческих Н-холинорецепторов в мозговом веществе надпочечников, и для нейронов вегетативных ганглиев. Хотя еще точные механизмы сопряжения Н-холинорецепторов с процессами тока Са2+ через мембраны во многом не изучены, уже сейчас можно сказать, что одним из путей фармакологической регуляции функциональной активности Н-холинергических систем может быть не только процесс узнавания Н-холинергиче-ских агонистов, но и последующие этаны сопряжения Н-холинорецепторов с эффекторной системой, регулирующей транспорт Na+ и Са2* через мембраны.
Важно отметить, что некоторые классические Н-холинобло-каторы (например, декаметоний, d-тубокурарип) обладают также свойствами агонистов, являясь по существу частичными агонистами в отношении Н-холипорецепторов скелетных мышц [Adams P.R., Sakmann В., 1978; Trantman А., 1982]. Оказалось, что некоторые курареиодобпые вещества не только конкурентно блокируют действие ацетилхолина в первио-мышеч-пом синапсе, по и сами способны вызывать деполяризацию мышечных волокон крыс [Trantman А., 1982]. При увеличе-
71
Дгоииог Антагонист
Бионаюр канала
Рис. 22. Функционирование Н-холипорсцсптора при воздействии агониста (ацетилхолина), антагонистов (курареподобиых веществ) н ЛВ, блокирующих ионный канал рецептора (анестетики, декамстоппй и др.) [Dreyer F., 1982].
иии концентрации тубокурарина частота открытия натриевых каналов в этих волокнах уменьшалась, а при увеличении концентрации ацетилхолина она повышалась.
По характеру влияния на нервно-мышечную передачу различные лекарственные вещества можно классифицировать следующим образом:
1) ЛВ, блокирующие открытый капал Н-холилорецепторов. К этой группе относятся местпоапестезирующие препараты, барбитураты, атропин, преднизолон, амантадин, хинакрцц, этидия бромид [Dreyer F., 1982]. Большинство из этих веществ имеют более сильное сродство к ионным каналам этого рецептора в открытом, чем в закрытом состоянии.
2) ЛВ, конкурирующие с ацетилхолином за связывание с Н-холицореценторами. К таким веществам относятся классические конкурентные антагонисты тубокурарип и галламин. Они имеют высокое сродство не только к участкам, узнающим ацетилхолин, по и к ИОШ1ЫМ каналам в открытом состоянии.
3) ЛВ, вызывающие последовательно открытие и блокирование ионных каналов Н-холипорецепторов. Примером таких веществ может служить декаметоний.
4) ЛВ, влияющие па липидное окружение Н-холинорецен-торов и тем самым изменяющие свойства их ионных каналов. Возможно, что таким образом действуют наркотические средства и алкоголь [Colquhoun D., 1983].
5) ЛВ, влияющие ла десеиснтизацию Н-холинорецеиторов — процесс, сопровождающийся закрытием ионных каналов. Как уже указывалось, веществом, ингибирующим десеиснтизацию, является 4 -ами1 юиир] 1дш1.
72
Для лучшего представления функционирования Н-хо-липореценторов при различных воздействиях можно обратиться к рис. 22, па котором изображены возможные механизмы действия ЛВ, индуцирующих блокаду ионной проводимости через канал, образуемый Н-холинорецелтором.
1.5, Вариабельность Н-холинорецепторов
Проблема, связанная с выяснением механизмов регуляции количества Н-холипореценторов и их способности взаимодействовать с лигандами, кроме теоретического, имеет и большое практическое значение.
По данным Л.Поттер (1979), после денервации скелетной мышцы лягушки наблюдается постепенное увеличение участков, связывающих а-бунгаротоксин. Через 2 —3 педели оно превышает нормальный уровень в 10 — 20 раз. Кроме того, для Н-холи-порецеиторов имеется (свойственный им и инсулиновым рецепторам) другой путь изменения их числа. При аутоиммунном заболевании (например, миастения) развивается гуморальная и клеточная иммунная реакция против Н-холинорецепторов [Drachman D.B., 1978; Conti Т. et al., 1979; Richman D.P. et al., 1979], что приводит к уменьшению числа Н-холипорецепторов па цостспнаптической мембране нервно-мышечного синапса и служит основной причиной нарушения нервно-мышечной передачи. У больных с этим заболеванием обнаружены антитела против Н-холинорецепторов [ Anpel S.N., Elias S., 1979], а введешюживотным IgG-аптител, выделенных у данных больных, сопровождается возникновением симптомов миастении [Togka K.U. et al., 1977].
F.Clementi и соавт. (1982) установили, что деградация Н-хо-линорецепторов в культуре мышечных клеток ВСЗН в норме или вызываемая антителами, не зависит от внеклеточного Са2+ и уменьшается в присутствии бацитрацина, метиламина и хлорида аммония. Антитела против холинорецепторов увеличивали число эпдоцитозиых везикул в этих клетках, но не влияли на скорость синтеза холинорецепторов. Рецепторы для холипоми-метиков, так же как и для (J-адреномиметиков, инсулина, трийод-тиронипа и других физиологически активных веществ после связывания агонистов образуют кластеры в определенных участках плазмолеммы и затем подвергаются интернализации путем эидо-циюза [Higuchi Н.К. et al., 1982]. Образующиеся из везикул
73
эндосомы сливаются с лизосомами, в которых происходит деградация рецепторов. A.Messing (1982) показал, что агонисты, снижающие число нейрональных рецепторов, связывающих «-бунгаротоксин, увеличивают деградацию Н-холипорецеиторов.
По данным F.Clementi и соавт. (1983), лизосомотропные вещества, ингибирующие функцию лизосом, уменьшают деградацию Н-холинореценторов, по не их интернализацию.
Таким образом, можно сделать вывод, что антитела против Н-холинорецепторов нарушают функцию первцо-мышеч-ного синапса вследствие увеличения скорости деградации этих рецепторов, опосредованную эндосомами и лизосомами.
По нашему мнению, такое своеобразное явление для Н-хо-линорецепторов, как возможность возникновения к ним аутоиммунных антител, может быть связано со значительным выступанием молекул Н-холипорецеиторов из мембраны и с легкостью взаимодействия с ними не только специфических агонистов, по и других молекул, в частности белков и клеток иммушюй системы.
1.6. Н-холинорецепторы — мишень действия ЛВ
Используемые в настоящее время в клинике Н-холиперги-ческие фармаконренараты имеют точкой своего приложения пейроэффекторпые синапсы диигателыюй нервной системы, ганглии и некоторые хемочувствительные структуры (синокаротидная зона). Агонисты Н-холинорецепторов (например, ло-белип) используются в качестве непрямых стимуляторов дыхательного центра, возбуждая Н-холипорецепторы синокаротидной зоны. Лобелии но сравнению с никотином оказывает более слабые ганглионарные эффекты и в меньшей степени, чем никотин, высвобождает катехоламины из мозгового вещества надпочечников и других органов, повышая артериальное давление. Однако в отличие от никотина лобелии неконкурентно, без деполяризации блокирует Н-холииорецепто-ры скелетных мышц [Leone L. et al., 1981]. Из веществ смешанного типа действия (одновременное возбуждение Н- и М-холипорецепторов) преимущественно влияет на Н-холи-норецепторы карбахолиц. Для пего характерны ликотииопо-добиые ганглионарные эффекты.
Значительно чаще в клинике применяются блокаторы Н-холинорецепторов, среди которых выделяют две группы пренара-
74
тов: ганглиоблокаторы и миорелаксанты. Это деление обусловлено гетерогенностью Н-холинорецепторов ганглиев вегетативной нервной системы и концевых пластинок скелетных мышц. Препараты эти хорошо известны и описаны во многих обзорах, учебниках и руководствах [Закусов В.В. 1979; Аничков С.В., 1982; Харкевич Д.А., 1983]. Нам приятно отметить, что проведение фундаментальных исследований строения Н-холипо-рецепторов отечественными учеными [Михельсон М.Я., Зей-маль Э.В., 1970; Хромов-Борисов Н.В., 1982; Харкевич Д.А., 1983] создало теоретические основы синтеза миорелаксантов, имеющих большое значение в практической фармакологии.
Кроме того, имеется ряд препаратов, которые тормозят высвобождение катехоламинов, вызываемое Н-холипомиметика-ми. В указанную группу входят: 1) а-адрепергические агонисты; 2) М-холинергические агонисты; 3) простагландины; 4) местпоапестезирующие вещества; 5) препараты, блокирующие адренергический нейрон (бретилий); 6) вещества, влияющие на пейротубулы (колхицин и винбластин) [Лоф-фелхолз К., 1982]. Считается, что эти препараты действуют на поступление Са2+, необходимого для инициации секреции, или нарушают дальнейшие стадии экзоцитоза. Приведенный пример указывает па важность изучения не только взаимодействия ЛВ с тем или иным видом рецепторов, по и всех этапов трансформации молекулярного сигнала в биохимический и физиологический ответ клетки, которые тоже могут быть мишенью действия различных фармакоирепаратов.
1.7. Фармакологическая и биохимическая характеристика М-холинорецепторов
Как известно, мускариновым агонистам свойственны такие эффекты, как сужение зрачка, сокращение пеисчерченпых мышц, иннервируемых парасимпатическими волокнами, стимуляция секреции слюнных и желудочных желез, комплексное изменение функций сердечно-сосудистой системы и др. Однако в большинстве фармакологических исследований М-холинорецепторов определяли способность холинергических средств влиять на сокращение пеисчерченпых мышц (чаще всего подвздошной кишки) и на артериальное давление [Stephenson R., 1956; Rang Н.Р., 1966; Bebbington P.W.et al., 1966]. Позднее с развитием техники микроионофореза и микроэлектродов появилась возможность изучать изменения мембрап-
75
цого потенциала при воздействии М-холипергических веществ [Bolton Т.В., 1972; Purves R.,1974]. Еще позднее было показано, что биологическим тестом функционирования М-холи-порецепторов может служить опосредование ими образования цГМФ [Honma М., Ui М., 1978; Richelson Е., El-Fakahany Е., 1981], Много ценной информации об М-холшюрецепторах было получено с помощью радиолигапдов. Известно, что наибольшая плотность М-холицорецепторов имеется в экстрапирамид-ной системе мозга [Hiley C.R., Bergen A.S.V. ,1974; Yamamura H.I., Snyder S.H., 1974] и что различные вещества (Na+, гуаниновые нуклеотиды) по-разному влияют на связывание агонистов и антагонистов с мускариновыми рецепторами [Ehlert F. J. et al,, 1980; El-Fakahany E.,Richelson E., 1981].
Более рашше экснеримептальныеданцые об М-холинорецелто-рах свидетельствовали об их гомогенности. Однако появление новых лигандов этих рецепторов позволило в ряде случаев выявить их неоднородность.
R.B. Barlow и соавт. (1972), изучив взаимодействие 28 антагонистов с М-холипорецепторами подвздошной кишки, бронхиальных мышц и радужки морской свинки, не обнаружили различий этих рецепторов в перечисленных тканях, К аналогичному выводу пришли T.Iuch и соавт. (1973) об М-холипорецепторах ЦНС, радужки, слюнных желез и подвздошной кишки, а также A.Beld и соавт. (1975) об М-холинореценторах мышцы трахеи, паращитовидной железы и хвостатого ядра.
Однако R.Barlow и соавт. (1976) обнаружили, что некоторые соединения имеют в 20 раз большее сродство к М-холипорецепто-рам подвздошной кишки, чем предсердия. В то же время никаких обобщений о специфичности рецепторов подвздошной кишки и предсердия этими авторами сделано не было.
С.Li и F.Mitchelson (1980) изучили антимускарииовую активность двух нейромышечных блокаторов стеркуропия и галламипа в отношении предсердия, подвздошной кишки н мочевого пузыря морских свинок. Оказалось, что оба антагониста имеют большее сродство к рецепторам сердца, чем к рецепторам подвздошной кишки и мочевого пузыря.
D.A.Brown и соавт. (1980), изучив влияние четырех антагонистов на деполяризацию изолированного верхнего шейного ганглия и па сокращение подвздошной кишки, пришли к выводу о неидентпчпости М-холипорецепторов в этих тканях; стеркуропий и нирепзепин имеют большое сродство к рецепторам ганглия, Д-дифепилацетоксии-М'-метилшшеридии — к рецепторам подяздошиой кишки, N-метилскоцоламип денст-
76
вовал на рецепторы этих тканей одинаково. Более того, если N-метилско иол амии и атропин одинаково связывались с М-холипорецепторамн гомогенатов головного мозга, желез, сердца и пеисчерчепных мышц, то пирензешш —различно [Hammer R. et al., 1980; Birdsall N. et al., 1980], что указывает на существование подклассов М-холипорецепторов.
В отличие от атропина сековирип также имел различное сродство к рецепторам подвздошной кишки и трахеи, с одной стороны, и к рецепторам радужки и желез — с другой [Zwagemakers J.M., Classen V., 1980, 1981].
Свойства нресипаитических М-холинорецепторов не отличаются от фармакологических характеристик центральных и периферических постсинаптическнх М-холинорецепторов [Bower D., Marek К., 1982].
C.Labrid и соавт. (1974), изучая ацтихолинергическую активность двух производных скополамина по отношению к агонистам, обнаружили конкурентное взаимодействие для ацетилхолина и фуртретопия и одновременно конкурентное и неконкурентное взаимодействие для ареколина и карбахола. Они выдвинули гипотезу о том, что существуют ^М-холино-реценторы, чувствительные к первым двум агонистам, и ГЦМ-холипорецепторы, чувствительные к карбахолу и ареколину.
R.Barlow и соавт. (1980) показали, что некоторые холино-миметики (3- и Д-ацттокси-Ы-метилпиперидилметиодид и ме-тахолин) в отличие от ацетилтропина неодинаково влияют на сокращение мышц подвздошной кишки, силу и частоту сокращений мышц предсердия морской свинки. На этом основании они выделили М1-рецепторы подвздошной кишки и М2 и М3-реценторы предсердия.
L.Brasili и соавт. (1981) синтезировали два производных оксотиолаиа, для которых атропин был неконкурентным антагонистом и которые позволили отдифференцировать М-холи-пореценторы кишечника, миокарда и трахеи.
В то же время необходимо отметить, что для агонистов иет такой корреляции, как для антагонистов в отношении их сродства к М-холинорецепторам, определяемого из кривых доза-эффект или с помощью изучения связывания радиолигаядов [Triggle D.J., 1979].
Основным доказательством гетерогенности М-холшюрецепто-ров является тот факт, что аптагопист пиреизепии имеет неодинаковое сродство к М-холинорецепторам различной локализации
77
[Birdsall N. et al., 1980; Hammer R. et al., 1980]. Мускариновые рецепторы, имеющие высокое сродство к пирепэеиипу, превалируют в различных областях головного мозга и периферических ганглиях млекопитающих, а рецепторы с низким сродством к пирепзепину — в сердце, пеисчерченпых мышцах верхних отделов желудочно-кишечного тракта и мочевого пузыря [Birdsall N. et al., 1980; Hammer R., 1980; Hammer R. et al., 1980]. В ганглиях эти М-холинорецепторы опосредуют деполяризацию, а в подвздошной кишке и сердце — сокращение гладких мышц.
Согласно данным R.Hammer и A.Giachetti (1982), атропин связывается с мембранами шейного ганглия теленка с Кд, равной 1,1 нМ, а с мембранами предсердий крыс с Кд, равной 3,2 нМ. В то же время для пиреизенина в предсердии существует один тип связывающих участков (Кд=620 пМ), а в ганглии — два типа связывающих участков (Кд=11 и 280 нМ). Пирензе-пии, обладая равной с атропином способностью блокировать ганглионарную стимуляцию, был по сравнению с атропином на 3 порядка менее эффективным в отношении блокирования брадикардии. Пирензепии и Me N-A-343 имеют избирательность по отношению к М^холинорецепторам. Эти результаты еще раз доказывают гетерогенность М-холипорецепторов, существование возбуждающих ганглионарных М,-рецепторов и М2-рецепторов в эффекторных органах. При изучении способности атропина, 3Н-М-метилскополамнпа, оксифелцикли-мипа, пирензепииа, гликопирроция, изопронамида, полдила и пропантелина конкурировать с 3Н-М-метилскополамином за связывание с М-холинорецепторами гомогената пеисчерчеп-ной мышцы желудка и верхнего шейного ганглия быка. J.C.Brawning и B.V.Heathcote (1983) обнаружили, что все эти вещества, за исключением ннрепзеиина, имеют связывающие свойства, аналогичные классическим антагонистам М-холипо-реценторов. Кроме пирензепииа, во всех случаях наблюдалась корреляция между сродством этих веществ к рецепторам in vivo и их избирательностью действия in vitro. Пирензепии имел сродство к рецепторам ганглия в 14 раз больше, чем к рецепторам пеисчерченпых мышц, что еще раз указывает па гетерогенность М-холинореценторов.
Вопрос о том, какова природа гетерогешюсти М-холипоре-центоров, явился предметом многочисленных исследований. N. J.Birdsall и соавт. (1980) считают, что найденные ими в мозжечке, стволе мозга, гипоталамусе, гиппокампе, коре мозга и полосатом теле три вида рецепторов для агонистов: оксотре-морипа, ацетилхолина, холина (+)- и (-)-метахолина, карбахо-
78
ла, фурметида, пилокарпина, гептил- и нонилтриметиламипа, характеризующиеся очень высоким сродством (ОВС), высоким сродством (ВС) и низким сродством (НС), представляют собой один тип рецепторов, но в различных конформационных состояниях. Это заключение основано на том, что при электрофорезе в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия в мембранах клеток коры и других областей головного мозга обнаруживают только один белковый пик, относящийся к М-холииорецепторам [Birdsall N. et at, 1979]. Считается, что фармакологические эффекты М-холинергических средств опосредованы М-холинорецептором с НС, поскольку в неисчер-чеипых мышцах преимущественно присутствуют именно эти рецепторы [Ehlert F. J. et al., 1979]. В пользу этой гипотезы говорит также тот факт, что гуашшовые нуклеотиды обладают способностью превращать ОВС- и ВС-участки в НС-участки [Ehlert F, J. et al., 1982].
N. J.Birdsall и соавт. (1980) разработали теорию взаимодействия агонистов с рецепторами, которые могут находиться в двух взаимонревращаемых конформациях.
Если константы связывания лиганда с рецептором в дяух состояниях есть К, и К2 и равновесие между двумя состояниями этого рецептора определяется одпомолекулярпой константой равновесия Ка, экспериментальную константу связывания лигапда с рецептором определяют по уравнению:
^«(к^кду/а+кр.
При преобладании одного из состояний Ка« 1 уравнение принимает вид:
- клк2к_.
Если принять, что различие между участками ОВС, ВС и НС обусловлено модификацией равновесия между основным и возбужденным состоянием рецептора, то величина Кя будет различной для участков ОВС, ВС и НС — К^, Кж, К и можно записать следующие уравнения:
к = к, + кж , хоне J £ аовс ’
К = К, + BLK , хвс 1 аве *
79
Удалив из этих уравнений К( и К2, получаем:
При KXOBC»Kwi; (это имеет место в случае М-холинорецепторов головного мозга) и К »К _ можно пренебречь К 11 К » до вс аде * * хде гшс
и тогда получится:
К -К К - К ховс хне _ аовс две
ИЛИ к /к = к /К . хве' хюве аде z апве
Левая часть последнего уравнения представляет собой отношение экспериментальных величии, а правая часть отражает фундаментальные свойства того или иного типа рецептора и не зависит от используемого лиганда.
Среднее значение отношения Кх1м./Кховс для изучаемых шести агонистов равнялось 6,58 -10 2 (±0,53-102). Следовательно, отношение Кж /К^ постоянно, как и требует данная теория.
Отношение К /К._, определяется уравнением:
К К + К,К
К к, + !СК
ХС1ВС I £ ЛОВС
Для оксотреморипа отношение К /К]1о1)(.=5,2-10"'. Следовательно, для этого вещества:
K,+K2K111C = 5,2-10 * (К, + К2К_). или
0.9995К/К = 5,2-Ю*4 К, - К . * 1z 2 т иоде аде
Так как Kf и К2 должны иметь положительные значения 5,2-ПГ4 К > К , * \н)М аде *
следовательно, К, /К . < 5,2-Ю4. хр[С иОгЦ.
Хотя пет возможности определить значения К K.iw. и КШ|С, данное неравенство указывает, что для выраженных агошютов отношение К,/К' больше 103; это соответствует высокой стеле-
80
пи избирательности агонистов к возбужденному состоянию рецепторов. Поскольку маловероятно, что величина >1, то можно считать, что внутреннее сродство агонистов к возбужденному состоянию рецепторов находится в области 106 —109 М’1; эта величина ие сильно отличается от значений сродства антагонистов к основному состоящие рецепторов.
При изучении связывания L- 3Н-хииуклидицилбензила-та с М-холицореценторами сгшаитосомальпых мембран коры головного мозга кошек J.S.Aguilar и соавт. (1982) также выявили гетерогенность этих рецепторов. Результаты но связыванию обрабатывали, используя различные модели: 1) модель для п гетерогенных участков (п=1, 2 или 3) и 2) модель для двух кооперативных участков. Оказалось, что первая модель лучше описывает полученные результаты. Скэтчардовский анализ показал, что Кд =5,2 и К;й=144 нМ; В х1=3(>6 и В„.,,=558 нмоль/ м2 белка. Конкуренция между хинуклидинилбеизилатом и мускариновыми антагонистами атропином и скополамином за связывание с мембранами характеризовалась величинами ICM 1,4 и 3,4 мкМ соответствсшю и коэффициентом Хилла около 1, а конкуренция его с мускариновыми агонистами оксотреморином и карбамилхолином — величинами 1СМ 0,9 и 47 мкМ и коэффициентами Хилла 0,70 в 0,56 соответственно. Из кинетических экспериментов следовало, что процесс диссоциации хину клидилилбецзилата из его комплекса с М-холииорецептора-мл двухфазен: быстрая компонента имеет К =37,7-103 мни'1, а медленная компонента К ( =4,8-Ю3 мин1. Константы скорости ассоциации агониста с рецепторами составили: K|=4,9-10“i и К+2=161- 10"* нмоль 'мшг1. Константы диссоциации, рассчитанные из этих кинетических данных, равнялись К1]=9,7 нМ и К12=342 нМ, что не сильно отличается от результатов, полученных с помощью равновесного диализа. Таким образом, данная работа свидетельствует о наличии двух независимых участков связывания хинуклидииилбепзилата в сипантосомальпых мембранах коры мозге кошек.
О гетерогенности М-холипорецепторов головного мозге крыс свидетельствуют также данные В.В. Виноградова и со-авт. (1984), согласно которым 4-метилпинеридилбепзилат в широком диапазоне доз вызывает двигательную гиперактивность, не оказывая влияния па выработку условного рефлекса пассивного избегания, а троцииовый эфир фецциклопеи-тялгликолевой кислоты воздействует па память п двигательную активность в одинаковых дозах. Скополамин при сопоставлении доз, вызывающих тот и другой эффекты, занимает промежуточное положение.
6 Зак. 227
81
По данным F.J.Ehler (1982), не но всех случаях агонисты и антагонисты конкурируют за одни и те же участки узнавания М-холинорецепторов. Так, показано, что никотиновый антагонист галламии ингибирует М-холипорецецторы сердца не но конкурентному механизму. Возможно, что галламии взаимодействует с участками, отличными от связывания ацетилхолина и классических мускариновых антагонистов.
О гетерогенности М-холипорецепторов свидетельствуют также данные, полученные в лаборатории Д.А.Харкевича. Обнаружено, что би с четвертичные аммониевые соли труксиллипо-вой кислоты обладают выраженной избирательностью но отношению к М-холицореценторам сердца; у кошек производные а-труксиллиновой кислоты апатруксоний и циклобутоний в малых дозах эффективно блокировали М-холинорецепторы сердца, но не М-холииореценторы подвздошной кишки, мочевого пузыря, кровеносных сосудов и слюнных желез. Их антимуска-риповое действие на бронхи было слабым [Kharkevich D.A. et al., 1981]. Избирательность анатруксопия к М-холицореценторам сердца была подтверждена в экспериментах с изолированными предсердиями п подвздошной кишкой крыс. В то время как сродство атропина к этим препаратам было одинаковым, апатруксоний значительно сильнее действовал на предсердие, чем на подвздошную кишку. Избирательное блокирование М-холинорецепторов сердца было выявлено этими авторами также для некоторых бисчетвертичных аммониевых производных с адамантилыпями радикалами —диадоция и декадо-ния, обладающими гидрофобными заместителями, способными образовывать дополнительные связи с М-холинорецепто-рами. В то же время бисчетвертичные аммониевые соли алифатических дикарбоиовых кислот и декаметоний, лишенные гидрофобных заместителей, не обладали анти мускарин о вьем кар-диотропным эффектом.
Важно отметить, что изменение антимускаршеовой активности в ряду бисчетвертичных аммониевых производных а-труксиллиновой кислоты коррелирует с изменением их кура-ренодобпой активности. Однако, как указывают D. A.Kharkevich и соавт. (1981), этот факт не доказывает идентичность мус-кариновых рецепторов сердца с никотиновыми рецепторами концевой пластинки.
Позднее Л.А.Ангелова (1985), изучая сравнительную чувствительность М-холинореценторов разной локализации к холипотропным средствам, также пришла к выводу о гетерогенности М-холинореценторов различных тканей.
Для практической фармакологии важно, что выявленная
82
гетерогенность М-холинорецепторов может позволить создать вещества, избирательно действующие на сердце и бронхи и ле влияющие на экзокринные железы.
По данным D.Krause и L.Edvinsson (1983), ацетилхолин в концентрации IO-6— 3104 М, но не оксотреморин и пилокарпин, вызывает сокращение отрезка изолированной артерии головного мозга кошек, а в концентрации Ю^М ацетилхолин индуцирует ее расширение. В обоих случаях атропин подавлял эффект ацетилхолина, а предварительная обработка артерии фенокси-бепзамипом (10’6М) сопровождалась необратимым блокированием способности ацетилхолина индуцировать сокращение, ио не дилатацию сосуда. При анализе М-холинорецепторов данного сосудистого препарата кошек с помощью 3Н-хипуклиди-нилбепзилата было выявлено, что специфическое с высоким сродством связывание радиолигаида (Кд=610'10М) ингибируется атропином и скополамином в паномолярных концентрациях. Из агонистов наиболее сильно снижал связывание этого лиганда оксотреморин (1СМ=2 мкМ). Важно, что феноксибензамин (10 мкМ) также уменьшал связывание аН-хииуклидипилбензилата с мембранами артерий кошек на 30%.
Ранее этими авторами было выявлено 2 класса М-холинорецепторов в сосудах быка, с которыми связываются холинергические агонисты [Estrada С., Krause D., 1982].
Таким образом, следует считать, что М-холипорецепторы сосудов млекопитающих гетерогенны и их можно дифференцировать с помощью феноксибецзамииа.
L. Nilvenbrant и B.Sparf (1983) изучили связывание ( —)-аН-хинуклидинилбензилата с мускариновыми рецепторами мочевого пузыря и продольной мышцы подвздошной кишки морской свинки. Выявленные параметры связывания (К =2,6-10" 10М в мочевом пузыре и 1,2-10’® М в подвздошной кишке) не подтвердили наличия гетерогенности М-холинорецепторов в данных биопрепаратах. Однако авторы не исключают наличие этой гетерогенности в них, которую, цо-видимому, можно будет определить с помощью антагониста пирензепииа.
Применение методов клонирования генов, кодирующих М-холипорецепторы, подтвердило наличие их гетерогенности и позволило обнаружить их 5 подтипов [Caufield F. et al., 1993].
Все М-холипорецеиторы сопряжены с G-белками, которые регулируют различные эффекторные системы. Стимуляция М, и М3-холипорецепторов сопровождается активацией фосфолипазой С, гидролизом фосфоинозитидов и мобилизацией внутриклеточного
в*
83
кальция. В результате этого прямо или посредством фосфолиро-вапия белков-мишеней возникают кальцийзависимые биохимические эффекты. В то же время стимуляция Мэ- и М4-холипорецеп-торов приводит к ингибированию аденилатциклазы и изменению проницаемости ионных каналов (например, увеличению калиевой проводимости в предсердии). Имеющиеся данные о М-холипоре-центорах обобщены в табл. 1.
Таблица 1.
Фармако-биохимические характеристики М-холинорецепторов
Рецептор Антагонист Ткань Ответ Молекулярный механизм
М< м2 Ч М4 Мз Атропин Пирензепии AF-DX 116 Гексагидро-силадифснп-дол Гпмбации Вегетативные ганглии Сердце Гладкие мышцы, железы Деполяризация Гиперполя-р и з а ц п я t снижение сократимости Сокращение ,увсличе-нис секреции Стимуляция фосфолипазы С, образование фосфоинозитидов и увеличение уровня внутри-клеточного кальция Активация калиевых каналов, ингибирование аденилатциклазы Аналогично рецепторам М2 Аналогично рецепторам М2 Аналогично рецепторам М t
Таким образом, в настоящее время имеется немало работ, свидетельствующих о гетерогенности М-холипореценторов. Однако для понимания ее биологического значения необходимы дальнейшие исследования, направленные па выделение и идентификацию М-холннорецеиторов и сопряженных с ними эффекторных систем, особенно это касается рецепторов М5.
Закапчивая рассмотрение фармако-биохимических свойств М-холинорецепторов, отметим, что М-холииорецснторы име-
84
югся не только в ЦНС и в периферических тканях, иннервируемых парасимпатическими нервами, по и в ряде пеипнервируе-мых клеток. Так, ни связыванию 3Н-хи11уклидипилбе113илата М-холинореценторы идентифицированы на мембранах теней эритроцитов человека [Arowstan K.S. et al., 1977], в нейтрофилах человека [Dulis В.Н. et al., 1974], в лимфоцитах мышей [Gordon М.А. et al., 1974] и в тканевых базофилах (тучные клетки) крыс [Masini Е. et al., 1983]. Данные М-холинорецепторы могут принимать участие в регуляции некоторых важнейших функций этих клеток, например, хемотаксиса нейтрофилов и высвобождения гистамина из тканевых базофилов [Brandina Р. et al., 1980; Masini .Е. et al., 1981]. Несомненно, что их изучению необходимо уделять больше внимания.
1.8. Молекулярные механизмы взаимодействия лигандов
с М-холинорецепторами
Все М-холипом и метики имеют последовательность атомов NCCOCC и содержат катионную заряженную головку. Для проявления агонистической активности необходима эфирная группа или эфирный кислород, а также концевая алкильная группа. Увеличение размеров этой концевой группы приводит к появлению у лигандов антагонистических свойств. Стереоизомерия также имеет несомненное значение во взаимодействии лигандов с М-холинорецепторами; активен только природный изомер мускарина (L=(+)= 2S, 3R, 5S).
При изучении пространственной структуры мускариновых агонистов методом реитгеиоструктурпого анализа R.W.Baker и соавт. (1971) показали, что углы t2(NCCO) и ^(ССОС) н молекуле ацетилхолина равны примерно 70° (рис. 23).
Предполагают, что катионная группа агошгета взаимодействует непосредственно с анионным участком рецептора, таким, например, как карбоксильная группа, и при этом имеется строго специфическая ориентация положительно заряженного азота агониста по отношению к кислороду рецептора. Согласно расчетам Il.Winstein и соавт. (1975), расстояние между N и О составляет 0,3 нм. На рис. 24 показано взаимодействие ацетилхолина с кар-
85
Рис. 23. Молекула ацетилхолина (большой светлый кружок — азот, светлые кружки меньшего размера — атомы углерода, темные большие кружки — атомы кислорода, самые маленькие светлые кружки — атомы водорода). Показаны четыре торзионных угла, из которых наибольший интерес представляют т. (ССОС) и тг (NCCO).
Рис. 24. Взаимодействие ацетилхолина с М-холипорецсптором.
а — ацетилхолин связывается с карбоксильным углеродом и электрофильной группой (в данном случае — гидроксильной, посредством образования водородной связи) рецептора; б — кислород и азот ацетилхолина обозначены символами Р и Q. Указаны угол PNOQ и расстояния |PQj и |PCj [Schulman j.M. et al., 1983[.
боксилыюй группой рецептора; кислород рецептора абстрактно представлен точкой Р па расстоянии 0,3 им от атома N. Эфирная группа или эфирный кислород взаимодействует с другим положительно заряженным участком рецептора, образуя с ним водо-
86
Рис. 25. Контуры молекулярного электростатического потенциала ONAH+...OH- вблизи эфирного кислорода в плоскости СОС (=О). Минимум электростатического потенциала, обозначенный Q, лежит в плоскости СОС па расстоянии 0,12 им от кислорода [Schulman J.M. et al., 1983].
По осям абсцисс и ординат — величина электростатического потенциала.
родную связь. На рис. 25 изображен молекулярный электростатический потенциал между протонированным З-ацетоксихипук-лидинидипом и ОН'в области эфирного кислорода в плоскости СОС=О группы. Электростатический потенциал имеет минимум в точке плоскости, обозначенной Q (см.рис. 25) и расположенной па расстоянии 0,12 нм от кислорода. Точка Q для такого же потенциала, расположенная в аналогичном направлении OQ, найдена для всех агонистов типа NCCOCC (см.рис. 25). Поскольку агонисты связываются с рецепторами с высоким сродством и стереоспецифичностью, следует полагать, что расстояшге между участками связывания рецептора (PQ) есть величина, неизменная для рецептора в активной конформации (для агонистов (PQ) отличается ле более, чем иа 0,03 нм и соответствует 0,58 — 0,66 нм). Следует отметить также, что для образования комплекса агонист — рецептор угол PNOQ также должен иметь строго определенную величину (см.рис. 25). По данным J.M.Schulman и соавт. (1983), конформация мускариновых агонистов, комплементарная рецептору, имеет энергию 13—17 кДж/моль. При анализе мускариновых агонистов, имеющих полужесткую структуру,
87
Таблица 2.
Сравнение величины т(и т,для мускариновых агонистов, определенных методом рентгеноструктурного анализа и с помощью квантово-механических расчетов (для активных конформаций) [Schulman J. М. etal., 1963]
Агонист Кристаллическое состояние Активная конформация
*1 Ь Ъ
Ацетилхолин 79 77 189 132
Р-Метилацетилхолин 217 87 189 132
Мускарин 144 73 159 143
F2268 103 94 158 140
5-Метилфурмегид 174 83 175 125
АСТМ 147 137 150 146
R-N-3-ацетилхннуклидин 76 106 187 122
обнаружено, что мускариновая фармакофора соответствует углу PNOQ, равному 60-117°.
В 1949 г. H.R.Ing сформулировал правило “5 атомов”, согласно которому среди мускариновых агонистов, имеющих структуру R—NMe3, наиболее активные те, у которых R состоит из 5 атомов, включая водород. В дальнейшем это правило было уточнено тем, что для взаимодействия агонистов с М-холпиорецеп-торамц важна не столько длина алкильной цепи, сколько расстояние между эфирной группой и эфирным кислородом и катионной головкой [Armitage A., Ing H.R., 1954]. Данное правило нашло подтверждение в исследованиях P.Pratesi и соавт. (1981), которые показали, что высокая мускариновая активность наблюдается для соединений с расстоянием (PCt) между группой, взаимодействующей с анионным рецепторным участком Р, и концевым атомом, обычно метильным углеродом, подобно 5-метилфур-метиду. Это расстояние равно 0,85 им. Расчет методами квантовой механики конформации ацетилхолина и fi-метилацетил-холииа позволил определить две конформации, соответствующие мускариновой фармакофоре; А-конформер имел т,, равный 189°, т2 составлял 132° и PC, равно 0,85 им, а В-коифор-мер имел 260°, 78° и 0,65 им соответственно [Schulman J.M. et al., 1983]. Исходя из предыдущих рассуждений, следует, что ацетилхолин и р-метилацетилхолип комплементарны мускари-
88
ноной фармакофоре в А-коиформацип. Вместе с тем следует отметить, что для мускариновых агонистов существует более чем одна конформация, соответствующая мускариновой фармакофоре, Так, некоторые агонисты имеют катионную головку различных размеров, алкильные группы у атома азота или фосфор или серу вместо азота.
Учитывая частое использование в литературе таких параметров конформации мускариновых агонистов, как углы и т,, целесообразно привести их значения для ряда агонистов, полученных методами реитгеноструктурного анализа и квантовой механики (табл. 2).
Как видно из таблицы, соответствие между кристаллической структурой и активной конформацией (фармакофоров) изученных агонистов, за исключением АСТМ, отсутствует. Последнее указывает па невозможность использования величин кристаллических углов для определения истинной мускариновой фармакофоры.
Переход от полного к частичному агопизму или антагонизму сопровождается увеличением размеров концевой группы, что следует из величины |PCj. Можно полагать, что частичные агонисты связываются как в участке, опосредующем возникновение биологического стимула, так и в “недействительном” антагонистическом участке. Соотношение величин связывания с этими участками зависит от таких параметров концевой ipyn-пы, как стереохимия, гидрофобность и др. Следовательно, антагонистами являются те вещества, которые имеют слишком большие размеры, чтобы взаимодействовать с активным участком, и связываются прочно с “недействительными’' участками.
Рассмотрение молекулярных механизмов взаимодействия лигандов с М-холнпореце1 порами будет неполным, если не остановиться па значительной зависимости этого взаимодействия от присутствия гуаниновых нуклеотидов. В.Ernst и соадт. (1982) показали, что при отсутствии в среде гуаниновых нуклеотидов антагонист 3Н-хш1уклидипилбепзилат взаимодействует с двумя классами связывающих участков мембран сердца лягушки: с низким сродством (^=733-1О '2 М) и высоким сродством (К =46-1017 М), относительное содержание которых было одинаковым. В присутствии ГФФМГФ (100 мкМ) 3Н-хипуклидииилбензилат связывался с 1 классом участков с высоким сродством (К =44-1 О '® М). ГФФМГФ не влиял иа общее содержание участков связывания этого радиолигапда. Агонист оксотреморин при отсутствии гуаниновых нуклеотидов связывался также с двумя классами
89
участков (К.^28-10’9 М и 400-109 М), относительное содержание которых составило 70 и 30% соответственно. При увеличении концентрации ГФФЫГФ до 10 мкМ относительное содержание центров связывания с высоким сродством снизилось до 33%, а центров связывания с низким сродством увеличилось до 67%. Следует отметить, что в отличие от адренергических и ряда других рецепторов гуаниновые нуклеотиды влияют не только на связывание агонистов, но и антагонистов с М-холипорецептора-ми. Можно полагать, что регуляция сродства лигандов обоих типов к мускариновым холинореценторам осуществляется через ГТФ-связывающий белок и что антагонисты стабилизируют одну, а агонисты — другую форму рецепторов.
V.Georges и соавт. (1982) сообщили о конформационных изменениях М-холинорецепторов мозга крыс, индуцируемых агонистами. Авторы показали, что в микросомной фракции переднего мозга антагонист 3Н-дексемитид взаимодействует с одним классом связывающих центров с Кд=1,1 нМ и В кс=3,25 икмоль на 1 мг белка. Кривая вытеснения связанного ^Н-дексемитида агонистами может быть разложена на две кривые, описывающие связывание агонистов М-холинорецеиторов с высоким сродством (=20%) и с низким сродством (=80%). Сродство карбамил-холина к первым было в 610 раз выше, чем ко вторым. Обработка мембран реагентом на SH-груниы N-этилмалеимидом (1 мМ) при 37°С в течение 20 мин. не изменяла параметров связывания радиолигаида, по повышала среднее сродство агонистов за счет увеличения их сродства к рецепторам с низким сродством; для ацетилхолина, карбамилхолииа, карбамоил-р-метилхо-лииа и оксотреморипа оно увеличивалось в 6,5; 3,6; 1,9 и 1,2 раза соответственно. Агонисты, по не антагонисты увеличивали скорость модификации N-этилмалеимидом рецепторов с низким сродством. По мнению V.Georges и соавт. взаимодействие агонистов с М-холипорецепторами с низким сродством описывается моделью Моно —Уаймена —Шанже, согласно которой равновесие между активной и “неактивной” конформациями этих рецепторов агонисты сдвигают в сторону активной конформации. По-видимому, N-этилмаленмид алкилирует М-холипорецепто-ры с низким сродством или их непосредственное окружение, когда они находятся в активной конформации и стабилизируют их в этой конформации.
Таким образом, как теоретические, так и экспериментальные исследования позволили получить важную информацию о некоторых аспектах молекулярных механизмов взаимодействия лигандов с М-холинореценторами. Дальнейший прогресс в этом направлении, ио-видимому, связан с выделением и очисткой молекул, выполняющих функцию М-холинорецепторов.
90
1.9. Солюбилизация М-холинорецепторов
Использование различных детергентов и фотоаффинных меток позволило выделить макромолекулы М-холинорецепто-ров и получить некоторые сведения об их физико-химических свойствах.
Т. Haga и соавт. (1982) показали, что с помощью холата натрия можно солюбилизировать 40 — 50% мускариновых хо-линореценторов из мембран хвостатого ядра головного мозга свиней. Без предварительной обработки этих мембран карба-милхолином или другими мускариновыми лигандами данный детергент подавлял способность солюбилизованпых М-холинорецепторов связывать 3Н-хинуклидинилбензилат. В то же время предварительная обработка мембран карбамилхоли-пом сохраняла способность этих рецепторов после солюбилизации специфически связывать этот радиолигапд (Кд=58 пМ). Следовательно, мускариновые лиганды стабилизируют М-холинорецепторы при их экстракции холатом натрия и позволяют получать рецепторы, имеющие те же свойства, что и мембранные рецепторы.
Согласно данным H.Repke (1982), М-холипореценторы из мембран головного мозга млекопитающих можно солюбили-зовать смесью дигитонин/гитоиин. При этом выделяется один белок или белок, ас< оциироваштый с гликопротеином.ГТФ (1 мМ) уменьшает сродство агонистов (пилокарпина, оксотремо-рипа) к комплексу М-холинорецептор —гликопротеин в 2 — 3 раза, по не влияет на их сродство к одному рецепторному белку. В то же время связывание антагонистов с обоими препаратами было одинаково.
С помощью фотоаффинпой метки можно выявить две макромолекулы мускаринового рецептора в аденогипофизе крыс. В присутствии Са2+ (1,9 мМ) связывание фотоаффинного антагониста М-холинорецепторов Ы-метил-4-пиперидилазидобензилата, меченного тритием, с гомогенатом аденогипофиза характеризуется двумя К , равными 0,64 ±0,06 и 11,2 ±0,25 нМ, а при отсутствии Са-+ —одной Кд, равной 2,45 ±0,04 нМ. После воздействия УФ-лучами в присутствии Са2+ антагонист связывается с двумя макромолекулами, имеющими Mt 86 000 и 160 000, а при отсутствии Са2+ он ковалентно связывается с одной макромолекулой с Мг 86 000, Можно предположить, что Са2+ индуцирует полимеризацию полипептида (Мг 86 000), в результате которой образуется макромолекула (Мг 160 000), обладающая
91
большим сродством к Ы-метил-4-цинерид и л азидобензил ату, По нашему мнению, исследования в этом направлении весьма перспективны, так как они приближают нас к пониманию молекулярных механизмов функционирования М-холинореценторов.
1.10, М-холинергические механизмы
Многими исследователями показано, что стимуляция мускариновых рецепторов сопровождается увеличением уровня цГМФ в нервной ткани in vivo и in vitro [Houma M., Ui M., 1978; Richelson E., El-Fakahany E,, 1981; Teolato S. et al., 1981; Repke H. et al., 1982]. В связи с этим можно предполагать, что данный циклический нуклеотид принимает участие в реализации мускариноподобного эффекта ацетилхолина.
Из всех изучаемых систем наибольшее повышение уровня цГМФ в результате мускариновой стимуляции наблюдалось в культуре клеток нейробластомы мышей NIE-115 (до 200 раз) [Richelson Е., El-Fakahany Е., 1981]. В этих клетках уровень цГМФ достигал максимума через 30 с и возвращался к исходному состоянию через 2 — 3 мин после воздействия агонистов. Повышение содержания цГМФ характеризовалось зависимостью от Са2т и температуры.
Об участии Са2+ в индукции М-холином и мети кам и образования цГМФ свидетельствуют следующие дачные;
1. Внеклеточный Са2+ необходим для реализации способности М-холипомиметиков повышать уровень цГМФ [Richelson Е. et al., 1978].
2, Блокаторы кальциевого капала (верапамил, Mn2+, Ni2+,Co2+ и La3+) подавляют увеличение синтеза цГМФ при стимуляции М-холицорецепторов [Study R.E. et al., 1978; El-Fakahany E., Richelson E., 1981].
3. Гуанилатциклаза нейробластомы мышей активируется Са2+ [BartjaiX.O. et al., 1978].
4. При действии кальциевого ионофора в присутствии Са2+ на интактные клетки наблюдается увеличение образования цГМФ [El-Fakahany Е., Richelson Е., 1980].
5. Стимуляция М-холинореценторов сопровождается увеличением входа Са2+ в клетки [Rosenberger L., Triggle D., 1979].
Есть все основания считать, что но аналогии с Г^гистамниерги-ческими и а-адренергическими процессами сопряжение М-холи-норецепторон с кальциевым каналом опосредовано фосфатидили-
92
Умэстом связывания М**спмнореце/>тсрой
шн
/ 'Мегабопнзм^ фосфолипид
' бХ до»
для С&2*-
Сократительные элементы
Фосфорил и- - - .Ов2* роваиме?
шшппт
ШШШДОШШ!
Нанял для N** и К*
Гуанмлатциклаза
Рис. 26. Молекулярная модель М-холипорецсптора с указанном трех основных процессов, возникающих после действия агониста.
а — конформационный никл рецепторного белка (включает в себя чувствительную конформацию, определяемую мембранным» липидами и связыванием ГТФ); б —стимуляция М-холинорецептора сопровождается индукцией метаболизма липидов и последующим изменением переноса ионов; в — эффекты, связанные с увеличением уровня свободного Са:+ в клетке [Rcpkc И., 1982].
нознтолом, метаболизм которого увеличивается при активации М-холинорецеиторов. Последовательность молекулярных событий, ведущих к формированию биохимического ответа клетки при стимуляции М-холшюрсцепторов, изображена на рис. 26. Увеличите концентрации Саг+в клетке может приводить, во-первых, к активации гуаиилатциклазы и сшггезу цГМФ; во-вторых, к сокращению мышечных элементов; в-третьих, к фосфорилированию некоторых белков, включая и сам М-холипорецецтор, что по механизму обратной связи вызовет снижение сродства агонистов к рецептору. Образующийся ГТФ со своей стороны также может быть модулятором связывающей способности М-холинорецепторов.
В то же время вопрос о специфической биологической функции цГМФ продолжает быть предметом дискуссии. Вначале предположили, что цГМФ опосредует отрицательный инотропный эффект ацетилхолина [Krause Е. et al., 1972; Nawrath Н., 1977]. Затем, однако, не было выявлено прямой связи между отрицательным инотропным эффектом холинергических агонистов и повы-
93
шепнем уровня цГМФ [Watanabe A., Besch Н., 1975; Brooker G., 1977], В некоторых случаях вещества, повышающие уровень цГМФ в клетках, не вызывали специфических холинергических реакций [Nawrath Н., 1976]. Вместе с тем B.E.Swar и C.D.Woody (1979) показали, что иопофоретическая аппликация цГМФ на нейроны коры мозга приводит к развитию электрофизиологических эффектов, характерных для ацетилхолина. Инкубация ней-робластомпых клеток NIE-115 с цГМФ также сопровождалась появлением гиперполяризации, как и в случае воздействия карба-милхолина [Wastek GJ. et aL, 1981 ].
Рассматривая роль цГМФ, необходимо отметить также его способность влиять на активность фосфодиэстеразы [Mu rad F. et al., 1970] и активировать цАМФ-зависимую протеинкиназу [Miymoto Е. et al., 1979]. В печени стимуляция холииорецеиторов сопровождается увеличением содержания не только цГМФ, но и цАМФ [Подосииикова Н.П. и др., 1984]. Дальнейшие исследования должны уточнить роль циклических нуклеотидов как вторичных посредников эффектов ацетилхолина и его агонистов. Однако, но нашему мнению, нужно также иметь в виду, что ряд биохимических эффектов, связанных со стимуляцией М-холинореценторов, может быть обусловлен продуктами обмена фосфатидилинозитола и Са2+.
Отметим, что ряд веществ, таких, например, как галоидалкила-мипы (фепоксибезамин, дибенамип), могут изменять функционирование М-холинергической системы, связываясь в большей степени с сопряженными с рецепторами кальциевыми каналами, чем с самими М-холипореценторами [Richelson Е., El-Fakahany Е>, 1981]. При этом именно сродством галоидалкиламипов к кальциевым каналам можно объяснить их способность блокировать функцию других рецепторов (а-адренергических, Гргистаминовых, серотониновых, дофаминовых и опиатных), также сопряженных с кальциевыми каналами.
К факторам, влияющим па сопряжение М-холипорецепторов с кальциевыми каналами, относятся лантаноиды, которое имеют большее, чем Са2+, сродство к участкам, его связывающим [El-Fakahany Е., Richelson Е., 1981].
Необходимо отметить, что имеются также данные о сопряжении М-холипорецепторов с аденилатциклазой [Murad F. et al., 1968]. В сердце активация этих рецепторов сопровождается ингибированием активности аденилатциклазы [Brawn J.H., 1979; Jakobs К.Н., 1979]. Гуаниновые нуклеотиды и Na* усиливают дан-
94
пыЙ эффект холинергических агонистов [Watanabe A. et al., 1978; Jakobs К. et al., 1979]. Предполагается, что в сопряжении М'холинорецепторов с адеиилатциклазой принимает участие ГТФ/ГДФ-связывающий белок (G-белок) [Hossy М.М, 1983].
Как и в случае других рецепторов, вслед за активацией М-холинорецецторов развивается их десепситизация, причем де-сенситизация к ацетилхолину может быть специфической и не-специфической. Как показали G.L.Cantoni и J.L.Eastman (1946), песиецифическая десепситизация М-холипорецепторов развивается после инкубации подвздошной кишки морской свинки с высокими концентрациями ацетилхолина или гистамина (контрактильный ответ исчезал для любого агониста). В то же время десеиси-тизация была специфической для рецепторов прямой кишки, которая после инкубации с гистамином теряла чувствительность к нему, цо не к ацетилхолину [Barsoum G.S., Gaddum J.H., 1935].
Согласно данным Е.Richelson (1978), при инкубации клеток нейробластомы мышей NIE-115 с мускариновыми агонистами в течение 30 мин. происходит быстрая и специфическая потеря способности клеток отвечать повышением уровня цГМФ при стимуляции М-холинорецепторов, по способность этих клеток связывать радиолигапды-агонисты не изменяется. Скорость развития этой десенситизации зависела от концентрации агониста и его эффективности, но не зависела от синтеза цГМФ и не выявлялась при температуре ниже 20 °C [El-Fakahany Е., Richelson Е., 1980]. После удаления агониста наблюдалось восстановление чувствительности (ресеиситизация) с t|/2, равным 13 мин. [Richelson Е., 1978]. Скорость ресепситизации не зависела от концентрации или типа агониста, что указывает па ее инициацию после диссоциации агониста от рецептора. Ресеиситизация также характеризовалась зависимостью от температуры. Величины энергий активации десенситизации и ресепситизации (59 и 96 кДж/моль соответственно) свидетельствуют о конформационных изменениях рецепторного белка во время этих процессов [El-Fakahany Е., Richelson Е., 1980]. Результаты исследований Е.El-Fakahany и E.Richelson (1980) свидетельствуют о том, что быстро наступающая десепситизация обусловлена инактивацией кальциевых каналов, сопряжет шх с М-холинорецепторами.
В отличие от короткодляшейся десенситизации в условиях длительной десенситизации, развивающейся при инкубации клеток с карбамилхолипом (1 мМ) в течение более чем 1 ч, происходит снижение числа M-холинорецепторов и их сродства к радиолигап-
95
дам-аптагонистам [Taylor J.E. et al., 1979]. После удаления агонистов возвращение числа рецепторов к исходному уровню происходило быстрее (t]/2=6 ч), чем их функции (t ,.,=16 ч).
Можно полагать, что снижение числа М-холипореценторов при длительной стимуляции обусловлено их фосфорилированием, так как.но данным R.D.Burgone и В.Pearce (1981),карбахол с одинаковой временной зависимостью индуцирует в нервной культуре клеток мозжечка крыс фосфорилирование трех белков с Mf 75 500, 67 000 и 62 000 и уменьшение числа участков, связывающих 3Н-хипуклидипилбепзилат. R.D.Burgoyne (1983) также показал снижение связывания этого мускаринового антагониста с сипан-тосомальпыми мембранами клеток головного мозга крыс в условиях фосфорилирования (присутствие в среде инкубации Mg2+, АТФ и цАМФ). Данное снижение числа М-холипореценторов было калмодулиизависимым и сопровождалось пропорциональным увеличением числа связывающих участков с ОВС по отношению к участкам с ВС.
По нашему мнению, фосфорилирование может быть одним из механизмов развития десеиситизации и других типов рецепторов, поскольку в присутствии Mg2+, АТФ или ГТФ наблюдается уменьшение способности вазопрессина [Roy С. et al., 1976], лютеинизирующего гормона [Boskaert J. et al., 1976], агонистов 0-адреиорецепторов [Anderson W.B,, Jawarski С., 1979; Levitzki A., Atlas D., 1981] и глюкагона [Solomon Y. et al., 1981] специфически влиять на аде-нилатциклазу.
Таким образом, имеющиеся сведения позволяют иредположгггь следующую схему функционирования М-холинорецепторов.
Агонист (А), взаимодействуя с интактным М-холипорецеи-тором (Р), вызывает изменение его конформации (₽'), после чего у пего появляется способность образовывать комплекс с эффекторной системой (Е) (возможно, ферментом, катализирующим метаболизм фосфатидилинозитола). В результате активации этого фермента (Е') происходит открытие кальциевого канала (КК) и он переходит в состояние повышенной проницаемости для Са2+ (КК'). Если деградации агониста не происходит, то комплекс агопист —рецептор —эффектор не диссоциирует, и он (комплекс) переходит в дес енснтизпрованное состояние (АРЕ° КК°). Кальций и лантаноиды в качестве аллостерических активаторов способствуют образованию этого комплекса. Антагонисты тина галоидалкиламипов (С) могут взаимодействовать как с рецептором, так и с кальциевым каналом, а
96
чистые антагонисты типа атропина (В) обратимо взаимодействуют только с самим рецептором. Процесс ресенситизации включает в себя диссоциацию комплекса агониста с рецептором и циклическое возвращение системы в исходное состояние.
С-Р СКК
t +С +е +с t
A + P^=t Д-Р А-Р'-Е' AP'-E'.KK^t w в-p АР' E' • KK' Биохимический ответ
I А + Р + Е4-КК *=*= АР°Е°ККЛ
1.11. Вариабельность М-холинорецепторов
Анализ работ, посвященных изучению измепашя физико-химических свойств М-холинорецепторов при тех или иных воздействиях, свидетельствует о том, что существует три группы их регуляторов: 1) модуляторы М-холипорецепторов, которые изменяют не число рецепторов, а их сродство к агонистам или антагонистам; 2) факторы, вызывающие изменения числа М-холинорецепторов, по не их сродства к радиолигандам; 3) факторы, индуцирующие изменения как сродства М-холинергических рецепторов к лигандам, так и их числа,
В предыдущих разделах мы уже касались возможности индукции гуаниновыми нуклеотидами, N-этилмалеимидом и катионами изменения способности М-холинореценторов связывать радиолиганды. Однако имеются также данные о том, что модуляторами М-холннорецепторов могут быть и другие вещества, в частности, изопротеренол. Суммация различных сведений о модуляторах М-холinюреценторов представлена в табл. 3.
В большинстве этих исследований в качестве гуаниновых нуклеотидов применяли негидролизуемый нуклеотид ГФФ(КН)Ф. Другие пуриновые нуклеотиды в этом отношении были неактивны, что указывает на избирательность данного эффекта гуаниновых нуклеотидов [Rosenberger L.B. et al., 1979, 1980]. Отметим, что в действии гуаниновых нуклеотидов и Na* на М-холипорецеп-торы имеет место синергизм [Rosenberger L.B. et al., 1980].
7.Зак. 327
97
Таблица 3.
Действие модуляторов на связывание агонистов с М-холинорецепторами
Вид саяэывающях участков Модулятор Р»диолиг«и* Агонист Снижение сродства- %
Сердце
Общая популяция Гуаниновые нуклеотиды ’Н-хинукли-диннлбензплат Карбахол 99
> > Оксотре* корни 88
* > > аН-цисметиЛ’ диоксолан 77
Участки С высоким сродством Изопротеренол эН-хинуклн-динилбензилат Карбахол 80
Участки с низким сродством > > > 16
Подвздошная кишка
Участки с высокий срод- Ионы аммония ’Н-хииук лиди- Оксотре* 77
ством Участки с низким срод- > нн л бензилат морин > 39
СТВОМ Общая популяция > аН-цисметнл-диоксолан > «6
ГыоыюД мозг
Участки с высокий срод- Ионы ам иония ’Н-хннуклндн- Оксотре- 73
ствоы нилбензилат морин
Участки ствоы с низким срод. » > 32
Общая популяция Ионы натрия Полосатое ’Н-1ШСМСТИЛ-диоксолан тело > 86
> > Ноны аммония эН‘ПНсыегнлдН’ оксолан Оксотре-морин 95
Примечание. Таблица составлена поданным L. В. Rosenberger и соавт. (1979); L. В. Rosenberger и соавт. (1980); С. Р. Berric и соавт. (1979); F. Ehlert и соавт. (1980); F.J. Ehlert и соавт. (1980); F.J. Ehlert и соавт. (1980); L. В. Rosenberger и соавт. (1980); И. И. Hossy (1983).
При сопоставлении действия Na* на М-холипергическне, ос-адрепергические и опиатные рецепторы можно заметить, что Na* снижает сродство агонистов, увеличивает сродство антагонистов к мускариновым рецепторам, но действует противоположным образом па сродство агонистов и антагонистов к а-адрепорецецторам и опиатным рецепторам [Pert С.В., Snyder S.H., 1974; Hosey М.М., 1982; Limbrid L.E. et al., 1982; Woodcock E.A., Murley B., 1982].
98
Таблица 4.
Вариабельность М-холинорецепторов при различных состояниях
Локализация М-холя норе-це тарой Состоянне Р1ДИОЛМГ«ИД Измене-«ее числя M-XD* шноре-цепки рое» %
Верхний шейный ганглий Денервация *Н-дннуклидиннл-бензилат *Н -метилскополамик 213
Сердце Введение феннлгнд-разнна (гипертрофия сердца) 23
То же ’Н-оксотреморин М 60
Левый желудочек сердца Введение 6-окон до- фамина а Н-хннуклнд иннлбеи -зил ат 18,4
» » » > » 23,9
» » > Трансплантация сердца » 128
ПравыА желудочек сердца » » » 149
Межжелудочковая пе- » » » 121
Полосатое тело головного мозга Длительное ингибирование холинэстеразы параоксоном > 25
> > Болезнь Гентингтона > 46
Гиппокамп Болезнь Алзгеймера > 57
Мем бра ны синаптосом головного мозга Никубацня с АТФ (1 мМ) я цАМФ (50 ыкМ) » 21
Примечание. Таблица составлена по данным Т. Taniguchi н соавт. (1983); Р. Chatelein и соавт. (1983); S. Yamada и соавт. (1980); D.D, Story и соавт. (1979); W.R.Roeske и соавт. (1978); М.Н. Smit и соавт. (1980); S.J.Enna и соавт. (1976); T.D. Kcisinc и соавт. (1978); R.D. Burgoyne (1983).
Сравнивая способность различных одновалентных катионов влиять па связывание 3Н-хипуклидш1илбензилата с М-холи-норецепторами эмбриона сердца цыплят, M.M.Hossey (1983) обнаружил, что NH4+ сильнее, чем Ма+, регулирует связывающую способность этих рецепторов. Установлено, что NH4* снижает сродство агонистов к М-холинорецепторам и является синергистом ГФФ [NH] Ф. М.М, Hossey обнаружил зависимость связывающей способности М-холинорецепторов от вида буфера. Оказалось, что трис уменьшает сродство агонистов и антагонистов к этим рецепторам. Кроме того, что вещество конкурирует с моновалентными катионами в отношении ингибирования связывания антагонистов с М-холинорецепторами. Поэтому при изучении характеристик связывания лигандов с М-холинорецепторами
г
99
(но-видимому, и с другими рецепторами) можно получить аномальные результаты (в трис-HCl буфере и фосфатном буфере Na+ противоположным образом влияет па сродство агонистов и антагонистов к М-холииорецепторам).
Существует довольно много данных о том, что при изменении концентрации агониста и при моделировании ряда патологических состояний меняется число М-холинореценторов (табл. 4).
Отметим также, что в процессе онтогенеза число М-холиноре-цепторов в головном мозге и сердце млекопитающих, определяемое по связыванию 3Н-хипуклидинилбензилата, увеличивается от 0 до того уровня, которое имеет место во взрослом состоянии [Coyle J.T., Yamamura H.Y., 1976; Roeski W., Yamamura H.Y., 1978; Roeski W.R. et al., 1979]. Поскольку для холинергических веществ величины IC^ коррелируют с величинами ЕД3) для препаратов сердца животных разного возраста, нельзя сомневаться в том, что рецепторы, определяемые но связыванию этого радиол и ганда, представляют собой физиологически активные М-холипореценторы.
По данным Р.Robbercht и соавт. (1982), а также E.J.Ishae и J.N.Pennofater (1983), при гипертиреозе у крыс происходит уменьшение, а при гипотиреозе увеличение общего числа М-холи-порецепторов в сердце.
Однако оно не изменяется при гипертрофии сердца, вызванной почечной гипертензией или при врожденной гипертонии [Robbercht Р. et al., 1981]. Так как P.Chatelain и соавт. (1983) установили неодинаковое увеличение числа общих (определяемых по связыванию 3Н-М-метилсконоламина) и с низким сродством (определяемых но связыванию 3Н-оксотреморипа) М-холинореценторов сердца при его гипертрофии, вызванной фе-пи л гидр азином, следует полагать, что участки связывания для мускариновых агонистов с высоким и низким сродством в сердце крыс регулируются независимо.
Как пример одновременного изменения и сродства и количества М-холинорецепторов можно привести результаты исследования М.Е.Goldman и С.К.Erickson (1982). Авторы обнаружили, что при внутрибрюшинном введении крысам амитриптилина (10 мг/кг) или атропина дважды в день в течение 30 сут. происходит снижение М-холинорецепторов в коре головного мозга, которые связывают 3Н-хипуклидинил бензил ат, и уменьшение сродства М-холинорецепторов к этому лиганду.
О независимости регуляции j [ресииаптических холинергических гегеро- и аутореценторов свидетельствуют результаты, нолучешще
100
M.Raiteri и соавт. (1983). Оказалось, что при длительном введении крысам параоксона (увеличите действия агонистов па холипоре-цепторы) или скополамина (блокирование действия ацетилхолина па рецепторы) происходит уменьшение или увеличение соответственно чувствительности пресииаптических ауторецепторов, определяемой по способности экзогенного ацетилхолина (0,5 мкМ) ингибировать высвобождение 3Н-ацетилхолина из синаптосом гиппокампа, по пе чувствительности пресипаптических мускариновых гетеро рецепторов, определяемой по потенцированию высвобождения 3Н-дофамипа из синаптосом полосатою тела.
Таким образом, следует отметить, что М-холинорецепторы представляют собой копформациопно подвижные структуры, число которых регулируется специальными механизмами, специфичными для того или иного тина клеток. Низкомолекулярные модуляторы (гуаниновые нуклеотиды и катионы) индуцируют конформационные изменения в макромолекуле М-хо-лииорецептора и тем самым изменяют его сродство к лигандам. Повышение или снижение числа молекулярных сигналов, получаемых клеткой посредством М-холинорецепторов но обратной связи (возможные механизмы этой связи рассмотрены в разделе 1.10), обусловливают уменьшение (интернализацию) или увеличение соответственно числа М-холипоре-цепторов па поверхности клеток.
1.12. М-холинорецепторы — мишень действия ЛВ
Как и в случае Н-холипорецепторов, мы рассмотрим только те холинергические вещества, фармакологические эффекты которых обусловлены непосредственным их взаимодействием с М-холипорецепторами. Мускарин стимулирует постгапглионар-пые мускариновые холипорецепторы и вызывает поздний ганглионарный цостси пиитический потенциал, блокируемый атропином. (+)-Энантиомер мускарина в 100—400 раз активнее его (-)-эпаптиомера [Leone L. et al., 1981].
Метахолип, так же как и мускарин, вызывает ганглионарный вторичный постсииацтический потенциал; он обладает сосудорасширяющим свойством. При парентеральном введении мета-холина имеется риск возникновения аритмий.
Мускариновые эффекты превалируют и у бетанизола; при пероральном введении наблюдаются его выраженное действие
101
на желудочно-кишечный тракт и мочевой пузырь, и слабые сердечные эффекты. Применяется бетапехол при атопии желудка и мочевого пузыря, а также в глазной практике с целью индукции миоза и снижения внутриглазного давления.
Оксотремории вызывает периферические и центральные пар-кипсопподобные эффекты (тремор, атаксия).
Следует отметить, что фармакологические эффекты М-холино-миметиков в норме и патологии могут быть неодинаковы. Так, Н.Н.Алинов и соавт. (1985) обнаружили, что возбуждение пилокарпином М-холинорецепторов сердца лягушки в нормальных условиях не приводит к положительному хронотропному эффекту, но при блокаде сердца возбуждение М-холинорецепторов сопровождается учащением сердечных сокращений.
Антагонисты М-холинореценторов оказывают противополож-. ное но сравнению с агонистами действие на неисчерчеипые мышцы желудочно-кишечного тракта, мочевого пузыря, глаза, бронхов, на секрецию желез, работу сердца и применяются для лечения язвы желудка, снятия спазма желчного и мочевого пузыря, для расширения зрачка, снижения функции слюшхых и бронхиальных желез и для симптоматического лечения паркинсонизма.
Главным М-холшюблокатором является алкалоид атропин, блокирующий мускариновые рецепторы миоцитов и сердечной мышцы, а также железистых клеток. Отсутствие специфичности в фармакологических эффектах атропина стимулировало поиск веществ с избирательным действием по отношению к М-холипорецепторам различных тканей.
C.Runti (1972) выделяет четыре группы М-холиноблокаторов. К первой группе относятся четвертичные аммониевые производные атропина, его энантиомер гиосциамин и другие природные или полусинтетические алкалоиды тропиновой кислоты, такие как скополамин (эти вещества плохо всасываются в кишечнике и не проникают в ЦНС).
Вторая и третья группы веществ получены путем модификации кислотной или катионной части атропина. Это эфиры 3-тро-панола с различными карбоновыми кислотами (гоматропин, октатропин) или основные эфиры трошшовой кислоты с аминоснирта-ми (ампрогронин, тропикамид). Однако каких-либо особенностей в фармакологических эффектах этих веществ пет.
Четвертую iy>yiniy новых антимускариновых средств, часть из которых внедрены в клиническую практику, составляют производные атропина с модификацией ето молекулы (адифешш, дицикло-
102
верил и др,). Кроме того, к пятой группе атронипоподобшях средств можно отнести аминоэфиры карбоновых кислот с амипоспи ртами, в структуру которых входит ацилы или радикал [Turbanti L. et al., 1982]. Из этой группы соединений выраженной спазмолитической активностью обладал роциверин. В отличие от традиционных антимускаршювых веществ роциверин характеризуется оптимальным балансом между нейротропным и миотроппым эффектами. При клинических испытаниях была подтверждена высокая эффективность этого препарата при всех формах болевого спазма различной этиологии.
Среди лигандов М-холинореценторов можно выделить центральные М-холииоблокаторы: амизил и метамизил, относящиеся к транквилизаторам.
Как отмечает К.С.Раевский (1982), в терапевтических дозах эти вещества оказывают успокаивающее действие на животных и человека, воздействуя преимущественно па психоэмоциональную сферу. Предполагается, что их действие связано с блокированием центральных М-холипорецепторов (амизил нивелирует реакцию ярости, вызываемую микронпъекцией ацетилзолипа в область переднего гипоталамуса).
Другое психотропное средство — антидепрессант амитриптилин — при хроническом введении обладает способностью не только блокировать центральные М-холинорецепторы, пои снижать их число [Godman Н.Е., Erickson С.К., 1982]. В то же время действие амитриптилина на центральную холинергическую систему было сходным с таковым для атропина, который не является антидепрессантом. В связи с этим нельзя считать, что действие антидепрессантов на центральные М-холинореценторы является основным при развитии его терапевтического эффекта.
В настоящее время вновь усиливается впимащте к атропинопо-добным веществам как к бронхиальным сназмалитикам. Сравнительно недавно F.Berti и соавт. (1980) обнаружили интересный факт: атропин и нпратрониум ингибируют образовать тромбоксана А, — одного из наиболее мощных стимуляторов сокращения неисчерченпых мышц бронхов, который образуется под воздействием первичных медиаторов анафилаксии, таких как гистамин. Это открытие было подтверждено C.C.Folco и соавт. (1982), которые показали, что нпратрониум и окситропиум ингибируют образование тромбоксана Aj, индуцируемого гистамином, брадикинином или лейкотриеном С4 (важнейшим компонентом медлешю реагирующей субстанции). При этом указанный эффект атропиноподобных средств развивался независимо от их антимускаринового
103
действия. Эти данные свидетельствуют о повой возможной точке приложения М-холипоблокаторов.
Таким образом, можно ожидать появления новых ЛВ с большей избирательностью по отношению к М-холипорецепторам различных тканей. Однако, учитывая изложенное, не исключено также, что будут созданы новые схемы лечения некоторых заболеваний с помощью давно используемых классических М-холииергнческих средств.
При поиске новых М-холинергических средств, по нашему мнению, следует учитывать выявленную П.П. Денисенко (1980) закономерность о тождественности медиаторов па «входе» и «выходе» эффективного звена механизма управления жизнедеятельностью организма. Эта закономерность может быть использована для определения локализации ц характеристики действия новых холинергических средств.
* ♦ ♦
В заключение отметим итоги исследований в области холипоре-центоров, имеющие, по нашему мнению, наиболее существенное значение для ее дальнейшего развития.
1. Холшюреценторы тетерогепны, причем существуют не только два основных класса этих рецепторов — мускариновые и никотиновые, по и подклассы.
2. Каждый вид холипорецецторов имеет высокую избирательность к определенным лигандам п выполняет специализированную функцию. В том или ином случае вторичными посредниками биохимического ответа клетки при стимуляции холипорецепто-ров могут быть Са2+, К+, Na+, продукты обмена фосфатидилинозитола и цГМФ.
3. Существуют как постсипаптические, так и иресин анти веские (среди них есть ауто- и гетерорецепторы) холипорецепторы, локализованные в ЦНС и практически во всех периферических органах.
4. Холшюреценторы—это генетически детерминируемые подвижные белковые образования, структура и функция которых зависит от возраста, гормонального статуса и изменяется при ряде заболеваний.
5. С помощью ЛВ, для которых мишенью действия служат холипорецепторы, можно регулировать психическую деятельность человека, а также влиять на функции сердечпо-сосуди-
104
стой, дыхательной, пищеварительной, мочевыделителыюй, двигательной и других систем организма.
В настоящее время еще не ясно, как в процессе эволюции сформировались рецепторы, сходные между собой в избирательной чувствительности к одному и тому же медиатору —ацетилхолину, по так сильно различающиеся по своей функции: одни из плх сопряжены с гуапилатциклазон, вторые — с кальциевыми каналами , третьи входят в состав каналов для К’ и Na+.
Важно отметить, что холинергические рецепторы функциотшру-ют во взаимодействии с другими рецепторными системами для физиологически активных веществ (об этом пе раз говорилось в данной главе). Этому вопросу необходимо уделять еще больщее внимание в дальнейшем. При этом не исключено, что в состав рецепторных систем входят одни и те же структуры. Например, имеется сходство между центрами связывания гуаниновых нуклеотидов, ответственных за активацию адепилатциклазы и за ингибирование связывания карбамил холина, с М-холинорецецторами сердца крыс [Wallbrock М. et al., 1981]. По нашему мнению, этот факт имеет принципиальное значение, так как если в состав эффекторных систем различных типов рецепторов входят одинаковые структуры, то, действуя па эти структуры, можно одновременно регулировать функции нескольких видов рецепторов. Не исключено, что появится новый класс ЛВ, действующих на меж-рецеиторном уровне (возможно, к такому классу веществ можно отнести антагонисты кальциевых каналов, сопряженных со многими видами рецепторов). Особенно интересны, по нашему мнению, полученные в последние годы данные о возможности некоторых стероидных гормонов, в частности, эстрогенов, увеличивать чувствительность М-холшюрецепторов в ЦНС и стенке сосудов, что может иметь большое значение в поиске новых путей терапии сердечно-сосудистых заболеваний и болезни Альцгеймера.
Глава 2
АДРЕНОРЕЦЕПТОРЫ
История открытия адренорецепторов неразрывно связана с исследованиями биологической сущности катехоламинов. Вначале было установлено, что экстракты надпочечников дают сосудосуживающий эффект [Oliver G., Schafer Е.Л., 1895]. F.Abel и C.Growford (1897) из надпочечников выделили прессорное вещество, которое оказалось М-метил-3,4-диоксифепилэтаиолами-пом. Оно было названо адреналином, или эпинефрином, J.N. Langley (1901) заметил сходство между действием адреналина и влиянием раздражения симпатических нервов. Это привело T.R.Elliot (1905) к предположению, что в окончаниях симпатических нервов выделяется адрепалипоподобиое вещество. Однако только в 1921 г. O.Loewi и соавт. прямо доказали выделение активного вещества при раздражении симпатических нервов, идущих к сердцу и селезенке.
В дальнейшем с помощью флюорометрического метода было обнаружено, что симпатические нервы выделяют симпатии I, или норадреналин, а клетки мозгового вещества надпочечников симпатии Е, или адреналин ]Baeg Z.H., 1934; Cannon W.B., Rosenblueth А., 1937; Euler Н.С., 1946].
Еще в 1905 г. J.N.Langley, используя рецепторную теорию Эрлиха, утверждал, что адреналин наряду с другими физиологически активными веществами оказывает эффект в результате взаимодействия с «рецепторными субстанциями». Однако прошло более 40 лет, прежде чем учение об адренорецепторах получило молекулярно-биологическое подтверждение и дальнейшее развитие.
При исследовании соединений, предотвращающих сокращение миометрия, вызываемое вазопрессином, R.Ahlquist (1948) выявил неожиданные факты: сосудосуживающее соединение фенилэфрин расслабляет пеисчерченные мышцы желудка, а метнлпорад-репалип, обладающий депрессорными свойствами, их не расслаб
106
ляет; изопротеринол в большой дозе вызывает сокращение матки кролика; артерепол по сравнению с адреналином дает меньший сосудосуживающий эффект [Ahlquist R.P., 1948].
Сравнивая фармакологические эффекты сходных по строению катехоламинов, R. Ahlquist пришел к следующим выводам:
I. Существует два типа адренотропных (адренергических) рецепторов, определяемых но их чувствительности к родственным симпатомиметическим аминам. К первому типу относятся а-рецепторы. Они опосредуют в основном возбуждение функции (сужение сосудов, сокращение пеисчерчешых мышц матки, мочевого пузыря, зрачка) и в ряде случаев ингибирование функции (расслабление кишечника). Ко второму типу относятся ^-рецепторы. Они опосредуют в основном возбуждение функции (расширение сосудов, релаксация иеисчер-чеипых мышц матки и бронхов) и в ряде случаев возбуждение функции (стимуляция миокарда).
П. Адреналин представляет собой биологически активный катехоламин но отношению как к а-, так и к р-адрепореце!порам; адренорецепторы комплементарны молекуле адреналина [Ahlquist R.P., 1962].
Несомненной заслугой R. Ahlquist как исследователя является доказательство им гетерогенности адренорецепторов и попытка объяснения с помощью этого феномена противоположной по направленности эффектов катехоламинов при действии их па различные биологические объекты.
После R.Ahlquist некоторые авторы предложили другие гипотезы, объясняющие другие парадоксы адрепорецепции. А.М.Lands (1952), изучив фармакологическую активность различных симпатомиметических аминов, выделил три вида адренорецепторов: Ас (возбуждающие), Аг (ингибирующие) и Аге (пеидеп-тифицироваппые). К пендеитифицироваштым он отнес адрепоре-цеиторысердца и кишечника. R.F.Furchgott (1959) рассматривал еще у-адрепорецепторы, опосредующие гликогенолитический эффект катехоламинов, и 8-адрепорецепторы, опосредующие угнетение катехоламинами ненечерченпых мышц кишечника. И все же наиболее рациональной оказалась классификация адренорецепторов, предложенная R.Ahlquist. Опа в настоящее время общепринята, хотя ее продолжают дополнять и уточнять. В последующем оказалось целесообразным p-адреп ©рецепторы разделить па два подкласса: р, и P2 [Furchgott R.F., 1967; Lands A.M. et al., 1967],а затем три подкласса (было доказано существование Р3 -адрепоре-
107
цепторов [Emorine L.J. et al., 1989]. Затем а-адренорецепторы разделили падва подкласса: «, и a, [Langer S.Z.,1974], а в последующем каждый из них еще па 3 подтипа: а1Л а|П ot,D иа2л а2П а.2С [Buckland P.R. et al., 1990; Voigt M.M., et al., 1991]. K.Starke (1972) и S.Z.Langer (1973) описали впутрисипапти ческу to топографию адренорецепторов.
2.1. а-Адренорецепторы (общие сведения)
Необходимость разделить а-адрепорецепторы па два подкласса возникла после открытия п изучения свойств а-адрепорецепторов па мембранах варикозных утолщений норадренергических нервных окончаний. Оказалось, что агонисты и антагонистыа-адрепорецепторов по-разному влияют па пре- и постсипаптические рецепторы сердца и легочной артерии кроликов и селезенки кошки [Starke К., 1972; Langer S.Z., 1973; Starke К. et al., 1975; Berthelsen S., Pettinger W., 1977]. Отмеченная вариабельность «-адренорецепторов обусловила разделение па пресинаптические (^-рецепторы), опосредующие ингибирование функции, и постсипаптические (с^-адрепорецепторы), опосредующие возбуждение функции. Однако в дальнейшем а2-адрепорецеиторы были найдены также на ностсицаптических мембранах и несипаитических структурах [Berthelsen S., Pattinger W., 1977; Starke К., Langer S.Z., 1979; Wikberg J.E.S., 1979]. Поэтому а,- и а,-адренорецепторы следует разделить только по чувствительности к агонистам и антагонистам, а не по функции и локализации. Ниже приведены химические формулы некоторых агонистов и антагонистов а(- и а2-адренорецепторов.
Наряду с классическим фармакологическим анализом прямые исследования характеристик а-адрепорецепторов проводятся с помощью различных радиолигапдов. 3Н-клопндип применяется для изучения взаимодействия фармакологических веществ с а,-адренорецепторами [Greenberg D.A., 1976; U.Prichard D.C. et al., 1977; Tanaka T., Starke K., 1980; Timmermans P.B, et al., 1982]. Для этой же цели P.M.Liebman и соавт. (1983) использовал вещество СС 7525А (3Н-1,3,4,14в-тетра-гидро-2-метил-10Н-пиразнп-(1,2-а)-пиррол-(2,1-с)(1,4)-бецзолдиазепииа малеат), а,-Адренорецепторы идентифицируют с помощью 3Н-празознна [Greengras Р., Bremner R., 1979; Timmermans P.B. et al., 1980]. При необходимости одновременно пометить радиолигапдом а,-
108
и а2-рецепторы используют 3Н-дигмдроэргокриптип [Hoffman В.В. etal., 1980; 1981; El-Refai M.F., Exton J.И., 1981].
2.1,1. af- Адренорецепторы
«t-Адренорецепторы выявлены в разных типах пейс черченных мышц: в мат^е крыс (в пей присутствуют примерно одинаковые количества а,- и «2-адренорецепторов) [Hoffman В.В. et al., 1979; Hoick МЛ. etal., 1979; Kunos G. et al., 1979], в vas deferens [Shultz G. et al.,1973], в желудке [Baur S. et al.,1981], в аорте [Cauvin C. et al., 1982], в артериях и венах [Curro F. А., 1983], а также в мышце сердца [Stilew G.L. et al., 1983].
При изучении параметров связывания ЭН-ди гидроэргокрип-типа с культурой миоцитов линии ДДТ( MF-2 L.E.Corenett и соавт. (1982) показали, что специфическое связывание этого лиганда насыщаемо и характеризуется К равной 1,7 ± 0,4 иМ и числом связывающих участков, равным 197 ±44 фмоль па 1 мг белка. Адрепалип>порадрепали1|>изоиротерепол вытесняли 3Н-дигидроэргокриитии из его связи с «-рецепторами. Математическое моделирование с помощью компьютера кривых конкуренции избирательного о^-аптагоииста празоси-па и избирательного с^-аптагониста иохимбипа с. этим радиолигандом позволило .стаповить, что более 95% «-адренорецепторов данных клеток относятся к «^подтипу.
В кишечнике «^адренорецепторы могут, вероятно, находиться не только па мембранах миоцитов. Об этом свидетельствуют данные D.T.Cotterel и соавт. (1983), которые показали, что агонисты а-адрепореценторов норадреналин >адрепалии> кло-пидип>фенилэфрин >метоксамнп стимулируют перепое жидкости через эпителий тощей кишки крыс. Этот перенос жидкости подавлялся антагонистами «-адренорецепторов: празози-nOM^eHTOHaMHHOM>WB4101>HoxnM6nHOM >раувольсципом. Видно, что «!-адренергические вещества в этом отношении активнее а,-адренергических веществ. Между физиологическими эффектами агонистов п антагонистов « адренорецепторов и нх влиянием на связывание 3Н- празозин а с мембранами наблюдалась корреляция. Поэтому можно считать, что сс-адренорецепторы, принимающие участие в регуляции транспорта жидкости через эпителий тощей кцщки крыс, представляют собой«(-адренорецепторы.
Выявленные N.Mohel и соавт. (1981) «^адренорецепторы в клетках бурого жира хомячков опосредуют способность фепил-
109
Агонисты а,
Нлонианн
Гуанфаиин
R(=H; Rj=H Норадреналин
R,=H; Rj=CH3 Адреналин
R(=CH3: R2=H а-Мстил-норадреналпн эфрина и норадреналина дозозависимым образом стимулировать включение 3Н-глицерина в фосфатидилинозитол и поглощение О2 данными клетками. О функции, которую выполняют а(-адренорецепторы ЦНС, пока имеется мало сведений.
R.Horton и соавт. (1982) показали, что инфузия агонистов а, -адренорецепторов d-амфетамина или фенилэфрина в субарахноидальное пространство поясничного отдела спинного мозга крыс приводит к увеличению величины рефлекса па акустическое возбуждение. Величина данного поведенческого эффекта
110
Антагонисты
Ы-СН2—CHaCl
0—CH я—сн—с н3
Фенокс ибе нзам и н
указанных агонистов коррелировала с оккупацией о^-адрепо-рецепторов в ткани спинного мозга. Максимальное потенцирование фенилэфрином упомянутого рефлекса наблюдалось при оккупации 30% о^-адренорецепторов. Результаты этого исследова-
111
пия позволили сделать следующие выводы: 1) «^адренорецепторы ЦНС принимают участие в регуляции поведения; 2) поведенческие эффекты ЛВ можно предсказывать на основании данных о связывающей способности соответствующих адренорецепторов, расположенных в ЦНС.
Принцип гетерогенности рецепторов, сформулированный нами ранее (см. главу 2), подтверждается тем, что «(- п «2-адрено-рецепторы являются неоднородными по физико-химическим характеристикам. Так, «(-адренорецепторы плазматических мембран гепатоцитов крыс связывают адреналин с высоким и низким сродством [El-Refai M.F. et al., 1979; El-Refai M.F., Exton J.H., 1980; Hoffman B.B. et al., 1979,1980, 1981; Aggerbeck M. et al., 1980]. Связывание адреналина с «(-адренорецепторами с высоким сродством характеризовалось К , равной 50 нМ и В^, равной 200 фмоль па 1 мг белка. Это связывание в большей степени ингибировалось празозином, чем йохимбином [El-Refai M.F., Exton J.H., 1980].
Плазматические мембраны гепатоцитов крыс содержат также «2-адренорецеиторы, которые связывают адреналин с высоким (К =1 нМ) и низким (К. =10 им) сродством [Hoffman В.В. et al., 1980; El-Refai M.F., Exton J.H., 1981]. Из сопоставления величин Кд взаимодействия адреналина с «у и сц-адрепорецеиторами видно, что тип рецепторов, который в наибольшей степени вовлечен в ответ клетки па адреналин, зависит от концентрации последнего. Так, если для изучения связывания используется 3Н-адреналин в концентрации 10 нМ, то он преимущественно взаимодействует с а,-адренорецепторам и [Hoffman B.B. et al., 1980], а если используются физиологически эффективные концентрации адреналина (50 — 100 пМ), то он взаимодействует в основном с а,-адренорецепторам! [El-Refai M.F., Exton J.H., 1980].
Кроме описанного типа «(-адренорецепторов, известен также другой класс «(-адренергических связывающих участков плазматических мембран клеток печени, которые имеют низкое сродство к адреналину (К- 1 мкМ), по высокое сродство к дигидроэргокриптнпу (К ~ 5 мкМ) [Clarke W.R. et al., 1978; Guellaen G. etal., 1978; El-Refai M.F. etal., 1979; Hoffman B.B. etal., 1979, 1980, 1981; Aggerbeck M. etal., 1980; El-Refai M.F., Exton J.H., 1980]. Эти участки составляют примерно 80% от общего числа связывающих участков 3Н-дцгидроэргокриптица с плазматическими мембранами клеток печени. Поскольку мягкая обработка трипсином плазматических мембран гепатоцитов не-
112
реводит некоторое количество «[-рецепторов с высоким сродством к ди гидроэргокрш пину в а(-адренорецепторы с высоким сродством к адреналину [El-Refai M.F., Exton J.H., 1980], можно полагать, что первые представляют собой прорецепторы вторых. Вероятно, в организме могут возникать условия, при которых может наблюдаться «поломка» перехода нрорецепторов в рецепторы, или наоборот, инициация данного процесса.
В 90-е годы с помощью метода гибридизации были найдены мРНК, кодирующие синтез а1А atn a)D подтипов альфа-адрепо-реценторов, а с помощью гибридизации in situ определена их локализация в центральной нервной системе человека и крыс [Nicholas А.Р. et al., 1996]. Сродство радиолигапдов к а(А-адре-пореценторам уменьшается в ряду: npa3O3Hn=WB4101>4)eiiTO-ламии>оксиметазолип>адреналип> норадреналин; к «1Т)-адре-норецепторам: npa3O3Hii>WB4101> фептоламип>оксиметазо-лип>адреиалип>порадрепалип; к «tD-адренорецепторам: нра-зозии>1Л?,В4101>порадрепалип>феитоламин >адреналин>окси-метазолип [Hardman J. et al., 1996].
2.1.2. а2-Адренорецепторы
Иные функции по сравнению с «[-адренорецепторами выполняют а2-адрепорецеиторы.
Пресинаитические а,-адрепорецепторы, локализованные в по-р-адрепергических нервных окончаниях, опосредуют аутоип-гнбирование высвобождения норадреналина как па периферии, так и в ЦНС [Langer S., 1981] (рис. 27).
Специфичность периферических пресииаитических реиореценторов определяется при использовании в качестве тест-объекта изолированной легочной артерии кроликов [Starke К. et al., 1975; Borowski Е. et al., 1977]. Клопидии, а-метилпо-радрепалин и трамазолин избирательно стимулируют о^-ад-реи©рецепторы, расположенные на пресииаитической мембране, а фенилэфрин и метоксамин преимущественно активируют постсинантические «[-адренорецепторы этой артерии. Йохимбин и особенно его диастереоизомер рауволсцин проявляют свойства избирательных антагонистов отмеченных сс,-адренорецепторов, а празозин и другой диастереоизомер иохимбина ко-рипаптнп — свойства избирательных антагонистов «[-адреиоре-цеиторов.
В. Зап. 22?
ИЗ
Рис. 27. Регуляция высвобождения норадреналина (НА) из варикозного утолщения норадренергического нерва, вызываемого электрической стимуляцией ,
Экзогенно введенный и циркулирующий НА действует преимущественно на внеспнаптические otj-адрснорсцспторы и вызывает сужен вс сосудов (Э), Предполагается, что нейрональный захват ограничивает доступ экзогенного НА к внутри-синаптическим а,-адренорецепторам, Ингибирование нейронального захвата кокаином увеличивает способность празозина блокировать эф^ккты экзогенного НА [LangerS. Z., 1981].
Во всех других изучаемых органах и тканях (сердце и глазная артерия кроликов, сердце и vas deferens крыс, сосуды кошек, сердце собаки, vas deferens мышей) пресипаптические а-адрепорецепторы имели такую же чувствительность к агонистам и антагонистам, как и ol,-адренорецепторы легочной артерии кроликов [Timmermans Р.В., Zwieten Р.А., 1982].
Кроме того, пресипаптические сс,-адрепорецепторы обнаружены в холинергических [Eunis A. etal., 1979; Wikberg J.E.S., 1979], серотонинергических [Frankhuyzen A.L., Mulger А.Н., 1980; Gothert M., Huth H., 1980] нервных окончаниях и па телах адренергических нейронов [Gedorbaum J.M., Adhajanian G.K., 1977; Brown G.L., Caulfield I., 1979]. Эти ot2-адренорецепторы опосредуют ингибирование высвобождения ацетилхолина, серотонина и гиперцоляризацию мембран норадренергических нейронов соот-ветствешю.
M.Raiter и соавт. (1983) показали, что пресипаптические а,-
114
адренорецепторы, регулирующие высвобождение норадреналина и серотонина в ЦНС, представляют собой стереохимически различные подтипы адренорецепторов.
Считается, что «/рецепторы ЦНС принимают участие в регуляции артериального давления [Timmermans P.B. et al., 1981], опосредуют седативный и противосудорожный эффект, а также регулируют температуру тела [Maskrey М. et al., 1970], процессы саливации [Rand M.J. et al., 1969] и высвобождение АКТГ [Van Loon С., 1971].
В ЦНС «/адренорецепторы расположены не только на пре-синаптических, по также и на иостсииаптических мембранах. Пре-сипантические «/адренорецепторы составляют меньшую часть всех «/адренорецепторов в ЦНС. Основанием такого заключения послужили работы, в которых установлено слабое влияние деструкции норадренергических нервных окончаний, вызванной 6-оксидофамииом, на число участков клеток головного мозга, связывающих 3Н-клоиидип [Morris M.J. et al., 1981; Dausse J.P. et a!., 1982].
Вопрос о локализации и функции центральных (^-адренорецепторов во многом еще не ясен. Решение его имеет большое практическое значение, так как есть все основания предполагать, что «./адренорецепторы в ЦНС участвуют в регуляции различных функций сердечно-сосудистой системы.
Постсинаитические о,-адренорецепторы были обнаружены позднее, чем пресицантцческие. Оценивая способность ряда веществ ингибировать сокращение изолированных отрезков артерии ладони человека, R.F.Moulds и E.Janerning (1977) и EJanerning н R.F.Moulds (1978) установили, что блокатор «,-адренорецепторов празозин в этом отношении неэффективен. В то же время празозин подавляет сократительное действие норадреналина па сосуды кишечника человека. Поэтому можно сделать вывод о существовании в пеисчерченпых мышцах сосудов человека нразозипрезистептных, или «/адреиорецеп-торов, и празозинчувствительиых, или «/адренорецепторов. Смешанный антагонист а,- и «,-адрецорецепторов фептоламип ингибирует эффект норадреналина во всех случаях.
В последующем «/адренорецепторы наряду с «/адренорецепторами были идентифицированы па иостсииаптических структурах сердца и сосудов крыс [Pichler L., Kobunger W., 1978], кролика, собак [Constantine J.W. et al., 1980; Langer S.Z. et at, 1981] и кошек [Timmermans P.B., 1981].
Постсипаптические а,- и «/адренорецепторы имеют различную чувствительность не только к антагонистам, но и к агонистам, У крыс стимуляция «(-адренорецепторов наблюдается при введении им (-)-фепилэфрина, а стимуляция с^-адреиорецелторов при введении азепексола [Timmermans Р.В. et al., 1980]. В основном все эксперименты, доказывающие существовать так называемых сосудосуживающих а2-адрепорецепторов, были проведены in vivo. В то же время результаты, полученные па мышцах сосудов in vitro, неоднозначны в отношении присут-ствия Оф и «/адренорецепторов. По данным M.J. Stevens и F.R.W.Moulds (1981, 1982), а-адре-иорецепторЫ сосудов человека отличаются как от а,-, так и от а,-адренорецепторов или представляют собой смешанную популяцию двух типов или более рецепторов. а-Адренорецепторы вен отличаются от рецепторов, присутствующих в артериях, и не подавляются празозином [Cochen M.L. etal., 1979; Rush N.J. et al., 1980].
а-Адренореценторы имеют также видовые отличия. При сравнении постсипаптических а-адреиорецеиторов аорты шести видов млекопитающих выявлено, что иохимбину и клоиидииу свойственно наибольшее сродство к а-адреп о рецепторам аорты крыс, промежуточное к а-адрепорецепторам аорты хомячков, кошек и собак и наименьшее — к а-рецецторам аорты морских свинок и кроликов [Ruffalo R.R. etal.,1982].
В отношении постсипаптических а-рецепторов аорты крыс можно указать, что имеющиеся сведения не позволяют их отнести только к подклассу о^- или а2-адренорецепторов [Downing D.A. et al., 1981].
Вместе с тем использование высокоизбирательных «^адренергических стимуляторов и блокаторов позволило идентифицировать «^адренорецепторы в опытах па базилярной артерии собаки [Sakakibara Y. et al., 1982], v.saphene собак [Shepperson N.B., Langer S.Z., 1981] и па сосудах перфузируемой задней части туловища [Kobinger W., Pichler L., 1981].
Кроме того, Оу адренорецепторы присутствуют па энтероци-тах подвздошной кишки кролика [Chang Е.В. et al., 1983], жировых клетках человека и хомячков [Schimmel R.J., 1976; Berlan М., Lefontan М., 1980, 1981], клетках островков поджелудочной железы мышей [Nakaclate Т. et al., 1980], тромбоцитах человека и кролика [Grant J.A., Scrutton М.С., 1980] и меланоцитах ящериц и лягушек [Pettinger W.A., 1977; Carter R.J., Shuster S., 1982]. Данные рецепторы опосредуют стимуляцию транспорта ионов через мембрану, ингибирование липолиза, вызываемого теофиллином, ингибирование высвобождения инсулина, агрегацию тром
116
боцитов и угнетение диспергирования гранул в меланоцитах, вызываемого мёлаиоцитстимулирующим гормоном, соответственно.
Предполагается, что иостсипаптические Офадрепорецепторы не обязательно локализованы в непосредственной близости от норадренергических нервных око1Гчапий и могут подвергаться воздействию экзогенного норадреналина в большей степени, чем эндогенного нейромедиатора, высвобождающегося в синаптическую щель (см.рис. 27) [Langer S.Z., 1981]. В то же время at-адренорецепторы повсеместно в организме расположены па постсипантических мембранах в непосредствен ной близости от норадренергических нервных окончаний.
В 90-е годы с помощью метода гибридизации как и в случае а(-адрепорецепторов была выяснена номенклатура сс,-адренорецепторов ~ «ЭА сс,в подтипова-адрепореценторов, ас помощью гибридизации in situ определена их локализация в центральной нервной системе человека и крыс [ Nicholas А.Р. et al., 1996]. Сродство радиолигапдов к а1А-адрепорецепторам уменьшается в ряду: иохим-бии>оксиметазошш>адрепали11> празозгиРпюрадрепалин; к о^-адре-нореценторам: иохимбип> >фе1П'оламин>празозин>иорадреналш1>ок-симетазоли11>адрс11алип; к о^- адренорецепторам: иохимбш1>фентола-мии>нразозин> >оксиметазолш1>адрепалш1>порадреналин [Hardman J.etaL, 1996].
Таким образом, мы рассмотрели имеющиеся сведения о синаптической и органной локализации и функции «-адренорецепторов. Учитывая приведенные данные, а также литературные сведения [Borlan М., Lafontan М., 1982; Goldberg M.R., Robertson D., 1983; Cash R. et al., 1983], можно предложить следующую классификацию.
I. Постсинаптические ^-адренорецепторы
1. а,-Адренорецепторы пеисчерчеппых мышц сосудов и мочеполовых органов (сокращение).
2. а,-Адренорецепторы сердца (положительный инотропный эффект, аритмия).
3. осj-Адренорецепторы печени (гликогенолиз, глюконеогенез).
4. ОС'-Адренорецепторы ЦНС (стимуляция).
5. «[-Адренорецепторы жировой ткани (стимуляция обмена фосфолипидов).
6. «[-Адренорецепторы экзокринных желез (стимуляция секреции).
7. а,-Адренорецепторы эпителиальных клеток кишечника (стимуляция траисэнителпалыюго переноса жидкости).
117
8. ot,-Адренорецепторы гладких мышц кишечника (гиперполяризация, расслабление)
II. Постсинаптические оуадренорецепторы
1. оу Адренорецепторы гладких мышц сосудов и других органов (сокращение).
2. оу Адренорецепторы жировых клеток (ипгибированйе липолиза).
3. а2-Адренорецепторы p-клеток островков поджелудочной железы (ингибирование секреции инсулина).
4. оу Ад pel ю рецепторы тромбоцитов (агрегация).
5. оу Адренорецепторы меланоцитов (ингибирование диспергирования меланиновых гранул).
6. оу Адренорецепторы клеток ЦНС (поведенческие реакции).
7. а,-Адренорецепторы симпатических ганглиев (гиперполяризация).
8. оу Адренорецепторы энтероцитов (стимуляция транспорта ионов через мембрану).
Ш. Пресинаптические оу адренорецепторы
1. ос,- Адренорецепторы в центральных и периферических норадренергических нервных окончаниях (ингибирование высвобождения норадреналина).
2. оу Адренорецепторы в серотонинергических нейронах (ингибирование высвобождения серотонина).
3. оу Адренорецепторы в холинергических нейронах (ингибирование высвобождения ацетилхолина).
2.1.3. Молекулярные механизмы взаимодействия лигандов с а-адренорецепторами
В связи с методическими трудностями выделения ос-адренорецепторов и изучения их химической природы до настоящего времени пе расшифрована химическая структура связывающих участков а-адрепорецеиторов. Все данные, касающиеся молекулярных механизмов взаимодействия лигандов с этими рецепторами, получены лишь косвенным путем при изучении зависимости физиологических эффектов, опосредуемых сс-адрепо-рецепторами, от химической структуры агонистов и антагонистов, а
118
ОН ОН
ОН ОН
Рис. 28. Иллюстрация взаимодействия изомеров норадреналина и дофамина е гипотетическим а-адрсиорецсптором,
(R)-( —}-Норадреналин связывается с тремя участками рецептора, a (S)-(+)-норадрсналпн и дофамин имеют двухточечное присоединение.
также конкурентных взаимоотношений между ними и радиолигандами за связь с а-адрепореценторами.
Еще в 1933 г. при изучении зависимости физиологической активности некоторых адренергических веществ от их структуры была сформулирована гипотеза, согласно которой а-адрепергиче-ская активность уменьшается в следующем ряду: К(-)-соедине-иие >3(+)=соеди11ение=дезоксисоединепие [Easson L.H., Stedman Е., 1933].
Согласно этим авторам, у молекулы, обладающей ассимет-ричным центром (Е=(-)-порадреналин), 3 из 4 групп ассимет-рпчпого атома углерода принимают участие в связывании с адренорецепторами. Данными группами являются основная аминогруппа, ароматическое кольцо с гидроксилами и бензольная оксигрунпа (рис. 28). Для 5=(+)-порадреиалина и дезок-сисоедянеиия (дофамина) в таком случае имеется возможность взаимодействия только с двумя участками а-адрепорецепторов.
В дальнейшем всестороннему анализу эту гипотезу подвергли R.R.Ruffolo и соавт. (1977, 1979, 1980, 1982, 1983). Изучая действие R(-)- и (+)-норадреналина, дофамина, R(-)- и S(+)-2-(3,4, а-триокснбеизил)-имидаэолииа и 2-(3,4-диоксибензил)-имн-
119
дазолипа па а,-адренорецепторы аорты и от,-адренорецепторы подвздошной кишки морской свинки, авторы сделали вывод, что с этой гипотезой согласуется биологическая активность фепетила-мипов (адреналин, норадреналин, дофамин), по не имидазолинов (иохимбин и его аналоги). Следовательно, фенетиламины и имидазолины могут различно взаимодействовать с «-адренорецепторами. Было обнаружено, что удаление одной или обеих гидроксильных групп катехольного кольца приводит к полной потере антагонистами активности ио отношению к «2-адренорецепторам, ио лишь уменьшает ее но отношению к (^-адренорецепторам. В то же время как для фенетиламииов, так и для имидазолинов присутствие 3,4-диоксикатехольиой группы было оптимально для проявления их «-адренергической активности. Для обоих классов агонистов активность но отношению к «^адренорецепторам в зависимости от характера заместителей уменьшалась в следующем порядке: 3,4-диокси>3-окси>4-окси>фе-иольиая группа. Если бензольная гидроксильная группа ие играла большой роли в эффективности обоих классов агонистов, то опа оказывала заметное противоположное влияние па сродство фенетиламииов и имидазолинов к «[-адренорецепторам (табл. 5).
Следовательно, ароматические и бензольные гидроксильные группы по-разиому влияют па взаимодействие имидазолинов и феиети-ламинов с а-адренореценторами. Причину этих различий иа молекулярном уровне еще предстоит изучить.
Таблица 5.
Сродство(Кд) и относительная эффективность фенетиламииов к имидазолинов с бензилгидроксильной группой и без нее по отношению к 0Cj-адренорецепторам аорты морской свинки [Ruffolo R. R. et al., 1983]
Соединение - 1g Кд Относительная 1 эффективность
Норадреналин 5,70±0,18 1,00
Дофамин 4,07±0,09 1,04±0,12
Оксиимидазолин 4,29+0,16 0,28±0,06
Дезоксиимидазолнп 4,51±0,13 0,38±0,04
1 Величина отношения эффективности агонистов к эффаспшностн адреналина, принятая за 1.
120
Если R.R.Ruffolo и соавт. (1977 — 1983) о сродстве и эффективности адренергических веществ судили с помощью классических фармакологических методрв, то Р.В.Timmermans и соавт. (1983) сродство производных бепзодиоксана к а,- и (^-адренорецепторам определяли но их способности вытеснять 3Н-празосин и 3Н-клоиидин соответственно из их комплексов с мембранами головного мозга крыс. При этом было обнаружено, что изменение в структуре бензодиоксапов заметно влияет па их сродство к af-адрено рецепторам и слабо влияет ца их сродство к (^-адренорецепторам. Бензодиоксаны имеют сродство к -адренорецепторам намного выше, чем к (^-адренорецепторам. Наибольшей избирательностью но отношению к -адренорецепторам обладает вещество UK-33 274. Отметим, что величины избирательности бензодиоксанов к а,- и «^-адренорецепторам коррелируют с их способностью подавлять сужение сосудов, опосредуемое этими рецепторами. Обсуждая зависимость сродства бензодиоксанов к «^адренорецепторам от их структуры, можно сказать следующее. Наличие двух метоксигрупп в положениях 2 и 6 предопределяет высокое сродство соединения к этим рецепторам. Удаление одной из этих метоксигрунп снижает данное сродство, а включение 4-оксигрупны его увеличивает. Кислородный атом в боковой цепи пе имеет большого значения для сродства вещества к -адренорецепторам. Большая роль здесь принадлежит вторичной аминогруппе, так как алкилирование ее снижает сродство соединения к «^адренорецепторам. Связывание бензодиоксапов с ct-адренорецепторами стерео-специфично, ибо зависит от конфигурации вокруг центра асимметрии в боковой цени соединений.
В качестве еще одной иллюстрации стереоспецифического характера взаимодействия а-адренорецепторов с их антагонистами можно привести данные W.L.Nelson и соавт. (1977), которые показали, что S-ципероксац но сравнению с R-нипе-роксапом обладает в 18 раз большей способностью подавлять а-адренергическую активность адреналина.
В связи с трудностью изучения молекулярной структуры комплексов лигандов с природными адренорецепторами предприняты попытки моделирования рецепторов для катехоламинов. В этом отношении интерес представляют данные Е.Kimura и соавт. (1983), согласно которым протонированный макроциклический гексамин-18-азакрун-6 образует стабильные комплексы с катехоламинами в растворах с нейтральным значением pH в соотношении 1:1. Дофамин, ДОФА и адреналин взаимодействовали с
121
этим полиамином с одинаковой константой стабильности, равной 103 М1. Можно полагать, что в этом взаимодействии принимают участие о-диоксибензольная часть молекул катехоламинов, а их NH3‘, NT Н2СН3_, СО2_ и ОН-гругшы, находящиеся в боковой цепи, в комплексообразовании участия не принимают. Данный макроциклический полиамид представляет собой лишь частичную модель адренорецепторов, поскольку рецепторы катехоламинов взаимодействуют, но-видимому, с ними в трех точках, которые комплементарны положительно заряженной аммониевой группе, р-окси-группе и катехольным гидроксилам. Однако точные сведения о молекулярной структуре комплекса катехоламины—а-адренорецен-тор можно получить, выделив рецепторы в чистом виде.
Такая попытка была сделана R.M.Graham и соавт. (1982). Авторы для очистки предварительно солюбилизированного дигитонином -адренорецептора мембран печени крыс с помощью аффинной хроматографии использовали новый аналог избирательного антагониста at-адренорецепторов нразозина-2-[4(-сукционил) пи-перазин-1-ил]-4-аминодиметоксиназолин, иммобилизованный через амидную связь на агарозе. Очищенный рецептор связывал 3Н-празозин и другие адренергические вещества с такими же стереоспецифичностью и сродством, как и мембранно-связанные рецепторы. С помощью методов гель-фильтрации и центрифугирования в градиепте плотности сахарозы было выявлено, что рецептор-дигитоциповый комплекс имеет радиус Стокса 4,9 им, коэффициент седиментации 7,1S и молекулярную массу 147 000. При электрофорезе данного комплекса в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия получена одна белковая полоса с молекулярной массой 59 000. Можно полагать, что белок с молекулярной массой 59 000 представляет собой субъединицу -адренорецепторов мембран гепатоцитов крыс, которая связывает катехоламины, и что существование различных типов «[-адренорецепторов, о которых речь шла ранее (см. раздел 2.1.1.), обусловлено ассоциацией этих субъединиц.
В результате взаимодействия катехоламинов с а-адрепо-рецепторами плазматических мембран гепатоцитов, по-видимому, происходят конформационные изменения рецепторов, которые являются пусковым механизмом, инициирующим цепь метаболических превращений в клетке, характеризующихся изменением тока Са2+ и К+ через мембрану, распадом гликогена, высвобождением глюкозы с соответствующими изменениями активности ферментов обмена углеводов и др.
122
Итак, можно заключить, что стремление исследователей к идентификации молекулы адренорецептора пока позволило создать несколько моделей этой узнающей и трансформирующей биологический сигнал молекулы (или комплекса молекул).
Остается надеяться, что в ближайшие десятилетия мы станем свидетелями еще одного открытия расшифровки строения адренорецептора. Конечно, па пути к этому открытию встретится немало трудностей, одной из которых является правильный выбор биологического объекта для исследования строения и функции рецепторов, комплементарных катехоламинам, норадреналину и адреналину.
2.1.4. Химическая природа а-адренорецепторов
С 1980 г. начались исследования по выяснению физико-химических свойств а-адренорецепторов. Т.Michel и соавт. (1981) сообщили о возможности солюбилизации а-адрепер-гических рецепторов нз мембран тромбоцитов человека с помощью дигитоиииа. Относительная эффективность, с которой различные лиганды вытесняли 3Н-иохимбин из его связи с солюбилизированными рецепторами, указывает на их отношение к ос2-адре11орецентора1. Если рецепторы в составе мембран метили 3Н-иохимбипом или 3Н-лорадрепалипом, а затем солюбилизировали и центрифугировали в градиенте плотности сахарозы, то коэффициент седиментации ос-адренорецепторов, меченных агонистом (14,6S), превышал коэффициент седиментации ос-адренореценторов, меченных антагонистом (12,95). Авторы предполагают, что более высокий коэффициент седиментации комплекса рецептор — агонист отражает присутствие в этом комплексе ГТФ-связывающего регуляторного белка.
G.Kunos и соавт. (1983) после метки 3Н-феноксибепзами-пом а,-адренорецепторов плазматических мембран гепатоцитов крыс солюбилизировали их тритоном Х-100. Выделенный комплекс белковой природы имел радиус Стокса 6 нм. Электрофорез меченных 3Н-фепоксибензамипом препаратов в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в восстанавливающих условиях позволил выделить два радиоактивных ника с Мг 80 000 и 58 000, причем второй может быть протеолитическим фрагментом первого.
123
Для дальнейшего изучения а-адрепорецецторов необходимо совершенствовать препаративные методы их выделения в чистом виде. В этих целях перспективным может оказаться использование клопидина -N-C-S в качестве фотоаффитюй метки «^адренорецепторов, и SKF 101253-сефарозы CL-4B в качестве эффективного сорбента этих рецепторов [Allas D. et al., 1982; Kedan J. eta!., 1982].
Для 6 подтипов a-адренорецепторов клонированы 6 различных генов [Bylund 1992; Ford et al., 1994]. В мембранных доменах среди подтипов а,-адренорецепторов имеется сходство в 75% аминокислотных остатков, а между «^адренорецепторами и ос,-адренорецепторами, также как и р-адреноре-цепторами гомология составляет 30% — 40%.
2.1.5. af -Адренергические механизмы
Рассмотрение биохимических механизмов, обеспечивающих трансформацию молекулярного сигнала, передаваемого клетке посредством ос,-адренорецепторов, мы начнем с клеток печени. Хотя ос,-адренорецепторы этого органа выявлены сравнительно недавно, они наиболее подробно изучены в отношении молекулярных механизмов, вовлеченных в ос-адрепергический ответ клетки. Связано это, по-видимому, с относительной легкостью по- ' лучения препаратов печени (изолированная перфузируемая печень, срезы печени, изолированные гепатоциты и др.) и с достаточно полными данными о функциональной биохимии клеток печени.
Существуют убедительные доказательства, что индукция катехоламинами метаболических изменений в гепатоцитах обусловлена их взаимодействием с «-адренорецепторами, расположенными на поверхности клеток, а не с внутриклеточными структурами. Наиболее важные их них следующие:
1) па внутриклеточных органеллах клеток печени нет катехо-ламипергических рецепторов [Clarke W.R, et al., 1978; El-Refai M.F. et al., 1979]; 2) адреналин быстро метаболизируется после проникновения в клетки печени [Dehage J.P. et al., 1980]; 3) адреналин, сшитый ковалентно с кополипептвдом (13К), который обладает большой молекулярной массой, пе позволяющей проникать адреналину внутрь клеток, оказывает все те же эффекты при добавлении его к изолированным гепатоцитам или перфу
124
зируемой печени крыс, что и свободный адреналин [Dehage J.P. et al., 1980].
Установлено, что -адренорецепторы опосредуют стимуляцию агонистами фосфорилазы печени крыс [Aggerbeck М. et al., 1980; El-Refai M.F., Exton J.Н., 1980; Hoffman D.D. et al., 1980; Tolbert M.E.M. et al., 1980]. Празозин примерно в 100 раз сильнее, чем иохимбин, ингибировал активацию фосфорилазы и высвобождение Са2+, вызываемые адреналином [Blackmore P.F., Exton J.H., 1981].
J.Becker и A. Jakob (1982) обнаружили, что стимуляция фенилэфрином (^-адренорецепторов перфузируемой печени крыс приводит вначале к поглощению, затем к высвобождению К+ печенью и к увеличению потребления О2 в период поглощения К+. Цианид (1 мМ), вызывающий ингибирование электронного транспорта в митохондриях, не влиял па поглощение К+, но уменьшал индуцируемую фенилэфрином продукцию лактата на 60% и снижал потребление Оа более чем на 90%. Оубаип (0,8 мМ) не влиял па индуцируемое фенилэфрином потребление кислорода клетками печени, по ингибировал поглощение К+ и образование лактата. Следовательно, можно считать, что АТФ, используемая для поглощения К+ при действии фенилэфрина, образуется в процессе гликолиза, а не окислительного фосфорилирования в митохондриях и что образование лактата вторично но отношению к повышению функциональной активности Na+, К+-АТФазы в плазматических мембранах.
Большинство «[-адренергических ответов клетки печени является кальцийзависимым. К ним относятся: 1) инактивация глико-генсннтетазы [HueL. etal., 1978; Garrison J.С. etal., 1979; Strickland W.G. et al., 1980]; 2) стимуляция глюконеогенеза [Tolbert M.E.M., Fain J.N., 1974; KneerN.M. etal., 1979]; 3) инактивация пируватки-иазы [Garrison J.C. et al., 1979]; 4) изменение транспорта К* через плазматическую мембрану и изменение ее потенциала [Haylett D.G., 1976,1978; Burgess G.M. et al., 1979; Blackmore P.F. et al., 1979; Althaus-Salzmann M. et al., 1980]; 5) активация фосфофруктокипа-зы [Patten G.S. et al., 1982].
В качестве результатов, подтверждающих роль кальция в этих процессах, можно привести следующие данные: 1) активация гликогенолиза исчезает при инкубации гепатоцитов с ЭГТА, связывающей Са2+; 2) эта активация имеет место при добавлении кальциевого ионофора А 23187; 3) киназа фосфорилазы р, которая переводит фосфорилазу р в фосфорилазу а, аллостерически сти
125
мулирует Саа+при его концентрации KF8 и 10 G М (такая концентрация Са2+ обычно наблюдается в цитозоле) [Keppcns S. et al., 1977; Blackmore P.F. etal., 1978; Chrisman T.D., Exton J,H., 1980].
Участие Ca2* в реализации таких эффектов катехоламинов, как стимуляция дыхания [Jacob A., Diem S., 1975; DehageJ.P. et al., 1981] и транспорт аминокислот [Pariza H.W. et al., 1977; Le Cam L., Freychet P., 1978] вполне вероятно, ио требует дополнительных доказательств.
В связи с этим не случайно, что в настоящее время исследователи направили усилия на изучение механизмов индукции катехоламинами повышения концентрации Са2+ в цитозоле клеток печени, считая, что этот процесс происходит через иосредш1чесгво -адренорецепторов.
Принципиально возможны два пути увеличения концентрации Са2+ в цитозоле клеток при а-адренергической стимуляции. Первый из них — увеличение входа Са2+ в клетки из внеклеточной среды. Такой механизм рассматривался F.D.Assimacopoulos-Jenet и соавт. (1977), S.Keppens и соавт. (1977), A.Foden и P.J.Randle (1978), J.Poggioli и соавт. (1980) и G.J.Barritt и соавт. (1981), которые показали трапзиторпое увеличение входа ^Са2* в клетки печени после стимуляции -адренорецепторов.
В то же время с помощью методов атомного абсорбционного анализа, металлохромпых красителей, хлортетрациклиновой флуорисцепции и Са2+-селективных электродов P.F.Blackmore и соавт. (1978, 1979), J.-L.J.Cehn и соавт. (1978), D.F.Babcock и соавт. (1979), J.-P.Dehay и соавт. (1980, 1981), M.AIthaus-Salzmann и соавт. (1980), а также P.H.Reinhart и соавт. (1982) не обнаружили в ранние сроки после а-адреиергической стимуляции увеличения поглощения клетками Са2\ наоборот, выявили повышение высвобождения Са2+ из клеток. Более того, при удалении Са2+ из среды инкубации с помощью ЭГТА ле наблюдалось уменьшения скорости и величины стимуляции агонистами активности фосфорилазы в клетках печени [Blackmore P.F. et al., 1978]. Поэтому данный механизм увеличения внутриклеточного содержания Са2+ маловероятен или, если он существует, то не является основным.
Вместе с тем имеется много данных в пользу второго механизма, согласно которому повышение уровня Са2+ в цитозоле обусловлено его мобилизацией из внутриклеточного депо. Установлено, что адреналин уменьшает содержание 45Са2+ в митохондриях па 50% [Barritt C.J. et al., 1981]. Однако вопрос, может лн Са2+
126
высвобождаться из других структур клеток, остается спорным. P.F. Blackmore и соавт. (1979), а также J.-P.Dehayen соавт. (1981) наблюдали индукцию фенилэфрином уменьшения содержания Са2+ в субклеточной фракции, обогащенной микросомами (эндоплазматическим ретикулумом), по опа тоже содержала митохондрии и плазматические мембраны. K.Yamagami и Н.Тегауата (1979) не зарегистрировали уменьшения адреналином содержания Са2+ в плазматических мембранах печени, хотя не исключено, что в процессе выделения этих мембран теряются компоненты, определяющие чувствительность клеток к адреналину.
Как уже указывалось, все эффекты агонистов -адренорецепторов опосредованы их взаимодействием с поверхностью клеток. Подтверждение этого — отсутствие высвобождения Са2+ из митохондрий и микросом при прямом воздействии на лих адреналина в физиологических концентрациях.
В связи с этим возникает еще один вопрос — какой механизм сопряжения существует между активацией «радренорецен-торов и высвобождением Са2+ из внутриклеточного депо или входом его из внеклеточной среды. По современным представлениям, определенную роль в этом сопряжении может играть обмен фосфатидилинозитола. Известно, что при инкубации тенацитов с а -агонистами происходит увеличение деградации фосфатидилинозитола, определяемое по повышению включения в пего 32Р (схема 3).
Есть данные [Billach М.М., Michel R.H., 1979], свидетельствующие, что разрушение фосфатидилинозитола, вызываемое указанными агонистами, происходит в более ранние сроки, чем изменение концентрации Са2+ в цитозоле. При этом очень небольшие изменения в обмене фосфатидилинозитола могут вызывать максимальный физиологический ответ.
Возможный механизм увеличения уровня Са2+ в цитозоле в результате деградации фосфатидилинозитола, катализируемой фосфолипазой С, представлен па рис. 29. Видно, что данный эффект может иметь место при высвобождении Са2+ из плазматических мембран, увеличении проницаемости мембран для внеклеточного Са2+ и образовании внутриклеточного посредника, вызывающего выход Са2+ пз органелл. Отметим, что в настоящее время все эти механизмы относятся больше к разряду гипотетических, чем доказанных.
В связи с этим возникает третий вопрос, касающийся механизма мобилизации внутриклеточного кальция: какая молеку-
127
СХЕМА 3. Влияние агонистов «^адренорецепторов на основные пути метаболизма фосфатидилинозитола.
ла может рассматриваться в качестве вторичного посредника. Им вряд ли может быть инозитол-! ,2-циклический фосфат или инозитол-1-фосфат, поскольку они не влияют па выход Са2+ из митохондрий [Exton J.H., 1981]. Фосфатидат в концентрации 104 М вызывает выход Саа+ из митохондрий печени крыс, по этот эффект есть следствие разобщения окислительного фосфорилирования [Exton J.H., 1981].
Возможно также, что разрушение фосфатидилинозитола — не единственный путь влияния агонистов а,-адренорецепторов на обмен липидов.
Имеется сообщение о том, что адреналин, действуя че-рез а(-адрепорецепторы, стимулирует деградацию в гепатоцитах фосфатидил инозитол-4,5-бифосфата [Kirk L.J. etal., 1981], который связывает Са2+ и, разрушаясь, его высвобождает. Так как эта деградация происходит более быстро, чем разрушение фосфатидилинози-
128
Рис. 29. Механизмы изменения уровня внутриклеточного кальция при индукции а^агопистамн деградации фосфатидилинозитола [Exton J. Н., 1981].
А —адреналин; c^-AR — «(-адрено рецептор; ФС-фосфолипаза С; ФИ — фосфатидилинозитол; ФА — фосфатидат; ДАГ— 1,2-диацилглицсрин; ИиФ —циклический инозитолфосфат; ГДФ-ДАГ — цитидиндифосфатдиацплглицсрин; ИФ — инозитол-1-фосфат; И —инозитол; МИТ — митохондрия. Пунктирными линиями показано гипотетическое действие ФА и ИцФ на высвобождение митохондриального Са2+ и на калышевые "ворота" плазматической мембраны.
тола, можно предполагать, что она представляет собой первичный ответ клетки па стимуляцию -адренорецепторов. Однако, опосредует ли это высвободившийся Са2+ деградацию полифосфои-позитидов в печени, остается невыясненным (отметим, что оп действует именно так в мышце радужки глаза) [Akhtar R.A., Abdel-ZatifA.A., 1978, 1980]. Другими словами, ответа на поставленный вопрос пока нет.
Исследования последних лет показали, что в специфических ответах гепатоцитов на а-адренергическую стимуляцию принимает участие цротенпкипаза, зависящая от Са2+ и фосфолипидов, таких как фосфатидилсерии и диацилглицерип [Kishimoto A. et al., 1980].
Наши представления о механизмах сопряжения «^адренергической стимуляции с метаболическими изменениями в клет
9. Зак. 227
129
ках печени неполные и находятся на стадии создания различных гипотез. Большое значение имеют два установленных факта: 1) биологическая активность агонистов а [-адренорецепторов опосредована их взаимодействием с этими рецепторами, находящимися только на поверхности клеток печени; 2) большинство метаболических эффектов агонистов являются кальцийзависимыми.
По-видимому, дальнейшие усилия в первую очередь необходимо направить на изучение молекулярных событий, происходящих в плазматической мембране в непосредственной близости от а(-адренорецеиторов в момент их взаимодействия с агонистами. Ими могут быть пе одна, а одновременно несколько реакций, например, изменение проницаемости мембран для ионов, изменения активности таких ферментов, как Na+, К+-АТФаза, фосфолипаза С и другие, опосредующих многие метаболические эффекты внутри клеток, о которых уже говорилось.
ctj-Адренергические механизмы в других органах и тканях исследованы менее подробно, чем в печени. Однако в основном эти механизмы сходны между собой. По данным Т.В.Bolton (1979), большинство гладкомышечных органов отвечают на «-адренергическую стимуляцию сокращением, связанным с повышением концентрации внутриклеточного Са2+. Сокращение неисчерчепных мышц происходит в результате стимуляции Са2+ кальмодулииза-висимой киназы легких цепей миозина, катализирующей их фосфорилирование, необходимое для его взаимодействия с актином в неисчерчепных мышцах [Adelstein R.S. et al., 1976; Adelstein R.S., Eisen berg E., 1980]. а-Агонисты могут вызывать физическое или тоническое сокращение неисчерчепных мышц. Фазическое сокращение происходит нри отсутствии внеклеточного Са2+, что свидетельствует о мобилизации Са2+ нз саркоплазматического ретикулума, митохондрий или плазматических мембран [Devine С.Е. et а!., 1972; Somlyo et al., 1974; Debbas G. et al., 1975]. В то же время топическое сокращение осуществляется только при наличии внеклеточного Са2+ [Bolton Т.Е., 1979]. Предполагается, что индукция «[-агонистами сокращений неисчерчепных мышц сопровождается метаболизмом фосфатидилинозитола как регулятора проницаемости мембран для Са2+ [Jones L.M.etal., 1979; Takhar A.P.S., Kirk С.J., 1981]. Подтверждением этого служит тот факт, что фосфатидат, образующийся в процессе метаболизма фосфатидилинозитола (см. схему 3), вызывает сокращение неисчерчепных мышц [Salmon D.M.,
130
Honeyman T.W., 1980].
По данным C.Canvin и соавт. (1982), at-антагонист празозин по сравнению с «..-антагонистом иохимбипом на 3 порядка сильнее ингибирует стимулируемый норадреналином вход 45Са в миоциты изолированной аорты кроликов и высвобождение в них внутриклеточного Са2+. Полученные результаты не подтверждают гипотезу, согласно которой at- и «2-адренорецен-торы специфически сопряжены со входом Са2+ или высвобождением Са2+, а свидетельствуют о том, что один подтип этих рецепторов может опосредовать оба процесса. Авторы считают, что различие в чувствительности к кальциевым антагонистам, наблюдаемое при использовании различных агонистов а,- и а2-адренорецепторов для активации сужения сосудов, обусловлено неодинаковой стимуляцией рецептор-активируемого кальциевого канала. Кроме индукции «(-агонистами в миоцитах повышения уровня внутриклеточного Са2+, в ряде случаев отмечено увеличение содержания цГМФ в vas deferens [Schultz J. et al.,1977] и в желудке [Baur S. et al.,1981]. цГМФ сам по себе не вызывает сокращения мыщц и гуаниновые нуклеотиды (ГТФ и 5'-гуанилимидофосфат) не уменьшают сродства адреналина и фенилэфрина к at-адренорецепторам пеисчерченных мышц [Carnett L.E. et al., 1981]. G.L.Stiles и соавт. (1983) также не обнаружили влияния гуанинового нуклеотида ГФФ(ЬШ)Ф на способность адреналина конкурировать с 3Н-иразозипом и ,251-ВЕ2254 за связывание с ^-адренорецепторами мембран сердца крыс. Заметим, однако, что гуаниновые нуклеотиды снижают сродство катехоламинов к р-адрено-рецепторам [Stiles G.L. et al., 1983] (см. раздел 2.2.2.).
Рассмотрим теперь имеющиеся сведения об -адренергических механизмах в ЦНС. Выявлено, что стимуляция (^-адренорецепторов клеток головного и сниппого мозга приводит и к повышению обмена фосфатидилинозитола [Hobin M.R., 1969] и к повышению внутриклеточного уровня цАМФ [Chasin М. et al., 1971; Perkins J.P., Moore M.M., 1973; Schultz J., Daby J.W., 1973; Sattin A. etal., 1975; Jones DJ., Mckenna L.F., 1980]. Между способностью адренергических агонистов конкурировать с а(-аптагоиистом WB4101 за связывание с мембранами головного мозга н индуцировать накопление цАМФ в головном мозге имела место корреляция [Davis J.N, et al., 1978].
U.Schwabe и J.W.Daby (1977) обнаружили, что степень повышения цАМФ в головном мозге зависит от концентрации Са2+ во внеклеточной среде. Кроме того, в аккумуляции цАМФ, по-
;г
131
видимому, играют роль простагландины группы Е. Это наблюдение подтверждается уменьшением способности «^агонистов вызывать накопление цАМФ в срезах коры и гипоталамуса в присутствии ингибиторов простагландин-синтазы и восстановление этой способности после добавления простагландина Е2 [Partington C.R., 1980].
Важно отметить, что особенностью ot)-адренергических механизмов в ЦНС является сопряжение стимуляции о^-адренорецепторов с изменением внутриклеточного уровня цАМФ, так как данной реакции в других тканях, содержащих а,-адренорецепторы, не наблюдалось,
В жировых клетках о^-агонисты увеличивают активность фосфорилазы, инактивируют гликогепсинтетазу, повышают включение 32 Р в фосфатидилинозитол, выход Л2К+и поглощение кислорода [Lawrence Jr.J.С., Larner J., 1978; Garcia-Sainz J.A., Fain J.N., 1980; Mohel N. etal., 1982, 1983]. Описанные эффекты уменьшались при снижении концентрации внеклеточного Са2+ и могли быть вызваны кальциевым ионофором А23187. По-вид и -мому, они связаны с повышением уровня Са2+ в адипоцитах.
Воздействие -агонистов на околоушную и другие слюнные железы, а также па слезную железу приводит к увеличению проницаемости мембран клеток этих желез для К+ с последующим выходом воды из клеток [Parod R.J., Putney Jr.J.W., 1978, 1979; Putney Jr.J.W., 1979; Parod R.J. et al., 1980]. Повышению калиевой проницаемости предшествовало увеличение внутриклеточного уровня Са2+ [Putney Jr.J.W., 1979]. Предполагается, что, как и в случае клеток печени, изменение ионных токов в клетках этих желез при О£(-адренергической стимуляции сопряжено с изменением обмена фосфолипидов и участием в этом процессе фосфатидата [Putney Jr.J.W, et al., 1980; Weiss S.J., Putney Jr.J.W., 1981].
Заканчивая рассмотрение -адренергических механизмов, подчеркнем, что стимуляция o^-адренореценторов, за исключением клеток ЦНС, не сопряжена с изменением уровня цАМФ, а сопровождается повышением внутриклеточной концентрации Са2+. Данное повышение может быть обусловлено входом внеклеточного Са2+ через кальциевые «ворота» в плазматической мембране или высвобождением Са2+ из его связи с внутриклеточными органеллами и плазматической мембраной (рис. 30). Молекулярные механизмы, лежащие в основе увеличения внутриклеточного уровня Са2+, могут быть различны.
132
* Рис. 30. Механизм опосредования -адренорецепторами физиологического ответа клетки [Exton J. Н., 1981].
a,R — а,-адренорецептор; ФИ — фосфатидилинозитол; ДАГ — 1,2-диацилглицсрин; ИцФ — инозитол-1,2-цикличе-ский фосфат; Ф —гипотетический фермент или механизм, сопряженный с а, -адренорецептором; М —гипотетический внутриклеточный посредник, высвобождаемый при активации X; СаМ — кальмодулин пли кальцийзависимыи регуляторный белок; Са!* — СаМ-про-теинкиназа — протеинкиназа или киназы, стимулируемые Са2* в присутствии кальмодулина.
Активация а(-адренорецепторов приводит к образованию внутриклеточного посредника в плазматической мембране, который, далее действуя па митохондрии и, вероятно, эндоплазматический ретикулум, вызывает высвобождение связанного с ним Са2+.
Возможно, роль этого внутриклеточного посредника выполняет продукт метаболизма фосфолипидов — фосфатидат. Следует особо подчеркнуть, что во многих тканях активация (^-адренорецепторов, так же как и М-холинорецепторов, сопряжена с увеличением обмена фосфатидилинозитола. Теоретически af-адрепореценторы могут регулировать активность фосфолипазы С, катализирующей гидролиз фосфатидилинозитола в плазматической мембране. Данный гидролиз может, во-первых, приводить к открытию «кальциевых ворота; во-вторых, сопровождаться образованием фосфатидата (или другого вторичного внутриклеточного посредника).
Повышением концентрации Са2+ в цитозоле при активации а(-адрекорецепторов пытаются объяснить многие эффекты, наблюдающиеся после а-адренерги ческой стимуляции. Кальций, связываясь с кальмодулином, активирует протеипкипазы, катализирующие фосфорилирование тех или иных клеточных белков, вовле-
133
чеппых в специфический «[-адренергический ответ клетки (см. рис. 30). Безусловно, данная гипотеза не исчерпывает других механизмов реализации кальцийзависимых и кальцийиезависимых эффектов «[-адренергических средств.
Установлено, что а [-адренорецепторы сопряжены посредством
-белка с фосфолипазами С, D или А,, обуславливая их активацию. При этом, как уже говорилось ранее, сами узнающие участки данных рецепторов гетерогеипы: а)А-рецепторы локализованы в сердце, печени, коре мозжечка, простате, легких, семявыводящем протоке (селективный антагонист 5-метилуранидил), а1П-рецепторы —• в почках, селезенке, аорте, легких, коре мозжечка ( селективный антагонист — WB4101), «^-рецепторы — в аорте, коре мозжечка, простате, гшшокампе.
2.1,6, а2-Лдренергические механизмы
Природные агонисты адреналин и норадреналин проявляют относительную неизбирателыюсть в отношении а,- и (^-адренорецепторов. Поэтому их «-адренергические эффекты в различных тканях определяются плотностью а,- и «-.-адренорецепторов в них. Например, тромбоциты содержат только «..-адренорецепторы, а околоушная железа в основном — а,-адренорецепторы. В то же время в некоторых тканях присутствуют одновременно оба подтипа этих рецепторов (это справедливо в отношении мышц матки, головного мозга и адипоцитов), что затрудняет анализ рецепторного связывания и последующего метаболического ответа клетки. Создание избирательных агонистов и антагонистов позволило лучше изучить природу и функцию этих рецепторов, по и в проблеме сопряжения активации а-адрепореценторов с возникновением физиологической реакции еще много неясного.
Поскольку существуют ноет- и пресипаптические (^-адренорецепторы, различающиеся между собой ио локализации и функции, необходимо рассматривать отдельно и «^-адренергические механизмы этих рецепторов.
По современным представлениям общим свойством всех постсипаптических «.-адренорецепторов является индукция снижения внутриклеточного уровня цАМФ посредством ингибирования адепнлатциклазы [Exton J.H., 1981].
K.H.Jacobs и соавт. (1978) обнаружили, что для проявления ингибирующего действия «2-агонистов на аденилатциклану тром
134
боцитов необходимо присутствие ГТФ. Эти авторы также показали, что иод действием а^-агопистов снижается Умаи. адепилатцик-лазы, по не изменяется ее сродство к Мц2+АТФ или свободному Mg2+.
При повышении концентрации Na+ в среде инкубации тромбоцитов наблюдалось усиление ингибирующего действия адреналина па адепилатциклазу [Michel Т. et al., 1980] и уменьшение способности «2-адренорецепторов тромбоцитов связывать катехоламины [Michel Т. et al., 1980; Motulsky H.J. et al., 1980].
Поскольку гуаниновые нуклеотиды снижают сродство а,-ад-репорецепторов тромбоцитов к агонистам, но не к антагонистам [Tsai B.S., Lefkowjtz R.J., 1978; Hoffman В.В. etal., 1980], предполагается, что «^-адренорецепторы могут находиться в двух состояниях и гуаниновые нуклеотиды переводят рецепторы с высоким сродством в состояние с низким сродством [Michel Т. et al., 1980]. Другими словами, в данном случае гуаниновые нуклеотиды выполняют функции модуляторов.
Вместе с тем при полном активировании аденилатциклазы тромбоцитов стабильными аналогами ГТФ: ГФФ(ЫН)Ф/ ГФФ(СНЭ)Ф и ГТФ-y-S фермент терял чувствительность к ингибирующему эффекту адреналина как в присутствии, так и отсутствии ГТФ [Jacobs К.Н. et al., 1976; Jacobs К.Н., 1978, 1979; Jacobs K.H., Schultz G., 1979]. Кроме того, эти аналоги обращали ингибирование аденилатциклазы адреналином и ГТФ [Jacobs К.Н., 1978, 1979; Jacobs К.Н., Schultz G., 1979].
Принимая во внимание эти результаты, можно постулировать: 1) ингибирование адреналином аденилатциклазы тромбоцитов происходит вследствие инактивации каталитически активной формы фермента; 2) этот процесс может быть связан со стимуляцией ГТФазы, сопряженной с аденилатциклазиой системой.
По-вцдимому, «..-агонисты вызывают ассоциацию (^-адренорецепторов с регуляторной мембранной компонентой (возможно, ГТФ-азой) аденилатциклазы, а гуаниновые нуклеотиды дестабилизируют этот комплекс. Доказательством приведенного предположения может служить тот факт, что комплекс меченый агонист — «2-адрепорецентор, выделенный из тромбоцитов человека, имеет коэффициент седиментации 4,6S, а комплекс меченый антагонист — «^-адренорецептор — 12.9S [Michel Т. etal., 1981].
D.Macfarlane и D.Stump (1982) показали, что специфическое связывание антагониста «..-адренорецепторов ;1Н-иохимбина с интактными тромбоцитами человека характеризуется константой дис-
135
соцнации, равной 2 — 7 лМ, и числом связывающих участков, равным 200 — 400 па тромбоцит. Концентрация адреналина, при которой наблюдалось ингибирование накопления цАМФ в тромбоцитах, составляла от величины его концентрации, при которой имело место ингибирование связывания 3Н-иохимбипа. В то же время концентрация иохимбина, при которой происходило ипз'ибирование действия адреналина па адепилатциклазу, была в 10 раз больше той, которая необходима для оккупации сс2-адрепо-реценторов. Значит, эти результаты указывают, что ингибирование аденилатциклазы вызывается образованием короткоживущего комплекса агонист — рецептор — адепилатциклаза.
По данным S.Jard и соавт. (1981), в присутствии одновалентных ионов (Li+, Na+, К+) и концентрации ГТФ больше 1 мкМ при активации «..-адренорецепторов плазматических мембран клеток печени происходит ингибирование адепилатцик-лазы. В то же время при отсутствии одновалентных ионов, по в присутствии ЭГТА и низких концентраций ГТФ <<0,1 мкМ) стимуляция этих рецепторов сопровождается повышением активности аденилатциклазы: данный эффект был обратимым при добавлении к среде инкубации Mg2+ или Са2+ [Jackowskc M.N. et al., 1981]. Другими словами, в зависимости от концентраций ГТФ и катионов сопряжение с^-адренорецепторов плазматических мембран носит положительный пли отрицательный характер. По-видимому, Mg2+, Са2+ и Na* регулируют сопряжение а2-адренорецепторов со стимулирующими или ингибирующими аденнлатциклазу белками, связывающими гуаниновые нуклеотиды.
Согласно данным E.B.Chang и соавт. (1983), Na+ (140 пМ) и ГТФ (0,1 мМ) увеличивают концентрацию п-аминоклопидп-на, при которой наблюдается вытеснение 3Н-клопидипа из его связи с ос,-адренорецепторами плазматических мембран энте-роцитов подвздошной кишки кроликов. J.Latifpour (1982) выявил а2-адренорецепторы в легких у новорожденных крыс. Поскольку гуанил-5М>’-имидодифосфат (100 мкМ) уменьшает способность адреналина ингибировать связывание 3Н-иохим-бипа с этими рецепторами, можно считать, что в сопряжении рецепторов с адеиилатциклазой принимает участие белок, связывающий гуаниновые нуклеотиды.
Связывание агонистов с ос,-адренорецепторами ЦНС также снижается в присутствии гуаниновых нуклеотидов [U'Prichard D.C., Snyder S.H., 1978, 1979, 1980; Grossmann Н., Presek Р., 1979].
136
Это снижение обращается двухвалентными катионами [U’Prichard D.C., Snyder S.H., 1980]. В коре головного мозга найдены а2-адренорецепторы с высоким и низким сродством [U’Prichard D.C. et al., 1979]. Гуаниновые нуклеотиды уменьшают число рецепторов с высоким сродством, а Мп2*, Mg2+ и Са2+ (0,01 — 1 мМ) их увеличивают [Rout В.М. et al., 1980]. При совместном же воздействии двухвалентных катионов и ГТФ число а2-адрепорецепторов значительно увеличивается [Rout R.M. et al., 1980]. В отличие от двухвалентных катионов Na+ уменьшает число (X,-адренорецепторов как с высоким, так и с низким сродством [Rout В.М. et al., 1980]. Отметим, что эти данные относятся ко всем адренорецепторам ЦНС, а не отдельно к пре- или постенцаптивеским.
Об О!2-адренергических механизмах в пеисчерченпых мышцах сведений мало. Известно только, что внеклеточный Са2+ необходим для сокращения пеисчерченпых мышц, опосредуемых а2-адрспорецепторами [Van Meel J.С.A. et al., 1981]. Поскольку №12-ЭДТА и блокаторы входа Са2+ в клетку ингибируют сокращения мышц сосудов при активации а2-адренорецепторов, можно считать, что внеклеточный Са2+ играет триггерную роль в сокращении мышечной оболочки сосуда [Timmermans P.B. et al., 1983]. Вместе с тем показано, что а2-адренергическая стимуляция сопровождается ингибированием адеиилатциклазы в жировой ткали [Kather Н. et al., 1977, 1980; Aktories К., 1979, 1980; Burns T.W. et al.,1981; Kather H.,Simon B., 1981; Berlan M., 1982]; в клетках гибрида нейробластомы и глиомы [Sabol S.L., Nirenberg М., 1979]; в щитовидной железе [Desmedt D.H., 1980]; в корковом веществе ночек [Woodcock Е. A. et al., 1980] и в околоушной железе [Oron Y. et al., 1980]. Это ингибирование имело место только при наличии ГТФ и одновалентных катионов.
При угнетении адеиилатциклазы, обусловленном а2-адренергической стимуляцией, имело место снижение уровня цАМФ в клетках островков поджелудочной железы [Tu rtle J.R.,Kipnis D.M., 1967]; желчного пузыря [Handler F. et al., 1978], кожи лягушки [Abe К. et al., 1969], щитовидной [Yamashita К. et al., 1979], околоушной желез [Butcher F.R. et al., 1976; Oron Y. etal., 1978], прямой кишки [Andersson R., Mohme-Londholm E., 1970], сердца [Watanabe A.M., 1977] и в глиальных клетках [McCarthly K.D., de Vellis J., 1979].
Таким образом, можно резюмировать, что, как правило, активация иостсииаптических о^-адрепорецепторов приводит к спн-
137
Рис. 31. Механизм опосредования а2-адренорецепторами физиологического ответа клетки [Exton J. Н., 1981].
a^R— с^-адрснорс-нептор: ИН— гипотетический ингибирующий регуляторный белок (участок), связьгааюпрпт гуаниновые нуклеотиды; Р — регуляторный димер иАМФ-зависнмой протеннкнназы.
жепию концентрации цАМФвклетках (рис. 31). Снижение концентрации цАМФ, но~видимому, связано со снижением активности аденилатциклазы. Для этого ингибирования необходимо присутствие ГТФ. Именно ГТФ и ингибирующий ГТФ-связывающнй белок, вероятно, ответственны за сопряжение между ос,-адренорецепторами и каталитическим компонентом аденилатциклазы в момент взаимодействия о^-адрецорецепторов с их агонистами.
Теперь несколько слов о нресинаптическпх а,-адренерп1ческих механизмах. При воздействии на нресшгантические (Хуадренорецеи-торы происходит изменение прогшцаемости пресинаитических мембран для Са2+ и К+, уровня цАМФ и цГМФ [Gother М. et al., 1979; Werner J., 1979; De Langen C.DJ. et al., 1980] и увеличение активности Na+, К+-АТФазы [Powis D.A., 1981].
Изучению роли Са2+ в опосредуемом <х2-адренорецецторами ингибировании высвобождения норадреналина из нейрональных окончаний посвящена работа A.N.M.Schofellmeer и соавт. (1982). Авторы обнаружили, что кальциевый антагонист СсР+ и норадреналин ингибируют электрически стимулируемое
138
Рис. 32. Возможный механизм модуляции пресииаптичсскими а-адрс но рецепторами высвобождения норадреналина [Schoffclmcr A. N. et al., 1982].
При возникновении потенциала действия Са1* проникает в варикозное утолщение норадренергического нерва и связывается с внутриклеточным рецептором (кальмодулином?). Активация прссинаптпческих а-адрснорснепторов приводит к ингибированию секреции норадреналина (НА) вследствие ограниченного связывания Са1* с внутриклеточным рецептором X, необходимым для инициации процесса секреции.
высвобождение 3Н-1юрадрепалипа из срезов коры головного мозга крыс. Данный эффект СсР+ и норадреналина уменьшался в присутствии 4-амидопирипа и восстанавливался при снижении внеклеточной концентрации Са2+. Блокирование преси-нантических рецепторов фентоламицом не влияло па ингибирующие эффекты Cd2+.
В присутствии тетродоксипа норадреналин сильно уменьшал высвобождение 3Н-порадрепалина, вызываемое К+ (20 мМ). Можно заключить, что пресипаптические -адренорецепторы принимают участие в регуляции секреции медиатора на этапе, следующем за входом Са2+ (рис. 32).
Мы предполагаем, что после проникновения в клетку Са2+ связывается с внутриклеточным рецептором, например, кальмодулином (повсеместно распространенный кальцийсвязывающий белок), который необходим для стимуляции экзоцитоза. Известно, что в нейрональных клетках а2-аго1шсты вызывают спнже1ше уровня цАМФ [Subol S.L., Nirenberg М., 1979] и повышают уровень цГМФ [О'Dea R.F., ZatzM., 1976], а дибутирил цГМФ имитирует тормозящее действие оксиметазолина па высвобождение 3Н-по-радреиалина [Pelayo F. et al., 1977]. Следовательно, в качестве посредника влияния а-адренергической стимуляции на кальцийсвя-
139
зывающие внутриклеточные участки, ответственные за секрецию нейромедиатора, может выступать цАМФ и/или цГМФ, Однако роль цАМФ и цГМФ в этих процессах необходимо уточнить.
Согласно совремешням представлениям в качестве траисдукто-ра о^-рецепторов может быть G,- белок, опосредующий ингибирование адеиилатциклазы или стимуляцию калиевых каналов или Gn -белок, опосредующий стимуляцию кальциевых каналов L- или N-типа, а также, возможно, Gi/B — белок, опосредующий активацию фосфолипазы С и А,- Гетерогенность ос,-рецепторов выражается в том, что а^-рецелторы локализованы в тромбоцитах, коре головного мозга, спинном мозге (селективный агоццст оксиметазолин), a,R-рецепторы — в печени и почках (селективный антагонист празозин), ot2C-рецепторы — в коре головного мозга (селективный антагонист празозин).
2,1.7, а-Адренорецепторы — мишень действия ЛВ
Как известно, агонисты и антагонисты а-адренореценторов широко используются в клинике. Многие особенности фармакологических эффектов этих веществ описаны в отечественной литературе [Машковский М.Д., 1996, 1998; Харкевич Д.А,, 1999; Аничков С.В., 1981; Комиссаров И.В., 1982, 1985]. Поэтому мы не будем останавливаться на хорошо известных фактах, а коснемся лишь механизмов терапевтического действия а-адрепергивеских средств.
В основном эти механизмы связаны с функционированием нресипиитических о^-адренорецепторов, модулирующих высвобождение нейромедиаторов: норадреналина, ацетилхолина, серотонина и дофамина из нервных окончаний. Агонисты этих рецепторов ингибируют синаптическую передачу, осуществляемую соответствующими медиаторами. Считается, что именно стимуляцией центральных о^-адрепорецепторов такими ЛВ, как клопидин и ct-метил-ДОФА (вероятно, через а-метилнорадреналип), обусловлено их депрессивное действие па сердечно-сосудистую систему.
Важно, что стимуляция центральных а2-адрепореценторов сопровождается увеличением вагусного влияния, снижением активности периферических симпатических нервов, снижением артериального давления и уменьшением частоты сокращений сердца
140
[Timmermans P.B., 1982]. Хотя трудно определить те нейроны головного мозга, которые главным образом отвечают за реализацию этих эффектов а2-аголистов, есть предположения, что такие нейроны локализованы в ядре солитарного пути [Hausler G., 1982], так как именно в этом ядре обнаружена высокая плотность а2-адре-нореценторов [Young W.S., Kuhar M.J., 1979, 1980] и локальное введение а-агопистов в пего вызывает снижение артериального давления [De Jong W., Petty MJ., 1982]. Однако пока еще точно неясно, локализованы ли депрессивные о^-адренорецепторы па пре-сипаптических норадренергических нейронах или ностсинаптиче-ски па телах клеток или дендритах, получающих норадренергическую иннервацию. С одной стороны, индукция клонидином снижения обмена норадреналина и обращение этого эффекта иохимби-пом свидетельствует о том, что эти а2-адрепорецепторы расположены нресипантически. С другой стороны, предварительное снижение содержания норадреналина высокими дозами резерпина и 6-оксидофамииа не приводит к исчезновению способности клопи-дипа уменьшать симпатическую активность и вызывать брадикардию [Warnke Е., Hoefke W., 1977], что указывает па отсутствие участия эндогенного норадреналина в проявлениях данных эффектов клоиидипа и па постсипаптическую локализацию этих а2-адрепореценторов. Возможно также, что в реализации фармакологической активности клопидица принимают участие af-адренорецепторы. Свидетельством тому являются данные P.J. Beckett и L.Finch (1982), которые показали, что антагонисты как ос,-, так и седадренорецепторов (празозин, WK32 274, корипатин, иохимбип, раувольсцип и PW21361) блокируют гипотензивный эффект вводимых в желудочки головного мозга агонистов <х,-адренорецепторов: клоиидипа (12,5 — 50 мкг), VK-14, 304 (6,25 —25мкг), гуан-фаципа (50—200 мкг) или лофексидипа (25 — 100 мкг).
J.H.Sinha и соавт. (1984) привели результаты, доказывающие участие а,-адренорецепторов в опосредовании гипотензии у кошек. Поэтому можно предполагать, что пе только -адренорецепторы, но и центральные at-адренорецепторы опосредуют гипотензивное действие клоиидипа и что центральные а-адре-иореценторы могут отличаться от периферических ос,- и седадрепорецепторов. Кроме того, нужно учитывать и то, что будучи стимулятором пресипантических ос,-адрепорецептеров, клопидин активирует данные рецепторы нервных волокон, подходящих к сердцу, и за счет этого также вызывает брадикардию [Cavero I., Roach A.G., 1980; De Jonge A. et al., 1981].
141
Седативный эффект клоиидипа и сходных препаратов может быть обусловлен его действием па пресипаптические оц-адрепоре-цеиторы в серотонинергических и дофаминергических нервных окончаниях. Сухость же во рту, вызываемая клонидипом, может быть обусловлена активацией оц-адреиорецелторов, локализованных в холинергических нервных окончаниях. Клопидии обладает способностью снижать симптомы абстиненции к опиатам [Gold M.S. et al., 1978]. Этот эффект может быть связан со стимуляцией центральных пресипаитических рецепторов, которая приводит к ингибированию электрической активности нейронов в голубом участке, или со специфическими взаимоотношениями между «-адренергическими и опиатными рецепторами, о чем сообщили M.S.Blank и H.G.Bohnet (1983).
Важно подчеркнуть, что резкое прерывание длительного лечения клонидипом вызывает развитие синдрома абстиненции [Weber M.A.J., 1980; Thoolen M.J.M.C. et al., 1981], который может рассматриваться как снижение чувствительности к нему центральных и периферических оц-адрепорецепторов.
В последнее время появляется все больше данных, указывающих на важную роль а,-адренорецепторов головного мозга и других органов в реализации фармакологической активности не только клонидшга, но и других ЛВ, таких как ИК 14304 трифтазина, хлорпромазина, которые блокируют возбуждающие эффекты нор-адреналипа [Bradshaw С.В. et al., 1983; Huerta-Baheiia J. et al., 1983].
Весьма полезным в клинической практике может оказаться способность агонистов а2-адрепореценторов азепексола и В-НТ 920 существенно снижать внутриглазное давление, не влияя па размер зрачка [Innemee Н.С., 1981]. Вполне возможно, что избирательные стимуляторы «/адренорецепторов составят новую группу противоглаукомпых средств.
Поскольку депрессивные состояния связывают с уменьшением норадренергической активности в ЦНС [Puetch A.J. et al., 1979], антагонисты а2-адрепореценторов могут оказывать положительный терапевтический эффект при этих заболеваниях. Отдельные антагонисты а2-адрепореценторов испытываются в клинике [Puech A.J. et al., 1979].
По-видимому, центральные ос,-адренорецепторы вовлечены в реализацию эффектов трициклических антидепрессантов [Smith С.В. et al., 1981]. Длительное ингибирование антидепрессантами нейронального захвата норадреналина вызывает снижение числа
142
[ipecnjiauTHческих а,-адренорецепторов и тем самым приводит к увеличению высвобождения нейромедиатора [Smith С.В. et al., 1983].
При физиологических условиях общий эффект агонистов и антагонистов а2-адрепорецеиторов будет результатом суперпозиции его пресипаитических и постсинантических эффектов. Более того, появляются данные, указывающие на существование некоторых различий между пре- и постсииап-тическими «2-адрено рецепторами [De Jonge A. et al., 1981]. Поэтому создание новых высокоизбирательпых агонистов п антагонистов пре- и иостсииаптических а,-адренорецепторов откроет новые возможности в регуляции многих органов, получающих норадренергическую иннервацию и, следовательно, при лечении сердечно-сосудистых, психических и других заболеваний.
В качестве примера приведем данные M.Burnier и соавт. (1983), которые описали эффекты фелтоламица при экспериментальной гипертензии. Авторы показали, что инфузия фен-толамипа (125 мкг/кг в 1 мин) повышает уровень аргининва-зопрессина в плазме крыс с гипертензией, вызванной дезокси-кортикостероном, до 104 пг/мл, а у крыс с нормальным давлением до 44 tir/мл. Пропранолол не влиял па уровень вазопрессина у обеих групп животных, а при совместном введении фептоламина и пропранолола наблюдалось увеличение уровня вазопрессина в плазме. Следовательно, блокада а-, по не р-адренорецепторов приводит к стимуляции секреции вазопрессина и развитию прессорной реакции. Можно полагать, что характер взаимоотношений между вазопрессином и «-адренергической системой имеет немаловажное значение в патогенезе гипертонической болезни и требует дальнейших исследований как с теоретической, так и с практической точки зрения.
Заканчивая данный раздел, следует подчеркнуть, что при разработке новых ЛВ, мишенью действия для которых являются a-адренорецепторы, перспективным может быть использование эндогенных модуляторов этих рецепторов: основанием для такого вывода могут служить результаты исследований антигипертензивной активности полярного почечно-медуллярного липида и его синтетического аналога 1-0-октадецил-2-ацетил-ЗН-глицеро-З-фосфорилхолип; эти соединения блокируют а-адрепорецепторы мышц сосудов и оказывают тем самым сосудорасширяющий и быстрый гипотензивный эффект.
143
В последние годы растет популярность антагонистов oq-адрепо-рецепторов как средств терапии доброкачественной гиперплазии простаты [Forray С., et al., 1994]. Выявление различных подтипов адренорецепторов создает хорошие предпосылки разработки селективных адренергических средств, имеющих троппость к сосудам или простате. Перспективны также работы в области создания новых антагонистов ос,-адренорецепторов, таких как дексмедетомидин, которые могут быть использованы для анестезии и регуляции болевой чувствительности. С другой стороны, среди а2 -агонистов могут быть созданы препараты для лечения ишемии головного мозга и сердца.
2.2. Д -Адренорецепторы
[}-Адренорецепторы, как и а-адрепорсцепторы, не являются гомогенными. Впервые па это обратили внимание N.C.Moran (1966). Антагонисты p-адрепорецепторов, по мнению N.C.Moran, с алкильными заместителями у а-углеродиого атома зтаполаминовой боковой цепи обладают различной способностью блокировать сосудистые и сердечные эффекты катехоламинов. Разделять р-адре-нореценторы на Р, и р.,предложили A.M.Zands и соавт. (1967) на основании выявленных различий в действии адренергических агонистов па те или иные органы. Рецепторы сердца и жировой ткани были ими отнесены к Ррадренореценторам, а бронхов и мышц сосудов — к р2-адреиореценторам.
Существование нескольких подклассов p-адреиореценторов подтвердилось тем, что одни антагонисты (практолол, атенолол, метопролол) более эффективно блокировали действие катехоламинов па сердце, а другие (салбутамол, сотерепол) обладали избирательностью по отношению к бронхам [Daly J., Levy В., 1979].
Считается, что р [-адренорецепторы имеют примерно одинаковую чувствительность к адреналину и норадреналину; они главным образом присутствуют в сердце, жировой ткани, сосудах и головном мозге. В то же время -адренорецепторы имеют большее сродство к адреналину, чем к норадреналину; они обнаружены в легких, печени, исчерченных мышцах и пепсчсрчеппых мышцах различных органов [Furchgott R.F.,1972; Ahlquist R.P.,1976],
В связи с ограниченным доступом некоторых ЛВ к рецепторам, избирательным поглощением и деградацией их в тка
144
нях трудно определить точную фармакологическую специфичность Р,- и 02-адрепорецепторов. Фармакологический ответ, опосре-дуемый 0-адренорецепторам и, зависит пе только от специфичности самих рецепторов, по и от фармакокинетики веществ-индикаторов. Поэтому важно отметить, что, согласно данным R.J.Ariens и A.M.Simonis (1983), Р,-адренорецепторы входят в состав синапсов и реагируют в основном па высвобождающийся из нервных окончаний порадрепалин, а 02-адрецо-рецепторы расположены впеснлаитически и реагируют в первую очередь па катехоламины циркуляторного русла.
Тот или иной орган может содержать пе только один подтип Р-адрепорецепторов. Поэтому неодинаковая фармакологическая специфичность различных тканей может быть обусловлена вариациями в соотношении подтипов данных рецепторов (0,/ р2).
Кроме того, в последние годы появились сообщения об атипичных 0-адреиорецепторах, которые нельзя отнести пи к 0,-, пи к 02-нодтнпу. Такие атипичные p-адрепореценторы, обладающие некоторым сходством как с Pj -, так и с Р2-адренореценторами, найдены в адипоцитах крыс [Belfrage Е., Fredholm В.В., 1978], эритроцитах лягушки, цыплят [Dickinson К.Е., Nahorski S.R., 1981] и индюков [Minnerman К.Р. et al., 1980]. Согласно результатам A.Bertholet и соавт. (1981), p-адрепорецепторы адипоцитов морских свинок также отличаются от классических р,- и 02-адрепо-рецет [торов.
Существовали предположения, что p-адрепорецепторы жировых клеток человека состоят по крайней мере из двух подтипов [Harms H.I-L et al., 1982]. Только после появления метода клонирования рецепторов было доказано существование еще одного подтипа Р^-адре норе цензоров, ответственных за регуляцию метаболизма липидов [ Strosberg A., Pietri-Rouxel F.,1996].
Таким образом, приведенные результаты свидетельствуют о том, что фармакологическая идентификация подтипов 0-адреиоре-цепторов в различных органах и тканях затруднена.
Для исследования более точных характеристик подтипов 0-адрепорецепторов в последнее время были разработаны и широко используются генетические и биохимические методы анализа 0-адренорецепции ио клонированию специфических мРНК и связыванию радиолигапдов. Наиболее значительным в развитии этого направления стало создание адренергических соединений, мечеп-
10. Зак.221
145
пых одновременно радиоактивной и фотоаффиппой метками, что позволяет изучать физико-химические свойства рецепторных молекул.
Для исследования связывающей способности р-адреноре-цеиторов наиболее часто используют два р-адрепоблокатора — 3Н-дигидроалпреиолол и 1251-йодоксибепзилпиндолол. При проведении подобных экспериментов обычно изучается конкуренция ряда фармакологических веществ, обладающих троп-постыо но отношению к р!-адренорецепторам (агонисты: норадреналин, Н110/38; антагонисты: практолол, атенолол, метопролол, п-окспренолол) или к Р^-адренорецепторам (агонисты: зип-терол, салметамол, тербуталин, салбутамол, эритронрокатерол; антагонисты: TPS 339, FCJ 118551).
Важно отметить, что специфичность данных веществ, определяемая по их способности ингибировать связывание радиолигандов с р-адрепореценторами in vitro, коррелирует с их специфичностью в отношении фармакологических эффектов in vivo. Другими словами, вещества, избирательные к р,-адренорецепторам в экспериментах ио связыванию, обладают кардио-тронностыо in vivo, а вещества, избирательные к Р2-адрепорецсцто-рам в экспериментах по связыванию, обладают бронхотрошюстыо in vivo. Однако пи одно из этих соединений не имеет абсолютной избирательности и большинство из них лишь в 20 — 50 раз отличается по своему сродству к pf- н р2-адрепорецепторам [Minneman К.Р., Molinoff Р.В., 1980].
В результате анализа ингибирования избирательным антагонистом Ррадрепорецепторов атенололом и избирательным антагонистом Р2-адренорецепторов ТСТ 118551 связывания ( — )-3Н-дигидроалпренолола с мембранами клеток различных тканей млекопитающих S.R.Nahorski (1981) получил данные о соотношении между р, - и р2-адре1 topeiiei порами в этих ткапях(табл.б).
При использовании в качестве радиолигапда (+)-|231-йодоксп-бепзилпиндолола были получены сходные с приведенными данные о содержании р,- и Р2-адренорецепторов в различных тканях (Minnerman К.Р. et al., 1979]. В клетках глиомыСб V.Hanburger и соавт. (1981) обнаружили 80 — 90% р]-адренорецепторов и 10 — 20% р2-адрепорецепторов.
Представленные в табл. 6 данные свидетельствуют, во-первых, о совместном присутствии р2- и Ррадрепорецепторов во многих тканях, что объясняет причину встречающихся трудностей при классическом фармакологическом изучении p-адренергических меха-
146
Таблица 6
Распределение подтипов ^-адренорецепторов
Органы, клетки Общая плотность р-ад-реиорецеп-торов, фмоль/мг белка ft, %
Легкие крыс 400 20 80
Легкие кроликов 350 80 20
Легкие быка 250 25 75
Предсердие крыс 50 65 35
Селезенка крыс 250 35 65
Метка крыс (высокий уровень остро-
генов) 100 20 80
Матка крыс (высокий уровень про-
гесгероиа) 100 0 100
Эритроциты крыс 100 0 100
Ретикулоциты крыс 600 0 too
Кора головного мозга крыс 120 65 35
Мозжечок крыс 50 0 100
Полосатое тело головного мозга
крыс 100 65 35
Лимбическая область головного
мозга крыс 70 55 45
цизмов; во-вторых, указывает па изменения соотношения между [3,-и Р,-адрепореценторами при нарушении гормонального фона.
Селективным лигандом ^-адренорецепторов является 3-П51-йодциаипиндолол [Pietri-Rouxel F., etal., 1995].
Важно отметить, что {3-адренорецепторы в том или ином органе могут располагаться как в кровеносных сосудах, так и непосредственно па клеточных элементах этого органа. Например, по данным M.S.Finkel и соавт. (1984), [3-адренорецепторы в легких распределены диффузио и имеются в крупных и мелких бронхах, а также в их кровеносных сосудах. Поэтому, по нашему мнению, при фармакологическом анализе подтипов [З-адрепорсцеп-торов в различных тканях необходимо дифференцировать принадлежность их к тому или иному виду клеточной популяции.
Вариабельность [З-адрепореценторов имеет большое теоретиче-
10*
147
с кое и практическое значение и стала предметом интенсивных исследований лишь в последние годы. Выявлено изменение как числа 0-адренорецепторов, так и соотношение их подтипов при различных воздействиях.
R.D.Aarens и соавт. (1983) обнаружили, что введение здоровым добровольцам эфедрина (200 мг/день) или тербуталина (15 мг/день) в течение 8 сут. приводит к снижению числа 0-адренорецепторов на мембранах лимфоцитов примерно па 50%. После прекращения введения эфедрина и тербуталина число 0-адрепорецецторов на мембранах лимфоцитов возвращалось к исходному уровню через 7 и 4 сут. соответственно.
В экспериментах in vitro также наблюдалось снижение числа р-адренорецепторов при воздействии агонистов этих рецепторов. Так, изопротеренол (1 мкМ) вызывал транзиторцое уменьшение числа 0-адренорецепторов в клетках глиомы С6 на 40% [Hertel С., Staehelin М., 1983]. Данный эффект изопротеренола не был энергозависимым.
Эти результаты дают возможность предполагать, что прогрессивное снижение фармакологических эффектов 0-адренер-гических агонистов при их длительном введении обусловлено снижением числа 0-адреиорецепторов.
Выраженное влияние па число p-адренорецепторов оказывают антидепрессанты. Имипрамип при его длительном введении крысам уменьшал число p-адренорецепторов в коре головного мозга [Geisber A. et al., 1982], а дезметилимипрамип в сердце [Nomura Y. et al., 1982].
S.L. Petrovic и соавт. (1983) обнаружили изменение числа 0-адренорецецторов и в соотношении их подтипов в почках крыс под воздействием андрогенов. При гипертрофии почек у мышей, вызванной внутримышечным введением пропионата тестостерона (1 мг/день в течение 21 сут.), происходит увеличение числа 0-адрепорецепторов па единицу белка мембран почек, связывающих ,231-йодциаипиндолол в 2 раза, по пе изменяется кажущаяся константа его диссоциации с этими рецепторами (Кч=20 — 25 пМ). Изучение влияния 0^селективных веществ црактолола и метопролола и 02-селективпых веществ IPS-339 и зицтерола на связывание этого радиолигаида с мембранами почек позволило установить, что андроген избирательно индуцирует увеличение количества 0-, но не 0,-адреиорецепторов в мембранах клеток почек.
K.P.Minneman и соавт. (1982) при введении крысам в течение
148
11 дней ингибитора мопоамипоксидазы паргилипа (25 мг/кг в 1сут.) или ишибитора нейронального захвата норадреналина дезметил имипрамииа (10 мг/кг 2 раза в 1 сут.) выявили снижение плотности |3 ,-адренорецепторов в полосатом теле головного мозга на 20 — 25%. В то же время адреналэктомия или хроническое введение избирательного антагониста ^-адренорецепторов пропранолола вызывали небольшое, по статически значимое увеличение плотности ^-адренорецепторов в полосатом теле. Однако адреналэктомия и указанные ЛВ не влияли заметно па число р,-адренорецепторов в полосатом теле.
Адреналэктомия сопровождается снижением числа р-адреноре-цепторов в жировых клетках крыс [Thotakura N.R. et al., 1982],а дексаметазон при его введении крысам вызывает увеличение плотности [J-адрено рецепторов в легких (данный эффект обусловлен синтезом нового белка) [Maniscalco W.M., Shapiro P.L., 1983].
В ряде случаев может изменяться соотношение не только между подтипами р-адреиорецепторов, по и между р- и «-адренорецепторами. Так, F.Okajuna, M.Ui (1982) сообщили о переходе рецепторов, опосредующих влияние катехоламинов па активность глн-когецфосфорилазы и гликогенеинтетазы, в процессе культивирования гепатоцитов крыс с сс-типа в p-тип, a K.Broustad, T.Christoffersen (1980) — об усилении £-, попе «-адренергической стимуляции образования цАМФ в гепатоцитах при регенерации печени. Согласно данным M.Accerbeck и соавт. (1983), через 36 ч после наложения лигатуры па желчный проток крыс происходит уменьшение числа р,-адренорецепторов на плазматических мембранах клеток печени с 680 до 285 фмоль/мг белка, ио увеличение числа Р-адренорецепторов с 25 до 67 фмоль/мг белка. Способность фенилэфрина и изопротеренола стимулировать гликоген-фосфорилазу гепатоцитов после холестаза уменьшалась и увеличивалась соответственно. У иитактиых животных активация этого фермента адреналином ингибировалась феитоламипом, но не пропранололом. В то же время при холестазе пропранолол в этом отношении был более активен, чем феитоламин. Поскольку при холестазе имело место 10-кратпос увеличение числа митозов в печени и включения 3Н-тимидина в ДНК гепатоцитов, можно полагать, что изменения адренергической регуляции гликогенолиза в печени при холестазе не обусловлены изменением гормональных эффектов вследствие нарушения нх метаболизма при данной печеночной патологии, а могут быть связаны с регенерационными процессами.
149
Таблица 7.
Факторы, регулирующие число адренорецепторов
Тип рецептора Фактор Характер изменения
р Агонисты Уменьшение
р Антагонисты Увеличение
аир Денервация »
Р Гормоны щитовидной железы »
а Тоже Уменьшение
р Глюкокортикоиды Увеличение
а Эстрогены »
а Прогестерон Уменьшение
р Ишемия сердца Увеличение
а Старение Уменьшение
р Спонтанная гипертензия Увеличение
а » *
р Врожденная сердечная недостаточность »
а Бутират (in vitro)
Имеющиеся сведения о влиянии различных факторов па адренорецепторы обобщены в табл. 7,
Таким образом, па основании приведенных результатов можно заключить, что причинами вариабельности р-адрепорецеп-торов могут быть:
1. Воздействие физиологически активных веществ, так или иначе влияющих па адренергические системы.
2. Изменение гормонального фона.
3. Изменение функционального состояния органа в условиях патологии (холестаз, регенерация и др.).
Мы считаем необходимым также отметить, что адренергическая регуляция функции тех или иных органов может изменяться не только за счет изменения числа или соотношения адренорецепторов, но и вследствие индукции изменения каких-то процессов сопряжения рецепторов с внутриклеточными структурами. Иллюстрацией этого положения служат данные М.М.Hawthorn и K.J.Brodby (1982). Авторы показали, что после впутрнбрю-шишю-го введения морским свинкам резерпина (0,1 мг/кг в 1 сут.) в течение 3 — 7 дней происходит значительное увеличение способности изопрецалииа повышать силу сокращений изолированных сосочковых мыши сердца. Поскольку изопрен ал и 11 не влиял на но-
150
ложителыюе инотропное действие гистамина и Са2+ на сосочковые мышцы, то можно считать, что данное повышение чувствительности мышц к изопреналипу является специфичным и опосредованным Р-адреиорецепторами. Мембраны мышцы желудочков сердца интактных морских свинок и тех животных, которым предварительно вводили резерпин, связывали 3Н-дигидроалпре1 юл о л с одинаковой константой диссоциации и содержали одинаковое число связывающих участков. Резерпин не влиял также па способность изопрепалипа вытеснять 3Н-дигидроалиренолол из его связи с p-адренорецепторами мембран мышцы желудочков сердца. Следовательно, связывающая способность p-адрепорецепторов и их число пе играют роли в индукции резерпином повышенной чувствительности сосочковых мышц сердца морских свинок к инотропному эффекту изопрепалипа, а опосредованы какими-то еще не изученными механизмами.
Можно предположить, что некоторые факторы влияют па сопряжение адренорецепторов с адепилатциклазой и таким образом изменяют ответ клетки на воздействие катехоламипер-гических агонистов. Действительно, имеются сведения о том, что при ряде воздействий может изменяться образование комплекса HRN, играющего ключевую роль в сопряжении (J-адрс-порецепторов с адепилатциклазой. Так, воздействие агонистов (десенситизация), гипотиреоз, солюбилизация рецепторов сопровождаются уменьшением образования комплекса HRN, а воздействие кортикостероидов, гипертиреоз и повышение вязкости мембран — увеличением образования комплекса HRN [I^efkowitz. R.T., 1981].
Закончив рассмотрение фармакологических и биохимических исследований эффектов катехоламинергических сосдинешгй, опосредуемых постсшоптическими ^-адренорецепторами, приводим обобщение имеющихся сведений об этих эффектах.
1. Pj-Адренорецепторы сердца (положительный инотропный и хронотропный эффект) [AriensEJ., Simons А.М., 1983].
2. р, -Адренорецепторы головного мозга (?).
3. р,-Адренорецепторы адипоцитов (липолиз) [Bertholet A. et al., 1981].
4. р^Адренорецепторы легких (?).
5. Р(-Адренорецепторы юкстагомерулярпого аппарата почек (увеличение секреции репина)
6. Pj-Адреиорецепторы неиспорченных мышц сосудов и других органов (расслабление) [Ahlquist R.R., 1976].
7. Р, -Адренорецепторы щитовидной железы (стимуляция сек-
151
рециц йодосодержащих гормонов) [Smith Н.Т. et al., 1983}.
8. р2-Адренорецепторы скелетных мышц (распад гликогена, стимуляция сокращений) [Furchgott R.F,, 1972].
9. Р,-Адренорецепторы адипоцитов (липолиз) [Senault О. et al., 1982],
10. Р2-Адренорецепторы слезной железы (стимуляция секреции) [Maudiut Ph. et al., 1983].
11. p2-Адренорецепторы клеток Лейдига (стимуляция стероидогенеза) [Poyet Р., Labrie F., 1983].
12. Р,-Адренорецепторы гепатоцитов (стимуляция гликогенолиза) [Arinze I.J., Kawai Y., 1983].
13. Р3-Адренорецепторы адипоцитов (регуляция образования макроэргов и термогепеза) [Strosberg A., Pietri-Rouxel F., 1996].
До сих пор речь шла о иостсииаптических [5-адренорецепторах, однако, необходимо отметить, что в периферических нервных окончаниях найдены нресипиитические Р-адрепорецепторы, опосредующие высвобождение норадреналина. Первое сообщение об этих рецепторах появилось в 1974 г. [Langer S.Z. et al., 1974]. Их присутствие показано в окончаниях норадренергических нервных волокон, подходящих ко многим внутренним органам животных и человека [Westfall Т.С. et al., 1977; Dahlof С. et al., 1978, 1981; Pelayo F. et al., 1978; Langer S.Z., 1981].
В ЦНС пресипаптическнх p-адренорецепторов пока не выявлено, хотя попытки идентифицировать имели место [Starke К., 1977; VisiE.S., 1979].
Как и ностсииантические p-адрепорецеиторы, пре-сишштические Р-адрепорецепторы стереоспецифпчны, так как (+)-изопротеренол в отличие от (-)-изопротеренола пе стимулирует высвобождение норадреналина [Cebich J. et al., 1978].
Имеющиеся экспериментальные данные противоречивы в отношении того, к какому подтипу относятся прес н на) гги чес кие р-адрепореценторы. С одной стороны, р,-агонисты тербуталин и салбутамол, по пе Р^агоиист Н110/38 увеличивают высвобождение 3Н-пОрадрепалииа из сосудосуживающих нервов человека при их электрической стимуляции [StjarneL., BrundinJ., 1976]; с другой стороны, пресипаптлческне Р-адрепореценторы икроножной мышцы кошек иш'ибируготся избирательным Р^адрепоблокатором метопрололом [Dahlof С. et al., 1975]. Эти результаты могут отражать видовые и/или тканевые различия p-адренорецепторов. В будущем необходимы дальнейшие эксперименты для выяснения идентичности или неидептичпости пресипаптическнх р-адрепоре-
152
центоров с классическими постсипаитическпми Р-адреиорецетпорами.
2.2.1. Химическая природа ft-адренорецепторов
р-Адренорецепторы являются мембраиосвязаппымн структурами. Поэтому выделение их в чистом виде, необходимое для последующего изучения молекулярной природы, представляет собой сложную задачу, к решению которой удалось приступить лишь в последние годы благодаря развитию биохимических препаративных методов (аффинная хроматография, различные виды электрофореза), применению иммобилизованных катехоламинов и моноклональных антител, а также благодаря синтезу антагонистов р-адренорецепторов, содержащих в своей структуре радиоактивную и фотоаффинную метки (последняя под действием ультрафиолетовых лучей ковалентно связывается с биомолекулами).
T.N.Lavinn соавт. (1982) показали, что p-адрепергнческнй антагонист п-азидобепзол-м- |251-йодкаразолол связывается с р,- и р2-адренорецепторам и мембран эритроцитов индюка и лягушки насыщаемым образом и с высоким сродством (Кх =10 — 15 пМ). Агонисты и антагонисты p-адренорецепторов конкурировали с ними за связывание с этими мембранами. Фотолиз мембранных образцов в присутствии данного антагониста с двойной меткой приводил к ковалентному включению лиганда в мембранные белки, которые в дальнейшем определяли с помощью методов электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и авто рад но 1'рафии. p-Адреперги веские агонисты и антагонисты защищали мембраны от ковалентной метки. Авторы обнаружили, что белки, ковалентно связывающие этот лиганд, представляют собой: в эритроцитах индюка в 100% случаев р2-адренорецситоры с молекулярной массой 58 000, в ретикулоцитах крыс в 100% встречаются 0.,-адре-нореценторы (М =65 000, 53 000), в клетках легких крыс в 80% находятся Р2-адренорепеиторы и 20% — адренорецепторы (М =62 000, 47 000, 36 000) и в клетках легких кролика в 20% — Р2-адрепорецепторы и 80% — р-адренорецепторы (М =65 000, 55 000).
R.Shorr и соавт. (1982) выделили pj-адренорецепторы эритроцитов индюка с помощью аффинной хроматографии. При гельэ-
153
лектрофорезе с додецилсульфатом натрия очищенного рецептора, меченного |231-цианпипдололом, выявились две полосы меченного белка с молекулярной массой 40 000 ±2000 и 45 000 ±3000 в соотношении 4:1, Эти два пептида в таком же соотношении и также специфично метились с помощью фотоаффишюго зонда 1231-п-азидобепзилкаразолола; после очистки они проявляли специфичность, аналогичную двум рецепторным фор-мам р ^адренорецепторов, и сходство в отношении их расщепления протеазами — химотрипсином и трипсином.
Таким образом, в этой и предыдущей работах независимо были получены очень близкие результаты о Р,-адренергических рецепторных связывающих участках в мембранах эритроцитов индюков. W.Burgermeister и соавт. (1983) для выделе-пия р-адрепоре-цепторов из мембран эритроцитов индюков применил другую метку — диазиридип- |251-йодциапИ11Пдолол. При фотолизе диазири-дип превращался в карбен, ковалентно связывающийся с белками эритроцитов. Данный белок, идентифицированный авторами как Р,-адренорецептор, имел молекулярную массу 40 000.
Эти результаты, а также данные A.Rashidbaidi и A.E.Rioho (1982) и W.Burgermeister и соавт. (1982) о ррадрепорецепто-рах эритроцитов индюков, голубей, уток, полученных с помощью фотоаффиппых меток, позволяют заключить, что их молекулярная масса находится в области 39 000 — 52 000.
В то же время р;-адренорецепторы эритроцитов индюков, выде-леш1ые с помощью моноклональных антител, представляли собой мономеры с молекулярной массой 65 000 [Venter J.С., Fraser С.М., 1983], С помощью этого же метода установлено, что Р-адрепоре-цснторы мембран клеток легких собак представляют собой молекулу с молекулярной массой 109 000, которая, вероятно, является димером, состоящим из мономеров с молекулярной массой 55 000 — 58 000 [Venter J.С., Fraser С.М., 1983].
Согласно данным T.N.Levin н соавт. (1982), специфические (^.-адренорецепторы легких крыс и хомячков имеют молекулярную массу 64 000,а по данным W.Burgermeister и соавт. (1983) 67 000 у морских свинок.
Солюбилизированные ди гитонином Р -адренорецепторы легких собак имели радиус Стокса, равный 4,9 нм и молекулярную масс;' около 52 000 [Homey C.J. et al., 1983]. Такую же молекулярную массу имели (^-адренорецепторы, фотоаффнп-по меченные :1Н-ацебутололазпдом. Авторы считают, что рецепторный белок содержит участок связывания гормона и что нативный |32-адренорецептор, солюбилизированный дигитошшом,
154
Рис. 33. Взаимодействие катехоламинов с различными подтипами р-адренорецепторов [Harms Н. Н. et al,, 1982].
А — гибрид р,- и р,-адренорецепторов (рецепторы адипоцитов крыс); Б — классические р2-адренорецепторы трахеи морской свинки; В — классические Р-адренорецепторы предсердия морской свинки.
может состоять более чем из одного такого белка.
Можно полагать, что существующие различия в результатах о величине молекулярной массы ^-адренорецепторов обусловлены как различиями в методиках выделения этих рецепторов, так и протеолизом рецепторов в процессе выделения.
2.2.2. Молекулярные механизмы взаимодействия лигандов с ^-адренорецепторами
Как уже указывалось, кроме двух (pj и [}.,) основных подтипов [З-адренорецевторой, существуют рецепторы со смешанными свойствами, характерными как для f^-, так и для Рй-рецепторов (такие рецепторы присутствуют па поверхности жировых клеток). Изучение взаимодействия адренергических веществ с различной структурой со всеми видами p-адрецорецепторов [Harms Н.Н. et al., 1974,1975, 1977, 1982] позволило предложить схематическое изображение взаимодействия лигандов с Р-адре-норененторами (рис, 33).
Отметим, что общей характеристикой всех агонистов и антагонистов p-адренорецепторов является присутствие в их структуре аминной п гидроксильной групп. У агонистов все заместители являются гидрофильными, что свидетельствует об их взаимодействии с участками, расположенными на поверхности рецепторного белка. У антагонистов присутствуют гидрофобные .замести -
155
тел и, которые, по-видимому, проникают в область рецептора, недоступную для гидрофильных заместителей,
Точная молекулярная структура связывающего участка р-адре-норецеиторов пока неизвестна. Имеются лишь некоторые данные об участии тех или иных функциональных .групп в формировании этого связывающего участка. Поскольку дитиолы в отличие от монотиолов снижают связывание 3Н-дигидроалпреиолола с Р2-ад-реиорецепторами мембран микросом скелетных мышц кролика, а Н2О2 частично обращает этот эффект веществ с двумя сульфгидрильными группами, М. Wkight и G.Drimmond (1983) делают вывод о том, что Р-адренорецепторы скелетных мышц содержат в своем составе дисульфидную группу.
По данным B.D.Chcrksey и соавт. (1981), в связывании пропранолола с p-адренорецепторами мембран эритроцитов лягушки принимают участие триптофановый остаток. Пропранолол защищает триптофановый остаток p-адрепореценторов от модификации его реагентом Кошланда (бромид 2-окси-5-питро-бепзола) и уменьшает интенсивность собственной флюоресценции триптофанового остатка. Оценка с помощью уравнения Ферстера расстояния между хромофорными центрами пропранолола и триптофанового остатка показала, что оно меньше 20 нм. По-видимому, гидрофобный «карман», содержащий данный триптофановый остаток имеет большое значение в связывании антагонистов, по не агонистов р-адрепорецепторов.
2.2.3. ^-Адренергические механизмы
Молекулярные механизмы, вовлеченные в реализацию физиологических эффектов катехоламинов, опосредованных р-адрепоре1 iei i-торамн, исследованы достаточно полно.
В экспериментах, проведенных на эритроцитах различных видов животных, клетках сердца, легких и некоторых культурах клеток (лимфома S49, глиома С6), было продемонстрировано существование сопряжения между р^ и р2-адренорецепторами с адени-латциклазой [Hoffman В.В., Lefkowitz R..J., 1980; Lefkowitz R.J., Hoffman B.B., 1980; Minucman K.P., Molinoff P.B., 1980; Ross E.M., Gilman A.G., 1980]. Авторы выявили, что в данном сопряжении, проявляющемся в активации адеиилатциклазы, принимают участие гуаниновые нуклеотиды и регуляторный белок, связывающий эти нуклеотиды.
156
СХЕМА 4. Регуляция катехоламинами активности аденилатциклазы при участии р-адренорецепторов
II — катехоламин, R — p-адренорецептор, N — белок, связывающий гуаниновые нуклеотиды; К— каталитическая часть аденилатциклазы.
По современным представлениям, при связывании агониста (Н) с Р-адрепорецепторами (R) образуется комплекс (Н — R) [Exton J.H., 1981] (схема4).
Взаимодействуя с белком, связывающим гуаниновые нуклеотиды (N), агонист образует тройной комплекс (H-RN). В результате этого взаимодействия происходит снижение сродства белка, связывающего гуаниновые нуклеотиды, к ГДФ. При этом ГДФ высвобождается и его место занимает ГТФ, который придает белку, связывающему гуаниновые нуклеотиды, заряд, вследствие чего уменьшается сродство p-адренорецептора к агонисту й агонист-рецепторпый комплекс распадается. Кроме того, связывание ГТФ индуцирует взаимодействие связывающего его белка с каталитической субъединицей аденилатциклазы (К) и образование активного ферментного комплекса (N"* — К). После гидролиза ГТФ в ГДФ, происходящего при участии ГТФазы, данный комплекс быстро распадается п адепилатциклаза становится неактивной. Согласно этой схеме, высвобождение ГДФ из его связи с белком является лимитирующим этапом активации аденилатциклазы.
Описанный механизм сопряжения p-адренорецепторов с аде-нилатциклазой можно также схематично представить па уровне плазматической мембраны [Nahorski S.R., Barnett D,В,, 1982] (рис. 34),
Y.I.Henis и соавт. (1982) с помощью видеонптепсификациоп-ноп микроскопии показали, что Р-адренорецеиторы изолировагшых
157
Агонист
Рис. 34. Механизм взаимодействия мембранных компонент при стимуляции агонистами р-адрепорецепторов.
Агонист связывается с рецептором R и вызывает конформационные изменения молекулы R, что приводит к связыванию комплекса агонист — рецептор с гуаниннуклсотидсвязывакнцкм белком G и образованию комплекса агонист — R — G. Образование последнего способствует обмену ГТФ с ГДФ за связь с G, после чего Происходит диссоциация G от R и связывание его с адени латин клало)! (АЦ). При этом R превращается в R1, а синтез цАМФ протекает до тех пор, пока ГТФ нс гидролизуется ГТФазой,
гепатоцитов человека в комплексе с флюоресцентным аналогом алнренолола существуют в кластерах как при 4°С, так и при 37°С. Кластеры наблюдались уже через 30 с после добавления лиганда, что позволяет предполагать их существование в отсутствии антагониста. Преникубация клеток с изопротеренолом в течение 5 — 30 мин приводила к высво-бождепию Р-адрепорецепторов из кластеров и цх гомогенному распределению по мембране (коэффициент латеральной диффузии был равен 1,410 й см2' с1). Зависимость высвобождения рецепторов из кластеров коррелировала с потерей чувствительности аденилатциклазы к Р-агонистам, по высвобождение происходило значительно медленнее активации аденилатциклазы. Результаты этой работы свидетельствуют, что активация аденилатциклазы через адренорецепторы не требует латеральной подвижности большинства адренорецепторов. Данные T.B.Nielsen и соавт. (1981) также согласуются с гипотезой о сопряжении p-адреиорецепторов с аденилатциклазой до гормональной стимуляции.
Важные сведения о механизмах функционирования р-адрепо-рецепторов были получены S.E.Pendersen и E.M.Koss (1982), ко
158
торые сумели реконструировать функциональную взаимосвязь между p-адренорецепторами, солюбилизировашгыми из мембран эритроцитов индюка, с ГТФ-связьшающим белком аденилатциклазы (N-белок), выделенным из мембран печени кролика. Этот белок был способен встраиваться в протео липосомы, содержащие р-адреиоре-цецторы. В присутствии изопротеренола N-белок быстро активировался ГТФ и восстанавливал активность аденилатциклазы в мембранах клеток. Стимуляция была пропорциональна концентрации протеоли носом. Авторы рассчитали, что 1 р-адренорецептор способен активировать 5 — 6 N-белков. По-видимому, |3-адренорецептор осуществляет своего рода катализ в аденилатциклазпой системе.
Все p-адренорецепторы, стимулирующие адепилатциклазу, сопряжены с Gs -белком [Hardman J., et al., 1996]. Этот белок может также передавать активирующее влияние на кальевые каналы мембран скелетных или сердечной мышц. Почти во всех случаях эффекты, опосредованные активацией р(- и (^-адренорецепторов, связывают с повышением внутриклеточного уровня цАМФ, обусловленного увеличением активности адепилат-нпклазы. В ряде экспериментов было выявлено, что активация аденилатциклазы NaF пе воспроизводит все эффекты, наблюдающиеся при стимуляции p-адренорецепторов. В качестве примера можно привести индукцию агонистами Р-адрецореценторов ингибирования поглощения Mg2* клетками лимфомы S49 [Maguire М.Е., Erodos J.J., 1980], стимуляции метилировшныфосфолишщов в эритроцитах и клетках астроцитомы [Hirata F. et al., 1979; Strittmater W.J., 1979] и изменение ионных трансмембранных токов; изадрип вызывает рост тока Са-’ , а р-адрепоблокаторы его ингибируют [Пороги ков В.И. и др.]. Теоретически это не кажется удивительным, поскольку изменение конформации р-адренорецепторов при воздействии па них агонистов может приводить к изменению активности пе только аденилатциклазы, но и функции других мембранных структур, с которыми контактируют данные рецепторы. Однако вследствие того, что изменение уровня цАМФ в клетке влияет на многие важнейшие клеточные функции, катехоламин-чувствительная адеиилатциклаза, но-видимому, принимает участие в реализации биологической активности адренергических средств. В то же время отметим, что пока пет ясности в вопросе, существуют ли различия в механизмах сопряжения Р,-и Р2-адрепорецеиторовс адепилатциклазой, по известно, что Рг-адренореценторы клеток глиомы С6 лучше сопряжены с адепилатциклазой, чем р^адрепорецеп-
159
Рис. 35. Регуляция высвобождения норадреналина при электрической стимуляции нерва, которая опосредована пресипаптпчсскимн р-адрепоре-цспторами [Langer S, Z,, 1981].
Норадреналин (НАУ, высвобождающийся при низкочастотном раздражении нерва, или циркулирующий адреналин (А) активируют прссннаптичсские р-адрс-порецепторы и тем самым увеличивают высвобождение медиатора. Этот эффект, вероятно, опосредован повышением уровня пАМФ в норадренергических нервных окончаниях. Показаны постеняаптнчсскнс р-адрсно|>сцспторы, принимающие участие в ответе эффекторной клетки. МАО — моноаминокспдаза митохондрий.
Topbi[Homburger V. et al,,1981].
Как и в случае иостсииаптических Р-адренорецепторов, стимуляция иресииаитических р-адренорецепторов может приводить к изменению уровня цАМФ. Считается, что облегчение высвобождения медиатора, вызываемое стимуляцией пресипап-тических р-адре-иорецепторов, опосредовано повышением содержания цАМФ в норадренергических нервных окончаниях (рис. 35). Изложенная точка зрения подтверждается данными о том, что ди бути рил цАМФ и теофиллин, увеличивающие внутриклеточный уровень цАМФ, повышают высвобождение норадреналина в семя вы водящем протоке морской свинки, вызываемое раздражением нерва [Wotten G.F. et al., 1973]. Папаверин, как и другие ингибиторы фосфодиэстеразы, усиливает высвобождение норадреналина при раздражении симпатических нервов [Cubeddu L.X. et al., 1975; Langer S.Z. et al., 1975; CeluchS.M. etal., 1978].
Положительная обратная связь, облегчающая высвобождение
160
медиатора из адренергических нейронов, по-видимому, играет немаловажную роль в возникновении гипертензии при стрессовом подъеме уровня адреналина в крови. Это предположение основано на том, что, во-первых, циркулирующий адреналин непосредственно может стимулировать иресипаптивеские ^-адренорецепторы, во-вторых, он может накапливаться в симпатических нервных окончаниях и, высвобождаясь из них, в последующем опять стимулировать эти же рецепторы, тем самым усиливая выброс катехоламинов [Rand M.F. et al., 1983]. Если это действительно так, то р-адреноб-локаторы, такие, как пропранолол, будут ингибировать данный эффект адреналина и уменьшать опасность возникновения гипертензии при стрессе. По нашему мнению, такой возможный эффект действия р-адреиоблокаторов нельзя оставлять без внимания.
2.2.4. Десепситизация fl-адренорецепторов
Известно, что при инкубации агонистов с клетками, содержащими p-адренорецепторы, в течение 15 — 30 мин развивается десенси-тизация рецепторов [Perkins J.P. et al., 1975; Mukherjee С., 1976, 1977]. Десепситизация сопровождается снижением числа Р-адре-порецепторов и способности агонистов активировать адеиилатцик-лазу [Kebabian J.M. et al., 1975; Mickey T.J. et al., 1976]. Изопротеренол снижает число P-адренорецепторов в мембранах клеток коры головного мозга [Wagner J., Davis J.N., 1979], жировой ткани [Gudicelli A.K. etal., 1979] и предстательной железы [Tick Е. et al., 1980].
Процесс десенситизации p-адрепорецепторов зависит от степени дифференцировки ткани. Согласно данным S.A.Morris и соавт. (1983), изопротеренол повышает концентрацию цАМФ в недифференцированных (с низкой плотностью) и дифференцированных (с высокой плотностью) мышечных клетках линии ЦЕд. К данному эффекту изопротеренола у клеток с низкой плотностью десепситизация развивается в 2 раза быстрее, чем у клеток с высокой плотностью. У десенситизировапных клеток с высокой плотностью сохраняется, а у десенситизировапных клеток с низкой плотностью исчезает активность изонротерепол-зависимой аденилатциклазы. При десенситизации число р-ад-реиорецеиторов, определяемое но связыванию ,2;>1-йодцианпип-долола, не изменяется у клеток с низкой плотностью, но уменьшается у клеток с высокой плотностью.
II . Зак. 227
161
При изучении молекулярных механизмов десенситизации Р-адренорецецторов были открыты новые важные факты о путях обмена рецепторных молекул в клетках.
По данным J.Stadel и соавт. (1983), определяемые но связыванию ,25Гцпаппиндолола Р-адрецореценторы плазматических мембран эритроцитов лягушки исчезают в процессе инкубации эритроцитов с агонистами p-адренорецепторов. Эти рецепторы обнаруживаются в легкой везикулярной фракции, получаемой при центрифугировании цитозоля эритроцитов цри 158 000 g в течение 1 ч. Активность маркерных ферментов плазматических мембран фгор-и форсколипстимулируемой аденилатциклазы, 5'-пуклеотидазы и ацетилхолинэстеразы в этой везикулярной фракции была незначительной. Гуаниновые нуклеотиды не влияли на связывание агонистов и антагонистов p-адренорецепторов с данными везикулами. С помощью фотоаффишюй метки |251-назидобепзилкаразолола выявлено, что Р-адренорецепторы плазматических мембран и везикул имеют одинаковые электрофоретические свойства. Авторы делают вывод, что индуцируемая катехоламинами десепситизация Р-адренорецепторов эритроцитов приводит к интернализации (проникновению внутрь клеток) более 50% рецепторов плазматических мембран в цитозольные везикулы, не содержащие аденилат-циклазной системы. Особый интерес представляют исследования, посвященные изучению механизмов процессов десенситизации р-адренорецепторов. Так как ингибиторы фосфолипазы А2 и транс-глутаминазы блокируют десенситизацию адренорецепторов [Hedberg А., 1983], становится понятной возможность многих гормональных воздействий, влияющих на активность этих ферментов, изменять также и чувствительность клеток к p-адренергическим стимулам. При инкубации предстательной железы крыс с изопротеренолом S.Shima и соавт. (1983) зарегистрировали уменьшение количества p-адренорецепторов, связывающих 3Н-дигвдроалпрево-лол, с 290 до 167 фмоль/мг белка и снижение способности изопротеренола стимулировать аденилатцнклазу. Предварительная инкубация ткани предстательной железы с ацетилхолином (100 мкМ), КСС1 (56 мМ) или кальциевым ионофором А 13287 (10 мкМ) предотвращала индукцию изопротеренолом десенситизации адеци-латциклазы, ио не снижения числа р-адреиорецеиторов. ГТФ терял способность увеличивать чувствительность аденилатциклазы после ее десенситизации, вызванной изопротеренолом, что может быть связано с нарушением функции цуклеотидсвязывающего регуляторного белка, обеспечивающего сопряжение между Р-адрено-
162
рецепторами и аденилатциклазой. Ацетилхолин предотвращал потерю способности ГТФ увеличивать стимулирующее действие изопротеренола на аденилатциклазу. Более того, при десепситизации имело место снижение способности ГФФ ШН)Ф и NaF стимулировать аденилатциклазу, а при предварительной инкубации предстательной железы с ацетилхолином снижение этой способности у ГФФ (NH)O и NaF пе наступало.
В связи с этим, несмотря на уменьшение числа р-адренорецеп-торов при десепситизации, остающиеся рецепторы могут передавать сигнал катехоламинов на аденилатциклазу при условии защиты пуклеотидсвязывающего регуляторного компонента (белка) в процессе десепситизации. Эта защита может обеспечиваться увеличением внутриклеточного уровня Са2+, вызываемого такими веществами, как ацетилхолин, А 13287 или КСС1. Таким образом, нарушение регуляторного белка, связывающего гуаниновые нуклеотиды, является одним из главных факторов развития десенси-тизации катехоламипчувствителыюй адеиилатциклазы.
Эти исследователи еще раз продемонстрировали, что изучение только связывания агонистов или антагонистов с рецепторами не дает нрава говорить об их биологической активности, поскольку для реализации указаююй активности необходимо существование сопряжения между данными рецепторами и какими-либо функциональными изменениями клеток. В связи с этим, но нашему мнению, открывается еще один путь регуляции адренореактив! 1ЫХ систем — воздействие па компоненты, трансформирующие и передающие сигналы, полученные рецептором в момент его взаимодействия со специфическими лигандами, на другие биоструктуры клеток.
2.2.5. ^-Адренорецепторы — мишень действия ЛВ
В клинике широко используются ^-адренергические ЛВ. По селективности выделяют избирательно действующие на р,-или Р2-адрепореценторы и неизбирательпо действующие (активные по отношению к Р,-и Р2-адреиорецепторам); по виду действия разделяются на антагонисты (блокирующие p-адренорецепторы) и агонисты (возбуждающие р-адрепорецепторы).
Различные сведения о механизме действия р-адреиергических веществ обобщены М.Д.Машковским (1978), Д.А.Харкевичем
и»
163
(1981), С.В.А1шчковым (1981), И.В.Комиссаровым (1982).
Мы в данном разделе остановимся лишь на некоторых, но нашему мнению, наиболее актуальных аспектах молекулярной фармакологии p-адренергических ЛВ.
Среди антагонистов [}-адренорецепторов наиболее широкое применение в клинике нашли пропранолол (сип.: индерал, обзи-дан, анаприлип) и сходные с ними препараты нронеталол и алпреналол, которые блокируют как Р,-, так и Р2-адренорецен-торы. Данные вещества снижают артериальное давление у больных с эссенциальной гипертонией [Maling T.J.B. et al., 1979]. Согласно сведениям M.Boak и соавт. (1982), при однократном введении больным с эссенциальной гипертонией пропранолола (5 мг) в течение 24 нед. (40 — 60 мг/день) не происходит изменения концентрации адреналина и норадреналина в плазме. После однократного введения пропранолола активность репина в плазме снижалась в меньшей степени, чем при его длительном введении, что указывает иа связь антигипертензивного эффекта пропранолола со снижением активности репина в плазме.
Атенолол и пропранолол уменьшают потребление О2 при физической нагрузке у людей [Kaiser Р. etal., 1983]. Эта способность [}-адреноблокаторов, но-ввдимому, оказывает благоприятное влияние при ряде заболеваний. Так, пропранолол нивелирует патологические изменения ЭКГ и предотвращает- распространение некроза в миокарде [Neli-Deweyr et al., 1983], а атенолол уменьшает размеры некроза миокарда при тралзиторной и постоянной коронарной окклюзии у экспериментальных животных [Коган А.Х. и др., 1984].
Атенолол, так же как и практолол и метопролол, относится к селективным [фадрепоблокаторам. Их преимущество ио сравнению с неселективными р-адреноблокаторамп при использовании в качестве антигипертензивных средств заключается в том, что они не оказывают побочного действия на Ру адренорецепторы бронхов и не вызывают бронхоспазма. Считается, что способность этих веществ снижать артериальное давление обусловлена блокированием Рррецепторов сердца, приводящим к развитию отрицательного инотропного эффекта и подавлением Рурецепторов почек, модулирующих высвобождение ренина [Fitzgerald J.D., 1982].
Нельзя не упомянуть о фадреиоблокаторах с частичной агонистической или внутренней симпатомиметической активностью. Такой активностью обладают многие Р-адреиоблокаторы: дихлори-зопреиалин, ацебуталол, алпренолол, окспренолол, пипделол, нракго-лол. Но она не обнаружена у атенолола, метопролола, иадолола,
164
пропранолола, соталола, тимолола и либеталола [Lewis W.L., McNeil J .J., 1982; McDevitt D.G., 1983]. Стимуляция блокаторами с частичной агонистической активностью (3-адрепорецепторов никогда не достигает той величины, которая имеет место при их стимуляции чистыми агонистами. Они стимулируют (^-адренорецепторы более медленно и менее выражение. Антагонисты с частичной агонистической активностью блокируют действие на сердце катехоламинов, но сами пи положительным, ни отрицательным инотропным эффектом не обладают. Кроме того, вещества с данной активностью не вызывают бронхоспазма, симптомов болезни Рейно, брадикардии и абстиненции (последняя проявляется после резкого прекращения введения p-адрепоблокаторов в виде аритмии, желудочковой тахикардии, недостаточности сердца, инфаркта миокарда и др.).
Как доказали исследования U.Parrig и G.Becker (1983), большое практическое значение имеет знание времени жизни комплексов антагонистов с ^-адренорецепторами. Авторы обнаружили, что через 90 мин после отмывания монослойной культуры клеток сердца новорожденных крыс от |)-адреноблокатора тимолола наблюдается его полное «отторжение» от рецепторных участков. При этом способность изоцрепалина стимулировать образование цАМФ отличалась от контрольной. В то же время через 90 мни после удаления из среды инкубации другого p-адреиоблокатора коразо-лола эта способность изопреналина была уменьшена на 50%. Диссоциация коразолола от участков его специфического связывания описывалась экспоненциальной кривой с ^равным 115 мин. Следовательно, фармакодинамические свойства p-адреиоблокаторов сильно зависят от кинетики их комплексообразования с Р-адреноре-центорами.
* ♦ ф
В обобщенном виде имеющиеся данные о клиническом применении адренергических веществ представлены в табл. 8.
В небольшой главе, естественно, нельзя рассмотреть все работы, посвященные проблеме адрепорецепции. Поток их настолько велик, что для ее полного освещения надо было бы написать несколько томов. Мы остановились лишь на наиболее важных, по нашему мнению, вопросах гетерогенности, изменчивости, регуляции и функционирования адренорецепторов.
Каковы же основные результаты изучения адрепорецепции?
1. Адренорецепторы в процессе эволюции сформировались как
165
генетически детерминированные белковые образования плазматических мембран клеток практически всех тканей и органов человека. Функция адренорецепторов заключается в специфическом узнавании, связывании молекул адреналина и норадреналина и передаче полученных от них молекулярных сигналов па различные биоструктуры клетки.
2. Адренорецепторы — коцформационио лабильные структуры. Их способность специфически связывать лиганды и трансформировать полученный сигнал зависит от присутствия или отсутствия одно- и двухвалентных ионов, циклических нуклеотидов и других низкомолекулярных соединений.
3. Адренорецепторы — динамические структуры. Число адренорецепторов одного класса, соотношение между классами и подклассами адренорецепторов, сопряжение адренорецепторов с определяющими их функциональную активность ферментами и другими регуляторными структурами в клетках могут меняться в процессе дифференцировки ткани, а также нри изменении гормонального фона и воздействии различных физиологических и патологических факторов.
4. Созданы и часто с успехом применяются ЛВ с избирательной трошюстью к определенному виду адренорецепторов для лечения ряда заболеваний сердечно-сосудистой и дыхательной систем.
Остановившись на уже достигнутом, необходимо сказать несколько слов о целях ближайших исследований.
С теоретической позиции, по нашему мнению, усилия ученых следует направить на решение следующих вопросов:
1. Изучить пространственную структуру всех видов адренорецепторов и зависимость этой структуры от различных воздействий.
2. Выяснить молекулярные механизмы сопряжения адренорецепторов с различными биомолекулами клетки.
3. Исследовать пути и механизмы регуляции обмена адренорецепторов, а также характер их наследования и эволюции,
4. Выделить и идентифицировать отдельные звенья адре-нореактивных систем, а затем их реконструировать в единое целое.
С практической точки зрения исследования но адрепорецеито-рологии следует вести в следующих направлениях:
1. Поиск более новых избирательных агонистов и антагонистов различных видов адренорецепторов и изучение механизмов их действия.
166
2. Поиск и анализ возможного использования в клинике ЛВ, взаимодействующих не с адрепалинсвязывающими участками адренорецепторов, а с другими структурами, так или иначе влияющими па функционирование адрепореактивных систем.
3. Выявление возможной корреляции между функциями адренорецепторов клеток крови с функциями адренорецепторов органов и тканей с целью поиска объективных способов оценки да молекулярном уровне функции того или иного вида адренорецепторов в организме, как для диагностики, так и проверки эффективности лечения с помощью адренергических средств.
4. Поиск других способов тестирования функции адренорецепторов у человека.
Как видно, теоретические и практические проблемы в области рецепторологии тесно переплетаются между собой; мы их выделили лишь условно. Решение перечисленных задач должно помочь разработать научно обоснованные методы лечения адренергическими веществами таких болезней века, как гипертоническая болезнь, инфаркт миокарда, бронхиальная астма и др.
Глава 3
ДОФАМИНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ
Первое сообщение о синтезе предшественника норадреналина —дофамина —было сделано одновременно и независимо друг от друга G.Barger, Р.С,Ewins (1910) п E.Mannich, W.Jacobsohn (1910), которые выяснили, что дофамин обладает слабой периферической симпатомиметической активностью. Затем было установлено, что дофамин изменяет функции сердечно-сосудистой системы совершенно отличные от тех, которые вызывают адреналин или норадреналин.
В 1942 г. Р.Holtz и Credner обнаружили, что дофамин снижает артериальное давление у морских свинок и кроликов. В то время еще ле были синтезированы специфические Р-адре-цоблокаторы, поэтому нельзя было выяснить, обусловлен ли данный эффект дофамина его взаимодействием с Р-адреноре-центорами или какими-либо другими рецепторами. Лишь недавно в условиях полной блокады а- и p-адренорецецторов удалось точно установить избирательное опосредование дофаминовыми рецепторами метаболических и сердечно-сосудистых эффектов дофамина [Seeman Р., 1982].
Еще раньше биохимическими методами было показано присутствие дофамина в головном мозге млекопитающих [Montagu К.А., 1957; Weil-Malherbe Н., Bone A.D., 1957; Carlsson A. et al., 1958]. С помощью гистохимических методик A.Carlsson и соавт. (1962) выявили локализацию дофамина в межнейро-пальпом пространстве, что дало возможность предположить существование дофаминергических нейрональных систем по аналогии с адренергическими и холинергическими системами.
Стимулом к поиску агонистов дофаминовых рецепторов были исследования Н. Ehringer и O.Hornykiewicz (1960), которые установили очень сильное снижение содержания дофамина в полосатом теле головного мозга больных, страдающих болезнью Паркинсона. Логично было предположить, что
168
дофаминергические вещества можно будет использовать в качестве иротивоиаркипсоиичсских средств. Первым агонистом дофаминовых рецепторов, кроме самого дофамина, стал апоморфин. Проведенные исследования А,И.Ernst (1965) показали, что поведенческие эффекты аиоморфипа опосредованы стимуляцией центральных дофаминовых рецепторов. В последующих исследованиях была выявлена агонистическая активность аиоморфипа в отношении дофаминовых рецепторов.
В настоящее время все дофаминергические вещества разделяют па агонисты и антагонисты.
3.1. Агонисты дофаминовых рецепторов
Агонисты дофаминовых рецепторов разделяют па прямые и непрямые.
3.1.1. Дофаминовые агонисты прямого типа действия
Агонисты этого типа взаимодействуют пе только с дофаминовыми рецепторами: амипотетралин и аноморфин стимулируют также а-адренорецепторы. Это не удивительно, так как сам дофамин активен по отношению к а- и p-адренорецепторам.
3.1.2. Дофаминовые агонисты непрямого типа действия
Данные вещества вызывают высвобождение дофамина (и норадреналина) из i агранулярного резерпиноустойчивого пула (амфетамин, 1-эфедрин) или из гранулярного и иеграну-лярного пулов (метилфенидат, мазинфен), а также блокируют обратный захват дофамина (номифепзип, беизотропин).
3.2. Антагонисты дофаминовых рецепторов
Эти соединения представлены антипсихотическими средствами: производными фенотназина (хлорпромазин, перфеназин), бутирофепона (гиалонеридол), дифенибутилпиперидииа (пимозид), тиоксаптеиа (флунентиксол), дибепзодназенииа (клозапин) н бензамида (сульпирид, метохлорирамид). Отметим, что некоторые дофаминовые антагонисты блокируют также сс-адрепергическце, холинергические, серотонинергические и гнетами нергнческие рецепторы.
169
3.3. Фармако-биохимический анализ дофаминовых рецепторов
Для изучения дофаминовых рецепторов полезным оказалось использовать препарат изолированного головного мозга змеи Helix aspersu и применение внутриклеточных микроэлектродов. Именно таким путем было доказано взаимодействие алкалоидов спорыньи с дофаминовыми рецепторами. Выяснено, что эргометрин и диэтиламид лизергиновой кислоты подавляют ингибирующее действие дофамина па нейроны Helix aspersu [Walker R.J. et al., 1968; Woodruff G.N., 1971].
Позднее были разработаны электрофизиологические методы изучения активности нейронов млекопитающих, что позволило выявить депрессивное действие иоцофоретически вводимого дофамина на электрическую активность нейронов хвостатого ядра и accumbens головного мозга крыс [Conzalez-Vega J.А., 1974; Siggins G.R. et al., 1974; Woodruff G.M. et al., 1976]. Данный эффект дофамина блокировали нейролептиками [Gonzalez-Vegas J.А., 1970; McCarthly P.S. et al., 1977; Bunney B.S., 1979].
Для оценки функциональной активности дофаминовых рецепторов ЦНС были разработаны также поведенческие тесты. Наибольшее распространение получила 6-оксидофамиио-вая вращательная модель, предложенная U.Ungerstedt (1971). Суть данного теста заключается в одностороннем разрушении нигростриатпого пути с помощью локального введения 6-оксидофамина в черную субстанцию. Если через несколько дней этим животным ввести апоморфин, то животные начинают вращаться в сторону, противоположную от полушария, в котором был разрушен пигростриатный путь (т.е. возникает стереотипия поведения). Эффект, аналогичный апоморфину, дают также эргометрин, бромкрентин [Carrodi Н. et al., 1973; Pi jnenburg A. J., 1973; Woodruff G.N., 1974],2-амино-6,7-1,2,3,4-тетрапафталеи (АДТН) [Woodruff G.N., Sunners С., 1979].
Эргометрин при его микроионофоретическом введении в хвостатое ядро и accumbens крыс вызывает дофамипоподоб-пый эффект [Woodruff G.H. et al., 1978].
Кроме того, можно оценивать фармакологическую активность дофаминергических веществ но двигательному тесту.
Пресипаптические дофаминовые рецепторы, или аутореце-цторы, изучают также с помощью электрофизиологического
170
171
.СНдСНз NH--СО---n'
^СН2СНЭ
метода. Дофаминергические нейроны компактной зоны черной субстанции идентифицируют ио изменению их электрической активности в ответ на внутривенное введение аиоморфииа и других агонистов и антагонистов дофаминовых рецепторов [Guyenet Р.С., Aghajanian G.K., 1978; Bunney B.S., 1979], если они проходят через гематоэнцефалический барьер. Дофаминовые ауторецеиторы модулируют высвобождение и синтез дофамина [Carlssgon А., 1975; Bunney В.S., 1979; Haubrich D.R., Pflueger А.В., 1982]. Выявлено, что стимуляция нресинаитиче-ских дофаминовых рецепторов сопровождается ингибированием высвобождения дофамина из дофаминергических нервов.
Дофаминовые рецепторы, расположенные на холинергических нейронах, опосредуют модулирующее влияние дофамина па высвобождение ацетилхолина [Cubeddu Z.X., Hoffman I.S., 1983].
Обнаружено, что двигательную стимуляцию вызывают дофаминовые агонисты: эргометрин [Pijnenburg A.J. et al.,1973], АДТН [Elkhawad А.О., Woodruff G.N., 1975; Woodruff G.N., Andrews C.D., 1979], а также амфетамин, стимулирующий высвобождение эндогенного дофамина [Taylor К.A., Snyder S.H., 1971]. Позднее было установлено, что данный эффект агонистов дофамина обусловлен их влиянием иа центральные дофаминергические системы. Показано, что двустороннее введение в ядро accumbens крыс эргометрина и АДТН приводит к продолжительному увеличению у них двигательной активности [Pijnenburg A.J., 1973; Elkhawad А.О., Woodruff G.N., 1975; Woodruff G.N., Andrews C.D., 1979]. Данный стимулирующий
172
Метилфенидат
эффект АДТН избирательно блокируется при внутрибрюшинном введении крысам низких доз флупептиксола, флуфенази-ла, или галоиеридо.’ a [Elkhawad А.О., Woodruff G.N., 1975; Woodruff G.H., Andrews C.D., 1978]. Сульпирид подавлял этот эффект АДТН в относительно высокой дозе (20 мг/кг) [Woodruff G.H., Andrews C.D., 1979], что может быть связано с его слабым проникновением в головной мозг. При непосредственном введении сульнирида в ядро accumbens он блокировал эффект АДТН в дозе 1 мкг.
Активность S-( — )-сульштрида в этом отцошешш была в 25 раз выше, чем R-(+)-сульнирида [Andrews C.D., Woodruff G.H., 1978].
Одним из основных способов прямого изучения локализации и характеристик дофаминовых рецепторов в настоящее время является метод исследования связывания меченных тритием лигандов с этими рецепторами. В качестве таких радиол игаидов используют антагонисты: йН-галоперидол [Creeese I. et al., 1975; Seeman P., 1975], 3Н-сиироперидол [Leysen J.E. et al., 1978], 3Н-цис (г)-флупелтиксол [Hyttel J., 1980], эН-домиеридои [Baudry M. et al., 1979], 3Н-сульни-рид [Theodoron A.E., 1979; Freedman S.B., Woodruff G.N., 1981;
173
cTOCi о OH •'XiT > ^.OCHj мНгЗОя^Ч^Цхл^' о Ct Хлорпроммин /СН3 чсн3 Г II Г«ОП#Р"Д°Л <r о<5н \ / СПИр«*₽"А“" L'-Cr3 флупвнтиисол 5 Бутанламол -^С(СНэ)3 М ОЛИНДОМ XN / 1 Сулкпирид С^Нз
174
Woodruff G.N., Freedman S.В., 1981] и агонисты: 3Н-апомор-фин [Seeman Р. et al., 1976] и 3Н-АДТН [Roberts P.J. et al., 1977; Davis A. et al., 1979; Woodruff G.N. et al., 1979]. По* скольку эти лиганды в ряде случаев связываются не только с дофаминовыми, но и с другими рецепторами [Leysen J.E., 1978], для оценки их специфического связывания с дофаминовыми рецепторами ткань предварительно инкубируют с блокаторами серотониновых и норадреналиновых рецепторов.
Связывание 3Н*сульпирида с высоко и частично очищенными мембранами синаптосом полосатого тела головного мозга крыс линии Вистар характеризовалось константой диссоциации, равной 7,4 и 8,8 нМ соответственно и максимальным числом связывающих участков, равным 240 и 400 нмоль/ мг белка соответственно [Woodruff G.N., Freedman S.B., 1981].
3Н-Сульнирид с высокой степенью специфичности связывался также с мембранами ядра accumbens, но пе с препаратами мембран клеток коры, мозжечка, гиппокампа [Freedman S.B. etal., 1981]. Поскольку полосатое тело и ядро accumbens богато насыщены дофаминергическими нервами, можно считать, что участки, специфически связывающие 3Н-сулыш* рид, представляют собой постсинантические дофаминовые рецепторы. Данное связывание 3Н-сульпиридом ингибировалось нейролептиками [Freedman S.B., 1981; Freedman S.B., Woodruff G.N., 1981].
Кроме ЦНС, присутствие дофаминовых рецепторов обнаружено в сосудах почек и на периферических норадренергических нервных окончаниях [Goldberg L.I., 1968]. Дофаминовые рецепторы сосудов почек опосредуют вазодилатацию. Агонистическую активность в отношении этих рецепторов проявляют только соединения с гидроксильными группами в положениях 3 и 4; из 44 изученных [Goldberg L.I. et al., 1968] амилов только энипил обладал дофамипоподобпой активностью. Агонисты дофаминовых рецепторов 2-амино-6,7-1,2,3,4-тетрагндропафтален (АДТН) и SKF 38 393 также увеличивают кровоток в почках [Horn М. et al., 1984]. Сосудорасширяющее действие дофамина подавлялось галоперидолом, хотя специфичность наблюдалась только в узком диапазоне концентрации [Yeh В.К. et al., 1969].
Эргометрин подавлял сосудорасширяющий эффект дофамина. Этот эффект дофамина блокируется сульпиридом у собак и морских свинок [Horn М. et al., 1981]. В то же время сульпирид не влияет на расширение сосудов почек,
175
вызываемое p-адреномиметиком изолреналином [Horn М. et al., 1981 ].
Эксперименты Р.Н.Kelly (1982) in vitro, в которых была показана способность дофамина индуцировать релаксацию сосудов кролика, подтвердили присутствие дофаминовых рецепторов в почках и позволили предположить, что сходные рецепторы локализованы в портальной вене и аорте. В то же время этим автором было установлено, что релаксирующее действие дофамина на мышцы тощей кишки опосредовано р-адреноре-цепторами. Проведенный фармакологический анализ влияния адренергических и дофаминергических веществ на сокращение мышечной оболочки сосудов и мышц топкой кишки позволили Р.Н.Kelly (1982) предложить схему взаимоотношений между дофаминовыми и а-адреиергическими рецепторами в этих тканях (схема 5),
Согласно этой схеме, если в тканях есть дофаминовые рецепторы, то галоперидол связывается с ними и в меньшей степени блокирует а-адрепорецспторы, стимулируемые адре-
Схема 5. Взаимоотношения между дофаминовыми (Д) и а-адренорецепторами (а)
ФИЛ — фенилэфрин; ДА —дофамин; Г — галоперидол; Ф—фснтилампи.
176
палииом и фенилэфрином. Вместе с тем поскольку дофамин связывается как с дофаминовыми, так и с адренергическими рецепторами, его агонистические свойства будут проявляться сильнее при действии адреналина, фенилэфрина или фентола-мииа на адренорецепторы. Об интерференции между дофамин- и адренергическими процессами свидетельствуют также исследования W.Maixner и соавт. (1983), а также B.Bongard и соавт. (1983).
По данным M.Relja (1982), специфическое связывание 3Н-галоперидола с мембранами клеток vas deferens крыс насыщаемо и характеризуется Кд, равной 21 иМ, и составляющей 74 фмоль/мг белка. (+)-Бутакламол по сравнению со своим фармакологически не активным энантиомером обладал в несколько раз меньшей способностью вытеснять этот лиганд, что свидетельствует о стереоспецифичности его связыва-1шя. Дофамин (ЮмкМ) уменьшал связывание галоперидола с этими мембранами на 50%. Норадреналин, адреналин и серотонин в концентрации 10 мкМ в этом отношении были практически не активными. Эти результаты указывают, что vas deferens имеются дофаминергические рецепторы, и дают возможность предполагать, что влияние дофамина и дофаминергических веществ на сексуальное поведение может быть опосредовано их периферическими эффектами, а не только действием на ЦНС.
Поскольку, согласно данным U.Caruso и соавт. (1982), блокатор периферических дофаминовых рецепторов домперидон у свиней вызывает увеличение концентрации панкреатического полипептида в крови и повышает количество бикарбонатов в перфузате двенадцатиперстной кишки, можно считать, что дофаминовые рецепторы играют важную роль в регуляции экзокринной секреции поджелудочной железы.
Кроме того, есть данные, что дофамин вызывает патрийурез, приводящий к увеличению диуреза у людей, собак, кошек и крыс, независимо от изменений почечного кровотока, скорости клубочковой фильтрации и почечной симпатической активности [Cavero I. et al., 1982]. По данным HJ.Akraffiong и соавт. (1983), В.М.Брюханова (1983), инфузия дофамина в почечную артерию собак увеличивает реабсорбцию глюкозы, а галоперидол блокирует это увеличение.
Так как дофаминергические нейроны присутствуют в ночках [Dinerstein R.J. et al., 1978], можно предполагать, что индукция дофамином данных эффектов опосредована дофаминовыми рецепторами канальцев почек.
I2.3u.227
177
При введении крысам больших доз дофамина его диуретический эффект исчезает, что может быть связано с активацией осад реи орецепторов почек [Берхиц Е.Б., 1985]; доказательством этого служит тот факт, что при блокаде фелтоламином «-адренорецепторов и в больших дозах дофамин усиливает диурез.
Таким образом, представленные сведения о дофаминовых рецепторах свидетельствуют об их широком распространении в организме млекопитающих. Не исключено, что последующие эксперименты позволят установить локализацию дофаминовых рецепторов еще в каких-либо органах и тканях, Однако накопившийся материал требует осмысления и классификации.
3.4. Классификация дофаминовых рецепторов
Дофаминовые рецепторы в настоящее время классифицируют по величинам связывания дофаминовых радиолигацдов с дофаминовыми рецепторами различных тканей в присутствии агонистов и антагонистов. Исследователи были вынуждены принять этот принцип классификации, так как не удалось найти корреляции между биохимическими и фармакологическими эффектами дофаминергических средств и их сродством к тем или иным дофаминовым рецепторам.
Следует подчеркнуть, что принцип множественности, сформулированный нами для любого типа рецепторов, находит подтверждение и для дофаминовых рецепторов.
Первоначально все дофаминовые рецепторы были разделены только на два тина: а-дофаминергические и р-дофамниер-гические [Kebabian J.W., 1978], но это оказалось неудобным в связи с возможной путаницей с а- и Р-адреиорецепторами. Поэтому дофаминовые рецепторы стали именовать как Д, и Д2-рецепторы [Kebabian J.W., Caine D.B., 1979]. Дррецеиторы— это дофаминовые рецепторы, которые сопряжены с дофамин-чувствительпой адеиилатциклазой, а Д,-реценторы — это дофаминовые рецепторы, которые не сопряжены с дофамннчувстви-телыюй адышлатциклазой. Однако такое разделение дофаминовых рецепторов оказалось неприемлемым, поскольку, во-нервых, имели место противоречия в данных о присутствии или
178
отсутствии дофам ин чувствительной аденилатциклазы в различных тканях [КеЬаЫап J.W., 1978; Miller R., McDermed J.D., 1979]; во-вторых, нет корреляции между выраженностью фармакологических эффектов дофаминергических агонистов и антагонистов и величиной их влияния иа активность аденилатци-клазы [Seeman Р., List S., 1982]. В последующем было предложено делить все дофаминовые рецепторы на четыре типа [Davis А., 1982; Seeman Р., List S., 1982].
Дг-рецепторы —это рецепторы, сопряженные с дофаминчув-ствительиой адепилатциклазой безотносительно к тому, сопряжен или нет этот фермент с другими дофаминовыми рецепторами, и без связи с какими-либо поведенческими эффектами. Д'-рецепторы стимулируются микромолярцыми концентрациями дофамина (1 — 10 мкМ) и подавляются микромолярцыми концентрациями большинства нейролептиков.
Д2-рецепторы—это рецепторы, которые чувствительны к ми-кромолярпым концентрациям дофамина и паномоляриым концентрациям нейролептиков (0,1—30 нМ).
Д3-рецепторы —это рецепторы, которые чувствительны к паномоляриым концентрациям (1 — 10 нМ) дофамина и ми-кромолярным концентрациям нейролептиков.
Д4-рецепторы—это рецепторы, которые чувствительны к нало-молярным концентрациям дофамина и нейролептиков (схема 6).
Схема 6.
Классификация дофаминовых рецепторов
179
При идентификации того или иного типа дофаминовых рецепторов пет необходимости связывающие участки делить на агонистические и антагонистические, поскольку величина 1СМ вытеснения дофаминергическими веществами различных радиолигандов примерно одинакова. Иллюстрацией этого может служить табл.9.
Таблица 9.
Величины ICse вытеснения дофаминергическими веществами 3Н-лигандов из их связи с /^-рецепторами мембран полосатого тела головного мозга теленка в наномолярной концентрации
1Н -лигаид
Дофаминергическое вещество ЭД »cnic перон. ’Н-лагадро. зргокркптив. 0.7 нМ *Н-бромкр«п-тнк, 0,2 нМ
Спнперон Пкмозид Галоперидол Клозапин Апоморфиц Дофамин 0,7 4,4 18 300 1350 5W0 0,7 2,4 15 200 230 4500 0,8 1.9 12 220 970 8500
Примечание. Таблица составлена по данным A.Closse и соавт. (1980) н М.
Titeler (1977).
Согласно приведенной классификации дофаминовых рецепторов, участки мембран полосатого тела головного мозга теленка, связывающие с высоким сродством 3Н-дофамин или 3Н-апоморфин, представляют собой Д3-реценторы [List S. et al., 1979, 1980; Lists., SeemanP., 1980]. Д3-Рецепторы не являются артефактом замораживания и отличаются от Д2-рецепторов [Seeman Р., List S., 1982].
На рис. 36 представлены кривые экспериментов но конкуренции, позволяющие дифференцировать Д3- и Д4-рецеиторы. Видно, что величины IC^—вытеснения дофамином и снинероном 3Н-дофамипа равны 5 и 1500 нМ соответственно; это свидетельствует о связывании 3Н-дофамина с Д3-рецепторами.
Ингибирование нейролептиками связывания 3Н-АДТН и 3Н-апоморфина было более сложным. В низких концентрациях (0,1—50 цМ) они ингибировали связывание этих лигандов с Д4-рецепторами, а в высоких концентрациях (200 — 2000 нМ) с Д3-рецепторами [Titeler М., 1979; List S., Seeman Р., 1980; List S. et al., 1980].
180
Рис. 36. Результаты конкурентных экспериментов, позволяющих дифференцировать Д< и Д-рецепторы в гомогенате полосатого тела Kpbic(Seeman Р., Lists.,1982].
В случае Дэ-рецепторов для дофамина величина 1СЯ находится между 1 и 10 нМ, а для нейролептиков 1СИ между 200 и 2000 нМ. В случае Д^-рецспторов для дофамина 1СМ находится между 1 и 10 нМ, а для нейролептиков между 0,1 и 10 нМ. Как Д3-, так и /^-рецепторы метятся 3Н*(±)-АДТН и 3Н-апоморфином.
По оси абсцисс — концентрация немеченых лигандов в молях. По оси ординат — величина связывания лигандов, меченных тритием, с дофаминовыми рецепторами в процентах. Специфическое связывание 3Н-лигандов определялось по ингибированию связывания аломорфином (1 мкМ), дофамином (1 мкМ) или (+)-бутакталамо-лом (1 и 10 мкМ).
Следует отметить, что величины IC^, конкуренции нейролептиков с 3Н-апоморфипом за связывание с Д3- и Д4-рецепто-рами зависят от экспериментальных условий; от конечной концентрации 3Н-апоморфина [Liesen J.E. et at, 1980], методов определения несцецифического связывания и добавления мембранной фракции до или после добавления других ингредиентов инкубационной смеси [List S. et al., 1980].
181
Согласно данным I,Creese и соавт. (1978), дофамин в низких концентрациях не влияет па связывание 3Н-апоморфи-иа; для него величина 1С50 равняется 250 11М, а для спине-pona 0,5 иМ. Эти величины типичны для Д,-рецепторов и свидетельствуют о том, что в данных экспериментальных условиях 3Н-аноморфин не связывался с Д3-рецеиторами. Причиной этого может быть использование высоких концентраций аскорбиновой кислоты без ЭДТА (известно деструктивное действие аскорбиновой кислоты в отсутствие ЭДТА на дофаминовые рецепторы).
По нашему мнению, при сравнении результатов, полученных различными авторами, необходимо также учитывать вариабельность дофаминовых рецепторов, связанную с генетическим различием. О генетическом контроле дофаминовых рецепторов в головном мозге мышей чистых линий сообщили R.Bohme и R.Ciaranello (1983). Для получения информации о Д,-рецепторах, имеющих высокое сродство к дофаминергическим антагонистам, они использовали 3Н-домнеридоп. У мышей линий С57В1/6, DBA/2, AKR и C57L имеются различия в числе Дг-рецепторов в полосатом теле, зрительных буграх и гипофизе. Поскольку плотности дофаминовых рецепторов в этих трех областях головного мозга мышей изучаемых линий не коррелировали между собой, можно полагать, что число дофаминовых рецепторов в каждой области контролируется генетически независимо друг от друга. Анализ Д2-реценторов у рекомбинантных мышей имбредпых линий показал, что они могут детерминироваться моногенетически.
A.T.Gower и соавт. (1982) продемонстрировали гетерогенность дофаминовых рецепторов ЦНС фармакологическими методами. Анализ влияния различных дофаминовых средств па поведение крыс показал, что эффект агонистов на вращение в противоположную сторону опосредуется двумя различными классами дофаминовых рецепторов, которые отличаются от дофаминовых рецепторов, опосредующих стереотипию поведения. Центральные дофаминовые рецепторы авторы классифицируют по их чувствительности к аиоморфипу или 2, 3, 4, 5-тетрагидро-7, 8-диокси-фенил-1Н-3-бензазепииу (ТДФБ); ТДФБ-чувствительпые рецепторы блокируются клозапином, по пе галоперидолом, пимозидом и флуфепазином и разделяются па два подкласса, которые отличаются между собой по чувствительности к клозапину и локсанииу. Однако, как эти рецепторы соотносятся с Д(-, Д2-, Д3 и Д4-рецепторами, выявляемыми биохимически, пока неизвестно.
182
В соответствии с приведенными данными и результатами анализа химической структуры дофаминовых рецепторов с помощью рекомбинантной технологии можно констатировать, что существует пе менее пяти типов дофаминовых рецепторов Д,, Д2, Д3, Д4, Д5. Они различаются по чувствительности к дофамину и нейролептику спиперону. Д,-рецепторы стимулируются дофамином и блокируются спипероиом в микромолярных концентрациях. Д,-участки чувствительны к дофамину в микромо-лярлых, а к спиперону в паломолярных концентрациях. Д3-рецепторы, напротив, связывают дофамин в паиомолярных, а спипероп в микромолярных концентрациях. Д4 - связывают дофамин и спипероп в паиомолярных концентрациях (Seeman Р., List S. 1981, 1982]. Д5- рецепторы, при сходном с Дррецеп-торами фармакологическом профиле, в 10 раз более чувствительны к дофамину, чем последние [Sunahara R.K., Guan Н.С., O’Dowd B.F. et al., 1991].
С помощью генной инженерии идентифицировано 5 генов, соответствующих типам рецепторов дофамина. Эти гены подразделяются па два семейства: гены не содержащие интронов и кодирующие Д, и Д5 типы рецепторов, а также гены, содержащие интроны и кодирующие Д2-, Да- и Д4-рецепторы. Обнаружено два варианта Д2 и три варианта Д3-рецепторов [Fears R., Bowen W.P., Brown F. et al., 1993, Schwartz J.C. 1993, Spano P.F., Memo M. 1993]. Размеры всех этих рецепторов близки: Д(-466, Д2-433 и 414 (из одного гена образуются два белка), Д3-400, Д4-387, Д5-477 аминокислотных остатков. Все рецепторы гомологичны и имеют 7 трансмембранных домена [Авдонин П.В., Ткачук В.А. 1994]. Д2- и Д3-рецепторы имеют преимущественно пресипаптическую локализацию; постсииантические рецепторы представлены Д,, Д2, Д3, Д4 и Д5-рецепторами [Раевский К.С. 1995].
Агонистами Дррецепторов являются такие соединения как СКФ 38393 (наибольший процент его специфического связывания с мембранами мозга достигается в фосфатном буфере при 0° С, когда К.,=5,8 пМ, Втах=384 фМ/мг белка) [Cereska K.Z., Zharkovsky A.M. 1988], А68930 [De Ninno M.P., Schoenleber R., Mac Kenzie R. et al., 1991, De Ninno M.P., Shoenleber R., Mac Kenzie R. et al., 1991, Grenader A., Healy D.P. 1992], дигидроксе-дил—агонист периферических Д(-рецепторов, фенолдопам. Ибо-: намин и апоморфии неселективцые агонисты дофаминовых реце-: пторов [Coudert Р.,Rubai C.,Bastide M.,Malhuret R., Chopineau j J. 1993, Kohli J.D., Horn P.T., Glock D. etal., 1993, MotloIaD.M.,
183
Brewster W.K., Cook L.L. et al., 1992]. Антагонистами Д^реценто-ров является SCH-23390 [(Р-(+)-8-хлор-2, 3, 4, 5 тетра-гидро-3-метил-5 феиил-14-З-бепэазепин], который обладает слабым центральным Д2-блокирующим действием и является сильным антагонистом Д(-рецепторов периферических сосудов [Hilditch А., Drew G.M., Naylor R.J. 1984]. SCH-23390 связывается с сосудами почек с Kd=4,2 uM, Bmax=180,6 фМ/мг белка [Amenta F., Ricci A. 1990], с пупочной артерией Krf=l,2 11^1, 8^=38,2 фМ/мг белка [Ferreira de Almeida j. A., Pereira Leite L., Cavallotti C. et al., 1993], квиппирол — антагонист Дррецепторов связывался с мембранами переднего мозга с Kd=9,5 нМ, В тах=38,2 фМ/мг сухого веса [Gehlert D.R., Gackenheimer S.L., Seiman Р., Schaus J. 1992]. Ок-топамин—эндогенный блокатор Дррецепторов [Cheng Т.Т., Tsai Т.Т. 1990, 1991]. NNC-112, NNC-687 и NN-756-иовые избирательные антагонисты Д.-рецепторов бензазениповой природы [Andersen Р.Н., Gronvald F.C., Hohlweg R. et al., 1992, Nielsen E.B., Andersen P.H. 1992]. Галоперидол и флупецтиксол наряду с Д,-рецепторами блокируют и Д2-рецепторы [Koshikawa N., Mori Е., Maruyama Y. et al., 1990].
Д(-рецепторы разных видов животных сходны между собой [Watts V.T., Lawler С.Р., Crilmere J.H. et al., 1993]. Количество и аффишюсть Д -рецепторов зависят от присутствия агониста или антагониста. На изолированных мембранах стриатума дофамин снижал аффинность и плотность Д,-рецепторов, а антагонисты при хроническом введении увеличивали их количество, по не аффинность [O'Boyle К.М., Gavin К.Т., Harrison N. 1993]. В мозге в присутствии высоких концентраций дофамина Д,-рецепторы переходят в высокоаффипцое состояние и стабилизируются в этой конформации. При низких концентрациях дофамина высокоаффинпые рецепторы переходят в низкоаффиц-пое состояние [Herve D., Trovero F., Blanc G. et al., 1992].
Д2-рецепторы являются гликопротеидами [Abbott W.M., Strange P.G., 1995]. Их агонисты представлены следующими соединениями: LY-141865 [Ruffolo R.R., Shaar С.J., 1983], N-04334 (в 200 раз активнее LY141865) [Horn A.S., Tepper R., Kebabian J.W. et al., 1984], BHT-920 [Pichler L,, Pifl C., Hornykiewiez O., Kobinger W., 1987], И-6644В и И-68553В (агонисты Д2- аутореценторов) [Riercey M.F., Brodevick P.A., Hoffmann W.E. et al., 1990], каберголип [Kimmig R., 1995], RU24213 и RH24946 (также антагонисты опиоидных рецепторов) [Fortin М., Degryse М., Petit F. et al., 1991], талипексол [Kropf W., Kuschinsky K., 1991], NCO920 [Hogberg T., Strom P.,
184
Hall H. et al., 1990], бромокриптин, квиипирол [Hom A.S., Tepper R., Kebabian J.W. et al., 1984]. Антагонисты Дурецепторов: домперидон (YM09151-2) [Teral M., Hidaka К., Nakamura Y., 1989], мосаирамин (Y-516) [Uchihashi Y., Morimoto T., Tadokoro S. 1992], оканеридои (R79598) [Megens A.A.H.P., Awouters F.H.L., Meert T.F. et al., 1992], бензамиды (сульпирид, тропа-прид, снектрамид, раклонрид, этиклоприд), снилерон [Amalric М., Merhow М., Polis J. et aL, 1990].
Антагонист Д2-рецеиторов [аН]-спипероп связывался с мембранной фракцией таламуса крысы с Kd=0,l пМ, Bmai=6,4 фМ/ мг белка [Young К., Wilcox R.E., 1991], хвостатого ядра теленка с Kd=0,16 пМ, Bm„=21,5 пМ/r тка1ш [Johansson А.М., Nordvall G., Hacksell W., 1991 ]. Антагонист Д2-рецепторов тронаприд, производное бензамида, связывался с Д2-рецепторами мозга с Kd=0,03 нМ [Schotte A., Janssen P.F.M., Veruimp М. et al., 1992].
Во взаимодействии Д2-аптагопистов бензамидной структуры основную роль играют N-бепзильные и N-алкильные группы. В структуре активной поверхности Д2-рецептора имеется 2 участка взаимодействия с N-алкильиыми заместителями [Pettersson J., Siljefors Т., 1992].
Обнаружен нелинейный характер кривой Скэтчарда для связывания [эН]-спиперопа с мембранами нейрогипофиза, что свидетельствует о наличии более чем одного класса участков связывания [Trieman М., Andersen Р.Н. 1989]. Возможно, это два нространстветю раздельных участка связывания спиперо-иа, одна из которых имеет активную карбоксильную группу, а другая содержит карбоксил или остаток гистидина. Такое предположение основано на том, что N^1-дициклогексил карбодиимид (реагент па свободные карбоксильные группы) эффективно угнетает связывание [3Н]-спиперопа. Кроме того, максимальное связывание [3Н]-сиинерона наблюдается при pH 7,5, что указывает па участие ионизированных остатков карбоксильных групп в связывании спиперона. Модификация гистидинового остатка в мембранах диэтилкарбонатом также ингибировала связывание спиперона, снижая сродство Д2-рецеп-тора к спиперону из-за аллостерического эффекта [Williamson R.A., Strange P.G. 1990, Woodward R., Daniel S.J., Strange P.G. et al., 1994]. По мнению других авторов Д2-рецепторы существуют в высокоаффипном и пизкоаффипцом состояниях по отношению к [3Н]-спинерону. Первые связывают [эН]-спи-пероп с Kd=0,2 —10 пМ и составляют 80% от общего числа
185
участков связывания. Ионы Mg повышают аффинность Д2-ре-цепторов, а ГТФ трансформирует их в иизкоаффинпые [De Vries D.J., Beart P.M. 1986]. Высокоаффиппое состояние Д2-рецепторов обусловлено сопряжением рецепторов с G-белка-мн. Антитела к С концевому участку а субъединицы белков Gt/ Go переводят рецепторы в низкоаффинное состояние [Plug M.J., Moller W., Dijk J. 1992].
Конформация белка Д^-рецеитора регулируется также ионами натрия и водорода. Связывание агонистов с Д2-рецепто-рами уменьшается при добавлении ионов Na или снижении pH до 6,8. Связывание антагонистов бензамидной структуры также уменьшается при снижении pH от 8,0 до 6,8, но увеличивается при добавлении ионов натрия. На связывание других антагонистов изменение pH существенно пе влияет [Neve К.А., Henningsen R.A., Bunzow J.R., Civelli О. 1989, Ningsen R.A., Bunzow J.R., Civelli О. 1989].
Выделены две субъедишщы Д2-рецепторов, связывающие дофамин. У свинок они имели Мг=140000 и 90000, а у собак 94000 и 34000. Удаление сиаловой кислоты и карбогидратов выявило две субъединицы с Mt =44000 и 23000 как у свинок, так и у собак. Отличие в молекулярной массе Д2-реценторов стриатума собак и свинок обусловлено их разным гликозилированием [Jarvie K.R., Niznik Н.В., Seeman Р. 1988]. Выявлены две изоформы Д2-рецепторов, которые они отличаются между собой по отношению к замещенным бензамидам (раклоприд и сульпирид), последовательностью 29 аминокислот в одном фрагменте и взаимодействием с G-белком. Существуют 2 изоформы мРНК Д,-рецептора. Д2 4)5-рецепторцая мРНК присутствует в количестве 2 — 45 % относительно мРНК исходной (Д24)4) формы, встречается в мозге и печени.
Хроническое введение Др Д2-аптагониста галоперидола индуцирует гиперчувствителыюсть Д2-ренепторов путем увеличения плотности рецепторов и увеличения в 2—4 раза количества мРНК [Giros В,, Sokoloff Р., Martres М.Р., Schwartz J.С. 1990]. Так же действует сулышрид [Rogue Р., Nanauer А., Zuiller J.etal., 1991]. Другие авторы не определяли увеличения мРНК Д2-рецепторов при увеличении плотности последних [Goss J.R., Kelly А.В., Johnson S.A., Morgan D.G. 1991] или наблюдали повышение уровня мРНК Go белка, связанного с Д2-рецепто-ром [Maus М., Vernier Р., Valdenaire О. et al., 1993].
186
3.5. Эффекторные системы дофаминовых рецепторов
В 1972 году Грипгард и соавторы в верхнем шейпом ганглии млекопитающих обнаружили аденилатциклазу, активируемую дофамином. Позднее было установлено, что Д1 -рецептор сопряжен с адепилатциклазой при помощи Отбелка [Balmforth A.J., Ball S.Q., Freshney R.L. et al., 1986, Vincent S.R., Drinnan S.L., Hope B.T. 1990]. Образующийся в результате активации адеиилатциклазы цАМФ стимулирует протеинкиназы А и С, которые фосфорилируют альфа-субъединицу Na-K-АТФазы [Btguin Р., Beg^ah A., Cotecchia S., Geering К. 1996]; отметим, что аналогичные процессы происходят при активации бета(2)-или альфа (1)-адрепореценторов и мускариновых холииоре-цепторов.
Д^реценторы имеют преимущественно ностсииаптическую локализацию. Однако у крыс стимуляция Д]-рецепторов мозга увеличивает выделение дофамина [Walters D.E., Howard S.G. 1990]. Выделение дофамина в хвостатом ядре также опосредуется Д,-рецепторами [Kurata K.,Shibata К. 1991]. Д]-агонисты стимулируют выделение ацетилхолина. Но оно опосредовано непрямой активацией пейрокининовых рецепторов [Andersen Р.Н., Gronvald F.C., Hoh.'weg R. et al., 1992]. В периферических тканях Д]-рецепторы нащяпы в сердце, сосудах ночек, кишечника, где они опосредуют сосудорасширяющий эффект дофамина.
Всего клонировано четыре подтипа Дррецепторов. Д]А, Д1В, Д,д и Д1С. Д]А-собственно Д,-рецептор, Д1В-Д5рецептор. Д1д-рецентор состоит из 445 аминокислотных остатков. Его аффинитет к дофамину в 10 раз выше, чем у Д^рецепторов. Д)Д_ и Д1С-рецепторы сопряжены с адепилатциклазой. Их возбуждение приводит к активации фермента [Demchyshyn L.L, Sugamori K.S., Lee F.J. 1995].
Эффекторной системой, сопряженной с Д2-рецепторами является аденилатциклаза. Путем введения к ДНК Д2-рецепторов в LtK клетки мышиных фибробластов получены Д2-рецепторы, активация которых тормозила активность адеиилатциклазы [Neve К.A., Henningsen R.A., Bunzow J.R., Civelli О. 1989, Ningsen R.A., Bunzow J.R., Civelli О. 1989]. В опытах на культуре клеток яичшгка китайского хомячка, в которых клонировали кДНК для Д2-рецепторов, дофамин ингибировал стимулированное форско-
187
липом накопление в клетках цАМФ [Kanteman R.J., Mahan L., Briley E.M. et al., 1991]. Активация Д2-реценторов тормозит активность аденилатциклазы ГТФ-зависимым образом [Cooper D.M.F., Bier-Laning С.М., Halford М.К. et aL, 1986]. Д2-рецен-торы регулируют циклазную систему посредством Git или Gi2 белков [Izenwasser S., Cote Т.Е. 1995]. Дофамин через Д2-рецецторы повышает проницаемость клеток гипофиза для К+ [Memo М., Pizzi М., Missale С. et al., 1990]. Активация Д2А-рецепторов приводит к стимуляции Са-активируемых (С каналов, сопряженных с G белками, а Д2В-рецепторов—потенциалуп-равляемых К+ каналов, также сопряженных с G белками [Мето М., Pizzi М., Missale С. et al., 1990]. Дофамин ингибировал чувствительные к конотоксипу Са^ токи в симпатических нейронах [Aguayo L.G., Grossie J. 1994].
Уровень экспрессии мРНК Д2-рецепторов в мозге крыс ие-уклошю возрастает от 1 до 28 дней в онтогенезе, после чего медленно снижается до минимального уровня к 12 месяцам [Srivastava L.K., Morency М.А., Mishra R.K. 1992]. Активность Д2-рецепторов снижается при старении, что может быть связано с усилением перекисного окисления липидов [Oliveira C.R. 1987]. При этом наблюдалось снижение Вт„ связывания ра-диолигацдов с Д2-рецептором [Lyo М., Yamasaki Т. 1993]. Длительная обработка дофаминергических рецепторов гипофиза фосфатидилсерином увеличивала их аффинность у старых крыс [Renzo G., Amoroso S., Taglialatela M. et al., 1987]. Ганглиозид JM может также предотвратить изменение Kd Д,-реце-пторов при введении нейротоксина МРТФ [Hadjiconstantinov М., Weihmuller F., Neff N.H. 1989], восстановить активность тирозипгидроксилазы, сниженную химическим воздействием; предотвратить истощение запасов дофамина, вызываемое фармакологическими средствами [Schneider J.S. 1992].
Д2-рецепторы отличаются более значительным резервом по сравнению с Д(-рецепторами [Nielsen Е.В., Andersen Р.Н. 1992]. Они вступают с Д^реценторами в кооперативное взаимодействие с одним и тем же пулом аденилатциклазы. Стимуляция Дррецепторов усиливает эффект блокады Д2-рецепторов [Szmigielski A., Zalewska-Haszubska J. 1991].
Д2-рецепторы являются ауторецепторами. Агонисты перго-лид и LY 171555 (1 и 10 мкМ) уменьшали спонтанное и стимулированное вератрином высвобождение дофамина в мозге, а антагонист сульпирид увеличивал высвобождение и тормозил влияние нерголида и LY171555 [Herdon Н., Strupish J., Nahorski
188
S.R. 1987]. Апоморфип (IO*—10-5M) тормозил высвобождение дофамина максимально через 60 мин. Дозы 104М и выше вызывали двухфазный ответ с первой короткой фазой усиления выброса дофамина [Goiny М., Guix Т., Herrera М.М., Ungerstedt М. 1989]. Угнетение выброса дофамина агонистами Д2-рецепторов обусловлено подавлением тока Са2+ в преси-наптической мембране. Пресипаптические Д2-реценторы участвуют также в регуляции высвобождения норадреналина (НА). На срезах мозга крыс, инкубированных с [3Н]НА агонисты Д2-реценторов В-НТ92О, В-НТ958, апоморфип снижали высвобождение норадреналина, которое предотвращалось Д2-антагопи-стом сульпиридом [Cichini G., Placheta Р., Singer Е.А. 1987]. Активация пресииаптических Д2-реценторов периферических тканей, угнетая высвобождение норадреналина, вызывает релаксацию сосудов [Ohlstein Е.А., Zabko-Potapovjch В. 1984], снижение АД и ЧСС [Nagahama S., Chen Y. F., Lindheimer M.D., Oparil S. 1986]. Д2-рецепторы регулируют активность тиро-зингидроксилазы и синтез дофамина на дофамин-ергических нервных окончаниях в стриатуме свинок, а у крыс в этот процесс вовлечены Д - и Д2-реценторы [Johnson Е.А., Tsou С.Е., Harrison-Shahan G., Azzaro A.J. 1992].
Согласно данным I.Yamaguchi и соавт. [Yamaguchi I., Walk S.F., Jose P.A., Felder R.A. 1996] Д,-рецепторы опосредуют ингибирование Na+/H+ обмена и активности Na+/K+-AT-Фазы, а Д2-реценторы — стимулирование Na+/K+ обмена в проксимальных канальцах клеток ночек.
Хотя способность дофамина в низких концентрациях стимулировать активность аденилатциклазы в гомогенате полосатого тела крыс была обнаружена еще в 1972 г., до сих пор пе известно, какую физиологическую роль играет этот эффект дофамина.
Между способностью дофаминовых агонистов влиять на поведение и стимулировать дофаминчувствительпую аденилат-циклазу корреляции пе было найдено.
Дофаминергическая адепилатциклаза обнаружена в нре- и в иостсипацтических мембранах.
С помощью дофамина, связанного с высокомолекулярными полимерами, С.Н. Кожечкип и Е.А.Кузнецова (1984) показали, что специфические рецепторы, чувствительные к дофамину, находятся на внешней поверхности нервных клеток.
В сопряжении дофаминовых рецепторов с адепилатциклазой принимают участие фосфолипиды. Об этом свидетельст
189
вуют результаты, полученные F.Srivastava и N .Johnson (1981), которые показали, что обработка отмытых мембран полосатого тела крыс фосфолипазами А2 и С предотвращает активацию адеиилатциклазы дофамином. Способность дофамина стимулировать аденилатциклазу восстанавливали азолектин, фос-фотидилхолин, но не фосфотидилипозит.
Важно, что дофамин может влиять на обмен фосфолипидов. G.Le Fur и соавт. (1981) показали, что взаимодействие дофамина с рецепторами лимфоцитов мышей, выявляемых по связыванию 3Н-спиронеридола, сопровождается стимуляцией синтеза фосфатидил-Ы-мопометила, N.N-диметилэтаноламина и фосфатидилхолина. Данный эффект дофамина был стерео-специфичен, чувствителен к ГТФ, зависел от дозы и блокировался галоперидолом. Т1ри этом дофамин увеличивал вход Са2+ в клетки, что может быть обусловлено изменением вязкости мембраны вследствие метилирования фосфолипидов.
Клетки передней доли гипофиза содержат два различных типа дофаминовых рецепторов: один тип, регулирующий высвобождение пролактина, не сопряжен с адепилатциклазой, другой тип, с неизвестной функцией, сопряжен с адепилатциклазой и регулируется ГТФ. Отметим, что эта роль ГТФ вообще характерна для дофаминовых рецепторов, сопряженных с адепилатциклазой (ГТФ уменьшает связывание агонистов, но пе антагонистов с дофаминовыми рецепторами полосатого тела крыс).
Стимуляция Д2-дофаминовых рецепторов передней доли гипофиза крыс приводит к ингибированию способности L-изопро-терепола индуцировать накопление цАМф и катехоламипстиму-лируемого увеличения активности адеиилатциклазы [Munemura М,, 1980], а также к подавлению стимуляции вазоактивным пептидом кишечника адеиилатциклазы [Onali Р. et al., 1981].
Можно полагать, что активация дофаминовых рецепторов передней доли гипофиза может влиять па секрецию гипофизарных гормонов путем подавления стимуляции различными веществами адеиилатциклазы.
По данным Т.Е.Costa и соавт. (1983), стимуляция этих же Д2-рецепторов сопровождается снижением базальной и стимулируемой изопротеренолом активности адеиилатциклазы. Холерный токсин увеличивал активность адеиилатциклазы, снижал способность агонистов p-адренорецепторов увеличивать активность этого фермента, по пе изменял функциональную активность Д2-рецепторов. В присутствии холерного токсина для ингибирования дофаминергическими агонистами активности адеиилатциклазы было необходимо наличие ГТФ. Негид-ролизуемый аналог ГТф 5-гуанилимидодифосфат без этих
190
агонистов ингибировал активность аденилатциклазы. Можно считать, что Д2-рецепторы сопряжены с ингибирующей гуани-лцуклеотидной компонентой и что при стимуляции этих рецепторов происходит изменение свойств данной компоненты, в результате чего она взаимодействует с ГТФ и тем самым ингибирует активность аденилатциклазы (схема 7).
Схема 7.
Гипотетическая модель регуляции дофамином аденилатциклазы в промежуточной доле гипофиза крыс
Дофаминергический агонист (дофамин) индуцирует взаимодействие Д2-рецепторов (Д-2) с ингибирующим гуанилнуклсотидным компонентом (N). При этом ГТФ взаимодействует с N., что при водит к ингибированию активности аденилатциклазы.
Исследования дофаминовых рецепторов передней доли гипофиза показали возможность их существования в двух состояниях с различным аффинитетом. A.De Lean и соавт. (1983) с помощью количественного анализа связывания антагониста дофаминовых рецепторов 3Н-спироперидола с мембранами клеток передней доли гипофиза свиней в присутствии агонистов выявили, что он связывается с двумя формами дофаминовых рецепторов: 1) рецепторами с высоким сродством и 2) рецепторами с низким сродством. Дофаминовые рецепторы с высоким сродством к агонистам, которые составляют 50% от общего числа связывающих участков, были обнаружены в результате анализа связывания с данными мембранами агониста 3Н-п-нропилапоморфипа. Гуаниновые нуклеотиды уменьшали способность агонистов вытеснять 3Н-снироперидол из его связывающих участков, и снижали величину связывания с высоким сродством. Следовательно, мембраны передней доли гипофиза свиней содержат 50% дофаминовых рецепторов, име
191
ющих высокое сродство к агонистам и низкое к антагонистам и 50% дофаминовых рецепторов, имеющих высокое сродство к антагонистам и низкое сродство к агонистам. В присутствии ГТФ форма рецепторов с высоким сродством к агонистам переходит в форму с низким сродством к агонистам, но высоким сродством к антагонистам.
N-Этилмалеимид (<100 мкМ) или нагревание мембран передней доли гипофиза свиней при 53°С в течение 4 мин приводили к уменьшению способности агонистов конкурировать с 3Н-спироперидолом за связывание с мембранами, снижению величины связывания 3Н-п-нропила1юморфина с рецепторами, имеющими высокое сродство к агонистам и к увеличению связывания антагонистов с дофаминовыми рецепторами при низких концентрациях лиганда [Kilpatrick B.F. et al., 1983]. Данные воздействия не влияли на общее число участков, связывающих 3Н-спироперидол. Однако при высоких концентрациях (>1 мМ) или при нагревании мембран более 10 мин связывание лиганда с мембранами уменьшалось, по-видимому, вследствие инактивации дофаминовых рецепторов. Таким образом, N-этилмаленмид и нагревание имитируют модулирующее влияние гуаниновых нуклеотидов па взаимодействие дофаминовых рецепторов передней доли гипофиза свиней с дофаминергическими лигандами (схема 8).
Схема 8.
Гипотетическая модель связывания агонистов и антагонистов с дофаминовыми рецепторами передней доли гипофиза свиней
192
Приведенные данные о дофаминергических механизмах позволяют считать, что Д^реценторы сопряжены с адепилатциклазой, стимулируемой дофамином при участии ГТФ, а Д2-реце-иторы сопряжены с ингибированием адеиилатциклазы также при участии ГТФ.
Д3-реценторы в настоящее время наиболее хорошо изучены в ЦНС, где они являются мишенью для атипичных нейролептиков [Sokoloff Т., Yicos В., Martres М.Р. et al., 1990]. В основном, они локализуются в лимбической системе [Giros В. 1991]. Д3-рецепторы, располагаясь пресинаптически, модулируют высвобождение дофамина. Их активация ингибирует выход дофамина. +Aj76 и (+)-ИН232-селективные антагонисты Д3-ауто-рецепторов стимулируют синтез, высвобождение и метаболизм дофамина зависимо от концентрации внеклеточного Са2+. AJ76 стимулирует ионные токи. Рецепторы, регулирующие синтез дофамина и его освобождение, относятся к разным подтипам Д3-рецепторов [Yamaguchi I., Walk S.F., Jose Р.А., Felder R.A. 1996]. По мнению Р.Р.Гайнетдипова и др. роль Д3-ауторецен-торов заключается нреимуществешю в регуляции пресипапти-ческого выделения дофамина [Gainetdinov R.R., Sotnkova T.D., Grecova T.V. 1995].
Клонирован ген, кодирующий Д5 -рецепторы. мРНК Д5-ре-центора найдена в мозге, почках, печени, щитовидной железе. Антитела к Д5-рецепторам метят нейроны хвостатого ядра, пирамидальные, спинальные нейроны [Bergson С„ Mrzljak Н., Lidow M.S., Coldman-Rakic P.S. 1995]. Активация Д5-рецептора стимулирует активность адеиилатциклазы через ГГФ-связываю-щий белок [Sunahara R.K., Guan Н.С., et al., 1991].
Таким образом, все пять подтипов дофаминовых рецепторов сопряжены с ГТ Ф-связывающими белками и все они представляют собой белковую альфа-спираль, состоящую из 7 доменов. Семейство рецепторов Д1 (Д1 и Д5) характеризуется локализацией в волосатом теле и коре головного мозга (Д,) и в гиппокампе и гипоталамусе (Д3); при стимуляции этих рецепторов увеличивается уровень цАМФ, повышается гидролиз фосфоинозитолдифосфата, происходит мобилизация кальция и активация протеинкиназ (данные рецепторы имеют длинную внутриклеточную С-копцевую часть). Семейство Д2-рецепторов (Д2, Дэ и Д^) характеризуется локализацией в полосатом теле, черной субстанции и гипофизе (Д2), в гиппокампе, зрительном бугре и n. accumbens (Д3) и коре головного мозга, мозжечке и среднем мозге (Д4); при стимуляции
U. Зак. 227
193
этих рецепторов уменьшается уровень цАМФ, увеличивается калиевая проницаемость плазматических мембран и снижается потенциал-зависимый ток ионов кальция (данные рецепторы имеют короткую внутриклеточную С-концевую часть).
Периферические дофаминовые рецепторы структурно и функционально сходны с центральными [Kujacie М., Sensson К., etal., 1991].
3.6. Солюбилизация дофаминовых рецепторов
Как Д2-, так и Д3-реценторы можно солюбилизировать с помощью 1% дигитонина [Modras В.К. et al., 1980; Davis A. et al., 1982].
В.К.Madras и соавт. (1982) выделили с помощью диги-топина и гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-50 Д2-рецеп-торы из полосатого тела человека, теленка и собаки. Солюбилизированные Д2-рецепторы человека и собаки связывали 3Н-сиипероп с примерно одинаковой К ; причем при солюбилизации связывающая способность этих рецепторов не менялась. В то же время солюбилизация Д2-рецепторов полосатого тела теленка приводит к снижению специфического связывания ими спиперона или хлорпромазина в 12 раз. Авторы делают вывод, что вследствие сходства с Д,-рецепторами человека и стабильности в растворе солюбилизированные рецепторы собаки представляют собой адекватную модель для изучения физико-химических свойств дофаминовых рецепторов.
A.Davis и соавт. (1982) с помощью такой же методики солюбилизировали Д3-рецепторы, связывающие 3Н-дофамип, из мембран клеток полосатого тела головного мозга собаки; при этом Кд связывания 3Н-дофамина увеличивали с 1,2 до 3,4 пМ.
Д3-Рецепторы солюбилизируются в меньшей степени, чем Д2*рецеиторы, что может быть связано с меньшей лабильностью по отношению к дигитопипу или меньшей гидрофобностью. Кроме того, Д2- и Д3-рецепторы имеют различную температурную чувствительность [Lew J.Y., Goldstein М., 1979] и неодинаково алкилируются [Titeler М., 1980].
Различие рецепторов, связывающих 3Н-спироперидол и 3Н-дофамин, подтверждено в работе Y.Yamamoto (1982). Оказалось, что марганец увеличивает специфическое связывание
194
3Н-дофамина (на 300%), по не 3Н-спироперидола с рецепторами головного мозга крыс. При солюбилизации дофаминовых рецепторов в отсутствии марганца их молекулярная масса равнялась 200 000 (радиус Стокса 560 нМ), а в присутствии марганца —400 000 дальтон (радиус Стокса 6,1 нМ). Причем марганец был обнаружен в той же фракции, что и солюбилизированный рецептор. В то же время молекулярная масса солюбилизировашшх рецепторов, связывающих 3Н-спнроперидол, равнялась 120 000 (радиус Стокса 4,3 нМ) как без, так и с марганцем.
Таким образом, Д2- и Д3-рецепторы представляют собой различные биомолекулы и могут быть разделены физико-химическими методами. Сведений о солюбилизации Д, и Д4-рецеп-торов мы не встретили.
3.7. Молекулярные механизмы взаимодействия лигандов с дофаминовыми рецепторами
Хорошо известно, что взаимодействие дофаминовых рецепторов с их агонистами, являющимися Е- и Z-стереоизомерами, отличается высокой стереоспецифичностью [Pelz К. etal., 1970; Engelhardt Е. et al., 1971].
Дофамин имеет гибкую амипоэтильпую боковую группу, которая может находиться в двух конформациях: развернутой (анти) и свернутой (гаух). В развернутой конформации возможно вращение вокруг фенильного углерода. Следовательно, существуют а- и fj-ротамеры дофамина. Для выявления конформации дофамина, которая комплементарна дофаминовым рецепторам, были синтезированы агонисты дофаминовых рецепторов, в структуру которых входила боковая цепь дофамина в фиксированной конформации.
Оказалось, что из этих конформеров наибольшей дофами-ноподобной активностью обладает АДТН. Можно заключить, что дофамин взаимодействует со своими рецепторами в виде Р-ротамера.
1 При анализе зависимости взаимодействия дофаминовых аго-цистов от их структуры с Д2-рецепторами можно отметить следующие закономерности.
и*
195
1. Группа агонистов, которая образует с рецепторами водородную связь, почти всегда представляет собой гидроксил, находящийся в положении 3 кольца дофамина. В случае алкалоидов спорыньи этой группой является NH. Вторая гидроксильная группа в положении 4 кольца играет вспомогательную роль. Так, (-)(5)-окси-Ы,Н-пропил-2-амииотетралин [(-)-5-ОН-ДПАТ] имеет только одну гидроксильную группу и величину 1СМ, отражающую его конкуренцию с 3Н-спипероиом за связывание с Д2-рецепторами, равную 190 пМ (рис. 38). Поэтому можно полагать, что Д,-рецепторы имеют основной и вторичный связывающие участки, с которыми агонисты образуют водородную связь.
2. Для соединении, находящихся в активной конформации, характерно увеличение сродства к Д2-рецепторам при повышении гидрофобности. Например, данное сродство увеличивается в следующем порядке: (+)-5,6-диокси-2-амипотетра-лин>(-)-апоморфип> (-)-Ы,п-пропил11Орапоморфип.
3. Наибольшей активностью обладают агонисты, у которых атом азота расположен на расстоянии 0,06 пМ от плоскости кольца. Как показано на рис. 37, К-(-)-апоморфин более активен, чем (+)-апоморфиц, и (-)-5-ОН-ДПАТ в 10 раз более активен, чем (+)-5-ОН-ДПАТ.
4. У большинства агонистов с выраженной дофаминергической активностью расстояние между гидроксильной группой и атомом азота равно 0,73 нМ или менее. Из соединений, у которых атом азота расположен так, как указано в пункте 3, (-)-5-ОН-ДПАТ и (±)-ОН-НПА обладают наибольшей активностью.
5. Существуют стерические препятствия взаимодействия агонистов с Д2-реценторами. Пример таких препятствий (P,Q) представлен на рис. 37 для (+)-эпантиомера (+)-изоапомор-фина. Для большинства биологически активных агонистов таких препятствий нет.
J.D.McDermed и H.S. Freeman (1982), изучая взаимодействие четырех агонистов ряда 2-аминотетралипа с дофаминовыми рецепторами, обнаружили, что 5- и 5,6-диоксипроизводпые 2-ами-нотетралина обладают выраженным сродством к дофаминовым рецепторам в 25-конфигурации, а 7- и 6,7- диоксинроизводные 2-аминотетралина—в Ж-конфигурации. Авторы предложили схематическое изображение взаимодействия этих соединений с дофаминовыми рецепторами (рис. 38). Данная инверсия стереохимии взаимодействия агонистов с дофаминовыми рецепторами отражает специфику взаимодействия молекул-партнеров, а пе внутримолекулярные особенности энантиомеров.
196
Рис. 31. Взаимодействие (а, б) агонистов с Д,-рсцепторами [Seeman Р., List S.,1982],
ГК—гидрофобный канал; Р и Q — стсрнческис препятствия.
Связывание антагониста дофаминовых рецепторов 3Н-;• сульиирида, который обладает избирательностью по отно-\ шепию к Д2-рецепторам, также характеризуется стереоспе-
197
Рис. 37. Продолжение.
цифичцостью. (+)-Бутакламол в 10 000 раз более сильно вытесняет 3Н-сульпирид из его связи с мембранами полосатого тела головного мозга крыс, чем (-)-бутакламол [Spano P.F, et al., 1980; Woodruff G.N., 1982]. На это связывание 3Н-суль-пирида не влияет цис-флупентиксол, который относится к се
198
лективным агонистам Д2-рецепторов, но, но данным G.N. Woodruff (1982), это пе так. Подобное противоречие может быть связано с различной степенью очистки мембран полосатого тела, поскольку существуют различия в сродстве лигандов к дофаминовым рецепторам, очищенных и частично очищенных мембран синаптосом [Freedman S.B. et al., 1981].
(+)-АДТН по сравнению с АДТН обладает в 27 раз большей способностью вытеснять 3Н-сульпирид из его связи с дофаминовыми рецепторами [Woodruff G.N., 1982]. Последнее дает возможность предполагать, что сульпирид связывается с теми же дофаминовыми рецепторами, что и агонисты, о которых речь шла ранее, т.е. Д2-рецепторами.
Связывание меченных тритием агонистов, таких как АДТН и сродство агонистов к дофаминовым рецепторам, связывающих 3Н-спиронеридол, уменьшается в присутствии гуаниновых нуклеотидов. Гуанил-5-ил-имидодифосфат уменьшал способность агонистов АДТН, дофамина и аиоморфипа, по не антагонистов флупептиксола, флуфеназина и 5-(-)-сульпирида вытеснять 3Н-сульпирид из его связи с мембранами полосатого тела головного мозга крыс [Freedman S.B. et al., 1981].
Связывание лигандов дофаминовыми рецепторами зависит также от присутствия одновалентных катионов. Присутствие ионов Na+ необходимо для связывания сульпирида с дофаминовыми рецепторами. Натрий избирательно увеличивает способность производных бензамида вытеснять 3Н-спи-пероп из его связи с дофаминовыми рецепторами. Эти результаты подтвердили S.В.Freedman и G.N. Woodruff (1981), которые обнаружили, что удаление ионов Na+ из инкубационной среды приводит к уменьшению связывания 3Н-сульпирида с мембранами полосатого тела головного мозга крыс с 208+25 до 27,5±5 фмоль/мг белка, но пе влияет заметно па его сродство к связывающим участкам. Ионы лития частично восстанавливают величину связывания 3Н-сульпнрида с данными мембранами.
Предварительная инкубация мембран полосатого тела с реагентом па сульфгидрильные группы N-этилмалеимидом (1 мМ) приводила к снижению связывания 3Н-сульнирида на 64%, что указывает па возможное участие SH-групп дофаминовых рецепторов в связывании лигандов. Если до воздействия N-этил-малеимида мембраны инкубировали в присутствии дитиотрей-тола, сульпирида или ионов Na+, то данный эффект не развивался. В то же время ГТФ не влиял па способность N-этилмалеи-мида уменьшать связывание 3Н-сульнирида.
199
Рис. 38. Предполагаемая ориентация агонистов при их связывании с дофаминовыми рецепторами [Me Denned J.D., Freeman F., 1982].
Возможно, ионы натрия вызывают такие конформационные изменения дофаминовых рецепторов, которые необходимы для связывания сульпирида и которые защищают сульфгидрильные группы от воздействия N-этилмалеимида. Не исключено, что дофаминовый рецептор представляет собой либо макромолекулярный комплекс, содержащий несколько связывающих участков для различных лигандов, либо множественные формы дофаминовых рецепторов (см .схему 6) являются различными связывающими участками или различными конформационными состояниями одного и того же рецептора.
До сих пор дискутируется вопрос: с ощшми и теми же или различными участками дофаминовых рецепторов связываются их агонисты и антагонисты. Для решения этой проблемы необходимо выделить, очистить и идентифицировать макромолекулы с сохраненной способностью связывать дофаминергические лиганды. Участки, связывающие 3Н-сиииероц и 3Н-аиоморфип, имеют сходную субклеточную локализацию. В связи с этим авторы предложили унитарную гипотезу дофаминовых рецепторов. Согласно этой гипотезе, дофаминовые рецепторы состоят из нескольких субъединиц, связывающих агонисты и антагонисты, причем количество участков, связывающих антагонисты, в 2—3 раза больше числа участков, связывающих агонисты (рис. 39).
200
3.8. Дофаминовые рецепторы сердечно-сосудистой системы
Дофамин, введенный внутривенно, оказывает уникальное дей-ствие па сердечно-сосудистую систему. Он увеличивает силу сердечных сокращений, в малых дозах оказывает отрицательное хронотропное действие и расширяет кровеносные сосуды, а в больших-~ вызывает положительный хронотропный эффект и сужает сосуды, повышает артериальное давление (АД) [Amenta F., Gallo Р., Rossodivita A., Ricci А. 1993, Casagrande С. 1991, Van Woerkens L.J., Duncker D.J., et al., 1991].
Действие дофамина на сердце и сосуды в основном опосредуется как адренергическими, так и дофаминовыми рецепторами.
Тонус кровеносных сосудов регулируется дофаминовыми рецепторами двух типов: Д2-рецепторами, расположенными пре-и постсинаптически, и Д,-рецепторами, расположенными на но-стсинантической мембране. На сегментах артерий крыс антагонист Д2-реценторов спироперидол связывался с Kd=3,37 нМ, ®mnx= 90 фМ/мг белка. После введения животным 6-гидрокси-дофамииа с целью химической десимпатизации отмечали отсутствие участков связывания спироперидола, что свидетельствует об их пресип анти ческой природе. В артериях крыс присутствуют Д2-реценторы, которые опосредуют ингибирование высвобождения норадреналина при действии Д2-агопистов [Mancini М., Ricci A., Amenta F. 1991].
Пресипаптические Д2-рецепторы тесно взаимодействуют с Oj-адреиорецепторами. Так, агонист Д2-рецепторов N-0923 в концентрации 10^М ингибировал высвобождение норадреналина из артерии крысы с ECJ0=7,9-10I0M, при блокаде а2-рецепторов иохимбином ЕСМ N-0923 увеличивалось до 4,2'10' ЭМ [Friedman D.J., Krause D.N., Piper D.S. 1992].
Д2-рецепторы присутствуют на постсинаптической мембране в сосудах ночек, где опосредуют вазодилатацию. Они отличаются от Д2-рецепторов мозга, так как не чувствительны к Д,-, Д2-агонисту квиппирону [Barthelmebs М., Krieger J.F., et а!., 1991]. Другие исследователи не находили Д2-рецеиторы в сосудах почек [Horn A.S., Tepper R., Kebabian J.W. et al., 1984].
Помимо Д2-рецепторов сосудорасширяющий эффект дофамина реализуется через Д^рецепторы, локализованные в гладких мышцах кровеносных сосудов [Berkowitz A., Erickson R., Zabko-Potapovich В., Ohestein Е.Н. 1984]. Возбуждение Дррецепторов
201
вызывает расслабление гладких мышц сосудов почек, кишечника, мозга, сердца [Goldberg L.L. 1984], легких [Cavero I., Thiiy С., et al., 1987, Hoshino Y., Obara H., Ywai S. 1986], не связанное с а- или Р-адрепорецепторпыми механизмами.
В разных сосудах сосудорасширяющий эффект дофамина, невидимому, опосредуют разные рецепторы. Так, дофаминовый агонист N-аллил, производное фенилдопамина SKF 85174, увеличивал кровоток в ночках, брыжейке, задних конечностях. Д(-анта-гонист SCH 23390 уменьшал действие агониста во всех областях, Д2-аптагонист домперидон — в задних конечностях. Сульни-рид, неизбирательный дофаминовый блокатор, полностью устранял эффект агониста [Van der Nipen Р., Schoors D.F., Dupont A.G. 1991].
Дофамин снижает АД за счет вазодилатации, стимулируя постганглионарные Д - и пресипантические Д2-реценторы, вызывающие соответственно релаксацию артериол путем накопления цАМФ и уменьшения симпатического сосудосуживающего влияния [Freitas М- 1993, Sakamoto Т., Chen С., Lokhandwala M.F. 1994]. Это подтверждается тем, что у больных гипертонической болезнью, предварительно получавших лабеталол (а- и [}- адреноблокатор), дофамин снижал АД. Действие дофамина отменялось блокаторами дофаминовых рецепторов домперидоном и метоклопрамидом [Forte Р., Martin G., Linchsinger A. et al., 1993].
Повышение АД, вызванное электростимуляцией шейио-груд-пого отдела спинного мозга, угнеталось Д2-агоиистом К,М,ди-п-проиилдофамипом и селективным агонистом (^-рецепторов В-НТ 933 [De Jonge A., Smit G., Thoolen M.J.C. et al., 1984].
Дофамин повышает объемный коронарный кровоток через пресипаптические Д,- и постсинаптические Д,-рецепторы коронарных сосудов [Катков Е.В., Сапожков А.В. 1988]. По мнению других авторов коропарорасширяющий эффект дофамина опосредован адренорецепторами [Zhao R.R., Wang Р.Н. et al., 1992],
Дофамин участвует в регуляции числа сердечных сокращений. Так, агонист дофаминовых рецепторов апоморфии при внутривенном введении оказывал двухфазное действие па ЧСС, стимулируя Д2-реценторы в низких концентрациях, он вызывал снижение ЧСС, а в высоких через Д,-рецепторы повышал ЧСС [Bredbergg Е., Paalzow L.K. 1991].
Д2-реценторы в сердце располагаются в окончаниях сердечного симпатического нерва. Их стимуляция приводит к уменьшению числа сердечных сокращений способом, отличным от сти
202
муляции о^-адрепорецепторов [Yoon J.H., Ко С.М, et al., 1994].
По мнению других авторов дофамин играет меньшую роль в регуляции сердечной хроиотропии по сравнению с норадреналином [Сутягин П.В., Червова И.А. и др.-, 1995], а повышение ЧСС дофамином в высоких дозах обусловлено активацией ^-адренорецепторов [Boucher М., Dubray С., Duchene М.Р. 1984]. Возможно участие и Д2-рецепторов, расположенных в окончаниях парасимпатических нервов. Их активация дофаминовыми агонистами приводит к угнетению выброса ацетилхолина [Roquebert J., Moran A. et al., 1991].
При гипертрофии миокарда, вызванной коарктацией брюшной аорты, количество Д2-рецепторов, определяемое по связыванию [3Н]-спипероиа, увеличивалось па 3-й день, было высоким на 14-й и вернулось к норме па 28 день после коарктации [Ganguly Р.К., Mukherjee К., Chen Y. 1992, Mukherjee К., Sahai A., Ganduly R.K. 1994].
Апоморфип (1 — 100 мМ/л1) па левом предсердии морских свинок производил положительный инотропный эффект (ПИЭ), который пе уменьшался предварительным введением резерпина и атропина, но отменялся антагонистом дофаминовых рецепторов галоперидолом и антагонистом Д^реценторов SCH-23390. На него пе влияли блокаторы Д2-, а- и Р-адренергических рецепторов. Это говорит о том, что цостсипаптические Д^рецепторы опосредуют положительный инотропный эффект дофамина [Wang N., Zhao D.H., Sheng В.Н. 1991]. Другие полагают, что дофамин и его аналоги усиливают силу сердечных сокращений, возбуждая адренорецепторы сердца. Так УМ-09538 (а- и р-адре-поблокатор) тормозил возшжповение ПИЭ дофамина [Endol М. 1983]. Brown считает, что ИЭ дофамина обусловлен превращением дофамина в норадреналин в предсердиях сердца [Brown I. 1990]. Это утверждение основано па том, что дофамин усиливал силу сокращения изолированного сердца лишь при наличии предсердий. Блокада активности р-гидроксилазы или же химическая десимпатизация устраняли ПИЭ дофамина. Сокращение гладких мышц сосудов дофамин вызывал без участия дофамип-р-гидроксилазы. По-видимому, превращение дофамина в норадреналин является важным фактором при действии дофамина на сердце, но пе па сосуды [Brown I. 1990]. По данным Ohuchi и соавт. для образования дофамина из естественных копыогатов (более 70 % катехоламинов плазмы представляют собой конъюгаты дофамина) и повышения силы сердечных со
203
кращений нужны предсердия. Ткань предсердий имеет скорость превращения сульфоконьюгата дофамина в дофамин равную 11,76, а ткань желудочков — 0,95 нМ/г/мип [Ohuchi J., Ishimino Y., Minakuchi К. et al., 1989].
Терапевтический эффект дофамина при сердечной недостаточности опосредуется как Д]-, так Д2-реценторами. Воздействуя на Д2-рецепторы, расположенные в окончаниях симпатического нерва, дофамин угнетает выделение норадреналина, уровень которого в крови при сердечной недостаточности высок, что ведет к десенситизации р-адренорецепторов. Стимулируя синтез норадреналина в сердечной мышце и возбуждая [^адренорецепторы сердца, дофамин усиливает силу сердечных сокращений; возбуждая Д(-рецепторы почечных артерий, усиливает почечный кровоток, а стимулируя Дрреценторы канальцев почек, усиливает натрийурез [Fransis G.S. 1995, Novicki S., Enero M.A. 1991, Vyas S.J., Apparsundaram S., Ricci A. et al., 1991]. Усиление диуреза дофамином обусловлено угнетением активности Ыа+-К+-АТФазы через активацию Дррецепторов [Bertorello А.М., Hopflield J.F. et al., 1990].
Зная способность дофамина связываться не только с дофаминовыми рецепторами, но и с а- и 0-адрепорецепторами, при сердечной недостаточности с нормальным тонусом сосудов и АД его применяют в малых дозах. При сочетании сердечной недостаточности с падением сосудистого тонуса и АД (кардиогенный шок) рационально введение больших доз для стимуляции а-адрепореценторов сосудов [Гусель В.А., Хаджидас А.К., Цибульский Э.К. 1990]. При сердечной недостаточности отмечена эффективность дофамина, ибонамипа, бромкринтина, леводопы. Ибопамии в организме превращается в активный метаболит эпиниц [Lokhandwala M.F., Hegde S.S. 1991]. Докар-намин также в организме превращается в дофамин и может быть использован при сердечной недостаточности [Nishiyama S., Kanno К,, Yamaguchi J. 1991]. ПИЭ дофамина отмечен и у больных с острым инфарктом миокарда и ностипфарктным кардиосклерозом [Малая Л.Т., Машковский М.Д., Абсава Р.И. и соавт. 1988]. Кроме того, в эксперименте дофамин тормозит образование коронарного тромба, в то время как норадреналин усиливает его [Berta B.J., Jill J.С., Nugent М. et al., 1989]. Вместе с тем, дофамин может ухудшать кровоток в ишемизированной области и усиливать реперфузионное повреждение миокарда [Kollar A., Kenesi V., Jahasz-Nagy А. 1991]. Хлорпромазин эффективно предотвращал в этом случае побочный эффект дофамина [Ларионов Н.П., Кулешов В.Ф. и соавт. 1991].
204
Присутствие дофаминовых рецепторов обнаружено в сосудах почек и па периферических норадренергических нервных окончаниях. Дофаминовые рецепторы сосудов ночек опосредуют вазодилатацию. Агонистическую активность в отношении этих рецепторов проявляют только соединения с гидроксильными группами в положениях 3 и 4 [Goldberg L.I. et al., 1968]. Агонисты дофаминовых рецепторов 2-амипо-6,7-1,2,3,4-тетрагидронафталеи (АДТН) и SKF 38 393 также увеличивают кровоток в почках [Horn М. et al., 1984]. Сосудорасширяющее действие дофамина подавлялось галоперидолом, хотя специфичность наблюдалась только в узком диапазоне концентрации.
Эргометрин подавляет сосудорасширяющий эффект дофамина. Этот эффект дофамина блокируется сульпиридом у собак и морских свинок. В то же время сулышрид не влияет на расширение сосудов почек, вызываемое [3-адреномиметиком изопрепалииом.
Эксперименты Р.Н.Kelly (1982) in vitro, в которых была показана способность дофамина индуцировать релаксацию сосудов кролика, подтвердили присутствие дофаминовых рецепторов в почках и позволили предположить, что сходные рецепторы локализованы в портальной вене и аорте. В то же время этим автором было установлено, что релаксирующее действие дофамина па мышг.ы тощей кишки опосредовано р-адреноре-центорами. Проведе.шый фармакологический анализ влияния адренергических и дофаминергических веществ на сокращение мышечной оболочки сосудов и мышц топкой кишки позволили Р.Н.Kelli (1982) предложить схему взаимоотношений между дофаминовыми и а-адрен-ергическими рецепторами в этих тканях (схема 5).
Согласно этой схеме, если в тканях есть дофаминовые рецепторы, то галоперидол связывается с ними и в меньшей степени блокирует а-адрепорецепторы, стимулируемые адреналином и фенилэфрином. Вместе с тем, поскольку дофамин связывается как с дофаминовыми, так и с адренергическими рецепторами, его агонистические свойства будут проявляться сильнее при действии адреналина, фенилэфрина или фентоламипа на адренорецепторы. Об интерференции между дофамин- и адренергическими процессами свидетельствуют также исследования W.Maixner и соавт. (1983), а также B.Bongard и соавт. (1983).
По данным M.Relja (1982), специфическое связывание ^-галоперидола с мембранами клеток vas deferens крыс насыщаемо и
205
характеризуется К , равной 21 нМ, и В^, составляющей 74 фмоль/мг белка. (+)-Бутакламол но сравнению со своим фармакологически пе активным энантиомером обладал в несколько раз меньшей способностью вытеснять этот лиганд, что свидетельствует о стереоспецифичности его связывания. Дофамин (ЮмкМ) уменьшал связывание галоперидола с этими мембранами на 50%. Норадреналин, адреналин и серотонин в концентрации 10 мкМ в этом отношении были практически не активными. Эти результаты указывают, что vas deferens имеются дофаминергические рецепторы, и дают возможность предполагать, что влияние дофамина и дофаминергических веществ па сексуальное поведение может быть опосредовано их периферическими эффектами, а не только действием па ЦНС.
3.9. Дофаминовые рецепторы центральной нервной системы
Для изучения дофаминовых рецепторов оказалось полезным использовать препарат изолированного головного мозга змеи Helix aspersu и применение внутриклеточных микроэлектродов. Именно таким путем было доказано взаимодействие алкалоидов спорыньи с дофаминовыми рецепторами. Выяснено, что эргометрин и диэтиламид лизергиновой кислоты подавляют ингибирующее действие дофамина на нейроны Helix aspersu.
Позднее были разработаны электрофизиологические методы изучения активности нейронов млекопитающих, что позволило выявить депрессивное действие иопофоретически вводимого дофамина на электрическую активность нейронов хвостатого ядра и accumbens головного мозга крыс. Данный эффект дофамина блокируют нейролептики.
Для оценки функциональной активности дофаминовых рецепторов ЦНС были разработаны также поведенческие тесты. Наибольшее распространение получила 6-оксидофаминовая вращательная модель, предложенная U.Ungerstedt (1971). Суть данного теста заключается в одностороннем разрушении нигрост-риатпого пути с помощью локального введения 6-оксидофами-на в черную субстанцию. Если через несколько дней этим животным ввести апоморфип, то животные начинают вращаться в
206
сторону, противоположную от полушария, в котором был разрушен нигростриатпый путь (т.е. возникает стереотипия поведения). Эффект, аналогичный апоморфипу, дают также эргометрии, бромкрецтип.
Эргометрин при его микроионофоретическом введении в хвостатое ядро и accumbens крыс вызывает дофаминоподобный эффект.
Кроме того, можно оценивать фармакологическую активность дофаминергических веществ но двигательному тесту.
Пресипантические дофаминовые рецепторы, или ауторецепторы, изучают также с помощью электрофизиологического метода. Дофаминергические нейроны компактной зоны черной субстанции идентифицируют по изменению их электрической активности в ответ на внутривенное введение апоморфипа и других агонистов и антагонистов дофаминовых рецепторов, если они проходят через гематоэнцефалический барьер. Дофаминовые ауторецепторы модулируют высвобождение и синтез дофамина. Выявлено, что стимуляция пресинаптических дофаминовых рецепторов сопровождается ингибированием высвобождения дофамина из дофаминергических нервов.
Дофаминовые рецепторы, расположенные на холинергических нейронах, опосредуют модулирующее влияние дофамина на высвобождение ацетилхолина.
Обнаружено, что двигательную стимуляцию вызывают дофаминовые агонисты: эргометрин, а также амфетамин, стимулирующий высвобождение эндогенного дофамина. Позднее было установлено, что данный эффект агонистов дофамина обусловлен их влиянием на центральные дофаминергические системы. Показано, что двустороннее введение в ядро accumbens крыс эргометрина и АДТН приводит к продолжительному увеличению у них двигательной активности. Данный стимулирующий эффект АДТН избирательно блокируется при внутрибрюшинном введении крысам низких доз флупептиксола, флу-фепазипа или галоперидола. Сулышрид подавляет этот эффект АДТН в относительно высокой дозе (20 мг/кг), что может быть связано с его слабым проникновением в головной мозг. При непосредственном введении сульпирида в ядро accumbens он блокирует эффект АДТН в дозе 1 мкг.
Активность 5-(-)-сулышрида в этом отношении в 25 раз : выше, чем R-(+) -сульпирида.
t Одним из основных способов прямого изучения локализа
207
ции и характеристик дофаминовых рецепторов в ЦНС по-прежнему остается метод исследования связывания меченных тритием лигандов с этими рецепторами. В качестве таких радиолигандов используют антагонисты: 3Н-галоперидол, эН-спироперидол, 3Н-цис (г)-флупептиксол, 3Н-домперидон, 3Н-сульпирид и агонисты: 3Н-апоморфин и 3Н-АДТН. Поскольку эти лиганды в ряде случаев связываются пе только с дофаминовыми, ио с другими рецепторами, для оценки их специфического связывания с дофаминовыми рецепторами ткань предварительно инкубируют с блокаторами серотониновых и норадреналиновых рецепторов.
Связывание 3Н-сулышрида с высоко и частично очищенными мембранами синантосом полосатого тела головного мозга крыс линии Вистар характеризуется константой диссоциации, равной 7,4 и 8,8 иМ соответственно и максимальным числом связывающих участков, равным 240 и 400 пмоль/ мг белка соответственно.
3Н-Сульпирид с высокой степенью специфичности связывался также с мембранами ядра accumbens, но не с препаратами мембран клеток коры, мозжечка, гиппокампа. Поскольку полосатое тело и ядро accumbens богато насыщены дофаминергическими нервами, можно считать, что участки, специфически связывающие 3Н-сульпирид, представляют собой постсинаптические дофаминовые рецепторы. Данное связывание 3Н-сульпиридом ингибируется нейролептиками.
Стимуляция Д ^дофаминовых рецепторов срезов неостриатума крыс антагонистом Д^рецепторов SKF-38 393 не влияет на индуцируемое К+ высвобождение из них 3Н-ГАМК, 3Н-глутамата, 3Н-серотонина, 3Н-дофамипа и нС-ацетилхоли-на. В то же время стимуляция Д2-дофамиповых рецепторов агонистом этих рецепторов RW 24 926 ингибировала вызываемое К+ высвобождение из срезов 3Н-дофамина и ,4С-ацетилхолила, но пе 3Н-ГАМК, 3Н-глутамата и 3Н-серото-пина. Антагонист Д2-рецепторов (-)-сулышрид подавлял данный эффект RW 24 926. По-видимому, ингибирующие высвобождение данных медиаторов дофаминовые аутореценторы и постсинантические дофаминовые рецепторы, опосредующие ингибирование высвобождения ацетилхолина, фармакологически сходны между собой и относятся к Д2-рецеиторам.
Пресинаптические дофаминовые аутореценторы относятся к Д2-рецепторам, так как сулышрид избирательно блокирует
208
Рис. 39. Унитарный дофаминовый рецептор, содержащий области (субъединицы) для связывания антагонистов
ингибирующее действие апоморфипа на высвобождение 3Н-дофамииа из клеток хвостатого ядра кроликов. В то же время есть данные, что нре- и ностсинаитивеские дофаминовые рецепторы отличаются между собой но чувствительности к агонистам и антагонистам [Haubrich D.R., Pflueger А.В., 1982]. Offermeer и J.M.van Rooyen (1982) считают, что иресинапти-ческие дофаминовые рецепторы, избирательно сильно связывающие 3Н-дофамин, относятся к Д3-рецепторам.
Пресинаитические дофаминовые ауторецепторы и постсинаптические дофаминовые рецепторы в ЦНС можно дифференцировать с помощью (-)-М-хлорэтилнорапоморфипа, который действует как необратимый антагонист постсипаптических рецепторов, но как необратимый агонист ауторецепторов, и с помощью 6,7-диокси-2-(К,Ы-диметил)-амииотетралипа, который стимулирует ауторецепторы, не влияя на постсипапти-ческие дофаминовые рецепторы. Предполагается, что в норме существует сбалансированная функциональная активность пре-и постсипаптических дофаминовых рецепторов в головном мозге. При нарушении этою баланса возникают «положительные» (галлюцинации, бред, расстройства мышления) или «отрицательные» (аффективные уплощения, бедность речи и потеря интереса к жизни) симптомы шизофрении. Схематично указанные два противоположных случая представлены на рис. 40. В связи с этим важно, что нейролептики эффективны для лечения «положительных» симптомов шизофрений и могут даже усиливать «отрицательные» симптомы этого заболевания. Если пре/постсипаптическая дофамииорецен-торпая гипотеза шизофрении верпа, то она открывает перспективы как в поиске новых ЛВ, избирательно влияющих па тот или иной вид шизофрении, так и в разработке рациональных форм лечения этого заболевания имеющимися дофаминергическими нротивопсихотическими веществами.
f 14.З.к.227
209
Пресимал- Постеимап-ги*>есммб < тнческие рецептору рецепторы
Преси«*п- Постс***»п-тичесние > тмчеокие рецептору рецептору
Рис. 40. Дофаминергический механизм шизофрении, основанный на дисбалансе между пре- и постсииаптичсскими дофаминовыми рецепторами [Lehmann Т., Langer S.,1982].
а — повышение активности постсинаптических дофаминовых рецепторов, сопровождающееся увеличением дофаминергического тонуса и появлением симптомов шизофрении (это повышение может быть вызвано хроническим введением амфетамина или агонистов дофаминовых рецепторов прямого действия); б—повышение активности пресинаптнчоских ингибирующих дофаминовых рецепторов, сопровождающееся снижением дофаминергического тонуса и появлением отрицательных симптомов шизофрении.
Важно отметить, что функциональная активность дофаминергической системы чувствительна к различным воздействиям, например, гормональным. P.A.Nausieda и соавт. (1979) сообщили о модификации чувствительности постсинаптических дофаминовых рецепторов женскими половыми гормонами. Недостаток этих гормонов снижал, а избыток повышал избыток дофаминовых рецепторов в ответ па стимуляцию их агонистами. Следовательно, можно предположить, что известные факты психических нарушений у женщин при изменении у них гормонального статуса могут быть обусловлены коррекцией дофаминергической чувствительности, связанной с циклическими изменениями уровня эстрогенов и прогестерона.
Пресииаптические дофаминовые рецепторы присутствуют пе только па дофаминергических, ио и па норадренергических нервных окончаниях. Эти рецепторы найдены как в ЦНС, так и на периферии, опосредуют ингибирование электрически стимулируемого высвобождения 3Н-порадрепалипа из срезов головного мозга и почечной артерии и селезенки [Langer G., 1973, 1981].
По данным P.Seeman (1980), большинство фармакологических эффектов дофаминергических агонистов опосредовано Д2-рецепторами. Примерно 50% всех Д3-рецепторов локализова-
210
Нор» ЛЛ ?ис- 4t. Локализация дофаминовых
7 рецепторов и участков связывания
радиолигандов в нигростриапюй системе крыс [Creese Р., 1982].
Черная субстанций
а—участки, связывающие с высоким средством эН-бутирофеноны, после разрушения полосатого тела каиновой кислотой; они исчезают при разрушении коры и нс регулируются ГТФ. Эти участки относятся к Д2- и Д4-рецепторам; б—участки, относящиеся к Д,-рецепторам; они опосредуют стимуляцию дофамином аденилат-циклазы и исчезают при разрушении полосатого тела каиновой кислотой; в—участки, связывающие с высоким сродством 3Н-агонисты и с низким сродством бутирофеноны; они исчезают при разрушении полосатого тела каиновой кислотой и относятся к Д,- и Дэ-рецепторам; д— участки, связывающие с высоким сродством 3Н-бутирофсноны и имеющие высокое или низкое сродство к агонистам в зависимости от уровня ГТФ; они исчезают при разрушении полосатого тела каиновой кислотой и относятся к Д2- н Д4-рецепторам; с— участки, связывающие с высоким Сродством 3Н-агон исты и с низким сродством бутирофеноны; они исчезают при разрушении полосатого тела 6-оксидофамином и относятся к пресинаптичсскнм рецепторам; ф—участки, опосредующие стимуляцию дофамином аденилаткиклазы; они исчезают при разрушении полосатого тела каиновой кислотой или перерезке стриатонигрального пути и относятся к Д ^рецепторам; ж —участки, связывающие ’Н-бутирофеноны с высоким сродством; они исчезают при разрушении черной субстанции 6-оксидофамином и относятся к Дг-рсцепторам; г —участки, связывающие эН-агонисты с высоким сродством; они исчезают при разрушении черной субстанции 6-оксидофамином и относятся к прссинаптическим Д3-рецепторам; ДН— дофаминергический нейрон. Участки б, в, д, и ж, г могут иметь, а могут не иметь одну и ту же нейрональную локализацию.
иы пресииаптически: они выполняют функцию дофаминовых ауторецепторов в ЦНС. Обобщить имеющиеся сведения о локализации дофаминовых рецепторов в пигростриатной системе можно в виде следующей схемы (рис. 41).
3.10. Дофаминовые рецепторы желудочно-кишечного тракта
Поскольку, согласно данным U.Caruso и соавт. (1982), блокатор периферических дофаминовых рецепторов домперидон у свиней вызывает увеличение концентрации цанкреатиче-
м*
211
ского полипептида в крови и повышает количество бикарбонатов в перфузате двенадцатиперстной кишки, можно считать, что дофаминовые рецепторы играют важную роль в регуляции экзокринной секреции поджелудочной железы.
3.11. Дофаминовые рецепторы почек
Кроме того, есть данные, что дофамин вызывает натрийурез, приводящий к увеличению диуреза у людей, собак, кошек и крыс, независимо от изменений почечного кровотока, скорости клубочковой фильтрации и почечной симпатической активности [Cavero I. et al., 1982]. По данным HJ.Akraffiong и соавт. (1983), В.М.Брюханова (1983), инфузия дофамина в почечную артерию собак увеличивает реабсорбцию глюкозы, а галоперидол блокирует это увеличение.
Так как дофаминергические нейроны присутствуют в почках, можно предполагать, что индукция дофамином данных эффектов опосредована дофаминовыми рецепторами канальцев почек.
При введении крысам больших доз дофамина его диуретический эффект исчезает, что может быть связано с активацией ос-адренорецепторов почек; доказательством этого служит тот факт, что при блокаде фентоламином а-адрепорецепторов и в больших дозах дофамин усиливает диурез.
3.12. Дофаминовые рецепторы надпочечников
M.Bevilacgua и соавт. (1982) обнаружили, что специфическое связывание 3Н-амино-6,7-окси-1,2,3,4-тетрагидропафталена (АДТН) с дофаминовыми рецепторами плазматических мембран клеток клубочковой зоны надпочечников теленка характеризуется насыщением и высоким сродством (согласно скэтчар-довскому анализу, К, равна 2,9±0,2 нМ, а Вцдьг равна 39±4 фмоль/ мг белка). Связывание АДТН было быстрым (t 1/г=3,2 мин) и обратимым (t)/2 =1,8 мин). Антагонист Д,-рецепторов (R)-сульпирид вытеснял АДТН из его связи с дофаминовыми рецепторами в 50 раз сильнее, чем антагонист Д2-реценторов (S)-
212
сулышрид. Агонист Д,-рецепторов S-38393 по сравнению с агонистами Д2-рецепторов бромкриптипом и дигидроэргокрин-типом сильнее вытеснял АДТН из его связи с данными рецепторами. Гуаниновые нуклеотиды и Na+ не влияли на связывание АДТН. В то же время фосфатидиповая кислота уменьшала это связывание. Уменьшение содержания цАМФ в клетках клубочковой золы в присутствии дофамина или дофамина и ГТФ не наблюдалось. Однако в этих клетках увеличивалось содержание цАМФ после воздействия АКТГ или (1-адреномиметиков. Таким образом, можно полагать, что дофаминовые рецепторы, связывающие АДТН, не сопряжены с адепилатциклазой и пе могут быть отнесены к подклассу Д2 дофаминовых рецепторов. Сведения, которые сообщил В.Б.Розен (1984), позволяют считать, что данные дофаминовые рецепторы надпочечников принимают участие в ингибировании секреции альдостерона.
3,13. Дофаминовые рецепторы — мишень действия ЛВ
Дофаминергические вещества как лекарственные средства — это новая отрасль фармакологии. Лишь сравнительно недавно дофаминовые агонисты, представляющие собой эрго-производные, бромкриптип (сильный агонист Д2-рецепторов и частичный агонист Д(-рецепторов) и перголид (агонист Д, и Д2-реце-пторов) стали использоваться для лечения болезни Паркинсона. Эти вещества имеют сходство с известным препаратом леводопа, но действуют более длительно.
Хотя еще в 50-х годах в клинике начали применять нейролептики, ио только несколько лет назад стало известно об их способности блокировать дофаминовые рецепторы. И если не совсем понятно, какую роль играет эта блокада в проявлении их психотропной активности, то достоверно установлено, что нет нейролептика, который бы не блокировал дофаминовых рецепторов.
Следует отметить, что эффекты психотропных средств при однократном и хроническом введении могут быть неодинаковы. Однако при хроническом введении нейролептиков всегда наблюдается повышение чувствительности дофаминовых рецепторов головного мозга [Майметс М.О. и др., 1985].
Известно, что кора лобной доли, ио не полосатое тело, устой
213
чива к развитию толерантности, к действию нейролептиков при их хроническом введении. Так, Е. Muller и соавт. (1982) обнаружили, что внутрибрюшинное введение крысам галоперидола (0,5 мг/кг в течение 3 недель или 2,5 мг/кг в течение 5 недель) не влияет на специфическое связывание 3Н-спиронеридола с дофаминовыми рецепторами лобной коры, по приводит к значительному увеличению его связывания с дофаминовыми рецепторами полосатого тела головного мозга.
В последнее время достигнуты успехи в поиске дофаминергических средств, не влияющих на двигательную актив-ность.Так, S.Hjorth и соавт. (1983) показали, что (+)-3-(3-оксифенил)-1Ч-п-пропилпиперидин обладает активностью агониста дофаминергических ауторецепторов и постсинаптических рецепторов, а его (-)-энантиомер—свойствами агониста ауторецепторов и антагониста дофаминовых постсинаптических рецепторов.
(-)-Эпантиомер характеризовался избирательностью по отношению к лимбической системе, что указывает на возможное его клиническое использование в качестве антипсихотических средств, не обладающих побочным действием на двигательную систему.
Агонисты постсипаптических дофаминовых рецепторов, возможно, найдут применение для лечения болезни Паркинсона. Поскольку стимуляция дофаминовых рецепторов гипофиза сопровождается снижением секреции пролактина, агонисты этих рецепторов представляют интерес также для терапии некоторых эидокринопатиЙ, например, гиперпролактинемии.
Кроме того, весьма перспективно использование дофаминергических агонистов в качестве гипотензивных средств благодаря их способности расслаблять мышечную оболочку сосудов, в особенности почечных.
Пока эти вопросы находятся в стадии экспериментальных разработок.
Выявлено, что относительно избирательные агонисты дофаминовых рецепторов, такие как бромкриптин, лерготрил, нер-голид и Ы,Ы-ди-н-пропилдофамин, снижают артериальное давление у крыс со спонтанной гипертензией. Поскольку блокаторы дофаминовых рецепторов (домперидон, галоперидол, ни-мозид, сульпирид) подавляли дашшш эффект, можно считать, что он опосредован стимуляцией дофаминовых рецепторов. Теоретически в основе антигипертензивного эффекта дофаминовых агонистов могут лежать два механизма: 1) релаксация
214
неисчерчепных мышц сосудов, опосредованная постеш этическими -рецепторами и 2) уменьшение нейронального высвобождения норадреналина вследствие активации пресипиитических Д2-рецепторов па нейронах ганглиев или синаптических нервных окончаниях [Cavero I. et al., 1982].
Несомненный интерес представляют дополнительные возможные механизмы: натрийуретическое действие дофамина и его способность снижать секрецию альдостерона. Так или иначе, именно периферические дофаминовые рецепторы сердечно-сосудистой системы можно рассматривать как мишень действия антигипертензивных средств. Клиническая ценность агонистов дофаминовых рецепторов может не ограничиваться только их использованием для лечения гипертонической болезни; они могут применяться и для терапии заболеваний сердца, кардиогенного шока и некоторых региональных сосудистых заболеваний (например, сосудов почек).
3.14. Заключение
Дофаминовые рецепторы гетерогеппы в отношении способности связывать лиганды и в отношении сопряжения биохимическими эффекторными системами.
Основываясь па имеющихся сведениях можно обобщить данные о функции дофаминовых рецепторов, локализованных в различных тканях.
1. Постсипаптические Д2-дофами новые рецепторы полосатого тела головного мозга (стимуляция двигательной активности, поведенческие эффекты, блокируемые нейролептиками).
2. Постсинаптические Д2-дофаминовые рецепторы гипофиза (ингибирование секреции гипофизных гормонов).
3. Постсипаптические Д,- дофаминовые рецепторы паращитовидной железы (высвобождение гормонов).
4. Постсинаптические Д(-дофамиповые рецепторы кишечника и сосудов почек (расслабление гладких мышц).
5. Пре- и постсипаптические Д( и Д3-дофаминовые рецепторы пигростриатной системы (функция неизвестна).
6. Пресипаптические дофаминовые рецепторы дофаминергических нервных окончаний (ингибирование высвобождения дофамина).
215
7. Пресинаптические Д, и Д,-дофамиповые рецепторы на нор-адренергических нервных окончаниях (ингибирование высвобождения норадреналина).
8. Дофаминовые рецепторы vas deferens (регуляция половых функций).
9. Дофаминовые рецепторы надпочечников (регуляция секреции альдостерона).
10. Дофаминовые рецепторы поджелудочной железы (регуляция секреции панкреатического полипептида и бикарбонатов).
11. Дофаминовые рецепторы канальцев почек (регуляция патрийуреза).
Такое широкое представительство дофаминовых рецепторов определяет их роль в регуляции многих важнейших функций организма. Не исключено, что последующие эксперименты позволят установить локализацию дофаминовых рецепторов еще в каких-либо органах и тканях.
Глава 4
ГИСТАМИНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ
Гистамгщ относится к наиболее старым биогенным аминам, история изучения которого начинается с 1907 г., когда Внндаус и Фогт синтезировали его из имдазолиропионовой кислоты. Первая работа, посвященная изучению биологической активности гистамина появилась в 1910 г. [Dale Н. et al., 1910]. Только через 26 лет после этого был синтезирован антагонист гистамина, который способствовал идентификации гистаминового рецептора [D.Bovet и A.Staub (1936)].
В связи с тем, что антигистаминный препарат меиирамин не обладает способностью блокировать действие гистамина па желудочную секрецию и частоту сокращении сердца, A.S.Ash и Н.Schild (1966) выдвинули гипотезу о существовании более чем одного класса рецепторов гистамина.
Согласно определению A.S.Ash и Н.Schild, рецепторы гистамина, которые опосредуют его эффекты и функция которых подавляется мепнрамнцом, представляют собой ^-рецепторы, а те рецепторы гистамина, на которые ие влияет меиирамин, не являются Г t-рецепторами.
В 1972 г. J.H.Black н соавт. удалось синтезировать антигистаминный препарат бурпмамад, который мог конкурентно ингибировать секреторный эффект гистамина в желудке, что послужило решающим экспериментальным доказательством существования второго тина гистаминовых рецепторов, названных Г,-реценторамн. Впоследствии оказалось, что бурпмамнд является более селективным антагонистом еще одного типа гистаминовых рецепторов Г.,-рецепта ров, локализованных в ЦНС, периферических цервах, эндотелии, эптерохромипных клетках и принимающих участие в регуляции высвобождения нейромедиаторов, релаксации сосудов, ингибировании желудочной секреции. Для Г,-реценторов были синтезированы другие специфические антагонисты — циметидин, ранитидин, фамотндпп, нашедшие широкое
217
применение в клинической практике в качестве противоязвенных препаратов.
Существование трех типов гистаминовых рецепторов в различных органах и тканях млекопитающих было неоднократно доказано при проведении фармакологических и биохимических экспериментов, что подтверждает наше предположение, сделанное несколько лет назад, о возможности появления других типов на том основании, что существуют некоторые экспериментальные факты (например, проявления седативного действия Г|-шггагоцистов, гипотензивного действия клоцидипа и аитидеирессивной активности трициклических антидепрессантов), которые нельзя объяснить с помощью существующих типов гистаминовых рецепторов.
4.1. Агонисты и антагонисты
гистаминовых рецепторов
После открытия гистамина было синтезировано более тысячи новых соединений, близких к его структуре. Однако лишь у некоторых из них была выявлена способность избирательно взаимодействовать с гистаминовыми рецепторами. Часть агонистов и антагонистов используется только в экспериментах для изучения распределения гистаминовых рецепторов в организме и для анализа строения этих рецепторов; многие из них широко используются или начинают использоваться в клинике. Химическая структура избирательных агонистов и антагонистов гистаминовых рецепторов приведена ниже.
.Агонисты Г] -рвцелтсфов
ннд
снэ
CHj—CHj-NHj
TMBBOnRMTVMKKH
CHr-CHj—NHa
218
Агонисты Гj -рецепюроо
сн3 СНа— СНа—NHa
4« Мети л гистамин
СН2—СНа—NH3
Ги ct ал or (ботааол)
S(CHa)2 NH2
Димаприт
Агонисты Г, - и ГQ -рецолгоро*
СН2--СН2---МН2
Тр н азояил эта ламин
Для веществ, имеющих избирательность к Г,-рецепторам, характерно наличие заряженной аммонийной группы, а для веществ, селективно взаимодействующих с Г2-рецепторами — имидазольного
219
Аитагониеты Г । -рецепторов
I /СНз
ch2-ch-n4cH3
СН3 Пкпольфен
Твввгил
Н2
—сн2—сна*—N(Ch3)2
Трнпелемнамнч
4 (5}-[2-(4-аанд0*2аитр{>анилкн} этнл] жмндаэзд (ДАН)
220
Акт аге пне ты Г £ рецепт Оро»
chno2
Ранггмдои
сн3 СНа—S—ОНа—СНа—NH—С—NH—сн3
HQ 8
* Метиаиид
На
СНа—S-— СНа—СН—NH—С— NH—СНз
Н2К
ici доги
кольца. lyАнтагонисты имеют липофильные арильные или тетроа-рильиые кольца, которые отличаются от имидазольного кольца, но, подобно гистамину, они имеют боковую цепь (обычно аммониевую), которая при физиологических значениях pH заряжена положительно. В то же время Г2-аптагонисты гидрофильны. Их сходство с гистамином заключается в том, что в их структуру входит имидазольное кольцо (оно может быть модифицировано и содержать заместители). Отличаются же они от гистамина тем, что имеют хотя п полярную, ио пе заряженную боковую цепь. Возможно, что отсутствие у них гнстамиимиметической активности связано
221
именно с незаряжеип остью боковой цени. В кристаллической форме метиамид [Prout С. et al., 1977] и циметидин [Hadicke Е. et al., 1973] образуют десятиЧлепное кольцо благодаря установлению внутримолекулярной водородной связи между положительно заряженным атомом азота имидазольного кольца и наиболее удаленной NH-групцой боковой цени. R.C.Litchell (1980) методом инфракрасной спектроскопии показал, что в растворе эти вещества также могут образовывать внутримолекулярные водородные связи и иметь более компактную конформацию.
Следует отметить, что избирательный антагонист Г(-рецепторов ААН при фотолизе необратимо связывается с этими рецепторами, что позволяет использовать его в идентификации связывающего участка Г,-рецепторов и изучении их физико-химических свойств [O'Dannel J.P. etal., 1981].
4.2. Топография гистаминовых рецепторов
В настоящее время установлено, что гистамин, наряду с другими медиаторными веществами и гормонами, практически повсеместно регулирует тонус пеисчерченпых мышц, действует как посредник на париетальные клетки желудка, выполняет роль синаптического медиатора и принимает участие в иммуиохнмическнх механизмах [Сергеев П.В. и др. 1996]. Фармакологическая дифференциация рецепторов, опосредующих те или иные эффекты гистамина, основана на анализе конкуренции между антагонистами и агонистами гистаминовых рецепторов, определяемой но сдвигу кривых доза—эффект. В результате такого подхода получены сведения о типах гистаминовых рецепторов в различных органах и тканях.
4.2.1. Гистаминовые рецепторы ЦНС
Гистамин в головном мозге находится, ио крайней мере, вдвух видах клеток: нейронах и тканевых базофилах (тучные клетки). Функция гистамина тканевых базофилов ЦНС еще не изучена, однако известно, что нейрональный гистамин выполняет нейромедиаторную роль [Schwartz J., 1980]. Считается, что ингибирование электрической активности нейронов коры головного мозга при иопофоретической аппликации гистамина опосредовано ^-рецепторами, а тахикардия и гипертензия, развивающиеся после введения гистамина в желудочки головного мозга, Г-рецепторами [Haas H.L.,WolfP„ 1977].
222
Рвота, вызываемая гистамином у собак, но мнению K.P.Bhar^ava и соавт. (1976), опосредована Г,- и Г2-реценторами головного мозга. C.P.Irivedi и соавт. (1976) наблюдали при введении гистамина внутрь желудочков головного мозга крыс гипогликемию, а при его периферическом введении — гипергликемию.
T.T.Quach и соавт. (1978) обнаружили, что гистамин при его инкубации со срезами коры головного мозга мышей в течение нескольких минут вызывает гидролиз примерно 70 — 80% всего внутриклеточного гликогена. ГрАгонисты, в отличие от Г2-агоии-стов, также обладали гликогенолитическим эффектом. Антагонисты адрено-, серотоницо- и Г2-рецепторов не влияли на данный эффект гистамина, Г,-антагонисты по конкурентному механизму его подавляли.
S.S.Hill и соавт. (1978), а также V.Traa н соавт. (1978) провели сравнительное изучение способности ^-агонистов вызывать гликогенолитический эффект в ткани мозга с их влиянием на связывание 3Н-менирамииа с Г(-нейрональными рецепторами. Было обнаружено, что гистамин значительно слабее ингибирует связывание ’Н-менирамина (К =45 мкМ), чем вызывает гликогенолиз (ЕСМ=3 мкМ), что дает возможность предполагать существование “избыточных гистаминовых рецепторов”. Предварительная инкубация срезов коры головного мозга с гистамином приводила к уменьшению числа ^-рецепторов, связывающих 3Н-мецирамии примерно на 20%, ио не изменяла их сродства к этому радиолиганду (рис. 42). Предстоит выяснить, может лн такое небольшое изменение числа Г,-рецепторов обусловить столь сильный сдвиг кривой зависимости гликогенолитического эффекта гистамина от его концентрации после предварительной инкубации срезов с гистамином (рис. 43).
Согласно данным G.Barbin и соавт. (1980), :,Н-гистамин обратимо, насыщаемым образом, с высоким сродством (Кя=711М) связывался с мембранами клеток головного мозга крыс. Различные нейромедиаторы заметно не влияли на это связывание гистамина. Изучение субклеточного распределения гистаминовых рецепторов показало, что их мало в синаптических везикулах, и они в основном локализованы в постсипаптических мембранах. Об этом также свидетельствует тот факт, что при нейрональной дегенерации, вызванной каиновой кислотой, число гистаминовых рецепторов уменьшалось на 50%, а после перерезки гистамицергических путей их число увеличивалось на 24%. В коре головного мозга число участков, связывающих 3Н-гистамин, равнялось 3,2±0,3нмоль/г
223
Рис. 42. Влияние предварительной инкубация срезов коры головного мозга с гистамином па связывание 3Н-меп прими па (график Скэтчар-да) [Schwartz J. et al., 1980].
По осн абсцисс — концентрация связанного 3Н-меппрамина (фмоль/мг белка); по осн ординат — отношение связанной концентрации 3Ц -иеппрампна к его свободной концентрации; 1 —контрольные срезы; 2 — срезы, предварительно инкубированные с 50 мкМ гистамина.
Put. 43. Влияние предварительно 11 инкубации срезов коры головного мозга мышей па индуцируемый гистамином гидролиз ’Н-глнкогела [Schwartz J. et al., 1980].
По осп абсцисс —log концентрации гистамина в молях. По осп ординат гид-ролиз 'Н-гликоген а в процентах; 1 — контрольные срезы; 2 — срезы, предварительно инкубированные с гистамином.
ткани; в полосатом теле оно было на 39% больше, а в таламусе, гипоталамусе, стволе мозга п мозжечке соответственно на 48, 52, 89 и 97% меньше.
Поскольку способность Г(- п Г2-агойистов ингибировать связывание 3Н-гистамипа с мембранами клеток головного мозга крыс не коррелирует с выраженностью их фармакологических эффектов, а Гр п Грантагонисты лишь слабо ингибируют его связывание, можно полагать, что участки, связывающие ’Н-гнстамли с высоким сродством, представляют собой новый класс гистаминовых рецепторов, отличных от Гр и Гр рецепторе в, или являются Гр и Гр peuei угорам и, но с измененной конформацией.
В то же время С.Rose н соавт. (1982), изучая фармакологические свойства нового Граитагоинста без седативной активности
224
терфеиадина а-[4( 1,1 -диметилэтнл)феш1л]-4-(оксидифе1шлметил)-Ьпиперидипбутаиола, обнаружили, что in vitro терфеиадии имеет одинаковое сродство к Г(-рецепторам головного мозга и периферических тканей, a in vivo он слабее всех известных -антагонистов ингибирует связывание 3Н-менирамииа с Г( -рецепторами коры головного мозга мышей. Эти данные соответствуют имеющимся сведениям о том, что терфеиадии не обладает седативным свойством.
Таким образом, можно резюмировать, что гистаминовым рецепторам ЦНС принадлежит важная роль в регуляции обмена углеводов, секреции гормонов, ио на вопрос, как эти эффекты связаны с проявлением физиологических реакций, вызываемых гистами-пергическими лягапдами, мы ответить пока не можем.
4.2.2. Гистаминовые рецепторы сердца и сосудов
В большинстве работ, посвященных изучению гистаминовых рецепторов сердца, использовали изолированные перфузируемые препараты сердец животных. Положительное хронотропное действие гистамина и Г2-агонистов па сердце эффективно блокируется Г2-, но не ^-антагонистами [McNeill J.H., Verma S. С., 1974}. Положительный инотропный эффект гистамина и его способность вызывать аритмии также блокировались как Г -, так и Г2-антаго1 тэтами [Levi R. et al., 1982]. В то же время гистамин реализует свой отрицательный дромотрошпяй эффект, взаимодействуя с ^-рецепторами. Эти дшшые, исследования O.Paloglu и соавт. (1982), J.Watkins и соавт. (1982),а также Т.Kimura и S.Satoh (1983),посвященные анализу роли типов гистаминовых рецепторов в опосредовании кардиотрошшх эффектов гистамина, позволяют заключить, что стимуляция Г,-рецепторов сопровождается снижением частоты сердечных сокращении, силы сокращений и атриовентрикулярной проводимости, стимуляция Г2-рецепторов — увеличением частоты, автоматизма и силы сердечных сокращений, а стимуляция как Г -, так и Г2-рецепторов — вазодилатацией коронарных сосудов.
Гистамин повышает силу сердечных сокращений через различные гистаминовые рецепторы у человека и животных. Положительный инотропный эффект на человеческом сердце гистамин оказывал в тех же концентрациях, в которых повышал активность аденилатциклазы, то есть через Г2-рецепторы [Bristow etal., 1982]. На изолированном сердце и на изолированных папиллярных мышцах морской свинки он вызывал усиление сокращений через Г2-рецепторы [Borhard et al., 1986]. Силу сокращений
19. За*. 227
225
левого предсердия морской свинки гистамин повышал через Г(-реценторы [Hattori etal., 1988].
На изолированных сосочковых мышцах кролика положительный инотропный эффект (ПИЭ) гистамина связан с возбуждением ^-рецепторов [Hattori et al., 1990]. На изолированном левом предсердии кролика повышение силы сердечных сокращений гистамином сопровождалось повышением уровня цАМФ и блокировалось циметидином, что характерно для возбуждения ^-рецепторов [Hattori et al., 1991 а]. Какие же типы гистаминовых рецепторов опосредуют положительный инотропный эффект гистамина у морских свинок и кроликов? ПИЭ гистамина у свинок блокировался циметидином, а у кроликов — мепирамипом. Следовательно, ПИЭ гистамина у свинок опосредуется Г2-, а у кроликов ^-рецепторами. Одиако в случае блокады Г2-рецепторов у свинок гистамин усиливал силу сердечных сокращений через Г,-рецепторы, а у кроликов — через Г2-рецепторы в случае блокады Г,-рецепторов.
Таким образом, в ПИЭ гистамина вовлечены больше [^-рецепторы у кроликов и Г2- у свинок. Их активация подавляет вовлечение других рецепторов. Видовые различия обусловлены различиями не в плотности рецепторов, а в количестве аденилатциклазы [Hattori, 1994].
У крыс и кошек ПИЭ гистамина связан с выделением катехоламинов [Neil, 1981]. Гистамин вызывает высвобождение 3Н-нор-адрецалица из правого предсердия кошки, предварительно проинкубированного с 3Н-порадреналином посредством экзоцито-за из окончаний сердечного симпатического нерва [Balfagon et al., 1985]. На изолированном сердце собаки усиление сердечных сокращений, вызванное гистамином (0,1 — 100 иг), также подавлялось р-адреноблокаторами, по ие антагонистами Г- и Г2-реценторов [Vidvio, Priola, 1990].
На изолировашгых эпикардиальных коронарных сосудах собак гистамин в низких концентрациях расширял, в больших вначале сужал, затем расширял коронарные сосуды. В аналогичных условиях агонист Г,- рецепторов 2-пиридил-этиламин в низких концентрациях только сужал, в больших вначале расширял, а затем сужал коронарные артерии, Агонист Г2-рецепторов диманрит только расширял сосуды. Эпикардиальные коронарные сосуды собак содержат Г,- и Г2-рецепторы, которые опосредуют коро-наросуживающий и коронарорасширяющий, соответственно, эффекты гистамина (Nakane, Chiba, 1987). Расширение коронарных
226
сосудов большими концентрациями агонистов rt- рецепторов, ио-видимому, опосредовано выделением эндотелиального релаксирующего фактора (Malinowska et al., 1992). Сужение коронарных артерий большими концентрациями Г2-агонистов обусловлено их тирамииоподобиым действием и выделением норадреналина.
Коронарный кровоток в субэндокардиальной области миокарда собак усиливался при активации как Г2-, так и Г -рецепторов, В эндокардиальных коронарных сосудах Г -рецепторы опосредуют коронарорасширяющий эффект гистамина (Christensen, Gross, 1983).
В изолированном сердце кролика гистамин сужал коронарные сосуды через Г,- рецепторы, так как антагонисты Гррецепторов мепирамин и хлорфенирамин устраняли действие гистамина (Corruzi etal., 1987). Таким образом, у животных гистамин через ^-рецепторы расширяет, а через -рецепторы сужает или расширяет коронарные сосуды.
У человека гистамин индуцирует спазм крупных коронарных артерий и релаксацию артерий малого калибра. Сосудосуживающее действие гистамина проявляется в ишемическом смещении сегмента ST па ЭКГ, увеличением скорости продукции миокардом молочной кислоты. Антагонисты Г,-рецепторов предупреждают коронароспазм. Расширение артерий малого калибра обусловлено активацией Г2-рецепторов [Cabanic, Jogfraing, 1988].
Г2-рецепторы опосредуют сосудорасширяющее действие гистамина путем повышения внутриклеточного уровня цАМФ в гладкомышечных и эндотелиальных клетках сосудов [Hekiman et al., 1992]. Сокращение сосудов, опосредованное ^-рецепторами, обусловлено повышением уровня внутриклеточного Са2+. Концентрация Са2+ в цитозоле под влиянием гистамина повышается двухфазно. Пиковый компонент этой реакции связан с высвобождением Са2+ из внутриклеточных депо, а фаза плато — с поступлением Са2+ извне, открытие Са2+ каналов связано с повышением уровня инозитолфосфата [Matsumoto et al., 1989].
В норме роль гистаминовых рецепторов в регуляции деятельности сердца и сосудов недостаточно ясна. Блокада ^-рецепторов фамотидином у здоровых испытуемых не изменяла АД, процент фракционного сокращения левого желудочка, круговое напряжение стенки в конце систолы, объемный ударный индекс, сердечный индекс, общее сосудистое сопротивление. Предполагают, ‘ЧТО у людей состояние основного левожелудочкового сокращения де зависит от Г,-медиаторных механизмов гистамина [Borow et al., 1992].
- Роль Г3-реценторов в норме также не известна. Стимуляция £ _
симпатических нервов лишь в 1,5 раза увеличивает выделение гистамина в сердце, но этого недостаточно для стимуляции Г3-рецепторов.
При ишемии выделение норадреналина возрастает и сопровождается увеличением выделения гистамина в 3,5 раза. В этих условиях Г3-рецеиторы могут быть активированы эидогелшым гистамином и играть важную роль в отрицательной регуляции выделения норадреналина [Imamuга et aL, 1994; Konstadt et al.,1995].
Если в норме содержание гистамина в плазме крови у мужчин 7,0, а у женщин 8,1 мкг на 100 мл крови, то при инфаркте миокарда оно достигает у мужчин 12,2, а у женщин 12,7 мкг/100 мл. При наличии аритмий уровень гистамина повышается до 16,1 мкг/100 мл крови [Rai et al., 1976]. Максимальный уровень содержания гистамина в крови наблюдается через 24 часа после начала болей [Zaca et al., 1986].
В высвобождении гистамина из сердца при ишемии участвуют радикалы кислорода. Перфузия изолированного сердца морской свинки раствором, содержащим FeCl2 и АДФ, заметно усиливала выделение гистамина, а добавление N-третбутнл-а-фенилнитропа, связывающего свободные радикалы, уменьшало высвобождение гистамина [Masini et al., 1988].
Выделение гистамина сердцем повышается как в фазе ишемии, так и реперфузии [Valen et al., 1994]. За повреждение миокарда при ишемии — реперфузии, по-видимому, ответственны Г,-рецепторы, так как антагонист Г,-рецепторов фени-стил значительно уменьшал его [Dzierzkowska et al., 1994].
Освобождение гистамина из сердечной мышцы участвует в генезе ранней желудочковой аритмии во время острой ишемии миокарда [Dai, 1987].
На перфузируемом по Лангендорфу сердце гистамин, связываясь с Г,-рецепторам и, индуцировал появление нового высокочастотного экстрасистолического фокуса. Циметидин блокировал эффекты гистамина [Lewi, Zavecz, 1979]. Гистамин (10й М) индуцировал также спонтанную активность препаратов волокон Пуркинье. Действие гистамина усиливалось после обработки волокон барием и строфантином. Укорачивалось время появления спонтанного потенциала действия, и при некоторых концентрациях гистамина увеличивалась амплитуда барий- и стро-фантин-ин Аудированных осцилляторных ностпотенциалов, свидетельствующих о перегрузке клеток Са2+ . Таким образом, гистамин вызывает аритмии через Г2-рецепторы под влиянием кальциевой перегрузки [Cerbai et al,, 1990]. Антагонист Г2-репенто-
228
рои циметидин у анестезированных крыс (120 мг в/в ) увеличивал аритмогенную и летальную дозу аконитина, уменьшал частоту возникновения фибрилляции желудочков и гибель крыс, которым вводили СаС12, устранял аритмии, вызванные окклюзией коронарной артерий. У кроликов он задерживал возникновение и укорачивал длительность адреналиновой аритмии, у морских свинок увеличивал дозы строфантина G, вызывающие желудочковые экстрасистолы и гибель животных [Fu Shao-kuan Li Yun-shan, 1983].
He только Г,-, но и Г,-рецепторы участвуют в реализации арит-могешюго действия гистамина. Аритмии, вызванные гистамином, на изолированном сердце морской свинки устранялись Г(- и Г2-апта-гопистами. Увеличение нормального синусового автоматизма и индукция патологического автоматизма устранялось ^-антагонистами, а триггерные аритмии и замедление атриовентрикулярной проводимости — Г)- и Г,-антагонистами [Levi et al., 1982]. Гистамин, 2(2-тиазолип-этиламин) — агонист Г,-рецепторов, импромидин -агоиист Г,-рецепторов снижали порог желудочковой фибрилляции сердца морской свинки. Влияние гистамина па порог желудочковой фибрилляции зависел, в основном, от действия на Г,-рецепторы, так как ЕС^ для тиазолин-этиламина составил 53,9 нМ, а для имнромидина —318 иМ [Trzeciakowski, Levi, 1982]. Фенкарол, блока-top Г(-рецепторов, обладал купирующим действием на моделях хлор-кальциевой, адреналовой и сгрофанпяювой аритмии [Яковлев и до., 1991].
Гипертрофия миокарда приводит к десенситизации [/адренорецепторов и сенситизации Г2-реценторов [Luo Wu Sheng, Guo Zhao-Gini, 1989]. При застойной сердечной недостаточности количество ^-адренорецепторов также понижается, а Г2-рецепторов сохраняется. Первый клинический агонист Г2-рецепторов импромидин был эффективен при застойной сердечной недостаточности, но обладал аритмогенным действием. Фенилциридиналкилкванидишя — арпро-мидип, ВИ-Е-50 и дифторированпые аналоги ВИ-Е-75 и ВИ-Е-76 — сильные Г2-агонисты с дополнительным Г,-блокирующим действием за счет подобной фенирамину части молекулы. Они обладают положительным инотропным и меньшим хронотропным и арит-могеппым действием, чем импромидин. В отношении увеличения ! dp/dt, минутного объема, повышения АД соединения располага- лись таким образом: ВИ-Е-76 > ВИ-Е-75 > арпромидин > имцро-мидин [Morsdorf et al., 1989; Maus Chrirtoph, 1990; Felix et al., ! 1991],
Положительный инотропный эффект арпромидииа на изоли-i рованном сердце морской свинки в 100 раз выше, чем у гистамина. Соединения, дифторироваиные в положении 3,4-(ВИ-Е-75) * 229
или в положении 3,4-(ВИ-Е-76), или хлорированные в 3,4 положе-нии (ВИ-Е-64) до 160 раз активнее гистамина [Buschauer, Baumann, 1991]. Новое производное триазола—амтемин вызывает положительный инотропный эффект, близкий по силе к гистамину [Poli etal., 1994].
При аутоиммунном миокардите у крыс и мышей гистамин оказывает положительное инотропное действие па сердце, опосредованное ^-рецепторами, хотя в норме гистамин у крыс и мышей вызывает отрицательный инотропный эффект через ^-рецепторы. В сердце нормальных мышей не определяются насыщаемые участки связывания антагониста [3Н ]-меиирамица, а при аутоиммунном миокардите выявляются два участка связывания лиганда. По-видимому, в миокарде контрольных крыс присутствуют только Г3-рецецторы, а в аутоиммунном сердце Г; и Г2-рецепторы [Goren et al., 1994].
Таким образом, гистаминовые рецепторы сердца вовлечены в патогенез аритмий, миокардитов, инфаркта миокарда, гипертрофии сердца. С позиции рациональной фармакотерапии в схемы лечения заболеваний сердца необходимо включать гистамииер-гические средства. Однако недостаточная изученность биохимических и физиологических свойств гистаминовых рецепторов сердца, а также молекулярных механизмов их функционирования не позволяет это делать с достаточной эффективностью.
Дальнейшие исследования в этом направлении позволят широко использовать гистаминергические средства в качестве кар-диотроппых.
Гистамин и его Г - и Г2-агонисты вызывают уменьшение артериального давления у большинства животных и человека [Powell I., Brody М., 1976; Hirshowitz В., 1979]. У кошек и собак Г - и Г2-антагонисты ингибируют снижение артериального давления, вызываемое гистамином [Powell J., Brody М., 1974;Black J.H. et al., 1975]. В то же время у телят депрессивный эффект гистамина частично подавляется мепирамином и потенцируется буримамидом [Eyre Р,, Wells P.W., 1973]. Локальная аппликация гистамина обычно сопровождается вазодилатацией; это справедливо в отношении сосудов кожи, скелетных мышц, желудочно-кишечного тракта и др. [Eyre Р., 1979]. Однако сосуды легких под воздействием гистамина либо расширяются, либо сужаются. Сосудосуживающий эффект гистамина подавляется ^-антагонистами или переходит под их воздействием в сосудорасширяющий эффект, который в свою очередь блокируется ^-антагонистами [Okpako D.T., 1973].
230
В капиллярах кожи людей выявлены Г(- и Г2-рецепторы [Greaves М. et al., 1977]. Вследствие этого Г,- или Г2-антагонисты, применяемые в отдельности, слабее подавляют развитие воспалительной реакции кожи, обусловленной гистамином, чем при их совместном введении. У цыплят Г,- и Г,-рецепторы опосредуют сосудорасширяющее действие гистамина [ Chand N., Eyre Р., 1976]. У кроликов, морских свинок и лошадей вазомоторный эффект гистамина имеет две фазы. Вначале наступает гипертензия, блокируемая ^-антагонистами, затем развивается гипотензия, подавляемая Г2-антагонистами [Carrol P.R., 1974; Hirshowitz В.,Waldo А., 1977]. Следовательно, у этих животных сосудосуживающее действие гистамина обусловлено -рецепторами, а сосудорасширяющее — Г2-рецепторами.
4.2.4. Гистаминовые рецепторы бронхов
В характере действия гистамина на бронхи существуют значительные видовые различия.
Гистамин вызывает сокращение неисчерченных мышц бронхов у человека, морской свинки, кроликов, свиней, телят, лошадей, цыплят [Chand W., Eyre Р., 1975] посредством взаимодействия с Г,-рецепторами. В то же время у кошек и овец гистамин расширяет бронхи, у первых связываясь с Г^, а у вторых — с Гг-рецепторами.
У человека, лошади и морских свинок вызываемое ^-антагонистами расслабление мышц бронхов блокируется Г2-антагонистами [Chand W„ Eyre Р., 1978; Окрако D.T. et al,, 1978], по у других видов (кошки, крысы, кролики) релаксация бронхов, индуцируемая Г2-агонистами, не ингибируется Г2-антагопистами, что дает возможность предполагать существование в дыхательных путях подтипов Г2-реценторов [Chand W., Eyre Р., 1977].
4.2.5. Гистаминовые рецепторы неисчерченных мышц желудочно- кишечного тракта
Стимуляция гистамином сокращений желудка у крыс и подвздошной кишки у морских свинок опосредуется ^-рецепторами [Black J.H., 1972]. По данным L.A. Barker (1981), увеличение гистамином фазической фазы и уменьшение тонической фазы изометрического сокращения подвздошной кишки у морских свинок опосредованы Г,-рецепторами.
4.2.6. Гистаминовые рецепторы секреторных клеток желудочно-кишечного тракта
Введегшый извне гистамин стимулирует функцию всех пищеварительных желез — слюнных, желудочных, поджелудочной и уси-
231
лнвает отделение желчн. Но наиболее сильно и специфично гистамин увеличивает продукцию НС1 париетальными клетками желудка. Г2-Ацтаголисты ингибируют стимулируемую гистамином кислотную секрецию в изолированных желудках собак, кошек, крыс, мышей, морских свинок и лягушек [Impicciatore М. et al., 1977; Persons М.Е., 1977]. Эти данные подтверждают ранее сделанное предположение J.H.Black (1972), что париетальные клетки желудка имеют Г2-рецепторы.
При изучении действия антагониста Г2-рецепторов ранитидина на ультраструктуру париетальных клеток собаки не было выявлено никаких токсических эффектов этого вещества и морфологических изменений при введении его даже в высоких дозах 225 — 450 мг/кг в 1 сут. в течение года. В то же время введение ранитидина в дозе 30 мг/кг в 1 сут. сопровождалось ингибированием секреции НС1 париетальными клетками [Ainge G., Poynter D,, 1982]. Схематично секреторный цикл париетальных клеток и влияние на него ранитидина представлен на рис. 44.
Еще одним подтверждением участия Г2-рецепторов в кислотной секреции желудка и, следовательно, в патогенезе гастродуоденальных заболеваний являются данные P.Del Soidato и соавт. (1982), которые показали, что циметидин и ранитидин, по не Г^антагопи-сты, дозозависимым образом ингибируют способность димаприта вызывать язву желудка у крыс.
В опытах на собаках и кошках G.Durant и соавт. (1977) продемонстрировали, что активация ^-рецепторов желудка приводит к ингибированию секреции НС1. По данным M.Impricciatore и соавт. (1978), антагонисты и агонисты Г(-рецепторов не влияют па кислотную секрецию изолированного препарата фундальной части желудка морской свинки, по вызывают сильную реакцию при воздействии агонистов или антагонистов Г2-реценторов. По-видимому, действие на желудочную секрецию, опосредуемое через Г,-рецепторы, может быть воспроизведено только на целом желудке с сохраненным кровоснабжением. Изучая механизм, посредством которого Г(-реценторы вовлечены в ингибирование кислотной секреции, К.Т.Bunge и М.Е.Parson (1978) пришли к выводу, что стимуляция Г(-рецепторов можег приводить к высвобождению катехоламинов, которые ингибируют секрецию, взаимодействуя с бета-адренорецепторами. L.Stanavnik и F.Erjavec (1983) показали,
232
Рис. 44. Секреторный цикл париетальной клетки [Ainge G., Poynter D., 1982].
А — париетальная клетка в состоянии покоя характеризуется большим числом цитоплазматических тубуловезикул (Т) и небольшим числом секреторных протоков (П). Б — клетка в активном секретирующем состоянии с небольшим числом тубуловезикул и увеличенньтми секреторными протоками. В — клетка в постсскрсторном состоянии со спавшимися протоками и началом восстановления тубуловезикул.
что Г,-антагонисты ингибируют секрецию слюны подчелюстной железой кошек. Буримамид не влиял па индукцию карбахолом секреции этой железы, что указывает па отсутствие высвобождения гистамина при холинергической стимуляции. На основании полученных результатов авторы предложили возможную схему регуляции гистамином секреции слюны (рис. 45). При электрической Стимуляции барабанной струны нейромедиатор, выделяемый из не-холипергнческих нервных окончаний, входящих в состав барабанной струны, вызывает высвобождение гистамина из тканевых базофилов. Этот гистамин действует непосредственно на секреторные клетки, увеличивая секрецию на нресинаптические рецепторы, локализованные па холинергических нервных окончаниях, модулируя высвобождение ацетилхолина, и на мышцы сосудов, уменьшая кровоток.
233
Chord* thympMf
Рис. 45. Участие гистамина в регуляции секреции слюны [Stanovnik L., Erjavec F., 1983].
Пресинаптические Г- и Га-рецепторы выявлены T.N.Shimizu (1980) и Z.C.Ercon, R.Turerer (1981). Гистаминовые рецепторы па секреторных клетках относятся к Г.,-типу, а на сосудистых клетках к Г - и Г2-тину.
4.2.7. Гистаминовые рецепторы мочевого пузыря
O.P.Khanna и соавт. (1977) не обнаружили влияния агонистов или антагонистов ^-рецепторов на мочевой пузырь морских свинок, который сокращался при стимуляции Г-рецепторов.
G.Bertraccini и соавт. (1983) обнаружили, что Г(-агонист 2-аминоэтилтиазол, по не Г2-агонцсты димаприт и импромидин, дозозависимым образом вызывает сокращения изолированных кусочков мочевого пузыря человека. Если Г(-аптагонисты подавляли данный эффект Г(-агонистов, то Г2-антагонисты циметидин, ме-тиамид н тиотидин потенцировали эффект гистамина в 3 раза. Как Г,-, так и Г2-антагоиисты пе влияли на исходную двигательную активность мочевого пузыря. Эти результаты позволяют считать, что Г(-реценторы превалируют в мышцах мочевого пузыря человека, а Г2-реценторы, присутствующие в небольшом числе, опосре
234
дуют релаксацию этих мышц. Отметим, что аналогичное соотношение между функцией и числом Г - и Г2-рецепторов имеет место также в неисчерчепных мышцах дыхательной системы и желудочно-кишечного тракта.
4.2.8. Гистаминовые рецепторы желчного пузыря
D. Woldman и соаэт. (1977) показали, что активация гистамином Г}-реценторов сопровождается сокращением желчного пузыря, а при возбуждении Г2-рецепторов имеет место его расслабление. Аналогичные результаты были получены M.Impiccatore (1978) на желчном пузыре морской свинки in situ.
4,2.9. Гистаминовые рецепторы матки
Согласно данным J.H.Black (1972), мышечнав оболочка матки содержит Гг-рецеиторы, через которые реализуется способность гистамина ингибировать сокращения, стимулируемые электрическим током или ацетилхолином. При анализе влияния Г2-алтагопистов па изолировавшую матку крыс E.Kubio и соавт. (1982) обнаружили, что циметидин и метиамид, по пе ранитидин, кроме их прямого действия на Г2-рецепторы, обладают непрямым симпатомиметическим эффектом. Поскольку Г2-антагонисты, за исключением ранитидина, высвобождают катехоламины из адренергических нервных окончаний матки — органа с высокой чувствительностью к норадреналину, данный непрямой эффект Г2-антагопистов необходимо учитывать при характеристике рецепторов, вовлеченных в ответ изолированной матки к гистамину.
4.2.10. Гистаминовые рецепторы эндокринной системы
В настоящее время имеются сведения о том, что гистамин принимает участие в секреции пролактина [Carlson Н.Е., Ippolity A.F., 1977; Bohnet H.G. etal., 1978; Knigge U. et al., 1981], лютеинизирующего гормона [Libertun C., McCann S.M., 1976], вазопрессина [Dogertom J. et al., 1976], тиреотропного гормона [May P. etal., 1976], соматотропного гормона [Pontiroli A.E. etal., 1976], тироксина [Onaya T. et al., 1977] и других гормонов. Г^Агояисты и Г2-антагонисты усиливают секрецию гипофизарных гормонов — вазопрессина, АКТЕ, пролактина, а -антагонисты и ^-агонисты ослабляют ее [Libertan С., McCann S., 1976; Ruddf С. et al., 1979]. P.Devoto и соавт. (1980) изучили характер связывания Г2-аптагоциста циметидина, являющегося высвободителем пролактина у человека [Caldann К. et al., 1979], с мембранами передней доли гипофиза крыс. Параметры связывания цимети
235
дина с этими мембранами были таковы: Кд составляла 40,3 пМ, а максимальное число связывающих участков — 1,94 нмоль/мг белка. Предполагается, что высвобождение пролактина под воздействием циметидина обусловлено непосредственным взаимодействием последнего с Г2-реценторами передней доли гипофиза.
При стрессе Г(-агонист 2-пнридилэтиламип и Г2-агонисты 4-метилгистамип и димаприт увеличивают ответ системы гипофиз — надпочечники, оцениваемой но повышению концентрации кортикостерона в сыворотке крови у крыс [Bugajski J., Gadek А., 1983]. Данное повышение уровня кортикостерона в ответ ла введение 2-пирилэтиламина. блокировалось менирамилом или хлориирамипом, а в ответ на введение 4-метилгистамина и димацрита — метиамидоми циметидином. Следовательно, влияние гистамина па секрецию кортикостерона у крыс в состоянии стресса опосредовало как Г,-, так и Гурецепторами.
Изучая механизм регуляции гистамином секреции АКТГ, B.Allolio и соавт. (1983) показали, что внутривенное введение людям Fj-антагониста меклазнпа значительно ингибирует увеличение концентрации АКТГ и кортизола в крови, по не соматотропного гормона и пролактина, вызываемое гипогликемией. Меклазип после перорального введения также уменьшал секрецию АКТГ в ответ на уменьшение уровня кортизола при ингибировании его биосинтеза метирапоном. Эти результаты дают возможность предполагать, что гистамин, действуя на Г,-рецепторы, стимулирует высвобождение кортикотропип-рилизинг-фактора, который, в свою очередь, повышает секрецию АКТГ.
По данным Т.Опауа и соавт. (1977), в мембранах фолликулярных клеток щитовидной железы имеются сопряженные с адепи-латциклазнон системой Г2-рецепторы, опосредующие способность гистамина стимулировать секрецию тироксина.
V.Schasdziarra и соавт. (1982), а также P.Linnestoad и соавт (1983) полагают, что гистаминовые рецепторы вовлечены в регуляцию эндокринной функции поджелудочной железы. Например, у собак высвобождение полипептида поджелудочной железы, вызываемое приемом нищи, опосредовано как Г,-, так и Г,-рецепторами [Linnestoad Р. etal., 1983].
По нашему мнению, дальнейшее изучение роли гистаминовых рецепторов в регуляции функций эндокринной системы поможет найти новые пути их коррекции.
4.2.11. Гистаминовые рецептары и иммунные реакции
Как известно, лейкоциты и тканевые базофилы, наряду с рецепторами для инсулина, катехоламинов и простагландинов,
236
содержат гистаминовые рецепторы [Eyre Р., 1979].
В экспериментах на культурах тканевых базофилов и лейкоцитов H.R,Bourne исоавт. (1971) обнаружили,что добавление гистамина в окружающую среду приводит к повышению содержания в них цАМФ и к уменьшению высвобождения из них гистамина в процессе иммунной реакции с антигеном. Добавление в среду Г,-антагопистов в отличие от ^-антагонистов блокировало данное действие гистамина на высвобождение его в ответ на развитие иммунной реакции [Lichtenstein L.M. etal., 1973]. Таким образом, гистамин, взаимодействуя с Г2-рецепторами тканевых базофилов ио механизму обратной связи может тормозить дальнейшую дегрануляцию клеток, его депонирующих. На основании этих результатов L.M.Lichtenstein и соавт. (1973) сформулирована гипотеза о двойствешюй роли гистамина в иммуповосиалительных реакциях: с одной стороны, гистамин, увеличивая проницаемость капилляров, усиливает воспаление, но с другой, при повышении его содержания в среде, он через Г2-рецепторы тканевых базофилов и лейкоцитов повышает содержание цАМФ в них и тем самым ингибирует процесс своего высвобождения.
Гистамин также влияет па Г2- рецепторы лимфоцитов [Plaut М. et al., 1975]. Обнаружено, что гистамин ингибирует цитолитическое действие Т-лимфоцитов мышей. Данный эффект гистамина был опосредован цАМФ и полностью блокировался ^-антагонистами буримамиДом и четиамидом.
Связываясь с Г2-реце. порами, гистамин ингибировал хемотаксис эозинофилов [Clark R.A. et al., 1977] и базофилов [Sett-Broun М., Leonard Е., 1977].
Следовательно, гистамин, который высвобождается во время развития анафилактических реакций, может влиять на выраженность последующих реакций иммунного ответа организма, взаимодействуя с Г2-реценторами клеток, принимающих участие в этом ответе.
Таким образом, представленные результаты фармакологического анализа гетерогенности и функции гистаминовых рецепторов подчеркивают их широкое распространение в различных органах и тканях млекопитающих.
Каждый год публикуются новые данные об открытии гистаминовых рецепторов ранее неизвестной локализации. Еще нет уверенности, что в настоящее время мы имеем полное представление о распределении гистаминовых рецепторов в организме и их функции. Тем не менее, мы считаем целесообразным имеющиеся данные по этому вопросу обобщить в табл. 10.
237
Таблица 10
Локализация Г(- и Г2-рецепторов и их функция
Локализация Тип рецепторов Эффект гистамина
Матка г, Расслабление
Бронхи Г, (превалируют) Сужение бронхов
Г2 (пебцдьшое число) Расширение бронхов
Артерии:
крупные Г, Сокращение
мелкие Сердце ri иГ1 Расслабление Положительный хронотропный
Г! и инотропный эффект (желудочки)
Г Положительный инотропный эффект (предсердия) и
и
замедление атриовентрикулярной проводи мости
и Г и Г Увеличение коронарного
кровотока
Тканевые базофилы .базофиль* itbic лейкоциты Гг Регуляция высвобождения гистам[uta по обратной связи
Тромбоциты Ингибирование секреции серотонина
Эозинофилы Ингибирование хемотаксиса
Лимфоциты И нгиби ронание цитолитического эффекта
Мочевой пузырь Г, (превалируют) Сокращение
Гг (небольшое число) Расслабление
Желчный пузырь Г! Сокращение
г3 Расслабление
Желудок Г, Сокращение
Поездou iлая кишка Г, (превалируют)
Гг (небольшое число) Расслабление
Париетальные клетки желудка г, Стимуляция секреции НС1
Секреторные клетки слюнных желез Стимуляция секреции слюпы
Клетки поджелудочной железы Г, иГ2 Стимуляция секреции панкреатического полипептида
Окончания Г Ингибирование высвобождения
симпатических нервов 1 2 катехоламинов
ЦНС Седативный эффект,
г, гликогенолиз, тахикардия ( гипертония
Г, и Гг Рвотный эффект
1. г Ингибирование электрической
2 активности нейронов коры
Гипофиз г Стимуляция секреции вазопрессина, АКТ Г,
пролактина
238
Следует отметить, что роль гистаминовых рецепторов в регуляции функции того или иного органа не одинакова. В соответствии с эффективностью и Гуантагонистов можно считать, что Г -рецепторы в основном локализованы в бронхах, подвздошной кишке и ЦНС, а Г2-реценторы — в слизистой оболочке желудка.
4.3. Молекулярные механизмы взаимодействия гистамина и его аналогов
с гистаминовыми рецепторами
Молекула гистамина имеет неравноценные атомы азота, которые различаются между собой величиной заряда. Эти атомы азота попеременно могут заряжаться положительно, образуя катионные головки. В молекуле гистамина выделяются две группы с основными свойствами: первая группа — алифатический амин с выраженными основными свойствами; вторая группа образована двумя атомами азота имидазольного кольца, которые функционируют как единая группа за счет резонанса.
В физиологических условиях молекула гистамина вследствие резонанса может существовать в трех формах III).
Согласно биохимической номенклатуре, атом азота имидазольного кольца гистамина, прилежащий к боковой цепи, обозначается как pros-атом азота (№), или пиридиновый, а противолежащий — как tel-атом азота (№), или пиррольный.
Предполагается, что только в первой форме гистамин способен связываться с рецепторами [Ganellini C.R. et al., 1979]. Поскольку различные заместители при атомах азота имидазольного кольца приводят к потере у производных гистамина активности по отпо-
239
шепию к рецепторам [Jonss R., 1966], можно считать, что водородные связи участвуют в комнлексировании гистамина с его рецепторами. Применение кваитово-механических методов расчета для изучения электронной структуры гистамина [Durant J. et al., 1975; Wenstein H. et al., 1976] позволило установить, что все атомы азота гистамина способны образовывать водородные связи (внутри- и межмолекулярцые).
Считается, что для реализации действия молекулы гистамина на Г -рецептор достаточно образования одной водородной связи с прилежащим атомом азота гетероцикла [Durant J. et al., 1975]. Активность аналогов гистамина в отношении Г2-реценторов может обеспечиваться лишь при наличии в гетероцикле одновремешю двух атомов азота, которые фиксируются двумя водородными связями. По мнению J. Du rant и соавт. (1975), это необходимо для переноса протона из одного активного центра (А) Г,-рецеитора в другой (В).
Конформационный анализ, проведенный R.Pullman и J.Port (1974), показал, что боковая цепь молекулы гистамина может находиться в двух стабильных конформациях: гош- и транс-форме. Хотя гош-форма является энергетически более выгодной, при гидратации в водных растворах разность энергий двух конформеров
нивелируется и обе формы присутствуют примерно в равных соотношениях.
Таутомеры (а,б,в) гистамина представлены ниже.
Предполагается, что цис-таутомер (<6, равен 120°, 02 — 300°) комплементарен Г2-рецепторам, а транс-таутомер (0, равен 0°, 02 — 180°) — Tj-рецепторам (рис. 46).
Анализ зависимости действия аналогов гистамина от структуры различных заместителей в циклической части молекул позволил
\—О,5Т нм---
б,=О"; 02=180’
240
Рис, 46. Гипотетическая структура Г,- и Г,-рецепторов [Maslinski С., 19811.
предложить схему строения рецепторов гистамина [Кац М.Н., 1985], Как Гр так и Г2-рецепторы гистамина имеют центр, образующий водородную связь с аммонийной группой этилам ип пой цепи. Вещества с липофильным заместителем в положении 2 имидазольного кольца — агонисты Г,-, но не ^-рецепторов, а вещества с гидрофильным заместителем в этом положении — агонисты Г2-, ио не Г -рецепторов, В отличие от Г2-рецепторов ^-рецепторы содержат липофильный диполь, который принимает участие в образовании дополнительной связи с С-5 гетероцикла (рис. 47). В отношении Г,-рецепторов известно, чтоЫа+, гуаниновые нуклеотиды, такие, как ГТФ, ГДФ и ГМФ-ФЫФ, уменьшают способность гистамина, по не его антагонистов вытеснять 3Н-мепирамин из его связи с Г( -рецепторами [Chang R.S., Snyder S.H., 1980]. В то же время Mg2+ и Мп2* увеличивают сродство гистамина к Г(-рецепторам. Влияние ГТФ на связывание эН-гистамица с гистаминовыми рецепторами представлено на рис, 48.
Не вызывает сомнения, что наши знаштя о взаимодействии шс-тамина с его рецепторами значительно расширятся, когда будут изучены биохимические свойства самих рецепторных систем. В этой связи представляют интерес данные D.Cook и соавт. (1977), которые исследовали влияние температуры па функции гистаминовых рецепторов. В качестве рецепторной системы авторы использовали препарат продольного слоя мышечной оболочки подвздошной кишки морской свинки, который содержит типичную Г(-
И.3<« 227 241
е
рецепторную систему при 37° С, Обнаружено, что при уменьшении температуры с 37п до 15° С активность классических антагонистов Г(-рецепторов хлорфепира-мина и трипеленпамина снижается, но появляется способность у ^-антагониста метиамида блокировать действие гистамина, выражающееся в сокращении отрезка подвздошной кишки морской свинки. При 37° С 2-галоидалкиламипы, являющиеся необратимыми антагонистами Г( -рецы ito-ров, сдвигали кривую зависимости доза —эффект для гистамина и снижали максимальный ответ кишки па действие гистамина, а при 15° С они не вызывали сдвига этой кривой, по блокировали действие гистамина по неконкурентному типу. Согласно полученным результатам, сниже-цие температуры приводит к заметным изменениям свойств рецепторов гистамина, что оказывает сильное влияние на эффекты конкурентных и необратимых антагонистов гистамина, по не на активности самого гистамина. Авторы предполагают, что данная рецепторная система содержит, по крайней мере, один
Гидрофильная зона
Г?-рецептор
Рис, 48. Влияние П’Ф (100 мкМ) на связывание 3Н-гистамииа с рецепторами коры головного мозга крыс [Schuartz J, etal., 1980],
По осн абсцисс — концентрации 3Н -гистамина в молях; по оси ординат — концентрация связанного 3Н-гисгам ина (пмоль/гткани).
242
тип связывающих участков, который ответствен за действие антагонистов, но не самого гистамина и что температурные изменения могут каким-то образом влиять на избирательность некоторых участков рецептора. По-видимому, изменения свойств рецепторов отражают изменения структуры мембраны, происходящие при изменении температуры, как это имеет место в случае мембрапосвязац-ных ферментов.
* * *
Доказательства того, что Г,- и Г ..-рецепторы являются различными биомакромолекулами, впервые получили M.Osband и R.Caffry (1979), Авторы описали экстракцию и разделение Гу и (^-рецепторов мембран тимоцитов теленка. Методом ионообменной хроматографии им удалось отделить Гурецепторы от Гурецепторов, что указывает па их различные физические свойства, Выявлено, что молекулярная масса Г,-рецепторов равна 50 000, а Г2-рецепторов — 40 000. Предполагается, что молекулярная масса Гурецепторов равна 70 000.
« * «
По аналогии с адрено- и холинорецепторами гистаминовые рецепторы становятся меиее чувствительными к антагонистам при их длительном возбуждении (феномен десепситизации).
Согласно данным J.F.Taylor и Е,Richelson (1974), предварительная инкубация клеток нейробластомы мышц с гистамином снижает образование цГМФ при стимуляции Г,-рецепторов. Данная десенситизация Гурецепторов была специфична, обратима, сопряжена с уменьшением величины максимального образования цГМФ и вызывалась только агонистами. Скорость развития десенситиза-ции зависела от концентрации гистамина, а вот восстановление первоначальных свойств этих Гурецепторов не зависело от концентрации агониста.
При снижении чувствительности гистаминовых рецепторов подвздошной кишки морской свинки к агонистам наблюдается умень- шепие способности антагониста феноксибеизамина подавлять взаимодействие гистамина с данными рецепторами [Kenakin D., Cook D., 1980]. Этот факт свидетельствует об изменениях на рецепторном уровне, возможно, о конформационных перестройках рецепто-/ ров па фоне уменьшения чувствительности Гуреценторов к гистамину,
Этапы десепситизации и восстановления чувствительности гис-г тамшювых рецепторов можно представить следующим образом:
243
Гистамин + Рецептор j—► Гистамип-рецепторпый (чувствительный) комплекс (активный)
Гистамш i-рецепторный комплекс (неактивный)
1 г
--------------- Рецептор (нечувствительный)
Данными о влиянии Г,-агонистов па число и сродство Г(-рецепторов мы не располагаем. В то же время N.Subramanian и соавт. (1981) обнаружили, что введение крысам Г(-антагониста дифенгидрамина значительно повышает число участков, специфически связывающих 3Н-менирамиц. Следовательно, число гистаминовых рецепторов и их связывающие свойства могут изменяться при тех или иных воздействиях, что также необходимо учитывать при исследовании молекулярной природы их комплексообразования с лигандами.
В будущем применение новых физико-химических методов должно дополнить пока еще ограниченные знания о молекулярных механизмах взаимодействия гистамина и его аналогов с гистаминовыми рецепторами.
4.4. Биохимические эквиваленты гистаминовых рецепторов
4.4,1. Г ^рецепторы
Для изучения биохимических эффектов, обусловленных активацией ^-рецепторов, полезным оказалось использовать культуры нейрональных клеток. E.Richelson (1978) обнаружил, что в ответ на воздействие гистамина в клетках нейробластомы мыши (клоп N1E-115) происходит быстрое и транзиторное увеличение уровня цГМФ. Данная стимуляция образования цГМФ ингибировалась -антагонистами, но не Г2-антагонистами, что указывает на вовлечение ^-рецепторов в действие гистамина на образование цГМФ. Эффекты, связанные с активацией Г(-рецепторов, являются Са2+-зависимыми.
244
Индукция гистамином образования цГМФ в верхнем шейном ганглии быка также опосредована Г(-рецепторами [Study R.E., Greengard Р., 1978]. Возможно, дашюе увеличение уровня цГМФ связано с ностганглионарным возбуждением, выявленным JJ.Brimble и D.I.Wallis (1973).
Еще одним биохимическим изменением в клетках после активации Г'-реценторов является гидролиз гликогена в ЦНС [Quach Т.Т. et al., 1980]. Г(-рецепторы определяются по специфическому связыванию селективных антагонистов мепирамина и тринроли-дипа. В левом предсердии кролика [3Н]-менирамин связывался гистаминовыми рецепторами с К=3,8 нМ и Втах=96 фМ/мг белка [Hattori et al., 1991 а], в мембранной фракции желудочков и правого предсердия морской свинки — с Kd=4,35 нМ и 414,9 нМ соответственно [Bennardinl, 1984], а левого предсердия — с Kd=l,5±0,2 пМ, Вшах=307±2,7 фМ/мг белка [Hattori et al., 1991 Ь]. Двухвалентные катионы (Са, Mg, Мп, Si, Ва) обладали способностью увеличивать связывание [3Н]-мепирамина с Г,-рецепторами [Fukni et aL, 1989].
Эффекторной системой, сопряженной с Г(-рецепторами, является фосфолипаза С. Возбуждение Г -рецепторов через G / Go белки приводило к активации фосфолипазы С и распаду фосфатидилинозитола. Образовавшийся инозитолфосфат вызывал выход Са** из внутриклеточных депо и увеличивал поступление Са** в клетку извне [Johnson, 1982; Hattori, 1991 а]. Гистамин стимулировал накопление ицозитол-1-фосфата после начального скрытого периода. Уровень последнего повышался в 2 раза через 60 мин после введения гистамина [Daum, 1983]. Активация ^-рецепторов приводит к стимуляции синтетазы окиси азота (через кальций/кальмодулин-зависимый путь) и последующей активации растворимой гуанилатцикла-зы в различных типах клеток. Кроме того, эти рецепторы также : Опосредуют действие гистамина, приводящее к высвобождению арахидоновой кислоты и синтезу ее метаболитов - простациклина и тромбоксана А2. Хотя Г,-рецепторы не сопряжены с дденилатциклазой, они принимают участие в регуляции уровня цАМФ путем усиления активации этого фермента при стимуляции Г2-рецепторов, адепозиновых А2-рецепторов и рецеп-1уоров вазоактивного кишечного полипептида.
| Все Г -рецепторы состоят из 491 аминокислотного остатка, ио Е'|-рецепторы сердца, по-видимому, отличаются от таковых мозга. Е сердце домен Г -рецептора, связывающий лиганды, имеет молеку-
245
лярпую массу 68 к Да, в мозге — в пределах 56 — 59 к Да [Ruat et al., 1991].
Таким образом, в отношении Г,-рецепторов можно постулировать, что они сопряжены посредством G-белков с системами регуляции уровня цГМФ и Са2+, а также обмена фосфолипидов и гликогена.
4.4.2. Гурецепторы
По современным представлениям, Гурецепторы сопряжены с аде-нилатциклазой, и их стимуляция сопровождается накоплением цАМФ в клетках [Karppanen Н., 1980; Taylor J.E., 1982]. Это справедливо в отношении Г2-рецецторов париетальных клеток слизистой оболочки желудка [Simon В., Kather Н., 1977; Major J.S., Scholes Р., 1978; Sewing К. et al,, 1979; Batzri S., 1981], сердца [Verma S.C., McNeill J.G., 1976, 1978; Jonson C.L,, Mizoguchi H,, 1977], матки [Verma S.C., McNeill J.H., 1976] (хотя в матке не обнаружена гистамипчувствительиая аденилатциклаза, гистамин повышает внутриклеточную концентрацию цАМФ, а буримамид блокирует этот эффект), головного мозга [Kanof P.D., Greengard Р., 1978], жировых клеток [Grund V.R. etal., 1973,1975], мышц сосудов [Reinhardt D., 1977], лейкоцитов [Anderson R. et al., 1977; Busse W. W., Sosman J., 1977] и лимфоцитов [Roszkowski W, et al,, 1977].
Г2-рецецторы определяются по специфическому связыванию селективных антагонистов ранитидина и тиотидица [Авдонин, Ткачук, 1994]. [3Н]-тиотидин связывался с мембранами левого предсердия морской свинки с Kd-10,8±l,2 11М и Bmax=41±8 фМ/мг [Hattori et al., 1991]. В левом предсердии кролика места связывания [яН]-тиотидииа характеризовались Kd=14,7 пМ, Втах-126 фМ/мг белка. Еще один антагонист Гурецепторов [3Н]-циметн-дип связывался с мембранами мозга с Kd=15,7 11М, Bmax=276 фМ/мг белка [Subramanian et al., 1981].
Гурецепторы состоят из 359 аминокислотных остатков, имеют 7 трансмембранных доменов и сопряжены с G-белками [Авдонин, Ткачук, 1994].
В человеческом сердце, полученном при трансплантации у реципиентов, гистамин, зависимо от содержания Mg и ГТФ, повышал активность аденилатциклазы. Его действие подавлялось циметидином [Bristow, 1982]. Активность аденилатциклазы, стимулированной гистамином, подавлял и тиотидип [Trist et al., 1987]. Из этого следует, что Гурецепторы при помощи G-бслков сопряжены с адеиилатциклазон.
246
Гистамин может также повышать активность адеиилатциклазы путем метилирования фосфолипидов (Ozawa et al., 1987]. В присутствии донора метильных групп s-адепозил-а-метионипа гистамин стимулировал активность адеиилатциклазы. Этот эффект подавлялся ингибитором фосфолипидных метилтрансфераз 8-адено-зин-а-гомоцистеином, а также антагонистом Г2-реценторов циметидином. По мнению авторов, метилирование фосфолипидов гистамином усиливает сопряжение Г2-реценторов с адепилатциклазой [Ozawa, Segawa, 1988]. В правом предсердии морской свинки метилирование фосфолипидов может активировать аденилатциклазу так же эффективно, как и ГТФ-связывающие белки [Ozawa et al., 1991].
Было замечено, что гистамин активирует медленные Na+-Ca++ каналы возбудимой мембраны миокарда [Ворцовицкий и др., 1974], вызывая ускорение потенциала действия за счет ускорения реполяризации изолированных полосок желудка сердца морской свинки. Это объяснялось увеличением поступления Са4+ в клетку с последующим усилением выхода К* из клетки в фазе реполяризации [Ledda et al,, 1977]. Действительно, на изолированных перфузируемых миоцитах желудочков морской свинки гистамин увеличивал амплитуду Са++тока (1Са), а также выходищего К+тока. Действие гистамина было опосредовало цАМФ и зависело от активации адеиилатциклазы. Оно устранялось циметидином [Heschlcr, 1987]. Следовательно, увеличение тока К+ и Са++, вызываемого гистамином, опосредовано Г2-рецепторами, связанными с Gs-белками и адепилатциклазой [Tanaka et al., 1991],
Путем активации Са++ каналов гистамин индуцирует потенциал действия [Keeskeiniti, 1981]. На фрагментах ткани синоатриального и атриовентрикулярного узлов сердца морской свинки и кролика гистамин увеличивал частоту пейсмекерных потенциалов действия и уменьшал длительность потенциала действия, диастолический потенциал синоатриального узла обоих видов и атриовентрикулярного узла у свинок, вызывал в 40 % случаев аритмии. Эффект гистамина блокировался циметидином. Таким образом, положительный хронотропный и аритмо-гепиый эффекты гистамина опосредуются Г2-рецеиторами [Chapula, Alejandro, 1987; Hiroyasa, 1993].
Гурецепторы тесло взаимодействуют с адренорецепторами. Электрофизиологические следствия стимуляции Г2- и (5-адре-иорецепторов схожи [Nellie et al., 1978]. На изолированном правом предсердии морской свинки гистамин и норадреналин
247
вызывали увеличение ЧСС путем активации разных типов рецепторов. При совместном действии гистамин через Г,-рецепторы ослаблял эффекты норадреналина, сдвигая вправо кривую доза-эффект норадреналина [Giacomini, Reis, 1986]. Присутствие гистамина уменьшало сродство Р-адрепореценторов к лигандам [Takayanagi et al., 1989]. Присутствие норадреналина, в свою очередь, ослабляло действие гистамина на сердце, сдвигая кривую доза—эффект последнего вправо, Истощение запасов норадреналина предварительным введением резерпина, напротив, приводило к повышению чувствительности изолированного сердца морской свинки и папиллярных мышц крысы к гистамину. За гииерчувст-вителыюсть были ответственны Г2-рецепторы [Okazaki et al., 1994]. Таким образом, в сердце имеет место кооперативное взаимодействие ос,-адренергических и Г2-гистамшювых рецепторов.
Длительное воздействие антагонистов приводит к повышению сродства Г2-рецепторов к лигандам без изменения плотности рецепторов [Kramer, 1987].
Гистамин и ГТФ в отношении их влияния на активность аденилатциклазы желудочков сердца морских свинок являются синергистами [Johnson C.L., Mizoguchi Н., 1977]. Гистамин и гуанилимидодифосфат оказывают синергическое действие па аденилатциклазу париетальных клеток желудка крыс [Bearer C.F. etal., 1981].
Увеличение уровня цАМФ, следуемое за стимуляцией Г2-рецецторов, приводит к запуску цепи биохимических реакций, реализующих специфическую физиологическую реакцию того или иного типа клеток.
Связывание ^Н-гистамина с Г2-реценторами мембран слизистой оболочки желудка морских свинок хорошо коррелирует со способностью гистамина увеличивать содержание цАМФ в клетках слизистой оболочки желудка и стимулировать секрецию НС1 обкладочными клетками [Batzri S., 1981].
C.F.Bearer и соавт. (1981) показали, что гистамин, взаимодействуя с Га-реценторами париетальных клеток желудка крысы, стимулирует аденилатциклазу. Синергистом этого эффекта гистамина был гуанилимидодифосфат. Важно отметить, что состояние, в которое переводили гистамин и гуанилимидодифосфат аденилатциклазу (активность фермента превышала первоначальную в 15 раз) после предварительной инкубации с ними клеток, не обращалось циметидином или ГТФ. Считается, что повышение уровня цАМФ в париетальных клетках желудка активирует карбоангидразу, которая катализирует образование
248
Рис. 49, Взаимосвязь гистамина (Г) с Гурецепторами (Г2 —Р), с адецнлатциклазпой системой (АЦ) и функцией париетальной клетки желудка морской свинки [DonsaT., CodeC. F,, 1973].
свободных Cl' и Н+ и тем самым стимулирует продукцию НС1 (рис. 49) [Donsa Т,, Code C.F., 1973]. Для других клеток, воспринимающих молекулярные сигналы от гистамина посредством Г2-рецепторов, даже гипотетических схем трансформации этого сигнала в физиологическую реакцию пока пет.
4.4.3. Гурецепторы
Гистаминовые Г3-рецепторы находятся на цостгапглиоцарных симпатических нервных окончаниях, иннервирующих сердце и сосуды. Их активация угнетает выделение норадреналина [Luo et al., 1991]; селективными лигандами Гурецепторов являются R (а)-метилгистамии (агонист) и тиоперамнд (антагонист) [Barocelli et al., 1993]. [:,Н]-метилгистамин связывался с мембранами мозга морской свинки с Kt=0,4 нМ, Втах=41фМ/мг белка [Korte et al., 1990]. Гурецепторы тесно взаимосвязаны с сс,-адренорецепторами. На срезах стриатума было показано, что активация ССуадреноре-цепторов уменьшает Гурецепторпое ингибирование высвобождения норадреналина и адреналина и наоборот [Zummen, Schlicker, 1991; Schlicker, 1994].
Активация периферических Гурецепторов и торможение выделения норадреналина блокируют адренергический инотропный ответ в предсердии морских свинок. Так, агонист Гурецепторов R (а)-метилгистамип (10 |0—103 М) вызывал ингибирование сократительного ответа изолированного ушка предсердия морской
249
свинки на электрическую стимуляцию симпатического нерва, ио j ie изменял сокращения, вызванного экзогенным норадреналином [Luo et al., 1991; Masahiro et a]., 1992], Отрицательный инотропный и хронотрош1ый эффекты R (а)-метнлгистамииа па изолированном предсердии морской свинки ослаблялись коклюшным токсином и усиливались блокатором Са** каналов N-тина омега-коцотоксином. Таким образом, Г3-реценторы, локализованные в окончаниях сердечного симпатического нерва и модулирующие высвобождение норадреналина, сопряжены с G1/G|) белками и снижают проводимость Са*+ каналов [Endou et aL, 1994; Konstadt et al., 1994]. Эксперименты на препаратах тканей головного мозга также показали сопряженность Г3-рецепторов с G-белками,
Г3- рецепторы имеют видовые отличия. Так, агонист Г .^рецепторов R (а)-метилгистамип у свинок снижал АД и уменьшал ЧСС, у кроликов — снижал АД, по повышал ЧСС, на крыс — не влиял [Me Leod, 1994],
Таким образом, хотя мы пе располагаем достаточным количеством данных о механизмах функционирования Г3-рецеиторов, есть все основания считать, что они относятся к семейству рецепторов, сопряженных с G-белками.
4.5. Гистаминовые рецепторы — мишень действия ЛВ
Исследование нейрохимических и патофизиологических механизмов функционирования гистаминовых рецепторов позволило приблизиться к пониманию молекулярных механизмов действия широко применяемых в клинической практике антигистаминных средств. В данном разделе мы рассмотрим некоторые аспекты молекулярных основ использования этих средств для лечения различных заболеваний.
Г ^антагонисты,
Большинство Г-антагонистов имеют сходную фармакологическую активность, обусловленную блокадой Г,-рецепторов. Среди этих препаратов выделяют средства первого поколения: этанола-мипы (карбшюксамипа малеат, клемастатина фумарат, дифеш идра-мипа гидрохлорид, хипуклидил-З-дифеиилкарбинола гидрохлорид, димепгидринат), этилендиамииы (пириламииа малеат, трю юлы [амина гидрохлорид, тринеле![амина цитрат), алкиламииы (хлорфепира-
250
мина малеат, бромфелирамяла малеат), пиперазины (гидроксизина гидрохлорид, гидроксизина ламоат, циклизина гидрохлорид, цикли-зипа лактат, меклизица гидрохлорид), фецотиазипы (прометазина гидрохлорид) и средства второго поколения: алкиламииы (акри-вастии), пиперазины (цетиризина гидрохлорид), штеридипы (асте-мизол, левокабастица гидрохлорид, лоратадин, терфенадии). Преимущества препаратов второго поколения заключаются в практическом отсутствии их действия в терапевтических дозах на ЦНС и их более продолжительном действии, что позволяет принимать 1 таблетку в день.
Аллергия и анафилаксия. Хорошо известно, что Г,-антагонисты достаточно успешно применяются в клинике для лечения ринитов, дерматитов и анафилактоидных реакций. Следует отметить, что, во-первых, они не во всех случаях эффективны, во-вторых, некоторые препараты теряют активность при длительном использовании, в-третьих, у многих больных они вызывают побочные эффекты. В последнее время появились сведения, что для терапии этих заболеваний более эффективно использование комбинации Г,- и Г2-аитагопистов [Lorenz W. etal., 1980].
Бронхиальная астма. В вопросе использования антагонистов гистамина для лечения бронхиальной астмы еще много неясного. Гистамин является мощным стимулятором сокращения мышц бронхов за счет активизации главным образом Г(-рецепторов. Можно было бы предположить, что ^-антагонисты будут купировать приступы бронхиальной астмы. Однако оказалось, что эти вещества очень слабо помогают при спазме бронхов. Поскольку ингибитор высвобождения гистамина кромогликат дипатрия с большим успехом применяется для профилактики бронхиальной астмы, можно думать, что неэффективность Г]-антагонистов обусловлена слишком высокой локальной концентрацией гистамипа в легких. При этом Г,-антагонисты могут блокировать активность гистамина только в очень высокой (непереносимой) концентрации. В связи с этим большие усилия предпринимаются для синтеза новых, более эффективных антигистаминных препаратов, в частности, производных бензоциклогапетиофена.
Психические заболевания. Хорошо известно, что многие Г,-аптагонисты оказывают центральное успокаивающее и снотворное действие.
Фундаментальные исследования по выявлению связи между способностью различных ЛВ вытеснять Г]-антагонист 3Н-мепира-
251
Таблица 11.
Воздействие психотропных средств на связывание 3Н-мепирамина в коре головного мозга мышей in vivo и его корреляция с седативными свойствами.
лв Дом, мг/кг Иитжбкромаяе еаяэымяня •Н-иеппремии», Л Сеаатяааыв (аффекты
Мекуитазия (—)-Хлорфеяирамия Бромфеннрамнн Циинариэин (+) -Хлорфеннракия
Трипролиднн Ципрогептадин Прометазин
Г,-антагонисты
0,2 1*0,7
0,1 16*3
0,2 51 ±3
1,2 60*6
0,1 69 ±4
0,4 70*3
0.4 75*1
1.0 77*6
Иприндол Вилоксазвя Дезипрамии Иннпрами» Манротклнн Кломипрамин Анатриитилип Доксепин
Антидепрессанты
0,7 19*3 +
1,0 20*6 +
1,0 30*8 +
1,5 39*6 ++
1.0 58*11 4~+
0,5 62*2 ++
1,0 85*6 +++
2,0 68*7; *4*+
Нейролептики
Трвфтораеразия Тркфлу перл дол 0.2 0.1 9*1 19*6 г И
Г алоперндол 0.2 21*6
Пнмоэнд 0,1 25*7
Флуфеназин 0,2 32*2
Дроперидок 3,0 56*3 '++
Тиоридазин 1.0 66*2
Хлорпромазин 4,0 73*4
Левомепромазин 4,0 75*3 f-++
Примечание. Значительного ингибирования этого связывания •’Н-мспирамина не наблюдалось после введения диазепама (0,1), мепробамата (6,0), фенобарбитала (2,0), пропранолола (1,6), алпренолола (2,0), салбутамола (0,04), клонидина (0,06), апоморфина (0,25), цинанссрина (1,2), скополамина (2,5) и атропина (2,5).
мин из его связи с (^-рецепторами головного мозга мышей jn vivo и их седативными эффектами у людей провели J.Schwartz и соавт. (1980). Полученные этими авторами данные представлены в табл. 11.
252
Выявленная корреляция между связыванием психотропных веществ с рецепторами и их седативной активностью свидетельствует, что эффект различных психотропных средств обусловлен блокадой Г,-рецепторов головного мозга. Такой же вывод можно сделать и на основании данных E.Richelson (1979, 1980), P.Uran и соавт. (1979). Однако согласно данным P.Diffley и соавт. (1980), нет корреляции между седативной активностью -антагонистов и их способностью ингибировать связывание Ш-меццрамшга in vitro или in vivo.
По нашему мнению, при анализе этих противоречий необходимо учитывать, во-первых, способность ЛВ проникать через гематоэнцефалический барьер, во-вторых, их способность взаимодейство-ватьие только с Г -, по и с Г2-рецепторами, а также с альфа-адреио-, холино-и серотониновыми рецепторами. J.P.GreenncoaBT., (1978), R.D.Kanof и P.Greengard (1978, 1979) обнаружили, что многие антидепрессанты являются конкурентными антагонистами Г2 -рецепторов в нейрональной ткали. При этом они ингибируют Г2-стимулируемую аденилатциклазу. Кроме того, антипсихотические средства (тиоридазил, хлорпромазин, галоперидол) но сравнению с антидепрессантами еще сильнее блокируют Г2-рецепторы [Chang R.S. et al., 1979; Richelson E., 1979]. Поэтому блокирование некоторыми веществами наряду с Г,-рецепторами также Г2-реце1 поров может быть еще одним нейрохимическим фактором, который определяет их фармакологическое действие.
J.P.Green и соавт. (1977, 1978) связывают формирование поведенческих эффектов галлюциногенов с их способностью блокировать Г2-рецепторы. Основанием для этого предположения служит тот факт, что D-ЛСД и D-Br ЛСД так же, как и избирательные Г2-антагонисты циметидин и метиамид, являются конкурентными антагонистами Г2-чувствителыюй адеиилатциклазы головного мозга морских свицок. L-изомер ЛСД пе влияет на поведение и неактивен по отношению к Г2-рецепторам.
Антигистаминные .препараты широко используют в качестве нротивопвотпых средств. Считается, что в данном случае терапевтический эффект обусловлен блокированием ^-рецепторов области postrema [Bkargavara К.Р., 1975].
В последнее время анализируются возможности использования антигистаминных средств для лечения приступов мигрени [Anthony М. et al., 1978]. Согласно полученным этими авторами результатам, r^aiiTai ojmcTbi неэффективны, а комбинация Г,- и Г2-антагопи-стов дает положительные результаты при транзиторной, но не при
253
хронической головной боли. Важной проблемой в терапевтическом использовании антигистаминных средств остается выяснение механизмов развития толерантности к их седативным эффектам [Nickolson A.N., 1983].
Таким образом, приведенные факты дают возможность заключить, что при различных заболеваниях раздельное воздействие Г,-или Г3-антагопистами часто менее эффективно, чем комбинированное. В то же время мы считаем, что прогресс в лечении многих болезней, в патогенезе которых важная роль принадлежит гистамину, будет определяться синтезом гистаминергнческих средств с селективным действием только на определенные гистаминовые рецепторы в ЦНС и других органах и тканях.
Язвенная болезнь. Лечение этого заболевания с помощью антигистаминных средств началось после создания первого избирательного антагониста Г2-рецеиторов буримамида [Black J.H. et al., 1972]. Через несколько лет были синтезированы еще два соединения этого ряда — метиамид и циметидин.
Изучещге влияния буримамида, метиамида и циметидина на желудочную секрецию соляной кислоты у людей и животных in vivo и in vitro показало, что они представляют собой эффективные ингибиторы секреции, индуцируемой любыми стимулами,
Бурпмамид заметно влияет на интенсивность желудочной секреции только при внутривенном введении. При пероральном введении он малоэффективен, по-видимому, вследствие быстрой инактивации в желудочно-кишечном тракте [Rasselbo J., 1973]. Неспособность буримамида вызывать выраженный фармакологический эффект при пероральном введении ограничивает возможности его применения в практике. От подобного недостатка свободны метиамид, который медленно абсорбируется из желудка, по полностью всасывается в тонком кишечнике [Hasselbo J., 1973], и циметидин, быстро всасывающийся в желудочно-кишечном тракте [Giffiths R. et al., 1977].
Циметидин и метиамид имеют количественное и качественное сходство по фармакологическим свойствам, однако они различаются ПО ТОКСИЧНОСТИ.
В ряде случаев применение метиамида сопровождалось деструкцией паренхимы почек и печени, небольшой гиперплазией щитовидной железы,нейтропенией и агранулоцитозом [Burlond W.L. et al., 1975; Ионов И. Д., 1978]. Возможно, что это связано с наличием в молекуле метиамида тиомочевииы. Циметидин, у которого тиомочевипа заменена на цианогуанидин, лучше рас
254
творяется и не вызывает приведенных выше побочных эффектов, поэтому в клинике первым [^-антагонистом, получившим широкое распространение, стал циметидин. Впоследствии появились другие препараты этого ряда — ранитидин, фамотидип, низатидип, отличающиеся еще более лучшей переносимостью.
Если циметидин, ранитидин, фамотидип и низатидип примерно в равной степени ингибируют кислотную секрецию желудка, то они имеют различную фармакологическую активность, не связанную с взаимодействием с Г2-рецепторами. В отличие от фамотндина и йизатидипа циметидин и в гораздо меньшей степени ранитидин ингибируют окислительную систему метаболизма ксенобиотиков при участии цитохрома Р-450 и поэтому увеличивают активность многих ЛВ. Из указанных гистаминовых антагонистов только циметидин метаболизируется этой же системой, связывается с андро-геловыми рецепторами и вызывает аптиапдрогеновые эффекты: гинекомастию у мужчин и галокторею у женщин. У мужчин, принимающих большие дозы циметидина, наблюдается уменьшение количества спермы и обратимая импотенция.
Ацтисекреторпый эффект Г,-антагонистов позволит их применять для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, причиной которых является повышение образования НС1 л пепсина; отмечен высокий терапевтический эффект Г2-антагонистов при лечении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, эрозивного гастрита [Ионов И.Д., 1978; Hirshowitz B.L., 1979].
Определенное значение в лечении язвенной болезни может иметь и способность Г2-аптагопистов уменьшать выброс гормонов надпочечников при стрессе, о чем сообщили J.Bigajski и A. Gadek (1983).
♦ * ♦
Таким образом, приведенные сведения показывают, что в последнее время фармако-биохимические исследования структуры и функции гистаминовых рецепторов являются неотъемлемой частью работ в области молекулярной фармакологии рецепторов для нейромедиаторных веществ. Доказана гетерогенность гистаминовых рецепторов; общепринято их деление на Г^, Г2- и Гэ -рецепторы.
Получены данные о биохимических изменениях в клетках, [ возникающих после активации данных рецепторов. В частпо-[1 сти, выявлено изменение уровня цАМФ или цГМФ, вызывае-| мое гистамином и его аналогами, что является значительным (прогрессом в наших представлениях о механизме их действия па
255
клеточном уровне. Применение методики радиолигаидиого связывания позволило установить прямое взаимодействие ряда психотропных средств с гистаминовыми рецепторами в ЦНС и высказать предположение о связи седативных и поведенческих эффектов этих веществ с блокадой Г - и Гурецепторов. Особый интерес представляет возможность создания селективных блокаторов периферических Г,-рецепторов, не проникающих в ЦНС и пе оказывающих седативного действия, для лечения аллергических заболеваний.
Большое будущее, ио-видимому, у селективных Г2-аитагоиистов как эффективных противоязвенных средств. В то же время необходимо проанализировать возможность их использования для терапии аллергии и бронхиальной астмы, поскольку лечение этих заболеваний только Гуаптагонистами не всегда дает положительные результаты.
Итак, подводя итоги рассмотрению трансформации молекулярного сигнала гистамина, его производных и некоторых ЛВ посредством различных гистаминовых рецепторов, можно заключить, что дальнейшие успехи терапии не только перечисленных заболеваний, по и ряда других (патология заживления ран, аномалия развития плода, злокачественные перерождения), в патогенезе которых гистамину принадлежит важная роль, во многом будут связаны как с исследованием молекулярной природы гистаминовых рецепторов и биохимических принципов их функционирования, так и с синтезом более специфических лигандов этихрецепторов.
Глава 5
СЕРОТОНИНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ
В 1947— 1948 гг. М.М.Rapoport и соавт, в сыворотке крови Млекопитающих обнаружили соединение, оказавшееся по химическому строению 5-окситриптамином (5-НТ), которое вызывало вазоконстрикцию. Это соединение часто называют также серотонином, учитывая источник его получения и миотроплый эффект. Начатое в 50-х годах изучение серотонинергической системы продолжается до сих пор. Как и в случае других биогенных аминов, для объяснения природы фармакологической активности серотонина была привлечена рецепторная теория Эрлиха. Вначале было высказано предположение о существовании специфических структур (серотониновых рецепторов), взаимодействуя с которыми серотонин «запускает» последовательную цепь процессов, приводящих к развитию физиологической реакции [Gaddum J.M., Picarelii L.P., 1957]. Затем благодаря совершенствованию методов препаративной биохимии, клонирования рецепторов, рад ио л ига одного связывания и синтезу многих аналогов серотонина экспериментально подтвердилось существование таких структур; в некоторых случаях удалось определить их химическую природу и принципы функционирования. При этом исследователи встретились со многими трудностями. Прежде всего необходимо было установить связь между множественностью эффектов серотонина, проявляющихся в изменении функций ЦНС, сердечно-сосудистой, дыхательной, мочевыделителыюй, желудочно-ки-! шечной систем, и теми серотониновыми рецепторами, которые ^опосредуют тот или иной эффект биогенного амина.
17. Зек 227
257
5.1. Агонисты серотониновых рецепторов
Вещества, которые оказывают серотонинмиметический эффект, непосредственно взаимодействуя с серотониновыми рецепторами, обычно изучают на изолированных препаратах (матка, подвздошная кишка), которые чувствительны к серотонину-В последнее время эти агонисты используются при исследовании серотониновых рецепторов головного мозга методом ра-диолигаидпого связывания, а также при проведении фармакологического анализа поведенческих эффектов серотонина.
Ниже изображена структура некоторых агонистов серотониновых рецепторов, представляющих собой два класса соединений: производные индола (буфотенин, Ы,Ы-диметил-5-метокситриптамиц) и пиперазина [квиназнн, МК-212 и I-(т-три-фтормегил)-нилеразин]. Считается, что МК-212 и кви-иазин могут стимулировать пре- и постсипаптические серотониновые рецепторы, а 1-(т-трифторметилфецил)-[1инерази11 имеет сродство к ностсинаптпческим рецепторам.
Прямой стимулятор серотониновых рецепторов 8-оксн-2-(ди-11-11ропиламипо)-тетралин (8-ОН-ДПАТ) вызывает типичный двигательный серотониновый синдром, па проявление которого пе влияет предварительное введение резерпина или ос-пропилдосс-адетамида (ингибитора триитофапгидрокеилазы).
8-ОН-ДПАТ угнетает электрическую активность серотонинергических нейронов шва. В то же время 8-ОН-ДПАТ парадоксально действует на сексуальное поведение. В отличие от других серотониновых агонистов сексуальную активность он пе умессь-шает, а увеличивает. Эти результаты позволяют предположить наличие двух типов постсипаптических рецепторов: 1) рецепторов, опосредующих типичный двигательный эффект серотонина и его агоштстов; 2) рецепторов, опосредующих ингибирующее влияете серотонина на сексуальное поведение. Первый тип рецепторов в отличие от второго стимулируется 8-ОН-ДПАТ.
5.2. Антагонисты серотониновых рецепторов
Лекарственные вещества, блокирующие эффекты серотонина па периферические ткани, его поведенческие эффекты и влияющие па связывание радиолигандов с серотониновыми реце-
258
Нянмзин
GH2GH2N(CH3h
н
Буфотенин
CHaGH2N(CH3h
N ГЬДимитил-5'41*тонсмТр*гтт11ММН
1-jm -T рифтормвтклфвнид}* мпермии
снаон
CY 5385?
Ц«гмсергил
Цргфоготтадик
5СнаСН2СНаМ(СНэЬ
'Ц*№НС9рмИ
259
пторами, относят к антагонистам серотониновых рецепторов. Их химическая структура приведена ниже.
Видно, что антагонисты серотониновых рецепторов отличаются от агонистов наличием 2—3 алкильных или арильных заместителей у атома азота (индольного или основного), углеводортдов, соседних с атомом азота или в пятом положении индольного ядра. Следует подчеркнуть, что способностью стимулировать или ингибировать тот или шюй тип серотониновых рецепторов обладают также соединения, имеющие сродство не только к серотониновым, по и к рецепторам других биологически активных веществ, например, к адреналину, гистамину, штатам, дофамину. В зависимости от характера серотониновых рецепторов некоторые вещества Mojyr выступать в качестве агонистов или антагонистов серотониновых рецепторов.
5.3. Гетерогенность серотониновых рецепторов (фармакобиохимический анализ)
При изучении влияния различных фармакологических веществ па действие серотонина на изолированные гладкомышечные органы и некоторые периферические ткани было обнаружено, что в одних случаях оно блокируется морфином, а в других случаях фен оке ибензам ином [Gaddum 1.М., 1957].
Поэтому было постулировано, что в нервом случае серотонин взаимодействует с М-серотониновыми, а во втором с Д-серотопиповыми рецепторами.
Согласно этой классификации, Д-рецепторы серотонина опосредуют его способность сокращать миоциты. Данный эффект блокируется диэтиламидом D-лизергиповой кислоты (LSD-25), который избирательно угнетает вызываемые серотонином сокращения изолированной матки, сосудов, бронхов, отрезков кишечника у многих млекопитающих. К одним из наиболее сильных блокаторов инотропных эффектов серотонина неиндолыюй природы относятся производные |3-галогеиалки-ламипа: дибенамнп и дибензилин (их аптисеротониповая активность примерно в 10 раз уступает таковой LSD-25).
Препарат ципрогеитадни, обладающий антигистаминными и аптибрадикипиниыми свойствами, превосходит LSD-25 по способности блокировать миотропную активность серотонина. Сла
260
бым аптисеротопиновым свойством обладает ципансерин [Пи-девич И.Н., 1982].
Чувствительность серотониновых рецепторов вегетативных ганглиев, которые опосредуют ганглийстимулирующие эффекты серотонина, избирательно велика но отношению к морфину. При концентрации морфина 1109 — 1-10'8 г/мл его антагонизм с серотонином носит конкурентный характер. Более низкой но сравнению с морфином способностью блокировать се-poTOiцшовые рецепторы вегетативных ганглиев (М-рецецто-ры) обладают местные анестетики (совкаии), ароматические производные гуанидина и бнгуанидина (фенилбигуапидин), соли окситриитамнпа (м-хлорбензилбуфотепидина бромид) и амидиновые производные индола (5-окси-3-индолацетамидии).
Наличие индольного ядра способствует большей избирательности действия антагонистов Д-тина. Вещества цеин-дольпой природы обычно угнетают не только эффекты серотонина, но и других серотониномиметиков.
' В 1962 г. И.Н.Пидевич обнаружила, что серотониновые рецепторы, ответственные за возникновение хеморефлексов с рецепторов сердца и легких у кошек, отличаются по чувствительности к блокирующим агентам от Д- и М-серотопиновых рецепторов. При этом было синтезировано вещество тинин-дол, являющееся конкурентным антагонистом способности серотонина вызывать хеморефлексы е рецепторов сердца и легких. Поэтому серотониновые рецепторы, проявляющие значительную резистентность к LSD-25 и морфину, но высокочувствительные к типиндолу, были названы Т-серотониновыми рецепторами.
После появления серотониновых агонистов и антагонистов, ; меченных радиоактивными изотонами, развития методики ра-Диолпгапдного связывания и получения возможности определения аминокислотной последовательности рецепторных бельков представления о гетерогенности серотониновых рецепто-i изменились.
5-НТ,-рецепторы характеризуются высоким сродством к се-он и ну, определяются в ЦНС и периферических тканях doteaux J.M., 1988]. Агонистами 5-НТ,-рецепторов являют-акие соединения, как 5-метокси-3( 1, 2, 3, 6-тетрагидро-пири--4-ил)-1п-ипдол [Maura G.,Raccatangiita Е. et al., 1986], 5-боксамидотриптамин, RV-24969 [Docherty Jomes R., 1983], Y-7378 [Ahlers S.T., Weissman B.A. et al., 1992]. (S) и (R)-1и-н-пропиламино)-6,7,8,9-тетрагидро-ЗН-бензо[е]индол-1-бальдегид — еще один класс активных при приеме внутрь аго-
261
шгстов 5-НТрреценторов [Stark R., Sullivan T.M. et al,, 1990]. Антагонистами являются спнроксатрин [Dabire H., Cherqui С. et al., 1988], WB-4101 [Gillis R_, Hill K. et aL, 1989].
Синтез селективных лигандов позволил выделить и охарактеризовать подтипы 5-HTj-рецепторов. В 1982 году был синтезирован высокоаффинный агонист 5-НТ1А рецепторов — 8-ОН-ДПАТ [Mestikawy S., Fargin A. et а!., 1991]. В дальнейшем было создано большое количество химических соединений, обладающих сродством к 5-НТ1А рецепторам. Это агонисты 5-НТ1А рецепторов: п-амииофенилэтил-т-трифторметилницеразнн [McCall R.B., Patel B.N. et al., 1987], Ь1-Ь1-дн-Н-пропил-5-карбо-ксамидотринтамиц, BAYR1531, флезиноксан, инсапнрои, MDL-73005 [Van Wijngaarden J. et aL, 1990], BMY-7378 [Cushing D.J., Cohen M.L., 1993, Diouf O. etal., 1994, Stubbs C.M. etal., 1991], BP-554 [Matsuda T., Seong К. H. et al., 1990], 6-гидрокси-3H-нроиил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н- Збензазепин и его аналоги [Wikstram Н. et al., 1992]. Новыми агонистами 5-НТ, рецепторов являются гетеробициклические фен и л пиперазины с N-4-арал-килышми заместителями [Van Steen В.J. et al., 1994].
В головном мозге млекопитающих были обнаружены серотониновые рецепторы 5-HTt и 5-НТ2. В экспериментах in vitro выявлено, что 5-НТ,-рецепторы связывают аН-серотопин в ткани всего головного мозга крыс [Peroutka S.J., Snyder S.R., 1979], а 5-НТ2-реценторы связывают нейролептик 3Н-спипс-рон в коре полушарий мозга [Leysen J.E.,Laduron Р.М.,1977; Peroutka S.J., Snyder S.R., 1979].
В экспериментах часто используется также еще один серото-шшергический радиолиганд 3Н-ЛСД; он имеет примерно одинаковое сродство к 5-HTf- и 5-НТ,-рецепторам. Данные рецепторы имеют различную селективность по отношению к серотонинергическим веществам: серотониновые антагонисты имеют большее сродство к 5-НТ,,-, чем к 5-НТ,-рецепторам, а производные индола более сильно связываются с 5-НТ,-рецепторами. По данным J.E. Ley sen и соавт. (1981), аити серотонинергическое вещество R 41 468 (3-{2-(4-[4-фторбензоил)-1-пииерц-динил]-этил}-2,4(1Н,ЗН)-хилазоли11дион) сильно связывается с 5-НТ,-рецепторами и не взаимодействует с 5-HTf-рецепторами (табл. 12).
262
Таблица 12.
Ингибирующая способность ЛВ по отношению к различным рецепторам (значения Км, нМ) [Leysen J.E. et aL, 1981].
ЛВ в-нт>-рецаоторк 5-НТг рвцептйрь Гг-ршеп* торы 111-Адре-морецеп-торы «t-Ларе-торы Дофл1в-зюмде рецепторы М-холн> норецеп-торы
R41468 2,1 Не акта век 10 10 Не активен 220 Не активен
Мегер гол ни 0,9 20 поо 38 380 23 То же
LSD 8,3 20 Не активен 160 58 20 э >
Метисе ргид 12 99 То же 2300 2600 200 » >
Метитепий Цяорогеп- 1,9 62 4,9 0,47 48 4,0 > >
теми 6.5 700 2,7 100 760 31 19
Пизотифея 6.5 1500 1,9 120 480 99 23
Мяансерин 13 1100 2,9 82 60 620 Не активен
Цянан серин 41 3500 1200 1200 Не актн вен 1600 То же
Сайнеров 1.2 160 Не активен 10 То же 0,16 > >
Пнпамаерон 5,3 5000 То же 54 610 120 Не активен
Галоперидол Феноксибенз- 48 Не активен а > 8,0 Не акта вен 1,2 То же
аыин ПО 1400 28 1,2 3,6 200 240
Морфин Не актн- Не актн- Не акти- Не актн- Не актн Не акта Не актн-
вен вен вен вен вен вен вен
Примечание. Данные соединения в концентрации <1 мкМ были нс активны по отношению к Р-адрсно|юцепторам и ГАМК-рецепторам. В случае опиатных рецепторов значения Кч для морфина, спицсрона, фепоксибензамина равнялись 6,5, 200, 320 нМ соответственно, а остальные препараты были нс активны в концентрации 1 мкМ.
Видно, что вещество R 41 468 дает возможность хорошо дифференцировать 5-НТ,-рецепторы и дофаминовые рецепторы. В то же время R 41 468 имеет достаточно сильное сродство к Г,-рецеигирам и альфа-адренорецепторам. Другие соединения, .Имеющие высокое сродство к серотониновым рецепторам, также # ряде случаев сильно связываются и с другими рецепторами. ,, По нашему мнению, этот факт указывает на определенное сходство различных рецепторов, например, серотониновых, гистаминовых, дофаминовых, и свидетельствует, что для объяс-цения механизмов действия многих ЛВ нельзя ограничиваться щссмотрепием их взаимодействия только с одним каким-пи-удь видом рецепторов.
263
G.Engle и соавт, (1983) показали, что в отличие от пейоди-рованного LSD, йод-125-LSD также обладает избирательностью по отношению к серотониновым 5-НТг-рецепторам. Свя-зывапиейод- 125-LSD с мембранами коры головного мозга крыс характеризовалось К., равной 0,9±0.1 нМ, Вмакс, равным 240±20 фмоль/мг белка. Неснецнфическое связывание йод-125-LSD при его концентрации 0,9 нМ определялось в присутствии кетансерниа (0,1 мкМ) или цинансерица (3 мкМ); оно не превышало 40% от его общего связывания. Характер конкуренции LSD с серотониновыми агонистами описывался моно-фазной кривой, а с серотониновыми антагонистами описывался двухфазной кривой. Способность серотониновых антагонистов вытеснять LSD из его связывающих участков коррелировала с их способностью ингибировать индуцируемые серотонином сокращения базилярной артерии собаки.
Величина связывания серотонинергических средств с 5-НТ,-рецепторами также хорошо сопоставляется с их способностью подавлять индукцию гриптамилом клонических судорог у крыс и уменьшать вызванные серотонином сужение просвета хвостовой артерии крыс.
Следовательно, можно заключить; 1) 5-НТ,-рецеиторы присутствуют как в ЦНС, так и на периферии; 2) эти рецепторы вовлечены в опосредование фармакологических эффектов серотонина (возможно, 5-НТ2-рецепторы сходны, по крайней мере, с частью Д-серотониновых рецепторов).
Если способность различных веществ связываться с 5-ПТ^-рецеиторами коррелирует с величиной ингибирования ими поведенческих эффектов серотонина (рнс. 50), то для 5-НТ,-реценторов такое соотношение отсутствует (рис. 51).
H.O.Kalkman и соавт, (1983) представили данные, свидетельствующие о наличии линейной корреляции (г=0,92) между способностью ссротопш1а>5-мстоксидиштам1Ц1а>'П»штамш1а>5-мегил-триптамнна> 5,6-дигидрокситриитамииа снижать диастолическое давление у анестезированных пентобарбиталом крыс, которым предварительно вводили кетансерип для блокирования 5-НТ2-рецепторов и способностью этих серотониновых агонистов вытеснять ;,Н-серотолин из его связи с 5-НТ,-рецепторами головного мозга. Этот результат и ингибирование антагонистом 5-НТ(-рецепторов квиназшюм гипотензивного эффекта серотонина дают возможность пред полагать, что 5-ИТ,-рецепторы опосредуют сосудорасширяющий эффект серотониновых агошютов.
О множественности серотониновых рецепторов свидетель-
264
Рис. 50. CpiuHicniie сродства различных ЛВ к 5-НТ,-рецепторам с их способностью ингибировать поведенческие эффекты 5-окснтриптофапа.
По оси абсцисс —величина (K_. нМ) ингибирования Л В связывания Л1чпиропсри-дола 5-11Т,-рецепторами; побей ординат—дозы 11)^ (мкмоль/ кг) ингибирования Л В "тряски головы'' у мышей, вызываемой 5-окситрпптофаном (S. Н. Snyder. S.J. Powtka, 1982].
Иприндол
100
Дезиправим ♦
Прометазин ♦
10
Амитриптилин
Цин аневрин Нлоэапин •
Галоперидол
Миамсерин •
to
• Хлорпромазин Пилаып&рОн •
• Ципрогептадин
Спнроперидол
о.I
Ю0 1000 [0000 100000
Рис. 51. Сравнение сродства различных ЛВ к 5-НТ -рецепторам с их способностью ингибировать поведенческие эффекты 5-окситроптоф;ша. По оси абсцисс — величина (К.. нМ) ингибирования ЛВ связывания •’Н-ссрото-нииа с З-НГ'-рецспторами: по"оси ординат —EDM (мкмо.пь/кг) ингибирования ЛВ "тряски головы" у МЫИ1СЙ, вызываемой 5-окснгринТофаном [S, И. Snyder SJ. Pcroutka, 1982]. ‘
265
ствует также фармакологический анализ поведенческих эффектов серотонина. Обнаружено, что классические серотониновые антагонисты метисергид, ципрогептадни, метергалип и ме-тиотепип не влияют на способность крыс различать введение им предшественника серотонина L-5-оксн триптофана, а ингибитор нейронального поглощения серотонина флуоксетин эту способность увеличивал. Поскольку данные серотониновые антагонисты блокируют синаптические эффекты серотонина в двигательных нейронах ствола мозга, по не влияют на его синаптические эффекты в гиппокампе и миндалине, можно полагать, что именно серотониновые рецепторы лимбической области определяют дискрими нативную способность крыс, выявленную R.J.Barret и соавт. (1982).
В связи с обнаружением большого количества рецепторов серотонина, список которых НОСТОЯ1ШО пополняется, возникла необходимость выработки четких критериев, ио которым можно было бы рецепторы отнести к тому или иному типу, т.е. классифицировать. Ранее принадлежность рецептора к определенному типу определяли по его способности взаимодействовать с различными химическими соединениями, т.е. оценивали сродство рецепторов к этим агентам и также но способности этих веществ влиять на функцию этого рецептора (активировать или блокировать рецептор). Позднее, знание о том, с какой внутриклеточной системой вторичных посредников сопряжен рецептор, позволило более то-Ч-1Ю различать один рецептор от другого. В настоящее время для характеристики рецептора этих сведений не достаточно. Помимо традиционного фармакологического подхода для идентификации рецепторов применяют методы молекулярной биоло-гии. Новью молекулярно-биологические методы иозволяктг идентифицировать ген, кодирующий рецептор, а также устанавливать аминокислотную последовательность рецептора. Поэтому рецепторы могут быть классифицированы па основании совокупности сведений о гене, кодирующим рецептор, структуре самого рецептора, типе системы вторичных нос]>ед1щков, с которой сопряжен этот рецептор, а также данных о сродстве рецептора к химическим соединениям и способности этих веществ влиять на функцию рецептора [Hoyer D., Martin G.R., 1996]). Такой комплексный подход позволил Международному Колштету но номенклатуре рецепторов серотонина разделить все известные ла сегодняшний день рецепторы серотонина на 7 семейств или типов: 5-НТ ; 5-НТа; 5-HT.r 5-НТ4; 5-HTs; 5-Г1Т6; 5-НТг В свою очередь тип 5-НТ,-рецепторов состоит из нескольких подтипов рецепторов:
266
5-HTt V 5-НТш, 5-HTiD, 5-HTie, 5-HT1f; в 5-HT2 тин входит 5-НТ.,д-, 5-HT2B-, 5-НТ2€-рецепторы; а 5-НТ.-тип объединяет 5-HT5A- и 5-НТ.в-рецеиторы. Передача сигнала на ферментную систему внутрь клетки со всех рецепторов серотонина, кроме 5-НТ3 рецепторов, осуществляется с помощью G-белков, поэтому, в свою очередь, эти рецепторы входят в суперсемейство рецепторов клеточной поверхности, сопряженных с G-белками. 5-НТ3-рецецторы образуют ионные каналы, регулирующие токи ионов Na\K+ и Са**, и поэтому входят в суперсемейство рецепторов, являющихся но сути ионными каналами. Давая общую характеристику семейству 5-НТурецепторов, следует отметить, все рецепторы 5-и подтипов, входящих в это семейство, являются простыми протеинами, семикратно пронизывающими мембрану. Эти протеины образованы из 365 до 422 аминокислотных остатков; их последовательности, относящиеся к различным подтипам рецепторов, гомологичны па 40%. Рецепторы посредством ингибиторных G-или Сп-белков сопряжены с адепилатпиклазой, поэтому при активации рецепторов активность аденилатциклазы ингибируется [Hoyer D. et aL, 1993].
Геи человека, кодирующий 5-НТ1А-рецеитор, локализован в 5cen-qll хромосоме. Подтип 5-НТ|Д- рецепторов широко распространен в ПНС, в особенности, в гиппокампе, septum, amygdala, т.е. областях мозга, которые, как полагают, участвуют в формировании настроения [Miquel М.С. et al., 1991]. Существуют upe-и гюстсинаитические 5-НТ|А-рецеиторы. Пресипаптические 5-НТ(А-рецепторы являются ауторецепторами. В отличии от других ауторецепторов серотонина, локализованных в пресинантнческой мембране терминалей нервных волокон, 5-НТ)Д-ауторецепторы расположены па пресипиитической мембране соматодепдрической области нейронов raphe [Aghajaniam G.K. et al., 1968, Blier P., DeMontigny C., 1987, Sharp T., Hjorth S., 1992]. При активации соматоделдричес-кие 5-НТ1А-ау'горецепторы блокируют выход серотонина из нресинантической мембраны посредством подавления возбудимости нейронов raphe [Sharp Т. et aL, 1989, Sprouse J.S., Aghajanian G.K., 1987]. Активация 5-НТ|Д-реценторов вызывает гиперполяризацию мембраны [Galligan J.J. et al., 1988, Johnson S.M. et aL, 1980, Tack J.F. et al, 1992]. Нет данных о существовании межвидовых различий в фармакологической чувствительности или структурной организации пре- и по-стсиваптических 5-НТ|А-реценторов. Вместе с тем, имеются доказательства того, что в пределах одного вида фармакологическая чувствительность пре- и постсипаптических 5-ПТ1Л-
267
рецепторов различается. Так, например, антагонисты постси-налтических 5-НТ1А-рецепторов часто проявляют частичную агонистическую активность на уровне соматодеидрических нре-синантических 5-НТ1А-ауторецепторов [Melier Е, et al., 1990, Fletcher A., Forster Е.А.,1996]. Полагают, что 5-НТ1А-реценто-ры вовлечены в реализацию антиденрессивного эффекта ингибиторов захвата серотонина, а именно, способствуют повышению уровня экстранейронального серотонина. Используя метод мнкродиализа было продемонстрировано, что количество серотонина в синаптической щели увеличивается при хроническом, но пе однократном применении ингибиторов захвата серотонина [Hjorth S., Auerbach S.B., 1996]. Терапевтическая эффективность ингибиторов захвата серотонина также наблюдается только при длительном применении. Очевидно, что кратковременное блокирование системы захвата серотонина не достаточно для изменения уровня экстранейронального серотонина и проявления антиденрессивного эффекта. Сама но себе блокада соматодеидрических 5-НТ1А-аутореце[ [торов пе влияет существенным образом на уровень серотонина в синаптической щели. Однако, если систему захвата серотонина предварительно заиигибировать, блокада 5-НТ[А-аутореценторов приводит к значительному увеличению количества серотонина в синаптическом пространстве [Hjorth S., Auerbach S.B., 1996, Hjorth S., Sharp T., 1993]. Можно полагать, что при использовании в хроническом режиме ингибиторов захвата серотонина имеет место длительное непрямое стимулирование соматодеидрнчес-ких 5-НТ1А-ауторецепторов, что приводит к их десеитизации, обуславливает повышение уровня экстранейронального серотонина. Клинические исследования показали, что при одновременном применении антагониста 5-НТ1А-ауторецепторов, пип-долола и ингибиторов захвата серотонина аптнденрессивлый эффект значительнее выражен и проявляется быстрее. В пользу предположения о том, что ингибиторы захвата серотонина реализуют свой эффект, активируя 5-НТ1А-ауторе цензоры (что приводит к их десептизацни). свидетельствуют также клинические данные об эффективном использовании агонистов 5-НТ1А-ауторецеиторов в лечении депрессий [Robinson D.S. et al., 1989, Robinson D.S. et al., 1990, Fletcher C.D. et al.,1993]. При активации иостсииаптических 5-HTt-рецепторов наблюдается типичный серотониновый синдром, который проявляется в flat body posture, forepaw treading, headweaving,гипотермии, высвобождении АКТГ. Стимуляция ностсинаитическнх 5-НТ1А-ре-
268
цепторов может вызывать ацксиогенные эффекты. Напротив, при активации пресинаитических соматодевдрических 5-НТ1л-ауторецепторов наблюдается анксиолитический эффект [Fletcher C.D. et al., 1993,]. Ген человека, кодирующий 5-НТ1В-рецептор, локализован в 6ql3 хромосоме, Подтип 5-НТ1В-реце-пторов (прежнее название — 5-НТвд -рецептор) локализован во фронтальных отделах коры головного мозга, стриатуме, базальных ганглиях. Пресинантические 5-НТ1р-рецепторы локализованы па терминалях нервных волокон и выполняют функцию ауторецепторов [Ноеуег D. et al., 1994]. Активация нреси-наптических 5-НТ1В-аутореценторов подавляет высвобождение серотонина из пресинаптической области терминалей нервных волокон [Gothert М., 1990]. Долгое время существовала неопределенность в отношении 5-НТ)В-ауторецепторов грызунов и человека (а также других видов—свиньи, кролика, морской свинки), пока пе было доказано существование межвидовых различий в фармакологической чувствительности этих рецепторов [Hamblin M-W., Metcalf М.А., 1991]. 5-НТ)В-ауторе-цеиторы крысы и мыши обладают уникальной фармакологической чувствительностью, проявляя высокое сродство к антагонистам р- адренорецепторов, в частности, к циалопиндололу [Engel G. et al., 1986, Middlemiss D.N., Hutson P.H., 1990]. У человека и перечисленных видов не было обнаружено ауторецепторов, чья фармакологическая чувствительность была бы идентична таковой э-НТ1В-ауторецеиторов крысы или мыши [Hoyer D. et al., 1989]. В связи с этим, было принято считать, что 5-НТ1В-рецепторы существуют только у крысы и мыши. У человека пресинантические ауторецепторы, являющиеся функциональными аналогами 5-НТ1В-рецепторов крысы/мыши и демонстрирующие близкую к ним, но не идентичную, фармакологическую чувствительность, получили назвашге 5-НТш-ре-цепторы [Hoyer D. et al., 1989]. Позднее было обнаружено, что популяция 5-НТ1С1-реценторов не однородна и состоит из 5-НТ)По-рецепторов и 5-НТ1 ^-рецепторов [Harting Р. et al., 1993]. Дальнейшая идентификация указанных подтипов 5-HTlD-pe-центоров с 5-НТ1В-рецептором затруднялась тем, что 5-НТ1П|1- и 5-HTt ^-рецепторы обладают схожей фармакологической чувствительностью, среди известных лигандов только кетансерин и ритацсерин проявляют небольшую селективность в отношении этих /тух рецепторов [Weinshank R. et al., 1991]. Вместе с тем данные сравнительного изучения локализации и функции 5-НТшр-рецептора человека и 5-НТ1В-ауторецентора кры
269
сы/мыши позволили Hoyer и Middle miss предположить, что эти рецепторы являются примером видовой гомологии. Внедрение методов молекулярной биологии способствовало разрешению сложной и долго существующей проблемы идентификации ауторецеиторов человека и грызунов. Сравнение аминокислотных последовательностей 5-^^— и 5-НТ1В-рецепторов показало, что структуры этих рецепторов в целом гомологичны на 93%, а трансмембранные домены идентичны на 96% [Adham N. et al.,1992]. Аминокислотные последовательности этих двух рецепторов различаются между собой только на один аминокислотный остаток, замена треонина на аспарагин (как у 5-НТ]В-рецецтора) которая, как полагают, произошла в результате мутации, обусловила различную чувствительность рецептора человека и грызунов к антагонистам Р-адренорецепторов [Oksenberg D. et al., 1992, Metcalf M.A. et al., 1992]. В то же время, несмотря на то, что в экспериментальных исследованиях была продемонстрирована весьма сходная фармакологическая чувствительность 5-HTlDy и 5-HTIDa-рецепторов, оба рецептора кодируются различными генами и в целом их аминокислотные последовательности были гомологичны на 63%, а трансмембранные домены - на 77% [Weinshank R. et al.,1991]. Согласно двум принципам, принятых Комитетом по номенклатуре рецепторов, рецепторы, являющиеся видовыми гомологами, не должны обозначаться как различные подвиды (как, например, 5-НТ1В и 5-HT]n|J) и рецепторы, кодируемые разными генами, не должны обозначаться одинаковыми буквами (как, например, 5-HTtDp и 5-HT1Da). В связи с вышесказанным, по решению Комитета по номенклатуре рецепторов серотонина 5-НТ)ое-рецепторы переименованы в 5-НТ1В-рецеиторы, а 5-НТ,^-рецепторы — в 5-HT1D-рецепторы [Hoyer D., Martin G.R., 1996]. Далее везде рецепторы указываются согласно повой классификации. Имеются сведения о том, что некоторое количество 5-НТ1В-ауторе-центоров может локализоваться на пресинаптической мембране соматодсндрической области нейронов raphe, хотя ранее полагали, что пресицаптическими соматодепдрическими ауторецепторами могут быть только 5-НТ1Л-рецепторы. 5-НТ1В-реце-пторы, локализованные в пресинаптической области окончаний нервных волокон, могут также функционировать как гетерорецепторы, контролируя высвобождение ацетилхолина, глутамина и дофамина [Hoyer D. et al., 1993]. 5-НТ|П-рецепто-ры расположены также на постсинантической мембране. Активация иостсииаптических 5-НТ1В-рецепторов у морской свинки и других видов вызывает гипертермию, этот эффект в от-
270
нет на введение агонистов 5-НТ1П-реценторов наиболее хоро-шо изучен у крыс. Агонист 5-НТ, „-рецепторов, анниртолин, вызывает анальгетические и антидепрессивные эффекты у крыс, в связи с этими данными интересно отметить, что поведение мышей-мутантов, у которых в организме полностью отсутствуют 5 - НТ гВ-рецепторы, характеризуется высокой агрессивностью и склонностью к потреблению алкоголя. 5-НТ1П-ре-центоры локализованы также на постсинаптпческой мембране гладкомышечных клеток церебральных сосудов и сосудов мягкой и твердой оболочек мозга [Beattie D.T. et al., 1994, Oksenbereg J.H. et al., 1992], т.е. сосудов, образующих вместе с тройничными нервами, три гем ино-васкулярную систему. В последние годы было установлено, что эти рецепторы, наряду с 5-НТ D-рецепторами, являются мишенями для противо-мигренозных средств, способных купировать дристуны мигрени [Moskowitz М.А., 1992, Humphrey Р.Р.А., Fenink W., 1991, Peroutka S.J. et al.,1993]. Такой вывод был сделан на основании клинических данных, продемонстрировавших высокую нро-тивомигренозную эффективность суматриптана [Plosker G., McTavish D., 1994].
Агонистами 5-НТ -рецепторов являются 5-бепзокснме-тнлтринтамип [Peroutka S.J., McCarthy B.G., Guan Х.-М., 1991], 5-(оксадиазолил)-тринтамины [Street L.T., Baker R. et aL, 1993], суматриптан [Hutson P.H., Biskerdike M.J. et al., 1990, MacIntyre P., Genimill J. et al., 1992].
5-HTjc-рецепторы найдены в сосудистом сплетении морских свинок и обладают высоким сродством к месулергину [Maloteaux J.M. 1988]. Однако, пи месулергии, ни другой лиганд 5-НТ]С-реценторов 1-(2,5-диметокси-н-йодофенил)-2-ами-Ноиронан не обладают достаточной избирательностью к 5-НТ1(.-рецепторам [Van Wijngaarden J. et ai., 1990].
В мышиных фибробластах экспрессирован ген, кодирующий ’ комплекс 5-НТ]С-рецептора с ГТФ связывающим белком. Полученный полипептид связывал 3Н-серотонии с Kd=3,6 нМ и Вп.м=275 фмоль/мг белка [Zgombick J.M., Weinshenk R.L. et al., 1991].
5-НТ|С*реценторы стимулируют синтез инозитолфосфатов в сосудах морских свинок. Посредством G-белков они связаны : с фосфолипазой С. Полагают, что 5-НТ]С-рецепторы являются Подтипом 5-НТ2-реценторов [Hoyer D., Waeber С. et aL, 1989].
В мембранах головного мозга человека идентифицирован еще один подтип 5-НТ,-реценторов — 5-НТ 1Е-рецептор, обладающий высокой аффинностью к серотонину (Kd=5,3) и сопряженный с G-белками [Leonhardt Sigrun, Herrick D.K. et aL, 1989].
271
Новым подтипом 5-НТ1-рецепторов, отрицательно сопряженных с адепилатциклазой, являются 5-НТ1Г-реценторы. Они обнаруживают высокую степень гомологичности с 5-НТ)Е- подтипом рецепторов (70%), 5-НТ1Л (63%) и 5-НТп (60%) рецепторами. мРНК для этого гена обнаружена в мозге, но не в сердце. Ка для 3Н-серотоиииа = 9,2 пМ. По аффинности к 5-НТ1р-рецецтору лиганды ранжировались следующим образом: 5-НТ > суматриптан > 5-карбоксиамидотршпап > 8-ОН-ДПАТ > спинерон. 5-НТ посредством этих рецепторов угнетал накопление цАМФ, стимулированное форсколипом [Adham N.t Као Н.Т. et al., 1993].
В структуру узнающего центра Р-НТ^рецепторов, по-видимому, входят кислые липиды (сульфатиды, сульфатидилсерин, фосфатидилинозитол). Они могут модулировать связывание лигандов с 5-НТ(-рецепторами [Nishimura J. et al, 1987, Yoshikawa S., Ishitani R., 1985].
Ген человека 1р36.3-р34.3. кодирует 5-НТ1П-рецепторы (прежнее название 5-НТ1Па-рецепторы), обнаруженные в небольшом количестве в головном мозге крысы, главным образом, в can-date putamen, nucleus accumbens, гиппокампе и коре головного мозга, а также в dorsal raphe и locus coeruleus. У человека, также как и морской свинки, в тригеми по-васку ля рлой системе обнаружены 5-НТш-рецепторы. Эти рецепторы относятся к системе тройничного нерва, они локализуются в периферических афферентных окончаниях нервов, ганглиях и нейронах ядер тройничных нервов [Longmore J. et al., 1997, Rebeck G.M. et al., 1994]. 5-НТш-рецеиторы, расположенные в нресииалтичес-кой области периферических окончаний афферентных волокон тройничного нерва, являются аутореценторами и при их стимуляции подавляется выход серотонина и вазоактивных веществ, что позволяет избежать активации этих волокон, а также вазодилатации церебральных сосудов [Bonaventure Р. et al., 1998, Moskowitz М.А., 1993, Nozaki К. etal., 1992, Buzzi M.G., Moskowitz M.A., 1992].
Серотониновые рецепторы 5-HT2 тина определяются но специфическому связыванию 3Н-спиперона, 3П-ЛСД, эН-миапсери-на и наиболее избирательного лиганда 3Н-кетаисерица [Leysen J.G., Cleyck F. et al., 1984]. Значение K(l для связывания 3Н-кетансерш1а с мембранами мозга крысы составило 1 нМ [McKenna, Dennis J., Peroutka S.J., 1989], a Kd и Binax связывания его с тромбоцитами кролика—3,93 нМ и 1,19 нмоль/мг белка соогвет-ствешю [Tsuchihashi Н., Yagi N. et al., 1991]. Кегансерии является антагонистом пе только 5-НТ2, но и альфа-адренорецепторов
272
[Nishimu га J., Kanaide H. etal., 1987]; более избирательно действует MDL-26508 [Van Wijngaarden J. et al., 1990]. К антагонистам 5-НТ2-редепторов относятся также MDL*11939, нирениерон, сероиерои, ритансерин, клозапин [Mass! М., Stefano М., 1987, Fuller R.W., Moddy H.D., 1990], ирицдолон (со слабым адреноблокирующим действием) [Gradin К. et al., 1991], LY-53857 [Dabire H.,Cherqui C. et al., 1988]. SR-463498 -мощный 5-НТ2-аптагонист, обладающий средним сродством к 5-НТ1С-рецепторам [Rinaldi С.М., Congy С. et al., 1992]. Среди новых соединений нужно отметить RP-6203 [Dobbe A.,Girdlestone D. et al., 1992], SB-204741 [Bonhaus D.W. et al., 1995].
Ген человека, кодирующий 5-НТ)Е-рецепторы, локализован на 6ql4-ql5 хромосоме. 5-НТ(Е-ренецторы впервые были обнаружены у человека. Эти рецепторы локализуются в caudate putamen и в меньшем количестве в amygdala, frontal cortex, globus pallidus [Hoeyr et al., 1993]. Функция этих рецепторов пе установлена, также не сообщается о существовании селективных или высокоаффинных лигандов.
5-НТ ^-рецепторы обнаружены в dorsal raphe, гиппокампе и коре головного мозга крысы и у мыши в полосатом теле, таламусе и гипоталамусе [Hoeyer D. et al., 1993]. 5-НТ1Г-рецемторы обнаружены в мозге человека и на периферии ~ брыжейке и матке [Носуг D. et al., 1993]. 5-НТ1(.-рецепторы локализуются в системе тройничного нерва у человека, oini обнаружены в ганглиях и периферических нервных окончаниях. Поскольку суматриптан и эрготаминсодержащие препараты проявляют высокое сродство также к 5-НТ 1Г-реректорам [Peroutka S.J. et al., 1993, Adham N. et al., 1996], полагают, что эти рецепторы могут являться мишенью для препаратов, обладающих нротивомигреиозпой ^пирующей активностью. В модельных экспериментах селективный агонист 5-НТ1Г-реценторов, LY-334370, эффективно подавлял патофизиологические реакции, вызываемые раздражением ганглия тройничного нерва, что позволяет предполагать у данного агониста цротивомигрепозпую активность. К LY-334370 существует пе только практический интерес в связи с возможностью использования его в лечении мигрени, ио также теоретический, поскольку это соединение проявляет значительно большее сродство (более, чем в 100 раз) к 5-НТ(Г-рецепторам по сравнению с 5-НТ1П п-реценторами [Adham N. et al., 1996]. Полагают, что при использовании этого препарата возможно будет избежать активации 5-НТ1П-рецепторов, локализованных в сосу-‘дах сердца, п возникающих в связи с этой активацией нежелательных явлений со стороны сердечно-сосудистой системы. К .числу главных недостатков препаратов, обладающих высокой
Ц Эм. 227
273
активностью в отношении 5-НТ1И ^-рецепторов, относят возможность возникновения у 5% пациентов реакций, схожих с симптомами ишемии сердца [ A. Maassen Van DenB rink et al.,1998].
Тип 5-НТг-рененторов объединяет 3 подтипа: 5-НТзд-, 5-НТзп-и 5-НТ3(.-реценторы. Давая общую характеристику 3 подтипам рецепторов, следует отметить, что все эти рецепторы являются простыми протеинами, семикратно пронизывающими мембрану. В целом, аминокислотные последовательности 3-х подтипов гомологичны на 50%, а их трансмембранные регионы —70 — 80%. Полагают, что все три подтипа рецепторов сопряжены с фосфолипазой С посредством а-субъедишты Gq ГТФ связывающего белка [Hoeyer D. et al., 1993]. Фосфолипаза С осуществляет гидролиз фосфатидилинозитола в инозитолтрнфосфат и диацилглицерол. Агонисты этих рецепторов индуцируют гидролиз фосфатидилинозитола. Вместе с тем имеются экспериментальные данные о том, что передача сигнала с 5-НТзв-реце-птора внутрь клетки может осуществляться не зависимо от гидролиза фосфатидилинозитола [Choi D-S. et al., 1996].
Ген человека, кодирующий 5-НТзд-рецентор, локализован в 13ql4-q21 хромосоме. В центральной нервной системе наибольшая плотность этих рецепторов обнаружена в пирамидальных нейронах в большинстве регионах коры головного мозга, claustrum, basal ganglia и в меньшем количестве в гиппокампе, хвостатом ядре [Hoeyer D. et al., 1993, Willins D.A. et al., 1997]. 5-HT^-рецепторы широко распространены в периферических тканях. Они обнаружены в сосудах, мочевом пузыре, желудочно-кишечном тракте, миометрии матки, тромбоцитах. Стимуляция центральных 5-НТ2Д-рецепторов вызывает тряску головы и отряхивание у крыс и подергивание головы у мышей [Bedard Р., Pycock C.J., 1977, Lucki I. et al., 1984, Malick J.B. et al,, 1977]. 5-HT2A-рецепторы опосредуют эффекты галлюциногенов у человека, а также высвобождение глютамина из мозжечка крыс и ^-эндорфина, кортикостерона, лютеинизирующего гормона и пролактина [Hoeyer D. et al., 1993, Glennon R.A., 1990]. 5-НТ2д-рецепторы участвуют в формировании сексуального поведения [Mendenson S.D., Gorzalka В.В., 1986]. Полагают, что 5-НТзд-реценторы вовлечены в патогенез депрессии и шизофрении. Посмертные исследования коры головного мозга выявили увеличение числа 5-НТ2А-реценторов у лиц, страдавших депрессией [Yates М. et al., 1990] и покончивших жизнь самоубийством [Mann J.J. et al., 1986], в то же время количество этих рецепторов в мозге пациентов, страдавших шизофренией, было снижено [Mita Т. et al., 1986]. В последние годы активно обсужда
274
ется значение 5-НТ2Д-рецепторов для лечения психозов и шизофрении. Следует отметить, что, в целом, серотонинергической системе в последние годы уделяется большое внимание в исследованиях патогенетических механизмов психических расстройств в связи с тем, что атипические антипсихотические препараты, демонстрирующие высокую клиническую эффективность, обладают равной или большей активностью в отношении рецепторов серотонина по сравнению с рецепторами дофамина [Meltzer H.J. et al., 1989]. Терапевтическая эффективность и меньшая тенденция возникновения экстрапирамид-ных расстройств при лечении атипичным антипсихотическим средством, клозапином, может объясняться ашагонизмом на уровне 5-НТ2д-рецепторов, обеспечивающим, по-видимому, повышение количества экстранейроиальпого дофамина в стриатуме. Стимулирование высвобождения дофамина антагонистами 5-НТ2А-рецепторов компенсирует или отменяет эффект дефицита экетранейроналыюго дофамина, который возникает в результате ингибирования рецепторов дофамина [Sailer C.F. et al., 1990]. Проводятся клинические исследования смешанных антагонистов В2/5-НТ,А-реценторов, олапзапипа и рисперидона, а также селективных антагонистов 5-НТ2Д-ренептОров, амцерозида и MDL 100907, также осуществляется поиск новых “сбалансированных” антагонистов дофамин/5-НТ2Д-реценто-ров. Регулирование дофаминергической системы посредством фармакологического воздействия па рецепторы серотонина является сутью нового подхода в лечении психозов. Существует предположение, что 5-НТ2А-рецепторы могут быть вовлечены в реализацию анти депрессивных эффектов антидепрессантов, поскольку проявление терапевтического эффекта и снижение числа 5-НТ2д-рецепторов, а также десешизация нейромедиаторных механизмов, опосредуемых 5-НТ2А-рецепторами, совпадают по времени [Kendall D.A., Nahorski S.R., 1985, Idzikowski С. et al., 1986, Sugrue M.F., 1983]. Кроме того, как показали клинические исследования, антагонисты 5-НТ2А-рецепторов, низо-тифеп, ритапсерин, пефазодон обладают антидепрессивной активностью [Leysen J.E. et al., 1983, Reyntjens A. et al., 1986, Standal J.E., 1977]. По-видимому, 5-НТ,л-рецепторы вовлечены а регуляцию сна. Имеются данные, что антагонист 5-НТ2д-реце-гтгрров, ритапсерин, улучшает качество сна. Антагонисты 5-НТ2Д-рецепторов увеличивают медленную фазу сна [Idzikowski С., -1986], а агонисты этих рецепторов сокращают фазу сна быстрого движения глаз [Dugovic С. et al.,1989]. 5-НТ2Д-рецепторы
и*
275
вовлечены в патогенез гипертонии и атеросклероза, вазоконстрикторные эффекты, опосредуемые 5-НТ^-реценторами, более выражены у таких пациентов и селективный антагонист 5-НТ2А-рецепторов, кетапсерии, эффективен в лечении указанных патологических состояний. Функция 5-НТ^-рецепторов может модифицироваться другими рецепторами. Агонисты 5-НТ1А-рецепторов при однократном введении блокируют поведенческие реакции, опосредуемые 5-НТ2А-рецепторами, что позволяет предположить существование механизма гетерологической взаиморегуляции между 5-НТ1А- и 5-НТгд-рецепторами [Arnt J. et al., 1989, Yocca F.D. et al., 1990, Eison A.S., Mullins U.L., 1996]. При хроническом введении селективные агонисты 5-НТ1Л-реценторов снижают число 5-НТ2А-рецепторов в коре головного мозга [Yocca F.D. et aL, 1991]. Поскольку эффекты агонистов 5-НТ)А-рецецторов наблюдались в условиях серотонинергической или норадренергической деиннервации [Yocca F.D. et al., 1991], сделано предположение, что в реализацию эффектов вовлечены ностсинаптические 5-НТ1А-рецепторы, стимуляция которых влияет на сосуществующие рядом 5-НТ2А-рецепторы [Eison A.S., Mullins U.L., 1996]. В пользу такого предположения свидетельствуют данные о том, что 5-НТ(Д- и 5-НТ2А-рецепторы оказывают противоположные эффекты па возбудимость нейронов префронтальных отделов коры головного мозга [Araneda R.C., Andrade R., 1991]. По-видимому, мелатонин также осуществляет гетерологическую регуляцию 5-НТ2А-рецепторов. При однократном введении мелатонин ингибировал поведенческие реакции, индуцированные агонистами 5-НТ^-рецепторов, и блокировал гидролиз фосфоинозитидов, но не оказывал эффекта на количество самих рецепторов в коре головного мозга [Eison А.Е., 1993]. Существует уникальный феномен в связи с 5-НТ^- и 5-НТ^-рецепторами, суть которого заключается в том, что агонисты и антагонисты 5-НТгд- и 5-НТ^-рецепторов при длительном использовании вызывают одни и те же эффекты —снижение числа этих рецепторов, снижение интенсивности гидролиза фосфоинозитидов и ослабление поведенческих реакций, опосредуемых этими рецепторами [Leyscn J.E. et al., 1986, May P.C. et al., 1986, Conn P.J., Sanders-Bush E., 1986, BuckholtzN.S. et al., 1986, Leysen J.E. et al., 1989, McKenna D.J. et al., 1989]. Кроме того, деиннервация, вызываемая перерезкой серотонинергических нервов или химическим воздействием, не влияет па количество 5-НТ^-рецепторов, интенсивность гидролиза фосфоинозитидов и проявление поведенчес
276
ких реакций, опосредуемых этими рецепторами [Blackshear И.А. et al., 1981, Conn P.J., Sanders-Bush E., 1986, Eison A.S. et al., 1989, Leyson J.E. et al., 1983]). Денервация, вызываемая разрушением норадренергических структур, также не оказывала заметного эффекта на количество и функционирование 5-НТ^-рецепторов [Eison A.S. et al., 1988]. Результаты этих исследований доказывают, что 5-НТ2А-рецепторы расположены на ност-синаптической мембране и регулируются принципиально иным способом по сравнению с рецепторами других моноаминов, количество которых, также как и чувствительность, увеличивается в условиях денервации, а агонисты и антагонисты при длительном применении оказывают противоположный эффект. Полагают, что нетипичное "поведение” 5-НТ2А-рецепторов может быть обусловлено достаточно низким сродством этих рецепторов к серотонину, в связи с чем, в нормальных условиях рецепторы лишены возможности взаимодействовать с серотонином. При введении антагонистов в хроническом режиме количество и чувствительность рецепторов может снижаться, что является по сути защитным механизмом клетки [Leysen J.E. et al., 1989, Trejser S., Kellar K.J., 1980]. Другое предположение заключается в том, что антагонисты уменьшают число и чувствительность 5-НТ2а-рецепторов, поскольку функционируют как “инверсированные агонисты’’, что было продемонстрировано в экспериментах с 5-НТ^-рецепторами [Sanders-Bush Е., 1994]). Было обнаружено, что в клетках, экспрессирующих 5-НТ^-ре-цепторы, базальный уровень гидролиза фосфоинозитидов, т.е. уровень гидролиза в отсутствии агониста, в несколько раз выше, но сравнению с клетками, лишенными этих рецепторов. Исследования способности антагонистов 5-НТ2С-рецеиторов влиять на базальный уровень гидролиза фосфоинозитидов позволили разделить их на 2 группы. Антагонисты 5-НТ2С-рецепторов, получившие название “нейтральные антагонисты”, например, 2-бромо-ДСД, блокировали гидролиз фосфоинозитидов, индуцированный серотонином, но сами по себе пе понижали базальный уровень гидролиза фосфоинозитидов. Антагонисты, получившие название “инверсированные агонисты”, например, майнсерип, ингибировали гидролиз фосфоинозитидов, стимулированный серотонином, и сами по себе снижали базальный уровень гидролиза фосфоинозитидов. Поскольку 5-НТ^.-рецепторы способны стимулировать независимый от агониста гидролиз фосфоинозитидов, было высказано предположение, что некоторое количество этих рецепторов пребывает в
состоянии сопряжения с G-белком в отсутствие агониста, индуцируя определенный уровень гидролиза фосфоинозитидов, а в случае взаимодействия ’“инверсированных агонистов” с рецептором, конформация рецептора изменяется, он выходит из комплекса с G-белком, и гидролиз фосфоинозитидов подавляется. В пользу такой гипотезы служат экспериментальные данные о том, что антагонисты, которые способны подавлять базальный уровень гидролиза фосфоинозитидов, т.е. “инверсированные агонисты”, также снижают число 5-НТ2А-рецеиторов. Напротив, антагонисты, неспособные влиять на базальный уровень гидролиза фосфоинозитидов, т.е. ’“нейтральные антагонисты", не изменяют количество 5-НТ2Д-рецепторов [Sanders-Bush Е., 1994]. “Нейтральные антагонисты" функционируют как классические антагонисты: связываются с рецептором и препятствуют связыванию агониста, тем самым блокируя эффекты, вызываемые агонистом, при этом не оказывают какого-либо эффекта сами но себе. Было высказано предположение о том, что конформационные изменения 5-НТ2А-рецепторов, вызываемые '‘инверс-агонистами ”, могут служить сигналом для запуска механизма интернализации рецепторов [Sanders-Bush Е., 1994, Sanders-Bush Е., 1994]. Эта гипотеза получила подтверждение в экспериментальных исследованиях in vivo и in vitro, показавших, что клозапин и некоторые другие антагонисты 5-НТ2Д-рецепторов при длительном воздействии индуцируют интернализацию рецепторов в составе эндосом и везикул в глубь клеток [Berry S.A. et al., 1996, Roth B.L., 1997].
Ген, кодирующий 5-НТ2П-рецептор, локализован- в хромосоме 2q36.3-2q37.1. мРНК 5-НТ2р-рецептора широко распространена в периферических тканях (плаценте, легком, ночке, сердце, кишечнике и желудке) и в меньшей степени в мозге человека [Schmuch К. et al., 1994,Kursar J.D, et al., 1996]. мРНК 5-HT2B-рецептора обнаружена во всех органах крысы и мыши, а у морской свинки в толстом и тонком кишечнике [Choi D.S. et al., 1996]. У крыс рецептор обнаружен в таких структурах мозга как amygdala, septum, гипоталамус, мозжечок. У грызунов активация 5-НТ2В-реценторов принимает участие в реализации анксиолитического эффекта и вызывает уменьшение grooming. Считается, что 5-НТ2Б-реценторы опосредуют сужение брыжеечной артерии у гипертензивных, но не у нормотензивных крыс [Watts W.T. et al., 1995].
5-НТ2П-реценторы опосредуют сокращение фундальной части желудка у крысы и эндотелий-зависимую релаксацию ярем-
278
пой вены у крысы и кошки и, возможно, легочную артерию у свиньи, посредством образования NO. Имеются данные, что активация 5-НТ2В-рецепторов, локализованных с фундальной части желудка, не сопровождается гидролизом фосфоинозитидов, что ставит под сомнение принадлежность этих рецепторов к виду 5-НТг-рецепторов [Сох D.A., Cohen M.L., 1996]. 5-НТ2Н-и 5-НТ2С-рецепторы характеризуются очень близкой фармакологической чувствительностью, поэтому существует немного соединений, с помощью которых можно было бы различать эти рецепторы [Nelson D.L., 1993]. В связи с этим существует проблема идентификации 5-НТ2В- и 5-НТ2С-рецепторов в тестах, оценивающих функциональную активность этих рецепторов с помощью химических соединений, поскольку функции одного рецептора могут быть присвоены другому [Kennett G. А., 1993, Kennett G.A., 1994]. Появление новых высокоселектив-пых лигандов 5-НТ2В- и 5-НТас-реце[ [торов дозволит более точно установить функции рецепторов и выявить их роль в патогенезе различных заболеваний. Полагают, что 5-НТ2В-рецепторы вовлечены в патогенез мигрени, поскольку неселективные антагонисты этих рецепторов, низотифен и майсерин, используют для профилактического лечения данного заболевания. Такое предположение основано на экспериментальных данных о том, что серотонин индуцирует эндотелий-зависимую релаксацию сосудов через образование NO [Brunning Т.А. et aL, 1994], a NO, раздражая афферентные чувствительные волокна, стимулирует выход нейромедиаторов и вазоактивных пептидов [Wei Е.Р. et al., 1992, Holzer Р., Jocie М., 1994, Hughes S.R., Brain S.D., 1994], веществ, как считают, являющихся триггерами приступа мигрени. Антагонизм на уровне 5-НТ3(1-рецепто-ров блокирует механизм формирования приступа [Fozard J.R., Kalkman Н.О., 1994].
Ген 5-НТ2С-рецептора локализован в Xq24 хромосоме. 5-НТ2с-реценторы обнаружены в наибольшем количестве в хориоидальном сплетении и в меньшей степени в гиппокампе, волосатом теле, Черной субстанции у крысы. У человека обнаружено сходное распределение рецепторов. В настоящее время пет доказательств , существования 5-НТэс-рецепторов в периферических тканях 1 [Hoyer D. et al., 1993]. Обнаружены функциональные и нефуик-|циоиальные изомеры 5-НТ^-реценторов, которые образуются с Цюмощью альтернативного сплайсинга мРНК или редакгирова-[ния мРНК. В результате редактирования в мРНК 5-НТ2С-рецеп-ктора вместо аденозина присутствует гуанозин. В настоящее вре-|МЯ идентифицировано 7 функциональных изомеров 5-НТ2С-ре-
279
цепторов. Изомеры не различаются но своей фармакологической чувствительности. Имеются данные, что различные изомеры могут с различной эффективностью сопрягаться с фосфолипазой [Bums С.М. et al., 1997]. Присутствие большого количества 5-НТ^.-рецепторов в хориоидальном сплетении позволяет считать, что данные рецепторы участвуют в продуцировании спишюмоз-говой жидкости. Полагают, что у человека и крысы анксиогешгые и панические эффекты агониста б-НТ^-рецепторов, мСРР, опосредуются 5-НТ2С-рецеиторами [Kennett G.A. et al., 1994]. Такое заключение согласуется с данными о том, что в модельных экспериментах селективные антагонисты этих рецепторов вызывали эффекты наподобие анксиолитических [Kennett G.A. et al., 1997]. Ингибиторы захвата серотонина уменьшают чувствительность 5-НТ^-реценторов, что, возможно, является одним из механизмов их аитидепрессивного действия [Kennett G.A. et al., 1993]. Аго-Ш1ст 5-НТк.-рецепторов, мСРР, может вызывать нарушение спа у человека, в то время как песелективный антагонист 5-НТ2-рецеп-торов, ритапсерин, улучшает качество сна, возможно, посредством связывания с б-НТ^-рецеиторами [Kennett G.A. et al., 1993]. Мыши-мутанты, в организме которых отсутствует 5-НТ^-рецептор, склонны к судорогам, проявляют беспокойство, что выражается в увеличенном приеме пищи и нарушении конгитивных функций. Такие мыши не чувствительны к гинолокомоториому и анксио-генному действию мСРР. Полагают, что 5-НТ^-рецеиторы вовлечены в механизм действия неселективных антагонистов б-НТ2-реценторов, метисергнда, пизотифена, майсерипа и цинрогептади-на, используемых для профилактики мигрени. В пользу этого предположения свидетельствуют данные о том, что введите мСРР лицам, страдающим мигренью, вызывает у них приступы головной боли наподобие мигренозных [Brewerton T.D. et. al., 1988, Gordon M.L. etal., 1993].
Агонистами 5-НТ2-реценторов являются триптамин, N-ме-тилгринтамии [Cory R.N., Osman R. et al., 1986].
Антагонистом 5-НТ - и 5-НТ2-рецепторов является метио-тепин [Hollenberg N.K., 1988].
Наивысшая плотность 5-НТ2-рецепторов определяется в коре мозга, в полосатом теле, прилежащем ядре, обонятельной луковице и мембранах тромбоцитов; б-НТ2- рецепторы опосредуют серотонин-индуцированное сокращение периферических сосудов, трахеи, бронхов, агрегацию тромбоцитов [Leysen J.G., Clerck F. et at, 1984].
Арилоксиалкилимидазолины представляют собой новый класс лигандов б-НТ2-рецепторов; они конкурировали с 1251-ЛСД за связывание с 5-НТ2Л и 5-НТ^ подтипами серотони
280
новых рецеп-торов фибробластов мышей [Siegel B.W., Freedman J. et al., 1996[.
В клетках опухоли почек экспрессировали копию ДНК 5-НТ2-рецепторов. Полученные рецепторы по своим свойствам не отличались от нативных. Значения Kd и Bmaj. связывания 3Н-спинерона для них составляли 0,91 нМ и 9467 фмоль/мг белка [Apud J.A., Cjrayson D.R. et al., 1992]. 5-HT2- и 5-НТ1С- рецепторы кодируются разными генами, хотя и содержат в своей структуре высококонсервативные трансмембранные домены, имеющие до 40% гомологии [Hartig P.R. 1989].
5-НТ2-реценторы имеют видовые различия. Так, эрголины, не содержащие заместителя в положении N, эрголинового ядра, проявили большее сродство к 5-НТг-рецепторам свинок, обезьян и человека, а соединения, содержащие Nt-изопропиловый заместитель—к 5-НТ2-рецеигорам крысы [Cushing D.J., Cohen M.L., 1993].
Лигандная специфичность 5-НТ2Л рецептора (ритансерин > спипероп > 5-НТ > SB204741) отличается ст таковой 5-НТ2В-рецепторов (5-НТ > ритансерин > SB204741 > спипероп) и 5-НТ2С-рецепторов (ритансерин > 5-НТ > спипероп = SB204741) [Bonhaus D.W., Bach С. et at, 1995]. В COS-1 клетках экспрессировал ген 5-НТ2В- рецептора человека. Полученные рецепторы отличались от крысиных 5-НТ2В-рецецторов. Последние имели большое сходство с 5-НТ1П-рецеиторами человека. мРНК для 5-НТв- рецептора человека найдена в почках, легком, сердце [Choi D.S., Birraux G. et al., 1994]. Другие исследователи обнаружили 5-НТ2В-рецепторы в мозге, селезенке, поджелудочной железе, но не в сердце [Bonhaus D.W., Bach С. et al., 1995].
Первичным ответом на стимуляцию 5-НТ2-рецепторов является ускорение обмена инозитол фосфатов [Leysen J.G., Clerck F. et al., 1984]. В культуре клеток из опухоли молочной железы серотонин стимулировал накопление инозитолфосфата, действуя на 1 тип 5-НТ рецепторов с Kd=l,27 мкМ. Антагонисты 5-НТ2-рецеп торов кетансерин и спипероп блокировали действие серотонина [Cory R.N., Bruno R. et al., 1987]. На основании этих данных было установлено, что 5-НТ2-рецепторы сопряжены с G-белками, посредством которых они регулируют активность фосфолипазы С [Apud J.A., Cjrayson D.R. et aL, 1992].
Как уже отмечалось, 5-НТ^-рецепторы, до недавнего времени ошибочно считавшиеся серотониновыми рецепторами 5-НТ1С-типа, в настоящее время относят ко второму типу серотониновых рецепторов, поскольку установлена высокая гомология 5-НТ2А- и 5-НТ1С-аминокислотных последовательностей, одинаковые интроп/экзонные характеристики генов, аналогичная система вторичных посредников (стимуляция фосфо
281
липазы С), сходная чувствительность к ряду селективных лигандов. Обращают на себя внимание данные о том , что 5-НТ,( -рецеиторы и М-холинореценторы регулируют проницаемость одних и тех же хлорных каналов [Шигапцов С.Н., 1996].
Серотонин и адреналин обладают аддитивным действием на фосфолипидную сигнальную систему. Если по отдельности серотонин стимулировал обмен фосфоинозитидов в человеческих тромбоцитах на 72,5%, а адреналин — на 50%, при совместном их внесении интенсивность обмена фосфоинозитидов возрастала на 129,3%. Эффект серотонина подавлялся кетансерином, а адреналина — антагонистом альфа-адренорецепторов иохимбипом [Rigatti B.W. et al., 1992].
5-HT:j-рецепторы найдены в основном в периферических тканях, где они регулируют сокращение гладких мышц, деполяризацию ностганглииарных волокон [Peroutka S.J., 1988]. Так, в парасимпатических нервах 5-НТэ-рецепторы располагаются пресинаптически; их активация вызывает высвобождение ацетилхолина [Moran A., Velasco С. et al., 1994].
Клонирован и экспрессирован в ооцитах Xenopus геи 5-НТ3- рецепторов. Информационная РНК, ответственная за синтез этого рецептора, найдена в головном и спинном мозге, сердце [Maricq A.V., Peterson A.S. et al., 1991]. Агонистом данного тина рецепторов является 2-метилсеротонип [Derkach V. et al., 1989], а антагонистами: MDL-72222 [Leonhardt Sigrun, Herrick D.K. et al., 1989], QR-38032F [Derkach V., Surprenant A. et al., 1989], JCS-205-930 [Yoshikawa S., Ishitani R., 1985], гранисет-рои, ондасетроп, QR-65630, репзаприд, закоприд [Van Wijngaarden J. et al., 1990], LY-27359 (более сильный антагонист, чем закоприд, ICS-205-920 и QR-38082 но влиянию на кишечник) [Cohen M.L., Blooinquist W.M. et al., 1990], ADR-851 [Stark R,, Sullivan T.M. et al., 1990]. Эфиры и амиды бепзимидазолон-1-карбоновой кислоты представляют собой еще один класс антагонистов 5-НТ3-реценторов [Turconi M.,Donetti A. et al., 1991], Y-25130 — селективный антагонист 5-НТч-рецелторов, обладающий слабым сродством к ^-гистаминовым рецепторам [Sato N., Sakamori М. et al., 1992]. JM-060-4,5,6,7-тетра-гидробензимидазоловое производное —более сильный антагонист 5-НТ3 рецепторов сердца, по сравнению с предыдущими лигандами [Miyata К., Kamato Т. et al., 1991]. Мета-хлорфенилниперазин —антагонист миокардиальных 5-НТ3- рецепторов [Sato N., Sakamori М. et al., 1992]. RQ-12915 —высокоактивный антагонист 5-НТ3-рецепторов с противорвотпым действием [Fitzpatrick L.R., Lambert R.M. et al., 1990]. Эффекторной системой, сопряженной с 5-НТ3-рецепторами, являют
282
ся ионные каналы. На изолированных нейронах и изолированных фрагментах мембран серотонин вызывал ток, переносившийся катионами. Эффекты серотонина воспроизводились агонистом 5-НТ3-реценторов 2-метилсеротонином и блокировались антагонистами JCS-205-930 и QR-38032F и не зависели от содержания ГТФ и G-белков. Это означает, что 5-НТ3- рецепторы напрямую связаны с ионными каналами, что позволяет серотонину участвовать в быстрой синаптической передаче [Derkach V., Surprenant A. et aL, 1989]. Величина отношения Na/К для активируемых серотонином каналов составляла 0,94 [Malone Н.М. et al., 1991].
Думуис А, и соавторы в первичной культуре нейронов бугорка эмбрионов крыс и на мембранах нейронов гиппокампа морских свинок обнаружили пизкоаффинные серотониновые рецепторы, положительно сопряженные с адепилатциклазой и предложили их назвать 5-НТ4-реценторами [Dumuis А., Bouhelal R. et al., 1988].
Идентичные рецепторы были обнаружены в подвздошной кишке, где они опосредовали сокращение и расслабление кишечника, вызванные серотонином [Costall В., Naylor R.J., 1993], И в миокарде предсердий, где опосредовали положительный инотропный эффект серотонина [Villalon С.М., den Воет М.О. et aL, 1991].
Известно 3 химических класса агонистов 5-НТ^-рецеиторов: 5-замещениые индолы (5-НТ,. б-мегокситриптамин), бензамиды (рен-запрцд, закон рид, ци.'анрид) и бепзимидозолоны (BIMUS). Эти вещества обладают сродством и к 5-НТ3-рецецторам. Так, бензамиды одновременно являются антагонистами 5-НТд- рецепторов.
Антагонистом 5-НТ4-рецеиторов является JCS-205930 в микромолярных концентрациях (в наномоляриых концентрациях он —блокатор 5-НТ 3-рецепторев) [Pank К.К., Tangri К.К. etal., 1991].
5-НТ4-рецепторы разных органов далеко не однородны. Так, 5-НТ4-рецепторы миокарда предсердий отличаются от таковых ЦНС большей аффинностью к серотонину, меньшей к репзанриду, еще меньшей к цизанриду. В мозге оба бензамида одинаково активны в отношении 5-НТ4- рецепторов и более эффективны, .чем 5-НТ [Kaumann A.J., Sanders L. et aL, 1991].
Положительный илотроплый эффект агонистов 5-НТ4~ре-центоров обусловлен повышением амплитуды тока Саг" (1Са) в предсердных кардиомиоцптах человека и свиней. Увеличение 1Са зависит от протеин киназы А (добавление в среду ингибитора фермента блокирует эффект агонистов) [Ouadid Н., Seguin J. et aL, 1992].
283
Предварительное добавление в среду цАМФ или изопрена-лина также предо!вращает 1Са. Наконец, усиление 1Са 5-НТ4 агонистами полностью подавляется JCS-205930 в дозе, блокирующей 5-НТ4-рецецторы (10 мкМ). Вышеизложенное позволяет заключить, что серотонин регулирует концентрацию Са в предсердных миоцитах через 5-НТ,-реценторы, положительно сопряженные с адепилатциклазой [Ouadid Н., Seguin J. et al., 1991], повышая уровень цАМФ и активность цАМФ зависимой проте-инкиназы [Kaumann A.J. et al., 1991, Pank K.K. et al., 1991].
Очевидно, вышеизложенным не исчерпывается все многообразие 5-НТ рецепторов. Синтез новых лигандов позволит открыть их новые типы и подтипы.
В последние годы клонированы три новых типа серотониновых рецепторов: 5-HTs, 5-НТ6 и 5-НТ?, но их физиологические функции еще не известны. Атипический антипсихотический препарат клозапин имеет высокое сродство к 5-НТ5- и 5-НТ6-реценторам.
Таким образом, рассмотренные данные о серотониновых рецепторах указывают на их гетерогенность как в ЦНС, так и в периферических тканях (ганглии, гладкомышечные органы). Однако приведенные сведения не позволяют дать их полной классификации и сделать вывод о соотношении между фармакологически выявленными серотониновыми Д-, Т- и М-рецепторами и биохимически идентифицированными серотониновыми 7 типами серотониновых рецепторов. Использование избирательных серотониновых агонистов и антагонистов и проведение комплексных фармако-биохимических исследований должны дать более полное представление о специфических свойствах тех или иных серотониновых рецепторов и их физиологических функциях.
5.4. Молекулярные аспекты функционирования серотониновых рецепторов
Имеющиеся данные о функции серотониновых рецепторов благодаря выделению в чистом ваде и изучению трансформации молекулярного сигнала серотонина в биохимический ответ клетки свидетельствуют о том, что 5-НТ,-, 5-НТ.,-, 5-НТ4-рецепторы принадлежат к классу рецепторов, сопряженных с G-белками. G-белки, связанные с 5-НТ-рецепторами, управля
284
ют тремя эффекторными системами: адепилатциклазой, подавляя ее активность в случае передачи сигнала от 5-НТ1Л, 5-HT1D, 5-НТ1П, 5-HTjE, 5-HT1F рецепторов и повышая —в случае возбуждения 5-НТ4-рецеиторов; фосфолипазой С (5-НТ1Е и 5-НТг-рецецторы), стимулируя фосфоинозитидный обмен, и калиевыми каналами (5-НТ1Л-рецепторы).
5-НТ3-рецепторы структурно и функционально отличаются от предыдущих рецепторов. Они относятся к классу рецепторов, напрямую связанных с ионными каналами.
Недавно выявленные 5-НТ6- и 5-НТ7-рецеиторы присутствуют в стриатуме, обонятельном бугорке, коре и гиппокампе. 5-НТ,- рецепторы сопряжены с калиевыми и кальциевыми каналами и могут регулироваться некоторыми нейролептиками.
B.Ilien и соавт, (1982) провели исследование селективного включения метки в солюбилизированный рецептор серотонина мозга крыс и собак, используя 3Н-нроизводпое антисеро-тонин-ергического препарата кетансерииа. Для солюбилизации серотониновых рецепторов микросомы мозга обрабатывали в течение 15 мин 0,25% лизофосфатидилхолином (0 °C, pH 7,0) в присутствии 1 мМ ЭДТА. Для снижения неспецифического связывания Н-кетансерииа радиолигандный анализ проводили при 30—50 “С (время инкубации 20 мин) и разделяли связанную и свободную метку с использованием активированного угля в присутствии 2% бычьего сывороточного альбумина. Пипампероп, метисергид и спинерон одинаково эффективно конкурировали с 3Н-кетацсерином за связывание с солюбилизированными рецепторами. Концентрация рецепторов в экстракте мозга собаки составляла -66% от их концентрации в мозге мышей. Диссоциация комплекса чН-кетансе-рин — серотониновый рецептор подчиняется кинетике первого порядка (t, 2 диссоциации при 30 — 50 °C равен 7,5 мин) и замедляется при охлаждении.
Большое значение для изучения биохимической природы серотониновых рецепторов имеют фотоаффинпые лиганды этих рецепторов. Согласно данным J.С.Shih и S.H.Cheng (1980), фотоактивируемос производное серотонина 3Н-нитроазидфе-пилсеротонин связывается с мембранами мозга человека с такими же параметрами, как 3Н-серотониц (Кд=1,1 нМ, 8^=0,32 нмоль/1' белка) с участками с высоким сродством. Участки, обладающие низким сродством к серотонину, данный фотоли-гапд не насыщает. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецил сульфата натрия меченных 3Н-питро-азмдсеротонином белков мембран из ткани коры головного мозга 24-летнего мужчины позволил выявить включение трития
285
в белки с относительной молекулярной массой 80 000, 49 000 и 35 000. В присутствии избытка серотонина включение метки не наблюдалось. Указанные белки метились в коре мозга пожилого человека (65 лет), однако в меньшей степени, что соответствует имеющимся сведениям об уменьшении связывания серотонина в головном мозге при старении.
D.S.Heron и соавт. (1980) обнаружили значительное влияние подвижности липидов мембран головного мозга мышей на связывание серотонина. Этот факт имеет большое значение для понимания не только механизмов функционирования серотониновых рецепторов, но и причин их неоднородности. В результате проведенных экспериментов было показано, что увеличение микровязкости (р), определяемой но деполяризации флюоресценции липидного зонда 1,6-дифенил*1,3,5-гек-сатриена, синаптических мембран, обусловленное добавлением гемисукцината холестерина или стеариновой кислоты, приводит к повышению специфического связывания 3Н-серотопина в 5 раз. Связывание серотонина увеличивалось до тех пор, пока значение микровязкостп р не достигало 1,75 относительных единиц, а затем уменьшалось при дальнейшем ее увеличении. В то же время уменьшение микровязкости мембранных липидов при добавлении лецитина или линолеи-иовой кислоты сопровождалось небольшим, но заметным снижением связывания серотонина. Следовательно, связывающая способность серотониновых рецепторов зависит от их липидного микроокружения. Если предположить, что слабо- и силь-носвязывающие участки серотонинового рецептора расположены на различных уровнях вертикальной оси рецепторной молекулы, то полученные D.S.Heron и соавт. (1980) данные указывают, что при обычных физиологических условиях доступные для связывания серотониновые рецепторы составляют около 20% имеющихся в мембране участков, способных связывать серотонин. При увеличении микровязкости мембран может происходить вертикальное вытеснение снльпосвязыва-ющих участков серотонинового рецептора на поверхность мембраны и их вклад в общее связывание серотонина значительно повышается.
Связывание серотонина с рецепторами представляет собой лишь первый этан функционирования серотонинового рецептора. Один из возможных следующих этапов — активация ферментов (например, аденилатциклазы)— также зависит от подвижности липидов, причем с увеличением подвижности липидов активация серогошиюм адетшлатциклазы увеличивается. Следовательно, общий ответ клетки-мишени определяется двумя процессами: достушюстыо серотониновых рецепторов (опа умень
286
шается при увеличении подвижности липидов) н активацией серотонином адеиилатциклазы (опа увеличивается при увеличении подвижности липидов). Ответ клетки будет максимальным в случае оптимальной микровязкости ее плазматических мембран.
Продолжая рассмотрение участия липидов в серотониновой рецепции, необходимо отметить, что, по мнению D.W.Woolley и B.W.Gommii (1964), серотониновым рецептором является комплекс белок —Са — липцд. Из миоцитов были выделены ганглиозиды в комплексе с серотонином и меченым Са2+.
Образование этого комплекса способствует переходу Са2’ из водной фазы в липидную. В отсутствии ганглиозида серотонин пе влияет па транспорт Са2", а нейраминидаза —фермент, разрушающий гликозидную связь между сиаловой кислотой и углеводом, и ЭДТА, связывающая Са2\ в малых концентрациях резко уменьшают чувствительность миоцитов к серотонину.
Химическую природу макромолекул, связывающих серото-пип-ергические лиганды, изучили J.P.Bennett и S.H.Snyder (1976). Они обрабатывали нейрональные мембраны различными реагентами, ферментами и детергентами. Полученные ими результаты суммированы в табл. 13.
По-вид иному, противоречие этих данных и тех, о которых шла речь ранее, обусловлено различием центральных ц периферических серотониновых рецепторов; для первых наличие ганглиозидов и сиаловых кислот не имеет значения, но важны жирные кислоты. В то же время можно утверждать, что основную составную часть всех серотониновых рецепторов составляет белок, встроенный в плазматическую мембрану эффекторных клеток.
Эффект серотонина может быть опосредован цАМФ, содержание которого увеличивается после стимуляции серотониновых рецепторов в срезах ткани мозга крыс и обезьян, матки, сердца, в клубочковой зоне надпочечников.
Действие серотонина на слпаитосомы коры мозга, характеризующиеся накоплением цАМФ, опосредовано активацией аденилатниклазы.
G.Filllon и М.Р.Fillion (1980) показали, что иостсинаити-ческие серотониновые рецепторы могут находиться в различных конформационных состояниях. Переход рецепторного белка из одного состояния в другое моделирует активность эффекторной системы — серотоннпочувствительной аденилат -циклазы. В состоянии покоя система узнавания для серотонина связывает его с низким сродством.
287
Таблица 13.
Влияние различных воздействий на мембраны коры головного мозга крыс на специфическое связывание эН-серотонина и 3H-LSD | Ley sen J.E., 1981]
Вещество 3Н-ссро-тошш 3Н-LSD Структуры, имеющие значение для связывания
Сульфгидрильные реагенты 44 44 SH
Карбоксильные реагенты 444 44 соон
Реагенты на триптофан Г 4
Трипсин 44 44 Интегральный белок
а-Химотрипсин и 4
Фосфолипаза А 444 444 Жирные кислоты
Фосфолипаза D Т t —
Нейраминидаза Т ? —
Тритон X 100 444 444
Деэоксихолат 444 444 Мембранные структуры
Твин 44 44 1/
Условные обозначения: 1 —снижение; Т —увеличение ТТ— на 50%; Т< 50%;
ТТТ> 50%
При взаимодействии агониста, но не антагониста, рецешор переходит в промежуточное состояние, стабилизируемое ГТФ; это состояние сопровождается активацией аделилатниклазы. Процесс конформационного перехода закапчивается формированием состояния, ври котором серотонин связывается с высоким сродством (состояние десенситизации) и больше нс может стимулировать аденилатциклазу.
Имеющиеся данные о механизмах функционирования раз-лич-пых серотониновых рецепторов, их локализации и селективных лигандах обобщены в табл. 14.
288
Таблица 14.
Серотониновые рецепторы
Подтип Селективный агонист Селективный антагонист Локализация Эффекторная система Функция
5-НТ) А 8-ОН-DPAT WAY 100135 Ядро шва Аденнлат-циклаза (ингибирование). Увеличение калиевой проницаемости (гипер-поляриза-ция) Ауто-Рецеп- тор
5-НТ1В - - Черная субстанция ** “
“5-HTlD Суматриптан - Сосуды ГОЛОВНОГО мозга — Суживание сосудов
5-НТ)е Кора головного мозга, полосатое тело
5-HT1f - Головной мозг, периферия -
5-НТ2а (Д-рецеп-торы) альфа-метил-5-НТ Кеган-серин, LY338S7. MDL 100,907 тромбоциты, гладкие мышцы, кора головного мозга Активация фосфолипазы С. Уменьшение калиевой проницаемости (медленная деполяризация) Агрегация тромбоцитов, сокращение МЫШЦ, нейрональное возбуждение
S-HTjb “— " LY53857 Дно желудка Сокращение
I9.3tp.227
289
Таблица 14. Продолжение.
5-НТ2С ** LY53857 Хориоидное сплетение -
5-НТ3 (М-рецеп-торы) 2-Мегил-5-НТ Ондансетрон, Тропи-сетрон Периферические нервы Увеличение проницаемости натрия и калия. Быстрая пшерпо-ляризацня Нейрональное возбуждение. Высвобождение серотонина
5-НТ4 Рензап-рид GR 113808 Гиппокамп, желудочно-кишечный тракт Активация аденилат-циклазы. Уменьшение калиевой проницаемости (медленная деполяризация) Нейрональное возбуждение. Ингибирование высвобождения серотонина. Высвобождение ацетил-холина
5-HTs - - Гиппокамп Не известна Не известна
5НТ6 - - Полосатое тело Активация аденилат-циклазы Не известна
5-НТ7 - - Гипоталамус, кишечник ft L й Не известна
По нашему мнению, в процессе дальнейшей разработки концепции механизмов функционирования серотониновых рецепторов необходимо учитывать их гетерогенность, а также данные о чувствительности связывания 3Н-серотопина с нейрональными мембранами к ионному составу (Са2+, Na+, К+) и нуклеотидам (АТФ, ГТФ и ГДФ).
290
Кроме того, целесообразно изучить возможности изменения сопряжения различных популяций серотониновых рецепторов с обменом фосфолипидов, с аденилатциклазой, фосфолипазой С, ионными каналами и другими мембранными структурами от возраста, пола и циркадных ритмов.
5.5. Серотониновые рецепторы — мишень действия ЛВ
Многие психотропные средства реализуют свою фармакологическую активность посредством взаимодействия с серотониновыми рецепторами.
Имеются сведения о том, что серотонинергические нейроны принимают участие в каталептогенном действии нейролептиков. Данный эффект нейролептиков уменьшается при разрушении серотонинергических нейронов п-хлорфенила-ланином, ципрогептадином и 5,7-диокситриптамипом, но он усиливается при стимуляции серотониновых рецепторов.
По данным М.О.Майметс и Э.Э.Весар (1983), избирательный антагонист галлюциногенных серотониномиметических рецепторов ниренперои проявляет в коре лобной доли высокое сродство к рецепторам для нейролептиков, связывающих 3Н-спироперидол (Кд=4,6 нМ), и угнетает двигательную активность интактных мышей. Кроме того, ниренперои полностью блокировал двигательное возбуждение, вызываемое фенамином,не влияя на федаминовую стереотипию. По мнению авторов, ии-ренперон взаимодействует только с такими рецепторами для нейролептиков, которые связаны с серотонинергической системой. Избирательное угнетающее влияние циренперона на двигательное возбуждение, вызываемое фенамином, а также повышение чувствительности к данному эффекту фенамина после отмены длительного введения пиренперона свидетельствуют о том, что возбуждающее влияние фенамина па моторную активность может реализовываться через 5-НТ2-рецепторы. Эти рецепторы принимают участие в действии нейролептиков па двигательную активность. Еще одним доказательством участия 5-НТ.,-се ротон иновых рецепторов в эффектах нейролептиков служат данные M.Mikmi и H.Mettrer (1984) о том, что после субхропического введения крысам хлорпромазина уменьшается
19*
291
число участков в коре головного мозга, которые специфически связывают 3Н-спиперон.
K.Tauimoto и соавт. (1983) обнаружили, что однократное или хроническое введение LiCi крысам снижает Кд и Виаяс связывания 3Н-серотонина в гиппокампе, ио не в коре мозга. Поэтому можно полагать, что ингибирующий эффект лития на серотониновые рецепторы может обусловить его действенность при аффективных расстройствах.
К другой группе психотропных средств, с которыми взаимодействуют серотониновые рецепторы, относятся антидепрессанты. G.Fillion и M.P.Fillion (1981) сообщили, что антидепрессанты имипирамин, хлоримипрамин, амитриптилин, тримни-рамин, дезипрамин, доксепип, иприндол, миансерин, флуоксетин и фенфлурамин в концентрации 10 пМ изменяют конформационное состояние постсипаптических серотониновых рецепторов сипаптосомальпых мембран головного мозга лошадей и крыс. Эти вещества уменьшали Кд комплекса 3Н-серотонипа с сипан-тосомальпыми мембранами в 4—9 раз. Другие ЛВ, такие как нейролептики галоперидол, флуфепазин, хлорпромазин, антагонисты серотонина цинапсерин, метисергид, метерголин, метиоте-иип(ЮнМ), в этом отношении были не активны. Следовательно, действие антидепрессантов на ностсинаптические серотониновые рецепторы специфично. Оно не обусловлено прямым взаимодействием с участком серотонинового рецептора, связывающим серотонин, так как они имеют низкое сродство к этому участку.
Возможно, ч то антидепрессанты взаимодействуют со специфическими участками, связывающими эндогенные имипрамино-подобные лиганды; в этом случае они индуцируют конформационное изменение серотониновых рецепторов по аллостерическому механизму. Нельзя также исключить, что антидепрессанты изменяют физико-химические свойства мембран в непосредственной близости от серотониновых рецепторов. Вещества, которые вызывают переход серотониновых рецепторов в высокоаффинное состояние, кроме антидепрессантов, представляют собой серотониновые агонисты.
G.Fillion и M.P.Fillion (1981) показали, что в соответствующей высокоаффипному состоянию конформации серотониновые рецепторы не могут передавать стимулирующее действие серотонина на аденилатциклазу. Следовательно, антидепрессанты вызывают десенситизацию серотониновых рецепторов.
292
Можно полагать, что описанный механизм вовлечен в реализацию клинических эффектов этих препаратов.
Согласно S.H.Snyder и S.J.Peroutka (1982), антидепрессанты влияют и на 5-НТ2-рецепторы, что сопровождается уменьшением их числа при хроническом, но не однократном введении. Данный эффект антидепрессантов также был избирательным, так как хлорпромазин и галоперидол не влияли на число этих рецепторов. Отметим, что содержание 5-НТ ^рецепторов в головном мозге крыс уменьшалось в небольшой степени только при хроническом введении имипрамина и ингибитора мопоаминооксидазы паргилина, но не других антидепрессантов. Итак, СЕШжение антидепрессантами числа 5-НТ2-рецепто-ров так же, как и числа бета-адренорецепторов в головном мозге, обусловлено интернализацией (даунрегуляцией) рецепторов в ответ на увеличение содержания серотонина в синаптической щели при действии антидепрессантов. Поскольку выраженность терапевтических эффектов антидепрессантов коррелирует с уменьшением числа 5-НТ2-рецепторов и бета-адреноренепгоров, S.H.Snyder и S.J.Peroutka (1982) предлагают использовать этот тест для определения числа указанных рецепторов при скрининге новых антидепрессантов.
Мы уже не раз отмечали, что антидепрессанты влияют и на другие рецепторы, например, гистаминовые, дофаминовые. Поэтому нужна ясность в вопросе, какую же роль тот или иной вид рецепторов ЦНС выполняет в общем спектре фармакологической активности этих препаратов. Хотя мы еще не можем констатировать, что эта проблема решена, тем не менее, считаем целесообразным высказать некоторые соображения.
По нашему мнению, необходимо учитывать различие быстрых непосредственных эффектов антидепрессантов и тех эффектов, которые возникают при их длительном использовании. Антидепрессанты (главным образом трициклические) имеют наибольшее сродство к гистаминовым рецепторам, высокое сродство к М-холинорецепторам, альфа-адренорецепторам, 5-НТ2-рецепторам и более слабое сродство к дофаминовым рецепторам и бета-адренорецепторам. В то же время при длительном (21 сут.) введении антидепрессантов в наибольшей степени уменьшалось связывание радиолигандов с 5-НТ2-рецепторами. При этом статистически достоверно снижалась связывающая способность бета-адренореиепторов и в ряде случаев 5-НТ -рецепторов, ио не М-холинорецепторов, альфа-ад-реноренепторов или дофаминовых рецепторов.
293
Таким образом, можно считать, что первоначальные эффекты антидепрессантов обусловлены в первую очередь их непосредственным взаимодействием с гистаминовыми, мускариновыми и альфа-адреноренепторами, а их отдаленные эффекты обусловлены снижением числа 5-НТ2-рецепторов и бега-адре-норецепторов.
Существуют сведения о возможности влияния с помощью серотонинергических средств и на другие физиологические функции. В частности, стимуляция центральных серотониновых рецепторов веществом МК-212 и фенфлурамином сопровождается развитием анорексогенного эффекта, причем эти вещества избирательно подавляют потребление крысами калорийной небелковой пищи. По нашему мнению, это важное преимущество серотонинергических средств ио сравнению с другими ЛВ, применяемыми при ожирении, например, по сравнению с амфетамином.
В последние годы большой интерес антагонисты серотонина привлекают как средства для лечения мигрени. Оказалось, что многие противомигреневые вещества обладают способностью взаимодействовать с теми или иными подтипами серотониновых рецепторов сосудов головного мозга человека. Препараты против острого приступа мигрени (алкалоиды спорыньи, суматриптан) имеют высокое сродство к 5-НТ1Д-рецепторам и более низкое —к 5-НТ)Л-рецепторам. Антагонисты 5-НТ,-рецепторов и/или 5-НТ1(,-рецепторов (метисергид, ципрогептадин, низотифеи, амитриптилин) являются профилактическими противомигрепевыми препаратами. Блокирование данных рецепторов в сосудах головного мозга и в нейрональной ткани сопровождается ингибированием деполяризации мембран нейронов и метаболизма арахидоновой кислоты. Суматриптан является производным триптана и обладает высокой, по не селективной активностью в отношении 5-НТ)В- и 5-HT1D-рецепторов (а также 5-НТ(р-репепторов) и низкой активностью в отношении всех других известных рецепторов нейромедиаторов, а также рецепторов возбуждающих, тормозных аминокислот, бензадиазепиповых, опиатных рецепторов [Beattie D.T. et al., 1994, Peroutka S.J. et aL, 1993, Peroutka S.J., McCarthy B.G., 1989]. Полагают, что суматриптан может подавлять приступ мигрени, сокращая церебральные сосуды и сосуды твердой и мягкой оболочек мозга посредством активации постсинацтических 5-НТ1В-рецепторов гладкомышечных клеток [Beattie D.T. et aL, 1994, Dechant К., Clissold S.,1992].
294
Эффект вазоконстрикции, по-видимому, предотвращает выход из сосудов в периваскулярное пространство активных веществ, способных раздражать афферентные периваскулярные нервные окончания волокон тройничного нерва. Некоторое количество 5-НТ1В-рецецторов локализуется в сосудах сердца [Ferro A. et al., 1995, Boulanger С.М. et al., 1995], поэтому при использовании препаратов, обладающих активностью в отношении данного типа рецепторов, могут возникать в некоторых случаях нежелательные эффекты со стороны сердечно-сосудистой системы. Противомигрепозный эффект суматриптан может также оказывать, активируя 5-НТ1П-рецепторы. Эффективность суматриптана как противомигренозиого средства стимулировала к созданию новых производных триптана, так называемых, высо-ко.селективных агонистов 5-НТ)В в-рецепторов 2-го поколения или триптанов 2-го поколения [Schoenen J., 1997, Goadsby Р.,1998]. От суматриптана эти препараты отличаются большей биодостуипостыо после перорального применения и способностью проникать через гематоэнцефалический барьер. К триптанам 2-го поколения относятся ризатриптап, золмитриптан, элетриптан, наратритггащфроватриптаи и другие.
Суматриптан, активируя пресипаптические 5-НТ1П-ауторе-центоры, ингибирует активность тройничного нерва па периферическом уровне, что наряду с вазоконстрикторным эффектом в отношении церебральных сосудов и сосудов оболочек мозга, как полагают, составляет суть противомигренозиого механизма этого препарата [Goadsby P.J., Olesen J., 1996, Schoenen J., 1997, Пухальскан Т.Г. и др., 1997]. Также как и в случае с 5-НТ1В-ренепторами, 5-НТ-реценторы обнаружены в ядрах raphe, где они, как полагают, являются лресипаитическими соматоден-дрическими ауторецеп’горами. Триптаны 2-го поколения, проникая через гематоэнцефалический барьер, достигают нейронов ядер тройничных нервов и подавляют их активность посредством активации преем пиитических соматодендрических 5-НТ]В- и 5-НТ1П-ауторецепторов [Goadsby P.J., 1997, Goadsby P.J., Hoskin K.L., 1996, Cumberbatch M.J. et al., 1997]. Следует считать, что суть противомигренозиого действия триптанов 2-го поколения состоит в активации периферических и центральных 5-НТ)П ,п-рецепторов, что проявляется в эффектах вазоконстрикции сосудов, входящих в тригемино-васкулярную систему, и нейроицгибпрования тройнич-иых нервов на уровне периферических афферентных окончаний, а также на центральном уровне—ганглиев и ядер [Goadsby P.J., Olesen J., 1996,
295
Schoenen J., 1997]. В последние годы, благодаря появлению высокоселективных агонистов 5-НТ|П/Г1-рецепторов, прояснен механизм противомигренозных эффектов эрготаминсодержащих препаратов, изучение которых осложнялось способностью этих соединений взаимодействовать с широким спектром рецепторов [McCarthy B.G., Peroutka S.J., 1989, Perrin V.L., 1985, Tfelt-Hansen P. et al.,1995]. Показано, что эрготамин и дигид-роэрготамин купируют приступы мигрени также, как и триптаны 2-го поколения, активируя периферические и центральные 5-НТ1В О-рецепторы [Silberstein S.D., 1996, Goadsby P.J., Olesen J., 1996, Goadsby P.J., 1997].
Практический интерес имеет участие серотониновых нейронов в регуляции артериального давления. Было обнаружено, что серотониновые агонисты вызывают гипотензивный эффект у крыс со спонтанной гипертензией [Fuller R.M. et al., 1979] н у больных, страдающих гипертонической болезнью [Tuomilehto J. etal., 1977]. Другими словами, серотониновые рецепторы являются молекулами-мишенями не только для их агонистов, но и для ЛВ, имеющих иную фармакологи вескую характеристику.
Антагонистом 5-НТ2-реценторов кровеносных сосудов, тромбоцитов и бронхов является кетансерин —эффективное антигипертензивное средство. Кетансерин ингибирует способность серотонина стимулировать образование альдостерона и уменьшает периферическое сосудистое сопротивление. При внутривенном введении больным артериальной гипертонией кетансерин через несколько минут снижает систолическое и диастолическое артериальное давление. При длительном его применении системное и почечное сосудистое сопротивление остается сниженным, хотя рефлекторная тахикардия постепенно исчезает. Кроме того, кетансерин уменьшает выраженность перемежающейся хромоты у больных атеросклерозом артерий нижних конечностей.
Перспективным мы считаем использование серотонинергических средств в эндокринологии, так как хорошо известно участие серотониновых нейронов в регуляции гипофизарной секреции. Серотонинергические нейроны дорсальных ядер шва, иннервирующие гипоталамус, оказывают тормозное влияние па периодическое выделение гопадотроцин-рилизипг-фактора, который контролирует ритмическую секрецию лютеинизирующего гормона у овариэктомированпых животных. Серотониновые агонисты вызывают' увеличение высвобождения кортикотронип-рилизинг-фактора из гипоталамуса, секреции АКТГ и уровня
296
кортикостерона в сыворотке, а серотониновые антагонисты уменьшают секрецию АКТГ п тем самым оказывают благоприятный терапевтический эффект при болезни И цепко-Кушинга.
» » »
Подводя итог исследований в области биохимической фармакологии серотониновых рецепторов, следует выделить следующие наиболее важные факты:
1. Серотониновые рецепторы млекопитающих представляют собой множественные гомогенные макромолекулы, встроенные в плазматические мембраны, которые трансформируют молекулярный сигнал серотонина и его аналогов в специфический ответ клетки.
2. Серотониновые рецепторы локализованы на ире- и пост-сипа! пи веских мембранах; они присутствуют па нейрональных мембранах и миоцитах, а также в тромбоцитах, принимая участие в регуляции разнообразных функций ЦНС, периферических органов и агрегационной активности тромбоцитов.
3. Связывающие свойства серотониновых рецепторов и их сопряжение с эффекторными системами клеток зависят от липидного микроокружения.
4. Число серотониновых рецепторов можег изменяться под воздействием различных ЛВ: нейролептиков, антидепрессантов и др.
Перед исследователями в данной области стоят задачи:
1. Создание классификации серотониновых рецепторов, объединяющей все виды данных рецепторов и их эффекторных механизмов.
2. Анализ физиологических функций, опосредуемых серотониновыми рецепторами, на основе индивидуальных особенностей в содержании серотонина и его обмена.
3. Выяснение биохимических этапов трансформации стимуляции серотониновых рецепторов агонистами в физиологическую реакцию клетки, ткани, органа пли системы в норме и патологии п разработка новых избирательных серотонинергических лекарственных средств для лечения ряда психических, неврологических, сердечно-сосудистых, пищеварительных, аллергических, опухолевых и эндокринных заболеваний.
Мы считаем, что современный уровень развития молекулярной фармакологии позволит решить эти задачи, имеющие не только теоретическое, по и большое практическое значение.
Глава 6
ИМИПРАМИНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ
Одновременно с широким внедрением в клиническую практику трициклических антидепрессантов и появлением этих препаратов, меченных радиоактивными метками, в 70-х годах XX столетия начались всесторонние исследования молекулярных механизмов действия этой группы ЛВ. С одной стороны, было обнаружено, что имипрамип концентрируется в синаптических участках головного мозга крыс [Ishitani R. et al., 1972; Ishitani R., Iwamoto T., 1976, 1977], с другой стороны, была найдена корреляция между способностью имипраминоподобных трициклических азггидепрессантов ингибировать высокоаффишюе связывание серотонина с сннаптосо-мальиыми мембранами и обратный захват серотонина сипаптосо-мами [Carlsson А., 1970; Lidbrink Р. et al., 1971; Kannengiesser M.N. etal., 1973; Ishitani R.. Iwamoto T., 1978]. Кроме того, R.Ishitani и T.Iwamoto (1978) обнаружили, что связывание 3П-иминрамипа, но нс ^З-хлорпромазина и 3Н-диметакрипа, с синантосомами головного мозга крыс характеризуется насыщаемостью и высоким сродством. Эти данные, а также открытие в головном мозге рецепторов дтя экзогенных лигандов — опиатов [Pert С., Snyder S.H., 1973] и бензодиазепинов [Mohler Н., Okada Т., 1977; Squires R.F., Braestrup С., 1977], способствовали дальнейшему поиску и изучению участков, специфически связывающих представителей другой группы психотроп пых средств — трициклических антидепрессантов. В результате в 1979—1980 гг. появились сообщения R.Raisman и соавт. о существовании в различных отделах головного мозга крыс участков, специфически, с высоким сродством (Кд=4,0 пМ), быстро и обратимо связывающих 3Н-иминрамин. Эти участки были найдены также в головном мозге и тромбоцитах человека [Langer S.F.etal., 1980; Paul S.M. etal., 1980, 1981; Rehavi M. et al., 1980]; выявлена взаимосвязь участков узнавания нН-имипрамипа с системой обратного захвата серотонина [Rehavi M.Y. etal., 1981, 1983]. Все это позволило раду авторов постулировать наличие в голов
298
ном мозге млекопитающих иминраминовых рецепторов, функция которых заключается в специфическом узнавании трициклических антидепрессантов и трансформации полученного сигнала в изменение функции синаптической мембраны [Машковский М.Д. и др,, 1981, 1983; Рожанец В.В. и др., 1982; Langer S.F. et al., 1980; Biegon A., Raihlow Т.С., 1983].
В данной главе дан анализ имеющихся сведений об этих рецепторах и принципах их функционирования.
6.1. Локализация и аффинитет имипраминовых рецепторов
В настоящее время можно считать доказанным существование участков, связывающих 3Н-имш1рамип в головном мозге млекопитающих, включая человека, и на тромбоцитах крови. Параметры взаимодействия 3Н-имипрамниа с его участками специфического связывания представлены в табл. 15.
Связывания 3Н-имипрамина с клетками сердца и vas deferens не выявлено. Важно отметить, что повышение температуры инкубации с 0 до 37 °C приводит к необратимому уменьшению специфического связывания 3Н-имипрамипа с мембранами гипоталамуса в 2 раза. Данная деструкция участков, связывающих 3Н-имипрамин при 37 °C, ле предотвращалась избытком немеченого дезицрамина (10 мкМ) и не была обусловлена солюбилизацией этих участков, так как пе было различий в числе растворимых рецепторов, элюированных из мембран при ' 0 или 37 °C [Kinner W.J. et al., 1981]. В то же время Са2’-; зависимый ингибитор протеазы лейпелтин (200 мкг/мл) пол-i ностыо предотвращал деструкцию 3Н-имипраминсвязываю-щих участков при 37 °C, что указывает на разрушающее дейст-; вие протеаз, высвобождаемых из клеток, на участки связывания , и белковую природу этих участков.
Из результатов, приведенных в табл. 15, видно, что имеются различия в данных, касающихся головного мозга человека, полученных разными авторами; это может быть объяснено неодинаковыми методами получения мембран и условиями инкубации. В этом аспекте, по нашему мнению, заслуживают внимания результаты M.Rehavi и соавт. (1983), согласно которым при определе-! Пии параметров связывания липофильных веществ, таких как имип-
299
Таблица 15. Параметры специфического связывания 3Н-имипрамина' с препаратами мембран различных областей головного мозга н тромбоцитов2.
Источник мембран Кд нМ В„. фмоль/мг беж»
Головной мозг крысы
Кора 3,9*0.1 385*22
» 4,04*0,52 249*23
Гипоталамус 3,4±0Д 600*39
5,2*3,4 279*47
Полосатое тел о 2,75*0,45 164*11
Мозжечок «,0*3,1 60*11
Гиппокамп «,3*1.5 800*60
Головной мозг человека
Гипоталамус 6,7*1.0 500*57
1,72*0,14 1620*290
Кора 7.6* 1.9 301 *52
1,72*0,14 700
Гиппокамп 4,2* 1,2 263*50
Хвостатое ядро 4,6*1,5 219*13
Корк мозжечка 1,72*0.14 400
Тромбоциты человека 1,0-2,0 600—800
» V 4,6 683
После сол юбнлюашш
днгшоннном ЮД 667
Культура клеток нейробластомы N4TG1 5.4 712,2
1 Эксперименты проводились п присутствии различных концентраций 3Н-имипрамина (0,5— 13 нМ) при О —4“С.
2 Таблица составлена по данным R. Rarsman и соавт. (1980), М. Sette и соавт. (1981); W. J. Kinner и соавт. (1981), S. Z. Lander rr соавт. (1981), М. S. Briley и соавт. (1980). A. Davis и соавт. (1983), М. Rchavr и соавт. (1980).
рамин, с мембранами головного мозга необходимо использовать сравнительно низкие концентрации немеченого лиганда для выявления неснецнфического связывания радиолиганда. По данным этих авторов, специфическое связывание 3Н-нмипрамина (0,5 — 20 нМ) с синаптоеомными мембранами головного мозга крыс насыщаемо, а с миелиновыми и ядерными мембранами цеиасыщаемо. Кроме того, в нервом случае в отличие от второго связывание лигандов зависит от концентрации Ма+ в среде инкубации. Исходя
300
0,4 0,8 1,2 1.8 2.0 2,4 2.8 3.2. 3.6 4,0 ton IC^g (гроабоциты)
Рис. 52. Корреляция между ингибированием связывания ’Н-имип-рамина с мембранами клеток головного мозга человека и тромбоцитов человека. Значения log рассчитаны исходя из величин 1СМ (концентрации ЛВ, при которых они ингибируют связывание 3Н -имипрамина на 50%), выраженных в наномолях.
Атропин, фентоламин метиамид, галоперидол, норадреналин, дофамин, ГАМК и гистамин в кониентрапи' 10 мкМ были нс активны [Rehavi М. et ai., 1980].
из изложенного, величины параметров связывания имипрамина с мембранами клеток головного мозга зависят от многих факторов (чистоты выделяемых мембран, температуры, концентрации NaT и используемых лигандов), чем могут и быть обусловлены различия дашых, представленных в табл, 15.
Как равновесные, так и кинетические параметры взаимодействия 3Н-имипрамина с мембранами клеток головного мозга и тромбоцитами человека одинаковы [Rehavi М. et aL, 1980]. Между способностью различных ЛВ вытеснять 3Н-имиирамгш из его связи с мембранами клеток головного мозга и тромбоцитов человека имеет место корреляция (рис. 52). Следовательно, тромбоциты человека могут служить хорошей моделью для изучения имипрами-цовых рецепторов.
В этой связи особый интерес представляют данные о снижении числа участков, связывающих 3Н-имипрамин, па тромбоцитах у больных с депрессивными состояниями [Briley М. et aL, 1980].
301
M.Sette и соавт. (1981) провели исследования, направленные на уточнение локализации имипраминовых рецепторов в головном мозге, хотя еще ранее имелись предположения об их ассоциации с серотонинсвязывающими участками, так как существует корреляция между способностью ряда ЛВ, таких как циталапрам, флуоксетин и ниталапрам, ингибировать связывашге 3Н-имиирамина и снижать поглощение серотонина гипоталамусом [Langer S.Z. et al., 1980]. Было обнаружено, что электролитическое разрушение дорсального ядра шва в головном мозге крыс приводит к значительному снижению числа участков, связывающих 3Н-имипрамин в гипоталамусе и коре [Sette М. et al., 1981]. Вместе с тем сродство имипрамина к этим участкам не изменялось. Поскольку при таком разрушении ядра шва происходит дегенерация аксонов и окончаний серотонинергических нервов, можно считать, что 3Н-имипраминсвязывающие участки локализованы на окончаниях нервов, относящихся к серотонинергическим. К такому же выводу пришли M.Rehavi и соавт. (1983), которые выявили параллелизм между субклеточным рас-нредела тем участков, связывающих 3Н-имипрамин с высоким сродством, и поглощением 3Н-серотонина сипаитосомами при отсутствии Na+.
При изучении субклеточных участков действия имипрамина методом функционирования M.D.Wood и M.G. Willie (1983) показали, что 3Н-имипрамии ассоциирует с синапгосомалыюй фракцией как in vivo, так и in vitro.
При анализе специфичности имипраминсвязывающих участков головного мозга крыс было обнаружено, что трициклические антидепрессанты ( хлоримицрамин, дезметилимипрамин, дезипрамин, цротринтилин, амитриптилин и доксепин) в концентрации 5 —50 мкМ уменьшают связывание 3Н-имипрамина [Рожанец В.В. и др., 1982; Raisman R. et al., 1980]. В то же время лиганды а- и р-адренорецепторов, холицорецепторов, дофаминовых и гистаминовых рецепторов, ингибиторы мопоаминоксидазы, аминокислоты и ряд других средств высокого сродства к иминраминовым рецепторам не проявили. Однако ингибитор обратного поглощения серотонина флуоксетин и серотонин заметно влияют па специфическое связывание имипрамина, что еще раз указывает на ассоциацию имипраминовых рецепторов с системой обратного захвата серотонина.
302
Рис. 53. Снижение специфического связывания 3Н-нми-пра-мпна (фмоль/ мг белка) с мембранами клеток коры головного мозга крыс при внутрибрюшинном введении им имнпрамииа и дезметплимип-рамгша в дозе 10 мг/кг в день в течение 21 сут. По оси ординат -специфическое связывание 3Н -имипрамица [Barbaccia М. L. et aL, 1983].
6,2. Молекулярные механизмы функционирования имипраминовых рецепторов
Как мы уже отмечали, имипраминовые рецепторы локализованы lia постсипиитических мембранах серотонинергических нейронов. Такая локализация имипраминовых рецепторов дает возможность предполагать, что их функция заключается в регуляции обратного захвата нейронами серотонина. Возможно, имипрамин вытесняет серотонин из его узнающего участка, входящего в состав системы обратного захвата серотонина. Последнее предположение вероятнее, так как 3Н-имипрамин конкурентно вытесняется серотонином из его связи с мембранными везикулами тромбоцитов [Talvenheimo J. etal., 1978].
При длительном введении крысам имипрамина или дезме-тилимицрамина наблюдалась интернализация (процесс исчезновения рецепторов с поверхности внутрь клеток) имицрами-цовых рецепторов (рис. 53), что свидетельствует об их действии по типу агонистов. Кроме того, при данном введении имипрамина происходило снижение числа участков мембран коры головного мозга крыс, специфически связывающих эН-Спиро-церидол, иными словами, серотониновых 5-НТ2-рецепторов.
Различные исследования, направленные на выяснение взаимоотношений между имипраминовыми рецепторами и системой обратного захвата серотонина [Talvenheimo J. et al., 1978; Grob G., 1981; Sette M. et al., 1981; Brunello N. et al., 1982], указы-
303
Рис. 54. Предполагаемый механизм регуляции имипрамипом и/или эндогенным модулятором обратного поглощения серотонина.
Слева представлены два возможных механизма модуляции эндогенным эффектором поглощения серотонина нервным окончанием, а — эндогенный модулятор, являющийся коме диатором в серотонинергическом нервном окончании; б — эндогенный модулятор, являющийся медиатором афферентного нервного волокна: 1 — серотонин: 2 — эндогенный модулятор; 3 — участок узнавания для серотонина системы обратного захвата серотонина: 4 — участок узнавания эндогенного модулятора и/или имипрамина { Barbate i a М. L. et aL, 1983].
вают на то, что они представляют собой функционально связанные, но не идентичные молекулярные образования.
M.L.Barbaccia и соавт. (1983) обнаружили, что после введения крысам имипрамина в течение 3 нед. имеет место значительное увеличение поглощения серотонина срезами гиппокампа. При этом увеличивалось значение Ума(я_, но слабо изменялась величина Км поглощения серотонина.
Поскольку уменьшение числа имипраминовых рецепторов сопровождается увеличением поглощения серотонина, то еще раз можно сделать вывод, что система обратного захвата серотонина и иминрамииовые рецепторы не идентичны между собой. Авторы постулируют, что участок узнавания для серотонина сопряжен с участком узнавания для имипрамина и/или для еще неизвестного эндогенного модулятора системы обратного захвата серотонина (рис. 54). Данная схема может рассматриваться лишь в качестве предположительной.
304
Таким образом, можно считать установленным, что имипрамип изменяет функции серотониновых синапсов. Нейрохимические эффекты имипрамина не ограничиваются серотонинергическими волокнами п их окончаниями. Имипрамип, так же как и дезметили-мнпрампп, при введении крысам в течение 21 дня уменьшает способность норадреналина стимулировать адепилатциклазу в срезах коры, но пе изменяет активацию аденилатциклазы серотонином в мембранах клеток гиппокампа [Vetulani J., Sulser F., 1975; Vetulani J. et al., 1976; Banerjee S.R. et al., 1977; Mischra R. et al., 1980].
Имипрамип ii дезметплимнпрамнп также уменьшали способность изопротеренола стимулировать адепилатциклазу синаптосом коры головного мозга крыс [Barbaccia M.L. et al., 1983]. В то же время предварительная дегенерация серотонинергических нейронов 6,7-днгидрокситрпптампном предотвращала развитие указанного эффекта антидепрессантов. Эти данные, а также то, что имипрамип снижает число (J-адренореценторов, но не связывается сам с симпатическими аксонами, дают возможность предположить, что импн-рамнп активирует медленно идущие процессы обратного поглощения медиаторов в окончаниях серотонинергических нейронов. Последнее приводит к измене!нпо функции адренергического синапса, проявляющемуся в интернализации норадренергических узнающих участков. По мнению M.L. Barbaccia и соавт. (1983), все антидепрессанты так пли иначе изменяют функцию адренергических нейронов. Имипрампповые алтнденрессаигы изменяют эту функцию за счет влияния на серотониновые синапсы, которые в качестве шггернепроиалыюго звена регулируют взаимоотношения между серотонинергической н адренергической системами.
6.3. Солюбилизация имипраминовых рецепторов
Дальнейшие успехи в выяснении функции имипраминовых рецепторов, несомненно, связаны с возможностью выделения их в чистом виде.
W.K.Kinncr и соавт. (1981) обнаружило, что эН-им]1прамнп-связывающпе участки из мембран гиппокампа крыс могут быть солюбилизированы 0,5% тритоном Х-100.
Результаты исследований различных воздействий па солюбилизацию имипраминовых рецепторов из мембран клеток гиппокампа приведены в табл. 16.
М.Зи.227
305
Если, ио данным W.J .Kinner н соавт. (1981), ^Н-шпшрамннсвязы-вающне участки из мембран клеток гиппокампа солюбилизируются 0,1% диштош-шом, то, согласно результатам, полученным A.Davis п
Таблица 16.
Влияние химических воздействий и температуры на солюбилизацию 3Н-имипраминсвязывающих участков из мембран клеток гиппокампа [Kinner W. J, et al., 1981].
Обработка Общее связывание ’Н-имлирамниа, фмоль Пес не пифическое связывание ’Н-имцирамииа, фмоль
Изотонический раст вор 7,4 6,8
Тритон Х-100, 0,5% 157,9 131,1
NaCl, 0,5 М 15,3 12,1
Днгитошш 8,0 7,7
Фосфолипаза А2, 100 мкг/мл 15,6 15,5
Прспнкубация при 37”С в течение 30 мни 7,8 7,0
При мсчан не. После сыивстствукицсгь нота; iter пня мембраны гяшкжампи аснтрнфутровалн при 30 000g в течение 10 мпн,, затем определяла связывание ими *Н-н.Ч1 in рамина (5 нМ) в супе|х|>осфате в присутствии 10 мкМ дезимипрамин;! (инкубация при 0”С в течение 1 ч.)
соавт. (1983), эти участки солюбилизируются 1% дигитопшюм из мембран тромбоцитов человека. При такой солюбилизации пе происходило изменений аффинности участков, связывающих :,Н-нмннра-ми п. В отсутствие лиганда через 2 дня инкубации солюбилизированных подобным образом нмццраминовых рецепторов число участков, связывающих импнрамнп, уменьшалось на 50%, а в присутствии лиганда связывающая способность этих рецепторов оставалась постоянной в течение 72 ч. Поскольку в тромбоцитах, кроме hmjшрамнновых, в значительном числе присутствуют лишь оц-эдренорецевторы [Garcia-Seville J.A. eta],, 1980; Motilsky H.J. etal., 1980], к которым tiMi в ipaMHii имеет слабое сродство [Tang S.W., Seeman Р., 1980], можно считать, что по методу, разработанному A.Davis н соавт. (1983), солюбилизируются в основном пмнцрампповыс рецепторы.
По нашему мнению, различия в результатах W.J.Kinner ц соавт. (1981) п A.Davis п соавт. (1983) могут быть обусловлены как неодинаковой конценцэацней используемого дпгигонпна, так н различием источников мембран, из которых выделялись рецепторы.
306
Таким образом, приведенные данные позволяют считать, что мембраны тромбоцитов могут служить объектом для изучения НМНИрамиловых рецепторов. В то же время необходимо указать па различия имипраминовых рецепторов головного мозга н тромбоцитов: если первые сопряжены с системой захвата серотонина, то вторые с системой захвата норадреналина [Langer S.Z., Davis А., 1984].
Хотя химическая природа участков специфического связывания пминрамипа еще не определена, можно полагать, что в их состав входит молекула — акцептор электронов, так как импирамип обладает выраженными электронно-донорными свойствами н образует комплекс с переносом заряда с NAD+ [Soccorsi L., 1981],
Дальнейшие исследования но выделению и очистке пмипра-мппсвязывающих участков помогут реконструировать систему имипраминовых рецепторов, сопряженных со структурами, обеспечивающими транспорт серотонина через синаптические или тромбоцитарные мембраны, и лучше попять механизмы их функционирования.
й Vr й
Суммируя рассмотренные данные, можно сформулировать следующие положения относительно имипраминовых рецепторов как материальных субстратов, опосредующих реализацию фармакологической активности трициклических антидепрессантов.
1, Имипраминовые рецепторы представляют собой макромолекулы, локализованные па иресинаитивеских мембранах серотонинергических нейронов, которые специфически №Г-зависимым образом обратимо связывают импнрампноподобные вещества и тем самым изменяют обратное поглощение серотонина.
2. Число имипраминовых рецепторов уменьшается при длительном применении иминрамииа, что одновременно сопровождается уменьшением количества 5-НТ.,-рецепторов и [З-адреноре-центорон, а также снижением активности порадреналипчувст-внтелыюй аденилатциклазы в головном мозге.
Открытие имипраминовых рецепторов и их изучение позволило предложи ть новую гипотезу о механике действия целон группы антидепрессантов, что является яркой иллюстрацией успехов психофармакологии. Не исключено, что вскоре будут получены сведения об эндогенных лигандах этих рецепторов, хотя их может и не быть. Криме того, следует ожидать получения новых данных об участках специфического связывания других аптнденрессан-
20*
307
тов, относящихся к атипичным. Например, имеются сведения о специфическом связывании аН-миапсерипа с нейрональными мембранами [Barbaccia M.L. et al., 1983]. Участки связывания имин-рамипа и миацсерина не идентичны. Для миапсерипсвязывающих участков модулятором является серотонин, их число не уменьшается при длительном введении миаисерина. Предполагается, что миапсерипсвязывающие участки отличаются от 5-НТ., -рецепторов, по ассоциированы с ними. Изучение функции данных участков, но-видимому, в дальнейшем позволит сформулировать понятие о мнацсериповых рецепторах.
В заключение следует подчеркнуть, что рецепторная теория позволяет материалистически объяснить механизмы действия психотропных ЛВ и способствует созданию научно обоснованных методов лечения ими психических заболеваний.
Глава 7
РЕЦЕПТОРЫ у-АМИНОМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ
В 1950 г. в головном мозге млекопитающих была идентифицирована нейтральная аминокислота, представляющая собой ?-амипомасляную кислоту (ГАМК) [Awapara J. et aL, 1950; Roberts E.. Frankel S., 1950; Udenfriend S., 1950]. Позднее электрофизиологическими методами E.Florey (1954), A.W.Basemore и соавт. (1957) показали, что ГАМК оказывает ингибирующее действие на нейроны рыб. D.R.Curtis и соавт. (1959) этот же эффект ГАМК продемонстрировали па нейронах млекопитающих. В последующих работах эти авторы установили, что данный эффект ГАМК обусловлен гиперполяризацией и увеличением проводимости нейрональных мембран [Curtis D.R. et al., 1968; Curtis D.R, et al., 1974].
В результате фармакобиохимического анализа механизма действия ГАМК и биологических исследований связывания 3Н-ГАМК с нейрональными мембранами сформировалось представление о ГАМК-реценторах как о структурах, воспринимающих специфический сигнал ГАМК.
В настоящее время продолжаются всесторонние исследования ГАМК-ергической системы: биосинтез ГАМК, ее высвобождение, обратный захват и др. Были получены сведения об участии ГАМК в регуляции сердечно-сосудистой системы, секреции гормонов, процессов сна, специальных сенсорных функций, в развитии эпилепсии, хорее Гентингтона, болезни Паркинсона. Многими авторами выявлены параллели между фармакологическими эффектами опиатов, этанола, барбитуратов и бензодиазепинов у различных позвоночных, включвя человека, и изменениями синтеза и метаболизма ГАМК. В данной Главе будут рассмотрены имеющиеся сведения о структурно-функциональных особенностях ГАМК-рецепторов, их гетеро-ГСшюсти, участии в трансформации ГАМК-ергических лигандов в биологический ответ клетки и об изменении ГАМК-рецепторов при воздействии различных факторов.
309
7.1. Агонисты и антагонисты ГАМК-рецепторов
Успехи в идентификации различных типов ГАМК-рецепторов и изучении их фармакологических и биохимических характеристик тесло связаны с созданием специфических агонистов и антагонистов этих рецепторов. Химическая структура агонистов и антагонистов ГАМК-рецепторов приведена ниже.
Вещества относятся к ГАМК-агонистам при наличии следующих свойств: 1) если их способность подавлять электрическую активность нейронов блокируется ГАМК-антагонистом бикукуллином (это справедливо в отношении мусцимола, дигидромусцимола, тиомусцимола, амина коджиловой кислоты, [4,5,6,7-тетрагидроизоксазол-5,4-с]-пиридин-3-ола (THIP), нзо-гувацина, пиперидип-4-сульфониевой кислоты (P4S) и имидазол-уксусной кислоты (IAA)); 2) если они вытесняют 3Н-ГАМК из ее связи с ГАМК-рецепторами in vitro (это справедливо в отношении уже перечисленных веществ и баклофена — селективного агониста пресинантических ГАМК-рецепторов).
Еще одним свойством, объединяющим большинство ГАМК-агопистов, является их способность стимулировать связывание 3Н-диазенама с бензодиазепиновыми рецепторами in vitro. В основном это характерно для агонистов с гибкой структурой. В то же время агонисты с жесткой структурой в этом отпошешш не активны (например, THIP) или даже ингибируют его связывание (например, P4S). Поскольку лет сведений о частичных антагонистических свойствах P4S, можно высказать следующие предположения: 1) соединение по сравнению с другими агонистами связывается с ГАМК-рецепторами, находящимися в ином конформационном состоянии; 2) существует различие во взаимодействии аготшстов с ГАМК-рецепторами in vitro и in vivo.
Следует подчеркнуть, что из ГАМК-агонистов только мусцимол, THIP и прогабид проникают через гематоэнцефалический барьер.
Антагонистом периферических ГАМК-рецепторов является 5-амиповалериановая кислота, которая блокирует действие ГАМК на электрически стимулируемые сокращения скелетных мышц крыс [Macdonald R.L., Young А.В., 1981]. Важно отметить, что взаимный обмен гетероциклических атомов азота и кислорода в молекуле THIP, при котором изменяется делокализация отрицательного заряда (изо-THIP), приводит к появлению антагонистических свойств по отношению к ГАМК-
310
Г А иН'Лгомнс ты
Мусцимол
ДнгкдромуСцгмфл
Тномусцимол
.Ноды и новая кислота
SL 75ID2
Г АМН-антвгонистм
Бикукуллин Пикротоксиння Изо-TH IP Изо-ТНАЗ
311
рецепторам. Такие же свойства имеются и у его гомолога с семичлепным кольцом изо-THAZ.
Из антагонистов ГАМК центрального действия широко известны бикукуллин и иикротоксицип, которые являются ценными «инструментами» в изучении ГАМК-рецепторпых эффекторных механизмов. M.A.Simmonds (1980) считает, что бикукуллин является конкурентным, а пикротоксинин — неконкурентным антагонистом ГАМК-рецепторов. Неконкурентные антагонистические свойства по отношению к ГАМК-рецепторам проявляет также пенициллин, который избирательно блокирует хлорпый канал в участке, отличном от места связывания бикукуллина или пйкротоксипипа [Perry T.L. etal., 1973].
Кроме того, существует много ЛВ со свойствами модуляторов, которые, взаимодействуя с ГАМК-рецепторным комплексом (бензодиазепины, барбитураты) или с участками нейрональных мембран, непосредственно не входящих в ГАМК-рецепторный комплекс (нейролептики, некоторые диуретики), изменяют функционирование ГАМК-рецепторов [Enna S.J., 1981].
Дальнейшие исследования характера влияния этих ЛВ на нейрональные мембраны также должны способствовать выяснению ГАМК-рецепторпых механизмов.
7.2. Классификация ГАМК-рецепторов
О фармакологической дискретности ГАМК-рецепторов стало известно в 70-х годах XX века, когда было установлено существование бикукуллипчувствительпых и бикукуллиннечувствитель-пых ГАМК-рецепторов [BeartP.M., 1982]. В настоящее время мы знаем, что бензодиазепины и барбитураты взаимодействуют со специфическими популяциями ГАМК-рецепторов. Это, безусловно, усложняет фармакологическую классификацию подтипов ГАМК-рецепторов. J.A.Johnston (1981) предполагает, исходя из теоретических соображений, существование 36 подтипов ГАМК-рецепторов.
По локализации можно различать пре- и постсипаптические ГАМК-рецепторы, а также центральные и периферические.
Фармакологически различают бикукуллипчувствительпые и баклофепчувствительпые ГАМК-рецепторы (ГАМКЛ- и ГАМКП-рецепторы соответственно).
Наиболее хорошо изучены ГАМКд-рецепторы; они чувстви-
312
тельпы также к антагонисту иикротоксинипу и сопряжены с хлорным каналом и участками связывания бензодиазепинов и барбитуратов.
ГАМКв-рецепторы были открыты позже. Они ассоциированы с каналами для Са2+ и гуаниновыми нуклеотидами, широко распространены в ЦНС и модулируют высвобождение катехоламинов [Bowery N.G. et al., 1982]. ГАМКВ -рецепторы расположены также на двигательных нервных окончаниях скелетных мышц крыс, которые опосредуют способность ГАМК и баклофена ингибировать мышечное сокращение.
_J.Org и D.Kerr (1983) установили, что ГАМК и ее аналог З-амицо-1-проиансульфоциевая кислота (3APS), но не бакло-: феи, посредством стимуляции ГАМКА-рецепторов отрезка подвздошной кишки морской свинки вызывают сокращение ее. Данный эффект ГАМК подавляется бикукуллином, пикротокси-1Ш1ЮМ, пиретапидом, тетраметилендисульфотетрамипом, атропином и тетродотоксипом. В то же время баклофен и ГАМК, но не 3APS, . посредством стимуляции ГАМКп-рецепторов препарата кишки морской свинки ингибировали электрически стимулируемые со-! кращения подвздошной кишки (па данный эффект ГАМК пе вли-• ял бикукуллин и антагонисты аденозиловых, опиатных, адрено- и холипорецепторов). Таким образом, можно считать, что в кишеч-jj гшке присутствуют ГАМКА-и ГАМКВ-рецепторы, которые припи-й мают участие в регуляции его перистальтики.
с Пресинантические ГАМК-рецепторы, модулирующие высво-f вождение ГАМК (ауторецепторы), блокируются бикукуллином, [ а модулирующие высвобождение других нейромедиаторов — нечувствительны к бикукуллину и являются Са2+-зависимыми [Енпа S.J., 1981].
Кроме того, существуют ГАМК-рецепторы, имеющие высо-‘ кое и низкое сродство к ГАМК [Еппа S.J., Snyder S.H., 1977], но как они соотносятся с ГАМКа- и ГАМКв-рецепторами, пока < неизвестно.
По нашему мнению, имеющихся данных недостаточно для того, чтобы точно определить принципы классификации на подтипы ГАМК-рецепторов. Но уже сейчас можно утверждать, что эти рецепторы гетерогенпы; в ближайшее время появятся новые данные о фармакологических и биохимических свойствах тех или иных типов или подтипов ГАМК-рецепторов, Которые необходимы для создания классификации, охватывающей все ГАМК-рецепторы организма млекопитающих.
313
7.3. Химическая природа ГАМ К-рецепторов
Применение различных физико-химических подходов позволило получить информацию о химической природе и размерах ГАМК-реценториого комплекса (табл. 17).
Таблица 17.
Физико-химические свойства ГАМК-рецепторного комплекса
Источник Молекулярная масса Связывание 3Н-мусцимола
Кд, нМ пмоль/мг белка
Кора головного мозга крыс Кора головного мозга быка То же Головной мозг крыс 230 000 220 000 270 000 5,5 5,5 12 18,5 и 64 3,0 2,7 1,56 3,4 к 1,8
Примечание. Таблица составлена по данным L.R. Chang, Е.Л. Barnard (1982), F.A. Stephenson и соавт. (1982), Y. Ito, К. Kiriyama (1982),
При солюбилизации ГАМК-рецеиторпого комплекса его способность связывать радиолиганды и его молекулярная масса практически не изменяются. Диазепам увеличивает связывание 3Н-мус-цимола как с сииаптосомальиыми мембранами, так и с солюбилизированным рецептором [Ito Y., Kiriyama К., 1982]. По-видимому, представленные данные относятся к ГАМКл-рецепто-рам. Это предположение основано па результатах но связыванию 3Н-мусцимола. Следовательно, если не все, то часть ГАМК-рецеи-торов представляет собой олигомеры белковой природы с молекулярной массой 220 000 —270 000, содержащие участки для специфического связывания беггзодиазеиипов, сопряженные с участками связывания ГАМК и хлорным каналом.
7.4. Молекулярные механизмы взаимодействия лигандов с ГАМК-рецепторами
Для изучегшя комплексообразования лигандов с ГАМК-рецепторами используются чаще всего агогшеты 3Н-ГАМК и 3Н-мусци-
314
мол. Обнаружено, что связывание 3Н-ГАМК с синаптическими ГАМК-рецепторами головного мозга крыс характеризуется наличием в нервной ткани участков, связывающих ГАМК с высоким сродством (Кд~ 20 нМ) и низким сродством (Кд~ 200пМ) [Еппа S.J., Snyder S.H., 1977]. При инкубировании свежеприготовленных мембран с 3Н-ГАМК в присутствии Na* (Na*-зависимое связывание) взаимодействие ГАМК с рецептором было не чувствительно к бикукуллину. Однако при замораживании мембран и их инкубации с ГАМК в отсутствие натрия (Ыа*-независимое связывание, характерное для синаптических рецепторов) взаимодействие ГАМК с рецепторами было чувствительно к бикукуллину [Zukin S.R. et al., 1974; Yong A.В. et al., 1976]. В первоначальных экспериментах был выявлен один класс этих Na*-независимых ГАМК-связываю-щих участков. В последующем оказалось, что обработка синантосом-иых мембран тритоном Х-100 или их повторное замораживание приводит к появлению 2-го типа этих участков [Erma S.J., Snyder ,5.11., 1977]. Эта процедура увеличивала сродство ГАМК к рецепторам более чем па порядок. Причиной описанного феномена может быть удаление из связи с рецепторами эндогенного ГАМК-моду-дягора (ГАМК-модулипа), который может быть ГАМК или какой-либо небольшой белок или пептид. В пользу первого предположе-,иия свидетельствуют данные, полученные C.R.Gardner и соавт. (1981), которые с помощью прямого определения концентрации ГАМК в мембранах клеток Г’ловпого мозга крыс показали, что даже в хорошо отмытых препаратах мембран присутствует определетшое количество эндогенной ГАМК. Эти авторы установили, что инкубация суспензии нейрональных мембран при 37 °C в течение 1 ч сопровождается значительным увеличением уровня ГАМК. Хотя источник образования этой ГАМК пе известен, данный эффект необходимо учитывать при определении параметров связывания ГАМК. Для предотвращения биосинтеза ГАМК необходимо отмывать мембраны при низкой температуре и после этого сразу проводить эксперименты по связыванию. Согласно даштым С.R.Gardner и соавт. (1981), при соблюдении этих требований удается получить Стабильные и воспроизводимые результаты по связыванию 3Н-ГАМК (рис. 55), которые свидетельствуют о существовании двух типов участков, связывающих ГАМК сК 9и 318 пМ. Присутствие двух классов ГАМК-связывающих участков с одинаковой способностью связывать ГАМК-ергические вещества показано также другими авторами [Olsen R.W., 1981]. Впоследствии был обнаружен 3-й тип связывающих участков ГАМК-рецепторов, который имеет слишком
315
Рис. 55. График Скэтчарда связывания 3Н-ГАМК с мембранами головного мозга крыс [Gardner С. R., 1981].
Перед экспериментами мембраны подвергали воздействию гипсюсмотического шока, 5-кратному замораживанию и отмыванию в холодном буфере. Концентрация ЭН-ГАМК равнялась от 0,5 до 500 нМ. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 1 мМ ГАМК; при низких концентрациях 3Н-ГАМК оно составляло ЗОЙ, а при высоких концентрациях 3Н-ГАМК —70% от общего связывания 3Н-ГАМК. Ось ординат —специфическое связывание 3Н-имипрамина (фмоль/мг белка).
низкое сродство для ГАМК, затрудняющее точную характеристику [Krogsgaard-Larsen Р., 1981]. Физиологическое значение каждого из этих участков остается неизвестным. Кроме того, необходимо отметить, что при проведении подобных исследований взаимодействия ГАМК-ергических радиолигапдов с нейрональными структурами следует учитывать возможность их связывания с экстрасинапти-ческими участками, о чем сообщили R.D.AlIan и соавт. (1980).
Перспективным для изучения рецентор-лигандцого связывания является использование методов математического моделирования. Такой подход для анализа связывания 3Н-ГАМК с мембранами клеток мозга крыс и коров использовали R.W. Olsen и соавт. (1981). По их данным, двухцептровая модель ГАМК-реценторов лучше соответствует экспериментальным результатам, чем модели с одним участком, тремя участками или отрицательной кооперативностью. Полученные данные согласуются с моделью подвижных рецепторов и эффекторов. Кинетический анализ показал гетерогенность констант скоростей ассоциации и диссоциации и скоростей температурной инактивации ГАМК-рецепторов. Скорость тепловой денатурации имела двухфазный характер. Вначале активировалась одна из двух субцоиуляций ГАМК-реценторов. С одной стороны, гетерогенность связывания ГАМК отражает наличие в мозге
316
двух дискретных популяций рецепторов; с другой стороны, сходство специфичности взаимодействия с этими рецепторами ГАМК-ергических лигандов более соответствует модели множественности сопряженных или конформационных состояний единственного ГАМК-рецептора.
Рецепторы ГАМК неодинаково распределены в ЦНС; число участков, связывающих 3Н-ГАМК с высоким сродством, максимально в мозжечке и минимально в спинном мозге [Еппа S.J. etal., 1978; PlachetaP., Karobath М., 1979].
3Н-Мусцимол также связывается с ГАМК-рецепторами головного мозга, по для него обнаружены только участки, связывающие с высоким сродством (Кд=6 пМ) [Macdonald R.L., Young А.В., 1981].
Поскольку разрушение ядер головного мозга, получающих ГАМК-ергическую иннервацию, сопровождалось исчезновением участков, связывающих с высоким сродством ГАМК и мусцимол (Guidotti A. et al., 1979], можно считать, что эти участки находятся па иостсинаптических мембранах. Локализация участков, связывающих ГАМК с низким сродством, пе известна.
При изучении влияния ГАМК-ергических средств па связывание 3Н-ГАМК с ее рецепторами было выявлено, что агонисты мусцимол, З-амипопропаисульфопиевая кислота и дигидромусцимол и антагонист (+)-бикукуллии конкурируют с 3Н-ГАМК за связывание с участками с высоким сродством. ГАМК взаимодействует с синаптическими рецепторами в специфической оптимальной конформации, в которой опа взаимодействует с L-глутаматдекарбоксилазой и ГАМК-трапсамипазой, ферментами, ответственными за синтез и распад ГАМК [Krogsgaard-Larsen Р., Johnston G.A., 1978].
Ингибирование (+)-бикукуллином связывания 3НТАМК с ее рецепторами характеризуется величиной 1СМ, равной 5 мкМ [Krogsgaard-Larsen Р., Johnston G.A., 1978].
Анализ конкурентных взаимоотношений между 3Н-бикукуллином и ГАМК [Mohler Н., Okada Т., 1978] свидетельствует, что ГАМК-рецепторы могут существовать в различных конформационных состояниях при связывают агонистов и антагонистов.
317
Различные фармакологические вещества, подавляющие или увеличивающие физиологические эффекты ГАМК (пикроток-сипип, деитилентетразол, пенициллин, барбитураты и бензодиазепины), пе ингибируют связывание ГАМК [Olsen R.W. et al., 1978], что указывает па отсутствие их прямого взаимодействия с участками, связывающими ГАМК.
Как видно из табл. 18, замена аминогруппы и карбоксильной группы ГАМК на другие основные и кислотные группы пе снижает внутреннюю активность соединений и их сродство к ГАМК-рецепторам. Делокализация отрицательного заряда в молекуле пе предотвращает их связывание с ГАМК-рецепторами, по приводит к исчезновению активации рецепторов, и у веществ появляются антагонистические свойства. Таким образом, при будущих исследованиях молекулярных механизмов взаимодействия лигандов с ГАМК-рецепторами необходимо рассматривать вклад в это взаимодействие различных структурных факторов, включая стереохимию, конформационную подвижность и делокализацию заряда.
Таблица 18.
Структура и активность некоторых аналогов ГАМК с заданными конфигурациями
.Соединение Иягнбйроиаийе связи с рецепторами (1Си< мкМ) Увели-чепие связывания »Н-дн-asenaxe (ЕСад. мкМ) Ингибирование Поглощения ГАМК '{1СИ, мкМ)
1. •-ГАМК § * н-тнп H-PAS
нейро-Я АМН КЫМН клет-ЯАМЯ
)-5'-Метнд-мусцимол (Ю"(+)57-Метил-мусцикол 0,64 0,51 1.6 0,74 5,8 230 1000 1000
19 8,9 8,2 9,5 «3 23 000 1000 1000
)-4-Метил-траис-АСА (й)-(+)*4-Метил-транс-АСА 4.1 3,5 2.5 2,6 21 390 5000 5000
148 145 84 88 670 2000 160 5000
(S)-(—)-4-Метнл-ГАМК. 4,7 2,5 5,2 2.9 24 550 750 1006
(1?)-(+)-4-Метил-ГАМ.К 5,0 4.3 6J 2,5 21 410 200 126
318
7.5. Молекулярные механизмы функционирования ГАМК рецепторов
ГАМК является тормозным нейромедиатором, несмотря на то, что опа может вызвать как гиперполяризацию, так и деполяризацию мембран клеток, содержащих ГАМК-рецепторы, Оба указанных эффекта обусловлены изменением проницаемости этих мембран для СГ. Индукция ГАМК гиперполяризации типична для клеток коры головного мозга, на плазматических мембранах которых находятся постсипаптические ГАМК-рецепторы; при этом происходит увеличение входа СГ в клетку. Поскольку деполяризацию ГАМК вызывает в тех клетках, мембраны которых содержат постсцнаптические ГАМК-рецепторы, что характерно для окончаний нейронов спинного мозга, то это приводит к ингибированию высвобождения нейромедиаторов и к угнетению нейрональной передачи; параллельно происходит увеличение выхода СГ из нервных окончаний.
Применение электрофизиологической техники и исследования связывания ГАМК-рецепторов с различными лигандами позволили в какой-то степени приблизиться к пониманию молекулярных механизмов функционирования ГАМК-рецепторпого комплекса.
По-видимому, участки ГАМК-рецептора представляют собой структурные субъединицы рецепторного комплекса, в состав которого входят также компоненты, каждый из которых связывает с высоким сродством бензодиазепины, неконкурентный антагонист ГАМК пикротоксинип (считается, что участок, связывающий пикротоксипин представляет собой место действия барбитуратов), антигельминтное средство авермектин [Krogsgaard-Larsen Р., 1981] и эфиры p-карболина [Chang L.R., Barnard Е.А., 1982] (рис, 56), Между данными компонентами ГАМК-рецепторпого комплекса in vitro выявлены аллостерические взаимодействия [Krogsgaard-Larsen Р., Falch Е., 1981; Olsen R.W., Snowman А.М., 1981], чем можно объяснить молекулярный механизм действия некоторых психотропных веществ, В то же время нужно учитывать, что, во-первых, существуют подклассы ГАМК-рецепторов, во-вторых, пе все ГАМК-рецеп-тбры сопряжены с бензодиазепиновыми рецепторами и наоборот (подробнее о сопряжении ГАМК-рецепторов и бензодиазепиновых рецепторов см, раздел 8.5).
Нам пе встретились биохимические работы, в которых бы
319
Гл нам н^я нл&тка
Рис. 56. Схематическое изображение центрального аксосоматичсского ГАМК-ергического синапса, Постси] таити чес кий рецепторный комплекс содержит хлорный капал, проницаемость которого регулируется двумя ГАМК-связываюпшми участками и по крайней мере двумя субъединицами, селективно связывающими бензодиазепины и виротоксины [De FcudisF.V, 1981].
было показано сопряжение ГАМК-рецепторов с какими-либо мембранными ферментами, регулирующими активность «хлорной помпы». Однако имеются сведения, что ингибирование ГАМК-ергической системы приводит к значительному увеличению уровня цГМФ в мозжечке и цАМФ в гипофизных клетках in vivo [Enna S.J., 1981] и что ГАМК и мусцимол вызывают увеличение уровня цАМФ в клетках яичника крыс [Erdo S.A., Lapis Е., 1982].
Таким образом, цока еще имеется слишком мало дашгых, позволяющих проследить все этапы между активацией ГАМК-реценторов и развитием таких физиологических эффектов, как противосудорожное и анксиолитическое действие, снижение агрессивности, изменение потребления пищи, снижение частоты сокращегшй сердца и артериального давления, изменение обмена дофамина и ацетилхолина и секреции пролактина, гормона роста, тиреотропина и гонадотропина, которые вызывают ГАМК-агонисты.
320
7.6. Влияние различных Л В на ГАМК-рецепторы
В последнее время были получены данные, свидетельствующие, что некоторые ЛВ, особенно психотропные, могут влиять па связывание ГАМК или ГАМК-агонистов с нейрональными структурами головного мозга млекопитающих, что может лежать в основе молекулярных механизмов их действия и требует специального рассмотрения.
7.6.1. Бензодиазепины
A.Guidottin соавт. (1978), атакже B.A.Mienersи АД.Salama (1982) показали, что бензодиазепины увеличивают Ь1а+-незави-симое связывание 3Н-ГАМКи 3Н-мусцимола с субклеточными препаратами ЦНС. В то же время R.W.Olsen и соавт. (1978), P.Andrewes и B.Tolinston (1979) такого эффекта ие обнаружили. Причинами дашгых различий могут быть, во-первых, неодинаковые методические подходы и, во-вторых, тот факт, что с бензодиазепиновыми рецепторами сопряжены те участки, которые связывают ГАМК со слишком низким сродством (Кд~ 1 мкМ). Так или иначе в экспериментах, проведенных in vitro, не получено данных, указывающих на какие-либо взаимоотношения между бензодиазепиновыми рецепторами и участками, связывающими ГАМК с высоким сродством. При хроническом введении мышам бензодиазепинов P.J.Marangos и J.N.Grawby (1982) обнаружили увеличение числа участков, связывающих 3Н-мус-цимол с высоким сродством, в переднем мозге и мозжечке.
По нашему мнению, влияние бензодиазепинов на ГАМК-ерги-ческую синаптическую передачу в определенной мере опосредует проявление их анксиолитической и противосудорожной активности, по не исключает других еще пе изучештых механизмов.
7.6.2. Этанол
По данным M.K.Ticku (1980), M.K.Ticku и Т.Burch (1980), через 30 мин после введения крысам этанола (2 — 4 г/кг) увеличивается величина Вмакс, но не Кч Ь1а+-независимого связывания 3Н-ГАМК в участках головного мозга с низким сродством, а при абстиненции после введения этанола в течение 21 дня снижается величина Кд этого связывания. О снижении Ь1а+-пезависимого связывания 3НТАМК с синап-тосомами коры головного мозга крыс при абстиненции к эта-
iil.3w.227
321
полу сообщил также L.Volicer (1980). У умерших больных алкоголизмом имело место увеличение Вна1н;, но ле Кл связывания 3Н-мусцимола с мембранами коры головного мозга [Tran V.T. et al., 1981].
Таким образом, имеющиеся данные свидетельствуют об изменении ГАМК-ергической системы при алкоголизме, по роль этой системы в острых и хронических эффектах этанола еще предстоит изучить.
7.6.3. Барбитураты
В настоящее время можно считать установленным, что барбитураты увеличивают значительно Na+-независимое, СГ-зави-симое связывание 3Н-ГАМК с ее рецепторами мембран клеток головного мозга быка и крыс. Способность барбитуратов (се-кобарбитал> пептобарбитал>гексобарбитал>барбитал>феио-барбитал) увеличивать это связывание ГАМК (величину В по не Кд) коррелирует с их наркотической активностью и их способностью подавлять влияние бикукуллина на эффекты ГАМК [Whittke S.R.,Turner A.J., 1982]. Данный эффект пентобарбитала обращается блокатором хлорного канала никро-токсииином [Olsen R.W., Snouman А.М., 1982]. Кроме того, барбитураты конкурируют с 3Н-а-дигидроиикротоксипином за связывание с мембранами клеток головного мозга крыс [Leeb-Zunberg F., Olsen R.W., 1980]; это дает возможность полагать, что барбитураты взаимодействуют с пикротоксипипсвязываю-щим участком ГАМК рецепторного комплекса и тем самым увеличивают постсииантические эффекты ГАМК.
7.6.4. Опиаты
M.K.Ticku и R.D.Hufman (1980) обнаружили, что после однократного внутрибрюшинного введения крысам морфина (25 мг/ кг) происходит снижение Na+-независимого связывания 3Н-ГАМК с мембранами клеток мозжечка, коры и полосатого тела головного мозга, обусловленное уменьшением В участков, связывающих ГАМК с высоким сродством. В то же время у крыс с физической зависимостью к морфину связывание ГАМК уменьшалось за счет снижения Внакс участков, связывающих с низким сродством.
В экспериментах in vitro также обнаружено снижение Na+-пезависимого связывания ГАМК, вызываемого налоксоном, морфином, леворфанолом и другими опиатными агонистами и антагонистами (1С30=25О —540 мкМ) [Flyttel J., 1979; Goldiner A. et
322
al., 1980]. Хотя между сродством этих опиатов к опиатным рецепторам и их способностью влиять па связывание ГАМК с ГАМК-рецецторами корреляции пе было, эти результаты позволяют в какой-то степени объяснить возбуждающие и судорожные эффекты опиатов их ГАМК-аптагопистическими свойствами. О существенной роли ГАМК-ергического компонента в механизме действия опиатов и энкефалинов свидетельствуют также данные В. В. Заку сова и соавт. (1982).
7.6.5. Пиразолпиридины
Согласно дашшм P.Placheta и M.Karobath (1980), а также В. A .Mieners и А. I. Salama (1982), пиразо лиирИдш пя, такие как этазолат и тракозолат, увеличивают Ыа+-независимое СГ-потен-цируемое связывание 3Н-ГАМК или 3Н-мусцимола с мембранами клеток головного мозга крыс, с чем могут быть связаны анксиолитические свойства этих соединений.
7.6.6. Нейролептики
В условиях in vitro нейролептики слабо ингибируют связывание 3Н-ГАМК с мембранами клеток головного мозга крыс (1СИ от 13 до 100 мкМ и более) [Hyttel J., 1979]. Однако при хроническом введении крысам галоперидола или хлорпромазина имеет место существенное увеличение связывания 3Н-ГАМК с мембранами клеток черной субстанции [Gale К., 1980]. Следовательно, ГАМК-ергическая компонента может иметь значение и в проявлении цсихотрош1Ых эффектов этой группы препаратов.
Из других химических веществ, оказывающих действие па свойства ГАМК-рецепторов, можно отметить соединения лития, которые при их хроническом введении вызывают уменьшение связывания 3Н-ГАМК с рецепторами полосатого тела и гипоталамуса, попе коры, мозжечка и гиппокампа крыс [Maggi А., Еппа S.J., 1980], и свинца, также уменьшающих связывание 3Н-ГАМК с некоторыми областями головного мозга [Memo М. et а!., 1980].
По нашему мнению, дальнейшие исследования роли ГАМК-ергической компоненты в действии разных групп нейротропных средств помогут пе только уточнить молекулярные механизмы реализации их психотропной активности, по и в какой-то степени позволят приблизиться к пониманию механизмов развития физической зависимости от них и толерантности.
щ 323 '
7.7. Использование антагонистов и агонистов ГАМК-рецепторов при неврологических и психических болезнях
Для реализации возможности действия на ГАМК-рецепторы ЦНС aroiuicTbi и антагонисты должны проникать через гематоэнцефалический барьер. До недавнего времени единственным таким агонистом был мусцимол, но он является довольно токсичным и быстро метаболизируется после периферического введения. Однако в последние годы появились такие ГАМК-агонисты, как THIP и прогабид, которые, проникая через гематоэнцефалический барьер, хорошо переносятся многими видами животных, достаточно устойчивы и уже начинают применяться для лечения людей с различными заболеваниями.
G.Bartholini и соавт. (1976) сообщили о лечении мусцимолом и прогабидом больных шизофренией и хореей Гентингтона. Если у цервой категории эти агонисты были не эффективны, то у больных второй категории прогабид, по не мусцимол, оказывал выраженное терапевтическое действие в начальных стадиях заболевания. Пока еще не ясно, па какие ГАМК-рецепторы ЦНС в данном случае влияет прогабид. Более того, поскольку при хорее Гентингтона развивается гиперчувстви-телыюсть постсинаптических ГАМК-реценторов [Krogsgaard-Larsen Р., 1981], высказывают предположение о целесообразности использования в этих случаях антагонистов ГАМК. Это предположение подтверждают предварительные эксперименты по использованию бикукуллина и изо-THIP у животных с экспериментальными двигательными расстройствами [Warmes Р. et al., 1979]. Сходство влияния прогабида и классических антидепрессантов (дезипрамип) на пор-адрепергическую (увеличение обмена норадреналина) и серотонинергическую (снижение обмена серотонина) системы указывает на потенциальную возможность использования его и других ГАМК-мимети-ков для лечения депрессивных состояний.
7.7.1. ГАМК-агонисты как анальгетики и анксиолитики
Некоторые ГАМК-ергические вещества, в частности, баклофен, обладают анальгетической активностью, которая не подавляется налоксоном (Hill G. et al., 1981], что указывает па независимость ее от опиатных рецепторов и па перспективность поиска среди агонистов или антагонистов ГАМК-
324
препаратов с обезболивающим эффектом, к которым пе развивается пристрастия. Кроме того, в клинике обнаружен транквилизирующий эффект агонистов ГАМК [Krogsgaard-Larsen Р., 1981]. В частности, в настоящее время в клинике изучаются возможности использования THIP для лечения различных патологических состояний, включая болевой синдром.
1.7.2. Агонисты ГАМК как возможные противосудорожные средства
В экспериментах па животных были получены данные о существовании противосудорожных свойств у мусцимола, THIP, амина коджиновой кислоты, баклофена и изогуваципа [De Feudis F.V., 1983]. У больных эпилепсией прогабид уменьшал или полностью устранял судороги (при этом традициошпяе противосудорожные вещества у них были пе эффективны) [Krogsgaard-Larsen Р., 1981]. Однако по этому вопросу необходима дополнительная информация.
Кроме того, возможно клиническое использование ГАМК-аго-пистов при эндокринологических заболеваниях [Grandison L., Guidotti А., 1979], сердечно-сосудистых болезнях [Antonactio M.J. et al., 1978], ожирении [Grandison L., Guidotti A., 1977] и агрессивности [Freden C. et al., 1980].
7.8. Изменение ГАМК-рецепторов при различных заболеваниях ЦНС
Особенно важен анализ роли ГАМК в развитии заболеваний ЦНС, поскольку он может способствовать разработке новых средств их лечения, что подчеркивают K.G.Lloyd (1980), K.G. Lloyd и соавт. (1980).
При болезни Паркинсона происходят не только выраженные изменения в дофаминергической, ио и в ГАМК-ергиче-ской системе головного мозга [Lloyd K.G., Hornykiewicz О., 1973]. Согласно данным K.G.Lloyd и соавт. (1977), при болезни Паркинсона происходит снижение связывания 3Н-ГАМК с мембранами нейронов гиппокампа и черной субстанции. Поскольку L-ДОФА и другие аптипаркипсопические средства не возвращают к норме связывания 3Н-ГАМК, можно считать, что его уменьшение обусловлено дегенерацией в черной субстанции дофаминергических нервных окончаний, на нресинаптических
325
мембранах которых локализованы ГАМК-рецепторы [Lloyd K.G., Homykiewicz О,, 1973],
При болезни Гентингтона выявлено увеличение связывания 3Н-ГАМК с рецепторами клеток полосатого тела, по не черной субстанции, и снижение К1 и Bhmc взаимодействия 3Н-ГАМК с мембранами клеток коры переднего мозга людей [Lloyd K.G. et al., 1980]. Важно отметить, что глицерофос фонта полам ип значительно уменьшает связывание Ш-ГАМК с нейрональными мембранами здоровых людей, по ие влияет на это связывание при болезни Гентингтона. Поскольку известно, что при этом заболевании изменяется метаболизм глицерофосфоэтаполамипа [Perry К.Н. et aL, 1973], можно полагать, что в возникновении данных изменений играет роль взаимодействие рецепторов ГАМК с фосфолипидами.
Отметим, что ГАМК-рецепторы могут также изменяться при заболеваниях сосудов мозга (они принимают участие в регуляции церебрального кровотока), а также при порфирии [Muller W.E., Snyder S.H., 1977; Edvinsson L., Krause D.N., 1979; Krause D.N. et al., 1980]. Кроме того, имеются предположения, что с нарушениями ГАМК-цейронередачи связаны маниакальные состояния. Эта гипотеза подтверждается ГАМК-ергическим механизмом действия препаратов лития [Emrich Н.М. et al., 1980] и купирование маний противосудорожными средствами, такими как вальпроат натрия [Emrich Н.М. et al., 1983].
Несомненно, что анализ биосинтеза и метаболизма ГАМК при названных и других нейро патологических состояниях может принести успех как для изучения патогенеза, так и для определения путей их лечения.
* * *
ГАМК-рецепторы присутствуют во всех областях ЦНС и в некоторых эффекторных органах. Выявлены отдельные типы ГАМК-рецепторов с различными фармакологическими и функциональными характеристиками. Наиболее изучены бикукуллин-чувствительные рецепторы, или ГАМКл-рецепторы, активация которых сопровождается изменением проницаемости плазматических мембран для СГ, следствием чего является деполяризация (пресипаптическое ингибирование) или гиперполяризация (постсипаптическое ингибироваиие)в зависимости от относительной внутриклеточной концентрации хлоридов.
326
Биохимическими методами у ГАМКл-рецепторов выявлены два различных ГАМК-связывающих участка, которые могут быть в двух различных конформациях, комплементарных структуре агонистов и антагонистов.
Участки ГАМ К - рецепторов, осуществляющие «узнавание» и связывание ГАМК, сопряжены с хлорным каналом.
Сродство ГАМК к связывающим участкам ее рецепторов может регулироваться эндогенными модуляторами и ЛВ (бензодиазепинами, барбитуратами и др.), к которым также имеются специфические участки связывания на ГАМК-рецепторпом комплексе.
Таким образом, особещюстыо ГАМК-рецепторов является то, что они представляют собой сложные олигомерные макромолекулы, содержащие участки специфического связывания не только для самой ГАМК, по и для других физиологически активных соединений. Реализация биологической активности последних опосредована модуляцией функции ГАМК-рецепторов. В связи с этим следует ожидать, что дальнейший прогресс в изучении биохимии ГАМК-рецепторов и создании новых ГАМК-ергических лигандов поможет в разработке более совершенных методов фармакотерапии ряда психических, сердечно-сосудистых и других заболеваний.
Глава 8
БЕНЗОДИАЗЕПИНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ
Понятие «бензодиазепиновые рецепторы» возникло после открытия в головном мозге млекопитающих специфических участков, связывающих с высоким сродством бензодиазепины [Mohler Н., Okada Т., 1977; Squires R., Braestrup С., 1977]. Найдена корреляция между величиной связывания бензодиазепинов с данными участками и выраженностью их анксиолитического противосудорожного, снотворного и других эффектов [Mohler II., 1982].
Присутствие стереоспецифических бензодиазепинсвязываюнщх участков в головном мозге можно продемонстрировать с помощью изучения равновесного связывания in vitro 3Н-дназепама с нейрональными мембранами. Способность различных бензодиазепинов вытеснять 3Н-дназепам из его связывающих участков прямо пропорциональна их фармакологической активности (рис. 57, 58) [Mohler Н., Okada Т., 1977, 1978]. Отсюда вытекает, что структуры головного мозга, специфически связывающие бензодиазепины, опосредуют реализацию нх фармакологических эффектов. Эти биохимические структуры называют бензодиазепиновыми рецепторами.
Методами авторадиографии и электронной микроскопии установлено, что бензодиазепиновые рецепторы локализованы главным образом в синапсах ЦНС [Mohler Н. et al., 1980]. По крайней мере, часть этих синапсов, как показали нммунохимнческис исследования, является ГАМК-ергнческнмн [Mohler Н., et al., 1981].
Кроме того, участки, специфически связывающие бензодиазепины, найдены па астроглиальных клетках головного мозга новорожденных мышей. По мнению Р.Connard (1981), нейрональные и глиальные бензодиазепиновые рецепторы отличаются между собой; последние опосредуют увеличение диазепамом поглощения астроцитами серотонина.
Плотность рецепторов, связывающих диазепам, наибольшая в коре мозга, где их в 5 раз больше, чем в стволе мозга.
328
Рис. 57. Зависимость способности бензодиазепинов вытеснять 3Н-дназспам (1,5 пМ) из его связи с гомогенатом коры головного мозга человека от их концентрации [Mohler Н,, Okada Т., 1980].
По осн ординат — величина специфического связывания 3Н-дназспама; по осн абсцисс — концентрация вытесняющего бензодиазепина в молях.
I 10 100 1000 10000
Рис. 58. Корреляция между способностью различных бензодиазепинов конкурировать с 3Н -диазепамом за связывание с рецепторами in vitro с их фармакологической активностью (способностью расслаблять мышцы у кошек) [Mohler Н., Okada Т., 1980].
По оси абсцисс — К вытеснения 3Н -диазепама из сто связи с бензодиазепиновыми рецепторами (нМ); но оси ординат —минимальная эффективная пероральная доза бензодиазепинов, при которой наступает мышечная релаксация у кошек (мг/кг).
Распределение бензодиазепиновых рецепторов ио отделам мозга не коррелирует с распределением рецепторов к ГАМК, ацетилхолину и серотонину, а также к глицину, энкефалину [Корнеев А.Я. идр., 1982].
329
Специфически бензодиазепины связываются только с мембранами клеток головного мозга; они в 15 раз слабее связываются с митохондриями почек п совсем не связываются с препаратами кишечника и мышц [Braestrup С,, Squires R.F., 1977].
Хотя не исключено, что бензодиазепиновые рецепторы могут находиться на пресипиитических мембранах, имеющиеся сведения указывают в основном на их локализацию на ностсн-пантических мембранах [Gidotti Л. et aL, 1978; Tallman J.F. et al., 1978; Karobath M., 1979].
8. /. Агонисты бензодиазепиновых
рецепторов
Избирательную агонистическую активность но отношению к бензодиазепиновым рецепторам проявляют производные беи-
Нлобмлм -
330
зодиазеиила и бепзазеиина, химические формулы которых представлены ниже.
Кроме того, существуют соединения, не являющиеся бензодиазепинами, ио обладающие некоторым сродством к бензодиазепино-
вым рецепторам и бепзодиазешшоподобцой фармакологической активностью.
Другие депрессанты ЦНС, такие как барбитураты, мепробамат, этанол, метаквалон, галоперидол, мусцимол, не взаимодействуют с бензодиазепиновыми рецепторами.
8.2. Антагонисты бензодиазепиновых
рецепторов
Среди производных бензодиазепина до настоящего времени не найдено соединения, которое бы блокировало действие агонистов на уровне бензодиазепиновых рецепторов.
В то же время в ряду имидодиазеиииов было обнаружено вещество Rol5-1788, которое сильно ингибирует специфическое связывание 3Н-диазе-иама с мембранами синаптосом головного мозга in vitro (IC30=2
331
нмоль/л), цо само но себе не обладает бепзодназешшоподобпымн поведенческими и нейрофизиологическими эффектами [Mohler Н, etal., 1981]. Детальный анализ показал, что Ro 15-1788 селективно ингибирует все центральные эффекты бензодиазепинов за счет конкурентного взаимодействия с ними за связывание с бензодиазепиновыми рецепторами [Hunkeler W. et al,, 1981; Mohler H. et al., 1981; Pole P.etal., 1981].
Важно отметить, что Ro 15-1788 является антагонистом только бензодиазепинов, цо не других веществ, угнетающе действующих иа ЦНС: этанола, фенобарбитала, метеквалона, мепробамата, галоперидола, этахолата, 1-циклосерлиа и мусцимола [Hunkeler W. et al., 1981; Mohler H. et al., 1981; Pole P. et al,, 1981].
Вполне возможно, что Ro 15-1788 найдет клиническое использование в качестве антидота при отравлении бензодиазепинами и в анестезиологии для прекращения седативного состояния, вызванного бензодиазепинами [Mohler Н., 1982].
Известны также и другие лиганды бензодиазепиновых рецепторов метил- или этил- р-карболнц-3-карбоксилат [Braestrup С. et al., 1980] и вещество CGS 8216 [Bernard Р. et al., 1981], которые, кроме подавления некоторых эффектов бензодиазепинов, ингибируют также активность барбитуратов и мепробамата и оказывают судорожное или противосудорожное действие [Bernard Р. et al., 1981; Cepeda С. et al., 1981; Cowen P.J. et al., 1981; O'Brien R.A. et al., 1981].
По мнению C.Braestrup ц соавт. (1983), лиганды типа ме-тил-р-карболнн-3-карбокснлата следует отнести к новому классу лигандов бензодиазепиновых рецепторов — обратным агонистам. Если агонисты угнетают аудногенные судороги ц оказывают анксиолитическое действие, то обратные агонисты вызывают судороги и тревогу, а антагонисты подавляют эффекты тех и других.
8.3. Гетерогенность бензодиазепиновых рецепторов
При изучении влияния триазолпцридазолшюв на связывание SH-бензодиазепинов с мембранами клеток коры головного мозга крыс было обнаружено два тина бензодиазепиновых рецепторов: 1) рецепторы, имеющие высокое сродство к беизо-
332
дпаэепинам и триазолниридозннам (БЗ^рецепторы); 2) рецепторы, имеющие высокое сродство к бензодиазепинам и низкое сродство ктриазолинрндозилам (Б32-реценторы) [Lippa A.S. etal.,1980]. В коре головного мозга бензодиазепиновые рецепторы 1-го типа составляли 60%, в мозжечке — 90%, в гиппокампе — 40% от их общего числа [Lippa A.S. et al., 1982].
Эти данные о гетерогенности бензодиазепиновых рецепторов были подтверждены методом авторадиографии, позволившим выявить превалирование бензодиазепиновых рецепторов 1-го тина в мозжечке, бледном шаре и некоторых областях коры и большое содержание бензодиазепиновых рецепторов 2-го типа в хвостатом ядре и скорлупе.
Производное триазолпиридозинов С1 218872 ингибировало связывание 3Н-бепзодиазенинов с рецепторами 1-го тина но конкурентному механизму, а с рецепторами 2-го типа — по неконкурентному или смешанному [Lippa A.S. et al., 1982]. Подобное влияние на связывание 3Н-бензодиазеиииов с БЗ^ и Б32-реценторами оказывал р-карболип-3-карбоксилат [Braestrup С. et al., 1980].
По данным A.S.Lippa и соавт. (1981),сразу же после рождения у крыс в головном мозге присутствуют в основном Б32-рецепторы. В 1-ю педелю жизни у них очень сильно увеличивается число БЗррецепторов, а число Б32-рецепторов ие повышается до 2-й цеделг постпатальпого периода.
О гетерогенности бензодиазепиновых рецепторов свидетельствуют также эксперименты, проведенные D.LBenson и соавт. (1981), которые показали, что фосфатные ионы защищают от температурной деградации только бензодиазепиновые рецепторы 2-го типа. ГАМК также в большей степени предотвращала температурную (38 — 40 °C) инактивацию бензодиазепиновых рецепторов 2-го типа, чем 1-го [Benson D.I. et al., 1981]. Кроме того, бензодиазепиновые рецепторы этих типов неодинаково солюбилизировались тритоном Х-100 и различными концентрациями NaCl [Zo М. et al., 1982].
K.W. Gu ii H.Iamamuram (1982) изучали способность Cl 218872 и [J-карбо л ин-3-карбоксц лата вытеснять 3Н-флупнтра-зецам или 3H-Ro 15 1788 из их связи с бензодиазепиновыми рецепторами гомогената коры головного мозга, гиппокампа, ствола среднего мозга и мозжечка крыс при 0 — 4° и 37°С. При температуре тела в отличие от 0°С авторы не выявили подтипов бензодиазепиновых рецепторов в коре, гиппокампе ц ство
333
ле головного мозга. По сравнению с другими областями головного мозга CL218872 и (J-карболин-З-карбоксилат имели наибольшую величину сродства к бензодиазепиновым рецепторам мозжечка при 37*' С. По мнению авторов, при этой температуре существует межрегиональная гетерогенность бензодиазепиновых рецепторов, внутрирегиональная гетерогенность этих рецепторов существует только при О — 4UC in vitro. Она обусловлена различными конформационными состояниями одного и того же типа рецепторов. Эти результаты указывают на важность учета температуры, при которой изучается связывание лигандов с бензодиазепиновыми рецепторами.
Еще одно подтверждение о гетерогенности бензодиазепиновых рецепторов было получено с помощью фотоаффишюй метки 3Н-флуннтразенамом бензодиазепиновых рецепторов в различных отделах головного мозга. Было обнаружено, что во всех случаях 3Н-флунитразенам после воздействия ультрафиолетовыми лучами ковалентно связывается с основным рецепторным белком, имеющим молекулярную массу 50 000 — 51 ООО [Mohler Н. et al., 1980; Sieghart W., 1983]. Однако дополнительно ЯН-флунитразепам во всех областях мозга, за исключением мозжечка, связывается также с 2 или 3 другими белками, имеющими молекулярную массу 53 000 — 59 000 [Sieghart W., Karobath И., 1980; Sieghart W., 1983].
По-видимому, бензодиазепиновые рецепторы мозжечка с молекулярной массой 51 000, связывание с которыми эН-флупит-разенама блокируется С1 218872, относятся к БЗ,-рецепторам, а рецепторы с молекулярной массой 53 000 — 59 000, могут образовывать БЗуреценторы. В последнее время появились сообщения о возможности существования в головном мозге БЗ.,-рецеиторов, которые имеют Низкое сродство к С1 218872, высокое сродство к Р-карболнпам, нечувствительны к ГАМК, бикукуллину н этазолу (в этом они отличаются от БЗ,- и Б3,-ре-центоров), но так же, как и БЗ,- и Б32-рецеиторы, связывают 3Н-бензодцазепн11Ы с К , равной 109 М [Williams М., 1983].
Большой интерес представляет вопрос, имеет ли гетерогенность бензодиазепиновых рецепторов, продемонстрированная в отношении их связывающей способности in vitro, фармакологическое значение. В этой связи следует отметить, что вещество С1 218872, характеризующееся заметно большим сродством к бензодиазепиновым рецепторам мозжечка, чем других областей мозга, обладает только анксиолитической и цротивосудо-
334
рожпоп активностью, по не седативным эффектом п способностью расслаблять мышцы [Li рра A.S. et al., 1979].
Подтверждением функциональной гетерогенности бензодиазепиновых рецепторов ц опосредования анксиолитического эффекта БЗ,-рецепторами служат данные о том, что толерантность развивается только к депрессивному действию бензодиазепинов, по не к их аптнкопфлнктцому и противосудорожному эффектам [Lippa A.S. et а!., 1979]. При хроническом введении бензодиазепинов развитие толерантности к пх депрессивному эффекту происходило параллельно со снижением числа бензодиазепиновых рецепторов во всем головном мозге; однако число рецепторов мембран клеток мозжечка, связывающих Ш-бецзодиазешшы, при этом не изменялось [RosenbergH.C., ChinT., 1981]. Следовательно, можно с достаточной степенью уверенности считать, что в реализации анксиолитической активности бензодиазепинов принимают участие БЗ,-рецепторы. Учитывая данные Н. A. Robert son (1984), следует считать, что другой тип бензодиазепиновых рецепторов опосредует противосудорожное действие бензодиазепинов.
Таким образом, имеющиеся биохимические и фармакологические сведения позволяют резюмировать: существуют различные бензодиазепиновые рецепторы, локализованные в ЦНС и отличающиеся селективностью, чувствительностью к температуре и электрофоретической н хроматографической подвижностью.
8.4. Молекулярные механизмы взаимодействия лигандов с бензодиазепиновыми рецепторами
Методом авторад иографин Н. Mohler п J.G.Richards (1981) показали, что бензодиазепины и антагонист Ro 15-1788 взаимодействуют с одними и теми же рецепторными участками. Б то же время мехагшзм взаимодействия агонистов и антагонистов с бензодиазепин овымп рецепторами различен. Если ГАМК усиливает сродство агонистов к этим рецепторам, то она не влияет на сродство к ним Ro 15-1788 н уменьшает сродство к ним бензодиазепинового судорожного ант агониста метил- р-карболин-З-карбоксилата.
Интересно отмегнть, что как и многое другие рецепторные снс-i темы, бензодиазепиновые рецепторы чувствительны к ГТФ. Обна-[ ружено, что ГТФ, ио не ГМФ, АТФ или АДФ, це изменяет числа
335
бензодиазепиновых рецепторов мембран клеток коры мозга быка, но уменьшает нх сродство к 3Н-флу нитразепам у [Fond J.C. et al., 1982]. При этом ГТФ не влияла ла взаимоотношения бепзодиазе-шиювых рецепторов с ГАМК-рецеиторамн. Эти результаты указывают, что гуаниновые нуклеотиды модулируют связывание агонистов с бензодиазепиновыми рецепторами и, вероятно, не влияют иа взаимодействие ГАМК-модулирующего белка с бензодиазепиновыми рецепторами.
Кинетический анализ показал, что образование комплекса флунитразепам — бензодиазепиновый рецептор состоит из двух этанов: 1) быстрое связывание и 2) медленная изомеризация рецептора, сопровождающаяся его конформационными изменениями, приводящими к развитию физиологического эффекта [Quast Н., Mahlmann Н., 1982].
Т.Н.Chiu и соавт. (1982) предложили кинетическую модель рецепции, предлагающую циклический переход бензодиазепинового рецептора между двумя связывающими конформациями R и R’. Обратимый переход R в R' сопровождается повышением сродства к лиганду (L). Связывание L с конформацией, соответствующей низкому сродству с рецептором, приводит к образованию легко обратимого комплекса RL, который изомеризуется в более устойчивый комплекс R'L. При этом скорость образования RL существенно выше скорости изомеризации этого комплекса в R'L, но подобный переход облегчается при увеличении температуры. ГАМК уменьшает Диссоциацию RL.
Изучение зависимости связывания диазепама, Ы-дезметпл-дназепама и флунитразепама с рецепторами мембран клеток головного мозга крыс от температуры (>10 °C) позволило установить, что причиной этого взаимодействия является изменение энтальпии (ДН=-40 —50 кДж/моль) с небольшим вкладом изменения энтропии (AS) [Quast U. et al., 1982]. Следовательно, ассоциация агонистов с бензодиазепиновыми рецепторами — это пе простое гидрофобное взаимодействие и не простая адсорбция лиганда па рецепторном участке, а сложная молекулярная реакция, сопровождающаяся конформационным переходом ре-
1 JL.
L+R w=fc LR *7* LR;
LK
ueiiTop-Juiraitfuioro комплекса.
Основываясь па термодинамических данных, Н.Mohler и
336
J,G.Richards предлагают следующую модель взаимодействия лигандов (L) с бензодиазепиновыми рецепторами (R):
как агонисты, так и антагонисты принимают участие в реакции (1) — образовании комплекса лиганд—рецептор. Однако только агонисты принимают участие в реакции (2), суть которой заключается в индукции конформационного изменения рецептора, ведущего к формированию активированного состояния R’, необходимого для инициации фармакологического ответа. В то же время судорожные лиганды индуцируют противоположные изменения бензодиазепинового рецептора в результате реакции (3).
Таким образом, термодинамический подход дал возможность В общих чертах описать этапы взаимодействия лигандов с бензодиазепиновыми рецепторам и, но проверить гипотезу, предлагаемую Н.Mohler и J.G.Richards, и изучать другие аспекты молекулярного механизма этого взаимодействия можно будет только с помощью методов, дающих возможность непосредственной регистрации характера конформационных изменений белков бензодиазепинового рецептора.
8.5. Биохимические механизмы функционирования бензодиазепиновых рецепторов
Как уже указывалось, бензодиазепиновые рецепторы локализованы на постсипаптнческих мембранах ГАМК-ергических систем ЦНС. Поданным Н.Mohler (1982), 30% фотоаффишюмеченных НН-флунитразепамом бензодиазепиновых рецепторов ассоциировало С имму иоцитохимически окрашенными ГАМК-ергическими нервными окончаниями. Именно с усилением ГАМК-ергическоЙ синаптической передачи, показанным электрофизио логически, и связывают проявление функциональной активности бензодиазепиновых рецепторов.
' Для установления взаимоотношений ГАМК-рецептора и .бензодиазепинового рецептора в мембранах клеток мозга теленка M.Gavish ц S.H.Snyder (1981) анализировали связыва-ННе лигандов этих рецепторов "Н-мусцимола и 3Н-флупитразепама И процессе хроматографической очистки рецепторов. В очищенных препаратах сохранялась различная специфичность связыва-
Эи.227
337
Рис. 59. Предполагаемый молекулярный механизм действия бензо* диазспинов [Mohler Н., 1982].
БР — бензодиазепиновый рецептор; бензодиазепиновая молекула изображена в виде трсуголыатка; ГАМК-Р — ГАМК-рспсптор; С1-— хлорид, прохо-дящпн через хлорный канал.
шш лигандов центрами связывания бензодиазепинового и ГАМК* рецепторов. В этих препаратах, как и па мембранах, агонисты ГАМК-рецепторов усиливали связывание 3Н-флунитразепама с бензодиазепиновыми рецепторами. Аналогичное действие па связывание 3Н-флуиитразенама оказывал СГ. Другими словами, узнающие центры ГАМК, бензодиазепинов, а также центры связывшшя СГ тесно связаны друг с другом и, возможно, входят в состав одного макромолекулярного комплекса.
A.Tomiko и соавт. (1983) для необратимого связывания 3Н-муецпмола (лиганда ГАМК-реценторов) и *Н-флу нитразепам а с сицацтосомными мембранами мозжечка крыс препараты мембран
338
Рис. 60. Модель механизма действия бензодиазепинов [Snyder S. Н., 1981].
i а — высвобождение ГАМК при стимуляции ГАМ К-сргпчес кого нейрона; б — связывание ГАМК с поетеипиитическим ГАМК-рсисптором сопровождается открытием хлорного канала; в — проникновение СГ через открытый Канал: г — связывание бензодиазепинов с бензодиазепиновыми рецепторами сопровождается дальнейшим увеличением проницаемости хлорного канала.
подвергали воздействию УФ-лучей (20 мин при 0°С). Последующий электрофоретический анализ показал, что рецепторный белок, содержащий 3Н-мусцимол или 3Н-флунитразепам, имеет Мг, равную № ООО ± 1 000. Этот результат также свидетельствует, что места Ьгецифического связывания бензодиазепина находятся па молекулах белка, входящего в структуру рецепторов к ГАМК.
h Доказательством сложной структуры бензодиазепинового рецептора служат данные М. Nielson и соавт. (1983), что облучение гомогената клеток коры головного мозга крыс электронами -высокой энергией приводит к возрастанию связывания 3Н-4-ГИл-6,7-диметоксн- Р-карболии-З-карбоповой кислоты с беи-Днаэенниовыми рецепторами. Авторы полагают, что данный ре-Ьптор представляет собой тетрамер (Мг субъединицы ~ 50 000), ассоциация которого па мономер и тример приводит к увеличено сродства радиолигапда к участку связывания в тримере.
К Оценка молекулярной массы белкового комплекса сипантиче-
339
Рис. 61. Сопряжение бензодиазепиновых (БЗ) рецепторов-с ГАМК-рецепторамп п хлорным каналом в нейрональной плазматической мембране [Bracstrup С., Neilsen М., 1980].
Гипотетический белок ГАМК-модулин (ГМ) взаимодействует как с бензодиазепиновыми, так и ГАМК-рспепторамп. Частичный агонист ГАМК-рецепторов THIP по сравнению с ГАМК вызывает менее выраженные конформационные изменения ГАМК-рецепторов. ГАМК, но нс THIP увеличивает сродство 3Н-диазепам а к БЗ рецепторам за счет вытеснения ГМ из его связи с рецепторным комплексом.
ских мембран коры головного мозга крыс, который связывает бензодиазепины и ГАМК, методами радиационной инактивации и гельфильтрации показала, что он равен 220 000 и 230 000 соответственно [Chang L.-R., Bornard Е.А., 1982]. Фотоаффшпю меченный 3Н-флупитразенамом полипептид с молекулярной массой 51 000 представлял собой субъединицу данного олигомерного белкового комплекса. A.Doble и L.L.Iveresen (1982) также использовали метод радиационной инактивации для изучения размеров молекулы бензодиазепиновых рецепторов. Согласно результатам этих авторов, бензодиазепиновые рецепторы, входящие в состав ГАМК-беизодиазепипсвязывающего комплекса, представляют собой димер с молекулярной массой 90 000 — 100 000. Предполагается, что присоединение к данному комплексу ГАМК приводит к разделению двух трансмембранных белков (димера бензодиазепиновых рецепторов), что сопровождается открытием капала для СГ. При открытом хлорном канале (мономер бензодиазепиновых рецепто-
340
рои) сродство к бензодиазепинам намного выше, чем при закрытом канале. Подобная модель функционирования рецептор-ионо-фориого комплекса предложена и для Н-холинорецептора [HeidmannT., Changeux S.H., 1978].
Заканчивая этот раздел, приводим современные схематические представления о строении и функции бензодиазепиновых рецепторов, сопряженных с ГАМК-рецептором и хлорным каналом (рис. 59-61).
Считается, что активация ГАМК-рецептора выделившимся нейромедиатором приводит к открытию этого капала, увеличению мембранной проводимости для СГ ц, следовательно, к ги-нерполяризации ностсинаитической мембраны, ведущей к увеличению устойчивости клетки к возбуждающим сигналам. Как отмечает W.Haefely (1984), бензодиазепины удлиняют возможность существования «открытых» ионных каналов в ответ на воздействие ГАМК, не влияя па число каналов и движение СГ.
Различные белковые компоненты, включая бензодиазепиновый рецептор, могут аллостерически взаимодействовать с ГАМК-рецептором н хлорным каналом. В присутствии бензодиазепинов возникают такие динамические межбелковые взаимодействия в ГАМК-рецепторном комплексе, которые сопровождаются усилением ГАМК-ергнческой синаптической передачи.
При изучении подтипов ГАМК-рецепторов, с которыми взаимодействуют бензодиазепины, оказалось, что ими являются ГАМКД-рецепторы. Поведенческие и электрофизиологические эффекты бензодиазепинов снижаются или предотвращаются после предварительного воздействия антагонистов ГАМКа-рецепторов (например, бикукуллин). Как известно, ГАМКа-рецеиторы представляют собой пептамер, состоящий из субъединиц в различных сочетаниях, которые могут иметь шесть альфа-субъедщпщ, три бега-субъединицы, три гама-субъсдиницы и 2 дельта-субъедииицы. Согласно экспериментам по клонированию этих рецепторов для формирова!шя участка, связывающего специфично бензодиазепины, необходимо присутствие альфа-, бета-, и гама-субъединиц (Pritchett et al., 1989), но для потенцирования бепзодиазешшами индуцируемою ГАМК повышения проницаемости для хлора в состав рецептора должны входить альфа- или бета- и гама-субъед| ншцы.
При отсутствии ГАМК бензодиазепины не влияют на хлорную проводимость нейрональных мембран. Бензодиазепины сдвигают влево кривую доза —эффект для ГАМК, не
341
влияя на максимальную величину повышения хлорной проницаемости, вызываемого ГАМК (Rogers et al,, 1994).
В то же время следует отметить, что не все эффекты бензодиазепинов опосредуются ГАМК-бепзодиазеииновым рецепторным комплексом. В низких концентрациях бензодиазепины оказывают депрессивное действие на нейроны гиппокампа, которое не блокируется бикукуллином или пикротоксином (Mendelson, 1992). В больших концентрациях бензодиазепины вызывают сон и амнезию, а также оказывают противосудорожные эффекты; в реализации этих эффектов могут принимать и другие механизмы — ингибирование поглощения аденозина, кальциевой проницаемости (Phillis, O'Regan, 1988).
8.6. Эндогенные лиганды бензодиазепиновых рецепторов
После открытия бензодиазепиновых рецепторов исследователи сразу начали поиск их эндогенных лигандов. Все известные нейромедиаторы ими не оказались. C.Marangos и соавт. (1978) выделили нз ацетоновых или метанольных экстрактов головного мозга быка и крыс диализируемые, устойчивые к нагреванию и действию протеолитических ферментов соединения, которые ингибируют связывание бензодиазепинов. Ими оказались пурины: инозин и гипоксантин [Skolnick Р. et al., 1978]. Однако их сродство к бензодиазепиновым рецепторам было па 6 порядков меньше по сравнению с бензодиазепинами. Тем пе менее, эти соединения могут служить эндогенными модуляторами бензодиазепиновых рецепторов. Так, электрофизиологические эффекты флуразепама и инозина в культуре нейронов спинного мозга мышей были сходны между собой [McDonald J. et al., 1979]. Увеличение лшшдорастворимо-сти молекул пуринов путем химической модификации более чем в 100 раз увеличивает их сродство к бензодиазепиновым рецепторам in vitro [Skolnick Р., Paul S.M., 1981].
В качестве эндогенных лигандов бензодиазепиновых рецепторов можно рассматривать тромбоксан А2 и никотинамид [Mohler Н., Pole Р., 1979], хотя их сродство к этим рецепторам также ниже самих бензодиазепинов.
342
В последующем появились сообщения, что в топком кишечнике п желчном протоке крыс присутствует пептид с молекулярной массой 16 000, который конкурентно ингибирует связывание 3Н-дпазенама со специфическими центрами связывания бензодиазепинов па сииацтосомиых мембранах головного мозга крыс [Nixon J.C., Woolf J.H., 1979; Woolf J.H., Nixon J.С., 1981], Авторы назвали этот пентод иепентрниом. По их данным, пепептрин ингибирует связывашге яН-дцазепама с константой Кг равной 4,6-10* М, но не влияет па специфическое связывание лигандов с рецепторами опиатов, ГАМК, дофамина и 0-адреио-рецепторамн. ГАМК и глицин в свою очередь пе влияли па ингибирование иеиептрипом связывания 3Н-диазепама.
После достаточно жесткого протеолиза трипсином, химотрипсином п проназой пеиептрпн сохранял способность ингибировать связывание эН-дпазецама, что указывает па сохранение у фрагментов непентрппа биологической активности.
С помощью антител против пепентрнна установлено, что в клетках коры переднего мозга присутствует вещество с пмму-пореактивпостью непентрппа. Эти данные дают возможность предполагать, что пепептрин может служить предшественником пептида с низкой молекулярной массой, обладающим высоким сродством к рецепторам бензодиазепинов в головном мозге. Однако его роль, так же как и роль пуриновых оснований, тромбоксана Аа п никотинамида как эндогенных лигандов бец-; зодпазелпповых рецепторов, еще предстоит изучить. Вместе с тем мы считаем необходимым подчеркнуть, что все они имеют более низкое сродство к бензодиазепиновым рецепторам, чем диазепам (константа связывания его с мембранами мозга крыс равна 3 иМ).
i Особое место среди возможных эндогенных лигандов бензодиазепиновых рецепторов занимают ^-карболниы, имеющие наибольшую способность вытеснять радполнгаиды из их связи с бензодиазепиновыми рецепторами. [i-Карболипы найдены в тромбоцитах н головном мозге [Williams М., 1983]; существует корреляция между анксиолитической активностью ₽-карболи-нов ц их способностью специфически связываться с бепзодиа-зешшовымн рецепторами in vivo [Stephens D.N. et al., 1984].
, Поскольку при выделении JJ-карболшюв необходимо исполь-: зовать высокие температуры и низкие значения pH, нредпола-; гается, что они образуются в результате альдегидной конденсации ; пептидов или белков, содержащих триптофан или триптамин. Од
343
нако следует отметить, что [J-карболнны могут также изменять серотонинергические процессы [Stephens J,К. et al., 1984], и их специфичность как эндогенных модуляторов бензодиазепиновых рецепторов цока нс изучена, как н не изучено, в каких структурах головного мозга образуются Р-карболнны и действительно ли существует возможность их взаимодействия с бензодиазепиновыми рецепторами in vivo.
Согласно результатам А.Я.Корнеева и М.И.Фактора (1983), в экстрактах головного мозга крысы присутствуют термоста-бцльныс вещества с молекулярной массой 2000 — 10 000, ингибирующие специфическое связывание ;fИ-диазепама. Дальнейшие исследования показали, что эндогенные ингибиторы специфического связывания бензодиазепинов в коре головного мозга с молекулярной массой 2500 относятся к бпомолекулам пепептидиой природы [Кладпнцкнй А.В., Мухин А.Г., 1984].
Таким образом, имеющиеся данные об эндогенных лигандах бензодиазепиновых рецепторов свидетельствуют о необходимости продолжения исследований в этом направлении для выяснения химической природы этих лигандов и принципов нх функционирования.
* * *
Итак, из имеющихся сведений о биохимической фармакологии бензодиазепиновых рецепторов можно сделать следующие выводы.
1. Бензодиазепиновые рецепторы представляют собой гетерогенные белковые молекулы, локализованные в ЦНС в основном па постсипаптических мембранах ГАМ К-ерги веских структур с молекулярной массой ~ 50 000.
2. Бензодиазепиновые рецепторы специфически с высоким сродством связывают производные бензодиазепина и некоторые химически родственные соединения и опосредуют нх фармакологическую активность, выражающуюся в снижении чувства страха, улучшении спа, мышечном расслаблении.
3. Механизм функционирования бензодиазепиновых рецепторов заключается в сопряжении с ГАМК-рецепторпым комплексом и в усилении ГАМК-ергпческой сншштнческой передачи.
В будущем эксперименты, ио-видимому, позволят выяснить молекулярный механизм сопряжения бензодиазепиновых рецепторов с ГАМК-рецепторпым комплексом и другие аспекты их функциональной активности. Особое внимание, цо нашему мнению, необходимо уделить изучению возможных эндогенных лигандов
344
бензол назеп и полых рецепторов, так как до сих пор не ясно, какую роль выполняют эти рецепторы в отсутствие экзогенных лигандов. Прогресс в данном направлении откроет, несомненно, новую страницу в наших представлениях о нейрональных и психических механизмах.
Глава 9
РЕЦЕПТОРЫ ВОЗБУЖДАЮЩИХ АМИНОКИСЛОТ
9.1. Классификация рецепторов ВАК
Возбуждающее действие L-глутамиповой и других кислых аминокислот сначала было установлено на нейронах сшитого мозга [Curtis et al.,1959; Curtis et al.,1960],а затем и на нейронах других отделов ЦНС [Krnjevic, Phillis, 1963]. При этом только внеклеточная аппликация этих аминокислот, а пе их введение в клетку, приводило к деполяризации нейронов. Самый сильный эффект проявила М-метил-О-аспаратшювая кислота (NMDA) [Curtis et al., 1960]. Это и позволило выдвинуть предположение о существовании мембранных рецепторов, управляющих электрической возбудимостью постсипантической мембраны, для L-глутамиповой кислоты и ее аналогов.
Была даже предложена «трехточечная» схема строения узнающего центра этих рецепторов [Curtis, Watkins, 1960]. В рамках этой схемы возбуждающее действие могут оказывать только кислые аминокислоты и их аналоги, в которых а-амино-кислот-пая группировка отделена от дистальной кислотной rpyiuibi цепочкой из 2 — 3 метиленовых групп. Отрицательно заряженные кислотные группы и протонированная аминогруппа взаимодействуют, соответствышо, с двумя положительно и одешм отрицательно заряженными пунктами в связывающем сайте рецептора.
Однако в последующих работах была установлена различная регионарная чувствительность нейронов мозга млекопитающих к деполяризующему действию кислых аминокислот [McLennan et al., 1979]. В частности, L-глутаминовая кислота значительно превосходила L-аспарагнповую по возбуждающе
346
му эффекту при подведении к интернейронам задних рогов спинного мозга, в то время как при тестировании этих аминокислот па клетках Репшоу передних рогов наблюдались противоположные результаты [Johnson et al., 1987], Эти исследования дозволили предположить существование двух типов рецепторов ВАК— «ас нарт ат-чувствительных» и «глутамат-чувствительных», что послужило отправной точкой для поиска специфичных антагонистов этих рецепторов.
Решающую роль в этих поисках сыграло открытие антагонистического действия диэтилового эфира L-глутамиповой кислоты (ДЭЭГ) и D-2-амино-адипиновой кислоты, блокирующих действие разных ВАК с различной эффективностью [Haldeman, McLennan, 1972], что и позволило установить наличие гетерогенной популяции рецепторов ВАК и разделить их на два класса: NMDA- и neNMDA типы [Davies, Watkins. 1982].
В результате дальнейших исследований с использованием современных методов электрофизиологии, радиолигапдпого связывания и молекулярной биологии было установлено, что в ЦНС млекопитающих существуют четыре типа ионотропных рецепторов ВАК, управляющих проницаемостью ионных каналов, и семейство метаботропных рецепторов ВАК, связанных с G-белком.
Современная классификация ионотропных рецепторов основана на разной их чувствительности к действию N-метил-D-аспарагиновой (NMDA), 2-амино- 3-(3-гидрокси-5-метилиэоксазол-4-ил)пропионовой (АМРА), каиновой и L-2-амицо-4-фосфопомасляной (L-AP4) кислот. Названия этих соединений, наиболее селективных лигандов данного типа рецепторов, и были присвоены соответствующим типам рецепторов—NMDА, АМРА, каинатный и L-AP4 типы, соответственно. Правда, первые три названы по избирательным агонистам, тогда как в последнем случае использовано название наиболее селективного антагониста.
Следует отметить, что в начале исследований по физиологии и фармакологии рецепторов ВАК рецепторы АМРА типа называли квнсквалатпыми по названию наиболее селективного из известных тогда агонистов — квисквалевой кислоты, природной аминокислоты, выделенной из семян растения Quisqualid fruc-tus. В электрофизиологических экспериментах она стимулировала возбуждающие рецепторы рака, лягушки и млекопитающих [Takemoto, 1978].
347
Однако исследования последних лет показали нецелесообразность использования этого названия для одного из ионотропных рецепторов ВАК. В первую очередь это связано с тем, что квискваловая кислота является также лигандом метаботропных рецепторов ВАК [Schoep et al., 1991]. Следует также отметить, что квискваловая кислота—соединение с весьма широким спектром действия; она способна влиять на различные биохимические и мембранные системы в нервных клетках не только за счет активации соответствующих ионотропных рецепторов, но и ио иному механизму —например, квисквалат тормозит натрий-зависимое выделение глутаминовой кислоты в нейронах. Упомянем также пока еще не нашедший объяснения факт взаимодействия квисквалата с рецептором L-AP4 типа. При инкубации срезов гиппокампа в среде, содержащей квисквалат, уже через несколько минут отмечается повышение чувствительности нейрональных ответов к блокирующему действию L-AP4 [Johnson, Koerner, 1988].
Поэтому, когда было обнаружено, что более активным и селективным агонистом этого тина рецепторов является синтетическая 2-амипо-3-(3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-ил)нропио-повая кислота (АМРА) [Brehm et al., 1988], за ними утвердилось название АМРА рецепторы.
При изучении ответов ЦНС млекопитающих на стимуляцию квисквилатом и каинатом очень часто наблюдается определенное сходство, такое же сходство наблюдается в чувствительности этих ответов к антагонистам. В связи с этим возникает вопрос — являются рецепторы neNMDA типа одним или несколькими образованиями. Другими словами —существуют ли отдельно рецепторы АМРА и каинатного типа? Известны и другие работы, в которых обсуждается сходство и различие этих двух типов рецепторов [см., например, Kiskin et al., 1986; Sakimura et al., 1990; Krogsgaard-Larsen et al., 1991]. Существует мнение, что в основе некоторых эффектов, индуцируемых каинатом в ЦНС млекопитающих, лежит активация АМРА рецепторов. Однако данные радиолигандпого анализа показывают, что 3Н-АМ-РА и 3Н-каипат сильно отличаются друг от друга но избирательности связывания и распределению мест связываивя [Foster, Fagg, 1984]. Более того, молекулярная масса структуры, содержащей сайт высокоаффиипого связывания 3Н-каината, составляет 76 кдальтоп, и этот рецептор чувствителен к ионам Са2+. Масса соответствующей структуры для 3Н-АМРА составляет 51,6 кдаль-тоц, и этот рецептор пе чувствителен к действию ионов каль
348
ция. При этом АМРА рецептор существует как равновесная смесь двух различных конформационных состояний, причем на положение равновесия влияют ионы SCN [Watkins, 1991]. Данные молекулярно-биологических исследований но клонированию и выделению ВАК-реценторных белков также свидетельствуют о различии этих рецепторов [Seeburg, 1993].
Метаботропные рецепторы ВАК чувствительны преимущественно к действию L-глутамиповой, квискваловой и транс-1-ами-поциклопентаи-1,3-дикарбоцовой (ACPD) кислот. Действие этих рецепторов конкурентно блокируется 2-амипо-З-фос-фононрониоповой кислотой. По совремешпям данным, семейство метаботропных рецепторов включает в себя семь подтипов (mGluRl — mGluR7) [Masuetal., 1991; Abeetal., 1992; Takashahi et al., 1993; Gabeiljui et al., 1993; Okamoto et al., 1994]. Белки этих рецепторов кодируются разными РНК [Tanabe et al., 1993], и рецепторы отличаются друг от друга по избирательности действия агонистов и физиологическим функциям. Подробнее эти вопросы мы рассмотрим в соответствующей главе.
Подчеркнем еще раз тот факт, что лиганды рецепторов ВАК в подавляющем большинстве случаев представляют собой соединения, в молекулах которых присутствуют две кислотные и одна основная функции. От природы кислотных функций, за-мещещюсти аминогруппы, расстояний между фармакофорными группами и копформациогшой подвижности молекулы зависит степень предпочтительности взаимодействия данного соединения с тем или иным типом рецептора.
Таким образом, нейромедиаторная система ВАК, подобно другим нейромедиаторным системам, представляет собой совокупность различных типов рецепторов, отличающихся друг от друга строением (канальные ионотропные или связанные с G-белком), распределением в ЦНС и функциональной значимостью. Ниже мы рассмотрим подробнее эти типы рецепторов.
9.2. NMDA рецепторы
В настоящее время из всех типов рецепторов ВАК рецептор NMDA типа изучен наиболее подробно. В первую очередь это связано с тем, что именно для этих рецепторов были открыты первые конкурентные антагонисты — 2-амиио-ш-фосфонокар-боновые кислоты.
349
Изучите действия па NMDA рецепторы различных классов соединений показало, что постсинаптический NMDA рецептор представляет собой сложное надмолекулярное образование, включающее в себя несколько сайтов регуляции—сайт специфического связывания медиатора (L-глутаминовой кислоты), сайт специфического связывания коагописта (глицина) и аллостерические модуляторные сайты, расположенные как иа мембране (полиаминовый), так и в ионном канале, сопряженном с рецептором (сайты связывания двухвалентных катионов и «фенциклидиновый»- сайт —участок связывания неконкурентных антагонистов). Поэтому в дальнейшем мы будем, наряду с термином NMDA рецептор, использовать и термин NMDA-рецеиторно-иопофорный комплекс, подчеркивая тем самым сложность его строения и множественность возможностей регуляции его функций.
К особенностям всего NMDA -рецепторно-ионофорного комплекса относятся: 1) хемо- и потенциал-чувствительности одновременно; 2) медленная динамика и определенная частотная характеристика запуска; 3) длительность эффекта; 4) потенциал — чувствительное “окно” (-30 —-20 мВ); 5) способность к временной суммации и усилению вызванного потенциала [Jose et al., 1996].
Работы по выделению NMDA-рецепторных белков и по установлению их молекулярной массы с помощью техники радиационной инактивации указывают, что масса комплекса, включающего в себя сайты связывания агонистов, конкурентных и неконкурентных антагонистов и глицина составляет около 120 ООО дальтон [Wong, Kemp, 1991].
Однако популяция ЫМОА-рецепторпо-иопофорцых комплексов в организме млекопитающих не гомогенна. Показано, что в головном мозге существуют NMDA-рецепторы с преимущественным сродством к агонистам (стриатум, мозжечок) или к таким антагонистам, как АР5 или СРР (неокортекс, таламус) [О1 verman et al., 1986].
Работы по выделению и анализу генов, кодирующих NMDA-реценторпые белки, показали, что NMDA рецептор может быть реконструирован в виде гетеромерной структуры из двух типов субъединиц, одна из которых всегда субъединица NMDAR1, а вторая —одна из четырех NMDAR2 субъединиц (NMDAR2A— NMDAR2D) [Seeburg, 1993]. Субъединица NMDAR1 является ключевой, так как обладает всеми свойствами, характерными для NMDA-рецецторио-ионофорного комплекса—избирательность к
350
шонистам и антагонистам, действие глицина, потенциал-зависи-мая блокада ионами магния, ингибирование ионами цинка и проницаемость канала для ионов кальция [Moriyoshi et al., 1991; Sugihara etal., 1992; Karp etal., 1993]. Субъединицы NMDAR2A-D не образуют канал, ио в сочетании с субъединицей NMDAR1 потенцируют активность всего комплекса [Ishii Т. et al., 1993]. мРНК субъединицы NMDAR1 экспрессируется во всех нейрональных клетках всех отделов мозга, тогда как экспрессия субъединиц NMDAR2A-D не одинакова в разных областях [Moriyoshi К. et al., 1991; Ishii et al., 1993]. Поэтому включение того или иного подтипа субъединицы NMDAR2 в гетеромерный комплекс определяет вариабельность рецептора. То есть, функциональная I'ereporeiiiiocTb NMDA рецепторов в различных нейрональных клетках определяется функциональными и анатомическими различиями субъединиц NMDAR2 [Sheng et al., 1994; Farrant et a!., 1994; Priestley, Kemp, 1994; Standaert et al., 1994]. Однако соотношение субъединиц, входящих в состав рецепторного комплекса, зависит пе только от типа ткани, но и изменяется с возрастом [Monyer et al., 1994].
От субъединичного состава рецепторного комплекса зависят не только параметры сродства лигандов (как агонистов, так и антагонистов) к глутамат-связывающему сайту NMDA рецептора [Laurie,Seeburg,1994; Lynch et al., 1994],такие «изорецепторы» отличаются аффинностью к агонистам и антагонистам других сайтов — глицинового, полиамииового и канального (неконкурентные антагонисты) сайтов [Kraus et al., 1994; Yonedaetal., 1994; Priestley, Kemp, 1994].
Агонисты и конкурентные антагонисты глутамат-связывающего сайта NMDA рецепторов.
К истинным агонистам и конкурентным антагонистам NMDA рецепторов относятся соединения, способные избирательно взаимодействовать непосредственно с глутамат-связывающим сайтом рецептора, участком узнавания медиатора. В отличие от них неконкурентные антагонисты модулируют активность NMDA рецепторно-ионофорного комплекса, связываясь с Другими молекулярными структурами в рецепторе, а коагопист глицин имеет свой специфический узнающий сайт.
Выявление и идентификация агонистов и конкурентных антагонистов NMDA рецепторов проводится с использованием модели конкурентного ингибирования специфического связывания меченого лиганда с последующим исследованием ха-; рактера действия этих соединений па синаптическую переда
351
чу на нейрональных моделях. Этот метод дает наиболее адекватную оценку относительной активности подобных соединений, так как данные электрофизиологических опытов не отражают реальной степени взаимодействия агониста с рецептором. В этих экспериментах суммарный нейрональный ответ зависит от целого ряда факторов, действующих в этой биологической системе: активации других рецепторов, активности систем захвата, прохождения вещества через мембраны и др. [Watkins, Olverman, 1988].
Особенности строения агонистов.
Из эндогенных соединений агонистами NMDA рецепторов являются сама L-глутаминовая кислота (однако опа не является специфичным агонистом, а действует па все тины рецепторов ВАК) и хинолиновая кислота—один из продуктов метаболизма триптофана [Lapin,Politi, 1993; Lapin, Ryzov, 1990; Stone, 1993].
К агонистам NMDA рецепторов относится также природная иботеновая кислота, представляющая собой аналог мусцимола, агониста ГАМК рецепторов, с карбоксильной группой в боковой цепи. Подчеркнем одну интересную особенность, связывающую между собой ГАМКергические и ВАКергические вещества —во многих случаях аналогичных упомянутому выше; различие в химическом строении агонистов заключается лишь в отсутствии карбоксильной группы в сх-ноложении к аминогруппе. Так, например, отличаются друг от друга у-амииомасляная и глутаминовая кислоты.
Агонистами глутамат-связывающего сайта NMDA рецепторов являются сама NMDA, иботеновая (IBO), трапс-нипери-дип-2,3-дикарбоновая (trans-2,3-PDA), D-гомоцистеинсульфи-повая (D-HCSA), (13,ЗК)-1-аминоциклобутап-1,3-ди-карбопо-вая (ACBD), (Ш,ЗК)-1-амииоциклопептап-1,3-дикарбо110вая кислота (ACPD), (2S.3R.4S)- и (2И,35,45)-3,4-циклопропилглу-тамиповые (2S,3R,4S-CPG и 2R,3S,4S-CPG, соответственно) кислоты (рис. 62). Среди других агонистов обращает на себя внимание (РЗ)-(тетразол-5-ил)глицин —наиболее активный из известных агонистов глутамат-связывающего сайта NMDA рецепторов [Schoepp et al., 1991; Lunn et al., 1992]. Формально его молекула не содержит у p-углеродпого атома карбоксильной группы. Роль дистальной кислотной группы в этой молекуле выполняет кислый гетероциклический остаток. Поэтому можно говорить, что молекулы всех этих соединений содержат все три группы, входящие в состав ВАКергивеского фармакофора: две кислотные и одну основную.
352
Для агонистов NMDA рецепторов характерны следующие структурные особенности: короткая пеночка, соединяющая терминальные кислотные функции; предпочтительность замещения атома азота аминогруппы; D-коифигурация хиралыюго центра. Агонистическая активность определяется природой о>-кислотной функции и убывает в ряду СООН > SO3H > РОЗН2 [Пиотровский, 1987].
Однако в настоящее время известны и соединения, содержа-; щие несколько иной фармакофор, например, N-фталамоил-Ь-. глутаминовая кислота (PhGA) [Kiskin et al., 1991].
i To, что PhGA является избирательным агонистом NMDA ; рецепторов, было обнаружено в электрофизиологических опытах па пирамидальных нейронах гиппокампа крыс. Это следует из того, что: а) ответ па его действие появлялся только в присутствии глицина, селективного модулятора NMDA рецепторов; б) обратный потенциал индуцируемых им токов был идентичен таковому для асиартат-ипдуцируемых токов; в) вызванный им ответ избирательно блокировался ионами Mg2*, блокатором ионных каналов NMDA рецепторов, конкурентным (D-AP5) и неконкурентным (кинуренатом) NMDA антагонистами; г) наблюдалась полная перекрестная десепситизация ответов на аспартат и PhGA. Однако максимальный ответ, вызываемый этим соединешгем, значительно меньше, чем ответы на аспартат и NMDA. В отличие от большинства других агонистов рецепторов ВАК, молекула PhGA пе содержит амино-, ио зато содержит три карбоксильные группы. Необходимость ароматической карбоксильной группы для проявления NMDA агонистического действия следует из того, что его дезкарбоксиапа- лог, N-бензоил-L-глутаминовая кислота, таким действием не об-. да дает. Поэтому PhGA была названа «суперкислым» атопитом NMDA типа [Kiskin et al., 1991].
Изучение влияние PhGA на связывание 3H-L-Glu с синаптическими мембранами гиппокампа человека ,в сравнении с 1NMDA показало, что оба соединения ингибируют ее связыва-'Ние с примерно одинаковыми константами. Добавление в инкубационную среду глицина пе влияло па параметры связывания 3H-L-Glu, по усиливало ингибирующее действие NMDA и |₽hGA. Эти данные также свидетельствуют об избирательности взаимодействия этого соединения с NMDA рецепторами [Ко-Ьешопков и др.,1995].
Ь.зк.зм 353
соон
НООС NHCHj
NMDA
он
н
НООС
trans-2,3-PDA
НООС
н 2n соон
D-HCSA
1R.3R-ACPD
1S.3R-ACBD
2S,3R,4S-CPG
н
Рис.62. Агонисты глутамат-связывающего сайта NMDA рецептора.
В опытах in vivo это соединение предупреждает судороги, вызываемые ВАК. Анализ его противосудорожного действия показал, что оно дозозависимо подавляет судороги, вызываемые NMLDA, и превосходит по силе действия y-DGG. Против
354
каииат-индуцированпых судорог PhGA действует слабо и только в максимальных дозах (1,0 мкмоль) [Гаряев и др., 1990].
Из сравнения данных биологического действия PhGA in vivo и in vitro можно сделать вывод, что опа является частичным агонистом. «Внутренняя активность* этого соединения невелика, поэтому при интрацеребровентрикулярном введении мышам его высокой дозы (1 мкмоль) судорожный ответ не возникает. Обладая практически таким же сродством к рецептору, что и NMDA, трикислота PhGA в экспериментах in vivo способна блокировать ее действие, так как концентрация последней в этих опытах на три порядка ниже.
Особенности строения антагонистов.
Важной вехой в изучении ВАКергической передачи стало открытие конкурентного NMDA антагонистического действия 2-амшю-со-фосфонокарбоновых кислот. Среди лигандов различных рецепторов ВАК па сегодняшний день этот класс соединений наиболее обширен. Он включает в себя дикарбоновые аминокислоты, пептиды, производные фосфоновой кислоты и циклические соединения. Наиболее известными конкурентными антагонистами NMDA рецепторов являются О-2-амиио-5-фосфоновалериа-повая кислота (D-AP5), 0-2-амипо-7-фосфоногептаиовая кислота (D-AP7), jJ-D-асиартиламииометил-фосфоиовая кислота (GAMS) И другие [Johnson, Koerner, 1988]. Эти соединения конкурентно ингибируют связывание меченых лигандов NMDA рецепторов с Мембранами мозга и устраняют ЫМОА-иодуцировапную деполяризацию спинальных мотонейронов, по не влияют па возбуждение нейронов, вызванное каинатом, квисквилатом или АМРА. NMDA-антагонисты, содержащие остаток фосфоповой кислоты, оказались очень эффективными средствами экспериментального Исследования рецепторов ВАК, однако их применение ограничено в основном моделями in vitro и опытами с интрацентралы 1ым введением из-за плохою проникновения этих соединений через ГЭБ. Тем не менее перспективность использования конкурентных антагонистов NMDA рецепторов в качестве противосудорожных и церебропротективпых препаратов послужила стимулом для многих гругш исследователей в поиске новых соединений подобного типа действия, способных проникать через ГЭБ. Например, (+/-)-3-карбокси-5-фос- фоно-1,2,3,4-тетрагидроизо-Ьполип (SC-48981), который может рассматриваться как жест-ПЙ аналог АР5, по млению авторов представляет собой пример жтивного при системном введении конкурентного антагониста MDA рецепторов с длительным действием [Vasquez et aL, 1992].
355
н
CO-NH1 ’
СООН
СООН
СООН
Рис. 63. N-фталамоил-L-глутам ивовая кислота (PhGA).
Следует отметить попытки замены полярной фосфоповой кислотной группы на ее биоизостеры, например, на кислый гетероцикл тетразол. В первую очередь речь идет о цис-4-(2Н-тетразол-5-илметнл)пинеридиц-2-карбо11овой кислоте (LY 233053) [Ornstein et al., 1991]. По данным этих авторов, такая замена привела, наряду с сохранением NMDA антагонистической активности, к укорочению времени действия вещества. По их мнению, препараты с таким сочетанием свойств могут иметь определенные перспективы клинического применения.
При рассмотрении агонистов NMDA рецепторов мы упоминали №фтадамоил-Ь-глутамиповую кислоту как пример «суперкислого» агониста. Недавно появилась работа, в которой описаны NMDA антагонистические свойства двух природных аминокислот—(2R,1’R)- и (2К,Г5)-2-амипе-3-(1,2-дикарбок-сиэтилтио)нропиоцовых кислот, выделенных из Amanita pantherilia [Fushiya et al., 1993]. Антагонистические свойства этих двух аминокислот определялись па нескольких моделях, в том числе радиолигацдным анализом и в электрофизиологических экспериментах. Как и PhGA, эти аминокислоты также содержат в молекуле три кислотные группы, по, в отличие от PhGA, имеют и свободную аминогруппу. Правда, встает вопрос, можно ли называть эти соединения, по аналогии с PhGA, «суперкислыми» антагонистами, или две дистальные карбоксильные группы в этих молекулах биоизостерпы двухзаряжеппой фосфоповой группе.
В настоящее время активно синтезируется и изучается уже третье поколение конкурентных антагонистов NMDA рецепторов. К первому поколению относятся DL-AP5, DL-AP7 и их D-изомеры. Ко второму —ОЕ-3-(2-карбоксициперазин-4-ил) пролил -1-фосфоновая кислота (СРР), ОЬ-3-(2-карбоксипипера-зии-4-ил)прО11-1-еп-1-фосфоновая кислота (СРРепе), DL-цпс-4-фосфопометилпиперидин-2-карбоиовая кислота (CGS19755), 2-амипо-4-метил-5-фосфоиоиелт-3-енкарбоповая кислота (CGS37849), 2-амипо-4,5-( 1,2-циклогексил)-7-фосфопогептано-вая кислота (NPC12626) и 3-карбокси-5-фосфопо-1,2,3,4-тет-
356
рагидроизохиполип (SC46981). Третье поколение—оптические изомеры антагонистов второго поколения D-CPP, D-CPPene, Cis-CGS19755 и (2R)-CGS37849. К третьему же поколению следует отнести и соединение NPC 17742 [2R,4R,5S-2-aMmio-4,5-(1,2-циклогексил)-7-фосфо1югептаповая кислота] [Ferkany et al., 1993].
Основные закономерности связи химической структуры с биологической активностью в ряду антагонистов NMDA рецепторов сводятся к следующему: относительно длинная цепочка, соединяющая терминальные кислотные функции (четыре-шесть атомов); предпочтительность замещения атома азота аминогруппы; D-конфигурация хиралыюго центра. Выраженность антагонистической активности зависит от природы св-кислот-ной функции и в отличие от агонистов возрастает в ряду СООН > SO3H > РОЗН2 [Пиотровский, 1987].
Глициновый участок.
Еще несколько лет назад глицин, как и ГАМК, считался основным тормозным медиатором в ЦНС человека и животных, ; ингибирующее действие которого связывали со специфически-: ми глициновыми рецепторами, конкурентно и селективно бло-i кируемыми стрихнином и открывающими хлорный канал в синаптической мембране [Раевский, Георгиев, 1976]. Никто не пред-нолагал его тесной связи с системой возбуждения в ЦНС. В своей классической статье в 1960 году Curtis и Watkins как раз и разделяли аминокислоты на возбуждающие и тормозные, относя к первым дикарбоновые аминокислоты —аспарагиновую, глутаминовую и их аналоги, а ко вторым — продукты их а-: декарбоксилирования —р-аланин, у-амипомасляпую кислоту и I их аналоги, в том числе и глицин. Однако в конце 80-х годов Е лавинообразно стало возрастать число работ, в которых доказы-I цается участие глицина в положительной регуляции NMDA ре-I менторов. Результатом этих исследований явилось доказатель-I ство существования в NMDA-рецепторио-иоцофорном комплексе к даецифи четкого сайта, способного связывать глицин [Thomson, Д990; Wong, Kemp, 1991].
К.. Первые факты, которые не вписывались в традиционную коп-кдеццию рассмотрения глицина как тормозного медиатора, поя-ЭДлись в работах, посиящецпых сравнительному изучению ана-мдмической локализации мест специфического связывания 3Н-Е^лиципа и 3Н-стрих1Шиа в ЦНС млекопитающих [Bristow et al., В<1986]. Оказалось, что с помощью меченого стрихнина идептифи-
357
н
ноос
РО3Н2 NHCH3
D-AP7
D-AP5
CO.MI
ро3н2
НООС NHCH3
Н
D-GAMP
D-CPP
D-CPPene
CGS 19755
CGS 37849
Рис.64. Антагонисты глутамат-связывающего сайта NMDA рецептора.
цируются рецепторы только задних отделов головного мозга и спинного мозга, в то время как радиоактивная метка, включенная в сам глицин, обнаруживается также в отделах переднего мозга, что указывает на наличие в этих структурах высокоаффипиых мест связывания глицина. Это позволило предположить, что в переднем мозге существует большая популяция стрихпип-не* чувствительных глицип-связывающих сайтов с неизвестной в то время функцией. Корреляция локализации этих мест связывания в переднем мозге с локализацией еще одного известного рецепторного комплекса, а именно Ы-метил-О-асиартатпого, натолкнула исследователей па мысль о том, что такое совпадение
358
не случайно, и между этими двумя сайтами существует определенная взаимосвязь [Monaghan, Cotman, 1985; Cotman et al., 1987]. Окончательные доказательства были представлены в работе Johnson и Ascher [1988], которые первыми сообщили о способности глицина в субмикромоляр!|ых концентрациях усиливать NMDA-вызванные ответы нейронов в культуре тканей. Поначалу ими было отмечено, что величина NMDA-иидуцироваипых токов в нейронах уменьшалась в двух случаях: при удалении изолированных нервных клеток от материнской колонии и при увеличении скорости перфузии культуры. Авторы предположили, что культуральная ткань выделяет неизвестное вещество, по-тенциирующее NMDA-ответы. Это вещество быстро удаляется или распадается в указа1шых выше двух ситуациях. После испытаний большого набора соединений, содержащихся в культуральной среде, было установлено, что этим «неизвестным» веществом, усиливающим ЫМОА-ипдуцировашняе токи, является не что иное, как простейшая аминокислота — глицин, Этет эффект глицина проявляется в низких концентрациях (ЕСЮ 100 — 300 пМ), что примерно в десять раз меньше, чем требуется для активации тормозного, стрихнин-чувствительного, рецептора [Wong, Kemp, 1991].
В дальнейшем аналогичные результаты были получены в опытах с гиппокампальными нейронами [Akaike et al., 1988], с гранулярными клетками мозжечка [Nemeth, Parks, 1989], нейронами стриатума [Ransom, Deschenes, 1988], а также на других экспериментальных моделях.
После того, как факт потенцирования глицилом NMDA-ип-дуцированного синаптического возбуждения уже пе вызывал сомнений, среди специалистов развернулась дискуссия о том, является ли глицин аллостерическим модулятором NMDA рецептора или его коагоцистом, и какова значимость глицила для возникновения глутаматных возбуждающих ответов в физиологических условиях. Еще в ранних работах, в частности Kessler et al.. [1989], было показано, что конкурентный антагонист глицинового сайта—кинурецовая кислота блокирует ответы нейронов па аппликацию NMDA в культуральной среде, пе содержащей глицина.
Пожалуй, только Kleckner et al. [1988] удалось получить Четкие доказательства того, что активация глициновых сайтов является абсолютно необходимым условием для нормального функционирования ЫМПА-реценторно-ионофорного комплекса,
359
н аргументировать гипотезу о глицине как коагоиисте рецепторов ВАК NMDA типа. В их экспериментах в ооциты Xenopus вводилась матричная РНК из первичной культуры мозга крысы, и в результате экспрессии генетического материала была получена возможность изучения процесса активации NMDA рецепторов в среде, лишенной глицина. Оказалось, что на этой модели NMDA-индуцироваппые ответы возникали только при добавлении в среду глицина.
Это и явилось решающим доказательством того, что глицин является коагонистом для NMDA-рецеиторпо-иопофорпого комплекса, то есть для открытия ионного канала требуется связывание соответствующих агонистов как с глутамат-, так и гли-цип-узнающими сайтами.
Эксперименты с избирательными антагонистами глицинового сайта также подтвердили этот вывод. Одним из таких соединений является естественный мегабо.шт триптофана—ки-нуреиовая кислота (4-гидроксихпиол ин-2-карбоновая кислота), Опа синтезируется в глиальных клетках и содержится в большом количестве в нервной ткани [Turski et al., 1987]. Известно, что кипуреповая кислота, антагонист рецепторов ВАК широкого спектра действия, обладает свойствами неконкурентного антагониста NMDA рецепторов [Kemp et al., 1987; Evans et al., 1987]. Однако, было обнаружено, что она конкурентно ингибирует стрихпип-печувствителыюе связывание 3Н-глици-па с мембранами мозга крыс [Kessler et al., 1989], а NMDA-блокирующее действие кипуреновой кислоты на срезах мозга может сниматься глицином, что указывает па ее антагонизм с глициновым сайтом [Watson et al., 1988]. Блокада кипурепа-том NMDA-индуцированных ответов снимается добавлением глицина или D-серипа, в то время как блокада ответов на агонисты АМРА рецепторов под действием кипурепата глицином не ослабляется [Monaghan et al., 1989]. Диалогичные дашгые были получены и в экспериментах с 7-хлоркинуреиовой кислотой [Kemp et al., 1988; Wong, Kemp, 1991].
Раскрытию механизмов взаимосвязи глутамат- и глициц-связывающих сайтов NMDA рецептора помогли дашпяе по изменению связывания антагонистов NMDA рецепторов в присутствии лигандов глицинового сайта. Глицин и D-серин повышали аффинитет 3Н-глутаматсвязывающих рецепторных сайтов, более чувствительных к антагонистам [Monaghan et al., 1988]. Глициновые агонисты уменьшали связывание АР5 и СРР
360
c NMDA рецепторами. Частичные антагонисты глициловых участков НА-966 и АСВС повышали связывание СРР с NMDA рецепторами в несколько раз [Lanthorn, 1994], причем эти эффекты устранялись при добавлении в среду глицина, D- или L-серииа. В нескольких работах показано, что такие антагонисты, как АР5, СРР и CGS-19755, уменьшают связывание глицина, тогда как агонисты па него не влияют [Kessler et al., 1989; Hood et aL, 1990]. Иную картину можно наблюдать при изучении влияния глициновых антагонистов на связывание лигандов рецепторов ВАК: 7-хлоркииуреиовая кислота и НА-966 уменьшали специфическое связывание глутамата с мембранами мозга [Danysz et al., 1994].
Глицин и его аналоги могут усиливать нейронередачу, опосредованную NMDA рецепторами, в мозговой ткани in vivo. Было установлено, что D-серип усиливал возбуждение нейронов, индуцированное микроиоцофоретическим подведением NMDA, в таламусе или в красном ядре [Sault , 1989]. Глицин также потенциировал NMDA-вызванное выделение цГМФ из клеток мозжечка крыс [Danysz et al., 1989]. Однако в других опытах in vivo и на срезах взрослой ткани не удалось показать .потенциирующий эффект самого глицина на NMDA-иидуци-рованлые ответы [Kemp et al., 1988; Watson et aL, 1988; Fletcher, Lodge, 1988]. Эти результаты указывают, что в нормальных условиях, вероятно, концентрация глицина вполне достаточна для полной активации глицинового сайта. Одлако вполне возможна и другая ситуация— NMDA вызывает выброс глицина из нейронов или глии до уровня, насыщающего глициновый сайт [Wong, Kemp, 1991].
Глутамат- и глицин-узпающие сайты NMDA-рецепторно-ка-цального комплекса аллостерическн влияют друг на друга, при этом изменяется внутренняя активность агониста, а не его аффинность. Частичный агонист, занимая один из узнающих сайтов, вызывает такие конформационные изменения всего рецепторного комплекса, которые приводят к увеличению скорости образования комплекса второго коагописта с рецептором [GrimwoodetaL, 1993; Lesteretal., 1993; Priestley, Kemp, 1994].
Учитывая интерес химиков и фармакологов к веществам, способным взаимодействовать с глициновым сайтом NMDA рецептора, остановимся на соединениях, являющихся его агонистами, частичными агошгстами и конкурентными антагонистами. Подчеркнем еще раз, что речь идет о стрихнии-нечувстви-
361
тельных сайтах специфического связывания глицина, входящих в состав NMDA-рецепторио-иоцофориого комплекса.
При анализе сведений о сравнительной силе агонистов и антагонистов следует учитывать определенное расхождение данных, связанное с различием экспериментальных моделей. Например, в электрофизиологических опытах было показано, что агонистическая активность убывает у глицина и родственных ему соединений в следующем ряду: глицин > D-серии > D-аланип > ^-аланин > р-фтораланип > D-циклосерип (D-CS) > L-серии > L-алацип [Chizhmakov et al., 1990], а максимальную активность, причем превосходящую глицин, проявляет 1-амипоциклоцроцан-1-карбоповая кислота (АСРгС). Несколько отличные от вышеприведенного ряды были получены в результате радиолигапдного анализа: глицин > D-серип > D-алапин > D-CS > L-алапип > L-серин > L-CS > у-О-глута-милглицин > метиловый эфир глицина [Monaghan et al., 1989]; и при определении связывания 3Н-ТСР (в присутствии агонистов NMDA-рецепторов): глицин > D-серин > D-алаццп > D-CS > L-алапип > L-серин. Можно особо выделить интересную работу McBain et aL, [1989], в которой авторы, изучив свыше 60 структурных аналогов глицина и других соединений, выделили следующие основные закономерности зависимости биологической активности от химической структуры для агонистов глициновых сайтов:
1) Все активные соедицешш содержат а-амипокислотную группировку. Поскольку в физиологических условиях, при pH близком к 7, эта группировка существует в виде цвиттериона, можно предположить, что в узнающем месте рецептора существуют одни положительно и один отрицательно заряженные центры (хотя лиганд может образовывать с рецептором не только ионные связи).
2) Решающее значение для проявления активности имеет расстояние между амино- и карбоксильной группами — оптимальной является их расположение при одном и том же атоме углерода. Введение между ними еще одного атома углерода ([J-аланип) приводит к резкому падению агонистической активности.
3) Если а-углеродлый атом хиральцый, то для проявления агонистической активности предпочтительной является D-конфигурация.
4) Агонисты глицинового сайта можно разделить па две груп-
362
соон
D-cycloSer
Gly
COOH
ACBC
NHj
ACPC
CO OH
NHj ACPrC
OH
R-(+)-HA-966
COOH
H
ACEA 1021
Puc. 65. Агонисты и антагонисты глицип-связывающего сайта NMDA рецептора.
пы: соединения, не содержащие в молекуле заместители, способные к образованию водородной саязи, и вещества, содержащие такие заместители. К первой группе относятся глицин, аланин и АСРгС, в молекулах которых а-углеродпый атом или пе имеет заместителя, или этот заместитель представляет собой гидрофобную группу. Во вторую группу входят D-серии и его апало-
363
ги с гидрофильными заместителями, способными выступать в роли акцептора протона при образовании водородной связи. Вероятно, образование водородной связи между молекулой лиганда и функциональными группами в узнающем сайте настолько способствует связыванию, что даже нивелирует отрицательное влияние стерических эффектов объемных заместителей.
При рассмотрении антагонистов глицинового сайта прежде всего остановимся на одном соединении —НА-966 (З-амиио-1-гидроксн-2-иирролидоп). Его антагонистическое действие па ВАКергическую передачу было обнаружено сравнительно давно [Wong, Kemp, 1991]. Однако только недавно было показано, что блокада NMDA-индуцированных ответов под действием НА-966 зависит от наличия в среде глицина, то есть НА-966 является конкурентным антагонистом глициновых сайтов NMDA-реценторпо-ионофорпого комплекса [Drejer et al., 1989]. Однако работы по разделению этого хиралыюго соединения на стереоизомеры показали, что в действительности R-(+)-HA-966 является частичным агонистом [Williams et al., 1989; Kemp, Leeson, 1993].
Среди антагонистов глициновых сайтов можно выделить несколько групп гетероциклических, полициклических и алициклических соединений: производные 4-гидроксихиполипа, хиноксалипдионов, ипдол-2-карбоновой кислоты, пирролидона, цнклобутаиа и циклопентана. На рис. 65 приведены структурные формулы основных агонистов и антагонистов глициновых сайтов NMDA рецептора.
Достаточно сильными антагонистами этого сайта являются также циклоленцин (1-аминоциклоцентапкарбоновая кислота, АСРС) и 1-аминоцикл обутаикарбоповая (АСВС) кислота, причем эти соединения ингибируют связывание глицина только с NMDA-рецепторно-ионофорным комплексом, но не со стрихнин-чувствительными глициловыми рецепторами. Интересно отметить близкое структурное сходство этих соединений с 1-амипоциклопропанкарбоновой кислотой (АСРгС), которая является высокоактивным агонистом этих сайтов. Такое изменение направленности действия при увеличении гидрофильности молекулы может свидетельствовать о большом значении взаимодействия этих соединений с липидами мембран—увеличение способности соединения к взаимодействию с липидной фазой существенно меняет психотропные свойства аналогов моно- и дикарбоповых кислот [Петров и др., 1995].
364
Иногда в экспериментах для блокады глицинового сайта NMDA рецептора используют два производных хиноксалин-диоиа — CNQX и DNQX [Birch et al., 1988], однако их применение в опытах in vivo при высокой концентрации глицина в среде и способности проявлять антагонистические свойства но отношению к другим типам рецепторов ВАК (АМРА и каинатным) ограничено. В ряду производных хипоксалиндиона сродство к глициновому сайту резко возрастает при увеличении числа заместителей в бензольном кольце. Так, избирательность взаимодействия тризамещешюго производного АСЕА- 1201 с глициновым сайтом на три порядка выше, чем с АМРА рецептором [Leeson, Iversen, 1994].
В работе Leeson et al., [1991] изучена связь химической структуры с биологической активностью в ряду производных и аналогов кипуреновой кислоты. Показано, что усиление блокирующего действия глицинового сайта происходит при введении заместителей в положения 5, 7 и 5,7 кипуреновой кислоты. Оптимальным оказалось 5-йод-7-хлорнроизводиое —наиболее сильный и селективный антагонист глицинового сайта NMDA рецептора. Замещение в положения 1 и б приводили к соединениям, проявлявшим neNMDA антагонистическую активность, а 8-замещеппые производные не действовали пи па один из типов рецепторов ВАК. Изучение активности аналогов кину-реповой кислоты показало, что необходимым условием проявления требуемой активности является наличие атома кислорода в положении 4, причем в оксо-таутомерцой форме. На основании полученных данных авторы предложили модель связывания с глициновым сайтом производных кипуреновой кислоты, включающую в себя: а) относительно небольшую но размеру гидрофобную область для связывания бензольного цикла, б) донорную группу, образующую водородную связь с оксо-группой в положении 4, в) акцепторную группу, образующую водородную связь с амино-группой в положении 1, г) полярную группу, образующую ионную связь с карбоксильной группой в положении 2. В дальнейшем авторы уточнили свою модель, показав при исследовании биологической активности серии производных 4-амидо-2-карбокситетрагидрохи1юлииов наличие в рецепторе объемной гидрофобной области рядом с местом связывания полярной группы в положении 4 антагониста [Leeson etal., 1992].
В работе Monaghan et al. [1988] высказывается предположение, что NMDA рецепторы существуют в двух копформациоп-
365
пых состояниях—arc цист-предпочитающее и антагонист-нред-псчитающее. Роль глицина как колониста заключается в том, что он превращает аптагонист-предпочитающую конформацию рецептора в агопист-предпочитающую. Предполагается, что к кииуреповая кислота сдвигает равновесие в сторону увеличения доли глицип-предпочитающей конформации [Chizhmakov et al., 1990].
Заключая раздел о роли глицина в функционировании NMDA-рецептор! юго комплекса в нейронах ЦНС следует подчеркнуть, что участие глицина является необходимым условием активации рецепторного комплекса, то есть он и1"рает роль коагониста. Поэтому глицин-связывающий сайт является еще одной структурой NMDA-рецепторно-ионофорного комплекса, через который возможна его фармакологическая регуляция. Необходимо отметить, что в связи с трудностями, встретившимися па пути внедрения в клинику конкурентных агонистов глутамат-связы-вающего сайта [см., например, Sveinbjomsdottir, 1993], соединения, влияющие па глициновый сайт, особенно его частичные агонисты, начинают привлекать все большее внимание.
Свойства ионного канала, сопряженного с NMDA-рецептором.
Стимуляция NMDA рецепторов агонистами приводит к деполяризации нейронов, что связано с «открыванием» сопряженных с рецептором Na* и К+-каиалов. Помимо одновалентных ионов, большую роль в NMDA-индуцированной деполяризации играют ионы кальция, которые после связывания агониста с NMDA рецептором входят внутрь клетки ио каналам, отличным от потенциал-зависимых Са^-капалов [Mayer et al., 1987]. Подобный же эффект был отмечен и для двухвалентных ионов Ва’+ и Cd2*, в то время как ионы Со2*, Мп2* и Mg2* не проникали через этот канал. Это позволило выдвинуть гипотезу о зависимости проникновения ионов (одно- и двухвалентных) через канал, ассоциированный с NMDA рецептором, от способности этих катионов терять гидратную оболочку [Ascher, Nowak, 1988]. Увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са2* при стимуляции NMDA рецепторов может лежать в основе как NMDA-илдуцированпой синаптической пластичности нервных клеток [Lynch et al., 1983], так и гибели нейронов при гипервозбужде-пии, вызванном высвобождением эндогенных или введением эк-зогеш1ых дикарбоповых кислот [Rothman, Olney, 1988]. Проницаемостью для иолов кальция обладают многие рецепторные
366
каналы, в частности, рецептора АТФ и никотинового холипоре-цептора, однако канал NMDA рецептора пропускает в 2—3 раза больше ионов кальция [Rogers, Dani, 1995].
Важной особенностью NMDA рецепторов, отличающей их от других типов рецепторов ВАК, являются иотенциал-зависи-мые свойства их ионного канала, которые впервые были обнаружены при аппликации агонистов NMDA рецепторов к двигательным нейронам спинного мозга кошки. При обычном потенциале покоя мембраны (-70-80 мВ) NMDA-активируемые входящие токи практически не регистрируются, однако при повышении потенциала до -30 мВ они значительно возрастают и достигают максимума при мембранном потенциале от -30 до -20 мВ, снижаясь при дальнейшей деполяризации до 0 мВ [Flatman et aL, 1983].
NMDA-рецепторный канал представляет собой “singly-occupied channel”, то есть в каждый момент времени только один катион занимает' место (или места) в области около моры канала. При этом локальный заряд в норе (или около нее) не вызывает появления на окружающей поверхности значительного потенциала, способного влиять на ионную проницаемость. Это означает, что механизм высокой ионной проницаемости канала NMDA рецепторов для ионов кальция отличен от такового для потен циал-зависимых кальциевых каналов, в которых существуют два высокоаффипных связывающих сайта, которые и обеспечивают высокую проницаемость для ионов кальция [Zarei, Dani, 1994].
Следует еще раз подчеркнуть, что ионный капал, сопряженный с NMDA рецептором, отличается от трансмембранных каналов, открывающихся при активации других рецепторов в центральной н периферической нервных системах. Ионные процессы, сопровождающие стимуляцию NMDA рецептора, являются уникальными [Ascher, 1988]. Рассмотрим теперь подробнее регуляцию и свойства капала, сопряженного с NMDA рецептором.
Модуляция свойств канала двухвалентными катионами.
Важную роль в регулировании функций NMDA-рецептор-но-иоцофориого комплекса играют двухвалентные катионы. По-тепцнал-зависимые свойства капала, ассоциированного с NMDA-рецепторным комплексом, определяются в первую очередь иолом Mg2*. Впервые эта идея была высказана при обнаружении ингибирующего действия ионов Mg2* па деполяризацию нейронов спинного мозга, вызываемую агонистами NMDA рецепто
367
ров [Ault et at, 1980]. В дальнейших исследованиях с использованием метода patch-clamp был установлен неконкурентный и потенциал-зависимый характер торможения ионами Mg2* синаптического возбуждения [Ascher et al., 1988]. Ионы Mg2+ могут вызывать цотепциал-зависимую блокаду канала, находясь не только с наружной стороны клеточной мембраны, но и с ее внутренней стороны. При этом внутриклеточный магний уменьшает величину выходного тока при положительных потенциалах [Nowak et al., 1984].
Этот феномен имеет место при концентрации ионов Mg2* в среде около 1мМ, что соответствует их физиологической концентрации во внеклеточной среде. В этих условиях высокочастотная стимуляция иреснцаптического входа может «пробить» магниевый блок NMDA-капала и вызвать деполяризацию пре-синаптической мембраны [Collingridge et al., 1988]. Торможение синаптической передачи через NMDA рецепторы ионами Mg2* можно зафиксировать пе только на электрофизиологических моделях, по и при изучении биохимических сдвигов, происходящих в нейронах при деполяризации мембраны. В исследованиях па культуре нервной ткани установлено, что Mg2* устраняет индуцированные агонистами NMDA типа изменения концентрации внутриклеточных «посредников» проведения нервного импульса: тормозит вход ионов Са2*, образование цГМФ и выделение арахидоновой кислоты [Murphy et al., 1987; Novell! et al., 1987].
Ингибирующее действие ионов Mg2* па процессы синаптического возбуждения избирательно проявляется при активации рецепторов ВАК только NMDA тина, по пе АМРА или каинатного типов. Поэтому Mayer и Westbrook [1987] предположили, что в канале NMDA рецептора существует участок специфического связывания этих ионов, который чувствителен к изменению трансмембранного потенциала, причем сродство этого участка к ионам магния (и, соответственно, способность Mg2+ блокировать шитый капал) повышается при гинерполяризации.
Важную роль Ионов Mg2* подчеркивают не только электрофизиологические и биохимические данные, по и результаты ра-диолигапдпого анализа. Хотя иолы Mg2* не влияют па специфическое связывание 3Н-глутаминовой кислоты, они способны модулировать связывание агонистов других специфических сайтов, входящих в состав NMDA рецепторов—фенциклидиновых и глициновых. В частности, у ионов Mg2* отмечался двухфазный эффект на связывание лигандов фенциклидинового
368
сайта: в малой концентрации (до 300 мкМ) они усиливали связывание 3Н-ТСР и 3Н-МК-801, в то время как в высоких концентрациях (около 1мМ) они это связывание ингибировали [Ferkany, 1986]. Тормозный эффект ионов Mg2* объясняется их связыванием со специфическим сайтом, расположенным в канале, в результате чего и блокируется синаптическая передача, а стимулирующее действие в малых концентрациях — взаимодействием с дополнительными сайтами связывания. Добавление глутамата усиливает модулирующее действие Mg2* на связывание лигандов фенциклидинового сайта и 3Н-глицица [Marvizon, Skolnick, 1988]. Показано, что места связывания МК-801 и ионов магния в NMDA-рецепторном канале перекрываются [Mori et al., 1992]. Таким образом, ионы магния, связываясь со специфическими сайтами в канале NMDA рецептора, способны пе только модулировать проводимость канала, по и вызывать конформационные изменения всего NMDA-реценторпо-ионофорпого комплекса.
Таким образом, можно сделать вывод, что на уровне синапса суммарный ответ при стимуляции NMDAepri-mecKoro синапса зависит не только от количества медиатора, выделившегося из пресипаитнческой мембраны, но и от величины исходного потенциала постсинаптической мембраны, который, в свою очередь, определяется ионами Mg2*.
В регуляции функционирования NMDA рецептора, помимо ионов Mg2*, участвуют также ионы Zn2*. В частности, в системе центральных нейронов добавление ионов Zn2* уменьшает вызванные агонистами NMDA рецепторов деполяризацию мембраны нервных клеток и нейротоксические изменения, но пе влияет па подобные процессы, индуцированные каинатом или квисквалатом [Koh, Choi, 1988]. Детальные исследования ингибирования ионами Zn2* NMDA-ипдуцированцых ответов гиппокампальных нейронов показали, что эти ноны неконкурентно тормозят нейрональное возбуждение, причем это торможение, в отличие от вызванного ионами магния, пе зависит от исходного потенциала ностсипантической мембраны.
Это позволяет говорить о различных механизмах регуляции NMDA-реценторпо-иопофориого комплекса нонами Zn2* и Mg2*. Ионы Zn2* оказывают сильное ингибирующее действие на связывание 3Н-МК-801 и, подобно конкурентному антагонисту АР5, ослабляют потенцирующий эффект глутамата [Reynolds, 1990]. В отличие от ионов магния, они уменьшают специфическое связывание 3Н-глутамата и 3Н-аспартата с мембранами гицнокам-
24.Зак.227
369
пильных клеток [Slevin, Kasarkis, 1985], что также свидетельству' ет о том, что точка приложения модулирующего действия ионов Zn2+ на NMDA-рецепторный комплекс находится вблизи (или тесно связана аллостерически) от участка связывания медиатора. Однако остается еще много нерешенных вопросов, особенно касающихся роли ионов Zn2+ в регуляции возбуждающей синаптической передачи в физиологических условиях. Можно привести любопытные данные о том, что в головном мозге максимальная концентрация иопов цинка обнаружена в гиппокампе [Donaldson et al., 1973], структуре, наиболее богатой ВАКергиче-скими терминалями, при деполяризации которых происходит высвобождение ионов Zn2+ в нресипиитическое пространство [Aniksztejn et al., 1991].
В заключение этого раздела следует отметить, что регуляция NMDA-реценторпо-иопофорпого комплекса двухвалентными ионами имеет большое значение в функционировании возбуждающей синаптической передачи, однако пока что не представляет большого интереса с точки зрения прикладной фармакологии.
Канальный сайт связывания неконкурентных антагонистов (фенциклидиновый).
История изучения неконкурентных антагонистов NMDA рецепторов началась с любопытного наблюдения фушгы английских исследователей, что так называемые «диссоциативные» анестетики, кетамин и фенциклидин, селективно блокируют возбуждение нейронов, вызванное NMDA [Anis et al., 1983].
Известные еще с середины 50-х годов, кетамин н фенциклидин (РСР) оказывают сильное анальгетическое действие, сопровождающееся слабой мышечной релаксацией и относительной сохранностью многих защитных рефлексов [Wilmot, 1989]. Необычные эффекты этих препаратов па изменение соматомотор-пых функций и вызвали появление термина «диссоциативные анестетики». Было установлено, что кетамин в значительной степени нарушает полисипаитические рефлексы и слабо-мопоси-иаитические, практически пе влияя па процессы торможения в ЦНС нервной системе [Tang, Schroeder, 1973]. Поскольку ранее было известно, что кетамин не изменяет процессы высвобождения и обратного захвата медиаторных аминокислот в нервной ткани [Ferkany, 1986], то в указанной работе Anis н соавт. [1983] была проверена гипотеза о ностсинаптическом действии фенциклидина и кетамина, точнее их способность блокировать си-
370
пиитическое возбуждение нейронов. У децеребрированных или наркотизированных пентобарбиталом кошек и крыс изучалось влияние обоих диссоциативных анестетиков на ответы спинальных нейронов при электрофоретическом подведении к ним агонистов рецепторов ВАК и ацетилхолина. Эти опыты показали, что кетамин и фенциклидин селективно ингибировали процессы возбуждения нейронов задних рогов спинного мозга, вызванные аппликацией NMDA и практически не влияли па квисквалат- и каинат-индуцироваипые эффекты. При тестировании на клетках Репшоу диссоциативные анестетики снижали ответы нейронов па ацетилхолин в значительно меньшей степени, чем па NMDA. Важно отметить, что кетамин пе усиливал процессы торможения спинальных нейронов при электрофоретическом подведении тормозных аминокислот —ГАМК и глицина. Таким образом, в указанной работе впервые были получены доказательства того, что фенциклидин и подобные ему соединения селективно блокируют постсипаптические NMDA рецепторы.
Этот феномен был подтвержден в серии дальнейших исследований на различных моделях в опытах in vitro. В частности было показано, что кетамин блокировал возбуждающие пост-сииаптические потенциалы, вызванные NMDA в срезах гиппокампа мышеи [Javitt, Zukin, 1991] и коры крыс [Harrison, Simmonds, 1985], а также снижал NMDA-стимулировапное высвобождение ацетилхолина из коры мозга крыс [Lodge, Johnson, 1990]. Высокую блокирующую активность и селективность по отношению к NMDA-ипдуцироваппым ответам проявили два других вещества из этой же группы —TCP и МК-801.
Радиолигандный анализ взаимодействия меченых антагонистов (фенциклидина, кетамина и МК-801) с рецептором показал, что они не ингибируют специфическое связывание агонистов NMDA рецепторов, следовательно эти соединения являются неконкурентными антагонистами [Monaghan, Cotman, 1988]. Они действуют па NMDA-рецепторпо’Иопофорцый комплекс только в присутствии агониста («use-dependences), откуда следует, что механизм их действия заключается в блокаде Открытого ионного канала [Davies et al., 1988]. Было установлено, что глутамат усиливал связывание 3Н-МК-801 [Wong et al., 1986]. Потенцирующее действие глутамата на связывание фенциклидина и его аналогов увеличивалось и в присутствии Глицина, аллостерического регулятора NMDA рецепторов I Johnson et al., 1987].
371
Установить локализацию этого сайта помогли, как уже указывалось в предыдущем разделе, исследования действия ионов Mg2+ на блокаду канала, вызванную МК-801. Вначале был сделан вывод о том, что место связывания «фепциклидин-нодобных» неконкурентных антагонистов NMDA рецепторов расположено в ионном канале рядом с участком, специфически связывающим двухвалентные катионы [Huettner, Bean, 1988); затем было показано, что эти сайты частично перекрываются [Mori et aL, 1992].
Известно, что фенциклидин и родствегшые ему соединения способны также взаимодействовать с а-опиатными рецепторами [Largent et al., 1986; Zukin, Javitt, 1993]. Оказалось, однако, что собственно места специфического связывания фенциклидина в головном мозге анатомически тесно связаны с NMDA рецепторами, что не наблюдалось для мест специфического связывания других ст-ониатпых агонистов [Jarvis et aL, 1990]. Такие аналоги, как TCP и особенно МК-801, вообще не проявляли аф-фишюсти к сигма-опиатным рецепторам, а специфически связывались лишь с NMDA-реценторцым комплексом и поэтому стали широко применяться для изучения имешю этих рецепторов [Wong et al., 1991]. В работе Manallac, Beart [1987] с помощью метода компьютерного молекулярного моделирования были рассчитаны модели мест связывания для фенциклидина и ст-опиа-тов. Оказалось, что эти модели отличаются друг от друга расположением места связывания атома азота, паправлешгем вектора пеподелешюй электронной пары атома азота, а также природой и расположением других связывающих групп. Следовательно, несмотря на то, что фенциклидин и его аналоги все-таки могут связываться с ст-опиатиыми рецепторами, места их связывашгя в NMDA-рецепторпо-иопофорпом комплексе отличны.
Таким образом, в середине 80-х годов с помощью электрофизиологических и радиолигандных исследований был доказан факт тесной структурной и функциональной зависимости сайтов специфического связывания NMDA и фенциклидина. Эти сведения имели несомненное значение для пейробиологов и пейрофармакологов, так как положительно решали принципиальный вопрос о возможности модуляции функций NMDA рецептора, играющих одну из ключевых ролей в осуществлении возбуждающей пейропередачи в ЦНС.
На рис. 66 приведены структуры неконкурентных антагонистов NMDA рецепторов, отличающихся друг от друга по силе и селективности. Эти соединения принадлежат к классам арил-циклогексиламила и диоксалана.
372
Рис. 66. Структуры некоторых неконкурентных антагонистов NMDA рецептора.
Особо следует остановиться на МК-801, на сегодняшний день наиболее изученном представителе класса неконкурентных антагонистов NMDA рецепторов. МК-801 был синтезирован в начале 80-х годов сотрудниками исследовательского центра Крупнейшей фармацевтической компании «Merck Sharp and Dohme» [Iversen et aL, 1994]. Это вещество быстро проникало Через ГЭБ и оказывало выраженное противосудорожное действие, сопровождающееся анксиолитическим эффектом.
В больших дозах это соединение, подобно диссоциативным анестетикам, вызывало выраженную анальгезию. Механизм его действия был неизвестен [Clineschmidt etal., 1982а; Clineschmidt etal., 1982b],
Молекула МК-801 хиральпа, то есть существуют два ее стереоизомера. Показано, что наиболее активен (+)-изомер, известный также под названием “дизоцилпин”. (-)-Изомер также проявляет свойства неконкурентного антагониста NMDA рецепторов, но его активность в 5 раз ниже. (Связь химической структуры с биологической активностью в ряду аналогов МК-801 рассмотрена в работе [Monn et aL, 1990]).
На различных моделях in vitro и in vivo было показало, что дизоцилпин эффективно блокирует нейротоксическое действие NMDA, причем в опытах па препарате эмбриональной сетчатки цыпленка он оказался самым активным соединением
373
[Olney et aL, 1987]. Дизоцилпил предотвращал дегенерацию нейронов в мозге крыс, вызванную интрацеребральным введением самой NMDA и другими NMDA-агонистами, и при системном введении [Foster et al., 1987; Foster et al., 1988; Beal et al., 1988]. Дизоцилпил оказался также эффективен и па некоторых моделях глобальной ишемии (см., например, [McCulloch et al., 1992]). Исследование эффектов дизоцилпина, как представителя класса NMDA антагонистов, свободно проникающих в ЦНС, на различных экспериментальных моделях позволило обнаружить некоторые неожиданные его свойства. Например, он предупреждал развитие как толерантности к морфину, так и зависимости от пего [Trujillo, Akil, 1991], блокировал нейротоксические эффекты, вызываемые белком GP 120 вируса иммунодефицита человека [Andersson et al., 1990]. Существует прекрасный обзор Iversen, специально посвященный МК-801 [Iversen L., 1994]. Однако клинические испытания дизоцилии-на не привели, к сожалению, к положительным результатам из-за выраженности различных побочных эффектов. Поэтому велись поиски путей ослабления побочных эффектов неконкурентных антагонистов NMDA рецепторов. Один из таких подходов изложен в работе [Lapin, Rogawsky, 1992], в которой показано, что блокада мускариновых рецепторов ослабляет двигательную гиперактивность, вызванную дизоцилиипом,
К неконкурентным антагонистам NMDA рецепторов относятся также некоторые природные токсины пауков, по химическому строению относящиеся к полиамипам — аргиопин и аргиопииины, PhTX-433 и другие. Так как их действие исследуется в основном па насекомых, мы лишь упомянем основные работы, в которых можно найти наиболее важные результаты этих исследований [Гришин и др., 1986; Магаза-пики др., 1986; Uscherwood, 1991; Antonov etal., 1987; Antonov et al., 1989; Grishin et al., 1989].
Полиаминовый участок.
В составе NMDA-рецепторпо-иопофорного комплекса существуют, кроме описанных выше, и другие места специфического связывания некоторых соединений. В работе Ransom, Stec [1988] был идентифицирован сайт связывания эндогенных полиаминов — спермина и спермидина [Shaw, Pateman, 1973]. Аналогично глутаминовой кислоте и глицину, эти полиамины усиливали связывание эН-МК-801 [Ransom., Stec, 1988; Williams et al., 1989; Reynolds I.J., 1990] и ЭН-ТСР [Sacaan,
Johnson, 1989a; 1989b], однако пе ингибировали связывание 3Н-глиципа и 3Н-СРР, что свидетельствовало об особом участке их действия. Сдвиг кривых доза —эффект глутамата и глицина при стимуляции связывания 3Н-МК-801 спермином свидетельствует об аллостерической связи сайтов связывания нолиами-пов с сайтами связывания агонистов и глицина [Wong, Kemp, 1991]. Эти же полиамины потепциировали нейрональное возбуждение, вызванное сочетанным введением NMDA и глицина в опытах in vivo [Pullan et al., 1989]. Необходимым условием для такого действия полиамидов является именно стимуляция NMDA-рецепторпо-иопофорпого комплекса одновременно агонистами самого рецептора и глицинового сайта. Конкурентные агонисты и антагонисты глицинового сайта по отдельности не устраняют эффект полиаминов. Полиамипы при взаимодействии с иолиаминовым сайтом положительно модулируют связывание глицина. Этот сайт находится в пределах NMDA-pe-центорио-ионофорного комплекса и пе чувствителен пи к конкурентным антагонистам типа СРР, пи к антагонистам глицинового сайта типа 7-хлоркинуреповой кислоты.
- Высказывается предположение, что полиамины вызывают такие изменения в NMDA-рецепторио-ионофориом комплексе, которые способствуют повышению аффинности мест связывания неконкурентных антагонистов в ионном канале [Enomoto et al., 1993].
Было обнаружено, что а-днфторметилорпитип обладает защитным действием против NMDA-индуцировапной нейротоксичности [Paschen et al., 1988; Markwell et al., 1990]. Известно, что это соединение является ингибитором фермента ории-типдекарбоксилазы, скорость-лимитирующего фермента синтеза нолиамшюв. Поэтому возникло предположение, что NMDA-ипдуцироваппая нейротоксичность связана с активацией орпитипдекарбоксилазы, и поэтому ингибиторы этого фермента, способные проникать в мозг, могут обладать нейропро-тективпым действием. Однако концентрация сс-дифтормети-лорнитипа, в которой ол способен проявлять этот эффект (5 мМ), очень высока. Поэтому механизм его защитного действия остается неясным.
Для полиаминового сайта в настоящее время обнаружены собственные антагонисты —это производные дифенилиипери-дипоэтапола ифенпродил {4-бепзил-1-[(3-гидрокси-3-(4-гид-роксифепил)проп-2-ил]ииперидил} и его аналог элипродил
375
{(4-хлорфе11ил)-[(4-фторфеиил)метил]-1-нипериди1юэтапол}, обладающие антиишемическим действием [Gotti et al., 1988]. Было показано, что эти соединения неконкурентно подавляют NM DA-индуцированиое повышение уровня цГМФ в срезах мозга и также неконкурентно ингибируют связывание 3Н-СРР и 3Н-ТСР [Carter et ai., 1988]. Неспособность глицина изменять активность ифеннродила при ингибировании связывания 3Н-МК-801 указывает на то, что места их действия различны. Ифенпродил и элипродил дозозависимо, но не полностью, ингибируют NMDA-иидуцироваппую деполяризацию нейронов [Carter et al., 1988]. Исследования с меченым 3Н-ифенпроди-лом указывают, что высокоаффиниые места его связывания могут входить в NMDA-рецепторио-иопофориый комплекс [Shoemaker et al., 1985]. Это связывание частично ингибируется конкурентными NMDA антагонистами и полностью спермином и спермидином, поэтому было высказано Предположение, что ифеп-продцл и элипродил действуют на полиаминовый сайт NMDA-реценторпо-ионофорпого комплекса [Carter et al., 1989].
Описано также обратимое, неконкурентное и потепциал-за-висимое ингибирование NMDA-ипдуцированных ответов в опытах на ооцитах Xenopus, обработанных РНК мозга крысы такими полиамипсодержащими токсинами, как филантотоксип и ар-гиотоксиц [Brackley et al., 1993].
Таким образом, эндогенные полиамины в физиологических концентрациях [Shaw, Pateman, 1973] модулируют функции NMDA рецептора, причем сайт их связывания входит в состав комплекса и расположен на внутренней стороне ностсинаити-ческой мембраны нейрона [Wong, Kemp, 1991].
9.3. АМРА рецептор
Как уже указывалось выше, ионотропные рецепторы ВАК иногда разделяют на NMDA- и neNMDA подтипы. В последнем случае из этого подтипа выделяют еще два —АМРА н каинатный типы.
Установлено, что активация АМРА рецепторов в мозге приводит к изменению проницаемости постсинаптической мембраны для одновалентных катионов — калия и натрия. При этом между процессами изменения ионной проницаемости мембраны, сопровождающими стимуляцию NMDA и АМРА рецепторов, име
376
ется ряд существенных различий. В частности, квисквалат-ип-дуцированные ионные токи могут возникать при низких значениях проводимости ностсинантической мембраны, в то время как для появления NMDA-ипдуцированных токов необходимо повышение проводимости мембраны в 5 —10 раз [Ascher, Nowak, 1988]. Открытие ионных каналов, сопряжешгых с АМРА рецепторами, пе зависит от величины потенциала мембраны, такие каналы относятся к потенциал-iгезависимому типу и опосредуют нотепциал-пезависимое возбуждение в нейрональных синапсах, тогда как ионные каналы, сопряженные с NMDA рецепторами, являются нотепциал-зависимыми. Стимуляция АМРА рецепторов, в отличие от NMDA рецепторов, не сопровождается входом ионов Са2+ во внутриклеточное пространство, что, в частности, доказано при изучении переноса радиоактивного Са2+ в гранулярные клетки мозжечка при возбуждении агонистами рецепторов ВАК [Wroblewski et al., 1993]. Однако показано, что нейротоксичность, вызванная активацией рецепторов ВАК iieNMDA типа, связана пе с натриевым током, а с прямым проникновением в клетку ионов кальция и активацией кальций-зависимых ферментативных процессов [Brorson et aL, 1994].
АМРА-рецеиториый ионный капал может быть реконструирован in vitro из белков, полученных экспрессией одной или коэкспрессией любых двух из четырех субъединиц, называемых GluRl — GluR4 (или GluRA—GluRD), каждая из которых состоит примерно из 900 аминокислотных остатков [Seeburg,1993],
Как и для NMDA рецепторов, показала гетерогенность популяции АМРА рецепторов в ЦНС млекопитающих [Wilsch et а!., 1995].
Агонисты АМРА рецепторов.
Работ по исследованию связи химической структуры с биологической активностью среди агонистов и антагонистов АМРА рецепторов, по сравнению с аналогичными работами по лигандам NMDA рецепторов, значительно меньше. Наибольший вклад в поиск лигандов рецепторов ВАК, особенно агонистов АМРА (квисквалатных) рецепторов, в изучение связи химической структуры с биологической активностью внесли сотрудники датской школы, возглавляемой Р.Krogsgaard-Larsen. Ими, в частности, был выполнен цикл работ ио синтезу аналогов природной иботеновой кислоты, агониста NMDA рецепторов, содержащейся в Amanita muscaria.
Это привело к открытию таких агонистов, как сама АМРА
377
[(Я5)-2-ами1ю-3-(3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-11л)прошюпо-вая кислота], (Е5)-2-ами1Ю-3-(3-гидрокси-5-третбутилизокса-зол-4-ил)пропиоповая кислота (АТРА), (Я5)-2-амшю-3-(3-гид-рокси-5-бромметилизоксазол-4-ил)нропионовая кислота (АВРА), 3-гидрокси-4,5,6,7-тетрагидроизоксазоло[4,5-с]цири-дин-5- и -7-карбоиовые кислоты (5-НРСА и 7-НРСА соответственно) [Brehm et al., 1988; Krogsgaard-Larsen et al., 1986]. Как уже указывалось выше, АМРА оказалась наиболее активным агонистом и дала название этому классу рецепторов. Из-за высокой селективности взаимодействия только с одним типом рецепторов ВАК 3Н-АМРА стала широко применяться в ра-диолигаидных исследованиях. Из энантиомеров АМРА наибольшей активностью обладает L-изомер.
Рептгеноструктурный анализ двух жестких аналогов АМРА (5-НРСА и 7-НРСА) показал, что изоксазольный цикл этих молекул планарен, а шестичлешюе кольцо находится в конформации «полукреола» с карбоксильной группой в экваториальном положении [Krogsgaard-Larsen et al., 1986]. По мнению авторов этих работ, конформация «полукресла» с экваториальным и (или) аксиальным расположением карбоксильной группы и является биологически активной.
Недавно был найден новый высокоактивный агонист АМРА рецепторов — ( Я5)-2-амиио-(3-карбокси-5-метилизоксазол-4-ил)про1шоповая кислота (АСРА) [Madsen, Wong, 1992]. По своей структуре это соединение отличается от АМРА лишь тем, что оксо-группа в положении З-изоксазолыюго цикла заменена на карбоксильную. АСРА в четыре раза активнее самой АМРА ипги-бировала связывание 3Н-АМРА, слабо влияла на связывание -Н-кашювой кислоты и не влияла па NMDA-зависимое связывание 3Н-глутамииовой кислоты. В некоторых структурах коры АСРА была в четыре раза сильнее АМРА по возбуждающему эффекту, причем ее деполяризующее действие блокировалось избирательным агонистом АМРА рецепторов (CNQX), по не блокировалось антагонистами NMDA рецепторов (АР5) [Madsen, Wong, 1992].
К агонистам АМРА рецепторов относится и природная 3N-оксалил-И-2,3-ди-аминопропионовая кислота (ODAP), представляющая собой структурный аналог дикарбоновых аминокислот, в котором две метиленовые группы заменены амидной [Bridges et al., 1989; Ross et al., 1989]. Интересным и специфическим примером агонистов АМРА рецепторов являегся и одно из родственных ODAP соединений, а именно бета-М-метн-ламипоаланип (ЗМ-метил-П-2,3-диаминоцроииоповая кислота,
378
ноос
5-НРСА
Рис. 67. Агонисты АМРА рецепторов.
NH—СО-СООН
НООС NH]
ODAP
Н
ВМАА). Это соединение не содержит, в отличие от ODAP, второй кислотной группы и поэтому, казалось бы, не может проявлять свойства лигандов рецепторов ВАК. Однако оказалось, что опа способна взаимодействовать с АМРА рецепторами в присутствии бикарбонат-иона [Copani et al., 1991; Allen et al., 1993; Matsuoka et al., 1993]. Двухзаряженпый бикарбонат-ион связывается с высокоосновной мет ил аминогруппой ВМАА, образуя при этом карбамат, обладающий двумя отрицательными и одним положителт иь'м зарядами, то есть этот комплекс обладает ВАКергическим фармакофором и проявляет свойства лиганда рецепторов АМРА типа [Nunn et al., 1991].
Кроме указанных производных 3-гидроксиизоксазола, способностью взаимодействовать с АМРА рецепторами обладают такие соединения, как 2-(2-оксо-1Н-нирид-6-ил)алаш1П, виллар-дин и бром вилл ар ди и, гомоиботеповая кислота и некоторые ее аналоги, а также некоторые карбоциклические дикарбоновые аминокислоты [Christensen et al., 1992; Пиотровский, Думпис, 1989].
Антагонисты АМРА рецепторов.
Одним из существенных препятствий па пути изучения физиологической роли АМРА рецепторов является отсутствие сильных и селективных антагонистов. Углубленное изучение действия диэтилового эфира L-глутамиповой кислоты (ДЭЭГ), у которого еще в начале 70-х годов была обнаружена способность блокировать глутамат-иидуцироваппое возбуждение нейронов, показало, что он является довольно слабым и отпоси-
379
CNQX
Рис. 68. АМРА антагонисты.
тельно селективным антагонистом АМРА рецепторов, не действуя иа NMDA- и каипат-иидуцироваппые ответы. Имеются, однако, данные, что ДЭЭГ блокирует возбуждающее действие ацетилхолина [Davies, Watkins, 1979; Hicks etal., 1978; McLennan, Lodge, 1979]. Блокирующее действие ДЭЭГ проявлялось в мил-лимолярпых концентрациях, к тому же показано, что в концентрации 10 мМ он подавлял и электрическую активность преси-пацтических волокон [Wigstrom et al., 1985]. В некоторых исследованиях вообще не было зарегистрировано блокирования ответов, вызванных аппликацией ВАК, с помощью ДЭЭГ [Collingridge et al., 1983; King et al., 1985; MacDonald et al., 1977]. К тому же его применение ограничено невысокой гидролитической стабильностью в организме [Мишин и др., 1991].
Нейрональные ответы, индуцированные квисквалатом, снижали также кипуреповая кислота [Ferkany, 1986], пиперазип-2,3-дикарбоновые кислоты [Ganong et al., 1986] и y-D-глутами-ламипометансульфоповая кислота (GAMS) [Jones et al., 1990], однако эти соединения тормозили одновременно и синаптическое возбуждение, вызываемое агонистами NMDA типа, и лишь GAMS проявил приемлемую степень избирательности по отношению к АМРА рецепторам [Watkins et al., 1991].
Определенные надежды исследователей были связаны с появившимися сведениями о том, что некоторые производные хи
380
ноксалин-2,3-диоиа проявляют селективную антагонистическую активность но отношению к АМРА рецепторам. Например, 6-циапо-7-ш1трохипоксалин-2,3-дио11 (CNQX) и 6,7-динитрохи-ноксалии-2,3-диоп (DNQX) взаимодействовали с местами специфического связывания каината, квисквилата и АМРА, но не с местами связывания агонистов NMDA тина [Honore et al., 1988], и избирательно подавляли синаптическое возбуждение, индуцированное neNMDA агонистами в препаратах неокортекса крыс и спинного мозга лягушек в опытах in vitro [Fletcher et al., 1988].
Однако вскоре выяснилось, что CNQX и DNQX селективно блокируют neNMDA рецепторы только в случае высокой концентрации в среде глицина. В дальнейшем этот неожиданный и интересный факт получил свое объяснение: хиноксалин-2,3-диопы конкурентно блокируют глициновый связывающий сайт в NMDA-реценторио-иопофорном комплексе [Kessler et al., 1989]. При отсутствии глицина в среде CNQX селективно блокирует глициновый рецептор, а при повышении содержания глицина происходит конкурентное вытеснение CNQX этой аминокислотой с глицип-связывающего сайта, и после этого уже CNQX проявляет антагонизм к АМРА и каинатным рецепторам. Поэтому в опытах in vivo, когда невозможно контролировать содержание глицина в среде, пока и невозможно дать точный ответ, в какой степени указанные производные хиноксалиндиопа (к которым можно добавить 6-хлор- и 6,7-дихлорнроизводиые) блокируют neNMDA рецепторы и глициновый сайт NMDA рецептора. Среди других производных хипоксалин-2,3-диопа следует отметить трициклическое производное NBQX, сильный ингибитор связывания 3Н-АМРА [Watkins et al., 1991]. Поиск новых neNMDA антагонистов в ряду производных хиноксалии-2,3-диона продолжается. Недавно появилась работа [Ohmori et ah, 1994], посвященная синтезу и исследованию зависимости ВАКергиче-ской антагонистической активности от химической структуры в ряду таких соединений. При этом авторами было показано, что 1Н-имидазол-1-ильный остаток является биоизостером циано- и иитрогруип. Наиболее активным антагонистом в серии, синтезированной авторами, оказался 6-(1Н-имидазол-1-ил)-7-питрохи-цоксалии-2,3-дноп.
Свойства избирательного и селективного антагониста АМРА рецепторов в опытах in vitro и in vivo проявляет недавно синтезированная 2-амипо-3-[3-(карбометокси)-5-метилизоксазол-4-ил]нроииоиовая кислота (AMOA) [Krogsgaard-Larsen et al., 1991].
381
По химической структуре это соединение представляет собой молекулу АМРА с одной блокированной кислотной функцией. Вспомнив о том, что блокирование кислотных функций у самой L-глутамииовой кислоты, превращение ее в ДЭЭГ, тоже приводит к соединению, проявляющему антагонистические свойства, можно высказать предположение, что такая химическая модификация молекул агонистов АМРА рецепторов может явиться одним из направлений синтеза АМРА антагонистов.
Таким образом, ситуация с избирательными конкурентными антагонистами АМРА рецепторов резко отличается от таковой в случае NMDA рецепторов, для которых изучается уже третье поколение конкурентных антагонистов. Поэтому в настоящее время поиск высокоселективных антагонистов АМРА рецепторов продолжается, тем более, что применение подобных соединений в качестве цереброиротективных средств при ишемии головного мозга имеет определенные перспективы.
Блокаторы ионного канала.
Как уже обсуждалось в предыдущей главе, в NMDA-рецеи-торцо-иопофорпом комплексе существуют места связывания конку рентных и неконкурентных антагонистов, а также и другие сайты, связывание с которыми различных лигандов модулирует функции всего комплекса. Однако и в АМРА-рецеп-торио-иоиофориом комплексе существуют сайты связывания не только для агонистов и конкурентных антагонистов [Lodge et aL, 1991; Jones et al., 1990]. Одно из таких соединений — филантотоксип, < use-dependent* антагонист АМРА рецепторов, блокирующий ионный капал [Jones et al., 1990]. Известны и некоторые другие соединения, антагонистическое действие которых па АМРА рецепторы связано с блокадой ионного капала: пентобарбитал [Miljkovic, MacDonald, 1986] и токсины пауков [Akaike et al., 1988].
Но этим сходство в возможностях регуляции функций АМРА и NMDA рецепторов не ограничивается. В работе Donevan и Rogawski [1993] показано, что соединение GYKI 52466 [1-(4-амииофеиил)-4-метил-7,8-метилепдиокси-5Н-2,3-бепзодиазе-пии] является высокоизбирательным неконкурентным антагонистом neNMDA рецепторов, причем механизм его действия отличается от других неконкурентных антагонистов этих типов рецепторов и является аллостерическим, а не капалобло-кирующим.
GYKI 52466 по химической структуре отличается от классических бензодиазепинов-а икс политиков в первую очередь тем,
382
что он является производным 2,3-, а не 2,4-беизодиазепииа. Сродство GYKI 52466 к классическому бензодиазепин-связы-вающему сайту па несколько порядков ниже, чем у диазепама [Tarnava et al., 1989, 1990]. У этого соединения сначала были найдены миорелаксирующие свойства [Tarnava et а!., 1989]. Затем был показан его антагонизм к ответам, вызываемым neNMDA агонистами [Tarnava et aL, 1990; Quardoz, Durand, 1991]. GYKI 52466 —первый неконкурентный neNMDA антагонист, совершенно не действующий на NMDA-ипдуцирован-ные ответы [Donevan, Rogawski, 1993]. Он блокирует ионные токи, вызываемые neNMDA агонистами, и их нейротоксическое действие, включая ишемическую дегенерацию нейронов [Zorumski et al., 1993]. Неконкурентный механизм его действия подтвержден данными электрофизиологических и нейро-токсикологических экспериментов. В качестве возможного объяснения этих свойств GYKI 52466 авторы выдвигают гипотезу о существовании в леНМПА-рецепторно-ионофорном комплексе неизвестного ранее сайта связывания бензодиазепинов. Отсутствие подобного сайта в NMDA-комплексе и обуславливает избирательность действия GYKI 52466 па neNMDA рецепторы. Известно, что циклотиазид способен подавлять быструю десенситизации АМРА рецепторов [Yamada, Rothman, 1992]. В то же время он может блокировать и действие GYKI 52466 на каинат- и АМРА-иидуцированиые токи, поэтому беизодиазе-нип-связывающий сайт neNMDA рецепторов управляет, вероятно, десецситизацией этих рецепторов [Zorumski et al., 1993].
Тот факт, что GYKI 52466 неконкурентно блокирует ответы как па квисквалат, так и каинат, интересен в связи с вопросом о том, действуют эти ВАК ла один и тот же или разные рецепторы. Если рецепторы для квисквалата и каината различны, то оба этих рецепторных комплекса должны иметь похожие беи-зодиазепип-связывающие сайты, так как GYKI 52466 блокирует действие как одной, так и другой аминокислот, и в обоих случаях эти эффекты чувствительны к действию циклотиазида. Zorumski et al., (1993) считают, что более приемлемым является предположение о наличии одного neNMDA рецепторно-ка-пальпого комплекса, отвечающего как на действие квисквалата, так и каината, в состав которого и входит бензо диазепин-свя-зывающий сайт. Тем более, что это согласуется с известными данными о фармакологическом взаимодействии квисквалата и каината в культуре нейронов гиппокампа [Patneau, Mayer, 1991; Thio et aL, 1991].
383
Однако окончательные доказательства гипотезы о существовании в АМРА-рецепторцо-иопофорпом комплексе беп-зодпазенин-связывающего места и установление его роли могут быть получены только после синтеза большого ряда аналогов GYKI 52466 и циклотиазида (о бензодиазенин-связывающем сайте АМРА рецептора см. также обзор Rogawski [1993]).
Заключая этот раздел, посвященный рецепторам ВАК АМРА типа, необходимо заметить, что в настоящее время сведений о молекулярных механизмах их функционирования очень мало, можно даже сказать, что крайне мало по сравнению с их физиологической значимостью для реализации функций мозга. Этот недостаток наших знаний об АМРА рецепторах мозга в настоящий момент объясняется отсутствием широкого набора специфических агонистов и, что более важно, антагонистов этого типа рецепторов ВАК, которые могли бы с успехом использоваться в различных экспериментальных моделях. Поэтому поиск веществ, селективно взаимодействующих с АМРА рецепторами, является необходимым условием дальнейшего прогресса исследований функций и физиологической роля этих рецепторов.
Физиологическая роль АМРА рецепторов изучена не так хорошо, как в случае NMDA рецепторов. Однако известно, что эти рецепторы также участвуют в развитии судорожных состояний.
9.4. Каинатные рецепторы
Кайловая кислота, природная аминокислота, выделенная из морских водорослей Digenia simplex, дала название третьему типу ионотропных рецепторов ВАК. О каинатных рецепторах известно довольно мало. В первую очередь это связано с тем, что до сих пор не обнаружены селективные антагонисты этого типа рецепторов ВАК. Вещества, способные блокировать каи-пат-ипдуцировашюе возбуждение в синапсах, блокируют и ответы нейронов на аппликацию АМРА агонистов. Естественно, в методическом аспекте это значительно затрудняет исследования особенностей каинатных рецепторов. Хотя участие каинатных рецепторов в пейродеструктивпых процессах в ЦНС установлено давно, сведения о физиологической роли этого тина рецепторов ВАК как в функционировании синапсов и нейронов, так и на системном уровне мозговой деятельности край-
384
не скудны. Поэтому интерес к каинатным рецепторам, в стратегическом направлении прежде всего предполагающий, в той или иной степени, создание новых нейротропных препаратов, у большинства исследователей невысок.
При стимуляции специфических иостсииаптических рецепторов происходит открытие иотеициал-независимых каналов для ионов К+ и Na+ [Mayer, Westbrook, 1987]. То же самое происходит и при действии агонистов АМРА типа, однако кайловая кислота способна также стимулировать вход ионов Са2+ внутрь нейронов за счет активации нресипантических рецепторов [Ferkany et al., 1989]. В частности, для гранулярных клеток мозжечка в культуре установлено, что повышение переноса 45Са2+ в клетке происходит при добавлении NMDA или каината, но не квисквалата [Wroblewska et al., 1993]. В области САЗ гиппокампа обнаружены нресипаптические каинатные рецепторы, модулирующие концентрацию внутриклеточного свободного кальция в нервных окончаниях [Malva et al., 1995].
Высокоаффипный каинатный рецептор in vitro может быть реконструирован из субъединиц GluR5, GluR6 и GluR7, а также субъединиц КА1и КА2 [Seeburg,1993]. Гибридизационный анализ in situ показывает, что эти пять субъединиц экспрессируются в разных структурах мозга, что свидетельствует о том, что каинатный рецептор включается во многие нейрональные цеди в мозге. Важно и то, что места экспрессии этих субъединиц в мозге примерно совпадают с местами высокоаффишюго связывания 3Н-каииата [Seeburg, 1993].
Структуры известных в настоящее время агонистов каинатных рецепторов в той или иной степени близки самой каиновой кислоте (известной также под названием а-каиновой] (см. рис. 69). Большой интерес представляет домоевая кислота, выделенная из морских водорослей Chondria armata. По агонистической активности опа превосходит каиповую кислоту, что, очевидно, связано с наличием большого непредельного заместителя в положении 4 пирролидинового цикла. Недавно из плодов Clitocybe acromelalga были выделены два соединения, структурно схожие с каиновой и домоевой кислотами — акро-меловые кислоты А и В, которые оказывали в 100 раз более выраженный деполяризующий эффект в нервно-мышечных соединениях рака, нежели каииовая кислота [Shanozaki, 1988].
Как уже подчеркивалось, па сегодняшний день неизвестны специфические антагонисты каинатных рецепторов, хотя возбуждение нейронов, вызываемое каиновой кислотой, может уст-
Н. 3». 227
385
н
Рис. 69. Агонисты каинатных рецепторов; А—каиповая кислота, В—до-моевая кислота, С—акромеловая кислота A, D—акромеловая кислота В.
раниться целым рядом соединений, блокирующих и другие типы рецепторов ВАК. Это относится, в частности, к y-D-Тлутамилметапсульфоновой кислоте, производным пиперазип-2,3-дикарбоновой и самой каиновой кислот, которые в различной степени способны подавлять также NMDA- и квисквалат-ицдуцировашюе возбуждение [Johnson, Koerner, 1988]. Из ныне известных антагонистов наиболее выраженной способностью блокировать каинатные и АМРА рецепторы обладают DNQX и CNQX, проявляющие антагонистическую активность в низких, микромолярных концентрациях [Honore et al., 1988]. Проведенный анализ по Шилду показал, что антагонизм этих соединений цо отношению к квисквалату и каинату носит конку рентный характер [Birch et al., 1988]. В высоких дозах DNQX неконкурентно блокирует и NMDA-индуциро-ванное возбуждение. Другое производное хипоксалица — 6,7-дихлор-З-гидроксихиноксалин-2-карбоновая кислота, отпосн-
386
i тельпо селективно, по сравнению с АМРА рецепторами, может I блокировать каинатные рецепторы [Frey et al., 1988].
j Избирательным и конкурентным антагонистом каинатных ре-I цепторов является также 2- амино- 3- [2- (3- гидрокси- 5- мети-I лизоксазол- 4- ил) метил]- 5- метил- З-оксо-изоксазолин-4-I ИЛ ]пр011иоповая кислота (AMNH) [Krogsgaard-Larsenetal., 1991]. | Полиаминсодержащие соединения, филантотоксин и его сиц-1 тетические аналоги, способны ингибировать эффекты каината, | при этом действие этих соединений неспецифично, так как ими | же блокируются и NMDA- индуцированные ответы [Blackley I etal., 1993].
9.5. L-AP4 рецепторы
. Идентификация трех основных типов рецепторов ВАК (NMDA, АМРА и каинатного) так или иначе связана с их селективными агонистами, оказывающими выраженное деполя-i ризующее действие на различные нейроны мозга. В отличие от ; них, выделение четвертого типа ионотропных рецепторов ['ВАК, так называемых Ь-АРД-чувствительных рецепторов (L-АР4), основано исключительно на опытах со специфическим антагонистом. Сама L-AP4 была синтезирована и изучена в [рймках поиска антагонистов рецепторов ВАК в ряду производ-hlbix кислых аминокислот, содержащих в качестве со-кислотной [Группы фосфопатный остаток [McLennan, 1979]. Уже в самом [Начале исследований способность L-AP4 устранять синацтиче-ЁСКое возбуждение в различных популяциях нейронов вызвала ЮСобый интерес, так как этот феномен наблюдался только в fcrporo определенных отделах мозга. В частности, L-AP4 при перфузии гиппокампальных срезов выраженью угнетала воз-Иуждепие гранулярных клеток зубчатой извилины при стиму-шции латерального перфорантного пути [Koerner, Cotman, 1981]. Подобным же образом L-AP4 блокировала моносинаптические ВИСП вентральных корешков, спинного мозга, регистрируемые при раздражении дорзальных корешков [Davies, Watkins, 982], нейрональные ответы в обонятельной коре, вызванные Иектрораздражепием латерального обонятельного тракта Collins, 1982] и, наконец, синаптическое возбуждение в системе мшистых волокон САЗ зоны гиппокампа [Lanthorn et al., 994]. Еще большее значение имело отсутствие у L-AP4 сно-
387
н
РО3Н2
НООС 1ЧН2
L-AP4
CJb-CO Nil CH “СО NH CH-COOH
» I I
V«2
соои
сн2 сн2
соон
СНд- СО -NH CH CH СО -NH CH COOH
3 I Л |
сн2
соон
сн2 соои
в
Рис. 70 . Лиганды L-AP4 рецепторов (A — NAAG, В — р-изомср).
собцости блокировать синаптическое возбуждение при аппликации агонистов известных типов рецепторов ВАК в указанные выше структуры мозга. На основании этого и было высказано предположение о существовании четвертого типа рецепторов ВАК, специфическим антагонистом которых является L-АР4 (D-изомер не отличается подобной селективностью и блокирует NMDA-, каината и квисквалат-вызваппую деполяризацию). В ряде работ показано, что Е-АР4-чувствительные рецепторы могут иметь пе только постсииаптивескую, ио и нреси-иаптическую локализацию [Cotman et al., 1986], что необходимо учитывать при объяснении некоторых эффектов антагониста. Например, в культуре гиппокампальных нейронов было продемонстрировано, что L-AP4 угнетает синаптические ответы, действуя пресипаптически [Smart, 1989].
В поиске других антагонистов типа L-AP4 были синтезированы его циклопентильпые и циклогексильпые аналоги, некоторые из которых проявили высокую активность [Crooks et al., 1988]. Ситуация с агонистами этого типа рецепторов ВАК остается неопределенной. По существу, сейчас только одно соединение может претендовать на роль агониста и, возможно, эндогенного лиганда этих рецепторов. Речь идет о мозгоснеци-фическом динептиде N-ацетил-Е-аспартил-Е-глутамицовой кислоте (NAAG), которому был посвящен ряд интересных иссле-
388
даваний. В продолговатом мозге он присутствует в достаточно заметной концентрации в структурах переднего мозга, содержащих L-AP4 рецепторы: зрительный бугор, латеральное коленчатое ядро, верхнее ядро четверохолмия, энториальпая кора и гиппокампальная формация [Anderson et al., 1987]. При повреждении коцкрептиых NAAG была впервые обнаружена в головном мозге кролика, а впоследствии и в мозговой ткани млекопитающих и человека [Curatolo et al., 1967].
В нейрофизиологических опытах было установлено, что NAAG вызывает возбуждение нейронов при его ионофорети-ческом подведении к гиппокампальным пирамидальным клеткам CAI зоны и пириформной коры у крыс [French-Mullen et al., 1985]. NAAG-индуцированная стимуляция пирамидальных клеток селективно блокируется L-AP4, но пе АР5, антагонистом NMDA рецепторов, что позволило высказать предположение о его взаимодействии с рецепторами L-AP4 типа. Однако при иитрацеребровептрикулярцом введении мышам сама NAAG не Проявила возбуждающего действия, а неожиданно сильное судорожное действие было обнаружено у изомерного соединения -- ^ацетил-[1-Е-аспартил-Ь-глутамицовой кислоты [Piotrovsky et al., 1991].
В пользу предположения о том, что NAAG может являться Эндогенным лигандом рецепторов ВАК свидетельствует также Наличие специфических систем его захвата и утилизации. NAAG проявляет высокое сродство и специфичность к хлор-зависи-мым участкам связывания 3Н-глутамата, которые относятся к системе транспорта медиатора из синаптической щели в преси-Нантическую терминаль [Koller, Coyle, 1985]. Параллельный Сдвиг кривой связывания 3Н-глутамата наблюдался при добавлении в инкубационную среду глутаминовой кислоты, L-AP4 и NAAG, но не NMDA и каиновой кислоты. Процесс деградации динептида проходит под действием специфической пептидазы мозга, которая расщепляет его па N-ацетиласпартат и глутаминовую кислоту [Ferkany, 1986]. До сих нор не имеет своего объяснения любопытная особенность этого фермента—его специфическим ингибитором является квисквалат.
L-AP4 рецепторы наименее изучены из всех четырех типов ионотропных рецепторов ВАК, что объясняется полным отсутствием агонистов и наличием, по существу, лишь одного специфического антагониста. Можно лишь надеяться, что появление в будущем большого набора соединений, способных проявлять свойства селективных агонистов и антагонистов этого типа ре
389
цепторов ВАК, поможет раскрыть молекулярные аспекты функционирования и физиологическую роль рецепторов ВАК L-АР4 типа.
9.6. Метаботропные рецепторы ВАК
В 1984 году появилось сообщение о том, что глутамат индуцирует хлорные токи в ооцитах лягушек после инъекции мРНК из мозга крысы [Gundersen et al., 1984]. В следующем году было показано сильное стимулирующее действие глутамата и квисквалата на гидролиз фосфоипозитола [Sladeczek et al., 1985]. В других ранних работах на различных моделях было показано, что некоторые агонисты рецепторов ВАК стимулируют гидролиз фосфоинозитидов [Sugiyama et al., 1987].
В результате гидролиза PIP2 образуются ииозитил-1,4,5-трифосфат (IP3) и диацилглицерии. IP3 быстро разрушается до 1(1,4)Р2 или фосфорилируется Са2+-активируемой IP3-3-киназой до 1( 1,3,4,5)Р4, который, в свою очередь, дифосфори-лируется в неактивный изомер I(1,3,4)P3. IP3 стимулирует выброс кальция из внутриклеточных депо [Schoepp et aL, 1991].
Естественно возник вопрос о специфичности рецепторов ВАК, сопряженных с IP. Поначалу казалось, что этот процесс реализуется за счет давно известных рецепторов, чувствительных к квисквалату, так как глутамат и квисквалат индуцировали хлорные токи [Verdoorn, Dingledine, 1988]. Первые сомнения в этом появились после сообщения о том, что jogo spider toxin, способный блокировать нейрональные ответы па квисквалат и каинат, не блокировал глутамат-ипдуцированное образование IP [Sugiyama et al., 1987].
Исследования нового класса рецепторов ВАК на ооцитах дали толчок аналогичным работам с объектами нервной системы млекопитающих. В целом фармакологические особенности процесса индукции квисквалатом оборота IP в головном мозге млекопитающих оказались довольно схожими с таковыми в препаратах ооцитов. В качестве примера можно указать наблюдавшуюся в срезах гиппокампа выраженную стимуляцию образования IP под действием иботепата, квисквалата или глутамата [Baudry et al., 1986], а также циклического аналога глутаминовой кислоты траис-1-амицоциклопептил-1,3-дикарбоио-вой кислоты [(1R,3S)-ACPD], Стимуляция квисквалатом обо
390
рота IP и гранулярных клетках мозжечка, так же как и в ооцитах, тормозилась при инъекции иертуссии токсина [Jackson, Usherwood, 1988].
Наиболее важным выводом этих работ явилось доказательство того, что глутамат-иидуцировапная стимуляция 1Р-цикла опосредована квисквалат-чувствительиыми рецепторами, отличными от известных ранее АМРА рецепторов.
Как на срезах мозга крыс, так и в ооцитах было показано, что сама АМРА не влиет па метаболизм IP, а квисквалат-и1 [Аудированное образование IP не устранялось таким АМРА антагонистом как CNQX [Verdoorn, Dingledine, 1988]. Полученные результаты позволили предположить существование в нейронах совершенно иного, нового тина рецепторов ВАК, сопряженных с обменом фосфатидилинозитола, для которых характерны: 1) активация L-глутаматом, иботепатом, квисквалатом и (1R,3S)-ACPD; 2) нечувствительность к действию других агонистов рецепторов ВАК—NMDA, АМРА и каината; 3) отсутствие эффекта антагонистов рецепторов NMDA, АМРА и каинатного типов.
Эти рецепторы получили название «метаботропных», так как их активация проявляется не в изменении проводимости мембраны в результате открытия канала, а в активации внутриклеточного метаболизма.
В настоящее время показано, что метаботропные рецепторы ВАК представляют собой гетерогенную популяцию глутаматных рецепторов, которые вызывают эффекты в клетках через G-белки. Показано, что in situ они стимулируют гидролиз фосфоинозитидов, в результате чего образуются диацилглицерив и ицозитол-1,4,5-трифосфат, влияют на уровень цАМФ (как понижая, так и повышая его), оказывают модулирующее влияние на различные ионные каналы (например, К+ и Са2+) [Winder etal., 1993; Schoepp, Conn, 1993; Littman et al., 1993; Cartmell et al., 1993]. В то время как ионотропные рецепторы ВАК осуществляют быструю синаптическую передачу, метаботропные рецепторы скорее выполняют модуляторные функции и вызывают долговременные изменения в деятельности клетки.
Метаботропные рецепторы ВАК (mGluRs) представляют собой целое семейство, состоящее, как минимум, из семи различных подтипов (mGluRl — mGluR7) [Masu et al., 1991; Tanabe et al., 1992, 1993; Abe et al., 1992; Nakajimaet al., 1993; Okamoto et al., 1994]. Эти рецепторы имеют семь трансмембранных сегмеп-
391
и
соон
h2n
соон
н
OUIS
1S3R-ACPD
HomoQUlS
Рис. 7i. Агонисты метаботропных рецепторов.
тов, похожих па такие же структуры у других рецепторов, связанных с G-белком. Самым существенным их отличием является существование большого N-концевого домена, расположенного вне мембраны снаружи клетки, причем именно в этом домене находится глутамат-связывающий сайт [Takahashi et al,, 1993; O’Hara et ah, 1993]. Это отличает семейство mGluR от других рецепторов, связанных с G-белком, так как в последних сайт связывания низкомолекулярного лиганда расположен в «трансмембранном кармане»,
Семь подтипов метаботропных рецепторов ВАК отличаются друг от друга механизмом передачи сигнала н чувствительностью к действию различных агонистов [Tanabe et al., 1992, 1993; Aramori et al., 1992; Abe et al., 1992; Nakajima et al., 1993; Okamoto et al., 1994]. С учетом аминокислотной последовательности, механизма передачи сигнала и селективности агонистов, семь метаботропных рецепторов можно разделить па три группы: mGluRl/mGluR5, mGluR2/mGluR3 и mGluR4/mGluR6/ mGluR7 [Nakanishi, 1992; Nakanishi, Masu, 1990]. Подтипы mGluRl и mGluR5 связаны с IP3/Ca2+ системой передачи сигнала, для них наиболее сильным агонистом служит квисквалат, Другие пять подтипов ингибируют каскад реакций, связанный с цАМФ. Они также различаются ио избирательности действия агонистов: для mGluRl /mGluR5 порядок активности лигандов квисквалат > глутамат > иботепат > 1S.3R-ACPD; для mGluR2/
392
mGluRS —L-CCG-I [(25,1'3,2'8)-2-(карбоксициклоиропил)гли-ции] > глутамат = 1S,3R-ACPD > иботепат > квисквалат; а для mGluR4/mGluR6/mGluR7“L-AP4 > глутамат »> 1S,3R-ACPD > квисквалат > иботепат [Suzdak et al,, 1994, см, также Suzdak et al,, 1993],
Активация рецепторов цервой группы (mGluRl/mGluR5) приводит к увеличению гидролиза IP3. Рецепторы второй группы (mGIuR2/mGIuR3) снижают активность аденилатциклазы и уровень цАМФ. Они чувствительны к действию нертуссии-токсипа, ингибирующего G-белок. Активация третьей группы рецепторов (mGluR4/mGIuR6/mGIuR7) также приводит к снижению уровня цАМФ. Они также чувствительны к действию иертуссин-токсина. Каждый из подтипов метаботропных рецепторов имеет уникальное распределение в ЦНС и сетчатке, Рецептор mGluR6 участвует в передаче зрительной информации, передавая сигнал с фоторецепторов па ОЫ-биноляриые клетки [Nakanishi et al,, 1994], Другие подтипы широко распространены в различных отделах мозга, что свидетельствует о том, что каждый из подтипов выполняет свою определенную функцию [Tanabe et al., 1992, 1993; Abe et al., 1992; Shigemoto et al., 1992; Ohishi et aL, 1993a, 1993b; Okamoto et aL, 1994].
При изучении эффектов активации метаботропных рецепторов ВАК в различных областях ЦНС показано, что эти рецепторы могут быть как пост-, так и нресинантическими [Baskys, Malenka, 1991]. При действии па последние 1S,3R-ACPD ингибирует выход глутамата-медиатор a [Miller, 1994], В гиппокампе метаботропные рецепторы осуществляют модулирующие функции и вовлечены в процессы синаптической пластичности [Conn, 1994],
Как уже указывалось выше, агонистами метаботропных рецепторов ВАК являются квискваловая, глутаминовая, иботеновая кислоты и 1S.3R-ACPD. Недавно были найдены еще некоторые сильные агонисты этих рецепторов — 3,5-дигидроксифе-цилглицин н (Й)-гомоквискваловая кислота [Porter et aL, 1992],
Интересный ряд представляют собой изомерные 2-(карбок-сицикло-11ро11ил)глицииы. Всего существует восемь стереоизомеров, отличающихся друг от друга строением хиральных центров. Было показано, что различные изомеры цо-разпому взаимодействуют с различными подтипами метаботропных рецепторов [Hayashi et aL, 1992]. К агонистам метаботропных рецепторов ВАК, связанных с G-белком, предположительно отпо-
393
сят и эндогенный дипентид N-ацетил-асиартилглутамиповую кислоту (NAAG), причем этот дипентид пе действует па метаботропные рецепторы, стимулирующие гидролиз ипозитилфос-фатидов [Wroblewska et al., 1993].
В некоторых работах к антагонистам относят L-AP4, так как была показана ее способность тормозить квисквалат-ипдуци-роваиный гидролиз инозитид фосфатидов, Некоторыми авторами этот эффект объяснялся идентичностью метаботропных и L-AP4 рецепторов [Nicoletti et al., 1987], Однако целый ряд других эффектов L-AP4 в различных отделах головного мозга не связан с метаболизмом IP [Monaghan et al., 1989]. Более того, предполагается, что большинство, по не все, эффекты L-АР4 связаны с его агонистическим действием па рецепторы mGluR4 [Kristensen et al., 1993],
К антагонистам метаботропных рецепторов относят АРЗ. Показано также антагонистическое действие на эти рецепторы таких соединений, как L-SOP, АР5, PDA, y-DGG, GAMS [Schoepp et al,, 1991]. Недавно найдены новые антагонисты - это DL-3-гидрокси-4-карбоксифеиилглицин, (К5)-а-метил-4-карбокснфе-нилглиции и (5)-4-карбоксифеинлглици11 [Thomsen, Suzdak, 1993; Bashir et al., 1993; Eaton et al., 1993].
Активация NMDA рецепторов тормозит образование фосфатидилинозитола, индуцированное действием агонистов метаботропных рецепторов, В частности, в зависимости от присутствия ионов Са2+ NMDA ингибировала этот процесс в срезах гиппокампа новорожденных крысят. NMDA-агонисты снижали также повышение уровня IP, вызванное стимуляцией М-холипоре-цепторов в гиппокампе [Baudry et al., 1986]. Топкие механизмы взаимодействия NMDA рецепторов и метаболизма IP пока еще не изучены. Сначала предполагалось, что агонисты NMDA рецепторов тормозят образование IP за счет нейротоксического эффекта, вызывающего серьезные нарушения внутриклеточного метаболизма [Nicoletti et al., 1996], Однако появившиеся впоследствии данные о том, что антагонисты NMDA рецепторов усиливают стимулирующее действие L-глутамата па метаболизм IP, позволили усомниться в этом [Kushner et al,, 1988].
Известно много работ, в которых показано взаимодействие ионотропных и метаботропных рецепторов ВАК, Сочетанной активации ионотропного АМРА и метаботропного рецепторов отводится важная роль в развитии механической гиперальге-зии [Meller et al., 1993], NMDA и метаботропного — в мехапиз-
394
мах развития долговременной потеициации в нейронах СА1 гиппокампа крыс [Behnisch, Reymann, 1993; Bashir et al,, 1993; Aronica et al., 1993],
О функциональной значимости метаботропных рецепторов ВАК для деятельности мозга известно относительно немного. Предполагается участие этих рецепторов в реализации (или регуляции) процессов роста нервных окончаний, В пользу этого предположения косвенно указывают данные о том, что эффекты различных факторов роста в нервной ткани опосредуются через фосфатидилинозитольный механизм. Кроме того, имеются сведения о быстром снижении активности метаботропных рецепторов после завершения сииаптогенеза и об обратном эффекте после деаффереитации нервных структур [Nicoletti et al.,1987]. В глутаматергических синапсах синтез белков в ностсинансе регулируется фосфатидилинозитольной системой вторичного мессенджера. [Weiler, Greenough , 1993],
По всей вероятности, метаботропные рецепторы активно участвуют в механизмах сииаптогенеза и включаются в механизмы его положительной и отрицательной регуляции. Как известно, уровень нейрональной активности может определяться балансом между двумя системами вторичных посредников — Саг+ и фосфатидилинозитола. Предполагая совместное существование на ностсинаптической мембране NMDA и метаботропных рецепторов, Nicoletti et al, [1996] указывают на следующую возможность модуляции ответа нейрона при его возбуждении эндогенным медиатором: при взаимодействии L-глу-тамата с метаботропными рецепторами в нервной клетке происходит стимуляция системы фосфатидилинозитола, а при связывании медиатора с NMDA рецепторами инициируется вход ионов Са-+ внутрь клетки и одновременное угнетение фосфатидилинозитольного метаболизма. Было обнаружено, что долговременному усилению, вызванному активацией NMDA рецепторов, предшествует активация метаботропных рецепторов [O’Connor et al,, 1994], Таким образом, соотношение между внутриклеточными посредниками может определяться активацией обоих типов рецепторов ВАК, что, в конечном итоге, и лежит в основе явления синаптической пластичности.
При активации в стриатуме метаботропного рецептора его агонистами, например 1S,3R-ACPD, может увеличиваться выброс дофамина, что, в свою очередь, приводит к активации D2 рецепторов, Эта роль метаботропных рецепторов в осуществлении экстрапирамидпых моторных функций может быть
395
основой для разработки повой стратегии лечения паркинсонизма и хореи Гентингтона [Schoepp, 1994b]. Об участии метаботропных рецепторов в развитии судорожных состояний и пейродегеперации нейронов свидетельствует тот факт, что 1S,3R-ACPD in vivo вызывает судороги и повреждения мозга, причем эти эффекты не блокируются антагонистами ионотропных рецепторов ВАК [Sacaan, Schoepp, 1992]. Следовательно, поиск среди лигандов этих рецепторов может привести к новым антиконвульсантам и нейро протекторам [Schoepp, 1994а; Pizzi et al., 1993].
ЭЛ. Рецепторы ВАК в ЦНС
Прежде чем перейти к рассмотрению вопроса о локализации рецепторов ВАК в ЦНС в целом и в отдельных ее структурах, остановимся на некоторых методических вопросах изучения этой проблемы. Наиболее распространенными методами являются исследование рецепторного связывания меченых лигандов и авторадиографический анализ [Young, Fagg, 1990]. Для анализа распределения данного типа рецепторов обычно используется один из наиболее селективных и активных агонистов. Однако при изучении распределения NMDA рецепторов это оказывается невозможным, так как аффинность меченого лиганда невысока, Поэтому для выявления и сравнительной характеристики NMDA рецепторов в радиолигапдных исследованиях обычно применяют меченые антагонисты [Olverman et al., 1984]. Специфическое связывание 3Н-АР5 с синаптическими мембранами мозга ингибируется L-глутаматом, L-гомо цисте атом, L-асцартатом и NMDA, но не квисквилатом, каинатом или L-AP4. Возможно также использование в авторадиографических исследованиях и неконкурентных антагонистов. В работе Maragos et al. (1988) с использованием 3Н-ТСР, лиганда фенциклидиновых сайтов, показано, что локализации NMDA- и фенциклидин-связывающих сайтов в головном мозге крыс очень близки.
Часто в качестве меченого лиганда используется 3Н-Ь-глу-таминовая кислота. Так как это соединение связывается со всеми тинами рецепторов ВАК, то для определения доли NMDA рецепторов в общем связывании используется «холодная*-NMDA, вытесняющая радиоактивную метку с участков NMDA-
396
специфического связывания. Показано, что в этом случае толь-i ко агонисты и антагонисты NMDA рецепторов способны изме-
нять вытеснение 3Н-С-глутамата немеченой NMDA [Greenamyre et al., 1988; Monaghan et al., 1985].
Для изучения анатомической локализации АМРА рецепторов в головном и спинном мозге в качестве меченого лиганда ; используется 3Н-АМРА, которая с одинаковым успехом может : быть использовала для работы с мембранными фракциями и для । авторадиографических исследований. Этот лиганд наиболее активно вытесняется из мест специфического связывания АМРА, I квисквалатом и L-глутаматом, слабее каинатом и совсем незпа-I чителыю -D-глутаматом, D-асцартатом, NMDA, АР5 и L-AP4 [Honore et al., 1988].
। Для идентификации каинатных рецепторов использу-f ется 3Н-каиновая кислота. Впервые ее специфическое связы-i вание с мембранами мозга описали Simon et al. [1976], указавшие на сильное ингибирование этого связывания L-глутама-(' том. Однако, по их данным, сам каинат очень слабо вытеснял L-глутамат. Впоследствии было показано, что агонисты NMDA i рецепторов (L-аспартат, NMDA и цис-ACPD) ле влияют на t связывание каината с мембранами мозга крыс, и только агоци-* сты АМРА рецепторов (L-глутамат, квисквалат) проявляют некоторое сродство к каинатным рецепторам [London, Coyle, 1979].
В настоящее время кроме методов радиолигандного анализа для изучения распределения рецепторов широко используется иммунохимический метод. Он позволяет не только устанавливать распределение рецепторов как единых комплексов, но и изучать региональное, клеточное и ультраструктурное распределение отдельных субъединиц рецепторов [Storm-Mathisen, Ottersen, 1991; Huntley et al., 1994].
9.7.1, Распределение рецепторов ВАК
Перейдем теперь к рассмотрению конкретных фактов. ВА-Кергическая система, как уже указывалось выше, является основной синаптической системой передачи возбуждения у млекопитающих. Поэтому не удивительно, что ВАКергические нейроны обнаруживаются практически во всех отделах ЦНС [Greenamyre, Porter, 1994]. Особенно высокая их плотность наблюдается во фронтальной коре, гиппокампе, прилежащем ядре и стриатуме, между которыми существуют тесные иерархические связи [Дамбипова,1989]. Рецепторы ВАК в онтогенезе появляются на относительно поздних стадиях. При изучении
397
распределения подтипов и динамики развития плотности рецепторов в различных областях мозга человеческого плода было показано, что специфическое связывание лигандов рецепторов ВАК появляется ца 16 педеле и достигает максимума па 20 — 21 неделях, то есть в период наивысшей клеточной пластичности. Затем к 24—26 неделям плотность мест связывания лигандов ВАК падает. Количество рецепторных участков связывания L-глутамата в структурах мозга уменьшается в ряду: лобная ко-ра> теменная кора>затылочная кора>нолосатое тело> гипцо-камп> средний мозг> гипоталамус> мозжечок> продолговатый мозг [Fagg, Foster, 1983; Youong, Petroff, 1991].
NMDA рецепторы.
Наибольшая плотность NMDA-чувствительных мест связывания 3Н-Е-глутамата была обнаружена в структурах переднего мозга. У крыс максимальная концентрация NMDA рецепторов характерна для зоны СА1 гиппокампа, в частности, для stratum radiatum и stratum oriens. В других областях гиппокампа отмечены: умеренная плотность в зоне САЗ, во внутреннем слое зубчатой извилины и низкая плотность в stratum lucidum [Monaghan et aL, 1985]. Что касается распределения этих рецепторов в новой коре, то в цитированной выше работе [Monaghan et al,, 1985] указывается, что наибольшая плотность NMDA рецепторов наблюдается в слоях I, II, III и V, Однако в работе Greenamyre et al. (1987) показало, что максимальное количество этих рецепторов обнаруживается в I, II и IV слоях неокор-текса. Если рассматривать кору в топографическом аспекте, то больше всего рецепторов ВАК, чувствительных к NMDA, находится во фронтальном, пириформцом, переднем цингулярном ц перериналыюм отделах коры, несколько меньше —в париетальной и эцториналыюй коре. В базальных ганглиях наибольшая плотность NMDA рецепторов обнаружена в прилежащем ядре, ядрах ольфакторной системы. В таламусе наибольшее количество этих рецепторов идентифицировано в передне-задних ядрах и некоторых ядрах средней линии (например, ромбовидное), хотя в целом таламические отделы характеризуются средним уровнем глутаматной метки. В большинстве структур среднего мозга и ствола плотность NMDA рецепторов низка, исключение составляют ядра коленчатого тела, дорсомедиалыюс ядро шва, нейроны центрального серого вещества, кохлеарное, медиальное вестибулярное ядро, ядро солитарного тракта, а также нейроны желатинозной субстанции задних рогов спинного моз-
398
Гн. Мозжечок содержит лишь небольшое количество этих рецепторов, которые в основном сосредоточены в слое гранулярных клеток,
Указанные особешюсти анатомической локализации NMDA рецепторов были установлены с помощью 3Н-глутамата и подтверждены в дальнейшем ауторадио 1'рафическимн исследованиями с использованием 3H-D-AP5 [Monaghan, Cotman, 1985].
АМРА рецепторы.
Наибольшая плотность мест специфического связывания ^-АМРА в мозге крыс обнаруживается в гиппокампальных пирамидных клетках, в stratum radiatum CAI и stratum oriens. В коре максимальный уровень связывания регистрируется в слоях I, II Н III, несколько ниже в V и VI слоях и гораздо меньше в IV слое. Среди подкорковых структур можно выделить хвостатое и прилежащее ядра, характеризующиеся иовышешюй плотностью АМРА рецепторов по сравнению с бледным шаром и безымянной субстанцией. Значительно меньше мест специфического связывания 3Н-АМРА было обнаружено в структурах среднего мозга и мозгового ствола [Mohaghan, Cotman, 1985], При сопоставлении анатомической локализации АМРА и NMDA рецепторов в головном мозге крысы можно в целом указать на их значительную схожесть, Некоторые отличия проявляются лишь в том, что высокая плотность АМРА рецепторов обнаруживается в пирамидных клетках гиппокампа, латеральном септуме и в V слое задней коры, что пе было отмечено для NMDA-чувствительных мест связывания эН-глутамата. И, наоборот, в таламусе, слое гранулярных клеток мозжечка обнаружена высокая плотность NMDA рецепторов и довольно низкая—АМРА рецепторов [см. также Dure et al., 1992].
Низкая плотность АМРА рецепторов в таламусе установлена и при исследовании распределения субъединиц этих рецепторов в ядрах таламуса методом антинентидцых антител [Jose ft al.,1996]. Наибольшее количество субъединицы GluRl обнаружено в интраламинарном и срединном ядрах, тогда как субъединицы GluR2-3 распределены более равномерно. Концентрация GluR4 выше всего в ретикулярном ядре, причем только у взрослых крыс, Иммуноцитохимическое распределение рецепторов neNMDA типа в неокортексе человека изучалось в работе Vickers et al. (1995). Детальное региональное, клеточное и ультраструктурпое распределение субъединиц ;piuR2(4) в гиппокампе обезьян приведено в работе [Siegel et
399
aL, 1995], Показано, в частности, что на ультраструктурцом уровне иммупореактивцость во всех основных областях гиппокампа локализована преимущественно в иостсииаптических уплотнениях дендритных шипиков и в соматодепдритной цитоплазме. Различия в локализации субъединиц NMDA и АМРА рецепторов в латеральных и базальных ядрах амигдалы см, [Farbet aL, 1995].
Каинатные рецепторы.
Первые исследования по «картированию» каинатных рецепторов были выполнены в начале 80-х годов авторадиографическим методом с использованием 3Н-каипата. Самый высокий уровень связывания лиганда был обнаружен в stratum lu-cidum гиппокампа крысы [Foster etal., 1988; Berger etal., 1995]. Очень высокая плотность каинатных рецепторов была также обнаружена в хвостатом ядре,
В отличие от связывания агонистов с другими типами рецепторов ВАК, уровень специфического связывания каиновой кислоты сильно колеблется в различных участках и слоях коры, Более высокий уровень был обнаружен во фронтальной и пере-рипалыюй коре, несколько ниже—в участках париетальной, темпоральной и эцториналыюй зонах. Среди различных слоев не-окортекса наибольшая плотность каинатных рецепторов обнаружена в V и VI слоях. В таламусе и гипоталамусе связывание 3Н-каината совпадало с локализацией NMDA рецепторов, В частности, максимальное количество этих типов рецепторов ВАК обнаруживалось в ретикулярном ядре и ядрах средней линии таламуса. Подобное сходство отмечено и для мозжечка, в котором максимальное содержание NMDA и каинатных рецепторов характерно для слоя гранулярных клеток. Довольно высокий уровень связывания 3Н-каииата обнаружен в заднем гипофизе и срединном возвышении. Нижние отделы мозга содержат немного каинатных рецепторов, которые локализуются преимущественно в ядре солитарного тракта, медиальном вестибулярном ядре и в гранулярных клетках заднего кохлеарного ядра, Однако в целом уровень специфического связывания 3Н-каипа-та выше, чем у NMDA, особенно в ядрах ствола. Описанная нами локализация каинатных рецепторов установлена для головного мозга крысы, однако такое же распределение присуще и головному мозгу человека [Tsumoto, 1990].
С использованием селективных аптипентидпых антител к субъединицам КА2 и GluR6/R7 каинатного рецептора была
400
изучена локализация этих субъединиц в нервной системе крысы [Petralia et al., 1994]. Концентрация оценивалась но яркости свечения в ноле светового микроскопа. Оказалось, что низкий и средний уровень свечения наблюдается во многих структурах мозга, таких как задние рога сшитого мозга, вестибулярных ганглиях, а также нейрогипофизе и эпифизе. Средний уровень—в обонятельной луковице, церебральной коре, гипоталамусе, тогда как в большей части таламуса наблюдался низкий уровень. В гиппокампе плотность рецепторов в пирамидных клетках САЗ была выше, нежели в пирамидных клетках СА1, причем эта разница была более заметна с антителами к GluR6/7. В стволе мозга средний уровень наблюдался в некоторых сенсорных, моторных и ретикулярных ядрах. В основном свечение наблюдалось в постсипаптических плотностях. Полученные авторами с помощью обычного микроскопа данные по локализации каинатных рецепторов в основном совпали с данными, полученными ранее радиолигаидвым методом и гибридизацией in situ.
Метаботропные рецепторы.
Метаботропные рецепторы широко представлены в нейронах сенсорной системы. Например, рецепторы mGluR6 тина найдены в фоторецепторах и ON-биполярпых клетках, в нресипап-тических окончаниях гранулярных клеток зрительного бугра, где они модулируют ингибирование ГАМК-передачи с гранулярных па митральные клетки [Nakanishi et al., 1994].
С использованием антител к С-копцевому участку белка, Входящего в состав mGluRl, установлена его высокая концентрация в нейронах зрительного бугра, stratum oriens СА1 и Полиморфном слое зубчатой фасции гиппокампа, бледном шаре, таламусе, черном веществе, верхних ядрах четверохолмия и Мозжечке. Меньшая концентрация обнаружена в иеокортексе, стриатуме, миндалине и гипоталамусе. Локализации mGluRl и субъединиц ионотропного АМРА рецептора обычно не совпадают, однако в клетках Пуркинье субъединицы этих двух Типов рецепторов располагаются совместно. По мнению авторов, ностсицантическая локализация этого метаботропного рецептора подтверждает его постулируемую физиологическую роль [Birse et al., 1993]. О распределении метаботропных рецепторов ВАК см. также серию работ группы японских авторов иод руководством S.Nakanishl [Tanabe et al., 1992, 1993; Abe et al., 1992; Shigemoto et al., 1992; Ohishi et al., 1993a, 4993b: Okamoto et al., 1994].
Эи. 227
401
9.7.2. Системная организация ВАКергической нейропередачи
Спинной мозг,
В ранних работах, посвященных изучению роли возбуждающих аминокислот в регуляции синаптической передачи на уровне спинальных отделов ЦНС, было показано распределение различных подтипов рецепторов в моно- и полисинанти-ческой передаче возбуждающего стимула [Evans, Watkins, 1977; 1978]. Предполагалось, что основная доля моносинантических потенциалов, вызванных с нейронов заднего рога (ранние ответы), опосредуется рецепторами neNMDA типа, в то время как полисннантические пути (поздние ответы) опосредуются NMDA-чувствительными рецепторными терминалями.
Основой для подобных выводов стала временная оценка ответа, наблюдаемого при стимуляции афферентных волокон. Однако в последующих исследованиях было установлено, что синаптическая задержка вызванного потенциала в эффекторных клетках ВАКергических нейрональных цепей в наибольшей степени зависит пе от количества синаптических терминалей, а от качества (типа) представленных на ностсинаитиче-ской мембране рецепторов. В работах, выполненных Dale и Roberts (1991) па эмбрионах Xenopus laevis, впервые были описаны времеш1ые характеристики ответа ВАКергических рецепторов. Авторами работы было установлено, что локальная стимуляция афферентных волокон или внутриклеточная стимуляция интернейрона приводит к появлению трех типов ответа. Наиболее частым из них был поздний В ПСП (время нарастания 22 мс), более редким был ранний ВПСП (время нарастания 3 мс) и третий тип ответа представлял собой алгебраическую сумму раннего и позднего компонентов. Фармакологическая оценка участия различных подтипов рецепторов в развитии ВПСП позволила установить прямую связь раппего ВПСП с рецепторами АМРА типа и, соответственно, позднего ответа с NMDA рецептором [Long, Tvans, 1988; Jahr et al.,1994].
Эти данные заставили пересмотреть результаты нейрофизиологических исследований и показали возможность участия обоих подтипов рецепторов ВАК как в моно-, так и в цолнсн-наптнческих нейрональных цепях, регулирующих синаптическую передачу в спинном мозге.
Подкорковые ядерные структуры.
Таламус. Предположение о присутствии рецепторов ВАК в структурах таламуса первоначально основывалось па паблю-
402
депиях эффективности блокирующего действия ДЭЭГ и DL-метилглутамата на возбуждение клеток вентробазалыюго ядра в ответ па стимуляцию афферентных волокон, В последующих экспериментах с внутриклеточной регистрацией потенциала было показало блокирующее действие кипуреновой кислоты, по не АР5 [Salt et al., 1986а;1986Ь]. Однако с помощью тетанической стимуляции афферентных волокон (20 Гц) была установлена возможность активации NMDA-рецепторных структур, что позволило высказать предположение об участии NMDA рецепторов вентробазалыюго ядра таламуса, подобно дорсальным ганглиям спинного мозга, в восприятии ноцицептивных раздражений [Salt et al., 1988]. Kemp и соавт. (1993) установили, что антагонисты NMDA рецепторов АР5 и НА-966 (но не ДЭЭГ и CNQX) подавляли вызванный раздражением проекций X и Y нейронов латерального коленчатого ядра спайковый разряд. В работе показана неэффективность атропина в подавлении вызванных ответов в данной структуре, что опровергает ранее полученные данные [Tebecis, 1973] об участии холипер-: гических нейронов в передаче нервного сигнала в латеральном : коленчатом ядре.
; В целом следует отметить, что данные о представительстве рецепторов АМРА в таламических ядрах очень малочисленны и ; противоречивы, что объясняется, по всей видимости, их незначительной ролью в данном регионе мозга [Spreafico et al., 1994].
Стриатум и мезепиефальиые ядра. Большинство афферентных проекций стриатума имеют источник в кортикальных структурах большого мозга. В работе [Stone,1979] сообщается, что D-2-аминоадипииовая кислота подавляет афферентную импуль- сацию кортикальных эфферентов па нейроны стриатума. В даль-1 цейших исследованиях была подтверждена neNMDA рецеп-1 торная природа этих ответов [Herding, 1985;1989].
Внутриклеточная регистрация клеточного потенциала позволила установить эффективность блокады вызванных потенциалов при низкочастотной стимуляции антагонистами рецепторов neNMDA типа, в то время как О-АР5-чувствительный компонент проявлялся, подобно гиппокампальным проекциям, Кири деполяризации нейрона ниже 50 мВ, либо в среде, обедиен-мой ионами магния.
К Черное вещество. Стимуляция стриатпых нейронов вызывает одновременно появление в клетках черного вещества возбу-Кдающего (ВАКергического) и тормозного (ГАМКергического)
403
потенциалов [Collingridge, Davies, 1981]. Возбуждающий потенциал при регистрации низкочастотного (1—2 Гц) раздражения нечувствителен к действию АР5 и D-2-аминоадипината [Collingridge, Davis, 1989]. Пока не установлена возможность и условия активации NMDA-рецепторных структур, хотя, но всей видимости, механизм их ответа будет соответствовать реакции ВАКергических нейронов других регионов мозга.
Субталамическое ядро. Однократное сверхпороговое раздражение корковых структур приводит к развитию эпилептиформной спайковой активности субталамического ядра. Показана связь этого ответа с активацией рецепторов АМРА (так как ДЭЭГ блокировал эффект), но не NMDA тина [Clements, 1996].
Прилежашее ядро. Большинство исследователей рассматривает данную структуру мозга как лимбико-моторный интерфейс, опосредующий выраженность и направлешюсть поведенческих реакций в зависимости от модальности эмоциональной реакции организма. Показано, что глутаматергическая и дофаминергическая медиаторные системы являются основными в прилежащем ядре. Именно их взаимодействие определяет качественные и количественные характеристики ответа. Предполагается, что прилежащее ядро участвует в интеграции поступающей по глутаматергическим входам информация из гиппокампа (субикулюма) и трансформации ее, после передачи в область субпаллидума, в моторный ответ [Aram, Lodge, 1988]. Таким образом прилежащее ядро выступает в роли стратегического транслятора акцептора действия в поведенческом акте (рис. 72).
Перегородка. Установлено существование прямых глута-мат-ергических проекций в латеральный септум из гиппокампа. Ионофоретическое подведение в эту зону ДЭЭГ (но не D-АР5) приводит к подавлению вызванных ответов. Аналогичные данные были получены при внутриклеточной регистрации потенциала нейронов латерального септума при введении ки-нуреповой кислоты [Stevens, Cotman, 1986], что свидетельствует о преимуществешюм расположении в этой зоне АМРА рецепторов. В целом следует отметить, что представительство различных типов рецепторов ВАК в дздшом регионе мозга мало отличается от их распределения в зоне СА1 гиппокампа, так как обе структуры получают афферентацию с одних и тех же нейронов зоны САЗ .
Ствол мозга. N.cuneatus одним из первых было описано в качестве объекта глутаматергической регуляции. Davies и Watkins [1983], а затем Stone [1979] показали на анестезированных уретаном крысах, что ионофоретическое подведение НА-966 спижа-
404
м
Рис. 72. Взаимодействие глутаматергической и других нейромедиаторных систем в регуляции поведенческого акта. Условные обозначения: CF - фронтальная кора; GP— бледный шар; HIPP—гиппокамп; NA— прилежащее ядро; S —стриатум; AM— миндалина; М—мышца. Медиаторная принадлежность афферентных волокон: глу—глутама-тергичсскис; д—дофаминергические; ацх—холинергические. Объяснения в тексте.
ет возбудимость нейронов этого ядра, вызвашюе стимуляцией восходящих и кортикофугальных афферентных входов. Аналогичные данные были получены при раздражении афферентов ядра тройничного церва (аналог ядер дорсального отдела столба Кларка).
Hill и Salt [1982] показали эффективность подавления ответов различной модальности в этом ядре при аппликации D-2-амипо-адипата. Вестибулярные ядра, взаимодействующие с афферентными волокнами интернейронов контрлатераль-ного лабиринта, входящих в состав VIII пары черепно-мозговых нервов, также находятся под глутаматергическим контролем. Первоначально было показано участие в передаче нервного стимула как NMDA, так и АМРА рецепторов [Jackson et Й1., 1985; Martin, 1985]. Впоследствии, с использованием мето-i Дов внутриклеточной регистрации потенциала Cochran и со-| йвт. [1987], удалось установить наличие раннего (neNMDA Sas' висимого) и позднего (NMDA-зависимого) компонентов отве-[ тов, вызываемых преимущественно с писи- и коптрлатераль-Е 1гых ядер соответственно [Knopfel, 1987].
405
Имеются данные об участии ядра солитарного тракта в регуляции кардиоваскулярной деятельности. Использование техники микроинъекций антагонистов рецепторов ВАК показало возможность подавления барорефлекторных ответов, замыкаемых через это ядро. Так, введение в ядро кинуреновой кислоты и АР5 приводило к развитию брадикардии и гипотензии [Guienet, Flits 1987; Kubo, Kihara, 1988J, что подтверждает участие в этих процессах обоих подтипов глутаматных рецепторов.
Мозжечок.
Большое количество работ посвящено исследованию ВА-Кергической регуляции двигательных и вестибулярных реакций в мозжечке и связанных с ним структурах. Наиболее изученными ВАК-ергическими проекциями являются афференты клеток Пуркинье, к которым относятся параллельные, лазящие и мшистые волокна.
Параллельные волокна обеспечивают основной возбуждающий вход с гранулярных нейронов на клетки Пуркинье. Мцого-числешшми исследованиями было установлено преимущественное участие в нейропередаче рецепторов АМРА типа. На нейрональных срезах и культуре гранулярных клеток мозжечка кролика было показано, что ионофоретическое подведение ДЭЭГ и кинуреновой кислоты, но не АР5, подавляет синаптическую передачу на этом пути [Kano, Kato, 1987; 1988}, в то время как отсутствие в инкубационной среде ионов магния не алияло па выраженность ответа клеток Пуркинье [Hirano, Hagiwara, 1988].
Лазящие волокна представляют собой проекции нейронов нижней оливы на дендриты клеток Пуркинье. На срезах мозжечка морской свинки Kimura и соавт. [1985] показана высокая чувствительность этих путей к ингибирующему действию АР5 и, в значительно меньшей степени, к ДЭЭГ, что свидетельствует о преимущественном участии в синаптической передаче в этом регионе рецепторов NMDA типа.
Мшистые волокна. В отличие от лазящих волокон, шшер-вируемые аксонами мшистых волокон нейроны содержат на постсинаптической мембране преимущественно терминали HeNMDA типа. Исследованиями Garthwaite и соавт. [1986; 1989] показано ингибирующее влияние CNQX на спайковую активность, в то время как D-AP5 был неэффективен на данной модели. Лишь при высокочастотной стимуляции (100 Гц) мшистых волокон в безмагииевой среде установлена возможность активации NMDA-рецепторпого комплекса. Большая плотность
406
NMDA рецепторов установлена на препаратах молодых животных, что подтверждает установленное ранее правило о высокой их значимости в регуляции процессов развития нервной ткани в период раннего онтогенеза.
Гиппокампальная фармация.
В первых работах, посвященных изучению нейрохимической организации гиппокампальной формации (ГФ) височной доли мозга, было установлено наличие неизвестных в то время ципксодержащих синаптосом, идентифицированных позднее как глутамат-ергические. В настоящее время доказано, что более 70 процентов синаптической передачи ГФ находится под контролем ВАК. Данная медиаторная система, благодаря своим уникальным нейрофизиологическим особенностям, определяет ключевую роль гиппокампа в механизмах нейрональной пластичности, фиксации индивидуального опыта, эмоциональной реактивности, судорожной готовности, оценке размерности временной шкалы и т.д. [Balster et al.,1992].
Использование топких нейрофизиологических, гистохимических, радиолигандных методов позволило установить особенности структуры и функции ВАКергических проекций ГФ. Выделяют три основных глутаматергических афферентных входа в ГФ: а) медиальный и латеральный пучки перфорантного пути (эпторинальиая кора—гранулярные клетки зубчатой фасции с минорными проекциями в САЗ и СА1 гиппокампа); б) мшистые волокна (гранулярные клетки зубчатой фасции—проксимальные апикальные дендриты stratum lucidum САЗ пирамидных нейронов); в) коллатерали Шаффера (нейроны САЗ—пирамидные клетки СА1; основные волокна этих нейронов оканчиваются на нейронах идеи- и контралатеральных САЗ зон гиппокампа) [Barrionuevo et al., 1986; Jack et al., 1971; Johnston et aL, 1992].
Оценка распределения подтипов глутаматных рецепторов не выявила существенных различий в их представительстве в различных регионах ГФ. По слоям показано преимущественное расположение рецепторов AMPA/NMDA типа в stratum radiale, в то время как каинатные рецепторы находятся в основном в молекулярном слое зубчатой извилины и stratum lu-cidum зоны САЗ гиппокампа [Lee, Choi 1992]. В ряде работ было показано, что локализация обоих подтипов рецепторов является необходимым условием поддержания нормального функционального состояния нервных клеток [Jay et al., 1992; Crunelly V. et al., 1982].
407
Рецепторный ансамбль, представленный NMDA, АМРА и, в меньшей степени, метаботропными рецепторами является, по-сути, единым функционально связанным надрецепторным комплексом, определяющим не только качественные, но и количественные градации ответа нейрона па поступающую информацию. Наличие подобной функциональной связи не является уникальным и применимо к другим медиаторным системам мозга, однако, для ВАК- ергических нейронов оно намного более значимо, ибо определяет их ключевую роль в процессах обработки и фиксации сенсорных сигналов любой модальности и знака, в особенности па уровне гиппокампальной формации и надме-зеицефальных структур.
Неокортекс.
Большое количество работ посвящено изучению роли глута-мат-ергических нейронов в осуществлении высших интегративных функций новой коры. Проведенные исследования позволяют говорить о широком представительстве в этой области мозга ВАКергических нейронов, осуществляющих путем сложного иерархического взаимодействия афферентных, кортикофугальных и вцутрикорковых проекций процессы переработки и сохранения поступающей информации. Общие принципы синаптической организации ВАКергической нейропередачи в неокортексе и гиппокампе весьма похожи. Однако функциональное значение взаимодействия нейрональных ансамблей, ввиду их многообразия, морфологической и функциональной полиморфпости, до настоящего времени остается малоизученным. Поэтому мы уделим основное внимание изложению накопленного фактического материала, позволяющего составить общее впечатление о состоянии проблемы.
Обонятельная зона. Детальный анализ результатов нейрофизиологических исследований по качественному и количественному изучению ответов ВАК-чувствительпых нейронов обонятельной коры проводится в обзоре [Collins et al., 1982]. Сообщается, что подобно гиппокампальным нейронам, низкочастотная электрическая стимуляция латерального обонятельного тракта приводит к АМРА-зависнмой активации ответов клеток коры, в то время как NMDA-зависимые ответы проявляются лишь при высокочастотной стимуляции или при добавлении в среду пикротоксина. Предполагается, что нейроны фазического типа (с регулярной снайковой активностью) определяют функционирование клеток в нормальных условиях, в то время
408
как тетаническая импульсация или блокада ингибиторных влияний приводит к переходу клеток в эпилептиформное состояние, характеризующееся нерегулярной пачечной (взрывной) активностью и опосредуемое активацией рецепторов NMDA типа. Установлена возможность регуляции афферентного потока через нресинаптическое звено [Hearn et al., 1986; Hori et al., 1991]. Предполагается наличие на пресинаптической мембране аксонов латерального обонятельного тракта NMDA, каинатных, L-AP4, по не квисквалатных рецепторов.
Пиигулярная и сенсомоторная зона. В работе Stone и соавт. [1979] приводятся убедительные доказательства участия ВАКергических терминалей в процессах возбуждения эффекторных нейронов конвекситальной коры при раздражении афферентов пирамидного тракта.
Аналогичные данные были получены при активации таламокортикальных проекций в сенсомоторную кору [Addae, Stone,1987]. В работах на коронарных срезах мозга Thompson и колл. [1985;1986] удалось установить рецепторную принадлежность вызываемых во II —III корковых слоях разрядов. Аналогичные данные были получены в работе [Лебедев,1986] на нейронах V слоя. Авторами работ было доказано существование па пирамидных клетках обоих подтипов глутаматных рецепторов, однако длинный латентный период АР5-чувстви-тельпого ответа свидетельствует о его полисипаптической при-. роде и проявляется, но всей видимости, при активации глутама-терги чески х внутрикорковых интернейронов IV слоя коры ; JfSutor, Hablitz, 1989], в то время как коротколатентные ответы I АМРА рецепторов являются результатом прямой активации i Афферентных волокон.
/ Изучение роли NMDA-рецеиции в передаче сенсорной ип-' формации, проведенное Artola и Singer [1987] путем внутрикле-i^Очной регистрации потенциалов нейрона, позволило установить, что NMDA рецепторы лишь в незначительной степени оп-.ределяют выраженность ВПСП (в режиме регулярной снайко-Вой активности). Однако в клетках с характерными для эпилептиформных разрядов пачечными ответами этот тип рецепторов Превалировал. В этой связи следует отметить, что, подобно дру-ЧВИм регионам мозга, в соматосенсорной коре существует частотами! зависимость рецепторного ответа и возможность перехода цри тетанической стимуляции клеток фазического тина в со-'ОТояпие эпилептиформной активности [Aram, Lodge 1988; 1989].
409
Кора
Компактная Ретикулярная
зона зона
Рис. 73. Схема взаимодействия медиаторных систем в хвостатом ядре и черном веществе. Стимуляция ДА рецепторов полосатого тела из окончаний ДАергического нейрона (А), локализованного в компактной зоне черного вещества, ингибирует ГАМКсргическнй пейроп (В), посылающий аксоны ретикулярной зоне черного вещества. Нейрон В активируется глутаматом, идущим из нейрона Г коры мозга, так что стимуляция ДАергических рецепторов полосатого тела ведет к усилению обмена ГАМК в черном веществе. Нейроп В ингибирует холин-ергнческис вставочные нейроны Д. Ингибирование за счет активации ГАМКергической системы в ретикулярной зоне черного вещества (Е) воспроизводит эффект стимуляции ДА рецепторов в полосатом теле (Раевский, Георгиев, 1986).
Зрительная зона. Hicks et al. [1981] показали существование в сунрасильвиевой зрительной зоне (Clare-Bishop) глутаматчувствительных нейронов. Ионофоретическое подведение АР5 при локальном раздражении аналогичной зоны мозга противоположного полушария приводило к подавлению вызвац-
410
пых ответов. В наибольшей степени чувствительными к действию NMDA антагонистов были клетки IVa и верхней части VI слоев коры [Tsumoto et al., 1986]. Следует отметить установленный в экспериментах факт синергичного подавления ответов при аппликации АР5 и атропина, что свидетельствует о существенной роли взаимодействия ВАК и холинергической систем в восприятии зрительной информации.
Энторииальная зона. Имеются данные о регистрации вызванной спайковой активности в IV/V слоях энторинальной коры при активации субикулюма в комбинированных срезах коры и гиппокампа [Jones, 1995]. Ответы носили характер медленных, усиливались в среде, обедненной ионами магния, в значительной степени подавлялись в присутствии АР5, что свидетельствует о связи их с активацией NMDA рецепторов. Длительная тетаническая стимуляция приводила к переходу ВПСП к отчетливо выраженной эпилептиформной активности [Walther et al., 1986].
9.8. Взаимодействие ВАКергической и других медиаторных систем
Взаимодействие различных медиаторных систем определяет функционированье центральной нервной системы как единого целого. Этот раздел нейрофизиологии — один из наиболее сложных и малоразработанных. Не претендуя на полный охват накопленного за последние годы экспериментального материала, в настоящей главе остановим свое внимание на некоторых, па наш взгляд, наиболее важных и интересных аспектах, позволяющих глубже понять роль ВАКергической медиаторной системы в ЦНС.
9.8.1. Дофаминергическая система.
Большое число работ посвящено исследованию взаимодействия дофаминергической и ВАКергической систем в стриатуме и функционально сопряженных с ним структурах.
Существуют два основных афферентных входа в стриатум: цигростриатный, имеющий дофаминергическую природу, и кор-тикостриатпый, представленный аксонами ВАКергических нейронов коры (рис. 73). Установлено, что локальное введение ДА и его агонистов приводит к подавлению К+ индуцированного
411
выброса глутамата па срезах стриатума [Mitchell,Dogget, 1980], высокоаффинпого обратного захвата медиатора [Nieoullon et al.,1982] и выброса его из стриатиых сипаптосом [Dodhukin et al.,1984].
Предполагается существование нескольких путей модуляции выброса медиатора из ВАКергических терминалей дофамином. По мнению одних авторов, основную роль играют D2 гетерорецепторы, расположенные на пресипантйческой мембранекортикостриатиых аксонов [Kerkerian,Nieoullon, 1988; Filloux et al.,1988]. По мнению других, взаимодействие осуществляется при участии интериейрональпых ГАМК- и, возможно, серотонинергических цепей [Westerink et al., 1992]. В свою очередь, глутаминовая кислота также является активным стимулятором выброса дофамина из сипаптосом стриатума.
В исследованиях с использованием микродиализиой техники было показано активирующее влияние глутамата и его аналогов па выброс дофамина в стриатуме, сочетающееся с увеличением спайковой активности дофаминергических нейронов ядер среднего мозга [Svensson et al., 1992]. Так, введение агонистов рецепторов ВАК (NMDA, АМРА, каинат) в микродиализные канюли в стриатуме и черной субсталции приводит к увеличению выброса дофамина. Наиболее эффективными на данной модели оказались каинат и АМРА [Westerink et al., 1992].
Анализ получешпях данных позволил предположить существование двух механизмов регуляции выброса дофамина: как нресипапти веского (ТТХ-зависимого и не зависящего от разрушения нейронов иботеиовой кислотой; более характерного для каината), так и ностсипаптического (низкие дозы веществ, увеличение внутриклеточного содержания кальция). Некоторые авторы высказывают предположение об осуществлении глу-таматергическоЙ системой фазического (стимулирующего) и топического (ингибирующего) влияния на выброс медиатора [Svensson et al., 1992]. Аналогичные результаты были получены Youngren н соавт. [1993] на нейронах прилежащего ядра, относимого, но мнению многих авторов, к структурам переднего стриатума. Показана дозозависимая активация выброса ДА в прилежащем ядре при введении аспартата и, в меньшей степени, глутамата. Установленное подавление эффекта под действием ТТХ свидетельствует о непрямой регуляции ответа эффекторных дофаминергических нейронов, осуществляемое либо через нресипантическое звепо, либо через систему вставочных интернейронов.
412
Изучению функционального взаимодействия между ВАКергической и дофаминергической системами в стриатуме посвящена работа Amalric et al. (1994). При изучении модуляции дофамином синаптической передачи в префронтальной коре было показано, что дофамин отчетливо снижает все компоненты синаптического ответа, вызванного электрической стимуляцией I и VI слоев. Особенно это относится к моносииаптиче-скому ВПСП, возникающему в результате активации ВАКергических рецепторов. При этом дофамин одинаково уменьшает как NMDA, так и АМРА компоненты моносипаптическо-го ВПСП. Ингибирующий эффект дофамина на ВАКергиче-скую передачу частично воспроизводится только агонистом D] рецепторов SKF 38393, по не агонистом D2 рецепторов квинпи-ролом. Соответственно, этот эффект дофамина снимается введением блокатора D, рецепторов SCH 23390, во пе сульпиридом, антагонистом D, рецепторов. Следовательно, ослабление ВАКергической передачи под действием дофамина связано с активацией рецепторов D, типа [Law-Tho D. et al., 1994].
При изучении влияния антагонистов АМРА/каинатных рецепторов — DNQX и GAMS па выраженность действия амфетамина, стимулирующего моторную активность, было показано, что увеличение двигательной активности, вызванное активацией дофаминовых рецепторов в прилежащем ядре и вентральном паллидуме, усиливается при стимуляции глутаматергических афферентов пеокортекса и лимбических структур. Инъекции DNQX и GAMS в прилежащее ядро блокируют эффект амфетамина (Willins et al., 1992].
Выявлено синергичное действие дизоцилпипа и смешанного D,/D2 агониста аиоморфипа при введении последнего в субпороговых дозах [Svensson et al., 1992].
Классической моделью но изучению механизмов дофаминовой регуляции в базальных ганглиях является болезнь Паркинсона. Известно, что дофамин оказывает модулирующее влияние ца выброс ацетилхолина па шиииковых нейронах хвостатого ядра, образующих основной выход па нейроны паллидума. Показано, что стимуляция D2 рецепторов этих клеток приводит к прямой активации выброса ацетилхолина, в то время как как активация D, рецепторов ведет к непрямому облегчению выброса медиатора, действуя транссипаптически. Дефицит выброса дофамина приводит к усилению топической активности холинергических проекций и развитию дефицитарных моторных расстройств. В исследованиях Le Moine и соавт. [1991] нреднола-
413
гается возможность регуляции выброса дофамина посредством активации кортикостриатных глутаматергических проекций. Из* вестпы данные, свидетельствующие о тоническом влиянии глу-таматергической системы на дофаминергические нейроны [Di Chiara, Morelli, 1993; Morelli et al., 1992].
Неполное соответствие дофаминовой теории шизофрении и терапии ее нейролептиками привело к мысли об участии в развитии данного психического расстройства и других медиаторных систем.
Широкое использование в клинике атипичных нейролептиков позволило по-иному взглянуть па механизмы развития и лекарственной коррекции психотических состояний [Bardgett et al., 1993]. Как известно, разделение нейролептиков па типичные и атипичные основало на их способности вызывать нарушения двигательной сферы, характерные для иаркипсонических расстройств. Антипсихотический эффект типичных нейролептиков связан с блокадой мезолимбических D2 ауторецепторов, в то время как их неврологические побочные эффекты вызваны блокадой иигростриатиых D2 рецепторных структур [Seeman, 1980]. Атипичные нейролептики, у которых отсутствует негативная неврологическая симптоматика, осуществляют свое действие через преимущественный антагонизм с D2 рецепторами мезолимбического отдела мозга и/или через другие механизмы (серотониновый) [Meltzer, 1990]. В совремешюй литературе имеются лишь единичные наблюдения о влиянии типичных и атипичных нейролептиков па ВАКергическую нейропередачу в ме-золимбическом и пигростриатном регионах.
Результаты исследований влияния атипичных нейролептиков: клозапина (смешанный D2/5-HT, антагонист), (-)-З-РРР (частичный D2 агонист), L-сульпирида (смешанный D2/D3 антагонист) и галоперидола па выброс глутамата в мезолимбиче-ском (прилежащее ядро) и икгростриатпом регионах позволили установить, что при однократном введении атипичные нейролептики снижают уровень глутамата в прилежащем ядре на 18—42%, в то время как галоперидол не оказывает выраженного эффекта. Среди вероятных механизмов предполагается существование прямой модуляции NMDA рецепторов клозапином [Freed et al., 1993]. Другой возможный путь—блокирование клозапином 5НТ2 рецепторов. Представленные результаты позволяют предположить возможное участие ВАКергической системы мозга в реализации эффектов этих препаратов. Снижение под влиянием атипичных нейролептиков уровня глутамата в
414
В. Е.
Рис. 74. Схема, иллюстрирующая гипотезу о взаимодействии глутамат- и дофаминергических волокон па нейронах стриатума.
А. В нормальных условиях дендриты стрио-ннгралъных проекций получают дофаминергические проекции из черной субстанции, а глутаматергичсскис входы из коры большого мозга соответственно. Дофаминергические афференты локализуются преимущественно на шейке дендритного шнлика, в то время как глутаматергичсскис на его головке. Б. При однократном назначении нейролептиков подавляется активность ДА рецепторов, что при сохранении активности глутаматср-гичсского входа приводит к возбуждению клетки. В. При длительном назначении нейролептиков наблюдается увеличение количества ДА рецепторов при компенсаторном снижении ВЛКрсиспторов, что возвращает к равновесию. Г. Разрушение черного вещества приводит к аналогичным с «Д» изменениям, однако более выраженным и необратимым. Д. Перерезка глутаматсргнчсского входа приводит к кратковременной депрессии мембранного потенциала. Е. В дальнейшем происходит нормализация клеточного потенциала.
Условные обозначения: квадрат—дофаминовый рецептор, треугольник— глутаматный рецептор; «+» — возбуждение, < ► —торможение; влияние антагониста рецепторов дофамина обозначено прерывистой линией (Freed, (986).
415
прилежащем ядре может объяснять их эффективность у рефрактерных к терапии больных, а неспособность атипичных нейролептиков увеличивать уровень глутамата в стриатуме помогает объяснить отсутствие у них острых экстрапирамид пых побочных расстройств, характерных для типичных нейролептиков.
В исследованиях, посвященных анализу роли подтипов дофаминовых рецепторов, показано, что локомоторная стимуляция D1 агонистом SKF 38393 на фоне опустошения депо моно-аминов потенцировалась введением дизоцилнина, в то время как эффекты D2 агонистов—квиппирола и бромкринтина снижались при его введении. Эффект SKF 38393 блокировался D( антагонистом SCH 23390, а эффект квиппирола блокировался D2 ацта-гонистами раклоиридом и галоперидолом, что подтверждает специфичность механизмов их действия [Freed,1989]. Приведенные результаты согласуются с данными, полученными Goodwin и соавт. [1989] на той же модели и Morelli and Di Chiara [1990] на модели с введением 6-гидроксидофамина. В работе Svensson et al. [1992] показало, что у мышей с опустошенными депо локальное введение D-AP5 в прилежащее ядро приводит к коитр-латеральным вращениям при системном введении SKF 38393 и ипсилатеральным вращениям при введении квиппирола.
В работе Freed [1989] излагается гипотеза о взаимодействии дофамин- и ВАКергической модуляции холинергических нейронов стриатума при развитии психоза и его купировании. По мнению авторов, механизм развития психоза очень близок к проявлениям гиперподвижпости, вызванных стимуляцией ДА рецепторов. Предполагается, что избыточное выделение ДА, приводящее к подавлению активности холинергических нейронов хвостатого ядра, вызывает активацию эффекторных нейронов бледного шара и соответствующие двигательные и психотические реакции.
Структура психотической реакции и ее механизм, несомненно, сложнее простого межмедиаторного взаимодействия на уровне стриатума, однако это звено является одним из главных. Окончательное оформление эмоциональной реакции в психотическую происходит, видимо, в сенсомоторных зонах коры. Однако для ее реализации требуется ослабление коркового контроля над структурами стриатума, что и наблюдается при психозе. Гипотеза автора состоит из следующих постулатов: 1) кортико-стриат-пые ВАКергические афференты принимают участие в развитии
416
'психоза; 2) однократное введение нейролептиков приводит к блокаде дофаминовых рецепторов и вызывает седацию без су-лцественного антипсихотического действия; 3) длительное па-;Ш1ачепие нейролептиков приводит к увеличению чувствительности и числа рецепторов дофамина и снижению седативного компонента нейролептиков; 4) длительное применение нейролептиков снижает чувствительность и число рецепторов ВАК. Имешю это, по мнению авторов, и вызывает снижение аффек-Живности терапии при хроническом их введешш (рис. 74).
Экспериментальным обоснованием представленной гипотезы йогут служить следующие наблюдения: введение в стриатум 6-фидроксидофамина приводит к уменьшению количества рецеп-'^оров ВАК па 40% [Bouyer et al., 1984]; декортикация снижает ‘Связывание меченого галоперидола в стриатуме на 40 — 50% ISchwarcz et al.,1978]. В работах [Hattori,Fibiger, 1982; Pature et al., 1987] приводятся данные о подавлении двигательной активности животных при локальной аппликации в стриатум ДЭЭГ и квисквалата— введение этих веществ па фоне хронического введения галоперидола устраняет седативное действие, что Свидетельствует о вызванном галоперидолом снижении чувствительности рецепторов ВАК. Имеются также постмортальные наблюдения о снижении числа АМРА рецепторов у больных шизофренией при длительном применении нейролептиков [Kerwin et а)., 1988].
Из этой гипотезы следует, что возможна коррекция психозов с помощью ВАКергических средств. При этом однократное назначение антагонистов рецепторов ВАК, особенно па фоне Нейролептика, приведет к усилению психоза, однократное назначение агониста ВАК снизит психотическую реакцию, а длительное назначение антагониста рецепторов ВАК приведет к повышению их чувствительности и развитию антипсихотических эффектов.
Однако ла основании представленных данных пока сложно делать далеко идущие выводы. Подобные взаимоотношения дофаминергической и ВАКергической систем характерны для структур с высокой плотностью как дофаминовых рецепторов, так и рецепторов ВАК (стриатум, прилежащее ядро), в то время как во многих нейрональных образованиях (гиппокамп, ио-. пая кора) подобного соответствия пе установлено. Поэтому последствия системного использования ВАКергических средств до конца пе ясны и требуют дальнейших исследований.
; 1T.3k.22T 417
9.8.2. ГАМКергическая система
При исследовании влияния антагонистов NMDA рецепторов на базальный уровень внеклеточной концентрации ГАМК в стриатуме и его изменение под влиянием высокой концентрации ионов калия было установлено, что фенциклидин и МК-801 ингибируют К*-индуцироваш1ый выброс ГАМК, но пе влияют на ее базальный уровень. Этот аффект антагонистов снимается самой NMDA (Hondo et al., 1995].
На изолированных нейронах гиннокамна было показано, что NMDA подавляет токи, вызванные активацией ГАМКЛ рецепторов, причем это действие NMDA связано с Са2+-зависимыми процессами фосфорилирования [Chen, Wong, 1995].
Введение бикукуллина, антагониста ГАМКа рецепторов, в дорсомедиальные ядра гипоталамуса крыс вызывает тахикардию, ассоциированную с защитной реакцией. Считается, что этот эффект связан с активацией ГАМКергических интернейронов в ядра солитарного тракта. Блокирование действия бикукуллина как антагонистом NMDA рецепторов МК-801, так и антагонистом neNMDA рецепторов CNQX указывает, что выброс ГАМК вызван действием глутамата на ионотропные рецепторы ВАК, расположенные на ГАМКергических интернейронах [Kunos, Varga, 1995].
При изучении участия метаботропного рецептора mGIuR2 в синаптической передаче между митральными и гранулярными клетками зрительного бугра было показано, что его активация в гранулярных клетках приводит к уменьшению ГАМК-стимулироваииых ингибиторных постсипаптнческих токов в митральных клетках, то есть ослабляет ГАМКергическую передачу импульса между этими двумя типами клеток. Авторы считают, что это взаимовлияние двух медиаторных систем является важным фактором в поддержании отношения сигпал-шум, что и позволяет выделять и разделять различные обонятельные стимулы [Hayashi et al., 1993].
9-8.3.Опиатергическая система
В ряде исследований было показано, что активация ц-опиат-ных рецепторов приводит к ослаблению эффектов ВАК. Так, ц-опиатиый агонист DAMCO уменьшал возбуждение спинальных нейронов I —IV слоев задних рогов. При этом в большей степени ингибировалось действие NMDA, нежели АМРА [Lei, Wilcox 1990]. Морфии оказывал антагонистическое действие на нейрональное возбуждение нейронов V слоя заднего рога
418
Спинного мозга, вызванное локальной аппликацией глутамата 1 [Zieglgansberger, Satoh, 1975; Dostrovsky, Pomeranz, 1976; Belcher, Ryall, 1978]. Эффект морфина был налоксон-чувствительным, ! .Что свидетельствует об участии опиатных рецепторов. При со-; Метанном иптратекальном введении антагонисты ВАК оказывают потенцирующее действие па морфиновую анальгезию [Chapman, Dickenson, 1992а]. Возможно, что опиаты и ВАК взаимодействуют через системы вторичных мессенджеров, которыми могут быть ионы кальция, фосфоинозитиды или циклические нуклеотиды [Levy et al., 1981]. Однако трансмембранный потенциал, вызванный NMDA, не блокируется морфином [Riveros, Orrego, 1986].
Спинальное гипоальгетическое действие антагонистов ВАК также ослабляется при одновременном их введении с опиатными антагонистами [Nasstrom et al., 1993]. Существует корреляция между морфин-индуцированной активацией нисходящих ингибиторных влияний и способностью морфина при внутрижелудочковом введении ослаблять ноцицептивное действие агонистов ВАК, введенных иптратекальпо [DeLander, Wahl, 1989, ! 1991; Jensen, Yaksh, 1989]. Поэтому можно предположить, что ВАКергическая система модулирует спинальное действие морфина за счет взаимодействия с нисходящими ингибиторными ВЛИЯНИЯМИ.
Взаимодействие ВАКергической и оииатергической систем Изучено и на сунраспинальном уровне при исследовании роли ВАКергической системы в эндогенных механизмах болевой регуляции. На основании экспериментальных данных была предложена схема взаимодействия этих двух систем в центральном 'Околоводопроводном веществе (ЦОВ). Согласно этой схеме, стимуляция опиатных рецепторов в этой области усиливает возбуждающие влияния на большое ядро щва (БЯШ) через Тормозные ГАМКергические нейроны и, следовательно, приводит к повышению болевых порогов. Стимуляция NMDA рецепторов оказывает аналогичное действие. Поэтому предпола-[гается, что эффекты стимуляции опиатных и NMDA рецепто-1ров конвергируют на общие ВАКергические нейроны, проецирующиеся в БЯШ [Jacquet, 1988].
< Еще одним примером взаимодействия ВАКергической и опиа-Т-ерги ческой систем может служить экспериментально установленный факт блокады развития морфиновой толерантности антагонистами рецепторов NMDA [Беспалов и др., 1994; Marek
etal., 1991a, 1991b; Trujillo, Akil, 1991], ингибирование развития сенситизации к кокаину и амфетамину [Karler etal., 1989; Schenk et al., 1993]. Блокировать развитие толерантности к морфину может также и антагонист глицин-связывающего сайта NMDA рецепторов АСЕА-1328 (1,4-дигидро-6,7-диметил-5-иитрохи-иоксалин-2,3-дион) [Lutfy et al., 1995]. Развитие зависимости к морфину ингибируют также антагонисты метаботропных рецепторов ВАК [Fundytus, Coderre, 1994]. О связи опиатной и ВАКергических систем см. также [Xie, Lewis, 1995].
Взаимодействие ВАКергической системы и этанола.
В культуре клеток этанол селективно ингибирует действие NMDA рецепторов, причем эффект обращается высокими дозами глицина. Эго действие этанола связано с тем, что оп уменьшает частоту открытия ионного капала [Weight et al., 1993]. После хронического приема алкоголя у животных во многих областях мозга возрастает количество NMDA рецепторов. В отличие от этанола, барбитураты сильнее ингибируют каинатные рецепторы [Hoffman, Tabakoff, 1993]. В нескольких системах in vitro было показано, что этанол проявляет свойства антагониста NMDA рецепторов [Balster et al., 1992]. При этом, как и большинство антагонистов рецепторов ВАК, он снижает нейротоксическое действие различных ВАК [Lustig et al., 1992]. В то же время судороги, возникающие при отмене этанола, блокируются такими NMDA антагонистами, как СРР и МК-801 [Riaz, Faingold, 1994]. Недавно были опубликованы данные, указывающие па то, что ингибирование этанолом NMDA рецепторов включает в себя глицин-чувствительный и глицин-нечувствительпый компоненты, что позволяет предполагать два различных молекулярных механизма данного процесса [Buller et al., 1995].
Изучение действия этанола и других спиртов па NMDA рецепторы позволило даже сделать определенные выводы о третичной структуре NMDA-реценториого белка. Хорошо известно, что при увеличении числа атомов углерода (п) в алифатических нормальных спиртах от 1 до 5 экспоненциально возрастает их токсичность, растворимость в липидах и способность нарушать структуру липидных мембран. Однако если токсичность достигает максимума при длине цепочки от 6 до 8 атомов, а затем резко падает («эффект прерывания», «cut off effect»), два других параметра продолжают увеличиваться симбапю с увеличе-
420
днем длины углеродной цепи. Для объяснения этого эффекта было исследовано влияние алифатических спиртов с различной длиной углеродной цепи на NMDA рецепторы, так как ранее было показано, что ингибирование этих рецепторов играет важную роль в развитии алкогольной интоксикации. Оказалось, что Ьпособпость к ингибированию экспоненциально возрастает в серии спиртов от метилового до пентилового (п=1—5), достигает Максимума при п=6—8, а затем резко падает. В случае neNMDA рецепторов ингибирующую активность, пропорциональную их гидрофобности, проявляют все первичные спирты до гептилового, а октиловый и нониловый спирты не активны [Akinsola et al.t 1995]. Этот «эффект прерывания» ингибирования спиртами NMDA рецепторов объясняется, по мнению авторов, существованием в рецепторном белке гидрофобного кармана, в котором могут помещаться молекулы только определенного размера [Peoples, Weight, 1995]. Так как наличие подобных гидрофобных областей в рецепторных белках, способных связывать первичные спирты, установлено и для некоторых других типов ио-Йотроппых рецепторов нейромедиаторов, исследования с исноль-зЬванием химерных молекул, содержащих N-концевой участок никотинового холинорецептора и С-коицевой фрагмент 5-НТ рецептора, дозволили локализовать участок связывания этанола Па N-концевом участке [Weight et al., 1996].
* ★ ♦
Накопленный экспериментальный материал позволяет говорить об участии ВАКергических структур в регуляции важнейших физиологических и патофизиологических процессов мозга. Несомненно, что в предстоящие годы будет сделано немало в плане более глубокого понимания механизмов регуляции важнейших психических функций, протекающих при участии ВАКергической медиаторной системы.
9.9. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Итак, ВАКергическая система является основной в передаче возбуждающего потенциала в ЦНС млекопитающих. Поэтому не удивительно, что рецепторы ВАК представлены во всех отделах ЦНС. Особенно высока их плотность во фронтальной коре, гиппокампе, прилежащем ядре и стриатуме. Количество рецепторных участков связывания L-глутамата в структурах мозга уменьшается в ряду: лобная кора> теменная кора>заты-лочная кора>полосатое тело> ги1шокамн> средний мозг> гипоталамус мозжечок> продолговатый мозг, что свидетельствует об их важной роли в интегративной деятельности мозга.
Нейромедиаторная система ВАК, подобно другим системам, представляет собой совокупность различных типов рецепторов, отличающихся друг от друга строением (канальные ионотропные или связанные с G-белком), распределением в ЦНС и функциональной значимостью.
Среди ионотропных рецепторов но названиям основных селективных лигандов выделяют 4 типа: NMDA, АМРА, каинатный и L-AP4. Группа метаботропных рецепторов более ге-терогенна и состоит из 7 типов, разделяемых на более мелкие специфичные по тину лиганда популяции.
Наиболее подробно изучено семейство ионотропных рецепторов NMDA типа. Установлено, что NMDA рецептор представляет собой сложное надмолекулярное образование, включающее в себя несколько сайтов регуляции: специфического связывания медиатора (L-глутаминовой кислоты), специфического связывания коагописта (глицина) и аллостерические модуляторные сайты, расположенные как на мембране (нолиами-новый), так и в иошюм канале, сопряженном с рецептором (сайты связывания двухвалентных катионов и «фенциклидиновый» — участок связывания неконкурентных антагонистов). Сложность организации рецептора определяет его роль в нейрохимической регуляции активности нейрона. Доказана ключевая роль этих рецепторов в формировании длительного возбуждающего постсипаптического потенциала, участвующего в пластической перестройке нейрона, процессах обучения, формировании судорожного порога, проведении болевого раздражения, токсической и инволюционной гибели нервной ткани.
Рецепторы АМРА тина относятся к нотенциал-пезависимо-му типу, имеют более простую структуру и проницаемы только
422
для одновалентных ионов. Предполагается их участие в фаз-ijroii регуляции нейрональной активности. Как и для NMDA [ рецепторов, показана гетерогенность популяции АМРА рецен-|торов в ЦНС млекопитающих.
Сведения о физиологической роли каинатных рецепторов как на субклеточном, так и на системном уровнях крайне немногочисленны.
Метаботропные рецепторы ВАК имеют семь трансмембранных сегментов, похожих на такие же структуры у других рецепторов, связанных с G-белками. Основная их функция — регуляция внутриклеточной активности посредством метаболической активации энергетического и пластического обмена. Связь С канальными белками происходит опосредованно через систе-Йу внутриклеточных мессенджеров.
Интенсивный поиск среди биологически активных лигандов ВАК фармакологически активных веществ уже привел к созданию таких препаратов как мемантин, ремацемид, декстрометорфан, фелбамат и некоторых других.
Глава 10
ПУРИНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ
Сравнительно давно стало известно, что аденозин обладает сердечно-сосудистыми эффектами, проявляющимися вазодилатацией и отрицательным инотропным, хронотропным и дромотршшым влиянием па сердце [Drury A.,Szent-Gyorgyi А., 1929; Berne R.M., 1963]. Хотя еще в 1954 г. F.A.Holton и P.Holton предположили о возможности выполнения АТФ нейромедиаторной функции, лишь в 70-х годах в результате работ G.Burnstockn соавт. экспериментально было установлено существование нурипергпческих нейронов, выделяющих пурины. Реализация физиологической активности пуринов опосредована рецепторами, расположенными на иосг-синантическнх мембранах нейрональных или эффекторных клеток [Burnstock G.,1972,1975,1978]. В дальнейшем существование этих рецепторов, называемых пуриновыми или аденозниовыми, было подтверждено многими исследователями [Burnstock G. et al., 1979; Cocks T.,Burnstock G.,1979; Cooper D.M. et al.,1980; Burnstock G., Broun C.M., 1981; Evans D.B., Schenden J.A., 1982].
Были получены сведения, касающиеся фармакологических п биохимических свойств пуриновых рецепторов в опосредовании физиологической активности некоторых групп ЛВ.
10.1. Лиганды пуриновых рецепторов
Современная классификация пуриновых рецепторов основана па различной чувствительности тех нлп иных рецепторов к аденозину и его аналогам. Химическая структура наиболее часто используемых лигандов пуриновых рецепторов при проведении фармакологического анализа представлена ниже.
424
СН2
Au 1.3*Д>1ЭТгп-0*феиилнс1нтнн
ин3 (ДФН)
Отметим, что аденозин и его производные ЦГА и ФИА обладают агонистическими, а метнлксаитнпы кофеин и ДФК — антагонистическими свойствами по отношению к пуриновым рецепторам.
10.2. Классификация пуриновых рецепторов.
Как уже указывалось, пуриновые рецепторы (их называют также аденозиловыми рецепторами) разделяют по их чувствительности к различным агонистам и антагонистам. Кроме того, в процессе изучения их функционирования обнаружилась необходимость разделить пуриновые рецепторы в зависимости от характера нх сопряжения с адепилатциклазой.
425
C.Londos nJ. Wolf (1977) обратили внимание па тот факт, что в одних тканях аденозин увеличивает, а в других снижает уровень цАМФ. Исследуя ряд аналогов аденозина, эти авторы пришли к выводу, что существуют но крайней мере два типа пуриновых рецепторов с различной структурной специфичностью. Они постулировали, что R-реценторы опосредуют увеличение активности аденилатциклазы и избирательно связывают лиганды с интактной рибозой, а Р-реценторы опосредуют снижение активности адепплат-циклазы; сродство лигандов к ним мало зависит от структуры рибозной части, по сильно уменьшается при модификации пуринового кольца. Было также выявлено, что Р-рецепторы чувствительны только к тем веществам, которые обладают способностью проникать в цитоплазму (возможно, это обусловливает их нечувствительность к метилксаптииам).
По классификации,предложенной G.Bumstock (1979).пуриновые рецепторы делятся па Р( и Р2. Р] -рецепторы чувствительнее к аденозину, чем к его фосфорилированным аналогам (наименее чувствительны к АТФ), и блокируются мегилксаигинами, а Р2-рецеито-ры более чувствительны к АТФ, чем к аденозину, и не блокируются кофеином л теофиллином.
Дальнейшие исследования, проведенные D.Van Calcer н соавт. (1979), показали, что существуют подтипы R-рецепторов в культуре клеток головного мозга: 1) А -рецепторы преимущественно стимулируются №-фепилцзонро11иладепозилом и вызывают снижение уровня цАМФ; 2) А2-рецепторы преимущественно возбуждаются аденозином ц опосредуют увеличение уровня цАМФ. Оба подтипа блокируются метилксантпиами. C.Londos и соавт. (1980) также выявили гетерогенность R-реценторов и разделили их па Ra и Rr R-Рецепторы онос])еду-ют ппгибирова1ше накопления цАМФ в адипоцитах, вызываемое фепилизопропиладепозипом>адепозипом, а Иа-реценторы опосредуют активацию аденилатциклазы в интерстициальных эндокршюцитах (клетки Лейдига) п гепатоцитах, вызываемую аденозппом>фенилизопроннладецознпом. Кроме того, 5'-N-этн л карбоксамид аденозин сильнее активирует Ra, чем R-pe-центоры. R-Рецепторы расположены с внешней стороны плазматической мембраны.
Различные виды пуриновых рецепторов представлены в табл. 19.
Некоторые авторы [Stone T.W., 1981, 1982] считают, что А,- и А2-рецецторы но классификации, предложенной D.Van Calker и соавт. (1979), представляют собой подтипы R-рецепторов, а
426
Классификация пуриновых рецепторов
Таблица 19.
РсИеПТОрЫ Агонисты Антагонисты Функции
р, Адснознн>АТФ Мстнлксантнны Обычно увеличение уровня 11АМФ
р= АТФ>аденозин Хкнпдпн Ингибирование накопления цАМФ
А, ФИА>аденознн Метил ксантины У величенис уровня цАМФ
А, Адсноз! । н> Ф И А Ингибирование накопления цАМФ
р 2‘,5'*Д||дсзокс11адсно- Устойчивые к
R 3|П1 м стнлксантн нам
5М-мстилкарбоксач1шадс- Мстнлксантииы Накопление цАМФ
воин н>адсн™ 111 |>ФИ А Ингибирование
R. Ф И А>ада 1031 к i>5N-3n lt-карбоксая 11 дадснози, i накопления цАМФ
А^-рецепторы, по данным D.Van Calker и соавт. (1979), идентичны ₽!-рецепторам [Burnstock G.,1978]. В таком случае классификация пуриновых рецеигоров, иредставлешт в табл. 19, может быть упрощена (табл. 20).
Кроме того, M.Shuba и A.Vladimirova (1980) в желудке выявили аиамничувствительиые и аиамипрезистентиые пуриновые рецепторы, опосредующие релаксирующий и сократительный эффект АТФ соответственно, ио как эти рецепторы соотносятся с типами пуриновых рецепторов, представленных в табл. 19 и 20, неизвестно.
Таблица 20
“Упрощенная” классификация пуриновых рецепторов
TllllJiypilllOBblX рецепторов Эквиваленты Авторы
Л 501313 f — h. « ЬЬ 11 II л С. Londos, J. Wolf (1977) G. Burnstock (1978) D. Van Calker ц соавт. (1979) C. Londos, J. Wolf (1977) C. Londos и соавт. (1980)
427
Рецептор Агонист Антагонист
Р 2\ 5 ’Дидазонсиадемозим Хинидин
%
Рис. 75. Топография различных пуриновых рецепторов, основанная на их классификации, представленной в табл. 17. [Stone Т. W., 1981].
Классификацию пуриновых рецепторов можно представить также в виде диаграммы (рис. 75).
Отметим, что Р-рецепторы, по данным C.Londos u J.Wolf (1977), как и Р2-рецепторы, по данным G.Burnstock (1978), пе чувствительны к метилксантииам; если в дальнейшем будет установлена идентичность этих рецепторов, то тогда классификация пуриновых рецепторов еще более упростится.
В последующие годы с помощью фармако-биохимического и генетического анализа были получены более полные данные о типах и подтипах пуриновых рецепторов (Williams, 1994; Rainnie, 1994). Согласно современным представлениям, существуют 2 подкласса пуриновых рецепторов. Р-рецепторы сопряжены с G-белками; эти рецепторы разделяют на 4 подтипа: At — А4 — для всех них агонистом является аденозин. Для А! и А-рецепторов антагонистами являются ксантины, а для А3 и А— рецепторов — нет. Активация А-рецепторов сопровождается ингибированием адеиилатциклазы и активацией калиевых каналов, а также в ряде случаев активацией фосфолипазы С. В то же время А2-рецепторы опосредуют активацию адепилат-циклазы.
428
Р,-рецепторы чувствительны к АТФ и родственным нуклеотидным трифосфатам, таким как УТФ. Эти рецепторы разделяют па 2 подтипа: Р2х-рецелторы сопряжены с ионными каналами, а Р2у-ре-децторы с G-белкамн, Обобщены имеющиеся данные о фармакологических и биохимических свойствах пуриновых рецепторов ЦНС 'в табл. 21.
Та6лица21.
Некоторые характеристики пуриновых рецепторов ЦНС
Подтип пуринивотч) рецептора Агонист Антагонист Трансдуктор Эффекторные механизмы
Р/А..А,,, АиД) А1-ЫЙ-Ш1КЛО’ пентил-ад снизил 8-ИИКЛОПСНТИЛ-тсофнллин G-белок 4-цАМФ* ХСа^и ТК’ проводимость
Ад, CGS21680 СО66713 G-бслок ТцАМФ
рь -мстнлсн-АМФ Сурам пн Ионный канал ? Са2+; Тк+; ? Na+ прово-димость
Рь АДФрР Сурамин G-бслок ТИнозитолтри-фосфат/ диацил-глицернн
В настоящее время достаточно подробно изучены подтипы Азрецепторы, разделяемые на А2а- и А2Ь-рецепторы. А2а-рецецторы обнаружены в нейтрофилах, тромбоцитах, сосудах и в ЦНС. В хвостатом ядре головного мозга А2а-рецелторы сопряжены с Д2-рецепторами. Причем стимуляция А2а-рецепторов приводит к ингибированию функциональной активности Д2-рецепторов, что имеет важное значение в развитии неврологических и психических заболеваний (Onmgmi Т., Fredholm В., 1996). С помощью метода клонирования обнаружено, что АЛ- и А^-рецепторы состоят примерно из 410 и 320 аминокислотных остатков соответственно (табл.22).
Особый интерес представляют лиганды А^-рецепторов, так как они могут быть использованы для терапии болезни Паркинсона, а также инсульта и воспалительных процессов в головном мозге.
Продолжают пристальное внимание привлекать также Р2-ре-
429
Таблица 22
Основные фармакологические и биохимические свойства А^-рецепторов.
Характеристики Ац-рецепторы Ать-рецепторы
Тип G-белка Gs Gs
Эффекторная система Аденилатциклаза Аденилатциклаза
Агонист CGS21680
Антагонисты SCH58261 KF17837 ZM 241385
Структура 409-410 аминокислотных остатка 328 (человек) 332 (мышь, крыса)
Локализация в ЦНС Хвостатое ядро, зрительный бугор, кора, гиппокамп везде, включая глиальные клетки
Локализация на периферии Сосуды, легкие, печень, почки, нейтрофилы, тромбоциты Желудочно-кишечный тракт; в небольшом количестве во всех клетках
Клеточные линии РС12 Лейкемические клетки, линии фибробластов, COS-7
Гены a2A;chr22 a2B;chr 17 (р.11.2-12)
цепторы, опосредующие ностсицаптическую деполяризацию при действии АТФ. Согласно данным C.Kennedy, Left Р. (1997), идентифицированы 5 подтипов этих рецепторов: Р2>) Р_)у, Р2и, Р?. , Р^, Фармакологические характеристики Р2-рецеиторов представлены в табл. 23.
Отметим, что сложность в фармакологической классификации пуриновых рецепторов заключается в том, что лиганды этих рецепторов подвергаются быстрой деградации. Поэтому предотвращение этой деградации (использование ингибиторов эктоиук-леотидазы) позволило уточнить классификацию, представленную в табл. 23. Использование ряда новых лигандов Р2-рецепторов позволит подтвердить пли опровергнуть наличие дополнительных их подтипов.
430
Таблица 23.
Фармакологические свойства Р?1 Р^-рецепторов
Рецептор Ряд агонистов
Р^-рецепторы (старая классификация без предотвращения разрушения агонистов) Р^-рецепторы (новая классификация с предотвращением распада агонистов) Р^-рецепторы (PC 12-клон) Pjy- рецепторы мстилен-АТФ»2-метнлтио-АТФ>АТФ 2-метмлтио-АТФ>АТФ> метилен-АТФ АТФ=2-метилтио-АТФ»метилен-АТФ 2-метилтио-АТФ»АТФ>мстил-АТФ
10.3. Топография пуриновых рецепторов
Рассмотрев современные представления о классификации пуриновых рецепторов, перейдем к анализу сведений о фармакологии пуриновых рецепторов отдельных органов и систем.
10.3J. Пуриновые рецепторы ЦНС
Определенные успехи в изучении пуриновых рецепторов ЦНС достигнуты с помощью радиолигандов агонистов 3Н-№-циклогек-силаденозипа (3Н-ЦГА), 3Н-№-фе1П1Лизопро1шладенозш1а (3Н-ФИА), 2-3Н-хлорадепозина и 3Н-аденоэина и антагониста 3Н-1,3-дизтил-В-феиилксаптипа (3Н-ДФК). Данные о параметрах взаимодействия некоторых радколигапдов с препаратами головного мозга млекопитающих представлены в табл. 24.
U.Schwabe и соавт. (1982) предложили в качестве радиолигаида для Р-нуриновых рецепторов ,231-№-р-гидроксифеиилиза-прон и л аденозин (ГФИА).
Связывание |231-ГФИА с мембранами клеток коры головного мозга крыс характеризуется их насыщением при 0,23 нмоль ГФИА на 1 мг белка, равновесной константой диссоциации, равной 0,48 нмоль/л, константой скорости ассоциации (3,25* 10s л/ моль в 1 мин.) и константой скорости диссоциации (0,11 мин '). При этом MgCl2 (10 нмоль/л) увеличивал его связывание с этими мембранами с 5,3±0,4 до 18,8±2,0 фмоль/мг белка. В то же время ГТФ (54 мкмоль/л) снижал связывание ГФИА па 50%. (-)-Изомер ЬГ-фенилизопропиладенозипа но сравнению с его (+)-изомером в 16 раз сильнее вытеснял ГФИА нз его связывающих участков. Специфическое связывание ГФИА силь-
431
Таблица 24.
Характеристики связывания раднолигандов пуриновых рецепторов с мембранами головного мозга млекопитающих
Ткань Лиганд Число участков связывай* ня Кд, нМ Ангоры
Кора головного мозга крыс 2 -3Н-Хлорале нозин 1 23 R. Н. Wu п соавт. (1980)
Головной мозг крыс 2 1.31116 М* Williams, Е. Л. Rbley (1980)
Тоже яН-Лденозин 2 17-КР и 14-103 U, Schwabe (1979)
Кора головного мозга крыс+ быков, морских свинок - 2 0,5 - 1,3 и 5 -9-КР М. Е. Newman и соавт. (1981)
Головной мозг быка и морской свинки зн-цгл t 0,7 (бык) (i (морская R. F. Hurns н соавт> (1980)
Кора головного мозга теленка и человека t 0,29 (теленок) 5,2 (чело пек) К. Н* Murphy, S. Н. Snyder (1982)
по уменьшалось в присутствии №-циклогексиладепозипа и (-)-№-фепилизоп реши л аденозина, в меньшей степени в присутствии 5'-N-этилкарбоксиамидоадепозипа и еще в меньшей степени в присутствии антагонистов аденозина: З-изобутил-1-метилксаптипа, теофиллина и кофеина.
Отметим, что скорость ассоциации 3Н-ФИА с пуриновыми рецепторами в 5 —10 раз выше, чем 3Н-ГФИА, а скорость ассоциации 3Н-ЦГА и |251-ГФИА имеет сходные кинетические характеристики связывания [Schwabe U., Trast Т., 1980; Goodman R.R etal., 1982].
Адениновые нуклеотиды в головном мозге выполняют нейромедиаторную роль [Phillips J.W.,Wu Р.Н.,1981] и влияют на активность адеиилатциклазы; посредством А,-рецепторов ее ингибируют, а посредством А^ рецепторов стимулируют [Londos С. et al., 1977, 1978; Van Calker D. et al., 1979; Cooper D. et al., 1980]. Метилксаптипы, такие как кофеин и теофиллин, блокируют действие аденозина на А^ и А3-рецепторы.
Считается, что 3Н-ЦГА связывается с А:-рецепторами головного мозга всех видов млекопитающих [Burns R.F. et al.,1980; Murphy K.H.,Snyder S.H., 1982],а 3Н-ДФК с A^-рецепторами
432
(Snyder S.H., 19811, ио только у мореких свинок.
Проведение поведенческих экспериментов показало гетерогенность А,-рецеиторов: противосудорожная активность L-ФИА у мышей и крыс не блокируется теофиллином. Производные аденозина имеют сродство к А^рецепторам при высокой температуре, а аналоги ксантина — при низкой температу-tpe [Murphy К.Н.,Snyder S.H.,1982].
Для оценки возможности опосредования пуриновыми рецепторами поведенческих эффектов ксантинов S.H.Snyder и ! соавт. (1981) была сопоставлена способность производных ксан-• типов вызывать двигательную стимуляцию с величиной их сродства к участкам, связывающим 3Н-ЦГА. Для большинства ме-Тилксантипов имела место корреляция между их способностью стимулировать двигательную активность и конкурировать с 3Н-ЦГА за связывание с пуриновыми рецепторами. В то же время В некоторых случаях были исключения: изобутилметилксан-Тин обладал высоким сродством к пуриновым рецепторам, по во всех дозах снижал двигательную активность. Кофеин действовал двухфазно: в низких дозах он угнетал двигательную активность, а в высоких дозах ее стимулировал. Теофиллин же ВО всех дозах был стимулятором. Эти данные позволяют считать, что метилксантилы взаимодействуют с различными участками: одни участки опосредуют стимуляцию метилксантииами двигательной активности, а другие, наоборот, двигательной депрессии .
Согласно сообщению S.H.Snyder (1981), L-ФИА в дозе 20 Мкг/кг у мышей вызывает снижение двигательной активности. ЦГА действовал аналогично, а D-ФИА был намного слабее, т.е. депрессивный эффект ФИА опосредован А^рецепторами, а стимуляция метилксантииами двигательной активности может иметь место при блокаде А,-рецепторов.
Заканчивая рассмотрение пуриновых рецепторов ЦНС, необходимо отметить, что некоторые пурины обладают способностью вытеснять бензодиазепины из их участков специфического связывания (см. раздел 8.6). Вместе с тем бензодиазепины ингибируют поглощение аденозина сипантосомами. Между данным эффектом бензодиазепинов и нх терапевтическим действием существует прямая зависимость [Phillis J.W. et al., 1981].
10.3.2 . Пуриновые рецепторы сердечно-сосудистой системы
D.B.Evans и J.A.Schenden (1982) показали, что аденозиловые агонисты (-)-Ы-(1метил-2-феиил)адепозин (N-феиилизо-цронил-адепозин) и N-циклогексиладенозин в наномолярпых коп-
2I.W227
433
центрациях снижают частоту и силу сокращений изолированного предсердия морской свинки, а 2-хлорадепозии, Ы,Ы-диметаладепо-зин и (+)-Ы-(1-метил-2-фенилэтил)аденозин в этом отношении менее активны. Данный кардиодепрессивный эффект аденозиловых агонистов подавляется теофиллином и 1,3-диэтилфенилксаптипом. Следовательно, можно считать, что отрицательный инотропный и хронотропный эффект аденозиновых агонистов опосредован А,-рецепторами, для которых свойственна стереоспецифичность. Кроме того, имеются сведения о существовании пуриновых рецепторов в коронарных сосудах, которые опосредуют сосудорасширяющий эффект пуриновых агонистов [Snyder S.H., 1981], но практически они еще не изучены.
10.3.3 . Пуриновые рецепторы гладкомышечных органов
В экспериментах на различных органах (сосуды, vas deferens, мочевой пузырь) показано, что аденозин>5'-АМФ>5'-АДФ>АТФ ингибируют вызываемые нервной стимуляцией сокращения неисчерчепных мышц [Clanachan A.S. etal., 1977; Verhaeghe R.H. et al., 1977; Paton D.M. etal., 1978; HedqvistP., Fredholm B.B., 1979; Dahlen S.E., Hedqyist P., 1980; Tayler D.A. et al., 1983]. Дащзый порядок снижения активности аденозиновых агонистов и блокирование их эффекта теофиллшюм свидетельствуют об их действии на Р^рецепторы.
Р,-Рецепторы расположены на пресипаптической мембране и опосредуют действие аденозина, выражающееся в снижении высвобождения нейромедиаторов, в частности, катехоламинов.
Согласно результатам, полученным A.Crema и соавт. (1983), АТФ и аденозин расслабляют изолированный препарат внутреннего анального сфинктера морских свинок. Проявление этого действия пуринов зависит от концентрации. Теофиллин (25 — 50 мкМ) не влияет на данный эффект пуринов, а краситель синий 2 ингибирует этот эффект АТФ, по не аденозина. Можно заключить, что па миоцитах внутреннего анального сфинктера морских свинок существует два различных тина пуриновых рецепторов. Поскольку АТФ и аденозин не влияют па электрически стимулируемые сокращения этого сфинктера, авторы полагают, что пуриновые производные в данном случае в большей степени являются модуляторами нейропередачи, чем медиаторами.
D.P, Westfall и соавт, (1978), G.K.Hogaboom и соавт. (1980), J.S.Fedan и соавт. (1978, 1981) обнаружили, что АТФ является возбуждающим медиатором в отношении yas deferens морских
434
свинок и крыс. На постсинаптических мембранах мышечных волокон vas deferens локализованы Р2-рецепторы. D. A.Taylor и соавт. (1983) указали на способность стабильных аналогов АТФ Вызывать сокращения vas deferens, она уменьшается в ряду аде-Иил-5-имидодифосфат- p-а- метилен-АТФ»аденозинтетра-фосфат>АТФ> АДФ. Кроме того, эти соединения в таком же порядке ингибируют вызываемые раздражением нервов сокращения vas deferens крыс. Так как теофиллин не влияет на данную активность АТФ и ее аналогов, можно считать, что они, наряду с действием на постсинаптические Р2-рецепторы, взаимодействуют с пресинаптическими Р2-рецепторами. Можно заключить, что vas deferens крыс содержит не только Р(- и Р2-рецепторы, ио и два различных подкласса Р2-рецепторов.
Практическое значение имеет существование пуриновых рецепторов в трахеобронхиальной системе. Аденозин и его аналоги вызывают сокращение неисчерченных мышц трахеи в микромолярных концентрациях [Snyder S.H., 1981]. Поскольку изомеры ФИА имеют одинаковую бронхоконстрикторлую активность, делается вывод о присутствии в трахее Аурецепторов.
10.3.4 . Пуриновые рецепторы лимфоцитов и тимоцитов
A.L.Schwartz и соавт. (1978) с помощью аденозина и его аналогов показали, что на поверхности лимфоцитов существуют пуриновые рецепторы, регулирующие внутриклеточный уровень цАМФ, который опосредует действие пуринов на цитолитическую активность лимфоцитов. В дальнейшем J.C .Bouhafous и соавт. (1981) выявили, что 5'-Ы-этилкарбоксамидаденозин, №-(1-2-фе-нилизопропил)-аденозин и 2-хлораденозип стимулируют активность адеиилатциклазы тимоцитов мыши. Стимуляция адени-Латциклазы первым из этих аналогов аденозина двухфазна, а дйумя последними его аналогами монофазна, что может быть связано с существованием подклассов рецепторов пурина на мембранах тимоцитов. Этими авторами пуриновые рецепторы с аналогичными свойствами обнаружены в зрелых и незрелых тимоцитах, лимфоцитах периферической крови человека и в Лимфобластомах L-1210 и EL-4. По мнению авторов, распространенные на лимфоцитах всех типов и сопряженные с аде-нилатциклазой рецепторы аденозина играют несомненную роль б их созревании. Важно отметить, что регуляция функций этих рецепторов может осуществляться не за счет изменения их числа, а вследствие изменения активности мембранных фер
435
ментов, контролирующих уровень аденозина, например, 5'-нуклео-тидазы и адеиозиндезаминазы, активность которых резко меняется в процессе созревания лимфоцитов и тимоцитов. В этой связи, мы считаем необходимым проанализировать роль пуринергической системы в реализации тимуслитического и лимфолитического эффекта стероидных гормонов. Основанием для этого могут служить полученные нами данные о специфическом действии стероидных гормонов в наномолярных концентрациях на 5’-нуклеотидазу в клетках-мишенях и на уровень циклических нуклеотидов в тимоцитах [Сергеев П.В., 1984]. А.С. Духаниным впервые показано, что:
< Экспрессия и посттрансляционная модификация аденозиновых рецепторов, сопряженных с G-белками, а также G-белков, участвующих в передаче сигналов от этих рецепторов на системы вторичных посредников, зависят от функционального состояния клеток (стадии клеточного цикла, интенсивности белкового синтеза, структуры цитоскелета и т.п.) и находятся под контролем глюкокортикоидных гормонов.
ф- Одним из механизмов иммунодепрессивного действия глюкокортикоидов является активация пуринергической системы и запуск адецозин-индуцированного пути подавления лимфоидного роста.
В работах А.С. Духанина установлено, что на плазматической мембране лимфоцитов содержится два типа рецепторов аденозина: Ad- и А^-подтипы пуриновых рецепторов. Сопряжение А(и Ам рецепторов аденозина с эффекторной молекулой - адеиилат-циклазой - осуществляется через различные типы регуляторных G-белков. Ингибирующее действие А,-рецепторов на аденилатциклазу опосредуется С^белком, чувствительным к коклюшному токсину. Стимуляция аденилатциклазы через А^-рецепто-ры обусловлена Gj-белком. Интегральный ответ клетки на аденозин определяется соотношением Ad/A2 рецепторов, их концентрацией и аффинностью к лиганду, которые могут изменяться под действием различных факторов. Глюкокортикоиды, подавляя активность Сделка, нарушают сопряжение At-подтипа пуриновых рецепторов с аденилатциклазой. Присутствующие на мембране лимфоцитов А(-рецепторы становятся “молчащими”, что приводит к изменению функционального соотношения Aj/Aj рецепторов в пользу А2-типа.
На основании собственных результатов А.С. Духанин предложил “пуриновую" гипотезу развития бронхиальной астмы,
436
согласно которой важное место в генезе заболевания принадлежит эндогенному пуриновому соединению аденозину. От соотношения А, /Aj пуриновых рецепторов зависит конечный ответ клетки Мшени на аденозин. У некоторых больных бронхиальной астмой (примерно 15 %) происходит уменьшение концентрации А?- и увеличение содержания А(-рецепторов на поверхности не только лимфоцитов периферической крови, но и в клетках бронхиального дерева. Преобладание эффектов возбуждения А,-рецепторов приводит к повышению тонуса бронхов. В этом случае назначение таким больным антагониста пуриновых рецепторов теофиллина дает положительный клинический эффект, а определение количества пуриновых рецепторов и их соотношения на лимфоцитах больных БА можно использовать в качестве метода оптимизации фармакотерапии этого заболевания.
10.3.5 . Пуриновые рецепторы тромбоцитов
Согласно данным D.Van Calker и соавт. (1979), пуриновые рецепторы, относящиеся к подклассу А2-рецепторов, присутствуют на тромбоцитах. Данные А2-рецепторы опосредуют способность аденозина и ФИА увеличивать внутриклеточный уровень цАМФ и тем самым ингибировать агрегацию тромбоцитов [Snyder S.H., 1981]. Этот эффект агонистов блокируется метилк-сантинами [Van Calker D. et al., 1979].
10.3.6 . Пуриновые рецепторы семенников
Методом радиолигандного связывания J.H.Phillis и соавт. (1979) показали, что пуриновые рецепторы находятся в семенниках. Результаты, полученные при изучении участков, саязывающих 3Н-ЦГА, методом авторадиографии, указывают на то, что пуриновые рецепторы локализованы на сперматоцитах. Однако роль пуриновых рецепторов в функционировании этих клеток еще предстоит изучить.
10.4. Фотоаффинная метка пуриновых рецепторов
При изучении химической природы и механизмов функционирования пуриновых рецепторов можно использовать фотоаффии-ные метки, имеющие специфическое сродство к этим рецепторам. Sjjong и R.J.Guillory (1975) обнаружили, что арилазидоамино-пропионил АТФ (ANAPP3) при облучении видимым светом кова
лентно связывается с митохондриальными аденозинтрифосфотазами миозина скелетных мышц кролика. G.K.Hogaboom и соавт. (1980) использовали этот фотоаффинный аналог АТФ для изучения пуриновых рецепторов vas deferens морских свинок. Ими установлено, что ANAPP3 специфично подавляет стимулируемые адениновыми нуклеотидами сокращении vas deferens. При облучении тканей видимым светом в присутствии ANAPP3 происходит необратимое блокирование данного эффекта адениновых нуклеотидов, а предварительная обработка АТФ предотвращает развитие необратимого антагонизма. В темноте антагонизм ANAPP3 был обратим. В то же время ANAPP3 не влияет на действие ацетилхолина, гистамина, норадреналина и КС1 на vas deferens. Эти результаты, во-первых, подтверждают существование пуриновых рецепторов, антагонистами которых являются АТФ, АДФ, АМФ, и, во-вторых, указывают на большую ценность фотоаффинных меток для изучения рецепторов интактных тканей.
Мы считаем, что если удастся в молекулы фотоаффинных меток ввести радиоактивные атомы, то с их помощью можно будет изучить физико-химические свойства пуриновых рецепторов.
Это будет логичным путем дальнейшего развития исследований, направленных на изучение динамической биохимии пуриновых рецепторов.
10.5. Молекулярные механизмы функционирования пуриновых рецепторов
Функционирование пуриновых рецепторов, как и многих других, связано с модуляцией активности аденилатциклазы и трансмембранным переносом ионов.
Аденозин увеличивает образование цАМФ [Sattin A., Kall T.W., 1970; Shimizi Н. et al., 1970; Sattin A. et al., 1975; Daly J., 1976, 1977; Mah H., Daly J., 1976]. Поскольку аденозин стимулирует аденилатциклазу в присутствии ингибитора поглощения аденозина дипиридамола нейрональными тканями, с одной стороны, этот фермент активируется также производными аденозина, которые не являются специфическими субстратами системы обратного поглощения (2-хлораденозин); с другой стороны, следует считать, что данный эффект опосредован пуриновыми рецепторами, локализованными на внешней стороне плазматических
438
мембран [Daly J,, 1976; Mah H., Daly J,, 19761. Метилксантииы блокируют стимулирующее действие аденозина на адепилатцикла-
[Bumstock G., 1978; Stone T.W.,1981], Данный эффект адено-щиа зарегистрирован в срезах коры головного мозга морских Свинок [Daly J., 1977], глиальных клетках головного мозга [Van Calker D. et al., 1979], культуре нейронов [Green R.D., Stanberry L.R., 1976], лимфоцитах мышей [Bonnafous J.C. et al., 1981], легких, Тромбоцитах, костном мозге, коже и надпочечниках [Stone T.W., 1981].
’ По аналогии с катехоламинами активация адеиилатциклазы । аденозином усиливается в присутствии гуанозин-5'-трифосфата j [Fain J.N., Malbon С.С., 1979; Rodbell М., 1980]. Вместе с тем [ связывание агонистов (например, 3Н-ЦГА) с пуриновыми рецеп-[ торами в присутствии ГТФ и ГДФ, но не ГМФ, уменьшается [Snyder f S.H., 1981]. Однако в отличие от ^-адренорецепторов, представ-1 ляющих собой независимое от каталитической субъединицы адеиилатциклазы молекулярное образование, пуриновые рецепторы непосредственно сопряжены с аденилатциклазой [Braun S., Levitski А., 1979]. Если пуриновые и катехоламиновые рецепторы присутствуют в клетке одновремешю, то пуриновые рецепторы принимают участие в регуляции величины и скорости активации катехоламинами адеиилатциклазы [Stone T.W., 1981 ]. Следовательно, можно полагать, что пуриновые рецепторы принимают участие в регу-i дяции циклазной системы.
. A.J.Blume и C.J.Foster (1976), A.Levitzki (1978), J.N.Fain и C.C.Malbon (1979) предложили модель регуляции пуринами активности адеиилатциклазы. Согласно этой модели, фермент, | связанный с ГТФ (ЕГГф), находится в активной форме, а при I гидролизе ГТФ (Е^) или отсутствии ГТФ (Ео) — в неактив-t ной форме. Считается, что аденозин изменяет равновесие от J к Ео. В состоянии Ео фермент обладает способностью легко связывать ГТФ и превращаться в активную форму.
В ряде случаев аденозин ингибирует накопление цАМФ, вызываемое такими агонистами, как изопреналип; это справедливо в отношении гепатоцитов, адипоцитов, глиальных клеток головного мозга [Londos С., Wolf J., 1977; Cooper D.M., Londos С., 1979; Van Calker D., 1979; Stone T.W., 1981]. Согласно классификации, представленной в табл. 19, стимулирующее и ингибирующее действие аденозина на аденилатциклазу опосредовано Аа- или Ra- и At или Rt-рецепторами соответственно.
Другой реакцией клеток, содержащих адеиозиновые рецепто-
439
ры, является изменение ионной проницаемости.
По современным данным, АТФ повышает мембранную проводимость для К+ у многих типов клеток и увеличивает скорость реполяризации потенциала действия [Stone T.W.,. 1981]. Уменьшение пресинаптической реполяризации сопровождается снижением проникновения Са2+ в нервное окончание и торможением высвобождения нейромедиатора. В этом отношении метилксан-тины являются антагонистами аденозина; они уменьшают скорость реполяризации и увеличивают выход Са2*, сопровождающийся повышением высвобождения нейромедиатора [Corrodi Н. etal., 1972; KaibaraK., Karszman А., 1978; Terrar D. А., 1978]. В то же время сведения о молекулярных механизмах сопряжения пуриновых рецепторов с ионными каналами пока отсутствуют. Необходимы дальнейшие исследования трансформации пуриновыми рецепторами молекулярного сигнала адениновых нуклеотидов в метаболический ответ клетки.
10.6. Взаимоотношения пуринергической системы с другими рецепторными
системами
Представление о биохимической фармакологии пуриновых рецепторов будет неполным, если не рассмотреть их изаимоот-ношения с рецепторами для других нейромедиаторов.
Еще в 1970 г. A.Sattin и T.Rall обнаружили, что аденозин (>АТФ) и норадреналин обладают язанмопотенцирующим свойством в отношении стимуляции аденилатциклазы в срезах головного мозга. Такое же взаимоотношение между аденозином и норадреналином продемонстрировали T.Stone и D.Taylor (1978), используя электрофизиологические пре- и постсинаптические эффекты аденозина. Действуя на пресинапс, аденозин Са2*-зави-симым образом ингибирует высвобождение нейромедиатора (Hedqvist Р., Fredholm В., 1979; Hollins С., Stone Т., 1980]; действуя на постсинаптическую мембрану, оп увеличивает эффекты катехоламинов (это действие имеет место в отношении а1, но не p-адренорецепторов) [Jones D., 1981]. Таким образом, получается, что суммарный эффект аденозина на ту или иную ткань есть результирующая величина от его нескольких эффектов. Например, конечное действие аденозина на миоциты сосудов будет
440
определяться соотношением его непосредственного влияния на пуриновые рецепторы миоцитов, уменьшением высвобождения норадреналина и потенцированием постсинаптического сократительного эффекта высвободившегося из нервного окончания норадреналина. Нарушение баланса между этими процессами может оказать заметное влияние на мышечный тонус сосудов и быть причиной гипертензии [Kamikawa Y. et al., 1980]. Важно отметить, что аденозин, кроме того, уменьшает восстановление чувствительности адренорецепторов к норадреналину, т.е. ускоряет ресенситизацию. Однако в этом отношении эффекты пуринов неодинаковы. Так, в отличие от аденозина, АТФ уменьшает норадреналиновый ответ миоцитов и не влияет на скорость ресенситизации «-адренорецепторов [Hoick М., Marks В., 1978].
Поданным Ф.П.Тринуса (1982), при поступлении импульса по адренергическим волокнам катехоламины выделяются в синаптическую щель вместе с АТФ. Медиатор и АТФ с ее продуктами гидролиза находятся в постоянной связи. АТФ и продукты ее гидролиза сенсибилизируют адренорецептор и оптимизируют его ртвет на стимулирующий импульс. При наличии в постсинаптических структурах пуринорецепторов АТФ возбуждает также и их, поэтому ответ эффектора состоит из суммы реакций адрено- и пуринорецепторов. Этим, по-видимому, и могут отличаться ответы разных исполнительных органов на одни и те же раздражители.
Важно отметить, что фармакологические эффекты адренергических средств могут быть частично опосредованы пуриновыми рецепторами. Так, U.Itsuko и соавт. (1984) обнаружили, что агрессия, вызываемая клонидином у мышей, обусловлена блокированием пуриновых рецепторов.
Другими рецепторами, на которые пурины оказывают модулирующее влияние, являются холипорецепторы. D.Ewald (1976) показал, что АТФ усиливает нейромышечную передачу, опосредуемую ацетилхолином. Позднее T.Akasu и соавт. (1981) обнаружили, что АТФ пе увеличивает сродства ацетилхолина к холи-норецепторам, а повышает число ионных каналов или проводимость уже имеющихся каналов, т.е. действует не на участок связывания ацетилхолина, а на какую-то другую часть холинорецептора. Ранее отечественные авторы [Турпаев Т., Сахаров Д., 1973] установили, что чувствительность холинорецепторов регулируется АТФ.
Таким образом, физиологическая функция эндогенных пуринов может заключаться в регуляции активности клеток различ
441
ных тканей посредством изменения чувствительности адрено- и холинорецепторов. Например, увеличение локальной концентрации АТФ может привести к повышению чувствительности к норадреналину. Аденозин вместе с тем может увеличивать чувствительность а-адренорецепторов, не изменяя чувствительности холинорецепторов.
Модулирующий эффект аденозина зарегистрирован также в опытах на изолированных жировых клетках [Joost H.J., Steinfelder H.J., 1982]. Аденозин увеличивает способность инсулина стимулировать транспорт глюкозы и ее включение в липиды адипоцитов крыс, но не изменяет связывания инсулина с адипоцитами. Следовательно, аденозин оказывает модулирующее влияние на инсулиновый эффект на этапе сопряжения инсулинового рецептора с системой транспорта глюкозы.
Итак, рассмотренные экспериментальные данные позволяют заключить, что пуринергические вещества являются модуляторами адренергических, дофаминергических, холинергических и инсулиновых рецепторов. Не исключено, что дальнейшие исследования в этом направлении позволят выявить модулирующие эффекты аденозина и его производных для других гормонов и нейромедиаторов.
10.7. Некоторые аспекты молекулярной фармакологии ксантинов
В течение многих лет считалось, что поведенческие эффекты метилксантинов обусловлены ингибированием фосфодиэстеразы и последующим накоплением цАМФ. Однако оказалось, что кофеин и теофиллин обладают выраженным действием ла поведение при концентрации 10 мкМ в головном мозге, при которой они не влияют па активность фосфодиэстеразы.
К бензодиазепиновым рецепторам метилксаптины имеют невысокое сродство. Величина их связывания с бензодиазепиновыми рецепторами не коррелирует с их стимулирующими эффектами [Snyder S.H., 1981].
В послед!те годы появляется все больше данных о том, что поведенческие и другие фармакологические эффекты метилксап-тинов связаны с их способностью блокировать пуриновые рецепторы [Snyder S.H., 1981; NolteD., 1983; Van Barstel R.W., 1983;
442
Рис, 76. Предполагаемое взаимодействие АТФ и метилксанти-иов с пуриновыми рецепторами [NoliteD., 1983].
Метилнсантин
урмиовый' рецепте
Вагассо R.A. etal., 1984]. Установлено, что существует корреляция между способностью метилксаптинов блокировать связывание 3Н-ЦГА с Аурегипторами головного мозга и величиной их стимулирующего эффекта на двигательную активность [Snyder S.H., 1981]. Если аденозин снижает двигательную активность, частоту сердечных сокращений, артериальное давление, липолиз и высвобождение катехоламинов, то кофеин повышает зги параметры и процессы [Van Barstel R.W., 1983; Gavley J. etal., 1983]. Кроме того, кофеин блокирует способность аналогов аденозина 5’-N-згилкарбоксамидоаденозина и (-)-М-(1-метил-2-фенилэтил)-адеио-зина, действующих на центральные пуриновые рецепторы, вызывать зависимое от дозы уменьшение двигательной активности и Снижение артериального давления у крыс [Вагассо R.A. et al., 1984].
Известно, что к кофеину развивается толерантность у человека [Colton Т. et al., 1967], а у мышей развивается толерантность к стимулирующему действию теофиллина на нигростри-атиую систему [Watanabe Н. et al., 1982]. Причиной развития толерантности может быть увеличение числа пуриновых рецепторов при длительной их блокаде метилксантинами. Под
443
тверждением этого предположения могут служить данные T.F.Murray (1982),который обнаружил,что при введении крысам теофиллина в течение 21 сут. происходит увеличение числа участков коры головного мозга, специфически связывающих 3Н-ЦГА, на 27,9%. J.P.Boulengler и соавт. (1983) подтвердили, что кофеин при его введении крысам в течение нескольких недель тоже увеличивает число пуриновых рецепторов в головном мозге.
Еще одной точкой приложения метилксантинов являются пуриновые рецепторы мышц бронхов, которые, как известно, опосредуют бронхоконстрикторный эффект аденозина и АТФ [Snyder S.H., 1981]. Метилксантииы в микромолярных концентрациях блокируют данный эффект аденозина.
Следовательно, молекулярный механизм реализации фармакологической активности метилксантинов во многом может быть объяснен блокированием ими пуриновых рецепторов. На рис. 76 схематически изображено сходство взаимодействия АТФ и метилксантинов с пуриновыми рецепторами. Учитывая гетерогенность пуриновых рецепторов, возможно, в будущем появятся вещества, специфически взаимодействующие только с одной определенной группой рецепторов. Так, препараты, блокирующие действие аденозина на бронхи, но не на головной мозг и сердце, могут оказаться эффективными для лечения бронхиальной астмы. Перспективным является создание агонистов пуриновых рецепторов, которые избирательно ингибируют агрегацию тромбоцитов и/или вызывают расширение коронарных сосудов. Не исключено, что производные аденозина найдут применение для лечения эмоциональных расстройств.
» * *
В заключение мы считаем необходимым подчеркнуть уникальность пуринергической системы как таковой. Эта уникальность заключается в том, что пурины в организме млекопитающих являются полифункциональными соединениями; они выступают в качестве макроэргов, входят в состав нуклеиновых кислот, различных коферментов и, наконец, участвуют в передаче нервных импульсов. Пуриновые рецепторы инициируют развитие таких процессов, как агрегация тромбоцитов, дифференцировка и рост иммунокомпетентных клеток и др.
Пока не изучена эволюция пуриновых рецепторов. По-ви-днмому, пуринергическая система является одной из самых древних в эволюционном плане. Эта мысль возникает вследствие того,
444
что пурины обладают способностью модулировать функции специализированных нейромедиаторных систем (адренергической и холинергической) и таким образом регулировать соотношение между активностью парасимпатической и симпатической системами.
Учитывая описанные особенности пуриновой рецепции в системе нейрохимических механизмов, можно сказать, что изучению их уделялось недостаточное внимание. Будущие исследования должны быть направлены на выяснение гетерогенности пуриновых рецепторов, их топографии, физико-химических свойств, сопряженности с циклазными системами, ионными каналами, а также составными компонентами рецепторов для других биорегуляторов.
Глава 11
ОПИОИДНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ
Введение
Лиганды опиоидных1 рецепторов имеют более, чем 5000-летнюю историю применения в медицине. Анальгетический и наркотический эффект опия использовался египетскими врачами; его описывали Гиппократ и Гален. Тысячелетиями опий применяется в восточной медицине. С древних времен курение опия распространено в исламских государствах, таких как Аравия, Турция, Иран. Опии также используется в традиционной медицине Китая и Индии.
В 1805 г. немецкий химик Фредерик Сертюрнер выделил активный компонент из опия, названный впоследствии «морфином*. Первый нолусиптетический аналог морфина, героин, был получен в 1898 г.
Однако лишь во второй половине XX в. удалось определить молекулярные механизмы действия опиоидных лигандов. В 1967 году Мартин, изучая фармакологическое действие морфина и налорфипа, впервые предположил существование двух типов рецепторов, опосредующих их анальгетический эффект. В 1973 году в связи с развитием техники радиорецеиторпых исследований одновременно три группы исследователей (Pert С., Snyder S.H., 1973; Simon E.J., 1973) сообщили о химической идентификации этих рецепторов. Через два года было показано существование более, чем одного тина центров связывания опиоидных пептидов (Pasternak G.W., Snyder S.H., 1975).
Открытие опиоидных рецепторов — это наиболее существенное достижение фармакологии опиоидов за последние десяти-’От гр. «opos* — сок.
446
Рис. 77. Первые открытые лиганды опиоидных рецепторов.
летия. Это открытие способствовало не только развитию путей направленного воздействия наркотических анальгетиков при тех или иных заболеваниях, но и позволило сделать шаг вперед в изучении нейрохимических механизмов восприятия боли, памяти, поведенческих реакций. За последние годы накоплено большое количество информации, посвященной выяснению роли опиоидных рецепторов в организме, их лигандам, роли опиоидной системы в развитии различных патологических состояний организма. Полный обзор этой информации выходит за рамки настоящей главы, более подробно с пей мож-iio ознакомиться в других работах (Зайцев С.В., Ярыгин К.Н., Варфоломеев С.Д., 1993; Minami M.r Satoh М., 1995; Dhawan B.N., 1996; Yaksh T.L., 1997).
Лиганды оггиоидных рецепторов
Первые лиганды опиоидных рецепторов, которые стали известны исследователям (морфии, порморфин, гидроморфин) имели природное происхождение. Первым полусинтетическим агонистом был героин (диацетилморфин). Первый антагонист опи-
447
N-Концевой фрагмент
АКТГ
В-Липотропин
сйЛТ КПП у-Липотропин
у-МСГ
[i-МСГ
Передняяи даме^кмеядам
АКТГ (}-Липотропин
N-Конец
Тоьо (ЦМВКуЮТЙЯ дан
Быстров грэлежугснюйи медленное передейдак
аМСГ
КПП
у-Липотропин
^ЭрррфИ!
Рис.78. Процессинг проопиомслапокортипа в передней и промежуточной долях гипофиза.
ОПДИЫХ рецепторов, налоксон, был получен в 1940-е годы. Химическая структура этих лигандов представлена ниже (рис,77).
В 1975 г. J. Hughes и соавт. в экстрактах мозговой ткани обнаружили эндогенные лиганды опиоидных рецепторов, которые, подобно морфину, ингибируют электрически стимулируемые сокращения vas deferens мышей и отрезка изолированной подвздошной кишки морской свинки. Эти эндогенные лиганды оказались нептанентидами и получили назвашге метионин- и лейци11-энкефалинов(мет- и лей-энкефалипы). Одновременно H.Teschemacher и соавт.(1975), используя технику экстракции, применяемую для выделения пептидных гормонов, идентифицировали в гипофизе быка опиоидный пептид, отличающийся от энкефалинов, по также оказывающий стереоспецифическое действие на опиоидные рецепторы. Этот пептид был назван эндорфином. Последующее изучение эндогенных опиатоподобных пептидов позволило установить, что их предшественниками являются проониомеланокортин, нроэпкефалин А и нроэн-кефалин В (рис.78 —79) (Marx J.L.,1983). Проониомелано-кортип содержит в своем составе ^-эндорфин, АКТГ и а-, р- и у-меланоцитстимулирующие гормоны; он синтезируется в передней и промежуточной долях гипофиза, гипоталамусе, других областях головного мозга и в некоторых периферических тканях, включая плаценту, желудочно-кишечный тракт и лег-
448
Мет-энкефали^Агф--Э/—Le/ Мет-энкефалин^-Иге’
Сигнальный
Проэн кефалин А
пептид
Неоавдррфин Дшор4мн-32
Сигнальный пептид
Проэнкефалин В „
ДинорфинА ДинорфинВ
Рис. 79. Структура проэнкефалина А и проэнкефалина В. [Marx J.L.,1983].
кие. В передней доле гипофиза крыс проопиомелапокортип расщепляется па АКТГ и Р-липотропип. Функция последнего еще пе достаточно изучена. Считают, что p-липотропип принимает участие в высвобождении р-эндорфипа.
В промежуточной доле гипофиза АКТГ подвергается дальнейшему расщеплению и превращается в а-меланоцитстиму-лирующий гормон и кортикотропипподобпый пептид, а из р-липотропииа образуется p-эндорфин и у-липотропин. По-видимому, процессинг гена, кодирующего проониомеланокортин, в передней и промежуточной долях гипофиза различен. По мнению J.L. Магх (1983), процессинг этого гена в гипоталамусе и других отделах головного мозга также характеризуется отличительными особешюстями, но точных сведений о нем пока пет. По нашему мнению, важен тот факт, что транскрипция гена проопиомеланокортина регулируется глюкокортикоидами. Именно на этом уровне может осуществляться взаимодействие между эндокринной и аналгезирующей системами.
Еще меньше сведений об экспрессии двух других генов, кодирующих опиоидные пептиды. Однако изучение аминокислотного состава проэнкефалина А показало, что он является предшественником мет- и лей-эпкефалинов и некоторых других энкефалипсодержащих пептидов. В свою очередь нроэнке-фалнн В содержит а-неоэндорфин, динорфины А и В и лей-энкефалин. Хотя эволюция трех генов, кодирующих опиоидные пептиды, неизвестна, можно отметить их некоторое сходство. Проониомеланокортин и проэнкефалины А и В имеют сходные размеры и одинаковое расположение их интронов; все они
». За» 227
449
содержат шесть цистеиновых остатков, сгруппированных вокруг N-конца.
Kakindani и соавт.(1982), изучив структуру препроэнкефа-лииа В, пришли к выводу, что он содержит, кроме ди-норфииа и р-неоэндорфина, еще одни опиоидный пептид (24 аминокислотных остатка), названный леуморфипом.
Е. Roti и соавт.(1984) сообщили еще об одном опиоидном пептиде—деморфипе, который оказывает стимулирующее действие на секрецию тиреотропина у мышей. В настоящее время охарактеризовано несколько близкородственных пептидов, на-звашсых дельторфинами (Sasaki N. et al., 1991). По всей видимости, деморфин и дельторфин синтезируются из одного предшественника, продеморфипа.
Сравнительно недавно описано семейство казоморфипов, которые впервые были выделены из бычьего казеинового пептона. Бета-казоморфипы предпочтительно действуют на ц-ониоидпые рецепторы, оказывая физиологическое действие на ЖКТ, увеличивая высвобождение инсулина. Другой структурно сходный с бета-казоморфином пептид назвал цитохрофииом, поскольку является фрагментом митохондриального цитохрома Ь.
Совершенно иной класс опиоидных пептидов, входящих в состав гемоглобина, был назван геморфипами и цитохрофина-ми. Впервые эти пептиды были получены in vitro в результате протеолиза, вызванного трипсином; однако, в последние годы появились данные, что геморфипы могут образовываться in vivo (Nyberg F. et al., 1997).
Недавно в ЦНС обнаружены эндогенные пептиды, селективно взаимодействующие с р-опиоидпыми рецепторами (Zadina J.E. et al., 1997), а также пептид ноцицеитип (Gumusel В. et al., 1997), который, как предполагают, взаимодействует с еще пе описанным типом опиоидных рецепторов. Кроме пептидных лигандов опиоидных рецепторов в головном мозге и надпочечниках обнаружены лиганды пепептидпой природы: морфии и кодеин. А так же было показано, что в организме происходит синтез эндогенного морфина.
В последние годы было получено много синтетических селективных агонистов/антагонистов опиоидных рецепторов (Dhawan B.N. et al., 1996). Структурные формулы некоторых из них мы приводим ниже (табл. 25 — 26).
450
Таблица 25. Некоторые эндогенные ’ Эндогенные пептиды и синтетические опиоидные пептиды
, дсЯ-энкефаяин , мст-энкефалин Динорфин-А Tyr-Gly-Gfy-Pbe-Leu Tyr-Gly-Gly-Pbe-Met Tyr-Gly-Gly-Pbc-Leu-Arg-Arg-Ile- Arg-Рго-Lys-Leu-Lys-Asp-Asn-Gln
Дкнорфнн-Б Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Gln-Phe-Lys-Val-Val-Tbr
П-Неозчдорфиы Tyr-Gly-Gly-Pbe-Leu-Arg-Lys-Tyr-Pro-Lys
Р-Нешндорфин Синтетические пептиды DAM GO DPDPE DSLET DADLE CTOP Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-Tyr-Pn> [1>А1а2,МеР1ге4О1у<о1)5)эикефалин [ 1>Реп2,1)-Реп5]энкефалнн f D-Sei^.D-LetPjaHKerfiaaHH-Thr6 [ I)-Ala2, 1>Ееи5]энкефалнн I)-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-
FK-33824 [П-А1а2]-дельторфкн-1 Дельторфин П j Морфи нении PLO17 DALSE Thr-NH2 [О-А1а1,Ы-МеРЬе4,Мее(О)5]эикефалип Tyr-D-Ala-Phe-Asp-Val-Val-Gly-NH2 Tyr-D-Ala-Phe-Glu-Val-Val-Gly-NH2 Tyr-Pro-Phe-Pro-NH2 Tyr-Pro-MePbe-D-Pro-NHj (D-Ala2, Leu5, Су56]энкефалян
Классификация опиоидных рецепторов
В настоящее время доказано, что опиоидные рецепторы являются гетерогенной популяцией. Достоверно описано 5 типов опиоидных рецепторов (Minami М., Saton М., 1995): 8, ц, к, О не. Следует иметь в виду, что пи для одного тина опиоидных рецепторов не описано специфического агониста или антагониста; все опиатные агонисты/антагонисты в той или иной степени могут взаимодействовать с различными типами опиоидных рецепторов. Однако, для каждого типа опиоидных рецепторов описаны наиболее типичные агонисты.
Для 8-опиондных рецепторов наиболее типичными агонистами являются N-аллил!юрметазоцин, энкефалины, [D-Ala2,D-Leu]-Янкефалин (DADLE); для ц-опиоидиых рецепторов — [D-Ala2, N-Me-Phe4, С1у-о15]-эикефалин (DAGO); для к-рецепторов динор-фииы, ЕКС, бремазоцип, U-50,488; для о-рецепторов типичным агонистом является соединение SKF-10047 и для е-опиоидных
451
Таблица 26,
Селективные лиганды опиоидных рецепторов
Тип рецепторсп
Агонисты
Антагонисты
DPDPE Дельторфин DSLET
9
Спирадолин U50.488 Динорфин-А
СН3
1CI 199 441 DIPPA
DAMGO Морфии Метан дон Фентанил Деморфин
СТОР
Мептазинол
5
452
рецепторов наиболее типичный агонист—[J-эндорфин.
ft- Кроме того, в литературе обсуждается существование т-, £- и № рецепторов (Simon Е. J,, 1991). Х-опиатным рецепторам отворится функция лабильных налоксон-связывающих рецепторов Зайцев С.В., Ярыгин К.Н., Варфоломеев С.Д., 1993). Имеются кже данные о существовании на иммуннокомпетентных клет-tax налоксон-нечувствительных опиоидных рецепторов, а на клетках нервной системы специфических рецепторов для ноцицеп-ТИна (Gumusel В. et al., 1997). Предполагается, что эти рецепторы опосредуют анальгетический эффект данного пептида.
Наиболее полно охарактеризованы ц-, 8- и к- опиоидные реце-[торы. С помощью синтетических высокоспецифичных лигандов [показано, что эти типы опиоидных рецепторов также гетерогеп-[НЫ. В частности, для к-опиоидных рецепторов описаны даже к]Ь-f{Lai J. et al., 1994), к^-и к2>-, (-, к^-, к2М- и кк^- субтипы.
8-Опиоидные рецепторы
, 8-Опиоидные рецепторы были впервые охарактеризованы в мышином vas deferens (Lord J.A, et al., 1977), где энкефалины Сильнее, чем морфии, ингибируют потенциалзависимое высвобождение медиатора в синаптическую щель.
. . Радиорецепторные исследования со специфическими лигандами позволили охарактеризовать два субтипа 8-опиоидных рецепторов: 6( и 82. Для 8,-рецепторов типичными агонистами являются [О-Реп2,О-Реп5]энкефалин и 7-бензилденеиалтрек-сон, для 62-рецепторов — [В-А1а2,О1и4]дельторфин, типичный Антагонист— налтрибец.
В настоящее время распределение 8-опиоидных рецепторов охарактеризовано авторадиографически (Dupin S. et al., 1991; Renda T. et al., 1993; Minami M., Satoh M., 1995). 8-Опиоидные рецепторы имеют наиболее сложное распределение в организме, чем все остальные типы опиоидных рецепторов. В центральной нервной системе наибольшая концентрация 8-опиоидных рецепторов наблюдается в обонятельной луковице, повой коре, хвостатом и добаиочпом ядрах. В таламусе, гипоталамусе и стволе мозга концентрация 8-опиоидных рецепторов невелика. В ЦНС 8-опиоидпые рецепторы располагаются, в основном, на пресинаптической мембране. По всей видимости, они оказывают ингибирующее воздействие на высво
453
бождение ряда нейротрансмиттеров (субстанция П, кальцито-иин-релизинг пептид и др.). В спинном мозге и симпатическом стволе обнаружено лишь незначительное число 8-опиоидных рецепторов,
В фундальной части желудка крысы обнаружены высокие концентрации 8-опиоидных рецепторов, располагающихся в мышцах сфинктеров, ауербаховском сплетении и непосредственно под слизистой оболочкой, В других участках желудка концентрация 8-олиоидных рецепторов не столь велика, а связывание 8-агонистов происходит в подслизистом сплетении и слизистой оболочке.
В двенадцатиперстной кишке 8-рецепторы распределены, в основном, в слизистой оболочке, в ворсинках и у основания ворсинок. В мышечном слое связывания 8-агонистов пе обнаружено. Сходное распределение 8-рецепторов обнаружено в подвздошной кишке крысы; однако, у морской свинки связывания 8-агоиистов в подвздошной кишке не происходит.
Наиболее изученным является распределение периферических 8-опиоидных рецепторов на клетках иммунной системы. Первоначально доказательства существоваштя опиоидных рецепторов на иммуццокомнетентцых клетках были получены фармакологически, затем — радиорецептор! 1ыми исследованиями (Зозуля А.А., Пшеничкш! С.Ф., 1990); в последние годы появляется все больше и больше молекулярно-биологических данных, подтверждающих существование 8-оииоидиых рецепторов на клетках иммунной системы. Так, в работе Sedqi М. et al., (1996) была показана экспрессия 3-, по пе р- и к- рецепторов па тимоцитах мыши. На Т- и В-клетках, а также енлепоцитах человека и мыши обнаружена экспрессия 8- опиоидных рецепторов (Gaveriaux С. et al., 1995, Wick M.J. et al., 1996). В работе Miller В,, (1996) показано, что 8-опиоидиые рецепторы экспрессируются только на CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитах мыши, в исследовании Chuang L.F. et al., (1994) показано наличие 8,-рецепторов на Т-клетках человека.
Следует отметить, что экспрессия 8-огшоидпых рецепторов па клетках иммушюй системы во многих случаях определяется функциональным состоянием этих клеток. Так, после 24-часовой инкубации с конкапаволином А экспрессия 8-рецепторов на соленоцитах мыши существенно снижается (Sharp В.М. et al., 1997).
До настоящего времени остается непонятным: различаются ли подтипы 8-опиоидных рецепторов только фармакологически, или существуют биохимические различия между этими
454
рецепторами. Известен только один ген, кодирующим 6-рецепторы (Rossi G.C.,1997). Однако было обнаружено, что блокада экспрессии 8,- или 82-опиоидных рецепторов зависит от участка мРНК, к которому подобраны антисмысловые олигопу-клеотидные последовательности (Wang J.В. et al., 1997,'.Narita М.М. et al., 1997; Lai J. et al., 1995; Rossi G.C. et al., 1997). Проведенные исследования позволяют предположить, что различия между субтииами 8-опиоидных рецепторов происходят из-за существования альтернативного сплайсинга ДНК.
8-рецепторы выполняют многие функции, участвуя в анальгезии, интеграции двигательной активности, регуляции моторики желудочно-кишечного тракта, обонянии, дыхании, распознавательных (когнитивных) функциях, в регуляции настроения и эмоций (Dhawan B.N., 1995). Доказано, что 8-рецепторы принимают участие в регуляции тонуса сердечно-сосудистой системы, оказывают центральный гипотензивный эффект. Показано, что активация 8-опиоидиых рецепторов может приводить к угнетению дыхания, снижению частоты дыхания, преимущественно за счет удлинения фазы выдоха (Freye Е. et al., 1991). Так же известно, что центральные (Broccardo М., Improta G., 1992) и периферические (Fox-Threlkeld J.A.E.T. et al., 1994; Pol О. et al., 1994) 8-рецепторы участвуют в снижении ряда функций желудочно-кишечного тракта, влияя па моторику и секрецию соляной кислоты в желудке. Спинномозговые репеп-торы участвуют в формировании болевой реакции (Steward Р.Е., 1993), вероятно, за счет регуляции обмена субстанции Р (Bourgoin S., 1994). При введении в спинной мозг 8-агонистов снижается болевая чувствительность в ответ па температурные или химические воздействия.
ц-Опиоидные рецепторы
К настоящему времени описаны следующие р-субтипы опиоидных рецепторов: р,- типичные агонисты: дигидроморфип, оксиморфопазиц; специфический необратимый антагонист: па-локсопазип и р2- агонисты: морфин, дигидроморфип, DAGO, кетоцнклазоции, р3- агонисты: морфин, алкалоиды, р,- и р2-опи-оидпые рецепторы имеют повсеместное распространение в ор-пшизме, тогда как р3-рецеиторы встречаются только па клетках ле нейронального происхождения (иммупоцитах и микрогли-альпых клетках). Последнему субтииу р-рецепторов отводит
455
ся роль рецепторов, специфически связывающих эндогенный морфин; кроме того, эти рецепторы с очень высокой аффинностью связывают алкалоиды опия (Stefano et al., 1996). Однако Pj- рецепторы практически не изучены, поэтому все приводимые ниже сведения относятся к р(- и рецепторам.
Наиболее высокая концентрация р-рецепторов наблюдается в хвостатом ядре. В высоких концентрациях эти рецепторы представлены в новой коре, таламусе, дополнительном ядре, гиппокампе и амигдале. В спинном мозге р-рецепторы расположены, в основном, на пресинаптической мембране. Достаточно большое число р-опиоидпых рецепторов находятся в симпатических ганглиях (до 60 — 70% общего числа опиоидных рецепторов). Умеренное количество р-реценторов найдено в околоводопроводном сером веществе, гипоталамусе, бледном шаре (Hiller J.M. et al,, 1994; Minami M., Ston M., 1995).
В теле желудка р-рецепторы располагаются в подслизистом (мейснеровом) сплетении. У морских свинок р-связывающие участки обнаружены также в ауэрбаховском сплетении. В двенадцатиперстной кишке р-агонисты связываются в слизистом слое (Зайцев С.В. и др., 1993). Наибольшие концентрации р-опиоидных рецепторов наблюдаются в подвздошной кишке, где эти рецепторы выявляются в слизистом, подслизистом слоях, а также в межмышечном и подслизистом сплетениях.
Было показано, что морфин способен вызывать гипергликемию, однако связывания этого ляганда с гепатоцитами не было обнаружено.
Высокоспецифические р-агонисты обладают ярко выраженной анальгетической активностью, опосредуемой р-рецептора-ми, которые расположены как в головном мозге, так и в снинпом мозге. Кроме того, р-рецепторы опосредуют целый ряд важнейших физиологических функций. Они участвуют в процессах дыхания (угнетение дыхательного центра и повышение его чувствительности к гиперкапнии); регуляции деятельности сердечно-сосудистой системы, регуляции аппетита, процессов обучения и памяти, терморегуляции, синтеза и высвобождения ряда гормонов (Dhawan B.N. et al., 1996). Кроме того, с р-рецепто-рами связано развитие привыкания к наркотическим веществам и наркомании.
456
Таблица 27.
Взаимодействие опиоидов с различными классами рецепторов
Типы рецепторов
8 м __Е2
Эндогенные пептиды
Мет-энкефалин ++ t ++
Лей-энкефалин ++ +++
р-эндорфин +++ 4-++
Динорфин Л 4-+ 4 44
Динорфин Б + + +++
а-неоэцдорфин + *4 +++
Экзогенные лиганды
Морфин 4-++ + +
Метадон +++
Эторфин 4-++ 4-++ 4-++ +++
Леворфанол +++ +++
Фентанил +++
Суфентанил 4-++ + +
DAM GO +4-+ +
Буторфанол 4-++
Бупренофин -*
Налоксон — - —
Налтрексон —i
СТОР —
Динренорфин
р-фуналтрексамид — * ++
Налоксоназин —* • *
Налорфин «— + +++
Пентазоцин ++ +
Налбуфин — ++ ++
Бремазоцин 4-4*+ ++ +++ ++
Этилкегоциклозацин + +4*4* +4*+
U50.488 +++
U69.593 4-++
Спирадолик + +++
Нор-биналторфнимин * — -
Налтриндол - * -
DPDPE ++
Дельторфин-П ++
DSLET + ++
Примечание: знаком + отмечены агонисты, знаком - отмечены антагонисты. Число знаков пропорционально степени выраженности свойств агониста/антагониста.
457
Таблица 28.
Эффекты опиоидов в моделях на животных (Pasternak, 1993)
Эффект Тип рецепторов Эффект агонистов Эффект антагонистов
Анальгезия супраспинальная спинальная Дыхание Ж КТ Психические функции 1*2 Н2'к Анальгезия Анальгезия Угнетение Угнетение Возбуждение
Пищевая мотивация Ссддативные эффекты р,к,5 МЛ Стимуляция Усиление Угнетение
Диуретические эффекты Синтез гормонов Стимуляция Стимуляция Угнетение
пролактин гормоны роста Синтез медиаторов ацетилхолин дофамин Mt Mi .5 Pi P2.8 Стимуляция Угнетение Угнетение Угнетение
к-Опиоидные рецепторы
Описаны следующие подтипы к-рецепторов: Kt (типичные агонисты: бремаэоцнц, дицорфип, цнклазацин), к2 (типичные агонисты: бремаэоциц, WIN 44,441, бензоморфал, [Arg6,Phe7]Mer-энкефалин) и к3 (агонисты: налмефен, динрепорфии, бремазо-цип, циклазошш).
Распределение к-опиоидиых рецепторов изучено слабо. Наибольшие концентрации этих рецепторов найдены в коре мозга, черной субстанции, ядрах ствола мозга. У крыс высокие концентрации к-рецепторов найдены также в дополнительном ядре. В спинном мозге и симпатическом ганглии крыс обнаружены лишь незначительные концентрации к-ониоидных рецепторов (Minami М., Saton М., 1995).
Опиоцдпые рецепторы к-тила обнаружены в ворсинках плаценты человека, по не у других млекопитающих. Показано, что эти репепторы участвуют в регуляции процессов высвобождения ацетилхолина.
к-Рецепторы выявлены на клетках лимфомы, а также па ряде иммунных клеток. По всей видимости, это говорит об участии
458
рецепторов данного типа в иммунных процессах, но роль их пока не ясна.
Роль к-рецеиторов заключается в регуляции болевой чувствительности, питьевой и пищевой мотивации. Возможно, что активация к-рецепторов приводит к угнетению высвобождения аптиди-уретического гормона (Lender К., 1983). Также к-опиоидные рецепторы участвуют в процессах терморегуляции и модуляции кардио-респираторных функций. Введите к-агонистов у людей может приводить к развитию дисфонии (Pfeiffer A. et al., 1986).
Биохимические свойства опиоидных рецепторов
Для детального изучения биохимических свойств опиоидных рецепторов многие годы предпринимались попытки выделить их из биомембраи в активной форме (солюбилизировать). Так, в начале 1980-х гг. Bidlack и Abood разработали методику очистки опиоидных рецепторов с помощью аффинной хроматографии. K.-J.Chang и P.Cuatrecasas (1981) разработали механический метод выделешгя рецепторов. Выделение опиоидных рецепторов с помощью детергента предложено в работах Simon E.J. (1981, 1984). В работе Зайцева С.В.и соавт., (1993) изучались опиоидные рецепторы лиофилизированных мембран, длительно сохраняющие свои свойства.
С помощью последней методики было показано, что опиоидные рецепторы сохраняют свои свойства в узком диапазоне температур: от 30 до 40°С. При увеличении (снижении) температуры связывание опиоидных агонистов и антагонистов резко изменяется. По всей видимости, при снижении температуры ниже 30°С или повышении более 40°С происходит обратимое изменение конформации рецепторных белков (Зайцев С.В. и соавт., 1993; Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г., 1999). Кроме того, опиоидные рецепторы чрезвычайно pH-чувствительны. рН-оптимум для 8-рецепторов составляет 6,0—7,0 и 7,5—7,5 для р-рецеиторов (Зайцев С.В. и соавт., 1993).
Значительный прогресс в изучении биохимических свойств чистых опиоидных рецепторов наметился только в последние годы. Он связал с развитием молекулярно-биологических методов. К настоящему времени рецепторные белки трех основных типов опиоидных рецепторов (р, 8, к) выделены и отклонирова-
459
цы (Kieffer B.L., 1995; Minami M., Satoh M., 1995). При этом, с молекулярно-биологической точки зрении, никаких данных, подтверждающих существование субтипов этих рецепторов, не получено. Только в работах Баре обнаружено незначительное различие (на 8 аминокислот) С-копца двух подтипов к-рецепторов, которое не приводит к существенным изменениям процессов связывания лигандов.
Изучение структуры ц-, 8- и к-опиоидных рецепторов показало, что они вряд ли транслируются с одного и того же гена (Dhawan B.N. et aL, 1996). Одиако, наблюдаемая высокая степень гомологии между опиоидными рецепторами различных типов не позволяет исключить наличие процессов альтернативного сплайсинга. Действительно, опиоидные рецепторы разных типов отличаются по аминокислотной последовательности не более чем на 40%, при этом опиоидные рецепторы одного и того же типа, выделенные у разных животных, совпадают но аминокислотной последовательности более чем на 90% (Knapp R.J. et al., 1995). Так, на рис.80 приведена модель мембранной топологии опиоидных рецепторов (Minami М., Satoh М., 1995). Как следует из рисунка, наиболее консервативными являются внутримембрагшые домены рецепторов. Наибольшие различия между различными типами опиоидных рецепторов наблюдаются в С-конце (Bell, Reisine, 1993).
Молекулярное клонирование показало, что опиоидные рецепторы сопряжены с G-белком и состоят из 7 трансмембранных доменов, 3 внутриклеточных и 3 внеклеточных петель. Внеклеточный N-копец рецептора имеет участки возможного гликозилирования: у б- и к- опиоидных рецепторов их два, у ц-опиоидпых рецепторов —пять. Различия в числе участков для гликозилирования приводят к существенным различиям в молекулярном весе различных опиоидных рецепторов (Dhawan B.N. et al., 1996).
Были изучены фармакологические свойства отклонирован-ных рецепторных белков в фибробластах обезьян и клеток, полученных из яичника китайских хомячков. Во всех случаях было показано индуцированное агонистами этих рецепторов ингибирование аденилатциклазы, природа которого до настоящего времени не ясна (Dhawan B.N. et aL, 1996).
При клонировании 8-опиоидпых рецепторов, полученных из клеток человеческой нейроглиомы (Evans C.J. et aL, 1992; Kieffer B.L. et aL, 1992), из нервных клеток мышей и крыс (Fukuda К.
460
Рис. 80. Модель мембранной топографии опиоидного рецептора. Аминокислотные остатки, идентичные для J1-, 8- и к-опиоидных рецепторов одновременно, показаны на рисунке черным цветом, идентичные для ц и 8- или ц- и к-рецепторов—серым цветом. Аминокислотная последовательность ц-рсцепторов, пеидентичная пи 8-, ни к- рецепторам, показана белым цветом. Значком 4х обозначены потенциальные участки гликозилирования.
et al., 1993), было показано, что эти рецепторы состоят из 372 аминокислот, 93% которых идентичны у животных разных видов (Knapp R.J. et al., 1994). Наибольшим сродством к клонированным рецепторам из алкалоидов обладал дипренорфип, чуть меньшим—эторфин. Было показано, что связывание палтрибепа с клонированными рецепторами вызывает ингибирование адени-латциклазы. Это позволяет предположить, что рекомбинантные S-опиоидные рецепторы по фармакологическим свойствам являются 32-рецепторами.
Клонированные к-опиоидные рецепторы мыши, крысы (Minami М. et al., 1993) и морской свинки связывают динор-фин и его аналоги с высокой аффинностью. Р-Эидорфип связывается с этими рецепторами с чрезвычайно низкой аффинностью. Определение сродства рекомбинантных к-опиоидных рецепторов к различным лигандам позволило предположить, что они идентичны «классическим» Kt-рецепторам.
Клонированные ц-опиоидные рецепторы крыс и человека
461
(Wang J.В. et al., 1994) связывают, как энкефалины, так и £-эндорфин. На основании сравнения сродства различных лигандов к этим рецепторам было сделано предположение, что рекомбинантные ц-ониомдные рецепторы идентичны р, -рецепторам (Wang J.B. et aL, 1994).
Молекулярные механизмы взаимодействия опиоидов и опиоидных пептидов с опиоидными рецепторами
Для понимания молекулярного механизма действия опиоидов необходимо знать структуру лигапд-реценторного комплекса на атомном уровне. Поскольку опиоидные пептиды мет- и лей-энкефалины и некоторые синтетические опиоиды, имеющие жесткую структуру, взаимодействуют с одними и теми же рецепторами, появляется уникальная возможность для оценки пространственной структуры пептид-рецепторпого комплекса.
Ниже приведена структура опиоидов и мет-эпкефалипа (рис. 81).
Между способностью этих веществ ингибировать электрически вызываемые сокращения vas deferens и подвздошной кишки морской свинки и сродством их к мембранам головного мозга крыс имеется корреляция. Найдено, что ключевую роль во взаимодействии с опиоидными рецепторами играет тирами-цовая часть пептида и фенольное кольцо морфина.
Удаление или ацетилирование a-аминогруины энкефалина сопровождается почти полной потерей у пего фармакологической активности, что указывает на необходимость присутствия положительно заряженного атома азота, так же как и четвертичного атома в молекуле морфина для проявления его биологического действия. Присоединение алилыюй группы к «-аминогруппе энкефалина приводит к появлению у него антагонистической активности; аллильное производное морфипа(иалок-сон) также является сильным антагонистом. 0-Метилирование тирозинового гидроксила энкефалина вызывает падение его физиологической активности; О-Метилированпый морфии (кодеин) также обладает слабой активностью.
8-специфичность нециклическим аналогам энкефалинов придают следующие свойства: гидрофильная боковая цепь остатка из одной или нескольких аминокислот в 5 положении, ароматический остаток в 4 положении, свободная СООН-групна в 5 ио-
Рис. 8!. Структура некоторых опиоидов и мст-эпксфалина.
ложепии, удлинение последовательностей добавлением триптофана.
Считается, что не взаимодействующие с опиоидными рецепторами глициновые остатки в положениях 2 и 3 энкефалина играют важную роль в создании оптимального пространственного расположения между тираминовой частью и липофильными остатками 4 и 5.
В экспериментах с производными орипавина присоединение пропил- или фенилэтильной группы к С-19 орипавина увеличивает его активность до уровня морфина, что указывает на наличие дополнительного липофильного участка в молекуле опиоидного рецептора, расположенного па расстоянии 1 нм от участка, связывающего фенолыюе кольцо лигандов (рис. 82). A. F. Bradbury и соавт.(1976) предположили,что между тираминовой частью и фенольным кольцом в положении 4 существует водородная связь 4 — 1, соответствующая
463
Рис. 82. Топография связывающих участков опиоидного рецептора. L1 — липофильный участок, взаимодействующий с фенольным кольцом, L2—липофильный участок, взаимодействующий с заместителями у С-19 атома, А— анионный участок, взаимодействующий с положительно заряженным азотом морфина, С— участок, взаимодействующий с 5-ми и 6-ми атомами углерода С-копца морфина [Schiller P.W., 1978].
расположению химических групп орипавина. Согласно этой модели, не происходит конформационного изменения пептида при его взаимодействии с рецептором. F.A. Gorin и G. R. Marshall (1977) предложили другую модель, согласно которой при связывании лиганда расстояние между двумя ароматическими кольцами составляет -0,5 нм, а в модели, предложенной A. F. Bredbury и соавт. (1976) оно равно 1 нм.
Это расстояние было найдено экспериментально в молекуле Тгр4, Ме1?-Э11кефалина, имеющего такое же сродство к опиоидному рецептору, как и природный пептид, оценив внутримолекулярный перенос энергии между хромофорами (тирозином и триптофаном) с помощью уравнения Ферстера па основании данных по тушению флуоресценции. Оказалось, что это внутримолекулярное расстояние у пептида в растворе равно 1 нм. Поэтому можно считать, если модель, предложенная F. A. Gorin и G. Marshall, верна, то при связывании пептида с опиоидными рецепторами расстояние между двумя ароматическими кольцами уменьшается до 0,5 им. Такое сильное конформационное изменение трудно предположить и необходимо применить новые методы и подходы для получения полной картины комплексообразования лигаидов с опиоидными рецепторами.
464
Хотя эксперименты по солюбилизации опиоидных рецепторов свидетельствуют, что они представляют собой белки или белковые комплексы, имеются также данные о том, что отрицательно заряженные лиганды играют существенную роль в свя-вываиии опиоидов. Действительно, цереброзидсульфат (3-0-Сульфогалактозилцерамид) обладает большинством свойств опиоидных рецепторов ЦНС. R.W. McLawhon и соавт. (1981) установили, что 3Н-эторфин неспецифичцо связывается с липосомами, состоящими из холестерина и фосфатидилхолина, ио такая специфичность появляется при добавлении к липосомам ганглиозидов GM2 и GM) или сульфатида. 3Н-Эторфин связывался также с экстрактом ганглиозидов гибридных клеток нейробластомы мышей NG108-15 и глиомы крыс NI8TG2, что указывает па возможную роль этих ганглиозидов в связывании опиоидов с данными клетками. Таким образом, можно считать доказанным способность отрицательно заряженных гликолипидов связывать опиоиды, ио физиологическое значение этого связывания еще не известно.
Именно поэтому представляют интерес следующие данные, согласно которым включение липидов в клетки нейробластомы с вомощью липосом потенцирует действие опиоидов па эти клетки. Включенный цереброзидсульфат обнаруживался во фракции плазматических мембран клеток, в которой определялась Наибольшая активность опиоидных рецепторов и вся активность аденилатциклазы. Обработка клеток 10 мкМ цереброзидсульфата в течение 8 ч, ио не добавление липосом непосредственно во время реакции увеличивает как исходный уровень цАМФ, так и стимулированный простагландином Ег Включение цереброзидсульфата вызывало повышение сродства опиоидных рецепторов к 3Н-налоксопу, но пе увеличение числа опиоидных рецепторов (Кд уменьшалась в 2 раза). Морфин пе вызывал уменьшения активности аденилатциклазы клеток NI8TG2 как базальной, так и стимулируемой простагландином Et, однако включений цереброзида приводило к дозозависимому ее ингибированию. При исследовании липидной специфичности выявлено, что для потенцирования опиоидной активности необходимо включение цереброзидсульфата. Из всех исследованных других фосфолипидов только фосфатидилхолин потенцировал ингибирующий эффект опиоидов. По мнению авторов, данный эффект цереброзидсульфата и фосфатидилхолина может быть обусловлен изменением активности мембранных трансметилаз I и И.
Сродство агонистов и антагонистов к данным рецепторам
465
весьма чувствительно к воздействию и ионов, и гуаниновых нуклеотидов. Влияние Na* на это сродство хорошо изучено. Считается, что при отсутствии Na* опиоидный рецептор комплементарен агонисту, а в присутствии ионов натрия —антагонисту. Вопрос о роли Na* в механизмах опиоидной рецепции подробно изложен в книге А. И. Майского и соавт. (1982).
Отметим, что другие ионы также регулируют взаимодействие лигандов с опиоидными рецепторами. Известно, что наряду с Na* К* и Li* заметно снижают величину специфического связывания агониста 3Н-О-А1а2-Туг-эпкефалина с опиоидными рецепторами головного мозга крыс, тогда как Mg2*, Мп2* и Са2* заметно его усиливали.
Гуаниновые нуклеотиды (ГТФ, ГДФ и гуанозиц-5-Р-,у-имидо-трифосфат) ингибируют связывание опиоидных агонистов с мем-браносвязанпыми опиоидными рецепторами клеток NG 108-15 (гибридные клетки нейробластомы и глиомы). Эти и другие данные (McLawhon R.W. et al., 1981) позволяют считать, что опиоидные рецепторы представляют собой комплекс опиатсвязывающе-го белка с гуанипнуклеотидчувствительным компонентом.
В то же время необходимо подчеркнуть, что при изучении влияния ионов и гуаниновых нуклеотидов па взаимодействие лигандов с опиоидными рецепторами важно учитывать их гетерогенность.
В этом аспекте весьма актуальными представляются данные K.J. Chang и соавт. (1981), которые выявили различное влияние ГТФ па взаимодействие лигандов с |Х- и 5-рецепторами. Эффект ГТФ был более выражен для ^.-рецепторов, чем для 5-рецепторов. Na*, Mg2* и ГТФ при совместном добавлении снижали сродство энкефалинов и других опиоидных агонистов к 5-рецепторам и сродство мет- и лей-эн кефали нов к |х-рецепто-рам сильнее, чем Na* и ГТФ в отдельности, но три агента в меньшей степени снижали сродство D-Ala2, Leu5- и D-Ala2, D-Еен5-эпкефалинов и морфина к р-рецеиторам, чем только Na* и ГТФ. Итак, количественные отличия в действии катионов и ГТФ на сродство лигандов к р- и 5-рецепторам иллюстрируют различия этих рецепторов и сложное взаимодействие катионов и нуклеотидов с опиоидными рецепторами.
Природа чрезвычайной чувствительности опиоидных рецепторов к ионам металлов и чрезвычайной рН-чувствителыю-сти была подробно исследована в работах Зайцева С.В. и др., (1993); Варфоломеева С.Д., Гуревича К.Г., (1999). Дляонреде-
466
леиия природы катионсвязывающих участков авторы строили корреляционные зависимости констант диссоциации различных металлов с рецепторами и с различными модельными соединениями (аминокислоты и др.) В случае 5-рецептора высокие значения коэффициента корреляции отмечаются для остатков фосфорной кислоты и фосфосерина, что указывает на участие фосфатной группы в рецепции 5-агонистов. При этом открытым остается вопрос: в состав какой молекулы (остатка) входит эта фосфатная группа? В равной мере это могут быть остатки серина или треонина или же это могут фрагменты фосфолипидов мембран. Последнее предположение наиболее вероятно, т.к. были получены убедительные данные об участии фосфолипидов мембран в процессах рецепции опиоидов. Однако вопрос до сих пор остается открытым.
На основании анализа корреляционных зависимостей для р-опиоидных рецепторов было показано, что центр связывания морфина содержит остатки гистидина, р-Рецепторы чрезвычайно чувствительны к содержанию в среде ионов кальция И магния. Кроме того, параметры pH-зависимости р-рецепто-ров близки к pH-зависимостям гистидина, что дает основание думать, что именно гистидин ответственен за рН-чувствитель-ность р-рецепторов. Кроме того, участие гистидина в рецепции р-лигандов подтверждают данные по химической модификации этих рецепторов диэтилпирокарбанатом (ДЭПК). Этот реагент при нейтральных значениях pH высокореактивен по отношению к имидазольным группам гистидина. Действительно, обработка мембранных препаратов, содержащих р-рецепторы, приводит к существенному снижению специфического связывания р-лигандов с мембранами, что подтверждает участие Гистидина в процессах рецепции р-лигандов.
Важные данные о взаимоотношении ц- и 5-опиоидных рецепторов получены в экспериментах R. В. Rothman и Т. С. Westfall (1982). Ими было обнаружено, что 3Н-лей-энкефалин соединяется с единственным классом связывающих участков мембран Клеток головного мозга крыс, а морфин по аллостерическому механизму снижает число участков, связывающих 3Н-лей-энке-фалиц. Этот результат дает возможность предполагать, что 3Н-ЛеЙ-эпкефалип имеет избирательную тропность к 5-рецепто-} рам, а взаимодействие морфина с р-рецепторами приводит к ! маскировке 5-рецепторов. При дальнейшем исследовании в этом Направлении R.B. Rothman и Т.С. Westfall (1982) обпаружи-
467
Рис. 83. Модель аллостерического взаимодействия между морфиновыми (ц) и энкефалиновыми (8) рецепторами. [Rothman, Westfall, 1982].
ли, что аН-эторфин избирательно связывается с р-рецептора-ми. Величины констант ингибирования (Кг) морфином, эндорфином и р-эндорфином связывания 3Н-эторфина близки к величинам, при которых они наполовину снижают число 8-реце-лторов. Мет- и лей-энкефалипы не влияли на связывание 3Н-эторфина, что указывает на отсутствие их сродства к р-рецеп-торам. Основываясь на этих результатах, авторы предложили рабочую гипотезу, согласно которой р- и 8-рецеиторы присутствуют в одном рецепторном комплексе и между ними имеет место аллостерическое взаимодействие (рис 83). Данная модель предполагает также, что p-эндорфин может связываться с р- и 8-рецепторами.
В следующей работе R.B. Rothman и соавт. (1983) была подтверждена эта гипотеза. Было выявлено, что 3Н-этор-фин и 3Н-налоксон связываются с одними и теми же рецепторами, а лей-энкефалин по неконкурентному механизму ингибирует связывание этих радиолигацдов. ДАДЛ ингибирует связывание 3Н-эторфипа с к-репенторами. Анализ конкурентных взаимоотношений между налоксоном и лей-эпкефалипом также показал, что лей-энкефалин слабо связывается с р-реце-пторами, причем р- и 8-рецепторы между собой аллостерически сопряжены.
Интересные данные по молекулярным механизмам связывания опиоидов с рецепторами были получены в работе (Minami
468
рецептор Ц MDDD DMMM MDMM DMDD
К* НМ 3,4б±0,84 - 3,16±0,91 - 5,24±0,86
'Рас. 84. Связывание селективного р-агописта (DAMGO [D-AIas, ;МеРЬс4,О1у-о13]-эпкефалин) с рекомбинантными ц/5- рецепторами. Участки, соответствующие ц-рецепторам, обозначены черным цветом (М), &• рецепторам —серым цветом (D). (Minami М., Satoh М., 1995). Kd— константа диссоциации DAM GO с рекомбинантными рецепторами.
М., Satoh М., 1995). Авторы использовали рекомбинантные рецепторы, состоящие из фрагментов р- и 8-рецепторов. Оказалось, что при замене первой внеклеточной петли ц-рецептора до фрагмент 8-рецептора, селективный р-агонист, DAMGO, связывался с рекомбинантным рецептором с чрезвычайно низкой аффинностью. При любых других заменах фрагментов ц-реце-пторов фрагментами 8-рецепторов существенного изменения аффишюсти не происходило (рис.84). Полученные данные свидетельствуют об обязательном участии первой внеклеточной Петли в процессах молекулярного узнавания опиоидов.
i Биохимические механизмы
[' функционирования опиоидных рецепторов
Как и любая другая рецепция, рецепция опиоидными [рецепторами их лигандов включает в себя не только процессы г узнавания, по и процессы передачи сигнала в клетку. В насто-[Цщее время эти многие из этих процессов изучены достаточно [Подробно, другие—не совсем.
К. Аденилатциклаза
г Детально вопросы сопряжения опиоидных рецепторов с аде-шлатциклазой были изучены ла клеточной линии NG108-15. Ю108-15 клетки являются гибридомной клеточной линией, по
469
лученной из клеток мышиной нейробластомы N18TG-2 и крысиной глиомы СбВи-1. Эти клетки содержат только один тип опиоидных рецепторов, а именно: 5-рецепторы (Chang K.J. et al., 1981). Опиоиды ингибируют как спонтанную, так и индуцированную простагландинами аделилациклазную активность клеток этой липни. Коклюшный токсин блокирует эффект опиоидов на аденилатциклазу NG108-15 клеток, что говорит об участии G( (Go) белка в ингибирующих эффектах опиоидов.
Ингибирующее влияние ц- и 5- агонистов на адепилатцик-лазу было также показано для многих регионов мозга, включая стриатум, таламус и околоводопроводное серое вещество. При этом было показано, что к-рецепторы не принимают участия в процессах ингибирования адеиилатциклазы в указанных областях. Однако к-агописты вызывали угнетение аденилатциклазной активности в мозжечке морских свинок.
Клонированные Ц-, 5- и к- рецепторы вызывали угнетение адеиилатциклазы в фибробластах обезьян и клетках яичника китайского хомячка (Evans C.J. et al., 1992; Wang J.В. et al., 1993). Этот эффект блокировалсв коклюшным токсином, что свидетельствует о сопряжении этих рецепторов с Gs или Go белками.
С другой стороны, стимулирующее воздействие опиоидов па аденилатциклазу также блокировалось коклюшным токсином. О классической точки зрения, аденилатциклаза угнетается Gl<0) белками. Однако также была описана аденилатциклаза второго типа, которая стимулируется через G|M) белки. Аденилатциклаза второго типа, сопряженная с опиоидными рецепторами, обнаружена в обонятельных луковицах крыс.
Кальциевые каналы
Активация ц-, 5- или к- опиоидных рецепторов приводит к ингибированию потепциал-зависимых кальциевых каналов. Этот эффект блокируется коклюшным токсином, что говорит об участии G, или Ge белков в процессе внутриклеточной передачи рецепторного сигнала. В работе (Minami М., Satoh М., 1995) предположено, что более вероятно участие Go, а не G| белков в этой передаче, что связано с классическими представлениями б функции этих белков.
Клонированные к-рецепторы па недифференцированных РС12 клетках также вызывали угнетение потенциалзависимых кальциевых каналов. Этот эффект блокировался коклюшным токсином.
470
J*uc. 85. Сопряжение опиоидных рецепторов с системами проведения И усиления сигнала {Smart D., Lambert D.G., 1996). В —рецепторы другого типа, АЦ — аденилатциклаза, ПКА—протеипкиназа А, 1Р3— мпоэито лтр ифосфат.
Калиевые каналы
Было показано, что активация ц- или 5-рецепторов приводит к активации потенциалзависимых калиевых каналов. Такая активация наблюдается в гиппокампе, нейронах желятшюзной субстанции (Minami М., Satoh М., 1995). Этот эффект был также обнаружен при изучении клонированных р-, 5- и к-рецепторов. Во всех (Случаях данный эффект блокировался коклюшным токсином, что Говорит об участии Go/G) белков в процессе внутриклеточной Передачи сигнала. В обобщенном виде сопряжение опиоидных рецепторов с эффекторными системами представлено на рис. 85.
. Роль опиоидной системы
!’; в развитии алкоголизма и наркомании
*' Еще задолго до открытия системы эндогенных опиоидных Пептидов, их аналоги было принято называть «наркотическими анальгетиками». Тем самым подчеркивалось, что эти соединения способны воздействовать на восприятие боли, на степень
471
осознанности действий. При введении в больших дозах наркотические анальгетики подавляют сознание и выключают болевую чувствительность. Побочными эффектами высоких доз веществ с наркотическим действием являются; изменение ритма и глубины дыхания, развитие гипотермии, расслабление мышечного тонуса.
После того, как была открыта и изучена эндогенная опиоидная система, была сформулирована гипотеза о ее роли в развитии алкоголизма и наркомании. Также было предположено, что некоторые вещества, пе способные непосредственно взаимодействовать с -«классическими* опиоидными рецепторами (этанол, марихуана), вызывают привыкание за счет воздействия на эндогенную опиоидную систему (Зайцев С.В. и др., 1993). Основными путями влияния на эндогенную опиоидную систему могут быть следующие: образование метаболитов, взаимодействующих с опиоидными рецепторами; влияние на сопряжение опиоидных рецепторов с системами проведения и усиления сигнала, модуляция секреции или выброса эндогенных опиоидов и другие.
Воздействие этанола на опиоидную систему
Этанол модулирует эффекты опиоидов, а опиоиды модулируют эффекты этанола. В экспериментах на животных было показано, что антагонист опиоидных рецепторов налоксон в значительной мере снимает синдром похмелья, что свидетельствует о вовлечении опиоидной системы в процесс формирования зависимости от этанола, а также налоксон уменьшает стремление к повторному приему алкоголя. Известно, что селективный антагонист 3-опиоидных рецепторов, ICI174864, снимает гипотермический эффект этанола. В работе Herz А., (1997) было показано, что прием алкоголя приводит к повышению выброса в кровь р-эндорфина, энкефалинов и динорфшюв, которые оказывают модулирующее влияние па мезолимбическую дофаминовую систему. При этом хроническое введение этанола увеличивает пе только выброс, но и синтез р-эцдорфипа.
С другой стороны, культивирование мембран клеток с этанолом приводит к существенному снижению специфичности
472
связывания 5-агонистов, не изменяя связывания ц.- и к-лигаи-дов. Исходя из этого, авторами был сделан вывод, что спирты, в первую очередь, оказывают влияние па 5-рецепцию. В дальнейшем было показано, что спирты действуют, нарушая липидный слой мембраны. Однако, in vivo, такой механизм вряд ли имеет место. Это связано с тем, что после перорального применения этанола его концентрация в крови не превышает 100 мМ, а значимое ингибирование связывание 3-лигацдов наблюдается в области порядка 300 мМ. Таким образом, концентрации этанола, наблюдаемые после его перорального введения, не могут существенным образом оказывать влияния па связывание опиоидов.
Хроническое введение этилового спирта приводит к достоверному изменению числа и аффинности опиоидных рецепторов. Имеющиеся в литературе данные во многом противоречивы и зависят от дозы, длительности введения и от вида животных. Однако, как подчеркнуто в обзоре (Зайцев С.В. и др., 1993), все обнаруженные изменения затрагивали 3-рецепторы И не затрагивали ц- и к-связывапие. Так, в работе (Pfeiffer A. et д1.,1981) показано снижение сродства 8-рецепторов к их селективным лигандам после 3-х недельного введения этанола крысам. У мышей после 5-дневпого введения этанола увеличивалось число 5-рецепторов в гомогенате мозга.
Интересные дашпяе были получены на гибридомных клетках JNG108-15, содержащих только 5-рецепторы. В серии работ группы Чарнесса было показало, что добавление в инкубациоштую сре-АУ этанола приводит к уменьшению связывания 5-лигандов. С Другой стороны, экспрессия 5-рецепторов возрастает на 85%, что ДОЖет свидетельствовать об уменьшении аффишюсти рецепторов. Кроме того, было показано, что инкубация NG108-15 клеток этанолом в течение 4 дней приводит к повышению чувствительности аденилатциклазы к ингибирующему действию 5-аго-нста эторфина в несколько раз. В эксперименте было показано, Ко этанол приводит к нарушению синтеза субъединиц G-бел-ПВ, подавляя синтез G^-субъедипицы С5-белка и усиливая син-Пз G^-субъединицы Ц.белка (Зайцев С.В. и др., 1993).
Ь Кроме тою, были получены многочисленные дагшые о влиянии этанола на биосинтез эндогенных опиоидов. Так, в работе chulz R. et al., (1980) было показано увеличение синтеза нро-Пиомелапокортипа в гипофизе через 20 мин после однократ-
473
иого введения этанола в дозе 2,5 г/кг массы крысы. При этом содержание иммуннореактивного пептида fj-эцдорфипа сохранялось повышенным не менее 40 минут. Другие авторы, используя другие схемы введения и других экспериментальных животных, показали сходные результаты. Хроническое введение этанола приводит, в первую очередь, к изменению синтеза проопиомелапокортина и содержанию (J-эцдорфина в тканях. Степень проявления эффекта зависит от изучаемой области мозга. Полученные данные дают основание достоверно утверждать, что этанол изменяет синтез эндогенных опиоидов, причем эффект во многом определяется наследственными и конституциональными факторами (Зайцев С.В. и др., 1993).
Роль опиоидной системы
в развитии наркомании
Как правило, развитие наркомании проходит три стадии:
1. Начальная стадия, которая характеризуется изменением реактивности организма и появлением психической зависимости.
2. Хроническая стадия, связанная с формированием физической зависимости.
3. Поздняя стадия, для которой характерно полное истощение организма.
Следует иметь в виду, что продолжительность стадий, их клиническая картина, степень выраженности тех или иных симптомов зависят от применяемого наркотика, его дозировки и способа введения, возраста и наследственно-конституциональных факторов.
Первой теорией, объясняющей привыкание к наркотикам, была теория даух фаз действия, согласно которой наркотики имеют две фазы действия: возбуждения и угнетения. Первая фаза менее продолжительна, поэтому требуется постоянное увеличение дозы для достижения желаемого эффекта.
В историческом плане интересна также гомеостатическая теория, предложенная Химмельсбахом в 1943 г. Согласно этой теории, при приеме наркотика происходит гомеостатическая адаптация к нему, которая нарушается при отмене препарата, вызывая синдром абстиненции.
Следует заметить, что физическая зависимость проявляется в непреодолимом влечении к наркотику и абстиненции (синдром
474
отмены). Влечение к наркотику определяет все поступки, вытесняя общественное поведение, половое поведение, чувство голода и жажды. Замена одного препарата на другой чаще всего не приводит к удовлетворению. Интересно, что проявления абстиненции всегда противоположны первоначальному действию наркотика. Так, при первом приеме наркотик приводит к гипотермии, оказывает седативное воздействие, приводит к сужению зрачков. При абстиненции, наоборот, развивается гипертермия, наступает общее возбуждение, зрачки расширяются.
Молекулярные механизмы наркомании до сих пор не изучены, литературные дашпяе во многом противоречивы. Известно, например, что морфин оказывает стимулирующее воздействие на синтез дофамина в голубом ядре, приводит к усилению синтеза серотонина и увеличению экспрессии р-адреноре-целторов в ЦНС, повышает активность энкефалиназы (основной фермент, осуществляющий расщепление эндогенных опиоидов в крови).
1»*; В исследованиях, проведенных Зайцевым С.В. и соавт. (1986, 1989, 1993) было показано, что у толерантных к морфину крыс после хронического введения этого препарата изменялись параметры связывания 5-, а не ц-рецепторов. При этом уменьшалось как число, так и аффинность 5-рецепторов. У крыс, нето-дерантцых к морфину, изменялись параметры связывания ц-рецепторов. У этих животных связывание ц-агонистов ухудшалось.
’ В других работах было показано разобщение опиоидных (рецепторов с вторичными мессенджерами при хроническом Е-—дении наркотиков. Так, снижение концентрации ионов каль-в нейронах при однократном введении морфина и восста-лепие ее до нормальной величины при хроническом введе-Йии. При этом формирование физической зависимости сопровождается увеличением активности цАМФ-протеинкиназы, что (Может привести к существенной компенсации ингибирующего (влияния опиоидов на активность цАМФ. В последние годы пыли также получены данные о снижении экспрессии G-бел-рюв и протеипкипаз при хроническом введении кокаина (Nestler 1997).
|i.. До настоящего времени открытым остается вопрос о механизмах формирования индивидуальной чувствительности (М наркотикам. Имеющиеся в литературе данные лишь позво--Ляют предположить, что потенциальными наркоманами яв
475
ляются люди с недостаточным биосинтезом эндогенных опиоидных пептидов, или лица с измененной чувствительностью р-рецепторов к их лигандам, или же люди, у которых но тем или иным причинам изменена система передачи рецепторных сигналов в клетки. Следует заметить, что изменение чувствительности рецепторов к лигандам может быть в первую очередь вызвано наследственными, а пе конституциональными факторами.
Опиоидные рецепторы — мишень действия лекарственных средств
С открытием опиоидных рецепторов все наркотические анальгетики, исходя из особенностей их взаимодействия с опиоидными рецепторами, делят на агонисты, антагонисты и анальгетики со свойствами и агонистов, и антагсншстов (частичные агонисты). В качестве наркотических агонистов в настоящее время используют морфии, героин (диацетилморфин), гидро-морфин (его можно вводить перорально в отличие от морфина и героина), кодеин, синтетические анальгетики морфинового ряда: оксикодон и леворфанол. Как наркотические анальгетики используют, кроме того, промедол, меперидин (медол) и его производные, а также метадоп (фенадон) и его производные.
В настоящее время ведется поиск наркотических анальгетиков, которые бы обладали обезболивающим свойством, не вызывая психо миметических эффектов, т. е. частичных агонистов опиоидных рецепторов. К частичным агонистам морфинового тина относятся пропирам, профадол и бупренорфин. Возможно, широкое применение найдет бупренорфин, так как при сублингвальном введении он лишь в 10 раз слабее морфина как анальгетик. Бупренорфин длительно находится в плазме крови и к нему очень слабо развивается толерантность и физическая зависимость, К частичным агонистам палорфинового типа относятся пентазоцин, налбуфин, буторфанол, из которых наиболее широко используется пентазоцин. Однако при сильных болях его применение ограничено ввиду появления психомиметических эффектов при повышении дозы.
Хроническое введение опиоидов (иногда даже второе-тре-тье) приводит к изменению концентрации опиоидных рецеп
^76
торов. В экспериментах на животных было показано, изменение концентрации опиоидных рецепторов наблюдается, в первую очередь, в областях, ответственных за восприятие боли: околоводопроводное серое вещество, черная субстанция (Yaksh 'T.L., 1997). По-видимому, данный механизм является основой .формирования синдрома привыкания к опиоидам.
, Чистые антагонисты опиоидных рецепторов налоксон и па-.д-трексон не обладают анальгетической активностью, но позволяют успешно бороться с острыми отравлениями морфином и его аналогами. Однако ври хроническом отравлении морфином эти антагонисты не оказывают лечебного действия и, бло--^сируя рецепторы, могут вызвать состояние абстиненции (Аии-Lwkob С. В., 1982).
L Важно отметить, что с опиоидными рецепторами могут взаимодействовать пе только классические наркотические анальгетики, по и некоторые другие фармакологические вещества, в (.Частности, анестетик кетамин, обезболивающий эффект которого подавляется налоксоном.
"" A.D.Finck и S.H.Ngai (1982) показали, что кетамин стерео-Специфично вытесняет 3Н-гидроморфип из его связи с опиоидными рецепторами головного мозга крыс, а также 3Н-эторфин Из различных областей головного мозга мышей in vivo, особенно из таламуса, по не из коры. Таким образом, эти результаты указывают па то, что обезболивающий эффект кетамина (главным образом его (+)-элаптиомера) во многом может быть обу-t словлен взаимодействием с опиоидными рецепторами.
Синтетический аналог энкефалинов, даларгип, нашел применение для лечения некоторых форм язвенной болезни. В Последние годы появились также данные об анксиолитическом действии данного препарата па крыс, зависящем однако от исходного психоэмоционального состояния животных (Зозуля 4-А. и соавт., 1998).
Мы считаем, что развитие биохимической фармакологии опи-Шдиых рецепторов позволит создать новые избирательные ЛВ для борьбы с болью как среди экзогенных опиоидов, так и среди кндогеппых опиоидных пептидов, увеличив их устойчивость к воздействию ферментов. Особенно перспективным представляется использование синтетических D-аиалогов эндогенных Опиоидов, которые устойчивы к действию ферментов.
477
Подводя итог рассмотрению основных достижений в области опиоидной рецепции, мы считаем необходимым подчеркнуть, что открытие опиоидных рецепторов, выделение и идентификация эндогенных опиатоподобпых пептидов, являющихся эндогенными лигандами этих рецепторов, в последние годы значительно расширили наши представления о нейрохимических механизмах функционирования ЦНС и ряда периферических органов. Можно надеяться, что ведущиеся интенсивные исследования об опиоидных пептидах и их роли в процессах восприятия боли, формирования эмоционального статуса, реакции на стресс, обучении и памяти, патогенезе шизофрапии и других психозов, зависимости и толерантности помогут решить многие медицинские и психобиологические проблемы.
Мы считаем, что в будущем необходимо больше внимания уделять взаимоотношением опиоидных рецепторов с другими видами рецепторов, поскольку, но уже имеющимся данным, процессы зависимости и толерантности к ошюидам могут усиливаться психотропными веществами, например, бензодиазепинами.
Глава 12
РЕЦЕПТОРЫ БЕЛКОВО-ПЕПТИДНЫХ ГОРМОНОВ
Исследования механизмов действия белково-пептидных тормолов за последние 30 лет привели к созданию теории реализации MX биологической активности. Основное положение этой теории Связало с понятием «рецепторы», которые ответственны за специфическое связывание белково-пептидных гормонов и преобразование гормонального сигнала в тот или иной вид биохимической и физиологической реакции.
В 60 — 70-х годах были получены экспериментальные факты (активация аденилатциклазы гормонами, ковалентно связанными с сефарозой, инактивация трипсином способности клеток связывать С Высоким сродством тронный гормон и др.), свидетельствующие О локализации данных рецепторов на плазматических мембранах компетентных клеток. Однако за последние несколько лег методами электронно-плотных меток и авторадиографии была показана Возможность проникновения белковом ieптмдпых гормонов в клетки путем пипоцитоза (т.е. подвергаться интернализации) и существования для них внутриклеточных рецепторов.
Нами проводились исследования некоторых аспектов функционирования рецепторов белково-пептидных гормонов, направленные па выяснение роли конформационных перестроек мембран В реализации физиологической активности этого класса соединений.
Данная глава посвящена анализу собственных и современных Литературных данных о локализации, химической природе, обмене | функциональной активности рецепторов белково-пептидных горюнов в норме и патологии, а также о молекулярных механизмах фИимодействия гормонов с рецепторами.
479
12.1. Белково-пептидные гормоны как лиганды рецепторов
К гормонам, имеющим белково-пептндную структуру, относятся гормоны гипофиза, поджелудочной и щитовидной желез, рилизинг-факторы гипоталамуса. Передняя доля гипофиза секретирует адренокортикотропный гормон (АКТГ), фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), липотропный гормон (ЛТГ), соматотропный гормон (СТГ), тиреотропный гормон (ТТГ), лактогенный гормон (ЛТГ), или пролактин, лютеинизирующий гормон (ЛГ). В промежуточной доле вырабатывается мелапоцитстимулирующий гормон (МСГ), в задней — окситоцин и вазопрессин. В щитовидной железе образуется тиреокальцитонин, в паращитовидной железе — паратгормон, в поджелудочной инсулин и глюкагон. Кроме того, с некоторыми оговорками к гормонам можно отнести и другие физиологически активные пептиды: ангиотензины, субстанцию Р, брадикинин, нейротензин, вазоактивный нентнд кишечника, соматомедипы, нейроме-дин К, пейронептид У, холецистокшшн, гастрин, интерлейкины, тромбин, секретил, факторы роста, активин, ингибив, эритропоэтин, интерфероны, онкостатин, фаторы некроза опухолей и др.
По химическому строению большинство из них представляет собой простые пептиды, образованные одной пептидной цепью, в состав которой входит различное число аминокислотных остатков: отЗ в тиреотронин-рилнзипг-факторе до 198в ЛТГ. В отличие от других белково-пецтидиых гормонов молекула инсулина состоит их двух пептидных цепей, связашпях между собой дисульфидными мостиками. К сложным белкам — гликопротеинам — относятся ЛГ, ФСГ, ТТГ.
После коррелятивного анализа аминокислотной последовательности некоторых белково-пептидиых гормонов и кининов было обращено внимание на то, что данные соединения содержат фрагменты, включающие от 2 до 5 идентичных или сходных аминокислот (схема 9).
Г.И.Чиненс и соавт. (1972) назвали эти участки общими фрагментами н сделали вывод, что общие структурные фрагменты отражают онределе1шую закономерность, поскольку статистическая вероятность нахождения двух одинаковых аминокислот, а тем более трех и более в одинаковой последовательности в структурах различных пептидов незначительна. Общие фрагменты, ио-видимому, ответственны за общность действия ряда белково-нентнд-пых гормонов, выражающегося в индукции изменения активности аденилатциклазы.
В то же время в структуре каждого гормона можно выделить
480
СХЕМА 9. Строение некоторых белково-поптадпых гормонов с ука-ЭИ1 тем общих фрагментов
цйптры, определяющие их взаимодействие только с клетками-мишенями и специфику их действия. В литературе принято называть их гофмацскими центрами [Сергеев П.В. и др. 1996].
Однако по сравнению с лигандами других рецепторов особенностью белково-пелтидиых гормонов является существование у них третичной структуры, что во многом осложняет определение участков их молекул, ответственных за связывание с рецепторами И за обеспечение трансформации биологической активности гормонов внутри клетки.
12.2. Молекулярные механизмы взаимодействия белково-пептидных
г гормонов с рецепторами
}' Определение параметров связывания гормонов с рецепторами Необходимо для идентификации рецепторов и получения информации об их функционировании. Взаимодействие данных гормо-М с рецепторами характеризуется быстротой, обратимостью, за
л.317
48)
висимостью от температуры, величины pH, присутствия одновалентных и двухвалентных катионов и гуаниновых нуклеотидов, в ряде случаев кооперативностью и наличием специфических и неспецифических участков связывания. Кинетика гормон-рецептор-иого взаимодействия зависит от температуры и концентраций молекул-партнеров. При 37° С равновесное состояние обычно достигается в течение нескольких минут, а при более низких температурах оно может пе настукать даже при истечении нескольких часов [Kahn C.R., 1976]. Некоторые сведения о параметрах связывания белково-пептидных гормонов с их рецепторами приведены в табл. 29.
Из таблицы видно, что при взаимодействии белково-пептидных гормонов с рецепторами может иметь место отрицательная или положительная кооперативность связывания либо ее может пе быть. Отрицательная кооперативность, сопровождающаяся снижением сродства рецепторов к гормонам, в большинстве случаев обусловлена увеличением скорости диссоциации комплекса гормон — рецептор. Кооперативный эффект сохраняется при солюбилизации рецепторов инсулина [Ginsberg В.Н. et al., 1976] и ТТГ [Jarfett L. et al., 1974]. В случае инсулинового рецептора отрицательный кооперативный эффект характеризуется снижением размеров солюбилизированного рецептора, вероятно, вследствие диссоциации субъединиц и уменьшением сродства к гормону в 10 раз [De Meyts Р. et al., 1976].
Поданным E.F.Verspohl и соавт. (1982), обработка клеток пан-креотических островков (Лангерганса) крысы трипсином (6 ЕД/ мл), нейраминидазой (100 ЕД/мл), 1-этил-3-(димегил-аминопропил)-карбодиимидом (20 мМ), тетранитрометапом (5 мМ) и 1,3-ди-фтор-4,2-дипитробензолом приводит к снижению Вмаи. взаимодействия 1г51-инсулш<а с этими клетками с 0,58 • 10 ,т М на один островок до 0,36, 0,30, 0,14, 0,08 и О.ЗЗ-Ю17 М на один островок соответственно. Трипсин, кроме того, увеличивал Кд с 0,4 до 8,3 нМ. Обработка клеток всеми перечисленными агентами снижала их чувствительность к ингибирующему эффекту экзогенного инсулина на секрецию островка инсулина. В то же время обработка данных клеток фосфолипазой не влияла на параметры связывания инсулина и его биологическое действие. Дитиоцитробензол (0,5 мМ) и п-хлормеркурийбензоат (0,5 мМ) увеличивали В _ до 1,88 и 1,210‘,т моля на один островок и Кд до 5,8 и 2,6 нМ соответственно, не изменяя чувствительности секреции клетками инсулина к экзогенному инсулину. Можно полагать, что аминогруппы, сиаловые кислоты, карбоксильные группы и тирозиновые
482
Таблица 29.
Параметры связывания белково-пептидиых гормонов с их рецепторами.
Локализация рецепторов К (М1) Констант скорости ассоциации. с ‘М1 Константа скорости диссоциации. (Гг В„ (число участков на клетку) Кооперативность связывания
Инсулктеые рецепторы
Печень 1,2X10* 0.13-1X Ю‘» О,7Х 10"» 100000-250000 Отрицательная;
Гепатоциты изолирован- К« 2X10* —— 50000
ные KjiJxlO* 3,3X10* 9100 —
Адипоциты 4,1X10» 1,1X10"* 50 000 Отрица-
10—12X10* тельнее
через 24 ч после удаления инсулина — — — 20X10* —
Моноциты 1,3X10* — — 16000 Отрица-
тельная
Эритроциты 3,2x10* Отрица-
индюка 3000 тельная
Эритроциты
лягушки Эритроциты K.i5,8xl0* — — 425 —-
СВИНЬИ 8,2X10’ — 29
Снкаптосо- МЫ мозга Эмбриональная — — 80*
3,3X10»
карцинома Клетки панкреатических К., 1,69x10” —— 0,112X10*
Островков Мембраны 2,2X10» — 0.58Х10-1’" —
плаценты 2,93-3,70*
Плацента (меле солюбилизации) К.ДЗХ10* К„22х10* — — 0,29* 1,95*
Асцитные
‘Нлаткн Эрлиха 3—1x10’ 180000
Пдаанатнче- K..1.5XI0* __
*ВМ мембраны шктовнд- Oxio* — — — —
[ВОЙ железы Выце Ядра клеток К„0,08x10*
щитовидной Ммлеэы быка Км1,4Х10* — —
|иавматиче-ме мем бра-ВМ И ядра ге-Катоцнтов
р№ией 0,3x10* —
483
Продолжение.
Локализация рецептора» К/М-') Констанга скорости ассоциации. с-'М-1 Константа скорости диссоциа-шш. с-1 (число участков на клетку) Кооперативность свяэыва НИЯ
Глюкагоновые рецепторы
Печень 1,5X10» 1X10» 4x10-» 110000
Плазматические мембраны гепатоцн* тов 2,5X10» —
Рецепторы СТГ
Лимфоциты Плазматические мембраны различных органов Мембраны комплекса Гольджи легких крыс 1,3X10» 0,026— 0,32X10» 1X10» — — 4000 Нет
Рецепторы Л Г
Клетки Лейдига 0,5—1x10*» 1x10» 2Х10-* 6000 Нет
Рецепторы хорионического гонадотропина
Яичинк 0,6X10*» 2,8X10» 2,1Х1О~» — —
Рецепторы ЛТГ
Микросомы печени Гранулезные 5,6X10» 1.5X10*» 1 1 —
клетки Печень 1,02—1,20x10» 0,6-1,8‘ •
Печень (после солюбилизации) 1,06—4,48"
Гонадоли Сериновые рецепторы
Передняя доля гипофиза зхю» 13x10’ 0,015— 0,018 — —
484
Продолжение.
Локализация рецепторов К/М-’) Константа скорости ассощИ’ ции. с-'М"1 Константа скорости диссоциации* с-1 (число участков на клетку) Кооператив^ ноегь связыва НИЯ
Рецепторы ТТГ
Щнтовадная Железа 1,9X10* КмбХЮ* К„17^1Х1О’ 1X10* 6x10-* 500 1,3X10-* — 7.2ХНГ* — Отрицательная
Рецепторы АКТГ
Кора над-^Мечников 7x10s — 3840
Вазопрессякопые рецепторы
Почки 5X10» 3.8X10* 7,5X10-» Положительная
Плазы атн че-Шне мембраны печени 2X10» 1,5*
Ангнотензн новые рецепторы
Надпочеч- 0,2-0,5x10* 2,4X10» 5x10"» Нет
КИКН
Мембраны 6,6x10» 0,800"
печени К.И.9Х10» 1Х10-* 0,229"
К«3,4Х1О» 7,5X10-* 1,820"
к^з.гхю» 0,650" —
К«а2,4х10» — 1,740" —
Сомптостптмнопые рецепторы
Мембраны передней поди гипофиза 8,6X10» — —»
485
Продолжение.
Локализация рецепторов
Ка(М') Константа скорости ассоциации. Константа скорости диссоциации. С-’ В (число KWC учаегковна клетку) Кооперативность связывания
Рецепторы паратгормона
Остеобласты 1,7x10s
1000
Примечание. Одной звездочкой обозначено число пикомолсй на 1 мт белка, двумя — число молей на островок.
гидроксилы, но не SH-группы и не фосфолипиды, участвуют во взаимодействии инсулина с рецептором клеток панкреатических островков. По-видимому, уменьшение числа инсулиновых рецепторов сопровождается уменьшением физиологического ответа клеток на инсулин.
При анализе количественных взаимоотношений между связыванием гормонов с рецепторами и их биологическим действием было показано, что ответ тканей-мишеней прямо пропорционален числу занятых рецепторных мест при низких концентрациях гормонов [Кап Р., Рот Дж., 1979]. Максимальный ответ часто достигается при насыщении небольшого числа рецепторов, т.е. существуют «запасные* или «резервные* рецепторы в соответствив с теорией Стефенсона (см. главу 2, часть I). Например, максимальная стимуляция инсулином окисления глюкозы или липогелеэа в жировой ткаии наблюдается в равновесных условиях при занятости лишь 2% всех имеющихся рецепторов.
S.Clark и соавт. (1981) показали, что обработка мембран плаценты фосфолипазой снижает вязкость мембраны и вызывает увеличение связывания 1г51-инсулипа за счет повышения числа связывающих участков. Скорость диссоциации ,251-инсулипа при 4 °C и при 24 °C была ниже у обработанных фосфолипазой мембран, чем у контрольных. Следовательно, можно считать, что обработка мембран фосфолипазой увеличивает подвижность рецепторов инсулина при 24 °C, но пе при 4 °C (это позволяет рецепторам или их субъединицам образовывать большие агрегаты и увеличивает сродство к инсулину), причем степень агрегации рецепторов регулирует их сродство к инсулину и, но крайней мере, частично опре-
486
делиет отрицательную кооперативность связывания инсулина.
B.H.Ginsberg и соавт. (1982) обнаружили, что увеличение количества фосфолипидов с ненасыщенными связями в плазматических мембранах асцитных клеток Эрлиха приводит к увеличению числа инсулиновых рецепторов, но и к уменьшению их сродства. Напротив, увеличение содержания фосфолипидов с насыщенными Связями сопровождалось уменьшением числа инсулиновых рецепторов и повышением их сродства к их гормону.
C.H.Powel-Jones (1981), изучая кинетику диссоциации комплекса тиреотропин—рецептор мембран нормальной щитовидной железы человека, установил, что диссоциация связанного ,251-тиреотропи-на двухфазна: Г равен 1,6 мин, t” составляет 86 мин. Диссоциация ускорялась при добавлении 0,15 М NaCl или 0,1 М MgCl2 и оставалась двухфазной. Медленно диссоциирующий компонент был более чувствителен к солям, чем быстро диссоциирующий компонент. Доля медленно диссоциирующего компопфиа повышалась При увеличении времени инкубации при 25°С, но не при 0°С. Авторы полагают, что при ассоциации формируются способные быстро диссоциировать комплексы 1г51-тиреотрошш—рецептор, которые при длительном существовании превращаются в медленно диссоциирующие комплексы вследствие диссоциации аденилатциклазы, сопряженной с рецепторами либо в связи с конформационными переходами рецепторов. Другими словами, связывание пептидных гормонов с рецепторами пе может быть описано как простая обратимая бимолекулярная реакция.
Неоднократно было показано, что гуаниновые нуклеотиды мо-Гут выступать в качестве аллостерических регуляторов рецепторов белково-пептидных гормонов, изменяя связывание лигандов и биологический ответ. По данным Y.Solomon и соавт. (1975), Н.Glossman и соавт. (1974), а также S.Jard и соавт. (1982), ГТФ стимулирует диссоциацию комплексов глюкагона, ангиотензина и вазопрессина с их рецепторами. ГГФ снижает сродство вазопрессина и ангиотензина II к их рецепторам мембран клеток печени крыс, по не влияет на связывание антагонистов этих гормонов [Ford S. et al., 1982]. Связывание ангиотензина II и глюкагона аффективно подавляется ГТФ в микромолярных концентрациях, а Вазопрессина в миллимолярных. Негидролизуемый аналог ГТФ о-гуан ил имидодифосф ат действует на ангиотепзиновые рецепторы аналогично ГТФ, но не влияет па вазонрессиновые рецепторы. Предполагается, что снижение сродства вазопрессина к его рецепторам в присутствии ГТФ обусловлено их фосфорилированием.
487
Связывание белково-пептидных гормонов с рецепторами зависит от величины pH и концентрации двухвалентных и в ряде случаев одновалентных катионов [Kahn С., 1976., Crane J.K. et al., 1982]. Более того, ингибирование гуаниновыми нуклеотидами связывания'^-ангиотензина II с мембранами печени крыс требует присутствия катиона — Mg2+ или Na+.
Рецепторы для вазоактивных полипептидов (ангиотензин, вазопрессин, брадикинин, субстанция Р и нейротензин) присутствуют в артериях, венах и сердце. Они опосредуют влияние пептидов па периферическое сопротивление сосудов, тонус вен, частоту сокращений сердца и коронарный кровоток. Некоторые данные о сродстве этих пептидов к сосудистым рецепторам и характере вызываемых ими эффектов представлены па табл. 30.
Сосудистые эффекты всех пептидов непосредственно обусловлены их взаимодействием с рецепторами, за исключением нейротензина, действие которого па портальную вену было опосредовано простагландинами,
Таблица 30.
Фармакологические эффекты, опосредованные рецепторами для вазоактивных пептидов [Regoli D., 1982]
Пептид Источник рецепторов Сродство пейте дов <t>D' нлп 1D’>
Ангиотензин Аорта кроликов Предсердие кроликов 8,86 7,36 Сокращение Вазодилатация
Брадикинин Сонная артерия собаки Шейная вена кроликов 8,64 8,46 Расслабление Сокращение
Дез-Arg1-брадикинин Аорта кроликов 7,27 >
Субстанция Р Сонная артерия собак Брыжеечная вена кроликов Сердце кроликов 10,0 7,5 3,3xl0-»M Расслабление Сокращение Вазодилатация
Нейротензин Портальная вена крыс Сердце крыс 1.6х10-»М 3,ОХ1О-*ЛЦ Сокращение Вазоконстрикция
’pD — логарифм концентрации пептида, при которой он вызывает эффект, соответствующий 50% от максимального.
J1D — промежуточная доза пептида в тех случаях, когда его максимальный эф<[х?кт определить нс удалось.
488
Рис. 86. Локализация ангиотензииовых рецепторов ЦНС.
d! t — рецепторы на Поверхности клеток желудочков головного мозга; 3 — рецепторы на клетках головного мозга; 3 — рецепторы синапсов, обрадованных ангиотензииер-Гнческими нейронами (Felix D., 1982].
Желу дочли головного нозга
Ангиотензин. Анализ действия ангиотензина и трех его аналогов на рецепторы сосудов и кишечника показал, что существует Один тин ангиотензииовых рецепторов [Regoli D., 1982]. Однако следует отметить, что в головном мозге, почках и надпочечниках Также имеются ангиотекзиновые рецепторы [Felix D., 1982; Mandelson F.A.O. et al., 1983]. Локализацияангиотензииовых рецепторов в головном мозге представлена па рис. 86. Хотя еще нельзя заключить, идентичны ли они периферическим апгиотецзи-новым рецепторам, одиако можно утверждать, что ангиотензин выполняет двойственную функцию: как истишгый гормон, циркулирующий в крови, и как эффекторный пептид, высвобождающийся из ангиотепзинергических нейронов и выступающий в роли нейромедиатора. Как при введении ангиотензина II в кровеносное русло, так и в желудочки головного мозга наблюдается повышение артериального давления [Felix D., 1982]. Кроме того, при его центральном введении ангиотензин высвобождает вазопрессин и АКТГ,
489
стимулирует истребление жидкости, нарушает обучение. На основании физиологических и фармакологических исследований эффектов ангиотензина II и распределения ангиотеизиновых рецепторов в головном мозге N.E.Sirett и соавт. (1982) пришли к выводу, что ангиотензин является медиатором. Его действие проявляется в лимбической системе. Кроме того, ангиотензиновые рецепторы расположены на лактотрофных и коргикогрофных клетках гипофиза и опосредуют действие ангиотензина II на секрецию пролактина и АКТГ [Mandelson FA.О., 1983]. В отличие от ашио-тензиновых рецепторов надпочечников и сосудов число ангиотензиновых рецепторов передней доли гипофиза не зависит от солевого баланса или от инфузии ангиотензина II.
Данные о влиянии трех различных видов вазопрессина, встречающихся в природе, на артериальное давление, диурез и изолированную матку крыс (dp-Tyr-Me-AVR и Tyr-Me-AVR подавляют действие вазопрессина па матку крыс, но не влияют на его анти-диуретический эффект; только dp-Tyr-Me-AVR ингибирует гипертензивное действие вазопрессина) указывают па существование, по крайней мере, двух типов вазонресснновых рецепторов.
Кинины При изучении кининовых рецепторов также были выявлены два типа рецепторов: В , опосредующие сократительное действие брадикинина па аорту и брыжеечную вену кроликов, и В2, опосредующие расслабляющее действие брадикинина на сонную артерию и шейную вену кроликов [Regoli D., Barabe J., 1980].
Субстанция Р. Исследование действия другого вазодилататора — субстанции Р и ее производных на сонную артерию собак, подвздошную кишку морской свинки и толстый кишечник крыс — дало возможность предположить существование трех различных типов рецепторов для этих пептидов [Regoli D., 1982].
Нейротензины. Поскольку D-Trp" и Туг-Ме‘1-нейрстензин блокируют влияние нейротензина па портальную вену и сердце крыс, но пена желудок, F.Rioux и соавт. (1980) считают, что существуют два типа нейротензиповых рецепторов.
Таким образом, проведение фармакологических экспериментов, в которых были определены такие параметры, как сродство и внутренняя активность вазоактивных пептидов, позволяет заключить, что для вазопрессина, кининов, нейротензина и субстанции Р существует несколько типов рецепторов, а для ангиотензина — единственный класс рецепторов. Дальнейшие биохимические исследования указанных рецепторов должны опровергнуть или подтвердить это положение.
490
Необходимо отметить, что нейромедиаторную функцию может выполнять не только ангиотензин, но и другие белково-пептидные гормоны. В подтверждение этого предположения можно привести следующие данные: 1) J.A.Fixher и соавт. (1981) обнаружили высокое содержание кальцитонина и его рецепторов в гомогенате гипоталамуса человека; 2) S.Ganuneltoft и соавт. (1981) показали связывание инсулина и вазоактивного полипептида кишечника с синаптосомами головного мозга крыс с Кд, равным 3 и 5 нМ соответственно; 3) Н.Hanley и соавт. (1982) выявили связывание 3Н-субстанции Р с препаратами мозга крыс с Кд, равной 0,04 нМ.
У тиреотропин-рилизипг-фактора выявлена анальгетическая активность, которая была значительно выше при его введении в желудочки головного мозга, чем при внутрибрюшинном введении мышам. При этом максимальный внальгетический эффект указанного пептида выше, чем у морфина. Антагонисты норадреналиновых, дофаминовых, серотониновых рецепторов не влияют на его обезболивающее действие. Все это дает возможность предполагать, что сильная обезболивающая активность тиреотропин-рили-Зипг-фактора обусловлена его взаимодействием с еще неизученными рецепторами ЦНС.
Заканчивая рассмотрение различных аспектов комплексообразования белково-нептидных гормонов с рецепторами, необходимо указать на специфичность этого комплексообразования. Обычно при изучении конкуренции между меченым гормоном и его аналогами за связывание с рецепторами имеет место корреляция между конкурирующей способностью соединений с их биологической активностью. Имеются данные об антагонистах белково-нептидных гормонов, которые специфично конкурируют с гормонами за связывание с рецепторами, но не вызывают физиологической реакции [Birubanmer L. etal., 1982].
Гормоны с близкой биологической активностью могут связываться с одними и теми же рецепторами. Например, ЛГ и хорионический гонадотропин непосредственно взаимодействуют с одним и тем же рецептором в гонадах [Rao S.V., Saxena В., 1973], а такие родствышые гормоны, как секретин, глюкагон и вазоактивный пептид кишечника, имеют различные рецепторы [Rodbell М. et al., 1971; Desbuguois В. et al., 1973]. Для гормонов, у которых перекрываются спектры их физиологической активности, характерны более сложные взаимоотношения. СТГ, пролактин и плацентарный лактоген реализуют свои эффекты посредством, по крайней мере, двух рецепторных участков: одного более специфичного к СТГ [Lesniak
491
M.A, et al., 1974], а другого более специфичного к лактогенным пептидам [Shin R.P.S., Friesen H.G., 1974]. Аналогично описанному, инсулин имеет некоторое сходство в своем действии на рост клеток и утилизацию глюкозы с ростковыми факторами и сомато-мединами. И в данном случае находят один класс рецепторов с высоким сродством к инсулину и с низким сродством к ростковым факторам и другой класс рецепторов с более высоким сродством к ростовым факторам, чем к инсулину [Van Wyk J.J. et al., 1974; Mrgyesi К. et al., 1975]. Эти данные указывают, что для того или иного типа белково-пептидных гормонов могут существовать различные классы рецепторов, идентифицируемые как с помощью радиолигандов, так и путем фармако-биохимического анализа. Несомненно, создание в будущем новых специфических антагонистов различных белково-пептидных гормонов будет способствовать выяснению их гетерогенности в аспекте функциональной активности и сродства к лигандам.
12,3. Субклеточная локализация рецепторов белково-пептидных гормонов
Хорошо известно, что рецепторы для белково-пептидных гормонов присутствуют на плазматических мембранах компетентных клеток. Об этом свидетельствуют результаты экспериментов по связыванию меченых гормонов с интактными клетками [Catt К.Н., Dufan M.L., 1973; Kohn С.К., 1976], с очищенными плазматическими мембранами (при очистке концентрация рецепторов увеличивается в 30 — 100 раз) [Freychet Р. et aL, 1971; Kahn С.К., 1975, 1976] и но изучению биологической активности производных гормонов, ковалентно присоединенных к гранулам агарозы или сефарозы [Джейкобс С., Куатреказас И.П., 1979]. Однако ряд исследователей выявили и присутствие участков, специфически связывающих белково-пептидные гормоны, на внутриклеточных органеллах-мембранах незернистой и зернистой эндоплазматической сети, комплекса Гольджи и ядра [Bergeron J.J. et al., 1973; Harvat A.E. et al., 1975].
По данным W.V. Moore и соавт. (1981), ,г51-соматотропин человека специфически связывается с фракциями плазматических мембран и мембран комплекса Гольджи печени крыс, причем мем-
492
брапы комплекса Гольджи связывают гормон даже с большим сродством, чем плазматические мембраны. Для СТГ также найдены рецепторы мембран комплекса Гольджи, которые отличаются отего рецепторов плазматических мембран [Moore W.K., 1981].
О способности инсулина связываться с мембранами комплекса Гольджи сообщили D.J.Flint и D.W.West (1984).
P.Steenuhout и соавт. (1981) показали, что через 12 мин после инъекции ,й1-инсулина в брыжеечную вену кролика большую часть метки обнаруживают внутри гепатоцитов, а при одновременной инъекции избытка немеченого инсулина метка внутри клетки не накапливается. Авторы считают, что введенный в воротную вену инсулин в течение 3 мин связывается с плазматическими мембранами гепатоцитов и через 3 мин интерпализуется. По их мнению, в условиях in vivo интерпализуется только связанный с мембранами инсулин.
Большой интерес представляет сравнение связывания белково-пептидных гормонов с плазматическими и ядерными мембранами компетентных клеток. A.Brisson-Loingarr и CJ.Blum (1983) показали, что 1251-инсулип специфически и обратимо связывается с изолированными ядрами и плазматическими мембранами клеток щитовидной железы быка. Равновесие достигалось за 1 ч при связывании ,251-ипсулина с ядрами и за 2 ч при его связывании с плазматическими мемирачами. По данным графиков Скэтчарда, на Ядрах и плазматических мембранах присутствуют два класса связывающих центров с высоким (Кд равна 1,3 и 0,6 нМ) и низким (Кд равна 667 и 208 нМ) сродством соответственно. Диссоциация радиолиганда, связанного с рецептором па плазматических мембранах, но не на ядре, ускорялась в присутствии немеченого инсулина, Что может указывать на отрицательную кооперативность связывания инсулина с плазматическими мембранами, но не с ядром.
J.A.Goid (1981) обнаружил три компонента с Мг 120 000, 90 000 и 50 000 в плазматических и ядерных мембранах печени Нормальных мышей и с ожирением, связывающих ,251-инсулии. Од-’ нако ядерные мембраны по сравнению с плазматическими содержали меньше белков, связывающих инсулин. В то же время сродство инсулина к рецепторам ядерных и плазматических мембран было одинаковым (Кд~ 3 нМ).
I.D.Goldfine и соавт. (1982) показали, что после инкубации ядер с 1251-инсулином связагшый с ядрами инсулин присутствует в
493
основном в мембранах ядра. Инсулин связывался также с очищенными ядернымн мембранами. При этом в ядерных мембранах обнаружены два класса участков связывания (рецепторов) инсулина с низким и высоким сродством (Кд равна 5,6 и 65 нМ соответственно). Эти рецепторы инсулина в ядерных мембранах имели пониженное сродство к инсулину, чем его рецепторы плазматических мембран. Суммарная иисулинсвязывающая способность ядерных и плазматических мембран одинакова (2 нмоль/мг белка). Аутоантитела против инсулина от больных с ипсулин-устойчивым диабетом угнетали связывание инсулина с ядернымн мембранами, но в значительно меньшей степени, чем с плазматическими мембранами. В низких концентрациях (1 пМ) инсулин стимулировал выход мРНК из ядер в бесклеточной системе и вызывал увеличение активности связанной с ядернымн мембранами нуклеозидгрифос-фатазы.
Таким образом, можно считать, что инсулиновые рецепторы ядерных мембран наряду с его рецепторами плазматических мембран принимают участие в связывании гормона и в реализации его биологической активности.
В дополнение к этому можно указать на сообщения о ядерной локализации связывающих участков для ТТГ в фолликулярных клетках щитовидной железы [Greenspan F.S., Hargadine J.P., 1965], митохондриальной локализации связывающих участков для паратгормона в эпителии почечного канальца [Nardguist R.E., Palmeri G.M., 1974], цитоплазматической и ядерной локализации связывающих участков для гонадотропинов в семенниках [Goldfine I.D. et al., 1977] и яичниках [Абель О.Х., 1983; Петруц П. и др., 1983], ядерпой локализации участков связывания для рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона гипофиза крыс [Millar R.P. et al., 1983].
Применение методов иммупофлюоресценции, авторадиографии и электронно-плотных меток позволило установить, что рецепторы белково-пептидных гормонов на плазматических мембранах расположены не гомогенно, а образуют кластеры по 3—12 молекул рецепторов, ассоциировашгых с гликокаликсом [Jarett L., Smitt R.M., 1974; Orel L. etal., 1975]. Более детальное изучение процессов кластеризации показало, что в большинстве случаев комплексы гормон — рецептор кластеризуются в специализированных областях плазматической мембраны — так называемых покрытых, или окаймленных ямках [Willingham S.M. etal., 1981]. Оказалось,
494
Рис. 87. Интернализация белково-нептидных гормонов внутрь клеток-мишеней [Willengham М. С. etal., 1981].
что покрытые клатршюм (белком, фиксирующим рецепторы) окаймленные ямки являются стабильными элементами; они постоянно связаны с плазматическими мембранами и лишь претерпевают морфологические изменения в процессе эпдоцитоза и пиноцитоза (рис. 87). После связывания и кластерирования лигандов в покрытые Окаймленные ямки начинается температурный и, вероятно, энерго-зависимый процесс закрытия шейки этой ямки. Существенно, что слияния мембран в области шейки на этой стадии не происходит; в данном случае имеет место «скрытая форма окаймленных ямок», которая характеризуется функциональной изоляцией. Следующая стадия ~ образование рецептосом, или эндосом. Считается, что При закрытии шейки активный транспорт ионов может вызывать повышение гидростатического давления внутри окаймленной ям
495
ки, которое заставляет ее удлиняться. В последующем рецептосо-ма отрывается от окаймленной ямки и направляется либо в комплекс Гольджи, либо сливается с лизосомами. Вторичные лизосомы, образующиеся в результате этого слияния, содержат внутри мембраны, рецептор и ферменты родительских первичных лизосом. В такой Системе гормон может претерпевать инактивацию и частичную деградацию (то же, по-видимому, относится и к рецептору) в автофагоцитирующей лизосоме. Вместе с тем гормон может претерпевать только частичную деградацию в функционально модифицированной лизосоме, называемой регуляторной. Затем гормон и его биологически активный фрагмент высвобождается из лизосомы и может теперь взаимодействовать с различными компонентами цитоплазмы или с ядром. Описанное явление получило название «интернализация»-. Этот термин уже нами применялся ранее. Другими словами, гормон может проникать в клетку и связываться с внутриклеточными рецепторами.
С помощью фотореакционноспособного инсулина и метода радиоавтографии были получены данные об интернализации ицсу-лин-рецепторпогокомплекса [Berhann Р. et al., 1982; Fehlaman М. et al., 1982]. S.Lopez и B.Desbuguois (1983) показали, что введение крысам глюкозы (300 мг) вызывает 5-кратное увеличение уровня инсулина в плазме и последующее уменьшение его связывания с плазматическими мембранами печени на 20—25%, но повышение его связывания с мембранами комплекса Гольджи на 50 — 70%. Эти изменения были максимальны через 5 — 15 мин и полностью исчезали через 1 ч. Они были обусловлены увеличением числа инсулиновых рецепторов во фракции комплекса Гольджи и снижением их числа в плазматических мембранах. Авторы заключают, что повышение концентрации инсулина в крови приводит к быстрой и обратимой транслокации инсулиновых рецепторов с поверхности клетки внутрь гепатоцитов без изменения их общего числа.
Заметим, что концепция о захватывании пептидных гормонов, связанных со специфическими рецепторами, системой «покрытые углубления — лизосомы», не является полностью оригинальной. Во многих классических исследованиях показано, что эта система важна для транспорта питательных и чужеродных веществ внутрь различных клеток [Steinman R.M., Cohn Z.A., 1972; Roth T.F. et al., 1976; Anderson R.G.W. et al., 1977]. Таким образом, экспериментальное доказательство возможности проникновения белково-пептидных гормонов внутрь клеток и демонстрация локализации
496
ИХ рецепторов не только на плазматической мембране, но и на внутриклеточных органеллах заставляют пересмотреть ранее принятую схему действия белково-пентидных гормонов, согласно которой они не проникают в клетку, а взаимодействуют только с ^рецепторами на плазматической мембране клетки-мишени. Эту схему 'Можно теперь дополнить этаном проникновения белково-нентид-ыых гормонов внутрь клетки и взаимодействием их с внутриклеточными рецепторами ядра, лизосом, комплекса Гольджи и других Органелл.
12.4. Химическая природа рецепторов белково-пептидных гормонов
Применение комплекса физико-химических методов, таких, как фотоаффинные и радиоактивные метки, радиоактивная инактивация, электрофорез, различные хроматографические и иммунологические методики, а также использование детергентов позволили достигнуть значительного прогресса в выделении, очистке и онре-। делении химической природы рецепторов белково-пентидных гор-‘ молов.
Во всех экспериментах по идентификации гормональных рецепторов обнаруживают деградирующее действие па них протеолитических ферментов, что указывает на важнейшую роль белковой компоненты рецепторов в узнавании гормона [Lefkowitz В. et al., 1971; Khan C.R., 1975; Клейн И., Леви Дж., 1979]. Вместе с тем МИЯШ№ фосфолипазы на связывание АКТГ, тиреотропин-рилизипг-фактора, ЛГ, инсулина и других гормонов свидетельствует о существенной роли фосфолипидов в процессах рецепции втих гормонов [Barden N., Labrie F., 1973; Kahn С., 1975; Clark S. et al., 1981]. Для рецепторов инсулина, ТТГ, гонадотропинов характерно участие углеводов в связывании гормонов [Cuatrecasas Р., 1974; Tate R.L. etal., 1975; Кэтт К., Дюффо М., 1979].
' У рецепторов гонадотропинов дисульфидиав rpyinia располо-{Оиа в самом активном центре или вблизи него; об этом свиде-шьствует чувствительность рецепторов к обработке н-хлормер-фийбепзойпой кислотой и N-этилмаленмидом [Dufau M.L. et al., 174; Кэтт К., Дюффо М., 1979].
* Молекулярная масса солюбилизированных рецепторов белко-
1м. w 497
Таблица 31.
Химическая природа и молекулярная масса рецепторов белково-пептидных гормонов.
Локализация рецепторов Наличке субъединиц Молекулярная массе
общая Отдельны* субыданнц
Рецепторы инсулина
Лимфоциты Да 300 000 75 000
Лимфобластоидиые клетки Да 370000 130000, 82 000,
IM-9 310 000 110000—120 000, 50000
Адипоциты Да 300 000 130000 , 90 000 и 40000
Печень, легкие крыс, плацента 35-32. 210.160.125.90-
человека Да .29-10* •49.10*
Лимфоциты человека Да 350000 130000, 90000
Плацента человека Да 30 000 45-90.49.10*
Фибропласты кур Да 130 000
Печень крыс Да 350 000 87 000
Рецепторы пролактина
Молочная железа кролика Микросомы печени мыши Плазматические мембраны крысы Нет 220000 350 000 37 000 73000
Рецепторы ТТГ
Щитовидная железа быка Гипофиз свиньи » человека Лимфоциты Да Да Да Да 280 000 87000 100000 75000— 80 000 250 000 166-, 75-, 24-10» 45 000 , 42 000 50 000 180 000-230 000
Рецепторы глюкагона
Печень, миокард крыс Миокард кошки Печень крыс Да Да 190000 26 000 188 000 90 000 52 000—70000
Рецепторы лютеианзкруюжего гормона
Семенники Да 194 000 90000
498
Продолжение.
Локигазацяя рецепторе* Наличие субъединиц Молекулярная масса
общая отдельные субъединиц
Рецепторы лактогенного гормона
Печень крыс 194 300— 270 000, 330 000 94 000
Рецепторы ангиотензина 11
Мембраны надпочечника крыс 116000
Рецепторы рнлнзинг-фактора гонадотропина
Мембраны гипофиза 60000
ВО-пептидных гормонов в отсутствие детергентов находится чаще всего в области от 30 000 до 350 000 (табл. 31).
. Рецепторы инсулина, ТТГ и ЛГ представляют собой гликопротеины, а пролактина, лактогенного гормона, ангиотензина II и рили->инг-фактора гонадотропина — белки, глюкагона — липопротеин.
Нередко в солюбилизированном материале рецепторов белко-
во-пептидных гормонов присутствует адеиилатциклазнвя активность [Kahn C.R., 1976], что указывает на тесную ассоциацию
••того фермента с рецепторами. Центрифугирование в градиенте 'Плотности солюбилизированных рецепторов позволяет определить
'Нх коэффициент седиментации и радиус Стокса: 5 — 12S и 4 —8 нм Соответственно [Kahn C.R., 1976; Levi G.S., 1979; Siegel T.W. et 'Ml., 1981].
Рецепторы белково-пептидных гормонов являются интегральными мембранными белками. Они обычно связывают при солю- бклиэации большое количество тритона Х-100 или другого неион-'ПОго детергента (0,2 —1,4 мг/мг белка). Как правило, эти рецеп-поры имеют большой объем и характеризуются неравномерной гид-Мштацией [Helenius A., Simons К., 1975].
M.l.Dufan и соавт. (1975) описали выделение и очистку из ^Ммбрапных клеток гонад рецепторов для ЛГ и хорионического
499
гонадотропина. При солюбилизации этих рецепторов любролом РХ выявляются два пика связывания гормона, меченного’25!. Первый пик имеет кажущуюся молекулярную массу около 200 000 (белок, дающий первый пик, ассоциировал с ддепилатциклазпой системы). С помощью аффинной хроматографии К.Кэтг и М.Дюф-фо (1979) очистили гопадотрошпювый рецептор до уровня 2500 пмоль/мг белка. Этот очищенный рецептор сохраняет высокую способность специфично связывать гонадотропины (при гель-элек-трофорезе с додецилсульфатом натрия рецептор характеризуется одним компонентом с молекулярной массой 90 000).
T.W.Sieget и соавт. (1981) с помощью аффинной хроматографии на инсулин-сефарозе очищали солюбилизированный тритоном Х-100 рецептор инсулина из плаценты человека. Выход белка составил 200—300 мкт- из одной плаценты (300 г влажной массы). В растворе инсулиновый рецептор существовал в виде комплекса с Мг 440 000, состоящего из кислого олигомерного белка 350 000 и связанного с этим белком детергента.
По данным центрифугирования в градиенте сахарозы рецепторный белок ассиметричен (f/f0=l,4), имеет коэффициент седиментации 12S, связывает 140 моль тритона Х-100 на 1 молекулу рецептора. При электрофорезе мечешюго ,251 рецептора в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия были обнаружены неокрашиваемые реактивом Кумасси пептиды с 45 000 и 90 000 и окрашиваемый реактивом Кумасси пептид с 135 000. Поскольку только последний пептид был специфически помечен 1231-инсулином, можно считать, что именно он представляет центр связывания инсулина.
О субъединичной структуре инсулиновых рецепторов свидетельствуют также данные J.Massague и соавт. (1980), J.Massague и соавт. (1982),а также FJ.Hyynes.P.C.Yip (1984). Важно,чтов плазматических мембранах клеток печени, ночек, легких крыс и плаценте человека J.Massague и соавт. (1980) обнаружили одни и те же субъединицы инсулинового рецептора с Мт 350 000, 320 000, 290 000. При восстановлении S—S-связей каждый из рецепторов диссоциировал в два этапа. На первом этапе при низкой концентрации дитиотрейтола структура 350 000 диссоциирует до 210 000, а структура 290 000 -- до 160 000. Структура 310 000 диссоциирует на две молекулы — 210 000 и 160 000. При высокой концентрации дитиотрейтола структура 350 000 диссоциирует до субъединиц 125 000 (а) и 90 000 ((3), структура 290 000 образует ct-субъедицицы и субъедини-цы 49 000 ( р(). При полном восстановлении структуры 320 000 обнаружены все три типа субъеди
500
ниц. Частично восстановленный фрагмент 210 000 состоял из а-субъедииицы, связанной дисульфидной связью с [5-субъединицей, а фрагмент 160 000 из а-субъедишщ, связанной с [^-субъединицей. Таким образом, можно заключить, что во всех тканях одновременно присутствуют три различные молекулярные формы рецепторов инсулина — (а)2 (р)2 (350 000), (а)3 (р) (р,) (320 000) и (а)2 (р[)2 (290 000).
По мнению M.P.Gzech (1982), гетеротетрамерную структуру рецептора инсулина можно представить формулой ([5-S — S-a)-S — S-(p-S — S-a), где a- и р-субъедипицы имеют соответственно 125 и 90 кД, причем S—S-связь между (a—S —5-р)-частями обладает более высокой чувствительностью к экзогенным восстановителям.
С.С.Yip и соавт. (1982) дали характеристику инсулиновых рецепторов адионоцитов крысы. Методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей авторадиографией авторы показали, что фотоаффипиое производное инсулина N-азидобен-эоилипсулип, меченный ,251, модифицирует три полипептида плазматических мембран с Мг 130000, 90 000, 40 000. В отсутствие соединений, восстанавливающих дисульфидные связи, радиоактивная метка обнаружена в белках с Мг 300 000. Восстановление этих комплексов приводило к появлению полос, соответствующих Мг 130 000, 90 000 и 40 000. Модификация этих белков не зависела от времени или от температуры инкубации, а также от присутствия ингибиторов протеолиза; метиламина, хлорохина, бацитрацина, фенилметилсульфонилфторида, п-хлормеркурийбензой-1юй кислоты, транзилола, Ы-метнлмаленмида или бензамидина. Протеолиз в полиакриламидном геле трипсином и химотрипсином компонентов 130 000 и 90 000 не приводил к появлению полосы, соответствующей М, 40 000. Все субъединицы защищались от Модификации избытков инсулина и преинкубацией с сывороткой крови больных, содержащих аутоиммунные антитела против рецепторов инсулина.
С помощью фотоаффиннойметки EJ.Haynes и C.C.Yip (1984) в плазматических мембранах гепатоцитов выявили инсулиновые рецепторы с молекулярной массой 130 000 и 117 000, а в мембранах адипоцитов — только с молекулярной массой 130 000. По мнению авторов, две формы инсулиновых рецепторов печени, отличающихся между собой структурой субъединиц, ответственны за различные функции: одна из них участвует в поглощении инсулица, а другая в реализации его действия.
P.J.Deutsch и соавт. (1983) сообщили о существовании
501
I
Ингибирование
Рис. 88. Рецепторный механизм действия инсулина.
Связывание инсулина с а-субъсдлниней инсулинового рецептора приводит к стимуляции тирозинкиназной активности р-субъсдииппы, что сопровождается инициализацией каскада биохимических реакций.
латентных рецепторов инсулина на поверхности адипоцитов мышей 3T3-L1, которые солюбилизируются 1% тритоном X-100. Среди солюбилизированных белков были идентифицированы два полипептида, связывающих инсулин, один из которых с Mf 130 000 был идентичен гормонсвязывающей субъединице рецептора. Второй полипептид, как полагают авторы, относится к популяции •* латентных*- рецепторов, так как пе подвергается изменениям в результате ферментативного гидролиза, приводящего к снижению инсулина с рецепторами клеточной поверхности на 90%. Эксперименты по схеме «импульс-чейз» позволили предположить, что полипептид с Mf 180 000 является предшественником, подвергающимся процессингу с
502
образованием субъединиц рецептора инсулина.
I Согласно современным представлениям инсулиновый рецептор Представляет собой гликопротеин, состоящий из двух альфа-субъе-:ДИпин с молекулярной массой 135 кдальтоц, каждая из которых •одержит 719 или 731 аминокислотных остатков, и двух бета-Субъедиииц с молекулярной массой 95 кдалътоп (620 аминокислотных остатков). Субъединицы образуют между собой дисульфидные связи, формируя гетеротеграмер: бета-альфа-альфа-бета [ Kahn, White, 1988]. Альфа-субъединицы в основном расположены j Ллеклеточло л содержат участки, связывающие инсулин, а бета-субъедииины находятся внутри мембраны и обладают тирозипки-' назион активностью (рис. 88).
I Рецепторы к другим белково-иентпдпым гормонам также ' имеют олигомерную структуру. По данным С.Demalion-Mason \ И R.M.Epand (1982), радиоактивно ц фотоаффипло меченный > Глюкагон включается в одни белок мембран печени крыс с Мг 200 000 и два белка с Мг в диапазоне 52 000 — 70 000. Для радиоактивности в этом диапазоне молекулярная масса разли-1 чалась в восстановленных и невосстановленных образцах, что ' указывает, так же как и в случае инсулиновых рецепторов, на 1 Наличие внутримолекулярных дисульфидных связей. Мг фо-к Тоаффишю меченного рецептора глюкагона, солюбилизирован-Е ИОГО Лубролом-ПХ, по данным гель-фильтрации на ультрагеле ЕДбА22, составляет 200 000 — 250 000. Добавление ГТФ к Е йол юбн лизирован пому из пеоблучеипых мембран комплексу Е ,м1-2(2-11Итро-4-азидофе11Ил)-сульфипилтриг1Тофа)1-ш1-глюкаго- 11В с рецептором приводило к его полной диссоциации. В час-ТИчно очищенной гель-фильтрацией фракции содержались все К включающие радиоактивность пептиды. Следовательно, можно считать, что рецептор глюкагона является олигомерным бел-Е КОм, состоящим пе менее чем из двух субъединиц, соединенных Г И/или стабилизированных дисульфидными связями. В печени Е Кролика субъединица рецептора для СТГ имеет молекуляр-liiyio массу 57 000; рецептор может существовать в виде дн-В Мера (100 000 — 124 000) или более крупного олигомера № (300 000) [Yinar S.I., Herington А.С., 1984]. В отношении рецепторов белково-пептидных гормонов, находящихся ла мем-к браиах клеток щитовидной железы свиньи, можно отметить, [ что оцл находятся в двух формах: с высоким и низким срод
503
ством к тиреотропину [Drummond R.W. et al., 1982].
Таким образом, можно заключить, что рецепторы белково-пептидных гормонов представляют собой олигомерные белковые комплексы. В их структуру могут входить углеводы и другие низкомолекулярные соединения, которые как интегральные мембранные белки тесно ассоциированы с фосфолипидами. Поскольку связывающая способность этих рецепторов чувствительна или к блокаторам SH-груип, входящих в состав связы-ваюпшх участков, или к восстановителям дисульфидных связей, определяющих степень диссоциации рецепторных субъединиц, можно ожидать, что от состояния окисления сульфгидрильных групп будет сильно зависеть функциональная активность этих рецепторов.
/2.5. Молекулярные механизмы функционирования рецепторов белково-пептидных гормонов
Современные представления о функционировали рецепторов белково-пептидных гормонов основаны на жидкостно-мозаичной модели плазматических мембран, которая в настоящее время является общепринятой. Поскольку многими авторами была выявлена зависимость активации гормонами биомолекул-эффекторов (например, адеиилатциклазы) от вязкости мембран, была предложена теория подвижных рецепторов, способных латерально диффундировать в плоскости мембраны [Cuatrecasas P., 1974; Kahn C.R., 1976], согласно которой гормональный рецептор (R) и эффектор (Е) как интегральные белки могут свободно «плавать* в мембране. При активации гормонами (Н) рецептора происходит изменение его конформации, в результате чего у него появляется возможность взаимодействовать с эффекторами (рис. 89). Последовательность этих событий можно написать в виде уравнений:
H+R=HR (па поверхности мембраны), HR+E=HR—Е (внутри мембраны).
Таким образом, получается, что разные гормоны взаимодействуя с разными рецепторами, могут активировать один и тот же эффектор, но и каждый гормон может влиять на функцию более
504
Рецептор f
Рис. 89. Сопряжение различных гормональных рецепторов с эффекторами. Рецептор 1 имеет олигомерную структуру; при связывании гормона он подвергается деполимеризации. Затем свободные субъединицы рецептора взаимодействуют с эффекторами. Так как па четыре молекулы рецептора приходится один эффектор, должны существовать резервные рецепторы. Рецептор 2 является мономером. При этом отношение рецептор/эффектор равно 1 : 1 (резервные рецепторы отсутствуют) [Kahn С. R., 1976J.
чем одного эффектора (см. рис. 89).
Убедительным доказательством данной теории явились эксперименты но гибридизации мутантных клеток, не имеющих рецепторов, с нормальными клетками, у которых предварительно инактивировали адепилатциклазу. Непосредственного контакта рецепторов и эффекторов при этом пе устанавливается, так как гормонально стимулируемая аденилатциклазиая активность восстанавливается значительно быстрее, чем происходит диффузное смешение мембранных белков [Hollenberg M.D., Cuatrecasas R, 1978].
При этом оказалось, что существуют мутантные клетки (лимфома S49), имеющие нормальные рецепторы и эффекторы, но не способные к сопряжению.
Впоследствии было обнаружено, что таким сопрягающим фак
505
тором является ГТФ-связывающий или регулируемый нуклеотидами белок (обозначаемый G или N) [Rodbell М., 1980], При атом было установлено, что существуют два типа этих регуляторных компонент: Gs и G, опосредующих способность ГТФ стимулировать и ингибировать аденилатциклазу соответственно. Следовательно, для реализации физиологической активности гормонов необходимо присутствие как самого гормона, так и ГТФ. Тогда математическое описание взаимодействия гормона с компонентами эффекторной системы будет выглядеть следующим образом:
H+RN = HRN*
H R Sf-ГТФ = H R N-ГТФ = H+R-N ГТФ
HR-N-ГТФ+Е = H-R-N-E
I
ГТФ
(Активный голофермент)
На I этане образуется активированное состояние №, что позволяет на II этапе образовать комплекс H-R N-ГТФ, способный па II этане активировать фермент. При этом присоединение ГТФ приводит к уменьшению сродства R к Н (этап II) и прекращению его сопряжения с Е. Таким образом, ассоциация макромолекулярных компонент (R N-E) увеличивает связывание лигандов (гормона и ГТФ), В этой «песоиряжешгой» равновесной модели конечная концентрация активного голофермепта есть функция относительных концентраций как макромолекулярных компонент, так и лигандов. В состоянии равновесия все комплексы R-N обладают одинаковой способностью взаимодействовать с Е, но количество RNE лимитируется концентрацией Е. По данным M.Rodbell (1980), в печени Е составляет 4 — 10% от уровня R и N. Мембраны клеток с генетически детерминированным дефицитом N не чувствительны к гормонам и гуапиновым нуклеотидам, а добавление к ним экстрактов, содержащих N3, восстанавливает способность ГТФ влиять па связывание гормонов.
Чаще всего белково-пептидные гормоны стимулируют адепи-латциклазпую систему, однако, инсулин, ангиотензин II и соматостатин ее ингибируют. Данные о влиянии различных гормонов на аденилатциклазу представлены в табл, 32.
Как видно из табл. 32, для большинства рецепторов белково-пептидных гормонов характерно их сопряжение с аденилатникла-зой. Поэтому многими авторами признается универсальной медии-
506
Таблица 32.
Влияние белково-пентидных гормонов на сопряженную с рецепторами адепилатциклазу (АЦ).
Горной Орган (тиаиь)-иитеиъ Влияние на А Ц’ систему Характеристике сопряжении
Инсулин Печень Ингибирование Через индукцию фактора с Мг 500 000
Глюкагон Желудок Активация Блокируется соматостатином
> Миокард Активация нна
> Адипоциты »
> Панкреатические островки >
» Печень » Зависима от ГТФ
Вазоактивный пептид кн’ шечника Гипофиз в
То же Опухолевые клетки поджелудочной железы человека > —
АКТГ Надпочечники >
Адипоциты »
Паратгормон Остеобласты » —»
Мембраны мнкросо-судов хоры мозга крысы Почки собаки » Усиливается ГТФ
> » Чувствительна к ГТФ, N-эти лм а лсиии ду
1 Почки кролика Дли стимуляции необходима С -концев а я часть
ТТГ Щитовглчая железа » Возможно участие ганглиозидов
Кальцитонин Почки, кости > —
лг ,» Желтое тело Клетки фолликулов » Зависима от ГТФ и МЯ’+
> Интерстнций семенников > -—
ФСГ Сем я выводящие ка- нальцы »
в Клетки фолликулов » Дегликознрование разобщает сопряжение
Хор иогона-дот^опин Яйцеклетка Зависима от гуаниновых нуклеотидов
Кожа лягушки > —-
Ангиотензин П Печень Ингибирование
Соматостатин Гипофиз > —
Окситоцин Адипоциты Активация
» Эпитсли й мочево го пузыря
> Мозговое вещество почки в
Вазопрессин Почки > ——
Секретин Железы желудка »
507
рующая роль этого фермента в процессе реализации биологической активности гормонов.
Важно подчеркнуть, что большинство эффекторов белково-пептидных гормонов, осуществляющих за счет прироста цАМф, реализуются лишь в присутствии Са2+. Согласно современным представлениям, гормоны вызывают повышение внутриклеточного содержания Са2+ посредством двух механизмов: усиленного его притока из внеклеточного пространства (по-видимому, этот процесс связан с изменением обмена фосфотидилипозитола) и высвобождением Са2+ в цитозоль из связанного состояния в митохондриях (результат действия цАМФ-зависимых протеиикипаз).
Осуществление внутриклеточных эффектов Са2+ тесно взаимосвязано с функционированием специфического Са^-сиязывающе-го белка кальмодулина, одной из функций которого является активирование фосфодиэстеразы, расщепляющей цАМф [Cheung W.Y., 1980; Means A.R., Chafonleas J.G., 1981]. Возрастание внутриклеточной концентрации Са2+ также сопровождается увеличением внутриклеточного содержания цГМФ. В свою очередь, цГМФ тормозит поступление Са2+ в клетку [Berridge M.J., 1975; Sandle J. et al., 1979]. Ионы Ca2+ активируют фосфолипазу А, что приводит к индукции образования простагландинов [Betteridge А., 1980].
Естествешю, последовательность биохимических событий, возникающая в той или иной клетке после ее взаимодействия с соответствующим гормоном, в каждом случае имеет свои особенности. Мы же привели лишь наиболее характерные изменения метаболизма компетентных клеток, вызываемые различными белково-неп-тидными гормонами, чьи рецепторы сопряжены с адепилатциклазой.
Отметим, что многие рецепторы для биогенных аминов и других биологически активных веществ также сопряжены с аденилат-циклазой (см. главы 1 —5, часть П). При этом чувствительность данного сопряжения с адепилатциклазой как для тех, так и для других рецепторов к различным воздействиям (гуаниновые нуклеотиды, катионы, фосфолипазы) часто одинакова. Поэтому мы не считаем целесообразным механизмы данного сопряжения рассматривать для каждого отдельного гормона, а ограничимся тремя общими схемами (рис. 90 — 92), на которых представлены два класса рецепторов, передающих стимулирующее или ингибирующее действие гормонов на аденилатциклазу посредством нуклеотидсвязы-вающих ре1уляторных белков.
В то же время мы пе можем утверждать, что эта схема абсолют-
508
Рис. 90. Индукция бслково-пептидпыми гормонами конформационных перестроек рецептора (R) и последующих изменений функций мембраны: активности аденилатциклазы (Еа) и проницаемости ионного канала (1ц) [Holenberg М. D., Guatrccasas Р., 1978].
Рис. 91. Организация адснилатциклазного фермента, регулируемого бслково-пслтиднымп гормонами и ГТФ. Рецептор (R) имеет различные части, обеспечивающие специфическое связывание гормона и сопряженнее пуклеотидрегулирусмым белком (N), который связывает ГТф. N образует “мост" между R и каталитическим компонентом (К) адепи-латциклазы [М. Rodbell, 1980].
509
Рис. 92. Двойственная регуляция аденилатциклазной системы стимулирующими и ингибирующими гормонами.
ПМ — плазматическая мембрана; Ra — рецептор активирующего гормона; R, — рецептор ингибирующего гормона; .Н,—активирующий нуклеотидрегу* лнруемый белок; Ни—ингибирующий нуклеотид регулируемый белок; Цт — центр регуляции сродства рецепторов к гормонам; Ц* —центр, связывающий катионы.
но универсальна. Аденилатциклаза является не единственной эффекторной системой, сопряженной с рецепторами белково-цептид-пых гормонов. Анализ белков гипофиза, фосфорилируемых при воздействии тиролиберина или в результате повышения внутриклеточного уровня цАМФ, вызываемого Вг2 -цАМФ или 8-Вг-цАМФ, позволил D.S.Drust и соавт, (1982) заключить, что тиролиберип действует по независимому от цАМФ пути. FJ.Rqgl и М J.M.Sewin (1982) показали, что соматостатин стимулирует фосфоиротеип-
510
фосфатазу в цитозоле клеток слизистой оболочки желудка крыс и фосфо) 1ротеин фосфатазу, очищенную в 40 раз методом хроматографии на сефарозе. Авторы считают, что в клетках слизистой оболочки желудка, как и в клетках других органов желудочно-кишечного тракта, присутствуют внутриклеточные рецепторы соматостатина, которые являются регуляторной субъединицей фосфоиротеидфосфа-тазы. Дефосфорилирование фосфонротеидов может быть одним из механизмов действия соматостатина.
Поданным A. Dazord и J. М. Saiz (1982), АКТГ, по нестабильный аналог цАМФ, вызывает увеличение включения 3Н-лейцина в белок надпочечников линии Yr В экспериментах in vivo цАМФ, вводимый гинофизэктомированным крысам, вызывал увеличение концентрации кортикостерона в крови с 2 до 270 нг/мл, не влияя па уровень биосинтеза белка в надпочечниках. Циклогексамид полностью блокировал увеличение биосинтеза белка и лишь на 30% уменьшал биосинтез кортикостероидов, индуцируемых АКТГ. Однако фрагмент АКТГП.М, не обладающий способностью активировать аденилатциклазу и стероидогенез, также замедлял деградацию белков. АКТГ, но не его фрагменты 1 —10 и 11 —24, а-мелано-тронии и ангиотензин II индуцировал биосинтез цитоплазматического белка с Мг 30 000 и митохондриального белка с Мг 134 000 in vivo. Эти результаты дают возможность полагать, что АКТГ индуцирует стероидогенез посредством взаимодействия с рецепторами, сопряженными с адеиилатциклазой, а трофическое и митогенное действие гормона осуществляется независимым путем — взаимодействием участка 1 — 10 АКТГ с еще не изученными рецепторами.
По данным Н. К. Wasner (1981), инсулин и адреналин ингибируют аденилатциклазу интактных гепатоцитов посредством индукции синтеза ингибирующего фактора с Мг 500, присутствующего в низкомолекулярной цитозольной фракции и в белковой фракции, ассоциированной с плазматическими мембранами. Синтез этого фактора стимулировался сразу при добавлении инсулина или адреналина, достигая максимума через 3 — 5 мин, и возвращался к первоначальному уровню через 15 — 20 мин. Авторы предполагают, что ингибирование этим фактором аденилатциклазы может происходить в результате фосфорилирования аденилатциклазы специфической протеипкиназой, стимулируемой данным фактором. Однако как инсулин индуциру-
511
Рис. 93. Действие белково-пептидных гормонов без использования вторичного посредника. Связываясь с рецепторами на плазматической мембране, гормон (Н) стимулирует транспорт глюкозы, аминокислот и/ или ионов. После интернализации гормон либо расщепляется, либо связывается с внутриклеточными органеллами [Goldfinc I. D., 1981].
ет синтез этого ингибирующего фактора, остается неизвестным. Возможно, что эта индукция обусловлена проникновением инсулина внутрь клеток и взаимодействием его с ядерпыми рецепторами (такой механизм действия инсулина изображен па рис. 93).
С. Rancachandran и соавт. (1982) с помощью перфузии сердца крысы изучали регуляцию инсулином активности гликоген-синтета-зы. Обнаружено, что истощение фонда гликогена после перфузии сердца раствором без глюкозы приводит к 13-кратлой активации гликогенсинтетазы и троекратному усилению ее стимуляции инсулином. Эти эффекты коррелировали с изменением активности фосфорилазы, киназы фосфорилазы и впутриклетошюго уровня цАМФ. Стимуляция этого фермента инсулином проявилась через 90 с после добавления инсулина в перфузионный раствор и достигала максимума на 4-й минуте. Зависимую от инсулина активацию гли-когенсинтетазы обращали глюкагон и адренергические агонисты: адреналин, изопротеренол, фенилэфрин. Действие глюкагона и агонистов {^адренорецепторов осуществлялось через системы цАМФ, а агонистов а-адренорецепторов, вероятно, через систему транспорта
512
CiF*. В связи с этим авторы заключают, что действие инсулина не опосредовано ин цАМФ, ли С;г\
N. Venhatosan и Н. Davidson (1983) также не обнаружили медиаторной роли Са2+ в действии инсулина на печень крыс.
Важные данные о фосфорилировании — дефосфорилировании Очищенного рецептора инсулина и плаценты человека были получены F.Machicao и соавт. (1982). Авторы показали, чтоипсулид Стимулирует фосфорилирование очищенного рецептора, увеличит вая вклм>чеш1е метки в субъединицу 95 000. Полумаксимальпый и Максимальный эффект инсулин вызывал в концентрациях 1 и 10 nMiсоответственно. При инкубации фосфорилированного рецепг тора в среде, содержащей NaF, происходило его дефосфорилирова-1ще. Следовательно, эти результаты позволяют считать, что рецензор инсулина обладает вротеннкинззой и фосфонротеинфосфатаз-Моп активностями.
Впоследствии было подтверждено, что одна из частей инсулинового рецептора является протеникииазой. Согласно данным E.Van Obberghen H соавт. (1983), р-субъеднпицы инсулиновых рецепторов гепатоцитов крыс с Мг 95.000 представляют собой протею 1кивазу и субстрат фосфорилирования. Предполагается, что инсулин связывается с et-субъедипицей рецептора и тем самым вызывает конформационные изменения, отражающиеся ла Р-субъедипицах в виде усиления их протекцииназиой активности. При этом происходит фосфорилирование молекулы инсулинового рецептора и других бедков. Эго фосфорилирование может быть инициатором каскада реакций, проявляющихся в виде различных эффектов инсулина. Кроме инсулина, способностью стимулировать киназную активность очищенного инсулинового рецептора обладают коиканавални А, агглютинин зерен пшеницы и поликлональные антитела против инсулиновых рецепторов [Roth R.A. et al., 1983]. В то же время моноклональные антитела против инсулиновых рецепторов, представляющие собой антагонисты инсулина, не стимулировали фосфорилирования инсулинового рецептора и подавляли стимулирующий эффект инсулина.
T.P.Ciaraldi п J.M.Olefsky (1983) продолжили изучение влияния температуры па сопряжение инсулиновых рецепторов с транспортом глюкозы в изолированных гепатоцитах. Они обнаружили; 1) при повышении температуры с 16 до 37°С снижается сродство илсулипа к его рецепторам, по не их чис
Н.Звк.Н?
513
ло; 2) способность инсулина стимулировать транспорт глюкозы повышается с увеличением температуры. Эти данные дают возможность предполагать, что в связывании инсулина и в сопряжении инсулиновых рецепторов с транспортной системой для глюкозы принимают участие различные физико-химические процессы.
Читатель уже, наверное, заметил, что наибольшее число исследований, направленных на изучение молекулярных механизмов функционирования рецепторных систем бел ново-нентид-иых гормонов, посвящено инсулиновым рецепторам. Эти рецепторы являются одной из самых сложных молекулярных систем. Они представляют огромный практический интерес. Некоторые данные о последовательности биохимических реакций, возникающих в результате взаимодействия инсулина с рецепторами, представлены на рис. 88. Кроме того, несомненный интерес имеют сведения еще об одном направлении исследований, которое может в'дальнейшем помочь раскрыть полную картину реализации молекулярных механизмов действия инсулина па клетки-мишени. Речь идет о протеазной активности инсулина. Существование у гормона данной активности подтверждается тем, что трипсин производит действие инсулина, выражающееся в активации пируватдегидрогеиазы и глико-геисинтетазы в плазматических мембранах адипоцитов крыс [Seals J.R., Czech М.Р., 1982] и в стимуляции включения |4С-глюкозы в гликоген гепатоцитов крыс [Draznin В., Trowbridge М., 1982]. Эти эффекты инсулина подавляются ингибиторами протеаз. J.R.Seals и М.Р.Czech (1982) сумели выделить растворимый фактор, медицрующий влияние инсулина на активность пируватдегидрогеиазы и глнкогенсиитетазы. Он имел молекулярную массу, равную 3000, и был отрицательно заряжен при pH 7,4. Авторы предполагают, что данный фактор появляется в результате связывания инсулина с рецепторами и последующей активацией протеаз, высвобождающих его из состава неизвестных белковых молекул.
В то же время подавление инсулином протеолиза внутриклеточных белков не чувствительно к ингибиторам протеаз [Draznin В., Trowbridge М., 1982]. Блокирование протеолиза внутриклеточных белков, наблюдаемое только через 30 мни инкубации гепатоцитов с инсулином, устранялось ингибитором трансглута-мипазы дапснлкадаверипом, который тоже подавляет накопле-
514
цие иптернализовашюго ,251-ипсулина в клетках в присутствии ингибитора лизосомного протеолиза хлорохина. Поэтому следует полагать, что стимуляция инсулином включения глюкозы в . гликоген и ингибирование протеолиза белков осуществляются разными путями. Видимо, для ингибирования протеолиза необходима интернализация инсулина, комплекснроваипого с рецензором.
* По нашему мнению, современный период накопления пока еще разрозненных и не всегда понятных фактов реализации впутри-'Клеточных эффектов инсулина и других белково-пептидных гор-’Йоиов в недалеком будущем закончится созданием обобщающей Схемы преобразования рецепторами гормонального сигнала на раз-11ых уровнях клетки с учетом временной зависимости появле-гого или иного эффекта.
ювые данные о механизмах действия белково-пептидных опов указывают па комплексное, одновременное их деист-:ак па плазматические мембраны клетки-мишени, так и па их неллы, включая ядро. Именно это, но нашему мнению, и ловлнвает многогранность, разпонаправленность, иродолжи-цость и глубину их эффектов. Несомненно, что 6 будущем тальное внимание исследователей будет направлено па вы-пие природы внутриклеточных компонентов, восприпимаю-гормональный сигнал комплексов гормон — рецептор или лыюго гормона после его отсоединения от рецептора и входа етку.
ем не менее нельзя забывать, что плазматическая мембрана ётся первой структурой, с которой связывается гормональная ;кула. От этого взаимодействия во многом зависит весь ход нейших событий преобразования гормонального сигнала в био-ческий ответ клетки.
пашей лаборатории с помощью флюоресцентных методов ) показано, что процессы, которые сопровождают гормоп-пторное взаимодействие, приводят к определенным струк-ым перестройкам мембран. При сравнении влияния ипсули-АКТГ ла характер свечения флюоресцентных зондов АНС‘ в плазматических мембранах клеток печени и искусст-ых фосфолипидных везикулах было обнаружено, что взан-1Йствие гормонов с плазматическими мембранами сопрово-•тся изменением также н липидного слоя мембран. Причем, удимому, конформационные перестройки рецепторного бел
515
ка являются первичными, обусловливающими специфику последующих изменений липидов [Лакин В.В., 1976, 1982], Поскольку между регистрируемыми флюоресцентными характеристиками и изменением степени активности мембрапосвязанных ферментов (АТФазы, 5’-нуклеотидазы) под воздействием гормонов имеется корреляция, можно предположить, что конформационные изменения и есть тот механизм, с помощью которого гормоны воздействуют па характер функционирования ферментных и транспортных систем мембраны.
В дальнейшем было установлено, что эффекты, вызываемые белково-неитидиымн тормолами па уровне плазматической мембраны, развиваются значительно быстрее, чем их эффекты, опосредуемые ядерлым аппаратом [Goldfine I.D., 1981]. По-виднмому, усиление транспорта аминокислот и других метаболитов («строительные материалы»), осуществляемого плазматической мембраной, должно предшествовать началу синтеза белков пли других макромолекул по «проектам», хранящимся в геноме. Так ли эго, покажут будущие эксперименты, однако нам представляется, что во временной последовательности данных эффектов ряда пептидных гормонов заложен приведенный выше биологический смысл. Закапчивая этот раздел, отметим*, что по характеру тралсдуктора и эффектора рецепторы белково-пептидных гормонов, локализованных в плазматических мембранах, можно разделить па следующие грушгы:
1. Трапсдуктор — G-белок, который передает регулирующее влияние ла аденилатциклазу или фосфолипазу С (лиганды этих рецепторов — нентиды, пепровептнды, цитокины, которые включают такие вещества, как вазопрессин, ангиотензин, холецистокшши, ФСГ, АКТГидр.).
2. Эффекторная часть самого гетететрамера обладает каталитической активностью (тнрозипкилазпон, сер]и|-треошшкш]аз!юй, iya-пнлатциклазцой и фосфотпрозипфосфатазлой). Активация этих рецепторов приводит к фосфорилированию или дефосфорилирова-ншо белков и к образованию цГМФ.
К семейству лигандов рецепторов, обладающих тирозппкппаз-ной активностью, относятся эпидермальный фактор роста, факторы роста и его аналоги, инсулин. К семейству лигандов рецепто-ров.обладающих ]'уапилатдиклазион активностью, относятся предсердные натрийуретические пептиды типов А, В, С. К семейству лигандов рецепторов, обладающих серин/треоплнкипазнон активностью относятся Активин, Ицгибип, трансформирующий фактор
516
роста бета тина lull. К семейству лигандов рецепторов, дмею-।щпх множественное мультисубъедшшиное строение (эти рецепторы лишены собственной тирозинкнпазпой активностью, но сопряжены с цитоплазматической тпрозинкнназой или другими ки-' низами), относятся гормон роста, пролактин, эритропоэтин, шггер-' Лейкина (2 — 7), фактор некроза опухолей, онкостатин, иптерфе-! ролы и др.
12.6. Регуляция обмена рецепторов белково-пептидных гормонов
।,
С Рецепторы гормонов, как и мембранные белки, подвергаются непрерывному обмену: вновь синтезированные белки встраивается в мембрану, а функционально «отработанные» деградиру-Естественно, любые изменения в скорости синтеза и деграда-^ЦИИ рецепторов будут приводить к изменению их общего количе-Сгва.
।, В.иастоящее время мы уже располагаем некоторыми данными ,рб обмене рецепторов белково-пептидных гормонов. В культуре .Л^мфоцигов человека обмен рецепторов СТГ и инсулина был оп-'(ределен с помощью блокирования их синтеза циклогекснмидом: дрем я полужнзни для рецепторов СТГ и инсулина равнялось 10 и |30— 40 ч соответственно [Kahn С.К., 1976].
Ь„ Средн факторов, которые регулируют концентрацию гормо-ШЛьлых рецепторов, в первую очередь, можно выделить уровень Ийдмого гормона. При этом имеет место обратная корреляция меж-Концентрацией гормона н числом соответствующих рецепторов |Н плазматической мембране компетентных клеток.
К. В последние годы предпринимаются попытки для выяснения Имехапизмов снижения числа гормональных рецепторов при по-Ишшеннн воздействия па них агонистов. M.Kasuda п соавт. (1981) Имучали обмен субъединиц рецептора инсулина в мембранах куль-Ипфы лимфоцитов человека. Для определения скорости деграда-ри рецепторов использовали импульсную метку лимфоцитов :t5S-Крепюшшом п поверхностные белки лимфоцитов, меченные NaIMI «{•помощью лактопероксидазы. Авторам удалось установить, что Идоемя нолужизцц основных субъединиц рецептора (135 000 и 95 В$00) составляет 9 — 12 ч в нормальной среде. При добавлении в
517
культурную среду инсулина (t мкМ) обмел субъединиц ускорялся в 2 ’/2 — 3'/2 раза (время цолужизлн < 3 ч). Ускорение деградации рецептора зависело от концентрации инсулина и коррелировало с инсулинзависимым снижением числа рецепторов. Соматотропин человека не влиял на обмен инсулиновых рецепторов. Циклогексимид (100 мкМ) частично блокировал инсулинзависимое ускорение деградации рецептора. Скорость биосинтеза рецепторов не изменялась в присутствии инсулина. Следовательно, эти данные позволяют заключить, что инсулинзависимое исчезновение рецепторов в лимфоцитах человека обусловлено ускорением деградации рецепторов. Такой же вывод можно сделать и об индуцированной инсулином «регуляции снизу» инсулиновых рецепторов в адипоцитах линии ЗТЗ LI [Ronnet G.V. et al., 1982]. В этом случае скорость синтеза инсулиновых рецепторов, определяемая по включению l3N, |3С- и 2Н-аминокислот, нс изменялась как после удаления инсулина, так и после его добавления к среде инкубации в концентрации 1 мкМ. При отсутствии инсулина в среде инкубации время нолужлзпл рецепторов инсулина увеличивалось с 8,1 до 14,8 ч, а в его присутствии снижалось до 6,9 ч. Клетки с увеличенным числом рецепторов обнаруживали в 2 раза более активный транспорт |4С-глюкозы, индуцированный инсулином (10 s М) в сравнении с клетками со сниженным числом рецепторов.
По нашему мнению, одним из путей деградации инсулиновых И других рецепторов является повышение интернализации комплексов гормон — рецептор при увеличении взаимодействия гормона на клетку. После интернализации гормои-реценторный комплекс может оказаться в лизосомах (образуются так называемые фаголизосомы) (см. рис. 87), где он подвергается деградации. Однако необходимо отметить, что разрушается пе весь пул питерпализоваппого рецептора. Часть рецептора может но обратному пути рециклироваться и снова появиться на поверхности клеток [Fehlmann М. et al., 1982]. По-видимому, в клетке существуют специальные механизмы регуляции между деградацией и рециклированием гормональных рецепторов, что создает оптимальный уровень рецепторов па плазматической мембране клеток и внутри них, и тем самым обеспечивает необходимую для клетки чувствительность к гормональному сигналу. Кроме того, следует учитывать возможность полной обратимости снижения числа инсулиновых рецепторов па поверхности комиетеит-
518
НЫХ клеток, вызванной однократной инъекцией инсулина. [Д, Lopez и B.Desbuquois (1983) показали, что 5-кратное увеличение концентрации инсулина в плазме крыс сопровождается снижением связывания 1251-нцсулш1а с плазматическими мембранами печени на 20 — 25% (максимум через 5— 15 мил), восстановлением до исходного уровня через 1 ч, но увеличением свя-ВЫВаиия гормона с мембранами фракции комплекса Гольджи Клеток печени на эту же величину в те же сроки. Поэтому Можно считать, что повышение уровня инсулина в физиологическом интервале концентраций вызывает быструю и обратимую транслокацию инсулиновых рецепторов с поверхности внутрь клетки без изменения их общего числа. Вероятно, имеется еще и нострецепторпый механизм регуляции чувствительности клеток к гормонам. J.H.Heaton и T.D.Gelehrtas (1981) ус-Тнновилн, что индуцируемая инсулином «регуляция снизу» рецепторов в культивируемых клетках гепатомы крысы нроисхо-ДИтуже при концентрации инсулина в среде 0,3 пг/мл, полу-Максималыюн ей опа Становится при концентрации 10 — 20 иг/ МЛ и максимальной ей — при его концентрации 100 пг/мл. i’ После удаления инсулина из среды клетки восстанавливают способность связывать инсулин, начиная с 2 — 4 ч до 24 ч,-когда .число рецепторов инсулина становится таким же, как в норме.
В ТО же время восстановление чувствительности клеток к ипсу-iJWliy, змеряемое по стимуляции инсулином транспорта а-ами-'Яоизомасляпой кислоты через мембрану, возвращалось к норме уже через 2 ч после удаления нпсулнна из среды. Уменьшение Числа рецепторов па 50 — 60% было недостаточным для полной Йотерп увствптелыюсти клеток к ипсулппу. Этот факт, а также несовпадение времени восстановления числа рецепторов и ’Чувствительности клеток к инсулину указывают, что десенсити-:>ИЦНя клеток объясняется пе «регуляцией снизу», а включает Некий нострецеиториый механизм.
У Как и следовало ожидать, рецепторы гормонов находятся под ЖИетмческим контролем. Установлено, что у мутантных мышей, Несущих в гомозиготном состоянии летальные мутации в виде ’Индуцированных радиоактивным излучением делений в локусе, детерминирующем альбинизм, хромосомы 7 и около пего, царуше-?На нормальная регуляция ряда зависимых от инсулина ферментов печени [Goldfeld А.Е., 1981]. В клетках печени новорожденных гомозиготных мышат с летальной мутацией 14 CoS и в выде
519
ленных из клеток мембранах содержание рецепторов инсулина составило20 —25% от нормы, а сродство рецепторов к инсулину было таким же, как в норме. Активность инсулиназы, разрушающей инсулин, пе отличалось от контроля. Эти данные свидетельствуют о том, что структурный геи инсулинового рецептора у мутантов не поврежден, а деления касается генов, участвующих в регуляции инсулинового рецептора, например, процессинга рецептора, его транспорта или встраивания в клеточную мембрану. В результате снижения числа рецепторов в мембране нарушается зависимая от инсулина регуляция дифференцировки клеток печени.
Хорошо известно также, что у мышей с врожденным ожирением (линия ob/ob) имеет место снижение числа инсулиновых рецепторов на гепатоцитах [Soli А.Н. et al., 1975], адипоцитах [Freychet Р. et al., 1972], тимоцитах (Soil А.Н, et al., 1974] и мышце сердца [Freychet P., Forgue E., 1974] na 50 — 70% без изменения сродства рецепторов к инсулину. Однако изменении активности 5'-нуклеотидазы и аденилатциклазы, а также числа рецепторов к глюкагону, СТГ и изопротеренолу у этих мышей пе наблюдается.
Еще одцим фактором модификации гормональных рецепторов могут быть модуляторы, действующие опосредованно на тот или иной тип рецептора. Примером этого утверждения могут быть данные R.J.Nabislds и соавт. (1982), которые показали, что обработка гранулезных клеток крыс фоллатропином 1, 10 и 100 иг/мл в течение 2 сут приводит к увеличению пролактиновых рецепторов в 3,85, 5,7 н 7,7 раз соответственно. Обработка этих клеток холерным токсином (10 мкг/мл) в течение 2 дней вызывала увеличение числа пролактиновых рецепторов в 2 раза. Вместе с тем Одновременная обработка клеток гопадолиберп-1юм (10* М) и фоллитропином (10 мг/мл) снижала число пролактиновых рецепторов на 64% но сравнению с клетками, обработанными только фоллитропином. Ингибирующее действие го-иадолибернпа предотвращалось его антагонистом D-Glu', D-Phe\ D-Trp. Воздействие хориогопадотроинном или лютроппном на клетки, которые предварительно инкубировали с фоллнтронп-1ЮМ, приводило к увеличению числа пролактиновых рецепторов в 2 раза по сравнению с клетками, обработанными предварительно только фоллптролпцом. Следовательно, можно считать, что фоллцтрониц, лютроннп и хорпогоиадотронпн пепосредст-
520
Венло увеличивают число пролактиновых гранулезных клеток, а гоиадолнберни, действуя через свои рецепторы, ингибирует , вызываемое фоллитроншюм повышение числа этих рецепторов. J.Kolena и E.Sebokova (1983) также зарегистрировали уве-t Л имение числа рецепторов к Л Г в семенниках крысы при введе-ь пин Нм СГ или пролактина, aD.L.Segaloff и L.E.Limbird (1983) 1 “ в граиулозных клетках фолликулов свиней при воздействии : ФСГ или холерного токсина — агентов, повышающих внутриклеточный уровень цАМФ.
По-вид иному, в регуляции числа рецепторов белково-пеитид-; ных гормонов может принимать участие цАМф. В этом аспекте i представляют интерес данные A.Avis и соавт. (1981), которые К установили, что обработка культивируемых клеток щитовидной I железы крысы 1 мМ 8-Вг-цАМФ при 37°С приводит к кластернза-[ ЦП и рецепторов для флюоресцентного конъюгата тиреотропина с ' тсЛрамегил родам пнизоцнанатом и уменьшению синтеза цАМФ в ответ на действие тиреотропина.
[ Знание механизмов регуляции как числа рецепторов, так и со-[ пряжения нх с эффекторными системами имеет большое значение для практической медицины, до сих нор пе решившей проблемы [ Лечения многих эндокринных заболеваний.
I Ю.В.Бездробпый и соавт. (1983) установили, что через 10 су-| др*с после адреналэктомии у крыс усиливается связывание иису-| Л1Ц1а с инсулиновыми рецепторами плазматических мембран жиро-BtVbtx клеток за счел* увеличения числа рецепторов, а при гинеркор-КТНццзме происходит угнетение экспрессии инсулиновых рецеито-Кпов этих мембран (уменьшается число и нх сродство к гормону). К&ги данные, а также результаты других авторов [Gigohm М., Smith Ц,, 1979; Greenfcld С. et al.., 1981 ] свидетельствуют о сложном и, ^видимому, непрямом действии глюкокортикоидов на инсулиио-НИе рецепторы,
К ( Изменение концентрации инсулиновых рецепторов и их связы-Мдощей способности нередко вст речаются при развитии устойчи-ИЬсди к инсулину [Bar R.S.,RothJ., 1977]. Устойчивость к ипсули-^Кцжак правило, имеет место у тучных люден. У них при стабиль-Кости метаболизма биологически активного инсулина наблюдает-м’СЯ снижение связывания инсулина с моноцитами [Archer J. A. et aL, !'• 1975-], обусловленное уменьшением концентрации инсулиновых ре-. ,^|Ц1ТО]хш. В соответствии с представлениями о «регуляции снизу* ^Ч(рЫ0налы1ЫХ рецепторов, чем больше пшерпнсул! темня, тем силь
521
нее уменьшается число инсулиновых рецепторов, и наоборот. Поэтому снижение калорийной ишцл является одним нз способов увеличения биологической активности инсулина как при ожирении, так н при диабете fPribor Н.С. et al,, 1979]. Отсюда попятно, почему, согласно данным L.H.Smith и соавт. (1977), при лечении больных диабетом нет прямой зависимости между дозой инсулина и его эффектами.
Причиной устойчивости к инсулину может быть наличие специфических антител против шюулнповых рецепторов, которые уменьшают связывание инсулина с рецепторами па 70 — 95% [Flier J. В. et al., 1975].
Таким образом, развитие устойчивости к инсулину может быть связано с увеличением уровня инсулина в крови, снижением концентрации инсулиновых рецепторов, наличием антител против инсулиновых рецепторов и нарушением функции этих рецепторов. Для диагностики причины инсулиновой устойчивости Н.С.РпЬог и соавт., (1979) применили тест на определение связывающей способности инсулиновых рецепторов моноцитов. В качестве средств, увеличивающих число инсулиновых рецепторов и не влияющих па уровень инсулина в крови, U.Keller и W.Bergen (1983) предложили использовать производные сульфонилмоче-вииы.
Роль рецепторов инсулина в изменении чувствительности клеток при ацидозе, избытке глюкокортикоидов, а также при старении рассмотрены Р.Кала и Дж.Рота (1979). Однако данные ио этим вопросам весьма противоречивы и требуют дальнейших исследовании. В одной из работ, посвященных этой проблеме, F.Vinicor л L.Kiedrowski (1982) описали изменения свойств и обмена инсулиновых рецепторов в процессе эмбрионального развития крыс. Мембраны гепатоцитов новорожденных крыс во сравнению с взрослыми животными связывали больше инсулина. Рецепторы инсулина у крыс разного возраста не отличались по своей специфичности к его аналогам. Однако скорость деградации |251-ппсулиш1 у новорожденных крыс была в 3 раза ниже, чем у взрослых. Число инсулиновых рецепторов после 1-х суток лостлаталыюго развития уменьшалось и через 3 недели пе отличалось от их числа у взрослых крыс. По млению авторов, инсулиновые рецепторы у новорожденных и взрослых крыс функционально близки, по у новорожденных содержится большее число этих рецепторов. Приведенный факт, а также возможно, умепь-
522
шенпая способность к десенситизации рецепторов в цечеци зародыша могут обусловить повышение запасов гликогена и ускорение роста органа в процессе пренатального развития. В этой связи представляют интерес данные В.S.Reed и соавт. (1981), показавших, что дифференцировка культивируемых преадшюци-тов 3T3-L1 в адипоциты сопровождается увеличением содержания рецепторов гигсулппа в 10 — 20 раз. При этом инсулин почти не влиял на содержание рецепторов и па скорость их деградации в дифференцированных клетках.
Таким образом, описанные результаты позволяют сделать вывод, что обмен, а значит и функции гормональных рецепторов могут изменяться под воздействием различных факторов. К таковым относят уровень самого гормона, возраст, степень дифференцировки клетки, а также наличие модуляторов, в качестве которых могут выступать различные физиологически активные вещества.
Мы считаем, что дальнейшие исследования, направленные на выяснение обмена рецепторов белково-пептидных гормонов при различных заболеваш!ях, старении, физической нагрузке и экстремальных воздействиях помогут нам приблизиться к иопимаиню как физиологических процессов развития организма млекопитающих, так и патогенеза многих заболевании.
♦ * ♦
Мы рассмотрели еще одни тип рецепторов физиологически активных соединений — рецепторы белково-пептидных гормонов. Этот раздел, но нашему мнению, является одним из самых важных в рецепторологии. Более детально с литературой ио данному вопросу можно познакомиться в обзорах М.П.Перцевой (1982), J.Karlon (1982), R.Nilf и соавт. (1981), J.S.Flier (1983), A.H.Forah (1983), K.Cheng и соавт. (1985), M.P.Crech (1985), J.P. Hughes, H.G.Friesen (1985) , O’Bnen, Granncr (1991), Authier et al. (1994) в др.
Мы постарались обратить внимание читателя па наиболее важные аспекты исследований молекулярных механизмов функционирования рецепторов белково-пептидных гормонов, которые предопределяют направления исследования и прогресс в использовании этих соединении как лекарственных средств.
На основании изложенного материала могут быть сформулированы следующие выводы:
523
1. Рецепторами белково-пептидных гормонов являются генетически детерминируемые белковые комплексы, имеющие олигомерную структуру. Их функция заключается в узнавании, специфическом связывании гормонов на поверхности клеток, ннтериализа-цип гормонов внутрь клеток и передачи гормонального сигнала эффекторным системам как на уровне плазматической мембраны, так н органелл клеток.
2. Рецепторы белково-пептидных гормонов гетерогепны, кон-формациошю подвижны, обладают способностью к кластеризации, интернализации, «регуляции снизу * н рециклизащш.
3. Функционирование рецепторов белково-пептидных гормонов зависит от концентрации катионов, сульфгидрильных групп, гуаниновых нуклеотидов, дифференцировки клеток.
Мы надеемся, что детальное изучение всех аспектов функционирования рецепторов белково-нептидных гормонов должно позволить раскрыть механизмы развития ие только различных заболевший!, ио и процессов старения, так как именно возрастные изменения в чувствительности тканей к гормонам являются одной из причин как роста к развития, так и старения и смерти живого организма.
Глава 13
РЕЦЕПТОРЫ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ
Стероидные гормоны как универсальные биорегуляторы контролируют практически все физиологические функции организма. Всесторонние исследования молекулярных механизмов их действия в 60 — 70-х годах XX века дали возможность сформулировать положение о существовании рецепторов стероидных гормонов, которые специфически связывают стероиды в цитозоле гормоцчувствительных клеток и транслоцируют их в ядро, где опосредуют трансформацию гормонального сигнала в биохимический ответ клетки, выражающийся в изменении функционирования ядерпого аппарата. Открытие механизма влияния гормонов на жизнедеятельность клеток многоклеточных организмов явилось одной из самых ярких страниц молекулярной биологии, надолго привлекло внимание стероидологов и как бы заслонило другие возможные аспекты действия стероидов.
Анализируя литературные и собственные данные о молекулярных механизмах действия стероидных гормонов последних лет, мы пришли к выводу, что ограничение рассмотрения реализации физиологической активности стероидов только классической двухэтапной схемой, включающей связывание с цитозольными рецепторами и активацию гормон-реценторпым комплексом процессов транскрипции, является ошибочным, поскольку стероидные гормоны как гидрофобные соединения обладают высокой мембранотропи остью и способностью кардинальным образом изменять функции всех мембран клеток [Сергеев П.В. и др., 1978, 1982, 1986,1995]. Развивая мембранную теорию действия стероидов, мы обнаружили специфичность их взаимодействия с плазматическими мембранами клеток-мишеней. Оказалось, что стероиды не просто встраиваются в липидные области биомемб-рап за счет своей гидрофобности, но в компетентных клетках с высоким сродством и стереоспецифичностью взаимодействуют с мембранными структурами и тем самым опосредуют изменение
525
структуры мембраны и активности мембранных ферментов. Эти структуры отвечают всем требованиям, предъявляемым к рецепторам физиологически активных веществ: они осуществляют узнавание стероидов при их контакте с клеткой-мишецью и превращение гормонального сигнала в биохимическую реакцию па уровне самой плазматической мембраны.
В дайной главе мы рассмотрим основные факты, доказывающие существование рецепторов различных классов стероидных гормонов, и проанализируем основные достижения в области изучения структуры и функции этих рецепторов.
13.1. Стероидные гормоны как лиганды рецепторов
Все стероидные гормоны являются производными циклопепта-нофепа! аренового ряда, состоящими из четырех колец А, В, С и D, которые составляют скелет стероидной молекулы. Стероид-ные гормоны, исходя из биологического действия, а также последовательности и числа углеродных атомов в их молекулах, делят на четыре основные группы.
1. С 18-стероиды—эстрогены с основными представителями: эстрадиолом, эстроном, эстриолом.
2. С2]-стероиды—гестагены с основным представителем: прогестероном.
3. С)Э-стероиды—андрогены с основным представителем: тестостероном.
4. С2]-стероиды — кортикостероиды с основными представителями: кортизолом, кортикостероном и альдостероном.
В отличие от многих других циклических соединений, характеризующихся плоской пространственной структурой, стероидные молекулы реализуют биологическое действие через трехмерную структуру. Стероидным гормонам присуща стереоспецифичность действия, связанная с различными видами изомерии — оптической, геометрической и конформационной. Подробно
526
роль изомерии и электронной структуры в их взаимодействии с рецепторами рассмотрена нами ранее [Сергеев П.В., 1984].
Для каждого из перечисленных видов стероидных гормонов существуют чувствительные клетки, содержащие соответствующие рецепторы. Надо отметить, что в ряде случаев один стероидные гормоны могут выступать в качестве антагонистов рецепторов других стероидов (например, прогестерон является антагонистом рецепторов для глюкокортикоидов; ципротероиа ацетат является агонистом гестагенных рецепторов, но антагонистом андрогенных рецепторов). В последнее время в результате развития химии появляется все больше агонистов и антагонистов рецепторов стероидных гормонов, которые важны как для практической медицины, так и для выяснения гормоц-реценторных вза-имоотцошешш.
13,2, Рецепторы стероидных гормонов плазматических мембран клеток-мишеней
Первой структурой, с которой взаимодействуют стероидные гормоны в процессе реализации биологической активности на клеточном уровне, является цитоплазматическая мембрана. Однако исторически сложилось так, что первоначально участки, специфически связывающие стероиды, были найдены не в ней, а в цитозоле клеток. Тем не менее, мы считаем целесообразным рассмотреть рецепторы стероидных гормонов, локализовашцяе в плазматических мембранах клеток-мишеней.
В настоящее время для всех классов стероидных гормонов доказано существование на плазматических мембранах клеток-мишеней специфических рецепторов, которые опосредуют быстрые, негеномпые эффекты стероидов, индуцируя изменения проницаемости мембраны для тех или гшых ионов, или изменяя активность ферментов, образование вторичных посредников внутри клеток.
В нашей лаборатории были проведены многочисленные эксперименты для выяснения молекулярных механизмов взаимодействия стероидных гормонов с мембранными структурами. Оказалось, что характер связывания стероидных гормонов плазматическими мембранами клеток печени подобен таковому в гепатоцитах и значительно отличается от липосом.
527
Рис. 94. Связывание кортикостерона (1), эстрадиола (2) и тестостерона (3) плазматическими мембранами клеток печена в зависимости от концентрации гормонов.
По осн абсцисс —концентрация гормонов (нМ); пе оси ординат—количество связанного гормона (пкмоль/мг белка). Условия: время инкубации с гормонами 30 мин при 20’С, концентрация плазматических мембран 0,3 мг белка/мл.
Изучение связывания стероидов с мембранами гепатоцитов показало, что его характер различен для тронного (кортикостерона) и петроииых (эстрадиола, тестостерона) гормонов (рис. 94). Как видно из рисунка, кортикостерон по сравнению с эстрадиолом и тестостероном связывается в большем количестве, особешю в области меньших концентраций.
Анализ в координатах Скэтчарда (рис. 95) позволил определить значение параметров специфического связывания кортикостерона, тестостерона и эстрадиола с плазматическими мембранами гепатоцитов (табл. 33).
Таблица 33.
Параметры связывания стероидных гормонов с плазматическими мембранами гепатоцитов
Стероидный гормон К; 10®, № В , максг, пкмоль/мг белка
Кортикостерон 0,88±0,16 1,04 ±0,17
Эстрадиол 0,61+0,02 0,15±0,06
Тестостерон 1,05±0,23 0,17+0,05
528
в и
Рис. 95. Связывание кортикостерона (1), эстрадиола (2) и тестостерона (3) плазм этическими мембранами гепатоцитов в координатах Скэтчарда, По оси абсцисс—количество связанного гормона — В (пкмоль/мг белка), по оси ординат — В/U, где U— концентрация свободного гормона (пкмоль).
Анализ характера взаимодействия гормонов между собой (построение результатов в модифицированных координатах Лайиуивера-Берка) (рис. 96) показал, что в случае эН-корти-костеропа и кортизола, кортикостерона и гидрокортизона имеет место прямая конкуренция за связывание с насыщаемой системой плазматических мембран гепатоцитов, а в случае 3Н-кортикостеропа и эстрадиола и тестостерона —неконкурентное ингибирование.
Процесс связывания 3Н-кортикостерона является температурно-зависимым, причем, как видно из табл. 34, к изменению температуры чувствительны обе системы связывания гормонов, особенно иеиасыщаемая.
Преинкубация изолированных плазматических мембран гепатоцитов с блокатором SH-груцпы — н-хлормеркурибепзо-атом натрия — снижает включение кортикостерона насыщаемой, но не иенасыщаемой системой. Данный факт свидетельствует о важности SH-грунн белков для функционирования насыщаемых «систем узнавания» глюкокортикоидов.
Протеолитические ферменты — пролаза и папаин —также вызывают значительную потерю связывающей способности насыщаемой компоненты плазматических мембран и нракти-
М.3».2’7
529
Рис. 96. Влияние стероидных гормонов (а, б) на связывание 3Н-корти-костеропа с плазматическими мембранами гепатоцитов крыс. По оси абсцисс —концентрация свободного гормона, (пкмоль)-1. По осп ординат—концентрация связанного гормона, (пкмоль/мг белка)-'.
I— нет немеченых стероидов; 2 —в присутствии тестостерона; 3 —эстрадиола; 4—кортизола; 5—кортизона; 6—кортикостерона.
530
Таблица 34.
Связывание 3Н-кортикостерона с плазматическими мембранами клеток печени при различных видах физико-химических воздействий
Вид обработки Насыщаемая свете* /иа. % Ненасыщйемэя ск* стена* %
Контроль 100±8 100±12
n -X лоры ер кур и бензон а т 47±12 89±17
Прон аза 19±7
Папаин 14±7 84 ±22
Нейраминидаза 31±12 101=4=21
Фосфолипаза Аг 60±26 В0ч»]3
2,4- Ди н и тро фенол 97±13 94±29
Цианистый натрий 88±19 105±22
Оу ба ин 105±24 97±19
Нагревание до 60 °C 44±14 47±15
Инкубация при 4 °C 109±25 42±И
> » 20°С 100±13 100±8
» » 37°С 92±17 184±28.
Примечание. В таблице представлены результаты 6—14 опытов, достоверный интервал (Х±ш().
чески не воздействуют на их иенасыщаемые структуры. Белки, вероятно, несут основную нагрузку в работе «систем узнавания» кортикостерона.
Определенное значение в этой системе принадлежит сиаловым кислотам и фосфолипидам, о чем свидетельствует уменьшение поглощения кортикостерона плазматическими мембранами при воздействии на них ферментами нейраминидазой и фосфолипазой А2.
Аналогичные изменения связывания 3Н-эстрадиола с плазматическими мембранами гепатоцитов имели место при воздействии различных физико-химических факторов.
В дальнейшем нами были поставлены опыты с плазматическими мембранами клеток матки. Оказалось, что в плазматических мембранах клеток матки количество связанных иетроппых гормонов — кортикостерона и тестостерона — линейно увеличивается с возрастанием их концентрации в среде (рис. 97). В то же время тропные гормоны эстрадиол и эстриол аккумулируются мембранами более сложным образом; до концентрации ЗЮ’9 и 1-Ю9 М соответственно процесс их связывания нелинеен, а при дальнейшем увеличении концентрации эстрогенов в среде наблюдается линейная зависимость их аккумуляции в мембранах. Интересно, что все исследоваш1ые стероидные гормоны
531
а Л
Рис, 97. Зависимость связывания эстрадиола (1), кортикостерона (2), тестостерона (3), эстриола (4) плазматическими мембранами клеток матки (а) и липосомами (б) от концентрации.
По оси абсцисс — общая концентрация гормона в молях. По оси ординат — концентрация связанного гормона в молях. Содержание мембран по белку 166 мкг, содержание липосом по липидам 166 мкг, температура инкубации 20 "С.
связываются липосомами прямо пропорционально их концентрации в среде (рис. 97). При этом чем выше у гормона коэффициент распределештя липид/вода, тем в большей степени он связывается с искусственными везикулами.
Анализируя эти данные, можно предположить, что различие результатов, представленных ла рис. 97, объясняется тем, что в связывании тройных гормонов клеточными мембранами участвует ие только одна липидная система. Данное предположение подтверждает и анализ экспериментальных кривых в координатах Скэтчарда (рис.98) па примере эстрадиола. Как можно видеть из рисунка, связывание встрогепа действительно обусловлено функционированием двух систем: насыщаемой и ненасыщаемой.
Графическое разложение экспериментальных кривых на составляющие, которые характеризуют «индивидуальную» работу каждой из связывающих систем и анализ насыщаемой компоненты в координатах Скэтчарда, позволило определить параметры ее функционирования — константу связывания (К ) и число мест связывания (М). Для эстрадиола и эстриола соответствующие значения К.н равны 0,62-10®и 0,3810® М'1; М равно О.в-Ю-’2 и 0,08-10‘,:! моль на 1 мг белка.
Для характеристики биохимической природы эстрогепсвязыва-ющих компонентов плазматических мембран клеток матки бы-
532
Рис. 98. Анализ экспериментальной кривой связывания эстрадиола плазматическими мембранами клеток матки в координатах Скэтчарда.
По оси абсцисс - общее связывание гормона в молях; по оси ординат —отношение количества свободного к связанному гормону.
ла поставлена специальная серия экспериментов, в которых изучалось связывание гормонов при действии на мембраны различных ферментов (пропазы, папаина, нейраминидазы, липазы), а также ПХМБ, повышенной температуры и низкого значения pH. Анализ полученных результатов позволил сделать вывод о том, что в процессе «узнавания» и специфического связывания эстрогенов насыщаемой системой плазматических мембран клеток матки принимают участие глико протеиды. Нарушение целостности липидного матрикса, структуры мембранных белков и их SH-rpynii приводит к снижению эстроген-связывающен способности указанных систем.
Таким образом, первичное распознавание клетками-мишенями тропных гормонов происходит па уровне плазматических мембран. Нарушение работы «узнающих» систем способно приводить к искажению физиологического ответа па гормональный сигнал.
Весьма интересной в этом плане является работа, выполненная С.Ш. Сулеймановым (1982), в которой изучалась эстро-генсвязывающая способность плазматических мембран миометрия человека при различных заболеваниях — миоме, аденокарциноме, выпадении матки. Деление больных по возрасту и по типу патологии позволило рассчитать достоверность различий величии связывания меченного эстрадиола плазматическими мембранами. Как оказалось, с возрастом происходит снижение связывающей способности плазматических мембран маток, удаленных по поводу миомы и выпадения. В то же время при аденокарциноме в разных возрастных группах достоверных отличий в связыва-
533
I i L,_____________I— 30 40 50 ВО_____________?0
Рис. 99. Зависимость связывания эстрадиола плазматическими мембранами клеток миометрия при различных заболеваниях.
1 — миома; 2—аденокарцинома; 3 — выпадение матки. По оси абсцисс—возраст бальных, годы; по оси ординат—количество связанного гормона (пкмоль/166 мг белка). Концентрация гормона 2‘10'9 М, температура 20’С.
ции не обнаружено (рис. 99). Отмечено, что у женщин одного возраста при аденокарциноме связывание значительно выше, чем при миоме (возраст 46—50 лет) и при выпадении матки (возраст 61-70 лет). Таким образом, при развитии аденокарциномы, являющейся гормонально-завис и мой опухолью, уровень связывающей способности мембран клеток матки во всем исследованном возрастном интервале остается таким же высоким, как в репродуктивном периоде. При развитии рака эндометрия у женщин важную роль играет длительная эстро-генизация, которая возникает при функциональных и органических изменениях в яичниках, нарушениях метаболизма стероидов, неадекватной гормональной терапии, изменении спектра секретируемых гормонов. Можно предположить, что при аденокарциноме в результате усиленной работы системы связывания увеличивается поступление эстрогенов в клетки-мишепи даже при нормальном содержании стероидов в крови, т.е. наблюдается гиперэстрагепизация клеток в результате нарушения принципа селективного отбора эстрогенов.
В мембранах гепатоцитов присутствуют два вида участков, специфически связывающих кортизол с константами диссоциации 1,5Л09 и 4,1-10'9 М и числом мест связывания 4,3 и 4,6 нмоль/г белка. При проведении конкурентного анализа с большим рядом природных и синтетических стероидов за связывание с плазматическими мембранами 3Н-кортизола были обнаружены высокая специфичность мембранных связывающих участков к природным глюкокортикоидам и отсутствие для дексаметазона (отметим, что в цитозоле присутствуют специфически связывающие участки как для кортизола, так и для дексамета
534
зона). Результаты В.Koch и соавт. (1978) свидетельствуют о наличии специфического связывания глюкокортикоидов с плазматическими мембранами гипофиза. В этом случае кортикостерон связывался с плазматической мембраной в большей степени (примерно в 4 раза), чем дексаметазон. Кортикостерон, дезокси кортикостерон и прогестерон существенно снижали связывание 3Н-кортикостерона с данными мембранами, а дексаметазон и эстрадиол обладали меньшим эффектом. В противоположность этому указанные стероиды не вытесняли 3Н-дексаметазон из мембран, что свидетельствует, вероятно, о неспецифическом связывании синтетического стероида. Экстрагированный тритоном Х-100 из плазматических мембран корта костеронсвязываюгций материал осаждался при центрифугировании (константа седиментации 4S).
Кроме того, специфически связывающие участки были выявлены в плазматических мембранах клеток плаценты человека для кортикостерона, в плазматических мембранах клеток почек крыс для альдостерона, в плазматических мембранах клеток матки крыс для 17р-эстрадиола.
Логично предположить, что результатом специфического связывания стероидных гормонов с плазматическими мембранами может быть развитие биохимического ответа уже па уровне самой мембраны.
Действительно, нам удалось установить, что активность маркерного фермента плазматических мембран клеток 5'-иуклеотид-азы в суспензии гепатоцитов и их плазматических мембран характерно изменяется в присутствии кортикостерона и гидрокортизона: при концентрации гормонов 0,1 и 10 цМ наблюдается снижение ферментативной активности па 12 — 16%. В то же время тестостерон, эстрон и 17₽-эстрадиол снижают активность 5'-пуклеотидазы клеток па 25 — 30% и мембран па 15 — 20% при концентрациях 0,1 нм и вызывают постепенное возрастание активности до исходного уровня по мере увеличения концентрации до 1 мкМ. Поэтому можно говорить о специфической реакции мембраносвязашюго фермента па взаимодействие глюкокортикоидов с системами «узнаваниям плазматических мембран компетентных клеток.
Исследование флюоресценции АНС' в плазматических мембранах гепатоцитов и липосомах показало, что все изучешгые стероиды снижают интенсивность флюоресценции зонда в мембранах пропорционально логарифму концентрации гормона в среде. Однако если в среде этот эффект коррелирует с коэффициен
535
том распределения стероидных гормонов в системе липид/ вода (эстрон, эстрадиол, кортикостерон, тестостерон, кортизол), то в плазматических мембранах такая корреляция нарушается. В них глюкокортикоиды снижают интенсивность флюоресценции зонда сильнее, чем более гидрофобные эстрогены. Обработка плазматических мембран блокатором SH-групп — ц-хлормеркурийбепзопом натрия — снимает различия в действии стероидов на флюоресценцию АНС' в биомем-бранах и липосомах.
Итак, при взаимодействии тропных стероидных гормонов с плазматическими мембранами имеют место специфические конформационные и функциональные изменения мембран. Следовательно, есть все основания считать, что участки плазматических мембран компетентных клеток, которые специфически связывают стероидные гормоны, выполняют рецепторную функцию.
К такому же выводу приводят результаты, полученные Т.М. Морозовой (1983), согласно которым плазматические мембраны опухолевых клеток молочной железы содержат участки (рецепторы), специфически связывающие эстрогены и опосредующие их стимулирующее действие па аденилатциклазу.
В то же время мы должны отметить, что роль данных мембранных рецепторов стероидных гормонов в реализации их физиологических эффектов еще предстоит изучить. Важно выяснить, существует ли параллелизм между сродством стероидов к мембранам и выраженностью их гормонального эффекта, проявляющегося в изменении характерных физиологических функций (такой параллелизм имеет место в случае цитозольных рецепторов стероидных гормонов). Будущие эксперименты должны дать определенный ответ па данный вопрос. Однако уже имеющиеся данные позволяют предполагать, что рецепторам плазматических мембран принадлежит некая дополнительная роль в опосредовании их биологической активности (в пользу этого говорит значительно более слабое связывание дексаметазона по сравнению с природными глюкокортикоидами с мембранами клеток-мишеней, несмотря на выраженную гормональную активность дексаметазона).
По нашему мнению, экстраядерпым эффектам стероидных гормонов необходимо уделять пристальное внимание. Так, но данным A.D.Goldstone и соавт. (1983), в концентрации IO'8 М тестостерон вызывает очень быструю (менее чем за 30 с) стимуляцию поглощения 45Са2+ срезами ночек. В этих же концентрациях гормон снижает содержание Са!+ в митохондриальной фрак-
536
цин и увеличивает количество растворимого Са2+, что указывает па мобилизацию внутриклеточных резервов этого катиона. По мнению авторов, данное влияние тестостерона на обмен Са2+ опосредует его способность стимулировать эидоцитоз и транспорт гексоз и аминокислот в срезах почек, так как повышенное содержание Са2+ в цитоплазме клеток служит регуляторным сигналом для активации транспортных реакций.
В настоящее время существуют многочислешгые датшые о мембранных, быстрых неге ном пых эффектах всех классов стероидных гормонов, а также витамина Д и тиреоидных гормонов. Мембранные рецепторы этих гормонов сопряжены с ферментами, катализирующими образование вторичных посредников; в большинстве случаев это фосфолипаза С, которая, регулируя обмен фосфоинозитидов, изменяет величины внутриклеточного pH и концентрации кальция, а также иротеиикиназа С, которая селективно катализирует фосфорилирование определенных внутриклеточных белков, изменяя их функциональную активность (Schmidt В. и соавт., 1998). Если о биохимических маркерах иегепомиых эффектов стероидов известно уже достаточно давно, то практически пе ясным остается вопрос о физиологических проявлениях активации мембранных рецепторов стероидных гормонов. В этой связи следует отметить некоторые работы, посвященные данной проблеме. В частности, имеются данные о повышении электрофизиологической активности нейронов барорецепторов собаки через 15 мин после введения альдостерона (Wang W. и соавт. 1992), об увеличении резистентности сосудов через 3 мии после внутривенного введения альдостерона (0,5 мг) у человека (Wehling М., 1998), об Индукции прогестероном акросомной реакции сперматозоидов и созревания ооцитов (Turner, Meizel, 1995), о седативных эффектах нейростероидов в результате их взаимодействия с ГАМКа-рецепторами (Zhang S. и соавт. 1994), о сосудорасширяющих эффектах эстрогенов (Ruehlmann D. и соавт., 1998). Дополнительные сведения о возникновении быстрых физиологических ответов при действии глюкокортикоидов, минералокортикоидов, эстрогенов, андрогенов, витамина Д и трийод-тиропипа можно найти в обзоре М. Wehling (1997) и в материале первой международной конференции “Быстрые ответы к стероидным гормонам”, Мангейм, Германия, 1998).
Важно отметить, что при анализе действия стероидных гормонов на структуру и функцию плазматических мембран необходимо принимать во внимание зависимость возникновения эффе
537
кта от времени, так как существуют данные об опосредованных мембранных эффектах стероидов, которые возникают через 30 мин после воздействия гормона. Согласно сообщению T.D.Colehrter (1979), дексаметазон ингибирует транспорт природных аминокислот в культивируемые клетки гепатомы, начиная с 30-й минуты с t[/2, равным 90—120 мин.
Суммируя изложенное выше, мы считаем, что многие физиологические и биохимические изменения в клетке при действии стероидных гормонов, их различный и даже противоположный характер действия находят свое объяснение с учетом вклада работы систем «узнавания» плазматических мембран клеток-мишеней. Можно утверждать, что «мембранный этап» играет важную роль в процессе рецепции гормонов и их биологическом действии, что позволяет вычленить его как отдельную стадию реализации активности стероидных гормонов.
Если раньше исследования рецепторных механизмов действия стероидных гормонов проводились в основном с целью выяснения причин чувствительности тех или иных клеток к стероидному гормону, то теперь, после появления методов генетической рекомбинации и выяснения химической структуры рецепторов стероидных гормонов, па первый план встал вопрос об их гетерогенности и вариабельности, как основы совершенствования фармакотерапии различных гормопоза-висимых заболеваний с помощью селективных чистых (полных) или частичных агонистов и антагонистов.
13.3. Биохимические свойства внутриклеточных рецепторов стероидных гормонов
Внутриклеточные рецепторы стероидных гормонов представляют собой ядерные белки, которые специфически связывают лиганд и опосредуют его модулирующее действие па транскрипцию специфических генов органов-мишеней, приводя к физиологическим и морфологическим изменениям в них. Эти рецепторы относятся к семейству внутриклеточных рецепторов стероидных гормопов/тиреоидных гормонов/ретиноидов/витамина Дг В их структуре выделяют домены, связывающиеся с лигандом, ДНК и ответственные за регуляцию транскрипции (табл.35).
538
Таблица 35.
Домены внутриклеточных рецепторов стероидных гормонов и их функции
А/В С D Е F
Б елок-белковые взаимодействия. Активация транскрипции. Узнавав Пе послсдова-ТСЛЫ1ОСТИ ДНК. Связывание с ДНК. Димеризация. Димериза-ция. Определение локализации в ядре клетки. Связывание лиганда. Активация тран-с к р и п ц и н. Связывание белков теплового шока н имму кофилинов. Определение локализации в ядре. Димеризация. Активация транскрипции.
N-концевой участок рецепторов (A/В -домен) отличается вариабельностью; он содержит от 25 (рецептор витамина Д) до 603 (рецептор минералокортикоидов) аминокислотных остатков. Домены С, D и Е, ответственные за связывание с ДНК, характеризуются консервативностью и мало отличаются друг от друга у рецепторов стероидов разных классов. Участок рецепторов, связывающийся с ДНК, содержит 2 выступающие цинк-содержащие структуры С, и С2 (рис. 100). Cf принимает участие в непосредственном связывали , с гормоночувствительными элементами (ГЧЭ) ДНК, а С2 —в образовании гомодимеров и гетеродимеров рецепторов.
В механизмах активации стероидами цитозольных рецепторов имеются общие характеристики. При отсутствии гормона рецепторы представляют собой неактивные олигомерные комплексы, содержащие белки теплового шока (hsp90 и hsp70), иммуно-филины и неидеитифицироваипые молекулы протеинов.
Основная функция белков теплового шока заключается в способствовании переходу гормопосвязывающего домена рецептора в конформацию, характеризующуюся высоким сродством к стероиду. Связывание гормона регулирует взаимодействие гормопосвязывающего домена с белками теплового шока.
Семейство белков теплового шока hsp90 широко распространено в клетках млекопитающих; они составляют 1—2% от всех белков цитозоля. В клетках млекопитающих этот белок кодируется 2 генами; человеческий ЬзрЭОа-белок па 86% по своему аминокислотному составу гомологичен ЬзрЭСф-белку. В иптакт-
539
Рис. iOO, Структура цитозольных рецепторов кортикостероидов человека.
а — аминокислотная последовательность ДНК-связывающсго участка глюкокортикоидного (ГР) и минералокортикоидного (МР) рецепторов человека;
б—функциональные участки ЕР (777 аминокислотных остатков) и МР (984 аминокислотных остатка). Показана гомология A/В, С и Е участков между МР и ГР.
пом виде ЬзрЭО-белок представляет собой димер с молекулярной массой равной 165 000—180 000 дальтон; он способен образовывать олигомеры из 4-х или более субъединиц. Чаще образуются гомодимеры аа- или pp-гомодимеры этого белка, хотя встречаются и его гетеродимеры. Очищенные hsp-белки имеют АТФ-азпую активность и подвергаются аутофосфорилирова-пию. Однако для реализации внутриклеточной функции этих белков нет необходимости в присутствии АТФ. Известно, что казеинкииаза 11 связывается с hsp-белками эукариот. В покое большинство hsp-белков находится в цитоплазме и в небольшом количестве —в ядре клеток. При стрессе эти белки переходят из цитоплазмы в ядро клетки. В большинстве случаев hsp-белки диффузно распределены в цитоскелете — в мембранах микросом, микротрубочках и микрофиламептах.
В интактных клетках в отсутствие лиганда рецепторы глюкокортикоидов, прогестинов и эстрогенов существуют в виде гетеротетрамерных структур: одной молекулы рецепторного белка, двух молекул hsp-белков и одной молекулы полипептида с молекулярной массой около 50 кдальтоп, называемого иммупо-филипом. Однако, в других условиях выделения и идентифи
540
кации отмеченных комплексов, а именно более мягких условиях их экстрации, одна рецепторная молекула находилась в связывании с 4 молекулами hsp-белка.
Кроме того, имеются биохимические данные о том, что указанные гетерокомилексы 9S глюкокортикоидных рецепторов связаны с нитями актина. Однако, роль микротрубочек в аккумуляции рецепторных комплексов в ядре клетки пока доказана только для рецепторов витамина Д (вещества, разрушающие микротрубочки, ингибируют модуляцию гешюй активности витамином Д, ио не прогестинами или глюкокортикоидами).
В рецепторных гетерокомилексах, определяемых иммунологически, выявляются также другие белки, два из которых представляют собой hsp70- и р23-белки. Временным участником рецепторных гетерокомнлексов является рбО-белок. Иммунофи-лины и фос-фатаза связываются с рецепторными гетерокомплексами (их ЬзрЭО-белками) при участии своих тетратрикопен-тидпых доменов.
Hsp-белки связываются с рецепторами стероидов АТФ-зави-симым образом с неразверпутыми областями рецепторного белка возможно посредством гидрофобных взаимодействий (гидролиз АТФ приводит к высвобождению белка из этой связи). В интактных клетках hsp-белок диффузно распределен между цитоплазмой и ядром, ио при тепловом шоке он концентрируется в ядре. В отличие от ЬзрЭО-белка, Й5р70-6елок не диссоциирует от стероидного рецептора при связывании стероида или повышении ионной силы. Хотя он присутствует в трансформированном гормональном рецепторе, при связывании последнего с ДНК, ла это связывание влияния ле оказывает. При добавлении АТФ к комплексу прогестеронового рецептора с Ьзр70-белком при 23°С наблюдалась его диссоциация, что указывает на индукцию этого процесса гидролиза АТФ. Полагают, что Ьзр70-белок взаимодействует с гормоиосиязывающим доменом в участке, который отличается от участков связывания ЬзрЭО-белка. Следует отметить, что в ряде случаев гормонрецепторные гетерокомилексы не содержат в своем составе Ьзр70-белка. На этом основании можно полагать, что данный белок, обычно взаимодействующий с многими белками клетки, пе играет какой-либо существенной роли в реализации функциональной активности рецепторов стероидных гормонов, хотя и может принимать участие в регуляции образования гетерокомплекса стероидных рецепторов в цитозоле и переходе его в ядро.
541
Еще одним белком, входящим в состав гетерокомплекса стероидных рецепторов, является белок р23, имеющий молекулярную массу равную 23 кДальтон. Данный белок обнаружен в составе прогестероновых рецепторов птиц и глюкокортикоидных рецепторов мышей. С помощью антител против р23 он был обнаружен во всех тканях живых организмов от дрожжей до человека. р23-Белок высвобождается из связи с гетерокомплексом прогестероновых рецепторов при добавлении прогестерона in vivo и после солевой обработки in vitro. Показано, что р23 непосредственно взаимодействует с Ьзр90-белком (данное взаимодействие требует присутствия АТФ). В то же время участка, с которым взаимодействует АТФ, на молекулах р23 и hsp-белка пе обнаружено.
Если роль р23-белка в функционировании гетерокомплекса стероидных рецепторов, еще не изучена, то уже есть более точные сведения об участии в нем иммупофилипов —консервативных белков, которые обладают пептидилпропилизомераз-пой активностью и которые названы так вследствие способности связывать иммунодепрессанты. С гетерокомплексами рецепторов стероидных гормонов связываются три типа иммуно-филинов, имеющих большую молекулярную массу. Благодаря наличию тетратрикопептидпых доменов иммупофилины взаимодействуют с ЬзрЭО-белкамп. Само взаимодействие иммуно-филинов с ЬзрЭО-белками посредством тетратрикопецтидцого домена характеризуется консервативностью и представляет основное белковое взаимодействие как у растений, так и животных. Иммунофилипы, взаимодействующие с гетерокомнлекса-ми рецепторов стероидных гормонов всех типов, имеют молекулярную массу около 59 кДальтон и принимают участие в разворачивании молекулы рецептора,
В образовашш и трансформации 9S гетерорецеиторцого ком-н-лекса, состоящего из гормопосвязывающего белка, белков hsp9O и hsp70, белка р23 и иммунофнлина, принимают участие АТФ и Mg. Эти процессы являются темиературозависимыми. Рецепторы, не содержащие hsp-белка, при нагревании теряют способность связывать гормон. В присутствии АТФ-образующен системы количество Ьзр70-белка, связанного с рецепторным гетерокомнлек-сом, уменьшается, а hsp-белка и р23-белка увеличивается.
В ответ па связывание с гормоном происходит отсоединение мономера рецептора от олигомерного комплекса и у мономеров появляется способность к димеризации и последующему взаимодействию с гормопчувствительпымп элементами (ГЧЭ),
542
которые обычно находятся в регуляторной области генов, отвечающих па стероиды. Взаимодействие гормо! [-рецепторного комплекса с ГЧЭ приводит к увеличению или снижению процессов транскрипции. Механизмы влияния стероидов па активность генов цока пе выяснены. Однако не вызывает сомнения, что они во многом определяются характером комплексообразования стероида с цитозольным рецептором и исходной структурой молекулы рецепторов. Согласно полученным в последние годы данным, эти рецепторы, во-первых, активны только в виде димеров, во-вторых, мономеры рецепторов стероидов одного класса пе одинаковы п поэтому могут существовать различные димеры, и, в третьих, мономеры рецепторов разных классов могут взаимодействовать между собой, то есть могут образовываться гетеродимеры стероидных рецепторов, представляющие собой гетерогенные рецепторные образования.
13.3.1. Рецепторы глюкокортикоидов
Характер действия кортикостероидов на многие ткани-мишени свидетельствует о наличии в клетках этих тканей для них цитозольных рецепторов [Сергеев П.В. и соавт. 1991, 1995, 1998; Сергеев П.В., 1984]. Легче перечислить органы, в которых не обнаружены рецепторы для кортикостероидов (у крыс это матка, тощая кишка, жировая ткань и мочевой пузырь, а у кроликов, цо-видимому, и последние три ткани содержат плазматические рецепторы для кортикостероидов).
В печени имеются 4—5 типов растворимых белков, которые связывают глюкокортикоиды. Один из них (I тип) идентичен транспортану или кортикостероидсвязывающему глобулину (он синтезируется в печени и секретируется в плазму). Другой (П тип) цитозольный белок, связывающий природные кортикостероиды, называют А-белком; А-белок дает перекрестную иммунологическую реакцию с трапскортииом и может быть промежуточным продуктом биосинтеза или деградации транскортина. К Ш типу данных белков относится лигандии; лигапдип находится в высокой концентрации в цитозоле печени; кроме кортикостерона, этот белок связывает ряд производных кортикостероидов, а также другие гидрофобные метаболиты: билирубин, желчные кислоты, холестершь Белок IV типа цитозоля печени (G-белок) можно назвать цитозольным рецептором для глюкокортикоидов; он специфически связывает пе только природные, но и синтетические гормоны (дексаметазон, преднизолон) и участвует в транспорте стероида в ядро.
Комплекс кортизон —цитозольный рецептор седимептиру-
543
гсг
-Тс
гсг
Изменение клеточной функции
Рис. 101. Механизм функционирования глюкокортикоидного цитозольного рецептора.
После диссоциации комплекса глюкокортикоид связывающего глобулина (ГСГ) со стероидом (С), последний проникает внутрь клетки, где связывается с глюкокортикоидным рецептором (ГР), В результате взаимодействия ГР с С происходит отсоединение от РГ белков теплового шока (HSP-70 и HSP-90) и иммунофилина (ИФ). В виде димера комплекс ГР-С проникает в ядро, где связывается с гормончувствитсльными элементами (ГЧЭ), регулирующими процесс транскрипции определенных генов.
ет при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы с константой 4S. В дальнейшем гормон-рецепторный комплекс подвергается активации (фосфорилированию), проходящей при участии рецелтортрансформирующего фактора — белка из группы аминотрансфераз (цАМФ-зависимая протеипки-паза), и изменению конформации (отсоединение от белков теплового шока и иммуиофилина). В ядре комплекс обнаруживается в трансформированном виде (рис.101).
Показательно, что пи один свободный кортизон, пи рецен-
544
тор без гормона пе проникают в ядро и не влияют па активность PH К-полимеразы.
Природа и число гормопчувствителыпях элементов (ГЧЭ), с которыми взаимодействуют стероид-рецепторные комплексы, продолжают изучаться; имеются данные об участии в этом взаимодействии ДНК и негистоиовых белков. Глюкокортикоиды могут стимулировать или ингибировать процесс транскрипции. Последовательность нуклеотидов ДНК, которая образует ГЧЭ стимулирующего типа для глюкокортикоидов представляет собой ГГТАЦАпппТГТТЦГ, где п — любой нуклеотид. Идентифицированы также некоторые гены, экспрессия которых негативно регулируется кортикоидами. В первую очередь это касается гена цро-ониомеланокортина, а также генов цитокинов, принимающих участие в воспалении и иммунных реакциях, коллагеназы и стромелизина. При этом гормон-рецепторный комплекс непосредственно связывается с белком активатором триск-рипции (АР-1), который стимулирует регуляторы транскрипции семейств Fos и Jun, индуцирующих экспрессию многих генов, включающих и те, которые ответствеш1ы за синтез цитокинов и коллагеназы. Кортикоиды ингибируют активность АР-1.
Цитозольные рецепторы и транскортикоподобные белки были найдены и в других органах-мишенях для глюкокортикоидов [Сергеев П.В., 1984].
Некоторые сведения о цитозольных рецепторах глюкокортикоидов различных тканей представлены в табл. 36.
Как видно из таблицы, рецепторы глюкокортикоидов различных тканей могут иметь неодинаковую молекулярную массу, сродство к лигандам и другие физико-химические характеристики. Более того, в одних случаях активация этих рецепторов сопровождается уменьшением их размеров (тимоциты, клетки опухоли гипофиза), а в других этого не происходит (семенники). Приведенные данные свидетельствуют о возможности различия функционирования глюкокортикоидных рецепторов в той или мной ткани.
Тем не менее, можно отметить некоторые общие закономерности взаимодействия стероидов с глюкокортикоидными рецепторами. Анализ зависимости сродства стероидов к этим рецепторам к термодинамических параметров указанных взаимодействий свидетельствует о том, что при физиологических условиях основной движущей силой связывания стероидов с рецепторами являются гидрофобные взаимодействия и что нн-
35 Зак.22?
545
Таблица 36.
Некоторые физико-химические свойства цитозольных рецепторов глюкокортикоидов
Ло1злл»цщ| рецепторе» Молеху» лярш маем Сродство Кд(нМ) лнгаяд *Н-дехса-меэдоя ®m»X' фжльДг Сел к» Радиус Стокса,мМ Констант* седиментации
Тимоциты крыс: 100000 1.1 (21е) 5,9(37°) 3000
актнвнроваивые 5,0 4.8
неактнвярованные 330000 8.3 9,2
Лимфома мышей 98000
Клетки опухоли гипофиза мышей
АТ-20: активированные 81000 —- 6,0 3,0
неактивированные 317 000 — 8,3 9,0
Клетки семенников крыс —X 6,5
Матка человека: эндометрий 0,9 100
4,3
Миометрий 2.3 223
Плацента человека (38—42 12,8 163
и 8-12) Печень крыс при /: 22,0 268 — —
25 °C 2.2 120
4 °C 2.6 140 —
С 10 мМ ЭДТА 2,1 260
Печень человека 17 67,5 7
Легкие человека Скелетные мышцы чело- 1.9 8.2 8
века 5,9 53
Головной мозг человека 5,8—8,2 300
Кожа человека Фибробласты мыши: 8,9 95 — —
при низкой ионной силе в 127000 __
изотоническом растворе Сетчатка эмбрионов цып- 109 000 — — —
лят 108 000
Сердце крысы Трабекулярные клетки че- 61000 3,0 330 —
лоаека —— 5 60001)*
Лейкоциты 2—10*
Фагоциты 2—10*
Лимфоциты 2—10* .
Фибробласты 32*
Миоциты — . 660*
Эндотелиальные клетки - 48*
Амнион человека 5-10 — • —
Примечание. Звездочкой отмечены в фмоль/на клетку.
546
дукция стероидом специфических конформационных изменений рецептора необходима для активации хроматина гормоп-рецецторным комплексом [Jan N.C. et al., 1982]. Изменения в структуре цитозольных рецепторов вследствие мутации могут привести к изменению чувствительности клеток к глюкокортикоидам. Так, C.H.Silley и K.R. Yamamoto (1979) сообщили о существовании у мутантных клеток лимфомы мышей S49 цитозольных рецепторов, которые, хотя и связывают стероид и взаимодействуют с хроматином, не индуцируют ранние изменения в структуре хроматина и развитие цитотоксического эффекта гормонов. В этом случае глюкокортикоидный рецептор имел низкую молекулярную массу (39 000). У чувствительных к глюкокортикоидам клеток лимфомы цитозольный рецептор имеет молекулярную массу 87 000. Это, но-видимо-му, указывает па потерю при мутации какой-то части рецептора, которая является ответственной за активацию хроматина. Предполагается, что эффекторная функция цитозольного рецептора глюкокортикоидов реализуется при участии С-копцевой части рецептора. Действие глюкокортикоидов носит разнонаправленный характер: они стимулируют анаболические процессы в печени (повышают синтез ДНК, РНК, белков), а на остальные органы (скелетные мышцы, почки, сердце, кожу, легкие) оказывают катаболическое действие.
Стероиды, взаимодействующие с глюкокортикоидными рецепторами, можно классифицировать па чистые агонисты, частичные агоипсты/аптагописты и чистые антагонисты.
Агонисты, как правило, медленнее, чем антагонисты связываются с цитозольными рецепторами и время жизни комплекса агонист —рецептор больше, чем антагонист —рецептор. Существование чистых агонистов и антагонистов предполагает существование двух различных функциональных форм или состояний рецептор-стероидпого комплекса и различий взаимодействий агонистов и антагонистов с цитозольными рецепторами. Изучив кинетику комплексообразования ряда стероидов с глюкокортикоидными рецепторами цитозоля тимуса крыс, T.RJones и Ph.A.C.Beli (1982) показали, что во всех случаях диссоциация комплексов описывается монофазпой кривой первого порядка, хотя константы скоростей диссоциации для отдельных стероидов различны: для агонистов (триамцинолона, дексаметазона, преднизолона и кортикостерона) К। равна 2,78-10‘2 — 4,9110', а для частичных агоцистов/апта-гоиистов (N-дезоксикортикостеропа, альдостерона и N-дезок-
и*
547
Схема 10.
Общая модель взаимодействия стероидов с глюкокортикоидными рецепторами [Jones Т. R., Bell Р. А., 1982].
А
Дексаметазон
Hft
Б Прогестерон
0,49
Активный
Неактивный
Неактивный
Активный
8,940 "3
А — значения Кд для чистого агониста дексаметазона. Б — величины Кд для антагониста прогестерона. Неактивное состояние рецептора и его комплекса с лигандом обозначены R1 и SR1 соответственно, а активное состояние рецептора и его комплекса с гормонами R2 и SR1.
сикортизола) и чистых антагонистов (прогестерона и 17-гидроксипрогестерона) К, равна 0,17 —9,02‘Ю'3 мин1.
Ассоциация стероидов с рецепторами описывалась кинетикой второго порядка Михаэлиса—Меитеп, которая наиболее выражена для прогестерона (для агонистов К+1 была, как правило, выше, чем для антагонистов).
Расчеты, основанные на определенных кинетических параметрах, показали, что значительная часть аптагонист-рецепторных комплексов (33% в случае прогестерона) находится в промежуточном состоянии, в то время как все агонист-рецепториые комплексы —в прочно ассоциированном состоянии.
Предполагая, что две формы стероид-рецепторного комплекса соответствуют его биологически активному и неактивному состоянию, предложена гипотетическая модель взаимодействия агонистов и антагонистов с глюкокортикоидным рецептором (схема 10).
Поскольку высокие концентрации чистого или частичного антагониста, но не чистого агониста, ускоряют скорость диссоциации комплекса 3Н-деке аметаз он — рецептор, можно пола
548
гать, что для антагонистов на рецепторе существует второй специфически связывающий участок, взаимодействие с которым приводит по механизму отрицательной кооперативности к снижению сродства первичного специфически связывающего участка для агонистов. Будущие эксперименты, по-видимо-му, ответят па вопрос, действительно ли существуют отдельные, но взаимодействующие между собой участки агонистов и антагонистов иа молекуле глюкокортикоидного рецептора.
Необходимо подчеркнуть, что глюкокортикоидные рецепторы —это мобильные структуры, чувствительные к температуре, ионной силе раствора, воздействию хелатных веществ, глицерина, антагонистов калмодулипа: трифторперазина, винбластина или пропранолола (последние действуют как глюкокортикоидные антагонисты, непосредствешю взаимодействуя с их рецепторами). С физиологической точки зрения важным является участие эндо-гашых Са2+ и Mg2+ в процессах стабилизации и трансформации глюкокортикоид-рецепторного комплекса.
Со времени открытия цитозольных рецепторов стероидных гормонов до настоящего времени привлекает внимание исследователей механизм их так называемой активации (или трансформации), позволяющий гормоп-рецепторному комплексу накапливаться в ядре. Выявлено, что глюкокортикоидные рецепторы цитозоля клеток опухоли мышей AtT-20 стабилизируются молибдатом и представляют собой тетрамеры, субъединицы которых имеют молекулярную массу 81 000. Поскольку 1-тиогли-цррип стимулирует активацию (диссоциацию тетрамерного комплекса), можно считать, что во взаимодействии субъединиц рецептора принимают участие сульфгидрильные группы (взаимодействие молибдата с SH-групиами белков может быть механизмом стабилизации глюкокортикоидного рецептора). Гипотетическая модель активации глюкокортикоидных рецепторов Представлена на рис. 102. Как видно из рисунка, активация цитозольного глюкокортикоидного рецептора включает диссоциацию идентичных субъединиц рецептора либо диссоциацию рецепторной субъединицы от «рецептор-ипгибирующих факторов», которые найдены также для эстрогенных, прогестиновых и андрогенных цитозольных рецепторов.
Особый интерес представляет дальнейшая судьба гормон-рецепторпого комплекса после его взаимодействия с хроматином. В последнее время исследователи смогли получить некоторую информацию, касающуюся этого вопроса.
549
ДнН
Рис. 102. Гипотетическая модель активации глюкокортикоидных рецепторов [Vedeskis W.V., 1983].
Неактивный рецептор представлен в виде гомотетрамера идентичных гормон-свяэывающих субъединиц или в виде комплекса рецепторной субъединицы с рецепторевязывающими факторами RBF. Н —Гормон.
P.Aranyi (1983) в модельных исследованиях установил, что при температуре 25 — 37 °C и высокой ионной силе (0,3 М КС1) происходит активация комплекса цитозольный рецептор — 3Н-триамцииалои и он связывается с ДНК-целлюлозой. Однако активация комплекса является преходящей, а за ней следует дезактивация, зависящая от температуры инкубации и концентрации КС1 и приводящая к снижению связывания рецептора с ДНК-целлюлозой. В то же время при этом изменении специфического связывания рецептора с триамцинвлопом пе наблюдалось. Ионы молибдата заменяли процессы активации и дезактивации, по пе предотвращали тепловую активацию гормон-рецепторпого комплекса. Можно полагать, что процесс дезактивации, описанный P.Aranyi (1983), аналогичен тому, что имеет место в живых клетках при уменьшении концентрации гормона (известно, что при исчезновении гормона рецепторы покидают ядро и появляются в цитоплазме в свободном состоянии).
Важные данные о динамике функционирования триамцина-лон-рецепторпого комплекса в клетках гепатомы Мориса 7777, хотя и косвенно, получили М.А.Красильников и соавт. (1983). Они обнаружили, что на начальных этанах гормональной индукции в клетки протекает максимальное количество специфически связанного триамциналопа, которое постепенно уменьшается в процессе последующей инкубации. С увеличением времени инкубации связывание 3Н-триамциналопа все в меньшей степени подавлялось избытком немеченого гормона, и снижа
550
лась скорость выхода 3Н-триамцш1алоиа из ядер в свободной от гормона среде. После удаления гормона из среды клетки сохраняли способность индуцировать синтез тирозипаминотран-сферазы на протяжении 10 ч и более, хотя уже через 3 ч количество связанного с клетками гормона снижалось до 20—25% от исходного уровня. При этом скорость последующей деиндукции синтеза фермента зависела от времени инкубации клеток со стероидом; в клетках, проинкубированных с триамцииалоиом в течение Ю мин, деиндукция развивалась медленнее, чем в клетках преинкубировашпях с ним в течение 48 ч. Поскольку известно, что взаимодействие гормоц-рецепторного комплекса с хроматином приводит к образованию повой конформационной структуры, обеспечивающей повышенный синтез специфических молекул мРНК, можно полагать, что подобная конформационная структура сохраняется в активном состоянии довольно продолжительное время (более 10 ч) и при резком снижении концентрации связанного гормона (дезактивация гормои-реце-иторного комплекса).
Заканчивая рассмотрение функционирования цитозольных рецепторов глюкокортикоидов, мы считаем необходимым обратить внимание па некоторые нерешенные проблемы по этому вопросу.
1. До сих пор пет классификации цитозольных рецепторов глюкокортикоидов, хотя имеются сведения об их гетерогенности и полиморфизме.
2. Неясна локализация цитозольных рецепторов стероидов. Не исключено, что процесс гомогенизации тканей, необходимый для выделения цитозольных рецепторов, приводит к разрушению лабильной связи их с цитоплазматической мембраной и элементами цитоскелета. Кроме того, еще не разработана адекватная методика получения полностью очищенного глюкокортикоидного стероидного рецептора. Существующие методики изучения распределения глюкокортикоидных рецепторов, основанные па связывании свободного глюкокортикоида с помощью древесного угля, покрытого декстраном, сопряжены со значительной потерей белка (до 96 %).
3. Самой сложной проблемой в циторецепции глюкокортикоидов, но нашему мнению, является взаимодействие гор-мон-рецепторного комплекса с хроматином. Несмотря на одинаковое содержание гормои-рецепторных комплексов в ядрах тимоцитов, различающихся своей чувствительностью к глюкокортикоидам, внутриядерное распределение таких комплексов у
551
гормонрезистеитпых и гормон чувствительны к клеток различно. Мы надеемся, что развитие новых методов препаративной биохимии, таких, как трехмерный электрофорез, аффшщая хроматография и другие, позволит выделить структуру ядерных акцепторов для гормон-рецеиториых комплексов и реконструировать в модельных условиях внутриядерные процессы реализации биологической активности глюкокортикоидов.
13.3.2. Рецепторы минералокортикоидов
Несмотря на то, что минералокортикоиды (основным представителем их у млекопитающих является альдостерон) ио структуре мало отличаются от глюкокортикоидов, в почках крыс существуют различные рецепторы для этих стероидных гормонов; рецепторы, опосредующие реализацию биологической активности минералокортикоидов, имеют высокое сродство к альдостерону и низкое сродство к кортикостерону, а рецепторы, принимающие участие в опосредовании глюкокортикоидной активности, имеют высокое сродство к кортикостерону и низкое сродство к альдостерону. Это объясняет известное перекрывание физиологических эффектов минералокортикоидов и глюкокортикоидов .
Следует отметить, что минералокортикоидные рецепторы найдены не только в классических органах-мишенях (почки, желудок, слюнные и потовые железы, гиппокамп, толстый кишечник), по и в паращитовидной железе, сердце, печени, селезенке и гипофизе. В сердце и печени альдостерон связывается с рецепторами со специфичностью и сродством, характерными для глюкокортикоидных рецепторов. В то же время в почках, эпителии желудка и слюнной железе альдостерон связывается со сродством, которое на 1—2 порядка превышает его сродство к глюкокортикоидным рецепторам.
В передней доле гипофиза минералокортикоидные рецепторы аналогичны этим рецепторам ночек и слюнной железы. В почках крысы и мочевом пузыре жабы присутствуют рецепторы, специфичные для альдостерона. После связывания с рецептором альдостерон проникает в ядро клетки; затем происходит ускорение синтеза нуклеиновых кислот и белков и, в конечном счете, увеличение активного транспорта Na+.
Радиоактивный аналог снироналактона (антагониста альдостерона) С-26 304 образует комплекс с цитозольными рецепторами почек, который пе способен проникать в ядро.
По-видимому, цитозольные рецепторы минералокортикоидов функционируют аналогично глюкокортикоидным рецепторам с той лишь разницей, что они связываются с различны-
552
Синтез Ма’/К'—АТФазы и других белков, индуиируеных альдостероном
Стимуляция транспортера Ма7К’ и существующих молекул №7К" — АТФазы вследствие увеличения внутриклеточной концентрации Na*
Условные обозначения:
— Альдостерон
— Мембранный рецептор
— Цитозольный рецептор
— Na+/H+ транспорт
Na*/K+ АТФаза
ИФ3 — Инозитолтрифосфат
ФС — Фосфолипаза С ДАГ — Диацил глицерин РКС — Протсипкиназа С
Рис. 103. Модель действия альдостерона на клетку почечного канальца.
ми ядерными акцепторами и стимулируют синтез различных типов мРНК. В частности, в почечных канальцах цитозольные рецепторы минералокортикоидов индуцируют синтез АТФазы, обеспечивающий трансмембранный перенос натрия и калия. Интересно отметить, что в случае альдостерона геномные и неге-иомные эффекты стероидов аддитивны и направлены па увеличение внутриклеточной концентрации ионов натрия, калия и кальция (рис. 103).
553
Рис. 104. Аминокислотная последовательность ципксодержашпх участков андрогенных рецепторов, принимающих участие в связывании с ГЧЭ хроматида.
13.3.3. Рецепторы андрогенов
Как известно, цитозольные рецепторы для андрогенов имеются не только в классических органах-мишенях- предстательной железе, семенниках, придатке семенников, но и в скелетных мышцах, печени, почках, тимусе, костях, гортани, селезенке, поджелудочной железе, легких, матке, фибробластах, В отличие от других стероидных гормонов андрогены в чувствительных к ним клетках подвергаются метаболической трансформации (стероид-5а-редуктаза катализирует DFH-зависи-мое восстановление тестостерона в 5а-дигидротестостерон), Хотя в обоих случаях цитозольные рецепторы связывают оба этих андрогена в различных тканях, относительная величина сродства к рецепторам между тестостероном и его восстановленным метаболитом различна.
Рецепторы андрогенов в к летках-мишенях мышей представляют собой тетрамеры (молекулярная масса от 120 000 до 270 000, константа седиментации 8S —8,5S), их в клетке содержится около 500, Наиболее характерным свойством рецептора является изменение его конформации (диссоциация на субъединицы) с молекулярной массой 80 000—100 000 после связывания со стероидами за счет аллостерических эффектов. Как и для других классов цитозольных рецепторов стероидов, у андрогенных рецепторов имеются цинксодержащие участки (рис. 104), ответ-
554
Рис. 105. Гипотетическая модель взаимодействия гормон-рецепторного комплекса с андрогенными ГЧЭ хроматина.
сгвепные за взаимодействие с гормончувствительными элементами (ГЧЭ) хроматина (рис. 105). После связывания андрогена с цитозольными рецепторами происходит активация рецептора, включающая фосфорилирование, изменение связывания белков теплового шока и тяжелых металлов, а также количества титруемых сульфгидрильных групп (рис. 106). Изменив конформацию, рецептор перемещается в клеточное ядро и «отыскивает» нужный участок связывания с хроматином. Хромосомные негистоиовые белки, ассоциированные с ДНК из хроматина ядер семенников и предстательной железы, содержат органоспецифические акцепторы для комплексов дигидротестостерона с его цитоплазматическим рецептором. Акцепторная способность хроматина клеток-мишеней андрогенных гормонов может быть перенесена с фракцией пегистоповых белков па хроматин тканей, пе являющихся мишенями; при этом стимулируется синтез новой мРНК.
Составной частью стимуляции андрогенов белкового синтеза является не только увеличение образования структурных белков, по и активация синтеза ферментов цикла Кребса, дыхательной цепи, глюкуронидазы и аргининазы.
555
Фосфорилирование
Белок теплового шока
Рис, 106. Гипотетическая модель активации андро-геп-рецспторпого комплекса.
При синдроме тестикулярной феминизации происходит снижение сродства цитозольного рецептора клеток-мишеней к дигидротестостерону и повышение его к андростепдиолу, исчезает аллостерический эффект и способность эффективно связываться с ядерцым хроматином.
В последние годы в связи с ростом андрогепзависимых опухолевых заболеваний для их лечения были разработаны специальные антиаидрогашые препараты — цинротеропа ацетат (Ал-Дрокур) и флутамид (Флутакан) (рис. 107); из этих препаратов наибольший интерес представляет Андрокур, так как он, наряду с антиандрогенными свойствами, обладает гестагенной активно-
Ципротерона ацетат 5а-дигидротестостерон флутамид
Рис. 107. Химическая структура 5а-дигидротсстостсроиа и анти андрогенов.
556
Рис. 108. Гипотетическая модель конкуренции ап-тиапдрогецов с андрогенами на уровне апдрогс-иового рецептора.
стью, что приводит к ингибированию выработки гонадотропинов и уменьшению их стимулирующего действия па семенники и снижению синтеза эндогенных андрогенов (препарат двойного действия). Предполагается, что в результате взаимодействия аптиапдрогепов с аидрогеповыми рецепторами по конкурентному механизму уменьшается способность .связывания с рецепторами активного андрогена 5-альфа-дигидротестостеропа и конформация рецептор; остается неактивной, неспособной к взаимодействию с ГЧЭ хроматина вследствие возникновения стери-ческих препятствий для цинксодержащих участков рецептора (рис. 108). В то же время необходимо отметить, что при возникновении апдрогензависимых злокачественных заболеваний (рак простаты) выявлены мутации андрогенных рецепторов (Wieacker Р. и соавт. 1998), которые в 7 случаях из 23 таким образом нарушают их структуру, что раковые клетки становятся нечувствительными к эндокринной терапии.
В заключение краткого ра ссмотреиия андрогенной рецепции мь: считаем необходимым отметить, что процесс взаимодействия андрогенов с клетками- мишенями аналогичен процессу рецепции других классов с той лишь разницей (уникальной для андрогенов), что па первых этапах во многих случаях они подвергаются метаболизму (превращение тестостерона в 5а-дигидротестостеров ). У читывал большую патофизиологи ческу ю роль изменчивости андрогенных рецепторов в возникновении рака простаты и эффективности проводимой лекарственной те-
557
Нлетсчная мембран*
Рис. 109. Взаимодействие эстрогенов (Е) с клеткой-мишенью [Sheldon J.S., KoidcS.S., 1979].
Кружочками с величинами констант седиментации обозначены цитозольные рецепторы эстрогенов.
ранил необходимы дальнейшие исследования, направленные на выяснение всех особенностей нарушения реценторопосредуе-мых процессов в андрогеизависимых органах при злокачественном перерождении.
13.3.4 Рецепторы эстрогенов
Данные рецепторы найдены в клетках матки, влагалища, передней доли гипофиза, гипоталамуса, молочных желез, печени, кожи, костной ткани, сердца, сосудов.
Цитозольные фракции эндометрия млекопитающих содержат рецепторы, связывающие эстрадиол с К-10’9 М.
Цитозольный рецептор в матке имеет константу седиментации 8S и молекулярную массу 236 000. При воздействии 0,3 М NaCl или КС1 комплекс эстроген — рецептор превращается в макромолекулу с константой седиментации 4S или 4,5S и молекулярной массой 61 000. Согласно данным A.C.Notides и соавт. (1973), существует такая же промежуточная форма эстрогенового рецептора с молекулярной массой 110 000 и коэффициентом седиментации 5,3S. Цитоплазматические рецепторы эстрогенов миометрия человека представляют собой белки, седиментирующие с константами 8S, 5S, 4S. Этапы взаимодействия эстрадиола с клеткой-мишенью, включая мембранные этапы, представлены па рис. 109. При избытке
558
Рис. 110. Схематическое изображение взапмоопюшений различных форм эстрогеновых рецепторов с ядрами клеток матки [Murayama A.,Fukai А., 1983].
гормона исчерпывается запас доступного для пего рецептора. Несмотря па присутствие эстрогена, дальнейшая стимуляция прекращается и может восстановиться только приблизительно через 8 ч.
Согласно предложенной схеме трансформации и транслокации эстрогеновых рецепторов (рис.110), цитоплазматический комплекс эстроген —рецептор (ЭР-Э) с константой седиментации 4S переходит необратимо в комплекс ЭР-Э 5S, который проникает в ядро. Такой механизм был обоснован следующими фактами: 1) ЭР-Э 4S необратимо превращается в ЭР-Э 5S при нагревании; 2) ЭР-Э 5S эстрагируется из ядра 0,4 М КС1; 3) нагревание цитозольного ЭР-Э увеличивает его способность связываться с изолированными ядрами. Одиако в дальнейшем А.Магауаша и соавт. (1980), A.Marayama и J.Fukau (1981, 1982, 1983) обнаружили, что при активации цитозольного ЭР-Э компонента А высвобождается из связи с компонентом В, который образует комплекс (1:1) с vero —ЭР-Э (4S-ЭР-Э), превращающийся в ЭР-Э 5S при охлаждении цитозоля. По данным этих авторов, в отсутствие стероида цитозольные
559
рецепторы связаны с факторами А и В (цитозольные рецепторы с константой седиментации 6S, 8S, 5S), и от связи с этими факторами зависит дальнейшая судьба эстрогенов. Результаты, полученные A.Marayama и F.Fukai (1983), свидетельствуют о том, что в ядро проникает комплекс vero-ЭР-Э, по не эстрогеновые рецепторы в комплексе со связывающими факторами. При низкой иошюй силе выявлено присутствие в цитоплазме фактора (компонент С), который специфично связывается с ЭР-Э 5S; данный комплекс имеет высокое сродство к ядериой оболочке, по не проникает в ядро. При протеолизе комплекса vero —ЭР-Э эндогенными протеазами образовывались его фрагменты —sekto —ЭР-Э (5«S>) и «3,8S» ЭР-Э, непроиикаю-щие в ядро. Таким образом, эндогенные протеазы могут регулировать транслокацию эстроген-рецепторпых комплексов в ядро и тем самым влиять на проявление биологической активности эстрогенов. Схематично взаимоотношения различных форм эстрогеновых рецепторов с ядрами клеток матки представлены на рис. 110. По аналогии с глюкокортикоидными рецепторами в цитоплазме клеток-мишеней для эстрогенов присутствуют модуляторы функции эстрогеновых рецепторов. Выявлены низкомолекулярные вещества, ингибирующие активацию эстроген-рецепториого комплекса в клетках матки крыс, что указывает па взаимодействие так называемого ингибитора с деактивированным рецептором. Модулятор цитозоля матки крыс имеет сродство только к эстрогеновым, но не глюкокортикоидным рецепторам, и индуцирует их агрегацию, сопровождающуюся потерей сродства рецептора к ядру’ Интересно, что данный фактор не обнаружен в цитозоле клеток матки неполовозрелых крыс.
По нашему мнению, перспективным в изучении эстрогеновых рецепторов является также иммунологический подход. С помощью антител против эстрогеновых рецепторов матки свиньи установлено, что три вида (цитозольные, ядериые, микросомные) этих рецепторов в клетках-мишенях, несмотря па различия их электрофоретических свойств, имеют одинаковые участки, связывающие гормоны. Эти данные подтверждают гипотезу сходного «ядра» у субклеточных форм цитозольного рецептора. По-видимому, с помощью моноклональных антител против очищенных эстрогеновых рецепторов различных видов можно будет получить более полную информацию об их гетерогенности у различных видов животных.
Необходимо отметить, что но недавно полученным сведепи-
560
ям существует возможность и другого канала связи между эк-страядерными факторами клетки-мишени и ядром. При исследовании действия эстрогенов на препуциальные железы ова-риэктомироваицых крыс выявлено, что эстрадиол захватывается цитоплазматическими лизосомами, участвующими в рецепции гормона на плазматической мембране и выступающими в качестве вектора, обеспечивающего быструю транслокацию гормона к ядру,- где происходит ядерио-лизосомиое взаимодействие. В пользу этого свидетельствуют данные о том, что после воздействия эстрогенов ядро содержит большое число лизосом и изменяется активность лизосомиых ферментов [Сергеев П.В., 1984].
Мы считаем необходимым также привести данные J.H.Tong и соавт.(1983), которые свидетельствуют о возможности проникновения эстрогенов и их конъюгатов в изолированные ядра печени путем простой диффузии ненасыщаемым образом.
Несколько слов, по-видимому, необходимо сказать и о других функциях цитозольных рецепторов эстрогенов, в частности об их способности ингибировать рибонуклеазу. Известно, что рецептор 4S и ингибитор рибонуклеазы имеют одинаковые физико-химические свойства, и активность рибонуклеазы в клетках матки обратно пропорциональна концентрации в них эстрогеновых рецепторов. Эти данные еще раз свидетельствуют о возможности существования у рецепторов физиологически активных веществ дополнительных, новых функций, биологическая роль которых еще во многом пе выяснена.
Выделение, последовательная очистка и анализ рецепторов эстрогенов из различных источников также показали, что места связывания эстрадиола в клетке характеризуются гетерогенностью. Наряду с классическими рецепторами, обладающими высокой аффинностью и ограниченным числом мест связывания (Кд 1нМ), в клетке-мишени имеются иизкоаф-фиппые рецепторы (Кд ЗОиМ) с большим числом связывающих мест. Эти типы рецепторов были обозначены номерами I и П соответственно.
Рецепторы эстрогенов, выделенные из цитозоля ткани матки млекопитающих, представлены в виде тетрамера, состоящего из двух эстрадиолсвязывающих единиц (ММ 85 — 90 кД) и двух пе связывающих стероид протеинов (ММ 90 кД).
Можно полагать, что разные типы рецепторов обеспечивают различные функции —один из них увеличивает активность
36.Зак.227
561
РНК-полимеразы II и дестабилизирует структуру хроматина, а другой отвечает за специфическую активацию считывания. Интересно, что в таких органах-мишенях, которые не отвечают на эстрадиол ускорением роста (гипофиз, гипоталамус), не обнаружены рецепторы эстрогенов II типа. Как правило, все формы рецептора имеют молекулярную массу около 65кД и являются химическими модификациями одного исходного пептида.
Сравнительное изучение распределения рецепторов эстрогенов в клетке показало, что около 30% рецепторов находится в ядре после гомогенизации, тогда как после энуклеации —86%. Общее количество рецепторов эстрогенов па клетку после энуклеации и гомогенизации практически не различалось (14000 — 17000 связывающих мест/клетку).
Для проявления морфогенетической активности эстрогенов их цитозольные рецепторы должны подвергнуться активации и трансформации.
Под активацией донимают изменение аффинности рецептора к хроматину после взаимодействия с эстрогеном, а под трансформацией — изменение коэффициента седиментации (4s—5s) рецептора.
К активации рецепторов эстрогенов могут приводить повышенная температура или ионная сила, щелочная среда, ультра-центрифугирование, разведение, преципитация сульфатом аммония, диализ.
Активация заключается в конформационных изменениях и, по-видимому, ускоряется высокой ионной силой. Второй шаг — трансформация активированного комплекса в 5s форму. Этот этап, вероятно, можно ингибировать высокой ионной силой, которая может привести к активации рецептора без его трансформации.
В активации рецепторов эстрогенов решающим событием является фосфорилирование рецепторной молекулы но тирознио-вому остатку. Эндогенные ферменты, ответственные за фосфорилирование, были выделены и идентифицированы. Тирозиновая киназа получена из цитозоля матки телок, а фосфотаза — из ядер клеток той же ткани.
Доказано, что in vivo комплекс рецептор—эстроген дефос-форилируется и инактивируется в ядре фосфатазой, тогда как неактивный цитозольный рецептор реактивируется in vitro тирозипкиназой в гормоисвязывающую форму. Активация рецепторов эстрогенов зависит от присутствия АДФ, АТФ,
562
ГТФ и от наличия ионов магния и кальция (2 — 5 мМ и 0,5 — 1 мМ соответственно). В активации рецепторов ионы магния необходимы для гидролиза терминальной фосфатной группы (блокированной у циклических аналогов) для успешной конверсии.
При инкубации рецепторов эстрогенов с ядерными экстрактами в течение 20 минут образуется мощный ингибитор фосфатазы; после этого времени ни добавление фосфатазы, ни самих рецепторов, ни их смеси с фосфатазой не вызывали ингибирования связывающей способности.
Введение эстрадиола (2—12 иМ) в среду инкубации стимулирует восстановление количества мест связывания после действия фосфатазы. Прогестерон, в свою очередь, ускоряет инактивацию ядерных рецепторов эстрогенов матки, что может быть опосредовано ядерпой фосфатазой.
Следовательно, эстрадиол и прогестерон разнонаправленно регулируют активность рецепторов эстрогенов: если эстрадиол активирует гормопсвязывающие места через тирозицки-назу рецептора, то прогестерон инактивирует эти места с помощью фосфатазы.
Молибдат, вольфрамат и ванадат снижают степень актнаа-ции рецептора, являясь, но всей видимости, ингибиторами киназы.
Возможным механизмом блока ионами металлов перехода рецепторов эстрогенов в активированную форму является частичный протеолиз рецептора, который может катализироваться кальцийзависимой протеазой цитозоля матки. Другая Са-зависимая протеаза матки специфически катализирует конверсию 8s-4s. Обе протеазы ингибируются молибдатом.
За активацией следует трансформация рецептора. Этот процесс зависит от присутствия специфического протеина, который связываясь с 4s формой рецепторов эстрогенов трансформирует его в 5s форму и предохраняет от эндогенных протеаз.
Количество комплексов рецептор—эстроген в цитозоле после добавления эстрадиола резко уменьшается и восстанавливается до контрольных значений через 24 часа. Гормон индуцирует синтезы своих рецепторов. С помощью ингибиторов транскрипции (актиномицин Д) и синтеза белка (циклогексе-мид) удалось установить, что 60% незанятых рецепторов восстанавливаются за счет новых синтезов. Остальные 40% пополняются за счет рециркуляции рецепторов эстрогенов.
При длительном воздействии эстрогенов на матку не па
зе-
563
блюдается стехиометрического перехода цитозольных рецепторов в ядро, и количество ГЧЭ в ядре меньше числа цитозольных рецепторов.
Концентрация рецепторов эстрогенов в клетке-мишени подчиняется циркадным и сезонным ритмам.
Ряд биологических эффектов эстрогенов пе связан с цитозольными рецепторами, ио они также важны для реализации их общего гормонального воздействия.
Инкубация изолированных плазматических мембран с эстрадиолом в физиологических концентрациях повышает активность аденилатциклазы, которая опосредует часть ранних эффектов эстрадиола, например, накопление гликогена.
Эстрадиол активирует процесс трансметилировация в клетках эндометрия, что влечет за собой увеличение чувствительности к децидуальному стимулу. Имеются доказательства мобилизации арахидоновой кислоты из мембранных фосфолипидов с последующей активацией синтезов простагландинов, как ранний ответ на децидуогепиый сигнал.
В лаборатории Морозовой Т.М. была выявлена активация фосфатидилинозитольного цикла в плазматических мембранах клеток опухоли молочной железы в ответ па введение в систему эстрадиола.
Рецепторы эстрогенов локализованы в дисперсном эухрома-типе, а пе в области гетерохроматина или ядрышка эпителиальных и стромальных клеток эндометрия человека.
Гормончувствительиые элементы хроматина для половых стероидов высокоспецифичиы, так как насыщаемы, имеют высокую аффинность к рецепторам эстрогенов и тканевую специфичность. По подсчету в интактном хроматине представлены 5000—10000 таких мест. Значительная доля ядер-пых акцепторов может быть маскирована протеинами.
ГЧЭ для эстрадиола в ядре объединяет макромолекулярный комплекс (рецептор—гистон —ДНК), который регулирует матричную активность генома. Так, показано, что рецепторы эстрогенов образуют комплекс специфических белков вокруг регуляторного района гена пролактина. Ген, кодирующий рецептор эстрогенов человека, локализован в 6q24-q27 хромосоме.
Эстрадиол индуцирует рост ткани-мишени (матки) —гипертрофию с последующей гиперплазией, что готовит ткань к возможной беременности. Наибольшей чувствительностью к эстрадиолу характеризуется эпителий эндометрия, менее
564
чувствителен —миометрий, и практически отсутствует биосинтетический ответ в стромальных клетках.
В течение первых 30 минут действия гормона в клетках матки неполовозрелых и овариэктомироваиных млекопитающих наблюдается резкое увеличение активности РНК-полимеразы II и синтезов hnPHK.
мРНК образуется из hnPHK и организуется в полисомы. Синтезы новых рибосом, происходящие в первые 1 — 2 часа действия гормона, обеспечиваются увеличением активности РНК-ноли-меразы I и активации транскрипции рРНК, которая повышается в 10 — 12 раз цо сравнению с контролем в первые 2 — 4 часа.
Во вторую стадию активации транскрипции происходит усиление синтезов мРНК и тРНК. При этом эстрогены положительно влияют па стабильность мРНК.
Ответ клетки-мишени на эстрогенный стимул не характеризуется какой-либо одной небольшой группой индивидуальных белков. Эстрадиол-индуцируемые белки разделяют на несколько функциональных групп. Первая группа связана с увеличением энергетического обеспечения гипертрофии матки. Ключевыми ферментами этого процесса являются креатипки-паза и енолаза. Увеличение концентрации креатипкипазы в области цитоскелета может отражать гормональную стимуляцию некоторых цитоскелетных функций. К первой группе эс-трогеи-индуцируемых белков можно отнести и глюкозо-6-фо-сфат дегидрогеназу.
Вторая группа протеинов связана с поддержанием транскрипционного ответа клетки-мишени: рибосомальные белки, протеины хроматина, орнитипдекарбоксилаза и 5-адепозипме-тионип декарбоксилаза. К этой группе можно отнести и вновь синтезирующиеся рецепторы эстрадиола.
Третья группа белков —протеины, связанные с поздней стадией ответа клетки и определяющие рост матки. Это — ДНК-нолимераза, ДНК-пуклеотидтрапсфераза, прогестероновый рецептор, белки активаторы плазминогена, которые могут участвовать в процессе имплантации. К этой группе также относят все оставшиеся функционально недетерминированные протеины.
Суммируя имеющиеся данные, процесс циторецепции эстрадиола можно представить следующим образом: эстрадиол с помощью транспортной системы крови попадает в ткапь-ми-шепь (доступность эстрадиола регулируется многими факто-
565
Белок теплового шока
Рис. 111. Классическая модель активации эстрогеновых рецепторов.
рами, в т.ч. содержанием в плазме крови ненасыщенных жир-пых кислот, анти-рецепторных иммуноглобулинов и др.). Эстрадиол специфически связывается с плазматическими мембранами клеток-мишеней. В результате связывания активируется механизм вторичных мессенджеров. В это время происходит концентрация лизосом в районе связывания гормона, которые обеспечивают его интернализацию внутрь клетки. Уменьшение вязкости плазматических мембран в районе фиксации и наличие ферментативной активности позволяет лизосомам транспортировать эстрадиол. В ядре эстрадиол-реце-пторный комплекс связывается с гормопчувствительпыми элементами в эухроматипе и поэтапно активирует синтезы РНК и белков. Одним из первых ответов клетки являются действия, направленные на поддержание своего рецепторного статуса — определяющего «лицо» дифференцированной клетки. Синтезированные субъединицы эстрогенных рецепторов фосфорилируются тирозипкипазами и экснанируются в различных компартментах клетки.
В дальнейшем эстрогеновые рецепторы диссоциируют и де фосфорилируются ядерной фосфатазой. Их период полужизни Т1/2 составляет 4 часа.
Классическая схема активации эстрогенами цитозольных рецепторов, включаюшая отсоединение от белков теплового шока и димеризацию, представлена ла рис. 111. В отношении эстрогенов предложена оригинальная модель, объясняющая селективность их действия па различные клетки ми-
566
Рис. 112. Специфичность действия эстрогенов, обусловленная вариабельностью ГЧЭ.
тени (рис. 112), суть которой заключается в существовании неодинакового числа, структуры и расположения ГЧЭ в хроматине (такая гипотеза правомерна и для других классов стероидных гормонов). Однако в случае эстрогенов именно с помощью этой гипотезы можно объяснить некоторые особенности фармакологической активности антиэстрогенов, которые в последние годы все шире используются в клинике в связи с ростом эстрогензависимых опухолевых заболеваний. Примерно 20 лет тому назад был разработан препарат тамоксифен для лечения гормопчувствителыюй аденокарциномы молочной железы у женщин. Однако в последние годы было установлено, что если в молочной железе тамоксифен является аптиэстрогепом, то в других органах он обладает разной степени выраженности эстрогенной активностью. В эндометрии тамоксифен, как и эстрадиол, вызывает в ряде случаев аденокарциному миометрия, а в кости оказывает нротивоосте-онорозиый эффект. В связи с этим фармакологи продолжили поиск чистых антиэстрогепов, так как использование тамоксифена для лечения рака молочной железы сопровождается риском появления рака эндометрия. Фармакологические свойства современных аптиэстрогелов обобщены в табл. 37.
Исходя из представленных данных, лечение рака молочной железы у женщин с сохраненной маткой следует проводить с помощью чистого антиэстрогена—вещества ICI 182,780, а у женщин после гистероэктомии— с помощью частичного апти-эстрогепа тамоксифена.
567
Таблица 37.
Сравнение эстрогенной активности (величина выражена количеством знаков +) эстрадиола и современных антяэстрогенов
Система (орган) Эстрадиол Тамоксифен Ралоксифен Идокси-фсн ICI 182,780
Кости -н-+ -Н- -Н- -Н- -
Молочные железы [ 1 1 - - - -
Сердечнососудистая 4--Н- + ++ -
система ЦНС +++ - - - -
Эндометрий +++ + +/- + -
13.3.5 Рецепторы гестагенов
Прогестиновые рецепторы впервые были обнаружены B.W.O'Malley и соавт. (1972) в яйцеводе кур, где прогестерон специфически индуцирует синтез белка куриного яйца— авидина. Яйцевод оказался наиболее удобным для изучения молекулярных механизмов действия прогестерона, хотя его рецепторы обнаружены также в половых органах женщин и головном мозге.
В результате очистки рецептора прогестерона кур было установлено, что он состоит из двух субъединиц 4S, обозначаемых А(Мг 10 000) и В(Мг 117 000), которые находятся в соотношении 1 : 1 и вместе имеют константу седиментации 6S. По другим данным, нативный цитозольный рецептор прогестерона яйцевода кур имеет константу седиментации 8S [Bichon Т. et al., 1983]. Считается, что рецептор А связывается с ДНК, а В— с очищенным хроматином яйцевода. Как и глюкокортикоидные рецепторы, прогестероновые рецепторы связываются с АТФ. При этом рецептор катализирует дефосфорил ирова-иие АТФ. Эта ферментативная активность обнаружена как у субъединиц А, так и В. Можно полагать, что активность прогестеронового рецептора, обусловливающая обмен фосфатов, является важным фактором в механизме действия гормона, выражающегося в активации определенного участка ядерного хроматина.
Изучение влияния различных ингибиторов фосфатазы и ста-
568
Рис. 113. Механизм стимуляции прогестероновым рецептором процесса транскрипции [Buller R. et al., 1976].
билизаторов цитозольных рецепторов типа молибдата показало, что механизм активации прогестеронового рецептора довольно сложен и может пе включать в себя дефосфорилирова-иие рецепторного белка.
T.Buchon и соавт. (1983) показали, что мочевина (<2М) вызывает трансформацию рецептора 8S в 4S, а Ма2МоО4 блокирует эту активацию. Возможно, что молибдат, ванадат или тангстат образуют связи между SH, NH2 или Н2О молекулами соседних субъединиц прогестеронового рецептора и тем самым стабилизируют его четвертичную структуру. В присутствии лигаида прогестероновый рецептор был более устойчив к действию мочевины, что указывает па конформационное изменение белка, на связывание стероида и на участие водородных связей в процессе образования гормон-рецепторного комплекса.
Согласно общепринятой схеме функционирования прогестеронового цитозольного рецептора (рис. ИЗ), димер А —В связывается со специфическими белками хромосом, после чего связанная с ДНК субъединица диссоциирует и переносится па «эффек-торпый участок», с которым взаимодействует новая РНК-полимераза, вызывая тем самым возникновение участков
569
инициации транскрипции. Не исключено, что прогестероновые рецепторы обладают, кроме фосфатазиой, протеазной или нуклеазной активностью. Поэтому мы считаем целесообразным уделить этому вопросу особое внимание, так как наличие у гормональных рецепторов ферментативной активности позволяет по-новому объяснить первичные механизмы их функционирования.
Прогестерон синтезируется прямо из прегненолона в желтом теле и в плаценте. Во всех стероидогенных тканях (кора надпочечников, желтое тело, лейдиговские клетки, плацента) механизм биосинтеза прогестерона одинаков, только в желтом теле и плаценте прогестерон является конечным продуктом биосинтеза, выделяемым в большей мере в кровь.
Синтез осуществляется в митохондриях, где из холестерина первоначально образуется прегненолон. Синтез контролируется гонадотропными гормонами ЛГ и ФСГ, действующими через систему аденилатциклазы. В течение фолликулярной фазы цикла синтезируется от 10 до 20 мг/день и несколько сотен мг/день в течение последней фазы беременности. В плазме крови прогестерон связывается с транскортииом с Касс тождественной для кортизола.
Метаболизм прогестерона происходит в печени, главным продуктом является биологически активный нрегнандиол, который после конъюгации с глюкуроновой кислотой выделяется из печени в кровь и впоследствии в мочу. Минорные метаболиты— нрегнаиолоп и нрегнапдионы. Все выделяемые метаболиты прогестерона биологической активностью практически не обладают.
Прогестерон специфически связывается с плазматическими мембранами клетки-мишени, что приводит в действие мехашим вторичных передатчиков, обеспечивая внегепомные эффекты.
Проникая в клетку, прогестерон связывается со специфическими рецепторными белками цитоплазмы.
Увеличение концентрации прогестерона в клетке приводит к снижению числа цитозольных рецепторов и параллельному увеличению гормоп-рецепторпых комплексов в ядрах клетки-мишени.
Переходу гормонального комплекса в ядро предшествует процесс активации, т.е. превращение комплекса в форму с повышенным сродством к хроматину. Этот процесс инициируется прогестероном, зависит от температуры и некоторых других факторов.
570
Активация комплекса сопровождается дефосфорилированием рецепторной молекулы под действием клеточных фосфатаз, что вызывает перераспределение зарядов па поверхности комплекса, диссоциацию комплекса 6s—6s в комплекс 4s и ведет к увеличению ДНК-связывающей активности.
Связывание гормоп-реценторного комплекса с ядерпыми гормон чувствительными элементами обеспечивает геномный ответ клетки. Субъединицы рецептора прогестерона обладают разной способностью ассоциироваться с компонентами клеточного ядра. Субъединица В гормон-рецепториого комплекса связывается с пегистоповыми белками хроматина, после чего димер диссоциируется и субъединица А связывается с ДНК.
Для стероидных гормонов характерна фазность действия. На начальных этапах гормоп-рецепторный комплекс инициирует синтез ограниченного числа мРНК, в основном за счет прямой активации РНК-полимеразы 2, увеличения скорости элонгации строящейся цепи мРНК и увеличения числа мест инициации для РНК-полимеразы 2. В результате этого синтезируются регуляторные белки-медиаторы, которые возвращаясь в ядро по каскадному механизму инициируют синтез основной массы мРНК, рРНК и иРНК, ответственные за конечный эффект гормона.
Прогестерон влияет на активность таких ферментов как изо-цитратдегидрогепаза ч лактатдегидрогеназа, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа, щелочшя фосфатаза, глутамиптрансфераза, ка-теисип-Д-лизосомалышя пептидаза. Прогестерон значительно усиливает синтез специфического белка утероглобипа и бла-стокииина. Была выделена иРНК для утероглобипа кролика, увеличение синтеза которой является ранним эффектом действия прогестерона.
Большая часть гормоц-рецепторпого комплекса в ядре инактивируется, диссоциирует, после чего в цитоплазму выходят стероид и неактивная рецепторная молекула. Инактивация рецептора происходит за счет более глубокого дефосфорилирования ядерпыми фосфатазами.
Действие прогестерона в половых органах при нормальных условиях связано с действием эстрогенов. Прогестерон вызывает в слизистой матки секреторную фазу —отек слизистой, секрецию желез эндометрия. Эндометрий таким образом готовится к имплантации яйцеклетки. Прогестерон обладает в определенной мере аитиэстрогенпым действием в матке, так как понижает сократимость миометрия и его чувствительность
571
к окситоцину. Во влагалище прогестерон вызывает пролиферацию, инфильтрацию лейкоцитами и секрецию густой слизи.
Метаболическое действие прогестерона заключается в стимуляции респирации. Поэтому понижается напряжение углекислого газа в альвеолярном воздухе в лютеальной фазе. Прогестерон повышает температуру тела. Прогестерону присущ также протеоапаболический эффект и повышение экскреции натрия и калия мочой. Данные эффекты объясняют антагонизмом с альдостероном (иатрийурез) или протеокатаболп-ческим действием (калийурез).
Наряду с другими гормонами, прогестерон играет несомненную роль в развитии секреторного аппарата молочных желез во время беременности, в регуляции половых циклов, созревании ооцитов, сохранении беременности.
Специфичность биологического действия прогестерона в матке проявляется в его антиэстрогеппом эффекте, который осуществляется двумя путями. Первый — уменьшение количества цитозольных рецепторов эстрадиола путем ингибиции их синтеза. Второй — индукция 17-р-гидроксистероиддегидроге11азы, которая превращает эстрадиол в менее активный эстрон. Прогестерон является и антагонистом эстрогепзависимого клеточного деления, поэтому он переводит пролиферирующий эндометрий в секреторную стадию.
13.4. Гетерогенность рецепторов стероидных гормонов, обусловленная их димеризацией
В настоящее время имеются доказательства существования различных но структуре мономеров рецепторов некоторых стероидных гормонов. В частности, для прогестерона выявлены две изоформы внутриклеточных рецепторов. У человека А-рецелторы (состоят из 933 аминокислотных остатков) отличаются от В-рецепторов отсутствием N-концевого участка, состоящего из 164 аминокислотных остатков. При наличии А и В изоформ в эквимолярных соотношениях может происходить их димеризация с образованием А/А, В/В гомодимеров и A/В гетеродимеров. Функция В-рецепторов заключается в активации специфических нрогестерон-стимулируемых генов. А-рецепторы могут ингибировать активность B-рёцеиторов, нрн-
572
чем не только В-рецепторов прогестерона, но и других классов етероидных гормонов, в частности, рецепторов эстрогенов. Соотношение А- и В-реценторов в тканях-мишенях для прогестерона определяет характер ее ответа при воздействии стероида. Известно, что экспрессия изоформ прогестиновых рецепторов изменяется во время менструального цикла.
Гетерогенность прогестиновых рецепторов имеет несомненное значение в действии анти прогестинов. Среди последних в настоящее время наилучшим образом изучены RU-486 (мефи-престоп) и ZK 98299 (онанристон). Оба антиирогестина имеют высокое сродство к прогестероновым и глюкокортикоидным рецепторам, хотя у мефипрестона оно выше, чем у онапристо-на; они также связываются с рецепторами андрогенов, по практически пе связываются с рецепторами эстрогенов. Мефип-рестоп усиливает димеризацию прогестероновых рецепторов и увеличивает их способность связываться с ДНК. В то же время онанристон ингибирует связывание гормон-рецеитор-пого комплекса с нрогестеропчувствительпыми элементами хроматина. В обычных условиях комплекс мефнпрестоп — рецептор связывается с этими элементами, но в результате этого связывания пе происходит изменения транскрипции генов. Интересно отметить, что при увеличении уровня цАМФ в клетках мефипрестои начинает действовать как агонист рецепторов прогестерона, а опапрнстоп п в этих условиях проявляет свою активность как их антагонист.
При эквимолярных концентрациях А- и В- пзоформ прогестиновых рецепторов связывание антагонистов с А-рецептора-ми приводит к более выраженному ингибированию транскрипции и пролиферации клеток эндометрия, чем при их связывании с В-рецепторами. Доминирование А-рецепторов проявляется и при действии опанристопа: при его связывании с А-рецепторами не происходит комплексообразования цитозольных рецепторов с хроматином. Ингибирование А-рецептора-ми не только В-реценторов прогестинов, по и рецепторов эстрогенов может обуславливать некоторые аптпэстрогенные эффекты аитипрогестипов.
Более двадцати лет прошло с тех пор, когда в клетках рака молочных желез женщин были обнаружены рецепторы прогестинов как маркеры гормональной зависимости онкологического процесса. В настоящее время эти рецепторы определяются пе только как показатели гормональной зависимости, но и для
573
прогноза заболевания, В то же время лишь по связывающей способности рецеп-торов нельзя судить об их функциональной активности, так как последняя зависит от соотношения тех или иных изоформ рецепторов в данной ткани.
Еще более сложная система гормональной регуляции возникает при взаимодействии мономеров внутриклеточных рецепторов стероидов разных классов. В последнее время появились работы, свидетельствующие о возможности образования гетеродимеров рецепторов глюкокортикоидов и минералокортикоидов. Данные рецепторы, кроме сходства в структуре консервативных областей, имеют высокую степень гомологии и в участках узнавания лиганда. Оказалось, что гормон-рецепториый комплекс регулирует экспрессию генов, связываясь с ДНК не только в виде димеров, по и гетеродимеров. Последние, специфически взаимодействуя с ДНК, могут вызывать эффекты, которые отличаются от эффектов, возникающих при взаимодействии с хроматином димерных комплексов рецепторов стероидных гормонов.
У людей глюкокортикоидные рецепторы связывают кортизол со сродством, которое в 10 раз меньше сродства альдостерона и кортизола к минералокортикоидным рецепторам. В результате в нейрональной ткани минералокортикоидные рецепторы, но сравнению с глюкокортикоидными, в той же степени заняты кортизолом при значительно меньшей его концентрации. В нейрональной ткани кортизол не активирует минералокортикоидные рецепторы, а в клетках почек существует Ир-гидроксистероиддегидрогеназа типа II (ее пет в нейрональной ткани), которая катализирует превращение кортизола в кортикостерон, имеющий слабое сродство к минералокортикоидным рецепторам. Вследствие этого в ночках минералокортикоидные рецепторы свободны для активации минералокортикоидами.
Важно подчеркнуть, что минералокортикоидные и глюкокортикоидные рецепторы одновременно присутствуют в ряде клеток — лимфоцитах, миоцитах, клетках гиппокампа, почек. В то же время в печени минералокортикоидных рецепторов сравнительно мало. Можно предполагать, что присутствие двух различных рецепторов, отвечающих на один и тот же гормональный сигнал, обеспечивает способность клеток более гибко реагировать па изменения концентрации кортикостероидов, которые могут быть в пределах от 0,5 до 100 нМ. Доказательством возможности совместного функционирования глюкокортико-
574
идпых и минералокортикоидных рецепторов могут служить данные M.J.Bradbury и соавт. (1994), согласно которым у адреналэктомировапных крыс подавление секреции АКТГ имеет место только при совместном введении дексаметазона (селективный агонист только глюкокортикоидных рецепторов) и низких доз кортикостерона (в этих условиях стероид преимущественно связывается с минералокортикоидными рецепторами), а в отдельности указашше стероидные препараты в этом отношении не эффективны.
Глюкокортикоидные рецепторы так же, как и димеры прогестиновых и апдрогеновых рецепторов, узнаются двумя инвертированными повторяющимися последовательностями ДНК, разделенными 3 нуклеотидами. Гетеродимеризация глюкокортикоидных и минералокортикоидных рецепторов приводит к увеличению их связывания с ДНК и стимуляции транскрипции генов (Trapp Т., Yjksboer F., 1996). Могут существовать значительные вариации в выраженности биологических эффектов кортикостероидов в зависимости от соотношения их концентраций в физиологических и патологических условиях.
Гетеродимеры кортикостероидных рецепторов связываются с ДНК сильнее, чем гомодимеры; в этом случае они снижают эффект гомодимерных гормоц-реценторных комплексов. Этот феномен, но-видимому, имеет важное клиническое значение, связанное с возможностью снизить побочное действие длительного применения кортикостероидов в высоких дозах. Например, дексаметазон, в отличие от кортикостерона, в однократной дозе у крыс вызывает апоптоз гормопчувствительпых клеток гипоталамуса и, как следствие, снижение экскреции АКТГ. При этом цредварителыюе введение крысам кортикостерона блокирует данный эффект дексаметазона, что может быть обусловлено предотвращением кортикостероном образования гомодимерных рецепторов, в его отсутствие формирующихся при действии дексаметазона. Отсюда следует необходимость пересмотра целесообразности использования специфических лигандов глюкокортикоидных рецепторов типа дексаметазона в качестве противовоспалительных препаратов. В этом отношении более безопасны природные кортикостероиды или их синтетические аналоги, например, преднизолон, которые сбалансировано влияют па экспрессию генов и не вызывают гибели чувствительных к ним клеток гипоталамуса или тимуса (необходимое условие предотвращения таких системных эффектов глюкокортикоидов как иммунодепрессия и подавление секреции эндогенных
575
кортикостероидов). Принимая во внимание эти рассуждения, можно предположить, что отсутствие значительных побочных системных эффектов у новых представителей негалогенизиро-ваппых стероидов, производных преднизолона, и наличие таковых у фторированных кортикоидов, имеющих сходство с дексаметазоном, обусловлено, по крайней мере, частично именно особенностями рецепторной димеризации в присутствии этих стероидов.
Гетеродимеризацию между минералокортикоидными и глюкокортикоидными рецепторами можно наблюдать в ооцитах Xenopus (Garty Y. et al, 1994). При введении в ооциты РНК клеток мочевого пузыря жабы у них начинают продуцироваться амилоридчувстввтельные Ыа+-кацалы. Экспрессия этих каналов значительно увеличивается при одновременном воздействии агониста минералокортикоидных рецепторов и антагониста глюкокортикоидных рецепторов. Следовательно, гетеродимеризация может быть инициирована рецепторными мономерами, образующими комплексы с агонистами и антагонистами. Существует ли такая гетеродимеризация у человека пока пе известно, но ее возможность следует обязательно учитывать при оценке действия антагонистов кортикостероидных рецепторов. Действие антагонистов рецепторов стероидных гормонов может быть обусловлено как прямой конкуренцией за связывание с агонистами, так и регуляцией функции рецепторов вследствие изменения их способности к образованию гомо- и гетеродимеров (Bitoni F.J. et al., 1996).
/5.5. Гетерогенность рецепторов стероидных гормонов, обусловленная мутациями
С проблемами вариабельности и гетерогенности рецепторов стероидных гормонов тесно связано такое явление как мутации генов, кодирующих белки этих рецепторов. Это направление лишь начинает развиваться, хотя некоторые давно известные врожденные аномалии, связанные с полом, может быть обусловлены именно мутациями. В частности, изменение структуры цитозольных андрогеновых рецепторов можег быть причиной по крайней мере трех патологий: синдрома печуветви-
576
телыюсти к андрогенам, мышечной атрофии и рака простаты. В настоящее время выявлены мутации в областях рецепторного белка андрогенов, которые ответственны за связывание рецептора с ДНК и за связывание рецептором андрогена, что обуславливает развитие синдрома нечувствительности к андрогенам (Brinkman А.О. et aL, 1995). Интересно отметить, что только одна точечная мутация в структуре андрогенового рецептора клеток рака простаты человека (замена треонина на алашш в С-коицевом стероидсвязывающем домене рецептора) приводит к появлению у них способности связывать с высоким сродством прогестины и эстрадиол и опосредовать их активность в отношении стимуляции транскрипции (Veldscholte J. et al., 1990). Поскольку рецепторы андрогенов играют одну из ключевых ролей в возникновении и прогрессировании рака простаты подобные исследования заслуживают пристального внимания.
* * *
Таким образом, получение новых данных о существовании вариабельности, гетерогенности и димеризации мономеров рецепторов стероидных гормонов различных классов указывает на необходимость учета этих феноменов при поисковых научно-исследовательских работах, направленных как на разработку новых высокоэффективных стероидных препаратов, так и на выяснение молекулярных механизмов патогенеза гормонозависи-мых заболеваний. С пашей точки зрения, при этом обязательно следует принимать во внимание существование пегеномиых эффектов стероидных гормонов, в особенности тех, которые сопровождаются изменением уровня циклических нуклеотидов и ионов кальция, так как эти вторичные посредники регулируют процессы фосфорилирования многих белков клетки и, в том числе, самих мономеров цитозольных рецепторов стероидов и, следовательно, процессы их димеризации. В этом аспекте весьма важно учитывать также особенности взаимодействия стероидов с транспортными белками. Если раньше считали, что эти белки выполняют лишь буферную роль, поддерживая определенный уровень свободной концентрации переносимых ими лигандов, то теперь имеются данные об их участии в реализации клеточных эффектов стероидных гормонов. Так, согласно данным A.Nakhla, W.Rosner (1996), дигидротестостерон и эстрадиол увеличивают рост культуры клеток рака простаты человека только в присутствии секс-стероид связывающего глобулина, и это увеличение обусловлено образованием внутриклеточного цАМФ.
37. Так. 227
577
Поэтому при изучении эффектов стероидных гормонов на изолированных клетках целесообразно аналогичные исследования проводить в присутствии транспортных белков крови для при* ближепия условий эксперимента к тем, что имеют место in vivo.
По нашему мнению, продолжение углубленных исследований механизмов действия стероидов, их биотранспорта и био-трансформации, а также получение данных по вопросам гете-рогешюсти рецепторов стероидов, обусловленной гомо- и гетеродимеризацией их мономеров как одного, так и разных классов стероидных гормонов, в будущем поможет правильно ориентировать клиницистов в выборе наиболее безопасного и эффективного препарата и способствовать совершенствованию лечения различных гормоиозависимых заболеваний.
13.6, Применение препаратов эстрогенов и гестагенов для заместительной гормональной терапии
Заместительная гормональная терапия (ЗГГ) у женщин в последние годы получает все большее распространение, что обусловлено обнаружением рецепторов женских половых гормонов не только в классических органах-мишенях (матка, влагалище, молочные железы), по и в сердце, сосудах, головном мозге, костной ткани, коже.
Поэтому при угасании функции яичников возникают многие патологические изменения (атеросклероз, остеопороз, болезнь Альцгеймера и др.). Для лечения и профилактики этих заболеваний разработаны различные препараты для ЗГТ.
Терапия эстрогенами должна, как правило, сочетаться с использованием гестагенов для снижения риска гиперплазии и последующего рака эндометрия. Мопотерапия эстрогенами показана только в двух случаях:
1. Женщины с удаленной маткой. В настоящее время известен лишь один полезный эффект гестагенов — защита эндометрия и стимулирующего эффекта эстрогенов. Поэтому у женщин с удаленной маткой гестагены не следует вводить.
2. Использование низких доз эстрогенов, при которых практически отсутствует риск пролиферации эндометрия. В частности, это имеет место при интравагипалыюм пути введения эстрогенов для лечения урогенитального синдрома эстроген
578
ной недостаточности. При восстановлении слизистой влагалища всасывания эстрогенов практически пе происходит и при местном применении эстрогенов их системных эффектов не наблюдается.
Для целей ЗГГ могут быть использованы несколько препаратов, содержащих эстрогены. Как известно, наиболее активным эстрогеном является этинил эстрадиол. Его дозы, которые необходимы для купирования климактерических симптомов, равны 5—10 мкг/день, перорально. Однако, вследствие узкого диапазона терапевтических доз, большой вероятности развития побочных эффектов и пе такого благоприятного влияния на метаболические процессы как у природных эстрогенов, этот гормон для целей ЗГГ использовать не целесообразно.
Эстриол и его производные в обычных дозировках пе оказывают пролиферативного эффекта на эндометрий, в достаточной степени пе защищает костную ткань от остеопороза, что также сдерживает его использование для системного введения; в основном, он применяется местно. В настоящее время наиболее широко при ЗГГ используются следующие лекарственные формы эстрогенов:
1. ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ
• Конъюгированные эстрогены
• Микроцизированиые формы эстрадиола:
Эстрадиола валерат
Эстрадиола бензоат
Эстриола сукцинат
2. ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ТРАНСДЕРМАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ Эстрадиол
3. ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ИНТРАВАГИНАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ Эстриол
4. ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ВНУТРИМЫШЕЧНОГО ВВЕДЕНИЯ Эстрадиола валерат
Для перорального введения нельзя использовать кристаллическую форму природного 17р-эстрадиола, так как в этом случае он практически пе всасывается в желудочно-кишечном тракте.
Конъюгированные эквип-эстрогены получают из мочи жеребых кобыл. В их состав входит смесь сульфатов натрия, эс-трон-сульфат — 50%. Большинство других компонентов гормонов или их метаболитов являются специфичными для лошадей—это эквилип-сульфат — 25% и 17альфа-дигидроэквилип -сульфат—15%. Оставшиеся 15 % составляют неактивные суль
37*
579
фаты эстрогенов. Эквилип обладает высокой активностью; он депонируется в жировой ткани и продолжает действовать даже после прекращения введения препарата. С фармакологической точки зрения действие конъюгированных эстрогенов ослабевает из-за ограниченной эффективности действия сульфатов эстрогенов па органы-мишени, хотя они легко проникают в клетки печени. Наиболее продаваемый в мире препарат, содержании! конъюгированные эстрогены “премарип” в дозах 0,625 мг и 1,25 мг эффективен для профилактики остеопороза, когда применяется в сочетании с препаратами кальция.
Если в Северной Америке широко используются препараты конъюгированных эстрогенов, то в Европе врачи предпочитают выписывать для ЗГТ в основном препараты, содержащие эстрадиола валерат—пролекарство эндогенного 17р-эстрадио-ла. При оральном назначении большая часть дозы эстрадиола валерата метаболизируется в слизистой оболочке кишечника и печени. При этом происходит гидролиз эстрадиола валерата и образуется 17£ -эстрадиол. В дозе 1—2 мг эстрадиола валерат для перорального приема как ионотерапия или в комбинации с гестагенами показал высокую эффективность в терапии климактерических расстройств.
Для парентерального введения существуют препараты эстрадиола для подкожного введения (классическая форма-депо — препарат Гиподиан-Депо, который вводится 1 раз в месяц).
Наиболее физиологичным путем создания нужной концентрации эстрогенов в крови женщин следует признать транс-дермальный путь введения эстрадиола, для чего были разработаны препараты накожных пластырей эстрадиола, среди которых одним из лучших является пластырь Климара, применяемый раз в неделю и обеспечивающий постоянный уровень эстрадиола в крови. Фармакокинетика эстрадиола при его трапс-дермалыюм введении отличается от той, которая имеет место после его перорального введения. Это отличие заключается в первую очередь исключением обширного начального метаболизма эстрадиола в печени и значительно меньшим влиянием па печень. При трапсдермалыюм введении эстрадиол меньше превращается в эстрон, который после перорального приема препаратов эстрадиола превосходит по своему уровню последний в плазме крови. Кроме того, после перорального приема эстрогенов они в значительной степени подвергаются печеночно-кишечной рециркуляции. Поэтому наиболее физиологически обоснованным следует признать трапсдермальный путь введения эстрадиола, при котором имеет место близкое к нор
580
ме соотношение эстрон/эстрадиол в крови и исчезает эффект иервичпого прохождения эстрадиола через печень, по наблюдается наиболее благоприятное влияние гормона па обменные процессы. При этом доза эстрогена, которая достаточна для купирования климактерических симптомов и предотвращения развития остеопороза составляет 50—100 мкг/день (в 20—40 раз меньше, чем после перорального введения).
Для э /3 всех женщин оптимальными дозами являются 2 мг эстрадиола, перорально, 50 мкг эстрадиола, трансдермально, и 0,625 мг конъюгированных эстрогенов. Через каждые 2 — 4 месяца проведения ЗГТ женщинам следует проходить обследование в клинике для коррекции этих доз. У женщин после 65 лет происходит снижение почечного и особенно печеночного клиренса гормонов, что требует особой осторожности в назначении эстрогенов в высоких дозах.
В ряде препаратов для ЗГТ используется эстриол в виде вагинального крема или свечей, а также таблетированной формы. В отличие от эстрона, эстриол пе может превращаться в эстрадиол. Эстриол имеет невысокую эстрогенную активность. В обычной оральной дозе 2 — 4 мг эстриол не оказывает стимулирующего действия па эндометрий и для профилактики остеопороза, благоприятного действия па липидный метаболизм и сердечно-сосудистую систему; назначение одного эстриола в обычно используемой дозе недостаточно.
Стандартные дозы эстрогенов в 10 — 25 % случаев пе позволяют получить защиту костей от остеопороза и в 30 — 60 % наблюдается лишь субонтимальпый клинический эффект. Многочисленные пути введения и возможность индивидуального подбора дозы эстрогенов, при котором уровень гормона в плазме колебался бы в пределах 60—150 пг/мл, создают предпосылки для успешного лечения в каждом случае.
ЗГТ должна соответствовать возрасту, должна быть постоянной и индивидуальной и пе должна вызывать менструально-подобные кровотечения. При индивидуальном подборе дозы необходимо учитывать как возраст и вес пациенток, так и особенности анамнеза, а также относительный риск и противопоказания к использованию.
Женщины, например, перенесшие гестоз во время беременности, не переносят эстрадиол в оральной форме, и конъюгированные эстрогены будут в этом случае предпочтительнее.
Несмотря па многие положительные эффекты эстрогена па организм женщины, большое значение имеют другие возможные эффекты эстрогенов, которые в ряде случаев могут быть пежела-
581
тельными. Поэтому специального рассмотрения требуют показания и противопоказания к использованию эстрогенов у женщин с климактерическими расстройствами. Гиперлииедемия, гипертензия и диабет в настоящее время рассматриваются как показания для проведения ЗГТ. Согласно последним даштым, риск развития венозного тромбоза не увеличивается, а даже уменьшается в отличие от того, что имеет место при использовании комбинированных оральных контрацептивов. Существует много данных, свидетельствующих о том, что ЗГТ не связано с развитием таких онкологических заболеваний, как рак прямой кишки, легкого, печени, яичников, шейки матки, меланомы и лейкемии. Однако это нельзя сказать в отношении опухолей миометрия и эндометрия. Риск развития последних при использовании ионотерапии эстрогенами увеличивается в 4—6 раз. Однако при комбинации эстрогенов с гестагенами такого увеличешгя не происходит и рак эндометрия при проведении ЗГТ не является клинической проблемой. Единственным не совсем ясным вопросом в отношении взаимосвязи между развитием рака и проведением ЗГТ является рак груди. Послед] ше эпидемиологические исследования позволяют считать, что заместительная терапия эстрогенами продолжительностью менее 10 лет не обуславливает риска развития рака груди. Однако этот риск может увеличиваться, если ЗГТ длится больше этого срока. Риск развития рака груди у женщин с возрастом увеличивается на 7% , а при проведешш ЗГТ эстрогенами или комбинацией эстрогепами/гестагепами более 10 лет он увеличивается до 9%. Имеются несколько исследований проведешь ЗГТ эстрогенами у женщин, оперированных по поводу рака груди, согласно которым она не приводит к возникновению рецидивов онкологического заболевшшя.
В рамках ЗГТ гестагены имеют большое значение для снижения стимулирующего действия эстрогенов па слизистую матки. В качестве гестагенов, наряду с прогестероном, применяются как его производные — 20-а и 20-р- дигидростероп, 17-ct- ги-дроксипрогестероп, так и производные 19-нортестостеропа.
Гестагены у пре- и перименопаузальпых женщин защищают эндометрий от эстрогепипдуцированпой гиперплазии и снижают риск возникновения карциномы эндометрия. Доза и подбор гестагена должны осуществляться таким образом, чтобы, с одной стороны, препятствовать пролиферации эндометрия, а с другой стороны, получить как можно меньше нежелательных гестаген-зависимых побочных эффектов. И, кроме того, нужно правильно использовать так называемые частичные (дополнительные) эффекты, которые характерны некоторым гестагенам (табл. 39).
582
Таблица 38.
Производные гидроксипрогестерона (С21-гестагены) и 19-нортестостерона
С 21-гсстагсны Производные 19“ нортестостерона
Хлормадииона ацетат Ципротерона ацетат Дндрогестсроп Медроксипрогестерона ацетат Мегсстрола ацетат Мсдрогестоп Номсгсстрол Норэтистсроп Норэтистсропа ацетат Лиисстрснол Норгестрел Левоноргестрел Норгестимат Дсзогсстрсл Гестодсн Диеногест
Таблица 39.
Частичные эффекты некоторых гестагенов
Гестаген гестагенный эстрогенный аптиэстро-геппый андрогенный аптиапдро-геииый
Прогестерон + — + — +/ —
Хлормадииона ацетат ++ — + — +
Ципротсропа ацетат ++ — + — +
Мсдроксипро“ гестсрона ацетат + — + (+) ((+))
Мегсстрола ацетат •+ — + — (+)
Медрогестон + — — (+)
Номсгсстрол ++ — + — +
Норэтистсропа ацетат ++ + + + —
Лиисстрснол ++ + + + —
Левоноргестрел +++ — ++ + —
Дезогестрсл +++ — + + —
Гестодсн +-н- — + + —
Норгестимат ++ — + + —
Диеногест ++ — — — +
583
При циклическом замещении гестагены нужно, как правило, использовать не менее 10 дней. Комбинированная эстроген/гестагенная терапия в постоянном режиме более предпочтительна для постменопаузы и пе рекомендуется в цремепоиаузе вследствие высокого риска возникновения кровотечений прорыва.
Все гестагены независимо от их химической структуры приводят к трансформации (секреторному превращению) пролиферативного эндометрия (табл. 40), относятся ли они к нроиз-Таблица 40.
Трансформирующая доза (ТД), доза, подавляющая овуляцию (ДПО), и андрогенная активность (АЛ) некоторых гестагенов
Гестаген ТД в мг ДПО в мг ААв %
Хлормадивопа ацетат 20 — 25 1.7 30
Ципротсропа ацетат 20 1,0 100
Номсгсстрол 120 1,25 70
Норэтистерона ацетат 50 0,4
Левоноргестрел 4 0,06
Дезогеетрел 2 0,06
Норгсстнмат 7 0,2
Гсстодсн 3 0,03
Днсногест 6 1,о
Таблица 41.
Преимущества С 21- гестагенов и 19-норгестагенов
С 21-гестагены 19-норгестагены
отсутствие андрогенного эффекта высокая биодостунность
при оральп )м приеме
минимальное влияние па параметры обмена веществ сильное гестагенное влияние
па эндометрий
минимальная способность к связыванию с ССГЧ антнапдрогенные эффекты: кожа и волосы высокая стабильность цикла
584
водным прогестерона или к 19-поргестагенам. Обе группы имеют свои преимущества (табл. 41).
Действие гестагенов осуществляется через эстрогениндуци-рованиые прогестероновые ядерпые рецепторы. Установлено, что стероиды пе просто пассивно проникают через клеточные мембраны, а существуют специфические механизмы транспорта для отдельных классов стероидов. Различное сродство лигандов к отдельным гормональным рецепторам обуславливает у синтетических гестагенов их многосторонние частичные дополнительные эффекты, которые характеризуются индивидуальностью, вследствие взаимодействия между эстрогенами и гестагенами (табл. 39). Помимо прогестероновых рецепторов, гестагены могут частично связываться с глюкокортикоидными, минералокортикоидными, эстрогенными и андрогенными рецепторами (табл. 42), откуда и происходят их дополнительные частичные эффекты.
Таблица 42.
Относительная способность различных гестагенов к связыванию с рецепторами цитоплазмы (по Куль, 1996).
Гестаген ПР АР ЕР ГР МР
Прогестс]хл1 50 0 0 10 100
Хлормадипопа ацетат 67 3 0 8 0
Цппротеропа ацетат 90 6 0 6 8
Медроксипрогестерона 115 5 0 29 160
ацетат
Мсгестрола ацетат 67 2 0 30 0
Номсгестрол 35 30 0 1 0
Норэтнстеропа ацетат 20 5 1 0 0
Лцпестрспол 1 1 3 0 0
Ле вопоргсстрел 150 45 0 2 70
3- Кето-дсзогсстрсл 150 20 0 14 0
Дезогсстрел 1 0 0 0 0
Норгсствмат 15 0 0 1 0
Дисногсст 5 10 0 1 0
Примечание. ПР-рсцспторы прогестерона, АР-андрогенныс рецепторы, ЕР-эстро-генные рецепторы, ГР-глюкокортикоидные рецепторы, МР-ммнсралокортггкоцдныс рецепторы.
Гестагены применяют преимущественно орально, иногда трап-сдермалыю (норэтистерон), вагинальпо (прогестерон), впут-риматочпо (впутриматочиые системы с левоноргестрелом).
585
Необходимая доза гестагенов зависит от числа прогестероновых рецепторов. И, соответственно, большее количество прогестероновых рецепторов требуег более высокие дозы гестагенов (Lindahl и соавт., 1991).
Доза, подавляющая овуляцию, время полураспада и трансформационная доза являются базисными понятиями в концепции ЗГТ и лечении гестагенами.
Орально применяемые гестагены в зависимости от дозы и структуры могут препятствовать позитивному влиянию эстрадиола па клетки печени. При этом противодействие проявляется за счет имеющегося частичного остаточного андрогенного эффекта у рассматриваемых гестагенов. Натуральный прогестерон обладает наименьшим гепатоцеллюлярным влиянием, а производные 19-портестостерона —наибольшим. Если пе использовать оральное введение гестагенов, то можно избежать эффекта первого прохождения через печень и тем самым снизить их сильное гепатоцеллюлярное влияние.
При вагинальном, внутримышечном, ректальном, трапсдер-мальпом введении достигается наименьшее воздействие на клетки печени.
Эстрогены приводят к типичным изменениям обмена липидов: увеличение содержания фракции триглицеридов п липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). Производные 19-пор-стероидов вызывают противоположное действие. При приеме комбинированного препарата, содержащего левоноргестрел в дозе не более 0,150 мг/депь, в течение 2 лет не возникает никакого существенного, статистически значимого влияния на липиды.
Прием низкодозировацпых препаратов с содержанием левоноргестрела 75 мг/дець приводит к падению содержания уровня липидов: причем больше липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), чем ЛПВП. Общий холестерил несколько уменьшается, уровень триглицеридов и соотношение ЛПНП/ЛПВП после 12 циклов остается неизменным.
Увеличение уровня секс-стероид связывающие глобулины человека (СССГ) в плазме крови под влиянием эстрадиола отчетливо нивелируется приемом норгестрела в дозе от 150 до 250 мг/деиь. Медроксипрогестерона ацетат (МПА), хлор-мадииоиа ацетат, ципротерона ацетат, диепогест и дидрогесте-роп пе оказывают никакого влияния па обусловленное эстрадиолом увеличение уровня СССГ.
Изменения толерантности к глюкозе могут зависеть от самого гестагена, его дозы и ипдивидулыюй предрасположенности пациентки. Производные гидрокси прогестерона в дозах,
586
применяемых в рамках ЗГТ, практически не оказывают никакого влияния на обмен глюкозы, в то время как эффект производных 19-норстероидов отчетливо зависит от дозы.
Применение препаратов с содержанием в них левоноргестрела в количестве 0,150 мг/день не приводит к заметным изменениям в обмене глюкозы у здоровых постменопаузальных женщин (Grezlehner и соавт., 1992).
Гестагены способны оказывать прямое воздействие на сердечно-сосудистую систему. В венозном русле у женщин, особенно предрасположенных к варикозу, гестагены могут привести к усилению вазодилатации. Следствием чего произойдет замедление скорости кровотока, переходящее в стаз. Lang и соавт. нашли, что прогестерон поддерживает дилатацию артерий. Медроксипрогестерона ацетат в дозах, применяемых в рамках ЗГТ, напротив, подавляет позитивные эффекты эстрогенов па коронарные артерии (Williams и соавт., 1994).
Что касается производных 19-норстероидов, то они ухудшают вызванные эстрогенами улучшение пульсового индекса в маточной артерии (Hillard и соавт.,1992,Marsh и соавт.,1994). Gangar и соавт.(1996) при четырехмесячпом оральном применении ЗГТ в виде 2 мг микрочипированного эстрадиола и 1 мг порэтистероиа ацетата ежедневно обнаружили значительное уменьшение пульсового индекса на уровне внутренней сонной артерии. Наибольшее уменьшение пульсового индекса нашли у женщин с самыми высокими исходными показателями. Авторы обращают внимание на то, что измерения па уровне внутренней сонной артерии для системной циркуляции предпочтительнее, нежели таковые на уровне маточной, к сужению которой и увеличению пульсового индекса приводит применение порэтистероиа ацетата (Marsh, и соавт.,1994).
Терапия 2 мг эстрадиола и 0,150 мг левоноргестрела в течение 24 циклов не приводит к отклонениям от физиологических параметров показателей тромбоцитов, фибриногена, тромбопластинового и тромбинового времени. Минимальные изменения были клинически пеэпачимы.
Имеющиеся данные позволяют выделить рецептор-опосре-дуемые и рецептор-иеопосредуемые эффекты эстрогенов в отношении сосудов.
Согласно проведенным экспериментам, эстрогеновые и прогестероновые рецепторы присутствуют в гладких мышцах артерий и веп. Причем, в венах их меньше, чем в артериях. Эстрогены индуцируют прогестероновые рецепторы, а прогестерон уменьшает количество рецепторов эстрогенов. Иными словами, уро-
587
вепь этих рецепторов может меняться в процессе менструального цикла. Действительно, показано, что количество эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в артериях матки женщин уменьшается в лютеипизующую фазу цикла, а также после менопаузы.
Гестагены для женщин с сохраненной маткой необходимы, т.к. создают защиту эндометрия против возникновения гиперплазии и карциномы эндометрия. В этом и проявляется преимущество относительно сильного аптиэстрогешюго действия производных 19-норстероидов и особенно левоноргестрела па эндометрий.
Во время 10 —14-дпевиой гестагенной фазы пе обязательно вводитыюлностыо дозу, необходимую для трансформации, чтобы обеспечить защиту эндометрия (Whitehead и соавт.,1994). Высокие дозы гестагенов за счет аптиэстрогешюго эффекта уменьшают и образование своих же собственных рецепторов. Но постепенно это действие высоких гестагенных доз ослабевает. С помощью низких доз левоноргестрела в течение 12 дней за цикл как после месячного, так и после 3-месячпого применения достигается достоверное торможение роста эндометрия у постменопаузальных женщин. Как следствие этого гестагенного эффекта в постменопаузе как при циклическом, так и при применении в постоянном режиме уменьшаются мепструаль-ноподобпые кровотечения, вызываемые гормонами. Похожие результаты наблюдаются и при применении хлормадипопа ацетата. Наиболее эффективная доза в этом случае составляет приблизительно 2 мг ежедневно.
При более низких или более высоких дозах степень наступления межменструальных кровотечений во время первого цикла приема гораздо выше.
Эффекты гестагенного воздействия па ткань молочной железы, особенно на альвеолярные клетки долек, зависят от длительности применения. Так, при кратковременном, ио 5 —6 дней, применение гестагенов вызывает пролиферацию альвеолярных клеток долек, а длительное, более чем десятидневное применение-торможение роста клеток. Следовательно, гестагенная фаза при применении двухфазных препаратов должна продолжаться пе менее 10, а лучше от 12 до 14 дней. При употреблении левоноргестрела в обычных дозировках больше наблюдаются не андрогенные, а анаболические эффекты. Те самые анаболические эффекты, которые и представляют собой в постменопаузе и в старости дополнительное позитивное желаемое воздействие.
Уделяя максимум внимания дискуссии о генерации гестагенов и поискам “идеального” гестагена, часто забывается о том, что прямое частичное андрогенное действие вызывает стимуляцию фибринолитических и липолитических процессов.
588
Исследования в рамках как краткосрочного (введение в постменопаузе эстрогеп/гестагепа), так и долговременного применения гормонов в постменопаузе (Kritz-Silversten und Barret-Connor,1996) показывают, что не наблюдается разницы в распределении жировой ткали. Соответствующий возрасту ростомассовый показатель (BMI) после применения постояшюй или циклической ЗГТ стал достоверно ниже относительно изначальных данных по сравнению с таковым у женщин, не применявших ЗГТ. Как сообщают Kritz-Silversten и Barret-Connor (1996), 15-летняя ЗГТ не была связана с изменениями массы тела и типа распределения жировой ткани. При использовании в качестве гестагена левоноргестрела или хлормадииона ацетата пе обнаружено статистически значимого изменения средней массы тела.
Гестагены могут вызывать изменения настроения, напряжение молочных желез, отеки ног. Чаще всего эти симптомы наблюдаются в первые 3 цикла привыкания к выбранному препарату или при передозировке после ликвидации климактерических жалоб. В этих случаях рекомендуется уменьшить дозу гестагена или всего препарата в целом. В последнем случае во время гестагенной фазы можно дополнительно вводить 1 мг эстрадиола.
При рассмотрении различных аспектов использования гормональных средств у постменопаузальных женщин следует принимать во внимание существование гетерогенности эсгрогегшых и гестагенных рецепторов и возможности взаимодействия ряда веществ избиратель! э г тем или иным подтипом этих рецепторов. В этом отношении интересно отметить, что использование тамоксифена для лечения рака молочной железы сопровождается защитой костной ткани от остеопороза, кроме того, длительное использование тамоксифена в ряде случаев сопряжено с развитием рака эндометрия. Иными словами тамоксифен действует ла молочную железу как алтнэстрогеп, а на костную ткань и эндометрий как эстроген. В связи с этим кажется целесообразным терапию тамоксифеном сочетать с использованием гестагенов. Другим примером соединения, которое может одновременно взаимодействовать с разными рецепторами, является тибо-лоп. Он имеет слабое сродство к андрогенным и эстрогенным рецепторам и, кроме того, обладает некоторой гестагенной активностью. В клинике отмечено положительное влияние тиболона на вазомоторные нарушении и в отношении профилактики остеопороза. Тиболои также может вызывать пролиферацию эндометрия. Имеющиеся данные позволяют считать, что тиболоп может служить дополнительным средством для проведения ЗГТ у постменопаузальных женщин.
589
Для изучения положительных и отрицательных эффектов разных видов гормональной заместительной терапии у женщин в постменопаузе A.Volpe и соавт. ИЗ женщин с проявлениями климактерического синдрома разделили па семь групп по 10—27 человек, которые в течение 6 месяцев получили следующие препараты: (1) конъюгированные эстрогены (КЭ) 0,625 мг в день в течение 21 дня + порэтистероп (НЭТ) в дозе 5 мг в день с 12-го дня по 21-й; (2) КЭ + ципротеропа ацетат (ЦПА) 12,5 мг в день в первые 10 дней; (3) эстрадиола валерат (ЭВ) 2 мг в день в течение 21 дня + НЭТ; (4) ЭВ + ЦПА; (5) эстриол (Е3) 2-4 мг в день; (6) тиболоц (ORG OD 14) 2,5 мг в день; и (7) плацебо, ио 1 таблетке в день.
Восемьдесят одна (81) пациентка из этого числа находилась в состоянии физиологической менопаузы (средний возраст 51 год), а остальные 32 (средний возраст 41 год) перенесли гистерэктомию с овариэктомией. Последний менструальный цикл закончился 1—5 лет назад. В течение 8 педель, предшествующих клиническим испытаниям, пациентки пе принимали гормональные препараты, а пациентки, у которых в связи с текущим состоянием или по данным анамнеза были противопоказания к приему эстрогенов, пе были включены в клинические испытания.
Перед началом лечения, через два и через 6 месяцев лечения с помощью специального теста оценивали степень выраженности следующих субъективных симптомов: приливы, затруднение способности к концентрации, головная боль, раздражительность, депрессия, тревожность, бессошшца, необычная астения, боли в синце, мышечная боль, сниженное либидо, сухость слизистой влагалища и диспареупия. Все симптомы, за исключением приливов жара, получали одну из следующих оценок: 0—отсутствует; 1—слабо выражен; 2 — умерешпяй; 3—резко выражен. Приливы жара оценивались следующим образом: 0—отсутствуют; 3—слабо выражены; 6—умерешпяе; 9 —резко выражены. Перед началом лечения и через 6 месяцев лечения проводили биопсию эндометрия у всех пациенток, находящихся в физиологической менопаузе, кроме получавших плацебо. Гистологический анализ всех случаев проводил один и тот же патолог, не осведомленный о лечении пациенток. Результаты анализа классифицировали по следующей схеме: (а) нормально (в основном неактивны, в основном слабая секреция, в основном пролиферативные изменения); (б) простая гиперплазия; (в) аденоматозная гиперплазия.
В группе получавших плацебо 3 пациентки после 2 месяцев и 4 пациентки после 3 месяцев больше не участвовали в испытаниях, и только 4 из 15 пациенток продолжали принимать «лечение» все 6 месяцев. Плацебо вызывало небольшое умень
590
шение приливов жара в течение первого месяца исследований, но впоследствии отмечена тенденция возвращения частоты приливов к исходной величине.
В течение всего лечения все препараты эстрогенов вызывали значительное снижение частоты приливов, причем Е3 действовал менее удовлетворительно, чем КЭ, ЭВ или Org OD 14. При подсчете баллов другие клинические симптомы показали снижение при различных видах лечения, особенно в группах, принимавших Org OD 14 и КЭ, хотя небольшое снижение наблюдали также в случае плацебо.
При гистологическом исследовании в конце шестого месяца ни у одной пациентки не выявлено изменений морфологии эндометрия. Наоборот, добавление прогестагена вызывало регрессию гиперплазии эндометрия у трех пациенток, лечившихся КЭ+НЭТ, у двух, получавших КЭ+ЦПА, у одной, принимавшей ЭВ+НЭТ, и у одной, принимавшей ЭВ+ЦПА.
В то же время установлено, что ни эстриол, пи Org OD 14 (при приеме без прогестагенов) пе вызывают никаких изменений в морфологии эндометрия.
Лечение эстриолом ни после 2, ни после 6 месяцев также пе приводит к существенным изменениям содержания в крови триглицеридов, общего холестерина, ЛПВП и ЛПНП. Как и ожидалось, то же самое справедливо и для плацебо. Конъюгированные эстрогены плюс ЦПА через 6 месяцев значительно повышали уровень ЛПВП (р<0,01), хотя другие липопротеины практически не изменялись.
Прием эстрадиола валерата с ЦПА увеличивал содержание ЛПВП (р<0,05), пе оказывая влияния на другие липопротеины.
При комбинированном приеме НЭТ с ЭВ или КЭ отмечено снижение ЛПВП-холестерина (р<0,05 и 0,01 соответственно) и одновременное увеличение во фракции ЛПНП. Более того, НЭТ+ЭВ повышали триглицериды (р<0,05), тогда как НЭТ+КЭ снижали концентрацию холестерина в сыворотке крови (р<0,05). Препарат Org OD 14 не оказывал значительного влияния на холестерин, триглицериды, ЛПВП и ЛПНП ни после двух, пи после шести месяцев лечения.
С клинической точки зрения, получешпяе результаты показывают, что конъюгированные эстрогены, эстрадиола валерат, Org OD 14 и эстриол весьма действенны в подавлении приливов жара. Обнаружено, что эстриол менее эффективен при той дозировке, которая применялась в данном исследовании (2—4 мг/ день, иреоралыю). Для достижения максимального эффекта следует назначать дозы 6—8 мг в день, однако такая дозировка, как известно, повышает частоту побочных эффектов эстриола.
591
Добавление прогестагена пе только защищает эндометрий от гиперпластического действия эстрогенов, но в некоторых случаях может благоприятно повлиять ла ранее развившуюся простую гиперплазию. В этом отношении ЦПА оказывается таким же эффективным, как и НЭТ, и для пациенток, получавших КЭ, и для принимавших ЭВ.
Однако, существуют сообщения о том, что некоторые виды прогестагенов, особенно с более выраженными андрогенными свойствами, такие как производные 19-портестостерона, оказывают отрицательное действие па липидные фракции плазмы крови. НЭТ противодействует положительному влиянию эстрогенов на концентрацию ЛПВП-холестерина и, кроме того, может повышать уровень ЛПНП, увеличивая тем самым риск сердечно-сосудистой патологии.
Поэтому для достижения благоприятного влияния ЗГТ па липидный обмен следует использовать такой гестаген как ЦПА, обладающий аптиандрогепной активностью и не влияющий на активность эстрогенов в отношении сывороточных липопротеинов, что, в конечном счете, подтверждает предположение о том, что именно андрогенная активность стероида является причиной вызываемых им изменений метаболизма липидов.
Если существующие эстрогены показывают сходную эффективность в улучшении климактерических симптомов, то доступные в настоящее время црогестагеппые соединения отличаются между собой как по способности защищать эндометрий от пролиферативных эффектов эстрогенов, так и ио характеру влияния па липидный обмен.
* * *
В данной главе, посвященной рецепции стероидных гормонов, мы наиболее подробно рассмотрели различные аспекты функционирования глюкокортикоидных рецепторов. С одной стороны, они являются наиболее изученными, с другой — именно эти рецепторы широко представлены в тканях млекопитающих. Несмотря па имеющиеся особенности рецепторов стероидов различных классов, можно отметить некоторые общие черты функционирования, которые сводятся к следующему.
1. На плазматических мембранах компетентных клеток существуют рецепторы, ответственные за специфическое ^узнавание» и связывание тропного гормона и преобразование гормонального сигнала па уровне мембраны.
2. Цитозольные рецепторы стероидных гормонов представляют собой олигомерные лабильные белковые макромолекулы, чувствительные к изменению концентрации К+, Na+, С;г+ или Mg^ и
592
имеющие высокое сродство к определенному типу гормона.
3. После связывания гормона цитозольные рецепторы подвергаются трансформации (активации): в комплексе со стероидом они проникают в ядро клетки и локально изменяют (как правило, стимулируют) процессы транскрипции.
На основании изложенного читателю, по-видимому, видны -«темные пятна» во взаимодействии стероидов с компетентными клетками. Поэтому отметим некоторые возможные направления дальнейших исследований.
1. Необходимо выяснить взаимоотношения между макромолекулами цитозоля и мембранных структур, специфически связывающих стероиды, и роль каждой их этих макромолекул в преобразовании гормонального сигнала в биохимическую реакцию.
2. Необходимо найти способы изучения функционирования рецепторов стероидных гормонов без изменения их нативной структуры.
3. К первоочередным задачам относится также изучение механизмов взаимодействия стероид-реценторных комплексов с хроматином и выяснение дальнейшей судьбы этого комплекса (т.е. изучение всего -«рабочего» цикла рецептора стероидного гормона).
Рассматривая проблему стероидной рецепции в целом, мы считаем необходимым отметить, что вследствие мпогоэташю-сти действия стероидных гормонов нельзя ограничиваться изучением только одной, пусть и специфической, реакции их взаимодействия со структурами клетки. Для оценки каждого этапа в реализации биологической активности стероидов следует определить временной характер того или иного эффекта стероида и обусловленность его тем или иным видом рецептора (имеются в виду не только рецепторы плазматических мембран и цитозоля, но и органелл, с которыми, по предварительным данным, также специфически взаимодействуют стероиды). Мы надеемся, что разработанная нами мембрашюрецепторная теория, элементы которой описаны в данной главе (подробно oiia изложена в книге П.В.Сергеева «Стероидные гормоны» 1984), явится теоретической базой дальнейших исследований молекулярных механизмов действия этой важной группы биорегуляторов, что, в конечном счете, будет непременно способствовать их более рациональному использованию в практической медицине.
.1К Зап. 227
Глава 14
НЕКОТОРЫЕ ПРОБЛЕМЫ ОНТОГЕНЕЗА И ФИЛОГЕНЕЗА РЕЦЕПТОРОВ
Рассматривая структурно-функциональные особенности тех или иных видов рецепторов физиологически активных веществ, мы не раз отмечали их высокую лабильность, подвижность и вариабельность. Неоднократно было показано, что при изменении внешних условий способность рецепторов выполнять свои функции меняется. Правильное функционирование рецепторов необходимо для адекватного реагирования клетки ца действие внешних факторов. Нарушение функции рецепторов есть причина патологии и смерти клеток. В данном случае имеется в виду не какая-то чрезвычайная причина (инфекцио1шая, механическая и др.), а физиологическая, т.е. обычное старешге. Понять эти причины можно, если проследить путь филогенеза и онтогенеза рецепторов, т.е. путь реализации всех этапов становления лиганд-реценторпых взаимоотношений.
В этом плане весьма актуально общебиологическое заключение, сделанное И.В. Давыдовским (1962): ^Внешние факторы сами по себе не создают в организме специфических изменений. Но последние возникнут с неизбежностью, когда внешний фактор найдет себе специфическое, т.е. адекватное функциональное и морфологическое преломление. Этим именно путем в организме возникли и закреплялись те или иные структуры и приспособительные устройства». В пашем случае к этим структурам (приспособительным устройствам) относятся рецепторы.
Движущей силой филогенеза являются мутагенез и отбор. Становление нового вида характеризуется появлением новых органов и механизмов их функционирования. Можно полагать, что лигапд-рецеигорные взаимодействия не были жизненно необходимыми механизмами на ранних стадиях филогенеза, но стали таковыми на стадии образования ассоциатов клеток. Два основных фактора этого взаимодействия лигацд (гормон) и рецептор,
594
но-видимому, возникли не одновременно. В общем случае биосинтез химических низкомолекулярных соединений (возможно, гормонов) и полимерных макромолекул (имеются в виду рецепторы) контролируется генами независимо друг от друга и, естественно, они могут существовать независимо друг от друга. По-видимому, они так и существовали ла начальных этапах филогенеза до тех пор, пока результат их взаимодействия не стал событием, имеющим большое значение для организмов в борьбе за выживание.
Важно, что, хотя одноклеточные организмы содержат адреналин [Janakivedi D. et al., 1966; Bloom J J., 1967], серотонин [Hill D.L., 1973] или ацетилхолин [Karlson P., 1972], каждый из которых обладает высокой биологической активностью и для которых имеются высоко специфические рецепторы у высших организмов, у них, как правило, нет специализированных структур, специфично связываясь с которыми медиаторы бы вызывали какой-нибудь эффект.
В то же время искусственное воздействие па одноклеточные организмы, такие как Tetrahymena, некоторыми гормонами высших организмов сопровождается ответной реакцией. Например, гистамин и серотонин увеличивают фагоцитирующую активность Tetrahymena [Csaba G., Lantos T., 1973]. Поскольку метаболит серотонина индолуксусная кислота таким свойством не обладает, можно считать, что одноклеточная Tetrahymena имеет своего рода рецепторы для некоторых физиологически активных веществ.
Гистамин, особенно серотонин, очень широко распространен в растительном и животном мире и может присутствовать в окружающей среде простейших даже в физиологических условиях. Другие гормоны, такие как инсулин и трийодтиронин, присутствующие только у позвоночных, не влияют па фагоцитоз Tetrahymena [Csaba G., Lantos T., 1975]. Однако адреналин и инсулин вызывают у mix увеличение поглощения глюкозы [Csaba G., Lantos Т., 1976]. Напомним, что у млекопитающих на этот процесс инсулин и адреналин влияют разнопаправлешю. Если судить но действию гормонов па аденилатциклазную систему Tetrahymena, то вследствие способности инсулина, глюкагона, адреналина, гистамина, серотонина индуцировать значительное повышение у них уровня цАМФ следует заключить, что эти одноклеточные организмы содержат также связывающие участки и для некоторых гормонов, отсутствующих в их окружающей среде в обычных условиях.
Кроме фагоцитоза и утилизации глюкозы, к третьей важнейшей функции клеток относится их деление. Эта функция Tetrahymena
ЗЯ*
595
также может регулироваться гормонами высших организмов тироксином и трийодтиронином, которые стимулируют рост Tetrahymena [Romanov Yu.A. et al., 1974]. Рост Tetrahymenaтакже стимулируют серотонин и грамии, но не адреналин [Csaba G. et al., 1979]. Данный эффект появляется при концентрации гормонов 109 М, а при концентрации 105 М они ингибируют рост Tetrahymena. Химически различные трийодтиропин и грамии увеличивали эффект друг друга, а родственные вещества серотонин и грамии подавляли эффект друг друга. Эти факты свидетельствуют о следующем: 1) одноклеточные организмы содержат связывающие участки (генуинные реценторподоблые структуры) для гормонов высших организмов; 2) в процессе филогенеза рецепторы сформировались раньше, чем появились комплементарные к ним лиганды.
Если считать, что развитие рецепторов — составная часть филогенеза, то можно думать о возникновении гормонов при дифференцировке химических соединений на оиределешюй стадии эволюции и вслед за этим установление эффективных лигандрецеп-торных взаимоотношений.
По-видимому, чувствительность мембран клеток как одноклеточных, так и многоклеточных беспозвоночных к гормонам позвоночных есть их общее свойство [Legros F. et al., 1975; Csaba G., Bierbauer J., 1977, 1978], дающее возможность предполагать, что первоначально в отсутствие комплементарных лигандов прорецепторы выполняли (возможно, выполняют и в настоящем) другую функционально значимую роль. Недавно, например, стало известно, что внутриклеточный рецептор для инсулина имеет протеиикипазную активность и в отсутствие инсулина функционирует как протеицкиназа (см. раздел 12.5). Отсюда вытекают следующие важные теоретические положения: 1) у любого из известных рецепторов для физиологически активных веществ, кроме рецепторной, должна существовать другая функция (любая из известных для белков); 2) при появлешш новых эндогенных лигандов возможно их взаимодействие с уже существующими биомакромолекулами живых клеток, пока неизвестными как рецепторы; 3) экзогенные лиганды могут иметь рецепторы, для которых нет эндогенных лигандов (пока нет точных доказательств о существовании высокоспецифичных эцдогец-ных лигандов для имипраминовых, пикротоксиновых, бензодиазепиновых и некоторых других рецепторов). Следует отметить, что рецепторы для многих ЛВ были найдены эмпирически. Поэтому детальное изучение третичной структуры функционально значимых биомакромолекул может помочь в направленном поиске химиче
596
ских веществ, комплементарных к тем или иным участкам макромолекул, функцию которых необходимо регулировать.
Следующий важный вопрос, требующий пристального внимания, относится к проблеме установления лиганд-рецепторных взаимоотношений. Как происходит этот процесс в ходе эволюции, неизвестно. Однако эксперименты с быстроразмножающимися одноклеточными организмами могут дать некоторые представления о возможных путях филогенеза рецепторов.
Поданным G.Csabaи T.Lantos (1973), инкубацияTetrahymena с гистамином (10^ М) в течение 3 мин приводит к увеличению фагоцитирующей активности на 40 — 50%. При продолжительной инкубации (до 4 сут.) фагоцитирующая активность Tetrahymena увеличивалась на 150%, При переносе Tetrahymena в среду без гистамина их фагоцитирующая активность возвращалась к исходному уровню, но после этого повторное действие гистамина в течение 3 мин сопровождалось значительно большим увеличением фагоцитирующей активности, чем при первом воздействии гистамина. Даш1ый эффект усиления способности гистамина повышать фагоцитирующую активность Tetrahymena сохранялся только в течение 2 нед. после прекращения инкубации клеток с гистамином. Поскольку за 4 сут. обычно появляется 20 — 25 поколений Tetrahymena, причиной выявленного феномена может быть отбор (т.е. преимущественное выживание тех клеток, которые содержат большее число рецепторов для гистамина) или индукция гистамином увеличения числа рецепторов для пего (так могут реагировать все клетки и отбор не играет никакой роли). Однако какая из этих двух альтернатив имеет место, неизвестно.
Изучение онтогенеза рецепторов к физиологически активным веществам также позволило получить важные данные о становлении лиганд-рецепторных взаимоотношений.
Результаты многочисленных исследований указывают на то, что как число рецепторов, так и их способность опосредовать гормональные эффекты изменяются в процессе онтогенеза [Перцева М.Н., 1982;CuatrecasasP., 1974; Freychet Р., 1975; Candy J., Marlin I., 1979]. Воздействие вазопрессина или окситоцина в неонатальном периоде развития крыс приводит к увеличению или уменьшению соответственно способности вазопрессина вызывать сокращение отрезка аорты у двухмесячных животных [Csaba G. et al., 1980]. После однократного введения крысам инсулина в неонатальном периоде у взрослых животных наблюдается пониженный уровень глюкозы в крови, что указывает на увеличение чувствительности рецепторов к эндо
597
генному инсулину; при введении крысам экзогенного инсулина имело место такое снижение уровня глюкозы в крови, как и у контрольных животных, но на более низкий уровень [Csaba G. etal., 1979].
В качестве другого примера возможности изменения нормального развития рецепторов можно привести данные G.Csaba и S.U.Nagy (1976, 1978), согласно которым нарэптералыюе однократное введение крысятам через 24 ч после рождения гонадотропина приводит к снижению эффекта тиреотропного гормона у взрослых животных и уменьшению его связывания с изолированными тиреоцитами. Поскольку гонадотропин и ТТГ гипофиза имеют одинаковую а-субъединицу и различную [Гсубъедишшу, можно полагать, что в период развития организма крыс а-субъедвни-цы этих гормонов могут взаимодействовать с рецепторами не только для одного, по и другого гормона, и взаимодействие гонадотропина с рецепторами для ТТГ в неонатальном периоде приводит к сильному изменению этого рецептора, которое сохраняется в течение всей жизни.
На основании указанных данных можно предполагать, что существует своего рода гормональный импринтинг. Однако еще не известно, каков его механизм — изменение числа рецепторов, изменение сродства рецепторов к гормону или изменение эффективности медиации.
По-видимому, мембранные рецепторы обладают повышенной лабильностью в период созревания. Данный период критической чувствительности охватывает не только перинатальную жизнь, но продолжается некоторое время после рождения. Однако точных данных о продолжительности этого периода, касающихся всех гормонов, пока нег, хотя, по нашему мнению, развитие исследований в этом направлении имеет важное практическое значение. По-види-мому, возникновение многих эндокринных расстройств можно будет устранить, выяснив механизм становления гормоп-рецептор-ных взаимоотношений в ранние критические периоды развития организма человека.
Современные представления о формировании в онтогенезе рецепторов плазматических мембран, сопряженных с аденилатцикла-зой, подробно рассмотрены М.Н.Перцевой (1982). Из приведенных автором данных вытекает; различия во времени и характере развития каталитической субъединицы адеиилатциклазы, с одной стороны, ее ответы на катехоламины, с другой — свидетельствуют о том, что комплекс рецептор —аденилатциклаза формируется в онтогенезе не как единое целое.
При изучении в онтогенезе роли мембранных липидов в уста-
598
Рис. 114. Формирование в онтогенезе комплекса гормональный рецептор — аденилатциклаза.
Р—рецептор; С—сопрягающий компонент аденилатциклазы; К—каталитический; Г и Ф - регуляторный соответственно гуаниннуклеотидсвязывающий и фторчувстпительный компоненты аденилатциклазы [М. Н. Перцева, 1982}.
Горшм
ЧАМФ цАМФ
01 atwn
иовлеиии сопряжения рецепторов с адеивлатциклазой было обнаружено, что в процессе развития у эмбрионов кур происходит снижение содержания холестерина и насыщения жирных кислот и увеличение уровня ненасыщенных жирных кислот в составе липидов плазматических мембран. При этом уменьшение микровязкости в ходе развития коррелирует с увеличением реактивности комплекса рецептор—аденилатциклаза [Smith F.B., Clare G.F., 1980]. Кроме того, отметим, что формирование другого компонента сопряжения рецепторов с аденилатциклазой — белка, связывающего гуаниловые кислоты, завершается в целом на довольно поздних стадиях: в конце эмбрионального и начале постлаталыюго периода, т.е. происходит позднее формирование самого рецептора и аде-нилатциклазы.
На основании экспериментальных данных М.Н.Перцева (1982) предлагает следующую схему функционального формирования в онтогенезе рецептор-эффекторной системы (рис. 114), На I этане (ранний эмбриональный период) плазматическая мембрана структурно еще не сформирована, на ее поверхности отсутствуют рецепторные белки. Молекулы аденилатциклазы или совсем пе связаны с плазматической мембраной, или еще не полностью в нее встроены из-за большой вязкости ее липидной фазы. На II этапе снижается вязкость липидного матрикса, что приводит к включению циклазы в мембрану. Параллельно начинается синтез мембранного белка. На III этапе раз-
599
пинаются сопрягающие компоненты, и появляется возможность эффективного взаимодействия между рецептором и ферментом.
Таким образом, можно считать, что комплекс рецептор—адепи-латциклаза развивается пе как единое целое: вначале каталитический и регуляторный, затем рецепторный и, наконец, сопрягающий компоненты.
Несомненно, что большой интерес представляет анализ возрастных изменений фуцкциоцировашгя дашюго комплекса в пост-на-талыюм периоде. Можно ожидать изменение его функционирования, так как хорошо известно, что с возрастом увеличивается мик-ровязкосгь мембран; последнее сопровождается уменьшением активности аденилатциклазы.
Оцисаш1ая гипотетическая схема имеет отношение только к рецепторам, сопряженным с адепилатциклазой, а сведений о молекулярных механизмах в онтогенезе других мембранных рецепторов мы пока не имеем.
О филогенезе и онтогенезе цитозольных рецепторов физиологически активных веществ сведения также ограничены.
По имеющимся данным, у одноклеточных нет цитозольных рецепторов. У Tetrahymena не найдено цитозольных рецепторов для стероидных гормонов, хотя они проникают внутрь клетки [Csaba G. et al., 1978]. Считается, что действие стероидов на фагоцитирующую активность Tetrahymena [Csaba G. et al., 1978] и метаплазию амебы Naeglieria gniberi [Pearson J.L., Willmer E., 1963] обусловлено взаимодействием гормонов с плазматическими мембра) 1ами.
На ранних этапах онтогенеза у позвоночных цитозольных рецепторов для стероидов также не обнаружено; они появляются позднее [Cake M.N., LitwackG., 1975]. При снижении морфологического значения гормона число цитозольных рецепторов и их аффинитет могут уменьшаться [Csaba G., 1980].
Воздействие гормонов в неонатальный период может приводить к нарушению (деформации) цитозольных рецепторов. Так однократное введение тестостерона в этот критический период удлиняет цикличность функционирования гипоталамуса у самок крыс [Barraclough С.А., 1966; Domer G., 1974, 1978].
Как уже отмечалось, у позвоночных внутриклеточные рецепторы имеются как для стероидных, так и для белково-пентидных гормонов. Вместе с тем для обоих типов гормонов существуют рецепторы на плазматических мембранах. По-видимому, мембранные рецепторы (филогенетически и онтогенетически более молодые) играют адаптивную роль, а цитозольные рецепторы (филогенетически и онтогенетически более старые), характерные для
600
высших животных, играют морфогенетическую роль и обеспечивают возможность регуляции хроматина.
Приведенные в данной книге материалы (см. раздел 12.6) свидетельствуют о том, что одним из возможных путей возникновения цитозольных рецепторов является интернализация мембранных рецепторов. По иммунологическим и физико-химическим свойствам мембранные и внутриклеточные рецепторы различаются между собой [Сергеев П.В., 1984; Goldfine I.D. et al., 1978; Gorden P., 1979], что указывает на возможность деградации мембранных рецепторов при их интернализации. По-видимому, возникший па определенном этане эволюции феномен интернализации рецепторов сыграл большую роль в совершенствовании структурно-фуш<-циопалыюй рефляции живых существ, так как обеспечил возможность направленного и избирательного переноса информации внешней среды к геному и более длительному (несколько часов) изменению функции клеток.
Рассматривая онтогенез рецепторов к физиологически активным веществам в поздний постнатальный период, напомним, что в данной книге мы не раз касались этих вопросов, и читатель уже имеет представление о возрастных изменениях рецепторов для биогенных аминов и ряда гормонов.
Известно, что число p-адренорецепторов лимфоцитов человека уменьшается от 24 лет до 81 года с 14 000 до 8 000 на клетку [Shoken D.D., Roth G.S., 1977]. При этом с возрастом происходит снижение базального и стимулируемого изопреналином уровня активности адеиилатциклазы, сопряженной с [J-адренорецепторами лимфоцитов [Krall J.F. etal., 1981].
В мозжечке, но не в коре головного мозга, A.Maggi и соавт. (1979) также обнаружили снижение числа [J-адренорецепторов с увеличением возраста людей. В экспериментах на животных было выявлено уменьшение с возрастом релаксации изолированной аорты, опосредуемой p-адренорецептором [Fleisch J.H., 1980]. С возрастом также уменьшается число р-адренорецепторов в мозжечке, но не в коре головного мозга [Maggi A. et al., 1979]. Однако у крыс M.I.Kalich и соавт. (1977) выявили увеличение активности адеиилатциклазы печени, сопряжешюй с Р-ад репо рецепторами.
Причиной уменьшения числа р-ад реиорецепторов может быть повышение концентрации циркулирующих в крови катехоламинов, так как известно, что инкубация лимфоцитов молодых субъектов с высокими концентрациями норадреналина сопровождается снижением активности адеиилатциклазы до того же уровня, который имеет место у пожилых людей [Kall J.F. et al., 1981].
601
В отношении а-адрепорецепторов имеющиеся экспериментальные данные свидетельствуют об отсутствии их изменений с возрастом [Elliot H.L., 1981; Scott P.J., ReidJ.L., 1982].
Анализ зависимости эффектов бензодиазепинов от возраста людей показал значительное увеличение случаев побочного действия нитразепама, хлордиазепоксида, диазепама и флуразепама [Greenblatt D.J. et al., 1977; Greenblatt D.J., Allen M.D., 1978]. При этом у пожилых людей ио сравнению с молодыми субъектами выявлено увеличение числа рецепторов, связывающих 3Н-диазе-пам в гиппокампе. Однако число этих рецепторов в коре, полосатом теле, мозжечке и гипоталамусе у них было одинаковым [Meno M.etal., 1981]. Дополнительные исследования в этом направлении должны дать более определенный ответ об участии бензодиазепиновых рецепторов в увеличении чувствительности людей к бензодиазепинам с возрастом.
Отметим, что изменение фармакологической активности ЛВ может быть связано не только с возрастными изменениями рецепторов, но и с изменением фармакокинетических параметров при старении организма [Scott P.J., 1982].
В онтогенезе вследствие неизвестных пока причин могут возникать различные патологические изменения рецепторов, являющиеся ведущим патогенетическим звеном при ряде заболеваний. Ранее мы приводили данные о разного рода нарушениях в рецеп-тор-эффекторных системах при нейронсихических и эндокринных заболеваниях. Однако в данном случае мы хотим особо выделить существование врожденных нарушений функций рецепторов. Примерами такой дисфункции являются синдром тестикулярной феминизации у мужчин, связанной с патологией рецепторов для де-гидротестостерона [Griffin J.E., Wilson J.D., 1980], и наследственная гиперхолестеринемия, обусловленная дисфункцией рецепторов для липопротеинов с низкой плотностью [Tenschert W. et al., 1981].
Другой причиной дисфункции рецепторов могут быть аутоиммунные заболевания. В настоящее время известны случаи возникновения аутоантител против Н-холинореценторов [Drachman D.B. etal., 1982], ^-адренорецепторов [Motulsky H.J., Insel Р.А., 1982], рецепторов дофамина [Knight J.G., 1982], инсулина [Taylor S.J. et al., 1982] и тиреотропного гормона [Werner S.C., van Westarp C.H., 1983], которые являются причиной миастении, бронхиальной астмы, шизофрении, диабета и гипертиреоза соответственно.
Поскольку есть все основания считать, что в основе возрастного выключегшя репродуктивной функции и, следовательно, старения лежит не что иное, как повышение гипоталамического порога
602
чувствительности к регулирующему влиянию половых гормонов, можно полагать, что наиболее простым способом изменения порога чувствительности к действию гормонов является изменение числа рецепторов в клетках соответствующего гипоталамического центра, например, -«полового центра» репродуктивной системы. При повышении концентрации гормона в крови происходит уменьшение числа гормональных рецепторов в клетке-ми шел и и соответственно чувствительность этой клетки уменьшается. Описанное явление наблюдается при нормальном старении [ Дильман В.М., 1981}. Таким образом, получается, что эволюционно возникшая способность клеток регулировать число рецепторов в зависимости ст уровня внешних сигналов (гормонов), с одной стороны, обеспечивает рост организма и наступление половой зрелости, с другой — старение и смерть. Эта способность каждой отдельной клетки генетически запрограммирована. При изменении данной генетической программы могут возникнуть такие деформации в рецепторных системах, которые окажутся несовместимыми с жизнью для того или иного организма. Примером такой деформации может служить активация ракового гена, который определяет продукцию так называемого трансформирующего белка. Выделенный из этих клеток трансформирующий фактор роста резко увеличивает число инсулиновых рецепторов, а возникающая «инсулинизация» клетки необходима для ускоренного поступления глюкозы и аминокислот при злокачественном госте. По-видимому, при этом увеличивается число не только рецепторов для инсулина, но и возможно для других гормонов, большое количество которых характерно также для эмбриональных клеток. В частности, в мембранах раковых клеток происходит накопление хорионического гонадотропина.
Таким образом, рассмотрение процессов действия онтогенеза и филогенеза физиологически активных веществ продемонстрировало главную роль специфических, чувствительных для них структур рецепторов в интегральных процессах развития высокоорганизованных живых организмов, а также их физиологии и патофизиологии. Все это делает крайне актуальными дальнейшие исследования в данной области, направленные на изучение механизмов функционирования рецепторов и становления лиганд-рецепторно-эффекторных взаимоотношений.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В дшшой книге мы рассмотрели определенные виды рецепторов для физиологически активных веществ. Эти рецепторы наиболее хорошо изучены. Одиако нельзя утверждать, что ими исчерпываются все рецепторы такого рода. Достаточно назвать рецепторы для тиреоидных гормонов, простагландинов, глицина, лектинов, холерного токсина, лейкотриенов, цитокинов, малых регуляторных пептидов с различной активностью, липопротеинов и др. Даже вкратце проанализировать имеющиеся данные о механизмах их функционирования пе представляется возможным в одной монографии. Вместе с тем мы считаем целесообразным в заключение дать в обобщенном виде представления о рецепторах разных классов с учетом общих положений учения о рецепторах.
Прежде всего, подчеркнем, что общее свойство всех рецепторов для физиологически активных веществ, расположенных па поверхности или в живых клетках, состоит в том, что в обязательном порядке первоначально имеет место «узнавание» рецептором соответствующего лиганда, которое характеризуется специфическим взаимодействием молекул-нартнеров с высоким сродством. В результате этого взаимодействия реализуется вторая функция рецепторов —трансформация полученного сигнала в биохимическую и затем в физиологическую реакцию живых систем. Предметом рецецторологии как части биохимической фармакологии является именно анализ взаимодействия молекул с рецепторами и преобразования молекулярного сигнала в биохимическую реакцию. Такими биохимическими реакциями могут быть изменение активности фермента, проницаемости ионных каналов и др. Разная клеточная локализация рецепторов и их сопряженность с биоструктурами позволяет их дифференцировать па классы (табл. 43).
Предложенное разделение рецепторов физиологически активных веществ на четыре класса условно и отражает еще недостаточный уровень знаний о биохимии и топографии рецепторов. Неясно еще, к какому классу рецепторов относятся участки мем-
604
Таблица 43
Классы рецепторов физиологически активных веществ
Локализация рецелторса
Регуляция чксла рецепторов
Мехэккэм фуяхцчмя* ромиж»
Белково-пептидные гормоны, биогенные амины, аце. тилхолнн, бензодиазепины, ими-пр амин, опиаты, стероидные гормоны, простагландины Липопротеиды с низкой плотностью, гликонротонды, фибрин, лам нн Стероидные маны всех сов Тиреоидные МОНЫ
к оба-
гор-клас-
гор-
Плазматиче-ская мембрана
* Регуляция снизу» (интернализация) (выявлена не во всех случаях)
То же
Цитозоль
Ядро
Зависимость зывающей собности от центрацин
валентных ионов
свя-спо-хон-двух-
Индукция образования ' или ингибирование образовання
цАМФ или цГМФ; изменение проницаемости для К+, CI”, Na+ или Са’+; измене нис обмена фосфолипидов Интернализация лиганда в клетку
Ядериая транслокация; изменение транскрипции генома Изменение транскрипции генома
Примечание. Для белково-пептидных гормонов также показана интернализация с участием рецепторов, однако пока неизвестно, идентичны ли они рецепторам, опосредующим их влияние на активность адеиилатциклазы и мембранный транспорт. Природа рецепторов стероидных гормонов, опосредующих их влияние на активность мембранных ферментов, также не изучена.
бран внутриклеточных органелл, специфически связывающие некоторые гормоны. Вполне возможно, что для некоторых физиологически активных веществ на плазматических мембранах существуют два класса рецепторов — один из них принимает участие в опосредовании действия па активность мембранных ферментов и проницаемость ионных каналов, а другой обеспечивает их интернализацию. Феномен интернализации физиологически активных веществ был выявлен относительно недавно; но-видимому, он имеет отношение к фагоцитозу клетками малых частиц. Вероятно, сам процесс фагоцитоза, который свойствен даже одноклеточным организмам, неснецифичен, по рецепторы, которые специфично связывают тот или иной лиганд, обеспечивают избирательность его поступления в клетку-мишень.
Все рецепторы физиологически активных веществ по принципу выполняемых ими функций можно разделить на две группы.
1. Основные рецепторы, опосредующие действие лигандов на эффекторы. К ним относятся адренергические, холинергические,
605
дофаминергические, гистаминергические, серотонинергические, ГАМК-ергические, гормональные рецепторы. Возбуждение или блокада этих рецепторов всегда сопровождаются регистрируемыми изменениями функционирования клетки.
2. Рецепторы-модуляторы, опосредующие действие лигандов па функцию других рецепторов. К ним можно отнести опиатные, пуриновые, бензодиазепиновые, имипраминовые рецепторы. В отсутствие лигандов, действующих на основные рецепторы, их пе всегда можно выявить. Поэтому неудивительно, что рецепторы-модуляторы были открыты позднее основных рецепторов. Хотя такое деление достаточно условно, оно лучше помогает представить рецепторную организацию клетки. Кроме того, нужно учитывать, что основные рецепторы также функционируют пе изолиро-вашю друг от друга. Следовательно, рассмотрение только одного типа рецепторов явно не достаточно для понимания всех возможностей регуляции интегрального ответа клетки. В этой связи весьма перспективным, цо нашему мнению, следует признать подход, развиваемый А.Н.Кудрипым о констелляционпых рецепторных системах с реципрокными отношениями [Kudrin A.N., 1982].
В процессе эволюции с помощью рецепторных констелляций была создана высокая степень надежности согласованной работы различных жизненно важных процессов в условиях постоянно меняющихся факторов внешней среды. Тем пе менее, существует и другая сторона рассматриваемой проблемы. Генетическая детерминация содружестве! той работы рецепторов обеспечивает не только развитие, рост и нормальное функционирование живых систем, но и возникновение тех молекулярных событий, которые обусловливают переход живой материи в неживую. Поэтому научно обоснованная терапия любых патологических явлений требует разработки, во-первых, новых путей диагностики разбалансировки функционирования рецепторных ансамблей и, во-вторых, создания эффективных средств нормализации возникших нарушений.
В этой связи большое значение имеет сопоставление экспериментальных фактов, полученных при изучении различных рецепторных систем. Несмотря на неодинаковость «узнающих* участков рецепторов для лигандов (например, для ацетилхолина, гистамина, ангиотензина), эти вещества вызывают сходные эффекты в одной и той же ткани (гладкие мышцы сосудов). В то же время один лиганд, такой как ацетилхолин, может действовать па совер-шешю различные рецепторы (имеются в виду никотиновые рецепторы скелетных мышц и мускариновые рецепторы гладких мышц,
606
которые имеют неодинаковые структуры как «узнающих», так и эффекторных систем) благодаря гибкости своей структуры и возможности принимать различные конфщурации. Кроме того, существуют лиганды, такие как гистамин, которые могут взаимодействовать с рецепторами различных классов. В низких концентрациях (10'* М) гистамин активирует свои собственные Г(- и Г,- рецепторы, а в сравнительно больших концентрациях (>104 М) — другие рецепторы (ацетилхолиновые). Множественность рецепторов, ярко выраженная для адренергической ( а,-, о^-, (J,-, (^-рецепторы), опиатной ( Ц-, 6-, ст-, Х’> к-рецепторы), серотониновой и других систем еще раз подчеркивает общую природу гетерогенности рецепторов и возможность существования перекрестных взаимосвязей того или иного лиганда с рядом рецепторных систем.
Как не раз было проиллюстрировано на страницах этой книги, лиганд-рецеиториое взаимодействие приводит к развитию не только специфического ответа (сокращение мышцы, выделение клеткой определенного секрета), по и одновременно может сопровождаться изменением числа и/или связывающей способности рецепторов и в конечном итоге увеличением или уменьшением биохимических проявлений рецепторной активации. Иными словами, рецепторную регуляцию следует рассматривать как составную часть ответа воспринимающего аппарата клетки на действие агониста.
Регуляция рецепторов может быть гомо- и гетеросвецифиче-ской. В случае гомоспецифической регуляции, или саморегуляции, лиганд изменяет функцию и/или число своих собственных рецепторов. Принимая во внимание возможность перекрестного взаимодействия лигандов с множеством рецепторов, этот гомоспецифиче-ский регуляторный процесс может быть обусловлен активацией рецептора независимо от природы активирующего лиганда.
Следовательно, гомологичные лиганды вызывают ряд сходных гомоснецифических регуляторных событий в одном или нескольких рецепторных участках.
В случае гетероснецифической регуляции активация одной рецепторной системы приводит к изменению совершенно другой системы. Эту перекрестную связь между рецепторными системами можно назвать траисрегуляцией рецепторов. Она имеет место для химически различных, или гетерологических, лигандов. Другими словами, при гомоспецифической регуляции происходит прямая активация процессов, ведущих к изменению рецепторных свойств, а при гетероснецифической регуляции активация одного рецептора сопровождается регуляцией другого рецептора при участии мо
607
лекул-носредпиков; в ее основе могут лежать механизмы, локализованные в плазматической мембране или в других комнарт-мептах клетки, удаленных от места лигапд-реценторного взаимодействия.
Вследствие субъединичной структуры гликопротеинов плазматических мембран клетки, как правило, одни субъединицы фармакологических рецепторов принимают участие в «узнавании* лиганда, а другие — в преобразовании молекулярного сигнала в биохимическую реакцию. Такое представление согласуется с теориями «впут-решюй активности» Ариеиса н «эффективности» Стефенсона, рассмотренными в первой части книги. В связи с этим функцию рецептора можно регулировать посредством воздействия на субъединицы, ответственные за связывание лиганда, или па субъединицы, принимающие участие в трансмембранной передаче сигнала. Так как активация клетки представляет собой комплексный процесс, состоящий из множества биохимических событий, рецепторная регуляция может осуществляться на участках, далеко удаленных от первоначальных рецептороносредуемых реакций. Например, процесс репеп-торрегулируемой активации какого-либо фермента, если опа связала с фосфорилированием и опосредована цАМФ (модулятор киназы), то происходит ее изменение при воздействии па другие ферменты обмена циклических нуклеотидов (фосфатаза, фосфодиэстераза), которые непосредственно пе ассоциированы с адепилатциклазой, активируемой гормоном.
Число участков, «узнающих» лиганд на поверхности клетки, зависит от соотношения процессов биосинтеза рецепторов, их интернализации и деградации. Во многих случаях биосинтез рецепторов идет тем же путем, что и синтез различных гликопротеинов, входящих в состав плазматической мембраны клетки. Так же, как и синтез многих составных компонентов клетки, синтез рецепторов может регулироваться гормонами и нейромедиаторами. На уровне биосинтеза рецепторов, включая посттрапсляциошгые процессы и гликозилирование, один лиганд, влияя на свои собственные рецепторы, может изменять число рецепторов для другого лиганда (гетероспецифическая регуляция).
Лиганды могут вызывать увеличение (пролактин, витамин D) или уменьшение (инсулин) своих собственных рецепторов на поверхности клетки. Рецепторы для одного лиганда (прогестерон) могут индуцироваться другими лигандами (эстрогены). Аптире-цепторпые антитела могут выступать в качестве агонистов или антагонистов рецепторов.
Механизм повышения лигандами связывающей способности рецепторов состоит в увеличении стабильности рецепторов, перерас-
608
пределении рецепторов в мембране и главным образом в индукции синтеза новых молекул рецептора. В то же время уменьшение плотности рецепторов па клеточной поверхности чаще всего обусловлено их интернализацией или «даун регуляцией». Судьба поступивших в присутствии лигандов в клетку рецепторов может быть различной. Некоторые из них не появляются на клеточной поверхности в течение определенного периода, необходимого для биосинтеза. Это и есть -«регуляция снизу». Другие рецепторы пе подвержены регуляции этого типа и быстро вновь встраиваются в мембрану. Разница в поведении этих рецепторов обусловлена тем, что первые (инсулиновые рецепторы) быстро попадают в лизосомы, где они разрушаются, тогда как вторые (рецепторы 0,-макро-глобулина) такому разрушению пе подвержены.
«Даунрегуляция» обычно относится к гомоспецифической регуляции рецепторов, но при перекрестном взаимодействии определенного лиганда с одним рецептором или более может происходить одновременная «дау1 (регуляция» нескольких рецепторов. В качестве примера такой гетероснецифической регуляции рецепторов можно провести изменение числа рецепторов для урогастропа (эпидермального фактора роста), вызываемое взаимодействием онухолеродного вещества 12-0-тетрадекаиоил-форбол-13-ацетата со своим клеточным рецептором, являющимся Са-фосфолипцдзависимой протеинкипазой. Аналогичной способностью регулировать число рецепторов для урогас-трона обладают ростковый фактор тромбоцитов и вазопрессин. Так как такой гетероснецифической регуляции не происходит в изолированных мембранах клеток, следует считать, что она реализуется только при участии цитоплазматических факторов.
Гетероснецифическая регуляция, выражающаяся в увеличении связывания лиганда, может быть также опосредована механизмами, локализованными в самой плазматической мембране или вблизи от {[ее. В частности, таков механизм изменения инсулином, бензодиазепинами и карбахолом связывания росткового фактора II, ГАМК и вещества WB 4101 (а,-адренергический лиганд) с их соответствующими рецепторами.
По нашему мнению, биохимические механизмы дашюй регуляции тесно связаны с носттрапсляционными изменениями рецепторов. После биосинтеза в эндоплазматическом ретикулуме рецепторы, так же как и другие мембранные белки, подвергаются N-гликозилирова-(шю (остаток аспарагиновой кислоты). Затем в комплексе Гольджи присоединенные олигосахариды модифицируются и к ряду рецепторов присоединяются жирные кислоты. Пока неизвестно, какую роль эти изменения рецепторов играют в их гомо- и гетероснецнфиче-
39.Зак.Ш
609
ской регуляции, однако с большой долей вероятности можно утверждать, что в этом аспекте большое значение имеет фосфорилирование рецепторов, обусловленное связыванием лиганда.
По современным представлениям, феномен фосфорилирования относится к одному из основных биохимических механизмов регуляции функциональной активности белков. Системы фосфорилирования рецепторных белков состоят их трех компонент: I) нротеинкицазы, катализирующей перенос фосфатной группы от донора (обычно молекула АТФ) к акцептору (белок); 2) белкового субстрата, к которому присоединяется фосфатная группа и 3) фос-фопротеиифосфатазы, которая катализирует отщепление фосфатной группы от субстрата. Протеимкипазы активируются вторичными посредниками рецепторов: цАМФ активирует А-киназы, цГМФ — G-киназу, диацилглицерин — С-кицазу, Са2+ — кальмодулнпза-висимую киназу. В случае рецепторов для инсулина и ряда ростковых факторов киназной активностью обладает белковая молекула самого рецептора.
Фосфорилированию мсиут подвергаться сериновые, треониновые и тирозиновые остатки многих рецепторов. Следствием этого являются индукция проникновения рецепторов в клетку и модуляция их функции. Фосфорилирование — необходимый этап попадания рецепторов в «покрытую клатрином» ямку, которая затем превращается в эндосому. Очевидно, именно фосфорилирование является тем механизмом, за счет которого могут реализовываться гомоспецифическая и гетероспецифическая регуляция рецепторов. При гомоспецифической регуляции лиганд вызывает интернализацию своего собственного рецептора (рецепторы инсулина и эпидермального фактора роста). При гетероспецифической регуляции лиганд, связываясь со своими собственными рецепторами, вызывает множественное фосфорилирование рецепторов и тем самым способствует их быстрой интернализации. Данные эффекты обычно обратимы, если иптериализовшшые гетерологичные рецепторы не подвергаются внутриклеточной деградации.
Важно, что фосфорилирование рецепторов тесно связано с метаболическими процессами (митогенезом) в норме и при патологических состояниях. Так, некоторые онкогенные белки имеют структурное сходство с рецепторами для ростковых факторов. Оказалось, что эфиры форбола, индуцируя фосфорилирование онкогенного белка erb В в эритробластах вирустрапсформированных клеток, подавляют экспрессию фенотипа и злокачествещю-перерожденпых клетках. Таким образом, изучение механизмов фосфорилировать рецепторов и рецептороподобных белков может помочь пе только
610
Гормридльный. ррюттор
Транстартьвя снста»э Р«ц,епт©р-длп коио* и м>?дбол*гм модулятор
Рис.. 115- Обобщенная модель рецепторных механизмов реализации действия на клетку физиологически активных веществ.
Штриховыми линиями показано сопряжение рецепторов с различными структурно-функциональными образованиями клетки. БПГ—белково-пептидный гормон; СГ — стероидный гормон; ЦРСГ — цитозольный рецептор стероидных гормонов; Т4 — тироксин: Т,— трийодтиронин; ТСБЦ — тироксинсвязываю-щий белок цитоплазмы; РТ3—ядерный рецептор трийодтиронина.
понять различные аспекты динамической биохимии рецепторов, но и приведет к открытию новых путей в лечении онкологических заболеваний.
В обобщенном виде модель функционирования известных в настоящее время рецепторных механизмов представлена на рис. 115. Физиологически активное вещество реализует свой эффект через взаимодействие с рецептором, который может быть расположен па поверхности клетки, или в одном или нескольких участках внутри нее. В ответ на возбуждение рецептора изменяется функция многих клеточных органелл и метаболических систем. Эти изменения возникают вследствие модификации концентрации внутриклеточных ионов, циклических нуклеотидов, метаболизма липидов, аллостерических эффектов и др.
В результате могут произойти сокращение, биосинтез, измениться мембранный потенциал, секреторный процесс, рост и размножение клетки и др. Рецепторы нейромедиаторов опосредуют, как правило, скоропреходящие эффекты; они локализованы на плазматической мембране, а рецепторы большинства гормонов опосредуют
39*
611
как скоропроходящие, так и продолжительные (трофические) эффекты (в этом случае рецепторы локализованы как на плазматической мембране, так и внутри клетки).
Итак, подводя итоги анализу различных аспектов рецептороло-гии для физиологически активных веществ, можно сделать некоторые общие выводы.
1. Рецепторы для физиологически активных веществ — это генетически детерминированные мобильные, лабильные, главным образом, белковые структуры, функции которых заключаются в «узнавании» химического сигнала и последующей его трансформации в адекватный ответ клетки. Другими словами, эти рецепторы представляют собой материальные субстраты чувствительности и реактивности клеток.
2. У животных отсутствуют клетки, не содержащие рецепторы к физиологически активным веществам.
Главная функция этих рецепторов, несомненно, приспособительная.
Рецепторные механизмы и есть та сущность наблюдаемых в физиологии и патологии процессов, которые, но словам И.В. Давыдовского, упираются в «дно жизни», и только с помощью них можно понять патогенез многих заболеваний.
На ранних этапах онтогенеза существует критический период установления лигаид-реценториых взаимоотношений (своего рода гормональный импринтинг), который определяет величину чувствительности определенной клетки к данному лиганду в течение всего жизненного цикла.
3. На определенном этапе эволюции путем отбора закрепляются взаимоотношения первоначально цеспецифических мембранных структур (или структур, возникших в результате мутации) с низкомолекулярными химическими молекулами, присутствующими во внеклеточной среде.
4. На ранних стадиях филогенеза у одноклеточных организмов отсутствуют мембранные рецепторы, характерные для позвоночных, хотя на плазматических мембранах простейших обнаруживаются структуры, с которыми взаимодействуют гормоны позвоночных и которые опосредуют их эффект.
5. Как правило, в перинатальном периоде увеличение концентрации гормона приводит к увеличению числа соответствующих рецепторов (эффект сохраняется всю жизнь), а в постнатальпом периоде повышение концентрации гормона сопровождается снижением числа рецепторов (эффект исчезает при нормализации концентрации гормона).
612
6. Первоначально в филогенезе возникли мембранные рецепторы для физиологически активных веществ, играющие приспособительную (адаптационную) роль (быстрое изменение функции клетки, длящееся несколько секунд или минут), а затем цитозольные рецепторы (медленное изменение функции клетки, которое длится несколько часов).
7. Изменения чувствительности определенных (главным образом гипоталамических) клеток позвоночных к физиологически активным веществам, обусловленные модификацией числа рецепторов, определяют рост, развитие и продолжительность их жизни.
8. В патогенезе большинства заболеваний, среди которых главные болезни века — сердечно-сосудистые и онкологические заболевания, существенную роль играют нарушения лиганд-ренентор-по-эффекторных взаимоотношений.
По нашему мнению, эти положения отражают основные достижения современной рененторологии и могут служить базой методологии будущих исследований по вопросам функционирования рецепторов в норме и патологии, а также поиска путей нормализации нарушений лиганд-реценторпо-эффекторных механизмов при тех или иных заболеваниях.
В будущем мы ожидаем появление сведений о новых, еще неизвестных, рецепторов к эндогенным и экзогенным лигандам, что наряду с всесторонними исследованиями уже известных рецепторов физиологически активных веществ, несомненно, позволит решить многие теоретические и практические медико-биологические проблемы.
По нашему мнению дальнейшее развитие реценторологии, как междисциплинарной науки, определяющее прогресс в области направленного поиска высокоиабирательных лекарствешгых веществ, обусловлено успехами в решении следующих вопросов:
1. Выяснение пространствениой структуры рецепторных систем и широкое внедрение компьютерных технологий для конструирования низкомолекулярных веществ с высокой селективностью действия.
2. Разработка методов анализа индивидуальных особенностей функционирования рецепторных систем с целью поиска возможностей применения генной терапии для исправления возникающих мутаций генов рецепторов.
3. Определение возрастных изменений рецепторных систем, а также годовых и дневных ритмов функциональной активности
613
рецепторов, что позволит оптимизировать проводимую фармакотерапию.
4. Выяснение химической природы гетерогенности рецепторов и характера взаимодействия между рецепторными системами различных типов с целью разработки комплексного подхода коррекции возникающих патологических изменений в клетках, тканях и органах.
5. Реконструкция рецепторов (создание молекулярных моделей взаимосвязанных частей рецепторных систем) для скрининга новых высокоэффективных лекарственных веществ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный кальций. — М.: Наука, 1994. — 295 с.
2. Бурлакова Е.Б., Кондратов А.А., Худяков И.В. Воздействие химических агентов в сверхмалых дозах па биологические объекты. — Известия АН СССР, сер.Биол., 1990, № 2, с. 184 — 193.
3. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г, Биокииетика. Практический курс. — М., Фаир-лресс, 1999. С. — 720 с.
4. Годухип О.В. Модуляция синаптической передачи в мозге. М.: Наука, 1987.
5. Гусель В.А., Хаджидас А.К., Цибульский Э.К. // Вопросы охраны материнства и детства. — 1990, N1, с. 17 — 20.
6. Дамбинова С.А. Нейрорецепторы глутамата. — Л., 1989.
7. Зайцев С.В., Ярыгин К.Н., Варфоломеев С.Д. Наркомания. Нейронентнд-морфииовые рецепторы. — М.: Изд-во МГУ, 1993, с. 52 66.
8. Зозуля А.А., Пшеничкин С.Ф. Опиоиды и иммунитет. — Итоги науки и техн. ВИНИТИ, сер. Иммунология, 1990, т. 25, с. 48 -120.
9. Катков Е.В., Сапожков А.В. // Фармакология и токсикология. — 1988, N7, с. 41 — 43.
10. Ларионов Н.П., Кулешов В.Ф., Максимов К.Н. и соавт. // Вопросы кардиологии: Тез. докладов 1 съезда карди-ол. Казахстана, Алма-Ата, 1991, т. 2, Алма-Ата, 1991, с. 140.
11. Малая Л.Т., Машковский М.Д., Абсава Р.И. и соавт. / / Клиническая медицина. — 1988, т. 66, N4, с. 22 — 27.
12. Петров В.И., Пиотровский Л.Б., Григорьев И.А. Возбуждающие аминокислоты. — Волгоград, ВМА, 1997, 168 с.
13. Полова Н.К., Маркель А.Л. //Фармакология и токсикология. — 1991, т.54, N4.2, с.28—30.
14. Раевский К.С. // Сб. тез. 1 съезда Рос. науч, об-ва фармакологов, Волгоград, 9—13 окт. 1995. — М., 1995, с. 349.
15. Раевский К.С., Георгиев В.П. Медиаторные аминокислоты: нейрофармакологи веские и нейрохимические аспекты. - М., 1986.
16. С.Н.Шиганцов// Бюл. экснерим. биологии и медицины, 1996, N26, с.687 - 689.
17. Сазанов Л.А., Зайцев С.В. Действие сверхмалых доз
615
биологически активных веществ; общие закономерности, особенности и возможные механизмы. — Биохимия, 1992, т. 57, вып. 10, с. 1443-1460.
18. Сергеев П.В., Духанин А.С., Шимановский Н.Л. Бюл.экс-нер.биол. и мед., 1995, № 10, с. 342—348.
19. Сергеев П.В., Шимановский Н.А. рецепторы физиологически активных веществ. — М., 1987.
20. Сергеева М.Г., Гончар М.В., Намгаладзе Д.А., Мевх А.Т., Варфоломеев С.Д. Простатландип-Н-сиитаза макрофагов мыши: ингибирующее и активирующее действие бруфена. — Биохимия, 1997, т. 62, вып. 3, с. 316 — 322.
21. Сутягин П.В., Чернова И.А., КнязеваЛ.А., Пылаев А.С. // Кардиология, 1995, N5, с. 88— 93.
22. Abbott W.M., Strange P.G. // Biosci. Repts., 1995, v. 5, N4, p. 303- 308.
23. Adham N., Kao H.T., Schecter L.E., Bard J., Olsen M., Urquhart D., Durkin M.,Hartig P.R.,Weinshank R. L., Branchek T.A.//Proc. Natl. Acad. Sci.—USA. — 1993. — Jun.15, vol.90, N2, p.408-412.
24. Aguayo L.G., Grossie J. //J. Pharmacol, and Exp. Ther., 1994, v. 269, N2, p. 503- 508.
25. Alexander G.E., Crutcher M.D. // Trends Neurosci., 1990, vol. 13, p. 266-271.
26. Amalric M., Merhow M., Polis J. et al. // Psychopharmacol., 1990, v. 101, suppl., p. 3.
27. Amenta F., Gallo P., Rossodivita A., Ricci A. // Naunyn-Schmiedebergs. Arch. Pharmacol., 1993, v. 347, N2, p. 147— 154.
28. Amenta F., Ricci A. // Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol., 1990, v. 342,N6, p. 719- 721.
29. Andersen P.H., Gronvald F.C., Hohlweg R. et al. // Eur. J. Pharmacol., 1992,v. 219,Nl,p. 45— 52.
30. Anderson J.J., Kuo S., Chase T.N., Engber T.M, // J. Pharmacol, and Exp. Ther., 1994, v. 269, N3, p. 1144— 1151.
31. Apud J.A., Cjrayson D.R., Erausquin E., De Costa E. // Neu ropharmacol., 1992, vol.31, Nl, p.l — 8.
32. Augustin L.B., Felsheim R.F., Min B.H., Fuchs S.M., Fuchs J.A., Loh H.H. Genomic structure of the mouse 8-opioid receptor.— Biochem. Biophys. Res. Commun., 1995, v. 207, p. 111-119.
33. Baamonde A., Dauge V., Ruiz-Gayo M., Fulga I.G.,
616
Turcaud S., Fou rnie-Zaluski M.C., Roques B.P. Antidepressant-like effects of endogenous enkephalins protected by systemic RB 101 are mediated by opioid delta and dophamine DI receptor stimulation. — Eur.J.Pharmacol.,1992,v. 216,p. 157 — 166.
34. Balmforth A.J., Bail S.Q., Freshney R.L. et al. / / J. Neurochem, 1986,v. 47,N3,p. 715— 719.
35. Baran H., Loscher W., Mevissen M. // Brain Res.,1994, vol. 652, p. 195-200.
36. Barthelmebs M., Krieger J.F., Grima M., 2mbs. J. L. // Fundam. and Clin. Pharmacol., 1991, v. 5, N5, p. 454.
37. Baskys A., Malenka R.C. //J. Physiol. (Lond), 1991, vol. 444, p. 687-701.
38. Baumgardner S.B., Condrea H., Daane TA., Dorsey JH., Jurow UN., Shively JP., Wachsman №., Wharton LR. and Zibel MJ. Replacement oestrogen therapy for menopausal vasomotor flushes. Comparison of quinestrol and conjugated oestrogens. Obstet. Gynecol., 1978; 51, 4: 445.
39. Bennett G.J. / Textbook of Pain. / Eds. P. D. Wall, R. Melzack. — Edinburgh, 1994b, p. 201—222,
40. Benten W.R.M., Lieberherr M., Giese G., Wrehlke C., Stamm O., Sekeris C.E., Mossmann H., Wunderlich F. Unconventional testosterone receptors in plasma membranes of T cells. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes, 106 (1998) A 45 -46.
41. Bergson C., Mrzljak H., Lidow M.S., Coldman-Rakic P.S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, v. 92, N8, p. 3468- 3472.
42. Berkowitz A., Erickson R., Zabko-Potapovich B., Ohestein E.H. / Dopamine Receptors Agonist. — New York, London, 1984, p. 195- 208.
43. Berta B.J., Jill J.C., Nugent M. et al.// Anesthesiology, 1989, v. 71, N3A (Suppl), p. 562.
44. Bertorello A.M., Hopflield J.F., Aperia A., Greengard P. / / Nature, 1990, v. 347,N6291,p, 386 - 388.
45. Bevan D.R. Newer neuromuscular blocking agents. Pharmacol. Toxicol., 1994, 74; 3 — 9.
46. Beyer C. The role of estrogens for developing dopamine neurons; non-classical signalling mechanisms. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes, 106 (1998) A47.
47. Bitonti A.J., Dumont J.A., Salituro F.G. et al., 1996, vol.58, p. 21—30.
48. Bonhaus D.W., Bach C., De Souza A., Salazar F.H., Matsuoka
617
B.D., Zuppan P., Chan H.W., Eglen R.M. //Br.J. —Pharmacol., 1995.-Jun., vol.115.N4, p.622-8.
49. Borski R., Hyde G., Fruchtman S. Cortisol rapidly reduces prolactin release through a nongenomic, membrane-associated action involving the calcium and cAMP messenger systems: the fish PRL cell model system. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes, 106 (1998) A53 — 54.
50. Boucher M., Dubray C., Duchene M.P. // Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol., 1984, v. 326, N2, p. 148— 154.
51. Bourgoin S., Benoliel J.J., Collin E., Mauborgne A., Pohl A., Hamon M., Cesselin F. Opioidergic control of the spinal release of neuropeptides: possible significance for the analgetic effects of opioids.— Fundam. Clin. Pharmacol., 1994, v. 8, p. 307-310.
52. Bradbu ry M .J., Akana S.F., Dal I man n M.TF. Endocrinology, 1994, vol.134, p.1286— 1296.
53. Bradley DD, Wingerd J, Petitti DB, Krauss RM, Ramcharan S. Serum high-density-1 i poprotein cholesterol in women using oral contraceptives, oestrogens and progestins. NewEngl. J. Med., 1978; 299: 17.
54. Bredbergg E., Paalzow L.K. //J. Pharmacol, and Exp. Then, 1991, v. 258, N3, p. 1055- 1060.
55. Briggs M and Briggs M. A randomized study of the metabolic effects of four low-estragen oral contraceptives,!. Results after 6 cycles. Contraception, 1981; 23: 463.
56. Brinkman A.O., Jenster G., Ris-Stralpers C./ et al., J.Steroid.Biochem.Molec.Biol., 1995, vol.53, p.443—448.
57. Broccardo M., Improta G. Antidiarrheal and colonic anti propulsive effects of spinal and supraspinal administration of the natural 8-opioid receptor agonist, [D — Ala^Jdeltorphin II, in the rat— Eur.J. Pharmacol., 1992, v. 218, p. 69—73.
58. Brown I. // Arch. Int. Pharmacodyn. et Ther., 1990, N308, p. 47- 62.
59. Bruning T.A., Hendrikc M.G.C., Chang P.C., Kuypers E.A.P. and van Zwieten P.A. In vivo characterization of vasodilating muscarinic-receptor subtypes in humans. Circ. Rec., 1994, 74:912 — 919.
60. Btguin P., Beggah A., Cotecchia S., Geering K.// AmerJ.Physiol., 1996, v.39, p. 131 —137.
61. Buzas B., Toht G., Cavagnero S., Hruby V.J., Borsodi A.
618
Synthesis and binding characteristics of the highly delta specific new triated opioid peptid (3H]deltorphin П.— Life Sci., 1992, v. 50, p. PL75-PL78.
62. Campbell 5, Whitehead M. Oestrogen therapy and the menopausal syndrome. Clin. Obstet. Gynecol., 1977; 4: 31 — 47.
63. Carruba G., Farruggio R., Miceli M.D., Di Falco M., Bellavia V., Castagnetta L. Estrogen regulation of cAMR levels and growth of cultured human prostate cancer cells. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes, 106 (1998) A43.
64. Casagrande C. // Herz., 1991, v. 16, N2, p. 102- 115.
65. Castro S., Strange P.G. // Brit. J. Pharmacol., 1992, v.
106, Suppl., p. 55 P.
66. Cavero I., Thiry C., PratzJ., Lawson K. // Clin, and Exp. Hypertens., 1987, v. 9, N5 — 6, p. 931 — 952.
67. Cereska K.Z., Zharkovsky A.M. // Уч. зап. Тарт, ун-та., 1988, N839, р. 55 - 69.
68. Chapman V., Dickenson А.Н. // Brit. J. Pharmacol., 1992, vol. 105, p. 138P.
69. Chen Q.X., Wong R.K. //J. Physiol., Lond., 1995, vol. 482, p. 353 - 362.
70. Cheng T.T.,Tsai T.T. // Neuroreceptor. Meeh. Proc. 3"* Int. Symp. Neurotransmitt. Receptors,Hiroshima,Febr. 5 — 8,1990.— New York, London., 1991, p. 237- 240.
71. Cboi D.S., Birraux G., Launay J.M., Maroteaux L. //FEBS-Lett. 1944. —Oct.3., vol.352, N3, p.393 - 9.
72. Chuang L.F., ChuangT.K., K.F. Killiam, Jr.; Chuang A.j., Kung H., Yu L., Chuang R.Y. Delta opioid receptor gene expression in lymphocytes. — Biochem. Biophys. Res. Comm., 1994. Aug. 15, v. 202, N3,p. 1291-1299.
73. Cichini G., Placheta P., Sjoger E.A. // Naunyn-Schiniedebeig s Arch, Pharmacol., 1987, v. 335, Nl, p. 28- 31.
74. Claustre Yves, Rouguier L., Serrano A., Benavides J., Scatton //Eur.J. Pharmacol., 1991, vol.204,Nl, p.71-77.
75. Coan E.J., Collingridge G.L. //J. Physiol. Lond., 1988, vol. 406, p. 71.
76. Cohen M.L., Bloomquist W.M., Gidda J.S., LacefieldW./ /J.PharmacoI. and Exp.Ther., 1990, vol.254, Nl, p.350 — 355.
77. Cooper D.M.F., Bier-Laning C.M., Halford M.K. et al. // Mol. Pharmacol., 1986,v. 29, N2, p. 113- 119.
619
78. Cory R.N., Osman R., Maayani S. //J.Pharmacol, and Exp. Ther.,1986, vol.236, Ni, p.48 - 54.
79. Cory R.N., R. Bruno, BillesG., FritzS., SalestreM.N., Bockaert J.//J. Pharmacol, and Exp.Ther., 1987, vol.241, Nl, p.258-267.
80. Costal! B., Naylor R.J.//Arzneim. Forsch., 1992, vol.42, N2A, p. 246—249.
81. Costall B., Naylor R.J.//Int.Clin Psychopharmacol., 1993, Nov.,vol.8., Suppl.2, p.ll —8.
82. Coudert P., Rubai C., Bastide №., Maihuret R., Chopineau J. // Actual, pharm., 1993, N315, p.67— 71.
83. Creese I. // Nervenkeilbunde., 1983, v. 2, N2, p. 88 — 93.
84. Crona N, Silfverstolpe G, Samsioe G. A double-blind crossover study on the effects of ORG OD14 compared to oestradiol valerate and placebo on lipid and carbohydrate metabolism in oophoretomized women. Acta Endocrinol., 1983; 102: 451 — 455.
85. Curtis D.R.,Watkins J. C. // J. Neurochem.,1960, vol. 6, p.117-141.
86. Cusack B., Nelson A. and Richelson E. Binding of antidepressants to human brain receptors: focus on newer generation compounds. Psychopharmacology. 1994, 114: 559—565.
87. CushingD..!., Cohen M.L.//J.Pharmacol, and Exp.Ther., 1993, vol.264,Nl,p.193 - 200.
88. Dabire H.,Bayjou R.,Chaguche-Teyara P.,Fournier B.,Laubie M., Schmitt H.//Fundam.and Clin.Pharmacol.,1991, vol.5, N9, p. 825.
89. Dabire H., Bayjou R., Chaguche-Teyara P., Fournier B.,De Nanteuil G., Laubie M., Safar M.,Schmitt H. //Eur. J.Pharmacol., 1991, Oct.15, vol.203.N2, p.323 - 324.
90. Dabire H.,Cherqui C., Fournier B., Schmitt H.// Eur. J. Pharmacol., 1988, vol. 150, Nl-2, p.143-148.
91. DaleN., Roberts A. //J. Physiol. (Loud.)., 1991, vol. 363, p. 35-59.
92. De Jonge A., Smit G., Thoolen M.J.C. et al. // Brit. J. Pharmacol., 1984, v. 81 (Proc. Suppl.), N19, p. 210 - 213.
93. De Ninno M.P., Schoenleber R., Mac Kenzie R. et al. / / Eur. J. Pharmacol., 1991,v. 199, N2, p. 209- 219.
94. De Vries D.J., Beart P.M. // Mol. Brain. Res., 1986, v. t,Nl, p. 29- 35.
95. Demchyshyn L.L, Sogamori K.S., Lee F.J. //J. Biol. Chem., 1995, v. 270, N8, p. 4005- 4012.
620
96. Derkach V., Surprenant A., North R.A.//Nature., 1989, vol.339, N6227, p.706-709.
97. Dhawan B.N., Cesselin F., Ragnubir R., Reisine R., Bradley P.B., Portoghese P.S., Hamon M. International union of pharmacology.12. Classification of opioid receptors. — Pharm. Reviews., 1996, v. 48, N.4, p.567-592.
98. Diouf O., Depreux P., Lesieur D., Caignard D.H., Guardiola B. //J.pharm.belg., 1994, vol.49, N3, p.267.
99. Dobbe A., Girdlestone D., Piot O., Gueremy C., Menager J., Zindel J.L., Blanchard J.C. // Brit. J.Pharmacol., 1992, vol.105, Nl, p.27-36.
100. Docherty Jomes R. //Arch.Pharmacol., 1983, vol.337, Nl, p.1-8.
101. Dumuis A., Bouhelal R., Sebben M., Cory R., Bochaert J. //Mol.Pharmacol., 1988, vol.34, N6, p.880 — 887.
102. Dumuis A., Selten M., Bochaert J. //Mol.Pharmacology, 1988, vol.33, N2, p.178-186.
103. Dupin S., Tafani J.A.M., Mazarguil H., Zajac J.M. [12iI][D-Ala2]deltorphin-I: a high affinity, delta selective opioid receptor ligand.-Peptides, 1991, v. 12, p.825 —830.
104. Dyck L.J. // Neurochem. Int., 1990, v. 17, Nl, p. 77 — 82.
105. El-Etr M., Akwa Y., Baulieu E.E., Schumacher M. Rapid effects of neuroste.oids: modulation of GnRH release by allopregnanolone, progesterone and pregnenolone sulfate in GT1 neurons. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes, 106 (1998) A49-50.
106. Endol M. //Jap. J. Pharmacol., 1983, v. 33, N4, p. 897-899.
107. Evans C.J., Keith Jr., D.E., Morrison H., Magendzo K., Adwards R.H. Cloning of delta opioid receptors by functional expression.— Sci.,1992, v. 258, p.1952—1955.
108. Exp. Ahlers S.T., Weissman B.A., Barrett J.E. // J. Pharmacol and Ther., 1992, vol.260, N2, p. 474 —480.
109. Fagg G.E. // Trends Neurosci., 1985, vol. 8, p. 207 — 210.
110. Fang L.F., Knapp R.J., Matsunaga T., Weber S.J., Davis T..Hruby V.J., Yamamura H.J. Synthesis of [D-Ala2,4’-125I-Phe3, Glu4] del toph in and characterization of its 8-opioid receptor binding properties.— Life Sci., 1992, v. 51, p. PL189 —PL193.
621
111. Farish E., Fletcher CD,, Hart DM., Lindsay R., Leggate J. ORG OD14: long-term effects on serum lipoproteins. Maturitas, 1984; 6: 297 - 299.
112. Fears R., Bowen W.P., Brown F. et al. // New. Trends. Clin. Neu ropharmacol., 1993, v. 7, N3, p. 126.
113. Ferreira de Almeida J.A., Pereira Leite L,, Cavallotti C. et al. // Eur. J. Pharmacol., 1993, v. 234, N2/3, p. 209— 214.
114. Fitzpatrick L.R., Lambert R.M., Pendley C.E., Martin G.E., Bostwick J.S., Bessner G.W., Airey J.E., Youssefyeh R., Pendleton R.G., Dechtor D.L. //J.Pharmacol, and Exp.Ther., 1990, vol.254, N2, p.450-455.
115. Forte P., Martin G., Linchsinger A. et al. // Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. Toxicol., 1993, v. 31, N 8, p. 404 — 406.
116. Fortin M., Degryse M., Petit F. et al. // Neuropharmacol., 1991,v. 30,N4,p. 409 — 412.
117. Foulon C., Kung M.P., Kung H.F. // J. Med. Chem., 1993, v. 36, N10, p. 1499- 1500.
118. Fox-Threlkeld J.A.E.T., Daniel E.E., Christinck F., Hruby V.J.,Cipris S.,Woskowska Z. Identification of mechanisms and sites of action of mu and delta receptor activation in the canine intestine.— J. Pharmacol. Exp. Ther., 1994, v. 268, p. 689 — 700.
119. Fransis G.S. // Clin. — Cardiol., 1995, v.18, N3 (Suppi), p.113- 116.
120. Freed W.J., Dillon-Carter O., Kleinman J. E. // Exper. Neurol, 1993, vol. 121, p. 48 — 56.
121. Freitas M. // Rev. Port. Cardiol., 1993, v. 12, N4 (Suppl.), p. 19-28, 7-8.
122. Freye E., Schnitzler M., Schenk G. Opioid-induced recpiratory depression and analgesia may be mediated by different subreceptors. — Pharm. Res,, 1991, v. 8, p. 196—199.
123. Friedman D.J., Krause D.N., Piper D.S. //J. Pharmacol. and Exp. Ther., 1992, v. 260, N2, p. 568— 575.
124. Fukuda K., Kato S., Mori K., Nishi M., Takeshima H. Primary structures and expression from cDNAs of rat opioid receptor form 8- and p-subtipes. — FEBS Lett., 1993, v. 327, p. 311-314.
125. Fuller R.W., Moddy H.D.//Neuroendocrinology, 1990, vol.52, N2, p.206—211.
126. Gainetdinov R.R., Sotnkova T.D., Grecova T.V. / Abstr. 8th Sardinian Conf. Neurosci: Anxiety and Depress.— Behav. Pharmacol., 1995, v. 6, N 1 (Suppl.), p. 74.
622
127. Gambrell Jr RD. The prevention of endometrial cancer post-menopausal women with progestagens. Maturitas, 1978| 107.
128. Gambrell Jr RD. The role of hormones in the etiolfl of breast and endometrial cancer. Acta Obstet. Gynecol. Scftfl 1979; (suppl.) 88 73. j
129. Gambrell RD. Jr. Estrogens, progestagens and endd trial cancer. J. Reprod. Med., 1977; 18: 301. "3
130. Ganguly P.K., Mukherjee K., Chen Y. / / Afl J. Physiol., 1992, v. 262, N 5 (p+t), p. E569 - 573. {I
131. Garty H., Peterson-Yantorno K., Asher C. et al. АЛЫ
Physiol., 1994, vol.266, p.108-116. J
132. Gaveriaux C., Peluso J., Simonin F., Laforet J., Ktartj Identification of kappa- and delta-opioid receptor tranral in immune cells. — FEBS Lett, 1995. Aug. 7, v. 369, N, Я p. 272 - 276. 'Д
133. Gehlert D.R., Gackenheimer S.L., Seiman P., ScHfl // Eur. J. Pharmacol., 1992, v. 211, N2, p. 189— 194. Д
134. Giannotti B., Haneke ., Eczema., England, 74 p, 1999
135. Gillis R., Hill K., Kirby J.S., Quest J., Hamosh P., Ntfl W., Kellar K. //J.Pharmacol. and Exp.Ther., 1989, vol. 2481 p.851-857. J
136. Giros B. // Pathol. Biol., 1991, v. 39, N4, p. 252— Я
137. Giros B., Sokoloff P., Martres M.P., Schwartz J.C, /
Eur. J. Pharmacol., 1990, v. 183, N5, p. 1619.
138. Gleeson S., Barrett J.E., Weissman B.A., Seggel Й //Eur.J. Pharmacol., 1992, vol. 229, N2 — 3, p.109 — 115,
139. Goiny M., Guix T., Herrera M.M., Ungerstedt M, , J. Neurosci. Meth., 1989,v. 29, М3, p. 290. i
140. Goldberg L.L. Dopamine Receptor Agonists. — New Y( London, 1984, p. 291— 301.
141. Goss J.R., Kelly A.B., Johnson S.A., Morgan D.G, ( Life Sci., 1991, v. 48, N10, p. 1015- 1022. 1
142. Gradin K., Hedner T., Persson B. |
J.N’eural.Transm.Gen.Sect., 1991, vol.83, N’3, p. 227 — 233. j
143. Graham S.H., Chen J., Sharp F.R. et al. //J. CerJ Blood Flow & Metabolism., 1993, vol. 13, p. 88 — 97. J
144. Granguly P.K., Mukherjee K., Chen Y, // AM Physiol., 1992, v. 262, N5 (Pt 1), p. 569- 573. ]
145. Grenader A., Healy D.P. // Brit. J.Pharmacol., Il v. 106, N2, p. 229- 230. I
623
146, Guillayment G. //J.pharm.belg., 1994, vol.49, N3, p.216— 220.
147. Gumusel B., Hao Q., Hyman A., Chang J.K., Kapusta D.R., Lippton H. Nociceptin: an endogenous agonist for central opioid likel (ORL1) receptors possesses systemic vasorelaxant properties. — Life Sci, 1997, v. 60. N8, PL141 —145.
148. Gunther A., Hesk M., Schmidt B.M.W., Falkenstein E., Wehling M., Christ M. Rapid aldosterone - induced increases of cAMP in vascular smooth muscle cells. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes, 106 (1998) Л51—52.
149. Hadjiconstantinov M., Weihmuller F., Neff N.H. // Eur. J. Pharmacol., 1989,v. 168,N2,p. 261— 264.
150. Hammond CB, Jelovsek FR, Lee G, Creasman WT, Parker RT. Effects of long-term oestrogen replacement therapy, IL Neoplasia. Am. J. Obstet. Gynecol., 1979; 133; 537.
151, Harper N.J.N. Neuromuscular blockage: measurement and monitoring. In, Applied Neuromuscular Pharmacology. (Pollard B.J., ed.) Oxford Universiti Press, Oxford, 1994, p. 319 — 344.
152. Hartig P.R. //Trends Pharmacol.Sci., 1989, vol.10, N2, p.64 —69.
153. Hayashi Y., Momigama A., Takahashi T. et al. / / Nature., 1993, vol. 366, p. 687 — 690.
154. Hegarty J., Harvey B. Nongenomic aldosterone effects on intracellular calcium in cultured human sweat gland epithelial cells. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes, 106 (1998) Л51.
155. Heike C.J., Thor K.B., Phillips E.T. //J.Pharmacol. Exp.Ther., 1991. —Dec., vol.259, N3, p. 1335 —1343.
156. Herdon H., Strupish J., Nahorski S.R. // Eur. J. Pharmacol., 1987, v. 138, Nl, p. 69- 76.
157. Herve D., Trovero F., Blanc G. et al. // Neuroscience., 1992, v. 46, N3, p. 687- 700.
158. Herz A Endogenous opioid systems and alcohol addiction. Psychopharmacology (Berl), 1997 Jan, 129:2, 99—111.
159. Hilditch A., Drew G.M., Naylor R.J. // Eur. J. Pharmacol., 1984., v. 97, N3— 4, p. 333— 334.
160. Hiller J.M, Fan L.Q., Simon E.J. Autoradiographic comparison of [3H]DADLE and [3H]DSLET binding: evidence for distinct delta 1 and delta 2 opioid receptor populations in rat brain. — Brain Research., 1996, v. 719, p. 85 — 95.
624
161. HogbergT., Strom P., Hall H. et al. // Acta Pharmacol. Nord, 1990, v. 2, N 1, p. 53 - 60.
162. Hollenberg N.K. //Annu.Rev.Pharmacol.and Toxicol. — vol.28. — Palo Alto Calif., 1988, p,44 —59.
163. Hope P.J., Fleetwood-Walker S.M., Mitchell R. Distinct antinonioceptive actions mediated by different opioids receptors in the region of lamina I and laminae Ш—V of the dorsal horn of the rat.— Br.J.Pharmacol., 1990, v. 101, p. 477 — 483.
164. Horn A.S., Tepper R.., Kebabian J.W. et al. // Eur. J. Pharmacol., 1984, v. 99, N 1, p. 125 — 126.
165. Horn P.T., Kohli J.D, // Eur. J. Pharmacol., 1991, v. 197, N2- 3, p. 125- 130.
166. Horwitz K.B., Tung L., Takimoto G.S. In The Endometrium as a Target for Contraception (Springer), 1997, p. 1 -20.
167. Hoshino Y., Obara H., Ywai S. // Life Sci., 1986, v. 39, N26, p. 2525- 2531.
168. Hoyer D. //Naunyn.Schmiedcrberge., 1969, vol.339.Suppl, p.96.
169. Hoyer D., Waeber C., Schoeffer P., Palacios J.M., Dravid A. //Naunyn-Schmiederbergs Arch. Pharmacol., 1989, vol.339, N3, p.252-288.
170. Hunter J.M. Muscle relaxants in renal disease. Acta Anaesthesiol Scand., 1994, 102 Suppl.: 2 — 5.
171. Hutson P.H., Biskerdike M.J., Smith S.M., Middlemiss D.N.//Eur. J.Pharmacol., 1990, vol. 183, N5, p.1967—1968.
17-2 . Inaba K., Morimoto Y., Fukuda I., Setoguchi M. // Ntppon.Yakurigaki.Zasshi. —1991. — Oct., vol.98, N4, p.293 —299.
173; Iversen L. // Neu retransmission., 1994, vol. 10, p. 1—4.
174. Izenwasser S., Cote T.E, // J. Neurochem., 1995, v. 64, N4, p. 1614- 1621.
175. Jarvie K.R., Niznik H.B., Seeman P. // Mol. Pharmacol., 1988, v. 34, N2, p. 91-97.
176. Jiang Q., Takemori A.E., Sultana M., Portoghese P.S., Bowen Mosberg H.I., Porreca F. Differential antagonism of opioid antinociception by [D-Ala2,Leu5,Cys®]enkephalin and naltrindol 5'-cyanate: evidence for delta-receptor subtipes.— J.Pharmacol. Exp.Ther., 1991, v. 265, p. 1069 — 1075.
177. Jick H„ Watkins RN., Hunter JR., Dinan В J., Madsen S., Rothman KJ., Walker AM. Replacement estrogens and endometrial cancer. New Engl. J. Med., 1979; 300: 218.
40.3a*.227
625
178. Johansson A.M., Nord vail G., Hacksell W. // J. Pharm. and Pharmacol., 1991, v. 43, N7, p. 481- 485.
179. Johnson Е.Л., Tsou C.E., Harrison-Shahan G., Azzaro AJ. // Neuropharmacol., 1992, v. 31,Nl, p. 95— 101.
180. Johnston D., Williams S., Jaffe D. et al. // Annu. Rev. Physiol., 1992, vol. 54, p. 489 — 505.
181. Jonge A., Smit G., Thoolen M.J.C. et al. / /J. Pharmacol., 1984, v. 81, N19, p. 130 - 139.
182. Kanteman R.J., Mahan L., Briley E.M. et al. // Mol. Pharmacol., 1991, v. 39, N3, p. 364- 369.
183. Karschin A., Ho B.Y., Labarca C., Elroy S.O., Moss B., Davidson N., Lester H.A. //Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,1991, Jul.l, vol.88, N13, p.5694-8.
184. Kaumann A.J., Sanders L., Brown A.M., Murray K.J., Brown M.J. // Naunyn. Schmiederbergs Arch.Pharmacol., 1991. — Aug., vol.344, N2, p.150 —9.
185. Kieffer B.L., Befort K., Gavriaux-Ruff C., Hirth C.G. The 8-opioid receptor: isolation of a cDNA by expression cloning and pharmacological characterization.— Proc .Nat I. Acad. Sci. US A, 1992, v. 82, p. 12048-12052.
186. Kimmig R. // Arzneimitteltherapic., 1995, v. 13, N 8, p. 375 - 381.
187. Knapp R.J., Malatynska E., Fang L., Li X., Babin E., Santoro G., Varga E.V., Hruby V.J., Roeske W.R. Identification of a human delta opioid receptor: cloning and expression.— Life Sci., 1994, v. 54. PL463-PL469.
188. Kohli J.D., Horn P.T., Glock D. et al. // Eur. J.PharmacoL, 1993, v. 235, Nl, p. 31- 35.
189. Kollar A., Kenesi V., Jahasz-Nagy A. // Acta. Chir. Hing., 1991, v. 92, N3, p. 237- 244.
190. Koshikawa N.,Mori E.,Maruyama Y. et al. // Eur. J. Pharmacol., 1990, v. 178, N2, p. 233- 237.
191. Kropf W., Kuschinsky K. // Neuropharmacol., 1991, v. 39, N 9, p. 953 - 960.
192. Kujacie M., Sensson K., Lofberg L., Carlsson A. // J. Neurol. Transmiss. Gen. Sec., 1991, v. 84,N3, p. 195- 209.
193. Kurata K., Shibata K. // Neurosci. Zeft., 1991, v. 133, Nl, p. 77-80.
194. Lai J., Bilsky E.J., Porreca F. Treatment with anticense oligodeoxy nucleotide to a conserved sequence of opioid receptors inhibits antinociceptive effects of delta subtipe selective
626
ligands. — J. Recep. Signal Transduct. Res., 1995. Jan—Mar, v. 15, Nl—4, p. 643 — 650.
195. Lauritzen C. The management of the premenstrual and post-menopausal patient. In: Van Keep PA, Lauritzen C (eds). Frontiers of hormone research, vol. 2, Ageing and estrogens. Basal: Karger, 1973; 2 - 21.
196. Le Mellay V., Grosse B., Lieberherr M, PLC₽2, Gpy, PKCy and estrogen signaling. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes, 106 (1998) A39.
197. Leonhardt Sigrun, Herrick Davis K., Titeler M. // J.Neurochem., 1989, vol.53, N2, p.465 — 471.
198. Leysen J.G., Clerck F., Nem-megeers C.J.G., Van Nucten J.M. //Neuropharmacology, 1984, vol.23, N B12, p.1493 — 1501.
199. Lokhandwala M.F., Hegde S.S. // Am. J. Med., 1991, v. 90, N5B, p. 25- 95.
200. Lord J.A.H., Waterfield A.A., Hughes J. Endogenous opioid peptides: multiple agouists and receptors.— Nature,1997, v. 267, N. 5611, p. 495-499..
201. Lynch D.R., Lawrence J. J., Lenz S. et al. // J. Neurochem., 1995, vol. 64., p. 1462—1468.
202. Lyng F.M., Jones G.R., Rommerts F.F.G. A new membrane receptor for androgens? Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes, 106 (1998) A 46—47.
203. Lyo M.,Yamasaki T. // Progr. Neuro-Psychopharmacol. and Biol. Psychiat., 1993, v. 17, N3, p. 451 — 421.
204. Machelon V., Lieberherr M. Non genomik actions of progesterone, estradiol and androstenedione in pig granulosa cells. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes, 106 (1998) A 43.
205. MacIntyre P., Genimill J., Hogg K., Bhargava B., Hillis S. //93 rd Annu.Meet., Orlando, Fa, March 18 — 20, 1992: Abstr.Pap. (Amer.Soc.Clin.Pharmacol. and Ther. —( Norristo n(Pa) ], [1992], p.152.
206. Maekawa K,, Minami M., Yabuuchi К., Toya T., Katao Y., Hosoi Y., Onogy T., Saton M. In situ hybritization study of p-and к-opioid receptors mRNAs in the rat spinal cord and dorsal root ganglia.— Neurosci. Lett., 1994, v. 168, p. 97 — 100.
207. Maggio R., Barbier P., Bolpgnesi M.L., Minarini A., Tedeschi D. and Melchiorre C. Binding profile of the selective mus
627
«•
carinic receptor antagonist tripitramine. Eur. J. Pharmacol., 1994, 268: 459-462.
208. Malone H.M., Peters J.A., Lambert J.J. // Neuropeptides, 1991, vol. 19. Suppl, p.25—30.
209. Maloteaux J.M. //New Trends Clin.Neuropharmacol., 1988, vol.2, N2, p.89.
210. Mancini M., Ricci A., Amenta F. // Arch. Int. Pharmacdyn. et ther., 1991, v. 309.— Jan. —Febr., p. 147— 159.
211. Mansour A., Fox C.A., Akil H., Watson S.J. Opioid receptor mRNA expression in the rat CNS: anatomical and functional implication. —Trends NeuroscL, 1995, v. 18, p. 22 — 29.
212. Mansour A., Fox C.A., Burke S., Meng F., Thompson R.C., Akil H., Watson S.J. Mu, delta and kappa opioid receptor mRNA expression in the rat CNS: an in situ hybridization study. — J.Comp.Neurol., 1994, v. 350, p. 412 — 438.
213. Maricq A.V., Peterson A.S., Brake A.J., Myers R.M., Jutius D,//Science. —1991. — Oct. 18, vol.254, N5030, p.432 —437.
214. Massi M., Stefano M. //Pharmacol. Biochem. and Behav., 1987, vol.26,N2, p.333-340.
215. Matsuda T., Seong К. H., Aono H., Kanda T., Baba A., Inata H., Saito K.-I., Tobe A. //J. Pharmacobio. —Dyn., 1990, vol. 13, N6, p.125.
216. Maura G., Raccatanglita E., Raiteri N. //Naumun-Schmiedebergs Arch.Pharmacol., 1986, vol.334, N4, p.323 — 326.
217. Maus M., Vernier P., Valdenaire O. et al. // J. Receptor. Rec., 1993, v. 13, Nl - 4, p. 313- 328.
218. McCall R.B., Patel B.N., Harris L.T. //J. Pharmacol, and Exp. Ther., 1987, vol.242, N3, p.l 152- 1159.
219. McKenna, Dennis J., Peroutka S.J. //J.NeuroscL, 1989, vol.9, N10, p.3482-3490.
220. McMillan D.E., Hardwick W.C., de Costa B.R., Rice K.C // J. Pharmacol. Exper. Ther., 1991, vol. 258, p. 1015 — 1018.
221. Megens A.A.H.P., Awouters F.H.L., Meert T.F. et al. // J. Pharmacol, and Exp. Ther., 1992, v. 260, N 1, p. 146 — 159.
222. Meldrum B.S., Garthwaite J. // Trends Pharmacol. Sci., 1990, vol. 11, p. 379-387.
223. Meldrum, M. Williams. - NY, 1990, p. 519-524.
224. Memo M., Castelletti L., Missale C., Spano P.F. // Eur. J. Pharmacol., 1987., v. 139, N3, p. 362— 367.
225. Memo M., Pizzi M., Missale C. et al. // Pharmacol. Res., 1990, v. 22, (Suppl.), N2, p. 324.
628
226. Mestikawy S., Fargin A., Raymond J.R., Gozlan H., Hnatowich M. //Neurochem.Res.,1991, vol.l6,Nl, p.l —10.
227. Miller B. Delta opioid receptor expression is induced by concanavalin A in CD4+T-cells. — J. Immunol., 1996, v. 157, N. 12, p. 5324 — 5328.
228. Minami №., Maekawa K,, Yabuuchi K,, Satoh M. Double in situ hybritization study on co-existence of Ц-, 3- and к- opioid receptors mRNAs with preprotachykinin A mRNA in rat dorsal root ganglia. — Mol.Brain Res., 1995, v. 30, p. 203 — 210.
229. Minami M., Satoh M. Molecular biology of the opioid receptors: structures, functions and distributions.— Neurosci. Res., 1995, v. 23. Sept. N. 2, p. 121-145.
230, Miyata K., Kamato T.,Yamano M., Nishida T.R., Ohta M.,Takeda M., Honda K. //J.PharmacoL and Exp.Ther., 1991, vol.259, N2, p.815- 819.
231. Monje P., Vazgez G., Boland R. Rapid changes in uterine intracellular calcium induced by l?P-estradiol correlates to the presence of novel estrogen membrane binding proteins. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes, 106 (1998) A43.
232. Moran A., Velasco C., Martin M.L., San-Roman L.// Eur. J. Pharmacol., 1994. — Feb.3, vol.252, N2, p.l61 —166.
233. Motlola D.M., Brewster W.K., Cook L.L. et al. // J. Pharmacol, and Exp. Ther., 1992, v. 262, Nl, p. 383— 393.
234. Mukherjee K., Sahai A., Ganduly R.K. //J. Anton Pharmacol., 1994, v. 14, N4, p. 307— 316.
235. Nagahama S., Chen Y. F., Lindheimer M.D., Oparil S. // J. Pharmacol, and Exp. Ther., 1986, v. 239, N2, p. 426— 432.
236. Nakhla A.M., Rosner W., Endocrinology, 1996, vol. 137, p. 4126 - 4129.
237. Narita M.M., Zoguchi H., Kampine J.P., Tseng L.F. The effect of pretreatment with a delta 2-opioid receptor antisense oligo de oxy nucleotide on the recovery from acute antinociceptive tolerance to delta 2-opioid receptor agonist in the mouse spinal cord,— Bz.J.Pharmocol.,1997. Feb., v. 120, N4, p. 587 — 592.
238. Nestler EJ. Molecular mechanisms of opiate and cocaine addiction. Curr Opin Neurobiol,1997. Oct.,7:5,713 —9.
239. Neuromuscular Pharmacology. (Poilard B.J.,ed.) Oxford Universiti Press, Oxford, 1994, p, 69—84.
240. Neve K.A., Henningsen R.A., Bunzow J.R., Civelli O. // Mol. Pharmacol., 1989, v. 36, N3, p. 446— 451.
241. Nielsen E.B., Andersen P.H. // Eur. J. Pharmacol., 1992, v. 219, Nl, p. 35- 44.
629
242. Nishi A., Karasawa A., Yoshikawa S., Ishitani R. //Jap.J. Pharmacol., 1985, N4, p.411 — 417.
243. Nishimura J., Kanaidc H., Shogakiuchi Y., Nakamura M. //Eur. J. Pharmacol., 1987, vol.133, N3, p.235-238.
244. Nishiyama S., Kann о К., Yamaguchi J. // J. Phar-macobiodyn., 1991, v. 14, N3, p. 120— 125.
245. Novicki S., Encro M.A. // Gen. Pharmacol., 1991, v. 22, N3, p. 459- 463.
246. Nyberg F., Sanderson K., Glomsta EL The hemorphins: a new class of opioid peptides derived from the blood protein hemoglobin. Biopolymers, 1997, 43:2, 147 — 56.
247. OBoyle K.M., Gavin K.T., Harrison N. / / J. Receptor. Rec., 1993, v. 13, Nl - 4, p. 329- 339.
248. Ohlstein E.A., Zabko-Putapovich B. // J. Pharmacol, and Exp. Ther., 1984, v. 229, N2., p. 433— 439.
249. Ohuchi J.,Ishimino Y. ,Minakuchi K. et al. // Eur. J. Clin. Pharmacol., 1989, v. 36, (SuppL), p. 213.
250. Oliveira C.R. // Cen. Biol. Mol. and Cell. Biol., 1987, v. 12, N3- 4, p. 140.
251. Olney J. W., Farber N.B. // Neuropsychopharmacology., 1995, vol. 13, p. 335-345.
252. Ouadid H., Seguin J., Dumuis A., Bockacrt J., Nargeot //J.Mol. Pharmacol., 1992. — Feb, vol.41, N2, p.346 — 351.
25 .3. Ouadid H., Seguin J., Frapier J.M., Dumuis A., Bockaert J., Nargeot J. //J.Physiol., 1991, vol.435, p.93.
254. Pan к К. К., Tangri К. К., Bhargava К.Р. //Indian. J. Med. Res., 1991, —Dec, vol.94, p.447—451.
255. Parks C.L., Shenk T.// J. Biol. Chem., 1996,— FEB., vol. 23, p.4417-4430.
256. Peroutka S.J. //Annu. Rev.Neurosci., vol.11 Palo Alto, Calif., 1988., p.45-60.
257. Peroutka S.J., Me Carthy B.G., Guan X. —M. //Life Sci., 1991, voL49, N6, p.406-418.
258. Pettersson J., Siljefors T. // J. Med. Chem., 1992, v. 35, N13, p. 2355- 2363.
259. Pichler L., Pifl C., Hornykiewiez O., Kobinger W. // Eur. J. Pharmacol., 1987, v. 135,N2, p. 239- 242.
260. Plug M.J., Moller W., Dijk J. / / Biochem. Int., 1992, v. 28, Nl, p. 21- 29.
261. Pol O., Ferrer I., Puig M.M. Diarrhea associated with intestinal inflammation increases the potency of mu and delta opioids on the inhibition of gastrointestinal transit in mice.—
630
J. Pharmacol, Exp. Ther., 1994, v. 270, p. 386 - 391.
262. Portoghcse P.S., Sultana M., Nagase H., Takemori A.E. A highly selective31-opioid agonist: 7-benzylidencnaltrexone. — Eur. J. Pharmacol., 1992, v. 218, p. 195-196.
263. Portoghese P.S., Sultana M., Nelson W.L., Klein P., Takemori A.E. 3-opioid antagonist activity and binding studies of regioisomeric isothiocyanate derivatives of naltrindole: evidence for 3-receptor subtipes.— J.Med.Chem., 1992, v. 35, p. 4086-4091.
264. Punnonen R., Liukko P., Cortes-Prieto J., Eydam F., Milojevic S., Trevoux R., Chryssikopoulos E., Franchi IF., Luisi M., Kicovic PM. Multicentre study of effects of ORG OD14 on endometrium, vaginal cytology and cervical mucus in post-menopausal and oophorectomized women. Maturitas, 1984; 5: 281 — 286.
265. Qiu X.C., Wang J.L., Shi Y.S., Han J.S. // Sheng, Li.Hsueh.Pao., 1991. —Dec., vol.43,N6, p.548 —555.
266. Raghupathi R.K., Rydclek T.L., Feitler M., Glennon R. //.I.Med. Chem., 1991, vol.34,N2, p.2633-2638.
267. Renda T., Negri L., Tooyama I., Casu C., Melchiorri P. Autoradiographic study on [3H]-[D-Ala2]deltorphin 1 binding sites in the rat brain.— Neuroreport, 1993, v. 3, p. 1143—1146,
268. Renzo G., Amoroso S., Taglialatela M. et al. // Neuroendocrine I. Lcff., 1987, v. 9, Nl, p. 51— 56.
269. Riercey M.F., Brodevick Р.Л., Hoffmann W.E. et al. // J. Pharmacol, and Exp. Ther., 1990, v. 254, N 2, p. 369 — 374.
270. Rigatti B.W., Paleos G.A.,Mann J.J. //Life Sci., 1992, vol.50, N3, p. 169 —180.
271. Rinaldi C.M., Congy C., Santucci V., Simiand J,, Gautret B.,Neliat G.,Labeeuw B.,Le Fur G.,Soubrie P.,Breliere T.C. //J.Pharmacol.and Exp.Ther., 1992, vol.262, N2, p.759 —767.
272. Robertson D.W., Bloomquist W., Wong D.T., Cohen M.L. //Life sci., 1992, vol.50, N8, p.599-605.
273. Rogue P., Nanauer A., Zuiller J, et al. // Eur. J. Pharmacol. Mol. Pharmacol. Sec., 1991, v.207, N2, p. 165— 168.
274. Roquebert J., Moran A., Demichel P., Sauvage M.F. // Eur. J. Pharmacol., 1991, v. 200, Nl, p.59- 63.
275. Rossi G.C., Leventhal L., Pan Y.X., Cole J., Su W., Bodnar RJ., Pasternak G.W. Antisense mapping of MOR-1 in rats: distinguishing between morphine and morphine-beta-glucuronide antinociception.— J.Pharmacol.Exp.Ther., 1997, v. 281, N.I, p.109-114.
276. Rossi G.C., Su-W., Levental L., Su-H., Pasternac G.W.
631
Antisense mapping delta 1 opioid receptor in mice: further support for delta receptor subtypes. — Brain Res., 1997, v. 753, N.I, p.l76— 179.
277. Ruehlmaiin D.O., Steinert J.R., Valverde M.A., Jacob R., Mann G.E. Cardiovascular actions of environmental estrogenic pollutants and estrogen: non-genomic mechanisms involved in acute coronary vasodilator responses. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes, 106 (1998) A 42.
278. Ruffolo R.R., Shaar C.J. // Eur. J. Pharmacol., 1983, v.92, N3-4, p. 295- 296.
279. Sakamoto T., Chen C., Lokhandwala M.F. // J. Auton Pharmacol., 1994, v.14, N4, p. 295— 306.
280. Sailer C.F., Salama A. // Eur. J. Pharmacol., 1985, v. 109, N2, p. 297- 300.
281. Sanchez-Roa P.M., Grigoriadis D.E., Wilson A.A. et al. //. Life Sci., 1989, v. 45, N 19, p. 1821 - 1829.
282, Sato A., Liu JP, Funder JW. Aldosterone rapidly represses protein kinase C activity in neonatal rat cardiomyocytcs in vitro. Endocrinology 138: 3410 — 3416, 1997.
283. Sato N., Sakamori M., Haga K., Takehara S., Setoguchi M.//Jpn. J.PharmacoL, 1992, —Aug., vol.59(4), p.443 — 448.
284. Schmidt Christ M., Falkenstein E., Wehling M.
Nongenomic steroid actions: Completing the puzzle. Aldosteron as an example. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes, 106 (1998) 441-445.
285. Schneider J.S. // Neuropharmacology, 1992, v. 31, N2, p. 185- 192.
286. Schoepp D.D. // Neuropsichopharmacology, 1994, vol. 10., p. 624S.
287. Schotte A., Janssen P.F.M., Veruimp M. et al. // Histochem. J., 1992, v. 24, N8, p.22.
288. Schwartz J. C. // M/S: Med. Sci., 1995, v. 11, N 3, p. 375 - 381.
289. Schwartz J.C. // New. Trends Clin. Neuropharmacol., 1993, v. 7, N3, p. 81- 82.
290. Schwartz Z., Sylvia V,, Dean D.D., Boyan B.D. The rapid effects of 17P-estradiol on protein kinase C in chondrocytes are mediated via a phospholipase C-dependent mechanism. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes, 106 (1998) A 40-A41.
291. Scinto L.F.M., Daffner K.R., Dressier D., Ransil B.I., Rentz D., Weintraub S., Mesuiam M. and Potter H.A. Potential
632
noninvasive neurobiological test for Alzheimer’s disease. Science, 1994, 266: 1051-1054.
292. Sedqi M., Roy S., Ramakrishman S., Loh H.H. Expression cloning of a full-lenght cDNA enconi nd delta opioid receptor from mouse thymocjtes. — J. Neu roimmunol., 1996, v. 65, N2, p. 167-170.
293. Secman P., List S. // Symp. 8 th Int. Congr. Pharmacol., Okayama, July., 1981, Oxford e. Q., 1982, p. 61— 70.
294. SeemanP., Van Toe A.D. //J. Neurochem-., 1995, v.64, N3, p. 1413.
295. Seuwen K., Poyssegur J.//Biochem.Pharmacol., 1990, vol.39,N6, p.985-990.
296. Sharp B.M., Shahabi N., Mckean D., Lj M.D., McAllen K. Detection of basal levels and induction of delta opioid receptor mRNA in murine splenocytes. — J. of Neuroimmun.,1997, v. 78, p.198-202.
297. Siegel B.W., Freedman J., Vaal M.J. , Baron B.M.// Eur. J. Pharmacol.— 1996— FEB,vol.5, p.307 — 318.
298. Silfverstolpe G., Gustafson A., Samsioe G., Svanborg A. Lipid metabolic studies in oophorectomized women. Effects of three different progestogens. Acta Obstet. Gynecol. Scand., 1980; 88: 89 - 95.
299. Simon E.J. Opioid receptors and endogenous opioid peptides. — Med.Res.Rev., 1991, v. 11, N4, p.357 —374.
300. Sine S.M. and Claudio T. y- and 5-subunits regulate the affininity and cooperativity of ligand binding to the acetylcholine receptor. J. Biol. Chem., 1991, 266; 19369 — 19377.
301. Smart D., Lambert D.G. The stimulatory effects of opioids and their possible role in development of tolerance.— TiPS, 1996, v. 17, p. 264-268.
302. Smith A.P., Loh H.H. Molecular approaches to isolating opioid receptors. — In: Ncurobiology of opioids (eds. Aimeida O.F.X., Shippenbcrg T.S.), Springer-Verlag, Germany, 1991, p. 89 — 100.
303. Sofuogly M., Portoghesee P.S., Takemori A.E. Differential antagonism of delta opioid agonists by naltrindole and its benzofurane analog (NTB) in mice: evidence for delta opioid receptor subtipes.— J. Pharmacol. Exp. Ther., 1991, v. 257, p.676-680.
304. Sokoloff T., Yicos B., Martres M.P. et al. // M/S: Med. Sci., 1990, v. 6, N8, p. 800- 802.
305. Spano P.F., Memo M. // New. Trends Clin. Neuro-pharmacol., 1993, v. 7, N3, p. 83.
633
306. Srivastava L.K.,Morency M.A..Mishra R.K. // Eur. J. Pharmacol. Mol. Pharmacol. Sec., 1992, v. 225, N 2, p. 143 — 150.
307. Stark R., Sullivan T.M., Imondi A.R. //FASEB Journal., 1990, vol.4, N3, p.812.
308. Steward P.E., Hammond D.L. Evidence for delta opioid receptors subtypes in rat spinal cord: studies with intrathecal naltriben, cyclic [D-Pen-', D-Pen5]enkephal in and [D-Ala2,Glu4]del-torphin.— J.Pharmacol. Exp. Ther., 1993, v. 266, p. 820 — 828.
309. Stjernlaf P., Gulline M., ElebringT., Andersson B., Wikstr N.L.S., Svensson K., Ekman A., Cartsson A., Sundell S. // J.Med.Chem., 1993, vol.36, N15, p.2059-2065.
310. Street L.T., Baker R., Castro J.L., Chambers M.S., Guiblin A.R., Hobbs S.C., Matassa V.G., Reeve A.T., Beer M.S., Middlemiss D.N., Noble A.J., Stanton J.A., Scholey K., Hargreaves R.T. // J.Med.Chem., 1993., vol.36, Nil, p. 1529-1538.
311. Stubbs C.M., Connor H.E., Feniuk W. // Eur.J.Pharmacol., 1991, vol.197, Nl —2, p.l 13— 116.
312. Studd JWW, Thom MH, Paterson MEL. The prevention and treatment of endometrial pathology in post-menopausal women receiving exogenous estrogens. In: lacobelli S, King RJB, Lindner HL (eds.). Proceedings of the First International Congress on Hormones and Cancer, Rome, Italy, October 3 — 6, 1979 (abstract). New York: Raven Press, 1979.
313. Sunahara R.K., Guan H.C., O'Dowd B.F. et al. // Nature., 1991, v. 350, N6319, p. 614- 619.
314. Sutter B.C.J., Kaaya A., Cordoba P., Sutter-Dub M.T. Acute non-genomic effects of progesterone on glucose metabolism in female rat adipocytes. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes, 106 (1998) A44.
315. Szmigielskj A., Zalewska-Haszubska J. //J. Neuropharmacology, 1991, v. 30, N3, p. 259- 266.
316. Takahashi K., Tsuchida K., Tanabe Y. et al. // J. Biol. Chem., 1993, vol. 268, p. 19341 - 19345.
317. Teral M., Hidaka K., Nakamura Y. // Eur. J. Pharmacol., 1989, v. 173, N2-3, p, 177- 182.
318. Trapp N., Holsboer F. NiPS, 1996, vol.17, p. 145-149.
319. Trieman M., Andersen P.H. // J. Receptor Res., 1989, v. 2, N4- 5, p. 297- 312.
320. Tsuchihashi H.,Yagi N.,Kimura M.,Shirota K. —// J.Pharmaco- bio. — Dyn., 1991, vol. 14, N8, p.461—466.
321. Turconi M., Donetti A., Schiavone A., Sagrada A.,
634
Montagna E., Nicola M., Cesana R.,Rizzi C..Micheletti R. //Eur. J. Pharmacol., 1991, vol.203, N2, p.203-211.
322. Uchihashi Y., Morimoto T., Tadokoro S. // Nihon Yakurigakii Zasshi, Folia Pharmacol. Jap., 1992, v. 99, N3, p. 153 - 160.
323. Undie A.S., Friedman E. // J. Pharmacol, and Exp. Ther., 1990, v. 253, N3, p. 987- 992.
324. Unwin N. Nicotinic acetylcholine receptor at 9A resolution. J. Mol. Biol. I, 1993, 229:1101-1124.
325. Utian WH. Menopause in modern perspective. A guide to clinical practice. New York: Appleton —Century —Crofts, 1980.
326. Van der Nipen P.,Schoors D.F.,Dupont A.G. // Arch. Int. Phannacodyn. et ther., 1991, v. 313, p. 98— 107.
327. Van Steen B.J., van Wijngaarden I., Tulp M.Th.M., Soudijn W. //J.Mcd.Chem., 1994, vol.37, N17, p.2761-2773.
328. Van Wijngaarden J.,Tulp M.Th.M., Soudijn W. // Eur.J.Pharmacol’., 1990, vol.188, N6, p.301-302.
329. Van Woerkens L.J., Duncker D.J., Den Boer M.O., Me Falls E.D., Sassen L.M., Saxena P.R., Verdouw P.D, // Br. J. Pharmacol., 1991, v. 104, Nl, p. 246- 250.
330. Veldscholte J., Vooryost-Ogink M.M., Bolt-de Vries J., et al., Biochiin.Biophis Acta 1990, vol.1052, p.187 —194.
331. Villaion C.M., den Boer M.O., Heliigers J.P.C., Werdouw P.D., Duncker D.J.C.M., Saxena P.R. //Fundam. and Cl in. Pharmacol., 1991, vol.5, N5, p.417.
332. Vincent S.R., Drinnan S.L., Hope B.T. // Eur. J. Pharmacol., 1990, v. 183, p. 2070.
333. Vita G.M., dickers A., Jedlicka A.E., George A.L., Heiman-Patterson T., Rosenberg H., Fletcher J.E. and Levitt R.C. Masseter muscle rigidity associated with glycine-1306 to alanine mutation in the adult muscle sodium channel cc-subunit gene. Anesthesiology, 1995, 82:1097—1103.
334. Vyas S.J., Apparsundaram S., Ricci A. et al. // Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol., 1991, v. 343, Nl, p. 21 — 30.
335. Walters D.E., Howard S.G, // Eur. J. Pharmacol., 1990, v. 184, N2- 3, p. 257- 264.
336. Wang J.B., Johnson P.S., Imai Y., Persico A.M., Ozenberger B.A., Eppler C.M., Uhl G.R. cDNA cloning of an orphate receptor genefamily member and its splice variant.— FEBS—Lett., 1994, v. 348, N. 1, p.75-79.
337. Wang N., Zhao D.H., Sheng B.H. // Chung. Kuo. Yao.
635
Li. Hsuch. Рао., 1991, v. 12,N3,p. 207- 211.
338. Water N., Lofberg L., Svensson K. et al. // Eur. J. Pharmacol., 1990, v. 187, N 3, p. 425 — 434.
339. Watkins J. C. // Can.J. Physiol.Pharmacol., 1991, vol. 69, p. 1064 — 75.
340. Watts V.T., Lawler C.P., Crilmere J.H. et al. // Eur. J. Pharmacol., 1993, v. 242, N2, p. 165- 172.
341. Wehling M. Nongenomic actions of steroid hormones. Trends Endocrinol Metab 5: 347 — 353, 1994.
342. Wehling M. Specific, nongenomic actions of steroid hormones. Annu. Rev. Physiol. 59: 365 — 393, 1997.
343. Wehling M., Spes C.H., Win N., Janson C.P., Schmidt Theisen K., Christ M. Rapid Cardiovascular Action of Aldosterone in Man. J. Clin Endocrinol Metab 83: 3517 — 3522, 1998.
344. Weinshank R.L., Zgombick J.M., Macchi M.J., Brancher T.A., Hartig P.G. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 1992, vol. 89, N8, p.3680— 3634.
345. When GB. Oestriol in the control of post-menopausal symptoms. Preliminary report for a clinical trial. Med. J. Austr., 1982; 176.
346. Whitehead MI, Campbell S. Endometrial estrogen, uterine and estrogen levels in menopausal women receiving estrogen therapy and estrogen/progestogen therapy. In: Brush MJ,Taylor RW, King RJ (eds.). Proceedings of the Second International Meeting on Endometrial Cancer Allied Topics. London: Balliere Tindall, 1978; 65 - 80.
347. Whitehead ML, McQueen J., Beard RJ., Campbell S. The effects of cyclical estrogen therapy and sequential estrogen/progestogen therapy on the endometrium of post-menopausal women, Acta Obstet. Scand., 1977; suppl. 65; 91.
348. Whitehead ML, McQueen J., Minardi J., Campbell S. Progestogen modification of estrogen-induced endometrial proliferation in climacteric women. In: Pasetto N, Paoletti R, Ambrus JL (eds) The menopause and post-menopause. Lancaster: MTP Press, 1980; 31 - 41.
349. Whitehead ML The effects of oestrogens and progestogens on the post-menopausal endometrium. Maturitas, 1978; 1:87.
350. Wick M.J., Minnerath S.R., Roy S., Ramakrishnan S., Loh H.H. Differential expression of opioid receptor genes in human
636
lymphoid cell lines and peripheral blood lymphocytes.— J.Neuroimmmunol., 1996. Jan., N64, Nl, p. 29 — 36.
351. Wieacker P.F., Knoke I., Jakubiczka S. Clinical and molecular aspects of androgen receptor defects. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes, 106 (1998) 446—452.
352. Wikstram H., Andersson B., Elebring T., Lagerkvist S., Hallnemo G., Pettersson I., Jovall P.-А., Svensson K., Ekman A., Carlsoon A. //J.Med.Chem., 1992, vol. 35, N22, p. 3984 — 3990.
353. Williamson R.A., Strange P.G. //J. Neu rochem,, 1990, v. 55, N4, p. 1357 — 1365.
354. Woodward R., Daniel S.J., Strange P.G. et al. // J. Neurochem., 1994, v. 62, N5, p. 1669.
355. Yaksh TL. Pharmacology and mechanisms of opioid analgesic activity. Acta Anaesthesiol Scand, 1997 Jan, 41:1 Pt 2, 94 — 111.
356. Yamaguchi I., Walk S.F., Jose P.A., Felder R.A. // Mol.Pharmacol., 1996, v.49, p.373 — 378.
357. Yamamoto T., Yaksh T.L. // Neuroscj. Lett., 1992, . vol. 135, p. 67-70.
358. Yoon J.H., Ко C.M., Ahn Y.S., Park K.S. // Yonsei ’ Med. J., 1994, v.35, N4, p. 411 —119.
1 359. Yoshikawa S., Ishitani R. //Life Sci., 1985, vo!.36, N5,
i p.485- 492.
S 360. Young A.B., Гagg G.E. // Trends Pharmacol. Sci., 1990, i vol. 11, p. 126-133.
361. Young A.M., Goushaw P. J., Witte R.R., //Paper presented at 58th CPDD Meeting, June 22—27, 1996, San Juan, Puerto-Rico.
362. Young K., Wilcox R.E. // Life sci., 1991, v. 48, N 19, p. 1845 - 1852.
i 363. Zadina J.E., Hackler L., Ge L.J., Kastin A.J. A potent and ; selective endogenous agonist for the mu-opiate receptor [see 'comments]— Nature, 1997, Apr., v. 386, N6624, p. 499 — 502.
364, Zgombick J.M. Weinshenk R.L., Macchj M., Schechter i L.E., BranchckT.A., HartigP.R. //Mol. Pharmacol., 1991, vol.40, 'N6, p.l036-1042.
365. Zhang S.J., Jackson M.B. Neuroactive steroids mo-
dulate GABAA receptors in peptidergic nerve terminals. J. Neuroendocrinol, 6: 533 — 538,1994.
366. Zhao R.R., Wang P.H., Zhang W.F., Feunell W.H. //
637
Menth. and Find. Exp. and Clin. Pharmacol., 1992, v. 11, Nl, p, 5- 11.
367. Zumagalli F., BrunelloN., Racagni G. // Riv. psichiat., 1994, v. 29, N4, p. 215- 225.
368. Албертис Б., Брей Д., Лионе Дж., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. — М.: Мир, 1994, т.1 — 516 с., т.2 — 540 с., т.З — 548 с.
369. Экклз Дж. Физиология синапсов. — М., 1966.
ОГЛАВЛЕНИЕ
ПРЕДИСЛОВИЕ...........................3
ВВЕДЕНИЕ .............................5
ЧАСТЬ I. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ РЕЦЕПТОРОЛОГИИ
Глава 1. Понятие рецепции ЛВ (история развития иред-тавлспнп о рецепции физиологически активных ве-(еств)..................................7
Глава 2. Кинетика взаимодействия ЛВ е рецептором.11
Глава 3. Закономерности рецепторного действия лекарствах веществ в сверхмалых дозах..................34
Глава 4. Химическая природа рецепторов физиологически нвпых веществ...................................40
Глава 5. Что такое специфичность рецепторов?....43
Глава 6. Современные методы рецеиторологии......49
ЧАСТЬ II. ЧАСТНЫЕ ВОПРОСЫ РЕЦЕПТОРОЛОГИИ
Глава 1. Ацетилхолиновые рецепторы..............54
Глава2. Адренорецепторы........................106
Глава 3. Дофаминовые рецепторы.................168
Глава 4. Гистаминовые рецепторы................217
Глава 5. Серотониновые рецепторы...............257
Глава 6. Иминрамиповые рецепторы...............298
Глава 7. Рецепторы у-амипомасляной кислоты.....309
Глава 8. Бензодиазепиновые рецепторы...........328
Глава 9. Рецепторы возбуждающих аминокислот....346
Глава 10. Пуриновые рецепторы..................424
Глава 11. Опиоидные рецепторы..................446
Глава 12. Рецепторы белково-пептидных гормонов.479
Глава 13. Рецепторы стероидных гормонов........525
Глава 14. Некоторые проблемы онтогенеза и филогенеза periоров.........................................594
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ....................................604
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................615