]) сФНРкгдг/л.
фдо,,/11
' } '• Г}].«у
Л.'О РЛЗШ^ШЯ
к.:г
)j:o I---
))0)i. >)>?' <
] .Г:-) I
) J.O,)i, Ou]]','. г );Г.,чг ni:
ч л ел i л- -uci f)] i c.oj i о: J.'i.f-i i y. L'/JVj)),,
профессора У;-". У. XAlti'WWA

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ
В СФЕРЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ЭКСПЕРТИЗЫ СРЕДСТВ
МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ
РУКОВОДСТВО
ПО ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМУ
(ДОКЛИНИЧЕСКОМУ) ИЗУЧЕНИЮ
НОВЫХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ
ВЕЩЕСТВ
Под общей редакцией
члена-корреспондента РАМН,
профессора Р. У. ХАБРИЕВА
Издание второе,
переработанное и дополненное
Рекомендуется Учебно-методическим объединением
по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России
в качестве учебного пособия для системы послевузовского
профессионального образования врачей
МОСКВА
2005

УДК 615.2/.3.07(075).9
ББК 52.8
Р85
Состав Редакционного совета 2-го издания «Руководства по
экспериментальному (доклиническому) изучению новых
фармакологических веществ»
ХАБРИЕВ Р. У. — председатель
Верстакова О. Л. — ответственный секретарь
Члены совета: Арзамасцев Е. В., Бабаян Э. А., Белоусов Ю. Б.,
Будаев В. М., Герасимов В. Б., Глушков Р. Г., Гусъкова Т. А.,
Дрожжин А. П., Ершов Ф. И., Жердев В. П., Игнатов Ю. Д.,
Кукес В. Г., Петров В. И., Петров Р. В., Рейхарт Д. В.,
Сергеев П. В., Сергиенко В. И., Середенин С. Б., Соколова Г. Б.,
Ткаченко С. Б., Филюнин С. В., Фирсов А. А., Фисенко В. П.,
Фомина И. П., Хаитов Р. М., Чельцов В. В., Яворский А. Н.,
Яковлев В. П.
Рецензенты:
академик РАН А. И. Мирошников,
профессор А. Г. Муляр,
профессор О. Н. Чиченков
Руководство по экспериментальному (доклиническому)
Р85 изучению новых фармакологических веществ / Под общей
редакцией члена-корреспондента РАМН, профессора
Р. У. Хабриева.— 2-изд., перераб. и доп.— М.: ОАО
«Издательство «Медицина», 2005.— 832 с: ил.
ISBN 5-225-04219-8
ББК 52.8
ISBN 5-225-04219-8 © Коллектив авторов, 2005
Все права авторов защищены. Ни одна часть этого издания не может быть
занесена в память компьютера либо воспроизведена любым способом без
предварительного письменного разрешения издателя.

СОДЕРЖАНИЕ
ПРЕДИСЛОВИЕ 6
ВВЕДЕНИЕ 8
Термины и определения 8
ГЛАВА I. Нормативные правовые акты, регламентирующие доклинические
исследования безопасности и эффективности фармакологических
веществ в Российской Федерации 13
Федеральный закон «О лекарственных средствах» (Ст. 36) ... . 13
Приказ Минздрава России № 267 от 19 июня 2003 г 14
ГЛАВА II. Доклинические исследования безопасности лекарственных
средств 28
Методические рекомендации по инспектированию лаборатории
(организации, выполняющей доклинические исследования) ... 28
Методические указания по изучению общетоксического действия
фармакологических веществ 41
Методические указания по оценке аллергизирующих свойств
фармакологических веществ 54
Методические указания по оценке иммунотоксического действия
фармакологических средств 70
Методические указания по изучению репродуктивной
токсичности фармакологических веществ 87
Методические указания по оценке мутагенных свойств
фармакологических веществ 100
Методические указания по оценке канцерогенных свойств
фармакологических веществ и лекарственных средств 122
Методические указания по оценке канцерогенное™
фармакологических средств и вспомогательных веществ в краткосрочных тестах 131
Методические указания по изучению общетоксического действия
противоопухолевых фармакологических веществ 170
Методические указания по оценке безопасности применения
лекарственных средств в клинике на основании результатов
доклинических токсикологических экспериментов 204
Методические указания по доклиническому изучению
безопасности лекарственных средств, полученных на основе биотехнологии 209
ГЛАВА III. Доклинические исследования эффективности лекарственных
средств 217
Методические указания по проведению доклинических
исследований фармакокинетики фармакологических веществ и
лекарственных средств 217
Часть 1. Доклинические исследования эффективности лекарственных средств,
предназначенных для лечения заболеваний центральной и
периферической нервной системы 230
Методические указания по изучению нейролептической
активности фармакологических веществ 230
Методические указания по изучению антидепрессантной
активности фармакологических веществ 244
Методические указания по изучению транквилизирующего (ан-
ксиолитического) действия фармакологических веществ 253
-3-

Методические указания по изучению снотворной активности
фармакологических веществ 263
Методические указания по изучению противосудорожной
активности фармакологических веществ 277
Методические указания по изучению антипаркинсонической
активности фармакологических веществ 295
Методические указания по изучению ноотропной активности
фармакологических веществ 308
Методические указания по экспериментальному доклиническому
изучению аддиктивного потенциала фармакологических средств,
обладающих психоактивными свойствами 320
Методические указания по экспериментальному изучению
препаратов для лечения нарушений мозгового кровообращения и
мигрени 332
Методические указания по изучению обезболивающего (морфи-
ноподобного) действия и налоксоноподобной активности
фармакологических веществ 338
Методические указания по изучению препаратов для лечения
алкоголизма 342
Методические указания по изучению препаратов для лечения
наркоманий и токсикомании 356
Методические указания по изучению местноанестезирующей
активности фармакологических веществ 364
Часть 2. Доклинические исследования эффективности лекарственных средств,
предназначенных для лечения заболеваний сердечно-сосудистой
системы 393
Методические указания по изучению кардиотонической
активности фармакологических веществ 393
Методические указания по изучению антиаритмической
активности фармакологических веществ 421
Методические указания по изучению противоишемического (ан-
тиангинального) действия фармакологических веществ 438
Методические указания по изучению гипотензивной активности
фармакологических веществ 444
Методические указания по изучению гиполипидемического и ан-
тиатеросклеротического действия фармакологических веществ . . 452
Методические указания по изучению фармакологических веществ,
влияющих на гемостаз 461
Часть 3. Доклинические исследования эффективности лекарственных средств,
предназначенных для лечения заболеваний системы органов дыхания 476
Методические указания по экспериментальному изучению проти-
вокашлевых и муколитических средств 476
Методические указания по изучению фармакологических веществ,
предназначенных для лечения бронхиальной астмы и других об-
сгруктивных заболеваний дыхательных путей 483
Часть 4. Доклинические исследования эффектнвностн хнмиотерапевтических
лекарственных средств 501
Методические указания по изучению иммунотропной активности
фармакологических веществ 501
Методические указания по изучению противомикробной
активности фармакологических веществ 515
Методические указания по изучению специфической
противовирусной активности фармакологических веществ 532
-4-

Методические указания по изучению специфической активности
индукторов интерферонов 558
Методические указания по изучению противотуберкулезной
активности фармакологических веществ 571
Методические указания по изучению противогрибковой
активности фармакологических веществ 582
Методические указания по изучению антипротозойной
активности фармакологических веществ 589
Методические указания по изучению антигельминтной
активности фармакологических веществ 615
Методические указания по изучению противоопухолевой
активности фармакологических веществ 637
Методические указания по изучению специфической активности
фармакологических веществ, предлагаемых для лечения гормоно-
зависимых опухолей 652
Методические рекомендации по доклиническому изучению
средств, способных ингибировать рецидивирование
злокачественных опухолей 669
Методические рекомендации по доклиническому изучению
средств, обладающих способностью ингибировать процесс мета-
стазирования и повышать эффективность цитостатической
терапии злокачественных опухолей 674
Часть 5. Доклинические исследования эффективности лекарственных средств
разных фармакотерапевтических групп 683
Методические указания по изучению гепатозащитной активности
фармакологических веществ 683
Методические указания по изучению препаратов, обладающих
свойствами антиоксидантов и хелаторов 691
Методические указания по изучению новых нестероидных
противовоспалительных препаратов 695
Методические указания по экспериментальному изучению
фармакологических веществ, обладающих свойствами антидотов
(Часть 1) 710
Методические указания по экспериментальному изучению
фармакологических веществ, обладающих свойствами антидотов и(или)
комплексонов, для защиты организма от поражающего действия
радиоактивных веществ (Часть 2) 721
Методические указания по доклиническому изучению
радиопротекторных свойств фармакологических веществ 724
Методические указания по доклиническому изучению
радиофармацевтических препаратов 729
Методические указания по экспериментальному
(доклиническому) изучению лекарственных средств, разрабатываемых из
природного сырья 741
Часть 6. Методические указания по подготовке регистрационного досье .... 747
Методические рекомендации по подготовке проекта инструкции
по применению препарата, предлагаемого для проведения
клинических исследований 747
Методические рекомендации по рациональному выбору названий
лекарственных средств 752
Основные методы статистической обработки результатов
фармакологических экспериментов (Часть 1) 763
Методические указания по статистической обработке результатов
доклинических исследований (Часть 2) 774
-5 -

ПРЕДИСЛОВИЕ
Стремительное развитие фундаментальных наук формирует условия для
создания новых фармакологических веществ, способных стать
лекарственными препаратами. Новые источники получения потенциальных
лекарственных средств значительно расширяют принципиальные возможности
фармакотерапии основных заболеваний человека. Между тем, внедрение
современных препаратов в клиническую практику осуществимо лишь при
условии детального изучения их специфической фармакологической
активности и безопасности на этапе экспериментальных исследований.
Указанное обстоятельство явилось причиной создания "Руководства по
экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических
веществ" в котором приняли участие ведущие специалисты Российской
Федерации, работающие в разных областях теоретической и практической
медицины. Первое издание этого Руководства вышло в свет в 2000 году и к
настоящему времени стало библиографической редкостью. Прошедшие
годы характеризовались повышением активности многих
научно-исследовательских учреждений нашей страны, занимающихся созданием
лекарственных препаратов и нуждающихся в современных правилах
доклинической оценки новых фармакологических веществ. Это является основным
мотивом, обусловившим необходимость подготовки второго
(дополненного и переработанного) издания Руководства.
Отличительной чертой второго издания "Руководства по
экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ"
является его направленность на гармонизацию с общепринятыми
международными требованиями. Так, в частности, это отечественное издание в
определенной степени гармонизировано с такими наиболее известными в
этой области знаний руководствами, как "Good Laboratory Practice for
Nonclinical Laboratory Studies", принятого в США, и "OECD Principles on Good
Laboratory Practice", принятого в Европейском Союзе.
В этой связи уже сейчас представляется очевидной необходимость
продолжения работ по совершенствованию научных и организационных
аспектов доклинических исследований новых лекарственных средств,
включая требования к планированию, порядку проведения, контролю, а также
оформлению, хранению и представлению их результатов.
Внедрение в практику работы отечественных учреждений,
разрабатывающих новых лекарственные средства, рекомендаций, представленных в
Руководстве, станет гарантией повышения качества доклинических
исследований в нашей стране и будет важным шагом в общем комплексе
мероприятий, необходимых для продвижения отечественных лекарственных
средств на мировой фармацевтический рынок.
Настоящее издание "Руководства по экспериментальному
(доклиническому) изучению новых фармакологических веществ" соответствует
основным направлениям проводимой в Российской Федерации реформы в
сфере обращения лекарственных средств, основной задачей которой является
-6-

обеспечение пациентов эффективными и безопасными лекарственными
средствами, созданными с учетом современных достижений медицинской
науки и промышленных технологий.
Руководитель Федеральной службы по
надзору в сфере здравоохранения и
социального развития доктор
медицинских наук, доктор фармацевтических
наук, профессор, член-корреспондент
Российской академии медицинских наук
Р. У. ХАБРИЕВ

ВВЕДЕНИЕ
Термины и определения
Абсорбция (всасывание) лекарственных средств — процесс, посредством
которого вещество с места применения попадает в кровообращение.
Аллергизирующее действие — способность вещества вызывать состояние
повышенной чувствительности (гиперчувствительность, сенсибилизация).
Аудит — систематическая и независимая проверка документации и
деятельности участвующих в доклиническом исследовании сторон.
Проводится для подтверждения факта осуществления этой деятельности, а также
для оценки соответствия процедур сбора, обработки и представления
данных требованиям протокола исследования, стандартных операционных
процедур, Правил проведения качественных доклинических исследований
(GLP) и разрешительных инстанций.
Безопасность лекарственных препаратов — характеристика
лекарственного препарата, основанная на сравнительном анализе соотношения
возможной пользы от применения препарата и риска причинения вреда
здоровью.
Биологически активные вещества — вещества, способные оказывать
влияние на биологические процессы в организме.
Биотрансформация — совокупность химических изменений веществ в
организме.
Биофармацевтическое исследование — испытание различных
фармацевтических факторов, характеризующих лекарственную форму препарата в
отношении его биологической доступности.
Воспроизведенный лекарственный препарат — лекарственный препарат,
обладающий доказанной терапевтической взаимозаменяемостью с
оригинальными лекарственными препаратами аналогичного состава,
выпускаемый иным, нежели разработчик, производителем без лицензии
разработчика. Допускается в обращение после истечения срока патентной защиты
на оригинальное лекарственное средство, как правило, на основании
оценки регистрационного досье сокращенного объема.
Вспомогательные вещества — дополнительные вещества, необходимые
для приготовления лекарственного препарата в готовой лекарственной
форме.
Галеновые препараты — фармакологические или лекарственные
средства, представляющие собой различные извлечения из лекарственных
растений, для применения внутрь и/или наружно.
Государственная фармакопея — сборник фармакопейных статей,
методов анализа и других нормативных требований, утверждаемый
компетентными органами здравоохранения соответствующих стран
Государственный реестр лекарственных средств — документ, в который
вносятся сведения о разрешенных к применению и производству в стране
лекарственных средствах
Двойной "слепой" опыт — метод, применяемый при оценке
фармакологических и/или лекарственных средств, когда ни больной, ни врач не
знают, что получает больной (испытуемый или стандартный препарат, либо
плацебо).
- 8 -

Действующее вещество — компонент(ы) фармакологических или
лекарственных средств, оказывающий(е) терапевтическое, профилактическое,
диагностическое или другое действие на организм.
Действующее вещество (субстанция) — вещество растительного,
животного, микробного, синтетического или полусинтетического
происхождения, обладающее фармакологической активностью и предназначенное для
производства и изготовления лекарственных препаратов.
Доклиническое исследование фармакологического вещества — изучение
фармакологических, токсических и фармацевтических (включая физико-
химические) свойств веществ и/или их комбинаций и разработка и
исследование готовых лекарственных форм.
Документ — материальный объект, содержащий в зафиксированном
виде информацию, оформленную установленным образом на
определенном языке и носителе информации, имеющий в соответствии с
действующим законодательством правовое значение.
Документация на препарат — оформленные в установленном порядке
материалы, содержащие данные о методах и результатах доклинического
и/или клинического испытания, а также контроля качества нового
фармакологического препарата, совокупность которых дает возможность
решить вопрос о клиническом изучении или разрешении медицинского
применения нового фармакологического средства и других специальных
вопросов.
Документооборот — процесс похождения документации внутри
организации или системы управления.
Иммунотоксичность — некомпенсированные нарушения в структуре и
функции иммунной системы, способные привести к снижению
резистентности организма.
Инфузионные растворы — препараты для внутривенного введения
большого объема жидкостей.
Исследовательская организация — учреждение, в котором
непосредственно проводится доклинические исследования тестируемого вещества при
его введении в тест-систему. Исследовательская организация, проводящая
испытания в соответствии с принципами GLP, должна быть аккредитована
для проведения доклинических испытаний.
Канцерогенность — действие вещества, способное вызывать развитие
опухолей.
Клиническое исследование — изучение, оценка фармакологического
средства по решению уполномоченного на то органа эффективности,
безвредности, дозировки и преимущества данного средства
Комбинированные лекарственные средства — фармакологические или
лекарственные средства, которые содержат в одной лекарственной форме
больше одного действующего вещества в фиксированных дозировках.
Комиссия по биоэтике — независимая комиссия, которая создается на
уровне исследовательской организации для оценки и контроля этических
аспектов работы с лабораторными животными: методической и
экспериментальной базы в отношении гуманного обращения с животными и их
рационального использования.
Контроль качества — часть надлежащей производственной практики,
которая связана с отбором проб, спецификациями, проведением
испытаний, а также методиками по организации, документированию и
процедурам выдачи разрешений, гарантирующие выпуск готовой продукции
надлежащего качества.
Контрольное вещество — любое вещество (или смесь), отличное от тес-
-9-

тируемого вещества, корма и воды, введенное в тест-систему с целью
сравнения с тестируемым веществом.
Кумуляция — накопление вещества в организме при повторном
воздействии (материальная кумуляция). Прогрессирующее нарастание изменений
в органах и тканях организма при повторном воздействии вещества
(функциональная кумуляция).
Лекарственная непереносимость — индивидуальная
сверхчувствительность, проявляющаяся токсическими явлениями при применении
терапевтической дозы препарата.
Лекарственная форма — придаваемое лекарственному средству или
лекарственному растительному сырью удобное для применения состояние,
при котором достигается необходимый лечебный эффект.
Лекарственное взаимодействие — изменение действия лекарственного
средства под влиянием другого препарата, применяемого одновременно,
до или после введения первого.
Лекарственное растительное сырье — растительное сырье, разрешенное
уполномоченным на то органом в установленном порядке для
медицинского применения
Лекарственные препараты — дозированные лекарственные средства в
определенной лекарственной форме.
Лекарственные средства — вещества, применяемые для профилактики,
диагностики, лечения болезни, предотвращения беременности,
полученные из крови, плазмы крови, а также органов, тканей человека или
животного, растений, минералов методами синтеза или с применением
биологических технологий. К лекарственным средствам относятся также вещества
растительного, животного или синтетического происхождения,
обладающие фармакологической активностью и предназначенные для
производства и изготовления лекарственных средств.
Лекарственные средства пролонгированного действия — препараты в
специальной лекарственной форме, обеспечивающей увеличение
продолжительности его действия.
Мутагенность — действие вещества, способное вызывать изменения
генетического аппарата клетки и приводящее к изменению наследственных
свойств.
Новое лекарственное средство (срок, до которого лекарственное
средство считается новым, устанавливается национальным законодательством) —
лекарственное средство, применяющееся не более 3 лет после регистрации
и промышленного выпуска
Нормативная система организации — совокупность норм, прямо и
косвенно регулирующих деятельность организации.
Нормативно-технические требования — документ, характеризующий
физико-химические, химические, некоторые биологические показатели и
содержание действующего вещества в фармакологическом средстве.
Общее действие — действие, носящее генерализованный характер или
наблюдаемое на удаленном от места поступления вещества участке. Для
проявления общего действия необходимо поступление и распределение
вещества в организме.
Острая токсичность — токсическое действие вещества, введенного в
однократной дозе или в многократных дозах в течение не более 24 ч,
которое может выражаться в расстройстве физиологических функций или
нарушении морфологии органов экспериментальных животных, а также
гибели животного.
Отклонения от протокола — незапланированные события, непредви-
-10-

денные обстоятельства, упущения (например, погодные факторы,
изменение температуры в комнатах содержания животных, ошибка при взятии
пробы и т. п.), приведшие к изменениям в протоколе.
Отчет о доклиническом исследовании — письменный документ,
проверенный службой контроля качества и подписанный руководителем
испытания и утвержденный руководителем исследовательской организации, в
котором представлено, как и что было сделано в ходе исследования, и что
было получено в результате его проведения.
Плацебо — индифферентное вещество в лекарственной форме,
имитирующей исследуемое фармакологическое средство
Побочное действие — действие, характеризующее способность вещества
одновременно с основным терапевтическим эффектом оказывать
нежелательное или токсическое действие.
Подострая (субхроническая) токсичность — совокупность функциональных
и/или морфологических нарушений органов и систем подопытного животного
после повторного введения. Продолжительность введения 2—12 недель.
Полупериод элиминации — время, необходимое для снижения
наполовину концентрации исследуемого вещества в крови (плазме, сыворотке).
Поправка к протоколу исследования — незапланированное утвержденное
изменение протокола: изменение дизайна исследования, включение новых
методов или отказ от каких-то методов, изменение названия испытания,
смена персонала и т. п.
Постоянная элиминации — величина, определяющая относительную
скорость снижения количества данного препарата в отдельных жидкостях
и тканях организма.
Привыкание — пониженная реакция организма на повторное
применение вещества
Пристрастие — непреодолимое стремление к приему
фармакологического или лекарственного средства
Простой "слепой" опыт — метод, применяемый при оценке
фармакологических и/или лекарственных средств, когда больной не знает, а врач
знает, какое лекарственное средство или плацебо получает больной.
Протокол исследования — письменный утвержденный документ, в
котором отражены цели и задачи испытания, приведен подробный план
(дизайн) исследования и указаны все методы, применяемые в исследовании, а
также персонал его выполняющий.
Регистрационное удостоверение — документ, подтверждающий
регистрацию лекарственного средства
Регистрационный номер — информационный номер (шифр), под
которым лекарственное средство зарегистрировано в стране и внесено в
Государственный реестр лекарственных средств
Репродуктивная токсичность — эмбрио- и фетотоксическое действие в
антенатальном и постнатальном периоде развития, а также влияние на
генеративную функцию организма.
Руководитель исследования — лицо, несущее полную ответственность за
организацию и проведение доклинического исследования.
Связь с белками сыворотки крови — связь между фармакологическим
веществом и белками сыворотки крови, в ходе которой образуется
состояние равновесия между свободной и связанной с белками плазмы крови
фракции лекарственного вещества.
Сертификация персонала — деятельность по подтверждению
соответствия квалификации персонала установленным требованиям или
профессиональным стандартам.
- 11 -

Система документации — система, по которой на каждом предприятии
осуществляется работа по обращению документов в соответствии с
действующим законодательством.
Скорость всасывания — постоянная величина, которая показывает,
какая часть действующего вещества попадает в кровь за определенный
период времени.
Слепой опыт — метод сравнительного испытания фармакологического
средства с использованием плацебо или стандартного лекарственного
средства при условии, что больной не знает об этом
Служба контроля качества — группа лиц, назначенных руководством
исследовательской организации не из числа участников исследования,
которая обеспечивает контроль качества проводимого исследования и
осуществляет оценку соответствия процедур сбора, обработки и представления
полученных данных требованиям правил GLP.
Специальные токсикологические исследования — изучение возможного
токсического влияния препарата: на репродуктивную функцию, включая
оценку эмбриотоксичности и тератогенности; мутагенного действия;
канцерогенного действия; опасности развития пристрастия; аллергизирующе-
го действия; иммунотоксичности
Срок годности — время хранения лекарственного средства, в течение
которого препарат сохраняет свои физико-химические,
микробиологические и терапевтические свойства без изменений или в установленном для
него пределах, при условии соблюдения условий хранения, утвержденное
законодательным органом на основании результатов специального
исследования.
Стабильность — свойство лекарственного (или фармакологического)
средства сохранять свои физико-химические и микробиологические
свойства в течение определенного времени с момента его выпуска.
Стандартная операционная процедура — письменный утвержденный
руководителем подразделения документ, в котором подробно описана
рутинная процедура, методика, манипуляция, выполняемая по установленному
стандарту.
Стандартное лекарственное средство (фармакологический стандарт) —
лекарственное средство с известными и определенными
фармакологическими, фармакотерапевтическими и токсическими свойствами, с
которыми сравнивается лекарственное средство, исследуемое клинически и док-
линически
Тахифилаксия — явление, состоящее в снижении фармакологического
эффекта при повторном применении препарата в течение короткого
времени.
Тератогенность — свойство, характеризующее способность вещества
при его применении в период беременности нарушать развитие тканей и
органов плода и приводить к врожденным уродствам.
Токсичность — свойство вещества при попадании в определенных
количествах в организм человека, животных или растений вызывать их
отравление или гибель.
Фармакодинамика — изучение совокупности эффектов, вызываемых
лекарственным веществом, а также механизмы его действия.
Фармакокинетика — изучение пути поступления, распределения и
метаболизма лекарственных веществ в организме, а также их выведение.
Фармакологическое вещество — вещество или смесь веществ с
установленной фармакологической активностью.
Фармакопейная статья — государственный стандарт лекарственного
-12-

средства, содержащий перечень показателей и методов контроля качества
лекарственного средства.
Фармакопейная статья предприятия — стандарт качества на
лекарственное средство под торговым названием, содержащий перечень
показателей и методов контроля качества лекарственного средства производства
конкретного предприятия, учитывающий конкретную технологию данного
предприятия и прошедший экспертизу и регистрацию в установленном
порядке.
Хроническая токсичность — совокупность функциональных и/или
морфологических нарушений органов и систем подопытного животного после
повторного введения. Продолжительность введения 3—6 мес, в некоторых
случаях 12—18 мес.
Элиминация — совокупность процессов, охватывающих выведение и
биотрансформацию препарата, приводящих к снижению содержания
действующего вещества в отдельных жидкостях и тканях организма.
Эмбриотоксичность — свойство, характеризующие способность
вещества вызывать нарушение развития или гибель плода.
Глава I
НОРМАТИВНЫЕ ПРАВОВЫЕ АКТЫ, РЕГЛАМЕНТИРУЮЩИЕ
ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ
И ЭФФЕКТИВНОСТИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральный закон
«О ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВАХ»
Статья 36. Доклинические исследования лекарственных средств
1. Целью доклинических исследований лекарственных средств является
получение научными методами оценок и доказательств эффективности и
безопасности лекарственных средств.
2. Доклинические исследования лекарственных средств проводятся
организациями-разработчиками лекарственных средств по правилам
лабораторной практики, утвержденным федеральным органом исполнительной
власти, в компетенцию которого входит осуществление функций по
выработке государственной политики и нормативно-правовому регулированию
в сфере обращения лекарственных средств.
(в ред. Федерального закона от 22.08.2004 № 122-ФЗ)
3. Доклинические исследования лекарственных средств проводятся по
утвержденному плану с ведением протокола и составлением отчета, в
которые заносятся результаты доклинических исследований лекарственных
средств. Организация-разработчик лекарственных средств выдает
заключение о возможности проведения в дальнейшем клинических исследований
лекарственных средств.
4. Доклинические исследования лекарственных средств на животных
- 13 -

проводятся в соответствии с международными правилами. Контроль за
соблюдением правовых и этических норм использования животных при
проведении доклинических исследований лекарственных средств
осуществляется соответственно федеральным органом исполнительной власти, в
компетенцию которого входит осуществление функций по выработке
государственной политики и нормативно-правовому регулированию в сфере
обращения лекарственных средств и его территориальными органами.
(в ред. Федерального закона от 22.08.2004 № 122-ФЗ)
Федеральный закон "О лекарственных средствах" № 86-ФЗ от 22 июня
1998 г. (в ред. Федеральных законов от 02.01.2000 № 5-ФЗ, от 30.12.2001
№ 196-ФЗ, от 10.01.2003 № 15-ФЗ, от 30.06.2003 № 86-ФЗ, от 22.08.2004
№ 122-ФЗ)
Зарегистрировано в Минюсте РФ
25 июня 2003 г. № 4809
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ПРИКАЗ
от 19 июня 2003 г. № 267
ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ПРАВИЛ ЛАБОРАТОРНОЙ ПРАКТИКИ
В соответствии с Федеральным законом "О лекарственных средствах" от
22.06.1998 № 86-ФЗ (с изменениями и дополнениями, Собрание
законодательства Российской Федерации, 1998, № 26, ст. 3006; 2000, № 2, ст. 126;
2002, № 1, ст. 2; 2003, № 2, ст. 167), Положением о Министерстве
здравоохранения Российской Федерации, утвержденным Постановлением
Правительства Российской Федерации от 29.04.2002 № 284 (Собрание
законодательства Российской Федерации, 2002, № 18, ст. 1771),
ПРИКАЗЫВАЮ:
Утвердить Правила лабораторной практики в Российской Федерации
(приложение).
Министр
Ю. Л. ШЕВЧЕНКО

Приложение
УТВЕРЖДЕНО
Приказом
Министерства здравоохранения
Российской Федерации
от 19.06.2003 № 267
ПРАВИЛА ЛАБОРАТОРНОЙ ПРАКТИКИ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
I. Общие положения
1.1. Правила лабораторной практики (GLP) при проведении
доклинических исследований в Российской Федерации разработаны в соответствии с
Федеральным законом "О лекарственных средствах" № 86-ФЗ от 22.06.1998
(Собрание законодательства Российской Федерации от 29 июня 1998 г.,
№ 26, ст. 3006; от 13 января 2003 г., № 2, ст. 167; от 10 января 2000 г.,
№ 2, ст. 126; от 7 января 2002 г. (часть I), № 1, ст. 2) и Положением о
Министерстве здравоохранения Российской Федерации, утвержденным
Постановлением Правительства Российской Федерации от 29.04.2002 № 284
(Собрание законодательства Российской Федерации, 6 мая 2002 г., № 18,
ст. 1771).
1.2. Настоящие Правила устанавливают требования к организации,
планированию и проведению доклинических исследований лекарственных
средств, оформлению результатов и контролю качества.
1.3. Доклинические исследования лекарственных средств включают в
себя химические, физические, биологические, микробиологические,
фармакологические, токсикологические и другие экспериментальные
исследования с целью получения научными методами оценок и доказательств
эффективности и безопасности лекарственных средств.
1.4. Минздрав России организует и проводит государственный контроль
доклинических исследований лекарственных средств во взаимодействии с
ФГУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения"
Минздрава России, Фармакологическим комитетом Минздрава России и
иными подведомственными научно-исследовательскими организациями,
институтами, лабораториями, входящими в систему государственного
контроля качества, эффективности и безопасности лекарственных средств.
1.5. Доклинические исследования лекарственных средств проводятся
организациями-разработчиками лекарственных средств в соответствии с
настоящими Правилами. Для организации и проведения исследований
организации-разработчики могут привлекать исследовательские организации
любой формы собственности, имеющие необходимую
материально-техническую базу, квалифицированных специалистов и проводящие
доклинические исследования лекарственных средств в соответствии с настоящими
Правилами.
1.6. Заявитель обращается в ФГУ "Научный центр экспертизы средств
медицинского применения" Минздрава России и представляет комплект
документов и данных (приложение 1).
1.7. ФГУ "Научный центр экспертизы средств медицинского
применения" в срок до 30 дней организует проведение экспертизы представленных
заявителем документов и данных по проведению доклинических исследо-
- 15 -

ваний лекарственных средств, подготавливает заключение (приложение 2)
и направляет его в Минздрав России для принятия решения.
1.8. Минздрав России в течение 10 дней принимает решение о
проведении доклинических исследований лекарственных средств и доводит его до
сведения заявителя.
1.9. Минздрав России вправе отказать в проведении доклинических
исследований в случаях представления заявителем неполного комплекта
документов, необходимого для принятия решения о проведении
доклинических исследований; недостоверной информации; несоответствия основным
требованиям, предъявляемым к организациям, проводящим
доклинические исследования (состояние материально-технической базы,
квалификация сотрудников, оснащение оборудованием и др.), указанным в
соответствующих разделах настоящих Правил.
1.10. Минздрав России осуществляет периодические проверки
деятельности организаций, получивших право на проведение доклинических
исследований лекарственных средств, которые включают оценку
соответствия проведения исследования требованиям действующего
законодательства, сравнение исходных данных и заключительного отчета, анализ
результатов исследования, рассмотрение материалов архива.
1.11. Минздрав России составляет, публикует и поддерживает в
актуальном состоянии перечень организаций, осуществляющих проведение
доклинических исследований лекарственных средств в соответствии с
настоящими правилами.
II. Термины и определения
Для целей настоящего документа используются следующие термины и
определения:
Документация — записи в любой форме, которые описывают методы
проведения и/или результаты доклинического исследования, а также
факторы, влияющие на проведение исследования, и действия, совершаемые
при проведении доклинического исследования.
Материалы доклинического исследования лекарственных средств —
комплект документов доклинического изучения лекарственного средства,
включающий отчеты по химическим, физическим, биологическим,
микробиологическим, фармацевтическим, фармакологическим,
токсикологическим и другим экспериментальным научным исследованиям или
литературные данные относительно состава, показателей качества и методов
контроля качества, свойств, специфической активности и безопасности
лекарственного средства, включая протоколы доклинического изучения.
Отчет — представленные в письменной форме результаты
доклинического исследования лекарственного средства, включающие описание
доклинических и статистических методов, данные, полученные в ходе
исследования, и выводы.
Первичные данные исследования — документы, отражающие
наблюдения и манипуляции, проводимые во время исследования (записи в рабочих
листах, лабораторных журналах, фотографии и фильмы, распечатки с
автоматизированных приборов, дискеты, записи параметров окружающей
среды в комнатах содержания животных, сертификаты на животных, текущая
документация состояния здоровья животных, записи об эксплуатации и
техническом обслуживании оборудования, расчетные процедуры).
Протокол доклинического исследования — документ, который описы-
-16-

вает задачи, методологию, процедуры, методы статистической обработки
данных и организацию исследования.
Руководитель исследования — лицо, ответственное за проведение
доклинического исследования лекарственного средства.
Стандартные операционные процедуры — документы, в которых
детально изложено выполнение определенных лабораторных процедур,
которые, как правило, не детализированы в протоколах исследований и
методических руководствах (далее — СОП).
Тест-система — биологическая, химическая, физическая и
информационная системы или их комбинации, используемые при доклиническом
исследовании лекарственных средств.
III. Принципы проведения доклинических исследований лекарственных средств
3.1. Целью доклинических исследований лекарственных средств
является получение научными методами оценок и доказательств эффективности
и безопасности лекарственных средств.
3.2. Доклинические исследования лекарственных средств проводятся по
утвержденному плану с ведением протокола и составлением отчета, в
который заносятся результаты доклинических исследований лекарственных
средств.
3.3. Доклинические исследования лекарственных средств на животных
проводятся в соответствии с международными правилами. Контроль за
соблюдением правовых и этических норм использования животных при
проведении доклинических исследований лекарственных средств
осуществляется Минздравом России и территориальными органами контроля качества
лекарственных средств.
3.4. Сбор, обработка и хранение информации, полученной в ходе
доклинического исследования лекарственных средств, должны обеспечивать
точное и обоснованное представление об эффективности и безопасности
лекарственных средств и объективность данных, полученных в ходе
исследования.
3.5. Производство и хранение исследуемого лекарственного средства, а
также обращение с ним осуществляется в соответствии с правилами
организации производства и контроля качества лекарственных средств (GMP),
а использование — в соответствии с утвержденным протоколом
исследования.
3.6. Организация, проводящая доклинические исследования
лекарственных средств, должна быть укомплектована персоналом, имеющим
необходимое образование, подготовку, квалификацию и опыт работы.
3.7. Руководитель организации согласовывает протокол, назначает
руководителя исследования и ответственных лиц из числа сотрудников, не
участвующих в исследовании, для осуществления независимого контроля
качества проведения исследования, обеспечивает своевременное повышение
квалификации и подготовку персонала.
3.8. Персонал, принимающий участие в проведении исследования,
знакомится с протоколом, информацией об исследуемом лекарственном
средстве, а также с функциями и обязанностями лиц, участвующих в
исследовании.
3.9. Руководитель исследования организует, осуществляет и
контролирует: проведение доклинического исследования; выполнение протокола
исследования и поправок к нему, стандартные операционные процедуры;
-17-

обеспечение доступа персонала к материалам доклинического
исследования; соблюдение правил проведения качественных доклинических
исследований; конфиденциальность полученных результатов; ответственных
исполнителей.
3.10. Ответственные исполнители обеспечивают подготовку и
проведение ключевых этапов исследования, включая обучение персонала;
контроль соблюдения стандартных методов и процедур, сбор и
документирование полученных данных; ведение учета непредвиденных обстоятельств и
принятие мер по их устранению; представление результатов исследования
в виде отчета.
3.11. Организация-разработчик лекарственного средства выдает
заключение о возможности проведения в дальнейшем клинических
исследований лекарственного средства.
IV. Система обеспечения качества доклинических исследований
4.1. Качество проведения доклинических исследований обеспечивается
контролем со стороны руководителя исследования и независимой и
систематической проверкой документации и деятельности, относящейся к
исследованию, проводимой с целью подтверждения факта осуществления
указанной деятельности и оценки соответствия процедур сбора, обработки
и представления данных требованиям действующего законодательства,
настоящих Правил, протоколу исследования, стандартным процедурам.
4.2. Контроль качества за проведением доклинических исследований
лекарственных средств включает в себя оформление перечня исследований,
проводимых в организации, с указанием для каждого исследования
руководителя и заказчика, названия исследуемого лекарственного средства,
описания тест-системы, даты начала и состояния каждого исследования на
текущий момент времени; оценку протоколов и методов исследования на
соответствие правилам лабораторной практики; мониторинг текущих
исследований; отчет о проведенных проверках и рекомендации по
устранению недостатков.
4.3. Для осуществления контроля качества руководство организации,
проводящей доклинические исследования лекарственных средств, должно
назначить в соответствии с правилами лабораторной практики
ответственных лиц за мониторинг исследования из числа сотрудников, не
участвующих в исследовании.
4.4. По результатам мониторинга оформляется заключение о ходе
проведения доклинического исследования, которое доводится до сведения
руководства организации и руководителя исследования, а в случае
выявления недостатков и нарушений представляются рекомендации по их
устранению.
V. Помещения
5.1. Помещения, предназначенные для проведения доклинических
исследований лекарственных средств, должны располагаться,
проектироваться, приспосабливаться и эксплуатироваться таким образом, чтобы
обеспечить качественное выполнение проводимых исследований. Для
экспериментальных исследований обязательно наличие вивария.
5.2. Помещения для экспериментальных животных должны:
-18-

5.2.1. Обеспечивать изоляцию (карантин) поступающих животных,
больных животных и животных, подозреваемых в носительстве инфекций;
5.2.2. Позволять раздельное содержание различных видов животных и
животных одного вида, являющихся объектом исследования различных
лекарственных средств;
5.2.3. Соответствовать требованиям санитарно-эпидемиологического и
ветеринарного законодательства.
5.3. Корма, оборудование и инвентарь для ухода за животными
необходимо хранить в помещениях, изолированных от мест содержания
животных. Помещения для проведения доклинических исследований
лекарственных средств, в том числе для работы с опасными для здоровья и жизни
человека объектами исследования, должны соответствовать установленным
санитарно-гигиеническим правилам.
VI. Оборудование
6.1. Организации, проводящие доклинические исследования
лекарственных средств, должны быть оснащены необходимым оборудованием,
прошедшим метрологический контроль и калибровку в установленном
порядке.
6.2. Эксплуатация оборудования проводится в соответствии с
техническим паспортом и инструкцией по применению. Результаты проведения
профилактических осмотров оборудования и текущего ремонта
фиксируются в специальном журнале, доступном в любое время сотрудникам,
эксплуатирующим оборудование или обеспечивающим его
обслуживание, и содержащем следующие сведения: наименование прибора,
производителя, страны происхождения производителя, модель прибора,
серийный (заводской) номер, дата получения и постановки на учет в
лаборатории, дата запуска в эксплуатацию, инвентарный номер, место
расположения прибора, сотрудник, ответственный за использование прибора,
сотрудник (подразделение, организация), ответственный за техническое
обслуживание прибора, детальные записи о плановом обслуживании
оборудования, датированные и заверенные подписью ответственного лица,
детальные записи о любых повреждениях, отказах, ремонте прибора,
датированные и заверенные подписью сотрудника (лица), ответственного
за техническое состояние прибора, детальные записи о калибровке
прибора, датированные и заверенные подписью лица, ответственного за
обслуживание прибора.
VII. Тест-системы
7.1. Вид, размер и характеристики тест-систем должны соответствовать
категориям доклинических исследований лекарственных средств. Условия
проведения исследований на тест-системах должны исключать воздействие
внешних факторов, способных повлиять на качество получаемых данных.
7.2. Доклинические исследования проводятся на здоровых животных.
Все процедуры, связанные с уходом за животными (кормление, поение,
смена подстилки, пересаживание, мытье клеток, уборка помещений, в
которых содержатся животные), описываются в стандартных операционных
процедурах.
7.3. Вновь прибывших животных изолируют для оценки состояния их
-19-

здоровья. Источники поступления, условия и дата поступления должны
быть документально оформлены. В случае ухудшения состояния здоровья
животных и их гибели, не связанных с проведением доклинического
исследования, указанных животных необходимо изолировать от основной
группы и подвергнуть, при необходимости, лечению, если это допускается
протоколом исследования, или гуманному умерщвлению. Диагноз, лечение
и его результаты должны быть документированы.
7.4. Для обеспечения индивидуального наблюдения в процессе
выполнения исследования животные должны быть идентифицированы. Способ
идентификации животного документируется. Все клетки, вольеры,
контейнеры, предназначенные для содержания животных, также подлежат
маркировке. Животные, предназначенные для исследования различных
лекарственных средств, пространственно изолируются друг от друга.
7.5. Корма и вода для животных должны обеспечивать пищевые
потребности в соответствии с протоколом исследования, быть свободными от
патогенных микроорганизмов и вредных примесей и не должны влиять на
результаты исследования.
7.6. Места содержания животных и производственные помещения
подвергаются периодической санитарной обработке, не оказывающей влияния
на результаты исследования.
VIII. Исследуемые и стандартные препараты
8.1. Физическое или юридическое лицо, независимо от форм
собственности, которое является инициатором проведения доклинического
исследования лекарственного средства и отвечает за его организацию (далее —
заказчик), предоставляет в организацию, проводящую доклинические
исследования лекарственных средств, исследуемое лекарственное средство,
необходимую документацию, с указанием температурного режима, условий
и сроков храпения исследуемого препарата, данные по стабильности,
информацию о мерах по обеспечению безопасности работы с исследуемым
препаратом, растворители и процедуры растворения, а также, если
необходимо, устройства для введения препарата.
8.2. Исследуемое лекарственное средство должно иметь упаковку для
защиты при транспортировке от загрязнения или порчи.
8.3. Организация, проводящая доклиническое исследование, должна:
8.3.1. Иметь утвержденный порядок приема и учета поступления
лекарственного средства.
8.3.2. Проводить учет лекарственных средств при поступлении,
расходовании, возврате заказчику или их утилизации.
8.3.3. Принимать меры по обеспечению идентификации исследуемых и
стандартных веществ (этикетка с указанием названия, химической
формулы, номера серии, даты выпуска, условий хранения и сроков годности) и
их стабильности на протяжении всего исследования.
8.3.4. Хранить исследуемое лекарственное средство отдельно от
веществ, реактивов, препаратов сравнения в соответствии с рекомендациями
заказчика, с соблюдением условий хранения, указанных производителем, в
течение всего срока годности.
-20-

IX. Стандартные операционные процедуры
9.1. Стандартные операционные процедуры разрабатываются на все
производственные операции, включая: поступление, идентификацию,
маркировку, обработку, отбор проб, использование и хранение исследуемых и
стандартных веществ; обслуживание и калибровку измерительных
приборов и оборудования для контроля окружающей среды; приготовление
реактивов, питательных сред, кормов; ведение записей, отчетов и их
хранение; обслуживание помещений, в которых содержатся тест-системы;
прием, транспортировку, размещение, описание, идентификацию и уход за
тест-системами; обращение с тест-системами; обезвреживание или
утилизация тест-системы; осуществление программы по обеспечению качества.
9.2. Соблюдение стандартных операционных процедур осуществляется в
целях обеспечения качества, достоверности и воспроизводимости
результатов исследования.
9.3. Отклонения от СОП должны быть документально оформлены и
согласованы с руководителем исследования. Стандартные операционные
процедуры подлежат своевременному пересмотру.
X. Планирование и проведение исследований
10.1. Доклиническое исследование лекарственных средств должно
проводиться в соответствии с протоколом, отражающим цели работы и
методы, используемые для достижения этих целей. Протокол исследования
должен быть одобрен заказчиком и утвержден руководителем
исследования.
10.2. Протокол включает в себя:
10.2.1. Цель исследования;
10.2.2. Задача исследования;
10.2.3. Сведения об исследуемом лекарственном средстве (физические,
химические, биологические, фармацевтические свойства);
10.2.4. Сведения о препарате сравнения (физические, химические,
биологические, фармацевтические свойства);
10.2.5. Используемые методы исследования;
10.2.6. Описание используемой в исследовании тест-системы;
10.2.7. Способы и пути введения исследуемого препарата и препарата
сравнения;
10.2.8. Схема исследования, обоснование избранной схемы
исследования;
10.2.9. Этические и правовые нормы доклинического исследования;
10.2.10. Оценка эффективности и безопасности исследуемого препарата;
10.2.11. Поправки к протоколу доклинического исследования;
10.2.12. Статистическая обработка результатов исследования;
10.2.13. Составление отчета;
10.2.14. Литература.
10.3. Вносимые изменения в протокол исследования утверждаются
руководителем исследования, а отклонения от протокола
(незапланированные события, непредвиденные обстоятельства, упущения) записываются,
пронумеровываются, подписываются, датируются в приложении с
указанием причин.
- 21 -

XI. Записи результатов исследования
11.1. В организации, проводящей доклинические исследования, должны
сохраняться все исходные данные, результаты измерений и наблюдений,
вычислений и преобразования данных, записи о калибровке оборудования,
отчеты (в том числе промежуточные), а также другие материалы и
документы, имеющие непосредственное отношение к данному исследованию.
11.2. Данные, образцы, навески и т. д. должны иметь индивидуальный
шифр, позволяющий однозначно идентифицировать исследование,
использовавшийся тест, метод, вид исследования, и биологическую систему,
и ссылку на сотрудников лаборатории, принимавших участие в получении
данных или образцов, в подготовке или проведении исследования.
11.3. Первичные данные, полученные в ходе исследования, должны
быть немедленно зарегистрированы, подписаны и датированы, не
допускается их уничтожение, подмена или перезапись. Данные на электронных
носителях по возможности дублируются в бумажном варианте.
11.4. Исправления первичных данных оформляются в виде дополнений,
которые подписываются и датируются ответственными исполнителями, с
указанием причин ошибок.
11.5. Материалы исследования должны позволять восстановить ход
исследования. После проведения доклинического исследования материалы
передаются в архив. Условия архива должны обеспечивать безопасное и
конфиденциальное хранение всех материалов исследования.
XII. Отчет о проведенных исследованиях
12.1. Заявитель в течение 30 дней после окончания проведения
доклинического исследования лекарственного средства представляет в ФГУ
"Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Минздрава
России, Фармакологический комитет Минздрава России отчет о
проведенном исследовании.
12.2. В отчете о доклиническом исследовании лекарственного средства
должны быть представлены:
12.2.1. Название, адрес организации, даты начала и завершения
доклинических исследований, цель и задачи исследования.
12.2.2. Описание исследуемого лекарственного средства, включая
сведения о физических, химических, биологических, фармацевтических
свойствах, составе лекарственной формы.
12.2.3. Вид исследования, характеристика и обоснование тест-системы,
отобранной для проведения доклинических исследований.
12.3. В случае проведения экспериментальных исследований на
животных необходимо указать:
12.3.1. Вид, возраст, количество животных в каждой группе, пол,
показатели массы тела, источник питания.
12.3.2. Режим дозирования, кратность и путь введения исследуемого
лекарственного средства.
12.3.3. Схема проведения доклинического исследования лекарственного
средства.
12.3.4. Описание методов статистической обработки результатов,
результаты исследования, представленные в виде обобщающих таблиц
(графиков) с соответствующей статистической обработкой, и комментариев к
ним, обсуждение результатов, выводы.
- 22 -

12.4. Отчет о результатах проведения доклинических исследований
составляется руководителем исследований, подписывается руководителем
организации и скрепляется печатью организации.
12.5. Дополнения к отчету должны быть оформлены в виде
приложений, содержащих ссылку на соответствующий раздел отчета (параграф,
рисунок, таблицу и т. д.) и подписанных руководителем организации.
12.6. ФГУ "Научный центр экспертизы средств медицинского
применения" Минздрава России, Фармакологический комитет Минздрава России в
срок до 30 дней рассматривают представленные материалы и направляют
заключение в Минздрав России.
XIII. Конфиденциальность
13.1. Сотрудники, принимающие участие в проведении доклинического
исследования, обязаны соблюдать конфиденциальность в отношении
любых данных, полученных в ходе исследования, в соответствии с
законодательством Российской Федерации.
13.2. Организация, проводящая доклинические исследования
лекарственных средств, должна обеспечить конфиденциальность результатов
исследований в рамках принятых ею обязательств и в соответствии с
законодательством Российской Федерации.
XIV. Архив
14.1. После завершения доклинического исследования все
экспериментальные данные, образцы, протокол исследования и другая документация
(калибровочные графики, методики, стандартные операционные
процедуры и т. д.), включая отчет и данные независимой проверки, должны
храниться в отдельных помещениях, специально выделенных для этих целей.
Архивные помещения должны иметь ограниченный доступ.
14.2. Материалы, помещенные в архив, должны быть обозначены в
соответствии с порядком хранения для быстрого поиска. Срок хранения
архивных материалов определяется порядком, установленным организацией.
14.3. Образцы исследуемого и стандартного веществ должны храниться
в течение времени, которое гарантирует их качество. Функции по
архивированию и поддержанию архива должны быть возложены на специальных
сотрудников организации, проводящего доклинические исследования.
14.4. Руководители организаций, проводящих доклинические
исследования, должны известить заказчиков об уничтожении любых материалов,
хранящихся в архивах, а также о реорганизации и/или ликвидации
организации и структурных подразделений, принимающих непосредственное
участие в проведении доклинических исследований.

Приложение № 1
к Правилам
лабораторной практики
в Российской Федерации
ЗАЯВЛЕНИЕ
на проведение доклинических исследований
лекарственных средств
(название организации, адрес, реквизиты)
просит разрешить проведение доклинических исследований
(вид исследования)
Руководитель подразделения
(Ф. И. О., ученая степень, ученое звание, должность)
Вид доклинических исследований лекарственных средств
1. Токсикологические:
— острая токсичность;
— подострая, субхроническая, хроническая токсичности;
— кумулятивное действие;
— местнораздражающее действие;
— аллергенность;
— иммунотоксичность;
— тератогенность;
— мутагенность;
— эмбриотоксичность;
— гонадотоксичность;
— канцерогенность;
— пирогенность.
2. Общефармакологические.
3. Специфические фармакологические (необходимо указать клинико-фар-
макологическую группу).
4. Фармакокинетические.
5. Химические, физические, биологические, микробиологические и
другие доклинические исследования.
Руководитель организации
(Подпись)
" " 200 г.

Список сотрудников для участия в проведении доклинических исследований
лекарственных средств
№ п/п
1
Ф. И. 0.
2

Должность
3
Образование
(специальность, учебное
заведение, год
окончания)
4
Вид
доклинического
исследования
5
Стаж работы
по профилю
исследования
6

Примечание
7
Руководитель организации
(Подпись)
" " 200 г.
Справка о состоянии производственных помещений для проведения
доклинических исследований лекарственных средств
Назначение
помещения
1
Специальное
или
приспособленное
2
Площадь, кв.
м
3
Температура,
град. С,
влажность, %
4
Наличие
специального
оборудования
5
Примечание
6
Руководитель организации
(Подпись)
"_" 200_ г.
Оборудование и аппаратура, имеющиеся в организации для проведения
доклинических исследований лекарственных средств
№ п/п
1

Наименование, тип
(марка),
заводской
номер
2

Изготовитель
(страна,
предприятие,
фирма)
3

Основные
технические

характеристики
4
Год
ввода в


плуатацию
5
Оценка
состояния (№
свидетельства
метрологической проверки,
периодичность)
6

Степень

амортизации,
%
7

Примечание
8
Руководитель организации
(Подпись)
" " 200 г.
Лабораторные животные и условия их содержания
Вид
Порода
Пол
Масса тела
-25-

Общее количество
Источник получения
Период акклиматизации
Идентификация
Рандомизация
Количество животных в клетке
Размеры клетки
Материал клетки
Рацион
Температура воздуха
Влажность воздуха
Руководитель организации
(Подпись)
200 г.
Перечень методов, используемых при проведении доклинических исследований
лекарственных средств
№ п/п
1
Название метода
2
Ссылка на литературный источник
3
Руководитель организации
(Подпись)
200 г.
Перечень стандартных операционных процедур
№ п/п
Название стандартной операционной процедуры
Руководитель организации
(Подпись)
200 г.

Приложение № 2
к Правилам
лабораторной практики
в Российской Федерации
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
о проверке организации, заявляемой для осуществления
доклинических исследований лекарственных средств
(наименование организации)
(дата составления акта)
(город)
В период с по 200_ г. на основании
(название, номер и дата документа о проведении проверки)
Комиссия в составе председателя
(Ф. И. О., должность, место работы)
и членов комиссии
(Ф. И. О., должность, место работы)
провела проверку с целью
При проверке установлено:
Оценка технической компетентности организации
1
1. Квалификация и опыт работы персонала в заявленной области
доклинических исследований, состояние работы по повышению квалификации
2. Условия размещения персонала, оборудования, тест-систем
3. Оснащенность и состояние оборудования
4. Характеристика тест-систем
5. Наличие и эффективность системы обеспечения качества
доклинических исследований лекарственных средств
6. Научно-методическое обеспечение проведения доклинических
исследований лекарственных средств
Заключение
комиссии
2
Комиссия рекомендует
(замечания и рекомендации по устранению
недостатков и совершенствованию работы организации)
Заключение
Председатель комиссии
(подпись)
Члены комиссии
(подпись)
С актом ознакомлен:
Руководитель организации
(подпись)
Дата
-27-

Глава II
ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Методические рекомендации по инспектированию лаборатории
(организации, выполняющей доклинические исследования)
СОСТАВИТЕЛИ: к. б. н. Т. А. Заргарова;
к. б. н. А. Н. Мурашев; член-корр. РАМН, проф.
Т. А. Гуськова; проф. В. Б. Герасимов; к. м. н.
О. Г. Аксенова; проф. Р. И. Ягудина
Схема-вопросник по инспектированию лаборатории (организации)
Название организации:
Адрес:
Дата инспекции:
Представитель СКК:
До проведения инспекции следует ознакомиться со следующими
документами:
• Протоколы исследований, проводимых в организации
• Отчеты о предыдущих инспекциях организации
• Организационная схема
• План здания
• СОП/список СОП, включая СКК
• Относящиеся к делу правила и инструкции
• Личные дела сотрудников/описание служебных
обязанностей/документация обучения
• Каталог испытаний
• Документы о сертификации, аккредитации и т. д. организации
Организация и персонал
А. Организационная структура
• Имеется ли в наличии организационная схема?
• Отражает ли схема субординацию должным образом?
• Насколько она точная?
• Датирована ли она?
• Указана ли на схеме Служба Контроля Качества?
• Указан ли на схеме архивариус?
• Имеются ли исторические копии схемы?
-28 -

В. Каталог испытаний
• Имеется ли в наличии Каталог Испытаний?
• Содержит ли он следующую информацию:
— тест система
— тип исследования
— дата начала исследования
— текущий статус
— имя спонсора
— имя руководителя исследования
• Индексирован ли Каталог по тестируемым веществам?
• Сохраняются ли старые Каталоги?
C. Личные дела/Служебные обязанности сотрудников
• Имеются ли в наличии личные дела/описание служебных
обязанностей для:
— персонала, участвующего в исследовании
— архивариуса
— персонала СКК
• Не устарели ли эти документы?
• Датированы ли они?
• Сохраняются ли старые версии документов?
• Сохраняются ли документы персонала, сменившего место работы?
• Определены ли лица, замещающие ключевой персонал в экстренных
случаях?
D. Записи обучения персонала
• Имеются ли в наличии записи обучения персонала?
• Указаны ли даты прохождения обучения и имя инструктора?
• Кто ведет записи обучения?
• Как часто эти записи проверяются?
• Существует ли программа обучения новых сотрудников?
• Существует ли текущая программа обучения для персонала?
• Кто проводит обучение?
• Достаточны ли квалификация и опыт инструкторов?
• Документируется ли обучение правилам GLP?
• Как часто проводится обучение правилам GLP?
• Документируется ли обучение СОП (включая новые версии)?
• Выглядит ли персонал должным образом обученным?
E. Персонал
• Имеется ли в наличии достаточно сотрудников для проведения
исследований согласно протокола?
• Используется ли персонал со стороны, работающий по контракту?
— уведомляется ли в этом случае спонсор?
• Достаточно ли часто меняется спец. одежда, чтобы предотвратить
кросс-контаминацию?
• Поддерживается ли на должном уровне персональная гигиена и
охрана здоровья персонала?
• Разработаны ли правила техники безопасности для персонала?
• Обучены ли должным образом временные сотрудники?
— документировано ли это обучение?
-29-

F. Менеджмент
• Назначает ли руководителя исследования до начала работ?
• Существует ли процедура быстрого назначения и смены руководителя
исследования?
• Обеспечивает ли наличие СКК?
• Обеспечивает ли, чтобы тестируемое, контрольное вещества и
вещество сравнения были должным образом протестированы на
идентичность, активность, чистоту, стабильность?
• Обеспечивает ли наличие соответствующего персонала, ресурсов,
помещений, оборудования, материалов и методик?
• Способствует ли тому, чтобы персонал четко понимал свои
обязанности?
• Обеспечивает ли принятие коррективных мер и их документацию
руководителем исследования в ответ на замечания СКК?
G. Руководитель исследования
• Несет ли руководитель исследования всю полноту ответственности за
данное исследование и является ли он единственным пунктом
контроля исследования?
— Расписывается в журнале исследования?
— Подписывает документированные отклонения от СОП и
протокола?
— СОП руководителя исследования?
• Разработана ли процедура для составления и утверждения протокола
исследования?
• Следит ли руководитель исследования за тем, чтобы протокол и
дополнения к нему были должным образом утверждены и
выполнялись?
• Следит ли руководитель исследования за тем, чтобы все данные, а
также непредвиденные обстоятельства должным образом
документировались и утверждались?
• Документирует ли руководитель исследования непредвиденные
обстоятельства, которые могут повлиять на результаты исследования?
— документировано ли возможное влияние на исследование?
• Следит ли руководитель исследования за принятием и
документированием необходимых коррективных мер?
• Следит ли он за соблюдением требований GLP?
• Следит ли за тем, чтобы все первичные данные, документация,
протоколы, образцы, отчеты были переданы в архив во время или по
завершению исследования?
• Документирует ли руководитель исследования свое участие в
проведении работ в "Журнале руководителя исследования?"
• Ведутся ли записи рабочих переговоров?
• Имеет ли руководитель исследования в своем распоряжении
документацию необходимых характеристик тестируемого вещества
(активность и т. д.)?
• Знакомит ли руководитель исследования персонал с их
обязанностями?
• Знаком ли руководитель исследования с обязанностями спонсора?
Н. Служба контроля качества
• Существует ли в организации независимая СКК?
-30-

— кому она подотчетна?
• Размещается ли СКК на территории организации?
• Сколько сотрудников в СКК?
• Какова периодичность подачи отчетов СКК менеджменту?
• Работает ли СКК в соответствии с СОП?
• Имеет ли СКК СОП, описывающие:
— внутренние и внешние инспекции организации
— обучение персонала СКК
— обязанности и ответственность персонала СКК
— индекс СОП СКК
— своевременный доклад о проблемах
— документацию СКК
— проверку первичных данных и отчетов
— архивирование документов СКК
— ответственность при выполнении субконтрактных работ
• Осуществляет ли СКК периодические инспекции организации? Как
часто?
• Инспектирует ли СКК компьютерную систему?
— валидацию программного обеспечения
— компьютеры
• Инспектирует ли СКК критические фазы каждого исследования?
• По какому принципу выбираются критические фазы?
• Содержат ли отчеты СКК следующую информацию:
— дата инспекции
— обнаруженные проблемы
— номер исследования
— фаза исследования
— имя инспектора
— дата подачи отчета руководителю исследования, менеджменту
• По какому принципу группируются документы СКК?
• Имеются ли в СКК копии всех протоколов и их изменений?
• Где и как архивируются документы СКК?
• Ведет ли СКК "Каталог испытаний"? Сохраняет ли прежние каталоги
в архиве?
• Каким образом СКК извещается о новом исследовании?
• Документирует ли СКК инспекции:
— протокола
— отчета контрактной организации
— изменений протокола
— заключительного отчета
— экспериментальной части
— первичных данных
— организации в целом
• Отслеживает ли СКК ответные меры по своим замечаниям?
• Содержит ли Заявление СКК:
— даты инспекций
— проинспектированные фазы исследования
— даты отчета об инспекциях менеджменту, руководителю
исследования
• Доступны ли для инспекции представителями регуляторных
организаций резюме отчетов СКК, содержащие информацию о:
— даты инспекций
— проинспектированные фазы исследования
-31 -

— номер исследования
— имя инспектора
Здания и помещения
I. План здания
• Имеется ли в наличии план здания?
• Достаточно ли он подробный?
• Имеется ли в наличии карта территории организации?
• Сохраняются ли датированные, исторические копии этих
документов?
J. Общие вопросы
• Проводится ли аккредитация, сертификация и инспектирование
организации?
— кем и как часто?
• Все ли исследования проводятся в соответствии с правилами GLP?
• В случае проведения исследований GLP и не- GLP статуса, как
достигается их разграничение?
• Существует ли процедура инспекции организации государственными
органами?
— уведомляется ли спонсор о подобных инспекциях?
— были ли замечания и какие меры были приняты?
— посылается ли спонсору письменный отчет?
• Позволяют ли размеры и планировка здания и помещений проводить
исследования должным образом?
• Приняты ли меры для ограничения возможного негативного влияния
на исследования?
• Достаточно ли развита система безопасности для обеспечения
конфиденциальности и сохранности первичных данных, отчетов и т. д.?
• Поддерживается ли в здании чистота и порядок?
• Как работает парогенератор для увлажнения комнат содержания
животных?
— как оценивается потенциальная токсичность используемых
химикатов?
• Как обеспечивается защита здания от пожаров?
• Существует ли программа защиты здания от вредителей?
— проводится ли специальная обработка помещений?
— нет ли следов присутствия насекомых?
— определены ли и документированы ли инсектициды/методы
обработки?
— одобрено ли применение инсектицидов менеджментом?
— документируется ли периодическая обработка помещений?
• Размещены ли на видном месте контактные номера телефонов на
экстренный случай?
• Имеет ли организация аккредитацию AAALAC?
• Имеет ли аккредитацию AAALAC технический персонал,
работающий с животными?
• Имеется ли в организации IACUC?
— разработаны ли процедуры для IACUC?
— рассматриваются ли протоколы-заявки на животных для каждого
исследования?
-32-

— есть ли в IACUC лицо, уполномоченное выдавать разрешение на
проведение повторяющихся исследований?
К. Помещения, предназначенные для содержания и работы с животными
• Достаточно ли в организации комнат содержания животных для того,
чтобы:
— содержать отдельно разные виды животных
— обеспечить процедуру карантина
— изолировать отдельные проекты
• Существуют ли изолированные помещения для проведения
исследований с радиоактивными, летучими веществами, аэрозолями,
инфекционными агентами?
• Существуют ли помещения для изоляции и лечения больных
животных?
• Достаточна ли изоляция подобных помещений?
• Существуют ли помещения для временного хранения отходов?
• Оборудованы ли эти помещения должным образом для
предотвращения загрязнения окружающей среды, распространения запаха,
защиты от вредных насекомых?
• Каким образом осуществляется процедура поддержания условий
окружающей среды (температуры, влажности, светового цикла) в
соответствии с протоколом?
• Ведется ли документация условий окружающей среды?
• Одобрены ли менеджментом организации чистящие и
дезинфицирующие средства, применяемые в комнатах содержания животных?
L. Хранилище вспомогательных материалов
• Существуют ли специальные помещения для хранения
— корма
— подстила
— клеток и аксессуаров
— оборудования
• Изолированы ли хранилища корма и подстила от комнат содержания
животных?
• Защищены ли хранилища корма и подстила от вредителей и
загрязнений?
• Хранятся ли корм и подстил на специальных поддонах или полках,
приподнятых над полом и отодвинутых от стен?
• Хранятся ли должным образом скоропортящиеся материалы?
М. Провизорские
• Существуют ли отдельные площади, позволяющие предотвратить
загрязнение и путаницу, для:
— получения и хранения тестируемого, контрольного веществ и
вещества сравнения
— смешивания этих веществ с носителем и хранения смесей
• Изолированы ли эти помещения от комнат, где размещена
тест-система?
• Соблюдаются ли условия для поддержания сохранности
характеристик веществ и их смесей?
• Имеет ли организация лицензию для работы с контролируемыми
веществами?
— не просрочена ли лицензия?
2-762
-33-

N. Лабораторные помещения
• Существуют ли отдельные помещения для проведения рутинных и
специализированных процедур, таких как асептическая хирургия,
некропсия, гистология и т. д.?
• Существуют ли помещения, предназначенные для мытья и
санитарной обработки лабораторной посуды и оборудования?
• Существуют ли помещения с поддерживаемыми условиями среды для
проведения компьютеризированных операций?
О. Архив
• Существует ли архив, позволяющий упорядоченно хранить и быстро
извлекать первичные данные?
• Имеются ли адекватные площади для хранения:
— документации
— образцов
• Существует ли лицо, ответственное за архив — архивариус?
• Назначен ли сотрудник, заменяющий его в непредвиденных случаях?
• Ограничен ли доступ в архив?
• Заперто ли помещение архива в нерабочие часы или во время
отсутствия архивариуса?
• Соблюдаются ли условия хранения документации и образцов,
предотвращающие их порчу?
• Используются ли другие архивы на контрактной основе?
• Если материалы хранятся в другом месте, есть ли в главном архиве
ссылка на это?
• Существует ли система индексации материалов, хранящихся в
архиве?
• Существует ли СОП, посвященная системе индексации?
• Существует ли процедура для добавления и извлечения материалов из
архива?
• Определены ли сроки хранения документов и образцов в архиве?
— не менее 2 лет с момента одобрения заявки на производство
лекарственного средства
— не менее 5 лет с момента подачи результатов исследования в
регулирующее агентство в поддержку заявки на производство
лекарственного средства
• Существует ли система, позволяющая отслеживать временное
местонахождение документа/образца?
• Поддерживается ли в архиве чистота и порядок?
• Имеются ли в наличии детекторы дыма и сигнализация?
• Защищен ли архив от пожаров/затопления?
• Отслеживается ли температурный режим?
• Идентифицированы ли все первичные данные?
• Адекватно ли сохраняются электронные данные?
• Позволяет ли система индексации получить доступ к электронным
данным?
• Определите, как и где хранятся оригинальные электронные данные и
их резервные копии?
-34-

Оборудование
Р. Дизайн оборудования
• Имеет ли оборудование, используемое для производства, измерения и
обработки данных подходящий дизайн и необходимую мощность для
выполнения задач согласно протокола?
• Имеет ли оборудование, используемое для контроля условий
окружающей среды подходящий дизайн и необходимую мощность для
выполнения задач согласно протокола?
• Позволяет ли расположение оборудования производить необходимые
операции, инспектирование, чистку и профилактику?
Q. Профилактика и калибровка оборудования
• Производится ли должным образом инспекция, чистка и
профилактика оборудования?
• Производится ли должным образом тестирование, калибровка и/или
стандартизация оборудования, используемого для производства,
измерения и обработки данных?
• Существуют ли СОП на каждую единицу оборудования,
используемого для производства, измерения и обработки данных?
• Прошло ли оборудование процесс валидации/верификации?
• Определяют ли процедуры рутинной инспекции, чистки,
профилактики, калибровки и/или стандартизации:
— используемые методы
— меры на случай поломки
— материалы
— лицо, ответственное за каждую операцию
— последовательность действий
— приемлемый диапазон калибровки
— расписание рутинной инспекции и профилактики (временные
рамки)
— архивирование документации
• Легко ли доступны СОП на оборудование для лабораторного
персонала?
• Регистрируются ли должным образом показатели воздухообмена,
очистки воды, светового цикла и т. д.)?
• Проверяется ли периодически исправность резервных систем
(сигнализации и т. д.)?
• Документируются ли регулярно инспекции, профилактика,
тестирование, калибровка и/или стандартизация?
• Содержат ли эти документы:
— дату операции
— определение операции как рутинной или не рутинной
— описание операции
— указание на применение соответствующей СОП
— документация не рутинной операции должна содержать
следующую информацию: природа дефекта, кем и когда дефект
обнаружен, принятые меры
— в случае неисправности, дается ли оценка возможного влияния на
результаты исследования?
2*
-35-

R. Специальное оборудование
Весы
• Как часто сертифицируются весы и разновесы?
• Как часто оборудование калибруется?
• Какой диапазон и тип разновесов используется?
• Покрывает ли диапазон калибровки предполагаемые
экспериментальные значения?
• Заполняются ли своевременно журналы оборудования?
Холодильники, морозильные камеры, инкубаторы
• Содержатся ли в чистоте и порядке?
• Идентифицирован ли каждый прибор?
• Регистрируется ли температура постоянно?
• Используется ли для мониторинга каждой единицу оборудования
сертифицированные стандарты?
• Имеются ли запасные генераторы?
• Предусмотрена ли аварийная сигнализация в случае неисправности?
• Регистрируются ли отклонения от нормальной работы в
документации исследования?
• Разработана ли процедура на случай срабатывания сигнализации?
• Извещается ли персонал в случае нарушения температурного
режима?
• Как часто размораживаются морозильные камеры?
• Описаны ли в СОП допустимые границы температур?
Компьютерные системы
• Существует ли письменное описание компьютерных систем?
• Имеется ли руководство пользователя?
• Валидировано ли программное обеспечение?
• Имеется ли в наличии план валидации?
• Документируется ли выполнение плана валидации?
• Существует ли процедура защиты компьютерной системы в случае
сбоя в энергоснабжении?
• Существуют ли процедуры и документация на случай изменения
системы?
— оценка изменений
— данные теста
— необходимый дизайн теста
— окончательное принятие изменений
• Существует ли контроль изменений для первичных данных?
• Существует ли оценка тестовых данных для подтверждения точности
переноса и правильности обработки данных в случае, когда
аналитическое оборудование подключено непосредственно к компьютеру?
• Существует ли определение первичных данных?
• Сохраняются ли исторические версии устаревших или
модифицированных компьютерных программ?
• Разработана ли система сбора данных в случае недоступности
компьютерной системы?
Хроматографические системы (ВЭЖХ, ГХ)
• Разработана ли программа профилактики?
• Документируются ли рутинные замены мелких частей прибора?
• Какие тесты используются для подтверждения того, что после
профилактических или коррективных действий оборудование работает
надлежащим образом?
-36-

• Какие методы валидации используются:
— никакие
— контрольные образцы
— профессиональное тестирование приглашенным специалистом
• Где документируются параметры для оценки хроматографической
системы?
— описание аналитического метода
— СОП
Рабочие процедуры
S. Стандартные операционные процедуры
• Имеются ли в организации СОП?
• Содержат ли СОП датированную подпись менеджера?
• Сохраняются ли исторические версии СОП?
• Разработана ли процедура ознакомления персонала с СОП и
документация этого?
• Разработана ли процедура периодического пересмотра СОП и
документация этого?
• Достаточно ли подробны СОП?
• Легко ли доступны СОП?
• Отражают ли СОП текущие процедуры?
• Имеется ли датированный полный список СОП?
• Указана ли причина пересмотра СОП?
• Имеются ли СОП, описывающие:
— подготовку помещений для животных
— уход за животными: размещение, кормление, обращение
— обращение с тестируемым, контрольным веществами и веществом
сравнения: получение, идентификация, хранение, смешивание и
т. д.
— наблюдение за тест-системой
— лабораторные тесты
— обращение с умирающими или преждевременно умершими
животными
— некропсию
— сбор и идентификацию образцов
— гистопатологию
— обращение с данными, их хранение
Т. Аналитические методы
• Имеются ли методики в письменном виде, формально валидирован-
ные и утвержденные?
• Документируются ли отклонения от методик с объяснениями?
• Существует ли руководство для проведения повторных анализов?
• Существует ли СОП по разработке и утверждению аналитических
методик?
• Существуют ли предписания для внешних программ Системы
Качества или профессионального тестирования?
• Определяется ли стабильность при замораживании/оттаивании?
• Существуют ли первичные данные в поддержку отчета о валидации?
-37-

U. Реактивы и растворы
• Содержат ли этикетки реактивов следующую информацию:
— идентификация
— условия хранения
— концентрация/титр
— срок годности
• Застрахованы ли исследования GLP статуса от использования
испорченных или просроченных реактивов?
• Существует ли в лаборатории четкое разделение реактивов для
исследований GLP и не- GLP статуса?
• Должным ли образом хранятся реактивы/растворы?
V. Образцы
• Ведутся ли записи получения образцов?
— документируются ли особые условия (поврежденный, оттаявший и
т. д.)
• Разработана ли система получения и хранения образцов в выходные
дни?
• Ведутся ли записи условий хранения, если ситуация критическая?
• Подписаны ли этикетки должным образом, чтобы предотвратить
путаницу?
— номер исследования
— номер животного
— дата получения образца
— содержимое
• Ведутся ли записи о перемещении или уничтожении образцов?
• Определен ли период хранения образцов?
• Отслеживается ли и документируется ли прохождение образцов на
протяжении исследования?
• Определена ли система поочередной ответственности за образцы?
W. Обращение с животными
• Разработаны ли процедуры размещения, кормления и ухода за
животными?
• Изолируются ли животные, прибывшие от внешних поставщиков?
— документируется ли информация о поставщиках животных?
• Ведутся ли записи в период карантина?
• Определяет ли ветеринар статус здоровья новоприбывших животных?
• Принимает ли ветеринар участие в выдаче животных для
исследований?
• Ведутся ли записи состояния здоровья резервных животных,
запланированных для участия в исследованиях GLP статуса?
• Используются ли в исследованиях животные, свободные от
заболеваний, способных повлиять на результаты исследования?
• Существует ли система изоляции животных, заболевших во время
исследования?
• Есть ли гарантии того, что лечение заболевших животных не
повлияет на результаты исследования?
• Документируется ли лечение заболевших животных?
• Документируется ли и сохраняется ли в дальнейшем следующая
информация о заболевших животных?
— диагноз
-38-

— утверждение предписанного лечения
— курс лечения
— даты применения лечебных процедур
• Идентифицируются ли в индивидуальном порядке все теплокровные
животные (за исключением новорожденных грызунов)?
• Находится ли вся информация, необходимая для идентификации
каждого животного снаружи на его клетке?
• Содержатся ли в разных помещениях животные разных видов?
• Содержатся ли в разных помещениях животные, задействованные в
разных исследованиях?
• Если необходимо совместное содержание животных, достигается ли
адекватное разделение за счет системы идентификации и
разграничения пространства?
• Производится ли мытье и санитарная обработка клеток, стеллажей и
аксессуаров через определенные промежутки времени?
— соблюдаются ли эти временные интервалы?
• Производится ли периодически микробиологический анализ для
подтверждения эффективности санитарной обработки?
• Анализируется ли периодически корм на вредные примеси,
способные повлиять на результаты исследования?
• Анализируется ли периодически питьевая вода на вредные примеси,
способные повлиять на результаты исследования?
• Анализируется ли корм на пищевую ценность или используется
сертифицированный корм?
• Берутся ли образцы питьевой воды на анализ именно в том месте,
откуда она поступает для поения животных?
• Сохраняются ли результаты анализа корма и воды как первичные
данные?
• Не оказывает ли используемый подстил влияния на результаты
исследования?
• Меняется ли подстил достаточно часто, чтобы животные содержались
в чистоте?
• Описаны ли в СОП следующие процедуры:
— разделение животных по видам и исследованиям
— размещение животных
— карантин
— уборка/санобработка помещений
— получение животных
— кормление животных
— заказ на приобретение животных
— уход за животными
— идентификация животных
— анализ корма и воды
— обращение с животными, обнаруженными умирающими или
мертвыми во время исследования
— осмотр животных
— лечение животных
• Проводится ли акклиматизация тест-системы до начала
исследования?
• Доступны ли записи обнаруженных при некропсии отклонений для
специалиста- гистопатолога?
-39-

Тестируемое, контрольное вещества, вещество сравнения
X. Характеристики тестируемого, контрольного веществ и вещества
сравнения
• Содержит ли каждая партия вещества следующую информацию:
— идентификация
— активность
— чистота
— другие характеристики
— состав
— лист безопасности (MSDS)
• Документируются ли и сохраняются ли в составе первичных данных
методы получения, синтеза вещества?
— валидированы ли эти методы?
• Если используются коммерческие препараты, имеют ли они этикетки
и сохраняются ли копии этих этикеток в составе первичных данных?
• Определяется ли стабильность либо до начала исследования либо
периодически во время исследования в соответствии с СОП для каждой
партии вещества?
• Содержат ли этикетки контейнеров следующую информацию:
— название
— срок годности, если известен
— химический код
— условия хранения
— номер партии
Y. Обращение с тестируемым, контрольным веществом и веществом
сравнения
• Хранятся ли они должным образом?
• Распространяются ли они таким образом, чтобы предотвратить
возможное загрязнение или порчу?
• Соблюдается ли необходимая идентификация веществ при их
распространении?
• Документируется ли получение и распространения каждой партии
веществ?
• Содержит ли эта документация информацию о датах и количестве
каждой выданной порции веществ?
• Ведется ли опись имеющихся в наличии веществ?
• Ограничен ли доступ к веществам только для авторизованного
персонала?
• Контролируются ли в хранилище условия окружающей среды?
• Обозначены ли ответственные лица?
Z. Смешивание веществ с носителями
• Определяется ли однородность смесей?
• Определяется ли периодически концентрация?
• Проверяется ли стабильность смесей либо до начала либо
периодически во время исследования
• Определены ли допустимые пределы отклонений от ожидаемых
значений для результатов анализа смесей на однородность,
концентрацию и стабильность?
• Указаны ли на контейнерах со смесями сроки годности?
-40-

• Документируются ли в результатах исследования повторные
измерения и необходимые коррективные меры при получении неадекватных
данных?
• Если компоненты смеси имеют разные сроки годности, указан ли на
контейнере самый короткий?
• Используются ли валидированные процедуры для чистки
измельчителей?
Методические указания по изучению общетоксического
действия фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н., проф. Е. В.
Арзамасцев; член-корр. РАМН, проф. Т. А. Гуськов а;
д. м. н., проф. И. В. Березовская; д. м. н.,
проф. Б. И. Любимов; д. б. н., проф. С. С. Ли-
берман; к. м. н. О. Л. Верстакова
Введение
Целью доклинических токсикологических исследований
фармакологического вещества является установление характера и выраженности его
повреждающего действия на организм экспериментальных животных и
оценка его безопасности.
Общепринятым является разделение токсикологических исследований
на изучение общетоксического действия и исследование специфических
видов токсичности (аллергенность, иммунотоксичность, репродуктивная
токсичность, мутагенность, канцерогенность).
Изучение общетоксического действия позволяет решить следующие
задачи:
1. Определить переносимые и токсические дозы фармакологического
вещества.
2. Выявить наиболее чувствительные к изучаемому фармакологическому
веществу органы и системы организма, характер и степень патологических
изменении в них, а также исследовать обратимость вызываемых
повреждений.
3. Изучить зависимость токсических эффектов от дозы и длительности
применения фармакологического вещества.
Соответственно этим задачам исследование общетоксического действия
подразделяется на два этапа:
1. Изучение "острой" токсичности фармакологического средства при
однократном или дробном введении через короткие (не более 3—6 ч)
интервалы в течение суток.
2. Изучение "хронической" токсичности при повторном длительном
введении (продолжительность введения определяется предполагаемым
курсом клинического применения).
-41 -

1. Общие положения
1.1. Условия проведения эксперимента
Токсикологические исследования обязательны как для субстанции, так
и для всех лекарственных форм фармакологического вещества. При
проведении исследования субстанции в полном объеме изучения лекарственной
формы вещества может быть сокращено. Если лекарственная форма
содержит вспомогательные вещества (стабилизаторы, растворители и т. п.), не
разрешенные для применения в медицинской практике, то каждое из этих
веществ исследуют отдельно. При комбинации нескольких
фармакологических веществ в одной лекарственной форме (фиксированная
комбинация) изучают токсичность комбинации в целом и каждого ингредиента в
отдельности, если он не был ранее разрешен для применения в
медицинской практике.
При изменении соотношения ингредиентов в комбинированной
лекарственной форме или увеличении дозировки, для решения вопроса о
необходимости проведения токсикологических исследований следует провести
переоценку новой комбинации с точки зрения безопасности ее
применения.
Необходимо проведение токсикологических исследований
воспроизведенных препаратов (генериков) в следующих случаях:
а) препараты, не имеющие разрешения к медицинскому применению в
стране-производителе и отличающиеся по составу лекарственной формы
от аналогичных, зарегистрированных в России;
б) препараты, не отличающиеся по составу лекарственной формы, но
содержащие ингредиенты нефармакопейного качества, или с изменением
состава оболочки;
в) препараты, полученные на основе биотехнологии (в любых случаях).
2. Минимальный объем токсикологических исследований генериков
должен включать:
а) сравнительное изучение острой токсичности на грызунах при том
способе введения, который указан в инструкции по применению
препарата;
б) сравнительное изучение субхронической токсичности на животных
(крысы, кролики, собаки или др.) при введении препарата не менее 2 нед,
при способе применения, указанном в инструкции, в дозах, вызывающих
токсический эффект, с обязательным гистологическим исследованием
внутренних органов и области введения препарата.
1.2. Фармакологическое вещество
1.2.1. Характеристика
Для проведения токсикологического изучения необходимо иметь
характеристику субстанции (предварительную нормативную документацию; проект
ФС) фармакологического вещества, согласно которой оно
идентифицируется, устанавливаются пределы содержания примесей, определяется его
стабильность. Дается также характеристика (проект ФСП) лекарственной
формы и вспомогательных веществ, использованных при ее получении
(растворители, наполнители, стабилизаторы и др.). Если характеристика
фармакологического вещества меняется, например в результате модификации спосо-
-42-

ба получения субстанции или лекарственной формы, следует оценить
влияние этого изменения в связи с данными, полученными при
токсикологическом изучении исходного фармакологического вещества.
1.2.2. Физические свойства
Следует иметь данные о растворимости, гидрофобности или липофиль-
ности фармакологического вещества, размере и форме кристаллов. Если
по условиям эксперимента субстанцию исследуют в виде раствора или
взвеси с использованием ингредиентов, не указанных в соответствующих
лекарственных формах фармакологического вещества, необходимо
привести характеристику этих ингредиентов и данные о стабильности
используемого раствора. При исследовании хронической токсичности применение
дополнительных растворителей не рекомендуется.
1.2.3. Данные о терапевтической активности
Для проведения токсикологических исследований должны быть
представлены данные, характеризующие терапевтическую активность
фармакологического вещества в эксперименте на животных, с указанием вида
животных, использованных моделей, доз и путей введения. Следует также
указать предполагаемые направления клинического изучения
фармакологического вещества, рекомендуемые дозы, способы и длительность
применения.
1.3. Экспериментальные животные
Для токсикологических исследований применяют здоровых
половозрелых животных, прошедших карантин не менее 10—14 дней. Необходимо
указать питомник, из которого получены животные. Неконтролируемыми
питомниками пользоваться не следует.
У животных разных видов токсичность фармакологических веществ
может сильно отличаться, поэтому необходимо проводить исследования на
нескольких видах животных, причем наряду с грызунами обязательно
использовать не грызунов. Из грызунов наиболее удобны для
токсикологических экспериментов мыши и крысы. Можно применять также кроликов,
морских свинок, собак, а также мини-свиней и обезьян.
Токсикологические исследования можно проводить как на нелинейных,
так и на линейных животных. В последнем случае следует указать линию
(штамм, линия) животных, поскольку чувствительность к
фармакологическому веществу может меняться и внутри вида в зависимости от линии.
Эксперименты проводят на животных обоего пола, учитывая
полученные данные отдельно для самок и самцов.
Следует указать возраст животных, так как в зависимости от возраста
может измениться фармакокинетика и, в связи с этим, — токсичность
фармакологического вещества. Для того чтобы избежать большого
разброса в исследуемых показателях, рекомендуется использовать животных
одного возраста. Динамика массы тела животных зависит от многих
факторов, в том числе и от исходной величины, поэтому разброс по исходной
массе не должен превышать ± 10 %.
-43-

1.3.1. Содержание животных
Содержание экспериментальных животных должно соответствовать
действующим Санитарным правилам по устройству, оборудованию и
содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев).
Следует учитывать, что чувствительность животных к
фармакологическому веществу может изменяться под влиянием ряда внешних факторов
(температура, влажность, освещенность и кратность воздухообмена
помещения, состав подстилок, загрязненность помещения ксенобиотиками
и др.).
Существенное действие на чувствительность животных к
фармакологическому веществу может оказать состав пищи. Рекомендуется давать
животным стандартную диету в соответствии с действующими нормами.
Для питья мелких лабораторных животных целесообразно использовать
автопоилки. Кормление следует производить в фиксированное время,
так как прием пищи может изменить чувствительность животных к
фармакологическому веществу.
Наряду с подопытными животными, получающими исследуемые
фармакологические вещества, в аналогичных условиях должны содержаться
контрольные животные.
1.3.2. Физиологическое и патологическое состояние животных
Действие фармакологического вещества может изменяться под
влиянием ряда физиологических факторов. Кроме факторов, упомянутых выше,
при проведении токсикологических исследований необходимо учитывать
суточные и сезонные ритмы деятельности организма. В связи с этим
рекомендуется вводить фармакологические вещества в фиксированное время
суток и указывать время года, когда проводились эксперименты.
Фармакологические вещества, предназначенные для детей, следует
дополнительно изучать на новорожденных и неполовозрелых растущих
животных (по специальным методическим рекомендациям), а вещества для
геронтологической практики дополнительно изучают на старых животных.
Учитывая изменение реактивности организма при беременности,
фармакологические вещества, специально рекомендованные для беременных
женщин, исследуют на животных в разные периоды беременности.
Обязательным является проведение токсикологических исследований на
здоровых животных, хотя наличие патологии может изменить
чувствительность животных и позволяет в ряде случаев получить дополнительную
информацию о токсичности фармакологического вещества. Однако широкое
использование животных с искусственными, спонтанными или
генетическими заболеваниями в настоящее время не может быть рекомендовано
при токсикологических исследованиях, поскольку ценность данных,
полученных в таких условиях эксперимента, требует дальнейшего изучения и
подтверждения.
1.3.3. Количество животных, используемых в опыте
Число животных в каждой группе должно быть достаточным для того,
чтобы оценить характер и частоту проявления токсических эффектов и
позволить подвергнуть результаты опытов статистической обработке. Вместе
-44-

с тем статистический анализ не должен маскировать случайные
биологические наблюдения, даже если они статистически недостоверны.
При комплектовании групп экспериментальных животных для
хронического токсикологического эксперимента надо иметь в виду необходимость
исследования динамики возможного токсического эффекта исследуемого
фармакологического вещества, для чего следует производить поэтапный
забой животных в процессе введения препарата и в различные сроки после
окончания его введения с целью выявления обратимости наблюдаемой
патологии.
2. Изучение "острой" токсичности
2. /. Общие положения
Острая токсичность — вредное действие препарата, проявляющееся
после его однократного применения или повторного введения через
короткие (не более 6 ч) интервалы в течение суток.
Целью изучения острой токсичности является определение
переносимых, токсических и летальных доз фармакологического вещества и причин
наступления гибели животных.
Основные параметры острой токсичности лекарственного средства
могут быть вычислены с помощью любых статистических методов, однако
предпочтительнее пользоваться методами, позволяющими провести
сравнительную оценку исследованных параметров для двух или более
фармакологических веществ, например методом Литчфидда и Уилкоксона.
Использованный метод должен быть обязательно указан в отчете.
2.2. Вид и количество подопытных животных
Острую токсичность следует изучать на нескольких видах животных,
причем обязательно использовать тот вид, на котором был показан
терапевтический эффект фармакологического вещества и на котором будет
исследована токсичность при длительном введении. Обычно используют 2—3
вида грызунов и не грызунов (мыши, крысы, морские свинки, кролики
или др.). Группы самцов и самок подопытных животных формируют
отдельно. Для мелких грызунов каждая группа должна содержать не менее
5—6 самок и такое же количество самцов.
Количество собак и кроликов в группе может быть 3—5. Общее
количество мелких грызунов, использованных в опыте, должно обеспечить
возможность вычисления ЛД50. Если из-за низкой токсичности
фармакологического вещества нельзя определить ЛД50, следует указать максимальную
дозу, которая была введена животным.
2.3. Пути введения
У мелких лабораторных животных токсичность фармакологического
вещества обычно исследуют при нескольких путях введения, причем
обязательно использовать тот путь, при котором была показана терапевтическая
активность фармакологического вещества, и путь, который предполагается
для клинического изучения. Фармакологические вещества, предназначенные
-45 -

для системного введения, вводят внутрь и парентерально (внутрибрюшинно,
если они не растворимы в воде, внутривенно и подкожно, если они
растворимы). Следует учитывать, что при определении токсичности имеют
значение концентрация и объем вводимого фармакологического вещества, а при
внутривенных инъекциях также скорость введения. Фармакологические
вещества, предлагаемые для местного применения, наносят или вводят в
соответствующую область согласно способу, предлагаемому для клиники. Кроме
того, дополнительно изучают их токсичность при системном применении.
Фармакологические вещества, предлагаемые для приема внутрь, следует
вводить через зонд, закладывать на корень языка, исключение могут
составить полимеры, которые можно давать с пищей.
Фармакологические вещества, рекомендованные для ингаляции,
изучают, помещая мелких лабораторных животных в затравочные каморы,
снабженные специальными затравочными устройствами.
Сравнение параметров токсичности при разных путях введения может
дать ориентировочные данные о скорости и степени всасывания
фармакологического вещества, а сопоставление прямых, отражающих зависимость
величины токсического эффекта от дозы, позволяет судить о сходстве или
различии в механизмах, вызывающих летальный исход при разных путях
введения.
2.4. Продолжительность наблюдения и регистрация картины интоксикации
Общая продолжительность наблюдения за животными при
исследовании острой токсичности должна составлять не менее 2 нед, причем в
первый день после введения животные должны находиться под непрерывным
наблюдением.
Регулярно фиксируют общее состояние животных, особенности их
поведения, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и
характер судорог, координации движений, тонус скелетных мышц,
реакцию на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители, частоту и
глубину дыхательных движений, ритм сердечных сокращений, состояние
волосяного и кожного покрова, окраску слизистых оболочек, размер
зрачка, положение хвоста, количество и консистенцию фекальных масс,
частоту мочеиспускания и окраску мочи, потребление корма и воды, изменение
массы тела и другие показатели, которые могут быть использованы для
выявления токсического эффекта. Для отдельных фармакологических
веществ целесообразно исследовать некоторые гематологические показатели
(морфологические, биохимические, свертываемость крови).
Весьма существенной является регистрация сроков развития
интоксикации и гибели животных. Целесообразно проводить макроскопическое
исследование внутренних органов погибших животных, а в случае
отсроченной гибели животных — и микроскопическое исследование (степень
кровенаполнения органов, наличие кровоизлияний, изъязвлений слизистых
оболочек и др.).
Результаты следует представлять в таблице (табл. 1).
Таблица 1
Вид
животных
Пол
Дозы в
мг/кг
Число
погибших
животных
ЛДю
ЛД,6
ЛД50 (с
доверительными
границами)
ЛД.4
-46-

3. Исследование кумуляции
При выборе доз для исследования хронической токсичности
фармакологического вещества следует учитывать его кумулятивное действие.
Поэтому до проведения хронических токсикологических экспериментов
рекомендуется определить индекс кумуляции фармакологического вещества,
т. е. отношение ЛД50 при однократном введении к ЛД50 при кратном
введении. Для этой цели можно использовать различные методы, основанные
на учете гибели животных при повторном введении фармакологического
вещества.
Предпочтение следует отдать изучению кумуляции методом Lim'a и со-
авт., позволяющим оценить не только кумулятивные свойства, но и
привыкание.
Схема изучения кумуляции методом субхронической токсичности по
Lim'y и соавт. следующая (табл. 2):
Таблица 2
Дни введения
1-4
5-8
9-12
13-16
17-20
21-24
25-28
Число животных (п = 10)
Доля от ЛД50
ОД
0,15
0,22
0,34
0,50
0,75
1,12
Суммарная доза за 24 дня = 12,8 ЛД50, максимальная
продолжительность эксперимента 24 ± 4 дня.
где Kt — коэффициент кумуляции, ЛД50п — средняя смертельная доза при п-кратном
введении, ЛД50 \ — средняя смертельная доза при однократном введении.
Кк < 1 — кумуляция.
Кк > 1 — привыкание.
4. Изучение "хронической"токсичности
4.1. Общие положения
Целью хронических токсикологических экспериментов является
характеристика степени повреждающего действия фармакологического вещества
при его длительном введении, выявление наиболее чувствительных
органов и систем организма, а также исследование степени обратимости
вызываемых им повреждений.
Продолжительность введения фармакологического вещества при
изучении хронической токсичности зависит от предполагаемой длительности
при применении в клинике (см. табл. 3).
-47-

Таблица 3. Продолжительность введения фармакологического вещества
экспериментальным животным в зависимости от длительности его применения у человека
Длительность применения препарата у
человека
Однократное введение
2—6 дней
7—14 дней
15—30 дней
1—6 мес
Длительность введения фармакологического
вещества животным
5—7 дней
14 дней
1 мес
2—4 мес
6—12 мес
4.2. Вид и количество экспериментальных животных
Хроническую токсичность изучают не менее чем на двух видах
животных. Желательно использовать животных, на которых был получен
терапевтический эффект. Обычно хронические эксперименты проводят на
крысах, кроликах, морских свинках и собаках.
Если воспроизведенное фармакологическое вещество исследуют
параллельно с его оригинальным фирменным аналогом (стандартное
лекарственное вещество), изучение хронической токсичности можно ограничить
экспериментами на грызунах (крысах, кроликах и др.). Группы
подопытных животных формируют отдельно из самок и самцов. Группы мелких
лабораторных животных должны содержать не менее 10 особей, крупных
животных — не менее 4.
4.3. Пути введения фармакологического вещества
Основным способом введения фармакологического вещества является
способ, рекомендованный для клинического изучения. Фармакологическое
вещество, предназначенное для применения внутрь, вводят лабораторным
животным через зонд в желудок или закладывают на корень языка, так как
это обеспечивает более точное дозирование, чем добавление
фармакологического вещества в корм. Количество фармакологического вещества,
получаемого животным за один прием, рассчитывают на единицу массы тела
животного в пересчете на действующее вещество (можно вести расчет на
единицу поверхности тела). Фармакологическое вещество вводят в виде
субстанции и той лекарственной формы, которая будет передана в
клинику.
4.4. Исследуемые дозы
Хроническую токсичность фармакологического вещества при его
системном применении исследуют в двух-трех (как правило, в трех) дозах.
При выборе доз руководствуются результатами, полученными при
исследовании острой токсичности фармакологического вещества, его
способностью вызывать кумулятивный эффект, а также максимальными суточными
дозами, в которых фармакологическое вещество рекомендовано для
клинического изучения.
Введение высшей дозы предполагает выявление возможных
токсических эффектов и гибель части животных. Эта доза может быть рассчитана
-48 -

с учетом ЛД50, полученной при изучении острой токсичности исследуемого
вещества для данного вида лабораторных животных. Минимальная доза
должна быть близка к терапевтической дозе, рекомендуемой для
клинического изучения. Третья доза является промежуточной. При постановке
экспериментов обязательно наличие контрольной группы животных,
содержащихся в таких же условиях, как и подопытные, и получающих
вспомогательные ингредиенты, входящие в состав исследуемой лекарственной
формы фармакологического средства, тем же способом, при котором
изучают токсичность самого вещества.
Фармакологические вещества, предназначенные для ежедневного
применения у человека, вводят экспериментальным животным 7 дней в
неделю.
Информация о межвидовом переносе доз представлена в таблицах 4 и 5.
Пример межвидового пересчета:
ЕД50для крыс массой 200 г — 10 мг/кг.
Для собаки с массой тела 9 кг доза рассчитывается по формуле:
10 мг/кг х 6,5 (коэффициент для крысы)
20,6 (коэффициент для собаки) =3,15 мг/кг.
Таблица 4. Коэффициенты пересчета доз (мг/кг, мг/м2) для мыши, крысы, обезьяны,
собаки и человека [Freireich at al., 1966)]
Вид животного
Мышь
Крыса
Обезьяна
Собака
Человек
Масса тела (кг)
0,018
0,020
0,022
0,024
0,050
0,070
0,080
0,100
0,150
0,200
0,250
2,0
2,5
3,0
6,0
7,0
8,0
9,0
5,0
10,0
20,0
40,0
60,0
70,0
80,0
Площадь поверхности тела (м2)
0,0062
0,0066
0,0071
0,0075
0,0122
0,0153
0,0167
0,0194
0,0254
0,0308
0,0357
0,188
0,217
0,244
0,344
0,369
0,404
0,437
0,26
0,44
0,80
1,30
1,62
1,80
1,96
Коэффициент пересчета
2,9
3,0
ЗД
3,2
4,1
4,6
4,8
5,2
5,9
6,5
7,0
10,6
11,5
12,3
18,0
19,0
19,8
20,6
19,0
23,0
25,0
31,0
37,0
39,0
41,0
-49-

Таблица 5. Коэффициенты для пересчета дозы в мг/кг на мг/м2 для разных видов
животных в зависимости от массы тела [Уланова И. П. и др., 1968]
Вид животного
Мышь
Крыса
Морская свинка
Кролик
Собака
Масса тела (кг)
0,018
0,020
0,022
0,024
0,050
0,070
0,080
0,100
0,150
0,200
0,250
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
10,0
11,0
12,0
13,0
14,0
15,0
Коэффициент пересчета
2,9
3,0
зд
3,2
4,1
4,6
4,8
5,2
5,9
6,5
7,0
4,0
4,8
5,6
6,4
7,2
10,9
12,8
14,7
16,6
18,5
21,6
22,2
23,6
23,9
24,2
24,8
4.5. Наблюдение за животными и регистрация картины интоксикации
На протяжении всего опыта животные должны находиться под
ежедневным наблюдением; отмечают потребление корма и воды, состояние
волосяного покрова и слизистых оболочек, поведение. Один раз в неделю
животных взвешивают, регулярно (в опыте продолжительностью до 1 мес —
не менее 2 раз, при более длительном исследовании — не менее 3 раз)
исследуют функциональное состояние сердечно-сосудистой, нервной,
эндокринной, выделительной и пищеварительной систем, изучают
морфологические и биохимические показатели крови. Методы исследования для
оценки функционального состояния органов и систем организма выбирает
исследователь: они должны быть современными и достаточно
чувствительными, чтобы обеспечить регистрацию признаков возможного
повреждающего действия изучаемого фармакологического вещества.
Примерная программа оценки токсичности фармакологического
вещества представлена в приложении 1.
Все животные, погибшие в течение опыта, подвергаются вскрытию для
-50-

установления характера повреждающего действия фармакологического
вещества. После окончания введения фармакологического вещества
проводят максимально полное обследование экспериментальных животных с
помощью гематологических, биохимических и физиологических тестов.
Часть животных из каждой группы забивают для патоморфологических
исследований. Определяют массу органов и проводят их гистологическое
исследование. За животными, оставленными в живых, проводят наблюдение
в течение 1 мес, после чего их обследуют в том же объеме, что и
животных, забитых сразу после окончания введения фармакологического
вещества. Для исследования динамики развития возможной интоксикации
периодически определяют изучаемые параметры. Опыты на мелких
лабораторных животных проводят с таким расчетом, чтобы полученные
результаты можно было подвергнуть статистической обработке.
При оценке изменений, наблюдаемых у животных в хроническом
токсикологическом эксперименте, необходимо исключить возможность
влияния всех побочных факторов, не связанных с приемом препарата
(заболевание животных, их питание, содержание и т. п.).
Могут возникнуть спонтанные изменения гемограмм, биохимических
показателей и анатомических характеристик, которые следует учитывать
при объяснении результатов. Не следует пренебрегать необъясненными
данными, их надлежит подвергнуть дальнейшему изучению.
В ряде случаев в дополнение к указанным выше методам может
потребоваться применение электронной микроскопии, гистохимических,
авторадиографических и других методов исследования.
Патологические изменения, возникающие у животных после введения
высоких доз фармакологического вещества, дают ценную информацию для
характеристики его токсических свойств, однако эта информация должна
быть подвергнута тщательному анализу и полученные результаты следует
рассматривать в качестве предупреждения, а не противопоказания для
клинических испытаний.
При решении вопроса о возможности передачи препарата на
клиническое изучение исследователь должен учесть следующие факторы:
1. Терапевтическую широту фармакологического вещества, т. е.
соотношение минимальной токсической и терапевтической доз.
2. Характер и обратимость выявленной патологии.
Заключение должно содержать суждения исследователей о степени
опасного острого и хронического отравления на основании проведенных
исследований, прогноз возможных побочных реакций и необходимых
ограничений, при клинических испытаниях.
Результаты доклинических токсикологических исследований
фармакологического вещества являются частью материалов, оцениваемых в аспекте
пользы и риска при разрешении клинических испытаний.
Схема отчета об исследовании общетоксического действия
фармакологического вещества
Отчет должен содержать следующие разделы: титульный лист, список
исполнителей, оглавление, реферат, введение, обзор литературы,
материалы и методы, результаты проведенных исследований, заключение, список
литературы, приложение.
Титульный лист: содержит название организации-исполнителя,
утверждение отчета, заверенное подписью руководителя учреждения и печатью
- 51 -

организации, название отчета, должность, фамилию, имя, отчество и
подпись руководителя проведенных исследований.
Список исполнителей: ответственный исполнитель, исполнители —
фамилия, имя, отчество, должность, степень, звание, подпись.
Оглавление: перечень разделов с указанием страниц отчета.
Введение: цель и задачи исследования.
Обзор литературы: информация об оригинальном фармакологическом
веществе или литературные сведения о воспроизведенном препарате.
Материалы и методы: физико-химическая характеристика субстанции и
лекарственной формы, их соответствие проекту нормативной
документации (ФСП, ФС) или качественный состав лекарственной формы
воспроизведенного лекарственного препарата, серия, соответствие проекту ФСП.
Характеристика использованных лабораторных животных (источник
получения, масса или возраст, пол, условия содержания).
Схема эксперимента, обоснование выбранных доз.
Описание методов исследования и метода статистической обработки
данных.
Результаты проведенных исследований: описание острой токсичности,
кумуляции и хронической токсичности в соответствии с полученными
достоверными изменениями изученных показателей и результатами патомор-
фологических исследований, способ умерщвления животных.
Заключение: краткое обсуждение полученных результатов, прогноз
возможных побочных эффектов, рекомендуемые ограничения или
необходимый контроль при проведении клинических испытаний.
Список литературы.
Приложение: таблицы индивидуальных показателей и результаты их
статистической обработки по всем изученным тестам, краткое
индивидуальное описание гистологических изменений органов и тканей
лабораторных животных.
Приложение 1. Перечень рекомендуемых тестов
Рекомендуемые
исследования
Интегральные показатели
Гематологические
исследования
Биохимические
исследования
Физиологические
исследования
Нагрузочные пробы
Рекомендуемые тесты
Внешний вид, поведение, симптомы интоксикации,
прирост массы тела (еженедельно), суточное потребление
пищи и воды (еженедельно).
Содержание в периферической крови эритроцитов, рети-
кулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарная
формула, количество гемоглобина, гематокрит,
параметры коагулограммы, резистентность эритроцитов.
Общий белок, белковые фракции, общий холестерин,
общие липиды, триглицериды сыворотки крови, глюкоза
крови, активность ЩФ, АЛТ, ACT, ЛДГ и др.
ЭКГ в II отведении, параметры ЭКГ (амплитуда зубцов
Р, R, S, Т, длительность (в с) интервалов P—Q, QRS, Q—
Т, R—R, комплекса), частота сердечных сокращений.
Поведенческие реакции методом "открытого поля". Сум-
мационно-пороговый показатель.
Диурез (спонтанный или с водной нагрузкой), рН,
удельная масса мочи
Гексеналовый сон.
Бромсульфалеиновая проба.
Нагрузка феноловым красным
-52-

Продолжение
Рекомендуемые
исследования
Патоморфологические
исследования
Рекомендуемые тесты
Вскрытие, макроскопическое описание органов и
тканей, места введения, определение относительной массы
органов, гистологическое исследование (головной мозг,
сердце, печень, легкие, селезенка, тимус, щитовидная
железа, лимфатические узлы, желудок, кишечник,
надпочечники, почки, мочевой пузырь, семенники,
яичники, костный мозг, место введения)
Примечание. Перечень тестов при изучении воспроизведенных препаратов может
быть сокращен с акцентом на известные побочные эффекты препарата.
Приложение 2. Максимально допустимые количества жидкости (в мл) для некоторых
видов лабораторных животных в зависимости от пути введения
Вид животных
Мышь
Крыса
Морская свинка
Кролик
Масса
тела (г)
20-24
25-30
>30
100-190
200-240
250-300
>300
250-300
2000-1400
2500-3000
>3000
Путь введения
в желудок
0,5
0,8
3,0
3,0
4,0-5,0
6,0
8,0
4,0-5,0
100,0
150,0
200,0
под кожу
1,0
5,10
15,0
30,0
в мышцу
0,5
5,0
5,0
15,0
в вену
0,2-0,5
2,0
5,0-8,0
20,0
в брюшную
полость
1,0
5,0
5,0
20,0-30,0
Приложение 3. Соотношение между массой и площадью поверхности тела человека и
экспериментальных животных
Человек. Вид
животных
Человек
Кролик
Морская свинка
Крыса
Мышь
Масса тела (г)
70 000
1500
400
200
20
Поверхность
тела (см2)
18 000
1240
480
304
61
Отношение поверхности
тела к массе (см2/кг)
257
826
1200
1517
3050
Приложение 4. Возраст и масса взрослых животных, используемых для определения
острой токсичности
Вид животных
Белые мыши
Белые крысы
Морская свинка
Кролики
Собаки
Возраст (мес)
2,0-2,5
2,5-4,0
3-4
4
9
Масса тела (г)
18-22
150-240
450-500
2000-3000
Зависит от породы

Л итература
1. Беленький М. Л. — В кн.: Элементы количественной оценки фармакологического
эффекта. — Л., 1968. — 151 с.
2. Березовская И. В. Классификация химических веществ по параметрам острой
токсичности при парентеральных способах введения // Хим.-фарм. журн. — 2003. — Т.
37, № 3.- С. 32-34.
3. Березовская И. В., Иванова В. М. Актуальные проблемы безопасности дженериков //
Бюллетень ВНЦ БАВ. — Старая Купавна, 2002. — С. 37—52.
4. Березовская И. В., Митрохин Н. М. Экспресс-методы определения острой
токсичности // Бюллетень ВНЦ БАВ. — М., 1990. - С. 45—67.
5. Балынина Е. С, Березовская И. В. Сравнительная оценка методов определения
ориентировочной реакции крыс в токсикологическом эксперименте // Фарм. и токси-
кол. - 1976. - № 5. - С. 635-638.
6. Голиков С. Н., Саноцкий И. В., Тиунов Л. А. Общие механизмы токсикологического
действия. — Л.: Медицина, 1986. — С. 279.
7. Липперт Г. Международная система единиц в медицине. — М.: Медицина, 1980. —
С. 208.
8. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. проф. В. В.
Меньшикова. — М.: Медицина, 1987.
9. Методы определения токсичности и опасности химических веществ
(токсикометрия) / Под ред. проф. И. В. Саноцкого. — М.: Медицина, 1970. — С. 343.
10. Общая токсикология / Под ред. Б. А. Курляндского и В. А. Филова. — М.:
Медицина, 2002. - С. 606.
11. Проблема нормы в токсикологии / Под ред. проф. И. М. Трахтенберга. — М.:
Медицина, 1991. - С. 204.
12. Уланова И. П., Сидоров К. К., Халепо А. И. К вопросу об учете поверхности тела
экспериментальных животных при токсикологическом исследовании / Под ред.
А. А. Летавета и И. В. Саноцкого. — Л.: Медицина, 1968. — Вып. 10. — С. 18—25.
13. Freireich E. J., Gehan E. A., Rail D.E. et al. Quantitative comparison of toxicity of
anticancer agents in mouse, rat, hamster, dog, monkey and man // Cancer Chemother. Res. —
1966. - Vol. 50 - N 4. - P. 219-244.
Методические указания по оценке аллергизирующих свойств
фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: член-корр. РАМН, проф.
Б. И. Любимов; д. б. н. Л. П. Коваленко; д. б. н.,
проф. В. Н. Федосеева; к. б. н. А. С. Иванова; к.
б. н. Т. Б. Мастернак; А. С. Ларин; к. б. н.
Г. П. Кудрина; д. м. н. Л. Ф. Шашкина; к. м. н.
В. М. Иванова; д. м. н., проф. А. В. Никитин;
А. Н. Николаев; д. м. н., проф. Е. В.
Арзамасцев; член-корр. РАМН, проф. Т. А. Гусъкова; к.
б. н. И. Б. Жоголева; к. м. н. О. Л. Верстакова
Введение
Настоящие методические рекомендации являются частью общей
программы оценки безопасности фармакологических средств и способствуют
унификации и оптимизации методических подходов по выявлению аллер-
гизирующего действия потенциальных лекарственных средств в экспери-
-54-

менте на животных с целью получения информативных и сопоставимых
результатов.
Использование стандартных методов при изучении аллергизирующих
свойств фармакологических средств, особенно вновь синтезированных,
дает возможность врачам более рационально назначать лекарства больным и
тем самым снизить число аллергических осложнений лекарственной
этиологии.
Материалы экспериментальной оценки фармакологического средства,
полученные по рекомендуемой программе, могут быть включены в
протокол клинических испытаний, в проект инструкции по его медицинскому
применению, а также, в некоторых случаях, могут быть использованы при
решении вопроса о судьбе препарата наряду с фармакологическими и хи-
миотерапевтическими данными.
1. Общие положения
Под аллергизирующими свойствами понимают способность того или
иного вещества вызывать при введении в организм состояние повышенной
чувствительности (гиперчувствительность, сенсибилизация), в основе
которой лежат различные иммунопатологические механизмы:
1. Анафилактический тип — реакция между фиксированными на клетке
антителами (AT) IgE и специфическим антигеном (АГ) с последующим
высвобождением медиаторов из клеток-мишеней (базофильные лейкоциты
или тучные клетки). К этому типу реакций относятся анафилактический
шок, отек Квинке, крапивница, определенные виды бронхиальной астмы.
2. Цитотоксический тип — реакция AT (IgM или IgG) с компонентами
клеточной оболочки. Разрушение клетки происходит в присутствии
комплемента (гемолитическая анемия, агранулоцитоз, лейкопения, тромбоци-
топения).
3. Аллергические реакции, связанные с образованием иммунных
комплексов в крови или тканях и активацией комплемента (феномен Артюса,
сывороточная болезнь, увеит, лекарственная лихорадка, аллергический
васкулит).
4. Клеточный тип — реакция сенсибилизированных лимфоцитов со
специфическим АГ. Механизм действия по типу гиперчувствительности
замедленного типа (ГЗТ) (аллергические дерматиты).
Механизм, по которому может развиваться аллергическая реакция,
зависит от многих факторов — природы АГ, дозы, пути введения, кратности
и продолжительности введения, наличия адъювантов, подбора животных,
физико-химической структуры фармакологического средства, способности
соединяться с белками в организме и др. В зависимости от этого
аллергические реакции развиваются по "немедленному" или "замедленному" типу.
Реакции "немедленного" типа развиваются быстро, в течение
нескольких минут (10—20 мин), в их механизме участвует реакция
антиген—антитело в тканях и жидких тканевых средах.
Реакции "замедленного" типа — реакции между АГ и
сенсибилизированными Т-лимфоцитами с последующим развитием (через 24—48 ч)
аллергического воспаления. Воспаление обусловлено действием медиаторов,
которые высвобождаются из сенсибилизированных лимфоцитов. Реакциям
"замедленного" и "немедленного" типов соответствуют разные стадии
аллергических реакций: иммунологическая, патохимическая, патофизиологическая.
При подборе тестов для испытания фармакологических средств на ал-
-55 -

лергизирующее действие необходимо руководствоваться следующими
принципами: информативность, экономичность, воспроизводимость,
оптимальное сочетание методов аллергодиагностики in vivo и in vitro,
использование таких методов, которые бы позволяли выявить разные типы
аллергических реакций.
1.1. Условия проведения эксперимента
Учет сенсибилизирующих свойств обязателен и проводится после
оценки токсичности всех новых фармакологических веществ. Исследованию
подлежат субстанции и все лекарственные формы. Особенно тщательной
проверке должны быть подвергнуты вещества, содержащие белковые
примеси и высокомолекулярные соединения. Если лекарственная форма
содержит вспомогательные вещества (стабилизаторы, растворители и т. п.),
не разрешенные для применения в медицинской практике и не изученные
ранее на этот вид активности, то каждое из этих веществ исследуют
отдельно. При комбинации нескольких фармакологических веществ в одной
лекарственной форме (фиксированная комбинация) изучают аллерген-
ность комбинации в целом и каждого ингредиента в отдельности, если он
не был ранее разрешен для применения в медицинской практике.
При изменении состава лекарственной формы, технологии ее
изготовления или состава вспомогательных веществ необходимо заново испытать
новую комбинацию на аллергенность.
При решении вопроса об исследовании неоригинального
фармакологического средства следует исходить из наличия достаточно обоснованных
литературных сведений экспериментального и ретроспективного характера
о способности оригинального лекарственного средства и лекарственного
препарата вызывать состояние сенсибилизации и степени ее проявления
или отсутствии таковой. В случае наличия этих данных, а также при
идентичности по качественному и количественному составу предлагаемой и
разрешенной лекарственных форм, можно ограничиться представлением
экспертного заключения.
1.2. Контрольный препарат
Изучение сенсибилизирующих свойств нового фармакологического
средства, относящегося к известному фармакологическому классу,
проводят в сравнении со стандартным лекарственным средством.
При необходимости изучения неоригинального фармакологического
средства исследование, как правило, проводят в сравнении с
оригинальными образцами.
Для оценки реактивности экспериментальных животных можно
использовать позитивный контроль, т. е. животных, которым вводят какой-либо
эталонный аллерген (например, 2,4,6-тринитрофенилсульфокислота, 2,4,6-
тринитрохлорбензол, 2,4-динитрохлорбензол, пикрилсульфокислота и др.).
1.3. Характеристика фармакологического средства
К моменту испытания необходимо располагать сведениями о физико-
химических свойствах фармакологического вещества; составе готовой ле-
-56-

карственной формы; дозах (летальная и эффективная, рекомендуемая для
клинических испытаний); признаках интоксикации, специфических для
данного вещества; рекомендуемых способах введения; профиле
фармакологического действия; показаниях и схемах применения препарата в
клинике. Желательно также иметь данные о фармакокинетике
фармакологического вещества.
Состав исследуемого фармакологического средства определяется
проектами временных фармакопейных статей на субстанцию и лекарственную
форму в соответствии с требованиями Минздрава России. Изучаемые
образцы должны соответствовать проекту временной фармакопейной статьи.
1.4. Растворители и разбавители фармакологических средств
Наиболее распространенными растворителями фармакологических
средств являются дистиллированная вода и изотонический раствор натрия
хлорида.
При работе с водонерастворимыми веществами возможно
использование 1 % этилового спирта, ацетона, 1 % раствора крахмала. При накожных
аппликациях применяют ланолин, вазелиновое или растительное масло
[8].
1.5. Исследуемые дозы
При исследовании сенсибилизирующих свойств фармакологических
средств наиболее оптимальным является испытание двух уровней доз.
Минимальная доза — близкая к рекомендуемой для клинических испытаний
терапевтическая доза для данного вида животных (1 ТД), максимальная —
на порядок выше рекомендуемой для клинических испытаний —
субтоксическая доза для данного вида животных (10 ТД), не выходящая за интервал
терапевтической широты действия лекарственного средства.
В случаях, когда реальная терапевтическая доза вещества не известна,
для сенсибилизации животных можно использовать дозы, последовательно
на порядок меньше, чем ЛД50 (1/10, '/100, '/юоо от ЛД50) при соответствующем
способе введения.
Эффект сенсибилизации оценивается как в реакциях in vivo, так и в
тестах in vitro.
При постановке кожных проб рабочую дозу определяют на интактных
животных. Разрешающей дозой считается та концентрация
фармакологического средства или испытуемого препарата (тест-препарат), которая при
внутрикожном введении на тестируемом участке кожи (для растворимых
веществ) или нанесении в виде мази (для нерастворимых веществ) не
вызывает кожно-раздражающего действия. Реактивность кожи выявляют
введением растворителя в том же объеме, что и тест-препарат.
Для оценки свойств тест-препарата в тестах in vitro дозы подбирают в
опытах с кровью интактных животных, используя несколько разведений
аллергена. В этом случае добавление аллергена в рабочей дозе в кровь
интактных животных не должно увеличивать спонтанного уровня
повреждения клеток крови, в частности, лимфоцитов.
-57-

1.6. Экспериментальные животные
Исследования проводят на следующих видах лабораторных животных:
морские свинки (масса тела 250—300 г), белые крысы популяции Wistar
(масса тела 200—225 г), мыши линии Balb/c, C57BI/6, СВА (масса тела
18—20 г). В некоторых случаях (в зависимости от задач эксперимента)
возможно применение беспородных мышей и кроликов.
Наиболее чувствительным, в видовом отношении, животным является
морская свинка. В опытах используются морские свинки-альбиносы или
животные, имеющие достаточно большие участки белой кожи. Разброс в
экспериментальных группах по исходной массе не должен превышать
±10 %. Чувствительность самцов и самок к одному и тому же препарату
может быть неодинакова, поэтому желательно проведение эксперимента
на животных обоих полов. Опыты проводят на молодых, здоровых и
половозрелых животных.
Животные должны пройти карантин не менее 10—14 дней. В целях
стандартизации перед опытом животных не кормят в течение суток.
Животные должны получать стандартную диету, представленную в виде
гранулированного корма (оптимальный вариант) или набора натуральных
кормов. Число животных в каждой группе должно быть достаточным (не
менее 10), чтобы оценить характер, частоту и степень проявления аллергизи-
рующих свойств и провести статистическую обработку экспериментальных
данных. Вместе с тем при оценке сенсибилизирующего действия
необходимо проводить описание индивидуальных реакций, даже если они
статистически недостоверны.
Результаты экспериментов обрабатываются методами вариационной
статистики по критерию Стьюдента.
2. Выявление развития сенсибилизации при различных путях поступления
фармакологических средств в организм
Пути введения и способы применения фармакологического средства в
эксперименте выбираются соответственно предполагаемым путям
введения и способам его применения человеком. Для препаратов,
использующихся перорально, следует применять внутрижелудочный способ
введения. Для некоторых препаратов (ингаляционные анестетики, мази, капли)
целесообразно изучение аллергенных свойств в условиях предполагаемого
применения (эпикутанный метод, конъюнктивальная проба, ингаляция
аэрозоля).
2.1. Эпикутанная сенсибилизация
Наиболее разработанным является метод эпикутанной сенсибилизации
(см. раздел 3.5). По этому методу получены многочисленные корреляции
результатов на лабораторных животных и людях-добровольцах. Однако в
каждом отдельном случае могут возникнуть трудности в определении
оптимальной схемы эксперимента (число аппликаций, концентрация
наносимого на кожу фармакологического средства и др.). Поэтому постановке
опытов по эпикутанной сенсибилизации обязательно предшествует
изучение раздражающего действия фармакологического средства.
- 58 -

2.2. Конъюнктивальная проба
Конъюнктивальная проба является очень чувствительным тестом и в
ряде случаев позволяет выявить реакцию животных на аллерген при
слабой аллергизации и отрицательных кожных тестах. При наличии хорошей
растворимости фармакологического вещества постановка ее обязательна.
Описание метода см. в разделе 3.6.
2.3. Ингаляционное введение фармакологического средства
Определение сенсибилизирующих свойств фармакологических средств,
предназначенных для ингаляционного применения, осуществляется при
распылении тест-препарата дозирующими баллончиками или
ингаляторами непосредственно в носоглоточную полость на протяжении 4 нед по 5
раз в неделю. Тестирование проводят после 10 ингаляций, а также после
месячного воздействия. Для этой цели наиболее адекватным является
метод, позволяющий выявить влияние сенсибилизирующих свойств
фармакологических средств на чувствительность гладких мышц трахеобронхиаль-
ной цепочки в эксперименте на морских свинках. Описание метода см. в
разделе 3.7.
2.4. Пероральное введение фармакологических средств
Морским свинкам в ротовую полость вводят по 1—2 капли водного
раствора тест-препарата или взвеси в 1 % крахмальном геле в течение 30 дней.
Тестирование сенсибилизирующих свойств проводят на 10, 15, 30-й дни от
начала введения испытуемого препарата.
Для выявления сенсибилизирующих свойств при данном способе
введения фармакологического средства рекомендуется использовать реакции:
торможения миграции макрофагов, непрямой дегрануляции тучных
клеток, кожные пробы.
3. Методы выявления сенсибилизации
Единого метода, с помощью которого можно зарегистрировать аллерги-
зирующее действие фармакологических средств, не существует. Отсюда
следует, что система испытаний потенциальных лекарственных препаратов
на аллергенность должна включать в себя набор методов аллергодиагно-
стики in vivo и in vitro, из которого в каждом конкретном случае можно
выбрать оптимальное сочетание тестов, позволяющих выявлять разные
типы гиперчувствительности.
Из специфических методов оценки сенсибилизирующих свойств
фармакологических средств можно рекомендовать следующие технически
простые и хорошо воспроизводимые.
/. Тесты in vivo
1. Оценка анафилактогенной активности в реакции общей анафилаксии
(анафилактический шок).
-59-

2. Кожные тесты:
а) активная кожная анафилаксия;
б) пассивная кожная анафилаксия;
в) реакция гиперчувствительности "замедленного" типа на мышах или
морских свинках;
г) реакция иммунных комплексов;
д) метод накожных аппликаций.
3. Конъюнктивальная проба.
II. Метод in situ
Метод оценки чувствительности гладких мышц трахеобронхиальной
цепочки к исследуемым препаратам в эксперименте на морских свинках.
III. Тесты in vitro
а) реакция непрямой дегрануляции тучных клеток;
б) реакция торможения миграции макрофагов;
в) псевдоаллергические реакции (тест Шор).
Возможности выявления сенсибилизации не ограничиваются
предложенными методиками, так как в настоящее время с целью обнаружения
аллергических свойств разработано и широко применяется множество
других методов исследований, в том числе тесты повреждения и альтерации
нейтрофилов, реакция усиления пиронинофилии лейкоцитов, определение
магния в сыворотке крови, колориметрический метод определения гиста-
мина в крови и органах животных и т. д.
Следует отметить, что наиболее информативными являются методы, с
помощью которых можно определить специфический для данного
лекарственного вещества иммуноглобулин Е, патологическая роль которого
доказана в развитии наиболее серьезных аллергических осложнений. Из
диагностических методов in vitro наиболее чувствительными являются радио-
иммуносорбентные и иммуноферментные методы. Наиболее оптимальный
подбор тестов зависит от направленности фармакологического действия
изучаемого препарата.
Выявлению сенсибилизации к фармакологическим средствам может
способствовать также и оценка некоторых неспецифических показателей,
таких как увеличение абсолютного числа или относительного количества
эозинофилов и базофилов, концентрация в сыворотке крови биогенных
аминов (гистамин, серотонин и др.), плазматизация и эозинофилия тканей
и др. Исходя из длительной апробации перечисленных в этой главе
методов в условиях экспериментальной оценки сенсибилизирующих свойств
лекарств и учитывая удовлетворительную корреляцию данных аллергодиаг-
ностики, полученных в эксперименте, с результатами клинических
испытаний на людях, можно рекомендовать их как основные в целях
унификации исследования аллергозов и накопления экспериментальных данных.
Эти тесты доступны для серийных исследований. Результаты,
полученные с их помощью, хорошо воспроизводимы.
-60-

3.1. Оценка анафилактогенной активности
3.1.1. Реакция общей анафилаксии (анафилактический шок)
Морским свинкам вводят исследуемый препарат в эффективной
терапевтической дозе (1 группа) и в дозе, в 10 раз ее превышающей (2-я
группа): первая инъекция подкожно, две последующие внутримышечно через
день в область бедра. Разрешающая инъекция — внутрисердечно или
внутривенно на 14—21-й дни после сенсибилизирующей инъекции.
Разрешающая доза должна быть равна суммарной сенсибилизирующей дозе.
Разрешающая инъекция на 14—21-й дни вводится и контрольной группе
животных, которым вводили только растворитель. Учет интенсивности
анафилактического шока — в индексах по Weigle [20].
3.1.2. Активная кожная анафилаксия
При изучении активной кожной анафилаксии сенсибилизация та же,
что и при изучении общей анафилактической реакции [17]. На 14—21-й
дни на выстриженных участках спины морским свинкам внутрикожно
вводят препарат в двукратных разведениях, в концентрациях, не вызывающих
кожно-раздражающего действия. Через 20 мин морским свинкам вводят
внутривенно по 0,5 мл 1 % раствора синего Эванса. Через 30 мин
животных забивают эфиром и определяют размеры синего пятна на внутренней
стороне кожи в месте введения препарата (при положительной реакции
диаметр пятна не менее 6 мм). В данной серии опытов вводить препарат
внутрикожно нужно микрошприцами, при правильном введении
образуется так называемая лимонная корочка. Если на месте введения через
некоторое время появляется кровь, то необходимо ввести препарат в другое
место. Для контроля реактивности кожи обязательно вводить тому же
животному на другом выстриженном участке 0,05 мл растворителя (стерильный
изотонический раствор натрия хлорида). Для удобства прочтения реакции
места введения можно обводить разноцветными фломастерами.
Разрешающие инъекции препарата и синего Эванса вводят также контрольным
животным, которым в дни сенсибилизации опытных групп вводили только
растворитель. У таких животных в месте внутрикожного введения
препарата диаметр окрашенного пятна не должен превышать 2—3 мм. Возможно
воспроизведение активной кожной анафилаксии и на мышах.
3.1.3. Пассивная кожная анафилаксия
В случае положительной реакции активной кожной анафилаксии (АКА)
проводят постановку реакции пассивной кожной анафилаксии (ПКА), во-
первых, для идентификации гомоцитотропных антител, во-вторых, для
определения их титра [5, 18]. Сенсибилизация подопытных животных
осуществляется по той же схеме, что и для общей анафилактической реакции:
сыворотку крови подопытного и контрольного животного (в нескольких
разведениях) вводят внутрикожно интактной морской свинке-альбиносу.
Через 24 ч внутривенно вводят смесь испытуемого препарата в дозе,
установленной для реакции АКА, и 0,5 мл 1 % раствора синего Эванса. Через
15 мин учитывают реакцию. Титром антител считают наибольшее
разведение, при котором возможно осуществление пассивного переноса. Титры
-61 -

AT выражают в log2, разведения сыворотки. Большими преимуществами
этого метода являются высокая специфичность и возможность получения
четкой количественной характеристики процесса, что осуществимо при
использовании красителя.
3.2. Реакция гиперчувствительности "замедленного " типа на мышах
Известно, что интенсивность реакций гиперчувствительности
замедленного типа (ГЗТ) к химическим соединениям и их длительность зависят от
сроков формирования и сочетанного действия различных субпопуляций Т-
супрессоров, подавляющих ГЗТ. Поэтому при индукции ГЗТ путем
введения мышам химических аллергенов в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ),
при котором не происходит формирования Т-супрессоров, возможно
усиление кожных аллергических реакций и вьывление аллергенных
свойств даже слабых химических аллергенов на нелинейных мышах массой
18—20 г. Мышей сенсибилизируют однократно путем внутрикожного
введения в основание хвоста 60 мкл эмульсии препарата в ПАФ — дозы,
эквивалентной 10 мМ раствору в ПАФ в соотношении 1:1. Для
приготовления такой эмульсии используют раствор Хенкса с рН 7,5.
Для выявления сенсибилизации через 5 сут мышам в подушечку задней
лапы вводят 40 мкл 10 мМ раствора тест-препарата в растворе Хенкса.
Через 6—22—24 ч после тестирования измеряют величину отека с помощью
инженерного микрометра МК-0-25. Разница в толщине обеих лапок
характеризует величину отека, по которой можно судить об интенсивности
реакции ГЗТ [12].
Контрольных животных сенсибилизируют эмульсией ПАФ с раствором
Хенкса по той же схеме, что в опыте.
В каждой группе должно быть не менее 10 животных. В том случае,
если тест-препарат становится аллергеном в процессе метаболизма,
например пенициллин, тестирование проводят максимальной концентрацией
вещества, эмульгированного в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ). Учет
реакции проводят через 48—72 ч.
ПАФ:
1 мл ланолина,
3 мл вазелинового масла,
5 мг убитой прогреванием вакцины БЦЖ,
50 мкл твина-20,
0,5 мл дистиллированной воды.
НАФ:
Те же самые компоненты, за исключением убитой прогреванием
вакцины БЦЖ. В качестве метода выбора может быть использована реакция ГЗТ
на морских свинках.
3.3. Реакция гиперчувствительности "замедленного " типа на морских
свинках
Животных опытных групп сенсибилизируют однократно, в подушечки 4
лапок, тест-препаратом в смеси с ПАФ в объеме 0,5 мл, в соотношении
1:1. Испытуемый препарат вводят 2 группам животных в дозах:
терапевтическая доза и в 10 раз ее превышающая [5].
Контрольным животным аналогичным способом вводят только ПАФ.
-62-

На 21-й день опыта животным на выстриженный участок спины внутри-
кожно (в/к) вводят разрешающую дозу препарата. Разрешающей дозой при
в/к введении будет являться та концентрация препарата, которая у интакт-
ных животных не вызывает раздражающего действия. Для контроля
реактивности кожи на другой выстриженный участок кожи вводится в/к 0,05
мл растворителя (фосфатный буфер рН 7,2 или стерильный изотонический
раствор натрия хлорида). Через 1, 24 и 48 ч определяют наличие
положительной реакции. Реакцию читают на наружной поверхности кожи, или с
помощью колометрической линейки С. В. Суворова через 24 ч и
оценивают в баллах по следующей шкале [10]:
0 — видимой реакции нет;
1 — бледно-розовая эритема по всему участку или по его периферии;
2 — ярко-розовая эритема по всему участку или его периферии;
3 — красная эритема по всему участку;
4 — инфильтрация и отек кожи (утолщение кожной складки) при
наличии или отсутствии эритемы;
5 — эритема, выраженная инфильтрация, очаговые изъязвления
(некроз), возможны геморрагии, образование корочек.
Следует отметить, что гиперергическая реакция, оцениваемая в 5
баллов, развивается крайне редко и, в ряде случаев, через 3—4 сут.
3.4. Реакция иммунных комплексов
Реакцию целесообразно использовать для выявления способности
лекарственных препаратов вызывать у животных развитие
гиперчувствительности, обусловленной образованием иммунных комплексов [7].
В определенных условиях комплекс антиген—антитело—комплемент,
откладываясь в тканях, обеспечивает развитие выраженного воспаления с
нейтрофильной инфильтрацией. Антителами, ответственными за развитие
таких реакций, могут быть IgG и IgM, способные активировать
комплемент по классическому пути. Активация комплемента приводит к
выделению биологически активных веществ, вызывающих повышение
проницаемости сосудов и способствующих фиксации иммунных комплексов на
стенках сосудов и развитию тканевых поражений.
Сенсибилизация животных путем многократного подкожного введения
антигена приводит (после разрешающей внутрикожной инъекции) к
развитию в месте инъекции геморрагического некротического воспаления,
обусловленного образованием специфических иммунных комплексов.
Сенсибилизацию морских свинок фармакологическим средством
проводят подкожно, пятикратно, с интервалом в 6 сут, в объеме 0,2 мл.
Сенсибилизирующая доза испытуемого препарата — терапевтическая и
в 10 раз превышающая (2 группы животных). Контрольным животным по
той же схеме и в том же объеме вводят растворитель.
Через 10 сут после последней сенсибилизирующей инъекции
тест-препарата сенсибилизированным животным осуществляют введение
разрешающей дозы, которую вводят внутрикожно в объеме 0,05 мл на
выстриженном участке кожи. На другом участке кожи этим же животным вводят
растворитель (контроль на реактивность кожи).
Разрешающую дозу тест-препарата определяют на интактных животных.
За разрешающую дозу принимается наибольшее разведение антигена, не
вызывающее видимых изменений в коже через 1 ч после внутрикожной
инъекции.
-63-

Учет реакции проводят визуально и гистологически. Уже через 30 мин
на месте инъекции могут развиться отек и резкая гиперемия. В течение
последующих 2—3 ч воспалительный очаг уплотняется, кожа становится
буро-красной.
Желательно провести гистологическое исследование, при котором, в
случае положительной реакции, может быть обнаружено острое
геморрагическое воспаление; в инфильтрированном участке могут быть видны
полиморфно-ядерные лейкоциты.
При большой дозе антигена местные явления нарастают, через
несколько суток очаг может подвергнуться некрозу.
3.5. Метод накожных аппликаций
На выстриженный участок кожи боковой поверхности туловища
морских свинок-альбиносов, ближе к середине туловища, наносят по 3 капли
раствора испытуемого вещества, приготовленного на дистиллированной
воде или других растворителях (ацетон, этиловый спирт, вазелиновое
масло и др.). Если вещество нерастворимо, то наносят по 0,5 г мази,
приготовленной на вазелине или ланолине. Дозы для эксперимента определяют
в соответствии с разделом 1.5. Вещество наносится на протяжении 2 нед
по 5 раз в неделю [4].
Реакцию кожи учитывают ежедневно по шкале оценки кожных проб
[9]. Этот эксперимент позволяет выявить опасность развития
неаллергического контактного дерматита в зависимости от дозы изучаемого
фармакологического средства.
Исследование сенсибилизирющего действия вещества проводят путем
20 повторных накожных аппликаций на участок боковой поверхности
туловища размером 2 х 2 см по 5 раз в неделю. Если наносят жидкость, то
ее дозируют пипеткой и берут по 3 капли (1 мл водного раствора — 60
капель, ацетона — 40, вазелинового масла — 51). Если применяют мазь, то ее
наносят равномерным слоем на весь участок аппликации с помощью
глазной стеклянной лопаточки. Более 20 накожных аппликаций проводить не
следует, так как они могут оказать гипосенсибилизирующее действие,
особенно если фармакологическое средство является слабым аллергеном.
Первое тестирование проводят после 10 аппликаций и, в случае
выявления аллергии, дальнейшее нанесение вещества можно прекратить. При
отрицательном или сомнительном результате число аппликаций обязательно
доводят до 20, после чего животных тестируют повторно.
3.6. Конъюнктивалъная проба
Сенсибилизацию животных осуществляют в соответствии со способом
введения тестируемого препарата в клинике. Для постановки пробы 1
каплю водного раствора аллергена вводят глазной пипеткой с вытянутым
тонким концом под верхнее веко подопытным и контрольным морским
свинкам, во второй глаз (контрольный) вводят 1 каплю воды. Закапывание
удобно производить при положении животного лежа головой вниз [2].
Реакции учитывают через 15 мин (быстрая реакция) и через 24—48 ч
(гиперчувствительность замедленного типа) и оценивают по следующей
шкале (в баллах):
1 — легкое покраснение слезного протока;
-64-

2 — покраснение слезного протока и склеры в направлении к роговице;
3 — покраснение всей конъюнктивы и склеры. Реакция сопровождается
зудом и при расчесывании лапками возможно развитие гнойного офталь-
мита. Подбор концентрации аллергена осуществляется путем закапывания
различных концентраций в глаз несенсибилизированного животного.
3.7. Метод оценки чувствительности гладких мышц трахеобронхиалъной
цепочки морских свинок при ингаляционном пути введения тест-препарата
Сразу же после забоя морских свинок готовят изолированную трахео-
бронхиальную цепочку из 16—20 отдельных колец трахеи, связанных по
стороне хряща тонкой шелковой ниткой таким образом, чтобы участки гладких
мышц, соединяющих хрящевые концы отдельных колец, находились на
одной линии и составляли продольную полоску длиной 3—4 см.
Приготовленную цепочку помещают в отдельный сосуд—"баню", который заполняют 10
мл питательного раствора Кребс—Гензелейта с температурой 35—37 °С [13].
Состав раствора в г/л Н20:
NaCl - 6,87,
КС1 - 0,42,
СаС12 - 0,28,
NaHPO4-0,15,
MgS04 x 7H20 - 0,29,
NaHC03 - 2,1,
глюкоза — 1,0.
Через питательный раствор в течение всего опыта пропускают газовую
смесь, состоящую из 95 % 02 и 5 % С02. Исследуемые вещества вносят в
"баню" в объеме 0,1—0,2 мл, затем цепочку многократно отмывают
свежими порциями питательного раствора. Повторные дозы исследуемых
веществ вносят через 15—20 мин. Определяют концентрацию препаратов,
которые вызывают пороговое сокращение цепочки. Чувствительность
последней к каждому веществу выражают в микрограммах на миллиметр.
3.8. Непрямая реакция дегрануляции тучных клеток (РДТК)
Постановку РДТК осуществляют следующим образом [3, 9]. Для
получения тучных клеток крыс животных забивают кровопусканием, вводят
внутрибрюшинно 5—8 мл подогретого до 37 "С раствора Тироде без
глюкозы, после легкого массажа брюшной стенки в течение 1 — 1,5 мин делают
ножницами по средней линии разрез длиной 1,5—2 см, переворачивают
тушку разрезом вниз и собирают экссудат, стекающий с петель кишечника
в смоченную гепарином пробирку. Препараты готовят на обезжиренных
предметных стеклах, окрашенных 0,3 % спиртовым раствором
нейтрального красного и высушенных при комнатной температуре.
К 0,03 мл взвеси тучных клеток добавляют 0,03 мл сыворотки
подопытного животного и 0,03 мл специфического аллергена (например,
исследуемого фармакологического средства).
Исследуемое фармакологическое средство должно быть растворимо в
воде. Разведение фармакологического средства обычно составляет 1:100
или более, чтобы в контроле на антиген дегрануляция тучных клеток не
превышала 5 %.
3-762
-65-

Далее препараты покрывают покровным стеклом, края которого
смазывают вазелином, затем инкубируют 15 мин в термостате при 37 °С.
Препараты микроскопируют под увеличением х20.
Оценку результатов проводят дифференциальным способом учета,
подсчитывают показатель дегрануляции тучных клеток (ПДТК) по формуле:
пттгъг — 1а + 2Ь + Зс + 3d
пдтк _ Too ■
где а, б, с, д — количество (среднее из трех повторений) дегранулирован-
ных клеток соответственно степени дегрануляции (слабовыраженной,
умеренной, резкой и степени полностью дегранулированных клеток). В
каждой камере подсчитывают 100 клеток, если ПДТК превышает 0,2. При
постановке реакции необходимо учитывать следующие контроли: перитоне-
альной взвеси тучных клеток, аллергена и сыворотки. В контрольных
пробах до нужного объема доводят растворителем (фосфатный буфер рН 7,2):
отсутствие подбора оптимальных доз антигена и исследуемой сыворотки,
нарушение рН среды.
4. Псевдоаллергические реакции
В настоящее время известно большое число веществ, способных при
введении в организм оказывать гистаминолибераторное действие и
вызывать истинные аллергические реакции. При действии специфического
антигена происходит специфическая гистаминолиберация из тучных клеток
(ТК), в результате взаимодействия аллергена с реагинами,
фиксированными на поверхности ТК, что сопровождается секрецией гистамина и других
медиаторов аллергической реакции. Известно, что многие лекарственные
средства и химические вещества высвобождают медиаторы, в том числе
гистамин, неспецифически, в результате прямого действия на ТК и базо-
фильные лейкоциты. Такой механизм гистаминолиберации характерен для
так называемых псевдоаллергических реакций, а вещества, вызывающие
эти реакции, называются неиммунологическими активаторами. В
настоящих методических рекомендациях предлагается использовать метод
определения процента гистаминолиберации из ТК крыс по реакции
конденсации медиатора с ортофталевым альдегидом. Для этой цели наиболее
адекватным методом является метод Шор. Кроме метода Шор, могут быть
использованы реакции воспаления (отека стопы крыс и мышей) на уже
известные неиммунологические активаторы (конканавалин А, 48/80, декст-
ран и др.) [16].
4.1. Метод Шор
Работа выполняется на интактных крысах популяции Wistar (1—2
животных для исследования одного вещества). После декапитации животному
внутрибрюшинно вводят 5—10 мл подогретого до 25 °С раствора Хенкса,
аккуратно массируют живот в течение 90 с. Вскрывают брюшную полость
по средней линии и отсасывают взвесь ТК пипеткой или сливают в
пробирки. Эритроцитов не должно быть. Тучные клетки осаждают
центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин и готовят в растворе Хенкса
10 мл взвеси ТК с концентрацией 105 кл/мл. Для подсчета клеток
используют 0,1 % раствор нейтрального красного.
-66-

Выявление гистаминолибераторного действия исследуемого вещества:
а) в предварительном эксперименте подбирают нетоксическую дозу
фармакологического вещества;
б) с целью инкубации с исследуемым веществом ТК разливают в 2
параллельные пробирки по 1 мл в указанной концентрации. К взвеси
добавляют по 100 мкл тест-препарата в нетоксической для ТК концентрации.
Пробирки слегка встряхивают и инкубируют в течение 10 мин при
температуре 37 °С. Для остановки процесса гистаминолиберации в пробирки
добавляют по 1,5 мл охлажденного раствора Хенкса, центрифугируют 5—10
мин при 1000—1500 об/мин и надосадок сливают в чистые пробирки для
определения выделившегося гистамина. К осадкам добавляют 0,1 мл 1 %
раствора трилона Х-100, вьщерживают при комнатной температуре 5—7
мин, добавляют 2,5 мл раствора Хенкса.
В качестве контроля используют:
1-я пробирка — стандартный раствор гистамина (1 мкг/мл 100 %
содержание гистамина);
2-я пробирка — раствор Хенкса (флюоресценции не должно быть);
3-я пробирка — 1 мл взвеси ТК в концентрации 105;
4-я пробирка — 1 мл рабочего раствора Хенкса.
3-я и 4-я пробирки ставятся для проверки чистоты реактивов.
Исследуемое вещество оценивают на степень спонтанной флюоресценции или
способность ее ингибиции.
4.2. Реакция конденсации с ортофталевым альдегидом (ОФА)
В четыре опытные пробирки (2-е надосадочной жидкостью и 2 — с
тучными клетками, лизированными трилоном) и контрольные 3-ю и 4-ю
добавляют по 0,2 мл ЗМ NaOH и 0,1—0,2 мл ОФА. Обязательно
встряхивают каждую пробирку сразу же после добавления ОФА. Через 4 мин
добавляют 0,15 мл 1,5 % Н3Р04 (среда должна быть кислая). Флюориметрия
[13] — через 10 мин после стабилизации раствора ортофосфорной
кислотой, измеряют флюоресценцию на спектрофлюориметре Хитачи НРр-4.
Сначала измеряют величину свечения контрольных проб, затем опытных
образцов.
Процент выхода гистамина рассчитывают по формуле:
-А- х юо,
А + В
где А — процент выделившегося гистамина из ТК (надосадочная
жидкость); В — процент гистамина, оставшегося в ТК (осадок ТК).
Определение рабочей зоны тест-препарата осуществляется опытным
путем. Обычно это уже 10~4— Ю-6 молей. К 900 мкл суспензии ТК в
концентрации 106 добавляют 100 мкл исследуемого вещества (инкубируют 10—15
мин в термостате при 37 °С). Затем подсчитывают живые клетки по
исключению трипанового синего (каплю клеточной суспензии при комнатной
температуре смешивают с каплей 0,1 % раствора трипанового синего и
через 1—3 мин подсчитывают число погибших, т. е. окрашенных, клеток),
количество погибших клеток не должен превышать 5 %.
Ставится контроль на отсутствие спонтанной дегрануляции:
ТК + трипановый синий — мертвые клетки < 5 %.
3*
-67-

4.3. Реакция воспаления на конканавалин А у мышей
Реакция воспаления на конканавалин А (Кон А) основана на
способности пектинов растительного происхождения высвобождать медиаторы
воспаления [16]. Опыты проводят на мышах самцах линии СВА или
беспородных мышах массой 18—20 г. Исследуемое фармакологическое средство
вводят рекомендуемым для клинического применения способом не менее
чем в 2 дозах: терапевтически эффективной (для мышей) и
субтоксической. Животным контрольной группы аналогичным способом вводят
соответствующий объем растворителя. Через 1 час (или через время
максимальной концентрации препарата в крови) мышам опытных и
контрольной групп субплантарно (в подушечку задней стопы) вводят Кон А в дозе
100 мкг/20 г массы тела (20 мкл раствора в концентрации 5 мг/мл), в конт-
ралатеральную конечность — тот же объем изотонического раствора
натрия хлорида. Таким образом, Кон А вводят в концентрации, значительно
превышающей оптимальную (1—10 мкл/мл) в опытах по изучению мито-
генной активности. Через 1 час мышей забивают, определяют массу лап и
подсчитывают индекс реакции воспаления (Ир) по формуле:
Ир = Роп ~ Рк х юо %,
Рк
где Роп — масса стопы задней лапы, в подушечку которой вводили Кон А,
Рк — изотонический раствор натрия хлорида.
Статистически достоверная разница между данными опытных и
контрольной групп, превышающая 20 %, считается значимой.
5. Оценка сенсибилизирующих свойств лекарственных средств
Степень аллергенной активности фармакологического средства
устанавливается в зависимости от ряда критериев, определенных в эксперименте
на животных: величина сенсибилизирующей дозы, степень развития
аллергического состояния, частота и характер проявления аллергической
реакции, величина титра сенсибилизации и др.
По результатам эксперимента наш опыт позволяет составить следующие
представления об испытанном фармакологическом средстве.
Если число сенсибилизированных животных в группе по одному из
испытанных тестов составляет менее 50 %, то наблюдаемые эффекты
рассматриваются как проявление индивидуальной чувствительности.
Если число сенсибилизированных животных в подопытной группе
составляет 50 % и более, то фармакологическое средство относится к
потенциальным аллергенам. И хотя трактовка результатов и перенос
экспериментальных данных в клиническую практику имеют определенные
трудности, названные критерии позволяют составить представление о степени
потенциальной опасности развития аллергоза в клинической практике.
На современном этапе внедрение в медицинскую практику новых
лекарств с выявленной аллергенной активностью нежелательно, однако
следует оценить соотношение польза—риск при их применении.
Полученные данные учитываются при проведении клинических
исследований фармакологического средства с указанием в протоколе
клинических испытаний возможности аллергических проявлений.
Если обнаружено, что изученное фармакологическое средство вызывает
псевдоаллергические реакции, необходимо продолжить исследования для
-68-

установления дозы, которая не вызывает неспецифического выброса гиста-
мина, и внести эти рекомендации в проект инструкции.
Работа по изучению потенциальной аллергенности фармакологических
средств с использованием описанных методов требует хорошей
профессиональной подготовки и должна проводиться иммунологами и научными
работниками, прошедшими необходимую стажировку в специальных
лабораториях.
Данные методические рекомендации характеризуют процедуру
проверки, но не являются пособием для освоения методов. Так как исследования
в области аллергии к лекарственным средствам интенсивно развиваются,
то через 2—3 года методические рекомендации целесообразно
пересмотреть с целью дальнейшей оптимизации работы по проверке аллергенной
активности новых фармакологических средств.
Л итература
1. Адо А. Д. Общая аллергология. — М.: Медицина, 1978. — С. 462.
2. Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии. — Ташкент, 1978. — С. 79—83.
3. Алексеева О. Г., Дуева Л. А. Аллергия к промышленным химическим
соединениям,— М.: Медицина, 1978. — С. 271.
4. Алексеева О. Г., Петкевич А. И. // Гигиена и санитария. — 1972, № 3. — С. 64—67.
5. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля. — М.: Медицина, 1967. — С. 472.
6. Любимов Б. И. и др. // Опыт оценки безопасности фармакологических средств в
России (1991—1996 гг.). Проблемы и перспективы: Тез. докл. симп., 12—13 ноября
1996 г. - 1997.
7. Никитин В. М. Справочник методов иммунологии. — Кишинев, 1982. — С. 303.
8. Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и
обоснование предельно-допустимых уровней загрязнения кожи: Методические указания /
Сост. Марченко Е. Н., Егоров Ю. Л., Шашкина Л. Ф. и др. — М., 1955.
9. Радунская С. Ф. Тест непрямой дегрануляции ТК крыс, как метод оценки
специфической активности инфекционных аллергенов: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. —
М., 1982. - 16 с.
10. Суворов С. В. — В кн.: Профилактика профессиональных заболеваний кожи
рабочих железнодорожного транспорта как комплексная гигиеническая проблема. —
М., 1974. - С. 103-122.
11. Суровикина М. С. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. —
1975, № 2. - С. 60-63.
12. Черноусое А. Д. // Гигиена труда и профессиональные заболевания. — 1987, № 6. —
С. 45-48.
13. Юденфред С. Флуоресцентный анализ в биологии и медицине. — М.: Мир, 1965. —
С. 169-173.
13. Cell P. G. H., Coombs R. R. A. Clinical aspects of immunology. — Oxford, Edinburg,
1975. - 1754 p.
15. George M., Vaughan T. M. // Proc. Soc. Exp. Biol. - 1965. - Vol. 111. — P. 514.
16. Khosrasi E. et al. Allergic conjunctivitis and uveitis models: Reappraisal with some
marketed drugs // Inflamm. Res. — 1995. — Vol. 44. — P. 47—54.
17. Ovary Z., Biov.i G. // Int. Arch. Allergy. - 1954. - Vol. 5. - P. 241.
18. Ovary Z. И Progr. Allergy. - 1958. - Vol. 5. - P. 459.16.
19. Shore P. A., Burkhalter A., Coch V. U. J. // Pharmacol, exp. Ther. - 1959. — Vol. 127. —
P. 182.
20. Weigh W. O., Cochrane G., Dixon F. L. // J. Immunol. — 1960. - Vol. 95. — P. 5.

Методические указания по оценке иммунотоксического
действия фармакологических средств
СОСТАВИТЕЛИ: академик РАМН, проф.
Р. М. Хаитов; к. б. н. А. С. Иванова; к. б. н.
Т. Б. Мастернак; к. б. н. О. Н. Стеценко; д. м.
н., проф. Р. И. Атауллаханов; член-корр.
РАМН, проф. Б. И. Любимов; д. б. н. Л. П.
Коваленко; к. м. н. Л. Ю. Телегин; член-корр.
РАМН, проф. Т. А. Гуськова; д. м. н., проф.
А. В. Никитин; к. б. н. Г. П. Кудрина; д. м. н.,
проф. Е. В. Арзамасцев
Введение
Методические рекомендации предназначены для сотрудников
исследовательских лабораторий, занимающихся доклиническими испытаниями
потенциальных лекарственных средств.
Настоящие Методические рекомендации являются частью общей
программы доклинического изучения безопасности новых фармакологических
средств и направлены на оценку потенциального риска для иммунной
системы человека.
В последние два десятилетия возрастающее количество публикаций о
повреждающем действии на иммунную систему факторов загрязнения
окружающей среды и ряда лекарственных препаратов привело к
формированию самостоятельного научного направления — иммунотоксикологии.
Иммунотоксикология зародилась u во второй половине 70-х годов XX
столетия. В 1979 г. в "Анналах Нью-Йорской Академии наук" публикуются
материалы первого симпозиума, посвященного данному вопросу, а в
1983 г. в журнале "Immunology Today" впервые было формально заявлено о
возникновении нового научного направления — иммунотоксикологии, как
результата слияния иммунологии и токсикологии [12, 14].
Иммунотоксикология в исследовательском плане определяется как
наука, занимающаяся идентификацией и анализом внешнесредовых агентов,
химических, пищевых и лекарственных факторов, которые вызывают
изменения иммунитета [15].
Первое десятилетие существования иммунотоксикологии было
ознаменовано развитием исследований по следующим направлениям [12, 18].
1. Доказательство того, что иммунная система организма может
являться мишенью поражающего действия ксенобиотиков.
2. Подтверждение того, что иммуносупрессия, гиперчувствительность и
аутоиммунные процессы могут являться нежелательными последствиями
воздействия ксенобиотиков.
3. Разработка стандартной группы тестов для изучения иммунотоксич-
ности на грызунах.
К настоящему времени поле научных интересов в области
иммунотоксикологии представляет собой четко ограниченную область иммунологии,
основывающуюся на токсикологических принципах. Так как во всем мире
в обществе растет понимание важности связи между иммунитетом и
общим состоянием здоровья человека, значение иммунотоксикологии
возрастает до степени жизненно важного междисциплинарного направления.
-70-

В настоящее время иммунотоксикология как научное направление
полноправно присутствует в программах большинства токсикологических
исследовательских учреждений.
В отличие от установленных Протоколов доклинического изучения
общетоксического действия, методологические и методические проблемы
исследования иммунотоксического действия фармакологических средств до
настоящего времени остаются предметом поиска и дискуссий во всем мире
[20].
В нашей стране был разработан ряд соответствующих методических
рекомендаций, регламентирующих изучение влияния на иммунную систему
фармакологических и иммунобиологических средств, изучение аллергизи-
рующего и иммунотоксического действия потенциальных лекарственных
препаратов [1, 2, 6, 7, 9, 11].
Под иммунотоксическим действием традиционно понимают
модифицирующее влияние ксенобиотиков и лекарственных средств на иммуногенез,
включая иммуносупрессию и гиперстимуляцию иммунититета, способное
привести к снижению резистентности организма к инфекции, повышению
риска онкологических заболеваний, развитию аутоиммунной патологии и
аллергизации организма [22].
Основная задача доклинического изучения влияния потенциальных
лекарственных средств на иммунную систему состоит в том, чтобы в
эксперименте на животных доказать или исключить возможность развития
иммунотоксического действия, вызванного фармакологическим средством
или его метаболитами.
Предложенный подход к оценке иммунотоксического действия
фармакологических средств заключается в исследовании ряда интегральных
иммунологических функций, позволяющих, с учетом результатов
гематологических и морфологических исследований лимфоидных органов, оценить
возможный риск при применении нового фармакологического средства.
1. Общие положения
Обязательному тестированию на иммунотоксичность должны
подвергаться новые, оригинальные фармакологические средства, а также
известные лекарственные средства, для которых отсутствуют данные об изучении
иммунотоксичности, рекомендуемые:
а) для применения длительными повторными курсами;
б) для применения в детской практике, а также для лечения
беременных женщин и при назначении в период лактации;
в) в качестве профилактических средств и контрацептивов;
г) для использования без назначения врача среди широких слоев
населения.
Рассматривается индивидуально вопрос об изучении имунотоксичности
препаратов:
а) предназначенных для лечения злокачественных новообразований;
б) применяемых однократно или коротким не повторяющимся курсом.
Тестирование не обязательно для фармакологических препаратов,
предлагаемых:
а) для лечения заболеваний, представляющих непосредственную угрозу
для жизни;
б) для иммуномодулирующих средств, безопасность применения
которых изучена в рамках исследования специфической активности;
- 71 -

в) воспроизводимых отечественных и зарубежных лекарственных
средств, если в литературе имеются достаточно обоснованные сведения
экспериментального и ретроспективного характера, подтверждающие
отсутствие иммунотоксических свойств соответствующего аналога.
2. Методология иммунотоксического тестирования
Главной задачей иммунотоксикологии является разработка стратегии
оценки состояния иммунитета, которая позволит четко прогнозировать
последствия влияния экзогенных факторов на иммунную систему человека.
Наиболее подробно и тщательно вопросы методологии иммунотоксико-
логического исследования были рассмотрены в 1994 г. на рабочем
совещании, состоявшемся в Арлингтоне (США) [20]. При тестировании на имму-
нотоксичность предлагается использовать этапный подход, как правило,
двух- или трехуровневый. При оценке иммунотоксичности приоритет
отдается функциональным методам иммунологического исследования,
морфологические и гистологические исследования служат дополнением. На
совещании большое внимание уделялось стандартизации методов: валид-
ность метода (селективность, специфичность, чувствительность, точность
и воспроизводимость); выбор животных (видовые и генетические
особенности); межлабораторная верификация исследований.
Существующие представления о ходе развития защитных реакций
иммунной системы [10] свидетельствуют о том, что в эксперименте
обнаружить повреждения в иммунной системе под воздействием химических или
фармакологических средств с большей вероятностью можно при
использовании модели антигенного стимула, т. е. на фоне развития специфического
иммунного ответа, включающего в себя все этапы иммунного
реагирования.
При обсуждении условий проведения исследований
иммунотоксических свойств фармакологических средств наибольшие дискуссии
вызывают вопросы выбора методов, доз и схем введения исследуемого
препарата.
Накопленный 20-летний опыт изучения иммуномодулирующего и
иммунотоксического действия фармакологических средств определяет
использование комплексного подхода. Этот подход включает в себя изучение
действия исследуемого соединения как при однократном введении в
широком диапазоне доз, различающихся на 3—4 порядка, так и при курсовом
введении в дозах, отобранных при однократном введении с учетом дозы,
рекомендуемой для клинического изучения и ЛД50 препарата.
Однократное введение фармакологического средства с перерывом в 1 ч
от введения антигена позволяет выявить прямое действие на иммунные
реакции и на клетки иммунной системы. Курсовое введение позволяет
оценить и непрямое иммунотоксическое действие, связанное с нарушением
органов и систем организма, сопряженных с иммунной системой (нервная
и эндокринная системы, печень и др.).
Для предварительного анализа иммунотоксичности фармакологического
средства могут быть использованы:
• данные литературы о влиянии на иммунную систему аналогов или
близких по действию и химической структуре веществ;
• результаты изучения общетоксического действия, полученные при
изучении подострой и хронической токсичности. Окраска органов
иммуногенеза азуром 2 и эозином вместо традиционно используе-
-72-

мого в токсикологии гематоксилина позволяет оценить зональную
принадлежность и степень дифференцировки иммунокомпетентных
клеток. Оценку активности морфологических изменений в лимфо-
идных органах можно проводить с использованием метода рангов
(приложение 2).
3. Условия проведения эксперимента
3.1. Предварительная оценка иммунотоксичности при однократном
введении
Цель данного этапа — выявить возможный иммунотропный потенциал
фармакологического средства при однократном введении животным в
широком диапазоне доз. Независимо от предполагаемых доз и пути введения
препарата в клинической практике оценку иммунотропного потенциала
предлагается проводить по схеме, оптимальной для выявления как имму-
носупрессивного, так и иммуностимулирующего действия. Оценка
проводится в интегральном функциональном тесте: выработка антителообразую-
щих клеток (АОК) при иммунизации мышей Т-зависимым антигеном —
эритроцитами барана (ЭБ). Результаты этих исследований позволяют
выявить характер действия на иммунную систему и активную дозу
фармакологического средства. Эти данные используются для обоснования
последующих исследований.
Препарат вводится однократно, внутривенно или внутрибрюшинно
(экспериментальный аналог внутривенного введения).
Уровень доз — 10-кратная терапевтическая для человека в расчете на
единицу массы тела и в дозах, кратных 5 (50-кратная, 250-кратная, 1250-
кратная). В случае невозможности использования высшей из
предложенных ДОЗ ИСПОЛЬЗуеТСЯ l/l0—V20 ДД50-
Препарат вводится в день иммунизации животных (перерыв 1 ч)
эритроцитами барана в дозе 2 х 107.
Оценку реакции производят на 4-е сутки методом локального гемолиза
в геле агарозы (приложение 1).
Мыши-гибриды (CBAxC57BL/6)F, 6—8-недельного возраста массой
18-20 г.
3.2. Оценка иммунотоксичности при курсовом введении
Целью данного этапа является оценка степени и длительности
возможного повреждения иммунной системы при введении препарата по схеме,
максимально приближенной к клиническому применению.
Режим введения — индивидуально, согласно предполагаемому для
использования в клинике.
Способ введения — согласно предполагаемому в клинике (для
внутривенных препаратов можно рекомендовать внутрибрюшинное введение
животным).
Уровень доз — как минимум два: 10-кратная терапевтическая и доза на
порядок выше нее. В случае невозможности использования высшей из
указанных доз, максимальная доза обосновывается индивидуально исходя
из специфики препарата.
Сроки наблюдения: оценку состояния иммунной системы проводят по
- 73 -

окончании введения фармакологического средства и в случае выявления
изменений какого-либо параметра через 7—21 день с целью определения
срока восстановления нарушенной функции.
3.3. Экспериментальные животные.
Используются сертифицированные животные: мыши СВА, BALB/c,
C57BL/6 и др. с массой тела 18—20 г. Однако в иммунотоксикологических
экспериментах предпочтительно использование гибридов первого
поколения 6—8-недельного возраста (масса тела 20—22 г). Такой выбор животных
обоснован фенотипической стабильностью и большей жизнеспособностью,
связанной с их гетерозиготностью. Кроме того, это позволяет снизить
вероятность непредсказуемого влияния нового вещества на величину
реакции в случае использования высоко- или низкоотвечающих мышей ин-
бредных линий. Наиболее доступными в наших условиях являются мыши-
гибриды (СВА х C57BL/6)F, и (C57BL/6 х DBA)F,.
Группы формируются с учетом получения статистически достоверных
результатов (не менее 10 голов). Разброс в группе по массе тела не должен
превышать ± 10 %. Необходимо, чтобы контрольные и опытные животные
были одного пола, возраста, получены одновременно из одного
питомника, содержались в аналогичных условиях. Условия содержания и питания
животных должны соответствовать установленным правилам.
В связи с тем, что действие фармакологического препарата зависит от
физиологического состояния животных, изменяющегося под влиянием
ряда внешних факторов, рекомендуется все исследования проводить в одно и
то же время суток (предпочтительно утром).
Контроль: контрольной группе животных вводится соответствующий
растворитель в том же объеме и по той же схеме, что и исследуемый
препарат. При длительном введении препарата желательно предусмотреть
группу интактных животных (того же возраста и источника) для выявления
возможных изменений в иммунной реактивности, обусловленных
факторами, не имеющими отношения к исследуемому веществу (стресс и др.).
Желательно в качестве положительного контроля предусмотреть также
использование известных иммунотропных препаратов
иммуностимулирующего и иммуносупрессирующего действия.
3.4. Обоснование предлагаемых методов и подходов к оценке
иммунотоксичности на первом этапе исследования
Luster и соавт. в руководстве "Metods in Immunotoxicology" [19] приводят
доказательства высокой прогностической ценности использования
комплекса перечисленных методов для оценки риска при изучении иммуно-
токсического действия.
• Используется один из предложенных или другие адекватные
поставленным задачам методы.
Из приведенных выше методов тестирования иммунотоксичности
наибольшего внимания, с точки зрения информативности, заслуживает
оценка гуморального иммунного ответа, т. е. способность иммунной системы к
выработке антител в ответ на инфекционные и неинфекционные
антигены. Процесс антителообразования, в котором в кооперативном
взаимодействии участвуют все основные клетки иммунной системы (Т-, В-, А-),
-74-

Таблица 1. Программа первого этапа оценки иммунотоксического действия
фармакологических средств при курсовом введении

Оцениваемая функция

Гуморальный
иммунный ответ
Клеточный
иммунный
ответ
Активность
фагоцитов
Модельные реакции
Оценка антителообразования
у животных при
иммунизации их тест-антигенами
Индукция реакции
гиперчувствительности замедленного
типа (ГЗТ) к
корпускулярному антигену и/или гаптену
Оценка фагоцитарной и
бактерицидной активности
фагоцитирующих клеток
разной локализации
Иммунологические тесты *
1. Определение антителообразующих
клеток к ЭБ в реакции локального гемолиза в
геле агарозы (метод Ерне).
2. Реакции гемагглютинации и гемолиза
Реакция ГЗТ к ЭБ или гаптену — тринит-
робензосульфоновой кислоте (ТНБС)
1. Фагоцитоз агентов различной природы
(ЭБ, тушь, латекс, стафилококк и др.) пе-
ритонеальными макрофагами.
2. Хемилюминесценция клеток при
фагоцитозе опсонизированного материала.
3. Определение активности фермента
5'-нуклеатидазы
включает главные этапы иммунного реагирования (фагоцитоз,
презентацию антигена, распознавание, активацию, пролиферацию, созревание,
синтез специфических антител и т. п.), а также сопровождается каскадом
цитокиновых реакций.
В качестве антигена могут быть использованы эритроциты барана (ЭБ).
Этот экспериментальный Т-зависимый тест-антиген наиболее полно
моделирует различные варианты чужеродного агента (корпускулярный, тимус-
зависимый, содержащий множество антигенных детерминант).
Наибольшее число исследователей в нашей стране и за рубежом для
оценки гуморального иммунного ответа отдают предпочтение методу
определения числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей при
иммунизации Т-зависимым антигеном [2, 7, 11, 16, 17]. Именно этот
интегральный показатель широко используется многими исследователями на
первом этапе тестирования фармакологических средств. Оценка иммуно-
тропного потенциала исследуемого препарата проводится в схеме,
оптимальной для выявления как иммуносупрессивного, так и
иммуностимулирующего действия (приложение 1).
Анализ результатов собственных исследований и данных литературы
позволил выявить высокую степень корреляции между активацией
антителообразования и системы фагоцитов и влиянием на резистентность
организма к инфекции [4].
Оценку клеточного иммунитета традиционно проводят с использованием
реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) при введении
определенных классов антигенов (эртроциты барана, туберкулин, овальбу-
мин и др.). Наиболее информативным представляется использование для
сенсибилизации тринитробензосульфоновой кислоты (ТНБС). Механизм
индукции гиперчувствительности замедленного типа при введении этого
гаптена подобен таковому при развитии контактной аллергии ко многим
химическим и лекарственным веществам, образующим комплексы с
белками организма. Усиление выраженности данной реакции под влиянием
фармакологического средства может характеризовать также и риск
изменения аллергостатуса и возможность повышения чувствительности организма
к традиционным аллергенам.
-75 -

Следующим, обязательным тестом первого этапа исследования иммуно-
токсичности является оценка фагоцитарной и бактерицидной активности
фагоцитов различной локализации: периферической крови,
фагоцитирующих клеток перитонеального экссудата. При этом в качестве антигена
используются агенты различной природы: тушь, эритроциты барана, латекс,
стафилококк и т. п. В настоящее время во многих лабораториях для
оценки активности фагоцитов широко используется метод хемилюминесценции
клеток при фагоцитозе опсонизированного материала in vitro. Доказана
также высокая информативность в оценке функциональной активности
макрофагов метода определения уровня мембранного фермента 5'-нуклеа-
тидазы [8]. Установлено, что активность препаратов, выявленная в
указанном тесте, коррелирует с иммуноадъювантной активностью и
способностью изменять резистентность животных к инфекции [4].
При выявлении на первом этапе нарушений в иммунном ответе под
влиянием фармакологического средства приступают к исследованиям
второго этапа, целью которого является получение дополнительной
информации о механизме действия исследуемого вещества, что позволяет с
большей степенью вероятности прогнозировать последствия применения в
клинике фармакологического средства.
3.5. Обоснование предлагаемых методов и подходов к оценке
иммунотоксичности на втором этапе исследования
При выявлении на первом этапе исследований чрезмерной активации
отдельных звеньев иммунитета имеется, по крайней мере, два аспекта для
прогноза опасности при применении потенциального лекарственного
средства, а именно: возможное усиление аллергизации и развитие
аутоиммунной патологии.
Требования к оценке аллергизирующих свойств фармакологических
средств изложены в специальных методических указаниях [3].
Оценка аутосенсибилизации является сложной задачей вследствие
разнообразия и специфичности структур организма, которые могут явиться
мишенью конкретной аутоагрессии.
В рамках данных рекомендаций для получения первичной информации
о возможности срыва толерантности применяют методы, широко
используемые в иммунологических исследованиях.
Для изучения митогенных свойств фармакологического средства и
влияния его на пролиферацию лимфоцитов рекомендуется реакция бласт-
трансформации лимфоцитов.
При наличии водорастворимой формы исследуемого средства, реакция
лимфоцитов на повторный контакт с ним in vitro позволяет оценить
возможность сенсибилизации организма животных, а добавление препарата в
культуру пролиферирующих клеток интактных животных позволяет
оценить его прямой митогенный эффект. Достаточно информативным,
коррелирующим с сенсибилизирующими свойствами фармакологического
средства, является факт усиления ФГА-индуцированной пролиферации спле-
ноцитов мышей после введения им препарата [5].
В качестве альтернативного метода оценки потенциальной способности
фармакологических средств индуцировать аутоиммунные и аллергические
реакции широко используется методика определения массы и клеточности
подколенного лимфатического узла, так называемый popliteal lymph node
assay, PLNA [13]. В журнале "Toxicology" [21] данный тест рекомендуется
-76-

Таблица 2. Программа второго этапа оценки иммуиотоксического действия
фармакологических средств при курсовом введении
Оцениваемая функция
Митогенные свойства
Поликлональные свойства
Функциональная
активность лимфоцитов
Резистентность мышей к
экспериментальной
инфекции
Модельная система
Прямое митогенное
действие лекарственных
препаратов на лимфоциты
Поликлональная активация
различных клонов антите-
лообразующих клеток
Пролиферативная
активность лимфоцитов in vitro
Заражение животных
различными видами
микроорганизмов
Иммунологические тесты
Реакция бласттрансформа-
ции лимфоцитов (РБТЛ)
под влиянием
исследуемого препарата in vitro
Определение антителообра-
зующих клеток к
различным антигенам в реакции
локального гемолиза (ЭБ,
ЭБ-ТНВС, ЭК)
Реакция бласттрансформа-
ции лимфоцитов
(спонтанная и индуцированная Т- и
В-мито генами)
Учет выживаемости и
продолжительности жизни
для прогноза лекарственной аллергии и аутоиммунитета: тестирование 130
соединений с помощью PLNA показало положительную корреляцию с
документированным аутоиммунным и аллергическим потенциалом и
отсутствие ложноотрицательных результатов.
Кроме указанных иммунологических методов исследования, важную
дополнительную информацию о возможном развитии аутоиммунных
осложнений могут дать морфологические исследования потенциальных
органов — мишеней аутоагрессии (почки, щитовидная железа, миокард и др.).
На втором этапе для уточнения последствий изменений в гуморальном и/
или клеточном иммунитете предлагается использовать прямой метод
заражения животных патогенными вирусами и бактериями после окончания
введения препарата и 2—3 нед спустя. Оценка выживаемости и
продолжительности жизни в сравнении с контрольными животными дает прямой ответ на
вопрос: приводит ли к развитию вторичного иммунодефицита и срыву
антиинфекционного иммунитета вызванное фармакологическим средством
нарушение, и как быстро восстанавливается иммунная система. Указанные
исследования могут проводиться только в специализированной лаборатории.
4. Интерпретация результатов
Интерпретация результатов экспериментальных исследований,
адекватная клиническим ситуациям, экстраполяция полученных данных на
человека представляюет наибольшую сложность в иммунологии,
следовательно, и в рассматриваемой проблеме.
Известно, что иммунная система способна к быстрому реагированию на
изменение гомеостаза и в то же время обладает значительными резервами к
самовосстановлению. Существуют механизмы обратного развития
иммунного ответа, направленные на восстановление структуры иммунной системы до
состояния, близкого к исходному. Важную роль играет при этом
прекращение вовлечения в реакцию новых клонов клеток в связи с устранением
антигенного стимула. Срабатывает также ряд механизмов активной иммуносу-
прессии, которую обеспечивают Т-клетки и макрофаги. В данном случае
-77-

роль указанных клеток состоит в генерации неспецифических супрессорных
сигналов, направленных на ограничение и прекращение иммунного ответа.
Временной интервал, в течение которого восстанавливаются
нарушенные функции, следует рассматривать как очень важный показатель для
характеристики безопасности препарата.
В случае выявления достоверных изменений какого-либо из
исследуемых параметров иммунореактивности животных, окончательный прогноз о
возможном иммунотоксическом действии фармакологического средства
можно будет сделать только после решения вопроса о длительности
сохранения выявленного нарушения иммунологической функции и способности
организма животных к восстановлению.
Для этого через 7—21 день по окончании курса введения исследуемого
препарата проводится тестирование состояния иммунной системы по тем
параметрам, для которых были выявлены достоверные изменения. Почему
последний срок 21 день? Это срок, в течение которого созревает новая
популяция лимфоцитов. Если через 3 нед у животных не произошло
восстановления нарушенной функции, то исследуемый препарат следует отнести
к высокоиммунотоксичным соединениям, он не может быть рекомендован
для клинических испытаний.
В случае когда измененная функция восстанавливается через 7—14 дней,
можно полагать, что исследуемый препарат не вызывает серьезного
повреждения иммунной системы животных. В то же время имеются основания
прогнозировать вероятность риска нарушений иммуногенеза при использовании
данного препарата у человека, иммунная система которого, как известно,
отличается более высокой чувствительностью по сравнению с животными,
особенно мышами. Решение о целесообразности дополнительного иммуно-
токсикологического исследования конкретного фармакологического
средства и рекомендация его клинических испытаний должно приниматься
индивидуально в зависимости от его уникальности. Если это уникальное
фармакологическое средство, не имеющее аналогов, и будет принято решение о
его клиническом испытании, то необходимо предусмотреть контроль
иммунного статуса на первом и втором этапе фазы клинических испытаний и
методы коррекции в случае выявления иммунопатологического эффекта.
Проводимые по обсуждаемой Программе экспериментальные
исследования фармакологических средств могут помочь установить
противопоказания или ограничения при применении потенциального лекарственного
средства или, напротив, выявить возможность расширения сферы его
применения как иммуномодулятора. В последнем случае изучение
специфической иммуномодулирующей активности фармакологических средств
должно явиться предметом специальных исследований, выходящих за рамки
изучения безопасности лекарственных препаратов.
Приложение 1
Опыт работы позволяет авторам предложить следующие варианты
постановки вышеуказанных методов.
Определение массы и клеточности органов иммунной системы
Мышей забивают с помощью цервикальной дислокации, извлекают
тимус, селезенку, лимфатические узлы и трубчатые кости. Лимфоидные ор-
-78-

ганы взвешивают и с помощью стеклянного гомогенизатора готовят
клеточную взвесь на среде 199 или на растворе Хенкса (рН 7,4). Полученную
суспензию фильтруют через 2 слоя капрона и дважды отмывают путем
центрифугирования при 200 g в течение 5 мин. Средой 199 из костей
вытесняют и затем гомогенизируют костный мозг. Далее подсчитывают
концентрацию ядросодержащих клеток (ЯСК) в 3 % уксусной кислоте.
Результаты выражают в абсолютных единицах числа ЯСК в органе и в
относительных значениях по отношению к массе органа.
Определение числа антителообразующих клеток (АОК)
Метод основан на образовании вокруг клеток, продуцирующих антитела
с высокой гемолитической активностью (IgM-антитела), сферической
зоны лизиса после добавления антигена и комплемента. Существует
значительное количество модификаций метода Ерне и Нордина, поэтому
исполнители могут выбрать вариант, оптимально отвечающий задаче
конкретного исследования.
Мышам вводят внутрибрюшинно суспензию трижды отмытых в
стерильном изотоническом растворе натрия хлорида эритроцитов барана (ЭБ)
в субоптимальной дозе, равной 5 х 107 ЭБ/мышь. Рекомендуется, чтобы
пути введения антигена и тестируемого препарата различались. Поэтому
препарат согласно предполагаемому способу клинического использования
вводят иным путем в 2 дозах по схемам, указанным выше. На 5-е сутки
после иммунизации определяют число АОК в селезенке. Целесообразно
также проведение реакции локального гемолиза на предмет обнаружения
возможного влияния на спонтанное бляшкообразование (в эксперимент
добавляют 3 группы без введения ЭБ: две с введением препарата и одна —
интактные животные). Наличие эффекта поликлональной активации будет
свидетельствовать о риске развития аутоиммунного состояния.
Постановка реакции. Животных забивают с помощью цервикальной
дислокации, извлекают селезенки и готовят клеточную суспензию при
помощи стеклянного гомогенизатора. Суспендирование проводят в растворе
Хенкса (рН 7,2—7,4) в объеме 5 мл на холоду. Приготовленную суспензию
фильтруют через 1 слой капрона и помещают в холодильник.
Приготовление агарозной смеси. Расплавленную в дистиллированной
воде 2 % агарозу (пригодна агароза различных фирм) добавляют к равному
объему нагретого до 45—48 °С двукратного (10-кратный концентрат,
разведенный в 5 раз дистиллированной водой) раствора Хенкса. В
приготовленную таким образом агарозу вносят суспензию ЭБ (концентрация 6—
8 млрд/мл) из расчета 1,2 % ЭБ на окончательный объем агарозы. По
2,75 мл полученной смеси разливают по пробиркам, предварительно
помещенным в водяную с температурой 46—48 С. Далее в пробирки,
содержащие агарозу с ЭБ, вносят определенное количество суспензии селезеночных
клеток (как правило, 0,05—0,2 мл), желательно определить его в
предварительных опытах. Содержимое пробирок встряхивают и выливают на чашки
Петри (диаметр чашки 100 мм). Осторожным покачиванием и вращением
смесь равномерно распределяют по дну чашки. После застывания агарозы
чашки помещают в термостат при 37,5 °С на 1 ч. Затем на поверхность
агарозы в чашках наливают по 3 мл раствора сухого комплемента морской
свинки (разведение в изотониическом растворе натрия хлорида 1:5) и вновь
инкубируют в термостате при 37 °С в течение 45 мин. После инкубации
комплемент сливают и проводят подсчет образовавшихся бляшек (зон гемоли-
-79-

за). При относительно небольшом числе бляшек (примерно до 120 на
чашку) их подсчитывают полностью. Если же бляшек больше, то их подсчет
производят следующим образом. В листе плотной черной бумаги вырезают
отверстие в форме квадрата со стороной 1 см (т. е. площадью 1 см2). Под-
кладывая лист с вырезанным квадратом под донышко чашки, просчитывают
выборочно число бляшек в 10 таких квадратах в разных участках чашки с
последующим перерасчетом на всю поверхность агарозы в чашке
(коэффициент перерасчета для чашек диаметром 100 мм равен 6,88). Зная объем
клеточной суспензии, наносимый на чашку, и общий объем селезеночной
суспензии, вычисляют количество бляшек (АОК) на всю селезенку.
При статистической обработке полученных данных определяют
среднюю геометрическую числа АОК и стандартную ошибку. При сравнении
результатов применяют критерий t Стьюдента. Достоверными считают
различия при Р < 0,05 . При постановке экспериментов необходимо
использовать не менее 10 животных в группе. Итоговые результаты являются
суммарными показателями по крайней мере 2 опытов.
Реакцию Ерне можно заменить определением на 7-е сутки после
иммунизации титра антител в сыворотке крови мышей с помощью реакции гем-
агглютинации.
Оценка фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов
Для фагоцитоза можно использовать различные частицы (меченые
эритроциты, дрожжевые тельца, частицы латекса и др.). Здесь приводится
описание фагоцитоза частиц коллоидной туши.
По окончании введения мышам исследуемого препарата через 24 ч
оценивают у них фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов по
интенсивности захвата ими частиц туши, введенной животным внутрибрю-
шинно в виде 0,05 % суспензии в объеме 2 мл. Через 10 мин брюшную
полость промывают 5 мл изотонического раствора натрия хлорида.
Полученные таким образом клетки перитонеального экссудата (КПЭ) трижды
отмывают, ресуспендируют в 1—2 мл изотонического раствора натрия хлорида,
подсчитывают концентрацию ЯСК и процент фагоцитирующих клеток.
Далее клетки осаждают центрифугированием, супернатант удаляют, а осадок
КПЭ лизируют дистиллированной водой. Лизаты КПЭ затем помещают в
плоскодонные планшеты и определяют с помощью спектрофотометра "Mul-
tiscan MCC 340" при длине волны, равной 620 нм, оптическую плотность,
отражающую количество туши, поглощенной перитонеальными фагоцитами.
Результаты выражают в условных единицах, отражающих оптическую
плотность лизата КПЭ, соотнесенную с количеством фагоцитирующих клеток.
Исследования позволяют оценить:
— концентрацию и количество ядросодержащих клеток в ПЭ;
— процент и количество фагоцитирующих клеток в ПЭ;
— суммарное количество туши, поглощенной КПЭ;
— количество туши, поглощенной одним фагоцитом (фагоцитарный
индекс).
Оценка активности нейтрофилов в тесте хемилюминесценции
В качестве источника нейтрофилов используют пуллированную
венозную кровь мышей, взятую в ЭДТА (1,5 мг/мл). Образцы крови 0,5—1 мл
-80-

лизируют добавлением 12—15 мл лизирующего раствора (NH4C1 8,26 г/л и
NaHC03 1 г/л, рН 7,2). После 7-минутной экспозиции при комнатной
температуре и центрифугирования (9 мин при 200 g) гемолизат удаляется,
осевшие клетки ресуспендируют в 1 мл буферного раствора (рН 7,2),
приготовленного из раствора Хенкса (без фенолового красного), дополненного
5 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES-буфера, 0,62 х Ю-3 М люминола (Sigma
Chemical Co.). По 100—50 мкл суспензии помещают в пробирки для хеми-
люминесценции, вносят 0,5 мл упомянутого буферного раствора с
добавлением люминола и помещают в ячейки хемилюминометра. Для
активации хемилюминесцентной реакции нейтрофильных гранулоцитов
используют опсонизированный зимозан (Sigma Chemical Co.). Образцы клеток
инкубируют в течение 15 мин, затем добавляют 10—20 мкл опсонизиро-
ванного зимозана (10 мг/мл) и регистрируют уровень и кинетику хемилю-
минесценции в течение 30 мин. Интенсивность хемилюминесцентного
ответа оценивают по максимальному значению на кинетической кривой.
Среднее значение интенсивности хемилюминесценции определяют по
данным не менее чем трех идентичных измерений. Результаты оценивают
количественно по числу импульсов в минуту на 1 мкл крови и на количество
нейтрофилов в 1 мкл.
Аналогичные исследования можно проводить, используя в качестве
источника фагоцитов клетки перитонеального экссудата и спленоциты.
Оценка влияния препаратов на гиперчувствительность замедленного типа
О состоянии клеточного иммунитета животных после введения им
фармакологических препаратов можно судить по способности мышей к
индукции реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к
эритроцитам барана (ЭБ) и к тринитробензолсульфоновой кислоте (ТНБС).
Использование двух разных антигенов позволяет с большей вероятностью
выявить стимулирующий или ингибирующий эффект препаратов, так как эти
реакции различаются по своей интенсивности (очень высокая в случае
ТНБС). При использовании только одного антигена предпочтение следует
отдать ТНВС в силу высказанных выше причин.
По окончании курса введения препарата мышей-самцов (СВА х C57BL/
6)F1 иммунизируют подкожно эритроцитами барана (2 х 108) в
межлопаточную область или 10 мМ раствором ТНВС (0,2 мл) в основание хвоста.
Вторую (разрешающую) инъекцию антигена производят на 5-е сутки в
подушечку задней лапы — "опытная лапа" (50 мкл суспензии ЭБ,
содержащей 108 клеток) или на 6-е сутки (50 мкл 10 мМ раствора ТНБС). В кон-
тралатеральную лапу вводят 50 мкл стерильного изотонического раствора
натрия хлорида ("контрольная лапа"). Результаты реакции регистрируют
через 24 ч путем определения массы "опытной" и "контрольной" лап.
Индекс реакции для каждого животного определяют по формуле:
и = м°п ~ мх х 100 %
Мк
где Моп и Мк — масса "опытной" и "контрольной" лап.
При статистической обработке определяют среднюю арифметическую
показателей и стандартную ошибку. Достоверность различий — по
критерию t Стьюдента.
- 81 -

Исследование спонтанной и индуцированной митогенами пролиферации
спленоцитов
Иммунотропные, митогенные, а в ряде случаев и аллергенные свойства
исследуемых препаратов можно оценить с помощью реакции бласттранс-
формации лимфоцитов. Использование этого подхода с применением Т- и
В-клеточных митогенов позволит также оценить преимущественное
влияние фармпрепаратов на Т- или В-клеточные популяции лимфоцитов.
Постановка реакции. Животных опытных и контрольных групп
забивают с помощью цервикальнои дислокации, извлекают селезенки и готовят
клеточную суспензию при помощи стеклянного гомогенизатора.
Полученные спленоциты отмывают средой 199 с 5 % сыворотки крупного рогатого
скота и по 200 мкл клеточной взвеси (с концентрацией 2 х 106 мл) в среде
RPMI-1640 (Flow, Англия), дополненной 10 % эмбриональной телячьей
сыворотки (Gibco, США), 0,01М буфера HEPES (Gibco, США), 200 мМ L-
глутамина (Sigma, США), 10 тМ 2-меркаптоэтанола (Merck, ФРГ), 100 мг/
мл стрептомицина и 100 ед/мл пенициллина вносят в лунки 96-луночных
планшетов. В часть лунок одновременно вносят митогены (ФГА, ЛПС) в
предварительно оттестированных концентрациях (10—20 мкг/мл).
Контрольные лунки митогена не содержат. При наличии инъекционной или
растворимой формы исследуемого препарата проводят оценку их митоген-
ных свойств, помещая в различных концентрациях в лунки, содержащие
спленоциты интактных животных. Внесение же препаратов в
максимальной, не митогенной концентрации в культуру спленоцитов животных,
получавших препарат, позволит судить о возможности сенсибилизации
организма животных к препарату в случае повышения пролиферации при
повторном контакте с препаратом спленоцитов животных опытных групп.
Затем селезеночные клетки инкубировали в течение 96 ч в атмосфере
5 % С02, при температуре 37 "С и за 24 ч до окончания культивирования в
лунки добавляли по 1 мкКИ раствора 3Н-тимидина в объеме 10 мкл.
Интенсивность включения 3Н-тимидина (число импульсов/мин) определяли в
клетках, собранных с помощью Cell Harvester (Flow), на сцинтилляцион-
ном счетчике (Marck-III).
Уровень РБТЛ спленоцитов под влиянием митогенов или вносимых в
среду культивирования препаратов оценивали по отношению к
интенсивности РБТЛ спленоцитов в среде, не содержащей митогены или
используемые препараты. Для оценки влияния препаратов на РБТЛ сравнивали
величину включения 3Н-тимидина клетками селезенки мышей,
получивших препараты, с таковой спленоцитов мышей, получивших
изотонический раствор натрия хлорида. Результаты выражают в значениях
импульсов в минуту.
Патоморфологические исследования
1. Иммунокомпетентные органы — тимус, селезенку, лимфатические
узлы различной локализации, фрагменты тонкого кишечника,
включающие групповые лимфатические фолликулы (пейеровы бляшки),
рекомендуется фиксировать в жидкости Буэна в течение 24 ч. (Ромейс Б.
Микроскопическая техника. — М., 1954. — С. 1396—1399).
Обезвоживание и проводку образцов, заливку в парафин с воском
проводят по общепринятой в гистологии технике.
2. После депарафинирования срезы (толщиной 3—5 мк) окрашивают
-82-

азуром и эозином по Нохт—Максимову (Ромейс Б. Микроскопическая
техника. - М., 1954. - С. 1396-1399).
3. Результат окраски: цитоплазма клеток, в которых идет активный
синтез РНК, имеет различные оттенки синего цвета, отчетливо
дифференцируются все клетки, входящие в структуру изучаемого органа на момент
забоя.
4. Для более объективной оценки влияния испытуемого препарата на
структуру органов иммунной системы можно применить простой в
исполнении полуколичественный метод рангов, предложенный экспертами ВОЗ
для патоло го гистологических исследований в прозектурах (Cottier A., Turk
/., Sobin L. A proposal for a standardized system of repoorting human lymph
node morphology in relation to immunological function // J. Clin. Patol. —
1973. - Vol. 26. - P. 317-331).
Минимальное количество рангов от 0 до +++, где 0 обозначает
отсутствие изменений, + — слабые изменения изучаемого признака (например,
количество иммунобластов в коре тимуса или в паракортикальной зоне
лимфатического узла), ++ — умеренные изменения и +++ — сильные
изменения. Можно увеличить количество рангов от 0 до ++++++, где + и
++ обозначают минимальные изменения и т. п. Каждый ранг можно
представить в цифрой (например + = 1, +++ = 3 и т. п.) и полученные
результаты обрабатывать статистически с помощью непараметрического
критерия U Вилкоксона—Манна—Уитни (Гублер Е. В., Генкин А. А. Применение
непараметрических критериев статистики в медико-биологических
исследованиях. — Л., 1973).
Приложение 2
Название учреждения-исполнителя
Подразделение
Адрес
Телефон
Факс
Ответственный исполнитель
Протокол №
Оценки влияния препарата на гуморальный иммунный ответ
Цель исследования
Исследуемый препарат Серия Дата выпуска
Схема введения
Начало введения Окончание введения
Доза мг/кг; Способ введения
Концентрация Объем введения Время введения
Препарат сравнения доза мг/кг на мышь
Используемые животные:
Мыши: линия , гибриды пол масса (М ± т)
Получены из питомника
Дата получения
Дата выхода из карантина
Количество животных в группе
- 83 -

Метод оценки. Локальный гемолиз в геле агарозы
Оцениваемый параметр — Количество антителообразующих клеток (АОК)
в селезенках мышей при иммунизации их эритроцитами барана
Дата иммунизации
Антиген-эритроциты барана:
Источник получения дата получения
Способ введения Концентрация
Объем введения Доза Время введения
Постановка реакции:
Дата
Источник антителообразующих клеток (АОК)
Селезенка: Объем суспензии Концентрация
Объем суспензии для внесения в смесь агарозы с ЭБ
Комплемент источник разведение объем внесения _
Результаты анализа Индекс стимуляции АОК на селезенку
№
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Группы
Положит, контроль
Отрицат. контроль
Препарат
-
-
-
-
-
'-
'-
'-
'-
'-
-"-
Препарат сравнения
Дозы
—
—
1 доза
-"-
-"-
.".
-"-
_"_
_".
_"_
АОК/
сел
(М + т)
Индекс
модуляции
(М ±т)
Р
АОК/ млн
ЯСК
(М + т)
Индекс
модуляции
(М + т)
Р
Заключение:
Ответственный исполнитель
Должность
Дата Подпись
Название учреждения-исполнителя _
Подразделение
Адрес
Телефон
Факс
Ответственный исполнитель
Протокол №
Оценки влияния препарата на клеточный иммунный ответ
Цель исследования
Исследуемый препарат Серия Дата выпуска
Схема введения
Начало введения Окончание введения
Доза мг/кг; Способ введения
Концентрация Объем введения Время введения
-84-

Препарат сравнения
мышь
доза
_мг/кг
на
Используемые животные:
Мыши: линия , гибриды пол vacca (M ± m)
Получены из питомника
Дата получения
Дата выхода из карантина
Количество животных в группе
Метод оценки — реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ)
Оцениваемый параметр — величина воспалительной реакции у
иммунизированных мышей при повторном введении антигена /эритроциты барана
(ЭБ) или тринитробензосульфоновая кислота (ТНБС)
Иммунизация
Дата
Антиген Э Б ТНБС
Источник получения
Концентрация
Объем введения
Доза
дата получения
Способ введения
Время введения _
Разрешающая инъекция
Дата
Антиген Э Б ТНБС
Источник получения
Концентрация
Объем введения
Доза
дата получения
Способ введения
Время введения _
Оценка реакции
Дата
Оцениваемый параметр — Процент прироста массы опытной лапки по
отношению к контрольной (индекс реакции)
Результаты анализа
№
Группы
Доза
Масса
контрольной лапки (мг)
(М±т)
Масса
опытной лапки (мг)
(М ±т)
Индекс
реакции %
(М ± т)
Положит, контроль
Отрицат. контроль
Препарат
10 Препарат сравнения
1 доза
-85-

Заключение:
Ответственный исполнитель
Должность
Дата Подпись
Литература
1. Кудрина Г. П., Шишкина Л. Ф., Иванова В. Ми др. Методические рекомендации по
оценке аллергенных свойств фармакологических средств. — М., 1988.
2. Кудрина Г. П., Буров Ю. В., Алтынбаева Р. Д. и др. Методические рекомендации по
оценке иммунотоксических свойств фармакологических средств. — М., 1991.
3. Любимов Б. И., Коваленко Л. П., Федосеева В. Н. и др. Методические указания по
оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ. — М., 2000.
4. Мастернак Т. Б., Малкина Е. Ю., Ларин А. С. и др. Протективное действие ряда им-
муномодуляторов и их влияние на активность макрофагов // Иммунология. —1998.
- № 1. - С. 33-36.
5. Мастернак Т. Б., Чижевская М. А., Иванова А. С, Манько В. М. Влияние иммуно-
модулирующих препаратов на индуцированную ФГА пролиферацию спленоцитов
мышей // Иммунология. — 1997. — № 4. — С. 27—31.
6. Медуницын N. В, Буковская С. Н, Григорьева Л. В. и др. Порядок и методы контроля
иммунологической безопасности вакцин. Общие методические принципы. — М.,
1989.
7. Петров Р. В., Хаитов Р. М., Манько В. М. и др. Методические материалы по
экспериментальному (фармакологическому) и клиническому испытанию иммуномодули-
рующего действия фармакологических средств. — М., 1984.
8. Туманян М. А., Кирилличева Г. Б. // Открытия. — 1986. — № 6. — С. 24.
9. Федосеева В. Н., Шарецкий А. Н., Аристовская Л. В. и др. Методические
рекомендации по экспериментальному изучению иммунотоксических свойств химических
факторов окружающей среды. — М., 1989.
10. Хаитов Р. М. Физиология иммунной системы. — М., 2001.
11. Хаитов Р. М., Атауллаханов Р. И, Иванова А. С. и др. Методические указания по
оценке иммунотоксического действия фармакологических веществ. — М., 2000.
12. Dean J. H., Padarathsingh M. L., Jerrells 71 R. Assesment of immunobiological effects by
chemicals, druugs or food additives. 1. Tier testing and screening approach // Drug Chem.
Toxicol. — 1979. - Vol. 2. - P. 5—17.
13. Descotes J., Verdier F. Popliteal lymph node assay. — In: Methods in Immunotoxicology,
Volume 1 / Eds Burleson J. R., Dean J. H., Munson A. E.). — Wiley-Liss, Inc., 1995. —
P. 189-196.
14. Devies G. E. Immunotoxicity: Undesirable effect of inappropriate responses //
immunology Todey. — 1983. — Vol. 4, N 1. — P. 1-2.
15. Dietert R. R., Golemboski К A. Immunotoxicologicat mechanisms. — In: Encyclopedia of
Molecular Biology and Molecular Medicine, Vol. 3 / Ed. Meyers R. A. — VCH, 1996. —
P. 295-302.
16. European Commission (1994) Risk Assessment of Existing Substances. Technical
Guidance Document XI/91/9194-EN, Chapter 7. European Communities, Luxembourg.
17. Hinton D. M. Testing guidelines for evaluation of the immunotoxic potential of direct food
additives. - Crit. Rev. Fd. Sci. Nutr., 1992, v. 32, No. 1, pp. 173-190.
18. Luster M. I., Munson A. E., Thomas P. T et al. Development of a testing battery to assess
chemical-induced immunotoxicity: National Toxicology Program's guidelines for
immunotoxicity evaluation in mice // Fundam. Appl. Toxicol. — 1988. — Vol. 10. — P. 2—9.
19. Luster M. L, Portier C, Pait D. G. et al. // Immunotoxicology and risk assessment. — In:
Methods in Immunotoxicology. — New York et al.: Willey-Liss, Inc., 1995. — Vol. 1. —
P. 51-68.
20. Neuman D. A. Immunotoxicity testing and risk assessment: Summary of 1994 Workshop
Immunotoxicology Technical Committee // Fd. Chem. Toxic, 1995. — Vol. 33, N. 10.
- P. 887-894.
21. Pieters R. The popliteal lymph node assay: a tool for predicting drug allergy // Toxicology.
- 2001. - Vol. 158, N. 1-2. - P. 65-69.
22. Stanworth D. R. Current concepts in hypersensitivity. — In: Immunotoxicology and Immu-
nopharmacology / Eds Dean J. H. et al. — New York: Raven Press, 1985. — P. 91—99.
- 86 -

Методические указания по изучению репродуктивной
токсичности фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: к. м. н. Н. М. Смольникова;
член-корр. РАМН, проф. Б. И. Любимов;
д. м. н., проф. А. Д. Дурнев; к. м. н. А. М. Ско-
сырева; к. м. н. Е. М. Чиркова; член-корр.
РАМН, проф. Т. А. Гуськова; к. б. н. И. В.
Голованова; к. м. н. Р. Д. Сюбаев; к. м. н. О. Л. Вер-
стакова
1. Введение
Изучение репродуктивной токсичности фармакологических веществ
является частью доклинических токсикологических исследований.
Исследования по выявлению репродуктивной токсичности включают:
— изучение влияния на генеративную функцию;
— изучение эмбрио- и фетотоксического действия, регистрируемых а
антенатальном и постнатальном периодах развития.
2. Общие положения
2.1. Тестированию на репродуктивную токсичность подвергаются все
новые оригинальные фармакологические вещества. Исключение может
быть сделано для веществ с противоопухолевой активностью, если их
применение ограничивается только онкологической практикой, и для веществ,
рекомендуемых для применения по жизненным показаниям.
2.2. К моменту начала тестирования необходимо располагать
сведениями о физико-химических свойствах вещества, дозах (летальная,
эффективная, рекомендуемая для клинических испытаний), признаках
интоксикации, специфических для данного вещества, рекомендуемых способах
введения, профиле фармакологического действия, показаниях и схемах
применения препарата в клинике. Желательно также иметь данные о фарма-
кокинетике фармакологического вещества.
2.3. Изучению подлежит субстанция фармакологического вещества. В тех
случаях, когда использование субстанции не обеспечивает преимущества
перед лекарственной формой в отношении возможности использования
широкого диапазона доз и удобства введения препарата экспериментальным
животным, целесообразно проводить изучение репродуктивной токсичности
лекарственной формы. При комбинации нескольких фармакологических
веществ в одной лекарственной форме (фиксированная комбинация) изучают
комбинацию в целом и каждого ингредиента в отдельности, если он не был
ранее разрешен для применения в медицинской практике.
2.4. Изучаемое вещество вводят тем способом, который предусмотрен
при клиническом применении. При пероральном способе применения
вещество следует вводить желудочным зондом. По возможности, следует
избегать внутрибрюшинного введения препарата.
2.5. Исследование можно проводить как на линейных, так и на
нелинейных крысах. Вещество испытывают не менее чем в 2 дозах. Дозы
тестируемого вещества рассчитывают на единицу массы тела. В качестве выс-
-87 -

шей используется максимальная, при которой не отмечается выраженного
токсического действия на животных. Эту дозу определяют, учитывая
токсикологическую характеристику вещества (ЛД50, кумулятивные свойства
и др.). В большинстве случаев в качестве максимальной дозы может
использоваться высшая доза, принятая в опытах по изучению хронической
токсичности. Исключение составляют вещества, изменяющие характер
своего действия при беременности. Низшая доза близка к терапевтической
дозе, рекомендуемой для клинических испытаний в пересчете на
животное. При постановке эксперимента обязательно должна быть контрольная
группа животных, которые содержатся в таких же условиях, как и
подопытные, и получают вспомогательные ингредиенты, входящие в состав
изучаемой лекарственной формы фармакологического вещества, тем же
способом введения, при котором изучают токсичность самого вещества.
Самцам препарат вводят в течение 48—60 дней, самкам — 15 дней. Затем
животных спаривают с интактными самками и самцами, формируя три
группы, включая интактных животных. Рекомендуется иметь в каждой
группе к началу спаривания не менее 15—20 самцов и 20—30 самок, у
которых перед началом опыта проверен эстральный цикл. Самок
подсаживают к самцам в соотношении 2:1, сроком на 2 астральных цикла.
Оплодотворение регистрируют с помощью вагинальных мазков. Половину
ссаженных самок подвергают эвтаназии на 17—21-й день беременности, на
вскрытии подсчитывают количество желтых тел в яичниках, мест
имплантаций в матке и количество живых и погибших плодов. На основании этих
данных определяют уровень пред- и постимплантационной смертности
зародышей. Другую половину самок оставляют до родов и наблюдают за
физическим развитием потомства до окончания вскармливания
(выживаемость, масса). Предымплантационную смертность определяют по разности
между количеством желтых тел в яичниках и количеством мест
имплантации в матке; постимплантационную смертность по разности между
количеством мест имплантаций и количеством живых плодов. Для оценки
способности к оплодотворению и зачатию вычисляют индекс,
характеризующий отношение числа беременных животных к числу ссаженных в
процентах.
2.6. При статистической обработке за единицу наблюдения принимают
помет, т. е. результаты, полученные при вскрытии одной самки. Сведения
о методах статистического анализа, использованных при обработке
результатов, должны быть указаны в отчете.
3. Изучение генеративной функции самок и самцов
3.1. Задачей этого этапа исследований является выявление возможного
отрицательного действия фармакологического вещества на стадии проге-
неза (формирование мужских и женских гамет), нарушений полового
поведения и транспорта продуктов зачатия.
3.2. Изучению должны подвергаться все новые оригинальные
фармакологические вещества. Исключение может быть сделано для веществ с
противоопухолевой активностью, если их применение ограничивается только
онкологической практикой, и для веществ, рекомендуемых по жизненным
показаниям.
Исследуются также вспомогательные вещества, не разрешенные для
медицинского применения.
3.3. Изучению подлежит субстанция фармакологического вещества. В тех
- 88-

случаях, когда использование субстанции не обеспечивает преимущества
перед лекарственной формой в отношении возможности использования
широкого диапазона доз и удобства введения препарата экспериментальным
животным, целесообразно проводить изучение репродуктивной токсичности
лекарственной формы. При комбинации нескольких лекарственных веществ
в одной лекарственной форме следует изучить комбинацию в целом только в
том случае, если один из компонентов в этом плане не изучен.
3.4. Изучаемое вещество необходимо вводить тем способом, который
предусмотрен при клиническом применении. При пероральном способе
применения вещество следует вводить зондом. Желательно предусмотреть
дополнительную группу животных для выяснения обратимости эффекта в
случае его обнаружения.
3.5. Необходимо иметь в виду, что подавление репродуктивной
функции при длительном введении некоторых фармакологических веществ
может быть обусловлено не только нарушениями гаметогенеза, но и многими
другими причинами (изменение эндокринной функции половых желез,
гипофиза, надпочечников, поражение гипоталамуса, центров головного
мозга и т. п.). Поэтому, если под влиянием тестируемого вещества возникают
нарушения плодовитости животных, необходимо выяснить, зависит ли это
от патологии спермато- или оогенеза, либо от других причин, используя
существующие методы выявления повреждающего действия
фармакологических веществ на спермато- и оогенез. Выбор конкретных методов
исследования проводится экспериментатором. Ряд рекомендуемых методов
приведен в приложении.
4. Изучение эмбрио- и фетотоксического действия, регистрируемого
в антенатальном периоде развития
4.1. Под эмбриотоксическими свойствами понимают способность того
или иного вещества оказывать токсическое действие на развивающиеся
зародыши. Эмбриотоксичность может проявляться как в повышении уровня
эмбриональной смертности (эмбриолетальное действие), так и в виде
анатомических, гистологических, цитологических, биохимических,
нейрофизиологических отклонений от нормы, проявляющихся до или после
рождения (тератогенное действие). Кроме того, эмбрио- и фетотоксичность
может проявляться в изменении массы тела, краниокаудального размера
плодов, задержке оссификации скелета (общая задержка развития),
увеличении перинатальной смертности.
4.2. Исследованию на наличие эмбриотоксических свойств должны
подвергаться все новые фармакологические вещества, которые могут быть
назначены женщинам в период беременности, а также все не
использовавшиеся ранее в медицинской практике соединения, которые в качестве
вспомогательных веществ включаются в лекарственную форму новых или
уже применяемых лекарств. Положения, изложенные в пунктах 1.3 и 1.4,
должны соблюдаться и при изучении эмбриотоксического действия.
4.3. Изучаемые вещества необходимо вводить тем же способом,
который предусмотрен при клиническом применении. При пероральном
способе применения вещество следует вводить зондом. По возможности
следует избегать внутрибрюшинного введения вещества.
4.4. Экспериментальные исследования должны включать изучение
состояния плодов к концу антенатального периода развития.
4.5. Поскольку чувствительность зародыша к токсическому действию
-89-

фармакологических веществ зависит от стадии развития, и при этом
зародыши, находящиеся на одной стадии развития, могут различаться в
чувствительности к действию различных по структуре веществ, сроки введения
вещества беременным самкам должны охватывать весь период
беременности.
4.6. Дозы тестируемого вещества рассчитывают на единицу массы тела
самки. Наиболее целесообразно, с точки зрения последующей
интерпретации результатов, — проводить тестирование вещества, используя не менее
2—3 доз (см. п. 2.5).
4.7. У всех без исключения млекопитающих часть зародышей погибает
до или после имплантации, а у некоторых зародышей спонтанно
возникают аномалии развития. Поэтому в лабораториях, проводящих
тестирование, необходимо иметь данные по так называемому "обобщенному"
контролю: данные, полученные на интактных животных, использовавшихся в
качестве контрольных в предыдущих исследованиях, при сохранении
стабильных условий их содержания.
4.8. Основные опыты проводят на крысах. В случае необходимости
получения дополнительной информации используют второй вид животных —
кролики, хомяки, мини-свиньи и др. При выборе вида животного
необходимо учитывать фармакокинетические параметры и видовую
чувствительность изучаемого лекарственного вещества.
4.9.1. ТЕСТИРОВАНИЕ НА КРЫСАХ. Каждая группа крыс как в
опыте, так и в контроле должна состоять не менее чем из 15—20 беременных
животных. Первым днем беременности считают день обнаружения
сперматозоидов в вагинальном мазке. В опытах используют виргинных самок
линейных, гибридных или рандомбредных животных.
4.9.2. Тестируемое вещество вводят самкам один раз в сутки,
желательно в одно и то же время. При отсутствии указаний о выраженной
индукции или ингибировании ферментов возможно введение лекарственных
веществ с 1-го по 19-й день беременности в 2—3 дозах (п. 2.5). Возможна и
следующая схема введения препарата: с 1-го по 6-й (доимплантационный
период), с 6-го по 16-й (органогенез), и с 16-го по 19-й дни беременности
(фетогенез). В этом случае изучаемое вещество вводят с 6-го по 15-й дни
беременности в 2—3 дозах, в остальные сроки можно ограничиться
введением одной высшей дозы (при отсутствии эффекта). Если по техническим
причинам невозможно ввести вещество в течение указанных сроков
(например, при внутривенном введении), экспериментатор может
воспользоваться схемой введения, предусматривающей 3- или 4-дневное
непрерывное введение вещества, учитывая при этом условия, изложенные в п. 2.5.
Крысам контрольной группы в эти же сроки следует вводить
растворители, используемые при приготовлении раствора или суспензии
тестируемого вещества. Кроме того, может быть образована группа интактных
беременных самок.
В ряде случаев, по усмотрению исследователя, целесообразно
использование сравнительного контроля, т. е. животных, которым вводят уже
применяемый в клинической практике препарат, близкий к изучаемому по
химической структуре или аналогичный по профилю фармакологического
действия. Для оценки реактивности экспериментальных животных можно
использовать позитивный контроль при введении животным какого-либо
эталонного тератогена (салициловокислый натрий, циклофосфамид и др.)
в дозе, оказывающей эффект примерно у 50 % зародышей.
4.9.3. Во время эксперимента следует наблюдать за состоянием и
поведением беременных самок, регулярно, не реже одного раза в неделю, взве-
-90-

шивать животных для выявления возможного токсического действия
изучаемого вещества.
4.9.4. Результаты оцениваются после эвтаназии и вскрытия самок.
Вскрытие проводят на 20-й день беременности.
4.9.5. Показателями эмбриотоксичности служат: пред- и постимпланта-
ционная эмбриональная смертность, морфологические (анатомические)
пороки развития, а также общая задержка развития плодов. Предымплан-
тационную смертность определяют по разности между количеством
желтых тел в яичниках и количеством мест имплантации в матке; постимлан-
тационную смертность — по разности между количеством мест
имплантаций и количеством живых плодов. При оценке тератогенного действия
рекомендуется сначала подсчитать количество плодов с аномалиями,
заметными при внешнем осмотре, а затем разделить плоды на 2 группы и у
одних плодов исследовать состояние внутренних органов, у других —
состояние скелета. Кроме того, плоды взвешивают и определяют их краниокау-
дальный размер.
4.9.6. При статистической обработке за единицу наблюдения
принимают помет, т. е. результаты, полученные при вскрытии одной самки.
Сведения о методах статистического анализа, использованных при обработке
результатов, должны быть указаны в отчете.
4.9.7. ТЕСТИРОВАНИЕ НА КРОЛИКАХ. Исследования проводят на
виргинных самках. Каждая группа (в опыте и контроле) должна состоять
не менее чем из 12 беременных крольчих.
4.9.8. Изучаемое вещество рекомендуется вводить с 6-го по 18-й дни
беременности (период органогенеза), один раз в сутки, в высшей дозе (п.
2.5). Группы контрольных животных должны быть такими же, как указано
в п. 4.9.2. Вопрос о том, использовать субстанцию или лекарственную
форму, решается так, как указано в п. 2.3. Результаты оценивают после
эвтаназии и вскрытия самок.
Вскрытие проводят на 27—28-й день беременности. Можно прибегать и
к хирургическому извлечению плодов у живых крольчих.
4.9.9. Показателями эмбриотоксичности служат те же показатели, что и
у крыс (п. 2.9.5). Статистическую обработку результатов проводят так же,
как изложено в п. 4.9.6.
Таблица 1. Исследование эмбриотоксического действия (наименование препарата) на
(наименование вида животных)
Показатели
Количество беременных самок
Количество желтых тел
Количество мест имплантации
Количество живых плодов
Количество резорбций
Количество мертвых плодов
Предымплантационная гибель
Постимплантационная гибель.
Краниокаудальный размер
Внешний осмотр плодов:
Масса плода
количество обследованных плодов
из них с аномалиями развития:
Дни введения препарата
О/О — в числителе — общее количество,
— в знаменателе — на одну самку
О/О
О/О
о/о
о/о
(в%)
(в %) (в г)
(в мм)
-91 -

Продолжение
Показатели
Дни введения препарата
абс.
%
Состояние костной системы:
количество обследованных плодов
из них с аномалиями развития:
абс.
%
Состояние внутренних органов:
количество обследованных плодов
абс.
Нарушения развития, отмеченные при исследовании плодов (наименование вида
животных), полученных от самок, которым вводили (наименование препарата)
Вид нарушения
Группа животных (экспозиция, доза препарата)
Количество плодов, имевших данное нарушение
абс.
% к общему количеству обследованных
по этой методике
5. Изучение антенатального повреждающего действия фармакологических
веществ, регистрируемого в постнатальном периоде развития
5.1. Целью исследований, проводимых на этом этапе, является
выявление нарушений эмбрионального развития, проявляющихся только в
постнатальном периоде жизни.
5.2. Исследование проводят на виргинных самках линейных, гибридных
или рандомбредных животных. Как в подопытной, так и в контрольной
группах должно быть получено потомство не менее чем от 10 самок.
Изучаемое вещество вводят самкам 1 раз в сутки с 6-го дня беременности и до
родов (период органо- и фетогенеза) в дозе, близкой к максимальной
(п. 1.6).
Контрольная группа самок должна получать в эти же сроки
растворитель, используемый при введении препарата. Во время введения препарата
необходимо регистрировать состояние и поведение самок, динамику массы
тела, продолжительность беременности, течение родов. За 3—4 дня до
родов беременных самок следует рассадить по одной в клетку и обеспечить
их подходящей подстилкой для устройства гнезда. В каждом помете
оставляют по 6—8 новорожденных (желательно одинаковое количество самок
самцов). На 25—30-й день после рождения крысят отсаживают от матерей.
5.3. Исследования следует начинать вскоре после рождения, но не
раньше чем через 24 ч, и, по возможности, продолжать до 2-месячного
возраста. Оценка включает следующие типы исследований: общие наблюдения за
физическим развитием потомства; изучение скорости созревания
сенсорно-двигательных рефлексов в период вскармливания самкой; изучение
двигательного и эмоционального поведения и способности к координации
движений у потомства после окончания вскармливания; изучение
обучаемости и памяти: выработка условных рефлексов как с положительным, так
и с отрицательным подкреплением и сохранение полученных навыков. В
92

исследованиях 1—3-го типа должны быть обследованы все животные. При
формировании групп для исследований 4-го типа от каждого помета
можно взять в группу по 2 животных. Программа изучения постнатального
развития определяется экспериментатором с учетом фармакологических и
токсических свойств изучаемого лекарственного вещества. Примерный
перечень тестов указан в приложении. В некоторых случаях он может быть
расширен для получения дополнительной информации (изучение влияния
на клеточный состав крови, проведение биохимических, патоморфологи-
ческих исследований, спаривание с последующим изучением потомства
Fl, F2 генераций и др.).
Необходимо иметь в виду, что введение некоторых веществ во время
беременности может неблагоприятно влиять на поведение самок, приводя
к нарушению лактации, угасанию материнских инстинктов и т. п. В связи
с этим может возникать необходимость перекрестного вскармливания
потомства.
5.4. Для некоторых фармакологических веществ, применяемых во время
грудного вскармливания, желательно изучение их влияния на развитие
потомства. Исследования проводят при введении вещества самкам с 1-го дня
после родов до окончания вскармливания (25-й день). Состояние
потомства оценивают, как и при изучении постнатального развития (п. 3.3).
5.5. При статистической обработке полученных результатов в качестве
независимой переменной используют среднее значение соответствующего
показателя для отдельного помета. В связи с этим при формировании
групп для отдельных серий испытаний желательно, чтобы соблюдалось
равное представительство от каждого помета. При этом необходимо
предусмотреть возможность раздельного анализа результатов для самок и
самцов. В отчете должны быть представлены сведения об использовавшихся
методиках статистического анализа.
6. Схема отчета о результатах изучения эмбриотоксических свойств
и влияния на репродуктивную функцию фармакологического вещества
4.1. Представляемый в Фармакологический Государственный комитет
Минздрава России отчет должен включать цифровые данные в форме
таблиц, содержащих основные сведения, необходимые для суждения о
наличии или отсутствии у изучаемого препарата неблагоприятного действия на
внутриутробное развитие и процессы репродукции. Форма некоторых
таблиц представлена в приложении.
4.2. При описании аномалий развития следует руководствоваться
общепринятой терминологией. Если трудно описать какую-либо из аномалий
развития, следует представить фотографию плода с этой аномалией.
4.3. В заключительной части отчета необходимо дать оценку результатам
тестирования по следующим направлениям:
— оценка результатов, полученных при изучении влияния препарата на
генеративную функцию;
— оценка результатов, полученных при обследовании потомства в
конце антенатального периода развития;
— оценка результатов, полученных при обследовании потомства в пост-
натальном периоде развития.
4.4. Общее заключение о наличии или отсутствии повреждающего
действия лекарственного средства на репродуктивную функцию и
внутриутробное развитие.
-93-

Приложени е
1. Основные методики, используемые в экспериментах по изучению
репродуктивной токсичности фармакологических средств
1.1. Эвтаназия подопытных животных и получение эмбрионального
материала. Эвтаназию самок осуществляют дислокацией шейных позвонков.
Вскрывают брюшную полость, вырезают матку, переносят в чашку Петри
с изотоническим раствором натрия хлорида. Вскрывают рога матки,
подсчитывают количество живых, мертвых, резорбированных плодов,
обследуют слизистую оболочку матки, отмечая места имплантации. Вынимают
плоды, освобождают их из оболочек. В яичниках подсчитывают
количество желтых тел беременности.
1.2. Наружный осмотр, взвешивание плодов. Все живые плоды каждого
помета обследуют под бинокулярным микроскопом типа МБС для
обнаружения внешних видимых аномалий развития. После этого плоды
взвешивают, отмечают состояние каждого плода и описывают аномалии,
указывают массу каждого плода и суммарную массу плодов помета.
После наружного осмотра плодов, регистрации всех аномалий и
взвешивания плоды каждого помета делят на две фуппы. Одну фуппу плодов
(около Уз) фиксируют в жидкости Буэна и используют для изучения
внутренних органов. Остальные плоды фиксируют в 96° этаноле и используют
для изучения состояния скелета.
1.3. Исследование внутренних органов плодов по методике Вильсона в
модификации отдела эмбриологии НИИЭМ АМН СССР.
Исследования проводят на плодах, которые фиксировали в жидкости
Буэна не менее 1 нед. Плод укрепляют на пробковом столике и при
помощи безопасной бритвы разрезом параллельно нижней челюсти отделяют
голову от туловища. Первый разрез головы проводят перпендикулярно
нижней челюсти непосредственно за вибрисами. На этом срезе видно
состояние нижней челюсти, переднего отдела твердого неба и носовой
полости. Второй разрез проводится через середину глазных яблок и
охватывает обонятельные луковицы. На третьем разрезе изучают состояние
головного мозга: коры больших полушарий, боковых, III и IV желудочков. Срез
проводят через большой поперечный диаметр черепа. Четвертый разрез
проходит параллельно третьему. Исследуют мозжечок и продолговатый
мозг. Пятый разрез идет через гортань, пищевод, спинной мозг, сосуды и
слюнные железы. Шестым разрезом отсекается шея от туловища. Разрез
проводят перед передними лапами. Видны пищевод, трахея, спинной мозг,
крупные сосуды. Седьмой разрез проходит через органы грудной клетки
непосредственно за передними конечностями. На разрезе видны: сердце,
легкие, бронхи, пищевод, спинной мозг. Восьмой разрез проводят по
середине между седьмым разрезом и пупочным кольцом. Осматривают печень,
а затем осторожно удаляют ее пинцетом и исследуют состояние
диафрагмы. Девятый разрез проходит ниже пупочного кольца. Видны кишечник,
поджелудочная железа. Осторожно удалив петли кишечника и печень,
можно наблюдать органы таза: почки, мочеточники, мочевой пузырь,
прямую кишку, внутренние половые органы. Необходимо обратить внимание
на почки (возможность гидронефроза), матку с придатками и тестикулы.
1.4. Метод висцерального исследования органов плодов по Стейплсу.
После внешнего осмотра живых плодов на наличие аномалий развития,
определения массы и краниокаудального размера производят декапита-
_94-

цию. Декапитированный плод фиксируют, глазными ножницами
разрезают переднюю брюшную стенку и грудь вдоль левого края грудины.
Пинцетом удаляют вилочковую железу и исследуют топографию и состояние
крупных сосудов, отходящих от сердца (правая и левая подключичные
артерии, общая сонная артерия, нисходящая аорта и легочная артерия).
Обращают внимание на их форму и размеры. Пинцетом фиксируют сердце за
ушко правого предсердия, рассекают сердце ножницами двумя разрезами
от верхушки к основанию (1 — правее, 2 — левее межжелудочковой
перегородки) и исследуют состояние межжелудочковой перегородки и
клапанов. Затем исследуют состояние легких (количество долей) и органов
брюшной полости. После извлечения печени определяют состояние
диафрагмы, а удалив петли кишечника, осматривают надпочечники, почки,
мочеточники и мочевой пузырь. Почки разрезают на уровне почечных
лоханок и исследуют их. Определяют абсолютную и относительную массу ви-
лочковой железы, сердца, почек. Устанавливают пол плода и изучают
топографию половых органов.
1.5. Окрашивание скелета ализарином (методика Доусона,
модифицированная в отделе эмбриологии НИИЭМ АМН СССР).
Плоды фиксируют в 96° этаноле не менее 7 дней. Объем спирта должен
превышать объем фиксируемых плодов в 10 раз. После фиксации у плодов
удаляют внутренности и погружают в 1 % раствор КОН для просветления
мягких тканей. Время пребывания плодов в этом растворе определяют
эмпирически (примерно 1—2 сут). Когда становятся видны закладки костей,
плоды вынимают, промывают водопроводной водой и переносят их в
раствор А (150 мл глицерина, 300 мл дистиллированной воды и 10 г КОН), к
которому добавляют несколько капель раствора Б (1 % раствор ализарина
красного) до появления светло-фиолетового окрашивания. Через 3—5 сут
окостеневшие участки скелета окрашиваются в красно-фиолетовый цвет.
Для обесцвечивания мягких тканей плоды переносят в раствор А на 7—14
дней, затем их проводят через смеси глицерина, спирта и воды с целью
обезвоживания (1:2:7, 2:2:6, 4:4:2, равные части спирта и глицерина,
чистый глицерин с добавлением 1—2 капель формалина). В чистом глицерине
плоды могут храниться. Плоды изучают под микроскопом МБС,
учитывают аномалии скелета, количество точек окостенения в различных костных
образованиях.
1.6. Методы изучения развития потомства в постнатальном периоде
жизни.
Общие наблюдения за физическим развитием потомства
Дни наблюдений
1-2-й
4, 7, 14, 21-й
Со 2-го
С 4-го
С 6-го
С 12-го
С 23-го
С 28-го
Регистрируемые параметры
Размер помета, число живых и мертвых новорожденных, число
особей разного пола. Вычисляется размер помета и индекс гибели
Гибель новорожденных, масса тела
Отлипание ушной раковины (в среднем — 2-й день)
Появление первичного волосяного покрова (в среднем — 5-й день)
Прорезывание резцов (в среднем — 8-й день)
Открытие глаз (в среднем — 14-й день)
Опускание семенников (в среднем — 25-й день)
Открытие влагалища (в среднем — 30-й день)
-95 -

Изучение скорости созревания сенсорно-двигательных рефлексов в период вскармливания
Дни

наблюдений
Со 2-го
С 5-го
С 6-го
6-8-й
8-9-й
9-11-й
13-
15-й
17-
20-й
С 8-го
С 14-го
14-
15-й
Показатели

Переворачивание на
плоскости*

Отрицательный
геотаксис*
Избегание
обрыва*

Маятниковый рефлекс
Открытое
поле — 1
Реакция на
акустический
стимул*
Зрачковый
рефлекс*
Избегание
обрыва
(вызванное
визуальным
стимулом)
Способ проведения опыта и регистрируемые параметры
Крысят кладут на спину на плоской поверхности, быстро
отпускают и измеряют время, необходимое для возвращения в
нормальное положение. Формирование рефлекса считается
завершенным (в среднем — на 8-й день), если крысята
возвращаются на все 4 лапы. Опыт проводят не более чем по
30 с с каждым животным до полного формирования
рефлекса во всех контрольных пометах
Опыт проводят 1 раз в день, по 1 мин. Крысят помещают на
наклонную плоскость (25°) головой вниз. Рефлекс считается
сформированным, если крысята поворачиваются на 180° (в
среднем — 7-й день). Можно измерять время удержания на
наклонной плоскости. Опыты проводят до полного
формирования рефлекса во всех контрольных пометах
Крысят кладут на стол или возвышающуюся над клеткой
платформу таким образом, что передние лапы касаются края
стола. Формирование рефлекса завершено (в среднем — 9-й
день), если в течение 10 с крысята отползают от края
площадки. Опыт проводят до полного формирования рефлекса
во всех контрольных пометах
Определяется как изменение направления головы и
туловища в горизонтальной плоскости приблизительно на 90° за
счет перемещения передних лап, когда задние конечности
поджаты и неподвижны. Измеряется количество поворотов
за 1 мин и количество изменений направления на обратное
(реверсия).
Крысят помещают на площадку размерами 30 х 30 см, на
которой проведены линии, образующие 36 квадратов.
Регистрируют:
поднимание головы и передних лап
ползание
опору на задние конечности, подъем всего тела
двигательную активность (число пересеченных квадратов),
умывания различного рода, обнюхивания, стойки,
карабканье на стенки, прыжки, время отсутствия активности,
возможные аномалии походки
Крысят помещают на небольшую площадку в
звукоизолированной клетке. Поворот площадки или движение животного
можно регистрировать автоматически или визуально.
Рефлекс считают сформированным если животное реагирует на
акустический стимул длительностью 0,3—0,5 с (в среднем
формируется на 13-й день). Опыты проводят до полного
формирования рефлекса во всех контрольных пометах
Регистрируют сокращение зрачка или поворот головы. Опыт
проводят в затемненном помещении с точечным источником
света до полного формирования рефлекса во всех
контрольных пометах (в среднем — 14—15-й день).
Животное помещают на площадку, поднятую на высоту 45
см над поверхностью. Избегание падения принимается за
положительное решение. Опыт проводят однократно, после
открытия глаз
-96-

Продолжение
Дни

наблюдений
10-
П-й
С 15-го
Показатели
Обонятельная
реакция
Мышечная
сила*
Способ проведения опыта и регистрируемые параметры
Животное помещают посредине рейки шириной 6 см с
делениями, которую кладут на клетки. Расстояние между
клетками можно менять. Определяют расстояние, на котором
животное правильно выбирает направление на клетку с сибсами
и матерью, в которой оно содержалось перед опытом.
Средний возраст формирования рефлекса — 10—11-й день).
Можно учитывать число падений, соскальзываний, совмещая этот
тест с тестом хождения по полоске
Животное помещают на густую проволочную сетку, которую
медленно поворачивают на 180°. Измеряют время
нахождения животного под сеткой, которое должно висеть на сетке
не менее 15 с. Опыты проводят до достижения критерия
всеми контрольными пометами
Исследование эмоционально-двигательного поведения и способности к тонкой координации
движений
17-
20-й
14-
25-й
40-
45-й
30-
45-й

Переворачивание в
свободном
падении
Удержание на

вращающемся цилиндре*
Открытое по-
ле-2
Спонтантная
двигательная
активность
Крысят держат спиной вниз на высоте 60 см над мягкой
поверхностью и быстро отпускают. Визуально регистрируют,
переворачиваются ли крысята в воздухе, чтобы упасть на все
4 лапы
Изучают время удержания на вращающемся цилиндре (при
скорости 30 об/мин). Испытания проводят до достижения
критерия — удержания в течение 3 мин на цилиндре с
резиновой поверхностью и диаметром приблизительно 12 см.
Сложность задачи можно варьировать, уменьшая диаметр
цилиндра и его текстуру, а также скорость вращения. Опыты
проводят до достижения критерия всеми контрольными
животными
Испытания проводят в 3-минутных тестах на протяжении 3—
4 дней, либо, при большом количестве животных (более 60),
один день при длительности теста не менее 3 мин. Крыс
помещают в центр ярко освещенной площадки, разбитой на
квадраты. Регистрируют время выхода из центра (латентный
период), число посещаемых квадратов (двигательная
активность), число стоек (реакция оглядывания), число умываний
различного типа (грумминг), число актов дефекации и
мочеиспускания (эмоциональность)
Измерение двигательной активности может быть проведено
одним из альтернативных методов анализа: "беличье колесо",
систем с фотоэлектрической и магнитной регистрацией и
т. п.
Примечание * — эти показатели можно изучать не в динамике, а однократно, в
предполагаемый день созревания рефлекса у контрольных животных.
4-762

Изучение обучаемости и памяти
Способ проведения эксперимента
Регистрируемые параметры
Пассивное избегание с отрицательным (болевым) подкреплением
Методика основана на естественной для крыс
реакции, большей частью на стремлении переходить
из освещенной камеры в темную. Крыс
помещают в освещенную камеру размером 40x20x20 см.
В 1-й день обучения животные в темной камере
получают электроболевое раздражение при силе
тока 1 мА. Через 24, 48 ч исследуют время
нахождения животных в освещенной камере (обычно не
более 2—3 мин)
Относительное число животных, не
избегающих светлой камеры.
Латентный период выхода в темную
камеру при первом предъявлении.
Латентный период выхода в
темную камеру через 24, 48 ч после
обучения
Активное избегание с отрицательным (болевым) подкреплением
Проводится обычно в так называемой челночной
камере, состоящей из двух отсеков, размером
20 х 20 х 20 см, и разделенных переходом или
дверцей. В полу камеры решетки, на которые
можно подавать ток силой 0,75—1,5 мА (обычно
определяют болевой порог индивидуально для
каждого животного и используют ток, равный 1,5
болевого порога). Обучение методом дискретных
проб заключается в том, что каждое испытание
начинается с сигнала (зуммер, свет). Если
животное через фиксированное время (5—10 с) не
переходит в безопасный отсек, подается
электроболевое раздражение. Опыты проводят до достижения
критерия обученное™ не менее чем у 80%
животных контрольной группы. Критерием обученно-
сти является 18 успешных избеганий в серии из
20 опытов. Крыс обучают двустороннему
избеганию. При изучении долгосрочной памяти
(например, 1, 7, 10 дней после достижения критерия)
животным подвергают однотипным с обучением
испытаниям. Угасание навыка исследуют каждый
день, не подкрепляя сигнал болевым
раздражением. Возможны модификации метода выработки
этого рефлекса: одностороннее избегание,
массированное обучение
Обучение в лабиринте с положительным
Используют Т-, У-образные лабиринты или
многосекционные лабиринты. Животных взвешивают
до начала ограничения в питании, после первого
дня испытания и после достижения критерия
обученное™. Опыты продолжают до достижения
критерия, подбираемого эмпирически при
анализе кривой обученное™. Опыты продолжают до
достижения критерия не менее чем 80%
животных контрольной группы. При отсутствии
различий в скорости обучения исследуют память
обученных животных. При исследовании памяти
необходимо, чтобы животные получили в процессе
обучения сходное количество подкреплений
Среднее количество правильных
ответов в зависимости от числа
предъявлений. Кривая обучаемости
— относительное число животных,
достигших критерия обученное™
при данном числе испытаний.
Среднее значение болевого порога.
Среднее число межсигнальных
реакций. Процент ошибочных
ответов при исследовании памяти.
Скорость угасания навыка
(пищевым) подкреплением
Среднее количество правильных
ответов в зависимости от числа
предъявлений. Кривая обученно-
сти. Частота (и длительность)
различных актов поведения, в том
числе и эмоциональная реакция на
лабиринт. Число различных
элементарных актов поведения до
достижения критерия обученное™.
Потеря массы тела в процессе
обучения и корреляция этого
показателя со скоростью приобретения
навыка
1.7. Для морфологического изучения семенников их фиксируют в 10 %
формалине или жидкости Карнуа, заливают в парафин, приготовляют
поперечные срезы толщиной 6—7 мк, окрашивают гематоксилином и эози-
-98

ном. Морфологическую оценку состояния сперматогенного эпителия
проводят по следующим количественным показателям:
а) индекс сперматогенеза = ЕА/100, где А — число стадий в каждом
канальце, 100 — число подсчитанных канальцев. Индекс сперматогенеза
подсчитывают по 4-балльной системе, фиксируют в канальце наличие
сперматогоний, сперматоцитов 1-го и 2-го порядка, сперматид и
сперматозоидов;
б) среднее количество нормальных сперматогоний в каждом канальце
(подсчитывают 20 канальцев);
в) относительное количество канальцев с 12-й стадией мейоза (метафаза
2-го деления созревания, подсчитывают в 100 канальцах).
Для исследования функционального состояния сперматозоидов обычно
используют суспензию, полученную при продольном разрезе придатка
семенника. Методика стандартизована по количеству (2 мл) изотонического
раствора натрия хлорида и времени перемешивания (2 мин) при
комнатной температуре. Это позволяет проводить оценку функции
сперматозоидов по следующим показателям: характер и продолжительность их
движения; относительное количество патологических форм сперматозоидов;
концентрация сперматозоидов в хвостовой части эпидидимиса. Возможно
также определение относительного количества живых сперматозоидов и их
резистентности — осмотической и кислотной.
1.8. Для морфологического изучения яичников их фиксируют в
жидкости Карнуа, заключают в парафин, приготовляют срезы по типу
топографических, через весь орган, толщиной 6 мк, окрашивают гематоксилином
и эозином. Эвтаназию животных проводят в стадии эструс или проэструс,
что необходимо для последующего подсчета структурно-функциональных
элементов в яичнике.
Регистрируют:
— примордиальные фолликулы и фолликулы с одним слоем
гранулезных клеток;
— фолликулы с двумя и более слоями гранулезных клеток;
— зрелые фолликулы (граафовы пузырьки);
— атретические тела и атрезирующие фолликулы;
— желтые тела;
— общее количество генеративных форм.
Указанные элементы подсчитывают по всей поверхности среза.
Фолликулы примордиальные и с одним слоем гранулезных клеток учитывают в
каждом 10-м срезе и результат умножают на 10, фолликулы зрелые с двумя
и более слоями гранулезных клеток, атретические тела подсчитывают в
каждом 5-м срезе, желтые тела фиксируют в срединном срезе. При
количественной оценке микроструктуры яичника регистрируют только фолликулы,
содержащие ядро и ядрышко.
Л итература
1. Гуськова Т. А. Оценка безопасности лекарственных средств на стадии
доклинического изучения // Химико-фармацевтический журнал. — 1990. — № 7. — С. 10—15.
2. Кирющенков А. П., Тараховский М. Л. Влияние лекарственных средств на плод. —
М„ 1990. - 286 с.
3. Методические указания по изучению эмбриотоксического действия
фармакологических веществ и влияния их на репродуктивную функцию. —Москва,
Фармакологический комитет, 1986. — 25 с.
4. Принципы оценки риска для потомства в связи с воздействием химических веществ
в период беременности. — Женева: ВОЗ, 1986. — 156 с.
4*
-99-

5. Торчинский Л. М. Доклиническое изучение тератогенных свойств лекарственных
препаратов: возможности увеличения информативности результатов эксперимента:
Дис. ... д-ра мед. наук. — М., 1990.
6. Beltrame D., Mazue J. Reprodactive toxicology guidelinesxomparison and application //
Ann. 1st. Super Sanita. — 1993. — Vol. 29. — P. 1, 3-4.
7. ICH Harmonised Tripartite Guideline Recommended for Adoption at Step 4 of the ISH
Process on 24 June 1993 by the ICH Steering Committee.
Методические указания по оценке мутагенных свойств
фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н., проф. А. Д. Дурнев;
д. б. н., проф. Ю. А. Ревазова; к. м. н.
О. Л. Верапакова; член-корр. РАМН, проф.
Т. А. Гусъкова; д. м. н., проф. В. С. Журков;
к. б. н. Ф. И. Ингель; к. м. н. Л. П. Сычева;
к. б. н. Т. Б. Танирбергенов; к. м. н. В. В. Юр-
ченко
1. Введение
Исследование мутагенности новых фармакологических средств и
вспомогательных компонентов лекарственных форм проводится на этапе
доклинического изучения безопасности их применения. Эта работа
предусматривает оценку способности лекарственных средств к индукции разных
типов мутаций в зародышевых и соматических клетках и делает
необходимым использование для оценки мутагенных свойств лекарств комплекса
методов, выполняемых на разных тест-объектах. Опыт работы по
тестированию лекарств, накопленный различными группами исследователей с
момента выхода первой редакции "Методических рекомендаций по оценке
мутагенности новых лекарственных средств" (1981), показывает, что
целесообразным представляется использование этапного подхода, сводящегося
к следующему: на уровне доклинических испытаний следует использовать
минимальный набор методов для оценки лекарств на мутагенность, а
именно: 1) учет хромосомных аберраций или микроядер в клетках
костного мозга млекопитающих и 2) учет генных мутаций с использованием в
качестве тест-объекта микроорганизмов или дрозофилы. При условии
получения отрицательных результатов препарат может быть допущен к первой
фазе клинических испытаний. Перед второй фазой клинических
испытаний необходимо провести изучение способности лекарственного препарата
индуцировать мутации в зародышевых клетках мышей (доминантный
летальный тест). В случае отсутствия мутагенной активности можно
продолжить клинические испытания. Если в отдельных тестах получены
неоднозначные, но воспроизводимые результаты, то на заключительных этапах
клинических испытаний следует провести исследование уровня
хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови леченых больных.
Дополнения и уточнения регламента выполнения рекомендованных
методов и трактовка экспериментальных результатов описаны в
соответствующих разделах.
- 100 -

Изучение генетической активности лекарственных средств требует
профессиональной подготовки.
Данные методические рекомендации описывают комплексную систему
проверки генетической активности новых лекарственных средств, но не
являются пособием для освоения методов. Последние в должном объеме
можно освоить только в результате стажировки в лабораториях
соответствующего профиля.
2. Общие подходы
2.1. Принципы отбора фармакологических средств для испытания
на мутагенную активность
Тестированию на мутагенную активность подвергаются новые
оригинальные фармакологические средства, созданные химическими,
биотехнологическими, генно-инженерными и иными способами, включая
полученные из сырья природного происхождения. Новые фиксированные
комбинации фармакологических средств, планируемые для широкого
клинического применения, при структурном сходстве компонентов комбинации с
известными канцерогенами, мутагенами или их метаболитами также
подвергаются испытанию. Для анализа структурного сходства используются,
во-первых, представительная база данных о мутагенных свойствах
широкого круга химических соединений и, во-вторых, специальные
компьютерные программы [12, 14].
2.2. Пути введения фармакологического средства, выбор доз, объекты
исследования
Пути введения исследуемого фармакологического средства должны
соответствовать планируемому способу приема лекарства человеком.
Если предполагается возможность энтерального и парентерального
введения, можно использовать внутрибрюшинный, подкожный или
внутримышечный способы введения. Фармакологические средства перорального
применения изучают при внутрижелудочном пути введения. Изучение
мутагенной активности ингаляционных анестетиков, мазей и т. п. проводят в
условиях предполагаемого применения (ингаляционное, накожное) и при
парентеральном введении.
Исследуемые фармакологические средства растворяют в
дистиллированной воде или изотоническом растворе натрия хлорида. Водонераство-
римые препараты вводят с Твином-80 или используют растворители
(этиловый спирт, диметилсульфоксид в конечной концентрации до 5 %); для
перорального введения порошкообразных лекарств можно использовать
растительное масло или 1 % водный раствор крахмала.
Оптимальный объем вводимых растворов фармакологических средств и
соответствующих растворителей (для контрольных групп животных)
должен составлять при пероральном и внутрибрюшинном способах введения
не более 0,5 мл и при внутримышечном — не более 0,2 мл.
Выбор доз для исследований определяется на основе результатов
оценки острой токсичности и терапевтической эффективности
фармакологического средства. Используются две дозы: одна соответствует
предполагаемой суточной терапевтической дозе для человека, пересчитанной на по-
- 101 -

верхность тела экспериментального животного [2], а вторая выбирается на
основе данных по острой токсичности и составляет ]/ю— '/5 LD50 для
используемого вида млекопитающих.
Проведение экспериментов in vivo диктует необходимость применения
генетически однородных животных. При этом использование мышей
предпочтительнее, однако не исключено применение других видов животных
(половозрелых самцов и самок).
3. Методы тестирования мутагенности фармакологических средств
3.1. Учет аберраций хромосом в клетках костного мозга млекопитающих
3.1.1. Термины и определения
Цитогенетическая активность — способность вещества вызывать
структурные и численные хромосомные нарушения в соматических и
зародышевых клетках.
Аберрации хромосомного типа — структурные нарушения на уровне
идентичных локусов обеих хроматид, выявляемые как парные фрагменты и
хромосомные обмены.
Аберрации хроматидного типа — структурные нарушения на уровне
одной хроматиды, выявляемые как одиночные фрагменты или хроматидные
обмены.
Ахроматические пробелы (гепы) — определяемые визуально нарушения
целостности окраски хроматиды, не превышающие по размеру ее ширину
и не сопровождающиеся сдвигом дистального участка относительно ее оси.
3.1.2. Цель исследования и принцип метода
Выявление и количественная оценка потенциальной цитогенетической
активности фармакологических средств в клетках костного мозга
млекопитающих.
В основе метода лежит регистрация видимых структурных нарушений
хромосом в клетках на стадии метафазы. Клетки костного мозга
характеризуются высоким уровнем митотическои активности, спонтанная частота
клеток с хромосомными повреждениями, включая гепы, составляет 1—
2,5 % [7].
3.1.3. Процедура тестирования
3.1.3.1. Лабораторные животные
Эксперименты проводят на самцах и самках мелких лабораторных
грызунов. Предпочтительно использование генетически однородных
животных, не менее 5 особей в каждой контрольной и экспериментальной
группе.
Животные должны содержаться при 12-часовом световом режиме в
условиях свободного доступа к воде и пище.
- 102-

3.1.3.2. Проведение эксперимента
В первой серии испытуемый препарат в дозе, соответствующей
суточной терапевтической для человека, и в субтоксической дозе вводят
однократно только самцам с фиксацией клеточного материала через 24 ч после
введения.
Во второй серии испытуемый препарат в дозе, соответствующей
суточной терапевтической для человека, вводят самцам и самкам ежедневно на
протяжении 4—5 сут. Фиксацию клеточного материала осуществляют через
6 и/или 24 ч после последнего введения в зависимости от фармакокинети-
ческих особенностей испытуемого препарата [10].
3.1.3.3. Контроли
В качестве позитивных контролей целесообразно использовать цикло-
фосфамид в дозе 20 мг/кг при однократном внутрибрюшинном введении
или любой другой известный агент, заведомо обладающий цитогенетиче-
ской активностью.
Негативным контролем является используемый растворитель.
3.1.3.4. Приготовление цитогенетических препаратов
Методика выделения клеток костного мозга и приготовления
препаратов для цитогенетического анализа подробно описаны в соответствующих
руководствах и ранее опубликованных методических рекомендациях [7,
10]. Полученные препараты (два стекла от каждого животного) шифруют и
подвергают микроскопическому цитогенетическому анализу.
3.1.3.5. Микроскопический анализ
Анализируют 100 метафаз от каждого животного. Анализу
подвергаются округлые метафазные пластинки без наложений хромосом с
модальным числом 40 — для мышей, 42 — для крыс. Учитывают число
одиночных и парных фрагментов, хроматидных и хромосомных обменов,
ахроматических пробелов (гепов) и разрывов по центромере, число клеток с
множественными повреждениями и клеток с полной деструкцией
хромосом.
3.1.4. Оценка результатов
Оценку результатов цитогенетического анализа проводят путем
сопоставления долей клеток с хромосомными аберрациями в контрольной и
опытных сериях эксперимента. Сравнение долей клеток с гепами и
разрывами по центромере следует рассматривать в качестве дополнительных
критериев цитогенетической активности исследуемого препарата.
Статистическую обработку проводят согласно общепринятым
рекомендациям [11].
Результаты документируются согласно табл. 1.
Доказательством цитогенетической активности исследуемого препарата
- 103 -

Таблица 1. Итоговая таблица результатов оценки цитогенетической активности
вещества в тесте по учету хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих
Условия

эксперимента
Мышь
№
Кол-во

исследованных
клеток
Количество аберраций

одиночные

фрагменты
парные

фрагменты
обмены
Клетки с

множественными

аберрациями
(%)

Пробелы, кол-
во/
клетки (%)
Доля

врежденных
клеток
(%)
является статистически значимое превышение доли аберрантных клеток в
опыте по сравнению с негативным контролем.
3.1.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки цитогенетической
активности вещества в тесте по учету хромосомных аберраций в клетках
костного мозга млекопитающих
Название эксперимента:
Животные:
Вид линия пол масса
Питомник
дата получения
количество
Вещество:
название
формула, физико-химические свойства
откуда получено
растворитель
позитивный контроль
Анализ данных литературы:
(структура, мутагенная и канцерогенная активность и т. д.)
Схема эксперимента:
дата проведения
путь введения дозы
длительность и кратность введения
группы
Методика приготовления препаратов:
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
3.2. Учет микроядер в клетках млекопитающих
3.2.1. Термины и определения
Микроядра — небольшие ДНК-содержащие образования, состоящие из
ацентрических фрагментов хромосом или отставших на стадии ана-телофа-
- 104-

зы хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра
дочерних клеток или образовывать одиночные или множественные
микроядра в цитоплазме.
3.2.2. Цель исследования и принцип метода
Выявление и количественная оценка потенциальной цитогенетической
активности фармакологических средств в полихроматофильных
эритроцитах костного мозга млекопитающих.
Метод основан на микроскопической регистрации клеток с
микроядрами. Спонтанная частота клеток с микроядрами составляет 0,1—0,2 % [8].
3.2.3. Процедура тестирования
3.2.3.1. Лабораторные животные
Эксперименты проводят на самцах и самках мелких лабораторных
грызунов. Предпочтительно использование генетически однородных
животных, не менее 6 особей в каждой контрольной и экспериментальной
группе.
Животные должны содержаться при 12-часовом световом режиме в
условиях свободного доступа к воде и пище.
3.2.3.2. Проведение эксперимента
В первой серии испытуемый препарат в дозе, соответствующей
суточной терапевтической для человека, и в субтоксической дозе вводят
однократно только самцам с фиксацией клеточного материала через 24 ч после
введения.
Во второй серии испытуемый препарат в дозе, соответствующей
суточной терапевтической для человека, вводят самцам и самкам ежедневно на
протяжении 4—5 сут. Фиксацию клеточного материала осуществляют через
6 и/или 24 ч после последнего введения в зависимости от фармакокинети-
ческих особенностей испытуемого препарата [10, 8].
3.2.3.3. Контроли
Негативным контролем является используемый растворитель.
В качестве позитивных контролей целесообразно использовать цикло-
фосфамид в дозе 20 мг/кг при однократном внутрибрюшинном введении
или любой другой известный агент, заведомо обладающий
цитогенетической активностью.
3.2.3.4. Приготовление цитогенетических препаратов
Методика выделения клеток и приготовления препаратов для цитогене-
тического анализа подробно описаны в соответствующих руководствах и
методических рекомендациях [10, 8]. Полученные препараты (два стекла от
- 105 -

Таблица 2. Результаты оценки цитогенетической активности вещества в тесте на
индукцию микроядер в клетках костного мозга млекопитающих
Группа

(вещество, доза)
№ мыши
Количество ПХЭ с микроядрами на 1000 ПХЭ
на каждую мышь
на группу в целом
Доля ПХЭ от
всех эритроцитов
каждого животного) шифруют и подвергают микроскопическому цитогене-
тическому анализу.
3.2.3.5. Микроскопический анализ
Анализируют 2000 полихроматофильных эритроцитов от каждого
животного, соотношение нормо- и полихроматофильных эритроцитов
определяют при подсчете 500 эритроцитов.
3.2.4. Оценка результатов
Критерием позитивного результата является воспроизводимое и
статистически значимое увеличение числа полихроматофильных эритроцитов
(ПХЭ) с микроядрами по крайней мере в одной из опытных групп по
сравнению с контрольной. Полученный положительный результат
свидетельствует, что вещество индуцирует хромосомные повреждения и/или
нарушения митотического аппарата клеток у экспериментальных животных.
Результаты опытов представляют в виде табл. 2.
Статистическую обработку проводят согласно общепринятым
рекомендациям [11].
3.2.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки цитогенетической
активности вещества в тесте на индукцию микроядер в клетках костного мозга
млекопитающих
Название эксперимента:
Животные:
Вид линия пол масса
питомник
дата получения
количество
Вещество:
название
формула, физико-химические свойства
откуда получено
растворитель
позитивный контроль
Анализ данных литературы:
(структура, мутагенная и канцерогенная активность и т. д.)
Схема эксперимента:
- 106-

дата проведения
путь введения дозы
длительность и кратность введения
группы
Методика приготовления препаратов:
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
3.3. Мутационный тест на Salmonella typhimurium (тест Эймса)
3.3.1. Термины и определения
Мутационный тест на Salmonella typhimurium является бактериальной
тест-системой для учета мутаций к прототрофности по гистидину при
действии химических соединений и/или их метаболитов, индуцирующих
мутации типа замены оснований или сдвига рамки считывания в геноме
этого организма.
Мутагены, индуцирующие замены пар оснований, — агенты,
вызывающие мутации типа замены пар оснований в молекуле ДНК. В данном тесте
эти мутации могут происходить или в сайте исходной мутации, или в
другом сайте хромосомы.
Мутагены, индуцирующие мутации типа сдвига рамки считывания, —
агенты, вызывающие вставку или делецию одной или нескольких пар
оснований в молекуле ДНК.
3.3.2. Цель исследования и принцип метода
Данный метод предназначен для выявления способности
фармакологических веществ или их метаболитов индуцировать генные мутации у
индикаторных штаммов Salmonella typhimurium.
Фармакологические средства с выраженной антибактериальной
активностью изучать в тесте Эймса нецелесообразно.
Бактерии обрабатываются тестируемым соединением с системой
метаболической активации или без метаболической активации. После
инкубации в течение определенного периода времени подсчитывается количество
ревертантных колоний у разных тестерных штаммов в сравнении с
количеством спонтанных ревертантов в вариантах негативного контроля
(необработанные культуры или культуры, обработанные растворителем).
Если тестируемое соединение и/или его метаболиты обладают
мутагенной активностью, то они будут индуцировать обратные мутации от ауксо-
трофности к прототрофности по гистидину у гистидинзависимых штаммов
Salmonella typhimurium [6, 15].
- 107-

3.3.3. Процедура тестирования
3.3.3.1. Бактерии
В качестве тестерных организмов используются штаммы Salmonella ty-
phimurium. Минимальный набор состоит из штаммов ТА 97, ТА 98 и ТА
100. При необходимости могут использоваться и другие виды и штаммы
микрорганизмов.
Каждый штамм должен быть проверен на ауксотрофность по гистиди-
ну, чувствительность к кристаллическому фиолетовому и устойчивость к
ампициллину. Тестерные штаммы должны иметь уровень спонтанных ре-
вертантов в пределах ожидаемого на основании литературных данных.
3.3.3.2. Метаболическая активация
В качестве экзогенной метаболической активации используется
фракция S9 печени крыс, предобработанных соволом (300 мг/кг, однократно,
внутрибрюшинно, за 5 сутдо забоя) [1].
3.3.3.3. Изучаемые дозы (концентрации)
Максимальная доза тестируемого соединения определяется его
токсичностью и растворимостью. Токсичность тестируемого соединения может
изменяться при использовании экзогенной метаболической активации.
Для нетоксичных хорошо растворимых соединений максимальная доза
может быть в пределах 1000—5000 мкг на чашку. Для тестируемых
соединений с бактерицидной активностью максимальная доза должна подавлять
рост бактерий не более чем на 50 %, что определяется либо по
уменьшению количества спонтанных ревертантов, либо по подавлению роста
бактериального газона. В любом случае должно проверяться не менее 5
различных доз тестируемого соединения, различающихся, например, в 10 раз.
3.3.3.4. Контроли
В каждом эксперименте обязательны одновременно проводимые
негативный (необработанный или растворитель) и позитивный контроли.
В качестве растворителя используются дистиллированная вода или ди-
метилсульфоксид, а при необходимости и другие растворители.
Позитивные контроли должны быть специфичны для каждого тестерно-
го штамма. Позитивный контроль для вариантов с метаболической
активацией должен соответствовать типу используемой системы экзогенной
метаболической активации.
3.3.3.5. Проведение эксперимента
Необходимые для проведения эксперимента оборудование, посуда,
реактивы, питательные смеси и растворы, проведение работ по получению
фракции S9, а также регламент работы с бактериальными культурами
описаны в литературе.
- 108-

Опыт параллельно ведут с использованием микросомальной
активирующей смеси и без нее для регистрации действия как прямых мутагенов, так
и непрямых, активность которых связана с образованием мутагенных
метаболитов, учитываемых при работе с микросомальной фракцией.
В контрольных вариантах опыта вместо испытуемого образца вносят
соответствующий объем растворителя.
3.3.4. Данные и их представление
3.3.4.1. Обработка результатов
Данные должны быть представлены в виде количества ревертантных
колоний на чашку. Как для тестируемого соединения, так и для позитивных
и негативных контролей указывается количество колоний для каждой
чашки, среднее количество ревертантных колоний на чашку и стандартное
отклонение. Если ни в одном из вариантов на данном штамме (штаммах) не
получено статистически значимых результатов, эксперимент прекращают.
В случае обнаружения позитивного результата опыт повторяют с целью
подтверждения эффекта, причем работу ведут только на том штамме
(штаммах), на котором был выявлен эффект. Если максимальный эффект
зарегистрирован на одной из промежуточных доз (такая ситуация
возможна при работе с фармакологическими средствами, обладающими
бактерицидными свойствами), прибегают к дроблению доз. При этом за среднюю
точку на шкале доз испытуемого вещества принимают дозу, на которой
был выявлен максимальный эффект. В опыт вводят еще 4 варианта: дозы в
2 и 5 раз меньше и больше средней дозы.
Если при проведении повторного опыта эффект не обнаруживается,
проводится еще один дополнительный опыт, результат которого
сравнивают с первыми двумя экспериментами. Заключение о наличии или
отсутствии мутагенной активности испытуемого соединения делают на основании
двух опытов с совпадающими результатами.
Для оценки результатов тестирования могут использоваться
соответствующие статистические методы, например метод попарных сравнений
Даннета [11].
3.3.4.2. Оценка результатов
Критериями позитивного результата являются или статистически
достоверное зависимое от дозы увеличение количества ревертантов, или
воспроизводимый и статистически достоверный позитивный ответ по крайней
мере для одной экспериментальной точки.
Тестируемое соединение, не вызывающее статистически достоверного
зависимого от дозы увеличения количества ревертантов или
воспроизводимого и статистически достоверного позитивного ответа для какой-либо
экспериментальной точки, рассматривается как немутагенное в данном
тесте.
Отчет должен включать следующую информацию:
— бактерии: использованные штаммы;
— условия проведения теста: уровни доз и обоснование выбора доз,
количество чашек на экспериментальную точку, токсичность, состав среды,
тип и состав системы метаболической активации, методика обработки, по-
- 109-

зитивные и негативные контроли;
— индивидуальные результаты для каждой культуры;
— среднее количество ревертантных колоний на чашку;
— стандартное отклонение;
— отношения доза—эффект (где возможно).
3.3.4.3. Интерпретация результатов
Позитивные результаты в этом тесте указывают на то, что тестируемое
соединение индуцирует генные мутации типа замены пар оснований или
сдвига рамки считывания у данного микроорганизма. Негативные
результаты в этом тесте указывают на то, что в данных условиях тестируемое
соединение не мутагенно для использованных штаммов Salmonella typhimuri-
um.
3.3.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки мутагенной активности
вещества в тесте по учету генных мутаций у бактерий
Название эксперимента:
Тестерные микроорганизмы:
Вид штаммы
Вещество:
название
формула, физико-химические свойства
откуда получено
растворитель
позитивный контроль
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:
дата проведения (начало, окончание, отдельные эксперименты)
способ обработки дозы
количество повторностей, количество чашек на дозу
система метаболической активации
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
3.4. Учет рецессивных, сцепленных с полом, летальных мутаций
у дрозофилы
3.4.1. Термины и определения
Летальная мутация — изменение в геноме, проявление которого
приводит к смерти его носителя.
Рецессивная мутация — изменение в геноме, которое проявляется в
условиях гомозиготности или гемизиготности.
- ПО-

Сцепленные с полом гены присутствуют в половых (X или Y)
хромосомах. Обсуждаемый метод определяет мутационные события в Х-хромосоме.
3.4.2. Цель исследования и принцип метода
С помощью данного метода проводят оценку способности испытуемого
вещества и продуктов его метаболизма индуцировать генные мутации в
зародышевых клетках дрозофилы.
Рекомендуемый метод, называемый Меллер-5, основан на индукции
исследуемыми лекарствами рецессивных летальных мутаций в
Х-хромосоме самцов дикого типа линии D-32. Эти мутации передаются через самок
F, самцам второго поколения, не доживающим до стадии имаго.
3.4.3. Процедура тестирования
Биология, морфология, разведение дрозофилы, а также инструменты
для работы с ней и приготовление питательных сред подробно описаны в
соответствующих руководствах [3].
3.4.3.1. Используемые линии дрозофилы
Для опытов по учету рецессивных, сцепленных с полом летальных
мутаций (РСПЛМ) требуется линия дикого типа с хорошо изученным
спонтанным фоном мутабильности, например Canton-S или D-32, а в качестве
тестерной линии лучше всего использовать линию BASC. В Х-хромосоме
мух этой линии имеются 2 инверсии — sc8 и d49, которые полностью
исключают возможность кроссинговера между половыми хромосомами, но
не нарушают жизнеспособности дрозофилы [3]. Фенотипическими
маркерами служат мутации Apricot — абрикосовые глаза и Ваг — полосковидные
глаза. В подобного рода экспериментах можно пользоваться также
тестерной линией CIB.
3.4.3.2. Пути введения и выбор доз
Обычно используют два основных способа введения испытуемых
фармакологических средств в организм дрозофилы: ингаляционный и перо-
ральный (с пищей). Чаще всего используют последний, при введении
соединения в корм. В этом случае целесообразно использовать стеклянные
пористые фильтры, погруженные в бюксы с веществами, растворенными в
1—5 % сахарном сиропе в исследуемых концентрациях. Если препарат
нерастворим в воде, можно (при обязательном применении соответствующих
контролей с растворителями) растворить его в этиловом спирте или диме-
тилсульфоксиде так, чтобы конечная концентрация этих растворителей в
сахарном корме не превышала 2 %. Допускается внесение
фармакологических средств непосредственно в корм. Ингаляционные затравки
осуществляются в эксикаторах. Расчет доз при ингаляционном введении производят
на объем эксикатора, а при пероральном — на объем корма.
В зависимости от токсичности фармакологического средства
длительность экспозиций может колебаться от нескольких часов до нескольких
- 111 -

Таблица 3. Учет рецессивных, сцепленных с полом, летальных мутаций на дрозофиле

Концентрация
Экспозиция
Кол-во
изученных
культур F2
Кол-во не-
фертиль-
ных
самцов F2
Количество
рецессивных летальных мутаций
абс.
%
Уровень
значимости
дней (обычно экспозиция составляет 48—72 ч). Комбинация различных
концентраций и экспозиций позволяет ориентировочно определять
количество ("дозу") фармакологического средства, вызывающую примерно 50 %
стерильность самцов. Эту "дозу" принимают за максимальную, которую
используют в эксперименте. Снижение "дозы" необходимо только в случае
испытаний фармакологических средств, обладающих выраженным
стерилизующим эффектом.
3.4.3.3. Проведение эксперимента
После обработки изучаемым фармакологическим средством самцов
линии D-32 скрещивают с виргинными самками тестерной линии BASC (5
самцов, 10 самок). После начала вылета мух первого поколения (¥х)
отбирают виргинных гетерозиготных самок и индивидуально скрещивают их с
самцами F^
После вылета второго поколения (F2), каждая культура просматривается
визуально с целью обнаружения таких, в которых отсутствуют самцы
дикого фенотипа (с красными глазами). Общее количество культуральных
пробирок определяет число проанализированных Х-хромосом самцов,
подвергшихся действию изучаемых соединений. Пробирки, в которых
отсутствуют самцы дикого типа, отмечают как "летали". Постановка контролей
обязательна [10].
3.4.4. Данные и их представление
Результаты опытов представляют в виде табл. 3.
Частоту рецессивных деталей оценивают как отношение числа культур
второго поколения без самцов дикого фенотипа к общему числу культур.
Всего необходимо поставить не менее 1000 культур F2 на одну
экспериментальную точку.
Для оценки значимости превышения частоты рецессивных леталей в
опыте над контролем следует применять точный критерий Фишера для
таблиц сопряженности 2x2. Различия между опытом и контролем
считаются значимыми при р < 0,01 [11].
3.4.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки мутагенной активности
вещества в тесте на индукцию рецессивных, сцепленных с полом, летальных
мутаций у дрозофилы
Название эксперимента:
Линии дрозофилы:
- 112-

Вещество:
название
формула, физико-химические свойства
производитель
растворитель
Анализ данных литературы:
(структура, мутагенная и канцерогенная активность и т. д.)
Схема эксперимента:
дата проведения
способ обработки концентрации
длительность обработки
группы
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
3.5. Учет соматической рекомбинации (мозаиицзма) у дрозофилы
3.5.1. Термины и определения
Под соматической рекомбинацией понимают обмен генетическим
материалом между гомологичными хромосомами соматических клеток в
митозе, приводящий к образованию мозаичных особей. При использовании в
качестве маркеров рецессивных генов возможно выявление генных
мутаций, делеций, митотических рекомбинаций и генных конверсии.
3.5.2. Цель исследования и принцип метода
Целью данного метода является интегральное выявление рекомбинаци-
онных и других мутационных событий, индуцируемых лекарственным
веществом или его метаболитами в соматических клетках личинок
дрозофилы. В основе метода лежит учет мозаичных пятен, возникающих у мух тес-
терных линий в результате комплексного нарушения генотипа: митотиче-
ской рекомбинации, потери хромосом и/или их фрагментов,
транслокаций, делеций и генных мутаций. В качестве маркеров возможно
использование генов "у" и "sn3" в трансположении [4].
3.5.3. Процедура тестирования
Биология, морфология, разведение дрозофилы, а также инструменты
для работы с ней и приготовление питательных сред подробно описаны в
соответствующих руководствах [3].
3.5.3.1. Используемые линии дрозофилы
Для учета соматического мозаицизма в данной тест-системе необходимо
поддержание следующих тестерных линий дрозофилы:
- 113 -

линия 1 — yellow — генотип у/у (у — рецессивный ген,
обусловливающий развитие желтой окраски тела и щетинок);
линия 2 — w, sn3 — генотип w sn-yY (w — white — белая окраска глаз,
sn3 — singed3 — извитая скрученная форма щетинок; оба гена
рецессивные);
Спонтанный уровень мутаций и рекомбинаций невысок и колеблется у
разных линий в пределах от 0,3 до 1,1 %.
3.5.3.2. Пути введения и выбор доз
Обычно используют один из двух способов введения испытуемых
фармакологических средств в организм дрозофилы: ингаляционный
или пероральный (с кормом). Если препарат нерастворим в воде,
можно (при обязательной постановке соответствующих контролей)
растворить его в этиловом спирте или диметилсульфоксиде так, чтобы
конечная концентрация этих растворителей в испытуемом растворе
составляла 2 %. В любом случае в культуру с кормом вносят 200 мкл
тестируемого раствора. Возможно распыление нерастворимых в воде
соединений по поверхности питательной среды. Ингаляционные
затравки осуществляются в эксикаторах, в этом случае расчет доз
производят на объем эксикатора.
Токсичность фармакологических средств устанавливают по
выживаемости самок Fb которая на максимальной из использованных
концентраций не должна быть меньше 50 %. Всего в эксперименте определяют
эффект 3 различных концентраций фармакологического средства. В
зависимости от токсичности фармакологического средства длительность
экспозиций может колебаться от нескольких часов до нескольких дней (обычно
экспозиция составляет 48—72 ч).
3.5.3.3. Проведение экспериментов
Девственных самок в количестве 10 особей помещают в пробирку,
содержащую стандартную питательную среду вместе с 5 самцами. Через 48—
72 ч родителей пересаживают в пробирки со свежей питательной средой, а
в прежние пробирки вносят растворы испытуемых фармакологических
средств.
Просмотр вылетевших особей начинают с 9—10-го дня после начала
эксперимента и продолжают до начала вылета следующего поколения.
Просмотр проводят под бинокулярным стереоскопическим микроскопом в
отраженном свете.
При скрещивании самок линии 1 с самцами линии 2 у гетерозиготных
самок первого поколения, имеющих генотип у+/ +w sn3, регистрируют
мутантные щетинки (макрохеты на голове, тораксе и скутеллюме)
фенотипа yellow или singed. В протоколе регистрируют общее число
просмотренных самок, число самок с одиночными (у, sn3) и двойными (у sn3)
пятнами [12].
3.5.4. Данные и их представление
Результаты экспериментов представляют в виде табл. 4.
- 114-

Таблица 4. Учет соматического мозаицизма при использовании маркеров у, w и sn3
Препарат,


ция/экспозиция
Общее
число

смотренных самок
Число самок с мутациями
пятен "sn3"
пятен "у"
пятен "у
sn3"
всего пятен
% ±т,*
*т, = l/vN , где N — число просмотренных особей.
Статистическую обработку результатов проводят с использованием %2~
критерия, сравнивая частоту появления особей с пятнами в контрольных и
опытных сериях [2].
3.5.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки мутагенной активности
вещества в тесте на индукцию соматического мозаицизма у дрозофилы
Название эксперимента:
Линии дрозофилы, условия скрещивания:
Возраст родителей на момент скрещивания:
Вещество:
название
формула, физико-химические свойства
производитель
растворитель
Анализ данных литературы:
(структура, мутагенная и канцерогеная активность)
Схема эксперимента:
дата проведения
способ обработки концентрации
максимальный возраст личинок на момент обработки группы
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
3.6. Метод учета доминантных летальных мутаций в зародышевых
клетках мышей
3.6.1. Термины и определения
Доминантные летальные мутации — генетические изменения,
индуцированные в родительских зародышевых клетках и приводящие к гибели
первое поколение потомков на эмбриональных стадиях развития. Большая
часть доминантных леталей представляет собой численные и структурные
аберрации хромосом, частично они могут быть представлены генными
мутациями.
- 115 -

3.6.2. Цель исследования и принцип метода
Выявление влияния исследуемого препарата на генетические структуры
зародышевых клеток. Мутагенный эффект проявляется в виде
повышенной эмбриональной смертности. Если яйцеклетка оплодотворена
сперматозоидом, несущим доминантную леталь, то смерть развивающегося
эмбриона может произойти как до, так и после имплантации. Для оценки
мутагенных свойств фармакологических средств учитывают постимпланта-
ционную смертность.
3.6.3. Процедура тестирования
Обычная схема проведения эксперимента включает обработку
фармакологическим средством самцов с последующим спариванием их с интакт-
ными самками [7, 9, 13].
3.6.3.1. Лабораторные животные
Эксперименты проводят на самцах и самках мелких лабораторных
грызунов. Предпочтительно использование генетически однородных
животных, не менее 5 особей в каждой контрольной и экспериментальной
группе.
Животные должны содержаться при 12-часовом световом режиме в
условиях свободного доступа к воде и пище.
3.6.3.2. Проведение эксперимента
Для каждого варианта опыта и контроля (понедельного) следует
использовать животных приблизительно одного срока рождения. Самок в
течение 2—3 нед после привоза не рекомендуется брать в опыт для
исключения неконтролируемых беременностей. Каждая группа самцов,
обрабатываемых фармакологическим средством, должна быть увеличена на 3—5
животных для использования их в случае непредусмотренной гибели в ходе
опыта.
Для выявления возможного мутагенного эффекта фармакологическое
средство исследуется в дозах '/ю и Уг LD при однократном введении.
Применяемые дозы не должны снижать фертильность более чем на 50 %.
В противном случае их уменьшают и повторяют эксперимент.
Исследование проводят в течение 3 нед на постмейотических стадиях
сперматогенеза. На каждую дозу и контроль берут не менее 15 самцов. Сразу же после
затравки к каждому обработанному или контрольному самцу
подсаживается по 3 виргинных самки. Подсадки самок проводятся еженедельно, с тем
чтобы вести анализ доминантной летальности соответственно стадиям
сперматогенеза обработанных самцов. Эмбриональная смертность плодов у
самок, забеременевших в 1-ю неделю после введения химического
вещества, будет свидетельствовать о мутационных событиях, произошедших в
зрелых сперматозоидах, 2-я неделя соответствует поздним сперматидам, 3-
я неделя — ранним и средним сперматидам.
Отсаженных от самцов самок вскрывают на 15—17-й день
беременности. Большая часть доминантных деталей вызывает смерть эмбрионов при
- 116-

Таблица 5. Форма регистрации первичного экспериментального материала в тесте на
доминантные летальные мутации
Номер самца
Номер самки
Число живых
эмбрионов
Число мертвых
эмбрионов
или вскоре после имплантации. Погибшие на этой стадии мертвые
эмбрионы выглядят как темные гомогенные округлые тела диаметром 2,5—3
мм. При вскрытии регистрируют количество живых и мертвых эмбрионов
у каждой самки отдельно. Рекомендуется вскрывать ножницами оба рога
матки, особенное внимание обращая на дистальные отделы, так как
именно там часто располагаются мертвые эмбрионы, которые в силу своих
небольших размеров могут быть не учтены при обычном просмотре матки,
растягиваемой двумя пинцетами. Данные вскрытия фиксируют по
следующей форме (табл. 5).
3.6.3.3. Контроли
В качестве позитивных контролей целесообразно использовать фотрин,
циклофосфамид или любой другой известный агент, заведомо обладающий
мутагенной активностью на зародышевых клетках млекопитающих.
Негативным контролем является используемый растворитель.
3.6.4. Оценка результатов
В итоговую табл. 6 вносят данные по каждой серии эксперимента (за
серию принимают группу самцов, обработанных определенной дозой
изучаемого фармакологического средства на данной стадии сперматогенеза),
включая число беременных самок и процент фертильности.
Основным показателем уровня доминантных летальных мутаций
служит уровень постимплантационных потерь, представляющий собой
отношение числа мертвых эмбрионов к сумме живых и мертвых эмбрионов
[9, 13]. Он характеризует постимплантационную смертность. Для оценки
значимости увеличения этого показателя в опыте по сравнению с
контрольным вариантом при работе с линейными животными используют
критерий х2ДЛя соотношения сумм живых и мертвых эмбрионов. В связи
с тем что при таком подходе будет игнорироваться индивидуальная
чувствительность мышей, для снижения доли ложнопозитивных результатов
решение о наличии мутагенного эффекта следует принимать на 1 %
уровне значимости.
Таблица 6. Изучение способности фармакологического средства индуцировать доми
нантные летальные мутации в зародышевых клетках мышей
Стадия сперматогенеза
Зрелые сперматозоиды
Поздние сперматиды
Ранние сперматиды
Доза
мг/кг
Число
беременных самок
Фертиль-
ность (%)
Постимплан-
тационная
смертность
Значение %2-
статистик
- 117-

Таблица 7. Уровень хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови больных до и после лечения
№
больного
1.
2.
Условия
взятия крови
До лечения
После
лечения
№
образца крови
Шифр
стекла
Кол-во


зированных мета-
фаз
Кол-во
клеток с

аберрациями
Аберрации (количество)

одиночные
фрагменты
хроматид-
ные
обмены
парные

фрагменты

хромосомные
обмены
всего
аберраций
пробелы
Соответствует протоколу № 1.
Таблица 8. Средние значения уровня хромосомных аберраций в группах: до лечения — после лечения
До лечения
После
лечения
Кол-во
больных
Кол-во

анализированных ме-
тафаз
Кол-во
клеток с
аберрациями
(х + ш)1
Аберрации (количество)
одиночные
фрагменты
хроматид-
ные обмены
парные
фрагменты

хромосомные обмены
всего
аберраций (х +
т)*
клеток с
пробелами
'm = l/«/N , где N — число просмотренных метафазных пластинок.

Корректным представляется использование двухфакторного
дисперсионного анализа.
Для заключения о степени мутагенной активности используют данные
постимплантационнои смертности на самой чувствительной стадии
сперматогенеза.
3.6.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки мутагенной активности
вещества в тесте по учету доминантных летальных мутаций в зародышевых
клетках млекопитающих
Название эксперимента:
Животные:
вид линия пол масса
питомник
дата получения
количество
Вещество:
название
формула, физико-химические свойства
откуда получено
растворитель
позитивный контроль
Анализ данных литературы:
(структура, мутагенная и канцерогенная активность и т. д.)
Схема эксперимента:
дата проведения
путь введения дозы
длительность и кратность введения группы
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
3.7. Учет хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови
леченых больных
3.7.1. Цель исследования и принцип метода
Выявление и количественная оценка потенциальной цитогенетической
активности фармакологических средств в клетках периферической крови
больных, подвергавшихся лечению исследуемым лекарственным
препаратом.
В основе метода лежит регистрация видимых на стадии метафазы
структурных нарушений хромосом в культуре клеток периферической крови,
стимулируемых к пролиферации действием митогена.
- 119-

3.7.2. Процедура тестирования
Для исследования используется цельная гепаринизированная венозная
кровь больных, находящихся на стационарном лечении. Взятие крови у
каждого больного проводят стерильно дважды — до начала лечения препаратом
и не позднее 24 ч после завершения курса. Численность группы составляет
12—15 человек вне зависимости от пола и возраста. В случае необходимости
возможно включение в одну группу больных, находящихся в разных
лечебных учреждениях. При этом следует избегать включениг в цитогенетическое
обследование пациентов, подвергающихся рентгенодиагностическим
процедурам и приему заведомо мутагенных лекарств (цитостатики и пр.).
3.7.3. Методика культивирования лимфоцитов периферической крови больных
3.7.3.1. Подготовка и проведение эксперимента
Взятие венозной крови производится стерильно в шприцы, содержащие
50 мкл стерильного водного раствора гепарина (30 МЕ/мл). От каждого
больного ставится 4 культуры — 2 для проб крови, взятых до начала
лечения препаратом, и 2 — для проб, взятых после окончания лечения.
Необходимые для проведения эксперимента оборудование, посуда,
реактивы, питательные смеси и растворы, регламент работы с культурами
клеток, условия фиксации и подготовка препаратов для цитогенетического
анализа описаны [5, 10].
3.7.3.2. Цитогенетический анализ
Перед анализом препараты шифруют. На каждого больного
анализируют не менее 200 метафазных пластинок: 100 до и 100 после приема
препарата.
Для анализа отбирают метафазные пластинки правильной формы, с
хорошим разбросом хромосом и модульным числом 46.
Учитывают число одиночных и парных фрагментов, хроматидных и
хромосомных обменов, число клеток с множественными аберрациями и
клеток с полной деструкцией хромосом.
Ахроматические пробелы (гепы), разрывы по центромере и клетки с
рано разошедшимися хромосомами, анеуплоидные клетки и клетки с эндо-
редупликациями оценивают отдельно и не включают в общее число
аберраций.
Дополнительно определяют пролиферативную активность клеток (мито-
тический индекс). Для этого определяют долю ядер, находящихся на всех
стадиях митоза, при тотальном подсчете 1000 ядер на каждый препарат.
3.7.3.3. Статистическая обработка полученных
результатов
Заключение о мутагенной активности исследуемого
фармакологического средства делают при сравнении уровней клеток с аберрациями
хромосом у больных до и после лечения с использованием критерия Уилкоксона
для разности пар [3].
- 120-

3.7.4. Отчетность
Протокол № 1
№ п/п
Ф. И. О.
больного
Дата взятия
крови
Диагноз
№ больницы,
отделение
Протокол № 2
Первичные данные цитогенетического анализа
Номер препарата
Номер микроскопа
Исследователь
Общее количество клеток — 100
Клеток с аберрациями
Количество аберраций
Количество поврежденных хромосом
Доля клеток с аберрациями
Мета-
фаза
№ 1
Мета-
фаза
№ 2
Сводные данные об индивидуальном уровне хромосомных аберраций,
определенном у каждого больного до и после лечения, представляются в
табл. 7.
Обобщение результатов исследования проводят на основе данных,
представленных в табл. 8.
На основании статистической обработки полученных результатов
делается заключение о наличии или отсутствии значимых различий в уровне
хромосомных аберраций у больных до и после лечения.
4. Заключение
Решение о наличии у исследуемого фармакологического средства
мутагенных свойств выносится, если позитивный мутагенный эффект
зарегистрирован хотя бы в одном тесте.
Исследование мутагенных свойств фармакологических средств, так же
как и экспертную оценку результатов, должны проводить специалисты,
имеющие достаточные профессиональные навыки по применению
методов, составляющих систему тестирования.
Литература
1. Белицкий Г. А., Фонштейн Л. М., Худолей В. В. и др. Совол как индуктор микросо-
мальных ферментов, акитивирующих проканцерогены // Экспериментальная
онкология. - 1987. - Т. 9, № Зю - С. 20-23.
2. Гуськова Т. А. Оценка безопасности лекарственных средств на стадии
доклинического изучения // Химико-фармацевтический журнал. — 1990. — № 7. — С. 10—15.
3. Медведев Н. Н. Практическая генетика. — М.: Наука, 1968. — 294 с.
- 121 -

4. Методические рекомендации по применению соматического мутагенеза у Dr. mela-
nogaster в качестве тест-системы для ускоренного определения канцерогенов / МЗ
СССР. - М., 1982.
5. Метод учета хромосомных аберраций как биологический индикатор влияния
факторов внешней среды на человека: Методические рекомендации. — М., 1974. —
32 с.
6. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с
помощью бактериальных тест-систем: Методические указания. — М., 1985. — 34 с.
7. Определение мутагенности химических соединений (генетический скрининг) на
лабораторных мышах: Методические указания. — М.: Медицина, 1977. — 12 с.
8. Оценка мутагенной активности химических веществ микроядерным методом
(методические рекомендации). — М., 1984. — 17 с.
9. Оценка мутагенности новых лекарственных средств: Методические рекомендации.
- М., 1994. - 20 с.
10. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных
химических веществ. Гигиенические критерии состояния окружающей среды 51. —
Женева: ВОЗ, 1989. - 212 с.
11. Статистическая обработка данных тестирования на мутагенность: Методические
указания. — Вильнюс, 1989.
12. Ashby J. International Commission for protection against. Environmenral Mutagens and
Carcinogens. Two million rodent carcinogens? The role of SAR and QSAR in their
detection // Mutation Research. — 1994. — Feb 1, vol. 305, N 1. — P. 3—12.
13. Ehling U. H., Machemer J., W. Buselmaier et al. Standard protocol for the dominant lethal
test on male mice, set up By the Work Group Dominant Lethal Mutations of the ad hoc
Committee Chemogenetic // Arch.Toxicol. - 1978. - Vol. 39. - P. 173-185.
14. Klopman G., Rozenkranz H. S. International Commission for protection against
Environmenral Mutagens and Carcinogens. Approaches to SAR in carcinogenesis and
mutagenesis. Prediction of carcinogenicity/mutagenicity using MULTI-CASE // Mutation
Research. - 1994. - Feb 1, vol. 305, N 1. - P. 33-46.
15. Maron D. M., Ames B. N. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test // Mutat.
Res. - 1983. - Vol. 113, N 3-4. - P. 173-215.
Методические указания по изучению канцерогенных свойств
фармакологических веществ и лекарственных средств
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н., проф. Л. Н. Пылев;
д. м. н., проф. Б. А. Курляндский; проф.
В. С. Турусов; проф. А. Б. Сыркин; д. м. н,
проф. Г. Б. Плисе; член-корр. РАМН, проф.
Т. А. Гуськова; член-корр. РАМН, проф. Б. И.
Любимов; к. б. н. Л. А. Васильева; д. м. н.
Л. Ф. Шишкина; к. м. н. В. М. Иванова; к. б.
н. О. И. Лаврик
Общие положения
Тестирование фармакологических и лекарственных средств (ЛС) на
канцерогенную активность имеет много общего с методическими
принципами изучения канцерогенной активности химических веществ,
биологических продуктов, пищевых добавок ("Методические рекомендации
по исследованию канцерогенных свойств химических веществ и
биологических продуктов в хронических опытах на животных" МЗ СССР 1981 г.,
- 122 -

"Оценка канцерогенной опасности веществ, добавляемых к пищевым
продуктам" ФАО/ВОЗ 1961 г.). Однако существуют и различия в оценке
потенциальной опасности ЛС для человека. В связи с этим и все
возрастающими требованиями к доклиническому испытанию безопасности ЛС
возникла необходимость в создании рекомендаций по тестированию ЛС
на канцерогенность и оценке их потенциальной канцерогенной
опасности для человека.
Фармакологический государственный комитет Минздрава России
(ФГК) рассматривает вопрос о разрешении клинических испытаний и
внедрении нового ЛС в медицинскую практику только при наличии
материалов по оценке его потенциальной канцерогенной опасности для человека.
Сведения о канцерогенности ЛС направляются разработчиками в ФГК
вместе с данными о других видах токсичности.
Оценка и изучение канцерогенности ЛС должны быть завершены до
решения вопроса о разрешении медицинского применения.
1. Принципы отбора ЛС для исследования
Оценка канцерогенной опасности для человека необходима для всех
ЛС. При этом следует исходить из положения, что ЛС подразделяются на:
— принципиально новые, не имеющие химических аналогов;
— вновь синтезируемые в известном химическом ряду;
— воспроизводимые.
Подходы к решению вопроса о тестировании на канцерогенность этих
групп ЛС должны быть разные. Однако во всех случаях на ранних стадиях
доклинического изучения ЛС необходимо: изучение имеющихся
литературных данных (ссылки), оценка предполагаемого способа применения Л С
в клинике, сведения о его физико-химических свойствах и составе
рекомендуемой лекарственной формы, анализ другой информации. При этом
учитываются положения, изложенные ниже в п.п. 1.1, 1.2, 1.3, 1.4.
Результаты изучения излагаются в экспертном заключении, в котором
высказывается мнение о необходимости тестирования ЛС на
канцерогенность или отсутствие таковой, определяются сроки проведения
тестирования в общей программе создания нового ЛС.
При решении вопроса о тестировании ЛС на канцерогенность в
хроническом эксперименте необходимо исходить из следующих положений:
1.1. Обязательному тестированию на канцерогенность должны
подвергаться вновь синтезируемые ЛС, рекомендуемые:
— в качестве профилактических, лечебно-косметических, репеллентных
средств и контрацептивов;
— для применения в течение всей жизни длительными (более 15 дней)
повторными курсами;
— для использования без назначения врача среди широких слоев
населения;
— для применения в детской практике, а также для лечения
беременных женщин и в период лактации.
1.2. Кроме этого, критериями для изучения Л С на канцерогенность
могут служить:
— наличие клинико-эпидемиологических данных, указывающих на
канцерогенный риск при применении в лечебной практике аналогов;
— наличие цитостатических, алкилирующих, гормоноподобных, рост-
стимулирующих свойств;
- 123-

— данные о положительных реакциях в краткосрочных тестах на
мутагенность или способность к ковалентному связыванию с ДНК;
— наличие ограниченных сведений о канцерогенности ЛС или его
аналогов для экспериментальных животных в ранее проведенных
исследованиях.
1.3. ЛС, вопрос об испытании которых рассматривается в каждом
отдельном случае:
— предназначаемые для лечения злокачественных новообразований;
— применяемые однократно или краткосрочными неповторяющимися
курсами (до 14 дней).
1.4. Тестирование на канцерогенность не обязательно для Л С,
предлагаемых:
— для лечения заболеваний, представляющих непосредственную угрозу
для жизни;
— воспроизводимых зарубежных ЛС, если в литературе имеются
достаточно обоснованные сведения экспериментального и ретроспективного
характера, подтверждающие отсутствие канцерогенных свойств
соответствующего аналога.
2. Характеристика Л С
Физико-химические свойства исследуемого на канцерогенность ЛС и
состав готовых лекарственных форм должны соответствовать проектам
временных фармакопейных статей на индивидуальное фармакологическое
вещество и готовые лекарственные формы.
Оценке подлежит действующее вещество (вещества). Если
лекарственная форма содержит вспомогательные вещества (стабилизаторы,
растворители, наполнители и т. д.), не имеющие разрешения для применения в
медицинской практике, то каждое из них оценивается отдельно. Если ЛС
изучено на канцерогенность ранее, то при разработке новой
лекарственной формы или при изменении состава вспомогательных веществ уже
изученной лекарственной формы необходимо провести экспертизу новой
комбинации.
3. Экспериментальные животные
При планировании хронического эксперимента на животных
рекомендуется исходить из условий, обеспечивающих максимальное проявление
канцерогенных свойств испытуемого агента с использованием животных
обоего пола. Допустимы отклонения от этой схемы в зависимости от
способа применения ЛС в клинике и особенностей его фармако- и токсико-
кинетики в организме.
При тестировании на канцерогенность, как правило, используются
мыши и крысы. Это могут быть как инбредные, так и неинбредные
животные, характеризующиеся сравнительно низкой вариабельностью в частоте
спонтанных опухолей. Испытания рекомендуется начинать на молодых
(6—8 нед) животных или, при возможности, сразу после того, как они
отняты от матери. В исключительных случаях могут быть использованы
другие виды животных — хомячки, кролики, собаки, обезьяны. Но при этом
необходимо, чтобы одним из двух видов, на которых тестируются ЛС,
были крысы или мыши. Так, при оценке гормональных препаратов (напри-
- 124-

мер, контрацептивов) тестирование канцерогенности рекомендуется
проводить также на крупных животных — собаках или обезьянах. При этом
период наблюдения увеличивается до 7—10 лет. (В этом случае в
Фармакологический комитет каждые 2 года представляются этапные
промежуточные отчеты о состоянии подопытных животных.)
Условия содержания и рационы питания животных должны находиться
в соответствии с общепринятыми в нашей стране рекомендациями.
Контрольные и подопытные животные должны быть одного возраста,
получены одновременно из одного питомника. Наличие контрольных
групп является обязательным во всех случаях, в том числе при работе на
животных с хорошо известной онкологической характеристикой,
поскольку частота и спектр спонтанных опухолей могут с течением времени
меняться даже у высокоинбредных линий. В каждую подопытную группу
следует брать не менее 50 животных каждого пола. Таким образом, на
испытание одного вещества при одном пути введения и двух дозах требуется не
менее 600 животных (200 мышей и 200 крыс в подопытных группах и 200
животных в контроле).
4. Исследуемые дозы
Для изучения канцерогенности ЛС, как правило, используются две
дозы.
При выборе дозы ЛС исходят из предпосылки, что наиболее
выраженный канцерогенный эффект проявится при использовании максимально
переносимой дозы (МПД). В соответствии с международными
требованиями, МПД определяют как максимальную дозу, не приводящую к гибели
животного от токсического действия и вызывающую в субхроническом
эксперименте торможение нарастания массы тела не более чем на 10 % по
сравнению с контролем. Наряду с МПД необходимо использовать
терапевтическую дозу для человека. Для нетоксичных соединений целесообразно
изучить терапевтическую и 10-кратную терапевтическую дозы. Решение о
выборе дозы специально обосновывается в протоколе исследования.
Определение МПД проводится па каждом виде животных обоего пола, при
каждом методе введения.
Определение МПД включает два этапа. На первом этапе проводят
исследования токсичности вещества в остром опыте с целью определения
ЛД50 и ЛД16 по методу Литчфилда и Уилкоксона. За динамикой гибели
животных ведут наблюдение в течение 14 дней.
На втором этапе определяется МПД в субхроническом опыте. Этот
опыт желательно проводить на 6—8-недельных животных обоего пола (при
каждом методе введения и на каждом виде животных). В
экспериментальную группу входят минимум 3 самца и 3 самки одинаковой массы, 5 групп
подопытных животных получают тестируемый препарат в разных дозах,
6-я группа — контрольная. Максимальная доза находится на уровне ЛД16,
определенной в остром опыте. Следующие 4 группы получают более
низкие дозы, каждая из которых в 1,5 раза ниже предыдущей. В этом режиме
вещество вводят подопытным животным в течение 6—8 нед и затем 2 нед
наблюдают за их состоянием. Контрольным животным вводят
растворитель. Критериями токсического действия вещества в субхроническом
опыте являются гибель животных или торможение нарастания массы тела.
Поэтому при проведении опыта следует строго следить за стандартностью
корма животных, который должен быть таким же, как в планируемом хро-
- 125 -

ническом исследовании на канцерогенность. Взвешивание животных
проводят 1 раз в неделю.
Увеличивать МПД в ходе хронического опыта нельзя.
5. Продолжительность опыта
Испытуемое ЛС вводится мышам 18 мес, крысам 24 мес, выживаемость
должна составлять не менее 50 %. Забой животных возможен сразу после
последнего введения. Наблюдение за животными осуществляется до конца
опыта или до гибели животных.
6. Пути и методы введения
При изучении канцерогенности ЛС, как правило, используются два
пути введения.
Выбор метода введения ЛС зависит от его физико-химических свойств
(агрегатного состояния, растворимости), его фармакокинетики и способа
применения.
Желательно, чтобы метод введения ЛС в опытах на животных был
максимально приближен к используемому в клинике; в случае нескольких
способов применения ЛС в клинике тестирование проводится при
использовании не менее двух путей введения вещества. Во всех случаях
рекомендуется одним из путей введения использовать внутрижелудочный. В тех
случаях, когда ЛС используется только внутрижелудочно, достаточно
ограничиться одним путем введения.
6.1. Пероральный путь
Частота введения испытуемого вещества должна, по возможности, быть
согласована с частотой введения ЛС больным. Однако ежедневное введение,
за исключением введения с кормом или питьевой водой, трудновыполнимо.
Зондом целесообразно вводить вещество через день. Введение ЛС через
желудочный зонд позволяет проводить более точную его дозировку.
В качестве растворителя ЛС используют вещества, не оказывающие
раздражающего действия, такие как изотонический раствор натрия хлорида,
вода, пастеризованное оливковое или подсолнечное масло (необходимо
контролировать суточный рацион жиров). Если вещество не растворяется в
воде, то готовят взвеси в жидком крахмале, карбоксиметилцеллюлозе.
Объем вводимой жидкости не должен превышать для мышей 0,5 мл, для
крыс — 2 мл.
Зонд изготавливается из толстой иглы для инъекции. Острие иглы
срезается и ее конец сгибается под углом 30 градусов. Во избежание травмы
слизистой оболочки пищевода на отпиленный конец напаивается
небольшая олива.
6.2. Парентеральные пути введения
При парентеральном пути введения ЛС животным необходимо
подобрать щадящий режим. Частота введения при данном способе может зави-
- 126-

сеть от физико-химических свойств ЛС, а также опасности механических
повреждений. Оптимальным вариантом, очевидно, является введение 1—2
раза в неделю.
ЛС инъецируют в виде растворов и суспензии в воде, крахмале,
растительном масле, глицерине.
Объем жидкости при подкожном введении в опыте на крысах не
должен превышать 1,0 мл, на мышах — 0,2 мл.
При внутримышечном введении крысам вводят до 0,5 мл жидкости,
мышам — не более 0,2 мл. Внутрибрюшинно крысам можно вводить до 2 мл,
мышам — не более 0,5 мл.
6.3. Смазывание кожи
Одним из путей тестирования ЛС, применяемых в клинической
практике в виде аппликаций на кожу и слизистые оболочки, является смазывание
кожи. Для этих целей рекомендуется использовать мышей гибридов
первого поколения (С57В1 X СВА), а также С57В1, СВА. Возможно
использование и неинбредных мышей. Помимо мышей, эксперименты со
смазыванием кожи можно проводить и на кроликах. На крысах такие опыты
проводить не следует вследствие резистентности их кожи к индукции опухолей.
Смазывание кожи следует проводить 2—3 раза в неделю. Исследуемое
вещество наносится микропипеткой или пипеткой на кожу
межлопаточной области (кроликам — на кожу уха). Дозу вещества рассчитывают,
исходя из массы капли и числа капель в 1 мл раствора. Волосы на месте
нанесения предварительно выстригают. В ходе опыта по мере отрастания
шерсти проводится повторная стрижка.
6.4. Внутритрахеалъное и внутрибронхиальное введение
Данные способы можно использовать в случаях, когда ингаляция
является основным способом введения ЛС в организм человека. Опыты можно
проводить на крысах и хомячках. Спонтанные опухоли легких у крыс и
хомячков редки. Воспалительные заболевания легочной ткани крыс
способны затруднить проведение хронического эксперимента. При проведении
опытов на мышах (особенно линии А,ВА1В/С, С57В1) следует принимать
во внимание возможность появления спонтанных опухолей легких,
главным образом аденом, и учитывать их при оценке результатов опытов по
тестированию на канцерогенность. Инсталляцию ЛС в легкие можно
проводить в виде водных растворов, суспензий, твердых и жидких аэрозолей.
Во всех случаях необходима постановка соответствующих контрольных
экспериментов. Вещества следует вводить 1—2 раза в месяц по 0,2—0,5 мл
крысам и хомячкам, 0,05—0,1 мл — мышам. Использование
ингаляционных камер возможно только при систематическом объективном контроле
концентраций ЛС.
6.5. Трансплацентарный метод воздействия
Трансплацентарный метод воздействия ЛС можно использовать, если
препарат предполагается к применению для лечения беременных женщин.
Испытуемое вещество вводится беременным самкам, начиная со 2—15-го
- 127 -

дня беременности, введение продолжается кормящим самкам на
протяжении периода лактации.
7. Протоколы эксперимента
На каждое испытуемое ЛС заводится рабочая тетрадь, в которой
указываются фамилия экспериментатора, название лаборатории, учреждения и
подробные сведения о препарате. Регистрируются также данные о
животных и условиях их содержания, сведения о введении испытуемого
вещества, в том числе времени суток, и материалы наблюдения за животными.
Взвешивание проводят перед первым введением испытуемого вещества,
еженедельно в течение первого месяца, один раз в 2 нед в течение второго
месяца, затем ежемесячно и перед вскрытием. Все животные
(экспериментальные и контрольные) подвергаются ежедневному осмотру.
8. Вскрытие животных и гистологическое исследование
Все павшие или забитые животные должны подвергнуться патологоана-
томическому исследованию. Забой животных в ходе опыта производят
лишь в тех случаях, когда, по мнению экспериментаторов, подопытное
животное не проживет более одних суток. Следует предостеречь против
излишнего забоя животных, что может привести к искусственному
сокращению продолжительности эксперимента. На каждое павшее (забитое)
животное заводят протокол вскрытия.
Полное вскрытие включает взвешивание животных, тщательное
наружное исследование и оценку степени разложения. Все органы, независимо
от наличия в них видимых макроскопических изменений, фиксируются в
10 % растворе формалина. Для гистологического исследования берут
кусочки органов и опухолей. Парные органы на исследование берутся оба.
При подозрении на лейкоз (увеличенные печень, селезенка,
лимфатические узлы) на исследование берут костный мозг (бедренная кость).
Архивный материал (фиксированные органы, блоки, гистологические стекла)
должны храниться не менее 3 лет после представления отчета по
результатам испытания. Морфологическое изучение должно проводиться
специалистом-патологоанатомом, который обладает знаниями в области
патологии экспериментальных животных.
9. Оценка результатов исследования
Результаты гистологического исследования по всему опыту
суммируются в таблице, кроме того, составляются таблицы по выживаемости до забоя
и времени возникновения наружных опухолей и гибели животных с
опухолями внутренних органов. При необходимости составляются
дополнительные таблицы: например, количество опухолей кожи на одно животное при
накожном нанесении, количество аденом легких на одно животное и т. д.
Данные обрабатываются общепринятыми методами вариационной
статистики, с применением метода % , Стьюдента—Фишера, дозового тренда
и метода Пето для случайных и фатальных опухолей.
Вещество признается потенциально канцерогенным, если даже в одной
из подопытных групп имеется статистически значимое превышение часто-
- 128-

ты опухолей по сравнению с существующим контролем. При этом
необходимо учитывать общую частоту опухолей, процент опухолей по отдельным
локализациям, величину среднего латентного периода появления
(обнаружения) опухолей, множественность их (если животных не забивают),
среднюю продолжительность жизни животных с опухолями.
Результаты исследования, оформленные в виде научного отчета в
соответствии с действующим ГОСТом, направляются в Фармакологический
государственный комитет Минздрава России. Решение о возможности и
условиях использования ЛС в медицинской практике принимает ФГК.
Приложение 1. Протокол
Опыт
Группа,
серия
вскрытия
Вид, линия
Пол
№ клетки
ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ
Воздействия
Пала Дата смерти
Забита
День, месяц
200 _ г.
Данные вскрытия
Органы, взятые для гистологии
Опыта
Посмертные изменения —
№
животного
Возраст

Гистологический номер
Гистологические исследования
1. Опухоли
2. Прочие изменения
Приложение 2. Частота опухолей у мышей (крыс) при пероральном и подкожном
введении испытуемого вещества

Группа

Контроль
Опыт

Контроль
Опыт
Способ
введения
Перо-
ральный
Перо-
ральный

Подкожный

Подкожный
Пол
Самки
Самцы
Самки
Самцы
Самки
Самцы
Самки
Самцы

Эффективное
число

животных (а)
Число
животных с
опухолями
абс
%(б)

Количество
опухолей (в)
всего на
1
животное (б)
Животные с опухолями
легкие
абс
%
(б)
печень
абс
%
(б)

Прочих
органов
(г)
(Д)
(е)
5-762
129-

Примечание: (а) — число животных, переживших время обнаружения первой опухоли в
любой из групп при данном методе введения. Например, при пероральном введении первая
опухоль обнаружена в опытной группе через 10 мес после начала эксперимента. Эффективное
число животных в контрольной группе при этом пути введения также рассчитывается на этот
срок; (б) — по отношению к эффективному числу; (в) — количество гистологических типов
опухолей всех локализаций, т. е. сумма всех опухолей, указанная в последующих графах; (г),
(д), (е) и т. д. — указывается число животных с опухолями прочих органов, в примечании —
какие конкретно найдены опухоли. Например, 3(г) — аденома гардеровой железы, саркома
матки, рак клиторной железы.
Приложение 3. Выживаемость мышей (крыс) при пероральном и подкожном введении
препарата

Группа

Контроль
Опыт

Контроль
Опыт
Способ
введения
Перо-
ральный
Перо-
ральный

Подкожный

Подкожный

Исходное
число
животных
50
50
50
50
Пол
Самки
Самцы
Самки
Самцы
Самки
Самцы
Самки
Самцы
Число животных (павших/выживших) к концу
указанного срока
0-3
мес
2/48
4-6
мес
8/42
7-9
мес
10/40
10-12
мес
10/40
21-24
мес
43/7
25-28
мес
48/2
Приложение 4. Средняя продолжительность жизни мышей (крыс) при пероральном и
подкожном введении вещества (мес.)

Группа

Контроль
Опыт

Контроль
Опыт
Способ
введения
Перо-
ральный
Перо-
ральный

Подкожный

Подкожный
Пол
Самки
Самцы
Самки
Самцы
Самки
Самцы
Самки
Самцы
Средняя
продолжительность жизни
всех
животных
животных с
опухолями
Средняя продолжительность
жизни животных с опухолями

печени

легких

почек
кроветворн.
и др. тканей
Срок

наружения
первой
опухоли

Методические указания по оценке канцерогенности
фармакологических средств и вспомогательных веществ
в краткосрочных тестах
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н., проф. Г. А. Белицкий;
д. б. н., проф. Ю. А. Ревазова; к. б. н. С. К. Аби-
лев; д. м. н., проф. Е. В. Арзамасцев; к. м. н.
О. Л. Верстакова; член-корр. РАМН, проф.
Т. А. Гуськова; д. м. н., проф. А. Д. Дурнев;
д. м. н., проф. В. С Журков; к. б. н. Ф. И
Мигель; д. м. н. А. Д. Куничан; к. б. н. И. В. Мизги-
рев; к. м. н. Л. П. Сычева; к. б. н. Т. Б. Танир-
бергенов; д. м. н., д. б. н., проф. В. В. Худолей;
к. м. н. В. В. Юрченко
1. Введение
Краткосрочное тестирование на канцерогенность следует применять в
системе доклинического изучения безопасности оригинальных
фармакологических средств (ФС) и вспомогательных веществ.
Вопрос о возможности перехода к клиническим испытаниям ФС с
точки зрения его канцерогенной безопасности может решаться на основании
краткосрочных скрининговых тестов (КСТ), а не после получения
результатов 2—3-летних экспериментов по индукции опухолей у животных,
которые в случае недостаточной эффективности ФС в клинике могут оказаться
ненужными.
При отрицательных результатах в КСТ дополнительная оценка
потенциальной канцерогенности на млекопитающих необходима для лекарств
длительного (более 1 мес) применения и лекарств безрецептурного
отпуска. Новые фиксированные комбинации фармакологических средств,
планируемые для широкого клинического применения, при структурном
сходстве любого из компонентов комбинации с известными
канцерогенами, мутагенами или их метаболитами также подвергаются испытанию на
млекопитающих.
Настоящие методические рекомендации имеют целью конкретизировать
понятие "скрининговые экспресс-методы", тактику их использования и
критерии получаемых результатов.
2. Общие положения
КСТ для выявления потенциальной канцерогенности основаны на
современных данных о механизмах химического канцерогенеза [Белицкий
Г. А., Худолей В.В., 1986; Белицкий Г. А. и др., 1987; Pienta R. G., 1979].
Полный объем понятия "канцерогенные соединения" включает в себя все
вещества, способные увеличивать в популяции количество опухолей
различных локализаций по сравнению с соответствующим контролем. Сюда
входят не только полные канцерогены, способные вызывать опухоли без
дополнительных воздействий, но также инициирующие агенты, промоторы
и коканцерогены. Процесс химического канцерогенеза в настоящее время
условно подразделяют на две стадии: инициацию и промоцию. На первой
5*
- 131 -

в генетическом аппарате клетки возникают стойкие изменения; на второй,
в основном за счет эпигенетических эффектов, создаются условия для
преимущественной пролиферации трансформированных клеток. На стадии
инициации наиболее существенным событием является повреждение ДНК
высокореактивными метаболитами канцерогенов, которое приводит к
возникновению точковых мутаций, перестановке блоков генов и т. д.
Предполагается, что в тех случаях, когда эти события затрагивают протоонкоген-
ные участки, последние могут активироваться и инициировать
злокачественную трансформацию клетки. К такому же результату приводит и
инактивация генов-супрессоров (антионкогенов). Высокая вероятность
причинной связи между мутагенезом и канцерогенезом, а также высокая
частота совпадения канцерогенных и мутагенных свойств среди различных
химических соединений привели к созданию многочисленных тестов, в
которых показателем предполагаемой бластомогенной активности служит
способность вызывать генные и хромосомные мутации.
Промоторы в биологически активных концентрациях не повреждают
ДНК, а оказывают плейотропное действие на клетки, изменяя, в
частности, структуру и функции клеточных мембран, нарушая проницаемость
межклеточных контактов. Соответственно, КСТ для выявления
промоторов предназначены для выявления этих особенностей.
Одним из интегральных показателей канцерогенной активности агента
может служить его способность озлокачествлять клетки в культуре, что
используется в ряде КСТ.
Для литературного поиска и анализа структурного сходства
используется, во-первых, представительная база данных о мутагенных и
канцерогенных свойствах широкого круга химических соединений, и, во-вторых,
специальные компьютерные программы [Ashby J., 1994; Klopman G., Rozenk-
ranz H. C, 1994]. Для анализа взаимосвязи между мутагенной активностью
и химической структурой можно использовать программы CASE [Klopman
G., 1984], MULTICASE [Klopman G., 1992] и ЭММА [Баскин И. И. и др.,
1993].
Настоящие методические рекомендации должны быть пересмотрены
через определенное время и модифицированы в соответствии с прогрессом
наших знаний о молекулярных механизмах химического канцерогенеза.
3. Принципы формирования батарей КСТ и минимальная батарея КСТ
Большинство КСТ моделирует отдельные стадии канцерогенеза,
поэтому наиболее успешным является их использование в виде батарей, т. е.
набора тестов. Подобные батареи должны отвечать ряду требований. КСТ,
включаемые в одну батарею, должны быть взаимодополняющими, т. е.
отличаться или по конечному эффекту (повреждение ДНК, генные мутации,
хромосомные аберрации, неопластическая трансформация, нарушение
метаболической кооперации и др.), или по уровню биологической
организации объекта исследования (прокариоты, эукариоты, системы in vitro, in
vivo). При этом последовательность испытаний предполагает движение от
простых к сложным и от кратких экспериментов к более длительным.
Отбираемые в батарею тесты должны быть надежно верифицированы на
соединениях с известной канцерогенной активностью. По степени
верификации различают рутинные "укоренившиеся" тесты, на которых было
испытано не менее 1000 соединений, "развитые" — не менее 100 и
"развивающиеся" — до 100. Эти тесты, при приемлемой стоимости и достаточной
- 132-

разработанности, должны быть высокочувствительными, специфичными и
обладать большой пропускной способностью.
Для выявления одних и тех же эффектов существует ряд равноценных
методов, которые могут взаимозаменяться. В ряде случаев, в зависимости
от особенностей тестируемого соединения, одним методам следует
отдавать предпочтение перед другими. Таким образом, батарея КСТ не
является жестко фиксированной. Действующим началом большинства известных
канцерогенов являются высокоактивные метаболиты, поэтому
необходимым компонентом ряда КСТ является система адекватной метаболической
активации испытуемых препаратов.
Исходя из приведенных соображений и реально освоенных методов, в
настоящее время представляется приемлемой следующая минимальная
батарея КСТ:
A. Тесты на выявление генных мутаций.
— Тест Эймса Salmonella/микросомы с использованием экзогенной
активации препаратов фракцией S9 печени крыс.
— Равнозначными тестами являются: индукция рецессивных,
сцепленных с полом, летальных мутаций или индукция соматических мутаций на
дрозофиле.
Б. Цитогенетические тесты.
— Индукция хромосомных аберраций или микроядер в клетках
костного мозга млекопитающих in vivo.
B. Тесты на повреждения ДНК.
— Репарационный тест на Е. coli или индукция SOS-ответа
бактериальной клетки, индукция внепланового синтеза ДНК в клетках
млекопитающих или выявление повреждений ДНК методом флюорометрии или
щелочной элюции.
Г. Тесты на промоторную активность.
— ГФРТ-тест на нарушение метаболической кооперации в смешанной
культуре соматических клеток млекопитающих.
Д. Прямые экспресс-тесты, регистрирующие опухолеобразующий
потенциал тестируемых веществ.
— Тест на трансформацию клеток в культуре или индукцию опухолей у
гидробионтов.
4. Правила продвижения исследуемых веществ по батарее КСТ
и интерпретация результатов испытаний
Результаты испытания препарата в батарее КСТ позволяют сделать
заключение о наличии или отсутствии канцерогенных свойств. Это
заключение носит вероятностный характер, в сущности, так же, как и
предсказание канцерогенной опасности вещества для человека на основании
экспериментов по индукции опухолей у животных.
При оценке результатов тестирования исходят из того, что
положительный эффект имеет преимущество перед отрицательным, а данные,
полученные в экспериментах in vivo, более весомы, чем аналогичные,
полученные in vitro. Согласно этому правилу, интегральный положительный
результат системы КСТ с гораздо большей степенью вероятности
свидетельствует о потенциальной канцерогенной опасности препарата, чем общий
отрицательный результат — о ее полном отсутствии.
С точки зрения прогноза канцерогенное™ существенное значение
имеют результаты, полученные в системе мутагенной оценки при учете генных
- 133 -

Таблица 1.
№

рианта
1
2
3
4
Положительные (+) и отрицательные (—) ответы при использовании методов учета
генных мутаций на бактериях или
дрозофиле
+ + 1 1
хромосомных аберраций в клетках
костного мозга мышей
1 + 1 +
Таблица 2.
№
варианта
1
2
3
4
5
6
Положительные (+) и отрицательные (—) ответы при использовании методов учета
генных мутаций
+
+
-
-
-
—
хромосомных аберраций
-
-
+
+
-
—
повреждений ДНК
+
-
+
-
+
—
мутаций (на бактериях и дрозофиле) и/или хромосомных аберраций (в
клетках костного мозга мышей).
При этом могут встречаться 4 варианта сочетаний результатов (табл. 1).
В случае варианта 1 делается заключение о канцерогенной опасности и
препарат не подвергается дальнейшим испытаниям. В остальных трех
случаях ставятся уточняющие эксперименты: репарационный тест на Е. coli
или индукция SOS-ответа у бактерий, а также регистрация внепланового
синтеза ДНК в культуре клеток млекопитающих или повреждений ДНК с
помощью щелочной элюции.
С учетом результатов I этапа испытаний могут получиться следующие
варианты сочетаний ответов (табл. 2).
В случае вариантов 1, 3 и 6 дальнейшие испытания прекращаются. В
случаях 1 и 3 делается заключение о наличии, а в случае 6 — об отсутствии
канцерогенной опасности. Для отдельных групп препаратов (например,
гормонов), несмотря на отрицательные ответы во всех трех группах
использованных тестов (вариант 6), может оказаться необходимым применение одного
из прямых экспресс-тестов на опухолеобразование: трансформацию клеток в
культуре или индукцию опухолей у гидробионтов.
В случаях 2, 4 и 5 переходят к следующему этапу испытаний. Стратегия
работы на этом этапе связана с подтверждением или отрицанием
способности исследуемого препарата индуцировать определенный тип
генетических эффектов.
В случае варианта 2 (см. табл. 2) проводится дополнительный учет
генных мутаций с помощью альтернативного метода, способного
зарегистрировать этот тип эффектов. Если на первом этапе был использован,
например, учет генных мутаций на бактериях, на данном (третьем) этапе работы
применяются методы тестирования генных мутаций на дрозофиле или в
культуре соматических клеток млекопитающих и наоборот.
В случае варианта 4 (см. табл. 2) эффект, полученный путем индукции
- 134-

перестроек хромосом или наличию микроядер в клетках костного мозга
мышей, проверяется на клетках костного мозга крыс.
В случае варианта 5 (см. табл. 2), эффект, полученный с
использованием бактерий (репарационный тест на Е. coli или индукция SOS-ответа),
проверяется с помощью методов учета повреждений ДНК в культуре
млекопитающих (индукция внепланового синтеза ДНК или учет повреждений
ДНК с помощью щелочной элюции).
При получении на данном этапе работы положительного результата в
вариантах 2, 4 и 5 делается заключение о возможности наличия у
исследуемого агента канцерогенной активности, связанной с индукцией
определенного типа генетических эффектов. При получении отрицательного ответа
переходят к заключительному этапу испытаний, связанному с
использованием одного из прямых экспресс-тестов определения канцерогенной
активности: учет опухолевой трансформации клеток в культуре или
индукции опухолей у гидробионтов. Заключение об отсутствии или наличии
канцерогенной активности у исследуемого вещества делается на основании
соответственно отрицательного или положительного ответа, полученного в
одном из этих методов.
Испытания на промоторную активность проводятся не всегда. Они
обязательны лишь в случае, если лекарственный препарат предназначен для кон-
тингентов, ранее экспонированных к инициирующим злокачественный рост
воздействиям: ионизирующей радиации, противоопухолевой терапии,
лечению пуваленом в комбинации с УФ-облучением по поводу псориаза и др.
5. Заключение
Работу по использованию КСТ, так же как и экспертную оценку
результатов, должны проводить специалисты, имеющие достаточные
профессиональные навыки по применению методов, составляющих систему
тестирования.
6. Краткосрочные скрининговые тесты для прогноза канцерогенности
фармакологических препаратов и вспомогательных средств
6.1. Мутационный тест на Salmonella typhimurium (тест Эймса)
6.1.1. Термины и определения
Мутационный тест на Salmonella typhimurium является бактериальной
тест-системой для учета мутаций к прототрофности по гистидину при
действии химических соединений и/или их метаболитов, индуцирующих
мутации типа замены оснований или сдвига рамки считывания в геноме
этого организма. В данном тесте эти мутации могут происходить или в сайте
исходной мутации, или в другом сайте хромосомы.
6.1.2. Цель исследования и принцип метода
Данный метод предназначен для выявления способности
фармакологических веществ или их метаболитов индуцировать генные мутации у
индикаторных штаммов Salmonella typhimurium.
- 135-

Фармакологические средства с выраженной антибактериальной
активностью изучать в тесте Эймса нецелесообразно.
Бактерии обрабатываются тестируемым соединением с системой
метаболической активации или без метаболической активации. После
инкубации в течение определенного периода времени подсчитывается
количество ревертантных колоний у разных тестерных штаммов в сравнении
с количеством спонтанных ревертантов в вариантах негативного
контроля (необработанные культуры или культуры, обработанные
растворителем).
Если тестируемое соединение и/или его метаболиты обладают
мутагенной активностью, то они будут индуцировать обратные мутации от ауксо-
трофности к прототрофности по гистидину у гистидин-зависимых
штаммов Salmonella typhimurium [Методы первичного выявления генетической
активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем
(методические указания), 1985; Maron D. М., Ames B. N., 1983].
6.1.3. Процедура тестирования
6.1.3.1. Бактерии
В качестве тестерных организмов используются штаммы Salmonella
typhimurium. Минимальный набор состоит из штаммов ТА97, ТА98 и ТА100.
При необходимости могут использоваться и другие штаммы.
Каждый штамм должен быть проверен на ауксотрофность по
гистидину, чувствительность к кристаллическому фиолетовому и устойчивость к
ампициллину. Тестерные штаммы должны иметь уровень спонтанных
ревертантов в пределах ожидаемого на основании литературных данных.
6.1.3.2. Метаболическая активация
В качестве экзогенной метаболической активации используется
фракция S9 печени крыс, предобработанных соволом (300 мг/кг, однократно,
внутрибрюшинно, за 5 сут до забоя) [Белицкий Г. А. и др., 1987].
6.1.3.3. Изучаемые дозы
Максимальная доза тестируемого соединения определяется его
токсичностью и растворимостью. Токсичность тестируемого соединения
может изменяться при использовании экзогенной метаболической
активации. Для нетоксичных хорошо растворимых соединений максимальная
доза может быть в пределах 1000—5000 мкг на чашку. Для тестируемых
соединений с бактерицидной активностью максимальная доза должна
подавлять рост бактерий не более чем на 50 %, что определяется либо по
уменьшению количества спонтанных ревертантов, либо по подавлению
роста бактериального газона. В любом случае должно проверяться не
менее 5 различных доз тестируемого соединения, различающихся,
например, в 10 раз.
- 136-

6.1.3.4. Контроли
В каждом эксперименте обязательны одновременно проводимые
негативный (необработанный или растворитель) и позитивный контроли.
В качестве растворителя используются дистиллированная вода или ди-
метилсульфоксид, а при необходимости и другие растворители.
Позитивные контроли должны быть специфичны для каждого тестерно-
го штамма. Позитивный контроль для вариантов с метаболической
активацией должен соответствовать типу используемой системы экзогенной
метаболической активации.
6.1.3.5. Проведение эксперимента
Необходимые для проведения эксперимента оборудование, посуда,
реактивы, питательные среды и растворы, проведение работ по получению
фракции S9, а также регламент работы с бактериальными культурами
описаны в литературе.
Опыт параллельно ведут с использованием микросомальной
активирующей смеси и без нее для регистрации действия как прямых мутагенов, так
и непрямых, активность которых связана с образованием мутагенных
метаболитов, учитываемых при работе с микросомальной фракцией.
В контрольных вариантах опыта вместо испытуемого образца вносят
соответствующий объем растворителя.
6.1.4. Данные и их представление
6.1.4.1. Обработка результатов
Данные должны быть представлены в виде количества ревертантных
колоний на чашку. Как для тестируемого соединения, так и для позитивных
и негативных контролей указывается количество колоний в каждой чашке,
среднее количество ревертантных колоний на чашку и стандартное
отклонение. Если ни в одном из вариантов на данном штамме (штаммах) не
получено статистически значимых результатов, эксперимент прекращают. В
случае обнаружения позитивного результата опыт повторяют с целью
подтверждения эффекта, причем работу ведут только на том штамме
(штаммах), на котором был выявлен эффект. Если максимальный эффект
зарегистрирован на одной из промежуточных доз (такая ситуация возможна
при работе с фармакологическими средствами, обладающими
бактерицидными свойствами), прибегают к дроблению доз. При этом за среднюю
точку на шкале доз испытуемого вещества принимают дозу, на которой был
выявлен максимальный эффект. В опыт вводят еще 4 варианта: дозы в 2 и
5 раз меньше и больше средней дозы.
Если при проведении повторного опыта эффект не обнаруживается,
проводится еще один дополнительный опыт, результат которого
сравнивают с первыми двумя экспериментами. Заключение о наличии или
отсутствии мутагенной активности испытуемого соединения делают на основании
двух опытов с совпадающими результатами.
Для оценки результатов тестирования могут использоваться
соответствующие статистические методы, например метод попарных сравнений Дан-
нета [Статистическая обработка данных тестирования на мутагенность, 1989].
- 137-

6.1.4.2. Оценка результатов
Критериями позитивного результата являются или статистически
достоверное зависимое от дозы увеличение количества ревертантов, или
воспроизводимый и статистически достоверный позитивный ответ по крайней
мере для одной экспериментальной точки.
Тестируемое соединение, не вызывающее статистически достоверного
зависимого от дозы увеличения количества ревертантов или
воспроизводимого и статистически достоверного позитивного ответа для какой-либо
экспериментальной точки, рассматривается как немутагенное в данном
тесте.
Отчет должен включать следующую информацию:
— бактерии: использованные штаммы;
— условия проведения теста: уровни доз и обоснование выбора доз,
количество чашек на экспериментальную точку, токсичность, состав среды,
тип и состав системы метаболической активации, методика обработки,
позитивные и негативные контроли;
— индивидуальные результаты для каждой культуры;
— среднее количество ревертантных колоний на чашку;
— стандартное отклонение;
— отношения доза—эффект, где возможно.
6.1.4.2. Интерпретация результатов
Позитивные результаты в этом тесте указывают на то, что тестируемое
соединение индуцирует генные мутации типа замены пар оснований или
сдвига рамки считывания у данного микроорганизма. Негативные
результаты в этом тесте указывают на то, что в данных условиях тестируемое
соединение не мутагенно для использованных штаммов Salmonella typhimuri-
um.
6.1.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки мутагенной активности
вещества в тесте по учету генных мутаций у бактерий
Название эксперимента:
Тестерные микроорганизмы:
вид штаммы
Вещество:
название
формула, физико-химические свойства
откуда получено
растворитель
позитивный контроль
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:
дата проведения (начало, окончание, отдельные эксперименты)
способ обработки дозы
количество повторностей, количество чашек на дозу
система метаболической активации
Полученные результаты:
- 138 -

Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
6.2. Учет рецессивных, сцепленных с полом, летальных мутаций
у дрозофилы
6.2.1. Термины и определения
Летальная мутация — изменение в геноме, проявление которого
приводит к смерти его носителя.
Рецессивная мутация — изменение в геноме, которое проявляется в
условиях гомозиготности или гемизиготности.
Сцепленные с полом гены присутствуют в половых (X или Y)
хромосомах. Обсуждаемый метод определяет мутационные события в
Х-хромосоме.
6.2.2. Цель исследования и принцип метода
С помощью данного метода проводят оценку способности испытуемого
вещества и продуктов его метаболизма индуцировать генные мутации в
зародышевых клетках дрозофилы.
Рекомендуемый метод, называемый Меллер-5, основан на индукции
исследуемыми лекарствами рецессивных летальных мутаций в
Х-хромосоме самцов дикого типа линии D-32. Эти мутации передаются через самок
F, самцам второго поколения, не доживающим до стадии имаго.
6.2.3. Процедура тестирования
Биология, морфология, разведение дрозофилы, а также инструменты
для работы с ней и приготовление питательных сред подробно описаны в
соответствующих руководствах [1].
6.2.3.1. Используемые линии дрозофилы
Для опытов по учету рецессивных, сцепленных с полом летальных
мутаций (РСПЛМ) требуется линия дикого типа с хорошо изученным
спонтанным фоном мутабельности, например Canton-S или D-32, а в качестве
тестерной линии лучше всего использовать линию BASC. В Х-хромосоме
мух этой линии имеются 2 инверсии sc8 и d49, которые полностью
исключают возможность кроссинговера между половыми хромосомами, но не
нарушают жизнеспособности дрозофилы [Медведев Н. Н., 1968]. Феноти-
пическими маркерами служат мутации Apricot — абрикосовые глаза и Ваг —
полосковидные глаза. В подобного рода экспериментах можно
использовать и другие тестерные линии.
- 139-

6.2.3.2. Пути введения и выбор доз
Обычно используют два основных способа введения испытуемых
фармакологических средств в организм дрозофилы: ингаляционный и пер-
оральный (с пищей). Чаще всего используют последний, при введении
соединения в корм. В этом случае целесообразно использовать
стеклянные пористые фильтры, погруженные в бюксы с веществами,
растворенными в 1—5 % сахарном сиропе в исследуемых концентрациях. Если
препарат нерастворим в воде, можно (при обязательном применении
соответствующих контролей с растворителями) растворить его в этиловом
спирте или диметилсульфоксиде так, чтобы конечная концентрация этих
растворителей в сахарном корме не превышала 2 %. Допускается
внесение фармакологических средств непосредственно в корм.
Ингаляционные затравки осуществляются в эксикаторах. Расчет доз при
ингаляционном введении производят на объем эксикатора, а при пероральном — на
объем корма.
В зависимости от токсичности фармакологического средства
длительность экспозиции может колебаться от нескольких часов до нескольких
дней (обычно экспозиция составляет 48—72 ч). Комбинация различных
концентраций и экспозиций позволяет ориентировочно определять
количество ("дозу") фармакологического средства, вызывающую примерно
50 %-ную стерильность самцов. Эту "дозу" принимают за максимальную,
которую используют в эксперименте. Снижение "дозы" необходимо только
в случае испытаний фармакологических средств, обладающих выраженным
стерилизующим эффектом.
6.2.3.3. Проведение эксперимента
После обработки изучаемым фармакологическим средством самцов
линии D-32 скрещивают с виргинными самками тестерной линии BASC
(5 самцов х Ю самок). После начала вылета мух первого поколения (FJ
отбирают виргинных гетерозиготных самок и индивидуально
скрещивают их с самцами Fj.
После вылета второго поколения (F2) каждая культура просматривается
визуально с целью обнаружения таких, в которых отсутствуют самцы
дикого фенотипа (с красными глазами). Общее количество культуральных
пробирок определяет число проанализированных Х-хромосом самцов,
подвергшихся действию изучаемых соединений. Пробирки, в которых
отсутствуют самцы дикого типа, отмечают как "рецессивные летальные мутации".
Постановка контролей обязательна [Руководство по краткосрочным тестам
для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ, 1989].
6.2.4. Данные и их представление
Результаты опытов представляют в виде таблицы (табл. 3).
Частоту рецессивных летальных мутаций оценивают как отношение
числа культур второго поколения без самцов дикого фенотипа к общему
числу культур. Всего необходимо поставить не менее 1000 культур F2 на
одну экспериментальную точку.
Для оценки значимости превышения частоты рецессивных летальных
мутаций в опыте над контролем следует применять точный критерий Фи-
- 140-

Таблица 3. Учет рецессивных, сцепленных с полом, летальных мутаций на дрозофиле
Препарат

Концентрация
Экспозиция
Число
изученных
культур в F2
Число не-
фертиль-
ных
самцов F2
Рецессивные сцепленные
с полом летальные
мутации
количество
%±т
Уровень
значимости
шера для таблиц сопряженности 2x2. Различия между опытом и
контролем считаются значимыми при р < 0,01 [Статистическая обработка данных
тестирования на мутагенность, 1989].
6.2.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки мутагенной активности
вещества в тесте на индукцию рецессивных, сцепленных с полом, летальных
мутаций у дрозофилы
Название эксперимента:
Линии дрозофилы:
Вещество:
название
формула, физико-химические свойства
производитель
растворитель
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:
дата проведения
способ обработки концентрации
длительность обработки
группы
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
6.3. Учет соматической рекомбинации (мозаицизма) у дрозофилы
6.3.1. Термины и определения
Под соматической рекомбинацией понимают обмен генетическим
материалом между гомологичными хромосомами соматических клеток в
митозе, приводящий к образованию мозаичных особей. При использовании в
качестве маркеров рецессивных генов возможно выявление генных
мутаций, делеций, митотических рекомбинаций и генных конверсии.
- 141 -

6.3.2. Цель исследования и принцип метода
Целью данного метода является интегральное выявление рекомбинаци-
онных и других мутационных событий, индуцируемых фармакологическим
средством или его метаболитами в соматических клетках личинок
дрозофилы. В основе метода лежит учет мозаичных пятен, возникающих у мух
тестерных линий в результате комплексного нарушения генотипа: митоти-
ческой рекомбинации, потери хромосом и/или их фрагментов,
транслокаций, делеций и генных мутаций. В качестве маркеров возможно
использование генов "у" и "sn3" в транс-положении [4].
6.3.3. Процедура тестирования
Биология, морфология, разведение дрозофилы, а также инструменты
для работы с ней и приготовление питательных сред подробно описаны в
соответствующих руководствах [7].
6.3.3.1. Используемые линии дрозофилы
Для учета соматического мозаицизма в данной тест-системе необходимо
поддержание следующих тестерных линий дрозофилы:
линия 1 — yellow — генотип у/у (у — рецессивный ген,
обусловливающий развитие желтой окраски тела и щетинок);
линия 2 — w, sn3 — генотип w sn3/Y (w — white — белая окраска глаз,
sn3— singed3— извитая скрученная форма щетинок; оба гена рецессивные).
Спонтанный уровень мутаций и рекомбинаций невысок и колеблется у
разных линий в пределах от 0,3 до 1,1 %.
6.3.3.2. Пути введения и выбор доз
Обычно используют один из двух способов введения испытуемых
фармакологических средств в организм дрозофилы: ингаляционный или пер-
оральный (с кормом). Если препарат нерастворим в воде, можно (при
обязательной постановке соответствующих контролей) растворить его в
этиловом спирте или диметилсульфоксиде так, чтобы конечная концентрация
этих растворителей в испытуемом растворе составляла 2 %. В любом
случае в культуру с кормом вносят 200 мкл тестируемого раствора. Возможно
распыление нерастворимых в воде соединений по поверхности
питательной среды. Ингаляционные затравки осуществляются в эксикаторах, в
этом случае расчет доз производят на объем эксикатора.
Токсичность фармакологических средств устанавливают по
выживаемости самок F1? которая на максимальной из использованных
концентраций не должна быть меньше 50 %. Всего в эксперименте определяют
эффект 3 различных концентраций фармакологического средства. В
зависимости от токсичности фармакологического средства длительность
экспозиции может колебаться от нескольких часов до нескольких дней (обычно
экспозиция составляет 48—72 ч).
- 142-

6.3.3.3. Проведение экспериментов
Виргинных самок в количестве 10 особей помещают в пробирку,
содержащую стандартную питательную среду, вместе с 5 самцами. Через 48—
72 ч родителей пересаживают в пробирки со свежей питательной средой, а
в прежние пробирки вносят растворы испытуемых фармакологических
средств.
Просмотр вылетевших особей начинают с 9—10-го дня после начала
эксперимента и продолжают до начала вылета следующего поколения.
Просмотр проводят под бинокулярным стереоскопическим микроскопом в
отраженном свете.
При скрещивании самок линии 1 с самцами линии 2 у гетерозиготных
самок первого поколения, имеющих генотип у + +/+ w sn3, регистрируют
мутантные щетинки (макрохеты на голове, тораксе и скутеллюме)
фенотипа yellow или singed. В протоколе регистрируют общее число
просмотренных самок, число самок с одиночными (у, sn) и двойными (у sn) пятнами
[4].
6.3.4. Данные и их представление
Результаты экспериментов представляют в виде таблицы (табл. 4).
Таблица 4. Учет соматического мозаицизма при использовании маркеров "у" и "w sn3"
Препарат


ция/Экспозиция
Общее
число

смотренных самок
Число самок с мутациями
пятен "sn"
пятен "у"
пятен "у sn"
всего пятен
% ±т'
'т= 1/N, где N — число просмотренных особей.
Статистическую обработку результатов проводят с использованием %2-
критерия, сравнивая частоту появления особей с пятнами в контрольных и
опытных сериях [Статистическая обработка данных тестирования на
мутагенность, 1989].
6.3.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки мутагенной активности
вещества в тесте на индукцию соматического мозаицизма у дрозофилы
Название эксперимента:
Линии дрозофилы, условия скрещивания:
Возраст родителей на момент скрещивания:
Вещество:
название
формула, физико-химические свойства
производитель
растворитель
- 143-

Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:
дата проведения
способ обработки концентрации
максимальный возраст личинок на момент обработки
группы
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
6.4. Учет аберраций хромосом в клетках костного мозга млекопитающих
6.4.1. Термины и определения
Цитогенетическая активность — способность вещества вызывать
структурные и численные хромосомные нарушения в соматических и
зародышевых клетках.
Аберрации хромосомного типа — структурные нарушения на уровне
идентичных локусов обеих хроматид, выявляемые как парные фрагменты
или хромосомные обмены.
Аберрации хроматидного типа — структурные нарушения на уровне
одной хроматиды, выявляемые как одиночные фрагменты или хроматидные
обмены.
Ахроматические пробелы (гепы) — определяемые визуально нарушения
целостности окраски хроматиды, не превышающие по размеру ее ширины
и не сопровождающиеся сдвигом дистального участка относительно ее оси.
6.4.2. Цель исследования и принцип метода
Выявление и количественная оценка потенциальной цитогенетической
активности фармакологических средств в клетках костного мозга
млекопитающих.
В основе метода лежит регистрация видимых структурных нарушений
хромосом в клетках на стадии метафазы. Клетки костного мозга
характеризуются высоким уровнем митотическои активности, спонтанная частота
клеток с хромосомными повреждениями, включая гепы, составляет 1 —
2,5 % [6].
6.4.3. Процедура тестирования
6.4.3.1. Лабораторные животные
Эксперименты проводят на самцах и самках мелких лабораторных
грызунов. Предпочтительно использование генетически однородных
животных, не менее 5 особей в каждой контрольной и экспериментальной
группе.
Животные должны содержаться при 12-часовом световом режиме в
условиях свободного доступа к воде и пище.
- 144-

6.4.3.2. Проведение эксперимента
В первой серии испытуемый препарат в дозе, соответствующей
суточной терапевтической для человека, и в субтоксической дозе вводят
однократно только самцам с фиксацией клеточного материала через 24 ч после
введения.
Во второй серии испытуемый препарат в дозе, соответствующей
суточной терапевтической для человека, вводят самцам и самкам ежедневно на
протяжении 4—5 сут. Фиксацию клеточного материала осуществляют через
6 и/или 24 ч после последнего введения в зависимости от фармакокинети-
ческих особенностей испытуемого препарата [Руководство по
краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических
веществ, 1989].
6.4.3.3. Контроли
В качестве позитивных контролей целесообразно использовать цикло-
фосфамид в дозе 20 мг/кг при однократном внутрибрюшинном введении
или любой другой известный агент, заведомо обладающий цитогенетиче-
ской активностью.
Негативным контролем является используемый растворитель.
6.4.3.4. Приготовление цитогенетических препаратов
Методика выделения клеток костного мозга и приготовления
препаратов для цитогенетического анализа подробно описаны в соответствующих
руководствах и ранее опубликованных методических рекомендациях [6;
Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и
канцерогенных химических веществ, 1989]. Полученные препараты (два
стекла от каждого животного) шифруют и подвергают микроскопическому ци-
тогенетическому анализу.
6.4.3.5. Микроскопический анализ
Анализируют 100 метафаз от каждого животного. Анализу подвергаются
округлые метафазные пластинки без наложений хромосом с модальным
числом 40 — для мышей, 42 — для крыс. Учитывают число одиночных и
парных фрагментов, хроматидных и хромосомных обменов,
ахроматических пробелов (гепов) и разрывов по центромере, число клеток с
множественными повреждениями и клеток с полной деструкцией хромосом.
6.4.4. Оценка резул ыпатов
Оценку результатов цитогенетического анализа проводят путем
сопоставления долей клеток с хромосомными аберрациями в контрольной и
опытных сериях эксперимента. Сравнение долей клеток с гепами и
разрывами по центромере следует рассматривать в качестве дополнительных
критериев цитогенетической активности исследуемого препарата.
Статистическую обработку проводят согласно общепринятым рекомендациям
- 145-

[Статистическая обработка данных тестирования на мутагенность, 1989].
Результаты документируются согласно табл. 5.
Таблица 5. Результаты оценки цитогенетической активности вещества в тесте по учету
хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих
Условия

эксперимента
Мышь
№

Количество

следованных
клеток
Аберрации (количество)

одиночные

фрагменты
парные

фрагменты
обмены
Клетки с


ственными

аберрациями
(%)
Гепы.
К-во/
Клетки
(%)
Доля

врежденных
клеток
(%)
Доказательством цитогенетической активности исследуемого препарата
является статистически значимое превышение доли аберрантных клеток в
опыте по сравнению с негативным контролем.
6.4.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки цитогенетической активности
вещества в тесте по учету хромосомных аберраций в клетках костного мозга
млекопитающих
Название эксперимента:
Животные:
вид линия пол масса
питомник
дата получения
количество
Вещество:
название
формула, физико-химические свойства
откуда получено
растворитель
позитивный контроль
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:
дата проведения
путь введения дозы
длительность и кратность введения
группы
Методика приготовления препаратов:
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
- 146 -

6.5. Учет микроядер в клетках костного мозга млекопитающих
6.5.1. Термины и определения
Микроядра — небольшие ДНК-содержащие образования, состоящие из
ацентрических фрагментов хромосом или отставших на стадии ана-телофа-
зы хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра
дочерних клеток либо образовывать одиночные или множественные
микроядра в цитоплазме.
6.5.2. Цель исследования и принцип метода
Выявление и количественная оценка потенциальной цитогенетической
активности фармакологических средств в полихроматофильных
эритроцитах костного мозга млекопитающих.
Метод основан на микроскопической регистрации клеток с
микроядрами. Спонтанная частота клеток с микроядрами составляет 0,1—0,2 % [12].
6.5.3. Процедура тестирования
6.5.3.1. Лабораторные животные
Эксперименты проводят на самцах и самках мелких лабораторных
грызунов. Предпочтительно использование генетически однородных
животных, не менее 6 особей в каждой контрольной и экспериментальной
группе.
Животные должны содержаться при 12-часовом световом режиме в
условиях свободного доступа к воде и пище.
6.5.3.2. Проведение эксперимента
В первой серии испытуемый препарат в дозе, соответствующей
суточной терапевтической для человека, и в субтоксической дозе вводят
однократно только самцам с фиксацией клеточного материала через 24 ч после
введения.
Во второй серии испытуемый препарат в дозе, соответствующей
суточной терапевтической для человека, вводят самцам и самкам ежедневно на
протяжении 4—5 сут. Фиксацию клеточного материала осуществляют через
6 и/или 24 ч после последнего введения в зависимости от фармакокинети-
ческих особенностей испытуемого препарата [12, 14].
6.5.3.3. Контроли
Негативным контролем является используемый растворитель.
В качестве позитивных контролей целесообразно использовать цикло-
фосфамид в дозе 20 мг/кг при однократном внутрибрюшинном введении
или любой другой известный агент, заведомо обладающий
цитогенетической активностью.
- 147-

6.5.3.4. Приготовление цитогенетических препаратов
Методика выделения клеток и приготовления препаратов для цитогене-
тического анализа подробно описаны в соответствующих руководствах и
методических рекомендациях [Оценка мутагенной активности химических
веществ микроядерным методом, 1984; Руководство по краткосрочным
тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ,
1989]. Полученные препараты (два стекла от каждого животного) шифруют
и подвергают микроскопическому цитогенетическому анализу.
6.5.3.5. Микроскопический анализ
Анализируют 2000 полихроматофильных эритроцитов от каждого
животного, соотношение нормо- и полихроматофильных эритроцитов
определяют при подсчете 500 эритроцитов.
6.5.4. Оценка результатов
Критерием позитивного результата является воспроизводимое и
статистически значимое увеличение числа полихроматофильных эритроцитов
(ПХЭ) с микроядрами по крайней мере в одной из опытных групп по
сравнению с контрольной. Полученный положительный результат
свидетельствует, что вещество индуцирует хромосомные повреждения и/или
нарушения митотического аппарата клеток у экспериментальных животных.
Статистическую обработку проводят согласно общепринятым
рекомендациям [Статистическая обработка данных тестирования на мутагенность,
1989]. Результаты документируются согласно табл. 6.
Таблица 6. Результаты оценки цитогенетической активности вещества в тесте на
индукцию микроядер в клетках костного мозга млекопитающих
Группа
(вещество, доза)
№ мыши
Количество ПХЭ с микроядрами на
1000 ПХЭ
на каждую мышь
на группу в
целом
Доля ПХЭ от
всех эритроцитов
6.5.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки цитогенетической активности
вещества в тесте на индукцию микроядер в клетках костного мозга
млекопитающих
Название эксперимента:
Животные:
вид линия пол масса
питомник
дата получения
количество
- 148-

Вещество:
название
формула, физико-химические свойства
откуда получено
растворитель
позитивный контроль
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:
дата проведения
путь введения дозы
длительность и кратность введения
группы
Методика приготовления препаратов:
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
6.6. Репарационный тест на Escherichia coli
6.6.1. Термины и определения
Репарационный тест на Е. coli является бактериальной тест-системой
для учета дифференциальной выживаемости бактерий при действии
химических соединений и/или их метаболитов, индуцирующих в геноме этого
организма повреждения ДНК, репарируемые в ходе эксцизионной и пост-
репликативной репарации.
6.6.2. Цель исследования и принцип метода
Данный метод предназначен для выявления способности
фармакологических веществ и/или их метаболитов индуцировать повреждения ДНК у
индикаторных штаммов Е. coli.
Репарационный тест на Е. coli основан на регистрации
дифференциальной выживаемости бактерий дикого типа и мутантных бактерий,
дефектных по определенным этапам репарации ДНК. Бактерии обрабатываются
тестируемым соединением с системой метаболической активации или без
метаболической активации в жидкой среде. После инкубации в течение
определенного периода времени регистрируется наличие бактериального
роста у разных тестерных штаммов при одних и тех же концентрациях
тестируемого соединения.
При наличии у тестируемого соединения ДНК-повреждающего
действия бактериальный рост наблюдается только у штамма дикого типа.
6.6.3. Процедура тестирования
6.6.3.1. Бактерии
В качестве тестерных организмов используются штаммы Е. coli B/r WP2
(дикий тип по репарации ДНК), WP67 (polA) и СМ571 (гесА).
- 149-

6.6.3.2. Метаболическая активация
В качестве экзогенной метаболической активации используется
фракция S9 печени крыс, предобработанных соволом (300 мг/кг, однократно,
внутрибрюшинно, за 5 сут до забоя).
6.6.3.3. Изучаемые дозы (концентрации)
Максимальная концентрация тестируемого соединения определяется
его токсичностью и растворимостью. Токсичность тестируемого
соединения может изменяться при использовании экзогенной метаболической
активации. Для нетоксичных хорошо растворимых соединений
максимальная концентрация может быть в пределах 1000—5000 мкг/мл. Для
тестируемых соединений с бактерицидной активностью максимальная
концентрация должна подавлять рост и бактерий дикого типа, и мутантных
бактерий. В любом случае должно проверяться не менее 5 различных
концентраций тестируемого соединения, различающихся, например, в 10 раз. При
отсутствии эффекта рекомендуется повторить тест с использованием более
дробных концентраций.
6.6.3.4. Контроли
В каждом эксперименте обязательны одновременно проводимые
негативный (необработанный или растворитель) и позитивный контроли.
В качестве растворителя используется дистиллированная вода или, в
случае водонерастворимых соединений, диметилсульфоксид (конечная
концентрация в инкубационной смеси не должна быть более 2,5 %).
6.6.3.5. Проведение эксперимента
Необходимые для проведения эксперимента оборудование, посуда,
реактивы, питательные смеси и растворы, проведение работ по получению
фракции S9, а также регламент работы с бактериальными культурами
описаны в литературе [19, 23].
Опыт параллельно ведут с использованием микросомальной
активирующей смеси и без нее для регистрации действия как прямых мутагенов, так
и непрямых, активность которых связана с образованием мутагенных
метаболитов, учитываемых при работе с микросомальной фракцией.
В контрольных вариантах опыта вместо испытуемого образца вносят
соответствующий объем растворителя.
6.6.4. Данные и их представление
6.6.4.1. Обработка результатов
Наличие или отсутствие роста отмечается в таблице символами "+" или
- 150-

6.6.4.2. Оценка результатов
Производится визуально по мутности и изменению цвета индикатора.
Отчет должен включать следующую информацию:
— бактерии: использованные штаммы;
— условия проведения теста: уровни концентраций и обоснование
выбора концентраций, количество культур на экспериментальную точку,
состав среды, тип и состав системы метаболической активации, методика
обработки, позитивные и негативные контроли;
— индивидуальные результаты для каждой культуры;
— среднее значение определений на экспериментальную точку;
— стандартное отклонение;
— отношения доза—эффект, где возможно.
6.6.4.2. Интерпретация результатов
Позитивные результаты в этом тесте указывают на то, что тестируемое
соединение индуцирует повреждения ДНК у данного микроорганизма.
Негативные результаты в этом тесте указывают на то, что в данных условиях
тестируемое соединение не индуцирует повреждения ДНК у Е. coli.
6.6.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки генотоксической активности
вещества в репарационном тесте у бактерий
Название эксперимента:
Тестерные микроорганизмы:
вид штаммы
Вещество:
название
формула, физико-химические свойства
откуда получено
растворитель
позитивный контроль
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:
дата проведения (начало, окончание, отдельные эксперименты)
способ обработки дозы
количество повторностей, количество культур на дозу
система метаболической активации
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
- 151 -

6.7. SOS-хромотест на Escherichia coli
6.7.1. Термины и определения
SOS-хромотест на Е. coli является бактериальной тест-системой для
учета индукции SOS-функций при действии химических соединений и/или
их метаболитов, вызывающих нарушения репликации и/или повреждения
ДНК в геноме этого организма.
6.7.2. Цель исследования и принцип метода
Данный метод предназначен для выявления способности
фармакологических веществ и/или их метаболитов индуцировать SOS-функции у
индикаторных штаммов Е. coli [Quillardet P. et al., 1982].
В SOS-хромотесте используют штамм Е. coli PQ37, в геноме которого
ген lacZ (структурный ген фермента р-галактозидазы) находится под
контролем промотора гена sfiA, определяющего одну из SOS-функций клетки
и контролируемого генеральным репрессором SOS-системы. Экспрессия
гена sfiA индуцируется после повреждения ДНК или остановке
репликации как часть SOS-ответа клетки Е. coli. SOS-экспрессия
колориметрически определяется по активности р-галактозидазы.
6.7.3. Процедура тестирования
6.7.3.1. Бактерии
В качестве тестерных организмов используется штамм Е. coli PQ37.
Возможно использование других штаммов.
6.7.3.2. Метаболическая активация
В качестве экзогенной метаболической активации используется
фракция S9 печени крыс, предобработанных Арохлором 1254 или соволом
(300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно, за 5 сут до забоя).
6.7.3.3. Изучаемые концентрации
Максимальная концентрация тестируемого соединения определяется
его токсичностью и растворимостью. Токсичность тестируемого
соединения может изменяться при использовании экзогенной метаболической
активации. Для нетоксичных хорошо растворимых соединений
максимальная концентрация может быть в пределах 1000—5000 мкг/мл. Для
тестируемых соединений с бактерицидной активностью максимальная
концентрация должна подавлять рост бактерий не более чем на 50 %. В любом
случае должно проверяться не менее 10 различных концентраций
тестируемого соединения, различающихся, например, в 2 раза.
- 152-

6.7.3.4. Контроли
В каждом эксперименте обязательны одновременно проводимые
негативный (необработанный или растворитель) и позитивный контроли на
•штамм (например, 4-нитрохинолин-1-оксид) и систему метаболической
активации (например, 2-аминоантрацен). В качестве растворителя
используется изотонический раствор натрия хлорида с 10 % диметилсульфокси-
дом (конечная концентрация в инкубационной смеси не должна быть
более 2,5 %).
6.7.3.5. Проведение эксперимента
Необходимые для проведения эксперимента оборудование, посуда,
реактивы, питательные смеси и растворы, проведение работ по получению
фракции S9, а также регламент работы с бактериальными культурами с
использованием анализатора "Bioscreen" описаны [26].
Опыт параллельно ведут с использованием микросомальной
активирующей смеси и без нее для регистрации действия как прямых мутагенов, так
и непрямых, активность которых связана с образованием мутагенных
метаболитов, учитываемых при работе с микросомальной фракцией. В
контрольных вариантах опыта вместо испытуемого образца вносят
соответствующий объем растворителя.
В автоматизированном варианте SOS-хромотеста ферментативная
реакция определяется в кинетическом режиме в течение 30 мин. Тест можно
проводить с помощью автоматизированного микробиологического
анализатора "Bioscreen" фирмы "Labsystems" (Финляндия), управляемого ПК по
программе "SOS Chromotest". С помощью этой программы можно
определять способность исследуемых веществ активировать SOS-систему как в
условиях метаболической активации, так и без нее. В анализаторе
использован принцип вертикальной фотометрии, реакция проводится в
стерильных пластиковых "сотовых" плашках с оптически прозрачными дном и
крышкой, возможно одновременное исследование до 3 веществ с
активацией и без активации и до 8 веществ без активации. Инкубацию можно
проводить как в анализаторе, так и вне его, время инкубации можно
изменять.
6.7.4. Данные и их представление
6.7.4.1. Обработка результатов
Обработка результатов проводится по программе, предложенной
фирмой "Labsystems". Программа обработки результатов определяет для каждой
концентрации исследуемого вещества отношение активности р-галактози-
дазы к активности щелочной фосфатазы, нормализует эти отношения на
начальный момент времени и вычисляет фактор индукции. Затем
автоматически строятся кривые зависимости фактора индукции от концентрации
исследуемого вещества и определяется наклон кривой на ее линейном
участке.
- 153-

6.7.4.2. Оценка результатов
Результаты анализируют по программе "SOS Data Processing",
описанной в инструкции к прибору. Получают кривые развития окраски в
каждой пробе, дозозависимые кривые для каждого исследуемого вещества и
контролей и кривые изменения фактора индукции в зависимости от
концентрации вещества. По их линейной части определяют
SOS-индуцирующий потенциал (SOSIP).
Отчет должен включать следующую информацию:
— бактерии: использованные штаммы;
— условия проведения теста: уровни концентраций и обоснование
выбора концентраций, количество культур на экспериментальную точку,
состав среды, тип и состав системы метаболической активации, методика
обработки, позитивные и негативные контроли;
— индивидуальные результаты для каждой культуры;
— отношения доза—эффект.
6.7.4.2. Интерпретация результатов
Позитивные результаты в этом тесте указывают на то, что тестируемое
соединение индуцирует SOS-функции у Е. coli. Негативные результаты в
этом тесте указывают на то, что в данных условиях тестируемое
соединение не индуцирует повреждения ДНК, приводящие к индукции SOS-
функции у данного штамма микроорганизмов.
6.7.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки генотоксическои активности
вещества в SOS-хромотесте
Название эксперимента:
Тестерные микроорганизмы:
вид штаммы
Вещество:
название
формула, физико-химические свойства
производитель
растворитель
позитивный контроль
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:
дата проведения (начало, окончание, отдельные эксперименты)
способ обработки дозы
количество повторностей
система метаболической активации
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
- 154-

6.8. Метод определения внепланового (репаративного)
синтеза ДНК
6.8.1. Термины и определения
Внеплановый синтез ДНК обозначает синтез ДНК в процессе эксцизи-
онной репарации.
6.8.2. Цель исследования и принцип метода
Для оценки потенциальной способности фармакологических
препаратов индуцировать повреждения ДНК используют прямые методы,
основанные на непосредственном измерении количества повреждений, и
косвенные, сущность которых сводится к оценке активности ферментов
репарации повреждений ДНК. Внеплановый (или репаративный) синтез
ДНК осуществляется путем вырезания дефектных участков ДНК и
застройки их вновь синтезированными последовательностями нуклеотидов
[14].
6.8.3. Процедура тестирования
6.8.3.1. Клеточные культуры
Можно использовать первичные фибробласты человека, лимфоциты
периферической крови человека, первичные гепатоциты крыс и др.
6.8.3.2. Метаболическая активация
В качестве экзогенной метаболической активации используется
фракция S9 печени крыс, предобработанных соволом (300 мг/кг, однократно,
внутрибрюшинно, за 5 сут до забоя).
6.8.3.3. Изучаемые дозы (концентрации)
Используется двухэтапная схема тестирования. Используются
следующие конечные концентрации: 0,1; 1,0; 10,0 и 100,0 мкг/мл. При
обнаружении эффекта только при действии одной концентрации вещества
эксперимент повторяют в диапазоне концентраций, в 2 и 5 раз больших и
меньших (2-й этап).
6.8.3.4. Контроли
В каждом эксперименте обязательной является постановка негативного
контроля, которым является растворитель.
В качестве растворителя используются дистиллированная вода или ди-
метилсульфоксид в конечной концентрации 1 %, а при необходимости —
другие растворители, которые используют в концентрациях, не
вызывающих токсического эффекта.
- 155 -

В качестве позитивных контролен используют диметилнитрозамин, ме-
тилметансульфонат и др. [41].
6.8.3.5. Проведение эксперимента
Последовательность операций, связанных с подготовкой и проведением
эксперимента, а также процедура оценки полученных данных и
квалификация результатов испытаний описаны в соответствующих руководствах
[14,39,41].
Уровень активности ферментов репарации, индуцированный действием
исследуемого вещества, оценивают по включению [3Н]-тимидина в ДНК
используемых культур клеток в присутствии ингибитора репликативного
синтеза ДНК — оксимочевины.
Радиоактивность измеряют с помощью жидкостно-сцинтилляционного
счетчика. Показателем уровня индукции репаративной активности служит
"индекс метки".
6.8.4. Данные и их представление
6.8.4.1. Обработка результатов
В каждом случае определение индекса радиоактивной метки проводят
усреднением результатов, полученных в двух независимых аналогичных
пробах. Статистическую обработку результатов экспериментов проводят с
использованием одностороннего гомокаскадического t-критерия Стью-
дента.
6.8.4.2. Оценка результатов
Согласно критериям Международной программы по стандартизации
краткосрочных тестов на канцерогенность, достаточным свидетельством
генотоксичности вещества в данном тесте является наличие дозовой
зависимости, в которой достоверность превышения опытных величин над
контрольными должна быть < 0,10 и по крайней мере в одной точке < 0,05
[Venitt S. et al., 1986]. Результаты документируются согласно табл. 7.
6.8.4.3. Интерпретация результатов
Позитивные результаты в этом тесте указывают на то, что тестируемое
соединение или его метаболиты индуцируют внеплановый (репаративный)
синтез ДНК. Негативные результаты в этом тесте указывают на то, что в
данных условиях тестируемое соединение и его метаболиты не проявляют
соответствующей активности.
Таблица 7. Оценка уровня репаративного синтеза ДНК, индуцированного
фармакологическим препаратом
Вариант
Вещество

Концентрация, мкг/мл
%
поврежденных клеток
Индекс метки
(имп/мин/млн клеток)
Р<
- 156-

6.8.5. Отчетность
Протокол представления результатов
Название эксперимента:
Клеточная линия:
Вещество:
название
формула, физико-химические свойства
откуда получено
растворитель
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:
дата проведения
концентрации
количество повторностей на одну концентрацию
система метаболической активации
контроли
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
6.9. Метод определения однонитевых разрывов ДНК клеток
млекопитающих методом щелочной элюции
6.9.1. Цель исследования и принцип метода
Метод основан на определении кинетики прохождения через
мембранные фильтры однонитевых фрагментов ДНК, которые образуются при
денатурации ДНК в присутствии щелочи. Скорость элюции ДНК
определяется скоростью денатурации ДНК, которая зависит от числа разрывов или
щелочелабильных сайтов, индуцированных исследуемым соединением или
его метаболитами.
6.9.2. Процедура тестирования
6.9.2.1. Клеточные культуры
Используют культуры постоянных клеточных линий, например клетки
легкого китайского хомячка линии V-79, клетки яичника китайского
хомячка СНО или культуры мышиных клеток L.
6.9.2.2. Метаболическая активация
В качестве экзогенной метаболической активации используется
фракция S9 печени крыс, предобработанных соволом (300 мг/кг, однократно,
внутрибрюшинно, за 5 сут до забоя).
- 157-

6.9.2.3. Изучаемые концентрации
Используется двухэтапная схема тестирования. Используются
следующие конечные концентрации: 0,1; 1,0; 10,0 и 100,0 мкг/мл. При
обнаружении эффекта только при действии одной концентрации вещества
эксперимент повторяют в диапазоне концентраций, в 2 и 5 раз больших и
меньших (2-й этап).
6.9.2.4. Контроли
В каждом эксперименте обязательной является постановка негативного
контроля, которым является растворитель.
В качестве растворителя используются дистиллированная вода или ди-
метилсульфоксид в конечной концентрации 1 %, а при необходимости —
другие растворители, которые используют в концентрациях, не
вызывающих токсического эффекта.
В качестве позитивных контролей используют диметилнитрозамин, ме-
тилметансульфонат и др. [41].
6.9.2.5. Проведение эксперимента
Последовательность операций, связанных с подготовкой и проведением
эксперимента, а также процедура оценки полученных данных и
квалификация результатов испытаний описаны в соответствующих руководствах
[Venitt S. et al., 1986].
Для проведения эксперимента клетки тестерной линии предварительно
культивируют в среде Игла или RPMI 1640 с 15 % инактивированной
сывороткой крупного рогатого скота, содержащей меченный тритием тими-
дин до появления монослоя. Затем культуры инкубируют с исследуемым
веществом. По истечении срока инкубации клетки снимают с подложки и
переносят на мембранные фильтры, где проводят процедуру лизиса с
последующей промывкой выделенной ДНК. Затем проводят щелочную элю-
цию ДНК и отбор элюатов без фракционирования. Содержание ДНК в
элюатах определяют в кислотонерастворимой фракции, которую
сорбируют на мембранные фильтры. Радиоактивность меченного тритием тимиди-
на, оставшуюся на фильтрах, определяют на сцинтилляционном счетчике.
Опыт параллельно ведут с использованием микросомальной
активирующей смеси и без нее для регистрации действия как прямых мутагенов, так
и непрямых, активность которых связана с образованием мутагенных
метаболитов, учитываемых при работе с микросомальной фракцией.
6.9.3. Данные и их представление
6.9.3.1. Обработка результатов
Полученные результаты выражают в виде % ДНК, оставшейся на
фильтре. При этом используют следующую формулу:
AF + A|
- 158-

где F — % ДНК (активность в имп/мин), оставшейся на фильтре после
элюции; AF — активность, оставшаяся на фильтре; АЕ — активность,
обнаруженная в элюате в пересчете на полный его объем.
Для расчетов используют среднее арифметическое всех независимых
параллелей эксперимента в том случае, если их результаты не различаются
больше, чем на За.
6.9.3.2. Оценка результатов
Наличие у изучаемого вещества ДНК-повреждающего действия
регистрируют при обнаружении достоверных различий между % оставшейся на
фильтре ДНК в контрольных и опытных вариантах.
Достоверность различий определяют с использованием критерия Стью-
дента.
Если ни в одном из вариантов не получено позитивных результатов,
эксперимент прекращают. Таким же образом поступают, если обнаружен
эффект с четкой дозовой зависимостью. Если эффект получен только на
одной концентрации, эксперимент повторяют с использованием схемы 2-
го этапа.
Отчет должен включать следующую информацию:
— использованные клетки;
— условия проведения теста: уровни концентраций и обоснование
выбора концентраций, количество повторностей на экспериментальную
точку, состав среды, тип и состав системы метаболической активации,
методика обработки, негативные контроли;
— индивидуальные результаты для каждой параллели;
— средние значения всех показателей;
— стандартное отклонение;
— уровень значимости различий с сериями негативного контроля.
6.9.3.3. Интерпретация результатов
Позитивные результаты в этом тесте указывают на то, что тестируемое
соединение или его метаболиты индуцируют однонитевые разрывы ДНК
или щелочелабильные сайты. Негативные результаты в этом тесте
указывают на то, что в данных условиях тестируемое соединение и его метаболиты
не проявляют соответствующей активности.
6.9.4. Отчетность
Протокол представления результатов определения однонитевых разрывов
ДНК клеток млекопитающих методом щелочной элюции
Название эксперимента:
Клеточная линия:
Вещество:
название
формула, физико-химические свойства
откуда получено
растворитель
- 159-

контроли
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:
дата проведения
концентрации
количество повторностей на одну концентрацию
система метаболической активации
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
6.10. Тест на угнетение метаболической кооперации в смешанной культуре
клеток для скрининга опухолевых промоторов
6.10.1. Термины и определения
TGS — клетки, чувствительные к токсическому аналогу пуриновых
оснований 6-тиогуанину.
TGR — клетки, резистентные к 6-тиогуанину вследствие отсутствия у
них фермента гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (ГФРТ).
В контексте данного метода промотор — агент, нарушающий
проницаемость межклеточных контактов в культуре соматических клеток
млекопитающих.
6.10.2. Цель исследования и принцип метода
Опухолевые промоторы снижают метаболическую кооперацию, которая
сдерживает пролиферацию трансформированных (инициированных)
клеток.
Цель метода — выявление способности изучаемого агента нарушать
проницаемость щелевых контактов клеток для молекул фермента (ГФРТ),
превращающего 6-тиогуанин в нуклеотид, включающийся в ДНК [Bradley
М. О. et al., 1981]. Тест применим для соединений, растворимых в
питательной среде для культивирования клеток млекопитающих.
Метод основан на том, что выживаемость ТСа-клеток в смешанной
культуре с TGs-клетками на среде с 6-тиогуанидином резко снижается,
так как в TGs-клетках образуется нуклеотид 6-тиогуанина, который через
щелевые контакты поступает в TGR-клетки и отравляет их. Внесение в
культуру агента, способного разобщать клеточные контакты, уменьшает
поступление в резистентные клетки токсичного 6-тиогуанина, что
приводит к возрастанию выживаемости TGR-клеток в смешанной культуре.
6.10.3. Процедура тестирования
Основным эффектом в тесте на угнетение метаболической кооперации
является увеличение выживаемости резистентных к 6-тиогуанину клеток
при их совместном культивировании с чувствительными вследствие
угнетения межклеточного обмена токсичным метаболитом 6-тиогуанином.
- 160-

6.10.3.1. Культура клеток
В тесте используют клетки легкого китайского хомячка линии V-79
дикого типа (TGR-клетки) и мутантные (TGs-клетки) из банка клеток,
замороженных в жидком азоте на ранних пассажах.
6.10.3.2. Изучаемые концентрации
Для выбора концентраций испытуемого вещества до постановки
основного эксперимента изучается его цитотоксическое действие. На 10 чашек
высевают по 5 х 105—106TGR-клеток. Через 4 ч после посева в среду
добавляют тестируемое вещество в логарифмически снижающихся
концентрациях, начиная с концентрации 100 мг/мл или 10 % раствора вещества в
среде, если оно жидкое. Через 72 ч культуры клеток микроскопируют.
Концентрация, приводящая к гибели более 75 % клеток или вызывающая
выраженные морфологические изменения у 75 % клеток, считается
токсичной. В основном опыте клетки экспонируют с последовательно
уменьшающимися концентрациями вещества, начиная с концентрации, равной
половине токсичной дозы.
6.10.3.3. Контроли
В качестве позитивного контроля используют известный промотор —
12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат (ТФА) в концентрации 5—100 мг/мл.
6.10.3.4. Проведение эксперимента
Необходимые для проведения эксперимента оборудование, посуда,
реактивы, питательные смеси и растворы, проведение работ по
получению фракции S9, а также регламент работы с культурами клеток
описаны [Тест-система для оценки способности индуцировать генные мутации
у млекопитающих, 1977; Bradley М. О. et al., 1981; Barret G. С. et al.,
1986].
Для того чтобы разделить специфическое разобщающее и
неспецифическое токсическое действие тестируемого соединения, параллельно с
изучением влияния соединения на метаболическую кооперацию проводят
изучение его цитотоксического действия.
6.10.4. Данные и их представление
6.10.4.1. Критерии адекватности постановки опыта
1. Эффективность клонирования ТОк-клеток в смешанной культуре в
контроле с растворителем не должна превышать 30 % от эффективности
клонирования TGR-KJieTOK в отсутствие ТСг8-клеток в контроле с
растворителем.
2. Выживаемость TGR-KJieTOK в смешанной культуре при обработке
промотором ТФА (положительный контроль) должна быть более чем в 2 раза
выше, чем в контроле с растворителем.
6-762
- 161 -

3. Цитотоксическое действие хотя бы 1—2 изучаемых концентраций
тестируемого соединения не должно быть выше 30 %.
6.10.4.2. Оценка результатов
Данные представляют в виде количества колоний на чашку во всех
группах опыта и контроля. Указывают количество колоний для каждой
чашки, среднее количество на чашку и стандартное отклонение.
Эксперимент повторяют не менее 5 раз.
Определяют цитотоксическое действие всех изученных концентраций
тестируемого соединения. Вычисляют в % относительную эффективность
клонирования TGR-mieTOK по отношению к контролю с растворителем
(ЭК). Концентрации тестируемого соединения, вызвавшие снижение ЭК
более чем на 30 % по сравнению с контролем, при оценке влияния
соединения на метаболическую кооперацию не рассматривают.
Абсолютное количество колоний ТОа-клеток, выявленное в чашках
каждой группы, умножают на соответствующую данной группе ЭК.
Значимость различий выживаемости TGR-mieTOK в смешанной культуре,
обработанной тестируемым соединением, оценивают при помощи
критерия Стьюдента.
Критериями положительного ответа являются:
— наличие достоверного увеличения относительной эффективности
клонирования TGR-mieTOK в культурах, обработанных тестируемым
соединением по сравнению с контролем;
— высокая воспроизводимость результата (не менее чем в трех опытах
из трех);
— существование зависимости "доза—эффект".
6.10.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки способности соединения к
угнетению метаболической кооперации в смешанной культуре клеток
Название эксперимента:
Культура клеток:
Вещество:
название
формула, физико-химические свойства
откуда получено
растворитель
позитивный контроль
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:
дата проведения
дозы (концентрации)
группы
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
- 162-

6.11. Тест на неопластическую трансформацию клеток грызунов в культуре
ткани
6.11.1. Термины и определения
Неопластической трансформацией является процесс, в результате
которого нормальные клетки приобретают способность расти в виде опухолей
при перевивке их сингенным животным.
6.11.2. Цель исследования и принцип метода
Целью исследования является выявление способности испытуемого
соединения превращать в культуре ткани нормальные клетки в
злокачественные. Принцип метода состоит в том, что в системе быстро
размножающихся соматических клеток малигнизирующие способности канцерогенов
проявляются быстрее, чем в организме, где имеется иммунологический
надзор.
6.11.3. Процедура тестирования
6.11.3.1. Культура клеток
Культуры соматических клеток длительно пассируют на среде,
содержащей тестируемое соединение. Клетки, не обладающие собственной
системой метаболической активации проканцерогенов, выращивают на
монослое облученных клеток, обладающих высокой активностью метаболизи-
рующих ферментов или обрабатывают смесью S-9 из постмитохондриаль-
ной фракции печени крыс. Колонии трансформированных клеток
морфологически отличаются от нормальных по внешнему виду и ростовым
потребностям, а также по способности давать опухоли при перевивке
сингенным животным. Сравнивают количество трансформированных колоний в
культурах, обработанных тестируемым соединением со спонтанным
уровнем.
6.11.3.2. Метаболическая активация
Для метаболической активации проканцерогенов готовят "кормилку",
которая представляет собой монослой у-облученных клеток (10 000 рад)
эмбриональных фибробластов или необлученную свежеприготовленную
культуру гепатоцитов взрослой крысы или мыши. Клетки "кормилки"
нежизнеспособны, но они кондиционируют среду и обеспечивают
метаболическую активацию проканцерогенов, к которой клетки иммортализован-
ных линий не способны. Оптимальной является "кормилка" из первичной
культуры гепатоцитов взрослых грызунов. Эмбриональные клетки первых
пассажей от эмбрионов III триместра беременности также пригодны, но
спектр активирующих цитохромов у них ограничен.
6*
- 163-

6.11.3.3. Изучаемые концентрации
Для изучения канцерогености испытуемого вещества в качестве
максимальной используют минимальную токсическую дозу. Для ее определения
используемые для скрининга клетки сажают в лунки пластиковых плат в
концентрации, обеспечивающей 30 % монослоя через 48 ч. Для
быстрорастущих клеток эти параметры могут быть другими, их подбирают
экспериментально. Через 48 ч после посева в лунках, культуральную среду
заменяют средой, содержащей различные концентрации испытуемого вещества
(обычно вначале с шагом '/ш, а затем '/2, по две лунки на каждую
концентрацию). Водорастворимые вещества непосредственно перед опытом
растворяются в культуральной среде. Нерастворимые в воде вещества обычно
растворяют в диметилсульфоксиде. Обязательно наличие контроля на
растворитель и чистого контроля без каких-либо добавок (минимум по 2
лунки). Учет результатов проводят от 3-го до 7-го дня после добавления
испытуемого вещества по характеру гибели клеток.
6.11.3.4. Контроли
В каждом эксперименте необходимо наличие контролей. Негативный
контроль: необработанная культура и растворитель. В качестве
позитивного контроля может быть использован 20-метилхолантрен либо другой
известный канцероген, предпочтительно того же ряда, что и тестируемое
соединение, испытанный ранее в культуре клеток.
6.11.3.5. Проведение эксперимента
В чашки Петри диаметром 50—60 мм на приготовленную "кормилку"
высевают от 300 до 1000 клеток-мишеней и через 24 ч добавляют
испытуемое вещество в концентрациях с шагом 1/2, с максимальной
концентрацией, которая оказалась минимально токсичной в тесте на токсичность. Кон-
тролями служат чашки с растворителем в максимальной для данной серии
концентрации (в случае ДМСО не более 0,5 %), чашки без какого-либо
воздействия, и чашки с заранее известным канцерогеном в работающей
концентрации (положительный контроль). При работе с эмбриональными
клетками хомяка клетки выращивают в течение 9 сут без замены среды,
после чего культуру отмывают любым солевым раствором и окрашивают
принятым в лаборатории методом. При работе с клетками иммортализо-
ванных клеточных линий культуру отмывают от канцерогена через 24—48
ч или позже, а затем клетки культивируют 4—6 нед без пересева, сменяя
среду 1—2 раза в неделю. После этого чашки промывают и окрашивают,
как и в тесте с использованием эмбриональных клеток хомяка.
6.11.4. Данные и их представление
6.11.4.1. Оценка результатов
Данные представляют в виде количества трансформированных колоний
на чашку. Как для тестируемого соединения, так и для позитивных и
негативных контролей указывают число колоний для каждой чашки, среднее
- 164-

количество трансформированных колоний для каждой чашки и
стандартное отклонение.
Все результаты должны быть подтверждены в независимом
эксперименте. Для оценки результатов тестирования используют соответствующие
статистические методы.
О трансформирующем действии испытуемого вещества судят по
характеру колоний клеток или очагов роста. Колонии
трансформированных клеток, при достаточном навыке, легко распознают по их монослой-
ному росту, отсутствию однонаправленной ориентированности. Такие
колонии состоят из резко поляризованных, перекрещивающихся,
расположенных в несколько слоев клеток. Окраска их более интенсивна за
счет многослойности. Клеточные штаммы, полученные из клеток таких
линий, обладают пониженной чувствительностью к концентрации
сыворотки в культуральной среде, образуют колонии в полужидком агаре, а
при прививке сингенным животным приводят к росту у этих животных
опухолей. Показателем активности испытуемого вещества является
соотношение колоний трансформированных клеток и нетрансформирован-
ных клеток.
Критериями позитивного результата являются или статистически
достоверное, зависимое от дозы, увеличение количества трансформированных
колоний, или воспроизводимый и статистически достоверный позитивный
ответ, по крайней мере для одной экспериментальной точки.
6.11.4.2. Интерпретация результатов
Тестируемое соединение, не вызывающее статистически достоверного,
зависимого от дозы увеличения количества трансформированных колоний
или воспроизводимого и статистически достоверного позитивного ответа
для какой-либо экспериментальной точки, рассматривается как
неканцерогенное в данном тесте.
6.11.5. Отчетность
Протокол представления результатов оценки способности соединения к
неопластической трансформации клеток грызунов в культуре ткани
Название эксперимента:
Культура клеток:
Вещество:
название
формула, физико-химические свойства
откуда получено
растворитель
позитивный контроль
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:
дата проведения
дозы (концентрации), обоснование выбора доз, количество чашек на
экспериментальную точку, токсичность, состав среды, тип системы
метаболической активации, методика обработки, позитивные и негативные кон-
троли
- 165 -

индивидуальные результаты для каждой культуры, среднее количество
трансформированных колоний на чашку, стандартное отклонение,
отношение доза—эффект, где возможно
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
6.12. Прямой ускоренный тест выявления канцерогенности
фармакологических препаратов на аквариумных рыбах Danio rerio (H)
6.12.1. Цель исследования и принцип метода
Целесоообразность использования аквариумных рыб для тестирования
на канцерогенность фармакологических препаратов обусловлена такими
особенностями биологии рыб, как высокая чувствительность к
канцерогенным агентам, быстрое получение ответа (менее 1 года), возможность
использования одновременно большого количества животных,
практически полное отсутствие спонтанных опухолей, а также относительно
невысокая, по сравнению с экспериментами на грызунах, стоимость
тестирования. Оценку канцерогенности производят на основании анализа
гистологических препаратов опухолей, которые имеют общие морфологические
признаки для всех позвоночных животных [5, 25, 36, 38].
6.12.2. Процедура тестирования
6.12.2.1. Лабораторные животные
Аквариумные рыбы D. rerio (H), размер 2,5—3,5 см, масса тела 150—250
мг, продолжительность жизни в условиях лабораторий — в среднем 1,5
года. Гистологическое строение тканей рыб этого вида описана в
соответствующих руководствах [24, 40].
6.12.2.2. Способ введения
Как правило, применяют метод растворения препарата в воде
аквариумов (иммерсия), реже используют скармливание (добавление в корм), а
также подкожные, внутримышечные, внутрибрюшинные инъекции,
накожную аппликацию (смазывание) и введение пилюль.
6.12.2.3. Дозы (концентрации)
Обычно при иммерсии используют концентрацию тестируемого агента,
соответствующую '/5 от LD50/30, установленной в подострых опытах на
токсичность; в случае слабой токсичности используют максимальнопереноси-
мую дозу. Концентрацию агента в воде контролируют спектрофотометриче-
ски, при необходимости ее постоянство поддерживают путем добавления в
аквариумы соответствующего количества тестируемого препарата.
- 166-

6.12.2.4. Экспозиция
При тестировании канцерогенности чаще всего используют постоянную
(непрерывную) экспозицию на протяжении всего периода опыта. В
зависимости от физико-химических свойств препарата возможно применение
пульсовой экспозиции (кратковременное, одно- или многократное
содержание в воде с тестируемым агентом).
6.12.2.5. Контроли
Позитивный (опыт с маркерным канцерогеном) и негативный
(необработанные или обработанные растворителем животные).
6.12.2.6. Проведение эксперимента
Используют рыб D. rerio в возрасте 3 мес, обоего пола, содержащихся в
стандартных лабораторных условиях.
Оценка токсичности, схема тестирования, продолжительность
тестирования, сбор материала и его гистологическая обработка описаны в
соответствующих методических рекомендациях [5, 38].
6.12.3. Данные и их представление
6.12.3.1. Оценка результатов
Оценка результатов тестирования выполняется на основании
детального анализа гистологических препаратов. Все препараты изучают с
помощью стандартной микроскопической техники. Описание каждого
препарата заносится в специальный протокол, указывая характеристику
объекта, условия содержания, количество животных в опыте, динамику
гибели и следующие показатели: время появления первой опухоли в
группе, частота опухолей (общее число и в процентах к числу
доживших до момента регистрации первой опухоли), средний латентный
период развития опухолей, количество опухолевых узлов на одно
животное, первичная множественность опухолей, процент злокачественных
опухолей, частота метастазирования, гистологическая структура
опухолей. Определяющим показателем является статистически значимое
превышение числа опухолей в опыте над интактным контролем.
Полученные данные подвергают статистической обработке (метод у_2,
критерий Стьюдента и др.).
Анализ препаратов осуществляется в соответствии с морфологическими
критериями опухолевого роста, принятыми в онкологии. При этом
тестируемый агент следует признать канцерогенным, если в экспериментальной
группе обнаружено статистически значимое (Р < 0,05) превышение
количества опухолей (злокачественных и доброкачественных) по сравнению с
группой негативного контроля.
- 167-

6.12.3.2. Интерпретация результатов
В случае если в экспериментальной группе не будет обнаружено
изменений, которые могут быть расценены как специфические предопухолевые
образования, в частности как диффузная или нодулярная гиперплазия
либо появление морфологически измененных участков (усиление базофи-
лии, уменьшение или увеличение размеров клеток, наличие
патологических митозов и т. п.), и их количество будет статистически значимо
превышать уровень аналогичных изменений в контроле, то тестируемый агент
следует признать как потенциально канцерогенный.
Если в экспериментальной группе не будет выявлено достоверных
отличий в частоте возникновения или предопухолевых изменений —
тестируемый агент следует рассматривать как не обладающий канцерогенными
свойствами.
6.12.4. Отчетность
Протокол представления результатов в прямом ускоренном тесте выявлене-
ния канцерогенности фармакологического препарата на аквариумных рыбах
D. rerio
Название эксперимента:
Животные:
вид количество условия содержания
Вещество:
название
формула, физико-химические свойства
откуда получено
растворитель
позитивный контроль
Анализ данных литературы:
Схема эксперимента:
дата проведения
способ введения дозы
длительность и кратность введения
группы
Методика приготовления и анализа гистологических препаратов:
Полученные результаты:
Публикации (по результатам работы):
Список цитированной литературы:
Исполнители:
Дата сдачи отчета:
Л итература
1. Баскин И. И., Любимова И. К., Абилев С. К. и др. Исследование количественной
связи между мутагенной активностью химических соединений и их структурой.
Замещенные бифенилы // Доклады Академии наук. — 1993. — Т. 332. — С. 587—589.
2. Белицкий Г. А., Фонштейн Л. М., Худолей В. В. и др. Совол как индуктор микросо-
мальных ферментов, активирующих проканцерогены // Экспериментальная
онкология. - 1987. - Т. 9, № 3. - С. 20-23.
3. Белицкий Г. А., Худолей В. В. //Вопросы онкологии. — 1986. — Т. 32, № 4. — С. 3—
11.
- 168 -

4. Белицкий Г. А., Шарупич Е. Г., Хованская Е. М. Методические рекомендации по
применению соматического мутагенеза у Drosophila melanogaster в качестве тест-
системы для ускоренного определения канцерогенов. — М., 1982. — 24 с.
5. Использование аквариумных рыб для ускоренной оценки канцерогенной активности
химических соединений: Методические рекомендации. — М., 1983. — 13 с.
6. Малашенко А. М., Суркова Н. И., Семенов X. X. Определение мутагенности
химических соединений (генетический скрининг) на лабораторных мышах: Методические
указания. — М., 1977. — 12 с.
7. Медведев Н. Н. Практическая генетика. — М.: Наука, 1968. — 294 с.
8. Метод определения разрывов ДНК как тест-система для выявления мутагенного
потенциала химических веществ: Методическое указание. — М., 1980. — 11 с.
9. Методические рекомендации по исследованию канцерогенных свойств
фармакологических и лекарственных средств // Ведомости Фармакологического комитета. —
1998. - № 1. - С. 21-24.
10. Методические рекомендации по проверке мутагенных свойств у новых
лекарственных препаратов. — М., 1981. — 56 с.
11. Оценка мутагенности новых лекарственных средств. — М., 1992. — 31 с.
12. Оценка мутагенной активности химических веществ микроядерным методом
(методические рекомендации). — М., 1984. — 17 с.
13. Оценка мутагенных свойств фармакологических средств // Ведомости
Фармакологического комитета. — 1998. — № 4. — С. 32—39.
14. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных
химических веществ. Гигиенические критерии состояния окружающей среды 51. —
Женева: ВОЗ, 1989. - 212 с.
15. Статистическая обработка данных тестирования на мутагенность: Методические
указания. — Вильнюс, 1989.
16. Тестирование химических соединений на предполагаемую канцерогенную
активность по реакции репаративного синтеза ДНК в культуре клеток: Методические
рекомендации. — М., 1982. — 21 с.
17. Тест-система для оценки способности индуцировать генные мутации у
млекопитающих: Методическое указание. — М., 1977. — 17 с.
18. Фонштейн JI. М., Абилев С. К., Бобринев Е. В. и др. Методические рекомендации по
применению теста Эймса Salmonella/микросомы. — М., 1983. — 25 с.
19. Фонштейн Л. М., Абилев С. К., Бобринев Е. В. и др. Методы первичного выявления
генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных
тест-систем (методическое указание). — М., 1985. — 34 с.
20. Ashby J. Two million rodent carcinogens? The role of SAR and QSAR in their detection.
// Mutat. Res. - 1994. - Vol. 305. - P. 3-12.
21. Barrett G. C, Kakunaga Т., Kuroki T. et al. In vitro assays that may be predictive of
tumour — promoting agents. — In: Long-term and Short-term Assays for Carcinogens: A
Critical Appraisal / Montesano R., Bartsch H., Vainio H. et al. (Eds) IARC Sci. Publ.
№ 83. - Lyon, 1986. - P. 287-302.
22. Bradley M. O., Bhuyan В., Francis M. С et al. Mutagenesis by chemical agents in V79
Chinese hamster cells: a review and analysis of the literature; a Report of the Gene-Tox
Program // Mutat. Res. — 1981. - Vol. 87. — P. 81-142.
23. Bridges B. A. Simple bacterial systems for detecting mutagenic agents // Labor. Practice.
- 1972. -Vol. 21. - P. 413.
24. Fournie J. W., Hawkins W. E., Krol R. M., Wolf M. J. Preparation of whole small fish for
histological evaluation. — In: Ostander G. K. (Ed.) // Techniques in Aquatic Toxicology. —
1996. - CRC Lewis Publisher. - P. 557-587.
25. Hawkins W. E., Walker W. W., Overstreet R. M. Carcinogenicity Test Using Aquarium
Fish // Toxicology Methods. - 1995. — Vol. 5. - P. 225-263.
26. Huttunen T. Bioscreen Application Manual, SOS-Chromotest with Bioscreen, Labsystems
Oy, Pulttitie 8, 00 880 Helsinki.
27. Kajiwara Y., Ajimi S., Hosokawa A., Maekawa K. // Mutat. Res.— 1997. — Vol. 393. —
P. 81-90.
28. Kerckaert G. A., LeBoeuf R. A., hfort R. J. // Fundam. Appl. Toxicol. — 1996. — Vol. 34.
- P. 67-72.
29. Klopman G. Artificial intelligence approach to structure-activity studies. Computer
automated structure evaluation of biological activity of organic molecules // J. Am. Chem.
Soc. - 1984. - Vol. 106. - P. 7315-7321.
30. Klopman G. MULTICASE. l.A hierarchical computer automated structure evaluation
- 169 -

program // Quantitative Structure-Activity Relationships. — 1992. — Vol. 11. — P.
176-184.
31. Klopman G., Rozenkranz H. S. Approaches to SAR in carcinogenesis and mutagenesis.
Prediction of carcinogenicity/mutagenicity using MULTI-CASE // Mutat. Res. — 1994. —
Vol. 305. - P. 33-46.
32. LeBoeufR. A., Kerckaert G. A., Aardema M. J. et al. // Mutat. Res. — 1996. — Vol. 356. —
P. 85-127.
33. Maron D. M., Ames B. N. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test // Mutat.
Res. - 1983. - Vol. 113. - P. 173-215.
34. Pienta R. G. In: Griffin A. C, Shaw С R. (Eds). Carcinogens: Identification and
Mechanisms of Action. — New York: Raven, 1979. — P. 121 — 141.
35. Quillardet P., Huisman 0., D'Ari R., Hofnung M. SOS-chromotest, a direct assay of
induction of an SOS function in Esherichia coli K12 to measure genotoxicity // Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA). - 1982. - Vol. 79. - P. 5971-5975.
36. Trends in Ichthyology: An International Perspective / Eds J. H. Schroder, J. Bauer, M.
Shartl. GSF-Forschungcentrum. — Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1993. —
432 p. .
37. Tsuchiya Т., Umeda M. // Carcinogenesis. - 1995. - Vol. 16. - P. 1887-1894.
38. Use of Small Fish Species in Carcinogenicity Testing. National Cancer Institute
Monograph, 65. US Departament of Health and Human Services. — Bethesda, 1984. — 409 pp.
39. Venitt S., Bartsch H., Becking G. et al. DNA damage and repair. — In: Long-term and
Short-term Assays for Carcinogens: A Critical Appraisal / Montesano R., Bartsch H.,
Vainio H. et al. (Eds). IARC Sci. Publ. № 83. - Lyon, 1986. - P. 129-142.
40. Westerfield M. The zebrafish book / Institute of Neurosciences, University of Oregon,
Eugene. — Oregon, 1993. — 260 p.
41. Williams G. M. Summary report of the performance of the assays for DNA damage. In:
Ashby J., de Serres F. J. et al. (Eds). Progress in Mutation Research, vol. 5, Elsevier Sci.
Publ., Amsterdam. - Geneva: WHO, 1985. - P. 59-68.
Методические указания по изучению общетоксического
действия противоопухолевых фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н. Л. М. Михайлова;
д. м. н., проф. А. Б. Сыркин; д. м. н., проф.
А. М. Гарин; д. м. н., проф. А. Ю. Барышников
Методические рекомендации разработаны в лаборатории фармакологии
и токсикологии РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН на основе многолетнего
опыта работы, современных национальных и зарубежных
токсикологических подходов по доклинической оценке безвредности лекарственных
препаратов и токсикологических протоколов Национального института рака,
США.
I. Введение
Разработка новых методов лечения онкологических заболеваний
является одной из кардинальных задач здравоохранения. Особое место занимает
создание и внедрение в медицинскую практику высокоэффективных
лекарственных препаратов. Современное лечение онкологических больных
на том или ином этапе обязательно включает применение
противоопухолевой химиотерапии. Широкое использование химиотерапии, как самостоя-
- 170-

тельно, так и в сочетании с другими методами, значительно повысило
возможности успешного лечения злокачественных опухолей, злокачественных
системных заболеваний крови и кроветворных органов. Но несмотря на
то, что противоопухолевая терапия имеет уже большую историю и
значительные успехи, проблема создания эффективных нетоксичных или
малотоксичных препаратов до сих пор не решена. На сегодняшний день не
создано ни одного противоопухолевого препарата, который был бы безопасен
в рекомендуемых для клинического применения дозах.
Проявления токсичности или побочного действия противоопухолевых
лекарств так или иначе лимитируют их практическое использование. Это
положение имеет закономерный характер в связи с особенностями
биологического действия противоопухолевых препаратов. Противоопухолевые
лекарственные средства относятся к одним из самых биологически
активных фармакологических средств, и это, наряду с принципом цитотоксич-
ности, заложенным в основе химиотерапии, определяет их повреждающее
действие в первую очередь на ткани, наиболее сходные с опухолевыми по
скорости пролиферации (костный мозг, лимфатическая система,
желудочно-кишечный канал, репродуктивные органы), что приводит к близкой
сопряженности лечебного и токсического эффектов. Противоопухолевые
препараты, как правило, обладают узким диапазоном "широты
терапевтического действия".
Как следствие сказанного, побочные и токсические эффекты у
противоопухолевых препаратов отмечаются гораздо чаще, чем при других
видах лекарственной терапии. При этом для противоопухолевых лекарств
характерны и специфические осложнения: отсроченная токсичность,
характеризующаяся скрытым (латентным) периодом в проявлении
токсического действия, большим разнообразием и сложностью ее выявления;
отсутствие избирательной токсичности; местнораздражающее действие, эм-
бриотоксичность, тератогенность, мутагенность, канцерогенность,
функциональная кумуляция, нейротоксичность и иммунотоксичность.
Поэтому лечение онкологических больных химиопрепаратами сопровождается
различными по своим проявлениям токсическими и побочными
эффектами.
Особенности токсического побочного действия противоопухолевых
препаратов, их вариабельность и сложность выявления требуют
специфических методических подходов к их доклиническому токсикологическому
изучению. Обоснованность и целесообразность таких подходов
определяется также эволюцией токсикологических требований к аналогичным
фармакологическим средствам за рубежом.
II. Общие положения по доклиническому изучению противоопухолевых
препаратов
Доклиническое токсикологическое изучение новых противоопухолевых
препаратов состоит из 2 этапов исследования.
I этап предклинического токсикологического исследования —
предварительный, представляет систему токсикологической программы под
названием "мини-токси", предусматривающую решение вопроса о
целесообразности и перспективности дальнейшего токсикологического изучения
нового препарата и продвижения его в клинику. При изучении
токсичности по программе "мини-токси" препарат характеризуется по 4 основным
тестам: 1) изучение острой токсичности; 2) изучение местнотканевых реак-
- 171 -

ций; 3) изучение лимитирующей токсичности; 4) биологическая
стандартизация по токсичности и пирогенности.
В результате этих исследований препарат получает основную
токсикологическую характеристику — "токсикологический паспорт", в котором
заложены количественная и качественная оценки нового
противоопухолевого препарата.
II этап методических подходов по предклиническому
токсикологическому изучению новых противоопухолевых препаратов представляет собой
расширенное исследование токсичности по "полной программе",
предусматривающее доклиническое изучение безвредности лекарственных
препаратов по требованиям нормативной документации Фармакологического
комитета Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФК МЗ
РФ) с учетом особенностей токсического действия противоопухолевых
препаратов и современных международных требований по доклинической
токсикологии.
Целью этих 2 этапов исследования является эффективное
доклиническое изучение безвредности новых противоопухолевых препаратов и
экстраполяция полученных экспериментальных данных на человека с
прогнозом клинической безвредности.
Для осуществления названной цели необходимо решение следующих
задач:
1. Определение количественной токсичности новых противоопухолевых
препаратов. Установление летальных, максимально переносимых,
токсических и нетоксических доз препаратов на разных видах животных.
Определение расчетных (ЛДШ, ЛДШ, ЛД5о, ЛД84) и уровней токсических доз:
летальной дозы (ЛД), высокой токсической дозы (ВТД), низкой токсической
дозы (НТД) и высокой нетоксической дозы (ВНТД). Установление
зависимости токсических проявлений от величины используемых доз препарата.
Выявление наиболее чувствительного вида животного к токсическому
действию нового препарата.
2. Изучение токсикодинамики препарата. Определение влияния новых
противоопухолевых препаратов на состояние органов и систем организма:
изучение токсичности и побочного действия новых препаратов на
периферическую кровь, желудочно-кишечный канал, печень, сердце и другие
органы.
3. Определение дозолимитирующей токсичности (ДЛТ) новых
противоопухолевых препаратов на основе подбора уровней доз, при которых
выявляется вид токсичности, лимитирующий его дальнейшее использование.
4. Изучение влияния новых противоопухолевых препаратов на функции
центральной нервной системы (ЦНС).
5. Изучение обратимости токсических эффектов новых
противоопухолевых препаратов.
6. Биологическое тестирование стандартности и качества новых
противоопухолевых препаратов по токсичности и пирогенности.
7. Прогнозирование токсических и побочных эффектов у человека при
применении новых препаратов в клинике.
8. Определение (прогнозирование) начальной ("стартовой") безопасной
дозы противоопухолевых препаратов на I фазу клинических исследований.
Для адекватной оценки безвредности новых противоопухолевых
препаратов необходимо учитывать реальную возможность их отсроченного или
пролонгированного токсического действия. "Латентный" период
токсического действия противоопухолевых препаратов может быть 1 мес и более
(до 1 года) в зависимости от принадлежности препарата к классу противо-
- 172-

опухолевых соединений, лекарственной формы, пути введения и режима
применения. В связи с этим сроки наблюдения за животными после
применения нового препарата должны определяться по основному
показателю — полной обратимости токсических эффектов.
При проведении токсикологических исследований новых
противоопухолевых препаратов длительность наблюдения за животными в каждом
конкретном случае определяется исследователем при условии, что
токсические проявления у животных в установленный им срок после
применения препарата исчезают.
Установлено также наличие у противоопухолевых препаратов периодов
("пиков") гибели животных, которые обусловлены преимущественным
летальным поражением определенных органов и тканей животных. На
основании этого определены временные этапы (сроки) токсического действия
противоопухолевых препаратов на определенные органы и системы
организма животных. Так, нейротоксичность, или действие на функции ЦНС,
выявляется непосредственно после введения препарата (сразу или через 30
мин), спустя 1—3 ч, первые 4 дня, 7-й, 8-й дни, а в случае применения
препаратов пролонгированного или отсроченного действия — через 1 мес
или позже. Длительное нейротоксическое действие вызывают липидоцито-
статики, гормоноцитостатики, гормональные препараты, соединения
платиновой группы. Гематотоксичность, или побочное действие на
периферическую кровь, после применения противоопухолевых препаратов отмечены
на 1-е сутки после многократного и 3, 7, 14, 21, 30, 45, 60-е сутки после
однократного и многократного применения. При отсроченном и
пролонгированном действии препарата — на 90-е, 120-е сутки и до 1 года.
Пролонгированную гематотоксичность, превышающую 2 мес, вызывают
препараты — производные карбоксамида, липидоцитостатики,
гормоноцитостатики. Кардиотоксичность, или побочное действие на функцию сердца,
после применения противоопухолевых препаратов определяется как в
ранние сроки — 1—7-е сутки наблюдения, так и в более поздние сроки — 30,
45—60-е сутки. При отсроченном или пролонгированном действии
противоопухолевых препаратов кардиотоксичность выявляется на 90, 120, 150-е
сутки после их применения. Примером отсроченного кардиотоксического
действия могут быть антрациклиновые антибиотики, гормональные
препараты и гормоноцитостатики. Гепатотоксичность, или побочное действие
на функции печени, отмечена после многократного применения
противоопухолевых препаратов на 1-е сутки и на 3, 7, 14, 21, 30, 45, 60-е сутки
после однократного и многократного применения. Проявление гепатоток-
сичности в поздние сроки — на 90, 120-е сутки — 6 мес — характерно для
препаратов — производных карбоксамида, препаратов платиновой группы,
гормональных препаратов, гормоноцитостатиков и липидоцитостатиков.
Нефротоксичность, или побочное действие на функции почек,
обнаруживается на 1, 3, 7, 14, 21, 30, 45-е сутки после применения
противоопухолевых препаратов. Нефротоксический эффект наиболее выражен у
препаратов комплексных соединений металлов, в частности, из группы
платиновых соединений, алкилирующих препаратов и некоторых препаратов —
производных нитрозомочевины.
Указанные временные этапы (сроки) внесены в протоколы по
доклинической токсикологии противоопухолевых препаратов в качестве
рекомендуемых сроков определения влияния препаратов на функциональное
состояние органов и систем организма животных.
Необходимость использования разных видов животных, в том числе
крупных, является обязательным условием в проведении доклинических
- 173 -

токсикологических исследований противоопухолевых препаратов.
Использование крупных животных — не грызунов (собаки) преследует две
основные цели. Это изучение токсических и побочных эффектов,
прогнозирование их у человека и предсказание безопасной "стартовой" дозы
для клинических исследований в случае, если собаки окажутся наиболее
чувствительным видом животного к изучаемому противоопухолевому
препарату.
При токсикологическом изучении противоопухолевых препаратов
существенная роль отводится мелким лабораторным животным (мыши, крысы)
не только при количественной оценке токсичности, но также и при
изучении качественной токсичности противоопухолевых препаратов, так как
мелкие животные являются наиболее адекватной моделью для
экспериментального индуцирования патологических состояний, вызываемых
противоопухолевыми препаратами у животных и человека.
Большая роль в доклинической токсикологии противоопухолевых
препаратов принадлежит мышам (крысам) еще и вследствие того, что
полученные данные по их летальности используются для определения
"стартовой" безопасной дозы для человека на I фазу клинических испытаний.
III. Предварительная оценка токсичности новых противоопухолевых
препаратов по программе "мини-токси"
Проведение исследований по программе "мини-токси" целесообразно
начинать на этапе разработки оптимальных лекарственных форм
противоопухолевых препаратов. При изучении нового препарата в субстанции и/
или в лекарственной форме по программе "мини-токси" необходимы
следующие сведения:
1. Название соединения или препарата, номер серии.
2. Химическая или структурная формула.
3. Описание соединения (внешний вид, цвет, запах, температура
плавления или кипения, растворимость, предельная концентрация в водных
или масляных растворах).
4. Состав модели лекарственной формы (качественный и
количественный).
5. Доказательство стандартности и стабильности препарата в
субстанции и/или лекарственной формы.
6. Возможные технологические примеси.
7. Условия хранения препарата в субстанции и/или условия хранения
моделей лекарственной формы.
8. Устойчивость модели лекарственной формы препарата.
9. Содержание активного вещества во флаконе.
10. Режим введения, дозы и путь введения препарата в модели
лекарственной формы, используемые в химиотерапевтических экспериментах.
11. Характеристика состояния мест введения препарата в
химиотерапевтических исследованиях.
12. Штаммы опухолей, линия животных в химиотерапевтических
исследованиях.
13. Сроки гибели животных с опухолями.
14. Заключение о противоопухолевой активности препарата в
субстанции или в модели лекарственной формы и его преимущество в данном
классе соединений или оригинальность.
Только имея перечисленные выше сведения о препарате в субстанции
- 174-

или в модели лекарственной формы, можно начинать токсикологическую
оценку по программе "мини-токси", которая включает изучение
токсичности по следующим тестам:
III. 1. Изучение "острой"токсичности препарата в субстанции
и/или в модели лекарственной формы на мелких лабораторных животных
Задачами настоящего исследования являются: 1) определение
однократных летальных доз ЛД50 и ЛД10 (МПД) с целью характеристики
количественной токсичности нового препарата в субстанции и/или лекарственной
форме; 2) сравнительный анализ полученных данных по критериям
количественной токсичности (ЛД50, ЛД10) препарата в субстанции и в
лекарственной форме; 3) определение степени опасности конкретного препарата
по критерию "широты токсического действия" и "широты смертельного
действия".
Учитывая особенности токсического действия противоопухолевых
препаратов, "широту токсического действия" предлагаем рассчитывать как
интервал между ЛД10 (МПД) и ЛД50 (среднесмертельная доза). "Широта
смертельного действия" рассчитывается как интервал между ЛД16 (частичнос-
мертельная доза) и ЛД84 (смертельная доза, близкая к абсолютной —
ЛД.оо)-
Установление расчетных токсических доз проводится с использованием
метода Литчфидда и Уилкоксона или с помощью какого-либо другого
метода.
III. 2. Изучение местнотканевых реакций при применении препарата
в субстанции и/или в модели лекарственной формы
Основная задача исследования — выявление местнораздражающего
действия препарата в субстанции и/или в модели лекарственной формы. Для
препаратов, предназначенных для внутривенного введения, эти
исследования рекомендуется проводить на кроликах. Препарат в субстанции или в
лекарственной форме вводится в краевую вену уха кролика. Для
препаратов, предназначенных для перорального и внутримышечного применения,
рекомендуется использовать крыс. Препарат в субстанции или в модели
лекарственной формы вводится в желудок с помощью специально
загнутой тупой иглы, насаженной на шприц, или — внутримышечно в мышцу
бедра задней лапки. При внутрибрюшинном назначении
противоопухолевых препаратов также рекомендуется использовать крыс. Местное действие
препарата оценивается по реакции брюшины и органов брюшной полости.
Для препаратов, предназначенных для подкожного применения, также
рекомендуется использовать крыс, однако одного вида животного для
оценки местного действия при подкожном введении препарата не
достаточно. Необходимо 2—3 вида животных, среди которых обязательно
должны быть морские свинки, так как установлено, что подкожная клетчатка
морских свинок является наиболее адекватной моделью подкожной
клетчатке человека.
При всех перечисленных путях введения количество введений
препарата определяется оптимальным химиотерапевтическим курсом. Оценка
местнораздражающего действия должна проводиться визуально
(макроскопически) и с использованием морфологических методов. Материал для мор-
- 175-

фологического исследования необходимо брать в 2—3 срока. Первый срок
зависит от режима введения препарата. Если препарат вводился
однократно, то рекомендуется участки исследуемой ткани для морфологического
изучения брать на 3—5-й день после его применения. Если многократно —
то участки мест введения должны быть взяты на 1—3-й день после
последнего применения препарата. Второй срок установлен с целью определения
развития процесса или его обратимости. В связи с этим рекомендуется
брать для морфологического исследования участки мест введения через
10—14 дней. При отсутствии обратимости местного токсического действия
на 14-й день наблюдения участки мест введения у животных должны быть
взяты на 30-е сутки после последнего введения препарата, а 14-е сутки
опыта необходимо рассматривать в качестве промежуточного срока для
определения характера развития процесса. В случае отсутствия полной
обратимости местного действия препарата на 30-й день опыта, можно оставить
группу животных для наблюдения на "тест обратимости" на более
длительный срок.
Образование тромбофлебитов, тромбозов при внутривенном
применении, образование некрозов, абсцессов в мышцах и подкожной клетчатке,
ульцерогенное действие при пероральном применении, образование
выпота, развитие спаечного процесса или слипчивого перитонита при внутри-
брюшинном применении рассматриваются как противопоказания для
дальнейшего токсикологического изучения противоопухолевого препарата.
К разряду "экспресс-методов" можно отнести изучение местнораздра-
жающего действия препарата в субстанции или в лекарственной форме
при нанесении его на конъюнктиву глаза кролика в рекомендуемом
режиме и концентрации.
Количество животных для оценки местнотканевых реакций препаратов
должно быть достаточным для проведения морфологических
исследований. На каждый срок взятия материала рекомендуется от 2 до 3 крупных
животных (кролики) и от 3 до 5 мелких животных (крысы, морские
свинки).
Ш.З. Определение лимитирующей токсичности
Задачей исследования является определение и изучение лимитирующей
токсичности, а также избирательности токсического действия препарата
(преимущественное действие) в субстанции и/или в модели лекарственной
формы при рекомендуемом в клинику пути введения. Поставленную
задачу следует решать при проведении исследований по субхронической
токсичности при трех- или пятикратном ежедневном введении препарата
крысам в дозах, установленных в опытах на мышах по острой
токсичности, равных ЛД10 (МПД) и '/г МПД, при пересчете через поверхность тела
на крыс с использованием методики Freireich (приложение 1, табл. 1, 2).
Оценивается клиническая картина интоксикации во время введения
препарата и после введения. Срок наблюдения не менее 30 дней. Критериями
оценки токсичности должны быть: 1) клинический анализ крови; 2)
биохимический анализ крови; 3) клинический анализ мочи; 4)
ЭКГ-исследования; 5) поведенческие реакции.
Все исследования необходимо проводить до введения препарата (фон —
за 5 сут до начала опыта) и после введения на 1, 7, 10—15, 20, 30-е сутки
опыта. Параллельно исследуется кровь, моча, ЭКГ и поведенческие
реакции контрольных животных. Гематологические исследования должны
- 176 -

включать подсчет эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, определение
количества гемоглобина, СОЭ, а также изучение лейкоцитарной формулы.
Анализ мочи крыс рекомендуется проводить по следующим
показателям: определение диуреза (отношение выпитой жидкости к вьщеленной
моче), белка, сахара, рН. Необходимо обращать внимание на цвет мочи и
проводить микроскопию осадка. Электрическую активность сердца крыс
следует оценивать при исследовании электрокардиограмм животных в I, II
и III стандартных отведениях. Биохимические исследования крови крыс
должны включать определение следующих показателей: глюкоза, аланин-
аминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (ACT), лактатдегид-
рогеназа (ЛДГ), щелочная фосфатаза (ЩФ), билирубин, креатинин,
мочевина, холестерин, белок, альбумины, К, Na, Ca, Fe, C1. Определение
массы тела животных следует проводить на -5, 0 день до введения препарата, а
после введения препарата — не реже 1 раза в неделю. Оценка
поведенческих реакций животных должна включать следующие тесты: определение
степени подвижности животных (адинамия, гиподинамия, гиперкинезия),
изменение координации движений (атаксия, атаксия в одну или обе
стороны, перитаксис), оценка позы животных (сидит, лежит, стоит,
распластанная на животе, на спине, лежит на боку), положение хвоста (лежит, висит,
стоит трубой), состояние глазного яблока (экзофтальм), глазных щелей
(сужены, расширены) и зрачка (миоз, мидриаз), состояние шерстного
покрова (взъерошен, алопеция), способность животных сохранять неудобное
положение тела (оценка степени каталепсии). При отсутствии нарушений
по названным тестам следует констатировать нормальные поведенческие
реакции животных.
Эвтаназию животных для морфологического изучения рекомендуется
проводить после окончания введения препарата (1-е сутки) и в конце
срока наблюдения (30-е сутки). При этом необходимо проводить взвешивание
органов (печень, сердце, почки, тимус, селезенка, надпочечники,
семенники, яичники).
Количество животных должно быть достаточным для возможности
взятия промежуточного материала для морфологических исследований. Число
животных (крысы) должно быть не менее 15 в группе. В случае отсутствия
чувствительности крыс к новому препарату исследования можно
проводить на любом другом виде животных, чувствительном к изучаемому
препарату.
III.4. Биологическая стандартизация и контроль качества препарата
в субстанции и в лекарственной форме
Основной задачей биологической стандартизации является
биологический контроль качества и безопасности применения противоопухолевых
препаратов в субстанции и в лекарственной форме.
Биологический контроль качества препарата должен проводиться по
двум основным критериям: по токсичности и пирогенности.
ШАЛ. Контроль качества по токсичности
Инструментальные методы контроля (физико-химические, химические,
биохимические и др.) противоопухолевых препаратов нуждаются в
постоянном подкреплении биологическими исследованиями по следующим
- 177 -

причинам: 1) результаты контроля качества противоопухолевых
препаратов, полученные инструментальными методами, не всегда коррелируют с
результатами биологической активности этих препаратов даже в тех
случаях, когда известно строение действующего противоопухолевого вещества, и
физико-химические методы анализа достаточно чувствительны; 2)
отсутствие государственных стандартных образцов на все противоопухолевые
препараты. При инструментальных методах контроля за 100 % стандарт
условно принимают рабочий образец — субстанцию с самым высоким
содержанием действующего вещества. В связи с этим биологический контроль
противоопухолевых препаратов по токсичности является основным
арбитражным критерием оценки его биологической активности, стандартности,
стабильности, качества и безопасности применения.
Биологический контроль по токсичности рекомендуется проводить для
всех противоопухолевых препаратов независимо от рекомендуемого пути
введения. Для оценки стандартности и контроля качества проводят
исследования "острой" токсичности препарата на мышах-самцах гибридах F,
(СВА х C57Bl/6j), массой 19—21 г. Для проведения исследования
необходимо использовать 3—5 серий препарата. Для препаратов, созданных
методом биотехнологии, рекомендуется не менее 5 серий. Каждая серия
препарата независимо от других оценивается по результатам изучения
"острой" токсичности. Препарат каждой серии в субстанции или в
лекарственной форме при рекомендуемом или удобном пути введения применяется в
7 дозах мышам. Полученные данные по "острой" токсичности каждой
серии препарата сравнивают с данными по острой токсичности стандартного
вещества и сопоставляются друг с другом. Рекомендуется сравнивать
количественные критерии оценки ЛД10 (МПД) и ЛД50. В случае адекватности
полученных результатов по каждой серии можно констатировать
биологическую стандартность препаратов по токсичности.
Для проведения контроля качества лекарств по токсичности
необходимо установить дозы, способные сравнительно быстро и адекватно оценить
качество препарата, так называемые тест-дозы. Понятие "тест-доза"
сформулировано действующей ГФ XI издания. Тест-дозы противоопухолевых
препаратов обычно близки по величине к максимально переносимым.
Действующая ГФ XI издания допускает при контроле качества лекарств,
применяемых для внутривенного введения в тест-дозе по токсичности,
возможность 10 % гибели животных. Тест-дозы новых противоопухолевых
препаратов также могут предусматривать 10 % гибель животных, но, в
отличие от других препаратов, время наблюдения при проведении контроля
противоопухолевых лекарств должно быть не менее 10 дней (в среднем
10—18 дней), в то время как ГФ XI регламентирует двухдневное
наблюдение. Это связано с особенностями биологического действия
противоопухолевых препаратов, о чем говорилось раньше, в частности, с отсроченно-
стью токсического действия и наличием у них "латентного" периода в
проявлении токсичности. В связи с наличием у противоопухолевых
препаратов 2—3 "пиков" гибели, между которыми имеются определенные
временные интервалы, срок наблюдения при их тестировании необходимо
устанавливать по периоду первого "пика" гибели. Причиной его, как правило,
является неспецифическое цитотоксическое действие (до 14 дней). Для
некоторых противоопухолевых препаратов срок наблюдения после введения
тест-дозы может быть увеличен. К таким препаратам относятся препараты
пролонгированного действия и препараты с избирательным токсическим
действием (кардиотоксичность, нефротоксичность и т. д.).
Контроль качества по токсичности противоопухолевых биопрепаратов и
- 178 -

препаратов, полученных генно-инженерным путем (цитокины, иммуно-
токсины, моноклональные антитела, модифицированные алло- и аутовак-
цины и др.) проводят на двух видах животных: на 5 здоровых мышах-
самцах массой 17—22 г и на 5 морских свинках массой 250—350 г.
Биопрепараты в тест-дозе вводят внутрибрюшинно в объеме до 1 мл на мышь и
до 5 мл на морскую свинку. Если при биологическом контроле ни одно
животное из обеих групп не погибнет или не реагирует необычным
образом на препарат и в конце испытаний не весит меньше, чем до начала
тестирования, образец считается прошедшим испытание на безопасность.
Срок испытания — 7 дней (Европейская Фармакопея, 1997 г.). Контроль
качества лекарственных биопрепаратов в национальной действующей
Фармакопее XI не регламентируется.
Ш.4.2. Контроль качества по пирогенности
Необходимо проводить для всех противоопухолевых препаратов,
рекомендуемых для парентерального применения. Особенно важен контроль
качества по пирогенности для новых противоопухолевых препаратов,
созданных биотехнологическими методами. Эти препараты и некоторые
другие, обладающие специфическим свойством вызывать пирогенную
реакцию у животных, необходимо стандартизовать по пирогенности.
Рекомендуется для названных препаратов выявить дозу, при которой
специфическое пирогенное действие не проявляется. Это так называемая
максимально непирогенная доза (МНПД). Для контроля новых противоопухолевых
препаратов в субстанции (субстанция должна быть стерильной) и в
лекарственной форме по пирогенности рекомендуется использовать 3—5 серий
препарата. Для препаратов, созданных биотехнологическими методами,
рекомендуется не менее 5 серий препарата.
Каждая серия препарата при рекомендуемом парентеральном пути
введения вводится в дозе, равной '/ю-'/го °т предполагаемой суточной
лечебной дозы для человека в пересчете на массу тела кролика. Оценка пиро-
генных свойств препарата проводится по требованиям ГФ XI издания. При
отсутствии пирогенных свойств всех исследованных серий препарата
выбранную дозу следует считать тест-дозой. В дальнейшем для контроля
качества лекарства следует применять установленную тест-дозу. При
проведении контроля качества лекарств по пирогенности необходимо следовать
общим требованиям ГФ XI издания. В случае если препарат в
примененной дозе С/ю или '/го °т суточной лечебной дозы для человека) вызывает у
кроликов пирогенную реакцию, подбор доз следует проводить
эмпирически. Однако этот факт, как правило, говорит о наличии пирогенов в
препарате или о его специфическом фармакологическом действии.
Противоопухолевые биопрепараты предполагают наличие микробных
эндотоксинов, количество которых и определяет степень их частоты.
Исследования на загрязненность эндотоксинами проводят с помощью ЛАЛ
(ЬАЬ)-теста (Limulus amoebocyte lysat assay) (Европейская Фармакопея,
1997 г.) или с помощью теста на пирогенность на кроликах. При контроле
качества препаратов по пирогенности ЛАЛ-тест может быть только
дополнительным к официальному тесту на кроликах. Кроме того, исследования
in vivo на кроликах дают результаты, которые можно соотнести к человеку.
Биологический контроль качества новых противоопухолевых
препаратов по токсичности и пирогенности является основным биологическим
критерием оценки их стандартности и качества. В связи с этим рекомендо-
- 179 -

вано введение этих показателей в частные временные фармакопейные
статьи на новые противоопухолевые препараты. После окончания проведения
I фазы клинического изучения нового препарата и установления
оптимальной лечебной дозы для человека необходима коррекция тест-дозы по
пирогенности. При изменении лечебной дозы для человека в процессе II—
III фаз клинических испытаний, тест-доза по пирогенности окончательно
устанавливается при внедрении нового препарата в широкую практику.
Измененные показатели по тест-дозам вводятся в частные временные
фармакопейные статьи и фармакопейные статьи на препарат.
Исследования по программе "мини-токси" должны заканчиваться
созданием оптимальной технологичной лекарственной формы препарата.
Решение о предклиническом токсикологическом изучении нового
противоопухолевого препарата возможно только после токсикологических
исследований по программе "мини-токси". Однако не все новые препараты
успешно преодолевают I этап исследования.
Препятствовать передаче противоопухолевого препарата на II этап
доклинического изучения по "полной программе" могут следующие причины:
очень узкий диапазон "широты токсического действия" препарата, дозоне-
зависимость лимитирующей токсичности, отсутствие избирательной
токсичности, необратимость токсических эффектов, местнораздражающее
действие, нестандартность противоопухолевого препарата.
Исследование воспроизведенных противоопухолевых препаратов по
программе "мини-токси" также обязательно перед расширенным
доклиническим изучением. Основной задачей в этом случае является установление
(подтверждение) биологической идентичности воспроизведенного
препарата фирменному оригинальному препарату. Эта задача решается при
сравнительной оценке "острой" токсичности воспроизведенного препарата
в субстанции и в лекарственной форме и фирменного препарата. При
условии химической и биологической идентичности проводятся
исследования по биологической стандартизации по показателям, предусмотренным
по программе "мини-токси". Только после названных исследований
воспроизведенные препараты могут быть переданы на доклиническое
изучение безвредности. Аналогичные требования должны предъявляться и к
российским препаратам, созданным на основе импортных субстанций.
IV. Доклиническая токсикологическая оценка новых противоопухолевых
препаратов по "полной программе"
Новые противоопухолевые препараты должны поступать на предклини-
ческое исследование в окончательно выбранной лекарственной форме,
охарактеризованной по программе "мини-токси".
Для проведения доклинического токсикологического изучения
необходимы следующие сведения о новом противоопухолевом препарате:
1. Структурная и химическая формула препарата.
2. Проект временной фармакопейной статьи (ВФС) на лекарственную
форму препарата.
3. Сведения о специфической активности препарата в лекарственной
форме.
4. Преимущество препарата в данном классе соединений или его
оригинальность.
5. Оптимальные терапевтические дозы.
6. Режим и путь введения, рекомендуемые в клинику.
- 180-

7. Проявившаяся токсичность препарата у животных с опухолями в хи-
миотерапевтических опытах.
8. Лекарственная форма препарата с соответствующей документацией
(состав качественный и количественных, содержание активного вещества
во флаконе).
9. Токсикологическая характеристика по программе "мини-токси".
Основная цель доклинического токсикологического изучения новых
противоопухолевых препаратов — исследование их безвредности
(безопасности) и прогнозирование токсических и побочных эффектов у человека
при клиническом применении, передача препарата на I фазу клинических
испытаний. Достижение названной цели осуществляется решением
следующих основных задач:
1. Изучение летальности у мышей и крыс, определение ЛД50 и ЛД10
(МПД) и других параметров токсичности.
2. Изучение "острой" и "хронической" токсичности на разных видах
животных, получение данных о токсических и побочных эффектах.
Определение зависимости доза—эффект.
3. Изучение дозолимитирующей токсичности (ДЛТ). Установление
уровня токсических доз, при которых выявляется вид токсичности,
лимитирующий дальнейшее использование препарата.
4. Определение длительности и отсроченности действия препаратов.
Изучение обратимости токсических эффектов.
5. Определение степени опасности токсического действия нового
противоопухолевого препарата.
6. Определение "стартовой" безопасной дозы для человека на I фазу
клинического испытания.
Для исследования общетоксического действия новых
противоопухолевых препаратов рекомендуется использовать мышей гибридов Fj (СВА х
C57B1/6J) и крыс неинбредных и/или линии Wistar. Мыши должны быть
массой не более 25 г, крысы — не более 250 г (в среднем 120—200 г).
Кролики породы шиншилла, массой до 2,5 кг. В качестве крупных животных
(не грызунов) рекомендуется использовать собак породы английский бигл,
в возрасте не старше 2 лет, массой до 14 кг.
Для доклинического токсикологического изучения нового
противоопухолевого препарата следует использовать его в одной серии. Исследования
необходимо проводить в рекомендуемой лекарственной форме и учитывать
способ и режим применения препарата, рекомендуемые для клинического
использования.
IV. 1. Исследование "острой"токсичности
Основными задачами исследований по "острой" токсичности нового
препарата являются определение величин летальных и токсических доз для
разных видов животных и изучение токсического действия на нормальные
органы и ткани при однократном применении.
В исследованиях по "острой" токсичности должны быть использованы 2—
3 вида животных. В качестве грызунов используются мыши, крысы. В
качестве не грызунов — собаки. Препарат при однократном применении мелким
животным вводится перорально, подкожно, внутримышечно, внутривенно, в
том числе обязательно используется тот путь, который рекомендован для
клинического применения. При клинической рекомендации внутривенного
введения препарата внутрибрюшинное применение мелким животным не
- 181 -

заменит внутривенного. При клинической рекомендации перорального
применения животным препарат вводится натощак. Накануне за 12 ч
необходимо прекратить кормление животных. Крупным животным (собаки, кролики)
при однократном введении используется только тот путь, который
рекомендуется в клинику.
При изучении "острой" токсичности на мелких лабораторных животных
(мыши, крысы) необходимо определить расчетные дозы препарата: ЛД50 —
среднесмертельная доза, вызывающая 50 % гибели животных, и ЛД10
(МПД) — максимально переносимая доза, которая может вызывать до
10 % гибели животных. По возможности, следует определять и другие
критерии количественной токсичности препарата: ЛД16 — частично
смертельная доза и ЛД84, близкая к ЛД100, и условно принятая за абсолютно
смертельную дозу. Диапазон доз между ЛД16 и ЛД84 определяет широту
смертельного действия препарата. Расчетные дозы препаратов рекомендуется
устанавливать по методу Литчфильда и Уилкоксона.
Мышам в качестве исходной дозы применяется суммарная доза,
установленная в химиотерапевтических экспериментах. Количество
используемых доз должно быть не менее 7, при этом их значение увеличивается или
уменьшается в 2 раза по сравнению с предыдущей дозой. Исследования
проводятся на мышах разного пола, учитывая результаты количественной
токсичности на самках и самцах. В случае если введение препарата
животным в рекомендуемой лекарственной форме лимитируется объемом
вводимого препарата, рекомендуется дробное введение через короткие
интервалы в течение суток.
Крысам в качестве исходной дозы рекомендуется использовать дозу
ЛД10 (МПД), установленную на мышах, считая, что ЛД10 для мышей при
пересчете на поверхность тела является эквивалентной по количественной
токсичности для крыс, т. е. соответствует мышиному эквиваленту ЛД10
(МэЛДю). В случае если исходная доза велика и не соответствует МэЛД|0,
ее уменьшают в 2, 4, 6, 8 раз и т. д. Если выбранная доза для крыс
оказалась низкой, ее увеличивают в 2, 4, 6, 8 раз и т. д. Пересчет доз через
поверхность тела с помощью коэффициентов следует проводить по методу
Freireich или по методу, предложенному отечественными авторами
(приложение 1, табл. 1, 2).
Определение "острой" токсичности на крысах так же, как и на мышах,
следует проводить на самках и самцах. Для установления количественных
критериев токсичности на крысах рекомендуется использовать те же
методы, что и в опытах на мышах. Критериями оценки "острой" токсичности
на мелких лабораторных животных являются: число павших животных и
сроки гибели, определение массы тела животных, клиническая картина
интоксикации, поведенческие реакции и аутопсия павших и
умерщвленных в конце опыта животных (макроскопическая оценка).
Продолжительность наблюдения 30—60 дней в зависимости от
принадлежности препарата к классу противоопухолевых соединений, лекарственной
формы и пути введения, при условии, что токсические проявления к этому
времени исчезнут. В случае отсутствия обратимости токсических эффектов,
для наблюдения на более длительный срок формируют группу животных на
"тест обратимости". В течение всего срока наблюдения рекомендуется
ежедневно отмечать появление и развитие патологических процессов: характер
стула, изменение массы тела, состояние глаз, носа, характер дыхания,
подвижность. Первые две недели необходимо определять массу тела животных
через каждые 3 дня, затем один раз в неделю и, если наблюдение более
1 мес, в последующем взвешивание животных проводить 2 раза в месяц.
- 182-

Большое внимание должно уделяться поведенческим реакциям мелких
животных. Должна оцениваться степень возбудимости животных по
уровню двигательной активности и агрессивности; нервно-мышечной
возбудимости (спонтанный тремор, судороги, повышение мышечного
тонуса); оцениваются рефлексы "позы", "походки". Изменение этих
показателей может говорить об атаксии, миорелаксации и других нарушениях.
Состояние вегетативных эффектов оценивается по величине зрачка (ми-
оз, мидриаз), наличию или отсутствию экзофтальма. Фиксируются все
патологические изменения в поведении и клиническом состоянии
животных. Обязательным является патологоанатомическое исследование
павших и умерщвленных в конце опыта животных (макроскопическая
оценка), которое может выявить кровенаполнение органов, характер их
повреждения, изменение их формы, массы и цвета. Все эти данные могут
стать основанием для определения тропности препарата к органам и
тканям. Морфологические (гистологические) исследования органов мелких
лабораторных животных в опытах по "острой" токсичности не
предусмотрены.
При исследовании "острой" токсичности противоопухолевых
препаратов на собаках используется 2—4 уровня токсических доз: летальные
дозы (ЛД); высокие токсические дозы (ВТД), вызывающие значительные
токсические изменения в органах и тканях; низкие токсические дозы
(НТД), вызывающие слабые незначительные изменения в органах и
тканях, и высокие нетоксические дозы (ВНТД), не вызывающие нарушения
(функциональные и морфологические) в органах и тканях животных. На
каждую дозу требуется по 2—4 собаки. При обнаружении разницы в
токсическом действии препарата у мелких животных разного пола
обязательно использовать собак-самок и собак-самцов на каждую дозу
препарата. Введение препарата должно соответствовать пути, рекомендуемому
в клинику. Препарат необходимо вводить в лекарственной форме без
изменения концентрации, рекомендуемой для применения человеку. В
случае если противоопухолевый препарат рекомендован для перорального
применения, его следует вводить в желудок натощак. В качестве
исходной дозы при изучении острой токсичности препарата на собаках
рекомендуется использовать ЛД|0 (МПД), установленную в опытах на мышах,
считая, что ЛД|0 для мышей при пересчете через поверхность тела
эквивалентна дозе для собак, т. е. соответствует мышиному эквиваленту ЛД10
(МэЛДю). Одновременно для исследования необходима вторая доза, в 10
раз меньшая исходной ('/ю МэЛД|0). В зависимости от результатов
исследования исходной дозы (МэЛД10), она должна быть уменьшена, если
оказалась летальной или увеличена до токсического уровня. В том случае,
если исходная доза (МэЛД10) вызывает общетоксическое обратимое
действие, сравнимое по токсичности с МПД на мышах, а '/,0 МэЛД|0
является абсолютно безопасной, можно ограничиться для токсикологической
характеристики препарата на собаках двумя уровнями доз (ВТД = МПД
и НТД или ВНТД). В случае невоспроизводимости летальности у мышей
в качестве альтернативного вида грызунов рекомендуется использовать
крыс. В этом случае для определения доз препарата для собак
используется крысиный эквивалент ЛД10. Длительность наблюдения после
применения препарата собакам не менее 60 дней.
Критериями токсического действия препарата в опытах на собаках
являются: гибель и сроки гибели животных, клиническая картина
интоксикации, поведенческие реакции, аутопсия с гистологической оценкой.
Клиническая картина интоксикации и поведенческие реакции отмечают -
- 183 -

ся в течение всего срока наблюдения. Взвешивание собак необходимо
проводить до введения препарата (-5, -3-й и 0-й день) и после введения —
1 раз в неделю в течение 1,5 мес, а затем 1 раз в месяц. Клинические
проявления интоксикации оцениваются как по внешним проявлениям,
так и при применении клинико-лабораторных и функциональных
методов исследования. Оценивается появление и развитие внешних
симптомов интоксикации: рвота, анорексия, характер стула, состояние глаз,
носа, общее состояние, характер дыхания, пульс и частота дыхания.
Необходимо четкое описание поведенческих реакций на однократное
("острое") введение препарата: возбудимость, агрессивность, пугливость,
изменения двигательной и нервно-мышечной активности (адинамия,
гиподинамия, походка, тремор, судороги, реакция на прикосновение,
положение тела, конечностей, хвоста, тонус мышц); изменения вегетативных
реакций (величина зрачка, величина глазной щели, экзофтальм,
саливация, непроизвольная дефекация, мочеиспускание, повышенный диурез и
т. д.). При изучении "острой" токсичности на собаках оцениваются
действие препарата на периферическую кровь, функциональное состояние
сердечно-сосудистой системы, печени, почек, желудочно-кишечного
канала. Предварительно определяются фоновые показатели, считая
результаты, полученные для каждой собаки, фоновыми или исходными (за 5 и
3 дня до введения препарата). В качестве контроля используются
здоровые (интактные) собаки, которым вводят растворитель изучаемого
препарата. При гематологическом исследовании периферической крови собак
регистрируются следующие показатели: число лейкоцитов, эритроцитов,
количество гемоглобина, тромбоцитов, гематокрит, скорость оседания
эритроцитов (СОЭ), число ретикулоцитов, резистентность эритроцитов,
время свертывания крови и лейкоцитарная формула. Эти исследования
следует проводить на 3, 7, 14, 21, 30, 45, 60-е сутки после применения
препарата и перед эвтаназией животных. Функциональное состояние
сердечно-сосудистой системы оценивается с помощью
электрокардиографии (ЭКГ). Рекомендуется определять частоту сердечных сокращений
(ЧСС), время полного сокращения (R—R), время электросистолы (Q—T)
и ее сегментов (QS и ST). Полученные результаты необходимо
сравнивать с фоновыми показателями и с контрольными данными,
полученными на здоровых собаках. Необходимо сравнивать величину и форму
зубцов ЭКГ до (фон) и после введения препарата, считая контрольными
результаты, полученные для каждой собаки до начала опыта. Содержание
электролитов в сыворотке крови дает дополнительную характеристику
функциональному состоянию сердца. Электрокардиографические
исследования следует проводить на 3, 7, 30, 60-й дни после применения
препарата и перед эвтаназией животных. Функциональное состояние печени
рекомендуется определять по биохимическим показателям сыворотки
крови собак. Критериями являются: уровень щелочной фосфатазы,
активность аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы (ACT и
АЛТ соответственно), содержание билирубина и холестерина. Белоксин-
тезирующая функция печени оценивается по содержанию общего белка
и альбуминов, углеводная функция — по содержанию глюкозы в
сыворотке крови собак. Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) следует
рассматривать как критерий оценки функции печени и сердца.
Функциональное состояние почек рекомендуется оценивать по биохимическим
показателям сыворотки крови собак: содержанию мочевины и креатини-
на. По возможности следует проводить клинический анализ мочи собак.
Однако процедура взятия мочи у собак сопряжена с определенными
- 184-

трудностями. Использование для этих целей катетеров травмирует уретру
животных, что вызывает у них беспокойство и другие осложнения в
поведенческих реакциях. Исследование мочи предусматривает определение
ее количества, цвета, реакции среды (рН), белка, сахара, плотности
(удельный вес) и микроскопию осадка. Исследования мочи у собак
необязательны. Все биохимические исследования крови следует проводить
на 3, 7, 14, 21, 30, 45, 60-е сутки после применения препарата и перед
умерщвлением животных. При наблюдении за животными свыше 60
дней исследования функционального состояния органов в последующем
следует проводить 1 раз в месяц. Все противоопухолевые препараты,
рекомендуемые для внутривенного применения, должны быть исследованы
в отношении их влияния на артериальное давление. Исследование
можно проводить как бескровным методом на крысах с помощью
специальных приборов, так и кровавым методом в "остром опыте" с
использованием кошек или собак.
По возможности рекомендуется проводить офтальмологические
исследования. При офтальмологическом обследовании собак используют
визуальные и инструментальные методы. При визуальном (наружном)
обследовании обращают внимание на состояние переднего отдела глаз животных:
веки, конъюнктива, роговица, диаметр зрачков и их реакция на свет. Для
обследования глубоких сред глазных яблок (хрусталик, стекловидное тело)
и глазного яблока используют электроофтальмоскоп на волоконном
световоде и щелевую лампу (по показаниям).
Для изучения повреждающего действия на нормальные органы и
ткани необходимо проведение патологоанатомического исследования
павших и умерщвленных собак. Эвтаназию собак рекомендуется проводить
методом усыпления с применением высоких токсических доз
барбитуратов (гексенал или тиопентал натрия) с последующим их
обескровливанием. Первую эвтаназию рекомендуется проводить на 7-й день после
однократного введения препарата в каждой первоначально выбранной дозе по
одной собаке. Вторая собака должна быть умерщвлена в срок
исчезновения токсических функциональных нарушений. Если при патоморфологи-
ческом исследовании указанной собаки токсические изменения не
исчезли, то другие собаки должны наблюдаться более длительное время.
Патологоанатомические исследования включают макроскопическую
оценку органов и тканей (внешний осмотр состояния слизистых
оболочек, кровенаполнения органов, кровоизлияние, общий вид
органов, вид паренхиматозных органов на разрезе, содержимое полости) и
морфологическое (гистологическое) изучение. К числу обязательных
органов для гистологического исследования относятся: костный мозг,
сердце, вены, селезенка, лимфатические узлы, печень, легкие,
поджелудочная железа, почки, мочевой пузырь, гипофиз, головной мозг,
щитовидная железа, тимус (вилочковая железа), надпочечник, яичник,
семенники, матка, молочная железа, пищевод, желудок, двенадцатиперстная
кишка, подвздошная кишка, толстая кишка, прямая кишка, подкожная
клетчатка, мышцы, предстательная железа. Другие органы подвергаются
гистологическому изучению в случае отмеченных макроскопических
изменений.
Выбор органов для гистологического исследования определяется как
результатами вскрытия умерщвленных животных, так и результатами
токсикологических экспериментов. Гистологические исследования должны
быть сведены к разумному минимуму и представлять собой
заключительный этап токсикологических исследований.
- 185 -

IV.2. Исследование "хронической"токсичности
Основными задачами исследований по "хронической" токсичности
нового препарата являются определение уровней токсических доз для
разных видов животных и изучение токсического действия на органы и
ткани при многократном применении. В исследованиях рекомендуется
использовать два вида животных: крысы и собаки. При изучении
"хронической" токсичности необходимо использовать путь введения, который
рекомендован для клинического применения. Внутривенное введение
препарата в опытах на крысах можно заменить на внутрибрюшинное.
Выбор длительности введения препарата животным зависит от
рекомендуемой продолжительности его применения человеку и составляет
утроенную величину от длительности введения человеку. В случае
рекомендации 5-дневного применения препарата в клинике, в опытах по
хронической токсичности на животных необходимо использовать 15-дневное
введение препарата; при рекомендации 10-дневного применения
человеку—в опытах на животных 30-дневное введение препарата и т. д. При
изучении "хронической" токсичности на крысах необходимо определить
3 уровня токсических доз нового препарата, характеризующие его
токсическое действие на органы и ткани при многократном применении:
высокая токсическая доза (ВТД = МПД), низкая токсическая доза (НТД) и
высокая нетоксическая доза (ВНТД). Характеристика названных уровней
доз представлена в разделе «Исследования "острой" токсичности новых
противоопухолевых препаратов». В связи с этим исследования по
изучению "хронической" токсичности необходимо проводить на 4 группах
животных одного пола. Количество крыс в группе должно быть не менее 15
особей. Параллельно формируется контрольная группа из интактных
животных. В качестве исходной разовой дозы рекомендуется использовать
максимально переносимую дозу (МПД), полученную на крысах при
однократном применении и деленную на количество введений. Другим
группам крыс препарат следует применять в разовых дозах,
соответственно в 2 раза больше и 2 раза меньше исходной дозы. Если названные
уровни доз не удалось определить, следует проводить дополнительные
исследования, увеличивая или уменьшая вводимые дозы в 4, 6, 8 раз и
т. д. Критериями оценки "хронической" токсичности на крысах
являются: число павших животных и сроки гибели, клиническая картина
интоксикации, поведенческие реакции и аутопсия с макроскопической и
морфологической оценками. Продолжительность наблюдения не менее 60
дней. Взвешивание крыс необходимо проводить за 3 дня до введения
препарата, в день введения (0-й день) и каждые 3 дня в первые две
недели после введения препарата, затем 1 раз в неделю и в последующем — 2
раза в месяц. Внешние проявления клинической интоксикации и
изменения в поведенческих реакциях оцениваются аналогично таковым при
изучении "острой" токсичности препарата. При изучении "хронической"
токсичности на крысах оценивается действие препарата на
периферическую кровь, функциональное состояние сердечно-сосудистой системы,
печени, почек, желудочно-кишечного канала. Рекомендуется
гематологические исследования проводить на -5, 1, 7, 14, 21, 30, 45, 60-е сутки
после многократного применения препарата. При отсутствии
восстановления показателей периферической крови гематологические исследования
в дальнейшем следует проводить 1 раз в месяц и перед эвтаназией
животных. Электрокардиографические исследования функционального
состояния сердечно-сосудистой системы следует проводить на -5, 1, 15, 30,
- 186 -

45 и 60-е сутки после введения препарата и перед эвтаназией животных.
Полученные результаты необходимо сравнивать с данными контрольных
животных. Исследования по изучению влияния препарата при
многократном применении на функциональное состояние органов и тканей
крыс проводится по тестам, представленным в разделе IV. 1 (собаки).
Дополнительно к этому в опытах по изучению "хронической" токсичности
на крысах необходимо проводить исследование по влиянию препарата на
функциональное состояние почек не только по биохимическим
показателям, но обязательно предусмотрен клинический анализ мочи и изучение
влияния препарата на суточный диурез. При проведении анализа мочи
рекомендуется определять цвет, рН мочи, белок, билирубин, сахар и
оценивать микроскопию осадка. Изучение суточного диуреза — определение
соотношения выпитой жидкости и выделенной. Анализ мочи следует
проводить до введения препарата (-5), на 1 день по окончании курса
введения препарата, на 14—15-й день наблюдения, через месяц, а затем 1
раз в месяц. Для изучения повреждающего действия на органы и ткани
рекомендуется проведение патологоанатомических исследований павших
и умерщвленных животных. При этом необходимо определять массу
исследуемых органов. Фрагменты органов и тканей подвергаются
гистологическому исследованию. Крыс следует умерщвлять на 1, 30, 60-е сутки
после применения препарата. Необходимо проводить быстрое и
безболезненное умерщвление животных с помощью двуокиси углерода или
методом усыпления с применением эфирного наркоза с последующим
обескровливанием. В эти же сроки следует проводить забор крови крыс
для биохимических исследований. При отсутствии обратимости
токсического действия к 60-м суткам опыта формируется группа животных на
"тест обратимости" или "отсроченное™ токсического действия". В этом
случае сроки эвтаназии животных могут быть более поздними.
При изучении "хронической" токсичности на собаках новый
противоопухолевый препарат вводится тем путем, который рекомендуется для
клинического применения. При установлении уровней токсических доз в
качестве первоначальной дозы рекомендуется высокая токсическая доза
(ВТД), полученная при однократном применении препарата собакам и
разделенная на количество введений. Последующие дозы должны быть в
2—4 раза и т. д. ниже или выше в зависимости от результатов токсического
действия первоначально выбранной разовой дозы. На каждую дозу
рекомендуется по 4 собаки, из них 2 самки и 2 самца. Препарат необходимо
вводить в лекарственной форме без изменения концентрации.
Длительность наблюдения после последнего применения препарата не менее
60 дней.
Критериями токсического действия препарата при многократном
применении собакам являются те же, что и при однократном применении.
Особое внимание следует уделять клиническим признакам интоксикации
"хронического" отравления. Отмечать активность животного (повышенная,
адинамия, летаргия), реактивность (равнодушие, возбудимость,
агрессивность); оценивать состояние шерстного покрова (пилоэрекция, выпадение
шерсти, пятнистая шерсть, сухость, влажность, изменение цвета шерсти);
отмечать внешние изменения глаз (слезотечение, выделение секрета,
сукровичные выделения, воспаление, помутнение роговицы), зубов (цвет,
поломка, потеря), конечностей (припухлость, отек); определять характер
дыхания (учащенное, замедленное, затрудненное), слюнотечения (гипосали-
вация, гиперсаливация), мочеиспускания (цвет, частота) и дефекации
(диарея, форма стула, цвет, частота). При проведении "хронических" ис-
- 187 -

следований токсичности нового препарата следует отмечать все
возникающие изменения в поведении и клиническом состоянии животных
(кровотечения из влагалища, лактация, возникновение ран, язв, поражение
кожи, конечностей, половых органов, возникновение опухолей и т. д.).
Функциональное состояние сердечно-сосудистой системы, печени, почек
и других органов в хронических экспериментах необходимо определять,
используя те же методические подходы, что и при изучении "острой"
токсичности препарата. Для определения повреждающего действия препарата
при многократном применении на нормальные органы и ткани проводятся
патологоанатомические исследования павших и умерщвленных собак
(макроскопическая и морфологические оценки). Эвтаназию собак
рекомендуется проводить на 1-й день после последнего введения препарата в
каждой дозе по 2 собаки разного пола. Следующее умерщвление собак
следует проводить в срок исчезновения у них токсических
функциональных нарушений. Если при патологоанатомическом исследовании этих
собак, несмотря на функциональную обратимость токсического действия,
констатируют органические изменения, другие собаки должны
наблюдаться более длительное время. Набор обязательных органов, фрагменты
которых берутся на гистологическое изучение при проведении исследований
по "хронической" токсичности, тот же, что и при исследовании "острой"
токсичности.
В связи с тем, что одной из серьезных особенностей токсического
действия противоопухолевых препаратов является влияние их на центральную
нервную систему, предложен комплексный методический подход по
оценке их побочного и токсического нейротропного действия. За основу этих
подходов принята панель психофармакологических тестов, используемых
для скрининга препаратов со специфической нейротропной активностью,
включающая оценку эмоционального состояния, оценку координации
движений и мышечного тонуса с помощью тестов "горизонтальная
проволока", "вращающийся стержень", подъем вверх по сетке в затемненный отсек
(тест сохранения ориентировочного рефлекса), удерживание на
перевернутой сетке, оценку ориентировочно-исследовательского поведения и
двигательной активности в "открытом поле", потенцирование и
пролонгирование гипногенного действия барбитуратов, влияние на судорожное действие
коразола, влияние на высшие интегральные функции мозга на модели
условного рефлекса пассивного избежания (УРПИ), изучение агрессивных
реакций по методике "агрессивного поведения", оценку анальгетических
свойств, влияние на температуру тела животных по измерению ректальной
температуры.
Реакцию животных после введения противоопухолевых препаратов
рекомендуется оценивать через 30 мин, 3 ч и 1 мес.
Важным показателем, характеризующим безвредность
противоопухолевых препаратов, является степень опасности их токсического действия.
Существуют несколько критериев опасности острого и хронического
действия лекарственных веществ. Основными критериями являются "широта
терапевтического действия" (диапазон между минимальными
эффективными дозами и минимальными токсическими дозами), "широта токсического
действия" и "широта смертельного действия". Очень важным фактором,
определяющим опасность противоопухолевых лекарственных препаратов,
является кумуляция. При изучении кумулятивных свойств
противоопухолевых препаратов можно определять 3 показателя кумуляции:
1. Коэффициент кумуляции, представляющий собой отношение
суммарной среднесмертельной дозы при многократном применении к средне-
- 188-

смертельной дозе при однократном применении. Если его величина ниже
1, можно говорить о кумулятивном эффекте и высокой опасности
применения препарата при длительном воздействии;
2. Степень кумуляции — это величина, обратная коэффициенту
кумуляции, выраженная в процентах;
3. Индекс кумуляции (Ik) — информативный фактор степени опасности
препаратов, так как при его определении можно судить не только о
кумулятивных свойствах, но и об обратимости токсических эффектов.
Существуют разные способы определения индекса кумуляции препаратов, однако
для противоопухолевых препаратов рекомендуется использовать метод
В. А. Чернова:
Ik = (МПД)1-(МПД)п х ш %
(п-1)Х(МПД)п
где МПД1 — максимально переносимая доза при однократном
применении; МПДп — максимально переносимая доза при многократном
применении; п — количество введений.
Отрицательная величина Ik показывает отсутствие кумулятивных
свойств препарата и обратимость токсических эффектов.
Важным фактором, определяющим степень опасности
противоопухолевых препаратов, является коэффициент видовой чувствительности (КВЧ).
КВЧ представляет собой отношение доз, вызывающих одинаковый эффект
у наиболее устойчивого к токсическому действию вида животного к
наиболее чувствительному. Чем меньше этот коэффициент, тем меньше видовые
различия у животных и тем больше гарантии безопасности применения
препарата в клинике. Особенно важен такой подход при определении
наиболее чувствительного вида животного к противоопухолевому препарату и
экстраполяции полученных доз препарата с животных на человека при
расчете начальной ("стартовой") безопасной дозы. Резкое различие в
результатах исследования токсичности на разных видах животных может
указывать на возможность видовой чувствительности человека к данному
препарату.
Как правило, противоопухолевые препараты относятся к
высокоопасным веществам, что необходимо учитывать при расчете начальной
безопасной дозы для человека на I фазу клинических испытаний.
Для определения начальной ("стартовой") безопасной дозы нового
противоопухолевого препарата для человека рекомендуется использовать
метод расчета на основе МэЛД|0 (мышиного или крысиного эквивалента
ЛД|0), который представлен в виде схемы:
ЛД10 на мышах
мг/м2
эквивалентность
Эквивалентная
ЛД10 для собак
МэЛД10
1/10 МэЛД10
/..2
М[/м
эквивалентность
I фаза
"Стартовая" доза
для человека
710 МэЛД10
Можно использовать два других метода расчета, основанные на
определении видовой чувствительности к новому препарату. Один из них
предусматривает установление начальной безопасной дозы для человека как '/3
- 189-

от низкой токсической дозы (НТД) наиболее чувствительного вида
животного, другой — как '/10 от высокой токсической дозы (ВТД = МПД) также
от наиболее чувствительного вида животного.
Пересчет токсических доз с одного вида животных на другой с
использованием коэффициентов поверхности тела осуществляется по методу
Freireich (приложение 1, табл. 1). Эскалация начальной безопасной дозы
для человека проводится на I фазе клинических испытаний по
модифицированному методу Fibonacci.
Сопоставляя экспериментальные методы подхода по расчетам
начальных ("стартовых") безопасных доз препаратов для человека на I фазу
клинического испытания, можно определенно сказать, что метод расчета,
основанный на использовании мышиного или крысиного эквивалента ЛДШ,
выигрывает перед методом расчета, основанного на чувствительности
животных к противоопухолевым препаратам, прежде всего в меньших
отличиях экспериментальных стартовых доз от клинических МПД, что дает
преимущество в сокращении степени эскалации начальной ("стартовой")
дозы и более быстром достижении истинной МПД препарата для человека.
Надежным методом расчета начальной ("стартовой") безопасной дозы
является также метод расчета, основанный на сопоставлении концентрации
препарата в плазме крови у разных видов животных с безопасностью и
токсичностью вещества при определенной схеме клинического
применения.
Воспроизведенные противоопухолевые препараты, переданные на
доклиническое токсикологическое изучение, проходят исследования
безвредности по сокращенной программе, в соответствии с приказом МЗ СССР
№ 1636 от 18 декабря 1986 г. "О мерах по ускорению внедрения новых
лекарственных средств". Исследования тератогенности, мутагенности,
канцерогенное™, токсического действия на репродуктивность для всех новых
противоопухолевых препаратов не обязательны. Обязательной является
оценка аллергенных и иммунотоксических свойств новых препаратов,
которая должна проводиться в соответствии с действующими требованиями
ФК МЗ РФ.
По окончании исследований по доклинической токсикологии новых и
воспроизведенных противоопухолевых препаратов результаты, полученные
в ходе этих исследований, представляются в виде отчета о безвредности
препарата в ФК МЗ РФ для получения разрешения на проведение I фазы
клинических испытаний.
Литература
1. Беленький М. Л. — В кн.: Элементы количественной оценки фармакологического
эффекта. — Л., 1968.- 151 с.
2. Вихляев Ю. И., Воронина Т. А., Гарибова Т. Л. и др. Феназепам. — Киев: Наукова
думка, 1982. — 436 с.
3. Гацура В. В. Методы первичного фармакологического исследования биологически
активных веществ. — М.: Медицина, 1974. — 143 с.
4. Государственная Фармакопея СССР, XI изд. — 1992.— Т. 2.— С. 182—185.
5. Давыдов В. Ф. Вопросы медицинской токсикологии в курсе фармакологии //
Учебно-медицинское пособие. — Горький, 1982. — 73 с.
6. Методические рекомендации по изучению общетоксического действия
фармакологических средств. Утверждены 29 декабря 1997 г. // Ведомости
Фармакологического комитета. - 1998. — № 1. - С. 27—32.
7. Михайлова Л. М. Токсикология новых отечественных противоопухолевых
препаратов (экспериментальное исследование): Дис. ... д-ра мед. наук. — 1995. — 417 стр.
- 190-

8. Раевский К. С. Фармакология нейролептиков. — М.: Медицина, 1976. — 270 с.
9. Сыркин А. Б. Предклиническое исследование противоопухолевых препаратов. — В
кн.: Система создания противоопухолевых препаратов в СССР и США. — М.:
Медицина, 1977. - Т. 1. - С. 119-128.
10. Сыркин А. Б., Юшков С. Ф., Зайцева Л. А. Доклиническая оценка новых
противоопухолевых препаратов (методические подходы) // Бюлл. информации по терапии
опухолей. - 1984. - Т. X. - С. 5-22.
11. Схема разработки нового вещества. Раздел "Клинические изучения". — В сб.:
Семинар по надзору за соблюдением норм производства медикаментов / Управление
по санитарному надзору над пищевыми продуктами и медикаментами США; МЗ
РФ; Государственный Комитет по санитарному и эпидемиологическому надзору
РФ. Россия, Москва, 1993 (17—21 мая).
12. Уланова И. П., Сидоров К. К., Халепо А. И. К вопросу об учете поверхности тела
экспериментальных животных при токсикологическом исследовании / Под ред.
А. А. Летавета и И. В. Саноцкого. — Л.: Медицина, 1968. — Вып. 10. — С. 18—25.
13. Чернов В. А. Методы экспериментальной химиотерапии. — М.: Медицина, 1971. —
С. 317.
14. Boissier J. R., Simon P. Lutilisation du test de la traction Test de la (Julon-Courvoisier)
pour letunde des psycholeptigues // Therapie. — 1960. — Vol. 15, N 6. — P. 1170—1174.
15. Collins J. M., Zaharko D. S., Dedrick R. L., Chabner B. A. Potential roles for preclinical
pharmacology in phase I clinical trials // Cancer Treat. Rep. — 1986. — Vol. 70, N 1. —
P. 73-80.
16. Dunham N. W., Miya T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit
in rats // J. Am. Pharm. Ass. - 1957. - Vol. 46, N 3. - P. 208-209.
17. European pharmacopoeia. — 1997. — Bioligical test. — P. 73—101.
18. Freireich E. J., Gehan E. A. Rail D. P. et al. Quantitative comparison of toxicity of
anticancer agents in mouse, rat, hamster, dog, monkey, and man // Cancer Chemother. Rep.
- 1966. - Vol. 50, N.4. - P. 219-244.
19. Food and Drug Administration (FDA) // Guideline for the Format and Content of the
Nonclinical / Pharmacology/ Toxicology Section of an Application. U. S. Department of
Health and Human Services, Public Health Service. Food and Drug Administration. —
1987. - 27 p.
20. Food and Drag Administration. Code of Federal Regulation. Title Section 610. 11, p. 45,
CFR (1988).
21. Grieshaber С. К., Marsoni S. Relation of preclinical toxicology to findings in early clinical
trials// Treat. Rep. - 1986. - Vol. 70, N 1. - P. 65-72.
22. Haffner F. Experementelle Pruning Schmerz Stillen der Mittel // Dtsch. Med. Wschr. —
1929. - Bd 55. - S. 731-733.
23. Janssen P., Jageneau A., Niemegeers С Effects of various drugs on osolation-induced
fighting behavior of mice //J. Pharmacol. Exper. Ther. — 1960. — Vol. 129. — P. 471.
24. Lowe M. C. Large animal toxicological studies of anticancer drugs. — In: Fundamentals of
Cancer Chemotherapy. Charter 25 / K. Hellman and S. Carter, eds. — New York: Mc-
Graw Hill, 1987. - P. 236-247.
25. Lowe M. C, Davis R. D. The current toxicology protocol of national cancer institute. —
In: Fundamentals of Cancer Chemotherapy. Charter 25 / K. Hellman and S. Carter, eds.
- New York: McGraw Hill, 1987. - P. 228-235.
26. Tedeschi R., Tedeschi D., Mucha A. et al. Effects of various centrally acting drugs on
fighting behaviour of mice // J. Pharmacol. Exp. Ther. — 1959. — Vol. 125, N 1. — P. 28—
34.
27. Toman J. E. P., Ewinyard E. A., Goodman L. S. Properties of maximal seizures and their
alteration by anticonvulsant drugs and other agents // J. Neurophysiol. — 1946, N 3. —
P. 231-239.
28. Toxicology Branch Developmental Therapeutics Program Division of Cancer Treatment
National Cancer Institute // Preclinical toxicology procedures, bibliography, references
and protocols for the evaluation of new therapies to treat cancer and AIDS. — 1992. —
P. 1-4.

Приложение 1
Таблица 1. Коэффициенты пересчета доз (в мг/кг на мг/м2) для мыши, крысы,
обезьяны, собаки и человека в зависимости от массы тела [Frelreich E. J., 1966]
Вид животного
Мышь
Крыса
Обезьяна
Собака
Человек
Масса тела
(кг)
0,018
0,020
0,022
0,024
0,050
0,070
0,080
0,100
0,150
0,200
0,250
2,0
2,5
3,0
6,0
7,0
8,0
9,0
5,0
10,0
20,0
40,0
60,0
70,0
80,0
Площадь поверхности тела (м2)
0,0062
0,0066
0,0071
0,0075
0,0122
0,0153
0,0167
0,0194
0,0254
0,0308
0,0357
0,188
0,217
0,244
0,344
0,369
0,404
0,437
0,26
0,44
0,80
1,30
1,62
1,80
1,96
Коэффициент пересчета
2,9
3,0
зд
3,2
4,1
4,6
4,8
5,2
5,9
6,5
7,0
10,6
11,5
12,3
18,0
19,0
19,8
20,6
19,0
23,0
25,0
31,0
37,0
39,0
41,0
Таблица 2. Таблица коэффициентов для пересчета доз в мг/кг на мг/м2для разных
видов животных в зависимости от массы тела [Уланова И. П. и др., 1968]
Вид животного
Мышь
Крыса
Масса тела (кг)
0,018
0,020
0,022
0,024
0,050
0,070
0,080
0,100
0,150
0,200
0,250
Коэффициент пересчета
2,9
3,0
3,1
3,2
4,1
4,6
4,8
5,2
5,9
6,5
7,0
- 192-

Продолжение
Вид животного
Морская свинка
Кролик
Собака
Масса тела (кг)
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
10,0
11,0
12,0
13,0
14,0
15,0
Коэффициент пересчета
4,0
4,8
5,6
6,4
7,2
10,9
12,8
14,7
16,6
18,5
21,6
22,2
23,6
23,9
24,2
24,8
Дозы препарата, рассчитанные на единицу поверхности тела, часто
близки для разных видов животных. Исходя из этого, умножив величину
дозы в мг/кг на коэффициент для данного вида животных с определенной
массой тела, получим дозу в мг/м2. Чтобы вычислить дозу в мг/кг для
другого вида, следует найденную величину разделить на коэффициент этого
вида с известной массой тела.
Пример: известна МПД для мышей с массой тела 20 г — 50 мг/кг.
Для собаки с массой тела, равной 10 кг, эта доза будет равна:
50 мг/кг х 3 (коэф. для мышей)
2^6 (коэф. для собак) = 6'94 мт^кг-
Приложение 2
Протокол № 1
"Острая" токсичность противоопухолевых препаратов на мелких
лабораторных животных (мыши, крысы)
1. Наименование препарата
2. Название организации заказчика
3. Наименование организации, проводящей испытания
4. Дата начала испытания. Дата окончания испытания
I. Описание исследуемого вещества (препарата), растворителя.
1. Наименование исследуемого вещества, характеристика. Состав
лекарственной формы, (проект ВФС) на лекарственную форму,
характеристика вспомогательных веществ.
Предварительные результаты по стабильности в условиях введения
животным. Условия хранения вещества.
2. Наименование контрольного вещества, растворителя.
Вспомогательные вещества, входящие в состав лекарственной формы;
7- 762
- 193 -

применяемые растворители. Разрешение на их применение в медицинской
практике.
3. Дозы, концентрации вводимого вещества (препарата), объемы
растворов препарата. Пути введения. Длительность наблюдения.
II. Животные.
Используют мышей-гибридов Fl (CBA x C57B1/6J) и крыс неинбредных
и/или линии Wistar. Мыши должны быть массой 18—25 г, в возрасте 6—8
недель, крысы — не более 250 г, в возрасте 8—12 недель. Фиксируется
наименование и адрес поставщика, дата получения животных и метод
маркировки. Животные должны содержаться в специальных просторных клетках,
сделанных из материала, удобного для поддержания чистоты и
стерилизации, а также удобных для раздачи корма и подачи воды. Количество
животных определяется размером клетки и пространством для их свободного
передвижения. Для кормления мышей и крыс используется специальный
стандартный, промышленный и сертифицированный сухой корм для
грызунов с установленным сроком годности. Вода должна быть сырой, чистой
и находиться в закрытых удобных поилках. Обеспечение кормом и водой
должно быть по потребностям животных. Пища и вода не должны
содержать посторонних примесей, так как они могут повлиять на результаты
исследования препарата.
До начала исследований (время начала проведения эксперимента
фиксируется) мыши и крысы должны обязательно пройти карантин в течение
7—14 дней. Профилактическое или терапевтическое лечение животных в
течение всего периода карантина недопустимо. Только здоровые животные
могут быть использованы в токсикологических экспериментах. В период
карантина необходимо строго следить за количеством съеденного корма и
выпитой воды, так как это является основным показателем состояния
здоровья животных. Оцениваются также поведенческие реакции животных, их
масса и температура тела.
III. Схема исследования.
Количество используемых доз препарата должно быть не менее 7.
Методом случайной выборки формируют 8 групп животных (мыши, крысы).
Не менее 6 животных в каждой группе на каждую дозу (мыши) и не менее
5 животных в каждой группе на каждую дозу (крысы) и 1 — контрольная
группа. Такие исследования проводят отдельно на мышах (крысах) самцах
и мышах (крысах) самках, т. е. на животных разного пола, учитывая
результаты "острой" токсичности в зависимости от пола животных. Дозы
препаратов рассчитывают, исходя из массы тела животных, по методике,
описанной в "Методических рекомендациях" п. IV. 1.
IV. Параметры оценки "острой" токсичности:
1. Количество и сроки гибели животных, "пики" гибели, характерные
для исследуемого препарата.
2. Клиническая картина интоксикации. Оценивают внешние
проявления токсичности, прежде всего — массу тела. Рекомендуется
взвешивать животных перед введением препарата за 5 или 3 дня и в день
введения (0 день), затем после введения препарата — первые 2 недели
1 раз в 3 дня, затем 1 раз в неделю в течение 1 месяца, в
последующем — 2 раза в месяц.
Регистрируют изменения в поведенческих реакциях: возбудимость,
характер этой возбудимости; двигательную активность, болевую реакцию,
эмоциональную реакцию, изменение мышечного тонуса (миорелаксация
или повышение мышечного тонуса). Оценивают безусловные рефлексы:
"рефлекс норки", "рефлекс позы". Исследователь фиксирует все токсиколо-
- 194-

гические изменения в поведении и клиническом состоянии животных:
саливация, диарея, сукровичные выделения, пилоэрекция, почесывание,
адинамия, конъюнктивит, экзофтальм, состояние глаз, носа, характер
дыхания, подвижность и другие.
3. Патологоанатомическое вскрытие павших и умерщвленных по
окончании исследования животных (мыши, крысы).
В исследованиях по "острой" токсичности предусмотрена только
макроскопическая (визуальная) оценка состояния органов и тканей мелких
лабораторных животных. Эвтаназия мышей и крыс проводится методом
применения диоксида углерода или методом усыпления эфиром.
Полученные в исследованиях данные должны быть представлены в виде
предварительного отчета и переданы руководителю исследования для
переработки при оформлении заключительного отчета по безвредности
противоопухолевого препарата.
Протокол № 2
"Хроническая" токсичность противоопухолевых препаратов
на крысах-самцах
1. Наименование препарата
2. Название организации заказчика
3. Наименование организации, проводящей испытания
4. Дата начала испытания. Дата окончания испытания
I. Описание исследуемого вещества (препарата), растворителя
1. Наименование исследуемого вещества, характеристика. Состав
лекарственной формы, (проект ВФС) на лекарственную форму,
характеристика вспомогательных веществ.
Предварительные результаты по стабильности в условиях введения
животным. Условия хранения вещества.
2. Наименование контрольного вещества, растворителя.
Вспомогательные вещества, входящие в состав лекарственной формы;
применяемые растворители. Разрешение на их применение в медицинской
практике.
3. Концентрация вводимого препарата. Путь введения, режим введения.
Разовая (суммарная) доза. Длительность наблюдения.
II. Животные
Крысы-самцы неинбердные или породы Wistar массой 150—200 г в
возрасте 8—12 нед. Фиксируется дата получения животных, название
питомника, метод маркировки.
Животные должны содержаться в специальных просторных клетках,
сделанных из материала, удобного для поддержания чистоты и
стерилизации, а также удобных для раздачи корма и подачи воды. Количество
животных определяется размером клетки и пространством для их свободного
передвижения.
Для кормления мышей и крыс используется специальный
стандартный, промышленный и сертифицированный сухой корм для грызунов с
установленным сроком годности. Вода должна быть сырой, чистой и
находиться в закрытых удобных поилках. Обеспечение кормом и водой
должно быть по потребностям животных. До начала исследования крысы
должны обязательно пройти карантин в течение 7—14 дней.
Профилактическое или терапевтическое лечение животных в течение всего периода
карантина недопустимо. Только здоровые животные могут быть исполь-
7*
- 195-

зованы в токсикологических экспериментах. В период карантина
необходимо строго следить за количеством съеденного корма и выпитой воды,
так как это является основным показателем состояния здоровья
животных. Оцениваются также поведенческие реакции животных, их масса и
температура тела.
III. Схема исследования
Количество используемых доз препарата должно быть не менее 3.
Методом случайной выборки формируются 4 группы по 15 животных на
каждую дозу и одна контрольная группа.
Дозу препаратов рассчитывают, исходя из массы тела животных в день
введения препарата (0-й день) (см. "Методические рекомендации" п. IV.2).
Группы
I. Контроль
II.
III.
IV.
Доза
препарата (мг/кг)
0
0
Количество
животных в
группе
15
15
15
15
Эвтаназия животных по срокам (дни)
1
5
5
5
5
30
5
5
5
5
60
5
5
5
5
При повышенной чувствительности к препарату крыс-самок по
результатам "острой" токсичности, "хроническую" токсичность аналогичным
образом проводят на крысах самках.
IV. Параметры оценки "хронической" токсичности
Клиническая картина интоксикации и физиологические исследования
Ежедневное наблюдение за состоянием животных.
Оценивается появление и развитие внешних симптомов интоксикации:
рвота, анорексия, характер стула, состояние глаз, носа, общее состояние,
характер дыхания, пульс и частота дыхания; возбудимость, агрессивность,
пугливость, изменение двигательной и нервно-мышечной активности
(адинамия, гиподинамия, изменение, походки, тремор, судороги, реакция
на прикосновение, положение тела, конечностей, хвоста, тонус мышц);
изменения вегетативных реакций (величина зрачка, величина глазной щели,
экзофтальм, саливация, непроизвольная дефекация, мочеиспускание,
повышенный диурез и т. д.).
Массу тела регистрируют на 5, 0, 1, 3, 7, 10, 14, 21, 30, 45, 60-й дни.
ЭКГ исследования проводят за 5 дней перед введением препарата, затем
на 1—3, 14, 30, 60-е сутки после окончания курса введения.
Параметры (I, II, III стандартные отведения):
частота сердечных сокращений ЧСС (уд/мин),
время полного сокращения RR (сек),
время электросистолы QT (сек),
сегмент QS (сек),
сегмент ST (сек),
качественная оценка.
Клинический анализ мочи проводят на —5, 1, 14, 30, 60 сутки
наблюдения.
Параметры: цвет, белок, сахар, рН, микроскопия осадка, суточный
диурез с учетом выпитой воды.
Для клинического анализа крови отбирают кровь из хвостовой вены
или из ретроорбитального синуса до начала исследования (—5, день) и 1,
30, 7, 14, 21, 30, 45, 60 дни после многократного введения.
- 196-

Для биохимического анализа кровь берут в дни умерщвления животных
на 1, 30 и 600 сутки опыта. В случае необходимости кровь для
биохимического исследования берут, пунктируя сердце. Кровь собирают утром
натощак.
Параметры клинического анализа крови: Параметры биохимического анализа крови:
гемоглобин (г/л), глюкоза (ммоль/л),
эритроциты (1000000 ммЗ), мочевина (ммоль/л),
лейкоциты (1000 ммЗ), креатинин (мкмоль/л),
формула крови (абс. и относит.), билирубин (мкмоль/л),
тромбоциты (1000 ммЗ), общий белок (г/л),
ретикулоциты (%), альбумин (г/л),
гематокрит (%), аланиновая кислота (АЛТ, Е./л),
аспарагиновая кислота (ACT, Е./л),
лактатдегидрогеназа (ЛДГ),
щелочная фосфатаза (Е./л),
натрий (ммоль/л),
калий (ммоль/л),
кальций (ммоль/л),
железо (мкмоль/л).
Если крысу умерщвляют в атональном состоянии, то перед эвтаназией
обязательно берут кровь для клинического и биохимического анализов.
IV. Процедура умерщвления животных (эвтаназия)
На 1 день после многократного исследования умерщвляют по 5
животных с наиболее выраженными клиническими симптомами из каждой
группы. Следующий срок —30 и 60 дни, если по ходу исследования не
выяснится необходимость его продолжения (например, при отсутствии
обратимости токсических эффектов). Эвтаназия проводится методом усыпления
крыс с применением эфирного наркоза с последующим их
обескровливанием. Накануне (за 24 часа) отбирают корм.
Перед умерщвлением измеряют массу тела, снимают ЭКГ и берут
пробы крови. При вскрытии следует провести полное паталогоанатомическое
обследование.
При внеплановом умерщвлении животного в атональном состоянии
эвтаназия по возможности должна проводиться по той же схеме, что и
плановая. Если крыса умерла и обнаружена в нерабочее время, то ее следует
вскрыть по возможности быстрее, и до вскрытия труп держать в
холодильнике (не более 24 часов). Крысу взвешивают и проводят забор тканей и
фрагментов органов, несмотря на аутолиз.
Приводится список тканей (см. Протокол № 5), которые исследуют,
отбирают и фиксируют в холодном нейтральном 10% формалине. Помимо
указанных в списке, отбирают и фиксируют любые ткани, имеющие
выраженные изменения. Ткани заливают в парафиновые блоки для
микроскопического исследования.
Для микроскопического (гистологического) исследования получают
срезы толщиной 5 мк, которые окрашивают гематоксилин-эозином.
Исследования должен проводить патоморфолог, который оценивает
результаты патологоанатомического исследования изучаемой ткани. Все
выявленный изменения классифицируют как связанные с действием препарата,
так и для каждого изменения определяется наиболее точный патоморфоло-
гический диагноз, включающий характер и степень тяжести повреждения
органов и тканей.
Полученные результаты должны быть проанализированы
исследователем-токсикологом совместно с патоморфологом и оформлены в виде
предварительного отчета по каждой крысе в отдельности. Предварительный от-
- 197-

чет передается руководителю исследования для доработки и
редактирования при оформлении заключительного отчета по безвредности
противоопухолевого препарата.
Протокол № 3
"Острая ("хроническая") токсичность противоопухолевых препаратов
на собаках "английский бигл"
1. Наименование препарата
2. Наименование организации заказчика
3. Наименование организации, проводящей испытания
4. Дата начала испытания. Дата окончания испытания
I. Описание исследуемого препарата
1. Наименование исследуемого вещества, характеристика. Состав
лекарственной формы, (проект ВФС) на лекарственную форму,
характеристика вспомогательных веществ. Предварительные результаты по
стабильности в условиях введения животным. Условия хранения
вещества.
2. Наименование контрольного вещества, растворителя.
Вспомогательные вещества, входящие в состав лекарственной формы;
применяемые растворители. Разрешение на их применение в медицинской
практике.
3. Концентрация вводимого препарата. Путь введения, режим введения,
Разовая (суммарная) доза. Длительность наблюдения.
П. Животные
Используются собаки-биглы — самки и самцы в возрасте 8 мес. — 2
года и массой 7—14 кг.
Собаки должны содержаться поодиночке в клетках из нержавеющей
стали и получать корм следующего состава (минимальное содержание):
белок - 20 %
жиры — 5 %
влажность — 10 %
водо- и жирорастворимые витамины и минеральные соли в
достаточном количестве.
Корм должен быть сухим, в брикетах или крупного помола,
промышленного производства и сертифицирован. Кормление собак проводится 1
раз в день. Перед кормлением собак выгуливают не менее 2 ч. Воду дают в
избытке. Пища и вода не должны содержать посторонних примесей, так
как они могут повлиять на результат исследования.
До измерения исходных показателей собаки должны пройти карантин
минимум в течение 14 дней. Не позже, чем через 7 дней после получения
собак необходимо провести полное обследование их состояния, включая
измерение массы тела, ректальную температуру, анализ кала на наличие
паразитов и клинический и биохимический анализ крови (клиническая
патология). При выявлении глистов собаку необходимо пролечить,
применяя препарат, одобренный ответственным исполнителем исследования. В
этом случае от момента окончания лечения до введения первой дозы
исследуемого препарата должно пройти не менее 4 недель.
III. Схема исследования
Методом случайной выборки формируют 4 группы по 4 животных с
равным количеством самок и самцов; 1 группа получает растворитель
(контроль), а 3 другие — 3 дозы исследуемого препарата. По 2 собаки
- 198 -

(самка и самец) умерщвляют на 7 и 60 дни после однократного
применения ("острая" токсичность) и на 1 и 60 день — после многократного
применения препаратов ("хроническая" токсичность). Дозы рассчитывают,
исходя из массы тела собаки в день введения препарата (см. "Методические
рекомендации" пп. IV. 1., IV.2).
Клиническая картина интоксикации и физиологические
исследования.
Оценивают поведенческие реакции и клиническую картину
интоксикации. Отмечают активность животного (повышенная, адинамия, летаргия),
реактивность (равнодушие, возбудимость, агрессивность); состояние
шерстного покрова (пилоэрекция, выпадение шерсти, пятнистая шерсть,
сухость, влажность, изменение цвета шерсти); внешние изменения глаз
(слезотечение, выделение секрета, сукровичные выделения, воспаление,
помутнение роговицы), зубов (цвет, поломка, потеря), конечностей
(припухлость, отек); определяют характер дыхания (учащенное, замедленное,
затрудненное), слюнотечения (гипосаливация, гиперсаливация),
мочеиспускания (цвет, частота) и дефекации (диарея, форма стула, цвет, частота).
Следует отмечать все возникающие изменения в поведении и клиническом
состоянии животных (кровотечения из влагалища, лактация,
возникновение ран, язв, поражение кожи, конечностей, половых органов,
возникновение опухолей и т. д., клиническая картина интоксикации). Температуру
тела определяют до введения препарата (5-й, 3-й дни) и на 3, 15, 30 и 60
дни после введения препарата.
Массу тела регистрируют на 5-й, 3-й и 0 дни до начала исследований
(исходные показатели), 3, 7, 14, 21, 30, 45 и 60 дни после введения
препарата и перед эвтаназией собаки.
Клинические симптомы регистрируют на 5-й и 3-й дни до начала
исследования (исходные показатели), сразу после введения препарата, через
30 мин, 3 часа и затем ежедневно или в соответствии с клинической
картиной интоксикации.
Потребление пищи и воды регистрируют количественно до начала
исследования (исходные показатели), и затем ежедневно в ходе
исследований.
ЭКГ-исследования проводят до введения препарата на 5-й и 3-й дни
(фоновые показатели) и после однократного введения на 3, 7, 30, 45 и 60
дни, а после многократного введения на 1, 3, 7, 30, 45 и 60 дни
наблюдения и перед эвтаназией собак.
Параметры (I, II, III стандартные отведения и AVL, AVR, AVF):
ритм и частота сердечных сокращений ЧСС (уд/мин),
время полного сокращения RR (сек),
время электросистолы QT (сек),
сегмент QS (сек),
сегмент ST (сек),
качественная оценка.
Офтальмологические исследования проводят на 5-й (3-й) дни до
введения препарата и на 3, 15, 30 и 60 дни наблюдения после однократного
применения и на 1, 15, 30 и 60 дни после многократного применения
препарата.
Параметры:
Наружное визуальное обследование состояния переднего отдела глаз
животных.
Наружная офтальмоскопия и обследование глубоких сред глазных яблок
(по показаниям).
_ 199-

Для клинического и биохимического анализов крови отбирают кровь до
начала исследования (5-й, 3-й дни) на 3, 7, 14, 21, 30, 45 и 60 дни после
однократного и 3, 7, 14, 21, 30, 45 и 60 дни после многократного введения.
Кровь собирают утром натощак.
Параметры клинического анализа крови: Параметры биохимического анализа крови:
Время свертывания (мин) Глюкоза В (ммоль/л)
Гематокрит (%) Мочевина (ммоль/л)
СОЭ мм/час Креатинин (ммоль/л)
Гемоглобин (г/л) Билирубин О (ммоль/л)
Эритроциты (1000000/ммЗ) Белок общий (г/л)
Тромбоциты (1000/ммЗ) Альбумин (г/л)
Лейкоциты (1000/ммЗ) АЛТ (Е/л)
Формула крови (в абс.) ACT (Е/л)
и на 100 клеток ЛДГ (Е/л)
Ретикулоциты (%) Щел. фосфатаза (Е/л)
Натрий (ммоль/л)
Калий (ммоль/л)
Кальций (ммоль/л)
Железо (мкмоль/л)
Если собаку умерщвляют в атональном состоянии, то перед
эвтаназией обязательно берут кровь для клинического и биохимического
анализов.
IV. Процедура умерщвления животных (эвтаназия)
На 7-й день после однократного и 1 день после многократного
исследования умерщвляют по 2 животных с наиболее выраженными
клиническими симптомами (самку и самца) из каждой группы. Остальных
умерщвляют на 60-й день, если по ходу исследования не выяснится необходимость
его продолжения (например, при отсутствии обратимости токсических
эффектов). Умерщвление проводится методом усыпления собак с
применением барбитуратов в токсических дозах с последующим их
обескровливанием.
Эвтаназию проводят утром натощак, и перед умерщвлением измеряют
массу тела, температуру, снимают ЭКГ и берут пробы крови. При
вскрытии следует провести полное патологоанатомическое обследование,
которое должно проводиться патологоанатомом в присутствии токсиколога.
Если собака умерла в нерабочее время, до вскрытия ее труп следует
держать в холодильнике (не более 24 ч). Собаку взвешивают, проводят
вскрытие, забор тканей и фрагментов органов, несмотря на аутолиз.
Приводится список тканей (см. Протокол № 5), которые исследуют,
отбирают и фиксируют в холодном нейтральном 10% формалине. Помимо
указанных в списке, отбирают и фиксируют любые ткани, имеющие
выраженные изменения. Ткани заливают в парафиновые блоки для
микроскопического исследования.
Для микроскопического гистологического исследования получают
срезы толщиной 5 мк, которые окрашивают гематоксилин-эозином.
Исследования должен проводить патоморфолог, который оценивает результаты па-
тогистологического исследования изучаемой ткани. Все выявленные
изменения классифицируют как связанные или не связанные с действием
препарата, и для каждого изменения определяется наиболее точный патомор-
фологический диагноз, включающий характер и степень тяжести
повреждения органов и тканей.
Полученные результаты должны быть проанализированы
исследователем-токсикологом совместно с патоморфологом и оформлены в виде
предварительного отчета по каждой собаке в отдельности. Предварительный
- 200 -

отчет передается руководителю исследования для доработки и
редактирования при оформлении заключительного отчета по безвредности
противоопухолевого препарата.
Протокол № 4
Влияние противоопухолевых препаратов на функциональное состояние
центральной нервной системы (ЦНС)
1. Наименование препарата
2. Наименование организации заказчика
3. Наименование организации, проводящей испытания
4. Дата начала испытания. Дата окончания испытания
I. Описание исследуемого препарата
1. Наименование исследуемого вещества, характеристика. Состав
лекарственной формы, (проект ВФС) на лекарственную форму,
характеристика вспомогательных веществ. Предварительные результаты по
стабильности в условиях введения животным. Условия хранения вещества.
2. Наименование контрольного вещества, растворителя.
Вспомогательные вещества, входящие в состав лекарственной формы;
применяемые растворители. Разрешение на их применение в медицинской
практике.
3. Дозы, концентрация вводимого препарата. Путь введения.
II. Животные
Используются мыши гибриды F1 (СВА х C57B1/6J) самцы массой 18—
25 гр, линейные мыши C57B1/6J самцы, массой 17—24 гр; неинбредные
крысы-самцы массой до 250 гр и крысы линии Wistar — самцы, массой
120-200 гр.
III. Схема исследования
Противоопухолевые препараты следует применять животным в
рекомендованной для клинического применения лекарственной форме при
рекомендуемом пути введения, однократно. В качестве контрольных
животных используют интактных мышей и крыс, а также животных, получавших
растворитель. Противоопухолевые препараты исследуют в летальных
(ЛД50), максимально-переносимых (МПД) и нетоксических дозах (1/10
МПД). Растворитель вводят контрольным животным в том же объеме, что
и животным в опыте. Реакцию животных на введение препарата
наблюдают через 30 мин, 3 ч и 1 мес (при пролонгированном действии
препаратов). Каждое животное оценивают по тестам психофармакологического
скрининга в отдельности.
Параметры:
Оценка эмоционального состояния. Эмоциональные реакции (мыши)
оценивают по методу, предложенному Brady и Nauta.
Исследуемые показатели: реакция на захват рукой; реакция на
приближение руки; реакция на приближение предмета к носу; реакция на
подталкивание предмета сзади; мышечный тонус; вокализация; дефекация; ури-
нация. Реакция животных оценивается по 4-балльной шкале: 0 —
отсутствие реакции, 3 — максимальная реакция, 1 и 2 — промежуточная
выраженность. При оценке по показателям "вокализация", "дефекация" и "ури-
нация" подсчитывается число звуков, болюсов и капель мочи.
Оценка координации движения ("горизонтальная проволока"). Для
оценки координации движений и возможного миорелаксантного действия
противоопухолевых препаратов мышей помещают передними конечностя-
- 201 -

ми на горизонтально натянутую проволоку на высоте 40 см. Учитывают
число животных в процентах в группе, зацепившихся за проволоку хотя бы
одной задней конечностью в течение 3 минут и сохранивших "рефлекс
подтягивания".
"Вращающийся стержень". Для оценки координации движений и
возможного миорелаксантного действия препаратов мышей помещают на
стержень диаметром 2 см, вращающийся со скоростью 5 об/мин.
Учитывают число животных в процентах в группе, удержавшихся на стержне в
течение 2 минут.
Подъем вверх по сетке в затемненное отделение. Для выявления
возможного седативного эффекта (депримирующего) препаратов мышей
помещают в освещенный отсек установки. Учитывают число животных в
процентах, зашедших вверх по наклонной под углом 60 градусов сетке в
затемненное отделение в течение 5 мин. Оценка сохранения
"ориентировочного рефлекса".
Удерживание на перевернутой сетке. Для выявления возможного
миорелаксантного эффекта препаратов мышей сажают на металлическую сетку
и переворачивают ее так, что животное оказывается вниз спиной.
Учитывают число мышей в процентах в группе зацепившихся и удержавшихся на
сетке в течение 1 минуты.
"Открытое поле". Для оценки ориентировочно-исследовательского
поведения и двигательной активности мышей помещают в ярко освещенную
камеру размером 40 х 40 см, окрашенную светлой краской. Пол камеры
разделен на 16 квадратов с 16 отверстиями диаметром 3 см каждое.
Спонтанную локомоторную активность животных за 2 минуты оценивают по
числу пересеченных квадратов (горизонтальная двигательная активность), —
критерием пересечения считают переход в соседний квадрат всеми
четырьмя лапами, — и по числу вертикальных стоек.
Ориентировочно-исследовательское поведение оценивают по числу вертикальных стоек и числу загля-
дываний в отверстия.
Потенцирование и пролонгирование гипногенного действия
барбитуратов. Мышам вводят гексенал в дозах 50 мг/кг (потенцирование) и 75 мг/кг
(пролонгирование) или тиопентал натрия в дозе 15 мг/кг
(потенцирование) и 30 мг/кг (пролонгирование) внутрибрюшинно. Учитывают число
животных в процентах, принявших боковое положение, время принятия
бокового положения и его длительность.
Влияние на судорожное действие коразола. Для оценки влияния
препаратов на судорожную готовность ЦНС мышам подкожно вводят коразол в
дозе 50 мг/кг. Учитывают число животных, у которых наблюдается
судорожная реакция, латентное время ее развития и характер судорог (наличие
только клонических или как клонических, так и тонических).
Температура тела. Ректальную температуру измеряют с помощью
медицинского электротермометра ТПЭМ-1.
Агрессивность. Оценку агрессивности производят по методике Tedeschi.
Пару мышей или крыс помещают в прозрачную камеру с
электропроводным полом, на который 2 минуты подают электрический ток силой 0,45
тА. Агрессивность оценивают по числу "драк" (укусов и столкновений в
вертикальной стойке).
Влияние на болевое раздражение. Врожденную оборонительную
реакцию мышей на защемление корня хвоста специальным зажимом
оценивают по модифицированной методике Haffher, используя 4-балльную шкалу:
0 — отсутствие реакции, 1 — вздрагивание, 2 — пробежка вперед, 3 —
скручивание к основанию хвоста и кусание зажима.
-202-

Влияние на высшие интегральные функции мозга на модели УРПИ
(условный рефлекс пассивного избегания). Выработка УРПИ основана на
врожденном стремлении мышей и крыс к ограниченному замкнутому
пространству (норковый рефлекс). УРПИ вырабатывают по
модифицированной методике Bures и Buresova. Экспериментальная камера для мышей
состоит из 2-х отделений, большего, освещенного (с прозрачными стенками)
размером 125 х 135 х 190 мм, и меньшего, затемненного, размером
90 х 100 х 180 мм с электропроводным полом. Мышь помещают в центр
освещенного отделения хвостом к перегородке с отверстием, которая
разделяет большее отделение от меньшего. Найдя отверстие в перегородке,
мышь переходит из освещенного отделения в затемненное. В течение 3
минут регистрируется общее время пребывания животного в меньшем
отделении и время первого захода в него. По истечении 3 мин в момент,
когда мышь находится в затемненном отделении, ей через пол наносят
электроболевое раздражение силой 0,45 тА до тех пор, пока животное не
выбегает в освещенное отделение. Если в течение 10 с мышь не возвращается
в затемненное отделение, ее удаляют из камеры и возвращают в клетку,
если же заходит, повторно наносят электроболевое раздражение.
Сохранность УРПИ тестируется через 24 ч после его выработки, помещая мышь в
освещенное отделение. При оценке сохранности УРПИ учитывают число
животных в процентах, зашедших в затемненный "опасный" отсек камеры
за 3 мин наблюдения, время первого захода в него, общее время
пребывания в нем при тестировании, разницу во времени пребывания животного в
затемненном отделении до выработки УРПИ и при его тестировании (At).
Чем лучше помнит животное о нанесенном в затемненной отделении
электроболевом раздражении, тем меньше времени оно находится в темноте,
тем больше латентное время первого захода в "опасное" отделение, тем
больше At, и тем меньше животных зайдет в "опасное" затемненное
отделение камеры.
На основании полученных результатов должна быть дана оценка
характера действия противоопухолевого препарата на ЦНС. При оценке нейро-
токсических свойств противоопухолевых препаратов необходимо также
учитывать результаты, полученные при изучении их общетоксических
свойств, в частности, изменение поведенческих реакций у разных видов
животных (мыши, крысы, кролики, морские свинки и собаки).
Полученные результаты должны быть оформлены в виде
предварительного отчета и переданы руководителю исследования. Предварительный
отчет после доработки будет использован при оформлении заключительного
отчета по безвредности противоопухолевого препарата.
Протокол № 5
Патоморфологическое исследование органов и тканей животных
1. Наименование препарата
2. Наименование организации заказчика
3. Наименование организации, проводящей испытания
4. Дата начала испытания. Дата окончания испытания
I. Характеристика препарата
Наименование препарата. Состав лекарственной формы.
Вспомогательные вещества, растворитель. Концентрация препарата, путь
введения, режим применения, дозы (разовая и суммарная). Длительность
наблюдения.
- 203 -

II. Животные
1. Вид животного, масса, пол. Метод эвтаназии.
2. Данные функциональных изменений со стороны органов и систем
животного.
3. Результаты патоморфологического изучения изменений внутренних
органов и тканей оформляются для каждого животного в отдельности.
III. Схема патоморфологического исследования
1. Макроскопическая оценка внутренних органов и тканей животных.
Включает внешний осмотр состояния слизистых, кровенаполнение
органов, кровоизлияния, общий вид органов, их форму, вид
паренхиматозных органов на разрезе, содержимое полостей, а также осмотр каждого
органа в отдельности, определение его массы и повреждений (сильные,
умеренные, без особенностей).
Обязательными органами для определения их массы (абсолютное
значение и относительное) являются сердце, печень, почки, селезенка,
надпочечники, семенники, матка, щитовидная железа.
2. Гистологические исследования
Выбор органов для гистологического исследования определяется как
результатами вскрытия умерщвленных животных, так и результатами
токсикологических экспериментов. К числу обязательных органов для
гистологического исследования относятся: костный мозг, сердце, вены,
селезенка, лимфатические узлы, печень, легкие, поджелудочная железа, почка,
мочевой пузырь, гипофиз, головной мозг, щитовидная железа, тимус (ви-
лочковая железа), надпочечник, яичник, семенники, матка, молочная
железа, пищевод, желудок, двенадцатиперстная кишка, подвздошная кишка,
толстая кишка, прямая кишка, подкожная клетчатка, мышцы,
предстательная железа. Другие органы подвергаются гистологическому изучению в
случае отмеченных макроскопических изменений.
Патоморфолог проводит патоморфологическое изучение изменений
органов, взятых для исследования, и сопоставляет их с состоянием органов
животных контрольной группы. После патогистологического изучения
внутренних органов экспериментальных животных по всем срокам опыта
патоморфолог составляет отчет по проведенным исследованиям, в которых
должны быть отражены основные патоморфологические изменения,
отмеченные во внутренних органах подопытных животных.
Методические указания по оценке безопасности применения
лекарственных средств в клинике на основании результатов
доклинических токсикологических экспериментов
СОСТАВИТЕЛИ: чл.-корр. РАМН, проф.
Т. А. Гуськова; чл.-корр. РАМН, проф. В. П. Фи-
сенко
Важнейшей проблемой лекарственной токсикологии является оценка
риска развития токсических или побочных эффектов фармакологических
веществ в клинике на основании результатов, полученных при
доклиническом изучении на экспериментальных животных.
- 204-

Практически все лекарственные препараты являются биологически
активными веществами, которые должны использоваться для лечения или
профилактики различных заболеваний в эффективных дозах и
определенными курсами. В связи с этим главной задачей доклинической
лекарственной токсикологии является оценка соотношения терапевтической
ценности предлагаемого фармакологического вещества и тех нежелательных
эффектов, которые могут возникнуть при его применении, т. е. соотношения
"польза/риск".
Исходя из этого и строится схема доклинического токсикологического
исследования потенциального фармакологического вещества. Данные
рекомендации касаются оценки безопасности лекарственных средств по
показателям общетоксического действия и не относятся к проблемам,
связанным с изучением специфических видов токсичности.
Изучение общетоксического действия лекарственных средств
регламентируется "Методическими рекомендациями", утвержденными МЗ РФ,
которые периодически пересматриваются и совершенствуются. В этих
рекомендациях определен тот минимум исследований по оценке острой и
хронической токсичности потенциальных лекарственных препаратов, который
необходим для оценки их токсичности, подробно рассмотрены вопросы,
касающиеся количества и вида экспериментальных животных, их пола,
содержания, длительности проведения экспериментов, оценки
функционального состояния жизненно важных органов и систем и др.
Не акцентируя внимание на содержании этих рекомендаций,
необходимо все-таки сказать, что изучение следует планировать так, чтобы на
основании полученных данных можно было бы ответить на следующие
вопросы:
— какие органы или системы наиболее чувствительны к препарату
(органы-мишени или системы-мишени),
— какова дозовая зависимость выявленных патологических эффектов,
— насколько обратимы выявленные изменения,
— каково соотношение "польза/риск" для данного вещества.
Кроме того, желательно определить противопоказания и
предостережения к применению данного фармакологического средства, наметить
мероприятия борьбы с токсическими эффектами, вызванными передозировкой
препарата.
При изучении острой токсичности обычно получают информацию о
симптомах острого отравления, величине смертельных доз (ЛД50) и только
для некоторых препаратов удается определить орган-мишень или систему-
мишень, например, нарушение кроветворения после однократного
применения цитостатиков, которое приводит животных к гибели в отдаленные
сроки после однократного введения препарата.
Основную информацию о взаимодействии фармакологического
вещества и организма можно получить только в хроническом токсикологическом
эксперименте, длительность которого регламентируется в зависимости от
предполагаемого курса применения препарата в клинике. При этом
следует иметь в виду, что в остром и хроническом экспериментах могут быть
выявлены различные механизмы токсичности, о чем свидетельствует
обширная литература. Не останавливаясь на различных механизмах
токсического действия, которые подробно рассмотрены в монографии С. Н.
Голикова, И. В. Саноцкого и Л. И. Тиунова, хотелось бы отметить, что при
хроническом воздействии химических веществ, в отличие от острого,
ослабляется избирательность действия и на первый план выходят
неспецифические изменения. Для лекарственных препаратов особое значение име-
- 205 -

ет воздействие на органы, ответственные за метаболизм и экскрецию.
Оценка функционального состояния органов дает определенное
представление о состоянии гомеостаза экспериментальных животных во время
хронических токсикологических исследований. Однако следует помнить один
из важнейших принципов функциональной системы, сформулированный
П. К. Анохиным, который гласит, что сила, отклоняющая параметры
данной функции от нормального уровня, и сила сопротивления этому
отклонению нарастают не пропорционально, причем сила сопротивления
превышает силу отклонения. Это особенно важно учитывать при длительном
введении вещества в малых дозах, когда интенсивность воздействия не
превышает критического уровня, гомеостатические системы успевают
включиться в процесс детоксикации и компенсировать функциональную
недостаточность органа-мишени. Компенсаторные системы организма
чрезвычайно велики, например, признаки функциональной
недостаточности надпочечных желез у крыс появляются только при поражении
структуры 9/ю ткани надпочечников. В связи с этим патоморфологическое
исследование органов экспериментальных животных после длительного
введения веществ выступает на первый план при оценке безопасности
лекарственного средства.
Гистологические и гистохимические исследования внутренних органов
животных непосредственно после окончания введения препарата
позволяют визуально определить патологические изменения в структуре органа и
охарактеризовать их количественно. Изучение органов части животных
через определенный период времени после окончания введения вещества
дает возможность судить об обратимости выявленной патологии у животных.
Но даже обратимые нарушения структуры органа имеют значение для
оценки безопасности препарата, поскольку в клинике у больных может
быть патология данного органа в стадии компенсации.
Оценка безопасности фармакологических веществ на стадии
доклинического изучения является неотъемлемой частью комплекса исследований,
необходимых для передачи потенциального лекарственного препарата на
клиническое изучение. В Методических рекомендациях по
доклиническому изучению общетоксического действия фармакологических веществ
изложена программа токсикологических исследований на различных видах
лабораторных животных, подробно рассмотрены вопросы, касающиеся
количества и вида экспериментальных животных, их пола, физиологического
состояния и содержания, определен минимум необходимых исследований
состояния гомеостаза животных в хроническом токсикологическом
эксперименте.
Данные рекомендации касаются экстраполяции на человека
результатов, полученных в хронических токсикологических экспериментах на
животных, что позволяет на стадии доклинического изучения нового
потенциального лекарственного средства прогнозировать безопасные дозы и
курс его применения с достаточно высокой степенью достоверности.
Прежде всего, при изучении потенциального лекарственного средства в
хроническом токсикологическом эксперименте в соответствии с
Методическими рекомендациями по изучению общетоксического действия
фармакологических веществ у каждого вида экспериментальных животных
определяют органы-мишени, наиболее чувствительные к данному препарату.
Рассчитывают суммарную дозу в миллиграммах на 1 кг массы тела
животного, вызывающую изменения структуры ткани органа, даже те, которые
носят обратимый характер. Затем необходимо пересчитать эту суммарную
дозу с экспериментальных животных на человека. Известно, что чем мень-
- 206 -

Таблица 1. Соотношение между массой и площадью поверхности тела человека и
экспериментальных животных
Объект исследования
Человек
Кролик
Морская свинка
Крыса
Мышь
Масса тела (г)
70 000
1500
400
200
20
Поверхность тела
(см2)
18 000
1240
480
304
61
Поверхность тела/
масса тела (см/кг)
257
826
1200
1517
3050
Таблица 2. Коэффициенты пересчета (Кп) доз (мг/кг) с животного на человека
Вид животного
Мышь
Крыса
Морская свинка
Кролик
Кп
11,8
5,9
4,7
3,2
ше размеры млекопитающего, тем больше отношение поверхности его тела
к массе и выше скорость окислительных процессов. В связи с этим при
пересчете дозы с животных на человека более точным было бы
определение суммарной дозы не в мг/кг, а в см/кг. Однако это неудобно, поэтому
на основании соотношения между массой тела и площадью его
поверхности человека и экспериментальных животных (табл. 1) нами предложены
коэффициенты пересчета (Кп) дозы с отдельного животного на человека
(табл. 2).
Таким образом, с помощью этого коэффициента расчетным методом
определяется суммарная доза для человека, адекватная аналогичной дозе,
вызывающей патологические изменения в органе-мишени.
Далее, разделив эту суммарную дозу (в мг/кг) на суточную дозу
препарата для человека в клинике, указанную в инструкции по клиническому
изучению, получаем расчетный безопасный курс (РБК) применения в
клинике.
Расчетный безопас- _ Суточная экспериментальная доза х курс (мг/кг) (дни)
ный курс (РБК) в днях Суточная доза для человека х Кп (мг/кг)
На основании соотношения РБК препарата и курса его применения в
клинике, заложенного в проекте инструкции для клинического изучения
или применения, вычисляется индекс безопасности (ИБ), величина
которого может служить критерием безопасного применения препарата в
клинике.
.. , ,..,,. Расчетный безопасный курс (РБК)
Индекс безопасности (ИБ) = _ . 1
Клинический курс (КК)
Чем выше эта величина, тем безопаснее лекарственное средство.
Конечно, может существовать индивидуальная чувствительность человека к
препарату или какие-то сопутствующие заболевания, повышающие риск
развития тех или иных побочных эффектов, но предлагаемый механизм
пересчета токсических доз с экспериментальных животных на человека
позволяет прогнозировать переносимость нового лекарственного средства в
- 207 -

Таблица 3. Классификация опасности лекарственных препаратов
I класс (высокоопасные) — ИБ < 1
II класс (умеренно опасные) — ИБ от 1 до 5
III класс (малоопасные) — ИБ > 5
соответствии с прилагаемой инструкцией с достаточной степенью
достоверности.
На основании величины ИБ можно представить классификацию
опасности (токсичности) лекарственных средств (табл. 3).
Пример.
При доклиническом изучении хронической токсичности
антиаллергического препарата бикарфена было установлено, что органом-мишенью у
крыс, морских свинок и кроликов является печень.
У крыс изменения в гепатоцитах были обнаружены после ежедневного
введения в дозе 50 мг/кг в течение 180 дней, следовательно:
РБК (для крыс) = 50 мг/кг-180 дней = 535 дней]
2,85 мг/кг* • 5,9 (Кп)
*2,85 мг/кг — суточная доза для человека.
У морских свинок изменения в органах были обнаружены после
введения бикарфена в суточной дозе 50 мг/кг в течение 60 дней.
РБК (для морских свинок) = 5° МГ/1СГ ' 6° *н°* = 224 дня.
2,85 мг/кг* • 4,7 (Кп)
У кроликов доза 50 мг/кг в течение 90 дней вызывала изменения в
гепатоцитах.
рек и- крсико.)-^ g»;."у^-и»,■,
Учитывая, что курс применения бикарфена в клинике в соответствии с
инструкцией для изучения был равен в среднем 20 дням, ИБ при
применении бикарфена составляет в пересчете с крыс — 535 / 20 = 26,7; с
кроликов - 493 / 20 = 24,6; с морских свинок — 224 / 20 = 11,2, т. е. ИБ > 5 в
пересчете со всех изученных видов животных.
Таким образом, бикарфен можно отнести к малоопасным
лекарственным средствам. При клиническом испытании была отмечена хорошая
переносимость бикарфена.
Л итература
1. Гуськова Т. А. Оценка безопасности лекарственных средств на стадии
доклинического изучения // Химико-фармацевтический журнал. — 1990. — № 7. — С. 10—15.

Методические указания по доклиническому изучению
безопасности лекарственных средств, полученных на основе
биотехнологии
СОСТАВИТЕЛИ: чл.-корр. РАМН, проф. Т. А.
Гусъкова; к. б. н. А. Н. Мурашев; академик
РАМН Р. М. Хаитов
Введение
Впервые лекарственные препараты на основе биотехнологии были
получены в начале 1980-х годов. Методические указания по доклиническому
изучению безопасности новых фармакологических средств, полученных
методом генетической инженерии, были утверждены Министерством
здравоохранения СССР в 1988 г. в качестве официального документа.
В настоящее время имеется большой опыт применения лекарственных
средств, полученных на основе биотехнологии.
В основу данных указаний положены методические указания,
утвержденные МЗ СССР в 1988 г., а также международные гармонизированные
требования к доклинической оценке безопасности лекарственных
препаратов, произведенных на основе биотехнологии, принятые управляющими
органами Совета Европы, Японии и США в 1997 г.
1.1. Оценка безопасности лекарственных средств, полученных на основе
биотехнологии, базируется на общих принципах комплексного изучения
токсичности потенциальных лекарственных средств в соответствии с
требованиями GLP.
1.2. Основными документами, регламентирующими объем, схему и
процедуру проведения экспериментов по исследованию безопасности
фармакологических средств, полученных на основе биотехнологии, являются
следующие:
— "Методические указания по изучению общетоксического действия
фармакологических веществ" (МЗ РФ, 2003);
— "Методические указания по оценке аллергизирующих свойств
фармакологических веществ" (МЗ РФ, 2003);
— "Методические указания по оценке иммунотоксического действия
фармакологических веществ" (МЗ РФ, 2003);
— "Методические указания по изучению репродуктивной токсичности
фармакологических веществ" (МЗ РФ, 2003);
— "Методические указания по оценке мутагенных свойств
фармакологических веществ" (МЗ РФ, 2003);
— "Методические указания по оценке канцерогенности
фармакологических веществ и лекарственных средств" (МЗ РФ, 2003);
— "Методические указания по прогнозированию канцерогенности
фармакологических средств в краткосрочных тестах" (МЗ РФ, 2003);
— "Методические указания по оценке безопасности применения
лекарственных средств в клинике на основании результатов доклинических
токсикологических экспериментов" (МЗ РФ, 2003).
Однако традиционные подходы к изучению токсичности лекарственных
препаратов, полученных на основе биотехнологии, могут быть
неприемлемы в связи с уникальностью и разнообразием структурных и
биологических свойств последних, которые могут включать видовую специфику, им-
- 209-

муногенность и непредсказуемую плейотропическую активность (влияние
одного гена на несколько фенотипических признаков). В этих случаях
необходимо выявить области несоответствия и оценить степень их важности
по отношению к общей оценке безопасности.
ФОРМУЛА МЕТОДА
2. Особенности проведения доклинической оценки общей токсичности
фармакологических средств, полученных на основе биотехнологии
Программа и объем доклинической оценки безопасности
фармакологических средств, полученных на основе биотехнологии и являющихся
аналогами известных препаратов, определяется требованиями к известным
препаратам, изготовленным по новой технологии. Биопрепараты, сходные
по строению и фармакологическим свойствам с препаратами, которые на
протяжении длительного времени применяются в клинической практике и
о которых имеется достаточно информации по оценке их безопасности,
могут быть изучены в ограниченном объеме.
Показания и противопоказания к использованию метода
Данные методические указания предназначены для доклинической
оценки безопасности лекарственных препаратов различного назначения
(диагностические, профилактические, терапевтические), полученных на
основе биотехнологии. Они применимы к лекарственным средствам,
полученным с использованием различных систем, включая бактерии, дрожжи,
насекомых, растения и клетки млекопитающих. Принципы, заложенные в
данных методических указаниях, применимы также к ДНК-рекомбинант-
ным протеинам, пептидам, синтезированным химическим путем,
эндогенным протеинам, полученным из человеческих тканей и лекарствам, на
основе олигонуклеотидов.
Данные методические указания не относятся к оценке безопасности
традиционных бактериальных или вирусных вакцин, вакцин ДНК, а также
клеточной или генной терапии.
2.1. Требования к исследуемому препарату
Особенности, связанные с технологией производства. Процесс
получения препаратов на основе биотехнологии связан с возможностью
присутствия примесей в основной субстанции. Это может быть загрязнение
остатками бактериальных или дрожжевых клеток, клеток насекомых,
растений и млекопитающих, что может повлечь за собой аллергические и
другие иммунопатологические реакции. Неблагоприятная реакция, связанная
с загрязнением компонентами нуклеиновой кислоты, существует в теории,
однако включает в себя потенциальную интеграцию в геном. Для
продукции, полученной с использованием клеток насекомых, растений и
животных, существует повышенный риск вирусной контаминации. Система
оценки безопасности таких препаратов должна быть построена таким
образом. Чтобы можно было выявить возможные побочные эффекты как
основной субстанции, так и примесей. Однако предпочтительнее проводить
-210-

процесс очистки для того, чтобы удалить примеси и загрязняющие
вещества, а не устанавливать программу оценки их токсичности. В любом случае
препарат должен иметь достаточно установленных характеристик для того,
чтобы можно было выбрать оптимальный метод доклинического изучения
его безопасности. Качество препарата, представленного для
токсикологических исследований, должно быть сравнимо с препаратом, передаваемым
на клинические испытания. Однако необходимо уделять внимание тому,
чтобы в ходе исследовательских программ происходили допустимые
изменения в производственном процессе с целью улучшения качества
препарата. Потенциальное влияние подобных изменений для экстраполяции на
людей результатов, полученных на животных, должно быть учтено.
Все изменения, связанные с технологией производства или изменением
показателей качества препарата, должны быть отражены в программе
исследования. В некоторых случаях могут потребоваться дополнительные
исследования (например, фармакокинетика, фармакодинамика и др.). Кроме
того, должно быть обоснование выбранного метода исследований.
МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ
МЕТОДА
2.2. Выбор экспериментальных животных
Учитывая видовую специфику многих лекарственных препаратов,
полученных с использованием биотехнологии, важное значение при изучении
их токсичности имеет выбор подходящего вида животных. Биологическая
активность вместе с видовой и/или тканевой спецификой многих
лекарственных препаратов, производимых с использованием биотехнологий, часто
делает невозможным использование в токсикологических исследованиях
обычных видов животных (крысы и собаки). Программы оценки
безопасности таких препаратов должны предусматривать использование
подходящих видов. В опытах in vitro клетки млекопитающих могут быть
использованы для предсказания определенных аспектов действия in vivo и
количественной оценки относительной чувствительности различных видов
(включая человека) к препаратам, полученным на основе биотехнологии. Такие
исследования могут проводиться, например, в целях определения
рецепторов, с которыми они взаимодействуют, и быть полезными при выборе
оптимальных видов животных для токсикологических исследований in vivo.
Обобщенные результаты исследований in vitro и in vivo помогают провести
экстраполяцию на человека данных, полученных на животных.
В случае моноклональных антител иммунологические свойства
препарата должны быть изучены детально, включая особенности антигенов, а
также их токсичность по отношению к человеческим тканям с обязательным
использованием соответствующих иммуногистохимических методов.
Программы оценки безопасности лекарственных средств обычно
должны предусматривать использование двух подходящих видов животных.
Однако в определенных случаях может быть достаточным использование
одного вида. Например, в случае, когда был определен только один
подходящий вид, либо в случаях, когда биологическое действие
биофармацевтического препарата хорошо известно. Кроме того, даже в тех случаях, когда
для оценки токсичности с проведением краткосрочных исследований
необходимо использование двух видов животных, для такой оценки с
проведением долгосрочных исследований может быть достаточным использова-
- 211 -

ние одного вида. Например, когда токсикологические характеристики
препарата, полученные при проведении краткосрочных исследований на двух
видах животных, являются схожими.
Данные, полученные при изучении токсичности на животных
неподходящих видов, могут ввести в заблуждение и не должны приниматься в
расчет. При отсутствии подходящих видов животных следует изучить
возможность использования трансгенных животных, имеющих рецепторы,
близкие к человеческим, либо использования гомологического белка.
Информация, полученная при использовании трансгенных животных, имеющих
сходные с человеческими рецепторы, оптимизируется, когда
взаимодействие препарата и рецептора имеет физиологические последствия, схожие с
ожидаемыми для человека. Хотя полезная информация может быть
получена при использовании гомологических белков, но она недостаточна
для решения вопроса о безопасности проведения клинических испытаний.
В случае невозможности использования трансгенных животных моделей
или гомологических белков необходимо проведение ограниченных
токсикологических исследований с использованием одного подходящего вида,
например с помощью изучения токсичности при введении препарата в
течение не менее 14 дней при оценке состояния гомеостаза животных в
полном объеме.
В последние годы достигнут значительный прогресс в разработке на
животных моделей заболеваний, близких заболеваниям человека. Эти
модели включают экспериментальные и спонтанные заболевания, а также
трансгенных животных. Они могут обеспечивать дальнейшие исследования
по оценке безопасности препаратов (например, оценка нежелательного
провоцирования развития заболевания). В определенных случаях
исследования, проводимые с использованием животных моделей заболеваний,
могут выступать альтернативой изучению токсичности с использованием
обычных животных. При использовании таких моделей заболеваний в
целях изучения безопасности должно быть представлено научное
обоснование.
2.3. Число и пол животных
Число животных, используемых в расчете на одну дозу препарата,
должно быть достаточным для оценки его токсического воздействия на
организм животных. Недостаточное количество животных в группе может
привести к невозможности наблюдения за обратимостью выявленных
токсических эффектов. Ограничения количества изучаемого препарата, которое
часто проявляются при проведении исследований с использованием
крупных животных (собаки, приматы), могут быть частично компенсированы
повышением частоты и продолжительности наблюдения за животными.
При оценке общетоксического действия препаратов должны
использоваться оба пола экспериментальных животных.
ОПИСАНИЕ МЕТОДА
2.4. Выбор дозы, способов и частоты введения
Принадлежность большинства препаратов, полученных с помощью
биотехнологии, к классу эндогенных веществ, содержащихся в организме
- 212 -

в определенных количествах и участвующих в процессах естественного
метаболизма, требует особого внимания в выборе доз при проведении
токсикологических исследований. С одной стороны, должен быть
соблюден принцип использования высоких доз, обеспечивающий необходимый
запас надежности оценки безопасности. С другой стороны, при
проведении экспериментов по оценке безопасности аналогов эндогенных
веществ (в особенности при исследовании их общетоксического и иммуно-
тропного действия) наиболее информативными могут оказаться
результаты, полученные при введении экспериментальным животным
терапевтических доз, обеспечивающих проявление специфической биологической
активности препарата. Возможны ситуации, когда при использовании
очень высоких доз некоторые эффекты исчезают или модифицируются.
Диапазон используемых доз должен определен с учетов этих
особенностей.
Определение среднесмертельных доз (ЛД50) для препаратов, полученных
с помощью биотехнологии, как правило, невозможно в связи с их низкой
токсичностью при однократном введении животным. В связи с этим
рационально отказаться от определения ЛД50 для тех фармакологических
средств, которые не вызывают гибели подопытных животных на уровне
доз, характеризующих их принадлежность к классу практически
нетоксичных веществ.
При исследовании общетоксических свойств лекарственных средств,
полученных на основе биотехнологии, в хроническом эксперименте
необходимо сохранить общепринятый набор из 3 доз, поскольку
зависимость доза—эффект является одним из основных критериев вредности
при оценке результатов доклинической оценки безопасности препарата.
При этом следует учитывать, что эти препараты могут быть
рекомендованы для клинического использования как в дозах, восполняющих
естественный дефицит вещества в организме, так и в дозах, многократно
превышающих его содержание в биологических субстратах организма.
Наименьшая доза может быть равной терапевтической дозе для вида
лабораторных животных, используемых в эксперименте, или максимальной
суточной для человека с учетом пересчета ее на данный вид животных.
Наибольшая доза препарата должна вызывать те или иные токсические
эффекты у животных, чтобы показать наиболее чувствительные органы
(органы-мишени) к изучаемому лекарственному средству, полученному с
помощью биотехнологии. Средняя доза препарата должна занимать
промежуточное положение, чтобы определить безопасную зону его
хронического воздействия.
Способ и частота введений экспериментальным животным
фармакологических средств, полученных на основе биотехнологии, должны быть
максимально приближены к указанным в инструкции для клинического
изучения или применений. Способ введения препарата
экспериментальным животным, отличный от используемого в клинической практике,
может быть применен только при технической невозможности введения
препарата животным данного вида. Следует учитывать фармакокинетику и
биодоступность препарата у используемых видов животных. Например, в
случае более быстрого метаболизма препарата у данного вида животных по
сравнению с человеком частота введений препарата лабораторным
животным может быть увеличена по сравнению с частотой, предлагаемой для
использования этого препарата в клинике. Необходимо также учитывать
объем вводимого вещества и его концентрацию.
-213-

2.5. Длительность введения
Длительность введения препаратов экспериментальным животным
должна соответствовать длительности применения в клинике. Для
большинства лекарственных препаратов, произведенных на основе
биотехнологии, эта продолжительность обычно составляла 1—3 мес. Для
биологических лекарственных препаратов, предназначенных для кратковременного
использования (например, менее 7 дней), введение в течение 2 нед
считается достаточным. Для биологических лекарственных препаратов,
предназначенных для лечения хронических болезней, достаточной
продолжительностью исследований считается 6 мес, хотя в некоторых случаях более
длительные или короткие исследования возможны при соответствующем
научном обосновании.
Когда это возможно, эти исследования должны включать себя и
изучение токсикокинетики.
Период восстановления (последействие препарата) должен быть
включен в план изучения для того, чтобы определить устранение или усиление
токсического эффекта. Длительность восстановительного периода
определяется тяжестью токсического эффекта, оказываемого биологическими
лекарственными препаратами. Группа выздоравливающих животных должна
находиться под наблюдением, пока не будет выявлена полная обратимость
выявленной патологии.
При изучении острой и хронической токсичности необходимо
оценивать состояние тканей в области введения или нанесения препарата у
экспериментальных животных с обязательным гистологическим
исследованием. При пероральном введении лекарственного средства необходимо
проведение гистологических исследований желудочно-кишечного тракта на
всем протяжении.
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА
3. Особенности изучения иммунотоксичности фармакологических средств,
полученных на основе биотехнологии
Многие лекарственные препараты для людей, произведенные с
использованием биотехнологий, являются иммуногенными для животных.
Следовательно, при изучении иммунотоксичности для обеспечения правильной
интерпретации полученных результатов должна быть дана характеристика
антителообразования. В частности, при интерпретации данных должно
быть рассмотрено воздействие образования антител на параметры фарма-
кокинетики/фармакодинамики, степень охвата и/или серьезность
побочных эффектов, активация комплемента или возникновение новых
токсических эффектов. Следует также уделить внимание оценке возможных
патологических изменений иммунной системы.
Обнаружение антител не должно служить единственным основанием
для раннего прекращения доклинического изучения безопасности или
изменения его продолжительности, если только иммунная реакция не
нейтрализует фармакологический и/или токсикологический эффект
биофармакологического препарата у большинства животных. Часто иммунная
реакция на биофармакологические препараты бывает различной, подобно
тому, как это наблюдается у людей.
На основании индуцирования образования антител у животных нельзя
-214-

спрогнозировать потенциал для образования антител у людей. У человека
могут вырабатываться сывороточные антитела против человеческих
белков, и часто терапевтическая реакция в их присутствии сохраняется.
Случаи серьезных анафилактических реакций на рекомбинантные белки s у
людей редки. В связи с этим результаты тестов на анафилактическую
реакцию у морских свинок, обычно дающие позитивный результат для
препаратов, содержащих белок, не могут служить основанием для
прогнозирования реакции у людей; считается, что такие исследования имеют малое
значение для рутинной процедуры оценки препаратов такого типа.
Предполагается, что многие лекарственные препараты, произведенные
на основе биотехнологии, стимулируют или подавляют иммунную систему
и, следовательно, могут оказывать влияние не только на гуморальный, но
и на клеточный иммунитет. Поэтому тактика рутинных исследований или
использования стандартных тестирующих устройств не рекомендуется для
лекарственных препаратов, произведенных на основе биотехнологии. Эти
препараты требуют более глубоких исследований влияния на иммунную
систему. С этой целью могут быть использованы "Методические указания
по изучению иммунотропной активности фармакологических веществ"
(МЗ РФ, 2003).
4. Особенности оценки репродуктивной токсичности фармакологических
средств, полученных на основе биотехнологии
Необходимость в изучении репродуктивной токсичности зависит от
препарата и клинических показаний. Установленный план изучения и
расписание дозировок могут изменяться в зависимости от видов, иммуноген-
ности, биологической активности и фармакокинетики. Например,
особенности, касающиеся эволюционной иммунотоксичности, которая может
применяться, в частности, к определенным моноклональным антителам с
продолжительным иммунологическим действием. Такие препараты могли
бы изучаться по плану, скорректированному для определения иммунной
деятельности новорожденных.
Если существует исчерпывающая общедоступная информация о
влиянии на репродукцию отдельного класса соединений (например, интерфе-
роны), где единственным чувствительным видом являются
нечеловекообразные обезьяны, то можно не проводить рутинного изучения
репродуктивной токсичности. В таком случае следует представить научную базу для
оценки возможного влияния таких препаратов на репродукцию и развитие
потомства.
5. Особенности оценки генотоксичности (мутагенности) фармакологических
средств, полученных на основе биотехнологии
Методы изучения генотоксичности, которые используют для обычных
лекарственних препаратов, не применимы для лекарственных препаратов,
произведенных на основе биотехнологии, и, следовательно, нет
необходимости в проведении таких исследований. Пептиды и протеины не
взаимодействуют с ДНК или другим хромосомным материалом.
В случае с некоторыми лекарственными препаратами, произведенными
на основе биотехнологии, существует потенциальная опасность
накопления спонтанно мутирующих клеток (например, посредством облегчения
- 215 -

селективного преимущества пролиферации) ведущая к канцерогенности.
Стандартный набор тестов на генотоксичность не предназначен для того,
чтобы обнаруживать указанные состояния. Для этих целей, возможно,
потребуется разработать альтернативные модели in vitro и in vivo.
Изучение генотоксичности должно быть представлено в тех случаях,
когда существует основание для беспокойства по поводу продукта
(например, из-за присутствия органических связующих молекул в сопряженных
белковых продуктах).
6. Особенности оценки канцерогенности фармакологических средств,
полученных на основе биотехнологии
Стандартные исследования на канцерогенность обычно не проводят для
лекарственных препаратов, произведенных на основе биотехнологии.
Однако оценка специфических канцерогенных свойств препарата может быть
необходима при значительной продолжительности клинического
применения, широты использования препарата в медицинской практике и/или
биологической активности продукта (например, фактор роста, иммуноде-
прессивные препараты и т. д.), когда имеется беспокойство по поводу
канцерогенного потенциала.
Препараты, которые могут поддерживать или содержать пролиферацию
трансформированных клеток и клональной экспансии, возможно, ведущей
к неоплазии, должны оцениваться относительно рецепторной экспрессии в
различных злокачественных и нормальных человеческих клетках. Следует
установить способность препарата стимулировать рост нормальных или
злокачественных клеток на рецепторном уровне. Когда данные in vitro
дают повод для беспокойства относительно канцерогенных свойств
препарата, может потребоваться дальнейшие изучение канцерогенности на
экспериментальных животных в соответствии с существующими методическими
указаниями для любых лекарственных средств. Важную информацию о
возможной клеточной пролиферации можно получить при исследовании
хронической токсичности лекарственного препарата, полученного на
основе биотехнологии.
В тех случаях, когда лекарственный препарат биологически активен и
не является иммунологическим для грызунов, а другие исследования не
принесли удовлетворительных результатов, для того, чтобы дать оценку
канцерогенному потенциалу, следует рассматривать полезность
исследования канцерогенности на отдельном виде грызунов. При этом следует
тщательно подойти к выбору дозы, учитывая данные фармакокинетических и
токсикологических исследований, анализ сравнительных рецепторных
характеристик и намеченных параметров применения препарата в клинике.

Глава III
ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Методические указания по проведению доклинических
исследований фармакокинетики фармакологических веществ
и лекарственных средств
СОСТАВИТЕЛИ: д. б. н., проф. А. А. Фирсов;
д. м. н., проф. В. П. Жердев; к. б. н. Е. Ю. Бар-
манова; к. х. н. А. П. Родионов; чл.-корр.
РАМН, проф. В. П. Фисенко
1. Введение
Изучение фармакокинетики — кинетики всасывания, распределения и
элиминации фармакологических средств в организме — является
составной частью доклинических испытаний фармакологических средств. В
настоящих Методических указаниях конкретизированы задачи, содержание и
порядок представления результатов доклинического изучения
фармакокинетики фармакологических средств.
Объем фармакокинетических исследований и соответствующей
документации дифференцируется следующим образом:
полный объем исследований
для оригинальных фармакологически активных веществ, а также
известных веществ, ранее не применявшихся в качестве фармакологических
средств (раздел 2);
ограниченный объем исследований:
— для новых лекарственных форм, содержащих известное
фармакологическое средство (раздел 3),
— для воспроизведенных фармакологических средств (раздел 4), для
обоснования расширения показаний к применим ранее
зарегистрированных фармакологических средств (раздел 5).
2. Фармакокинетические исследования оригинальных фармакологических
средств
2.1. Цели и задачи
Целью исследования фармакокинетики фармакологического средства
является количественная характеристика процессов его всасывания,
распределения и элиминации (метаболизм и экскреция).
Знание фармакокинетических свойств фармакологического средства
позволяет обосновать выбор путей и методов его введения, выявить ткани, в
которые оно проникает наиболее интенсивно и/или в которых
удерживается наиболее длительно, установить основные пути элиминации фармако-
- 217-

логического средства. Фармакокинетические данные необходимы для
установления зависимости "концентрация—эффект", которая характеризуется
меньшими видовыми различиями, чем зависимость "доза—эффект", и
поэтому может быть использована для прогнозирования действия
фармакологического средства у человека. Кроме того, по результатам
экспериментального изучения фармакокинетики фармакологического средства
возможно предсказать концентрацию препарата в крови (плазме) или, по
меньшей мере, скорость ее снижения у человека и, таким образом,
выбрать ориентировочную схему дозирования, которая может быть затем
уточнена в ходе клинических испытаний. Важной задачей изучения
фармакокинетики оригинального фармакологического средства является
оптимизация выбора его лекарственной формы.
2.2. Объект исследования и лабораторные животные
2.2.1. Фармакологические средства
Объектом исследования является любое фармакологическое средство, за
исключением гомеопатических, независимо от его эндогенной или
экзогенной природы.
2.2.2. Лабораторные животные
Исследования фармакокинетики проводятся на здоровых,
бодрствующих или наркотизированных животных одного пола (желательно
линейных), масса тела которых отличается от нормального значения для
соответствующего возраста не более чем на 10 %. В качестве
экспериментальных моделей применяются крысы, кролики, собаки, обезьяны. В
специальных случаях, например при проведении комплексных фармакокинети-
ческих и фармакологических или токсикологических исследований,
допускается использование мышей, морских свинок и кошек.
Необходимо использовать не менее двух видов животных, один из
которых не относится к грызунам.
2.2.3. Биологический материал
Важнейшим элементом фармакокинетического изучения
фармакологического средства является исследование динамики изменения его
концентрации в крови, поэтому плазма (или сыворотка) крови рассматривается в
качестве основного вида биоматериала. В тех случаях, когда
фармакологическое средство связывается компонентами плазмы (сыворотки) и/или
эритроцитами, соответствующие показатели должны быть оценены при
концентрациях фармакологического средства, которые отражают диапазон
изменения его уровней в плазме (сыворотке) крови.
Определение концентрации фармакологического средства в крови
обязательно и в тех случаях, когда фармакологическое средство предназначено
для местного применения, — для того, чтобы оценить его системную
доступность или доказать, что оно не достигает системного кровотока. В
последнем случае единственным видом биологического материала, в котором
требуется определять концентрацию фармакологического средства, являет-
- 218 -

ся ткань в месте его применения (например, кожа или подлежащие
мышцы при накожной аппликации фармакологического средства).
Выбор периферических тканей, в которых следует определять
концентрацию фармакологического средства, осуществляется таким образом,
чтобы среди объектов исследования оказались ткани, различающиеся по
степени васкуляризации. В качестве сильно васкуляризированных тканей
можно использовать, например, сердце или селезенку, умеренно
васкуляризированных — ткань мышц, слабо васкуляризированных — сальник,
кожу или кости (в каждом случае по одному виду биоматериала). Наряду с
этим необходимы данные о концентрации фармакологического средства в
зонах его терапевтического действия (например, ткань легкого, если хи-
миотерапевтическое средство предполагается применять при пневмонии,
ткань головного мозга, если предполагается лечить менингит, и т. д.) и
токсического действия (например, в тканях почек, если
фармакологическое средство обладает нефротоксическим действием).
Необходимо также определять концентрацию фармакологического
средства в органах, обеспечивающих его элиминацию (печень, почки), а
также в экскретах (моча, желчь, фекалии — в зависимости от их роли в
элиминации).
2.3. Регламент эксперимента
2.3.1. Пути и методы введения фармакологического средства
Пути введения. Фармакокинетику фармакологического средства
необходимо исследовать при тех способах введения, которые предполагается
рекомендовать для клинических испытаний. При этом даже в тех случаях,
когда фармакологическое средство предполагается применять только вне-
сосудистым путем, следует изучать фармакокинетику также при
внутривенном введении фармакологического средства, если это позволяет его
растворимость. Такие данные необходимы для оценки системных фарма-
кокинетических параметров, а также абсолютной биодоступности
препарата (см. раздел 2.5).
Методы введения. Внутривенно фармакологические средства можно
вводить в хвостовые вены мышей и крыс, ушные вены морских свинок и
кроликов, бедренные вены собак и кошек. При многократном введении
фармакологического средства животному допускается замена внутривенного
введения на внутрибрюшинное, однако в дни проведения повторного фар-
макокинетического исследования фармакологическое средство следует
ввести тем же способом, что и при однократном введении, т. е.
внутривенно (см. раздел 2.5.2).
Внутрь фармакологические средства вводятся натощак (животные не
получают пищи в течение ночи без ограничений в питьевой воде) с
помощью глоточного или дуоденального зонда. Добавление фармакологических
средств в пищу или питьевую воду не допускается, поскольку в таких
случаях трудно обеспечить точную дозировку.
Внутримышечно фармакологические средства вводятся в бедренную
мышцу; подкожно — в заднюю лапку крыс, кошек и собак, в бок (ближе к
позвоночнику) морским свинкам, кроликам; накожно — на депилирован-
ную поверхность спины или живота крыс, морских свинск, кроликов,
собак.
В зависимости от вида лекарственной формы и ее предназначения воз-
- 219-

можны закапывание растворов или аппликация мазей на слизистую
оболочку глаза, инстилляция в переднюю камеру глаза, введение
суппозиториев, ингаляция паров, газов, аэрозолей, в частности путем помещения
животных в затравочные камеры, внесение фармакологических средств в
кожные или мышечные карманы, имплантация под кожу, в мышцы или
полости и т. д.
2.3.2. Режимы введения фармакологического средства
Фармакокинетика фармакологического средства должна быть изучена
при его однократном и многократном введении.
Основными целями фармакокинетического исследования при
однократном введении фармакологического средства являются характеристика
его фармакокинетического профиля в крови, включая проверку гипотезы
линейности, изучение распределения между кровью и периферическими
тканями, метаболизма и экскреции — на животных одного вида
(предпочтительно на крысах), а также оценка биодоступности при внесосудистом
введении лекарственного вещества в готовой лекарственной форме — на
животных другого вида (предпочтительно на собаках или кроликах).
Целью фармакокинетического исследования при многократном
введении фармакологического средства является выяснение его способности
накапливаться в организме и возможностей прогнозирования этих процессов
по данным, полученным при однократном введении, — на животных
одного вида.
При однократном введении необходимо исследовать фармакокинетику
фармакологического средства в крови при использовании не менее трех
уровней дозы, отражающих диапазон, в котором у животных данного вида
реализуется желаемый эффект фармакологического средства без признаков
побочного действия. Это необходимо для проверки гипотезы линейности
фармакокинетики (см. раздел 2.5).
При многократном введении достаточно использовать один уровень
дозы (желательно близкий к величине ЕД50, установленной при
фармакологических или химиотерапевтических исследованиях), если
фармакокинетика линейна, но не менее двух разных доз (одна из которых соответствует
меньшей, а вторая — большей дозе, в которых фармакологическое
средство вводилось однократно), если фармакокинетика нелинейна. Интервал
дозирования (как правило, 24 ч) и продолжительность многократного
введения должны соответствовать использованным в фармакологических
(химиотерапевтических) исследованиях.
2.3.3. Продолжительность эксперимента
Длительность наблюдения за концентрацией фармакологического
средства в биоматериале определяется возможностями аналитического метода,
однако в любом случае должна быть не менее чем в г раз больше периода
полувыведения, как после однократного, так и после многократного
введения. То же относится и к фармакологическим средствам в составе
лекарственных форм, обеспечивающих пролонгированное высвобождение
активного компонента.
- 220-

2.3.4. Схема отбора проб биоматериала
Схема отбора проб определяется формой кривой "концентрация
фармакологического средства — время" — чем сложнее форма, тем чаще
требуется отбирать пробы. Вместе с тем схема должна быть достаточно
экономной, чтобы число животных, включенных в эксперимент, обеспечивало его
компактность и не требовало учета дополнительных факторов (изменения
гемодинамики, средней массы тела, возраста и др. в процессе
исследования). Число повторностей определения концентрации определяется
индивидуальной вариабельностью фармакокинетического профиля и точностью
аналитического метода — чем сильнее вариабельность и ниже точность,
тем больше требуется повторных определений. В тех случаях, когда у
каждого животного из выборки отбирается только одна проба (одно
животное — одна точка), число животных на одну точку должно быть не
меньше 8. В тех случаях, когда у каждого животного пробы отбираются в
каждой временной точке, число животных должно быть не меньше 6.
Поскольку априори установить оптимальный регламент трудно,
целесообразно вначале провести пробные эксперименты на ограниченном числе
животных при введении им фармакологического средства в большей из
планируемых доз. При этом следует отобрать возможно большее число
проб в моменты времени, возрастающие в геометрической прогрессии
(например, через 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8 ч и т. д.). Визуальный анализ обычно
позволяет выявить на кривой "логарифм концентрации фармакологического
средства (или логарифм скорости экскреции) — время" фрагменты,
характеризующиеся неодинаковым наклоном. При одномоментном
внутривенном введении обычно выявляются 2—3 фазы снижения концентрации
фармакологического средства в крови, при внесосудистом введении —
наряду с фазами снижения концентрации (их число может быть меньше, чем
при внутривенном введении) выявляется фаза предшествующего
возрастания концентрации; при использовании лекарственных форм с
пролонгированным высвобождением фармакологического средства к уже
упомянутым нередко добавляется фаза плато и т. д. Несколько проще обычно
выглядят фармакокинетические кривые фармакологических средств в
периферических тканях, для которых не характерны резкие перепады
концентрации.
В любом случае выбор моментов времени отбора проб должен
обеспечивать получение нескольких (не менее трех) точек для каждого фрагмента
фармакокинетической кривой. Особое внимание следует обратить на ее
конечный участок, наклон которого не только определяет величину
основных фармакокинетических параметров, в частности периода
полувыведения фармакологического средства, но и позволяет оценить необходимую
продолжительность наблюдения за концентрацией (или скоростью
экскреции) фармакологического средства для последующего основного
эксперимента (см. раздел 2.3.3).
При изучении кинетики экскреции необходимо определять не только
концентрацию фармакологического средства в каждой порции экскрета,
но и его объем, посколькуя кинетическому анализу подвергаются данные
"скорость экскреции (отношение количества фармакологического
средства, выделенного за фиксированный промежуток времени, к
продолжительности этого промежутка) — время" и/или "кумулятивная экскреция —
время".
Для упрощения последующего фармакокинетического анализа следует
спланировать эксперимент таким образом, чтобы у каждого животного все
- 221 -

пробы были отобраны в одни и те же моменты времени (или в выбранные
промежутки времени, если речь идет об экскретах), предусмотренные
регламентом.
2.4. Методы количественного определения концентрации
фармакологических средств
Для определения концентрации фармакологических средств в
биоматериале могут быть использованы различные методы (физико-химические,
иммунологические, микробиологические и др.), обеспечивающие
возможность уверенного слежения за концентрацией фармакологического
средства при выбранных условиях фармакокинетического эксперимента, в
частности его длительности, и отвечающие общим требованиям
избирательности, точности, воспроизводимости.
В тех случаях, когда в биоматериале наряду с неизмененным
фармакологическим средством присутствуют продукты его биотрансформации, а
суммарная кумулятивная экскреция неизмененного фармакологического
средства значительно ниже дозы, необходимо количественное определение
метаболитов. Вместе с тем детальное изучение кинетики образования и
элиминации метаболита(ов) требуется только при условии существенного
вклада метаболического превращения фармакологического средства в его
элиминацию, особенно когда метаболит обладает биологической
активностью.
Если вследствие пресистемной элиминации фармакологического
средства оно подвергается метаболическому превращению и не обнаруживается
в крови в неизмененном состоянии и/или не обладает биологической
активностью (пролекарство), необходимо определять концентрацию именно
метаболита(ов).
2.5. Анализ фармакокинетических данных
2.5.1. Однократное введение фармакологического средства
Гипотезая линейности. Проверка этой гипотезы является важнейшим
элементом фармакокинетического анализа, так как позволяет оценить
предсказуемость изменений концентрации (С) в ответ на изменение дозы
(D) фармакологического средства. Для проверки этой гипотезы следует
оценить статистическую достоверность отклонения от нуля свободного
члена линейной регрессии площади под кривой "концентрация—время".
Гипотеза принимается, если свободный член незначимо отличается от
нуля. Кроме того, вывод о линейности фармакокинетики
фармакологического средства может быть сделан при условии совмещения кривых
"концентрация (С)—время (t)", нормированных относительно дозы (кривые
изменения C/D во времени), или при условии, что значения параметров фар-
макокинетики (см. ниже) не зависят от дозы. Гипотеза линейности
проверяется применительно к фармакокинетическим профилям
фармакологического средства в крови, однако та же гипотеза может быть проверена и для
других видов биоматериала, в котором определяется концентрация
фармакологического средства (тест-ткани).
В тех случаях, когда линейность фармакокинетики сохраняется только в
ограниченном диапазоне использованных доз, следует указать его пределы.
- 222 -

Системные параметры. При условии линейности для характеристики
фармакокинетических свойств фармакологического средства следует
использовать параметры, значения которых не зависят от структуры
соответствующей математической модели (внемодельные параметры).
Общий клиренс (С1), отражающий объем тест-ткани, освобождающийся
от фармакологического средства в единицу времени, определяется
отношением дозы к площади под кривой "концентрация—время" (AUC, в
пределах от нуля до бесконечности):
CI = D/AUC.
Стационарный объем распределения (Vgg) — коэффициент
пропорциональности между концентрацией фармакологического средства в
тест-ткани и его количеством в организме, отражающий интенсивность
распределения фармакологического средства между тест-тканью и другими
тканями, — определяется произведением С1 на среднее время удержания
(MRT — среднее время пребывания в организме молекулы
фармакологического средства):
Vss = С1 х MRT.
Значения С1 и Vss могут быть оценены только по данным C(t),
полученным при внутрисосудистом введении фармакологического средства,
поскольку в этом случае количество фармакологического средства,
поступившее в системный кровоток, равно дозе.
Величина MRT может быть рассчитана по формуле:
MRT = AUMC/AUC,
где AUMC — площадь под кривой "произведение времени на
концентрацию фармакологического средства (tC) — время (t)".
Наряду с параметрами CI, Vss и MRT следует оценить
продолжительность периода полувыведения (Т1/2) — период времени, в течение
которого концентрация фармакологического средства снижается вдвое.
Величина Т1/2 может быть рассчитана по формуле:
Т1/2 = 0,693 А,
где t, — показатель экспоненты, характеризующей скорость снижения
концентрации препарата на конечном (моноэкспоненциальном) участке фар-
макокинетической кривой.
Параметры CI, Vss и MRT характеризуют фармакокинетический
профиль в целом, но не позволяют прогнозировать отдельные значения C(t).
Такой прогноз осуществляется с помощью структурных моделей (частевых,
стохастических, физиологических). Их использование предусматривает
оценку ряда параметров, которые необходимы для математического
описания фармакокинетических данных и прогнозирования уровней
фармакологического средства, создающихся при его многократном введении (см.
раздел 2.5.2).
Характеристика всасывания фармакологического средства и оценка
биодоступности. Фармакокинетические профили фармакологического
средства в крови при его внесосудистом введении должны быть
охарактеризованы максимальной концентрацией (Сшах) > временем ее достижения (tmax) >
параметрами AUC, MRT, Ti/2.
Абсолютная степень всасывания (fa — абсолютная биодоступность)
определяется отношением значений AUC при внесосудистом (ev) и внутри-
сосудистом (iv) введении лекарственного вещества:
fa = AUCev/AUCiv.
- 223 -

Объективная оценка fa может быть получена путем использования
вместо AUC значений площади в пределах от нуля до момента отбора
последней пробы крови (AUQ), если величина AUCt составляет не менее 80 %
от AUC.
Скорость всасывания характеризуется значениями tmax и Cmax/AUC или
Cmax/AUCt, а также среднего времени всасывания (МАТ), которое
определяется разностью:
МАТ = MRTev - MRTiv.
Подобно описанному выше для случая внутрисосудистого введения
фармакологического средства фармакокинетические профили после его
внесосудистого введения следует описать математической моделью. Это
необходимо не только для прогнозирования значений C(t), но и для
уточнения оценок tmax > Cmax и Cmax/AUC или Cmax/AUCt, поскольку момент
достижения наибольшего из измеренных значений концентрации и ее
величина являются лишь оценками истинных значений tma][ и Стах.
Характеристика распределения фармакологического средства в организме.
Данные о распределении фармакологического средства между
компонентами крови (плазмы или сыворотки) степенью связывания (f — отношение
концентрации связанного вещества к его общей концентрации), если она
не зависит от концентрации фармакологического средства, и параметрами
уравнения Скэтчарда (константа равновесия и концентрация центров
связывания), если fb зависит от концентрации.
Интенсивность проникновения фармакологического средства в
периферические ткани должна быть охарактеризована тканевой доступностью
(fr), определяемой отношением значения AUC в ткани (AUCr) к
соответствующей величине AUC в плазме или сыворотке крови (AUCp):
ft = AUGt/AUCp.
Целесообразно также оценить кажущийся коэффициент распределения
(Kd) фармакологического средства между кровью и тканью, определяемый
отношением соответствующих концентраций в конечных
(моноэкспоненциальных) фазах фармакокинетических кривых при условии, что их
наклон характеризуются близкими значениями В:
Kd = Ct/Cp.
Длительность присутствия фармакологического средства в
периферической ткани выражается значениями периода полувыведения и/или
среднего времени удержания (Т1/2, т и MRTt).
Итог изучения распределения фармакологического средства в
организме — выявление тех тканей, в которые оно интенсивно проникает или в
которых длительное время удерживается, что может иметь существенное
значение для фармакологических и токсикологических исследований.
Характеристика метаболического превращения фармакологического
средства. Фармакокинетические профили метаболита (М) должны быть
охарактеризованы соответствующими значениями параметров Cmax, tmax, AUC,
MRT, T1/2 (Cmax, M > tmax, M > AUCm, MRTm, T1/2m). При этом степень
превращения фармакологического средства в метаболит может быть выражена
отношением AUCM/AUC.
Характеристика экскреции фармакологического средства. Интенсивность
выведения фармакологического средства с экскретом характеризуется
экскреторным клиренсом, отражающим скорость освобождения тест-ткани
(обычно плазма или сыворотка крови, но не экскрет!) от
фармакологического средства в результате экскреции. При исследовании экскреции фар-
- 224-

макологического средства с мочой оценивается почечный клиренс (С12),
определяемый отношением скорости экскреции к средней концентрации
фармакологического средства в крови в соответствующий период времени
или отношением кумулятивной экскреции (МЕ) к AUC
фармакологического средства в крови:
С12 = Me/ AUC.
Внепочечный клиренс (С1|1Г) фармакологического средства оценивается
по разности между общим и почечным клиренсом:
С1ПГ = С1 - Clj.
Нелинейная фармакокинетика. Описанный в предыдущих разделах
аппарат применим для фармакологического средства, фармакокинетика
которых линейна. Если фармакокинетика нелинейна, фармакокинетические
свойства могут быть охарактеризованы кажущимся значением Т1/2,
величиной AUC, а при внесосудистом введении фармакологического средства
значениями Стах и tmax.
Применительно к лекарственным формам, обеспечивающим
пролонгированное поступление фармакологического средства в системный
кровоток или длительное высвобождение в месте введения (лекарственные
формы, предназначенные для местного применения), необходимо оценивать
также минимальную концентрацию Cnii„, которая создается соответственно
в крови или в месте действия к концу интервала дозирования (tmin). Кроме
того, следует рассчитать интегральную среднюю концентрацию
(квазистационарная концентрация — С^), определяемую отношением AUC в
пределах от 0 до tiniI1 к tmi,„ и оценить выраженность флуктуации уровней
фармакологического средства путем отнесения разности (Спшх, Cmin) к С^.
2.5.2. Многократное введение фармакологического средства
Анализ фармакокинетических данных в этом случае может быть менее
детальным, чем при однократном введении фармакологического средства.
Если фармакокинетика линейна, следует оценить значения CI, Vgs и MRT
с использованием стационарных значений AUC и AUCm, рассчитанных в
пределах интервала дозирования, и Т1/2 при внутрисосудистом введении
фармакологического средства и tmax, T1/2, а также стационарные значения
Q„ax> Qnin> Qas ПРИ ег0 внесосудистом введении, а для лекарственных форм
пролонгированного действия — отношение (С,пах — Cniin)/Css.
Результаты фармакокинетического исследования при многократном
введении фармакологического средства необходимо сопоставить с
данными его фармакокинетики, полученными после однократного введения.
Наряду с сопоставлением значений фармакокинетических параметров следует
сравнить фактические уровни фармакологического средства с
прогнозированными по параметрам фармакокинетической модели, установленным
при его однократном введении. Целью такого сравнения является
выявление возможных нарушений в закономерной кумуляции
фармакологического средства и оценка предсказуемости Css по данным, полученным при
однократном введении фармакологического средства.
8-762
- 225 -

2.6. Рекомендация выбора дозы фармакологического средства для I фазы
клинических испытаний
В соответствии с общепринятыми представлениями выбор дозы
фармакологического средства для I фазы клинических испытаний
осуществляется на основе результатов токсикологических экспериментов. Вместе с тем
для препаратов, характеризующихся значительным терапевтическим
индексом, такая доза может быть оценена по данным фармакодинамики и
фармакокинетики фармакологического средства у животных.
Прогнозирование дозы базируется на соотношениях между массой (ш)
и поверхностью тела (S) человека и животного. При этом предполагается,
что минимальная эффективная доза, отнесенная к (S), у человека и
животного одинакова.
Для соответствующих вычислений целесообразно воспользоваться
таблицей.
Соотношение между дозами фармакологического средства у человека (масса тела —
70 000 г) и животных (в скобках — стандартная масса тела в г)
Мышь
(20) 388
Крыса
(200) 56,0
Морская
свинка
(400) 31,5
Кролик
(1500) 14,2
Кошка
(2000) 13,0
Обезьяна
(4000) 6,1
Собака
(12 000) 3,1
Примечание. S (см2) =11,2 т2/3.
Для того чтобы оценить дозу фармакологического средства для
человека, величину дозы, использованной в опытах на животных, следует
умножить на число, содержащееся в соответствующей графе таблицы.
Например, если минимальная эффективная доза фармакологического средства
для крысы массой 200 г составляет 10 мг, то соответствующая доза для
человека массой 70 000 г будет в 56 раз выше, т. е. 560 мг.
По результатам экспериментальных исследований, по крайней мере в
тех случаях, когда фармакокинетика фармакологического средства
описывается моноэкспонентой, возможно прогнозирование фармакокинетиче-
ского профиля у человека. При этом предполагается, что внутрисосудистое
введение фармакологического средства человеку в дозе, которая в
пересчете на единицу поверхности тела эквивалентна использованной в опытах на
животных, обеспечивает создание в крови человека такой же начальной
концентрации. Дальнейшее снижение уровней фармакологического
средства можно прогнозировать с учетом соотношения между значениями Т1/2
У животных (а) и человека (h):
Т|дь = (m„/ma) х 0,25 х Т1/2,а.
Знание Т1/2 h позволяет ориентировочно оценить длительность
наблюдения за концентрацией лекарственного вещества в крови (см. раздел 2.3)
при клиническом исследовании фармакокинетики.
3. Фармакокинетическое изучение новых лекарственных форм, содержащих
известное фармакологическое средство
Основной целью такого исследования является выявление фармакоки-
нетических преимуществ новой лекарственной формы перед
существующей. В тех случаях, когда эти преимущества не связаны с качественным
-226 -

изменением фармакокинетического профиля в крови (предотвращение
деградации фармакологического средства в желудочно-кишечном тракте,
снижение пресистемной элиминации, пролонгация удерживания
фармакологического средства в организме, повышения направленности транспорта
к месту действия и др.), осуществляется оценка биодоступности
фармакологического средства при его введении в новой лекарственной форме (г) и
внутрисосудистом введении или также внесосудистом введении в уже
выпускаемой стандартной (s) форме. В первом случае оценивается
абсолютная, а во втором — относительная биодоступность (степень всасывания,
параметр f) фармакологического средства при его введении в
оригинальной лекарственной форме соответственно по формуле, приведенной в
разделе 2.5, и по формуле:
f = AUCr/AUCs.
При наличии данных фармакокинетики фармакологического средства
при внутрисосудистом введении может быть установлена характеристика
скорости всасывания препарата — среднее время всасывания (МАТ). В
любом случае исследования, предусмотренные настоящим разделом, носят
сравнительный характер (прямое сравнение в эксперименте).
Объем фармакокинетического изучения новых лекарственных форм,
содержащих воспроизведенное фармакологического средства, соответствует
указанному в разделе 4. В тех случаях, когда фармакокинетические
свойства новой лекарственной формы качественно отличаются от описанных для
уже существующих форм (плато концентрации или ее замедленное
снижение после диффузного максимума вместо относительно быстрой
элиминации с четко выраженным максимумом), необходимо параллельное
изучение фармакокинетики и фармакодинамики, с оценкой эквиэффективных
уровней фармакологического средства.
4. Фармакокинетические исследования воспроизведенных
фармакологических средств
Основной целью таких исследований является получение доказательств
идентичности фармакокинетических свойств воспроизведенного
фармакологического средства или лекарственной формы соответствующему
оригиналу. В связи с этим исследование всегда носит сравнительный характер
(прямое сравнение с оригиналом или сравнение с соответствующими
литературными данными). Результаты такого сравнения имеют решающее
значение для судьбы воспроизведенного препарата, поскольку его
доклинические испытания помимо фармакокинетических исследований обычно
включают только оценку острой токсичности.
Фармакокинетические исследования воспроизведенного
фармакологического средства выполняются на одном виде животных с использованием
одной дозы, вводимой однократно, и предусматривают определение
концентрации только в крови (сыворотке, плазме). В специальных случаях
изучения лекарственных форм, предназначенных для местного
применения, в качестве биоматериала могут быть использованы ткань или
биожидкость, отбираемые в зоне помещения препарата.
Если воспроизведенное фармакологическое средство или лекарственная
форма сравнивается с оригинальными непосредственно в фармакокинети-
ческом эксперименте, выбор дозы не имеет принципиального значения —
важно, чтобы в обоих случаях она была одинаковой. Если в сравнительных
8*
-227-

целях используются литературные данные, доза воспроизведенного
фармакологического средства должна точно соответствовать дозе оригинального
вещества, использованной в фармакокинетическом изучении на том же
виде животных.
Регламент фармакокинетического эксперимента (продолжительность
слежения за концентрацией препарата в крови, частота и моменты отбора
проб крови), обработка данных не отличаются от описанных в разделах 2.3
и 2.5. Поскольку в этих случаях нет необходимости прогнозировать
концентрацию препарата у человека, расчеты, предусмотренные разделом 2.6,
не проводятся.
5. Фармакокинетическое изучение воспроизведенных фармакологических
средств с целью расширения показаний к их применению
Необходимость в таких исследованиях обычно возникает при решении
вопроса о целесообразности применения фармакологических средств и
лекарственных форм при беременности, как для лечения матери, так и
плода, при инфекциях, локализованных в относительно труднодоступных для
проникновения препарата органах и тканях, например в тканях головного
мозга и т. д. Поэтому соответствующие фармакокинетические
эксперименты носят ограниченный и вместе с тем направленный характер. Так, для
препаратов, которые предполагается применять при беременности,
оценивается способность фармакологического средства проникать через
плацентарный барьер — по фармакокинетическим профилям в крови (сыворотке,
плазме) матери и биожидкостях и/или ткани плода. Для препаратов,
которые предполагается использовать при инфекциях головного мозга,
проникновение лекарственного вещества через гематоэнцефалический барьер
и т. д. Подобные исследования выполняются на одном виде животных с
использованием двух доз, как при однократном, так и при повторяющемся
введении. Выбор доз и схем длительного введения фармакологического
средства, а также регламента фармакокинетического эксперимента
опирается на принципы, изложенные в разделах 2.2 и 2.3, а анализ фармакоки-
нетических данных — на оценку тканевой доступности и коэффициента
распределения препарата (раздел 2.5). Экстраполяция доз
фармакологического средства, обеспечивающих, например, безопасные и/или
эффективные уровни в ткани плода, эффективные концентрации в головном мозге
и др., осуществляется способами, описанными в разделе 2.6.
6. Отчетная документация о фармакокинетическом исследовании
В отчете об исследовании фармакокинетики должны быть представлены
сведения об использовавшихся лабораторных животных (вид, линия, пол,
возраст, масса тела), их содержании до исследования и состоянии в
момент проведения исследования (бодрствование или наркоз). При работе с
наркотизированными животными должны быть приведены данные о
применявшихся для наркоза препаратах, дозах.
Необходимо представить информацию о способах введения препаратов
и отбора биоматериала, о подготовке и хранении проб. Важна также
информация о стабильности новых фармакологических средств и о
максимальных сроках хранения содержащих их образцов биожидкостей.
Следует подробно описать методику определения концентрации препа-
-228 -

ратов в биологических жидкостях. Охарактеризовать использованные
реактивы, дать сведения о применявшихся приборах и оборудовании.
Метрологические характеристики методики должны включать порог
чувствительности, диапазон линейности, точность, воспроизводимость.
Результаты определения концентрации фармакологического средства
желательно представить в графической форме. При этом на график
(линейный или, лучше, полулогарифмический) должны быть нанесены
средние значения найденных концентраций и границы доверительного
интервала.
Следует указать методы вычисления параметров фармакокинетики
(раздел 2.5). Если при этом использовалась компьютерная техника, нужно
представить данные о применявшихся программных средствах.
В заключение следует указать ориентировочные дозы для I фазы
клинических испытаний и период полувыведения оригинального лекарственного
вещества, оцененные способами, изложенными в разделе 2.6.
Л итература
1. Жердев В.П., Пиотровский В.К., Борисенко С. А., Клейменове Н. Н. Современное
состояние проблемы фармакотерапии (биодоступность фармакологических средств). —
М.: ВНИИМИ, 1987. - Вып. 2. - 76 с.
2. Пиотровский В. К. // Фармакология и токсикология. — 1986, № 5. — С. 118—127.
3. Соловьев В. П., Фирсов А. А., Филов В. А. Фармакокинетика: Руководство. — М.:
Медицина, 1980. — 423 с.
4. Фирсов А. А., Пиотровский В. К. Фармакокинетические методы в биофармации //
Итоги науки и техники. — М.: ВИНИТИ, 1984. — Т. 14. — С. 114—227.

ЧАСТЬ 1
ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ,
ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ
ЦЕНТРАЛЬНОЙ И ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ НЕРВНОЙ
СИСТЕМЫ
Методические указания по изучению нейролептической
активности фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: чл.-корр. РАМН, проф. К. С.
Раевский; к. м. н. В. Б. Наркевич
ВВЕДЕНИЕ
Антипсихотические средства (син.: нейролептические средства,
нейролептики) представляют собой основную группу психотропных веществ,
применяемых для лечения психозов эндогенного и экзогенного
происхождения. Уникальным свойством веществ этой группы является наличие
антипсихотического действия, т. е. способности устранять бред и
галлюцинации.
В настоящее время в группу нейролептиков входят вещества,
различающиеся по химическому строению, влиянию на психопатологическую
симптоматику и своим побочным эффектам. Несмотря на большое количество
существующих препаратов, нейролептики в многих случаях оказываются
недостаточно эффективными или вызывают нежелательные побочные
эффекты. В связи с этим изыскание новых эффективных избирательно
действующих антипсихотических средств остается актуальной задачей
современной фармакологии.
Основные принципы и методы скрининга нейролептиков сложились на
основе изучения фармакологических свойств так называемых типичных
нейролептиков, производных фенотиазина и бутирофенона. Представители
этой группы наряду с антипсихотическим эффектом вызывают
характерные экстрапирамидные расстройства и ряд других побочные эффектов, к
которым относятся, в частности, агранулоцитоз и пролактинемия. Как
показывают исследования, поведенческие эффекты нейролептиков связаны,
главным образом, с блокадой дофаминовых рецепторов мозга.
Нейролептики данной группы в той или иной степени влияют на активность и
других нейромедиаторных систем: адренергической, серотонинергической, хо-
линергической.
Несмотря на то что классические (типичные) нейролептики (аминазин,
галоперидол и их аналоги) до настоящего времени широко применяются в
- 230-

клинической психофармакологии, наибольший интерес представляют
препараты нового поколения, получившие название атипичных
нейролептиков. К ним относятся вещества разного химического строения: дибензазе-
пины (клозапин и его аналоги), бензамиды (сульпирид), производные гам-
ма-карболина (карбидин) и некоторые другие. Основным отличием
препаратов этой группы является отсутствие или малая выраженность
экстрапирамидных расстройств. Особенность механизма действия атипичных
нейролептиков определяется избирательным угнетением мезолимбическои и
мезокортикальнои дофаминергических систем мозга при меньшей степени
воздействия на нигростриатную систему. Некоторые представители нового
поколения нейролептиков оказывают также угнетающее влияние на серо-
тонинергические системы мозга.
Стратегия поиска антипсихотических веществ строится на ряде
основных положений, к которым относятся следующие:
а) дофаминергическая гипотеза шизофрении предполагает, что в основе
антипсихотического эффекта нейролептиков лежит их способность
оказывать центральное дофаминергическое действие;
б) функциональная неоднородность дофаминергических систем мозга
(связь нигростриатной системы с контролем моторных функций, с одной
стороны, участие мезолимбическои и мезокортикальнои систем в
опосредовании высших интегративных функций мозга и эмоциональной
сферы — с другой);
в) молекулярная, функциональная и фармакологическая гетерогенность
рецепторов основных нейромедиаторных систем мозга, вовлеченных в
механизмы действия психотропных веществ (дофаминовые, серотониновые,
гистаминовые, ГАМК, глутаматные и другие рецепторы);
г) моделирование структуры активного центра рецептора и
компьютерный дизайн соединений, обладающих высоким сродством к последнему.
Исходя из вышесказанного, принципиальной задачей современной
психофармакологии представляется создание избирательных антагонистов до-
фаминовых/серотониновых рецепторов, обладающих преимущественным
действием на мезолимбические и мезокортикальные структуры мозга.
Частной задачей является поиск избирательно действущих агонистов/антаго-
нистов пресинаптических рецепторов дофамина и серотонина,
ответственных за регуляцию дофамин(серотонин)ергической нейропередачи.
Методология поиска веществ с атипичным профилем нейролептической
активности строится на применении экспериментальных методов
скрининга in vitro и in vivo. Это, в первую очередь, методика радиолигандного
связывания, широкий круг поведенческих методик, биохимические методы
оценки состояния нейромедиаторных систем мозга, некоторые
специальные методы исследования, в частности нейроэндокринологические.
Идеология и экспериментальные подходы, изложенные выше, легли в
основу настоящих методических рекомендаций. При подготовке данной
работы частично использованы материалы методических рекомендаций,
одобренных Фармкомитетом 28.08.1988 г. С появлением атипичных
нейролептиков методология скрининга новых соединений с предполагаемой
антипсихотической активностью претерпела существенные изменения.
В экспериментах на животных атипичные нейролептики не вызывают
каталепсии и не угнетают стереотипии, вызываемые апоморфином и
фенамином. Напротив, сульпирид, клозапин и карбидин способны
потенцировать стереотипное поведение. Как показывают исследования, "атипич-
ность" действия этих веществ связана с особенностями их влияния на ней-
ромедиаторные системы мозга. Установлено, что некоторые атипичные
- 231 -

нейролептики избирательно блокируют пресинаптические дофаминовые
рецепторы в лимбической системе, другие оказывают м-холиноблокирую-
щее или серотониноблокирующее действие. В связи с этим в настоящее
время наряду с тестами, традиционно используемыми для скрининга
нейролептиков, необходимо использовать тесты, позволяющие предсказать
нейролептическую активность у веществ с атипичным действием.
В отличие от типичных нейролептиков, длительное применение
препаратов указанной группы не сопровождается увеличением концентрации
пролактина в крови больных. В связи со сказанным в настоящие
методические рекомендации включены тесты, позволяющие выявить вещества с
атипичным действием. Благодаря широкому развитию методов радиоли-
гандного связывания в настоящее время стало возможным применять их и
для скрининга новых соединений. В ряде случаев они с успехом заменяют
поведенческие методы скрининга, но отличаются от последних большей
производительностью и экономичностью. Использование этих методов
является в настоящее время обязательным. Кроме того, в методических
рекомендациях дается описание некоторых поведенческих и биохимических
методов, рекомендуемых для более полного изучения отдельных сторон
действия нейролептиков, оценки вероятности возникновения
экстрапирамидных эффектов, а также для исследования механизма действия нейроэн-
докринных антипсихотических веществ. Некоторые из этих методов
достаточно трудоемки, требуют специального оборудования, в связи с чем могут
рассматриваться в качестве дополнительных.
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТИ НЕЙРОЛЕПТИКОВ
Все методы следует разделить на три группы:
1. Поведенческие методы.
2. Методы определения нейрорецепторного профиля соединения (в том
числе методы радиолигандного связывания).
3. Биохимические и другие дополнительные методы.
1. Поведенческие методы
1.1. Влияние на ориентировочно-двигательную реакцию и локомоторную
активность
Опыты проводятся на мышах или крысах. Для определения
ориентировочной реакции животное помещают в закрытую темную камеру
соответствующих размеров, пол которой разделен на секторы (обычно не менее
четырех), после чего подсчитывают число вставаний на задние лапы
(вертикальная составляющая ориентировочной реакции), число пересеченных
квадратов (горизонтальная компонента), а также число заглядываний в
отверстия в полу (норковое поведение, отражающее исследовательскую
активность) за 2,5—5 мин наблюдения.
Для регистрации двигательной активности используются различные
типы актометров. В настоящее время наиболее распространенным является
фотоэлектрический актометр типа "Варимекс". Он состоит из 20 и более
затемненных камер, снабженных 2—6 фотоэлементами. Источники света
находятся напротив фотоэлементов, расположенных на различных уровнях
-232 -

внутри камеры. Пересечение животным луча света регистрируется
счетчиком, данные могут выводиться на компьютер.
Для определения двигательной активности животных предварительно
адаптируют к экспериментальной камере в течение 30 мин для
исключения ориентировочной компоненты двигательной активности.
Наблюдение осуществляется в течение 0,5—4 ч с регистрацией активности каждые
15 мин.
Данные тесты позволяют выявить общее депримирующее действие. В то
же время они не являются специфическими, поскольку многие вещества
других фармакологических групп (снотворные, седативные,
транквилизаторы) также способны угнетать ориентировочно-двигательную реакцию и
локомоторную активность животных.
1.2. Влияние на условные рефлексы
Опыты проводятся на мышах или крысах. Используются методики,
позволяющие быстро выработать условный рефлекс у животных. Наиболее
часто применяются методы условного рефлекса активного или пассивного
избегания, позволяющие изучить влияние соединений на скорость
выработки и угасания условной реакции оборонительного типа.
1.2.1. Условный рефлекс пассивного избегания (УРПИ)
Обучение основано на врожденном стремлении крыс к пребыванию в
небольшом затемненном пространстве. Преимущество метода состоит в
том, что в зависимости от изменения схемы введения веществ можно
оценить их влияние на различные этапы формирования памятного следа —
образование, фиксацию и воспроизведение приобретенного навыка
избегания.
1.2.2. Условный рефлекс активного избегания (УРАИ)
Известно, что оборонительные условные рефлексы проявляют высокую
чувствительность к угнетающему действию нейролептиков. В связи с этим
данная методика может быть рекомендована для включения в число
обязательных тестов расширенного этапа изучения новых нейротропных
соединений с потенциальной нейролептической активностью.
Сущность метода заключается в том, что крыса, стремясь избежать
болевого раздражения через электродный пол, взбирается на вертикальный
стержень и удерживается на нем в течение всего периода безусловного
раздражения. Условным сигналом является звук (или свет); через 5 с к нему
присоединяется электрическое раздражение, длящееся также 5 с. Как
правило, крыса быстро усваивает безусловную реакцию бегства, а затем у нее
возникает условно-оборонительный рефлекс, получивший название
условного рефлекса избегания.
Для испытания веществ отбираются лишь крысы с прочным короткола-
тентным условным рефлексом (процент положительных реакций на
условный сигнал без подкрепления в контрольных испытаниях должен быть не
ниже 85—90 %). Вещества вводятся внутрибрюшинно или per os в дозах,
оказывающихся эффективными по тесту фенаминовой локомоторной ги-
- 233 -

перактивности или апоморфиновой вертикализации у мышей. В опытах по
изучению влияния на угашение УРАИ применяется только условный
сигнал без болевого подкрепления. Реакция учитывается по степени
увеличения латентного периода условной реакции, а также в альтернативной
форме, т. е. по числу животных в группе, у которых подавление условного
рефлекса было полным.
Все известные нейролептики замедляют выработку условного рефлекса
и ускоряют его его угашение. В отличие от психотропных веществ других
фармакологических групп, нейролептики влияют на угашение условного
рефлекса в дозах, не вызывающих подавления двигательной активности.
Результаты опытов с условно-оборонительным рефлексом избегания
обнаруживают удовлетворительную корреляцию с активностью
нейролептиков в клинике при лечении психически больных.
1.3. Влияние на угнетение "стартл-реакции " и ее препульсовое
ингибирование
Нарушения дофаминергической нейропередачи как на пост-, так и на
пресинаптическом уровнях рассматриваются в качестве одного из
важнейших патофизиологических звеньев формирования многих
психопатологических синдромов, протекающих с аффективными расстройствами. При
изучении влияния новых соединений на эмоциональное состояние страха
и тревожности в качестве поведенческой модели используется так
называемая акустическая стартл-реакция (АСР), которую принято рассматривать
как одну из адекватных моделей, пригодных для исследования
эмоциональных состояний у животных и человека, а ее модификации, в частности
препульсовое и латентное ингибирование, позволяют моделировать
некоторые симптомы шизофрении и других психозов. Фармакологическое
исследование свидетельствует, что нейролептики отчетливо угнетают
препульсовое ингибирование АСР, агонисты дофаминовых рецепторов
увеличивают ее амплитуду. Использование в качестве поведенческой модели
АСР позволяет оценивать моторный компонент (амплитуду реакции), мне-
стические процессы (снижение амплитуды реакции как характеристику
процесса привыкания), а также реакцию условного страха на
экспериментальную обстановку, проявляющуюся в изменении времени замирания.
Исследования проводятся на крысах-самцах массой 250—300 г. За 24 ч
до процедуры угашения АСР животное адаптируют к экспериментальной
камере в отсутствие звуковых сигналов. При проведении сеанса
угашения крыс помещают в экспериментальную камеру и в течение 5 мин
регистрируют реакцию замирания, затем предъявляют 10 сильных звуковых
раздражителей длительностью 500 мс с интервалом между стимулами 20
с. Спустя 24 ч после обучения животных вновь помещают в
экспериментальную камеру, в течение 5 мин регистрируют поведение замирания с
последующим тестированием долговременного привыкания АСР (10
звуковых стимулов через 20 с). Регистрация АСР осуществляется с
помощью специальной камеры, соединенной через электронную систему тен-
зоусилителя с самописцем и компьютером. Амплитуда АСР измеряется в
течение 100 мс после подачи звукового раздражителя. Подача сильных
звуковых сигналов осуществляется через усилительную головку. В
качестве стимула используют широкополосный шум длительностью 500 мс и
громкостью ПО дБ, а в качестве фонового, маскирующего звукового
сигнала применяют широкополосный шум громкостью 72 дБ. Регистрацию
-234-

поведения замирания — времени полного отсутствия движения
животного, включая движение вибрисс, осуществляют визуально. Если
непосредственно перед акустической стимуляцией животному предъявляется
дополнительный звуковой сигнал, наблюдается так называемое препульсо-
вое ингибирование, т. е. уменьшение реакции на звуковой сигнал.
Нейролептики избирательно подавляют феномен препульсового ингибирова-
ния. Метод достаточно специфичен.
1.4. Влияние на спровоцированную агрессивность
Опыты проводят на самцах мышей и крыс. Наиболее простой метод
провокации агрессивности — нанесение электроболевого раздражения
путем пропускания импульсов электрического тока (1,5—2 мА) через
электродный пол камеры, в которую помещается пара животных. Под-
считывается число агрессивных атак за 2—5 мин наблюдения. Другой
метод заключается в последовательном увеличении напряжения
переменного тока, пропускаемого через электродный пол, с 6 до 54 В до тех пор,
пока не будет отмечена вокализация и внутривидовая агрессия в двух
испытаниях подряд. Регистрируют порог возникновения данных
феноменов.
1.5. Изучение каталептогенных свойств веществ
Каталептогенное действие веществ оценивают на мышах или крысах.
Данный тест является одним из наиболее важных в скрининге веществ с
потенциальной нейролептической активностью и используется для
выявления вероятности возникновения побочных экстрапирамидных
эффектов. Существуют различные варианты данного метода, но все они сводятся
к определению способности животного сохранять искусственно
приданную позу. Наиболее распространен следующий вариант теста. Передние
лапы животного помещают на горизонтальную проволочную перекладину
(так называемая "поза лектора"), расположенную на высоте 4 см (мыши)
или 10 см (крысы), и определяют время удержания данной позы в течение
5 мин наблюдения. Затем подсчитывается среднее время сохранения позы
для группы животных.
Помимо количественной оценки каталепсию можно оценивать и
качественно с использованием различных шкал интенсивности. При этом в
качестве критерия каталептогенного действия используют способность
животных сохранять заданную позу в течение 60—120 с наблюдения.
Тестирование проводят обычно повторно в течение 3—4 ч, что позволяет получить
информацию о динамике развития и продолжительности действия
исследуемого вещества. Широко распространена шкала Di Chiara-Morelli, где
1 балл соответствует 15—29 с удержания позы, 2 балла — 30—59 с и 3
балла — 60 с и более. Следует, однако, учитывать, что при повторном
тестировании интенсивность каталепсии может увеличиваться не только за счет
фармакологического эффекта вещества, но и вследствие выработки
обстановочного условного рефлекса. Типичные нейролептики вызывают у
животных ярко выраженную каталепсию, сохраняющуюся в течение
нескольких часов, у атипичных нейролептиков каталептогенный эффект выражен
либо незначительно (сульпирид, раклоприд), либо отсутствует совсем (кло-
запин).
-235 -

1.6. Влияние на стереотипное поведение, вызванное введением апоморфина
у крыс
Данный тест является одним из наиболее информативных и широко
используется для выявления способности веществ блокировать дофаминер-
гическую нейропередачу в нигростриатной системе мозга. Подобное
действие характерно для соединений с типичным профилем нейролептической
активности. В качестве экспериментальных животных используются
крысы. Животным подкожно вводится агонист дофаминовых рецепторов апо-
морфин в дозах 0,3—1 мг/кг. Оценивается интенсивность стереотипных
реакций: принюхивания, грызения, лизания. Принята трехбалльная шкала
оценки поведенческих феноменов, согласно которой отдельным
стереотипным движениям, (в том числе непостоянному принюхиванию)
приписывается оценка в 1 балл, в то время как наличие непродолжительно
длящейся интенсивной стереотипии (в том числе лизания и грызения)
оценивается в 2 балла. Постоянная интенсивная стереотипия оценивается в 3
балла. Оценку проводят повторно в течение 1 мин через 15—30 мин после
введения апоморфина, наблюдение ведется в течение 1—2 ч. Учитывается
интенсивность и общая продолжительность стереотипного поведения.
Данный тест высокочувствителен для нейролептиков, являющихся
производными фенотиазина и бутирофенона. В то же время некоторые
атипичные нейролептики, такие как сульпирид и клозапин, не оказывают
заметного влияния на апоморфиновую стереотипию. Карбидин может ее
усиливать. В связи с этим результаты данного теста не могут считаться
решающими для заключения о наличии антипсихотического эффекта.
Угнетение стереотипии указывает на способность исследуемого
вещества оказывать угнетающее влияние на дофаминергическую нейропередачу в
нигростриатной системе мозга.
1.7. Влияние на феномен "вертикализации ", вызванной введением
апоморфина у мышей
Опыты проводятся на мышах массой 18—25 г. Животных помещают в
цилиндрические стандартные камеры с плексигласовым дном, высотой 14
и диаметром 12 см, изготовленные из проволочного прутка толщиной 2 мм
при расстоянии между прутьями 1 см. Апоморфин (2—5 мг/кг) вводят
подкожно непосредственно перед помещением животных в камеры.
Регистрация стереотипного поведения проводится многократно каждые 2 мин на
протяжении 1 ч. Фиксируются следующие поведенческие показатели:
количество лап животного на сетке (феномен "вертикализации"),
обнюхивание, грызение, лизание, кусание при каждом наблюдении. Одновременно
в опыте наблюдается до 30 животных. По окончании опытов подсчитыва-
ется суммарный балл стереотипии для каждого животного за весь период
наблюдений. При оценке число баллов соответствует числу лапок на сетке.
Для других форм стереотипного поведения используются следующие
критерии: обнюхивание — 1 балл (слабая стереотипия), грызение, лизание и
кусание — 2 балла (выраженная стереотипия). Для каждой
экспериментальной группы подсчитывается величина Mime использованием
критерия Манна—Уитни.
Данный тест имеет большее прогностическое значение для выявления
собственно психотропного действия, чем тест апоморфиновой стереотипии
у крыс, поскольку как типичные нейролептики, так и соединения с атипи-
-236 -

ческим профилем обладают способностью угнетать феномен "вертикализа-
ции". Тест позволяет выявить способность веществ блокировать дофами-
нергическую передачу в мезолимбической системе мозга. В то же время
следует отметить, что подобный эффект характерен также и для некоторых
веществ, не обладающих антипсихотическими свойствами — пропраноло-
ла, диазепама, амитриптилина, миансерина, ареколина, физостигмина
и др.
В качестве модификации описанного теста предлагается использование
амфетамина (2,5 мг/кг, внутрибрюшинно) вместо апоморфина.
1.8. Влияние на эффекты малых (пресинаптичских) доз апоморфина
Апоморфин в малых дозах (0,01—0,15 мг/кг) вызывает зевательные
движения у крыс, что предположительно связано с влиянием на пресинапти-
ческие дофаминовые рецепторы. Для проведения теста группе из 8—10
животных вводится апоморфин в дозе 0,1 мг/кг, после чего подсчитывается
число зеваний каждого животного в течение часа. Известно, что
нейролептики обладают способностью угнетать этот эффект апоморфина даже в
малых дозах. Данный тест является наиболее чувствительным из
существующих в настоящее время методик, позволяющих выявить способность
нового соединения блокировать пресинаптические рецепторы дофамина.
1.9. Влияние на рвоту, вызванную апоморфином
Опыты проводят на собаках. Апоморфин вводят в дозе 0,1 мг/кг в вену
и регистрируют появление рвоты. Определяют ЭДд по способности
исследуемого вещества предупреждать рвоту. Все известные нейролептики
угнетают рвоту, вызванную апоморфином, блокируя дофаминовые рецепторы
рвотного центра продолговатого мозга.
1.10. Влияние на амфетаминовую гиперактивность у мышей
Амфетамин (фенамин) вызывает увеличение спонтанной двигательной
активности у мышей, что связывают с усилением дофаминергической ней-
ропередачи предположительно в мезолимбической системе головного
мозга. Животным спустя 15—30 мин после исследуемого вещества подкожно
вводят амфетамин в дозе 2,5—10 мг/кг и регистрируют двигательную
активность в актометре в течение 1—2 ч. Типичные нейролептики проявляют
дозозависимый антагонизм по отношению к эффекту амфетамина, в то
время как атипичные действуют, как правило, значительно слабее или не
угнетают амфетаминовую гиперактивность. Вещества с антидепрессантной
активностью могут усиливать эффект амфетамина.
1.11. Влияние на амфетаминовую стереотипию у крыс
Опыты проводят на крысах. Животным подкожно вводят амфетамин
(фенамин) в дозе 2,5—5 мг/кг и через 15—30 мин регистрируют
интенсивность стереотипных движений, используя шкалу, аналогичную описанной
в разделе 1.6. Типичные нейролептики угнетают амфетаминовую стереоти-
-237-

пию в отличие от атипичных, не проявляющих подобной активности в
этом тесте. Более того, некоторые атипичные нейролептики (сульпирид,
клозапин, карбидин) могут потенцировать стереотипию, что, очевидно,
указывает на возможный антидепрессивный компонент в спектре
фармакологического действия вещества.
1.12. Влияние на 5-окситриптофановый гиперкинез у мышей
Предшественник серотонина 5-окситриптофан вызывает у мышей
характерный гиперкинез в виде резких встряхиваний головой (twitches)
продолжительностью 30—60 мин, что объясняется активацией серотонинерги-
ческой системы ЦНС. Группе из 8—10 мышей вводится внутрибрюшинно
5-окситриптофан в дозе 300 мг/кг через 30 мин после введения
исследуемого вещества. Подсчитывается число встряхиваний головой за 1 мин для
каждого животного с интервалами 10 мин в течение 60 мин. Многие
нейролептики угнетают встряхивания, что указывает на наличие у них
центрального серотониноблокирующего действия. В ряде работ высказывается
предположение о том, что антигаллюцинаторный эффект нейролептиков
может быть связан с блокадой серотониновых рецепторов в ЦНС.
1.13. Влияние на ареколиновый тремор
Данный тест используется для выявления центрального М-холинобло-
кирующего действия веществ. Опыты проводят на мышах. Изучаемое
вещество вводится однократно за 30 мин до подкожного введения ареколина
в дозе 25 мг/кг. Регистрируется длительность тремора. О наличии антихо-
линергического действия говорит уменьшение продолжительности тремора
или его полное устранение. Мускариноблокирующий эффект характерен
для клозапина, что, возможно, объясняет, по крайней мере частично,
отсутствие у этого нейролептика влияния на экстрапирамидную систему
мозга.
1.14. Влияние на ректальную температуру
В опытах используются мыши или крысы. Температуру измеряют при
помощи электротермометра с ректальным датчиком. У мышей ректальная
температура определяется при погружении электрода на глубину 1,5—1,8
см, у крыс — на глубину 2,5 см. Обязательным является определение
ректальной температуры у контрольной группы животных, получавших
изотонический раствор натрия хлорида. Для нейролептиков типа аминазина
характерно выраженное гипотермическое действие.
2. Определение нейрорецепторного профиля нового соединения
2.1. Общая стратегия исследования
Исследованиями последнего времени установлено, что рецепторы ней-
ротрансмиттеров, прежде всего дофамина и серотониниа, являются
гетерогенными и подразделяются на несколько подгрупп. Так, среди дофамино-
-238-

вых рецепторов принято выделять 2 основные подгруппы, обозначаемые
как Д1 и Д2, последние, в свою очередь, включают в себя Д1 и Д5
подтипы (подгруппа Д1-подобных рецепторов) и Д2, ДЗ, Д4 (подгруппа Д2-по-
добных рецепторов). Принципиальное отличие между рецепторами
состоит в том, что первые активируют синтез циклического АМФ, вторые либо
его угнетают, либо не оказывают влияния. Описано также несколько
подтипов серотониновых рецепторов, сродство к которым проявляют многие
из современных антипсихотических средств. Наиболее важными для
понимания механизма нейролептического действия являются рецепторы 5-НТ2
подтипа. Для всех указанных выше подтипов нейрорецепторов созданы
вещества — лиганды, проявляющие ту или иную степень избирательного
действия, в основе которого лежит специфическое сродство (аффинитет) к
данному рецептору. В переднем мозге наиболее широко представлены
рецепторы Д1, Д2 и 5-НТ2 подтипов, с которыми взаимодействуют
практически все известные в настоящее время нейролептики.
В связи с этим определение способности нового соединения с
предполагаемой антипсихотической активностью связываться с указанными
подтипами рецепторов является обязательным условием его доклинического
изучения. Нейролептики последнего поколения, включая клозапин, олан-
зепин, рисперидон, проявляют высокую степень сродства (аффинитета) к
рецепторам Д2 и 5-НТ2 подтипов. В качестве лиганда, способного
связываться с обоими подтипами рецепторов, используется меченый спиропери-
дол (спиперон). Высокой избирательностью в отношении 5-НТ2 подтипа
рецепторов обладает кетансерин, являющийся, как и спироперидол,
антагонистом (блокатором) этих рецепторов и широко используемый в
качестве радиолиганда при скрининге соединений с нейролептической
активностью. Важное значение для характеристики рецепторного профиля новых
нейролептиков имеет определение степени их сродства к альфа-адреноре-
цепторам ЦНС. Из числа наиболее распространенных антипсихотических
препаратов аминазин, галоперидол и клозапин обладают способностью
связываться с этими рецепторами наряду с высоким аффинитетом к
рецепторам Д2 и 5-НТ2 типа.
В последнее время большой интерес привлекают к себе два других
подтипа дофаминовых рецепторов — ДЗ и Д4, относящиеся кД2-подобным.
Способностью связываться с этими рецепторами обладают атипичные
нейролептики, в частности клозапин. Принято считать, что наибольшую
прогностическую значимость в плане предсказания нейролептической
активности новых химических соединений имеет их сродство к дофаминовым
рецепторам Д2 подтипа, наиболее широко представленным в областях
мозга, где локализованы окончания дофаминергических нейронов (стриатум,
прилежащее ядро, префронтальная, цингулярная, фронтальная кора,
обонятельный бугорок).
Для большинства нейролептиков установлена высокая степень
корреляции между характеристиками связывания вещества с Д2 рецептором, с
одной стороны, и средней терапевтической дозой, обеспечивающей
антипсихотический эффект в клинике, — с другой. Поскольку избирательные
лиганды Д1 подтипа дофаминовых рецепторов не показали
антипсихотической активности в клинике, для практических целей скрининга можно
считать достаточным определение количественных характеристик сродства
(обычно это 1С50, т. е. концентрация вещества, при которой имеет место
50 % вытеснение 3Н-спироперидола) данного соединения к Д2
дофаминовому рецептору. Перспективными принято считать соединения,
проявляющие сродство к Д2, 5-НТ2 и альфа-адренорецепторам в нанограммовом
-239-

диапазоне концентраций (1С50, в пределах 108 М). При наличии
активности этого уровня целесообразно провести более широкое изучение рецеп-
торного профиля вещества, включая определение 1С50 по связыванию с 5-
НТ1, 5-НТЗ серотониновыми рецепторами, бета-адренорецепторами, мус-
кариновыми холинорецепторами, Д1, ДЗ, Д4-подтипами дофаминовых
рецепторов, гистаминовыми рецепторами, сигма-сайтом NMDA-рецепторно-
го комплекса, ГАМК-рецептором, транспортными белками,
обеспечивающими обратный захват дофамина и других нейротрансмиттеров. Эти
исследования позволяют получить достаточно полный "нейрорецепторный
профиль" соединения.
2.2. Методика радиолигандного связывания
В настоящее время методы радиолигандного связывания, используемые
для характеризации способности нового соединения связываться с тем или
другим рецептором (подтипом рецептора), являются наиболее важными в
скрининге нейролептиков. Метод радиолигандного связывания позволяет
непосредственно качественно и количественно оценить взаимодействие
вещества с рецепторами, изучить связь между структурой и действием и
провести сравнительную оценку соединений по силе взаимодействия с
рецептором. По сравнению с поведенческими методами скрининга и
биохимическими методами, методы радиолигандного связывания просты в
техническом отношении и не требуют больших количеств животных,
реактивов и исследуемых веществ, что особенно важно при работе с большим
числом соединений.
В качестве радиолиганда дофаминовых рецепторов используется 'Н-
спиперон с удельной активностью 15—40 Ки/ммоль. 3Н-спиперон метит
также 5-НТ2 серотониновые рецепторы, поэтому его с успехом можно
применять для оценки взаимодействия веществ с 5-НТ2 рецепторами.
Рекомендуется изучить влияние веществ на связывание с препаратами
мембран, полученными из различных структур мозга (стриатума, лимбической
системы и фронтальной коры). В стриатуме и структурах лимбической
системы 3Н-спиперон связывается, главным образом, с дофаминовыми
(Д2), во фронтальной коре — с серотониновыми (5-НТ2) рецепторами.
Изучаемые структуры выделяют из мозга 3—4 крыс, взвешивают и
гомогенизируют в ледяном 50 мМ Трис-HCl буфере (рН = 7,5; t = 20°С) в
стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (900—1000 об/мин,
7—10 пассажей). Гомогенат центрифугируют 30 000 d 20 мин при 0—4°С,
осадок ресуспендируют в 5 мМ трис-буфере, содержащем 120 мМ NaCl,
2,5 мМ СаС1, 6 мМ КС1 и 1 мМ MgCl, (рН = 7,1 при t = 370 °С).
Суспензию мембран (0,1 мг белка/мл) инкубируют с 3Н-спироперидо-
лом (0,1—0,25 нМ) в отсутствие и присутствии различных концентраций
исследуемых веществ (0,1—10 мкМ) при 25 "С 30 мин или 37 °С 10—15 мин
и связанный спиперон выделяют фильтрованием на стекловолокнистых
фильтрах типа GF/B ("Whatman"). Радиоактивность, оставшуюся на
фильтрах, подсчитывают методом жидкостного сцинтилляционного счета.
Рассчитываются концентрации веществ, угнетающие связывание 3Н-спиперо-
на на 50 % (1Сд,). Большинство известных нейролептиков угнетают
связывание 3Н-спиперона в наномикромолярном диапазоне концентраций.
Поскольку как агонисты, так и антагонисты дофаминовых рецепторов
вытесняют 3Н-спиперон из мест связывания, то для их разграничения
рассчитывают коэффициент Хилла. Для большинства антагонистов он близок к 1, а
- 240 -

для антагонистов — значительно ниже 1. У известных нейролептиков
способность вытеснять 3Н-спиперон обнаруживает достаточно высокую
степень корреляции с их антипсихотическим действием и выраженностью
экстрапирамидных расстройств.
Аналогично проводится опыт связывания 3Н-спиперона с серотонино-
выми рецепторами фронтальной коры. Если изучаемое вещество в нано-
молярных концентрациях вытесняет радиолиганд из мест связывания,
идентифицированных как серотониновые рецепторы, это указывает на
наличие серотониноблокирующего действия. Для определения аффинитета
исследуемого соединения к другим рецепторам используются
соответствующие радиолиганды.
3. Биохимические и другие дополнительные методы, используемые
для определения дискинетического потенциала нейролептиков и для более
углубленного анализа их действия на моноаминергические системы
3.1. Изучение дискинетического потенциала нейролептиков
Длительное применение нейролептиков может вызывать у больных
неврологические нарушения в виде дискинезии. Наиболее опасное
осложнение длительного приема нейролептиков — поздняя дискинезия.
Предполагается, что одной из причин развития дискинезии является
компенсаторное увеличение числа дофаминовых рецепторов в ЦНС в ответ на
длительную блокаду дофаминергической передачи, вызванную нейролептиками.
Имеется корреляционная связь между дискинетическим потенциалом
нейролептиков и их способностью вызывать гиперчувствительность
дофаминовых рецепторов стриатума при повторном введении. Способность
нейролептиков вызывать компенсаторное повышение активности
дофаминергической системы удается выявить в эксперименте на животных при
повторном введении веществ с их последующей отменой.
Опыты проводят на крысах. Исследуемые вещества вводят ежедневно в
течение 3—4 нед. Параллельно контрольным группам животных вводится
изотонический раствор NaCl и галоперидол 0,3—1 мг/кг внутрибрюшинно
в качестве эталонного препарата. Затем вещества отменяют и на 4—5-й
день после отмены контрольным и опытным животным вводят апоморфин
0,5 мг/кг. Каждые 15 мин в течение часа оценивают интенсивность апо-
морфиновой стереотипии. Если у животных, получавших изучаемое
соединение, наблюдается усиление апоморфиновой стереотипии по сравнению с
контрольной группой, то это свидетельствует о развитии
гиперчувствительности дофаминовых рецепторов, а следовательно, о возможности
появления дискинезии в условиях хронического применения. Биохимические
доказательства гиперчувствительности могут быть получены с
использованием методов радиолигандного связывания и определением величины Вшм,
отражающей число функционирующих дофаминовых рецепторов.
3.2. Влияние на содержание катехоламинов, серотонина и их метаболитов
в структурах мозга крыс
Наиболее чувствительным, точным и общепринятым является в
настоящее время метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с
электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД). Для определения содержания мо-
-241 -

ноаминов в структурах мозга рекомендуется использовать ВЭЖХ/ЭД в
обращенных фазах с ионпарным реагентом октилсульфатом натрия (ОСИ).
Маточные растворы моноаминов и внутреннего стандарта 3,4-диокси-
бензиламина (ДОБА) с концентрацией 0,1 мг/кг готовятся 2 раза в месяц
0,1 Н НСЮ4, с добавлением 1 % метабисульфата натрия. Рабочие
стандарты (100 нг/мл), необходимые для калибровки прибора, готовятся
ежедневно. Для определения катехоламинов и ДОФА используется метод
избирательного осаждения их на окиси алюминия в щелочной среде.
Вещество с предполагаемой нейролептичекой активностью вводится
внутрибрюшинно или перорально за 60 мин до декапитации крыс. Навеску
ткани гомогенизируют в 20 объемах 0,1 н НСЮ4. Затем образцы
центрифугируют при 10 000 g в течение 5 мин. Осаждение на окиси алюминия
проводится в гранулированном пузырьке.
Смесь содержит: 2 мл супернатанта, 2,5 мл ДОБА, 50 мг А12Оэ и 1 мл
трис-HCl буфера с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА; 1,5 М, рН
= 8,6). После трехкратной промывки 2 мл бидистиллированной воды катехо-
ламины и ДОФА элюируют с помощью 200 мкл 0,1 н НСЮ4,
центрифугированием через целлюлозные фильтры (0,2 мкм). Для определения
катехоламинов, серотонина (5-ОТ), 5-оксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК), 3,4-
диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и гомованилиновой кислоты
(ГВК) к навеске ткани добавляют 20 объемов 0,1 н НСЮ4, содержащей
ДОБА (50 нг/мл). Затем образцы центрифугируют при 15 000 g в течение 10
мин. Супернатант фильтруют центрифугированием в течение 2 мин через 0,2
мкм целлюлозные фильтры. 20 мкл чистого фильтрата наносят на колонку
путем прямой инъекции. Разделение изучаемых веществ проводят на
хроматографе типа LC-304 Т (ВАЗ), снабженном инжектором 7125 Reodyne 20 мкл
петлей для нанесения образцов. Используют колонку Biophase RP-18 октаде-
цилсилановую 4,6 250 мм, защищенную предколонкой RP-18 4,6 мм 30 мм,
20 мкм колонку термостатируют при 45 "С. В качестве детектора используют
двойной амперометрический детектор LC-4B с ячейками LC-17 D и двумя
параллельными стеклоуглеродными электродами TL-5. Потенциалы,
приложенные к рабочим электродам, составляют +650 мВ и +850 мВ против Ag/
AgCl электрода сравнения RE-1. Скорость потока — 1 мл/мин. Для
определения катехоламинов, серотонина, 5-ОИУК, ДОФУК и ГВК используют
следующую подвижную фазу. Маточные растворы 0,02 М лимонной
кислоты и 0,02 М NaH2P04, буфера, содержащего 0,269 мМ ЭДТА, смешиваются в
пропорции 2,45:1. Затем добавляется 0,3 мМ ОСН и 40 % ацетонитрила, рН
= 3,6 устанавливается добавлением фосфорной кислоты. Подвижную фазу
фильтруют, применяя вакуумный насос, через целлюлозные фильтры (0,25
мкм) типа "Синпор". Для определения катехоламинов и ДОФА в качестве
подвижной фазы используют 0,15 М буфер монохлоруксусной кислоты,
содержащей 2 мМ №2ЭДТА и 25—30 мг/л ОСН, рН = 3,0, которое
устанавливается добавлением NaOH. Подвижную фазу фильтруют.
Известные нейролептики вызывают повышение содержания
метаболитов ГВК и ДОФУК, что свидетельствует об увеличении скорости
метаболического оборота дофамина. Последнее может рассматриваться как
компенсаторная реакция, развивающаяся в ответ на блокаду дофаминовых
рецепторов нейролептиками.
По этому тесту типичные нейролептики более активны, чем атипичные.
Определение содержания аминов и их метаболитов в различных структурах
мозга позволяет выявить структурную избирательность действия веществ.
Используют, как правило, стриатум, прилежащее ядро перегородки,
фронтальную кору мозга.
- 242-

Для более детальной характеризации взаимодействия новых соединений
с неиротрансмиттерными системами мозга рекомендуется использовать
методику определения скорости метаболического оборота моноаминов с
применением ингибитора декарбоксилазы L-ароматических аминокислот
(соединение NSD-1015), а также технику внутримозгового микродиализа,
позволяющую оценить влияние вещества на пресинаптическую регуляцию
биосинтеза и высвобождения нейротрансмиттера (дофамина, серотонина).
Последние методы могут рассматриваться как дополнительные.
3.3. Изучение влияния на уровень секреции пролактина
Секреция пролактина регулируется дофаминергическими волокнами ту-
бероинфундибулярного тракта, берущего начало в области аркуатного и
перивентрикулярного ядер гипоталамуса. Дофаминовые рецепторы
преимущественно Д2 подтипа, локализованы на секреторных клетках
переднего гипофиза, где они выполняют функцию ингибиторного контроля
секреции пролактина. Нейролептики при введении людям или
экспериментальным животным, блокируя Д2 дофаминовые рецепторы, вызывают
усиление секреции пролактина, что может быть причиной таких нежелательных
побочных эффектов, как галакторея, аменорея, бесплодие, гиперплазия
молочной железы.
Нейролептики нового поколения, благодаря своему низкому сродству к
Д2 рецепторам тубероинфундибулярной системы, как правило, не
вызывают пролактинемию.
Для оценки возможного влияния нового соединения с предполагаемой
нейролептической активностью на дофаминергическую передачу в
тубероинфундибулярной системе крысам вводят вещество в терапевтической дозе
однократно или в течение 2 нед, определяя уровень пролактина в плазме
крови радиоиммунологическим методом.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Поскольку до настоящего времени экспериментальная модель психоза
не разработана, предсказать антипсихотическое действие удается только на
основе косвенных признаков, характеризующих данный класс
психотропных средств. Применение широкого набора тестов поведенческого,
электрофизиологического, радиолигандного и биохимического анализа
позволяет с достаточно высокой степенью вероятности выявить соединения,
обладающие антипсихотическим эффектом, и предсказать особенности их
действия в клинических условиях.
Современная идеология создания новых антипсихотических веществ
базируется на представлении об избирательности их действия на дофаминер-
гические и сертонинергические системы мозга. Новый препарат,
предлагаемый для клинического изучения, наряду с высокой антипсихотической
активностью (прогнозируемой на основе совокупности экспериментальных
данных) не должен обладать экстрапирамидным потенциалом, т. е.
способностью вызывать побочные эффекты типа паркинсонизма и поздней дис-
кинезии. Такие вещества получили название атипичных нейролептиков,
представителем которых является клозапин и его аналоги. Для оценки
возможного экстрапирамидного потенциала нового соединения используются
специальные методические подходы.
-243 -

На этапе первичного скрининга принципиально важным для
прогнозирования возможного нейролептического (антипсихотического) действия
исследуемого соединения является установление его способности к
высокоаффинному (на уровне наномолярных концентраций) связыванию с
дофаминовыми (Д2) и серотониновыми (5-НТ2) рецепторами мозга.
Методические указания по изучению антидепрессантной
активности фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛЬ: д. м. н. Н. И. Андреева
ВВЕДЕНИЕ
Антидепрессанты являются одной из основных групп психотропных
препаратов, применяемых для лечения депрессий эндогенного и
экзогенного происхождения.
В настоящее время эта группа препаратов включает не только так
называемые типичные антидепрессанты (соединения трициклической
структуры и ингибиторы моноаминоксидазы первого поколения), но и ряд
препаратов разной химической структуры (тетра-, би- и моноциклических),
которые в силу особенностей их строения и механизма действия стали
называть атипичными (миансерин, мапротилин, тразодон, пиразидол, моклобе-
мид и др.).
Основные принципы и методы скрининга антидепрессантов сложились
на основе изучения фармакологических свойств типичных
антидепрессантов. Появление новых антидепрессантов не внесло принципиальных
изменений в представления о биохимической сущности депрессии, а также
методах отбора потенциальных антидепрессивных средств.
Независимо от того, на каком уровне нейромедиаторной передачи
сказывается влияние антидепрессантных средств, все они в итоге вызывают
усиление функций катехол- и/или индоламинных нейронов и уменьшение
нейротрансмиттерного дефицита, характерного для депрессивных
состояний, и именно на этом основании ведется поиск и отбор
антидепрессантных средств.
Доклиническое изучение антидепрессантов, так же как и других
лекарственных препаратов, должно решить ряд вопросов:
а) наличие специфической активности;
б) отсутствие токсических свойств;
в) отличия и преимущества новых препаратов по сравнению с
существующими.
Для выявления специфической активности потенциальных
антидепрессантов в настоящее время используют ряд экспериментальных методов,
включающих различные фармакологические, физиологические и
биохимические исследования.
Отличия и преимущества вновь предлагаемых антидепрессантов по
сравнению с известными оценивают по наличию качественных и/или
количественных различий в фармакологических эффектах и по особенностям
механизма действия.
-244-

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТИ АНТИДЕПРЕССАНТОВ
Все методы можно в основном разделить на следующие группы:
1. Поведенческие методы.
2. Нейрофармакологические методы.
3. Биохимические методы.
1. Поведенческие методы
1.1. Влияние на общее состояние и простые поведенческие реакции у белых
мышей
Оценивается состояние животных после введения им исследуемых
соединений: отмечают сохранение или изменение способности к обычной
локомоции, наличие или отсутствие феномена Штраубе, положение лап
(хождение на кончиках лап, расползание конечностей, подпрыгивание,
боковое положение и др.), изменение окраски кожи, частоты дыхания,
температуры тела, сохранение или утрату рефлекторной возбудимости,
наличие тремора и судорог, способности повисать на сетке, удерживаться на
вращающемся стержне и др. Изменение этих показателей дает самое
первое представление о возможном активирующем влиянии на те или иные
функции центральной нервной системы или седативных свойствах
соединений.
1.2. Влияние на условные рефлексы
Опыты проводятся на мышах и крысах. Исследуют условные рефлексы
с позитивным и негативным подкреплением, "оперантное" поведение,
модельные "психотические" состояния, вызываемые электрическим и
химическим раздражением структур головного мозга, и др.
Широкое распространение в фармакологическом эксперименте
получил метод условных электрооборонительных рефлексов избегания у
крыс.
Антидепрессанты с седативным компонентом действия (амитриптилин,
доксепин и др.) оказывают угнетающее влияние на условный рефлекс
избегания, но антидепрессанты со стимулирующим компонентом действия
(имипрамин, пиразидол и др.) оказывают различное влияние на условно-
рефлекторную деятельность в зависимости от дозы: стимулирующий
эффект в малых дозах и тормозной — в больших.
1.3. Влияние на биоэлектрическую активность мозга
Электроэнцефалографические методы нельзя отнести к обычным
методам отбора, но они могут быть использованы для более углубленного
изучения соединений, обнаруживших активность в других скрининговых
тестах.
Изучают влияние соединений на спонтаннную биоэлектрическую
активность коры и подкорковых структур мозга, изменение реакции
активации, вызванной электростимуляцией ретикулярной мезэнцефалической
-245-

формации, ноцицептивным и звуковым раздражениями, изменение
судорожной активности гиппокампа, вызванной электрическим раздражением
этой структуры мозга, изменение реакции перестройки коркового ритма
(реакция "усвоения" или "следования"), вызванной ритмической
фотостимуляцией.
Антидепрессанты, обладающие преимущественно стимулирующим
действием на центральную нервную систему: десипрамин, вилоксазин
и др. — вызывают десинхронизацию ЭЭГ. Антидепрессанты,
оказывающие седативное действие: амитриптилин, мапротилин и др. — вызывают
синхронизацию ЭЭГ. Синхронизирующим действием обладает также
имипрамин.
Антидепрессанты, вызывающие синхронизацию ЭЭГ и обладающие
центральной антихолинергической активностью (имипрамин,
амитриптилин, мапротилин и др.), угнетают или полностью блокируют реакцию
"пробуждения", вызванную электростимуляцией ретикулярной формации
среднего мозга. Антидепрессанты, оказывающие преимущественно
активирующее влияние на ЭЭГ и лишенные центрального холинолитического
эффекта (азафен, пиразидол и др.), вызывают снижение порога реакции
"пробуждения", оказывают стимулирующее влияние на восходящую
активирующую систему мозга.
1.4. Влияние на эмоционально-стрессовые состояния
1.4.1. Тест отчаяния
Стрессовое состояние вызывают у крыс и мышей форсированным
плаванием. Животных помещают в цилиндр, диаметром для мышей — 10 см,
высотой 25 см, для крыс — 18 и 40 см соответственно. Цилиндр
наполняют на '/з водой (27 °С). После неудачных попыток выбраться из воды
животные принимают характерную неподвижную позу, которую расценивают
как проявление подавленности, "отчаяния". Фиксируют все активные
попытки животных выбраться из воды в течение первых 6 мин после
погружения в воду. В модификации метода для этой цели используют
вращающееся в воде колесо, соединенное со счетчиком.
Под влиянием антидепрессантов, независимо от механизма их
действия, активность животных возрастает и время неподвижности
(иммобилизации) уменьшается.
1.4.2. Тест "выученной беспомощности"
Неизбегаемое электроболевое раздражение вызывает у крыс длительно
сохраняющийся дефицит поведения, проявляющийся затруднением
обучения условнорефлекторным или оперантным реакциям избегания.
Крыс помещают в клетки с полом из металлических прутьев и
подвергают повторным электроболевым воздействиям (50—80 ударов током
0,4 мА, 15 с, интервал между ударами тока 10—110 с). На следующий день
у животных начинают вырабатывать условную реакцию избегания.
Применение антидепрессивных средств в течение 7—14 дней препятствует
развитию торможения выработки условной реакции.
- 246 -

1.4.3. Тесты реактивного и резерпинового депрессивноподобных состояний
у кошек
Моделирование депрессии у кошек вызывается: 1) созданием повторной
конфликтной ситуации с апериодическим электроболевым подкреплением
(опыты в камере с электродным полом) и 2) однократным введением
резерпина 0,1 мг/кг подкожно.
Устойчивое реактивное депрессивноподобное состояние развивается
через 10—12 сут, носит стойкий характер и сохраняется до 3 нед.
Резерпиновая депрессия развивается в полном объеме через 18—24 ч
после введения резерпина, сохраняется в течение 4 сут и постепенно
исчезает на 7-е сутки.
Оценивают: эмоциональное состояние (негативное и позитивное), зоо-
социальное взаимодействие, мотивационную активность, соматомоторные
и некоторые вегетативные показатели и др.
Антидепрессанты вызывают нормализацию неадекватного поведения и
соматомоторных показателей полностью или отдельных групп показателей.
1.4.4. Тесты агрессивного поведения у мышей и крыс
Агрессивное поведение вызывается изоляцией, электрическим
раздражением через электродный пол, использованием штаммов крыс,
убивающих мышей, введением клофелина (в больших дозах — 20 мг/кг внутри-
брюшинно или внутривенно, вызывающих стимуляцию постсинаптиче-
ских а-адренорецепторов и вследствие этого возбуждение животных
вплоть до появления агрессивного поведения).
Антидепрессанты, особенно антидепрессанты с седативным
эффектом, уменьшают многие виды агрессивного поведения, однако клониди-
новая агрессия при хроническом введении антидепрессантов
усиливается.
2. Нейрофармакологические тесты
2.1, Тесты, основанные на взаимодействии с веществами, оказывающими
депрессивное влияние на центральную нервную систему
2.1.1. Влияние на эффекты резерпина и тетрабеназина
Опыты проводят на мышах и крысах. Резерпин и тетрабеназин
оказывают депрессивное действие на центральную нервную систему животных,
вызывая уменьшение двигательной активности, кататонию, гипотермию,
блефароптоз, потенцирование действия снотворных, угнетение процессов
выработки условных рефлексов и др. На ЭЭГ они вызывают
возникновение высокоамплитудной активности. Резерпин вводят внутрибрюшинно
мышам в дозе 2,5 мг/кг, крысам в дозе 4 мг/кг. Оценку депрессивных
эффектов резерпина проводят через 4 ч после введения, когда его эффекты
выражены в полной мере.
Исследуемые соединения можно вводить до резерпина (за 1 ч при
введении внутрь или за 30 мин при их подкожном или внутрибрюшинном
введении) или на фоне уже развившихся эффектов резерпина (через 4—
17 ч после него).
- 247-

Тетрабеназин вводят внутрибрюшинно в дозе 40 мг/кг через 1 ч после
исследуемых соединений. Оценку депрессивных эффектов тетрабеназина
проводят через 1 ч после его введения. Опыты проводят при температуре
окружающей среды 20—22 °С. Действие изучаемых соединений чаще всего
оценивают по уменьшению вызываемых резерпином и тетрабеназином
гипотермии и блефароптоза. Гипотермию определяют электротермометром в
прямой кишке. Блефароптоз оценивают в баллах.
Однократное или повторное введение антидепрессантов уменьшает или
предотвращает развитие депрессивных явлений.
2.1.2. Влияние на эффекты нейролептиков
Типичные нейролептики вызывают у экспериментальных животных
угнетение двигательной активности и ориентировочных реакций, кататонию,
гипотермию и другие депрессивные эффекты.
Наибольшее распространение при исследовании антагонизма
антидепрессантов в отношении депримирующих эффектов нейролептиков
получил тест фенотиазиновой каталепсии. Для этой цели крысам или
мышам вводят трифтазин или метеразин внутрибрюшинно в дозах 3—
6 мг/кг.
Состояние каталепсии у животных оценивает по их способности
сохранять в течение определенного времени (в секундах) заданные им
непривычные позы (помещение передних лап животных на горизонтальную
проволоку или деревянную ступеньку).
Введение антидепрессивных препаратов (предварительное или на фоне
действия каталептогенных средств) уменьшает каталепсию.
2.1.3. Влияние на эффекты клофелина
В условиях эксперимента на разных видах животных (мыши, крысы,
кошки, кролики) введение клофелина в малых дозах (0,1—0,5 мг/кг
внутривенно или внутрибрюшинно), стимулирующих пресинаптические а-ад-
ренорецепторы, сопровождается депрессивными эффектами: общим
угнетением, уменьшением двигательной активности, синхронизацией ЭЭГ,
гипотермией, гипотензией и др.
Антидепрессанты ослабляют указанные эффекты клофелина, особенно
при их хроническом введении.
2.2. Тесты, основанные на взаимодействии с веществами, активирующими
центральную нервную систему
2.2.1. Влияние на эффекты фенамина
Взаимодействие с фенамином изучается по показателям фенаминовой
стереотипии и гипертермии у мышей и крыс, "групповой токсичности" у
мышей, десинхронизации ЭЭГ у кошек и кроликов. Фенаминовую
стереотипию оценивают у каждого животного в течение 1 мин наблюдения в
баллах от 0 до 4, гипертермию измеряют электротермометром в прямой
кишке каждый час в течение 4 ч после введения фенамина. При изучении
"групповой токсичности" определяют количество летальных исходов у мы-
- 248-

шей, сгруппированных по 10 и помещенных в клетки размером
25 х 15 х Ю см, через 24 ч после введения фенамина. Фенамин
используют в дозах 2,5—5—7,5—10 мг/кг подкожно.
В электроэнцефалографических исследованиях на кошках и кроликах
при изучении влияния на десинхронизирующее действие фенамина
последний применяют в дозах 0,5—1 мг/кг внутривенно.
Антидепрессанты усиливают эффекты фенамина.
2.2.2. Влияние на эффекты L-дофа (Ь-диоксифенилаланина)
L-дофа вводят мышам и крысам в дозах 100—200 мг/кг внутрибрюшин-
но. В этих дозах L-дофа вызывает угнетение, гипотермию и уменьшение
двигательной активности, тогда как в дозах 500 мг/кг и больших L-дофа
вызывает возбуждение, агрессивность, усиление двигательной активности,
повышение температуры тела. Введение L-дофа сопровождается также
рядом симптомов, свидетельствующих о возбуждении вегетативной нервной
системы: пилоэрекцией, увеличением саливации, гиперпноэ,
экзофтальмом, увеличением мочеотделения и др.
При предварительном введении антидепрессантов, особенно
ингибиторов моноаминоксидазы, L-дофа в дозах 100—200 мг/кг оказывает такое же
действие, которое наблюдается при введении его в дозе 500 мг/кг, т. е.
отмечается усиление стимулирующего действия L-дофа.
2.2.3. Влияние на эффекты фенилэтиламина
2-фенилэтиламин (ФЭА) вызывает у мышей и крыс стереотипию,
гиперактивность, гипертермию и другие эффекты, сходные с эффектами
фенамина. Эти эффекты наблюдаются при введении ФЭА в дозах 100 мг/кг и
больших (подкожно или внутрибрюшинно). При предварительном
введении антидепрессантов — ингибиторов моноаминоксидазы, ФЭА уже в
дозах 10—20—40 мг/кг вызывает значительное повышение температуры тела,
выраженную гиперлокомоцию, стереотипию, а также токсический эффект
у сгруппированных мышей. Методы с ФЭА используются в основном для
оценки ингибирующей МАО активности и в первую очередь для оценки
влияния на МАО типа Б.
2.2.4. Влияние на эффекты апоморфина
Наиболее простым и информативным тестом является тест апоморфи-
новой гипотермии, причем гипотермию вызывают большими (10—25 мг/кг
подкожно), но не малыми (0,1—1 мг/кг, как при исследовании
нейролептиков) дозами. Предварительно введенные антидепрессанты (не
ингибиторы МАО) отчетливо снимают гипотермический эффект апоморфина.
Антидепрессанты, обладающие антимоноаминоксидазной активностью, при
введении за 30—120 мин до апоморфина усиливают и удлиняют
гипотермический эффект апоморфина.
Наряду с уменьшением гипотермии от больших доз апоморфина,
антидепрессанты — не ингибиторы МАО, усиливают ряд других его эффектов:
грызение (бумажный пол), стереотипию, двигательную активность,
агрессивность и др. Для скрининга эти методы применяют редко, так как по-
-249-

тенцирующее действие антидепрессантов в этих тестах непостоянно,
выражено незначительно и обнаруживается, главным образом, при их
хроническом введении.
2.2.5. Влияние на эффекты 5-окситриптофана
Центральные эффекты 5-окситриптофана, обусловленные стимуляцией
серотонинергических структур мозга, представлены тремором,
стереотипией, гипертермией у кроликов и гипотермией у мышей, встряхиваниями
головы у мышей и др.
Феномен встряхивания головы ("кивки", head twitch) является наиболее
распространенным методом оценки воздействия на центральные серотони-
новые структуры.
5-окситриптофан вводят в дозах 50 и 300 мг/кг внутрибрюшинно. В
дозе 50 мг/кг (ЭД4) 5-окситриптофан практически не вызывает встряхиваний
головы. Из антидепрессантов только ингибиторы МАО усиливают
действие 5-окситриптофана в этой дозе, способствуя появлению
множественных кивков головы.
В дозе 300 мг/кг 5-окситриптофан вызывает встряхивания головы,
которые заметно уменьшаются под влиянием антидепрессантов — не
ингибиторов МАО. Наиболее активны атипичные антидепрессанты — миансерин,
тразодан и др., но и антидепрессанты — блокаторы захвата моноаминов
(имипрамин, амитриптилин и др.) также обладают серотонинолитическим
эффектом.
2.2.6. Влияние на действие триптамина
При введении внутривенно в дозе 5 мг/кг крысам и 25 мг/кг (ЭД4)
мышам триптамин не оказывает заметного действия на состояние и
поведение животных. После предварительного введения ингибиторов МАО
триптамин в тех же дозах вызывает короткие (15 с) клонические судороги, а
также "игру на рояле" передних лап, сгорбленную позу, животные пятятся
назад, наблюдаются одышка, цианоз хвоста и кончика морды и др., т. е.
эффекты, характерные для больших доз триптамина (40 мг/кг ЭД98).
Антидепрессанты с иным механизмом действия, как правило, эффектов
триптамина не усиливают.
2.2.7. Влияние на действие ареколина, никотина, оксотреморина и других
холиномиметиков
В опытах на белых мышах изучают уменьшение вызываемых холиноми-
метиками гиперкинеза, судорог, гипотермии и других эффектов, а также
летальных исходов.
Антидепрессанты, обладающие холинолитической активностью
(амитриптилин, доксепин, мапротилин и др.), предотвращают эти эффекты, а
также и периферические парасимпатические эффекты, вызываемые хо-
линергическими веществами. Наиболее отчетливо проявляется
антагонизм с гипотермическим эффектом. При исследовании взаимодействия с
оксотреморином на мышах исследуемые соединения вводят до внутри-
брюшинного введения оксотреморина (0,25—0,5 мг/кг). Оценку тремора
-250-

и ректальной температуры проводят через 30—60 мин после введения ок-
сотреморина.
Влияние на центральные холиноструктуры изучают также в опытах на
кошках и кроликах по уменьшению десинхронизирующего действия на
ЭЭГ антихолинэстеразных веществ: галантамина (1—2 мг/кг), физостигми-
на (0,1—0,2 мг/кг) и холиномиметика ареколина (0,25—0,5 мг/кг),
введенных внутривенно. Опыты проводят на ненаркотизированных,
обездвиженных диплацином (4—6 мг/кг внутривенно) кошках и кроликах с
хронически вживленными в разные области коры и подкорковых структур мозга
электродами.
Антидепрессанты, обладающие центральным антихолинергическим
действием, уменьшают или полностью снимают активацию ЭЭГ, вызванную
указанными выше препаратами.
2.2.8. Влияние на изменения артериального давления, вызываемые введением
норадреналина, тирамина, серотонина и других нейромедиаторных веществ
Этот тест не только дает возможность разграничить антидепрессанты с
разным механизмом действия, он является важным также для оценки их
безопасности (главным образом, в отношении прессорной реакции на ти-
рамин).
Антидепрессанты — блокаторы нейронального захвата моноаминов — в
большинстве случаев усиливают прессорные эффекты норадреналина и
серотонина, но не влияют на действие непрямодействующих аминов
(тирамина, фенилэтиламина и др.), в то время как антидепрессанты —
ингибиторы МАО усиливают прессорные реакции последних, но мало влияют на
действие экзогенных норадреналина и серотонина; антидепрессанты-седа-
тики с выраженным центральным антисеротониновым действием (амит-
риптилин, доксепин, миансерин, азафен и др.) заметно уменьшают прес-
сорный эффект серотонина.
Опыты проводят на интактных и наркотизированных собаках, кошках,
крысах, кроликах, а также на крысах с разрушенным спинным мозгом.
Регистрируют реакцию артериального давления, а у кошек, кроме того,
сокращение мигательной перепонки, вызванные перечисленными выше
аминами, и изменение этих показателей под влиянием антидепрессантов.
У интактных крыс измерения артериального давления проводят в
хвостовой артерии, у наркотизированных животных с помощью канюли,
введенной в сонную артерию. Прессорные амины вводят внутривенно до и
спустя разные сроки (5, 10, 30, 60, 120, 180 мин и более) после введения
исследуемых соединений.
3. Биохимические методы
3.1. Влияние на активность моноаминоксидазы
Определение проводят in vitro и in vivo. В опытах in vitro используют
суспензии фрагментов митохондриальных мембран печени и мозга крыс.
Опыты in vivo также обычно проводят на крысах. Активность МАО
определяют в гомогенатах печени и мозга крыс [50 % гомогенаты,
приготовленные на 10 мМ фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 2 % неионного
детергента Тритона Х-100]. Животных забивают в разные сроки после вве-
- 251 -

дения исследуемого препарата. Для определения активности МАО типа А
применяют в качестве субстрата норадреналин и серотонин, для
определения активности МАО типа Б применяют в качестве субстрата фенилэтила-
мин и бензиламин. Оптимальные концентрации субстратов подбирают в
предварительных опытах. Обычно при определении активности МАО
мозга субстраты используют в следующих концентрациях (в мкмолях на 1,8 мл
пробы): норадреналина битартрат — 4, серотонина креатининсульфат —
12, дофамина гидрохлорид — 6, тирамина гидрохлорид — 8, 2-фенилэтил-
амина гидрохлорид — 2; а при определении активности МАО печени —
серотонин и дофамин — 10, тирамин — 6, 2-фенилэтиламин — 0,8. Об
активности МАО судят по освобождению аммиака в процессе инкубации
проб в течение 50 мин при температуре 37 "С в атмосфере кислорода. В
суспензии митохондрий содержание белка определяют по Лоури, а в гомо-
генатах тканей — по Кьельдалю.
3.2. Влияние на нейрональный захват моноаминов
Основным признаком захвата катехоламинов является повышение
(часто незначительное) их содержания в тканях. Для изучения этого могут
быть использованы методы, которые позволяют точно и специфично
определить малые количества катехоламинов (флюориметрический,
гистохимический, радиохимический и др.). Наиболее широкое распространение
получил метод с использованием радиоактивных изотопов.
Удобной моделью для изучения фармакологического воздействия на
процесс захвата являются синаптосомы целого мозга или разных его
отделов. Синаптосомы (фракция изолированных нервных окончаний)
являются местом наибольшего связывания медиаторов.
Синаптосомы можно получить из мозга крыс. Выделение синаптосом
из инкубационной среды и регистрацию активности осуществляют по
методу Снайдера. Радиоактивность измеряют методом жидкостного сцинтил-
ляционного счета.
Разные антидепрессанты в различной степени тормозят обратный захват
тех или иных моноаминов.
3.3. Влияние на радиолигандное связывание с разными типами рецепторов
Метод радиолигандного связывания позволяет непосредственно
оценить взаимодействие соединений с рецепторами. Для этой цели
применяется ряд радиолигандов (с определенной удельной радиоактивностью),
специфически связывающихся с разными типами адрено-, серотонино-,
холино-, ГАМКергическими и другими рецепторами мозга. В качестве ра-
диолиганда адренорецепторов используют [3Н]-празозин или [3Н]-2-(2,6-
диметоксифенокси-этил) аминометилбензодиоксан; оц-адренорецепторов
[3Н]-клофелин; р-адренорецепторов — [3Н]-дигидроальпренолол; серото-
ниновых-lA рецепторов — [3Н]-серотонин, [3Н]-ЛСД [3Н]-ЛСД
обнаруживает высокое сродство как к серотониновым-1, так и к серотониновым-2
рецепторам) или [3Н]-(ЗН)-8-гидрокси-п-дипропил-аминотетралин; серо-
тониновых-2 рецепторов — [3Н]-кетансерин, [ Н]-миансерин или (в
фронтальной коре) — [3Н]-спироперидол (в стриатуме и структурах лимбиче-
ской системы [3Н]-спироперидол связывается, главным образом, с дофа-
миновыми-2 рецепторами); М-холинорецепторов — [3Н]-хинуклидилбен-
- 252 -

зилат; гистаминовых рецепторов — [3Н]-мепирамин. Техника
исследования заключается в основном в определении (в опытах на крысах) разницы
в связывании гомогенатами мозга крыс радиолигандов в присутствии и
отсутствии соответствующих антидепрессантов. Разные антидепрессанты
обладают разными видами рецептороблокирующего действия, но
практически все антидепрессивные средства значительно подавляют связывание
радиолигандов с р-адрено- и серотониновыми-2 рецепторами. Исследование
перестройки рецепторных систем под влиянием антидепрессивных средств
требует их хронического введения.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Предлагаемые экспериментальные методы находятся на уровне
современных знаний и могут, как правило, "предсказать" наличие
антидепрессивной активности. Кроме того, некоторые из описанных поведенческих,
нейро- и биохимических методов применяются для изучения отдельных
сторон действия, побочных эффектов, а также для изучения механизма
действия. Эти методы более трудоемки и могут быть рекомендованы лишь
в качестве дополнительных. Из большого числа предлагаемых методов
первичного изучения антидепрессантов весьма информативными для
предварительного суждения о потенциальной антидепрессивной активности
соединений являются, судя по опыту нашей работы, следующие: тест Porsolt
(и его модификации), выявляющий активирующий эффект соединений в
условиях эмоционального стресса; тесты, выявляющие антирезерпиновую
активность, а также потенцирующее влияние на действие фенамина, L-до-
фа, 5-окситриптофана и, наряду с этим, тесты, выявляющие антисерото-
ниновое действие (наиболее характерное свойство атипичных
антидепрессантов миансерина и тразодона). Несмотря на то что эти методы являются
косвенными, они имеют информативную ценность в силу того, что они
отражают влияние соединений на определенные звенья нейрохимических
процессов мозга, с которыми, по современным представлениям, связан
патогенез депрессий.
Методические указания по изучению транквилизирующего
(анксиолитического) действия фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н., проф. Т. А. Воронина;
академик РАМН С. Б. Середенин
Введение
К препаратам с транквилизирующим типом действия относятся
вещества, обладающие способностью устранять тревогу, страх, беспокойство,
напряжение, повышенную раздражительность, бессонницу и другие
проявления невротических, неврозоподобных, психопатических состояний,
вегетативных дисфункций. Исходя из основного специфического эффекта,
транквилизаторы, особенно за рубежом, обозначают как анксиолитики
- 253 -

(anxiety — беспокойство), а многие авторы считают термин
транквилизаторы устаревшим.
До настоящего времени наиболее широко известными
транквилизаторами остаются анксиолитики бензодиазепиного ряда (диазепам, хлордиазе-
поксид, оксазепам, лоразепам, феназепам, гидазепам, медазепам и др.),
применяемые в лечебной практике уже почти 40 лет. Спектр их
фармакологической активности, кроме специфического анксиолитического
эффекта, включает другие проявления действия — противосудорожное, седатив-
ное, миорелаксантное. Кроме того, при длительном применении бензодиа-
зепинов возможно возникновение лекарственной зависимости.
В последние годы появились транквилизаторы нового типа, с большей
избирательностью собственно анксиолитического эффекта и меньшими
побочными эффектами. В противоположность классическим бензодиазе-
пинам, являющимися прямыми агонистами бензодиазепиновых
рецепторов, новые вещества обладают тропностью к определенным подтипам
бензодиазепиновых, ГАМК-рецепторов, свойствами агонистов-антагонистов,
частичных агонистов (например, алпидем, абекарнил, бретазенил, имида-
зенил и др.), имеют тропность к стероидному компоненту ГАМК-бензо-
диазепинового рецепторного комплекса (альфаксалон), оказывают
модулирующее влияние на ГАМК-бензодиазепиновый рецепторный комплекс
(мембранотропные антиоксиданты мексидол и бемитил). В лечебную
практику внедряются препараты с серотонинергическим механизмом действия:
агонисты серотонин-1А и дофаминовых рецепторов (буспирон, гепирон,
ипсаперон и др.), антагонисты серотонин-2 рецепторов (ритансерин, пи-
ренпирон, ципрогептадин и др.) и серотонин-3 рецепторов (ондансетрон,
закоприд и др.). Анксиолитическим эффектом обладают антагонисты холе-
цистокинин-В рецепторов и кортикотропин-рилизинг-фактора,
неконкурентные антагонисты NMDA рецепторов, некоторые эндогенные нейро-
пептиды и ряд других веществ.
Появление новых анксиолитиков с различным нейрохимическим
механизмом действия требует и новых методических подходов к их изучению,
расширения, уточнения и изменения традиционной программы
исследования, ранее ориентированной, главным образом, на поиск препаратов,
близких по типу действия к бензодиазепиновым транквилизаторам. В
настоящих рекомендациях представлен унифицированный методический
подход к изысканию и изучению веществ с различным механизмом
действия, обладающих транквилизирующей (анксиолитической) активностью и
предлагаемых для клинического изучения.
Результаты экспериментального изучения нового препарата с
транквилизирующим действием должны содержать материалы, доказывающие
наличие у него высокой анксиолитической активности и преимущества
нового препарата перед уже известными. Например, новое вещество по
сравнению с уже существующими должно обладать большей избирательностью
специфического анксиолитического эффекта, иметь меньшие побочные
эффекты, токсичность и большую терапевтическую широту, или новое
вещество должно обладать уникальным сочетанием свойств и новым
механизмом действия, или новое средство предлагается для лечения таких
состояний, при которых существующие препараты малоэффективны.
Исследования следует проводить на различных видах лабораторных
животных (например, мыши и крысы), а при необходимости можно
использовать и более крупных животных (кошки, собаки, кролики). Полученные
данные обрабатываются с помощью современных методов статистики и
представляются в виде таблиц, а при необходимости и рисунков.
-254-

1. Изучение специфической анксиолитической активности
В связи с многообразием методов, используемых для изучения
анксиолитической активности, представляется целесообразным выделить
основные, базисные методы исследования, которые дают наиболее полную
информацию и являются общепринятыми в России и за рубежом и, таким
образом, являются наиболее желательными при изучении нового
препарата, и дополнительные методы, расширяющие представления о
специфической анксиолитической активности, но исследования по которым не
являются обязательными.
/. /. Исследования, доказывающие наличие анксиолитической активности по
базисным тестам
Исследования, представляемые в данном разделе, яв^ются
определяющими для препарата и поэтому должны быть выполнены с соблюдением
следующих обязательных требований.
По каждому тесту следует использовать вещество не менее чем в 3
дозах, рассчитанных в соответствии с ЛД50 соединения (не более '/10 от ЛД50)-
Должны быть использованы по меньшей мере 2 способа введения
вещества, один из которых должен соответствовать предполагаемому
клиническому способу применения препарата.
По меньшей мере по одному из основных тестов должна быть изучена
кривая зависимости доза—эффект в возможно более широком диапазоне
доз и определена продолжительность анксиолитического эффекта при
использовании того пути введения, который соответствует предполагаемому
клиническому применению.
Исследование анксиолитической активности должно быть обязательно
проведено в сравнении с наиболее известными эталонными препаратами
этого же типа действия.
В связи с разнообразием вариантов используемых методик каждый
используемый метод должен быть подробно описан в соответствующем
разделе перед изложением результатов.
При проведении исследований следует обязательно использовать
следующие тесты: не менее двух методов, основанных на наказуемом
поведении (например, тест конфликтной ситуации в одной из модификаций и
методика четырех пластин), ставшую популярной в последнее время
методику приподнятого крестообразного лабиринта и метод фармакогенетиче-
ского анализа поведения животных с различными типами (активным и
пассивным) эмоционально-стрессовой реакции.
1.1.1. Методика конфликтной ситуации (вариант Vogel)
Поведенческие модели создания у животных состояния беспокойства и
страха с использованием наказующего раздражителя, подавляющего
проявления условного или безусловного поведения, являются наиболее
широко используемыми методиками при оценке транквилизаторов. Принцип
методики состоит в том, что наказующий фактор (например, болевое
раздражение) подавляет привычное для животного поведение, в результате
чего создается ситуация невозможности осуществления необходимой
мотивации, рассогласование желаемого и действительности, что подкрепляется
- 255 -

страхом получения болевого раздражения. Эффект анксиолитиков
заключается в преодолении страха перед наказующим фактором и в
восстановлении значимого для животного поведения, что выражается в увеличении
числа наказуемых ответов, например взятий воды, несмотря на получение
при этом болевых раздражении. Эти методики имеют хорошую
воспроизводимость, четкие контроли и высокую степень корреляции с
клиническими эффектами.
Наиболее известной и широко применяемой методикой конфликтной
ситуации является модель в варианте Vogel, создаваемая у крыс путем
подавления болевым электрическим раздражителем питьевого рефлекса при
потреблении ими воды из чашки или трубки-поилки.
Предварительно животных лишают воды на 48 ч, не ограничивая
потребление корма, и затем вырабатывают навык взятия воды из поилки,
помещая крысу в камеру, где она находит поилку с водой и начинает пить,
Камера имеет размер 275 х 275 х 450 мм, электродный пол и поилку с
водой (сосуд с cocmj^i на стене), расположенную на высоте 5 см от пола. На
следующий день крысу помещают в камеру на 10 мин и через 10 с после
начала питья каждое взятие воды наказывается электроболевым
раздражением (1 мА). В результате, чтобы удовлетворить питьевую мотивацию,
крыса должна преодолеть чувство страха перед наказанием. Число
наказуемых взятий воды за 10 мин нахождения в камере является мерой анксио-
генного состояния. Транквилизаторы устраняют чувство тревоги и страха и
увеличивают число наказуемых взятий воды. Высокой эффективностью по
этим тестам обладают все известные классические транквилизаторы, а
также анксиолитики нового поколения.
1.1.2. Конфликтная ситуация (вариант Geller, Seifter)
Методика основана на оперантном поведении в камерах Скиннера, где
питьевой или пищевой рефлекс вырабатывается при подкреплении с
помощью нажатия на рычаг или педаль (для грызунов) или "клевания" (для
птиц). В отличие от классического условного рефлекса, когда реакция
животного определяется вызывающим ее раздражением, выработка оперант-
ного рефлекса характеризуется установлением временной
последовательности между реакцией животного, проявляющейся время от времени в
данной ситуации, и подкрепляющим раздражителем. При оперантном
поведении подкрепление подается в различных режимах, либо периодически
через фиксированные (FI) или переменные (VI) интервалы времени, либо
с фиксированным (FR) или переменным (VR) отношением к числу
условных реакций, и конфликтная ситуация осуществляется на этом фоне.
Конфликтная ситуация по Geller, Seifter хорошо формируется на основе
камер Скиннера. Сначала у крыс с питьевой депривацией осуществляют
обучение в режиме FR4, когда животное получает подкрепление водой
после 4 нажатий на рычаг. Затем у этих же крыс вырабатывается оперантный
рефлекс по VI30 расписанию, когда оперантный рефлекс осуществляется в
варьирующем интервале 30 с и после выработки этого рефлекса оба
расписания совмещаются. Далее в период выполнения нажатий по расписанию
FR4 вводится наказующий удар током. В результате крысы осуществляют
оперантную деятельность по VI расписанию с высоким уровнем
выполнения (около 180 нажатий за 3 мин), что позволяет оценить седативное или
активирующее действие препарата, а по наказуемому расписанию FR4
радиус низкой частотой (около 5 нажатий за 3 мин), что позволяет оценить
-256-

анксиолитическое действие препаратов, которые избирательно
увеличивают оперантные ответы в FR фазе. Результаты исследований по этому тесту
стабильны и имеют высокую прогностическую значимость. Однако
трудоемкость методики (для выработки рефлексов требуется 16 нед),
необходимость использования дорогостоящего оборудования ограничивают ее
применение.
1.1.3. Метод четырех пластин
Метод четырех пластин основан на подавлении
ориентировочно-исследовательского поведения грызунов электроболевым раздражителем. Крысу
(мышь) помещают на одну из четырех пластин, составляющих пол камеры,
и после ознакомления с обстановкой (15—30 с) при переходе животного с
пластины на пластину оно получает болевое раздражение, подаваемое
через пол, в результате чего повышается уровень тревожности и уменьшается
число переходов. Эффект анксиолитиков заключается в уменьшении
страха получения болевого наказания и в увеличении числа переходов по
пластинам.
1.1.4. Методика условного защитного закапывания
Методика условного защитного закапывания у грызунов относится к
филогенетическим моделям анксиогенеза, где также присутствует наказую-
щий фактор. Сначала крыса (мышь) получают болевое раздражение через
определенный предмет, например стержень, вмонтированный в пол или
стену. При повторных посадках в камеру животные предпринимают
попытки закапывания наказующего предмета элементами подстилки,
например шариками, стружками, сгребаемыми лапами с пола камеры.
Продолжительность закапывания оценивается как показатель тревожности.
Транквилизаторы обладают способностью уменьшать продолжительность этой
реакции животного.
1.1.5. Методика приподнятого крестообразного лабиринта
Методика основана на навыке предпочтения грызунами темных нор,
естественного страха нахождения на открытых площадках и падения с
высоты.
Наиболее распространенным вариантом приподнятого крестообразного
лабиринта (ПКЛ) является установка, которая состоит из крестообразно
расходящихся от центральной площадки под прямым углом 4 рукавов: два
противоположных, открытых, без стенок и два закрытых, темных.
Центральная площадка и пол открытых рукавов, как правило, прозрачны,
тогда как пол и стенки закрытых рукавов покрашены в темный цвет.
Эксперименты проводятся как при обычном освещении, так и при
дополнительном освещении открытых рукавов. Наиболее часто используемые размеры
ПКЛ для крыс: рукава 10 х 10 х 50 (60) см, центральная площадка
10 х Ю х Ю см, ПКЛ приподнят на 80—100 см; для мышей рукава
составляют 5 х 5х 20 (25) см, центральная площадка — 5x5x5 см, ПКЛ
приподнят на 25(30) см. Непосредственно перед началом эксперимента
животных выдерживают (от 3 до 5 мин) в темных клетках. Затем животное поме-
9-762
- 257-

щают в ПКЛ на центральную площадку, головой к открытому рукаву и в
течение определенного интервала времени (5 мин, или 5 + 5 мин, или
3 + 3 мин, или поминутно 5 мин) регистрируют время пребывания
животных в открытых, закрытых рукавах, а также на центральной площадке,
количество заходов в открытые и закрытые рукава, латентный период
первого захода в открытый рукав,
Контрольные интактные животные предпочитают большую часть
времени проводить в закрытых, темных рукавах. Анксиолитический эффект
препарата оценивается по увеличению числа заходов в светлые рукава и
времени нахождения в них, без увеличения общего числа заходов. Время
нахождения на центральной площадке позволяет оценить показатель
принятия решения. По общему числу заходов в открытые и закрытые рукава и
вертикальным стойкам можно оценить общую двигательную активность.
Эмоциональность крыс оценивается по числу мочеиспусканий и болюсов.
1.1.6. Методика оценки поведения в темной/светлой камере
Методика светлой/темной камеры использует естественное стремление
грызунов избегать ярко освещенных мест и по идеологии близка к
методике приподнятого крестообразного лабиринта [Costal В. et al., 1989].
Животных помещают в ярко освещенный отсек двухкамерной светлой/темной
установки и за определенный период времени (3—5 мин) регистрируют
число переходов между светлым и темным отсеками, длительность
пребывания в светлом и темном отсеках. Транквилизаторы увеличивают число
переходов из одного отсека в другой и время нахождения в светлом отсеке.
1.1.7. Поведение в открытом поле мышей с активным (линия С57В1/6)
и пассивным (линия Balb/C) типами эмоционально-стрессовой реакции
Известно, что в зависимости от индивидуальных, наследственных,
конституционных характеристик, эмоционально-стрессовое воздействие по-
разному влияет на отдельных особей. У одних — стрессовый ответ
сопровождается активацией деятельности и ее продуктивности, а у других
эмоциональный стресс приводит к дезорганизации поведения или к
пассивному отстранению от решения проблем. Генетическая гетерогенность
популяции по эмоционально-стрессовой реакции и зависимость эффекта
транквилизаторов от характера поведения выявляются и в эксперименте,
особенно отчетливо в условиях методики открытого поля.
Методика открытого поля в традиционном варианте, как известно,
широко используется в психофармакологии для изучения влияния веществ на
оринтировочно-исследовательское поведение, двигательную активность и
выявления анксиолитического действия. Однако, без учета характера
эмоционально-стрессовой реакции животных, в условиях этой модели анксио-
литическое действие не выявляется отчетливо. В противоположность этому
оценка транквилизаторов с использованием фармакогенетического
подхода с анализом фенотипических особенностей позволяет не только выявить
специфический анксиолитический эффект, но и отдифференцировать его
от других проявлений действия.
Методика освещенного открытого поля представляет собой квадрат
(чаще) или круг со стенками и прозрачной крышкой. Вариантом методики
для мышей может служить камера размером 40 х 40 х 20 см с прозрачной
- 258 -

крышкой. Пол камеры равномерно разделен линиями на 9 квадратов с 16
отверстиями диаметром 2 см. Предварительно мышей инбредных линий
C57BI/6 и Balb/C перед экспериментом в течение 3 мин выдерживают в
темноте, после чего помещают на один из периферийных квадратов
открытого поля. Наблюдение за животным производится в течение 3 мин,
как правило, с поминутной регистрацией. Фиксируется число
пересеченных квадратов на периферии и в центре (отдельно), число вертикальных
стоек, число заглядываний в отверстия, количество болюсов и
мочеиспусканий. У мышей линии C57BI/6 обмечается активный тип реакции на
эмоционально-стрессовое воздействие, а у мышей линии Balb/C —
наоборот, пассивный тип поведения.
Транквилизаторы оказывают отчетливый анксиолитический эффект у
животных с пассивным типом поведения, выражающийся в устранении
состояния застывания (freezing), страха, испуга и в активации поведения. В
противоположность этому у мышей с активным типом поведения
транквилизаторы вызывают седативный эффект. Высокую прогностическую значимость
данная модель имеет не только при оценке классических транквилизаторов
бензодиазепинового ряда, но и при изучении транквилизаторов нового
поколения, атипичных препаратов с расслоением анксиолитического и седа-
тивного эффектов и избирательных, селективных анксиолитиков.
1.2. Дополнительные исследования по расширенному изучению
анксиолитической активности
В качестве дополнительных методов исследования анксиолитической
активности можно использовать методы наказуемого поведения,
изложенные в разделе 1.1, но не выбранные авторами как обязательные, например
методика Geller—Seifter, а также следующие рекомендуемые тесты,
которые используются некоторыми исследователями для изучения отдельных
сторон анксиолитического эффекта.
1. Методика внешнего торможения условных рефлексов активного
избегания в камере шаттл-бокс или питьевых рефлексов в лабиринте.
Принцип метода состоит в том, что у крыс сначала вырабатывается условный
рефлекс, а затем, в момент его выполнения, включается сильный световой
раздражитель, который стрессирует животное и затрудняет выполнение
условной реакции. Действие анксиолитиков заключается в устранении стрес-
сорной ситуации и восстановлении условно-рефлекторной деятельности.
2. Методики зоосоциального взаимодействия основаны на этологиче-
ских исследованиях. У пары крыс фиксируется продолжительность
активных социальных контактов (обнюхивание, облизывание, груминг,
покусывание и т. д.), которые резко подавляются в незнакомых условиях
экспериментальной камеры, особенно при ее ярком освещении. Анксиолитики
восстанавливают нарушенное поведение и увеличивают дружественные
социальные контакты.
3. Методики изоляционного синдрома используют феномен нарушения
поведения, возникающего у крыс (мышей) после длительной (4—12 нед)
изоляции. После изоляции одна группа животных становится агрессивной,
а другая — "починенной (тимидной)". Исследуется влияние
транквилизаторов на поведение животных обоих типов, в особенности при контакте
"изолированного" животного с подсаженным к нему в клетку животным,
не проходившим изоляцию (интрудером).
4. Методики агрессивного поведения. Наиболее известной и простой
9*
- 259-

моделью является методика агрессивного поведения пары крыс (мышей),
спровоцированного электроболевым раздражением через электродный
пол. Регистрируется число схваток между животными и порог
возникновения (по величине подаваемого на пол тока) агрессивной реакции.
Агрессивное поведение создается также раздражением или удалением
некоторых структур мозга, использованием межвидовой агрессивности,
например между кошкой и собакой, кошкой и мышью, или естественной
агрессивности некоторых видов диких животных. Большинство
транквилизаторов обладают способностью уменьшать проявления агрессивного
поведения животных.
5. Стрессорная ситуация, вызываемая неизбегаемым электроболевым
раздражением лап животных или иммобилизацией путем фиксации лап
или тела мелких лабораторных животных оказывает сильное воздействие
на животное, вызывая нередко необратимые изменения. Под влиянием
транквилизаторов наблюдается улучшение в состоянии животных.
6. Стресс по Жуве осуществляется путем помещения крыс на малые
площадки в бассейн с водой на 24 ч, что создает условия гиподинамии,
изоляции и депривации парадоксальной фазы сна. В стрессорной ситуации
наряду с нарушением нейромедиаторного баланса наблюдаются стойкое
денатурационное изменение белков мембранных структур, усиление
процессов перекисного окисления липидов. Нарушение поведения крыс
выражается в повышении уровня тревожности и эмоциональности, изменении
ориентировочно-исследовательского и целенаправленного поведения,
ухудшении процессов обучения. Транквилизаторы, особенно атипичные,
устраняют различные проявления нарушений, возникающих при этом виде
стресса.
7. Методика обратимого функционального нарушения ЦНС (сбой
рефлекса избегания) построена на основе нарушения однозначности
причинно-следственных отношений между раздражителями, реакцией и ее
следствиями применительно к челночной камере. При этом нарушается
однозначность отношений как между условным и безусловным
раздражителями, так и между реакцией и ее следствием, что вызывается включением
звука после выключения тока и тем, что реакция животного уже не
приводит к обычному выключению тока. В результате возникает прагматическая
неопределенность ситуации, срыв высшей нервной деятельности, что
выражается в эмоциональной напряженности, появлении состояния тревоги
и страха. Транквилизаторы устраняют проявления сбоя рефлекса
избегания.
8. Методика пространственной переделки рефлекса избегания в
челночной камере. У крыс с уже сформированной реакцией избегания меняют
место нахождения отверстия для перехода в другой отсек челночной
камеры, что приводит к нарушению выполнения выработанного навыка,
уменьшению числа реакций избегания и увеличению числа
межсигнальных реакций. Транквилизаторы уменьшают число межсигнальных реакций
в этой ситуации.
9. Условная эмоциональная реакция. Предварительно у крыс
вырабатывается оперантный рефлекс в камере Скиннера с нажатием на рычаг.
Затем животные получают неизбегаемое электроболевое раздражение через
электродный пол, сочетаемое с условным сигналом. При повторной
посадке животного в камеру включение только условного сигнала вызывает
эмоциональную напряженность и уменьшение оперантных реакций.
Транквилизаторы увеличивают число оперантных ответов, подавленных условным
сигналом.
-260-

10. Методика вкусового отвращения. Питье крысами приятных на вкус
растворов (например, сахарина) подавляется, когда их потребление
предварительно сочетается с веществами с резким, неприятным вкусом,
например лития хлоридом. Условное вкусовое отвращение к сахарину
устраняется транквилизаторами.
11. Методика стартл-реакции. Методика стартл-реакции основана на
страхе животного, возникающего при действии внезапного резкого
звукового раздражителя, нередко сочетаемого с болевым раздражением. Стартл-
реакция выражается во вздрагивании и замирании животного.
Продолжительность этой реакции определяет уровень анксиогенного состояния,
которое редуцируется под влиянием транквилизатора.
12. Стресс у крысят возраста 16—20 дней возникает при отнятии их от
матери или из гнезда или при воздействии холодом и выражается в
характерных звуках (ultrasonic 35—55 kHz), издаваемых крысятами.
Транквилизаторы бензодиазепинового ряда и буспирон обладают способностью
устранять стрессорную вокализацию крысят, что свидетельствует об их ан-
ксиолитическом эффекте.
Кроме того, для изучения действия транквилизаторов используется
целый ряд других, более редко встречаемых тестов: методика консуматорного
поведения (усиленного потребления пищи), стимуляция
околоводопроводного серого вещества, методика лекарственной дифференцировки и
лекарственной дискриминации анксиолитических и анксиогенных веществ,
различные виды стресса, вызванного холодом, гипертермией, и агрессивного/
оборонительного поведения и др.
2. Сопутствующие психотропные эффекты, побочное действие и острая
токсичность
В дополнение к данным об основном анксиолитическом эффекте
должны быть представлены результаты исследования других проявлений
действия нового препарата и сведения об его острой токсичности. Ориентируясь
на данные о спектре фармакологической активности известных
транквилизаторов, следует представить исследования о наличии или отсутствии у
изучаемого вещества седативного или активирующего, противосудорожно-
го, снотворного, антидепрессивного и миорелаксантного действия,
исследовать его влияние на обучение и память.
Для выявления этих эффектов можно использовать общепринятые
тесты. Для оценки седативного или активирующего действия можно
применить регистрацию поведения в открытом поле и в различных актомет-
рах, тест залезания на сетку; для предварительной оценки снотворного
эффекта — тест потенцирования гексеналового сна или других снотворных;
оценка противосудорожного действия осуществляется по антагонизму с
судорожными веществами (коразол, тиосемикарбазид, бикукуллин и др.) и
при судорогах, вызванных максимальным электрошоком; изучение
влияния вещества на условно-рефлекторную деятельность и процессы
обучения и памяти осуществляется с использованием рефлексов активного и
пассивного избегания, лабиринтных рефлексов, оперантного поведения
(используется 2 теста); для исследования антидепрессивной активности
можно использовать метод поведенческой беспомощности; для изучения
миорелаксантного действия используются тесты вращающегося стержня,
рефлекса подтягивания на перекладине, удерживания на перевернутой
сетчатой платформе, тест бокового положения. Исследование дополнитель-
-261 -

ных психотропных эффектов проводится в диапазоне терапевтических,
оказывающих анксиолитический эффект, доз.
Изучение побочных эффектов (седативный, миорелаксантный,
негативное влияние на память и др.) следует осуществлять в широком диапазоне
доз от минимальных терапевтических до субтоксических. Нужно
использовать не менее двух видов животных и путь введения, соответствующий
предполагаемому клиническому. Информация о побочных эффектах
дополняется результатами, полученными в разделе "Изучение общей
фармакологической активности".
Острая токсичность изучается на двух видах животных, на которых
осуществлялось исследование анксиолитической активности, при тех же путях
введения: рассчитывается ЛД50. По соотношению доз, вызывающих
специфический (анксиолитический) эффект, и доз, оказывающих побочный и
токсический эффект, определяется широта терапевтического действия.
Данные по побочным эффектам и токсичности нового препарата
сопоставляются с данными, полученными для эталонных препаратов.
3. Изучение толерантности и возможной лекарственной зависимости
при длительном применении препарата и его отмене
Изучается переносимость препарата и развитие толерантности по ан-
ксиолитическому и побочным проявлениям действия при длительном (не
менее 1 мес) введении препарата.
В связи с риском возникновения лекарственной зависимости к новому
анксиолитику обязательными являются исследования по изучению
развития этого феномена, абстинентного синдрома при отмене препарата после
его длительного применения. Кроме того, желательно провести
исследования с использованием модели самовведения препарата или других методик
для выявления возможного наркогенного потенциала.
4. Исследование механизма действия препарата
Представляются данные по изучению механизма действия, имеющиеся
на настоящий момент. Рекомендуются радиолигандные исследования,
изучение сдвигов нейромедиаторного баланса, вторичных мессенджеров и
т. д. Желательно проведение электрофизиологического анализа механизма
действия, в частности оценка спектра мощности в различных структурах
мозга, изучение различных фаз сна и противосудорожного эффекта на
моделях генерализованной и фокальной эпилепсии.
5. Изучение взаимодействия нового препарата с другими психотропными
препаратами
В связи с широким использованием транквилизаторов в наборе
средств комбинированной терапии целесообразно в первую очередь
исследовать взаимодействие нового препарата с другими
транквилизаторами, снотворными и этанолом. Желательно также представить данные о
комбинированном применении препарата с нейролептиками,
антидепрессантами, местноанестезирующими, наркотическими и противосудо-
рожными средствами.
-262-

6. Изучение общей фармакологической активности, влияния
на сердечно-сосудистую систему и дыхание
Наблюдение за состоянием животного осуществляется на мышах и
крысах при введении препарата в широком диапазоне доз — от не
оказывающих заметного влияния на общее состояние до вызывающих гибель. При
этом определяется повышение или снижение возбудимости, увеличение
или снижение двигательной активности, наличие тремора, судорожных
подергиваний, судорог, гиперкинезов, изменение цвета кожных покровов,
взъерошивание шерсти, каталепсия, птоз, стереотипия, груминг и т. д.
Изучаются пиннеальный, болевой и роговичный рефлексы, влияние на
температуру тела, на потребление воды и пищи. Следует изучить влияние
препарата на эффекты нейромедиаторов, например на эффекты ареколина,
треморина, 5-окситриптофана, фенамина, резерпина, дофамина, апомор-
фина, бикукуллина, флумазенила, дизоцилпина и других анализаторов
нейромедиаторных систем.
Влияние на сердечно-сосудистую систему, дыхание и на
периферические отделы нервной системы изучается на интактных или
наркотизированных кошках, кроликах или крысах по влиянию на уровень кровяного
давления, ритм сердечной деятельности (желательно и других показателей
работы сердца), дыхание, а также на реакции, вызванные введением
нейромедиаторов, например адреналина, норадреналина, ацетилхолина, серо-
тонина.
Заключение
В заключении приводятся данные о спектре анксиолитических
эффектов, особенностях других психотропных свойств, анализируются побочные
эффекты, представляются сведения о преимуществах нового препарата
перед известными средствами сходной направленности действия.
Методические указания по изучению снотворной активности
фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н., проф. Т А. Воронина;
к. б. н. Л. Н. Неробкова
Введение
Применяемые в настоящее время в лечебной практике снотворные
средства различаются по фармакологическим свойствам и механизму
действия. В связи с этим для исследования новых снотворных средств в
эксперименте и выбора эталонного препарата сравнения необходимы
сведения о классификации и особенностях действия известных снотворных. На
основании особенностей снотворного эффекта и механизма действия
снотворных веществ, а также учитывая время появления в лечебной практике
и применения препаратов, можно выделить снотворные средства 1-го по-
-263-

коления (барбитураты), снотворные средства второго поколения (бензо-
диазепины) и снотворные средства третьего поколения (триазолобензодиа-
зепины, циклопироллоны, имидазопиридины).
Барбитураты, которые являются сильнодействующими веществами со
многими побочными эффектами, до появления снотворных бензодиазепи-
нового ряда занимали лидирующее положение в группе снотворных
препаратов. Они определяются как неизбирательные депрессанты центральной
нервной системы, способные изменять уровень активности от возбуждения
к умеренной седации, гипнотическому состоянию и глубокой коме. Сон,
вызываемый барбитуратами, существенно отличается от естественного сна.
Наряду с сокращением периода засыпания, они изменяют структуру сна,
уменьшая ортодоксальный медленноволновый сон и укорачивая
представленность парадоксального быстрого сна.
Снотворные средства из ряда производных бензодиазепина являются в
настоящее время наиболее широко употребляемыми препаратами этого
типа действия. В сравнении с барбитуратами они более безопасны, обладают
значительно меньшими побочными эффектами, применяются в малых
дозах и, так же как барбитураты, выказывают продолжительный (6—8 ч) сон.
Известными препаратами этого ряда со снотворным эффектом являются
нитразепам, флунитразепам, флуразепам, феназепам, лоразепам, темазе-
пам, квазепам, мидазолам, тиазолам, бротизолам, эстазолам и др. Другими
проявлениями действия этих веществ, кроме снотворного, являются ан-
ксиолитический, седативный, противосудорожный, миорелаксантный. По
соотношению отдельных компонентов в спектре препаратов их можно
разделить на 3 группы: I — препараты с преобладанием в спектре
снотворного, седативного эффектов, но обладающие также менее выраженным ан-
ксиолитическим, противосудорожным действием (нитразепам,
флунитразепам, флуразепам); II — препараты, сочетающие снотворный эффект с не
менее мощным анксиолитическим действием (феназепам, лоразепам);
III — препараты с преобладанием в спектре снотворного, седативного
эффекта при незначительной выраженности анксиолитического триазолобен-
зодиазепины (мидазолам, триазолам, бротизолам, эстазолам). Наиболее
мощным снотворным эффектом обладают препараты флунитразепам,
феназепам, циназепам, мидазолам, триазолам. Бензодиазепиновые
снотворные в значительно меньшей степени, чем барбитураты, нарушают
структуру сна. Препараты вызывают сон близкий к физиологическому,
уменьшают период засыпания, уменьшают число ночных пробуждений. Однако
изменение баланса различных фаз сна под влиянием бензодиазепинов все же
происходит. Может наблюдаться снижение продолжительности медленно-
волнового сна и уменьшение относительного процента парадоксального
сна.
Особую группу снотворных препаратов из класса 1,4-бензодиазепина
составляют производные триазолобензодиазепина, которые оказывают
сильное, но кратковременное снотворное действие: триазолам, мидазолам,
лопразолам, бротизолам, эстазолам. Эти препараты вызывают
значительное сокращение времени засыпания, укорочение длительности временных
пробуждений во время сна и влияют на структуру сна. Наиболее часто
наблюдается увеличение 2-й стадии сна, уменьшение 3-й и 4-й стадий сна и
удлинение латентного периода парадоксального сна.
К снотворным средствам третьего поколения относятся снотворные из
классов имидазапиридина и циклопирролона, среди которых наиболее
известны золпидем (ивадал) — производное имидазопиридина и зопиклон
(имован) — производное циклопирролона. Золпидем уменьшает время за-
- 264-

сыпания и сокращает число ночных пробуждений, увеличивает
продолжительность и структуру сна, причем удлиняются 2-я, 3-я и 4-я фазы
ортодоксального медленноволнового сна, но не изменяется общая
продолжительность парадоксального, быстрого сна. Зопиклон обладает сходным с
бензодиазепинами фармакологическим профилем действия, оказывает
влияние на структуру медленноволнового сна, но не уменьшает доли
быстрого сна. Снотворным эффектом обладают также этанол и дельта-пептид
сна.
Механизм действия снотворных препаратов осуществляется главным
образом за счет или усиления работы основной тормозной — ГАМКерги-
ческой системы мозга и/или путем блокады возбуждающих систем мозга.
Так, барбитураты воздействуют на барбитуровый сайт надмолекулярной
части хлорного канала. Бензодиазепиновые и новые небензодиазепиновые
снотворные реализуют свое действие через взаимодействие с бензодиазе-
пиновым рецептором, после чего увеличивается сродство к ГАМК-А
рецептору, повышается частота открытия хлорного канала и увеличивается
ток хлора внутрь нейрона.
Новые вещества со снотворной активностью могут быть найдены среди
агонистов/антагонистов бензодиазепинового и ГАМК-А рецептора и среди
веществ, оказывающих непосредственное влияние на хлорный канал.
Среди веществ, оказывающих действие на ГАМК-стимулируемый хлорный
канал, и веществ, влияющих на стероидный компонент, представляет
интерес класс бициклофосфатов (например, производные бутилбициклофосфо-
ротионата), которые являются регуляторами ионного потока через
хлорный канал. Существенный интерес в плане поиска могут представить аго-
нисты ГАМК-А рецептора, например аналоги изогувацина, изонипекоти-
новой кислоты, пиперидин-4-сульфоновой кислоты, габохадола (THIP).
Кроме того, воздействие может быть направлено на глицин-стимулируе-
мый хлорный канал (вещество пропофол). Кроме того, не исключено
появление новых гипно-седативных веществ на основе нейропептидов, что
обосновывает существование дельта-пептида сна, а также среди веществ,
влияющих на глутаматергическую систему (пример кетамина) и на
различные субъединицы КМДА-рецептора.
При экспериментальном изучении нового соединения с предполагаемой
снотворной активностью прежде всего следует доказать у него наличие
этого проявления действия в поведенческих и электрофизиологических
исследованиях и выявить преимущества нового вещества перед уже
известными. Исследования следует проводить на различных видах лабораторных
животных (мыши, крысы), а при необходимости использовать кошек.
Исследование должно проводиться в сравнении с эталонным снотворным
препаратом, наиболее близким по спектру и механизму действия к новому
соединению со снотворной активностью.
1. Методы оценки снотворного действия веществ по изменению поведения
животных
/. /. Методика оценки гипнотического эффекта по боковому положению
животных
Исследования проводят в опытах на белых мышах и крысах.
Исследуемый препарат вводится внутрибрюшинно или внутрь. Контрольные
животные при переворачивании их в неудобную позу на спину немедленно воз-
- 265 -

вращаются в нормальное положение, т. е. осуществляют рефлекс
переворачивания (rigthing reflex). Под влиянием высоких доз веществ, вызывающих
гипнотическое состояние, животные через некоторое время после
введения вещества остаются в неудобной позе на спине или на боку, которая
обозначается как наличие бокового положения. Регистрируется латентное
время возникновения бокового положения и его продолжительность.
Определяется процент животных, у которых развивается боковое положение в
зависимости от определенной дозы вещества (используется не менее 3 доз)
и на основании этих данных определяется ЭД50 — доза, вызывающая
эффект у 50 % животных.
Методика бокового положения оценивает гипнотический эффект
вещества, развивающийся при использовании снотворных в высоких дозах.
Поэтому данную методику можно использовать для первичной
предварительной оценки исследуемого вещества.
1.2. Методика потенцирования снотворного действия барбитурата
Известные снотворные средства в малых снотворных дозах обладают
способностью потенцировать и пролонгировать действие барбитуратов,
вводимых в малых подпороговых дозах.
Исследование проводят на белых мышах и крысах. Наиболее часто из
барбитуратов используется гексенал (гексобарбитал). Сначала гексенал
вводится животным в различных дозах (не менее 3) и определяется кривая
зависимости доза—эффект по показателю утраты животными рефлекса
переворачивания (животные остаются в неудобной позе на спине или на
боку, которая обозначается как наличие бокового положения). На основании
этих данных строится кривая зависимости доза—эффект и рассчитывается
доза гексенала, вызывающая боковое положение у 5 % животных (ЭД5).
Обычно эта доза для гексенала составляет 50 мг/кг (внутрибрюшинно), но
может колебаться от 30 до 60 мг/кг. В основном эксперименте гексенал
вводят после введения исследуемого вещества, на пике максимального
действия последнего. Исследуемое вещество вводится в нескольких дозах.
Регистрируется число "заснувших" (с боковым положением) животных
после введения вещества и гексенала в дозе (ЭД5). Оценивается процент
животных с эффектом после введения различных доз нового соединения и на
основании этих результатов рассчитывается ЭД50 — доза, вызывающая
эффект у 50 % животных.
1.3. Методика пролонгирования снотворного действия барбитурата
Исследования проводят в опытах на белых мышах и крысах. Число
животных в группе не менее 10. Наиболее часто из барбитуратов используется
гексенал (гексобарбитал). Гексенал используется в дозе, вызывающей
боковое положение у 5 % животных (ЭД5). Обычно эта доза составляет
50 мг/кг (внутрибрюшинно), но может колебаться от 30 до 60 мг/кг.
Вещество с предполагаемым снотворным действием вводится в различных дозах
до введения гексенала. Оценивается способность вещества пролонгировать
действие гексенала, для чего для каждого животного регистрируется время
засыпания (момент утраты рефлекса переворачивания), время
пробуждения (восстановление рефлекса переворачивания) и продолжительность
сна. На основании этих данных на одном графике строится кривая засы-
-266-

пания и кривая пробуждения. Методом пробит-анализа вычисляется
продолжительность сна у 50 % животных (по разнице показателей времени
засыпания и пробуждения). Оцениваются также средняя продолжительность
сна и латентное время засыпания, определяемые при введении различных
доз препарата.
2. Методы оценки снотворного действия веществ в электрофизиологических
экспериментах
Электрофизиологические методы являются единственно адекватными
моделями для оценки влияния веществ на сон [ Клыгуль Т. А. и др., 1976;
Жуков В. Н., 1977; Воронина Т. А., Неробкова Л. Н., 1981; Власов Н. А. и
др., 1983; Вейн А. М., 1991; Неробкова и др., 1992; Van den Broek et al.,
1996].
Согласно поведенческим показателям, сон определяется как обратимое
состояние неподвижности, сопровождающееся характерной, неподвижной
позой и ослаблением сенсорных контактов с окружающей средой. Однако
в чисто поведенческом эксперименте на основании наблюдения за
животным трудно отделить сон от состояния спокойного бодрствования, так как
в состоянии спокойного бодрствования животные часто принимают такие
же позы, как в состоянии сна. У интактных животных также невозможно
определить, не разбудив животное, пороги пробуждения. Таким образом,
для определения состояния сна необходима регистрация электрической
активности мозга.
Применение общепринятых электрофизиологических и
нейрофизиологических критериев характеристики фаз цикла сон—бодрствование
позволяет выявить, прежде всего, две четко дифференцированные фазы сна:
медленноволновую и парадоксальную. В эксперименте медленноволновая
фаза сна и ее подстадии легко определяются по электрической активности
коры больших полушарий и дорсального гиппокампа. У основных видов
лабораторных животных медленноволновая фаза сна характеризуется
медленными высокоамплитудными волнами в тета и дельта-диапазонах, а
также сонными веретенами. У человека и приматов в медленноволновой фазе
сна выделяют стадии поверхностного и глубокого медленноволнового сна.
Переходная стадия между медленноволновой фазой сна и парадоксальной
фазой сна плохо различима и поэтому, как правило, не выделяется. При
переходе наблюдается снижение амплитуды медленных волн и увеличение
их частоты вплоть до развития типичной десинхронизации при
парадоксальном сне.
Парадоксальная фаза сна у экспериментальных животных
характеризуется четко выраженным гиппокампальным тета-ритмом, десинхронизаци-
ей электрической активности в электрокортикограммах, резким
снижением амплитуды электромиограммы шейных мышц и наличием быстрых
движений глаз на электроокулограмме. Вспомогательное значение для
выделения стадий сна имеет регистрация электрокардиограммы и пневмограммы,
так как при парадоксальном сне у животных может возникать аритмия
дыхания и пульсограммы. Необходимо подчеркнуть, что ни один отдельный
электрический или физиологический показатель не является достаточным
для идентификации различных стадий сна и только одновременная
регистрация нескольких показателей позволяет выделить все стадии с достаточно
высокой степенью надежности. При анализе электрофизиологических
данных следует учитывать не только продолжительность отдельных фаз сна,
-267-

но и количество переходов между стадиями, длительность и число их
фрагментов, латентное время наступления первой фазы медленноволново-
го сна и латентное время наступления первой фазы парадоксального сна.
[Мухамедов Л. М., 1976; Карманова И. Г., Оганесян Г. А., 1994].
2.1. Методика оценки влияния веществ на циклы сон—бодрствование у крыс
Регистрация циклов сон—бодрствование проводится у свободно
передвигающихся крыс (как правило, белые беспородные самцы массой 220—
280 г) с хронически вживленными электродами [Клыгуль Т. А. и др., 1976;
Воронина Т. Д., Неробкова Л. Н., 1981; Deportere H., 1980; Неробкова и
ДР-, 1992].
Операции по вживлению электродов проводятся у анестезированных
крыс (как правило, под нембуталовым наркозом — 50 мг/кг,
внутримышечно), за 7—10 дней до проведения экспериментов. Электроды для
регистрации электрической активности вживляют в сенсомоторную область
коры, дорсальный гиппокамп и мышцы шеи. Координаты дорсального
гиппокампа рассчитываются по стереотаксическому атласу [Буреш и др.,
1964]. Индифферентный электрод, используемый при монополярной
записи, помещается на носовой кости черепа. Для регистрации
электрической активности мозга и электромиограмм шейных мышц можно
использовать электроды, изготовленные из нихромовой проволоки в
лаковой изоляции, диаметром 90 мк для вживления в гиппокамп и 120 мк —
для вживления в сенсомоторную зону коры и в мышцы шеи. Кроме того,
желательно записывать электроокулограмму. Для регистрации движений
глазных яблок униполярные электроды изготавливаются из тонкого
многожильного провода, покрытого полиэтиленовой изоляцией и
прикрепленного к крючку из нержавеющей стали, который фиксируется в
верхней части глазницы. Концы электродов припаивают к посеребренным
(или позолоченным) штырькам диаметром 0,8—1 мм, которые
закрепляются на кости черепа зубным висват-цементом или иным быстротвер-
деющим зубопротезным материалом. Во время эксперимента к штырькам
подключаются отводящие провода, идущие на коммутатор
электроэнцефалографа. Соединение отводящих проводов с коммутатором должно
быть гибким и подвижным, чтобы обеспечить безартефактную запись
электрограмм у свободно передвигающихся животных на протяжении
длительного времени.
Запись биоэлектрической активности осуществляется через 5—7 дней
после операции, как правило, с 9—10 часов утра, в течение 5—8 ч
(обязательно не менее 5 ч) на чернильнопишущем электроэнцефалографе.
Можно использовать также компьютерную электроэнцефалографию. Стадии
сна у крыс при правильном методе анализа четко разграничиваются. Мед-
ленноволновая фаза сна характеризуется медленными
высокоамплитудными волнами в тета- и дельта-диапазонах, а также сонными веретенами.
Парадоксальная фаза сна у крыс характеризуется четко выраженным гиппо-
кампальным тета-ритмом, который является наиболее четким показателем
при идентификации парадоксального сна. Гиппокампальный тета-ритм,
регистрируемый во время парадоксального сна, качественно отличается от
тета-ритма бодрствования. Различают тонический и фазический
компоненты тета-ритма. Тонический компонент характеризуется низкой
частотой (4—7 кол/с) и низкой амплитудой, и его нейрохимическая основа
является холинергической. Для фазического компонента характерна высоко-
-268-

амплитудная и высокочастотная активность, которая имеет ГАМКергиче-
скую природу [Monmaur P., 1981; Monmaur P., Tomson M., 1985].
Нарушения фазического тета-ритма в период парадоксальной фазы сна
наблюдается при различных патологических состояниях — стресс, эпилепсия,
паркинсонизм [Воронина Т. А. и Неробкова Л. Н., 1988; Соколова Н. Е. и др.,
1988; Воронина и др., 1989; Nerobkova et al., 1996]. Наряду с этим, при
парадоксальном сне наблюдаются десинхронизация электрической
активности в электрокортикограммах, резкое снижение амплитуды электромио-
граммы шейных мышц и, кроме того, наблюдается наличие быстрых
движений глаз на электроокулограмме, которые совпадают с понто-геникуло-
кортикальными (ПГО) спайками, возникающими на фоне максимально
развитого тета-ритма. Кроме того, наряду с быстрыми движениями глаз,
также совпадая с ПГО-спайками, могут возникать короткие подергивания
различных групп мышц (вибрисс, языка, морды, ушей, конечностей и
туловища).
В период бодрствования регистрируется десинхронизация электрокор-
тикограмм, слабомодулированный тета-ритма в гиппокампофаммах и
электромиофамма шейных мышц.
Определение отдельных фаз сна следует проводить с использованием
комплекса показателей, поскольку различить, например, парадоксальный
сон и бодрствование только по изменению электрокортикофамм
невозможно, так как в обоих состояниях электрокортикофамма
десинхронизирована. Четким показателем при характеристике фаз сна у животных
является электромиофамма шейных мышц. Активность этих мышц всегда
регистрируется во время бодрствования и медленноволнового сна, но в
период парадоксального сна она полностью исчезает.
При анализе циклов сон—бодрствование по изменению
зарегистрированных в течение 5 ч электрокортикофамм, гиппокампофамм, миофамм
шейных мышц и электроокулофамм определяются следующие показатели:
1. Абсолютная продолжительность сна — общее время сна в минутах за
5-часовой период регистрации.
2. Общее время сна, выраженное в процентах от времени непрерывной
регистрации электрофизиологических показателей.
3. Абсолютная продолжительность парадоксальной фазы сна — общее
время парадоксальной фазы сна в минутах за 5-часовой период
регистрации.
4. Абсолютная продолжительность медленноволновой фазы сна.
5. Латентное время появления медленноволнового сна (в минутах) —
соответствует периоду от момента начала регистрации
электроэнцефалограммы до возникновения первого эпизода фазы медленноволнового сна.
6. Латентное время возникновения парадоксальной фазы сна (в
минутах) — соответствует общему времени медленноволнового сна,
предшествующему первому эпизоду парадоксального сна.
7. Процентное содержание парадоксальной фазы сна. Подсчитывается
абсолютное время парадоксальной фазы сна в минутах и выражается в
процентах относительно общего времени сна в минутах, принятого за
100%.
8. Процентное содержание медленноволновой фазы сна.
Рассчитывается аналогично парадоксальной фазе сна.
9. Процентное содержание эпизодов бодрствования (пробуждения).
10. Число эпизодов парадоксальной фазы сна за 5 ч регистрации.
11. Среднее время сна без пробуждений (в минутах).
12. Число эпизодов пробуждения.
- 269-

Для оценки влияния на структуру сон—бодрствование исследуемых
веществ, вводимых однократно, эксперименты (через 5—7 дней после
операции) проводят по определенной схеме: 1-й день — адаптация животных к
экспериментальной камере в течение 1—2 ч, 2-й день — регистрация
фоновой биоэлектрической активности в течение 5 ч, 3-й день —
регистрация биоэлектрической активности на фоне введения вещества (не менее 5
ч). Вещество вводится за 10—30 мин до начала регистрации. При изучении
влияния вещества при его длительном введении на циклы
сон—бодрствование регистрация электрической активности проводится ежедневно на
всем протяжении курсового введения вещества и через 24 ч после отмены.
При оценке влияния веществ на структуру цикла сон—бодрствование
следует учитывать влияние на сон экспериментальных условий, например
таких, как длительность адаптации к экспериментальной обстановке,
условия содержания и освещенности, характер и режим питания, сезон года,
посторонние раздражители и др.
При выборе эталонных препаратов сравнения рекомендуется
использовать снотворные бензодиазепинового ряда, снотворные нового поколения,
наиболее близкие к исследуемым веществам по механизму действия.
2.2. Методика оценки влияния веществ на циклы сон—бодрствование
у кошек
Циклы сон—бодрствование у кошек имеют свои особенности в отличие
от крыс [Jouvet H. et al., 1964; Жуков В. Н., 1977]. Показано, что у этого
вида животных медленноволновая фаза сна характеризуется
синхронизированной высоковольтной медленноволновой активностью в коре и гиппо-
кампе при отсутствии движений глазных яблок и наличием тонической
активности скелетных мышц; парадоксальная фаза сна характеризуется
быстрой низковольтной активностью в коре, сопровождающейся
ритмической активностью в дорсальном гиппокампе (тета-ритм), вспышками
быстрых движений глазных яблок и отсутствием тонической активности
скелетных мышц. Для бодрствования характерна быстрая низковольтная
активность (десинхронизация) как в коре, так и в дорсальном гиппокампе,
которая сопровождается высоким тонусом скелетной мускулатуры
(возможны движения глазных яблок). Таким образом, у кошек, в отличие от
крыс, при бодрствовании отсутствует гиппокампальный тета-ритм.
Эксперименты обычно проводят на кошках (самцах) массой 3,5—5,0 кг
в условиях хронического опыта. Электроды для записи
электроэнцефалограммы изготавливают из нихромовой проволоки в лаковой изоляции
диаметром 250 мк. Кончик проволоки протяженностью 0,5 мм освобождается
от изоляции. Электроды вживляются в дорсальный гиппокамп (А 1,0; L
9,0; Н + 6,0) и кору головного мозга (А 9,0; L 9,0) с помощью стереотакси-
ческого прибора. Индифферентный электрод закрепляется на гребне
затылочной кости. Для регистрации движений глазных яблок униполярные
электроды изготавливаются из тонкого многожильного провода, покрытого
полиэтиленовой изоляцией и прикрепленного к крючку из нержавеющей
стали. Крючок фиксируется в верхней части глазницы. Два электрода для
биполярной записи тонуса скелетной мускулатуры, изготовленные тем же
способом, что и глазные электроды, вживляются в дорсальную группу
мышц шеи. Все свободные концы электродов подпаивают к контактам
специального многоштырькового разъема. Электроды и разъем фиксируют
на черепе животного с помощью самозатвердевающей зубопротезной пла-
-270-

стмассы "Протакрил" и часовых винтиков из нержавеющей стали,
диаметром не более 1 мм.
Опыты проводятся в условиях свободного поведения животных в
камерах размерами 60 х 60 х 60 см с предварительной адаптацией к обстановке
эксперимента в течение нескольких дней. В камерах животные находятся в
течение 3,5 ч в одно и то же время суток (между 11.30 и 15 часами). На 5—
6-й день после операции, через 30 мин после помещения животных в
камеры, начинается 3-часовая регистрация электрофизиологических
показателей сна и бодрствования. Запись электрической активности коры, гип-
покампа и шейных мышц, а также движений глазных яблок производят на
чернилопишущем электроэнцефалографе.
При оценке структуры сон—бодрствование учитываются такие же
показатели, что и у крыс.
— латентное время появления первой фазы медленноволнового сна и
латентное время наступления парадоксального сна,
— продолжительность и процентное содержание периодов
бодрствования и обеих фаз сна — медленноволновой и парадоксальной по
отношению к общему времени регистрации.
— число эпизодов по фазам сна и их средняя продолжительность.
Так же как и в исследовании на крысах, изучение влияния исследуемых
веществ на упомянутые выше показатели сна начинают после получения
контрольных результатов, стабильно отражающих паттерн структуры сон-
бодрствование у данного животного.
Исследуемые вещества вводят за 30 мин до посадки животных в
экспериментальную камеру для регистрации ЭЭГ. Повторные опыты можно
проводить не ранее чем через неделю и только после получения у
животных параметров сна, не выходящих за рамки контрольных.
2.3. Методика депривации парадоксальной фазы сна у крыс по методу Жуве
(модель нарушений сна при невротических расстройствах)
Метод депривации парадоксальной фазы сна крыс при помещении их
на малые площадки, окруженные водой, был предложен Jouvet и соавт. в
1964 г. и получил широкое распространение в исследованиях сна из-за
простоты и доступности [Deportere Н., 1980; Демин Н. Н. и др., 1986;
Маркина Н. В. и др., 1986; Вознесенский А. Г. и др., 1989; Воронина Т. А.
и др., 1990]. Методика используется как модель нарушений сна при
невротических расстройствах различной тяжести.
Эксперименты проводятся на половозрелых белых крысах самцах с
хронически вживленными электродами в сенсомоторную зону коры,
дорсальный гиппокамп и мышцы шеи. Координаты дорзального гиппокампа
определяются по стереотаксическому атласу мозга крыс [Буреш и др.,
1964].
Депривацию парадоксальной фазы сна проводят в бассейне с водой, в
котором находятся площадки диаметром 6—6,5 см, выступающие на 2 см
над уровнем воды, на которых животные могут свободно сидеть. Для того
чтобы крысы не сталкивали друг друга в воду, каждая из них находится в
отдельном отсеке. Во время бодрствования, дремоты и медленноволнового
сна у крыс сохраняется напряжение мышц, что позволяет животным
удерживаться на площадках. Во время парадоксальной фазы сна мышцы
расслабляются и животные падают в воду, таким образом достигается
избирательная депривация парадоксальной фазы сна. Показано, что этим спосо-
- 271 -

бом достигается в среднем 85 % депривация парадоксальной фазы сна, в
то время как медленноволновый сон уменьшается лишь на 40—50 %. В
условиях этой модели в результате иммобилизации, изоляции, падений в
воду и охлаждения у животного возникает сильный стресс.
Характер электрофизиологических и поведенческих изменений зависит
от длительности депривации парадоксальной фазы сна. Показано, что
24-часовая депривация не вызывает заметных изменений в поведении
животных, но приводит к увеличению (в 1,5—2 раза) продолжительности
парадоксальной фазы сна после отмены депривации по сравнению с
контролем. Семидневная депривация парадоксальной фазы сна вызывает
стабильное нарушение структуры сна и существенные поведенческие
нарушения, которые выражаются в растормаживании эмоционально-мотивацион-
ного поведения, усилении агрессивности, нарушении памяти и др., а
также развитии язв желудка, уменьшении массы тимуса и увеличение массы
надпочечников. При этом варианте эксперимента животных дважды в
сутки снимают с площадок в бассейне для кормления на короткий период
(15—20 мин), не давая им спать в это время.
Регистрация циклов сон—бодрствование проводится в течение 5 ч за
день до начала депривации сна и непосредственно после окончания сеанса
депривации, который осуществляется, в зависимости от цели
исследования, от 24 ч до 7 сут. У интактных (без депривации парадоксального сна) и
опытных (с депривацией — активный контроль) крыс регистрация циклов
сон—бодрствование осуществляется согласно описанию, представленному
в п.2.1 (Методика регистрации циклов сон—бодрствование).
Исследуемые вещества вводят за 10—15 мин до помещения животных в
бассейн. Регистрируются те же показатели, что и у контрольных крыс.
2.4. Методика нарушений структуры сон—бодрствование при сдвигах
дофамин-холинергических взаимодействий (нарушения сна
при паркинсоническом синдроме и депрессивном состоянии)
Как известно, нейротоксин 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропири-
дин (МФТП), в зависимости от дозы и длительности введения, вызывает у
крыс паркинсонический синдром или депрессивное состояние. Наряду с
этим системное введение специфического нейротоксина МФТП,
вызывающего гибель дофаминергических клеток в черной субстанции,
приводит к существенному нарушению циклов сон—бодрствование [Крупина
Н. А. и др., 1995; Воронина Т. А. и др., 1996; Nerobkova L. N. et al., 1996;
Voronina T. A. et al., 1996].
Однократное внутрибрюшинное введение нейротоксина в дозе 40 мг/кг
животным в возрасте 4—5 мес приводит к резкому нарушению структуры
сна. Регистрацию циклов сон—бодрствование проводят в трех вариантах:
непосредственно после введения МФТП, через 1,5 ч и через 3 ч после
введения нейротоксина, согласно методике, описанной в пункте 2.1. В первом
варианте опыта, когда регистрация циклов сон—бодрствование начинается
непосредственно после введения МФТП, отмечается резкое увеличение
процентного содержания бодрствования за счет редукции медленноволно-
вого сна и полного отсутствия парадоксальной фазы сна. При регистрация
циклов сон—бодрствование через 1,5 ч после введения МФТП структура
циклов сон—бодрствование претерпевает аналогичные изменения, но
латентное время медленноволнового сна сокращается по сравнению с первой
группой. При регистрации циклов сон—бодрствование через 3 ч после вве-
- 272-

дения МФТП процентное содержание медленноволнового сна
приближается к показателям контрольных животных, однако нарушения
парадоксальной фазы сна остаются значительными. Первые 15 мин после
введения МФТП отмечаются проявления паркинсонического синдрома
(кратковременный тремор, ригидность, синдром Штраубе и судорожные
подергивания мышц тела, эти изменения сохраняются в течение 60—90 мин. Через
1,5 ч судорожные проявления исчезают и развивается гипокинезия,
которая сохраняется на протяжении 3—4 ч.
Введение МФТП в меньшей дозе — 15 мг/кг (внутрибрюшинно) в
течение 15 дней приводит к развитию депрессивного состояния у животных
[Крыжановский Г. Н и др., 1995] и нарушению структуры
сон—бодрствование [Voronina Т. A. et al., 1996; Крупина Н. А. и др., 1997], что позволяет
использовать данную модель для оценки влияния веществ на структуру сна
при депрессивных состояниях. Регистрацию циклов сон—бодрствование
осуществляют согласно методике, описанной в пункте 2.1.
Существенное изменение структуры сна, хотя и в меньшей степени, чем
МФТП, вызывает также агонист мускариновых рецепторов оксотреморин
в дозе 0,1 мг/кг (внутрибрюшинно). Под влиянием оксотреморина
увеличиваются латентные периоды медленноволнового сна и парадоксальной
фазы сна, сокращается число эпизодов парадоксальной фазы сна и их
длительность, изменяется процентное соотношение медленноволнового сна и
эпизодов бодрствования, у животных снижается двигательная активность,
появляются вегетативные нарушения и тремор [Воронина Т. А. и др.,
1989].
Методики нарушений сна при сдвигах дофамин-холинергических
взаимодействий, моделирующих депрессии и паркинсонический синдром,
могут быть использованы дополнительно при оценке снотворных препаратов
с определенной направленностью действия и механизмами.
Нарушения структуры сон—бодрствование можно вызвать также
алкоголизацией животных [Виглинская И. А., 1981, Виглинская И. В., Буров
Ю. В., 1987], раздражением гипоталамуса [Жуков В. Н., 1977],
ретикулярной формации [Ковальзон В. М., Цибульский В. Л., 1985], депривацией
парадоксальной фазы сна на электродном полу [Воронина Т. А. и др.,
1996], созданием хронических эпилептогенных очагов [Воронина Т. А.,
Неробкова Л. Н., 1988]. При необходимости эти методики могут быть
использованы при экспериментальной оценке и выявлении особенностей
снотворного действия нового вещества.
3. Сопутствующие психотропные эффекты, побочное действие и острая
токсичность
Основываясь на данных об известных препаратах со снотворным
эффектом, которые обладают целым набором психотропных свойств, следует
выполнить исследования, показывающие наличие или отсутствие у
изучаемого вещества транквилизирующего, седативного, или активирующего,
противосудорожного, антидепрессивного и миорелаксантного действия,
исследовать его влияние на обучение и память. Для выявления этих
эффектов можно использовать общепринятые тесты. Для оценки седативного
или активирующего действия можно применить регистрацию поведения в
открытом поле и в различных актометрах, тест залезания на сетку; для
оценки транквилизирующего эффекта — методику конфликтной ситуации;
оценка противосудорожного действия осуществляется по антагонизму с су-
-273-

дорожными веществами (коразол, тиосемикарбазид, бикукуллин и др.) и
при судорогах, вызванных максимальным электрошоком; изучение
влияния вещества на условнорефлекторную деятельность и процессы обучения
и памяти осуществляется с использованием рефлексов активного и
пассивного избегания, лабиринтных рефлексов, оперантного поведения; для
исследования антидепрессивной активности можно использовать метод
поведенческой беспомощности. Исследование дополнительных
психотропных эффектов проводится в диапазоне доз, оказывающих снотворный
эффект.
Изучение побочных эффектов (седативный, миорелаксантный,
негативное влияние на память и др.) следует осуществлять в более широком
диапазоне доз от минимальных терапевтических, выявляемых в
электрофизиологических исследованиях, до субтоксических. Для изучения мио-
релаксантного действия используются тесты вращающегося стержня,
рефлекса подтягивания на перекладине, удерживания на перевернутой
сетчатой платформе, тест бокового положения. Нужно использовать не
менее двух видов животных и путь введения, соответствующий
предполагаемому клиническому. Информация о побочных эффектах дополняется
результатами, полученными в разделе "Изучение общей
фармакологической активности".
Острая токсичность изучается на двух видах животных, на которых
осуществлялось исследование снотворной активности, при тех же путях
введения; рассчитывается ЛД50- По соотношению доз, вызывающих
специфический (снотворный) эффект, и доз, оказывающих побочный и
токсический эффект, определяется широта терапевтического действия. Данные по
побочным эффектам и токсичности нового снотворного препарата
сопоставляются с данными, полученными для эталонных препаратов.
4. Изучение толерантности и возможной лекарственной зависимости
при длительном применении препарата и его отмене
Изучается переносимость препарата и развитие толерантности по
снотворному и побочным проявлениям действия при длительном (не
менее 1 мес) введении препарата. В связи с риском возникновения
лекарственной зависимости к новому снотворному средству обязательными
являются исследования по изучению возможного развития абстинентного
синдрома при отмене препарата после его длительного применения.
Желательно провести исследования с использованием и других методик для
выявления возможного наркогенного потенциала.
5. Изучение взаимодействия нового препарата с другими психотропными
препаратами
В связи с широким использованием снотворных на фоне применения
других средств необходимо исследовать взаимодействие нового препарата
прежде всего с этанолом и транквилизаторами. Желательно также
представить данные о комбинированном применении препарата и с другими
психотропными средствами.
- 274-

6. Изучение общей фармакологической активности, влияния
на сердечно-сосудистую систему и дыхание
Наблюдение за состоянием животного осуществляется на мышах и
крысах при введении препарата в широком диапазоне доз — от не
оказывающих заметного влияния на общее состояние до вызывающих гибель.
Оценку поведения и общего состояния животных после введения веществ
осуществляют так же, как и для других психотропных препаратов. Желательно
получить представление о влиянии препарата на эффекты нейромедиато-
ров, в частности ареколина, 5-окситриптофана, фенамина, резерпина,
дофамина, апоморфина, бикукуллина, флумазенила, дизоцилпина и других
анализаторов нейромедиаторных систем. Влияние на сердечно-сосудистую
систему, дыхание и периферические отделы нервной системы изучается на
интактных или наркотизированных кошках, кроликах или крысах по
влиянию на уровень кровяного давления, ритм сердечной деятельности
(желательно и других показателей работы сердца), дыхание, а также на реакции,
вызванные введением нейромедиаторов.
7. Изучение механизма действия нового препарата.
Желательно представить данные о влиянии нового вещества на ГАМК-
бензодиазепиновый хлор-ионофорный супрамолекулярный
многокомпонентный комплекс. В частности, оценить влияние веществ на
барбитуровый сайт надмолекулярной части хлорного канала, исследовать
взаимодействие с бензодиазепиновым и ГАМКергическим рецептором, исследовать
влияние вещества на стероидный компонент ГАМК-бензодиазепинового
рецепторного комплекса. Желательно получить представление о действии
вещества на глицин-стимулируемый хлорный канал, изучить сдвиги ней-
ромедиаторного баланса, представить данные о влиянии вещества на глу-
таматергическую систему. Наибольшую ценность могут представить
данные о влиянии новых веществ на ГАМК-бензодиазепиновый комплекс,
регулирующий функции хлорного канала, на хлорные токи, регулируемые
глициновым рецептором и кальциевый ток, регулируемый NMDA-рецеп-
торным комплексом.
Заключение
В заключении резюмируются данные, полученные при исследовании
снотворного действия нового препарата, приводятся данные о других
психотропных свойствах нового вещества, анализируются побочные эффекты,
представляются преимущества нового препарата перед известными
средствами сходной направленности действия.
Литература
1. Буреш Дж., Петрань М., Захар Д. Электрофизиологические методы исследования в
биологии. — М.: Мир, 1964. — 551 с.
2. Вейн А. М. Три трети жизни: сон и бодрствование. — М.: Знание, 1991. — 263 с.
3. Виглинская И. В. Влияние фармакологических веществ на нарушения сна при
экспериментальном алкоголизме: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. — М., 1981.
4. Виглинская И. В., Бурое Ю. В. Возможные корреляции между уровнем алкогольной
-275-

мотивации и электрофизиологической структурой сна у крыс // Бюлл. эксп. биол.
и мед. - 1987. - № 4. - С. 394-396.
5. Власов Н. А., Вейн А. М., Александровский Ю. А. Регуляция сна. — М.: Наука, 1983.
- 232 с.
6. Вознесенский А. Г., Неробкова Л. Н., Воронина Т. А., Ковалев Г. В.
Электрофизиологический и поведенческий анализ влияиния пикамилона на процесс обучения и
амнезию УРПИ после депривации ПФС. — В сб.: Пикамилон — новый цереброва-
скулярный и ноотропный препарат. — Уфа, 1989.
7. Воронина Т. А., Неробкова Л. Н. Влияние феназепама на циклы сна у крыс // Фар-
макол. и токсикол. — 1981. — № 1. — С. 18—21.
8. Воронина Т. А., Неробкова Л. Н. Нарушение обучения и структуры сна у крыс с эпи-
лептогенным кобальтовым очагом в сенсомоторной области коры // Бюлл. эксп.
биол. и мед. — 1988. - № 2. — С. 130-142.
9. Воронина Т. А., Гугуцидзе Д. А., Неробкова Л. Н. Анализ структуры
сон—бодрствование при паркинсоническом синдроме, вызванном 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетра-
гидропиридином и оксотреморином // Бюлл. эксп. биол. и мед. — 1989. — № 3. —
С. 314-316.
10. Воронина Т. А., Мдзинаришвили А. Л., Молодавкин Г. М. Влияние вальпроевой
кислоты на структуру сна и потребление этанола у крыс с различными типами
индивидуальной реактивности до и после стрессорного воздействия // Бюлл. эксп. биол.
и мед. - 1989. - № 9. - С. 294-296.
11. Воронина Т. А., Неробкова Л. Н, Маркина Н. В. и др. Возможные механизмы
действия мембрано-активных веществ с антиоксидантными свойствами в экстремальных
ситуациях. — В сб.: Клеточные механизмы реализации фармакологического
эффекта / Ред. С. Б. Середенин. — М., 1990. — С. 54-77.
12. Демин Н. Н. , Шелепкина Е. П., Воронина Т. А. и др. Изменение мембранных белков
в стволе головного мозга крыс при лишении их парадоксальной фазы сна и
продолжительность этой фазы при последующем свободном поведении //
Физиологический жур. им. И. М. Сеченова. — 1986. - Т. 72, № 6. - С. 723—727.
13. Жуков В. Н. Электрофизиологический анализ влияния нейротропных веществ на
нарушенную эмоциональным стрессом структуру сна: Автореф. дис. ... канд. мед.
наук. - М., 1977.
14. Карманова И. Г., Оганесян Г. А. Физиология и патология циклов
сон—бодрствование: эволюционные аспекты. — Новосибирск: Сиб. Наука, 1994. — 180 с.
15. Клыгуль Т. А., Кадлецова О., Вихляев Ю. И. Влияние нитразепама при его
длительном применении на циклы сна у крыс // Бюлл. экспер. биол. и мед. — 1976. —
№ 2. - С. 188-190.
16. Ковапьзон В. М., Цибульский В. Л. Лишение парадоксального сна, стресс и
эмоциональность у крыс // Журн. высшей нервной деятельности. — 1985. — Т. 35, вып. 1.
- С. 117-124.
17. Крупина Н. А., Крыжановский Г. Н., Иорданская Т. Е. и др. Нарушение REM-сна
при экспериментальном депрессивном синдроме, вызванном системным введением
крысам 1-метил-4-фенил-1,2,3,6- тетрагидропиридина (МФТП) // Бюлл. эксп.
биол.и мед. - 1997. - Т. 123, № 2. - С. 138-142.
18. Крыжановский Г. Н, Крупина Н. А., Кучеряну В. Г. Новая модель
экспериментального депрессивного синдрома у крыс, вызванного системным введением 1-метил-4-
фенил-1,2,3,6- тетрагидропиридина // Журн. высшей нервной деят. им. И. С.
Павлова. - 1995. - Т. 45, вып. 2. - С. 12-17.
19. Маркина Н. В., Воронина Т. А., Неробкова Л. Н. Влияние веществ класса ноотропов
на поведение крыс в условиях депривации парадоксальной фазы сна // Журн.
высшей нервной деятельности. — 1986. — Т.Зб, вып. 5. — С. 963—967.
20. Мухамедов Л. М. Сравнительная физиология сна млекопитающих. Итоги науки и
техники. — Физиология человека и животных. — 1976. — Т. 31. — Механизмы сна. —
С. 111-169.
21. Неробкова Л. Н., Богданов Н. Н., Маркина Н. В. Электрофизиологический анализ
действия гидазепама. Гидазепам. — Киев: Наукова думка, 1992. — С. 75—82.
22. Соколова Н. Е., Таранова Н П., Воронина Т. А. и др. Нейрохимические и
нейрофизиологические эффекты 2-этил-б-метил-З-оксипиридина в норме и при
нарушениях сна у крыс // Нейрохимия. — 1988. — Т. 7, № 4. — С. 483—492.
23. Deportere H. Some aspects of polygraphic studies on sleep-wakefulness cycle in rat. —
Waking and Sleeping, 1980. — P. 47—62.
24. Jouvet D., Vimont P., Delorme F., Jouvet M. Etude de la privation selective de la phase
- 276 -

paradoxale de sommeil chez le Chat // С R. Soc. Biol. — 1964. — Vol. 158, N 4. — P.
756-764.
25. Monmaur P. Phasic hippocampal activity during paradoxical sleep in the rat. Selective
suppression after diazepam administration // Experientia. — 1981. — Vol. 37. — P. 261—
262.
26. Monmaur P., Thomson M. A. Hippocampal-dentate thetha disturbance after selective
CAL— pyramidal cell damage in rat // Brain Research. — 1985. — Vol. 385, N 2. — P.
301-311.
27. Nerobkova L. N., Markina N. V, Voronina T. A. et al. Disturbances in sleep-wakefulness
pattern and learning ability in rats with MPTP-induced parkinsonian syndrome // Behav.
Pharmacol. - 1996. - Vol. 7, Suppl. 1. - P. 17-19.
28. Van den Broek, С M. Van Rijn, J. Van Egmond et al. The Hypnotic Midazolam does not
result in pharmacological dissociation between behavioral and the correlation dimension
of the EEG // Sleep-Wake research in the Netherlands. — 1996. — P. 2—3.
29. Voronina T. A., Markina N. V, Zucarsi E. E. et al. The action of nacom and amitriptiline on
MPTP—induced depression in rats // Behav. Pharmacol. — 1996. — Vol. 7, Suppl. 1. — P.
36-37.
Методические указания по изучению противосудорожной
активности фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н., проф. Т. А. Воронина;
к. б. н. Л. И. Неробкова
Современные противоэпилептические препараты включают вещества
различных классов химических соединений и механизма действия,
многие из которых известны довольно давно. Наиболее широко
применяемыми из них являются следующие: фенобарбитал (1912), фенитоин
(1938), этосуксимид (1958), клоназепам (1964), карбамазепин (1967),
вальпроевая кислота (1974), вигабатрин (1989), ламотриджин (1991), га-
бапентин (1993), топирамат (1995), тиагабин (1996). Классификации про-
тивоэпилептических препаратов представлены в обзорах и книгах
[Воронина Т. А., 1994; Харкевич Д. А., 1998; Dichter М. А., 1997; Unverferth К.,
Rundfeld С, 1999]. Несмотря на имеющееся структурное сходство —
химическая структура фенобарбитала послужила основой для создания
препаратов из классов гидантоина (фенитоин), суксинимида (этосукцимид)
и оксазолидина (триметадион), — эти вещества обладают различными
противосудорожными эффектами. Фенобарбитал и фенитоин
эффективны при подавлении генерализованных тонико-клонических судорог и
простых комплексных парциальных судорог, тогда как этосуксимид
эффективен в подавлении абсансов. Различны и основные механизмы их
действия — фенитоин блокирует вольтаж-зависимые натриевые каналы,
а этосуксимид блокирует кальциевые Т-каналы. Появившиеся в 80-е
годы противоэпилептические препараты нового поколения составили
альтернативу препаратам первого поколения у 25 % пациентов. В настоящее
время наиболее широко применяемыми препаратами являются
фенитоин, карбамазепин и вальпроат [Levy R. Н., 1995; SCRIP Reports, 1997].
Эти препараты при изучении в эксперименте новых противосудорожных
веществ следует в первую очередь использовать как эталонные
препараты.
-277 -

При создании новых соединений с противоэпилептической
активностью необходимо представлять, к какому типу судорог будет тропно
действие будущего препарата в клинике, и на этом основании строить
стратегию экспериментального изучения нового соединения. Как известно,
диагноз эпилепсии основывается на регистрации моторных судорог и
изменений в электрической активности мозга (ЭЭГ). Эпилептические судороги
представляют собой анормальные синхронизированные разряды,
возникающие среди большой популяции нейронов. В зависимости от
вовлекаемой нейрональной популяции могут возникать моторные, поведенческие
нарушения, изменение сознания. Судороги являются однотипными для
определенного больного, но очень существенно различаются между
отдельными пациентами. В связи с этим, согласно классификационной
системе, предложенной Международной противоэпилептической лигой,
разделяют симптоматическую и синдроматическую (эпилептический
синдром) классификации [Commission on Classification and Terminalogy of the
International League Against Epilepsy, Epilepsia, 1981].
Согласно симптоматической классификации судороги разделяют на
парциальные (фокальные) и генерализованные. Парциальные судороги
подразделяются на простые парциальные судороги с сохранным сознанием
и комплексные парциальные судороги с нарушением сознания, когда
пациент полностью не осознает окружающее; парциальные судороги могут
переходить во вторично генерализованные с тонико-клоническими
судорогами. Генерализованные судороги подразделяются на состояния,
протекающие только с потерей сознания (абсансы) и с нарушением моторной
активности (миоклонус, клонус, тонические, клонические, атонические
судороги). Атонические и клонико-тонические судороги сопровождаются
потерей сознания. Эпилептический статус характеризуется тем, что
судорожные припадки следуют один за другим без восстановления сознания.
На основе этих представлений и разработаны методики, моделирующие
различные типы судорог.
Поиск новых противоэпилептических препаратов, в том числе и нового
поколения, ведется прежде всего на основе оптимизации структур
известных препаратов, изучения взаимосвязи структура—активность, что
позволяет усилить противосудорожную активность, снизить побочные эффекты
и улучшить нейропротекторные свойства. Другая стратегия включает
изыскание новых препаратов на основе представлений о механизмах действия
известных средств, что приводит к открытию мишеней, возможно и не
вовлекаемых в эпилепсию, но участвующих в реализации действия
противоэпилептических веществ. На настоящий момент наиболее продуктивной
стратегией изыскания новых противоэпилептических веществ принято
считать программу, включающую различные элементы обозначенных
выше подходов.
1. Методики скрининга противоэпилептических веществ
Впервые батарея методов для изучения противоэпилептических веществ
в эксперименте была предложена L. S. Goodman и соавт. (1945) и Е. А.
Swinyard (1969). Первое место в предложенной ими стратегии занимали
методики максимального электрошока и антагонизма с пентелентетразо-
лом (коразолом), которые и до настоящего времени остаются основными
моделями в первичных скрининговых исследованиях
противоэпилептических препаратов. За рубежом наиболее часто для оценки противоэпилепти-
- 278 -

ческих веществ в эксперименте используется (с различными
модификациями) программа, разработанная в США, — ADDP (Antiepileptic Drug
Development Program).
Настоящие Методические рекомендации по экспериментальному
изучению веществ с потенциальной противоэпилептическои активностью
основываются на обозначенных выше подходах к поиску современных
противоэпилептических препаратов с учетом их механизма действия и
имеющихся представлений о патогенезе эпилепсии и ее проявлениях в
клинике.
Первый этап выявления потенциальных противоэпилептических
препаратов состоит в оценке противосудорожных свойств веществ в скрининго-
вых исследованиях на моделях первично-генерализованной эпилепсии,
включающих судороги, вызванные электрическим (тест максимального
электрошока) и химическим воздействием (тест антагонизма с коразолом)
у мышей и крыс [Воронина Т. А. и др., 1982; Porter et al., 1985; Loscher W.,
1991 a,b,c; Rostock et al., 1996].
Программа исследования включает несколько последовательных фаз.
1. Выявление противосудорожной активности и определение ее уровня
по величинам ЭД50 (эффективная доза, оказывающая противосудорожный
эффект у 50 % животных). Исследования проводятся на мышах с
использованием внутрибрюшинного введения вещества по тестам максимального
электрошока (МЭШ) и антагонизма с коразолом (подкожное введение).
2. Определение уровня неврологического дефицита по величинам ТД50
(доза, вызывающая нейротоксический эффект у 50 % животных) по тесту
вращающегося стержня в опытах на мышах при внутрибрюшинном
введении вещества. Вычисление терапевтической широты действия соединения
по показателям ТД50/ЭД50.
3. Определение острой токсичности вещества (ЛД50) У мышей при
внутрибрюшинном введении.
4. Определение активности соединения при введении внутрь мышам по
тестам максимального электрошока (МЭШ), антагонизма с коразолом
(подкожное введение) и вращающегося стержня.
5. Определение противосудорожной активности соединения при
введении внутрь у другого вида животных — крыс по тесту антагонизма с
коразолом.
6. Сравнение активности нового соединения с активностью известных
противосудорожных средств по тестам максимального электрошока
(МЭШ), антагонизма с коразолом (подкожное введение) и вращающегося
стержня.
Выбор для первой стадии скрининга противосудорожных веществ
именно тестов максимального электрошока (МЭШ) и антагонизма с коразолом
(подкожное введение) обусловлен качественным различием в развитии и
проявлении этих судорожных припадков [Swinyard E. А., 1969; White et al.,
1992а]. Принято считать, что судороги, вызываемые МЭШ, моделируют
"большие, Grant mal" судорожные припадки, а судороги, вызываемые
подкожным введением коразола, — "малые, petit mal" припадки. Эти тесты
являются обязательными и в программе ADDP. Основной компонентой
судорог при МЭШ является тоническая экстензия задних конечностей, и ее
устранение вызывает фенитоин, карбамазепин, но не бензодиазепины и
триметадион.
Основной компонентой коразоловых судорог являются клонические
судороги, и их устраняют бензодиазепины, триметадион, вальпроат, но на
них оказывает слабое действие фенитоин.
-279-

/. /. Тест максимального электрошока (МЭШ)
Эксперименты проводятся на мышах и крысах. Животные получают
через корнеальные или пиннеальные электроды электрические стимулы (50
Гц, 50мА для мышей и 50 Гц, 150 мА для крыс), длительностью 0,2 с.
Используемый показатель — максимальная тоническая экстензия задних
конечностей, которая возникает у 100 % контрольных животных.
Оценивается способность исследуемого вещества предупреждать развитие тонической
экстензии при его введении внутрибрюшинно или внутрь перед
проведением МЭШ. Для определения ЭД50 — эффективной дозы вещества,
оказывающей противосудорожный эффект у 50 % животных, используется по
меньшей мере 3 дозы вещества и каждая доза испытывается на 8—10
животных. В качестве препаратов сравнения рекомендуется использовать фе-
нитоин, карбамазепин и вальпроат.
1.2. Судороги, вызванные коразолом при его подкожном введении
Опыты проводят на беспородных белых мышах самцах или мышах
Crl:NMRI BR массой 19—29 г. Каждая доза испытывается на 10
животных. Коразол вводится подкожно в область шейного отдела спины. В
связи с высокой гигроскопичностью коразола и нестабильностью
действующей дозы на первом этапе исследования определяется кривая
зависимости доза—эффект для коразола. Животные наблюдаются в течение
30—60 мин после инъекции коразола с регистрацией основного
показателя — первых генерализованных клонических судорог с утратой рефлекса
переворачивания. На основе этих данных рассчитывается методом
пробит анализа (Litchfield, Wilcoxon) доза вызывающая судороги у 97 %
животных (СД97). Эта доза может колебаться в зависимости от качества
коразола от 50 до 120 мг/кг. После введения дозы СД97 у всех контрольных
животных развиваются судорожные проявления в такой
последовательности. 1. Одно или более миоклонических подергиваний всего тела. 2.
Повторяющиеся клонические судороги передних и/или задних
конечностей длительностью более чем 3 с без потери рефлекса переворачивания.
3. Генерализованные клонические судороги передних и задних
конечностей с утратой рефлекса переворачивания. 4. Тоническая экстензия
передних конечностей с потерей рефлекса переворачивания. 5. Тоническая
экстензия передних и задних конечностей с утратой рефлекса
переворачивания. У 90—100 % контрольных животных после введения коразола
обязательно должны наблюдаться судорожные проявления, описанные в
пунктах 1—3. Для определения противосудорожной активности нового
исследуемого соединения коразол вводят после соединения на пике его
максимального эффекта и затем осуществляют регистрацию судорог в
течение 30—60 мин. Животные, у которых не наблюдаются после введения
вещества и затем коразола судорог в течение 30 мин, описанных в пункте
2, — повторяющиеся клонические судороги передних и/или задних
конечностей длительностью более чем 3 с без потери рефлекса
переворачивания или судорог последующих 3—5 стадий, рассматриваются как
защищенные. Исследуется несколько доз соединения и на основании
полученных данных методом пробит-анализа расчитывается ЭД50 и 95 %
доверительные интервалы (Litchfield, Wilcoxon).
- 280-

1.3. Оценка нейротоксичности (ухудшение моторной функции)
Нейротоксичность у мышей и крыс прежде всего оценивается по
нарушению координации движений по тесту вращающегося стержня.
Неспособность животных удерживаться на вращающемся стержне в течение 1
мин, хотя бы один раз из 3 попыток, учитывается как показатель
нарушения этой функции. Для мышей, как правило, используется стержень
диаметром 2,5 см и скоростью вращения 6 оборотов в минуту, а для крыс —
диаметром 6 см и скоростью вращения 8 оборотов в минуту. Контрольные
мыши удерживаются на вращающемся стержне по несколько минут, тогда
как крысы требуют нескольких посадок на стержень. Исследуется
несколько доз нового соединения и затем методом пробит-анализа расчитывается
ТД50 (доза, оказывающая нейротоксическое действие у 50 % животных) и
95 % доверительные интервалы (Litchfield, Wilcoxon). Кроме того,
возможно визуальное наблюдение за животными (крысы) с регистрацией
нарушения походки, поз, мышечного тонуса.
1.4. Острая токсичность соединений
Острая токсичность изучается на двух видах животных, на которых
проводилось исследование противосудорожной активности, при внутрибрю-
шинном и пероральном путях введения. Животные помещаются в
индивидуальные клетки со свободным доступом к воде и пище. Регистрация
гибели животных осуществляется через 24 ч после введения вещества.
Вещество вводится не менее чем в 3—4 дозах. На основании полученных
результатов рассчитывается ЛД50 (Litchfield, Wilcoxon).
2. Методики судорог, используемые для изучения спектра
противосудорожных эффектов исследуемых веществ
2.1. Методики, моделирующие первично-генерализованные судороги
2.1.1. Судороги, вызванные пикротоксином при его подкожном введении
Опыты проводят на беспородных белых мышах самцах или мышах
Crl:NMRI BR массой 19—29 г. Каждая доза испытывается на 10 животных.
Пикротоксин вводится в дозе, вызывающей судороги у 97 % животных
(обычно доза 2,5 мг/кг) подкожно в область шейного отдела спины.
Животные наблюдаются в течение 30—60 мин после инъекции пикротоксина.
Соединение, с учетом пика его максимального эффекта, вводится до
введения пикротоксина. В качестве критерия оценки противосудорожного
действия нового вещества используется его способность подавлять
развитие повторяющихся клонических судорог передних и/или задних
конечностей длительностью более чем 3 с без потери рефлекса переворачивания.
Исследуется несколько доз изучаемого соединения и на основании
полученных данных методом пробит-анализа расчитываются ЭД50 и 95 %
доверительные интервалы (Litchfield, Wilcoxon).
- 281 -

2.1.2. Судороги, вызванные бикукуллином при его подкожном введении
Опыты проводят на беспородных белых мышах самцах или мышах
Crl:NMRI BR массой 19—29 г. Каждая доза испытывается на 10 животных.
Бикукуллин вводится в дозе, вызывающей судороги у 97 % животных
(обычно доза 2,7 мг/кг) подкожно в область шейного отдела спины.
Животные наблюдаются в течение 30—60 мин после инъекции бикукуллина.
Исследуемое соединение вводится, с учетом пика его максимального
эффекта, до введения бикукуллина. В качестве критерия оценки противосу-
дорожного действия нового вещества используется его способность
подавлять развитие вызываемых бикукуллином повторяющихся клонических
судорог передних и/или задних конечностей длительностью более чем 3 с без
потери рефлекса переворачивания. Исследуется несколько доз изучаемого
соединения и на основании полученных данных методом пробит-анализа
расчитываются ЭД50 и 95 % доверительные интервалы (Litchfield, Wilcoxon).
2.1.3. Судороги, вызванные стрихнином при его подкожном введении
Опыты проводят на беспородных белых мышах самцах или мышах
CrkNMRI BR массой 19—29 г. Каждая доза испытывается на 10 животных.
Стрихнин вводится в дозе, вызывающей судороги у 97 % животных
(обычно доза 1,2 мг/кг), подкожно в область шейного отдела спины. Животные
наблюдаются в течение 30—60 мин после инъекции стрихнина.
Исследуемое соединение вводится, с учетом пика его максимального эффекта, до
введения стрихнина. В качестве критерия оценки противосудорожного
действия нового вещества используется его способность подавлять
развитие тонических судорог, вызываемых стрихнином. Исследуется несколько
доз нового соединения и на основании полученных данных методом
пробит-анализа расчитываются ЭД50 и 95 % доверительные интервалы
(Litchfield, Wilcoxon).
2.1.4. Судороги, вызванные тиосемикарбазидом
Антагонизм с тиосемикарбазидом оценивается в опытах на мышах по
способности исследуемых веществ предупреждать развитие судорог у
животных. Оценку противосудорожного эффекта проводят по изменению
латентного времени первого судорожного приступа, по наличию судорог и
гибели животных. Тиосемикарбазид, как правило, в дозе 28 мг/кг (ЭД97 —
доза, вызывающая судороги и гибель у 97 % животных), вводят внутри-
брюшинно через 10—40 мин после введения исследуемого вещества.
"Защищенными" считают животных, которые выживают в течение 90 мин
после введения тиосемикарбазида.
2.1.5. Судороги, вызванные камфорой
Исследования проводятся на белых беспородных мышах-самцах массой
20—24 г. Камфора вводится в дозе 1 г/кг подкожно или внутрибрюшинно
в масляном растворе. Исследуемое вещество вводится до введения
камфоры, и затем регистрируется его способность ослаблять выраженность
судорог и выживаемость животных. Рассчитываются показатели ЭД50.
- 282-

2.1.6. Судороги, вызванные М-метил-О-аспартатом (NMDA)
или квисквалатом
Опыты проводят на беспородных белых мышах самцах или мышах
CitNMRI BR массой 19—29 г. Каждая доза испытывается на 10 животных.
NMDA или квисквалат вводят в желудочки мозга. В низких дозах NMDA
или квисквалат вызывают интенсивные эпизоды клонических судорог, а
при увеличении дозы примерно в 10 раз в картине судорог преобладает
тоническая экстензия передних конечностей. Дозы, вызывающие эти
судороги у 97 % животных, могут варьировать. Наиболее часто для NMDA и кви-
сквалата они составляют 0,2 мкг/5 мл для клонических судорог и 3 мкг/5
мл для тонических судорог. Животные наблюдаются в течение 30 мин
после инъекции NMDA или квисквалата. Исследуемое соединение вводится,
с учетом пика его максимального эффекта, до введения NMDA или
квисквалата. В качестве критерия оценки противосудорожного действия нового
вещества используется его способность подавлять развитие клонических и
тонических судорог, вызываемых NMDA или квисквалатом. Исследуется
несколько доз нового соединения и на основании полученных данных
методом пробит-анализа расчитываются ЭД50 и 95 % доверительные
интервалы (Litehfield, Wilcoxon). Подробно методика описана N. A. Singh и соавт.
(1988), Е. A. Swinyard и соавт. (1993).
2.1.7. Методика определения судорожного порога для судорог, вызванных
коразолом
Коразол (0,1 % раствор) вводится (титруется) внутривенно в хвостовую
вену мышей со скоростью 0,3 мл/мин (желательно использовать инфузион-
ный насос). У контрольных животных при такой инфузии появляются
следующие типы судорог. 1. Одно или более миоклонических подергиваний
всего тела. 2. Повторяющиеся клонические судороги передних и/или задних
конечностей длительностью более чем 3 с без потери рефлекса
переворачивания. 3. Генерализованные клонические судороги (клонус) передних и
задних конечностей с утратой рефлекса переворачивания. 4. Клонические
судороги, за которыми следует тоническая экстензия передних конечностей с
потерей рефлекса переворачивания. 5. Тоническая экстензия задних
конечностей с утратой рефлекса переворачивания (наблюдается не всегда,
поскольку часто животные погибают ранее развития этой стадии).
В качестве критерия оценки противосудорожного действия нового
вещества наиболее часто используется его способность предупреждать
развитие 1, 3 и 4-й стадий судорог. Чтобы определить пороги судорожной
реакции для различных стадий, используются группы животных по 10—12
мышей для каждой дозы. Исследуемое вещество вводится внутрибрюшинно и
затем через определенный интервал времени, в учетом пика действия
вещества, начинается титрование коразолом. Эффект вещества учитывается
отдельно для каждой стадии как процент увеличения количества коразола,
необходимого для получения судорог, характерных для этой стадии.
Рассчитывается значимость различий в дозах коразола, требуемых для
получения судорог у контрольных и опытных животных, обычно используя
Student's t-тест. В случае получения статистически значимых эффектов по
этим данным рассчитывается показатель TID50 (threshold increasing dose) —
доза, увеличивающая порог судорог к коразолу на 50 %, как правило,
методом логарифмической линейной регрессии.
-283-

2.1.8. Методика киндлинга, вызванного введением коразола
Фармакологический киндлинг моделируется в опытах на мышах и
крысах путем повторных введений коразола в дозе, не вызывающей
судорожных состояний [Крыжановский Г. Н. и др., 1988]. Мышам коразол вводят
в подпороговой дозе, как правило, 30 мг/кг внутрибрюшинно с
интервалами не менее 24 ч. Крысы получают коразол в дозе 35 мг/кг по той же
схеме. Оценку судорожных реакций у животных определяют по 4-балльной
шкале: 0 баллов — отсутствие судорожных реакций, 1 балл —
подергивания головой или отдельных мышц тела, 2 балла — серийные повторные
подергивания всего тела, 3 балла — клонико-тонические судороги с "позой
кенгуру" и "барабанный бой", 4 балла — клонико-тонические судороги с
падением набок и постприступной депрессией, повторные
клонико-тонические судороги и смерть. Наблюдения проводятся в течение 25 мин после
введения коразола.
2.1.9. ЭЭГ -исследование первично-генерализованной эпилептиформной
активности, вызванной бемегридом
Первично-генерализованная эпилептиформная активность (ЭпА) в
эксперименте создается в основном на крысах при внутримышечном введении
0,5 % раствора бемегрида в дозе 10 мг/кг или коразола в дозе 25—30 мг/кг.
Эксперименты проводятся на крысах массой тела 250—280 г с хронически
вживленными электродами в сенсомоторную кору (координаты: 1,5—2 мм
вперед или назад от брегмы и 2 мм вправо или влево от сагиттального шва)
и некоторые подкорковые структуры, наиболее часто, в область дорсального
гиппокампа (координаты: 3 мм назад от брегмы, 3 мм вправо или влево от
сагиттального шва, на глубину 3 мм от поверхности кости), или
миндалевидный комплекс. Операция по вживлению хронических электродов
осуществляется, как правило, под нембуталовым наркозом за 5 дней до
проведения эксперимента. Запись электрической активности обычно проводят в
условиях свободного передвижения животного по камере. Регистрация
биопотенциалов мозга осуществляется на чернилопишущем электроэнцефалографе
или любым другим способом, позволяющим регистрировать и
количественно оценить изменения эпилептиформных разрядов в электрограммах
исследуемых структур и оценить противосудорожный эффект препарата.
Исследуемое вещество вводят за несколько минут до введения бемегрида, так,
чтобы пик его активности приходился на пик активности бемегрида. Оценка
противосудорожного действия веществ проводится по изменению числа
разрядов за минуту, длительности отдельных разрядов и общей длительности
разрядов за минуту. Предполагается, что в основе действия веществ на число
разрядов и их длительность лежат различные механизмы и
антиэпилептические эффекты могут выражаться как в уменьшении числа разрядов, так и в
снижении их длительности, либо в сочетании этих эффектов.
3. Методики, моделирующие парциальные (фокальные)
и вторично-генерализованные судороги в хроническом эксперименте
Необходимость использования "очаговых" моделей эпилепсии при
оценке действия противоэпилептических препаратов очевидна, так как
известно, что противоэпилептические средства, которые успешно применя-
-284-

ются при первично-генерализованной эпилепсии, часто оказываются
неэффективными при различных формах очаговой и
вторично-генерализованной эпилепсии (у 20—30 % больных). Кроме того, показано, что во
многих случаях эпилепсии, имеющей первично-генерализованные формы,
могут существовать трудно диагностируемые очаги-генераторы [Крыжа-
новский Г. Н., 1997].
Наиболее адекватными моделями для воспроизведения в эксперименте
парциальных (фокальных) психомоторных судорог являются методики
киндлинга, вызываемого повторной электрической стимуляцией (начиная
с подпороговых значений тока) миндалины, гиппокампа или других
областей лимбической системы, и кобальтовая модель эпилепсии. В условиях
этих моделей развиваются фокальные судороги, которые имеют сходство с
комплексными парциальными судорогами у человека. Если продолжать
электрическую или химическую стимуляцию, в дополнение к фокальным
судорогам развиваются вторичные генерализованные судороги. Однажды
развившись, повышенная чувствительность к электрической или
химической стимуляции остается постоянной. При этих моделях развивается
хроническая дисфункция мозга, вызывающая не только повышенную
чувствительность к судорогам, но и длительное нарушение поведения.
3.1. Методика киндлинга, вызванного электрической стимуляцией
миндалины
Исследование проводится на белых крысах самцах или самках,
беспородных или линии Вистар. У анестезированных животных, используя сте-
реотаксический прибор, вживляется один биполярный электрод в правую
базолатеральную миндалину. Координаты электродов от брегмы — АР —
2.2, L — 4.7, V — 8.7. Индифферентный электрод помещают на череп над
контралатеральной париетальной корой. Через 2 нед после операции
начинают моделирование киндлинга. Электрическая стимуляция миндалины
осуществляется от электрического стимулятора (500 мА, 1 м/с, 50/с, в
течение 1 с) один раз в день до тех пор, пока не возникает 10
последовательных пятистадийных судорог.
Оценку судорог при киндлинге осуществляют, как правило, по
классификации Racine (1972) по следующим стадиям: 1 — замирание, закрытие
глазной щели, подергивание усов, принюхивание, фациальный клонус;
2 — наклон головы, связанный с более выраженным фациальным
клонусом; 3 — клонус одной передней лапы; 4 — запрокидывание, часто
связанное с билатеральным клонусом передних лап; 5 — запрокидывание с
утратой равновесия и сопровождаемое генерализованными клоническими
судорогами.
Электрическая активность миндалины регистрируется через
биполярный электрод, вживленный в эту структуру мозга, до и после стимуляции.
Начинают стимуляцию с 10 мА и затем интенсивность увеличивается
каждый день на 20 % с интервалами в 1 мин, до тех пор пока не возникают
разряды последействия продолжительностью более 3 с — ЭЭГ спайки с
амплитудой, по крайней мере в 2 раза превышающей обычную амплитуду,
и частотой более 1/с. Определение порогов для разрядов последействия
осуществляют с интервалами в 2—3 дня, до тех пор, пока все животные не
воспроизводят судорожные пороги. У животных с киндлингом, кроме
основного показателя — порога судорожной реакции, регистрируют
длительность судорог — лимбических (стадии 1—2) и/или моторных судорог (ста-
-285-

дии 3—5) и длительность разрядов последействия. Исследуемые вещества
вводят животным со стабильным судорожным порогом и регистрируют
ослабление описанных выше судорожных реакций. Повторные
эксперименты на этих же крысах с тем же веществом или с другим препаратом можно
проводить с интервалом в 7 дней. В заключение следует провести
гистологические исследования по определению правильности нахождения
биполярных электродов в миндалине [Tober Ch. et al., 1996].
Модель киндлинга, вызванная электростимуляцией миндалины,
является наиболее распространенной моделью киндлинга. Однако, кроме нее,
можно использовать киндлинг, вызванный электростимуляцией гиппокам-
па или других областей лимбической системы [White H. S. et al.,1992b].
3.2. Методика эпилептогенного хронического очага, вызванного аппликацией
кобальта у крыс
Эксперименты проводят на белых беспородных крысах-самцах массой
тела 180—220 г с хронически вживленными электродами. Эпилептогенный
очаг создается аппликацией порошка металлического кобальта на
поверхность сенсомоторной коры левого полушария (координаты — 1,5 мм,
вперед от брегмы и 1,5—2 мм латеральнее сагиттального шва). Операции
проводят в условиях анестезии (как правило, под нембутаповым наркозом —
40 мг/кг, внутримышечно). В черепе крысы просверливается отверстие
диаметром 1 мм, в которое насыпают порошок металлического кобальта на
высоту 2 мм. Канюлю закрепляют на поверхности черепа при помощи
висват-цемента или любой зубопротезной быстротвердеющей пластмассы.
Одновременно в мозг крысы вживляют электроды, изготовленные из ни-
хромовой проволоки (диаметром 90—120 мк), в лаковой изоляции для
регистрации электрограмм. Концы электродов припаивают к посеребрянным
штырькам, которые закрепляются на кости черепа, так же как и канюля.
Электроды вживляют в ипсилатеральную и контралатеральную (по
отношению к очагу) зону сенсомоторной коры и некоторые структуры лимби-
ко-гипоталамического комплекса. Индифферентный электрод вживляют в
носовую кость черепа. Биоэлектрическую активность исследуемых
структур регистрируют у свободно передвигающихся животных ежедневно
начиная со 2-го дня после аппликации кобальта. Ежедневное мониторирование
электрической активности мозга крыс позволяет выявить особенности
развития эпилептической системы в различные сроки после аппликации эпи-
лептогена и выбрать наиболее информативные периоды для воздействия
антиэпилептическими средствами. Подсчитывают число и длительность
разрядов в минуту, длительность одного разряда, а также латентное время
возникновения отдельных пароксизмов в каждой исследуемой структуре,
что позволяет определить наиболее точно место приложения вещества и
сделать предположение о возможном механизме действия вещества.
В развитии эпилептиформной активности крыс с кобальтовым эпилеп-
тогенным очагом можно выделить стадии, различающиеся по
электрофизиологическим и нейрохимическим характеристикам [Поздеев В. К., 1983;
Неробкова Л. Н., Воронина Т. Д., 1988; Дюмаев К. М. и др., 1995].
В первые два дня после операции в электрограммах всех исследуемых
областей отмечаются эпилептиформные разряды, доминирующие, в
основном, в элетрограммах, записанных с поверхности двигательной коры в
непосредственной близости от "эпилептогенного" очага. В это время у крыс
отмечаются отдельные подергивания передней правой лапы или головы.
-286-

Следует отметить, что на протяжении одного опыта в электрограммах
одной и той же крысы могут присутствовать разнообразные пароксизмы:
сгруппированные острые волны, высокоамплитудные острые волны,
множественные пики, комплексы острых волн и комплексы "пик—волна"
К 3—4-му дню после аппликации кобальта отмечается тенденция к
генерализации эпилептиформной активности в зеркальный очаг и
подкорковые структуры. К 5—6-му дню после операции у всех крыс с кобальтовым
эпилептогенным очагом регистрируются генерализованные эпилептиформ-
ные разряды, одинаковые по амплитуде и синхронно возникающие во всех
исследуемых структурах, в это время у животных отмечаются подергивание
правой и левой передних лап, головы и туловища. Генерализованная
активность сохраняется обычно в течение нескольких дней, с постепенным
нарастанием ее в электрограммах подкорковых образований. Затем
отмечается постепенное ослабление ЭпА в "истинном" очаге и некоторое
усиление в "зеркальном" очаге и подкорковых структурах. Приблизительно к
концу 2-й недели после аппликации кобальта эпилептиформная
активность в электрограммах всех исследуемых областей ослабевает, возникая
лишь при световой или звуковой стимуляции.
Таким образом, в развитии ЭпА в электрограммах мозга крыс с
кобальтовым эпилептогенным очагом в сенсомоторной области коры можно
выделить три стадии: 1-й этап — начало развития эпилептической
активности с наличием пароксизмальных разрядов в электрограммах коры ипсила-
терального полушария и значительно меньшей выраженностью ее в других
отведениях (24—48 ч после аппликации кобальта); 2-й этап — наличие
генерализованных эпилептиформных разрядов как в контралатеральном
полушарии, так и в подкорковых структурах (5—6-е сутки); 3-й этап —
уменьшение эпилептических разрядов в кортикограммах первичного
(истинного) очага и сохранность их в электрограммах зеркального очага и
подкорковых структур (14-е сутки).
Исходя из этого, изучение влияния новых веществ на ЭпА желательно
проводить отдельно на каждом этапе. Наиболее важно исследовать
действие исследуемых веществ в начальной стадии развития эпилептической
системы (1—2-й день после аппликации кобальта) и на стадии
генерализации ЭпА (через 5—6 дней после аппликации эпилептогена). Оценивается
способность веществ устранять или ослаблять проявления судорожной
активности в электрограммах исследуемых структур мозга по числу разрядов
за минуту, общей длительности разрядов за минуту и длительности
отдельных разрядов в каждой исследуемой структуре. Влияние веществ на
вторично-генерализованные судороги оценивали по изменению ЭпА в
электрограммах зеркального очага и подкорковых структур.
3.3. Модель парциальных судорог, вызванных аппликацией оксида алюминия
в опытах на кошках
Для создания хронического эпилептогенного очага в экспериментах на
животных используется применение оксида алюминия в опытах на
кроликах и кошках. Эпилептиформная активность, регистрируемая в
электрограммах сенсомоторной коры и подкорковых структур, наблюдается в
отдаленные сроки после аппликации эпилептогена и сохраняется в течение
нескольких месяцев. Наиболее часто используется модель, предложенная
R. Guerrrero-Figueroa и соавт. (1966), в опытах на кошках. Эпилептоген-
ный очаг создается путем нанесения оксида алюминия в одну из специфи-
-287-

ческих структур мозга (дорсальный гиппокамп, миндалина и пр.). При
введении эпилептогена в область дорсального гиппокампа правого
полушария регистрирующие электроды вживляются кошкам через 1 мес после
имплантации эпилептогена, так как только к этому времени появляются
заметные изменения электрической активности в зоне первичного очага.
Электроды вживляются в оба гиппокампа, миндалину и сенсомоторную
кору обоих полушарий. Анализ развития первичного и вторичных очагов и
формирования эпилептической системы проводится по изменению
характера эпилептиформной активности (ЭпА). Регистрируется число разрядов
и их длительность. При этом ЭпА может регистрироваться как во время
двигательных (моторных) пароксизмов, так и без них. У животных с гип-
покампальными эпилептогенными очагами наблюдается повышенная
агрессивность, изменяется эмоционально-поведенческий статус. Таким
образом, эта модель может использоваться не только для оценки
специфического влияния антиэпилептических веществ на ЭпА, но и оценить их
влияние на эмоциональную сферу в поведении животных. Однако данная
модель применима в условиях хорошо финансируемой фирмы, так как
требует длительного содержания животных в условиях вивария.
Использования криогенных очагов эпилепсии требует специальной
техники и оборудования, что затрудняет широкое применение этой модели
при изучении противосудорожных веществ.
3.4. Модель парциальных судорог, вызванных аппликацией пенициллина
Эксперименты обычно проводятся на крысах линии Вистар или белых
беспородных крысах-самцах массой 180—250 г. За сутки до эксперимента в
черепе животных просверливаются отверстия 2x4 мм над
симметричными областями сенсомоторной коры головного мозга и устанавливаются
монополярные корковые серебряные электроды для отведения
электрической активности с указанных областей. Очаги эпилептической активности
создаются аппликацией фильтровальной бумаги, смоченной раствором
натриевой соли бензилпенициллина в концентрации 20 000 МЕ/мл.
Исследуемые антиэпилептические вещества вводят либо на фоне устойчивой
эпилептиформной активности, либо за 30 мин до создания очагов. Элек-
трокортикограммму регистрируют у свободно передвигающихся животных.
Оценку противосудорожных свойств веществ проводят по изменению
амплитудно-частотных характеристик эпилептиформных разрядов, их числу
и продолжительности существования очагов [Карпова М. Н. и др., 1989].
4. Модель эпилептического статуса
Эксперименты проводятся на белых беспородных крысах-самцах массой
220—250 г с хронически вживленными электродами и кобальт-индуцирован-
ным эпилептогеннным очагом в сенсомоторной области коры. Эпилептоген-
ный очаг создается по методике описанной в пункте 3.2. Начиная с 4-го дня
после аппликации кобальта, ежедневно проводят ЭЭГ-мониторинг. Когда у
крыс появляются отдельные клонические подергивания передних лап и/или
мордочки, а в электрограммах исследуемых структур мозга отмечается
стойкая эпилептиформная активность, проводят провокацию эпистатуса.
Обычно наиболее благоприятными являются сроки на 7—8-й день после
аппликации кобальта, когда у всех крыс отмечаются стойкие изменения электриче-
-288-

ской активности, отдельные клонические подергивания передних лап или
головы. Эпилептический статус вызывают внутримышечным введением тиа-
лактоном гомоцистеина (DL-homocysteine thiolactone — НСТ) в дозе 5,5
ммоль/кг, разводимого в 3,5 мл/кг нормального изотонического раствора
натрия хлорида непосредственно перед использованием. Мониторирование
электрической активности проводится сразу после инъекции НСТ и до
конца эксперимента, что позволяет определить точное время наступления
генерализованных клонико-тонических приступов (ГКТП) и определить
временные интервалы между последовательными приступами [Walton Y. et al., 1988,
1996]. Для оценки способности веществ устранять развившийся статус
исследуемые вещества вводятся сразу после окончания второго приступа
ГКТП. Контрольной группе животных в те же сроки вводят изотонический
раствор натрия хлорида в равных объемах. После этого наблюдение
проводят не менее 30 мин. Способность веществ устранять эпилептический статус
оценивается по уменьшению числа ГКТП, наблюдаемых после введения
антиэпилептического вещества, и по длительности интервала между
приступами ГКТП. Регистрируется процент животных, у которых после введения
исследуемого вещества в различных дозах отсутствовали приступы ГКТН, и на
основании этих данных рассчитывается ЭД50.
Использование НСТ для провокации генерализованных тонико-клони-
ческих судорог у крыс с кобальтовым эпилептогенным очагом позволяет
также оценить влияние веществ на вторично-генерализованные судороги.
Развивающиеся при этом моторные и/или электрографические приступы
оцениваются по их длительности, числу и характеру. При оценке
моторных судорог учитывается наличие отдельных подергиваний передних
конечностей, головы или отдельных мышц тела, комплексные подергивания,
клонико-тонические судороги с "позой кенгуру" и "барабанный бой", кло-
нико-тонические судороги с падением набок и постприступной
депрессией, учитывается процент животных у которых отмечается боковое
положение. Кроме того, регистрируется появление агрессии или гиперактивности.
5. Генетические модели эпилепсии
5. /. Аудиогенные судороги у мышей линии DBA/2J
Исследования осуществляются на мышах линии DBA/2J возрастом 21 —
22 дня и массой 6—10 г. Мышей помещают в круглые пластиковые клетки
(диаметр 19—20 см) и включают звуковой сигнал ПО дБ (12 кГц) в течение
60 с, регистрируя в этот период наличие судорог. Судороги оцениваются по
балльной шкале: 0 — отсутствие судорог, 1 — дикий бег менее чем 10 с, 2 —
дикий бег более 10 с, 3 — клонические судороги, 4 — экстензия передних
конечностей/флексия задних конечностей, 5 — тонические судороги, 6 —
остановка дыхания. Исследуемое соединение вводится до помещения
животных в звуковую камеру. Статистические различия между контрольной и
опытной группами рассчитываются, как правило, по Mann-Whitney U-тесту.
5.2. Модель аудиогенной эпилепсии у крыс линии Крушинского—Молодкиной
Аудиогенную эпилепсию моделируют и изучают на крысах линии
Крушинского—Молодкиной (КМ), для которых характерно наличие
обусловленной эпилептиформной реакции на звуковое раздражение [Семиохина
10 - 762
- 289-

А. Ф. и др., 1993]. Крыс подвергают акустическому воздействию в
звукоизолированной камере размером 30 х 55 х 45 см в течение 90 с (сила звука 60—
120 дБ). Звук вызывает у крыс резкое двигательное возбуждение,
переходящее в клонико-тонический припадок. Для оценки наблюдаемого эффекта
используются следующие количественные показатели аудиогенной реакции:
латентный период возникновения двигательного возбуждения в ответ на
звуковое воздействие (в с), интенсивность судорожного припадка (в баллах от 0
до 4) и характер судорожной реакции (одно- или двухволновой).
Интенсивность судорожного припадка оценивается по следующей шкале: 0 баллов —
отсутствие двигательного возбуждения, 1 балл — двигательное возбуждение
(беспорядочный бег, прыжки), не заканчивающееся судорожным
припадком, 2 балла — двигательное возбуждение, заканчивающееся падением
животного на брюшко с последующими клоническими судорогами, 3 балла —
двигательное возбуждение, заканчивающееся падением животного на бок с
клоническими судорогами, 4 балла — двигательное возбуждение с падением
животного на бок с тоническим напряжением всей мускулатуры и
временной остановкой дыхания. Исследуемое вещество вводится до начала
звуковой экспозиции, с таким расчетом, чтобы пик действия вещества
приходился на время экспозиции. Оценка противосудорожных эффектов проводится
по сумме баллов в контрольной и опытной группах, а также по изменению
латентного времени возникновения двигательного возбуждения
4.3. Исследования на линиях животных с генерализованными
эпилептическими абсансами
Изучение антиэпилептических свойств веществ по способности
угнетать абсансы проводятся на генетических или мутантных линиях
животных. Известна генетическая линия крыс WAG/Rij с генерализованными
эпилептическими абсансами. Эксперименты на этих крысах позволяют
использовать не только электрофизиологические, но и поведенческие методы
анализа. При этом анализируется влияние веществ на число и
длительность разрядов "пик—волна" и характер поведения [van Luijtelaar E. L.,
Coenen A. M., 1995].
Мутантная линия летаргических мышей Lh/Lh, у которых отмечаются
спонтанные эпилептические абсансы, также используется для оценки ан-
тиабсансной активности новых веществ [Hosford D. A. et al., 1995].
Предполагается, что в механизме нарушений, связанных с эпилептическими
абсансами, ключевую роль играет подтип ГАМК-Б рецептора, поэтому его
агонисты усиливают судорожную активность и могут быть использованы
для анализа антиабсансной активности. В связи с тем что использование
линейных животных не всегда доступно, в экспериментах на крысах
абсансы могут быть вызваны введением пентилентетразола или гамма-оксибути-
рата [Hosford D. A. et al., 1995].
6. Изучение спектра нейропсихотропной активности и побочных эффектов
В связи с тем что известные противосудорожные препараты обладают,
помимо основного, противосудорожного эффекта, другими
проявлениями действия, следует изучить более подробно спектр нейропсихотропной
активности нового препарата и получить сведения о его побочных
эффектах.
-290-

Следует получить данные о наличии или отсутствии у изучаемого
вещества седативного или активирующего, анксиолитического и миорелаксант-
ного действия, исследовать его возможное влияние на память. Для
выявления этих эффектов следует использовать общепринятые тесты:
регистрацию поведения в открытом поле и в различных актометрах, тест залезания
на сетку, методики конфликтной ситуации и приподнятого
крестообразного лабиринта; для изучения миорелаксантного действия используются
тесты вращающегося стержня, рефлекса подтягивания на перекладине,
удерживания на перевернутой сетчатой платформе, тест бокового положения.
Изучение эффектов новых соединений на процессы обучения и памяти
следует проводить с использованием методик условных рефлексов
активного и пассивного избегания, лабиринтных моделей. Исследование этих
эффектов проводится в диапазоне терапевтических доз, оказывающих про-
тивосудорожный эффект.
Для расширения представлений о механизме действия нового
соединения следует изучить его влияние на проявления действия различных ней-
ромедиаторных анализаторов, например на эффекты ареколина, тремори-
на, 5-окситриптофана, фенамина, резерпина, дофамина, апоморфина,
флумазенила, дизоцилпина и др.
Изучение побочных эффектов следует осуществлять в более широком
диапазоне доз: от средних терапевтических до субтоксических,
использовать не менее двух видов животных и путь введения, соответствующий
предполагаемому клиническому. Данные по побочным эффектам нового
препарата сопоставляются с данными, полученными для эталонных
препаратов. Информация о побочных эффектах дополняется результатами,
полученными в разделе "Изучение общей фармакологической активности".
7. Изучение толерантности и возможной лекарственной зависимости
при длительном применении противосудорожного препарата и его отмене
В связи с тем что противосудорожные препараты применяются, как
правило, длительными курсами, необходимо исследовать эффекты нового
вещества при его длительном применении (введение не менее 1 мес). При
хроническом введении препарата изучаются его переносимость и развитие
толерантности по противосудорожным, сопутствующим и побочным
эффектам. Кроме того, необходимо провести исследования по изучению
возможного абстинентного синдрома при отмене препарата после его
длительного введения.
8. Исследование механизма действия нового соединения
Представляются данные по изучению механизма действия,
имеющиеся на настоящий момент. Поскольку патомеханизм развития эпилепсии
до настоящего времени еще полностью не раскрыт и не ясны точные
молекулярные мишени для воздействия новых противоэпилептических
веществ, изучение механизма их действия осуществляется, как правило, на
основе представлений о механизме действия известных препаратов.
Рекомендуется оценить действие новых веществ на функционирование
натриевых и кальциевых Т-каналов, исследовать их действие на ГАМКер-
гическую и возбуждающую глутаматергическую нейропередачу.
Поскольку в последние годы интенсивные и перспективные исследования ведут-
ю*
- 291 -

ся среди антагонистов АМРА подтипов глутаматных рецепторов [Rogaw-
ski M. А., 1995] или активаторов калиевых каналов [Rundfeldt С, 1997],
желательно получить данные о влиянии нового препарата на эти
механизмы. Появлению новых мишеней воздействия противоэпилептических
веществ может способствовать исследование тканей из эпилептического
очага человека или анализ генома человека с наследственной
эпилепсией. Познания в этой области могут привести к созданию компенсаторной
терапии.
9. Взаимодействие нового препарата с другими психотропными препаратами
В связи с широким использованием противосудорожных препаратов в
наборе средств комбинированной терапии следует изучить
комбинированное действие нового соединения с известными и наиболее часто
применяемыми нейропсихотропными средствами, в частности этанолом,
снотворными, транквилизаторами, антидепрессантами и др.
10. Изучение общей фармакологической активности, влияния
на сердечно-сосудистую систему и дыхание
Наблюдение за состоянием животного осуществляется на мышах и
крысах при введении препарата в широком диапазоне доз: от не оказывающих
заметного влияния на общее состояние до вызывающих гибель. При этом
определяются повышение или снижение общей возбудимости, увеличение
или снижение двигательной активности, наличие тремора, судорожных
подергиваний, судорог, гиперкинезов, изменение цвета кожных покровов,
взъерошивание шерсти, каталепсия, птоз, стереотипия, груминг и т. д.
Изучаются пиннеальный, болевой и роговичный рефлексы, влияние на
температуру тела, потребление воды и пищи.
Влияние на сердечно-сосудистую систему, дыхание и на
периферические отделы нервной системы изучается на интактных или
наркотизированных кошках, кроликах или крысах по влиянию на уровень кровяного
давления, ритм сердечной деятельности (желательно и других показателей
работы сердца), дыхание, а также на реакции, вызванные введением ней-
ромедиаторов, например адреналина, норадреналина, ацетилхолина, серо-
тонина и в ответ на раздражение периферического отрезка блуждающего
нерва и др.
11. Изучение фармакокинетики и биодоступности исследуемого вещества
Исследование фармакокинетики и биодоступности является
необходимым и важным звеном исследования для любого препарата и особенно с
противосудорожным действием, в связи с необходимостью в последующем
в значительном числе случаев осуществления фармакокинетического
мониторинга в клинике. Изучение и расчет показателей фармакокинетики и
биодоступности не отличаются от таковых при изучении препаратов
других типов действия.
Исследование хронической токсичности, тератогенности, мутагенности,
аллергогенности и др. осуществляется в соответствии с действующими
методическими рекомендациями ФК МЗ РФ.
-292-

Заключение
Изложенный выше комплекс методов позволяет выявить эффективные
противосудорожные средства, определить их преимущества перед
известными препаратами, возможные побочные эффекты и в дальнейшем
предложить их для клинических испытаний в качестве противоэпилептических
средств.
В заключении к представляемому отчету в ФК МЗ РФ резюмируются
данные, характеризующие всю совокупность противосудорожных
эффектов представляемого соединения, а также сопутствующих неиротропных
эффектов. Описываются выявленные побочные эффекты. Анализируются
основные преимущества нового препарата перед известными средствами
сходной направленности действия.
Л итература
1. Воронина Т. Д., Вихляев Ю. И., Неробкова Л. Н. и др. Характеристика
фармакологических свойств феназепама. Методы исследования. — В кн.: Феназепам / Ред. С.А.
Андронати. — Киев: Наукова Думка, 1982. — С. 145—150.
2. Воронина Т. А. Фармакология современных противосудорожных средств // Анти-
конвульсанты в психиатрической и неврологической практике / Ред. А. М. Вейн,
С. Н. Мосолов. — Спб.: Мед. инф. агентство, 1994. — С. 3—30.
3. Дюмаев К. М., Воронина Т. А., Смирнов Л. Д. Антиоксиданты в профилактике и
терапии патологий ЦНС. — М.: Изд-во Института биомедицинской химии РАМН,
1995.
4. Карпова М. Н., Глебов Р. Н, Панков О. Ю. и др. Влияние блокатора СА-каналов
риодипина на очаговую и генерализованную эпилептическую активность // Бюлл.
экспер. биол. и мед. — 1989. - Т. 108. - № 11. — С. 553—554.
5. Крыжановский Г. Н. Киндлинг как модель формирования эпилептической
активности // Успехи физиологических наук. — 1988. — Т. 19. — № 4.— С. 12—31.
6. Крыжановский Г. Н. Общая патофизиология нервной системы. — М., 1997.
7. Неробкова Л. Н, Воронина Т. А. Нарушение обучения и структуры сна у крыс с эпи-
лептогенным кобальтовым очагом в сенсомоторной области коры // Бюлл. эксп.
биол. и мед. — 1988. — № 4. — С. 397—400.
8. Поздеев В. К. Медиаторные процессы и эпилепсия. — Л.: Наука, 1983.
9. Симеохина А. Ф., Федотова И. Б., Кузнецова Л. М. Крысы линии Крушинского—
Молодкиной как модель для изучения патологических состояний и методов их
регуляции // Лаб. животные. — 1993. — Т. 3, № 4. — С. 202—210.
10. Харкевич Д. А. Фармакология: Учебник для студентов высших медицинских
учебных заведений. — 6-е изд. — М.: ГЭОТАР-Медицина, 1999. — 650 с.
11. Dichter M. A. Overview: The neurobiology of epilepsy. — In: J. Engel, T. A. Pedley (eds):
Epilepsy: A comprehensive Textbook Philadelphia—New York: Lippincott—Raven
Publishers, 1997.
12. Commission on Classification and Terminalogy of the International League Against
Epilepsy // Epilepsia. - 1981. - Vol. 22. - P. 489-501.
13. Oam M., Gram L. (eds). — Comprehensive Epileptology. — New York: Raven Press,
1991.
14. Hosford D. A., Wang Y., Liu С С, Snead О. С. Characterization of the antiabsence
effects of SCH 50 911, a GABA—В receptor antagonist, in the lethargic mouse, gamma-hy-
droxybutirate and pentylenetetrazole models // J. Pharmacol. Exp. Ther. — 1995. —Vol.
274. -N. 3. - P. 1399-1403.
15. Goodman L. S., Swinyard E. A., Toman J. E. Laboratory technics for the identification and
evaluation of potentially antiepileptic drugs // Proc. Am. Fed. Clin. Res. — 1945. — Vol.
2. - P. 100-111.
16. Guerrero-Figueroa R., Barros A., Lester В., Heath R. Electrophysiological Studies of Hippoc-
ampal Epileptiform Discharges During Emotional Stages // Acta Neurol. Latinoamer. —
1966. - Vol. 12. - P. 6-26.
17. Levy R. H., Mattson R. H., Meldrum B. S. (eds). Antiepileptic Drugs. — 4th ed. —
NewYork: Raven Press, 1995.
-293 -

18. Loscher W., Nolting B. The role of technical, biological and pharmacological factors in the
laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. 1Y. Protective indices // Epilepsy Res. —
1991a. - Vol. 8. - P. 1-10.
19. Loscher W., Fassbender C. P., Nolting B. The role of technical, biological and
pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. II. Maximal electro-
shoch seizure models. — Epilepsy Res., 1991b.—V.8. — P. 79—94.
20. Loscher W., Honack D., Fassbender С P., Nolting B. The role of technical, biological and
pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III.
Pentylenetetrazol seizure models // Epilepsy Res. — 1991c. — Vol. 8. — P. 171 — 189.
21. Porter R. J., Hessie B. J., Cereghino J. J. et al. Advances in the clinical developvent of
antiepileptic drugs // Federation Proc. — 1985. — Vol. 44. — P. 2645—2649.
22. Racine R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Votor seizure //
Electroenceph. Clin. Neurophesiol. — 1972. — Vol. 32. — P. 295.
23. Rogawski M. A. — In: Stone T. W. (ed.). — CNS Neurotransmitters and
Neuromodulators: Glutamate, 1995, Vol. 2, CRC, Boca Ration, FL. - P. 219-237.
24. Rostock A., Tober Ch., Rundfeld С et al. D-23 129: a new anticonvulsant with a broad
spectrum activity in animal models of epileptic sezures // Epilepsy research. — 1996. —
Vol. 23. - P. 211-223.
25. Rundfeldt С The new anticonvulsant retigabine (D-23 129) acts as an opener of K+
channels in neuronal cells // Europ. J. Pharmacol. —1997. — Vol. 336. — P. 243—249.
26. Singh N. A., Swinyard E. A., White H. S. Effect of prototype anticonvulsants on N-me-
thyl-D-aspartate (NMDA)- induced seizures in mice // Fed. Am. Soc. Exp. Biol. — 1988.
- Vol. 2. - A1068.
27. Swinyard E. A. Laboratory evaluation of antiepileptic drugs. Review of laboratory methods
// Epilepsia. - 1969. - Vol. 10. - P. 107-119.
28. Swinyard E. A., Wolf H. H., White H. S. et al. Characterization of the anticonvulsant
properties of F-721 // Epilepsy Res. - 1993. - Vol. 15. - P. 35-45.
29. SCRIP Reports. Epilepsy: A mature market or long-term prospect. — Richmond: PJB
Publications Ltd., 1997.
30. Tobee Ch., Rostock A., Rundfeld Ch., Bartsch R. D-23 129: a potent anticonvulsant in the
amygdala rindling model of complex pertial seizures // Europ. J. Pharmacol. — 1996. —
Vol. 303. - P. 163-169.
31. Unverferth K., Rundfeldt С Antiepileptics // Ulmann's Encyclopedia of industrial
chemistry, sixth edition. - Wiley-VCH Verlag GmbH, D-69 469 Weinhaim, 1999. — P. 1 — 12.
32. Van Luijtelaar E. L., Coenen A. M. Effects of remacemide and its metabolite FPL 12 495
on spike-wave discharges, electroencephalogram and behaviour in rats with absence
epilepsy // Neuropharmacoly. — 1995. — Vol. 34, N 4. — P. 419—425.
33. Walton N. Y and Treiman D. M. Experimental secondarily generalized convulsive status
epilepticus induced by D. L.-homocysteine thiolactone // Epilepsy Res. — 1988. — Vol.
2. - P. 79-86.
34. Walton N. Y, Jaing Q., Hyun В., Treiman D. M. Lamotrigine vs. phenytoin for treatment
of status epilepticus: comparison in an experimental model // Epilepsy Res. — 1996. —
Vol. 24. - P. 19-28.
35. White H. S., Patel S., Me/drum B. S. Anticonvulsant profile of MDL 27,266: an orally
active, broad spectrum anticonvulsant agent // Epilepsy Res. — 1992. — Vol. 12. —
P. 217-226.
36. White H. S., Wolf H. H., Swinyard E. A. et al. A neuropharmacological evaluation of fel-
bamate as a novel anticonvulsant // Epilepsia. — 1992b. — Vol. 33 (3). — P. 564—572.
I

Методические указания по изучению антипаркинсонической
активности фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н., проф. Т. А. Воронина;
д. м. н. Е. А. Вальдман; к. б. н. Л. Н. Неробкова
Паркинсонический синдром (ПС) является проявлением ряда
заболеваний различной этиологии — первичного паркинсонизма, включающего
собственно болезнь Паркинсона; вторичного (сосудистого,
травматического, токсического, вызываемого рядом лекарственных препаратов), а также
различных форм мультисистемной дегенерации. При ПС проявляется
классическая триада симптомов — тремор, ригидность и олигокинезия.
Несмотря на различия в этиологии, патогенетическая основа всех форм
ПС одинакова. Основные нарушения при ПС связаны с нейродегенератив-
ными процессами в базальных ядрах головного мозга Дегенерация
дофаминовых (ДА) нейронов в нигростриатуме, преимущественно в
компактной части черной субстанции, является патохимическим коррелятом
основных симптомов ПС — акинезии и ригидности. Недостаточность
тормозного действия ДА нигростриатума приводит к гиперактивации холи-
нергических (ХЭ) нейронов, с которой связывают проявления основных
двигательных расстройств при ПС, особенно тремора. Кроме черной
субстанции, патологические процессы при ПС развиваются в стриатуме,
бледном шаре, вентролатеральном ядре таламуса и субталамических ядрах.
Таким образом, дефицит ДА и гиперактивация ХЭ нейронов считается
основным патогенетическим звеном паркинсонического синдрома. В
зависимости от преобладания той или иной основной симптоматики в клинике
вьщеляют акинетическую, акинетико-ригидную, ригидно-дрожательную и
дрожательную формы ПС. Возникновение определенной формы ПС
зависит, прежде всего, от того, нарушение какой медиаторной системы
является инициальным звеном патологического процесса
Группа противопаркинсонических средств включает в себя препараты
различного механизма действия, направленного на основные звенья
патогенеза паркинсонического синдрома (ПС) Наибольшее значение имеют
средства, повышающие дофаминергическую передачу. В качестве средства
заместительной терапии широко используется метаболический
предшественник ДА — 1-дофа (L-диоксифенилаланин, леводопа), который в
отличие от ДА проходит через гема-тоэнцефалический барьер и при участии
дофадекарбоксилазы превращается в ДА. С целью уменьшения
периферических побочных эффектов применяют комбинированные средства —
1-дофа с ингибиторами периферического декарбоксилирования (синемет,
наком) или бенсераэидом (мадопар). Широко используются агонисты ДА-
рецепторов — парлодел (бромкриптин), лизурид, перголид, и ингибиторы
МАО-В — селегелин, юмекс, депренил. В качестве монотерапии на ранних
стадиях и в комплексной терапии применяются также колинолитические
препараты — циклодол, паркопан, биперидин, акинетон и др. Отдельное
место занимает амантадин (мидантан), механизм действия которого
связывают с непрямым дофаминергическим и холинолитическим эффектами за
счет блокады NMDA-рецепторов. Однако большинство
противопаркинсонических препаратов имеют много побочных эффектов и обладают
ограниченной эффективностью поэтому поиск новых средств лечения ПС
остается актуальным.
- 295 -

Изучение активности потенциальных противопаркинсонических
препаратов проводят на моделях ПС. Обычно прибегают к различным способам
угнетения ДА-передачи, прежде всего в нигростриатуме, или активации
ХЭ-нейронов. Два типа этих моделей различаются по динамике развития
процесса и его проявлениям и рассматриваются как воспроизводящие,
соответственно акинетико-ригидную иди дрожательную формы ПС. При
угнетении ДА-передачи ПС возникает медленно, продолжается несколько
суток, начинается с олигокинезии; преобладает акинетико-ригидная
форма. Редукция симптомов начинается с ригидности, и их выраженность
зависит от возраста животных ПС при активации ХЭ-системы развивается
быстро, продолжается несколько часов, начинается с тремора, преобладает
ригидно-дрожательная форма, редукция симптомов начинается с тремора,
возраст экспериментальных животных существенного значения не имеет.
Результаты экспериментального изучения нового препарата должны
содержать материалы, доказывающие наличие у него выраженной противо-
паркинсонической активности и преимуществ перед уже известными
средствами.
Исследования следует проводить на различных видах лабораторных
животных, например мышах и крысах, а при необходимости можно
использовать и более крупных животных (обезьян). По каждому тесту вещество
изучают не менее чем в трех дозах должны быть использованы по меньшей
мере два способа введения, один из которых соответствует
предполагаемому клиническому способу применения препарата. Не менее чем по одному
из основных тестов необходимо изучить кривую зависимости доза-эффект
и определить продолжительность эффекта при использовании пути
введения, соответствующего предлагаемому в клинике. Исследование противо-
паркинсонической активности проводится обязательно в сравнении с
наиболее известными эталонными препаратами этого же типа действия.
Полученные данные обрабатываются с помощью современных методов
статистики и представляются в виде таблиц, а при необходимости —
рисунков.
ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ
ПРОТИВОПАРКИНСОНИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДСТВ
1. Методы, основанные на угнетении дофаминергической передачи
Методы, основанные на угнетении ДА-передачи, включают тесты,
моделирующие развитие каталепсии и других зкстрапирамидных нарушений
введением дофаминергических веществ, и модели ПС, создаваемые при
применении нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина
(МФТП), вызывающего избирательное повреждение ДА-нейронов.
Каталепсию вызывают, как правило, введением различных нейролептиков, из
которых чаще всего используют галоперидол и трифтазин. Типичные
нейролептики вызывают блокаду ДА-рецепторов, и при их назначении в
больших дозах даже при однократном применении наблюдается развитие
экстрапирамидных нарушений. Следует отметить, что данная модель имеет ряд
недостатков. Под действием нейролептиков дегенеративные изменения в
ДА-нейронах и их терминалях не развиваются, в то время как при ПС
отмечается гибель не менее 70—80 % ДА-нейронов компактной части черной
-296 -

субстанции. Однако данные методики моделируют выраженную
каталепсию и позволяют установить наличие ДА-звена в механизме действия
исследуемого соединения и поэтому широко используются для оценки про-
тивопаркинсонических средств. Кроме того, для создания
экстрапирамидных нарушений используется резерпин, вызывающий ДА-дефицитное
состояние путем истощения запасов катехоламинов в ЦНС. Наиболее
адекватной моделью ПС в настоящее время признана методика с применением
в ней ротоксина МФТП, вызывающего неиродегенеративные изменения
ДА-нейронов черной субстанции.
/. /. Методика каталепсии, вызванной галоперидолом
Галоперидол является типичным нейролептиком — производным бути-
рофенона. Действие его наступает быстро и продолжается длительное
время. Механизм действия галоперидола связывают с блокадой ДА-рецепто-
ров центральным альфа-адреноблокирующим действием и нарушением
процесса обратного нейронального захвата и депонирования адреналина.
Наиболее частым побочным эффектом галоперидола являются
экстрапирамидные расстройства.
Исследования проводят на беспородных крысах (самцах) массой 180—
220 г. В каждой группе по 6—10 животных. Каталепсию вызывают внутри-
брюшинным введением галоперидола в дозе 1 мг/кг. Препараты сравнения
и исследуемые соединения вводят одновременно с галоперидолом.
Антагонизм с галоперидолом оценивают в градированной и альтернативной
форме по способности исследуемых веществ уменьшать время каталептогенно-
го состояния крыс и процент животных с каталепсией в группе.
Продолжительность каталепсии измеряют через 30, 60, 120 и 180 мин. Как
правило, эффект наиболее выражен через 120 мин.
1.1.1. Метод оценки каталепсии по Morpurgo
Продолжительность каталепсии измеряют в секундах по времени
застывания животного в непривычной позе на ступеньках и оценивают в баллах.
Животное усаживают на задние лапки так, чтобы, опираясь передней
лапкой на ступеньку, крыса держала бы другую лапку без опоры. Если крыса
сохраняет эту позу в течение 10 с при высоте ступени 3 см, засчитывают 1
балл, при высоте ступени 10 см — 2 балла. Поочередно помещают правую
и левую лапу на нижнюю, затем на верхнюю ступени. Таким образом,
максимальное развитие каталепсии у одного животного может быть
оценено в 6 баллов. Попытки усадить животное в нужную позу продолжают не
более 1 мин, степень каталепсии оценивают в баллах по группе.
1.1.2. Метод оценки каталепсии с использованием параллельных перекладин
или стенок
Передние и задние конечности животного помещают на параллельные
перекладины (стенки) таким образом, чтобы спина животного была
прямой. Фиксируют время пребывания крысы в неподвижном состоянии.
Оценивают общую продолжительность каталепсии, а также процент
животных с каталепсией в группе. При альтернативном учете критерием на-
-297-

личия каталептического состояния считают пребывание в неподвижном
состоянии на перекладинах (стенках) в течение 45 с. Попытки придать
животному нужную позу не продолжают более 1 мин.
Возможна также оценка каталепсии на параллельных перекладинах или
в кольце у мышей. В этих вариантах опыта дозу галоперидола,
вызывающую каталепсию более чем у 50 % животных в контрольной группе,
следует подбирать с учетом выраженных линейных различий.
1.2. Методика создания каталепсии, вызванной трифтазином
Трифтазин является типичным нейролептиком производным фенотиа-
зина, обладающим выраженным ДА-блокирующим и слабым адренолити-
ческим действием. В больших дозах трифтазин вызывает отчетливые
экстрапирамидные расстройства.
Исследования проводят на белых беспородных крысах самцах. Для
создания выраженных экстрапирамидных нарушений в эксперименте
трифтазин (2 мг/кг внутрибрюшинно) вводится через 30 мин после введения
исследуемых и эталонных веществ. Каталепсию оценивают через 30 мин
после введения трифтазина по методике Morpurgo или параллельных
перекладин (стенок), описанных выше. Наблюдение за животными можно
осуществлять в течение 3—5 ч.
1.3. Модель экстрапирамидных нарушений, вызванных резерпином
Резерпин вызывает истощение запасов катехоламинов в ЦНС и в связи
с этим позволяет моделировать ДА-дефицитное состояние,
наблюдающееся при ПС.
Влияние препаратов на экстрапирамидные нарушения, вызванные
резерпином, оценивают у белых беспородных мышей по тесту двигательной
активности и по влиянию на вегетативные проявления действия
резерпина: птоз, диарея, саливация, снижение температуры тела. Резерпин
вводится в дозе 2,5 мг/кг внутрибрюшинно в суспензии с Твин 80. Исследуемые
вещества вводят через 30 мин после введения резерпина. На данной
модели существенно различаются проявления ПС в зависимости от возраста
животных.
1.3.1. Оценка двигательной активности
Двигательную активность оценивают в актометре (Ugo Basile Optovan-
mex или другой модификации) в течение 10 мин через 2 ч после введения
резерпина. В актометр помещают группу животных. Обычно учитывают
общий показатель по группе, при этом контрольная и опытные группы
должны содержать равное количество животных.
1.3.2. Оценка вегетативных нарушений
Птоз регистрируют в баллах по величине глазной щели: 3 — полное
закрытие глаз, 2 — щель до 1 мм, 1 — щель до 2 мм, 0 — глаза полностью
открыты. Саливацию оценивают по размеру мокрого пятна на шее: 3 — до
- 298 -

2 см, 2 — до 1 см, 1 — до 0,5 см, 0 — отсутствие эффекта. Регистрируют
наличие диареи. Температуру тела измеряют электротермометром с
ректальным датчиком при погружении электрода на глубину 1,5—1,8 см.
1.4. Модель ПС у мышей и крыс, вызванного системным введением
нейротоксина МФТП
Модель ПС, вызванного введением нейротоксина МФТП, является
наиболее адекватной моделью ПС, поскольку МФТП вызывает
избирательное повреждение дофаминергических нейронов черной субстанции
МФТП при действии МАО. В астроцитах превращается в 1-метил-4 фе-
нилпиридиний (МФП+), который с помощью дофаминового транспортера
захватывается ДА-нейронами. Эффекты МФТП обусловлены токсическим
действием МФП+, вызывающим энергетическую недостаточность за счет
ингибирования комплекса-1 дыхательной митохондриальной цепи. Этот
эффект наиболее выражен у приматов, у мышей некоторых линий,
особенно С57В1/6. Доказана специфичность возникающих под действием
нейротоксина изменений в нигростриатуме и у крыс, однако крысы менее
чувствительны к МФТП. Для моделирования ПС у крыс требуется применение
более высоких доз МФТП, чем у приматов. МФТП вводится внутрибрю-
шинно в изотоническом растворе натрия хлорида. Животным контрольной
группы вводится изотонический раствор натрия хлорида. Для мышей
линии С57В 1/6 доза нейротоксина составляет 30 мг/кг однократно, для
белых беспородных крыс в возрасте 4—5 мес — 40 мг/кг, 7—8 мес — 30 мг/
кг, 12 мес и старше — 20 мг/кг (ЛД50 МФТП составляет для крыс 4—5 мес
около 70 мг/кг). Крысам нейротоксин вводится однократно или через 12 ч
в течение 2—4 сут.
Исследуемые вещества вводят обычно на фоне развернувшихся
экстрапирамидных нарушений, но в зависимости от задач, при однократном
введении МФТП возможно введение исследуемых веществ за 30 мин до
нейротоксина.
Оценку основных экстрапирамидных нарушений следует начинать сразу
после введения нейротоксина и продолжать наблюдение в течение 2—3 ч.
Эффективность исследуемых препаратов оценивают по их способности
ослаблять основные проявления ПС, вызываемого введением МФТП, олиго-
кинезии, ригидности и тремора, а также регистрируют наличие и
выраженность слюнотечения, пилоэрекции, ретропульсии, нарушений дыхания.
1.4.1. Оценка выраженности ригидности
Мышечный тонус задних лап мышей и крыс определяют по
сопротивлению пассивной флексии в голеностопном суставе. Для количественной
оценки ригидности мышц туловища используют симптом "горбатости",
выраженность которого зависит от мышечной ригидности и определяется
по укорочению расстояния от шеи до основания хвоста за счет
сгорбленности животного. Ригидность у крыс оценивается по балльной системе:
0 — отсутствие ригидности, 1 — укорочение расстояния от шеи до
основания хвоста менее чем на 3 см, 2 — более чем на 3 см.
-299-

1.4.2. Регистрация двигательной активности
При ПС, вызываемом нейротоксином, наблюдается не только
уменьшение количества движений, но и нарушение их качественной структуры.
Понятие "олигокинезия" включает уменьшение количества и качества
локомоторной активности животных. Животных тестируют в открытом поле,
регистрируя в течение 5 мин число горизонтальных движений,
вертикальных движений (стойки), поисковой активности (заглядывание в
отверстия), груминг. Регистрация двигательной активности возможна в актомет-
рах любого типа — Ugo Basile, Optovanmex и др. Регистрацию
двигательной активности проводят до начала экспериментов и далее через
различные интервалы времени после введения веществ в зависимости от
характера эксперимента. Как правило, олигокинезия наиболее выражена через
90 мин после введения МФТП и сохраняется на протяжении 23 ч.
1.4.3. Регистрация тремора
Тремор оценивают по выраженности в баллах и по продолжительности,
регистрируя время начала и окончания. По локализации и амплитуде
тремор выражают в баллах: 0 — отсутствие, 1 — локальный
мелкоамплитудный тремор головы, передних лап или хвоста, 2 — локальный среднеам-
плитудный тремор, 3 — генерализованный мелко- или среднеамплитудный
тремор всего тела.
1.5. Модель ПС, вызванного 6-гидроксидофамином
6-гидроксидофамин (6-ГОДА) при системном введении не проникает
через ГЭБ. При введении в мозг или спинномозговую жидкость 6-ГОДА
разрушает катехоламинсодержащие нейроны, снижает уровни ДА, норад-
реналина (НА), адреналина и метаболитов. Крысы наиболее подвержены
действию нейротоксина, но описаны проявления его эффектов и у мышей,
и у обезьян. В боковые желудочки вводят 100—250 мкг 6-ГОДА в 10—25
мкл растворителя. При введении в ткань мозга используют раствор 2 мкг/
мкл, вводят не более 4 мкл со скоростью не выше 1 мкл/мин, чтобы
уменьшить зону механического повреждения, в которой наблюдаются
неспецифические изменения нейронов. Селективного действия в отношении
ДА-нейронов можно добиться предварительным введением дезипрамина —
ингибитора высокоаффинного транспорта НА.
/. 6. Потенцирование эффектов апоморфина
Потенцирование эффектов апоморфина (агониста дофаминовых
рецепторов) указывает на способность исследуемого вещества оказывать
стимулирующее влияние на дофаминергическую передачу в нигростриатной
системе головного мозга.
Эксперименты проводятся на белых беспородных крысах. Апоморфин
вводится подкожно в дозах 0,3—1 мг/кг. Исследуемые вещества вводят за
15—30 мин до апоморфина. Оценивается выраженность стереотипных
реакций грызения, лизания, принюхивания. Принята трехбалльная шкала
оценки: 1 балл — отдельные стереотипные движения (например, непосто-
- 300-

янные принюхивания), 2 — интенсивная непродолжительная стереотипия
(в том числе лизание, грызение), 3 — постоянная интенсивная
стереотипия. Учитывается общая продолжительность стереотипного поведения.
Возможно проведение оценки эффектов исследуемого соединения на
феномен "вертикализации" у мышей. Апоморфин вводится подкожно в
дозе 2—5 мг/кг. Животных помещают в цилиндрические камеры с
плексигласовым дном, изготовленные из проволоки толщиной 2 мм при
расстоянии между прутьями 1 см. Регистрируют стереотипное поведение каждые
2 мин в течение 1 ч. Для феномена вертикализации число баллов
соответствует числу лапок на сетке, другие формы стереотипного поведения
оценивают, как описано выше. По окончании эксперимента подсчитывают
суммарный балл стереотипии для каждого животного за все время
наблюдения.
/. 7. Потенцирование эффектов амфетамина
Введение амфетамина в дозах 2,5—5 мг/кг (подкожно) вызывает у крыс
стереотипное поведение. Исследуемые вещества вводят за 15—30 мин до
амфетамина. Интенсивность и выраженность стереотипных движений
оценивают через 15—30 мин после введения амфетамина по методике,
описанной в п. 1.6.
У мышей можно оценить влияние веществ на вызываемое амфетамином
увеличение спонтанной двигательной активности. Животным через 15—30
мин после введения исследуемого вещества вводят подкожно 2,5—10 мг/кг
амфетамина и регистрируют двигательную активность каждые 5 мин в
течение 30 мин индивидуально у каждого животного в актометрах
различного типа.
2. Методы, основанные на активации холинергической системы
Как известно, ацетилхолин (АХ) является медиатором многочисленных
интернейронов хвостатого ядра, и именно в этой структуре наблюдается
наибольшая концентрация АХ. Холинергическая модель ПС
воспроизводится различными способами первичной активацией ХЭ-нейронов
хвостатого ядра (интракаудальное введение АХ спрозерином), системным
введением ареколина или оксотреморина.
2.1. Модель тремора, вызванного оксотреморином
Оксотреморин — активный метаболит треморина, специфический холи-
нергический мускариновый антагонист. Системное введение
оксотреморина вызывает у крыс и мышей гипокинезию, генерализованный тремор и
мышечную ригидность. При оценке тремора у крыс исходный раствор
оксотреморина (в 1 мл — 1 мг) 1 мкл разводится в 20 мл дистиллированной
воды и вводится внутрибрюшинно в количестве 0,2 мл на 100 г массы тела
животного.
Тремор оценивают по выраженности в баллах и по продолжительности,
регистрируя время начала и окончания. По локализации и амплитуде
тремор выражают в баллах: 0 — отсутствие, 1 — локальный
мелкоамплитудный тремор головы передних лап или хвоста, 2 — локальный среднеампли-
- 301 -

тудный тремор, 3 — генерализованный мелко- или среднеамплитудныи
тремор всего тела. Кроме тремора регистрируются проявления ригидности
слюнотечения, пилоэрекции. Исследуемые вещества и эталонные
препараты вводятся за 30 мин до введения оксотреморина. В зависимости от задач
эксперимента возможно введение исследуемых веществ после введения
оксотреморина.
2.2. Модель тремора, вызванного ареколином
Эксперименты проводят на мышах. Ареколин вводят подкожно в дозе
25 мг/кг. Исследуемые вещества и эталонные препараты вводят за 20—
30 мин до введения ареколина. Регистрируют латентный период,
продолжительность и выраженность тремора. По локализации и амплитуде
тремор выражают в баллах: 0 — отсутствие, 1 — локальный
мелкоамплитудный тремор головы, передних лап или хвоста, 2 — локальный
среднеамплитудныи тремор, 3 — генерализованный мелко- или среднеамплитудныи
тремор всего тела.
3. Электроэнцефалографические методы оценки ПС
Эксперименты проводятся на белых беспородных крысах самцах разных
возрастных групп (от 4 до 8 мес массой 220—600 г) с хронически
вживленными электродами.
Операции по хроническому вживлению электродов в мозг крысы
проводят под нембуталовым (40 мг/кг внутримышечно) наркозом. Электроды
изготавливают из нихромовой проволоки в лаковой изоляции диаметром
120 мкм (для корковых) и 70—80 мкм (для подкорковых). Электроды
крепятся на поверхности черепа при помощи висфат цемента и норакрила.
Координаты электродов рассчитывают при помощи стереотаксического
атласа мозга крысы. Электроды вживляют в хвостатые ядра (ХЯ), бледный
шар, сенсомоторную кору. Индифферентный электрод вживляют в
носовую кость черепа.
Регистрацию биоэлектрической активности исследуемых структур мозга
(кора, гиппокамп, гипоталамус, хвостатые ядра, бледный шар, черная
субстанция) осуществляют на 3—5-й день после операции в условиях
свободного передвижения животного путем монополярного отведения с
использованием специальных программ для обработки ЭЭГ или биоусилителя
энцефалографа-электроэнцефалографа. Возможно одновременное
применение компьютерной записи (проводят непрерывную запись в течение 5 ч)
с использованием программ BRAINSYS, Canon и пр. Исследуемые
вещества вводят через 10 мин после начала эксперимента. Контрольным крысам
вводят плацебо. Эффекты оценивают по способности исследуемых
препаратов устранять типичные изменения ЭЭГ на различных моделях ПС.
3.1. ЭЭГ корреляты нарушений при моделировании ПС оксотреморином
После введения оксотреморина наблюдается пачкообразная активность
высокоамплитудных волн с заостренными вершинами. На фоне
максимально выраженных олигокинезии и тремора наблюдается
генерализованная пароксизмальная активность в виде групп синхронизированной мед-
- 302-

ленной активности и групп более быстрых волн с заостренными
вершинами во всех структурах с некоторым преобладанием в бледном шаре.
Исследуемые вещества вводят животным с явлениями ПС и регистрируют
динамику лечебного эффекта.
3.2. ЭЭГ корреляты нарушений при введении МФТП
При моделировании акинетико-ригидной формы ПС введением МФТП
пачкообразная активность не наблюдается, преобладает дизритмичная
активность и пароксизмальные разряды, а также высокоамплитудные
медленные волны преимущественно в ХЯ.
При однократном системном введении нейротоксина МФТП обычно
наблюдается замедление электрической активности, на фоне которой
регистрируются пароксизмальные разряды быстрых и медленных волн а также
сгруппированные волны частотой 9—10 Гц, амплитудой 50—70 мкВ
наиболее выраженные в ХЯ. Изменения ЭЭГ коррелируют с развитием
олигокинезии ригидности и тремора. Исследуемые вещества вводят животным с
явлениями ПС и регистрируют динамику лечебного эффекта.
4. Дополнительные исследования, расширяющие представления
о противопаркинсонической активности препаратов
4.1. Введение ацетилхолина с прозерином в хвостатое ядро крыс
Введение ацетилхолина (АЦХ) с ингибитором холинэстеразы
прозерином в ХЯ моделирует гиперактивацию холинергической системы при ПС.
Раствор, состоящий из 5 мкг АЦХ и 1 мкг прозерина, вводят в хвостатое
ядро крыс. Внутримозговые инъекции осуществляются с помощью
микрошприца Гамильтона, помещенного в микроманипулятор стереотаксическо-
го прибора через специальные канюли, фиксированные на черепе
животного. Фиксацию животных в стереотаксическом приборе вживление
канюль проводят под гексеналовым наркозом (150—180 мг/кг
внутрибрюшинно). Канюли для внутримозговых инъекций устанавливают
через специально подготовленные отверстия в черепе стереотаксические
координаты хвостатого ядра определяют по координатам стереотаксиче-
ского атласа.
Эксперименты проводят через 1—2 сут после операции. Через 3—5 мин
после микроинъекции АЦХ с прозерином начинается тремор —
эквивалент дрожательной формы ПС, затем развиваются ригидность и олигоки-
незия эквивалент акинетико-ригидной формы. Исследуемые вещества
вводят за 30 мин до микроинъекции. Регистрация тремора, олигокинезии и
ригидности осуществляется по методам, описанным выше.
4.2. Модель ПС, вызванного внутримозговым ведением
1-метил-4-фенилпиридиния (МФП+)
Токсический эффект МФТП на нейроны черной субстанции
обусловлен его конечным продуктом окисления МФП+, который обладает
высоким сродством к ДА-нейронам. Введение МФП+ непосредственно в
черную субстанцию (ЧС) вызывает у крыс выраженную дегенерацию ДА-ней-
- 303-

ронов ЧС, снижение стриатного ДА и двигательные нарушения,
характерные для ПС.
Опыты проводятся на белых беспородных крысах-самцах
9—10-месячного возраста. Животным под наркозом по координатам
стереотаксического атласа в компактную зону ЧС билатерально имплантируются
металлические канюли. Через 7—8 дней после операции с помощью микрошприца
Гамильтона в каждое ядро ЧС через канюлю однократно вводят 10 мкг
МФП+ в 2 мкл изотонического раствора натрия хлорида. Животным
контрольной группы вводят соответствующую концентрацию йодистого
натрия в 2 мкл изотонического раствора натрия хлорида, так как 1-метил-4-
фенилпиридин используется в виде йодита. Исследуемые вещества вводят
на фоне развернутой картины ПС. Эффекты веществ оценивают по
степени изменения олигокинезии ригидности и тремора по методам,
описанным выше. Следует отметить, что ПС регистрируется до 5—7-х суток. При
проведении длительного эксперимента надо учитывать, что введение
МФП+ вызывает у животных адипсию и афагию, и поэтому следует
применять искусственное вскармливание.
4.3. Модель ПС, создаваемого введением каиновой кислоты в ХЯ мозга
Каиновая кислота — аналог глутаминовой кислоты — вызывает блокаду
ГАМКергических нейронов, что приводит к растормаживанию холинерги-
ческих нейронов. Опыты проводятся на крысах. Животным под гексенало-
вым наркозом (100 мкг/кг) билатерально имплантируют металлические
канюли (Д 0,22 мм) в ростральные отделы ХЯ по координатам атласа.
Одновременно вживляют регистрирующие монополярные электроды в ХЯ и
сенсомоторную кору головного мозга. Через 5—7 дней после операции с
помощью микроинъектора вводят 5 мкл раствора каиновой кислоты (0,1 —
0,15 мкг) в каждое ядро. Животным контрольной группы вводят такой же
объем буферного раствора. Исследуемые вещества вводят за 30 мин до
микроинъекции.
Проявления ПС — ригидность, гипокинезия — развиваются быстро и
сохраняются до 5—7 дней после однократной инъекции. Воспроизводится
симптомокомплекс характерный для акинетико-ригидной формы ПС.
Эффекты веществ оценивают по степени изменения олигокинезии,
ригидности и тремора по методам, описанным выше. На ЭЭГ начиная с первых
минут после введения каиновой кислоты отмечается появление спайковых
потенциалов в коре и возрастание амплитуды разрядов в ХЯ головного
мозга. Периоды высокоамплитудной активности в ХЯ сменяются спайко-
выми потенциалами. Изменения ЭЭГ наблюдаются до 7 дней после
введения каиновой кислоты.
4.4. Моделирование паркинсонического синдрома интракаудатным
введением антител к дофамину
Антитела к ДА получают иммунизацией кроликов по стандартной схеме
конъюгантом ДА-белок. Гамма-глобулин из сывороток контрольных и
опытных животных очищают от антител к белку-носителю методом
иммунной хроматографии. Животным под гексеналовым наркозом по
координатам стереотаксического атласа в ростральные отделы ХЯ билатерально
имплантируют регистрирующие нихромовые электроды. Через 5—6 дней
- 304-

после операции в каждое ХЯ вводят иммуноглобулины, содержащие
антитела к ДА, по 200 мкг белка в объеме 5 мкл со скоростью 1 мкл/мин. Внут-
римозговые введения проводят с помощью микроинъектора в область,
расположенную на расстоянии 1 мм от регистрирующего электрода.
Регистрацию электрической активности проводят до и после введения антител на
протяжении 5—7 ч и в течение 1—2 последующих суток. Исследуемые
вещества вводят на фоне развернутой картины ПС.
Введение антител к ДА приводит к выраженному снижению
двигательной активности, появлению периодов "застывания", периодической
акинезии, совпадающих с периодами высокоамплитудной ЭЭГ-активности в ХЯ.
Через 20—25 мин после введения антител к ДА у большинства животных
развивается приступообразный мелко- и среднеамплитудный тремор
головы, который может сохраняться до 24 ч. Возникновение тремора
коррелирует с появлением средне- и высокоамплитудной пароксизмальной
активности в ХЯ. Редукция олигокинезии, ригидности и тремора
сопровождается нормализацией электрической активности в ХЯ.
4.5. Повреждение токами высокой частоты нигростриатного проводящего
пути в вентромедиальных отделах покрышки ствола мозга у приматов
На этой модели впервые получены прямые доказательства связи
повреждения компактной части черной субстанции вследствие ретроградной
дегенерации ее нейронов и снижения содержания ДА в ипсилатеральном
стриатуме. Разрушение у обезьян токами высокой частоты вентромедиаль-
ной сегментальной области на границе ростральных отделов моста со
средним мозгом приводит к повреждению черной субстанции и снижению
содержания ДА в ХЯ на стороне операции. При этом на стороне, ипсилате-
ральной повреждению, развиваются гипокинезия, ригидность и тремор
конечностей.
4.6. Моделирование паркинсонического синдрома нейротоксином МФТП
у приматов
Приматы являются наиболее чувствительными к нейродегенеративно-
му эффекту МФТП. Введение МФТП проводят внутривенно, как
правило, в условиях кетаминовой анестезии. Стабильный ПС развивается при
повторных введениях, причем величина и кратность доз подвержены
значительным индивидуальным колебаниям (от 0,75 мг/кг однократно до
2 мг/кг 20 инъекций). У животных развиваются выраженная
гипокинезия, тремор конечностей при произвольных движениях, ригидность при
пассивных движениях. Симптомы сохраняются на протяжении
нескольких месяцев после последнего введения МФТП, выздоровления не
наступает.
Другим методом создания ПС является введение МФТП в сонные
артерии (0,5 мг/кг в 40 мл гепаринизированного изотонического раствора
натрия в течение 20 мин). В этом случае гипокинезия и тремор развиваются
на стороне контралатеральной инфузии и затрагивают преимущественно
верхнюю конечность. У некоторых животных наблюдается ипсилатераль-
ное вращение. Симптомы гемипаркинсонизма сохраняются несколько
месяцев. Эффекты исследуемых препаратов оценивают на фоне развернутой
картины ПС.
- 305-

4.7. Экспериментальный ПС, вызванный введением столбнячного токсина
в ХЯ крыс
Введение столбнячного токсина приводит к локальному нарушению
тормозных механизмов в ростральной части обоих ХЯ и к развитию у
животных ряда невропатологических синдромов, в том числе ПС, который
наблюдается на поздних стадиях патологического процесса.
Микроинъекции столбнячного токсина проводят по координатам сте-
реотаксического атласа в оба ХЯ крыс. Фоновую активность нейронов ХЯ
исследуют у наркотизированных животных. Анализ распределения
нейронов по частоте импульсной активности показывает, что у животных с ПС в
исследуемой области увеличивается число нейронов с более высокой
частотой генерации потенциалов. Эффекты исследуемых препаратов
оценивают на фоне развившихся проявлений ПС.
5. Сопутствующие нейропсихотропные эффекты, побочное действие
и острая токсичность
В дополнение к данным об основной противопаркинсонической
активности следует представить данные о других эффектах препарата и острой
токсичности. Учитывая спектр фармакологической активности известных
препаратов, близких по структуре исследуемому, определяют наличие или
отсутствие седативного или активирующего эффектов, влияние на
обучение и память, агрессивность и другие возможные эффекты.
Для оценки седативного или активирующего действия регистрируют
поведение в открытом поле и в актометрах любого типа, используют тест за-
лезания на сетку; изучение влияния на обучение и память можно провести
в тестах пассивного и активного избегания: для изучения миорелаксантно-
го действия используются тесты вращающегося стержня, рефлекса
подтягивания на перекладине, тест бокового положения; для оценки
агрессивности можно использовать провоцирующий "драку" электрический ток.
Исследование дополнительных эффектов проводят в широком диапазоне
доз.
Острая токсичность изучается на двух видах животных, на которых
изучалась основная активность, при тех же путях введения. Рассчитывается
ЛД50-
б. Изучение эффектов препарата при длительном введении и отмене
Учитывая, что лечение больных паркинсонизмом проводится
длительными курсами, а также имеющиеся данные о снижении эффективности
большинства известных противопаркинсонических препаратов при
длительном применении, следует проводить оценку эффективности
исследуемого вещества на нескольких базисных тестах при курсовом введении (не
менее 1 мес).
С целью оценки возможного синдрома отмены следует провести оценку
основных показателей поведения и рефлексов животных после отмены
длительного введения препарата (через 36—72 ч). Поскольку существует
возможность усиления симптомов ПС на фоне резкой отмены препарата,
целесообразно оценить реакцию животных по основным проявлениям ПС
на основных моделях.
- 306-

7. Исследование механизма действия препарата
Представляются данные по изучению механизма действия, имеющиеся
на данный момент. Рекомендуются радиолигандные исследования,
изучение сдвигов нейромедиаторного баланса, особенно ДА, АЦХ, серотонина.
8. Изучение взаимодействия с другими препаратами
В связи с преобладанием заболеваемости паркинсонизмом среди людей
пожилого возраста, имеющих, как правило, ряд сопутствующих
заболеваний и принимающих другие препараты, рекомендуется оценить
взаимодействие нового препарата с транквилизаторами, снотворными, а также с
этанолом и, желательно, сердечно-сосудистыми препаратами.
9. Изучение общей фармакологической активности, влияния
на сердечно-сосудистую систему, дыхание
Наблюдение за состоянием животных осуществляют на мышах и крысах
при введении препарата в широком диапазоне доз. При этом определяются
повышение или снижение возбудимости, наличие судорог, гиперкинезов,
изменение цвета кожных покровов, взъерошивание шерсти, птоз,
стереотипия, груминг. Изучается пиннеальный, болевой, роговичный рефлексы,
влияние на температуру тела, потребление воды и пищи. Влияние на
сердечно-сосудистую систему, дыхание и на периферические отделы нервной
системы изучается на интактных или наркотизированных кошках,
кроликах или крысах по влиянию на уровень кровяного давления, ритм
сердечной деятельности, дыхания, а также на реакции, вызванные введением
нейромедиаторов, например адреналина, норадреналина, ацетилхолина,
серотонина.
Заключение
В заключении кратко суммируются полученные данные о спектре про-
тивопаркинсонической активности, анализируются дополнительные и
побочные эффекты, представляются сведения о преимуществах нового
препарата перед известными средствами сходной направленности действия.

С связи с разнообразием форм условно-рефлекторного обучения и
моделей изучения памяти методика каждого используемого теста должна
быть описана подробно в соответствующем разделе.
1.1. Влияние на обучаемость в методике условного рефлекса пассивного
избегания (УРПИ)
Базисной моделью для оценки влияния веществ на формирование и
воспроизведение памятного следа в норме и в условиях его нарушения
(амнезия) является методика условного рефлекса пассивного избегания
(УРПИ). Основными преимуществами этой методики являются быстрота
выработки рефлекса (обучение с одной пробы) и возможность
дифференцирование воздействовать на различные фазы памяти.
Существует несколько вариантов методики условных рефлексов
пассивного избегания, вырабатываемых в одном сочетании. Наиболее часто
используемая форма УРПИ — обучение животных (крыса, мышь) в
установке, состоящей из двух отсеков, затемненного и освещенного, соединенных
дверцей. Помещенное в освещенный отсек (хвостом к дверце) животное
довольно быстро переходит через дверь в затемненный отсек (норковый
рефлекс) и затем (в различных модификациях метода либо сразу после
входа, либо через определенный период пребывания в темном отсеке)
получает там электрокожное раздражение через электродный пол.
Параметры этого болевого раздражения — сила, длительность, характер могут
варьировать, но они должны быть достаточными, чтобы обучить животное
УРПИ. Электроболевое раздражение наносится либо в течение
определенного времени, для чего дверца закрывается заслонкой, либо до тех пор,
пока животное не возвратится в освещенный отсек через оставшуюся
открытой дверцу. В том и другом случае животное должно обучиться не заходить
в темную камеру, где оно получило болевое раздражение, и пассивно
избегать неприятную ситуацию, находясь в светлом отсеке.
Могут быть использованы и другие варианты установок для обучения
УРПИ. Животное помещают на освещенную, находящуюся на высоте
платформу, в силу свойственного грызунам норкового рефлекса оно
переходит в соединенную с платформой темную камеру, где получает
обучающее электроболевое раздражение через электродный пол; о степени
обучения судят по латентному времени первого захода в темную камеру и
длительности нахождения на платформе при повторном помещении туда
животного. Еще одним вариантом является методика, в которой безопасная
платформа находится в середине электрифицированного пола, при
переходе на этот пол животное получает болевое раздражение и, чтобы избежать
его, должно оставаться на безопасной площадке. Во всех описанных выше
модификациях методики УРПИ параметры электроболевого раздражения,
наносимого через электродный пол, составляют 0,3—0,6 мА.
Проверка сохранения УРПИ (воспроизведение рефлекса) состоит в
повторном помещении животного в освещенный отсек, висячую
платформу и т. д. через различные интервалы времени (6, или 8, или 24, или
48, или 72 ч, или 7 сут и т. д.). Наиболее часто используется интервал
24 ч. Для оценки степени обучения через эти интервалы регистрируется
латентное время первого захода в темный отсек камеры, где ранее с
использованием болевого раздражения проводилось обучение, и времени,
проведенного в светлом и темном отсеках за фиксированный интервал
(2, 3, 5 мин).
- 309-

1.2. Влияние на различные фазы памяти в методике УРПИ
Для исследования влияния веществ на фазы памяти используется
методика УРПИ, описанная выше. Вещество в этом случае вводится в
различные стадии формирования памятного следа. Для получения данных о
влиянии вещества на процесс ввода и первоначальной обработки
информации вещество вводится непосредственно перед процедурой обучения, а
проверка обученного осуществляется, например, через 24 ч. Для получения
данных о влиянии вещества на процесс консолидации вещество вводится
непосредственно после процедуры обучения, а проверка также
осуществляется через 24 ч. Для получения данных о влиянии вещества на процесс
воспроизведения информации вещество вводится перед воспроизведением
рефлекса (через 24 ч после обучения). Регистрируется во всех случаях при
воспроизведении УРПИ: латентное время первого захода в опасный,
темный отсек и общее время нахождения в светлом и темном отсеках за
определенный интервал времени. С целью оценки влияния предполагаемого
НП на процессы забывания тестирование сохранения памятного следа
осуществляется спустя отдаленные интервалы (2—8 нед).
1.3. Амнезия УРПИ, вызванная электрошоком
Амнезию условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) можно
вызвать многими способами, но наиболее принятыми и широко
применяемыми являются амнезии, вызванные максимальным электросудорожным
шоком (припадком) и введением скополамина. Электросудорожный шок
(ЭШ) наносится через электроды, наложенные на роговицу глаз (15—20
мА, 200—500 мс) или на поверхность ушных раковин (10—100 мА, 200—
500 мс) мышей или крыс непосредственно после выработки условной
реакции пассивного избегания. Воспроизведение рефлекса осуществляют
через различные интервалы времени, наиболее часто через 24 или 48 ч.
Регистрируется латентное время первого захода животного в темный опасный
отсек и общее время пребывания животного в темном и светлом отсеках за
определенный период времени (2—3 мин). ЭШ вызывает амнезию УРПИ,
которая выражается в уменьшении латентного времени захода в темный
опасный отсек и в увеличении времени пребывания в темном отсеке.
Для оценки антиамнестического действия веществ их следует вводить, в
зависимости от цели исследования, или до обучения, что делается
наиболее часто, или непосредственно перед действием ЭШ, или перед
воспроизведением УРПИ. Ноотропный эффект во всех случаях выражается в
устранении амнезирующего действия ЭШ, что характеризуется увеличением
латентного времени захода в темную камеру и уменьшением времени
нахождения в ней при воспроизведении рефлекса.
1.4. Амнезия, вызванная скополамином
Амнезию условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) вызывают
введением скополамина (0,5—1,5 мг/кг внутрибрюшинно) мышам или
крысам за 30 мин до обучения УРПИ или непосредственно после
обучения. Воспроизведение УРПИ осуществляют через различные интервалы
времени, наиболее часто через 24 ч. Регистрируются такие же показатели,
как при амнезии, вызванной ЭШ. Исследуемые вещества вводят или до
- 310 -

обучения УРПИ и введения скополамина, или после проведения обучения,
или перед воспроизведением рефлекса через 24 ч.
Ноотропный эффект во всех случаях выражается в устранении скопола-
миновой амнезии, что характеризуется увеличением латентного времени
захода в опасный отсек камеры и уменьшением времени пребывания в нем
при воспроизведении УРПИ.
1.5. Влияние на обучаемость в методике условного рефлекса активного
избегания
Изучение влияния веществ на процесс обучения предпочтительно
проводить, используя методику двустороннего избегания болевого
раздражения через электродный пол в челночной камере типа Shuttle-box у мышей
и крыс. Использование модели активного избегания позволяет проводить
обучение при многократных повторениях и оценить динамику выработки
условного рефлекса. Установка состоит из двух отделений, разделенных
перегородкой, в которой имеется дверца. Оба отделения имеют отдельно
электрифицированный пол. Условным раздражителем является свет, звук,
которые предъявляются за 6—10 с до безусловного раздражителя, которым
является электроболевое раздражение(50—100 Гц, 20—30 В, 10 мс),
подаваемое через электродный пол поочередно то в одном, то в другом
отделении. Чтобы не получить болевого раздражения, животное должно
обучиться перебегать в другой отсек камеры во время действия условного сигнала
(условный рефлекс). Перебегание в другой отсек в ответ на действие
болевого раздражителя является безусловным рефлексом (реакция избавления).
Схема выработки условного рефлекса активного избегания состоит в
следующем. Животное получает ежедневный сеанс обучения, состоящий из
стандартного числа сочетаний условного и безусловного раздражителей
(например 10, 20, 30); регистрируется число условных и безусловных
ответов. Обучение продолжается или до полной выработки условного рефлекса
активного избегания, когда при предъявлении условного сигнала животное
выполняет рефлекс избегания в 100 % и не получает болевых раздражений,
или же до определенного, выбранного экспериментатором критерия. Во
всех случаях ежедневно регистрируется количество условных реакций
избегания и реакций избавления за сеанс обучения и время (в секундах)
выполнения этих рефлексов, а также общая продолжительность обучения до
выбранного критерия. Испытуемые вещества вводят перед сеансом
обучения или непосредственно после сеанса обучения. Контрольной группе
вводят изотонический раствор натрия хлорида или дистиллированную воду.
Ноотропные препараты ускоряют выработку условного рефлекса
активного избегания, хотя их эффект в этом тесте является обычно менее четким,
чем в тесте УРПИ, и проявляется в основном на начальных фазах
выработки или в специальных условиях "функционального сбоя".
/. 6. Влияние на обучаемость в методике условного рефлекса
с положительным подкреплением
Условный пищевой или питьевой рефлекс вырабатывается у животных,
как правило, в однодорожечной камере, У- или Т- образном лабиринте.
Крыс с литьевой (пищевой) депривацией в течение 48 ч помещают в
стартовый отсек У- или Т-образного лабиринта, в одном из рукавов которого
-311 -

помещена кормушка с водой (пищей). Через 30—60 с после посадки
открывают дверцу стартового отсека. Световой звуковой сигнал или щелчок
открывания дверки служит условным раздражителем. Регистрируется
время побежки животного от стартового отсека до кормушки, число
правильных и неправильных ответов (заходы в пустой рукав). Рассчитывается
среднее для группы время выработки рефлекса до определенного
критерия, процент животных с выработанным рефлексом за определенное
количество сочетаний, число сочетаний, требуемое для выработки рефлекса до
критерия. В качестве критерия выработки рефлекса выбирается обычно 7
или 8 правильных пробежек из 10 предъявляемых. При выработке
пищевого рефлекса существенным представляется выбор пищевого подкрепления
и условия содержания животных. В качестве подкрепления применяют
кусочки хлеба или сыра массой 0,15—0,20 г, зерна подсолнечника. В
условиях предшествующей выработке рефлекса пищевой депривации (48 ч)
животные имеют свободный доступ к воде. Кормление животных вне
эксперимента должно осуществляться в одно и то же время суток, обычно после
окончания экспериментов. Пища должна быть стандартной и калорийной.
За время опыта по выработке рефлекса падение массы животного не
должно превышать 20 % от исходного уровня. НП обычно ускоряют выработку
рефлекса с позитивным подкреплением. Исключение составляют те
случаи, когда предполагаемый НП обладает также анорексигенным
действием.
/. 7. Активность в тесте неассоциативного обучения
Перечисленные методы относятся к категории ассоциативного
обучения, поскольку они базируются на оценке животным некоего ключевого
(болевого или пищевого подкрепления) фактора, как обязательно
ассоциирующегося с определенным условно-рефлекторным или обстановочным
(контекстуальным) фактором. Наряду с этим существует неассоциативное
обучение, одной из разновидностью которого является угашение, или
"негативное обучение", обязанное своим названием тому, что оно сводится не
к приобретению нового опыта, а к ослаблению существовавшей реакции.
Одной из наиболее простых и воспроизводимых форм "негативного
обучения" является угашение двигательной активности как следствие
ослабления исследовательско-ориентировочной реакции в результате оценки
животным окружающей обстановки как не имеющей биологического
значения. Важным отличием этой формы поведения от ассоциативного
обучения с отрицательным подкреплением является полное отсутствие фактора
инвазивности.
Влияние НП на угашение исследовательско-ориентировочной реакции
может исследоваться в экспериментах различных типов, из которых
наиболее приемлемыми для повседневной фармакологической практики
являются два.
1. Согласно методу, описанному Platel и соавт. (1984), одиночное
животное (мышь или крыса) помещается в открытое поле, в котором
регистрация двигательной активности осуществляется в течение 5 мин.
Повторное помещение животного в эту же ситуацию осуществляется в интервале
от 2 до 7 дней (в зависимости от задачи исследования). Предполагаемый
НП вводится после первой экспозиции, таким образом оценивается
эффект вещества на забывание.
2. В отличие от этих экспериментов, в которых для оценки угашения
- 312 -

используется повторная регистрация двигательной активности, в методике
угашения, разработанной в Институте фармакологии РАМН, применяется
однократная, но более длительная регистрация — в течение 30 мин —
срока, достаточного для развития угашения в одном сеансе, определяемого
поэтому как "острое угашение". Регистрация активности осуществляется с
помощью многоканального анализатора двигательной активности типа
Optovarimex или его аналога. Исследования проводятся на группе (обычно
из 10 мышей), что позволяет уменьшить влияние индивидуальных
различий в исходной двигательной активности и реакции на исследуемый НП.
Другим важным достоинством фупповой регистрации является то, что в
этом случае оценивается ослабление обследования не только окружающей
обстановки, но и "партнеров" по группе. Любой НП, независимо от его
химической структуры, будучи введен до регистрации двигательной
активности, достоверно ускоряет развитие ее острого угашения. Очевидно, что
метод острого угашения исследовательской реакции пригоден только для
оценки "чистых" НП, не вызывающих ни стимуляции, ни угнетения
исходной двигательной активности.
1.8. Транскаллозальный вызванный потенциал
Транскаллозальный вызванный потенциал (ТВП) является одним из
основных тестов, позволяющем оценить скорость передачи информации
между полушариями мозга. Способность облегчать межполушарную передачу
является одним из общих свойств всех ноотропных веществ. Исследования
проводят на кошках, кроликах или крысах. Животным под анестезией
вживляют раздражающий биполярный электрод в прецентральную область
коры одного из полушарий мозга, а регистрирующий электрод помещают в
симметричной точке противоположного полушария мозга.
Индифферентный игольчатый электрод вкалывают в затылочную рубцовую ткань головы
животного. Эксперименты проводят через 5—6 дней после операции на
ненаркотизированных и не обездвиженных миорелаксантами животных,
мягко фиксированных в специальном станке. ТВП получают с помощью
электрической стимуляции 20—40 В, с длительностью импульса 0,2—1 мс.
Сначала определяют порог вызванного потенциала и затем исследуют
действие вещества при силе раздражения, равной полуторапороговой
величине стимула. ТВП, усредненный по 20 реализациям, регистрируют на
протяжении 500 мс после подачи стимула.
Осуществляется покомпонентный анализ ТВП, оцениваются латентные
периоды, амплитуда и форма первичного позитивного (Р1), первичного
негативного (N1) и вторичного позитивного (Р2) компонентов вызванного
потенциала и их изменение на фоне введения веществ. Регистрацию и
обработку данных желательно осуществлять с помощью
специализированного нейрокомпьютерного анализатора.
1.9. Изучение противогипоксических свойств
Противогипоксическими свойствами обладают многие ноотропные
препараты. Однако следует учитывать, что ими обладают и другие вещества, в
том числе препараты, обладающие способностью ухудшать мнестические
функции, например бензодиазепиновые транквилизаторы. С другой
стороны, не все НП обладают антигипоксическим эффектом, который, таким
- 313-

образом, может рассматриваться как полезное дополнение к чисто ноо-
тропным, т. е. когнитивным эффектам.
Для изучения противогипоксических свойств рекомендуется
использовать не менее 2 моделей гипоксии различного генеза. Во всех случаях
следует регистрировать время выживания (резервное время) животных в
условиях гипоксии и количество выживших и погибших животных в
процентах. Испытуемое вещество вводят до начала эксперимента с учетом пика
его действия.
Гипобарическая гипоксия создается в проточно-вытяжной барокамере с
поглотителем СО"2. Животных (мышей, крыс) "поднимают на высоту" 11 км
(198,7—185 мм рт. ст.) со скоростью 25—50 м/с. Нормобарическая гипоксия
с гилеркапнией ("баночная" гипоксия) является наиболее простым методом
оценки противогипоксической активности. Животных одинаковой массы
(разброс не более 2 г на группу) помещают по одному в герметически
закрываемые банки объемом 200 см3 (для мышей). Гемическая гипоксия
воспроизводится путем однократного введения мышам нитрита натрия в дозе 150—
250 мг/кг подкожно.
Кроме того, противогипоксическое действие можно оценить в условиях
циркуляторной гипоксии, гистотоксической гипоксии и др. Более
подробное описание методов изучения противогипоксической активности
представлено в Методических рекомендациях по экспериментальному
изучению противогипоксических препаратов.
/. 10. Влияние на физическую работоспособность
Эксперименты на бегущей дорожке (тредмил) или на вращающемся
("беличьем") колесе проводятся на крысах. Учитывается максимальная
длительность бега до отказа.
Используется также такая модель, как плавание с дополнительной
нагрузкой, составляющей, в зависимости от задачи, от 6 до 10 % от
собственного веса животного. Эксперименты проводятся на мышах и крысах.
Плавание осуществляется в бассейне с предварительно отстоянной (для
уменьшения содержания растворенного газа) водой при температуре воды 24—
26 °С. Груз фиксируется на туловище или прикрепляется к хвосту.
Учитывается длительность плавания до появления первых признаков утомления
и сроки гибели животных Наряду с этим можно регистрировать динамику
изменения ЭКГ и интервалограмму R—R, а также исследовать
метаболические показатели мышечного утомления, содержание лактата, пирувата и их
соотношение, уровень аммиака и креатинина.
Потенциальный НП должен быть изучен также как минимум на одной
из моделей патологических состояний, являющихся объектом
клинического применения этой группы препаратов.
2. Методы моделирования патологии ЦНС
2.1. Мнестические нарушения при перинталъных повреждениях
Перинатальная патология моделируется в нескольких вариантах,
соответствующих определенным видам патологических воздействий, которым
может подвергаться плод или новорожденный.
В связи с высокой социальной и медицинской значимостью родитель-
- 314-

ского алкоголизма и наркомании как наиболее распространенного
патогенетического фактора задержки умственного развития и других видов
патологии высшей нервной деятельности у детей, при оценке потенциальных
НП целесообразно использовать модели этих видов патологии.
Моделируется ряд форм перинатальной алкоголизации в течение
беременности, либо в период кормления потомства, либо в оба эти периода;
специально исследуется также влияние алкоголизации самцов до зачатия.
Эксперименты во всех случаях проводятся на крысах. Наиболее часто
применяемой при оценке эффекта НП является пренатальная алкоголизация.
Пренатальная алкоголизация. Пренатальная алкоголизация самок
осуществляется с первого дня беременности (определяемого по моменту
появления сперматозоидов во влагалищном мазке) путем введения через
желудочный зонд 25 % этанола в дозе 4000 мг/кг в течение всей беременности
(21 день).
Лечение потомства предполагаемым НП (или изотоническим раствором
натрия хлорида — для группы активного контроля) на модели пренаталь-
ной алкоголизации и при всех описываемых далее видах перинатальной
патологии, за исключением модели постнатального влияния ингибитора
белкового синтеза и модели хронической внутриутробной гемической
гипоксии, осуществляется в интервале между 8-м и 20-м днем беременности
(критический период для синтеза ДНК, РНК; глутамата, ГАМК), препарат
вводится подкожно в дозах, аналогичных таковым для взрослых животных.
Пренатальная морфинизация осуществляется введением в морфина в
дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно 2 раза в день. Пренатальное воздействие
бензодиазепинов и барбитуратов моделируется введением феназепама
(10 мг/кг внутрь) и фенобарбитала (30 мг/кг внутрь) соответственно.
Постнатальное угнетение белкового синтеза моделирует ситуацию,
имеющую место при воздействии антибиотиков, например левомитицина,
применяемого для лечения новорожденного или кормящей матери.
Ингибитор белкового синтеза циклогексемид вводится крысенку в период
между 7-м и 14-м днями ее жизни в дозе 0,6 мг/ кг (подкожно). Такое
воздействие на мозг новорожденного в критический период его раннего
постнатального развития вызывает отдаленные нарушения когнитивных
функций; введение ноотропов, проводимое в интервале между 8-м и 14-м
днями раннего постнатального периода, ослабляет выраженность этих
нарушений.
Перинатальная гипоксия. Распространенной причиной перинатального
повреждения потомства является гипоксия. Значимость этой модели
определяется тем обстоятельством, что кислородная недостаточность возникает
при широком спектре состояний во время беременности, родов и в пост-
натальном периоде. Наиболее часто используемой формой модельной
патологии является пренатальная гипобарическая дыхательная гипоксия и
внутриутробная гемическая гипоксия
Пренатальная гипобарическая гипоксия моделируется "подъемом"
крысы на 15-й день беременности в барокамере. Разрежение, соответствующее
высоте 5000 м, достигается со скоростью 500 м/мин, после чего эта
степень разреженности воздуха сохраняется 15 мин. Затем с той же скоростью
осуществляется "подъем" до высоты 8500 м. При этом разрежении крысу
выдерживают 120 мин, после чего осуществляют "спуск" со скоростью
3000 м/мин. Введение предполагаемого НГП, как и в случае
перинатальной алкоголизации, осуществляется между 8-м и 20-м днем постнатальной
жизни.
Хроническая внутриутробная гемическая гипоксия. Нитрит натрия в
- 315 -

дозе 40 мг/кг (внутрибрюшинно) вводится крысе в период между 10-м и
19-м днями беременности. Предполагаемый корректор вводится перораль-
но с 12-го по 19-й день беременности.
Независимо от характера повреждающего воздействия, оценка
состояния потомства производится по одной и той же схеме и включает
следующие параметры. В 2—3-недельном возрасте регистрируются показатели
физического развития крысят, становления простых сенсомоторных
реакций. В 1-месячном возрасте изучают поведение крысят в открытом поле,
исследовательскую реакцию и ее угашение в приборе OPTOVARIMEX, в
2-месячном — адаптивную реакцию избавления из погруженного в воду
цилиндра. У части животных в этом возрасте оценивали состояние рабочей
памяти по параметрам оптимальности исследовательского поведения в
крестообразном лабиринте; в 3-месячном возрасте исследовали
обучаемость и память в тесте УРПИ или УРАИ. У части животных в этом
возрасте оценивали способность к выработке условного рефлекса с позитивным
подкреплением, используя Т-образный лабиринт с пищевым
подкреплением. Поскольку, наряду с когнитивными нарушениями, у потомства,
подвергшегося перинатальным повреждающим воздействиям, могут возникать
изменения в состоянии эмоционального контроля, целесообразно
исследовать эмоциональный статус этих животных, а также протестировать их на
моделях приподнятого крестообразного лабиринта и конфликтного
поведения.
2.2.А. Изучение памяти при естественном старении
Память старых индивидуумов характеризуется ухудшением процессов
запоминания и сохранения информации на текущие события и извлечения
памятного следа, а также ускорением забывания новой информации.
Экспериментальные исследования по выявлению мнестических дефицитов
целесообразно проводить на мышах в возрасте 14—19 мес (иногда нарушения
возникают в возрасте 8 мес) и на крысах 16—22—24-месячного возраста
(иногда нарушения выявляются в возрасте 12 мес). Для выявления
нарушения обучения и памяти у старых животных предпочтительнее
использовать методики рефлексов пассивного избегания, описанные выше, и тесты,
выявляющие неврологические дефициты. Исследуемые вещества
необходимо вводить хронически (курсовое введение не менее 2 нед).
2.2.Б. Нарушение памяти в прогериатрических моделях
В прогериатрических моделях используют взрослых животных, у
которых путем определенных воздействий (длительное введение алкоголя или
холестерина, диета без витамина Е, облучение рентгеновскими лучами
и др.) моделируется ситуация ускоренного старения мозга.
Наиболее удобными являются модели нарушения памяти после
потребления животными (крысы, мыши) с пищи, содержащей 2 % холестерина в
течение 2—3 мес, а также после длительной алкоголизации. Этанол вводят
половозрелым мышам с 3-месячного возраста в течение 20—36 нед с
питьевой водой (в виде 15 % раствора). Среднесуточное потребление этанола
одной мышью составляет 0,58—0,63 мл/сут в пересчете на абсолютный
спирт.
Нарушения памяти выявляются в моделях пассивного и активного из-
- 316 -

бегания и в тестах оценки неврологического дефицита. Следует
использовать курсовое применение исследуемого вещества (не менее 2—4 нед).
Учитывая тот факт, что важным патогенетическим фактором болезни
Альцгеймера является дефицит холинергической синаптической передачи,
в качестве одного из методов моделирования когнитивной патологии,
имеющей место при этом заболевании, применяется хроническое введение
скополамина. Скополамин вводится крысам в дозе 1 мг/кг, внутрибрю-
шинно, в течение 20 дней. Последующие 10 дней крысам вводится либо
0,9 % раствор хлористого натрия (активный контроль), либо
предполагаемый НП, последнее введение осуществлялось за 24 ч до сеанса обучения
УРПИ. Тестирование сохранения памятного следа проводилось через 24 ч
и через 30 сут после обучения. Животным, составляющим группу
пассивного контроля, изотонический раствор натрия хлорида вводится в течение
всего эксперимента.
2.3. Когнитивные нарушения, вызванные фронтальной лобэктомией
Лобэктомия моделирует ситуацию поражения мозговой ткани,
вызванного массивной травмой, гематомой, опухолевым процессом.
Использование именно фронтальной лобэктомии для выявления потенциальных ноо-
тропов обусловлено представлениями о ее ключевой роли в осуществлении
когнитивных функций. Крысы подвергаются тренировке по программе
активного либо пассивного избегания (одна из этих двух форм обучения для
каждого эксперимента). После тестирования сохранения памятного следа
осуществляемого через 7 дней при обучении активному избеганию либо
через 24 ч при обучении пассивному избеганию, крысе под пентобарбита-
ловым наркозом производится краниотомия, вскрытие твердой мозговой
оболочки и удаление (с помощью миниатюрного скальпеля) 50 % объема
префронтальной коры. В течение 9 дней, следующих за операцией,
осуществляется терапия предполагаемым ноотропом (либо изотоническим
раствором натрия хлорида — для контрольной группы), после чего
определяется в соответствующем тесте степень сохранения памятного следа.
2.4. Нарушения когнитивных функций, вызванные различного рода
ишемическими воздействиями
Экспериментальные модели клинических форм ишемии делятся на две
группы фокальной и глобальной ишемии.
А. Из моделей фокальной ишемии наиболее часто применяемой
является окклюзия средней церебральной артерии По характеру вызывающего ее
воздействия эта форма ишемии, в свою очередь, делится на две группы —
перманентной и обратимой. Перманентная ишемия достигается путем
перевязки, прижигания, введения эндотелина I. Обратимая ишемия
достигается наложением на то или иное время сосудистого зажима, или лигатуры.
Трепанация кости и препарирование сосуда производится под нембутало-
вым наркозом.
Относительно неинвазивной формой фокальной ишемии является фо-
тоиндуцированный тромбоз. Эксперименты проводятся на крысах, под
хлоралгидратной анестезией. Метод состоит во введении в подключичную
вену фоточувствительной краски бенгальского розового (40 мг/кг) и
облучении светом ксеноновой лампы (250 Вт), фокусируемым с помощью во-
- 317 -

локонного световода на интактной кости в области избранного отдела
мозга, например префронтальной коры. Взаимодействие циркулирующей в
крови краски со светом ведет к активации свободнорадикальных
процессов с последующей аггрегацией тромбоцитов и образованием ишемическо-
го инсульта.
Наиболее часто применяемый при перечисленных формах ишемии
протокол эксперимента предусматривает обучение животного рефлексу
пассивного избегания, а возможно и регистрацию его поведения в открытом
поле или в анализаторе Optovarimex, последующее ишемизирующее
воздействие, послеоперационное введение предполагаемого НП (однократно
или повторно — в течение срока, определяемого особенностями действия
изучаемого вещества), изучение сохранности памятного
условно-рефлекторного следа и повторная регистрация двигательной активности для
оценки степени угашения (неассоциативное обучение). Возможно также
использование протокола с профилактическим введением изучаемого НП.
Б. Из моделей глобальной ишемии наиболее часто используемыми
являются двух- или четырехсосудистая перевязка артерий у песчанок, мышей
линии ddY или крыс. В случае использования модели двухсосудистой
перевязки на крысах ее обычно комбинируют с гипотензивным
воздействием. Состояние глобальной ишемии развивается в условиях клинической
смерти. Одна из моделей клинической смерти у крыс состоит в
прекращении кровообращения длительностью от 12 до 15 мин путем внутритора-
кального пережатия сосудистого пучка с помощью специального
приспособления, подводимого под сосудистый пучок без повреждения грудной
клетки. Последующая реанимация состоит в наружном массаже и
искусственной вентиляции легких. Протокол эксперимента предусматривает
введение предполагаемого НП с нейропротекторным действием через 30 мин
после начала сердечно-легочной реанимации, в последующем оценивается
неврологический статус, исследуется поведение в открытом поле,
обучаемость в Т-образном лабиринте с пищевым подкреплением.
3. Анализ механизма действия потенциального ноотропа
При представлении документации по всякому фармакологическому
препарату необходимо располагать данными о механизме его действия. В
отношении ноотропов данные о механизме действия значительно менее
исчерпывающие, чем для других групп нейротропных веществ. Известно,
что механизм их действия характеризуется многокомпонентностью.
На уровне общего метаболизма эффект НП характеризуется
повышением скорости оборота информационных макромолекул и активацией
синтеза фосфолипидов за счет угнетения нуклеотидфосфатазы, активации аде-
нилаткиназы и фосфорилазы Ад. Для многих НП показана способность
предотвращать активацию перекисного окисления липидов, вызванную
такими патологическими процессами, как старение, ишемия, стресс.
Что касается влияния НП на нейромедиаторные процессы, получены
доказательства специфической роли холинергической и глутаматергиче-
ской систем в реализации эффекта НП. В связи с этим при изучении
нового НП может оказаться полезным изучить его влияние на число муска-
риновых рецепторов и их аффинность к соответствующим лигандам.
Доказательства вовлечения глутаматергических механизмов в реализации
эффекта того или иного НП могут быть получены как в опытах с
изучением влияния данного НП на рецепторное связывание меченого глута-
- 318 -

мата, так и в электрофизиологических экспериментах. В последнем
случае речь может идти как об экспериментах с внутриклеточной
регистрацией активности одиночных нейронов и изучением динамики десенсити-
зации при подведении избирательных агонистов различных подтипов
NMDA и nonNMDA глутаматергических рецепторов, так и об опытах с
изучением длительной гиппокампальной потенциации (ДГП). Последняя
является глутаматзависимым электрофизиологическим феноменом си-
наптической пластичности, имеющей прямое отношение к обучению и
памяти. Эффект НП может оцениваться как по облегчению фоновой
ДГП, так и по способности восстанавливать дефицит ДГП,
обусловленный различными повреждающими воздействиями, например пренаталь-
ной алкоголизацией.
Представление в Фармакологический комитет всего комплекса
биохимических и электрофизиологических данных по механизму действия
нового НП не является обязательным. Может быть представлен любой
фрагмент, касающийся как перечисленных выше механизмов активности, так,
особенно для веществ оригинальной структуры, и данные о новых
аспектах действия.
4. Изучение спектра нейротропной активности, побочных эффектов и острой
токсичности
В связи с тем что известные НП обладают, помимо основного, ноо-
тропного эффекта, другими проявлениями действия, следует изучить
более подробно спектр нейротропной активности нового препарата и
получить сведения о его острой токсичности. Следует представить данные о
наличии или отсутствии у изучаемого вещества седативного или
активирующего, судорожного или противосудорожного, анксиолитического и
миорелаксантного действия. Для выявления этих эффектов следует
использовать общепринятые тесты: регистрацию поведения в открытом
поле и в различных актометрах, тест залезания на сетку, антагонизм с
судорожными веществами (коразол, тиосемикарбазид, бикукуллин и др.) и
максимальным электрошоком, методики конфликтной ситуации и
приподнятого крестообразного лабиринта; для изучения миорелаксантного
действия используются тесты вращающегося стержня, рефлекса
подтягивания на перекладине, удерживания на перевернутой сетчатой
платформе, тест бокового положения. Исследование психотропных эффектов
проводится в диапазоне терапевтических доз, оказывающих ноотропный
эффект. Изучение побочных эффектов следует осуществлять в более
широком диапазоне доз: от средних терапевтических до субтоксических,
использовать не менее двух видов животных и путь введения,
соответствующий предполагаемому клиническому. Информация о побочных
эффектах дополняется результатами, полученными в разделе "Изучение
общей фармакологической активности".
Острая токсичность (регистрация гибели животных через 24 ч после
введения вещества) изучается на двух видах животных, на которых
проводилось исследование ноотропной активности, при тех же путях введения;
рассчитывается ЛД50. Данные по побочным эффектам и токсичности
нового препарата сопоставляются с данными, полученными для эталонных
препаратов.
- 319-

5. Изучение общей фармакологической активности, влияния
на сердечно-сосудистую систему и дыхание
Наблюдение за состоянием животного осуществляется на мышах и
крысах при введении препарата в широком диапазоне доз: от не оказывающих
заметного влияния на общее состояние до вызывающих гибель. При этом
определяется повышение или снижение общей возбудимости, увеличение
или снижение двигательной активности, наличие тремора, судорожных
подергиваний, судорог, гиперкинезов, изменение цвета кожных покровов,
взъерошивание шерсти, каталепсия, птоз, стереотипия, груминг и т. д.
Изучается пиннеальный, болевой и роговичный рефлексы, влияние на
температуру тела, потребление воды и пищи. Следует изучить влияние
препарата на эффекты соответствующих нейромедиаторных анализаторов,
например на эффекты ареколина, треморина, 5-окситриптофана,
фенамина, резерпина, дофамина, апоморфина, бикуккулина, флюмазенила, дизо-
цилпина и других анализаторов.
Влияние на сердечно-сосудистую систему, дыхание и на периферические
отделы нервной системы изучается на интактных или наркотизированных
кошках, кроликах или крысах по воздействию на уровень кровяного
давления, ритм сердечной деятельности (желательно и других показателей работы
сердца), дыхание, а также на реакции, вызванные введением нейромедиато-
ров, например адреналина, норадреналина, ацетилхолина, серотонина и в
ответ на раздражение периферического отрезка блуждающего нерва и др.
Заключение
В заключении приводятся данные, характеризующие всю совокупность
ноотропных эффектов изученного соединения, а также сопутствующих
нейротропных эффектов. Описываются выявленные побочные эффекты.
Анализируются основные преимущества нового препарата перед
известными средствами сходной направленности действия.
Методические указания по экспериментальному
доклиническому изучению аддиктивного потенциала
фармакологических средств, обладающих психоактивными
свойствами
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. «., проф. Э. Э. Звартау;
д. м. н. А. В. Кузьмин; д. м. н. А. Ю. Беспалов;
к. м. н. Н. А. Пашкина
Введение
Под аддиктивным потенциалом фармакологических средств понимают
их способность вызывать патологическое пристрастие. Теоретической
основой доклинической оценки аддиктивного потенциала
фармакологических средств является физиологическая концепция патогенеза наркотокси-
- 320 -

команий, согласно которой нейробиологическая природа аддиктивного
эффекта фармакологических средств связана с их влиянием на мозговые
системы "награды" и "наказания". На основе экспериментальных
исследований выделены фармакологические свойства, которые рассматриваются
как специфические предикторы способности психоактивных соединений
вызывать пристрастие:
1. Наличие у вещества первично-подкрепляющих свойств. Эти свойства
выявляются в опытах по выработке и поддержанию поведенческой
реакции внутривенного самовведения (РВС), при которой безусловным
подкрепляющим раздражителем является исследуемое вещество.
2. Наличие вторично-подкрепляющих свойств у условных раздражителей,
которые сочетались с действием фармакологического безусловного
раздражителя. Эти свойства выявляются в опытах по выработке условнорефлектор-
ной реакции на место (обстановку), ассоциированное с действием
фармакологического средства (условная реакция предпочтения места — УРПМ).
3. Наличие у вещества способности вызывать активацию системы
положительного подкрепления (система "награды"). Данная способность
выявляется по изменению показателей реакции электрической самостимуляции
(РСС).
Наличие этих свойств позволяет прогнозировать потенциал пристрастия
(аддиктивный потенциал) данного соединения. Сопоставление активности
и эффективности главного (терапевтического) эффекта исследуемого
вещества с его активностью и эффективностью в тестах оценки
аддиктивного потенциала позволяет делать заключение о наркологической
безопасности фармакологического средства.
Протокол исследования целесообразно разделить на две фазы. В первую
фазу целесообразно использовать тесты, наиболее удобные для первичного
скрининга, т. е. позволяющие получить максимально быстрый ответ и
наиболее простые по выполнению. Этим требованиям удовлетворяют
экспресс-метод инициации РВС у мышей и выработка УРПМ у мышей и
крыс. Задачей исследования является получение кривых зависимости
"доза—эффект" для 5—6 доз (при заданном пути введения) в сравнении с
эффектом растворителя и/или препарата сравнения.
Вторая фаза исследований позволяет подтвердить
первично-подкрепляющие свойства исследуемого соединения на втором виде животных
(крысы) и исследовать на этапе поддержания характер РВС при изменении
разовой дозы соединения, эффект его замены растворителем. Оценка
влияния вещества на РСС мозга позволяет исследовать также зависимость
"время—эффект" по влиянию вещества на возбудимость нервного
субстрата системы "награды".
Следует подчеркнуть, что выявление предикторов потенциала
пристрастия во всех тестах позволяет сделать вывод только о подкрепляющем
эффекте соединения и его влиянии на мозговой субстрат системы "награды",
но не о его непосредственной способности вызывать наркоманию,
токсикоманию или психологическую зависимость. Данные нозологические единицы
и синдромы являются сложным клиническим феноменом, который
формируется в течение достаточно продолжительного времени и при участии не
только биологических, но и других, в том числе социальных факторов.
Вместе с тем, как показывает клинический опыт, подкрепляющее действие
является "общим знаменателем" аддиктивных соединений и его выявление в
эксперименте на животных действительно является предиктором, т. е.
позволяет предсказать, что на основе этого подкрепляющего эффекта может
сформироваться патологическое влечение к данному веществу.
11 -762
- 321 -

Формула метода
Методические указания предлагают эффективную и технологически
простую программу доклинических экспериментальных исследований для
оценки аддиктивного потенциала (потенциала пристрастия)
фармакологических средств. Программа включает экспериментальные процедуры,
которые в наибольшей степени подтвердили свою прогностическую ценность в
исследованиях многочисленных фармакологических лабораторий в нашей
стране и за рубежом. Впервые в программу исследования включены
методики "первичного" скрининга, позволяющие быстро и с высокой степенью
надежности выявить адциктивный потенциал фармакологических веществ
(реакция внутривенного самовведения у мышей, условная реакция
предпочтения места).
ПОКАЗАНИЯ И ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ К ИСПОЛЬЗОВАНИЮ
МЕТОДА
Методические указания предназначены для экспериментальной
доклинической оценки аддиктивного потенциала (потенциала пристрастия)
фармакологических средств. Заключение об аддиктивном потенциале и
степени наркологической безопасности фармакологического средства на основе
предлагаемых экспериментальных тестов будет более уверенным, если
выполнены все предлагаемые исследования, т. е. оценены первично- и
вторично-подкрепляющие эффекты, а также влияние вещества на систему
"награды".
Каждый из тестов имеет свои преимущества и ограничения, которые в
сравнительном плане охарактеризованы в табл. 1.
МЕТОДЫ, РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ДЛЯ ПЕРВОЙ ФАЗЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ (МЕТОДЫ "ПЕРВИЧНОГО СКРИНИНГА")
1. Выработка реакции внутривенного самоввведения (РВС) у мышей
Главное достоинство метода — быстрота получения результатов —
определяется использованием естественной
ориентировочно-исследовательской реакции (выглядывание в отверстие при помещении в
затененную камеру), хорошо выраженной у мышей. При сочетании с инфузией
раствора аддиктивного соединения исследовательская реакция не
угашается, а, напротив, оживляется, так как исследуемый препарат обладает
"аттрактивными" мотивационными свойствами. Важным элементом
метода является использование пары мышей, одна из которых является
"активной" (AM), и ее выглядывания в отверстие приводят к внутривенной
самоинфузии исследуемого раствора, а также к инфузии той же дозы в
вену второй, контрольной мыши (КМ). Последняя, таким образом,
получает инфузии исследуемого соединения в том же режиме, что и AM, но
это введение является принудительным, а не "самовведением", так как
оно не зависит от собственной ориентировочно-исследовательской
реакции контрольного животного. Использование КМ позволяет оценивать
влияние исследуемого препарата на общее поведение, в частности на
уровень исследовательской реакции.
- 322-

МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕТОДА
Экспериментальные животные. Мыши-самцы массой 18—24 г.
Установка. Экспериментальная установка должна обеспечивать
возможность размещения двух мышей в смежных камерах, размеры которых
(например, 8x8x8 см) позволяют животным сохранять относительную
свободу движений, в частности выглядывания в отверстия на передней стенке
камеры, несмотря на фиксацию хвоста. Передняя стенка каждого бокса
имеет отверстие диаметром 1,2 см на высоте 0,5 см от пола, снабженное
инфракрасным датчиком для регистрации реакции выглядывания.
Фотодатчик через интерфейс связан с компьютером, который по
соответствующей программе управляет работой двухшприцевого микроинъектора с
шаговыми двигателями, осуществляя кратковременную инъекцию заданного
объема раствора исследуемого препарата (1,6 мкл на инъекцию) в ответ на
каждое выглядывание. Задняя стенка каждого бокса прорезана
вертикальной щелью шириной 0,5 см. Размещение животного в боксе производят с
учетом следующих условий: 1) мышь может свободно выглядывать в
отверстие на передней стенке; 2) доступ для пункции к латеральным хвостовым
венам не затруднен (хвост выводят через щель на задней стенке за пределы
бокса и фиксируют к горизонтальной поверхности липкой лентой); 3)
исключается возможность выдергивания иглы и повреждения катетера
животным во время эксперимента. По данным литературы и нашему опыту,
мыши сравнительно легко переносят данную форму частичной
иммобилизации.
ОПИСАНИЕ МЕТОДА
Протокол исследования включает исходное тестирование
ориентировочно-исследовательской активности и последующую сессию инициации
(выработки) РВС.
Задачей исходного тестирования является оценка индивидуальной
ориентировочно-исследовательской реакции мышей и основанный на ней
подбор пар для сессии РВС. Группы, которые формируются после
предварительного тестирования продолжительностью 10 мин, должны содержать
не менее 6—8 пар мышей на каждую дозу (концентрацию) и рандомизиро-
ваны таким образом, чтобы средний уровень исследовательской
активности в каждой группе был по возможности близким.
Как показывает опыт, инициация РВС как "больших" (морфин, кокаин,
амфетамин, эфедрон), так и "малых" (никотин, кофеин, этанол) аддиктив-
ных средств происходит в течение 10—20 мин. Поэтому общая
продолжительность сессии с выработкой РВС составляет 30 мин. Предварительно
отобранные пары мышей помещают в экспериментальные боксы и после
3—4 мин адаптации в латеральные хвостовые вены обеих мышей вводят
иглы, подсоединенные к инъектору через полиэтиленовые катетеры. Во
время 30-минутной сессии выработки РВС "активная мышь" (AM)
получает внутривенные инъекции исследуемого раствора после каждого
выглядывания. Контрольная "пассивная мышь" (КМ) получает инъекции в ритме
выглядываний AM, но вне связи с собственными выглядываниями. Таким
образом, оба животных получают одинаковое число инъекций с
одинаковым распределением инъекций во времени и, соответственно, одинаковую
дозу препарата, что позволяет при оценке эффекта и сравнении данных у
AM и КМ "уравнять" влияние препаратов на двигательную и исследова-
п*
-323-

тельскую активность. По окончании 30 мин иглы извлекают и животных
возвращают в общую клетку.
Заключение о положительно-подкрепляющем эффекте исследуемого
соединения основывают на расхождении количества выглядываний (KB) AM
и КМ. Если за период сесссии KB AM превышает KB ПМ, то делают
заключение о мотивационно-позитивном (положительно-подкрепляющем)
эффекте соединения. Если KB AM в период сессии меньше по сравнению
с KB ПМ, то эффект соединения расценивают как "аверсивный" ("нака-
зующий").
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА
Кривая зависимости "концентрация—эффект" (эффект оценивается по
разности KB AM и КМ) при инициации РВС имеет характерную для
данной модели куполообразную форму с максимальным значением показателя
при определенной концентрации(иях)/разовой дозе(ах), характеризующих
наиболее активный мотивационный эффект соединений. Модель
инициации РВС у мышей проявила высокую чувствительность и селективность.
Так, на этой модели в течение одной экспериментальной сессии
выявляются подкрепляющие свойства не только эталонных аддиктивных средств
(опиаты, кокаин, амфетамин, эфедрон), но и таких веществ, как этанол,
никотин, кофеин. Опиоидные анальгетики, которые лишены выраженного
аддиктивного потенциала (буторфанол, налбуфин, трамадол), не
проявляют подкрепляющих свойств на данной модели.
В табл. 1 суммированы сравнительные достоинства и ограничения
данной модели. Таким образом, метод инициации РВС у мышей является
чувствительным и быстрым способом оценки аддиктивного потенциала,
удовлетворяющим требованиям первичного скринингового теста.
Таблица 1. Сравнительная характеристика методов оценки аддиктивного потенциала
Метод
Электрическая
самостимуляция мозга
Условнорефлектор-
ное предпочтение
места
Достоинства
Возможность повторного
тестирования группы животных
Возможность оценки зависимости
"доза—эффект" и "время—эффект"
на одном и том же животном и
оценки параметров активности и
эффективности фармакологического
средства
Возможность оценки эффектов
повторного введения веществ
(толерантность, зависимость, сенситиза-
ция)
Эффект соединения оценивается
после его выведения из организма
(исключается непосредственное
влияние вещества на поведение во
время теста)
Условия и ограничения
Владение методами стерео-
таксической имплантации
электродов
Наличие адекватной
аппаратуры для исследования
оперантных реакций и
электростимуляции мозга
Обязательность этапов
выработки и стабилизации
оперантной реакции
Возможность ошибки в
оценке эффекта веществ
из-за фармакогенного
влияния на выполнение
оперантной реакции вне связи
с изменением функции
системы "награды"
Значительная
вариабельность индивидуальных
данных
- 324-

Продолжение
Метод
Достоинства
Условия и ограничения
Одновременно
оцениваются как
"аттрактивные", так и
аверсивные
свойства исследуемого
вещества
Внутривенное
самовведение:
инициация (мыши)
Внутривенное
самовведение:
инициация (крысы)
Внутривенное
самовведение:
поддержание (крысы)
Нет ограничений в путях введения
исследуемых веществ
Преимущественно качественная
("да-нет") оценка результатов теста
при сбалансированной по
исходному предпочтению отсеков
экспериментальной камеры процедуре
исследования (unbiased procedure)
Возможность параллельного
наблюдения за индивидуальным
поведением животного в периоде
обусловливания
Техническая простота, дешевизна,
высокая производительность метода
Техническая простота: исключаются
имплантация сосудистых катетеров,
предварительное обучение
животных
Малые затраты времени: средняя
продолжительность исследования
одной дозы — 1 ч, исследование
одного соединения (полная кривая
"доза—эффект") при наличии
многоканальной установки — 1—3 дня.
Контролируется влияние
исследуемого соединения на
ориентировочно-исследовательскую реакцию
(контрольное животное)
Прямое доказательство
подкрепляющего поведения поиска и
потребления эффекта исследуемого
вещества
Возможность длительного изучения
потребления аддиктивного вещества
и влияния на него
фармакологических и иных факторов
Возможность оценки потребления
аддиктивных соединений по
механизму как положительного, так и
отрицательного (у зависимых
животных) подкрепления
Возможность оценки способности
поддерживать самовведение других
веществ при замене ими исходного
соединения (тест замены)
Необходимость проведения
дополнительного
исследования по специальному
протоколу для сравнения
мотивационной "ценности"
исследуемого и эталонного
соединений
Необходимость
соответствующего аппаратного и
программного обеспечения
Невозможность
многократного использования
животных для оценки
поддержания внутривенного
самовведения
Индивидуальная, циркади-
анная, ультрадианная и
сезонная вариабельность
базовой оперантной реакции
(выглядывания в отверстие)
Необходимость
имплантации внутрисосудистого
катетера
Необходимость
соответствующей аппаратуры и
системы управления (оперант-
ные камеры, инъекторы,
противоперекручивающие
устройства и пр.)
Трудоемкость и
сравнительно большая
продолжительность исследования
То же, что в схеме
инициации
Возможно изменение
реакции на исследуемое
вещество при повторной
экспозиции (толерантность, сенси-
тизация)
325

2. Выработка условнорефлекторной реакции предпочтения места (УРПМ)
у крыс и мышей
Нейтральные обстановочные раздражители при сочетании с
"награждающим" эффектом аддиктивных средств могут приобретать собственные
"аттрактивные" свойства, на базе которых вырабатываются инструментальные
реакции второго и более высоких порядков, которые подкрепляются этими
условнорефлекторными раздражителями. Если эффект аддиктивного
вещества испытывается животным в определенном месте, например в одной из
камер двух- или многокамерной установки или участке "открытого поля",
имеющем специфические дискриминативные стимульные свойства
(тактильные, световые, обонятельные и т. п.), то животное предпочитает
находиться в этом месте, если ему предоставляется выбор. Условнорефлекторная
реакция предпочтения места (УРПМ) получила широкое распространение
при изучении аддиктивных средств с конца 70-х — начала 80-х годов. Если
вещество проявляет противоположный (аверсивный) эффект, то
вырабатывается условнорефлекторная реакция избегания места (УРИМ). Таким
образом, условный рефлекс на место может иметь противоположную
направленность (УРПМ или УРИМ) и отражать итоговое взаимодействие
исследуемого вещества с мозговым субстратом мотивационных реакций. Выработка
условного рефлекса на место является технически простым тестом
доклинической оценки аддиктивного потенциала фармакологических средств,
имеющим свои достоинства и недостатки (табл. 1).
Методика выработки УРПМ у крыс существует в двух модификациях:
а) с исходным предпочтением животными одного из экспериментальных
отсеков (biased procedure) и б) с исходно сбалансированным выбором
отсеков экспериментальной камеры (unbiased procedure). При первом
варианте метода легче получить четкую кривую зависимости "доза—эффект",
однако при этом трудно исключить вклад антиаверсивных свойств
исследуемого вещества в окончательный эффект обусловливания. При
использовании второй модификации уверенность в определении избирательных
"награждающих" (УРПМ) или аверсивных (УРИМ) эффектов препаратов
выше. В настоящих методических рекомендациях рассматривается
методика выработки УРПМ при исходно сбалансированном выборе отсеков
экспериментальной камеры (unbiased procedure).
МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕТОДА
Экспериментальные животные — крысы-самцы массой 150—250 г.
Рекомендуется содержать животных при инвертированном режиме
освещения (12-часовой цикл темнота/свет) для активации поведения во время
экспериментов в темновой фазе. Эксперименты начинают примерно через
час после начала темнового цикла. Предварительно формируются группы
(не менее 8 животных в группе) для изучения эффекта каждой дозы
препарата и растворителя.
Экспериментальная установка обычно состоит из двух или более камер
различной формы и размера, которые отличаются по текстуре пола,
окраске стенок и т. п., что позволяет животным дифференцировать разные
камеры. Важно, чтобы при свободном исследовании камер в группе крыс не
проявлялось предпочтения одной из них. Желательна автоматическая
регистрация с помощью механических или оптических датчиков времени
нахождения животных в отсеках установки и количества переходов.
- 326 -

ОПИСАНИЕ МЕТОДА
Протокол исследования предусматривает периоды обусловливания и
тестирования. Период фармакологического обусловливания продолжается
4 дня. Каждый день проводят две сессии выработки условного рефлекса на
место. Первая сессия является дифференцировочной. Перед помещением в
один из отсеков (отсеки камеры разделены перегородкой) на 20—45 мин (в
зависимости от сроков действия препарата) животным вводят
растворитель. Во время второй сессии вводят исследуемое соединение (в
контрольной группе — растворитель) перед помещением животного в
противоположный отсек на 20—45 мин. Размещение животных после инъекции в том
или ином отсеке производят в случайном порядке таким образом, что
половину группы размещают в данном отсеке после инъекции препарата, а
другую половину — после введения растворителя. После каждого опыта
камеры обрабатывают 3 % раствором перекиси водорода.
Заключительное тестирование выработки условного рефлекса на место
проводят через 72 ч после последнего обусловливания. Из камеры
вынимается перегородка между отсеками, и в течение 15 мин крысы свободно
исследуют экспериментальную камеру.
Регистрируют время нахождения в отсеках и количество переходов из
одного отсека в другой. Время, проводимое в отсеке, ассоциированном с
действием препарата, сравнивают со временем нахождения в отсеке,
ассоциированном с растворителем. Положительное значение разности двух величин
указывает на выработку УРПМ, а отрицательное на УРИМ. В качестве
альтернативного (квантового) показателя используют количество животных в
группе с выработанной УРПМ или УРИМ. За критерий предпочтения
условно принимается время нахождения в данном отсеке более 2/з (более 600
с) или, соответственно менее '/з (300 с) от общего времени теста (900 с).
Этот критерий примерно соответствует диапазону доверительных границ для
животных контрольной группы, получающих изотонический раствор.
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА
Положительный условный рефлекс на место, ассоциированное с
фармакологическим эффектом, оценивается как косвенное свидетельство
положительных мотивационных свойств изучаемого соединения. Метод
выработки УРПМ в рассмотренной модификации достаточно чувствителен и
позволяет выявить аддиктивный потенциал как "больших" (кокаин,
морфин), так и малых (кофеин, никотин, этанол) аддиктивных средств. Он
также специфичен и не выявляет положительного условного рефлекса на
место при сочетании с эталонными веществами, не имеющими аддиктив-
ного потенциала (ненаркотические анальгетики, нейролептики и др.), т. е.
не дает ложноположительных реакций. Вместе с тем выработка УРПМ,
ассоциированного с фармакологическим эффектом, при отсутствии
предпочтения какого-либо из отсеков экспериментальной камеры в контрольной
группе (unbiased procedure) не позволяет с уверенностью количественно
разделить исследуемые вещества по эффективности (максимуму)
подкрепляющего эффекта, а также получить стабильные и воспроизводимые
кривые зависимости "доза—эффект".
Для сравнения аддиктивного потенциала соединений можно
использовать вариант выработки УРПМ, при котором помещение в один отсек
камеры сочетается с действием эталонного наркотика (например, кокаина), а
- 327-

в другой — с действием исследуемого соединения. В этих условиях можно
видеть, что животные предпочитают отсек, ассоциированный с инъекцией
кокаина по сравнению с местом, где вводились, например, кофеин,
никотин или этанол. С другой стороны, животные не отдают явного
предпочтения отсеку, ассоциированному с кофеином, перед местом, где они
испытывали действие никотина или этанола.
Основные требования к установке для выработки УРПМ у мышей
аналогичны таковым для крыс. По сравнению с крысами мыши, как правило,
проявляют более высокую двигательную активность в камере, и временная
асимметрия выражена слабее или отсутствует. Поэтому протокол
исследования может предусматривать претесты для оценки исходного
предпочтения отсеков камеры животными, и эффект препарата можно оценивать по
изменению (приросту в случае УРПМ) времени пребывания животного в
данном отсеке после периода фармакологического обусловливания.
Исследование может проводиться также и по схеме, изложенной выше для
выработки условной реакции на место у крыс.
МЕТОДЫ, РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ДЛЯ ВТОРОЙ ФАЗЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ (МЕТОДЫ "УГЛУБЛЕННОГО СКРИНИНГА")
3. Инициация и поддержание реакции внутривенного самовведения (РВС)
у крыс
МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕТОДА
Экспериментальные животные. Крысы-самцы линии Wistar массой
180-200 гр.
Установка. Камеры, в которые помещают животных, имеют размер
30 х 30 х 30 см и снабжены двумя педалями. Одна из них при замыкании
контактов включает инъектор, а вторая необходима для контроля
неспецифической оперантной активности животного. Возможно использование
камер, снабженных не педалями, а двумя отверстиями диаметром 1,5 см на
высоте 2,0 см от пола и на расстоянии 15 см друг от друга. В оба отверстия
вмонтированы инфракрасные датчики, связанные через интерфейс с
компьютером типа PC, причем одно из отверстий является "активным" и
выглядывание в него ведет к инфузии исследуемого раствора. Оперантный
ответ типа выглядывания является более естественным для крыс, чем
нажатие на педаль, и вырабатывается быстрее.
Для инфузии веществ используют микродозаторы с регулируемыми
скоростью подачи растворов (от долей секунды до 10—20 с) и объемом
разовых инфузии (от 10 до 400 мкл/кг). Оптимальные параметры (объем
разовой инфузии и болюсная доза) подбираются индивидуально для каждого
препарата. Инфузию сочетают со световым раздражителем,
сигнализирующем о фармакологическом подкреплении инструментальной реакции.
Инфузии производятся автоматически в ответ на выглядывание в одно из
отверстий или в ответ на нажатие на соответствующую педаль.
Соответственно, оперантные реакции на протяжении срабатывания инъектора (от 2 до
13 с в зависимости от марки и типа микродозатора) фиксируются, однако
не ведут к активации инъектора.
Для обеспечения свободы перемещения животных в эксперименте
применяют шарнирное соединительное устройство ("swivel joint"),
предупреждающее перекручивание соединительных трубок от катетера к инъектору.
- 328-

ОПИСАНИЕ МЕТОДА
Крысам под общей анестезией через наружную яремную вену в ушко
правого предсердия имплантируют силиконовые катетеры, которые
фиксируют на черепе животного акриловым цементом. Через 3—4 сут после
операции крыс переводят в виварий с инвертированным световым
режимом и им ограничивают пищевой рацион с целью снижения массы на 10—
15 % от исходной. Через 3 дня после этого приступают к выработке РВС.
Перед началом тестирования проверяют проходимость катетера путем
введения 0,1—0,2 мл изотонического солевого раствора.
Протокол опыта предусматривает повторные ежедневные посадки
животного в экспериментальную камеру и регистрацию количества оперант-
ных реакций за время эксперимента. Практически удобнее использовать
ограниченную во времени сессию РВС (1—3 ч). Задачи исследования
определяют повторность и регулярность сессий. При выработке РВС обычно
к пятой сессии выясняется, способно ли животное обучиться РВС при
избранной разовой дозе исследуемого соединения. Рекомендуется
исследовать несколько разовых доз (не менее 4—5)изучаемого соединения.
Показателями РВС являются количество самовведений препарата в
каждый из тестовых дней, а также количество выглядываний в неактивное
отверстие (или нажатий на "неактивную" педаль). Регистрируют также
суммарную дозу вещества, введенную за сессию. В случае использования
протокола выработки РВС после окончания эксперимента (5 дней) животных
забивают и положение внутривенной канюли верифицируют
гистологически. В опытах с поддержанием РВС после периода тренировки (5—8 дней)
большинство животных (60—70 %) обучается самовведению эталонных ад-
диктивных соединений (кокаина, морфина, этанола). В дальнейших
опытах используют только животных со стабильным уровнем потребления
эталонного адциктивного препарата (колебания не более 15 % от среднего
уровня на протяжении 3 последовательных экспериментальных сессий).
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА
РВС у крыс используется для предсказания адциктивного потенциала
физиологически активных соединений почти сорок лет. Модель
подтвердила свою чувствительность и специфичность. С ее помощью выявляются
подкрепляющие свойства практически всех психоактивных соединений,
которые известны своим аддиктивным потенциалом у человека.
Соответственно, вещества, не являющиеся объектом злоупотребления у человека, не
поддерживают РВС у крыс.
В табл. 1 суммированы сравнительные достоинства и ограничения
данной модели.
4. Реакция электрической самостимуляции (РСС) системы "награды" мозга
Активация реакции самостимуляции (РСС) при введении адциктивного
вещества является неотъемлемым звеном доказательств единой мишени
для электрической (РСС) и фармакологической (исследуемое вещество)
стимуляции и рассматривается как экспериментальный эквивалент эйфо-
ризирующего действия фармакологических веществ.
Существует большое количество модификаций метода электрического
- 329-

самораздражения мозга, основанных как на особенностях оперантного
(инструментального) поведения, так и на требованиях, диктуемых
необходимостью исследования конкретного фармакологического агента.
Несмотря на многообразие экспериментальных подходов, для обычных скринин-
говых целей при исследовании аддиктивного потенциала
фармакологических агентов с помощью РСС наиболее информативным и корректным
признано использование методик, позволяющих оценивать возбудимость
нервного субстрата системы "награды" по минимальной (пороговой)
интенсивности "награждающей" стимуляции, достаточной для поддержания
условной инструментальной реакции.
Существуют две основные методики определения пороговой
интенсивности стимуляции ("титрование порога"): "аутотитрование", при котором
пороговая интенсивность контролируется самим животным, и титрование
порога, которое производится по определенному алгоритму
исследователем. Несмотря на исключительную объективность методики "аутотитрова-
ния", ее практическое использование сопряжено со значительными
затратами времени и ресурсов и не может быть избрано для скрининга
фармакологических агентов. Поэтому рекомендуется использовать методику
титрования порога РСС, которое осуществляет исследователь.
МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕТОДА
Опыты проводятся на самцах крыс массой 150—300 г в зависимости от
используемого атласа мозга крыс. РСС исследуют в стандартной камере
Скиннера, оборудованной двумя — "награждающей" и "ненаграждающей",
педалями. Для РСС необходим источник электрических импульсов
(например, стимулятор ЭС-51), который позволяет осуществлять стимуляцию
по постоянному току в широком амплитудном и/или частотном диапазоне.
ОПИСАНИЕ МЕТОДА
Электроды имплантируют по стереотаксическим координатам в
медиальный переднемозговой пучок или вентральную тегментальную область
(вентральная покрышка) среднего мозга. Имплантация электродов в
вентральную тегментальную область рекомендуется в связи с низкой
вероятностью возникновения аверсивных реакций при электрическом
раздражении этой структуры. Могут использоваться моно- или биполярные
электроды. Последние предпочтительны из-за более высокой селективности
стимуляции. При использовании монополярных электродов устанавливают
дополнительный индифферентный электрод в несквозном отверстии в
лобной кости.
Через 5—7 дней после операции приступают к выработке и
стабилизации РСС при следующих параметрах раздражения: прямоугольные
биполярные импульсы частотой 100 Гц, длительность импульса 0,1 мс,
продолжительность серии импульсов 300 мс, амплитуда импульсов в
примерном диапазоне 70—300 мкА для монополярной стимуляции или 10—100
мкА для биполярной стимуляции. Выработка реакции РСС
осуществляется с помощью методов "последовательного приближения" к
необходимой поведенческой реакции (например, нажатие на педаль). После
помещения животного в оперантную камеру последовательно подкрепляют
"награждающей" стимуляцией сначала нахождение в части камеры, наи-
- 330-

более близкой к "подкрепляющей" педали, затем каждое движение по
направлению к педали, исследование педали, касание педали, и т. д. После
выработки навыка нажатия на педаль (1—2 сессии), на протяжении 3—4
ежедневных сессий определяют амплитуду стимуляции, которая
поддерживает частоту оперантной реакции 40—60 нажатий в минуту. Как
правило, при удачной имплантации электродов на выработку и
стабилизацию РСС требуется 4—6 экспериментальных сессий длительностью 30—
40 мин.
Для анализа подкрепляющих свойств РСС используется процедура
определения пороговой интенсивности электрической стимуляции (по
амплитуде или частоте импульсов). В первом случае интенсивность
стимуляции регулируют изменением амплитуды импульсов при фиксированной
частоте, а во втором — фиксируют амплитуду стимуляции и изменяется
частота. Ниже приводится пример рекомендуемой процедуры определения
пороговой интенсивности стимуляции.
Ежедневные тренировочные сессии состоят из двух блоков, следующих
один за другим и разделенных интервалом в 1 ч. Каждый блок начинается
с трех независимых от поведения животного стимуляций, которые
отделены 1-секундными интервалами и предназначены для "разогрева"
животного. Исходно амплитуду стимуляции устанавливают на уровне,
использованном на этапе стабилизации РСС и приблизительно соответствующем
частоте оперантной реакции 40—60 нажатий на педаль в минуту. Затем
амплитуду стимуляции снижают каждую минуту на 2 мкА (этот шаг
изменения амплитуды подобран эмпирически и оказался удобным в
практическом определении порогов РСС). По достижении порогового значения
амплитуду стимуляции начинают увеличивать с тем же шагом. Пороговая
интенсивность стимуляции для получения РСС определяется как амплитуда,
при которой поддерживается ЧСР не менее 10 нажатий на педаль в
минуту. Для каждого блока стимуляции пороговое значение амплитуды
определяют два раза — при снижении амплитуды и затем при повышении, после
чего рассчитывают среднее значение.
В начале следующего блока стимуляции или новой сессии амплитуду
стимуляции устанавливают на уровне, определенном во время предьщущеи
сессии или блока и соответствующем ЧСР 40—60 нажатий на педаль в
минуту. Частота импульсов постоянно поддерживается на уровне,
использованном на этапе стабилизации самостимуляции (100 Гц).
При проведении экспериментальных сессий после первого блока
стимуляции вводится фармакологическое средство. При необходимости
исследования зависимости "время—эффект" экспериментальные сессии
удлиняются, и после введения фармакологического средства следуют 2—3 блока
стимуляции в заданные экспериментатором интервалы времени.
Изменение пороговой интенсивности стимуляции под действием
фармакологического средства или его растворителя выражают в процентах к
значению пороговой интенсивности, определенной во время первого
блока экспериментальной сессии. При расчете среднеэффективных доз
фармакологических средств используется такой параметр, как количество
животных в группе (в процентах), у которых снижение пороговой
интенсивности стимуляции выходит за пределы нижней границы доверительного
интервала колебаний пороговой интенсивности в контроле, т. е. после
введения индифферентного растворителя. ЭД50 определяют по методу Литч-
фильда—Уилкоксона или с помощью пробит-анализа. Анализ
зависимостей "доза—эффект" и "время—эффект" проводят с помощью одно- и двух-
факторного дисперсионного анализа для повторных измерений. Для полу-
- 331 -

чения достаточного объема данных для анализа зависимостей
"доза—эффект" и "время—эффект" достаточны группы из 5—6 животных (при
введении различных доз препаратов по схеме "латинский квадрат").
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА
К настоящему времени практически для всех известных веществ с ад-
диктивным потенциалом доказана способность активировать РСС. Список
изученных аддиктивных средств включает опиаты (морфин, героин),
психостимулянты (кокаин, амфетамины), галлюциногены (фенциклидин,
ЛСД), барбитураты, бензодиазепины, этанол, никотин и др. Под влиянием
фармакологических агентов принципиально возможно несколько
вариантов изменения параметров реакции электрической самостимуляции. После
введения различных аддиктивных средств наблюдается снижение
пороговой интенсивности реакции РСС, что отражает повышение возбудимости
нейронального субстрата. В то же время другие параметры реакции РСС,
такие как частота самораздражений за экспериментальную сессию, могут
как повышаться (психостимулянты, низкие дозы опиатов), так и
снижаться (этанол, барбитураты).
Результаты экспериментов по РСС позволяют проводить анализ
зависимостей "доза—эффект" и "время—эффект" для исследуемых веществ, а
также сравнения эффективности между отдельными веществами и в
особенности по отношению к эталонным препаратам.
Ввиду того что вживление электродов для исследования РСС
производится в строго контролируемых условиях (стереотаксическая методика,
гистологическая верификация положения электрода после эксперимента),
данная методика позволяет интерпретировать эффекты исследуемого
вещества как способность активировать нейроанатомический субстрат,
общий для всех известных наркотиков.
Методические указания по экспериментальному изучению
препаратов для лечения нарушений мозгового кровообращения
и мигрени
СОСТАВИТЕЛИ: проф. Р. С Мирзоян; проф.
А. С. Саратиков; проф. М. Б. Плотников; к. м.
н. А. В. Топчян; к. б. н. Т. С. Ганыиина
Введение
Фармакологическая регуляция нарушений мозгового кровообращения
является одной из важнейших проблем современной фармакологии и
медицины, что определяется высоким уровнем смертности и инвалидности
населения от сосудистой патологии мозга. В структуре цереброваскуляр-
ных расстройств существенная роль принадлежит ишемическим
поражениям головного мозга. Об этом свидетельствует частота ишемических
инсультов, преходящих и динамических нарушений мозгового кровообращения
- 332-

Спазмы сосудов мозга имеют место и выражены в значительной степени
при геморрагическом инсульте и субарахноидальном кровоизлиянии.
Недостаточность кровоснабжения мозга характерна и для первой пусковой
фазы приступа мигрени
В связи с этим поиск новых лекарственных средств, улучшающих
мозговое кровообращение, в том числе противомигреневых, является весьма
актуальной проблемой. Об этом свидетельствуют также недостаточная
эффективность и наличие существенных побочных эффектов у применяемых
в неврологической практике фармакологических средств.
Препараты, улучшающие мозговое кровообращение, широко
применяются в неврологической практике для лечения ишемических
поражений мозга и ишемических инсультов. Однако вопрос о сроках
назначения указанных препаратов решается неоднозначно. Так, одни
исследователи применяют цереброваскулярные средства сразу же после
наступления ишемического инсульта, а другие — в течение первых суток
воздерживаются от назначения препаратов, улучшающих мозговое
кровообращение. Дело в том, что применяемые в клинической практике
цереброваскулярные препараты в той или иной степени обладают
гипотензивными свойствами. Снижение уровня артериального давления, а
следовательно, и перфузионного давления у больных с ишемическим инсультом,
вызывает дальнейшее ухудшение кровоснабжения ишемизированных
областей мозга.
Поэтому при поиске новых цереброваскулярных препаратов
необходимо учитывать, что перспективное соединение должно:
а) существенно увеличивать мозговое кровообращение;
б) не обладать выраженным гипотензивным эффектом;
в) преимущественно улучшать кровоснабжение ишемизированных
областей мозга.
Методология поиска средств для лечения мигрени отличается от
собственно цереброваскулярных препаратов, несмотря на важное значение
сосудистого компонента в патогенезе этого заболевания. Так, в настоящее
время установлено, что в генезе приступа мигрени существенную роль
играет нейромедиатор серотонин. Показано, что серотонин, с одной
стороны, оказывает выраженное сосудосуживающее влияние на мозговые
артерии, а с другой — участвует в проведении болевых импульсов. Известно,
что первая фаза приступа мигрени характеризуется констрикторной
реакцией церебральных сосудов, вслед за которой отмечается компенсаторное
понижение тонуса сосудов мозга. Применение в клинической практике
как антагонистов, так и агонистов серотониновых рецепторов
подтверждает участие серотонина в патогенезе мигрени. Для профилактики приступа
мигрени используются антагонисты 5НТ2-типа серотониновых рецепторов
(метисергид, пизотифен). Купируют приступ мигрени как антагонисты
серотонина (эрготамин, дигидроэрготамин), так и агонисты 5НТ,-типа
рецепторов (суматриптан и др.).
Учитывая важную роль цереброваскулярного компонента в генезе
приступа мигрени, при поиске новых противомигреневых препаратов важно,
чтобы вещество проявляло антисеротониновую активность по отношению
к церебральным сосудам и к нейромедиаторным системам, участвующим в
проведении болевых импульсов. Используемые в настоящее время
агонисты 5НТ,-рецепторов повышают тонус сосудов, в том числе коронарных,
что является весьма существенным побочным эффектом, ограничивающим
их применение в медицинской практике.
- 333 -

ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ДОКЛИНИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Скрининг соединений для выявления у них цереброваскулярной
активности
Изучение влияния новых или известных химических соединений на
кровоснабжение мозга включает в себя обязательное исследование общего
или регионарного мозгового кровотока в сопоставлении с изменениями
системного артериального давления, являющегося важнейшим условием
осуществления перфузионного давления в сосудах мозга, и частоты
сердечных сокращений. Значительные изменения системного артериального
давления и частоты сердечных сокращений следует рассматривать как
побочный эффект, который может ограничивать прямое влияние на мозговое
кровообращение. Важно выявить диапазон доз, в которых соединение
проявляет избирательное действие на мозговой кровоток без существенных
изменений системного артериального давления. Соединения,
оказывающие выраженное гипотензивное действие (снижение на 15 % и более от
исходного артериального давления), исключаются из дальнейшего
исследования.
Изучение мозгового кровообращения, системного артериального
давления в острых или хронических экспериментах проводят на крысах,
кроликах, кошках, собаках. В отчете необходимо указать вид общего
обезболивания, дозу и способ введения исследуемого вещества.
Кровоснабжение мозга оценивают путем измерения:
1) кровотока в каротидных или вертебробазилярных артериальных
системах или оттока крови из мозга с помощью расходомеров
(ультразвукового, электромагнитного и др.);
2) мозгового кровотока, определяемого с помощью радиоактивных
инертных газов при их ингаляции (ксенон-133);
3) мозгового кровотока с помощью меченых микросфер;
4) локального - кровотока в отдельных структурах мозга, оцениваемого
полярографическим методом с регистрацией водородного клиренса при
его ингаляции или генерации в мозговой ткани;
5) локального кровотока в коре головного мозга с помощью лазерных
допплеровских флоуметров.
Оценку возможного избирательного влияния соединений на мозговое
кровообращение можно производить и на изолированных сосудах мозга.
Однако эти эксперименты могут быть лишь предварительным этапом
скрининга, так как они позволяют оценивать влияние веществ на сосуды
мозга в условиях изоляции от системной гемодинамики, изменения
которой могут существенно модулировать влияние соединения на
кровоснабжение мозга.
Цель первого этапа — выявление соединений, которые обладают
выраженным и относительно избирательным влиянием на мозговое
кровообращение и превосходят эталонные препараты.
Для изыскания новых средств для лечения мигрени не обязательно
изучение влияния этих соединений на церебральную гемодинамику интакт-
ных животных. Поиск этой группы препаратов следует проводить со
второго этапа доклинических исследований, а именно, с определения их
эффективности в условиях расстройств мозгового кровообращения серотони-
нергической природы.
- 334 -

2. Определение эффективности соединений в условиях экспериментальных
цереброваскулярных расстройств
Выявленное на первом этапе избирательное влияние соединения на
церебральную гемодинамику не гарантирует его достаточной эффективности
при различных формах расстройств мозгового кровообращения. Поэтому
следующим этапом является определение эффективности перспективного
соединения в условиях сосудистой патологии мозга в сравнении с
эталонным препаратом.
2.1. Локальная ишемия мозга, вызванная перевязкой средней мозговой
артерии у крыс
Для поиска средств для лечения ишемического инсульта необходимо
использовать экспериментальную модель, наиболее приближенную к
указанной патологии. Такой моделью является локальная ишемия мозга,
вызванная перевязкой средней мозговой артерии у крыс.
Исследование проводится на крысах с массой тела 350—400 г под
общей анестезией хлоралгидратом (400 мг/кг внутрибрюшинно).
Животных помещают в специально сконструированную установку,
которая позволяет удобно и жестко фиксировать голову в боковом
положении левой стороной кверху. Операцию производят с помощью
нейрохирургической бинокулярной лупы с волокнистым осветителем (ЛБВО).
После удаления шерстяного покрова и обработки операционного поля делают
разрез кожи по ходу скуловой кости (около 2 см). Затем расширяют
раневую поверхность ранорасширителем и обнажают слюнную железу,
расположенную в задненижнем квадрате операционного поля. С помощью
микрохирургических инструментов слюнную железу вместе с сосудистым
сплетением аккуратно отделяют от окружающих тканей и перемещают в задне-
верхний квадрат с ее последующей иммобилизацией. После удаления
скуловой кости раскрываются края крепления височной мышцы к нижней
челюсти и с помощью бормашины производится щадящий разрез кости по
краю крепления к ней сухожилия указанной мышцы. Далее, поднимают с
помощью крючков нижний край височной мышцы кверху, при этом
обнажается височная ямка, дно которой образует крыловидная мышца с
проходящим рядом нижнечелюстным нервом. С помощью специально
сконструированного ранорасширителя раздвигается крыловидная мышца,
вследствие чего открывается поверхность черепа между овальным отверстием и
отверстием зрительного нерва. В этой области, а именно под нижним
краем височно-челюстного сустава, сверлится отверстие диаметром около 2
мм и тем самым обнажается место расположения средней мозговой
артерии. Дальнейшую операцию по перевязке указанной артерии проводят под
микроскопом с большим фокусным расстоянием (f = 190 мм) под
большим увеличением (14,03,3). Под левую среднюю мозговую артерию
подводят иглу с этиконовой нитью толщиной 10/0 (Ethicon Ltd.), прокалывая
иглой твердую мозговую оболочку. Перевязку средней мозговой артерии
проводят у ее основания. После перевязки ток крови по средней мозговой
артерии прекращается, что можно наблюдать в поле зрения под
микроскопом.
С целью проведения опытов на бодрствующих животных по
возможности восстанавливают топографию мышц и мягких тканей операционного
поля. В частности, прикрепляют сухожилия височной мышцы к нижней
- 335 -

челюсти для сохранения жевательного процесса. При такой постановке
опыта создается возможность для проведения исследований на
оперированных животных в течение месяца и более.
2.2. Глобальную ишемию мозга воспроизводят у крыс билатеральной
окклюзией общих сонных артерий в сочетании с контролируемой гипотен-
зией. Артериальное давление понижают до 50 мм рт. ст. Гипотензия
необходима для моделирования ишемии мозга, так как двусторонняя перевязка
общих сонных артерий не обеспечивает понижения мозгового кровотока
до величин, при которых развивается ишемическое поражение.
Понижение артериального давления достигается контролируемым кровопусканием
или применением ганглиоблокаторов, а-адреноблокаторов.
Двусторонняя перевязка общих сонных артерий и понижение
артериального давления вызывают морфологические изменения в клетках
избирательно уязвимых структур — в пирамидальных нейронах СА 1, в гиппо-
кампе, caudoputamen и новой коре. При этом развиваются также
нарушения энергетического обмена в ткани мозга.
2.3. Субарахноидальное кровоизлияние моделируют на
наркотизированных кошках путем введения крови под оболочки мозга. Голова животного
фиксируется в стереотаксическом приборе, обнажаются кости черепа.
После расчета стереотаксических координат тонким сверлом делают
отверстие в кости в области передней супрасильвиевой борозды правого
полушария. С помощью тонкой инъекционной иглы с полумягким катетером
вводят в субарахноидальное пространство 2 мл аутогенной крови. При
морфологическом контроле гематома определяется в виде подоболочечно-
го кровоизлияния вдоль поверхностной артерии, проходящей в
супрасильвиевой борозде. Изменения кровоснабжения мозга, внутричерепного
давления, сопротивления мозговых сосудов и артериального давления
соответствуют динамике этих показателей у больных с субарахноидальным
кровоизлиянием.
2.4. Интрацеребральная геморрагия может быть воспроизведена у
бодрствующих или наркотизированных кошек и крыс. После
предварительного стереотаксического вживления полой иглы в область внутренней
капсулы внутримозговое кровоизлияние вызывают медленным (в течение
3—4 мин) введением аутогенной крови кошкам в объеме 2 мл, крысам —
0,3 мл. В большинстве случаев кровь распределяется в виде хорошо
очерченной гематомы у конца инъекционной иглы с деформацией и
разрушением подкорковых структур в области ядер таламуса, реже — в
подкорковом белом веществе. У кошек внутримозговая геморрагия приводит к
стойкому понижению общего мозгового кровотока, сопровождающемуся в
ряде случаев мозаично расположенными очагами гиперемии, и гипоксии
мозговой ткани.
2.5. Спазмы мозговых сосудов, вызванные серотонином
Моделирование цереброваскулярных расстройств серотонинергической
природы необходимо для поиска средств для лечения мигрени.
Эксперименты проводятся как на изолированных сосудах мозга, так и на целом
животном с регистрацией мозгового кровотока. Влияние веществ на
изменения мозгового кровотока и уровень артериального давления, вызванные
серотонином (20 мкг/кг внутривенно) изучают на кошках под общей
анестезией (уретан 500 мг/кг и хлоралоза 50 мг/кг внутривенно) в условиях
искусственной вентиляции легких с регистрацией напряжения углекисло-
- 336 -

ты в артериальной крови (рС02 = 38—40 мм рт. ст.). Мозговой кровоток
регистрируют с помощью ультразвукового или электромагнитного фло-
уметров, датчики которых диаметром 1—2 мм устанавливают на общей
сонной артерии. При этом тщательно перевязывают все артерии,
питающие кровью экстракраниальные ткани головы, а именно каудальную и
краниальную артерии, мышечные ветви, затылочную артерию, язычную,
наружную челюстную, большую ушную, поверхностную височную и
нижнюю зубную артерии. Артериальное давление регистрируют в бедренной
артерии. Серотонин (20 мкг/кг внутривенно) в большинстве опытов
вызывает уменьшение объемной скорости мозгового кровотока на 40—50 % и
понижение уровня артериального давления. Эффект серотонина
наблюдается сразу же после введения и продолжается 5—7 мин. Необходимо
отметить, что серотонин при многократном введении (4—6 раз) с интервалом в
30 мин вызывает аналогичные изменения мозгового кровотока и
артериального давления. Поэтому после двух контрольных реакций на серотонин
вводится испытуемое вещество и затем вновь вводится серотонин.
Учитывая необходимость перорального применения противомигренево-
го средства, после отбора эффективного соединения следует изучить его
влияние на изменения мозгового кровотока, вызваннные серотонином,
при введении per os. В этих опытах продолжительность наблюдения
увеличивается до 60—120 мин, что обусловлено особенностями прохождения
препарата через желудочно-кишечный тракт.
3. Изучение механизма действия
Для выяснения механизма действия отобранных на втором этапе
соединений рекомендуются следующие методические подходы:
3.1. Изучение собственно сосудистых механизмов действия,
включающее:
а) исследование воздействия на рецепторный аппарат стенок мозговых
сосудов с помощью агонистов и антагонистов адрено-, холино-, серотони-
но-, гистамино-, ГАМК-, пептидергических рецепторов (эксперименты in
vivo и in vitro с применением соответствующих анализаторов);
б) исследование мембранного компонента действия (определение
активности Na+, К+-АТФазы, Са2+-АТФазы), определение содержания
цАМФ в стенке мозговых сосудов, их способности продуцировать вазоак-
тивные простагландины, полипептиды и др.;
в) изучение влияния соединения на механизмы формирования
сосудистого тонуса гладкомышечных клеток, обмен ионов кальция в гладкомы-
шечных клетках.
3.2. Исследование влияния соединения на центральные механизмы
регуляции мозгового кровообращения путем изучения рефлекторных
реакций мозговых сосудов.
3.3. Изучение регуляции агрегатного состояния крови (агрегация
тромбоцитов, эритроцитов, гематокрит и вязкость крови).
3.4. Изучение влияния соединения на обмен нейромедиаторов (норад-
реналина, серотонина, ГДМК, глутамата, опиоидных пептидов и др.) в
центральной нервной системе.
3.5. Исследование метаболических аспектов действия соединения, в
частности на углеводный, белковый и липидный обмен мозговой ткани.
3.6. Изучение влияния соединения на содержание оксида азота и
продуктов перекисного окисления липидов в ткани мозга.
- 337-

3.7. Изучение влияния соединения на функциональное состояние
мозга.
3.8. Исследование противоотечных свойств соединения, его влияния на
уровень внутричерепного давления, вязкоэластические свойства мозга.
Этот этап исследования не является обязательным, но он направлен на
выяснение механизмов сосудистого, нейротролного и метаболического
действия соединения. Выбор конкретных методических подходов
определяется участием тех или иных возможных механизмов действия
соединения в патогенетической терапии конкретного сосудистого заболевания
мозга.
Методические указания по изучению обезболивающего
(морфиноподобного) действия и налоксоноподобной активности
фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н., проф. В. М. Булаев;
к. м. н. Н. В. Коробов
Общие положения
На препараты, предлагаемые для клинических испытаний в качестве
обезболивающих средств центрального действия и их антагонистов,
должны быть представлены материалы экспериментальных исследований,
характеризующие специфическую фармакологическую активность и общую
фармакологическую активность соединений.
Изучение специфической фармакологической активности новых
веществ с предполагаемыми свойствами обезболивающих средств должно
проводиться в прямом сравнении с наиболее известными и близкими по
химической структуре и рецепторной специфичности препаратами. Для
опиоидных анальгетиков препаратами сравнения могут быть опиоидные
агонисты — морфин или фентанил, парциальные агонисты — бупренор-
фин, агонисты-антагонисты, например буторфанол. Предполагаемые
специфические опиоидные антагонисты также должны сравниваться с
известными препаратами — налоксоном или налтрексоном
Если предполагается наличие обезболивающих свойств у препаратов не-
опиоидной структуры, например относящихся к агонистам альфа-2-адре-
норецепторов и ГАМК-рецепторов, антидепрессантам, противосудорож-
ным средствам и т. д., для сравнения должен быть выбран
соответствующий представитель — клофелин, баклофен, амитриптилин, карбамазепин
и т. д. Если предлагаемый анальгетик не имеет известного близкого
аналога, его следует сравнивать с несколькими препаратами из разных
фармакологических групп.
Эксперименты должны проводиться на нескольких видах животных при
различных путях введения исследуемых соединений. Обязательны способы
введения, рекомендуемые для клинического изучения препарата. Диапазон
доз, в которых следует изучать новое соединение, должен быть достаточно
широким от подпороговых до сублетальных и летальных.
При определении специфической активности нового соединения необ-
- 338-

ходимо установить общую продолжительность его действия, скорость
наступления эффекта, момент максимального действия, возможность
кумуляции при повторных введениях.
1. Требования, предъявляемые к изучению специфической
фармакологической активности соединений с предполагаемыми свойствами
опиоидных анальгетиков
Антиноцицептивное действие исследуемых соединений оценивают в
опытах на мышах, крысах или кроликах по способности ослаблять ноци-
цептивный ответ при механическом, электрическом, термическом и
химическом раздражении. Рекомендуется несколько путей введения
препарата — подкожный, внутримышечный, внутрибрюшинный и внутривенный,
а также под оболочки спинного мозга. Данные об антиноцицептивной
активности и продолжительности действия испытываемых соединений
представляют в статистически обработанном виде (с указанием эффективных
доз и временных отрезков с доверительным интервалом или другими
общепринятыми критериями достоверности) в сравнении с выбранными
эталонными препаратами. Специфичность опиоидного характера антиноци-
цептивного действия испытуемых соединений подтверждают в опытах с
использованием налоксона или налтрексона — опиоидных антагонистов,
которые предупреждают или устраняют антиноцицептивный эффект опио-
идов.
Аналогичный подход следует применять и при оценке других
фармакологических эффектов, обусловленных влиянием препаратов на опиоидные
рецепторы.
Для изучения специфической опиоидной активности целесообразно
использовать лишь широко применяемые и хорошо описанные в научной
литературе стандартные фармакологические тесты. Ниже приведен
примерный перечень наиболее распространенных тестов:
1.1. Дозированное механическое раздражение основания хвоста мышей
с помощью зажима (метод Гафнера) с альтернативным учетом
двигательной реакции животных.
1.2. Электрическое раздражение кожи хвоста крыс с определением
порога ноцицептивной реакции по писку ("вокализации") животных.
1.3. Термическое раздражение кожи хвоста мышей или крыс с
помощью сфокусированного теплового пучка (тест отдергивания хвоста) с
регистрацией латентного периода рефлекторного двигательного ответа.
1.4. Термическое раздражение кожи лап у мышей или крыс при
помещении животных на нагретую металлическую поверхность (тест "горячей
пластины") с регистрацией латентного периода двигательной реакции.
1.5. Химическое раздражение, вызываемое внутрибрюшинным
введением мышам или крысам 0,6 % раствора уксусной кислоты или другого
общепринятого альгетического вещества с оценкой характерных
двигательных ответов (тест "корчей").
1.6. Электрическая стимуляция пульпы зуба у кроликов с регистрацией
электрофизиологических ответов в различных отделах головного мозга.
1.7. Определение порога реакции на нанесение ноцицептивных
стимулов различной модальности при введении исследуемых соединений под
оболочки спинного мозга (в опытах на бодрствующих крысах или
кроликах с предварительно вживленными катетерами под оболочки мозга).
Тесты 1.1.—1.7 позволяют получить спектр антиноцицептивных характе-
- 339-

ристик испытываемых соединений и в определенной степени
прогнозировать характер возможного обезболивающего действия у человека.
Допускается использование и других тестов, отражающих особенности
антиноцицептивного действия исследуемых веществ.
1.8. Влияние на дыхание. В опытах на бодрствующих и
наркотизированных крысах или кроликах оценивают влияние испытуемых соединений
(при подкожном и внутривенном введении) на частоту и объем дыхания, а
также способность специфических антагонистов восстанавливать дыхание.
1.9. Влияние на кашлевой рефлекс. На наркотизированных кошках при
электрической стимуляции верхнего гортанного нерва регистрируют спи-
рограмму и нейрограмму диафрагмального нерва. В качестве препарата
сравнения используют кодеин.
1.10. Влияние на моторику желудочно-кишечного тракта. В опытах на
мышах или крысах оценивают скорость продвижения активированного
угля по кишечнику животных в сравнении со стандартным препаратом.
1.11. Влияние на сократительную активность изолированных органов
животных. Для оценки опиоидного рецепторного механизма действия
исследуемых соединений оценивают их влияние на спонтанные и вызванные
стандартной электрической стимуляцией сокращения изолированного
сегмента подвздошной кишки морской свинки (главным образом, мю-рецеп-
торный компонент), семявыносящего протока мышей (в основном, дельта-
рецепторный компонент) и семявыносящего протока кролика (каппа-ре-
цепторный компонент), а также способность налоксона или налтрексона
ослаблять или устранять угнетающее действие предполагаемых опиоидных
агонистов. При наличии у препарата других механизмов действия
(например, адренергических или серотонинергических) необходимо
подтверждение этого на соответствующих общепринятых экспериментальных моделях.
Целесообразно оценить рецепторные свойства исследуемых веществ в
экспериментах с радиолигандным связыванием на биологических препаратах
соответствующих рецепторов.
1.12. Исследование толерантности к антиноцицептивному действию.
Опыты проводятся с использованием ряда тестов, указанных в п.п 1.1—1.7
в течение 10—30 дней в зависимости от предполагаемой
продолжительности применения препарата.
1.13. Изучение способности вызывать физическую зависимость.
Исследуемые соединения подлежат тестированию согласно соответствующим
методическим рекомендациям Минздрава России.
2. Требования, предъявляемые к изучению специфической
фармакологической активности соединений с предполагаемыми свойствами
антагонистов опиоидных анальгетиков
У соединений с предполагаемыми свойствами антагонистов опиоидных
анальгетиков оценивают способность устранять и предупреждать эффекты,
вызываемые морфином и другими опиоидными анальгетиками. В качестве
препарата сравнения используют налоксон или налтрексон. Испытуемые
соединения вводят подкожно или внутривенно до и после инъекции
стандартной дозы исследуемого аналгетика. Оценивают количественно
способность исследуемых соединений ослаблять или блокировать эффекты
опиоидных анальгетиков по следующим тестам:
2.1. Влияние на ноцицептивную реакцию (см. п.п. 1.1.— 1.7).
2.2. Влияние на дыхание (см. п. 1.8).
-340-

2.3. Влияние на моторику желудочно-кишечного тракта (см. п. 1.10).
2.4. Влияние на сократительную активность изолированных органов
животных (см. п. 1.11).
При получении результатов, подтверждающих наличие у исследуемых
соединений высокой специфичности антиопиоидного действия,
необходимо провести более детальное изучение спектра их фармакологической
активности.
2.5. Исследование стимулирующего влияния на центральную нервную
систему. В опытах на мышах оценивают способность соединений влиять
на продолжительность гексеналового и этанолового наркоза, на
проявления центрального действия резерпина или тетрабеназина, фенамина,
апоморфина и, при необходимости, других фармакологических
стандартов.
2.6. Влияние на течение геморрагического шока. В опытах на
наркотизированных крысах или кроликах изучают способность испытуемых
соединений изменять артериальное давление при дозированной кровопо-
тере.
3. Требования, предъявляемые к изучению специфической
фармакологической активности соединений неопиоидного ряда, обладающих
обезболивающими свойствами
Антиноцицептивные свойства соединений неопиоидного ряда
целесообразно исследовать по схеме, рекомендованной для опиоидных
препаратов, с добавлением необходимых моделей, характеризующих особенности
действия изучаемых соединений в соответствии с предполагаемым
клиническим применением. Желательно получить максимально возможный
спектр антиноцицептивного действия и подтвердить неопиоидный
характер основных эффектов, установить рецепторный или медиаторный
механизм действия, а также показать эффективность специфических
антагонистов, если они имеются.
Обязательно исследование толерантности и способности вызывать
физическую лекарственную зависимость.
4. Требования, предъявляемые к изучению общих фармакологических
свойств и токсичности соединений с предполагаемыми свойствами
обезболивающих средств преимущественно центрального действия
и их антагонистов
Изучение общих фармакологических свойств новых соединений
проводят на нескольких видах животных с использованием различных путей
введения и широкого диапазона доз препаратов.
4.1. Влияние на спонтанную и стимулируемую двигательную активность
(с использованием актографа или "открытого поля"), координацию
движений, мышечный тонус, уровень возбудимости центральной нервной
системы, простые и условные рефлексы у крыс или мышей.
4.2. Влияние на сердечно-сосудистую систему (уровень артериального
давления, ЭКГ, сократимость миокарда) изучают на крысах и кроликах.
4.3. Влияние на температуру тела (измеряют ректальную температуру) у
крыс или мышей.
4.4. Влияние на биоэлектрическую активность мозга исследуют на не-
- 341 -

наркотизированных крысах или кроликах с хронически вживленными
электродами в области коры и подкорковых образований мозга.
4.5. Изучение фармакокинетики проводится так же, как и для других
групп нейротропных средств. При этом обязательным является
определение биодоступности лекарственных форм при рекомендуемых путях
введения препаратов.
Фармакокинетические исследования должны быть направлены на
установление терапевтической концентрации, периода полусуществования
препарата, на выявление активных метаболитов и путей выведения из
организма животных как основного вещества, так и его метаболитов.
При выявлении активных метаболитов следует оценить их вклад в
развитие основных и побочных эффектов исследуемого соединения.
Экспериментальная работа по изучению острой и хронической
токсичности, специфических видов токсичности (аллергогенность, тератоген-
ность, мутагенность, канцерогенность и др.) проводится и оформляется в
соответствии с действующими методическими рекомендациями
Фармакологического комитета Минздрава России.
Методические указания по изучению препаратов для лечения
алкоголизма
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н., проф. А. И. Майский;
д. б. н. Р. М. Салимое.
Настоящие методические указания имеют целью унификацию
методического подхода к изысканию новых фармакологических средств для
лечения алкоголизма. Представленная система тестов предполагает
выявление у изучаемых веществ способности ослаблять сформированную
алкогольную мотивацию и предупреждать формирование алкогольной
мотивации. Кроме того, предлагаемые тесты позволяют оценить
выраженность толерантности к алкоголю, симптомы алкогольной интоксикации,
абстиненции и поведенческие маркеры алкогольной мотивации. При
наличии соответствующих данных, основанных на сведениях о механизме
действия изучаемого фармакологического вещества, помимо тестов,
рекомендуемых данной системой, могут быть выполнены и иные
исследования.
Согласно современным представлениям, алкогольная интоксикация,
толерантность, синдром отмены алкоголя и алкогольная мотивация по
своим генетическим и нейробиологическим механизмам являются
относительно независимыми феноменами, требующими поиска различных
способов их купирования. Особенностью новейших исследований, кроме
того, является большое внимание к выявлению маркеров склонности к
формированию алкогольной мотивации с целью определения среди
населения групп риска и планирования необходимых для них
профилактических мероприятий, включая применение фармакологических средств.
Последнее также требует обеспечения соответствующих доклинических
исследований.
- 342 -

1. Методические приемы, используемые при изучении фармакологических
средств для лечения алкоголизма
/. /. Растворы алкоголя и условия их предоставления животным для оценки
алкогольной мотивации
Исторически традиционным является предоставление лабораторным
животным свободного доступа к двум сосудам, один из которых содержит
10 % или 15 % раствор этанола, а другой — чистую воду. Если
лабораторные животные принадлежат к одной из линий, выведенных путем отбора
особей, предпочитающих раствор этанола воде (крысы линий АА, Р, sP,
HAD1, HAD2, а также мыши линии C57BL и их сублинии), то достаточно
1 мес доступа к алкоголю для формирования у большинства из них
алкогольной мотивации. Если лабораторные животные не принадлежат к одной
из указанных генетических линий, то необходим 4—8-месячный период
доступа к алкоголю, по завершении которого следует произвести
предварительный отбор особей, предпочитающих раствор этанола воде и
потребляющих метаболически значимые дозы алкоголя (не менее 5 г/кг в сутки).
В последнее десятилетие, с целью предоставления животным возможности
потреблять более высокие дозы алкоголя, была обоснована возможность
использования и более высоких концентраций этанола (до 30 %), а также
вкусовых добавок, таких как 0,1 % сахарин, 0,02 % ментол и др.,
корректирующих неприятный вкус этанола. Благодаря этому у животных, не
принадлежащих к указанным выше линиям генетических "алкоголиков", срок
формирования алкогольной мотивации сокращается до 1—2 мес. Во время
оценки индивидуального потребления алкоголя животным предлагают
выбор между двумя сосудами с раствором алкоголя или водой, содержащими
одинаковые вкусовые добавки.
В экспериментах используют взрослых самцов крыс или мышей.
Животных следует снабдить индивидуальными метками и содержать в
группах, поскольку известно, что изоляция от особей своего вида является
стрессовым фактором, влияющим на потребление алкоголя. В связи с этим
оценка индивидуального потребления алкоголя каждым животным в
условиях изолированного содержания не должна продолжаться более 5 сут.
1.1.2. Формированиея алкогольной мотивации
В период формирования алкогольной мотивации животные должны
постоянно иметь свободный доступ к стандартному сухому
брикетированному корму, бутылке с чистой водой и дополнительному сосуду с раствором
этилового спирта, имеющему соответствующую метку. Жидкости должны
обновляться не реже 2—3 раз в неделю. Во избежание выработки реакции
на определенное положение бутыли, сосуды с водой и алкоголем следует
менять местами не реже 2 раз в неделю. Раствор алкоголя должен быть
доступен все время.
1.1.2. Оценка индивидуального потребления жидкостей в условиях свободного
доступа к алкоголю
Для оценки индивидуального потребления жидкостей животных следует
поместить на короткий промежуток времени (от 24 ч до 5 сут) в индивиду-
- 343 -

альные клетки. Животные должны иметь свободный доступ к пище и двум
градуированным сосудам, содержащим воду и тот же раствор алкоголя,
который они получали в общих клетках. Если животным ранее
предоставляли подслащенный алкоголь, то при индивидуальном тесте им должен быть
предоставлен выбор между раствором алкоголя и водой, имеющими
одинаковые вкусовые добавки. Если используется высокая концентрация
алкоголя (около 30 %), то для предупреждения вытекания и испарения его
раствора в данном тесте рекомендуется использовать пипетки, нижний
конец которых L-образно изогнут и имеет небольшое отверстие для питья
(1,5 х 3 мм), открывающееся вверх. Количество раствора спирта и воды
оценивают по градуировке сосудов. Количество жидкостей в сосудах
измеряют перед помещением животных в индивидуальные клетки и затем через
каждые 24 ч теста.
По завершении индивидуального теста определяют массу тела
животных; потребление спирта и воды выражают в г/кг в час.
Рекомендуется также иметь клетки без животных, снабженные сосудами
с водой и алкоголем, для получения калибровочных измерений для оценки
влияния посторонних случайных событий (вибрация, толчки, перепады
температуры и др.).
1.1.3. Оценка алкоголь-депривационного эффекта
В период депривации продолжительностью около 3 сут животные
остаются в своих жилых клетках, а бутылку с раствором алкоголя заменяют на
бутылку с водой. В случае если животные имели доступ к подслащенному
раствору алкоголя, то на период алкогольной депривации последний
следует заменить на воду с такими же вкусовыми добавками. Оценку
индивидуального потребления жидкостей осуществляют в тех же условиях, что и в
тесте 1.1.1. Количество жидкостей в сосудах измеряют в следующие
моменты времени:
— перед помещением животных в индивидуальные клетки;
— через 1,5 ч после начала индивидуального теста;
— через 24 ч после начала индивидуального теста;
— при тесте продолжительностью более суток — каждые последующие
24 ч.
По завершении' индивидуального теста определяют массу тела
животных и потребление спирта и воды, выражающееся в г/кг в час. Оценивают
амплитуду алкоголь-депривационного эффекта в виде разницы между
темпом потребления алкоголя в первые 1,5 ч после депривации и таковым до
депривации, а также скорость восстановления потребления алкоголя до
уровня, имевшегося перед лишением алкоголя.
1.2. Тест этанолового наркоза
Животным внутрибрюшинно вводят 12,5 % раствор этанола. Объем
вводимого раствора выбирается пропорционально массе тела так, чтобы
боковое положение у животных контрольной группы продолжалось 1—2 ч,
что позволяет зарегистрировать как усиление, так и ослабление
наркотического действия этанола под влиянием изучаемого вещества.
Животных располагают на горизонтальной поверхности при
постоянной комнатной температуре и протоколируют время наступления этаноло-
- 344-

вого наркоза и выхода из него по критерию перехода в неподвижное
лежачее положение и выхода из него. Следует учитывать, что данный тест
чувствителен к изменению температуры и физиологическому состоянию
животных. Он применяется для суммарной оценки активности этанол-мета-
болизирующих систем и чувствительности центральной нервной системы к
этанолу
1.3. Тест крестообразного лабиринта
Крестообразный лабиринт состоит из 4 камер (пронумерованных 1, 2,
3, 4), соединяющихся между собой через такую же пятую центральную
камеру. Тупиковые и центральная камера лабиринта для мышей
представляют собой куб с ребром длиной 15 см и отверстием для входа
сечением 7x7 см. В лабиринте для крыс центральная камера представляет
собой куб с ребром длиной 20 см, а тупики имеют размеры 30 х 20 х 20 см
и соединяются с центральной камерой отверстием для входа сечением
12 х 12 см.
Животное помещают в центральную камеру, сверху лабиринт
закрывают прозрачной крышкой и позволяют ему исследовать помещения
аппарата до тех пор, пока животное не произведет 13 посещений его
тупиковых камер. Заход в тупик считают состоявшимся, если животное
переносит все 4 лапы в это отделение лабиринта. Последовательность переходов
и их продолжительность регистрируют с помощью программы
персонального компьютера. Последующий анализ осуществляют с помощью
другой программы, которая выделяет и оценивает следующие виды
поведения:
— Общее время в лабиринте, затраченное на 13 заходов в его тупики,
являющееся коррелятом исследовательской активности в тесте открытого
поля.
— Латентный период начала исследования лабиринта — время между
помещением животного в центральную камеру и его первым заходом в
тупик. Этот показатель коррелирует с избеганием посещения открытых
рукавов приподнятого плюс-образного лабиринта и предложен для отбора ан-
ксиолитического действия веществ.
— Полный обход лабиринта, продолжающийся до того момента, когда
будут посещены все его отсеки. Это поведение отражает способность к
пространственной ориентации и рассматривается как одна из форм
элементарной рассудочной деятельности у животных Чем более эффективна
пространственная ориентация, тем меньше число визитов, затраченных на
первый полный обход, и больше общее число совершенных полных
обходов.
— Возврат в тупик, посещенный при предыдущем визите. Это
поведение рассматривается как показатель ошибок краткосрочной памяти.
— Поочередное посещение двух из четырех тупиков, которое
интерпретируется как поведенческая стереотипия. Такой эпизод поведения имеет
Mecio, если в течение трех или более визитов в тупики подряд посещались
какие-либо 2 из 4 отсеков
— Количество правых и левых поворотов при переходе из тупика в
тупик через центральный отсек лабиринта, отражающие степень асимметрии
локомоции.
-345 -

1.4. Тест неизбегаемой скользкой воронки
Аппарат представляет собой стеклянную воронку с высокими
бортиками, основание которой наполнено водой комнатной температуры.
В аппарате для крыс верхняя цилиндрическая часть имеет диаметр 40 см
и высоту 18 см, нижняя цилиндрическая часть имеет диаметр 10 см и высоту
6 см, а средняя коническая часть, сужающаяся по углом около 40 градусов,
имеет высоту около 14 см.
В аппарате для мышей верхняя цилиндрическая часть имеет диаметр
27 см и высоту 8 см, нижняя цилиндрическая часть имеет диаметр 5 см и
высоту 4 см, а средняя коническая часть сужается по углом около 40
градусов и имеет высоту около 9 см.
Животное помещают в нижнюю часть воронки таким образом, что, стоя
в ее основании, оно находится примерно по пояс в воде. В течение 3 мин
регистрируют продолжительность следующих видов поведения:
— нахождение в воде на дне воронки;
— вылезание из воды и принятие распластанной позы над водой в
горловине воронки, считавшееся мерой пассивного избегания воды;
— попытки выпрыгнуть из воронки, служившие мерой активного
избегания воды.
Первый показатель имеет положительную, второй и третий —
отрицательную корреляцию с так называемым поведением "отчаяния" в тесте
вынужденного плавания.
1.5. Реакция вздрагивания при предъявлении резкого звука
Животным предъявляют 5 громких звуковых стимулов с интервалом
16—20 с в момент, когда мышь всеми 4 лапами стояла на полу.
Приблизительные параметры звука: частота около 10 кГц, интенсивность около
ПО дБ, длительность звукового импульса 0,2 с (время нарастания импульса
порядка 0,05 с). Реакцию оценивали в баллах: 0 — видимое отсутствие
реакции; 1 — замирание; 2 — вздрагивание, 3 — прыжок.
Усиление реакции вздрагивания является компонентом синдрома
отмены алкоголя, который угасает в течение первых 2 сут абстиненции.
/. 6. Введение фармакологических веществ
Изучаемое фармакологическое вещество растворяют в 0,9 % растворе
NaCl. При необходимости применяют эмульгатор типа Твин. Растворы
готовят таким образом, чтобы животные получали инъекции объемом 10 мл
на 1 кг массы тела. Контрольным животным вводят 0,9 % раствор NaCl
или соответственно 0,9 % раствор NaCl с Твином.
Во избежание излишнего стресса для животных, их следует
предварительно приучать к взятию в руки. При выполнении инъекции следует
фиксировать животное руками и применять достаточно острые иглы для
шприцов. С целью уменьшения влияния случайных факторов
необходимо осуществлять все варианты эксперимента одновременно, а если это
невозможно, то применять схему планирования последовательного
псевдослучайного порядка выполнения эксперимента типа латинских
квадратов.
- 346 -

2. Организация экспериментов по изучению потенциальных средств
для лечения алкоголизма
Хотя положительный алкоголь-депривационный эффект является
реакцией на отмену алкоголя, его динамика не соответствует таковой для
синдрома "физической" зависимости. У крыс алкоголь-депривационный
эффект усиливается в первые дни абстиненции, достигая максимума к 2—
7-му дню лишения алкоголя, и его величина остается относительно
неизменной при более длительной абстиненции (до нескольких месяцев).
Синдром физической зависимости от алкоголя, состоящий у крыс и мышей в
усилении реакции вздрагивания и двигательной активности в новой
обстановке, напротив, достигает максимума в первые сутки абстиненции и
угасает в течение последующих 1—2 сут лишения алкоголя. Толерантность к
наркотическому действию этанола также угасает в течение первых 1—2 сут
лишения алкоголя.
Что касается линий животных, выведенных по различиям в их
предпочтении алкоголя, то различия между ними по показателям этанолового
наркоза не коррелируют с различиями в их алкогольной мотивации. Так,
крысы линии М по сравнению с крысами линии ANA имеют больший
латентный период и меньшую продолжительность бокового положения тела
после введения тест-дозы этанола. В то же время между крысами линий Р и
NP по данному тесту не обнаружено существенных различий.
В экспериментах следует использовать взрослых самцов крыс или
мышей. Возраст животных в течение всего периода работы с ними должен
находиться в пределах 2—10 мес. Животных распределяют на
необходимое число групп, например на одну контрольную и несколько
экспериментальных групп, предназначенных для испытания разных доз
вещества. Оптимальным количеством особей в каждой группе является 15—20.
Подбор животных в группы осуществляется таким образом, чтобы все
изучаемые исходные показатели потребления воды и раствора этанола не
обнаруживали статистически значимой разницы при сравнении
контрольной группы с каждой из экспериментальной групп. При
планировании эксперимента с участием интактных животных, например для
определения наркотического действия этанола, животных распределяют по
группам случайным образом.
При выборе доз изучаемого фармакологического вещества необходимо
убедиться в том, что максимальная из планируемых к испытанию доз не
превышает 1/20 от LD50 острой токсичности для данного вещества. Следует
также предварительно убедиться в том, что в изучаемом диапазоне доз
данное вещество не усиливает симптомы алкогольной интоксикации (см.
тест 2.1).
2.1. Оценка влияния фармакологических веществ на симптомы алкогольной
интоксикации
Используются интактные животные. Для эксперимента могут быть
использованы тесты 1.2 или 1.3. Изучаемое вещество вводится через 10 мин
после внутрибрюшинного введения этанола.
В тесте 1.3 наблюдаются наиболее выраженные признаки алкогольной
интоксикации, поскольку данный тест предполагает использование
животными двигательных навыков, связанных с ориентацией в пространстве.
Этанол используется в дозах 1—3 г/кг у крыс и 2—4 г/кг у мышей. Крите-
- 347-

рием влияния на эффект этанола является изменение скорости и
эффективности ориентации в пространстве.
Более высоких доз этанола требует тест 1.2. Этанол используется в
дозах около 4,5 г/кг у крыс и 5,5 г/кг у мышей. При этом следует
подобрать такую дозу, чтобы боковое положение у животных контрольной
группы продолжалось 1—2 ч, что позволяет зарегистрировать как
усиление, так и ослабление наркотического действия этанола под
влиянием изучаемого вещества. Критерием влияния на эффект этанола
является изменение скорости наступления или прекращения бокового
положения тела.
Уменьшение признаков алкогольной интоксикации под влиянием
изучаемого фармакологического вещества интерпретируется как
вытрезвляющий тип действия данного соединения.
2.2. Оценка влияния фармакологических веществ на сформированную
алкогольную мотивацию
В экспериментах используют крыс или мышей, которые в условиях
свободного доступа к алкоголю предпочитают его воде и потребляют не менее
0,21 г/кг в час (5 г/кг в сутки) и которые после кратковременного лишения
алкоголя демонстрируют увеличение его потребления по сравнению с
периодом до депривации (см. разделы 1.1.1, 1.1.2 и 1.1.3).
После предварительного теста на наличие алкоголь-депривационного
эффекта и распределения животных на группы их в течение не менее 2 нед
содержат в общих клетках в условиях свободного доступа к воде и раствору
алкоголя. После этого приступают к введению изучаемого вещества.
Последнее, в зависимости от ожидаемых механизмов его действия, может
о
я
X
ю
1_
of
с;
О
i_
О
с;
я
ш
X
ш
с;
VD
Ш
О.
(-
с "'" 1 2 3 ~4 7 14~~
Длительность лишения алкоголя, дни
Рис. 1. Потребление алкоголя в субпопуляции мышей (гибридов линий
C57BL х СВА), имеющей алкоголь-депривационный эффект после 12 недель
доступа к 30 % алкоголю с добавлением 0,1 % сахарина и 0,02 % ментола. Представлены
результаты повторного теста, выполненного после лишения алкоголя на 1, 2, 3, 4, 7
или 14 суток, при котором в течение суток мыши имели доступ к 30 % алкоголю и
воде с добавлением 0,1 % сахарина и 0,02 % ментола.
Заштрихованные столбики — первые 1,5 часа; белые столбики — последние 22,5 часа;
•статистически значимое различие (р < 0,05, t — критерий Стьюдента) между измерениями,
выполненными в течение первых 1,5 часов и последующих 22,5 часов теста, выявляющее алкоголь-
депривационный эффект.
- 348 -
2,0
1,5
1.0
0,5
У
111
/
/
/
/
/
1| /
/
и
У
/
/
' 1
к
1

осуществляться как в период свободного доступа животных к алкоголю,
так и в условиях его лишения.
Оптимальной продолжительностью введения вещества является 2-не-
дельный период. Однако при наличии предпосылок, связанных с
известными особенностями механизма действия изучаемого вещества,
продолжительность этого периода может быть изменена.
По завершении периода введения вещества проводят 2—3
последовательных теста на алкоголь-депривационный эффект (см. раздел 1.1.3) с
интервалом в 1 нед между тестами. Критерием уменьшения алкогольной
мотивации является уменьшение амплитуды алкоголь-депривационного
эффекта по сравнению с контрольной группой, получавшей плацебо.
При наличии такого эффекта изучаемого вещества рекомендуется
выявить продолжительность существования данного эффекта после
окончания периода инъекций вещества.
2.3. Оценка влияния фармакологических веществ на формирование
алкогольной мотивации
Данный тест аналогичен тесту 2.2. В экспериментах используют интакт-
ных крыс или мышей. В зависимости от ожидаемых механизмов действия
изучаемого вещества, его введение может осуществляться как до
предоставления доступа к алкоголю, так и в период свободного доступа к нему.
Продолжительность введения вещества выбирается исходя из
предполагаемых механизмов действия изучаемого вещества, но должна быть не менее
2 нед. По завершении периода введения вещества и предварительного
доступа к алкоголю проводят 2—3 последовательных теста на
алкоголь-депривационный эффект (см. раздел 1.1.3) с интервалом в 1 нед между тестами.
Критерием замедления формирования алкогольной мотивации является
уменьшение в популяции количества особей, имеющих
алкоголь-депривационный эффект, и уменьшение амплитуды последнего по сравнению с
контрольной группой, получавшей плацебо.
2.4. Оценка влияния фармакологических веществ на сформированную
толерантность к алкоголю
Используются интактные животные и животные, имевшие
продолжительный доступ к алкоголю, предпочитающие его воде и потребляющие не
менее 0,21 г/кг в час (5 г/кг в сутки).
Для эксперимента могут быть использованы тесты 1.2 или 1.3. Изучаемое
вещество вводится через 10 мин после внутрибрюшинного введения этанола.
В тесте 1.3 этанол используют в дозах 1—3 г/кг у крыс и 2—4 г/кг у мышей.
Изучаемыми показателями являются скорость и эффективность ориентации
в пространстве. В тесте 1.2 этанол используют в дозах около 4,5 г/кг у крыс
и около 5,5 г/кг у мышей. Изучаемыми показателями являются скорость
наступления и продолжительность бокового положения тела.
Степень толерантности к этанолу оценивают по различиям в изучаемых
показателях между группами животных, имевшими или не имевшими
предварительный доступ к алкоголю. Критерием влияния
фармакологического вещества на толерантность к этанолу является изменение указанной
разницы между животными, имевшими или не имевшими доступ к
алкоголю, по сравнению с контрольными группами, которым назначали плацебо.
- 349-

Мыши сАДЭ
Рис. 2. Потребление алкоголя в субпопуляции мышей (гибридов линий
C57BL х СВА), имеющей алкоголь-депривационный эффект после 12 недель
доступа к 30 % алкоголю с добавлением 0,1 % сахарина и 0,02 % ментола. Представлены
результаты повторного теста, выполненного после лишения алкоголя на 1, 2, 3, 4, 7
или 14 суток, при котором в течение суток мыши имели доступ к 30 % алкоголю и
воде с добавлением 0,1 % сахарина и 0,02 % ментола.
Заштрихованные столбики — первые 1,5 часа; белые столбики — последние 22,5 часа;
♦статистически значимое различие (р < 0,05, t — критерий Стьюдента) между измерениями,
выполненными в течение первых 1,5 часов и последующих 22,5 часов теста, выявляющее алкоголь-
депривационный эффект.
Мыши без АДЭ
Рис. 3. Латентный период (слева) ч продолжительность (справа) бокового
положения тела после в/б введения этанола (5 г/кг) в период после лишения алкоголя
длительностью 1, 2 или 3 суток у мышей-гибридов линий C37BL х СВА, имевших
(мыши с АДЭ — заштрихованные столбики) или не имевших (мыши без АДЭ — белые
столбики) алкоголь-депривационного эффекта после 11 недель доступа к 30 %
алкоголю с добавлением 0,7 % сахарина и 0,02 % ментола.
Пунктирная линия — показатели у контрольных мышей, на имевших доступа к алкоголю & —
статистически значимое различие (р < 0,05, t-критерий Стьюдента) между группами мышей,
имевших или не имевших предварительный доступ к алкоголю.
- 350-

2.5. Оценка влияния фармакологических веществ на формирование
толерантности к алкоголю
Данный тест аналогичен тесту 2.4. В экспериментах используют интакт-
ных крыс или мышей. В зависимости от предполагаемых механизмов
действия изучаемого вещества, его вводят как до предоставления доступа к
алкоголю, так и в период свободного доступа к нему. Продолжительность
введения вещества выбирается исходя из предполагаемых механизмов его
действия, но не менее чем в течение 2 нед.
По завершении периода введения вещества и предварительного доступа
к алкоголю животных лишают алкоголя и применяют тесты 1.2 или 1.3.
Изучаемое вещество вводят через 10 мин после внутрибрюшинного
введения этанола. В тесте 1.3 этанол используют в дозах 1—3 г/кг у крыс и 2—4
г/кг у мышей. В тесте 1.2 этанол используют в дозах около 4,5 г/кг у крыс
и около 5,5 г/кг у мышей. Изучаемыми показателями являются скорость
ориентации в пространстве, а также скорость наступления и
продолжительность бокового положения тела. Влияние изучаемого
фармакологического вещества на формирование толерантности к этанолу оценивают по
изменению разницы в изучаемых показателях между группами животных,
имевших или не имевших предварительный доступ к алкоголю, по
сравнению с контрольными животными, получавшими плацебо.
2.6. Оценка влияния фармакологических веществ на симптомы алкогольной
абстиненции
Используются интактные животные и животные, имевшие
продолжительный доступ к алкоголю, предпочитающие его воде и потребляющие не
менее 0,21 г/кг в час (5 г/кг в сутки).
Для эксперимента могут быть использованы тесты 1.3 или 1.5.
Изучаемыми показателями являются скорость ориентации в пространстве и
амплитуда реакции вздрагивания. Выраженность алкогольной абстиненции
оценивают по различиям в изучаемых показателях между группами
животных, имевших или не имевших предварительный доступ к алкоголю.
Критерием влияния фармакологического вещества на признаки
алкогольной абстиненции является изменение указанной разницы между
животными, имевшими или не имевшими доступа к алкоголю, по сравнению
с контрольными животными, получавшими плацебо.
2.7. Оценка влияния фармакологических веществ на формирование
симптомов алкогольной абстиненции
Данный тест аналогичен тесту 2.6. В экспериментах используют интакт-
ных крыс или мышей. В зависимости от предполагаемых механизмов
действия изучаемого вещества его вводят до предоставления доступа к
алкоголю или в период свободного доступа к нему. Продолжительность введения
вещества зависит от предполагаемых механизмов действия изучаемого
вещества, но должна быть не менее 2 нед. По завершении периода введения
вещества и предварительного доступа к алкоголю животных лишают
алкоголя и применяют тесты 1.3 или 1.5. Изучаемыми показателями являются
скорость ориентации в пространстве и амплитуда реакции вздрагивания.
Влияние фармакологического вещества на формирование алкогольной аб-
-351 -

О)
s
s
Q.
О
Ь
CO
a
о
ю
CO
c;
CO
o;
2
a>
a
230
210
190 -
170
150
I
2 3 6
Длительность лишения алкоголя (дни)
Мыши сАДЭ
Мыши безАДЭ
Рис. 4. Продолжительность исследования крестообразного лабиринта посте
лишения алкоголя длительностью 1, 2, 3 или 6 суток у мышеи гибридов линии
C57BI х СВА, имевших (мыши с АДЭ — заштрихованные столбики) или не
имевших (мыши без АДЭ — белые столбики) положительного алкоголь-депривационно-
го эффекта после 11 недель доступа к 30 % алкоголю с добавлением 0,1 % сахарина
и 0,02 % ментола.
Пунктирная линия обозначает соответствующий показатель у контрольных мышей, не
имевших доступа к алкоголю & — статистически значимое различие (р < 0,05, t-критерий Стью-
дента) между группами мышей, имевших или не имевших предварительный доступ к
алкоголю.
стиненции оценивают по изменению различии в изучаемых показателях
между группами животных, имевших или не имевших предварительный
доступ к алкоголю, по сравнению с животными, которым назначали
плацебо.
2.8. Оценка влияния фармакологических веществ на признаки
предрасположенности к формированию алкогольной мотивации
В настоящее время установлено, что животные, имеющие в результате
направленной селекции врожденное предпочтение алкоголя,
характеризуются типологическими различиями, сходными с таковыми у алкоголиков
1-го или 2-го типа по Cloninger. Сравнение линий указанных эталонных
крыс, сгруппированных по типу имеющейся у них алкогольной
мотивации, по показателям их исследовательского поведения и поведения в неиз-
бегаемой ситуации (тесты 1.3 и 1.4.) приведены в табл.
В тесте крестообразного лабиринта латентный период начала
исследовательского поведения обнаруживает значительное различие и при
сравнении линий крыс, сгруппированных по типу имеющейся у них алкогольной
- 352-

Рис. 5. Реакция вздрагивания (5 предъявлений с интервалом 16—20 секунд резкого
звукового щелчка 9 кГц громкостью 108 дбА) после лишения алкоголя на 1 или 2
суток у мышей-гибридов линии C57BL х СВА, имевших (мыши с АДЭ —
заштрихованные столбики) или не имевших (мыши без АДЭ — белые столбики)
положительного алкоголь-депривационного эффекта после 11 недель доступа к 30% алкоголю с
добавлением 0,1 % сахарина и 0,02 % ментола.
Пунктирная линия обозначает соответствующие показатели у контрольных мышей, не
имевших доступа к алкоголю. *— статистически значимое различие (р < 0,05, t-критерий Стьюден-
та) между группами мышей, имевших или не имевших доступ к алкоголю.
мотивации. Данный показатель, рассматриваемый как проявление тревоги
по отношению к новой обстановке, больше у всех линий, предпочитающих
алкоголь, по сравнению с соответствующими не предпочитающими
линиями. При этом абсолютная величина различия между алкоголь-предпочи-
тающей и непредпочитающей линиями меньше у крыс с алкогольной
мотивацией 2-го типа (0,9 ± 0,3 с — линия М по сравнению с ANA; 2,1 ± 0,3
с — линия Р по сравнению с NP) в отличие от крыс с алкогольной
мотивацией 1 типа (5,4 ± 2,2 с — линия HAD1 по сравнению с LAD1; 8,3 ± 3,1
с — линия HAD2 по сравнению с LAD2). Хотя общая продолжительность
исследовательского поведения не различается статистически значимо в
указанных парах линий крыс, предпочитающих и не предпочитающих
алкоголь, данный показатель также был значимо меньше у крыс с
мотивацией 2-го типа. Этот показатель характеризует время, затрачиваемое на
ориентировочно-исследовательскую деятельность, и является аналогом
соответствующих показателей в тесте открытого поля.
Поведение в неизбегаемой ситуации скользкой воронки также
отличается при сравнении указанных пар линий, а направленность этих различий
противоположна у линий, сгруппированных по типу имеющейся у них
алкогольной мотивации. Непосредственное сравнение линий,
сгруппированных по типу имеющейся у них алкогольной мотивации, также
свидетельствует о более выраженном поведении избегания у линий АА и Р, имеющих
алкогольную мотивацию 2-го типа. При этом крысы линий М и Р имеют
более продолжительные попытки избегания в данной ситуации по
сравнению с соответствующими не предпочитающими линиями. Крысы же ли-
12 - 762
353

Таблица. Поведение крыс с алкогольной мотивацией 1-го (линии HAD1 и HAD2) и 2-
го (линии АА и Р) типа по Cloninger в крестообразном лабиринте и скользкой воронке
(средняя величина и стандартная ошибка)
Классификация по типу алкогольной
мотивации по Cloninger
Тип 2 (АА, Р)
Тип 1 (HAD1, HAD2)
Тест крестообразного лабиринта
Латентный период 1-го визита (с)
Общее время в лабиринте (с)
Число визитов при первом патрулировании
Число патрулирований
Число возвратов
Число стереотипных визитов
Число поворотов направо
Число поворотов налево
Число дефекаций
3,7 + 03***
231,9 ± 16,3**
5,7 + 0,3
2,4 ± 0,1
03 + 0,1
4,9 ± 0,5
3,4 ± 0,3
3,3 ± 0,3
0,9 + 0,2
13,3 ± 2,2
325,5 + 20,3
5,3 + 0,3
2,5 + 0,1
0,2 + 0,1
5,0 + 0,1
3,5 + 0,4
4,0 + 0,4
1,0 + 0,4
Тест скользкой воронки
Время неподвижности в воде (с)
Время пассивного избегания (с)
Время попыток активного избегания (с)
89,6 + 6,7**
60,4 + 6,0**
30,5 ± 3,4***
144,8 + 8,4
32,0 + 8,1
2,6 + 0,6
** и *** _ статистически значимое (р < 0,01 и < 0,001) различие между типологическими
группами линий по t-критерию Стьюдента.
ний HAD1 и HAD2, напротив, демонстрируют менее продолжительные
попытки избегания по сравнению с соответствующими не
предпочитающими линиями. Таким образом, выявленные различия между указанными
группами линий крыс, предпочитающих алкоголь (линии HAD1 и HAD2
по сравнению с линиями М и Р) полностью соответствуют различиям по
аналогичным свойствам поведения между больными алкоголизмом 1-го и
2-го типа. Для последних характерны сравнительно меньшая тревожность,
большее стремление к новизне, решительность и оптимизм.
Характерно, что продолжительное потребление алкоголя крысами
линий, предпочитающих алкоголь, приводит к уменьшению их отличий в
отношении вышеперечисленных поведенческих признаков по сравнению с
соответствующими не предпочитающими линиями. Так, потребление
алкоголя крысами линии АА в течение 3 нед, составлявшее 6,6 ±0,1 г/кг в
сутки, и крысами линии sP в течение 2 нед, составлявшее около 5 г/кг в
сутки, увеличивает продолжительность их пребывания в открытых аллеях
приподнятого крестообразного лабиринта Потребление алкоголя крысами
линии Р в течение 4 нед, составлявшее 5,5 ± 0,5 г/кг в сутки, приводит к
уменьшению латентного периода первого визита в тупик крестообразного
лабиринта и уменьшению продолжительности попыток избегания из
скользкой воронки.
Характеристики поведения различных вновь изучаемых линий и групп
крыс и мышей могут быть сопоставлены с таковыми у эталонных линий
крыс HAD1, HAD2, АА и Р.
Литература
1. Буров Ю. В., Жуков В. Л., Кампов-Полевой А. Б. Методические рекомендации по
экспериментальному (фармакологическому) изучению препаратов предлагаемых
- 354-

для клинической апробации в качестве средств для лечения и профилактики
алкоголизма / Фармакологический комитет, протокол № 12 от 8 июня 1979 г. — М.,
1980. - С. 1-21.
2. Буров Ю. В., Кампов-Полевой А. Б., Кашевская О. П. Формирование
экспериментального алкоголизма в популяции беспородных крыс // Бюлл. эксперим. биол. и
Мед. - 1983. - Т. 96. - С. 67-68.
3. Буров Ю. В., Кампов-Полевой А. Б., Никитина Л. Н. Влияние психотропных веществ
на формирование алкогольной мотивации у беспородных белых крыс // Бюлл.
эксперим. биол. и мед. — 1986. — Т. 101. — С. 289—291.
4. Вальдман А. В., Майский А. И., Кампов-Полевой А. Б. и др. Биологические основы
поиска средств для дифференцированной фармакотерапии алкоголизма // Вестник
АМН СССР. - 1988. - № 3. - С. 28-32.
5. Майский А. И., Ведерникова Н. Н., Чистяков В. В., Лакин В. В. Биологические
аспекты наркомании. — М.: Медицина, 1982.
6. Салимое Р. М. Анализ механизмов алкогольной мотивации и ее фармакологическая
коррекция (экспериментальное исследование): Дис. ... д-ра биол. наук. — М.: НИИ
фармакологии РАМН, 1998.
7. Салимое Р. М., Виглинская И. В. Оценка ускоренного развития устойчивой
алкогольной мотивации у крыс с целью изучения потенциальных противоалкогольных
средств // Бюлл. эксперим. биол. и мед. — 1990. — Т. 109. — С. 364—366.
8. Amit Z., Brown Z. W. Actions of drugs of abuse on brain reward systems a reconsideration
with specific attention to alcohol // Pharmacol. Biochein. Behav. — 1982. — Vol. 17. —
P. 233-238.
9. Bohn M. J., Barren К E., Essex M. J. A comparison of factors influencing drinking
obsessions and compulsions // Alcohol. Clin. Exp. Res. — 1996. — Vol. 20 (2), Suppl. — P.
95A.
10. Files F. J., Samson H. H., Denning С Е. Comparison of alcohol self-administration in a
continuous access situation by rats bred selectively for differing alcohol preference //
Alcohol. Clin. Exp. Res. — 1996. — Vol. 20 (2), Suppl. - P. 62A.
11. Froehlich J. C, Li T-K. Opioid involvement in alcohol drinking// Ann. New York Acad.
Sci. - 1994. - Vol. 739. - P. 156-167.
12. Jellmek E. M. The disease concept of alcoholism. — Hillhouse, Haven, CT, I960.
13. Kampov-Polevoy А. В., Kashevskaya O. P., Sinclair J. D. Initial acceptance of ethanol:
gustatory factors and patterns of alcohol drinking // Alcohol. — 1990. — Vol. 7. — P.
83-85.
14. Kampov-Polevoy A., Garbutt J. C, Janowsky D. Evidence of preference for a high
concentration sucrose solution in alcoholic men // Am. J. Psychiat. — 1997. — Vol. 154. — P.
269-270.
15. Kiianmaa К Behavioral and neurochemical mechanisms un derlying genetically
augmented alcohol drinking // Canad. J. Physiol. Pharmacol. — 1994. — Vol. 72 (Suppl. 1). — P.
17.
16. Knapp D., Saier J., Pohorecky L. A. Observation of novel behaviors as indices of alcohol
withdrawal-induced anxiety // Alcohol Alcoholism. — 1992. — Vol. 27 (Suppl. 1). —
P. 90.
17. Koob O. F., Rassmck S., Heinnchs S., Weiss F. Alcohol, the reward system and
dependence // Exs. - 1994. - Vol. 71. - P. 103-114.
18. Kornet M., Goosen C, Van Ree J. M. The effect of interrupted alcohol supply on
spontaneous alcohol consumption by rhesus monkeys // Alcohol Alcoholism. — 1990. — Vol.
25. - P. 407-412.
19. Kornet M., Goosen C, Van Ree J. M. Effect of naltrexone on alcohol consumption during
chronic alcohol drinking and after a period of imposed abstinence in free-choice drinking
rhesus monkeys // Psychopharmacology. — 1991. — Vol. 104. — P. 367—376.
20. Lankford M. F, Myers R. D. Genetics of alcoholism simultaneous presentation of a
chocolate drink diminishes alcohol preference in high drinking HAD rats // Pharmacol. Bio-
chem. Behav. — 1994. — Vol. 49. - P. 417-425.
21. Le A. D., Ко J., Chow S., Quan B. Alcohol consumption by C57BL/6, BALB/c and DBA/
2 mice in a limited access paradigm // Pharmacol. Biochem. Behav. — 1994. — Vol. 47.
- P. 375-378.
22. O'Leary M. R., Calsyn D. A., Haddock D. L., Freeman C.W. Differential alcohol use
patterns and personality traits among three alcoholics anonymous attendance level groups
further considerations of the affiliation profile Drug Alcohol Depend. — 1980. — Vol. 5.
- P. 135-144.
12*
-355 -

23. Liskow B.I., Goodwin D. W. Pharmacological treatment of alcohol intoxication,
withdrawal and dependence a critical review // J. Stud Alcohol. — 1987. — Vol. 48. — P. 356—
370.
24. MeKinzie D. L., Eha R., McBride W. J. et al. Evidence for neuroadaptive changes that
occur during abstinence and promote alcohol relapse // Alcohol Clin Exp Res. — 1996. —
Vol. 20. - N 2, Suppl. - P. ISA.
25. Modell J. G., Glaser F. В., Cyr L., Mounts. J. M. Obsessive and compulsive characteristics
of craving for alcohol in alcohol abuse and dependence // Alcohol Clin Exp Res. — 1992.
- Vol. 16. - P. 272-274.
26. Myers R. D. New drugs for the treatment of experimental alcoholism // Alcohol. — 1994.
-Vol. 11. - P. 439-451.
27. Rassnick S., Koob G. F., Geyer M. A. Responding to acoustic startle during chronic etha-
nol intoxication and withdrawal // Psychopharmacology. — 1992. — Vol. 106. — P. 351 —
358.
28. Salimov R. M., Sinclair J. D. Behavioral predictors of alcohol use in rats and mice In
Biological basis of individual s/nsitiv ity to psychotropic drugs / Seredenin S.B., Longo V.,
Gaviraghi G„ eds. — London: Grajfham Press, 1994. — P. 203—211.
29. Sinclair J. D. Drugs to decrease alcohol drinking // Ann med. — 1990. — Vol. 22. —
P. 357-362.
30. Sinclair J. D., Vilamo L., Jakobson B. Selective extinction of alcohol drinking in rats with
decreasing doses of opioid antagonists // Alcohol Clin Exp Res. — 1994. — Vol. 18. —
P. 489.
Методические указания по изучению препаратов для лечения
наркоманий и токсикомании
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. «., проф. А. И. Майский;
д. б. н. Р. М. Салимое
Настоящие методические указания имеют целью унификацию
основных методов изыскания фармакологических веществ (ФВ) для лечения
наркомании и токсикомании. Представленная система тестов предполагает
выявление у изучаемых веществ способности ослаблять сформированное
влечение и/или предупреждать формирование зависимости от обладающих
аддиктивным потенциалом веществ и абстиненции.
1. Методические приемы, используемые при изучении фармакологических
веществ для лечения злоупотребления препаратами, обладающими
аддиктивным потенциалом (ПОАП)
Чаще всего эксперименты поводят на мелких лабораторных животных,
хотя в некоторых случаях, например при внутривенном самовведении
растворов изучаемых веществ, используют также собак и обезьян. Животных
следует содержать в комфортных условиях, поскольку известно, что
различные стрессовые факторы могут оказывать разнонаправленное влияние
на формирование и проявления зависимости к ПОАП и, тем самым,
затруднять выявление эффектов изучаемых ФВ. В связи с этим животных
следует содержать в группах, на протяжении всего эксперимента они
должны постоянно иметь свободный доступ к стандартному сухому
брикетированному корму и чистой воде.
-356-

/./. Способы предоставления животным добровольного доступа к ПОАП
и оценки зависимости от них
1.1.1. Добровольное употребление веществ в виде раствора для питья
Животным предоставляют доступ к раствору ПОАП, чистой воде и
пище в течение не менее чем 1—2 мес. При необходимости коррекции вкуса
раствора применяемого вещества, можно использовать вкусовые добавки,
такие как 0,1 % сахарин, 0,02 % ментол и др., которые не имеют
калорической ценности для организма. Используемые жидкости следует обновлять
не реже чем 2—3 раза в неделю.
Во время оценки индивидуального потребления ПОАП животных
следует поместить на короткий промежуток времени (от 24 ч до 5 сут) в
индивидуальные клетки, где им предлагают выбор между двумя сосудами,
содержащими раствор применяемого вещества или воду. В случае же
коррекции вкуса раствора использовавшиеся ранее вкусовые добавки должны
содержаться как в воде, так и в растворе ПОАП. Количество жидкостей в
сосудах измеряют перед помещением животных в индивидуальные клетки и
затем через каждые 24 ч теста. По завершении индивидуального теста
определяют массу тела животных; потребление ПОАП выражают в мг/кг в
час. Рекомендуется также иметь клетки без животных, снабженные
сосудами с водой и раствором ПОАП, с целью получения калибровочных
измерений для оценки влияния посторонних случайных событий (вибрация,
толчки, перепады температуры и др.).
В период депривации, продолжительностью около 3 сут, животные
остаются в своих жилых клетках, а бутылку с раствором ПОАП заменяют
бутылкой с водой. В случае если животные имели доступ к подслащенному
раствору, то на период депривации сладкий раствор ПОАП следует
заменить водой с такими же вкусовыми добавками. Количество жидкостей в
сосудах измеряют в следующие моменты времени:
— перед помещением животных в индивидуальные клетки;
— через 1,5 ч после начала индивидуального теста;
— через 24 ч после начала индивидуального теста;
— при тесте продолжительностью более суток — каждые последующие
24 ч.
По завершении индивидуального теста определяют массу тела
животных, и рассчитывают потребление ПОАП в мг/кг в час в течение первых
1,5 ч после депривации и в течение последующих 22,5 ч, а также за каждые
последующие сутки (если таковые измерения проводились). Показателем
психологической зависимости от ПОАП служит амплитуда депривацион-
ного эффекта в виде статистически значимой разницы между темпом
потребления этих веществ в первые 1,5 ч после депривации и таковым до
депривации, а также время восстановления их потребления до уровня,
имевшегося перед началом депривации.
1.1.2. Добровольное вдыхание веществ в виде газообразной смеси
Используется устройство, состоящее из камеры, которая на
противоположных стенках имеет два отверстия с герметичными автоматическими
клапанами. Клапаны расположены на высоте, соответствующей
положению головы животного, стоящего на задних лапах, и обеспечивают
возможность вдыхания им воздушной смеси заданного состава из внешней
- 357-

емкости. Каждый клапан снабжен инфракрасным детектором с
микропроцессорным контролем, который автоматически открывается при
пересечении инфракрасного луча передней частью головы животного. Один из
клапанов предоставляет доступ к смеси воздуха с ПОАП, а другой
(контрольный) — к чистому воздуху. Животное помещают в камеру на 30—120 мин
и регистрируют число подходов к каждому клапану и продолжительность
их открытого состояния. Критерием добровольного вдыхания животными
ПОАП является статистически значимое превышение указанных
показателей для смеси воздуха с данным веществом по сравнению с чистым
воздухом. Животным в течение 5 дней ежедневно на 30—120 мин предоставляют
доступ к обоим клапанам, после чего следует двухдневный перерыв.
Зависимость считают сформированной, если в течение 2 нед подряд
добровольное вдыхание ПОАП за первые 10—30 мин после депривации будет
статистически значимо превышать аналогичный показатель до депривации.
1.1.3. Добровольное внутривенное введение веществ
У наркотизированного животного обрабатывают операционное поле
антисептиком и вживляют стерильный катетер в один из крупных
кровеносных сосудов, жестко закрепляют его и закрывают заглушкой. Рану на коже
обрабатывают антисептиком и закрывают хирургическим клеем. После
заживления раны животных обучают нажимать на педаль, которые
сопровождаются введением раствора ПОАП в кровяное русло. Суточную дозу ПОАП
делят на части и вводят с интервалом 1—3 ч. При этом обучение проводят с
постепенным увеличением (до нескольких десятков) количества нажатий на
педаль, необходимых для получения однократной инъекции. Зависимость
считают сформированной, если животные добровольно вводят себе ПОАП и
демонстрируют депривационный эффект, который проявляется в виде
усиления реакции само введения в течение первых 1—2 ч эксперимента по
сравнению с последующим его периодом в течение данного дня и/или с таковым
накануне. Недостатком данного метода является то, что ослабление
инструментальной реакции самовведения возможно не только из-за изменения
подкрепляющих свойств применяемого безусловного стимула, но и в связи с
затруднением самого навыка нажатия на педаль.
В связи с этим при изучении новых ФВ необходимо оценивать их
влияние также и у контрольной группы животных, у которых навык нажатия
на педаль подкрепляется каким-либо натуральным положительным
стимулом, например питьем раствора сахарина.
1.1.4. Добровольное внутримозговое введение веществ
Наркотизированное животное фиксируют в стереотаксическом
аппарате, разрезают кожу на голове и высверливают отверстие в кости черепа.
С помощью стереотаксического-манипулятора стерильную канюлю
опускают в ткань мозга в соответствии с координатами стереотаксического
атласа мозга. В кости черепа вокруг канюли крепят микрошурупы, к
которым с помощью быстротвердеющей зубоврачебной пластмассы жестко
крепят канюлю. Канюлю закрывают заглушкой с мандреном. Рану на коже
обрабатывают антисептиком и закрывают хирургическим клеем. Канюлю
вживляют в структуру головного мозга, которую относят к центральной
системе положительного подкрепления. Чаще всего для этой цели выбира-
- 358-

ют nucleus accumbens, в отношении которого известно стремление
животных производить инъекции широкого спектра ПОАП. После заживления
раны животных обучают нажатиям на педаль, которые сопровождаются
введением в выбранную зону мозга микродоз ПОАП. Сеансы обучения
проводят с интервалом 1—3 ч с постепенным увеличением до нескольких
десятков количества нажатий на педаль, необходимых для получения
однократной инъекции. Зависимость считают сформированной, если
животные демонстрируют стабильное самовведение применяемого вещества и
депривационный эффект, который проявляется в виде статистически
значимо большей выраженности этой реакции в течение первых 1—2 ч
эксперимента по сравнению с последующим его периодом в течение данного
дня или с таковым накануне. При изучении новых ФВ, так же как и для
метода внутривенного самовведения, необходимо проводить контрольные
эксперименты с группой животных, у которых навык нажатия на педаль
подкрепляется каким-либо натуральным положительным стимулом,
например питьем раствора сахарина.
1.2. Способы принудительного введения животным ПОАП
1.2.1. Субхронические инъекции
Животных приучают к взятию в руки и затем начинают ежедневные
инъекции ПОАП. Инъекции производят внутрибрюшинно, подкожно или
внутривенно 1, 2 или 3 раза в сутки. При необходимости возможно также
введение вещества в желудок с помощью шприца, игла которого имеет
достаточную длину и заканчивается оливообразным утолщением.
Контрольные инъекции должны выполняться в тех же условиях с
применением изотонического раствора натрия хлорида или иного применявшегося
растворителя. Продолжительность периода инъекций в зависимости от
применяемого вещества и вида животных должна составлять не менее 1 —
2 нед.
1.2.2. Субхроническая имплантация под кожу
Прессуют таблетки, содержащие 75 мг порошка имплантируемого ПОАП,
смешивают микрокристаллической целлюлозы, 0,75 мг порошка двуокиси
кремния и 1,5 мг стеарата кальция. (Таблетки-плацебо содержат вместо
применяемого вещества эквивалентную порцию целлюлозы.) Таблетки
упаковывают в синтетическую сетку. Животному под наркозом через нарез в коже
спины подкожно имплантируют таблетку ниже места разреза. Рану
обрабатывают антисептиком и закрывают хирургическим клеем. Время,
необходимое для формирования зависимости от применяемого ПОАП, определяется
видом животных и природой применяемого вещества и составляет не менее
4—5 сут. По завершении указанного периода делают новый надрез, таблетку
удаляют, а рану обрабатывают антисептиком и заклеивают. Оставшееся в
таблетках количество применявшегося ПОАП определяют путем его
растворения, фильтрации и высушивания с целью вычисления его среднего
расхода.
- 359-

1.2.3. Субхроническое ингаляционное введение
Животных помещают в камеру, содержащую заданную концентрацию
паров применяемого ПОАП. Продолжительность однократной экспозиции
может составлять 30—120 мин в сутки. Количество сеансов, необходимых
для формирования зависимости от применяемого вещества, зависит от
вида животных и природы применяемого вещества и должно составлять не
менее 5—10 экспозиций.
1.3. Поведенческие методы, используемые для оценки выраженности
толерантности и синдрома абстиненции
1.3.1. Тест отдергивания хвоста при нанесении теплового стимула
Данный метод является общепринятым для оценки болевой
чувствительности. Животное не жестко фиксируют в прозрачном цилиндре так,
чтобы хвост находился снаружи между сфокусированным лучом яркого
света и фотодатчиком. Измеряют время до отдергивания хвоста,
используя автоматическую оценку латентного периода отдергивания с ошибкой
измерения не более 0,1 с. Увеличение латентного периода отдергивания
хвоста Является свидетельством уменьшения болевой чувствительности.
Последнее наблюдается, в частности, при введении анальгетических
веществ.
1.3.2. Реакция вздрагивания
Мышам предъявляют 5 громких звуковых стимулов с интервалом 16—20 с
в момент, когда животное всеми 4 лапами стоит на полу. Приблизительные
параметры звука: частота около 10 кГц, интенсивность около ПО децибел,
длительность звукового импульса 0,2 с, время нарастания импульса порядка
0,05 с. Реакцию оценивают в баллах: 0 — видимое отсутствие реакции; 1 —
замирание; 2 — вздрагивание; 3 — прыжок.
Усиление реакции вздрагивания является компонентом умеренного
синдрома отмены, который обычно угасает в течение первых 2—3 сут
абстиненции.
1.3.3. Аудиогенные судороги
Животному (мыши, крысы), помещенному в замкнутое помещение, в
течение 5 мин предъявляют непрерывный звуковой стимул частотой 9—
12 кГц интенсивностью 110—120 децибел. Реакцию оценивают в баллах:
0 — видимое отсутствие реакции; 1 — двигательное возбуждение, бег; 2 —
клонические судороги; 3 — тонические судороги.
Возникновение аудиогенных судорог служит проявлением выраженного
синдрома отмены, которое обычно угасают в течение первых 1—2 сут
абстиненции.
- 360-

1.4. Введение фармакологических веществ
Изучаемое ФВ растворяют в 0,9 % растворе NaCl. При необходимости
применяют эмульгатор типа Твин. Растворы готовят таким образом, чтобы
животные (мыши, крысы) получали инъекции объемом не более 10 мл на
1 кг массы тела. Контрольным животным вводят 0,9 % раствор NaCl или,
соответственно, 0,9 % раствор NaCl с эмульгатором Твин.
Во избежание излишнего стресса для животных, их следует
предварительно приучать к взятию в руки. При выполнении инъекции следует
фиксировать животное руками и применять достаточно острые иглы для
шприцев. С целью уменьшения влияния случайных факторов
необходимо либо осуществлять все варианты эксперимента одновременно, а если
это невозможно, то следует применять схему планирования
последовательного случайного порядка выполнения эксперимента типа латинских
квадратов.
2. Организация экспериментов по изучению потенциальных средств
для профилактики и лечения злоупотребления ПОАП
В экспериментах следует использовать взрослых самцов крыс или
мышей. Возраст животных в течение всего периода работы с ними должен
находиться в пределах 2—10 мес. Животных снабжают индивидуальными
метками и распределяют на необходимое число групп (например, на одну
контрольную и несколько экспериментальных групп), предназначенных
для испытания разных доз вещества. Оптимальным количеством особей в
каждой группе является 15—20 голов. Подбор животных в группы
осуществляется таким образом, чтобы все изучаемые исходные показатели не
обнаруживали статистически значимой разницы при сравнении контрольной
группы с каждой из экспериментальных групп. При планировании
эксперимента с участием интактных животных, при отсутствии у них исходных
измеряемых показателей, допускается распределение животных по группам
случайным образом.
При выборе доз изучаемого ФВ необходимо убедиться в том, что
максимальная из планируемых к испытанию доз не превышает '/20 от LD50
острой токсичности для данного вещества.
2.1. Выработка реакции предпочтения места при подкреплении ПОАП
Используется устройство (челночная камера или лабиринт), состоящее
из одного или более отделений, внешний вид или освещенность одного из
которых ("подкрепляемого") сильно отличается от остальных и служит
условным стимулом. Животное помещают в одно из "неподкрепляемых"
отделений устройства и позволяют ему свободно перемещаться до захода в
"подкрепляемое" отделение. Затем животное вынимают и производят
безусловное подкрепление в виде инъекции ПОАП или предоставления ему в
той или иной форме возможности добровольного употребления ПОАП.
Сочетание данных условного и безусловного стимулов повторяют
ежедневно до тех пор, пока животное не будет первым посещать "подкрепляемое"
отделение в течение нескольких (3—5) сочетаний подряд. Скорость
выработки данного условного рефлекса на место зависит от выраженности
подкрепляющих свойств данного вещества.
- 361 -

2.2. Оценка влияния фармакологических веществ на влечение к ПОАП
В экспериментах используют животных, характеризующихся
устойчивым употреблением ПОАП в условиях свободного доступа, а также
увеличением его потребления после кратковременной депривации (см. разделы
1.1.1, 1.1.2, 1.1.3 и 1.1.4).
После предварительного теста на наличие депривационного эффекта и
распределения животных на группы, их в течение не менее 2 нед содержат
в общих клетках в условиях свободного доступа к ПОАП. После этого
приступают к введению изучаемого ФВ, которое, в зависимости от
ожидаемых механизмов его действия, может осуществляться как в период
свободного доступа к применяемому ПОАП, так и в условиях лишения
последнего.
Оптимальной продолжительностью введения изучаемого ФВ является 2-
недельный период. Однако при наличии предпосылок, связанных с
известными особенностями механизма действия изучаемого вещества,
продолжительность этого периода может быть изменена.
По завершении периода введения вещества проводят 2—3
последовательных теста на депривационный эффект (см. разделы 1.1.1, 1.1.2, 1.1.3 и
1.1.4) с интервалом приблизительно в 1 нед между тестами. Критерием
уменьшения зависимости от применяемого ПОАП является уменьшение
амплитуды депривационного эффекта по сравнению с контрольной
группой, получавшей плацебо. При наличии такого результата рекомендуется
выявить продолжительность его существования после окончания периода
инъекций изучаемого ФВ.
Оценку влияния ФВ на формирование влечения к ПОАП производят в
аналогичных условиях и по тем же критериям. Основным отличием
является то, что введение изучаемого ФВ производится параллельно с
формированием влечения к применяемому веществу. Продолжительность
введения вещества выбирается исходя из предполагаемых механизмов действия
изучаемого вещества, но не менее 2 нед. По завершении периода введения
изучаемого ФВ и предварительного доступа к ПОАП проводят 2—3
последовательных теста на выраженность депривационного эффекта (см.
разделы 1.1.1, 1.1.2, 1.1.3 и 1.1.4) с интервалом в 1 нед между тестами.
Критерием замедления формирования зависимости от применяемого ПОАП
является уменьшение в популяции количества особей, имеющих
депривационный эффект, и уменьшение амплитуды последнего, по сравнению с
контрольной группой, получавшей плацебо.
2.3. Оценка влияния фармакологических веществ на симптомы
толерантности и абстиненции
В экспериментах используют животных, демонстрирующих устойчивое
добровольное употребление ПОАП в условиях свободного доступа (см.
разделы 1.1.1, 1.1.2, 1.1.3 и 1.1.4) или подвергавшихся принудительному
введению указанных веществ (см. разделы 1.2.1, 1.2.2 и 1.2.3).
Для эксперимента могут быть использованы тесты 1.3.1, 1.3.2 и 1.3.3.
Изучаемыми показателями являются, соответственно, латентный период
отдергивания хвоста, амплитуда реакции вздрагивания и выраженность
судорожной реакции.
Увеличение латентного периода отдергивания хвоста является
свидетельством уменьшением болевой чувствительности. Ослабление аналгези-
- 362-

рующего действия ПОАП при его субхроническом применении является
признаком формирования толерантности к данному эффекту вещества.
Абстинентный синдром, наиболее выраженный в первые сутки лишения
применявшегося ПОАП, характеризуется резко выраженным увеличением
болевой чувствительности, которая, как правило, превышает таковую у ин-
тактных животных, а также увеличением амплитуды реакции вздрагивания
и выраженности судорожной реакции.
Влияние ФВ на симптомы толерантности и абстиненции оценивают,
сравнивая изучаемые показатели между группами животных, имевших или
не имевших предварительный доступ к ПОАП, а также между
подгруппами, получавшими изучаемое ФВ или плацебо.
Оценку влияния ФВ на формирование симптомов абстиненции
производят в аналогичных условиях и по тем же критериям. Отличием является
то, что введение изучаемого ФВ производится параллельно с применением
ПОАП. Продолжительность введения вещества зависит от предполагаемых
механизмов действия изучаемого вещества, но должна составлять не менее
2 нед. По завершении указанного периода животных лишают
применявшегося ПОАП и используют тесты 1.3.1, 1.3.2 или 1.3.3.
Приведенные выше методики представляют собой необходимое и
достаточное условие для оценки аддиктивного потенциала ФВ.
Однако, при наличии соответствующих данных, основанных на
сведениях о механизме действия изучаемого ФВ, в дополнение к
рекомендуемым тестам, могут быть выполнены и другие исследования ПОАП с
использованием иных экспериментальных моделей. Например, можно
использовать феномен самостимуляции лимбических структур мозга [Olds M.
Е., et al., 1964], относящихся к центральной системе положительного
подкрепления.
Литература
1. Вальдман А. В., Звартау Э. Э. Использование эмоционально-подкрепляющих
систем мозга как средства патогенетической терапии алкоголизма и наркомании //
Журн. невропатол. психиат. — 1980. — Т. 80. — С. 1020—1024.
2. Погорелое В. М. Экспериментальное изучение центральных катехоламинергических
механизмов процесса добровольного вдыхания паров летучих органических
веществ и разработка принципов его фармакологической коррекции: Дис. ... канд.
мед. наук. — М.: Институт фармакологии РАМН, 1999.
3. Beardsley P. M., Bolster R. L. The intravenous self-administration of antihistamines by
rhesus monkeys // Drug Alcohol Depend. — 1992. — Vol. 30, N 2. — P. 117—126.
4. Carroll K. M., Rounsaville B. J., Bryant K. J. Should tolerance and withdrawal be required
for substance dependence disorders? // Drug Alcohol Depend. — 1994. — Vol. 36, N 1.
- P. 15-22.
5. De la Garza R., Johanson С. Е. The effects of food deprivation on the self-administration
of psychoactive drugs // Drug Alcohol Depend. —1987. — Vol. 19, N 1. — P. 17—27.
6. Emmett-Oglesby M. W., Peltier R. L., Depoortere R. Y. et al. Tolerance to
self-administration of cocaine in rats: time course and dose-response determination using a multi-dose
method // Drug Alcohol Depend. - 1993. - Vol. 32, N 3. - P. 247-256.
7. Heyne A., Wolffgramm J. The development of addiction to d-amphetamine in an animal
model: same principles as for alcohol and opiate // Psychopharmacology (Berl). — 1998.
- Vol. 140. - P. 510-518.
8. Hyytia P., Schulteis G., Koob G. F. Intravenous heroin and ethanol self-administration by
alcohol- preferring AA and alcohol-avoiding ANA rats // Psychopharmacology (Berl). —
1996. - Vol. 125. - P. 248-254.
9. Jones В. Е., Prada J. A. Drug-seeking behavior in the dog: lack of effect of prior passive
dependence on morphine // Drug Alcohol Depend. — 1977. — Vol. 2, N 4. — P. 287—
294.
-363-

10. Kovalev G. I., Salimov R. M., Gainetdinov R. R., Budygin E. A. Behavioral and
neurochemical predictors of organic solvent vapors voluntary inhalation in rats. A model of
toxicomania? In: Biological basis of individual sensitivity to psychotropic drugs / Seredenin
S. В., Longo V., Gaviraghi G., eds. - London: Graffham Press, 1994. — P. 213—218.
11. Kruszewska A., Langwinski R. The influence of pimozide, haloperidol, alpha-mefhyl-p-ty-
rosine and reserpine on the development of morphine dependence in rats // Drug Alcohol
Depend. - 1983. - Vol. 11, N 3-4. - P. 383-388.
12. McBride W. J., Murphy J. M., Ikemoto S. Localization of brain reinforcement
mechanisms: intracranial self-administration and Intracranial place-conditioning studies // Be-
hav. Brain Res. - 1999. - Vol. 101. - P. 129-152.
13. Olds M. E., [to M. Adrenergic and cholinergic action on behaviour and unit activity driven
by brain reward // Proc. 25-th Internal. Corgs. Physiol. Sci. Munich. — 1971. — Vol. 9.
- P. 430.
14. Salimov R., Rakhmankulova I. Withdrawal-induced short-term increase in voluntary intake
of diazepam in mice is not a stable group characteristic // Pharmacological Res. — 1995.
-Vol. 31 (Suppl). - P. 111.
15. Salimov R., Rakhmankulova I. Pentobarbital withdrawal induces the short-term decline in
its voluntary intake in mice // Pharmacological Res. — 1995. — Vol. 31 (Suppl). —
P. 112.
16. Salimov R., Salimova N., Klodt P., Maisky A. Interaction between alcohol deprivation and
morphine withdrawal in mice // Drug and Alcohol Dependence. — 1993. — Vol. 34. —
P. 59-66.
17. Smith S. G., Werner T. E., Davis W. M. Intragastnc drug self-administration by rats
exposed successively to morphine and ethanol / Drug Alcohol Depend. — 1981. — Vol. 7,
N 3. - P. 305-310
18. Sudakov S. K., Konstantmopolsky M. A., Surkova L. A. et al. Evaluation of Wistar rats'
individual sensitivity to the development of physical dependence on morphine // Drug
Alcohol Depend. - 1991. - Vol. 29, N 1. - P. 69-75.
19. Valdman A. V., Zvartau E. E. Systems of reinforcement and drug dependence // Drug
Alcohol Depend. — 1982. — Vol. 10, N 4. - P. 295—301.
Методические указания по изучению местноанестезирующей
активности фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: чпен-корр. РАМН Ю. Д.
Игнатов; И. В. Черепкова; Ю. Н. Васильев; А. П. Га-
ленко-Ярошевский; В. Н. Жуков
1. Требования, предъявляемые к современным местноанестезирующим
средствам
Исходя из потребностей клиники, в последнее время все большее
значение приобретает изыскание новых местноанастезирующих средств (МС)
и их лекарственных форм пролонгированного действия. Актуальность и
перспективность создания пролонгированных МС определяется их
использованием для терапии хронических болевых синдромов, в
послеоперационном периоде, при транспортировке больных и т. д.
Многие из МС проявляют активность практически при всех видах
местного обезболивания. Однако данные экспериментальных исследований и
практика местного обезболивания у людей показывают, что у ряда веществ
местноанестезирующая активность (МА) может быть неодинаковой при
разных видах анестезии. Так, некоторые МС, высокоактивные при ин-
- 364-

фильтрационной и проводниковой анестезии, оказываются
малоактивными при терминальной, поскольку плохо проникают через кожу и
слизистые оболочки. В связи с этим одним из требований, предъявляемых к
МС, является достаточная активность, обеспечивающая в условиях
определенного вида анестезии (терминальной, инфильтрационной,
проводниковой) возможное проведение безболезненного хирургического
вмешательства и различных врачебных манипуляций
Практический опыт местного обезболивания свидетельствует, что МС
обладают токсичностью, которая, как правило, возрастает параллельно с
МА и складывается из проявлений их резорбтивного действия (наиболее
опасные — воздействие на ЦНС и кардиодепрессорные эффекты) и мест-
нораздражающих эффектов (вплоть до некробиотического действия).
1. Критерии оценки местноанестезирующего эффекта
Одной из главных характеристик, подлежащих оценке в процессе
скрининга новых соединений, является их МА характеристика, отражающая
величины основных специфических проявлении фармакологического
эффекта: глубины (силы) анестезии, скорости наступления анестезии и ее
продолжительности. Эти показатели и рассматриваются в качестве главных
критериев оценки веществ в эксперименте.
Глубина местноанестезирующего эффекта — вызываемое веществом
ослабление ноцицептивной (болевой) реакции (вплоть до ее полного
исчезновения) в сравнении с исходными (фоновыми) значениями этой реакции
в ответ на ноцицептивную стимуляцию участков тканей, иннервируемых
нервными элементами, на которые локально воздействует вещество.
Глубина эффекта оценивается по характеру обусловленных веществом
изменений показателя величины внешних стимулов, вызывающих пороговое
проявление ноцицептивной (болевой) реакции, и чаще всего выражается в
процентах от исходных (фоновых) значений этого показателя (или в иных
единицах, характеризующих его изменения).
Скорость наступления анестезии — интервал времени между введением
или нанесением на поверхность изучаемого вещества и началом
проявления его МА. Латентный период действия МС зависит от способа их
введения и является наибольшим при аппликации вещества на кожные покровы
или слизистые оболочки. У большинства препаратов эффект развивается в
пределах нескольких минут.
Продолжительность анестезии — период времени от момента
наступления МА до его исчезновения. При проведении скрининга новых
соединений необходимо учитывать, что продолжительность действия не может
быть беспредельной, и во всех случаях необходимо добиваться полного
восстановления чувствительности. Поэтому при исследовании новых
веществ пролонгированного действия особого внимания требует выбор
адекватных моделей, которые позволяют достоверно оценивать МА в течение
длительного периода времени. При изучении МС веществ длительного
действия целесообразно увеличивать интервалы времени между повторным
тестированием эффекта, что позволит снизить трудоемкость исследования.
При экспериментальной оценке МС в зависимости от выбранного
метода исследования используют определенные показатели, количественно
отражающие их активность: ЭК50 и ЭК100 — средние эффективные
концентрации вещества, вызывающие соответственно 50 % и 100 % эффекты;
МЭК — минимальные эффективные концентрации, вызывающие местно-
- 365 -

анестезирующее действие; ЭД50 ЭД,00 — средние эффективные дозы,
отражающие количество вещества (в мг) в 1 мл раствора или на 1 кг массы
животного и вызывающие соответственно 50 % и 100 % местноанестезирую-
щие эффекты.
Наряду с исследованием МА новых соединений необходимо оценивать
выраженность их местнораздражающего и резорбтивного действия (ЛД50).
При этом следует учитывать, что новые соединения в концентрациях,
предлагаемых для клинического применения, не должны обладать местно-
раздражающим эффектом. При рассмотрении токсикологических
характеристик и активности нового вещества следует иметь в виду, что в
практическом отношении интерес могут представлять только те соединения,
терапевтическая широта которых существенно больше, чем у эталонных
препаратов.
2. Значение некоторых физико-химических характеристик новых соединений
при скрининге местных анестетиков
Известно, что активность МС зависит от ряда их физико-химических
свойств.
Между такими физико-химическими свойствами МС, как
растворимость, величина рН, основность, липофильность, способность к
распределению в нерве, поверхностная активность, способность к адсорбции,
связыванию с белками плазмы крови, влияние на проницаемость бислойной
фосфолипидной мембраны и их анестезирующими свойствами существует
симбатная зависимость.
Некоторые характеристики физико-химических свойств веществ,
наиболее важные для начальных этапов исследования.
Растворимость. Для скрининга МС прежде всего необходимо выбирать
водорастворимые соединения, поскольку именно растворы местных
анестетиков наиболее широко применяются в клинике. Однако
малорастворимые в воде соединения могут представлять определенный интерес для
создания средств для терминальной анестезии, но в соответствующей
лекарственной форме.
рН растворов. Большинство МС являются хлористоводородными
солями, растворы которых наиболее стабильны при рНЗ,5—6,0. Так как все
МС являются основаниями, то при сдвиге рН в сторону более высоких
значений увеличивается концентрация свободного основания в
соответствии с их значениями рКа, в результате чего возрастает их проникающая
способность. При низких значениях рН активность соединений, как
правило, уменьшается и при этом возможно появление или усиление
местнораздражающего действия. Поэтому большие отклонения рН опытных
растворов от рН изотониического раствора натрия хлорида в определенной
степени могут повлиять на результаты исследования, особенно при
изучении МА на изолированных нервах и на моделях терминальной анестезии.
Концентрация растворов. Скрининг МС целесообразно проводить в
растворах тех концентраций, в которых применяются эталонные препараты:
для терминальной анестезии в интервале от 0,25 % до 2—5 %, для ин-
фильтрационной и проводниковой — от 0,125 % до 1—2 %. При этом
начинать исследование следует с 1 % растворов и в зависимости от
полученных результатов, отражающих активность и местнораздражающее действие
нового соединения, проводить последующее изучение свойств препаратов
в более высоких или более низких концентрациях.
- 366-

Наиболее ценным показателем при сравнении исследуемого вещества с
эталонным препаратом является сопоставление их в эквиэффективных
концентрациях (процентных и молярных). Соотношение эффективной и
токсической доз изучаемого вещества позволяет представить его
терапевтическую широту и определить максимально возможный безопасный
объем вводимого раствора в конкретной эффективной концентрации.
В исследованиях, в которых выявляется зависимость "доза—эффект",
может быть определена минимальная эффективная концентрация,
отражающая фармакокинетические характеристики препарата.
3. Задачи и прогностическое значение методов первичного скрининга
и углубленного изучения местных анестетиков
Исследования, проводимые в рамках скрининга МС могут быть
подразделены на три этапа: альтернативное выявление местноанестезирующего
эффекта, первичный скрининг и углубленное изучение.
Альтернативное выявление местноанестезирующего эффекта новых
соединении предполагает использование простейших методов, позволяющих
осуществить ориентировочный отбор соединений, представляющих
интерес для дальнейшего изучения. С этой целью могут использоваться
методы, подробно изложенные в различных руководствах (13, 15, 18),
включая практикумы для студентов медицинских институтов. Большинство
этих методов позволяет установить только сам факт МА у нового
соединения. В случае положительного результата необходимо проведение более
детального исследования на моделях первичного скрининга.
Первичный скрининг — позволяет изучить активность новых
соединении при различных видах анестезии, определить скорость развития и
продолжительность действия в сравнении с эталонными препаратами, выявить
местнораздражающие и резорбтивные эффекты и рассчитать
терапевтическую широту. Методы первичного скрининга должны отличаться
простотой выполнения, экономичностью и большой "пропускной" способностью.
Углубленное изучение — проводят на последних этапах исследования
новых соединений, у которых была выявлена достаточная активность. На
этапе углубленного изучения используют методы, моделирующие
потенциальное применение препарата в клинических условиях по
предполагаемому целевому назначению.
4. Выбор эталонных препаратов при скрининге местных анестетиков
Большинство МС обладает активностью, как правило, при всех видах
местного обезболивания. Однако на практике используется принцип
относительно специализированного применения отдельных препаратов для
соответствующего вида анестезии. В соответствии с этим при скрининге
новых МС необходимо дифференцированно подходить к выбору "эталонных"
препаратов — препаратов сравнения.
Для терминальной (поверхностной, аппликационной) анестезии в
клинике преимущественно применяют анестезин, дикаин и пиромекаин. В
качестве "эталонного" препарата для данного вида анестезии при
использовании водорастворимых веществ следует использовать дикаин (тетракаин).
Дикаин — высокоактивный препарат при анестезии слизистых оболочек,
но он высокотоксичен. Следовательно, при создании новых средств для
- 367-

этого вида анестезии перспективным будет изыскание соединений, равных
или превышающих по активности дикаин, обладающих длительным
эффектом и значительно менее токсичных.
Из применяемых в настоящее время в Российской Федерации
анестетиков в наибольшей степени удовлетворяют требованиям инфильтрационной
анестезии тримекаин и лидокаин (ксилокаин). Однако их существенным
недостатком является относительно небольшая продолжительность
действия и сравнительно высокая токсичность, которая в два раза превышает
таковую у новокаина (прокаина). Поэтому для этого вида анестезии также
необходим поиск веществ, по активности и продолжительности действия
превышающих тримекаин и ксикаин, но более безопасных.
В качестве "эталонных" препаратов для проводниковой и
спинномозговой анестезии следует использовать маркаин (бупивакаин) или менее
активные — тримекаин, лидокаин. Маркаин вызывает длительную (до 8 ч)
анестезию, но при его применении могут наблюдаться проявления резор-
бтивного действия. В связи с этим необходимо изыскание новых
соединений, менее токсичных и не уступающих по силе и продолжительности
эффекта маркаину.
5. Методика выполнения исследования местноанестезирующей активности
соединений на различных моделях
Учитывая, что МС применяются при различных видах местного
обезболивания, для скрининга новых соединений необходимо использовать
методы, моделирующие поверхностную, инфильтрационную,
проводниковую, эпидуральную и спинномозговую анестезию.
1. Модели поверхностной (терминальной) анестезии
1.1. Комбинированное (одновременное выявление способности вещества
вызывать поверхностную анестезию по методу Regnier и особенностей его
местнораздражающего действия по методу Setnicar (18)
В опыте используют ненаркотизированных кроликов — самцов массой
2,0—2,5 кг. Кролика помещают в специальный ящик с отверстием,
фиксирующим голову. Определяют порог чувствительности роговицы глаза
кролика к тактильному воздействию. С этой целью применяют различные
приспособления. Ренье рекомендовал конский волос, другие исследователи
предпочитают нейлоновую нить (леску), конец которой оплавляют в пламени
горелки, или стеклянную палочку с шарообразным кончиком диаметром 1,5 г
до сгибания, или просто тонкую металлическую проволоку в виде петли.
При проведении исследований необходимо использовать одно стандартное
приспособление, в наименьшей степени травмирующее роговицу.
Исходную чувствительность роговицы глаза кролика (контроль)
определяют дважды с интервалом в 5 мин (ресницы перед опытом отстригают).
Раствор исследуемого вещества в объеме 0,4 мл инсталлируют в конъюнк-
тивальный мешок глаза кролика за 2 раза, с интервалом 30 с. Первое
определение поверхностной анестезии проводят на 8-й минуте опыта и
повторяют на 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 и 60-й минутах (13
определений). Каждый раз отмечают минимальное число прикосновений
одинаковой силы и ритма, вызывающее смыкание век.
- 368-

Каждую концентрацию вещества проверяют 8 раз, используя роговицу
разных глаз. За индекс Ренье, характеризующий степень анестезии,
принимают среднюю величину, вычисленную из суммы величин, полученных
при испытании исследуемого вещества в течение 60 мин. Отсутствие
мигательного рефлекса в течение 1 мин (100 прикосновений) расценивают как
показатель полной анестезии. Максимальный индекс Ренье для
высокоактивных веществ равен 1300, минимальный — 13, для неактивных
соединений.
Исходя из полученных данных, отражающих изменения
чувствительности роговицы под воздействием местноанестезирующего соединения,
определяют начало (для активных веществ с 1-й минуты после введения),
длительность полной (100 %) анестезии, общую длительность МА. При
определении длительности анестезии, вызываемой высокоактивными
соединениями, опыты можно продолжать до 120 мин и более.
Относительную активность исследуемых соединений высчитывают по
уравнению Валетта (Valeric) (18).
Т (х - п) +1 fN - х) Y = (N - п),
где Y — концентрация эталонного препарата, при которой индекс Ренье
соответствует индексу Ренье изучаемого соединения; Т — концентрация
раствора эталонного препарата, индекс которой превышает индекс Ренье
изучаемого соединения; t — концентрация раствора эталонного препарата,
индекс Ренье которой меньше индекса Ренье изучаемого соединения, N —
индекс Ренье для Т; п — индекс Ренье для t; x — индекс Ренье изучаемого
соединения.
Пример расчета относительной активности исследуемого вещества по
сравнению с дикаином:
Индекс Ренье 1 % раствора исследуемого вещества х = 336.
Индекс Ренье 0,05 % раствора дикаина Т = 480.
Индекс Ренье 0,025 % раствора дикаина t = 320.
Эквивалентная концентрация дикаина (Y), при которой индекс Ренье
равен индексу Ренье раствора исследуемого соединения (в концентрации
1 %), будет составлять:
у = 0,05 • (336-320)+ 0,025 • (480-336) = Q 02?5 %
480-320
При сравнении эквивалентной концентрации дикаина "Y" и
исследуемого соединения видно, что дикаин при поверхностной анестезии более
чем в 36 раз превосходит исследуемое соединение. Следовательно, его
относительная активность составляет только около 0,03 от активности
дикаина, принятой за единицу.
Чувствительность роговицы глаза кроликов может значительно
отличаться друг от друга, поэтому рекомендуется предварительно подобрать
животных, у которых определенная концентрация эталонного препарата
всегда вызывает сходные результаты.
Одновременно с выявлением МА определяют местнораздражающее
действие исследуемого вещества на ткани глаза кролика (18).
Для оценки этого действия используется следующая шкала:
а) нет видимых изменений (—);
б) гиперемия конъюнктивы и края век, мигательной перепонки в
пределах 30 мин, смыкание век не более чем на 5—10 мин после введения
вещества (+);
в) гиперемия конъюнктивы век, мигательной перепонки, каря век,
- 369-

склеры и инфильтрация (уплотнение) тканей век в течение 30—300 мин
(++);
г) гиперемия конъюнктивы век, мигательной перепонки края век,
склеры и инфильтрация, длящиеся более 300 мин (+++).
Обнаружение у изучаемого вещества местнораздражающего действия
(++ и более в соответствии с представленными шкалами) свидетельствует
о малой перспективности этого вещества.
1.2. Изучение местноанестезирующей активности при поверхностной
анестезии слизистой оболочки глотки и трахеи кошек (метод разработан
в НИИ фармакологии РАМН (10)
Метод предназначен для изучения МА новых соединений в условиях,
моделирующих их возможное применение в области глотки и трахеи, в
частности, для проведения эндоскопических манипуляций. Данный метод
является модификацией метода изучения активности местных анестетиков
на слизистой оболочке глотки кролика (20). Выбор кошек в качестве
объекта исследования обусловлен особенностями анатомического строения
ротовой полости и глотки, обеспечивающими по сравнению с кроликом и
другими мелкими лабораторными животными широкий доступ к глотке,
гортани и трахее.
В эксперименте используют кошек-самцов массой 3,5—4 кг. Изучение
активности МС осуществляют на животных, наркотизированных нембута-
лом (30 мг/кг, внутрибрюшинно). В условиях такого наркоза на протяжении
3—4 ч у кошек полностью сохранены резко выраженные кашлевые
рефлексы в ответ на механическую симуляцию слизистых оболочек: прикосновение
кончиком катетера последовательно к дужкам, надгортаннику, голосовой
щели, к стенкам трахеи. Положение животного — на спине. Голова кошки с
максимально раскрытой пастью вместе с языком фиксируется на прочном
пластмассовом кольце с соответствующими пазами для зубов. Это кольцо
закрепляют между клыками нижней и верхней челюсти. Кольцо сбоку жестко
фиксируют к штативу, получая наиболее удобный обзор и доступ к глотке,
гортани и трахее. Затем приступают к фоновому тестированию кашлевых
рефлексов кошки последовательно в ответ на механическую стимуляцию
глотки, надгортанника, голосовой щели и трахеи. Стимуляцию
осуществляют относительно жестким полиэтиленовым катетером с наружным
диаметром 3 мм, длиной 14 см с запаянным закругленным концом. На протяжении
3,0 см от запаянного конца катетер имеет множественные мелкие отверстия
по окружности с целью его последующего использования для орошения
трахеи раствором изучаемого вещества. Получив фоновые характеристики каш-
левой реакции, с помощью стандартного пульверизатора с расстояния 5 см
от надгортанника орошают слизистую оболочку глотки, надгортанника и
входа в гортань, используя 0,5 мл изучаемого вещества. Через 5 мин после
орошения в трахею вводят упомянутый катетер на глубину 5 см от уровня
голосовой щели и через него под давлением с помощью шприца орошают
0,5 мл вещества слизистую оболочку трахеи.
Повторное тестирование кашлевого рефлекса выполняют через 3, 5, 10,
15, 20, 30, 40 мин и т. д. после орошения в полном соответствии с
механической стимуляцией, произведенной при фоновом тестировании. Об
анестезирующей активности, о начале и длительности судят по способности
вещества полностью подавлять кашлевой рефлекс у животного при
механическом раздражении.
- 370 -

2. Модели инфильтрационной анестезии
2.1. Изучение местноанестезирующей активности при инфильтрационной
анестезии у морских свинок по методу Bulbring и Wajda (18)
Исследования проводят на морских свинках-самцах массой 200—250 г.
В область спины каждого животного, предварительно удалив с нее
волосяной покров, в 4 точках — А, Б, В, Г (по углам квадрата со стороной 3 см)
внутрикожно вводят в объеме 0,25 мл свежеприготовленные изотонические
растворы изучаемого соединения и эталонного препарата. Растворы
целесообразно вводить таким образом, чтобы исследуемое соединение в
каждой концентрации инъецировалось в одну переднюю (А) и одну заднюю
(Г) точки, а эталонный препарат в соответствующих концентрациях — в
точки Б и В. Область введения препарата обводят чернилами. Местноане-
стезирующую активность оценивают 6—8 раз для каждой из выбранных
концентраций. Чувствительность в месте введения определяют
прикосновением инъекционной иглой сериями по 6 прикосновений с
промежутками 3—4 с, через каждые 5 мин, в течение 30 мин. Суммарное число
прикосновений иглы, не вызывающих реакции животного (подергивание
кожи) в течение 30 мин, расценивается как индекс инфильтрационной
анестезии для раствора в данной концентрации. Кроме того, можно
определить и среднюю эффективную концентрацию (ЭК50), которая представляет
собой такую концентрацию, при которой индекс инфильтрационной
анестезии равен 18. Определение индексов для растворов каждой
концентрации обычно проводят на 3—4 животных. Исходя из зависимости "доза-
эффект", определяют относительную активность исследуемого соединения.
При этом на графике по оси ординат наносят индексы инфильтрационной
анестезии, а по оси абсцисс — логарифмы исследованных концентраций.
Результаты исследований сводят в таблицу. В качестве примера см. табл. 1.
2.2. Изучение местноанестезирующей активности при инфильтрационной
анестезии брюшной стенки у кроликов "болевым " методом (5)
Опыты выполняют на ненаркотизированных кроликах-самцах, массой
2,0—2,5 кг. Кролика фиксируют на спине за лапы на станке. Кожу живота
сбоку на уровне средней трети освобождают от волосяного покрова. На
платиновые электроды помещают небольшие кусочки ваты, смоченные в
изотоническом растворе натрия хлорида. Электроды закрепляют на
брюшной стенке кролика с помощью резинового пояса.
Раздражения наносят прямоугольными импульсами электрического
тока длительностью 0,3 мс, частотой 50 Гц, амплитудой от 5 В и выше (элек-
Таблица 1. Местноанестезирующая активность новокаина и тримекина при
инфильтрационной анестезии у морских свинок
Новокаин
Тримекаин
Концентраи
%
0,25 0,5
0,25 0,5
ия раствора
ММ
9,0 18,0
8,8 17,6
Индекс
инфильтрационной анестезии
24,3 ±3,5 31,0 + 2,5
33,5 ± 2,0 36,0 ± 0,0
Примечание. Представлены средние данные из 8 опытов, со стандартной ошибкой
средней.
- 371 -

Таблица 2. Местноанестезирующая активность тримекаина, маркаина и новокаина при
инфильтрационной анестезии брюшной стенки у кроликов
Концентрация раствора
соединения
Тримекаин 1 % (35,0 мМ)
Маркаин 0,75 % (24,9 мМ)
Новокаин 1 % (360 мМ)
Анестезия
время
наступления
анестезии (мин)
5,0 + 0,7
5,0 + 0,6
15,4 ± 1,0
глубина
анестезии в %
100
100
60
длительность
полной
анестезии (мин)
140,0 ± 6,5
260,0 ± 4,2
общая
длительность
анестезии (мин)
210,0 + 2,3
460,0 ± 8,5
60,0 + 1,5
Примечание. Представлены средние данные из 5 опытов со стандартной ошибкой
средней.
тростимулятор ЭСЛ-2), до появления ответной болевой реакции кролика.
Интервал между стимуляциями равен 1 мин. Длительность каждого
стимула — 2 с. Показателем болевой реакции является изменение ритма и
амплитуды дыхания интактного животного. Регистрацию дыхания
осуществляют на самописце с помощью механодатчика любой конструкции,
связанного с капсулой Марея, в которую поступает воздух через резиновую
трубку, помещенную в один из носовых ходов кролика, или с помощью
термодатчика, укрепленного у ноздри на пути выдыхаемого воздуха.
За пороговое раздражение принимают минимальное напряжение
электрического тока в вольтах, при котором возникает болевая реакция
кролика, сопровождаемая изменением ритма дыхания. Обычно эта величина
составляет 10—25 В (фоновое значение). После определения порога болевой
реакции животного электроды снимают и отмечают место их
расположения на коже, очертив его чернилами. Исследуемое вещество в виде 1 %
раствора вводят внутрикожно (0,5 мл) и подкожно (2 мл) под электрод с
помощью шприца и иглы, с наружным диаметром 0,3 мм. Тестирование
"болевой" реакции в ответ на стимуляцию осуществляют сразу, через 3, 5,
10, 15, 20, 30, 60, 90, 120 мин и т. д., после введения вещества. О времени
наступления анестезии, ее глубине и длительности судят по изменению
порога электрического раздражения участка кожи, инфильтрированного
раствором исследуемого вещества. Глубину анестезии выражают в
процентах. За 20 % анестезию принимают действие вещества, устраняющее
реакцию на пороговое раздражение. Повышение по сравнению с пороговым
значением величины раздражения на 5 В принимают за 40 % анестезию,
на 10 В — за 60 % и т. д. Повышение порога на 20 В условно принимают
за 100 % анестезию. С каждой концентрацией изучаемого вещества ставят
5 опытов. Высокоактивные вещества проверяют в 0,5 %, 0,25 % и меньших
концентрациях, малоактивные — в 2 % и 5 % концентрациях. Объем
высокоактивного вещества может быть уменьшен до 1 мл. Результаты опытов
заносят в таблицу. В качестве примера см. табл. 2.
3. Модели проводниковой анестезии
3.1. Изучение местноанестезирующей активности при проводниковой
анестезии седалищного нерва лягушки по методу Тюрка (5,13)
В опыт берут лягушек Rana temporaria. Лягушку декапитируют,
сохраняя нижнюю челюсть, и разрушают спинной мозг до уровня II—III груд-
- 372 -

Таблица 3. Местноанестезирующая активность новокаина и тримекаина при
проводниковой анестезии седалищного нерва лягушек
Концентрация раствора
соединения
Новокаин 1 % (36,0 мМ)
Тримекаин 1 % (35,0 мМ)
Анестезия
время наступления анестезии
14,0 ±0,3
7,0 ± 0,2
длительность (мин)
60,0 ± 7,3
181,0+ 14,2
Примечание. Представлены средние данные из 5 опытов со стандартной ошибкой
средней.
ного позвонка. Отпрепаровывают седалищные нервы обеих лап и
изолируют их от окружающих тканей с помощью тонких прокладок из любого
индифферентного материала (целлулоида, тефлона, отмытой от эмульсии
фотопленки). Обнаженные участки нервов покрывают ватными тампонами,
смоченными изотоническим раствором натрия хлорида в объеме 0,1 мл.
Лягушку подвешивают за нижнюю челюсть на штативе. Определяют время
сгибательного рефлекса каждой лапки в ответ на погружение ее в 0,2 Н
раствор соляной кислоты на глубину 1 см. С одного нерва снимают ватку с
изотоническим раствором и заменяют ее на ватку с изучаемым раствором
вещества. Растворы изучаемого вещества используют в объеме 0,1 мл.
Другая лапка остается контрольной — с изотоническим раствором натрия
хлорида на нерве.
В эксперименте используют молярные концентрации изучаемых
веществ при строго определенном (7,35) рН раствора. Определяют действие
вещества через 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 мин после
подведения его к нерву. После каждою погружения лапки в кислоту, ее
отмывают изотоническим раствором. За минимальную эффективную
концентрацию принимают наименьшую концентрацию вещества, которая
вызывает полный блок проведения импульсов по нерву в отсутствие
сгибательного рефлекса при соприкосновении лапы с кислотой в течение
1 мин. Определяют время наступления полного блока и длительность
анестезии. Для каждой концентрации используют не менее 5 лягушек.
Результаты исследования сводят в таблицу. В качестве примера см.
табл. 3.
3.2. Изучение местноанестизирующей активности при проводниковой
анестезии поясничного сплетения у лягушек по методу Bulbring и Wajda
(18)
Исследования проводят на лягушках Rana temporaria. Лягушку декапи-
тируют, сохраняя нижнюю челюсть, и разрушают спинной мозг до III
грудного позвонка. Брюшную полость вскрывают поперечным разрезом
под грудиной и удаляют внутренние органы так, чтобы было обнажено
поясничное сплетение. Лягушку подвешивают на штативе за нижнюю
челюсть. Определяют исходное время сгибательного рефлекса лапок (не
более 3 с) после погружения в 0,2 Н раствор соляной кислоты на глубину
1 см. Исследуемое вещество вливают в свободное пространство нижней
части брюшной полости. Анестезирующий эффект определяют по времени
исчезновения рефлекторной реакции при раздражении задних
конечностей. Действие веществ в возрастающих концентрациях определяют через
короткие интервалы времени (5 мин). Лапку после каждого погружения в
- 373-

Таблица 4. Местиоаиестезирующая активность тримекаииа при проводниковой
анестезии поясничного сплетения у лягушек
Концентрация раствора
соединения
Тримекаин 1 % (35, 0 мм)
Тримекаин 5 % (17,50 мм)
Анестезия
время наступления анестезии
(мин)
8, 4 + 04
3,5 + 0,2
длительность анестезии (мин)
>50 мин.
>50 мин.
Примечание. Представлены средние данные из 5 опытов со стандартной ошибкой
средней.
раствор соляной кислоты отмывают изотоническим раствором натрия
хлорида. Определяют время наступления и продолжительность действия
при проведении анестезии изучаемых соединений в разных концентрациях
и минимальную эффективную концентрацию, оказывающую местноане-
стезирующий эффект. Результаты опытов заносят в таблицу. В качестве
примера см. табл. 4.
3.3. Изучение местноанестезирующей активности при проводниковой
анестезии хвоста у мышей по методу Bianchl (20)
Опыты выполняют на беспородных белых мышах-самцах массой 18—
22 г. Для эксперимента отбирают животных, отвечающих на механическое
сдавливание хвоста с помощью небольшой артериальной клипсы в течение
30 с. Наложение клипсы, бранши которой обтянуты тонкой резиновой
трубочкой, производят дистальнее места последующей инъекции под кожу
хвоста 0,1 мл изотонического раствора натрия хлорида (для контрольной
группы) или раствора изучаемого вещества (для опытной группы), которые
вводят на расстоянии 1 см от корня хвоста. Повторное тестирование
осуществляют через 15 мин после введения 0,1 мл раствора исследуемого
вещества. Поскольку реакция животных в ответ на механическое
сдавливание хвоста регистрируется в альтернативной форме, по результатам
исследования можно говорить только о 100 % глубине эффекта изучаемого
вещества. В рассматриваемом методе заключение о характере местноанесте-
зирующего вещества можно сделать на основании вычисляемой ЭД50 (мг/мл)
изучаемого раствора. Для определения начала и длительности эффекта
вещества можно тестировать животных многократно с 15—30-минутными
интервалами. При этом обязательным является сопоставление результатов
полученных в опытной группе животных с результатами контрольной
группы.
Таблица 5. Местиоаиестезирующая активность новокаина и кокаина при
проводниковой анестезии хвоста у мышей
Вещество
Новокаин
Кокаин
Количество мышей
120
160
Анестезия
ЭД50 (мг/мл)
4,25 (3,4 (5,31)
0,66(0,53 (0,81)
относительная активность
1
6,4
Примечание. Представлены средние данные из 5 опытов.
- 374-

В табл. 5 в качестве примера представлены ЭД50 новокаина и кокаина
при тестировании ответной "болевой реакции" через 15 мин после
введения вещества.
3.4. Изучение местноанестезирующей активности при проводниковой
анестезии седалищного нерва у крыс по методу Camougic и Тактап (15)
Исследования проводят на беспородных крысах-самцах массой 180—
220 г. У животных предварительно тестируют двигательную реакцию в
ответ на болевое механическое сдавливание стопы. Регистрацию реакции
осуществляют на аналгезиметре, представляющем из себя рычаг, с
автоматически перемещающимся по его градуированному плечу грузом массой
350 г. Нижнюю конечность животного удерживают между неподвижной
площадкой и рычагом аналгезиметра. Учитывают значение шкалы прибора
в условных единицах, при котором крыса совершает попытку высвободить
конечность из-под рычага (приведенные в табл. 6 результаты получены на
аналгезиметре фирмы "Ugo Basel, Rid. Res. Appar 21 025, CAT № 7200").
Кроме того, вне аналгезиметра регистрируют положение нижних
конечностей крысы при удерживании животного на весу за хвост, отмечая при
этом в норме разведение пальцев задней конечности в виде "веера".
Изучаемое вещество вводят в область седалищного нерва в объеме
0,2 мл в условиях пронации нижней конечности с ее внутренней стороны.
Вкол иглы производят с дистальной стороны по ходу нерва между
четырехглавой мышцей бедра и большой ягодичной мышцей. Точность
подведения вещества к нерву требует хорошего навыка. Другую заднюю
конечность используют в качестве контроля, подводя к седалищному нерву в
том же объеме эталонное вещество.
Повторное тестирование реакции животного в ответ на болевое
механическое сдавливание и регистрацию реакции "веера" пальцев осуществляют
сразу через 3, 5, 15, 30, 45, 60, 75 мин и т. д. После введения вещества
определяют время наступления, глубину и продолжительность анестезии,
вызываемой изучаемыми веществами. При проведении исследований новых
соединений в различных концентрациях может быть определена ЭК50.
Результаты исследований сводят в таблицу В качестве примера см. табл. 6.
3.5. Изучение местноанестезирующей активности при проводниковой
анестезии седалищного нерва у кроликов с помощью "болевого " метода (5)
Опыты выполняют на кроликах-самцах массой 2,0—2,5 кг. Кролика
фиксируют на животе за лапы на станке. Область бедра освобождают от
Таблица 6. Местноанестезирующая активность тримекаина при проводниковой
анестезии седалищного нерва у крыс
Объем и концентрация
Тримекаин 0,2 мл 2 % (7'0,0i мМ)
Анестезия
время наступления
анестезии (мин)
2,0 ± 0,3
глубина
анестезии в %
90
длительность
анестезии (мин)
110,0 ± 9,4
Примечание. Представлены средние данные из 5 опытов со стандартной ошибкой
средней.
- 375-

шерсти. Под легким ингаляционным эфирным наркозом обнажают
седалищный нерв, под очищенный от соединительной ткани и жировой
клетчатки нерв подводят полиэтиленовую ванночку (размерами 1 х 1 см с
прорезями, соответствующими диаметру седалищного нерва) и на 1 см дис-
тальнее — платиновые электроды, с межэлектродным расстоянием 2—
3 мм. Участок нерва над ванночкой покрывают ваткой, смоченной
изотоническим раствором натрия хлорида. После выхода кролика из наркоза
наносят болевое раздражение на нерв прямоугольными импульсами тока
длительностью 0,3 мс, с частотой 50 Гц, амплитудой от 0,5 В и выше
(электростимулятор ЭСЛ-2), до появления ответной реакции кролика,
сопровождающейся изменением ритма и амплитуды дыхания. Интервал
между подачей стимулов равен 1 мин. Длительность каждого стимула — 2 с.
Регистрацию дыхания осуществляют на самописце с помощью механодат-
чика любой конструкции, связанного с капсулой Марея, в которую
поступает воздух через резиновую трубку, помещенную в один из носовых ходов
кролика или с помощью термодатчика, укрепленного у ноздри на пути
выдыхаемого воздуха.
За пороговое раздражение принимают минимальную величину
напряжения электрического тока в вольтах, при которой наступает заметная
болевая реакция кролика, сопровождаемая изменением ритма и амплитуды
дыхания. Обычно эта величина составляет 0,5—1,5 В — фоновое значение.
После определения порога болевой чувствительности, участок нерва над
ванночкой покрывают сухой ваткой и смачивают ее 1,0 мл 1 % раствора
исследуемого вещества. Тестирование "болевой" реакции в ответ на
стимуляцию осуществляют через 3, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90, 120 мин и т. д. после
подведения изучаемого вещества к нерву. Через 30 мин после начала
опыта вещество удаляют из ванночки вместе с ваткой и заменяют его
изотоническим раствором натрия хлорида на ватке. О времени наступления
анестезии, ее глубине и длительности судят по изменению порога
электрического раздражения нерва кролика после воздействия на него раствора
испытуемого вещества. Глубину анестезии выражают в процентах. За 20 %
анестезию принимают действие вещества, устраняющее реакцию на
пороговое раздражение. Повышение, по сравнению с пороговым, величины
раздражения на 1 В принимают за 40 % анестезию; на 2 В — за 60 % и т. д.
Повышение порога на 4 В принимают за полную (100 %) анестезию. С
каждой концентрацией изучаемого вещества ставят 5 опытов.
3.6. Изучение местноанестезирующей активности при проводниковой
анестезии седалищного нерва у кроликов с помощью "бескровного " метода,
(метод разработан в НИИ фармакологии РАМН) (12)
Опыты выполняют на кроликах-самцах массой 2,0—2,5 кг.
Проводниковую анестезию у животных проводят, используя
инъекционный способ подведения изучаемого вещества к нервному волокну.
Инъекционную иглу, служащую одновременно электродом, на всем
протяжении, за исключением острия, изолируют тонкой полиэтиленовой
трубкой и подводят к седалищному нерву кролика в области верхней трети
бедра (на 1 см ниже от середины линии, проведенной от седалищного
бугра до вертела бедренной кости; точность подведения вещества к нерву
требует хорошего навыка).
Для уточнения правильности проведения иглы через нее проводят
электростимуляцию нерва. Подведение иглы считывается точным, если имеет-
- 376-

Таблица 7. Местноанестезирующая активность тримекаина, маркаина и новокаина при
проводниковой анестезии у кроликов
Концентрация раствора
соединения
Тримекаин 1 % (35 мМ)
Маркаин 0,75 % (24,9 мМ)
Новокаин 1 % (36 мМ)
Анестезия
время
наступления
анестезии (мин)
10,0 + 0,9
12,0 + 0,5
20,8 + 1,0
глубина
анестезии в %
100
100
60
длительность
полной
анестезии (мин)
140,0 + 6,2
310,0 + 6,5
общая
длительность
анестезии (мин)
171,0 ± 3,8
420,0 ± 10,2
50,4 ± 2,2
Примечание. Представлены средние данные из 5 опытов со стандартной ошибкой
средней.
ся реакция нерва на раздражение его прямоугольными импульсами тока
длительностью 0,3 с, частотой 50 Гц и амплитудой 0,36 В.
Далее через эту иглу вводят изучаемое вещество и иглу удаляют.
По изменению болевой чувствительности кролика в ответ на
стимуляцию лапы, осуществленную при помощи подкожных электродов, судят о
начале, глубине и длительности анестезии.
Оценку местноанестезирующего эффекта соединения осуществляют в
соответствии с критериями, описанными для "болевого" метода (3.5).
Результаты опытов заносят в таблицу. В качестве примера см. табл. 7.
3.7. Изучение местноанестезирующей анестезии нижнего дентального нерва
у кроликов (метод разработан на кафедре фармакологии СПбМУ
им. Павлова) (2)
Исследования проводят на кроликах-самцах массой 2—2,5 кг.
Вживление электродов в пульпу резца производят под нембуталовьм наркозом.
В верхнем резце животного на расстоянии 1,5—2 мм друг от друга
высверливают два отверстия диаметром 1 мм и глубиной до уровня предентина.
Пульпарный канал не вскрывают, что предотвращает нарушение
жизнедеятельности пульпы в течение продолжительного времени. Для
улучшения контакта электродов с твердыми тканями зуба дно препарированной
полости заполняют серебряной амальгамой. В качестве электродов
используют многожильные провода с диаметром не более 1 мм в тефлоновой
оболочке. Стимулирующие концы электродов зачищают и вставляют в
подготовленные лунки, где фиксируют с помощью самотвердеющей
пломбировочной пластмассы, которая обеспечивает надежную фиксацию и
изоляцию кончиков электродов от окружающих тканей. Свободные концы
электродов проводят под кожей лицевой поверхности черепа с помощью
направляющей иглы и выводят на теменную область, где фиксируют к коже
кисетным швом. Защищенные концы соединяют с коммутационными
проводами от выходных клемм стимулятора. Используют любой тип
стимулятора с выходом по току, генерирующего импульса прямоугольной формы.
Параметры раздражения, частота 100 имп/с, длительность 0,5 мс, сила
тока градуально возрастает в интервале 0,1—10 мА, продолжительность
стимуляции 1 с. Исследование начинают через 3—4 дня после операции.
Во время опыта кролик находится в специальном ящике с отверстием для
фиксации головы. Определяют исходные значения порогов рефлекса
открывания пасти и жевательных движений и вокализации. Раствор анестетика в
- 377-

Таблица 8. Местноанестезирующая активность тримекаина при проводниковой
анестезии нижнего дентального нерва у кроликов
Концентрация
раствора
соединения
Тримекаин
1 % (35 мМ)
Тримекаин
2 % (мМ)
Компоненты болевой
реакции
Рефлекс открывания
пасти Вокализация
Рефлекс открывания
пасти Вокализация
Глубина анестезии
время тестирования после введения соединения
(мин)
10
200
200
200
200
30
200
200
200
200
45
200
200
200
200
60
151
142
142
200
75
132
114
114
200
90
100
100
100
154
105
126
120
100
объеме 1 мл в исследуемом диапазоне концентраций инъецируют под угол
нижней челюсти, при этом иглу вводят на глубину 0,5 см, направляя вдоль
внутренней поверхцости кости. Повышение порогов рефлекса открывания
пасти и вокализации после введения местного анестетика выражают в
процентах по отношению к их исходному уровню и результаты заносят в
таблицу. За полную анестезию принимают сдвиг порогов на 100 %. На одном
животном можно проводить исследование одновременно двух различных
веществ или одного вещества в разных концентрациях. В этом случае
препарируют оба резца, и исследуемое вещество вводят с двух сторон. Через 15—
30-минутные интервалы проводят повторные раздражения пульпы до
полного восстановления порогов рефлекса открывания пасти и вокализации.
Результаты исследований сводят в таблицу. В качестве примера см. табл. 8.
3.8. Изучение местноанестезирующей активности при проводниковой
анестезии большеберцового нерва у кроликов (метод разработан на кафедре
фармакологии СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова) (2)
Опыты выполняют на кроликах-самцах массой 2—2,5 кг. Под
глубоким нембуталовым наркозом осуществляют хроническую имплантацию
электродов на болылеберцовый нерв. С этой целью нижнюю треть
наружной поверхности голени тщательно освобождают от шерсти. В
стерильных условиях проводят разрез кожи и подкожной клетчатки
параллельно ахиллову сухожилию в области проекции нерва. Нерв выделяют
из окружающих тканей с помощью стеклянных палочек на протяжении 1
см. На обнаженный нерв накладывают электрод специальной
конструкции и фиксируют с помощью шелковых лигатур. Электрод представляет
собой полиэтиленовую трубку диаметром 0,2—0,3 мм и длиной не более
0,5 мм. По внутренней поверхности трубки в поперечном направлении
проходят два серебряных провода диаметром 0,1—0,2 мм. С наружной
стороны трубки серебряные электроды спаивают с многожильными
проводами в тефлоновой оболочке и тщательно изолируют. Свободные
концы тефлоновых проводов проводят под кожей спины с помощью
направляющей иглы, выводят на теменную часть черепа и фиксируют там к
коже с помощью кисетного шва. Операционную рану послойно зашивают.
Опыты начинают после полного заживления операционной раны —
через 4—5 дней после операции. Во время опыта животных помещают в
специальную камеру с прозрачной стенкой, позволяющей наблюдать за
их поведением. Свободные концы электрода соединяют с проводами от
- 378 -

Таблица 9. Местноанестезирующая активность трнмеканна при проводниковой анесте
зии кожного нерва у кроликов

Концентрация
раствора
соединения
Тримекаин
1 % (35 мМ)
Тримекаин
2 % (70 мМ)
Компоненты
болевой
реакции
Флексор-
ный рефлекс
вокализация
Флексор-
ный рефлекс
вокализация
Глубина анестезии
время тестирования после введения соединения (мин)
10
200 200
200 200
30
200 200
200 200
40
200 200
200 200
60
200 191
200 20
75
148 126
200 200
90
100 100
143 138
105
100 100
выходных клемм стимулятора. Раздражение кожного нерва осуществляют
пачками прямоугольных импульсов с параметрами 100 имп/с, 0,5 мс, 1 с,
5—30 В. Сначала определяют интенсивность стимуляции, вызывающую
флексорный рефлекс и вокализацию, затем после введения препарата
через 15—30 мин проводят повторные тестирования. Раствор местного
анестетика вводят в объеме 1 мл в область проекции нерва выше
расположения электрода. Оценку местноанестезирующей активности препаратов
осуществляют по изменению интенсивности стимуляции, необходимой
для возникновения флексорного рефлекса и вокализации, выраженных в
процентах по отношению к их исходному значению. За полную
анестезию принимают сдвиг порогов на 100 %. Результаты опытов заносят в
таблицу. В качестве примера см. табл. 9.
3.9. Изучение местноанестезирующей активности при инфильтрационной,
проводниковой и терминальной анестезии у крыс (метод разработан
на кафедре СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова) (2)
Исследования проводят на беспородных белых крысах-самцах массой
200—250 г. Принцип метода заключается в регистрации латентного
периода отдергивания хвоста (tail flick) при термическом воздействии в области
проксимальной трети хвоста. Термическое воздействие наносят с помощью
установки любой конструкции, позволяющей получить сфокусированный
пучок света от лампы накаливания. Интенсивность термического ноци-
цептивного воздействия должна быть отрегулирована таким образом,
чтобы исходные реакции отдергивания хвоста возникли с латентным
периодом в интервале 3—6 с.
При инфильтрационной анестезии раствор препарата в различных
концентрациях вводят под кожу хвоста в области нанесения
термического воздействия в объеме 0,5 мл. При проводниковой анестезии
равномерно с 4 сторон обкалывают корень хвоста раствором препарата в объеме 1
мл. Для оценки активности препаратов при терминальной анестезии
предварительно тщательно выбривают поверхность хвоста в области
нанесения термического воздействия или скарифицируют эпидермис
(моделирование раневой поверхности) на площади 0,5 х 0,5 см.
Фильтровальную бумагу, соответствующую по размеру площади подготовленного
участка хвоста, смачивают 0,5 мл раствора препарата в различных
концентрациях и фиксируют на хвосте с помощью лейкопластыря. При
исследовании местноанестезирующих свойств материалов (полимерные
-379-

Таблица 10. Местноанестезирующая активность тримекаина и маркаина при инфильт-
рационной, проводниковой и терминальной анестезии хвоста у крыс
Концентра-
11ТДС1 ПЙРТОП.
ЦИЯ pacibu-
ра
соединения в %
(мМ)
Тримекаин
0,05 (1,8)
0,1 (3,5)
0,25 (8,8)
0,5 (17,6)
1 (35,0)
Маркаин
0,05 (1,7)
0,1 (3,3)
0,25 (8,3)
0,5 (16,6)
1 (70,0)
Тримекаин
0,5 (17,60)
1 (35,0)
2 (70,0)
Маркаин
0,5 (16,6)
1 (33,3) в
Тримекаин
2 (70,0)
Вид местной
анестезии
Инфильтра-
ционная
проводниковая

Терминальная
Глубина анестезии
время тестирования от момента введения соединения
10
1,39
1,66
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
—
—
2,0
30
1,16
1,1
1,98
1,9
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
—
—
1,64
60
0
0
1,7
1,41
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
1,8
2,0
2,0
2,0
2,0
0
90
0
0
0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
1,6
1,46
1,83
—
—
120
1,2
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
0
1,16
1,23
2,0
2,0
150
0
1,54
2,0
2,0
2,0
2,0
0
1,16
—
—
180
1,17
2,0
2,0
2,0
2,0
0
2,0
2,0
210
0
1,17
1,85
2,0
2,0
—
—
240
0
1,61
2,0
2,0
—
—
270
0
1,56
1,84
2,0
2,0
300
1,25
1,39
1,72
1,86
330
1,35
1,46
1,64
360
0
0
1,23
390
0
пленки, тампоны, перевязочные материалы, содержащие местноанесте-
зирующее средство) их накладывают на подготовленную поверхность
хвоста и фиксируют. Животным контрольной группы вводят тем же
способом и в том же объеме изотонический раствор натрия хлорида. После
введения препарата проводят повторное тестирование с интервалом
времени 15—30 или 30—60 мин.
Максимальное время однократного термического воздействия на фоне
действия препарата не должно превышать 20 с, что соответствует
увеличению латентного периода рефлекса отдергивания хвоста не менее чем в два
раза (на 100 %) и расценивается как полная анестезия. Указанные
значения латентных периодов (максимальные исходные и предельно
допустимые) зависят от технических особенностей устройства, используемого для
термического ноцицептивного воздействия и должны специально
определяться для каждого конкретного прибора.
Полученные данные обрабатывают статистически и сопоставляют со
значениями латентных периодов в контрольной группе животных,
используя критерий Стьюдента. Результаты исследований сводят в таблицу,
рассчитывают коэффициент (К), представляющий собой отношение среднего
-380-

значения латентных периодов отдергивания хвоста после введения
изучаемого вещества через определенное время, к среднему значению исходных
латентных периодов в контроле. В качестве примера см. табл. 10.
3.9.1. Изучение местноанестезирующей активности при проводниковой
анестезии блуждающего нерва у кошки (метод разработан в Кубанской
государственной медицинской академии) (14)
У искусственно вентилируемой кошки, находящейся под хлоралозо-
нембуталовым наркозом (75 + 15 мг/кг внутрибрюшинно) в условиях
автоматического поддержания температуры тела при 37 °С (с помощью
контактного термометра и рефлектора мощностью 100 Вт), выделяют, лигиру-
ют и перерезают на шее правый (левый) блуждающий нерв.
Периферический отрезок нерва накалывают на биполярные игольчатые электроды
(изготовленные из инсулиновых инъекционных игл) с межэлектродным
расстоянием 2—3 мм и заливают расплавленной смесью медицинского воска с
вазелиновым маслом. На расстоянии 1,0—1,5 см от электродов нерв
помещают в круглую ванночку диаметром 1 см и глубиной 1,0 см с прорезями
для размещения нерва и двумя патрубками для замены используемых
растворов. Участок нерва между электродами и ванночкой, а также вход и
выход из последней тоже заливают смесью воска и вазелинового масла.
После этого заполняют ванночку раствором И. П. Кравкова без глюкозы
(Nad - 0,9 г, КС1 - 0,2 г, СаС12, NaHC03 - 0,15 г, Н20 - 100 мл) и
закрывают крышечкой для предотвращения высыхания раствора. На грудной
клетке в области сердца и на одной из конечностей фиксируют
ЭКГ-электроды. Выходной сигнал электрокардиографа подают на устройство,
выделяющее зубец R ЭКГ и запускающее от него электростимулятор,
работающий в режиме одиночных серий импульсов. Раздражая нерв в
периодическом режиме электрическими импульсами (2 мс, 40 Гц, 10 с), определяют
порог хронического эффекта (обычно 0,3—0,4 В) по удлинению интервала
R—R ЭКГ на 5—10 %. После этого наносят на нерв одиночный залп из 3
супермаксимальных импульсов (2 мс, 40 Гц, 6 порогов) синхронно с
зубцом R ЭКГ и определяют исходный хронотропный эффект ХЭ0 100. (Тс—
Тп)/Тп, где Тп — последний перед стимуляцией, а Тс — совпадающий со
стимуляцией кардиоцикл. Вслед за этим удаляют из ванночки
изотонический раствор натрия хлорида и заполняют ее раствором анестетика
избранной концентрации. Через каждые 2 мин (до достижения плато
эффекта) таким же образом определяют текущий ХЭ (ХЭТ, %), после чего
тщательно промывают и снова заполняют ванночку изотоническим раствором
натрия хлорида с последующим определением ХЭТ через 4, 8, 16, 32 мин и
т. д., увеличивая каждый раз интервал между раздражениями нерва в 2 ра-
Таблица 11. Местноанестезирующая активность (М ± т) новокаина (п = 7) и маркаи-
на (п = 6) при проводниковой анестезии блуждающего нерва у кошек
Изучаемый
раствор анестетика, %
Новокаин, 0,5 %
Маркаин, 0,25 %
Время
наступления
9,0 ± 0,7
10,0 ± 0,9
Глубина
100
100
Длительность
0,6 + 0,6*
56,0 + 5,8
Время
23,0 + 2,1
261,2 + 14,7
Примечание. * — восстановление проводимости нерва начинается сразу после
удаления анестетика.
-381 -

за. При этом глубина анестезии (ГА, %) на протяжении всего опыта
оценивается по формуле:
ГА = 100 (ХЭ0 - ХЭТ)/ХЭ0.
Для каждой концентрации изучаемого вещества выполняют 5—7
экспериментов с обобщением результатов в виде таблицы. В качестве примера
см. табл. 11.
4. Комбинированные модели анестезии
4.1. Комбинированное (одновременное) выявление местноанестезирующей
активности при инфильтрационной и проводниковой анестезии у мышей
(метод разработан в НИИ фармакологии РАМН) (11)
Опыты выполняют на беспородных мышах-самцах массой 18—20 г, у
которых оценивают латентный период отдергивания хвоста при
термическом воздействии фокусированного пучка света. Методика проведения
исследования аналогична описанной для крыс за исключением того, что при
отборе животных наведение луча света осуществляют дважды в
последовательности: "дистальный—проксимальный" участки хвоста с интервалом
10 с и получают таким образом фоновые значения латентных периодов в
пределах от 3 до 5 с. Раствор исследуемого вещества в объеме 0,05 мл
вводят с помощью инъекционной иглы диаметром 0,3 мм под кожу в
ростральном направлении в дорсальную поверхность проксимального участка
хвоста на расстоянии 1 см от его корня. Для точного дозирования объема
вещества используют шприц с микровинтом, соединенный с иглой с
помощью полиэтиленового катетера.
В процессе повторного тестирования термическое воздействие наносят
дважды в той же последовательности, что и при контрольном
тестировании: сначала — на дистальный участок (1 см от кончика хвоста), затем —
на проксимальный участок (область инфильтрирования раствором
изучаемого вещества — 1 см от корня хвоста). В первом случае оценивают
значения латентных периодов реакций для проводниковой анестезии (П), во
втором — для инфильтрованной (И). Оценку МА новых соединений
осуществляют в соответствии с критериями, описанными для метода на
крысах (3,9).
Используя метод двойного наведения луча на хвост мышей, можно
получить дополнительную информацию о глубине и длительности МА в
условиях, когда тепловое воздействие наносится в течение более длительного
времени, ограниченного повреждением тканей хвоста. В этом случае схема
эксперимента должна быть изменена. Отобранных по результатам
фонового тестирования животных группируют (по 6 мышей) для каждого
заданного интервала между моментом введения анестетика и моментом
последующего тестирования, которое осуществляют у каждой группы один раз.
Тестирование контрольной группы животных производят в соответствии с
временем тестирования опытных групп: через 5, 15, 30, 60, 90 мин и т. д.
Полученные данные обрабатывают статистически, учитывая значения
латентных периодов реакции отдергивания хвоста по каждой группе
животных отдельно по результатам стимуляции дистального (М ± т) и (Ml ±
т), и, соответственно, проксимального (М2 ± т) участков хвоста. Затем
сопоставляют указанные значения с соответствующими значениями
латентных периодов в контрольной группе животных, используя t-критерий
- 382-

Таблица 12. Местноанестезирующая активность тримекаина и маркаина при инфильт-
рационной и проводниковой анестезии у мышей
Объем и
концентрация раствора
соединения
Тримекаин 0,05 мл
1 % (1,8 мМ)
Маркаин 0,05 мл
1 % (1,7 мМ)
Вид
местной

анестезии
И
П
И
П
Глубина анестезии (К)
время тестирования от момента введения соединения (мин)
5
2,9
1,3
3,5
1,2
15
2,3
1,4
2,24
1,5
30
1,9
1,2
2,9
2,8
60
1,6
1,0
2,5
2,0
90
2,0
1,4
120
1,3
1,0
180
1,2
Примечание. Представлены данные из 6 опытов для каждой временнбй
характеристики.
Стьюдента. Полученные результаты сводят в таблицу, рассчитывают
коэффициенты (К), характеризующие глубину местноанестезирующего
действия соединения в каждый из изучаемых временных интервалов между
введением вещества и моментом тестирования его эффекта. Коэффициент К
представляет собой отношение среднего значения латентных периодов
отдергивания хвоста после введения изучаемого вещества к среднему
значению латентных периодов в контрольной группе животных. См. табл. 12.
При проведении исследований по методикам 3.2 и 4.1 необходимо
соблюдать оптимальный температурный режим в экспериментальной
комнате (не менее 200), так как при охлаждении животного ухудшается
гемодинамика в области хвоста и увеличивается вероятность появления
ошибочных данных.
5. Модели эпидуральной анестезии
5.1. Изучение местноанестезирующей активности при эпидулярной
анестезии у кроликов (метод разработки в научно-исследовательской
лаборатории анестезиологии и реаниматологии Московской медицинской
академии им. И. М. Сеченова) (8)
Исследования проводят на кроликах-самцах массой 2,8—3,6 кг. Под
местной анестезией (новокаин — 0,5 % раствор) осуществляют доступ к
дужке поясничного позвонка на уровне гребней подвздошных костей. С
помощью зубного бора диаметром около 1,5 мм в душке позвонка осторожно
высверливают отверстие, достигая твердой мозговой оболочки. Через это
отверстие на глубину 1,5 см аккуратно, не перфорируя твердую мозговую
оболочку, в ростральном направлении вводят полиэтиленовый катетер
диаметром около 1,4 мм, который используют для введения изучаемого
вещества в перидуральное пространство. Перед введением вещества
оценивают исходный порог болевой реакции в ответ на электростимуляцию задней
конечности кролика через внутрикожные игольчатые электроды.
Используют прямоугольные импульсы тока частотой 100 Гц, длительностью 1 мс,
напряжением от 1 В и выше от стимулятора ЭЛС-2, продолжительность
каждого стимула 2—3 с. Болевые пороги определяют по дыхательной (см.
раздел 2.2) и двигательной реакциям, а также по вокализации животных.
Раствор изучаемого вещества в нужной концентрации вводят через катетер
в объеме 1 мл и по изменениям болевых порогов определяют начало, глу-
-383 -

Таблица 13. Местноанестезирующая активность тримекаина при эпидуральной
анестезии у кроликов

Соединение
Тримекаин
Доза
(мг/кг)
2,0
Анестезия
Дыхательной
Двигательной
Голосовой
Увеличение болевого порога в
% через 15 мин после введения
соединения по реакции
168,7 ± 12,1
135,4 ±21,8
146,9 ± 30,2
Общая
длительность анестезии
(ч)
1,5-2,0
бину и продолжительность местной анестезии. Сопоставляют результаты,
полученные в группах сравнения (у животных при эпидуральном введении
изотонического раствора натрия хлорида, у животных при эпидуральном
введении эталонного местного анестетика) с результатами, полученными в
опытной группе (у животных при эпидуральном введении изучаемого
вещества). Статистическую обработку проводят с помощью
непараметрического метода. Результаты опытов заносят в таблицу (табл. 13).
5.2. Изучение местноанестезирующей активности при эпидуральной
анестезии у кроликов с помощью бескровного " метода (метод разработан
в НИИ фармакологии РАМН) (4)
Опыты выполняют на кроликах-самцах массой 2,8—3,0 кг. Кролика
фиксируют на животе за лапы на станке. Определяют порог болевой
чувствительности животного, используя электростимуляцию одной из задних
лап. Раздражения наносят электрическим током частотой 50 Гц,
длительностью 1 мс с помощью внутрикожных электродов от стимулятора ЭСЛ-2.
Показателем болевой реакции является изменение ритма и амплитуды
дыхания животного. Регистрацию дыхания осуществляют на самописце,
связанном с капсулой Марея, в которую поступает воздух через резиновую
трубку, вставленную в ноздрю кролика. На спине кролика определяют
месторасположение подвздошных костей. На этом уровне, по ходу
позвоночника, освобождают кожу от шерсти. Анестезию проводят "бескровным"
методом (без наркоза и операции). Пункцию эпидурального пространства
осуществляют тупозаточенной детской иглой для спинномозговой
анестезии после анестезии кожи 0,2 мл и 0,25 % раствора новокаина на один
сегмент выше подвоздошных костей. Иглу вводят в межостистые связки, по
центру позвоночника, под углом 35—45, краниально, с мандерном. Ман-
дерн удаляют и подсоединяют шприц с изотоническим раствором натрия
хлорида и пузырьком воздуха. Осторожно продвигают поршень и иглу в
перидуральное пространство.
Китериями попадания в перидуральное пространство служат тест утери
сопротивления и характерное вздрагивание кролика на введение иглы.
Далее через эту иглу вводят медленно за 20—30 с 1 мл раствора изучаемого
вещества, после чего иглу удаляют.
Вместе с тем точность введения в эпидуральное пространство таким
способом требует хорошего навыка.
Тестирование болевой реакции животного в ответ на стимуляцию
задней конечности осуществляют непосредственно после введения вещества
через 3, 5, 15, 30 мин и далее через каждые 30 мин.
О времени наступления анестезии, ее глубине и длительности судят по
изменению показателя болевого порога животного. Глубину анестезии вы-
- 384-

Таблица 14. Местноанестезирующая активность тримекаина при эпидуралыюй
анестезии у кроликов (бескровный метод)
Соединение
Тримекаин

Концентрация
раствора
соединения
2 %
Доза (мг/
кг)
8,0
Анестезия
время наступления
анестезии (мин)
40%
глубины
1,0 + 0,2
100 %
глубины
2,5 ± 0,5
длительность анестезии
(мин)
100 %
глубины
37,5 ± 7,5
40 %
глубины
71,0 ± 14.2
Примечание. Представлены средние данные из 5 опытов со стандартной ошибкой
средней.
ражают в процентах. Повышение порога по сравнению с исходным
значением на 2 В принимают за 40 % анестезию, на 5 В — за 100 % и
расценивают как полный эпидуральный блок. Результаты опытов заносят в
таблицу (табл. 14).
6. Модели спинномозговой анестезии
6.1 Изучение местноанестезирующей активности при спинномозговой
анестезии у крыс по методу Dib (16)
Исследования проводят на крысах массой 200—250 г в условиях
свободного поведения животных. Предварительно под нембуталовым наркозом
крысам вводят полиэтиленовый катетер под твердую оболочку спинного
мозга. С этой целью поверхность кожи на уровне IV—V поясничных
позвонков тщательно выбривают. Разрезают кожу и фасции, раздвигают
мышцы и инъекционной иглой делают отверстие в твердой мозговой
оболочке спинного мозга. Катетер диаметром 0,5—1 мм и объемом 5 мкл
осторожно вводят через это отверстие и продвигают вверх на 2—3 сегмента.
Свободный конец катетера фиксируют к мышцам во время послойного
зашивания раны. Эксперименты на животных проводят на 3—4-й день после
операционной подготовки. Болевую чувствительность животных
оценивают в тесте отдергивания хвоста и/или по порогу вокализации при
механическом раздражении корня хвоста. Одновременно можно регистрировать
реакции артериального давления в сонной артерии и частоту дыхания.
Раствор изучаемого вещества вводят с помощью микрошприца типа МШ-
М 1. Через выбранные промежутки времени осуществляют повторные
определения болевой чувствительности животных, которые сопоставляют с
контрольными значениями.
6.2, Изучение местноанестезирующей активности при спинальной
анестезии у крыс "бескровным " методом (метод разработан в НИИ
фармакологии РАМН)
Опыты проводят на крысах-самцах массой 200—250 г. На уровне
поясничного отдела позвоночника крысы ножницами (одним движением)
отсекают предварительно анестезированный (1—2 мл 2 % раствора новокаина)
участок кожи диаметром 2 см. В результате этой манипуляции обнажаются
13 - 762
- 385-

Таблица 15. Местноанестезирующая активность тримеканна при спнналыюй анестезии
у крыс ("бескровный" метод)
Объем и

концентрация
раствора
соединения
Тримекаин
40 мкл 2 %
Стимуляция
электрическая
термическая
механическая
анестезия
глубина в %
60

длительность (мин)
10,5 + 2,4
глубина в %
20

длительность (мин)
5,01 + 1,5
глубина в %
25

длительность (мин)
5,0 + 1,6
Примечание. Представлены средние данные из 6 опытов со стандартной ошибкой
средней.
четкие анатомические структуры костно-мышечного аппарата поясничной
области крысы, позволяющие визуально и пальпаторно обнаружить
локализацию остистых отростков позвоночника и связок между ними, которые
являются основными ориентирами для направленного погружения
инъекционного погружения инъекционной иглы до уровня спинномозгового
канала.
Используя тесты отдергивания лапы и отдергивания хвоста при
электростимуляции лапы и тепловом и механическом раздражении корня
хвоста, определяют пороги болевой чувствительности животных до введения
вещества.
Спинальное подведение вещества крысам осуществляют с помощью
туберкулезного шприца, оснащенного дозирующим микровинтом и
соединенного при помощи полиэтиленового капилляра с инъекционной иглой
(может быть использован любой микроинъектор с ценой деления 1 мкл).
Для проведения опыта используют инъекционную иглу от туберкулезного
шприца, диаметром 350 мк, с измененным углом заточки 45°. Игла
вкалывается строго по сагиттальной плоскости каудально, под углом около 50" к
линии позвоночного столба, в области связки между остистыми
отростками III и IV поясничных позвонков, на глубину до ощущения легкого
"провала" иглы. Сразу после этой процедуры приступают к медленному
введению изучаемого раствора вещества (объем 40 мкл) в спинномозговой
канал крысы с помощью микроинъектора (точность подведения вещества к
спинному мозгу требует хорошего навыка). Критерием попадания
активного вещества к спинному мозгу является определяемый визуально
паралич задних конечностей животного.
В этих условиях приступают к последовательному тестированию болевой
чувствительности животных. В первые 15 мин после введения изучаемого
вещества определяют изменение болевой чувствительности крыс через
каждые 5 мин и далее через каждые 15 мин, до восстановления фоновых
значений, зарегистрированных непосредственно перед началом эксперимента. На
основании изменений болевых порогов животных после введения
исследуемого вещества определяют время наступления, глубину и продолжительность
анестезии. Увеличение болевого порога в 5 раз при электрическом
раздражении лапы или механическом раздражении корня хвоста крысы, а также
увеличение порога болевой чувствительности на 10 с при термическом
раздражении хвоста животного принимают за 100 % анестезию. С каждой
концентрацией раствора изучаемого вещества ставят 6 опытов. Контрольным
крысам вводят изотонический раствор натрия хлорида (или другой раствори-
-386-

тель, используемый для исследуемого вещества) таким же способом, как и
опытным крысам. Результаты опытов сводят в таблицу. В качестве примера
см. табл. 15.
7. Методики изучения местнораздражающего действия местных анестетиков
Местные анестетики в определенных концентрациях могут оказывать
местнораздражающее действие. Перспективными для клинического
применения считаются только те препараты, местнораздражающее действие
которых проявляется в концентрациях, существенно превосходящих их
"терапевтические", т. е. применяемые в клинике. В связи с этим при
проведении доклинического изучения новых местных анестетиков совершенно
необходимым является специальное исследование и местнораздражающих
свойств.
Проявления местнораздражающего действия новых препаратов могут
быть предварительно обнаружены при скрининге, например при оценке
терминальной анестезии методом Regnier на роговице глаза кролика или
инфильтрационной анестезии на морских свинках (метод Bulbring и Waj-
da). При этом наблюдение за местом инъекции препарата проводят в
течение недели, так как повреждающее действие наиболее отчетливо
проявляется в этот период. Для более детальной оценки местнораздражающего
эффекта исследуемых препаратов целесообразно использовать специальные
методы.
7.1. Изучение местнораздражающего действия на крысах по методу Норре,
Alexander и Miller (17), Kollzer и Wehr (19)
Опыты выполняют на белых крысах-самцах массой не менее 120 г,
которым в область хвоста после предварительного удаления волосяного
покрова внутрикожно в 4 точках вводят по 0,1 мл раствора исследуемого
соединения в концентрациях, убывающих в геометрической прогрессии. Для
определения раздражающих свойств раствор нового соединения в каждой
из исследуемых концентраций должен оцениваться не менее чем на бжи-
Таблица 16. Оценка местнораздражающего действия соединений
Степень
раздражения в баллах
Ранние признаки раздражения
тканей (через 3 ч)
Поздние признаки раздражения
тканей (через 24 ч)
На месте инъекции изменения
отсутствуют
Визуально различаемое слабое
окрашивание тканей диаметром
не более 6 мм
Яркое (от светло-голубого до
умеренно синего)
окрашивание тканей диаметром 3—7 мм
Яркое темно-синее
окрашивание тканей диаметром 4—8 мм
Темно-синее кольцо с ишеми-
ческим центром
Изменения отсутствуют
Незначительное уплотнение на
месте инъекции при отсутствии
гиперемии
Незначительная, полностью
обратимая геморрагия, при отсутствии
признаков некроза
Выраженная геморрагия с
начинающимся некрозом тканей, без
признаков воспалительной реакции
Выраженный некроз тканей с
начинающейся воспалительной реакцией
13*
- 387-

вотных. Сразу после последней внутрикожной инъекции, каждой крысе в
бедренную вену вводят по 0,1 мл на 100 г массы 1 % раствора трипанового
синего. Степень раздражения тканей оценивают спустя 3 и 24 ч по
4-балльной шкале (табл. 16).
Для каждой концентрации высчитывают среднее арифметическое
значение местнораздражающего действия в баллах и вычерчивают график
зависимости раздражающего эффекта от концентрации (по оси абсцисс —
логарифмы концентраций, по оси ординат — степень раздражающего
действия). График позволяет определить 3 показателя местнораздражающего
действия: 1) степень раздражающего действия, вызываемого 1 % раствором
соединения; 2) пороговую концентрацию, не вызывающую необратимых
изменений в тканях; 3) среднюю раздражающую концентрацию, при
которой степень раздражения равна 2 баллам, т. е. концентрацию, не
вызывающую необратимых изменений в тканях. Эти показатели также могут быть
получены расчетным путем при использовании метода наименьших
квадратов. Бесперспективными для клинического применения следует считать
те соединения, у которых средние раздражающие концентрации
приближаются к "терапевтическим" концентрациям.
7.2. Изучение местнораздражающего действия соединений на кроликах
по методу Camougis и Takman (15)
Исследования проводят на кроликах-самцах, массой 2,5—3,0 кг.
Заднюю поверхность спины вдоль позвоночника тщательно, без повреждения
кожного покрова освобождают от шерсти. Растворы местных анестетиков,
приготовленные на изотоническом растворе натрия хлорида, вводят внут-
рикожно в объеме 0,1 мл. Места введения обводят чернилами. Необходимо
использовать специальные шприцы и иглы. Местнораздражающий эффект
оценивают через 24 ч по шкале:
Эритема отсутствует
слабо выражена
средне выраженная
сильно выраженная
Отек отсутствует
слабо выраженный
средне выраженный
сильно выраженный
Размер реактивных изменений (диаметр) 5 мм или меньше
от 5 до 10 мм
более 10 мм
Характер эритемы равномерное покраснение
эритематозное кольцо с ишемическим
центром
0
1
2
3
0
1
2
3
1
2
3
0
1
Для каждой концентрации необходимо провести минимум 6
наблюдений в различных точках. Максимальный местнораздражающий эффект
соответствует 10 баллам шкалы. Для каждой концентрации рассчитывают
средние показатели в баллах, определяют среднюю раздражающую
концентрацию, соответствующую 5 баллам. Определение средней
раздражающей концентрации можно проводить так же, как описано в предыдущем
методе (7.1).
-388 -

7.3 Изучение местнораздражающего действия препаратов на слизистой
оболочке глаза кролика по методу Coelzer и Wehr (19)
Исследуемые вещества в виде 2 % растворов на изотоническом растворе
натрия хлорида вводят в том же объеме, как и при определении действия
веществ по методу Regnier. Одновременно проводят исследование местно-
раздражающих свойств новых соединений по указанной методике. Степень
местнораздражающего действия соединений (средние данные 8 опытов)
оценивают по четырехбалльной шкале через 3 и 24 ч после их введения в
конъюнктивальный мешок глаза кролика.
При оценке действия препаратов можно использовать и прожемуточные
градации, например 2,5 и т. д. При резко выраженных проявлениях
раздражающего действия препаратов оценка их местноанестезирующего
эффекта невозможна из-за сильного блефароспазма.
ПРОГРАММА СКРИНИНГА МЕСТНОАНЕСТЕЗИРУЮЩИХ СРЕДСТВ
Скрининг местных анестетиков может проводиться с помощью любых
из перечисленных выше методов в зависимости от задач и практических
возможностей экспериментатора. Однако при оптимизации скрининга,
сокращения времени исследования, уменьшения его трудоемкости,
повышения прогностического значения полученных результатов при составлении
программы исследования необходимо учитывать три обязательных
условия. Во-первых, МА новых соединений должна быть изучена на моделях
терминальной, инфильтрационной и проводниковой анестезии.
Во-вторых, с учетом современных требований, предъявляемых к МА,
исследования свойства новых веществ должны проводиться в сравнении с
эталонными препаратами с использованием методов, позволяющих максимально
точно (насколько это возможно в экспериментальных условиях)
установить продолжительность их эффекта. В-третьих, наряду с исследованием
МА новых соединений необходимо определить выраженность их
местнораздражающего и общетоксического действия. Только при соблюдении
этих условий может быть сделано наиболее полное и объективное
заключение о МА исследуемого препарата при различных видах анестезии и о
перспективах его клинического применения.
Таблица 17. Оценка местнораздражающего действия местных анестетиков на
слизистой оболочке глаза кролика
Степень
раздражения в баллах
Признаки раздражения
Полное отсутствие проявлений раздражающего действия
Слабо выраженная инъекция сосудов конъюнктивы и увеличение
капилляров склеры
Начальные признаки воспалительной реакции конъюнктивы,
сильное покраснение, слезотечение и выделение секрета
Сильно выраженные воспалительные явления и повреждение
поверхностных клеточных слоев роговицы при отсутствии
необратимых изменений
Хемоз, резко выраженное раздражение и воспалительная реакция с
образованием пустул, возникновением необратимых изменений в
виде рубцов, помутнение роговицы, слепота
-389-

ПЕРВИЧНЫЙ СКРИНИНГ
1. Модели поверхностной (терминальной) анестезии.
1.1. Изучение поверхностной анестезии на роговице глаза по методу
Regnier—Valette.
2. Модели инфильтрационнои анестезии.
2.1. Изучение МА при инфильтрационнои анестезии кожи и подкожной
клетчатки у морских свинок по методу Bulbing и Wajda.
2.2. Изучение МА при инфильтрационнои анестезии у крыс.
2.3. Изучение МА при инфильтрационнои анестезии у мышей.
3. Модели проводниковой анестезии.
3.1. Изучение МА при проводниковой анестезии у мышей.
3.2. Изучение МА при проводниковой анестезии у крыс.
4. Методы выявления местнораздражающего действия.
4.1 Изучение местнораздражающего действия у крыс по методу Норре,
Alexander, Miller.
4.2 Изучение местнораздражающего действия у кроликов по методу
Truant и Tait, Camougis и Takman.
4.3. Изучение местнораздражающего действия на слизистой оболочке
глаза кролика по методу Setnicar, Koelzer и Wehr.
В перечень приведенных тестов первичного скрининга включены не
один, а несколько методов оценки МА при однотипных видах местного
обезболивания, что дает более широкие возможности для выбора из них
наиболее доступных для исследователя. При выборе программы скрининга
следует иметь в виду, что наиболее информативными являются
исследования МА новых соединений при разных видах анестезии у одного и того же
вида животного в условиях однотипного ноцицептивного воздействия,
поскольку это дает возможность объективной оценки основных параметров
действия препаратов в сравнительном аспекте. Исходя из экономических
соображений (расход изучаемого вещества, временные затраты) и вида
животных, в программу скрининга рекомендуется включать методы
комбинированного (одновременного) выявления МА веществ у мышей или
проведение последовательного исследования МА новых соединений при
терминальной, инфильтрационнои и проводниковой анестезии на модели
термического раздражения хвоста и комбинированного метода изучения мест-
ноанестезирующего и местнораздражающего эффектов препаратов на
роговице глаза кроликов. Если использование комбинированных методов
оценки по каким-либо причинам оказываетя невозможным, допустимо
применение любого из перечисленных выше методов, моделирующих
различные виды анестезии.
При изучении МА новых соединений необходимо параллельно
проводить оценку их местнораздражающего эффекта в месте введения в течение
ближайших 1—5 сут. Для перспективных в плане клинического
применения соединений целесообразно проведение последующего, более
детального исследования их местнораздражающего действия с использованием
методов, сообразно с планируемым целевым назначением препарата (см.
раздел 7).
5. Изучение острой токсичности
В рамках первичного скрининга предпочтительно изучать острую
токсичность на мышах при внутрибрюшинном, внутривенном и подкожном
введениях исследуемого соединения, с вычислением ЛД50 по методу Beh-
rens. Соотношение ЛД50 и дозы (из расчета использованного объема
вещества в соответствующей концентрации), вызывающей местноанестезирую-
- 390-

щий эффект в течение 1 ч у одних и тех же животных, может
рассматриваться в качестве ориентировочного показателя терапевтической
безопасности исследуемого соединения. Другим показателем терапевтической
безопасности является соотношение средней тканераздражающей
концентрации (СРК, см. 7.1, 7.2) с концентрацией вызывающей местноанестези-
рующий эффект длительностью 1 ч.
Определение общетоксического действия, соединений следует
проводить в соответствии с общими требованиями МЗ РФ.
В дальнейшем с целью более детального исследования МА новых
соединений с учетом предлагаемого способа применения в клинике должны
использоваться методы углубленного (целевого) изучения.
УГЛУБЛЕННОЕ (ЦЕЛЕВОЕ) ИЗУЧЕНИЕ
1. Модели поверхностной (терминальной) анестезии.
1.1. Изучение поверхностной анестезии на роговице глаза кролика по
методу Regnier, в более широком диапазоне концентраций.
1.2. Изучение МА при поверхностной анестезии слизистой оболочки
глотки и трахеи кошек.
1.3. Изучение МА при терминальной анестезии хвоста у крыс.
2. Модели инфильтрационной анестезии.
2.1. Изучение МА при инфильтрационной анестезии у морских свинок
в более широком диапазоне концентраций.
2.2. Изучение МА при инфильтрационной анестезии брюшной стенки у
кроликов.
3. Модели проводниковой анестезии.
3.1. Изучение МА при инфильтрационной анестезии седалищного нерва
у крыс.
3.2. Изучение МА при проводниковой анестезии седалищного нерва у
кроликов.
3.3. Изучение МА при проводниковой анестезии нижнего дентального
нерва у кроликов.
3.4. Изучение МА при проводниковой анестезии у кроликов.
4. Изучение МА при эпидуральной анестезии у кроликов.
5. Изучение МА при спинномозговой анестезии у крыс.
Методы углубленного изучения, учитывая их сложность и трудоемкость,
целесообразно использовать только на конечных этапах исследования с
целью уточнения основных параметров действия новых соединений.
Обязательность (или необязательность) исследования новых
соединений на тех или иных моделях углубленного (целевого) изучения
определяется тем конкретным видом (или видами) анестезии, при котором
планируется возможное применение этих соединений в клинике. При этом для
каждого выбранного вида анестезии желательно получить информацию не
менее чем на 2 моделях, соответствующих данному виду обезболивания и
на разных видах животных.
В заключение необходимо отметить, что любая программа
исследований, выбранная авторами, должна быть составлена так, чтобы полученные
данные давали возможность составить наиболее полное и объективное
представление о местноанестезирующей активности соединения, скорости
наступления и продолжительности эффекта при различных видах
анестезии, о его местнораздражающих и общетоксических свойствах и оценить
перспективность клинического применения его как препарата.
-391 -

Литература
1. Беленький М. Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. —
Рига, 1959.
2. Игнатьев Ю. Д., Васильев Ю. В., Шальнова Л. И. и др. Местноанестезирующие
свойства полимерного соединения тримекаина // Бюл. экспер. биол. и мед. — 1986.
- № 6. - С. 686-688.
3. Методические рекомендации, требования к доклиническому изучению
общетоксического действия новых фармакологических веществ / Фармакологический комитет
МЗ СССР. - М., 1985.
4. Осипов С. А., Чернякова И. В., Киселевич В. Е. Сравнительная оценка действия
местных анестетиков в сочетании с морфином при их эпидуральном введении //
Анестезиология и реаниматология. — 1993. — № 1. — С. 44—45.
5. Прянишникова Н. Т., Шаров Н. А. Тримекаин. Фармакология и клиническое
применение. — М.: Медицина,1967.
6. Прянишникова Н. Т., Чернякова И. В. Поверхностная активность и механизм
действия лекарственных веществ // VII Метод. Конгресс по ПАВ. — М., 1978. — Т. 3. —
С. 390-408.
7. Прянишникова Н. Т., Чернякова И. В., Сколдинов А. П. и др. Поиск новых
обезболивающих средств среди амидов циклических аминокислот. - В кн.:
Целенаправленный поиск нейротропных препаратов. — Рига, 1983. — С. 110—131.
8. Сачков В. К, Сухонощенко Е. А., Коган Е. А. и др. Эпидулярная аналгезия кетами-
ном в эксперименте // Анестезиология и реаниматология. — 1986. — № 4. — С. 7—
12.
9. Чернякова И. В. Связь анестезирующей и антиаритмической активности
производных а - азациклоалканкарбонаовых кислот с их влиянием на проницаемость
биологичной фосфолипидной мембраны // Бюл. экспер. биол. и мед. — 1982. — № 5. —
С. 56 - 58.
10. Чернякова И. В., Жуков В. В. Способ изучения действия местных анестетиков при
поверхностной анестезии слизистой глотки и трахеи // Всес. научн. конф. "Оценка
фармакологической активности химических соединений: принципы и подходы". —
М., 1989. - С. 351.
11. Чернякова И. В., Жуков В. Н. Метод комбинированной оценки активности новых
веществ при проводниковой и инфильтрационной анестезии у мышей с
использованием теста "отдергивание хвоста" // Всес. научн. конф. "Оценка
фармакологической активности химических соединений, принципы и подходы". — М., 1989. — С.
118.
12. Чернякова И. В., Киселевич В. Е., Осипов С. А. Новый метод проведения
проводниковой анестезии в эксперименте // Всес. научн. конф. с междун. участием "Синтез,
фармакология и клинические аспекты новых обезболивающих средств". —
Новгород, 1991. - С. 114—115.
13. Харкевич Д. А. Руководство к лабораторным занятиям по фармакологии. — М.:
Медицина, 1986.
14. Шейх-Заде Ю. Р., Галенко-Ярошевский А. П., Чередник И. Л., Поиков В. И. Способ
оценки проводниковой анестезии // Бюл. экспер. биол. и мед. — 1999. — № 4. —
С. 412-414.
15. Camourgis С, Takman В. N. Method's in pharmacology. —New York, 1971.
16. Dib B. Intrathecal chronic cathetarisation in the rat // Pharmacol. Biochem. and Behav.
- 1984. - Vol. 20. - P. 45-48.
17. Hoppe J. O., Alexander E. В., Miller Z. С Use of the trypan blue and rabbit eye thests for
irritation // J. Amer. Pharm. Ass. - 1950. — Vol. 39. - P. 147—151.
18. Quevauviller A. Experimental methods for comparing local anesthetic activity // Intern.
Encyclopedia ofPharmac. and Ther. Sec. 8, v.I local Anaesthcthics, Pergaman Press,
1971. - P. 291-318.
19. Koelzer P. P., Wehr R. H. Bezichungen zmischen chemischer. Konstituion und phannoco-
lo-gischer wirkung bei mehreren. — Arzneimittel Forsch, 1959. — S. 683—693.
20. Valette G, Carion J. Suz une methode depreciation des effects anesthesiologues locaux sur
la muguesure bucco — pharyngel du Zappirt // Ann. Pharm. tr. — 1963. — Bd 21. —S.
723-726.

ЧАСТЬ 2
ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ,
ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ
СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ
Методические указания по изучению кардиотонической
активности фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н. С. А. Крыжановский;
к. м. н. А. С. Лосев; к. б. н. М. Б. Вититнова;
к. 6. н. О. Е. Пасхина
Введение
Сердечная недостаточность — тяжелое распространенное заболевание,
характеризующееся неспособностью сердца обеспечить адекватное
кровоснабжение организма и, тем самым, реализовать его метаболические
потребности.
В основе этого патологического процесса лежит недостаточное
кровоснабжение органов и тканей организма, приводящее к уменьшению
доставки к ним кислорода и других субстратов, необходимых для нормального
функционирования. Это связано с низким сердечным выбросом и
нарушением компенсаторной способности миокарда (систолическая сердечная
недостаточность), застоем крови в легких, сердечных венах, а также
замедлением элиминации продуктов метаболизма (диастолическая сердечная
недостаточность). "Насосная" недостаточность сердца приводит к
формированию в организме ряда компенсаторных механизмов, играющих важную
роль в патогенезе недостаточности кровообращения. Среди них на первое
место выходят такие, как:
— увеличение объема (дилатация) и массы миокарда левого желудочка
сердца;
— повышение общего периферического сопротивления вследствие
повышения тонуса симпатической нервной системы и увеличения в плазме
крови концентрации катехоламинов;
— активация ренин-ангиотензиновой системы и, как следствие этого,
задержка натрия и воды в организме.
В настоящее время базисная фармакотерапия сердечной
недостаточности направлена на коррекцию основных патофизиологических нарушений,
лежащих в основе ее развития:
— восстановление или усиление сниженной насосной функции сердца;
— устранение несоответствия между инотропной функцией сердца и со-
- 393-

стоянием периферического сосудистого русла, т. е. восстановление
физиологического соответствия между пред- и постнагрузкой на миокард;
— удаление из организма избыточного количества внеклеточной
жидкости и стабилизация на физиологическом уровне электролитного баланса
организма;
— восстановление или улучшение метаболических процессов,
протекающих как в самой сердечной мышце, так и в органах-мишенях (печень,
почки, легкие, надпочечники и т. д.)-
Для реализации этих задач в арсенале современных кардиологов
имеется большое количество разнообразных лекарственных средств: ингибиторы
АПФ, периферические вазодилататоры, диуретики, однако, несомненно,
главенствующая роль в терапии как острой, так и хронической сердечной
недостаточности принадлежит кардиотоническим лекарственным
средствам — препаратам, оказывающим положительное инотропное влияние на
миокард.
КЛАССИФИКАЦИЯ КАРДИОТОНИЧЕСКИХ СРЕДСТВ
И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИХ ДЕЙСТВИЯ
Исторически кардиотонические лекарственные средства, применяемые
в клинике для лечения сердечной недостаточности, делятся на две
большие группы:
I. Гликозидные, или стероидные, кардиотоники
Стероидные кардиотоники по своим физико-химическим свойствам
делятся на полярные — гидрофильные (например, строфантин) и
неполярные — липофильные (например, дигоксин, дигитоксин) сердечные глико-
зиды. Кроме того, их можно разделить на природные (например,
дигоксин), природные модифицированные (например, метилдигоксин) и
комбинированные препараты (например, кардиовален).
П. Нестероидные, или негликозидные, кардиотоники
А. Рецепторного типа действия
1. Лекарственные средства, преимущественно стимулирующие ргадре-
нореактивные рецепторы сердца:
— арилалкиламины (например, дофамин, добутамин);
— производные дибензоксипина (например, ВМ 10 188);
2. Лекарственные средства, влияющие на специфические неадренерги-
ческие рецепторные образования сердца и реализующие свои эффекты
через активацию цАМФ-зависимых механизмов мембранного транспорта
ионов Са++:
— полипептиды (например, глюкагон).
Б. Нерецепторного типа действия
1. Лекарственные средства, преимущественно блокирующие фосфоди-
эстеразу:
— хиназопинпиперидины и фталазинпиперидины (например, буквине-
ран, карбазеран);
- 394-

— производные изохинолина (например, пиперазинилхинолины —
ОРС-8212);
— ксантины (например, теофиллин).
2. Лекарственные средства, преимущественно стимулирующие адени-
латциклазу:
— лекарственные препараты растительного происхождения, выделенные
из растения Coleus forskohli (например, форсколин).
3. Лекарственные средства, преимущественно влияющие на
внутриклеточный обмен Са++ в кардиомиоцитах:
— пиридины и бипиридины (например, амринон, милринон);
— производные имидазола, бензимидазола, имидазопиразина
(например, сульмазол);
— ионофоры ионов Са++ (например, карбоксильные антибиотики);
— агонисты ионов Са++ — активаторы медленных кальциевых каналов
(например, производные дигидропиридина — Вау-К-8644).
В. Лекарственные средства, реализующие свой кардиотонический эффект
как через рецепторные, так и нерецепторные механизмы (например,
репротерол)
Помимо лекарственных средств, обладающих истинной кардиотониче-
ской активностью, для лечения сердечной недостаточности применяют
достаточно большое количество препаратов, влияние которых на
сократительную активность сердечной мышцы является опосредованным через их
основные фармакологические эффекты (уменьшение пред- и/или
постнагрузки на сердце, вазодилатация, улучшение коронарного кровотока и
т. д.). К этим лекарственным средствам можно отнести периферические
вазодилататоры, ингибиторы АПФ, а-адреноблокаторы, диуретики,
естественные метаболиты и др. Однако следует подчеркнуть, что некоторые
естественные метаболиты (например, а-карнитин, таурин) могут быть
отнесены к истинным кардиотоническим средствам.
В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что положительный
инотропный эффект различных групп истинных кардиотонических средств
связан с их способностью при помощи различных механизмов увеличивать
концентрацию свободных ионов кальция в цитоплазме кардиомиоцитов.
Кроме того, важную роль в реализации кардиотонического действия
препарата может играть повышение сродства сократительных белков
кардиомиоцитов к ионам Са++.
Известны, как минимум, четыре основных пути увеличения
концентрации свободных ионов Са++ в цитоплазме кардиомиоцитов.
Первый путь. Этот путь увеличения концентрации в цитоплазме
свободных ионов Са++ связан с наличием в мембране кардиомиоцитов Na+/Ca++
обменника: увеличение в цитоплазме содержания свободных ионов Na+
приводит к переносу ионов Са++ из внеклеточной жидкости в цитоплазму
в обмен на ионы Na+. Другими словами, вызываемое любым путем
увеличение концентрации в клетке свободных ионов Na+ (см. ниже) неизбежно
приводит к последующему увеличению концентрации в цитоплазме ионов
Са++ и, как следствие этого, реализации положительного инотропного
эффекта, выражающегося в укорочении "предвыбросного" периода,
удлинении времени выброса (т. е. сокращение становится более эффективным) и
увеличении ударного объема сердца. Повышение концентрации Na+ может
происходить следующими путями:
— ингибирование Na+/K+-ATOa3bi (таким образом действуют
сердечные гликозиды): №+/К+-АТФаза катализирует АТФ-зависимый транспорт
-395-

ионов Na+ и К+ через плазматические мембраны животных клеток. На
каждую молекулу гидролизованного АТФ из клетки выводится 3 иона Na+ и
поступает 2 иона К+. Фермент является электрогенным насосом,
генерирующим трансмембранный потенциал. Он состоит из 2 субъединиц: а (115
кД) — каталитическая и р (55 кД) — гликопротеин, — и существует в виде
ос-р или (а-р)2, а-субъединица аналогична кальциевой АТФазе;
— блокадой трансмембранных К+ каналов. В этом случае ионы К+ не
выходят из цитоплазмы, вследствие чего концентрация внеклеточного К+
уменьшается. Это влечет за собой снижение активности №+/К+-АТФазы
(эффект аналогичен действию сердечных гликозидов), в результате чего в
кардиомиоцитах накапливаются ионы Na+. Неизмененная при этом
активность быстрых Na+ каналов также способствует накоплению ионов Na+ в
клетке;
— активацией быстрых Na+ каналов;
— увеличением концентрации свободных ионов Na+ посредством
активации Na+/H+ обменника. Известно, что Na+/H+ обменник активируется
при стимуляции саркоплазматического ретикулума. Агонисты
специфических рецепторов мембран кардиомиоцитов, стимулируя фосфолипазу С
через систему G-белков и стимуляцию рецепторов (например, глюкагоном),
могут активировать саркоплазматический ретикулум и, тем самым,
стимулировать Na+/H+ обмен, что реализуется в усилении сократительной
активности миокарда.
Второй путь связан с увеличением входа (потока) ионов Са++ из
внеклеточной жидкости в цитоплазму через медленные потенциалзависимые
кальциевые каналы. Медленные кальциевые каналы активируются агони-
стами и/или при фосфорилировании Са++ каналов различными протеин-
киназами (цАМФ-зависимая протеинкиназа С; Са++ и диацилглицеринза-
висимая протеинкиназа С; Са++-кальмодулинзависимая протеинкиназа
и др.). Влияние протеинкиназ на функциональную активность
кардиомиоцитов реализуется при помощи различных вторичных мессенджеров —
внутриклеточных "посредников" (цАМФ, диацилглицерин, Са++ и др.).
Концентрация вторичных мессенджеров в цитоплазме изменяется при
воздействии на клетку внешних стимулов (первичных мессенджеров —
медиаторов, гормонов, агонистов и т. д.).
Передача сигнала от первичных мессенджеров вторичным
осуществляется по универсальному принципу: первичные мессенджеры или
внеклеточные лиганды активируют специфические сарколеммальные рецепторы,
которые, в свою очередь, через систему G-белков передают сигналы на
эффекторные ферменты, ответственные за генерацию вторичных
мессенджеров. Вследствие этого, как уже говорилось выше, активируются
соответствующие протеинкиназы, которые катализируют перенос фосфатных
групп с молекул АТФ на белки-мишени, в частности белки Са++-зависи-
мых каналов, тем самым переводя их в активное состояние.
Вторичный мессенджер — цАМФ — в клетках образуется при
активации аденилатциклазной системы, состоящей из 3 компонентов (систем):
— система мембранных рецепторов, селективно взаимодействующих с
лигандами (агонистами или антагонистами);
— система G-белков, связывающих гуанидиновые нуклеотиды и
осуществляющих передачу сигнала от активированных рецепторов на
каталитический компонент аденилатциклазной системы (различают 2 типа
G-белков: Gs — стимулирующие и Gi — ингибирующие активность
каталитического компонента аденилатциклазной системы);
— каталитический компонент аденилатциклазной системы, превращаю-
- 396-

щий АТФ в цАМФ. Последний взаимодействует с протеинкиназой А,
которая, в свою очередь, фосфорилирует белки медленных Са++ каналов.
Активация Са++ каналов приводит к увеличению входа ионов Са++ в
цитоплазму кардиомиоцитов, что реализуется в усилении сократительной
активности миокарда.
Кардиотонические средства могут повышать концентрацию цАМФ в
цитоплазме кардиомиоцитов следующими путями:
— активация аденилатциклазной системы посредством активации
специфических стимулирующих рецепторов (таким образом действуют агони-
сты рецепторных образований: изадрин, дофамин, глюкагон и др.);
— активация каталитического компонента аденилатциклазной системы
(таким образом действует фореколин);
— ингибирование фермента — фосфодиэстеразы, разрушающего цАМФ
(таким образом действуют ксантины, амринон, милринон и др.).
Активация медленных Са++ каналов может осуществляться также через
протеинкиназу С, активность которой стимулируется другим вторичным
мессенджером, диацилглицерином, в присутствии ионов Са++. В этом
случае под влиянием лиганда, например глюкагона, происходит активация
соответствующих рецепторов. С рецепторов сигнал передается Gs-белкам,
которые, в свою очередь, активируют эффекторный фермент — фосфоли-
пазу С. Фосфолипаза С, взаимодействуя с фосфоинозитольными фосфоли-
пидами (элементами плазмолеммы), стимулирует образование двух
вторичных мессенджеров: диацилглицерина и инозитолтрифосфата. Диацилгли-
церин, как уже было сказано выше, реализует свои эффекты через
протеинкиназу, а инозитолтрифосфат реализует третий основной путь
увеличения числа свободных ионов Са++ в цитоплазме.
Третий путь. Инозитолтрифосфат стимулирует выход ионов Са++ из
внутриклеточных депо. Высвободившиеся ионы Са++ сами играют роль
вторичных мессенджеров, реализуя свои эффекты через специальную
протеинкиназу. Особенность этой протеинкиназы заключается в том, что она
активируется не собственно ионами Са++, а их комплексом с цитоплазма-
тическим белком кальмодулином. Комплекс Са++—кальмодулин
активирует Са++-кальмодулинзависимую протеинкиназу, которая, в свою очередь,
переводит медленные Са++ каналы в активное состояние, что реализуется в
усилении инотропной функции сердечной мышцы.
Четвертый путь. Вход ионов Са++ в клетку может быть стимулирован и
при помощи ионофоров. При этом ионофоры встраиваются в мембрану
кардиомиоцита и образуют, благодаря организации зарядов внутри петли
антибиотика, канал, специфичный для ионов Са++ в стехиометрическом
отношении 1:2, через который не перемещаются ионы с зарядом 1+ и 3+
(таким образом действуют карбоксильные антибиотики, например,
А23 187-кальцимицин).
ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЪЯВЛЯЕМЫЕ К СОВРЕМЕННЫМ
КАРДИОТОНИЧЕСКИМ СРЕДСТВАМ
Несмотря на то что опыт применения кардиотонических средств
насчитывает более двух веков, а спектр препаратов, используемых для
дифференцированного лечения сердечной недостаточности, достаточно велик,
клиника до настоящего времени испытывает значительные затруднения
при лечении пациентов, страдающих этой патологией, особенно ее
хронической формой. Эти затруднения связаны не только с тяжелым состоянием
- 397-

больных, страдающих устойчивыми формами хронической сердечной
недостаточности, но и с наличием практически у всех кардиотонических
средств существенных побочных эффектов и реальной опасности их
передозировки.
Естественно, что поиск новых кардиотропных средств является весьма
актуальной задачей современной кардиофармакологии. Вместе с тем
гетерогенность этой группы лекарственных средств, связанная как с различной
химической структурой препаратов, так и с особенностями их механизмов
действия, не позволяет предложить унифицированную схему поиска новых
оригинальных кардиотонических средств. Поэтому исследователи,
приступающие к скринингу кардиотонических средств, должны полностью
отдавать себе отчет в том, что для решения поставленной перед ними задачи
они должны располагать достаточно сложным и дорогостоящим
комплексом электрофизиологического и биохимического оборудования,
позволяющим целенаправленно и объективно оценить кардиотонический эффект
изучаемых химических соединений или природных биологически
активных веществ.
Перед тем как непосредственно перейти к программе поиска и
изучения механизмов действия новых оригинальных кардиотонических средств,
необходимо остановиться на требованиях, предъявляемых к современным
кардиотонический средствам.
Безусловно, создание "идеального" кардиотонического средства, даже
теоретически, представляется достаточно труднорешаемой задачей, однако
предлагаемое в качестве него соединение должно отвечать, как минимум,
большинству из следующих требований:
— обладать выраженным положительным инотропным действием,
повышать систолический выброс за счет более полного опорожнения левого
желудочка сердца и уменьшать конечно-систолический объем сердца.
Положительный инотропный эффект не должен сопровождаться
существенным повышением потребности миокарда в кислороде;
— положительно влиять на процессы релаксации миокарда;
— снижать общее периферическое сопротивление (т. е. препарат
помимо положительного инотропного действия должен снижать пред- и
постнагрузку на сердце);
— обладать отрицательным хронотропным действием или, как
минимум, не изменять частоту сердечных сокращений в эффективных дозах;
— не оказывать негативного влияния на предсердно-желудочковое
проведение;
— не накапливаться в организме, а в случае кумуляции — не оказывать
аритмогенного действия;
— желательно, чтобы препарат положительно влиял на показатели
почечного, коронарного, мозгового и мезентериального кровообращения
или, как минимум, их не уменьшал;
— не влиять негативно на электролитный обмен;
— увеличивать натрийурез и уменьшать застойные явления;
— быть совместимым с известными препаратами, применяемыми для
лечения сердечной недостаточности;
— обладать достаточно длительным действием;
— желательно, чтобы препарат был эффективен при различных путях
введения (особенно per os) и имел удобные для применения лекарственные
формы;
— производство субстанции и лекарственной формы препарата должно
быть технологичным;
- 398-

— стоимость готовых лекарственных форм препарата не должна
существенно превышать стоимость известных препаратов для лечения сердечной
недостаточности.
ПРИНЦИПИАЛЬНАЯ СХЕМА ПОИСКА
И ДОКЛИНИЧЕСКОГО ИЗУЧЕНИЯ
КАРДИОТОНИЧЕСКИХ СРЕДСТВ
В соответствии с требованиями, предъявляемыми к современным кар-
диотоническим средствам, и построена программа поиска и
доклинической оценки химических средств или природных биологических
соединений, предлагаемых в качестве кардиотоников.
Здесь следует подчеркнуть, что предложенная программа включает в
себя достаточно широкий спектр методических приемов, позволяющий
исследователям выбрать те из них, которые позволят оптимально решить
стоящую перед ними задачу.
Принципиально программа поиска и доклинического изучения кардио-
тонических средств строится следующим образом.
I этап. Скрининг (первичный отбор) и первичная оценка возможных
механизмов действия соединений. Естественно, что основной задачей
этого этапа является оценка влияния изучаемых соединений на силу и
скорость сердечных сокращений. На этом этапе необходимо решить
следующие задачи:
— определение инотропной активности соединения (СЕ50 ИН01р, СЕмакс инотр,
CF V
— определение хронотропной активности соединений (СЕ50 ХРон >
CF CF V
^"^макс хрон.» ч-"-^мин хрон./э
определение влияния изучаемых соединений на потребление сердцем
кислорода;
— определение острой токсичности (ЛД50) изучаемого соединения.
На этом же этапе желательно, по возможности, оценить влияние
изучаемых соединений на активность №+/К+-АТФазы, аденилатциклазы,
фосфодиэстеразы, а также их влияние на рецепторную систему сердца. Так
как все исследования этого этапа, за исключением определения LD50, как
правило, проводятся в экспериментах in vitro, то после выявления
потенциально активных соединений можно оценить их эффект на модели
"спонтанной" недостаточности изолированных препаратов миокарда (см.
ниже) и, в случае отсутствия отрицательного результата, перейти к
изучению эффектов отобранных соединений на моделях сердечной
недостаточности в экспериментах in vivo.
По завершении I этапа поиска необходимо целенаправленно провести
системную оценку полученных результатов, отобрать наиболее
перспективные соединения, после чего определить диапазон доз, способ и схему
применения отобранных соединений на II этапе поиска. На втором этапе
доклинического изучения должны быть испытаны не только более
эффективные, но и менее токсичные (имеющие большое значение LD50, чем
известные кардиотонические соединения.
II этап. Изучение активности отобранных соединений на различных
моделях экспериментальной недостаточности кровообращения в
экспериментах in vivo:
— определение эффективности отобранных соединений на различных
моделях острой сердечной недостаточности;
-399-

— определение эффективности отобранных соединений на различных
моделях хронической сердечной недостаточности.
При изучении эффективности отобранных соединений на различных
моделях сердечной недостаточности оценивают их гемодинамические и
метаболические эффекты, по возможности оценивают влияние соединения
на водно-солевой обмен, морфологические и/или ультраструктурные
изменения в органах-мишенях и т. д. В этих же экспериментах желательно
оценить антиаритмическую активность соединений, их влияние на системное
и регионарное кровообращение, биохимический профиль, ферменты
крови и т. д.
Так же, как и на первом этапе, необходимо сравнивать эффекты
изучаемых соединений и эталонных препаратов. Кроме того, по завершении
II этапа исследований необходимо определить эффективную дозу
соединений, оптимальный путь введения соединений и разработать схему их
применения.
III этап. Изучение спектра сердечно-сосудистой активности
потенциальных кардиотонических соединений:
— оценка антиаритмической активности;
— оценка противоишемической (антигипоксической) активности;
— оценка антигипертензивной активности;
— оценка влияния изучаемого соединения на систему PACK (регуляции
агрегантных свойств крови) и систему осморегуляции.
Изучаемые соединения, как минимум, не должны обладать аритмоген-
ными, гипергензивными и агрегантными свойствами и не должны
повышать потребность миокарда в кислороде.
IV этап. Изучение безопасности потенциальных кардиотонических
средств (подострая и хроническая токсичность, эмбриотоксичность,
мутагенность и т. д.).
В случае получения предварительных результатов об отсутствии у
потенциальных кардиотонических средств повреждающих воздействий на
организм продолжают систематическое изучение безвредности препарата и
параллельно переходят к V—VIII этапам направленного поиска
кардиотонических средств.
Кроме того, на этом этапе для препаратов I класса необходимо
идентифицировать потенциальный антидот (антидот "дигитализации"), так как
для этой группы препаратов нельзя исключить наличия кумулятивного
эффекта.
V этап. Изучение спектра общей фармакологической активности
отобранных соединений и их фармакокинетики. Фармакокинетические
параметры потенциальных кардиотоников необходимо изучать в модельных
экспериментах на животных с острой и хронической недостаточностью
кровообращения. Такой подход обусловлен тем, что метаболизм и
распределение веществ в норме резко отличаются от данных процессов и,
соответственно, параметров фармакокинетики в условиях сердечной
недостаточности.
VI этап. Изучение основных молекулярных механизмов действия
отобранных соединений.
VII этап. Разработка лекарственной формы препарата.
VIII этап. Разработка необходимой документации на субстанцию и
лекарственную форму и написание временной фармакопейной статьи.
-400-

МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРИЕМЫ И МОДЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ, КОТОРЫЕ
МОГУТ БЫТЬ ИСПОЛЬЗОВАНЫ НА I ЭТАПЕ ПОИСКА
И ИЗУЧЕНИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ КАРДИОТОНИЧЕСКИХ СРЕДСТВ
I этап скрининга, как правило, проводится в экспериментах in vitro на
полосках миокарда или на препаратах изолированного сердца. При этом
необходимо учитывать следующее: если для скрининга соединений
стероидной структуры (потенциальных блокаторов Йа+/К.+-АТФазы)
особенности распределения рецепторных структур и организации сарколеммы по
отделам сердца не имеют принципиального значения, то для скрининга
соединений нестероидной структуры эти обстоятельства приобретают
решающее значение и выбор участка миокарда (полосок) может существенно
повлиять на результаты эксперимента. Это обусловлено тем, что инотроп-
ные и хронотропные характеристики изолированных полосок, взятых из
разных отделов сердца, не одинаковы, что связано с особенностями транс-
мембранного транспорта ионов Са++, чувствительности и количества а- и
р-адренорецепторов, а также различиями в концентрации ионов Са++ и
Na+ в них. В то же время активность №+/К+-АТФазы во всех участках
миокарда практически одинакова.
Исходя из этого, скрининг и оценку первичной кардиотонической
активности соединений, предположительно блокирующих Na+/K+-ATOa3y,
обычно проводят в экспериментах на изолированных полосках миокарда,
тогда как скрининг и оценку первичной кардиотропной активности
соединений нестероидной структуры логично проводить на препарате
изолированного сердца по Лангендорфу, что хотя дороже и длительнее по
времени, но позволяет более объективно оценить активность изучаемых
соединений.
Перед тем как перейти к характеристике основных методических
приемов, используемых при скрининге и первичной оценке возможных
механизмов действия потенциальных кардиотонических соединений,
необходимо остановиться на описании параметров оценки сократительного статуса
сердечной мышцы в экспериментах in vitro.
1. Методические приемы, используемые для скрининга и доклинического
изучения кардиотонической активности соединений преимущественно
стероидной структуры
1.1. Основные параметры изометрического сокращения
Оценка абсолютной силы сокращений различных препаратов в
условиях изометрического режима проводится при сопоставлении величин
максимального изометрического напряжения (Тмакс), которое численно равно
FMaKC (FMaKC — максимально развиваемая сила). Соответствует величине
отрезка ab — рис. 1) в пересчете на площадь поперечного сечения
мышечного препарата.
Ввиду того что сечение мышечного препарата имеет неправильную
форму, проводят условное (воображаемое) аппроксимирование
(приближение) неправильной формы полоски миокарда длиной L к гипотетическому
цилиндру длиной LMaKC (при условии, что LMaKC — длина препарата, при
которой сила изометрического сокращения максимальна).
В этом случае площадь поперечного сечения препарата определяется по
формуле:
-401 -

2мН
'То
2мН/с
Рис 1. Основные параметры сокращения и
расслабления сердечной мышцы (пояснения в
тексте).
/ — схематическая кривая силы изометрического
сокращения; //— первая производная.
S = m/Ld,
где m — масса препарата,
L = LMaKC, d - удельная
масса (для миокарда —1,07
г/мм3), +Тмакс—
максимальная скорость сокращения.
Определяют путем
дифференцирования (dT/dt) и
соответствует отрезку fg на
рис.1 (размерность мН/мм2
с"1; мН = 10-3Н); Тмакс -
максимальная скорость
расслабления.
Соответствует величине отрезка fg' на
рис.1 (размерность — мН/
мм2 с-1). Эти показатели
удобно выражать
относительно величины
максимально развиваемой силы
(первая производная
изометрического
сокращения): +F'/F; - F'/F (т. е.
соотношение отрезков fg/ab
и fg'/ab на рис.1).
Т0 — напряжение покоя. Равно напряжению мышцы после растяжения
ее до LMaKC. Соответствует отрезку ic на рис. 1. Размерность — мН/мм2.
Для оценки скорости инотропной реакции обычно используют
следующие показатели:
ВДМ — время достижения максимальной силы изометрического
сокращения? Соответствует отрезку ас на рис. 1 и выражается в секундах (с).
ВР — время расслабления. Соответствует отрезку ае на рис. 1 и
выражается в секундах (с). Однако обычно пользуются показателем '/2 ВР (время
полурасслабления) — т. е. время, за которое величина расслабления
достигает 50 %. Соответствует отрезку ad на рис. 1 и выражается в секундах (с).
Величину инотропного эффекта изучаемых соединений на этапе
скрининга выражают или в абсолютных величинах, или в относительных
единицах (например, в % по сравнению с исходным уровнем).
Как правило, из-за длительного эксперимента наблюдаются
определенные колебания параметров изометрического сокращения препарата
теплокровных животных. Поэтому может быть рекомендована методика,
предусматривающая выражение эффекта, обусловленного каждой
концентрацией препарата, в % к максимальному, измеренному после воздействия
агента, введенного в заведомо избыточной концентрации (Ю-2—Ю-4 М).
1.2. Изучение влияния испытуемых соединений на параметры
изометрического сокращения препаратов сердечной мышцы теплокровных
животных
Скрининг кардиотонических средств целесообразен лишь при
использовании простых, легко воспроизводимых и экономичных методов. Этим
требованиям удовлетворяет методика оценки параметров изометрического
-402-

сокращения изолированных препаратов миокарда теплокровных
животных.
Для скрининга соединений стероидной структуры (потенциальных бло-
каторов Йа+/К+-АТФазы) оптимально использовать препараты,
полученные из сердца морской свинки.
Как уже было сказано выше, для скрининга потенциальных кардиото-
нических средств нестероидной структуры рационально использовать
изолированное сердце. Однако в случае невозможности проведения таких
экспериментов скрининг соединений нестероидной стуктуры можно
проводить на изолированных препаратах, полученных из сердец
млекопитающих, как минимум, двух биологических видов (крысы, морские свинки,
кролики, кошки).
В эксперименте могут быть использованы папиллярные мышцы, трабе-
кулы, полоски желудочков и левого предсердия. Препараты, выделенные
из правого предсердия, на данном этапе не используются (так как они
обладают собственной ритмической активностью). В том случае, когда
скрининг проводится на многоканальной микромеханографической установке,
рационально одновременно использовать препараты из различных отделов
одного сердца (например, папиллярную мышцу, полоски миокарда левого
предсердия и желудочка). Удобным объектом является также перфузируе-
мая через артерию межжелудочковая перегородка сердца кролика.
Следует обязательно учитывать, что препараты миокарда теплокровных
животных крайне чувствительны к изменению состава перфузионного
раствора (рН, концентрация ионов, температура, интенсивность оксигенации и
т. д.), поэтому его параметры от опыта к опыту должны быть постоянными.
У животных под наркозом (как правило, нембутал) после торакотомии
извлекают сердце, которое фиксируют в ванночке с охлажденным до 20 °С
оксигенируемым питательным раствором.
Папиллярные мышцы у крыс выделяют из левого, у морских свинок —
из правого, у кроликов и кошек — из обоих желудочков.
Особое внимание следует обратить на атравматичность выделения
мышечных препаратов. Толщина полоски является лимитирующим фактором
поступления кислорода к ее глубоким участкам, а "концевые эффекты"
мышечного препарата (вносящие значительную погрешность при
регистрации изометрического сокращения) тем больше, чем короче препарат.
Поэтому следует выбирать наиболее тонкие (менее 1 мм в диаметре) и
длинные папиллярные мышцы, а полоски вырезать диаметром 1—1,5 мм и
длиной 6—8 мм.
Препараты сердечной мышцы помещают в термостатируемую перфузи-
онную камеру. Объем каждой из ячеек — около 1 см3.
Каждый препарат одним концом крепится к неподвижному крючку, а
другим жестко фиксируется к рычагу механоэлектрического преобразователя
силы — механотрона. Начальное растяжение препарата (преднагрузка)
задается с помощью специального микрометрического устройства. Для
определения длины рабочей части мышцы камера должна быть оборудована
оптической системой, позволяющей проводить измерения с точностью S 0,01 мм.
Платиновые пластинчатые электроды для бесконтактной стимуляции
располагают на стенках камеры вдоль ее продольной оси. Для уменьшения
высвобождения эндогенных катехоламинов могут быть использованы
игольчатые платиновые электроды.
Силу (FMaKC) и напряжение покоя (Т0), развиваемые каждым препаратом
и измеренные при помощи механотронов, после усиления и
дифференцирования регистрируют совместно с первой производной (±FMaKC на осцил-
-403-

лографе или быстродействующем регистрирующем приборе (скорость
регистрации должна быть не менее 100 мм/с).
Время, затраченное на выделение и фиксацию препарата, не должно
превышать 3—4 мин. Перфузию осуществляют одним из указанных
растворов (температура для препаратов миокарда крыс +28—30 ± 0,5 °С, для
морских свинок — +30—34 °С). Скорость перфузии — 5 мл/мин. Раствор
оксигенируют газовой смесью, содержащей 95 % 02 и 5 % С02.
Препараты стимулируют прямоугольными импульсами длительностью
3—5 мс и амплитудой, на 10—20 % превышающей пороговую. Частота
стимуляции определяется типом полоски миокарда, видом животных и
индивидуальными особенностями испытуемого препарата и может варьировать
в пределах 0,2—4 Гц.
"Врабатывание" препарата продолжается 30—40 мин при минимальной
преднагрузке. Рабочее растяжение в каждом конкретном случае задается
таким образом, чтобы длина препарата приближалась к 1макс кривой
Франка— Старлинга, т. е. препарат развивает максимальное напряжение при
данной частоте стимуляции. Для дальнейшей работы следует использовать
лишь те мышечные препараты, отношение Т0/Тмак(. которых не превышает
Уз (см. подробно: Быков Б. Л., Желамский С. В., 1982).
При изменении частоты стимуляции следует подобрать адекватное ей
начальное растяжение и продолжить "врабатывание" препарата до
достижения стационарного уровня.
До начала испытаний изучаемых соединений определяют
чувствительность препарата к "эталонным" инотропным агентам: изопротеренолу
(изадрину) — [1 х Ю"8 М]; строфантину-g — [1 х 10"7 М], дофамину [1 х
10'5 М] и т. д.
Препараты, не реагирующие на "эталонные" средства, из дальнейших
исследований исключаются.
По достижении исходного стационарного уровня сокращений для
выявления момента начала действия испытуемого соединения, а также момента
достижения нового стационарного уровня регистрацию параметров
сокращений мышцы проводят постоянно со скоростью развертки не менее
1 мм/с. Полоски миокарда перфузируют раствором, содержащим
изучаемое соединение в концентрации (Ю-9—Ю-2 М). Если в течение 10 мин
испытуемое соединение не оказывает влияния на сократительные свойства
препарата, то в дальнейшем для перфузии используют раствор, в котором
содержание данного соединения на порядок выше. Наблюдения
продолжают в течение 10 мин.
Для препаратов сердец крыс используют раствор Кребса состава: NaCl —
120 мМ, КС1 - 4,8 мМ, КН2Р04 - 1,2 мМ, MgS04 - 2,5 мМ, NaHC03 - 25
мМ, СаС12 — 2,6 мМ, глюкоза — 5,34 мМ, рН — 7,4.
Для препаратов сердец морских свинок — раствор Тироде: NaCl —
118,4 мМ, КС1 - 4,9 мМ, СаС12 - 2,5 мМ, NaHCO, - 25 мМ, NaH2P04 -
1,2 мМ, MgCl2 —1,2 мМ, глюкоза — 10 мМ, рН — 7,4. Для других видов
применяются различные модификации указанных растворов.
Целесообразно испытывать каждое соединение, используя различные частоты.
Необходимое количество вещества взвешивают с точностью до
четвертого знака, растворяют в перфузате до получения концентрации 10"3—10"2
М. Для нерастворимых в воде соединений используют соответствующие
неполярные растворители, которые должны быть добавлены в
эквивалентном количестве к перфузионному раствору, не содержащему испытуемого
вещества. Затем методом серийных разведений получают растворы
концентрации 10'4, 10"5, 10~6 М и т. д.
-404-

В зависимости от полученных результатов, эффекты испытуемого
соединения изучают в широком диапазоне концентраций 10~9— Ю-2 М.
Если же соединение в одной из испытуемых концентраций проявляет
положительный инотропный эффект, перфузию препарата питательным
раствором, содержащим более высокую дозу вещества, начинают на
высоте действия предыдущей. В этом случае концентрацию последовательно
повышают в 3, 10, 30, 300 раз и т. д., пока величина положительного ино-
тропного эффекта продолжает увеличиваться.
Другой методический прием предусматривет отмывание препаратов в
течение 15—30 мин (до постоянного уровня сокращений) после испытания
исследуемого вещества в каждой из концентраций.
Изучая влияние фармакологических соединений на кинетику
изометрического сокращения и расслабления у теплокровных, определяют не
только величину максимально развиваемого напряжения (Тмакс), но и другие
параметры.
Статистическую обработку результатов проводят общепринятыми
методами на основании данных не менее 5 экспериментов на однородных
препаратах (папиллярные мышцы, левое предсердие или полоски желудочков)
сердец животных одного вида.
Для суждения об эффективности испытуемых соединений вычисляют
их СЕ50 (концентрация, увеличивающая FMaKC на 50 %). Для выведения СЕ50
строят болограммы или накопительные кривые.
Отбор соединений, подлежащих дальнейшему экспериментальному
изучению, производят, в первую очередь, сопоставляя СЕ50 испытуемых и
"эталонных" препаратов.
Обязательным является сопоставление СЕ50 вычисленных на основании
данных, полученных у животных как минимум 2 биологических видов,
один из которых — морские свинки.
В некоторых случаях для сравнения эффективности испытуемых и
"эталонных" кардиотоников полезно сопоставлять величины их
минимальных и максимальных инотропных концентраций (СЕмининотр. — СЕмаксинотр).
В качестве обобщенной характеристики может служить величина tga,
представляющая отношение Km x Ymax (Ymax — максимальное значение
эффекта, найденное на графике, построенном в координатах Лейньюиве-
ра—Берка). Увеличение tga означает уменьшение сродства исследуемого
вещества к предполагаемому рецептору и/или уменьшение
максимального эффекта.
1.3. Определение избирательности инотропного действия потенциально
кардиотоническнх соединений
Об избирательности (селективности) положительного инотропного
действия судят по коэффициенту СЕ50 „Нотр./СЕ50 хрон, где СЕ50 инотр. —
концентрация вещества, вызывающая увеличение FMaKC на 50 %, а СЕ50 —
вызывающая увеличение на 50 % частоты сокращений изолированного
спонтанно сокращающегося правого предсердия сердца животного того же
вида. Регистрацию влияния испытуемых соединений на частоту сердечных
сокращений проводят аналогично методике, приведенной выше, однако
при этом полоски миокарда, выделенные из правого предсердия, не
подвергают электростимуляции.
Перспективными для дальнейшего изучения являются соединения,
коэффициент селективности которых менее 1.
-405 -

1.4. Моделирование сердечной недостаточности на изолированных
препаратах миокарда
Испытание потенциально кардиотонических соединений на лишенных
нейрогуморальных регуляторных влияний целого организма препаратах
миокарда с различными формами экспериментальной недостаточности
позволяет установить особенности реализации их положительного инотроп-
ного действия в условиях, когда нарушения сократительной функции
зависят только от структурных и метаболических повреждений сердечной
мышцы.
1.4.1. Модель "спонтанной недостаточности" изолированных препаратов
миокарда
Опыты проводят на изолированных левых предсердиях, папиллярных
мышцах морских свинок, крыс или папиллярных мышцах кошек,
сокращающихся в изометрическом режиме при адекватной частоте стимуляции
для крыс — 0,5—1 Гц, для кошек, морских свинок — 2—2,5 Гц. После
достижения стабильного уровня максимально развиваемого напряжения
(Тмакс) и +Т'макс, частоту стимуляции увеличивают в 2 раза. Перфузию
препаратов осуществляют оксигенированным раствором Кребса при
температуре +35—37 °С. Как правило, через 60—90 мин после достижения нового
стационарного уровня Тмакс +Тмакс и — Тмакс начинают уменьшаться.
Критерием развития "спонтанной" недостаточности препаратов является
снижение Тмакс более чем на > 50 %.
1.4.2. Модель "гипоксической недостаточности" изолированных препаратов
миокарда
Снижение параметров сократимости на изолированных препаратах
миокарда теплокровных животных (папиллярная мышца, правое предсердие,
полоски желудочков) достигается использованием для аэрации газовой
смеси, содержащей 5 % 02, 5 % С02 и 90 % N2. Снижение Тмакс и + Т'макс
наблюдается в течение первых 10 мин и достигает, как правило, 30—50 % от
исходного уровня. Применение "аноксического" раствора (95 % N2 и 5 % С02)
позволяет добиться снижения Тмакс на 85—90 %.
2. Методические приемы, используемые для скрининга и доклинического
изучения кардиотонических соединений преимущественно нестероидной
структуры
2.1. Оценка кардиотонической активности изучаемых соединений
на препарате изолированного сердца для изучения сократительной функции
миокарда
Оценку инотропной активности потенциальных кардиотонических
соединений нестероидной структуры рационально производить на модели
изолированного перфузируемого сердца крысы по Лангендорфу в
модификации А. А. Корнеева [Корнеев А. А., 1985].
При работе на многоканальной установке каждый препарат может
-406-

перфузироваться раздельно. В этом случае одновременно могут быть
использованы растворы различной концентрации (например, КГ9, Ю-8,
1(Г7 М).
Ymax — максимальное значение эффекта, найденное на графике,
построенном в координатах Лейньюивера—Берка.
Могут быть использованы и другие адекватные модели сердечной
недостаточности.
Возможно использование классической модели изолированного сердца
по Лангендорфу и/или других ее модификаций.
Настоящая модификация модели позволяет наряду с оценкой
сократительного статуса миокарда регистрировать в динамике некоторые
параметры метаболизма сердца: скорость потребления кислорода (УДЬ1Х), скорость
протока перфузата (V), ряд производных этих показателей, ЧСС, измерять
в перфузате концентрации лактата, пирувата, измерять степень оксигена-
ции. Перфузию осуществляют 60—90 мин.
Установка для перфузии изолированного сердца состоит из 6 основных
блоков:
1) резервуара с перфузионным раствором на 1 л;
2) перистальтического насоса;
3) системы термостатируемых стеклянных трубок;
4) термостатируемой перфузионной камеры;
5) градуированной пробирки для сбора коронарного элюата;
6) двух полярографических ячеек для определения напряжения
кислорода в притекающем к сердцу и оттекающем от сердца перфузате.
Препаровка сердца. Для забора сердца используют беспородных крыс-
самцов после 24 ч голодания. Непосредственно перед проведением
эксперимента животным интраперитонеально вводят раствор нембутала
(100 мг/кг) с гепарином (5000 ЕД/кг). Через 10-15 мин после наступления
анестезии производят вскрытие грудной клетки и перикарда, освобождают
сердце. Затем отсекают сердце от удерживающих его сосудов и быстро
помещают его в сосуд с 0,9 %-ным раствором NaCl, стоящий на льду. Вся
процедура должна занимать не более 30 с. Полная остановка сердца
происходит через 30—40 с от момента вскрытия грудной клетки.
Перфузия сердца. Сразу после экстирпации сердце, потерявшее
сократительную активность, канюлируют через аорту канюлей диаметром 2 мм
и начинают его перфузию. Сразу же после восстановления сократительной
активности основание сердца осторожно освобождают от остатков
перикарда и канюлируют легочную артерию (диаметр канюли 1,5 мм).
Давление перфузата на клапан аорты должно составлять 20 см вод. ст. После
стабилизации деятельности сердца (через 20—30 мин) начинают
регистрацию исследуемых параметров (см. ниже).
В качестве солевого раствора для перфузии сердца используют раствор
Кребса—Хенселейта следующего состава: NaCl — 118 мМ, КС1 - 4,7 мМ,
СаС12 - 2,5 мМ, MgS04 - 1,2 мМ, КН2Р04 - 1,2 мМ, NaHC03 - 25 мМ,
этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) — 0,5 мМ. В качестве субстрата
окисления используют глюкозу в концентрации 11 мМ. Перфузионный раствор
оксигенируют газовой смесью, содержащей 02 и С02 в соотношении 19:1
("карбоген") до установления рН раствора 7,4 при 37 "С. Температуру пер-
фузионного раствора поддерживают автоматически. Исследуемые
соединения добавляют в резервуар с перфузионным раствором в объеме не более
1 % от объема перфузата.
Регистрация частоты и силы сокращений сердца. Для исследования
сократительной функции сердца в динамике определяют два энергозависи-
-407-

мых показателя: силу (ССС) и частоту (ЧСС) сердечных сокращений. Для
регистрации сократительной активности сердца обычно используют
прибор, предназначенный для измерения амплитуды апико-базальных
укорочений изолированного сердца и позволяющий также оценивать ЧСС при
регистрации этих параметров на самописце или при визуальном контроле
на осциллографе.
Измерительная часть прибора состоит из датчика и усилителя. Датчик
продольных сокращений находится непосредственно в перфузионной
камере и состоит из трех частей: 1) металлической иглы длиной 4 см с
кончиком специальной формы для крепления к ткани; 2) бруска
стеклотекстолита сечением 2x4 мм для изоляции потенциала перфузионной
камеры от общей земли (корпуса); 3) стальной пластинки, на которой
специальным клеем приклеены два тензорезистора (по одному с каждой
стороны). Упругость стальной пластинки такова, что перемещение
кончика иглы на 1 мм соответствует натяжению силой в 1 г. Сигнал с тензо-
резисторов подается на вход тензоусилителя. Степень усиления сигнала
подбирается таким образом, чтобы на самописце натяжение силой в 1 г
преобразовалось в сигнал амплитудой в 1 см. ССС рассчитывают по
величине перемещения иглы сердцем во время сократительного акта на
основе данных о величине приложенной силы для данного перемещения
иглы. Калибровочный график зависимости перемещения иглы от
величины приложенной силы представлен на графике 1. Ввиду того что
между данными параметрами существует линейная зависимость с
коэффициентом, равным 1, для простоты ССС может быть выражена не в граммах,
а в миллиметрах амплитуды апико-базальных укорочений сердца на
ленте электрокардиографа, на которой 1 г соответствует 10 мм амплитуды.
Частотные характеристики прибора позволяют регистрировать колебания
с частотой от 0 до 20 Гц. Датчик прибора вставляют в перфузионную
камеру и осторожно крепят к ткани левого желудочка. Перемещая в
вертикальной плоскости датчик, добиваются оптимального (в 1,5 раза)
растяжения исследуемого объекта.
ЧСС оценивают по числу апико-
базальных укорочений сердца в
минуту
Анализируют еще один
показатель — произведение ССС х ЧСС,
которое рассматривают как
мощность, развиваемую миокардом.
Произведение амплитуды апико-
базальных укорочений (ССС) на
ЧСС прямо пропорционально
коррелирует с систолическим ле-
вожелудочковым давлением,
развиваемым сердцем, и отражает
суммарную сократительную
активность сердца [van der Kraaijeta L.,
1989].
Определение потребления
сердцем кислорода. Измерение
скорости потребления кислорода
изолированным сокращающимся
сердцем проводят с помощью
полярографического метода [Корнеев
12 3 4
Перемещение кончика иглы, мм
Пояснения в тексте.
-408-

A. A., 1985; Ishikawa K. et al., Neely J. R. et al., 1967; Taegtmeyer H. et al.,
1980].
В качестве кислородного датчика используют электрод типа Кларка.
Для регистрации обычно используют проточную полярографическую
ячейку, оптимальный объем которой равен 1,0—1,5 мл.
Для определения скорости потребления миокардом кислорода
регистрируют напряжение кислорода в притекающем к сердцу ("артериальном")
и оттекающем от сердца ("венозном") перфузате. Определяют скорость
протока перфузата (YnpOT). Расчет скорости потребления миокардом
кислорода производят по следующей формуле [Neely J. R. et al., 1967]:
УЛЬ|Х (мкмоль Сь/мин/г сух.веса) = -,п , г х
дых v 2i i I i 760 (мм. рт.ст.)
растворимость 02 при 37 °С (мл/мл) VnpoT. (мл/мин)
22,4 мл/мкмоль сух. вес сердца, г
Для оценки метаболических процессов, происходящих в миокарде,
рассчитывают следующие показатели, связывающие потребление кислорода с
параметрами сократительной функции: эффективность функционирования
миокарда (ЭФМ — отношение мощности, развиваемой миокардом, к
количеству потребленного кислорода — ССС х 4CC/Vablx), отношение
количества потребленного кислорода к ССС (УДЫХ/ССС) и к ЧСС (УДЫХ/ЧСС),
отражающие удельный расход кислорода сердцем на поддержание
соответственно силы и частоты сердечных сокращений.
На этом же этапе исследований можно провести ингибиторный анализ
(блокаторы а- и р-адренорецепторных структур миокарда, блокаторы
метаболизма и т. д.), что позволяет выявить некоторые механизмы действия
изучаемых соединений. Кроме того, изменение содержания О; в перфузате
(50 % 02) позволяет при помощи гипоксии моделировать острую
сердечную недостаточность, так как известна зависимость мощности,
развиваемой миокардом, от степени насыщения перфузата кислородом [Корнеев
А. А., 1985].
Для суждения об эффективности испытуемых соединений вычисляют
их СЕ50 (концентрация, увеличивающая FMaKC на 50 %; для препаратов
изолированного сердца FMaKC равняется СССмакс).
Для соединений рецепторного типа действия СЕ50 численно
соответствует константе Михаэлиса комплекса агонист-рецептор (Кш), которая
может служить мерой активности испытуемых соединений,
предположительно способных связываться с определенными клеточными рецепторами. В
случае необходимости вычисляют СЕ50 для временных параметров
изометрического сокращения.
Описание принципов расчетов, измерений и изображений
(графических) результатов, отражающих взаимодействие изучаемых соединений с
рецепторными структурами сердца, приведено в книге П. В. Сергеева и
Н. Л. Шимановского "Рецепторы" (1987).
Более наглядной характеристикой взаимодействия агониста и рецептора
является константа сродства (Кс) — величина, обратная Km. Kc может
быть определена как из Km, так и непосредственно на графике,
построенном по принципу Лайньюивера—Берка [Комиссаров И. В., 1969].
Отбор проб перфузата для биохимического исследования. Для
определения содержания в перфузате лактата и пирувата, а также для измерения
активности ЛДГ и других метаболитов оттекающий от сердца перфузат
собирают в охлажденные пробирки, которые хранят при 0 °С. При заборе
пробы одновременно измеряют Ynp0T для расчета скорости выхода из серд-
-409-

ца ЛДГ, лактата и пирувата. После измерения активности ЛДГ пробы пер-
фузата обрабатывают перхлорной кислотой (0,1 мл 57 %-ной кислоты на
1 мл пробы) для предупреждения влияния эндогенной ЛДГ при измерении
количества лактата и пирувата в перфузате.
3. Определение острой токсичности исследуемых соединений
На этапе скринига токсичность испытуемых веществ (LD50) определяют
каким-либо экспресс-методом (например, по Прозоровскому В. Б. и
соавт., 1978) в острых опытах на мышах при внутрибрюшинном (для
нерастворимых в воде веществ — пероральном) введении. LD50 выражают в
мг/кг или мМ/кг.
4. Изучение энергетического обмена миокарда
На этом и/или последующих этапах поиска и доклинического изучения
кардиотонических средств желательно оценить влияние потенциально
активных соединений на различные стороны метаболизма миокарда.
Известно, что реализация положительного инотропного эффекта невозможна без
мобилизации многочисленных согласованных во времени метаболических
реакций, обеспечивающих как увеличение силы и скорости сокращения
миокарда, так и активацию сопряженных биохимических процессов.
Спектр этих биохимических реакций достаточно велик, однако
главенствующая роль среди них отводится метаболическим процессам,
ответственным за энергообеспечение сократительного акта. Энергообеспечение
инотропного статуса кардиомиоцитов осуществляется такими
последовательными реакциями:
— образованием АТФ в реакциях окисления жирных кислот, глюкозы и
других субстратов, сопряженных с фосфорилированием АДФ
неорганическим фосфатом;
— транспортом энергии от мест образования к местам использования;
— реакциями использования энергии для сокращения, поддержания
ионных градиентов на клеточных мембранах, осуществления
биосинтетических процессов.
Влияние испытуемых соединений на важнейшие показатели энергетики
миокарда, характеризующие каждый из рассмотренных выше этапов,
изучают, используя общепринятые биохимические методы (см. "Методы
биохимических исследований", 1982; "Методы практической биохимии", 1978;
"Методы современной биохимии", 1975 и др.). При этом оценивают:
— содержание АТФ, АДФ, АМФ, КФ, Фн. Анализ динамики
изменения этих показателей, а также расчет общепринятых коэффициентов,
например потенциала фосфорилирования, позволит сделать вывод о
преимущественном влиянии изучаемых соединений на процессы синтеза и/или
утилизации кардиомиоцитами макроэргов;
— содержание гликогена и жирных кислот в гомогенате сердечной
мышцы, что позволяет судить об интенсивности использования и
образования основных энергетических субстратов в миокарде;
— содержание пирувата и лактата в миокарде и крови, их соотношения,
а также активность лактатдегидрогеназной реакции, что позволяет судить о
влиянии изучаемых соединений на интенсивность реакций аэробного и
анаэробного окисления;
-410-

— активность креатинфосфокиназы, характеризующую скорость
переноса энергии от мест образования к местам утилизации.
В экспериментах, направленных на выявление ведущих метаболических
звеньев, которые лежат в основе фармакодинамических эффектов
исследуемых соединений, могут быть также использованы дополнительные
методы исследования (определение содержания субстратов и активности
отдельных ферментов гликолиза и цикла трикарбоновых кислот, содержания
никотинамидных коферментов, интенсивности окислительного фосфори-
лирования в митохондриях и т. п.).
Помимо изучения влияния исследуемых соединений на
энергетический статус миокарда (оценку желательно проводить в модельных
экспериментах), исследуют их влияние на следующие звенья метаболизма
миокарда:
А. Для стероидных кардиотоников изучают их влияние на активность
К+-, Na+-AT<Da3bi.
Определение проводится любым доступным методом [Якутии В. И.,
1977]:
а) по концентрации рубидия в эритроцитах;
б) по концентрации пирофосфорной кислоты;
в) по образованию пирувата в пируваткиназной системе;
г) по величине трансмембранного потенциала тромбоцитов [Малая
Л. Т. и др., 1996].
Б. Для нестероидных кардиотоников (в зависимости от химической
структуры и/или предполагаемого механизма действия) оценивают их
влияние на активность аденилатциклазы и фосфодиэстеразы, функцию
медленных кальциевых каналов, а также рецепторный аппарат сердца
5. Изучение электролитного и пластического обмена миокарда
Сила и длительность сокращения сердечной мышцы определяется не
только эффективностью энергообеспечения контрактильного аппарата
кардиомиоцитов, но и уровнем Са++ вне и внутри клетки. Разнообразные
механизмы, приводящие к повышению внутриклеточной концентрации
свободных ионов Са++, играют важнейшую роль в реализации
положительного инотропного действия кардиотонических средств.
Определение важнейших параметров электролитного баланса
сократительных кардиомиоцитов, активности ферментных систем,
обеспечивающих поддержание ионных градиентов и формирование ионных токов, а
также показателей белкового обмена проводят, как правило, лишь для
выяснения механизмов кардиотонического действия изучаемых средств.
Выбор тех или иных методов диктуется конкретной задачей, стоящей перед
исследователем.
В параллельных исследованиях желательно оценить антиоксидантные
свойства соединений, мембраностабилизирующее действие и т. д. Эти
исследования рационально проводить на VI этапе поиска и доклинического
изучения потенциальных кардиотонических средств.
По завершении I этапа исследователь должен провести системный
анализ полученных данных, что позволит ему построить адекватную схему
проведения модельных экспериментов II этапа, целью которого является
не только изучение кардиотонических эффектов исследуемых соединений,
но и подбор эффективных доз препарата, определение оптимальных путей
и схем применения потенциальных кардиотонических средств.
-411 -

МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРИЕМЫ И МОДЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ, КОТОРЫЕ
МОГУТ БЫТЬ ИСПОЛЬЗОВАНЫ НА II ЭТАПЕ ПОИСКА
И ИЗУЧЕНИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ КАРДИОТОНИЧЕСКИХ СРЕДСТВ
6. Методы оценки влияния изучаемых соединений на сократительную
активность миокарда и параметры гемодинамики в условиях целостного
организма
Основной характеристикой функционального состояния сердца как в
норме, так и при сердечной недостаточности служит сократимость
миокарда. Этот же показатель является важнейшей количественной мерой
оценки действия кардиотонических веществ.
На современном уровне методических возможностей инотропные
свойства испытуемых соединений оценивают по увеличению сократительной
активности миокарда.
Выражением механической деятельности сердца является его насосная
функция, которая определяется величиной минутного объема крови.
Минутный объем крови (МОК) является важнейшим показателем
производительности сердца, однако лимитируется состоянием сократительной
способности миокарда, степенью диастолического наполнения желудочка
(преднагрузка), сопротивлением выбросу крови в аорте и легочной артерии
(посленагрузка) и частотой сокращения сердца.
Поэтому информативность этого параметра, а также вычисленных на
основании его величин приобретает значимость лишь при анализе их
совместно с показателями сократительной активности миокарда. Эту
информацию получают, как правило, путем одновременной катетеризации
полостей сердца и магистральных сосудов экспериментальных животных или
же имплантацией на восходящую часть дуги аорты датчика
электромагнитного или ультразвукового расходомера, что позволяет составить достаточно
полное представление о кардиотонических свойствах исследуемых
соединений и перспективах их дальнейшего изучения.
6.1. Оценка сократительного статуса сердца путем катетеризации его
полостей
Для оценки влияния испытуемых кардиотонических средств на
сократительную активность миокарда необходимо определить величину
развиваемого давления в полостях сердца и его скорость. Величина внутриже-
лудочкового давления характеризует в основном изоволюмическую фазу
сокращения и не может служить показателем фазы изгнания. Скорость
укорочения и расслабления миокардиальных волокон рассчитывают,
анализируя формирование давления в полости желудочка (Р) во времени
(dP/dt).
Определяемая в эксперименте величина dP/dtMaKC (максимальная
скорость нарастания давления в желудочке) достаточно объективно
свидетельствует об инотропном состоянии миокарда. Тем не менее dP/dtMaKC
является отражением сократимости миокарда только при незначительных
изменениях гемодинамических характеристик. Поэтому предложено большое
количество так называемых изоволюмических индексов сократимости,
основанных на определении соотношения между скоростью нарастания и
развиваемым давлением [Мойбенко А. А., Орлова Н. Н., 1978]. С
практической точки зрения дополнительно к величинам Р и dP/dtMaKC достаточно
-412-

Рис. 2. Индексы сократимости миокарда
1 — ЭКГ; 2 — кривая скорости изменения
давления в левом желудочке сердца — dP/dt
(dP/dtMaKc. — максимальное значение этой
величины; dP/dtMHH. — максимальная
скорость снижения давления); 3 — кривая
давления в левом желудочке сердца: Рмакс. —
максимальное развиваемое давление (мм рт. ст.);
Р — развиваемое давление (мм рт. ст.). 1ГГ —
площадь под кривой давления —
заштрихована — интегральное изометрическое
напряжение; / — время от зубца Кдо максимума dP/dt
(при расчетах индекса сократимости в целом
сердце используется величина не t, a I,5t —
подробнее см. Vfcragut U.R, 1965); 4 —
нулевая линия.
рассчитать индексы dP/dtMaKC/Рразвиваемое [Vecragut U. P., Kiadyenbuehl H. Р.,
1965] и +dP/dtMaKC./IIT [Siegal J. H., Sonnenblick E. H., 1963].
Преимуществом указанных индексов является их малая зависимость от
изменений притока крови к сердцу и давления в аорте (пред- и
постнагрузки), меньшая степень искажений, вносимых вследствие резонансных
свойств катетеров, а также возможность автоматизации расчетов.
Опыты выполняют на наркотизированных (нембутал, 40 мг/кг)
животных (собаки, кошки, кролики, крысы).
Катетеры для измерения давления в соответствующих участках
сосудистого русла в полостях сердца вводят общепринятыми методами через
бедренную и сонную артерию, а также яремную вену.
Давление в полостях сердца и сосудов определяют
электроманометрическим способом: для регистрации давления и его первой производной
применяют систему катетер—датчик давления с собственной частотой порядка
40—70 Гц. Первую производную давления в желудочках (dP/dt) получают с
помощью электронного дифференциатора. В процессе опыта наряду с
величиной давления в левом и правом желудочках и ее первой производной
измеряют системное артериальное давление (САД) в бедренной артерии,
давление в легочной артерии (Рла), записывают ЭКГ в стандартных
отведениях.
На основе анализа записи кривых давления в желудочках и его первой
производной измеряют и рассчитывают следующие величины (в
отдельности для каждого желудочка) — см. рис.2.
Как известно, мобилизация сократительной функции сердца может
быть оптимально реализована только в сочетании с повышением
интенсивности расслабления. Поэтому при определении характера влияния
потенциально кардиотонических соединений на релаксационные свойства
миокарда исходят из величины:
dP/dt^,. — максимальная скорость снижения давления в желудочке (мм
рт.ст./с);
dP/dtMHH/ Р — индекс расслабления (с-1).
Наряду с указанными параметрами рассчитывают величины
артериального давления (АД) (систолическое, диастолическое, пульсовое), Рла
(систолическое, диастолическое, пульсовое). На основе анализа ЭКГ
определяют ЧСС и другие показатели.
_/ч_
1 /TVp/dt"
■«P/dtmii
l-1,5t-
-413-

6.2. Изучение сократительной функции миокарда на основе анализа кривой
фазового кровотока в восходящей части дуги аорты
Сократительную функцию миокарда можно оценить и с помощью
анализа фазового кровотока в восходящей части дуги аорты,
зарегистрированного при помощи электромагнитного или ультразвукового расходомера.
Преимущество этого методического приема заключается в том, что в
одном модельном эксперименте можно не только оценить инотропную
активность сердца, но и получить данные об ударном и минутном объемах
сердца, его работе, индексе энергетических затрат сердца и общем
периферическом сопротивлении (ОПС) и т. д.
При скрининге допускается расчет только одного индекса Верагута.
При наличии соответствующего оборудования величину давления в
желудочках желательно определить у ненаркотизированных животных в
соответствии с рекомендациями Diederen (1981).
Схема эксперимента заключается в следующем.
Анестезированным животным (наркоз — нембутал (40 мг/кг,
внутривенно) до хирургического уровня наркоза Ша) (крысы, кошки, кролики,
собаки и др.) после левосторонней торако- и перикардотомии на
восходящую часть дуги аорты помещают датчик (соответствующего диаметра)
электромагнитного или ультразвукового расходомера.
Катетеризуют правую бедренную вену для введения препаратов и левую
бедренную артерию для измерения системного артериального давления.
Эти катетеры также используют для забора проб крови (контроль газового
состава).
В этих же экспериментах для прямой оценки сократительной
способности миокарда в полость левого желудочка через верхушку сердца или путем
катетеризации аорты можно ввести катетер для прямой регистрации лево-
желудочкового давления и его производных [dP/dt и ( /dt) ].
На основании анализа кривой фазового кровотока в восходящей части
дуги аорты [Spencer M. F, Greiss P. S., 1962] и других регистрируемых
показателей (артериальное и левожелудочковое давление, ЭКГ) определяют
следующие индексы гемодинамики и деятельности сердца:
1 — артериальное давление (систолическое и диастолическое), мм рт.
ст.;
2 — среднее артериальное давление, мм рт. ст. Этот показатель
определяется по формуле, предложенной В. Д. Карпманом (1963):
Pm = Pg + 0,43 (Ра - Pg),
где Рт — среднее артериальное давление;
Ра — систолическое давление;
Рд — диастолическое давление;
0,43 — коэффициент Карпмана;
3 — частота сердечных сокращений, уд/мин: рассчитывают, определяя
время между двумя сердечными циклами;
4 — время систолического выброса;
5 — время диастолического расслабления;
6 — ударный объем сердца, мл. Этот показатель
рассчитывают по формуле Сименса, которая
сводится к расчету площади, ограниченной кривой
сердечного выброса:
Ударный объем = S x h x 0,64;
-414-

7 — минутный объем сердца (сердечный выброс), л/мин. Эту величину
определяют как произведение ударного объема на частоту сердечных
сокращений;
8 — максимальная линейная скорость кровотока в аорте, см/с. Этот
показатель может быть рассчитан несколькими путями:
V (см/с) =—L^6F
с / 7i - 2W2
где F — максимальный (пиковый) кровоток; С — наружная окружность
аорты; W — толщина аортальной стенки; 1,66 — фактор перевода
скорости.
Максимальная линейная скорость кровотока может быть выражена
также как соотношение максимального (пикового) кровотока к площади
внутреннего поперечного сечения аорты.
Площадь внутреннего поперечного сечения аорты (SBHyrp) определяют
по формуле:
п2
°внугр. . >
где ДВнугр. ~ внутренний диаметр аорты; SBHyTp — площадь внутреннего
сечения аорты.
Внутренний диаметр аорты представляет собой разницу между
внутренним диаметром датчика и толщиной аортальной стенки. Если внутренний
диаметр датчика электромагнитного расходомера равен наружному
диаметру аорты (2R), то толщина аортальной стенки вычисляется по формуле:
п = 0,08 х 2Ra,
где п — толщина аортальной стенки; 2Rg — внутренний диаметр датчика.
(Следовательно, внутренний диаметр аорты можно выразить
следующим образом:
Дв„™. = 2R, - (0,08 + 2R,),
9 — максимальное ускорение кровотока в аорте, см/с2 (сократимость
миокарда — см. Noble N. J. N. et al, 1966) — определяется как отношение
максимальной линейной скорости ко времени ее нарастания от нуля до
пика;
10 — индекс энергетических затрат сердца (ИЭЗС) вычисляется по
формуле:
ИЭЗС = ЧСС х САД / 1000;
11 — работа сердца, кг/м — вычисляется как произведение минутного
объема (МО) на САД х 0,0136;
12 — общее периферическое сопротивление (ОПС), дин.с/см"5,
рассчитывают по формуле Wiggers (1947):
ОПС = ЧИСТ"2 х °'06-
где Рср — среднее давление в аорте, мм рт.ст.; МОС — минутный объем
сердца, л/мин; 1332 и 0,06 — коэффициенты перевода.
Полученный на основе описанных методических подходов комплекс
показателей, характеризующих влияние испытуемого соединения на
основные параметры кардио- и гемодинамики, анализируют с учетом
требований, предъявляемых к кардиотоническим препаратам.
-415 -

Перспективными для дальнейшего изучения будут считаться вещества,
существенно увеличивающие силу сокращений, скорость сокращения и
индекс сократимости (dP/dtMaKC/Pp и dP/dtMaKC/IIT), а также улучшающие
релаксационные свойства миокарда (повышающие dP/dtMHH и dP/dtMHH/Pp;
уменьшающие КДДЛЖ/ /КДДПЖ).
Несомненно следует обратить внимание на вещества, увеличивающие
МОК, УОК, РИЛЖ и уменьшающие ОПС.
Кроме того, необходимо принимать во внимание влияние испытуемых
соединений на величины САД, Рла, ЧСС, на характер ЭКГ (отсутствие
тахикардии, аритмий, нарушений формы и амплитуды зубцов, длительности
интервалов и т. п.).
Дозы на данном этапе доклинического изучения подбирают опытным
путем, исходя из величин LD50 и СЕ50 испытуемых соединений,
рассчитанных в опытах на изолированных препаратах миокарда.
Влияние потенциально кардиотонических соединений на
сократительную активность миокарда и параметры гемодинамики исследуют как при
однократном, так и при повторном назначении препарата (внутрь и
парентерально), в том числе при длительной внутривенной инфузии.
6.3. Определение минутного объема крови (МОК) методом термодилюции
Сущность метода, основанного на принципе Стюарта, состоит в том,
что при введении в кровеносное русло индикатора, в качестве которого
используют изотонический раствор натрия хлорида (10—20 °С), происходит
внутрисосудистое изменение температуры, регистрируемое в виде кривой
термодилюции. Для получения последней в дугу аорты через сонную
артерию вводят датчик для измерения температуры. Кривую терморазведения
регистрируют на ленте электронного автоматического самопишущего
потенциометра и переносят на график в полулогарифмической системе
координат для определения площади, ограниченной этой кривой.
МОК рассчитывают по формуле:
мок=Уг(Т-Тп)60
где V — объем введенного индикатора; Тк и Ти — температура крови и
температура вводимого раствора; г — скорость движения ленты
регистрирующего прибора; STk — сумма изменений температуры крови через
каждую секунду; К — коэффициент, рассчитываемый по соотношению
произведений удельной массы и удельной теплоемкости крови и индикатора.
Одновременно регистрируя САД, ЧСС и МОК (л), а также оценивая
площадь поверхности тела животного (определяется по таблицам),
рассчитывают следующие показатели гемодинамики:
УОК — ударный объем крови (л);
СИ — сердечный индекс (л/м2 мин);
СиИ — систолический индекс (л/м2);
РИЛЖ — рабочий индекс левого желудочка (н/м2 мин);
Регистрацию МОК также можно проводить методом электромагнитной
и ультразвуковой флоуметрии (см. ниже), тетраполярной реографии,
разведения радиоактивных индикаторов или красителей и т. п. Возможно
применение в качестве индикатора охлажденных кровезамещающих
жидкостей (полиглюкин, реополиглюкин и т. п.).
-416 -

ОПС — общее периферическое сопротивление (кПа х с/л);
Д — дебит сердца (мл/с);
ОЦОК — остаточный центральный объем крови (мл);
ВК — время кровообращения на участке "бедренная вена—сонная
артерия" (с).
7. Модели острой сердечной недостаточности (ОСН)
7.1. Модель острой и подострой сердечно-сосудистой недостаточности
гемодинамического типа у крыс (методика Beznak—Когана)
Сердечно-сосудистая недостаточность гемодинамического типа
вызывается у крыс массой 190—220 г путем стенозирования диафрагмального
сегмента брюшной аорты.
В опытах на крысах могут быть созданы и другие модели
недостаточности сердца (НС).
Для оценки степени НС используют электрокардиографические
(учащение сердечного ритма, увеличение систолического показателя, смещение
электрической оси сердца в сторону левограммы, преходящие
патологические изменения интервала S—Ти зубца Тс одновременным увеличением
зубца Q) и гемодинамические показатели. Кроме того, степень НС
характеризуют на основании данных макроскопических (абсолютная,
относительная масса сердца, сердечный коэффициент (СК), масса сердца (СК),
масса сердца .
равная х 100; наличие отеков, гидроторакса, асцита) и био-
MclCCcl ЖИВОТН.
химических исследований.
При необходимости проводят оценку состояния сократительного статуса
сердца при помощи одного из приведенных выше методических приемов.
7.2. Воспроизведение острой левожелудочковой недостаточности у собак
путем последовательной перевязки левой нисходящей и левой огибающей
коронарной артерии
У анестезированных (нембутал, 40 мг/кг, внутривенно) собак после
левосторонней торако- и перикардотомии выделяют участки огибающей и
нисходящей ветви левой коронарной артерии и подводят под них
лавсановые лигатуры для последовательной перевязки. Перевязку начинают с дис-
тально расположенных участков коронарных артерий. Так как в этих
экспериментах высок риск гибели животных ввиду развития фибрилляции
желудочков сердца, требуется наличие дефибриллятора. (Подробное
описание методики см. Jentzer J. H. et al., 1981.)
8. Модели хронической сердечной недостаточности
8.1. Воспроизведение НС путем создания дозированного надклапанного
стеноза аорты у кроликов
Дозированный стеноз восходящей аорты моделируют у кроликов,
наркотизированных барбамилом (60 мг/кг, внутривенно), путем затягивания
шелковой лигатуры на шаблоне диаметром 2,4 мм, что соответствует
14 - 762
-417-

уменьшению наружного диаметра аорты в 2,5 раза [Дугин С. Ф.,
Городецкая Е. А., 1984]. Признаки недостаточности сердца развиваются, как
правило, через 6 нед после операции. Данная модель достаточно адекватно
воспроизводит типичные для застойной недостаточности сердца
клинические признаки и регуляторные нарушения, но, к сожалению,
характеризуется высокой смертностью животных.
8.2. Экспериментальный стеноз аорты у собак
Методы создания коарктации аорты путем сдавления ее извне или
уменьшения диаметра за счет иссечения части стенки аорты, а также путем
введения раздражающих растворов детально описаны в монографии А. М.
Хилькина и В. Я. Светлова "Моделирование поражений сердца и сосудов в
эксперименте" (1979).
8.3. Моделирование НС путем создания митральных пороков
Методики создания стеноза левого атриовентрикулярного отверстия и
недостаточности митрального клапана у собак в остром и хроническом
опыте подробно рассмотрены в книге "Моделирование заболеваний"
(1973). Величину стеноза или недостаточности дозируют по интенсивности
изменения давления в левом желудочке и предсердии.
К развитию НС приводит стенозирование митрального отверстия,
сопровождающееся повышением давления в левом предсердии более 65 мм
рт.ст., а также недостаточность митрального клапана II—III степени. При
II степени порока (створки разрушены на 11—15 % общей площади)
давление в левом предсердии повышается в среднем на 275 %, а Р^ -
снижается на 19 %. Недостаточность III степени развивается при разрушении
клапана на 16—25 %. Давление в левом предсердии повышается более чем
в 4 раза, а Р^ — снижается в среднем на 23 %.
При формировании порока II степени продолжительность жизни собак
11—30 сут. Большинство животных с недостаточностью клапана III
степени погибают в течение суток после операции.
8.4. Модель хронической сердечной недостаточности (ХСН) на крысах
[Ковалев Г.В. и др., 1988]
Крысам-самцам массой 200—250 г подкожно вводят изадрин (ново-
дрин) в дозе 80 мг/кг дважды с интервалом 24 ч [Чернух А. М., Коптева
Л. А., 1977].
Изадриновая интоксикация значительно уменьшает реакцию на
нагрузку объемом и пережатием восходящей аорты, что свидетельствует о
нарушении актомиозинового взаимодействия. Установлено, что введение
больших доз изадрина приводит к нарушению и повреждению (р-адренорецеп-
торов сердца [Чернух А. М., Коптева Л. А., 1977].
У животных развивается некротическое повреждение миокарда и они
могут быть использованы в экспериментах (острых, хронических) по
поиску, изучению и применению нестероидных кардиотоников.
Исследование функциональных возможностей миокарда, в частности,
можно начинать с 5—7-го дня после введения животным 2-й дозы изадри-
-418 -

на. На уровне целостного организма наблюдаются снижение физической
работоспособности (плавательная проба, бег в тредбане), изменения в
структуре индивидуального поведения, снижается устойчивость к гипокси-
ческим пробам, увеличивается частота дыхания и ЧСС.
На уровне миокарда в зависимости от задач исследования проводят
функциональные пробы.
Для этого животное наркотизируют (этаминал натрия, 40 мг/кг, внутри-
брюшинно), переводят на искусственное дыхание. Проводится торакото-
мия, затем перикардотомия. Через верхушку сердца в полость левого
желудочка вводится катетер, соединенный с электроманометром.
Регистрируются и рассчитываются следующие показатели кардиодинамики: внутри-
желудочковое давление (ВЖД) и его первая производная dP/dt, по которой
рассчитывается скорость сокращения и скорость расслабления миокарда
(dP/dt+, dP/dr), индекс Верагута, индекс расслабления. Интенсивность
функционирования структур (ИФС) рассчитывают по формуле:
ИФС = ВЖД х МЛЖ / ЯСС,
где МЛЖ — масса левого желудочка (МЛЖ = 2/з массы сердца), ЧСС —
частота сердечных сокращений.
Функциональные возможности миокарда оценивают по следующим
тестам:
нагрузка объемом — внутривенное введение изотонического раствора
натрия хлорида из расчета 0,1 мл/100 г;
проба на адренореактивность — внутривенное введение адреналина в
разведении 10—6 г/л из расчета 0,1 мл/100 г;
пережатие восходящей дуги аорты в течение 10—15 с.
По сравнению с интактной (контрольной) группой у животных,
получавших изадрин, наблюдается достоверное значительное снижение ИФС
примерно на 40—50 % и индекса расслабления на 60—70 %, другие
регистрируемые показатели существенно не отличаются от показателей
контрольной группы.
Наибольшие различия в функциональном состоянии сердец животных
контрольной группы и крыс с изадриновой интоксикацией выявляются
после проведения функциональных проб.
Известно, что реально оценить функциональные возможности миокарда
можно только с использованием нагрузочных тестов. Нагрузка объемом,
пережатие восходящей аорты характеризуют состояние актомиозинового
взаимодействия; введение адреналина характеризует состояние рецептор-
ного аппарата сердца и функционирование саркоплазматического ретику-
лума [Меерсон Ф. 3., 1984].
Эффективные кардиотоники (эталонные препараты) и исследуемые
соединения и схемы их применения должны оказывать положительное
влияние на измеряемые показатели по сравнению с "изадриновым" контролем
во всех 3 функциональных пробах.
Настоящая модель оценки существующих и потенциальных кардиото-
ников имеет ряд преимуществ и достоинств перед моделями in vitro.
Во-первых, она реализуется на традиционных лабораторных животных
(крысы) с высоким выходом (в отличие от адреналиновой модели
миокардита), во-вторых, легко воспроизводится, в-третьих, как в процессе
изадриновой интоксикации, так и в дальнейшем животные не подвергаются
никаким другим воздействиям и находятся в "традиционной" среде, а
недостаточность формируется постепенно, что в наибольшей степени
приближает данную модель к реальной ситуации в жизни. При этом можно в
14*
-419-

процессе эксперимента проводить как функциональные пробы на уровне
организма, так и брать экспериментальный материал (кровь, моча, биопта-
ты) без существенного нарушения состояния организма, что в
значительной степени повышает эффективность исследований и надежность
интерпретации экспериментальных данных.
8.5. Моделирование хронического легочного сердца (ХЛС)
С целью воспроизведения хронического легочного сердца в
эксперименте на собаках моделируют хроническую пневмонию на основе эмболи-
зации сосудов малого круга [Ковалев Г.В. и др., 1988]. Одновременно в
патологический процесс вовлекаются паренхима легких, бронхолегочный
аппарат, что сопровождается иммунологической перестройкой организма с
участием аутоиммунного механизма повреждения легочной ткани на
поздних этапах формирования пневмонии.
При ХЛС отмечается снижение сократительной способности миокарда,
уменьшение интенсивности диастолического расслабления, стойкое
повышение давления в малом круге кровообращения (через 9—12 мес от
момента воспроизведения хронической пневмонии), а также
морфологические признаки деструктивно-дистрофического процесса в миокарде.
При проведении II этапа поиска и доклинического изучения
потенциальных кардиотонических средств, помимо вышеперечисленных,
возможно использование и других модельных экспериментов, позволяющих
адекватно оценить кардиотонические эффекты исследуемых соединений в
условиях острой или хронической сердечной недостаточности.
Учитывая сложность и трудоемкость моделирования патологических
состояний, приводящих к развитию сердечной недостаточности,
исследование фармакодинамики потенциальных кардиотонических средств должно
проводиться комплексно. В силу этого, наряду с оценкой действия
изучаемых соединений на основные показатели деятельности сердца и
гемодинамики, следует стремиться получить максимальную информацию об их
влиянии на метаболизм сердечной мышцы, электрофизиологический
статус миокарда, электролитный баланс организма, оценить динамику
морфологических изменений в сердце и органах-мишенях и т. д.
Исследования могут быть дополнены на различных этапах курсового
применения изучаемого вещества оценкой дозированной физической
нагрузки.
По завершении II этапа скрининга, в случае выявления потенциально
активных кардиотонических соединений, превосходящих по своей
специфической активности "эталонные" препараты, определяют возможные
показания для их клинического применения и переходят к выполнению
последующих этапов поиска, которые проводят в соответствии с
существующими методическими рекомендациями и нормативными документами по
доклиническому изучению лекарственных средств ФК МЗ РФ.
Литература
1. Быков Б. Л., Желамский С. В. // Физиол. журн. СССР. — 1982. - Т. 64, № 3. -
С. 425-428.
2. Дугин С. Ф., Городецкая Е. А. // Кардиология. - 1984. - Т. 24, № 7. — С. 102-104.
3. Карпман В. Л. Фазовый анализ сердечной функции. — М.: Медицина, 1965. — 230 с.
4. Ковалев Г. И., Петров В. И., Гурбанов К. Г. и др. — В кн.: Фармакология
кардиотонических средств. - М.: АМН СССР, 1988. - С. 106-110.
- 420-

5. Коган А. X. // Бюлл. эксперим. биол. — 1961. — Т. 45, № 1. —С. 112.
6. Комиссаров И. В. Элементы теории рецепторов в молекулярной фармакологии. —
М.: Медицина, 1969. — С. 33-35.
7. Корнеев А. А. Исследование некоторых кислородзависимых процессов на
изолированном сокращающемся сердце при гипоксии: Дисс. ... канд. биол. наук. — М.,
1985. - 176 с.
8. Малая Л. Т., Макаревич И. Ф., Ковчанко Н. В., Горб Ю. Г. Сердечные гликозиды. —
Харьков: Основа, 1996. — 464 с.
9. Меерсон Ф. 3. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических
повреждений сердца. — М.: Медицина, 1984. — 269 с.
10. Методы биохимических исследований. — Л.: ЛГУ, 1982. — 272 с.
11. Методы практической биохимии. — М.: Мир. — 1978. — 268 с.
12. Методы современной биохимии. — М.: Наука. — 1975. —176 с.
13. Моделирование заболеваний / Под ред. С. В. Андреева. — М., 1973. — С. 223—227.
14. Мойбенко А. А., Орлова Н. Н. // Физиологический журнал (Киев). — 1978. — Т. 24,
№ 6. - С. 839-848.
15. Прозоровский В. Б. и др. // Фармакология и токсикология. — 1978. — Т. 41, № 4. —
С. 497-502.
16. Сергеев П. В., Шимановский Н. Л. Рецепторы. — М.: Медицина, 1987. — С. 8—27.
17. Хилькин А. М., Светлова В. Я. — М.: Медицина, 1979. — С. 259—267.
18. Чернух А. М., Коптева Л. А. — В кн.: Метаболизм миокарда. — М.: Медицина,
1977. - С. 329-338.
19. Якутии В. И. // ХФЖ. - 1977. - Т. 11, № 4. - С. 128-131.
20. Diederen. // Arzneim. Forsch. - 1981. - Vol. 331-1, N I. - P. 141-146.
21. Ishikawa S., Schrier R. W. // Am. J. Physiol. - 1984. - Vol. 246, N 1. - Pt2. -
P. 104-113.
22. JentwrJ. H., Le Jemtel T. H. // Am. J. Cardiol. — 1981. — Vol. 48, N 1. —P. 75-83.
23. Kraaij A. M. M. van der, Eijk H. J. van, Koster J. F. // Circulation. - 1989. - Vol. 80,
N 1. - P. 158-164.
24. Lecarpentier Y., Martin J. L., Gastineau et al. // Am. J. Physiol. — 1982. — Vol. 242, N
5. - P. 855-861.
25. Neely J. R., Liebermeister В., Battersby E. J., Morgan H. E. // Am. J. Physiol. — 1967. —
Vol. 212, N 4. — P. 804—814.
26. Noble N. J. N.. Trenchard D., Gus A. // Circulat. Res. - 1966. - Vol. 19. - P. 139-152.
27. SiegalJ. H., Sonnenblick E. H. // Circlat. Res. - 1963. - Vol. 12. - P. 597-610.
28. Spencer M. F., Greis P. S. // Circulat. Res. - 1962. - Vol. 10. — P. 274-279.
29. Taegmeyer H.. Hems R., Krebs H. A. // Biochem. J. - 1980. - Vol. 186, N 3. - P. 701 —
711.
30. Veragut U. P., Krayenbuehl H. P. // Cardiol. - 1965. - Vol. 47, N I. - P. 96-112.
Методические указания по изучению антиаритмической
активности фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н., проф. Н. В.
Каверина; д. м. н. С Ю. Бердяев; к. б. н. Е. П. Кищук;
к. б. н. О. Е. Пасхина
Введение
Антиаритмические препараты, применяющиеся в медицинской практике,
различаются по фармакологическим свойствам и по механизмам действия на
электрофизиологические процессы в мембране миокардиальных клеток.
Поэтому для рационального выбора антиаритмиков в клинике или отбора в
эксперименте важную роль играют их классификации. В настоящее время
- 421 -

классификация включает в себя пять классов (табл. 1). К I классу
антиаритмического действия относятся соединения, общими свойствами которых
является способность специфически воздействовать на процесс, в результате
которого деполяризующий заряд переносится через мембрану, т. е. на
быстрый входящий натриевый ток. Натриевые каналы быстро инактивируются
после деполяризации и остаются в инактивированном состоянии до тех пор,
пока не наступит реполяризация. В качестве критерия различий между
подклассами I класса учитывается изменение кинетики связывания с каналом
(блокада натриевых каналов) и высвобождения из них (восстановление).
Препараты IB класса имеют быструю кинетику, т. е. постоянная времени их
связывания с каналом и восстановления менее 1 с. Быстрая кинетика IB
класса означает, что время нормальной диастолы достаточно для того, чтобы
вещество успело освободиться из большинства натриевых каналов. В этих
условиях интервал HV и комплекс QRS остаются неизмененными, не
приводя к изменениям синусового ритма. Препараты 1С класса, напротив,
замедляют проведение, что связано с медленной кинетикой их связывания с
натриевыми каналами и освобождения. Антиаритмики IA класса занимают
промежуточное положение.
Программа проведения исследований по поиску и изучению механизмов
антиаритмического действия новых химических соединений
Исследования условно можно разделить на несколько этапов:
1-й этап. Выявление антиаритмического действия исследуемых
соединений.
2-й этап. Изучение характера и спектра действия отобранных
соединений.
3-й этап. Изучение механизмов действия наиболее активных
соединений. Электрофизиологические исследования.
4-й этап. Изучение общих фармакологических свойств, аритмогенного
действия и токсичности отобранных соединений.
5-й этап. Изучение фармакокинетики отобранных соединений (при
введении внутривенно и внутрь).
Поиск новых антиаритмических средств начинают с изучения
химических соединений с предполагаемыми антиаритмическими свойствами на
моделях нарушений сердечного ритма. Экспериментальные аритмии
могут быть вызваны различными методами. В настоящее время принято
использовать модели аритмий, либо приближающиеся к ситуациям,
которые возникают в клинических условиях, либо имитирующие
определенные аритмии. Примером первого варианта модели являются нарушения
ритма, вызванные высокими дозами оубаина или строфантина К.
Возникающая при этом аритмия моделирует нарушения сердечного ритма в
клинике при передозировке сердечных гликозидов. К тому же типу
моделей следует отнести аритмии, вызванные перевязкой или сужением
просвета коронарной артерии, моделирующие ситуацию, когда аритмия
возникает у пациентов в результате ишемии, реперфузии или инфаркта
миокарда.
В других случаях для отбора соединения с антиаритмическими
свойствами применяют модели с использованием химических веществ, аритмо-
генное действие которых связано с влиянием на мембрану миокардиаль-
ных клеток. Примером может служить действие аконитина, который
модифицирует быстрые натриевые каналы в мембране миокардиальных клеток
- 422-

Таблица 1. Классификация антиаритмических средств
Класс
IA
1Б
1С
Описание действия
I. Угнетение фазы 0
Деполяризации
Умеренное (удлинение репо-
ляризации)
Слабое
Сильное (слабое влияние на
реполяризацию)
II. р-Адреноблокаторы
III. Удлинение реполяризации
IV. Блокаторы кальциевых
каналов
V. Специфические брадикар-
дические средства
Избирательное действие на
клетки синусового узла
Примеры
Хинидин
Новокаинамид
Дизопирамид
Лидокаин
Мексилетин
Токаинид
Энкаинид
Флекаинид
Лоркаинид
Пропранолол
Амиодарон
Соталол
Верапамил
Алинидил
Фалипамил
таким образом, что они находятся преимущественно в активированном
состоянии, вызывая аритмогенный эффект.
В распоряжении экспериментатора имеется целый ряд моделей
аритмий, которые условно классифицируются на предсердные, желудочковые
и смешанные. Оценка эффективности соединений проводится по
способности либо устранять уже развившуюся аритмию, либо предупреждать
развитие нарушений сердечного ритма. Скрининг соединений,
обладающих антиаритмическим действием, можно также проводить по тестам,
характеризующим состояния основных свойств миокарда, таких как
изменение автоматии, возбудимости (рефрактерного периода) и
проводимости, которые играют важную роль в развитии аритмий. Использование
всех этих методов позволяет отобрать наиболее эффективные и наименее
токсичные соединения из изучаемого нового ряда и после подробного
фармакологического исследования охарактеризовать спектр
антиаритмической активности. Так как новые соединения с антиаритмическими
свойствами могут относиться к различным классам антиаритмических
средств, исследование должно проводиться в сравнении с
антиаритмической активностью эталонного препарата того класса, к которому
относиться исследуемое вещество (например, пропранолола — для антиарит-
миков II класса, лидокаина — для IB класса, верапамила - для IV класса,
соталола — для III класса и т. д.). Исследования проводят на животных
разного вида. Способ введения зависит от растворимости препарата, хотя
по возможности исследование должно включить внутривенное введение
и введение внутрь. Обязательным является использование того способа
введения, который рекомендован для клинического изучения данного
препарата.
-423 -

Этап 1. Модели скрининга антиаритмических веществ
/. /. Аритмии, вызванные химическими веществами
1.1.1 Изучение антиаритмической активности на аконитиновой модели
аритмии у бодрствующих крыс
При изучении большого ряда соединений скрининг можно начать с
использования этой модели. Аконитин, как известно, модифицирует
быстрые натриевые каналы в миокардиальных клетках. Поэтому, если
изучаемый препарат проявляет высокую активность на данной модели, полагают,
что его можно отнести к I классу антиаритмического действия. Под
влиянием аконитина возникает политопная экстрасистолия, которую можно
сопоставить с аритмией, наблюдающейся в клинических условиях. Акони-
тиновую аритмию вызывают у бодрствующих нелинейных крыс массой
160—180 г. Аконитин вводят в хвостовую вену в дозе 40—50 мкг/кг.
Регистрируют нарушения ритма смешанного предсердно-желудочкового типа.
Исследуемое соединение вводят профилактически за 1—2 мин до введения
аконитина. Электрокардиограмму (ЭКГ) регистрируют во II стандартном
отведении на 3, 5, 10, 15, 20-й минутах и т. д. Продолжительность аритмий
в среднем составляет 1,5—2 ч. Активность соединений оценивают по их
способности предотвращать развитие нарушений сердечного ритма под
влиянием аконитина. В качестве критерия для суждения об
эффективности вещества используют ЭД50* (вычисляют по методу Литчфилда и Уил-
коксона), а о широте терапевтического действия судят по отношению
ЛД50/ЭД5о (отношение средней летальной дозы к средней эффективной),
которое обозначают как антиартмический индекс.
Соединения, обнаружившие наибольшую эффективность по этому
тесту, отбирают для дальнейшего изучения.
1.1.2. Изучение антиаритмической активности на хлоридкальциевой модели
у крыс
Высокие дозы хлорида кальция (200—250 и до 300 мг/кг) вызывают у
наркотизированных и бодрствующих крыс тяжелые нарушения сердечного
ритма, заканчивающиеся обычно летальной фибрилляцией желудочков
Используют нелинейных бодрствующих крыс обоего пола массой 180—200
г, которым в хвостовую вену вводят 250—300 мг/кг хлорида кальция в виде
10 % раствора. В большинстве случаев фибрилляция желудочков возникает
на 1—2-й минуте после введения. У остальных животных сразу же после
введения возникает синусовая брадикардия с желудочковыми
экстрасистолами на фоне атриовентрикулярной блокады, которые переходят в
короткий залп желудочковой тахикардии и завершаются фибрилляцией
желудочков. Исследуемые соединения вводят внутривенно за 2 мин до
введения кальция хлорида. Электрокардиограмму регистрируют во II
стандартном отведении. За критерий антиаритмического эффекта принимают
уменьшение в процентах случаев летальной фибрилляции и процент
предотвращения изучаемым соединением гибели животных. Эффект
исследуемого вещества определяют количественно, вычисляя ЭД50-
Вызванные хлоридом кальция аритмии являются наиболее тяжелыми и
мало поддающимися воздействию антиаритмических средств. Механизм,
посредством которого высокие дозы хлорида кальция оказывают аритмо-
-424-

генное действие, сложен и до конца не выявлен. С одной стороны, хлорид
кальция оказывает прямой эффект на мембрану миокардиальных клеток,
приводя к сдвигу влево кривой соотношения максимальной скорости
деполяризации и мембранного потенциала и увеличивая таким образом
натриевую проводимость и процессы реактивации натриевых каналов. С
другой стороны, асинхрония восстановления возбудимости различных
миокардиальных волокон и волокон Пуркинье вносит существенный вклад в
генерацию аритмий под влиянием повышенной концентрации ионов
кальция. В добавление к прямому действию на миокард хлорид кальция,
введенный внутривенно в больших дозах, вызывает нарушения сердечного
ритма опосредованным путем через активацию симпатических влияний на
миокард. На данной модели обычно проявляют активность соединения,
относящиеся к I и IV классам антиаритмического действия.
1.1.3. Изучение антиаритмической активности на адреналиновой модели
аритмий
Адреналиновая модель аритмии используется для отбора соединений со
свойствами антиаритмиков II и IV классов. Быстрое внутривенное
введение 100 мкг/кг адреналина собакам или кошкам приводит к развитию
желудочковой экстрасистолии и моно- или мультифокальной желудочковой
тахикардии. Аритмогенный эффект катехоламинов связывают, как
известно, с увеличением проводимости медленных кальциевых каналов и
возникновением эктопической пейсмекерной активности в предсердиях и
желудочках. Нарушения сердечного ритма, если не заканчивается
фибрилляцией желудочков, то длятся обычно 6—7 мин. Для того чтобы получить
более стойкий и длительный эффект, адреналин используют в меньших дозах
на фоне ингаляции наркотических веществ (эфир, галотан, циклопропан и
метилхлороформ). Эфирно-адреналиновую модель аритмии воспроизводят
на кошках массой 3 кг. Животных наркотизируют внутривенным
введением 30 мг/кг этаминала натрия. Катетеризируют яремную вену для введения
исследуемых веществ и сонную артерию для регистрации артериального
давления. ЭКГ регистрируют во II стандартном отведении. Исследуемое
соединение вводят в 3 мл дистиллированной воды. После повторной
записи ЭКГ адреналин вводится внутривенно в дозе 20 мкг/кг одновременно с
эфиром, который инстиллируется в трахею из расчета 0,1 мл/кг через
катетер, введенный при помощи ларингоскопа. Последующие записи ЭКГ
производятся через 1, 3, 5, 10, 15, 30 и 50 мин. Антиаритмическую
эффективность соединений оценивают по их способности предупреждать гибель
животных от фибрилляции желудочков. Учитывают процент выживших
животных, а также отношение числа погибших животных к общему числу
животных.
Так как одновременное использование двух или даже трех аритмоген-
ных факторов затрудняет интерпретацию полученных данных,
рекомендуется использовать модель нарушений ритма, вызванных адреналином у
бодрствующих кроликов. Кроликам массой 2,5—3,0 кг внутривенно вводят
адреналин гидрохлорид в виде 0,1 % раствора в дозах 120—150 мкг/кг. В
течение 6—7 мин после введения у животных возникают нарушения ритма
сердца двух типов. В одних случаях сразу же после введения адреналина в
высоких дозах (150—160 мг/кг) возникает политопная экстрасистолия,
сменяющаяся обычно желудочковой тахикардией и заканчивающаяся
фибрилляцией желудочков. В других случаях желудочковая экстрасистолия
- 425 -

возникает на фоне резкой брадикардии с атриовентрикулярной блокадой
различных степеней, которая через 2—3 мин переходит в политопную экс-
трасистолию и желудочковую тахикардию. Брадикардия носит
рефлекторный характер в ответ на вызванное адреналином резкое повышение
артериального давления Через 30 мин. после определения аритмогенной дозы
адреналина вводят внутривенно исследуемое соединение и записывают
ЭКГ во II стандартном отведении. Через 2 мин после введения
исследуемого соединения повторно вводят адреналин в аритмогенной дозе.
Антиаритмическую эффективность соединений определяют как по полному
предупреждению возникновения нарушений ритма сердца, так и по их
способности предупредить гибель животных от фибрилляции желудочков.
1.1.4. Изучение антиаритмической активности на строфантиновой
(оуабаиновой) модели аритмий у морских свинок
Строфантиновую аритмию получают в опытах на наркотизированных
морских свинках, которым вводят в яремную вену строфантин "К" в дозе
0,5 мг/кг. Нарушения сердечного ритма начинаются с появления
брадикардии и блока атривентрикулярного проведения, на фоне которых
появляются сначала отдельные экстрасистолы, которые затем переходят в
политопную экстрасистолию, заканчивающуюся обычно фибрилляцией
желудочков. Аритмия продолжается 15—20 мин. Эффективность
антиаритмических веществ оценивают по их способности предупреждать развитие
строфантиновой аритмии или удлинять время выживания животных.
Изучаемые соединения вводят внутривенно профилактически за 3—5 мин до
введения строфантина. ЭКГ регистрируют во II стандартном отведении
каждые 2—5 мин до 30 и более.
Аритмию можно вызвать оуабаином (строфантином "G") Оуабаин
вводят наркотизированным эфиром морским свинкам в дозе 250 мкг/кг.
Возникающие нарушения ритма сердца аналогичны аритмиям, которые
развиваются при введении строфантина "К" в дозе 500 мкг/кг. Эффективность
исследуемых соединений определяют по их способности предупреждать
гибель животных в процентах по отношению к гибели животных в
контроле. Изучаемые соединения вводят внутривенно за 2—3 мин до введения
оуабаина.
1.1.5. Изучение антиаритмической активности соединений на модели
аритмий у кроликов, полученной с помощью хлорида бария
Известно, что бария хлорид способен угнетать калиевую проводимость.
Модель аритмии с использованием хлорида бария считают адекватной для
выявления веществ со свойствами класса III антиаритмического действия.
Опыты проводятся на бодрствующих кроликах массой 2,0—3,0 кг, в ушную
вену которых вводят 2 % раствор бария хлорида (4 мг/кг). Для дальнейших
исследований отбирают животных, у которых в течение каждой минуты
возникает не менее одной экстрасистолы. Через 5—8 дней начинают
исследование. Испытываемый препарат вводят внутривенно через 2 мин
после хлорида бария. ЭКГ регистрируют во II стандартном отведении в
течение 15 с со скоростью 50 мм/с. Регистрируют фон, после введения бария
хлорида и через каждую минуту после введения изучаемого соединения.
Обычно после введения хлорида бария в дозе 4 мг/кг развивается много-
- 426 -

фокальная аритмия. Подбирают дозы исследуемого вещества, в которых
оно уменьшает или полностью устраняет аритмию в течение 15 мин.
Эффект изучаемого соединения вычисляют в процентах для каждой дозы.
Для окончательного суждения о принадлежности нового препарата к
определенному классу необходимо электрофизиологическое исследование.
Этап 2. Модели аритмий, используемые для изучения характера и спектра
действия исследуемых веществ
2.1. Модели аритмии желудочкового типа, вызываемые путем нарушения
кровоснабжения миокарда по методу Harris
2.1.1. Модель желудочковых аритмий, вызванная двустепенной перевязкой
коронарной артерии
Желудочковые нарушения ритма, вызванные окклюзией нисходящей
ветви левой коронарной артерии, получают у собак по методу Harris.
Данную модель считают особенно важной потому, что характер нарушений
сердечного ритма напоминает пароксизмальную тахикардию и
желудочковую экстрасистол ию, встречающуюся в клинике. Перевязку нисходящей
ветви левой коронарной артерии производят у собак в два этапа. Двойную
лигатуру подводят под артерию у верхушки левого ушка. Интервал между
частичной и полной окклюзией составляет 24 ч. Нарушения ритма
выражаются в желудочковой тахикардии и экстрасистолии. Аритмия длится
2—3 сут, но для суждения о действии изучаемых веществ следует
проводить исследования через 24 ч после полной окклюзии коронарной артерии.
ЭКГ регистрируют во II стандартном отведении. Эффективность
соединений оценивают по их способности восстанавливать синусовый ритм.
Вычисляют процент эктопических и нормальных сокращений.
2.1.2. Желудочковые аритмии, вызванные острой окклюзией коронарной
артерии и ее резкой реперфузией
Острая окклюзия нисходящей ветви левой коронарной артерии у
наркотизированных этаминалом натрия (35 мг/кг) кошек или кроликов
приводит к развитию различных желудочковых нарушений ритма, которые после
резкой реперфузии, как правило, приобретают еще более выраженный
характер вплоть до фибрилляции желудочков. Антифибрилляторную
активность новых соединений можно также изучать на модели острой
коронарной окклюзии у бодрствующих крыс.
Согласно современным представлениям, механизм возникновения ре-
перфузионных аритмий отличается от механизма возникновения
нарушений ритма вследствие острой окклюзии и связан с перегрузкой кардио-
миоцитов внутриклеточным кальцием и гибелью митохондрий.
Существенную роль в этом механизме играют токсические эффекты свободных
кислородных радикалов и перекисного оксиления мембранных липидов и
протеинов. Так как соединения с антиоксидантным действием могут
оказаться эффективными при реперфузионных аритмиях, необходимо
исследовать активность новых веществ не только при острой окклюзии, но и
при последующей постишемической реперфузии. Соединения,
неэффективные в первом случае, могут оказаться активными во втором.
-427 -

2.1.3. Модель острой окклюзии коронарной артерии у крыс в хроническом
эксперименте
В опыт берут беспородных белых крыс-самцов массой 180—200 г.
Оперируют в два этапа. На первом этапе под эфирным наркозом вскрывают
грудную клетку в четвертом межреберье слева. Затем в верхней трети левой
нисходящей коронарной артерии вживляют окклюдер. Нить окклюдера
проводят под артерией атравматической иглой, концы нити выводят под
кожу на груди в области четвертого межреберья. Далее грудную клетку
зашивают, а концы лигатуры выводят под кожу. Животные находятся в
свободном поведении 4—5 дней. В день исследования под эфирным наркозом
извлекают концы лигатуры и затягивают их над артерией. Через 1 — 1,5 ч
животных берут в опыт. Регистрируют ЭКГ во II стандартном отведении.
Исследуемое вещество вводят внутривенно за 3—5 мин или внутрь за 30
мин до окклюзии.
2.2. Модели аритмий предсердного типа
2.2.1. Метод регистрации максимально-воспроизводимой частоты сокращения
изолированного предсердия
В опытах in vitro для определения максимально-воспроизводимой
частоты сокращений при постоянной интенсивности раздражения используют
метод, основанный на определении частотного порога, отражающего
величину эффективного рефракторного периода предсердий. Изолированное
правое ушко предсердия сердца кролика или морской свинки помещают в
с окигенированным раствором Рингера—Локка при постоянной
температуре, равной 29—ЗГС. После адаптации к условиям бани предсердие
раздражают током возрастающей частоты до момента выпадения очередного
сокращения, т. е. до того момента, когда предсердие перестает усваивать
заданный ритм. Эта частота рассматривается как максимальная,
отражающая величину эффективного рефракторного периода (ERP = 1/f —
интенсивность электрического тока, которым наносится раздражение, вдвое
превышает пороговую величину). Опыт повторяется после добавления
исследуемого вещества. В случае положительного действия
максимально-воспроизводимая сердцем частота сокращений уменьшается. Определяют
концентрацию веществ, уменьшающую максимально-воспроизводимую
частоту сокращений изолированного предсердия на 15 %, т. е. вычисляют
величину ЭД15. Применение более высоких концентраций, вызывающих
эффект свыше 30 %, может привести к появлению необратимых изменений в
ткани ушка и делает невозможной длительную работу на данном
предсердии.
2.2.2. Модель изучения влияния веществ на нарушения ритма предсердного
типа по методу Rosenbleuth et Ramos
Нарушения ритма предсердия получают у собак под морфинно-урета-
новым наркозом при искусственном дыхании. Сердце обнажают и
синусовый узел на участке между устьями верхней и нижней полых вен
разрушают. Затем предсердия раздражают прямоугольными стимулами
длительностью 1 мс, напряжением, вдвое превышающим пороговое, при частоте им-
- 428 -

пульсов 15—20 Гц. Электрическую активность предсердий осуществляют
прямой регистрацией электрограммы правого предсердия, регистрацию
возбуждений желудочков — записью ЭКГ во II стандартном отведении.
Исследуемые соединения вводят через 30 мин после возникновения
нарушений ритма. Нарушения ритма после механического разрушения
синусового узла и раздражения электрическим током предсердия характеризуются
их трепетанием, при этом частота сокращений предсердий увеличивается в
2—7 раз по сравнению с исходной. Частота сокращений желудочков также
несколько возрастает: в одних опытах на несколько ударов, в других — в
2—3 раза. Антиаритмическая активность соединений оценивается методом
"биологического титрования" при внутривенном введении их с постоянной
скоростью (1 мг/кг в 1 мл в 1 мин) до полной нормализации синусового
ритма.
Возникновение эктопической пейсмекерной активности в предсердиях
можно добиться также местной аппликацией таких веществ, как аконитин,
вератрин или хлористый барий, меняющих соответствующим образом
проводимость ионных каналов мембран кардиомиоцитов.
2.2.3. Модель фибрилляции предсердий в опытах на анестезированных кошках
по методу Шейх-Заде
Опыты проводятся на кошках, анестезированных уретаном и хлорало-
зой в дозах 75 и 15 мг/кг соответственно (внутрибрюшинно). Проводят
искусственную вентилляцию легких. Через яремную и бедренную вены
вводят в правое предсердие биполярные электроды для регистрации предсерд-
ной электрограммы и стимуляции предсердий. В шейном отделе
препарируют и обнажают правый блуждающий нерв, который перерезают; на
периферический его конец накладывают платиновые электроды, с
расстоянием между ними 2 мм. Регистрируют ЭКГ и электрограмму. С помощью
стимулятора находят порог раздражения блуждающего нерва (2 мс, 30
импульсов в 1 мин, иногда частоту меняют). После начала стимуляции нерва
на фоне урежения частоты сокращений в 2 раза и более проводят парную
стимуляцию предсердия (5 мс), которая приводит к фибрилляции.
Вещества вводят внутривенно.
2.3. Модели аритмии желудочкового типа, вызванные с помощью
электрической стимуляции сердца
2.3.1. Максимально-воспроизводимая частота сокращений (эффективный
рефрактерный период) и фибрилляция желудочков сердца < 1)
Опыты проводят на наркотизированных нембуталом (40 мг/кг) кошках
массой 2—4 кг при искусственном дыхании. Температуру тела
поддерживают на уровне 37 °С путем внешнего подогрева. Артериальное давление
регистрируют в бедренной артерии электроманометром,
электрокардиограмму — во II стандартном отведении. Нарушения сердечного ритма
вызываются с помощью подшитых к миокарду правого желудочка биполярных
электродов. Электрическим раздражением создают искусственный
"эктопический очаг возбуждения" для получения отдельных или групповых
экстрасистол или развития фибрилляции. Применяют различные по
интенсивности параметры раздражающих стимулов, которые через изолирую-
-429 -

щую токовую приставку подают на миокард от электрического
стимулятора. Навязывание миокарду желудочков ритма раздражений, превышающих
частоту возбуждения синусового узла, приводит к усвоению ритма сердцем
лишь до определенного предела. Дальнейшее повышение частоты
раздражений, исходящих из искусственно созданного "эктопического очага
возбуждения", приводит к тому, что ритм не усваивается, т. е. сердце не
реагирует на импульсы, идущие из "эктопического очага возбуждения". Этот
феномен, отражающий защитный механизм сердца, связан с попаданием
более частых стимулов в эффективный рефрактерный период при
случайном их распределении. Чем меньше частота навязанных из "эктопического
очага" раздражений усваивается сердцем, тем большим антиаритмическим
действием обладает изучаемое соединение.
Порог фибрилляции определяют повторяющимся сканированием
уязвимого периода (восходящая часть зубца Т на ЭКГ) серией прямоугольных
импульсов, длительностью 1—4 мс, частотой следования в пачке 50 Гц и
повышающейся интенсивности до тех пор, пока не возникает
фибрилляция желудочков Используют в зависимости от целей эксперимента от 20
до 90 импульсов в пачке. Эта методика имеет преимущества перед нередко
применяемым переводом желудочков на искусственную стимуляцию с
последующей синхронизацией подачи пачки импульсов в уязвимый период,
так как не требует таких искусственных условий, как прекращение доступа
"нормальных" импульсов из синусового узла при разрушении атриовентри-
кулярного соединения механически или с помощью формалина. За
величину порога принимают минимальную интенсивность тока в
милливольтах, вызвавшее фибрилляцию желудочков. Дефибрилляцию производят с
помощью дефибриллирующего разряда заданной интенсивности,
подаваемого непосредственно на миокард от аппарата ДИ-03.
Исследуемые вещества вводят внутривенно. Учитывают максимальную
частоту, при которой сердце перестает усваивать навязанный ритм. Эта
частота отражает изменения эффективного рефрактерного периода под
влиянием исследуемого вещества, а также минимальную силу тока,
которая необходима для того, чтобы вызвать фибрилляцию желудочков.
Этап 3. Изучение механизма действия отобранных соединений
3.1. Электрофизиологические методы исследования антиаритмических
средств
Выше мы указывали, что если в распоряжении экспериментатора
имеется необходимая аппаратура, электрофизиологические исследования
имеет смысл проводить в тот период изучения препарата, когда установлена
его антиаритмическая активность. На основании результатов, полученных
на моделях аритмий, экспериментатор имеет представление лишь о
возможной принадлежности препарата к определенному классу
антиаритмического действия. Мембранно-клеточные механизмы действия
антиаритмических веществ изучают, применяя стандартную микроэлектродную
технику отведения трансмембранных потенциалов, а также регистрацию
трансмембранных ионных токов с помощью метода фиксации потенциала
(voltage-clamp). Изучают влияние веществ на потенциал покоя (ПП) и
потенциал действия (ПД) миокардиальных клеток разных отделов сердца
(синусовый и атриовентрикулярный узлы, волокна Пуркинье, предсердные
и желудочковые волокна сократительного миокарда), максимальную ско-
- 430 -

рость деполяризации (Vmax), пороговый и максимальный диастолический
потенциалы, длительность ПД на разных уровнях реполяризации,
эффективный, относительный и функциональный рефрактерные периоды и т. д.
Прямое измерение ионных токов кардиомиоцитов позволяет определить,
на какие входящие (быстрый натриевый или медленный кальциевый) или
выходящие (калиевые) токи действует изучаемое соединение. Для
нахождения места антиаритмиков в современной классификации важно не
только то, на какой ионный ток действует данное соединение, но и каким
образом оно взаимодействует с каналом. Антиаритмический эффект, как
показано в ряде исследований, определяется в значительной степени тем, в
каком состоянии — открытом, закрытом или инактивированном —
находятся каналы, на которые действует изучаемое соединение.
3.1.1. Изучение электрофизиологического действия изучаемых веществ
в опытах in vitro
Для изучения характеристик потенциала действия in vitro в настоящее
время чаще всего используют препарат папилярной мышцы морской
свинки. В качестве примера описываем этот метод подробно. В опыт берут
морских свинок массой около 400 г. Животных забивают кровопусканием.
Сердце извлекают, тонкую папиллярную мышцу вырезают из правого
желудочка и помещают в проточную камеру. Суперфузию проводят с
постоянной скоростью (18 мл/мин) раствором Кребса—Хенселяйта следующего
состава (в мМ/л): NaCl 113,8, СаС12, - 3,2; КН2Р04 - 1,2; KC1 - 4,7,
MgS04 — 1,2, глюкоза — 10,0; поддерживали уровень кислорода 95 % и
5 % С02; рН 7,4; t° раствора 35 "С. В папиллярной мышце укрепляют
биполярный электрод (Ag/AgCl), с помощью которого наносят стимулы
пороговой интенсивности в мв и различной частоты от 1 до 3 Гц.
Трансмембранные потенциалы регистрируют с помощью стеклянных
микроэлектродов, заполненных КС1 (3 мМ/л), с сопротивлением кончика электрода 10—
25 мОм. После усиления потенциалы подаются на осциллоскоп и
регистрируются в реальном времени после аналого-цифрового преобразования.
Измеряют следующие параметры: RP — потенциал покоя (мв), OV — овер-
шут (мв), Vmax — максимальная скорость нарастания потенциала
действия, СТ — время проведения и АРД90 — длительность потенциала действия
при 90 % реполяризации, мс. Эффективный рефрактерный период (ERP)
измеряют, применяя добавочный стимул, равный двойному пороговому.
Относительный рефрактерный период (RRP) определяют как наименьшую
разность между длительностью ответов в фазе конечной реполяризации. В
качестве эталонов сравнения используют антиаритмические препараты
того класса, эффекты которого определяются у исследуемого соединения.
Такого же рода исследования могут быть проведены на полосках миокарда
лягушки.
3.1.2. Изучение электрофизиологического действия изучаемых препаратов
в опытах in vivo с помощью программной электрической стимуляции
миокарда
В настоящее время изучению электрофизиологических свойств
антиаритмических веществ на целом животном с использованием программной
электрической стимуляции миокарда придается важное значение, так как
-431 -

характер исследования и его протокол полностью совпадают с
электрофизиологическим исследованием, проводящимся в клинических условиях [2].
В опыт берут собак, наркотизируют, интубируют, переводят на
искусственное дыхание, фиксируют на операционном столе на правом боку. В
асептических условиях вскрывают грудную клетку в четвертом межреберье
слева. Перикард надрезают, выделяют нисходящую ветвь левой коронарной
артерии ниже края ушка левого предсердия. Параллельно артерии
накладывают инъекционную иглу № 20. Первую лигатуру завязывают на игле,
что создает препятствие циркуляции крови в расположенном ниже участке
миокарда. Через 30 мин завязывают наглухо вторую лигатуру (операция по
Harris). В яремную вену вводят полиэтиленовый катетер, конец которого
выводят на шею собаки и фиксируют. Выживших животных берут в
эксперимент для дальнейших исследований.
На 2—4-е сутки животных берут для проведения
электрофизиологического исследования. После нембуталового наркоза животных интубируют
и проводят искусственную вентиляцию легких. По операционному шву
вновь вскрывают грудную клетку, позволяя осуществить доступ к
поврежденному ранее миокарду.
Через бедренную артерию вводят зонд-электрод, который
устанавливают в луковице аорты и с его помощью регистрируют биполярную
электрограмму пучка Гиса. Другой биполярный электрод, имеющий вид зажима,
укрепляют на ушке левого предсердия. С его помощью регистрируют
электрограмму левого предсердия и проводят электростимуляцию левого
предсердия. Третий биполярный электрод с расстоянием между
электродами 5 мм, погружают в толщу миокарда левого желудочка в области
нормального (неинфарцированного) миокарда в зоне, близкой к ушку левого
предсердия. С помощью этого электрода регистрируют электрограмму
левого желудочка и проводят его электростимуляцию. На протяжении
исследования за электрической активностью сердца непрерывно наблюдают по
монитору компьютера и заносят в память наружную электрокардиограмму
в отведениях I, II и III, а также электрограммы сердца. В последующем,
извлекая из памяти компьютера данные исследования, производят
расшифровку. Наружная электрокардиограмма воспроизводится при
фильтрации сигнала от 0 до 250 Гц. Электрограмму пучка Гиса фильтруют в
диапазоне 60—400 Гц, а миокардиальные электрограммы — в диапазоне 100—
400 Гц.
После наложения электродов и регистрации контрольных электрограмм
проводят программу электростимуляции сердца. Ее выполняют с помощью
программного стимулятора. Продолжительность прямоугольных импульсов
составляет 2 мс. Электростимуляцию сердца осуществляют импульсами с
амплитудой, вдвое превышающей порог навязывания ритма. Полный
протокол электростимуляции включает следующее.
1. Частую стимуляцию предсердий прерывающимися сериями из 20
импульсов со ступенеобразно нарастающей частотой с фиксированным
увеличением в 10 имп/мин, начиная с частоты, на 10 имп/мин превышающей
частоту собственного ритма сердца, и до достижения блокады проведения
импульсов по предсердно-желудочковой проводящей системе.
2. Стимуляцию предсердий одиночными преждевременными импульсами
(метод S1S2) на фоне навязанного с постоянной частотой базисного ритма.
Серии базисного ритма состоят из 10 импульсов, и следующий за ними
преждевременный импульс, посылаемый первоначально в позднюю
диастолу, каждый раз укорачивается с фиксированным уменьшением в 5 мс до тех
пор, пока не достигается эффективный рефрактерный период предсердий.
-432-

После этого истинное значение эффективного рефрактерного периода
определяют, изменяя интервал сцепления на 1 мс. Данный вид стимуляции
выполняют как минимум на двух частотах навязанного ритма, определяя
минимальную его частоту частотой собственного ритма. Обычно используют
частоты, соответствующие длительности интервалов между стимулами в 350,
300, 250 и 200 мс.
3. Стимуляцию желудочков одиночными преждевременными
импульсами (метод 81S2) на фоне навязанного базисного ритма. Методика
аналогична той, которая описана выше для электростимуляции предсердий.
4. Стимуляцию желудочков парными преждевременными импульсами
(метод S1S2S3) на фоне навязанного базисного ритма. Для этого сначала
интервал S1S2 устанавливают на 5—10 мс больше эффективного
рефрактерного периода желудочков, а затем проводят сканирование диастолы
импульсом S3 до достижения им эффективного рефрактерного периода
желудочков. Данный вид стимуляции проводят на тех же частотах базисного
ритма, что и стимуляцию методом S1S2.
5. В случаях, когда при проведении электростимуляции желудочков
методом S1S2S3 не удается спровоцировать желудочковую аритмию,
проводят электростимуляцию желудочков методом S1S2S3S4 и S1S2S3S4S5, что
не является обязательным в протоколе настоящего исследования.
В результате регистрации электрической активности сердца и
проведения частой электростимуляции предсердий определяют следующие
показатели:
— длительность спонтанного синусового цикла (интервал РР);
— интервал PQ;
— длительность комплекса QRS — измерение проводят от момента
наиболее ранней активации желудочков по наружной ЭКГ или по
электрограмме пучка Гиса до окончания осцилляции V на электрограмме пучка
Гиса.
— интервал QT. Измерения производят на синусовом ритме, величину
интервала QT выражают в абсолютных величинах в мс, обозначая данный
показатель QTmax. Величину интервала QT выражают также в
корригированной форме (QTc), определяя ее по формуле
Q7c= QT(ms)/RR(s).
Длительность интервала QT измеряют также при частой стимуляции
предсердий в последнем навязанном цикле, определяя наименьшую его
величину во всем диапазоне частот стимуляции. Этот показатель
обозначали как Q Train.
— время внутрипредсердного проведения (интервал РА) — время от
начала зубца Р в любом из трех стандартных отведений наружной ЭКГ до
первой быстрой высокоамплитудной осцилляции предсердий на
электрограмме пучка Гиса;
— время проведения импульса по АВ узлу (интервал АН) — время от
начала первой быстрой высокоамплитудной осцилляции предсердий на
электрограмме пучка Гиса до начала осцилляции пучка Гиса;
— время проведения импульса по системе Гиса—Пуркинье (интервал
HV) — время от начала осцилляции пучка Гиса до начала возбуждения
желудочков по электрограмме пучка Гиса или наружной ЭКГ в зависимости
от того, где возбуждение желудочков регистрируется раньше;
— минимальная длительность цикла стимуляции предсердий, при
которой сохраняется проведение импульсов на желудочки с кратностью 1:1
(СЫ:1);
-433 -

— время восстановления функции синусового узла (SNRT) — время
от начала последней активации предсердий, вызванной
электростимулом, до начала первой спонтанной активации предсердий после
прекращения серии частой стимуляции предсердий. Данную величину
определяют на всех частотах стимуляции предсердий и в качестве SNRT
выбирают максимальную из них. Вычитая из полученной величины SNRT
длительность спонтанного синусового цикла (интервал РР), получают
корригированное время восстановления функции синусового узла
(CSNRT).
В ходе стимуляции предсердий и желудочков методом S1S2 определяют
следующие показатели:
— эффективный рефрактерный период предсердий (ERPA) — наиболее
длительный интервал S1S2, при котором в ответ на S2 не возникает
возбуждения предсердий;
— функциональный рефрактерный период предсердий (FRPA) —
наиболее короткий интервал между возбуждениями предсердий в ответ на S1
и S2;
— общий рефрактерный период предсердий (TRPA) — наиболее
короткий интервал S1S2, при котором не наблюдается задержки импульса в
ответ на S2;
— относительный рефрактерный период предсердий (RRPA) — разность
между TRPA и ERPA;
— эффективный рефрактерный период АВ узла (ER-PAVN) — наиболее
продолжительный интервал между возбуждениями предсердий в ответ на
S1 и S2, при котором второй импульс блокируется в АВ узле;
— функциональный рефрактерный период АВ узла (FRPAVN) —
наиболее короткий интервал между возбуждениями пучка Гиса в ответ на
возбуждения предсердий после Sin S2;
— общий рефрактерный период системы Гиса—Пуркинье (TRPHPS) —
наиболее продолжительный интервал Н1Н2, при котором отмечается
удлинение интервала HV или аберрация комплекса QRS;
— эффективный рефрактерный период желудочков (ERPV) — наиболее
продолжительный интервал S1S2, при котором в ответ на S2 не
происходит возбуждения желудочков;
— функциональный рефрактерный период желудочков (FRPV) —
наиболее короткий интервал между возбуждениями желудочков в ответ на S1
hS2.
При электростимуляции желудочков различают следующие виды
спонтанной эктопической активности:
— повторный желудочковый ответ (RR) — от 1 до 5 следующих друг за
другом спонтанных эктопических возбуждений желудочков;
— неустойчивая желудочковая тахикардия (VTNS) — спонтанная
желудочковая эктопическая активность продолжительностью более 5 циклов,
но менее 30 с;
— устойчивая желудочковая тахикардия (VTS) —спонтанная
желудочковая эктопическая активность продолжительностью более 30 с;
— фибрилляция желудочков (VFb).
При развитии фибрилляции желудочков или устойчивой желудочковой
тахикардии, не купирующейся электростимуляцией желудочков и
приводящей к серьезным гемодинамическим последствиям, проводят
электроимпульсную терапию (DS shock). При этом энергию импульса подбирают,
начиная с 1,0 RW, так, чтобы определить порог дефибрилляции. Если это
происходит в контрольном исследовании до введения препарата, то после
- 434-

восстановления нормального ритма следует выждать период не менее 20
мин, контролируя величину ERPV и давая ей возможность вернуться к
контрольному значению.
После завершения контрольного исследования вводят изучаемый
препарат. В течение 60 мин через каждые 5 мин измеряют интервалы ЭКГ и
электрограммы пучка Гиса. Начиная с 15 мин проводят программу
электростимуляции в последовательности, описанной выше.
В случаях, когда у одного животного изучают препарат в двух разных
дозах, вторую дозу следует вводить не менее чем через час после введения
первой. Контрольными значениями изучаемых показателей для второй
дозы служат те же величины, что и для первой.
Этап 4. Общие фармакологические свойства, аритмогенное действие
и токсичность изучаемых соединений
4.1. Методы, позволяющие выявить общую фармакологическую активность
4.1.1. Использование методов радиолигандного связывания для изучения
спектра взаимодействия изучаемых соединений с мембранными рецепторами
различных типов.
В настоящее время для изучения характера действия изучаемых
химических веществ широко применяют методы радиолигандного
связывания. Методы радиолигандного анализа позволяют выявить мишени —
специфические рецепторы, через которые вещество влияет на
метаболизм клетки. Изучение механизмов взаимодействия химических
соединений с различными типами рецепторов позволяет выявить те особенности
строения вещества, которые определяют его свойства, и на этой основе
сформулировать требования к направленному синтезу новых соединений.
С другой стороны, представляет значительный интерес исследовать
спектр взаимодействия уже изученного нового препарата с мембранными
рецепторами различных типов. Объем исследований зависит от
методических возможностей. Для изучения антиаритмических препаратов
представляет интерес изучение связывания соединений с рецепторами
натриевых, кальциевых и калиевых каналов, мускариновыми рецепторами
(М,М2); а,,а2-адренорецепторами, Рь^-адренорецепторами,
дофаминовыми 02-рецепторами, гистаминовыми рецепторами и т. д. Определяют
константы связывания изучаемого соединения с мембранными
рецепторами различных типов.
4.1.2. Влияние на сердечно-сосудистую систему
В опытах на наркотизированных или бодрствующих собаках или
кошках регистрируют артериальное давление и деятельность сердца (частоту
сердечных сокращений, ударный и минутный объемы, сократительную
функцию миокарда). Влияние на сократимость имеет важное значение для
оценки нового антиаритмического препарата. Так как угнетение
сократимости присуще многим антиаритмическим веществам, важно выяснить
насколько интенсивно оно выражено. В той же степени это относится и к
влиянию нового соединения на частоту сердечных сокращений и функцию
проведения.
-435 -

4.1.3. Изучение влияния на вегетативный отдел нервной системы
Исследования проводят на целом животном (наркотизированные
кошки) и на изолированных органах (изолированные отрезки кишечника). На
целом животном изучают влияние веществ на реакции артериального
давления, вызванные введением адреналина, норадреналина, ацетилхолина, а
также раздражением периферического отрезка блуждающего нерва, а также
на сокращение мигательной перепонки у кошек при раздражении
симпатического нерва на шее.
В опытах на изолированных отрезках кишечника исследуют влияние
веществ на спазм кишечника, вызванный ацетилхолином.
4.2. Изучение аритмогенного действия, острой и хронической токсичности
изучаемых веществ
4.2.1. Изучение острой и хронической токсичности изучаемых веществ
Острую токсичность изучают на первом этапе исследований, вычисляют
LD50 и терапевтическую широту (LD5o/3D5o). При этом 3D50 можно взять
из результатов исследований, полученных на аконитиновой или хлорид-
кальциевой модели.
Хроническую токсичность изучают так же, как и для соединений
другого типа действия. Длительность введения вещества зависит от того, в
какой лекарственной форме предполагается применять препарат.
В связи с тем что для купирования или профилактики аритмий
требуются различные по длительности курсы лечения, а также разные способы
введения препаратов (внутрь или парентерально в виде одномоментной
струйной или длительной капельной инфузии), особое значение для
выбора оптимально эффективных доз имеет изучение фармакокинетики.
4.2.2. Модель для изучения аритмогенного действия соединений (аритмии,
вызванные тригерной активностью)
Выраженность аритмогенного действия имеет важное значение для
оценки нового соединения, предлагаемого в качестве антиаритмического
препарата. Аритмогенное действие является одним из самых неприятных
побочных явлений антиаритмических средств.
Аритмогенный эффект можно наблюдать в различных экспериментах in
vivo, однако трудно оценить его количественно. Для оценки аритмогенной
активности может быть предложена следующая методика [6]. Кроликам-
самцам проводят премедикацию морфином гидрохлоридом (2 мг/кг
подкожно). Затем наркотизируют а-хлоролозом (90—120 мг/кг) внутривенно в
виде инфузии в течение 15 мин. Далее переводят на искусственное
дыхание. Яремную вену катетеризируют для инфузии метаксамина (а,-адрено-
миметик) и изучаемого соединения. Артериальное давление регистрируют
в сонной артерии. Биполярный электрод вводят через яремную вену в
правый желудочек. Поверхностную ЭКГ во II отведении регистрируют с
помощью игольчатых электродов, которые вводят подкожно. Регистрируют
ЭКГ во II отведении и интракардиальную электрограмму, кровяное
давление перед началом инфузии метоксамина, который вводится с
постоянной скоростью в дозе 15 мг/кг в минуту. После 15-минутной инфузии ме-
-436-

токсамина начинают инфузию исследуемого препарата, разведенного в
10—12 мл дистиллированной воды Последующие дозы изучаемого
вещества вводят в течение часа. Желудочковые экстрасистолы учитывают, когда
появляются пробежки полиморфной желудочковой тахиаритмии, начиная
с восьми последовательных сокращений с типичным кручением комплекса
QRS вокруг оси электрокардиограммы. Учитывают количество приступов
полиморфной желудочковой тахикардии или других нарушений ритма (би-
геминия, нарушения проведения и т. д.). В качестве эталонов сравнения
берут препараты, аналогичные изучаемому соединению по классу
антиаритмического действия. Этот метод особенно актуален при изучении
препаратов класса III антиаритмического действия, для которых развитие
аритмогенного действия особенно типично.
Этап 5. Изучение фармакокинетики исследуемого вещества. Биодоступность
изучаемого соединения. Сопоставление фармакодинамики
и фармакокинетики
Для сопоставления фармакодинамики и фармакокинетики
антиаритмических препаратов обычно используют модель желудочковой аритмии на
собаках, полученную с помощью метода Harris. У собаки берут пробы
крови до введения препарата и после его введения. Промежутки времени
забора крови определяют в каждом отдельном случае в соответствии с
длительностью действия препарата.
В большинстве исследований для изучения фармакокинетики
используют метод ВЭЖХ. Важным этапом в фармакокинетике препарата играют
возможные активные метаболиты, которые могут брать на себя долю
антиаритмического действия. Расчет показателей фармакокинетики и
биодоступности не отличается от расчета показателей при изучении препаратов
других типов действия. Очень важным для любого препарата является его
биодоступность.
Заключение
Рекомендованный комплекс методов позволит выявить соединения,
которые по спектру и характеру своего действия могут быть предложены для
клинических испытаний в качестве антиаритмических средств.
Вместе с тем не следует забывать, что в ходе клинического изучения
нового препарата может возникнуть необходимость проведения
дополнительных экспериментальных исследований, направленных на более детальное
изучение механизмов действия, имеющих важное значение для
оптимизации клинического применения каждого из предложенных средств.

Методические указания по изучению противоишемического
(антиангинального) действия фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н., проф. Г. Г. Чичканов;
д. б. н. И. Б. Цорин
На протяжении длительного времени исследователи, занимающиеся
созданием новых средств для лечения больных ишемической болезнью
сердца (ИБС), обращали основное внимание на поиск веществ, способных
устранять или предупреждать приступы стенокардии. Однако ИБС,
которая возникает вследствие несоответствия между потребностью миокарда в
кислороде и возможностями кровоснабжения (следовательно, и снабжения
кислородом) его отдельных областей, необязательно сопровождается
приступами стенокардии, а может проявляться в виде безболевых ("немых")
эпизодов ишемии миокарда. Такие эпизоды по данным суточного монито-
рирования наблюдаются более чем у половины больных с типичной
стенокардией напряжения. При этом они чаще имеют место у больных с
поражениями нескольких ветвей коронарной артерии. По данным
клиницистов, у больных с подтвержденным диагнозом ИБС из всех
регистрируемых у них в течение суток эпизодов ишемии миокарда около 3/4 могут
носить безболевой характер, а у 4—5 % больных ИБС заболевание может
вообще протекать бессимптомно.
Вот почему для лечения больных ИБС необходимы не только и даже не
столько вещества с антиангинальными свойствами, т. е. купирующие
болевой приступ, сколько препараты, улучшающие функциональное состояние
самого очага ишемии сердечной мышцы, т. е. обладающие выраженным
противоишемическим действием.
Перед специалистами, занимающимися поиском такого рода средств,
стоят большие трудности. В самом деле, на современном этапе наших
знаний о патогенезе ИБС, клинике и терапии этого заболевания, учитывая
разнообразие форм ИБС, стадий ее развития, речь не может идти о
создании какого-либо одного "идеального" антиангинального препарата. И если
еще в 70-х — начале 80-х годов пытались найти идеальное вещество типа
амиодарона (кордарона), которое было бы способно уменьшать
потребление сердцем кислорода, значительно увеличивать коронарный кровоток и
при этом не угнетать функцию сердца, обладать антиадренергическим
действием, то позднее от таких попыток отказались. Сегодня в клинике ИБС
находят применение вещества с самым разнообразным механизмом
действия.
Выделяют 3 основные группы противоишемических (антиангинальных)
средств, нитраты, (3-адреноблокаторы, антагонисты кальция. Каждая из
названных групп неоднородна, и ее можно разделить на подгруппы,
имеющие особенности в механизме антиангинального (противоишемического)
действия. Помимо этих основных групп, важное место в терапии больных
ИБС могут занимать вещества с иными фармакологическими свойствами,
в частности активаторы К+ АТФ-чувствительных каналов, антигипоксан-
ты, антиоксиданты, ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента,
препараты, влияющие на равновесие в системе простациклин—тромбок-
сан, специфические брадикардические средства и др. Обладая различными
механизмами действия, все эти препараты приводят в соответствие
потребность сердца в кислороде и его доставку или за счет улучшения коронар-
-438-

ного кровообращения, или воздействуя на метаболизм миокарда,
уменьшая его потребность в кислороде, или действуя на то и другое.
В связи со сказанным становится очевидным, что поиск новых веществ
с противоишемическими (антиангинальными) свойствами уже на ранних
стадиях следует проводить, учитывая возможные механизмы их действия.
Современную программу поиска и доклинического изучения такого
рода средств можно представить следующим образом.
/ этап. Первичная оценка фармакологического вещества
Уже на этом этапе можно выявить способность веществ оказывать вазо-
дилатирующее (коронарорасширяющее) действие и/или влиять на
энергетический метаболизм миокарда, уменьшая его потребность в кислороде.
Однако на сегодняшний день не существует какого-либо одного простого,
легко воспроизводимого метода, который дал бы определенный ответ на
вопрос о перспективности вещества в качестве противоишемического (ан-
тиангинального) средства. Как ни привлекательно было бы упростить
систему первичного отбора такого рода средств, сделать это не представляется
возможным. По сути дела, на сегодня при первичной оценке вещества
остается незаменимым общепринятый метод регистрации коронарного
кровотока на целом животном (кошки, собаки) по оттоку крови из
коронарного синуса, который дает наиболее полный ответ на вопрос о влиянии
препарата на такие важные показатели состояния сердечно-сосудистой
системы, как артериальное давление, тонус коронарных артерий, величину
тотального коронарного кровотока и поглощения сердцем кислорода
(которое прямо пропорционально произведению артериовенозной разницы
оксигемоглобина (или напряжения кислорода) и коронарного кровотока,
т. е. именно те показатели, которые и определяют соответствие
потребности сердца в кислороде и его доставки.
Перспективным будет считаться вещество, которое увеличивает
содержание оксигемоглобина (напряжение кислорода) в крови коронарного
синуса. При этом объемная скорость коронарного кровотока может как
увеличиваться, так и уменьшаться Важно, чтобы при увеличении коронарного
кровотока поглощение сердцем кислорода уменьшалось или не
изменялось. Оно может также увеличиваться, но в значительно меньшей степени,
чем увеличивается при этом коронарный кровоток. При уменьшении
коронарного кровотока под влиянием исследуемого вещества поглощение
сердцем кислорода должно уменьшаться в значительно большей степени,
чем коронарный кровоток.
Отбор противоишемических (антиангинальных) средств на "более
простых" моделях (изолированные сосуды сердца, изолированные перфузируе-
мые сердца различных видов животных) по трудоемкости, прогнозируемо-
сти, точности оценки, стоимости работы не может в полной мере заменить
названный метод исследования.
// этап. Изучение противоишемического действия отобранного вещества
на различных моделях острой и хронической ишемии миокарда
1. Модель острой ишемии миокарда, вызванной временной полной
окклюзией передней нисходящей ветви левой коронарной артерии в
течение 5—20 мин с последующей реперфузией в опытах на кошках или соба-
- 439 -

ках. О противоишемическом действии фармакологического вещества судят
по снижению средней величины подъема сегмента ST на множественных
отведениях эпикардиальной электрограммы. Вещество с возможным про-
тивоишемическим (антиангинальным) действием будет снижать среднюю
величину подъема сегмента ST на электрограмме. Оценку противоишеми-
ческого действия можно также проводить, регистрируя региональную
сократительную функцию миокарда во время окклюзии и реперфузии
коронарной артерии, с помощью тензорезисторов или ультразвуковых
кристаллов. Вещество с противоишемическим действием будет уменьшать
угнетение сократимости, вызываемое ишемией, и/или улучшать ее
восстановление во время реперфузии. В этих же экспериментах можно изучать
влияние веществ на увеличение содержания К и лактата в крови коронарного
синуса, вызываемое ишемией.
2. Модель острой ишемии миокарда, вызванной стенозом передней
нисходящей ветви левой коронарной артерии и навязыванием сердцу
высокого искусственного ритма. Острые опыты на наркотизированных
собаках. Эксперименты проводятся так, что очаг ишемии в сердце возникает
при обязательном наличии двух факторов определенной степени сужения
просвета нисходящей ветви левой коронарной артерии в средней ее трети
и навязывания сердцу высокого искусственного ритма, превышающего
фоновый на 70—90 ударов. Отдельно каждый из названных факторов не
приводит к возникновению ишемии. Навязывание ритма осуществляется с
помощью электрической стимуляции правого ушка сердца. При
стимуляции в течение 3—5 мин в миокарде образуется очаг ишемии, который
регистрируется в нескольких отведениях эпикардиальной электрограммы в
виде подъема сегмента ST. Одновременно возникает угнетение
региональной (локальной) сократительной функции. Прекращение стимуляции
нормализует электрограмму и региональную функцию миокарда В этих же
опытах можно брать образцы коронарной венозной крови для определения
в них метаболитов (лактат, пируват, глюкоза, калий).
Вещество, обладающее противоишемическим действием, будет
значительно уменьшать или даже полностью предупреждать подъем сегмента ST
и/или угнетение региональной сократительной функции во время
стимуляции сердца и нормализовать измененные показатели метаболизма.
3. Для изучения действия препаратов в условиях более тяжелой ишемии
может быть использована модель на наркотизированных собаках, у
которых одновременно со стенозом передней нисходящей ветви левой
коронарной артерии воспроизводят окклюзию огибающей ветви левой
коронарной артерии и в условиях навязывания высокого ритма сокращении
сердца регистрируют эпикардиальную электрограмму и/или региональную
сократительную функцию миокарда в бассейне, снабжаемом передней
нисходящей ветвью левой коронарной артерии.
4. Модификацией предыдущей модели являются эксперименты на
бодрствующих собаках или свиньях со стенозом коронарной артерии, у
которых приступ ишемии вызывают с помощью бега животных на третбане.
О противоишемическом действии веществ судят по снижению подъема
сегмента ST на ЭКГ и предотвращению угнетения региональной
сократительной функции.
5. Хорошо известно, что ишемия вызывает закисление среды в ткани.
На основе этого факта была разработана модель ишемии миокарда у
наркотизированных собак. В этих опытах у животных воспроизводят
дозированный стеноз передней нисходящей ветви левой коронарной артерии.
При уменьшении коронарного кровотока в венечной артерии на 50—70 %,
- 440 -

которое контролируют с помощь электромагнитного или ультразвукового
измерителя потока крови, рН в зоне ишемии уменьшается с 7,5 до 6,8—
6,9. Изучаемое вещество вводят через 30 мин после начала стеноза. О про-
тивоишемическом действии судят по снижению закисления среды.
6. Одним из показателей успеха терапии больных ИБС служит
поддержание на адекватном уровне показателей гемодинамики и деятельности
сердца. В связи с этим значительный интерес представляет модель на
наркотизированных животных (кошки, собаки), у которых воспроизводят
длительную (20—40 мин) окклюзию передней нисходящей ветви левой
коронарной артерии с последующей реперфузией. Противоишемическое
действие вещества оценивают по поддержанию показателей гемодинамики и
деятельности сердца по сравнению с контрольной серией экспериментов.
В этих же опытах в конце периода реперфузии исследуют влияние
вещества на истощение макроэргических фосфатов в очаге ишемии.
7. Хорошо известно, что ишемия вызывает значительное увеличение
соотношения лактат/пируват в коронарной венозной крови, причем в
течение первого часа этот процесс имеет линейный характер. В связи с этим
для оценки противоишемического действия может быть использована
модель на наркотизированных животных (кошки, собаки), у которых в
течение 60-минутной окклюзии передней нисходящей ветви левой коронарной
артерии через определенные промежутки времени берут пробы крови из
венечного синуса или из вены, непосредственно дренирующей очаг
ишемии. В крови, как правило, энзиматическим методом определяют лактат и
пируват и вычисляют их соотношение. О противоишемическом действии
веществ судят по скорости прироста этого соотношения, определяемой с
помощью регрессионного анализа. Вещество, защищающее миокард от
ишемического повреждения, будет уменьшать коэффициент линейной
регрессии по сравнению с контрольной серией экспериментов.
8. В последние годы для оценки противоишемического действия
веществ широкое распространение получили эксперименты по изучению их
влияния на размер инфаркта миокарда у различных видов животных
(собаки, свиньи, крысы, мыши). Эксперименты проводятся как в условиях
постоянной, так и временной окклюзии с последующей реперфузией.
Некроз выявляют окрашиванием с помощью нитротетразолия синего, зону
риска — с помощью синьки Эванса (в опытах на мышах зона риска не
определяется). Рассчитывают отношение объема некроза к объему миокарда
всего левого желудочка и к величине зоны риска. Основным показателем
противоишемического действия вещества является уменьшение отношения
объема некроза к объему зоны риска по сравнению с контрольной серией
экспериментов.
9. Значительный интерес представляет модель коронарного спазма у
животных (крысы, кошки, собаки). Для создания ишемии животным внут-
рикоронарно или внутривенно вводят вещество, вызывающее спазм
коронарных артерий: метахолин, вазопрессин, дигидроэрготамин, эндотелии
(путь введения зависит от вещества). В этих условиях на ЭКГ в
стандартных отведениях или эпикардиальной электрограмме (кошки) возникнет
значительный подъем сегмента ST. Вещество, обладающее противоишеми-
ческим действием, будет уменьшать или предотвращать эти изменения
ЭКГ.
10. Для изучения противоишемического действия вещества может быть
применена модель коронарного микротромбоза у наркотизированных
кошек. Для создания тромбоза животным через катетер, введенный в ушко
левого предсердия, осуществляют постоянную инфузию АДФ. Тромбоз вы-
-441 -

зывает подъем сегмента ST на эпикардиальной электрограмме. Вещество,
обладающее противоишемическим действием, будет уменьшать или
предотвращать эти изменения эпикардиальной электрограммы.
Из предложенного комплекса различных моделей ишемии при
изучении противоишемического действия вещества в каждом конкретном
случае необходимо отобрать не менее 2—3 доступных для исследователя
моделей ишемии.
III этап. Исследование основных механизмов противоишемического
действия препарата
1. Исследование влияния отобранного вещества на системную
гемодинамику и функцию сердца в опытах на различных видах животных (крысы,
кошки, собаки) с открытой и закрытой грудной клеткой. Вещество
вводится внутривенно, внутрибрюшинно или per os. Регистрируется фазовый
аортальный кровоток в восходящей части дуги аорты с помощью
электромагнитного или ультразвукового метода исследования с определением:
частоты сокращении сердца, времени систолического выброса и диастоли-
ческого расслабления, систолического и сердечного выбросов, среднего
ускорения кровотока в аорте (показатель сократимости сердечной мышцы)
работы сердц. Одновременно производится измерение аортального
давления, центрального венозного давления.
2. Для оценки прямого влияния вещества на тонус коронарных и
периферических сосудов может быть использован общепринятый метод рези-
стографии.
3. Важную информацию о непосредственном влиянии вещества на
сократительную функцию сердечной мышцы дают опыты с регистрацией
инотропного эффекта на изолированной папиллярной мышце сердца
различных видов животных (крысы, морские свинки).
4. Изучение влияния вещества на перераспределение кровотока между
субэпи- и субэндокардиальными слоями миокарда, а также ишимизиро-
ванной и условно-интактными зонами сердечной мышцы.
4.1. Опыты на различных видах животных (кошки, собаки, свиньи) с
использованием таких известных методов исследования, как меченые
микросферы клиренс водорода.
4.2. В опытах на собаках использование метода одновременной
регистрации ретроградного коронарного кровотока и ретроградного перфузион-
ного давления в бассейне окклюзированной передней нисходящей ветви
левой коронарной артерии и коронарного кровотока в огибающей ветви
левой коронарной артерии, снабжающей кровью условно-интактные зоны
миокарда левого желудочка с помощью электромагнитного или
ультразвукового метода. По соотношению ретроградного коронарного кровотока и
кровотока в огибающей ветви левой коронарной артерии можно судить о
перераспределении кровотока под влиянием вещества между очагом
ишемии и условно-интактными зонами миокарда.
4.3. Эксперименты на собаках с использованием метода одновременной
регистрации с помощью ультразвуковой допплеровской техники кровотока
в венах, дренирующих кровь непосредственно из самого очага ишемии и
из всего левого желудочка сердца (v.magna). Оценка перераспределения
кровотока в миокарде производится по соотношению первого и второго
кровотока соответственно.
5. Изучение влияния вещества на коллатеральную гемодинамику и пе-
-442 -

рераспределение кровотока в сердечной мышце в условиях хронической
ишемии.
Эксперименты проводятся в два этапа. На первом у анестезированных
нембуталом собак производится постепенная (в течение 1 ч) полная
окклюзия передней нисходящей ветви левой коронарной артерии в средней ее
трети. Спустя 6—8 нед собаки берутся в острый опыт. О хорошо развитом
коллатеральном кровообращении в сердце в этих опытах свидетельствуют
высокое ретроградное перфузионное давление (оно составляет около 65 %
от среднего аортального) и значительно большая по сравнению с
экспериментом при острой ишемии абсолютная величина объемной скорости
ретроградного кровотока. Оценка кровоснабжения очага ишемии может
проводится одним из двух методов, описанных выше, по соотношению
ретроградного коронарного кровотока и кровотока в огибающей ветви левой
коронарной артерии или по соотношению кровотока в венах, дренирующих
кровь непосредственно из очага ишемии и всего левого желудочка
(v.magna).
6. Изучение воздействия препарата на различные стороны метаболизма
миокарда.
6.1. Определение в ишемизированном миокарде экспериментальных
животных (кошки, собаки, свиньи) in situ содержания макроэргических
фосфатов, неорганического фосфора, энергетического заряда, НАД,
НАДН, окислительно-восстановительного потенциала лактата, пирувата,
глюкозы, гликогена фосфолипидов, активности фосфофруктокиназы, гек-
сокиназы и др.
6.2. Опыты на изолированных сердцах экспериментальных животных
(крысы, морские свинки, кролики) в условиях нормоксии и гипоксии с
регистрацией показателей насосной и сократительной функций,
содержания некоторых метаболитов (лактат пируват, глюкоза, свободные жирные
кислоты) в перфузате. Изучение влияния препарата на эти показатели в
нормальных условиях и в условиях блокады некоторых путей метаболизма
(например, гликолиза восстановления цитохромов и др.).
6.3. Изучение влияния препарата на дыхание сердечной мышцы с
помощью метода Варбурга или на окислительное фосфорилирование в
изолированных митохондриях с расчетом дыхательного контроля.
7. Изучение действия препарата в опытах на изолированных
коронарных артериях, аорте воротной вене. Влияние на калиевую контрактуру
(расслабление позволяет предположить блокаду медленных кальциевых
каналов), а- и р-адренергические и холинергические реакции. Опыты на
сосудах с разрушенным эндотелием и в условиях блокады синтеза простаг-
ландинов.
8. Исследование влияния препарата на адренореактивные структуры
сердца. Опыты на изолированном сердце (лягушки, крысы, морские
свинки) или целом животном (крысы, кошки). Реакции на изопротеренол, нор-
адреналин. Контроль участия а- и р-адренергических структур во влиянии
препарата на сердце (регистрация деятельности сердца с использованием
стимуляторов и блокаторов адренергических структур).
9. Изучение влияния препарата на болевой компонент сосудистых
реакций. Острые опыты на кошках или крысах с регистрацией прессорных
реакций на раздражение большеберцового нерва, анализ влияния препарата
на рефлекторные ответы в симпатических нервах сердца.
10. Изучение влияние препарата на электрофизиологические свойства
различных тканей сердца. Регистрация спонтанной импульсации
изолированного венозного синуса лягушки. Микроэлектродные исследования на
- 443 -

пейсмекерных клетках синусного узла, волокнах Пуркинье и
сократительных кардиомиоцитах.
11. Изучение влияния препарата на морфологию интактного и ишеми-
зированного миокарда с использованием гистологических,
гистохимических авторадиографических и электронно-микроскопических методов
исследования.
12. Влияние препарата на реологические свойства крови. Исследование
агрегационной способности тромбоцитов, вязкости крови, коагуляцион-
ной активности тромбоцитов, проведение тромбоэластографии и электро-
коагулографии (общепринятые методы).
13. Изучение возможных антиаритмических свойств нового препарата.
Используются аконитиновая, хлоридкальциевая, адреналиновая модели
аритмий, модель фибрилляции желудочков у крыс, модель аритмий у
бодрствующих собак по Harris.
14. Изучение фармакокинетики нового препарата при различных путях
введения.
Приведенная программа поиска и доклинического изучения новых
препаратов с предполагаемым противоишемическим действием включает
большой комплекс исследований. В зависимости от результатов,
полученных при первичной оценке препарата, исследователь уделяет более
пристальное внимание отдельным методам исследований, наиболее важным
для определения спектра и механизма действия препарата. Чем тщательнее
проведено доклиническое изучение, тем легче сформулировать показания
к клиническому применению препарата. Информация, полученная в
условиях эксперимента, дает возможность сделать правильный подбор
больных, обеспечить оптимальные условия для выявления особенностей
действия препарата, наметить меры профилактики осложнений, подобрать
оптимальные дозы, способ применения и определить длительность курса
лечения.
Методические указания по изучению гипотензивной активности
фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: чл.-корр. РАМН, проф. В. И
Петров; д. м. н. О. С. Медведев; к. м. н. М. Ю.
Соломин; к. б. н. А. Н. Мурашев
Общие положения
Клиническая медицина требует широкого арсенала гипотензивных
препаратов, которые обладали бы оригинальными механизмами действия,
высокой эффективностью, минимальными побочными эффектами. Антиги-
пертензивный препарат может быть рекомендован для длительной терапии
или для купирования острых гипертензивньк состояний.
Антигипертензивный препарат для длительной терапии должен:
1. Снижать системное артериальное давление (АД) постепенно и
продолжительно при введении внутрь.
2. Снижать системное АД до нормального или близко к нормальному
- 444-

уровню, не вызывать ортостатическую гипотонию, не нарушать
адаптационных реакций сердечно-сосудистой системы.
3. Не вызывать привыкания и синдрома отмены после прекращения
приема препарата, т. е. не давать вторичного гипертензивного эффекта.
4. Не ухудшать кровоснабжение жизненноважных органов.
5. Не вызывать тахикардию, не ухудшать функциональные возможности
миокарда, не нарушать процессов срочной и долговременной адаптации
сердца к повышенной нагрузке.
6. Не снижать умственную и физическую работоспособность, не
вызывать нарушения настроения, процессов обучения, памяти, социальной
адаптации.
Для купирования острых гипертензивных состояний (гипертонических
кризов) лекарственный препарат должен:
1. Обладать высокой антигипертензивной активностью,
специфичностью действия на сердечно-сосудистую систему.
2. Приводить к быстрому, но нерезкому снижению системного АД.
Оказывать кратковременное гипотензивное действие.
3. Не вызывать тахифилаксии.
4. Не нарушать кровоснабжение жизненноважных органов, не
оказывать кардиотоксического действия.
ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ДОКЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
1-й ЭТАП — скрининг.
Задача: Выявление гипотензивной активности фармакологического
средства (ФС) и ее сопоставление с препаратом сравнения (эталоном).
2-й ЭТАП — углубленное изучение особенностей и возможного
механизма действия ФС.
Основные задачи:
1. Определение видовой чувствительности экспериментальных
животных к сосудистому действию ФС.
2. Оценка влияния ФС на базовые показатели центральной
гемодинамики.
3. Исследование влияния ФС на кровоснабжения жизненно важных
органов.
4. Изучение роли ЦНС в механизме гипотензивного действия ФС.
5. Изучение эффективности ФС при курсовом введении.
6. Определение влияния ФС на уровень катехоламинов и активность
ренина в плазме крови.
7. Выявление возможного негативного влияния на умственную
работоспособность, процессы поведения, обучения, памяти. Дополнительные
задачи.
1. Изучение влияния ФС на гладкие мышцы сосудов.
2. Сравнительное изучение действия ФС на тонус резистивных и
емкостных сосудов и приток крови к сердцу.
3. Изучение влияния на буферные сосудистые рефлексы в норме и в
условиях эмоционально-болевого воздействия.
4. Определение влияния на спонтанную и вызванную (стимуляцией
различных центральных структур) активность в преганглионарных и постганг-
лионарных волокнах симпатических нервов.
-445 -

1-й ЭТАП - СКРИНИНГ
Для реализации задачи необходимо решить, обладает ли ФС
гипотензивной активностью, будучи взятым в стандартной, заведомо большой
дозе. Для этого выполняются две серии по 3—4 опыта.
В первой серии опытов ФС вводится внутрь в дозе 50 мг/кг
бодрствующим крысам с экспериментальной наследственной гипертонией.
Предварительно животным вживляется полиэтиленовый катетер в бедренную или
сонную артерию для прямой регистрации АД. В течение 6 ч после
введения вещества регистрируются АД и частота сердцебиений. Для проведения
эксперимента требуются электроманометр с малым объемным смещением
(не более 0,01 мм/100 мм рт.ст.), кардиотахометр, запускаемый пульсовой
волной АД и двухканальный регистратор. ФС подвергается дальнейшему
изучению, если под его влиянием АД понижается на 25 мм рт.ст. или
более на период 2 ч или более.
В опытах второй серии — 3—4 эксперимента — ФС вводится в дозе 5
мг/кг внутривенно наркотизированным нормотензивным крысам. У
животных измеряется АД и частота сердцебиений. В связи с отсутствием
гипотензивного эффекта у нормотензивных животных при однократном
введении бета-адреноблокаторов и ингибиторов ангиотензин-конвертирую-
щего фермента протокол опыта включает введение стандартной дозы
изадрина и ангиотензина-П до и после введения исследуемого вещества.
ФС подвергается дальнейшему изучению, если оно приводит к снижению
АД на 25 мм рт.ст. и более или угнетает эффекты изадрина или ангиотен-
зина-I, даже в случае отсутствия заметного влияния на АД.
Далее необходимо попытаться получить предварительные данные о
механизме гипотензивного действия ФС, что позволит обоснованно подойти
к выбору препарата сравнения из большого набора применяемых в
клинике антигипертензивных препаратов.
Опыты второй ступени рационально выполнять на наркотизированных
кошках или собаках, у которых регистрируются следующие параметры:
АД, частота сердцебиений, ЭКГ, давление в полости левого желудочка,
первая производная левожелудочкового давления, конечно-диастолическое
давление в левом желудочке, тонус третьего века. Для анализа механизма
действия ФС с гипотензивной активностью предлагается проводить бо-
люсные внутривенные введения агониста альфа-1-адренорецепторов — ме-
затона, агониста бета-адренорецепторов — изадрина, симпатомиметика ти-
рамина, ангиотензина-I и ангиотензина-П. О влиянии исследуемого
соединения на ганглионарную проводимость можно судить по изменению
сократительных ответов мигательной перепонки (третьего века),
вызванных раздражением преганглионарных и постганглионарных волокон
шейного симпатического нерва. Возможные эффекты исследуемого
соединения на тестирующие воздействия позволяют обосновать выбор препарата
сравнения. Животное во время опыта обогревается, чтобы температура
тела его была в пределах 37—38 "С. В каждой лаборатории должны быть
подобраны стандартные дозы тестирующих препаратов (агонистов и
антагонистов различных рецепторов).
Предлагаемая схема эксперимента позволяет получить данные о
наличии гипотензивной активности ФС на новом виде животных по
отношению к первичным опытам на крысах и получить представление о его
влиянии на основные типы рецепторов, участвующих в регуляции
сердечно-сосудистой системы с минимально возможными трудозатратами.
В завершении скрининга необходимо получить ответы на следующие
- 446 -

вопросы: 1. Чему равны эквиэффективные дозы изучаемого ФС и
препарата сравнения — ЕД20, т. е. дозы, снижающие АД на 20 %; 2. Чему равна
доза ЛД50 для ФС и препарата сравнения?
Количественная оценка гипотензивной активности соединения и его
токсичности позволит его сравнить с препаратом сравнения по
терапевтическому индексу (ТИ). ТИ = ЛД 50 / ЕД 20.
Количественную оценку гипотензивной активности ФС (БД 20)
рекомендуется проводить в опытах на крысах с таким типом
экспериментальной гипертонии, которая наиболее чувствительна к действию соединений с
данным механизмом действия. Так, например, при изучении новых
ингибиторов ангиотензин-конвертирующего фермента желательно проводить
эксперименты на крысах с двухпочечной моделью гипертонии (сужение
одной почечной артерии и сохранение интактной второй почки), так как в
первые недели развития гипертонии у них повышена активность ренин-
ангиотензиновой системы. Большинство других соединений с
гипотензивной активностью может быть изучено на спонтанно-гипертензивных
крысах и крысах с ДОКА-солевой гипертонией. Гипотензивная активность
бета- адреноблокаторов с трудом выявляется в опытах с однократным
введением. При изучении ФС в опытах на бодрствующих животных
предпочтительнее использовать прямые методы измерения АД.
Острая суточная токсичность (ЛД 50) определяется на мышах и крысах
при тех же путях введения, которые могут быть рекомендованы для
клинических испытаний. Описание методов и расчетов приведено в книге М. Л.
Беленького "Элементы количественной оценки фармакологического
эффекта". — Л., 1963.
На основании экспериментов на этапе скрининга экспериментатор
имеет возможность сравнить новое ФС и адекватно выбранный препарат
сравнения по силе и длительности гипотензивного действия, по
терапевтической широте, получить предварительные представления о возможных
побочных эффектах и т. д. Результаты скрининговых исследований
должны дать ответ на вопрос: имеет ли новое соединение преимущества перед
уже известным и используемым в клинике препаратом со сходным
механизмом действия? В случае положительного ответа необходимо переходить
ко второму этапу доклинических исследований вещества.
2-й ЭТАП - УГЛУБЛЕННОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ
И МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ НОВОГО ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО
СРЕДСТВА
1. Определение видовой чувствительности экспериментальных
животных к сосудистому действию ФС.
Исследования проводятся на двух—трех видах животных: крысы,
кошки, кролики, собаки, морские свинки и др. (желательно два ввда грызунов
и один вид животных, не относящихся к грызунам) при введении веществ,
обладающих отчетливой гипотензивной активностью. ФС вводится в
эффективной дозе (ранее определена при изучении зависимости
доза—эффект) 3—4 животным. Одинаково выраженное гипотензивное действие ФС
в опытах на животных разных видов повышает вероятность перенесения
экспериментальных данных по гипотензивной активности ФС на человека.
2. Изучение влияния ФС на основные показатели центральной
гемодинамики.
Экспериментальные животные — крысы 180—250 г, кошки 2—4 кг, кро-
- 447-

лики 2,5—5 кг, собаки 10—25 кг. Наркоз — нембутал 50 мг/кг или уретан с
хлоралозой соответственно 600 и 40 мг/кг. САД измеряется
электроманометром или ртутным манометром Людвига в общей сонной артерии или в
бедренной артерии.
МОК определяется методом термодилюции, тетраполярной реографии,
электромагнитной или ультразвуковой флоуметрии.
Электромагнитная и ультразвуковая флоуметрия требует
соответствующего оснащения, перехода животного на искусственное дыхание и
сложных хирургических манипуляций — вскрытие грудной клетки, выделение
восходящей части аорты, наложение датчика на нее и др. Достоинством
этого метода определения МОК является: а) возможность непрерывного
наблюдения за динамикой сердечного выброса; б) возможность
регистрации первой производной сигнала кровотока в аорте, по которой можно
судить о контрактильности левого желудочка.
Для регистрации МОК пригоден хорошо апробированный метод
термодилюции, который подробно описан в литературе и дающий достоверные
данные о величине сердечного выброса. Недостатком метода является
дискретность определения показателей МОК.
В ходе опыта может регистрироваться ЭКГ. Величина ОПС (лучше
рассчитывать удельное периферическое сопротивление) оценивается по
формуле: УПС = АД/МОК кг массы животного. В фармакологическом
эксперименте нас интересует не абсолютная величина показателей
кровообращения, а их динамика после введения исследуемого препарата по
сравнению с исходными величинами.
Эти исследования имеют важное значение для понимания гемодинами-
ческого механизма гипотензивного действия препарата, для прогноза его
возможного дальнейшего применения в клинической практике и
определения более рациональных путей к дальнейшему его углубленному
изучению.
3. Изучение влияния ФС на кровоснабжение жизненноважных органов:
мозг, сердце, почки.
В опытах данной серии важно оценить влияние ФС на объемную
скорость кровотока в жизненноважных органах. Для этого необходимо
использовать любой из методов определения кровотока — ультразвуковую
или электромагнитную флоуметрию, капельные измерители венозного
оттока.
Одним из наиболее удобных и информативных является метод с
использованием меченых изотопами микросфер [Медведев О. С. и др., 1983],
позволяющий определить объемную скорость кровотока в любом органе
или ткани.
О негативном влиянии нового вещества на коронарное
кровообращение, очевидно, можно судить по изменению сегмента ST на
множественных ЭКГ сердца, записанных в норме и при временной ишемии миокарда
до и после введения.
4. Оценка центрального компонента в механизме гипотензивного
действия ФС. Для оценки центрального компонента в действии ФС могут быть
использованы достаточно простые методы. К ним относится изучение
изменений АД под влиянием вещества у спинальных животных или
животных с разрушенным мозгом. Электрическая сгимуляция преганглионарных
симпатических волокон у животных с разрушенным мозгом
осуществляется с помощью спицы из нержавеющей стали, вставленной в
спинномозговой канал. Неизолированный участок спицы-электрода может быть
установлен на любом уровне канала для избирательной стимуляции сосуди-
- 448 -

стых (уровень нижних грудных и верхних поясничных сегментов) или
сердечных (уровень верхних грудных сегментов) симпатических волокон.
Отсутствие влияния изучаемого ФС на фоновый уровень давления и прессор-
ные реакции, вызванные электрической стимуляцией, у животных с
разрушенным мозгом позволяет думать о центральном механизме
гипотензивного действия. Убедительные данные о наличии или отсутствии
центрального гипотензивного действия вещества могут быть получены в опытах с
введением соединения внутривенно и в позвоночную артерию. Если
одинаковое снижение АД может быть вызвано введением малой дозы ФС
внутриартериально или значительно большей дозы — внутривенно, то это
говорит о наличии центрального механизма в развитии гипотензивного
эффекта
5. Изучение эффективности ФС при курсовом введении.
Опыты проводятся на животных (крысах, кроликах, собаках) с
экспериментальной гипертонией. Периодически измерение АД может
производиться с использованием непрямых методов.
6. Изучение влияния ФС на уровень катехоламинов и активность
ренина в плазме крови.
Для ответа на вопрос о нейро-гормональных сдвигах в организме
экспериментальных животных, которые могут возникать под влиянием ФС, нет
необходимости проводить специальные эксперименты. Кровь для
биохимического определения ренина и катехоламинов может быть забрана у
животных , используемых в других сериях опытов.
Предлагаемый комплекс методов позволяет ответить на все вопросы,
поставленные перед фармакологом на 2-м этапе доклинических
испытаний нового вещества и является достаточным для оценки специфической
активности новых антигипертензивных препаратов. Все эксперименты 2-го
этапа испытаний должны проводиться в одинаковом объеме для нового
соединения и препарата сравнения.
7. Выявление возможного негативного влияния изучаемого ФС на
умственную работоспособность, процессы поведения, обучения, памяти.
7.1. Изучение влияния ФС на ориентировочно-исследовательскую
(эмоционально-двигательную) активность в тесте "открытое поле" [Воронина
Т. А., Середенин С. Б., 1998].
По наблюдаемым элементам поведения можно оценить состояние
двигательной, исследовательской и эмоциональной сферы животного. В
предлагаемой модификации теста оценивают время выхода из центра
(латентный период ориентации животного), число исследованных квадратов
(горизонтальная двигательная активность), число стоек (исследовательская
активность), число умываний и вычесываний различного типа груминг
(комфортность), а также число актов дефекации и мочеиспускания
(эмоциональность и эмоциональная тревожность). Оценивая данные
показатели, можно выявить центральные (психотропные) эффекты исследуемого
ФС.
Дополнением к данной методике для выявления влияния исследуемых
ФС на элементы обучаемости и памяти служат методы 7.2.1 и 7.2.2
[Воронина Т. А., Островская Р. У.,1998].
7.2. Изучение влияния ФС на обучаемость и память.
7.2.1. Пассивное избегание с отрицательным (болевым)
подкреплением (УРПИ). Регистрируют долю животных, не избегающих светлой
камеры, латентный период выхода из темной камеры при первом
предъявлении, латентный период захода в темную камеру через 24, 48 ч после
обучения.
15 - 762
-449 -

7.2.2. Активное избегание с отрицательным (болевым) подкреплением
(УРАИ).
Регистрируют среднее количество правильных ответов в зависимости от
числа предъявлений, число животных, достигших критерия обучаемости
при данном числе испытаний, среднее значение болевого порога, среднее
число межсигнальных реакций, процент ошибочных ответов при
исследовании памяти, скорость угасания навыка.
Анализ результатов по методам 7.1 и 7.2 позволяет выявить наличие в
спектре фармакологического действия изучаемого ФС положительного или
отрицательного эффекта на функции ЦНС, что может иметь существенное
значение для определения его перспективности в качестве потенциального
антигипертензивного средства.
При изучении ФС могут быть случаи, когда по механизму действия
новое соединение не похоже ни на одно из классических гипотензивных
средств, предлагаемых в качестве препарата сравнения. В таком случае
экспериментатору предлагается провести дополнительные исследования с
целью более полной характеристики препарата. К дополнительным
методам исследования могут быть отнесены следующие.
1. Изучение влияния ФС на гладкие мышцы сосудов.
Исследование может проводиться на изолированных сосудах с
использованием для анализа блокаторов альфа- и бета-адренорецепторов.
Удобной также является модель бариевого спазма изолированного
отрезка тонкого кишечника. Спазмолитическая активность препарата
указывает на его прямое миотропное действие.
Миотропные свойства вещества могут быть изучены в опытах на
изолированном перфузируемом ухе кролика (по Н. В. Кравкову — С. А.
Писемскому). Перфузию проводят при комнатной температуре 20—23 °С.
Оценивают эффект изучаемого ФС на исходный сосудистый тонус и на прессор-
ные реакции, вызванные норадреналином, ангиотензином-П, эфедрином.
Используя известные блокаторы гистаминовых, альфа- и
бета-адренорецепторов, серотониновых, ангиотензиновых рецепторов, определяют
антагонист сосудорасширяющего действия изучаемого вещества.
2. Сравнительное изучение действия ФС на тонус резистивных и
емкостных сосудов, на приток крови к сердцу.
В физиологической литературе признается значительная роль
емкостных сосудов в формировании притока крови к сердцу и динамики
сердечного выброса [Ткаченко Б. И., 1974]. В последнее время показано, что
емкостные сосуды играют важную роль в становлении гипертонической
болезни; в частности, повышение тонуса емкостных сосудов в начальной
стадии гипертонии ведет к увеличению притока крови к сердцу и
повышению сердечного выброса.
Несмотря на важную функцию емкостного отдела в физиологии и
патологии системы кровообращения, до сих пор мало изучено действие вазоак-
тивных веществ на тонус венозных сосудов.
Методы исследования тонуса аккумулирующих сосудов у животных
описаны Б. И. Ткаченко и Г. В. Чернявской (1976). Авторы подчеркивают,
что основным параметром венозного отдела сосудистой системы является
не венозное давление, которое не может характеризовать ни емкостной
функции этих сосудов, ни активности их гладкомышечных образований, а
объем крови, что и определяет необходимость изучения кровенаполнения
венозных сосудов. Метод аккумулографии, предложенный Д. П.
Дворецким (1967), позволяет одновременно судить об изменении тонуса
резистивных и емкостных сосудов.
-450-

3. Изучение влияния на буферные сосудистые рефлексы в норме и в
условиях эмоционально-болевого воздействия.
В поддержании нормального уровня системного АД важную роль
играют буферные синокаротидные и артериальные рефлексы. Данные о
влиянии вещества на функционирование прессорных и депрессорных каротид-
ных рефлексов имеют теоретическое и практическое значение.
Опыты могут выполняться на наркотизированных животных (прессор-
ный и депрессорный рефлекс в этих опытах воспроизводится обычным
путем) и на животных в свободном поведении.
У животных в свободном поведении прессорный рефлекс можно
получить кратковременным пережатием общей сонной артерии окклюдером
любой конструкции. Большие трудности представляет воспроизведение де-
прессорного рефлекса. С этой целью используют лишь кардиохроно-
тропный компонент барорефлекса при повышении АД на 30—40 мм рт.
ст., вызванном введением мезатона или норадреналина.
4. Влияние ФС на спонтанную и вызванную стимуляцией центральных
структур или различных афферентов активность в преганглионарных
(белая соединительная веточка) и постганглионарных (почечный и
нижнесердечный нервы) волокнах симпатических нервов.
Опыты проводятся на наркотизированных животных с интактным
мозгом, децеребрированных (межколликулярная перевязка) и спинальных
(пересечение спинного мозга по С1 или С8) кошках. Спонтанная и вызванная
активность в пре- и постганглионарных волокнах регистрируется обычным
способом, описанным в работе В. А. Цырлина (1974). Сосудистые прессор-
ные и депрессорные реакции АД и электрофизиологические ответы в
соответствующих нервах вызываются прямой и рефлекторной активацией
продолговатого и спинного мозга.
Заключение
Рекомендованный комплекс мероприятий позволяет выявить ФС,
которые по спектру и характеру своего действия могут быть предложены для
клинических испытаний в качестве антигипертензивных средств.
Вместе с тем нужно иметь в виду, что в процессе доклинического
изучения нового ФС может возникнуть необходимость проведения
дополнительных исследований, направленных на более детальное изучение
механизмов действия, имеющих важное значение для оптимизации
клинического применения каждого из предложенных веществ. В данном случае
перечень дополнительных методов исследования ФС может быть столь
обширным, что экспериментатор должен сам решить, какие методы самые
информативные с учетом специфических особенностей каждого соединения.
Список литературы
1. Алмазов В. А., Цырлин В. А., Шляхто Р. В., Маслова Н. П. Ангигипертензивные
препараты. — Л., 1997.
2. Арабидзе Г. Г., Белоусов Ю. Б., Варакин Ю. Я. Диагностика и лечение артериальной
гипертонии: Методические рекомендации. — М, 1997.
3. Вальдман А. В., Козловская М. М., Медведев О. С. Фармакологическая регуляция
эмоционального стресса. — М., 1979.
4. Воронина Т. А., Середенин С. Б. Экспериментальное изучение препаратов с
транквилизирующим (анксилитическим) действием // Ведомости Фармакологического
комитета. — 1998. — № 2. — С. 19—24.
15*
-451 -

5. Воронина Т. А., Островская Р. У. Экспериментальное изучение препаратов с ноо-
тропным типом действия // Ведомости Фармакологического комитета. — 1998. —
№ 2. - С. 25-31.
6. Дворецкий Д. П. Регуляторные взаимоотношения сосудов малого и большого кругов
кровообращения: Дисс. ... канд. мед. наук. — Л., 1967.
7. Доклад научной группы ВОЗ. Принципы оценки лекарственных средств,
применяемых в медицине. Серия технических докладов ВОЗ. — 1997. — № 563.
8. Доклад комитета экспертов ВОЗ. Борьба с артериальной гипертензией. — М., 1997.
9. Зубарев А. Р., Григорян А. Р. Ультразвуковое ангиосканирование. — М., 1991.
10. Кушаковский М. С. Гипертоническая болезнь и вторичные артериальные гипертен-
зии. - М, 1982.
11. Медведев О. С, Южаков С. Д., Машковкий М. Д. и др. Влияние атенолола и пропра-
нолола на системную и региональную гемодинамику // Бюлл. экспер. биол. и мед. —
1983. - № 7. - С. 59-61.
12. Петров В. И., Недогода С. В., Тихонов В. П. Гипертоническая болезнь. — Волгоград,
1997.
13. Ткаченко Б. М. Венозное кровообращение. — Л., 1974.
14. Ткаченко Б. М., Чернявская Г. В. Изучение емкостных сосудов. — В кн.: Методы
исследования кровообращения. — Л., 1976. — С. 4—78.
15. Чазов Е. И. Пути поиска фармакологически активных веществ для лечения
больных с заболеваниями сердца и сосудов. — В кн.: Целенаправленный поиск новых
сердечно-сосудистых препаратов. — Рига, 1980. — С. 5—19.
Методические указания по изучению гиполипидемического
и антиатеросклеротического действия фармакологических
веществ
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. «., проф. В. Е. Рыжен-
ков; д. м. н., проф. О. В. Ремезова; д. б. н.
В. Г. Макаров.
Введение
Многочисленные экспериментальные, клинические и
эпидемиологические исследования позволили выделить главные факторы риска (ФР)
развития атеросклероза и его осложнений — ишемической болезни сердца
(ИБС), поражений артерий головного мозга и нижних конечностей — как
наиболее частых причин инвалидизации и смертности населения в
экономически развитых странах, в том числе в России. Среди них — нарушения
липидного и липопротеинового (ЛП) обменов (дислипопротеидемии ате-
рогенного характера). При этом наиболее существенным является
увеличение в крови атерогенных липопротеидов: а) ЛП низкой плотности (ЛПНП
или бета-ЛП), отражающееся в нарастании общего холестерина (ХС) в
крови и в этом классе ЛП, б) липопротеиды очень низкой плотности
(ЛПОНП или пребета-ЛП), отражающиеся в увеличении триацилглицери-
дов (ТГ) в крови, в) особого липопротеида (ЛПа), липидный состав
которого близок ЛПНП, но его апобелок представляет собой гликопротеин,
напоминающий плазминоген, что способствует атеротромботическому
поражению артерий. Второй важной причиной, способствующей атерогенезу,
является снижение в крови антиатерогенных липопротеидов высокой
плотности (ЛПВП или альфа-ЛП), отражающееся в уменьшении содержа-
-452-

ния ХС этого класса ЛП (альфа-ХС). Кроме того, установлено, что
высокая атерогенность ЛПНП связана с их окислением, которое происходит
главным образом в метаболически нарушенной артериальной стенке.
Развитие дислипопротеидемии атерогенного характера обусловлено
действием многочисленных неблагоприятных факторов среды,
сопутствующими заболеваниями, наследственной предрасположенностью. Одна из
важных причин — нарушения функционального состояния печени, которая
играет ключевую роль в обмене липидов и ЛП, в ней синтезируются ХС,
ТГ, насцентные (до конца не сформированные) ЛПВП, ЛПОНП, желчные
кислоты, а также аполипопротеины. В печени сосредоточено около 70 %
рецепторов, акцептирующих атерогенные ЛП (апо В, Е-рецепторы) и
только в ней имеется ферментная система деградации ХС (7 альфа-гидроксила-
за ХС).
На коррекцию названных нарушений направлено действие гиполипиде-
мических средств. Особенно благоприятным считается эффект гиполипи-
демического препарата, если наряду со снижением повышенного уровня
общего ХС и/или ХС ЛПНП наблюдается уменьшение пероксидации
последних, увеличение сниженного содержания ХСЛПВП (нарастание
альфа-ХС), а также нормализация функции печени.
Применение гиполипидемических средств необходимо и при таких
заболеваниях, как сахарный диабет и гипотиреоз, при метаболическом
синдроме, а также при трансплантации органов и коронарном шунтировании,
так как в этих случаях развивается дислипопротеидемия атерогенного
характера, значительно утяжеляющая течение основного заболевания и
послеоперационного периода, а при сахарном диабете выступающая в
качестве одной из причин большой смертности от осложнений атеросклероза.
В инициации атерогенеза большое значение имеют первичные
метаболические нарушения артериальной стенки, приводящие к увеличению ее
проницаемости для компонентов крови, в том числе для атерогенных
ЛП, а также способствующие экспрессии адгезивных, провоспалитель-
ных, ростовых и других повреждающих факторов. При этом снижается
синтез таких защитных субстанций, как простациклин, азота оксид, гепа-
ран сульфат, фибринолитические факторы и ряд других. В то же время
увеличивается образование повреждающих молекул — тромбоксана А2,
эндотелина, протеина-1 (моноцитарного хемоаттрактанта), фактора
свертываемости крови Виллебранда, а также супероксидных радикалов.
Происходит глубокое окисление ЛПНП (окЛПНП), активация проникших в
артериальную систему моноцитов/макрофагов, которые взаимодействуют
с окЛПНП посредством неспецифических, ненасыщаемых скэвенджер-
рецепторов ("уборщиков мусора"), что приводит к образованию пенистых
клеток, переполненных липидами (в основном эфирами ХС) —
предшественников атеросклеротической бляшки. Большая роль в атерогенезе
отводится экспрессии в артериальной стенке ядерного фактора
транскрипции каппа В (NF-кВ), который индуцирует образование провоспа-
лительных факторов — цитокинов, циклооксигеназ и других
повреждающих молекул.
Кроме неспецифического взаимодействия окЛПНП с макрофагами, в
артериальной стенке они связываются и со специфическим экспрессиро-
ванным лектиноподобным рецептором для этих ЛП (LOX-1), что также
способствует образованию адгезивных, провоспалительных и ряда других
названных выше повреждающих молекул.
Эти механизмы атерогенеза обусловливают поиск средств,
препятствующих метаболическим нарушениям артериальной стенки, способных инги-
-453-

течение нескольких дней перед применением агента, индуцирующего
развитие названных нарушений. Кроме того, считается профилактическим
действием в случаях одновременного применения изучаемого нового
вещества с агентом, приводящим к развитию нарушений липидного обмена и/
или атеросклероза (например, атерогенной диеты).
Лечебным действием изучаемого препарата является его способность
снижать уже развившуюся гиперлипидемию или оказывать регрессию
сформировавшегося атеросклеротического поражения артерий. В этом
случае изучаемое новое соединение начинают вводить после развития
названных патологий.
Особенностью изучения специфической гиполипидемической
активности новых веществ является обязательное пероральное их введение
животным, так как препараты этой группы применяются, как правило, пер-
орально. В случае исследования активности готовой лекарственной формы
нового соединения, например таблеток, учитывается содержание
действующего начала, а также количество и состав вспомогательных веществ.
Последние вводятся контрольной группе животных в количестве,
соответствующем введению их опытной группе в состав таблеток. Последние
измельчаются до порошка и вводятся в состав диеты или через зонд в
желудок. По окончании опытов мелких лабораторных животных забивают дека-
питацией, кроликов — под наркозом путем воздушной эмболии.
Определение содержания основных липидов — общего ХС, а-ХС, ТГ в
сыворотке крови, общего ХС и ТГ в печени, общего ХС в ткани аорты
проводится после экстракции их органическими растворителями с
помощью общепринятых, описанных в литературе методов. При возможности
используются автоматизированные методы. Можно рекомендовать
применение стандартизированных наборов, имеющихся в продаже, для
определения общего ХС, а-ХС, ТГ. Изучение спектра ЛП сыворотки крови
проводится описанными в литературе методами — электрофорезом
сыворотки крови в полиакриламидном геле или на бумаге, ультрацентрафуги-
рованием ее в соответствующем градиенте плотности калия бромида.
Ориентировочно можно использовать метод осаждения суммарной фракции
ЛПНП + ЛПОНП из сыворотки крови гепарином в присутствии Мп2+,
причем после центрифугирования в супернатанте остаются ЛПВП.
Определение в этих фракциях ХС позволяет дифференцировать его содержание
в атерогенных (апо В-содержащих) ЛП и в антиатерогенных ЛПВП (а-
ХС). Эта процедура позволяет определить и степень пероксидации
атерогенных и антиатерогенных ЛП путем изучения содержания окисленных
продуктов в соответствующих фракциях. Последнее имеет значение для
дополнительной характеристики спектра действия нового препарата с
выявленной гиполипидемической активностью.
1. Изучение гиполипидемической активности новых веществ в опытах
на крысах
Для индуцирования гиперлипидемии у крыс применяют несколько
способов.
1. С целью скрининга гиполипидемической активности новых
соединений применяют поверхностно-активные вещества (например, внутрибрю-
шинное введение тритона WR-1339, Твина-80), что приводит к быстрому
(через 8—10 ч) увеличению уровня липидов в крови (особенно ТГ) и
снижению а-ХС. Масса тела животных должна быть 220—250 г, так как у мо-
-455-

лодых животных гиперлипидемия трудно воспроизводится этим способом.
Исследуемые вещества вводят перорально, одновременно с тритоном или
предварительно, в течение 6—10 дней. Предварительное введение
изучаемых веществ, особенно природного происхождения, направлено на
насыщение ими ряда органов и тканей, связанных с метаболизмом липидов —
печени, жировой ткани. Это широко используется в случаях однократного
применения агента, индуцирующего развитие гиперлипидемии. Кровь
получают у голодавших (время действия тритона) животных. В сыворотке
крови определяют содержание общего ХС, ос-ХС, ТГ, в печени — ХС и ТГ.
2. Одним из широко применяемых способов индуцирования
гиперлипидемии у крыс является длительное (2—3 нед) применение диеты,
содержащей ХС (2,5 %), метилтиоурацил (0,12 %) и 30 % растительного масла,
предварительно прогретого при высокой температуре и охлажденного. Иногда в
диету добавляют витамин D2, способствующий липидозу аорты. Обычно
масса тела животных составляет 150—180 г. Сроки применения гиперлипи-
демической диеты могут варьировать в зависимости от изменений состава
ингредиентов. Животных забивают через 14—18 ч голодания. Этот срок
необходим для исключения возможности влияния диеты на содержание
липидов (особенно ТГ) в крови. Данная модель гиперлипидемии варьирует как
по соотношению ингредиентов в диете, так и по длительности ее
применения. Изучают содержание липидов и ЛП в сыворотке крови и липидов в
печени, ХС в ткани аорты, а также степень пероксидации ЛПНП.
3. Гипертриглицеридемию у крыс индуцируют однократным введение
этанола (9 г/кг массы тела) в виде 30—40 % раствора перорально через
зонд. Исследуемые вещества животные получают в течение 6—10 дней до
введения этанола и за 20—30 мин перед его введением. Через 6—8 ч
животных забивают и определяют содержание липидов в сыворотке крови и в
печени.
В литературе описаны и другие подходы к моделированию нарушений
липидного и липопротеинового обменов у крыс для оценки
эффективности новых веществ. Иногда изучают возможную активность соединений на
интактных животных.
2. Оценка эффективности новых веществ в опытах на морских свинках
В эксперименте используются самцы животных с массой тела 300—400 г,
которым вводят 2 мл смеси ХС (0,5 г/кг) с жирами (свиной жир и
предварительно прогретое подсолнечное масло в соотношении 4:1) через зонд в
ротовую полость. Продолжительность опыта 16—18 дней. Животных забивают
под наркозом декапитацией после 12—14-часового голодания. Содержание
липидов определяют в сыворотке крови и печени, ЛП — в сыворотке крови.
Кроме того, определяют степень пероксидации ЛПНП. У морских свинок, в
отличие от крыс и кроликов, содержание ос-ХС в сыворотке крови очень
низкое, и его трудно определить существующими методами.
3. Исследование гиполипидемического и антиатеросклеротического действия
новых веществ в опытах на кроликах
Для изучения влияния новых соединений на липидный и ЛП состав
крови в условиях гиперлипидемии, а также антиатеросклеротическое их
действие необходимо проведение опытов на кроликах с исходной массой
-456-

тела 2,8—3 кг, которым длительно (3—4 мес) вводится ХС (0,2—0,3 г/кг) с
пищей или в виде раствора в подсолнечном масле через зонд в желудок. В
этих условиях, кроме выраженной гиперхолестеринемии и накопления
атерогенных ЛП в крови, снижается содержание антиатерогенных ЛПВП.
Происходит также увеличение содержания ХС и ТГ в печени и ХС в
артериях (в частности, в аорте). Кроме того, развивается атеросклеротическое
поражение аорты (методом планиметрии регистрируется до 40—50 %
площади аорты, пораженной атеросклеротическими бляшками).
Данная модель гиперлипидемии и атеросклероза у кроликов,
разработанная и описанная впервые академиком Н. И. Аничковым и сотр.,
широко применяется до настоящего времени при изучении гиполипидеми-
ческого и антиатеросклеротического действия новых фармакологических
веществ. Эти вещества вводятся на протяжении того же периода
времени, что и ХС. Выясняется их влияние на содержание общего ХС, ос-ХС,
ТГ в сыворотке крови животных; на содержание ХС в аорте, липидов в
печени и оценивается степень атеросклеротического поражения аорты.
Кроме того, методом электрофореза сыворотки крови в полиакриламид-
ном геле (или бумаге, целлюлозе) изучается влияние новых веществ на
спектр ЛП. Желательно выделение фракций ЛП
ультрацентрифугированием в градиенте плотности и изучение их липидного и белкового
состава.
При испытании фармакологического вещества на кроликах количество
животных в контрольной и опытной группах должно быть не менее десяти.
Это объясняется значительным индивидуальным разбросом липидных
показателей у этих животных, а также наличием среди них особей,
устойчивых к развитию экспериментальной гиперлипидемии и атеросклероза.
Последние по мере выявления должны из исследования исключаться. Для
сравнительного изучения активности нового соединения с известным
выделяется дополнительная группа кроликов. Кроме того, необходимо
выделить контрольную группу (интактные кролики). Желательно изучить
действие нового препарата на липиды крови у интактных кроликов, т. е.
ввести еще одну группу животных. Кровь для исследования берется у
кроликов через 12—18 ч голодания.
В случае если под влиянием изучаемого вещества будет установлена та
или иная степень атеросклеротического поражения аорты кроликов без
существенного влияния на выраженность гиперлипидемии, то данное
вещество, вероятно, может снижать ее проницаемость для атерогенных ЛП,
т. е. быть похожим по механизму действия на перидинолкарбамат (про-
дектин, пармидин). В зависимости от структурных особенностей
исследуемого вещества уменьшение проницаемости аорты для атерогенных
ЛП может быть обусловлено и его взаимодействием с атерогенными ЛП
(образование комплекса, как это установлено при введении гепарина и
структурно близких ему сульфатированных полисахаридов) или
влиянием на метаболизм артериальной стенки и другими механизмами. Отсюда
вытекает необходимость изучения механизма действия подобных
соединений с применением соответствующих методик, сравнение их гиполи-
пидемической и антиатеросклеротической активности с известными
препаратами.
Изучение механизмов действия новых эффективных веществ,
оказывающих нормализующее влияние на нарушенный липидный и ЛП обмен и
на развитие атеросклероза, способствует выяснению причин и условий
этих нарушений, а также расширению показаний к их применению и
созданию соединений с дифференцированным действием.
-457 -

4. Изучение механизма действия новых веществ с гиполипидемическим
и антиатеросклеротическим действием
Для этих целей требуется проведение опытов in vitro и in vivo. Известно,
что липолиз и липогенез в жировой ткани играют важную роль в липид-
ном обмене, и угнетение липолиза является существенным в механизме
гиполипидемического действия некоторых известных препаратов
(например, никотиновой кислоты). В этой связи необходимо изучение липолиза в
жировой ткани.
4.1. Изучение действия исследуемого вещества на липолиз в жировой
ткани в опытах in vitro (желательное исследование). В этих опытах
используется жировая ткань или жировые клетки придатка яичника взрослых
крыс-самцов, которые инкубируются в специальной среде. Исследуемые
вещества добавляются в среду инкубации в разных концентрациях в
зависимости от их химического строения. По интенсивности выделения в
среду инкубации неэстерифицированных жирных кислот (НЭЖК) или
глицерина оценивается влияние нового вещества на липолиз. В качестве
препарата сравнения применяется никотиновая кислота.
4.2. Изучение влияния нового вещества на концентрацию НЭЖК в
крови. Концентрация НЭЖК в крови может служить отражением
интенсивности липолиза в жировой ткани. В опыт берутся крысы-самцы (170—200 г),
которым для стимуляции липолиза в жировой ткани вводится внутрибрю-
шинно адреналин (1,0—1,5 мг/кг). Через 30 мин после инъекции
адреналина определяется уровень НЭЖК в плазме (сыворотке) крови.
Испытуемые вещества вводятся перорально однократно за 1—2 ч до инъекции
адреналина или предварительно в течение 3—5 дней (последнее введение —
за 1—2 ч до инъекции адреналина). Учитывая дифференцированный
характер аденилциклазных систем в жировой ткани желательно
дополнительно исследовать влияние новых веществ на липолиз, вызванный
введением адренокортикотропного гормона (АКТГ) и теофиллина.
4.3. Изучение связывания желчных кислот. Известно, что гиполипиде-
мическое действие желчных секвестрантов осуществляется путем
связывания в кишечнике желчных кислот (продуктов деградации ХС в печени) и
выведения их из организма. Для определения способности нового
соединения связывать желчные кислоты проводятся опыты in vitro. К 2 мл 4 %
водного раствора соли желчной кислоты (холата, гликохолата или таурохо-
лата натрия) добавляется 100 мг испытуемого вещества, растворенного или
суспендированного в 1 мл дистиллированной воды. После встряхивания в
течение 15 мин и центрифугирования в супернатанте определяют
количество соли желчной кислоты, не связанной изучаемым соединением.
4.4. Изучение связывания нового вещества с атерогенными липопротеи-
дами. Известно, что гепарин и некоторые полярные полисахариды
обладают способностью образовывать с атерогенными ЛП растворимые и
нерастворимые комплексы, не проникающие в артериальную стенку. Если в
процессе исследования специфической активности нового вещества
возникает предположение о наличии у него способности связывать атерогенные
ЛП, то желательно проведение соответствующих опытов in vitro. Для этих
целей используется сыворотка крови гиперлипидемических животных или
человека. К 0,2 мл сыворотки добавляется 2 мл 0,025 М раствора кальция
хлорида. Исследуемое вещество (и для сравнения гепарин) вводятся в
равных концентрациях (до 1 %). Кроме того, как желательное исследование
рекомендуется проведение опытов с применением выделенных
ультрацентрифугированием ЛПНП (человека или животных). Раствор последних на-
-458-

сыщают аммониевой солью 8-анилино-1-нафтолсульфонатом, обладающей
способностью к флуоресценции. К раствору добавляют изучаемое
вещество и по степени уменьшения флуоресценции судят об интенсивности
связывания его с ЛПНП. В качестве сравниваемого соединения используется
гепарин.
4.5. Ускорению развития атеросклероза способствует накопление пере-
кисных продуктов как в крови, так и особенно в атерогенных (апо-В-со-
держащих) ЛП, в основном в ЛПНП. Антиатеросклеротическое действие
официнального препарата пробукола во многом объясняется антиокси-
дантными его свойствами. В связи с этим можно рекомендовать изучение
новых веществ на показатели ПОЛ (диеновые конъюгаты, малоновый ди-
альдегид, флуоресцирующие продукты ПОЛ) как в сыворотке крови, так и
в атерогенных Л П. Содержание продуктов ПОЛ увеличивается в условиях
экспериментальной гиперлипидемии и дислипопротеидемии. Выделение
апо-В-содержащих ЛП проводится с помощью описанных в литературе
методов — ультрацентрифугированием или путем связывания и осаждения
их из сыворотки крови гепарином в присутствии Мп2+.
4.6. Изучение влияния новых соединений на активность
постгепариновой липолитической активности крови (липопротеидлипазы) (желательное
исследование). Если при исследовании нового вещества будет обнаружено
выраженное снижение ТГ и ЛПОНП в крови животных, то для выяснения
механизма его действия желательно изучить влияние препарата на липоли-
тическую активность (липопротеидлипазу) крови, поскольку последняя
стимулирует гидролиз ЛП, богатых ТГ. Для этих целей используются
крысы-самцы (200—250 г) или кролики-самцы (2,5—3 кг), которым
предварительно перорально вводится изучаемое соединение (однократно или в
течение недели), затем внутривенно гепарин (20—50 ед/кг массы тела).
Берут исходную пробу крови и пробу через 10 мин после введения гепарина.
В этих пробах крови определяют активность липопротеидлипазы
(постгепариновую липолитическую активность крови). В контрольных опытах
вводится равный объем растворителя изучаемого вещества.
4.7. Для характеристики механизма гиполипидемического действия
нового соединения исследуется, по возможности, его влияние на ключевой
фермент биосинтеза ХС-гидрокси-метилглутарил-коэнзим-А-редуктазу, а
также на 7-а-гидроксилазу ХС в печени с использованием
соответствующих методик, описанных в литературе.
4.8. Изучение влияния нового соединения на экскрецию желчных
кислот и холестерина. При исследовании механизма гиполипидемического
действия нового вещества со способностью к связыванию желчных кислот
в кишечнике (как это наблюдается при применении официнальных
желчных секвестрантов) необходимо проведение опытов на крысах, морских
свинках или кроликах. В навеске кала животных, собранного за 24 ч,
определяется содержание желчных кислот с помощью описанных в литературе
методов. Дополнительно можно рекомендовать изучение влияния нового
вещества на экскрецию ХС (увеличение выделения ХС с калом
наблюдается, например, под влиянием некоторых пищевых волокон). Исследуется
содержание ХС в навеске кала экспериментальных животных, собранного
за 24 ч.
4.9. Исследование действия новых веществ, не обладающих гиполипи-
демическим действием, но оказывающих антиатеросклеротический
эффект. В опытах на кроликах, получавших ХС и исследуемое вещество,
определяется проницаемость аорты. Для этих целей за 1—2 ч до забоя
животных им внутривенно вводится краситель (синяя краска Эванса 0,5 % рас-
-459-

твор, 2 мл) и после извлечения аорты планиметрически определяется
площадь окрашивания эндотелия. В контрольных опытах вводится
растворитель изучаемого вещества.
Кроме того, желательно изучить влияние нового соединения на
проникновение меченых ЛПНП (I125 ЛПНП) в аорту кроликов. Для этого
ЛПНП выделяют из плазмы крови кроликов с помощью
ультрацентрифугирования в соответствующем градиенте плотности, вводят радиоактивную
метку в белковую часть ЛП. Затем последние инъецируют внутривенно
кроликам (10—20 мг по белку I125 ЛПНП с разной удельной
радиоактивностью белка ЛПНП), получавшим и не получавшим испытуемое
соединение. Через 6 ч животных забивают, извлекают аорту и в отделенной от ад-
вентиции интиме-медии измеряют радиоактивность. Количество ЛПНП,
проникших в аорту, рассчитывают на сухую массу интимы-медии аорты,
учитывая удельную радиоактивность ЛПНП.
4.10. Пролиферация и миграция активированных гладкомышечных
клеток артерий в метаболически и морфологически нарушенные участки
артериальной стенки как следствие влияния факторов риска развития
атеросклероза, является завершающим этапом образования атеросклеротиче-
ской бляшки. Поэтому для выяснения возможного антипролиферативного
действия изучаемого соединения проводятся опыты in vitro в культуре
клеток, в том числе гладкомышечных. Условия инкубации клеток описаны в
специальной литературе.
4.11. Учитывая существенную роль в атерогенезе воспалительного
процесса артериальной стенки, для характеристики нового вещества с
выявленной антиатеросклеротическои активностью желательно исследовать
противовоспалительную его активность. Для этих целей используются
мыши и крысы с индуцированным разными способами воспалением,
описанными в соответствующих методических рекомендациях.
Таким образом, перечисленный комплекс методов, описанных и в
прилагаемой литературе, позволяет выявить специфическую активность
нового соединения, в определенной степени выяснить механизм его действия и
рекомендовать для клинического изучения в качестве гиполипидемическо-
го и/или антиатеросклеротического средства. В то же время в ходе
клинического испытания может возникнуть необходимость дополнительных
исследований, направленных на выяснение других сторон действия
препарата, важных для оптимизации его применения.
Относительно требований, характеризующих общую
фармакологическую активность и токсичность новых гиполипидемических и антиатеро-
склеротических веществ, то изучение их влияния на функциональное
состояние ряда органов и систем, определение острой и хронической
токсичности проводятся по программе, предусмотренной официальными
документами Минздрава РФ для всех новых веществ, представляемых в
Фармакологический комитет для получения разрешения на клиническое
изучение.
Литература
1. Андрианова И. П., Рыженков В. Е., Лапук Я. И. и др. Специфическое связывание
холестерина энтеросорбентами // Вопр. мед. химии. — 1986. — № 2. — С. 80—89.
2. Богданов В. Л., Викторова Е. Н., Веселова Т. В. и др. Флуоресцентный метод
регистрации продуктов пероксидации в плазме крови и липопротеидах низкой плотности
// Оптический журнал. — 1995. — № 11. — С. 89—90.
3. Куфлина С. А., Павлова Т. Н. Эвтаназия экспериментальных животных //
Методические рекомендации МЗ СССР. — М., 1985.
- 460 -

4. Лопухин Ю. М., Андрианова И. П.,. Рыженков В. Е. и др. Энтеросорбент с
иммобилизованным хлоридом триметиламиноэтанола. I. Гиполипидемические свойства //
Вопр. мед. химии. —1994. — Т. 4, № 1. — С. 18—20.
5. Макаров В. Г., Рыженков В. Е., Северцева О. В. и др. Гиполипидемическое и анти-
оксидантное действие концентрата облепихового масла в эксперименте // Вопр.
биол., мед. и фармац. химии. — М., 1998. — № 3. —С. 42—44.
6. Ремезова О. В. Гиполипидемическая, антиоксидантная и антипролиферативная
активность изофлавоноидов // II Межд. съезд "Актуал. проблемы создания новых
лек. препаратов природн. происхождения". — Санкт-Петербург—Валаам. — 1998. —
С. 74-77.
7. Рыженков В. Е., Соловьева М. А., Ремезова О. В., Окуневич И. В.
Гиполипидемическое действие сульфатированных полисахаридов // Вопр. мед. химии. — 1996. — Т.
42, вып. 2. - С. 115-119.
8. Фрешни Р. (ред.) Культура животных клеток. Методы. — М.: Мир, 1989. — 332 с.
9. Eastman J. W., Pelton J. R. Comparison of agarose and polyacrylamide techniques for
lipoprotein electrophoresis // Clin Chem. — 1978. — Vol. 24. — P. 2066—2068.
10. Esterbauer H., Striegl H., Puhl, M. Rothededer. Continuons monitoring of in vitro
oxidation of human low density lipoproteins // Free Rad. Res. Commun. — 1989. — Vol. 6,
N 1. - P. 67-75.
11. Kuron G. W., Grier N., Huff J. W. The bile acid binding and hypocholesterolemic action
of two water — soluble polymers // Atherosclerosis. —1980. — Vol. 37, N 3. — P. 253—
360.
12. Lingren F. Т., Jensen L. C, Flatch F. T. Blood lipid and lipoprotems guantitation,
composition and metabolism. — N-Y—London—Sydney, 1972. — P. 181—274.
Методические указания по изучению фармакологических
веществ, влияющих на гемостаз
СОСТАВИТЕЛИ: проф. В. А. Макаров; к. м. н.
Г. Н. Петрухина; к. м. н. Н. И. Дрозд; к. м. н.
Г. Г. Белозерская; О. Е. Неведрова
Общие замечания
Оценку специфической фармакологической активности
лекарственных регуляторов функции гемостаза проводят, как правило, в несколько
этапов. Первым этапом является изучение действия вещества in vitro в
плазме. Однако в силу различных причин (биотрансформация препарата
в активную форму в организме, непрямой характер действия и др.)
отрицательный результат на первом этапе не является причиной
"отстранения" вещества от исследования на следующих этапах. Не всегда также
положительный результат на первом этапе (в силу быстрой
биотрансформации в организме, наличия выраженных побочных эффектов и др.)
является залогом его эффекта при введении в организм. Второй этап —
исследование действия в условиях введения интактному животному. Этот
этап позволяет определить время начала, максимума и окончания
действия, степень выраженности эффекта под влиянием разных доз, выявить
предпочтительные пути введения потенциального лекарственного
средства, апробировать способы снятия эффекта исследуемого вещества под
влиянием специфических антагонистов или неспецифических
мероприятий. В этом случае целесообразно также оценить эффект вещества или
-461 -

лекарственной формы на свертывающую систему крови и фибринолиз,
помимо параметров, предназначенных для оценки специфической
фармакологической активности. Третий этап — оценка эффекта изучаемой
субстанции или лекарственной формы на фоне экспериментальной
модели тромбоза или геморрагии (в зависимости от характера активности
изучаемого средства).
Для характеристики особенностей действия исследуемых веществ и их
активности вызываемые ими эффекты должны был сравнены с
эталонными препаратами. Желательно, чтобы препарат сравнения был близок по
химической структуре и механизму действия к изучаемому средству.
Средства, влияющие на функцию гемостаза, делятся на две большие
группы — противотромботические и гемостатические средства. Противо-
тромботические средства можно разделить на ингибиторы агрегации
тромбоцитов (антиагреганты), антикоагулянты, тромболитические (фибриноли-
тические) средства. В соответствии с этой рубрикацией далее описаны
методики оценки специфической фармакологической активности
исследуемых средств.
ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТИ АНТИАГРЕГАНТОВ
Оценку специфической фармакологической активности потенциальных
антиагрегантов необходимо проводить в три этапа: оценка антиагрегацион-
ных свойств in vitro, оценка специфической фармакологической
активности in vivo на интактных животных, оценка специфической
фармакологической активности in vivo с использованием модельных состояний,
сопровождающихся повышением агрегации и адгезии тромбоцитов.
Следует отметить, что проведение исследований in vitro не всегда
возможно. Так, популярные в клинике антиагреганты тиклопидин и клопи-
догрель (ингибиторы АДФ-индуцированной агрегации) неактивны in vitro,
но за счет эффекта своих метаболитов оказывают выраженное действие in
vivo. Подобным же эффектом обладают и некоторые антагонисты фибри-
ногеновых рецепторов тромбоцитов GPIIb/IIIa (например, фрадафибран).
Проведение этого исследования не всегда возможно также в силу плохой
растворимости вещества, его высокой оптической плотности, резкого
влияния на рН и др. Однако большинство известных в настоящее время
ингибиторов межтромбоцитарного взаимодействия проявляют антиагрега-
ционную активность и при исследовании в пробирке.
Изучение специфической фармакологической активности
потенциальных антиагрегантов предпочтительно проводить с использованием крови
здоровых доноров. Взятие крови следует проводить непосредственно перед
исследованием, используя в качестве стабилизатора 3,8 % раствор цитрата
натрия (кровь : цитрат натрия — 9:1). Использование консервированной
крови недопустимо. Для приготовления богатой тромбоцитами плазмы
кровь сразу после получения (во всяком случае не позднее чем через 30
мин) центрифугируют в течение 10 мин при 1000 об/мин, после чего
верхний слой плазмы переносят в другую пробирку, а остаток центрифугируют
в течение 20 мин при 3000 об/мин для получения бестромбоцитарной
плазмы. Необходимо помнить, что любые манипуляции с тромбоцитами
можно проводить только в посуде, сделанной из тромборезистентного
материала. В течение всего периода исследования кровь и богатая
тромбоцитами плазма должны находиться при комнатной температуре, а запись аг-
-462-

регации тромбоцитов и предагрегационную инкубацию с изучаемыми
веществами следует осуществлять при 37 °С.
При исследовании воздействия антиагрегантов на тромбин-индуциро-
ванную агрегацию тромбоцитов необходимо освободить эти клеточные
элементы от присутствия плазмы, что можно осуществить двумя
способами: отмывкой тромбоцитов в буфер путем повторного центрифугирования
с последующим ресуспензированием (1) или гель-фильтрацией (2). При
изучении антиагрегационного эффекта веществ, влияющих на активность
эндогенного тромбина (таких, как гирудин, гирулог, гепарин и т. п.),
можно воспользоваться методом Е. F. Plow и соавт. (3), где возможность
оценки агрегации тромбоцитов в плазме под действием эндогенно
генерируемого тромбина достигается использованием ингибитора полимеризации
фибриногена, представляющего собой тетрапептид Gly-Pro-Arg-Pro.
Вне зависимости от используемого проагреганта полученную богатую
тромбоцитами плазму или суспензию тромбоцитов необходимо
стандартизировать по количеству клеточных элементов, которое должно быть
примерно одинаковым во всех сравниваемых опытах и составлять около 250
тыс/мкл. В качестве разводящей жидкости следует использовать или ауто-
логичную бестромбоцитарную плазму (при работе с богатой тромбоцитами
плазмой), или буферный раствор, в котором было проведено ресуспензи-
рование клеток.
Перед началом проведения эксперимента необходимо оценить
растворимость изучаемого вещества. При использовании в качестве растворителя
спирта следует помнить о том, что количество вводимого спиртового
раствора не должно превышать 1—2 % от общего объема реакционной смеси.
Во всех случаях вне зависимости от природы растворителя следует
проводить контрольное изучение его возможного влияния на агрегацию
тромбоцитов.
Для исключения возможного изменения чувствительности тромбоцитов
к проагреганту, растворителю или исследуемому веществу под влиянием
времени, прошедшего с момента приготовления плазмы, контрольные
записи агрегатограммы необходимо осуществлять до начала эксперимента,
через равные промежутки времени в ходе эксперимента (например, каждая
3-я агрегатограмма должна быть контрольной), а также по завершении
опыта.
Исследование агрегации тромбоцитов целесообразно проводить по
методу G. G. V. Вот (4). О степени агрегации чаще всего судят по
максимальной величине падения оптической плотности после окончания
реакции по сравнению с исходной величиной. Объемы вводимой в кювету аг-
регометра плазмы и проагреганта зависят от технических характеристик
прибора. Объем исследуемого антиагреганта не должен быть большим, так
как излишнее разведение плазмы или суспензии тромбоцитов может
привести к заметному изменению оптических свойств реакционной смеси и
повлиять на результаты эксперимента. Обычно раствор изучаемого
вещества при использовании растворителей, не влияющих на физиологическую
активность тромбоцитов (физиологический раствор, буферы для работы с
клетками крови, аутологичная бестромбоцитарная плазма), не превышает
10 % от общего объема реакционной смеси.
Выбор проагреганта зависит от предполагаемого механизма действия
изучаемого вещества. Так, например, в схему оценки антиагрегационного
эффекта веществ — антагонистов тромбоксановых рецепторов следует
включить исследование их влияния на агрегацию тромбоцитов,
индуцированную арахидоновой кислотой. Во всех случаях целесообразно использо-
-463-

вать АДФ, коллаген, адреналин. Так как выраженность процесса агрегации
тромбоцитов положительно коррелирует с дозой антагониста,
обязательным условием достоверной оценки эффективности исследуемой
субстанции и возможности сравнения антиагрегационных свойств нескольких
потенциальных лекарственных средств является использование индуктора
процесса межтромбоцитарного взаимодействия в одной и той же
концентрации во всех опытах. Обычно фирмы-изготовители реактивов для
лабораторных исследований рекомендуют оптимальные концентрации для
выпускаемых ими индукторов агрегации. Чаще всего АДФ используют в
конечных концентрациях 10"5 М (для записи одноволновой агрегатограм-
мы) и 1(Г7 М (для индукции двухволновой агрегации тромбоцитов),
коллаген — 50,0 мкг/мл, адреналин — 2,5—5,0 мкг/мл, тромбин — 0,3 ЕД/мл
и арахидоновую кислоту — 10~3—Ю-7 М. Оценку антиагрегационного
эффекта потенциальных ингибиторов функциональной активности
тромбоцитов наиболее корректно проводить с использованием величины 1С, т.
е. следует рассчитать, какое количество антиагреганта (в молярном
выражении) необходимо для снижения величины максимальной амплитуды
агрегации на 50 %. Следует отметить, что снижение агрегационной
способности на 50 % и более является терапевтическим уровнем действия
антиагреганта.
Вторым этапом исследований является оценка специфической
фармакологической активности in vivo на интактных животных. Важным
моментом, в существенной степени определяющим успех проведения данного
этапа доклинического изучения потенциальных антиагрегантов, является
правильный выбор вида экспериментальных животных. При этом прежде
всего следует руководствоваться видоспецифичностью действия изучаемых
препаратов, а также особенностями системы свертывания крови и
метаболизма, имеющими место у животных — объектов эксперимента. Кроме
того, следует учитывать, что у мелких лабораторных животных (мыши,
крысы, морские свинки) сложнее проводить многократное взятие крови и
практически невозможно делать это в необходимом для опыта объеме.
Если исследуемое вещество не обладает какими-либо особенностями,
делающими невозможным изучение его фармакодинамики с использованием
именно этого вида животного, наиболее доступными и удобными для
проведения изучения антиагрегантов являются кролики.
Взятие крови у кроликов осуществляется из краевой вены уха методом
свободного падения капель; приемы стабилизации крови, приготовления
богатой тромбоцитами и бестромбоцитарной плазмы не отличаются от
таковых при работе с кровью человека. Следует, однако, учитывать, что
количество тромбоцитов у кроликов существенно выше, поэтому
стандартизация плазмы по числу клеток часто требует более существенного ее
разведения.
Общий объем крови, взятой у кролика в течение одного дня
эксперимента, не должен превышать 20—25 мл. Если условия опыта предполагают
использование крови в несколько больших количествах, то необходимо
провести контрольное исследование влияния кровопотери, выполненной в
режиме основного эксперимента, на функциональное состояние системы
гемостаза у животных.
Для исследования влияния потенциального антиагреганта на
функциональную активность тромбоцитов in vivo также наилучшим является метод
регистрации агрегации тромбоцитов, предложенный G. G. V. Born (4). Так
как чувствительность к проагрегантам тромбоцитов кроликов отличается
от чувствительности человеческих тромбоцитов, в качестве агонистов не-
-464-

целесообразно использовать АДФ в конечной концентрации 10"7 М,
адреналин, а также коллаген и ристомицин. Наиболее информативными
являются агрегатограммы, регистрирующие процесс, инициированный АДФ в
конечной концентрации 10"5 М и коллагеном.
На данном этапе исследования, помимо характеристики антиагрегаци-
онных свойств изучаемого вещества, необходимо оценить и другие
возможные аспекты его влияния на систему гемостаза. Прежде всего следует
определить выраженность коагулологических изменений, непосредственно
связанных с возможным снижением функциональной активности
тромбоцитов. К таким показателям относится время кровотечения. Желательно
также провести определение влияния исследуемого вещества на адгезию
тромбоцитов.
Выбор других оценочных параметров зависит от предполагаемых
эффектов исследуемого вещества, однако во всех случаях следует выполнить
тесты, дающие интегральное представление о возможных изменениях коа-
гулологического потенциала крови, произошедших под действием
изучаемой субстанции, как зависящих, так и не зависящих от ее влияния на
функциональную активность тромбоцитов. К таким тестам относятся
число тромбоцитов, протромбиновое время, активированное частичное тром-
бопластиновое время, уровень фибриногена, суммарная фибринолитиче-
ская активность.
Выбор методики определения числа тромбоцитов может быть достаточно
свободным, но, учитывая, что количество тромбоцитов у кролика в 2—3 раза
превышает этот показатель у человека и, следовательно, затрудняет и так
непростую процедуру подсчета этих клеток в мазке или камере Горяева, мы
рекомендуем воспользоваться фотометрическим методом В. Walkowiak и соавт.
(5).
Так как в силу видовых особенностей системы свертывания крови
величина протромбинового времени у кроликов существенно короче, чем у
человека, достоверная оценка этого показателя требует использования
хорошо стандартизированных реактивов и довольно большой выборки
результатов исследования. С другой стороны, выполнение этого теста
представляется весьма желательным, так как его результаты позволяют дать общую
характеристику состояния активации свертывающей системы крови по
внешнему пути.
При определении активированного частичного тромбопластинового
времени (АЧТВ) в плазме кроликов следует помнить, что величина этого
показателя у животных примерно в 1,5—2,5 раза меньше, чем у человека.
Оценка состояния фибринолитической системы крови у кроликов
сопряжена с определенными трудностями, что связано с существенным (по
сравнению с кровью человека) удлинением времени лизиса сгустка.
Поэтому наиболее приемлемым методом, позволяющим быстро выявить
возможные изменения скорости тромболизиса, мы считаем определение
фибринолитической активности разбавленной крови по G. Feamley (6). Этот
метод прост в исполнении, не требует дорогостоящего оборудования и
реактивов и позволяет не дожидаться полного растворения сгустка. Вполне
достаточно в избранный исследователем и одинаковый во всех опытах
(например, 3 ч) момент времени после образования сгустка в равных объемах
смеси, взятой из экспериментальных пробирок, провести гемолиз и
определить содержание гемоглобина, величина которого пропорциональна
величине лизированной части стандартного сгустка.
При работе с кроликами следует помнить, что гемостазиологические
константы этих животных подвержены сезонным колебаниям, что делает
-465 -

совершенно необходимым проведение контрольных исследований
одновременно с основным опытом.
Третьим этапом исследований является оценка специфической
фармакологической активности. Основной задачей данного этапа до
клинического изучения новых антиагрегантов in vivo с использованием модельных
состояний, сопровождающихся повышением агрегации и адгезивности
тромбоцитов, является оценка их противотромботической активности.
Моделью клеточного тромба, обусловленного преимущественно
тромбоцитами, может служить методика, описанная М. А. Матяшовой (7).
Модель адгезивного тромбоза создается на микрососудах брыжейки крыс.
К венулам диаметром 40—90 мк подводится электрод с диаметром 5—8 мк.
Анодным током напряжением 100 В и силой 4 мА вызывают образование
тромбоцитарного тромба. Время нанесения раздражения 20 мс. С
помощью объект-микрометра определяют время возникновения тромба, время
отрыва первого конгломерата от основной массы тромба и среднюю
площадь тромба.
Для исследований эффективности антиагрегантов можно использовать
экспериментальный тромбоз сосудов артериального русла (коронаротромбоз,
тромбоз бедренной артерии и т. п.). В качестве критериев оценки влияния
антиагрегантов на тромбогенез следует выбрать такие тесты, которые
позволили бы прямо и желательно количественно оценить именно тромбообразо-
вание. Такими критериями могут быть размер или масса модельного тромба,
величина накопления в тромбе меченых клеточных элементов или факторов
свертывания, частота развития тромбоза и т. п. Кроме того, в качестве
модельного состояния можно использовать экспериментальное диссеминиро-
ванное внутрисосудистое свертывание крови. В этой ситуации критериями
оценки противосвертывающего эффекта антиагрегантов могут быть число
тромбоцитов, уровень продуктов паракоагуляции, степень потребления
фибриногена или антитромбина III и другие показатели, отражающие тяжесть
ДВС-синдрома.
При выполнении данного этапа исследования чрезвычайно важно точно
выбрать препараты сравнения. Такими веществами должны быть только
антиагреганты, которые широко и успешно применяются в клинике
именно в тех случаях, когда планируется использование исследуемых
субстанций. К таким препаратам можно отнести ацетилсалициловую кислоту, тик-
лопидин, абцикси-маб, тирофибан, берапрост натрия и др.
ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТИ АНТИКОАГУЛЯНТОВ
Антикоагулянтами называют вещества, блокирующие образование
фибрина. Антикоагулянты прямого действия влияют на факторы свертывания
крови непосредственно в кровотоке. Антикоагулянтами непрямого
действия называются вещества, тормозящие синтез факторов свертывания
крови в органах и тканях.
Известные в настоящее время антикоагулянты прямого действия могут
подавлять активность тромбина либо непосредственно (гирудин), либо
совместно с антитромбином III (нефракционированный гепарин). Кроме
того, возможен антикоагулянтный эффект, связанный с подавлением
активности фактора Ха (низкомолекулярные гепарины).
При разработке новых антикоагулянтов прямого действия проводят ряд
анализов в системе in vitro с использованием плазмы крови животных или
- 466 -

человека (донора), в которую добавляются различные концентрации
потенциального антикоагулянта. Специфическую активность анализируемого
вещества определяют по калибровочной кривой активности стандартного
аналога (нефракционированного или низкомолекулярного гепарина или
гирудина). И анализируемое вещество, и аналог добавляют в бедную
тромбоцитами цитратную плазму.
При разработке ингибиторов тромбина, не требующих в качестве
кофактора антитромбин III (ATIII), в роли веществ для сравнения антикоа-
гулянтного эффекта используют выделяемый из пиявок белок гирудин или
рекомбинантный гирудин. Удлинение времени свертывания в тестах
времени свертывания цельной крови, тромбинового времени (ТВ), частичного
тромбопластинового времени (ЧТВ) и АЧТВ плазмы зависит от
концентрации ингибиторов тромбина.
Наиболее воспроизводимым тестом является АЧТВ (основан на
активации внутреннего пути свертывания нитратной бедной тромбоцитами
плазмы; в качестве активаторов могут использоваться белая глина, кремнезем,
эллаговая кислота и т. д., а также фосфолипиды поверхности;
определяется время образования фибринового сгустка [8]. Доступно и просто
измеряется активность гирудина и других ингибиторов тромбина в плазме по
титрованию тромбина [9]. Количество антикоагулянта, нейтрализующее 1 ЕД
тромбина, принимают за условную тромбинингибирующую единицу
(ATU). Для выполнения анализа равные объемы раствора с разным
количеством протеазы (калиброванной по стандартному тромбину) добавляют к
смеси антикоагулянта с фибриногеном или нитратной плазмой.
Активность антикоагулянта определяется в условных единицах, что
соответствует разнице между количеством тромбина, выраженном в ЕД, в реакции с
ингибитором и без (на появление фибринового сгустка уходит разное
время от начала реакции).
Тест ТВ основан на активации экзогенным тромбином фибриногена и
других факторов свертывания крови, что приводит к появлению
фибринового сгустка [8]. Рекомендуется использование данного теста для оценки
функциональной активности всех антикоагулянтов, влияющих на фибри-
нообразование. При этом под влиянием потенциального антикоагулянта
время образования сгустка должно вырасти в 4—5 раз.
Амидолитическое измерение антитромбиновой антикоагулянтной
активности (alia), специфической для прямых ингибиторов тромбина,
особенно эффективно при малой выборке [10]. Фиксированный объем
раствора стандартизированного тромбина смешивают с пробой плазмы,
содержащей антикоагулянт. Остаточную активность тромбина определяют
спектрофотометрически после добавления хромогенного субстрата.
Специфическую активность, рассчитанную по калибровочной кривой, выражают
в тромбинингибирующих единицах (TIE) на 1 мг ингибитора.
К антикоагулянтам прямого действия, активирующим плазменные
ингибиторы сериновых протеаз свертывающей системы — АТШ и кофактор
гепарина-Н, относятся гликозаминогликаны природного (нефракциониро-
ванный гепарин, полисульфаты дерматана, гепарана, хитозана и хиндоити-
на), полусинтетического (низкомолекулярные гепарины, полисульфат дек-
страна) и синтетического (полисульфат пентозана) происхождения.
Предварительная оценка активности подобного антикоагулянта может
проводиться в тестах АЧТВ, ТВ, а также ингибирования фактора Ха. Для
потенциального антикоагулянта необходимым является удлинение
времени свертывания плазмы в тесте АЧТВ в два раза по сравнению с
контролем (без добавления антикоагулянта). Инактивация тромбина АТШ в при-
-467-

сутствии антикоагулянта приводит и к удлинению времени появления
фибринового сгустка в тесте ТВ.
Для определения удельной активности исследуемого антикоагулянта
удобны методы, основанные на измерении активности тромбина при ин-
гибировании АТШ. С помощью хромогенных субстратов активность
тромбина фиксируется по росту оптической плотности раствора смеси
реагентов при длине волны 405 нм. Добавленный антикоагулянт уменьшает
оптическую плотность. Калибрование результатов по Международному
стандарту гепарина с активностью в антитромбиновых единицах позволяет
измерить alia активность образца. Как правило, исследование проводят с
применением калибровочной кривой на низкий уровень антикоагулянта
0,02—0,10 ЕД и на высокий 0,1—0,6 ЕД. Условия для постановки теста с
пептидньми субстратами подбираются таким образом, чтобы скорость
инактивации фермента была линейна в зависимости от концентрации
антикоагулянта. После начальной активации фермента добавляется избыток
субстрата, что ведет к остановке взаимодействия между тромбином и АТШ
вследствие насыщения протеазы пептидным субстратом. Если добавить
избыток фермента, то субстрат будет истощаться и реакция не будет
линейна.
Для оценки активности новых ингибиторов фактора Ха (типа фракси-
парина) используют, помимо описанных выше методов для исследования
гепариноидов (АЧТВ, alia), еще и Heptest (Haemachem, Inc, StLonis, Mo,
USA) — коагулологическое определение а-Ха активности исследуемого
вещества. Измерение основано на предварительной инкубации цитратной
бедной тромбоцитами плазмы с раствором фактора Ха и последующим
добавлением раствора кальция хлорида. Результаты оцениваются по времени
появления фибринового сгустка от начала реакции. Калибрование
результатов определений по Международному стандарту низкомолекулярного
гепарина позволяет измерить а-Ха активность образца антикоагулянта.
Чувствительность этого метода составляет 0,025 а-Ха ЕД/мл. Отмечается
высокая корреляция между определениями аХа амидолитически и с
помощью Heptest (г = 0,93). Появление сгустка плазмы через 40 с от начала
реакции соответствует концентрации антикоагулянта в 0,15 аХа ЕД/мл, через
73 с - 0,34 аХа ЕД/мл.
При исследовании потенциального ингибитора полимеризации
фибрина используют АЧТВ и ТВ. На основании изложенного можно сделать
вывод, что при исследовании возможной прямой антикоагулянтной
активности вещества с принципиально новой химической структурой исследуют in
vitro следующие тесты: время свертывания цельной крови, АЧТВ, ТВ, alia,
аХа.
Эксперименты in vivo с оценкой воздействия антикоагулянтов на
плазменный и тромбоцитарный гемостаз животного при том или ином виде
введения, а также на развитие экспериментального тромбоза проводятся
на кроликах, крысах, морских свинках и свиньях с последующим
изучением геморрагической активности в модельных экспериментах на кроликах и
крысах. В качестве препаратов сравнения используются препараты не-
фракционированного гепарина, низкомолекулярных гепаринов или
гирудина.
Для оценки специфической активности антикоагулянтов прямого
действия, влияющих на тромбин без помощи АТШ при введении (внутривенном
или подкожном) экспериментальным животным (кроликам или крысам),
используются тесты АЧТВ и ТВ. Значимым изменением времени
свертывания плазмы в тесте АЧТВ при внутривенном введении антикоагулянта кро-
- 468 -

ликам или крысам является увеличение в 2 раза в течение 60 мин.
Наибольшей чувствительностью обладают наборы, в которых в качестве активаторов
свертывания используются эллаговая кислота или измельченный кремнезем
(РТТа liquid "Boehringer Manhein", Automated APTT "Organon Teknika"; IL-
APTT micronized silica "IL"). ТВ при внутривенном введении кроликам
должно увеличиваться примерно в 4 раза. Следует отметить важность
использования в экспериментах животных одной линии или породы и одного пола.
При разработке новых гепариноидов в качестве экспериментальных
животных чаще используют кроликов, крыс, реже — морских свинок. Для
анализа специфической активности гепариноидов при введении в
организм экспериментального животного можно использовать тесты времени
свертывания цельной крови, АЧТВ, ТВ, alia и аХа активностей. Все они
практически нечувствительны к низким дозам гепарина (менее 0,1 ЕД/мл;
за фармакопейную единицу принята активность, составляющая '/ш мг
2-го Международного стандарта гепарина).
Разрабатываемый гепариноид может обладать способностью
образовывать комплекс с поликатионами, поэтому необходимо провести анализ
нейтрализации его антикоагулянтной активности сульфатом протамина, по
аналогии с известным для гепарина методом in vivo и in vitro, что важно
для купирования возможных передозировок антикоагулянта.
Важным моментом во всех исследованиях является подготовка плазмы
при центрифугировании крови 20 мин при 2000 g и 4°С, что в
значительной степени снижает гепариннейтрализующую активность тромб оцитарно-
го фактора 4.
Эффект разрабатываемых ингибиторов фактора Ха оценивают по
результатам анализа плазмы при внутривенном или подкожном введении
кроликам или крысам. Для контроля используют интегральный метод
АЧТВ (активность исследуемого низкомолекулярного гепарина
подтверждает увеличение времени свертывания плазмы в 2 раза по сравнению с
контролем) и специальные методы: определение анти-Па и анти-Ха
активностей плазмы.
При исследовании ингибиторов полимеризации фибрина и при
разработке новых антикоагулянтов необходимы исследования их влияния на
тромбоциты (агрегация и число клеток) в системах in vitro и in vivo, а также
проведение стандартной коагулограммы и исследования их действия на
фибринолиз.
Антитромботическую активность разрабатываемых антикоагулянтов
изучают на экспериментальных моделях тромбозов. В частности, для
воспроизведения венозного тромбоза используют кроликов (можно использовать
также крыс, морских свинок). Хорошо воспроизводимой моделью венозного
тромбоза является модель S. Wessler и соавт. [11]. Наркоз достигается внут-
рибрюшинным введением нембутала в дозе 60 мг/кг по 1 мл на 200 г массы
животного. Антитромботический агент (исследуемое вещество, а в
контрольном опыте препарат сравнения — гирудин, нефракционированный гепарин
или низкомолекулярный гепарин) вводится в яремную вену в объеме 1 мл в
ту же вену через 15, 60, 90, 120, 180, 240, 300 мин в разных сериях вводится
активированная стеклом сыворотка человека (0,75 мл/кг) или тромбопла-
стин. Животным контрольной группы вводят физиологический раствор. За
15 мин до инъекции аутологичной сыворотки животным вводится атропин
(5 мг/кг) с целью подавления фибринолиза. Моделирование венозного
тромбоза проводят на противоположной яремной вене путем перевязки
сантиметрового участка вены, которая не использовалась для введения веществ.
Эффективность антитромботической активности оценивают в баллах по
-469-

форме тромба, извлеченного из перевязанного участка вены (0 и 1 балл —
выраженный антитромботический эффект, в поле зрения сгустка либо не
было, либо наблюдалось несколько микроскопических нитей; 2 балла —
умеренный антитромботический эффект в поле зрения несколько маленьких
тромбиков; 3, 4 балла — эффект отсутствует или незначителен, в поле
зрения один большой или 2—3 тромба меньшего размера), пересчет баллов на
процент предотвращения тромбоза проводится по следующей формуле:
l-Sa/4n*100,
где Sa — антитромботический эффект в баллах; п — число экспериментов.
Эта же методика может быть проведена с введением меченого 1125-фибри-
ногена, в этом случае антитромботическую активность можно определить
по включению в тромб метки.
Геморрагическую активность разрабатываемых антикоагулянтов обычно
определяют по времени кровотечения у крыс по истечении крови в
подкожное пространство. Для этого в яремную вену вводят исследуемый
препарат и через 30 с надрезают кожу на спине между лопатками. Под
кожу на глубину 10 см вводят острые концы ножниц, раздвигают бранши на
4 см и в таком положении извлекают ножницы, достигая тем самым отсе-
парирования кожи от подлежащих тканей. Под кожу помещают марлевую
салфетку размером 14 х 14 см. Через 30 мин проводят гемолиз
эритроцитов, помещая салфетку в пробирку с 10 мл дистиллированной воды. Через
2 ч, после полного гемолиза клеток, пробы спектрофотометрируют при
длине волны 540 нм, определяя оптическую плотность растворов
гемоглобина. Концентрацию гемоглобина определяют по калибровочной кривой.
Особой группой антикоагулянтов прямого действия являются средства,
уменьшающие концентрацию в крови фибрина. К таким препаратам
относится анкрод (арвин). Механизм его действия связан со способностью
вызывать свертывание фибриногена и неспособностью активировать фактор
XIII (фибринстабилизирующий). В связи с этим образуется сгусток,
способный быстро лизироваться. В опытах in vitro эффективность препарата
оценивают по способности образовывать фибрин, растворимый в 5 М
мочевине. Для этого при 37 °С к 0,1 мл донорской плазмы добавляют 0,1 мл
раствора исследуемого вещества, после образования фибрина добавляют 5
М мочевину. Если растворение сгустка происходит в интервале до 10 с, то
исследуемая субстанция может быть допущена до испытаний in vivo.
Исследование in vivo проводится с использованием метода Wessler и соавт.,
описанного выше.
К антикоагулянтам непрямого типа действия относятся средства,
снижающие синтез факторов II, VII, IX, X в печени.
Исследование данной группы антикоагулянтов целесообразно
проводить на кроликах породы шиншилла. В качестве препарата сравнения
используется варфарин.
Оценка эффекта проводится по методу A. J. Quick с определением про-
тромбинового индекса или международного нормализованного
соотношения. Для работы в современных условиях можно использовать тромбопла-
стин производства фирмы "Технология-стандарт" (г. Барнаул); из
производимых в настоящее время в России он наиболее чувствителен в
описываемом тесте. Исследование эффекта исследуемого вещества проводят в
интервале от 3 до 96 ч после введения.
При исследовании неизвестного вещества необходимо также изучить
возможность купирования его непрямого антикоагулянтного эффекта с
помощью витамина К, в дозах 2—10 мг/кг.
-470 -

Оценка геморрагического эффекта исследуемой субстанции, как и
оценка противотромботической активности антикоагулянтов непрямого
действия, производится идентично таковой у антикоагулянтов прямого
действия.
Оптимальный антикоагулянт непрямого действия должен тормозить
генерацию факторов протромбинового комплекса в 2—2,5 раза по тесту
Каика, купироваться при введении витамина К,, а также обладать меньшей
(или равной) по сравнению с варфарином (в дозах 2—2,5 мг/кг)
геморрагической активностью [12].
ТРОМБОЛИТИЧЕСКИЕ СРЕДСТВА
Действие препаратов этой группы связано с их способностью к
деполимеризации фибрина в тромбе.
Используемые в настоящее время тромболитические средства можно
разделить на препараты "старого" и "нового" поколения. Препараты
"старого" поколения (фибринолизин, стрептокиназа, урокиназа и др.) обладают
равным фибринолитическим действием как в зоне тромба, так и в общем
кровотоке. Препараты "нового" поколения (эминаза, проурокиназа,
тканевый активатор плазминогена и др.) в большей степени проявляют свой
эффект в тромбе, чем в общем кровотоке. Их фибринолитический эффект
выше фибриногенолитического.
Первичная оценка фибринолитических средств производится in vitro
путем определения их амидолитической и фибринолитической активности.
Наиболее точная оценка амидолитической активности, т. е. способности
разрывать связи аргинина, проводится с помощью хромогенных
субстратов. В России наборы, содержащие субстрат плазмина, производятся
фирмой "Технология-стандарт" (г. Барнаул). Опыты проводятся на
стандартной донорской плазме.
Использование хромогенного субстрата позволяет оценить эффект
быстро, с использованием минимального количества исследуемого вещества.
Измерения проводят следующим образом: в 3 пластиковых пробирках
смешивают по 10 мкл исследуемой плазмы, 100—300 мкл раствора
потенциального активатора фибринолиза (в контроле добавляют идентичный
объем физиологического раствора) и 900—700 мкл 0,05 М трис-HCl буфера,
содержащий 0,15 М NaCI, pH 7,4 соответственно. Смесь инкубируют 15
мин при температуре 37 °С, затем переносят смесь в кювету, добавляют
200 мкл раствора субстрата For-Ala-Phe-Lys-pNaHBr (концентрация
исходного раствора 4 мг/мл). Через 120 с добавляют 1 мл 15 % раствора
уксусной кислоты, перемешивают и через 5—10 мин определяют оптическую
плотность исследуемого образца плазмы при длине волны 405 нм.
Степень влияния разных концентраций активатора фибринолиза
выражают в процентах и рассчитывают по формуле:
AAl ~ АА-2 • юо %,
ДА2
где ДА, — оптическая плотность плазмы, содержащей потенциальный
активатор; ДА2 — оптическая плотность плазмы, не содержащей исследуемой
субстанции.
В каждом опыте перед добавлением хромогенного субстрата измеряют
оптическую плотность растворов (фон), которая вычитается из значения
оптической плотности после добавления субстрата.
-471 -

Описание дано для работы на спектрофотометре, где кювета имеет
вместимость 2 мл. При работе с кюветами вместимостью 1 мл объем
смешиваемых реагентов следует уменьшить в 2 раза.
Оценка фибринолитической активности потенциальных тромболитиков
осуществляется на фибриновых пластинах или эуглобулиновыми
методами. Некоторые из этих методик описаны в руководстве В. П. Балуды и со-
авт. [8]. В этих экспериментах целесообразно использовать стандартную
донорскую плазму.
При получении положительных результатов в опытах in vitro (т. е. при
получении эффекта, соизмеримого с вышеупомянутыми тромболитически-
ми препаратами) проводится изучение специфической фармакологической
активности на животных. Как правило, эксперименты проводятся на
крысах линии Вистар, морских свинках, кроликах или собаках.
Исследование тромболитической активности на животных предполагает
экспериментальное моделирование тромбоза и последующее определение
степени тромболизиса. В частности, A. Bemat и соавт. [13], D. Collen и со-
авт. (14) в экспериментах на кроликах-самцах предлагают вводить тромб
стандартного размера, содержащий 1125-фибриноген в V. Jugularis. После
введения тромболитического средства замеряют элиминацию J125 из зоны
тромба, обращая внимание на ее скорость и уровень остаточной
радиоактивности в области тромба.
В экспериментах in vivo также необходимо провести сравнительное
исследование эффективности разрабатываемых тромболитиков с известными
тромболитическими средствами.
Важное значение в экспериментах in vivo имеет также исследование
действия изучаемого тромболитического средства на параметры гемостаза,
отражающие наклонность к геморрагическим осложнениям. При
исследовании новых тромболитиков необходимо изучить их влияние на уровень
фибриногена, активность фибринолиза, уровень плазминогена.
"Идеальный" тромболитический препарат не должен на фоне высокого
тромболитического эффекта значительно снижать уровень фибриногена, выражено
активировать фибринолиз и истощать запасы плазминогена.
Ряд веществ обладает непрямым фибринолитическим эффектом,
связанным с высвобождением из тканей активаторов плазминогена. Как
правило, эти соединения сами не обладают выраженным тромболитическим
эффектом, но способны усилить эффект других тромболитиков. Подобный
эффект определяется по нарастанию концентрации тканевого активатора
плазминогена после введения исследуемой субстанции [15] по сравнению с
описанными выше средствами, нашедшими широкое применение в
клинической практике.
ОЦЕНКА СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТИ И ГЕМОСТАТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ МЕСТНОГО
И РЕЗОРБТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ
Для оценки местных гемостатических средств чаще всего используют
кроликов, крыс, собак. Моделирование капиллярно-паренхиматозных
кровотечений чаще всего производится на печени, селезенке, почках.
Основными критериями эффективности гемостатического препарата местного
действия являются время кровотечения и величина кровопотери.
Эксперименты по оценке специфической фармакологической
активности гемостатических средств местного действия удобно проводить на кро-
-472-

ликах породы шиншилла обоего пола массой 2—4 кг под тиопенталовым
наркозом (2—4 мл 0,1 % раствора внутривенно, а затем 6—10 мл 0,1 %
раствора внутрибрюшинно из расчета на 1 кг массы животного). Проводится
лапаротомия с использованием продольного разреза по белой линии
живота. В рану выводится кишечник и ограничивается салфетками,
смоченными теплым физиологическим раствором. Выводится также передняя
поверхность печени. С помощью специального
приспособления-ограничителя (пластмассовый пластик с круглым отверстием в центре) производится
резекция выступившей части печени лезвием. Срезанный сегмент в
вертикальной проекции имеет вид круга или эллипса, его размеры и форма
постоянны.
Образовавшаяся равномерно кровоточащая рана с ровными краями и
равномерной кривизной имеет общую площадь около 2,5 см2 и глубину
около 0,3 см.
Для сравнительной оценки исследуемого гемостатического средства и
контроля на доле печени одновременно производят два описанных среза.
Статистический анализ даже небольшого количества экспериментов
позволяет нивелировать отклонения результатов, связанных с различной
анатомической локализацией ран в контроле и опыте. С этой целью следует
также менять локализацию контрольных и опытных участков геморрагии в
разных экспериментах. В качестве контроля может служить тампон из
марлевых салфеток, в качестве препарата сравнения — гемостатические
препараты, такие как "Суржицел", "Сорбсан", "Колетекс-Гем". Остановку
развившегося капиллярно-паренхиматозного кровотечения выполняют
одновременно путем нанесения на одну рану известного гемостатического
средства, а на другую — исследуемого. При этом гемостатические средства
должны полностью покрывать всю раневую поверхность. Время остановки
кровотечения определяют по секундомеру. Определение времени
остановки кровотечения на хвосте крысы, на ухе кролика и др. дает большой
разброс результатов по сравнению с оценкой гемостатического эффекта на
паренхиматозных органах. Критерием оценки момента остановки
кровотечения является полное отсутствие проникновения крови через поверхность
и края применяемого гемостатика.
В конце эксперимента необходимо измерить массу излившейся крови
(кровопотерю). Если препарат представляет собой повязку, губку или
пленку, то для этого следует знать массу применяемых препаратов в
чистом виде и после пропитывания их кровью. Разница в массе является кро-
вопотерей в данном эксперименте. Если же испытывается порошок или
жидкость, то их надо нанести на марлевом тампоне, измерив его массу до
и после пропитывания кровью.
Среди гемостатических средств резорбтивного действия важное место
занимают препараты, активирующие синтез факторов свертывания крови,
преимущественно в печени. Основным препаратом этой группы является
витамин К,. Он активирует, в частности, синтез протромбина (фактор II),
проконвертина (фактор VII), Кристмас-фактора (фактор X), фактора
Стюарта—Прауера (фактор IX). Этот препарат выпускается зарубежными
фирмами под названием "Мефитон", "Конакион". В нашей стране в
распоряжении врачей имеется лишь синтетический препарат витамина К3 — "Ви-
касол".
Оценка специфической фармакологической активности препаратов
этой группы проводится по измерению протромбинового индекса или
международного нормализованного соотношения. Эффект витамин
^-подобных препаратов проводят на кроликах на фоне введения антикоагулян-
-473-

тов непрямого действия (варфарин, синкумар, фенилин), удлиняющих
протромбиновое время в 2—2,5 раза, сравнивая их эффект с указанными
препаратами витамина К,.
Эффект антагонистов гепарина можно оценить in vitro и in vivo по
степени инактивации гепарина в тестах времени свертывания цельной крови
и АЧТВ. При этом доза гепарина должна быть таковой, чтобы удлинить
указанные параметры в 2—2,5 раза. Эффект новых антагонистов гепарина
необходимо сравнить с таковым у протамина сульфата и полибрена.
Эксперименты с внутривенным введением веществ целесообразно проводить
на кроликах или собаках.
Оценка препаратов факторов VIII и IX проводится в соответствии с
существующими фармстатьями в системе АЧТВ на плазмах, дефицитных по
указанным факторам. При этом исследуемое средство следует сравнить с
эффектом PPSB (фактор IX) или криобулином (фактор VIII). Эксперимент
in vivo возможен лишь на линиях животных, дефицитных по указанным
факторам.
Наряду с соединениями, способствующими синтезу факторов
свертывания крови, описаны вещества, активирующие различные факторы
гемостаза в кровотоке; в частности, известны активаторы фактора XIII. Подобным
свойством обладает эллаговая кислота. Она сокращает время свертывания
цельной крови, кефалиновое время, не оказывает влияния на
протромбиновое время, тромбиновое время, АЧТВ, эуглобулиновый лизис, агрегацию
тромбоцитов.
Специфическая активность средств, останавливающих кровотечение, с
неизвестным механизмом действия проводится на основе интегральных
коагулологических тестов: время свертывания цельной крови, время ре-
кальцификации плазмы, АЧТВ. Следует отметить, что не всякое
кровоостанавливающее средство обязательно должно влиять на свертываемость.
Оно может сокращать гладкую мускулатуру, снижать сосудистую
проницаемость, что можно оценить по тестам, не входящим в круг настоящих
методических указаний.
Для остановки кровотечений используются не только стимуляторы
фибринообразования, но и ингибиторы фибринолиза. Оценку
специфической фармакологической активности этих средств проводят вначале in vitro
с помощью хромогенных субстратов на плазмин.
Для проведения анализа на первом этапе к 200 мкл стандартной
плазмы добавляют раствор потенциального ингибитора фибринолиза в
объеме 25—30 мкл. Для контроля используют ту же плазму, в которой вместо
исследуемой субстанции добавляют физиологический раствор.
Полученные смеси инкубируют 10 мин при 37 "С. Дальнейшие исследования
проводят следующим образом. В пластиковой пробирке смешивают 20 мкл
исследуемой плазмы с ингибитором, 200 мкл раствора стрептокиназы,
концентрация которой в исходном растворе составляет 1000 ед/мл и
800 мкл 0,05 М трис-HCl буфера, содержащего 0,15 М NaCl (pH 7,4).
Смесь инкубируют 15 мин при температуре 37 "С, затем переносят смесь
в кювету, добавляют 200 мкл раствора субстрата For-Ala-Phe-Lys-pNaHBr
(концентрация исходного раствора 4 мг/мл). Через 120 с добавляют 1 мл
15 % раствора уксусной кислоты, перемешивают и через 5—10 мин
определяют оптическую плотность исследуемого образца плазмы при длине
волны 405 нм. Точно так же измеряют оптическую плотность раствора,
содержащего ту же плазму без добавления ингибитора, объем которого
замещают физиологическим раствором. Ингибирование фибринолиза
рассчитывают в процентах по формуле:
- 474-

AA' AA-2 • 100 %,
где ДА) — оптическая плотность плазмы, не содержащей исследуемой
субстанции; ДА2 — оптическая плотность плазмы, содержащей
потенциальный ингибитор.
В каждом опыте перед добавлением хромогенного субстрата измеряют
оптическую плотность растворов (фон), которая вычитается из значения
оптической плотности после добавления субстрата.
Описание дано для работы с кюветой объемом 2 мл. При работе с
кюветой вместимостью 1 мл объем реагентов уменьшают в 2 раза.
Исследования in vitro можно проводить также по методу Astrup на фиб-
риновых пластинах или эуглобулиновым методом [8].
In vivo в экспериментах на крысах или собаках также проводят контроль
фибринолитической активности с помощью наборов с хромогенными
субстратами либо на фибриновых пластинах, либо эуглобулиновым методом.
Конкретную точку приложения действия потенциального антифибри-
нолитического агента можно уточнить в постскрининговых исследованиях,
изучив его влияние на активность тканевого и урокиназного активаторов
плазминогена, толерантность сгустка к плазмину и др.
Препаратами сравнения в случае непосредственного ингибитора
плазмина могут быть контр икал или апротинин. Если же ингибитор является
блокатором генерации плазмина, то его целесообразно сравнить с амбеном
или аминокапроновой кислотой.
Л ите ратура
1. Ноте W. С, Simons E. R. // Thromb. Res. - 1978. - Vol. 13, N. 4. - P. 599-607.
2. Tangen 0., Berman H. C, Ma фу P. // Thromb. Diath. ffaemorr. - 1971. — Vol. 25. -
P. 268-278.
3. Plow E. E, Marguerie G. // Proc. Natl. Acad. Sci USA. - 1982. - Vol. 79. - P. 3711 —
3715.
4. Born G. G. V. I/ Nature (London). - 1962. - Vol. 194. - P. 927-929.
5. Walkowiak В., Michalak E., Kovolkiewich W., Cierniewski С W. 11 Thromb. Res. — 1990.
- Vol. 56, N 6. - P. 763-766.
6. Eeamley G., Balmforth G., Feamley E. // din. Sci. - 1957. - Vol. 16, N 4. - P. 645.
7. Матяшова М. А. Влияние индукторов и ингибиторов агрегации тромбоцитов на
формирование экспериментального тромба: Дис. ... канд. мед. наук. — М., 1978.
8. Балуда В. П., Баркаган 3. С, Гольдберг Е. Д. и др. Лабораторные методы
исследования системы гемостаза. — Томск, 1980.
9. Markwardt F. Naunyn Schmiedebergs // Arch. Pharmacol. — 1956. — Vol. 229. —
P. 389-399.
10. Griessbach V., Stunebecher J., Markwardt F. // Thromb. Res. — 1985. — Vol. 37(2). —
P. 347-350.
11. Wessler S., Reimer S. M., Sheps M. С J. Appl. Physiol. - 1959. - Vol. 14(9). - P. 943-
946.
12. Чазов Е. И., Лакш К. М. Антикоагулянты: и фибринолитические средства. — М.:
Медицина, 1977.
13. BematA., Dot E, Herbert M. et al. Fibrinolysis. — 1993. - Vol. 7, N 1. — P. 23—40.
14. Collen D., De Mol M., Demarsin F. et al. Fibrinolysis. — 1993. — Vol 7, N 4. — P. 242—
247.
15. Баркаган 3. С, Момот А. П. Основы диагностики нарушений гемостаза. — М.:
Ньюдиамед АО, 1999.

ЧАСТЬ 3
ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ,
ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ
СИСТЕМЫ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ
Методические указания по экспериментальному изучению
противокашлевых и муколитических средств
СОСТАВИТЕЛЬ: д. м. н., проф. В. Л. Ковалева
Введение
Кашель, как известно, является наиболее распространенным
респираторным симптомом. В норме кашель является защитным механизмом
и служит для очищения дыхательных путей от секрета, избыточно
накапливающегося в крупных бронхах и трахее, инородных тел и ирри-
тантов.
Кашель инициируется химической и механической стимуляцией
рецепторов носа, пищевода, гортани, трахеи, крупных бронхов, а также плевры,
перикарда и диафрагмы. Среди провоцирующих кашель агентов
важнейшими являются курение, воздушные поллютанты (диоксид азота, диоксид
серы, озон и др.). Стимул проводится через афферентные волокна п. vagus
к "кашлевому центру", расположенному в стволе головного мозга.
Рефлекторная дуга замыкается эфферентными волокнами п. vagus и спинальных
нервов С2 и СЗ, идущих к мышцам диафрагмы, грудной клетки и живота.
Кашель возникает при сокращении этих мышц с последующим внезапным
открытием голосовой щели.
Патологические состояния дыхательных путей, основным симптомом
которых является кашель, хорошо известны. К ним относятся:
1. Обструктивные заболевания дыхательных путей (бронхиальная астма,
хронический обструктивный бронхит).
2. Инфекция дыхательных путей (острый бронхит, пневмония.
3. Фарингит, синусит, туберкулез).
4. Интерстициальный фиброз легких.
5. Саркоидоз.
6. Бронхогенные карциномы (у 70—90 % больных с бронхогенной
карциномой кашель является ведущим симптомом).
7. Рецидивирующие аспирации у пожилых пациентов и у больных с
заболеваниями центральной нервной системы и нарушением глотания.
Кроме того, возможен психогенный кашель, встречающийся при
психоэмоциональных расстройствах. Он не сопровождается продукцией мокро-
-476-

ты, обычно не возникает в ночное время и не поддается влиянию
традиционно используемых противокашлевых препаратов.
Сильный приступ кашля, в особенности так называемый сухой кашель,
резко увеличивает внутрилегочное давление, что приводит к снижению
наполнения кровью правого желудочка сердца; в результате уменьшается
ударный объем, могут возникнуть синусовая аритмия и понижение
давления в большом круге кровообращения, нарушение газообмена. Сильный
приступ кашля или длительный неукротимый кашель может быть
источником и ряда других осложнений — от разрыва прямой мышцы живота до
перелома ребер и пневмоторакса [Empey, 1980; Irwin, 1981]
Недавние экспериментальные и клинические исследования показали,
что в реализации кашлевого рефлекса, кроме центрального механизма,
основными элементами которого являются дельта-опиоидные рецепторы
[Kotzer et al, 2000] и серотониновые рецепторы первого типа (5-НТ1А)
[Stone et al., 1997], участвует НАНХ-система (неадренергическая нехоли-
нергическая система). Ключевую роль в этой системе играют субстанция Р
и нейрокинин А. В слизистой оболочке трахеобронхиального дерева
человека и других млекопитающих выявлена высокая плотность рецепторов
субстанции Р и тахикининов — NK(1), NK(2), NK(3). Получены
убедительные доказательства того, что кашлевой рефлекс реализуется через эти
рецепторы [Moreaux et al., 2000].
Таким образом, длительный, изнуряющий пациента кашель, особенно
непродуктивного характера (т. е. без образования слизи), требует
определенного терапевтического вмешательства, направленного на подавление
приступа кашля и улучшение дренажной функции бронхов.
Современные противокашлевые лекарственные средства подразделяют
на 2 группы [Харкевич, 1993]:
1. Средства центрального действия.
2. Средства периферического действия.
К традиционным препаратам 1-й группы относят кодеин,
наркотические анальгетики, окселадина цитрат. К широко используемым
препаратам 2-й группы принадлежит либексин. Выраженными противокашлевы-
ми свойствами обладают некоторые новые современные лекарственные
средства, например весьма перспективный препарат для лечения бронхо-
легочной патологии — фенспирид (нестероидный
противовоспалительный препарат), недавно вошедший в клиническую практику [Laude et al.,
1995].
Для поиска и изучения новых фармакологических веществ с
потенциальной противокашлевой активностью используют ряд экспериментальных
моделей кашля, которые условно можно подразделить на модели кашля с
преимущественно центральным механизмом (кашель индуцируется,
например, капсаицином) и модели кашля с периферическим механизмом
(раздражение ирритантных рецепторов слизистой оболочки трахеи и
бронхов).
НОВИЗНА ПРЕДЛАГАЕМОГО МЕТОДА
Впервые представлены рекомендации по исследованию
экспериментальных моделей кашля, методов первичного отбора и углубленного
изучения фармакологических веществ на этапе доклинического исследования
противокашлевых и муколитических средств.
- 477 -

ОПИСАНИЕ МЕТОДОВ
1. Экспериментальные модели для изучения противокашлевой активности
новых фармакологических веществ
/./. Первичный отбор новых фармакологических веществ
с противокашлевой активностью
Для скрининга желательно использовать классическую модель кашля у
морских свинок, индуцированного лимонной кислотой. Эта модель вполне
доступна и хорошо воспроизводима. При анализе литературы,
посвященной поиску веществ с противокашлевой активностью, можно встретить
описание разнообразных моделей кашля с участием разных
экспериментальных животных, однако подавляющее большинство исследователей
вполне справедливо считают модель с индукцией кашля лимонной
кислотой наиболее адекватной, хорошо контролируемой и воспроизводимой в
100 % случаев [Braga et al, 1993; Laude et al, 1995; Kapui et al, 1998; Kotzer
et al., 2000].
Чрезвычайно интересными и важными представляются результаты
недавно проведенных экспериментов на морских свинках, в которых было
показано, что кашель-индуцирующее действие лимонной кислоты
реализуется через дельта-опиоидные рецепторы [Kotzer et al., 2000] и NK-рецеп-
торы [Advenier et al., 1993; Moreaux et al, 2000].
Необходимо подчеркнуть, что имеются значительные видовые различия
в реактивности экспериментальных животных на кашель-индуцирующие
агенты (лимонную, лауриловую кислоты, капсаицин и др.). В специальном
исследовании, посвященном сравнительному изучению интенсивности
кашлевой реакции, вызванной аэрозольным воздействием лимонной
кислоты и капсаицина, у морских свинок, крыс линии Вистар и кроликов,
было показано, что на лимонную кислоту и капсаицин реагируют кашлем
100 % морских свинок. При этом интенсивность кашлевой реакции
хорошо коррелирует с концентрацией лимонной кислоты или капсаицина.
Только 43 % крыс реагировали кашлем на аэрозоль лимонной кислоты и
28,6 % — на капсаицин. Что касается кроликов, то лишь у 61 % из них
удалось вызвать кашель на аэрозоль лимонной кислоты и ни в одном
случае — на капсаицин. В заключение был сделан вывод, что морские свинки
наиболее предпочтительны для воспроизведения кашля, индуцированного
химическими агентами [Tatar et al, 1997].
1.2. Модель кашля у морских свинок, индуцированного лимонной кислотой
[Ucelay et al., 1991]
Морских свинок (самок и самцов) массой 300—400 г перед началом
опыта (за 14—16 ч до опыта) оставляют без корма. Животных размещают
(каждого по отдельности) в камере из плексигласа или тефлона
(20 х 14 х 12 см). Морской свинке, находящейся в камере, ингалируют в
течение 5 мин с помощью специального устройства (ультразвукового или
пневматического компрессора)* аэрозоль 10—17 % водного раствора
лимонной кислоты (Sigma). Эксперимент состоит из 2 этапов. На первом
* Можно применять в аналогичных экспериментах небулайзер фирмы Pari, скорость
воздушного потока которого составляет 0,16 л/с, давление 0,5 bar.
- 478 -

этапе животных индивидуально тестируют по интенсивности реакции на
лимонную кислоту за день до введения испытуемого вещества. В опыт
отбирают группу интенсивно кашляющих морских свинок (в среднем 20—30
кашлевых приступов в течение 30 мин). На втором этапе (на следующий
день) испытывают собственно противокашлевые свойства изучаемого
вещества. Для этого животным вводят парентерально (подкожно,
внутримышечно, внутрибрюшинно за 5—10 мин до индукции кашля) или внутриже-
лудочно (за 30—60 мин до индукции кашля) или ингаляционно (в виде
аэрозоля) испытуемое вещество в нужном диапазоне доз. После
терапевтического вмешательства морскую свинку подвергают аэрозольному
воздействию 10—17 % раствора лимонной кислоты в течение 5 мин. Подсчитывают
количество приступов кашля в течение последующих 15—20 мин и
выражают полученные результаты в процентах от нелеченого контроля,
который принимают за 100 %. В случае использования нескольких доз
вещества определяют дозовую зависимость. При необходимости оценивают
длительность противокашлевого эффекта и уровень толерантности к нему.
В зависимости от цели эксперимента в качестве референтных препаратов
центрального действия могут быть использованы морфин (0,01—1 мг/кг
внутрибрюшинно), кодеин (5—20 мг/кг подкожно), либексин, окселадина
цитрат и др.; из группы препаратов периферического действия — леводро-
пропизин, фенспирид (3—10 мг/кг в виде аэрозоля).
2. Углубленное изучение новых фармакологических веществ
с противокашлевой активностью
Углубленное изучение новых веществ с противокашлевой активностью
проводят с целью выяснения их механизмов действия, причем модель
кашля, индуцированного капсаицином, необходима в первую очередь для
исследования веществ с предполагаемым центральным механизмом
противокашлевого действия, а остальные модели (2.2; 2.3; 2,4) могут быть
использованы для изучения противокашлевых веществ с преимущественно
периферическим механизмом действия.
2.1. Модель кашля у морских свинок, индуцированного капсаицином —
селективным кашель-индуцирующим агентом
Эту модель следует рассматривать как важнейшую на этапе более
детального изучения противокашлевых веществ, так как механизм действия
капсаицина неоднозначен: с одной стороны, эффект капсаицина
реализуется через опиоидные рецепторы, о чем свидетельствует блокада его
действия морфином [Rogers, Barnes, 1989], а с другой стороны, его эффект
опосредован рецепторами нейропептидов [Lavezzo et al., 1992].
Процедура подготовки и тестирования морских свинок та же, которая
описана в 1.1. Для индукции кашля животным ингалируют с помощью не-
бульйзера или другого распылителя капсаицин (Sigma) в концентрации
15—30 мкМ в течение 5 мин.
Способы введения тестируемых веществ, оценка противокашлевого
эффекта и референтные препараты те же, что и в разделе 1.1. Из наиболее
подходящих референтных препаратов можно назвать леводропропизин,
который, как полагают, обладает прямым влиянием на С-волокна. В
некоторых случаях, когда необходимо оценить прямое воздействие вещества на
- 479-

рецепторы, его вводят непосредственно в желудочки мозга
наркотизированной морской свинки.
Для изучения агонистического или антагонистического действия
тестируемых веществ на этой модели используют в качестве неселективного
антагониста опиоидных рецепторов налоксон (3 мг/кг, внутримышечно),
селективных антагонистов опиоидных рецепторов : mu-рецепторов — beta-
funaltrexamine (20 мг/кг, подкожно), sigma-рецепторов — rimcazole (внут-
рибрюшинно), дельта-рецепторов — налтриндол, а в качестве селективных
агонистов опиоидных рецепторов: дельта-рецепторов — DADLE (D-AJIA-
D-лей-энкефалин), mu-рецепторов — codeine phosphate, hydrocodone;
kappa-рецепторов — BRL 52 974, sigma-рецепторов — dextromethorphan (внут-
рибрюшинно) [Lavezzo et al., 1992; Kotzer et al., 2000].
Общепризнанно, что моделирование кашля у свинок с помощью
лимонной кислоты и капсаицина является наиболее репрезентативным. С этой
точки зрения указанные модели более всего подходят для исследования про-
тивокашлевых свойств веществ. Гораздо реже используются некоторые
другие экспериментальные модели кашля: они весьма трудоемки и сложны в
техническом отношении и неоднозначны по получаемым результатам. Тем
не менее мы считаем необходимым их упомянуть для получения более
полного представления о моделях кашля, описание которых мы нашли в
литературе.
2.2. Модель кашля, индуцированного механическим раздражением слизистой
оболочки трахеи, у наркотизированных кошек и морских свинок [Bolser et
al., 1994, 1997] *
Кошек массой 2,5—4,5 кг наркотизируют пентобарбиталом внутрибрю-
шинно в дозе 35 мг/кг. При необходимости дополнительно вводят
анестетик в дозе 5 мг/кг. В трахею (на уровне интраторакального отдела)
вставляют канюлю, через которую механически раздражают слизистую оболочку
трахеи движением кверху и книзу в течение 10 с фиксированного на
проволочной нити полиэтиленового цилиндра диаметром 5 мм и длиной 10
мм. Для регистрации сокращений диафрагмальных и абдоминальных
мышц, характеризующих силу кашля, использовали биполярные
электроды (соединенные с самописцем), которые вставляли через небольшие
разрезы по средней линии прямой мышцы живота. Исследуемые вещества
вводят через канюлю, вставленную в вертебральную артерию. Противо-
кашлевой эффект оценивают по числу кашлевых толчков, возникающих на
каждый механический стимул, и по размеру амплитуды сокращения
диафрагмальных мышц (инспираторных и экспираторных), которые
регистрировали с помощью электромиографа.
2.3. Модели кашля, индуцированного диоксидом серы (газ) или аммонием
(газ) у мышей [Saha et al., 1997]
В этих моделях чаще всего используют белых нелинейных мышей.
Животных размещают в прозрачной клетке из плексигласа, в которую
подают диоксид серы или аммоний. Противокашлевое действие оценива-
*В другом варианте модели используют электрическое раздражение верхнего
гортанного нерва.
-480 -

ется положительно, если мыши не кашляют в течение 3 мин.
Использование этих моделей требует специального оборудования для подачи газа
животным.
2.4. Модель кашля, индуцированного Bordetella pertussis bacilli у мышей
[Guiso et al, 1999] и крыс [Parton et al, 1994]
Специфическая модель, требующая специальных условий для работы с
культурами бактерий (эксперимент проводится в боксе). Заражение мышей
или крыс проводится интраназально.
3. Исследование муколитических свойств новых фармакологических веществ
Муколитики имеют большое значение в лечении заболеваний
дыхательных путей, сопровождающихся затруднением удаления секрета из их
верхних и нижних отделов. Роль муколитиков значительно возрастает при
повышенной вязкости мокроты, которая может стать причиной застоя
бронхиального секрета при обструкции нижних дыхательных путей (например,
при бронхиальной астме, хроническом обструктивном бронхите). Удаление
мокроты способствует улучшению вентиляции альвеол и предупреждению
инфекции дыхательных путей.
Длительное время основными препаратами, применяемыми для этой
цели, были отхаркивающие средства, действие которых в значительной
мере связано со стимуляцией рецепторов слизистых оболочек бронхов и
механическим усилением продвижения мокроты.
В последнее время появились новые возможности повышения
дренажной функции трахеи и бронхов с помощью новых эффективных средств,
которые обладают способностью влиять на реологические свойства
мокроты, ее адгезивные показатели, а также облегчать выведение мокроты
физиологическим путем. В отличие от прежних секретомоторных препаратов,
стимулирующих только отхаркивание (трава термопсиса, корень алтея,
пертуссин, глицирам, бензоат натрия и др.), новые препараты обладают
муколитическими (т. е. бронхосекретолитическими) свойствами:
усиливают физиологическую активность мерцательного эпителия, перистальтику
бронхов и стимулируют секрецию бронхиальных желез, а также
уменьшают вязкость мокроты. Одним из эффективных препаратов этой группы
является бромгексин.
3.1. Исследование муколитической активности веществ [Perry et al., 1941]
Морских свинок или кроликов (по 8—10 в группе) анестезируют этами-
налом натрия (40 мг/кг). В трахею животного вставляют канюлю,
соединенную с аппаратом искусственного дыхания (Ugo Basile), после чего
животное укладывают вниз головой под углом 45°. Мокроту из канюли
собирают отсасыванием с помощью шприца в течение 2 ч после введения
лекарства.
Испытуемое вещество вводят внутрибрюшинно или внутрижелудочно в
объеме 1 мл (в соответствующем диапазоне доз). Сравнивают объем
мокроты, полученной у животных, которым вводили испытуемое вещество, и
леченных препаратом сравнения — ацетилцистеином, бромгексином (суб-
16 - 762
-481 -

станция). Желательно исследовать и качественный состав мокроты:
вязкость, плотность и т. д. и сравнивать его с нелечеными животными и
леченными эталонными препаратами.
ПРЕДПОЛАГАЕМАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ
Применение данных методических указаний при поиске и отборе новых
фармакологических веществ, обладающих противокашлевой и муколитиче-
ской активностью, позволит при проведении доклинических исследований
объективно оценить их специфическое фармакологическое действие с
целью решения вопроса о целесообразности и возможности проведения
клинических исследований.
Л итература
1. Харкевич Д. А. Фармакология. — М.: Медицина, 1993.
2. Advenier С, Girard V., Naline E. et al. Antitussive effect of SR 48 968, a non-peptide
tachykinin NK2 receptor antagonist // Eur. J. Pharmacol. — 1993. — Vol. 250(1). — P.
169-171.
3. Braga P. C, Bossi R., Piatti G. Dal Sasso M. Antitussive effect of oxatomide on citric asid-
induced cogh in conscious guinea pig // Arzneimittelforschung, 1993, 43(5), 550—553.
4. Bolser D. C, DeGennaro F. C, O'Reily. S. et al. Peripheral and central sites of action of
GABA-B agonists to inhibit the cough reflex in the cat and guinea pig // Br. J.
Pharmacol. - 1994. - Vol. 113. - P. 1344-1348.
5. Bolser D. C, DeGennaro F. C, O'Reily. S. et al. Central antitussive activity oof the
tachykinin receptor antagonists CP-99 994 and SR-48 968 in the cat and guinea pig // Br. J.
Pharmacol. - 1997. - Vol. 121. - P. 165-170.
6. Guiso N. et al. Intranasal murine model of Bordetella pertussis infection // Vaccine. —
1999. - Vol. 17(19). - P. 2366-2376.
7. Empey W. // Therapiewoche. - 1980. - Vol. 30. - P. 1913.
8. Irwin R. S. et al. // Therapiewoche. — 1981. — Vol. 31. — P. 6660.
9. Kapui Z., Mikus E. G., Bence J. et al. Experimental studies on the antitussive properties of
the new xanthine derivate // Arzneimittelforschung. — 1998. — Vol. 48(12). — P. 1147—
1155.
10. Kotzer С J., Hay D. W., Dondio G., Peetrillo P., Underwood D. С The antitussive activity
of delta-opioid receptor stimulation in guinea pigs // J. Pharmacol. Exp. Ther. — 2000. —
Vol. 292(2). - P. 803-809.
11. Laude E. A., Bee D., Crambes O., Howard P. Antitussive and antibronchoconstriction
actions of fenspiride in guinea-pigs // Eur. Respir. J. — 1995. — Vol. 8(10). — P. 1699—
1704.
12. Lavezzo A., Mellilo G., Clavenna G., Omini C. Peripheral site of action of levodropropizine
in experimentally-induced cough: role of sensory neuropeptides // Pulm. Pharmacol. —
1992. - Vol. 5(2). - P. 143-147.
13. Moreaux В., Nemmar A., Vincke G., Hallou D., Beerens D., Advenier C, Gustin P. Role of
substance P and tachykinin receptor antagonists in citric acid-induced cough in pigs //
Eur. J. Pharmacol. - 2000. - Vol. 408(3). - P. 305-312.
14. Parton R. et al. Responses to Bordetella pertussis mutant strains and to vaccination in the
coughing rat model of pertissis // J. Med. Microbiol. — 1994. — Vol. 40(5). — P. 307—
312.
15. Rogers D. F., Barnes P. J. Opioid inhibition of neurally mediated mucus secretion in
human bronchi // Lancet. — 1989. — Vol. II. - P. 930-932.
16. Saha K., Mukherjee P. K., Murugesan Т., Saha В., Pal M. Studies on in vivo antitussive
activity of Leucas lavandulaefolia using a cough model induced by sulfur dioxide gas in
mice // J. Ethnopharmacol. - 1997. — Vol. 57(2). - P. 89-92.
17. Stone R. A., Barnes P. J., Chung K. F. Effect of 5-HT1A receptor agonist, 8-OH-DPAT,
on cough responses in the conscious guinea pig // Eur. J. Pharmacol. — 1997. — Vol.
332(2). - P. 201-207.
-482-

18. Tatar M., Pecova R., Karcolova D. Sensitivity of cough reflex in awake guinea pigs, rats
and rabbits // Bratisl. Lek. Listy. - 1997. - Vol. 10. - P. 539-543.
19. Ucelay M., Labeaga L., Orjales A. et al. Evaluation of Bronchospsmolytic, Antiallergic,
Anti-inflammatory, Mucolytic and Antitussive Activities of Decasilate in Experimental
Models. // Arzneim.-Forschung / Drug. - 1991. — Vol. 41(1), N 5. — P. 528—532.
Методические указания по изучению фармакологических
веществ, предназначенных для лечения бронхиальной астмы
и других обструктивных заболеваний дыхательных путей
СОСТАВИТЕЛЬ: д. м. н., проф. В. Л. Ковалева
Введение
Современная концепция бронхиальной астмы описывает ее как
"характерный воспалительный процесс в бронхиальной стенке, который
вызывает развитие обструкции бронхов и их гиперреактивности, предрасполагая,
таким образом, бронхиальное дерево к сужению в ответ на различные
стимулы, как специфические (антиген), так и неспецифические (полютанты,
холодный воздух, физическое воздействие)" (Совместный доклад
Национального института здоровья США и Всемирной организации
здравоохранения, 1996).
Следует подчеркнуть, что приоритет в понимании сущности
патологической основы БА как аллергического воспаления принадлежит
отечественным ученым патофизиологам-аллергологам — А. Д. Адо и его школе:
И. С. Гущину, В. И. Пыцкому, Л. А. Горячкиной и др.
Как известно, главный клинический патологический признак
бронхиальной астмы — обратимая обструкция бронхов. Различают два вида
бронхиальной обструкции: обратимую и необратимую. Предполагается, что
обратимая обструкция бронхов вызывается острым аллергическим
воспалением дыхательных путей, важнейшими свидетельствами которого
являются: а) отек слизистой и подслизистой оболочек бронхов; б) инфильтрация
стенки бронхов клетками воспаления, в первую очередь эозинофилами,
базофилами, тучными клетками и др., являющимися основными эффек-
торными звеньями воспалительной реакции благодаря их способности сек-
ретировать преформированные (гистамин и др.) и вновь генерируемые
(PG, LT, PAF) медиаторы воспаления, которые действуют на
клетки-мишени непосредственно и через нейрогенные механизмы; в) обширные
поля десквамации клеток реснитчатого эпителия бронхов; г) слизистые
пробки, обтурирующие мелкие и средние бронхи; д) гиперплазия гладких
мышц бронхов [Чучалин, 1997; Barnes, Chung, Page, 1988].
В свою очередь необратимая бронхоконстрикция связана со
структурной перестройкой коллагена в стенках сосудов и бронхов, совершающейся
в результате глубокого повреждения эндотелия. Этот процесс приводит к
гипертрофии и гиперплазии гладких мышц и является неуклонно
прогрессирующим. Обратимая бронхиальная обструкция поддается
терапевтическому воздействию, цель которого — не допустить или по крайней мере
затормозить переход обратимой обструкции в необратимую, так как в слу-
16*
- 483 -

чае необратимой бронхоконстрикции ни один из известных препаратов,
включая кортикостероиды, не способен существенно ослабить ее.
Второй главный признак БА — резко усиленная реактивность
дыхательных путей, которая является неотъемлемым качеством всех клинических
форм БА независимо от этиологического фактора (атопическая, инфекци-
онно-зависимая, астма физического усилия, холодовая). Наиболее важная
черта бронхиальной гиперреактивности — ее неспецифичность: больные
БА отвечают бронхоспазмом на широкий круг эндогенных и экзогенных
стимулов, подавляющее большинство которых индифферентно для
здоровых людей [Cockcroft, 1988; O'Byrne, 1988].
Общеизвестно, что одним из основных (по крайней мере для атопиче-
ской БА) патогенетических механизмов БА, обусловливающих спазм
бронхов, является анафилактическая реакция на антиген у
сенсибилизированного индивида, реализуемая тучными клетками и базофилами через IgE-
зависимый механизм [Гущин, 1998].
Кроме того, недавние исследования позволили оценить принципиально
важную роль Т-лимфоцитов в развитии астматического воспаления.
Показано, что Т-лимфоциты являются центральными клетками в
регулировании воспалительной реакции дыхательных путей, которое осуществляется
посредством высвобождения цитокинов (IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, GM-
CSF) и их действия на клетки-мишени аллергии [Chung, 1992; Robinson et
al., 1993; Holgate, 1993]. Появляется все больше свидетельств, что в
поддержании воспалительной реакции бронхов имеет значение выработка
цитокинов не только Т-лимфоцитами, но и структурными клетками-фиброб-
ластами, клетками эндотелия легочных сосудов и цилиндрического
эпителия бронхов [Robinson et al., 1993; Nicod, 1993; Corrigan, 1994].
Иммунологические исследования последних лет выявили важную роль
Т-лимфоцитов в иммунном каскаде, сопровождающем реакцию антиген-
антитело. Недавно было показано, что тучные клетки и базофилы человека
участвуют в синтезе IgE В-лимфоцитами с помощью механизма выброса
IL-4 и вовлечения CD40, что свидетельствует о роли тучных клеток и базо-
филов в инициировании и поддержании IgE-зависимой аллергической
реакции в тканях, опосредованной Т-лимфоцитами [Gauchat et al., 1993]. Но
обнаружен и IgE-независимый механизм аллергической реакции, при
которой Т-лимфоциты, активированные соответствующим антигеном, могут
привлекать и активировать другие лейкоциты, в первую очередь эозинофи-
лы, а также тучные клетки, альвеолярные макрофаги, т. е. Т-лимфоциты
способны прямо провоцировать начало воспалительного каскада. В этом
случае активированные Т-лимфоциты сами по себе являются провоспали-
тельными клетками [Кау, 1991; Holgate, 1993].
Важным патогенетическим фактором при ХОЗЛ является нарушение
мукоцилиарного клиренса: асинхронизация и замедление (вплоть до
полной остановки) движения ресничек мерцательного эпителия, его
метаплазия, увеличение числа бокаловидных клеток, изменение количественного и
качественного состава бронхиального секрета (постепенное замещение
фазы золя фазой геля), снижение содержания в бронхиальном секректе
компонентов местного неспецифического иммунитета и секреторного IgA. Все
это вместе приводит к образованию характерных слизистых пробок, обту-
рирующих просвет бронхов, и к активизации микрофлоры,
поддерживающей воспалительный процесс в дыхательных путях.
Гиперфункция и повреждение мерцательного эпителия бронхов в
свою очередь вызывают пролиферацию миофибрилл и отложение
коллагена в базальной мембране. Этот процесс заканчивается гиперплазией и
-484-

гипертрофией гладкой мускулатуры бронхов, являющихся основой
изменения реактивности дыхательных путей [Barnes et al., 1988; Pretolani et
al., 1989].
При формировании гиперреактивности и обструкции бронхов
немаловажное значение имеют не только эффекторные клеточные механизмы, но
и нарушения регуляции тонуса гладких мышц дыхательных путей.
Регуляция тонуса гладких мышц бронхов — это комплексный процесс, в котором
участвуют различные рецепторы клеточной мембраны, посредством
которых осуществляется баланс между бронхоконстрикторным действием
парасимпатической нервной системы, с одной стороны, и бронхорасширяю-
щим действием бета-адренергической системы — с другой.
Из представленного анализа основных патогенетических механизмов
БА и ХОЗЛ логически вытекают основные принципы фармакотерапевти-
ческих подходов к этой патологии: быстрое купирование спазма бронхов,
обеспечение нормализации тонуса бронхов, надежный контроль
аллергического воспаления дыхательных путей, что позволяет предупреждать
самую возможность развития спастических реакций с их стороны,
улучшение мукоцилиарного клиренса.
В соответствии с изложенным стратегия создания новых
антиастматических средств должна быть нацелена на поиск и изучение:
1) бронхорасширяющих средств;
2) средств, контролирующих аллергическое воспаление дыхательных
путей;
3) муколитических средств.
Разработка методических рекомендаций по изучению специфической
фармакологической активности средств, предназначенных для лечения
ХОЗЛ, имеет конечной целью унификацию методов и экспериментальных
моделей, использование которых позволило бы исследователям,
работающим в данной области, выполнить необходимую часть фармакологической
работы на современном уровне с минимальными затратами на
приобретение дорогостоящих животных, материалов и др.
Наш собственный опыт работы на перечисленных ниже моделях
показал их информативность, доступность и хорошую воспроизводимость.
НОВИЗНА ПРЕДЛАГАЕМОГО МЕТОДА
Настоящие методические указания являются исправленным и
дополненным вариантом аналогичных указаний Руководства по
экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ
2000 г.
ОПИСАНИЕ МЕТОДОВ
1. Первичное изучение бронхолитической активности веществ
на экспериментальных моделях in vitro
Для первичного отбора (скрининга) новых веществ, обладающих брон-
хорасширяющей активностью, необходимы простые, доступные и
недорогие экспериментальные модели, позволяющие быстро получить результаты
испытания нового ХС. К числу таких относятся модели контрактуры
гладких мышц изолированных органов морской свинки, в первую очередь тра-
-485 -

хеи и главных бронхов; в некоторых случаях — подвздошной кишки и
матки. В качестве классических бронхоконстрикторных агентов применяют
гистамин и ацетилхолин (или карбахолин).
Необходимо учитывать, что для скрининга и изучения веществ с
предполагаемым бета 2-адреномиметическим действием лучше использовать
трахею, главные бронхи или матку морской свинки (в которых
превалируют бета-рецепторы 2-го типа), а бронхолитическую активность веществ с
неизвестным механизмом действия можно исследовать на любой из
указанных моделей, но желательно начинать с контрактуры изолированной
трахеи.
/./. Приготовление изолированного гладкомышечного препарата трахеи
[Blattner et al, 1980]
В эксперименте используют морских свинок (самок и самцов) массой
500-600 г.
У наркотизированной морской свинки осторожно извлекают трахею и
разрезают на кольца по 2 хряща в каждом. Полученные кольца (по 5
колец) соединяют в цепочку и разрезают хрящи. Подготовленную цепочку
(изолированный препарат трахеи) помещают в термостатируемую камеру
(37 °С), соединенную с датчиком и содержащую раствор Кребса—Хенсляй-
та (119 mM Nad, 4,8 тМ КС1, 1,2 тМ MgCl2, 1,2 мМ СаС12, 2,53 тМ
NaHC03, 24,8 тМ глюкозы, рН 7,4). В качестве датчика, преобразующего
механический сигнал в электрический, может быть использован
отечественный прибор Механотрон 6М х 2Б или другой датчик.
Исследование релаксирующей способности изучаемых веществ
проводят либо в изотоническом, либо в изометрическом режиме. В зависимости
от этого исходная нагрузка на препарат должна составлять 0,5—0,7 г при
работе гладкомышечного органа в изотоническом режиме и 1,5—2 г при
работе в изометрическом режиме.
Сокращение трахеи регистрируют с помощью самописца. Релаксацию
гладкомышечного препарата трахеи выражают в процентах от
максимальной амплитуды сокращения, вызываемого добавлением в инкубационную
среду медиатора. Определяют среднюю величину от измерений 4—5
отрезков. Строят кривую доза—эффект. Среднеэффективную концентрацию
(1С50) определяют графически по методу Литчфидда и Вилкоксона.
1.2. Модель гистамин- и ацетилхолин-индуцированной контрактуры
гладких мышц изолированной трахеи морской свинки
Сокращение гладкомышечного препарата изолированной трахеи,
приготовленного описанным выше способом, вызывают добавлением в
инкубационную среду гистамина (Sigma) или ацетилхолина (Sigma) в
концентрации 10~5—10"6 М. Через 30—60 с после внесения спазмогена
регистрируют максимальную амплитуду сокращения трахеи. Исследуемое
соединение вносят на высоте контрактуры в тот момент, когда амплитуда
сокращения достигает плато. Вещества добавляют в ванночку кумулятивно в
концентрации от Ю-12 до Ю-4 М после добавления медиатора на высоте
амплитуды сокращения или однократно предварительно (в том же
диапазоне концентраций) за 3 мин до инициации контрактуры.
Для оценки бронхорасширяющей активности исследуемого вещества в
- 486 -

качестве препаратов сравнения удобно использовать традиционные брон-
холитики — сальбутамол, теофиллин с тем, чтобы сопоставить их средне-
эффективные концентрации (1С50).
1.3. Модель анафилактической контрактуры гладких мышц изолированной
трахеи активно сенсибилизированной морской свинки (реакция Шульца—
Дейла) [Koda et al, 1970]
Морскую свинку активно сенсибилизируют внутрибрюшинным или
внутримышечным введением 0,5 мл физиологического раствора,
содержащего овальбумин (Sigma, grade III) (антиген) в дозе 20 мкг и 100 мг
А1(ОН)3 (адьювант) на свинку. Показано, что при таком способе
сенсибилизации (антиген в маленькой дозе + адъювант в большой дозе) у
животного через 3—4 недели образуются гомоцитотропные антитела,
принадлежащие к классу IgE [Andersson, 1980].
Эксперимент начинают через 4—5 нед после сенсибилизации.
Выделение трахеи и приготовление из нее препарата осуществляют по
описанному выше способу. Сокращение препарата трахеи вызывают добавлением в
культуральную среду овальбумина в концентрации 1 — 10 мкг/мл.
Исследуемое соединение вносят в ванночку в концентрации 10"'2—10-5 М в
кумулятивном режиме. Предварительно вызывают сократительный ответ
гладкомышечного препарата трахеи на воздействие гистамина (10~5 М).
Амплитуда сокращения, вызванного ОА, должна составлять не менее 80 %
от амплитуды сокращения, вызываемого гистамином. Определение
эффекта изучаемого соединения производится описанным выше способом. В том
случае, если испытуемое соединение плохо растворяется в воде, его
растворяют в ДМСО. Наш опыт работы показал, что 10—20 % концентрация
ДМСО не оказывает расслабляющего влияния на гладкую мускулатуру.
Однако необходимо учитывать склонность сенсибилизированной
гладкой мышцы к спонтанному расслаблению. В силу этого обстоятельства
необходимы строгие контроли и неоднократные повторения эксперимента с
одними и теми же концентрациями изучаемого вещества.
В качестве препарата сравнения удобно использовать кромогликат
натрий (интал), недокромил натрий или другие антиаллергические
препараты.
1.4. Модель анафилактической контрактуры гладких мышц изолированного
препарата ileum морской свинки [De Angelis, 1980]
В некоторых случаях, когда необходимо испытать одновременно
несколько веществ, можно использовать в качестве гладкомышечного
препарата отрезок тонкого кишечника морской свинки. Преимущество работы с
изолированными отрезками тонкой кишки состоит в том, что таких
отрезков от одной и той же морской свинки можно получить в большом
количестве — до 7—15. Недостатком же является вероятность значительных
межиндивидуальных различий по степени сенсибилизированное™
антигеном.
Методика активной сенсибилизации овальбумином (ОА) морской
свинки описана выше. У животного после умерщвления немедленно извлекают
из брюшной полости тонкую кишку, выделяют участок ileum, ближайший
к илеоцекальному углу. Участок разрезают на сегменты длиной 10 мм. От-
-487-

дельный сегмент кишки прошивают с обеих сторон и помещают в термо-
статируемую ванночку при 37 "С, содержащую раствор Кребса—Хенсляйта.
Сегмент прикрепляют к тонкому крючку, соединенному с датчиком, и
уравновешивают его в течение 60 мин с помощью базальной нагрузки,
равной 0,5—0,7 г (в изотоническом режиме).
Прежде всего оценивают ответ данного сегмента кишки (его
реактивность) на гистамин, который вносят в ванночку в концентрации 10~5—
10"7 М. После удаления гистамина, отмывания его раствором Кребса и
возвращения мышцы к исходному состоянию последующее сокращение
сегмента кишки вызывают овальбумином в концентрации 1—10 мкг/мл. В
каждом эксперименте сократительный ответ мышцы отдельного сегмента на ОА
сравнивают с тем сокращением, которое было вызвано гистамином в
соответствующей концентрации. Степень выраженности ответа данного сегмента
на ОА выражают в процентах от сократительного эффекта гистамина.
Уровень сенсибилизации считается достаточным, если ответ сегмента на ОА
составляет не менее 80 % от ответной реакции на гистамин.
Испытуемые вещества в диапазоне концентраций Ю-12—Ю-4 М вносят в
ванночку либо за 3 мин до ОА-индукции, либо на высоте контрактуры
сегмента кишки (кумулятивно).
Эффект воздействия вещества оценивают как торможение
анафилактического сокращения препарата кишки, выраженное в процентах от амплитуды
сокращения контрольного препарата (инкубация только с растворителем).
Каждый сегмент может прореагировать с ОА только один раз, поэтому при
инкубации сегмента с веществом следует начинать с самой низкой его
концентрации, постепенно повышая до 10~4 М. Среднеэффективная
концентрация ID50 высчитывается графически по Литчфилду—Уилкоксону.
1.5. Модель спонтанного тонуса гладких мышц изолированной трахеи
морской свинки [Sakai et al., 1992]
В тех случаях, когда нужно выявить прямое действие вещества на тонус
гладкой мышцы, используют модель спонтанного тонуса трахеи.
Препарат трахеи готовят, как описано выше. Релаксацию спонтанного
тонуса гладкой мускулатуры трахеи вызывают добавлением в среду
культивирования изопреналина (1,0 мкМ). После отмывания на препарат дают
базальную нагрузку, равную 0,5 г. При этом спонтанный тонус
восстанавливается до постоянной величины.
Исследуемое соединение вносят в среду культивирования (раствор
Кребса—Хенсляйта) в концентрации Ю-9—10~4 М кумулятивно.
Релаксацию, вызванную изопреналином, принимают за 100 %. Определяют брон-
хорасслабляющий эффект изучаемого вещества, сравнивая его с эффектом
релаксации, вызванным изопреналином.
2. Углубленное изучение бронхолитической активности ХС
на экспериментальных моделях in vivo
2.1. Модели in vitro
При углубленном изучении веществ также необходимо использовать
модели контрактуры гладкомышечных органов in vitro, которые описаны в
разделе 1, но при этом спектр медиаторов контрактуры значительно рас-
- 488 -

ширяется. В зависимости от задач эксперимента применяют в качестве
бронхоконстриктора аденозин, лейкотриены С4 и D4, простагландины,
PAF. Возможна стимуляция электрическим током. В этом случае
применяют платиновые электроды величиной 1 см2, которые размещают вдоль
гладкомышечного препарата на расстоянии 10 мм от него для трансму-
ральной стимуляции электрическим током силой 320 тА в течение 10 с.
2.2. Модели in vivo
Оценка бронхолитического действия вещества, полученная in vitro, —
очень важный этап изучения бронхорасширяющего действия нового
соединения, так как эти модели позволяют получить быстрый ответ и
представление о диапазоне концентраций, однако без использования моделей
бронхоспазма in vivo нельзя сделать окончательный вывод о бронхорасши-
ряющей активности изучаемого вещества. Для выявления указанной
активности используют 2 традиционные модели бронхоспазма,
индуцированного либо гистамином, либо ацетилхолином (карбахолином, метахолином):
А. Модель бронхоспазма у наркотизированной морской свинки с
оценкой параметров внешнего дыхания.
Эта модель позволяет исследовать параметры внешнего дыхания
животного и количественно их оценить с помощью трансдуцера бронхоспазма и
самописца.
Б. Модель бронхоспазма у ненаркотизированной морской свинки с
аэрозольным воздействием бронхоконстриктора
2.2.1. Модель гистамин- и ацетилхолин-индуцированного бронхоспазма
[Konzett, Rossler, 1940]
В эксперименте используют морских свинок (самцов и самок) массой
350-400 г.
У наркотизированной морской свинки (этаминал натрий 70 мг/кг,
внутрибрюшинно) выделяют трахею, вставляют в нее канюлю, которую
подсоединяют с помощью системы полихлорвиниловых трубочек к
датчику бронхоспазма и аппарату искусственного дыхания (Ugo Basile). В
течение эксперимента поддерживается определенный режим дыхания: объем
дыхания — 6—8 мл, частота — 70 в минуту. Гистамин (Histamine
hydrochloride) 5—10 мкг/кг или ацетилхолин (Acetylcholine) 40 мкг/кг вводят
внутривенно (V. jugularis) с 15-минутным интервалом.
После трех одинаковых ответов на бронхоконстриктор вводят
исследуемое соединение и мониторируют ответ в течение 60—120 мин.
Исследуемое соединение вводят разными способами:
1) внутривенно (в надключичную или бедренную вену) за 2 мин до
индукции бронхоспазма;
2) внутрижелудочно (с помощью зонда) однократно за 1—2 ч или
многократно за 72, 48, 24 и 1 ч до введения бронхоконстриктора;
3) ингаляционно с помощью дозирующего устройства для ингаляции
либо растворов, либо сухих порошков за 30 мин до индукции
бронхоспазма.
С помощью самописца, подсоединенного к датчику, регистрируют
изменение сопротивления дыхательных путей воздушному потоку, т. е.
величину бронхоконстрикторной реакции. При введении медиатора (гистами-
-489-

на, ацетилхолина) сопротивление дыхательных путей резко возрастает. Эта
степень увеличения сопротивления бронхов эквивалентна величине брон-
хоспазма, индуцированного тем или иным констриктором.
Эффект исследуемого соединения оценивают по степени торможения
бронхоспазма, выраженной в процентах по отношению к максимальному.
Максимальный бронхоспазм вызывают полным пережатием трубочки,
соединенной с трахеальной канюлей, и принимают его за 100 %.
Сравнивают действие изучаемого соединения с нелеченым контролем и
с эффектом референтного препарата. В качестве последнего лучше всего
использовать сальбутамол как высокоэффективный бронходилататор,
эффект которого хорошо исследован на этой модели при всех способах
введения.
Другим традиционным препаратом сравнения является теофиллин; его
также можно использовать при внутривенном (2—20 мг/кг), внутрижелу-
дочном и интрадуоденальном способах введения.
Если испытуемое соединение плохо растворимо в воде и его
необходимо ввести парентерально, его растворяют в 10 % растворе ДМСО. В
некоторых случаях вещество вводят в виде суспензии интрадуоденально в 0,5 %
растворе карбоксиметилцеллюлезы или Твине-80.
2.3. Модель бронхоспазма у ненаркотизированной морской свинки
с аэрозольным воздействием бронхоконстриктора
У морских свинок индуцируют бронхоспазм аэрозольным воздействием
гистамина (1 % раствор) или ацетилхолина (0,5 % раствор) с помощью
ультразвукового или компрессорного небуляйзера. Морскую свинку
помещают в камеру, имеющую определенный объем, к которой подсоединяют
небуляйзер. Время экспозиции 20 с. Реакция на бронхокостриктор
оценивается по симптомам: чиханью, кашлю, одышке. Самое тяжелое
проявление реакции — коллапс (животное падает на бок) и гибель от удушья.
Оценивают латентный период (в минутах) между воздействием
бронхоконстриктора и первыми признаками бронхоспастической реакции и
сравнивают с контрольной группой (без лечения). Пути введения веществ и
препараты сравнения те же, что и в 2.1.
3. Контроль аллергического воспаления в легких
3.1. Модель аллергического воспаления и гиперреактивности дыхательных
путей [Hutson P. A., Church M. К. et al., 1988]
В экспериментах используют морских свинок обоего пола массой 300—
400 г. Схема иммунизации морских свинок: вначале животных
иммунизируют внутрибрющинным введением овальбумина в дозе 10 мг/кг с
7-дневным интервалом (дважды), затем свинкам ингалируют с помощью небу-
ляйзерной техники (Pari) раствор овальбумина в возрастающей
концентрации, начиная с 0,1 %, затем 0,2 %, 0,5 % и так увеличивая до 1 % с
интервалом в 4 дня между ингаляциями на протяжении 1,5 мес. Через 24 ч после
разрешающей дозы ОА (1 % раствор) изменения в дыхательных путях
оценивают с помощью комплекса методов: гистологических, морфометриче-
ских и цитологических. Гиперреактивность дыхательных путей оценивают
по метахолиновому или гистаминовому тесту (п. 2.2).
-490-

Цитологические методы
Забор бронхоальвеолярного смыва проводят под внутрибрюшинном
гексеналовым наркозом путем двукратного промывания легких через
трахею 10 мл подогретого до 37° С физиологического раствора.
Жизнеспособность клеток определяют в тесте с трипановым синим. В жидкости
бронхоальвеолярного смыва после центрифугирования при 200 g в течение 10
мин, определяют абсолютное количество клеточных элементов в 1 мл
смыва (цитоз). В мазках, окрашенных по Романовскому—Гимзе, подсчитывают
эндопульмональную цитограмму [Авцын А. П. и др., 1982; Романова Л. К.,
1985].
Морфометрические методы
Морфометрическое исследование лимфоидной ткани, ассоциированной
с бронхами, проводят в макропрепаратах по методу J. Beinenstock, W.
Fohnsonr, D. Perey, (1973). Легкие с трахеей удаляют из грудной полости.
Макропрепарат погружают в 2 % водный раствор уксусной кислоты и
помещают в холодильник (8—12 °С). Через 18—24 ч под лупой проводят мор-
фометрическую оценку лимфоидной ткани, ассоциированной с бронхами.
Легкие укладывают в чашку Петри, залитую парафином. Главные и
долевые бронхи рассекают ножницами с тупыми концами. В макропрепарате
легких лимфоидные фолликулы имеют вид белесоватых бляшек
(диаметром 3—5 мм), выступающих над поверхностью слизистой оболочки
бронхов. Объемную плотность лимфоидных фолликулов оценивают под лупой
с помощью сетки Г. Г. Автандилова.
Гистологические методы
Легкие фиксируют в жидкости Карнуа, заливают в парафин и
изготовляют гистологические срезы толщиной 4—5 мкм. Готовят 2 серии
гистологических препаратов. В первой серии гистологические препараты
окрашивают гематоксилином и эозином. В гистологических срезах подсчитывают
количество эозинофилов и нейтрофилов. Во второй серии препараты
окрашивают толуидиновым синим ph 2,0. В гистологических срезах
подсчитывают количество тучных клеток; в том и другом случае клетки считают в
поле зрения при увеличении 400.
Степень дегрануляции тучных клеток можно оценивать
полуколичественным способом по Д. П. Линдер (1980):
+ — вся цитоплазма заполнена темно-фиолетовыми гранулами;
++ — отмечаются отдельные участки просветления в цитоплазме
клеток;
+++ — участки просветления цитоплазмы занимают от 50 до 70 %
цитоплазмы;
++++— гранулолизис.
Вычисляли индекс дегрануляции.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с
использованием методов вариационной статистики: вычисляли средние
арифметические величины, ошибку средней арифметической, среднеквад-
ратическое отклонение. Достоверность различий между показателями
средних вычислений определяли по критериям Стьюдента.
-491 -

Изучаемые вещества вводят либо внутрибрюшинно, либо перорально,
либо ингаляционно (в этом случае лучше использовать небуляйзерную
технику) в профилактическом, лечебно-профилактическом или лечебном
режиме. Наш собственный опыт показал, что для выявления
антиаллергических свойств вещество лучше всего ингалировать морским свинкам
ежедневно 1 раз в сутки в одно и то же время в течение 6 последних (с учетом
периода иммунизации) суток. Время ингаляции — 180 с.
Наличие аллергического воспаления в легких морских свинок, а также
антиаллергический эффект фармакологических препаратов оценивают по
клеточному составу бронхоальвеолярного смыва (БАС) и выраженности
гиперплазии бронхоассоциированной лимфоидной ткани. Во второй части
эксперимента действие препаратов оценивают по гистологическим и мор-
фометрическим критериям.
3.2. Модель аллергического ринита
В экспериментах используют морских свинок обоего пола массой 300—
400 г. Схема иммунизации морских свинок та же, что и в разделе 3.1:
вначале животных иммунизируют внутрибрюшинным введением овальбумина
в дозе 10 мг/кг с 7-дневным интервалом (дважды), затем свинкам ингали-
руют с помощью небуляйзерной техники (Pari) раствор овальбумина в
возрастающей концентрации, начиная с 0,1 %, затем 0,2 %, 0,5 % и так
увеличивая до 1 % с интервалом в 4 дня между ингаляциями на протяжении
1,5 мес. Разрешающую дозу ОА (1 % раствор) дают с помощью
микропипетки в носовые ходы (по 50 мкл). Через 24 ч животному, находящемуся
под наркозом (тиопентал натрия 60—70 мг/кг), в трахею вставляют
канюлю, через которую перфузируют 10 мл физиологического раствора (37 °С)
со скоростью 2,5 мл/мин. Собирают перфузат. После центрифугирования
при 200 g в течение 10 мин в 1 мл бронхоальвеолярного смыва
подсчитывают с помощью камеры Фукса—Розенталя абсолютное количество
клеточных элементов (цитоз). В мазках, окрашенных по Романовскому—Гим-
зе, подсчитывают эндопульмональную цитограмму.
3.3. Оценка влияния на анафилактические реакции
3.3.1. Модель антиген-индуцированного бронхоспазма у
активносенсибилизированных наркотизированных морских свинок
В эксперименте используют морских свинок массой 350—400 г.
Животных сенсибилизируют внутримышечным введением 0,5 мл
раствора, содержащего овальбумин в дозе 20 мкг и гидрокись алюминия в
количестве! 00 мг на свинку по методу Andersson. Через 3—4 нед после
начала сенсибилизации можно начинать эксперимент: к этому сроку
образуются IgE-антитела в достаточно высоком титре и после введения
разрешающей дозы антигена развивается сильная бронхоспатическая реакция.
У наркотизированной морской свинки (этаминал натрий 50 мг/кг,
внутрибрюшинно) выделяют трахею, вставляют в нее канюлю, которую
подсоединяют с помощью системы полихлорвиниловых трубочек к
датчику бронхоспазма и аппарату искусственного дыхания (Ugo Basile). В
течение эксперимента поддерживается определенный режим дыхания: объем
дыхания — 6—8 мл, частота — 70 в минуту. Разрешающая доза антигена
- 492 -

150—200 мкг/кг вводится в v. jugularis. Исследуемое соединение вводят
разными способами:
1) внутривенно (с помощью канюли в надключичную или бедренную
вену) за 3 —5 мин до индукции бронхоспазма;
2) внутрижелудочно (с помощью зонда) однократно за 1—2 ч или
многократно за 72, 48, 24 и 1 ч до внесения разрешающей дозы овальбумина;
3) ингаляционно с помощью дозирующего устройства для ингаляции
растворов либо сухих порошков за 15—30 мин до индукции бронхоспазма.
С помощью самописца, подсоединенного к датчику, регистрируют по
Konzett и Rossler изменение сопротивления дыхательных путей
воздушному потоку, т. е. величину бронхоконстрикторной реакции. При введении
антигена сенсибилизированной морской свинке сопротивление
дыхательных путей резко возрастает (как известно, у морской свинки легкое
является шоковым органом). Эта степень увеличения сопротивления
эквивалентна величине бронхоспазма, индуцированного антигеном. Эффект
исследуемого соединения оценивают по степени торможения бронхоспазма,
выраженной в процентах по отношению к максимальному.
Максимальный бронхоспазм вызывают полным пережатием трубочки,
соединенной с трахеальной канюлей, и принимают его за 100 %.
Сравнивают действие изучаемого вещества с препаратом сравнения
(интал, тайлед, кетотифен, азеластин, антагонисты HI-рецепторов 2-го
поколения, кортикостероидные препараты).
3.3.2. Модель антиген-индуцированного бронхоспазма у ненаркотизированных
морских свинок при аэрозольном воздействии веществ
Морских свинок массой 300 г активно сенсибилизируют способом,
описанном выше. Через 3—4 нед после сенсибилизации анафилактическую
реакцию у животных (в специальной камере из плексигласа) вызывают
резрешающей дозой овальбумина, который вводят в виде аэрозоля (0,5 % в
0,9 % растворе NaCl) с помощью ультразвукового или компрессорного
небуляйзера. Длительность и скорость аэрозольного введения веществ
зависит от типа небуляйзера. Аналогично вводят изучаемые вещества. Эффект
вещества оценивают по длительности латентного периода между началом
ингаляции и первыми признаками анафилактической реакции
(сокращение абдоминальных мышц), после чего животных удаляют из камеры.
Важно отметить, что животные не погибают при правильном проведении
манипуляций и могут быть использованы в дальнейшем, но точной оценки
параметров внешнего дыхания при таком способе исследования получить
нельзя. Поэтому обе модели дополняют друг друга.
3.3.3. Модель легочной анафилаксии (увеличение сосудистой проницаемости
дыхательных путей) у морских свинок [Rogers, Belvisi, 1988]
Эксперименты выполняют на морских свинках массой 300—400 г. У
наркотизированных животных осуществляют вентиляцию легких и тем или
иным способом вводят испытуемые вещества. Через 10 мин после
подсоединения трахеальной канюли к аппарату искусственного дыхания, в v.
jugularis вводят испытуемое вещество и еще через 10 мин Evans blue в дозе
20 мг/кг и через 1 мин PAF в дозе 50 ng/кг. Через 5 мин эксперимент
заканчивают. После умерщвления животного выделяют легкие, из которых
-493 -

экстрагируют краситель Evans blue с помощью инкубации ткани в форма-
миде (2 мл) при 37 "С в течение 16 ч, измеряют его содержание спектрофо-
тометрически при длине волны 620 nm и выражают в нанограммах на 1 мг
сухой ткани.
3.3.4. Второй вариант этой модели предусматривает использование
иммунизированных морских свинок. Метод иммунизации описан в 3.1.1. В этом
варианте опыта практически одновременно вместе с Evans blue вводят
разрешающую дозу антигена (25 мг/мл). Введение изучаемых веществ возможно
разными способами.
3.3.5. Модель пассивной кожной анафилаксии у крыс [Goose, Blair, 1969]
При необходимости исследования значительного количества веществ и
выбора наиболее эффективных из них лучше всего использовать реакцию
пассивной кожной анафилаксии у крыс, которая представляет
классическую модель для отбора веществ, влияющих на IgE-зависимую
анафилактическую реакцию.
Эксперименты выполняют на белых неинбредных крысах-самцах
массой 200-220 мг.
Исследование включает 3 части.
1. Иммунизация 4—5 крыс. Животные дважды с интервалом в 1 мес
получают внутрибрюшинные инъекции овальбумина 100 мкг и 1 мг гидроки-
си алюминия в объеме 0,5 мл.
2. Тест на уровень сенсибилизации крыс.
Из подъязычной вены иммунизированных крыс забирают кровь,
получают сыворотку, в которой определяют титр гомоцитотропных антител IgE
следующим образом: из исследуемой сыворотки готовят серию
двухкратных разведениий в изотоническом растворе NaCl и пробы вводят по 0,1 мл
в область спины внутрикожно. Титры сыворотки 1:64 и 1:128 достаточны
для проведения ПКА, если площадь окрашенного пятна составляет не
менее 10 мм2.
3. Реакция пассивной кожной анафилаксии.
Сыворотку в объеме 0,1 мл вводят внутрикожно в 2 различных места
выбритого участка спины (лопаточная область) крысы. Через 48 ч
животным вводят разрешающую дозу антигена вместе с синькой Эванса (Evans
blue) в хвостовую вену в объеме раствора (5 мл/ кг), содержащего 25 мг/кг
ОА и 25 мг/кг красителя Evans blue. Животных анестезируют эфиром и
забивают через 30 мин после введения антигена, вырезают кусок кожи с
синим пятном на внутренней стороне кожи в месте инъекции сыворотки.
Выраженность анафилактической реакции определяют по площади
пятна. Эффект вещества оценивают по размерам площади пятна в сравнении
с контрольными животными, не получавшими лечение, и выражают в
процентах от контрольных цифр.
3.4. Оценка влияния на реакции гиперчувствительности замедленного типа
3.4.1. Модель гиперчувствительности замедленного типа к эритроцитам
барана у мышей (феномен Артюса) [Lagrange, 1976]
Мышей линии BALB/c или (CBAxC57Bl)Fl самцов массой 30 г
сенсибилизируют введением 2 х 107 суспензии эритроцитов барана в 0,2 мл
-494-

4.1.1. Методика ингаляционного введения сефадекса А-25
В качестве ирританта использован сефадекс А-25.
Сефадекс А-25 Fine ДЕАЕ [2-(диэтиламиноэтил) сефадекс] —
высокомолекулярный полимер глюкозы, производное декстрана — гидрофильный
порошок с размером частиц от 20 до 80 мкм. Сефадекс А-25 не является
антигеном, но так же, как и другие полимеры ряда декстрана, обладает
неспецифическим адъювантным действием. При попадании в дыхательные
пути сефадекс А-25, увлажняясь, образует гель. Высокомолекулярные
полимеры, к которым относится сефадекс А-25, способны вызывать в легких
развитие воспалительных реакций с образованием гранулем. Важным
качеством сефадекса является высокая летучесть, способствующая хорошему
распылению порошка.
Введение сефадекса А-25 осуществляется с помощью дозирующего
ингаляционного устройства для введения сухих порошков лабораторным
животным (разработан в НИИ медицинского приборостроения В. А. Казна-
чеевым и А. В. Лохмачевым).
Введение сефадекса в дозе 5 мг/кг крысам проводят под легким
эфирным наркозом. Для того чтобы вводимый порошок попал в трахею и
бронхи, тубус ингалятора вводят в ротоглотку животного. Для этого с
помощью лигатуры фиксируют верхнюю челюсть за резцы и одновременно
оттягивают лигатурой нижнюю челюсть вместе с языком. В момент запы-
ления крылья носа животного прижимают к перегородке двумя пальцами
руки.
После запыления животные быстро выходят из наркоза; во внешнем
виде, поведении и характере дыхания каких-либо особенностей не
наблюдается, но у отдельных животных может быть преходящая одышка.
Развитие воспалительного процесса в легких крыс исследуется в
зависимости от задач эксперимента в динамике на 7, 14, 21 и 80-е сутки после
аэрозольного воздействия сефадекса А-25. Воздействие исследуемого
вещества производят по нескольким критериям. В их число входят:
1. Гистологическое исследование легких.
2. Морфометрическая характеристика легочной ткани крыс.
3. Цитологическое исследование бронхоальвеолярного смыва
(определение цитоза и эндопульмональная цитограмма).
4. Морфометрическое исследование бронхоассоциированной лимфоид-
ной ткани.
5. Характеристика клеточной инфильтрации межальвеолярных
перегородок.
4.1.2. Морфологическая характеристика легких крыс Вистар в различные
сроки после аэрозольного воздействия сефадекса А-25
Контрольная группа. В легких крыс контрольной группы
межальвеолярные перегородки тонкие, легочная паренхима равномерно воздушная.
Эпителий бронхов без дистрофических изменений. Просветы бронхов и
альвеол свободны от содержимого, в просветах альвеол единичные
альвеолярные макрофаги. Междольковая и перибронхиальная соединительная
ткань рыхлая с небольшим количеством сосудов. В гистологических
препаратах может быть обнаружена незначительная острая очаговая эмфизема,
составляющая не более 3 % от общей площади ступенчатых срезов легкого.
Количество нейтрофилов в межальвеолярных перегородках при морфомет-
-496 -

рическом исследовании легких не более 3. В эндопульмональной цито-
грамме бронхоальвеолярного смыва преобладают макрофаги;
многоядерные макрофаги практически отсутствуют. Абсолютное количество клеток в
1 мл бронхоальвеолярного смыва составляет, по нашим данным,
0,12 ± 0,05 х Ю6. В макропрепаратах легких контрольной группы крыс,
фиксированных в 2 % водном растворе уксусной кислоты, объемная
плотность бронхоассоциированной лимфоидной ткани, оцениваемой по лим-
фоидным фолликулам в стенке бронхов, составляет, по нашим данным,
39,0 ± 1,8.
7-е сутки после ингаляции сефадекса.
При гистологическом исследовании в легких крыс выявляется картина
острого бронхита, альвеолита и острой викарной эмфиземы. Стенки
бронхов всех уровней диффузно инфильтрированы нейтрофилами; эпителий с
дистрофическими изменениями, очагово десквамирован. В
межальвеолярных перегородках, как в зоне аэрогематического барьера, так и в "углах"
межальвеолярных перегородок, отмечаются отек, диффузная
инфильтрация нейтрофилами. При морфометрическом исследовании количество
нейтрофилов в ткани легких резко увеличено по сравнению с интактными
животными. Выявляются зрелые макрофагальные гранулемы,
локализованные в периваскулярной, перибронхиальной соединительной ткани,
углах межальвеолярных перегородок. Клеточные элементы гранулем
представлены главным образом одноядерными макрофагами, единичными
многоядерными макрофагами, нейтрофилами и лимфоцитами. Количество
клеток в гранулеме составляет 20—150.
При морфометрическом исследовании легких объемная плотность
альвеолита составляет в среднем 17,7 ± 2,9 %, а эмфиземы 15,4 ± 3,4 %. Мор-
фометрическое исследование бронхоассоциированной лимфоидной ткани
на 7-е сутки после аэрозольного воздействия сефадекса А-25 выявляет
максимальное увеличение объемной плотности лимфоидных фолликулов.
Бронхоальвеолярный смыв характеризуется нарастанием показателя
цитоза. В эндопульмональной цитограмме преобладают нейтрофилы и
лимфоциты. Среди альвеолярных макрофагов большое количество многоядерных
клеток, содержащих 2—5 гранул.
14-е сутки. На 14-е сутки после аэрозольного воздействия сефадекса А-25
в легких крыс Вистар выраженность и распространенность бронхита и
альвеолита не нарастают, но увеличивается число гранулем, содержащих
гигантские клетки инородных тел. Большая часть клеток инфильтрата в стенке
бронхов и межальвеолярных перегородок представлена лимфоцитами и
гистиоцитами, т. е. на 14—21-е сутки нейтрофильный альвеолит сменяется лим-
фоидно-гистиоцитарным. Показатели объемной плотности альвеолита и
эмфиземы не изменяются. Показатель цитоза бронхоальвеолярного смыва на
14-е сутки после аэрозольного воздействия сефадекса А-25 остается
высоким.
Морфометрическое исследование бронхоассоциированной
лимфоидной ткани крыс Вистар выявляет снижение объемной плотности
лимфоидных фолликулов по сравнению с 7-ми и 1-ми сутками.
На 21-е сутки после аэрозольного воздействия сефадекса А-25
распространенность альвеолита и бронхита в легких крыс возрастает. Объемная
плотность соединительной ткани в легких крыс этой группы по сравнению
с контрольной группой, 7-ми и 14-ми сутками возрастает в 2 раза.
В бронхоальвеолярном смыве крыс на 21-е сутки эксперимента отмечен
максимальный показатель содержания клеточных элементов: он в 4,2 раза
превышает показатель в контроле.
-497 -

На 80-е сутки при морфометрическом исследовании показатели
объемной плотности альвеолита и соединительной ткани возрастают и
максимально выражены на этот срок. Однако распространенность эмфиземы, по
характеру хронической обструктивной, по сравнению с предыдущими
сроками не увеличивается. Сохраняется гиперплазия иммунного аппарата
легких. Но исследование бронхоальвеолярного смыва крыс Вистар выявляет
нормализацию цитологического состава.
Важно подчеркнуть, что воспалительный процесс в легких по данным
морфологического, морфометрического и цитологического исследований
легких, оценки клеточного состава бронхоальвеолярного смыва
максимально выражен на 7-е сутки эксперимента. Именно этот срок
наблюдения удобно использовать для тестирования противовоспалительных
свойств новых веществ.
Итак, достоинством разработанной модели является ее простота и
легкость воспроизведения. В качестве критериев оценки эффективности
противовоспалительной эффективности лекарственных средств
рекомендуется использовать морфометрические показатели: объемную плотность
альвеолита, эмфиземы, числа нейтрофилов в межальвеолярных
перегородках; а также данные цитологического исследования бронхоальвеолярного
смыва — показатели цитоза, содержания лимфоцитов и нейтрофилов.
Кроме того, на разработанной модели можно оценивать влияние
испытуемых веществ на иммунную систему по выраженности гиперплазии бронхо-
ассоциированной лимфоидной ткани путем подсчета объемной плотности
лимфоидных фолликулов в стенке бронхов.
Исследуемые вещества можно вводить, как показал наш опыт,
различными путями: внутрибрюшинно, внутрижелудочно и ингаляционно с
помощью этого же ингаляционного дозирующего устройства. Мы
использовали однократное и курсовое (ежедневно в течение 7 дней) введение
лекарственных веществ, причем ингаляцию сефадекса и испытуемого
вещества производили с коротким интервалом (не более 30—60 мин) между
воздействиями. Эффект лечения оценивали, как уже было сказано выше,
через 7 сут после индукции воспаления. Однако в зависимости от задачи
эксперимента эффект противовоспалительного действия вещества может
быть оценен и в значительно более отдаленные сроки — через 14, 21, 30,
60 дней и т. д.
В условиях этой модели препаратами сравнения могут быть
нестероидные противовоспалительные препараты (напроксен, индометацин и др.),
ингаляционные кортикостероиды (будесонид, флунизолид и др.).
Количество животных в группе должно быть не менее 10.
4.2. Модель ПАФ (полный адъювант Фрейнда) — индуцированного отека
лапы крыс
Данная модель позволяет быстро оценить способность испытуемого
вещества влиять на экссудативную фазу воспаления. Полагают, что в случае
индукции отека ПАФ основную роль играют продукты липоксигеназного
пути метаболизма ненасыщенных жирных кислот.
В эксперименте используют крыс-самцов массой 200—300 г. Полный
адъювант Фрейнда (ПАФ) вводится субплантарно по 0,1 мл в правую лапу.
Исследуемое соединение вводят внутрижелудочно (5—10 мг/кг в 0,5 мл
1 % раствора крахмала за 24 и 2 ч до введения флогогенного агента. Объем
лап измеряют через 24 ч после инициации процесса с помощью плетизмо-
-498 -

метра (Ugo Basile). Эффект терапевтического воздействия исследуемого
соединения оценивают по степени угнетения воспалительной реакции и
рассчитывают по формуле, указанной в разделе 3.2.1.
ПРЕДПОЛАГАЕМАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ
Применение данных методических указаний при поиске и отборе новых
фармакологических веществ, обладающих бронхолитической,
антиастматической и антиаллергической активностью, позволит при проведении
доклинических исследований объективно оценить их специфическое
фармакологическое действие с целью решения вопроса о целесообразности и
возможности проведения клинических исследований.
Л итература
Гущин И. С. Немедленная аллергия клетки. — М.: Медицина, 1976.
Гущин И. С Аллергическое воспаление и его фармакологический контроль. — М.: Фар-
марус принт, 1998.
Макарова О. В., Ковалева В. Л., Сладкопевцев А. С. и др. Экспериментальная модель
неинфекционного гранулематоза легких // Пульмонология. — 1996. — № 1. — С. 76—
79.
Совместный доклад Национального института Сердце, Легкие и Кровь и Всемирной
организации зравоохраненя, Издание № 95—3659, январь, 1995.
Чучапин А. Г. Бронхиальная астма. — В 2-х т. — М.: Агар, 1997.
Andersson P. Antigen-induced bronchiaal anapylaxis in actively sensitized guinea-pigs. Allergy. —
1980. - Vol. 35. - P. 63-71.
Barnes P. J., Chung К F., Page С Р. Inflammatory Mediators and asthma // Pharmacol. Rev.
- 1988. - Vol. 40. - P. 49-84.
Biattner R., Classen H. G, Dehnert H. et al. Experiments on isolated smooth muscle
preparation / Eds J. M. Barnden a. R. Colson. — 1980.
Cockroft D. W., О'Byrne P. M. Mechanisms of airway hyper-responsiveness. — In: Bronchial
Asthma. Mechanisms and Therapeutics. — 3rd ed. — Boston, 1993. — Ch4.
Corrigan С J. Immunological aspects of asthma // Clinical. Immunotherapeutics. — 1994. —
Vol. 1(1). - P. 31-42.
DeAngelis L. // Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol. — 1980. — Vol. 2. — P. 335.
Gaose J., Blair A. M. Passive cutaneous anaphylaxis in the rat // Immunology. — 1969. — Vol.
16. - P. 749-760.
Holgate S. Mediator and cytokine mechanisms in asthma // Thorax. — 1993. — Vol. 48. —
P. 103-109.
Holgate S. T. Asthma: past, present and future // European Respir. J. — 1993. — Vol. 6. —
P. 1507-
Hutson P. A., Church M. K, Clay T. P. et al. Early and Late-Phase Bronchoconstriction after
Allergen Challenge of Nonanesthetized Guinea Pigs // Am. Rev. Respir. Dis. — 1988. —
Vol. 137. - P. 548-557.
Kay A. B. Asthma and inflammation // J. Allergy Clin. Immunol. — 1991. — Vol. 87. —
P. 893-910.
Koda A., Nagai H., Wada H. Pharmacological actions baicalin and baicalein // Folia
Pharmacol. Japan. - 1970. - Vol. 66. - P. 237-247.
Konzett H., Rossler. R. Versuchsanord nung zu untersuchungen an der Bronchialmuskulatur.
Naunyn-Schmiedebergs // Arch. Exp. Path. Pharmak. — 1940. — Vol. 195. — P. 71—74.
Kovaleva V. L., Makarova O. V., Veselova N. I. New experimental model for testing of
antiasthmatic drugs // 1st European Congress of pharmacology. — Milan, 1995.
Lagrange Ph. Mecanismes de regulation de I'activite des cellules lymphocytaries T: applications
a la pathologie infectieuse et tumorale. I. — Hypersensibilite de type retarde et reponse
humorale // Pathologie Biologie. — 1976, January. — P. 67—73
Perry W., Boyd E. M. // J. Pharmacol. Exper. Ther. - 1941. — Vol. 73. — P. 65.
Pretolani M., Ferrer-Lorenz P., Vargaftig В. В. From anti-asthma to PAF-acether antagonism
and back // Biochemical Pharmacology. — 1989. — Vol. 38. - P. 1373—1389.
-499 -

Robinson D. S., Durham S. R., Kay A. B. Cytokines in asthma // Thorax. — 1993. — Vol. 48. —
P. 845-853.
Rogers D. F., Belvisi M. G. et al. Effects and interactions of sensory neuropeptides on airway
microvascular leakage in guinea pigs // Br. J. Pharmacol. — 1988. — Vol. 95. — P. 1109.
Sakai R., Konno K. et al. Effects of alkyl substitutions of xanthine skeleton on bronchodilation //
J. Med. Chem. - 1992. - Vol. 35. - P. 4039-4044.
Tarayre J. P., Barbara M., Aliaga M. and Tisne-Versailles. Comparative actions of
immunosuppressants, glucocorticoids and non-steroidal anti-inflammatory drugs on various models of
delayed hypersensitivity and on a non-immune inflammation in mice. Arzneim.-Forsch //
Drug Res. - 1990. - Vol. 40. - P. 1125-1131.

ЧАСТЬ 4
ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ЭФФЕКТИВНОСТИ ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Методические указания по изучению иммунотропной
активности фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: академик РАМН Р. М.
Хаитов; член-корр. РАМН И. С. Гущин; проф.
Б. В. Пинегин; к. м. н. А. И. Зебров
1. Оценка иммунотропной активности фармакологических препаратов
Цель данного раздела методических рекомендации заключается в
описании комплекса стандартных методик, с помощью которых можно
оценить эффект изучаемого вещества на иммунитет и сделать вывод о
возможности его отнесения к группе иммунотропных средств (ИТС). При
этом следует идентифицировать то звено иммунитета, на которое в
наибольшей степени действует изучаемое вещество.
Для того чтобы отнести тот или иной препарат к разряду ИТС,
целесообразно изучить его влияние на гуморальный клеточный иммунитет и
систему цитокинов. Задача заключается в количественной оценке эффекта
различных доз изучаемого вещества при введении на различных этапах
развития иммунного ответа, т. е. должен быть оценен эффект дозы и
эффект времени.
/. /. Подготовительная работа
Подготовительная работа при проведении опытов in vivo заключается в
выборе экспериментальных животных, способа введения и доз изучаемого
препарата Для изучения иммуномодулирующей активности препарата
наиболее целесообразно использовать мышей линии СВА BALB/c CB57/B1 и др.
массой 18—20 г. Необходимо, чтобы опытную и контрольную группу
составляли животные одного возраста, пола, массы, полученные одновременно из
одного питомника и содержащиеся в одинаковых условиях. Введение
исследуемого препарата в различных экспериментах должно осуществляться в
одно и то же время суток Для получения стабильных и достоверных
результатов на каждую дозу следует брать не менее 10 мышей. При проведении
опытов in vitro в качестве источника материала рекомендуется использовать
периферическую кровь здоровых доноров в возрасте от 20 до 50 лет.
-501

Выбор низшей дозы препарата должен исходить из минимальной
терапевтической дозы для человека в перерасчете на 1 г массы животного
или на площадь тела. Высшая доза препарата должна составлять '/10 от
LD50. При отсутствии информации о терапевтической дозе для опытов in
vivo в качестве ориентировочных можно использовать дозы 1000 мкг,
100 мкг и 10 мкг на мышь, для опытов in vitro — 10 мкг, 1 мкг и 0,1 мкг
на 1 мл питательной среды. Следует подчеркнуть, что эти дозы являются
ориентировочными. При изучении нового вещества каждый
экспериментатор должен выбирать и обосновывать дозы этого вещества для
исследования самостоятельно. Способ введения препарата во всех
экспериментах in vivo должен быть единообразным. Чаще всего в этих экспериментах
используются подкожный, внутрибрюшинной или внутривенный путь
введения препарата.
Результаты экспериментов с опытной и контрольной группами должны
быть обработаны и сравнены статистически с использованием t-критерия
Стьюдента. Если вариационный ряд не несет черт нормального
распределения, данные должны быть обработаны с помощью непараметрических
методов. Результат влияния препарата на иммунитет может быть
рассмотрен как положительный только при наличии статистически значимой
разницы между контрольной и опытной группами.
1.2. Оценка влияния препарата на неспецифическую резистентность
организма
Одной из характерных черт иммуномодуляторов является их
способность усиливать неспецифическую резистентность к бактериальным и
вирусным инфекциям. Для этого целесообразно использовать в качестве
объекта для исследования мышей, а в качестве инфекционных агентов —
стафилококк и кишечную палочку — наиболее доступные для лабораторных
исследований бактерии.
Для оценки стимуляции неспецифической резистентности изучаемый
препарат вводят внутрибрюшинно или подкожно в различных дозах
мышам линии СВА или (CBA/C57black)Fl. Наиболее часто используются
дозы 1000 мкг, 100 мкг, 10 мкг в объеме 0,5 мл физиологического раствора.
Контрольные мыши получают 0,5 мл физиологического раствора. Через
48—72 ч одну группу подопытных и контрольных мышей заражают
внутрибрюшинно 1—2 DCL Staph, aureus, другую группу Е. coli. Наблюдения за
животными ведут в течение 10 дней. Опыт можно учитывать только в том
случае, если в контрольной группе гибель животных будет составлять не
менее 90 %. По данным этого опыта препарат можно рассматривать как
ИТС, если он по крайней мере в дозах 100 мкг и 10 мкг обеспечивает 60 %
и выше выживание мышей.
При наличии соответствующих условий целесообразно оценить
способность препарата повышать неспецифическую резистентность и к
вирусным агентам (факультативный опыт). Для этих целей используют
вирус гриппа, адаптированный к мышам. Схема и оценка результатов
эксперимента такие же, как и с бактериями. Подопытных и контрольных
мышей заражают интраназально 1—2 DCL вируса гриппа и гибель
мышей изучают в течение 10 дней. Препарат можно рассматривать как
ИТС, если хотя бы одна из используемых доз препарата обеспечит 60 %
и выше выживание мышей.
-502-

1.3. Оценка влияния препарата на фагоцитоз
Для оценки влияния препарата на фагоцитоз используют мышей через
24—48 ч после введения исследуемой дозы препарата. Для изучения
фагоцитарной активности нейтрофилов мышам вводят внутрибрюшинно 3—
4 мл 2—3 % раствора пептона и через 2 ч их умерщвляют с помощью
хлороформа. Животных вскрывают в асептических условиях. Из брюшной
полости с помощью пастеровской пипетки отсасывают жидкость, помещают
ее в силиконизированные центрифужные пробирки и центрифугируют в
течение 10 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в среде 199,
подсчитывают число клеток в камере Горяева и доводят их до концентрации
1—2 млн/мл по нейтрофилам. К клеткам добавляют равный объем
бактерий (чаще всего стафилококк, не содержащий белка А) в соотношении
1:10 и инкубируют при 37 °С в течение 30 мин. Бактерии предварительно
должны быть опсонизированы пуловой мышиной сывороткой. Опсониза-
цию проводят в течение 10 мин при температуре 37 "С с последующим
отмыванием. После инкубации готовят по аналогии с кровяным мазок, на
предметном стекле фиксируют его метанолом 20 мин и красят краской
Романовского—Гимзы в течение 30—40 мин.
Для изучения фагоцитарной активности макрофагов на 3—4-е сутки
после введения пептона мышей умерщвляют с помощью хлороформа (нельзя
убивать с помощью дислокации шейных позвонков), вскрывают в
асептических условиях и вводят внутрибрюшинно 3—4 мл среды 199 с 10 %
эмбриональной телячьей сыворотки. После легкого массажа брюшной
полости жидкость отсасывают с помощью пастеровской пипетки. Полость
можно промывать средой 199 несколько раз, объединяя в одну все полученные
порции. Далее исследование ведется как и в опытах с нейтрофилами.
Учет результатов осуществляется микроскопически. В мазке при
увеличении 90 с иммерсионной системой посчитывают фагоцитарный индекс,
процент фагоцитирующих нейтрофилов и фагоцитарное число
поглощенных бактерии на 1 нейтрофил.
Для оценки влияния препарата на фагоцитоз in vitro берут кровь из ку-
битальной вены в пробирку с гепарином из расчета 25 единиц на 1 мл,
2 мл исследуемой крови смешивают с 0,8 мл 3 % раствора желатины,
приготовленного на среде 199. Ставят в термостат на 20—30 мин при 37 "С.
После инкубации в центрифужную пробирку отсасывают надосадочный
слой, содержащий все клеточные элементы. Клетки 2 раза отмывают средой
199 при 200 g в течение 10 мин. К осадку после последнего
центрифугирования добавляют 1 мл среды 199, и в камере Горяева с применением
краски С. И. Задорожного и И. М. Дозморова (0,01 % раствор азура II в 0,05 %
растворе тритонах Х-100) считают число нейтрофилов. Готовят на среде
199 клеточную суспензию, содержащую 2 млн нейтрофилов на 1 мл.
Параллельно с этим готовят взвесь Staph, aureus (целесообразно использовать
штамм стафилококка, не содержащий белка А) в концентрации 20 млн/мл.
Стафилококк предварительно должен быть опсонизирован пуловой
человеческой сывороткой в течение 20 мин при 37 °С и тщательно отмыт.
При постановке реакции смешивают в 96-луночных круглодонных
планшетах 90 мкл клеточной суспензии и 90 мкл стафилококка
(соотношение 1:10) и планшеты инкубируют при 37 °С в течение 30 и 60 мин. Для
изучения исследуемого препарата к смеси добавляют по 20 мкл этого
вещества в соответствующих концентрациях. В контроле к смеси добавляют
20 мкл среды 199. После окончания инкубации планшеты центрифугируют
при 200 g 10 мин и из осадка готовят препараты по методике, представлен-
-503 -

ной ранее. Сравнивают по фагоцитарному индексу и фагоцитарному числу
способность исследуемого препарата влиять на поглотительную стадию
фагоцитоза.
1.4. Оценка влияния препарата на гуморальный иммунный ответ
Оценку влияния препарата на гуморальный иммунный ответ
целесообразно изучать путем определения числа антителообразующих клеток (АОК)
и титров антител после иммунизации эритроцитами барана мышей, высо-
коотвечающей (СВА) и низкоотвечающей (C57/BL) линий. Для
иммунизации животных следует использовать минимальные дозы (5 х Ю6) антигена.
Число АОК определяют с помощью метода локального гемолиза по Ер-
не и Нордину. Для этого клетки селезенки иммунизированных животных
совместно с эритроцитами барана и комплементом помещают в агаровый
(агарозный) гель. Клетки в условиях in vitro продолжают синтезировать
антитела, которые лизируют эритроциты. Вокруг этих клеток образуются
видимые макроскопически зоны гемолиза. Подсчитывая эти зоны, можно
определить, какое число АОК приходится на 106 ядросодержащих клеток и
на всю селезенку.
При постановке опыта мышей внутрибрюшинно иммунизируют
эритроцитами барана в дозе 5 х 106. При определении числа IgM АОК на 4-е
сутки (пик развития lgM-ответа) животных забивают, выделяют селезенку,
с помощью стеклянного гомогенизатора готовят клеточную суспензию,
фильтруют ее через двойной капроновый фильтр и после счета в камере
Горяева доводят концентрацию спленоцитов до 1 х Ю7 клеток на 1 мл.
Готовят смесь, состоящую из 0,7 % агара Difko на среде Хэнкса клеток
селезенки и эритроцитов барана. Для этого к 0,5 мл расплавленного и
помещенного в водяную при 45 °С агара добавляют 50 мкл суспензии
спленоцитов и 10 мкл осадка эритроцитов, трижды отмытых в физиологическом
растворе. Смесь выливают в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм и
быстрыми круговыми движениями равномерно распределяют агаровую
смесь по дну чашки. После застывания агара чашки помещают на 1 ч в
термостат при температуре 37 "С. После инкубации к чашкам добавляют
комплемент 0,5 мл сыворотки морской свинки в разведении 1:10, и снова
инкубируют 1 ч в термостате при той же температуре. Учет результатов
опыта ведется невооруженным глазом. На красном фоне подсчитывают
число зон гемолиза (просветления). Каждая зона соответствует одной IgM
АОК.
Для определения числа IgG АОК животных забивают на 6—7-й день —
пик развития lgG-ответа. Опыт ведут, как при определении IgM АОК,
после подсчета числа этих клеток в чашки Петри вносят 0,5 мл кроличьей
антисыворотки против мышиного IgG в соответствующем разведении.
Далее инкубируют 1 ч в термостате при 37 "С, добавляют комплемент и после
инкубации подсчитывают число вновь появившихся зон гемолиза, каждая
из которых соответствует одной IgG АОК.
Для определения титра антител используют при иммунизации
эритроцитами барана реакцию гемагглютинации. Она основана на способности
антител, содержащихся в сыворотке крови иммунизированных животных,
склеивать (агглютинировать) эритроциты барана. Кровь для получения
сыворотки берут на 7—10-й день после иммунизации мышей эритроцитами
барана (максимум накопления антител в крови) в указанной выше дозе
путем декапитации или с помощью пастеровской пипетки из окологлазной
- 504-

пазухи. В 96-луночных плоскодонных планшетах готовят двукратные
разведения исследуемой сыворотки в объеме 0,5 мл начиная с разведения
1:10. В контрольную лунку вносят 0,5 мл физиологического раствора. Ко
всем лункам добавляют 0,5 мл 1 % эритроцитов барана. Учет реакции
ведется после инкубации планшетов в термостате в течение 2 ч при 37 °С.
При положительном результате эритроциты оседают на дне лунки
планшета в виде зонтика, при отрицательном — в виде пуговки. За титр
принимают то последнее разведение исследуемой сыворотки, при котором еще
наблюдается положительный результат. Контрольная лунка должна быть
отрицательной.
При оценке действия препарата на гуморальный иммунный ответ
изучают его влияние на индуктивную и продуктивную фазы этого ответа.
В первом случае различные дозы препарата вводят одновременно с
антигеном, во втором случае — на 3-й или 5-е сутки после иммунизации при
изучении IgM- и IgG-ответа соответственно.
Оценку влияния препарата на синтез основных классов
иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM in vitro проводят на культуре мононуклеаров
периферической крови человека. Методика выделения клеток, условия их
культивирования и стимуляции описаны в разделе 1.6. Здесь целесообразно
отметить, что для индукции синтеза иммуноглобулинов применяют поликло-
нальные активаторы В-лимфоцитов — митоген лаконоса или золотистый
стафилококк (штамм Cowan) в субоптимальных дозах. Культуры
мононуклеаров активированные указанными митогенами в присутствии различных
доз исследуемого вещества, инкубируют в термостате в течение 10 дней —
срок максимального накопления иммуноглобулинов в культуральной
среде. Количество иммуноглобулинов определяют с помощью двухцентрового
иммуноферментного метода, используя соответствующие наборы, или с
помощью нефелометрического анализа.
1.5. Оценка влияния препарата на клеточный иммунный ответ
Для оценки влияния препарата на клеточный иммунный ответ
используют реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ),
характеризующуюся двумя важными чертами — информативностью и простотой
исполнения. При постановке ГЗТ антиген вводят двукратно — для
сенсибилизации и для разрешения.
Сенсибилизация корпускулярными или растворимыми белковыми
антигенами вызывает образование антигенспецифических Т-лимфоцитов.
При повторном введении антигена эти Т-лимфоциты специфически
взаимодействуют с ним и выделяют ряд провоспалительных цитокинов. Если
разрешающая доза антигена вводится подкожно или внутрикожно, то на
месте инъекции развивается воспалительная реакция, интенсивность
которой легко измерить. Классическим примером ГЗТ являются
туберкулиновые пробы.
При постановке ГЗТ для сенсибилизации мышам подкожно вводят
1 х Ю7 эритроцитов барана в объеме 100 мкл. Разрешающую дозу антигена
1 х 108 эритроцитов барана в объеме 20 мкл вводят на 5-й день после
сенсибилизации под апоневротическую пластинку одной из задних конечностей.
В контралатеральную лапу в качестве контроля вводят физиологический
раствор в таком же объеме. Учет интенсивности воспалительной реакции
осуществляют через 24 ч после введения разрешающей дозы антигена. Для
этого мышей забивают сразу, а затем обе лапки отрезают на уровне голеностоп-
- 505-

ного сустава и взвешивают на торсионных весах. Определяют индекс
воспаления (ИВ) по разнице массы опытной (О) и контрольной (К) лап:
ИВ= ^=J£ -100 %.
к
Оценку влияния препарата целесообразно осуществлять как на стадии
сенсибилизации, так и разрешения. С этой целью различные дозы
препарата вводят одновременно с сенсибилизирующей и разрешающей дозами
антигена. При этом препарат оказывает влияние на различные стадии
клеточного иммунного ответа: в первом случае на процесс образования клона
антигенспецифических Т-лимфоцитов, во втором случае на способность
этих лимфоцитов при встрече с антигеном продуцировать провоспалитель-
ные цитокины.
1.6. Оценка влияния препарата на пролиферативную активность
Т- и В-лимфоцитов
Оценка пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов с помощью
реакции бласттрансформации в известной степени является интегральным
методом определения их функциональной активности. Этот метод основан
на способности некоторых лектинов вызывать поликлональную активацию
и пролиферацию лимфоцитов, которая оценивается радиометрически по
интенсивности включения в клетки 3Н-тимидина. Как правило, для
активации Т-лимфоцитов используют фитогемагглютинин (ФГА) или конкана-
валин А (Кон А), для активации В-лимфоцитов — митоген лаконоса (МЛ)
или Staphylococcus aureus (штамм Cowan).
В реакции бласттрансформации используют взвесь мононуклеаров. Для
их выделения кровь разводят 1:2 средой 199 настраивают на градиент фи-
коллпака d = 1,077, и центрифугируют при 400 g в течение 40 мин. Белое
кольцо, образующееся на разделе фаз и содержащее мононуклеары,
аккуратно отсасывают пастеровской пипеткой и 2 раза отмывают средой 199 с
помощью центрифугирования 10 мин при 200 g. Осадок ресуспендируют в
соответствующей питательной среде, считают в камере Горяева количество
клеток и доводят их питательной средой до нужной концентрации.
При постановке реакции бласттрансформации мононуклеары доводят до
концентрации 2 млн/мл полной ростовой средой (ПРС), состоящей из
среды RPMI 1640 10 % эмбриональной телячьей сыворотки ЮмМ Hepes 2 мМ
L-глютамина и 40 мкг/мл гентамицина. Реакцию ставят в объеме 150 мкл в
96-луночных плоскодонных планшетах. В опытные лунки вносят 50 мкл
мононуклеаров с указанной выше концентрацией клеток, 50 мкл Т- или В-ми-
тогена в соответствующей дозе (дозу митогена следует определить в
предварительных экспериментах и для оценки действия препарата она должна быть
субоптимальной) и 50 мкл ПРС (индуцированная бласт-трансформация). В
контрольные лунки вносят 50 мкл клеток и 100 мкл ПРС (спонтанная бласт-
трансформация). Планшеты направляют на 72 ч при температуре 37 "С в
инкубатор, содержащей 5 % С02. За 6 ч до окончания инкубации в опытные и
контрольные лунки добавляют 1 цКи 3Н-тимидина. После окончания
инкубации с помощью специального прибора для сбора клеток харвестера
лимфоциты из лунок планшета переносят на стекловолокнистый фильтр и
тщательно промывают дистиллированной водой. Вся радиоактивность,
связанная с макромолекулярными структурами клетки, остается на фильтре.
Фильтры помещают во флаконы со сцинтилляционной жидкостью и изме-
- 506-

ряют радиоактивность на р-счетчике. Каждую пробу ставят в трех лунках и
результаты по определению радиоактивности усредняют. Оценку результатов
опыта определяют по двум показателям: числу импульсов в 1 мин и индексу
стимуляции (ИС). Последний определяют по формуле:
где О — радиоктивность в лунках с митогеном, К — радиоактивность в
лунках без митогена.
Изучение препарата на пролиферативный ответ Т- и В-лимфоцитов
целесообразно проводить на моделях как индуцированной, так и спонтанной
бласттрансформации. В первом случае в опыте смешивают 50 мкл моно-
нуклеаров, 50 мкл митогена в субоптимальной концентрации и 50 мкл
препарата в соответствующем разведении, в контроле — 50 мкл мононук-
леаров 50 мкл митогена и 50 мкл ПРС. Во втором случае в опыте
смешивают 50 мкл мононуклеаров, 50 мкл препарата в соответствующем
разведении и 50 мкл ПРС, в контроле — 50 мкл мононуклеров и 100 мкл ПРС. По
ИС оценивают влияние препарата на спонтанную и индуцированную
пролиферацию лимфоцитов.
/. 7. Оценка влияния препарата на синтез интерлейкина-2 и других
цитатное
ИЛ-2 является одним из центральных цитокинов иммунной системы,
играющим исключительно важную роль в иммунорегуляторных процессах. Он
синтезируется преимущественно ТН1 лимфоцитами с фенотипом
CD3+CD4+, хотя некоторые клоны CD3+CD8+ Т-лимфоцитов также
обладают способностью продуцировать этот цитокин. Одним из главных
функциональных свойств ИЛ-2 является стимуляция пролиферации лимфоидных
клеток. Это свойство ИЛ-2 используется для оценки его функциональной
активности in vitro. Используются для этих целей 2 биологических метода:
1) определение ИЛ-2 с помощью ИЛ-2-зависимой Т-клеточной линией
CTLL;
2) определение ИЛ-2 с помощью бластов, стимулированных ФГА или
Кон А.
Общим этапом этих методов является получение материала,
являющегося источником ИЛ-2. В качестве этого материала используют суперна-
танты культур мононуклеров, полученные на первые сутки их
культивирования in vitro в соответствии с методикой, описанной в разделе 1.6.
Получают 4 вида супернатанта: от клеток, стимулированных Т-митогеном в
присутствии препарата; от клеток, стимулированных Т-митогеном; от
клеток, культивируемых в присутствии препарата, и от клеток,
культивируемых только в ПРС.
При определении ИЛ-2 с помощью клеток CTLL эти клетки засевают в
ПРС в 96-луночные круглодонные планшеты в количестве 4 х 103 на
лунку. В опытные лунки вносят различные количества исследуемых суперна-
тантов, в контрольные — такое же количество ПРС.
При определении ИЛ-2 с помощью бластов последние получают через
72 ч после стимуляции мононуклеаров ФГА, используя для этих целей
оптимальную дозу митогена. Клетки трижды отмывают в ПРС,
подсчитывают их количество в камере Горяева и доводят их до концентрации 1 хЮ6 в
ПРС. В опытные лунки 96-луночного круглодонного планшета вносят по
-507-

100 мкл бластов и 100 мкл исследуемых супернатантов, в контрольные
лунки — 100 мкл бластов и 100 мкл ПРС.
Как в первом, так и во втором опыте планшеты направляют на 24 ч при
температуре 37 "С в С02-инкубатор, содержащий 5 % С02. За 6 ч до
окончания инкубации в опытные и контрольные лунки добавляют 1 цКи 3Н-
тимидина. Учитывают интенсивность включения метки в лимфоциты по
числу имп/мин. Оценивают способность исследуемого препарата
усиливать (мононуклеары, стимулированные ФГА + препарат) и индуцировать
(мононуклеары, стимулированные только препаратом) синтез ИЛ-2.
Полученные результаты сравнивают с данными исследования супернатантов
мононуклеаров, культивируемых без препарата.
Оценка влияния препарата на синтез цитокинов не ограничивается
определением только ИЛ-2. При наличии в лаборатории соответствующих
технических возможностей целесообразно исследовать и другие цитокины,
продуцируемые моноцитами/макрофагами, Т- и В-лимфоцитами. Главным
методическим подходом является применение культуры мононуклеаров
периферической крови человека, стимулированных полисахаридом энтеро-
бактерий — для индукции синтеза монокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12,
фактора некроза опухолей и др.) или ФГА (или Кон А) для индукции
синтеза интерлейкинов (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10 и др.) и у-интерферона.
Особенно важным является изучение цитокинов, определяющих функциональную
активность центральных иммунорегуляторных клеток — ТН1- и ТН2-хел-
перов у-интерферона и ИЛ-4 соответственно и некоторых монокинов,
играющих исключительно важную роль в иммунорегуляции и инициации
иммунного ответа (например, ИЛ-12 или ИЛ-1). Цитокины в супернатанте
стимулированных культур, как правило, определяют с помощью двухцен-
трового иммуноферментного анализа.
1.8. Оценка влияния препарата на функциональную активность
естественных киллеров
Естественные киллеры (ЕК) представляют собой большие гранулярные
лимфоциты с фенотипом CD3 CD16+CD56+. Они играют важную роль в
защите организма от различных внутриклеточных микроорганизмов и
опухолевых клеток. ЕК распознают и убивают клетки-мишени без
предварительной их сенсибилизации. Такими клетками-мишенями являются клетки
миелобластоидной или лимфобластоидной линии К562 и MOLT4
соответственно. Функциональную активность ЕК определяют в цитотоксической
реакции по их способности лизировать эти клетки, используя, как
правило, радиометрический метод.
Для этого на 2-й день после пересева клетки линии К562 в
концентрации 10°/мл инкубируют в течение 1 ч при 37 "С с 3Н-уридином в дозе 3
цКи на 1 мл клеточной суспензии и после инкубации троекратно
отмывают от метки в большом избытке среды 199.
Цитотоксическую реакцию ставят в объеме 200 мкл в круглодонных 96-
луночных планшетах. Для этого 100 мкл меченых клеток-мишеней и 100 мкл
мононуклеаров (клетки-эффекторы) периферической крови донора
смешивают в соотношении 1:50, 1:25 и 1:10 в триплетах на каждое разведение. Для
определения спонтанного выхода метки к клеткам-мишеням добавляют
равное количество ПРС. Для определения максимального выхода метки к
клеткам-мишеням добавляют равный объем тритона Х-100. Для определения
влияния препарата на функциональную активность ЕК к смеси клеток эф-
- 508-

фекторов и клеток-мишеней добавляют исследуемую дозу препарата, взятую
в минимальном объеме (10—20 мкл). Планшеты отправляют на 16—24 ч в
С02-инкубатор при 37 °С Далее содержимое клеток переносят с помощью
харвестера на стекловолокнистые фильтры, промывают, сушат, помещают во
флаконы со сцинтилляционной жидкостью и определяют радиоактивность
на р-счетчике. Определяют индекс цитотоксичности — ИЦ:
ИЦ = 1 - (А - В) / (С - В) х ЮО,
где А — радиоактивность клеток-мишеней в присутствии
клеток-эффекторов; В — радиоактивность, оставшаяся после обработки клеток-мишеней
тритоном Х-100 (максимальный выход); С — радиоактивность
клеток-мишеней в отсутствие клеток-эффекторов.
Оценку влияния препарата на функциональную активность ЕК
определяют путем сопоставления ИЦ в культурах мононуклеаров,
инкубированных в присутствии препарата и без него.
Выбор из числа приведенных методов тех, которые необходимы для
изучения предполагаемой иммунотропной активности конкретного
препарата, определяется его физико-химическими, фармакологическими и фар-
макокинетическими свойствами. Этим же в конечном итоге определяется
выбор используемых концентраций изучаемого препарата, режима и
способов его введения в организм или испытания в условиях in vitro. Главным
является идентификация того звена иммунитета, на который действует
данный препарат. Эффект влияния препарата на тот или иной параметр
иммунитета может считаться доказанным, если различие в опытной и
контрольной группах являются статистически значимым и воспроизводимым.
2. Оценка проаллергического/противоаллергического и аллергизирующего
действия препаратов
Целью использования методов, изложенных в настоящем разделе,
является установление возможного влияния препаратов на экспериментальные
модели аллергии. Вполне вероятно, что новые препараты (в частности, им-
мунотропные) могут усиливать/потенцировать (или тормозить)
аллергические реакции. Если есть основания предполагать такие свойства у нового
фармакологического соединения (препарата), то используют методы из
числа приведенных ниже. Подбор рекомендуемых методов осуществлен
таким образом, чтобы составить впечатление о действии препарата на
интегральные модели аллергического ответа или на составляющие его звенья.
В случае выявления тормозящего действия препарата на аллергический
ответ этот препарат может рассматриваться как потенциальное
противоаллергическое средство. В отдельном подразделе описаны подходы,
используемые для суждения о наличии аллергизирующих (сенсибилизирующих)
свойств у исследуемого препарата.
2.1. Оценка проаллергического/противоаллергического действия
2.1.1. Системная анафилаксия (анафилактический шок)
Для получения активного анафилактического шока морских свинок
предварительно сенсибилизируют подкожно каким-либо чужеродным
белком. Наиболее доступным является использование с этой целью нормаль-
-509-

ной лошадиной сыворотки. Однократное подкожное введение 0,1 мл
сыворотки обеспечивает высокий уровень сенсибилизации. Для
воспроизведения анафилактического шока на 14—21-й день после первичной инъекции
белка свинкам 2 групп внутрисердечно или внутривенно вводят 0,1—0,5 мл
лошадиной сыворотки (разрешающая инъекция).
Доза антигена подбирают опытным путем. Реакция обычно наступает
через 1—2 мин. Оценку реакции проводят по четырехплюсной схеме:
+ — кратковременное почесывание носа, взъерошивание шерсти,
падение температуры тела (не менее чем на 1 °С);
++ — четко выраженные частые почесывания, единичные чиханья,
падение температуры тела;
+++ — спастический кашель, боковое положение животного, отделение
кала и мочи;
++++ — спазм дыхательных путей, конвульсивные прыжки, судороги,
животное погибает (как правило, на 5-й минуте).
2.1.2. Продукция аллерген-специфических IgE и IgG антител in vivo
Наиболее подходящим и доступным объектом являются мыши (СВА х
C57BL)F1 массой 18—20 г. В качестве антигена используют не менее чем
трижды перекристаллизованный овальбумин куриных яиц.
В зависимости от целей, определяемых характером используемого
фармакологического препарата, сенсибилизацию мышей осуществляют в
одном из трех режимов, обеспечивающих преимущественную продукцию IgE
антител, продукцию IgE и IgG (IgGl) антител или максимальный IgE- и
lgG-ответы.
Для первого режима доза овальбумина составляет 0,5 мкг/мышь, для
второго — 10 мкг/мышь, для третьего — 100 мкг/мышь. При
использовании первого режима lgE-ответ может быть зарегистрирован лишь после ре-
иммунизации. После третьей инъекции титры IgE антител возрастают,
превышая титры появляющихся к этому времени IgGI антител.
Сенсибилизирующие дозы овальбумина: 10 мкг/мышь и 100 мкг/мышь позволяют
получить lgE-ответ уже после первой сенсибилизирующей инъекции. При
использовании дозы овальбумина 100 мкг/мышь в ответ на реиммунизи-
рующие инъекции увеличение титров IgGl антител сопровождается
заметным уменьшением титров IgE антител.
Сенсибилизацию мышей проводят повторными инъекциями
овальбумина с интервалом в 4 нед (допустимо сокращение интервалов до 3 нед).
Овальбумин вводят внутрибрюшинно с 0,5 мг А1(ОН)3, (при дозе
овальбумина 0,5 мкг/мышь и 10 мкг/мышь) или с 5 мг А1(ОН)3 (при дозе
овальбумина 100 мкг/мышь) в 0,5 мл физиологического раствора. В
серии испытаний используют не менее 5 мышей. Кровь для оценки
кинетики образования антител получают в определенные сроки
сенсибилизации из ретроорбитального синуса. Титры IgE антител определяют на
нелинейных крысах-самцах в реакции пассивной кожной анафилаксии (см.
раздел 2.1.3). Титры IgGl антител определяют в реакции пассивной
кожной анафилаксии (ПКА) на нелинейных мышах или иммуноферментным
методом. Для воспроизведения ПКА сыворотку крови
иммунизированных мышей в необходимых разведениях вводят в объеме 30 мкл внутри-
кожно в область спины. На мышах оптимальным является использование
лишь 6 точек введения сыворотки крови. Разрешающую дозу
овальбумина (0,5 мг в 0,2 мл 0,5 % раствора синего Эванса, "Serva") вводят мышам
-510-

в хвостовую вену через 2 ч после внутрикожного введения сыворотки. В
остальном процедура проводится так же, как и при постановке реакции
ПКА на крысах.
2.1.3. Пассивная кожная анафилаксия (ПКА)
Наиболее распространенным и доступным приемом воспроизведения
реакции этого типа является ПКА крыс (no Z. Ovary), кожа которых
пассивно сенсибилизирована сывороткой крови активносенсибилизирован-
ных мышей, содержащей аллерген-специфический IgE (см. раздел 2.1.2).
Для опытов используют нелинейных крыс-самцов массой 150—250 г.
Животным под эфирным наркозом строго внутрикожно в область живота
вводят микрошприцем по 30 мкл физиологического раствора и по 30 мкл
последовательных двукратных разведений (начиная с разведения 1:4) пула
сывороток мышей, содержащего аллерген-специфический (антиовальбуми-
новый) IgE. Разрешающую инъекцию овальбумина делают крысам в
хвостовую вену через 24 ч после пассивной сенсибилизации кожи. Антиген
вводят под поверхностным эфирным наркозом из расчета 100 мкг
овальбумина на 100 г массы тела в 1 мл 0,5 % раствора синего Эванса ("Serva") на
физиологическом растворе. Интенсивность ПКА оценивают через 30 мин
по прокрашиванию участков кожи, для чего животных забивают под
эфирным наркозом перерезкой сонных артерий, кожу отсепаровывают и
выраженность реакции определяют по площади прокрашенного участка,
измеряемой на внутренней поверхности кожи.
2.1.4. Анафилаксия изолированных органов
В качестве моделей анафилаксии изолированных органов может быть
использована пассивная и активная анафилаксия изолированных гладко-
мышечных органов экспериментальных животных и человека.
Анафилактическую реакцию в этом случае оценивают по сократительному эффекту
в условиях изометрической регистрации напряжения мышц с
соблюдением контроля сократительной реакции на действие подходящего для
данного объекта медиатора (гистамина, ацетилхолина, цистеиновых лей-
котриенов и пр.). Анафилаксия изолированных органов может быть
также воспроизведена на модели активной или пассивной
анафилактической реакции изолированной легочной ткани животных или человека,
оцениваемой по вызванному антигеном высвобождению из нее предсу-
ществующих или вновь образуемых медиаторов аллергии (гистамина,
триптазы, цистеиновых лейкотриенов; фактора, активирующего
тромбоциты).
Наиболее доступным объектом является активная анафилаксия
изолированных гладкомышечных органов морской свинки. Предпочтение в этом
случае отдается изолированным препаратам подвздошной кишки, так как
можно получить достаточно большое число отрезков кишечника для
проведения сравнительных испытаний в одном опыте на нескольких образцах
гладкомышечного органа одного и того же животного.
Морских свинок сенсибилизируют так же, как описано в разделе 2.1.1,
или не менее чем трижды перекристаллизованным овальбумином. Оваль-
бумин вводят троекратно через день в виде смеси, состоящей из 0,25 мл
физиологического раствора, содержащего 5 мг овальбумина, и 0,25 мл пол-
-511 -

ного адъюванта Фрейнда. Первую инъекцию проводят подкожно в область
задней конечности; две последующие — внутримышечно в область бедра.
Опыты ставят через 3—4 нед после последней сенсибилизирующей
инъекции. Описанный способ подготовки животных дает 100 % сенсибилизацию
животных и их гладкомышечных органов.
Для подготовки отрезков кишечника животных под эфирным
наркозом забивают кровопусканием из сонных артерий. Затем вскрывают
брюшную полость, обнажают подвздошную кишку, которую отсекают
вблизи илеоцекального угла. Подвздошную кишку освобождают от
брыжейки и вырезают отрезки длиной около 5—6 см, которые промывают
при помощи шприца жидкостью Кребса при комнатной температуре. Из
промытых отрезков получают более короткие фрагменты (1,5—2 см),
которые прошивают с обоих концов шелковыми нитками. До момента
использования отрезков в опыте их сохраняют в жидкости Кребса при
температуре 4°С. Интервал времени между взятием отрезков кишечника и
испытанием их в опыте может составить до 8 ч (контролированный
интервал). Испытуемый отрезок помещают в ванночку для изолированных
органов (наиболее удобный объем — 20 мл), укрепляя один конец на
полом стеклянном крючке, через который поступает в ванночку кислород.
Второй конец прикрепляют к датчику для регистрации напряжения
мышцы. Опыты проводят в условиях постоянной перфузии органа
жидкостью Кребса со скоростью около 2 мл/мин с обеспечением
возможности переключения перфузии на жидкость, содержащую испытуемые
препараты.
2.1.5. Анафилактическая секреция гистамина из тучных клеток животных
и базофилов человека in vitro
Принцип метода определения высвобождения гистамина из тучных
клеток крыс и мышей состоит в том, что смешанную клеточную взвесь,
полученную из брюшной и плевральной полостей, или выделенные из нее
тучные клетки инкубируют в присутствии испытываемого агента при
определенной температуре (если не изучается зависимость эффекта от
температуры, то температурный режим соответствует 37 °С) и времени инкубации.
Клетки осаждают центрифугированием; надосадочную жикость отделяют,
а клетки лизируют добавлением к ним дистиллированной воды. Затем
раздельно определяют флюориметрическим методом содержание гистамина в
осадочных и надосадочных порциях. Поскольку высвобожденный гиста-
мин находится в несвязанном состоянии и в лизатах клеток отсутствуют
компоненты, вмешивающиеся в реакцию определения гистамина, то не
требуются предварительные этапы экстракции и очистки гистамина.
Высвобождение гистамина выражают в процентах к его общему содержанию
в каждой порции клеток.
Принцип метода определения высвобождения гистамина из
базофилов периферической крови человека состоит в том, что обогащенную ба-
зофилами (до 2—4 %) взвесь лейкоцитов периферической крови человека
инкубируют в присутствии испытываемого агента при определенной
температуре и продолжительности инкубации. Клетки осаждают
центрифугированием; надосадочную жидкость отбрасывают, а в осадках клеток
определяют остаточный гистамин микрофлюориметрическим методом.
Освобождение от примеси эритроцитов позволяет исключить
многоэтапные процедуры экстракции и очистки гистамина. Микроспектрофлюори-
-512-

метрический вариант метода определения гистамина имеет высокую
чувствительность, достаточную для определения гистамина в базофилах.
Необходимость использования такого варианта связана с низким
содержанием гистамина в базофилах (до 2 мкг на 1 млн базофилов). Однако мик-
роспектрофлюориметрический вариант не позволяет определить очень
низкие концентрации гистамина в надосадочных жидкостях, содержащих
белок. Поэтому уровень высвобождения гистамина оценивают
сравнением образцов, содержащих испытываемый агент, с контрольными
образцами клеток.
В специальных предварительных опытах изучают возможность
вмешательства изучаемого фармакологического средства в реакцию
определения гистамина, проводят пробы на параллельность калибровочных
кривых.
Подробности методов определения секреции гистамина из тучных
клеток и базофилов, составы используемых растворов и условия проведения
реакции определения гистамина описаны в соответствующих методических
рекомендациях (см. список рекомендуемой литературы).
Выбор из числа приведенных методов тех, которые необходимы для
изучения предполагаемого противоаллергического или проаллергического
действия конкретного препарата, определяется его физико-химическими,
фармакологическими и фармакокинетическими свойствами. Этим же
определяется выбор предела используемых концентраций изучаемого
препарата, режима и способов его введения в организм или испытания в
условиях in vitro.
2.2. Оценка аллергизирующего (сенсибилизирующего) действия препаратов
2.2.1. Оценка анафилактогенной активности
Морским свинкам вводят исследуемый препарат по следующей схеме:
сенсибилизирующие инъекции — первая инъекция подкожно, две
последующие — внутримышечно через день в область бедра. Разрешающая
инъекция — внутрисердечно на 14—21-й день после сенсибилизирующей
инъекции. Дозу ориентировочно подбирают ту, которую предполагают
использовать для получения основного фармакологического действия при
однократном применении. Расчет интенсивности анафилактического шока в
индексах по Weigle.
2.2.2. Активная кожная анафилаксия
На морских свинках. Сенсибилизация та же, что и в п. 2.2.1.
Разрешающее введение — внутрикожно, в двукратных разведениях препарата.
Внутривенно вводят 0,5 мл 1 % раствора синего Эванса. Учет реакции проводят
через 20—30 мин после внутрикожного введения препарата путем
регистрации окрашенного пятна в месте введения испытываемого препарата.
На мышах. Сенсибилизация — 1 раз в 4 нед (всего 4 инъекции).
Разрешающее ведение — через 1 нед после последней сенсибилизирующей
инъекции в двукратных разведениях препарата внутрикожно в объеме
0,03 мл. Внутривенно вводят 0,5 мл 1 % раствора синего Эванса. Учет
реакции проводят через 20—30 мин после внутрикожного введения
препарата.
17 - 762
-513-

3. Оценка иммунотропного действия лекарственных средств, не являющихся
иммуномодуляторами
Для лекарственных препаратов, которые сами по себе не являются
иммуномодуляторами, предусмотрен ограниченный перечень методов,
позволяющий установить их возможное действие на иммунную систему.
1. Изучение влияния препарата на фагоцитарную активность (см. раздел
1.3 "Оценка влияния препарата на фагоцитоз").
2. Изучение влияния препарата на антителообразование (см. раздел 1.4
"Оценка влияния препарата на гуморальный иммунный ответ").
3. Изучение влияния препарата на Т-клеточный иммунный ответ (см.
раздел 1.5 "Оценка влияния препарата на клеточный иммунный ответ").
4. Оценка аллергенного действия (см. разделы 2.2.1 "Оценка анафилак-
тогенной активности" и 2.2.2 "Активная кожная анафилаксия").
5. Влияние на продукцию IgE антител (см. раздел 2.1.2 "Продукция
аллерген-специфических антител").
Рекомендуется все новые лекарственные средства изучать с помощью
указанных методик на иммунотропную активность.
Л итература
1. Гущин И. С. Анафилаксия гладкой и сердечной мускулатурыю — М.: Медицина,
1973. - 176 с.
2. Гущин И. С. Аллергическое воспаление и его фармакологический контроль. — М.:
Фармарус Принт, 1998. — 250 с.
3. Гущин И. С, Зебрев А. И., Богуш Н. Л. и др. Экспериментальная модель для
разработки и оценки способов контроля немедленной аллергии // Патол. физиол. —
1986. - № 4. - С. 18-23.
4. Гущин И. С, Зебрев А. И., Читаева В. Г., Войтенко В. Г. Оценка функции клеток
мишеней аллергии: Методические рекомендации. Минздрав СССР. — М., 1987.
5. Петров Р. В., Лопухин Ю. М., Чередеев А. Н. и др. Оценка иммунного статуса
человека: Методические рекомендации. — М., 1984.
6. Петров Р. В., Хаитов Р. М., Пинегин Б. В. и др. Оценка иммунного статуса при
массовых обследованиях: Методические рекомендации // Иммунология. — 1992. —
№ 6. - С. 51-62.
7. Хаитов Р. М., Пинегин Б. В., Истамов X. И. Экологическая иммунология. — М.,
1996.
8. Хаитов Р. М., Пинегин Б. В. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их
клинического применения // Клиническая иммунология. — 1996. — № 8. — С. 7—12.
9. Хаитов Р. М., Пинегин Б. В. Иммунодиагностика и иммунотерапия нарушений
иммунной системы // Практикующий врач. —1997. — № 12. — С. 5—13.

Методические указания по изучению противомикробной
активности фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: чл.-корр. РАМН, проф.
Т. А. Гуськова; академик РАМН А. М. Егоров;
чл.-корр. РАМН, проф. В. П. Фисенко; д. м. н.,
проф. С. В. Сидоренко; д. м. н., проф. И. П.
Фомина; д. м. н., проф. В. П. Яковлев; к. м. н.
Л. А. Блатун; к. м. н. С. В. Буданов; к. б. н.
М. В. Шульгина; к. б. н. А. Н. Васильев;
Л. Б. Смирнова; к. м. н. А. А. Цыбанев
1. Введение
Современные антибиотики и синтетические антимикробные препараты
занимают ведущее место в лечении бактериальных инфекций. Они
применяются по поводу различных инфекционно-воспалительных заболеваний у
70—100 % больных хирургического, урологического, гинекологического
стационаров, отделений реанимации и интенсивной терапии и в детской
практике, у 50—60 % терапевтических больных. На долю
антибактериальных препаратов приходится около 25—30 % расходов многопрофильной
больницы на лекарственную терапию. Номенклатура средств
антимикробной терапии огромна и непрерывно пополняется за счет внедрения в
клиническую практику новых поколений антибиотиков, новейших
антибактериальных препаратов, получаемых путем химического синтеза.
Побудительной причиной, стимулирующей развитие исследований по созданию
новых антибактериальных препаратов, является возникновение и широкое
распространение антибиотикорезистентности и как следствие — снижение
эффективности антимикробной химиотерапии. Принято считать, что
основным путем преодоления резистентности является создание новых
антимикробных препаратов. Применение стандартных и достоверных методов
оценки антимикробной активности и химиотерапевтического действия
новых антимикробных препаратов на этапах доклинического изучения
должно служить ограничительным механизмом, позволяющим отбирать и
рекомендовать для широкого медицинского применения лишь препараты,
кардинально превосходящие существующие по показателям эффективности,
фармакокинетическим, фармакологическим свойствам, скорости
формирования устойчивости.
Целью методических указаний по доклиническому изучению
антибиотиков и синтетических антибактериальных препаратов является
унификация исследований по оценке спектра антимикробной активности и
химиотерапевтического действия с использованием комплекса стандартных
методов. По результатам исследования должна быть установлена активность
нового препарата в отношении определенных групп возбудителей,
рекомендованы показания к применению, ориентировочные режимы лечения
на период клинических испытаний.
17*
-515-

2. Методы и модели экспериментального изучения новых антибиотиков
2.1. Спектр действия и сравнительная антимикробная активность in vitro
изучаемого вещества и его лекарственных форм
2.1.1. Оценка спектра действия и степени антибактериальной
активности in vitro новых антибиотиков и синтетических антибактериальных
веществ производится в отношении определенного набора штаммов
(чувствительных и устойчивых к антибиотикам). Отбирают вещества,
характеризующиеся широким или узконаправленным спектром антибактериального
действия, используя высокочувствительные эталонные штаммы (из
международных и региональных коллекций) и свежевыделенные клинические
штаммы грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.
Каждый вид должен быть представлен 4—5 штаммами с различным набором
маркеров антибиотикорезистентности.
2.1.2. Новые антибактериальные препараты должны быть оценены
также на наличие активности в отношении таких проблемных возбудителей,
как метициллинорезистентные стафилококки; устойчивые к бензилпе-
нициллину Streptococcus pneumoniae, устойчивые к ванкомицину
Staphylococcus spp., Enterococcus spp., множественноустойчивые энтеробактерии
(Escherichia coli, Citro-, Enterobacter spp., Klebsiella spp. и др.); Shigella spp.,
Salmonella spp., устойчивые к амикацину и другим аминогликозидам Pseu-
domonas aeruginosa, другие виды псевдомонад (Burkholderia cepacia, Steno-
trophomonas maltophilia и др.) и неферментирующих грамотрицательных
бактерий (Acinetobacter spp.). Эти микроорганизмы выделяют из
клинического материала, идентифицируют и оценивают по структуре и уровням
антибиотикоустойчивости.
Определение спектра антибактериального действия и антибиотикочув-
ствительности проводят методом двукратных серийных разведений на
жидкой или плотной питательной среде. Условия определения
(питательная среда, число и характеристика штаммов, особенности
культивирования, сроки учета результатов и др.) зависят от вида возбудителя (табл. 1, 2)
[1].
2.1.3. Скорость формирования устойчивости к новым соединениям
Определение рекомендуется проводить на плотных питательных средах,
содержащих концентрации препарата ниже соответствующих значений
МПК и двукратно возрастающие концентрации испытуемых соединений.
Для выявления природноустойчивых мутантов в популяции штамма его
подвергают однократному воздействию препарата, для чего взвесь одно-
двухсуточной культуры в изотоническом растворе натрия хлорида засевают
на чашки с агаром, содержащим 25—100 мг/л вещества (в зависимости от
установленных значений МПК). Состав среды, продолжительность и
температура инкубации зависят от вида микроорганизма. У выросших
колоний определяют уровень резистентности к препарату.
Частота мутаций устанавливается отношением числа антибиотикоустой-
чивых клеток к числу особей, выросших на контрольных чашках без
антибиотика.
Скорость формирования устойчивости устанавливается при посеве
культур (посевная доза 1010 микробных тел на чашку Петри) на агар,
содержащий двукратно возрастающие концентрации препарата, используя
для дальнейших пересевов последнюю чашку, на которой обнаружили рост
единичных колоний. При оценке результатов устанавливают степень
возрастания устойчивости (колонии, выросшие в присутствии максимальных
-516-

I
-J
Таблица 1. Определение антибактериальной активности и спектра антиш
Этап

следования
1
I—III
Микроорганизм
Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes3"
Str. faecalis3"
Вас. subtilis
Escherichia coli
Providencia stuartii
Klebsiella pneumoniae
Pseudomonas aeruginosa
Proteus vulgaris
Salmonella typhi
Shigella flexneri
Haemophilus influenzae
S. aureus
Str. pneumoniae3"
Str. pyogenes rp A3x
Str. faecalis3"
E. coli6x7x
Enterobacter-Citrobacter
spp.6x
Haemophilus influenzae3"3"
Kl.pneumoniae7"
Ps. stutzeri
Ps. aeruginosa5"
Ps. fluorescens
Pr. mirabilis6"
Pr. vulgaris Shigella spp.7"
Salmonella typhi7"
S. enteritidis
Serratia marcescens
Bacteroides spp.4"
Clostridium spp.4"
Arizona spp.
Hafhia spp.
Число

штаммов
1-2
4-5

Характеристика штаммов
Штаммы
эталонные
(международных
коллекций),
штаммы све-
жевыделен-
ные,
генетически
измененные (мно-
жественноан-
тибиотико-
устойчивые)
Метод
изучения
Метод
диффузии
в агар,
испытуемые
вещества
вносятся в
"лунки" в
агаре
Метод
двукратных
серийных

разведений в
жидкой и
плотной

питательной средах
■кробного действия новых антибиотиков и химиопрепаратов [1]
Рекомендуемые питательные
среды
Среды на переваре Хоттин-
гера (33 мг %-аминного
азота, рН 7,0).
Синтетическая среда для
химиопрепаратов состава: глюкоза —
2 г, NaCl - 5 г
(NH4)2S04 - 5 г,
КН2Р04 — 3 г, желатина —
3 г, никотиновая кислота —
0,01 г на 1 л
дистиллированной воды, рН 7,2
Мясопептонный бульон
или 25-х мясопептонный
агар рН 7,2—7,4, для
микробов, хорошо растущих на
обычных средах; среды с
добавлением крови,
глюкозы и др. для микробов,
нуждающихся в специальных
добавках
Величина посевной
дозы (микробных
клеток/мл)
1 мл — 10*
суточной культуры на
100 мл
растопленного и
охлажденного до 50 °С
агара, 3-10"
микробных клеток на
1 мл
105 микробных
клеток/мл2"
Т-инкуба-
ция и сроки
учета
результатов
37°С, 18 ч
37°С, 18 ч,
48-72 ч
при учете
результатов
активности
в
отношении
устойчивых
штаммов,

характеризующихся

замедленным ростом

Примечание.
I) Этап первичной оценки антибактериальной активности культуральной первичных препаратов антибиотиков или индивидуального вещества
соответственно.
II) Этап оценки антибактериального спектра перспективных веществ соответветственно.
"Необходимость стандартизации по содержанию Mg++ (не более 20—35 мкг/ более 50—100 мкг/мл) и др. 2-валентных ионов при определении
чувствительности к аминогликозидам и тетрациклинам.
^При определении антибактериальной активности антибиотиков, имеющих беталактамную структуру используют ряд посевных доз — 103,
105,109КОЕ/мл.
3хМикроорганизмы, растущие на специальных питательных средах.
4хМикроорганизмы, требующие специальных условий культивирования.
5хВ том числе штаммы, устойчивые к гентамицину, амикацину.
6хВ том числе штаммы, устойчивые к ампициллину, цефалоспоринам I—II поколений.
'"Множественно-устойчивые штаммы с устойчивостью к большинству групп антибиотиков и химиопрепаратов.
Наборы национальных эталонных международных штаммов, клинических штаммов микроорганизмов различных видов из коллекции NCCLS
(Laboratory National Committee for Clinical and Standards), США, со статусом музейных можно получить из коллекции Государственного научного
центра по антибиотикам
Таблица 2. Определение чувствительности возбудителей опасных инфекционных заболеваний к новым антибиотикам и химиопрепаратам

Микроорганизм
Yersinia
pestis
BacuUus
anthracis
Pseu-
domonas
mallei
Число

штаммов
25
25
10
Характеристика штаммов
а) штаммы эталонные;
б) природные со
стабильной
вирулентностью; в) свежевыделен-
ные; г) генетически
измененные
а) штаммы эталонные;
б) природные со
стабильной
вирулентностью
Метод изучения
Метод двукратных
серийных разведений в жидкой
или плотной питательной
среде
Рекомендуемые
питательные среды
Агар или бульон
Хоттингера, рН 7,2—
7,4
Агар или бульон
Хоттингера; рН 7,2—
7,4
МПА и МПБ + 5%
глицерин, Луриа-
агар рН, 6,8-7,0
Величина посевной
дозы
105, 10" микробных
клеток/мл
106, 10' спор/мл
10', 10" микробных
клеток/мл
Температура
инкубации и сроки учета
результатов
28 °С при
определении МПК — в
течении 2 сут,
МБК - 5 сут
37°С при
определении МПК —
24 ч, МБК - 5 сут
37°С при
определении МПК —
24 ч, МБК - 5 сут

Продолжение

Микроорганизм
Burkholde-
ria pseu-
domallei
Rickettsia
prowazekii
Coxiella
burnetii
Brucella
spp.
Francisella
tularensis
Число

штаммов
20
1
1
10
10
Характеристика штаммов
штамм Брейнль
штамм Грига
а) эталонные; б) свеже-
выделенные штаммы
а) эталонные
(Евроазиатский и Американский
варианты); б) свежевы-
деленные; в)
генетически измененные
Метод изучения
Риккетсии смешиваются с
различными
концентрациями препарата и
вводятся в желточный мешок 6—
7-дневного эмбриона или в
культуру фибробластов
куриного эмбриона
Метод двукратных
серийных разведении в
полужидком агаре (2%)
Метод двукратных
серийных разведений в плотной
питательной среде
Рекомендуемые
питательные среды
Возможно
применение дрожжевого или
казеинового агара и
бульона, рН 6,8—7,0
Куриные эмбрионы,
культура клеток,
вши
Куриные эмбрионы,
культура клеток,
вши
Агар Альбини, рН
7,0-7,2
Рыбно-дрожжевой
агар с 10% свежей
дефибриниро ванной
крови
Величина посевной
дозы
104—105
микробных клеток/мл
104-105 ИД/эмбри-
он 50
105—107
микробных клеток/мл
2 х Ю6 микробных
клеток/мл
Температура
инкубации и сроки учета
результатов
а) 6—7-дневные
эмбрионы
куриные инкубируют
при 36-37 "С 10-
12 дней, оценка
после 1—2 слепых
пассажей; б)
культура клеток, 5 сут,
37 °С
37 °С определение
МПК — 2 сут и
МБК — 10 сут
37°С определение
МПК — 2 сут и
МБК — 10 сут

концентраций испытуемого вещества) и скорость ее развития (отмечается
последний пересев, после которого прекращается или замедляется
возрастание устойчивости).
Стабильность приобретенной устойчивости in vitro у мутантных культур
изучают путем пересевов культур на жидкой или плотной питательной
среде без препарата с периодическим определением (после 5, 10, 15 и т. д.
пассажей) МПК не менее чем для 100 вариантов штамма, по результатам
которого устанавливается степень снижения МПК у вариантов штамма или
сохранения их значений на уровне, характерном для мутанта [1].
2.1.4. На этапах последующей детальной оценки нового перспективного
соединения целесообразно изучить мишени и механизмы его
антибактериального действия с использованием простых тестов. Эти исследования
проводятся с целью выявления скорости формирования устойчивости,
способности оказывать разрушающее воздействие на макромолекулярные
структуры бактериальной клетки.
Рекомендуемые методы основаны на определении уровня одного из
внутриклеточных фрагментов бактериальной клетки — р-галактозидазы,
являющегося маркером белкового синтеза в клетках Escherichia coli.
Предпосылкой при проведении этих исследований является снижение скорости
синтеза р-галактозидазы в присутствии веществ, подавляющих синтез
белка.
Для проверки действия новых соединений на синтез белка и
проницаемость клеточной стенки используют трехкомпонентную систему,
содержащую культуру клеток Е. coli К-12 в логарифмической фазе роста,
испытуемый препарат в концентрации 0,5 МПК, 1 МПК, 2 МПК и т. д. до
конечной концентрации 10 мг/л. По изменению активности р-галактозидазы в
присутствии ее индуктора — изопропил-тио Д-в-галактозида под влиянием
испытуемого вещества определяют его влияние на проницаемость
мембраны, скорость и уровень синтеза фермента.
Для выявления ДНК-повреждающего действия соединений можно
использовать тест-систему, в которой индукцию SOS оперонов в присутствии
различных концентраций испытуемого вещества оценивают по
абсолютному значению активности р-галактозидазы и расчету коэффициента
индукции — соотношения абсолютных значений активности фермента в
присутствии ДНК-повреждающих агентов и в необработанной культуре EG1000/
PJE43. Способность тестируемых соединений вызывать разрывы в
бактериальной ДНК в данной системе позволяет оценить предположительно не
только механизм повреждающего воздействия, но и прогнозировать их
возможную генотоксичность.
2.1.5. Необходимый объем исследований по оценке активности
воспроизводимых препаратов (дженериков) значительно меньше. Задачей
исследования в этом случае является подтверждение соответствия
воспроизводимого препарата — исходному (зарегистрированному в России,
желательно выпускаемому фирмой-разработчиком). Набор референс —
микроорганизмов может быть ограничен 1—2 штаммами на каждый вид с
использованием только тех видов, которые входят в спектр действия
воспроизводимого препарата. В ходе изучения определяется значения МПК и МБК
соединения. Контролем служат субстанция и лекарственная форма препарата
сравнения. Контроль антимикробной активности не только субстанции, но
и лекарственной формы препарата необходим для исключения возможного
влияния на антимикробную активность вспомогательных веществ,
содержащихся в лекарственной форме дженерика.
- 520-

2.2. Порядок исследования при определении спектра антимикробного
действия и активности нового соединения in vitro состоит из ряда этапов
2.2.1. Первичная оценка изучаемых соединений на чувствительность к
антибиотикам эталонных штаммов различных видов фамотрицательных и
фамположительных микроорганизмов.
2.2.2. Детальное изучение степени антибактериальной активности
соединений в отношении штаммов фамотрицательных и
фамположительных микроорганизмов из международных коллекций с известными
механизмами резистентности.
2.2.3. Исследование активности новых соединений в отношении набора
множественно-устойчивых и клинических штаммов условно-патогенных и
патогенных микроорганизмов оценивают в сравнении с известными
препаратами близкой химической фуппы или аналогичными по
антимикробному эффекту. В случае преимущественной активности испытуемого вещества
в отношении фамположительных микроорганизмов контролем служат
природные пенициллины, полусинтетические пенициллиназоустойчивые пени-
циллины, цефалоспорины I—II поколений, макролиды, линкозамиды и др.
При активности соединений в отношении фамотрицательных возбудителей
в качестве контроля можно использовать азтреонам, полимиксин В.
Для препаратов широкого спектра действия контролем могут быть ами-
ногликозиды, тетрациклины, хлорамфеникол, полусинтетические
пенициллины и цефалоспорины III—IV поколений.
При постановке опытов по изучению антибиотикочувствительности
соблюдение ряда условий является определенной гарантией их
достоверности. К ним относятся:
— Выбор адекватных питательных сред, которые должны отвечать
требованиям стандартности и воспроизводимости результатов. В их составе не
должны содержаться вещества, подавляющие действие антибиотиков и
синтетических препаратов.
В наибольшей степени соответствует указанным требованиям при
определении антибиотикочувствительности среда Мюллер—Хинтона.
Возможным также является использование бульона или 1,5—2 % агара Хоттинге-
ра, содержащего 110—130 мг% аминного азота с необходимыми добавками
при определении чувствительности р-гемолитических стрептококков фуп-
пы А, В. При определении чувствительности гемофильной палочки,
возбудителей опасных инфекционных заболеваний применяют специальные
среды. Подробные рекомендации по этому разделу приведены в
соответствующих руководствах [1, 2, 3].
— Первоначальные концентрации оцениваемых препаратов
устанавливаются с учетом токсичности, установленной в опытах по изучению острой
токсичности, ориентировочной химической структуры нового соединения.
Первая пробирка ряда при проведении исследований методом серийных
разведении в исходной питательной среде обычно содержит испытуемый
раствор в концентрации 100—200 мг/л. В ее присутствии обычно
подавляется рост большинства музейных антибиотикочувствительных штаммов, а
также множественно-устойчивых эталонных и клинических штаммов. Эти
концентрации превышают в 8—10 раз и более максимальный уровень
концентраций антибиотиков в крови при их введении в максимально
переносимых дозах.
Основной раствор вещества, из которого готовят последующее
разведение, должен содержать 1 мг (1000 мкг) в 1 мл. Из него готовят рабочий
раствор — 100—200 мг/л, который последовательно разводят двукратно в
- 521 -

жидкой или плотной питательной среде в ряду из 8—10 пробирок.
Последняя пробирка служит контролем роста культуры.
— Величина посевной дозы. Обычно используют взвесь суточной
бульонной или агаровой культуры тест-штаммов из расчета 103, Ю5, Ю7,
109 КОЕ/мл в объеме 0,2 мл, которую в зависимости от задачи опыта
добавляют в каждую пробирку с разведениями испытуемого препарата.
Пробирки инкубируют при температуре 37 "С в течение 18—24 ч. Результаты
оценивают визуально, определяя наличие или отсутствие роста в среде,
содержащей различные концентрации испытуемого соединения. Последняя
пробирка ряда с задержкой роста (прозрачный бульон) соответствует
минимальной подавляющей (бактериостатической концентрации) препарата
в отношении данного штамма. Бактерицидную концентрацию определяют
путем высева из 2—3 последних пробирок ряда с отсутствием видимых
признаков роста на агар или бульон. После оптимального для каждого
микробного вида срока инкубации посевов отмечают наименьшую
концентрацию вещества в пробирке, высев из которой не дал роста Эту
концентрацию принимают за минимальную бактерицидную [4].
2.2.4. Сравнительную степень антибактериальной активности
препаратов оценивают величиной минимальной подавляющей (МПК) или
бактерицидной концентрации (МБК), определяемых не менее, чем при 2
значениях посевной дозы: минимальной (104—105 КОЕ/мл) и максимальной
(106—109 КОЕ/мл) в зависимости от вида возбудителя. По разнице
значений МПК и МБК, установленных при максимальной и минимальной
величинах инокулума, можно:
а) прогнозировать химиотерапевтическую эффективность соединений в
условиях генерализованной инфекции;
б) судить о возможности достижения бактерицидного действия веществ
в условиях макроорганизма (с учетом их переносимости), условно
классифицировать новый препарат по типу действия на бактериальную клетку
(бактериостатическое или бактерицидное действие);
в) устанавливать наличие (или отсутствие) перекрестной устойчивости
испытуемых микроорганизмов к новому соединению;
г) выявлять преимущества нового соединения перед известными по
широте спектра действия, активности в отношении различных
микроорганизмов ("проблемных" возбудителей, внутриклеточных патогенов, анаэробных
микроорганизмов и др.), а также по сравнительной степени
антимикробной активности, бактерицидное™ и др.;
д) определять влияние на активность нового соединения рН
питательной среды (в диапазоне 6,0—8,0), величины инокулума (в пределах от 103
до Ю9 КОЕ/мл), белков сыворотки крови человека и лабораторных
животных. Новые препараты рассматриваются перспективными для дальнейшего
изучения, если значения их МПК in vitro для тест-штаммов не превышают
10-20 мг/л
3. Изучение химиотерапевтической эффективности антибиотиков
и синтетических антибактериальных препаратов на моделях
экспериментальных инфекций
Задачей химиотерапевтического эксперимента является оценка
эффективности испытуемого соединения и его лекарственных форм (нового или
воспроизводимого) в условиях моделирования инфекционного процесса in
vivo.
- 522-

Изучение химиотерапевтических свойств новых соединений проводится
в отношении возможно большего числа микробных видов возбудителей
инфекции человека. На первых этапах скрининга эффективных препаратов
используют простейшие модели генерализованной инфекции
(экспериментальный сепсис, вызываемый условно-патогенными микроорганизмами,
отнесенными по степени патогенности и контагиозности к III группе
возбудителей).
Рекомендуемый набор культур для воспроизведения инфекции
включает стафилококки (плазмокоагулирующий и коагулазонегативный штаммы,
антибиотикочувствительные и антибиотикоустойчивые с различным
набором маркеров резистентности, в том числе метициллинорезистентные),
стрептококки (гемолитический и зеленящий), пневмококки
(чувствительные к бензилпенициллину и пенициллинорезистентные), различные виды
энтеробактерий — антибиотикочувствительные и
множественно-устойчивые (эшерихии, клебсиеллы, протеи, шигеллы, сальмонеллы),
псевдомонады и другие неферментирующие грамотрицательные бактерии, возбудители
газовой гангрены, дрожжеподобные грибы Candida и др. [5]
3.1. Экспериментальные животные
При изучении химиотерапевтической эффективности соединений
используют различные виды животных: белые мыши и крысы, морские
свинки, кролики, обезьяны. Однако на первом этапе исследования
предпочтение отдается мышам, на которых возможно проведение массовых опытов с
затратой наименьшего количества испытуемого препарата. Следует
учитывать, что клиника инфекций, моделируемых в этих опытах, существенно
отличается от проявлений соответствующих заболеваний человека. В этих
исследованиях подтверждается лишь выявленное in vitro наличие
антибактериальной активности у испытуемых соединений без разработки
конкретных схем применения у больного.
3.2. Выбор экспериментальной модели
План химиотерапевтического исследования in vivo в зависит от того,
имеет экспериментатор дело с новым соединением или
воспроизведенным препаратом. Для воспроизведенного препарата после установления
биоэквивалентности лекарственной формы прототипу химиотерапевтиче-
скую эффективность оценивают по сокращенному варианту на 2—3
стандартных моделях сепсиса, вызываемого стафилококком, кишечной
палочкой или протеем, применяют антибиотикочувствительные штаммы
бактерий.
Для новых соединений набор моделей должен быть достаточно
широким, а их первоначальный выбор основывается на данных антимикробного
спектра, установленном in vitro. В случае отсутствия необходимой
информации в исследованиях in vitro перспективные вещества из новых
химических групп должны быть изучены при экспериментальных инфекциях, так
как их активность может выявиться только после соответствующих
метаболических превращений in vivo.
Необходимым требованием при выборе модели является ее
стандартность, воспроизводимость, закономерность развития симптомов
заболевания в повторных опытах при заражении животных одной и той же культу-
- 523-

рой определенного микробного вида. В первых опытах устанавливается
наличие у испытуемого соединения химиотерапевтического эффекта. В
дальнейшем на ряде моделей острых и хронических инфекций, в том числе
приближающихся по течению к наблюдаемым в клинике формам
заболевания, устанавливают широту химиотерапевтического действия препарата,
зависимость его выраженности от тяжести инфекции, используемых схем
применения. Наиболее распространенными в химиотерапевтических
опытах являются модели генерализованной инфекции (экспериментальный
сепсис) белых мышей, вызываемой вирулентными штаммами грамположи-
тельных и грамотрицательных микроорганизмов с различной степенью
чувствительности к антимикробным препаратам.
3.3. Описание моделей
3.3.1. Острая генерализованная инфекция
У мелких животных может быть воспроизведена при внутривенном,
внутрибрюшинном, подкожном или внутримышечном заражении (в двух
последних вариантах при использовании высоковирулентньк штаммов).
Набор возбудителей для воспроизведения инфекции определяется
установленным спектром действия препарата и включает представленные в табл. 1
возбудители. Заражающая доза, для воспроизведения определенной модели
и всех последующих, для каждого штамма определенного вида возбудителя
устанавливается в предварительных опытах.
3.3.2. Хроническая септикопиемия (стафилококковая) развивается при
внутривенном введении штаммов стафилококков с пониженной
вирулентностью. Инфекция (септические очажки со скоплениями микробов в
паренхиматозных органах) развивается на 5—7-й день после заражения с
гибелью животных до 10-го дня.
3.3.3. Пневмония с генерализацией инфекции — одна из наиболее
частых моделей, используемых при изучении химиотерапевтических свойств
препаратов. Она воспроизводится путем интраназального заражения белых
мышей суточной бульонной или агаровой культурой пневмококков,
стафилококков, клебсиелл, эшерихий, смешанной культурой грамотрицательных
и грамположительных микроорганизмов. Используется заражающая доза
(для каждого возбудителя), обеспечивающая 100 % гибель животных в
течение 48—72 ч. Распространенность и тяжесть процесса, сроки гибели
животных определяются видом возбудителя, его вирулентностью, величиной
заражающей дозы и др. Эти модели для оценки химиотерапевтических
свойств испытуемого препарата удобны, так как дают возможность
установить его эффективность не только по выживаемости животных, но и по
динамике изменений клинический картины заболевания.
3.3.4. Экспериментальный пиелонефрит (стафилококковый, коли-ба-
циллярный, протейный, а также вызванный ассоциацией
микроорганизмов) может быть воспроизведен путем внутрибрюшинного или интраурет-
рального заражения мышей суточной культурой соответствующего
возбудителя. В первом случае при заражении животных одной смертельной
дозой (1 DLM) развивается септикопиемия с двусторонними
метастатическими абсцессами почек, в центре которых находятся скопления микробов,
окруженных участками некроза. При интрауретральном заражении
наблюдается картина восходящего пиелонефрита с образованием гнойных
абсцессов почки и интерстициального нефрита с возможной генерализацией
-524-

процесса. Гибель животных в зависимости от вида микроорганизма,
величины заражающей дозы наблюдается в течение 2—5 сут.
3.3.5. Инфекции, вызываемые патогенными или условно-патогенными
энтеробактериями. Большинство экспериментальных животных (белые
мыши, крысы, морские свинки, кролики) устойчивы к энтеральному
заражению сальмонеллами, шигеллами, эшерихиями и др. В связи с этим для
оценки химиотерапевтического действия препаратов в отношении этих
микроорганизмов разработаны специальные модели:
— Генерализованная сальмонеллезная септикотоксемия белых мышей,
развивающаяся при внутрибрюшинном введении суточной культуры
Salmonella typhi. Гибель 100 % животных наблюдается в течение первых 2 сут
при картине токсемии и бактериемии с высевом сальмонелл из крови,
паренхиматозных органов, лимфатических узлов.
— Генерализованная форма сальмонеллезной инфекции (S. typhi, Salmonella
spp.) воспроизводится путем внутрибрюшинного введения белым мышам
смыва суточной культуры сальмонелл в смеси с голодным агаром (0,4 %), в
соотношении часть культуры и 4 части агара в объеме 0,5—1 мл Срок
наблюдения за животными 10 дней (гибель 100 % животных).
— Брюшнотифозная пневмония с генерализацией. Белых мышей
заражают интраназально взвесью суточной культуры сальмонелл в объеме
0,05 мл. Гибель 80—90 % животных наблюдается в течение первых 3—4 сут
после заражения; гистологически в легких выявляют очаги серозно-гемор-
рагического воспаления, фибринозную экссудацию в плевру;
специфическую пролиферацию светлых "тифозных" ретикулярных клеток. В
цитоплазме "тифозных" клеток и внеклеточно обнаруживается большое
количество сальмонелл.
Генерализованная дизентерийная инфекция белых мышей
воспроизводится внутрибрюшинным введением суспензии суточной культуры шигелл
(Шига—Флекснера) в 0,5—1 мл изотонического раствора натрия хлорида в
смеси с 0,4 % голодным агаром. Гибель животных в зависимости от вида
шигелл и вирулентности штаммов происходит в течение 2—7 сут после
заражения при картине токсикосептицемии.
Дизентерийная пневмония белых мышей — стандартная и хорошо
воспроизводимая при интраназальном заражении модель. Клиника заболевания
развивается через 2—3 сут после заражения с гибелью животных в эти
сроки. Морфологически в легких определяются сливные очаги уплотнения
багрово-красного цвета (гнойный бронхит), спавшиеся расширенные
легочные артерии, лимфатические сосуды (в их просвете наблюдается
серозная жидкость с примесью эритроцитов); отмечается полнокровие крупных
и мелких вен. В процессе лечения наблюдается положительная динамика
изменений в легких, без нормализации тканей.
3.3.6. Экспериментальный менингит и менингоэнцефалит кроликов
Заражение взвесью суточных культур возбудителей производят в
большую цистерну мозга (вирулентные штаммы стафилококков, синегнойной
палочки, клебсиелл, ассоциации возбудителей и др.). В течение 72—96 ч
развивается гнойно-геморрагический (в зависимости от вида возбудителя)
менингит или менингоэнцефалит с гибелью животных в течение этого
срока. При использовании высоких инфицирующих доз
менингоэнцефалит осложняется сепсисом. Клинически заболевание проявляется в
повышении температуры, ригидности затылочных мышц, снижении массы тела.
Из ликвора высевается возбудитель; в спинномозговой жидкости
наблюдается цитоз, высокое содержание белка и др. В оболочках мозга
развиваются процессы, типичные для гнойного воспаления. Нелеченые животные
-525-

погибают при явлениях нарастающей интоксикации. О химиотерапевтиче-
ском эффекте судят по температуре тела в опыте и в контроле, массе тела
животных, динамике развития менингеальных симптомов, числу
лейкоцитов в крови и лейкоцитарной формуле крови, количеству белка в
спинномозговой жидкости, цитозу, патоморфологической картине оболочек,
ткани мозга и внутренних органов.
Модель экспериментального менингита кроликов, вызванного интраци-
стернальным заражением различными возбудителями, приближается по
патогенезу к менингиту и менингоэнцефалиту у человека и является
достаточно информативной. Картина менигоэнцефалита кроликов развивается
значительно медленнее, чем сепсис у мышей, что позволяет оценить
динамику лабораторных показателей крови, ликвора, явлений интоксикации у
экспериментальных животных в течение длительного времени.
3.3.7. Анаэробные инфекции
Для оценки эффективности препаратов при клостридиальных
инфекциях используют модель газовой гангрены, вызываемой различными видами
патогенных клостридий (Clostridium perfringens, С. septicum, С. histolyti-
cum, С. oedermatiens и др.) и микробными ассоциациями. Практически все
виды лабораторных животных восприимчивы к заражению клостридиями
(белые мыши, молодые крысы массой 35—50 г, морские свинки, кролики,
обезьяны). Животных заражают внутримышечно, вводя в предварительно
травмированную мышцу бедра суточную культуру клостридий в среде
Китта—Тароцци в объеме от 0,05 до 2 мл в зависимости от вида
возбудителя и экспериментального животного. При хорошо подобранной
заражающей дозе клиническая картина местного и общего процесса у мышей
развивается в течение 48—72 ч, у морских свинок — 2—5 дней. Местные
морфологические процессы характеризуются некробиозом коллагеновой
ткани; скоплением микробов в мышечной ткани, венозным полнокровием,
резкими венозными стазами, артериальной ишемией, некрозом стенок
кровеносных сосудов. Во внутренних органах и в ткани мозга отмечаются
развитие дегенеративно-некротических процессов, расстройство
кровообращения (особенно выраженное в сердечной мышце).
Основными признаками эффективности испытуемого препарата при
экспериментальной газовой гангрене являются уменьшение и
исчезновение микробов в пораженных тканях, уменьшение отека, пролиферация
соединительной ткани, резорбция некротизированных тканей [5].
3.3.8. Экспериментальный каловый перитонит белых мышей или крыс,
вызванный неклостридиальными анаэробами, является наиболее простой
моделью и часто используется при оценке эффективности новых
соединений с антианаэробной активностью. Заболевание воспроизводится путем
внутрибрюшинного введения 5—10 % каловой взвеси в изотоническом
растворе натрия хлорида. Гибель животных начинается на 4—5-й день
после заражения и морфологически проявляется в картине сливного
перитонита с многочисленными гнойными абсцессами в паренхиматозных
органах, серозным экссудатом в брюшной полости. Эффективность новых
соединений оценивается по показателям предупреждения гибели животных,
удлинения сроков выживания, положительной клинической динамики
перитонита.
3.3.9. Локализованная гнойная инфекция белых мышей
Для получения локализованных процессов животных заражают внутри-
кожно, подкожно, в полость суставов, субконъюнктивально, в глаз.
Испытуемые препараты применяют местно в виде соответствующих местных
лекарственных форм; парентерально или комбинированно (местное и сис-
- 526 -

темное применение). Способ лечения определяется поставленной задачей:
оценки создаваемой лекарственной формы при установленной химиотера-
певтической активности нового соединения; отработки схем терапии при
тяжелом течении заболевания.
Изучение химиотерапевтической эффективности нового соединения по
расширенному кругу показаний на специальных моделях (туберкулез,
микозы, гельминтозы, хламидийная инфекция и др.) проводится на втором
этапе, как правило, на крупных животных, с учетом рекомендаций по
режимам применения, данных о бактериостатических, бактерицидных
свойствах in vitro и in vivo и др. Оценка эффективности препарата при опасных
инфекционных заболеваниях (чума, туляремия, бруцеллез, сибирская язва
и др.), при опасных вирусных инфекциях, глубоких микозах и др.
проводится в специальных лабораториях, имеющих разрешение на проведение
этих работ.
3.4. Порядок исследования
После выявления химиотерапевтической эффективности у нового
препарата in vivo на этапе первичного скрининга проводят исследование при
системных и локализованных инфекциях с определением терапевтических
преимуществ нового соединения перед близкими препаратами по
химической структуре или по спектру антимикробного действия. При
фиксированной заражающей дозе (1 DLM) и на стандартной модели (например,
стафилококковой или коли-сепсис) определяется оптимальный способ
введения (внутривенно, внутримышечно, внутрь), устанавливаются
значения ЕД50—ЕД100. Растворы испытуемого соединения для парентерального
введения готовят на дистиллированной воде или изотоническом растворе
натрия хлорида, нерастворимые — вводят внутрь в виде взвеси в
изотоническом растворе натрия хлорида, в 0,5—5 % растворе крахмала или в 0,15—
0,25 % водном растворе агар-агара.
При оптимальном способе введения и оптимальной дозе определяется
связь эффективности препарата с тяжестью инфекции (при различных
инфицирующих дозах 1 LD50, 2—4 LD50, 10 LD50, 100 LD50 и более в
зависимости от вида возбудителя). Оценивается эффективность препарата в
различные сроки до заражения (3, 6, 12, 24 ч — профилактические режимы) и
после заражения (через 1, 3, 6, 12, 24 и 48 ч после заражения — лечебное
действие), при различной кратности введения (однократно или повторно в
зависимости от модели). Для каждого временного промежутка
устанавливается минимальная эффективная доза и доза, обеспечивающая
максимальный терапевтический эффект. При выборе первоначальной дозы
следует исходить из предполагаемой терапевтической дозы для человека в
пересчете на поверхность тела соответствующего вида животного [6].
Последняя доза (субтоксическая) должна обеспечивать 100 % защитный
эффект. Для удобства статистической обработки разница между двумя
последовательными дозами должна отличаться на фиксированную величину или
в определенное число раз (0,2; 0,4; 0,6; 0,8 мг и т. д. или в 2 раза 0,2; 0,4;
0,8; 1,6 мг и т. д.). Полученные результаты подвергают математической
обработке с расчетом средних величин, стандартного отклонения,
стандартной ошибки средней арифметической, доверительного интервала,
доверительных границ или вычисления критерия х2. Математические методы
используются при расчете значений ЕД50 испытуемого препарата,
необходимых при оценке эффективности нового соединения по сравнению с
известными [7]. Значения ЕД50, установленное в химиотерапевтической
эксперименте, необходимо сопоставить с LD50 (средней токсичной дозой
изучаемого соединения для животных при введении внутривенно и внутрь)
- 527-

для определения величины химиотерапевтического индекса. Контроль
переносимости в каждом опыте определяется на интактных и
инфицированных животных.
Для определения эффективности препарата при местном действии
готовят лекарственные формы в виде мазей, гелей, эмульсий, суспензий,
повязок, специальных стерильных форм для имплантации в раны (пластины,
бусы и др.). При сравнительной оценке эффективности соединений
исследование проводят, соблюдая равные условия для испытуемого вещества и
препарата сравнения.
К каждому варианту опытов ставятся два контроля:
— контроль гибели животных без лечения (используемый растворитель
вводят в том же объеме и тем же способе введения и продолжительности
лечения, что и испытуемое соединение;
— контроль эффективности лечения (в сравнении с известным
препаратом или соединением, наиболее эффективным при данной инфекции).
Длительность наблюдения за животными в зависимости от
особенностей течения инфекции может составлять 10—15 дней при острой
генерализованной инфекции; 2—3 нед — при восходящем пиелонефрите; 3—5
дней — при каловом перитоните; 15—20 дней — при хронической
стафилококковой инфекции и др.
3.5. Оценка эффективности препаратов
Основными параметрами при оценке эффективности нового
соединения в химиотерапевтических опытах являются:
— Сравнительная выживаемость и сроки гибели животных в
контрольных и опытных (леченых) группах животных. Оцениваются различия в
смертности (%) контрольных и леченых животных.
— Средняя продолжительность жизни отдельного животного или
суммарной продолжительности жизни всех животных, входящих в
сравниваемые группы. Продолжительность жизни в днях в группе выражают в
процентах по отношению к максимально возможной длительности жизни при
данном сроке наблюдения. Для корректности выводов о
химиотерапевтических свойствах испытуемого соединения на основе данных о
выживаемости необходимо проводить исследования на достаточном числе
животных в группах (не менее десяти в каждой группе). Воспроизводимость
результатов должна быть подтверждена в 2—3 повторных исследованиях.
— Динамика освобождения организма экспериментального животного
от возбудителя: в процессе лечения и по его окончании проводится посев
крови, ткани и органов с определением числа микробов на 1 г ткани или
жидкости у леченых и нелеченых животных,
— Динамика клинических (поведенческие реакции, изменения массы
тела, состояние шерстного покрова, температуры тела) и лабораторных
(картина крови, спинномозговой жидкости и др.) проявлений заболевания.
— Динамическая оценка патоморфологических изменений органов и
тканей в процессе лечения и после его окончания [5].
Результаты исследования во всех вариантах опытов статистически
обрабатываются с расчетом средних величин, стандартной ошибки средней,
доверительного интервала, доверительных границ. Оценка химиотерапевти-
ческой эффективности нового соединения в сравнении с известными
препаратами близкой химической структуры или близкими антимикробными
свойствами проводятся путем сравнения средних эффективных доз (ЕД50),
средних смертельных доз (LD50), сопоставления значений
химиотерапевтического индекса [5].
На основании оценки химиотерапевтических свойств нового соедине-
- 528 -

ния in vivo делается заключение о его преимуществах равнозначности или
недостатках по сравнению с известными препаратами (по широте спектра
химиотерапевтического действия, по степени стерилизующего эффекта —
полная или частичная эрадикация; значительное снижение обсемененно-
сти органов, персистенция возбудителя и др.).
Результаты изучения химиотерапевтической эффективности
воспроизводимых препаратов оцениваются на их соответствие известным
характеристикам для прототипа. Исследования по оценке эффективности новых
препаратов при экспериментальных опасных инфекционных заболеваниях,
туберкулезе, микозах, при заболеваниях вызываемых простейшими,
гельминтами, проводятся на крупных животных в соответствии со
специальными методическими рекомендациями.
Таким образом, наиболее важными отличиями при изучении
антимикробной активности и химиотерапевтического действия новых препаратов
известных и воспроизводимых в той или иной лекарственной форме
являются объем необходимых исследований in vitro и in vivo.
С учетом данных, характеризующих основные свойства
воспроизводимых препаратов, их оценка осуществляется по укороченной программе.
In vitro она включает сравнительную оценку антимикробной активности
на уровне соединения и лекарственной формы (для исключения
возможного влияния на степень активности, включенных в состав лекарственной
формы вспомогательных веществ). В необходимый набор штаммов входят
музейные культуры микроорганизмов в пределах спектра действия и
уровня чувствительности, характерной для воспроизводимого соединения.
In vivo используются простейшие экспериментальные модели
(например, острый сепсис, вызываемый грамположительными и грамотрицатель-
ными микроорганизмами, в зависимости от спектра действия прототипа),
позволяющие убедиться в идентичности сравниваемых препаратов в
одинаковых условиях опыта (пол, масса, линии животных, при работе с
линейными животными, одинаковые условия содержания и пищевого
режима; идентичные способы и режимы введения лекарственного препарата,
время начала лечения по отношению к заражению и др. Как и в случае
исследований in vitro в химиотерапевтических опытах должны оцениваться
как воспроизводимая субстанция, так и лекарственная форма.
Спектр исследований при оценке принципиально новых соединений
направлен на выявление его кардинальных преимуществ по сравнению с
имеющимися в огромной номенклатуре антибактериальных препаратов.
Он включает ряд этапов и предусматривает использование комплекса
обязательных методов in vitro и in vivo.
In vitro устанавливается спектр антимикробного действия соединения на
расширенном наборе музейных штаммов грамположительных и грамотри-
цательных аэробных и анаэробных микроорганизмов, различных видов,
включая внутриклеточнорасположенных (на данном этапе возможно
использование только субстанции нового соединения). На следующем этапе
исследований используется музейный набор штаммов микроорганизмов
международных и национальных коллекций, включающих штаммы с
различным набором маркеров, уровней и механизмов антибиотикорезистент-
ности. Каждый вид должен быть представлен 3—4 штаммами при
возможности с различными уровнями резистентности (для проблемных
возбудителей). Выявление на данном этапе активности нового соединения в
отношении множественно-устойчивых штаммов является подтверждением
новизны структуры и ее перспективности для дальнейшей оценки.
Следующий этап исследований предусматривает изучение антимикроб-
-529-

ной активности нового соединения в отношении большого набора
клинических штаммов микроорганизмов, устойчивых к известным антибиотикам
и синтетическим антибактериальным препаратам, включая
полирезистентные. Конкретный набор микробных видов определяется установленным на
предыдущих этапах спектром действия нового вещества. Из того же
исходят и при выборе контрольных препаратов (активных преимущественно в
отношении грамположительных или грамотрицательных микроорганизмов
при узконаправленном спектре действия отобранного соединения или
набора препаратов широкого спектра действия при соответствующих данных
для нового вещества).
Данный этап исследований позволяет исключить наличие перекрестной
устойчивости у полирезистентных штаммов к испытуемому соединению и
дает возможность, с известной долей вероятности, судить о степени его
новизны.
Исследования in vitro обычно проводятся на стадии субстанции
испытуемого препарата, однако испытуемый образец должен быть стандартным
по основным химическим параметрам и иметь паспорт. На
заключительном этапе исследований in vitro необходимо провести сравнительную
оценку активности субстанции и окончательной прописи лекарственной формы
нового вещества в отношении небольшого набора чувствительных
штаммов для исключения возможного отрицательного влияния
вспомогательных средств на антибактериальные свойства испытуемого соединения.
Изучение химиотерапевтической активности (in vivo) отобранного
вещества также проходит в ряд этапов. Оценка химиотерапевтической
активности новых соединений включает первичный этап исследования при
остром сепсисе белых мышей, вызываемом грамотрицательными и/или грам-
положительными микроорганизмами с учетом установленного спектра
действия. На данном этапе определяется доза препарата (минимальная
эффективная и максимальная, обеспечивающая 100 % защитный эффект),
устанавливается оптимальный способ введения, зависимость эффекта от
вида возбудителя, величины заражающей дозы, определяется значение
ED50 и др. Контроль известного препарата подбирается с учетом спектра
действия нового, испытуемый препарат используется в виде субстанции —
полностью стандартизованный с паспортными данными и лекарственной
формы.
На следующем этапе на широком спектре экспериментальных моделей
(пневмония, перитонит, менингит, остеомиелит, различные формы
раневой и ожоговой инфекций и др., воспроизводимых на белых крысах,
морских свинках, кроликах, хомяках) устанавливаются терапевтические
возможности испытуемого препарата, определяются оптимальные способы и
режимы введения, выявляется возможное его использования в
профилактических и терапевтических режимах. Оптимальные способы и режимы
введения определяются с учетом физико-химических, фармакодинамиче-
ских, фармакокинетических свойств препарата. (Методы изучения
токсичности фармакологических, фармакокинетических и фармакодинамических
свойств новых соединений изложены в соответствующих методических
указаниях.) Задачей данного этапа исследования является определение
круга показаний, способа/способов введения, ориентировочных режимов
лечения. Испытуемый препарат используется в виде стандартной
лекарственной формы.
На заключительном этапе оценки химиотерапевтического действия
лекарственная форма нового соединения изучается на моделях
(патогенетически и по развивающемуся синдромокомплексу), близких клиническому
- 530-

течению заболеванию человека: бактериальный эндокардит, туберкулезный
менингит, опасные инфекционные заболевания, глубокие микозы и др.,
воспроизводимые на собаках, обезьянах, кроликах, хомяках и т. д.
(исследования проводятся в специализированных учреждениях). Полученные
результаты в предыдущих сериях опытов и на данном этапе используются
для разработки программы клинических испытаний нового соединения на
больном.
Отчетные материалы по всему объему проведенных исследований
должны состоять из двух основных разделов:
1. Результаты изучения антимикробной активности и спектра действия
новых препаратов in vitro в сравнении с известными лекарственными
средствами близкой химической структуры или аналогичного спектра
действия.
2. Результаты изучения химиотерапевтического действия оригинальных
соединений или воспроизводимых препаратов на экспериментальных
моделях инфекций.
В каждом разделе должны быть представлены сравнительные,
статистически обработанные данные, позволяющие оценить преимущества нового
препарата перед существующими антибиотиками той же химической
группы или применяющимися по тем же показаниям. Для воспроизведенного
препарата доказывается его идентичность с прототипом по данным
изучения спектра и степени антимикробной активности, химиотерапевтического
действия, биоэквивалентности лекарственной формы, принятой в качестве
эталона, которая изучается на крупных животных (собаки).
По результатам комплексного изучения биологических свойств нового
антибиотика или синтетического антимикробного препарата
разрабатывается программа клинических испытаний или программа изучения
биоэквивалентности воспроизводимых лекарственных форм.
Литература
1. Навашин С. М., Фомина И. П., Лобусева А. Н., Самойлова Л. Н. и др. Методические
рекомендации по экспериментальному и клиническому изучению, оценке
антимикробной активности и переносимости новых антибиотиков и химиопрепаратов
для экстренной профилактики и этиотропного лечения опасных инфекционных
заболеваний и раневой инфекции. — М., 1989.
2. Скала Л. 3., Сидоренко С. В., Нехорошева А. Г., Резван С. П., Карп В. П.
Практические аспекты современной клинической микробиологии. — М.: ТОО Лабинфарм,
1997. - С. 76-93.
3. Навашин С. М., Фомина И. П. Рациональная антибиотикотерапия (справочник). —
4-е изд. — М.: Медицина, 1982. — 496 с.
4. Essential Proctdures for Clinical Microbiology / Ed. H. D. Isenberg. — ASM Press USA,
1998. - P. 693-731.
5. Вершин Г. Н. Экспериментальная химиотерапия. — Изд. 2-е. — М.: Медицина,
1982. - С. 5-12, 100-192, 507-523.
6. Туськова Т. А. Ведомости Фармакологического Комитета. 1999, 1.
7. Соловьев В. Н., Фишман В. М. // Хим.-фарм. журн. — 1971. — № 1. — С. 55—57.

Методические указания по изучению специфической
противовирусной активности фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: академик РАМН, проф. Ф.
И. Ершов; д. б. н. А. Н. Наровлянский; д. м. н.
П. Г. Дерябин; к. м. н. Л. К. Березина; член-
корр. РАМН, проф. Т. А. Гуськова; к. б. н. И.
С. Николаева; к. б. н. М. В. Мезенцева; д. м.
н., проф. С. С. Григорян; д. б. н. С. В. Ожерел-
ков; к. м. н. А. Н. Васильев; В. Э. Щербенко;
И. А. Ленёва
Введение
Проблема поиска эффективных противовирусных препаратов
обусловлена высокой заболеваемостью и широкой распространенностью вирусных
инфекций, сопровождающихся частым развитием затяжных и хронических
форм, тяжелыми последствиями для детей раннего и лиц преклонного
возраста. Несмотря на интенсивный скрининг, проводимый во всем мире,
количество противовирусных препаратов при ряде инфекций ограничено, а
при некоторых инфекционных заболеваниях их нет совсем. В
значительной степени это объясняется особенностями паразитизма вирусов,
поражающих геном клетки. С этим связано важное требование к поиску
противовирусных препаратов, которые должны либо непосредственно
воздействовать на сам вирус, не повреждая клетки, в которой он паразитирует,
либо обладать способностью активации выработки эндогенного интерферона
[12]. Все это определяет трудности поиска эффективных в условиях
организма препаратов, хотя в экспериментальных условиях in vitro нередко
многие вещества могут оказывать прямое ингибирующее действие на
внеклеточный вирус. Традиционные методы первичного исследования
противовирусной активности веществ были разработаны к началу 60-х годов,
затем они были усовершенствованы и к настоящему времени могут
считаться вполне сложившимися и обоснованными. Между тем анализ
современной литературы свидетельствует о том, что методы и схемы оценки
противовирусных препаратов, используемых исследователями, различны, что
приводит к несопоставимым, а порой и противоречивым результатам. Это
обстоятельство определяет необходимость разработки системы
стандартных методов и схем оценки для отбора потенциальных противовирусных
препаратов как средств профилактики и лечения вирусных инфекций.
НОВИЗНА ПРЕДЛАГАЕМОГО МЕТОДА
Предложен стандартизованный комплекс методов, расширяющий
возможности доклинического определения противовирусной активности
фармакологических веществ. Обоснована необходимость двухэтапного
исследования противовирусной активности на моделях in vitro и in vivo.
Определены критерии оценки противовирусного действия лекарственных веществ
в культуре клеток. Подробно описаны особенности проведения
исследований эффективности противовирусных средств при экспериментальных
вирусных инфекциях на животных.
- 532-

МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ
МЕТОДА
Стандартное оборудование и реактивы вирусологической лаборатории.
ОПИСАНИЕ МЕТОДОВ
Начальным этапом изучения противовирусных препаратов является
первичный отбор (скрининг), который должен быть
высокопроизводительным, простым и доступным для каждой вирусологической лаборатории.
Он состоит из двух этапов: испытания in vitro — в культуре клеток и in
vivo — в опытах на животных.
1. Методы испытания противовирусных препаратов в культуре клеток
Химиотерапия вирусных инфекций начинается с испытаний веществ
синтетического или природного происхождения в культуре клеток.
Оценка антивирусной активности препаратов в культуре клеток
предполагает контроль репродукции вируса. Для этого используют методы,
применяемые для определения инфекционной активности вируса:
1) цитопатогенное действие (ЦПД), 2) метод флуоресцирующих антител
(МФА), 3) метод ингибиции бляшкообразования, 4) реакция гемагглю-
тинации, 5) реакция гемадсорбции, 6) методы электронной микроскопии,
7) микрометод, 8) радиоизотопный метод, 9) метод иммуноферментного
анализа, 10) информационные ресурсы.
1.1. Цитопатогенное действие
Большинство вирусов (покс-, герпес-, миксо-, парамиксо-, тогавирусы
и др.) дают четко выраженный цитопатогенный эффект в перевиваемых и
первично-трипсинизированных клетках человеческого и животного
происхождения. Описано много методик оценки вирусингибирующего действия
химиопрепаратов с использованием этого теста при выращивании клеток в
пробирках, на матрасах и пластиковых панелях. Последние получили
наиболее широкое распространение, так как позволяют использовать культуру
клеток в микрообъемах и оценивать одновременно большое количество
соединений при минимальном расходе питательных сред и изучаемых
веществ. Микрометод оценки противовирусных препаратов на основе ЦПД
используют для исследования вирусов полио-, адено-, герпеса,
везикулярного стоматита и др. (28, 33).
1.2. Метод флуоресцирующих антител
Метод флуоресцирующих антител (МФА) используют в лабораторной
практике по отбору вирусных ингибиторов в культуре клеток значительно
реже, чем метод на основе ЦПД вирусов. Следует отметить, что этот метод
имеет несколько вариантов, применяют как прямой, так и непрямой
МФА. Эффективность препарата может быть оценена по сравнительной
интенсивности свечения в клетках экспериментальной и контрольной
-533-

групп в течение одного цикла репродукции вируса [35], по подсчету
количества светящихся или инфицированных (%) клеток в присутствии
препарата и без него(Зб), по определению титра вируса [24].
МФА для первичного испытания противовирусных средств в культуре
клеток, в основе которой лежит определение титра вируса, включает 2
этапа: 1-й этап (МФА-1) — предварительное определение подавляющего
эффекта с одновременной оценкой токсичности соединений для культур
клеток, 2-й этап (МФА-2) — определение действия активных соединений на
накопление вируса в культуре клеток [26].
1-й этап. Оценка токсичности и предварительное изучение вирусинги-
бирующего действия соединений проводятся одновременно, что позволяет
экономить время и материалы и получать результаты уже после первого
опыта. Для проведения такого опыта берут не менее трех концентраций
препарата с 10-кратными разведениями и на каждую дозу — три конечных
разведения вируса (с учетом его титра). Обычно используют перевиваемые
линии клеток (СПЭВ, ВНК-21 и др.), которые выращивают на покровных
стеклах в пробирках или в микропланшетах. Исследуемый вирус вносят в
культуру клеток и помещают на 50—60 мин в термостат при 37 °С. Затем
инокулят удаляют, клетки трижды отмывают от неадсорбированного
вируса и в пробирки заливают поддерживающую среду, содержащую препараты
в различных концентрациях. Так, если исследуемый химиопрепарат в кон-
центации 1000 мкг/мл оказывает цитотоксическое действие (ЦТД) на
клетки по данным прижизненного морфологического исследования, то
снижение его дозы в 10 раз может не только не оказать на клетки токсического
действия, но и привести к снижению титра вируса на 1.0 lg.
Достоинством данного метода является одновременная оценка
токсичности и предварительное изучение вирусингибирующего действия
соединений. Причем следует подчеркнуть, что токсическое влияние препарата
изучается на инфицированной культуре клеток. Инфекционный титр
вируса определяют через 48 ч инкубирования и выражают в ТЦД50/мл.
Репродукцию вируса учитывают с помощью прямого МФА с контрастированием
фона. Приготовление препаратов для люминесцентной микроскопии
проводят по общепринятой методике [30]. Концентрации препарата,
оказывающие повреждающее действие на клетки по данным прижизненного
морфологического исследования (ЦТД), оценивают как токсические.
Максимально переносимой концентрацией препарата (МПК), нетоксичной
для клеток, обычно считают '/2 от концентрации, не оказывающей ЦТД.
Минимально эффективная вирусингибирующая концентрация (МЭК) —
это концентрация препарата, снижающая титр вируса не менее чем на 1.5
lg (26). Инфекционный титр вируса определяют с помощью МФА по 4-
крестовой системе и выражают в ТЦД50/мл [36]. Вирусингибирующий
эффект оценивают по снижению титра вируса препаратами и степени (%)
подавления.
Препараты, проявляющие вирусингибирующее действие (не менее
95 %), подлежат дальнейшему изучению в культуре клеток для
определения их влияния на накопление вируса.
2-й этап. Используют "пристеночную" культуру клеток, выращенную в
пробирках. Методика инфицирования клеток и введения препаратов не
отличается от описанной выше. Концентрации препаратов колеблются от
МПК и ниже с двукратным шагом. Для каждой инфицирующей дозы
вируса используют не менее 4 пробирок. Через 48 ч инкубации клетки
разрушают троекратным замораживанием и оттаиванием, содержимое пробирок
объединяют по группам и титруют по МФА для определения концентра-
-534-

ции репродуцированного возбудителя. Вирусингибирующий эффект
оценивают по кратности снижения титра вируса в экспериментальной группе
по сравнению с контрольной. Одновременно определяют ХТИ препарата.
Описанная методика оценки вирусингибирующего действия химиопре-
паратов с использованием МФА является весьма чувствительным тестом
при первичном отборе и испытании противовирусных средств. Этот метод
позволяет проводить количественную оценку противовирусной активности
соединений с получением достоверных результатов.
1.3. Метод ингибиции бляшкообразования
Наибольшее распространение при оценке противовирусного действия
химиопрепаратов в культуре клеток получил метод подавления
бляшкообразования. Основным методом для первичного исследования
антивирусных свойств химиопрепаратов в культуре клеток является скрининг-
тест [5, 36, 38]. Этот метод обеспечивает большую пропускную
способность. В основе метода лежит одна из наиболее точных и признанных
методик количественного определения вирусов — методика подавления
бляшкообразования. Использование этого метода получило особенно
широкое распространение в последние годы, когда были разработаны условия
для получения бляшек большинства вирусов. Существуют различные
модификации этого метода [6, 32, 38].
В настоящее время получение высокоочищенных ингредиентов,
входящих в состав питательного покрытия, а также новых культур клеток
позволяет проводить культивирование практически всех известных вирусов.
Агардиффузионный скрининг-тест предполагает изучение соединений в
широком диапазоне концентраций.
После формирования клеточного монослоя во флаконах или в чашках
Петри ростовую среду удаляют, клетки промывают и инфицируют в
течение 1 ч в термостате, после чего инфицирующий инокулят удаляют и
монослой заливают средой (содержащей испытуемый препарат или не
содержащей), соединенной с агаром. После застывания агара флаконы
переворачивают так, чтобы слой агара находился вверху, и помещают в термостат
при 36 °С. На 3-й день инкубации во флаконы добавляют второе агаровое
покрытие, содержащее нейтральный красный в разведении 1:1000.
Флаконы с застывшим вторым слоем агара снова помещают в термостат. Через
3—20 ч (в зависимости от скорости репликации вируса в клетках) проводят
учет количества бляшек в опытных и контрольных флаконах.
Оценка результатов опыта может быть проведена путем сравнения
подсчитанного количества бляшек в опытных и контрольных чашках
(флаконах).
1.4. Реакция гемагглютшаици
Реакция гемагглютинации (РГА) основана на способности вирусов (ор-
томиксо-, парамиксо- флави-, тогавирусы и др.) агглютинировать
эритроциты ряда животных. Данную реакцию используют для оценки
противовирусного действия препаратов в отношении вирусов, обладающих гемагглю-
тинирующей активностью. При использовании этого теста надо иметь в
виду, что не всегда торможение РГА коррелирует со способностью
препарата подавлять инфекционную активность вируса.
-535-

1.5. Реакция гемадсорбции
Реакция гемадсорбции основана на способности культур клеток,
зараженных вирусом, адсорбировать на своей поверхности эритроциты и
является наиболее чувствительной для ортомиксо- и парамиксовирусов. Вирус-
ингибирующий эффект препаратов оценивают по уменьшению количества
гемадсорбированных клеток в экспериментальной группе по сравнению с
контролем. В качестве примера можно привести использование
подавления гемадсорбции вируса гриппа А для оценки эффективности амантади-
на, ремантадина, рибавирина и 2-дезокси-О-глюкозы [32]. Описано
использование метода гемадсорбции для оценки других антивирусных
препаратов в отношении некоторых ортомиксовирусов [21].
Л 6. Метод электронной микроскопии
Электронную микроскопию (ЭМ) используют для изучения механизма
противовирусного действия соединений [24]. Метод ЭМ дает неполное
представление о цикле репродукции вирусов, особенно ранних этапов (эк-
липс-фаза, синтез ранних вирусспецифических ферментов и др.), которые
протекают без существенного изменения ультраструктуры
инфицированных клеток. Более перспективным представляется использование
иммунной ЭМ, которая позволяет обнаруживать появление ранних антигенов, а
также антигены на клеточной поверхности и вирусспецифические рецеп-
торные структуры. Однако эти методы требуют сложного технического
оснащения, и их использование при проведении первичного отбора
проблематично.
1.7. Микрометод
Оптимизация методов первичного отбора противовирусных препаратов
в культуре клеток развивалась по линии создания систем, позволяющих
одновременно оценивать большое количество соединений. Прогрессивным
методом этого плана исследований следует считать микрометод,
являющийся экономичным и довольно простым [3, 27]. По этому методу
культуру клеток выращивают в пластиковых панелях с 96 лунками, в каждую из
которых вносят по 0,1 мл вируссодержащей суспензии и затем — по 0,1 мл
поддерживающей среды, содержащей исследуемые вещества с кратностью
разведения 1:2 начиная с концентрации 1000 мкг/мл. Через 48—72 ч (срок
максимального накопления вируса) культуру клеток микроскопируют для
определения титра по ЦПД и вычисления индекса селективности
препаратов. В качестве второго критерия оценки можно использовать вычисление
титра в надосадочной жидкости. Представленный метод является
чувствительным и позволяет проводить одновременное исследование большого
количества соединений (4 препарата на панель) при минимальном расходе
питательных сред и изучаемых веществ.
С помощью микрометода можно оценить одновременно цитотоксиче-
ские и противовирусные свойства вещества, во-первых, по степени инги-
биции вирусспецифического ЦПД, во-вторых, по снижению 50 % ингиби-
рующей дозы и, в-третьих, по степени ингибиции микробляшкообразова-
ния [34].
-536-

1.8. Радиоизотопный метод
Ускоренный метод оценки противовирусной активности соединений в
культуре клеток, который основан на определении синтеза нуклеиновых
кислот по включению меченых предшественников: 3Н-уридина (РНК) и
3Н-тимидина (ДНК) [25], является высокопроизводительным и позволяет
одновременно оценивать большое количество веществ (100 проб за 3 ч).
По мнению исследователей, данный метод более чувствителен, чем
скрининг-тест редукции бляшек. Вместе с тем следует подчеркнуть, что
обязательным условием этого метода является использование культур клеток,
свободных от микоплазм, которые разрушают аденин и уридин.
1.9. Метод иммуноферментного анализа (ИФА)
Принцип иммуноферментного анализа основан на выявлении
комплекса антиген—антитело с помощью фермента (пероксидаза, щелочная фос-
фатаза и др.) по изменению окраски специфического субстрата. Основной
компонент твердофазных иммуноферментных тест-систем —
полистироловый планшет с лунками или полистироловые шарики, на поверхности
которых сорбирован антиген: вирусный лизат, рекомбинантные белки или
синтетические антигенные детерминанты.
Для изучения активности химических соединений используют
модифицированный иммуноферментный анализ, который позволяет выявить
уровень экспрессии вирусных антигенов на поверхности клеток в опытных и
контрольных пробах
Клетки выращивают в 96-луночных пластиковых планшетах до
получения монослоя.
Перед заражением вирусом клетки промывают средой без сыворотки.
Исследуемые вещества добавляют к клеткам и выполняют ряд
последовательных двукратных разведений. Часть лунок с клетками используют для
контроля вирусов и клеток. После инкубации клеток с исследуемыми
соединениями в течение 30 мин при 37 "С в лунки, исключая клеточный
контроль, добавляют вирус, планшеты инкубируют в атмосфере С02 в
течение 18—24 час при 37 "С. После инкубации клетки просматривают под
инвертированным микроскопом, чтобы убедиться в отсутствии в них цито-
токсических и цитопатических изменений. Далее клетки фиксируют,
высушивают и затем отмывают раствором фосфатного буфера. Все дальнейшие
процедуры проводят в соответствии с техникой постановки
иммуноферментного выявления антигена, разработанного для соответствующего вируса.
По окончании реакции проводят измерение оптической плотности
(ОП) каждой лунки при соответствующей длине волны. В качестве
контроля используют лунки, не зараженные вирусом. Для одного разведения
вируса используют как минимум 4 повтора, для которых вычисляют
среднее значение ОП. Процент ингибирования в зависимости от концентрации
препарата определяют как отношение ОП опыта/ОП вирусного контроля,
умноженного на 100 %.
/. 10. Информационные ресурсы
В последние годы разработан комплекс программных средств для
статистической обработки, хранения и оперирования данными, адаптированных
к специфике проводимых вирусологических исследований [Бореко, 2003].
-537-

На его основе создан информационный ресурс "Результаты испытания
противовирусной активности синтетических соединений и веществ
природного происхождения" (№ 1170200154 от 11.06.02 г.). Группы
синтетических соединений, обладающих противовирусной активностью,
сформированы на основе оригинальных названий согласно разработанной базе
данных, содержащих информацию о химическом названии,
физико-химических свойствах, строении, источнике получения и противовирусной
активности исследованных соединений.
Компьютерная модель живой клетки может значительно ускорить
разработку новых противовирусных средств и поможет предварительному
отбору перспективных лекарственных соединений.
2. Критерии оценки противовирусного действия химиопрепаратов в культуре
клеток
При проведении исследований по отбору противовирусных препаратов
важна адекватность критериев оценки. Такие критерии применимы к
исследованиям на культуре клеток: 1) при проведении первичного отбора и
2) при оценке избирательности противовирусного действия. Применение
культур клеток является наиболее дешевым и быстрым методом оценки
противовирусной активности соединений.
На 1-м этапе первичного отбора соединения подразделяют на активные
и неактивные.
Вещества, проявившие активность на 1-м этапе, дополнительно
изучают по следующим показателям: снижение инфекционного титра,
подавление репродукции вируса в условиях одноциклового опыта, величина ХТИ.
Основным критерием при изучении специфического противовирусного
действия соединений является показатель ХТИ, определяемый
отношением среднетоксичной концентрации вещества (СТ50) к среднеэффективной
вирусингибирующей концентрации (ЕД50).
Величина ХТИ наиболее достоверно характеризует специфическую
противовирусную активность исследуемого вещества. Исследование
вирусингибирующей активности соединений показало, что наиболее однородной
является группа веществ, ХТИ которых равен 8 и более.
Оптимальный срок контакта изучаемого соединения с культурой клеток
при определении МПК соответствует периоду максимального
функционирования клеточных культур (в среднем 4 сут) [33]. Выраженную активность
проявляют соединения, у которых снижение титра вируса при действии
МПК вещества составляет не менее 2,0 lg, подавление репродукции вируса
в условиях одноциклового опыта — на 1,25—2,0 lg и ХТИ 8 и больше. Эти
соединения можно считать перспективными для дальнейших исследований
в опытах на животных [4, 7].
3. Система оценки противовирусного действия веществ в культуре клеток
Основной задачей данного начального этапа исследований является
выявление первичной специфической противовирусной активности
тестируемых веществ с помощью объективных методов испытания. Основы схемы
испытаний являются общими независимо от используемого типа вируса, а
специфические особенности репликации вируса того или иного семейства
могут иметь свои методические приемы.
- 538-

Оценка противовирусного действия соединений включает 3
последовательных этапа, когда вещества, проявившие активность на 1-м этапе,
изучают на 2-м и т. д. Для 1-го этапа рекомендуются скрининг-тест и МФА-1,
которые позволяют одновременно оценить пороговую токсическую дозу
вещества и первичный ингибирующий эффект.
Избирательность противовирусного действия устанавливают на 2-м
этапе. Метод торможения (редукции бляшек) позволяет дать количественную
оценку с расчетом титра вируса. Снижение титра вируса можно определить
также по ЦПД и МФА-2. 2-й этап предполагает изучение вирусингиби-
рующего действия соединений одним из указанных методов в условиях
многоциклового опыта. При одном цикле репродукции вируса исследуется
действие препарата на разные стадии репродукции вируса (3-й этап).
Следовательно, использование культур клеток позволяет достаточно
быстро и с большой достоверностью оценить противовирусную активность
веществ. Результаты этого этапа исследований позволяют говорить о
перспективной значимости исследуемого вещества и необходимости его
испытания в опытах на животных.
4. Испытание противовирусного действия веществ при экспериментальных
вирусных инфекциях на животных
Следующим этапом изучения противовирусного действия соединения,
оказавшегося эффективным в культуре клеток, является
экспериментальная его оценка при инфекциях у животных. Корреляция между вирусинги-
бирующей активностью веществ в культуре клеток и в опытах на животных
существует не всегда. Отсутствие корреляции обусловлено
патогенетическими особенностями конкретной моделируемой вирусной инфекции и
химической структурой вещества.
Основным требованием к экспериментальной модели вирусной
инфекции является адекватность ее соответствующему заболеванию человека.
Большинство вирусных инфекций моделируются на мышах,
чувствительность которых к различным вирусам далеко не одинакова. Путь
инфицирования зачастую отличается от естественного пути заражения человека,
что накладывает свои особенности на патогенез заболевания. Тем не менее
использование конкретной экспериментальной модели на мышах дает
ценную первичную информацию об эффективности изучаемого препарата.
Выбор доз заражения. При моделировании смертельных вирусных
инфекций для данного вида животного обычно используют несколько доз
заражения в диапозоне 1—10—30 ЛД50 [1, 13, 14]. При получении
положительного результата (выживаемость) инфицирующую дозу можно повысить
до 100 ЛД50 и более. Эффективность веществ может быть выявлена и при
использовании минимальных инфицирующих доз (порядка 1—10 ЛД50)-
При моделировании несмертельных вирусных инфекций, когда
показателем оценки эффективности препарата не является выживаемость,
величина дозы заражения должна быть максимальной (с учетом титра вируса).
Путь инфицирования. Для создания модели инфекционного заболевания
у животного необходимо использовать тот путь инфицирования, который
соответствует естественному пути заражения человека данной инфекцией.
При отсутствии чувствительности животного используют другие пути
заражения с учетом тяжести течения инфекции, при этом очень важен выбор
сроков наблюдения за инфицированными животными. Длительность
максимального наблюдения за животными при острых вирусных инфекциях
- 539-

определяет показатели сроков максимальной и остаточной смертности.
Так, например, при периферическом заражении белых мышей патогенным
штаммом тоговируса восточного энцефаломиелита лошадей (ЕЕЕ) в дозах
5—10 ЛД50и выше сроки максимальной гибели животных соответствуют 7-
му дню после заражения, а остаточная гибель — 10-му. Исходя из этих
показателей сроки максимального наблюдения за инфицированными
животными составляют 14—21 день.
Рассматривая нелетальные модели вирусных инфекций с
использованием неадаптированного вируса, сроки наблюдения за животными
определяются динамикой накопления вируса в чувствительных органах. Так,
например, при интраназальном заражении белых мышей тоговирусом Пик-
сун максимальное накопление возбудителя в чувствительных органах
(головной мозг и селезенка) соответствует 120 ч после заражения, а спустя
168 ч вирус не репродуцируется. На этом основании сроки максимального
наблюдения за инфицированными животными соответствуют 7 дням
(168 ч) [25].
Немаловажное значение в моделировании вирусных инфекций имеют
штаммовые особенности вируса. В данном случае речь идет о том, что при
использовании в исследованиях различных штаммов вируса одного
семейства можно получить неадекватные результаты. Так, например, вирус
гриппа A WSN оказался резистентным к ремантадину, который в свою
очередь обладает селективным ингибирующим действием в отношении
почти всех эпидемических штаммов вируса гриппа А последних лет.
Выявлены штаммовые различия в чувствительности белых мышей как у одного
вируса (штаммы Софьин и Пан), так и у различных вирусов комплекса
клещевого энцефалита [14].
На этом основании можно заключить, что при моделировании
экспериментальной вирусной инфекции (ЭВИ) необходимо использовать
эталонные штаммы вируса (по таксономической квалификации — типичный
представитель). При получении положительных результатов в дальнейшем
можно использовать штаммы тестируемого вируса, имеющие наиболее
важное значение в эпидемиологической и клинической практике.
И наконец, следует при моделировании ЭВИ отметить большое
значение для оценки достоверности результатов испытаний однородность
возраста, массы и генотипа подопытных животных. Так, например, показана
зависимость генотипа животного и штаммовых особенностей вируса на
течение экспериментального клещевого энцефалита у белых мышей [14].
При подкожном заражении мышей линий СВА и С57В1/6 массой 18—20 г
выявлены межлинейные различия в чувствительности животных. Для
моделирования ЭВИ важно использовать животных наиболее чувствительных
линий, одинаковой массы и одного возраста.
После выбора соответствующей экспериментальной модели определяют
эффективность действия препарата при различных способах введения по
профилактической и лечебной схемам, а также влияние препарата на
репродукцию вируса в органах и тканях и др.
Для выбора разовой и суточной доз препарата и схем его введения
необходимо провести опыты по определению его острой токсичности хотя
бы при трех путях введения, одним из которых является способ,
рекомендуемый для применения в клинике.
Результаты дальнейших исследований должны определить
целесообразность того или иного пути введения препарата для обеспечения химиоте-
рапевтического эффекта.
Доза препарата для различных видов животных должна быть эквива-
-540-

лентна дозам, предлагаемым для клинического испытания при перерасчете
на единицу поверхности тела. Каждая экспериментальная группа должна
состоять не менее чем из 10 животных (для крупных — обезьян, собак —
до 5).
Схемы оценки эффективности препаратов подразделяются на
профилактическую и лечебную. Профилактическая схема предусматривает
введение препарата до или в момент заражения и в течение инкубационного
периода. При изучении лечебной схемы препарат назначают с момента
появления первых симптомов заболевания до полного купирования инфекции.
При изучении профилактической эффективности препарата вначале
используют концентрации препарата, соответствующие '/8, '/16, 1/г2 ЛД50, в
условиях однократного введения. При разработке схем многократного
назначения препарата используют данные, полученные при его однократном
назначении.
Критериями оценки эффективности действия препарата являются
степень защиты (%), средняя эффективная доза (ЕД50) по показателю
выживаемости, средняя продолжительность жизни (СПЖ) животных и величина
ХТИ.
Клиническое выздоровление животных должно быть подтверждено
вирусологическими исследованиями.
Данные критерии позволяют определить степень активности препаратов
на основе количественных показателей. Препараты, при введении которых
степень защиты животных составляла до 30 %, следует считать
неактивными, а 70 % и выше — активными. Показатель эффективности препарата
(степени защиты животных) определяется при использовании для
заражения животных трех инфицирующих доз (5, 10, 30 ЛД50)-
Обязательными показателями, характеризующими защитные свойства
исследуемых препаратов, являются ЕД50 и степень защиты при испытании
средства по профилактической и лечебной схемам. ЕД50 — это показатель
(величина) суточной дозы препарата (мг/ЕД), которая обеспечивает
защиту 50 % животных. ЕД5о вычисляют графически или по методу Кербера [29,
30] при использовании одной (постоянной) инфицирующей дозы.
СПЖ животных отражает динамику выживаемости до момента гибели и
выражается в днях. Этот показатель также объективно отражает
противовирусное действие препарата. Показатели ЕД50 и СПЖ в
экспериментальной группе (для оцениваемого препарата) должны существенно отличаться
от таковых контрольной группы. Величина ХТИ должна строго
обосновывать рекомендуемый диапазон лечебных доз препарата при конкретном
пути его введения в организм.
5. Вирусы
Для изучения токсичности и испытания специфической
противовирусной активности предполагаемых фармакологических веществ могут быть
использованы различные РНК- и ДНК-содержащие вирусы.
РНК-вирусы:
1) вирус гриппа (с. Orthomyxoviridae);
2) вирусы кори, свинки (с. Paramyxoviridae);
3) вирусы везикулярного стоматита, бешенства (с. Rabdoviridae);
-541 -

4) вирусы Коксаки В, гепатита А и энцефаломиокардита (с. Picornaviri-
dae);
5) вирусы клещевого энцефалита, желтой лихорадки, Денге, гепатита С
(с. Flaviviridae);
6) вирус восточного энцефаломиелита лошадей, вирус Пиксун (с. Toga-
viridae);
7) вирусы Крымской-Конго геморрагической лихорадки (с. Bunyaviri-
dae);
8) иммунодефицита человека (с. Retroviridae);
9) другие вирусы.
ДНК-вирусы:
1) вирус цитомегалии человека, вирусы герпеса простого 1-го и 2-го се-
ротипов (Herpesviridae);
2) другие вирусы.
Общие принципы изучения изложены в разделах 1—4. В качестве
примера изучения конкретной группы вирусов ниже излагаются методы,
используемые при поиске новых препаратов, активных против гриппа,
герпеса, гепатита С, клещевого энцефалита.
5.1. Вирусы гриппа
Из трех существующих серологических типов вируса гриппа (А, В, С)
причиной эпидемий и пандемий являются вирусы типа А и В. При этом
вирусы типа А характеризуются чрезвычайно высокой антигенной
изменчивостью, что обусловливает кратковременность приобретенного к ним
иммунитета. По этим причинам именно различные штаммы вирусов
гриппа А и В во многих исследовательских лабораториях являются объектами
для проведения поиска активных противогриппозных веществ [8, 9, 16,
19]. С этой целью используют вирусы гриппа А с различными
антигенными формулами: APR-8/34(HlNl), A/Betesda/63(H2N2), A/Aichi/74(H3N2)
и др., а также различные штаммы вируса гриппа В, адаптированные к
культуре клеток, куриным эмбрионам и мышам.
Изучение противовирусной активности веществ в отношении вирусов
гриппа А и В проводят в опытах in vitro в культуре клеток и in vivo — в
модельных опытах на животных.
5.1.1. Изучение активности веществ в отношении вируса гриппа в опытах in
vitro
Для работы может быть использован любой вид культуры клеток,
обеспечивающий интенсивное размножение вируса гриппа А или В. С этой
целью успешно используют культуры почки эмбриона человека, почки
обезьян, телят, куриных эмбрионов, клеточные линии, например MDCK
(почки собаки).
-542-

Определение цитотоксичности и противовирусной активности испытуемых
препаратов
В опытах используют переносимые дозы испытуемого соединения.
Оценка противовирусной активности соединений в культуре клеток
осуществляется путем контроля репродукции вируса различными методами:
учет цитопатогенного действия вируса на клетки (ЦПД), реакцию
гемагглютинации с вируссодержащей жидкостью, реакцию гемадсорбции на
инфицированном клеточном монослое, метод ингибирования бляшек,
методы электронной микроскопии, метод флуоресцирующих антител (МФА),
метод иммуноферментного анализа (ИФА) (см. раздел 1).
Изучение вирулицидного действия соединений в контактных опытах
in vitro
Вирулицидную активность соединений можно изучать при их
непосредственном контакте с вирусом в пробирке с последующим определением
инфекционности смеси на мышах или куриных эмбрионах. Для
проведения эксперимента готовят разведения испытуемого соединения, например,
в концентрации от 1000 до 1 мкг/мл.
Для более полного выявления вирулицидных свойств соединений
следует использовать несколько заражающих доз вируса, например 100, 10
и 1 LD100. В стерильные пробирки наливают по 0,5 мл соответствующих
разведений испытуемого соединения и вируса. В контрольную пробирку к
0,5 мл соответствующего разведения вируса добавляют 0,5 мл буферной
смеси. Смесь тщательно встряхивают и штатив с пробирками
устанавливают над ванной со льдом, чтобы температура в пробирках не превышала
14 °С. Такие условия не сказываются на действии соединения на вирус и в
то же время предохраняют вирус от инактивирующего влияния
повышенной температуры.
Контакт соединения с вирусом длится один час. При этом пробирки
встряхивают регулярно, не менее 4 раз. Затем полученными смесями
интраназально в объеме 0,05 мл заражают по 5 мышей (с массой тела 12—
14 г) (подробную методику см. в разделе 2.1). За мышами устанавливают
наблюдение в течение 14 дней. Погибших животных вскрывают,
регистрируя специфические патологоанатомические изменения в легких.
Специфичность гибели животных от гриппозной пневмонии следует
подтверждать также постановкой реакции гемагглютинации с легочной тканью
павших мышей, а также ее патоморфологическими исследованиями.
Вместо мышей смеси после контакта можно ввести в аллантоисную
полость 9-дневных куриных эмбрионов (по 5 эмбрионов на каждое
разведение). Зараженные эмбрионы инкубируют 48 ч в термостате при 37 °С.
Затем ставят РГА по обычной методике.
Если испытуемое соединение в контактных опытах in vitro в
концентрации 10 мкг/мл и ниже полностью нейтрализует инфекционные свойства
одной или более LD100, то его оценивают как высокоактивное с точки
зрения вирулицидного действия.
-543-

Изучение активности веществ в отношении вируса гриппа в опытах in vivo
на модели гриппозной пневмонии белых мышей
Экспериментальная модель гриппозной пневмонии мышей является
доступной в исполнении и достаточно информативной, причем химиоте-
рапевтический эффект, полученный на этой модели, может проявляться не
только за счет вирусспецифической активности, но и за счет интерферон-
индуцирующего или иммуномодулирующего действия изучаемых
препаратов. Поэтому изучение активности соединений на модели фиппозной
пневмонии мышей представляет особый интерес и может быть
рекомендовано для всех потенциально активных веществ.
Изучение проводят на белых нелинейных мышах с массой тела 14—16 г.
Для заражении используют штаммы вируса фиппа А или В,
адаптированные к мышам. Вируссодержащим материалом обычно является легкое,
зараженное вирусом фиппа мыши, или аллантоисная жидкость,
зараженная вирусом фиппа 9-дневного куриного эмбриона. Для проведения хи-
миотерапевтических опытов заражающая доза составляет 10 LD. При этом
90—100 % животных погибают от фиппозной пневмонии на 5—7-е сутки
после заражения. Но для более подробного изучения противовирусной
активности соединения можно использовать как более высокие, так и более
низкие заражающие дозы вируса. Заражение животных проводят интрана-
зально (в объеме 0,05 мл) под легким эфирным наркозом.
Для изучения на мышах могут быть использованы как растворимые, так
и нерастворимые в воде соединения. Дозы изучаемого соединения
подбираются с учетом LD для этого соединения. Обычно используют '/4 или '/8
от LD50 и более низкие дозы. Следует учитывать повышение токсичности
соединений для инфицированных животных.
Схемы введения препарата могут быть как профилактические, так и
лечебные. Путь введения соединения также может быть различным: перо-
ральным или парентеральным (подкожно, внутрибрюшинно,
внутримышечно, внутривенно).
При проведении эксперимента наряду с группами мышей,
получающих испытуемое соединение в разных дозах, планируются фуппы
контроля. В каждой группе должно быть не менее десяти животных. За
лечеными и контрольными мышами устанавливается ежедневное наблюдение
на протяжении 14 дней. После вскрытия павших мышей регистрируют
патологоанатомические изменения в легких. В случае гибели мыши от
фиппозной инфекции ее легкие увеличены в размерах, красные,
плотные. При погружении кусочка легкого в воду он тонет. Под
микроскопом видны очаги пневмонии катарально-геморрагического характера.
Изменения в легких оцениваются в баллах по 4-балльной системе. При
специфической гибели мышей от фиппозной пневмонии их легкие
имеют поражения на 3—4 балла. Для уточнения факта гибели животных от
фиппозной инфекции рекомендуется выборочно провести реакцию ге-
магглютинации с легочной тканью павших мышей.
Химиотерапевтическую активность соединений на модели фиппозной
пневмонии оценивают по следующим показателям.
1. Учет степени снижения летальности: соединения, снижающие
летальность животных на 60 % и более по сравнению с контролем, представляют
интерес для углубленного изучения.
2. Учет средней продолжительности жизни мышей или общей суммы
прожитых всеми мышами дней в опытных и контрольных фуппах.
3. Определение титра вируса в легких леченых и контрольных мышей:
-544-

снижение титра вируса на 1,75 lg и более в группе леченых животных
свидетельствует об угнетении его репродукции.
4. Снижение количества случаев пневмоний и степени их
интенсивности у леченых животных по сравнению с контролем.
5. Изучение зависимости "доза—эффект" и определение ХТИ (чем выше
ХТИ, тем больший интерес представляет вещество).
Активное соединение должно быть изучено по сравнению с активным
противогриппозным препаратом, применяющимся в медицинской
практике.
5.2. Вирусы герпеса
Широкое распространение, ряд биологических особенностей, важная
роль в инфекционной патологии человека, присущие вирусам герпеса,
обусловливают актуальность разработки и изучения противогерпетических
препаратов. Вирусы простого герпеса (ВПГ) относятся к ДНК-геномным
вирусам. Для них характерны длительное существование в организме,
преимущественно в латентной форме. Вызываемые ими заболевания имеют
многочисленные клинические проявления (поражения кожи, слизистых
оболочек, роговицы, конъюнктивы и других оболочек глаз, головного
мозга, гениталий и других органов и тканей) и могут протекать остро или
переходить в хроническую рецидивирующую форму. Выявлена
этиологическая и патогенетическая роль ВПГ, особенно 2-го типа, при раке шейки
матки. Доказаны влияние герпетической инфекции на детородную
функцию женщин, а также ее тяжелые последствия для здоровья матери и
ребенка.
Изучение активности веществ в отношении ВПГ 1 и 2 типов проводят в
опытах in vitro с использованием различных культур клеток и в модельных
опытах на животных [20, 21, 22].
Необходимо отметить, что любой антивирусный препарат должен быть
испытан на штаммах герпеса как чувствительных, так и резистентных к
ацикловиру.
Изучение активности веществ в отношении вирусов герпеса in vitro
в клеточной культуре
Практически все известные культуры клеток могут быть использованы
для размножения ВПГ, но количество вируса, динамика его накопления и
характер цитопатического действия на клетки различны в разных
культурах, что следует учитывать при выборе культуры клеток для постановки
химиотерапевтических опытов. С этой целью часто используют первичные
клетки фибробластов эмбриона курицы (ФЭК), клетки эмбриона человека
(КЭЧ) или клеточную линию Vero (клетки почки обезьян) и др.
Изучение активности веществ в отношении вируса герпеса в культуре
клеток эмбриона курицы (ФЭК)
Первичную культуру ФЭК, инфицированную вирусом герпеса в дозах
1—1000 ТЦЦ50 (50 % тканевых цитопатогенных доз), инкубируют в
термостате при 37°С и в течение 5 сут ежедневно микроскопируют, отмечая ци-
18 - 762
-545 -

топатическое действие вируса на клетки по сравнению с контрольными
пробирками, где монослой не бьы инфицирован. Цитопатическое действие
ВПГ на клетки морфологически проявляется в образовании симпластов
или округлых шарообразных клеток в сочетании с пролиферацией и
гигантскими многоядерными клетками.
Для изучения противовирусной активности веществ в пробирки с
клеточным монослоем вносят 0,8 мл среды без сыворотки, в которой
содержится испытуемое вещество в максимально переносимой или меньшей
концентрации. Через 1 ч контакта вещества с клетками добавляют
указанные выше дозы вируса. Действие вещества определяют по его способности
предотвращать цитопатическое действие вируса на клетки по сравнению с
контролем через 72 ч инкубации.
В опытах необходимы три контроля: состояние клеточного монослоя,
репродукции вируса, цитотоксического действия вещества.
Ингибирующее действие веществ оценивают по снижению
инфекционного титра вируса под действием испытуемого вещества по сравнению с
контролем. Снижение на 1,5—2,0 lg ТЦД свидетельствует о выраженной
противогерпетической активности изучаемого соединения, особенно если
ХТИ при этом равен 8 и более.
Следует отметить, что существует большое разнообразие постановки
эксперимента с внесением испытуемого соединения в разные сроки до или
после инфицирования монослоя, а для регистрации репродукции вируса
герпеса в чувствительной клеточной культуре можно использовать метод
иммунофлюоресцирующих антител (ИФА), метод ингибиции бляшкообра-
зования, метод иммуноферментного анализа и др.
Изучение активности веществ в отношении вирусов герпеса в опытах
in vivo
Изучение активности веществ в отношении ВПГ 1-го и 2-го типов в
модельных опытах in vivo чрезвычайно важно, так как позволяет выявить
химиотерапевтическое действие соединения в целостном организме.
Большое разнообразие клинических форм герпетической инфекции у человека
(герпес кожи, герпес гениталий, герпетический энцефаломиелит,
герпетический кератит и др.) делает необходимым изучение активности на
различных моделях.
Изучение активности веществ в отношении вируса герпеса на мышах
Белые нелинейные мыши с массой тела 8—10 г высоковосприимчивы к
внутримозговому заражению ВПГ 1-го и 2-го типов. Инкубационный
период составляет 3—5 дней, после чего развивается характерная
клиническая картина герпетического энцефалита, проявлениями которого
являются возбуждение, ортостатическое положение, расстройство координации,
парезы задних конечностей и судороги. Заболевание заканчивается
гибелью животных на 4—10-й день после заражения в зависимости от
использованной дозы вируса и его вирулентности. Энцефаломиелит
воспроизводится также при внутрибрюшинном или интраназальном заражении
мышей.
Для проведения химиотерапевтических экспериментов используют
мышей с массой тела 12—14 г. Предпочтителен способ заражения внутрибрю-
-546-

шинный или интраназальный. При внутримозговом заражении животных
инфекция развивается очень быстро, что затрудняет выявление химиотера-
певтического эффекта изучаемых веществ. Способы и время введения
изучаемых веществ могут быть различными в зависимости от поставленных
целей (изучение профилактического или лечебного действия). В химиоте-
рапевтических экспериментах используют переносимые для
инфицированных животных дозы изучаемых веществ. Группы леченых и контрольных
животных должны включать не менее 10 мышей каждая. Защитный
эффект выражается в процентах и учитывается по снижению летальности
мышей в группе леченых животных по сравнению с контролем. О проти-
вогерпетической активности испытуемого препарата свидетельствует
снижение летальности мышей на 30 % и более. Активность испытуемого
соединения оценивается также по удлинению инкубационного периода по
сравнению с контролем, увеличению средней продолжительности жизни и
снижению титра вируса в мозговой ткани леченых мышей.
Изучение активности веществ в отношении вируса герпеса на кроликах
Вирусы простого герпеса обладают кератотропными свойствами,
вызывая офтальмовирусную патологию. Наиболее подходящей и доступной
моделью для изучения противовирусной активности препаратов при офталь-
могерпесе являются кролики. Эта модель очень удобна и информативна,
так как легко воспроизводится, клиническая картина офтальмо герпеса
близка к таковой у людей, позволяет получить четкие результаты
терапевтической эффективности, коррелирующие с противовирусной активностью
испытуемого вещества, установленной в культуре клеток и на мышах.
Для химиотерапевтических исследований используют молодых
кроликов породы шиншилла с массой тела 2—2,5 кг, так как их роговица более
чувствительна к ВПГ. Герпетический кератит вызывают следующим
образом. Перед заражением глаза анестезируют закапыванием в конъюнкти-
вальный мешок 0,5 % раствора дикаина. Затем глазное яблоко фиксируют.
Удобнее, если глазное яблоко выведено из орбиты путем нажатия
пинцетом под его нижний край. Острой иглой наносят поверхностные линейные
насечки (в слое эпителия) в виде 3 взаимно перпендикулярных полос. Ви-
руссодержащий материал наносят на поврежденное место в количестве
0,01 мл. Веки плотно смыкают и слегка втирают инокулят в роговицу.
Наблюдение за развитием клинической картины кератита проводят,
рассматривая ежедневно глаза с помощью бинокулярной лупы. Перед осмотром
поверхность роговицы окрашивают 0,5 % раствором флюоресцеина для
выявления эрозированных участков. Эрозии роговицы, обусловленные
механической травмой, обычно эпителизируются в течение 48 ч. Сроки
появления первых признаков заболевания варьируют в зависимости от степени
патогенности штаммов вируса. При использовании вирулентных штаммов
с выраженными кератотропными свойствами клинические признаки гер-
песвирусного кератита обнаруживаются через 12—24 ч после заражения,
выраженная картина кератита развивается через 48—72 ч. Клинические
явления могут нарастать еще в течение нескольких дней с признаками
воспаления радужной оболочки, а затем постепенно уменьшаются.
Первое проявление инфекционного процесса выражается в образовании
мелких пузырьков вдоль насечек на роговице, которые вскоре сливаются,
образуя поражения, напоминающие веточку. Обычно на роговице
появляются 2—3 такие веточки, которые более отчетливо видны при окраске
18*
-547-

0,5 % раствором флюоресцеина. Степень тяжести поражений варьирует от
слабо ветвистой дендрической язвы до тяжелых поражений с вовлечением
глубоких слоев роговицы. Это различие в степени интенсивности
заболевания может зависеть как от степени патогенности вируса, так и от
индивидуальной особенности животного.
В большинстве случаев наблюдается ограничение инфекционного
процесса и самопроизвольное выздоровление в течение 3-х недель. Обычно
через 12—15 суток уменьшается инфильтрация и наступает полная эпите-
лизация роговицы. Как правило, на роговице на месте ее поражения
остается рубец. Иногда течение инфекции может быть более тяжелым и
заканчиваться через 30—45 дней образованием грубых обширных помутнений
роговицы, выраженным сосудистым паннусом, заращиванием зрачка.
Однако такое течение кератита у кроликов нежелательно. При различных
формах поражений глаз наблюдается образование небольшого количества
отделяемого, содержащего лейкоциты. Иногда в отделяемом может быть
обнаружен вирус. Необходим контроль микрофлоры конъюнктивы.
Герпесвирусный характер заболевания можно подтвердить
обнаружением в слезе или в соскобе с конъюнктивы век антигена ВПГ методом
флуоресцирующих антител.
Как правило, у кроликов с развившимся герпетическим поражением
глаз в сыворотке крови на 7-й день после заражения появляются
специфические вируснейтрализующие антитела. Титр антител достигает максимума
на 11—12 день.
Тяжесть течения экспериментального герпетического кератита зависит
от вирусной нагрузки, вирулентности и кератотропности возбудителя. Для
инфицирования глаз рекомендуется использовать ВПГ, пассированный
путем внутримозгового заражения мышей, в виде 10 % суспензии мозга
мышей, содержащей 4—4,5 lg LD50 в количестве 0,03 мл. Однако при частых
пассажах на мышах не все штаммы вируса сохраняют кератотропные
свойства. При этом нередко усиливаются нейротропные свойства вируса
герпеса, приводящие к развитию энцефалита, что является нежелательным
осложнением герпетического кератита. Для сохранения кератотропных
свойств вируса необходимо проводить пассажи вируса на роговице
кроликов. Нейротропные свойства ВПГ уменьшаются при использовании
попеременного пассирования вируса в клеточной культуре ФЭК или от
роговицы к роговице кроликов с однократным пассированном путем
внутримозгового заражения мышей.
Для экспериментальных исследований можно использовать ВПГ 1-го
типа штаммы 1-С, 9-С, "Коптев", "Ела"; ВПГ 2-го типа штаммы "Трайков",
ВН, MS.
На каждую дозу изучаемого вещества планируют группу кроликов (3—5
животных). Такая же группа животных должна быть контрольной.
Заражать можно оба глаза, но использовать один глаз для лечения, а другой в
качестве контроля не следует. Способ применения испытуемых веществ
может быть разным: инсталляции растворов, аппликации мази, субконъ-
юнктивальные инъекции, пероральное введение и т. д. Контрольным
животным по той же схеме вводят плацебо (растворитель, мазевую основу и
т. д.). При изучении терапевтической активности соединений лечение
начинают через 2—3 дня после заражения при наличии начальной клиники
кератита. Длительность курса может быть различной — 7—10 дней и более,
в зависимости от эффективности изучаемого соединения. При оценке
активности проводят сравнительный анализ тяжести клинического течения
кератита в группе леченых и контрольных животных, учитывают длитель-
-548-

ность течения инфекции, определяют титр вируса в соскобах с роговицы
глаза путем титрования на мышах или в культуре клеток. Проводят также
морфологическое исследование тканей глаза кроликов, пораженных
вирусом герпеса, у контрольных животных и после лечения активным
веществом.
Генитальный герпес
Противогерпетическая активность лекарственных препаратов in vivo
традиционно определяется на модели генитального герпеса морских
свинок.
Наиболее адекватной генитальному герпесу человека является интрава-
гинальная модель герпетической инфекции морских свинок, которая
имеет ряд характерных, сходных с генитальным герпесом человека, признаков,
включающих: естественный путь заражения (интравагинально);
самоограничение первичного вульвовагинита; ассоциация с с неврологическими и
урологическими симптомами (осложнениями); латентная инфекция в
чувствительных ганглиях; спонтанные или индуцированные рецидивы, а
также гуморальные, клеточные и цитокиновые ответы на ВПГ-2 (40).
Герпетическая инфекция воспроизводится на самках морских свинок
(линия Hartley) весом 200—250 г инстилляцией интравагинально
специальным шприцем вируссодержащей жидкости с инфекционным титром ВПГ-
2 не ниже 105 БОЕ/мл.
Клинические симптомы генитального герпеса регистрируются
ежедневно в группе контроля и опытных группах перед проведением
соответствующих схем лечения. Наблюдения за животными при первичной
инфекции проводят до 21 дня после заражения.
Критериями оценки тяжести инфекционного процеса служат степень
выраженности, распространенность и размеры специфических поражений:
покраснение, припухлость, отек, мелкие и крупные пузырьки, язвы с
мацерацией, геморрагические корки, струп и наличие системных признаков.
Максимальная выраженность каждого из указанных признаков составляет
4 балла.
Эффективность препарата оценивается на пике развития
патологического процесса по снижению выраженности клинических проявлений,
сокращению сроков заболевания и расчету индекса лечебного действия
(ИЛД). При различных схемах применения препарата (дозы, кратность
введения, продолжительность курса лечения) ИЛД рассчитывается для
каждой из них.
При более длительном наблюдении (до 2—3 месяцев) у контрольных
животных в различные сроки после первичной инфекции наблюдаются
спонтанные рецидивы герпетических высыпаний и/или асимптомное
выделение HSV-2, что позволят оценить эффективность противорецидивного
действия препарата или различных схем его применения и рассчитать
индекс его противорецидивного действия (ИПД).
В зависимости от целей доклинического испытания препарата
герпетическая инфекция может быть воспроизведена на морских свинках самцах.
В этих случаях вируссодержащий материал наносится и втирается в
предварительно скарифицированную кожу penis. Скарификацию проводят под
анестезией с помощью хирургического ланцета, площадь скарификации не
менее 4 мм.
-549-

5.3. Вирус гепатита С
Вирус гепатита С (ВГС) открыт в 1986 г., и данные изучения
последовательностей генома ВГС (РНК) позволили отнести этот вирус к семейству
Flaviviridae, род Hepacivirus. Среди других возбудителей вирусных
гепатитов ВГС занимает ведущее положение, поскольку является одной из
главных причин хронических форм вирусных гепатитов, часто
заканчивающихся циррозом или гепатоцеллюлярной карциномой. Вирусный гепатит
С имеет глобальное распространение: более 3 % населения мира
инфицировано ВГС [17]. Чрезвычайно высокая степень изменчивости генома ВГС
явилась причиной появления значительно отличающихся друг от друга
генотипов вируса (в настоящее время известно до 6 циркулирующих в мире
генотипов ВГС), каждый из которых имеет до десяти разных субтипов. В
Российской Федерации среди 5 известных генотипов ВГС (la, lb, 2а, 2Ь и
За) доминирующим в циркуляции является генотип lb, который, как
известно, чаще других генотипов ВГС является причиной цирроза или
первичного рака печени. Попадая в организм человека, ВГС подвергается
дальнейшей изменчивости; возникают так называемые квазивиды ВГС,
которые теряют способность связываться с ВГС специфическими
антителами. Вот почему в крови людей одновременно определяют как антитела к
ВГС методом иммуноферментного анализа (ИФА), так и РНК ВГС —
методом полимеразной цепной реакции (ОТ ПЦР). Это основные
специфические маркеры инфекции, известные в настоящее время.
До настоящего времени в лечении ВГС препараты ос-интереферона не
имеют альтернативы. Более эффективной, но и значительно более
дорогостоящей считается комбинированная терапия интерферона с виразолом
(рибавирином). Однако только у 30—40 % инфицированных ВГС после
длительного лечения наблюдается положительный эффект при лечении
этими препаратами. Наиболее трудно поддаются лечению больные ВГС,
вызванным генотипом вируса lb. В этой связи представляется важным и
необходимым поиск новых более дешевых и более эффективных
препаратов для лечения вирусного гепатита С. Из-за отсутствия
экспериментальных лабораторных моделей ВГС-инфекции работа по скринингу
противовирусных соединений в отношении вирусного гепатита С еще недавно
была невозможна. Было известно, что лишь обезьяны шимпанзе
чувствительны к инфекции ВГС. Однако из-за дороговизны этих животных и ухода за
ними исследования во всем мире значительно ограничены. В НИИ
вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН впервые в мире были разработаны
модели инфекции, вызванной ВГС, как в культурах клеток, так и в
организме инфицированных животных [10, 11]. В результате этих
исследований из крови ВГС-инфицированных людей были выделены и
идентифицированы цитопатогенные варианты ВГС, относящиеся к разным
генотипам вируса. Таким образом, была реализована возможность исследований
по изучению противовирусной активности фармакологических веществ в
отношении инфекции, вызванной вирусом гепатита С.
Изучение противовирусной активности фармакологических соединений
в отношении ВГС инфекции in vitro
Получены данные о том, что изолированные варианты ВГС могут
размножаться и индуцировать цитопатогенный эффект в различных культурах
клеток: а) в перевиваемых клеточных линиях СПЭВ (клетки почки эм-
-550-

бриона свиньи), ВНК-21 (культуры клеток почки сирийского хомячка),
Vero (культуры клеток почки зеленой мартышки), клон 6 клеток Vero, SW-
13 (культуры клеток аденокарциномы надпочечника человека), ПТП-клет-
ки тестикул поросенка, МТ-4 — культуры клеток человека лимфобласто-
идного происхождения) и др.; б) в первичных культурах клеток: ФЭК
(фибробласты куриного эмбриона), первичные лимфоциты, первичные
культуры клеток головного мозга новорожденных мышей (ГМС). Все
упомянутые культуры клеток могут быть использованы для изучения
противовирусной активности фармакологических препаратов в отношении
инфекции, вызванной ВГС. Однако если речь идет об исследовании индукторов
интерферона, то лучше всего использовать ВГС-инфицированные
культуры клеток SW-13, ФЭК. Следует отметить, что для изучения
противовирусного эффекта предпочтительнее использовать однодневный монослой
первичных клеток или одно-двухдневный монослой перевиваемых культур
клеток как наиболее чувствительных к репликации ВГС. Культуры клеток
выращивают в 24-луночных панелях и на первой стадии их используют для
определения цитотоксических свойств изучаемого препарата. В
дальнейших исследованиях используют нетоксичные для клеток дозы препарата.
Для изучения противовирусного действия препаратов, как правило,
используют одну дозу вируса, равную 10,0 ТЦД50/клетка. Поэтому в
исследованиях используют ВГС с известным титром инфекционной активности
для культур клеток. Заражение культур клеток проводят по классическому
типу: монослой клеток освобождают от питательной среды, промывают
средой Хэнкса, удаляют культуральную жидкость и наносят по 20—40 мкл
вируссодержащего материала в дозе 10,0 ТЦД50/клетка. После
20-минутного контакта неадсорбировавшийся вирус удаляют и вносят по 0,4 мл
ростовой культуры.
Обработка клеток препаратом проводится следующим образом:
готовятся нетоксичные для клеток дву- или десятикратные разведения препарата,
по 40 мкл каждого разведения вносят в среду-поддержку инфицированных
культур клеток. В исследованиях культуры клеток, инфицированной ВГС,
используется разное время для внесения препарата и изучения его
противовирусного действия: а) за 24 ч до инфекции клеток, б) в момент
инфекции, в) через 24 ч после инфекции. Во всех случаях используют
адекватные контроли, которыми служат: 1) ВГС инфицированные культуры
клеток без добавления препарата; 2) неинфицированные культуры клеток,
обработанные препаратом как в случаях а, б и в; 3) неинфицированные
культуры клеток. Культуры клеток наблюдают в течение 6—7 дней, когда в
ВГС инфицированных культурах клеток (контроль вируса) развивается
максимальный цитопатогенный эффект). В эти сроки определяют
жизнеспособность (%) клеток во всех вариантах опыта, окрашивая клетки мети-
леновой синькой. При этом жизнеспособность незараженных культур
клеток и культур клеток, обработанных препаратом, должна быть
максимальной, до 100 %, жизнеспособность ВГС инфицированных культур клеток
(контроль вируса) — минимальной (менее 20 %). В этом случае
статистически достоверное увеличение жизнеспособности ВГС инфицированных
клеток, "леченных" препаратом, может свидетельствовать о
противовирусном действии того или иного фармакологического препарата.
Однако в исследованиях по изучению противовирусной активности
препаратов в отношении ВГС инфекции обязательным является и 2-й этап
изучения противовирусной активности, который позволяет дать
количественную оценку влияния противовирусного эффекта препарата на
проявления инфекционных свойств ВГС.
- 551 -

С этой целью через 2—3 дня после заражения клеток ВГС пробы среды
отбирают из лунок всех вариантов опыта для определения инфекционной
и антигенной активности ВГС. Инфекционную активность ВГС
определяют титрованием проб среды в чувствительных культурах клеток, каковыми
могут быть культуры клеток СПЭВ, Vero-Еб, ПТП, ВНК-21 или другие из
перечисленных выше. Главное, чтобы в этих культурах клеток ВГС мог
индуцировать отчетливый цитопатогенный эффект. Титрование проб,
содержащих ВГС, проводят на 24- или 96-луночных панелях, используя для
каждой пробы по крайней мере по три лунки. Обязательными являются
контрольные лунки с неинфицированными культурами клеток. Учет
титрования вируса проводят на 6—7-й день, когда в культурах клеток, зараженных
пробами среды, отобранными из лунок с ВГС-инфицированными
клетками (контроль вируса) развивается максимальный цитопатогенный эффект.
Учет результатов проводят на основании сравнительного расчета
инфекционных титров ВГС по формулам Рида и Менча или Кербера во всех
вариантах опыта (Леннет-30). В случае если препарат подавляет репликацию
ВГС в этих культурах на 2,0—3,0 lg и более, полученные данные
свидетельствуют о его антивирусном действии.
Следует отметить, что ВГС, как и многие представители семейства Fla-
viviridae, обладает способностью агглютинировать эритроциты гуся. Эта
способность вируса к гемагглютинации может быть проверена в реакции
гемагглютинации (РГА) в классической постановке [Clarke, Casals, 1954].
Именно этот тест (РГА) может быть использован в первую очередь как
экспресс-метод для оценки противовирусной активности
фармакологического препарата на первом этапе исследований в динамике, когда
необходимо определить жизнеспособность ВГС инфицированных клеток. РГА
может служить и как дополнительный метод оценки противовирусной
активности препарата.
Количественный метод ОТ ПЦР, широко используемый для
диагностики ВГС в крови и в материалах, полученных при биопсии печени людей, в
настоящее время в доклинических испытаниях препаратов вряд ли может
быть применим, так как является дорогостоящим. Однако, когда препарат
полностью подавляет ЦПД ВГС, ОТ ПЦР может быть использован как
тест, подтверждающий высокую активность препарата.
Изучение противовирусной активности фармакологических соединений
в отношении ВГС инфекции у животных
Известно, что цитопатогенными вариантами ВГС, выделенными из
сыворотки инфицированных людей, при внутривенном заражении можно
инфицировать мышей и кроликов. Несмотря на то что у зараженных ВГС
животных, как правило, не развиваются клинические симптомы
заболевания, в различных органах и тканях происходит интенсивная репликация
ВГС, подтверждая пантропные свойства вируса. Эта особенность и легла в
основу изучения противовирусной активности препаратов при ВГС
инфекции у животных, которая заключается в том, чтобы определить
инфекционную и антигенную активность ВГС в органах и тканях ВГС
инфицированных лабораторных животных. Для работы с лабораторными животными
требуется разрешение этического комитета по работе с лабораторными
животными и использованию их для заражения ВГС. Спустя неделю после
внутривенного введения ВГС содержащего материала и после лечения
препаратами, у мышей забирают кровь, печень, головной мозг, а также селе-
-552-

зенку и лимфатические узлы (иногда исследования ограничиваются
кровью или сывороткой крови, печенью и головным мозгом). У кроликов
чаще всего отбирают сыворотку крови и лимфоциты. Далее органы и ткани
отдельно от каждого инфицированного животного гомогенизируют,
полученные гомогенаты центрифугируют при 4000 об/мин, после чего надоса-
дочная жидкость используется для определения инфекционной и
антигенной концентрации ВГС методом титрования в чувствительных для ВГС
культурах клеток. Учет и сравнительный анализ, а также оценку действия
препарата(ов) проводят по аналогичной схеме, описанной при изучении
противовирусной активности препаратов в отношении ВГС инфекции в
культурах клеток. Полученные данные могут быть дополнены результатами
изучения ВГС специфической антигенной активности в органах и тканях
леченных и не леченых ВГС инфицированных животных (методы ИФА и
РГА).
Нередко при оценке противовирусного действия препарата на ВГС
инфекцию у животных определяют уровни ВГС-специфических антител в
крови лабораторных животных. Изменение титра антител, спектра антител
может свидетельствовать в пользу действия препарата. Особенно важно
определение вируснейтрализующих антител в крови ВГС инфицированных
животных в реакции биологической нейтрализации, которую следует
ставить в культурах клеток, чувствительных к цитопатогенному действию
вируса. Сыворотки перед определением вируснейтрализующих антител
разводят до 1:5—1:10, предварительно прогревают на водяной бане при 56 °С в
течение 20 мин. Реакцию биологической нейтрализации можно ставить
как с целью определения титра вируснейтрализующих антител (в этом
случае используют одну дозу вируса и серию двукратных разведений
сыворотки), так и для определения индекса нейтрализации, когда используют одно
разведение сыворотки и серию десятикратных разведений ВГС.
Увеличение титра вируснейтрализующих антител к ВГС или индекса
нейтрализации (частное от деления титров ВГС до и после нейтрализации
сыворотками) может свидетельствовать об иммуностимулирующем
действии противовирусного препарата, используемого в опытах с животными,
инфицированными ВГС.
Таким образом, доклиническое изучение противовирусной активности
фармакологических препаратов в отношении инфекции, вызванной
вирусом гепатита С, может слагаться из двух этапов: исследования
противовирусной активности in vitro, т. е. в культурах, чувствительных к репродукции
ВГС клеток, и исследования противовирусной активности in vivo на уровне
организма лабораторных животных.
5.4. Вирус клещевого энцефалита
Возбудитель клещевого энцефалита (КЭ) — вирус из семейства Flaviviri-
dae, переносимый иксодовыми клещами и вызывающий тяжелые
заболевания человека и животных. Это — природно-очаговое заболевание, пик
которого приходится на весенне-осенний период.
На сегодняшний день КЭ является одним из наиболее опасных природ-
но-очаговых инфекций на территории Российской Федерации. За
последние 15 лет заболеваемость КЭ значительно возросла. Так, если в 1980—
1986 гг. число заболевших КЭ не превышало 700—1200 человек ежегодно,
то в 2000—2003 гг. эта цифра возросла до 8000—11 000 случаев в год. При
этом половина из них приходится на жителей крупных городов, а 40 — со-
-553-

ставляют дети до 12 лет. Несмотря на то что летальность при КЭ не
превышает 2—4 %, в районах Урала, Восточной Сибири и Дальнего Востока
ежегодно наблюдаются вспышки КЭ, вызываемые высокопатогенными для
человека штаммами КЭ. В этих случаях смертность может увеличиваться
до 30 % за счет преобладания тяжелых двухволновых очаговых, менинго-
энцефалитических форм КЭ.
Очаги КЭ, различающиеся по тяжести заболевания, распространены в
европейской и азиатской частях России и ряде европейских стран и стран
СНГ. В последнее время число случаев заболевания КЭ увеличивается.
Заболевание характеризуется острым началом, лихорадкой, сильной
головной болью, тошнотой, рвотой, фотофобией, параличом шейно-плечевого
отдела. Есть легкие и бессимптомные формы.
В целях профилактики КЭ используют несколько вариантов инактиви-
рованных вакцин, однако их применение не решает всех проблем
профилактики этой инфекции. Основными причинами недостаточной
эффективности вакцинации населения инактивированными вакцинами
являются: 1) частые нарушения инструкций по применению вакцин (не
проводятся необходимые троекратные инъекции при первичной вакцинации и
своевременная ревакцинация); 2) аллергические реакции; 3) вторичные
иммунодефицита, связанные с воздействием на организм внешних
факторов (стресс и т. п.). В настоящее время не разработаны эффективные
лечебно-профилактические препараты против вируса КЭ, а также средства
этиотропной терапии при клинически выраженном КЭ. Это связано с тем
обстоятельством, что вирус КЭ обладает способностью длительно перси-
стировать в ЦНС и органах иммунной системы (от нескольких месяцев до
нескольких лет). Основная опасность использования противовирусных
препаратов при КЭ заключается в часто наблюдаемой трансформации
острых форм КЭ в хронические формы на фоне применения таких средств.
Существенным ограничением для поиска и внедрения в практику
противовирусных препаратов является развитие в организме при КЭ целого ряда
иммунопатологических реакций, что препятствует применению иммуномо-
дуляторов. В связи с этим разработка лечебно-профилактических
лекарственных средств против КЭ является весьма актуальной.
Существует широкая антигенная вариабельность этого вируса. Чаще
всего при химиотерапевтических исследованиях используют штаммы Со-
фьин и Абсеттаров, а также штаммы вируса КЭ, недавно изолированные в
ходе полевых исследований. Вирус КЭ обладает цитопатогенным
действием в культуре клеток почки эмбриона свиньи СПЭВ, ВНК-21, культуре
клеток почек зеленой мартышки (Vero, 4647), хорошо размножается в фиб-
робластах куриного эмбриона (ФЭК).
Подавление ЦПД вируса КЭ на клетки
Клетки выращиваются в микропанелях. Вирус титруется обычным
способом и в присутствии различных концентраций противовирусного
препарата. Учет проводится в присутствии витального красителя.
Подавление бляшкообразования
Вирус КЭ образует характерные бляшки под агаровым покрытием при
репродукции в культуре клеток СПЭВ. Противовирусный препарат может
- 554-

быть добавлен в агаровое покрытие. Учитывается число бляшек при
титровании вируса КЭ с добавлением и без добавления препарата в агаровое
покрытие.
Подавление репродукции вируса КЭ в клетках СПЭВ
Вирус КЭ выращивается в культуре клеток СПЭВ без добавления и в
присутствии противовирусного препарата в 2—3 концентрациях.
Репродукция вируса оценивается по цитопатогенному действию на клетки, иммуно-
ферментным методом и по инфекционности вируса с помощью
последующего титрования вирусного потомства методом бляшек.
Подавление вирулентности вируса в опытах на мышах
При интрацеребральном заражении вирус КЭ вызывает гибель белых
беспородных мышей массой 5—6 г. Вирус титруется в присутствии и в
отсутствие противовирусного препарата. Оценивается удлинение времени
жизни и летальность животных. В работу берутся не менее 2—3
концентраций противовирусного препарата. Одним из ведущих критериев
безопасности препарата является отсутствие у выживших животных (после введения
вируса и препарата) инфекционного вируса в ЦНС, селезенке и
лимфатических узлах через 30—60 сут после заражения вирусом и введения
препарата. Наличие или отсутствие инфекционного вируса определяют
традиционными методами in vivo (на 2—3-дневных сосунках беспородных белых
мышей) или in vitro (на культуре клеток СПЭВ).
Описанные выше методы определения специфической
противовирусной активности применимы при изучении широкого спектра вирусов, для
которых созданы адекватные модели in vitro и in vivo.
ПРЕДПОЛАГАЕМАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ
Разработанная стандартная методика изучения специфической
противовирусной активности фармакологических веществ позволяет повысить
эффективность доклинического изучения потенциальных противовирусных
лекарственных средств, добиться воспроизводимости и сопоставимости
результатов исследований. Использование предлагаемого стандартного
комплекса методов позволит ускорить внедрение в практику новых
эффективных противовирусных препаратов и уточнить показания к их назначению
при различных вирусных инфекциях.
Л итература
1. Андреева О. Т., Амбросьева Г. В. Модели экспериментального герпеса и их
применение для изучения антивирусных веществ // Методические проблемы
экспериментальной химиотерапии вирусных инфекций. — Минск, 1980. — С. 89—96.
2. Вотяков В. И., Бореко Е. И., Владыко Г. В. Первичное изучение антивирусных
свойств синтетических и природных соединений: Методические указания. —
Минск, 1984.
3. Вотяков В. И., Бореко Е. И., Судник Ю. М. и др. Методические вопросы поточно-
поэтапного определения антивирусных свойств у новых веществ // Проблемы и
-555-

перспективы изучения нуклеозидов, бициклогептана, адамантана и других
противовирусных соединений в эксперименте и клинике. — Минск, 1982. — С. 17—
22.
4. Вотяков В. И., Бореко Е. И. Подход к оценке активности химических соединений
против вирусов, размножающихся в тканевых культурах // Методические вопросы
научной разработки противовирусных средств. — Минск, 1977. — С. 10—14.
5. Вотяков В. И., Бореко Е. И., Владыко Г. В. и др. Первичное изучение антивирусных
свойств синтетических и природных соединений. — Минск, 1986. — 25 с.
6. Галабов А. С, Галегов Г. А. Методические аспекты химиотерапии вирусных
инфекций // Acta Virol. - 1978. - Т. 22. - С. 343-348.
7. Галегов Г. А., Пушкарская Н. Л., Леонтьева Н. А. и др. Программа
экспериментального изучения антивирусных (антигриппозных) препаратов и критерии их
поэтапной оценки // Вопр. вирусол. — 1976. — № 4. — С. 503—507.
8. Гуськова Т. А., Глушков Р. Г. Арбидол - иммуномодулятор, индуктор интерферона,
антиоксидант. "Тинотекс", — М., 1999.
9. Гуськова Т. А., Николаева П. С, В. В. Петере. Руководство по
экспериментальному доклиническому изучению новых фармакологических веществ. МЗ РФ. — М.,
2000. - С. 274-281.
10. Дерябин П. Г., Вязов С. О., Исаева Е. И. и др. Персистенция вируса гепатита С в
культурах клеток головного мозга мышей-сосунков // Вопр. вирусол. — 1997. —
Т. 6. - С. 254-258.
11. Дерябин П. Г., Львов Д. К. Высокопродуктивный вариант вируса гепатита С.
Выделение, характеристика, идентификация // Доклады Академии наук РФ. — 1998. — Т.
358, № 5. - С. 688-691.
12. Ершов Ф. И. Антивирусные препараты. — М.: Медицина, 1998.
13. Ильенко В. И. Методы испытания и оценки противовирусной активности
химических соединений в отношении вируса гриппа. — Л., 1977. — 34 с.
14. Ларина Г. И., Левкович Е. И. Взаимосвязь генотипа животного и штаммовых
особенностей вируса с течением экспериментального клещевого энцефалита // Вопр.
вирусологии. — 1983. — .№ 3. — С. 345—348.
15. Леннет Э., Шмидт Н. Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных
заболеваний. — М.: Медицина, 1974.
16. Ленева И. А., Фадеева Н. И., Федякина И. М., Гуськова Т. А. и др. Применение им-
муноферментной индикации вирусспецифических антигенов в изучении нового
противовирусного препарата арбидола // ХФЖ. — 1994. — № 9. — С. 4—8.
17. Львов Д. К., Дерябин П. Г. Географическое распространение вируса гепатита С и его
генотипов // Вопр. вирусолог. — 1997. — Т. 5. — С. 196—199.
18. Методы экспериментальной химиотерапии / Под ред. Г. Н. Першина. — М.:
Медицина, 1971. - С. 239-305.
19. Методы испытания и оценки противовирусной активности химических соединений
в отношении вируса гриппа: Методические указания, МЗ СССР. — Л., 1977.
20. Николаева И. С. и др. Патоморфологическое изучение эффективности бонафтона в
эксперименте // Фармакол. и токсикол. — 1976. — № 3. — С. 336—340.
21. Николаева И. С. и др. Экспериментальное изучение новой лекарственной формы
противовирусного препарата — флореналь // Фармакол. и токсикол. — 1977. —
№ 1. - С. 82-86.
22. Николаева И. С. и др. Экспериментальное изучение глазных лекарственных пленок
с оксолином // Фармакол. и токсикол. — 1977. — № 3. — С. 346—348.
23. Носков Ф. С, Демченко В. М., Соколова Е. Д. и др. Методы дифференциации
токсического и специфического действия противовирусных препаратов при первичном
отборе // Методические вопросы научной разработки противовирусных средств. —
Минск, 1977. - С. 49-55.
24. Першин Г. Н, Богданова Н С. Химиотерапия вирусных инфекций. — М., 1973. —
24 с.
25. Чижов Н П., Лукьянова Р. И. Модель экспериментальной инфекции Пиксуна у
белых мышей // Вопр. вирусологии. — 1985. — № 2. — С. 214—215.
26. Чижов Н П., Носков Ф. С. Схема первичного отбора противовирусных препаратов //
Молекулярная биология вирусов, химиотерапия и химиопрофилактика вирусных
инфекций. — Минск, 1974. — С. 217—219.
27. Шашихина М. Н, Челнов В. М., Жаврид С. В. Применение микрометода тканевых
культур для массового отбора антивирусных средств // Методические вопросы
научной разработки противовирусных средств. — Минск, 1977. — С. 55—61.
-556-

28. Aparecida M., Brito V. P., Carmo L. et at. Emprego di microtecnica na triagem de
substantias antivirais // Rev. Microbiol. — 1981. — Vol. 12, N 3. — P. 65—69.
29. Berenbaum M. C. A method for testing for synergy with anv number of agents // J.
Infectious Diseases. - 1978. - Vol. 137. - P. 122-130.
30. Canonico P. G. Ribavirin // Antibiotics. - 1983. - Vol. 6. - P. 161 — 186.
31. Finter N. B. Methods for screening in vitro and in vivo for agents active against myxovi-
ruses // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 1970. - Vol. 173, N 1. - P. 131-138.
32. Heider H., Adamczyk В., Richter B. Evaluation of antiviral substances against influenza A
virus strains by the haemadsorption reduction test // Acta Virol. — 1980. — Vol. 21, N 5. —
P. 373-376.
33. Langtois M., Rasset S., Denis 1., Aymard M. A micromethod for evaluating the sensitivity
of ocular herpes stains to antiviral drugs // Pathol. Biol. — 1983. — Vol. 31, N 6. —
P. 555-559.
34. Lloyd R. E., Weigent D. A., Stanton G. S. Microassay for Sindbis virus and interferon
activity// J. Clin. Microbiol. — 1983. - Vol. 18. - P. 296—299.
35. Mckinley M. A., Miralles J. V., Brisson С J., Pancic F. Prevention of human poliovirus
induced paralysis and death in mice by the antiviral agent arildone // Antimicrobial Agents
a. Chemotherapy. - 1982. - Vol. 22. - P. 1022-1024.
36. Oxford J. S. Specific inhibitors of influenza virus replication as potential chemoprophylac-
tic agents // J. AntimicrobialChemotherapy.— 1975. — Vol. 1, N 1. — P. 7—23.
37. Schwobel W., Stretsste G., Kiefer G. Attempts to standardize the screening for antiviral
drugs in vitro tests // Chemotherapy. — 1979. — Vol. 25. — P. 268—278.
38. Sehgal C. L. Host pathogenicity of variola virus for experimental animals // J.
Communication Disorders. - 1984. - Vol. 16, N 2. - P. 136-143.
39. Schwobel W., Stretsste G., Kiefer G. Attempts to standardize the screening for antiviral
drugs in vitro tests // Chemotherapy. — 1979. — Vol. 25. — P. 268—278.
40. Stanberry L. R. Evaluation of herpes simplex virus vaccines in animals: the guinea pig
vaginal model // Rev. Infect. Dis. - 1991. - Vol. 13. - Suppl. 11. - S. 920-923.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:
БОЕ — бляшкообразующие единицы
В ГС — вирус гепатита С
ВПГ —вирус простого герпеса 1-го и 2-го типа
ИЛД — индекс лечебного действия
ИПД — индекс противорецидивного действия
ИФА — иммуноферментный анализ
КЭ — клещевой энцефалит
ЛД — летальная доза
МПК —максимально переносимая доза
МФА — метод флуоресцирующих антител
МЭК — максимально эффективная концентрация
ОТ-ПЦР — обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция
РГА — реакция гемагглюцинации
СПЖ — средняя продолжительность жизни
ТЦД — тканевое цитопатогенное действие
ЭМ — электронная микроскопия
ЦПД — цитопатогенное действие
ЦТД — цитотоксическое действие
ХТИ — химиотерапевтический индекс

Методические указания по изучению специфической
активности индукторов интерферонов
СОСТАВИТЕЛИ: академик РАМН, проф.
Ф. И. Ершов; д. б. н. Э. Б. Тазулахова; д. б. н.
А. Н. Наровлянский; д. м. н., проф. С С.
Григорян; к. б. н. М. В. Мезенцева; В. Э. Щербенко
Введение
Семейство интерферонов (ИФН) относится к числу наиболее
изученных цитокинов, осуществляющих межклеточные взаимодействия и
обеспечивающих сохранение гомеостаза организма. При вирусных заболеваниях
отмечается резкое нарушение функционирования системы ИФН, его
многочисленных эффектов (антивирусного, антипролиферативного, иммуно-
модулирующего, радиопротекторного и др.) и сложившихся межклеточных
взаимодействий. Дефекты системы ИФН приводят в свою очередь к
нарушению функционирования иммунной и гормональной систем и как
следствие повышению риска развития тяжелых инфекционных и
онкологических заболеваний. Когда нарушение функции системы ИФН устойчиво
улавливается современными методами исследования, их определяют как
ИФН-дефицитное состояние организма.
В последние годы среди различных патологий резко возрос удельный вес
вирусных инфекций (особенно таких, как грипп, герпес и гепатиты). В
связи с этим огромное значение приобретает создание и использование
препаратов, пригодных для неспецифической терапии и профилактики вирусных
инфекций. Отмечается все более широкое применение цитокинов [ИФН,
интерлейкины (ИЛ), фактор некроза опухолей (ФНО), ростовые факторы] и
индукторов ИФН для лечения различных заболеваний вирусной и
невирусной этиологии.
КЛАССИФИКАЦИЯ, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И ОБЛАСТЬ
ПРИМЕНЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНОВ И ИНДУКТОРОВ
ИНТЕРФЕРОНОВ
ИНТЕРФЕРОНЫ
Существующие медицинские препараты ИФН делятся по своему
составу на альфа-, бета- и гамма-ИФН, а по способу получения — на
природные (полученные из препаратов человеческой крови) и рекомбинантные.
Все ИФН обладают как противовирусной, так и иммуномодулирующей
активностью. Механизм действия альфа- и бета-ИФН заключается в
основном в блокировании начала трансляции, т. е. синтеза вирусспецифических
белков, путем распознавания и дискриминации вирусных
информационных РНК от клеточных. Механизм действия гамма-ИФН гораздо сложнее.
Помимо противовирусной активности, он является одним из ведущих
медиаторов иммунитета человека и животных [1].
Настоящие методические указания представлены комплексом тестов,
необходимых при проведении доклинического отбора лекарственных
противовирусных препаратов (в том числе индукторов интерферона) для не-
- 558 -

специфической терапии и у больных с различными формами вирусной
патологии.
КЛАССИФИКАЦИЯ ИНТЕРФЕРОНОВ
Природные
Рекомбинантные
Альфа-фероны
Бета-фероны
Гамма-фероны
Альфа-2А
Альфа-2В
Альфа-2С
Бета-ИФН
Гамма-ИФН
Человеческий лейкоцитарный ИФН (ЧЛИ)
Эгиферон
Виллферон
Лейкинферон
Человеческий фибробластный ИФН
Ферон
Человеческий иммунный ИФН (гамма-ИФН)
Реаферон
Роферон
Виферон
Реалвдирон
Интрон А
Инрек
Берофор
Рекомбинантные бета-ИФН (бета-фероны)
Рекомбинантные гамма-ИФН (гамма-фероны)
"Цитируется по справочнику Ф. И. Ершова "Антивирусные препараты" (2).
Спектр заболеваний, при которых показаны ИФН, можно разделить на
3 большие группы: вирусные инфекции, онкологические заболевания и
другие формы патологии. Ниже приводится спектр заболеваний, при
которых показана эффективность препаратов ИФН.
СПЕКТР АНТИВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ ИНТЕРФЕРОНА*
Гепатит В
Гепатит С
Гепатит D (дельта)
Герпес генитальный
Опоясывающий лешай
Папилломавирусные заболевания
(гени-
тальные бородавки, остроконечные
кондиломы)
Папилломатоз гортани
СПИД
Рассеянный склероз
ЧЛИ, роферон, интрон, берофор,
виллферон, гамма-интерферон
Роферон, интрон, виллферон, ферон
Роферон, интрон, виллферон
ЧЛИ, роферон, интрон, ферон
ЧЛИ, роферон, берофор
Роферон, интрон, берофор, виллферон,
ферон, ЧЛИ, гамма-интерферон
ЧЛИ, интрон, берофор, виллферон, ферон
ЧЛИ, интрон, виллферон, ферон
Бетасерон, бетаферон, ферон
Выявлен положительный эффект
Герпес- и аденовирусные кератиты и кера-
токонъюнктивиты
ОРВИ
Цитомегаловирусные инфекции как
осложнения после пересадки органов
Подострый склерозирующий панэнцефалит
Альфа- и бета-интерфероны
Альфа- интерферон ы
То же
То же
"Цитируется по справочнику Ф. И. Ершова "Антивирусные препараты" (2).
-559-

ИНДУКТОРЫ ИНТЕРФЕРОНОВ
Индукторы интерферонов представляют собой весьма разнообразное по
составу семейство высоко- и низкомолекулярных соединений, обладающих
высокой способностью синтезировать собственный (эндогенный) ИФН в
организме животных и человека. Собственно способностью индуцировать
образование эндогенного ИФН и других цитокинов объясняются
противовирусные и иммуномодулирующие свойства этих перспективных
противовирусных препаратов нового поколения. Ниже приводится классификация
и итоги доклинических испытаний индукторов ИФН, обладающих
высоким химиотерапевтическим индексом и пригодных для профилактики и
лечения вирусных инфекций и заболеваний невирусной этиологии.
КЛАССИФИКАЦИЯ ИНДУКТОРОВ ИНТЕРФЕРОНОВ
Химическая природа
Синтетические соединения
Низкомолекулярные (ароматические углеводороды)
Флуореноны
Акриданоны
Полимеры (дсРНК)
Поли(А),поли(У)
Поли(Г),поли(Ц)
Поли(И),поли(Ц)
Природные соединения
Низкомолекулярные полифенолы
(производные госсипола)
Полимеры (дсРНК)
Препарат
Амиксин
Циклоферон,неовир
Полудан
Полигуацил
Амплиген
Мегасин, кагоцел, саврац,
рогасин, гозалидон
Ларифан, ридостин
ОСНОВНЫЕ ИТОГИ ДОКЛИНИЧЕСКОГО ИСПЫТАНИЯ ИЗУЧЕННЫХ
ИНДУКТОРОВ ИНТЕРФЕРОНА
Индуктор
Амиксин
Кагоцел

Циклоферон
Неовир
Ларифан
Применение
Системное (в/в, в/м,
п/к, п/о)
Местное
Системное (в/м, п/о)
Системное (в/в, в/м,
п/к)
Местное
Системное (в/в, в/м,
п/к, в мозг, аэр.)
Грипп, ОРВИ,
острые энцефалиты,
герпетический
менингит, бешенство,
новообразования
Органы-мишени
Кровь, кишечник,
печень, мозг, лим-
фоидные органы
Кровь, печень,
почки, селезенка, лим-
фоидные органы
Кровь, печень, мозг,
легкие, селезенка,
мышцы
Кровь, печень,
почки селезенка, лим-
фоидные органы
Спектр активности
Острые и хронические
энцефалиты, бешенство,
гепатиты, новообразования
Герпес, грипп, ОРВИ
Грипп, ОРВИ, герпес,
гепатит, бешенство, клещевой
энцефалит
ОРВИ, хламидиозы,
гепатиты, бешенство,
ВИЧ-инфекция, энцефалиты
ОРВИ, урогенитальные
хламидиозы
-560-

Продолжение
Мегасин
Полигуа-
цил
Полудан
Ридостин
Рогасин
Саврац
Местное
Местное
Системное (в/в, в/м,
п/к, и/н, аэр.)
Местное
Системное (в/в, в/м,
п/к)
Местное
Системное (в/в, в/м,
п/к, п/о)
Системное (в/в, в/м,
п/к, п/о, рект.)
Местное
Кровь, печень,
селезенка, легкие,
мышцы, лимфоидные
органы
Легкие, мышцы,
лимфоидные органы
*
Кровь, печень,
селезенка, кишечник
Кровь, селезенка,
печень, кишечник,
мозг, мышцы,
лимфоидные органы
Грипп, ОРВИ, герпетические
кератоконъюнктивиты,
опоясывающий лишай
Герпетические кератоконъ-
юнктивиты, опоясывающий
лишай
Грипп, острые энцефалиты,
гепатит, бешенство
Герпетические кератиты и
кератоконъюнктивиты
Грипп, ОРВИ, хламидиоз,
бешенство
Кератоконъюнктивиты,
грипп, ОРВИ
Гепатиты А и В,
новообразования
Бешенство, гепатит А,
новообразования, энтеровирус-
ные инфекции, урогениталь-
ные хламидиозы
Грипп, ОРВИ
НОВИЗНА ПРЕДЛАГАЕМОГО МЕТОДА
Предложена и апробирована оригинальная методология, позволяющая
определить интерферон-индуцирующий эффект исследуемых препаратов и
уточнить направление их применения при различных вирусных
заболеваниях. С помощью представленных методологических подходов
значительно расширен диапазон тестов для оценки специфической активности
индукторов интерферонов. Описано определение динамики продукции
интерферона, интерферон-продуцирующей способности иммунокомпетент-
ных клеток, способности синтезировать интерферон различными органами
и тканями, способности синтезировать цитокины в ответ на индукцию
исследуемым препаратом, определение гипореактивной фазы.
МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ
МЕТОДА
Стандартное оборудование и реактивы вирусологической лаборатории.
ОПИСАНИЕ МЕТОДА
ДОКЛИНИЧЕСКИЙ ОТБОР ИНДУКТОРОВ ИНТЕРФЕРОНОВ
ПЕРВИЧНЫЙ ОТБОР (СКРИНИНГ) ПРЕПАРАТОВ IN VITRO
Разработанные методы позволяют определить следующие параметры:
1) токсичность препаратов и максимально переносимую концентрацию,
-561 -

2) противовирусную активность препарата,
3) интерферон-индуцирующую активность препарата.
Основные материалы и методы
Вирусы. При изучении антивирусных препаратов целесообразно
использовать вирусы, отличающиеся высокой чувствительностью к действию
интерферонов и коротким циклом размножения: венесуэльского
энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ), Синдбис (ВС), везикулярного стоматита,
штамм Индиана (ВВС), а также энцефаломиокардита мышей (ЕМС).
Клетки. В работе могут быть использованы клетки, чувствительные к
действию ИФН: 1) первично трипсинизированные клетки — фибробласты
эмбрионов кур (ФЭК) и человека (ФЭЧ), почки и легкие эмбрионов
человека (ПЭЧ и ЛЭЧ), а также перевиваемые клетки диплоидных фибробла-
стов человека (ДФЧ) и культуры мышиных (L929) и обезьяньих (BSC-1)
клеток.
Культивирование клеток. В работе используют 24-часовой монослой
клеток, выращенных в 96-луночных плоскодонных планшетах в среде RP-
MI 1640 или двойной среде Игла с добавлением 10 % прогретой бычьей
(для первичных клеток) или 10 % телячьей эмбриональной сыворотки,
глютамина (0,3 мг/мл) и гентамицина (0,08 мг/мл) в термостате с С02.
Эталонные индукторы ИФН. В качестве эталона может быть
использован комплекс поли (И)—поли(Ц) фирмы "Calbiochem", а также амиксин,
ридостин и циклоферон.
Определение токсичности in vitro
Готовят 10-кратные разведения препарата в культуральной среде,
обычно от 1000 до 0,01 мкг/мл, и вносят в культуры клеток, достигших
монослоя (по 4 повтора на каждое разведение). Контакт препарата с клетками
осуществляют 4 и 24 ч при 37 "С, после чего планшеты микроскопируют
для определения цитодеструктивного действия, отмечаемого по 4-кресто-
вой системе, по методу Финтера, где 100 % деструкция клеток
обозначается 4+, 25 % деструкция — 1+. Минимальная концентрация препарата,
вызывающая цитотоксический эффект на 50 % (++), рассматривается как
цитопатогенная доза (ТЦД50). На основании полученных данных
определяют максимально переносимую концентрацию препарата (МПК), которую
вычисляют по формуле:
МПК = ТЦДм/4.
Испытания активности препарата проводят в концентрациях от '/4
концентрации МПК и ниже.
Исследование интерферон-индуцирующей активности in vitro и критерии его
оценки
Первичная оценка интерферон-индуцирующей активности препарата
проводится в культуре первично-трипсинизированных или диплоидных
клеток человека и животных. Пробы культуральной жидкости (по 4
повтора на каждое разведение) берутся через 4 и 24 ч после контакта изучаемого
-562-

препарата с клетками. Параллельно (в качестве контроля) используют
стандартные индукторы ИФН в максимальной интерферон-индуцирующей
концентрации, рекомендованной для каждого эталонного индуктора ИФН.
Собранные пробы хранят при температуре —20 °С.
Титрование ИФН проводят в 96-луночных плоскодонных планшетах с
культурой диплоидных фибробластов человека (ДФЧ) или животного,
выращенных в ростовой среде до образования монослоя. В качестве
индикаторного тест-вируса используется вирус энцефаломиокардита мышей
(ВЭМК). За единицу активности ИФН (Ед/мл) принимается величина,
обратная его максимальному разведению, которая защищает 50 % клеток от
цитопатогенного действия 100 ТПД50 вируса. В каждом титровании
используется также референс-препарат ИФН для перевода полученной
активности ИФН в международные единицы (ME).
Определение противовирусной активности препаратов
После удаления из опытных планшет культуральной жидкости для
определения уровня ИФН, индуцированного различными концентрациями
исследуемых препаратов, клетки заражают тест-вирусом в дозе,
вызывающей 100 % поражение клеток (ТЦЦ50) через 24—48 ч после заражения. В
качестве контроля используют клетки, не обработанные препаратами.
Определение противовирусного действия препарата проводят методом
титрования проб, собранных через 24 ч после заражения вирусом культуры
клеток, чувствительных к данному вирусу, выращенных в плоскодонных
планшетах.
Оценка результатов испытания препаратов in vitro
Оценка противовирусной активности соединенния проводится по
степени ингибиции размножения тест-вируса. Препаратом, обладающим
выраженным антивирусным эффектом, следует считать соединение,
подавляющее размножение вируса в культуре клеток на 1,7—2,0 lg.
При оценке результатов испытания препаратов в культуре клеток
основным следует считать их способность индуцировать продукцию
интерферона. Что же касается противовирусной активности, то она должна
учитываться в случае обнаружения у препарата интерферон-индуцирующей
активности, и для ее оценки пригодны параметры, разработанные для
широкого круга химиотерапевтических препаратов, обладающих
противовирусной активностью.
При обнаружении способности препарата индуцировать в клетках ИФН
следует определить минимально эффективную концентрацию препарата
(МЭК), что позволит вычислить химиотерапевтический индекс (ХТИ)
исследуемого вещества in vitro. ХТИ представляет собой отношение
максимально переносимой концентрации (МПК) к минимально эффективной
концентрации (МЭК):
ХТИ = МПК/МЭК.
Схема первичной оценки препаратов in vitro, таким образом, включает
три основных параметра (интерферон-индуцирующая способность,
антивирусное действие и ХТИ).
-563-

ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИНДУКТОРОВ ИНТЕРФЕРОНА IN VITRO
Показатель эффективности
Титры ИФН МЕ/мл
Снижение титра вируса, lg
ХТИ
Неактивные, слабоактивные
< 4-8
< 1,78
< 4
Активные
> 16-32
> 1,78
>8
Высокоактивные
> 32-64
>3-6
> 16
ПЕРВИЧНЫЙ ОТБОР ИНДУКТОРОВ ИНТЕРФЕРОНА IN VIVO
Первичная оценка индукторов ИФН in vivo проводится, как правило, на
белых беспородных мышах или мышах линии СВА и включает несколько
этапов.
1. Определение LD50 препарата при внутрибрюшинном введении.
2. Определение индукции сывороточного ИФН через 6 и 24 ч после
внутрибрюшинного введения препарата.
3. Определение противовирусной активности на мышах по показателю
защиты от смертельной вирусной инфекции.
Основные материалы и методы
Вирусы. При изучении антивирусных препаратов in vivo целесообразно
использовать вирусы, отличающиеся высокой чувствительностью к
действию интерферонов. Одним из них может, в частности, служить вирус эн-
цефаломиокардита мышей (ЭМК).
Животные. В работе используются мыши линии СВА и нелинейные
белые мыши массой 10—12 и 16—18 г.
Эталонные индукторы ИФН. В качестве эталонных могут быть
использованы индукторы ИФН: амиксин, ридостин и циклоферон в максимально
эффективных концентрациях in vivo.
Титрование ИФН осуществляется по методике, описанной выше, в
культуре мышиных перевиваемых клеток L929 с использованием
индикаторного тест-вируса — ВЭМК мышей.
Определение LDS0 препарата in vivo
LD50 препарата определяют на белых нелинейных мышах массой 10—
12 г. Животным внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл вводят препарат в
различных концентрациях. Каждый день в течение 2 нед регистрируют
смертность животных и затем высчитывают LD50 препарата по одному из
общепринятых методов.
Определение интерферон-индуцирующей активности препарата
Для определения интерферон-индуцирующей активности препарата
используются мыши массой 18—20 г, которым внутрибрюшинно вводится
доза, равная '/4—Vie LD50 Через 6 и 24 ч после введения препарата у
животных собирают кровь. Этот срок рекомендуется использовать для того,
чтобы в испытываемой зоне учесть препараты с различной динамикой
продукции стимулируемого ИФН. Для забора крови и приготовления сы-
-564-

воротки используются обычные методы. Для каждой пробы используют не
менее 4—5 животных. Пробы ИФН титруют параллельно с контролем и
стандартом мышиного ИФН по ЦПД, вызываемому ВЭМК на
перевиваемой линии мышиных клеток L929, выращенных на пластиковых
плоскодонных 96-луночных планшетах описанным выше способом.
Определение противовирусной активности по выживаемости животных
Определение противовирусной активности in vivo производят на белых
беспородных мышах массой 10—12 г. На каждое условие эксперимента
используют по 10 животных. Предварительно выбирается инфицирующая
доза вируса. С этой целью вирус, используемый для моделирования
экспериментальной инфекции, титруют на мышах и высчитывают инфицирующую
дозу вируса, которая должна вызывать от 80 до 95 % погибших животных.
Препарат в дозе '/4> 'A. Vie и т. д. LD50 вводят мышам внутрибрюшинно в
объеме 0,2 мл за 24 и 2 ч до заражения вирусом. На каждое условие
эксперимента используют не менее 10 животных. Наблюдение проводят в
течение 14 дней, ежедневно отмечая количество погибших животных, и
вычисляют количество оставшихся живыми в процентах. Если выживаемость
составляет менее 30 %, препарат считается слабоактивным, от 30 до 60 % —
активным и более 60 % — высокоактивным.
Определение химиотерапевтического индекса
ХТИ представляет собой отношение минимальной токсической дозы
(МТД) к минимальной эффективной дозе (МЭД).
ХТИ = МТД/МЭД МТД = LD50/4.
Соединения, имеющие ХТИ < 4, считаются слабоактивными, > 8 —
активными и > 16 — высокоактивными.
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИНДУКТОРОВ ИНТЕРФЕРОНА IN VIVO
Показатель эффективности
Титры ИФН, МЕ/мл
Выживаемость, %
ХТИ
Неактивные, слабоактивные
< 32
< 30
<4
Активные
> 32-100
> 30-60
>8
Высокоактивные
> 100
>60
> 16
УГЛУБЛЕННОЕ ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ
Отобранные в результате первичного скрининга наиболее
высокоактивные и малотоксичные индукторы интерферона подвергаются углубленному
исследованию, которое должно предусматривать следующие тесты:
1) исследование способов введения препарата и определение динамики
продукции ИФН;
2) определение интерферон-продуцирующей способности иммуноком-
петентных клеток (спленоцитов, тимоцитов, клеток периферической крови
и костного мозга) в ответ на индукцию исследуемым препаратом;
3) определение способности синтезировать ИФН различными органами
и тканями мышей в ответ на индукцию исследуемым препаратом;
-565 -

4) определение способности синтезировать другие цитокины;
5) определение гипореактивной фазы in vitro и in vivo;
6) отработка оптимальных схем введения препарата;
7) определение спектра антивирусного действия препарата.
Основные материалы и методы
Вирусы. При изучении антивирусных препаратов in vivo целесообразно
использовать вирусы, охватывающие как можно более широкий круг
вирусных инфекций у животных, сходных с соответствующими
инфекционными заболеваниями человека. Это прежде всего вирусы, вызываюшие
энцефалиты, а также вирусы гриппа, герпеса, гепатита, бешенства.
Животные. В работе используются мыши линии СВА и нелинейные
белые мыши массой 10—12 и 16—18 г.
Эталонные индукторы ИФН. В качестве эталонных могут быть
использованы индукторы ИФН: амиксин, ридостин и циклоферон в максимально
эффективных концентрациях in vivo.
Культивирование клеток. Иммунокомпетентные клетки, выделенные от
мышей, культивируют в круглодонных 96-луночных планшетах в среде RP-
MI 1640 с добавлением 10 % телячьей эмбриональной сыворотки, глюта-
мина (0,3 мг/мл) и гентамицина (0,08 мг/мл) в термостате с С02.
Титрование ИФН осуществляется по методике, описанной выше.
Определение динамики продукции ИФН и способов введения препарата
in vivo
Исследование способов введения препарата и определение динамики
продукции ИФН в ответ на индукцию тестируемого препарата является
необходимым этапом для оптимизации схем его введения. Исследования
желательно проводить на мышах линии СВА, так как эти животные
обладают высокой способностью к продукции ИФН.
Для определения динамики продукции ИФН используются мыши
массой 18—20 г, которым препарат вводят в объеме 0,2 мл разными
способами (внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, подкожно, пе-
рорально, интраназально и ректально). При внутрибрюшинном,
внутривенном, внутримышечном и подкожном способах препарат вводится в
максимально эффективной дозе, установленной в ходе доклинического
отбора препарата in vivo. При внутримышечном, пероральном, интрана-
зальном и ректальном способах введения препарата, кроме этой дозы,
используют еще одну концентрацию препарата, равную '/10 максимально
эффективной дозы, поскольку, как было установлено в ряде случаев, при
этих способах введения индукторов максимальный эффект достигается
при использовании вещества в концентрации, в 5—10 раз меньшей, чем
при внутрибрюшинном его применении. Через 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72 и
96 ч после введения препарата у животных собирают кровь и определяют
концентрацию ИФН в сыворотке. В связи с тем что у линейных мышей
результаты колеблются в незначительном диапазоне, можно
использовать по 4 мыши на каждую точку.
Для забора крови, приготовления сыворотки и титрования ИФН
используются методы, описанные выше.
-566-

Определение интерферон-продуцирующей способности
иммунокомпетентных клеток в ответ на индукцию исследуемым
препаратом
Индукторы ИФН обладают уникальной способностью "включать"
синтез ИФН в определенных популяциях клеток и органов, что в ряде случаев
имеет определенные преимущества перед мультипотентной стимуляцией
иммуноцитов интерферонами. При этом надо иметь в виду, что при
разных способах введения препарата в продукции ИФН могут принимать
участие различные органы, ткани и клетки иммунной системы.
Одним из важных этапов доклинического исследования индукторов
ИФН является определение интерферон-продуцирующей способности
иммунокомпетентных клеток (спленоцитов, тимоцитов, клеток
периферической крови, лимфатических узлов и костного мозга) в ответ на индукцию
исследуемым препаратом. Этот тест может помочь ответить на вопрос:
какие клетки иммунной системы принимают участие в продукции ИФН в
ответ на индукцию исследуемым препаратом? Исследование проводят 2
методами.
1. Этот эксперимент позволяет ответить на вопрос, способны ли и в
какой степени те или иные клетки иммунной системы синтезировать ИФН в
ответ на индукцию исследуемым препаратом. С этой целью обескровливают
5 интактных животных линии СВА, массой 18—20 г, собирая кровь в
центрифужную пробирку с 1—2 каплями гепарина. Затем животных
препарируют, собирая в отдельные емкости со средой (RPMI 1640 с добавлением 0,08
мг/мл гентамицина) берцовые кости, тимусы, подмышечные лимфатические
узлы и селезенки. Клетки из тимуса, лимфатических узлов и селезенки
выдавливают в стерильные чашки Петри при помощи шпателя, а из костей —
при помощи шприца с тонкой иглой, дважды отмывают
центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин в растворе Хенкса, суспендируют в
малом объеме среды RPMI, подсчитывают концентрацию клеток в камере
Горяева и разводят средой инкубирования (см. раздел "Материалы и
методы") до конечной концентрации 5—10 • 106 кл/мл. Кровь разводят в 10 раз
той же средой. Клетки индуцируют максимально эффективной дозой
препарата, установленной in vitro, и инкубируют в 96-луночных круглодонных
планшетах (по 3 лунки на условие эксперимента). Пробы культуральной
жидкости собирают через каждые 24 ч в течение 3 сут. Титры ИФН
исследуют в гомологичной культуре клеток L929 методами, описанными выше.
2. Данный метод позволяет ответить на вопрос: какие клетки иммунной
системы принимают участие в продукции ИФН при разных способах
введения исследуемого препарата? Клетки выделяют из животных,
индуцированных разными способами, описанными выше. Для эксперимента
используют максимально эффективные in vivo концентрации препарата.
Выделение и культивирование клеток, а также отбор проб и титрование ИФН
осуществляют так же, как в предыдущем эксперименте.
Определение способности синтезировать ИФН различными органами
и тканями мышей в ответ на индукцию исследуемым препаратом
Предлагаемый метод позволяет уточнить эффективность разных
способов введения вещества и наметить круг инфекций, при которых данный
препарат может оказаться эффективным.
Для определения динамики продукции ИФН в различных органах
- 567-

используются мыши массой 18—20 г, которым препарат вводят в объеме
0,2 мл разными способами, описанными выше, в максимально
эффективной концентрации для данного способа введения вещества. Через 4,
24, 48, 72, 96 и 120 ч животных (по 4—5 на каждую точку) забивают и
стерильно извлекают в отдельные емкости мозг, легкие, кишечник,
печень, мышцы.
Собранные органы взвешивают, растирают в стерильных ступках,
предварительно обработанных хромпиком, чтобы остатки детергента не влияли
на определение активности ИФН. Для снижения активности протеаз в
тканях все процедуры осуществляют на холоде в кратчайшие сроки.
Ступки предварительно охлаждают при 4°С, помещая в ледяную . Выделение
ИФН осуществляют в буфере Hepes 10 mM. Для предотвращения протео-
литического гидролиза ИФН в элюирующий буфер добавляют контрикал
до конечной концентрации 500 ЕД/мл. Для получения 20 % взвеси
добавляют 4 мл раствора на 1 г ткани. Разрушение клеток осуществляют
троекратным замораживанием и оттаиванием образцов жидким азотом,
который приливают прямо в ступки. Для более полной элюции ИФН,
связанного с мембранами, пробы обрабатывают Ма2ЭДТА, которую добавляют до
конечной концентрации 10 тМ. Пробы инкубируют при 4°С 2 ч, после
чего удаляют нерастворимый осадок центрифугированием (500 об/мин в
течение 30 мин). Титры ИФН в надосадочной жидкости определяют
методами, описанными выше.
Нейтрализацию Ка2ЭДТА в пробах проводят непосредственно перед
титрованием ИФН, для чего добавляют в раствор соли двухвалентных
катионов Са++ и Mg++. Молярное соотношение №2ЭДТА/двухвалентные
катионы составляет 1:0,6 или 1:0,8.
Ниже приводятся примеры, иллюстрирующие эффективность метода.
ВЛИЯНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ ТКАНЕЙ НА УРОВЕНЬ ТЕСТИРУЕМОГО
ИФН (Ед/мл)
Исследуемый орган
Мозг
Селезенка
Мышцы
Кишечник
Химические добавки
-
160
10
10
10
№2ЭДТА
10 000-25 000
640
100
10
контрикал
10
10
10
5000-10 000
№2ЭДТА + контрикал
200
400
100
10 000
Из представленных данных видно, что добавление Ка2ЭДТА к пробам
мозга, селезенки и мышц существенно повышает выход тестируемого
ИФН, в то время как добавление Ка2ЭДТА к пробам кишечника не
влияет на биологическую активность выделенного ИФН. Наоборот,
контрикал не повышает выход ИФН из тканей мозга, селезенки и мышц, в
то время как его добавление существенно увеличивает выход ИФН из
кишечника.
Поскольку комплексная обработка в ряде случаев оказывается менее
эффективной, для определения биологической активности ИФН в
кишечнике рекомендуется применять контрикал, а Ка2ЭДТА — для определения
в других органах.
-568-

Определение способности синтезировать цитокины
Определение цитокин-продуцирующей способности препаратов
проводят in vitro в 24-луночных планшетах. Для этого в планшеты вносят кровь
доноров или мышей линиии СВА, разведенную в 10 раз в среде RPMI-
1640 (с глютамином, 2 % телячьей сывороткой и антибиотиками). Затем в
планшеты вносят индукторы ИФН в различных концентрациях, а также
стандартные индукторы ИФН (ВБН, СЭА, ФГА, ЛПС, Кон А). Планшеты
инкубируют 24 ч в С02-инкубаторе при 37 °С. Оставшуюся кровь
центрифугируют. Полученную плазму крови тестируют на присутствие ИФН и
других цитокинов.
Количественное содержание цитокинов (ИФН, ИЛ, ФНО, рецепторов
цитокинов и др.) в плазме/сыворотке и пробах цельной крови,
индуцированных исследуемыми цитокинами и индукторами ИФН с последующей
индукцией стандартными индукторами ИФН или без нее, определяют
методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием
коммерческих тест-систем.
Определение гипореактивной фазы in vitro и in vivo
Долгое время считалось, что индукторы ИФН активны только при
профилактическом применении. Циркуляция ИФН в организме животных
и человека в ответ на введение индуктора ИФН ограничена, как правило,
2 сут. Это ограничение связано с тем, что ИФН, образовавшийся в
организме животных и человека в ответ на введение исследуемого препарата,
быстро выводится из кровотока. Кроме того, вслед за индукцией ИФН,
параллельно с продукцией, происходит быстрое включение контрольных
механизмов синтеза ИФН, которое влечет за собой период рефрактерности
(неспособности синтеза ИФН в ответ на повторную индукцию тем же
препаратом как in vitro, так и in vivo). Эта фаза наступает после достижения
максимума продукции ИФН. Рефрактерность развивается в ответ на
первое введение препарата. Повторное введение индуктора только помогает
выявить фазу гипореактивности.
Рефрактерность до последнего времени была одним из ограничений
применения индукторов ИФН, поскольку повторное введение индуктора в
организм, находящийся в состоянии гипореактивности, по меньшей мере
нецелесообразно. Однако в последние годы были предложены схемы
применения индукторов ИФН с учетом рефрактерной фазы, позволяющие
преодолеть кратковременность действия индукторов.
Длительность фазы рефрактерности зависит как от клеток, так и от
использованного индуктора и места введения препарата в организм.
Определение гипореактивной фазы in vitro
Удобным методическим приемом для определения гипореактивной
фазы является повторное внесение индуктора ИФН в культуральную
жидкость через определенные интервалы времени.
С этой целью используют культуру первично-трипсинизированных или
диплоидных клеток человека и животных, выращенных в 96-луночных
плоскодонных планшетах. Степень ИФН ответа клеток оценивают по
титрам ИФН, регистрируемым в культуральной жидкости, собранной (по 3
-569-

лунки на условие) через 18 ч после повторного использования индуктора.
Титрование ИФН осуществляют в гомологичной культуре методами,
описанными выше.
Определение гипореактивной фазы in vivo
Для определения рефрактерной фазы in vivo используются мыши
линии СВА и нелинейные белые мыши массой 16—18 г. Животным вводят
препарат внутрибрюшинно в максимально эффективной концентрации.
Повторное введение препарата в той же концентрации осуществляется
через определенные интервалы времени. Животных обескровливают
через интервал времени, необходимый для осуществления полноценного
синтеза, индуцированного данным препаратом. ИФН в сыворотке крови
исследуют, титруя пробы ИФН в культуре клеток L929, методами,
описанными выше.
Отработка оптимальных схем введения препарата
Оптимизация схем введения индуктора состоит из нескольких этапов и
включает:
1) определение оптимальной концентрации препарата (минимальной
дозы, при которой достигается максимальный интерферон-индуцирующий
эффект),
2) определение наиболее эффективного способа введения,
3) определение сроков повторного введения препарата,
4) возможность сочетанного применения исследуемого препарата с
другими индукторами ИФН, различными цитокинами, включая ИФН, и
другими препаратами.
Оптимальная концентрация препарата и определение наиболее
эффективного способа его введения определяются на начальных этапах
доклинического изучения индукторов ИФН. Сроки повторного введения
определяются исходя из рефрактерной фазы.
Вторым способом преодоления рефрактерное™ является чередование
введений 2 индукторов ИФН. В последние годы было показано, что ре-
прессоры (белки, осуществляющие контрольные механизмы продукции
ИФН) обладают специфичностью по отношению к индуктору. Поэтому
состояние рефрактерности может быть преодолено при введении
индукторов ИФН разной природы. Чередование 2 индукторов ИФН разной
природы с учетом рефрактерной фазы каждого из них позволяет получать
относительно высокие титры ИФН, циркулирующие в кровотоке в течение
длительного времени.
Методы определения титров ИФН, циркулирующего в кровотоке
животных, описаны в предыдущем разделе ("Определение гипореактивной
фазы in vivo").
Определение спектра антивирусного действия препарата
Методы определения спектра антивирусного действия препарата
описаны в другом разделе методических рекомендаций.
-570-

ПРЕДПОЛАГАЕМАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ
Метод изучения специфической активности индукторов интерферонов
позволяет проводить доклиническую оценку интерферон-индуцирующей
активности изучаемых препаратов in vitro и in vivo, прогнозировать их
эффективность в терапии заболеваний вирусной этиологии и в
доклинических условиях отработать оптимальные схемы введения препарата.
Литература
1. Ершов Ф. И. Система интерферона в норме и при патологии. — М.: Медицина,
1996. - С. 53-70.
2. Ершов Ф. И. Антивирусные препараты. — М.: Медицина, 1998.
Методические указания по изучению противотуберкулезной
активности фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: чл.-корр. РАМН, проф. Т. А.
Гуськова; д. м. н., проф. В. И. Голышевская; к.
б. н. М. В. Шульгина; к. б. н. Л. П. Мартынова;
д. м. н. Г. Н. Можокина; д. м. н. Г. Б. Соколова
В связи с расширяющейся эпидемией проблема борьбы с туберкулезом
продолжает сохранять свое значение для здравоохранения России и всего
мира. Эффективность лечения больных туберкулезом во многом зависит от
разработки, освоения и промышленного производства новых
лекарственных средств, обладающих повышенной бактериостатической активностью
по отношению к микобактериям туберкулеза (МБТ). Эти исследования
являются частью Программы ВОЗ по борьбе с туберкулезной инфекцией.
Несмотря на имеющийся в клинике набор противотуберкулезных средств,
эффективность их применения снижается из-за быстрого приобретения
лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза к наиболее
активным противотуберкулезным препаратам. Резистентные к действию
известных лекарственных средств МБТ могут длительное время находиться в
остаточных очагах инфекции, сохраняя способность к размножению, что
приводит к реактивации инфекционного процесса. В связи с этим поиск
новых противотуберкулезных препаратов, активно воздействующих
непосредственно на микобактерий туберкулеза и не вызывающих побочных
реакций, является необходимым условием в борьбе с туберкулезной
инфекцией. Большое значение здесь имеют микробиологические исследования,
при которых изучается эффективность лечения экспериментального
туберкулеза с учетом изменения бактериальной популяции, определение
бактериостатической и бактерицидной активности новых препаратов в
сравнении с традиционно применяемыми. Принципиальные подходы к изучению
противотуберкулезной активности различных синтетических и природных
соединений не отличаются от методов экспериментальной антимикробной
терапии в отношении других микроорганизмов, однако имеют важные
особенности, обусловленные биологией микобактерий туберкулеза. На-
-571 -

стоящие рекомендации основываются на описанных ранее методах и
многолетнем опыте скрининга веществ на антибактериальную активность,
накопленном в ЦНИИТ РАМН, ЦХЛС-ВНИХФИ, НИИ фтизиопульмоно-
логии ММА им. И. М. Сеченова.
Изучение бактериостатической и бактерицидной активности новых
соединений в опытах in vitro
Штаммы
В связи с выраженной специфичностью многих лекарственных средств
по отношению к М. tuberculosis испытание веществ на бактериостатическую
активность должно проводится в первую очередь с использованием
лабораторных тест-штаммов М. tuberculosis человеческого типа — Academia, H37Rv.
Кроме того, в случае обнаружения выраженной антибактериальной
активности веществ целесообразно изучить чувствительность к ним клинических
штаммов, т. е. вьщеленных из патологического материала больных
туберкулезом, как чувствительных к основным противотуберкулезным препаратам,
так и имеющим различные спектры устойчивости к ним. В случае
соединений, гомологичных применяемым противотуберкулезным препаратам,
обязательно тестирование их активности в отношении клинических штаммов,
устойчивых к гомологу изучаемого вещества. Целесообразно также изучить
действие соединений на микобактерии бычьего и птичьего типа.
Лабораторные (М. tuberculosis H37Rv, Academia), а также клинические
штаммы микобактерии туберкулеза с различной степенью резистентности
к противотуберкулезным препаратам могут быть получены из Музея
культур и Национальной коллекции штаммов М. tuberculosis, вьщеленных от
больных туберкулезом (ЦНИИТ РАМН, Москва, Яузская аллея, 2) или в
НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И. М. Сеченова (Москва, ул.
Достоевского, 4).
Питательные среды и условия культивирования микобактерии
Питательной средой для культивирования микобактерии, согласно
международным стандартам, является плотная яичная среда Левенштейна—
Иенсена. Для повышения эффективности культуральных исследований
используют плотную питательную среду (ППС) Финн-2. Использование 2
сред одновременно повышает процент выявления МВТ из патологического
материала. Штаммы должны регулярно пересеваться один раз в 4 нед.
Время роста культуры на плотных яичных средах в среднем составляет 21 день
(18-28 дней).
Приготовление сред для культивирования микобактерии
Среда Левенштейна—Йенсена
Состав:
Солевой раствор:
калий фосфорнокислый однозамещенный — 2,4 г
-572-

магний сернокислый — 0,24 г
магний лимоннокислый — 0,6 г
L-аспарагин — 3,6 г
глицерин — 12 мл
вода дистиллированная — 600 мл
Реактивы растворяют в указанной последовательности при
подогревании, не доводя до кипения, и стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение
20 мин. Срок хранения стерилизованной солевой основы — 3—4 нед.
Яичная масса: 24—27 штук (в зависимости от величины) свежих диетических
яиц моют в теплой проточной воде щеткой с мылом, погружают на 30 мин
в 70 % спирт. Затем яйца разбивают стерильным пинцетом в стерильную
посуду с бусами над пламенем горелки, хорошо гомогенизируют,
добавляют 600 мл солевого раствора и 20 мл стерильного 2 % водного раствора
малахитового зеленого. Смесь фильтруют через марлевый фильтр и
разливают в пробирки.
Свертывание производят при 85 °С в течение 45 мин.
Среда Финн 2
Состав:
Солевая основа:
магний сернокислый — 0,5 г
натрий лимоннокислый — 1,0 г
квасцы железоаммиачные — 0,05 г
калий фосфорнокислый однозамещенный — 20 г
аммоний лимоннокислый однозамещенный — 5,0 г
натрий глутаминовокислый однозамещенный — 10 г
вода дистиллированная — до 1 л
Ингредиенты растворяют в указанном порядке в теплой
дистиллированной воде, стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 20 мин.
Яичная масса: 24—27 штук (в зависимости от величины) свежих
диетических яиц обрабатывают, как для среды Левенштейна—Йенсена,
смешивают с солевой основой и малахитовым зеленым в тех же объемах, что и
для приготовления среды Левенштейна—Йенсена. Свертывают при
температуре 85 °С в течение 45 мин.
Питательную среду разливают в пробирки по 5 мл и свертывают в
аппарате в наклонном положении в соответствии с режимом, указанном для
каждой среды, не допуская ее перегрева. Рекомендуется проводить
свертывание среды в электросвертывателе с автоматической регулировкой
температуры.
В опытах in vitro, кроме плотных питательных сред, используется
жидкая синтетическая среда Школьниковой.
Жидкая среда Школьниковой
Состав среды:
калий фосфорнокислый однозамещенный — 1,5 г
натрий фосфорнокислый двузамещенный — 2,5 г
магний сернокислый — 0,5 г
натрий лимоннокислый — 1,5 г
железо лимонноаммиачное зеленое, водное — 0,05 г
-573-

L-аспарагин — 1,0 г
глицерин — 30 мл
дистиллированная вода — до 1 л
Реактивы последовательно растворяют в теплой дистиллированной
воде, подводят рН до 7,0, используя для этого 40 % едкий натр. Стерилизуют
в автоклаве при 1 атм в течение 30 мин.
Перед посевом суспензии микобактерий в среду вводят 10 %
стерильной плазмы крови человека или инактивированной при 70 "С сыворотки
крупного рогатого скота.
Приготовление стандартного раствора бактериальной суспензии
Культура микобактерий (14—21 день), выращенная на плотной яичной
среде в стерильных условиях, снимается с косяка платиновой
лопаточкой, растирается в пробирке и суспензируется в 0,9 % растворе NaCl
(физиологический раствор). Далее крупным частицам культуры дают
осесть, выдерживая пробирку 20 мин при комнатной температуре. Взвесь
бактерий отбирается пипеткой и переносится в другую пробирку.
Необходимая оптическая плотность, или мутность, соответствующая 5-му
стандарту, достигается добавлением в пробирку физиологического
раствора. В 1 мл суспензии, соответствующей 5-му стандарту оптической
плотности, содержится 500 млн микробных тел (5 х 108 микробных тел).
Суспензию микобактерий засевают в жидкую среду из расчета 0,2 мл на
2 мл среды. Такой способ засева обеспечивает равномерное внесение
посевного материала в пробы.
Приготовление разведений изучаемых соединений
Исходный раствор испытуемого соединения обычно готовится с
использованием стерильного физиологического раствора или
дистиллированной воды. В случае низкой растворимости вещества применяют этиловый
спирт, диметилсульфоксид (ДМСО) или растворитель, предложенный
разработчиками препарата. Навеску вещества растворяют в минимальном
объеме растворителя и после этого разводят водой или физиологическим
раствором до нужной концентрации. Например, к навеске 10 мг вещества
добавляют 1, 2, 3 мл спирта или ДМСО, встряхивают, при необходимости
подогревают в теплой водяной бане или в термостате при 37 "С. После
этого полученный раствор или гомогенную взвесь доводят водой или
физиологическим раствором до необходимой концентрации.
При применении высоких концентраций растворителей необходимо
контролировать эффект воздействия этих веществ на рост микобактерий.
В случае изучения веществ — гомологов известных
противотуберкулезных препаратов при выборе испытуемых концентраций целесообразно
ориентироваться на данные о минимальных подавляющей (МПК) и
бактерицидной (МБК) концентрациях этих препаратов.
В случае изучения веществ, относящихся к новым химическим группам,
следует испытывать широкий спектр концентраций.
Пример расчета необходимых концентраций для исследования новых
соединений в жидкой среде Школьниковой:
I разведение: 10 мг вещества + 10 мл жидкости (дистилированная вода,
спирт, физиологический раствор, ДМСО) = 10 мл — 1000 мкг/мл;
-574-

II разведение: 1 мл I разведения + 9 мл среды Школьниковой = 10 мл —
100 мкг/мл.
Это и есть исходное рабочее разведение.
Определение бактериостатической активности
Для выявления бактериостатической активности изучаемых веществ
применяют метод серийных разведений. В пробирки разливают по 2 мл
питательной среды. Для получения серий необходимых концентраций
изучаемых препаратов в первую опытную пробирку наливают 4 мл исходного
рабочего разведения. Ряд серийных разведений получают, перенося
последовательно из каждой пробирки по 2 мл жидкости в следующую. Из
последней, 10-й пробирки, 2 мл жидкости удаляют. Концентрации в данном
случае уменьшаются от 100 до 0,195 мкг/мл. Кроме того, в каждом
опытном ряду необходимо наличие 2 контрольных пробирок, содержащих 2 мл
среды без препаратов. Далее во все пробирки ряда засевают по 0,2 мл
бактериальной суспензии, приготовленной по 5-му стандарту оптической
плотности. Пробирки закрывают силиконовыми пробками или
парафинируют и инкубируют в термостате при 37 °С. В качестве контрольного ряда
необходимо применять известные противотуберкулезные препараты.
Рост поверхностной культуры штамма Academia в пробирках без
препарата может быть определен визуально на 7—8-й день как пленка на
поверхности среды, глубинный рост H37Rv — на 10-й день как хлопьевидный
или зернистый осадок на дне пробирки. Из этого осадка готовятся мазки и
окрашиваются по Цилю—Нильсену. Результаты оцениваются на 14-й день
как по количеству МБТ в полях зрения, так и по интенсивности "косооб-
разования" при микроскопии мазков по следующей схеме:
нет МБ — на 100 полей зрения 0
1—9 МБ — на 100 полей зрения +
при наличии МБ от 10 до 100 в 100 полях зрения +
при наличии МБ от 1 до 9 в одном поле зрения ++
при наличии МБ от 10 и более в одном поле зрения,
образование "кос" +++
Описанный выше метод позволяет определить МПК, т. е.
концентрацию вещества, приводящую к частичному (+) или полному (0) подавлению
роста МБТ в жидкой среде.
Определение бактерицидной активности
Вещества с высокой бактериостатической активностью изучаются более
подробно, определяется способность их к бактерицидному действию.
Культивирование микобактерий и приготовление разведений веществ в
этом случае проводятся, как описано выше. Испытуемые концентрации
выбираются в соответствии с определенными ранее значениями МПК.
Проверяется различная продолжительность воздействия соединения на
культуру микобактерий: 1, 3, 6, 24 ч и 2, 5 и 10 сут. Действие соединения
останавливают путем отмывания культуры от изучаемого вещества. Для этого
пробирки с культурой центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин,
надосадок сливают, осажденные микобактерий дважды отмывают 0,9 %
раствором NaCl.
Отмытые от антибактериального вещества микобактерий суспензируют в
-575-

1,0 мл 0,9 % раствора NaCl. Из полученной суспензии приготовляют мазки
и окрашивают по Цилю—Нильсену, затем засевают по 0,2 мл на 2 пробирки
с плотной яичной средой Левенштейна—Йенсена и Финна-2.
Результат микроскопии мазков оценивают как по количеству микобак-
терий в поле зрения, так и по интенсивности "косообразования" в
соответствии с приведенной выше схемой. Учет результатов культуральных
исследований проводят через 21—28 дней и 2,5 мес культивирования в
термостате при 37 °С по следующей схеме:
отсутствие колоний на косяке 0
единичные, до 20 колоний +
от 20 до 100 колоний ++
более 100 колоний +++
Жизнеспособность микобактерий в питательной среде можно также
оценить при окрашивании мазков по Мурахаши.
Окраска мазков по Цилю—Нильсену
Приготовленные мазки покрывают фильтровальной бумагой и наносят
1,5 мл карболового фуксина на один мазок, затем медленно нагревают
предметное стекло с мазком над пламенем горелки до появления пара. При этом
не допускают кипение фуксина и высушивание материала. Мазок с
прогретым раствором оставляют на 5 мин. Затем удаляют фильтровальную бумагу и
аккуратно смывают остатки краски со стекла проточной водой.
Обесцвечивание проводят 25 % раствором серной кислоты (2 мл на
мазок) в течение 3 мин. Затем промывают препарат проточной водой и
дополнительно обрабатывают 96 % этиловым спиртом (2 мл на мазок) в
течение 5 мин. Гашение фона достигается обработкой 0,3 % раствором мети-
ленового синего в течение 30—60 с.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРОВ
Все растворы готовятся с использованием дистиллированной воды
1. Насыщенный спиртовой раствор фуксина:
основной фуксин — 3 г
96 % этиловый спирт — 100 мл.
2. Рабочий раствор фуксина:
кристаллы фенола — 5 г
медленно нагревают до расплавления, доливают 90 мл воды, затем в
полученный раствор фенола добавляют 10 мл насыщенного раствора фуксина.
3. 25 % серная кислота:
в 300 мл воды доливают 100 мл 98 % (концентрированной) серной
кислоты. Данная манипуляция проводится с крайней осторожностью!
4. 0,3 % метиленовый синий:
0,3 г метиленового синего растворяют в 100 мл воды.
Окраска люминесцентными красителями (ауромином, родамином)
Фиксированный в сухожаровом шкафу при 80 "С 1 ч мазок окрашивают
в течение 40—50 мин, нанося 1,5 мл раствора флюорохромов на стекло.
После окраски мазок смывают водой, обесцвечивают 3 % солянокислым
-576-

спиртом (2 мл) в течение 3 мин и снова промывают водой. Гашение фона
достигается обработкой 0,3 % водным раствором метил енового синего в
течение 30 с, после чего мазок промывают водой.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРОВ
Все растворы готовятся с использованием дистиллированной воды
1. Раствор флюорохромов:
1,0 г ауромина 00 и 0,1 г родамина С отечественного производства либо
родамин В (тетраэтилродамин С26 Н31 CL N2 03-Sigma) растворяют в
небольшом объеме воды, затем доводят объем раствора водой до 1000 мл. Все
растворы флюорохромов хранят во флаконах из темного стекла!!!
2. 3 % солянокислый спирт:
8,5 мл концентрированной соляной кислоты добавить в 91,5 мл 96 %
этилового спирта.
3. 0,3 % раствор метиленового синего:
0,3 г метиленового синего растворить в воде и довести до 100 мл водой.
Для микобактерий туберкулеза характерно золотисто-желтое свечение, в
то время как кислотоустойчивые сапрофиты при окраске ауромином-рода-
мином имеют свечение зеленоватого оттенка.
Окраска мазков по Мурахаши
Фиксированные мазки погружают в метанол на 10 мин и после
высушивания в вытяжном шкафу помещают в 1 % раствор малахитового
зеленого в ацетатном буфере, рН 4,1, затем подогревают на водяной бане при
50—60 °С в течение 20 мин. После охлаждения в растворе малахитового
зеленого мазки промывают проточной водой, подсушивают в вытяжном
шкафу и помещают в 1 % раствор карболового фуксина на 3—4 мин.
После обработки фуксином мазки промывают проточной водой, сушат в
вытяжном шкафу и обесцвечивают 2 % азотной кислотой, после чего
повторно промывают проточной водой. Живые микобактерий окрашиваются в
зеленый цвет, мертвые — в красный.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРОВ
Все растворы готовятся с использованием дистиллированной воды
1. Насыщенный спиртовой раствор фуксина:
основной фуксин — 10 г
96 % этиловый спирт — 100 мл.
2. Рабочий раствор фуксина (1 %):
кристаллы фенола — 5 г
медленно нагревают до расплавления, доливают 90 мл воды, в
полученный раствор фенола добавляют 10 мл насыщенного раствора фуксина.
3. 1 % раствор малахитового зеленого в ацетатном
буфере, рН 4,0—4,2:
0,1 Н уксусная кислота — 820 мл
(60 мл ледяной уксусной кислоты довести до 1000 мл)
0,1 Н уксуснокислый натрий — 180 мл
(16,4 г уксуснокислого натрия в 200 мл воды)
19 - 762
- 577-

малахитовый зеленый — Юг.
4. 2 % азотная кислота:
к 65 частям воды добавляют 2 части 67 % (концентрированной) азотной
кислоты.
Все пробирочные опыты должны иметь троекратную повторность.
Изучение химиотерапевтической эффективности в опытах in vivo
Вещества с выраженным противотуберкулезным действием,
определенным в опытах in vitro должны быть изучены на модели экспериментальной
туберкулезной инфекции.
Подопытные животные
В качестве экспериментальных животных рекомендуется использовать
мышей и морских свинок. Высокая восприимчивость к туберкулезу этих
животных позволяет создать эффективную модель туберкулезной
инфекции для изучения химиотерапевтического эффекта исследуемых
соединений.
Предпочтение отдается мышам линии BALB/c или СВА с повышенной
чувствительностью к туберкулезу, но в эксперименте могут быть
использованы и белые беспородные мыши. Установлено, что резистентность к
туберкулезу у мышей повышается с возрастом и массой, поэтому группа
подопытных животных должна быть стандартизована по этим параметрам:
в опыт включаются половозрелые самцы и самки масоой 18—25 г.
В эксперименте допустимо использование морских свинок разного веса.
Однако желательно использование молодых животных весом 250—300 г.
Модель туберкулезной инфекции у лабораторных животных
Генерализованный туберкулез (ГТ) как экспериментальная модель для
изучения эффективности химиотерапии характеризуется выраженными и
легко тестируемыми патологическими изменениями, сходными у мышей и
морских свинок. Развитие процесса у экспериментальных животных
протекает достаточно быстро, но вместе с тем позволяет контролировать
процесс химиотерапии.
Заражение лабораторных животных проводится двухнедельной
вирулентной культурой М. tuberculosis H37Rv или клинических штаммов,
выделенных от больных туберкулезом, чувствительных или устойчивых к
традиционным противотуберкулезным препаратам. Для этого с косяка снимают
культуру, просушивают при помощи стерильной фильтровальной бумаги,
переносят в пробирку и взвешивают на аналитических весах. После этого
культуру переносят в стерильную фарфоровую ступку, а пробирку
взвешивают. В разнице двух взвешиваний находят массу культуры.
Морских свинок заражают подкожно в правую паховую область: для
"острого" опыта доза заражения составляет 0,1 мг в 0,5 мл
физиологического раствора на одну особь. При такой дозе заражения гибель 95—100 %
животных происходит к концу 1-го месяца от момента заражения. Для
хронического эксперимента, длящегося 3 мес и более, инфицирующая
доза составляет 0,025 мг в 0,5 мл.
-578-

Мышей заражают внутривенно в хвостовую вену или венозный синус
глаза в дозе 0,5 мг культуры в 0,5 мл физиологического раствора (вена
хвоста) или 0,1 мг в 0,2 мл раствора (венозный синус глаза).
Для заражения животных используют и другой метод расчета доз.
Двухнедельную вирулентную культуру выбранного для заражения штамма
снимают с косяка плотной среды и приготовляют бактериальную суспензию
по 5-му стандарту оптической плотности. Титр полученной суспензии —
5 х Ю8 микробных тел в 1 мл. Исходную суспензию разводят в 10 раз и
получают титр — 5 х Ю7 микробных тел в 1 мл. К 4 мл полученной
суспензии добавляют 1 мл физиологического раствора с целью получения
суспензии титром 4 х Ю7 микробных тел в 1 мл или 2,0 х Ю7 в 0,5 мл (для
мышей). Инфицирующая доза для морских свинок составляет 5 х Ю7
микробных тел в 1 мл или 2,5 х Ю7 микробных тел в 0,5 мл.
Все экспериментальные животные разделяются на группы в
зависимости от режима химиотерапии и штамма, которым проводилось заражение.
Для статистической обработки данных эксперимента количество животных
в группе должно быть:
морских свинок — от 6 до 10 особей,
мышей — от 10 до 20 особей.
Весь эксперимент подразделяется на контроль и опыт.
Контроль
1-я контрольная группа — незараженные животные,
2-я контрольная группа — животные, зараженные штаммом H37Rv, не
получающие лечение,
3-я контрольная группа — животные, зараженные штаммом H37Rv,
получающие лечение гомологом нового соединения или любым
традиционным ПТП.
Опыт
1-я опытная группа — животные, зараженные штаммом H37Rv,
получающие лечение изучаемым веществом в дозе мг/кг массы животного,
2-я опытная группа — животные, зараженные штаммом H37Rv,
получающие лечение изучаемым веществом в дозе мг/кг массы животного,
и т. д.
Лечение животных начинают после развития туберкулезного процесса,
который тестируется по общему состоянию животных (снижение
активности, затрудненное дыхание, снижение массы). Кроме того, через 2—4 дня
(мыши) и 12—14 дней (морские свинки) проводится эфтаназия с помощью
эфирного наркоза нескольких особей из любой группы зараженных
животных, паренхиматозные органы (легкие, печень, селезенка) подвергаются
макроскопическому и микробиологическому исследованию.
У животных при вскрытии обнаруживаются очаги туберкулезного
воспаления. При бактериоскопическом исследовании в мазках присутствуют
кислотоустойчивые МБ. Из гомогенатов паренхиматозных органов
высевают М. tuberculosis.
Введение изучаемого соединения начинают через 4 дня после
заражения для мышей и 14 дней для морских свинок. Вещества вводят
ежедневно, перорально. Лекарственные препараты, полностью растворимые в
физиологическом растворе и предназначенные в дальнейшем для
внутримышечного или внутривенного введения, могут вводиться
экспериментальным животным внутримышечно.
Изучаемые дозы новых соединений выбираются соответственно дозам
гомологов этих соединений, используемых в клинике туберкулеза. Они
могут быть ниже (если вещество проявляет в опытах in vitro более высокую
19*
-579-

активность) или выше установленных клинических доз, но не должны
превышать 'Д ЛД50 испытуемого вещества.
Длительность лечения может варьировать от 4 до 12 нед. Лечение
заканчивается, когда в контрольной (нелеченой) группе смертность достигает 70
или 100 %. При необходимости можно продолжать лечение животных до
их полного излечения, даже в случае гибели 100 % животных в
контрольной группе.
По окончании лечения животных подвергают эфтаназии, после чего
проводят макроскопическое исследование, определяя индекс поражения
внутренних органов, экстракты легкого, печени, селезенки исследуют на
наличие микобактерий микроскопически и путем высева на плотную
питательную среду. Помимо макроскопического и микробиологического
исследований, желательно проводить (при возможности) и гистологическое
исследование паренхиматозных органов экспериментальных животных.
Эффективность лечения определяется по продолжительности жизни
животных, разнице в массе тела животных в начале и конце опыта, по
массе легких и других паренхиматозных органов, наличию специфических
изменений в паренхиматозных органах, индексу высеваемости и бактерио-
скопическому показателю.
Макроскопическая оценка изменения внутренних органов животных
представляется индексом поражения, который определяется для каждой
группы по четырехбалльной системе, предложенной Г. Н. Першиным и
усовершенствованной А. Н. Тогуновой:
Пораженность паренхиматозных органов:
1—3 мелких очага в легких — +/-(0)
4—10 мелких полупрозрачных очагов в легких при отсутствии видимой
патологии в печени и селезенке + (1)
10—20 хорошо выраженных очагов в легочной ткани и единичные — в
печени и селезенке ++ (2)
20 и более крупных очагов в легких (до 0,5 см в диаметре),
множественные очаги в печени и селезенке +++ (3)
кавернозно-некротические поражения легких, кахексия, гибель
животного ++++ (4).
Индекс высеваемости микобактерий туберкулеза определяют как
среднее из общего количества колониеобразующих единиц на каждую группу.
Равновеликие кусочки легкого, печени и селезенки каждого животного
растирают в фарфоровой ступке, заливают 5 мл 6 % раствора серной
кислоты, гомогенизируют. Полученную массу центрифугируют в течение
10 мин при 3000 об/мин. Время контакта микобактерий туберкулеза с
серной кислотой не должно превышать 15—20 мин. Серную кислоту сливают,
осадок дважды отмывают 0,9 % раствором NAC1, растворяют в 1,0 мл
физиологического раствора и засевают на 5 пробирок с плотной яичной
средой Финн-2. Пробирки с посевами инкубируют в термостате при 37 °С в
течение 10—12 нед. Интенсивность роста культуры учитывается по
четырехбалльной системе, предложенной Г, Н. Першиным:
1—3 колонии на 1 косяке с плотной яичной средой +/— (0)
4—10 колоний на 1 косяке с плотной яичной средой + (1)
11—30 колоний на 1 косяке с плотной яичной средой ++ (2)
31 — 100 колоний на 1 косяке с плотной яичной средой +++ (3)
сплошной рост колонии на 1 косяке с плотной средой ++++ (4)
- 580-

Из гомогената органов также делают мазки и окрашивают их по Ци-
лю—Нильсену или люминесцентными красителями (см. выше). Бактерио-
скопический показатель определяют как среднее значение общего
количество микобактерий на группу. Результат бактериоскопии учитывается по
четырехбалльной системе, предложенной Г. Н. Першиным:
от 1 микобактерий в 100 полях зрения
до 10 микобактерий в 10 полях зрения +/— (0)
от 1 микобактерий в 10 полях зрения
до 1 микобактерий в 1 поле зрения + (1)
2—10 микобактерий в 1 поле зрения ++ (2)
11—50 микобактерий в 1 поле зрения +++ (3)
свыше 50 микобактерий в 1 поле зрения ++++ (4)
Эффективность каждого режима химиотерапии выражается индексом
эффективности, исчисляющимся по формуле А. Н. Тогуновой,
усовершенствованной в ЦНИИТ РАМН (отдел патоморфологии и микробиологии):
Индекс эффективности = 100 % - \ П0Р* х 100,
I пор2
где I nopt — индекс поражения исследуемой группы, I пор2 — индекс
поражения контрольной группы.
Противотуберкулезное действие новых соединений в первую очередь
изучается на мышах в связи с тем, что это модель не требует больших
материальных затрат. При получении положительных результатов проводится
дальнейшее исследование на морских свинках.
Следует иметь в виду, что экспериментальный туберкулез у морских
свинок имеет некоторые отличия от инфекционного поражения мышей.
При генерализованном туберкулезном процессе у мышей воспалительные
изменения локализуются в основном в легких, тогда как у морских свинок
этот показатель отступает на задний план по сравнению с поражением
печени и селезенки. В связи с этим приведенная выше схема оценки
поражения внутренних органов должна быть адаптирована для морских свинок,
отдавая приоритет поражению селезенки и печени.
Высокоактивные соединения с низкой токсичностью должны быть
изучены на модели туберкулеза на еще одном виде животных, например на
модели туберкулеза легких у кролика.

Методические указания по изучению противогрибковой
активности фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: член-корр. РАМН, проф.
А. А. Кубанова; д. м н. Ж. В. Степанова; член-
корр. РАМН, проф. Т. А. Гуськова; к. б. н.
Т. В. Пушкина; к. б. н. Л. Ю. Крылова;
И. Б. Шилова
1. Введение
Грибковые заболевания человека — микозы делятся на 4 большие
группы: 1) кератомикозы (отрубевидный или разноцветный лишай и
весьма условно — эритразма, узловая трихоспория, подмышечный трихоми-
коз); 2) дерматомикозы (эпидермофития, рубромикоз, трихофития,
микроспория и фавус) — наиболее распространенная группа, занимающая в
общей дерматологической структуре заболеваемости второе место после пио-
дермитов; 3) кандидозы (кожи, слизистых оболочек и внутренних
органов); 4) глубокие (системные) микозы, составляющие относительно редко
встречающуюся группу грибковых заболеваний [4].
Учитывая различную чувствительность патогенных грибов этих четырех
групп к фармакологическим веществам, необходимо проводить изучение
активности веществ в отношении грибов каждой группы.
2. Изучение активности веществ in vitro
2.1. Изучение активности веществ методом двукратных серийных
разведений в жидкой среде
Наиболее распространенным методом является изучение активности
веществ методом двукратных серийных разведений в жидкой среде Сабуро
[3]. Готовят два параллельных ряда разведении испытуемого препарата в
жидкой среде Сабуро, в которую засевают затем соответствующую
культуру гриба. Засеянные пробирки держат в термостате при 27 °С 14 дней.
Чувствительность к препарату определяется его минимальной дозой, при
которой роста гриба не наблюдается.
Разведение препарата производится следующим образом. Жидкую среду
Сабуро разливают стерильно по 3 мл в каждую пробирку; в первую
пробирку ряда наливают 4,5 мл. Всего в ряду 10—12 пробирок; из них
последняя контрольная. В качестве стандартной навески берут 10 мг испытуемого
препарата в 10 мл дистиллированной воды. Если препарат нерастворим в
воде, его растворяют в 1 мл соответствующего растворителя, а затем
добавляют 9 мл дистиллированной воды. Если при этом выпадает осадок,
растворение принимают как условное и опыт ставят так же, как с
водорастворимым препаратом при условии постоянного встряхивания пробирки при
его разливке. Таким образом, исходное разведение содержит испытуемый
препарат в концентрации 1000 мкг/мл. Затем 0,5 мл этого разведения
вносят в первую пробирку ряда (с 4,5 мл среды), разводя тем самым
концентрацию препарата еще в 10 раз. Следовательно, первая пробирка ряда
содержит 100 мкг/мл испытуемого препарата. В дальнейшем из первой про-
- 582-

бирки после тщательного продувания через стерильную заткнутую ватой
пипетку берут 3 мл раствора и перенося его во вторую пробирку,
тщательно продувают, берут снова 3 мл и переносят его в третью пробирку и т. д.;
из предпоследней пробирки 3 мл выливают. В последнюю пробирку как в
контрольную препарат не вносится. Таким образом, в каждом ряду первые
пробирки содержат по 2 мл раствора, а все последующие — по 3 мл. В
каждой последующей пробирке концентрация препарата уменьшается вдвое;
при этом получается ряд следующих разведений в мкг/мл гаммах на 1 мл —
100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,12; 1,5; 0,75; 0,38; 0,19.
Инокулят для засева готовят по-разному в зависимости от точности
опыта и поставленных целей. Обычно берут смыв культуры с агарового
косяка в жидкой среде Сабуро значительной мутности (на глаз). Кожистые
культуры, не содержащие конидий, можно предварительно растереть в
ступке. Оттитрованной пипеткой, содержащей 25 капель в 1 мл, вносят по
одной капле взвеси в каждую пробирку с разведенным препаратом,
включая контрольную. После засева штатив энергично встряхивают и
помещают в термостат на указанный срок.
Если приготовленных разведений бывает недостаточно и даже в
последней пробирке, содержащей препарат, рост отсутствует, то опыт повторяют,
удлиняя ряд до 15—20 пробирок. Если же во всех пробирках, включая
первую, имеется рост, то ряд удлиняют влево, т. е. берут навеску препарата, в
10 раз большую.
Для точного учета вносимого инфекта плотность взвеси гриба
определяют по бактериальному стандарту, учитывая, что величина грибковых
элементов примерно в 10 раз превышает величину бактерий (например,
2 млрд микробных тел в 1 мл по стандарту соответствуют 200 000 000
грибковых тел в 1 мл), а для более высокой точности просчитывают грибковые
элементы в счетной камере.
При испытании препаратов в отношении возбудителей трихомикозов
(трихофитии, микроспории, фавуса) в качестве посевного материала лучше
использовать не культуры, а волосы, пораженные соответствующими
грибами. Грибы в культуре представлены вегетативными формами (мицелии,
микроканидиями), чувствительными к воздействию внешней среды. В
пораженных же волосах грибы существуют преимущественно в виде спор
сохранения, защищенных от внешних воздействий мощной двухконтурной
оболочкой. Поэтому устойчивость дерматофитов к одним и тем же
препаратам в волосах в 20—30 раз выше, чем их устойчивость к культуре.
Если принять во внимание, что при проведении лечения или
дезинфекции вещей грибковых больных приходится иметь дело именно с
паразитической, а не сапрофитической формой дерматофитов, то целесообразнее
производить отбор химиотерапевтических препаратов, используя не
культуры, а пораженные волосы. На основании макроскопического вида
отбирают волосы, заведомо пораженные грибами (коротко обломанные,
тусклые, изогнутые, покрытые чехлом), и по 2—3 таких волоса помещают в
каждую пробирку ряда, включая контрольную. Волосы следует помещать в
раствор препарата и следить за тем, чтобы они не всплыли, иначе остается
не смоченные раствором участки, которые могут дать рост.
Указанной методикой устанавливают фунгистатическое действие
препарата. По окончании регистрации опыта по фунгистатическому действию
испытуемых веществ можно произвести проверку фунгицидных свойств
препаратов. Для этого из пробирок, в которых не отмечено роста
дерматофитов, извлекают волосы, тщательно отмывают их в стерильной
дистиллированной воде и сеют на чистую жидкую среду Сабуро. Наблюдение за по-
- 583-

сеянным материалом производят в течение 1,5—2 мес. Отсутствие роста
грибов свидетельствует о фунгицидных свойствах препарата.
Испытание фунгицидной активности можно проводить также и другим
способом. Измельченные волосы, пораженные грибами, погружают в
раствор препарата на тот или иной срок, после чего отмывают их в
растворителе, в котором растворялся препарат (спирт, этилцеллосольв и др.),
споласкивают в стерильном физиологическом сеют на жидкую среду Сабуро.
При этом для более полной характеристики препарата необходимо
варьировать как концентрацию, так и длительность экспозиции.
2.2. Изучение активности веществ методом диффузии в агар
Можно использовать метод диффузии в агар (чашечный метод). В
расправленную и остуженную до 40—42 °С твердую среду Сабуро вливают
2 мл определенной взвеси культуры гриба в физиологическом растворе,
смесь хорошо перемешивают и выливают в чашки Петри.
По другому варианту на застывшую среду наносят взвесь культуры
испытуемого гриба и равномерно растирают ее шпателем по поверхности
агара. Число чашек определяется количеством испытуемых препаратов и
степенью повторности опытов; кроме того, еще 1—2 чашки как
контрольные, с которыми не производят дальнейших опытов. При застывании
агара на его поверхность накладывают 1—3 алюминиевых кольца, в которые
затем помещают дозированное количество испытуемого препарата. По
величине зоны задержки роста вокруг кольца судят о противогрибковой
действии препарата. Однако метод серийных разведении в жидкой
питательной среде является более точным.
Данные о противогрибковой активности препаратов, полученные в
опытах in vitro, не всегда совпадают с результатов опытов in vivo и
проверки этих препаратов в клинических условиях. Поэтому на стадии
доклинического изучения необходимы эксперименты на животных.
3. Изучение эффективности фармакологических веществ в опытах in vivo
Следует отметить, что не все микозы человека можно воспроизвести на
животных; кроме того, экспериментальные инфекции часто имеют иной
характер течения. Тем не менее ряд экспериментальных моделей
грибковых инфекций необходимо использовать для изучения эффективности
новых фармакологических веществ.
3.1. Изучение эффективности фармакологических веществ на моделях
дерматомикозов морских свинок
3.1.1 Дерматомикозы морских свинок, вызываемые зоофильными
дерматофитами (Trichophyton gypseum, Microsporon lanosum)
10—12-дневную культуру гриба вместе с агаром растирают в ступке до
получения однородной кашицы. У морской свинки на спине или боковой
поверхности туловища (лучше на участке с белой или светлой шерстью)
выстригают волосы на площади 5x5 см. Участок протирают спиртом, а
затем острым скальпелем скарифицируют до появления сукровицы. Следу-
- 584-

ет избегать появления крови, которая тормозит рост грибов. В
подготовленный таким образом участок кожи втирают в течение 1—2 мин кашицу
из культуры гриба.
Заболевание протекает с образованием инфильтратов, корок, резких
воспалительных явлений. Инфекция длится 4—5 нед и заканчивается
самоизлечением. Наличие грибковой инфекции подтверждается
микроскопическим исследованием корок. При появлении инфекционного процесса
начинается применение препарата в той лекарственной форме и при том
способе введения (местно, внутрь или парентерально), который будет
впоследствии рекомендован в клинику. Критерием эффективности препарата
служит различие в сроках освобождения от грибов и излечения опытных и
контрольной групп животных.
3.1.2. Дерматомикозы, вызываемые антропофилъными дерматофитами
(Trichophyton violaceum, Trichophyton crateriforme, Microsporum ferrugineum,
Achorion Schonnleinii)
Поскольку животные менее чувствительны к антропофильным дермато-
фитам, чем к зоофильным, для заражения используются не культуры этих
грибов, а пораженные ими волосы. Эти волосы растирают в ступке с
кусочками агара Сабуро и по той же методике прививают животным. Первые
признаки заболевания возникают на 5—7-й день в виде гиперемии и
шелушения, в дальнейшем развивается инфильтрат с корками на поверхности,
в которых заключены обломавшиеся пораженные волосы. Через 2,5—3 нед
корки отпадают, обнажая эрозированные поверхности, которые в течение
4—5 нед полностью эпителизируются и зарастают новой шерстью.
При прививке антропофильных возбудителей клинические явления
менее выражены; длительность патологического процесса остается в тех же
пределах. Наличие грибкового процесса подтверждается
микроскопическим исследованием корок и обломавшихся волос. При заражении микро-
спорумами в целях диагностики можно использовать люминесцентную
лампу (лампу Вуда), в свете которой пораженные только этими
возбудителями волосы светятся зеленым светом. Однако этот очень удобный и
быстрый метод диагностики имеет ту особенность, что при смазывании
некоторыми лечебными препаратами люминесценция гаснет. Поэтому лучшим
методом контроля является микроскопическое исследование.
После установления наличия грибкового поражения можно начинать
соответствующее лечение. Испытуемые препараты можно готовить в виде
мазей на основах, легко "отдающих" препарат, спиртовых растворов и
других лекарственных формах. Методики лечения отрабатываются в
зависимости от эффективности препарата. Критерием излеченности является
отсутствие грибов при микроскопическом исследовании. Разница в сроках
излечения у подопытных и контрольных животных дает возможность
оценить эффективность терапевтического действия препарата.
3.1.3. Дерматомикоз морских свинок, вызванный эпидермофитоном
Для инфицирования лучше использовать порошкообразную культуру
Epidermophyton rubrum [5]. Инокулят втирают в боковую поверхность тела
морской свинки после проведенной эпиляции и скарификации кожи
(эпидермофития волосистой части) или в безволосую кожу подошв и межпаль-
- 585 -

цевых сладок лапок (эпидермофития гладкой кожи), или в ногтевую
пластинку (онихомикоз), для чего коготок морской свинки размягчают онихо-
лизином или каким-либо другим средством, делают глубокий надрез, в
который вносят кусочек культуры гриба, и заливают коготок коллодием.
В случае инфицирования волосистой кожи животных на 5-й день на
месте инокуляции гриба появляется гиперемия и небольшое шелушение.
Затем образуются пустулы и корочки с тусклыми обламывающимися
волосками. В коже и волосках определяются элементы гриба. Процесс
длится 20—30 дней и заканчивается самоизлечением.
В случае инфицирования морских свинок в лапку, гиперемия,
инфильтрация и крупнопластинчатое шелушение появляется на 12— 15-й день. В
коже обнаруживаются многочисленные нити мицелия. Инфекционный
процесс также заканчивается самоизлечением, однако он продолжается
более длительный срок, чем при инфицировании в боковую поверхность тела
морской свинки (примерно 1,5—2 мес).
При онихомикозе инфекционный процесс развивается через 2 нед
после инфицирования в виде деформации ногтя, появления желтоватого
пятна; позже ногтевая пластинка начинает крошиться. В отделяемом
субстрате определяются элементы гриба.
Применение фармакологического вещества может начинаться
одновременно с заражением, т. е. профилактически, или после появления первых
признаков развития инфекции.
Об эффективности препарата судят по различию в сроках излечения
или освобождения от возбудителя между подопытными и контрольными
животными.
3.2. Изучение эффективности фармакологических веществ на моделях
кандидоза
Грибы рода Candida поражают слизистые оболочки, кожу и различные
внутренние органы (легкие, кишечник и др.), иногда может развиться кан-
дидамикотический сепсис. В связи с этим можно использовать несколько
моделей экспериментального кандидоза для определения эффективности
фармакологического вещества.
3.2.1. Сепсис у мышей, вызванный Candida albicans
Белых мышей инфицируют путем введения в хвостовую вену взвеси
гриба Candida albicans. Заражающая доза может варьировать в зависимости
от степени вирулентности возбудителя; в среднем она составляет 25 млн
микробных тел гриба (подсчет в камере Горяева). Инфекция протекает
остро и заканчивается 100 % летальностью через 5—9 дней после
заражения. У животных отмечается резкая потеря массы тела, заторможенность
движений. При вскрытии наблюдается поражение всех паренхиматозных
органов с наличием беловато-сероватых узелков на их поверхности,
содержащих скопления гриба.
Препараты вводят одновременно с заражением или в различные сроки
после инфицирования в зависимости от поставленной задачи. Однако,
учитывая тяжесть и быстрое течение инфекционного процесса,
целесообразно начинать лечение одновременно с заражением. Об эффективности
судят по выживаемости мышей в группе леченых животных, а также по
- 586-

различию в средней продолжительности жизни подопытных и
контрольных мышей. В качестве оценки эффективности могут быть использованы
данные патоморфологических и микробиологических исследований
внутренних органов, однако это следует проводить только у выживших
животных.
3.2.2. Менингоэнцефалит у мышей, вызванный Candida albicans
Интрацеребральное введение мышам различных штаммов Candida
albicans вызывает развитие инфекционного процесса, который по данным
микологического и патоморфологического исследований можно
охарактеризовать как кандидозный энцефаломенингит, осложненный
генерализованным кандидозом [2]. Свежевыделенные клинические штаммы вирулентнее
лабораторных. Вирулентность их не зависит от локализации выделения
возбудителя (кожа, слизистая оболочка полости рта, гениталии, ликвор).
Инфицирующую дозу (40—60 млн грибковых клеток на мышь) в виде
взвеси гриба в физиологическом растворе вводят в мозг в объеме 0,05 мл.
Область заражения — около средней линии черепа на 2—3 мм выше
глазницы. Инфекционный процесс характеризуется хроническим течением.
Препараты вводят одновременно с заражением или в различные сроки
после инфицирования в зависимости от поставленной задачи. За
животными ведут наблюдение в течение 30 сут от момента заражения. Об
эффективности проведенной химиотерапии судят на основании выживаемости
мышей в группе леченых животных, а также по различию в средней
продолжительности жизни подопытных и контрольных мышей. В качестве
оценки эффективности могут быть использованы данные
патоморфологических и микробиологических исследований внутренних органов, однако
это следует проводить только у выживших животных.
3.3. Изучение эффективности фармакологических средств на моделях
глубоких микозов
Работа с возбудителями глубоких микозов представляет опасность для
экспериментатора, поэтому изучение на экспериментальных моделях
должны проводиться в специальных лабораториях с соблюдением всех
мер, обеспечивающих безопасность людей.
3.3.1. Кожный спиротрихоз мышей
Белым мышам подкожно вводят суспензию дрожжевой фазы гриба Spo-
rotrichum в объеме 1 мл. Инфицирующая доза зависит от вирулентности
гриба, которая определяется предварительно.
Кожные поражения характеризуются некрозом с образованием
абсцессов и разрушением мышц. В некротических очагах обнаруживаются
характерные для Sporotrichum сигаровидные тельца и дрожжевые клетки.
Грибы высеваются из пораженных участков спустя 2—3 и даже 6—7 нед
после заражения. Гибели животных не наблюдается. Препараты вводят в
различные сроки после заражения в зависимости от поставленной задачи
(профилактический или лечебный эффект). Об эффективности судят по
различию клинической картины инфекции в опытных и контрольной
- 587-

группах, а также по высеваемости возбудителя из пораженных участков
кожи.
При необходимости можно повысить тяжесть течения инфекции у
мышей введением им кортизола. В этом случае инфекционный процесс
заканчивается летальностью, и об эффективности можно судить по разнице
в показателях выживаемости и продолжительности жизни животных в
опытных и контрольной группах.
3.3.2. Криптококкоз у мышей
Поскольку Criptococcus neoformans часто поражает центральную
нервную систему, Sittman [1] использовал интрацеребральный метод заражения
белых мышей, вводя через "родничок" шприцем 3 млн клеток гриба в 1—2
каплях физиологического раствора. У мышей развивались явления менин-
гоэнцефалита, и животные погибали в течение 3—73 дней.
Генерализованный криптококкоз с поражением печени, почек, легких
можно получить, вводя внутрибрюшинно или внутривенно соответственно
по 0,5 и 0,2 мл двухмиллиардной взвеси гриба в физиологическом растворе
(по бактериальному стандарту).
Способы введения лекарственных средств и их дозировки должны быть
предварительно отработаны на здоровых животных. Контролем излеченно-
сти должны служить сроки выживаемости (при смертельных инфекциях),
культуральные и гистологические исследования органов и микроскопиро-
вание отпечатков с разрезов внутренних органов.
Л итература
1. Sittman M. J. Hyg., - 1959,69,49.
2. Бакланова О. В., Падейская Е. Н. Химиотерапевтическая активность кетоконазола,
амфоглюкамина и микогептина на модели кандидоза центральной нервной
системы белых мышей // Хим.-фарм. журн. — 1987. — № 8. — С. 955—959.
3. Першин Г. Н. Методы экспериментальной химиотерапии. — М.: "Медицина", 1971. —
С. 538.
4. Скрипкин Ю. К. Кожные и венерические болезни. — М.: "Медицина", 1980. — С.
164.
5. Умнова И. И. Клиника и дифференциальная диагностика поражений кожи,
вызываемых красным эпидермофитоном: Дис. — Москва, 1954.

Методические указания по изучению антипротозойной
активности фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: член-корр. РАМН, проф.
Т. А. Гуськова; к. б. н. Л. Ю. Крылова; д. м. н.,
проф. М. Н. Лебедева; к. м. н. Е. Н. Морозов;
к. б. н. Т. В. Продеус; к. б. н. Т. В. Пушкина;
академик РАМН, проф. В. П. Сергиев; д. м. н.,
проф. Э. Е. Шуйкина; к. б. н. Е. А. Черникова
1. Введение
Протозойные инфекции — заболевания, вызываемые одноклеточными
эукариотными микроорганизмами подцарства [Protozoa, Levine et al.,
1980], — занимают значительное место в патологии человека и животных.
Подцарство Protozoa охватывает большое количество разнообразных
микроорганизмов, различающихся по своим морфологическим и
физиологическим свойствам и по чувствительности к химиотерапевтическим средствам.
Поэтому для оценки эффективности новых фармакологических веществ
необходимы доклинические исследования в отношении каждого
возбудителя, представляющего опасность для человека и относящихся к данному
подцарству.
2. Изучение противоамебной активности фармакологических веществ
Наибольшее значение имеет амебная дизентерия, которая вызывается
Entamoeba histolytica.
2.1. Изучение пртивоамебной активности in vitro
Изучение противоамебной активности фармакологических веществ в
опытах in vitro проводят с культурами Entamoeba histolytica.
Для исследований могут быть использованы как свежие штаммы энта-
меб, выделенные у больных, так и лабораторные. Чистые культуры
Entamoeba histolytica получить и поддерживать сложно, поэтому используют
смешанные культуры, в которых рост амеб происходит в присутствии
бактерий, сопутствующих амебам в кишечнике больного. Наиболее простой
средой для роста такой культуры является среда Павловой (1983), основой
которой служит раствор буферных солей — Na2HP04 x 2Н20 (0,59 г) и
КН2Р04 (0,45 г) — в 1 л физиологического раствора. рН раствора в
пределах 6,5—6,8. Стерилизацию среды проводят в автоклаве при 1 атм в
течение 30 мин. К охлажденному раствору добавляют нативную стерильную
сыворотку крупного рогатого скота в соотношении 1:20, затем при
соблюдении правил асептики производят разлив жидкой части среды по 5—8 мл
в стерильные пробирки с раствором крахмала.
Для приготовления крахмала вымытый рис замачивают на 24 ч в
водопроводной воде. Затем растирают в ступке и отмывают крахмал через
сложенную в 3—5 слоев марлю. Крахмалу дают осесть, сливают воду и
высушивают в термостате. Растертый в порошок крахмал рассыпают по
-589-

пробиркам по 5—10 мг и стерилизуют сухим жаром при 180° в течение
40 мин.
Культуры амеб выделяют у больных амебиазом. Посев кусочка слизи из
кала больного производят на среде Павловой. В первые дни пересевы
культуры делают ежедневно. Амебы вырастают на дне пробирки. Для
наблюдения за ростом культуры со дна пробирки пастеровской пипеткой
берут каплю осадка и закрывают покровным стеклом. Амебы хорошо видны
среди зерен крахмала при увеличении в 100 и 400 раз. Вегетативные
формы в препарате сохраняют подвижность. Отчетливо видны внутренний и
наружный слой цитоплазмы, вакуоли и включения (зерна крахмала,
бактерии и т. д.). Цисты в культуре встречаются редко.
Штаммы поддерживают постоянными пересевами на свежую
питательную среду. Пересевы рекомендуется производить каждые 72—96 ч.
Для определения концентрации препарата, подавляющей рост амебы в
культуре, пользуются различными модификациями метода серийных
разведений. В качестве стандартных препаратов можно использовать эметин
(активная концентрация 0,06 мкг/мл), фентролин (0,12 мкг/мл). Для
контроля заражения в каждый опыт берут 3—5 пробирок без препаратов.
Для заражения готовят взвесь амеб. На 10—15 пробирок опыта берут 1—
3 пробирки с 48-часовой культурой амеб. Взвесь приготовляют из осадков
культур с таким расчетом, чтобы в препарате (раздавленная капля)
содержалось 15—20 амеб в поле зрения при увеличении в 100 раз. Для каждой
пробирки опыта берут 0,25 мл взвеси амеб.
Учет результатов опыта проводят через 48, 72 и 96 ч. Определяют, есть
ли амебы в капле из осадка на дне пробирки. Активной концентрацией
считается то максимальное разведение препарата, при котором нет роста
амеб.
При определении активности препарата следует учитывать, что
действие изучаемого вещества может быть направлено не только на амеб, но и
на сопутствующую бактериальную флору, гибель которой повлечет за
собой исчезновение из культуры амеб. Столь существенного недостатка
можно избежать, используя в эксперименте чистую культуру Entamoeba
histolytica.
Для поддержания аксенической культуры дизентерийной амебы
предложена Diamond (1978) и широко апробирована среда TYS-33 на основе
триптиказы (гидролизат казеина), дрожжевого экстракта; соли содержащей
ион железа и сыворотки. Приготовление 1 л среды включает следующие
этапы: растворение в 870 мл бидистиллированной воды 20 г
ферментативного гидролизата казеина, 10 г экстракта кормовых дрожжей; 10 г
глюкозы; 1,0 г L — цистеина гидрохлорида; 0,2 г аскорбиновой кислоты; 1 г
К2НР04; 0,6 г КН2Р04 и I мл железоамиачной соли лимонной кислоты
(коричневая форма — 22,8 мг/мл); доведение рН до 6,8 путем добавления
IN NaOH; внесение антибиотиков из расчета на 1 мл среды 1500 ед
пенициллина и 100 ед стрептомицина; разлив в колбы и автоклавирование при
115 (С 8 мин. Стерильную среду можно хранить при 20 (С несколько
месяцев. Перед использованием в среду добавляют предварительно инактиви-
рованную сыворотку в объеме 10—15 %.
Для активирования используют флаконы из стекла, объемом от 2 до 6
мл (инсулиновые), которые заполняют средой до "плечиков". Режим
пересева 48—72 ч. Рост амеб оценивают при микроскопировании поверхности
внутренней стенки флакона при х 100.
- 590-

2.2. Изучение противоамебной активности фармакологических веществ
в опытах in vivo
Entamoeba histolytica патогенна для многих экспериментальных
животных — кошек, собак, кроликов, морских свинок, крыс, хомяков и т. д.,
причем молодые животные значительно чувствительнее взрослых. У этих
животных можно получить в эксперименте амебиаз кишечника и внеки-
шечные поражения типа амебного абсцесса.
Для изучения активности новых химиотерапевтических средств при
кишечном амебиазе удобной моделью следует считать кишечный амебиаз
белых крыс, воспроизводимый путем интрацекального заражения крысят
(вес 21—25 г).
Для заражения крысят приготовляют взвесь амеб так же, как и для
опытов in vitro. На одно животное берут 0,1—0,2 мл взвеси амеб.
Подопытных крыс нумеруют и взвешивают. В середине брюшка ближе
к левой стороне у них выщипывают шерсть. Затем животных
наркотизируют эфиром. Для этого их помещают в закрытую стеклянную банку, на дне
которой находится смоченная эфиром вата. Как только животное
принимает боковое положение, его вынимают и фиксируют на операционном
столике брюшком вверх. Затем смазывают брюшко йодом. В стерильных
условиях послойно вскрывают кожу и мышцы живота. Для этого
несколько левее средней линии живота делают разрез длиной примерно 0,5 см. С
помощью хирургического пинцета (лучше применять маленькие глазные
пинцеты) отыскивают червеобразный отросток, в конец которого через
иглу шприца вводят инфицирующий материал в количестве 0,1—0,2 мл,
затем иглу вынимают и рану зашивают послойно. На мышечный слой
накладывают швы из шелка или кетгута, а края кожного разреза фиксируют
шелком или скобками. Рана быстро заживает. У зараженных животных в
слепой кишке, а иногда и в прилежащих отделах толстого кишечника
развивается специфический воспалительный процесс. Воспалительные
изменения в слепой кишке достигают своего максимума на 5—7-й день, после
чего стой или иной скоростью начинается обратное развитие процесса.
Изменения, наблюдающиеся в слепой кишке крыс, касаются ее
слизистой оболочки, подслизистого и мышечного слоев, содержимого кишки и
окружающих ее тканей, а также мезентериальных желез.
При максимально выраженных изменениях со стороны слепой кишки
наблюдается значительное уменьшение ее размеров и изменение формы,
вследствие образования перетяжек, вздутий и т. д. Спайки с подлежащими
тканями наблюдаются редко. Мезентериальные железы увеличены.
При вскрытии отмечается изменение характера содержимого. Вместо
каловых масс имеется жидкое содержимое слизеподобного характера, где
находятся отдельные гноевидные комочки, в которых при микроскопии
обнаруживается большое количество амеб.
В ряде участков уплотненной, не имеющей складок слизистой оболочки
слепой кишки видны изъявления, покрытые гноевидными желтыми
пробками, иногда с примесью крови. При гистологическом изучении язв
можно установить, что они располагаются в сглаженной слизистой, инфильт-
рованной воспалительным экссудатом, и сглаженной. В подслизистом и
мышечном слоях развиваются явления воспаления. Амебы
обнаруживаются в подслизистом слое и слизистой оболочке. Гноевидные пробки,
покрывающие язвы, содержат остатки лейкоцитов и амебы. В некоторых
амебах встречаются фагоцитированные остатки лейкоцитов, эритроцитов и
бактерий.
-591 -

Состояние кишечной стенки содержимого слепой кишки оценивают по
четырехбалльной системе:
"4"максимальные изменения, захватывающие всю стенку слепой кишки.
Имеется резкое изменение в характере содержимого. Вместо каловых
масс — слизисто-гнойное содержимое с большим количеством амеб.
"3"изменения стенок кишки выражены слабее. Одновременно со слзи-
сто-гнойным содержимым имеются и жидкие каловые массы.
"2"слепая кишка изменена мало, имеются отдельные, более
уплотненные участки; жидкие каловые массы, содержащие отдельные гноевидные
комочки с большим количеством амеб.
"Г'слепая кишка несколько уменьшена, уплотнения слизистой
единичны. В содержимом отдельные амебы.
"(("отсутствие изменений и амеб в содержимом.
Если амебы в кишке при микроскопии не найдены, производится посев
содержимого кишки на питательную среду для подтверждения отсутствия
амеб. Высев производится на среду Павловой, и культура просматривается
под микроскопом через 24 и 48 ч.
Исследуемые вещества вводят в различных дозах внутрь или
парентерально. Начинают лечение через один час после инфицирования. Курс
лечения, как правило, 5 дней. Животных забивают на 6—7 день от начала
опыта. Эффективность вещества оценивают по различию показателей
нарастания массы тела и патологической картине в кишечнике, а также по
отсутствию возбудителя в кишечнике.
В качестве препаратов сравнения можно использовать эметин. Который в
дозе 4 мг/кг при 5-дневном введении внутрь дает полное излечение
животных, или биомицин, обеспечивающий 100 % излечение животных при таком
же курсе в дозе 50 мг/кг. Биомицин в дозе 100 мг/кг при однократном
введении в день заражения также обеспечивает полное излечение животных.
3. Изучение противолямблиозной активности фармакологических веществ
Возбудитель лямблиоза человека — Lamblia (Giardia) intestinalis —
представляет собой одноклеточный организм, относящийся к отряду Diplomon-
adida. Лямблии обитают в двенадцатиперстной и верхней трети тонкого
кишечника. Существует в вегетативной форме и в виде цист,
выделяющихся во внешнюю среду.
3.1. Изучение активности фармакологических веществ в отношении
лямблий (L. intestinalis, L. duodenalis) в опытах in vitro
Рост Lamblia intestinalis в аксенических условиях обеспечивает среда
TYI-S-33 в модификации Keister (1983). Состав и способ приготовления
аналогичен описанному для Entamoeba histolytica с изменениями за счет
внесения 50 мг/100 мл среды порошка натуральной желчи крупного
рогатого скота; увеличения количества L-цистеина гидрохлорида до 0,2 г на
100 мл среды. рН среды колеблется в пределах 7,0—7,1.
Предпочтительна стерилизация среды фильтрованием под давлением с
использованием фильтра с размером пор 0,22 мкм.
Штамм L. intestinalis поддерживают в термостате (36,6 (С) в наклонном
положении флакона с постоянным пересевом на свежую среду каждые
48-72 ч.
- 592-

Учитывая сложность постановки экспериментов in vitro, для оценки
проитволямблиозной активности веществ чаще используют сразу опыты in
vivo.
3.2. Изучение противолямблиозной активности фармакологических веществ
в опытах in vivo
Лабораторные животные не чувствительны к заражению L.intestinalis, но
чувствительны к L. muris. Наиболее простой, но достаточно
информативной моделью для оценки химиотерапевтической активности веществ при
лямблиозе является экспериментальный лямблиоз белых мышей [5].
Для опытов используются белые мыши весом 13—15 г. Заражают
животных взвесью, содержащей вегетативные формы лямблий и их цисты.
Взвесь приготовляют из содержимого тонкой кишки спонтанно
зараженных мышей. В дальнейшем регулярными пассажами можно специально
поддерживать штамм лямблий.
Содержимое кишки спонтанно зараженных мышей выдавливают в
емкость с физиологическим раствором и выдерживают при температуре 37 "С
в течение 1—2 ч. В приготовленной взвеси, помимо цист, должно
содержаться не менее 5—12 вегетативных форм лямблий в поле зрения
(увеличение х ЮО). Мышей заражают этой взвесью в объеме 0,3—0,5 мл через
рот. Уже с 3-го дня после заражения лямблии обнаруживаются в
содержимом кишечника у всех мышей. С 10—15-го дня количество лямблий в
кишечнике уменьшается.
В тонком кишечнике лямблии распространены неравномерно.
Наибольшее количество лямблий находится в верхней трети тонкой кишки.
При применении лекарственных средств возможен сдвиг в распределении
лямблий по кишечнику. В связи с этим при оценке результатов опыта
необходимо приготовлять не менее трех препаратов из различных участков
тонкой кишки, например из верхней, средней и нижней третей. Для
обнаружения лямблий можно применять нативные препараты (например,
раздавленную каплю) и окрашенные мазки. Следует учитывать, что, помимо
лямблий, в кишечнике мыши (особенно в нижней трети тонкой кишки и
верхнем отделе толстой) встречаются другие простейшие и глисты.
Наиболее часто обнаруживаются трихомонады, энтеромонас, хиломастикс, амебы
и их цисты и яйца глистов.
Введение лямблий существенно не влияет на общее состояние мышей.
В первые 10 дней у них может быть жидкий кал. На вскрытии кишечник
выглядит вздутым, полнокровным, в толстой кишке — неоформленный
кал, тонкой — обильное количество масс творожистого вида. На стенках
кишки и в ее содержимом при микроскопии обнаруживаются в большом
количестве вегетативные формы лямблий. Количество их колеблется от
единичных в препарате до 50—70 в поле зрения при увеличении в 100 раз.
Изучаемое вещество начинают вводить с 3-го дня после заражения.
Курс лечения составляет 5 дней. На 2-й день по окончании лечения всех
мышей забивают и исследуют содержимое их тонкого кишечника. Об
эффективности веществ судят по отсутствию лямблий при просмотре не
менее 3 препаратов, приготовленных из разных участков тонкого
кишечника.
В качестве препаратов сравнения можно использовать акрихин или
аминохинол, которые в дозе 400 мг/кг при 5-дневном введении внутрь
приводят к 100 % излечению животных.
- 593-

4. Изучение противотрихомонадной активности фармакологических веществ
Трихомонады, простейшие жгутиковые микроорганизмы, относятся к
семейству Trichomonadidae. Эти жгутиконосцы обитают в
желудочно-кишечном тракте различных животных и человека. Только два представителя
этого семейства — Trichomonas vaginalis и Trichomonas foetus —
паразитируют в мочеполовых органах. Передача заболевания происходит половым
путем. Трихомонады обнаруживаются на слизистой оболочке половых
органов и могут быть выделены в чистой культуре. У человека наибольшее
значение имеет Trichomonas vaginalis, которая вызывает урогенитальный
трихомониаз (трихомонадоз, трихомоноз).
4.1. Изучение противотрихомонадной активности фармакологических
веществ в опытах in vitro
Определение противотрихомонадной активности веществ можно
проводить в опытах с культурой трихомонад в пробирках, в культуре тканей, на
куриных эмбрионах. Наибольшее распространение получили методы
оценки активности препаратов в опытах с трихомонадами, растущими в чистой
культуре [Diamond, 1957] или в ассоциации с бактериями.
Штаммы трихомонад в ассоциации с бактериями, в частности с
кишечной палочкой, можно культивировать на среде Павловой (см. выше),
перевивая такие культуры каждые 2--3 дня.
Активную концентрацию препарата, задерживающую рост трихомонад в
культуре (трихомоностатическую концентрацию), определяют методом
серийных разведений. Объем среды 5 мл. Исходная концентрация препарата
1:1000, каждая последующая в 2 раза ниже, чем предыдущая.
Одновременно с изучаемым, ставят ряд опытов со стандартным препаратом. В качестве
стандартных применяют различные противотрихомонадные средства: мет-
ронидазол — активная концентрация 0,4—1,9 мкг/мл, трихомонацид —
1,9—3,8 мкг/мл, осарсол — 500—1000 мкг/мл. В качестве контроля
заражения берут 3—5 пробирок со средой, не содержащей препаратов.
Для опытов применяют культуру, содержащую не менее 80 %
подвижных трихомонад, что соответствует стадии логарифмического роста. Такая
культура может быть получена через 24—48 ч после внесения в 10 мл
среды 0,5—3 млн простейших. Заражающая доза в среднем составляет
10 000—25 000 трихомонад в 1 мл среды. Учет результатов опыта проводят
в течение 2—5 дней.
Рост трихомонад заметен визуально, однако более точные результаты
можно получить при микроскопическом исследовании содержимого
пробирок. Его тщательно перемешивают и определяют количество трихомонад
в препарате раздавленной капли в 125 полях зрения или в счетной камере.
Активной концентрацией препарата считают такую минимальную
концентрацию, которая полностью задерживает рост трихомонад.
Трихомонацидное действие препарата определяется методом
субкультур. Опыты ставят по обычной методике, как для определения трихомона-
статического действия. После учета результатов эксперимента делают
пересевы из каждой пробирки на свежую питательную среду. Объем
пересеваемого материала 0,25 мл. Через 48 ч для бактериальных и 96 ч для
безбактериальных культур проводят учет результатов. Трихомонацидной
считается та минимальная концентрация, при которой рост простейших
отсутствует как в культуре, так и в субкультуре.
- 594-

При непосредственном контакте противотрихомонадных средств с
простейшими наступает их гибель, которой предшествует остановка движения
жгутиков и ундулирующей мембраны. Действие препаратов можно оценить
по времени, которое необходимо для обездвиживания трихомонад. Для
опытов берут густую взвесь трихомонад и смешивают в равных
количествах с раствором или взвесью препаратов в физиологическом растворе.
Контролем является смесь трихомонад с физиологическим раствором.
Начальная концентрация вещества 10 мг/мл.
После тщательного смешивания из полученной культуры приготовляют
висячие капли. Наблюдение за состоянием трихомонад проводят через 5,
10, 15, 20, 30, 45 мин и затем каждый час. Опыты позволяют определить
время наступления обездвиживания трихомонад от различных
концентраций препарата.
4.2. Изучение химиотерапевтической противотрихомонадной активности
препаратов в опытах in vivo
Для оценки противотрихомонадной активности препаратов in vivo
существует много моделей. В качестве инфицирующего агента для
воспроизведения заболевания животных применяют не только T.vaginalis, но и
другие виды трихомонад: Т. foetus, T. gallinae, T. muris и др. Но учитывая
наибольшее значение в распространении заболеваний у человека Т. vaginalis,
целесообразно использовать в качестве инфицирующего материала именно
этот возбудитель.
В зависимости от области введения Т. vaginalis у животных развиваются
местные воспалительные процессы: при подкожном или внутримышечном
введении у мышей развиваются абсцессы; при внутрибрюшинном
введении простейших — перитонит; при внутривлагалищном введении крысам,
хомякам и морским свинкам можно вызвать трихомониаз половых
органов. Наиболее простой в исполнении и достаточно информативной можно
считать экспериментальную модель абсцесса белых мышей, вызванную Т.
vaginalis. При обнаружении высокой активности на этой модели,
целесообразно провести исследование на экспериментальной модели трихомонад-
ного вагинита белых крыс.
4.2.1. Трихомонадный абсцесс белых мышей
Для опытов берут половозрелых мышей, взвешивают их и делят на
группы по 5—10 особей в каждой. Количество групп берется с таким
расчетом, чтобы одна группа мышей оставалась не леченой (контроль).
Остальным группам вводят изучаемые препараты в 2—3 дозах каждый.
Первое введение препарата производят за 2 ч до заражения,
последующее — ежедневно. Для заражения применяют 24—48-часовые культуры
трихомонад, находящиеся в стадии логарифмического роста. Подсчет
паразитов производят в камере Горяева. Для заражения мышей берут дозу, в
4—5 раз превышающую минимальную заражающую в объеме 0,15—0,3 мл.
Инокулят вводят под кожу спины, которую предварительно смазывают
настойкой йода.
На месте введения трихомонад в первые дни появляется уплотнение в
подкожной клетчатке. В дальнейшем в течение 4—5 дней развивается
инфильтрат, который в виде бугорка начинает возвышаться над поверхно-
-595-

стью кожи. Кожа над бугорком некротизируется и абсцесс вскрывается. На
месте абсцесса образуется корка. В течение всего процесса в подкожной
клетчатке находят трихомонад. Простейшие хорошо видны в нативном
препарате по характерному движению их жгутиков и ундулирующей
мембраны. Размеры особей варьируют в значительных пределах. Трихомонады
высеваются на питательную среду с антибиотиками.
Для наблюдения за течением инфекции тяжесть развития трихомонад-
ного абсцесса удобно оценивать в условных единицах на 7-й день после
заражения: "О" — отсутствие изменений на месте введения инокулята;
"1" — отечность подкожной клетчатки, крепитация или рубец на месте
абсцесса, кожа не заросла шерстью; "2" — инфильтрат в подкожной
клетчатке или частичное отторжение корки; "3" — абсцесс возвышается над
поверхностью кожи или корка над поверхностью абсцесса; "4" — некроз
кожи над поверхностью абсцесса.
Полученные результаты для отдельных животных суммируются по
группам и вычисляется средний уровень инфекции в каждой из них. Животных
забивают и сепарируют кожу на месте заражения. Из содержимого
абсцесса, а при его отсутствии из соскоба с подкожной клетчатки готовят натив-
ный препарат с каплей физиологического раствора. Раздавленную каплю
исследуют на наличие трихомонад- Хорошие результаты дает метод посева
материала на питательную среду.
В качестве стандартного препарата можно использовать метранидазол,
который излечивает мышей при введении под кожу и внутрь в дозе 25 мг/
кг в течение 5 дней.
При изучении новых классов соединений, когда химиотерапевтическая
активность препаратов невелика, можно пользоваться другим способом
учета результатов — ежедневно отмечать размеры абсцессов у всех мышей.
Уменьшение и задержка в развитии абсцессов у леченых животных будут
указывать на наличие химиотерапевтической активности препарата.
После обнаружения у фармакологического вещества
химиотерапевтической активности целесообразно провести изучение на модели трихомонад-
ного вагинита у крыс.
4.2.2. Трихомонадный вагинит белых крыс
Трихомонадный вагинит белых крыс воспроизводится после
специальной подготовки животных, которая включает 2 этапа: проведение
операции кастрации крыс и создание состояния течки, достигаемой введением
эстрогенных препаратов.
Для опытов отбирают здоровых небеременных крыс весом 120—160 г.
Продолжительность цикла овуляции у крыс 6—7 сут. При исследовании
влагалищного мазка легко установить отдельные фазы этого цикла. В
состоянии покоя (dioestrus) во влагалище обнаруживаются лейкоциты и
небольшое количество слизи, в стадии предтечки (proeoestrus)—много
опущенных эпителиальных клеток овальной формы, в стадии течки (oestrus) —
большое количество безъядерных ороговевших чешуек и клеток и,
наконец, в стадии послетечки (metaoestrus) во влагалище появляются
лейкоциты и эпителиальные клетки. Определение стадии полового цикла важно
для дальнейшей работы по наблюдению за течением инфекционного
процесса у зараженных крыс.
Крыс оперируют под уретановым наркозом (доза уретана 1 г/кг).
Растворы уретана (20—25 %) вводят внутрибрюшинно. Крысу привязывают к
- 596 -

операционному столику за лапки вверх спиной. Шерсть на спине
выщипывают или сбривают, кожу обрабатывают йодом. Затем разрезают ее
вдоль позвоночника в поясничной части. На расстоянии около 2 см справа
и слева от позвоночника находятся окутанные жировой тканью рога матки
и яичники. Через разрез длиной 0,5—1 см кончиками пинцета вытягивают
рог матки, на конец накладывают лигатуру и отсекают яичник. Производят
послойное зашивание мышцы и кожи. Послеоперационный период
продолжается обычно 14—15 дней. К этому сроку во влагалище
устанавливается стадия покоя, что должно быть подтверждено исследованием мазка.
Заражение трихомонадами удается получить только у крыс, находящихся в
состоянии течки. Течка воспроизводится введением, предварительно
кастрированным крысам эстрадиола бензоата или эстрадиола дипропионата.
Препараты вводят в масляном растворе под кожу или внутримышечно по
10 мг. Данная доза эстрадиола вызывает 17—24-дневную течку.
Повторными иньекциями эстрадиола (под контролем влагалищного мазка) можно
длительно поддерживать течку у крыс.
До заражения крыс отбирают штамм трихомонад, обладающий
наибольшей вирулентностью. Имеются наблюдения, что при пассировании на
крысах вирулентность штамма усиливается.
Культуру трихомонад крысам вводят во влагалище при помощи
туберкулинового шприца со стеклянной или резиновой канюлей на конце.
Заражающая доза — по 500 000 подвижных трихомонад на крысу в объеме
0,15—0,25 мл. Заражение проводят три дня подряд. Через 2—3 дня после
заражения отбирают крыс, во влагалище которых обнаруживаются трихо-
монады.
У зараженных крыс развивается вагинит, сопровождающийся
увеличением секрета, появлением в нем трихомонад и бактерий. После
прекращения течки они исчезают. При непрерывной течке простейшие у некоторых
животных определяются до 75 дней. Вначале в увеличенные и
наполненные серозным содержимым рога матки проникают трихомонады, которые
затем вытесняются бактериями. Содержимое рогов мутнеет, приобретает
гноевидный характер. Вокруг матки развивается воспалительный процесс,
в который вовлекается брюшина. В дальнейшем образовываются свищи.
Количество трихомонад в промывных водах влагалища может быть
выражено в условных единицах: "0" — трихомонады отсутствуют; "+" —
единичные трихомонады в препарате; "++" — единичные в поле зрения;
"+++" — до 25 трихомонад в поле зрения; "++++" — свыше 25 трихомонад
в поле зрения.
Заразившихся крыс разделяют на группы по 5—10 животных в каждой с
таким расчетом, чтобы уровень инфекции был одинаковый. Одна группа
служит контролем заражения. Исследуемые препараты вводят в 2—3 дозах
ежедневно на протяжении 5 дней. Препараты применяют в изотонизиро-
ванных водных растворах и масле. Обследование животных проводят в
середине курса лечения, по окончании лечения и далее каждые 3—5 дней до
исчезновения трихомонад у контрольных животных. Количество
трихомонад, которое определяется в смывах из влагалища крыс, отмечается в
условных единицах. При наличии у препарата местного раздражающего
действия во влагалище появляются лейкоциты, а при тяжелях формах
раздражения — эритроциты.
В качестве стандартного препарата применяют метронидазол, который
излечивает крыс при подкожном применении в дозах от 25 мг/кг и при
местном применении — 10—20 мк/кг пасты или 3—6 мг на крысу.
На модели трихомонадного вагинита крыс изучают противотрихомонад-
- 597-

ную активность препаратов, апробированных на модели трихомонадного
абсцесса белых мышей. Модель позволяет изучить противотрихомонадную
активность препаратов при различных способах введения, при
комбинированном применении, например, местно и внутрь, определять оптимальную
продолжительность курса лечения, устанавливать лечебные и переносимые
дозы при местном применении и т. д.
При необходимости трихомонадные вагиниты можно получить также у
морских свинок, золотистых хомячков и обезьян, организм которых не
нуждается в гормональной перестройке перед заражением.
5. Изучение пртиволейшманиозной активности фармакологических веществ
Инфекции, вызванные лейшманиями, чаще развиваются в странах с
жарким климатом и имеют для России значение завозных инфекций.
В лабораторных условиях чаще всего используют следующие виды
лейшманий:
1. Leishmania donovani, L. infantum — возбудители висцерально^ лейш-
маниоза;
2. L. major, L. tropica — возбудители кожного лейшманиоза;
3. L. brasiliensis — возбудитель кожно-слизистого лейшманиоза.
Перечисленные виды лейшманий патогенны для человека и поэтому
требуют при работе соответствующих мер предосторожности.
Возбудители различных нозологических форм лейшманиозов имеют
большое морфологическое сходство. В жизненном цикле лейшманий
имеются две стадии. Одна из них развивается в организме млекопитающзих
как внутриклеточный паразит моноцитарных клеток кожи (кожные формы
инфекции) и внутренних органов (печень, селезенка, костный мозг и др.)
при висцеральном лейшманиозе. Это лейшманиальная форма — амастиго-
та. Она неподвижна и не имеет жгута. Промастигота (лептомонада) —
жгутиковая (подвижная форма) развиваетсяв организме москита —
переносчика данной группы инфекций,а также в культурах на искусстенных
питательных средах при температуре 20—28 (С.
5.1. Изучение противолейшманиозной активности веществ в опытах in vitro
5.1.1. Метод серийных разведений со жгутиковыми формами
Промастиготные формы лейшманий легко культивируются на плотной
кровяной среде, оптимальный температурный режим 22—25 (С, в темноте.
В опытах используют культуру на второй неделе роста (:—12 дней) в виде
суспензии паразитов, полученной из смыва культуры с поверхности
питательной среды. Поддержание музейных препаратов на плотных кровяных
средах осуществляют перевивкой культур петлей в возрасте 21—24 дня.
Общеизвестна кровяная среда NNN (Novy-Neal-Nicolle), ее состав: агар-
агар — 14,0 г, хлористый натрий — 6 г, дистиллированной воды — 900 мл.
К сваренному и проавтоклавированному (1,5 атм — 20 мин) добавляют
20 % по объему свежевзятой кроличьей крови, при этом нужно учесть,
чтобы кровь не свернулась, т. е.исходная температура агара не должна
превышать 53 °С (Цит. По Кожевникову, Добротворской, Латышеву, 1947).
Агар перемешивают с кровью, быстро разливают по пробиркам и
скашивают. Каждую порцию среды проверяют на стерильность при 37 °С в течение
- 598 -

24—72 ч. В дальнейшем с целью повышения урожайности культуры
Э. Е. Шуйкиной (1961) была предложена двухфазная среда. В качестве
твердой фазы был взят кровяной агар NNN, жидкой фазой служила смесь
среды 199 и 0,5 % раствора гидролизата лактальбумина. Среды разливали в
конические колбы объемом 0,75 — 1 л. В колбу наливали 60 — 75 мл, 8 5
агара, 0,7 % хлористого натрия (0,53 г). Агар автоклавировали при + 5 атм.
20 мин. В расплавленный агар остуженный до 53 °С вносили 7—10 свеже-
взятой дефибринированной кроличьей крови. Содержимое колбы
перемешивали круговыми движениями, избегая образование пузырей на
поверхности агара. Кровяной агар после застывания помещали в термостат при
37 "С на 24—48 часов для проверки на стерильность. По окончании
инкубации на стерильный агар наслаивали по 25—30 мл среды 199 и
гидролизата лактальбумина. Ватные тампоны заменяют на стерильные резиновые
пробки. Вновь контролируют среду на стерильность. Для посева
используют смывы культур из пробирок или из колб из расчета не более 105—
10б кл/мл свежей среды. Лейшманий выращивают в темноте при
оптимальной для роста промастигот температуре 22—25 °С. Температура выше
28 "С отрицательно влияет на состояние культуры. Культура пригодна для
исследований в возрасте с 5-го по 10—12-й дни. Число паразитов в 1 мл
культуры варьирует от 1 107 до 30—50107, т.о. в 1 колбе можно получить
1,5—2 млрд промастигот за несколько дней. Культуры лейшманий на
кровяных средах поддерживают без применения антибиотиков. Лейшманий
относительно медленно растущие микроорганизмы. Кровяные среды —
прекрасный субстрат для развития разнообразных микроорганизмов.
Поэтому необходимо очень тщательное и высоко профессиональное
выращивание культуры этой группы протистов.
Для опытов по оценке противолейшманиальной активности изучаемых
веществ готовят стерильную среду следующего состава:
дефибринированной крови кролика 1 объем, 6,3 % раствора хлористого натрия — 1 объем,
6 объемов дистиллированной воды. Полученную среду центрифугируют,
отсасывают жидкую фазу и хранят ее на холоду. Перед постановкой опыта
2 объема среды смешивают с 1 объемом свежей кроличьей сыворотки.
Рассчитывают объем среды для конкретного опыта. В контрольные пробирки
вносят чистую среду. В опытные пробирки вносят среду, в которую
предварительно добавляют суспензию промастигот лейшманий из расчета
1 х 106 мл и тщательно размешали. Эту смесь разливают по мини
пробиркам в объеме 0,47 мл, затем в каждую опытную пробирку вносят
двукратные разведения испытуемых веществ, в объеме 0,03 мл. Через 5 дней
инкубации при 22—25 °С в темноте. Содержимое пробирок исследуют в свежем
и окрашенном мазке и таким образом определяют минимальную
концентрацию препарата, которая полностью подавляет рост промастигот, т. е.
лейшманистатическую концентрацию испытуемого вещества.
5.1.2. Метод "висячей" капли
Культура, приготовленная так, как описано в предыдущем разделе,
может быть исследована методом "висячей капли". На ряд покровных стекол
наносят по 1 стандартной капле взвеси паразитов любого вида и равной по
объему капле испытуемого препарата в различных концентрациях.
Стандартная заражающая взвесь должна содержать не менее 2 х Ю6
промастигот в 1 мл. Препараты микроскопируют при ув. об. 40х. Для этого после
смешивании раствора препарата со взвесью культуры осторожно перевора-
- 599-

чивают каплей вниз и тщательно притирают к лунке предметного стекла.
Края покровного стекла заливают разогретым парафином. Результаты
регистрируют через разные временные интервалы (минуты, часы, сутки).
Опыт проводят при температуре 22—25 °С. Контролем служит препарат, в
котором капля культуры смешивается с физиологическим раствором. В
подобных препаратах можно наблюдать изменения подвижности и
морфологии жгутиконосцев по воздействием лекарственных средств.
5.1.3. Метод серийных разведений с лейшманиальными формами
Исследование лейшманостатической концентрации веществ в
отношении к амастиготам лейшманий разных видов проводят на суспензии
клеток печени и селезенки золотистых хомяков и мышей на последних
стадиях развития висцерального лейшманиоза, когда сформировался гепатолие-
нальный синдром и кахексия. Для работы используют стандартные
сбалансированные солевые растворы (Эрла, Хенкса и пр.) или питательные среды
(среда 199, 0,5 % раствор гидролизата лактальбумина, RPMI — 1640 и др.).
Важно не изменять состав сред при выполнении всей серии исследований.
К любой из выбранных сред добавляют 10 % (по объему) стерильной
бычьей (коровьей) сыворотки. Все этапы опыта проводят с соблюдением
стерильности. Выделенный орган от больного животного измельчают в
одной из перечисленных сред, суспензию подвергают непродолжительному
мягкому центрифугированию для осаждения крупных частиц и клеток. На-
досадочную жидкость, содержащую основную массу паразитов, отсасывают
Под микроскопом определяют качество суспензии и число паразитов в
поле зрения при ув. об. 40 ", т. к. точный подсчет амастигот в гемоцитометре
затруднен. Всю серию опытов стараются проводить примерно при одном и
том же содержании паразитов в суспензиях органов. При постановке
опыта в мини пробирки разливают по 0,45 мл ряд разведений исследуемого
препарата. Затем в каждую пробирку вносят по 0,05 стандартной
суспензии паразитов. Опыт проводят при температуре 22—25 °С и постоянном
встряхивании пробирок 60 раз в 1 мин в продолжении всего опыта. Через
24 ч содержимое пробирок исследуют под микроскопом. Через сутки
повторяют микроскопический анализ состояния опытных культур, и
содержимое пробирок, в которых отмечено снижение активности роста
культуры или его полное угнетение, высеивают в пробирки на косяки кровяного
агара. В течение двух недель наблюдают за развитием культуры промасти-
гот на среде с целью уточнения активности действия препарата — цитоста-
тического или цитотоксического.
Более точный в количественном отношении и в физиологическом
плане результат дает исследование действия препарата выполненное на
переживающей культуре перитонеальных прилипающих клеток (макрофагов)
грызунов. Эта методика позволяет проводить наблюдения за результатами
действия препаратов по единой методике за видами лейшманий,
возбудителями висцерального, кожного и кожно-слизистого лейшманиоза, а также
на животных разных линий как чувствительных, так и устойчивых к лейш-
маниям. Последнее очень важно, т. к. известно, что лейшманиоз у линий
мышей, чувствительных к нему, излечивается менее успешно, чем у
устойчивых.
Работать целесообразнее на линейных мышах, так как можно получить
достаточный по объему и числу пул генетически однородных клеток.
Можно работать как с активированными макрофагами, так и с неактивирован-
-600-

ными. В первом варианте можно получить больший выход клеточной
массы. Переживающая культура прилипающих перитонеальных клеток или
тканевых макрофагов из печени и селезенки мышей и хомяков широко
применяется в иммунологических, микробиологических и
вирусологических исследованиях. Для изучения эффективности химиотерапевтических
препаратов против лейшманий пригодна любая методика ведения
культуры. Поэтому отметим ниже лишь особенности ведения культуры
лейшманий на макрофагах in vitro. В естественных условиях in vivo у
теплокровных лейшманий поражают именно зрелые клетки моноцитарного ряда,
т. е. макрофаги, в которых развиваются и размножаются паразиты. Спустя
сутки после выделения макрофагов, когда они уже хорошо распластаются
на стекле, их заражают промастиготами из расчета: 1000 макрофагов на 1
стекло в пробирку с культурой и 5—10 тысяч промастигот на 1 пробирку с
культурой макрофагов. Заражение клеток лейшманиями происходит в
течение ближайших несколько часов инкубации, спустя 1—3 часа после
заражения и инкубирования культуры при 37 °С проникшие в макрофаги
промастиготы трансформируются в амастиготы. По окончании инкубации
клеток с паразитами среду заменяют. Принципиальную важность имеет
сохранение единообразия условий заражения на протяжении выполнения
всей серии экспериментов. Препарат можно вводить одномоментно с
заражением макрофагов или после заражения и смены среды. Это позволяет
оценить действие препарата на процессы инвазии и фагоцитоза
промастигот макрофагами и на внутриклеточное развитие амастигот. Используя
макрофаги мышей, оппозитных по чувствительности линий животных к
лейшманиозу, можно оценить размах вариации эффективности препарата
в генетически неоднородной популяции животных или человека.
Интенсивность размножения паразитов можно оценить по активности
включения трития или меченного углерода, а также путем микроскопического
анализа. Подсчитывают число амастигот внутриклеточных и свободных в
культуре на 100 клеток моноцитарного ряда (или ядер). Далее определяют
среднее число паразитов на 1 клетку хозяина. Продолжительность роста
амастигот в монослое перитонеальных клеток мышей минимальна для
возбудителей висцерального лейшманиоза и составляет 5—7 дней и более 10
дней — при заражении монослоя слабовирулентными штаммами дерма-
тропных видов возбудителей. Следует учитывать различие активности
роста паразитов в макрофагах мышей, оппозитных по чувствительности к
лейшманиям, поэтому оптимально проводить одновременную оценку
препарата по этим показателям.
Методика исследования химиотерапевтических препаратов в монослое
перитонеальных прилипающих клеток позволяет отказаться от
трудоемкого и мало информативного в количественном отношении метода
культивирования in vitro кусочков ткани больного лейшманиозом животного.
5.2. Изучение противолейшманиозной активности веществ в опытах in vivo
Исследования проводят на моделях висцерального и кожного
лейшманиоза.
-601 -

5.2.1. Изучение химиотерапевтической активности препаратов
при экспериментальном висцеральном лейшманиозе
Лечебное действие противолейшманиальных препаратов изучают
преимущественно на золотистых хомяках в связи с их высокой
восприимчивостью к висцеральному лейшманиозу. При заражении патогенным
материалом у хомяков развивается генерализованный висцеральный лейшманиоз и
животные погибают от интенсивного поражения селезенки, печени
системы кроветворения с явлениями пролиферации ретикуло-эндетелиальной
системы. Важным показателем развития инфекции является спленомега-
лия, гепатомегалия и кахексия. Поэтому у зараженных животных
необходимо оценить массу тела животных, а при забое и массу селезенки, чтобы
определить селезеночный индекс (отношение массы селезенки к массе
тела больного животного). Все эксперименты на хомяках нужно выполнять
на животных 2-месячного возраста, масса которых около 30 г. После
заражения, лучше в селезенку, хомяк продолжает расти около месяца. Затем
рост прекращается, масса тела остается на одном уровне в течение 1—2
нед, а потом уменьшается. Это свидетельствует о становлении иммунного
конфликта, о начале развития сплено- и гепатомегалии. В этот период
инфекции число паразитов во внутренних органах становится достаточным
для их обнаружения. Угнетение развития и размножения паразитов под
влиянием химиотерапевтических препаратов продлевает период
относительного благополучия в течении лейшманиоза, развитие спленомегалии и
кахексии будет сдвинуто на более поздние сроки.
Для экспериментальной оценки эффективности фармакологических
веществ используют метод исследования, позволяющий в течение 8 дней
получить результат. Кратко этот метод состоит в следующем: животных
заражают в селезенку (хомяков) или внутривенно (мышей) суспензией из
селезенки инфицированного животного или промастиготами из культуры на
второй недели роста и вводят препараты внутрибрюшинно в течение 6
дней начиная со дня заражения. На 8-й день опыта животных забивают,
посчитывают число паразитов в отпечатках из внутренних органов на 1
ядерную клетку хозяина у леченых и контрольных животных. Сравнивая
эти показатели, делают заключение об активности препарата.
5.2.2. Изучение химиотерапевтической активности препаратов
при экспериментальном кожном лейшманиозе
Экспериментальный кожный лейшманиоз воспроизводят амастиготами
на белых мышах. В качестве возбудителя заболевания используют
следующие виды лейшманий: L. major, L. tropica.
Заражение животных промастиготами более близко к естественному,
так как оно подобно укусу переносчика. Кроме того, эти формы легко
культивировать на искусственных питательных средах и дозировать под
контролем гемоцитометра. Однако в процессе длительного
культивирования промастигот на искусственных питательных средах вирулентность их
утрачивается. Чтобы предотвратить это явление, рекомендуют хранить
паразитов в стеклянных капиллярах при низкой температуре (—70 °С) в смеси
с 7,5 % глицерина. По мере необходимости выдержанные при низкой
температуре клетки пересеивают на искусственную питательную среду.
При заражении животных амастиготами используют кусочки
пораженной лейшманиозом кожи. Их измельчают, растирают с песком, добавляют
- 602-

физиологический раствор и антибиотики(пенициллин и стрептомицин по
100 ЕД на 1 мл физиологического раствора) и фильтруют через ватный
фильтр. На каждое животное используют примерно 10—120 мг
пораженной ткани. Патогенный материал вводят внутрикожно.
5.2.2.1. Экспериментальный кожный лейшманиоз белых
мышей
Для опытов отбирают мышей весом 16—18 г. За 2 дня до заражения у
животных выщипывают шерсть на спине у основания хвоста на участке
диаметром 2 х 2,5 см. Заражение осуществляется культуральными
формами высоковирулентных штаммов L. major, выделенных из язв человека или
грызунов. Культуру лейшманий выращивают при температуре 20—25 °С на
среде NNN. Для заражения используют 2-недельную культуру. Для
получения взвеси культуру смывают с поверхности среды физиологическим
раствором, переносят в стерильную колбу с бусами и тщательно встряхивают.
Подсчет промастигот производят в гемоцитометре и готовят такую взвесь,
которая содержит 106 паразитов в объеме 0,05 мл. Эту заражающую дозу
вводят животным внутрикожно в область основания хвоста.
После короткого инкубационного периода (5—10 дней) у мышей на
месте введения культуры образуется типичная лейшманиола: сначала
появляется блестящий плотной консистенции бугорок, который через 5—
7 дней подвергается эрозии. Эрозия начинается с центра и постепенно на
месте бугорка образуется язва, имеющая вначале небольшие размеры (1 —
2 мм2). В дальнейшем она увеличивается и приобретает характерный вид:
округление контура, валикообразный край по периферии. В содержимом
бугорка (при проколе его) или в отпечатках поверхности язвы, сделанных
в этот период, имеется большое количество расположенных в макрофагах
и свободно лежащих лейшманий. Отделяемое язвы засыхает с
образованием корки, которая плотно прилегает к краям язвы. При надавливании на
корку по краям язвы выступает серозная жидкость, содержащая большое
количество лейшманий. В течение 2—3 мес язва сохраняет свой
первоначальный вид, затем инфильтрат, окружающий язву рассасывается и
уплощается, исчезает валикообразный край, язва приобретает неправильную
форму, корка становится все массивнее, и, наконец, язва теряет свой
характерный вид. В ряде случаев процесс приводит к гангрене хвоста.
Иногда он сопровождается появлением у мышей вторичных лейшманиом на
мордочке, ушах, лапках и хвосте.
Введение испытуемого вещества можно начинать как в день заражения
(профилактических опыт), так и в разных стадиях развития инфекции
(лечебный опыт). Для предварительного ориентировочного исследования хи-
миотерапевтической эффективности вещества наиболее удобными сроками
начала лечения мышей являются 12-е и 35-е сутки. На 12-е сутки как
правило у мышей начинает образовываться язва. К 35-м суткам у всех мышей
имеются развитые лейшманиомы. Препараты оказавшиеся эффективными
следует изучить при более позднем применении — через 3 и 6 мес после
заражения.
Водят препараты ежедневно один раз в сутки в течение 20 дней
различными способами в зависимости от задачи исследования. Критерием
эффективности препарата служат следующие показатели: 1) степень местного
поражения; 2) размер лейшманиомы; 3) наличие лейшманий в язве; 4)
гистологическая картина лейшманиомы.
-603 -

Степень местного поражения определяют следующим образом: "О" —
отсутствие поражения; "+" — инфильтрация; "++" — изъязвление;
"+++" — образование язвы с коркой; "++++" — обширная язва; "++" —
затихание процесса, начало эпителизации; "+" — дальнейшее заживление,
сопровождающееся шелушением; "О" — полная эпителизация.
Сумма крестов в группе животных в каждый момент исследования
деленное на число животных в группе составляет среднюю степень
поражения для группы. Суммируя эти показатели по окончании опыта и деля
полученную сумму на число наблюдений, получают среднюю степень
местного поражения за весь опыт.
Размер лейшманиомы определяют путем измерения ее длины и
ширины и вычисления площади пораженного участка в мм2. Сумма размеров
отдельных язв деленная на число животных в группе, составляет средний
размер лейшманиомы для этой группы животных. Количество лейшманий
в отпечатках из язв оценивается по следующей схеме:
"О" — отсутствие лейшманий; "+" — 1 лейшмания на 1—9 полей зрения;
"++" — от 2 до 10 лейшманий в 1-м поле зрения; "+++" — от 11 до 50
лейшманий в 1-м поле зрения; "++++" — более 50 лейшманий в 1-м поле
зрения.
Степень местного поражения и площадь пораженного участка
определяют каждую неделю, а наличие лейшманий в отделяемом язвы — 2 раза в
месяц.
Показатель эффективности вычисляют по формуле:
(А-В) • 100
А
где А — средняя степень местного поражения за весь опыт в группе
контрольных мышей; В — средняя степень местного поражения за весь опыт в
группе леченных животных.
Вещества, имеющие показатель эффективности более 30 %, следует
отнести к группе активных. Однако практический интерес могут
представлять лишь вещества с показателем эффективности близким к 50 %.
6. Изучение противотрипаносомной активности фармакологических веществ
Трипаносомозы относятся к трансмиссивным заболеваниям,
вызываемым жгутиковыми простейшими. Эти заболевания распространены в
странах тропического пояса. Различают африканский (сонная болезнь) и
американский (болезнь Шагаса) трипаносомозы.
Изучение противотрипаносомной активности веществ проводят в
опытах in vitro и in vivo.
6.1. Изучение противотрипаносомной активности веществ проводят
в опытах in vitro
Изучение влияния веществ на трипаносомы in vitro проводят методом
серийных разведении. Для роста и развития трипаносом используют
жидкую питательную среду, содержащую в равных объемах 0,5 % раствор
глюкозы в физиологическом растворе и инактивированную кроличью
сыворотку, рН среды 7,0.
В ряд мини-пробирок разливают по 0,5 среды, затем в первую пробирку
-604-

опытного ряда добавляют 0,5 мл испытуемого препарата желаемой
концентрации. После тщательного встряхивания пробирок из первой во вторую
переносят 0,5 мл жидкости, затем тот же объем жидкости после
встряхивания переносят из второй пробирки в третью и т. д. Опытные пробирки с
различными разведениями испытуемого препарата и контрольные,
содержащие только питательную среду, засевают суспензией трипаносом. Эту
суспензию готовят в стерильных условиях путем взятия крови из сердца
инфицированной мыши и смешивают ее с небольшим объемом солевого
цитрата. Суспензию трипаносом центрифугируют для осаждения
клеточных элементов крови. Надосадочную жидкость, содержащую трипаносо-
мы, отсасывают, а из осадка трипаносом приготовляют суспензию
определенной густоты на физиологическом растворе. Густоту суспензии
контролируют с помощью гемоцитометра.
После засева суспензии пробирки опытного ряда накрывают
стеклянными колпачками или пробирками и помещают в термостат при
температуре 37 "С. Через определенные промежутки времени в течение суток из
каждой пробирки опытного ряда исследуют каплю взвеси под
микроскопом и подсчитывают число трипаносом. Под влиянием активного
препарата трипаносомы погибают. Наименьшую концентрацию препарата,
которая полностью подавляет жизнеспособность трипаносом, называют титром
активности изучаемого вещества.
6.2. Изучение противотрипаносомной активности веществ проводят
в опытах in vivo
Наиболее удобной химиотерапевтической моделью трипаносомной
инфекции считается экспериментальный трипаносомоз белых мышей
Trypanosoma musculi.
Для заражения мышей могут быть использованы различные виды
трипаносом. В зависимости от вида возбудителя инфекционный процесс
протекает остро или хронически. Острое заболевание вызывают Trypanosoma
equiperdum, Trypanosoma brucei, Trypanosoma rhodesiense, Trypanosoma
gambiense, Trypanosoma evansi и другие виды трипаносом. Trypanosoma cru-
zi вызывает у мышей хроническое заболевание. Trypanosoma congolense, в
зависимости от взятого штамма, — либо острую тяжелую инфекцию со
смертельным исходом, либо хроническое заболевание, при котором
трипаносомы спонтанно появляются в крови.
Трипаносомоз мышей, вызванный Trypanosoma equiperdum, протекает
остро с летальным исходом и большим количеством микроорганизмов в
крови, что позволяет четко оценивать химиотерапевтический эффект
препаратов.
Штаммы Trypanosoma equiperdum поддерживают на мышах и морских
свинках. Для поддержания штаммов на белых мышах принят следующий
метод пассирования: у инфицированной мыши, содержащей в крови
множество трипаносом, надрезают кончик хвоста и пастеровской
гашеткой набирают небольшое количество крови из хвостовой вены. Эту кровь
вводят под кожу двум здоровым мышам. Через 48 ч у них в крови уже
можно обнаружить трипаносомы. Перевивать штамм следует через двое
суток.
При пассаже штамма на морских свинках ухо больного животного
протирают ватой, смоченной в спирте, иглой от шприца делают укол в одну из
вен уха и выступившую каплю крови набирают в пастеровскую пипетку и
- 605 -

вводят под кожу двум здоровым морским свинкам. У этих животных
инфекция протекает хронически с невысоким уровнем трипаносом в крови и
дает несколько рецидивов, во время которых трипаносомы появляются в
крови в большом количестве. Штамм следует перевивать через 3—4 нед (в
период рецидивов), при наличии множества трипаносом в крови морских
свинок. В случае потери штамма на мышах заражение животных
производят кровью от больных морских свинок, причем штамм пассируют
троекратно через мышей. Только после этого можно приступать к заражению
животных для опыта.
Опыты проводят на мышах любого пола весом 15—18 г.
Наиболее распространенным методом заражения является подкожный,
реже применяют внутрибрюшинное и внутривенное заражение. Мышей
для опыта никогда не заражают цельной кровью. Кровь для этой цели
разводят солевым цитратом, который готовят по следующей прописи: Natrii
citrici 0,3; Natrii chioridi 0,6; Aq. destill. 80,0. В некоторых случаях
лимоннокислый натрий может быть заменен гепарином. В солевом растворе,
содержащем гепарин (1:5000), трипаносомы дольше сохраняют свою
жизнеспособность. Нитратный солевой раствор готовят ex tempore, доводят до
кипения и охлаждают до комнатной температуры, после чего в нужное
количество солевого цитрата осторожно добавляют кровь инфицированной
мыши со множеством паразитов. Кровь из вены хвоста или сердца
животного набирают в пастеровскую пипетку и переносят в колбу с солевым
цитратом. Для приготовления взвеси требуемой густоты кровь следует
добавлять понемногу. Густоту заражающей взвеси определяют путем
микроскопии капли взвеси под покровным стеклом с сухой системой
микроскопа (40 х Ю). Большей частью для заражения мышей готовят взвесь,
содержащую в раздавленной капле 3—4 трипаносомы в одном поле зрения. Для
получения такой взвеси обычно бывает достаточно добавить к 40—60 мл
солевого цитрата несколько капель крови до получения слабо розового
окрашивания раствора. Взвесь для заражения вводят мышам в равном объеме
(0,5 мл) под кожу спины около шеи. Колбу со взвесью между отдельными
инъекциями необходимо встряхивать, так как трипаносомы быстро
оседают на дно.
Инфицированность мышей констатируют обнаружением трипаносом в
крови при микроскопии. Для этого небольшую каплю крови из хвостовой
вены помещают на предметное стекло, покрывают покровным, осторожно
придавливают для получения более тонкого слоя и микроскопируют с
сухой системой (40 х 10). В случае правильного заражения мышей при
микроскопическом исследовании их крови через 72 ч можно легко обнаружить
в каждом поле зрения микроскопа единичные трипаносомы, затем число
из возрастает и мышь погибает на 4—5-е сутки при наличии в крови
множества трипаносом.
При описанном способе заражения трипаносомы появляются в крови
через 72 ч, поэтому кровь мышей как контрольной, так и опытной групп
исследуют под микроскопом именно через этот срок и затем ежедневно в
течение всего опыта. Показателем интенсивности инфекции является
количество трипаносом в крови. Подсчет их производят ежедневно в тонком
мазке, в котором эритроциты расположены плотно в один слой.
Трипаносомы в мазках подсчитывают на определенное число
эритроцитов, например, на 200 или 500 эритроцитов подсчитывают число
паразитов. При этом следует определить число эритроцитов в 1 мкл крови, тогда
можно пересчитать и число трипаносом в 1 мкл крови.
Изучаемые вещества вводят различными способами (внутрь, подкожно,
-606-

внутривенно и т. д.) до или через 1 ч после заражения (профилактическое
действие) или через 3 дня после инфицирования (лечебное действие).
Химиотерапевтическую эффективность препарата оценивают по
следующим показателям:
1) времени появления трипаносом в крови у леченых мышей в
профилактическом опыте;
2) длительности срока, на который исчезают трипаносомы в группе
леченых мышей в лечебном опыте;
3) продолжительности жизни леченых мышей по сравнению с
контрольными (в профилактическом и лечебном опытах).
В случае отсутствия трипаносом в крови леченых животных можно
говорить о стерилизующем действии препарата. Однако для подтверждения
стерилизующего эффекта вещества необходимо кровь излеченных
мышей, взвесь из их органов (печень и селезенка) ввести внутрибрюшинно
здоровым животным. Если при этом инфекция у мышей не разовьется,
можно быть уверенным в наличии стерилизующего действия препарата.
В качестве эталонных препаратов могут быть использованы пиральдин,
который вызывает исчезновение трипаносом из крови через 24—48 ч
после введения, или новарсенол, обеспечивающий исчезновение
трипаносом из крови экспериментальных животных к концу первых суток после
начала лечения.
7. Изучение активности фармакологических веществ в отношении
возбудителей токсоплазмоза
Токсоплазмоз — паразитарная болезнь, характеризующаяся поражением
главным образом нервной системы, лимфатических узлов, скелетных
мышц, миокарда, глаз, печени и селезенки. Наиболее часто токсоплазмозы
имеют хроническое течение. Особую опасность представляет врожденный
токсоплазмоз, который развивается в результате внутриутробного
заражения плода от матери, больной токсоплазмозом.
Возбудитель токсоплазмоза — Toxoplasma gondii является
внутриклеточным паразитом, относится к простейшим (класс споровиков) и образует
цисты.
В лабораторных условиях штаммы токсоплазм поддерживают на белых
мышах. Пассажи проводят каждые 3—4 дня, заражая мышей экссудатом
внутриперитонеально. Взвесь токсоплазм из брюшной полости может
сохраняться при — 10—20 °С в течение 2—3 нед. Штамм систематически
проверяют на стерильность в отношении бактерий.
Токсоплазмы хорошо растут и длительно сохраняют свои свойства в
культуре тканей куриного эмбриона клеток Hela и др. Простейших вносят
в 1—2-дневную культуру тканей, где они размножаются внутри клеток.
Максимальное количество достигается на 2-й день. Пересевы делают
каждые 2—3 дня. Куриные эмбрионы 6—10-дневного возраста заражают в
желточный мешок или хориоаллантоисную оболочку. Токсоплазмы
обнаруживаются в свободном состоянии и внутри клеток ретикуло-эндотели-
альной системы и крови.
Эти методы культивирования токсоплазм используют и для оценки
активности фармакологических средств. Вещества в переносимых тканями и
эмбрионами концентрациях, которые устанавливаются в предварительных
опытах, вносят в питательную среду или эмбрион. Препарат растворяют в
буферном изотонизированном растворе хлорида натрия. В некоторых слу-
-607 -

чаях эмбрионы и культуру тканей заражают токсоплазмами,
контактировавшими с изучаемыми препаратами.
При оценке результатов используют метод непосредственного
обнаружения токсоплазм и различные серологические реакции.
В опытах in vivo используют экспериментальную модель токсоплазмоза
белых мышей. Инфекцию вызывают внутрибрюшинным введением
токсоплазм. Возможны и другие методы заражения — подкожный,
внутривенный и др. В перитонеальной полости мышей накапливается экссудат,
содержащий свободно лежащие и расположенные в лейкоцитах паразиты.
Через 2—3 дня после заражения токсоплазмы проникают во все органы;
больше всего их обнаруживается в селезенке, печени и легком.
Химиотерапевтические эксперименты начинают с определения
заражающей дозы токсоплазм, т. е. определяют, какое количество простейших
вызывает у мышей острую смертельную инфекцию продолжительностью
6—8 дней. Для определения этой дозы готовят взвесь токсоплазм из
экссудата брюшной полости, инфицированной токсоплазмами мыши с таким
расчетом, чтобы в 0,2 мл взвеси было 1 млн, 0,1 млн, 0,01 млн и т. д.
особей. Количество токсоплазм подсчитывают в гемоцитометре; учитываются
только свободно лежащие паразиты. Инокулят вводят внутрибрюшинно.
Фармакологическое вещество в зависимости от его свойств вводят
внутрь или парентерально, начиная за 2 ч до заражения и далее ежедневно
в течение 5 дней.
Нелеченые контрольные мыши погибают на 6—8-й день. При
применении активных препаратов увеличивается продолжительность жизни
животных или происходит полное излечение. Наблюдение за выжившими
животными целесообразно продолжать не более 30 дней. Если животное к
этому времени не погибло, необходимо установить, инфицировано оно
или полностью излечилось. Для этого используют метод обнаружения
токсоплазм в мазках и гистологических препаратах, заражение взвесью из
органов и тканей интактных животных, реакцию с красителем и
серологические реакции [Е. М. Шитова, Н. А. Новицкая, 1966; А. В. Левит и др.,
1964; В. Н. Калякин, Ю. А. Мясников, 1967]. Следует иметь в виду, что у
лабораторных животных спонтанно встречаются токсоплазмозы, а также
близкие к токсоплазмам по морфологии организмы: энцефалитозон, гепа-
тозон, М-организм и др.
При работе с культурами токсоплазм и с животными, зараженными ими,
следует соблюдать большую осторожность: надевать резиновые перчатки,
защитные очки и маску. Описаны случаи лабораторного заражения. Все
зараженные животные и куриные эмбрионы должны содержаться в помещении,
изолированном от основного вивария и лабораторий. Все инфицированные
материалы следует тщательно дезинфицировать. А погибших животных,
эмбрионы и отходы (остатки пищи, подстилки и пр.) — сжигать.
В связи с тем. что средства для лечения токсоплазмоза находят
применение в основном в акушерской практике, большое внимание следует уделить
изучению токсических свойств препаратов, передаваемых на клиническое
изучение, в частности обязательно изучение тератогенного действия.
8. Изучение противомалярийной активности фармакологических веществ
Основными возбудителями малярии являются плазмодии четырех
видов: P. vivax, P. malariae, P. falciparum и P. ovale. Однако у мелких
лабораторных животных эти виды плазмодиев не вызывают развитие инфекции.
- 608 -

Поэтому в качестве модели применяется малярийная инфекция,
вызванная другими видами плазмодиев, — возбудителями малярии птиц и
грызунов. Отмечено большое сходство в цикле развития малярии у этих
животных и у человека, а также в их отношении к лекарственным веществам.
Изучение противомалярийной активности различных соединений
проводится в основном на следующих моделях: цыплятах, зараженных P. gall-
inaceum и мышах, зараженных P. berghei. Указанные виды животных при
достаточном количестве введенных паразитов восприимчивы к
малярийной инфекции в 100 % случаев. Можно проводить исследования также на
утятах при заражении P. cophurae и обезьянах, зараженных разными
видами плазмодиев (P. cynomolgi, P. knowlesi и др.), причем P.cynomolgi
вызывает у обезьян рецидивирующий тип малярии.
Малярийный паразит в разных стадиях своего развития может обладать
неодинаковой чувствительностью к одному и тому же препарату. Поэтому
действие противомалярийных препаратов изучается применительно к
разным стадиям развития плазмодия.
В развитии малярийного паразита в организме позвоночного хозяина
существуют, как известно, эритроцитарный и тканевый (экзоэритроци-
тарный) циклы. Спорозоиты при укусе зараженного комара проникают у
птиц в макрофагальные клетки тканей разных органов и в эндотелий
сосудов, у млекопитающих — в паренхиматозные клетки печени, где
размножаются шизогонией. Эти стадии развития паразитов обозначают как
преэритроцитарные, или ранние тканевые, формы. Спустя определенный
срок мерозоиты тканевых форм проникают в кровь и продолжают свое
развитие в эритроцитах (эритроцитарная шизогония). В эритроцитах
наряду с бесполыми формами образуются также половые (гаметоциты, га-
монты). В цикле развития некоторых видов малярийных паразитов,
помимо преэритроцитарных стадий, предполагается также наличие пара-
эритроцитарных, или поздних тканевых, стадий, их развитие может идти
параллельно эритроцитарной шизогонии. Эти тканевые формы в
дальнейшем также образуют мерозоиты, способные проникать в кровь и
развиваться в эритроцитах.
Для определения полного спектра действия исследуемого соединения
изучается его влияние в основном на бесполые эритроцитарные формы
(шизонты), тканевые формы и гамонты.
8.1. Изучение действия препаратов на бесполые кровяные стадии
Цыплят и кур заражают в основном теми же методами, которые
применяются для заражения певчих птиц, однако чем более крупных птиц берут
в опыт, тем большее количество крови с паразитами им надо вводить.
Кровью, полученной из сердца от 2—3 цыплят в возрасте 3—6 нед, можно
заразить партию в 50 цыплят.
Мышей заражают внугрибрюшинно или внутривенно. Для заражения
небольшого количества мышей кровь берут из хвоста, отрезав его кончик;
заражение больших партий мышей производится кровью, полученной из
сердца, а затем разведенной физиологическим раствором с таким
расчетом, чтобы в 0,2 мл вводимой жидкости содержалось примерно 1—2 млн
паразитов. Инфекция развивается также при заражении мышей под кожу,
однако при этом число паразитов нарастает не так бурно, а у части мышей
инфекция совсем не развивается.
Для поддержания штамма на цыплятах или грызунах им вводят кровь,
20 - 762
-609-

разведенную обычно 1:10 физиологическим раствором с добавлением к
нему лимоннокислого натрия.
При внутримышечном заражении молодые цыплята и мыши погибают
от инфекции почти в 100 % случаев. Часть более взрослых цыплят и кур
выживает.
У зараженных молодых цыплят при относительно высоком количестве
введенных плазмодиев наблюдается бурное развитие инфекции. Первых
паразитов обнаруживают на 4—6-й день после заражения, и птицы
погибают в разные сроки (через 1—4 нед в зависимости от условий опыта) с
большим содержанием паразитов в крови. Однако встречаются отдельные
особи, у которых инфекция развивается медленно, число паразитов не
достигает высокого уровня и через какой-то срок их совсем не удается
обнаружить.
У цыплят и кур течение инфекции существенно зависит от возраста
животных. Так, у зараженных внутримышечно цыплят в возрасте примерно
от 1 до 2-х месяцев отмечается бурное нарастание числа паразитов и птица
погибает спустя 2—4 нед после заражения. У более взрослых цыплят и кур
инфекция развивается медленнее, паразиты могут спонтанно исчезать из
периферической крови, а потом вновь обнаруживаться, подобно тому, как
это наблюдается у канареек. Чем старше цыплята, тем больший их
процент выживает. Однако паразиты в их крови сохраняются, что можно
доказать, как указывалось выше, положительной изодиагностической
пробой.
При внутривенном заражении молодых цыплят паразитов
обнаруживают в крови уже через 1—2 дня. Количество плазмодиев быстро нарастает и
птицы гибнут через 7—15 дней после заражения.
У мышей, зараженных внутрибрюшинно или внутривенно, инфекция
протекает остро и заканчивается смертью животных на 8—18-й день в
зависимости от числа введенных плазмодиев, линии животных и
особенностей штамма. При этом методе заражения первых паразитов можно
обнаружить в крови уже на следующий день, а при введении их под кожу — на
4—5-й день после заражения.
Изучаемое вещество вводят либо тотчас после заражения животных
(иногда до него), либо в период обнаружения паразитов в периферической
крови. Эффективность препарата устанавливается при применении ряда
критериев, основанных на различии в сроках появления плазмодиев в
крови и интенсивности их размножения. Для этой цели мазки крови, взятые
от подопытных животных и окрашенные по Романовскому, подвергают
микроскопическому исследованию с иммерсионной системой.
Количество паразитов в крови, или "уровень паразитемии" оценивают
по шкале Мошковского (см. таблицу). Число паразитов обозначается в
баллах от 1 до 7, выражающих логарифм числа паразитов при основании 5
или знаками от ((+)) до +++++. Шкала построена для условного
препарата, соответствующего 625 полям зрения, со средним содержанием по 125
эритроцитов в поле зрения.
Активность препаратов устанавливают на основании ряда критериев.
Одним из показателей является определение различий в длительности
инкубационного периода (в днях) у леченых животных по сравнению с
контрольными при достижении в обеих группах одинакового эффекта.
Условно длительность инкубационного периода для каждого подопытного
животного определяют числом дней, истекших с момента заражения до
появления в крови одного паразита в поле зрения (++). Учитывают срок
появления паразитов в крови у отдельных животных и определяют средний по-
-610-

Таблица 1. Условные обозначения содержания паразитов в крови
Балл
1
2
3
4
5
6
7
Обозначение
((+))
(+)
+
++
+++
++++
+++++
Число паразитов
По полям зрения
1 паразит в 125 полях зрения
1 паразит в 25 полях зрения
1 паразит в 5 полях зрения
1 паразит в 1 поле зрения
5 паразитов в 1 поле зрения
25 паразитов в ] поле зрения
Поражены почти все эритроциты, в поле
зрения много свободных паразитов
В условном препарате
5
52 = 25
53 = 125
54 = 625
55 = 3 125
56= 15 625
57 ~ 70 000
казатель длительности инкубационного периода для каждой группы. Этот
критерий назван Ш. Д. Мошковским сопоставлением активности "по
горизонтали".
Другим критерием — сравнением "по вертикали" — является оценка
на основании показателя числа паразитов в крови в определенный день
от момента заражения цыплят. Как и в первом случае, определяют
среднее для каждой группы, исходя из данных, полученных для каждого
животного. Количество плазмодиев измеряют в баллах или условных
крестах.
Третьим критерием является сравнение среднего количества плазмодиев
в крови на протяжении срока, истекшего со следующих суток после
прекращения лечения до периода падения числа паразитов.
Может представить интерес также изучение кинетических кривых
изменения содержания паразитов в крови в процессе всего развития инфекции,
определение характера кривых при заражении животных разным
количеством паразитов и изменение этих кривых под влиянием лекарственных
препаратов в зависимости от доз и сроков введения.
С целью определения степени активности исследуемого препарата в том
же опыте параллельно с ним изучается активность препарата, принятого за
стандарт. В качестве стандарта может быть взят хорошо изученный
противомалярийный препарат.
На основании сопоставления величины доз изучаемого и стандартного
препаратов, вызывающих одно и то же торможение в развитии паразитов,
судят о степени активности изучаемого соединения.
8.2. Изучение действия препаратов на тканевые формы паразитов
Модель для изучения действия препарата на тканевые формы могут
служить зараженные малярией животные, у которых обнаруживаются экзо-
эритроцитарные стадии плазмодия. Наиболее широко распространенной
моделью для данных исследований являются цыплята, экспериментально
зараженные спорозоитами P. gallinaceum. В мазках из головного мозга
цыплят удается обнаружить через несколько дней после введения им споро-
зоитов тканевые формы паразита почти в 100 % случаев. Они имеют вид
вытянутых протоплазматических тяжей (1—15 m и более в длину) с
большим количеством ядер внутри. Такие образования заполняют на
небольшом участке просвет капилляра.
20*
-611 -

Заражение цыплят производят взвесью спорозоитов в физиологическом
растворе или через укус зараженного комара.
Культуру комаров Aedes aegypti, переносчиков P. gallinaceum, легко
поддерживать в лабораторных условиях. Самки комара, напившиеся кровью,
через 4—5 сут откладывают яйца на влажный субстрат — влажную
фильтровальную бумагу. Яйца закладывают в кристаллизаторы с
дистиллированной водой и добавляют органические вещества — рис, дафний и др.,
являющиеся кормом для личинок. Из яиц вылупляются личинки, которые
после линек превращаются в куколки. Куколок вылавливают, переносят в
небольшие сосуды с водой, которые помещают в марлевые садки. Через
1—2 дня вылетают окрыленные комары. Оптимальные условия для
содержания комаров: температура 25—26 "С, влажность 70—80 %.
Вылетевшие из куколок комары начинают пить кровь лишь через
несколько дней. Обычно комаров кормят, помещая на садок ватку,
смоченную 4 % раствором глюкозы. Яйца комаров можно хранить длительный
срок в высушенном виде при комнатной температуре без доступа света, а
затем по мере необходимости получать из них культуру комара.
За 10—12 дней до постановки намеченного опыта комаров заражают на
птице с паразитами в крови. Предварительно комаров заставляют голодать
не менее суток. Напившихся на птице комаров отсаживают в отдельный
садок, который содержат при указанных выше условиях температуры и
влажности. Спустя несколько дней вскрывают 1—2 комаров, чтобы
установить степень их зараженности. На 4—6-е сутки в желудках комаров
обнаруживаются цисты, а на 8—10-й день в слюнных железах отмечается
наличие спорозоитов.
С целью изучения действия препаратов на тканевые формы плазмодия
часто применяется методика заражения цыплят взвесью спорозоитов.
Комаров со зрелыми спорозоитами вылавливают из садка в пробирки,
оглушают парами эфира, обрывают у них ножки, отделяют грудку со
слюнными железами и растирают в ступке с небольшим количеством
физиологического раствора (0,5 мл). Желательно добавлять равное количество
нормальной куриной сыворотки. Полученную взвесь спорозоитов разводят
физиологическим раствором и вводят цыпленку по 0,2 мл жидкости из
расчета 0,5 или 1 комар на птицу. Заражение производят в грудную мышцу
цыпленка, иногда в вену.
При отсутствии культуры комаров действие препаратов на тканевые
формы может изучаться на цыплятах, зараженных суспензией из растертых
органов, в которых при предварительном микроскопическом исследовании
установлено наличие тканевых форм. Органы (селезенка, мозг, печень), в
которых содержится большое количество экзоэритроцитарных паразитов,
тщательно рстирают в физиологическом растворе, после чего тканевую
взвесь вводят внутримышечно подопытным цыплятам. Можно применять
также внутрибрюшинное заражение.
При заражении спорозоитами тканевые формы в мозгу птиц
обнаруживаются примерно на 10-е сутки, иногда — несколько раньше. Наличие
паразитов в периферической крови отмечается на 7—9-й день. Часть цыплят
погибает через 10—20 дней после заражения при наличии разного
количества экзоэритроцитарных и эритроцитарных форм, часть же птиц живет
более длительный срок; в мозгу и крови таких цыплят паразиты иногда не
обнаруживаются в течение длительного срока. Однако затем птица может
погибнуть ввиду содержания большого количества тканевых паразитов в
капиллярах мозга.
При изучении действия препаратов на тканевые формы необходимо ус-
-612-

танавливать наличие или отсутствие этих форм в разных фазах инфекции.
С этой целью применяют прижизненную пункцию мозга цыпленка.
Шприцем с толстой иглой делают укол в область больших полушарий,
насасывают в иглу некоторое количество мозгового вещества, делают из него
толстый мазок на предметном стекле, фиксируют его в 96 % спирте и
окрашивают по Романовскому. Цыпленок может перенести несколько
прижизненных пункций.
Тканевые формы в капиллярах мозга обнаруживаются большей частью
в период наличия эритроцитарных форм в крови и являются, таким
образом, поздними, или параэритроцитарными, формами. Ранние тканевые
формы указанным путем обнаружить, как правило, не удается; их
исследуют на гистологических срезах методами, которые для массовых опытов при
изучении активности соединений не применяются.
Изучаемые препараты вводят зараженным цыплятам per os, подкожно,
внутривенно. Длительность курса варьирует в зависимости от задач опыта.
Для изучения способности препарата воздействовать на спорозоитов его
следует вводить птице в течение некоторого времени до ее заражения с
таким расчетом, чтобы ко дню введения спорозоитов концентрация
препарата в организме цыпленка достигла достаточно высокого уровня. При
изучении действия препарата на ранние тканевые формы его вводят за
несколько часов или вскоре после инъекции спорозоитов и далее в течение
3—5 дней. Если нет необходимости уточнять действие препарата на ранние
или поздние тканевые формы, курс лечения можно продлить до 2 нед.
Для микроскопического исследования кровь берут у цыплят ежедневно,
начиная примерно с 7-го дня после заражения; пункцию мозга производят
с 8—10-го дня 3—4 раза на протяжении инфекции.
Если в течение 1—2 мес наблюдения в мазках из крови и мозга цыплят
обнаружить паразитов не удается, делают вывод, что препарат оказал
влияние на тканевые формы и предохранил птиц от развития инфекции.
8.3. Изучение гамотропного действия препаратов
В эпидемиологии малярии большое значение имеют препараты,
которые благодаря действию на половые формы малярийного паразита
снижают заражаемость комаров.
Для изучения гамотропных свойств препаратов применяются
следующие методы:
1) в опыте in vitro определяется способность препарата тормозить экс-
флагелляцию (образование микрогамет);
2) действие на гамонты устанавливается на основании подсчета
количества половых форм до и после введения зараженной птице препарата;
3) гамонтоцидное действие определяется по заражаемости комаров,
кормленных на птице, получавшей препарат.
8.3.1. Изучение дисфлагеллирующего действия
Процесс эксфлагелляции, который происходит в организме комара,
можно наблюдать in vitro при исследовании капли крови под
микроскопом. Описанная ниже методика позволяет определять способность
препарата тормозить эксфлагелляцию (дисфлагеллирующее действие препарата).
У зараженной птицы (чиж, чечетка, канарейка, цыпленок) исследуют
-613 -

кровь в период наличия паразитов. При этом наряду с бесполыми
формами, как правило, обнаруживается и некоторое количество половых форм.
В пастеровской пипетке смешивают каплю крови с каплей
лимоннокислого натрия (3,8 %) и физиологического раствора. Жидкость, помещенную
между покровными стеклами, исследуют во влажной камере под
иммерсионной системой микроскопа при температуре не ниже 25 °С.
В крови зараженной птицы, содержащей паразитов, уже через 5—
10 мин можно наблюдать микрогаметы в виде подвижных жгутов,
прикрепленных к остаточному телу. Жгуты отчетливо видны при несколько
затемненном поле зрения. Обычно наблюдаются в поле зрения 2—3 эксфла-
геллирующих формы.
Перед введением препарата устанавливают число этих форм у каждой
птицы, затем вводят изучаемое вещество и вновь исследуют кровь через
6—24—48 ч. Препарат, обладающий дисфлагеллирующим действием,
тормозит процесс эксфлагелляции в течение 1—2 дней (гамостатическое
действие) и эксфлагеллирующие гаметы не удается наблюдать в течение этого
срока. Параллельно необходимо проводить контрольные исследования с
кровью птиц, не получавших препарат.
8.3.2. Влияние препарата на число гаметоцитов в крови
В крови зараженных птиц обнаруживаются бесполые и половые формы
паразита в разных стадиях развития. В опыт подбирают птиц с примерно
одинаковым общим количеством паразитов в крови и подсчитывают у них
процентное содержание половых форм (мужских и женских) по
отношению к эритроцитам. Препарат вводят однократно. Снижение численности
гамонтов через 24—48 ч после лечения указывает на активность препарата.
8.3.3. Влияние на заражаемость комаров
Птице в период значительного содержания паразитов в крови вводят
однократно определенную дозу исследуемого препарата. Через 12—24 ч
птицу подсаживают к комарам, предварительно голодавшим в течение
суток. Напившихся комаров отсаживают в отдельный садок и в дальнейшем
кормят 4 % раствором глюкозы. Контрольную партию комаров кормят на
той же птице до введения ей препарата. Для определения зараженности
комаров вскрывают на 6—10-е сутки после кормления и определяют
наличие цист в желудках и спорозоитов в слюнных железах, отсутствие цист
или задержка в слюнных железах спорозоитов. Отсутствие цист или
задержка в их развитии у комаров опытной группы при нормальном
половом созревании паразитов в контрольной группе указывает на активность
препарата.
Л итература
1. Астафьев Б. А., Яроцкий Л. С, Лебедева М. Н. Экспериментальные модели парази-
тозов. - М.: Наука, 1989. - С. 278.
2. Кожевников П. В., Добротворская Р. В., Латышев Н. И. Учение о кожном лейшма-
ниозе. —М. — С. 370.
3. Бакулина Н. А., Краева Э. Л. Микробиология. — М.: Медицина, 1980. — С. 444.
4. Павлова Е. А. Среда для культивирования простейших кишечника // Мед.
паразитология. - 1938. - VII, в. 2. - С. 224-227.
- 614 -

5. Першин Г. Н. Методы экспериментальной химиотерапии. — М.: Медицина, 1971. —
С. 536.
6. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых
фармакологических веществ. — М.: Ремедиум, 2000. — С. 297—308.
7. Diamond L. S. The establishmtnt of variobs Trichomanads of animals and man in axenic
cultures // J. parasitol. — 1957. - Vol. 43, 4. — P. 488-490.
8. Diamond L. S. et al. A new mtdicem for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica
and other Entamoeba // Trans. R. S. Trop. Med. Hyg. — 1978. — Vol. 72. - P. 431 —
432.
9. Keister D. B. Axenis cultivation of Giardia lamlia in TYI-S-33 mtdium supplemented with
bile // Tran. R. S. Tropp. Med. Hyg. - 1983. Vol. 7. - P. 487-488.
10. Levine N. D. et al. A new revised classifcation of the Protosoa. // J. Protosoa. — 1890. —
Vol. 27. - P. 37-58.
Методические указания по изучению антигельминтной
активности фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н., проф. Б. А.
Астафьев; д. м. н., проф. М. Н. Лебедева; член-корр.
РАМН, проф. Т. А. Гуськова; к. б. н. Н. Л. Вере-
тенникова; к. м. н. Г. А. Гицу; к. б. н.
В. И. Джабарова; к. м. н. Ф. П. Коваленко;
к. б. н. Л. В. Федянина; к. м. н. Д. Г. Баяндина;
Е. И. Самочатова
Введение
Поиск новых антигельминтиков и доклиническая разработка новых
методов химиотерапии гельминтозов ведутся, как правило, на лабораторных
моделях животных, экспериментально зараженных гельминтозами,
имеющими медицинское или ветеринарное значение или близких к ним по
систематическому положению возбудителей и особенностям течения. Наличие
адекватных моделей гельминтозов позволяет решить ряд важных
теоретических и практических вопросов и открывает перспективы выявления
новых химиотерапевтических средств, а в ряде случаев — и разработки
наиболее эффективных схем их назначения. Основной целью скрининга
является выявление новых активных соединений, превосходящих по своей
эффективности, широте применения и токсикологическим показателям уже
применяемые на практике или же позволяющих снизить затраты на их
производство.
Новые противопаразитарные препараты должны удовлетворять всем
требованиям медицинской или ветеринарной практики, а именно:
1) низкая токсичность с отсутствием побочного действия на организм
хозяина;
2) высокая эффективность специфического действия;
3) активность в отношении разных стадий развития гельминта;
4) простота синтеза, доступность исходного сырья, химическая
устойчивость препарата;
5) дешевизна и удобство для массового применения.
Вещества, предлагаемые для практического применения, должны пре-
-615-

восходить уже апробированные на практике главным образом в
эффективности и переносимости.
Для успешного решения проблем химиотерапии и профилактики
гельминтозов желательно иметь препараты с лечебным и профилактическим
(овицидным и/или ларвицидным) действием.
Настоящие методические указания разработаны с целью унификации
методов моделирования гельминтозов и экспериментального
доклинического изучения новых антигельминтных препаратов, обеспечивающих
получение сопоставимых данных и объективных выводов.
1. Общая часть
1.1. Обследование лабораторных животных на зараженность
гельминтозами
При экспериментальных исследованиях необходимо предварительное
обследование животных на зараженность гельминтозами, а также и в ходе
эксперимента. С целью диагностики кишечных гельминтозов применяют
исследование нативного мазка по методам Като, флотации или осаждения.
Для исследования по методу Като 100 мг фекалий без добавления воды
или какой-либо другой жидкости наносят на предметное стекло,
покрывают специально обработанной полоской целлофана и придавливают на
предметном стекле резиновой пробкой ровным слоем, но так, чтобы
фекалии не выдавливались из-под целлофана. Из гидрофильного целлофана
толщиной 22 мкм готовят полоски площадью 8,2 см2 и обрабатывают их
путем погружения в раствор следующего состава: 6 мл 3 % водного
раствора малахитовой зелени, 500 мл глицерина, 500 мл 6 % раствора фенола.
Микроскопию мазка проводят через 30—40 мин после его приготовления.
При небольшом количестве яиц или личинок гельминтов в фекалиях
прибегают к методам обогащения. Для исследования яиц большинства
видов гельминтов применяют метод флотации по Фюллеборну.
Флотационный раствор готовят следующим образом: 400 г соли растворяют в 1 л
воды, доводят до кипения, остужают и фильтруют через вату или марлю в
отдельный сосуд. Фекалии тщательно размешивают в насыщенном растворе
поваренной соли в стаканчике объемом 10—20 мл и с помощью
проволочной петли удаляют всплывшие частицы клетчатки. Затем на стаканчик
накладывают обезжиренное предметное стекло, доливают насыщенный
раствор поваренной соли доверху так, чтобы мениск жидкости соприкасался с
поверхностью предметного стекла. Через 25—30 мин стекло быстрым
движением снимают, переворачивают нижней поверхностью вверх и микро-
скопируют. Этот метод пригоден для диагностики всех гельминтозов
пищеварительного тракта, кроме трематодозов, так как удельный вес яиц
трематод превышает таковой флотационной жидкости, вследствие чего
они выпадают в осадок.
Для исследования фекалий на наличие личинок гельминтов или для
обнаружения их в легких, крови, печени и других органах и тканях
применяют метод Бермана: фекалии или измельченные органы наносят на мелкую
металлическую сетку и помещают ее в стеклянную воронку, закрепленную
на штативе. На нижний конец воронки надевают резиновую трубку с
зажимом. В воронку наливают подогретую до 40 °С воду так, чтобы нижняя
часть сетки с фекалиями или частицами органов была погружена в воду.
Личинки выходят из исследуемого объекта и скапливаются в нижней части
-616-

резиновой трубки. Через 2—4 ч (при выделении личинок из фекалий) или
через сутки (при выделении личинок из тканей) открывают зажим и
спускают жидкость в пробирку. Личинки постепенно оседают на дно
пробирки. Процесс можно ускорить центрифугированием. Осадок микроскопи-
руют.
При некоторых цестодозах выделяются целые зрелые членики
гельминтов. Для их обнаружения фекалии промывают на мелком сите. Можно
применять также отстаивание осадка со сливанием поверхностного слоя
жидкости. После неоднократного повторения этой процедуры
просматривают осадок на темном фоне, на котором хорошо заметны членики цестод,
во всех случаях имеющие белый цвет.
1.2. Метод выделения яиц гельминтов из фекалий инвазированных
животных
Яйца гельминтов для заражения новой партии животных можно
получить двумя способами.
1. При вскрытии ранее зараженных животных выделяют и измельчают
паразитов. При этом среди яиц, выделившихся из матки гельминтов,
оказывается большое количество незрелых яиц.
2. Яйца выделяют из фекалий животных. Для этого отбирают
необходимое количество доноров. Животных помещают в клетки с сетчатым дном.
Фекалии ежедневно выбирают с поддонника клетки на который
предварительно помещают увлажненную фильтровальную бумагу. Фекалии можно
накапливать в течение нескольких дней, сохраняя их при температуре 4 °С.
Выделение яиц из фекалий осуществляют флотационно-центрифужным
методом. Фекалии тщательно размешивают в насыщенном растворе
поваренной соли и разливают по центрифужным пробиркам. Смесь
центрифугируют 5—7 мин при 1500 оборотах в минуту. Поверхностную пленку со
всплывшими яйцами снимают проволочной петлей, состоящей из
нескольких колец, и стряхивают в стаканчик с солевым раствором. После
этого содержимое пробирок опять размешивают с солевым раствором и
вновь центрифугируют. Эту манипуляцию повторяют несколько раз.
Собранные яйца отмывают водой 7—8 раз с последующим
центрифугированием, после чего собирают со дна пробирки с помощью шприца с иглой.
1.3. Методы культивирования яиц и личинок гельминтов
Для развития яиц большинства геогельминтов (аскаридаты, трихоцефа-
ляты, гангулетеракисы и др.) до инвазионной стадии их помещают на
часовое стекло в 1 % раствор соляной кислоты. Раствор заменяют через
каждые 2—3 дня. Часовые стекла хранят в чашках Петри в термостате при
температуре 25—30 "С. На дно чашек под часовое стекло помещается
увлажненная фильтровальная бумага. Чашку накрывают крышкой которую
каждые 2—3 сут рекомендуется открывать на 20—30 мин. В ходе
культивирования необходимо следить за количеством раствора в часовом стекле. По
мере его испарения добавляют 1 % НС1 до прежнего уровня.
Культивирование до инвазионной стадии свободноживущих личинок
нематод (трихостронгилят стронгилоидесов и др.) также проводят в чашках
Петри в смеси фекалий с почвой или активированным углем. Можно
применять для этой цели агар (1,5 г агара на 100 мл воды). Агар разливают в
-617-

большие чашки Петри и оставляют до застывания. На середину пластинки
агара наносят слои смеси из фекалий и активированного угля высотой 0,5
см. При этом слой агара по краям, по крайней мере на 3 см, должен
оставаться свободным. Вылупившиеся из яиц личинки выползают на агар и
проникают в него, скапливаясь по краю.
При культивировании личинок стронгилят, в том числе ниппостронги-
люса, наилучшие результаты получаются при использовании следующего
способа. Фекалии, содержащие достаточное количество яиц (2—7 или
более в поле зрения при 70-кратном увеличении) в тонком мазке,
увлажняют 0,1 % раствором салициламида в дехлорированной водопроводной
воде и смешивают в равных пропорциях с активированным углем. Салици-
ламид предотвращает развитие плесени. Эту массу слоем толщиной не
более 0,5 см наносят на круг фильтровальной бумаги, на 1 см отступя от
края. Фильтровальную бумагу со слоем фекалий помещают в чашку Петри
на круг из губки, слегка смоченной водой (вместо губки можно
использовать и другой влагоемкий материал). Чашки Петри закрывают крышками и
помещают в термостат при температуре 25—30 °С. Инвазионные личинки
скапливаются по краю фильтровальной бумаги, где их видно
невооруженным глазом. При появлении в копрокультуре плесени следует оросить ее
1 % раствором нистатина. По достижении личинками инвазионной стадии
края фильтровальной бумаги отрезают и помещают их для сбора личинок в
аппарат Бермана.
1.4. Методы заражения лабораторных животных гельминтами и введения
испытуемых препаратов
Инвазионный материал, необходимый для заражения лабораторных
животных, получают различными путями в зависимости от биологических
особенностей тех или иных видов гельминтов. Личинок биогельминтов,
находящихся в тканях промежуточных хозяев, скармливают животным
вместе с тканями промежуточного хозяина или выделяют из последних и
вводят в очищенном виде. Личинок стронгилят, в частности ниппострон-
гилюсов, вводят иглой шприца под кожу.
Взвесь инвазионных яиц гельминтов вводят животным в пищевод или
желудок с помощью шприца с канюлей.
Для дозирования инвазионного материала тщательно встряхивают
водную взвесь инвазионных яиц или личинок гельминтов. Из только что
перемешанной взвеси с помощью шприца с иглой берут несколько капель
взвеси и в 3 каплях, нанесенных на предметное стекло, подсчитывают
количество яиц или личинок. Определив среднее число яиц или личинок в 1
капле, умножают на число капель в 1 мл взвеси. После этого рассчитывают
количество взвеси, содержащее необходимое число инвазионного
материала. При подсчете учитывают только жизнеспособные яйца или личинки.
При отборе и дальнейшем изучении препаратов способы их введения
зависят от вида животного и характера инвазии. Обычно препараты вводят
в желудок или пищевод, иногда — внутримышечно, подкожно или
внутривенно.
Мышам, крысам, морским свинкам и другим мелким грызунам
препараты вводят в пищевод или желудок при помощи шприца с металлической
оливой на конце иглы или пипеткой с оплавленным концом. Мышам
можно вводить не более 0,3—0,5 мл, крысам и морским свинкам не более
1—2 мл жидкости на животное. Хорошо растворимые вещества мелким
-618 -

животным вводят в виде водных растворов, а нерастворимые — в виде
суспензии в жидком крахмальном геле.
При эхинококкозах испытание препаратов проводят и при внутрибрю-
шинном введении.
Для оценки эффективности препаратов используют сравнение доз,
вызывающих одинаковый эффект, или определяют эффект одинаковых доз
препаратов. Масса испытуемого вещества чаще выражается в весовых
соотношениях: г/кг или мг/кг массы тела животных. В отдельных случаях,
особенно при сравнении активности препаратов определенного ряда,
представляет интерес сравнить их в эквимолярных дозах в пересчете на
основание.
1.5. Методы учета антигелъминтной эффективности препаратов
Методы испытания препаратов и учета их эффективности различаются
в зависимости от вида животных, на которых проводят опыты, и
гельминтов, которыми они заражены. При первичном испытании препаратов на
крупных животных препараты вводят в различных дозах, используя для
каждой дозы по 2—3 животных.
Предварительно определяют токсичность препарата, для чего его вводят
в возрастающих дозах белым мышам или животным других видов.
Определяют ЛД,б, ЛД50, ЛД84 по Керберу для белых мышей, крыс, иногда собак.
На каждую дозу берут по 7—10 животных.
При использовании крупных животных применяют два метода учета
эффективности дегельминтизации. Первый метод заключается в подсчете
яиц, выделяющихся в определенных порциях фекалий до испытания
препарата и через различные сроки после него. В дальнейшем вычисляют
процент снижения выделения яиц. Одновременно ведут сбор фекалий, их
промывку и подсчет отошедших паразитов. В ряде случаев, особенно при
небольших размерах гельминтов, проследить за их элиминацией (отхожде-
нием) не представляется возможным, особенно в связи с их деформацией
или перевариванием в кишечнике хозяина. Перевариванию могут
способствовать и некоторые препараты (фенасал и др.). В таких случаях
эффективность терапии учитывают посредством подсчета яиц в фекалиях. При
некоторых цестодозах (тениидозы дифиллоботриозы) учитывают
отошедшие сколексы. В отдельных случаях можно вести контроль за
эффективностью действия препаратов по отсутствию выделения яиц или проглоттид
через сроки, необходимые для регенерации стробилы.
Для количественного определения яиц, выделяемых с фекалиями
подопытных животных, в мерную стеклянную колбочку наливают децинор-
мальный раствор едкого натрия до отметки "56 мл", затем добавляют
испражнения до тех пор, пока уровень жидкости не достигнет 60 мл. После
взбалтывания со стеклянными бусами забирают для исследования 0,075 мл
(1 каплю) смеси, помещают на предметное стекло, покрывают покровным
стеклом и микроскопируют при увеличении 56. Обнаруженное число яиц
умножают на 200 и получают количество яиц в 1 мл экскрементов.
Второй метод учета эффективности дегельминтизации заключается в
подсчете отошедших гельминтов, а при последующем вскрытии
пролеченных животных также и в подсчете оставшихся паразитов. Это наиболее
точный метод. После введения препарата ежедневно собирают отдельно от
каждого животного и промывают фекалии, подсчитывают число отшедших
гельминтов. Через 7—20 дней животных убивают и подсчитывают количе-
-619 -

ство паразитов в органах, в которых они локализуются (метод неполных
гельминтологических вскрытий, по К. И. Скрябину).
Эффективность препарата определяют по двум показателям, учитывают
количество или процент животных, полностью освободившихся от
гельминтов — экстенс-эффективность (ЭЭ), и число или процент отошедших
паразитов — интенс-эффективность (ИЭ). При определении
эффективности препаратов ЭЭ часто не учитывают, так как для получения
достоверных величин требуется значительное число животных. В связи с
трудностью или невозможностью подсчета отошедших паразитов для вычисления
ИЭ сравнивают среднее число гельминтов у вскрытых животных в
опытной и контрольной группах и определяют ИЭ (в %) по формуле:
ИЭ = 100 (К - О) / К,
где К — среднее число гельминтов в контрольной группе; О — среднее
число гельминтов в опытной группе
Для опытной и контрольной групп следует использовать животных
одного пола и возраста, содержащихся в одинаковых условиях. Следует
иметь в виду, что на заражаемость животных гельминтозами и
эффективность дегельминтизации может влиять сезон года. Время суток также
может оказывать существенное влияние на эффективность химиотерапии.
При отборе (скрининге) химических соединений или растительных
препаратов, обладающих антигельминтными свойствами, большая часть
испытуемых соединений оказывается неэффективной. В связи с этим при
первичном скрининге рекомендуется вводить препараты в максимально
переносимой дозе. При ИЭ ниже 50 % препарат характеризуют как
слабоэффективный. Если эффективность препарата свыше 50 %, а особенно
80—100 %, его рекомендуется испытать повторно из-за возможной
нестабильности результатов экспериментальной химиотерапии. Окончательную
эффективность устанавливают при проверке нескольких серий препарата
каждой — не менее чем на трех различных партиях животных. Определяют
среднюю эффективную дозу (ЕД50), а также ЕД16, ЕД84. Достоверность
результатов вычисляют методами биологической статистики.
Для получения более достоверных данных в опытные и контрольную
группы рекомендуется включать не менее 7—10 животных. С целью
экономии экспериментальных животных отобранные для дальнейших
исследований препараты следует испытывать на партиях по 100—150 животных,
имея для них одну контрольную группу. Часто у животных, получивших
неэффективный препарат, интенсивность инвазии бывает выше, чем у
контрольных животных, что обусловлено его токсическим действием с
последующим ослаблением иммунобиологических реакций организма
хозяина.
Широко применяемым в химиотерапии тестом определения качества
препаратов является их химиотерапевтический индекс (ХТИ), который
определяют путем сопоставления минимально эффективной и максимально
переносимой доз или средней эффективной и средней смертельной доз.
Однако препараты, обладающие антигельминтными свойствами и
незначительной острой токсичностью, при повторных введениях в небольших
дозах могут вызывать тяжелые побочные явления и хронические
поражения органов и систем. В связи с этим правильнее определять ХТИ путем
сравнения минимально эффективных доз и доз, не вызывающих
хронических изменений в организме хозяина. Рекомендуется определять химиоте-
рапевтические индексы, характеризующие степень безопасности препарата
относительно каждого конкретного повреждающего эффекта. Такие индек-
-620-

сы называют органомишеневыми терапевтическими индексами (ОМТИ).
ОМТИ вычисляется через отношение минимальной дозы, повреждающей
тот или иной орган (систему) экспериментального животного к
предполагаемой лечебной дозе этого препарата для человека.
Существенным недостатком проводимых фармакологических и
токсикологических исследований антигельминтиков является то, что они
выполняются только на здоровых животных. Однако известно, что
чувствительность к химическим препаратам как организма хозяина, так и
обитающих в нем гельминтов может существенно изменяться при развитии
патологических процессов.
2. Специальная часть
НЕМАТОДОЗЫ
2.1. Энтеробиоз
Энтеробиоз — гельминтоз из группы нематодозов, вызываемый
острицей Enterobius vermicularis, паразитирующей в кишечнике только человека,
особенно часто у детей, и проявляющийся нарушениями преимущественно
органов пищеварения, нервной системы, развитием иммунодефицитных
состояний. Характерен зуд в перианальной области.
В качестве моделей для изучения терапии энтеробиоза наиболее
целесообразно использовать белых мышей, у которых встречаются два вида ок-
сиурид: Aspiculuns tetraptera и Syphacia obvelata. Нередко в качестве
лабораторной модели используют также мышей или крыс, экспериментально
зараженных Ganguleterakis spumosa. Значительно более дорогой является
модель Passaluns ambiguus на кроликах.
При температуре 37 с в водопроводной воде яйца A. tetraptera и S.
obvelata развиваются до инвазионной стадии в течение соответственно 23—24 и
20—22 ч, но в изотоническом растворе натрия хлорида при той же
температуре сроки их развития удлиняются до 45—48 и 35—40 ч соответственно.
Эти условия содержания яиц не отражаются на их жизнеспособности.
В матке самок A. tetraptera зрелые яйца появляются на 10—12-й день
инвазии. Для оксиурид характерны 4 линьки. Две из них осуществляются в
яйце. Третью и четвертую личинка совершает в организме хозяина.
Личинки A. tetraptera третью линьку проходят на 3—4-й день инвазии, а
четвертую — на 6—7-й день. У личинок S. obvelata третья линька происходит на
2—3-й, четвертая — на 4—5-е сутки после заражения.
При экспериментальном заражении мышей аспикулурозом или
сифациозом им вводят per os no 100 инвазионных яиц. При изучении
активности против личинок оксиурид химиопрепараты следует вводить на 4—5-й
день после заражения аспикулурозом и на 3—4-й день — сифациозом. Для
исследования химиотерапевтической активности препаратов на
половозрелой стадии их вводят на 10—11-й день при использовании модели аспику-
луроза и на 8—9 день при сифациозе. Учет результатов химиотерапии
проводят через 3—4 сут после окончания курса лечения одновременно в
опытных и контрольной группах.
Гангулетеракидозом крыс хорошо заражаются белые мыши. Это
значительно облегчает и удешевляет работу. От инвазированных мышей
собирают яйца паразитов. Яйца культивируют при 27 °С в течение 14 дней. К
этому времени в них формируется подвижная личинка. Мышам вводят по 100
-621 -

инвазионных яиц G. spumosa, в результате чего у животных развивается по
40—95 нематод. Выделение яиц начинается через 25—38 дней после
заражения. Инвазия стойко сохраняется не менее 5 мес. Паразиты развиваются
примерно у 90 % животных. Для экспериментальной терапии
предварительно обследуют мышей и отбирают выделяющих яйца гангулетеракиса.
Испытание препаратов начинают с 40-го дня после заражения мышей.
Препараты вводят в течение 1—3 дней. Для предварительного отбора
достаточно использовать по 8—10 животных на каждый препарат. Учет
эффективности через 3—4 сут одновременно в опытных и контрольной группах.
Яйца пассалуруса (P. ambiguus) становятся инвазионными при
температуре 35—36 °С через 7—8 сут. В кишечнике кроликов паразит достигает
половозрелой стадии на 17—24-е сутки. Однако препатентный период (до
момента выползания самок из ануса) длится 56—67 сут. Для изучения ан-
тигельминтного действия препаратов на личиночные стадии пассалуруса
химиотерапию следует проводить на 10—14-е сутки, на половозрелую — на
25—27-е сутки.
2.2. Аскаридоз
Аскаридоз — один из наиболее распространенных в мире гельминтозов
человека с выраженной аллергической симптоматикой в острой
(миграционной) стадии заболевания (при первичном заражении и особенно в
случаях суперинвазии) с преобладанием явлений со стороны органов
дыхания, кроветворения, а в стадии паразитирования гельминтов в тонкой
кишке — со стороны органов пищеварения нервной и других систем.
Возбудитель аскарида (Ascans lumbricoides Linnaeus, 1758) — строго
специфичный паразит человека. У животных A. lumbricoides может паразитировать
лишь как транзитный паразит, т. е. на личиночной (миграционной) стадии
никогда не достигая следующей кишечной стадии. Воспроизводство на
лабораторных моделях личиночной стадии аскариды может представлять
большой интерес для исследователей и быть весьма информативным. В
связи со значительными трудностями получения инвазионного материала
экспериментаторы часто предпочитают использовать близкий вид — As-
canssuum, паразитирующий у свиньи.
Аскарид свиньи обычно получают с мясокомбината. В лабораторных
условиях (обязательно только в вытяжном шкафу, так как возможны
аллергические реакции на испарения аскарид, вплоть до анафилактического
шока) вскрывают самок аскарид. Отсекают периферический отдел матки с
двумя ее рогами, каждый размером до 1,5—2 см, выдавливают из матки
яйца гельминта на часовое стекло диаметром 8,0 см. В него наливают 1 %
раствор соляной кислоты (для профилактики развития посторонней
микрофлоры, особенно грибковой) так, чтобы культура яиц слегка была им
прикрыта, и помещают во влажную камеру в чашку Петри (см. раздел 1.3).
Чашку помещают в термостат при температуре 30 "С не менее чем на 18
дней. С целью аэрации культуры яиц крышку чашки Петри необходимо
ежедневно приоткрывать, а содержимое часового стекла перемешивать
вращением вокруг вертикальной оси или покачиванием. Через этот срок
яйца достигают инвазионной стадии. С целью контроля за инвазионно-
стью яиц через 8 сут после экспериментального заражения убивают 3
белых мышей. Их легкие мелко иссекают ножницами и с помощью метода
Бермана (см. раздел 1.1) определяют наличие мигрировавших в легкие
личинок аскарид.
-622-

Для экспериментального заражения обычно используют белых мышей,
реже крыс или морских свинок. Личинки мигрируют в тканях печени, а
затем легких в течение 10—16 дней. В связи с этим при испытании анти-
гельминтного действия препаратов на личиночной стадии A. lumbricoides
или A. suum завершить исследование рекомендуется в течение первых 9
дней после заражения. Для этого животных лечат на 6—7-е сутки инвазии,
вскрывают — на 9-е сутки.
Моделями кишечной стадии аскаридоза могут служить кошки,
зараженные Тохосага mystax, или собаки, зараженные Т. cams. Используют
спонтанно зараженных животных, которых отбирают при копрологическом
обследовании. Обычно лучше заражены молодые животные. Результаты
испытания препаратов учитывают путем сбора отошедших нематод, по
динамике выделения яиц или посредством подсчета обнаруженных при
вскрытии животных живых паразитов.
2.3. Токсокарозы — ларвальные нематподозы человека
У человека нередко возникают заболевания, которые относят к группе
болезней, вызываемых мигрирующими личинками гельминтов животных
— larva migrans. В условиях умеренного климата наиболее часто
возбудителями этих болезней являются нематоды собак и кошек — Тохосага cams и
Тохосага mystax. Эти заболевания по своему течению весьма напоминают
миграционную фазу аскаридоза с поражением тех же органов и систем:
легких, печени, кроветворных и других органов, а также в отличие от
аскаридоза головного мозга человека.
Половозрелые токсокары локализуются в тонкой кишке собак и кошек,
с фекалиями которых во внешнюю среду выделяются яйца гельминтов.
После созревания во внешней среде они становятся инвазионными в том
числе и для человека.
Яйца токсокар собирают от инвазированных животных. При
температуре 25—30 °С (в условиях термостата) и достаточной влажности они
становятся инвазионными в течение не менее 14 дней. Животных (обычно
лабораторных мышей) заражают по 50—100 яиц с помощью шприца с
канюлей, которую вводят в пищевод. Испытание препаратов проводят в
первые 5 дней после заражения. Учет результатов лечения производят через
2—3 сут после окончания лечения. Для этого подсчитывают количество
личинок токсокар в головном мозге и легких подопытных и контрольных
животных. Указанные органы мелко иссекают ножницами и исследуют но
методу Бермана (см. 1.1).
2.4. Трихоцефалез
Трихоцефалез — один из наиболее распространенных в мире кишечных
гельминтозов человека. Возбудитель — власоглав Trichocephalus trichiurus
[Linnaeus, 1771; Blanchard, 1895] — строго специфичный гельминт
человека, паразитирующий преимущественно в слепой кишке. Заболевание
характеризуется хроническим течением с преобладающим поражением
пищеварительного тракта и нервной системы.
Представители рода Trichocephalus Schrank, 1788 встречаются у ряда
животных, но наиболее доступной и удобной лабораторной моделью
являются белые мыши, зараженные Т. muris Schrank, 1788. Первоначально модель
-623-

воспроизводится при сборе нематод от домовых мышей, которые наиболее
интенсивно заражены в районах с теплым и влажным климатом, в
частности на Кавказе. Яйца трихоцефалюсов от лабораторных мышей получают
флотационно-центрифужным методом или из самок нематод, извлеченных
из слепой кишки инвазированных животных. Для развития яиц гельминта
до инвазионной стадии их помещают в термостат при температуре 30 °С.
Методика описана в разделе 1.3. К 16—20-му дню подвижными становятся
большинство личинок, однако инвазионной стадии они достигают лишь
через 5—10 дней после этого. К этому моменту на головном конце
становится заметным втянутый маленький хитиновый стилет, играющий
важную роль в пенетрации слизистой оболочки кишки хозяина.
Паразит начинает откладывать яйца на 36—43-й день инвазии. Период
выделения яиц длится в среднем 45 дней (31—56), а продолжительность
жизни мышиного власоглава составляет в среднем 88,3 дня (от 76 до 100).
При инвазионной дозе 50 яиц развивается от 8 до 45 особей власоглава,
при дозе 100 яиц наблюдается значительный падеж мышей к моменту
достижения гельминтом половозрелой стадии.
Оптимальными являются лабораторные модели с использованием
мышей-самцов линии DBA/2 или AKR/y, что обусловлено их высокой
восприимчивостью к этой инвазии и незначительным разбросом в группах по
ее интенсивности. Это позволяет получать более точные результаты
исследований.
При массовом отборе препаратов целесообразно каждый из них вводить
8—10 животным. Для экспериментальной терапии используют мышей с
момента выделения яиц и в течение последующих 10 дней. Препараты
вводят в течение 2—4 дней подряд. Вскрытие животных опытных и
контрольной групп производят через 5—7 дней после окончания курса
лечения.
При оценке результатов исследований следует учитывать, что трихоце-
фалюсы у мышей значительно более устойчивы к антигельминтикам, чем
паразитирующий у человека Т. trichiurus.
2.5. Анкилостомидозы и трихостронгилидозы
К анкилостомидозам человека относятся анкилостомоз и некатороз,
возбудителями которых являются Ancylostoma duodenale и Necator amenra-
nus. Анкилостомозы и антропонозы характеризуются хроническим
течением, прогрессирующей слабостью, головокружением, слабостью, железоде-
фицитной анемией, отеками. Половозрелые гельминты локализуются в
двенадцатиперстной кишке и в верхнем отделе тощей кишки.
Трихостронгилидозы — зоонозы. Заболевание человека вызывают 13
видов трихостронгилид, среди которых наибольшее значение имеет Tri-
chostrongylus colubriformis. Трихостронгилидозы характеризуются
хроническим течением с преобладающим поражением пищеварительного тракта,
признаками аллергического поражения кроветворных органов печени,
кишечника и др. Трихостронгилиды у человека паразитируют в тонкой
кишке, преимущественно в двенадцатиперстной, проникая головным концом в
поверхностные слои слизистой оболочки.
Лабораторной моделью анкилостомидозов человека являются собаки и
кошки, зараженные Ancylostoma camnum и Uncinaria stenocephala. Эти
модели практически неприемлемы для скрининга антигельминтиков. К тому же
кошки недостаточно восприимчивы к заражению U. Stenocephala. В связи с
-624-

этим в экспериментальных лабораториях широко применяются модели нип-
постронгилеза на разных видах лабораторных животных. Возбудителем нип-
постронгилеза является Nippostrongylus brasiliensis.
Инвазия N. brasiliensis происходит посредством проникновения
инвазионной личинки через рот или кожу. Независимо от способа заражения
личинка попадает в малый круг кровообращения, затем в легкие (через 14—
20 ч). Через 35—40 ч после проникновения паразита в организм хозяина
личинка проходит 3-ю линьку и переходит в 4-ю стадию. Она длится 12—
15 ч. Через 50—60 ч после заражения личинка мигрирует из легких в
пищеварительный тракт, где через 90—108 ч после заражения гельминт
претерпевает 4-ю линьку. На половозрелой стадии он локализуется в тонкой
кишке.
Для поддержания лабораторного штамма возбудителя ниппостронгилеза
используют крысят массой 40—50 г, которым подкожно вводят по 500 или
1000 инвазионных личинок в 0,25—0,5 мл 0,7 % раствора натрия хлорида.
Заражение производят без антибиотиков, так как они снижают
интенсивность инвазии. На 6—7-й день после заражения крысята начинают
выделять яйца ниппостронгилюса. Их количество быстро возрастает к 10-му
дню, а с 14—15-го дня после заражения начинается постепенное
уменьшение выделения яиц. Период яйцепродукции длится 67—91 день.
Метод культивирования яиц и личинок ниппостронгилюса описан в
разделе 1.3. Собранные личинки могут сохранять инвазивность
(заражающую способность) в течение 10-15 дней при температуре 18—20 "С в
тонком слое (2—-3 мм) 0,7 % раствора натрия хлорида. Повышение
температуры значительно сокращает срок их жизни. Для постоянного поддержания
штамма N. brasiliensis и получения достаточного количества инвазионных
личинок каждые 10 дней заражают по 10—12 крысят и получают от них до
90 000 яиц в сутки. Для экспериментальной терапии можно использовать
белых мышей.
Крысы значительно лучше заражаются ниппостронгилезом, чем мыши.
Препатентный период гельминта у крыс длится 4—8 сут, у мышей — 6—9
сут. С увеличением возраста животных длительность его возрастает.
Плохо заражаются ниппостронгилезом золотистый хомяк, хлопковая
крыса, не заражается морская свинка.
Белым мышам массой 10—12 г подкожно вводят по 500 инвазионных
личинок N. Brasiliensis. Число приживающихся нематод может
колебаться от 1 до 480 экземпляров (чаще 50—100). Выделение яиц у них длится с
6-го по 54-й день после заражения. Максимальное число яиц выделяется
с 10-го по 18-й день, в среднем по 3000—9000 на 1 г фекалий.
При экспериментальной химиотерапии препараты вводят обычно
однократно при первичном отборе не менее чем 8—10 животным на каждый
препарат. Учет эффективности лечения проводят через 2 сут путем
сравнения числа нематод в опытной и контрольной группах.
У мышей и крысят подсчет половозрелых ниппостронгилюсов можно
производить в компрессории под бинокулярной лупой.
2.6. Трихинеллез
Трихинеллез — остро протекающая болезнь человека и млекопитающих
с ярко выраженными аллергическими проявлениями, вызываемая
нематодой Trichinella spiralis. Вид включает три вариетета: Т. spiralis var. Spiralis, T.
spiralis var. Nativa, Т. spiralis var. Nelsoni. В 1972 г, от енота-полоскуна Рго-
- 625 -

cyor lotor на Северном Кавказе выделен новый вид Т. pseudospiralis.
Трихинеллы паразитируют в одном и том же хозяине в виде половозрелой
кишечной и личиночной мышечной стадий.
В качестве экспериментальной модели трихинеллеза используют в
основном мышей, крыс, значительно реже морских свинок. Лабораторных
животных заражают путем скармливания кусочков трихинеллезного мяса,
в котором предварительно с помощью компрессионного метода
подсчитывают количество личинок трихинелл. Животных можно заражать per os
личинками, вьщеленными из мышц путем переваривания мясного фарша
(80 г на 1 л переваривающей жидкости) в растворе, содержащем 0,5—1,0 %
пепсина, 0,7 % соляной кислоты и 0,9 % поваренной соли. Переваривание
производят в колбах, которые помещают в термостат при температуре 37—
38 "С на 8—18 ч. После этого переваривающую жидкость процеживают
через мельничный газ и собирают в пробирки. Подсчет личинок производят
путем определения их количества в единице объема взвеси.
Для заражения обычно используют белых мышей-самцов в возрасте
1,5 мес и массой 18—20 г. Для изучения противотрихинеллезной
активности препаратов рекомендуется заражать животных по 100—140
личинок на мышь. При этом используют следующие сроки проведения
экспериментальной терапии: 1—2-й день инвазии — действие на незрелых
кишечных трихинелл, 2—4-й день — на зрелых кишечных трихинелл, 7—
13-й день инвазии — на мигрирующих личинок, 21—25-й день инвазии
— на неинкапсулированных личинок, локализованных в
поперечнополосатых мышцах, 30—35-й день инвазии — на инкапсулированных
мышечных личинок.
Учет эффективности лечения на ранней стадии инвазии (1—4-е сутки)
осуществляют или путем подсчета числа кишечных трихинелл в стенке
тонкой кишки леченых и контрольных животных на 7—10-й день после
заражения или путем подсчета числа мышечных трихинелл не ранее чем
через 3—4 нед после окончания лечения.
ЦЕСТОДОЗЫ
У человека в кишечнике паразитирует ограниченное число видов цес-
тод, у которых слабо выражена видовая чувствительность к антигельмин-
тикам. Поэтому препараты, эффективные при одних цестодозах, обычно
также эффективны и при других. В связи с этим отбор новых противоцес-
тодных средств удобно проводить на белых мышах, зараженных
карликовым цепнем. Практика показала, что выявленные на этой модели анти-
гельминтики и их комбинации высокоэффективны не только при гимено-
лепидозе человека, но также и при тениаринхозе, тениозе, дифиллобот-
риозах.
2.7. Гименолепидоз карликовый
Гименолепидоз — гельминтоз человека, в основном детей и грызунов
(домовой мыши, крыс, суслика европейского, хомяка) с
преимущественным поражением пищеварительного тракта и иммунной системы.
Возбудитель — карликовый цепень Hymenolepis nana. Обитает в тонкой кишке
человека или грызунов, где проходит три стадии развития. Личиночную
(цистицеркоидную) стадию паразит проходит в ворсинках преимуществен-
-626 -

но верхней половины тонкой кишки. Эта стадия длится у мышей 4—6 сут.
Зрелый цистицеркоид выходит из ворсинки в просвет тонкой кишки, где
через стадию юного неполовозрелого паразита (препатентная стадия)
обычно на 12—14-е сутки достигает половозрелой (имагинальной) стадии
и начинает выделять инвазионные яйца. Вследствие отсутствия иммунной
защиты грызуны легко заражаются повторно (суперинвазия). Как правило,
повторное заражение происходит вследствие копрофагии. Однако
возможна также внутрикишечная аутосуперинвазия, т. е. без выхода яиц во
внешнюю среду. Суперинвазии осуществляются обычно на 13—15-е сутки после
первичного заражения. При суперинвазии, значительно реже при
первичном заражении мышей часть цистицеркоидов развивается в брыжеечных
лимфатических узлах. Длительность жизни карликового цепня первой
генерации в организме белой мыши составляет 15—16 сут.
Животных заражают по 100—200 инвазионных яиц Н. Nana, которые
вводят с помощью шприца со специальной канюлей непосредственно в
пищевод. Для этого на 13—15-й день инвазии цестод извлекают из тонкой
кишки экспериментально зараженных животных. Растирают их пестиком в
ступке или разрушают в небольшом количестве водопроводной воды
посредством неоднократного насасывания в шприц с насаженной на него
иглой-канюлей. Однако при втором способе происходит стимуляция инва-
зивной (заражающей) способности онкосфер карликового цепня, что
побуждает к срочному использованию их для заражения следующей партии
животных. При необходимости длительного сохранения яиц карликового
цепня высвобождение яиц из матки члеников цестод лучше отложить до
дня следующего заражения.
Цестоды Н. папа рекомендуется хранить в водопроводной воде при
температуре 4°С. Каждые 5—7 сут воду в стаканчике, где хранятся цестоды,
рекомендуется менять. Максимальный срок сохранения инвазивности
онкосфер в этих условиях составляет около 30 сут.
Гименолепидозом хорошо заражаются аутобредные белые мыши,
однако интенсивность их инвазии при совершенно одинаковых условиях
заражения и содержания может резко колебаться, что несколько осложняет
оценку результатов экспериментов, в том числе по скринингу противоцес-
тодных средств. Моделирование гименолепидоза на инбредных мышах
позволяет получить более четкие результаты на меньшем количестве
животных, но имеет свои особенности. Наиболее высокой восприимчивостью к
первичному заражению яйцами Н. папа обладают гибридные мыши
F,CBA/Lac C57B1/6) и мыши линии BALB/c, а наименьшей — С57В1/6 и
CC57W. Наиболее благоприятные условия для развития суперинвазии
имеют место у мышей линий А/Не и CBA/Lac, наименее — линии С57В1/6 и
DBA/2.
Необходимо остановиться еще на одной детали, имеющей практическое
значение, — на способе подсчета числа цистицеркоидов в ворсинках
тонкой кишки. Для этого через 96 ч после заражения животных убивают.
Полностью извлеченную тонкую кишку помещают в чашку Петри с таким
объемом водопроводной воды, чтобы покрыть всю кишку, и помещают в
холодильник на 48 ч (при 4 °С). Затем кишку вскрывают продольным
разрезом ножницами, тщательно прополаскивают в ванночке с
водопроводной водой и помещают для просветления на 24 ч в 50 % раствор глицерина
(при 4°С). После этого можно подсчитывать число цистицеркоидов под
микроскопом при увеличении 7x8. Кишка, обработанная по этому
способу, может сохраняться при описанных выше условиях в течение 10 сут и
более без существенного влияния на результаты подсчета цистицеркоидов.
-627 -

Все препараты, оказавшиеся эффективными при экспериментальном
гименолепидозе, эффективны также и при других кишечных цестодозах
человека и экспериментальных животных.
2.8. Цистицеркоз
Цистицеркоз у человека развивается или как осложнение тениоза
(возбудитель — свиной цепень, Taema solium Linnaeus, 1758), или вследствие
попадания в пищеварительный тракт с пищей, или через грязные руки он-
косфер свиного цепня Чаще всего поражает головной мозг.
Изучение терапии цистицеркоза можно проводить на свиньях и
собаках, зараженных Cysticercus cellulosae. Заражение происходит при
скармливании зрелых члеников, полученных от больного тениозом человека.
Намного более доступными и безопасными для экспериментаторов моделями
являются мыши и крысы, зараженные яйцами цестоды кошек — Hydati-
gera taeniaeformis.
Яйцами Н. taeniaeformis хорошо заражаются белые мыши и крысы в
возрасте до одного месяца (3,5—4-недельного возраста), у которых в печени
развивается цистицерк, или стробилоцерк, — Strobilocercus fasciolans.
Животных заражают по 25—50 яиц Н. taeniaeformis. К 4-му дню инвазии стро-
билоцерки в печени грызунов представляют округлое скопление делящихся
паренхиматозных клеток, лежащих между печеночными балками. Через
7 дней формируются пузырьки стробилоцерков около 0,3—0,5 мм в
диаметре. На 31-й день инвазии внутри пузырей локализуются сформированные
головки, которые начинают выворачиваться наружу. Через 50 дней инвазии
цисты достигают размера 8—10 мм в диаметре; капсулы выпячиваются за
пределы печени; полностью сформированные стробилоцерки с вывернутыми
головками связаны с пузырями короткими тонкими шейками. Сколекс
вооружен крупными присосками и хоботком с крючьями такой же формы и
размера, как у взрослых цестод. Пузыри сохраняют жизнеспособность более
4 мес. Однако при интенсивных инвазиях гибель стробилоцерков наступает
в более ранние сроки, начиная примерно с 30—50-го дня.
При изучении действия препаратов на указанные виды личинок цестод
учитывают число погибших личинок, определяемых по внешнему виду.
При обнаружении эффективного препарата личинок исследуют
микроморфологическими методами.
2.9. Эхинококкозы
К эхинококкозам относят эхинококкоз однокамерный, или гидатидоз-
ный вызываемый, однокамерным эхинококком — Echinococcus granulosus,
и эхинококкоз многокамерный, или альвеолярный (альвеококкоз)
вызываемый Е. multiloculans. Это наиболее тяжело протекающие гельминтозы
человека и вместе с тем широко распространенные среди
сельскохозяйственных и диких животных. Методы экспериментальной терапии эхинокок-
козов сходны.
Первичное заражение лабораторных животных яйцами эхинококков,
если оно необходимо, требует большой осторожности и специальных
условий. Эксперименты ведут на животных, зараженных вторичным эхинокок-
козом, который воспроизводится путем внутрибрюшинного введения
зародышевых сколексов (протосколексов) и ацефалоцист.
-628-

Зрелые протосколексы представляют собой яйцевидные тела с
ввернутым внутрь сколексом, вооруженным крючьями. По краям тела протоско-
лекса располагаются многочисленные известковые тела. Протосколексы
имеют длину 0,14—0,18 мм и ширину 0,09—0,12 мм. Они обладают
выраженной подвижностью. Ацефалоцисты мелкие, не содержащие протоско-
лексов, ларвоцисты альвеококка диаметром от 0,1 до 1,0 мм.
Первоначально протосколексы гидатидозного эхинококка можно
получить при операциях по поводу этого заболевания, а также от овец при их
забое. Эхинококком от свиней мыши не заражаются. В дальнейшем
эхинококковая модель поддерживается путем пассирования протосколексов
и(или) ацефалоцист. Для заражения лабораторных животных
однокамерным эхинококкозом используют жидкость из пузырей и соскоб с
герминативной оболочки ларвоцист. При однокамерном эхинококкозе удается
проводить ограниченное число пассажей при альвеококкозе — более 50.
Рекомендуется следующая стандартная методика перезаражения
лабораторных животных протосколексами и ацефалоцистами альвеококка.
Животное, предназначенное для получения инвазионного материала,
усыпляют и после обработки брюшной стенки йодом или спиртом подвергают
вскрытию. Извлекают ларвоцисты. Протосколексы и ацефалоцисты
выделяют в боксе в стерильных условиях. Очищенные от тканей хозяина
ларвоцисты измельчают ножницами или в мясорубке. Полученную массу
отжимают через мельничный газ с диаметром ячеек 1,0 мм. Фильтрат
помещают в цилиндр и несколько раз промывают стерильным изотоническим
раствором натрия хлорида до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет
прозрачной. В полученный таким образом инокулят добавляют
пенициллин и мономицин по 4000 ед/мл каждого. Если животные плохо
заражаются эхинококкозом, то к инокуляту добавляют гидрокортизон (25 мг/кг
массы тела животного).
Указанную взвесь вводят внутрибрюшинно или подкожно в количестве
0,5—1,0 мл. Каждому животному рекомендуется вводить примерно по 1000
протосколексов и 100—200 ацефалоцист. Для получения равномерной
инвазионной взвеси и точности дозирования лучше использовать
электромагнитную мешалку. 100 г зрелых ларвоцист достаточно для заражения 500
животных.
Для поддержания штамма альвеококка лучше всего использовать
хлопковых крыс, монгольских песчанок и белых крыс.
Для заражения используют хлопковых крыс не старше 30—45 дней. В
этом возрасте масса их тела достигает 40—50 г. Пол животных значения не
имеет. Хлопковых крыс можно заражать подкожно по 1400 ± 100 зрелых
протосколексов Е. multiloculans в область задней трети правой или левой
половины живота. Инвазионный материал вводят в 0,5 мл изотонического
раствора натрия хлорида, содержащего по 1000 ЕД пенициллина и моно-
мицина. При этом масса ларвоцист через 30 дней достигает 130—420 мг,
через 60 дней — 1,0—3,5 г, через 80 дней 4,5—14 г и через 120 дней — 15—
30 г. Юные протосколексы в подкожных ларвоцистах появляются к 50-му
дню, единичные зрелые — к 60-му дню, а к 90-му дню основная масса
протосколексов — зрелые. При внугрибрюшинном заражении зрелые
протосколексы в ларвоцистах появляются к 43-му дню, а к 60-му дню
большинство из них зрелые.
При заражении хлопковых крыс яйцами альвеококка зрелые
протосколексы в ларвоцистах появляются к 65-му дню инвазии.
У монгольских песчанок наблюдается быстрый рост ларвоцист. Зрелые
протосколексы в них появляются через 4 мес после заражения.
- 629-

Естественную невосприимчивость белых крыс к ларвальному альвео-
коккозу преодолевают путем использования животных в возрасте 3—9 нед
и внутрибрюшинного заражения животных ацефалоцистами диаметром
0,1—1,0 мм (по 500—1000 ацефалоцист на животное) и протосколексами
альвеококка. Длительность выживания зараженных альвеококкозом белых
крыс достигает 2 лет, а биомасса паразита — 400 г, превышая массу тела
хозяина в 1,5—2 раза. Созревание паразита начинается через 1 мес.
Золотистых хомяков также заражают внутрибрюшинно по 300—1000
ацефалоцист диаметром 0,1—1,0 мм Длительность выживания зараженных
животных достигает одного года, а биомасса паразита — 30 г. Созревание
паразита начинается через 1,5—2 мес.
Возраст белых аутобредных мышей при заражении не более 45—60
дней, а масса их тела к этому времени достигает 18—20 г. Мышей
заражают per os no 1000 протосколексов одновременно с 100—200
ацефалоцистами. При медленно прогрессирующем росте ларвоцист альвеококка у белых
аутобредных мышей паразит созревает примерно через 2 мес после
заражения, а длительность выживания зараженных мышей 3—4 мес и более.
Разработаны модели многокамерного эхинококкоза с первичным
поражением печени или легких. Для воспроизведения этих моделей
предварительно готовят инокулят ацефалоцист. Для этого ларвоцисты
многокамерного эхинококка, выделенные из экспериментально инвазированных
белых крыс-доноров через 5—10 мес после заражения, измельчают
ножницами или мясорубкой Обработанную таким образом ткань паразита
смешивают со стерильным изотоническим раствором натрия хлорида в объемном
соотношении 1:8—1:10. Смесь процеживают 2—3 раза через мельничный
газ с диаметром ячеек 0,3 мм. Фильтрат взбалтывают и через 2 мин
отстаивания всю надосадочную жидкость заменяют свежим изотоническим
раствором натрия хлорида. Эту операцию повторяют до тех пор, пока надоса-
дочная жидкость не станет прозрачной. После этого определяют
концентрацию ацефалоцист.
Для воспроизведения модели многокамерного эхинококкоза печени у
животных (белых или хлопковых крыс в возрасте соответственно 1 или 2 мес)
под общим эфирным наркозом в асептических условиях рассекают послойно
переднюю брюшную стенку по средней линии живота от мечевидного
отростка на расстоянии 3—4 см. Из правой половины брюшной полости
извлекают петли кишечника, смещают их влево, открывая подход к верхней
брыжеечной вене, в которую вводят комбинированный катетер, состоящий из
черенка инъекционной иглы с внутренним диаметром 0,3 мм, жестко
соединенного с прозрачной и гибкой полиэтиленовой (хлорвиниловой) трубкой
длиной 9—12 см и внутренним диаметром 0,5 мм. На другом ее конце
имеется расширение для соединения с канюлей шприца. В верхнюю
брыжеечную вену каждому животному в течение 2—3 мин вводят до 0,2—0,3 мл
равномерно перемешанного инокулята, содержащего 20—50 жизнеспособных
ацефалоцист. Ушивают стенку сосуда. Вправляют петли кишечника в
брюшную полость и послойно зашивают брюшную стенку.
Для воспроизведения модели многокамерного эхинококкоза легких
лабораторным животным в тех же условиях вводят в бедренную вену по 20—
200 ацефалоцист. Объем вводимого инокулята 0,3—0,6 мл.
При отборе новых препаратов для терапии эхинококкозов лечение
целесообразно начинать на белых мышах и белых крысах через 1 мес, а на
хлопковых крысах — через 1 нед после заражения.
Для скрининга соединении эффективных при ларвальных эхинококко-
зах используют два метода. Первый метод основан на свойстве активных
-630-

препаратов быстро вызывать деструкцию паразита при парентеральном
введении зараженным животным. На ранней стадии инвазии животным
(мышам, хлопковым крысам) вводят внутрибрюшинно испытуемое
соединение в дозе '/5 от максимальной нелетальной дозы (МНЛД). Препаратами
сравнения могут служить мебендазол или альбендазол. Через 1 — 1,5 мес
животных вскрывают и определяют жизнеспособность ларвоцист
эхинококка. На испытуемое соединение берут не менее 5 животных. Второй
метод основан на феномене ранних, как правило обратимых, деструктивных
процессов в ларвоцистах эхинококка у инвазированных животных под
влиянием активных соединений. На поздней стадии инвазии животным вводят
испытуемое соединение в желудок в течение 5—7 дней в суточной дозе,
близкой к МНЛД, или внутрибрюшинно 1 раз в день в течение 1—3 дней в
суммарной дозе, равной '/5 от МНЛД. Каждое животное взвешивают с
точностью до 1 г 1—2 раза в день в течение 5—7 дней от начала опыта. На одно
испытуемое соединение берут не менее 5 животных. Показателем
эффективности препарата является выраженное и стабильное снижение массы тела
животного за счет прекращения роста ларвоцист и их деструкции.
Химиотерапевтическую активность соединений при экспериментальных
ларвальных эхинококкозах оценивают с помощью индекса торможения
роста ларвоцист (ИТРЛ), выраженного в процентах через различные сроки
по окончании лечения по следующей формуле:
ИТРЛ = 100 (Мк - Мл) : (Мк - Ми),
где Мк, Мл — средние показатели массы ларвоцист соответственно у
контрольных и леченых животных по завершении опыта; Ми — средняя масса
ларвоцист перед началом лечения.
Чем ближе к 100 % ИТРЛ, установленный в результате использования
того или иного препарата, тем выше его противоэхинококковая
эффективность. ИТРЛ у наиболее эффективных препаратов превышает 100 %, что
объясняется снижением массы ларвоцист по отношению к их массе до
начала лечения.
Жизнеспособность ларвоцист эхинококка определяют с помощью
микроскопического исследования нативных препаратов на наличие и
выраженность деструктивных изменений у зародышевых элементов паразита.
Показателями гибели протосколексов служат исчезновение известковых
телец, помутнение и потемнение паренхимы, деформация или отделение
от сколекса короны крючьев нарушение целостности тегумента.
Признаками гибели ацефалоцист являются сглаженность структуры, потемнение,
зернистость паренхимного слоя, его отслоение от кутикулярной оболочки,
нарушение целостности последней, сжатие (коллапс) ацефалоцист.
Жизнеспособность ларвоцист проверяется также путем пассирования их
хлопковым крысам или монгольским песчанкам.
Имагинальный альвеококкоз воспроизводят на золотистых хомяках 1—
1,5-месячного возраста. Животным вводят в желудок 1000—2000
протосколексов из ларвоцист альвеококка от экспериментально зараженных
грызунов-доноров (хлопковые крысы, белые мыши, белые крысы) и
обрабатывают иммунодепрессантом (подкожные инъекции гидрокортизона за 3 дня
и в день заражения протосколексами или однократная инъекция трикорта-
40 в день заражения протосколексами). Испытание препаратов проводят
по стандартной методике, применяемой при просветных формах
гельминтов, т. е. обитающих в просвете кишки. Продолжительность эксперимента
не должна превышать 2 нед, так как созревание онкосфер в стробиле
половозрелых эхинококков происходит к 20-му дню инвазии.
-631 -

ТРЕМАТОДОЗЫ
2.10. Описторхоз
Описторхоз — хронически протекающий гельминтоз с
преимущественным поражением гепатобилиарной системы и поджелудочной железы,
сопровождающийся развитием выраженного иммунодефицитного состояния.
Возбудитель — Opisthorchis leirneus. Описторхоз — широко
распространенное заболевание населения Западной Сибири, Приуралья, Татарстана и
Восточного Казахстана, в меньшей степени — Архангельской и Иркутской
областей, Украины, Белоруссии.
Цикл развития описторхиса включает смену трех видов хозяев.
Окончательными хозяевами являются человек, кошка, свинья и многочисленные
другие млекопитающие, питающиеся рыбой. Промежуточные хозяева —
моллюски рода Cadiella, дополнительные — рыбы семейства карповых
(язь, елец, чебак).
В организме окончательных хозяев паразит локализуется в желчных
ходах печени, желчном пузыре, реже — в поджелудочной железе. У рыб
развиваются метацеркарий — инкапсулированные личинки описторхиса,
которые локализуются в подкожной клетчатке и мышцах, особенно спины.
Для вьщеления метацеркарий целесообразно использовать более крупную
рыбу, которая, как правило, заражена интенсивнее мелкой. Рыбу
вылавливают в интенсивных очагах описторхоза и, обернув влажной материей,
хранят в холодильнике при температуре 4 "С, лучше непосредственно под
морозильной камерой.
Для заражения лабораторных животных можно использовать два метода
получения метацеркарий. При первом скальпелем соскабливают
подкожную клетчатку и мышечную ткань зараженной рыбы и, исследуя ее с
помощью бинокулярной лупы, выделяют кусочки с нужным количеством
метацеркарий, которые затем скармливают грызунам. Этот метод трудоемкий
и недостаточно точный. Более простым и точным является метод
заражения животных метацеркариями, полученными путем переваривания
рыбьего фарша.
Для этого навеску фарша помещают в колбу и заливают искусственным
желудочным соком (10 мл концентрированной соляной кислоты, 3 г
пепсина, 9 г натрия хлорида на 1 л дистиллированной воды). На 100 г фарша
берут 1 л желудочного сока. Колбу устанавливают на электромагнитную
мешалку и помещают в термостат при температуре 37—38 "С на 1,5 ч.
После этого содержимое сосуда фильтруют через металлическое сито с
диаметром ячеек 1 мм. Фильтрат разливают в лабораторные цилиндры, и
через 15—20 мин отстаивания надосадочную жидкость сливают. Осадок
разбавляют водопроводной водой и вновь дают ему отстояться. Эту процедуру
повторяют не менее 5 раз. Осадок с метацеркариями разливают по
часовым стеклам. В них под контролем бинокулярной луны проводят
окончательную отмывку метацеркарий изотоническим раствором натрия хлорида.
Для этого, вращая часовое стекло вокруг вертикальной оси,
концентрируют метацеркарий ближе к его центру, а излишки физиологического
раствора вместе с остатками тканей рыбы удаляют пипеткой или шприцем с
насаженной на него иглой. Эту процедуру повторяют несколько раз до
получения относительно чистой взвеси метацеркарий. В связи с тем что
метацеркарий стимулированы изотоническим раствором натрия хлорида и
содержанием их при температуре 37—38 "С, рекомендуется их сразу же
использовать для заражения подопытных животных. В качестве последних
-632-

используют молодых золотистых хомяков с массой тела около 40—45 г.
Хорошо заражаются также и животные с массой тела 60—70 г. Заражающая
доза — 30—50 метацеркарий. Их вводят в пищевод с помощью шприца с
канюлей в 0,5—1,0 мл.
У золотистых хомяков яйца гельминта появляются в фекалиях на 28—
30-й день инвазии, у джунгарских хомячков на 27-й и у белых крыс — на
30-й день.
При массовом отборе препаратов для каждого из них достаточно
использовать по 5 животных. Учитывают среднее число трематод у леченых и
контрольных животных. Вскрытие следует проводить не ранее чем через
7—10 дней после окончания лечения. Препараты, проявившие
достаточную эффективность, проверяются повторно на большем числе животных и
сравниваются с препаратами, апробированными на практике и принятыми
за стандарт (хлоксил, празиквантель). С учетом того, что антигельминтики
обладают разной эффективностью в зависимости от срока инвазии,
целесообразно определить эффективность препарата через различные сроки
после заражения подопытных животных.
2.11. Фасциолезы
Фасциолезы — заболевания травоядных животных (крупного рогатого
скота, овец, коз, кроликов и др.) и человека, характеризующиеся в
основном поражением печени. Их возбудителями являются трематоды —
печеночный сосальщик Fasciola hepatica Linnaeus, 1758, и гигантская двуустка
F. gigantica Cobbold, 1856.
Для экспериментальной терапии фасциолезов используют кроликов,
овец, реже белых крыс и мышей.
Яйца фасциол можно получить методом осаждения из фекалий
домашних животных, а также из желчи или из трематод, собранных при убое
животных. Яйца трематод для развития и вылупления из них личинок
помещают в отстоявшуюся водопроводную воду при комнатной температуре,
через 10—15 дней из яиц выходят мирацидии. Однако они не выходят из
яиц в темноте и могут сохраняться в таких условиях до 5 мес. Для
дальнейшего развития личинок необходим промежуточный хозяин, которым
являются различные виды пресноводных моллюсков. Наиболее подходящим
для культивирования адолескариев F. hepatica являются малые прудовики
(Linnaea truncatula). Их содержат в чашках Коха диаметром 10—24 см и
высотой 6,5—7,5 см. В качестве корма используют элодею —
прошлогодние вымоченные в воде в течение суток листья деревьев (березы, осины,
ольхи, тополя и др.). Дно чашек увлажняют дехлорированной водой, а
чашки прикрывают стеклом. В каждую чашку помещают по 5—10 малых
прудовиков. Для длительного содержания большого числа малых
прудовиков применяют крупные бетонированные водоемы (площадью до 4 м2 и
глубиной до 0,1—0,7 м) с проточной водой. Малые прудовики лучше
переживают при температуре, не превышающей 18—22 "С.
Яйца фасциол, находящиеся в воде в чашках Петри, после развития в
них мирацидиев помещают под лампу. Выходящие из них мирацидии под
лупой вылавливают пипеткой и определенное их количество подпускают в
индивидуальном порядке к прудовикам, помещенным в небольшом
количестве воды в чашках Петри. Мирацидии довольно быстро проникают в
тело моллюска. Через 2—3 ч прудовиков переносят в аквариум.
Длительность партеногении в моллюсках при комнатной температуре варьирует от
-633-

50 до 80 дней. Спустя указанный срок церкарии выходят из тела
моллюсков и инцистируются, превращаясь в адолескариев, которые уже через
12 ч становятся инвазионными. Собранных под лупой при помощи
пипетки адолескариев вводят лабораторным животным в желудок. Работу можно
значительно упростить, используя естественно зараженных моллюсков из
неблагополучных по фасциолезу хозяйств.
Фасциолы достигают половой зрелости у кроликов через 2—2,5 мес. У
белых мышей при введении им по 5 адолескариев фасциолы достигают
половой зрелости на 35—36-й день инвазии и откладывают яйца в течение
7 нед. Однако через 4—5 нед с момента достижения паразитом
половозрелой стадии наблюдается значительная гибель подопытных животных.
Белые крысы заражаются фасциолезом в 65—75 %. При заражении их
по 10—12 адолескариев через месяц отдельные паразиты встречаются в
желчных ходах, но большинство их находится в паренхиме печени.
С целью испытания противофасциолезного действия препаратов
предложен метод имплантации фасциол белым крысам под кожу. По этому
методу фасциол, извлеченных из печени сельскохозяйственных животных,
отмывают и содержат в изотоническом растворе натрия хлорида,
подогретом до 37 "С. Перед имплантацией их помещают в стеклянные трубочки,
по три в каждую. В качестве подопытных животных используют
крыс-самцов с массой тела до 200 г. Их наркотизируют эфиром, фиксируют в
положении на животе на столике для манипуляции с мелкими лабораторными
животными, выстригают шерсть на спине и делают два параллельных
разреза кожи спины на уровне лопаток, длиной около 0,7 см. В разрезы на
глубину 3,5 см вставляют стеклянные трубочки с фасциолами и при
помощи тонкой деревянной палочки или куриного пера осторожно
проталкивают их в глубь разреза. Раны зашивают, крысам вводят антибиотик.
Имплантированные под кожу крыс фасциолы сохраняют жизнеспособность в
течение 4—6 сут. За этот период можно поставить эксперимент по
испытанию препаратов с предполагаемым фасциолоцидным действием. По
окончании опыта фасциол извлекают и определяют их состояние (мертвые,
частично утратившие жизнеспособность и пр.).
2.12. Парагонимозы
Парагонимозы — трематодозы человека и плотоядных животных,
вызываемые более чем 35 видами гельминтов рода Par agommus Braun, 1899.
В России природные очаги парагонимозов имеются в Амурской области,
Приморском и Хабаровском краях. Промежуточными хозяевами парагони-
мусов на Дальнем Востоке являются пресноводные моллюски рода Juga. a
дополнительными — речные раки и пресноводные крабы, окончательные
хозяева — дикие плотоядные животные, редко — человек.
У окончательных хозяев гельминты локализуются в фиброзных капсулах
в бронхах и легких, на плевре, в диафрагме головном мозге и т. д. С
мокротой и фекалиями яйца парагонимуса попадают в воду, где через 3—4 нед
развиваются мирацидии которые внедряются в пресноводных моллюсков.
Приблизительно через 5 мес из моллюсков выходят церкарии, которые
внедряются в пресноводных раков и крабов. В них формируется
инвазионные личинки — метацеркарии, которые при поедании зараженных раков и
крабов из кишечника окончательного хозяина мигрируют в разные органы
и ткани, где через 1,5—3 мес развиваются в зрелого паразита.
В Приморском крае нередким заболеванием являлся личиночный
-634-

(ларвальный) парагонимоз, возбудителем которого является P. westermani
ichunensis. Человек играет роль резервуарного хозяина. Гельминт
паразитирует только в личиночной форме, локализуясь в мышцах конечностей
диафрагмы, межреберных мышцах. Характерна яркая клиника острой стадии
рецидивирующих поражений бронхолегочного аппарата, протекающих с
выраженными токсико-аллергическими проявлениями.
Экспериментальными животными служат белые мыши, крысы кошки и
собаки. Для заражения животных получают метацеркарии из речных раков
и крабов. Крыс и мышей заражают per os 10—20, кошек и собак 50—100
метацеркариями. Через 40—60 дней паразит достигает стадии половой
зрелости.
Испытание препаратов рекомендуется начинать через 2—4 нед после
заражения животных. С целью скрининга противопарагонимозных
препаратов можно использовать молодых паразитов. Для их получения измельчают
стенки брюшной и плевральных полостей и другие органы зараженных Р.
westermani мышей. Полученную измельченную массу помещают на 12 ч в
раствор Рингера при 37 °С, в который добавлен пенициллин (200 ЕД/мл),
стрептомицин (100 мкг/мл) и испытуемый препарат в разных
концентрациях. Если препарат оказывается эффективным, дальнейшее его изучение
ведут на лабораторных моделях парагонимоза in vivo.
3. Основные принципы техники безопасности при работе с лабораторными
животными, эксприментально зараженными гельминтозами
Помимо общих санитарно-гигиенических правил, при работе с
лабораторными животными и трупным материалом необходимо дополнительно
соблюдать ряд предосторожностей и условий содержания инвазированных
животных.
При ряде гельминтозов попадание в пищеварительный тракт
инвазионных яиц или личинок гельминтов может вызвать заражение
обслуживающего персонала и экспериментаторов. Наибольшую опасность
представляют яйца аскарид, карликового цепня, а также выделенные из тканей
хозяина личинки трихинелл, метацеркарии описторхиса, адолескарии
трематод, онкосферы свиного цепня, плероцеркоиды лентецов. Для заражения
свиней и собак цистицеркозом требуются особые условия. Однако
скрининг и испытание противоцистицеркозной эффективности препаратов
можно проводить на лабораторных мышах или крысах, экспериментально
зараженных стробилоцеркозом (см. раздел 2.8).
Инвазионный материал помещают в кюветы, которые по окончании
работы обрабатывают кипятком или обжигают спиртом. Для работы с
животными необходимо иметь специальный халат и резиновые перчатки.
Использованная посуда обезвреживается кипячением. По окончании работы
с животными или инвазионным материалом рабочий стол обжигают
спиртом, перчатки и руки моют теплой водой с мылом.
Зараженные гельминтами животные содержатся в виварии на общих
условиях при строгом соблюдении контроля за их содержанием и хранением
трупов животных до их отправки на утилизацию.
Свою специфику имеет работа с ларвальными эхинококкозами.
Поддержание лабораторных штаммов эхинококков и скрининг антигельминти-
ков проводят на грызунах, зараженных протосколексами и ацефалоциста-
ми этих цестод. В связи с этим, а также вследствие инвазивности для
человека используемого для заражения животных материала следует соблюдать
-635 -

особые меры предосторожности, заключающиеся в строгом соблюдении
указанных выше профилактических мероприятий. Кроме того, вскрытие
животных и ларвоцист во всех случаях производят под прикрытием
стеклянной или пластмассовой перегородки во избежание попадания
инвазионного материала в глаза. С этой же целью заражение животных
производят в защитных очках. Для содержания зараженных эхинококкозами
животных должно быть выделено отдельное помещение и предприняты меры,
исключающие разбегание животных из помещения. Выбежавшее из клетки
животное должно быть отловлено. Желательно с этой целью в комнате
иметь заряженные мышеловки и крысоловки. Необходимо также
предусмотреть систему мероприятий, исключающих возможность поедания
хищными животными зараженных грызунов и их трупов. С этой целью
комнаты, где содержатся зараженные эхинококкозами животные, должны
иметь выложенные кафелем пол и стены, а также цементный порог
высотой не менее 40 см. Дверь комнаты с животными перед уходом персонала
из помещения запирается на замок. Рекомендуется иметь при входе в
помещение дополнительный бокс с решетчатой дверью на пружине.
Попадание собаки или кошки в помещение вивария, где содержатся
зараженные ларвальными эхинококкозами животные, рассматривается как
чрезвычайная ситуация, и такое животное подлежит уничтожению.
Выделение ларвоцист для перезаражения животных проводят в
специальной комнате. Животное-донор доставляется из вивария в банке заранее
усыпленным. Приготовленную взвесь протосколексов и ацефалоцист
переносят в виварии, где и производят заражение животных. Оставшийся
после заражения инвазионный материал, посуду и инструмент кипятят.
Заражение животных эхинококкозами производят в специальной
комнате вивария. Все эксперименты с животными проводят только в этой
комнате. Вынос живых животных из вивария запрещается.
Обслуживающий персонал удаляет трупы павших животных из клеток
при их ежедневной уборке, заворачивает в бумагу с надписанным номером
клетки и помещает в банку с плотно закрываемой крышкой.
При необходимости трупы животных хранят в холодильнике,
находящемся в этой же комнате. В лабораторию их переносят только в
специальных банках. Отработанные трупы засыпают хлорной известью и переносят
в общий бак для утилизации.
Обслуживающий персонал вивария, а также все научные сотрудники и
лаборанты, работающие с лабораторными животными, должны быть
проинструктированы о правилах работы с зараженными животными.
Повторные инструктажи проводят систематически 2 раза в год с соответствующей
регистрирующей записью в специальном журнале.

Методические указания по изучению противоопухолевой
активности фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н. Е. М. Трещалина;
к. б. н. О. С Жукова; д. м. н., проф. Г. К.
Герасимова; к. м. н. Н. В. Андронова; академик
РАЕН, проф. А. М. Гарин
1. Введение
Несмотря на существование в клинической практике более 100
противоопухолевых препаратов, эффективность большинства из них
недостаточна и спектр онкозаболеваний, чувствительных к химиотерапии, ограничен.
Поэтому остается актуальным вопрос о разработке новых более активных
препаратов, а также поиск веществ, эффективных при опухолях с
первичной и приобретенной резистентностью к лекарственной терапии. В связи с
этим решение о продвижении нового вещества с ппротивоопухолевой
активностью на клинические испытания принимается на основании одного
из следующих критериев:
■ новый механизм действия,
■ высокая противоопухолевая активность in vivo,
и избирательная цитотоксичность в отношении определенных культур
опухолевых клеток in vitro и ксенографтов опухолей человека,
■ отсутствие перекрестной устойчивости с известными веществами.
В настоящее время общепринята методика определения
противоопухолевого действия, ориентированная на оценку скорости роста опухоли. В
этом случае в качестве модели используются перевиваемые in vivo
опухолевые системы с генерализованным и солидным характером роста. При этом
эксперименты на сверхчувствительных (высокоиммунногенных) опухолях
не дают возможности адекватно оценить эффективность вещества.
Поэтому на всех этапах разработки противоопухолевых препаратов ведущую роль
должны играть неиммунногенные и высокометастазирующие опухолевые
модели или опухоли с приобретенной резистентностью к химиотерапии,
что обеспечивает их достаточную прогностическую ценность. Большое
значение придается данным, полученным на моделях, свойства которых
приближены к свойствам отдельных опухолей человека — ксенографтах
опухолей человека, растущих у иммунодефицитных мышей, на клеточных
линиях опухолей человека, обладающих различными биологическими и
биохимическими свойствами и лекарственной чувствительностью.
В последние годы в результате интенсивного развития молекулярной
биологии и генетики выявлены новые молекулярные мишени для
противоопухолевой химиотерапии, в том числе специфичные для опухолевой
клетки. В результате стало возможным создавать противоопухолевые
препараты, направленные на специфичные для данного вида опухолей
молекулярные мишени ("таргетная" или адресная терапия). Для выявления и
изучения веществ с подобным механизмом действия необходимо использовать
опухолевые модели (культуры клеток, опухоли мышей и человека) с
высокой экспрессией мишеней, на которые направлено действие препарата.
Особое место в онкологии занимает экссудативный опухолевый плеврит
метастатической природы (ОП), частота развития которого при лимфомах
и солидных опухолях достигает 45 %, а при мезотелиоме плевры имеет
-637-

первичную природу и встречается у большинства больных. Обычный
способ применения химиотерапии недостаточно результативен.
Современные подходы к терапии ОП ориентированы на использование
полихимиотерапии и плевросклерозирующих средств (ПСС). Недостатком
внутриплевральной терапии ОП с применением ПСС является невысокая
эффективность, недостаточное склерозирование плевральной полости и
сильная болевая реакция. Вследствие этого поиск новых ПСС актуален, в
связи с чем требования к их доклинической оценке дополнительно
включены в настоящие методические рекомендации.
Данные Рекомендации не касаются изучения веществ, предназначенных
для лечения гормонозависимых опухолей, а также антиметастатических
средств, при разработке которых следует руководствоваться специальными
методическими рекомендациями ФК МЗ РФ.
При выполнении доклинических исследований необходимым
требованием является качество тестируемого агента, удовлетворяющее
соответствующим требованиям.
2. Изучение специфической активности in vivo
Для клинических испытаний могут быть предложены оригинальные
вещества новых классов, аналоги известных лекарственных средств и
воспроизведенные (generic) вещества. В зависимости от этого различаются
требования, предъявляемые к таким препаратам при передаче их на
клиническое изучение, критерии оценки эффективности и методы изучения.
2.1. Оригинальные вещества нового класса
Критерии эффективности
Соединение нового класса, рекомендуемое для клинического изучения,
должно соответствовать одному или более из следующих критериев
эффективности:
• торможение роста хотя бы одной солидной опухоли из обязательного
к изучению спектра на 90 % и более, сохраняющееся не менее 7 сут
после отмены вещества;
• торможение роста не менее трех солидных опухолей или подкожно
перевитых лейкозов, упомянутых в обязательном перечне, на 70 % и
более с сохранением значимого эффекта не менее 7 сут;
• увеличение продолжительности жизни животных с лейкозом на 75 %
и более;
• продолжительности жизни животных с солидной или асцитной
опухолью на 50 % и более;
• полная ремиссия у 50 % животных (отсутствие признаков опухоли/
лейкоза в течение 60 дней);
• излечение 50 % животных (отсутствие признаков опухоли/лейкоза в
течение 90 дней);
• высокая избирательная цитотоксичность in vitro;
• новый, ранее неизвестный механизм действия (при наличии
существенной противоопухолевой активности).
Обязательные исследования:
• Изучение спектра противоопухолевой активности.
-638-

• Определение диапазона терапевтических доз с доказательством
наличия избирательности терапевтического действия (терапевтический
индекс).
• Изучение действия на развившуюся опухоль.
• Выбор оптимального пути введения в организм.
• Выбор оптимальной схемы применения.
• Сравнительное изучение эффективности субстанции и лекарственной
формы.
• Изучение механизма противоопухолевого действия,
ориентированного на определенные клеточные мишени.
Дополнительные исследования:
■ Изучение эффективности в комбинации с известными
противоопухолевыми препаратами.
■ Изучение действия на опухоль с приобретенной лекарственной
резистентностью.
■ Изучение действия на ксенографты опухолей человека у иммуноде-
фицитных мышей.
■ Изучение способности ингибировать процесс метастазирования
злокачественных опухолей (см. соответствующие Рекомендации ФК МЗ РФ).
2.2. Аналоги известных противоопухолевых препаратов
Помимо создания препаратов с ранее неизвестной структурой или
механизмом действия перспективной задачей является поиск новых вариантов
соединений, уже применяемых в химиотерапии опухолей.
В данном случае необходимо показать существенные преимущества
предлагаемого на клинические испытания аналога перед лучшими,
наиболее близкими по структуре препаратами того же класса, доказательством
чего должно быть наличие хотя бы одного из следующих признаков:
• увеличение эффективности не менее чем в 2 раза по любому из
критериев;
• появление более значимого эффекта, например, излечение всех
животных при применении препарата хотя бы в одной дозе;
• отсутствие или снижение токсических эффектов, наблюдаемых у
препаратов сравнения (например, нефротоксичности у комплексных
соединений платины, кардиотоксичности у антрациклиновых
антибиотиков и т. д.);
• существенный антиметастатический эффект при отсутствии такового
у препарата сравнения или увеличение антиметастатического эффекта
не менее, чем в 2 раза;
• возможность использования более удобных и/или безопасных путей
введения препарата;
• существенные отличия в спектре противоопухолевой активности, в том
числе в отношении опухолей, резистентных к препарату сравнения;
• отличия в механизме действия и/или фармакокинетике.
Обязательные исследования:
Все исследования проводятся параллельно с препаратом сравнения
(прототипом), который должен быть лучшим из данного класса, в
следующем объеме:
• изучение спектра противоопухолевой активности,
• изучение противоопухолевой активности на любых резистентных к
прототипу опухолях или культурах клеток,
-639-

• определение диапазона терапевтических доз и схемы применения,
• изучение иного пути введения (при наличии показаний) на любой
чувствительной к прототипу модели,
• сравнительное изучение антиметастатической активности (при
наличии показаний),
• сравнительное изучение токсичности (при наличии преимуществ
перед прототипом),
• сравнительное изучение эффективности и токсичности субстанции и
лекарственной формы (проводится без прототипа),
• доказательства иного механизма действия, если это является
основанием для передачи вещества на клинические испытания.
Дополнительные исследования:
• изучение эффективности в комбинации с известными
противоопухолевыми препаратами.
2.3. Воспроизведенные зарубежные препараты
В результате экспериментального изучения воспроизведенного
препарата должны быть получены данные, подтверждающие его идентичность с
воспроизводимым по противоопухолевому и другим биологическим
эффектам. При сравнительном изучении в качестве объекта сравнения
предпочтительно берется препарат, выпущенный фирмой-создателем, а при
недоступности последнего — один из известных препаратов,
зарегистрированный в РФ и применяемый в клинике.
Обязательные исследования:
• Изучение противоопухолевой активности на 1—2 наиболее
чувствительных к прототипу опухолях.
• Подтверждение диапазона терапевтических доз и схемы применения.
• Сравнительное изучение эффективности субстанции и лекарственной
формы (если создана новая лекарственная форма, исследование
проводится по рекомендуемому для аналогов плану).
• Доказательство идентичности фармакокинетических параметров.
3. Модели и методы in vivo
3.1. Изучение спектра противоопухолевой активности
В опытах используются 2—8 генерации перевиваемых опухолей. Путь
введения вещества и путь прививки опухоли не должны совпадать. Для
изучения спектра противоопухолевой активности используют не менее
двух терапевтических доз вещества, при этом уменьшение массы тела
животных должно быть < 20 %. Исследование проводится с субстанцией или
лекарственной формой вещества, рекомендованной для доклинического
изучения.
Перевиваемые опухоли мышей и крыс
Обязательные:
• Лимфолейкоз Р388. Прививается внутрибрюшинно, внутривенно или
подкожно суспензией клеток, полученных из асцита, в разведении
-640-

питательной средой. Прививочная доза 106 клеток. Штамм
поддерживается на мышах линии DBA2. Для опыта используются мыши
линии DBA2 или гибриды BDF1 [DBA2xC57BL/6j] обоего пола с массой
тела 18—20 г (масса тела во всех случаях одинакова).
• Лимфолейкоз L1210. Прививается внутрибрюшинно, внутривенно или
подкожно суспензией клеток, полученных из асцита, в разведении
питательной средой. Прививочная доза 105 клеток. Штамм
поддерживается на мышах DBA2. Для опыта используются мыши линии
DBA2 или гибриды BDF1 обоего пола.
• Меланома В16. Неиммуногенная, метастазирует в легкие. Прививается
подкожно или внутрибрюшинно взвесью опухолевых клеток по 30—
60 мг в 0,3—0,5 мл питательной среды на мышь. Штамм
поддерживается на мышах C57BL/6J. Для опыта используются мыши C57BL/6J и
гибриды BDF1 или Fl [CBAxC57BL/6j] обоего пола. Для оценки
эффекта по действию на метастазирование опыты проводятся в
соответствии со специальными рекомендациями ГФК.
• Эпидермоидная карцинома легкого Lewis (LLC, 3LL). Неиммуногенная,
метастазирует в легкие. Прививается подкожно взвесью опухолевых
клеток по 30—60 мг в 0,3—0,5 мл питательной среды на мышь.
Штамм поддерживается на мышах-самцах C57BL/6J. Для опыта
используются мыши-самцы C57BL/6J и гибриды BDF1 или F1. Для
оценки эффекта по действию на метастазирование опыты проводятся
в соответствии со специальными рекомендациями ГФК МЗ.
• Аденокарцинома молочной железы Са755. Иммуногенная, неметастази-
рующая. Прививается подкожно взвесью опухолевых клеток по 30—
60 мг в 0,3—0,5 мл питательной среды на мышь. Штамм
поддерживается на мышах C57BL/6J. Для опыта используются мыши-самки
C57BL/6J и гибриды BDF1 или F1.
Дополнительные:
• Лимфаденоз Фишера L5178Y. Трансплантируетсяается
внутрибрюшинно суспензией клеток из асцита, в разведении питательной средой.
Прививочная доза 106 клеток. Штамм поддерживается на мышах
DBA2. Для опыта используются мыши линии DBA2 или гибриды
BDF1 обоего пола. Начало лечения через 24 ч после прививки.
• Опухолевый плеврит лимфолейкоза Р388 (ОП/Р388). Штамм
поддерживается на мышах DBA2. Для опыта используются мыши линии DBA2
или гибриды BDF1 обоего пола. Лейкоз прививают суспензией асцит-
ных клеток в разведении питательной средой, прививочная доза —
5 х 105—1 х 106 кл/мышь в объеме 0,2—0,3 мл. Мышь фиксируют,
кожу в области грудной клетки справа обрабатывают спиртовым
раствором йода. По правой средней аксиллярной линии на 1 см выше
края реберной дуги делают кожный разрез 1,0 см и обнажают
операционное поле. На иглу на расстоянии 1,5—2 мм от среза надевают
ограничитель для предотвращения перфорации легкого. Иглу вводят в
межреберье в точке пересечения средней аксиллярной линии и
границы нижнего края легкого на выдохе и быстро производят
инъекцию. Модель используют для веществ, предназначенных для лечения
опухолевых плевритов.
• Рак шейки матки РШМ5. (плоскоклеточный ороговевающий,
метастазирует лимфогенно). Прививается подкожно взвесью опухолевых
клеток по 30—60 мг в 0,3—0,5 мл питательной среды на мышь.
Штамм поддерживается на мышах-самках СВА. Для опыта
используются мыши-самки линии СВА.
21 - 762
-641 -

• Аденокарцинома толстой кишки АКАТОЛ. Неметастазирующая.
Прививается подкожно взвесью опухолевых клеток по 30—60 мг в 0,3—
0,5 мл питательной среды на мышь. Штамм поддерживается на
мышах линии Balb/c. Для опыта используются мыши Balb/c обоего пола.
• Гепатома 22 солидная и асцитная. Прививается внутрибрюшинно
(АГ22) или подкожно (Г22) суспензией асцитных клеток по 105 кл/
мышь или взвесью клеток из подкожно растущей опухоли по 30—60
мг в 0,3—0,5 мл питательной среды на мышь. Штамм поддерживается
на мышах СЗНА. Для опыта используются мыши линии СЗНА обоего
пола.
• Карцинома Эрлиха асцитная и солидная. Используются 3 варианта:
анеуплоидный (ELD), диплоидный и тетраплоидный. Прививается
внутрибрюшинно (АОЭ) или подкожно (СЭ) суспензией клеток
асцита по 107 клеток на мышь или взвесью клеток из подкожно растущей
опухоли по 30—60 мг на мышь в разведении питательной средой.
Штамм поддерживается на мышах F1. Для опыта используются
мыши линии Balb/c, гибриды Fl, C57BL/6J или СЗНА обоего пола.
• Гепатома Зайделя асцитная и солидная. Прививается
внутрибрюшинно (АГЗ) или подкожно (ГЗ) суспензией клеток асцита по 107 клеток
на мышь или взвесью клеток из подкожно растущей опухоли по 30—
60 мг на мышь в разведении питательной средой. Штамм
поддерживается на крысах линии Wistar. Для опыта используются крысы Wistar
обоего пола с массой тела 100—200 г.
Условия проведения экспериментов
Лейкозы, привитые внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.
Начало лечения через 24 ч после прививки. Наблюдение за мышами до
гибели. Оценка эффективности терапии по увеличению
продолжительности жизни, числу полных ремиссий или излечению.
Асцитные или солидные опухоли, привитые внутрибрюшинно или подкожно.
Начало лечения через 48 ч после прививки. Наблюдение за мышами в
течение 21—30 дней для оценки эффекта по торможению роста опухоли.
Наблюдение за мышами до гибели для оценки эффекта по увеличению
продолжительности жизни, числу полных ремиссий и излечению.
3.2. Выбор оптимального пути введения в организм
Исследование проводится на высокочувствительной к изучаемому
веществу опухолевой модели. Оптимальным считается путь введения, при
котором достигается наибольшая эффективность по всем критериям
эффективности.
Водорастворимые вещества
Вводят парентерально — внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно,
внутримышечно или (при наличии показаний) внутриплеврально. При
наличии местно-раздражающего действия вещество вводят только
внутривенно. В качестве растворителя для парентерального введения субстанции
допустимо использование любого физиологически адекватного
растворителя, не вызывающего местного раздражающего действия. Внутривенные
инъекции производят в хвостовую вену (< 10 мл) или в супраорбитальный
синус (< 0,3 мл). Внутрибрюшинные инъекции (< 10 мл) производят в
-642-

нижнюю треть брюшной полости. Подкожные инъекции (< 0,3 мл)
производят в складку кожи на боку или спине животного. Внутримышечные
инъекции (< 0,1мл) производят в медиальную группу мышц бедра. Внутри-
плевральные инъекции осуществляют по методике, описанной в п. 3.1.
Нерастворимые в воде вещества
Вводят в желудок с помощью зонда или парентерально в специально
разработанных лекарственных формах. В качестве растворителя
используют физиологически адекватные наполнители и растворители, такие как
1 % крахмальный клейстер, растительное масло, поливинилпирролидон
(ПВП) и пр.
3.3. Определение диапазона терапевтических доз
Исследование проводят при оптимальном пути введения вещества в
организм в диапазоне доз от неэффективной до максимально переносимой
(МПД). Целесообразно использовать не менее шести однократных или
курсовых доз (при любой длительности курса). Для каждой дозы
определяется максимальный противоопухолевый эффект по одному из возможных
критериев.
С помощью построения графика "доза—эффект"определяется ЕД20,
ЕД50 и ЕД90 — расчетные дозы, вызывающие торможение роста опухоли
(ТРО) на 20 %, 50 % и 90 %, соответственно. Затем рассчитываются
терапевтические индексы (ТИ20, ТИ50 или ТИ90) как соотношение
соответствующей летальной и эффективной доз. ТИ является единственным
показателем избирательности противоопухолевого действия, рекомендуемое
значение ТИ50 > 2. Наиболее часто определяют ТИ50 по формуле:
ТИ50 = Ща,
ЕД5о
где ЛД50 — доза, вызывающая гибель 50 % здоровых животных.
3.4. Выбор оптимальной схемы применения
Оптимальная схема применения зависит от биодоступности вещества, а
также наличия кумуляции и обратимости противоопухолевого и
токсического действия и определяется эмпирически в рамках серии опытов,
проведенных на высокочувствительной опухолевой модели. Эмпирически
найденная оптимальная схема (диапазон доз, количество введений, интервалы
между введениями, путь введения), а также данные фармакокинетики
вещества являются обоснованием для терапевтической схемы при
проведении клинических испытаний.
3.5. Изучение действия на развившуюся опухоль
Опыты проводятся на наиболее чувствительной опухоли при среднем
объеме (Vcp) к началу лечения не менее 500 ммЗ и колебании Vcp в группе
не более 10 %. Учитывая большие размеры опухоли, целесообразно
повысить величину суммарной дозы вещества. Оценка противоопухолевого
эффекта производится по торможению роста опухоли в динамике через более
короткие интервалы, чем при обычной схеме лечения.
21*
-643-

3.6. Изучение действия на опухоли с приобретенной лекарственной
устойчивостью
Используются любые доступные опухолевые штаммы, в частности,
лейкозы:
• Лимфолейкоз Р388, резистентный к цисплатину (Р388/ДДП);
• Лимфолейкоз Р388, резистентный к адриамицину (Р388/Адр);
• Лимфолейкоз L1210, резистентный к циклофосфану (Ы210/ЦФ).
Может также быть использован любой иной опухолевый штамм с
приобретенной лекарственной устойчивостью. Клетки указанных опухолевых
штаммов трансплантируются как указано в п. 4.1. Штаммы ведутся на
мышах линии DBA2 при поддерживающей терапии веществом, к которому
наработана резистентность. Лейкозные штаммы прививаются внутрибрю-
шинно. Для опыта используются мыши той линии, на которой
индуцирована резистентность. Начало лечения через 24 ч после трансплантации.
Наблюдение за мышами продолжается до их гибели. Оценка
противоопухолевого эффекта проводится по увеличению продолжительности жизни
мышей. Сравнение эффекта нового тестируемого вещества проводится с
взятым в оптимальной терапевтической дозе эффектом препарата, к
которому индуцирована резистентность.
3.7. Оценка действия на опухоли человека, растущие у иммунодефицитных
мышей
Используется любой доступный вариант — культура опухолевых клеток,
штамм опухоли или ксенографт, перевитые подкожно или ортотопически.
Основные локализации опухолей: рак толстой кишки (штамм или
ортотопически трансплантированный ксенографт первой генерации), рак
молочной железы, меланома и др. Опухоли трансплантируются подкожно по 1 —
3 х 106 клеток/мышь. Начало лечения на 5—12-е сутки после
трансплантации. Наблюдение за мышами в течение 21—28 дней после окончания
лечения. Оценка противоопухолевого эффекта по торможению роста опухоли.
Метастазирующие опухоли прививаются ортотопически. Оценка
эффекта проводится по частоте и/или степени моно- или полиорганного
(визуально или морфологически) метастазирования.
3.8. Оценка действия агентов для "таргетной" терапии
Для изучения "таргетных" (адресных) агентов используется опухолевый
материал с высокой экспрессией маркера. Например, с высокой
экспрессией Her-2/neu рак молочной железы человека ВТ-474 или SKSR3, а также
рак яичника человека SKOV3, с высокой экспрессией NF/Kb рак
предстательной железы человека РС-3, различные варианты меланомы с высокой
экспрессией VEGF и пр.). Эксперименты выполняются в системах in vitro
и/или in vivo:
• Клеточные линии опухолей человека;
• Перевиваемые опухоли человека у иммунодефицитных мышей;
• Перевиваемые опухоли обычных инбредных мышей.
Оценка эффекта проводится по стандартным критериям, описанным в
соответствующих разделах.
-644-

3.9. Оценка плевросклерозирующей активности
Исследование проводится на здоровых инбредных мышах обоего пола
линейных или гибридных массой тела 20—25 г.
Индукция плевродеза
При индукции плевродеза используется методика внугриплевральных
инъекций. В плевральную полость здоровых мышей (п > 6) однократно
вводят тестируемое вещество в диапазоне доз в объеме от 0,05 до 0,5 мл. В
зависимости от степени местно-раздражающего действия (МРД) агента
мыши переносят введение по-разному. При хорошей переносимости их
можно сразу перенести в клетку. При ограничении подвижности и
увеличении глубины легочных экскурсий может наступить гибель от плевро-
пульмонального шока. В этом случае следует снизить величину вводимой
дозы вещества за счет уменьшения объема или концентрации раствора.
В течение 4—5 дней после введения мыши малоподвижны, глубина
дыхательных экскурсий увеличена. Эта симптоматика прямо связана с дозой
и концентрацией склерозирующего агента. В случае применения
переносимых доз и концентраций, в последующие 2—3 нед состояние мышей
нормализуется. В случае развития острого неспецифического серозного
плеврита в этот период может наступить гибель мышей. При вскрытии
погибших мышей в плевральной полости обнаруживается транссудат до
1,0 мл.
На 18—21-е сутки после введения тестируемого агента всех мышей
усыпляют эфирным наркозом, после чего подвергают аутопсии, при которой
визуально изучают состояние грудной полости.
Шкала оценки плевросклерозирующего действия
Степень
плевросклерозирующего Симпоматика
действия (баллы)
1 Утолщение перикарда и легочной связки
2 То же плюс сращение перикарда с окружающими тканями вплоть
до разделения единой плевральной полости мышей на две
3 То же плюс спайки между париетальной и висцеральной плеврой,
занимающие до 1/3 поверхности плевры
4 То же плюс спайки между париетальной и висцеральной плеврой,
занимающие до 1/2 поверхности плевры
5 Облитерация полости (плевродез)
Примечание. Эталонный ПСС — 3 % раствор тетрациклина.
Расчет терапевтического индекса (ТИ)
Первоначально экспериментально определяется доза, вызывающая
максимальное склерозирование без гибели мышей (МСД). Затем на здоровых
мышах изучается острая токсичность агента при внутриплевральном
введении и по общепринятому методу Литчфилда—Уилкоксона рассчитывается
величина дозы, близкой к максимально переносимой (МПД, ЛД5). После
чего ТИ рассчитывается по формуле:
-645 -

мед
где ТИ — терапевтический индекс; ЛД5 — доза, близкая к максимально
переносимой; МСД — максимальная склерозирующая доза.
Для 3 % тетрациклина в опыте на мышах-самках линии BALB/c массой
тела 20—25 г при введении ЛД5 = 186,2 мг/кг, максимальная
склерозирующая доза МСД = 150 мг/кг, ТИтетрациклина = 1,24. Эти цифры
характеризуют тетрациклин как препарат с невысокой избирательностью
терапевтического действия, поскольку для достижения полного склерозирования
необходимо применение дозы, близкой к токсической. Полученные
данные согласуются с клиническим опытом применения тетрациклина.
Совпадение экспериментальных и клинических данных говорит об
адекватности модели тетрациклинового плевродеза на мышах для оценки склерози-
рующего действия препаратов.
Заключение об эффективности ПСС
Эффект тестируемого вещества оценивается по 5-бальной шкале в
сравнении с 3 % тетрациклином (эталон). Критерий отбора — 4—5 баллов
(склерозирование более 2/з поверхности плевральной полости, плевродез).
О перспективности вещества для клинической апробации судят по
терапевтическому индексу ТИ > 1,24 (тетрациклин) при однократномвнутрип-
левральном введении.
3.10. Оценка эффективности в комбинации с известными
противоопухолевыми препаратами
Изучаемое вещество вводят в комбинации с доступными наиболее
эффективными и широко используемыми в клинической онкологии
препаратами (циклофосфаном, доксорубицином, цисплатином, 5-фторурацилом,
метотрексатом, таксолом, гемзаром и пр.). Целесообразно использовать
чувствительную и резистентную к известному препарату опухоли и вводить
комбинаты в дозах, составляющих половину от МПД и максимальной
эффективной дозы, если таковые не совпадают. В качестве
положительного контроля вещество и препарат вводят в полных или удвоенных дозах,
что позволяет при равном противоопухолевом эффекте в сравниваемых
группах оценить терапевтический эффект комбинации:
• Аддитивный эффект — эффект комбинации выше эффекта наиболее
эфффективного комбинанта.
• Синергический (суммационный) эффект — эффект комбинации равен
сумме эффектов комбинантов.
• Потенцирующий эффект — эффект комбинации выше суммы
эффектов комбинантов.
3. П. Сравнительное изучение субстанции и лекарственной формы
Исследование проводится в прямом параллельном сравнении на 1—2
наиболее чувствительных опухолях при оптимальной схеме применения
вещества в двух дозах.
-646-

4. Оценка противоопухолевого эффекта
4.1. Оценка противоопухолевого эффекта по торможению роста опухоли
Проводится определение 2—3 размеров опухоли у каждого животного в
группе, после чего вычисляется объем (V, ммЗ) опухоли по формулам:
V = а • ь
V = (а • Ю
2
где a, b и с — длина, ширина и высота опухолевого узла. Затем
вычисляется средний объем опухоли в группе Vcp.
Степень торможения роста опухоли определяется по показателям ТРО и
Т/С, вычисляемым по формулам:
v — v
ХРО% = контроля Y опыта
' КПЫТ11ПЛЯ
100
т/с
v„,
100
где V — средний объем опухоли (мм3) в подопытной и контрольной
группах, соответственно, на конкретный срок; Т — леченая группа; С —
контрольная группа; Т/С — величина, обратная ТРО, используется в случаях,
когда имеется стимуляция роста опухоли и во всех случаях лечения
развившейся опухоли.
Допустимо определять ТРО и Т/С, используя в качестве показателя
среднюю массу опухоли у погибших и забитых в различные сроки опыта
животных. ТРО и Т/С рассчитываются на 1-е, 7-е и 14-е сутки после
окончания лечения. Значимый противоопухолевый эффект должен сохраняться
не менее 7 сут.
Количественные критерии оценки ингибирующего эффекта на опухолях
животных
ТРО <20 % 0
ТРО <20-50 % ±
ТРО <51—80 % +
ТРО <81-90 % ++
ТРО <91—100 % + <50 % ПР/излечения +++
ТРО <91 —100 % + > 50 % ПР/излечения ++++
Количественные критерии оценки активности на ксенографтах опухолей
человека
Т/С = 51-100 %
Т/С = 36-50 %
Т/С = 21-35%
Т/С = 6-20 %
Т/С < 5 %
о
+
++
+++
++++
Минимальные значения для трех обязательных для изучения
чувствительных к препарату солидных опухолей или подкожно перевитых
лейкозов:
ТРО > 70 %, Т/С < 30 %.
Минимальные значения для единственной чувствительной к препарату
опухоли из всего спектра обязательных для изучения опухолей:
ТРО > 90%, Т/С < 10%.
-647-

4.2. Оценка ингибирующего рост опухоли эффекта по логарифму погибших
клеток
Дополнительно может быть рассчитано количество погибших клеток в
подкожно привитых опухолях. Для этого в контрольной ^контроля) и
леченой (tonbiTa) группах определяется среднее время удвоения объема
опухоли или достижения определенной величины. Разница между
показателями '^контроля" и 'Чопыта" (время задержки роста опухоли в подопытной
группе) находится в прямой связи с величиной пула погибших клеток к
данному сроку. Рассчитывается lg числа погибших клеток (lg n) по
формуле:
lg п
tK-to
3,32Td:
где tK — to — время задержки роста опухоли в опыте; Td — время
удвоения размеров опухоли, рассчитанное по экспоненциальной кривой роста
опухоли в контроле; 3,32 — число удвоений, необходимое для увеличения
lg n на один порядок.
Критерий активности
Лечение должно сопровождаться увеличением lg погибших клеток не
менее чем в 2—4 раза.
4.3. Оценка противоопухолевого эффекта по увеличению
продолжительности жизни
Проводится по окончании опыта и гибели всех животных.
Определяется средняя продолжительность жизни (СПЖ, дни) в группе и
вычисляются показатели увеличения продолжительности жизни (УПЖ %)
(УПЖ = Т/С - 100) и Т/С по формулам:
УПЖ%
'-'-*■ 1-^-опита '-'И'^-контроля
спжк,
100
т/с
спж0
спж,,ш
100
Количественные критерии активности:
Т/С
<125 %
125-160 %
161-200 %
201—300 % или 161—200 % при однократном введении
> 200 + ПР < 50 % или 201—300 % при однократном введении
> 300 % + ПР > 50 % или < 50 % при однократном введении
0
+
+
++
+++
++++
Минимальные значения Т/С для животных:
• с лейкозами:Т/С > 175 %, УПЖ > 75 %;
• с асцитными и солидными опухолями:Т/С > 150 %, УПЖ > 50 %;
• с опухолевыми плевритами (ОП):Т/С > 150 %, УПЖ > 50 %.
-648-

4.4. Оценка противоопухолевого эффекта по числу полных ремиссий
и излечению от опухоли
Подсчет числа полных ремиссий производится не ранее, чем через 30
дней (лейкозы) или 60 дней (солидные и асцитные опухоли), а подсчет
числа излеченных животных производится не ранее, чем через 90 дней
после окончания курса терапии. Отсутствие признаков опухолевого
поражения определяют при патологоанатомическом вскрытии.
4.5. Статистический анализ результатов изучения in vivo
Результаты, полученные при проведении экспериментов, подвергаются
статистической обработке с целью установления степени вариабельности
вычисленных показателей и достоверности выявленных различий.
При статистической обработке результатов опытов, проведенных на
опухолях, характер роста которых подчиняется законам нормального
распределения, возможно применение параметрических методов статистики (метод
Стьюдента—Фишера, критерий Т, доверительный интервал). Для опухолей,
рост которых не подчиняется законам нормального распределения,
используется любой из непараметрических методов статистической обработки
результатов биологического эксперимента (критерий U, критерий Вилкоксона
и т. п.). Различия можно считать достоверными при р < 0,05.
5. Исследование цитотоксического эффекта in vitro
Основной целью исследований in vitro является оценка прямого
цитотоксического эффекта потенциальных противоопухолевых препаратов и
выявление возможной дифференциальной чувствительности опухолевых
клеток человека различного генеза к изучаемым соединениям.
Исследование может проводиться на всех стадиях разработки новых препаратов.
5.1. Методы изучения
Система отбора и изучения соединений с потенциальной
противоопухолевой активностью in vitro основана на определении степени подавления
роста клеток под влиянием тестируемого агента, которое вычисляется по
формуле: N% = (1 — Опыт/Контроль) х Ю0. При этом используются
следующие методы оценки:
— метод подсчета клеток (преимущественно для лейкоза MOLT-4),
— МТТ-тест,
— 3Н — тимидиновый тест.
Перечисленные методы предусматривают ведение клеточных культур в
условиях, указанных далее по тексту. При всех методах изучаемое
соединение тестируют в 3 параллельных измерениях при 4 концентрациях —
10"7 М, Ю-6 М, Ю-5 М и 10"4 М, для аналогов Сахаров — до 10"3 М. Затем
по кривой зависимости роста культуры клеток от концентрации
соединения определяют ИК50 и ИК90, то есть концентрации препарата,
вызывающие торможение роста клеток на 50 % и 90 %. После определения ИК50
проводится дополнительное тестирование при 4—5 концентрациях,
близких к ИК50.
-649-

5.2. Критерии оценки цитотоксического эффекта
Соединение нового класса считается цитотоксически активным при
ИК50 < 10-4М, аналог известного противоопухолевого препарата
оценивается как цитотоксичный, если его ИК50 < ИК50 препарата сравнения.
Метод подсчета клеток (лейкоз MOLT-4)
Соединение полностью растворяют в питательной среде RPMI-1640 без
сыворотки в двукратной концентрации по отношению к конечной и
стерилизуют через мембранный фильтр с d = 0,22ц. Если для растворения
требуется специальный растворитель, он добавляется в эквивалентных
концентрациях в контрольные образцы. В остальных случаях в качестве
контроля используют среду RPMI-1640, содержащую 20 мМ буфера Hepes.
Суспензию разбавляют до концентрации 1 х 105 кл/мл средой RPMI-
1640, содержащей 20 % эмбриональной сыворотки теленка и 20 мМ буфера
Hepes, и распределяют в пробирки для клеточных культур из боросиликат-
ного стекла. В каждую пробирку помещают 1 мл среды, содержащей
культуру, и 1 мл среды, содержащей исследуемое вещество в определенной
концентрации. В итоге конечное разведение клеток составляет 5 х 104 кл/
мл в общем объеме среды 2 мл. Закрытые пробками пробирки инкубируют
в вертикальном положении в течение 48 ч при 37 "С. По окончании
инкубации содержание клеток в пробах (число клеток в мл среды) измеряют с
помощью автоматического счетчика клеток. Для каждой концентрации
испытуемого соединения вычисляют среднее значение из трех параллельных
измерений и рассчитывают отношение к контрольному (без соединения)
росту в процентах.
МТТ-тест для линий опухолевых клеток человека
МТТ-тест основан на ферментном восстановлении неокрашенной соли
тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид,
МТТ) в живых метаболически активных клетках с образованием голубых
кристаллов формазана.
Клетки в концентрации 1 х 103 — 5 х 103 в 100 мкл среды RPMI-1640,
содержащей 20 % эмбриональной сыворотки теленка и 20 мМ буфера
Hepes, помещают в лунки 96-луночных микролитровых пластин с объемом
лунки 200 мкл и инкубируют 24 ч при 37 "С. Затем добавляют исследуемое
соединение в различных концентрациях в объеме 100 мкл и инкубируют в
течение 48 ч при тех же условиях. После этого содержащую препарат среду
удаляют, в лунки добавляют 200 мкл среды без сыворотки, вносят 10 мкл
готового раствора МТТ (исходная концентрация 5 мг/мл в фосфатном
буфере) и дополнительно инкубируют в течение 4 ч. По окончании
инкубации удаляют среду из лунок и добавляют по 150 мкл диметилсульфоксида
(ДМСО) для растворения образовавшихся в результате реакции синих
кристаллов формазана. Оптическую плотность растворенного в ДМСО
формазана измеряют колориметрически на оптическом счетчике для
многолуночных планшетов при е = 570 нМ. Вычисляют величины ИК50 и ИК90
способом, указанным в п. 5.1.
-650-

3Н-тимидиновый тест
3Н-тимидиновый тест может выполняться с использованием дисков для
определения ЗНтимидина, включившегося в клетки, или с помощью
измерения радиоактивности кислотных гидролизатов кислотонерастворимой
фракции клеток (РКГКФ).
С использованием дисков
Исследуемое соединение растворяют в среде RPMI-1640, содержащей
20 мМ буфера Hepes, в концентрации, превышающей конечную в 4 раза.
Полученный раствор стерилизуют фильтрованием через мембранный
фильтр с d = 0,22 мк и делают серийные разведения в той же среде.
Суспензию опухолевых клеток разбавляют средой RPMI-1640 (+20 мМ Hepes)
до 3,2 х 105 кл/мл, распределяют по лункам в равных объемах по 50 мкл и
инкубируют в течение 24 ч при 37 оС. После этого в лунки вносят
растворы соединения по 50 мкл из расчета 4 измерения на одну исследуемую
концентрацию и продолжают инкубацию в течение 48 ч при 37 ОС. За 1 ч
до окончания инкубации в лунки вносят ЗН-тимидин аликвотами по 100
мкл до конечной концентрации 0,2 мкСи/мл. После инкубации клетки
собирают на диски из фильтровальной бумаги и промывают 10 раз
изотоническим раствором хлорида натрия на автоматическом сборщике клеток.
Высушенные диски помещают в сцинтилляционные флаконы, содержащие
3 мл сцинтиллятора, и с помощью жидкостного сцинтилляционного
счетчика подсчитывают радиоактивность в распадах в минуту на пробу.
Среднее значение для четырех измерений уровня радиоактивности при каждой
исследуемой концентрации выражают в процентах от контроля и
вычисляют ИК50 и ИК90.
С измерением РКГКФ
Опухолевые клетки в количестве 1,0—2,0 х 105 кл/мл в 2 мл среды
RPMI-1640 помещают в стеклянные флаконы с d = 2 см и инкубируют в
течение 24 ч при 37 ОС. Затем в инкубационную среду вносят исследуемое
соединение, растворенное в минимальном объеме среды (100 мкл), и
инкубируют в течение 48 ч в тех же условиях. За 1 ч до окончания инкубации
в образцы вводят специфический предшественник ДНК ЗН-тимидин
аликвотами по 100 мкл до конечной концентрации 1 мкСи/мл. По окончании
инкубации клетки промывают раствором Хенкса и 2,5 % НС104 и гидро-
лизуют в 5 % НС104 в течение 20 мин при 80 ОС. Образцы гидролизатов в
объеме по 0,1 мл помещают в сцинтилляционную жидкость ЖС-8.
Уровень радиоактивности проб (расп/мин) измеряют на жидкостном сцинтил-
ляционном счетчике, выражают в % к контролю и вычисляют значения
ИК50 и ИК90.

Методические указания по изучению специфической
активности фармакологических веществ, предлагаемых
для лечения гормонозависимых опухолей
СОСТАВИТЕЛИ: к. м. н. 3. С Смирнова;
д. м. н., проф. Г. К. Герасимова; д. м. н., проф.
А. М. Гарин; д. м. н. А. С. Соколова
1. Введение
К гормонозависимым опухолям относятся опухоли, происходящие из
клеток молочной железы, матки, яичников, предстательной железы,
щитовидной железы, надпочечников, гипофиза. За последнее десятилетие
показана гормональная зависимость опухолей желудочно-кишечного тракта,
меланомы, рака легкого, в лечении которых до последнего времени
гормональные препараты, как правило, не использовались.
В большинстве случаев основным принципом, на котором
основывается применение гормонотерапии, является устранение из организма
гормона или гормонов, стимулирующих рост данной опухоли, либо
нейтрализация их действия. В ограниченном числе случаев терапевтический эффект
гормонов определяется их прямым действием на опухолевые клетки. Если
до недавнего прошлого основным методом нейтрализации действия
гормонов было хирургическое удаление или лучевое разрушение эндокринных
желез, то в настоящее время главным образом применяются методы
фармакологического подавления продукции гормонов или нейтрализация их
эффекта. В зависимости от уровня, на котором действуют препараты, их
эффект может быть условно подразделен на центральный — подавление
продукции гипофизарных гормонов (периферические гормоны и их
производные, которые тормозят продукцию гормонов гипофиза по механизму
отрицательной обратной связи, а также гормоны гипоталамуса и их агони-
сты); периферический — снижение продукции гормонов в
периферических эндокринных железах или тканях (ингибиторы ферментов стероидо-
генеза) и клеточный — влияние на рецепцию гормонов в клетке за счет
конкурентного связывания с рецептором или изменения уровня
рецепторов (антигормоны).
В экспериментальной химиотерапии на всех этапах изучения
соединений с противоопухолевой активностью используется определенный набор
опухолей животных, чувствительных к химиопрепаратам разных классов.
Однако большинство таких опухолей нечувствительны к препаратам
гормональной природы. В то же время анализ данных литературы по
гормонотерапии опухолей человека показывает, что выбор определенной группы
гормонов для лечения первичных опухолей основан на данных о гормоно-
зависимости тканей-мишеней и возникающих в них опухолей, т. е. в
основе направленного противоопухолевого действия гормональных препаратов
лежат физиологические регулирующие свойства гормонов.
В связи с вышесказанным впервые разработаны методические
рекомендации для доклинического изучения новых лекарственных средств,
предназначенных для лечения гормонозависимых опухолей, а также критерии
значимости их терапевтического эффекта. Эти рекомендации учитывают
современное научное состояние экспериментальной и клинической
онкологии и, кроме того, отечественную материальную базу.
- 652-

2. Изучение специфической активности
В соответствии с задачами исследования и учитывая высокую
специфичность действия гормональных препаратов, их аналогов и
антигормонов, система изучения фармакологических веществ, предназначенных
для лечения гормонозависимых опухолей, включает три обязательных
этапа.
2.1. In vitro определение специфического связывания соединений с
рецепторами гормонов (РГ) в нормальных тканях экспериментальных
животных или в тканях опухолей животных и человека, содержащих
определенные РГ. Возможно также изучение влияния соединений на реакцию
опухолевых клеток в различных культурах гормонозависимых опухолей человека
или животных (РГ+ и РГ-).
2.2. Изучение гормонального действия in vivo на ткани-мишени с
использованием методов эндокринологического анализа.
2.3. Изучение противоопухолевых свойств на гормоночувствительных и
гормонозависимых опухолях
Для клинических испытаний могут быть рекомендованы оригинальные
соединения нового класса, аналоги известных лекарственных средств и
воспроизведенные вещества. Поэтому для каждой группы соединений
должны быть определены критерии эффективности фармакологических
веществ, передаваемых на клинические испытания.
Оригинальные соединения нового класса
Критерии эффективности
Соединение нового класса, рекомендуемое для клинического изучения,
должно соответствовать одному или более из следующих критериев:
• наличие высокого сродства к РГ in vitro ингибирование
специфического связывания с РГ 3[Н] — гормона соединением > 50 %, Kd >
1(Г8 М;
• влияние in vitro на реакцию опухолевых клеток гормонозависимых
опухолей человека или животных РГ+ и РГ" (стимулирующее или ин-
гибирующее действие в культурах РГ либо без эффекта в культурах
РГ или РГ);
• отсутствие или наличие гормонального (антигормонального) действия
на ткани-мишени in vivo;
• полная или частичная (на 50 % и более) регрессия ДМБА-индуциро-
ванных опухолей молочной железы крыс у > 50 % животных;
• частичная (на 50 % и более) регрессия рака яичников,
индуцированного по методу Бискиндов у > 50 % животных;
• торможение роста аденокарциномы предстательной железы R3327-H
>70%;
• торможение роста одной или более гормоночувсгвительных опухолей
мышей > 70 %;
• увеличение продолжительности жизни леченых животных с одной
или более гормоночувствительной опухолью мышей > 25 %;
• новый, ранее неизвестный механизм противоопухолевого действия;
• действие на ксенографты гормонозависимых опухолей человека у им-
мунодефицитных мышей (дополнительное исследование).
-653-

Аналоги известных противоопухолевых препаратов
Поиск аналогов известных противоопухолевых препаратов является
не менее актуальной задачей, чем создание новых фармакологических
веществ с ранее неизвестной структурой В этом случае необходимо
показать существенные преимущества предлагаемого на клинические
испытания аналога перед наиболее активным из этого ряда
соединением, доказательством которых может служить один из следующих
критериев:
• увеличение сродства к рецепторам гормонов in vitro > 20 % либо Kd
ниже хотя бы на один порядок по сравнению с прототипом;
• влияние in vitro на реакцию опухолевых клеток гормонозависимых
опухолей человека или животных РГ+ и РГ~ в дозе хотя бы на один
порядок ниже по сравнению с прототипом;
• отсутствие или снижение нежелательного гормонального эффекта,
наблюдаемого у препарата сравнения (например, вирилизм у
женщин, подвергающихся лечению андрогенами, либо феминизация у
мужчины при лечении эстрогенами и т. д.);
• статистически достоверное увеличение противоопухолевой
активности по любому из критериев (ТРО, УПЖ, регрессии, излечению);
• отсутствие или уменьшение токсических эффектов, характерных для
этой группы гормональных веществ (например, сердечно-сосудистые
нарушения при лечении эстрогенами либо нарушения функции
печени и почек при лечении андрогенами и т. д.);
• возможность использования новой лекарственной формы и/или
более удобного пути введения соединения;
• отличия в механизме действия и/или фармакокинетике.
Все исследования аналога проводятся параллельно с препаратом
сравнения (прототипом), используя те же модели и методы изучения для
выявления преимуществ перед прототипом.
Воспроизведенные зарубежные препараты
В результате сравнительного изучения воспроизведенного препарата с
зарубежным (любой доступной фирмы или зарегистрированным в РФ и
применяемым в клинике) в эквимолярных дозах должны быть получены
идентичные результаты по противоопухолевому и другим биологическим
эффектам.
2.1.1. Определение специфического связывания с рецепторами гормонов
Для оценки взаимодействия производных стероидных гормонов с
рецепторами используются нормальные ткани экспериментальных животных
(в основном крыс): матка, содержащая рецепторы эстрогенов и прогести-
нов; предстательная железа, в которой имеются рецепторы андрогенов;
печень, содержащая рецепторы глюкокортикоидов. Используется также
ткань гормонозависимых опухолей животных и человека, в которых
предварительно определяется содержание рецепторов стероидных гормонов с
помощью современных методов исследования [1].
Первоначально определяют содержание рецепторов стероидных
гормонов в нормальных тканях или опухолях. Нормальную или опухолевую
-654-

ткань замораживают жидким азотом и измельчают до порошка. Для
получения гомогената ткань экстрагируют 6 объемами Трис-НС1-буфера
(рН 7,4), содержащего 10 мМ Трис, 1,5 мМ ЭДТА, 0,5 тМ дитиотрейтола
и 10 % глицерина (по объему). Гомогенат центрифугируют на
ультрацентрифуге 1 ч при 100 000 g и в полученном супернатанте-цитозоле
определяют рецепторы стероидных гормонов.
Цитозоли инкубируют при 0—4°С в течение 18—20 ч с 3Н-эстрадиолом-
17р (РФ) для определения РЭ, с 3Н-прогестероном (РФ) или 3H-R-5020
(NEN) для определения РП, 3H-R-1881 (NEN) для определения РА и 3Н-
дексаметазоном (Amersham) для определения РГ. Для разделения
свободного VH-стероида и 3Н-гормон-рецепторного комплекса пробы
обрабатывают углем, покрытым декстраном.
Счет радиоактивности производят в жидкостном Р-счетчике. Белок
определяют методом Lowry [2].
Содержание рецепторов стероидных гормонов в цитозоле нормальных
тканей и в опухолях выражают в фемтомолях (фмоль) гормона,
специфически связанного 1 мг цитозольного белка. Эту величину рассчитывают по
формуле:
N = DPM общ - DPM несп х ,
КхОДхСб
где N — количество рецепторов (фмоль на 1 мг белка); DPM общ —
средняя величина общего (в отсутствии конкурента) связывания
меченого гормона в аликвоте надосадочной жидкости, получаемой после
осаждения угля (расп/мин); DPM несп — средняя величина
неспецифического (в присутствии конкурента) связывания в аналогичной аликвоте
(расп/мин); разность между этими величинами (DPM общ — DPM несп)
соответствует специфически связанному гормону; К — коэффициент
пересчета количества связанного гормона из расп/мин в фмоль, зависящий
от удельной радиоактивности 3[Н]-стероида; Сб — концентрация белка в
цитозоле (мг/мл).
Умножение на 2 связано с тем, что при добавлении суспензии угля,
покрытого декстраном, происходит двукратное разведение цитозоля.
Границей рецептороположительности условно считают 10 фмоль/мг
цитозольного белка.
Величину специфического связывания препарата (процент ингибирова-
ния специфического связывания 3[Н]-гормона препаратом) с рецепторами
стероидных гормонов (РГ) вычисляют по формуле:
И= В спец преп х ,„„ %
В спец горм
где И — ингибирование специфического связывания с РГ 3[Н]-гормона
препаратом; В спец преп — специфическое связывание гормона в
присутствии препарата; В спец горм — специфическое связывание гормона в
отсутствии препарата.
Показателем сродства препарата с рецептором является величина
равновесной константы диссоциации препарат-рецепторного комплекса (Kd).
Kd вычисляют по формуле:
Kd гормона
Kdnpen = 150 преп. х Kd гормона + L,
где Kd гормона — константа диссоциации гормон-рецепторного
комплекса; 150 преп и 150 гормона — концентрации препарата и гормона, на
- 655 -

50 % подавляющие специфическое связывание Н-гормона. Kd гормона
рассчитывают в координатах Scatchard; L — концентрация метки, при
которой определяется специфическое связывание препарата [3].
2.1.2. Изучение влияния на реакцию опухолевых клеток в различных культурах
гормонозависимых опухолей человека или животных (РГ" и РГ)
Исследование влияния in vitro на реакцию опухолевых клеток
гормонозависимых опухолей человека или животных РГ+ и РГ" может проводиться
различными методами (см. "Методические рекомендации по
доклиническому изучению противоопухолевой активности фармакологических
веществ", 1999).
2.2. Изучение специфического гормонального действия in vivo
на ткани-мишени
Изучение гормонального действия in vivo на ткани-мишени проводят с
использованием методов эндокринологического анализа [4]. Для
соединений с гормональной активностью биологические тесты часто позволяют
оценить не только специфичность гормонального действия, по и его
длительность.
2.2.1. Определение эстрогенной активности
• Определение эстрогенной утеротропной активности по увеличению
массы матки инфантильных крыс.
Для оценки эстрогенной активности исследуемых веществ используют
так называемый 3-дневный утеротропный тест, позволяющий
устанавливать степень активности препарата в зависимости от дозы. В опытах
используют 21—23-дневных неполовозрелых самок крыс смешанной
популяции массой тела 30—40 г, получающих в течение 3 дней подкожно или per
os в различных дозах масляные растворы исследуемых веществ и стандарта
(эстрон Эь либо эстрадиол — Э2, либо этинилэстрадиол ЭЭ2).
Контрольным животным вводят растворитель. В каждой группе не менее 8—10
животных. На 4-й день животных забивают декапитацией, матку извлекают и
взвешивают с точностью до 0,5 мг. Полученные результаты обрабатывают
статистически. Относительную активность исследуемых веществ
определяют в процентах от стандарта и вычисляют по формуле:
ЭА = -MSL • 100 %,
Мет
где ЭА — эстрогенная, утеротропная активность исследуемого соединения;
Мо — средняя масса матки (мг) в группе мышей, получавших исследуемое
соединение; Мет — средняя масса матки (мг) в группе мышей, получавших
стандарт (эстрон Эь либо эстрадиол — Э2, либо этинилэстрадиол ЭЭ2).
• Определение эстрогенной активности по появлению реакции течки у
кастрированных самок.
Для выявления течки у кастрированной самки крысы или мыши
необходимо однократное или двукратное введение под кожу масляного
раствора испытуемого вещества в количестве 1—5 мг. Для сравнения можно ис-
-656-

пользовать любой из выпускаемых промышленностью эстрогенных
препаратов (синэстрол, эстрадурин, этинилэстрадиол) либо гормон, входящий в
молекулу исследуемого соединения. Препарат сравнения вводят в той же
дозе и режиме введения.
До введения соединения у кастрированных самок следует ежедневно в
течение 2 нед брать влагалищные мазки, картина которых будет постоянно
соответствовать фазе покоя, если у животного полностью удалены
яичники. Продолжая ежедневно брать мазки во время и после введения
соединения, можно обнаружить на 3-й или 4-е сутки переход в состояние течки. В
зависимости от силы проявления эстрогеннои активности соединения у
неполовозрелых животных течка может быть либо кратковременной, либо
длительной. При низкой эстрогеннои активности и использовании доз
тестируемого соединения, близких к пороговым, реакция течки может
проявляться не у всех животных.
2.2.2. Определение антиэстрогенной активности
• Антиэстрогенную активность можно определять по уменьшению под
влиянием соединения массы матки в условиях стимуляции ее роста
эстрогеном у неполовозрелых животных.
Тестирование проводят на неполовозрелых мышах-самках массой тела
8—10 г смешанной популяции. Животные получают в течение 3 дней
ежедневно 0,1 мл спирто-масляного раствора (1:10) эстрона (суммарная доза —
1 мкг/жив) подкожно одного или в комбинации с 0,2 мл раствора
тестируемого соединения в различных дозах. Контрольная группа получает
инъекции растворителя. В группах используют не менее 8 животных. На 4-й
день животных забивают декапитацией, матки выделяют, очищают от
соединительной ткани и взвешивают с точностью до 0,5 мг. Результаты
выражают в миллиграммах массы матки.
Процент подавления активности эстрона вычисляют по формуле:
ИЭ = Мэ ~ Мэ+С х юо %,
Мэ - Мк
где ИЭ — ингибиция гормонального эффекта эстрона; Мэ — средняя
масса матки (мг) в группе мышей, получавших эстрон; Мэ+с — средняя масса
матки (мг) в группе мышей, получавших эстрон и тестируемое соединение;
Мк — средняя масса матки (мг) в контрольной группе.
• Оценка антиэстрогенной активности по торможению естественной
реакции течки у самок-мышей или крыс.
У мышей или крыс 2,5-месячного возраста и старше (включая
плодоносящий период) ежедневно берут влагалищные мазки в одно и то же время
суток в течение 2 нед до введения вещества. Под микроскопом определяют
дни течки (эструс). Нециклирующих животных и с единичными днями
течки из опыта исключают. Остальных делят на группы (по 5—7 опытных
и 6—10 контрольных) и начинают введение соединения в различных дозах
в течение 10 дней, продолжая ежедневно брать мазки. Динамику течки
наблюдают еще в течение 4 нед. Расчет активности производят по
изменению среднего количества эстральных дней до, во время и после введения
соединения за равные промежутки времени 14 дней (время, равное трем
циклам), условно называя это число индексом течки — ИТ.
• Определение антиэстрогенной активности по эффекту химической
кастрации мышей-самок.
-657-

Испытуемое соединение вводится подкожно в течение 10 дней, после
чего оценивается репродуктивная способность самок по количеству родов
за год в сравнении с контрольными самками. Эффект химической
кастрации (ЭХК) вычисляется по формуле:
ЭХК = М5 х ЮО %,
Nk
где No — количество самок в опытной группе, у которых не было родов за
год; Nk — количество рожавших самок в контрольной группе.
2.2.3. Определение андрогенной активности
Андрогенную активность соединения определяют на кастрированных
крысятах массой 50—70 г по изменению массы вентральной доли
предстательной железы или семенных пузырьков. Испытуемое соединение в 2—3
дозах вводится в течение 10 дней. Через 10 дней крыс забивают, вьщеляют
вентральную долю предстательной железы, а также семенные пузырьки и
взвешивают.
Величину активности выражают в виде индексов — отношение
относительной массы соответствующих органов в опытной группе к таковой в
контроле, которую принимают за единицу и вычисляют по формуле:
Андрогенный индекс = —°-
Мк
где Мо — средняя масса предстательной железы или семенных пузырьков
(мг) в группе мышей, получавших исследуемое соединение; Мк — средняя
масса предстательной железы или семенных пузырьков (мг) в контрольной
группе мышей, получавших растворитель. Для сравнительной оценки
андрогенной активности испытуемого соединения с сильным андрогеном в
качестве последнего обычно используют тестостерон, который вводят
подкожно в течение 10 дней в дозе 2 мг на крысу. В этом случае за единицу
принимают относительную массу вентральной доли предстательной
железы или семенных пузырьков крыс, получавших тестостерон, и вычисляют
по той же формуле.
2.2.4. Определение анаболической активности
Для оценки способности веществ усиливать процессы анаболизма
белков используют метод, основанный на миотропном действии тестируемых
соединений. У самцов крыс после кастрации значительно уменьшается, а
под влиянием андрогенов увеличивается масса мышцы "поднимающей
задний проход" (m. levator ani). Поэтому этот эффект используют для оценки
анаболического действия испытуемых соединений, которые вводятся в
различных дозах в течение 10 дней.
Величину активности также выражают в виде индекса отношения
относительной массы m. levator ani в опытной группе к таковой в контрольной
группе кастрированных крыс, которую принимают за 1 и вычисляют по
формуле:
Анаболический индекс = —- ,
Мк
-658-

где Мо — средняя масса m. levator ani (мг) в группе мышей, получавших
исследуемое соединение; Мк — средняя масса m. levator ani (мг) в
контрольной группе мышей, получавших растворитель.
2.2.5. Определение антиандрогенной активности
• Антиандрогенное действие соединения обычно оценивают по
изменению массы вентральной доли предстательной железы, семенников и
семенных пузырьков. Опыты проводят на половозрелых
крысах-самцах. Испытуемое соединение вводится подкожно в 2—3 дозах в
течение 10 дней. Антиандрогенная активность определяется по
уменьшению массы вентральной доли предстательной железы, семенных
пузырьков и семенников по сравнению с таковой у контрольных
животных. По окончании введения соединения животных забивают,
указанные органы взвешивают и вычисляют их относительную массу на
единицу массы тела. Величину антиандрогенной активности
оценивают в процентах по отношению к контролю.
• Эффект химической кастрации мышей-самцов.
Испытуемое соединение вводится самцам в течение 10 дней. Затем
самцы ссаживаются с самками. Эффект химической кастрации мышей-самцов
оценивается по репродуктивной способности самок, а именно по
количеству родов за год в сравнении с контрольными самками. Эффект
химической кастрации (ЭХК) вычисляется по формуле:
ЭХК ^ х юо %,
Nk
где No — количество самок в опытной группе, у которых не было родов за
год; Nk — количество рожавших самок в контрольной группе.
2.2.6. Определение кортикостероидной активности
Как известно, надпочечники являются жизненно необходимыми
органами, так как их удаление через определенное время приводит к гибели
животных. Изучение кортикостероидной активности проводят на адре-
налэктомированных крысятах 3—4-недельного возраста, которым вводят
соединение в различных дозах в течение 5 дней. Животных наблюдают
до их гибели, причем ежедневно отмечают массу тела и общее их
состояние. Эффект оценивают в конце наблюдения по проценту погибших к
общему числу оперированных животных в опыте по сравнению с
контролем, а также по средней продолжительности жизни погибших крыс после
операции.
2.2.7. Определение прогестиновой активности
• Определение прогестиновой утеротропной активности по увеличению
массы матки у овариэктомированных крыс-самок.
Изучение прогестиновой активности исследуемого соединения
проводят на овариэктомированных самках крыс по изменению массы матки.
В группах используют не менее 10 животных. Через 24 ч после окончания
3—4-дневного введения соединения крыс забивают декапитацией, выделя-
- 659-

ют матки, очищают от соединительной ткани и взвешивают с точностью
до 0,5 мг. Относительную активность исследуемых соединений определяют
в процентах от контроля и вычисляют по формуле:
ПА = М? х юо %,
Мк
где ПА — прогестиновая утеротропная активность исследуемого
соединения; Мо — средняя масса матки (мг) в группе мышей, получавших
исследуемое соединение; Мк — средняя масса матки (мг) в контрольной группе
мышей, получавших растворитель.
• Оценка прогестиновой активности по торможению естественной
реакции течки у самок мышей или крыс.
У мышей или крыс 2,5-месячного возраста и старше (включая
плодоносящий период) ежедневно берут влагалищные мазки в одно и то же время
суток в течение 2 нед до введения вещества. Под микроскопом определяют
дни течки (эструс). Нециклирующих животных и с единичными днями
течки из опыта исключают. Остальных делят на группы (по 5—7 опытных
и 6—10 контрольных) и начинают введение соединения в различных дозах
в течение 10 дней, продолжая ежедневно брать мазки. Динамику течки
наблюдают еще в течение 4 нед. Расчет активности производят по
изменению среднего количества астральных дней до и после введения вещества
за равные промежутки времени — 14 дней (время, равное трем циклам),
условно называя это число индексом течки — ИТ.
2.3. Изучение противоопухолевой активности на гормоночувствительных
и гормонозависимых моделях опухолей
При изучении противоопухолевой активности соединений с
предполагаемым действием на гормонозависимые опухоли используют ряд
известных моделей опухолей, возникающих в тканях-мишенях для гормонов:
перевиваемые, ортотопические и индуцированные. Для изучения
противоопухолевых свойств веществ с различной физиологической
направленностью и механизмом действия составлены наборы опухолей,
позволяющие вести отбор новых оригинальных препаратов с желаемым
гормональным действием. Учитывая отечественную материальную базу,
наборы опухолей для изучения противоопухолевой активности соединений с
предполагаемым действием на гормонозависимые опухоли содержат как
гормонозависимые опухоли, адекватные опухолям человека (ДМБА-ин-
дуцированные опухоли молочной железы, перевиваемая аденокарцинома
предстательной железы Dunning R3327-H, рак яичников,
индуцированный по методу Бискиндов), так и гормоночувствительные перевиваемые
опухоли мышей. Гормонозависимыми следует считать опухоли,
сохраняющие способность реагировать на изменение уровня эндогенных
гормонов, причем реагировать соответственно реакции нормальной ткани,
исходной для данной опухоли. Тогда как гормоночувствительными
называются опухоли, обладающие свойством реагировать на вводимые извне
гормоны [5].
-660-

2.3. Рекомендуемые модели опухолей
2.3.1. Для соединений с эстрогенной активностью
• Высокометастазирующий рак ВМР-П *.
Происходит от спонтанной аденокарциномы молочной железы мышей
A/snell [6]. Характеризуется высокой частотой поражения органов,
связанных с продукцией и метаболизмом стероидных гормонов: яичников
(81 %), матки (75 %), надпочечников (85 %). Опухоль содержит РЭ
(8,4 ± 2,4 фмоль/мг белка), РП (14,6 ± 8,3 фтоль/мг белка) и РГ
(19,9 ± 3,2 фмоль/мг белка). Для перевивки опухолевую ткань измельчают
ножницами до гомогенной консистенции, добавляют среду 199 до
соотношения 1:10 и 0,5 мл полученной суспензии, что составляет приблизительно
50 мг опухолевой массы, вводят подкожно в область правой подмышечной
впадины мышам линии A/snell массой 18—20 г [7]. Штамм поддерживается
на мышах-самках линии A/snell. Начало лечения — через 48 ч после
перевивки. Курс лечения ежедневный в течение 5 или 10 дней.
Противоопухолевый эффект оценивается по торможению роста опухоли в течение 21—30
дней. Наблюдение за мышами проводится до их гибели для оценки
противоопухолевого эффекта препарата по увеличению продолжительности
жизни по сравнению с контролем.
• Перевиваемая аденокарцинома предстательной железы Dunning
(R3327-H) крыс линии Copenhagen**.
В 1961 г. Dunning обнаружил аденокарциному предстательной железы у
старой крысы Copenhagen [8]. Эта опухоль была перевита подкожно крысам
той же линии, и от нее было получено более 10 сублиний, в том числе анд-
рогенозависимая, медленнорастущая аденокарцинома R3327-H. Штамм
поддерживается на крысах-самцах Copenhagen. Опухоль характеризутся
наличием РА (39,7 ± 2,4 фмоль/мг белка) и РЭ (8,1 ± 1,3 фмоль/мг белка).
Перевивается под гексеналовым наркозом кусочком опухоли 5 мм3 через разрез на
правом боку крысам-самцам массой тела 200—250 г. Через 60 дней
начинается рост опухолей. Начинают лечение крысы при достижении объема
опухоли 1400—1500 мм3. Курс лечения обычно длительный, непрерывный до 60
дней (для антиандрогенов), либо прерывистый (для гормоноцитостатиков
или эстрогенов). Противоопухолевый эффект оценивается по торможению
роста опухоли. Наблюдение за крысами зависит от длительности сохранения
противоопухолевого эффекта после окончания лечения, но не менее 10 нед.
Рак яичников, индуцированный по методу Бискиндов. Опухоли яичников,
главным образом гранулезоклеточные, иногда лютеомы или смешанные,
индуцируют у кастрированых самок-мышей или крыс 2—3-месячного возраста
путем трансплантации части яичника под капсулу селезенки [9]. Для
индукции используют мышей и крыс различных линий и гибридов, а также
беспородных. Опухоли возникают через 6—7 мес у мышей и через 10—11 мес у
крыс. Измеряют опухоли при лапаротомии. Лечение начинают, когда
опухоли достигают определенных размеров: у мышей — 150 мм3, а у крыс — 1500
мм3. Курс лечения не менее 20 дней. Оценивают противоопухолевый эффект
по регрессии опухолей непосредственно после окончания лечения и
отдаленный эффект спустя 4 и/или 8 нед, а также при лапаротомии.
*Все указанные модели перевиваемых опухолей мышей имеются в Банке опухолевых
штаммов РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН.
**R3327-H поддерживается в отделе экспериментальной химиотерапии опухолей РОНЦ
им. Н. Н. Блохина РАМН.
-661 -

2.3.2. Для соединений с антиэстрогенной активностью
• Эпидермоидная карцинома легкого Льюис (LLC, 3LL). Карцинома
легких возникла спонтанно у мышей С57В16 в 1951 г [10, 11].
Характеризуется высокой частотой метастазирования в легкие. Опухоль
содержит РЭ (19,6 ± 8,3 фмоль/мг белка) и РА (16,4 ± 10,3 фмоль/мг
белка). Для перевивки опухолевую ткань измельчают ножницами до
гомогенной консистенции, добавляют среду 199 до соотношении 1:10
и 0,5 мл полученной суспензии, что составляет приблизительно 50 мг
опухолевой массы, вводят подкожно в область правой подмышечной
впадины мышам-самцам линии C57BL6 или гибридам BDF, [DBA x
C57BL6] массой 18—20 г. Штамм поддерживается на мышах-самцах
линии C57BL6. Начало лечения — через 48 ч после перевивки опухоли.
Курс лечения — ежедневное введение в течение 5 или 10 дней.
Противоопухолевый эффект оценивается по торможению роста опухоли в
течение 21—30 дней. Наблюдение за мышами проводится до их
гибели с целью оценки противоопухолевого эффекта по увеличению
продолжительности жизни подопытных животных по сравнению с
контрольными.
• ДМБА-индуцированные опухоли молочной железы крыс [12].
Индукция опухолей осуществляется четырехкратным еженедельным
внутривенным введением ДМБА в водно-жировой эмульсии в суммарной
дозе 8 мг на крысу. Опухоли индуцируют у крыс-самок линии Wistar
и реже у беспородных начиная с 55-дневного возраста.
ДМБА-индуцированные опухоли молочной железы крыс содержат РЭ (17,3 ± 5,5
фмоль/мг белка), РП (39,6 ± 16,3 фмоль/мг белка), РГ (12,1 ± 3,4
фмоль/мг белка) и РА (13,4 ± 2,4 фмоль/мг белка). Лечение
начинают по достижении объема первичной опухоли не менее 2500 мм,
когда опухоли практически не подвергаются спонтанной регрессии.
Курс лечения не менее 30 дней. Противоопухолевый эффект
оценивается по частичной или полной регрессии первичной опухоли.
Наблюдение за животными зависит от длительности
противоопухолевого эффекта после окончания лечения, но не менее 10 нед.
2.3.3. Для соединений с прогестиновой активностью
• Рак шейки матки РШМ-5 при ортотопической перевивке. Опухоль
первоначально индуцирована метилхолантреном в подкожном ауто-
трансплантате шейки матки мыши-СВА в 1970 г [13]. Опухоль
перевивается при лапаротомии кусочком опухоли размером 1 мм в один
из рогов матки с помощью троакара. При перевивке используются
мыши линии СВА массой 18—20 гр, находящиеся под гексеналовым
наркозом. РШМ-5 при ортотопической перевивке содержит РЭ
(9,3 ± 1,9 фмоль/мг белка), РП (16,9 ± 3,8 фмоль/мг белка) и РГ
(24,6 ± 4,9 фмоль/мг белка). Штамм поддерживается на
мышах-самках линии СВА. Начало лечения — на 5-й день после перевивки
опухоли. Курс лечения — ежедневное введение в течение 10 дней. Забой
мышей производится на 18-й день от начала опыта.
Противоопухолевый эффект оценивается по торможению роста опухоли (изменению
массы опухоли).
• Рак яичников, индуцированный по методу Бискиндов (см. 2.3.1).
• ДМБА-индуцированные опухоли молочной железы крыс (см. 2.3.2).
-662-

2.3.4. Для соединений с андрогенной активностью
• Эпидермоидная карцинома легкого Льюис (LLC, 3LL) (см. 2.3.2).
• Рак яичников, индуцированный по методу Бискиндов (см. 2.3.1).
• ДМБА-индуцированные опухоли молочной железы крыс (см. 2.3.2).
2.3.5. Для соединений с антиандрогенной активностью
• Перевиваемая аденокарцинома предстательной железы Dunning
(R3327-H) крыс линии Copenhagen (см. 2.3.1).
2.3.6. Для соединений с глюкокортикоидной активностью
• Аденокарцинома молочной железы Са-755. Са-755 получена в 1936 г.
от спонтанной опухоли молочной железы у мыши-самки линии
C57BL<; [14]. Опухоль содержит РЭ (10,3 ± 1,9 фмоль/мг белка), РП
(13,9 ± 2,1 фмоль/мг белка) и РГ (15,9 ± 1,5 фмоль/мг белка). Для
перевивки опухолевую ткань измельчают ножницами до гомогенной
консистенции, добавляют среду 199 до соотношения 1:10 и 0,5 мл
полученной суспензии, что составляет приблизительно 50 мг
опухолевой массы, вводят подкожно в область правой подмышечной
впадины мышам-самкам линии C57BL6 или гибридам BDF! [DBA x С57В1^]
массой 18—20 г. Штамм поддерживается на мышах-самках линии
C57BL6. Начало лечения — через 48 ч после перевивки опухоли. Курс
лечения — ежедневное введение в течение 5 дней.
Противоопухолевый эффект оценивается по торможению роста опухоли в течение
21—30 дней. Наблюдение за мышами проводится до их гибели с
целью оценки противоопухолевого эффекта по увеличению
продолжительности жизни подопытных животных по сравнению с
контрольными.
• Меланома В-16. Опухоль возникла в 1954 г. спонтанно в коже мыши
C57BL|5 около глаза [15]. Опухоль содержит РП (17,2 ± 5,1 фмоль/мг
белка) и РГ (19,2 ± 3,1 фмоль/мг белка). Для перевивки опухолевую
ткань измельчают ножницами до гомогенной консистенции,
добавляют среду 199 до соотношения 1:10 и 0,5 мл полученной суспензии,
что составляет приблизительно 50 мг опухолевой массы, вводят
подкожно в область правой подмышечной впадины мышам линии С57В1^
или гибридам BDF\ [DBA x C57BL6] массой 18—20 г. Штамм
поддерживается на мышах линии C57BL6. Начало лечения — через 48 ч после
перевивки опухоли. Курс лечения — ежедневное введение в течение 5
дней. Противоопухолевый эффект оценивается по торможению роста
опухоли в течение 21—30 дней. Наблюдение за мышами проводится
до их гибели с целью оценки противоопухолевого эффекта по
увеличению продолжительности жизни подопытных животных по
сравнению с контрольными.
• Аденокарцинома толстой кишки АКАТОЛ. В 1971 г. опухоль возникла
из подкожного сингенного трансплантата толстой кишки эмбриона у
мыши BALB/c [16]. Опухоль содержит РП (18,8 ± 6,2 фмоль/мг
белка) и РГ (31,5 ± 6,2 фмоль/мг белка). Для перевивки опухолевую
ткань измельчают ножницами до гомогенной консистенции,
добавляют среду 199 до соотношения 1:10 и 0,5 мл полученной суспензии,
-663-

что составляет приблизительно 1 х Юб опухолевых клеток (50 мг
опухолевой массы), вводят подкожно в область правой подмышечной
впадины мышам-самцам линии BALB/c массой 18—20 г. Штамм
поддерживается на мышах линии BALB/c. Начало лечения — через 48 ч
после перевивки опухоли. Курс лечения — ежедневное введение в
течение 5 дней. Оценка противоопухолевого эффекта осуществляется
по торможению роста опухоли до его окончания. Затем мышей
забивают.
2.3.7. Для агонистов и аналогов гормонов гипоталамуса (RH-LH
и соматостатина)
ДМБА-индуцированные опухоли молочной железы крыс (см. 2.3.2).
Перевиваемая аденокарцинома предстательной железы Dunning
(R3327-H) крыс линии Copenhagen (см. 2.3.1).
2.3.8. Для гормоноцитостатиков, обладающих двойным механизмом действия
— цитотоксическим и гормональным
• Две-три модели перевиваемых опухолей, используемых для оценки
противоопухолевых свойств цитостатиков (см. "Методические
рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой
активности фармакологических веществ, предлагаемых для испытания в
клинике", 1999).
• Опухоли, используемые для изучения противоопухолевой активности
препаратов с определенной гормональной направленностью.
3.2. Критерии оценки противоопухолевого эффекта
Торможение роста опухоли (%)
Проводится измерение трех максимальных взаимно перпендикулярных
размеров (длина, ширина и высота) у каждого животного и вычисляется
объем опухоли, а затем средний объем опухоли в группе. Измерение
объема перевиваемых опухолей у мышей проводится через каждые 5 дней, а у
крыс 1 раз в неделю.
V(mm3) = L x S х н,
где L, S, Н — длина, ширина и высота опухолевого узла (мм)
Торможение роста опухоли (ТРО, %) вычисляется по формуле:
ТРО = Vk~Vo х юо %,
где Vk — средний объем опухоли в контрольной группе на определенный
срок измерения (мм3); Vo — средний объем опухоли в опытной группе на
определенный срок измерения (мм3).
-664-

Регрессия роста опухоли (%)
На ДМБА-индуцированных опухолях молочной железы и раке
яичников, индуцированном по методу Бискиндов, вычисляют регрессию роста
опухоли. Также проводится измерение трех максимальных взаимно
перпендикулярных размеров опухоли (длина, ширина и высота) у каждого
животного и вычисляется объем опухоли. Регрессия роста опухоли
вычисляется у каждого животного в группе. Измерение объема
ДМБА-индуцированных опухолей молочной железы у крыс проводится 1 раз в неделю, а в
случае индуцированных опухолей яичников — непосредственно после
курса лечения и/или через 4 и 8 нед после окончания лечения (при лапарото-
мии):
V(mm3) = L х S х Н,
где L, S, Н — длина, ширина и высота опухолевого узла (мм).
Регрессия роста опухоли (%) вычисляется по формуле:
Регрессия = Уи ~ Vt x 100 %,
Vh
где Vt — объем опухоли у животного на определенный срок измерения;
Уи — исходный объем опухоли у животного перед началом лечения.
Увеличение продолжительности жизни (УПЖ, %)
Сравнительная оценка терапевтического эффекта по
продолжительности жизни подопытных и контрольных животных проводится после гибели
всех животных от опухолевого процесса, после чего определяется средняя
продолжительность жизни (СПЖ, дни) в опытной и контрольной группах
и вычисляется УПЖ (%).
1. УПЖ = СПЖо ~ СПЖк х 100 %
СПЖо
Т/с = СПЖо х 100 %
1 СПЖк
где СПЖк — средняя продолжительность жизни животных в контрольной
группе (дни); СПЖо — средняя продолжительность жизни животных в
опытной группе.
Излечение животных от опухоли (%)
Этот эффект оценивается не ранее чем через 90 дней после начала
опыта. Определяется количество животных без признаков заболевания, для
чего животных забивают, подвергают макроскопическому исследованию и
вычисляют процент излеченных животных по формуле:
Число излеченных животных
Излечение = Общее число животных в группе х 10° %-
-665-

4. Изучение способа применения
4.1. Определение терапевтической дозы
Большинство соединений с гормональной активностью являются
нерастворимыми в воде соединениями и на первых этапах исследования in vivo
вводятся либо в виде масляной эмульсии подкожно, либо в виде суспензии
в 1 % крахмальном клейстере per os или внутрибрюшинно. Учитывая нашу
материальную базу, выбор терапевтической дозы сначала проводится на
мышах с гормоночувствительными опухолями с использованием не менее
5—6 курсовых доз. Далее разрабатывается прототип лекарственной формы
(подбираются фармакопейные растворители) и на гормонозависимых
опухолях крыс отрабатывается терапевтическая доза, учитывая индекс
пересчета дозы на крыс, при использовании уже 2—3 доз.
4.2. Выбор оптимального пути введения
Для достижения максимального терапевтического эффекта прототип
лекарственной формы соединения вводится в организм разными способами
с целью выбора наиболее оптимального пути введения.
Возможные пути введения:
• Подкожный путь. Соединение вводится под кожную складку на
спине или на боку животного. Объем вводимого препарата < 0,2
мл/инъекцию мышам и < 0,3 мл/инъекцию крысам.
• Внутримышечный путь. Объем вводимого соединения < 0,15
мл/инъекцию мышам и < 0,3 мл/инъекцию крысам.
• Внутривенный путь. Объем вводимого соединения в хвостовую вену
или супраорбитальный синус : < 0,5 мл/инъекцию мышам и < 1,0 мл/
инъекцию крысам.
• Пероральный путь. Объем вводимого в желудок соединения с
помощью зонда < 1,0 мл мышам и < 1,5 мл крысам.
• Ректальный путь. Объем вводимого ректально соединения < 0,5 мл/
введение мышам и < 1,0 мл/введение крысам.
• Интраназальный. Объем вводимого интраназально соединения < 0,1
мл/введение крысам.
4.3. Выбор оптимальной схемы применения
Оптимальная схема применения определяется эмпирически на
высокочувствительной модели опухоли и при проведении нескольких
экспериментов. Оптимальная схема применения соединения обычно выбирается
при учете данных фармакокинетики препарата и его биодоступности.
Выбранная оптимальная схема применения соединения имеет большое
значение для проведения токсикологического исследования и рекомендуется
для проведения одной фазы клинических испытаний.
4.4. Изучение действия на опухоли человека, растущие
у иммунодефицитных мышей (дополнительные модели опухолей)
В настоящее время в РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН создана
коллекция из 12 штаммов опухолей человека, трансплантируемых на бестимус -
-666-

ных мышах: рак желудка, рак толстой кишки, рак печени, рак молочной
железы, хорионэпителиомы, рак гортани, рак легкого, опухоль Вильмса,
рак почки, саркома Юинга, меланомы [17].
Опухоли перевиваются подкожно не менее 1,2 млн клеток/мышь.
Начало лечения — на 5—8-е сутки. Оценка противоопухолевого эффекта — по
торможению роста опухоли. Наблюдение за мышами проводится в течение
21 дня.
4.5. Сравнительное изучение субстанции и лекарственной формы
Исследование проводится в одном опыте на 1—2 наиболее
чувствительных опухолях при оптимальной схеме применения соединения в двух дозах.
5. Статистическая обработка
Группы формируются с учетом получения статистически достоверных
результатов: контрольная группа должна состоять не менее чем из 10,
опытная группа — 8 животных. Опыт должен быть повторен не менее двух
раз.
При статистической обработке результатов опытов, проведенных на
опухолях, характер роста которых подчиняется законам нормального
распределения, возможно применение параметрических методов статистики:
метод Стьюдента—Фишера, критерий %2. В остальных случаях
используется любой непараметрический метод (парный критерий Вилкоксона,
критерий Q и т. д.).
Результаты считаются статистически значимыми при р < 0,05.
Заканчивается доклиническое изучение написанием "Отчета в
Фармакологический комитет МЗ РФ по изучению специфической активности
фармакологического средства для лечения гормонозависимых опухолей,
предлагаемого для испытания в клинике".
Содержание Отчета в Фармакологический комитет МЗ РФ
Обязательная часть
• Данные in vitro о сродстве к рецепторам гормонов или о влиянии на
реакцию одной или нескольких культур опухолевых клеток
гормонозависимых опухолей животных или человека.
• Данные о гормональном эффекте in vivo.
• Данные о противоопухолевом эффекте.
• Зависимость противоопухолевого эффекта от дозы, диапазон
терапевтических доз.
• Выбор оптимального пути введения и обоснование лекарственной
формы.
• Данные об идентичности по противоопухолевой эффективности
субстанции и предлагаемой лекарственной формы препарата (на 1—2
опухолях).
• Данные об особенностях механизма действия (в том случае, если эти
особенности являются основанием для предклинического изучения и
продвижения препарата на клинические испытания).
-667-

Желательно включить в Отчет:
• Данные о механизме действия или предположение о возможном
механизме действия препарата.
• Сведения о динамике роста наиболее чувствительной опухоли в
течение всего периода наблюдения.
• Действие на опухоль человека у иммунодефицитных мышей.
• Данные о действии препарата на клеточный цикл.
Литература
1. Бассалык Л. С, Дегтярь В. Г. Рецепторы стероидных гормонов. — М., 1987. —
С. 19-29.
2. Lowry О., П., Rozenbroungli N. J., Fair U. I., Randall R. J. Protein measurement with fo-
lin phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.
3. Cheng J. C, Pmsoff W. H. Relationship between the inhibition constant (K.i) and the
concentration of inhibitor which causes 50 percent inhibition (I 50) of an enzymatic
reaction // Biochem. Pharm. - 1973. - Vol. 22. - P. 3099-3108.
4. Кабак Я. М. Практикум по эндокринологии. — М.: Изд-во Московского
Университета, 1968. — 275 с.
5. Лазарев Н. И., Шароухова К. Д., Гончарова М. Г. и др. Механизмы
противоопухолевого действия гормонов. — М.-. Медицина, 1974. — 168 с.
6. Сенин В. М. Новые органотропно-метастазирующие опухоли мышей и их
использование для изучения влияния лазерного излучения на процесс диссеминации //
Вестник АМН СССР. - 1984. - № 5. - С. 85-91.
7. Софьина 3. П. Методика первичного отбора соединений с противоопухолевой
активностью // Вопр. онкол. — 1976. — № 4. — С. 82—96.
8. Smolev J. К., Heston W. D. W., Scott W. W., Coffey D. S. Characterization of the
Dunning R3327 H prostatic adenocarcinoma: an appropriate animal model foi prostatic cancer
// Cancer Treat. Rep. - 1977. - Vol. 61. - P. 273-287.
9. Biskind G. R., Biskind M. S. Experimental ovarian tumours in rats // J. Clin. Pathol. —
1949. -Vol. 19. - P. 501-521.
10. Mayo J. G. Biological characterization of the subcutaneously implanted Lewis lung tumor
// Cancer Chemother. Rep. — 1972. — Part. 2. — Vol. 3, N 1. — P. 325—330.
11. Sugiura K., Stock С Ch. Studies in a Tumor Spectrum. III. The Effect of Phosphoramides
on the Growth of a Variety of Mouse and Rat Tumors // Cancer Res. — 1955. — Vol. 15,
N 1. -P. 38-51.
12. Huggins Ch., Briziarelly G., Suton H. Rapid induction of mammary carcinoma in the rat and
the iaflutnce of hormones on the tumors // J. Exp. Med. — 1959. — Vol. 109, N 1. — P.
25-41.
12. Аманджолов В. С, Ирд Е. А., Софьина 3. П. Характеристика перевиваемого рака
шейки матки (РШМ-5) // Вопр. онкол. — 1972. — Т. 18. — № 5. — С. 96—98.
13. Dunham L. J., Stevart H. L. A survey of transplantable and transmissible animal tumors // J.
Nat. Cancer Inst. — 1953. — Vol. 13, N 5. — P. 1299—1377.
14. Geran R. S., Greenberg N. H., Macdonald M. M. Protocols for screening chemical agents
and natural products against animal tumors and other biological systems // Cancer
Chemother. Rep. - 1972. - Part. 33. - Vol. 3, N 2. - P. 9-11.
15. Зинзар С Н., Лейтина Б. И., Тунян Б. Г. Злокачественные опухоли, возникшие из
сингенных трансплантатов эмбрионального желудочно-кишечного тракта // Вопр.
онкол. - 1972. - Т. 18. - № 4. - С. 89-92.
16. Ревазова Е. С, Соловьев Ю. Н. Штаммы опухолей человека, трансплантируемые на
бестимусных мышах и крысах. — БЭБМ. — 1985. — № 2. — С. 189—191.

Методические рекомендации по доклиническому изучению
средств, способных ингибировать рецндивирование
злокачественных опухолей
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н. А. М. Козлов; к. б. н.
Н. М. Перетолчина; к. б. н. С. М. Киселев;
Н. С Сапрыкина; д. б. н. Л. М. Михайлова.
Ответ, ред.: проф. А. Ю. Барышников
Введение
Рецндивирование опухолей после хирургического удаления наряду со
способностью к метастазированию является одним из ключевых признаков
их злокачественности. Предотвращение рецидивирования — большая
проблема хирургического лечения злокачественных новообразований разного
гистогенеза и локализаций.
В основе рецидивирования злокачественных клеток лежит способность
опухолевых клеток к инвазивному росту и их подвижность. Опухолевые
клетки продуцируют активные протеолитические ферменты, такие как
активаторы плазминогена и металлопротеиназы матрикса, способные
деградировать базальные мембраны кровеносных сосудов и многие компоненты
экстрацеллюлярного матрикса. В результате локального протеолиза
опухолевые клетки разрушают прилежащие участки здоровых тканей и
занимают их пространство. При этом нарушаются межклеточные адгезивные
контакты, происходит дезинтеграция структуры опухолевой ткани.
Освободившись от межклеточных адгезивных контактов, злокачественные клетки под
влиянием хемоаттрактантных стимулов, опосредованных многими цитоки-
нами и другими физиологически активными молекулами микроокружения,
проникают в здоровые, неповрежденные ткани на значительное
расстояние от клинически и морфологически верифицированных зон
неопластического поражения.
Так же очевиден вклад в феномен рецидивирования невозможности
абсолютной абластичности выполняемой в каждом конкретном случае
хирургической манипуляции.
Хирургическое удаление опухоли в большинстве случаев не гарантирует
достижения принципа радикализма операции. Сохранившиеся в зоне
хирургического вмешательства опухолевые клетки являются причиной
возникновения рецидивных опухолей. Рецидивы могут появляться как в
ближайшее время, так и в отдаленные сроки после проведения хирургического
вмешательства
Локально-диссеминированые опухолевые клетки, остающиеся в
пораженном органе в зоне хирургического вмешательства, ввиду
гетерогенности клеточной популяции первичного опухолевого узла могут различаться
по многим признакам нормального и злокачественного фенотипа, что
наряду со многими другими факторами создает предпосылки формирования
значительных и разнообразных отличий первичных и рецидивных
опухолей.
Рецидивные опухоли могут отличаться от первичных опухолей по
степени плоидности клеток, параметрам клеточного цикла, экспрессии
мембранных биорегуляторных молекул (адгезивные молекулы, опухолеассо-
циированные и дифференцировочные антигены, проапоптические молеку-
-669-

лы и др.), и это определяет их разную чувствительность к терапевтическим
воздействиям.
Таким образом, различия первичных и рецидивных опухолей к
системным терапевтическим воздействиям могут наблюдаться у больных, не
получавших ранее химиотерапии.
Опухолевые клетки, оставшиеся в зоне хирургического вмешательства,
оказываются под воздействием факторов воспалительной реакции. Они
испытывают влияние провоспалительных цитокинов (таких, как IL-1, IL-
4, IL-5, IL-6, TNFa) и других медиаторов воспаления, контактируют с
активированными элементами стромы, вследствие чего испытывают
дополнительное мощное воздействие на фенотип и генотип. При этом часть
опухолевых клеток может быть элиминирована эффекторными клетками
иммунной системы, другая остается жизнеспособной, но значительно
модифицированной.
Таким образом, рецидивные опухоли, формирующиеся под
воздействием нового микроокружения, могут состоять из клеток со значительно
измененным фенотипом по сравнению с первичными опухолями. Это может
влиять на проявления различных признаков их злокачественности.
Важно, что такие опухоли могут различаться по кинетическим
параметрам клеточной пролиферации, чувствительности к различным
терапевтическим агентам.
Имеющиеся научные данные свидетельствуют о наличии особенностей
в развитии рецидивных опухолей непосредственно после хирургического
лечения, а также в отсроченные периоды после них, в том числе
касающихся чувствительности к химиотерапевтическим препаратам, а также
другим средствам системной противоопухолевой терапии. Различия эти
опосредованы как местными клеточными и тканевыми факторами, так и
факторами системного характера, в частности динамикой развития
специфического и неспецифического противоопухолевого иммунитета.
Данные обстоятельства, а также интересы клинической практики
обосновывают необходимость поиска средств эффективной профилактики ре-
цидивирования злокачественных опухолей, а также разработки
эффективных средств терапии рецидивов.
Наличие адекватных экспериментальных моделей, а также
унифицированных стандартных методических подходов и критериев оценки
эффективности антирецидивной терапии является необходимым условием
изучения закономерностей рецидивирования, поиска средств для профилактики
рецидивирования, а также средств и методов их эффективного лечения.
Настоящие методические рекомендации предназначены для
упорядочения и стандартизации методических подходов и критериев оценки
антирецидивной активности новых лекарственных средств на стадии первичного
отбора и углубленного изучения в эксперименте.
ОПИСАНИЕ МЕТОДА
ФОРМУЛА МЕТОДА
Модели рецидивирования: искусственное и спонтанное рецидивирование
Исследования должны проводиться в сингенной системе, с
использованием линейных животных. Результаты, полученные в аллогенной системе,
непригодны для экстраполяции в клинику.
-670-

Для оценки антирецидивной активности препаратов используются
опухоли, обладающие способностью к спонтанному метастазированию. Это
наиболее адекватные экспериментальные модели опухолей. Мы
рекомендуем использовать карциному легкого Льюис и меланому В-16. Это
опухоли разного гистогенеза, разной чувствительности к терапевтическим
агентам, характеризующиеся разной реакцией на операцию удаления
первичного опухолевого узла. Эти опухоли хорошо известны широкому кругу
исследователей за рубежом и в нашей стране и характеризуются стабильным
фенотипом. Использование этих опухолей обеспечивает возможность
получения достоверных и воспроизводимых результатов.
Модель искусственного рецидивирования
Метод основан на имплантации дозированного количества клеток
карциномы легкого Льюис или меланомы В-16 (от 1 х 105 до 1 х 106) в 0,1 мл
культуральной среде под хирургический шов, наложенный на разрез
кожных покровов мыши (BDF, или С57 В16).
Модель спонтанного рецидивирования
Основана на резекции подкожного первичного опухолевого узла, в
сроки, не обеспечивающие достижения радикальности операции (9—12-й день
после подкожной трансплантации 1 х 106 клеток карциномы легкого
Льюис или меланомы В16).
Модель спонтанного рецидивирования наиболее полно воспроизводит
клиническую ситуацию, позволяет оценить антирецидивный эффект на
фоне формирования противоопухолевого иммунитета, системных
взаимоотношений организм—первичная опухоль—метастазы.
Моделирование искусственного рецидивирования
В экспериментах используют мышей линии С57В16 или гибридов первого
поколения BDF, (C57B16 х DBA/2), желательно самцов, массой 18—20 г.
Разрез кожного покрова в области бока производят под общей
анестезией (внутрибрюшинно гексенал в дозе 100 мг/кг). Для этого животное
помещают на операционный столик в положении на спине и фиксируют
конечности специальными зажимами. На коже бока (площадь участка
20 х 30 мм) удаляют волосяной покров. Подготовленный для операции
участок кожи дезинфицируют 2 % спиртовым раствором йода. Ножницами
с острыми прямыми браншами производят разрез кожного покрова
длиной 15—20 мм. Затем разрез кожного покрова ушивают. Зону разреза
обрабатывают 5 % спиртовым раствором йода.
Через 24 ч после операции под шов шприцем с тонкой иглой в объеме
0,1—0,2 мл культуральной среды 199 каждой мыши вводят 1 х Ю6
опухолевых клеток. После этого из общего числа животных формируют
контрольную и терапевтические группы в количестве, определяемом целями
эксперимента. В контрольной и каждой группе, получавшей лечение, должно
быть не менее 10 животных.
-671 -

Моделирование спонтанного рецидивирования
Эксперименты, как и при моделировании искусственного
рецидивирования, выполняют на мышах линии С57В16или гибридах первого поколения
BDF, (С57В16 х DBA/2), желательно самцах, массой 18—20 г.
В начале эксперимента всем животным под кожу бока (в область,
предварительно лишенную кожного покрова, площадью 20 х 30 мм3) по
общепринятой методике инокулируют по 1 х 106 клеток карциномы опухоли
Льюис или меланомы В16. По достижении объема опухоли 1,5 см3 (на 9—
12-й день после трансплантации опухолевых клеток) ее удаляют
хирургическим способом под гексеналовым наркозом.
Предварительно, перед операцией, из общего количества животных
формируют контрольную и терапевтические группы с опухолями
соизмеримой величины. Для этого измеряют два взаимно перпендикулярных
диаметра опухолей и рассчитывают их объем по формуле:
v= (a x в)2
2
В каждой группе должно быть не менее 15—20 животных.
Для удаления первичного опухолевого узла животное помещают на
операционный столик в положении на спине, конечности фиксируют
зажимами. Кожу обрабатывают 2 % спиртовым раствором йода. Ножницами с
закругленными браншами удаляют опухолевый узел вместе с небольшим
прилегающим участком кожного покрова.
Дефект кожного покрова закрывают наложением шва. Зону
хирургического вмешательства обрабатывают 5 % спиртовым раствором йода.
Наложения повязки не требуется.
Схемы лечебных воздействий
Профилактика рецидивирования
Тестируемые препараты в соответствии с предполагаемыми
механизмами действия вводят животным до индукции искусственных рецидивов или
операции удаления первичной опухоли при моделировании спонтанного
рецидивирования.
В данном случае регистрируемый эффект будет характеризовать
способность изучаемого агента ингибировать процесс рецидивирования опухоли
(частоту появления рецидивов).
Изучаемые препараты вводятся животным в соответствии с разными
схемами до индукции искусственных и спонтанных рецидивов. Введение
препаратов завершается за сутки до индукции рецидивов. Препараты
изучаются в широком диапазоне доз, вплоть до максимально переносимых.
При наличии данных, характеризующих противоопухолевую,
антиметастатическую, иммуномодулирующую и другую биологическую активность
препарата, последний для профилактики рецидивирования используется в
оптимальных дозах и режимах.
-672-

Терапия рецидивных опухолей
Изучаемые препараты вводятся животным через 48 ч после индукции
искусственных рецидивов или хирургического удаления первичной
опухоли при использовании модели спонтанного рецидивирования.
Продолжительность курсов лечения определяется предполагаемым
механизмом антирецидивного действия изучаемых агентов. Так же как в
случае оценки профилактического действия, изучаемые препараты вводятся
животным в различных дозах и режимах. Схемы терапии, так же как и в
первом случае, строятся на основе данных, характеризующих
предполагаемый механизм биологического действия изучаемого агента.
Изучаемые агенты, механизм действия которых опосредован
модуляцией систем организма и клеточных биологических реакций, могут как инги-
бировать, так и стимулировать частоту рецидивирования опухолей.
Критерии оценки активности ингибиторов рецидивирования
Частота рецидивирования
Вычисляется путем соотношения числа животных с рецидивами к
общему числу животных в группе. Показатель рассчитывается для
контрольной группы животных, не получавших лечения, а также для каждой
леченой группы.
Различие между контрольной и лечеными группами рассчитывается на
основании критериев статистической достоверности.
Препарат считается активным, если частота рецидивов в группе
животных, получавших воздействие до индукции искусственных или спонтанных
рецидивов, оказывается достоверно ниже, чем в группе контрольных
нелеченых животных.
Средняя продолжительность безрецидивного периода
Определяется путем вычисления средней продолжительности времени
от момента индукции рецидивов до момента появления рецидивов у
каждой мыши контрольной и опытной групп.
Пример:
При индукции искусственных рецидивов вторичные опухоли в
контрольной группе появились у каждой из 10 мышей на 3, 3, 5, 5, 5, 6, 6, 6,
6, 9-й день. Средняя продолжительность безрецидивного периода будет
равна сумме указанных величин, деленной на 10. В данном случае она
будет равна 5,4 дня.
Продолжительность безрецидивного периода у каждой мыши в группе,
получавшей лечения соответственно равна 7, 7, 7, 12, 13, 15, 19, 25, 25,
26 дням. Средняя продолжительность безрецидивного периода в этой
группе равна 15,8 дня. При выявлении статистической достоверности
различий между этими величинами (5,4 дня в контрольной группе и 15,8 дня
в группе, получавшей лечение) можно говорить о способности изучаемого
препарата ингибировать процесс рецидивирования злокачественной
опухоли.
Показатель продолжительности безрецидивного периода используется
при моделировании искусственного и спонтанного рецидивирования.
22 - 762
-673-

Чувствительность рецидивных опухолей к терапевтическим воздействиям
Оценивается на модели искусственного рецидивирования.
После трансплантации опухолевых клеток (1 х 106) под шов,
наложенный на разрез кожного покрова, животных формируют в группы по 10.
Спустя 48 ч после трансплантации опухолевых клеток животным вводят
изучаемый препарат. Эффект лечения оценивают по общепринятым
критериям, рассчитывая показатель торможения роста опухоли в различные
сроки после окончания терапии. Первое измерение опухолей производят
после окончания курса терапии, последующие — с интервалом в 3—5
дней, вплоть до окончания эксперимента.
В эксперименте предусматривается группа животных с подкожно
трансплантированными опухолями по обычной методике (первичные опухоли).
Сравнение эффекта терапевтического агента в отношение первичных и
рецидивных опухолей позволит получить информацию, конкретизирующую
представление о целесообразности использования для терапии рецидивных
опухолей препаратов, эффективных в отношение первичных опухолей.
Для оценки чувствительности рецидивных опухолей к терапевтическим
агентам используются стандартные методы и критерии изучения
противоопухолевой активности.
ПОКАЗАНИЯ И ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ МЕТОДА
Методические рекомендации могут быть использованы для оценки
антирецидивных эффектов как средств лекарственной терапии
(химиотерапия, биотерапия), так и физических факторов воздействия (лучевая,
фотодинамическая , лазерная терапия и т. д.).
Методические рекомендации разработаны авторами на основе
многолетнего личного опыта работы в области экспериментальной химиотерапии.
Методические указания по доклиническому изучению средств,
обладающих способностью ингибировать процесс
метастазирования и повышать эффективность цитостатической
терапии злокачественных опухолей
СОСТАВИТЕЛИ: д. б. н. Е. П. Зуева; д. м. н.
А. М. Козлов; д. м. н, проф. Г. К. Герасимова;
к. б. н. Е. Н. Амосова; к. б. н. Т. Г. Разина;
академик РАМН В. Е. Гольдберг.
Ответ, ред.: академик РАМН Е. Д. Гольдберг;
проф. А. Б. Сыркин
Введение
Метастазирование опухоли — один из ключевых признаков ее
злокачественности. Именно раннее метастазирование лимитирует эффективность
всех известных способов терапии, применяемых в онкологии. Основанием
- 674-

для составления настоящих методических рекомендаций послужила
необходимость разработки общих подходов к выявлению средств для
предупреждения и лечения метастазов опухолей, повышения эффективности
существующих (хирургического, химиотерапевтического, лучевого) методов
лечения злокачественных новообразований с целью получения
информативных и сопоставимых результатов.
Метастазирование злокачественной опухоли — каскад селективных
биологических процессов, включающий специфическое взаимодействие
опухолевых клеток, обладающих высоким метастатическим потенциалом с
клетками и компонентами экстрацеллюлярного матрикса
микроокружения, инвазию прилежащих нормальных тканей, проникновение
опухолевых клеток в лимфу и кровь, транспортировку их с током биологических
жидкостей, адгезию к клеточным и субклеточным субстратам в органах-
мишенях и вторичную пролиферацию в зонах вторичного роста. Под
антиметастатической активностью понимают способность фармакологических
средств, воздействуя на те или иные биологические процессы, играющие
существенную роль в механизме метастазирования злокачественной
опухоли, препятствовать реализации признаков метастатического фенотипа
опухолевых клеток.
Отбор препаратов-антиметастатиков проводят на животных с
перевиваемыми опухолями. При этом оценивают действие исследуемого вещества
как на развитие первичного опухолевого узла и выраженность
метастатического процесса, так и на эффективность цитостатического и
хирургического лечения (удаление опухоли). Результативность лечебных воздействий
определяют по торможению роста основного опухолевого узла (масса
опухоли, торможение роста опухоли в процентах) и распространенности
метастатического поражения (частота метастазирования, количество и масса
метастазов, индекс ингибирования метастазирования).
Наличие антиметастатической активности препарата может быть
продемонстрировано на любых моделях спонтанного метастазирования, но
обязательно должно быть подтверждено в экспериментах с применением по
крайней мере двух из общепринятых моделей метастазирования,
используемых в работах по экспериментальной химиотерапии (карцинома
легкого Льюис и меланома В-6). Следует учитывать тот факт, что средства,
обладающие достоверной антиметастатической активностью, могут не
проявлять эффекта в отношении первичной опухоли.
Соединения, характеризуемые как обладающие антиметастагической
активностью и перспективные для апробации в клинике, должны обладать
способностью:
1. Эффективно ингибировать процесс спонтанного метастазирования
перевиваемых опухолей при подкожной или внутримышечной их
перевивке в присутствии первичного опухолевого узла (на 35—75 %).
2. Достоверно повышать эффективность химиотерапевтического
лечения при тестировании на моделях спонтанного метастазирования
опухолей.
3. На фоне удаления первичного опухолевого узла достоверно
ингибировать развитие метастазов, а также увеличивать продолжительность жизни
животных (в 1,3—2 раза).
При оценке антиметастатической активности комбинации цитостатика
и средства, обладающего антиметастатической активностью, необходимо
сопоставить эффективность комбинации с максимальной активностью
одного цитостатика (применяемого в максимально эффективной дозе, а не
только в той, в которой он применялся в комбинации), выраженной как в
22*
-675 -

показателях торможения процесса метастазирования, так и в увеличении
средней продолжительности жизни.
Кроме моделей спонтанного метастазирования, на этапе
предварительного отбора средств, обладающих потенциальной антиметастатической
активностью, могут быть использованы модели искусственного
метастазирования, предполагающие получение метастазов в тех или иных внутренних
органах после внутривенного или внутриартериального введения
опухолевых клеток. Использование моделей искусственного метастазирования
позволит существенно сократить время предварительного исследования,
определить оптимальный режим клинического применения на дальнейших
этапах исследования.
Углубленное изучение наиболее перспективных соединений,
проявивших высокую активность на этапе скрининговых исследований, должно
включать:
а) разработку оптимальных режимов и способов применения на
моделях спонтанного метастазирования;
б) разработку схем сочетанного применения цитостатиков и средств,
обладающих антиметастатической активностью, на моделях спонтанного
метастазирования;
в) разработку оптимальных схем применения средств с
антиметастатической активностью на фоне удаления первичного опухолевого узла.
НОВИЗНА ПРЕДЛАГАЕМОГО МЕТОДА
Разработаны требования по объему экспериментального изучения
лекарственных средств, способных ингибировать метастазирование
злокачественных опухолей.
ОПИСАНИЕ МЕТОДОВ
Метастазирующие опухоли мышей
Опухоль после удаления в асептических условиях у животных-доноров
измельчают ножницами до гомогенной консистенции, затем пропускают
через набор сит с уменьшающимся диаметром пор. Измельченную ткань
обрабатывают коллагеназой (0,1 % раствор, 30 мин), отмывают трижды в
фосфатном буфере или среде 199, определяют жизнеспособность
опухолевых клеток путем окрашивания их трепановым голубым. Карциному
легких Льюис, меланому В-16 и Клаудмана перевивают мышам линий
C57BL/6, F, (C57BL/6 х СВА) или BDF, (DBA/2XC57BL/6) под кожу бока
(1 х 106 клеток в 0,2 мл среды 199 или изотонического раствора натрия
хлорида) либо внутримышечно (в бедро задней лапы 1 х Юб клеток в 0,1
мл среды 199 или изотонического раствора натрия хлорида). Клетки сарко-
мы-37 перевивают беспородным мышам или тетрагибридам СВЛ
подкожно или внутримышечно в указанных выше количествах. Для тестирования
антиметастатической активности целесообразно использовать мышей
массой не менее 20—22 г.
Возможны перевивки опухолевых клеток в подушечку задней
конечности.
Одновременно с оценкой действия исследуемого препарата на развитие
метастазов и первичного опухолевого узла проводят изучение его влияния
-676-

на эффективность цитостатической химиотерапии. Цитостатики вводят в
режиме, вызывающем умеренное торможение опухолевого процесса (30—
60 % торможения роста первичной опухоли при незначительном
изменении интенсивности развития метастазов). В качестве основного химиоте-
рапевтического средства используют циклофосфан в режиме 100 мг/кг
дважды с интервалом между введениями 96 ч, начиная лечение с 7—10-х
суток после перевивки (применяют внутримышечный либо внутрибрюшин-
ный способ введения цитостатика).
При использовании цитостатиков другого механизма действия режимы
их введения должны быть подобраны экспериментатором, учитывая
указанные выше параметры роста опухоли.
В каждой серии экспериментов из подопытных животных формируют
следующие группы: 1. Контрольная, получающая соответствующие
растворители. 2. Группа животных, получающая исследуемый препарат. 3. Группа
мышей, получающая только цитостатик. 4. Группа животных, получающая
цитостатик в сочетании с исследуемым препаратом.
Для оценки влияния испытуемого средства на различные этапы
опухолевого роста его вводят в разные сроки с момента трансплантации
опухолевых клеток (на 2—4-е сутки или 7—10-е сутки). Необходимо также
определить оптимальные сроки введения препарата по отношению к
инъекциям цитостатика.
С целью определения действия исследуемого препарата на токсический
эффект цитостатика по отношению к клеткам белой крови спустя 48—72 ч
после введения циклофосфана проводят подсчет числа лейкоцитов в
периферической крови. В случае выявления у препарата способности
препятствовать развитию лейкопении желательно проводить углубленные
гематологические исследования.
При оценке эффективности лечебных воздействий учитывают массу
первичного опухолевого узла, частоту метастазирования опухоли,
количество и суммарную массу метастазов, рассчитывают индексы ингибирова-
ния метастазирования и торможения роста опухоли в процентах (см.
Приложение).
Рекомендуемые для широкого практического применения в работах по
отбору антиметастатиков карцинома легких Льюис, меланомы В-6 и Кла-
удмана, а также саркома-37 характеризуются высокой интенсивностью
метастазирования и дают макроскопические метастазы, доступные для
качественной и количественной оценки простыми способами. Динамика
метастазирования этих опухолей после подкожной и внутримышечной
имплантации 1 х 106 клеток такова, что к 7-му дню у всех животных появляются
микрометастазы в легких, визуально выявляемые позже 21-го дня и
достигающие величины, оптимальной для подсчета примерно к 25-му дню после
перевивки.
Оптимальным сроком оценки выраженности антиметастатического
действия препарата является момент гибели первой мыши в группе
контрольных животных.
При работе с саркомой-37, метастазирующей по лимфогенному типу и
поражающей при подкожной перевивке подмышечные, паховые,
подчелюстные, паратрахеальные и другие группы лимфатических узлов,
интенсивность метастазирования оценивают путем вычисления суммарной
массы метастазов в пересчете на одну мышь, а также частоты метастазов
той или иной локализации по отношению к общему числу животных в
группе.
Препарат может быть отнесен к группе антиметастатиков, увеличиваю-
-677-

щих эффективность цитостатической терапии, в случае воспроизводимого
существенного противометастатического действия и повышения под
влиянием исследуемого средства антибластомной активности цитостатика.
Метастазирующие опухоли крыс
Лимфосаркому Плисса и карциносаркому Уокер-256 перевивают
крысам беспородным или линии Wistar 20 % взвесью опухолевых клеток в
0,2 мл среды 199 или изотонического раствора натрия хлорида под кожу
спины. При постановке эксперимента из животных с опухолями
формируют группы, аналогичные описанным в разделе "Метастазирующие опухоли
мышей". Циклофосфан вводят в дозе 20 мг/кг с интервалам 48 ч 3—5 раз,
начиная с 7—10-х суток после перевивки (внутрибрюшинно или
внутримышечно). Наряду с использованием циклофосфана допускается
применение других противоопухолевых средств, при этом необходимым условием
является выбор режима, вызывающего умеренное торможение опухолевого
процесса (30—60 % торможения роста первичной опухоли при
незначительном изменении интенсивности развития метастазов). Контроль за
уровнем лейкоцитов в периферической крови осуществляется после 3-го и
5-го введений циклофосфана.
При работе с карциносаркомой Уокер-256 может быть использован
способ перевивки опухолевых клеток в дистальную треть хвоста
(подкожно), позволяющий выявить влияние препарата на метастазирование,
осуществляющееся по смешанному типу (лимфогенное, гематогенное).
В случае подкожной перевивки опухолей введение исследуемого
препарата начинают с момента появления у большинства животных
пальпируемых опухолевых узелков (4—5-е сутки после перевивки). Крыс с
карциносаркомой Уокер-256, перевитой под кожу хвоста, начинают лечить
исследуемым препаратом со времени формирования у большинства животных
опухолевого узла (12—14-е сутки после трансплантации).
Эффективность лечебных воздействий оценивают не ранее чем на 22-е
сутки после перевивки, определяя массу первичного опухолевого узла при
трансплантации под кожу спины, массу лимфатических (подмышечных,
паховых, парааортальных) узлов, количество метастатических узлов в
легочной ткани (при перевивке карциносаркомы Уокер-256 в хвост),
рассчитывая показатель торможения опухолевого роста в процентах и частоту ме-
тастазирования (см. Приложение).
Препарат может быть отнесен к группе антиметастатиков,
увеличивающих эффективность цитостатической терапии в случае воспроизводимого
достоверного противометастатического действия и повышения под
влиянием исследуемого средства антибластомной активности цитостатика.
Моделирование процесса метастазирования при удалении первичного
опухолевого узла
При изучении ингибиторов процесса метастазирования режим адъю-
вантной терапии, предполагающий удаление первичного опухолевого узла
на фоне сформировавшихся в организме метастазов, является наиболее
адекватным клинической ситуации.
Удаление подкожно перевитой опухоли у мышей проводят под гексена-
ловым, тиопенталовым (по 100 мг/кг массы животного) или эфирным нар-
-678-

козом. Использование для наркоза эфира требует большого внимания для
регулирования глубины наркоза.
Животное помещают на операционный столик в положение на спине,
фиксируют конечности специальными зажимами. Опухолевый узел
удаляют ножницами с закругленными браншами вместе с прилежащим
участком кожного покрова, площадь которого должна быть достаточно велика,
чтобы предупредить возможность рецидивирования. Дефект кожного
покрова закрывают наложением шва, смазывают 5 % спиртовым раствором
йода. Наложения повязки или наклейки не требуется. Оптимальный срок
удаления первичного опухолевого узла — 7—9-й день после подкожной
перевивки 1 х Ю6 опухолевых клеток. К этому времени у всех животных уже
имеются микрометастазы. Удаление опухоли в более ранние сроки
нецелесообразно ввиду отсутствия метастазов у части животных, а в более
поздние — из-за снижения вероятности радикального вмешательства.
Кроме описанного способа экспериментаторами может быть
использовано удаление основного опухолевого узла у мышей с карциномой легких
Льюис, перевитой в подушечку задней лапы (2 х ю5 клеток в 0,1 мл среды
199 или физиологического раствора). Эфирный наркоз дают ингаляционно
до исчезновения болевой чувствительности. Лапку с опухолью ампутируют
не ранее 14-х суток после перевивки по коленному суставу при наложении
перетягивающего жгута. Операционную рану обрабатывают медицинским
клеем.
Из животных с опухолями формируют следующие группы:
1) контрольная, получающая соответствующий растворитель;
2) группа мышей с удаленной опухолью;
3) группа мышей, получающих исследуемый препарат при удалении
опухоли.
Введение исследуемого препарата начинают за 1 ч до операции и
продолжают ежедневно в течение 8—10 сут. Эффективность лечебных
воздействий определяют, подсчитывая количество метастатических узлов в
легких, частоту метастазирования опухоли, степень поражения легких
метастазами и индекс ингибирования метастазирования (см. Приложение).
Целесообразно оставить половину животных в каждой опытной группе
на выживание, чтобы оценить эффективность терапии по увеличению
средней продолжительности жизни животных. Данный показатель,
полученный для животных с радикально удаленными опухолями, следует
расценивать как наиболее объективное свидетельство антиметастатической
активности тестируемого соединения.
Метод получения искусственных метастазов
Для получения искусственных метастазов могут использоваться клетки
меланомы В-16, адаптированной к росту in vitro. После снятия с подложки
трипсинизацией, определения жизнеспособности путем окрашивания три-
пановым голубым и подсчета клеток в камере Горяева 6—8-недельным
мышам линии C57BL/6 или F, (CBA2 x C57BL/6) вводят в хвостовую вену
1 х Ю5 опухолевых клеток в 100—150 мкл фосфатного буфера. Спустя 15—
20 дней идентифицируют наличие метастазов в легких путем подсчета
колоний или взвешивания легких, пораженных метастазами (сравнивая с
контрольной группой здоровых животных).
Последний этап гематогенной диссеминации опухоли может быть
воспроизведен путем внутривенной перевивки клеток карциномы легких
-679-

Льюис. Для инокуляции используют взвесь опухолевых клеток (1 х Ю6
клеток) в изотоническом растворе натрия хлорида или среде 199.
Количественная оценка развития процесса метастазирования производится на
15—20-е сутки после перевивки.
ПРЕДПОЛАГАЕМАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ
Методологические аспекты изучения средств, обладающих способностью
ингибировать процесс метастазирования опухолей в эксперименте
Необходимо четко дифференцировать способность лекарственных
средств ингибировать процесс метастазирования опухоли, т. е.
формирования метастазов, и воздействовать на уже существующие метастазы. В
первом случае речь идет о профилактике метастазирования или об
антиметастатической активности лечебного средства, во втором — о терапии
метастазов той или иной локализации. В одном случае могут быть отобраны
средства, обладающие способностью предотвращать метастазирование, в
другом — разработаны рациональные подходы к терапии диссеминирован-
ных опухолей (охарактеризованы известные или отобраны новые средства
и оптимальные режимы их применения для терапии метастазов
конкретных локализаций). Методические подходы к отбору и изучению
собственно антиметастатичеоких средств (селективных ингибиторов процесса
метастазирования) и изучению эффективности препаратов в отношении
сформировавшихся метастазов существенно различаются.
Исходя из данных фактов, тестируемые препараты с целью
предотвращения возникновения метастазов, т. е. выявления их собственно
антиметастатического действия, необходимо вводить в организм животных, начиная
через 24—48 ч после подкожной или внутримышечной перевивки
опухолей. При этом необходимо использовать режимы многократного введения
препаратов, особенно в случае отсутствия у них способности ингибировать
развитие первичной опухоли. При тестировании активности препаратов в
отношении уже сформировавшихся метастазов испытуемые соединения
необходимо вводить животным, начиная по крайней мере с 7-го дня после
перевивки опухоли. При этом необходимо четко представлять, что в
данном случае речь идет о противоопухолевой активности в отношении
метастазов конкретной локализации. Здесь, как и при введении препаратов в
ранние сроки развития опухоли, эффект изучаемых средств в отношении
метастазов может быть оценен как при наличии первичной опухоли, так и
на фоне ее хирургического удаления.
Таким образом, отчет об изучении специфической активности
препарата, обладающего антиметастатическими свойствами и способностью
повышать эффективность химиотерапевтического или хирургического лечения,
должен отражать:
1. Данные об антиметастатической активности и способности повышать
эффективность цитостатической терапии или хирургического лечения.
2. Данные о влиянии препарата на развитие первичного опухолевого
узла.
3. Зависимость эффекта от дозы, режима и пути введения препарата.
4. Зависимость эффекта от сроков начала лечебных воздействий по
отношению ко времени перевивки опухоли.
5. Экспериментальное доказательство эффективности избранной
лекарственной формы хотя бы на одной модели перевиваемых опухолей.
-680-

Предлагаемый для клинической апробации препарат должен обладать
широтой терапевтического действия, обеспечивающей возможность
получения лечебного эффекта в дозах, не вызывающих токсического эффекта.
Приложение
Основные критерии оценки эффективности лечения
1. Процент торможения роста опухоли вычисляют по формуле:
Средняя масса опухоли Средняя масса опухо-
в контрольной группе "лив опытной группе
Средняя масса опухоли в контрольной группе
х 100.
2. Процент увеличения продолжительности жизни животных вычисляют
по формуле:
Средняя продолжительность Средняя продолжитель-
жизни в контрольной группе ~ ность жизни в опытной
Средняя продолжительность жизни в контрольной группе
х 100.
3. Частота метастазировапия опухоли — процент животных с
метастазами по отношению к общему количеству животных в группе.
4. Площадь метастазов определяют по формуле яг3.
5. В случае лимфогенного метастазирования подсчитывают массу
метастазов и среднее значение этого показателя в группе. У животных с лим-
фосаркомой Плисса метастазом считают подмышечные лимфатические
узлы массой 200 мг и более. В сомнительных случаях лимфатические узлы
подвергают гистологическому исследованию.
6. В зависимости от количества и размера метастатических узлов в
легочной ткани определяют степень поражения легких, применяя критерии,
разработанные Tarin и Price (1979).
К высокой степени поражения легких относятся 3, 4 и 5-я степень.
Низкая степень поражения предполагает наличие у животных менее 30
метастатических узлов (0, 3 и 2-я степень) (табл. 1).
Степень метастатического поражения легких в зависимости от количества и размера
метастазов [Tarin and Price, 1979]

Степень
Количество метастазов и их диаметр
Отсутствуют
Меньше 10 с диаметром, не превышающим 1 мм
От 10 до 30 метастатических узлов, некоторые из них размером больше 1 мм в
диаметре
Больше 30 метастазов различных размеров, однако отсутствуют сливные
Тяжелое поражение легочной ткани, менее 100 штук, но сливного роста еще нет
Массивное поражение легких, более 100 метастазов, наличие сплошных
опухолевых узлов
7. Индекс ингибирования процесса метастазирования (ИИМ)
рассчитывают по формуле:
-681 -

ИИМ = (АхВк)-(АхВ) х 100 %
Ак х вк
где Ак и А — частота метастазирования в легкие у мышей контрольной
группы и опытной; Вк и В — среднее число метастазов в легких в
контрольной и опытной группах.
8. Величину средней массы метастазов в легких определяют, вычитая из
показателя массы легких, пораженных метастазами, среднюю массу легких
интактных животных без опухолей. Уровень торможения метастазирования
определяют по формуле:
ТМ = Мк ~ Моп х юо,
Мк
где Моп — средняя масса метастазов в пересчете на одну мышь в каждой
из опытных групп: Мк — аналогичный показатель для группы
контрольных животных.

ЧАСТЬ 5
ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
РАЗНЫХ ФАРМАКОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ГРУПП
Методические указания по изучению гепатозащитной
активности фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: проф. А. И. Венгеровский,
проф. И. В. Маркова, проф. А. С. Саратиков
Введение
Гепатозащитные средства предназначены дня нормализации функции и
метаболизма печени при ее поражениях, ускорения регенерации и
восстановления функциональной активности гепатоцитов. Они находят
применение для патогенетической терапии острых, хронических (персистирую-
щего, активного) гепатитов, цирроза печени и жирового гепатоза
токсической, лекарственной и алкогольной этиологии. Менее эффективны эти
препараты при вирусном гепатите.
Описанные в литературе средства, оказывающие положительное
влияние на гепатоциты при патологии печени, подразделяются по механизму
действия на следующие группы:
1. Антиоксиданты — растительные полифенолы (легалон, силибор, ка-
терген, фламин, конвафлавин), витамины (ос-токоферол, ретинол, пантоте-
новая кислота, витогепат), тиолы (цистеин, N-ацетилцистеин, малотилат).
2. Средства, осуществляющие репарацию мембран гепатоцитов
(препараты фосфолипидов — эссенциале, липостабил).
3. Стимуляторы регенерации паренхимы печени (кальция пангамат, ме-
тилметионинсульфония хлорид, метионин, уридин, цитидин, оротовая
кислота).
Таким образом, круг веществ с гепатозащитными свойствами
достаточно велик, однако в соответствии с современной классификацией
лекарственных средств из их числа выделяют сравнительно небольшую группу ге-
патопротекторов, обладающих избирательным терапевтическим влиянием
на печень. К ним относят легалон, силибор, катерген, эссенциале и
некоторые другие препараты.
Фармакологическое действие гепатопротекторов обусловлено
собственным антиоксидантным эффектом и потенцированием эндогенных антиокси-
дантных систем гепатоцитов, ингибированием фосфолиполиза с
уменьшением продукции лизофосфатидов и восстановлением нормального спектра
фосфолипидов мембран, улучшением депонирования ионов Са2+, а также
-683-

улучшением матриксной и барьерной функций цитолеммы, мембран
митохондрий, эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и лизосом. При этом гепа-
тозащитные средства улучшают обмен белков, липидов, углеводов,
биоэнергетику, антитоксическую, экскреторную, холеретическую и другие функции
печени, устраняют гиперферментемию, стимулируют процессы регенерации.
Настоящие рекомендации направлены на унификацию методических
подходов к изысканию веществ с прогнозируемыми гепатозащитными
свойствами. Терапевтическое влияние потенциальных гепато протекторов
проявляется на моделях патологии печени, главным образом при
экспериментальных токсических остром и хроническом гепатитах, жировом гепа-
тозе, а также в культуре гепатоцитов или их органоидов, поврежденных
токсическими агентами.
Исследования проводят в сравнении с эталонными средствами,
выбираемыми в зависимости от происхождения, химического строения и
предполагаемого механизма действия нового соединения. Например,
растительные гепатопротекторы изучают в сравнении с легалоном, силибором
или катергеном, препараты фосфолипидов — в сравнении с эссенциале.
Оптимальные терапевтические дозы в экспериментах на мышах и крысах
при введении препаратов в желудок составляют для легалона и силибора
100—200 мг/кг, для катергена — 100—500 мг/кг, для эссенциале — 60—
80 мг/кг. В скрининговых исследованиях действие новых гепатопротекто-
ров по каждому тесту оценивают в 3—5 дозах, одна из которых
соответствует дозе эталонного препарата; при расширенном изучении гепатозащит-
ной активности вещества вводят в ранее определенной оптимальной
терапевтической дозе. В клинике гепатопротекторы чаще всего назначают
внутрь, поэтому в эксперименте их вводят животным в желудок с
помощью зонда. Экспериментальные данные подвергают статистической
обработке и представляют в форме таблиц и графиков.
Доклиническая оценка гепатопротекторов включает следующие 3 этапа:
1. Первичный отбор соединений.
2. Расширенное изучение специфической гепатозащитной активности и
исследование механизма действия отобранных на первом этапе
соединений.
3. Оценка общетоксического действия и специфических видов
токсичности (мутагенные, канцерогенные, аллергогенные, иммунотоксические,
эмбриотоксические и тератогенные свойства). При оценке мутагенных
свойств гепатопротекторов-антиоксидантов следует иметь в виду
возможность перехода антиоксидантного эффекта в прооксидантный, поэтому
особое значение имеет широта дозового диапазона, в котором проявляется
гепатозащитное и антиоксидантное действие.
1. Первичный отбор соединении
Скрининг гепатопротекторов включает ряд тестов, проводимых на
мелких лабораторных животных с острым токсическим гепатитом или
изолированных гепатоцитах, поврежденных гепатотоксинами.
А. Острый токсический гепатит
У беспородных или линейных мышей и крыс вызывают острый гепатит
введением СС14 или D-галактозамина. ССЦ в 50 % растворе на оливковом
-684-

масле вводят в желудок однократно в дозах 4—5 мл/кг или в течение 4—
6 дней в дозах 1—1,25 мл/кг, внутрибрюшинно однократно в дозах 0,2—
0,4 мл/кг, подкожно на протяжении 2—4 дней в дозе 2 мл/кг D-галактоза-
мин в водном растворе вводят в желудок или внутрибрюшинно 1—3 дня в
дозах 300—1000 мг/кг. Введение изучаемых веществ проводят за 1 ч до
применения гепатотоксинов. Контрольные животные получают
токсиканты и эквиобъемное с гепатопротекторами количество растворителей.
СС14-гепатит характеризуется развитием колликвационного некроза,
белковой и жировой дистрофии гепатоцитов, локализованных
преимущественно в центральной зоне печеночной дольки, где максимальна
активность зависимых от цитохрома Р-450 монооксигеназ и преобладает
продукция повреждающих метаболитов гепатотоксина. D-галактозамин
вызывает острый гепатит, идентичный по морфологическим и биохимическим
изменениям в печени вирусному гепатиту человека.
Исследования проводят прижизненно в динамике и после декапитации
животных через сутки после последнего введения гепатопротекторов.
Наиболее информативными тестами, доказывающими эффективность
соединений, испытываемых в качестве гепатопротекторов, являются следующие:
1. Гексеналовая проба на мышах (80 мг/кг внутрибрюшинно) и крысах
(60 мг/кг внутрибрюшинно) позволяет по продолжительности наркоза
животных оценить скорость метаболизма гексенала, осуществляемого цито-
хром Р-450-зависимой монооксигеназной системой гепатоцитов, и
характеризует состояние одной из приоритетных функций печени —
антитоксической.
2. Проба с бромсулъфалеином (БСФ) свидетельствует о состоянии
экскреторной и антитоксической функций печени. Спектрофотометрически
определяют содержание БСФ в крови крыс через 1,5, 15 и 45 мин после
введения красителя (1—5 мг/кг) в хвостовую вену. Вычисляют коэффициент
ретенции БСФ, элиминируемого в виде конъюгатов с цистеином и глута-
тионом.
3. Определение активности аланинаминотрансферазы (АЛАТ) и аспар-
тагпаминогпрансферазы (АСАТ) в сыворотке крови позволяет установить
влияние потенциальных гепатопротекторов на цитолиз гепатоцитов,
вызываемый гепатотоксинами.
4. Относительная масса печени (отношение массы печени в
миллиграммах к массе тела в граммах) характеризует степень выраженности
воспалительных процессов в органе.
5. Определение степени жировой дистрофии печени на модели СС\4-гепа-
тита у мышей и крыс дает возможность оценить терапевтическую
эффективность новых гепатопротекторов в отношении одного из наиболее
типичных патологических процессов в поврежденном органе. Исследование
проводят гистохимически с помощью окраски Суданом III или IV срезов,
приготовленных на замораживающем микротоме из фиксированных 10 %
нейтральным формалином кусочков печени. Для полуколичественной
оценки содержания липидов используют пятибалльную шкалу:
1. Минимальная степень ожирения: гепатоциты с жировыми
включениями находятся только по периферии дольки в области триады.
2. Слабая степень: гепатоциты, содержащие липиды, занимают
примерно '/4— Уз длины печеночных балок в перипортальной зоне.
3. Умеренная степень: подобные гепатоциты занимают '/3—'/4 длины
печеночных балок по периферии дольки.
4. Высокая степень: гепатоциты с жировыми каплями занимают 'Л—2/з
длины печеночных балок.
- 685 -

5. Максимальная степень: стеатоз распространяется на всю печеночную
дольку.
Гистохимический метод обнаружения липидов является более
чувствительным, чем биохимический.
Б. Эксперименты на изолированных гепатоцитах
В экспериментах на изолированных гепатоцитах, поврежденных
добавлением в культуральную среду СС14 (2—4 ммоль) или D-галактозамина
(1,85—3,5 ммоль), оценивают жизнеспособность клеток по тестам
поглощения трипанового синего (интактные гепатоциты с неповрежденной ци-
топлазматической мембраной не окрашиваются при кратковременной
инкубации), выхода АЛАТ, АСАТ и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в среду
инкубации.
На скрининговом этапе исследования критерием отбора перспективных
гепатопротекторов служит их более высокая терапевтическая
эффективность, чем у эталонных веществ. Необходимо установить острую
токсичность изучаемых препаратов: перспективны лишь вещества, относящиеся к
III—IV классам.
2. Расширенное изучение специфической гепатозащитной активности
и исследование механизма действия отобранных на первом этапе соединений
А. Модели острой патологии печени
Показателем терапевтической эффективности потенциальных
гепатопротекторов является уменьшение морфогистохимических, биохимических
и функциональных нарушений при экспериментальных поражениях
печени. Для моделирования острого гепатита на крысах применяют вещества с
различным механизмом патогенного действия.
1. Гепатотоксины, преобразуемые зависимой от цитохрома Р-450 моно-
оксигеназной системой в свободные радикалы и электрофильные интерме-
диаты, ковалентно связывающие биомакромолекулы центролобулярных ге-
патоцитов (СС14, фторотан, бромбензол, парацетамол, тетрациклин).
2. Аллиловый спирт, окисляемый цитозольной и митохондриальной ал-
когольдегидрогеназами в электрофильный метаболит акролеин,
повреждающий перипортальные гепатоциты вследствие дефицита в них
восстановленного глутатиона.
3. Гепатотоксины, первично нарушающие обмен РНК и белка в
гепатоцитах (D-галактозамин) *.
Бромбензол вводят внутрибрюшинно в дозах 0,25—0,4 мг/кг
однократно; парацетамол (ацетаминофен) — в желудок в дозах 500—1000 мг/кг 1 —
2 дня; тетрациклин — в желудок в дозе 500 мг/кг на протяжении 5 дней;
аллиловый спирт — в желудок в дозах 0,05—0,1 мл/кг или
внутрибрюшинно в дозе 0,05 мл/кг 1—2 дня. Ингаляцию фторотана (галотана) проводят в
концентрации 0,5—1 об. % в течение 2—4 ч (концентрацию кислорода во
вдыхаемой смеси снижают до 10—14 об. %). Применение СС14 и
D-галактозамина для моделирования гепатита описано в разделе 1.
*Возможно также использование аминазина, а-аманитина, фаллоидина, лиофилизиро-
ванного экстракта бледной поганки, гелиотропа, эндотоксина Е. coli.
-686-

Жировой гепатоз вызывают у крыс с помощью интоксикации
гидразином (в желудок 180—200 мг/кг, 1—2 дня) или этанолом (в желудок 7—
10 мл/кг 40 % раствора, 7 дней).
Повреждение печени для оценки гепатозащитного эффекта получают
также временным (20—30 мин) пережатием печеночной артерии и
воротной вены. Возникающая при этом тотальная ишемия моделирует
ситуации, наблюдаемые в условиях трансплантации печени,
сердечно-сосудистой недостаточности и инфаркта миокарда. Влияние новых гепатопротек-
торов на процессы регенерации паренхимы печени оценивают на модели
резекции '/3—2/з органа.
Потенциальные гепатопротекторы вводят профилактически за 1—2 ч до
поступления в организм гепатотоксинов или ишемии, одновременно с ге-
патотоксинами или с лечебной целью на фоне сформированной патологии
печени.
О влиянии препаратов на состояние пораженной парехимы печени
судят по следующим тестам:
1. Гистологическое строение печени. На обзорных препаратах печени,
окрашенных гематоксилин-эозином или галлоцианин-пикрофуксином,
изучают гистологическую картину, подсчитывают количество некротизиро-
ванных гепатоцитов (имеющих ядра в состоянии пикноза, лизиса или
безъядерных) на 2500 клеток в 40 полях зрения, проводят различные мор-
фометрические исследования.
2. Гистохимические показатели состояния печени. Нуклеиновые кислоты,
белки, гликоген, липиды, активность ферментов в печени выявляют по
методикам, описанным в руководствах. Количественные изменения
гистохимических показателей оценивают с помощью цитофотометрии в
проходящем свете. Содержание гликогена и активность глюкозо-6-фосфатазы
рационально определять также биохимическими методами.
3. Ультраструктура паренхимы печени. Исследования проводят с
помощью электронной микроскопии.
4. Биохимические показатели крови, отражающие метаболизм и функцию
печени.
4.1. Активность ферментов печеночного происхождения в крови. Для
дифференциальной диагностики основных патологических синдромов,
установления эффективности и механизма действия новых гепатозащитных
агентов достаточно исследовать активность индикаторных ферментов цито-
литического синдрома (трансаминазы, ЛДГ, сорбит-, глутаматдегидрогеназы,
у-глутамилтрансфераза, альдолаза, уроканиназа, кислая фосфатаза, фосфо-
липаза А и др.); секреционных ферментов (холинэстераза) и экскреционных
ферментов — маркеров холестаза (щелочная фосфатаза, лейцинаминопепти-
даза, 5'-нуклеотидаза и др.). Из них печеночноспецифическими ферментами
являются уроканиназа, термостабильная фракция ЛДГ, глутамадегидрогена-
за. Основные методы определения активности перечисленных ферментов
приведены в руководствах. Рекомендованы модификации методов
определения активности уроканиназы и фосфолипазы А. Рационально использовать
стандартные наборы реактивов для определения активности ферментов.
4.2. Содержание в крови белков, липидов, углеводов. В сыворотке
крови определяют содержание общего белка, альбуминов, глобулинов (а,, а2,
Р, y)> общих липидов, холестерина, фосфолипидов, триглицеридов, липо-
протеинов различной плотности и глюкозы.
5. Участие печени в синтезе прокоагулянтов. В крови определяют
содержание фибриногена, проконвертина, тромбопластина и протромбиновый
индекс.
-687-

6. Экскреторная функция печени. В крови измеряют ретенцию БСФ (см.
раздел 1), содержание билирубина и его фракций. Вычисляют
коэффициент связывания билирубина как отношение концентраций связанного с
глюкуроновой кислотой и общего пигментов. По результатам этих
исследований можно судить о способности ферментов гепатоцитов
осуществлять реакции конъюгации, так как 80—100 % билирубина связывается с
глюкуроновой кислотой.
7. Антитоксическая функция печени. Исследования проводят на фоне
интоксикации СС14, аллиловым спиртом или D-галактозамином, наиболее
глубоко повреждающих антитоксическую функцию печени, а также у ин-
тактных животных с целью выявления у новых гепатопротекторов свойств
индукторов или ингибиторов метаболизма ксенобиотиков.
7.1. Содержание РНК белка и цитохромов измеряют в микросомальной
фракции печени, содержащей 90—95 % белка ЭПР. Анализы проводят в
течение суток после вьщеления микросом. Содержание цитохромов Р-420
и Р-450 определяют на двулучевом спектрофотометре по величине
поглощения комплекса восстановленных гемопротеинов с окисью углерода
соответственно при 420 и 450 нм; количество цитохрома Ь5 регистрируют по
разнице в поглощении между его окисленной и восстановленной
формами.
7.2. Стабильность цитохрома Р-450 оценивают по интенсивности
образования функционально инертного цитохрома Р-420 в процессе инкубации
микросом в течение 30 мин при 37°С. Рассчитывают степень спонтанной
тепловой инактивации цитохрома Р-450 как изменение в процентах
разностей между конечным содержанием этого гемопротеина и цитохрома Р-420
по сравнению с исходной величиной, а также период полуинактивации
цитохрома Р-450 — время, за которое половина его молекул превращается
в цитохром Р-420.
7.3. Каталитическую активность микросом в реакциях метаболической
трансформации оценивают с использованием различных субстратов
цитохрома Р-450. Определяют активность N-деметилазы амидопирина
(субстрат I типа) и n-гидроксилазы анилина (субстрат II типа). Рационально
также полярографическое изучение метаболизма гексобарбитала и
амидопирина.
7.4. Дыхательную функцию микросом регистрируют полярографически
по скорости окисления НАД • Н и НАДФ • Н.
7.5. Интенсивность второй фазы биотрансформации — реакций
конъюгации оценивают по активности УДФ-глюкуронилтрансферазы, а также по
содержанию в крови конъюгированного билирубина и скорости экскреции
БСФ.
8. Желчеобразовательная функция печени. Исследование проводят на ин-
тактных животных и животных с СС14-гепатитом. О наличии у
потенциальных гепатопротекторов холеретических свойств судят по скорости
секреции желчи и концентрации в ней билирубина, холестерина и желчных
кислот.
9. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) и активность антиоксидантной
системы печени. Исследование проводят вследствие важной роли, которая
отводится антиоксидантному эффекту в механизме терапевтического
действия гепатопротекторов при патологии печени, вызванной ядами-проок-
сидантами (СС14, бромбензол, парацетамол, аллиловый спирт и др.). В ли-
пидных экстрактах гомогенатов, микросом и митохондрий печени
измеряют содержание появляющихся на начальных этапах ПОЛ диеновых конъ-
югатов, имеющих сопряженные двойные связи, а также оснований Шиф-
- 688-

фа — вторичных продуктов взаимодействия N-концевых остатков белков,
аминокислот и аминогрупп фосфолипидов с альдегидами, возникающими
в ходе реакций ПОЛ. Кинетику образования низкомолекулярного продукта
деградации гидроперекисей жирных кислот — малонового диальдегида
исследуют по реакции с тиобарбитуровой кислотой при стимуляции ПОЛ in
vitro ионами двухвалентного железа и аскорбиновой кислотой или
ферментативным путем с помощью НАДФ • Н.
Функцию антиоксидантной системы печени оценивают по содержанию
восстановленного и окисленного глутатиона, активности глутатионперок-
сидазы, глутатионредуктазы, глутатион-8-трансферазы, супероксид-дисму-
тазы, каталазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, антирадикальной
активности мембранных липидов.
10. Содержание фракций липидов и фосфолипидов в печени. В липидных
экстрактах гомогенатов, микросом и митохондрий печени интактных
животных и животных с экспериментальной патологией гепатобилиарной
системы, получавших потенциальные гепатопротекторы, определяют
суммарное содержание липидов и количество их фракций — фосфолипидов,
свободного холестерина, моно-, диацилглицеридов, свободных жирных
кислот, триглицеридов, эфиров холестерина, а также суммарное содержание
фосфолипидов и количество их фракций. Рациональна идентификация
жирных кислот в составе фосфолипидов печени.
Часть перечисленных методов исследования можно осуществлять в
экспериментах на изолированной печени, перфузируемой средой с
добавленными гепатотоксинами и гепатопротекторами.
Б. Экспериментальные фиброз и цирроз печени
Фиброз и цирроз печени у крыс моделируют применением СС14
(самостоятельно или совместно с этанолом) или тиоацетамида. СС14 вводят
дважды в неделю либо внутрибрюшинно в дозах 0,5—1 мл/кг в течение 5—
10 недель, либо подкожно в дозах 0,25—2 мл/кг в течение 3—6 мес.
Ускорить формирование хронического патологического процесса в печени
возможно потенцированием гепатотоксического эффекта СС14 с помощью
этанола. По этой методике СС14 вводят в желудок по 0,1 мл/кг дважды в
неделю в течение 4 нед, этанол — в виде 5 % раствора в качестве питья
вместо воды на протяжении всего опыта. Тиоацетамид вводят ежедневно
внутрибрюшинно в дозах 50—100 мг/кг 1—2 мес или в желудок 25 мг/кг
2—4 мес. Помимо рассмотренных выше показателей в гомогенатах печени
определяют содержание пролина, оксипролина фракций нейтральносоле-
растворимого, кислоторастворимого и кислотоустойчивого коллагена,
активность пролингидроксилазы, количество гликозаминогликанов и глико-
протеинов. Большое значение имеет морфогистохимическое исследование
печени, включая выявление компонентов соединительной ткани. В
сыворотке крови измеряют содержание гликозаминогликанов и гликопро-
теинов.
В. Исследование гепатозащитного эффекта в культуре гепатоцитов
Исследования проводят на изолированных гепатоцитах (в том числе на
культивируемых раздельно центролобулярных и перипортальных клетках),
в среду инкубации которых помещают растворимые в воде гепатопротекто-
-689-

ры (примерная концентрация для индивидуальных веществ составляет
0,01—1 мг/мл) и гепатотоксины (СС14 2—4 ммоль, парацетамол 1,75—10,4
ммоль, D-галактозамин 1,85—3,5 ммоль, тиоацетамид 1,35—5,3 ммоль, ал-
лиловый спирт 100—175 мкмоль, акролеин 1,5—5 ммоль, гидразин 8—
20 ммоль). Определяют показатели жизнеспособности гепатоцитов (см.
раздел 1), а также исследуют морфологию клеток, биотрансформацию в
них ксенобиотиков, процессы липопероксидации, транспорт ионов.
Корреляция между антигепатотоксическим действием in vivo и in vitro может
отсутствовать.
Для оценки мембраностабилизирующего эффекта потенциальных гепа-
топротекторов исследуют их способность повышать резистентность
эритроцитов к осмотическому и механическому повреждению и предотвращать
развитие гемолиза.
3. Оценка общетоксического действия и специфических видов токсичности
Исследуют влияние гепатопротекторов на основные органы и системы в
условиях хронического эксперимента, а также возможные мутагенные,
канцерогенные, аллергогенные, иммунотоксические, эмбриотоксические и
тератогенные свойства.
Предлагаемая схема позволяет провести доклинические испытания
перспективных гепатопротекторов, исключив уже на ранних этапах
исследования препараты, недостаточно активные или токсичные, что значительно
экономит время и средства.
Литература
1. Автандилов Г. Г. Медицинская морфометрия. — М.: Медицина, 1990. — 384 с.
2. Алимова Е. К., Аствацатурьян А. Т. Исследование жирных кислот и липидов методом
хроматографии. Новое в лаборатории и клинике. — М.: Медицина, 1967. — 108 с.
3. Арчаков А. И. Оксигеназы биологических мембран. — М.: Наука, 1983. — 56 с.
4. Асатиани В. С. Ферментные методы анализа. — М.: Наука, 1969. — 740 с.
5. Атроскин Л. С, Напаян Г. В. Цитофотометрия. — Л.: Наука, 1977. — 295 с.
6. Балуда В. П., Баркаган 3. С, Гольдберг Е. Д. и др. Лабораторные методы
исследования системы гемостаза. — Томск: Изд-во Томского ун-та, 1980. — 314 с.
7. Боголепов Н. Н. Методы электронно-микроскопического исследования. — М.:
Медицина, 1976. — 72 с.
8. Введение в количественную гистохимию / Под ред. Журавлевой Т. Е., Прочуханова
Р. А. — М.: Медицина, 1978. — 247 с.
9. Виноградов В. В. Принципы и методы гистоцитохимического анализа в патологии. —
Л.: Медицина, 1971. — С. 7—87.
10. Гацура В. В., Саратиков А. С. Фармакологические агенты в экспериментальной
медицине и биологии. — Томск: Изд-во Томского ун-та, 1977. — 56 с.
11. Голиков С. Н., Саноцкий И. В., Тиунов Л. А. Общие механизмы токсического
действия. — Л.: Медицина, 1986. — 280 с.
12. ГОСТ 12Ш776. Вредные вещества.
13. Губский К. И. Коррекция химического поражения печени. — Киев: Здоровья, 1989.
- 168 с.
14. Козловская Л. В., Николаев А. П. Учебное пособие по клиническим лабораторным
методам исследования. — М., 1984.
15. Копылова Т. Н., Майоре А. Я., Элерте Д. Л. Клеточная и субклеточная
экспериментальная патология печени. — Рига, 1982. — С. 35—45.
16. Лойда 3., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. — М.: Мир, 1982. — 272 с.
17. Меркулов Г. А. Курс патогистологической техники. — М.: Медицина, 1969. — 424 с.
18. Методы биохимических исследований. Липиды и энергетический обмен / Под ред.
Прохоровой М. И. — Л.: Изд-во Ленинградского ун-та, 1982. — 272 с.
-690-

19. Скакун Н. П., Шманъко В. В., Охримович Л. М. Клиническая фармакология гепато-
протекторов. — Тернополь.: Збруч, 1995. — 272 с.
20. Скакун Н. П., Саратиков А. С, Олейник А. Н., Венгеровский А. И. Этиловый
алкоголь. Фармакокинетика взаимодействия с лекарствами, гепатотоксичность. —
Томск.: Изд-во Томского ун-та, 1985. — 136 с.
21. Adzet Т., Camarasa J., Hernandez J., Laguna J. // Actapharm jugosi. — 1987. — Vol. 37,
N 3. - P. 183-187.
22. Castell J., Gomez-Lechon M. // Interact, between Drugs and Chem Ind Soc Proc Esleve
Found Symp II Mallorca 6—8 Oct 1986 Amsterdam e a. — 1987. - P. 135-149.
23. Galligani L., Lonati-Gattigani M., Fuller G. // Biomed Ex press. — 1979. — Vol. 31, N 7. —
P. 199-201.
24. Gossrau R., Frank H., Graf R. // Histochem J. - 1988. - Vol. 20, N 12. - P. 732-733.
25. Hennings G. // Aryieimittel Forsch. — 1979. - Bd. 29. — N 5. — S. 720-724.
26. Kagawa K., Matsutaka H., Yamagushi Y. et al. // Jap. J. Phar. macol. — 1986. — Vol. 42,
N 1. - P. 19-26.
27. Miccadei S., Nakae D., Kyle M. et al. // Arch. Biochem. and Biophys. — 1988. —
Vol. 265, N 2. - P. 302-310.
28. Mourelle M., Favan L., Amewua J. // Appi Toxicol. - 1988. — Vol. 8, N 5. — P. 351-
354.
29. Patel J., Gordon W., Nelson S., Leibman K. // Drug. Metab. and Disposit. Biol. Fate
Chem. - 1983. - Vol. II, N 2. - P. 164-166.
30. Rwans L., Kasanke S. // Drug, and Chem. Toxicol. - 1984. - Vol. 7, N 6. - P. 595-
604.
31. Strubelt O., Obermeier F., Siegers С // Acta Pharmacol ettox icol. — 1978. — Vol. 43,
N 3. - P. 211-218.
32. TappelA. Pathobiology of cell membranes. - New York, 1975. — Vol. 1. — P. 145—150.
Методические указания по изучению препаратов, обладающих
свойствами антиоксидантов и хелаторов
СОСТАВИТЕЛИ: проф. Л. Г. Коркина; акад.
РАМН Б. Т. Величковский; к. б. н. 3. П. Чере-
мисина; к. б. н. Т. Б. Суслова; д. м. н.
С. К. Соодаева; к. м. н. И. Б. Деева; к. б. н.
Б. Л. Лурье; к. м. н. Г. А. Ибрагимов; Т. В. Сни-
гирева; П. Е. Трахтман
Введение
В последнее десятилетие установлено, что важным патогенетическим
фактором процесса старения, мутагенеза, химического канцерогенеза,
развития ряда тяжелых заболеваний является избыточное образование в
организме активных форм кислорода (АФК), получившее название оксидатив-
ного стресса. Поэтому ведется поиск препаратов, способных предотвратить
или ослабить повреждения, вызываемые оксидативным стрессом.
Генерация АФК в организме осуществляется двумя путями. Первый
путь — ферментативный. Он приводит к образованию супероксидных
анион-радикалов — 02 у пероксида водорода — Н202 и др. Второй путь —
каталитический. Он заключается в трансформации под влиянием ионов
железа и других переходных металлов тех АФК, которые синтезированы
ферментами, и приводит к образованию наиболее агрессивных АФК,
например гидроксильных радикалов — Н02.
- 691 -

В связи с этим особенно перспективными могут стать те препараты,
которые блокируют оба этих пути, т. е. обладают способностью и
антиоксидантов, и хелаторов ионов железа. Методические рекомендации
предлагают надежный и быстрый способ первичного отбора препаратов,
характеризующихся указанными сочетанными свойствами.
ОПИСАНИЕ МЕТОДА
Формула метода. Новизна метода заключается в том, что в качестве
индуктора используются волокна асбеста, которые не только стимулируют
ферментативную кислородзависимую бактерицидную систему фагоцитов,
генерирующую АФК, но и вызывают их вторичную каталитическую
трансформацию на Fe2+, содержащемся в пограничном слое волокна.
Предложены математические формулы определения эффективности антиоксидантов
и хелаторов.
МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕТОДА
Реактивы и оборудование. При осуществлении метода используются
следующие реагенты:
1) стандартный набор реактивов для биохимической лаборатории;
2) реагенты для измерения хемилюминесценции в суспензии клеток:
а) люминол, пероксидаза хрена, трипановый синий производства
фирмы "Сигма", США. Кат. № Т 9284;
б) гепарин натрия (№ 2176, 19.12.88), эфир медицинский (№ 64/228/
322), перекись водорода раствор (№ 74/614/30);
в) хлорид натрия (NaCl), дигидрат хлорида магния (MgCl2 x 2Н20), ди-
гидрат двузамещенного фосфата натрия (Na2HP02 Х 2Н20);
г) волокна хризотил-асбеста Баженовского месторождения (ТУ 31-02-
22—87). Производитель — завод по производству асбеста, г. Асбест,
Екатеринбургской области;
3) стандартное оборудование лаборатории молекулярной биологии.
Приборы. Для измерения хемилюминесценции может быть использован
разрешенный для применения в медицинской практике (Приказ МЗ СССР
№ 413 от 12.07.1989 г.) анализатор хемилюминограмм АХЛГ-2-01, а также
другие разрешенные к применению в медицинской практике в
установленном порядке хемилюминометры. Световой микроскоп.
Лабораторные животные. Беспородные белые крысы масой 180—200 г.
ОПИСАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ МЕТОДА
Метод состоит из двух частей. Определение антиоксидантной
способности вещества осуществляется в суспензии перитонеальных макрофагов,
активированных хризотил-асбестом. Исследование хелатирующих свойств
вещества проводится в модельной бесклеточной системе, содержащей пер-
оксид водорода и хризотил-асбест. Метод заключается в измерении
интенсивности хемилюминесценции в обеих системах с помощью любого
разрешенного к применению в медицинской практике хемилюминометра,
имеющего систему термостатирования и перемешивания.
- 692-

Определение антиоксидантной способности препарата
За сутки до выделения перитонеальных макрофагов белым крысам
перестают давать пищу. В день определения под эфирным наркозом крысам
внутрибрюшинно вводят 15 мл раствора Хенкса с 5 ед/мл гепарина,
подогретого до 37 °С. Брюшко массируют 3—5 мин. Затем животных забивают
декапитацией. Вскрывают брюшную стенку, пастеровской пипеткой
отсасывают содержимое перитонеальной полости и фильтруют его через
двойной слой аптечной марли. Суспензию центрифугируют при 400 g в течение
10 мин. Супернатант сливают, осадок ресуспендируют в 10 мл среды
Хенкса и снова осаждают центрифугированием. Процедуру отмывки
повторяют дважды. Окончательно ресуспендируют клетки в 1,0 мл среды Хенкса.
Все процедуры по выделению клеток проводят при 4 "С (температуре
тающего льда). Подсчитывают количество клеток в камере Горяева и доводят
средой Хенкса до концентрации 5,0 х Ю-6 мл-1. Хранят клетки при
температуре тающего льда и используют для работы в течение 4—5 ч.
Рекомендуется проверять жизнеспособность выделенных клеток с
помощью теста с трипановым синим. Для этого к 0,1 мл суспензии клеток
добавляют 0,1 мл 0,1 % раствора трипанового синего на 0,9 % NaCl.
Подсчитывают число нежизнеспособных клеток с интенсивно окрашенной
цитоплазмой и ядром. Для работы используют суспензию с содержанием
жизнеспособных клеток не менее 85 %.
Для определения антиоксидантной способности препарата в
измерительную кювету хемилюминометра помещается 0,85 мл среды, содержащей
ПО мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl (рН 7,4), 5 мМ D-глюкозы, 2,5 мМ
MgCl2 х 2Н20 и 0,65 мМ люминола (рН 7,4—7,5). Затем в кювету
добавляется 0,1 мл суспензии клеток, регистрируют интенсивность клеточной хе-
милюминесценции (ХЛ) в измерительной кювете при температуре
37 ± 0,5 °С и постоянном перемешивании содержимого кюветы, чтобы не
допустить осаждения клеток и волокон асбеста. Через 3—5 мин измеряют
уровень спонтанной ХЛ макрофагов. После этого в кювету вводят 0,05 мл
исследуемого препарата и в течение 3—4 мин наблюдают за изменением
уровня ХЛ, определяя, влияет ли исследуемый препарат на окислительный
метаболизм макрофагов. Если влияние отсутствует, в кювету вводят 0,05
мл физиологического раствора с 0,3 мг хризотил-асбеста. Измеряют
максимальный уровень свечения (ХЛопыт). Обычно он достигается за 3—4 мин.
В следующей пробе в кювету хемилюминометра помещается суспензия
клеток и хризотил-асбеста (в отсутствие исследуемого препарата) и также
отмечается максимальный уровень ХЛ, обозначаемый как ХЛконтроль.
Расчет антиоксидантной активности препарата проводится по формуле:
ХЛконтроль ~ ХЛопыт х 100% = X %
YJT '
'^i контроль
где X — антиоксидантная активность в процентах.
Следует проводить не менее 3 параллельных измерений
антиоксидантной активности каждого исследуемого препарата.
Определение хелатирующей способности препарата
На поверхности волокон хризотил-асбеста, содержащей ионы железа,
происходит разложение пероксида водорода с образованием гидроксильно-
го радикала. Этот процесс подобен действию фермента пероксидазы.
-693-

Fe2
н,о, > но + но.
12W2
Этот процесс полностью или частично блокируется, если исследуемый
препарат связывает ионы железа на поверхности асбеста.
Для характеристики хелаторных свойств препарата вначале проводятся
три предварительные серии эксперимента. Определяется интенсивность
вспышки ХЛ при разложении стандартного количества Н202 ферментом пе-
роксидазой. Для этого в кювету прибора с 1 мл среды, содержащей ПО мМ
NaCl, 15,4 мМ Na2HP04 х 2Н20 (рН 7,4) и Ю-5 М люминола (рН 7,4-7,45),
последовательно добавляют раствор Н202 в конечной концентрации
2,5 х Ю-7 М. Наблюдаемое при этом свечение обозначают как ХЛисхояная.
Затем выясняют возможность непосредственного взаимодействия препарата с
Н202. Для этого определяют интенсивность вспышки ХЛ при добавлении в
кювету со стандартной средой и стандартным количеством пероксида
водорода 0,05 мл исследуемого препарата и через 2 мин — избытка фермента пе-
роксидазы хрена. Результат измерения ХЛ обозначают как ХЛпрепарат. Если
препарат не взаимодействует с Н202, то светосумма ХЛ не изменяется. Далее
выясняется степень разложения Н202 на волокнах хризотил-асбеста. Для
этого определяется интенсивность вспышки ХЛ при добавлении в кювету
прибора, содержащую стандартную среду и стандартное количество
пероксида водорода, суспензии хризотил-асбеста 0,5 мг/мл и через 2 мин —
избытка фермента пероксидазы хрена. Результат обозначается как ХЛас6есг.
В опытной серии в кювету прибора со стандартной средой вначале
вводится 0,5 мл исследуемого препарата, затем 0,5 мг/мл суспензии хризотил-
асбеста, через 2 мин — стандартное количество пероксида водорода и еще
через 2 мин — избыток фермента пероксидазы хрена. Полученную свето-
сумму свечения обозначают как ХЛ0ПЫТ.
Расчет хелатирующей способности препарата производят по формуле:
vr __ -^^исходная -^ 1 препарат -^^асбест -^^опыт ^ т лл
YJT — YJT — ХТТ
л*' * исходная л*' * препарат -/VJ1 асбест
где У — хелатирующая способность препарата в процентах.
Исследуемый препарат является тем более перспективным, чем выше
его антиоксидантная и хелатирующая активность. Дальнейшее
исследование перспективного препарата проводится в соответствии с требованиями
Фармакологического комитета РФ.
ПОКАЗАНИЯ И ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ МЕТОДА
Метод применяется для ускорения и оптимизации отбора
лекарственных препаратов с антиоксидантными и хелатирующими свойствами. Не
подлежат исследованию токсичные вещества, подавляющие спонтанную
хемилюминесценцию макрофагов.
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА
Предлагаемый метод позволяет производить предварительный отбор-
скрининг потенциальных лекарственных веществ, обладающих
антиоксидантными и хелатирующими свойствами. Данные свойства являются
молекулярной основой для дальнейшего испытания отобранных веществ в ка-
-694-

честве противовоспалительных, антифиброзных, хелатирующих средств,
антидотов при остром или хроническом отравлении тяжелыми металлами.
Поскольку изыскание и исследование новых фармацевтических
препаратов является дорогостоящим и длительным процессом, снижение
стоимости и времени проведения изыскательских работ, предполагаемое при
применении данного метода, является основным показателем его
эффективности. Предлагаемый метод в полной мере отвечает международным
требованиям, предъявляемым к испытанию биологически активных соединений.
Методические указания по изучению новых нестероидных
противовоспалительных препаратов
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н., проф. Г. Я. Шварц;
к. м. н. Р. Д. Сюбаев
Введение
Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) являются
группой лекарственных средств, которые применяют для
симптоматического лечения воспалительных процессов, сопровождающих многие,
прежде всего ревматические, заболевания [Сигидин Я. А. и др., 1988].
НПВП являются одной из наиболее широко применяемых групп
лекарственных средств. В частности, в США в структуре всех рецептурных
препаратов их доля составляет более 25 %; НПВП назначают примерно 20 %
стационарных больных с различными заболеваниями внутренних органов
[Brooks, Day, 1991].
В группу НПВП объединены более 50 веществ различного химического
строения, которые выпускаются в виде нескольких тысяч разнообразных
монокомпонентных и комбинированных лекарственных форм (таблетки,
свечи, ампульные растворы, мази, гели и др.).
По химическому строению НПВП являются гетерогенной группой,
которые подразделяют на вещества кислотного и некислотного строения.
Наиболее широко представлены НПВП кислотного строения, среди
которых выделяют производные карбоновых (арилкарбоновых, арилалкановых)
и эноловых (пиразолидиндионы и оксикамы) кислот [Сигидин Я. А. и др.,
1988; Шварц Г. Я., 1988; Насонов Е. Л. и др., 1996]. Существенно меньше
количество некислотных НПВП, в группу которых включено около 10
препаратов различного химического строения.
Группу НПВП, прежде всего кислотного строения, объединяют не
только отдельные элементы химической структуры, но и, вероятно,
обусловленные ими сходства фармакологических свойств и механизмов действия.
Все они оказывают собственно противовоспалительное (антиэкссудатив-
ное), аналгезирующее и жаропонижающее действие, способны тормозить
миграцию нейтрофилов в очаг воспаления и агрегацию тромбоцитов, а
также активно связываться с белками сыворотки крови, особенно с
альбуминами. Им присущи и сходные побочные эффекты — повреждающее
действие на слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта (ульцеро-
генное действие или гастротоксичность), нарушения функций почек и не-
-695 -

которые другие. Различия в действии НПВП носят в основном
количественный характер. Но именно эти различия, обусловливающие наряду с
терапевтической эффективностью переносимость отдельных препаратов у
разных контингентов больных, а также особенности их фармакокинетики
являются основой не только для индивидуализированного применения
различных НПВП, но и поиска новых препаратов этой фармакотерапевти-
ческой группы, имеющих преимущества перед существующими.
По современным представлениям [Vane, 1996], механизм действия
кислотных НПВП состоит в подавлении (торможении, ингибировании)
активности полиферментного комплекса (называемого простагландинсинте-
тазой или циклооксигеназой — ЦОГ или СОХ в англоязычной
литературе), включающего диоксигеназу, изомеразу, редуктазу и др.,
катализирующего метаболизм полиненасыщенной арахидоновой кислоты,
образующейся под влиянием фермента фосфолипазы А2 из фосфолипидов клеточных
мембран. ЦОГ, называемая также рН-эндопероксидсинтетазой, является
бифункциональным связанным с клеточной мембраной гемопротеином,
локализованным в эндоплазматическом ретикулуме вблизи мест
высвобождения арахидоновой кислоты из мембранных фосфолипидов. ЦОГ,
функционирующая в присутствии молекулярного кислорода и различных
кофакторов, катализирует две ключевые реакции в метаболизме
арахидоновой кислоты, ведущие к образованию циклических эндоперекисей: а)
окисление с присоединением кислорода в положениях 9, 11 и 15 ее
молекулы с образованием промежуточного соединения, называемого проста-
гландином (ПГ) G2, и б) конверсию ПГС2 в ПГН2, являющегося
предшественником всех типов ПГ (ПГЕ, TIYF и др.), а также простациклина и
тромбоксанов А2 и В2, обладающих широким спектром биологических
свойств и высокой активностью. Некоторые из образующихся при
дальнейшем метаболизме циклических эндоперекисей ПГ (ПГ серии Е)
рассматривают как важнейшие "медиаторы" и модуляторы воспалительных
реакций, участвующие в развитии их основных проявлений: нарушений
микроциркуляции и формировании отека, развитии гипералгезии, лихорадки и
т. д. Действие ПГ в тканях усиливают свободные радикалы "гидрокси"-ти-
па, также образующиеся при ферментативном окислении арахидоновой
кислоты и вызывающие повреждения клеточных мембран, в том числе ли-
зосомальных, что сопровождается высвобождением лизосомальных
ферментов.
Принципиальное значение с точки зрения понимания патогенеза
воспаления и механизма действия НПВП имеют данные о том, что ЦОГ
существует в виде 2 изоформ, обозначаемых как ЦОГ-1 и ЦОГ-2 и
играющих разную роль в метаболизме арахидоновой кислоты в физиологических
и патологических условиях [Xie W. et al., 1992; Vane J. R., 1996].
Характеристика изоформ ЦОГ представлена в табл. 1.
ЦОГ-1 представляет собой конститутивный, т. е. постоянно
синтезируемый под влиянием физиологических стимулов и присутствующий в
клетках фермент, участвующий в образовании ПГ, простациклина и
тромбоксанов, являющихся регуляторами микроциркуляции и других функций в
различных тканях, в том числе в слизистой оболочке
желудочно-кишечного тракта, почек, образование тромбоксанов из тромбоцитов, ряда
функций эндотелия и т. п.
В отличие от ЦОГ-1, ЦОГ-2 является изоформой ЦОГ и в
физиологических условиях присутствует в тканях в крайне низкой концентрации. Ее
образование стимулируется рядом активируемых в условиях воспаления
факторов, таких как цитокины (интерлейкины — ИЛ-1, фактор некроза
-696-

Таблица 1. Характеристика ЦОГ-1 и ЦОГ-2 [по D. DeWitt et al., 1993; А. Филипович-
Сосиовска, 1997, с изменениями]
Характеристика
Изоформа
Регуляция
Тканевая экспрессия
Предполагаемая роль
Факторы, стимулирующие
образование (экспрессию)
Повышение образования
под влиянием
стимулирующих факторов
Кодирующие гены
Молекулярная масса
Локализация в клетке
ЦОГ-1
Конститутивная
Общая
Тромбоциты, эндотелий,
желудок, почки и др.
Синтез ПГ, регулирующих
физиологические функции
желудка, почек, сосудов
Физиологические
В 2—4 раза
22 kb + 11 аминокислотных
остатков (экзонов)
70 kD
Цитоплазма
ЦОГ-2
Индуцируемая
Местная
Активированные
моноциты, фибробласты, синовио-
циты, предстательная
железа, мозг и др.
Синтез ПГ, участвующих в
развитии воспаления,
контроле митогенеза,
клеточного деления
Воспалительные
В 10—80 раз
8,3 kb +10 аминокислотных
остатков (экзонов)
70 kD (60 % гомологии с
ЦОГ-1)
Околоядерная область
Таблица 2. Соотношение иигибирующей активности НПВП в отношении ЦОГ-1 и
ЦОГ-2 [по Vane, 1995]
Препарат
Ацетилсалициловая кислота
Диклофенак Na
Ибупрофен
Флурбипрофен
Индометацин
Напроксен
Ацетаминофен
Пироксикам
Мелоксикам
Соотношение ингибирования ЦОГ-2/ЦОГ-1
166
0,7
15
1,3
60
0,6
7,4
150
0,8
опухолей — ФНО-альфа и др.), свободные радикалы кислорода, липополи-
сахариды, митогенные факторы, активатор тканевого плазминогена и др.
ЦОГ-2 синтезируется в воспаленных тканях "клетками воспаления" —
макрофагами, моноцитами, а также синовиоцитами и фибробластами.
Именно этот фермент играет ключевую роль в образовании провоспали-
тельных ПГ, участвующих в развитии и поддержании воспалительного
процесса. НПВП оказывают ингибирующее влияние на обе изоформы
ЦОГ. Однако имеются существенные количественные различия в
тормозящем влиянии препаратов этой группы в отношении каждой из изоформ
ЦОГ (табл. 2).
Естественно, механизм действия НПВП не исчерпывается действием на
метаболизм ПГ. Он значительно сложнее и включает в себя влияние и на
иные элементы воспалительного процесса. В частности, имеются
аргументированные указания, касающиеся влияния НПВП на метаболизм и эф-
-697-

фекты других медиаторов воспаления — кининов [Шварц Г. Я. и др.,
1984], биогенных аминов и адренергические структуры, высвобождение и
активность лизосомальных ферментов, иммунные механизмы, свободно-
радикальные процессы и др. [Сигидин Я. А. и др., 1988].
Необходимо отметить и то, что лекарственные препараты многих фар-
макотерапевтических групп, в частности агонисты альфа- и бета-адреноре-
цепторов, некоторые психотропные, нейротропные, антигистаминные, им-
мунотропные, антибактериальные, цитостатические и другие препараты,
обладают элементами действия НПВП и могут вызывать торможение
острой экссудативной реакции, уменьшать боль либо оказывать
жаропонижающий эффект. В связи с этим лишь углубленное изучение
потенциальных лекарственных средств, включающее набор приведенных в данных
Методических рекомендациях методов, дает ответ на вопрос, можно ли их
рассматривать в качестве потенциальных НПВП.
Фармакологическое изучение потенциального НПВП включает оценку
его основных терапевтических свойств — противовоспалительного, анальге-
тического и жаропонижающего действия, а также наличия специфического
побочного эффекта НПВП кислотного строения — ульцерогенного
действия.
Настоящая редакция Методических рекомендаций содержит
стандартный набор "классических" методик и традиционных моделей для
исследования потенциальных НПВП. В ряде случаев на этапе скрининга может
быть целесообразным использование альтернативных моделей и методов in
vitro. Вместе с тем на этапе углубленного изучения специфической
активности обычно применяются наиболее адекватные, традиционные методы,
которые в настоящее время повсеместно используются ведущими
разработчиками лекарственных средств в нашей стране и за рубежом при
доклиническом изучения НПВП. Примерная схема поэтапного изучения
потенциальных НПВП представлена в приложении 1.
На этапе скрининга при оценке специфической активности
исследуемые вещества, как правило, вводят зондом в желудок в виде водных
растворов или суспензий на 0,5 % Твине 80 (в качестве растворителя может
быть также использован 1 % крахмальный клейстер) за 1 ч до индукции
воспаления. При углубленном изучении отобранного при скрининге
вещества и его лекарственных форм обычно применяют способы введения,
рекомендуемые для использования в клинике. Каждую дозу вводят группам
из 6—10 животных. Во всех экспериментах используют стандартных
половозрелых (желательно линейных) лабораторных животных обоего пола —
мышей (массой тела 20—26 г), крыс (массой тела 130—180 г).
Определение значений средних и стандартной ошибки проводят
традиционными методами вариационной статистики. Следует отметить, что
показатель ЭД50 адаптирован к оценке результатов, полученных в
градированной форме, и соответствует дозе, вызывающей 50 % эффект (снижение
воспалительной, болевой, лихорадочной реакций или выраженность
ульцерогенного действия). Показатель ЭД50, для альтернативных реакций типа
"да—нет" (как в случае определения ЛД50) используется редко, так как он
требует дополнительного обоснования выбранного критерия и затрудняет
сопоставление с показателями, обычно определяемыми для градированных
реакций. Применение альтернативных показателей можно рекомендовать
для использования дополнительных методов.
На этапе углубленного изучения действие фармакологически активного
вещества сравнивают с эталонным препаратом, в качестве которого
рекомендуется использовать наиболее эффективные и безопасные современные
-698 -

НПВП: диклофенак натрий, ибупрофен, пироксикам и др. (приложение 2,
табл. 1).
При углубленном изучении потенциального НПВП могут быть
использованы дополнительные методы оценки влияния на активность ЦОГ-1 и
ЦОГ-2, агрегацию тромбоцитов, клеточные и гуморальные звенья
иммунных процессов и др.
При оформлении отчета по результатам проведенного изучения
необходимо руководствоваться требованиями ГОСТа. В отчет должны входить
приложения с подробными протоколами экспериментов и первичными
данными.
МЕТОДЫ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ДОКЛИНИЧЕСКОГО
ИССЛЕДОВАНИЯ НПВП
Фармакологическое изучение потенциального НПВП включает оценку
его основных терапевтических свойств — противовоспалительного, анальге-
тического и жаропонижающего действия, а также наличия специфического
побочного эффекта НПВП кислотного строения — ульцерогенного
действия.
1. Противовоспалительное действие
Нарушение микроциркуляции и формирование отека относятся к
основным "классическим" признакам воспаления как возникшей в ходе
эволюции реакции живой ткани на местное повреждение. В формировании
острой воспалительной реакции принимают участие многочисленные
медиаторы и модуляторы воспаления (гистамин, серотонин, лизосомальные
ферменты, ПГ, кинины, цитокины и др.), образование и стадийное
выделение которых отражают не только характер и интенсивность
повреждающего (провоспалительного) фактора, но и длительность его воздействия.
Изменение соотношения образования указанных биогенных веществ
способствует переходу острого воспаления в хроническую фазу с
преобладанием пролиферативного компонента тканевой реакции. НПВП оказывают
тормозящее влияние на развитие любого вида воспалительных реакций вне
зависимости от характера повреждающего фактора, фазы и стадии
процесса. В этой связи при оценке потенциального НПВП целесообразным
является исследование его действия как на моделях острого экссудативного,
так и хронического пролиферативного воспаления.
Оценка влияния на острое экссудативное воспаление
1.1. Каррагениновый отек лапы у крыс [Winter С. et al., 1962]
Острую воспалительную реакцию (отек) воспроизводят субплантарным
(под подошвенный или плантарный апоневроз) введением 0,1 мл 1 %
раствора каррагенина*. Выраженность воспалительной реакции оценивают
через 3 ч после индукции воспаления по изменению объема лапы (онко-
метрически). Исследуемые вещества вводят зондом в желудок за 1 ч до
*Сульфатированный полисахарид из ирландского морского мха.
-699-

каррагенина. Противовоспалительный эффект, оцениваемый по
уменьшению отека, выражают в процентах к контролю; по результатам действия не
менее трех доз исследуемого вещества проводят расчет ЭД50-
Дополнительный метод/модификация: формалиновый отек (субплан-
тарное введение 0,1 мл 2 % раствора формалина). Каолиновый отек (суб-
плантарное введение 0,1 мл 10 % водной суспензии). При использования
метода "отек лапы" для изучения лекарственных форм для наружного
применения препараты наносят на лапу, слегка втирая, и накладывают
пластырь с марлей за 2 ч и 1 ч до индукции воспаления. Дозы исследуемого
вещества при накожной аппликации или ректальном введении не должны
существенно отличаться от эффективных доз, определенных при внутри-
желудочном введении.
1.2. Перитонит у крыс*
Острая экссудативная реакция — перитонит, вызывается внутрибрю-
шинным введением 1 % раствора уксусной кислоты (1 мл на 100 г массы
тела). Через 3 ч животных забивают, вскрывают брюшную полость и
собирают экссудат. Исследуемые вещества вводят зондом в желудок за 1 ч до
уксусной кислоты. Антиэкссудативный эффект оценивают по уменьшению
объема экссудата в процентах к контролю, при необходимости определяют
ЭД50. Критерий эффективности при скрининге — снижение экссудативной
реакции более чем на 50 %.
1.3. Ультрафиолетовая эритема у морских свинок** [Swingle et al., 1971]
Острую воспалительную эритему у морских свинок-альбиносов обоего
пола массой 250—500 г вызывают облучением ультрафиолетовыми (УФ)
лучами участка кожи живота (3x4 см, лишенного шерсти за 1 сут до
проведения опыта). В качестве источника УФ облучения используют
кварцевую лампу (длина волны 280 нм); облучение осуществляют с расстояния
10 см в течение 60 с. Выраженность эритемы и отека кожи оценивают
через 4 ч по 4-балльной шкале (при необходимости интегральной оценки
реакции на облучение показатели суммируются; максимальное значение — 8
баллов).
Хроническое пролиферативное и иммунное воспаление
1.4. Фетровая гранулема у крыс [Meier et al., 1950]
Хроническое пролиферативное воспаление вызывают имплантацией под
кожу живота 4 простерилизованных фетровых дисков массой около 10 мг.
Операцию выполняют под легким эфирным наркозом в асептических
условиях. На 8-е сутки после операции фетровые диски с образовавшейся
* Рекомендуется использовать как вспомогательный метод и для предварительной
оценки антиэкссудативного действия при скрининге на мышах после регистрации
болевой реакции в тесте "корчей".
** Наиболее адекватный метод оценки противовоспалительного действия лекарственных
форм для наружного применения.
-700-

вокруг них грануляционными тканями извлекают, взвешивают на
торсионных весах и высушивают до постоянной массы при 60 "С. Пролифератив-
ную реакцию оценивают по разнице между массой высушенной гранулемы
и исходной массой фетрового диска. Экссудативную реакцию оценивают
по разнице между массой сырой и высушенной гранулемы. Исследуемые
вещества вводят ежедневно в течение 7 дней. Противовоспалительное
действие (влияние на пролиферативный и экссудативный компоненты
хронического воспаления) выражают в процентах по отношению к контролю;
ЭД50 исследуемого вещества обычно определяют для антипролиферативно-
го действия.
1.5. Адъювантный артрит у крыс [Newbould В. В., 1963]
Хроническое иммунное воспаление моделируют у крыс субплантарным
введением в правую заднюю лапу 0,1 мл адъюванта Фрейнда (взвесь БЦЖ
2,5 мг/мл в вазелиновом масле). Воспалительная реакция, как правило,
оценивается в динамике каждые 2 дня. Могут учитываться также и другие
симптомы генерализованной реакции организма на введение адъюванта
(отек ушей, хвоста полиартрит, ухудшение общего состояния, снижение
массы тела, гибель). Первичная реакция (отек на правой лапе) оценивается
онкометрически на 3-й день после инъекции адъюванта. Вторичная
иммунологическая реакция (отек на левой лапе) оценивается на 14-й день после
введения адъюванта (при профилактической схеме введения) или на 25-й
день (при лечебной схеме введения). ЭД50 исследуемого вещества
определяют, как правило, в отношении вторичной реакции.
а) При изучении профилактического действия исследуемые вещества
вводят ежедневно, в течение 14 дней, начиная введение за 1 день до
инъекции адъюванта.
б) При оценке лечебного действия исследуемые вещества вводят
ежедневно, в течение 12 дней, начиная с 14-го дня после инъекции адъюванта.
2. Анальгетическое действие
Наряду с тормозящим влиянием на острое экссудативное и хроническое
пролиферативное воспаление, характерным для НПВП является наличие
анальгетических свойств. Эти препараты, ряд из которых относят к группе
так называемых ненаркотических анальгетиков (в отличие от
наркотических морфиноподобных), применяют для устранения слабых или умеренно
выраженных болей, сопровождающих радикулиты, миозиты, а также
другие мышечно-суставные заболевания, при головной и зубной боли. Их
особенностями является отсутствие угнетающего влияния на дыхательный
и кашлевой центры головного мозга и способности вызывать эйфорию,
явления психической и физической зависимости. Механизм анальгетиче-
ского действия НПВП складывается в основном из 2 компонентов,
каждый из которых может иметь самостоятельное значение: во-первых, за счет
антиэкссудативных свойств, способствующих уменьшению механического
давления воспаленных тканей на болевые рецепторы, и, во-вторых, из-за
уменьшения альгогенного действия образующихся в нефизиологических
количествах в очаге воспаления химических медиаторов боли — проста-
гландинов, кининов и др., участвующих в формировании гипералгезии.
Именно феномен гипералгезии, заключающийся в снижении порога боле-
-701 -

вой чувствительности воспаленных тканей к действию болевых стимулов
различной модальности, является основным объектом влияния НПВП, в
связи с чем данный эффект препаратов нередко называют гипоальгетиче-
ским. Определенное значение во влиянии отдельных НПВП (например,
салицилатов) на воспалительные реакции воспалительного генеза может
иметь их воздействие на таламические центры болевой чувствительности
(центральный эффект).
Воспалительная гипералгезия
2.1. Механическое раздражение воспаленной лапы у крыс [Randall L. О.,
Selitto J., 1957]
Воспалительная гипералгезия (повышенная болевая чувствительность
воспаленных тканей) вызывается каррагенином (аналогично технике,
описанной в п. 1.1, 0,1 мл 1 % раствора, субплантарно) и оценивается по
снижению порога болевой чувствительности — ПБЧ (по разности ПБЧ) на
механическое раздражение тканей лапы животного до введения каррагени-
на и через 3 ч после него. Измерение обычно проводят на воспаленной
лапе. Наряду с этим оценка ПБЧ на интактной лапе может служить
дополнительным контролем и позволяет выявить аналгезию центрального
происхождения. Используемый аналгезиметр должен обеспечивать плавное
увеличение нагрузки на воспаленную лапу до появления болевой реакции
(оцениваемой по писку животного). Исследуемые вещества вводят через 2
4 после введения каррагенина. Анальгетический эффект с определением
ЭД50 оценивают по снижению гиперальгезии через 1 ч после внутрижелу-
дочного введения препарата. Критерий эффективности — снижение гипер-
алгезии не менее чем на 50 %. При изучении продолжительности действия
исследуемого вещества ПБЧ регистрируют каждый час.
Дополнительный метод/модификация: для моделирования гипералгезии
может быть использовано субплантарное введение 0,1 мл 10 % суспензии
пивных дрожжей, 2 % формалина или адъюванта Фрейнда (адъювант,
5 мг/мл БЦЖ в вазелиновом масле, вводится за 24 ч до исследуемого
вещества).
Химическое болевое раздражение
2.2. Корчи, вызванные уксусной кислотой у мышей [Koster et al., 1959]
В опытах на мышах специфическую болевую реакцию "корчи"
(характерные движения животных, включающие сокращения брюшных мышц,
чередующиеся с их расслаблением, вытягиванием задних конечностей и
прогибанием спины) вызывают внутрибрюшинным введением 0,75 %
уксусной кислоты (0,1 мл/10 г массы тела). В течение последующих 15 мин
после инъекции подсчитывают количество корчей для каждого
животного (по 10 животных в группе). Анальгетический эффект оценивают по
уменьшению количества корчей в процентах к контролю. Критерий
эффективности при скрининге — снижение болевой реакции не менее чем
на 50 %.
Дополнительные методы/модификации: корчи, вызываемые
внутрибрюшинным введением уксусной кислоты у крыс (1 % раствор, 0,5 мл/
-702-

100 г); фенилбензохинона у мышей (0,02 % раствор, 0,15 мл/10 г); ацетил-
холина у мышей (3,2 мг/кг, 0,05 % раствор, регистрация альтернативная в
течение 2 мин).
3. Жаропонижающее действие
Характерным свойством НПВП является жаропонижающая активность,
выраженность которой широко варьирует. Уменьшение лихорадочной
реакции этими препаратами по современным представлениям связано в
определенной степени с ингибированием биосинтеза ПГ в головном мозге,
либо с их взаимодействием с рецепторными образованиями, в частности, в
тканях центральной нервной системы (термочувствительные нейроны в
гипоталамусе). При этом, как полагают, антипиретические свойства НПВП
отражают способность препаратов проникать в мозг, т. е. зависят от фар-
макокинетических характеристик. Изучение жаропонижающих свойств
потенциальных НПВП, таким образом, позволяет не только охарактеризовать
данный вид фармакологической активности, но и косвенно судить о
способности проникать в центральную нервную систему.
а. Дрожжевая лихорадка у крыс [Loux et al., 1972]
Лихорадочную реакцию вызывают подкожным введением 20 %
суспензии пекарских дрожжей. Ректальную температуру измеряют
электротермометром до введения пирогена и через 18 ч после него (разница этих
измерений представляет собой оцениваемую гипертермическую реакцию).
Жаропонижающее действие оценивают по уменьшению гипертермии через
2 ч после введения исследуемого вещества. Возможна регистрация
динамики эффекта через часовые промежутки в течение 7 ч.
Дополнительный метод/модификация: лихорадка у крыс, вызванная
внутривенным введением пирогенала (500 МПД/кг).
4. Ульцерогенное действие
Повреждающее влияние НПВП на слизистую оболочку
желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), называемое также ульцерогенным действием,
является характерным для этой группы препаратов побочным эффектом,
связанным, по современным представлениям, преимущественно с
основным механизмом их действия — тормозящим влиянием на активность
фермента циклооксигеназы (ЦОГ). При этом важно отметить, что данный
эффект, в целом коррелирующий с силой противовоспалительного
действия [Сюбаев Р. Д. и др., 1986], отражает неизбирательность действия
большинства существующих НПВП в отношении изоформ этого фермента —
конститутивной (ЦОГ-1) и индуцируемой (ЦОГ-2). Именно подавление
НПВП активности ЦОГ-1 и связанное с этим уменьшение
катализируемого данным ферментом синтеза ПГ, простациклинов и тромбоксанов,
являющихся физиологическими регуляторами микроциркуляции в слизистой
оболочке ЖКТ, рассматривают как основной механизм, лежащий в основе
ульцерогенного эффекта данной группы лекарственных средств. В связи с
этим изучение ульцерогенного эффекта у потенциального НПВП дает
возможность, с одной стороны, выявить наличие и выраженность этого по-
-703-

тенциально неблагоприятного эффекта, а с другой — косвенно судить о
влиянии изучаемого вещества на биосинтез ПГ.
а) Однократное введение. Исследуемые вещества (в виде водных
растворов или суспензий на Твине 80 * вводят однократно внутрижелудочно
крысам, лишенным пищи за 16 ч до опыта (животных помещают в клетки с
сетчатым полом без подстилки, чтобы исключить поедание мусора и
экскрементов). Через 3 ч животных забивают, извлекают желудки, рассекают
их по малой кривизне и промывают в изотоническом растворе натрия
хлорида для удаления содержимого. Оценку ульцерогенного эффекта проводят
по 4-балльной шкале: 0 — отсутствие повреждений, 0,5 — гиперемия, 1 —
единичные незначительные повреждения (1 или 2 точечных
кровоизлияния); 2 — множественные повреждения (эрозии, точечные
кровоизлияния); 3 — значительные и множественные повреждения слизистой
оболочки (эрозии, кровоизлияния); 4 — грубые повреждения, охватывающие всю
поверхность слизистой оболочки (массивные кровоизлияния, эрозии,
перфорации). По результатам оценки определяют УД50 — дозу исследуемого
вещества, вызывающую ульцерогенный эффект, соответствующий 2
баллам.
б) Повторное (субхроническое) введение. Используется как
дополнительный метод, рекомендуется для изучения лекарственных форм.
Исследуемые вещества вводят внутрижелудочно в течение 4 дней до оценки
ульцерогенного действия. Возможно определение УД5о-
Доклиническая оценка ульцерогенных свойств исследуемого вещества
проводится с учетом результатов токсикологического изучения
лекарственных форм в хроническом эксперименте.
5. Влияние на эффекты медиаторов воспаления in vitro и in vivo
В качестве дополнительных могут быть использованы следующие
методы, позволяющие судить о влияние исследуемых веществ на образование,
высвобождение и эффекты медиаторов воспаления:
а) влияние исследуемых веществ (Ю-10—Ю-5 г/мл) на сокращение
изолированных отрезков подвздошной кишки морской свинки, вызванное
арахидоновой кислотой (натриевая соль) (Ю-5 г/мл); гистамином (5 х Ю-8
г/мл), серотонином (2 х Ю-6 г/мл), ПГЕ2 (5 х Ю-8 г/мл); брадикинином
(5 х Ю-8 г/мл);
б) влияние исследуемых веществ на экссудативную реакцию (отек лапы
у крыс), вызванную субплантарным введением 0,1 мл раствора
арахидоновой кислоты (0,1 %); вещества 48/80 (0,005 %); гистамина (0,1 %); серото-
нина (0,01 %); ПГЕ2 (0,005 %).
ЭТАПЫ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ НПВП
Скрининг
Данный этап представляет собой предварительную оценку наличия
противовоспалительных свойств у исследуемых веществ для определения
целесообразности их дальнейшего изучения в качестве потенциальных НПВП.
* Применение крахмального клейстера нежелательно из-за возможного защитного
обволакивающего эффекта.
-704-

Включение теста оценки специфического ульцерогенного действия на
данном этапе обусловлено его высоким прогностическим значением,
поскольку ульцерогенность является практически неотъемлемым свойством и
основным "нежелательным побочным эффектом" аспириноподобных
НПВП, ингибиторов ЦОГ. Анализ спектра действия современных НПВП
выявляет высокую корреляции (г = 0,89) между противовоспалительной
активностью и ульцерогенными свойствами [Сюбаев Р. Д. и др., 1986].
Следует иметь в виду, что интерпретация результатов скрининговых
исследований по одной серии экспериментов в значительной степени имеет
вероятностный характер. Вероятность правильного прогноза при отборе
веществ для углубленного изучения значительно возрастает при наличии
достоверного и дозозависимого эффекта, а также при сочетании всех 3
видов активности, характерных для НПВП.
Начальная ориентировочная оценка острой токсичности исследуемых
веществ служит лишь для определения диапазона адекватных доз, которые
используются в последующих фармакологических экспериментах данного
этапа. При незначительном количестве исследуемых веществ
целесообразно провести полноценное изучение острой токсичности с определением
статистически достоверного показателя ЛД50.
Рекомендуемый набор скрининговых тестов включает:
а) Ориентировочное определение ЛД50 для мышей при внутрижелудочном
введении. Регистрация гибели животных проводится не ранее чем на 3-й
сутки (при проведении стандартного токсикологического эксперимента
наблюдение за состоянием животных проводится в течение 14 дней).
Макроскопическое обследование состояния слизистой оболочки желудка у
павших и выживших животных может дать предварительную информацию
о возможном ульцерогенном действии исследуемого вещества, которое в
дальнейшем оценивается в опытах на крысах.
б) Противовоспалительное действие. Антиэкссудативный эффект
исследуемого вещества при внутрижелудочном введении в дозах, составляющих
0,05 ЛД50 и 0,1 ЛД50, оценивают на модели каррагенинового отека лапы у
крыс. Оценка противовоспалительного эффекта проводится через 3 ч
после индукции воспаления. Критерием эффективности (при альтернативной
оценке реакции) по данному тесту следует считать достоверное
уменьшение отека лапы не менее чем на 30 % по сравнению с контролем.
В качестве альтернативного метода можно использовать модель
формалинового отека лапы у крыс.
в) Аналъгетическое действие. Анальгетический эффект исследуемого
вещества (в тех же дозах) оценивают по способности уменьшать число
болевых реакций, "корчей", у мышей при внутрибрюшинном введении 0,75 %
раствора уксусной кислоты. Критерием эффективности (при
альтернативной оценке) считают достоверное угнетение болевой реакции на 50 % и
более. Следует отметить, что данный эксперимент позволяет получить
предварительную дополнительную информацию о возможном антиэкссу-
дативном действии исследуемого вещества по измерению объема экссудата
в брюшной полости через 2 ч после введения уксусной кислоты.
Более достоверные результаты могут быть получены при использовании
аналогичной модели экссудативной реакции брюшной полости на крысах.
г) Ульцерогенное действие. В опытах на крысах, лишенных пищи за 16 ч
до опыта, оценивают ульцерогенное действие исследуемых веществ при
однократном внутрижелудочном введении в дозе 0,2 ЛД50. Оценку
ульцерогенного действия проводят через 3 ч после введения веществ.
23 - 762
-705-

2. Углубленное изучение специфической активности
Целью данного этапа исследований является оценка специфической
противовоспалительной активности и широты терапевтического действия
отобранного соединения. Исследования включают определение показателей
специфической активности субстанции (ЭД50) и проведение серий
сравнительных экспериментов с позитивным контролем, в качестве которого
используют стандартные НПВП, применяемые в адекватной (эквитоксиче-
ской дозе). Широту терапевтического действия исследуемого вещества
оценивают по индексу безопасности — УД50/ЭД5о, а также по
терапевтическому индексу — ЛД50/ЭД5о, которые сравнивают с соответствующими
показателями стандартных НПВП (препарата сравнения).
3. Дополнительные исследования
Целью данного этапа является изучение лекарственных форм
перспективных веществ, отобранных для клинических испытаний, а также
расширение характеристики их фармакологического спектра за счет
использования дополнительных методов оценки специфической активности
(противовоспалительного, анальгетического и жаропонижающего действия) и
изучения общих фармакологических свойств.
Использование различных экспериментальных моделей иногда
позволяет выявить особенности механизма действия исследуемого вещества и
прогнозировать возможные побочные эффекты.
Дополнительные исследования следует проводить с использованием
препарата сравнения — стандартного НПВП (см. приложение 2).
Наряду с использованием дополнительных "альтернативных" методов
оценки специфической противовоспалительной активности на данном
этапе проводят:
а) изучение эффективности исследуемого вещества при лечебной схеме
применения;
б) изучение общих фармакологических свойств (влияние на
центральную и периферическую нервную систему, сердечно-сосудистую систему,
тонус бронхов, свертывание крови, кроветворение, функцию печени и
почек и др.);
в) изучение специфического фармакологического действия
лекарственных форм (проводятся наиболее показательные сравнительные
эксперименты с применением рекомендуемых способов введения).
Изучение механизмов действия
Данные вид исследований предполагает использование принципов
фармакологического анализа, а также биохимических и других специальных
методов, позволяющих оценить выраженность типичного для большинства
современных НПВП механизма действия — ингибирование ЦОГ,
избирательность влияния на ее изоформы (ЦОГ-1, ЦОГ-2), или выявить иные
механизмы действия.

Приложение 1
ПРИМЕРНАЯ СХЕМА ИЗУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ
НЕСТЕРОИДНЫХ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ СРЕДСТВ
1. Скрининг
1.1. Острая токсичность (ЛД50 для мышей при внутрижелудочном
введении).
1.2. Противовоспалительное действие (каррагениновый отек лапы у
крыс; внутрижелудочное введение в дозах 0,05 ЛД50 и 0,1 ЛД50)-
1.3. Анальгетшеское действие ("корчи" у мышей, вызванные уксусной
кислотой; внутрижелудочное введение в дозе 0,1 ЛД50)-
1.4. Ульцерогенное действие (однократное внутрижелудочное введение
крысам в дозе 0.2ЛД50).
2. Углубленное изучение специфической противовоспалительной
активности
2.1. Острая токсичность (ЛД50 для мышей при рекомендуемых способах
введения).
2.2. Противовоспалительное действие (ЭД50).
а) Острое экссудативное воспаление.
(каррагениновый отек лапы у крыс, "перитонит" у мышей и крыс,
"ультрафиолетовая эритема" у морских свинок-альбиносов)
б) Хроническое пролиферативное воспаление ("фетровая гранулема" у
крыс).
в) Хроническое иммунное воспаление ("адъювантный артрит" у крыс).
Анальгетическое действие (ЭД50; механическое болевое раздражение
воспаленных тканей — каррагениновый отек).
Жаропонижающее действие (ЭД50; "дрожжевая лихорадка" у крыс).
Ульцерогенное действие (УД5о; при однократном внутрижелудочном
введении на крысах). Вычисление показателей широты терапевтического
действия (терапевтический индекс — ЛД5о/ЭД5о; индекс безопасности — УД5о/
ЭД50). Сравнительная оценка широты терапевтического действия
исследуемого вещества и стандартных НПВП.
Дополнительные исследования
Противовоспалительное действие:
а) отек лапы у крыс, вызванный формалином, декстраном, каолином;
б) эксперименты с использованием адреналэктомированных крыс на
моделях острого и хронического воспаления (каррагениновый отек,
фетровая гранулема).
Анальгетическое действие:
а) "корчи" у мышей , вызванные фенилбензохиноном, ацетилхолином;
б) механическое болевое раздражение воспаленной и интактной лапы у
крыс (гиперальгезия, вызванная введением формалина, суспензии пивных
дрожжей, адъюванта Фрейнда).
Жаропонижающее действие:
Гипертермическая реакция у крыс, вызванная пирогеналом.
Изучение продолжительности действия (противовоспалительного, аналь-
гетического, жаропонижающего).
Лечебная схема введения (сравнительная оценка противовоспалительного
действия при профилактической и лечебной схеме введения на моделях
острого и хронического воспаления).
23*
- 707 -

Ульцерогенное действие (оценка ульцерогенного действия у крыс при
повторном субхроническом введении препарата).
Изучение лекарственной формы.
а) Экспериментальное обоснование дозировки и выбор состава
лекарственной формы.
б) Изучение специфической фармакологической активности и
ульцерогенного действия предлагаемых лекарственных форм в сравнении с
субстанцией и препаратом сравнения (оценивается эффект одинаковых или
эквитоксических доз исследуемого вещества и препарата сравнения).
Изучение общих фармакологических свойств.
Изучение механизмов действия
Влияние на гипофиз-адреналовую систему (оценка
противовоспалительной активности на адреналэктомированных животных — каррагениновый
отек).
Влияние на эффекты медиаторов воспаления in vivo и in vitro:
а) влияние на воспаление лапы у крыс, вызванное веществом 48/80,
гистамином, серотонином, арахидоновой кислотой, ПГЕ2;
б) влияние на спазмогенную реакцию изолированной подвздошной
кишки морской свинки, вызванную гистамином, серотонином, брадики-
нином, ПГЕ2, арахидоновой кислотой.
Возможное участие центральных механизмов анальгетического эффекта:
а) механическое болевое раздражение интактных (невоспаленных)
тканей;
б) термическое болевое раздражение (метод "отдергивания хвоста",
метод "горячей пластинки").
Другие экспериментальные методы, позволяющие выявить особенности
механизма действия.
Приложени е 2
Таблица 1. Соотношение противовоспалительной и ульцерогенной активности НПВП у
крыс*
Препарат
Ибупрофен
Диклофенак натрий
Напроксен
Пироксикам
Фенилбутазон
АСК"
Индометацин
ЭД50 (мг/кг), каррагениновый отек
48
8
15
20
56
98
10
УД50 (мг/кг)
310
48
49
36
120
240
10
УД50/ЭД50
6,45
6,0
3,2
1,8
2,1
2,45
1,0
Таблица 2. Соотношение противовоспалительной активности и острой токсичности
НПВП в эксперименте*
Препарат
Ибупрофен
Диклофенак натрий
Напроксен
Пироксикам
Фенилбутазон
ЭД50 (мг/кг), каррагениновый отек
48
8
15
20
56
ЛД50 (мг/кг)
750
370
620
290
430
ЛДя/ЭД»
16
46
42
15
7,7
- 708 -

Продолжение
Препарат
АСК**
Индометацин
ЭД50(мг/кг), каррагениновый отек
98
10
ЛД50 (мг/кг)
1600
47
ЛД5о/ЭД5„
16
4,7
*Г. Я. Шварц, Р. Д. Сюбаев, 1982, Р. Д. Сюбаев и соавт., 1986.
*АСК — ацетилсалициловая кислота.
Л итература
1. Насонов Е. Л., Цветкова Е. С, Балабанова Р. М. и др. // Клин, медицина. — 1996.
- № 4. - С. 1-4.
2. Сигидин Я. А., Шварц Г. Я., Арзамасцев А. П., Либерман С. С. Лекарственная терапия
воспалительного процесса (экспериментальная и клиническая фармакология
противовоспалительных препаратов). — М.: Медицина, 1988. — 240 с.
3. Сюбаев Р. Д., Шварц Г. Я. // Бюл. эксперим. биол. и мед. — 1986. — № 12. —
С. 733-735.
4. Сюбаев Р. Д., Машковский М. Д., Шварц Г. Я. и др. // Хим.-фарм. журнал. — 1986.
- № 1. - С. 33-39.
5. Филипович-Сосновска А. // Новости фармации и медицины. —1997. — № 5—6. —
С. 89-94.
6. Шварц Г. Я. Ц Хим.-фарм. журн. — 1988. — № 11. — С. 1317—1326.
7. Шварц Г. Я., Пасхина Т. С, Якубовская Р. И. // Фармакол. и токсикол. —1984.—
№ 4. - С. 74-81.
8. Brooks P. М., Day R. О. // New Engl. J. Med. - 1991. - Vol. 324. - P. 1716-1725.
9. DeWitt D. L., Meade E. A., Smith W. L. // Amer. J. Med. - 1993. - Vol. 95. - Suppl.
2A. - P. 40S-44S.
10. Roster R., Anderson M., de Beer E. // Fed. Proc. - 1959. - Vol. 18. - P. 412.
11. Loux J., de Palma P., Yanksell S. // Toxicol. Appl. Pharmacol. — 1972. - Vol. 22. -
P. 672.
12. Meier R., Schuler W„ Dessaulles P. // Experientia. — 1950. — Vol. 6. — P. 469.
13. Newbould B. // Br. J. Pharmacol. — 1963. — Vol. 21. - P. 127.
14. Randall L., Selitto J. // Arch. Int. Pharmacodyn. — 1957. — Vol. 111. — P. 209.
15. Swingle K., Hamilton R., Harrington J., Kvam D. // Arch. Int. Pharmacodyn. — 1971. —
Vol. 189. - P. 129.
16. Vane J. R. // Br. J. Rheumatol. - 1996. - Vol. 35. - P. 1-3.
17. Vane J. R., Betting R. M. // Inflamm. Res. - 1995. — Vol. 44. - P. 1—10.
18. Winter C, Risley E., Nuss G. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. — 1962. — Vol. 111. —
P. 544.
19. Xie W., Robertson D. L., Simmons D. L. // Drug. Dev. Res. — 1992. — Vol. 25. —
P. 249-265.

Методические указания по экспериментальному изучению
фармакологических средств, обладающих свойствами антидотов
(Часть 1)
СОСТАВИТЕЛИ: к. м. н. С Е. Колбасов;
к. м. н. С М. Королев; д. м. н. С. П. Нечипорен-
ко; д. м. н. А. Н. Петров; к. м. н. В. К.
Сибиряков; к. м. н. М. К. Шевчук
Введение
"Антидотная" терапия является одним из наиболее эффективных
способов лечения острых отравлений химическими веществами. Ее роль
особенно велика при оказании медицинской помощи в токсикогенной стадии
течения интоксикации. Правильное применение антидотных средств
позволяет также ускорить восстановление нарушенных функций организма
пациента в целом.
В настоящее время существует несколько определений понятия
"антидоты", которые, несмотря на внешние отличия по своей сути, идентичны и
в полной мере отражают современные представления об антидотных
средствах. В качестве примера можно привести формулировку отечественных
авторов: "Антидоты — медицинские средства (в том числе и лекарственные
препараты), которые либо обезвреживают яд в организме в процессе
физических или химических превращений при непосредственном
взаимодействии с ядом, либо предупреждают и устраняют токсические эффекты за
счет антагонизма с ядом в действии на рецепторы, ферменты и
физиологические системы".
Эксперты международной программы по химической безопасности
(МПХБ) определили антидоты как терапевтические вещества,
применяемые для противодействия токсическому эффекту(ам) конкретного
ксенобиотика.
По сравнению с другими лекарственными средствами оценка
эффективности антидотов имеет ряд особенностей. Из-за ограниченной
возможности клинических испытаний большее значение имеют
экспериментальные доказательства эффективности этих препаратов. Побочное действие,
острая и хроническая токсичность имеют меньшее значение, чем в случае
других лекарств, так как обычно антидоты применяются однократно и по
жизненным показаниям.
Данные методические указания регламентируют порядок и объем
исследований (в том числе вид и количество подопытных животных), методы
моделирования отравлений и критерии эффективности антидотов. В них
также приведены основные термины и понятия, используемые для
количественной оценки антидотного эффекта.
Учитывая огромное количество химических веществ и соответственно
многообразие проявлений их токсического действия, в отдельных случаях
некоторые положения могут уточняться.
-710-

1. Общие положения
На препараты, предлагаемые для клинических испытаний в качестве
средств, обладающих свойствами антидотов, должны быть представлены
материалы экспериментальных исследований, характеризующих
специфическую антидотную и общую фармакологическую активность соединений.
Изучение специфической активности антидотов должно проводиться на
моделях соответствующих интоксикаций и в сравнении с известными
(если таковые имеются), используемыми в клинической практике
антидотами.
Антидотная активность предлагаемых средств характеризуется
следующими величинами:
— коэффициент защиты: отношение среднесмертельных или среднеэф-
фективных по определяющему эффекту доз (концентраций) на фоне
применения антидота к среднесмертельным или среднеэффективным по
определяющему эффекту дозам (концентрациям) без антидота;
— выживаемость в %, время гибели, динамика симптомов интоксикации;
— антидотная мощность: количество среднесмертельных или среднеэф-
фективных по определяющему эффекту доз (концентраций) на фоне
антидота, при которых выживает (отмечается определяющий эффект) 50 %
отравленных животных;
— показатель гарантированной защиты: предельно переносимые дозы
(концентрации) на фоне применения антидота, не вызывающие появления
видимых симптомов интоксикации, нарушений состояния и поведения
подопытных животных.
1.1. Общие положения оценки эффективности антидотов
Оценка антидотной активности проводится последовательно на мелких
лабораторных животных (грызуны) и негрызунах (кошки, собаки).
1.1.1. Определение зависимости доза—эффект (например, ЛД50 у интактных
и леченых антидотом животных)
Животные: белые мыши или крысы.
Количество животных: необходимое для определения основных токси-
кометрических параметров (ЛД10, ЛД50, ЛД90) или эффективных доз (ЕД)
по определяющим эффектам токсиканта при отсутствии смертельных
исходов в группах леченых и нелеченых животных.
Время введения антидота зависит от применения его в лечебных или
профилактических целях. В последнем случае антидот вводится до
введения токсиканта.
Регистрируемый эффект: летальность по группам или наличие
определяющих эффектов, характерных для конкретного токсиканта.
1.1.2. Исследование с введением фиксированной дозы токсиканта
Животные: кошки, собаки или обезьяны (не менее 2 обоего пола в
группе). Группы животных: интактные (нелеченые антидотом) и
защищаемые антидотом животные.
- 711 -

Путь введения: рекомендованный для клинического применения. Доза
токсиканта: кратная ЛД50 (ЕД50), при которой отмечается максимально
возможная летальность (максимально выраженный эффект) в группе
контрольных животных. Доза антидота: вызывающая защитный эффект по
предварительным экспериментам на негрызунах.
Так как полученная информация об эффективности антидота в данном
случае относится только к его эффективности при применении ЛД50 (ЕД50)
токсиканта, для расширения информации об эффективности антидота и
получения данных независимых от направления расхождения кривых
доза—эффект в сторону больших и малых доз токсиканта рекомендуется
рассчитывать коэффициент защиты как отношение ЛДШ (ЕД10) леченых
антидотом животных к ЛДэд (ЕДзд) нелеченых (показатель гарантированной
защиты). При значении этого отношения больше 1, эффективность
антидота считается удовлетворительной.
2. Основные этапы исследования доклинической оценки специфической
антидотной активности
Эффективность противоядия оценивается в опытах на теплокровных
животных и в опытах in vitro.
2.1. Исследования in vitro
Некоторые свойства антидотов могут быть оценены в исследованиях in
vitro. Например, для оценки эффективности антидотов, действие которых
обусловлено ингибированием активности специфических ферментов. В
частности, исследования такого рода могут быть проведены в отношении ре-
активаторов холинэстеразы (антидотов, применяемых при отравлении хо-
линолитиками). В этих случаях изучается кинетика восстановления
активности холинэстеразы (ХЭ), угнетенной различными ФОС и карбаматами.
Преимуществом такого рода исследований является не только простота
получения большого количества данных, но и возможность работать с ХЭ
человека, что упрощает процесс экстраполяции экспериментальных
данных с животных на человека. В опытах с низкоорганизованными
биологическими объектами (простейшие, примитивные ракообразные, культуры
клеток и т. д.) или в исследованиях на изолированных органах можно
проводить предварительную оценку эффективности антидотов.
2.2. Исследования in vivo
2.2.1. Оценка антидотной активности при внутримышечном (внутривенном)
поступлении токсиканта
В реальной ситуации интоксикация такого рода возможна при
передозировке лекарственного препарата, вводимого в стационаре или в
домашних условиях, при повышенной чувствительности больного к
определенным лекарственным препаратам, при суицидных или криминальных
отравлениях. Кроме того, этот путь введения отмечается точностью дозирования
и часто используется при изучении патогенеза отравлений и анализа
механизма аитидотного действия.
- 712 -

Предварительно проводится определение ЛД50 токсиканта (или ЕД50 при
отсутствии смертельного исхода) при его внутримышечном введении. С
этой целью используют белых крыс массой тела 180—200 г или белых
мышей массой тела 18—22 г. Среди животных одной группы максимальная
разница в массе тела не должна составлять более 10 %. Предварительно на
5—6 животных проводится ориентировочное определение уровня
смертельных доз, после чего ставится развернутый эксперимент с введением
5—6 доз токсиканта, требуемых для расчета ЛД50 (ЕД50)- Количество
животных в группе не менее 6. Токсикант вводят внутримышечно в нативном
виде, в виде раствора или суспензий. В качестве растворителя может быть
использована дистиллированная вода для инъекций, изотонический
раствор натрия хлорида или такие растворители, как Твин 20, Твин 80, или
другие растворители, принятые в токсикологической практике.
Максимально вводимый за один раз объем составляет для мышей 0,5 мл, для
крыс — до 5 мл, для собак — до 10—12 мл жидкости. Животные
контрольной группы должны содержаться в тех же условиях, что и животные
опытных групп, и получать внутримышечную инъекцию растворителя.
Длительность наблюдения за животными зависит от фармакодинамических
свойств токсиканта (сутки — 2 нед). Регистрируемый показатель —
летальность по группам (наличие определяющего эффекта). По результатам
развернутого эксперимента рассчитывается средняя величина ЛД50 (ЕД50) и ее
ошибка (М ± т). После определения ЛД50 (ЕД50) токсиканта проводят
экспериментальную оценку антидотной активности предлагаемого препарата
в опытах на грызунах и негрызунах с определением показателей
выживаемости, антидотной мощности, гарантированной защиты, а также по
динамике симптомов интоксикации (п. 1.1).
2.2.2. Оценка эффективности антидотов при пероральном поступлении
токсиканта
Эффективность антидота в данном случае оценивается на модели
интоксикации соответствующим токсикантом при его пероральном
поступлении. Первоначально определяется ЛД50 (ЕД5о) по определяющему
эффекту). Введений токсиканта в желудок экспериментальных животных
осуществляется:
1) естественным путем (с пищей, питьевой водой);
2) в чистом виде, в виде растворов, эмульсий, взвесей и т. д. Последний
способ введения предпочтительнее, поскольку позволяет получать
воспроизводимую картину действия конкретного токсиканта, не зависящую от
внешних условий (характер, количество пищи и пр.). Моделирование пер-
оральной аппликации в свою очередь определяется его
физико-химическими свойствами (агрегатное состояние, растворимость, характер
растворителя и т. п.), возможностью использования летальных доз.
Выбор вида лабораторных животных определяется, кроме механизма
действия токсиканта, дозой используемого вещества (летальная или
вызывающая определенные токсические эффекты). В табл. 1 приведены
максимально допустимые количества введенной в желудок жидкости для ряда
видов экспериментальных животных.
В качестве модельного вида животных могут быть использованы белые
мыши или крысы массой тела 180—200 г и 18—22 г соответственно. Число
животных в группе не менее 6, число групп — необходимое для введения
5—6 доз токсиканта, требуемое для расчета ЛД50 (ЕД50). После набора дос-
-713-

Таблица 1.
Вид животных
Мышь
Крыса
Морская свинка
Кролик
Масса (г)
20-24
25-30
>30
100-190
200-240
250-300
>300
250-300
>300
2000-2400
2500-3000
>3000
Количество жидкости (мл)
0,5
0,8
1,0
3,0
4,0-5,0
6,0
8,0
4,0-5,0
6,0
100,0
150,0
200,0
таточного количества статистических данных необходимо использовать
крупных животных (кошки, собаки, обезьяны).
Токсикант вводится непосредственно в желудок экспериментальным
животным при помощи металлических (мелкие лабораторные животные)
или резиновых зондов (крупные животные), что позволяет быть
уверенным:
— в точной дозировке исследуемого вещества;
— избежать возможного нежелательного местного воздействия
исследуемого вещества на слизистые оболочки ротовой полости и пищевода.
Внутрижелудочное введение токсиканта осуществляется животным
натощак (через 4 ч после кормления). Кормление затравленных животных
производится через 3—4 ч после введения вещества.
Жидкие вещества вводятся в чистом виде либо, если их токсичность
чрезвычайно высока и доза не соответствует задачам моделирования
конкретной интоксикации, используются растворы и эмульсии вещества.
В качестве растворителей наиболее часто используются дистиллированная
вода, этиловый спирт, растительные масла, твины различных марок.
Животным контрольной группы вводится соответствующий растворитель или
инертное вещество.
Необходимо отметить, что токсиканты вводятся в минимально
возможных объемах. При установлении диапазона смертельных или среднеэффек-
тивных по определяющему эффекту доз растворы вещества следует
вводить, варьируя объемом, но не концентрацией во избежание изменения
токсикокинетики исследуемого агента. Длительность наблюдения за
животными зависит от вида моделируемой острой интоксикации (сутки —
2 нед).
В ходе моделирования отравления необходимые величины степени
интоксикации (ЛД, ЕД) получают, используя стандартные статистические
методы обработки экспериментальных данных (пробит-анализ,
регрессионный анализ, непараметрические методы). При работе с небольшими
выборками (крупные лабораторные животные) целесообразно рассчитывать
значения искомых параметров по методу, предложенному В. Б.
Прозоровским.
Для объективной оценки результатов моделирования интоксикации
применяют общие и специальные методы исследования функций органов
-714-

и систем. Выбор конкретных методов определяется ведущим механизмом
токсического действия вещества. Предлагаемый антидот вводится путем,
рекомендуемым для клинического применения до введения токсиканта
(профилактический антидот) или через определенное время после
введения токсиканта. Время введения антидота должно быть приближено к
реальной обстановке (времени возможного его применения). Оценка
эффективности антидотов производится по показателям выживаемости, антидот-
ной мощности, гарантированной защиты, а также по динамике симптомов
интоксикации (п. 1.1).
2.2.3. Оценка эффективности антидота при ингаляционном поступлении
токсиканта
В условиях экспериментальных исследований ингаляционный путь
введения ядов является наиболее сложным с технической точки зрения. Это
дополняется сложностью определения реально поглощенной дозы
вредного вещества из-за сорбционных потерь и неравномерности дыхания
подопытных животных.
Затравки осуществляются в одном из двух режимов — статическом или
динамическом. Используются белые крысы массой тела 180—240 г,
максимальная разница массы между особями одной группы не должна
превышать 10 %. Минимальная статистическая группа — 6 особей. Число групп —
необходимое для введения 5—6 доз токсиканта.
При статической затравке животные помешаются в эксикатор или
термокамеру типа Б. А. Курляндского. При этом объем воздуха на одно
животное в час должен составлять не менее 5 л. Пары, газы или аэрозоли
нагнетаются в затравочный объем для создания необходимой концентрации с
учетом потерь на оседание и адгезию не менее 35 %. Время затравки
определяется, исходя из конкретных условий моделирования аварийной
ситуации на производстве или патогенезом интоксикации.
Концентрация яда определяется отношением массы нагнетенного
вещества к затравочному объему. Условно поглощенная доза яда определяется
умножением концентрации на время воздействия и средний объем
легочной вентиляции крысы (0,1 л/мин). Разделив полученный результат на
среднюю массу животных, получают сопоставляемую с другими путями
введения дозу яда.
Динамические затравки осуществляются в камерах типа Б. А.
Курляндского, причем в затравочной атмосфере находится только голова
животного, помещаемого в специальный пенал ("домик"). В камеру с помощью
дозаторов могут непрерывно подаваться не только пары, газы и аэрозоли, но
и пыли исследуемых токсикантов. Сорбционные потери при непрерывном
перемешивании воздуха вентилятором не превышают 25 %.. Концентрация
яда определяется отношением массы нагнетенной за время затравки
вещества к объему камеры и кратности воздухообмена. Обычно кратность
воздухообмена для камеры объемом 100 л составляет 20 л/мин. Оценка
эффективности антидотов производится по показателям выживаемости, ан-
тидотной мощности, гарантированной защиты, а также по динамике
симптомов интоксикации (п. 1.1).
-715 -

2.2.4. Оценка антидотной активности при накожном поступлении
токсиканта
Для оценки антидотной активности при накожном поступлении
антидота необходимо определить ЛД50 токсиканта при этом пути
поступления, которая выражается в мг/кг массы тела и(или) мг/см2 поверхности
тела. Для исследования используются белые крысы с исходной массой
тела 189—200 г, белые мыши (18—22 г), морские свинки (200—300 г),
кролики породы "шиншилла" или альбиносы. Исследования проводят не
менее чем на 2 видах животных; обязательным условием являются опыты
на белых крысах. Количество животных в группе не менее 8—10 особей.
Среди животных одной группы максимальная разница в массе тела
должна составлять не более 10 %. Участок аппликации должен составлять 5 %
общей поверхности кожи животных, что соответствует 2/з хвоста крыс и
мышей или участку кожи на спине мышей 1,5 х 2 см, крыс 4x4 см; для
кроликов 7 х 8 см и для морских свинок 5x5 см. Более точно общая
поверхность тела животного и соответственно площадь участка
аппликации могут быть рассчитаны, исходя из массы их тела по общепринятым
формулам.
За 1—2 дня до эксперимента тщательно выстригают шерсть на участке
аппликации (применение депиллятора недопустимо). В опыт пригодны
животные с чистой здоровой кожей без механических повреждений.
Шерсть выстригают на симметричных участках спины по обе стороны
позвоночника, оставляя шерстный покров между ними в 2 см. Правый бок
служит для аппликации изучаемого вещества, левый — для контроля.
На время экспозиции животных фиксируют для исключения слизыва-
ния продукта с кожи. Фиксация должна осуществляться наиболее
физиологичным методом. С этой целью для кроликов применяют специальные
станки или полужесткие воротники (из резины, пластика или линолеума).
Морских свинок помешают в индивидуальные домики.
Время экспозиции — 4 ч. Время наблюдения после однократной
аппликации — 2 нед.
Исследуемое соединение наносится на участок, равный 5 %
поверхности кожи животного в строго дозированных количествах из расчета на 1 кг
массы тела и на 1 см поверхности кожного покрова путем равномерного
распределения на его поверхности. Нанесение продукта на кожу спины
начинают обычно с 20 мг/см2.
Изучаемые соединения наносят на кожу, как правило, в нативном виде.
В случае невозможности нанесения вещества в чистом виде или при
наличии выраженного раздражающего действия применяют разведение
химического вещества. В качестве растворителя и разбавителя следует
использовать дистиллированную воду или модельную среду, имитирующую
потовую жидкость. При невозможности разведения вещества в перечисленных
выше растворителях допускается применение растительного и
вазелинового масла, этилового спирта или ацетона.
Нанесение вещества осуществляется открытым способом при
температуре окружающей среды 18—24 °С. Для летучих веществ (температура
кипения до 160°) следует использовать закрытый способ: компрессионный
метод Ведрова и Долгова, метод наклейки капсул и часовых стекол,
применение камер КНИД-1.
На контрольный участок кожи животного наносится растворитель или
разбавитель, используемый в опыте.
После окончания экспозиции остатки продукта удаляются теплой водой
-716-

с мылом. Необходимо избегать грубых манипуляций, способных вызвать
изменения кожи.
После определения ЛД50 токсиканта проводят экспериментальную
оценку антидотной активности предлагаемого препарата в опытах на
грызунах и негрызунах с определением показателей выживаемости,
антидотной мощности, гарантированной защиты, а также по динамике симптомов
интоксикации (п. 1.1).
3. Определение острой токсичности и широты терапевтического действия
антидота
Установление параметров острой токсичности проводится на грызунах
(мыши, крысы) и негрызунах (собаки).
3.1. Исследования на грызунах
Животные: два вида (мыши, крысы), половозрелые, обоего пола .
Число животных: в группе не менее 6 особей.
Путь введения: пероральный и парентеральный, включая
рекомендованный для клинического применения.
Дозы: 4—5 доз, достаточных для расчета основных токсикометрических
параметров (ЛД50, ЛД16, ЛД84).
Частота введения: однократно.
Период наблюдения: 14 дней.
Регистрируемые показатели: ежедневное наблюдение общего состояния,
взвешивание животных 3 раза в течение периода (до начала исследования,
через 7 и 14 дней), вскрытие павших животных и всех выживших в конце
эксперимента, макроскопическое описание, определение относительной
массы органов и изучение гистологической структуры органов с
выраженными макроскопическими изменениями.
3.2.2. Исследования на негрызунах
Животные: один вид животных (собаки), половозрелые, обоего пола.
Число животных: в группе не менее 2 животных.
Путь введения: рекомендованный для клинического применения.
Дозы: две дозы для ориентировочного определения летальной дозы.
Частота введения: однократно.
Длительность наблюдения: 14 дней.
Регистрируемые показатели: ежедневное наблюдение за общим
состоянием, взвешивание не менее 3 раз за период наблюдения, лабораторные
исследования по мере необходимости; в конце периода наблюдения или
после гибели все животные вскрываются, дается макроскопическое
описание, органы взвешиваются, имеющие макроскопические изменения
подвергаются гистологическому исследованию.
Для характеристики безопасного применения препарата введен
показатель широты терапевтического действия или диапазон доз лекарственного
препарата, которые лежат между минимально действующей и минимально
токсической дозами.
Количественной характеристикой широты терапевтического действия
-717-

является терапевтический индекс, представляющий собой отношение:
I = ЛД50/ЕД50. При прочих равных условиях препараты с большим
терапевтическим индексом имеют предпочтение.
Данные по токсичности нового антидота, значению терапевтического
индекса и побочным эффекта сопоставляются с данными, полученными
для эталонных препаратов.
4. Изучение фармакокинетики
Исследование фармакокинетики антидота проводится как с целью
прогнозирования и планирования сроков его введения, так и для прогноза
последствий его влияния на организм.
4.1. Исследование зависимости концентрации препарата в плазме крови
от времени после его введения
Животные: собаки-самцы, половозрелые, массой тела 15—20 кг.
Число животных: 2.
Путь введения: рекомендованный для клинического применения.
Дозы: определяются пределом обнаружения препарата в сыворотке
крови и составляют величину, в 100 раз превышающую предел
обнаружения (с учетом возможных потерь препарата, связанных с его
биодоступностью и возможностями применяемых методов).
Частота введения: однократно.
Время регистрации: зависит от пути введения препарата, при
внутривенном — 0 мин, 1—2 мин, 5 мин, 10 мин, 20 мин, 40 мин, 1 ч, 2 ч и до
регистрации следовых количеств препарата в плазме крови.
4.2. Оценка фармакокинетических показателей
Оценка фармакокинетических показателей проводится 2 методами: мо-
дельно зависимым с привлечением стандартных фармакокинетических
моделей и методом интегральных моментов, являющимся
модельно-независимым. Использование 2 методов необходимо для проверки адекватности
полученной фармакокинетической модели. Для характеристики
фармакокинетики препарата в плазме крови рассчитываются следующие показатели:
b — постоянная убывания на хвосте распределения (мин)
С„шх — максимальная концентрация (мкг/мл)
AUC — полная площадь под кривой (мин мкг/мл)
MRT — среднее время удерживания (мин)
С1 — общий клиренс (мл/мин/кг массы)
V0 — центральный объем распределения (мл/кг)
V — стационарный объем распределения (мл/кг)
ТЭфф — эффективная длительность процесса (мин)
В некоторых случаях для оценки фармакокинетических показателей
можно использовать альтернативные методы. Примером этого могут
служить ингибиторы холинэстераз (ХЭ), основные фармакокинетические
параметры которого могут быть получены по данным динамики ингибирова-
ния активности ХЭ. Также возможна регистрация динамики изменения
характерного для исследуемого антидота фармакологического эффекта.
-718-

5. Анализ механизма действия
При представлении документации по всякому фармакологическому
препарату необходимо располагать данными о механизме его действия. В
отношении антидотов известно, что поводом для создания эффективного
противоядия является либо случайное обнаружение факта антагонизма токсиканта
и противоядия, либо целенаправленное изучение механизмов действия
токсиканта, особенностей его токсикокинетики и установления на этой основе
возможности модификации вызываемых им эффектов. В связи с этим
методология изучения механизма действия противоядия во многом определяется
методологией изучения механизма действия токсиканта, и набор
методических приемов для определения механизма действия антидота идентичен
таковому для определения механизма действия яда. Выбор конкретных
методических подходов определяется участием тех или иных возможных
механизмов действия соединения в патогенетической терапии интоксикации
конкретным токсикантом.
Этот этап исследования не является обязательным, но он направлен на
выяснение механизма антидотного действия препарата.
6. Изучение общей фармакологической активности, влияния на основные
системы жизнеобеспечения организма
Животные: один вид животных (мыши или крысы), половозрелые,
обоего пола.
Число животных: в группе не менее 6 животных. В каждом конкретном
случае набор методических приемов определяется механизмом действия
антидота.
Путь введения: рекомендованный для клинического применения.
Дозы: широкий диапазон доз — от не оказывающих заметного влияния
на общее состояние до вызывающих гибель.
Частота введения: однократно.
Длительность наблюдения: 14 дней.
Регистрируемые показатели: повышение или снижение общей
возбудимости, увеличение или снижение двигательной активности, наличие
тремора, судорожных подергиваний, гиперкинезов, изменение цвета кожных
покровов, взъерошивание шерсти, каталепсия, птоз, стереотипия, груминг
и т. д. Изучаются пиннеальный, болевой рефлексы, влияние на
температуру тела, потребление воды и пиши. Регистрируются показатели внешнего
дыхания, ЭКГ, артериальное давление, состояние высшей нервной
деятельности (определяемое с помощью метода регистрации условной
реакции пассивного избегания), функциональное состояние печени, почек,
гематологические показатели, активность основных ферментов.
7. Перечень представляемых материалов
В Фармакологический государственный комитет для получения
разрешения на клинические испытания представляются следующие документы:
1. Представление.
2. Проект названия препарата.
3. Проект фармакопейной статьи.
4. Проект инструкции по клиническому применению препарата.
- 719 -

5. Отчет об экспериментальном исследовании специфической антидот -
ной активности.
6. Отчет об экспериментальном исследовании безопасности препарата,
поведенном в рамках требований Фармакологического государственного
комитета РФ.
7. Выписка из решения Ученого совета института или лаборатории,
одобрившего предложение антидота для рассмотрения ФК.
8. Литературная справка (для препаратов, описанных в литературе).
9. Образцы препарата и лекарственная форма его.
10. Образец препарата сравнения.
Литература
1. Бейли Н. Математика в биологии и медицине: Пер. с англ. — М.: Мир, 1970. —
326 с.
2. Всемирная организация здравоохранения: Руководство по контролю за ядами. —
М.-. Медицина, 1998. — 113 с.
3. Военная токсикология, радиология и медицинская защита / Под ред. Н. В. Саватее-
ва. - Л.: ВМА, 1987. - 355 с.
4. Куценко С. А. Антидоты. Состояние проблемы, принципы разработки // Тезисы
докл. Всеармейской научно-практической конференции, посвященной 200-летию
Российской Военно-медицинской академии, Санкт-Петербург, 30—31 марта, 1999.
- С. 30-53.
5. Методы определения токсичности и опасности химических веществ
(токсикометрия) / Под ред. И. В. Саноцкого. — М.: Медицина, 1970. — 343 с.
6. Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и
обоснование предельно-допустимых уровней загрязнения кожи: Методические указания
№ 2102-79. - М., Минздрав СССР, 1980. - 23 с.
7. Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP) /
Под ред. Ю. В. Бурова, И. В. Березовской и др. — М., 1992.
8. Пиотровский В. К. Метод статистических моментов и интегральные модельно-неза-
висимые параметры фармакокинетики // Фармакол. и токсикол. — 1986. — № 5. —
С. 118-127.
9. Прозоровский В. Б., Прозоровская М. П., Демченко В. М. //Фармакол. и токсикол. —
1978. - № 4. - С. 497.
10. Прозоровский В. Б. Практическое пособие по ускоренному определению средних
эффективных доз и концентраций биологически активных веществ. — Байкальск:
Изд-во ОДПК, 1994.
11. Прозоровский В. Б. Индекс гарантированной защиты — новый показатель
эффективности антидотов // Токсикол. вестник. — 1999. — № 4. — С. 10—14.
12. Соловьев В. Н., Фирсов А. А., Филов В. А. Фармакокинетика. — М.: Медицина, 1980.
- 423 с.
13. Токсикометрия химических веществ, загрязняющих окружающую среду / Под ред.
А. А. Каспарова, И. В. Саноцкого. — М.: Центр международных проектов ГКНТ,
1986. - 426 с.
14. Трахтенберг И. М., Сова Р. Е., Шефтель В. О. и др. Проблема нормы в
токсикологии. — М.: Медицина, 1991. — 208 с.
15. Уланова И. П., Сидоров К. К., Холено А. И. К вопросу об учете поверхности тела
экспериментальных животных при токсикологическом исследовании. — В кн.:
Токсикология новых промышленных веществ. — Вып. 10. — Л.: Медицина, 1968. —
С. 18-25.

Методические указания по экспериментальному изучению
фармакологических веществ, обладающих свойствами
антидотов и (или) комплексонов, для защиты организма
от поражающего действия радиоактивных веществ (Часть 2)
СОСТАВИТЕЛИ: д. б. н. А. Т. Иванников;
д. м. н. В. С. Калистратова
1. Введение
Методические указания предназначены для унификации
экспериментального изучения фармакологических веществ, обладающих свойствами
антидотов и (или) комплексонов, для защиты организма от поражающего
действия радиоактивных веществ (РВ).
Одной из глобальных задач современной химии является
целенаправленное создание соединений с заранее заданными свойствами антидотов
при отравлении чужеродными ядами, в том числе радионуклидами.
Биологическое действие радионуклидов обусловлено ионизирующим
излучением, возникающим в результате самопроизвольного распада их
ядер. В отличие от обычных ядов большинство РВ являются биологически
опасными в исчезающе малых, невесомых количествах. Поэтому РВ не
могут оказать вредное химическое воздействие на организм, за исключением
урана-238, имеющего очень большой период полураспада (4,5><109 лет) и
малую удельную активность.
В отличие от ядов химического действия связывание или осаждение РВ
не прекращает их действия. В случае поражения РВ основной акцент
должен быть сделан на прекращение инкорпорации и удаление РВ из
организма, в результате чего достигается снижение поглощенной дозы и,
следовательно, ослабление биологических эффектов облучения.
Поглощенная доза является мерой радиационного воздействия на
организм. Применительно к РВ поглощенная доза является произведением
количества (концентрации) нуклида в тканях, вида и энергии излучения и
времени контакта излучателя с облучаемой тканью. Так как вид и энергия
излучения РВ неизменны, для снижения поглощенной дозы и уменьшения
биологических эффектов облучения следует идти по пути снижения их
концентрации в органах и тканях и сокращения времени воздействия
излучателей, т. е. ускорить их выведение из организма.
При исследовании препаратов, рассчитанных на ускорение выведения
того или иного РВ из организма животных, необходимо учитывать
токсикологию этого РВ, физико-химические свойства, характер его
распределения и скорость выведения из организма. Прежде всего следует иметь в
виду путь поступления РВ в организм, который определяет величину
резорбции, облучение органов первичных депо, что в значительной мере может
определять особенности клинических проявлений лучевой болезни при
инкорпорации РВ.
2. Этапы изучения антидотов и комплексонов
Экспериментальное изучение проводится в три этапа:
первый — предварительный отбор препаратов;
-721 -

второй — детальное исследование эффективности препаратов,
предназначенных для ускорения выведения радиоактивных изотопов из
организма;
третий — изучение безвредности отобранных препаратов.
2.1. Предварительный отбор.
2.1.1. Задача предварительного отбора — выявить эффективные средства
ускорения выведения РВ.
2.1.2. Испытание средств, предлагаемых для ускорения выведения РВ из
организма, проводится как в ранние сроки после поражения, так и в более
поздние, когда РВ депонируется в органах и тканях.
2.1.3. Испытания проводятся на мелких лабораторных животных
(крысах массой 180—220 г, мышах массой 18—22 г), обязательно самцах.
2.1.4. Для определения эффективности препарата устанавливают
количественное содержание радиоактивных элементов в различных органах
подопытных и контрольных животных. Для этого животных забивают в
различные сроки (1, 3, 5, 10 сут) после введения лечебного средства по 3—
5 животных на каждый срок.
В предварительных опытах можно ограничиться определением РВ лишь
в ранние сроки после поражения и главным образом в органах
максимального депонирования радиоизотопа и в тушке животного [1].
2.1.5. Каждый опыт должен включать следующие четыре группы не
менее чем по 10 животных в каждой:
1. Опытная группа для определения выведения радиоактивного изотопа
после применения изучаемого соединения.
2. Контрольная группа для изучения выведения радиоактивного изотопа
без применения изучаемого соединения.
3. Контрольная группа для изучения выживаемости после применения
изучаемого соединения.
4. Биологический контроль.
Животные всех групп должны находиться в одинаковых условиях
содержания и кормления.
2.1.6. Введение радиоактивного изотопа в организм производится
однократно при любой аппликации (перорально, внутрибрюшинно,
внутривенно, внутримышечно, ингаляционно и пр.) в одинаковом для всех групп
количестве, позволяющем надежно определять содержание радиоизотопов в
органах наибольшего депонирования с учетом ожидаемого эффекта
выведения. Введение радиоактивного изотопа выражается в беккерелях на 1 кг
массы животного.
Для ингаляционного введения применяют ультразвуковые генераторы
аэрозолей, например УЗГ-2, TURUSI 2,3, как наиболее эффективные по
сравнению с пневматической аэрозольной аппаратурой (ПАИ-1, АИ-2) [2].
Ингаляционный способ введения можно осуществлять и с помощью ин-
тратрахеального введения (крысам), который одинаково приемлем как для
введения РВ, так и препаратов.
2.1.7. Введение изучаемого соединения для ускорения элиминации
радиоактивного изотопа из организма производится однократно при трех
уровнях доз. Для адсорбентов — перорально, для комплексонов — при
любой аппликации, но одинаково для всех групп данного опыта, сразу или
через 10—30 мин после поражения.
Животных первой и второй групп забивают на 1—3-й сутки после
применения лечебного средства. Животных третьей и четвертой групп
наблюдают до 10 сут, что дает возможность произвести предварительную оценку
токсичности испытуемого средства.
-722-

2.1.8. Оценку эффективности изучаемого вещества производят
сравнительно (контроль—опыт) по количеству выведенного из организма
изотопа, по остатку его в критическом органе или в цельной тушке.
Все расчеты выведенного из организма и оставшегося в организме
изотопа производят в процентах к введенному количеству и в процентах от
соответствующего контроля со статистической обработкой материала в
виде среднего и ошибки среднего. Достоверность различий оценивается по
критерию "t" Стьюдента или %2 при р < 0,05 или 0,1.
2.1.9. Если исследуемое соединение увеличивает выведение из
организма радионуклида на 70 % и выше по сравнению с контролем, то такое
соединение подлежит более подробному, детальному исследованию на
крысах и обязательно на собаках.
2.2. Детальное исследование эффективности препаратов.
2.2.1. В опытах уточняется оптимальная для эффекта доза, изучается
эффективность предлагаемого средства в зависимости от времени
применения после поступления радиоактивного изотопа, длительность и
кратность введения, исследуется выведение изотопа с мочой и калом.
2.2.2. Опыты проводят на двух группах животных: 1. Подопытная
группа для определения выведения радиоактивного изотопа при введении
изучаемого соединения и 2 — контрольная группа для изучения выведения
изотопа без применения изучаемого соединения.
2.2.3. В экспериментах используются половозрелые животные, самцы
или самки, по 5—10 животных в группе: крысы массой 160—250 г, собаки
(беспородные) — 8—12 кг.
2.2.4. Параллельно при тех же условиях (время введения, доза и т. д.)
изучается эффективность имеющегося препарата, ранее разрешенного для
применения при поступлении данного радиоизотопа. Материалы о
рекомендуемых для выведения РВ и лечения средствах и результатах
исследовании содержатся в работах Л. А. Ильин [3], Д. И. Семенова и И. П. Тре-
губенко [4], В. П. Борисова [5], В. С. Балабуха [6] и др.
Это позволит оценить эффективность изучаемого средства по
сравнению с уже имеющимся и сделать заключение о преимуществе или его
отсутствии у изучаемого средства перед имеющимся.
2.2.5. Содержание радиоизотопа или его концентрация (на 1 г ткани)
определяется в следующих органах подопытных и контрольных животных:
легких, сердце, кишечнике (двенадцатиперстной, тонкой и толстой
кишке), печени, селезенке, почке, костях (бедренной и грудине или в
хвостовом позвонке), крови, мышечной ткани, тушке в целом, в щитовидной
железе (в опытах с радиоактивным йодом), а также в моче и кале. Общая
активность скелета рассчитывается путем умножения содержания ее в бедре
на 20. Масса мышцы принимается за 45 % от массы всей крысы [7]. При
испытании средств, ускоряющих выделение остеотропных элементов,
проверяется содержание кальция в крови.
2.2.6. При равноценной эффективности или преимуществе изучаемого
средства перед имеющимся приступают к третьему этапу исследования —
изучение безвредности препарата и фармакокинетики, которые проводят в
соответствии с методическими указаниями по этим разделам.
Л итература
1. Закутинский Д. И., Селиванова Л. Н. Биологическая оценка препаратов для
профилактики и лечения лучевой болезни. — М.: Медгиз, 1960.
2. Борисов В. П., Скоморохова Т. Я., Кендыш М. М. Ультразвуковая аэрозоль-терапия
- 723 -

комплексонами при ингаляционных поражениях радиоактивными веществами.
Тезисы 3-й Всесоюзной конференции по аэрозолям, Ереван, октябрь, 1977. — Т. 2. —
с. 130-131.
3. Ильин Л. А. Основы защиты организма от воздействия радиоактивных веществ. —
М.: Атомиздат, 1977.
4. Семенов Д.И., Трегубенко И.П. Комплексоны в биологии и медицине. —
Свердловск: УНЦ АН СССР, 1984.
5. Борисов В. П., Журавлев В. Ф., Иванов В. А., Северин С. Ф. Неотложная помощь при
острых радиационных воздействиях: изд. 2-е, доп. и перераб. / Под. ред. Л. А.
Ильина. — М.: Атомиздат, 1976.
6. Балабуха B.C., Иванников А.Т., Архипова О.Г., Тихонова Л. И. Уран и бериллий.
Проблемы выведения из организма / Под ред. В. С. Балабуха. — М.: Атомиздат,
1976.
7. Москалев Ю.И. Дис. докт. — М.: Ин-т биофизики Минздрава СССР, 1955.
Методические указания по доклиническому изучению
радиопротекторных свойств фармакологических веществ
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н. П. П. Михайлов;
Э. П. Коровкина
Введение
Радиопротекторы — это синтетические химические вещества или
продукты природного происхождения, применение которых до или в ранние
сроки после облучения способны обеспечить защиту организма от
поражающего действия смертельных доз радиации или уменьшить степень
выраженности лучевого поражения.
По целевому назначению радиопротекторы условно подразделяются на
3 группы:
1. Радиопротекторы экстренного действия.
Предназначаются для применения в условиях воздействия на организм
внешнего гамма (протонного) или гамма-нейтронного облучения при
кратковременном (мгновенном) облучении ионизирующей радиацией с
большой мощностью дозы и должны оказывать противолучевое действие
не позднее чем через 15—20 мин. после их применения; фактор изменения
дозы (ФИД) радиопротекторов экстренного действия должен составлять не
менее 1,4—1,5 в диапазоне среднелетальных доз.
2. Радиопротекторы длительного действия.
Предназначаются для повышения радиорезистентности на длительный
срок и применяются при протяженном или фракционированном гамма-
облучении (например, на следе радиоактивного облака или зараженной
местности, при ликвидации аварий на энергетических ядерных установках,
при длительных космических полетах) и должны обеспечивать длительный
радиозащитный эффект (не менее 7—10 сут).
3. Радиопротекторы многоразового применения. Предназначаются для
повышения радиорезистентности при несмертельных дозах
гамма-облучения различной мощности. В отличие от радиопротекторов длительного
действия, эффект которых проявляется при однократном применении пе-
-724-

ред облучением, для противолучевых средств этой группы допускается
многократное применение как перед (1—2 нед), так и в процессе
облучения. ФИД в диапазоне среднелетальных доз должен быть не менее 1,3.
При подготовке данных методических указаний были использованы:
Медико-тактические требования к противолучевым средствам. — М, 1991;
Владимиров В. Г., Красильников И. И., Арапов О. В. Радиопротекторы:
Структура и функция. — Киев: Наукова Думка, 1989. — 258 с;
Методические рекомендации по изучению общетоксического действия
фармакологических средств Минздрава России.
ЭТАПЫ ИЗУЧЕНИЯ РАДИОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
1. Первичный отбор.
2. Изучение эффективности радиопротекторных свойств веществ на
различных видах лабораторных животных.
3. Изучение фармакодинамики и механизма радиозащитного действия
отобранных соединений.
1. Первичный отбор
1.1. Задача первичного отбора — выявить вещества, обладающие
радиозащитными свойствами.
1.2. Радиозащитную эффективность потенциальных радиопротекторов
оценивают в условиях воздействия излучения в дозе СД80_Шо-
1.3. Противорадиационную активность химических соединений с
предполагаемым радиозащитным действием изучают на кондиционных
половозрелых мышах массой тела 18—24 г инбредных линий (С57В1, СВА, ин-
бриды и др.), предпочтительно на самцах. Допустимо проводить на
беспородных белых мышах.
1.4. Первоначально изучают острую токсичность (по регистрации
гибели животных в течение 3 сут) в опытах на мышах при внутрибрюшинном
введении вещества.
Определяют величины ЛД16, ЛД50 и ЛД84 изучаемого потенциального
радиопротектора. Эти показатели желательно рассчитывать по методу Литч-
фильда и Уилкоксона, но можно и по другому методу (см., например,
Беленький М. Л. Элементы количественной оценки фармакологического
эффекта. — Л.: Медгиз, 1963).
1.5. Радиозащитное действие исследуют при введении не менее двух доз
изучаемого вещества, составляющих '/8 и '/2 величины ЛД16.
1.6. Препарат вводят за 15—20 мин до облучения внутрибрюшинно в
виде водного раствора; нерастворимые в воде соединения — в виде
суспензии или эмульсии. Время профилактического применения химических
веществ, у которых специфическая активность начинает проявляться позже
или раньше указанного выше срока, устанавливают с учетом временных
особенностей их фармакологического действия.
1.7. Изучение радиозащитной эффективности новых химических
соединений проводят не менее чем на четырех группах мышей:
Первая группа — мыши, облученные на фоне действия изучаемого
соединения, вводимого в дозе, составляющей '/2 величины ЛД16 (подопытные
животные).
-725-

Вторая группа — мыши, облученные на фоне действия изучаемого
соединения, вводимого в дозе, составляющей '/8 величины ЛД16 (подопытные
животные).
Третья группа — мыши, облученные без применения потенциального
радиопротектора. Этим животным перед облучением вместо изучаемого
соединения вводят физиологический раствор или другой соответствующий
растворитель (контроль облучения).
Четвертая группа — мыши, не подвергавшиеся облучению и действию
потенциального радиопротектора, служат контролем состояния здоровья
подопытных животных (биологический контроль). При гибели в
биологическом контроле более 5 % мышей данный опыт не учитывается.
1.8. Все группы должны быть равноценными по полу и массе тела
животных и состоять не менее чем из 10 мышей каждая.
1.9. Мыши всех групп до окончания опыта должны находиться в
одинаковых условиях содержания и кормления.
1.10. Контрольных и подопытных мышей облучают одновременно (в
одной посадке), желательно в утренние часы (до 12.00).
1.11. Срок наблюдения — не менее 30 сут после облучения.
1.12. Радиозащитную эффективность соединений оценивают по
проценту выживших мышей в течение 30 сут после облучения и по средней
продолжительности жизни павших животных.
1.13. При обнаружении соединений, повышающих выживаемость
смертельно облученных мышей более чем на 50 %, для суждения о
достоверности полученных результатов необходимо по крайней мере троекратное
повторение опыта, а также наличие данных об эффективности в
сравнительных экспериментах в этих же условиях одного из известных
радиопротекторов, например цистамина, мексамина, серотонина и др.).
2. Изучение радиопротекторных свойств фармакологических веществ
на различных видах лабораторных животных
2.1. В случае обнаружения при первичном отборе соединений,
обладающих выраженным радиозащитным действием (выживаемость 50 % и
выше), приступают ко второму этапу исследований, который начинают с
изучения на мелких лабораторных животных радиозащитной эффективности
при способах введения, применяющихся в клинике.
2.2. В экспериментах не менее чем на трех видах животных, в том числе
обязательно на одном из крупных (собаки, обезьяны, свиньи), изучают
радиозащитную эффективность исследуемых соединений. В экспериментах
используются половозрелые животные (мыши, крысы, хомячки и др.)
предпочтительно самцы. Из крупных лабораторных животных
предпочтительны собаки в возрасте 1,5—5 лет в пределах следующих трех категорий
по массе: 8—12, 12—18, 18—25 кг. В опытах на мелких лабораторных
животных каждая группа должна состоять не менее чем из 20 особей, а в
опытах на крупных — по 10 особей.
Опытные и контрольные группы должны быть равноценными по
количеству, полу и массе тела животных и до окончания опыта находиться в
одинаковых условиях содержания и кормления.
2.3. В этих экспериментах должны быть установлены:
2.3.1. Оптимальная радиозащитная доза по тесту выживаемости для
каждого вида животных. Оптимальной радиозащитной дозой является та
доза препарата, которая обладает максимальным противолучевым эффектом
-726-

без выраженного побочного (отрицательного) действия, не ухудшает
общего состояния животных и не нарушает деятельности важнейших
функциональных систем организма (сердечно-сосудистой системы,
желудочно-кишечного тракта и др.).
После установления оптимальных радиозащитных доз приступают к
изучению хронической токсичности на одном из видов крупных
лабораторных животных. В случае обнаружения отрицательного (токсического)
действия препарата на организм дальнейшее углубленное исследование
радиозащитной эффективности, фармакодинамики и других свойств нового
радиопротектора, как неперспективного соединения, прекращается.
2.3.2. Срок наступления и продолжительность радиозащитного эффекта
при введении оптимальной радиозащитной дозы радиопротектора.
2.3.3. Данные о терапевтической широте для каждого вида животных.
Терапевтическая широта — это отношение максимально переносимой
дозы протектора к радиозащитной. Для мелких лабораторных животных
этот коэффициент устанавливается делением максимально переносимой
дозы на минимальную радиозащитную дозу, а для крупных —
максимально переносимой дозы на оптимальную радиозащитную, так как для
определения минимальной радиозащитной дозы требуется большое число
животных.
2.3.4. Фактор изменения дозы (ФИД) по выживаемости на мелких
лабораторных животных, определяемой при введении вещества в оптимальной
радиозащитной дозе.
2.4. Оценку радиозащитной эффективности протектора производят на
основании сопоставления данных по течению и исходу острой лучевой
болезни у контрольных и подопытных животных.
2.5. При определении степени тяжести лучевой болезни на крупных
лабораторных животных нужно учитывать следующие показатели:
2.5.1. Общее состояние и поведение животного (подвижность, угнетение
или возбуждение, агрессивность, пугливость, походка, реакция на внешние
раздражители, в том числе на болевые).
2.5.2. Состояние шерстного покрова и кожи (прочность удерживания
шерсти, взъерошенность, блеск или матовый оттенок, характер и
локализация облысения, эластичность и болезненность кожи, наличие отеков,
повреждений, раздражений, нагноений, кровоподтеков и пр.).
2.5.3. Состояние слизистых оболочек рта и глаз (бледность,
покраснение, синюшность, набухание, наличие кровоизлияний или эрозий,
количество и характер выделений и пр.).
2.5.4. Состояние органов дыхания и сердечно-сосудистой системы
(частота пульса, ритм и степень наполнения; состояние носового зеркальца;
выделения из носа; затрудненное или свободное дыхание; кашель).
2.5.5. Состояние органов пищеварения по характеру пищевой
возбудимости (с охотой ли ест и пьет животное; съедает ли положенную порцию
корма), проглатывания корма, наличию рвоты, частоте испражнений,
консистенции и цвету кала, примеси в кале (слизь, кровь).
2.5.6. Характер мочеиспускания (частота, цвет мочи и пр.).
2.5.7. Массу тела животного, определяемую в одни и те же часы до
кормления 3—4 раза до облучения и не реже одного раза в сутки после
облучения. У всех животных массу определяют индивидуально, а у мышей
допускается определение средней массы взвешиванием группы животных.
2.5.8. Температуру, измеряемую один раз в сутки (лучше в утренние
часы) в прямой кишке.
2.5.9. Изменение количественного состава периферической крови (лей-
-727-

коциты, эритроциты, тромбоциты, гемоглобин, СОЭ, лейкоцитарная
формула), исследуемой один раз в 3—5 сут.
2.6. Наблюдение за крупными животными (собаки, обезьяны, свиньи)
должно продолжаться не менее 45 сут после облучения, а за грызунами —
не менее 30 сут.
2.7. Все павшие животные подвергаются патологоанатомическому
исследованию.
3. Изучение фармакодинамики, безвредности и механизма радиозащитного
действия отобранных протекторов
Для изучения фармакодинамики, безвредности и механизма
радиозащитного действия радиопротектора используют те способы введения и
лекарственные формы, которые будут рекомендованы человеку.
3.1. Общетоксическое действие изучается в соответствии с
"Методическими рекомендациями по изучению общетоксического действия
фармакологических средств".
3.2. Острую токсичность перспективного радиопротектора определяют
на 2—3 видах животных, в том числе обязательно на одном из видов
крупных. В этих исследованиях устанавливают максимально переносимые (не
вызывающие токсических проявлений), токсические и смертельные дозы,
а на грызунах также величины СД16, СД50 и СД84. Всех павших животных, а
также выживших (их забивают в конце эксперимента) подвергают
тщательному патоморфологическому исследованию.
3.3. Для характеристики безвредности препаратов необходимо иметь
данные о влиянии на организм животного многократных введений
(показатель хронической токсичности). Эти опыты должны проводиться на 2—3
видах животных, в том числе обязательно на одном из видов крупных
(собаки, обезьяны, свиньи).
3.4. Препарат вводят в оптимальной защитной дозе для данного вида
животного один раз в день в течение 5—14 дней (в зависимости от
предполагаемой длительности при применении в клинике).
3.5. При изучении хронической токсичности необходимо вести
наблюдение за животными с регистрацией их общего состояния, изменения
массы тела, картины периферической крови (гемоглобин, эритроциты,
тромбоциты, лейкоциты, лейкоцитарная формула, СОЭ), функции почек
(количество мочи, содержание в ней белка, эритроцитов, уробилина,
микроскопия осадка) и печени.
3.6. Всех павших в процессе опыта животных, а также выживших (их
забивают сразу же после окончания опыта) подвергают
патоморфологическому исследованию. Гистологически исследуют ткани печени, почек,
селезенки, щитовидной железы, надпочечников, гипофиза и др.
3.7. Для фармакологической характеристики протектора изучают его
действие на дыхание, сердечно-сосудистую систему, гладкую мускулатуру
кишечника и матки, функции печени и почек, а также другие показатели в
зависимости от особенностей фармакодинамики соединения.
3.8. Изучают местно-раздражающее действие препарата на ткани при
парентеральном способе введения и на слизистую оболочку
желудочно-кишечного тракта при назначении внутрь.
3.9. Из общих эффектов радиопротектора следует обращать внимание
на вызываемое им изменение зрачков (сужение или расширение).
3.10. Выясняют влияние оптимальной радиозащитной дозы радиопро-
-728-

тектора на выносливость соответствующих видов животных к физическим
нагрузкам, действию высоких и низких температур окружающей среды,
повышенному содержанию углекислоты, повышенному и пониженному
содержанию кислорода во вдыхаемом воздухе.
3.11. Определяют влияние факторов, указанных в п. 3.10, на
радиозащитную эффективность изучаемого соединения.
3.12. Изыскивают способы лечения отравлений, связанных с
передозировкой препарата.
3.13. Изучают пути реализации радиозащитного эффекта исследуемых
препаратов и их фармакокинетику.
3.14. Исследование канцерогенных свойств проводится в соответствии с
"Методическими рекомендациями по изучению канцерогенных свойств
фармакологических и лекарственных средств".
3.15. Оценка мутагенных свойств проводится в соответствии с
"Методическими рекомендациями по изучению мутагенных свойств
фармакологических средств".
Полученные данные используют для установления радиозащитных доз
применительно к человеку.
Методические указания по доклиническому изучению
радиофармацевтических препаратов
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. и., проф. В. Н. Корсун-
ский; к. м. н. Е. П. Павлов; к. т. н. А. В. Тул-
шаев; к. т. н. А. К. Реброва
Введение
Целью проведения доклинических исследований новых
радиофармацевтических препаратов (далее по тексту РФП) является определение их
функциональной пригодности и безопасности при введении в
рекомендуемых активностях. Объем исследований не может быть точно
ограничен и зависит от используемого нуклида (период полураспада, тип
излучения), функционального предназначения РФП, способа его
применения.
Результаты, полученные в ходе проведения доклинических
исследований, являются основой для целесообразности проведения клинических
исследований РФП.
Настоящие Указания устанавливают порядок проведения
доклинических испытаний радиофармацевтических препаратов, оформления
полученных в ходе этих испытаний результатов, форму отчета и инструкции по
клиническому изучению.
Указания не распространяются на порядок проведения исследований с
помощью позитронно-эмиссионной томографии.
В Указаниях использованы ссылки на нормативные документы:
ГОСТ Р 1.5.—92 ГСС РФ "Общие требования к построению,
изложению, оформлению и содержанию стандартов";
ОСТ 91 500.01.000—2000 "Порядок разработки, согласования, принятия,
-729-

внедрения нормативных документов системы стандартизации в
здравоохранении";
ОСТ 91 500.01.0007—2001 "Система стандартизации в здравоохранении";
ОСТ 91 500.05.001—00 "Стандарты качества лекарственных средств.
Основные положения";
"Нормы радиационной безопасности для пациентов при использовании
радиоактивных веществ с диагностической целью"
Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению
новых фармакологических веществ. — М., 2000.
В настоящих Указаниях применяют следующие термины с
соответствующими определениями
Радиофармацевтический препарат (РФП) — диагностическое или
терапевтическое средство, содержащее радионуклид.
Функциональная пригодность РФП — возможность использования РФП
для конкретного радиодиагностического теста или терапевтического
применения.
Биопроба — органы, ткани, жидкости, содержащие радионуклид (РФП).
Период биологического полувыведения РФП Т(биол) — время выведения
половины введенного количества РФП из органов или организма
животных без учета времени физического распада радионуклида.
Коэффициент дифференциального накопления РФП — отношение
концентрации РФП в исследуемом органе или патологическом очаге к
окружающим тканям.
Сцинтиграфия — визуализация распределения РФП в органах и тканях с
использованием гамма-камеры.
Сканирование — визуализация распределения РФП в органах и тканях с
использованием сканера.
Токсикологическое исследование — установление характера и
выраженности повреждающего действия РФП на организм экспериментальных
животных и оценка его безопасности.
Острая токсичность — вредное действие препарата, проявляющееся
после его однократного применения или повторного введения через
короткие (не более 6 ч) интервалы в течение суток
Субхроническая токсичность — повреждающее действие РФП при его
длительном введении с наблюдением за состоянием подопытных
животных и патогистологическим исследованием их внутренних органов после
окончания эксперимента. Продолжительность введения РФП при
изучении субхронической токсичности зависит от предполагаемой длительности
применения в клинике.
Лучевые нагрузки — дозы облучения органов и организма животных,
создаваемые при том или другом пути введения РФП.
Изучение функциональной пригодности РФП
Независимо от характера и назначения препарата обязательным
является изучение его распределения у экспериментальных животных после
введения тем способом, который предлагается для клинического применения.
Вводимое количество препарата зависит от вида экспериментальных
животных и чувствительности радиометрической аппаратуры. Однако
вводимый объем при внутривенной инъекции не должен превышать 0,5 мл для
мышей, 2,0 мл для крыс и 10 мл для кроликов и собак. Забой мышей и крыс
проводят декапитацией под наркозом, кроликов — воздушной эмболией.
- 730-

Содержание радионуклида (РФП) в выделенных органах и тканях
(биопробах) определяют методами прямой радиометрии. Используют
относительный метод измерения, заключающийся в сравнении скоростей счета от
исследуемой биопробы и эталона при условии, что биопроба и эталон
имеют одинаковые геометрические размеры и условия измерения их одинаковы.
Радионуклиды, обладающие гамма-излучением, регистрируют по
характерным для них линиям гамма-излучения.
Эталон может содержать мерную долю от количества введенного РФП.
Эталон и биопробы должны помещаться в емкости одинаковой формы,
иметь одинаковый объем и подвергаться радиометрии в идентичных
геометрических условиях.
Поскольку во всех экспериментальных ситуациях выдержать
одинаковыми объемы эталона и исследуемой биопробы трудно, можно
использовать эталон определенного объема и вводить поправку в скорость счета
исследуемой биопробы в зависимости от ее объема. Для этого используют
кривую, учитывающую изменения эффективности регистрации
используемого гамма-излучения для конкретных условий измерения в зависимости
от объема пробы. Для получения такой кривой поправок строят
зависимость скоростей счета от объема водного раствора с радионуклидом,
используемым в качестве маркера испытываемого РФП. При этом
целесообразно активность всех объемов иметь одинаковой. Это достигается
методом разведения путем приливания к исходному (небольшому) мерному
количеству раствора радионуклида (маркера РФП) мерных количеств
разбавителя (водного раствора) с таким же рН, как и у раствора РФП, для
предотвращения сорбции радионуклида на стенках емкости или выпадения
осадка.
Для РФП, содержащих бета- и альфа-излучающие нуклиды, используют
метод толстослойного источника либо проводят измерения активности в
жидкостном сцинтилляторе. В первом случае исследуемые пробы
гомогенизируют и превращают в таблетки определенного диаметра прессованием.
Толщина таблетки должна быть больше максимального пробега
бета-частиц. Диаметры эталона и исследуемой пробы в виде таблетки должны быть
одинаковы. Для введения исследуемой пробы в жидкий сцинтиллятор
проводят специальную их подготовку.
Исследуемые органы и ткани для РФП с высоким избирательным
накоплением должны быть выбраны так, чтобы суммарное содержание в них
препарата в ранние сроки после инъекции составляло не менее 80 % от
введенного количества. Для всех остальных препаратов исследуемые
органы и ткани выбирают в соответствии с основной целью изучения
распределения — определить функциональную пригодность РФП. Сроки
исследования определяют с учетом биологического поведения РФП (скорость
накопления в органе, выведение из органа и всего тела и т. д.) и
необходимости получить полную характеристику распределения и
перераспределения препарата в организме, определить время максимального накопления
и период биологического полувыведения (Тбиол) РФП из критического
органа, а также исходные величины для расчета тканевых доз облучения,
если таковые неизвестны в литературе. На каждый выбранный срок берут
минимум 3 экспериментальных животных. Опытные и контрольные
исследования следует проводить на животных одной линии, одного возраста и
пола, с учетом определенного сезона и одинакового питания.
Результаты изучения распределения обрабатывают статистически и
представляют в виде таблиц. Содержание нуклида выражают в процентах
от введенного количества РФП на весь орган и на 1 г органа (ткани).
-731 -

В случае метки препарата радионуклидом с периодом полураспада 5
дней и более обязательно проводят изучение выведения нуклида из
организма одним из принятых методов — радиометрией всего тела,
профильным сканированием или радиометрией экскретов. Продолжительность
исследования определяется конкретно для каждого РФП, а результаты
должны быть достаточными для математического описания выведения. Данные
представляют как в таблице, так и в виде графиков в
полулогарифмическом масштабе.
Помимо указанных методик, необходимы следующие дополнительные
исследования РФП в зависимости от его назначения.
РФП диагностического назначения
Основное внимание при исследовании препаратов этой группы должно
быть направлено на определение:
• величины максимального накопления и концентрации РФП в
интересующем органе или патологическом очаге;
• коэффициентов дифференциального накопления препарата в этом
органе (или патологическом очаге) по отношению к близлежащим
органам и тканям;
• динамики изменения содержания РФП и коэффициентов
дифференциального накопления.
Коэффициент дифференциального накопления определяют на
основании данных прямой радиометрии и рассчитывают как частное от деления
величин концентрации РФП в исследуемых тканях. Для изучения
кинетики препарата в исследуемом объекте необходимо проведение
радиографических или динамических гамма-сцинтиграфических исследований.
Необходимыми являются сравнительные исследования
функциональной пригодности исследуемого препарата с лучшими аналогами.
РФП для статических исследований
Эти препараты предназначены для визуализации органов и систем
организма или патологических очагов. При их исследовании обязательно
определяют значение максимальной концентрации и максимального
накопления, время их достижения, продолжительность плато и коэффициенты
дифференциального накопления для исследуемого органа (ткани) или
патологического очага. Обязательно проведение сцинтиграфии
(сканирования) в разные сроки после инъекции препарата с определением
коэффициентов дифференциального накопления для исследуемых органов
(тканей, патологического очага). Сцинтиграфия обязательно должна быть
проведена в период максимального накопления препарата в исследуемом
органе (ткани, патологическом очаге).
РФП для динамических исследований
РФП этой группы предназначены для изучения функционального
состояния органов и систем организма или исследования метаболических
процессов в органах (тканях) путем записи информации в динамическом
или серийном статическом режиме с различными временными парамет-
- 732-

рами сбора и последующей сравнительной количественной обработкой
данных. Основными исследуемыми показателями являются
биокинетические параметры РФП: время максимального накопления в
интересующем органе (ткани), биологический период полувыведения, клиренс
и др.
Для этой группы данные по исследованию функциональной
пригодности препаратов методами изучения распределения должны быть
дополнены результатами сравнительного исследования соответствующей
функции органа или метаболического процесса с помощью одного из
принятых лабораторных методов. В случае отсутствия таковых при достаточном
литературном обосновании ценности применения такого РФП
целесообразно проведение исследований, доказывающих, что с помощью данного
РФП регистрируется конкретная функция органа или биохимический
процесс. Необходимы также исследования параметров биокинетики
исследуемого РФП в норме и при экспериментальных патологических
состояниях, сопровождающихся соответствующими изменениями функции
или метаболизма органа и ткани. Для известных препаратов
исследования на животных с экспериментальными моделями могут не
проводиться, но обязательным является изучение в сравнении с известными
аналогами.
Методика исследования РФП в эксперименте должна соответствовать
рекомендуемой для изучения в клинике.
РФП лечебного назначения
РФП лечебного назначения применяют с целью достижения локального
облучения определенного участка тела в случаях, когда показано лучевое
лечение. В связи с этим основным направлением является определение
поглощенных доз в облучаемой ткани на единицу вводимой
радиоактивности, равномерности облучения облучаемого объекта и поглощенных доз в
очаге воздействия, близлежащих здоровых тканях и критических органах и
тканях. Эти данные получают расчетным путем, используя результаты
исследований распределения и перераспределения РФП в облучаемом очаге
и в организме экспериментальных животных. Оценка эффективности
данного вида лучевой терапии возможна с использованием всех обычно
применяющихся методик определения клинико-биохимических показателей,
патоморфологических, цитологических исследований, световой и
электронной микроскопии.
РФП для внутриопухолевого введения
Исследования проводят на животных с индуцированными или
трансплантированными опухолями в течение не менее 4 периодов полураспада
лечебного радионуклида. Целесообразно использовать радиорезистентные
виды опухолей. Перевивку или индукцию опухоли можно проводить в
удобной для экспериментатора области тела. Препарат вводят в
опухолевый узел в повреждающей дозе и методами прямой радиометрии
определяют скорость выведения из места инъекции, критические органы и
величину накопления в них, скорость выведения радионуклида из организма
(посредством радиометрии экскрементов или, если есть соответствующие
линии гамма-излучения у радионуклида, с помощью счетчика всего тела).
-733-

Полученные данные используют для расчета поглощенных доз в
опухолевом узле, критических органах (тканях) и во всем теле.
Для этой группы РФП обязательны дополнительные исследования на
животных с трансплантированными опухолями с целью установления
диффузии препарата в опухолевой ткани после введения его в объеме 0,1 мл, а
также повреждающей дозы при инъекции в опухолевый узел из нескольких
точек для равномерной инфильтрации согласно данным о диффузии.
РФП для внутриартериального введения
При выборе экспериментальной модели опухолевого роста основным
критерием является степень ее кровоснабжения на уровне артериол и
капилляров. В эксперименте используют гиперваскуляризированные на этом
уровне виды опухолей. Характер васкуляризации опухоли в ряде случаев
может быть оценен посредством ангиосцинтиграфии с помощью меченых
макроагрегатов или микросфер альбумина.
При оценке этой группы РФП, помимо исследований по определению
степени депонирования и динамики поведения радионуклида в
опухолевом узле, необходимо оценить и скорость его выведения из окружающей
интактной ткани (органа). Исследования проводят в течение не менее 4
периодов полураспада радионуклида. РФП вводят в рекомендуемой
методикой дозе. В связи с техническими трудностями проведения этих
исследований у животных допустимо на интактных животных оценить степень
депонирования препарата в интактном органе (ткани), для облучения
опухолей которых предназначен препарат, а у другой группы животных
оценить степень депонирования препарата в опухолевой ткани при
трансплантации (или индукции) опухоли в удобную для внутриартериального
введения часть тела животного. При оценке депонирования препарата в
опухоли особое внимание уделяется оценке поступления препарата в
общий кровоток по артериовенозным шунтам. Целесообразно также
определить накопление радионуклида в критических органах и тканях и
выведение его из организма. Полученные данные используют для расчета
поглощенных доз в опухолевой и других тканях. Обязательным является оценка
равномерности облучения опухоли с помощью изучаемого препарата. При
проведении этих исследований необходимо определить минимальное
количество препарата, способное равномерно облучать единицу массы
опухоли. При оценке равномерности облучения опухоли важно учитывать
развитие некробиотических процессов в опухолевом узле. Для этих
исследований лучше использовать "молодые" опухоли.
РФП для внутрилимфососудистого введения
Изучение препаратов этой группы проводят на кроликах или собаках.
Кроликам РФП вводят в один из лимфатических сосудов нижней трети
бедра на заднебоковой поверхности в объеме не более 0,2 мл, собакам — в
лимфатический сосуд тыла стопы в объеме не более 0,5 мл. При
экспериментальной оценке препаратов необходимо определить величину
депонирования РФП в лимфатических узлах. Особое внимание при этом
уделяется сравнительному содержанию радионуклида в последовательно
расположенных группах лимфатических узлов — подколенных и тазовых, скорости
выведения его из них, накоплению в критических органах и выведению из
-734-

организма. Полученные данные используют для определения поглощенных
доз в последовательно расположенных группах лимфатических узлов и
других органах. Целесообразным является расчет изодозных кривых в
тканях, окружающих лимфатический узел, особенно в случаях использования
радионуклидов с рентгеновским излучением. При использовании
препаратов этой группы нужно оценить интенсивность диффузии радионуклида
через стенку лимфатического сосуда и узла в прилежащие ткани. Для
препаратов, не обладающих тропностью к злокачественным
новообразованиям лимфатических узлов, проведение исследований возможно на интакт-
ных животных.
Тройные РФП для системного (внутривенного) введения
Препараты данной группы после системного (внутривенного введения)
избирательно накапливаются в тех органах и тканях, тропностью к
которым они обладают. При оценке этой группы РФП, помимо исследований
по определению степени депонирования и динамики поведения
радионуклида в "критическом" органе/ткани (опухолевом узле в случае опухоле-
тропных РФП), необходимо оценить и скорость его выведения из интакт-
ных тканей (органов), в которые попадает препарат при системном
введении (например, печень при введении меченых моноклональных антител).
Целесообразно также, помимо определения накопления радионуклида в
"критических" органах и тканях, определять и выведение его из организма
в целом.
ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Целью доклинических токсикологических исследований
фармакологического вещества является установление характера и выраженности его
повреждающего действия на организм экспериментальных животных и
оценка его безопасности.
Оборудование
Стенды с набором реактивов для биохимических исследований, ЛАЛ-
тесты, микробиологический бокс с ламинарным потоком стерильного
воздуха, оборудование для гематологических и морфологических
исследований.
Общепринятым является разделение токсикологических исследований
на изучение общетоксического действия и исследование специфических
видов токсичности (канцерогенность, мутагенность, аллерген но сть, эм-
бриотоксическое и тератогенное действие, влияние на иммунореактив-
ность).
Определение объема токсикологических исследований
По объему токсикологических исследований РФП подразделяются на
две группы:
а) РФП, токсикологическое исследование которых может быть ограни-
-735-

чено оценкой тканевых доз облучения исследуемых органов и всего тела,
определением реакции на внутривенное введение (на грызунах одного
вида) и проведением испытания на пирогенность и стерильность
(инъекционные формы):
• РФП, содержащие радионуклиды без носителя;
• РФП, для метки которых был использован новый радионуклид без
изменения состава препарата и/или использована новая технология
получения РФП без изменения его состава, если замена
радионуклида или новая технология не привели к увеличению дозы облучения,
содержания основного вещества или примесей;
• РФП на основе химических соединений с изученными
фармакологическими свойствами при том же способе введения.
б) РФП, проходящие испытания в объеме, установленном
"Методическими указаниями по изучению общетоксического действия
фармакологических веществ" (МЗ РФ, 2000 г.) , а также настоящим документом:
— РФП, состав которых изменен добавлением известных средств;
— РФП с изменением способа введения;
— РФП на основе химических соединений с неизвестными
фармакологическими и токсикологическими свойствами.
Изучение острой токсичности (РФП групп 6.1.6)
Острая токсичность — вредное действие препарата, проявляющееся
после его однократного применения или повторного введения через короткие
(не более 6 ч) интервалы в течение суток.
Продолжительность введения фармакологического вещества экспериментальным
животным в зависимости от длительности его применения у человека
Длительность применения препарата
у человека
Однократное введение
2—6 дней
7—14 дней
15-30 дней
1—6 месяцев
Длительность введения фармакологического
вещества животным
5—7 дней
14 дней
1 месяц
2—4 месяца
6—12 месяцев
Острую токсичность определяют не менее чем на двух видах
лабораторных животных. Используют только тот путь введения препарата, который
предлагается для клинического изучения. Группы подопытных животных
формируют отдельно из самцов и самок. Для мелких грызунов каждая
группа должна содержать не менее 5—6 самок и такое же количество
самцов. Количество кроликов в группе может быть 3—5.
Продолжительность наблюдения за животными должна составлять не
менее 2 нед. В первый день опыта животные должны находиться под
непрерывным наблюдением. При развитии интоксикации и падежа
животных от введения РФП дают клиническое описание интоксикации и
проводят гистологическое исследование внутренних органов павших животных.
Метод определения ЛД5о обязательно указывают в отчете. Если из-за
низкой токсичности препарата нельзя определить ЛД50, следует указать его
- 736-

максимальную дозу, которая была введена животным, и подсчитать, во
сколько раз она превышает предполагаемую (рекомендуемую)
клиническую. Степень токсичности РФП оценивается по коэффициенту
безопасности — отношению ЛД5о к максимальной клинической дозе.
Коэффициент безопасности для РФП должен быть не менее 100.
Изучение субхронической токсичности (РФП групп 6.1.6)
Целью хронических токсикологических экспериментов является
характеристика степени повреждающего действия фармакологического вещества
при его длительном введении, выявлении наиболее чувствительных
органов и систем организма, а также исследование степени обратимости
вызываемых повреждений.
Продолжительность введения фармакологического вещества при
изучении хронической токсичности зависит от предполагаемой длительности
при применении в клинике (см. таблицу в разделе 6.3).
Субхроническая токсичность РФП изучается на представителях двух
видов животных (крысы, хомяки, морские свинки или кролики и собаки).
Препарат вводится троекратно (1 раз в день в течение 3 дней без
перерыва). Продолжительность наблюдения зависит от периода полураспада
радионуклида, биологического периода полувыведения препарата из
критического органа, но не должна быть менее 30 сут. Клиническую дозу
рассчитывают по основному веществу (на 1 кг массы тела) с учетом
необходимого для исследования количества радионуклида на конец срока годности
РФП.
Субхроническую токсичность оценивают по общему состоянию и
поведению животных, изменению массы тела, коэффициентов массы
критических органов, по морфологическому составу периферической крови,
гемолитическому действию препарата, биохимическому составу сыворотки
крови, химико-морфологическому анализу мочи, по состоянию
сердечно-сосудистой системы по данным ЭКГ, по реакции на введение препарата, на
основании патолого-анатомических и гистологических исследований
внутренних органов, изучению местно-раздражающего действия РФП. Изучают
пирогенные свойства препарата.
Изучение специфических видов токсичности
К специфическим видам токсичности относятся аллергенное,
мутагенное, канцерогенное, иммунологическое, эмбриотоксическое и
тератогенное действие.
Эти исследования проводятся в соответствии с "Руководством по
экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических
веществ" (М., 2000, с. 25-65).
Расчет лучевых нагрузок
При изучении токсичности РФП необходимо учитывать дозы облучения
критического органа и всего тела. Дозы облучения рассчитывают на основе
результатов изучения фармакокинетики РФП, они могут быть
заимствованы из литературы. При оценке доз облучения, создаваемых диагностиче-
24 - 762
-737 -

скими РФП, следует руководствоваться утвержденными "Нормами
радиационной безопасности для пациентов при использовании радиоактивных
веществ с диагностической целью".
Изучение токсичности РФП, предназначенных для использования
в педиатрии
Эти исследования проводятся в соответствии с "Руководством по
экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических
веществ" (М., 2000) на неполовозрелых животных в объеме, указанном в
"Методических указаниях по изучению общетоксического действия
фармакологических веществ".
Приложение А
(Обязательное)
СХЕМА ОТЧЕТА
о доклиническом изучении радиофармацевтического препарата
Часть I. Изучение функциональной пригодности
• Реферат.
• Введение (цель и задачи исследования).
• Литературная справка (состояние проблемы, предполагаемые
способы решения).
• Материалы и методы.
• Результаты исследований.
Раздел должен содержать:
1. Для всех РФП:
• Данные по распределению при введении тем способом, который
предлагается при клиническом испытании препарата.
• Для РФП с радионуклидом, имеющим Т1/2 5 дней и более, результаты
изучения выведения из организма.
2. Для диагностических препаратов:
• Данные о динамике изменений накопления и концентрации
радионуклида в интересуемом органе или патологическом очаге.
• Данные о динамике изменений коэффициентов дифференциального
накопления в интересующем органе (патологическом очаге) и крови,
а также близлежащих органах и тканях.
• Результаты сцинтиграфии (сканирования) в период максимального
накопления радионуклида в органе (патологическом очаге) и в
период достижения максимальной величины коэффициента
дифференциального накопления в органе (патологическом очаге) и крови.
• Для РФП, предназначенных для статических исследований, —
результаты сцинтиграфии (сканирования) в разные сроки после
инъекции препарата с определением отношения: скорость счета под
соседними участками поля к минимальной скорости счета под органом
(патологическим очагом).
• Для РФП, предназначаемых для динамических исследований, —
результаты радиографического исследования по предлагаемой для кли-
-738-

нического испытания методике у интактных животных и животных с
экспериментальной патологией.
Данные о конкретных преимуществах исследуемого препарата по
сравнению с лучшими аналогами. Если препарат не описан в
литературе, — результаты сравнительного исследования с помощью
изученного препарата и одного из принятых лабораторных методов.
. Для терапевтических РФП:
Данные о выведении РФП из облучаемой ткани после введения
препарата в повреждающей дозе.
Данные о соотношении поглощенных доз в облученной ткани,
близлежащих здоровых тканях и критических органах и тканях на
единицу вводимой радиоактивности.
Для внутриопухолевого введения — данные о диффузии препарата в
опухолевой ткани.
Для внутриартериального введения — результаты определения
минимального количества препарата, способного равномерно облучать
единицу массы опухоли.
Для внутрилимфососудистого введения — данные о величине
депонирования радионуклида в последовательно расположенных группах
лимфатических узлов и скорости выведения из них; в случае применения
радионуклида с рентгеновским или гамма-излучением — данные
расчетов изодозных кривых вокруг лимфатического узла, данные по степени
диффузии радионуклида за пределы лимфатических узлов и сосудов.
Заключение.
Список использованной литературы.
Часть II. Изучение безопасности
Реферат.
Введение (цель и задачи исследования, обоснование объема
исследований).
Материалы и методы.
Результаты исследований. Приводятся данные по острой и
субхронической и специфическим видам токсичности.
Заключение, в котором указываются возможные ограничения для
проведения клинических испытаний.
Приложение Б
(обязательное)
СХЕМА ИНСТРУКЦИИ
по клиническим исследованиям радиофармацевтического препарата
Приводят условное название препарата, химическое название
основного вещества.
Описывают внешний вид препарата, приводят его основные
физико-химические параметры (радиохимическая чистота, объемная активность),
способ приготовления (для РФП на основе генераторов).
Приводят основные ядерно-физические характеристики радионуклида
(период полураспада, выход основных гамма-линий и бета-излучения).
24*
-739-

Основные фармакологические свойства
Приводят сведения о фармакокинетике и метаболизме препарата, из
которых должны вытекать целесообразность клинического изучения его по
предлагаемым показаниям, а также возможные противопоказания и
побочные действия.
Приводят значения лучевой нагрузки на критические органы и ткани и
организм в целом.
При наличии аналогичных препаратов, применяемых в медицинской
практике, указывают отличительные особенности данного препарата.
Показания к изучению
Указывают основные заболевания или состояния организма, при
которых целесообразно провести клиническое изучение препарата.
Способ применения и рекомендуемые дозы
Указывают пути введения препарата, вводимые по активности дозы.
Для лечебных препаратов — методика введения препарата, возможность
повторного введения, интервалы между повторными введениями и дозы.
Методы исследования
Приводят сведения о характере подготовки больного к исследованию
(при необходимости), о методиках исследования, включая положение
больного, аппаратурное оформление, проекции исследования, время
начала исследования после введения РФП и его продолжительность, методики
аппаратурного сбора и обработки информации.
Противопоказания
Излагают основные противопоказания, вытекающие из биологических
свойств препарата.
Побочные действия
Указывают нежелательные явления, которые следует ожидать в
процессе применения препарата, исходя из его биологических свойств.
Перечисляют основные мероприятия по их предупреждению и лечению.
Лекарственная форма препарата
Указывают лекарственную форму препарата, активность препарата в
одной единице лекарственной формы.
Условия и сроки хранения
Указывают соответствие хранения с действующими основными
санитарными правилами работы с радиоактивными веществами и источниками
ионизирующих излучений, необходимость хранения препарата в особых
условиях (например, при определенной температуре) и допустимые сроки
хранения.
Составители Методических указаний выражают благодарность за
рецензирование данного документа:
канд. техн. наук В. Г. Скворцову, канд. мед. наук Р. А. Розиеву
(Медицинский радиологический научный центр РАМН, г. Обнинск); докт. мед.
наук, проф. В. Б. Сергиенко (Российский кардиологический научно-
производственный комплекс Минздрава РФ, Москва); канд. мед. наук
С. В. Ширяеву (Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Бло-
хина, Москва); чл.-корр. РАМН, проф. Ю. Б. Лишманову
(Научно-исследовательский институт кардиологии Томского научного центра
Сибирского отделения РАМН, Томск); канд. мед. наук. В. Ю. Сухову (Центральный
научно-исследовательский рентгено-радиологический институт Минздрава
РФ, Санкт-Петербург), канд. мед. наук Е. А. Казиахмедову, канд. мед.
наук О. Л. Верстаковой (Институт доклинической и клинической экспертизы
лекарственных средств ФГУ "НЦЭСМП", Москва).
-740-

Методические указания по экспериментальному
(доклиническому) изучению лекарственных средств,
разрабатываемых из природного сырья
СОСТАВИТЕЛИ: академик РАМН, проф.
В. Г. Кукес; д. м. н. В. К. Колхир; д. фарм. н.
Т. А. Сокольская; д. фарм. н., проф. В. Л. Баги-
рова; д. б. н., проф. С. А. Вичканова; д. м. н.,
проф. В. М. Булаев; д. м. н., проф. Е. Е. Лесиов-
ская; д. ф. н., проф. И. А. Самылина; к. б. н.
Л. В. Крепкова; к. б. н. В. В. Бортникова;
к. м. н. А. И. Мартынов; к. б. н. Н. М.
Крутикова; д. м. н. Е. В. Ших; к. б. н. О. Е. Пасхина;
к. б. н. Н. Ю. Фролова; д. м. н., проф. Е. В.
Арзамасцев; научн. сотр. Н. Г. Оленина
Введение
Настоящие методические указания содержат требования по объему
экспериментального изучения лекарственных средств, разрабатываемых на
основе растительного и животного сырья, продуктов пчеловодства,
морепродуктов и других источников природного происхождения. Они являются
частью общей программы доклинических фармакологических и
токсикологических исследований, обязательных при разработке новых
лекарственных средств в Российской Федерации. Задачей данных методических
указаний является изложение принципов и объема экспериментального
изучения лекарственных средств природного происхождения (ЛСПП).
Указания предназначены для специалистов различного профиля, занимающихся
разработкой новых лекарственных средств на основе сырья природного
происхождения.
Существующий в мире высокий интерес к ЛСПП сопровождается
повышением требований к их эффективности и безопасности; методам
контроля их качества. По сравнению с синтетическими препаратами ЛСПП
обладают рядом отличительных особенностей: они содержат, как правило,
несколько биологически активных веществ, которые определяют основное
фармакологическое действие препаратов; обладают широким спектром
фармакологического действия; качество и эффективность ЛСПП во
многом зависят от технологии их получения и т. д. Указанные особенности
ЛСПП предъявляют повышенные требования к их стандартизации, при
строгом соблюдении которых может быть гарантирована
воспроизводимость заявляемых фармакологических эффектов и уровня безопасности
ЛСПП.
НОВИЗНА ПРЕДЛАГАЕМОГО МЕТОДА
Настоящие методические указания являются описанием комплекса
процедур, гарантирующих всестороннее изучение нового ЛСПП (определение
фармакологической активности и необходимый объем токсикологических
исследований) в соответствии с современными требованиями. Основой
изучения являются стандартные операционные процедуры, соответствую-
-741 -

щие принципам Good Laboratory Practice (GLP). Новизна данных
методических указаний заключается в том, что впервые вводятся требования по
стандартизации фармакологически активных компонентов
разрабатываемого лекарственного средства и его фармакологическому исследованию в
сравнении с уже зарегистрированным препаратом (стандартом) той же
фармакологической группы в аналогичной лекарственной форме.
Указанные требования позволяют отбирать новые лекарственные средства
природного происхождения, не уступающие по эффективности и
безопасности уже разрешенным для медицинского применения.
МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕТОДА
При проведении экспериментального изучения фармакологической
активности и безопасности новых ЛСПП должно использоваться
специализированное отечественное и зарубежное оборудование,
сертифицированное в установленном порядке Минздравом РФ. При фармакологическом
изучении нового ЛСПП в качестве препаратов сравнения необходимо
использовать только лекарственные средства, зарегистрированные в
установленном порядке в Минздраве РФ.
Экспериментальное изучение фармакологической активности и
безопасности новых ЛСПП должно начинаться после решения всех вопросов,
связанных со стандартизацией исходного сырья, субстанции и разработки
готовой лекарственной формы. Необходимые показатели стандартизации
должны быть зафиксированы в нормативных документах, включающих
методы качественной и количественной оценки исходного сырья, субстанции
и лекарственной формы. Образцы для доклинического изучения должны
быть подготовлены по утвержденному регламенту.
ОПИСАНИЕ МЕТОДА
Объем экспериментального изучения фармакологической активности и
токсикологического исследования ЛСПП может существенно отличаться
для оригинальных препаратов (ранее неизвестных и не
зарегистрированных в РФ) и препаратов, созданных по аналогии с известными ЛСПП и на
основе уже разрешенного Минздравом РФ лекарственного сырья.
Исходя из этих положений, ЛСПП, находящиеся на этапе
доклинического изучения, можно разделить на следующие группы.
I. Оригинальные монокомпонентные ЛСПП, созданные на основе:
а) нового химического соединения, выделенного из разрешенных видов
сырья природного происхождения;
б) нового (неофицинального) вида сырья природного происхождения.
II. Оригинальные комплексные ЛСПП:
а) имеющие в своем составе не описанные ранее химические
соединения, выделенные из природного сырья;
б) имеющие в своем составе неофицинальные виды природного сырья
или полученные на их основе субстанции;
в) имеющие в своем составе официнальные виды природного сырья
или содержащие разрешенные к медицинскому применению компоненты.
III. Известные моно- и многокомпонентные (комплексные) ЛСПП:
а) заявленные по новым показаниям;
б) заявленные в новой лекарственной форме;
-742-

в) заявленные для применения в новой дозе или способах введения;
г) воспроизведенные ЛСПП.
В настоящее время доклиническое изучение нового ЛСПП включает
проведение фармакологических и токсикологических исследований, объем
которых определяется его происхождением, химическим составом,
сведениями об эффективности и безопасности применения используемого
природного сырья в отечественной и зарубежной медицине, видом заявляемой
специфической активности и др.
1. Оценка фармакологической активности
Фармакологическую активность (общую и специфическую) новых
ЛСПП изучают в соответствии с действующими методическими
указаниями, разработанными ФК МЗ РФ и утвержденными Минздравом России
для отдельных фармакотерапевтических групп. Исследования проводят на
различных видах лабораторных животных с использованием
экспериментальных моделей патологических состояний, а также в условиях
эксперимента in vitro.
Изучение общей фармакологической и специфической активности в
полном объеме проводят для:
— новых субстанций и ЛСПП, представляющих собой оригинальные
монокомпонентные препараты на основе новых, ранее не применявшихся
соединений природного происхождения;
— новых субстанций и ЛСПП на основе ранее не регистрировавшихся в
Российской Федерации видов природного сырья;
— новых комплексных ЛСПП на основе ранее не регистрировавшихся в
Российской Федерации субстанций и видов природного сырья.
Изучение фармакологической активности в ограниченном объеме с
использованием в эксперименте основных методик, подтверждающих
заявляемое фармакологическое действие препарата, проводят для:
— новых композиций, имеющих в своем составе зарегистрированные
субстанции или официнальные виды природного сырья;
— субстанций и ЛСПП на основе неофицинального природного сырья,
но широко используемого в народной медицине или пищевой
промышленности;
— моно- и многокомпонентных ЛСПП, заявляемых по новым
показаниям;
— моно- и многокомпонентных ЛСПП, заявляемых в новой
лекарственной форме;
— моно- и многокомпонентных ЛСПП, заявляемых для применения в
новых дозировках;
— моно- и многокомпонентных ЛСПП, заявляемых для применения
при новом пути введения.
Для ЛСПП, представляющих собой индивидуальное соединение
природного происхождения, проводят фармакокинетические
исследования.
Для ЛСПП, содержащих новую, ранее не применявшуюся комбинацию
субстанций или видов сырья, необходимо проводить доклиническое
исследование, доказывающее оптимальность новой комбинации по сравнению с
активностью ранее зарегистрированного состава.
При воспроизводстве известных, в том числе импортных, ЛСПП
должна быть документально подтверждена идентичность сырья, химического
-743-

строения или химического состава и лекарственной формы
воспроизводимого ЛСПП базовому препарату и представлена подробная литературная
справка, отражающая все аспекты фармакологической активности
базового препарата.
2. Токсикологические исследования ЛСПП
а) Токсикологическое изучение оригинальных ЛСПП
При оценке безопасности оригинальных ЛСПП, являющихся новыми
биологически активными химическими соединениями (одно- или
многокомпонентными), полученными из природного сырья, а также препаратов,
полученных из неофицинального вида природного сырья или их
комбинации, токсикологическое изучение ЛСПП предусматривает проведение
исследований в полном объеме, в соответствии с действующим
законодательством и методическими указаниями, разработанными ФК МЗ РФ и
утвержденными Минздравом России. При этом проводится изучение
общетоксического действия ЛСПП и лекарственной формы в условиях
острых, подострых и хронических экспериментов на лабораторных животных,
а также исследуются возможные мутагенные, аллергизирующие, иммуно-
токсические свойства, канцерогенность и влияние на репродуктивную
функцию.
б) Токсикологическое изучение ЛСПП из официнальных видов
природного сырья
Для регистрации новых ЛСПП на основе разрешенных к медицинскому
применению в РФ субстанций природного происхождения и
официнальных видов природного сырья допустим ограниченный объем
токсикологических исследований при условии, что дозы основных действующих
веществ, входящих в состав таких препаратов, не превышают доз, ранее
разрешенных к медицинскому применению. Для таких ЛСПП необходимо
выполнить следующий объем токсикологических исследований:
— изучение токсичности препаратов при однократном введении
лабораторным животным (острая токсичность);
— изучение токсичности субстанции и лекарственных форм препаратов
при длительном введении (хроническая токсичность);
— изучение аллергизирующих и местно-раздражающих свойств (при
необходимости изучение на молодых развивающихся животных и
исследование других видов специфической токсичности).
Обязательный объем исследований включает:
1. Определение острой токсичности ЛСПП, относящихся к
перечисленным группам, в соответствии с "Методическими указаниями по изучению
общетоксического действия фармакологических веществ". Для сборов
возможно ограничить проведение изучения токсичности при одном способе
введения, который рекомендован для клинической практики.
2. Изучение хронической токсичности препаратов, относящихся к этим
группам, в соответствии с упомянутыми выше "Методическими
указаниями". Для сборов можно ограничиться экспериментами на крысах при
введении их в двух дозах в течение 1—6 мес (в зависимости от длительности
применения данных ЛСПП у человека). Исследование новых
лекарственных форм ЛСПП, которые не представляется возможным ввести крысам,
проводится на кроликах или собаках.
3. Изучение аллергизирующих и местно-раздражающих свойств
препаратов этих групп в соответствии с действующими методическими указа-
-744-

ниями. В ряде случаев (разработка детских лекарственных форм,
назначение ЛСПП беременным) проводится изучение препаратов на молодых
развивающихся животных и исследование их влияния на репродуктивную
функцию (эмбриотоксичность, тератогенность и собственно влияние на
репродуктивную функцию).
Объем доклинических исследований разрабатываемых ЛСПП
определяется сведениями об эффективности и безопасности применения
данного природного сырья в отечественной и зарубежной медицине,
химическим составом, видом заявляемой специфической активности. При
изучении фармакологической активности и токсичности новых ЛСПП на
доклиническом этапе исследования необходимо руководствоваться
действующими методическими указаниями Фармакологического комитета
МЗ РФ. Заявленная активность должна быть подтверждена в сравнении с
известными ЛСПП из данной фармакологической группы, а если
таковых нет — с эталонными по заявляемой активности препаратами,
полученными путем синтеза (желательно также, чтобы препарат сравнения
соответствовал исследуемому ЛСПП по лекарственной форме и способу
введения).
Особое внимание следует уделить обоснованию эффективных доз новых
ЛСПП по результатам экспериментальных исследований, в том числе с
учетом литературных данных. Требуется также определить и обосновать
курс лечения, обозначить максимально допустимые разовые и курсовые
дозы, отразить вопросы, связанные с передозировкой и взаимодействием с
другими лекарственными средствами.
Все исследования, предусмотренные настоящими "Методическими
указаниями", должны быть оформлены в виде научных протоколов (отчетов),
обобщающих результаты фармакологических и токсикологических
исследований. В отчетах должны быть приведены конкретные данные
результатов исследований, обработанные статистически и представленные в виде
таблиц, графиков и др. Для используемых методик приводятся ссылки на
опубликованные работы. Если исследование касается изучения противо-
микробных, противовирусных или противоопухолевых свойств ЛСПП,
приводится подробная характеристика штаммов микроорганизмов и
опухолей с указанием вида (на латинском языке), источник получения или
паспорт и т. д. В конце отчета приводятся обсуждение результатов и
выводы. Все отчеты должны быть утверждены руководителем научной
организации, где проведены исследования, и заверены печатями этой
организации.
Разработчик обязан также иметь необходимые нормативные документы
на ЛСПП (ФСП на субстанцию, стандарт, лекарственную форму, сырье),
научно обоснованный проект названия ЛСПП, проект программы
клинических исследований, проект инструкции по медицинскому применению
препарата, составленный в соответствии с требованиями МЗ РФ. Кроме
того, авторы должны подготовить литературную справку, касающуюся
данного ЛСПП и его состава, а также объяснительную записку, в которой
излагается обоснование разрабатываемого ЛСПП, объем проведенных
научных исследований и достигнутые результаты. Для проведения
фармацевтической экспертизы разработчик должен иметь образцы ЛСПП
(субстанция, лекарственные формы, стандарт — при необходимости) в требуемых
для исследования количествах.
Представлять нормативную и другую документацию в МЗ РФ следует в
соответствии с перечнем документов, необходимым для регистрации
лекарственного средства на территории РФ.
-745-

ПРЕДПОЛАГАЕМАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ
Внедрение в практику "Методических указаний по экспериментальному
(доклиническому) изучению лекарственных средств, разрабатываемых из
природного сырья" позволит значительно повысить качество новых
лекарственных препаратов природного происхождения, гарантировать их
фармакологическую активность и безопасность.

ЧАСТЬ 6
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ПОДГОТОВКЕ
РЕГИСТРАЦИОННОГО ДОСЬЕ
Методические рекомендации по подготовке проекта инструкции
по применению препарата, предлагаемого для проведения
клинических исследований
СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н., проф. А. К.
Стародубцев; д. м. н., проф. А. Н. Яворский; д. м. н.,
проф. В. М. Булаев; к. м. н. А. С. Румянцев;
член-корр. РАМН, проф. Б. И. Любимов;
д. м. н., проф. В. В. Челъцов; д. м. н., проф.
В. Б. Герасимов; д. м. н., проф. Э. А. Бабаян;
член-корр. РАМН, проф. В. П. Фисенко; к. б. н.
Д. В. Рейхарт; С. Б. Ткаченко
В настоящих рекомендациях приведена структура разделов проекта
инструкции по применению препарата, предлагаемого для проведения
клинических исследований.
Для составления текста инструкции используют данные доклинических
исследований, полученные организацией (фирмой-разработчиком).
ПРОЕКТ ИНСТРУКЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ПРЕПАРАТА,
ПРЕДЛАГАЕМОГО ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ КЛИНИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
Название. Сначала указывают предлагаемое организацией
(фирмой-разработчиком) название препарата. Затем обязательно указывается
химическое рациональное название действующего фармакологического вещества,
а при наличии — его Международное непатентованное название (МНН).
Описание лекарственной формы. Приводят основные характеристики
лекарственных форм препарата (внешний вид, цвет, при необходимости
запах, вкус, растворимость в воде и др.) в соответствии с данными,
представленными в проекте Фармакопейной статьи.
Состав. Приводится перечень компонентов, входящих в состав
препарата и их количество. Если препарат не является индивидуальным
химическим соединением, то приводится его состав, источник получения. Для
комбинированных препаратов указываются все действующие вещества.
Для растворов, применяемых внутрь, наружно, парентерально, ингаля-
-747-

ционных лекарственных форм необходимо указывать все дополнительные
вещества, которые входят в состав лекарственной формы.
Фармакологическая группа. Раздел должен начинаться с указания
групповой принадлежности препарата по классификации лекарственных
средств (желательно по рекомендованной Всемирной организацией
здравоохранения Анатомо-терапевтической классификацией — АТС). При
возможности добавляются и другие общепринятые группы, по которым
можно классифицировать предлагаемый препарат: по химическому
происхождению (сердечные гликозиды, глюкокортикостероиды, сульфаниламиды
и др.), механизму действия (адреноблокирующие, холиномиметики, блока-
торы каналов для ионов кальция и др.), побочному эффекту (метгемогло-
бинообразующие, вызывающие лекарственную зависимость и др.).
Если в соответствии с действующим законодательством Российской
Федерации или нормативными правовыми актами препарат может быть
отнесен к особой категории (наркотические, психотропные,
сильнодействующие, ядовитые), это должно быть обязательно указано в данном разделе
инструкции.
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
Фармакодинамика. Информация в этом разделе должна в полной мере
охарактеризовать основные фармакологические свойства входящих в
состав препарата веществ, на которых основано проведение его клинических
исследований в качестве средства для лечения, профилактики или
диагностики болезней.
Излагают данные о механизме основного фармакологического
(терапевтического) действия и возможных побочных эффектах препарата.
Приводят токсикологическую характеристику препарата, включая информацию о
тератогенности, мутагенности, канцерогенности и других возможных
отдаленных побочных эффектах.
Желательно изложить сведения о возможных особенностях действия
препарата при различных формах и стадиях течения болезни, у людей
разных возрастных групп, у беременных женщин, кормящих матерей, при
нарушении функций различных систем организма (желудочно-кишечного
тракта, печени, почек, сердечно-сосудистой системы и др.).
Фармакокинетика. В этом разделе должны быть представлены
полученные в опытах на животных данные о всасывании, распределении по
тканям и органам, особенностях метаболизма, элиминации и другие фармако-
кинетические характеристики препарата.
Всасывание. Приводятся данные о характере и скорости всасывания
препарата или его основных компонентов. При парентеральном,
ингаляционном, ректальном введении или наружном применении препарата
важно обозначить отличительные черты или особенности таких путей
поступления, которые имеют существенное значение для эффективного и
безопасного применения препарата.
В этом разделе должны быть указания о времени наступления эффекта,
пике максимальной концентрации в крови и действия препарата.
Распределение. Приводятся данные о распределении действующего
фармакологического вещества в кровяном русле (связывание с белками,
свободная фракция), степень накопления в разных тканях, проникновение
через гематоэнцефалический барьер и плаценту.
Метаболизм. В этом разделе излагаются сведения о скорости и уровне
-748-

превращений в печени и других тканях, время полужизни (Т1/2),
фармакологическая активность метаболитов, путь выведения метаболитов в
активном или индифферентном виде и т. п.
Выведение. Приводят сведения о путях и скорости элиминации,
способности к накоплению на пути экскреции и характеристике кумуляции
(материальная или функциональная) препарата.
ПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ
Указывают предполагаемое клиническое назначение препарата и его
основное применение в качестве лечебного, профилактического или
диагностического средства. Приводится перечень конкретных заболеваний,
синдромов и симптомов, при которых препарат рекомендуется изучить при
клиническом исследовании. При обозначении названий заболеваний
следует руководствоваться Международной статистической классификацией
болезней и проблем, связанных со здоровьем (МКБ-Х).
Не допускают общих выражений типа: "Используется при заболеваниях
сердца", "Применяется при болях в суставах" и т. п.
Обязательно указывается возможность исследования у детей (с
указанием возраста), а также у людей пожилого возраста, беременных женщин,
кормящих матерей.
СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ И ДОЗЫ
Указывают пути введения, разовую дозу (для определенных категорий
препаратов — противоопухолевые и др., желательно указать дозу из
расчета на поверхность или массу тела), кратность использования и
продолжительность интервала времени между повторными приемами (введениями)
препарата, суточную дозу, продолжительность курса лечения, возможность
повторных курсов лечения и длительность перерыва между курсами.
Обязательно приводятся максимальная разовая и суточная дозы.
Для препаратов, предназначенных к исследованию у детей, указываются
возрастные дозы, желательно с учетом поверхности или массы тела.
При необходимости подробно описывают способы подготовки
препарата для применения. Например, для таблеток, принимаемых внутрь,
необходимость предварительного раздробления и растворения таблетки в воде,
или, наоборот, требование принять таблетку, покрытую защитной кишеч-
норастворимой оболочкой, без ее повреждения и т. д. Для приготовления
растворов для парентерального введения — какой вид и количество
растворителя использовать, необходимость подогревания раствора перед
введением, скорость введения в сосудистое русло и др.
ПОБОЧНОЕ ДЕЙСТВИЕ
В разделе указывают все возможные нежелательные явления и
осложнения, которые можно прогнозировать на основании проведенных
экспериментальных токсикологических исследований. Здесь должно быть указано
на возможность индивидуальной непереносимости; повышенной
чувствительности к препарату; понижение или повышение эффективности при
многоразовом применении; другие особенности.
-749-

ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ
В этом разделе приводится перечень заболеваний и состояний, при
которых применение препарата нежелательно или противопоказано. Особо
оговаривается возможность применения (или не применения) препарата
при беременности и в период лактации.
Приводятся случаи, когда показания для применения препарата
ограничиваются (относительные противопоказания).
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ДРУГИМИ ЛЕКАРСТВЕННЫМИ
ПРЕПАРАТАМИ
В данном разделе желательно отразить сведения, которые касаются
возможного взаимодействия с другими лекарственными препаратами и
особенно отрицательных эффектов. Указывают химические или
физико-химические несовместимости, комбинации, которые нельзя использовать
(нельзя смешивать в одном порошке, растворах, применять в одном шприце и
т. д.).
Указываются изменения фармакологического эффекта одного или
нескольких лекарственных препаратов при их одновременном применении,
которые проявляются в суммации эффекта, синергизме или антагонизме, а
также изменение кинетики препарата на разнообразных уровнях его (их)
пребывания в организме — всасывание, распределение, связывание с
белками, метаболизм, выведение и др.
ПЕРЕДОЗИРОВКА
Этот раздел является обязательным для всех препаратов, подлежащих
клиническим испытаниям. Особенно подробно он должен быть изложен
для препаратов, которые могут быть отнесены к наркотическим,
психотропным, сильнодействующим и ядовитым.
Приводятся предполагаемые признаки (клиническое описание
симптомов и/или синдромов) и методы оказания медицинской помощи при
остром или хроническом отравлении; возможные способы предупреждения
отравлений (передозировки).
ОСОБЫЕ УКАЗАНИЯ
Этот раздел вводится при необходимости. Здесь указывают условия, при
которых препарат может изменять свои свойства, и вытекающие из этого
особенности его применения для определенной категории людей (фарма-
когенетический фактор, профессиональные вредности).
Обязательно указывают на возможность отрицательного влияния
препарата на выполнение потенциально опасных видов деятельности,
требующих особого внимания и быстрых реакций (управление автомобилем и
другими транспортными средствами, работа с движущимися механизмами,
работа диспетчера и оператора и т. п.).
-750-

ФОРМА ВЫПУСКА
Указывают готовую лекарственную форму, в которой изготовитель
предлагает тот или иной препарат (таблетки, раствор, мазь и др.),
количество действующего фармакологического вещества, выраженное в единицах
массы (граммы) или в единицах действия, процентное содержание в одной
единице объема жидкой лекарственной формы, количество доз в одной
упаковке. Если препарат выпускается в нескольких лекарственных формах
или различных дозировках, приводится каждая из них, с указанием полной
характеристики.
Упаковка. Дается информация о форме и количестве учетных единиц
(таблеток, ампул и др.) в упаковке препарата.
Упаковка лекарственного средства, предназначенного для клинических
исследований, должна иметь надпись: "Для клинических испытаний".
УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ
Если в соответствии с законодательством Российской Федерации или
нормативными правовыми актами действующее начало препарата или его
компоненты отнесены к особой категории (наркотические, психотропные,
сильнодействующие, ядовитые), это должно быть обязательно указано в
данном разделе инструкции с последующей ссылкой на особые условия
хранения данного препарата.
В соответствии с проектом нормативно-технической документации
(Временная фармакопейная статья и др.) указываются условия
окружающей среды, которые обеспечивают сохранение качества препарата в
течение срока хранения (температура, защита от света, другие параметры и
условия). Для отдельных категорий препаратов (кровезаменители, растворы
для инъекций и др.) целесообразно указать очевидные признаки утраты
качества при ненадлежащем хранении (выпадение осадка, изменение цвета
и др.) с указанием о недопустимости их применения в этом случае.
Обязательно отдельной строкой дается указание, что лекарственное
средства следует хранить в местах, недоступных для детей.
СРОК ГОДНОСТИ
На упаковке препарата должны быть указаны дата изготовления и срок
годности.
Обязательно отдельной строкой дается указание, что лекарственное
средства по истечении срока годности не должно применяться.
ОРГАНИЗАЦИЯ-РАЗРАБОТЧИК
(ПРЕДПРИЯТИЕ-ПРОИЗВОДИТЕЛЬ) *
Указывается название организации (фирмы)-разработчика
(предприятия-производителя) препарата и ее точный адрес.
Методические рекомендации по рациональному выбору названий
лекарственных средств.
* Проект инструкции подписывается ответственным составителем и руководителем и
заверяется печатью организации (фирмы)-разработчика.
-751 -

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ДЕПАРТАМЕНТ ГОСУДАРСТВЕННОГО КОНТРОЛЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
И МЕДИЦИНСКОЙ ТЕХНИКИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "НАУЧНЫЙ ЦЕНТР
ЭКСПЕРТИЗЫ СРЕДСТВ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ"
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Департамента
государственного контроля
лекарственных средств и
медицинской техники
Минздрава России
В. Е. АКИМОЧКИН
1 июля 2003 г.
СОГЛАСОВАНО
Руководитель ФГУ
"Научный центр экспертизы
средств медицинского применения"
Минздрава России, академик
Р. В. ПЕТРОВ
1 июля 2003 г.
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО РАЦИОНАЛЬНОМУ
ВЫБОРУ НАЗВАНИЙ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Методические рекомендации разработаны в ФГУ "Научный центр
экспертизы средств медицинского применения" Минздрава России.
Авторский коллектив:
Выровщикова А. В., к.ф.н.
Дудченко В. В., к.м.н
Корнеева Л. В.
Румянцев А. С, к. м. н., доцент
Яворский А. Н., д. м. н., профессор
ВВЕДЕНИЕ
Методические рекомендации предназначены для юридических и
физических лиц, осуществляющих следующие виды деятельности: разработку,
исследование, экспертизу, регистрацию, производство, ввоз, вывоз,
контроль за производством, обращением, реализацией и применением
лекарственных средств в Российской Федерации и иные виды деятельности в
сфере обращения лекарственных средств.
Требования, изложенные в настоящих методических указаниях,
применяются при разработке и ведении нормативной и технической
документации, регламентирующей обращение лекарственных средств; при
разработке и ведении лингвистических средств (классификаторов и рубрикаторов)
для автоматизированных систем информации о лекарственных средствах; в
научно-исследовательских публикациях; в рекламе.
-752-

Для подготовки настоящих рекомендаций использованы следующие
документы:
Федеральный закон "О лекарственных средствах" № 86-ФЗ от 22 июня
1998 г.
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации "Об
утверждении Положения о порядке проведения государственного контроля
эффективности и безопасности лекарственных средств на территории
Российской Федерации" № 223 от 28.05.2003 г.
Актуальность подготовки настоящих рекомендаций обоснована
следующими общими положениями.
В результате прошедшей за последние годы радикальной
трансформации всей сферы обращения лекарственных средств, создалась совершенно
новая ситуация с информацией о лекарствах, главной характеристикой
которой стало чрезвычайное многообразие названий лекарств. Сегодня на
фармацевтическом рынке страны более 1500 фармацевтических
предприятий и фирм предлагают потребителю около 15 тыс. лекарственных
препаратов [1]. В результате ни врачи, ни тем более потребители уже не в
состоянии разобраться в бесчисленных, быстро меняющихся и нередко очень
сходных между собой наименованиях лекарств.
С учетом этих обстоятельств рассмотрение вопроса о принципах
рационального выбора названий и упорядочения номенклатуры лекарств
представляется вполне актуальным.
Всемирной ассамблеей здравоохранения государств—членов Всемирной
организации здравоохранения (ВОЗ) в 1950 г. была принята резолюция,
которая определила необходимость международной координации работы
национальных комиссий по вопросам экспертизы номенклатуры
лекарственных средств, создания соответствующего экспертно-консультативного
совета ВОЗ и разработку специальной программы по Международным
непатентованным названиям лекарств (МНН).
Причина такого внимания общества к вопросу выбора названий
лекарств определяется особым статусом лекарств среди всех других
обращающихся на рынке товаров. Медицинский аспект состоит в понимании
высокого риска для здоровья и жизни пациента, связанного с
возможностью ошибки в названии лекарства, как при его назначении врачом, так и
при применении с целью самолечения. Экономический аспект
определяется конкурентными отношениями между производителями лекарств,
каждый из которых хочет иметь собственное название (торговую марку) и
использовать его в качестве инструмента индивидуализации продукции и
последующей рекламы, способствующей продвижению своего товара на
рынок. По этой причине для регистрации лекарственного средства
заявителем нередко представляются названия, лишенные всякой связи с
объективной характеристикой его терапевтической эффективности, и без учета
безопасности для потребителя, что может привести к нарушению
конституционных прав граждан на охрану здоровья и медицинскую помощь.
С учетом очевидной противоречивости этих аспектов рациональный
выбор названий лекарства представляет сложную мультидисциплинарную
проблему, заведомо связанную с конфликтом интересов различных
субъектов сферы обращения лекарственных средств.
В силу этих обстоятельств решение о присвоении наименования требует
обязательного проведения экспертизы названия при регистрации каждого
нового лекарства с использованием однозначно установленной и
юридически значимой процедуры. Необходимость экспертизы названий при
регистрации обусловлена взаимосвязью между информацией, которую содер-
-753-

жит название, с такими существенными характеристиками лекарства, как
эффективность, безопасность и качество, без учета которых невозможно
гарантировать его рациональное применение.
Принятие такого решения должно основываться на исторически
оправданных и сформировавшихся в общепринятой международной практике
критериях и научных рекомендациях, сформулированных в результате
подробного и всестороннего коллегиального обсуждения
экспертов-специалистов, способных оценить всю совокупность медицинских, правовых,
экономических и иных возможных последствий.
В настоящих методических рекомендациях использованы следующие
термины и определения.
На основании Федерального закона "О лекарственных средствах" и с
учетом отечественной и международной практики обобщающий термин
"название лекарственного средства" включает два отдельных термина:
название "фармацевтической субстанции" и название "лекарственного
препарата".
Название фармацевтической субстанции, под которой понимают
определенное вещество, обладающее фармакологической активностью и
предназначенное для производства и изготовления лекарственных
препаратов, — это словесное обозначение в виде определенного сочетания букв
(знаков) или отдельных слов, идентифицирующее фармацевтическую
субстанцию, имеющую определенное химическое строение и
фармакологические свойства.
Из данного определения следует, что имеющее определенное
химическое строение и фармакологические свойства фармацевтическая
субстанция может быть зарегистрирована только под одним названием.
В качестве такого единого названия, как правило, используется
международное непатентованное название данной фармацевтической субстанции
(International Nonproprietary Names for Pharmaceutical Substances),
рекомендованное ВОЗ.
Название фармацевтической субстанции может также иметь
историческое происхождение (так называемые "традиционные лекарственные
средства") или выбрано по определенным правилам и закреплено в
соответствии с действующей в установленном порядке юридической процедурой
при регистрации лекарственных средств уполномоченным органом.
Название лекарственного препарата, под которым понимают
дозированное лекарственное средство, готовое к применению, — это словесное
обозначение в виде определенного сочетания букв (знаков) или отдельных
слов, идентифицирующих лекарственный препарат с определенным
химическим составом и фармакологическим действием.
С учетом исторически сложившейся отечественной практики под этим
общим термином "название лекарственного препарата" в разное время
фактически существовало два различных определения, которые
формулировались исходя из различных принципов.
Первое определение использовалось во времена существования СССР и
в тот период было единственно возможным для отечественных препаратов,
поскольку разработчики, создававшие научно-техническую документацию,
сама эта документация (включая название) и предприятия-производители,
использовавшие эту документацию для выпуска готовой продукции,
находились исключительно в государственной собственности. В приказе
Минздрава о разрешении к медицинскому применению лекарственного
препарата указывалось имя разработчика, который выбирал название исходя
исключительно из таких научных предпосылок, как химический состав и
-754-

фармакологические свойства. После акта о разрешении медицинского
применения лекарственного препарата название как составной элемент
комплекта научной и научно-технической документации в соответствии с
государственным планом передавалось на одно или несколько
предприятий, которые производили данный препарат под этим единым названием.
На основе этого определения, начиная с 50-х годов до 1991 г.,
Минздравом СССР были разрешены к медицинскому применению более
тысячи названий отечественных лекарственных препаратов, которые в течение
десятилетий одновременно производились многими отечественными
фармацевтическими предприятиями и широко применялись в медицинской
практике. В результате эти названия вошли во всеобщее употребление как
обозначения товара определенного вида и стали общеизвестными для
специалистов и потребителей.
Второе новое определение применяется в отношении отечественных
препаратов с 1991 г., после вступления России в период рыночных
преобразований и превращения бывших государственных фармацевтических
предприятий в самостоятельные хозяйствующие субъекты различной
формы собственности, конкурирующие между собой на свободном
фармацевтическом рынке. Регистрация лекарственных препаратов начала
проводиться с указанием имени предприятия-производителя, а название
выбиралось им исходя из маркетинговых соображений с целью выделить свой
товар среди однородных товаров конкурентов. Эти объективные процессы
явились причиной перехода к новому для России, но давно
общепринятому в международной практике понятию как торговое (фирменное)
название лекарственного препарата (Trade Name), главной характеристикой
которого является способность отличать лекарственный препарат одного
производителя от однородных препаратов других производителей.
Это современное определение может быть сформулировано следующим
образом. Торговое название лекарственного препарата — это словесное
обозначение, под которым определенное предприятие-производитель
проводит регистрацию, предлагает к реализации и реализует на
фармацевтическом рынке произведенный им лекарственный препарат, обладающий
определенным качественным и количественным составом и
фармакологическими свойствами.
В отечественной практике торговые названия лекарственных
препаратов, как правило, используются для обозначения воспроизведенных
различными предприятиями-производителями лекарственных препаратов,
содержащих одинаковую дозу одной или нескольких фармацевтических
субстанций, но отличающихся по составу и количеству вспомогательных
веществ и(или) использованной технологией производства, имеющие статус
генерических аналогов (multisource or generic pharmaceutical products,
generics).
Таким образом, с учетом исторически сложившейся отечественной и
общепринятой международной практики все названия лекарственных
препаратов могут быть разделены на две самостоятельные группы:
общеизвестные названия и торговые названия.
Правовой статус названий, относящихся к каждой группе,
принципиально различен и состоит в следующем.
Общеизвестные названия, как и международные непатентованные
названия, могут быть использованы всеми заинтересованными
юридическими и физическими лицами. Правовая охрана названий этой группы
обеспечивается антимонопольным законодательством и законодательством в
сфере защиты интеллектуальной собственности, в котором такие названия
-755-

относят к категории непатентуемых (nonproprietary name), т. е. вошедших
во всеобщее употребление как обозначение товаров определенного вида.
Торговые названия, предложенные предприятиями-производителями, в
свою очередь делятся на дае группы:
Названия, утвержденные в качестве названий лекарственных
препаратов при регистрации лекарственных препаратов уполномоченным органом
в соответствии с требованиями Федерального закона "О лекарственных
средствах".
Названия, дополнительно зарегистрированные в качестве товарных
знаков Федеральным органом исполнительной власти в области охраны
объектов интеллектуальной собственности в соответствии с требованиями
Закона "О товарных знаках, знаках обслуживания и наименованиях
происхождения товаров" (синонимы — Оригинальное название, Товарный знак,
Патентованное название — Trade mark, Brand name, Proprietary name).
Названия этой группы представляют собой особую форму интеллектуальной
(промышленной) собственности, принадлежащей государству,
юридическому или физическому лицу (лицам), имеющим исключительное право на
их использование, охраняемое международным [6] и законодательством
Российской Федерации в сфере защиты интеллектуальной собственности
[3].
ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ РАЦИОНАЛЬНОГО ВЫБОРА НАЗВАНИЙ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Основные принципы выбора названий фармацевтических субстанций
Для выбора названия фармацевтической субстанции могут быть
использованы:
— Химическое название в соответствии с требованиями
Международного союза по чистой и прикладной химии (IUPAC) [4].
Выбор химического названия применим только для лекарственных
средств, представляющих химические вещества, имеющие
идентифицированную структуру молекулы. Эти названия хорошо применимы для
лекарственных веществ, имеющих относительно простое строение. Однако в
качестве названий лекарственных средств, имеющих более сложное
строение, химические названия являются малоприменимыми в силу их
чрезмерной грамматической и лексической сложности.
— Международное непатентованное название (МНН) в соответствии с
рекомендациями ВОЗ [5].
Утверждение международного непатентованного названия ВОЗ
представляет сложную и длительную официальную процедуру, которая
завершается публикацией рекомендованного МНН в журнале "WHO Drug
Information" и специальном международном справочнике ВОЗ "International
Nonproprietary Names for Pharmaceutical Substance. Cumulative List".
Основные принципы утверждения МНН изложены в специальном
руководстве ВОЗ [5] и могут быть кратко сформулированы в следующем
виде:
— МНН не должны быть слишком длинными и трудными в
произношении и написании.
— МНН не должны быть сходными в произношении и написании с
названиями других находящихся в обращении лекарств.
— МНН должны отражать взаимосвязь с существующей классификаци-
-756-

ей лекарств. С этой целью при формировании названий используют
специальный перечень структурных элементов (корневых основ — stem)
(краткий список структурных элементов приведен в приложении 2).
— При выборе МНН следует избегать словесных элементов, способных
вызвать ассоциативную связь лекарственного средства с анатомическими,
физиологическими терминами, определенным заболеванием или
ожидаемым лечебным эффектом.
— Для облегчения перевода МНН на другие языки следует избегать
использования букв, транслитерация которых может вызвать затруднения.
Программа ВОЗ по выбору МНН применима только для лекарственных
средств, полученных методами химического синтеза и биотехнологии и
имеющих определенную химически идентифицированную структуру
молекулы. Поэтому в качестве МНН не могут быть рекомендованы названия
лекарственных средств растительного происхождения и гомеопатические
средства.
— Непатентованное название, действующее до утверждения
соответствующего международного непатентованного названия.
Открытие новых лекарственных средств является общепризнанным и
наиболее очевидным выражением научно-технического прогресса в
медицине, который, с одной стороны, определяет успехи в лечении и
профилактике болезней человека, с другой — обеспечивает развитие
фармацевтического производства. Поэтому в странах, уровень научно-технического
развития которых позволяет проводить поиск, изучение и внедрение в
медицинскую практику и фармацевтическое производство новых
лекарственных средств, существуют национальные системы экспертного отбора и
введения в действие непатентованных названий для новых лекарственных
средств с возможностью их последующего представления в ВОЗ для
присвоения статуса МНН.
Утверждение непатентованного названия лекарственного средства
проводится уполномоченным органом во взаимодействии с уполномоченным
подведомственным учреждением.
Основные принципы выбора названий лекарственных препаратов
Для выбора названия "Лекарственного препарата", как дозированного
лекарственного средства, готового к применению, могут быть
использованы следующие варианты:
— Международное непатентованное название (МНН) в соответствии с
рекомендациями ВОЗ.
Данное название может быть использовано для монокомпонентных, т. е.
содержащих только одно лекарственное средство (фармацевтическую
субстанцию) лекарственных препаратов.
Для идентификации товара на рынке предприятие-производитель
может дополнять используемое в качестве названия лекарственного
препарата МНН своим зарегистрированным в качестве товарного знака полным
или сокращенным (аббревиатура) наименованием.
— Общеизвестное (непатентованное) название (common name,
nonproprietary name), утвержденное Федеральным органом контроля качества
лекарственных средств.
Данное название может быть использовано для лекарственных
препаратов соответствующего состава и фармакологического действия.
Для идентификации товара на рынке предприятие-производитель мо-
-757-

жет дополнять используемое в качестве названия лекарственного
препарата общепринятое название своим зарегистрированным в качестве
товарного знака полным или сокращенным (аббревиатура) наименованием.
— Торговое название (Trade Name).
Название лекарственного препарата является частью медицинской
терминологии и по своей сути призвано помогать специалистам
(медицинским и фармацевтическим работникам) ориентироваться в его составе и
действии.
Названия лекарственных препаратов должны быть по возможности
краткими, легко произносимыми, благозвучными, привычно звучащими
для русского языка.
Названия лекарственных препаратов с различными действующими
веществами (фармацевтическими субстанциями) должны отличаться по
написанию и звучанию.
Не допускается регистрация в качестве названий лекарственных
препаратов обозначений, являющихся ложными или способными ввести в
заблуждение потребителя относительно товара или его изготовителя, а также
противоречащих общественным интересам, принципам гуманности и
морали.
Не могут быть рекомендованы в качестве названий вновь
регистрируемых лекарственных препаратов обозначения, идентичные или признанные
графически и(или) фонетически сходными с названиями, ранее
зарегистрированных лекарственных препаратов различных по составу и действию.
Проверка предлагаемых названий на графическое и фонетическое
сходство проводится в соответствии с рекомендациями (приложение 1).
В торговых названиях лекарственных препаратов не следует
использовать структурные элементы, являющиеся составными частями МНН
(приложение 2).
Не следует использовать МНН или графически и(или), фонетически
сходные с ними названия для лекарственного препарата другого
химического состава или действия, а также включать в названия лекарственного
препарата слова или части слов, характерные для названий препаратов
других химических и(или) фармакологических групп.
Лекарственные препараты, выпускаемые в различных лекарственных
формах, рекомендуется называть по входящему в их состав лекарственному
средству (фармацевтической субстанции). Разные названия для разных
лекарственных форм одного и того же лекарственного средства допускаются
только как исключение, например, при значительном изменении действия
лекарственного препарата под влиянием лекарственной формы и
соответственно изменения показаний по применению.
Лекарственная форма препарата и дозы лекарственного вещества не
выносятся в название лекарственного препарата. Исключение составляют
лекарственное растительное сырье и лекарственные средства из
лекарственного растительного сырья (приложение 3).
Для названия лекарственных препаратов (монопрепаратов), содержащих
одну фармацевтическую субстанцию, имеющую общепринятое
непатентованное название, целесообразно использовать общепринятое название.
Для идентификации предприятия-производителя
(организации-разработчика) в такое название допускается включить их наименование или
аббревиатуру.
Для названий комбинированных лекарственных препаратов обычно
используют комбинацию из слогов и букв, входящих в названия
составляющих их фармацевтических субстанций.
-758-

Не следует использовать одинаковые названия для комбинированных
лекарственных препаратов, отличающихся составом или соотношением
дозировок входящих в них фармацевтических субстанций.
Не рекомендуется использование названий, способных ввести в
заблуждение потребителя относительно истинного состава и действия
лекарственного препарата. К этой категории относятся обозначения,
порождающие в сознании потребителя представления об определенной качественной
характеристики (составе и(или) фармакологических свойствах)
лекарственного препарата, которое не соответствует действительности.
Название лекарственного препарата не должно представлять его как
уникальное, наиболее эффективное, наиболее безопасное, исключительное
по отсутствию побочных эффектов.
Возможно использование в названии препарата принятых в
медицинской терминологии латинских слов и частиц.
Не рекомендуется полностью воспроизводить в названиях
лекарственного препарата названия болезней и симптомов заболеваний,
анатомические и физиологические термины, имена собственные, географические
названия, общепринятые символы и слова из бытовой лексики. Не
допускается использовать в названиях слова графически и(или) фонетически
сходные с нецензурными выражениями.
Не следует использовать в качестве названий обозначения,
тождественные или имеющие графическое и(или) фонетическое сходство с
официальными наименованиями особо ценных объектов культурного наследия
народов Российской Федерации либо объектов всемирного культурного или
природного наследия.
Приложение 1
к Методическим рекомендациям
по рациональному выбору
названий лекарственных средств
МЕТОДИКА ПРОВЕРКИ ЗАЯВЛЕННЫХ НАЗВАНИЙ НА ГРАФИЧЕСКОЕ
И ФОНЕТИЧЕСКОЕ СХОДСТВО
Название считается сходным с другим названием, если оно
ассоциируется с ним в целом, несмотря на их отдельные отличия.
Сходство названий может быть звуковым (фонетическим), графическим
(визуальным).
Звуковое сходство определяется на основании следующих признаков:
— наличие близких и совпадающих звуков в сравниваемых
обозначениях;
— близость звуков, составляющих обозначения;
— расположение близких звуков и звукосочетаний по отношению одних
к другим;
— наличие совпадающих слогов и их расположение;
— число слогов в обозначениях;
— место совпадающих звукосочетаний в составе обозначений;
— близость состава гласных;
— близость состава согласных;
— характер совпадающих частей обозначений;
-759-

— вхождение одного обозначения в другое;
— ударение.
Признаки, на основании которых определяется звуковое сходство
словесных обозначений (перечисляются ниже), могут учитываться как каждый
в отдельности, так и в различных сочетаниях.
Наиболее распространенные случаи звукового сходства:
— тождество звучания начальных частей обозначений и сходство
звучания конечных частей: флоксан — флоксал; глиотен — глиофен; имигил —
имидил; тимопил — тимонил;
— сходство звучания начальных частей обозначений и тождество
звучания конечных частей: абуфен — ибуфен; мигран — имигран;
— тождество звучания начальных и конечных частей обозначений и
сходство звучания средних частей: пиновит — пиковит; эклин — экалин;
— тождество звучания средних частей обозначения и сходство звучания
начальных и конечных частей: окоден — акодин.
Общее правило состоит в том, что при подсчете составляющих слова
букв (знаков) различия между сравниваемыми названиями должны
составлять 3 и более букв (знаков) в любом сочетании.
Приложение 2
к Методическим рекомендациям
по рациональному выбору
названий лекарственных средств
СТРУКТУРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ МЕЖДУНАРОДНЫХ НЕПАТЕНТОВАННЫХ
НАЗВАНИЙ, ОТНОСЯЩИХСЯ К РОДСТВЕННЫМ ХИМИЧЕСКИМ
И(ИЛИ) ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИМ ГРУППАМ [5]
Снотворные и наркотические вещества производных барбитуровой кислоты
Нейролептики прозводные фенотиазина (группа хлорпромазина)
Анальгетики производные 4-оксипиперидина (группа промедола)
Анальгетики производные фениламинопиперидина
Трициклические антидепрессанты производные дибензоазепина (группа
имипрамина)
Трициклические антидепрессанты производные дибензоциклогептена
(группа амитриптилина)
Антидепрессанты производные сиднонимина (группа сиднофена)
Препараты лития
Ноотропы производные ацетамида (группа пирацетама)
Противосудорожные препараты производные бензодиазепина
Противосудорожные препараты производные иминостильбена (группа кар-
бамазепина)
Противосудорожные препараты производные гидантоина (группа фени-
тоина)
Холинолитики производные атропина
Местные анестетики (группа прокаина)
Антихолиностеразные средства (группа пиридостигмина, физостигмана)
Реактиваторы холинэстеразы (группа тримедоксима)
Дофаминергические средства
Антагонисты рецепторов 5НТз-серотонина (группа ондансетрона)
-барб
-мазин
-перидии
-фентанил
-прамин
-птилин
-сидн
-ли
-ацетам
-азеп
-зепин
-тонн
-троп
-каин
-стигмин
-ксим,
-оксим
-допа
-сетрон
-760-

Продолжение
Блокаторы кальциевых каналов производные дилтиазема -тиазем
Ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента -прил
Антагонисты бета-адренорецепторов -олол
Приложение 3
к Методическим рекомендациям
по рациональному выбору
названий лекарственных средств
ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ НАЗВАНИЙ ЛЕКАРСТВЕННОГО
РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
ИЗ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ [7]
Название лекарственного растительного сырья "ангро" цельного,
измельченного и порошка образуется из родового названия производящего
растения в родительном падеже и названия органа растения во
множественном числе именительного падежа (исключения составляют "кора" и
"трава" — в единственном числе).
Название сырья указывается на русском и латинском языках.
Например: 1. Красавки листья
Belladonnae folia
Цельные, измельченные, порошок "ангро"
2. Калины кора
Viburni cortex
Цельная, измельченная, порошок "ангро"
В случае если используется сырье от определенного вида
лекарственного растения, то указывается и вид данного растения.
Например: 1. Горицвета весеннего трава
Adonidis vernalis herba
Цельная, измельченная, порошок "ангро"
2. Аралии маньчжурской корни
Araliae mandshuricae radices
Цельные, измельченные, порошок "ангро"
Следует иметь в виду, что документация на лекарственное растительное
сырье "ангро" является базовой (сырье играет роль субстанции) для
фасованного сырья и препаратов на его основе. Формирование названий
фасованной продукции и растительных препаратов осуществляется на базе
названий сырья-субстанции.
Для лекарственных средств из растительного сырья (фасованной
продукции) указывается название сырья на русском и латинском языках, а
затем заявляемые виды фасовки сырья в именительном падеже
множественного числа, с указанием измельченности для сырья, расфасованного в
пачки, пакеты и фильтр-пакеты.
Например: Мяты перечной листья
Menthae piperitae folia
брикеты,
измельченные — пачки, пакеты,
порошок — фильтр-пакеты.
-761 -

Примечание. Латинское название приводится только для
лекарственного растительного сырья, но не сборов, настоек и др.
Название сборов, состоящих из нескольких видов лекарственного
растительного сырья, формируется из торгового названия, лекарственной
формы (сбор), а затем заявляемого варианта фасовки.
Например: Арфазетин сбор
измельченный, порошок — "ангро",
измельченный — пачки, пакеты,
порошок — фильтр-пакеты.
С появлением новых торговых названий для препаратов лекарственного
растительного сырья, которые фирмы-производители присваивают старым,
известным, считаем целесообразным сохранять на переходный период
старое название одновременно с новым.
Например: 1. Фитонефрол (урологический) сбор
измельченный — пачки,
порошок — фильтр-пакеты.
2. Фитосон (успокоительный № 3) сбор
порошок — фильтр-пакеты.
Названия лекарственных препаратов, приготовленных из
лекарственного растительного сырья, следует формировать из названия растения
(источника сырья) в родительном падеже и названия лекарственной формы.
Например: Шиповника сироп;
Овса настойка;
Боярышника настойка;
Валерианы экстракт густой;
Родиолы экстракт жидкий.
В том случае, если для производящего растения в документе на
растительное сырье указывается видовое название, следует сохранять его в
названии лекарственного препарата. ,—
Например: Бессмертника песчаного экстракт жидкий. /
Если от одного производящего растения разрешены к заготовке и
используются несколько видов лекарственного растительного сырья, следует
указывать в названии сырьевую часть.
Например: 1. Лимонника плодов настойка,
2. Лимонника семян настойка.
В том случае, когда от одного производящего растения разрешены к
заготовке и используется только один вид сырья, не следует указывать его
сырьевую часть.
Например: 1. Шиповника сироп,
2. Облепиховое масло.
Л итература
1. Государственный реестр лекарственных средств / Минздрав России. — Т. 1. — М.,
2002. - 1300 с.
2. Федеральный закон "О лекарственных средствах" № 86-ФЗ от 22 июня 1998 г.
3. Закон "О товарных знаках, знаках обслуживания и наименованиях происхождения
товаров" № 3520-1 от 23 сентября 1992 г.
4. Номенклатурные правила ИЮПАК по химии. — М., ВИНИТИ, 1979. — Т. 1. — 660
с; т. 2. - 896 с.
5. Guidelines on use of International Nonproprietary Names (INNs) for Pharmaceutical
Substances. WHO/PHARM S/Nom 1570. - Geneva: WHO, 1997.
6. Мадридское соглашение о международной регистрации знаков от 14.09.1991 г.
7. Арзамасцев А. П., Самылина И. А., Баландина И. А., Багирова В. Л. Методические
-762-

указания "Принципы формирования названий лекарственного растительного сырья
и лекарственных средств из лекарственного растительного сырья" /
Фармакопейный государственный комитет Минздрава России, Институт стандартизации
лекарственных средств Научного центра экспертизы средств медицинского применения
Минздрава России. — М., 2003.
Основные методы статистической обработки результатов
фармакологических экспериментов (Часть 1)
СОСТАВИТЕЛЬ д. б. н. Р. М. Салимое
1. Основные понятия статистических оценок в медико-биологических
исследованиях
Бурное развитие медико-биологических исследований, происходившее
во второй половине XX века, стало возможным во многом благодаря
разработке и широкому распространению методов статистического анализа
данных экспериментов. Для отечественных исследователей особое место
занимали превосходные публикации ряда авторов на русском языке (М. Л.
Беленький, Н. А. Плохинский, Р. Рунион и др.), в которых выбор методов
был основан на оптимальном сочетании эффективности статистических
критериев с простотой математических алгоритмов, пригодных для
обработки данных вручную. К настоящему времени, однако, широкое распро-г
странение компьютерной техники устранило ограничение, связашго^Ус
применением сложных математических процедур. Среди множества
статистических методов разными группами разработчиков компьютерных
программ была выделена группа наиболее эффективных приемов анализа
медико-биологических данных и даже достигнута определенная унификация
формы хранения результатов в базах данных и диалога программы с
пользователем. Среди наиболее популярных пакетов таких программ можно
отметить STATISTICA, CSS, SPSS, STATGRAPH, SYSTAT, MICROSTAT
и др. Современному пользователю уже нет необходимости знать все детали
соответствующих математических процедур и достаточно лишь понимания
основных допущений и ограничений, связанных с планированием и
сбором результатов экспериментов, а также с применением конкретных
статистических методов. Настоящие методические рекомендации выполнены на
примере пакета программ STATISTICA для Wndows95.
Содержание любого статистического метода обычно состоит в оценке
вероятности статистических гипотез. Исходной является так называемая
"нулевая гипотеза". В общем виде она заключается в том, что наблюдаемое
разнообразие признаков является случайным и на самом деле нет ни
различий между изучаемыми группами данных, ни связи между различными
показателями. Математически обосновано существование 3 основных
уровней вероятности, при которых отвергается "нулевая гипотеза": р <
0,05, р < 0,01 и р < 0,001. Наибольшее значение имеет уровень
вероятности р < 0,05, достижение которого является необходимым и достаточным
условием для отвержения "нулевой гипотезы". Указанные уровни могут
быть интерпретированы как вероятность получения несовпадающего
результата при повторном проведении эксперимента. Чем меньше величина
-763-

указанной вероятности, тем больше уверенность в обоснованности
статистической оценки. Вместе с тем если указанное критическое значение
вероятности не достигнуто (р > 0,05), то это еще не означает окончательного
доказательства отсутствия различий и взаимосвязей. В этом случае
определенного вывода не делают.
Вероятность рассматриваемых статистических гипотез оценивается с
помощью разнообразных методов, основанных на закономерностях
распределения случайных величин. При этом результаты оценки
сравниваются с соответствующими теоретически вычисленными значениями, а сами
методы статистических оценок разделяются на параметрические и
непараметрические. Большинство параметрических методов предполагает, что
изучаемый параметр имеет так называемое нормальное распределение, или
распределение, сводимое к нормальному. Одним из важных свойств
нормального распределения состоит в том, что наиболее вероятным значением
измеряемой величины является средняя арифметическая от собранных
наблюдений. К числу наиболее распространенных параметрических методов
относятся критерий Стьюдента для парных сравнений, анализ дисперсий
ANOVA и MANOVA, анализ корреляций Пирсона, регрессионный и
факторный анализ.
Непараметрические методы характеризуются независимостью от типа
распределения изучаемого параметра. Они проще в употреблении, однако
по сравнению с параметрическими методами характеризуются меньшей
мощностью. Непараметрические методы рекомендуется для быстрой
предварительной оценки или в тех случаях, когда параметрические методы не
могут употребляться в связи с формой распределения изучаемого
признака. К числу наиболее распространенных непараметрических методов
относятся критерии Манна—Уитни и Вилкоксона для парных сравнений
количественных признаков, критерий Хи-квадрат и точный метод Фишера для
парных сравнений качественных признаков, а также анализ корреляций
Спирмена.
Следует отметить, что применение методов вариационной статистики
начинается с выбора соответствующего плана эксперимента. Важной
аксиомой, лежащей в основе большинства статистических сравнений,
является принцип "прочих равных условий", предполагающий, что
сравниваемые группы отличаются по влиянию изучаемых контролируемых факторов
(условий эксперимента), но находятся в условиях одинакового влияния
всех остальных (неконтролируемых) факторов. Исходя из этого принципа,
идеальное исследование влияния разных условий эксперимента должно
было бы быть выполнено с использованием одного и того же объекта в
один и тот же момент времени в одной и той же точке пространства. Хотя
нереальность такого эксперимента очевидна, все же имеется возможность
выполнить указанный принцип "прочих равных условий". Для этого
необходимо осуществить случайное чередование изучаемых контролируемых
факторов относительно остальных неконтролируемых факторов [Плохин-
ский, 1970, с. 70—71]. В результате этого влияние неконтролируемых
факторов войдет в ошибку случайного разнообразия, которая оценивается
отдельно от влияния организованных факторов. Для указанной цели
применяют планы экспериментов, использующие псевдослучайную
последовательность опытов, так называемые латинские квадраты (см. ниже).
Например, для изучения признака в контрольной группе и в условиях влияния
вещества в дозах 0,5, 1,0 или 2,5 мг/кг производят последовательную
нумерацию всех имеющихся вариантов опыта: № 1 — контроль, № 2 — доза 0,5
мг/кг, № 3 — доза 1,0 мг/кг, № 4 — доза 2,5 мг/кг. Последовательность
-764-

выполнения вариантов опыта будет определяться таблицей, каждая строка
которой выполняется слева направо, а строки чередуются в направлении
сверху вниз:
1234
4 123
34 12
234 1
В обычном бесповторном эксперименте каждому числу в строке
соответствует новое животное или объект наблюдения.
Для автоматической генерации случайной последовательности
выполнения вариантов опытов можно использовать опцию Experimental Design
стандартного пакета программ, в котором выбирают раздел Latin squares и
затем выбирают Generate design, указав в окне Number of levels количество
вариантов опыта (в данном случае — 4).
Немаловажное значение имеет также использование достаточного
количества объектов измерений. В общем случае эта величина определяется
эмпирически и должна быть тем больше (или меньше), чем больше (или
меньше) вариабельность (разнообразие) изучаемого признака. Во многих
медико-биологических исследованиях достаточно 10—15 измерений на
точку.
Большинство существующих пакетов статистических программ
предполагает хранение полученных результатов в собственных базах данных.
Результаты хранятся в форме таблиц, в которых каждый из столбцов
представляет собой определенный измеряемый параметр или код условий
эксперимента, а каждая строка — определенный индивидуум или объект
измерений. Приступая к заполнению базы данных, следует визуально
оценивать наличие возможных артефактов, которые могут выглядеть как
слишком большие или малые значения, а также как измерения с неадекватным
количеством десятичных знаков. В стандартном пакете программ
выбирают опцию Data Management и затем Create new data file. При этом
необходимо указать число изучаемых признаков (столбцов таблицы) — Number
of variables и число использованных объектов исследования (строк
таблицы) — Number of cases, а также присвоить какое-либо имя файлу, в
котором в дальнейшем будут храниться эти данные. В качестве примера такой
базы данных в настоящих методических указаниях использованы
собственные данные автора о влиянии разных доз морфина на латентный период
отдергивания хвоста у мышей в ответ на болевое воздействие
интенсивного пучка света, который определялся в 4 последовательных измерениях,
выполнявшихся с интервалом 15 с (см. приложение 1). Файл содержит 6
независимых признаков (столбцов), которые называются "Код", "Доза",
"Т1", "-г/2'^ "-г/3" и "Х4". Указанный файл содержит 40 строк, каждая из
которых соответствует опыту с участием новой мыши.
Прежде чем приступить к оценке различий между изучаемыми группами
или взаимосвязей между признаками, следует проверить тип распределения
изучаемого признака, а точнее проверить его принадлежность к
нормальному распределению. Для этого в стандартном пакете программ выбирают
опцию Nonparametrics/Distribution и в окне Continuous distribution выбирают
Normal. После этого в окне Variable выбирают анализируемый показатель
(столбец), указав количество классов распределения Number of categories.
Последнее зависит от числа измерений в группе (N) и оценивается по
формуле l+3,31g(N) (см. Плохинский, 1970, с. 289, 293). В ряде случаев
возможно можно получить нормальный тип распределения путем соответствующего
преобразования величин, имеющих иные типы распределения.
-765-

2. Оценка различий между изучаемыми условиями эксперимента
2.1. Анализ статистических характеристик отдельной группы
Любой параметр, измеренный у некоторой группы объектов,
отличается от этого же параметра в генеральной совокупности, т. е. от
теоретической величины, которая могла бы быть получена при изучении всех
возможных объектов данного типа. Статистики, называемые средней
арифметической (или просто средней) и стандартной ошибкой средней
величины, составляют основу для оценки пределов, в которых находится
средняя величина данного признака в генеральной совокупности. При
этом общепринятым является указание на величину признака в
определенной группе в виде:
Средняя величина + Стандартная ошибка.
При использовании стандартного пакета программ следует выбрать
опцию Basic Statistics, а в ней — Descriptive statistics. В появившемся окне
следует указать анализируемые признаки (Variables) и, нажав виртуальную
кнопку More statistics, включить требуемые статистики, например число
измерений (Valid N), среднюю величину признака (Mean) и стандартную
ошибку средней (Standard error of mean). Для примера, приведенного в
приложении 1, можно выбрать первый латентный период (Variable 3—Т 1)
в контрольной группе, нажав виртуальную кнопку Select cases, а в
открывшемся окне для условия include if указать: v2 = 0 (включить в обработку
данные только тех мышей, у которых параметр 2 равен нулю). В результате
появится следующая таблица:
Valid N
Tl
Mean
10
Error
2.930 000
Standard
.249 911
Таким образом, в указанной группе параметр Т1 измерен у 10 мышей и
равен 2,93 ± 0,25 с.
2.2. Сравнение двух групп данных
Сравнение средних величин двух групп является простейшим способом
оценки влияния какого-либо фактора на изучаемый признак. При этом
возможны два типа сравнений: 1) сравнение одного и того же параметра
(столбца) в двух различных группах животных или объектов измерения; 2)
сравнение одного и того же параметра, измеренного многократно
(различных столбцов) в одной и той же группе объектов.
Классическим параметрическим критерием для обоих типов
указанных ситуаций является t-критерий Стьюдента. Предположим, что для
данных, приведенных в приложении 1, необходимо сравнить латентный
период первой реакции отдергивания хвоста между группами мышей,
получавших инъекцию физиологического раствора или морфина в дозе 1
мг/кг. При использовании стандартного пакета программ следует
выбрать опцию Basic Statistics, а в ней — t-test for independent samples. В
появившемся окне следует указать независимую переменную (grouping
variable), столбец с названием Code и анализируемый признак (dependent
variable), столбец с названием Т1, а также указать коды сравниваемых
-766-

групп, определяемых по столбцу Code (1 и 3). В результате появится
следующая таблица:
Т1
Mean 1
2.930 000
Mean 2
8.300 000
t-value
-3.76796
df
18
P
.001 408
Результат означает, что введение морфина в дозе 1 мг/кг вызывает
статистически значимое [t(18) = 3,77, р = 0,001] увеличение указанного
латентного периода в среднем с 2,9 до 8,3 с. Величина в скобках (df)
означает число степеней свободы, которое используется для отыскания
критических значений соответствующего теоретического распределения случайной
величины, и равно числу элементов свободного разнообразия в группе
минус число ограничений разнообразия. В данном случае число степеней
свободы равно 18, оно вычисляется как общее число измерений (20) минус
число сравниваемых групп (2).
Для непараметрической оценки этих же групп в стандартном пакете
программ выбирают опцию Nonparametrics/Distribution и затем Mann-
Whitney U test. В появившемся окне следует указать независимую
переменную (grouping variable) — Code, анализируемый признак (dependent
variable) — ТЛ, а затем коды сравниваемых групп — 1 и 3. В результате появится
следующая таблица:
Т1
Rank Sum
Group 1
55.0
Rank Sum
Group 2
155.0
U
0.00
z
-3.77964
p-level
.000 157
Z adjusted
-3.78 534
p-level
.000 154
Непараметрическая оценка также обнаруживает статистически
значимую (Z = 3,79, р < 0,001) разницу между указанными группами.
Если же, например, необходимо сравнить латентный период первой и
второй реакции отдергивания хвоста в контрольной группе мышей, то в
опции Basic Statistics следует выбрать t-test for dependent samples. В
появившемся окне следует указать сравниваемые переменные (Variables) Tl и Т2.
Контрольная группа выбирается нажатием виртуальной кнопки Select
cases: в открывшемся окне для условия include if указать: v2 = 0 (включить в
анализ данные строк, в которых параметр 2 равен нулю). В результате
появится следующая таблица:
Т1
Т2
Mean
2.9300
2.3100
Std. Dv.
.79 028
.52 588
N
10
Diff.
.6200
Diff.
.7254
t
2.7028
df
9
P
.024 284
Полученный результат означает, что у контрольных мышей повторное
нанесение теплового стимула вызывает статистически значимое [t(9) =
= 2,77, р = 0,024] укорочение указанного латентного периода в среднем с
2,9 до 2,3 с.
Для непараметрической оценки этих же признаков у контрольной
группы мышей в стандартном пакете программ выбирают опцию
Nonparametrics/Distribution и затем Wilcoxon matched pairs test. В появившемся окне
указывают сравниваемые переменные (Variables — ТЛ и Т2) и выбирают
контрольную группу нажатием виртуальной кнопки Select cases, указав для
условия include if — v2 = 0. В результате появится следующая таблица:
Т1&Т2
Valid N
10
Т
3.00
Z
2.310 161
p-level
.020 886
- 767-

Следовательно, непараметрическая оценка также обнаруживает
статистически значимую (Z = 2,31, р = 0,021) разницу между латентным
периодом первого и второго отдергивания хвоста у контрольных мышей.
Для оценки альтернативных (качественных) событий применяются
непараметрические критерии Хи-квадрат и точный критерий Фишера.
Например, если в контрольной группе из 8 животных не наблюдалось гибели,
а под влиянием какого-либо вещества в группе из 7 особей погибло 4, в
опции Nonparametrics/Distribution выбирают "2 х 2 Tables". Появившуюся
четырехпольную таблицу заполняют следующим образом:
— в верхнюю клетку левого столбца вводят число случаев с изучаемым
событием в контроле (0), а в его нижнюю клетку — число случаев без
изучаемого события в контроле (8);
— в верхнюю клетку правого столбца вводят число случаев с изучаемым
событием в опыте (4), а в его нижнюю клетку — число случаев без
изучаемого события в контроле (3). Результирующая таблица содержит
статистическую оценку различия по ряду критериев:
Row
Frequencies, row 1
Percent of total
Frequencies, row 2
Percent of total
Column totals
Percent of total
Chi-square (df = 1)
V-square(df = 1)
Yates corrected Chi-square
Phi-square
Fisher exact p, one-tailed
two-tailed
McNemar Chi-square (A/D)
Chi-square (B/C)
Column 1
0
0.000 %
8
53.333 %
8
53.333 %
6.23
5.82
3.65
.41 558
1.33
.75
Column 2
4
26.667 %
3
20.000%
7
46.667 %
p= .0125
p= .0159
p= .0559
p= .0256
p= .0256
p= .2482
p= .3865
Totals
4
26.667 %
11
73.333 %
15
Таким образом, в анализируемом примере различие между контролем и
опытом оказалось статистически значимым как критерию Хи-квадрат
[х2(1) = 6,23, р = 0.0125], так и по точному критерию Фишера (р = 0,0256).
Следует отметить, что точный критерий Фишера имеет большую мощность
и точность, если число измерений не превосходит 30, а при большем числе
измерений оба указанных метода дают сходный результат.
2.3. Сравнение нескольких групп данных
Анализ дисперсий (ANOVA) является общепризнанным инструментом
для оценки и выявления различий, имеющихся среди нескольких групп
данных, при разной сложности эксперимента. При этом могут
анализироваться эффекты нескольких независимых переменных (условий
эксперимента), каждая из которых имеет несколько уровней (состояний). Данный
метод также оценивает и статистическую значимость взаимодействия
эффектов независимых переменных. Разновидностью данного метода
является анализ дисперсий для экспериментов с повторными измерениями
(MANOVA).
-768-

Для анализа примера, приведенного в приложении 1, выбирают
опцию AN OVA/MAN OVA. В появившемся окне выбирают независимую и
зависимые переменные (Variables). В данном случае независимой
переменной является код варианта опыта (столбец Code), а зависимыми
переменными — латентный период 1-го, 2-го, 3-го и 4-го отдергивания
хвоста (Т1, Т2, ТЗ, Т4), т. е. результаты повторных измерений
гомологичного параметра. Нажав виртуальную кнопку Codes for between-groups
factors, указывают, какие именно варианты опыта (уровни независимой
переменной) включаются в анализ. В данном случае это все группы (коды
1—4). Нажав виртуальную кнопку Repeated measures (within SS) design,
указывают количество уровней повторно измеряемого признака (No. of
levels), которое в данном случае равно 4 в соответствии с избранными
признаками Т1—Т4, и условное имя для фактора повторных измерений
(Test). Финальное окно позволяет нажатием виртуальной кнопки All
effects получить статистики, оценивающие статистическую значимость
влияния организованных факторов:
Summary of all Effects;
1-CODE. 2-TEST
13
23
12
MS Effect
1107.052
42.399
7.895
df
36
108
108
MS Error
28.80 806
3.47 554
3.47 554
F
38.42 856
12.19 912
2.27 168
p-level
.000 000
.000 001
.022 628
Дополнительное нажатие виртуальных кнопок
Code
Groupl
Group2
Group3
Group4
All Groups
Tl
2.93 000
5.76 000
8.30 006
14.42 000
7.85 250
T2
2.31 000
4.64 000
6.58 000
14.77 000
7.07 500
T3
2.33 000
3.57 000
3.86 000
14.33 000
6.02 250
T4
1.87 000
2.85 000
4.09 000
13.48 000
5.57 250
\MidN
10
10
10
10
40
Полученный результат означает наличие статистически значимого
влияния как введения морфина [F(3,36) = 38,43, р < 0,001], которое вызывает
увеличение латентного времени, так и повторного нанесения теплового
стимула [F(3,108) = 12,2, р < 0,001], которое способствует уменьшению
изучаемого показателя. Наличие же статистически значимого
взаимодействия указанных независимых переменных [F(9,108) = 2,27, р = 0,023]
означает, что под влиянием одного из воздействий меняется направленность
влияния другого фактора эксперимента. Как видно из таблицы средних,
это происходит при введении морфина в дозе 2,5 мг/кг, на фоне которой
повторяющийся тепловой стимул уже не вызывает укорочения латентного
времени.
Попарное сравнение конкретных групп с помощью встроенного t-кри-
терия может быть выполнено нажатием виртуальной кнопки Planned
comparisons. Например, если нужно сравнить влияние морфина в дозе 1 мг/кг
с эффектом дозы 2,5 мг/кг на латентное время первого теста, то для
первых двух уровней переменной Code назначают состояние, равное 0 (т. е. не
включать их при сравнении), а для сравниваемых доз, имеющих коды 2 и
3, — состояния, равные +1 и —1 (противоположный знак идентифицирует
сравниваемые группы). Для переменной Т1 фактора Test назначают
состояние + 1 (т. е. использовать для сравнения), а для переменных Т2—Т4
25 - 762
-769-

состояние, равное 0 (т. е. не включать их в сравнение). В результате
появится следующая таблица:
Effect
Error
Sum of Squares
187.2720
431.0010
df
1
36
Mean Square
187.2720
11.9722
F
15.64 217
p-lewl
.000 344
Результат сравнения означает, что введение морфина в дозе 2,5 мг/кг по
сравнению с введением морфина в дозе 1 мг/кг статистически значимо
[F(l,36) = 15,64, р< 0,001] и вызывает увеличение латентного времени в
первом тесте.
3. Оценка взаимосвязи изучаемых признаков
В тех случаях, когда требуется оценить взаимосвязи между изучаемыми
признаками, могут применяться методы корреляционного, регрессионного
и факторного анализа.
3.1. Корреляция и регрессионный анализ
Коэффициент корреляции (г) между двумя признаками является
простейшим показателем их связи, которая интерпретируется как
синхронность колебаний величины этих признаков. Величина коэффициента
корреляции может колебаться в пределах от —1 до +1. Абсолютная величина
коэффициента корреляции интерпретируется как показатель силы связи.
Отрицательный знак коэффициента корреляции означает, что один из
признаков уменьшается при увеличении другого, тогда как положительный
знак указывает на однонаправленные синхронные изменения обоих
признаков. В случае нормального распределения признаков применяется
метод корреляции Пирсона, тогда как для иных типов распределений
используется непараметрическая корреляция Спирмена.
На примере данных, изложенных в приложении 1, можно, например,
рассчитать взаимосвязь между латентным временем отдергивания хвоста
при первом, втором и третьем нанесении теплового стимула. Для этого в
стандартном пакете программ выбирают опцию Basic statistics/Tables и
затем — Correlation matrices. В появившемся окне нажимают виртуальную
кнопку One variable list, после чего указывают анализируемые признаки
(Т1, Т2 и ТЗ). Результирующая таблица будет выглядеть следующим
образом:
N = 40
Т1
Т2
ТЗ
Т1
1.0000
р= —
.8927
р = .000
.8777
р = .000
Т2
.8927
р = .000
1.0000 р = -
.9126
р = .000
ТЗ
.8777
р = .000
.9126
р = .000
1.0000 р= -
Результат анализа указывает на наличие статистически значимой
положительной корреляции между первым и вторым тестом (г = 0,89, п = 40,
- 770 -

p < 0,001), первым и третьим тестом (г = 0,88, п = 40, р < 0,001), а также
вторым и третьим тестом (г = 0,91, п = 40, р < 0,001).
Непараметрический корреляционный анализ этих же признаков можно
осуществить, выбрав опцию Nonparametrics/ Distribution и затем —
Correlations. В появившемся окне тип корреляции устанавливают в положение
Spearman R, а изучаемые признаки (Tl, T2 и ТЗ) выбирают нажатием
виртуальной кнопки Variables. Результирующая таблица будет выглядеть
следующим образом:
Т1&Т2
Т1&ТЗ
Т2&ТЗ
Valid N
40
40
40
Spearman R
.880 837
.807 407
.817 678
t(N-2)
11.46 942
8.435!)!)
8.75S81
p-level
.000 000
.000 000
.000 000
Результат непараметрического анализа также выявил статистически
значимую положительную корреляцию между первым и вторым тестом (R =
= 0,88, п = 40, р < 0,001), первым и третьим тестом (R = 0,81, п = 40, р <
< 0,001), а также вторым и третьим тестом (R = 0,82, п = 40, р < 0,001).
Регрессионный анализ позволяет оценить не только величину
коэффициента корреляции (т. е. силы связи) между признаками, но и
устанавливает формулу количественной зависимости их друг от друга, которая дает
возможность найти значения одного из них при определенных значениях
другого (включая, к примеру, ЕД50).
Для данных, изложенных в приложении 1, можно рассчитать
взаимосвязь между латентным временем отдергивания хвоста при первом
нанесении теплового стимула и применявшейся дозой морфина. Для этого в
стандартном пакете программ выбирают опцию Linear Regression. В
появившемся окне нажимают виртуальную кнопку Variables, указывая
анализируемые признаки (Dose и ТГ). Результирующая таблица будет выглядеть
следующим образом:
Regression Summary for Dependent Variable: Tl
R = .78 839 578 RI = .62 156 791
F(l,38) = 62.414 p < .00 000 Std.Error of estimate: 3.3848
Intercpt
DOSE
BETA
.788 396
St. Err. of BETA
.099 793
В
3.332 500
4.520 000
St. Err. of В
.783 424
.572 132
t(38)
4.253 762
7.900 273
p-level
.000 132
.000 000
Полученный результат означает, что данные признаки имеют
статистически значимую взаимосвязь (г = 0,79, п = 40, р < 0,001) и эта зависимость
описывается статистически значимым [F(l,38) = 62,41, р < 0,001]
уравнением:
Т1 = 3,3325 + 4,52 х Dose
или обратным уравнением:
Dose = -0,0798 +0,13 752 х Т1.
Исходя из этих уравнений, можно найти величину ЕД50 или иные
эффективные дозы. Так, например, теоретическая величина дозы,
вызывающей увеличение первого латентного времени в два раза (т. е. с 2,93 до
5,86), может быть найдена из второго уравнения нажатием виртуальной
кнопки Predict dependent variable: в появившемся поле с надписью Т1
следует указать его величину (5,86). В результате появится теоретическая доза,
рассчитанная для данного эффекта, которая будет равна 0,726 мг/кг.
25*
- 771 -

В том случае, если есть сомнения в линейной форме взаимосвязи между
изучаемыми показателями, следует проделать аналогичный расчет, выбрав
опцию Nonlinear Estimation. В частности, для вычисления эффективных
доз при анализе альтернативных (качественных) событий следует затем
выбрать окно Probit regression.
3.2. Факторный анализ
Факторный анализ является мощным инструментом, когда имеется
множество взаимосвязанных признаков и требуется определить наличие
среди них объединений сильно связанных показателей, которые в то же
время относительно слабее связаны с другими признаками данного
множества. Такие объединения могут быть интерпретированы как проявление
влияния неких более общих факторов. Например, взаимосвязь таких
признаков, как масса тела, масса жировых отложений и пониженная
подвижность индивидуума, могут быть интерпретированы как фактор "полноты
тела".
Необходимо помнить, что современный математический аппарат
факторного анализа основан на предположении о нормальном распределении
признаков и их независимости. Последнее, в частности, не позволяет
одновременно анализировать собственно измеренные признаки и
показатели, полученные путем преобразования первичных признаков.
Различают два общепринятых типа факторного анализа: метод главных
компонент (компонентный анализ) и метод главных факторов. В обоих
случаях выполняется определение количества основных факторов,
влияющих на разнообразие изучаемых признаков, идентифицируются признаки,
связанные с этими факторами, и факторные нагрузки на эти признаки,
которые интерпретируются аналогично коэффициенту корреляции между
выделенным фактором и данным признаком.
В отношении результатов, изложенных в приложении 1, может,
например, возникнуть вопрос о том, не образуют ли результаты многократного
применения теплового стимула независимые подгруппы, например
подгруппу первичной реакции (Т1 или Т1 вместе с Т2) и подгруппу
отставленной реакции (ТЗ и Т4 или Т2—Т4). Выбрав в стандартном пакете программ
опцию Factor Analysis, указывают анализируемые переменные (Variables) —
Tl—T4 и затем — метод главных компонент (Principal components). Если
прораммой было выявлено более одного фактора, то желательно
выполнить вращение взаимного расположения осей факторов (Factor rotation) с
помощью, к примеру, алгоритма Varimax. Нажатие виртуальной кнопки
Factor loadings позволяет получить результирующую таблицу факторных
нагрузок, которая будет выглядеть следующим образом:
Factor Loadings
Tl Т2 ТЗ Т4
Expl.Var Prp.Tofl
Factor 1
.943 538
.971 635
.956 867
.937 521
3.628 881
.907 220
В настоящем примере программа выявила только один общий фактор,
который описывает (объясняет) 90,72 % общего разнообразия анализируе-
- 772-

мых признаков. Таким образом, все изучаемые признаки имеют высокую
степень взаимосвязи друг с другом, что не подтверждает первоначально
выдвинутую гипотезу.
Литература
1. Беленький М. Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта.
— Рига: Издательство Академии наук Латвийской ССР, 1959.
2. Плохинский Н. А. Биометрия. — М.: Изд-во МГУ, 1970.
3. Рунион Р. Справочник по непараметрической статистике. — М.: Финансы и
статистика, 1982.
4. Статистические методы для ЭВМ / Под ред. К. Эйнслэйна, Э. Рэлстона, Г. С.
У ил фа. — М.: Наука, 1986.
5. STATISTfCA for Windows. Release 4.0. Statsqft, Inc., 1993.
Приложение 1
Латентный период отдергивания хвоста у мышей в ответ на его нагрев
интенсивным световым пучком в аппарате Tail-Flick в четырех
последовательных измерениях, выполненных с интервалом 15 с подряд (Tl, T2, ТЗ и
Т4). За 30 мин до опыта производили внутрибрюшинное введение
физиологического раствора или морфина сульфата в дозе 0,5, 1,0 или 2,5 г/кг.
Код
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
Доза
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
.5
.5
.5
.5
.5
.5
.5
.5
.5
.5
.0
.0
.0
.0
.0
.0
Т1
4.7
2.2
2.2
2.3
3.5
2.5
2.9
2.5
3.5
3.0
4.7
7.5
4.9
5.6
6.3
5.9
4.5
6.9
5.6
5.7
4.8
4.8
5.5
5.4
18.9
10.5
Т2
3.5
2.6
2.2
1.9
1.6
2.1
2.6
2.3
1.9
2.4
3.7
4.5
6.2
3.2
5.0
5.5
3.2
4.5
4.6
6.0
3.1
2.3
2.1
4.0
12.8
15.3
ТЗ
4.2
2.1
2.9
2.2
1.2
2.3
1.8
1.9
2.5
2.2
1.8
4.7
2.1
5.3
3.0
3.3
3.2
3.3
4.0
5.0
2.0
2.3
2.0
1.3
10.8
4.7
Т4
1.6
2.7
2.2
1.8
1.3
1.5
2.4
1.5
1.8
1.9
2.3
1.5
4.6
3.!!
1.9
3.8
2.9
3.9
1.8
2.0
1.6
2.0
1.7
3.9
5.7
10.3
-773-

Продолжение
Код
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Доза
.0
.0
1.0
.0
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
Т1
5.2
8.3
8.2
11.4
21.5
5.3
20.0
18.0
16.5
14.0
11.3
8.1
16.8
12.7
Т2
6.4
5.0
6.6
8.2
20.2
5.2
16.7
14.9
11.9
16.0
17.5
13.4
15.0
16.9
ТЗ
3.8
2.5
5.3
3.9
20.3
3.8
20.0
10.6
15.4
17.9
15.7
11.1
13.8
14.7
Т4
4.2
4.0
2.8
4.7
20.0
1.6
11.8
20.0
17.3
12.0
14.4
15.6
12.1
10.0
Методические указания по статистической обработке
результатов доклинических исследований (Часть 2)
СОСТАВИТЕЛИ: член-корр. РАМН проф.
В. И. Сергиенко; к. т. н. И. Б. Бондарева;
д. м. н., проф. Е. И. Маевский
При проведении доклинических испытаний лекарственного препарата
анализируются различные аспекты его фармакологической активности в
сравнении с аналогичными проявлениями активности уже применяемых
лекарственных средств. При этом должны быть решены задачи
количественной оценки безопасности фармакологической эффективности, т. е.
статистического описания показателей эффекта и сравнения
соответствующих показателей исследуемого препарата и препарата контроля.
Понимание основ математической статистики позволяет более грамотно подходить
к вопросам планирования и статистической обработки результатов
доклинических испытаний. Основные особенности статистической обработки
данных доклинических испытаний связаны с небольшими объемами
анализируемых выборок и использованием при оценке реакций, вызываемых
лекарственным препаратом, специфической формы представления данных.
Последнее означает, что показатели могут быть выражены не только в
количественной форме (результаты выражаются в каких-либо единицах
измерения), но и в качественной или альтернативной форме, при которой в
результате эксперимента возможно лишь два ответа: наличие или
отсутствие эффекта (результаты выражаются в частотах, процентах или пробитах).
Эти особенности диктуют выбор тестов и процедур математической
статистики, наиболее приспособленных для решения возникающих задач.
Статистический анализ данных, получаемых в ходе доклинических
испытаний, необходим, поскольку известно, что одна и та же доза изучаемо-
- 774 -

го вещества вызывает у различных особей фармакологический эффект
неодинаковой интенсивности и направленности, и эта индивидуальная
чувствительность может варьировать в достаточно широких пределах. В силу
этого параметры, количественно оценивающие изучаемый
фармакологический эффект, являются случайными величинами и должны быть описаны
соответствующими статистическими характеристиками. На языке
математики отдельные числовые значения варьирующего параметра принято
называть вариантами. Хотим предупредить, что, с точки зрения математики
и статистики, не существует принципиального различия между
эффектами, которые медики относят к прямому или побочному дествую. В
дальнейшем, говоря об эффекте, мы будем подразумевать изучаемое в данном
исследовании проявление фармакологической активности.
Описанию статистических методов посвящено большое количество
различных учебников; ту или иную формулу для расчета известных
статистических характеристик можно найти в справочниках [3, 4, 6—17, 19—22].
Нашей целью является не простое перечисление методов и схем расчетов
из области математической статистики, которые принято использовать в
медико-биологических приложениях, а анализ применимости этих
подходов к статистической обработке результатов доклинических испытаний. К
сожалению, объем данной работы не позволяет нам одинаково подробно
осветить все темы и разобрать все статистические задачи, возникающие
при анализе данных доклинических испытаний, поэтому мы приведем
ссылки на работы, в которых нужные методы, процедуры и примеры их
использования разобраны более детально. Кроме того, основные подходы
и статистические методы, обычно применяемые в медико-биологических
исследованиях, подробно рассмотрены в книге [18].
I. Нормальное распределение
Огромный материал, накопленный экспериментальной биологией,
свидетельствует о том, что распределение животных одного и того же вида по их
чувствительности к воздействию большинства лекарственных препаратов
достаточно хорошо описывается нормальным распределением. Это означает,
что если на бесконечно большом количестве животных будет измеряться
эффект, вызываемой определенной дозой препарата, то графическое
изображение результатов такого эксперимента (ось абсцисс — величина эффекта, ось
ординат — количество животных, у которых наблюдался эффект данной
величины) будет описываться симметричной кривой вида (рис. 1). Кривая
такого же типа будет получена, если по оси абсцисс откладывать дозы
изучаемого вещества, а по оси ординат — частоты появления учитываемого
эффекта, полученные в ходе эксперимента на большом количестве животных при
учете фармакологического эффекта в альтернативной форме.
Изображенная на рис. 1 кривая носит название кривой нормального
распределения, или кривой Гаусса—Лапласа. Кривая такого типа однозначно
характеризуется двумя величинами: М — математическим ожиданием (или
арифметическим средним значением) и а — средним квадратическим (или
стандартным) отклонением. Значения этих величин определяют положение
кривой в системе координат и ее форму. Так, максимум достигается в точке,
соответствующей среднему значению М; среднее квадратическое отклонение
определяет форму кривой: при большой вариабельности данных, т. е.
большом значении а, кривая будет более пологой, при малой — крутой. Таким
образом, в случае нормального распределения изучаемый количественный
- 775 -

показатель фармакологической активности может быть охарактеризован
средним значением (среднее значение величины эффекта, вызываемого
определенной дозой препарата, или при учете эффекта в альтернативной
форме — средняя величина дозы, вызывающая учитываемый эффект) и средним
квадратическим отклонением (или дисперсией).
Сказанное выше справедливо в предположении об использовании в
эксперименте достаточно большого количества животных или, говоря
математическим языком, при сплошном изучении генеральной
совокупности. Однако в реальных испытаниях эксперимент ставится на
ограниченном количестве животных, которые представляют выборку из генеральной
совокупности. Количество объектов в выборке называется объемом
выборки и обозначается п. При анализе данных доклинических испытаний
обычно приходится иметь дело с малыми выборками (п < 30). Известно,
что правильно отобранная часть генеральной совокупности довольно
хорошо отображает структуру этой совокупности, но полного совпадения
выборочных показателей с характеристиками генеральной совокупности, как
правило, не бывает. Выборочные характеристики являются
приближенными оценками генеральных параметров. Это — случайные величины, и их
оценки могут быть точечными и интервальными.
Выборочная средняя х и среднее квадратическое отклонение Sx,
являющиеся точечными оценками соответствующих параметров М и а
генеральной совокупности, вычисляются по следующим формулам:
X = 1/n I xi
где xi—i — значение оцениваемого признака, п — обьем выборки, Z —
знак суммирования по всем элементам выборки (i = 1, ... ,п).
Dx = Sx2 — выборочная дисперсия признака. (3)
Величину отклонения выборочного показателя (статистики) от его
генерального параметра называют статистической ошибкой. Для измерения
этой ошибки некоторой статистики служат дисперсия или квадратическая
ошибка статистики (нельзя путать соответственно с выборочными
дисперсией и средним квадратическим отклонением). Квадратическая ошибка
средней арифметической ах может быть найдена по формуле:
ох = ^ (4)
На практике достаточно часто приходится сравнивать изменчивость
признаков, выраженных разными единицами. В этих случаях используют
относительные показатели вариации, например коэффициент вариации
Var. Этот показатель представляет собой среднее квадратическое
отклонение, выраженное в процентах от величины средней арифметической:
Var= 100 % - ^
X
Этот показатель также является выборочным, и его ошибка может быть
оценена по формуле:
ovar = Var*jM±^™Z (5)
- 776-
(1)
(2)

Обычно варьирование признака считается средним, если величина
коэффициента вариации находится в пределах от 10 до 25 %.
По известным выборочным характеристикам можно построить
интервальную оценку или доверительный интервал, в котором с той или иной
вероятностью находится генеральный параметр. Вероятности, признанные
достаточными для уверенного суждения о генеральных параметрах на
основании известных выборочных показателей, называют доверительными.
Обычно в фармакологических исследованиях приемлемым является
значение доверительной вероятности Р = 0,95. Величина, дополняющая
значение доверительной вероятности до единицы, обозначается а, а = 1 — Р.
Как известно из центральной предельной теоремы, независимо от
распределения исходной совокупности, из которой извлечены выборки,
выборочные средние имеют приближенно нормальное распределение. Таким
образом, доверительный интервал для выборочного среднего значения
находится между границами X — t*ax и X + t*ax, где t — коэффициент Стью-
дента, величина, зависящая от объема выборки и от выбранного уровня
значимости, определяется по таблицам распределения Стьюдента (табл. 1).
В данном случае число степеней свободы при пользовании таблицей
вычисляется как f = п - 1. Иллюстрацию см. на рисунке 2.
Надо обратить внимание, что в некоторых учебниках по биометрии
предлагается при построении доверительного интервала для генеральной
средней в качестве значений t брать критические значения стандартного
нормального распределения Za (табл. 7) или, другими словами,
предельные значения распределения Стьюдента (табл. 1 для числа степеней
свободы, равного бесконечности). Тогда наиболее часто используемым
доверительным вероятностям соответствуют следующие табличные значения
коэффициента: Р1 = 0,95 соответствует Z = 1,96; Р2 = 0,99 — Z = 2,58;
РЗ = 0,999 — Z = 3,29. Однако такой метод применим только в том случае,
если дисперсия изучаемой совокупности известна заранее. В случае
неизвестной и оцененной по выборке дисперсии для построения
доверительного интервала при оценке значения коэффициента Стьюдента по таблицам
необходимо учитывать число степеней свободы.
При достаточно большом объеме выборки (п > 30) получается, что
истинное значение средней при уровне вероятности Р = 0,95 находится в
пределах X ± 2*ах. При этом вероятность выхода истинного значения
средней за пределы этих границ равна уровню значимости 0,05.
Пример 1.
Изучали влияние предварительного введения потенциального аитиги-
поксанта на содержание креатинфосфота (ммоль/г) в ткани сердца и
концентрацию молочной кислоты в крови (ммоль/д) у животных,
подвергшихся действию острой гипоксической гипоксии (подъем в барокамере на
высоту 8000 м). Результаты приведены в табл. 11. Группа 1 — интактные
животные, группа 2 — животные, перенесшие 30-минутную гипоксию, группа
3 — животные, перенесшие 30-минутную гипоксию на фоне введения ан-
тигипоксанта.
В качестве примера для расчета рассмотрим данные 1-го столбца табл.
11. Выборочное математическое ожидание вычисляется по формуле
Y _ 12+13+14+15+14+13+13+10+11 + 16 _ ,, ,
X - _ - 13,1
Выборочная дисперсия данного показателя равна Dx = 3,2; среднее
квадратическое отклонение
- 777 -

Sx= VDx = ТЗД = 1,79.
Var= |^| * 100 % = 13,7 %;
ошибка коэффициента вариации
oVar = 3,12.
Ошибка выборочной средней ах = U-?- = 0,57
Лб
Коэффициент Стьюдента t в данном случае для числа степеней свободы
f = 10 — 1 = 9 и уровня значимости 5 % равен 2,26 (табл. 1), 95 %
доверительный интервал для средней арифметической заключен между
границами 13,1 + 2,26*0,57. Таким образом, левая граница интервала равна 11,81,
а правая 14,39.
Обычно при анализе результатов доклинических испытаний средние
значения вычисляются для сопоставления их с показателями группы
контроля; на основе такого сопоставления и делаются определенные выводы,
ради которых проводятся испытания. Если исследователь просто
сопоставляет средние значения, рассчитанные по малым выборкам, без учета их
случайной природы, возникает реальная опасность ошибочных
заключений. Необходимо иметь в виду, что разность средних арифметических двух
выборок, каждая их которых имеет свою ошибку, также является
случайной величиной со своей стандартной ошибкой. Сопоставление
выборочных средних арифметических, рассчитанных на основе ограниченного
количества наблюдений, позволяет оценить лишь доверительные границы, в
пределах которых при данном уровне значимости находится разность
истинных средних значений. Такие сопоставления методами математической
статистики требуют проверки гипотезы о равенстве средних значений
выборок.
П. Статистические гипотезы и их проверки
О преимуществе той или иной из сравниваемых групп судят обычно по
разности между средними, средними долями или другими выборочными
показателями — величинами случайными и являющимися
статистическими оценками соответствующих генеральных показателей. Вопрос о
достоверности различий решается обычно на основе проверки по выборочным
характеристикам той или иной статистической гипотезы.
В области клинических испытаний широкое применение получила так
называемая нулевая гипотеза Но. Смысл ее сводится к предположению,
что разница между генеральными параметрами сравниваемых групп равна
нулю и что различия, наблюдаемые между выборочными
характеристиками, носят исключительно случайный характер. Так, например, если одна
выборка извлечена из нормально распределенной генеральной
совокупности с параметрами Ml и al, а другая — из совокупности с параметрами М2
и а2, то нулевая гипотеза состоит в том, что Ml = М2, т. е. Ml - М2 = 0.
Противоположная нулевой — альтернативная гипотеза, состоит в том, что
средние считаются либо просто неравными Ml — М2 ^ 0 (двусторонний
тест), либо исследователь ориентирован в направлении эффекта одного
метода над другим, а возможность преимущества другого исключается,
например Ml > М2 (односторонний тест). При таком подходе не ставится за-
- 778 -

дача количественной оценки имеющихся различий, достаточно лишь
проверить, принадлежат ли обе группы с определенной вероятностью к
различным генеральным совокупностям. Надо заметить, что при решении
других статистических задач нулевая гипотеза будет иметь другую
формулировку.
Проверяется статистическая гипотеза с помощью величин или, другими
словами, статистик, функции распределения которых известны и
табулированы (например, t-распределение Стьюдента, распределение %2 и др.).
Эти величины в каждом конкретном случае позволяют выявить,
удовлетворяют ли выборочные показатели принятой гипотезе. Процедура
проверки гипотезы связана с объемом выборки (или соответствующим числом
степеней свободы f) и уровнем значимости а. Уровень значимости или
вероятность ошибки I рода, допускаемой при оценке принятой гипотезы,
может различаться (5, 1, 0,1 %), но в клинических приложениях, если
специально не оговорено другое значение, он обычно принимается равным
5 %.
Важным является также вопрос о справедливости нулевой гипотезы.
Для оценки справедливости Но рассчитывается показатель, который
обычно обозначается буквой р. Он оценивает вероятность того, что значение
критерия окажется не меньше критического значения при условии
справедливости нулевой гипотезы, т. е. при отсутствии различий между
сравниваемыми группами. Поэтому если в результате проверки нулевой гипотезы
она было отвергнута на уровне значимости а, то для отражения наличия
статистически значимых различий результат сравнения может быть
записан в виде р < а. Это означает, что ошибка сравнения возможна не более
чем в а* 100 % случаев, а значит, маловероятна.
Для проверки гипотез в биометрии возможны два вида критериев:
параметрические (построенные на основании параметров данной
совокупности) и непараметрические (построенные непосредственно по вариантам
данной совокупности и их частотам). Первые служат для проверки гипотез
о параметрах совокупности, распределенных по известному закону
(обычно в биометрии по нормальному закону), вторые — для проверки гипотез
независимо от формы распределения совокупностей. Так, при нормальном
распределении признака параметрические критерии обладают большей
мощностью, чем непараметрические, поэтому, если известно, что
сравниваемые выборки извлечены из нормально распределенных совокупностей,
предпочтение следует отдавать параметрическим критериям. В случае
очень больших отличий распределения признака от нормального закона
или при малых объемах выборки следует применять непараметрические
критерии. Если варьирующие признаки выражаются не числами, а
условными знаками, применение непараметрических критериев оказывается
единственно возможным. Проверить, извлечена ли рассматриваемая
выборка из нормально распределенной совокупности, в свою очередь можно
с помощью специальных статистических тестов. Коротко познакомим с
некоторыми из них.
III. Проверка гипотезы о законах распределения
Гипотезу о законе распределения проверяют разными способами,
например с помощью коэффициентов асимметрии и эксцесса. С формулами
для расчета этих показателей можно познакомиться, например, в [7, 9, 12,
15, 16]. При нормальном распределении эти показатели должны быть рав-
-779-

ны нулю. Однако на практике такое равенство почти не встречается, так
как эти показатели также являются случайными величинами, имеющими
ошибки. Поэтому для проверки нормальности распределения
рекомендуется использовать соответствующие таблицы, в которых указаны
критические точки для этих коэффициентов при различных уровнях значимости и
объемах выборки п. Если рассчитанные значения для асимметрии и
эксцесса превосходят эти критические точки, гипотеза о нормальности
распределения отвергается.
Кроме того, для оценки меры совпадения теоретической кривой
распределения с фактическими данными на практике чаще всего
используется критерий % Хи-квадрат. Полученные в ходе эксперимента результаты
представляются в виде вариационного ряда или ряда распределения.
Вариационный ряд представляет собой двойной ряд чисел, показывающий
для каждого значения признака (варианты), сколько раз оно(она)
встречается в данной совокупности (частота варианты). Это определение в
большей мере относится к так называемому безынтервальному вариационному
ряду. Однако если общую вариацию признака (в пределах от минимальной
до максимальной варианты) разбить на промежутки и подсчитать частоту
попадания вариант данной совокупности в эти интервалы, получится
интервальный вариационный ряд. Графически вариационные ряды могут
быть представлены в виде полигонов распределения для безынтервальных
рядов и гистограмм распределения частот для интервальных рядов.
Данный критерий согласия эффективен при условии наличия не менее
пяти частот в каждом интервале вариационного ряда. Если же в
каком-нибудь интервале вариационного ряда содержится менее пяти частот, то этот
класс объединяется с соседним классом. Общая формула этого критерия
выглядит как:
где f — фактические частоты, оцененные по изучаемой выборке, ft —
частоты, рассчитанные по теоретическому распределению.
Для оценки полученной величины Хи-квадрат необходимо знать число
степеней свободы, которое зависит от того, какой тип теоретического
распределения участвует в расчетах. Так при нормальном распределении
число степеней свободы f = k - 3, где к — число интервалов ряда.
Вычисленное значение х2 не должно превышать табличное (таблица 2) при данных
значениях f и а, при этом мы имеем право сделать вывод о
несущественном различии теоретического и эмпирического распределений. При
полном совпадении эмпирических частот с вычисленными значение
Хи-квадрат было бы равно 0.
Пример 2
Проиллюстрируем применение критерия согласия Хи-квадрат для
проверки нормального закона распределения, используем данные столбцов
4—6 табл. 11 (исходное содержание молочной кислоты). Данные этих трех
столбцов могут быть объединены в одну обобщенную выборку, поскольку
исходно все животные были однородны. Таким образом, мы получаем
выборку объемом п = 30 и хотим проверить, является ли она выборкой из
генеральной совокупности, распределенной по нормальному закону.
Среднее значение нашей выборки равно 1,49, а среднее квадратическое
отклонение 0,46. Ранжируя обобщенную выборку в порядке возрастания, видим,
что значения изучаемого показателя варьируют от 0,7 до 2,5. Построим ин-
-780-

тервальный вариационный ряд: диапазон значений данного показателя
[0,5; 2,5] разобьем на интервалы длиной 0,5 (получили 4 интервала) и
определим частоту попадания вариант нашей выборки в соответствующие
интервалы (см. табл. 12 1—2-й столбцы). Поскольку табулировано (табл.
10) распределение нормальной случайной величины с нулевым
математическим ожиданием и единичной дисперсией (стандартная нормальная
переменная), проводим стандартизацию нашей переменной Xi (вычитаем
среднее значение из величин Xi, делим результат на среднее квадратиче-
ское отклонение), полученное значение заносим в 3-й столбец табл. 12. По
табл. 10 для значений стандартизованной переменной определяем
соответствующие ординаты кривой нормального распределения (столбец 4).
Теоретические частоты нормального распределения (столбец 5) получаем,
умножая ординаты нормальной кривой из столбца 4 на произведение объема
выборки (30) и ширины интервала (0,5), а затем деля результат на среднее
квадратическое отклонение (0,46). Надо заметить, что это достаточно
удобный, но не единственный способ расчета теоретических частот
нормального распределения.
На рис. 3 показаны распределения теоретических и фактических частот
распределения. Каждое слагаемое для критерия согласия х2 представляет
собой разницу между соответствующими фактическими и теоретическими
частотами, возведенную в квадрат и деленную на значение теоретической
частоты, в нашем примере критерий х2 = 1,95. В данном случае
выборочное и теоретическое распределения различаются несущественно, так как
рассчитанная величина статистики х2 не превышает табличное значение
3,84 (табл. 2), взятое для числа степеней свободы f = 4 — 3 = 1 и уровня
значимости а = 5 %. Таким образом, можно сделать вывод, что с
вероятностью более 95 % наша выборка извлечена из совокупности,
распределенной по нормальному закону.
Более подробно с критериями для проверки гипотез о законе
распределения можно ознакомиться, например, в [7, 9, 12, 15,16].
IV. Первичная обработка результатов
Построение рядов распределения — один из возможных способов
описания полученных данных. А средняя арифметическая и дисперсия — одни
из основных характеристик варьирующих объектов. Однако надо иметь в
виду, что они не являются универсальными; для статистического описания
данных в качестве обобщающих характеристик совокупности полезными
(особенно если совокупность не распределена по нормальному закону)
могут оказаться и так называемые структурные показатели. На практике
часто используют такие структурные показатели, как медиана, мода, квантили
(квартили, децили, перцентили), минимальное значение, максимальное
значение, размах вариации и др. Подробнее об этом можно прочитать в [1,
9, 13, 15, 16].
Так, медиана определяется как средняя, относительно которой ряд
распределения делится на две равные части: в обе стороны от медианы
располагается одинаковое число вариант. Для ранжированного ряда с нечетным
числом членов центральная варианта и будет его медианой. При четном
числе членов ряда медиана определяется по полусумме двух соседних
вариант, расположенных в центре ранжированного ряда.
Еще одна структурная характеристика — мода. Так называется
величина, наиболее часто встречающаяся в данной совокупности. В случае нор-
- 781 -

мального распределения значения средней арифметической, медианы и
моды совпадают.
Квантили — конкретная варианта совокупности, отсекающая в пределах
вариационого ряда определенную часть (указывается в процентах) его
членов. На практике используются обычно перцентили РЗ, Р10, Р25, Р50, Р75,
Р90 и Р97, причем Р25 и Р75 соответствуют первому и третьему квартилям,
между которыми содержится 50 % элементов выборки, а Р50 равен
медиане. Формулы для расчета моды и квантилей для интервальных
вариационных радов содержатся, например, в [9,15,16].
Размах вариации равен разности между максимальным и минимальным
вариантами совокупности.
При первичной обработке данных часто возникает ситуация —
отдельные варианты полученной в эксперименте выборки по своим значениям
сильно отличаются от остальных ее членов. Возможно, это произошло из-
за погрешностей в постановке эксперимента, тогда эта сомнительная
варианта должна быть исключена. Однако делать это только по желанию
экспериментатора недопустимо, поскольку возможно, что эта варианта на
самом деле принадлежит изучаемой совокупности. Вопрос о таком
исключении может быть решен только на основе проверки специальных
статистических критериев [1, 7, 9, 12, 15]. Одним из таких критериев является
проверка разностей между сомнительными и соседними членами
ранжированного ряда [9].
Для этого вычисляются статистики
t, = Х2 ~_Х| или t2 = х"~_х"-'
Х„-1 Х( Х„ Хг
Первая для проверки наименьших xl, вторая — для наибольших хп
сомнительных вариант ранжированного ряда. Гипотезу о принадлежности
сомнительной варианты изучаемой совокупности отвергают, если
соответствующее рассчитанное значение статистики превзойдет табличное
значение (табл. За и 36) для выбранного уровня значимости и объема выборки п.
Пример 3.
Для оценки перцентилей рассмотрим выборку из примера 1, ранжируем
ее в порядке возрастания, получаем ряд: 10 11 12 13 13 13 14 14 15 16.
Медианой выборки (Р50) будет среднее значение 5-й и 6-й варианты, т. е.
она равна 13, мода также равна 13 (это значение встречалось чаще других),
Р25 оценим как 12, соответственно Р75 можно оценить как 14. В данном
случае мы можем только оценить значения квартилей, поскольку точно
обеспечить разбиение порядковых статистик на 4 подмножества равного
размера с помощью квартилей (Р25, Р50, Р75) можно лишь в том случае, когда
объем выборки имеет вид п = 4к + 3 (к — любое целое число). В этом
случае квартилям соответствуют следующие варианты ранжированного ряда:
Р25 = Xk+1; P50 = X2)t+2J P75 = Хз^+з-
Максимальная варианта нашей выборки равна 16, а минимальная 10,
размах равен 6. Статистические результаты опыта можно записать в форме
х + Sx (x max — х min). Так, в нашем примере эта запись будет выглядеть
как 13,1 ± 1,79 (10 — 16). Иногда применяется запись вида х ± Sx (x — t* и
х — X + t* а х), то есть в скобках указывают границы 95 % доверительного
интервала для средней арифметической. В нашем случае получаем запись
13,1 ± 1,79 (11,81 - 14,39).
Допустим, что в данном примере в результате неконтролируемых
нарушений условий фиксации ткани в жидком азоте вместо какого-то из
значений (например, последнего) было получено значение 6. Эта варианта яв-
-782-

ляется сомнительной, ее значение существенно меньше остальных,
проверим возможность ее исключения. Ранжированный вариационный ряд в
данном случае будет выглядеть как 6 10 11 12 13 13 13 14 14 15.
Рассчитаем для сомнительной варианты статистику tl:
Критическое значение для статистики tl (уровень значимости равен 5 %
и п = 10) равно 0,41 (табл. За), а значит, рассчитанное значение критерия
превосходит табличное. Нулевая гипотеза может быть отвергнута на
выбранном уровне значимости, и сомнительная варианта отбрасывается.
V. Параметрические критерии для проверки гипотезы о различии
(или сходстве) между средними значениями
Наиболее распространенным параметрическим методом оценки
различий между сравниваемыми средними является критерий Стьюдента, или t-
критерий. Так как согласно нулевой гипотезе Ml — М2 = 0, то t-критерий
выражается в виде отношения разности выборочных средних к ошибке
такой разности, т. е.
|t| = Х1~Х2 или t = X1~X2 (7)
ad Vaxl2 + ax22
где ad — ошибка разности средних значений, axl, ax2 — ошибки
сравниваемых средних арифметических.
Гипотезу о равенстве математических ожиданий отвергают, если
фактически полученная величина t-критерия превзойдет или окажется равной
табличному значению (распределение Стьюдента, табл. 1) для принятого
уровня значимости и числа степеней свободы f. При этом делается
заключение о наличие статистически значимых различий между средними
значениями при соответствующем уровне значимости.
Формулы для расчета тестовой статистики t и числа степеней свободы f
несколько различаются в зависимости от равенства или неравенства
дисперсий сравниваемых совокупностей. Этот вопрос требует внимательного
рассмотрения, особенно для выборок малого объема (п < 20).
В случае равенства дисперсий или выборок достаточно большого
объема ошибка разности средних ad определяется по следующим формулам:
Для неравночисленных выборок при nl * п2,
Z(xi-Xl)+I>i-X2)fnl + n21
4 nl + n2-2 ^ nln2 J K '
Для равночисленных выборок при nl = п2 формула несколько
упрощается:
= L(xi-Xl)+I(xi-X2)
*J (n-l)n v '
Число степеней свободы для случая равных дисперсий равно f = nl +
+ n2 - 2.
Если хотя бы одна из сравниваемых выборок мала, то сначала следует
проверить гипотезу о равенстве дисперсий выборок. В зависимости от от-
-783-

вета на этот вопрос последующее сравнение средних арифметических
производят двумя различными способами.
Для проверки гипотезы о равенстве генеральных дисперсий пользуются
критерием Фишера. При этом вычисляют показатель Фишера, равный
отношению большей дисперсии к меньшей:
F = §*L sxl2 > Sx22 (10)
Sx22
Показатель Фишера всегда F > 1, а при равенстве дисперсий F = 1. Чем
значительнее неравенство, тем больше будет значение показателя, и
наоборот. Функция F табулирована [7, 9, 12, 15, 16] и зависит от чисел
степеней свободы fl =nl — I,f2 = n2— 1. Если вычисленное значение F
превысит соответствующее табличное значение и гипотеза о равенстве
дисперсий будет отвергнута, то это означает, что выборки взяты из
совокупностей с разными дисперсиями.
Итак, в случае несущественно различающихся или равных дисперсий
средние арифметические сравниваются по формулам (7—9), приведенным
выше.
А при различных по величине дисперсиях выборок разница средних
арифметических оценивается по формуле t с числом степеней свободы:
/= Г^"^ П-Чгг (И)
(число степеней свободы округляется до целого числа),
|t| = XI-Х2 (12)
ISxl2 + Sx?
Ч nl п2
Пример 4.
Допустим, что в ходе испытаний были получены значения
определенного параметра, характеризующего эффект изучаемого воздействия, для
двух групп животных. Используя данные примера 1 (2-й и 3-й столбец
табл. 11), покажем, как можно сравнить две независимые выборки, взятые
из нормально распределенных совокупностей, для получения ответа на
вопрос о существовании статистически достоверных различий между их
средними значениями. Поскольку значения генеральных параметров
неизвестны, определим выборочные средние и дисперсии для обеих
выборок. В нашем случае nl = 10; п2 = 10; XI = 8,4, Х2 = 11, Dxl = 2,28,
Dx2 = 3,1. Прежде всего проверим по критерию Фишера гипотезу о
равенстве дисперсий обеих выборок, F-отношение равно 3,1/2,28 = 1,36. По
таблицам находим критическую точку для отношения Фишера в случае
уровня значимости 5 % и числа степеней свободы fl = f2 = 9, ее значение
равно 3,18. Наше рассчитанное F-отношение не превышает табличное,
т. е. на 5 % уровне значимости нулевая гипотеза о равенстве дисперсий
остается в силе.
А значит, расчет критерия Стьюдента будем проводить по формулам (7
и 9) (случай равенства дисперсий и равночисленных выборок). Для
двустороннего критерия Стьюдента определяем модуль разности между
выборочными средними, он равен 2,6. Найдем ошибку разности средних:
-784-

ad = /Dxl + Dx2 = /2,28 + 3,1 = „ ?3
a/ n H 10
Тогда значение t-критерия Стьюдента равно t = 2,6 / 0,73 = 3,56.
Для уровня значимости 5 % и числа степеней свободы 1 = 10 + 10 —
2 = 18 по табл. 1 находим критическое значение, равное 2,1. Так как
вычисленное значение критерия превосходит соответствующее табличное,
нулевая гипотеза отвергается на уровне значимости р < 0,05. На принятом
уровне значимости разница между результатами опыта в двух
сравниваемых группах оказалась статистически достоверной.
Для сравнения двух зависимых выборок или выборок с попарно
связанными вариантами проверяют гипотезу о равенстве нулю среднего значения
их попарных разностей. В этом случае оценкой разности между
генеральными средними будет средняя разность, определяемая из суммы попарных
разностей, т. е.
Ydi _ _
d = ^— = XI - Х2 (13)
п
Оценкой генеральной дисперсии разности средних будет выборочная
дисперсия
, V(di-d)2
Sd2=^ —L (14)
n- 1
где di = Xli — X2i — попарные разности связанных вариант, п — число
парных наблюдений. Ошибку средней разности определяют по формулам:
= /Z(di-d)2
ad = \£-£ -L. (15)
11 n(n-l)
Если члены генеральной совокупности распределяются нормально, то
разности между ними будут также распределяться нормально. Поэтому для
проверки нулевой гипотезы о равенстве средних значений рассчитывается
тестовое отношение
t = d/ad, (16)
которое проверяется по таблицам Стьюдента (табл. 1) для выбранного
уровня значимости и числа степеней свободы f = п — 1. Нулевая гипотеза
отвергается для данного уровня значимости, если вычисленное значение
превзойдет соответствующее табличное.
Пример 5.
Для примера сравнения выборок с попарно связанными вариантами
рассмотрим результаты изменения содержания молочной кислоты в крови
животных из примера 1. Для 2-й группы животных будем решать так
называемую статистическую задачу "до и после", анализируя столбцы 5 и 7
табл. 11. Таким образом получаем две связанные выборки концентрации
молочной кислоты в крови животных 2-й группы: исходно и после
подъема в барокамере.
di _ 41 _
Средняя разность равна D = *-<— = 31 =4,1;
п 10
Ошибка разности ad = Sd/ г = 0,97/ /jq = 0,31.
Критерий t = d/ad = 4,1/0,31 = 13,4. Для уровня значимости 5 % и чис-
-785-

ла степеней свободы f = 10 — 1=9 критическое значение равно (табл. 1)
2,26. Так как вычисленное значение критерия превышает соответствующее
табличное, нулевую гипотезу отвергают, и с вероятностью более 95 %
можно утверждать, что разница между сравниваемыми выборками
статистически достоверна.
Правильное применение t-критерия предполагает нормальное
распределение совокупностей, из которых извлечены сравниваемые выборки. Если
это условие не выполняется, то более эффективными будут
непараметрические критерии.
VI. Непараметрические критерии для проверки гипотезы о различии
(или сходстве) между средними значениями
Как уже говорилось выше, литературные данные из области
экспериментальной биологии, свидетельствуют о том, что распределение
животных одного и того же вида по их чувствительности к воздействию любого
лекарственного препарата достаточно хорошо описывается нормальным
распределением. Это значит, что обычно изучаемые параметры
фармакологического эффекта при их представлении в количественной форме
описываются нормальным законом и для сравнения средних значений этих
параметров могут применяться параметрические критерии. Однако
хотелось бы подчеркнуть, что при количественной форме описания признаков
для сравнения средних значений может применяться и целый ряд
непараметрических критериев (особенно в случае малых объемов выборок), среди
которых важное место занимают так называемые ранговые критерии.
Применение этих критериев основано на ранжировании членов сравниваемых
групп. При этом сравниваются не сами члены ранжированного ряда, а их
порядковые номера, или ранги. Познакомиться с основными
непараметрическими критериями: Х-критерием Ван-дер-Вардена (для независимых
выборок), U-критерием Уилкоксона (для независимых выборок), критерием
знаков z (для попарно связанных выборок) Т-критерием Уилкоксона (для
попарно связанных выборок) — можно, например, в книгах [6, 7, 9, 12, 13,
15, 16, 19]. Там же даны и основные таблицы для проверки этих
критериев. При решении конкретной задачи очень важно правильно выбрать
критерий; решение этих вопросов для медико-биологических приложений
достаточно подробно рассмотрено в [4, 9, 15, 19].
Приведем U-критерий Уилкоксона (Манна—Уитни) для проверки
гипотезы о принадлежности сравниваемых независимых выборок к одной и
той же генеральной совокупности или совокупностям с одинаковыми
параметрами. Гипотезу проверяют, расположив в обобщенный ряд
значения сравниваемых выборок в возрастающем порядке. Всем значениям
полученного обобщенного ряда присваиваются ранги от 1 до N = nl+n2.
Для каждой выборки находятся суммы рангов R и рассчитываются
статистики:
Ui = Ri - "'("* + *) для i = 1 и 2 - номер выборки (17)
Если нулевая гипотеза верна и выборки извлечены из одной и той же
генеральной совокупности, мы не должны ожидать преобладания
наблюдений из одной выборки на одном из концов объединенного вариационного
ряда, их значения должны быть достаточно равномерно рассеяны по всему
обобщенному ряду. Таким образом, слишком большие или слишком ма-
-786-

ленькие значения статистики R должны заставить нас усомниться в
справедливости нулевой гипотезы.
В качестве тестовой статистики выбирают минимальную величину U и
сравнивают ее с табличным значением для принятого уровня значимости.
Гипотеза принимается, и различия считаются недостоверными, если
рассчитанное значение больше соответствующего табличного (табл. 4).
Обычно в таблицах приводятся критические значения данного критерия
для объема выборок 20 или 40. В случае выборок большего объема для
проверки данного критерия применяется нормальная аппроксимация.
Тогда критические значения для критерия U можно рассчитать по формуле:
U,..,,,^ = \ nl*n2 - Za* J±nl*n2*(nl + п2 + 1).
где Za — критические значения стандартного нормального распределения
(табл. 7).
Пример 6.
Проверим гипотезу о принадлежности сравниваемых независимых
выборок к одной и той же генеральной совокупности с помощью
непараметрического U-критерия Уилкоксона. Сравним результаты, полученные в
примере 4 для 2-го и 3-го столбцов табл. 11 по критерию Стьюдента, с
результатами непараметрического сравнения. Для расчета U-критерия
Уилкоксона расположим варианты сравниваемых выборок в порядке
возрастания в один обобщенный ряд и присвоим вариантам обобщенного ряда
ранги от 1 до nl + п2. Первая строка представляет собой варианты первой
выборки, вторая — второй выборки, третья — соответствующие ранги в
обобщенном ряду :
67788 999 10 11
8 9 9 11 11 12 12 12 13 13
1 2,5 2,5 5 5 5 9 9 9 9 9 12 14 14 14 17 17 17 19,5 19,5
Надо обратить внимание, что если имеются одинаковые варианты, им
присваивается средний ранг, однако значение последнего ранга должно
быть равно nl + п2 (в нашем случае 20). Это правило используют для
проверки правильности ранжирования.
Отдельно для каждой выборки рассчитаем суммы рангов их вариант R1
и R2. В нашем случае
R1 = 1 + 2,5 + 2,5 + 5 + 5 + 9 + 9 + 9 + 12 + 14 = 69
R2 = 5 + 9 + 9 + 14 + 14 + 17 + 17 + 17 + 19,5 + 19,5 = 141
Для проверки правильности вычислений можно воспользоваться другим
правилом:
Rl + R2 = 0,5*(nl + n2)*(nl + п2 + 1).
В нашем случае
Rl + R2 = 69 + 141 = 0,5*20*21 = 210.
Статистика U1 = 69 - 10*11 / 2 = 14, U2 = 141 - 10*11 / 2 = 86. Для
проверки одностороннего критерия выбираем минимальную статистику
U1 = 14 и сравниваем ее с табличным значением (табл. 5) для nl = n2 = 10
и уровня значимости 1 %, равным 19. Так как вычисленное значение
критерия меньше табличного, нулевая гипотеза отвергается на выбранном
уровне значимости, и различия между выборками признаются
статистически значимыми с вероятностью более 99 %. Таким образом, вывод о суще-
-787-

ствовании различий, сделанный с помощью параметрического критерия
Стьюдента, подтверждается с помощью данного непараметрического
метода.
В случае попарно связанных выборок применяется Т-критерий Уилкок-
сона. При этом ранжируют попарные разности положительные и
отрицательные (кроме нулевых) в один ряд так, чтобы наименьшая абсолютная
разница (без учета знака) получила первый ранг, одинаковым величинам
присваивают один ранг. Отдельно вычисляют сумму рангов
положительных (Т+) и отрицательных разностей (Т—); меньшую из двух таких сумм
без учета знака считают тестовой статистикой данного критерия. Нулевую
гипотезу принимают на данном уровне значимости, если вычисленная
статистика превзойдет табличное значение (табл. 4) (число парных
наблюдений уменьшают на число исключенных нулевых разностей). Таким
образом, можно сказать, что если нулевая гипотеза верна, статистики Т+ и Т—
примерно равны, сравнительно малые или большие значения Т статистик
заставят нас отклонить нулевую гипотезу об отсутствии различий.
Пример 7.
Допустим, в результате проведения эксперимента был вычислен ряд
попарных разностей между показателем эффекта в двух попарно связанных
группах (nl = п2 = 10) (например, так называемая задача "до и после"):
0,2 —0,4 0,7 —0,9 1,3 1,5 -0,1 0,8 —1,0 1,1. Ранжируем попарные
разности в один рад, независимо от знака разности, получаем следующий
ранжированный ряд:
-0,1 0,2 -0,4 0,7 0,8 -0,9 -1,0 1,1 13 1,5
123456789 10
Рассчитаем отдельно сумму рангов положительных (Т+) и
отрицательных (Т—) разностей, в нашем случае Т+ = 2 + 4 + 5 + 8 + 9 + 10 = 38,
Т— =1 + 3 + 6 + 7 =17. Для проверки двустороннего Т-критерия
используем меньшую статистику Т— = 17, сравним ее с табличным значением
(табл. 4) для числа попарных разностей п = 10 и уровня значимости 5 %.
Такое табличное критическое значение равно 9. Рассчитанное
минимальное значение Т статистики превосходит соответствующее табличное
значение, а значит, нулевая гипотеза остается в силе.
VII. Сравнение средних значений нескольких выборок
Приведенный выше критерий Стьюдента может быть использован для
проверки гипотезы о различии средних только для двух групп. Если схема
эксперимента предполагает сравнение большего числа групп, совершенно
недопустимо сравнивать их попарно. Для корректного решения этой
задачи можно воспользоваться, например, дисперсионным анализом [4, 7, 9,
13, 15, 16]. Однако дисперсионный анализ позволяет проверить лишь
гипотезу о равенстве всех средних. Но если гипотеза не подтверждается,
нельзя узнать, какая именно группа отличалась от других. Это позволяют
сделать методы множественного сравнения, которые в свою очередь также
бывают параметрические и непараметрические.
Среди параметрических критериев наиболее известны критерий
Стьюдента для множественных сравнений, критерий Ньюмена—Кейлса,
критерий Тьюкки, критерий Даннета, а среди непараметрических — критерий
Краскела—Уоллиса.
-788 -

Рассмотрим лишь некоторые из них. Еще раз обращаем внимание, что
к рассмотрению этих критериев надо прибегать в случае, если
дисперсионный анализ показал наличие значимых различий между средними
значениями выборок.
Буквой m обозначим число сравниваемых групп.
Критерий Стьюдента для множественных сравнений основан на
использовании неравенства Бонферрони [4, 24]: если к раз применить
критерий с уровнем значимости а, то вероятность хотя бы в одном случае найти
различие там, где его нет, не превышает произведения к на а. Из
неравенства Бонферрони следует, что если мы хотим обеспечить вероятность
ошибки а', то в каждом из сравнений мы должны принять уровень
значимости а'Д — это и есть поправка Бонферрони (к — число сравнений).
Понятно, что такое уменьшение в несколько раз уровня значимости
делает тест достаточно «жестким». С ростом числа сравнений установить
различия становится достаточно трудно. Чтобы несколько смягчить данный
тест, пользуются обобщенной оценкой внутригрупповой дисперсии, число
степеней свободы при этом возрастает, что в свою очередь приводит к
уменьшению критического значения для проверки теста. Обобщенную
оценку внутригрупповой дисперсии в случае групп разного объема можно
вычислять по формуле:
s (n, - l)s] + (п2 - l)s22 + ... + (п,„ - l)sj ^ (18
п, + п2 + ... + п,„ — m
где ni — численность соответствующей i-группы, величины si в формуле
обозначают средние квадратичные отклонения в сравниваемых группах.
Для групп одинакового объема данная формула несколько упрощается и
обобщенная оценка внутригрупповой дисперсии вычисляется как среднее
значение дисперсий, рассчитанных для всех сравниваемых групп в
отдельности. Величина тестовой статистики при сравнении i и j групп
рассчитывается по обычной формуле с учетом обобщенной оценки дисперсии:
t- Xl-Xj _ Xl-Xj (19)
P7i sgr/I7I'
Vn, nj A/n. nj
и опять в случае групп равного объема п формула упрощается.
t = Xi~Xj (20)
sgr</2 / n
Оценка внутригрупповой дисперсии может быть предоставлена также
дисперсионным анализом (остаточная составляющая, связанная с
внутригрупповой вариацией). Число степеней свободы для критерия Стьюдента с
поправкой равно f = m*(n-l), где п — объем групп, а для групп разного
объема число степеней свободы будет равно суммарной численности групп
N минус количество групп m (что в случае m > 2 превышает обычное
число степеней свободы для критерия Стьюдента, равное суммарной
численности двух непосредственно сравниваемых групп минус два).
Этот метод хорошо работает, если число сравнений невелико, обычно
не больше 8. При большом числе сравнений критерий Ньюмена—Кейлса и
критерий Тьюкки дают более точную оценку вероятности а' [4, 7, 19].
Иногда задача заключается в том, чтобы сравнить несколько групп с
единственной — контрольной. Конечно, можно использовать любой из
указанных выше методов: попарно сравнить все группы, а потом выбрать
-789-

только те сравнения, в которых участвовала контрольная группа. Однако
из-за большого числа лишних сравнений критическое значение окажется
неоправданно высоким. Для решения этой задачи статистики существуют
специальные методы, например, еще одна модификация критерия Стью-
дента с поправкой Бонферрони и критерий Даннета.
В случае использование поправки Бонферрони необходимо учесть
реальное число сравнений для этой задачи, оно равно числу групп m минус
один и, соответственно рассчитать уровень значимости а = а'/(т-1).
Критерий Даннета более чувствительный, чем предыдущий, особенно
при большом числе групп. Критерий Даннета является модификацией
критерия Ньюмена—Кейлса, и тестовая статистика в этом случае
вычисляется как:
q' = Xi~Xj , (21)
где Sgr — оценка внутригрупповой дисперсии; Хк и Хс — сравниваемые
средние значения; nk и пс — численность групп.
Для проверки критерия Даннета средние значения для всех групп
упорядочиваются по абсолютной величине их отличия от контрольной
группы, сравнения начинают с группы, наиболее отличающейся от контроля.
Для обращения к таблице для проверки критерия используется еще один
параметр 1, представляющий собой число сравниваемых групп вместе с
контрольной. Вычисленное значение q' сравнивается с табличным (табл. 9)
значением, и, если оно превосходит табличное, делается вывод о наличии
статистически значимого различия. Число степеней свободы для этого
критерия также равно f = m*(n — 1) = N — m, где N — суммарная
численность всех групп, m — число сравниваемых групп. Если различия с
очередной группой не найдены, сравнения прекращаются.
Непараметрический критерий Краснела—Уоллиса для сравнения
средних значений нескольких выборок основан на построении объединенного
вариационного ряда из вариант рассматриваемых выборок и присвоении
рангов всем вариантам в объединенном ряду объемом N. Далее
вычисляются статистики Ri для каждой рассматриваемой выборки отдельно,
равные суммам рангов в обобщенном ряду вариант, входящих в данную i-тую
выборку. При этом для каждого наблюдения в конкретной выборке мы
можем указать средний ранг, равный Ri/ni, для всех i от 1 до т. Если
выполняется нулевая гипотеза и все совокупности имеют одно и тоже
распределение, то можно ожидать, что все средние ранги примерно равны. А
именно они примерно равны общему среднему рангу R:
R=(l + 2 + ... + N)/N=l(N + 1)
В качестве статистики критерия используется мера, которая
чувствительна к отклонению выборочного Ri/ni от теоретического значения R:
■^ ni 4
Сумма берется по всем m выборкам.
Проверить статистику Краскела—Уоллиса можно по специальным
таблицам [9, 12, 19]. Однако если почти все ni > 5, то удобна аппроксимация,
1 ?К
которая основана на том, что статистика имеет распределение
-790-

Хи-квадрат с m-1 степенью свободы при условии справедливости нулевой
гипотезы. Таким образом, рассчитав значение статистики К, его
сравнивают с критическим значением распределения Хи-квадрат (табл. 2),
умноженным на коэффициент X ' N(N + 1) Если вычисленное значение К
превосходит скорректированное критическое, нулевая гипотеза отвергается на
уровне значимости а% и различия считаются статистически значимыми.
Для анализа повторных измерений обычно применяется
непараметрический критерий Фридмана [4, 18, 19].
Пример 8.
Применение критериев множественного сравнения проиллюстрируем
на примере результатов эксперимента из примера 1, относящихся к
содержанию креатинфосфата в ткани сердца животных групп 1, 2 и 3 (столбцы
1—3 табл. 11). Группу 1 будем считать контрольной и сравним полученные
в этой группе результаты с результатами в группах 2 и 3 с помощью
критерия Даннета. Прежде всего вычислим для этих групп средние значения и
дисперсии: XI = 13,1; Х2 = 8,4; ХЗ = 11,0; Dxl = 3,2; Dx2 = 2,28;
Dx3 = 3,1. Рассчитаем величины отклонений средних значений групп 2 и 3
от среднего значения контрольной группы 1; эти отклонения равны
соответственно 4,7 и 2,1. Таким образом, сначала будем определять значения
критерия Даннета для сравнения контрольной группы с группой 2, а
затем, если статистически значимое различие будет установлено, — с
группой 3. Поскольку предполагается, что дисперсии сравниваемых групп
одинаковы (критерий Фишера), величина внутригрупповой дисперсии S2BHy
может быть определена как среднее арифметическое дисперсий
сравниваемых групп. Тогда S2BHy оценивается как 2,86. Критерии Даннета для
сравнения контрольной группы с группами 2 и 3 соответственно равны:
„. , 13,1-8.4 ,621. q. . 13.1-Ю.4 , vt.
Число степеней свободы в данном случае равно 30 — 3 = 27, уровень
значимости выберем равным 5 %, тогда по табл. 9 критическое значение
равно 2,33. Вычисленные значения критерия превзошли критическое
табличное, значит, различия между контрольной и двумя другими группами
можно признать статистически значимыми на выбранном уровне
значимости.
Критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони. По-прежнему
сравниваем 2-ю и 3-ю группы с контрольной 1-й. Для этих двух сравнений
рассчитываем по формулам (7 и 9) значения критерия Стьюдента (аналогично
примеру 4). Получаем значения t = 6,35 для сравнения со второй группой
и t = 2,65 для сравнения с третьей. Однако в данном случае уровень
значимости выбираем из расчета 0,05 / 2 = 0,025, число степеней свободы равно
f = 3*(10 - 1) = 27. Соответствующее значение в таблице распределения
Стьюдента приблизительно равно 2,5 (для сравнения — без учета поправок
оно было бы равно 2,05). Рассчитанные нами значения t-критерия
превзошли выбранное критическое значение, а значит, нулевая гипотеза
отвергается и различия признаются статистически значимыми на уровне
значимости (для всего критерия) 5 %. В данном случае мы не делаем
заключения о различии групп 2 и 3 между собой.
Для сравнения этих трех групп применим непараметрический подход;
для этого проанализируем эти же данные с помощью критерия Краскела—
-791 -

Уоллиса. Как и для критерия Уилкоксона— Манна—Уитни мы будем
использовать ранги вариант в объединенной совокупности. Как и раньше,
одинаковым вариантам присваиваем средний ранг так, чтобы последнее
значение ранга было равно объему объединенного ряда.
Группа 1: 12 13 14 15 14 13 13 10 11 16
Ранги 19,5 24 27,5 29 27,5 24 24 12,5 15,5 30 R1 = 233,5
Группа 2 8 89 10 7799 11 6
Ранги 5 5 9 12,5 2,5 2,5 9 9 15,5 1 R2 = 71
Группа 3 8 9 9 11 12 12 13 13 12 И
Ранги 5 9 9 15,5 19,5 19,5 24 24 19,5 15,5 R3 = 160,5.
Как и раньше, сумма всех рангов должна быть равна 0,5*N*(N + 1), где
N — объем обобщенного ряда. В нашем случае сумма рангов должна быть
равна 465. Рассчитываем статистику Краскела—Уоллиса:
К = (233'5)2 + ilD. + О60'5)' - 30(30 + !) = 5452,2 + 504,1 + 2576,0 - 7207,5 = 1324,8.
Тестовая статистика К = 17,1. Критическое значение критерия
%2 для 2 степеней свободы и 30(30 +1) уровня значимости 5 % (табл. 2)
равно 5,99. Поскольку вычисленное значение критерия превзошло
соответствующее табличное на уровне значимости 5 %, нулевая гипотеза
отвергается и различия между всеми тремя группами признаются статистически
значимыми.
VIII. Альтернативная форма учета реакций
Всестороннее изучение картины токсического действия исследуемого
лекарственного препарата требует выделения сопоставимых параметров.
Эта задача решается, например, если из всей массы наблюдений
использовать для статистического анализа только наблюдения за исходами
токсического воздействия: погибло животное или выжило. Так, при
изучении наркотических средств можно учитывать реакцию по тому, перешло
или не перешло животное в "боковое положение", при изучении проти-
восудорожных средств — предотвращена или нет судорожная реакция и
т. д. Все эти примеры иллюстрируют способ учета реакции в
альтернативной форме, т. е. реакции, которая или наступает, или нет.
Альтернативное распределение — это распределение элементов совокупности на
две части (две альтернативы) по какому-либо признаку, чаще всего по
качественному. Эти признаки не связаны между собой никакими
арифметическими соотношениями, упорядочить их невозможно.
Единственный способ описания качественных признаков состоит в том, чтобы
подсчитать число объектов, имеющих одно и то же значение или долю от
общего числа объектов, которая приходится на то или иное значение.
Надо сказать, что качественные переменные могут иметь число градаций
больше двух, тогда для их анализа применяются статистические методы
сравнения распределений.
В случае качественной классификации невозможно ввести такие
количественные параметры, как математическое ожидание, дисперсия и др.
Тем не менее можно указать определенный численный параметр, имею-
- 792-

щий вполне точный и объективный смысл: доля вариант одного типа. Так,
для альтернативного распределения доля
Р=-Г^Ц=^. (22а)
п 1 + п 2 п
где nl, п2 — численности альтернатив; n = nl + п2 — численность всей
совокупности. Кроме того, доля может быть выражена в процентах:
р= ,nl *100% = nl ' 100%. (226)
nl+n2 n
В отношении доли вариант в альтернативном распределении возникают
те же статистические задачи, что и для параметров, представленных в
количественной форме:
• оценка доли р в генеральной совокупности по выборочным данным,
нахождение доверительного интервала для р;
• выявление различия между генеральными долями pi и р2 двух
совокупностей по выборочным данным, т. е. сравнение двух выборочных
долей вариант.
Формула (21—22) позволяет рассчитать выборочную оценку
генеральной доли р. Поскольку в эксперименте участвует офаниченное количество
животных, возникает вопрос об определении доверительного интервала
для р. Строго эта задача решается с использованием биномиального
распределения [4, 7, 12, 15, 16, 21]. Соответствующие расчеты очень
громоздки, поэтому составлены таблицы [12] и нонофаммы [15], в которых можно
сразу найти 95 % и 99 %-ные доверительные фаницы для выборочной
доли. Ввиду большого объема этих таблиц они обычно приводятся лишь в
специальных справочниках. Поэтому на практике часто пользуются
различными приближенными методами. Как правило применяется
нормальное приближение, то есть замена биномиального распределения
нормальным. Из центральной предельной теоремы следует, что при достаточно
большом объеме выборки выборочная оценка доли приближенно
подчиняется нормальному закону распределения, имеющему генеральное среднее и
стандартное отклонение, равное стандартной ошибке доли ар.
При таком подходе доверительные фаницы для генеральной доли
определяются как p±za *ap, где стр — стандартная ошибка доли задается
соотношением:
= Р(1-Р)
ар = ^^^^ ■ (23)
a za — определяется по значению доверительной вероятности по табл. 7
(обычно в случае доклинических испытаний Р = 95 % и соответствующее
значение Z = 1,96).
При малых объемах выборок нормальное приближение дает слишком
неточные результаты. Условием применимости аппроксимации с помощью
нормального распределения в данном случае является выполнение
соотношения п*р < 5. В случае невыполнения этого условия для исправления
положения Р. Фишер предложил пользоваться угловой трансформацией или,
проще говоря, вспомогательной величиной < р, связанной с р равенством:
9 = 2arcsin Jp . (24)
Эта величина имеет распределение, близкое к нормальному. Порядок
действий предполагается следующий: для получения доверительных гра-
-793-

ниц для доли вариант сначала нужно найти значение ср и вычислить
интервал ф ± Za/Vn. Затем по формуле р = sin2 ф/n пересчитать полученные для
Ф значения границ, вернувшись снова к значениям р. Конечно, переход от
р к ф и обратно с применением таблицы тригонометрических функций
достаточно неудобен. Поэтому была составлена специальная таблица,
которая непосредственно связывает значения р и ср (табл. 6).
Еще одна задача возникает при анализе выборочных долей и требует
внимания. При значениях р, близких к 0 или 1 (т. е. при нулевом или
100 % эффекте), в случае малого объема выборки условия центральной
предельной теоремы нарушаются, и при этом нужно несколько изменить
процедуру построения доверительных интервалов.
Статистические оценки нулевого и 100 % эффекта
Очевидно, что любой признак, наблюдавшийся в 100 % случаев, у
группы, состоящий из 10 вариант, может в большой мере объясняться
случайным совпадением и не воспроизводиться в дальнейшем при продолжении
опытов. Тот же признак, наблюдаемый в 100 % случаев у группы,
состоящей из 1000 вариант, имеет гораздо большую достоверность. Поэтому даже
в случае появления в процессе испытаний 0 или 100 % долей эти
результаты должны быть скорректированы.
Для этого можно пользоваться следующим подходом: рассматривать
возможный процент противоположного эффекта при дальнейшем
увеличении числа подобных наблюдений и его стандартную ошибку:
р= i±i*ioo, (25)
п + 2
op = JSMES
где а — полученный в эксперименте обобщенный показатель (0 %), р —
скорректированное значение этого показателя в %.
Доверительный интервал для скорректированного значения доли
задается соотношением а ± t * ср, где t определяется по табл. 1 для выбранного
уровня значимости и объема выборки.
Пример 9.
Лабораторным животным вводили гепатопротектор, и о его
эффективности судили по действию гексенала (40 мг/кг), который вызывает у
животных сон. Контрольная группа состояла из 36 животных, а опытная — из
25 Если животное перешло в состояние сна, будем обозначать такой исход
как "ДА".
Таким образом, доля животных, перешедших в состояние сна,
например в опытной группе, равна р = 9/25 = 0,36, или 36 %. Ошибка
выборочной доли в данном случае равна стр = 0,096 или 9,6 %. Соответствующий
95 % доверительный интервал для выборочной доли заключается между
0,17 и 0,55 или, другими словами, между 17 и 55 %. Рассчитаем
доверительный интервал для выборочной доли с учетом угловой трансформации.
По табл. 6 находим для доли 0,36 значение q > 1,287. Границы 95 %
доверительного интервала задаются соотношением ср ± Za/Jn, и в нашем
случае получаем диапазон от 0,9 до 1,68 (значение Za = 1,96 определяем по
табл. 7 для уровня значимости 5 %). Теперь по табл. 6 по рассчитанным
граничным значениям ср определяем значения р, соответствующие грани-
-794-

цам доверительного интервала, получаем диапазон от 0,19 до 0,55. И хотя
этот интервал достаточно широк, он имеет практическое значение.
Проиллюстрируем ситуацию с возникновением в опыте так
называемого нулевого эффекта. Допустим, что в табл. 14 в опытной группе ни одно
животное из 25 не перешло в сон (0 %)
Тогда р = 1±1 *100 = 3,7; ар = I3'7' 9в'3 = 3,57
F 25 + 2 F V 25 + 3
95 % доверительный интервал для этой выборочной доли заключен
между значениями 0 % — 0 % + 2,06*3,57 (так как доля не может иметь
отрицательное значение), или можно записать, что доля животных в опытной
группе, перешедших в сон, равна 0 ± 3,57 (0 — 7,35) %. Таким образом,
несмотря на нулевой эффект в опыте из 25 животных, с вероятностью
более 95 % можно утверждать, что при продолжении опытов доля животных,
переходящих в сон, будет заключена в пределах от 0 до 7,35 % случаев.
При этом с вероятностью более 95 % можно сказать, что при продолжении
опытов противоположные исходы будут наблюдаться не менее чем у
92,65 % животных.
Оценка разности между долями
Поскольку выборочная доля аналогична выборочному среднему, задача
оценки разности между долями решается аналогично задаче оценки
разности между средними значениями. При этом также можно использовать
различные параметрические и непараметрические методы сравнения.
Рассмотрим критерий Стьюдента. Рассчитываемая тестовая статистика t
представляет собой отношение разности выборочных долей к стандартной
ошибке разности выборочных долей
t = 21ZP2 г (27)
adp
где pi, р2 — сравниваемые выборочные доли, adp — стандартная ошибка
разности выборочных долей.
Нулевая гипотеза в данном случае состоит в том, что pi = р2. И ее
отвергают, если рассчитанная статистика t превзойдет табличное значение,
выбранное в соответствии с заданным уровнем значимости а и числом
степеней свободы f = nl + п2 — 2.
Ошибка разности между долями, взятыми из приблизительно
равновеликих выборок (объем выборок отличается менее чем на 25 %),
вычисляется по формуле:
adp = Japl2 + op22 = Hd-Pl) + Р2(1-Р2) (28)
V nl n2
В случае, когда сравнивают доли из неравновеликих выборок и при
75 % < р < 25 %, ошибку разности долей определяют по формуле:
^f1-^!^' (29)
где р — определяют как средневзвешенную из pi и р2 долей:
р=Р1-п1+Р2-п2
nl + п2
-795-

Если доли выражают в процентах от п, то в приведенных формулах
вместо 1-р нужно брать 100 — р.
Описанный выше критерий проверки равенства долей в двух выборках
применим при не слишком больших и не слишком малых значениях р
(25 % < р < 75 %). Особенно это важно учитывать в случае малых
выборок. Свободным от подобного рода ограничений и более универсальным
оказывается способ проверки равенства долей, основанный на ср-преобра-
зовании Фишера. Для компенсации ошибок вводится специальная
поправка Иейтса, называемая также поправкой на непрерывность, равная 1/(2*п).
Эту поправку вычитают из большей и прибавляют к меньшей доле. Затем
исправленные доли в % трансформируют с помощью таблицы 6. С учетом
этой поправки величина критерия определяется формулой:
t = (Ф1 - Ф2) Щ3^2 , (31)
Vnl + п2
Ф — угловая трансформация частоты, задаваемая формулой (24).
Повторим, что условием для неприятия нулевой гипотезы служит
превышение рассчитанным значением статистики t соответствующего
табличного значения (табл. 1 критерия Стьюдента) для выбранного уровня
значимости и числа степеней свободы f = nl + n2—2.
Таблицы сопряженности: критерий Хи-квадрат
Для оценки значимости расхождения частот какого-либо явления в двух
группах опытов может быть использован статистический метод, который
носит название критерия fl. Этот критерий может быть применен,
например, при сравнении в эксперименте двух групп животных — подопытных и
контрольных; двух групп животных, получивших два различных
сравниваемых по своей активности вещества; двух групп животных, получивших
различные дозы изучаемого препарата или одну и ту же дозу различными
путями введения, и т. д. Для описания результатов такого эксперимента
удобно применять таблицы сопряженности, в которой для каждой из групп
указывается число животных с каждым из двух альтернативных значений
признака. Таким образом, для двух рассматриваемых групп и для двух
возможных исходов получается таблица размерности 2x2.
Допустим, в результате проведения испытаний было определено, что
процент погибших животных в подопытной группе ниже (или выше), чем
в контрольной, но является ли это различие значимым? Для ответа на этот
вопрос вычисляется величина статистики А2, которая является показателем
максимально возможных при данном уровне значимости отклонений
частот.
Как обычно, для анализа таблицы сопряженности выдвигается нулевая
гипотеза: отсутствует влияние изучаемого препарата на исход
эксперимента. Исходя из нулевой гипотезы, можно посчитать, какова была бы
смертность в каждой из групп, если бы смертельные исходы по частоте
равномерно распределились в обеих группах. Результаты эксперимента в двух
группах объединяются, и определяется процент "хороших" и "плохих"
исходов по суммарным результатам в двух группах. При этом
рассчитываются таблицы ожиданий, т. е. результаты, которые можно было бы ожидать в
обеих группах, при правильности нулевой гипотезы и равномерности
распределения частот различных исходов в обеих группах. На основании
сопоставления таблиц сопряженности и таблиц ожидания составляется таб-
- 796-

лица отклонений наблюдавшихся частот рп от ожвдаемых ро. Для расчета
величины у2 из абсолютной величины каждого отклонения вычитают 0,5
(поправка Иейтса), полученную разность возводят в квадрат и результат
делят на соответствующее ожидание. Поправка применяется только для
таблиц сопряженности 2x2. Статистика у2 представляет собой сумму
полученных величин:
„2 = v(|pn-po|-l/2)2
у? = у VIF" F»l 1 / *■) (32)
Вычисленное значение %2 сопоставляют с табличными значениями
(табл. 2) для разных уровней вероятности. Для таблиц сопряженности
2x2 (число степеней свободы равно 1) критические значения для %2
равны 3,84 (для а = 0,05) и 6,63 (для а = 0,01) Нулевая гипотеза отвергается,
если вычисленное значение превосходит табличное при данном уровне
значимости.
Следует подчеркнуть, что в таком виде данный критерий может быть
использован только при сопоставлении данных, представленных в
альтернативной форме. Кроме того, правомерность его применения
ограничивается в соответствии с условием Кокрена. Рекомендация Кокрена для
таблиц 2X2 состоит в следующем: если сумма четырех частот меньше 20,
следует использовать точный критерий Фишера. Если сумма между 20 и 40 и
наименьшая ожидаемая частота меньше 5, то следует использовать точный
критерий Фишера. Если сумма равна 40 и более, то можно применять
критерий %2 с поправкой на непрерывность [15].
Критерий Хи-квадрат может применяться к таблице сопряженности
произвольной размерности в случае, если все ожидаемые числа не меньше
1 и доля клеток с ожидаемыми числами меньше 5 не превышает 20 %. При
этом данный критерий является аналогом критериев для множественного
сравнения групп; подробнее об этом в [7, 15, 16, 19, 21].
Точный критерий Фишера
Когда число наблюдений невелико и в таблицах ожиданий встречаются
клетки со значениями, меньшими 5, критерий %2 неприменим. В этом
случае используют другой непараметрический критерий — точный критерии
Фишера. Он основан на переборе всех возможных вариантов заполнения
таблицы сопряженности при данной численности групп, поэтому чем она
меньше, тем проще его применять. Критерий Фишера позволяет получать
точные значения вероятности событий, столь же или еще менее
вероятных, чем те которые наблюдались в действительности. Подробнее с этим
методом можно познакомиться, например, в книгах [4, 7, 15, 19].
Нулевая гипотеза состоит в том, что между воздействием препарата и
исходом нет никакой связи, а значит, показатели опытной и контрольных
групп совпадают. Тогда вероятность получить некоторую таблицу 2x2 вида:
nil nl2
п21 п22
nl.
п2.
n.l n.2|N
равна
ре— п1.!п.1!п2.!п.2! /->-,-.
nll!nl2!n21!n22!N! l ;'
-797-

где nl и n2 — суммы по строкам (число животных в опытной и контрольной
группах), п.1 и п.2 — суммы по столбцам (число животных с первым и
вторым исходом в обеих группах), N — общее число наблюдений 1 обозначает
факториал (п! = 1*2*... *(п — 1)*п, 0! = 1). Построив все остальные варианты
заполнения таблицы, возможные при данных суммах по строкам и
столбцам, по этой же формуле рассчитывают их вероятность. Вероятности,
которые не превосходят вероятность исходной таблицы (включая саму эту
вероятность), суммируют. Надо заметить, что числитель данной формулы и
величина N! зависят только от величин сумм по строкам и столбцам, которые
остаются постоянными при изменении варианта заполнения таблицы,
поэтому их значения можно не пересчитывать каждый раз. Другой способ
уменьшить объем вычислений — выписать в числителе и знаменателе вместо
факториалов соответствующие им произведения натуральных чисел, а затем
произвести очевидные сокращения сомножителей. Таким образом, алгоритм
точного критерия Фишера может быть сформулирован следующим образом:
• по полученной в эксперименте таблице сопряженности вычислить
вероятность получить эту таблицу,
• рассмотреть все остальные возможные варианты заполнения таблицы
при неизменных суммах по строкам и столбцам (для этого в одной из
клеток надо поставить все числа от нуля до максимально возможного,
пересчитывая числа в остальных клетках так, чтобы суммы по
строкам и столбцам сохранялись),
• вычислить вероятность для всех полученных таблиц,
• просуммировать вероятность получить исходную таблицу и все
вероятности, которые ее не превышают.
Вычисленное значение Pf соответствует р-значению, обсуждавшемуся в
разделе о проверки гипотез, а значит, данная гипотеза отвергается на
заданном уровне значимости а при значении Pf < а. Необходимо обратить
внимание на то, что предложенный в некоторых книгах по биометрии
вариант данного критерия, учитывающий лишь вероятность получения
исходной таблицы, дает заниженное значение Pf. А это в свою очередь
приводит к тому, что делается вывод о наличии значимых различий в то
время, когда их на самом деле нет. Кроме того, надо предупредить, что в
различных учебниках и справочниках предложены различные модификации
данного критерия [4, 7, 15, 21, 19].
Для примера рассмотрим таблицу сопряженности 2x2 вида:
Исходы
Опытная группа (по)
Контрольная группа (nk)
Всего...
ДА
1
5
6
НЕТ
6
8
14
Всего
7
13
20
Так как некоторые значения в клетках таблицы меньше 5, пользоваться
критерием %2 невозможно. Для точного критерия Фишера существуют
односторонний и двусторонний варианты критерия. Рассмотрим
односторонний вариант критерия. Рассчитаем вероятность при тех же значениях
сумм по строкам и столбцам получить такой же набор чисел в клетках, что
и в исходной таблице:
-798 -

Возьмем наименьшее из чисел в клетках, это единица на пересечении
первой строки и первого столбца. Уменьшим это значение на 1, числа в
остальных клетках изменим так, чтобы суммы по строкам и столбцам
сохранялись. Получим таблицу вида:
Исходы
Опытная группа (по)
Контрольная группа (ric)
Всего
ДА
0
6
6
НЕТ
7
7
14
Всего
7
13
20
Для этой таблицы вероятность заполнения равна:
Pf= ?! 1316! 14! =0044
20!0!7!б!7! '
Наименьшее из чисел в таблице равно нулю, продолжать процесс
уменьшения невозможен. Таким образом, односторонний вариант
критерия дает значение вероятности Pf = 0,23 + 0,044 = 0,274. Мы получили
точное значение вероятности событий, столь же или менее вероятных, чем
те, которые в действительности наблюдались. Рассчитанное значение
вероятности достаточно высокое (если принять а = 0,05), данные следует
считать согласующимися с нулевой гипотезой, согласно которой
распределения двух совокупностей одинаковы.
Чтобы воспользоваться двусторонним вариантом критерия, нужно было
бы перебрать все остальные варианты заполнения таблицы при
сохранении неизменными сумм по строкам и столбцам. В нашем случае,
например, надо было бы увеличивать элемент на пересечении первой строки и
первого столбца, пересчитывая все остальные клетки таблицы, пока какой-
либо другой элемент таблицы не обратится в 0. При этом появляются еще
5 вариантов (кроме двух, показанных выше) заполнения таблицы, из
которых только 3 дают вероятность заполнения соответствующей таблицы
меньше вероятности заполнения исходной таблицы. Суммарная
вероятность в данном случае Pf = 0,35. Таким образом, сделанный с помощью
одностороннего критерия статистический вывод подтверждается.
Пример 10.
Сравним результаты в опытной и контрольной группах из примера 9.
Данные примера 9 представлены в альтернативной форме, и мы можем
рассчитать соответствующие значения долей. Табл. 14 называется таблицей
сопряженности 2x2.
Попробуем использовать критерий Стьюдента для проверки разности
между выборочными долями 0,36 и 0,78 опытной и контрольных групп
(неравновеликие группы из табл. 14). Определим средневзвешенную долю р =
= (9 + 28) / (25 + 36) = 0,61. Ошибка выборочной доли равна стр = 0,13 (по
формуле 29). Значение критерия t = (0,36 — 0,78) / 0,13 = -3,23. По
таблицам критерия Стьюдента (табл. 1) для числа степеней свободы f = 61 —
2 = 59 и уровня значимости 5 % определяем критическое значение, равное
2,001. Нулевая гипотеза о равенстве долей отвергается, так как рассчитанная
нами статистика по модулю превосходит критическое табличное значение.
Применим поправку на непрерывность (угловая трансформация). По
табл. 6 для значений долей 0,36 и 0,78 определим соответствующие
значения ф (ф1 = 1,287; ф2 = 2,165). Разность между значениями ф1 — ф2 равна
—0,878; значение критерия t в этом случае будет —3,37 (формула 31). Оно
-799-

также по модулю превышает соответствующее табличное значение для 5 %
уровня значимости, а значит, нулевая гипотеза может быть отвергнута.
Проверим полученные выводы с помощью критерий у2 для таблиц
сопряженности. Всего в опытной и контрольной группах (табл. 14, объем
двух групп N = 61) в состояние сна перешло 37 животных, или 61 %. Если
бы гепатопротектор не оказывал влияния, животные переходили бы в
состояние сна с равной частотой в обеих группах. Рассчитав, сколько
составляет 61 % от 25 и 36 животных в разных группах, определим ожидаемые
доли при справедливости нулевой гипотезы. Ожидаемая таблица
сопряженности будет иметь вид:
Для каждой из четырех клеток исходов найдем разницы между
наблюдаемыми и ожидаемыми значениями (разницу между соответствующими
значениями в табл. 14 и 15). По формуле (32) рассчитаем величину
статистики х2 = 9,14 (с учетом поправки). Табличное значение критерия
(табл. 2), соответствующее одной степени свободы и уровню значимости
5% , равно 3,84. Рассчитанное нами значение тестовой статистике
превзошло критическое табличное, поэтому с вероятностью более 95 % мы
отклоняем нулевую гипотезу об отсутствии влияния гепатопротектора.
Результаты согласуются с полученными раннее с помощью критерия Стью-
дента. Задача сравнения результатов в случае связанных пар наблюдений
для альтернативного распределения решается с помощью критерия Мак-
Нимара [4, 17, 18], а множественные сравнени выполняются с помощью
критерия Кокрена [4, 17, 18].
IX. Построение доверительного интервала для значений измеряемого
признака
Все рассмотренные выше процедуры позволяли строить доверительные
интервалы для различных параметров распределения: средних значений
или долей. Однако часто возникает необходимость построить
доверительный интервал для самих значений измеряемого признака. Например,
наиболее известная задача: оценить диапазон, в который попадают 95 %
всех значений совокупности. Если речь идет о нормальном распределении
и объем выборки достаточно большой, этот диапазон задается
выборочным средним плюс-минус два стандартных отклонения. Правило же трех
сигм (выборочное среднее плюс-минус три стандартных отклонения)
задает интервал, в который попадают практически все значения совокупности.
В случае малых выборок для решения этой задачи надо брать более
широкий диапазон, границы которого задаются соотношением
X ± Ка • Sx,
где X — выборочное среднее, Sx — выборочное стандартное (или среднее
квадратическое) отклонение, Ка — коэффициент, который зависит от
доли членов совокупности, которые должны попасть в интервал, от
выбранной вероятности, что они туда действительно попадут 1 — а, и от объема
выборки п. Таблицу для значений коэффициента Ка можно найти,
например, в [12], а графики для Ка представлены в [4]. Так, для вычисления
95 % доверительного интервала (а = 0,05), в который должно попадать
90 % членов совокупности, по выборке объемом 10—20 значение Ка равно
2,3—2,8. А 95 % интервал по выборке того же объема, в который должны
попадать 99 % членов совокупности, определяется значениями Ка,
равными 3,7—4,4. Если несколько увеличить объем выборки п = 20—30, то для
-800-

95 % доверительного интервала (а = 0,05), в который должно попадать
90 % членов совокупности Ксс, равно 2,14 — 2,3. А 95 % интервал по
выборке того же объема, в который должны попадать 99 % членов
совокупности, определяется значениями Ксс, равными 3,4—3,7. Видно, что с
ростом объема выборки значения коэффициентов убывают и в пределе (при
бесконечно больших значениях п) стремятся к критическим значениям для
стандартного нормального распределения.
При расчете доверительных интервалов для значений признака нужно
обратить внимание, что в расчетную формулу входит именно выборочная
дисперсия, а не стандартная ошибка средней арифметической. Ошибочная
подстановка в формулу стандартной ошибки средней приводит к
построению другого интервала, а именно интервала, в который с вероятностью
95 % попадет генеральное среднее совокупности.
X. Анализ корреляции
Одним из важных разделов статистики является корреляционный
анализ. Понятие корреляции отражает главным образом степень
выраженности связи между вариационными рядами. Наглядно эта связь может быть
отражена графически На координатной плоскости по оси абсцисс
откладывают значения одного вариационного ряда, а по оси ординат — другого.
Совокупность таких точек на координатной плоскости (их число равно
числу наблюдений) создает общую картину корреляции и обычно
позволяет построить некоторую усредненную кривую (чаще — прямую)
взаимозависимости параметров, составляющих оба вариационных ряда. В данном
случае эти два вариационных ряда для нас равноправны в причинном
смысле. Характер и выраженность связи между двумя случайными
величинами XI и Х2, имеющими нормальное распределение, устанавливаются
коэффициентом корреляции:
]Г(ХП-Х1) • (X2i-X2)
г = '-' (34)
1]Г(Xli-Xl)2 • (X2i-X2)2
где Xli и X2i — соответствующие значения параметра в i-м наблюдении; XI,
Х2 — средние значения рядов, состоящих из п наблюдений. Вычисленный
коэффициент корреляции является выборочной оценкой генерального
коэффициент корреляции совокупности, а значит, как и любая случайная
величина, имеет ошибку от. Отношение выборочного коэффициента
корреляции к своей ошибке является критерием для проверки нулевой гипотезы о
равенстве нулю генерального коэффициента корреляции совокупности (или
соответственно о независимости случайных величин XI и Х2):
tr = r*J3- (35)
Число степеней свободы для проверки критерия равно f = n — 2,
гипотезу проверяют по таблицам распределения Стьюдента (табл. 1) в
соответствии с выбранным уровнем значимости. Если вычисленное значение
превзойдет или окажется равным соответствующему табличному, нулевую
гипотезу отвергают.
26 - 762
- 801 -

Существуют и другие формулы для вычисления коэффициентов
корреляции, а также эти формулы могут уточняться по отношению к большим и
малым выборкам [7, 9, 13, 15, 16]. Так, было установлено, что при
выборках малых объемов (п < 30) расчет коэффициента по этим формулам дает
заниженные оценки соответствующего генерального параметра. Для
корректировки можно применять, например, z-преобразование Фишера:
z=l/2 1n|4i- (36)
Значения z принимают свои значения в интервале от плюс до минус
бесконечности, распределение этой величины приближенно нормальное.
Тогда критерием достоверности является показатель:
tz = z* Vn - 3 . (37)
По таблице распределения Стьюдента (табл. 1) для выбранного а и
числа степеней свободы f = n — 2 проверяют нулевую гипотезу о том, что в
генеральной совокупности этот параметр равен 0. Гипотезу отвергают на
выбранном уровне значимости, если tz превзойдет соответствующее
табличное значение.
Однако независимо от способа вычисления коэффициент корреляции
обладает определенными свойствами. Величина коэффициента корреляции
всегда заключена в пределах — 1 < г < 1. Если г < 0, то это означает, что с
увеличением в вариационном ряду наблюдаемых величин XI
соответствующие им значения Х2 второго вариационного ряда в среднем
уменьшаются. Если г > 0, то с увеличением одного параметра другой параметр
также в среднем возрастает. Если г = 0, то это означает, что параметры XI и
Х2 абсолютно независимы. При г = 1 между параметрами существует
прямо пропорциональная функциональная зависимость (в
медико-биологических исследованиях крайне редкий случай). Чем больше абсолютная
величина коэффициента корреляции, тем при данном объеме выборки больше
доверительная вероятность того, что характер связи действительно
соответствует полученному коэффициенту корреляции.
В медико-биологических приложениях часто встречаются случаи, когда
характеристики взаимосвязанных структур оцениваются лишь качественно.
При этом приходится оперировать так называемыми ранговыми
коэффициентами корреляции [6, 7, 9, 15, 16]. Кроме того, такой
непараметрический подход применяется в случае малых выборок. Так, например,
коэффициент корреляции рангов, предложенный К. Спирменом, вычисляется
по формуле:
6 ■ £di2
где di — разность между рангами сопряженных признаков в обобщенном
ряду, п — число парных членов ряда. При полной связи ранги признаков
(при расстановке их в обобщенном ряду) совпадут и разность между ними
будет равна 0, соответственно коэффициент корреляции будет равен 1.
Если же признаки варьируют независимо, коэффициент корреляции
получится равным 0.
Аналогично коэффициент корреляции рангов является оценкой
соответствующего генерального параметра, его значимость оценивается с
помощью статистики:
- 802-

rst = -^=(1 - -^т) , (39)
где za и m связаны соотношениями с уровнем значимости: для a = 5 %
Z = 1,96 и m = 0,16; для a = 1 % Z = 2,58, m = 0,69. Нулевую гипотезу
отвергают, если полученное значение rs превзойдет или окажется равным
рассчитанному критическому значению rst.
В биометрии, кроме того, известны задачи, в которых требуется
оценить зависимость некоторого признака Z сразу от нескольких других
признаков: xl, х2, ..., хт. Эти задачи решаются методами многомерного
корреляционного и регрессивного анализа [7, 9, 13, 15, 16].
Важно понимать, что коэффициент корреляции удовлетворительно
характеризует лишь связи, не слишком отклоняющиеся от прямолинейных
(линейная зависимость). Первоначально оценить, к какому типу
относится данная связь: прямолинейному или криволинейному, можно,
построив эмпирическую линию регрессии. Более точно допустимая степень
отклонения связи от прямолинейной определяется при помощи
критериев криволинейности. Если изучаемая связь является криволинейной,
силу такой связи можно оценивать с помощью корреляционных
отношений дисперсий или методами дисперсионного анализа. Подробнее с
соответствующими формулами можно познакомиться в справочниках или
книгах [7, 9, 15].
Мы хотим обратить внимание читателей на принципиальные ошибки,
которые достаточно часто возникают при оценке корреляционных
зависимостей. Одна из наиболее распространенных ошибок — отсутствие
проверки статистической значимости рассчитанного коэффициента корреляции.
Часто имеющихся объемов выборок недостаточно для получения
статистически значимого выборочного коэффициента корреляции. Если
соответствующий критерий показал отсутствие значимости оцененного
коэффициента корреляции, можно для полученного значения г оценить объем
выборки п, достаточный для окончательного решения вопроса о
статистической значимости выборочного коэффициента корреляции (т. е. для
опровержения нулевой гипотезы об отсутствии корреляции, если корреляция
действительно существует):
п = Ц + 3, (40)
z
где величина Za задается по принятому уровню значимости (предельно
точки распределения Стьюдента — табл. 1), а z — преобразование
рассчитанного коэффициента корреляции г (формула 36).
Однако при обнаружении статистически достоверной корреляции
между явлениями часто возникает другая ошибка — желание связать их
непосредственной причинной связью. Неверная логическая цепочка выводов
при этом приводит к ошибочному заключению: раз явления А и В
находятся в тесной корреляционной связи и явление В возникает во времени
позднее А, следовательно, А является причиной В. Однако явления А и В
могут быть не только не связаны друг с другом причинно-следственной
связью, но и не иметь единой первопричины.
Пример 11.
Изучали зависимость между содержанием креатинфосфата в ткани
сердца и приростом концентрации молочной кислоты в крови
лабораторных животных (пример 1, 2 и 7-й столбец табл. 11). Прежде всего построи-
26*
- 803-

ли линию регрессии для изучаемых параметров и убедились, что данная
зависимость хорошо аппроксимируется прямой, т. е. связь является
линейной (рис. 4). Для оценки тесноты такой связи рассчитаем коэффициент
корреляции (параметрический). Так, значение коэффициента корреляции,
оцененного по формуле (34), равно г = —0,91. Знак минус означает, что
большим значениям одного признака соответствуют меньшие значения
другого. Оценим значимость рассчитанного коэффициента корреляции,
значение статистики tr = —6,17. Проверяем данную статистику по
таблицам распределения Стьюдента (табл. 1) для числа степеней свободы f =
= 10 — 2 = 8 и уровня значимости 5 %. Рассчитанное значение статистики
(tr = —6,17) по модулю превосходит соответствующее табличное значение
(2,31). Таким образом, нулевую гипотезу отвергают на уровне значимости
р < 0,05, и рассчитанный коэффициент корреляции признается
статистически значимым. Проверим нулевую гипотезу в отношении z
преобразованного коэффициента корреляции. Преобразование Фишера для
рассчитанного коэффициента корреляции z = — 1,53; соответствующее значение
статистики tz = —4,05. Это рассчитанное значение по модулю превосходит
соответствующее табличное 2,31 (табл. 1, f = 8, ос = 0,05). А значит, вывод
о статистической значимости коэффициента корреляции подтверждается.
Оценим для нашего примера коэффициент корреляции рангов. Если бы
отдельные варианты ряда не повторялись, их рангами были бы
натуральные числа от 1 в порядке возрастания. Но одинаковым значениям вариант
присваиваются ранги, равные средним арифметическим их рангов.
Величина di представляет собой попарные разности рангов изучаемых выборок.
В качестве правила для проверки правильности ранжирования используют
равенство 0 суммы di.
Сумма d,2 равна 296, по формуле (38) для п = 10 получаем ранговый
коэффициент корреляции rs = -0,82. Критическая точка, рассчитанная по
формуле 39 для уровня значимости 5 % (za = 1,96, m = 0,16) равна 0,64.
Так как значение рангового коэффициента корреляции по модулю
превосходит соответствующее критическое значение, с вероятностью более
95 % можно утверждать, что между сравниваемыми параметрами
существует отрицательная корреляционная связь.
XI. Задачи статистической обработки кривых "доза—эффект"
Для изучения влияния различных доз препарата в доклинических
испытаниях обычно используется альтернативный способ описания данных
эксперимента. При этом, как правило, опыт ставят так, чтобы дозы
принимали определенные значения из изучаемого диапазона. Такие значения
дозы являются аргументом функции "доза—эффект". Значения такой
функции или "ответы " могут принимать лишь два противоположных
значения: наличие или отсутствие эффекта (гибель, судороги, изменение
положения, появление определенных симптомов и т. д.). Доля р
тест-объектов, дающих положительный ответ, рассматривается как оценка
вероятности реагирования при данной дозе. Эта доля может изучаться методами,
описанными выше: построение доверительного интервала для доли,
выяснение значимости различий долей для сравниваемых групп и т. д. Однако
исследователя может интересовать связь между вероятностью реагирования
р и интенсивностью воздействия (доза D). Обычно доля р возрастает с
увеличением D, принимая значения от 0 до 1. Данная зависимость называется
кривой эффекта или кривой "доза—эффект " и изображается несимметрич-
- 804-

ной S-образной кривой (рис. 5А). Эта кривая может быть построена и в
логарифмических координатах lg(D) — р (рис. 5Б).
Анализ кривой "доза—эффект " заключается в оценке с ее помощью
обобщенных численных характеристик, отражающих наиболее
существенные стороны изучаемого явления. Одной из таких характеристик может
служить доза, вызывающая эффект у 50 % тест-объектов. Ее называют
50 % эффективной дозой и обозначают ЭД50. Для некоторых
лекарственных препаратов может употребляться показатель 50 % летальная доза
ЛД50. Показателем широты фармакологического действия является
индекс, равный отношению ЛД50 к ЭД50; подробнее об этом в [2].
Существует достаточно много методов оценки ЭД50 (метод Рида и Менча, метод
Кербера, метод Беренса, формула Г. Н. Першина, графические методы
пробит-анализа и др.), каждый из которых имеет свои преимущества и
недостатки. Детальное изложение этих методов содержится в [2, 21]. Мы
остановимся лишь на некоторых из них. Надо обратить внимание, что
независимо от выбранного метода расчета величина ЭД50 оценивается по
выборочным данным, поэтому для нее необходимо строить доверительные
интервалы.
Метод Рида и Менча — один из наиболее простых и часто употребимых
методов определения ЭД50, однако условием его применения является
изучение равноотстоящих доз в серии опытов и одинаковой численности
тест-объектов для каждой дозы. Метод Кербера, например, свободен от
этих недостатков, но имеет свои ограничения. Точность этого метода
снижается из-за ошибок при вычислении площадей методом трапеций и из-за
неточного экспериментального определения значения дозы, при которой
приближенно достигается 100 % положительный результат.
От указанных ограничений и недостатков можно избавиться, если
допустить, что кривая "доза—эффект" генеральной совокупности после
логарифмического преобразования координат приближенно описывается
нормальным законом распределения. Это предположение и лежит в основе
так называемого пробит-метода. Тогда доли р положительных ответов
можно приравнять к накопленным частотам z нормального распределения,
которые задаются соотношением:
Z = Ф(^М) , (41)
где Ф — интеграл вероятностей, М и а — параметры нормального
распределения.
В дальнейшем при описании данного метода будем обозначать буквой 1
величину lg(D) и для простоты называть ее дозой, тогда 150 — доза, при
которой половина тест-объектов дают положительный ответ. Эта величина
и позволяет в дальнейшем оценить искомое значение ЭД50.
Заменяя в этой формуле z на р, х на 1, и М на 150, получаем:
Р = Ф(^0). (42)
Нам нужно получить зависимость доли р от дозы 1, для этого будем
строить график, откладывая по оси ординат вместо значений р значения
У' = Ч>(Р), (43)
где Ц1 — функция, обратная интегралу вероятностей Ф, то есть р = Ф(у'), ее
значения определяются по специальным таблицам [12, 13, 19]. Таким
образом
-805 -

т. е. , получаем уравнение прямой линии. Значит, если откладывать по оси
абсцисс значения 1, а по оси ординат — значения у' = vj/(p), то точки будут
представлять прямую линию с углом наклона 1/а. При значениях р<0,5
соответствующие значения у' будут меньше нуля. Для исправления этой
ситуации производится корректировка значений у':
У = ч/(Р) + 5, (45)
Получаемые значения у и называют пробитами. Обратим внимание, что
значения пробитов для р = 0 и р = 1 нельзя найти по такой формуле. На
практике часто применяют замену р = 0 на р = V5ni> ар=1нар = 1 — 1/
5ni.
Поскольку в доклинических испытаниях численность тест-объектов в
группах невелика, удобно пользоваться специальной таблицей, в которой
пробит для данного опыта находится непосредственно по общему числу
тест-объектов в опыте и числу положительных ответов (табл. 8), и уйти от
использования таблиц интеграла вероятностей.
Значение 150 задается абсциссой точки, ордината которой равна 5
(соответствует р = 0,5). Приближенно эту точку можно найти графически,
проведя через нанесенные на график экспериментальные точки наилучшим
образом описывающую их прямую. Известны более сложные методы
определения значения 150, и они очень подробно разобраны, например, в [2].
Известны также различные методы оценки стандартной ошибки 150.
Так, достаточно точной считается формула:
ст/50 = —g— (46)
где п' — число тест-объектов, для которых значения пробитов находятся в
пределах от 3,5 до 6,5. Величина а задается выражением и оценивается по
построенному графику:
а = у2*(/(у = 6) - /(у = 4)). (47)
Известны методы оптимизации, позволяющие достаточно точно
построить распределение вероятности того, что случайно отобранное из
совокупности животное дает положительную реакцию на данную дозу.
Например, оценив с помощью метода максимального правдоподобия
параметры такого распределения, можно рассчитывать дозы, необходимые для
получения любого заданного значения отклика [15]. Однако эти методы
достаточно сложны и требуют серьезной математической подготовки.
Среди упрощенных методов, позволяющих осуществлять графический
пробит-анализ при необходимости даже на обычной миллиметровой
бумаге без использования логарифмически-пробитной сетки, широкое
распространение получил метод Литчфилда и Уилкоксона. Этот метод и его
модификация 3. Ротом детально изложены в [2], там же даны необходимые
для расчетов номограммы и разобраны приемы вычислений. Мы лишь
коротко рассмотрим основные принципы метода.
На первом этапе для каждой испытанной дозы заполняют
соответствующую строку рабочей таблицы для последующей проверки критерия х2-
Структура рабочей таблицы такова [2]:
Если в испытании несколько доз не вызвали эффекта ни у одного
животного или, наоборот, вызвали эффект у всех животных в группе, то в
- 806 -

таблицу вносят не более чем по две такие дозы. Однако в опыте доходить
до таких доз не обязательно.
На втором этапе на логарифмически-пробитную сетку наносят точки,
используя данные 1—3 таблицы, при этом точки с 0 и 100 % эффектом не
наносятся. С помощью прозрачной линейки нанесенные точки
соединяются прямой линией. На третьем этапе по проведенной кривой оценивают
процент эффекта, соответствующий каждой из испытанных доз,
получаются ожидаемые эффекты для столбца 4 таблицы. В таблицу не вносят
ожидаемые эффекты, если они меньше 0,01 или больше 99,9 %. Эффекты для
неэффективных доз или доз со 100 % эффектом корректируются с
помощью специальных таблиц [2], а исправленные значения вносят в 3-ю
колонку таблицы и на построенный график.
Далее проверяют, соответствуют ли проведенная прямая новым точкам.
В случае несоответствия прямая проводится заново. После этого
пересчитывают и ожидаемые и исправленные значения.
Четвертый этап начинается после того, как вы убедитесь зрительно, что
точки на графике достаточно хорошо описываются проводимой прямой.
Математически это соответствие проверяется по критерию х2 по формуле,
аналогичной формуле (32). Однако в данном случае величина критерия
рассчитывается как сумма (по всем занесенным в таблицу 17 строкам)
квадрата разности процента ожидаемого и наблюдаемого эффектов
(квадрат значения из столбца 5), деленного на произведение ожидаемого
эффекта (столбец 4), и эффекта, обратного ожидаемому (100 % минус
значение из столбца 4). Без дополнительных вычислений слагаемые для
требуемой тестовой статистики могут быть оценены с помощью специальных
номограмм [2]. Тогда величиной статистики критерия будет сумма этих
слагаемых для каждой дозы, умноженная на среднее число животных в
группе. Число степеней свободы для проверки данной гипотезы равно
количеству доз на графике минус 2; обычно уровень значимости
принимается равным 5 %. Статистику проверяют по таблицам распределения х2
(табл. 2). Проведенная прямая соответствует данным эксперимента, если
рассчитанное значение меньше табличного. В противном случае прямую
пытаются провести иначе. Если такие попытки не приводят к лучшей
аппроксимации, формулы для дальнейших расчетов будут несколько
отличаться [2].
Если же прямая достаточно хорошо описывает данные, следующий этап
связан с определением ЭД50 и ее доверительных границ. Для этого из
графика находят дозы, ожидаемый эффект которых равен 16, 50 и 84 %.
Буквой п' обозначим общее количество животных, которые участвовали в
испытании доз, давших ожидаемый эффект в диапазоне 16—84 %
(соответственно величина пробитое в диапазоне 4—6). Далее вычисляется
величина S:
S = 0,5*(ЭД84/ЭД50 + ЭД50/ЭД16) (48)
и величина фактора гЭД50 (также может быть определена по нонограмме
И):
ОД50 = S2'777"'. (49)
95 % доверительные границы для величины ЭД50 вычисляются так:
нижняя граница задается соотношением ЭД50 / 1ЭД50, а верхняя
соотношением ЭД50 * гЭД50.
Данный метод отличается не только простотой вычисления, он хорош
еще и тем, что позволяет вычислять величины не только ЭД50, но и ЭД
- 807-

любой частоты наступления эффекта [2]. Кроме того; интересны методы
сравнительной оценки фармакологической активности двух соединений,
результаты которых были обработаны по методу Литчфилда и Уилкоксона.
Для такого сравнения обычно используют параметры ЭД50, гЭД50, S и fs.
Эти методы также представлены в [2] наряду с методами расчета среднего
эффективного времени, требуемого для наступления определенного
фармакологического эффекта. В той же работе проанализированы
особенности обработки данных с помощью обычной миллиметровой сетки, что
обычно не приводит к снижению точности метода.
XII. Кривая выживаемости
Статистические методы анализа более отдаленных результатов
воздействия используют понятие выживаемости и представление данных в виде
таблиц и кривых выживаемости [4, 5].
Выживаемость S(t) — это вероятность прожить более t с момента начала
наблюдения. А кривая выживаемости отражает вероятность пережить
любой из моментов времени t после некоторого начального события. Надо
сказать, что подход и математический аппарат, которые относятся к
анализу выживаемости, могут успешно применяться для анализа других
показателей эффекта, например продолжительности до появления опухолей
или метастазов и т. д. Но для простоты изложения в дальнейшем мы будем
говорить только в терминах выживаемости и продолжительности жизни.
Типичная кривая выживаемости представлена на рис. 6. В начальный
момент выживаемость равна 1, затем кривая постепенно понижается и
приближается к 0. Время, до которого доживает половина совокупности,
называется медианой выживаемости.
Как и случае выборочного среднего, в данной задаче существует
понятие кривой выживаемости для совокупности и ее выборочной оценки по
результатам эксперимента. Если бы не возможное выбывание в процессе
эксперимента, выборочная оценка выживаемости S(t) определялась бы как
отношение числа переживших момент t к объему выборки п.
Для учета выбывания при построении таблиц выживаемости
используется, например, моментальный метод. В общем виде математическое
выражение для него задается следующей формулой:
S(t) = П(1 - dtl/,«i), (50)
где dt — число умерших в момент t, nt — число наблюдавшихся к момету t.
Символ произведения означает, что нужно перемножать значения (1 — dt/
nt) для всех моментов времени, когда произошла хотя бы одна смерть в
период от 0 до t.
Полученные результаты расчетов представляются в виде таблицы,
строки которой соответствуют моментам времени, в которые происходила хотя
бы одна смерть, а также в виде графика. Точки на графике также
соответствуют моментам, когда умер хотя бы один из наблюдавшихся. Эти точки
соединяются ступенчатой линией, и этот график и будет выборочной
оценкой кривой выживаемости. Кроме того, построенную кривую можно
охарактеризовать и обобщенным показателем, например медианой. Для
этого надо найти точку, в которой кривая выживаемости впервые
опускается ниже 0,5. Если в эксперименте число умерших было меньше
половины, найти медиану невозможно. При этом обобщенным показателем
может быть любой другой перпентиль (меньше 50 %). По таблицам выживае-
-808-

мости более точно, чем при использовании общепринятого расчета
среднего значения, может быть определен и показатель, называемый средней
продолжительностью жизни.
Допустим, что в испытаниях на 10 животных были получены
следующие результаты: 8 животных умерли через 3, 5, 7 ч (2 животных), 8, 11,
12 ч (2 животных) после начала опыта. Кроме того, в связи с нарушениями
условий опыта 2 животных выбыли из эксперимента через 6 и 9 ч (в
таблице эти события обозначим знаком —). Построим таблицу выживаемости
для таких результатов.
Полученные моментальным методом результаты из табл. 18 приведены
на графике (рис. 7). Для данной кривой выживаемости медиану визуально
оценим как 8 часов, так как в этой точке кривая впервые опустилась ниже
отметки 0,5.
Если кривую выживаемости построить в логарифмической системе
координат (t — InS(t)), то наклон кривой в каждой конкретной временной
точке будет показывать уровень летальности среди выживших животных в
данный период времени.
Как всегда при исследовании выборки, выборочная кривая
выживаемости представляет собой оценку кривой выживаемости для совокупности.
При этом для каждой точки на кривой можно, например, по формуле
Гринвуда определить оценку точности приближения или стандартную
ошибку выживаемости:
as(t) = S(t)* /У . dt' ,~, (51)
' VZJnti(nti-dti)' v '
где сумма берется по всем моментам времени от 0 до t включительно.
Строить доверительные интервалы для выживаемости в момент t
аналогично построению такого интервала для выборочной доли. Такой
доверительный интервал для каждого момента t задается соотношением S(t) ± za
*s(t), где za — двустороннее критическое значение для стандартного
нормального распределения (в случае 95 % интервала Za = 1,96, для других
значений см. табл. 7). Более точный метод построения доверительного
интервала для выживаемости представлен в [4].
В доклинических испытаниях часто возникает необходимость
сравнивать выживаемость различных групп или, другими словами, сравнивать
кривые выживаемости. Если, скажем, в сопоставленных группах получена
одинаковая выживаемость, но при этом в одной из них большая часть
животных погибает в более ранние сроки по сравнению со второй, эти
различия будут наглядно продемонстрированы при построении кривых
выживаемости и скрыты при оценке эффекта прямым методом.
Мы дали лишь упрощенное представление об основных подходах к
оценке эффекта с помощью кривых выживаемости. Более детально с
другими методами построения таких кривых, их статистического анализа и
сравнения можно познакомиться, например в [4, 5, 18].
XIII. Некоторые вопросы планирования эксперимента
Вопросы экономики и этики требуют внимательного отношения к
планированию испытаний лекарственных препаратов. Этот вопрос достаточно
сложен в математическом плане, особенно в случаях, когда при
статистической обработке проведенных испытаний необходимо проверять
несколько статистических гипотез [4, 15, 24, 25] или при невозможности исполь-
- 809-

зования для сравнения показателей эффекта равночисленных групп [5].
Поэтому в рамках данной работы мы познакомим лишь с общими
подходами и приведем несколько наиболее простых приближенных формул для
оценки необходимой численности сравниваемых групп.
Особенностью планирования доклинических испытаний является то,
что используемые в них лабораторные животные составляют однородные
популяции, в большей или меньшей степени различающиеся между
собой. Различие особей влечет за собой необходимость статистического
оценивания. Исследователь никогда не имеет в своем распоряжении всей
популяции (генеральной совокупности) для постановки опытов и обычно
имеет дело лишь с выборкой из этой совокупности. При этом особую
важность приобретают задачи планирования, например определения
объема выборки, при котором она отражает свойства генеральной
совокупности достаточно точно. На практике часто на этапе планирования
испытаний эта задача не решается строго, а планируемый объем
назначается на основе прошлого опыта проведения сходных испытаний. К
сожалению, о важности решения этой задачи вспоминают, как правило, когда
испытания уже закончены и начинается процесс статистической
обработки полученных результатов. При этом может оказаться, что
полученных данных недостаточно для статистически достоверного ответа на
вопросы, ради которых и проводилось испытание. Исследователям надо
иметь в виду, что неэтичными являются испытания как имеющие
чрезмерно большой объем испытуемых, так и испытания слишком малого
объема.
Чтобы ответить на вопросы, поставленные перед доклиническим
испытанием препарата, с помощью различных критериев приходится
проверять нулевую гипотезу об отсутствии эффекта, сравнивая при этом
выборочные средние доли, кривые выживаемости и т. п. Вывод об
отсутствии таких различий тесно связан с понятием чувствительность критерия.
Чувствительностью критерия называется как раз способность его
обнаружить различия. Чтобы оценить чувствительность критерия, нужно задать
величину различий, которые он должен выявлять. Если в результате
проверки гипотезы о существовании различий был сделан вывод об их
отсутствии, необходимо проверить, была ли чувствительность критерия
достаточной для обнаружения таких различий. Чувствительность зависит
от величины различий, разброса данных и объема выборки. При этом
наиболее важным параметром является объем выборки, чем он больше,
тем меньшие различия окажутся статистически значимыми. Таким
образом появляется возможность заранее оценивать численность выборок,
необходимых для выявления эффекта. Надо заметить, что вопросы
чувствительности важны и при использовании методов корреляционного,
регрессионного, дисперсионного анализа и др. методов статистики [4, 19,
20].
С понятием чувствительности критерия связаны понятия ошибок I и II
рода. Так, ошибка I рода — возможность ошибочно отклонить нулевую
гипотезу, то есть найти различия там, где их нет (ложноположительный
результат). Приемлемая для данного эксперимента вероятность ошибки I
рода называется уровнем значимости а. Ошибка II рода возникает, если мы
принимаем нулевую гипотезу, когда она не верна, другими словами, не
находим существующее различие (ложноотрицательный результат).
Вероятность ошибки II рода обозначается буквой р. Вероятность обнаружить
различия, т. е. чувствительность или мощность критерия, равна 1 — р. При
прочих равных условиях, тот критерий имеет преимущество, который име-
- 810-

ет меньшую вероятность ошибки II рода. Эту ситуацию иллюстрирует рис.
8, на котором схематично представлены распределения нулевой (А) и
альтернативной (Б) гипотез для проверки одностороннего теста о наличии
статистически значимых различий.
Таким образом, на чувствительность критерия различные факторы
влияют так:
• уровень значимости а — чем меньше к, тем ниже чувствительность;
• отношение величины различий к стандартному отклонению — чем
оно больше, тем больше чувствительность (для количественного
определения признака); частота события — чем больше число (или
доля) событий, тем выше чувствительность (для учета реакции в
альтернативной форме);
• объем выборки — чем больше, тем больше чувствительность.
Подробнее этот вопрос разобран в [1, 4, 9, 15].
Надо заметить, что в большинстве случаев параметрические критерии
являются более мощными, чем их непараметрические аналоги, и, если
соблюдаются все предпосылки использования параметрического критерия,
замена его соответствующим непараметрическим может привести к
увеличению вероятности ошибки второго рода. Подробнее об этом можно
узнать в [17].
Кроме того, надо обратить внимание, что для различных критериев
чувствительность вычисляется по-разному. Соответственно по-разному
решается и обратная задача: при выбранных значениях вероятности ошибок I и
II рода (заданной чувствительности) и желаемой величине различий между
эффектами оценить требуемый объем выборок для получения
статистически достоверных результатов сравнения. Существуют графики,
номограммы [4, 25] и таблицы [5], связывающие чувствительность с величиной
различий для наиболее часто встречающихся значений а и различных
объемов выборок. Мы приведем лишь некоторые формулы для наиболее часто
используемых критериев. Приведенные ниже формулы являются
приближенными и применимы при объемах выборок больше 20.
Если критериями эффекта служат количественные признаки,
выражаемые статистическими средними величинами, то формула расчета
минимального объема групп для сравнения двух показателей с учетом
вероятности ошибок I и II рода имеет вид (равновеликие группы):
n= (Za + Zp)2Sxo +,Sxk . (52)
д2
где Sxo и Sxk — стандартные отклонения сравниваемых показателей в
опытной и контрольной группах, Д — требуемая величина различий между
средними значениями сравниваемых групп, Za и Zp — критические
значения нормального распределения, соответствующие установленным
уровням ошибок аир, определяются по таблицам (табл. 7).
При альтернативной форме описания эффекта с помощью частот (или
долей) Р0 и Рк необходимое число наблюдений при равных по
численности опытной и контрольной группы определяется по формуле:
п = (Za + ZP)2PO(1QQ-P0) + Pk(100-Pk), (53)
д2
где Д — величина разности между частотами РО - Рк. Такой метод дает
достаточно точные результаты при 25% < Р <75%. При других значениях
частот для корректировки возникающих искажений, как говорилось выше,
-811 -

вводится поправка ср = 2*arcsinVp (табл. 6). Объем выборки вычисляется
при этом как:
n=2(Za + Zp)\ (54)
(фо-фк)
Финансовые, этические или другие соображения,могут требовать
формирования различных по численности опытной и контрольной групп.
Если известна фиксированная численность одной (например, контрольной
группы), nk можно оценить требуемую численность другой группы (пО)
для формирования статистически значимого заключения о различиях в
эффекте между ними.
В случае количественного представления признаков эта формула
выглядит так [5]:
no= (Za + Zp)2Sxo2 (5
A2_(Za + ZP)2Sxk2
nk
Для альтернативного представления признаков:
по= (Za + Zp)W (56)
(ф0_ф ^(Za±Z^Sxe
nk
Данные формулы предполагают использование одностороннего теста
(показатель одной группы лучше показателя другой, исключая
возможность превосходства последнего). В случае необходимости "улавливания"
различий в эффекте в ту или иную сторону применяется двусторонний
тест. Приведенные формулы для расчета при этом не меняются, но
значение уровня значимости а.заменяется на а/2. Подробнее эти вопросы
рассмотрены в [5, 18, 24, 25].
Однако на практике при использовании этих достаточно простых
формул могут возникнуть проблемы. Дело в том, что для некоторых
испытаний заранее может быть неизвестна величина дисперсии (или среднее
квадратичного отклонения) признака. Обычно эта проблема решается с
помощью использования вместо этой величины ее аналога, известного из
проведенных ранее похожих испытаний, или используются литературные
данные. Кроме того, уже на этапе планирования испытаний расчеты могут
показать, что необходимый объем контрольной и тестируемой групп для
констатации требуемых различий при желаемых уровнях ошибок первого и
второго рода превышает реально возможный для проведения таких
испытаний. Однако объем групп можно попробовать снизить, варьируя
желаемые значения ошибок первого и второго рода или величины различий
между группами. Если и это не приводит к желаемому результату, надо
отдавать себе отчет в ограниченных возможностях такого эксперимента. Это
также является сигналом к более внимательному отношению к результатам
"негативных" испытаний (различия не были найдены) с малым объемом
выборок, поскольку именно недостатки в планировании эксперимента
могли привести к тому, что изучавшиеся методы лечения, имеющие
клинически важный эффект, были забракованы.
Известны также формулы для планирования исследований в случае
применения методов анализа выживаемости.
Проблема усложняется, если в ходе планируемого испытания должны
- 812-

быть получены ответы на несколько вопросов о различных параметрах
эффекта, что соответственно потребует статистической проверки нескольких
критериев значимости различий, эта проблема подробно освещена,
например, в [4, 25].
В заключение можно сказать, что хотя на практике вычисление
требуемого объема выборок для испытаний препаратов является скорее
оправданием уже выбранной численности групп, результаты испытаний не могут
считаться достоверными без вычисления оценки чувствительности или
мощности критериев, применявшихся для констатации наличия или
отсутствия статистически значимых различий. Детальный анализ ошибок
планирования испытаний, которые привели в свою очередь к сомнительным
выводам в результате статистической обработки экспериментальных
данных, проведен авторами [24], и их выводы, безусловно, имеют
теоретическую и практическую ценность.
Л итература
{.Айвазян С. А., Енюков И. С, Мешалкин Л. Д. Основы моделирования и первичная
обработка данных. — М.: Финансы и статистика, 1983.
2. Беленький М. Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта.
— Л.: Гос. изд-во мед. литературы, 1963.
3. Браунли К. А. Статистическая теория и методология в науке и технике. — М.:
Наука, 1977.
4. Стентон Г. Медико-биологическая статистика. — М.: Практика, 1999.
5. Двойрин В. В., Клименте А. А. Методика контролируемых клинических испытаний.
— М.: Медицина, 1985.
6. Зайцев Г. Н. Методика биометрических расчетов. — М.: Наука, 1973.
7. Кендалл М., Стьюарт А. Многомерный статистический анализ и временные ряды.
— М., 1976.
8. Кокс Д., Снелл Э. Прикладная статистика. Принципы и примеры. — М.: Мир, 1984.
9. Лакин Г. Ф. Биометрия. — М.: Высшая школа, 1990.
10. Митропольский А. К. Техника статистических вычислений. — М., 1971.
11. Мэйндоналд Дж. Вычислительные алгоритмы в прикладной статистике. — М.:
Финансы и статистика, 1988.
12. Мюллер П., Пойман П., Шторм Р. Таблицы по математической статистике. — М.:
Финансы и статистика, 1982.
13. Поллард Дж. Справочник по вычислительным методам статистики. — М.: Финансы
и статистика, 1982.
14. Поляков И. В., Соколова Н. С. Практическое пособие по медицинской статистике.
— Л.: Медицина, 1975.
15. Рафалес-ЛамаркаЭ. Э., Николаев В. Г. Некоторые методы планирования и
математического анализа биологических экспериментов. — Киев: Наукова Думка, 1971.
16. Рокицкий П. Ф. Биологическая статистика. — Минск: В. ш., 1973.
17. Рунион Р. Справочник по непараметрической статистике. — М.: Финансы и
статистика, 1982.
18. Сергиенко В. И., Бондарева И. Б. Математическая статистика в клинических
исследованиях. — М.: Гэотар медицина, 2000.
19. Справочник по прикладной статистике / Под ред. Э. Ллойда, У. Ледермана. - М.:
Финансы и статистика, 1989.
20. Справочник по теории вероятностей и математической статистике / Под ред. В. С.
Королюка, Н. И. Портенко и др. — М.: Наука, 1985.
21. Теннант-Смит Дж. Бейсик для статистиков. — М.: Мир, 1988.
22. Урбах В. Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских
исследованиях. - М., 1976.
23. Черныш В. И., Напалков А. В. Математический аппарат биологической
кибернетики. - М., 1976.
24. Medical Uses of Statistics / Edited by Bailor J. C, Mosteller F. — NEJM Books, 1986.
25. Senn S. Statistical Issues in Drug Development. — John Wiley & Sons, 1997.
- 813 -

OO -4
-4 СЛ
OO 00
to to
i-1 О
О 00
^ 40
Ю Ю
U\ 4^
4D -J
OO СЛ
40 40
Ю M
00 -4
00 KJ\
as oo
40 -4
U) UJ
i-1 О
t-л *-
to 40
as i—
U) U)
4^ U)
00 4^
О О
<-Л 40
U) U)
-4 tyi
i-1 -4
Lf\ •—
СЛ 00
Ф- Ф.
Ю О
U) -4
I—" 40
Ю О
as
Lft
,338
40
,369
to
4^
to
to
as
to
4П
as
to
00
00
4^
w\
U)
to
о
о
о
OJ
4^
to
ГТч
-4
OJ
40
to
LA
to
t-л
4^
,339
00
,245
to
to
U)
о
-4
to
4^
4П
4П
as
to
—j
4^
00
00
U)
о
(Л
—J
oo
u>
to
00
о
t*J
-4
as
40
—J
4^
U)
,339
-4
-4
to
О
as
4^
to
СЛ
00
w\
to
ел
■^
1—'
40
to
40
_
4^
*-*
U>
*—
U)
40
U)
ел
н--
to
U)
U)
to
,340
ил
,984
4П
00
^^
to
to
to
U)
СЛ
to
to
4^
-.1
U)
as
to
-4
ел
00
oo
to
40
00
40
U)
4^
LA
to
00
to
,340
4^
,845
00
ел
4^
40
to
о
to
as
to
UJ
U)
U)
-4
to
ел
to
—j
fO
00
U)
о
о
U)
to
4П
О
40
-
О
,341
U)
-4
О
-4
to
-4
Lf\
sr>
as
-.1
t-n
to
*-*
4П
to
О
to
4^
-4
SJ
U4
to
as
--i
ел
-4
U)
^-
to
ел
4^
О
40
342
to
,549
t/i
4П
00
-4
00
U)
о
-4
to
О
4^
00
U)
to
U)
to
о
40
to
Lf\
*—
00
00
to
40
(Л
00
00
40
00
343
,389
4^
as
00
4^
as
sr>
1—'
40
40
О
to
U)
to
as
as
as
to
U)
un
00
40
to
-4
00
-4
—J
00
-4
344
о
to
40
U)
OJ
as
to
t/i
t/i
о
-J
-4
t-л
U)
t-n
to
о
о
40
О
to
*—
40
(Л
t-л
to
ел
*—
to
4^
-4
as
346
40
037
to
о
-4
4^
О
as
-4
as
о
^-»
U)
00
4^
-4
Lf\
to
О
to
-4
00
to
4^
U)
to
to
as
LA
348
-4
841
о
as
4^
Lft
to
(Л
4»
to
4^
4^
4^
40
as
00
to
00
Ln
4^
00
to
to
4^
l/\
00
LA
4^
as
626
40
236
о
—J
о
to
00
U)
U)
t/l
о
00
СТч
_
ел
-.1
t./i
о
to
о
t/1
^*
4л
4^
U)
357
(-П
385
-4
779
40
4^
00
00
1—'
■^
4^
U)
U)
to
-.1
-4
_
4^
00
ел
о
^
00
4^
ел
-4
U)
to
366
4^
О
OO
as
to
-4
00
LA
40
348
i_
U)
4^-
(-П
Ю
oo
u»
CO
_
ел
to
as
as
to
^.
386
to
773
4^
605
LA
40
40
—J
378
40
to
О
о
t/l
4»
-4
„
U)
00
^-<
as
-
о
455
t_.
323
to
706
U)
00
ьп
024
ел
635
—j
879
„
о
00
to
00
-*)
0,5
о
to
LA
о
о
о
о
LA
о
о
to
о
о
о
D05
о
о
•а
о
Н
S
к
S
I
—J СЛ
to to
— to
to to
40 40
о to
U) 4^
40 О
-4 to
8 to
о
40 40
ел оо
to to
la as
oo to
U) U)
to U)
40 -4
Ln
to
U)
to
4П
LA
4^
О
-4
ел
о
to
о
о
to
ел
ел
U)
4^
ел
4^
to
4^
to
4П
00
4^
*-*
4^
4^
О
to
о
to
to
-4
О
U)
t/I
U4
U) to
to to
ел oo
U) U)
о о
*-* ^У1
4^ 4^
to U)
to to
U) to
О 40
to to
о о
4^ 4л
to to
-J -4
t-л ел
U) U)
ел ел
t-n ел
"
to
to
о
<.*>
^->
4^
4^
4^
to
00
to
о
^
to
—J
ел
U)
ел
—j
о
to
to
U)
U)
^
-4
4^
t/i
40
to
—J
to
о
LA
to
-4
-4
U)
ел
40
40
to
to
ел
U)
to
t-n
4^
-4
00
to
ел
to
о
ел
to
-4
00
U)
-4
OO
to
U)
U)
U)
ел
^-n
о
4^
to
ЬП
to
о
ел
to
-4
so
U)
-4
U)
-4
to
^>J
-4
U)
(л
О
t-n
4^
to
4^
to
О
ел
to
00
о
U)
—J
t-n
ел
to
4^
t-n
U)
-4
ЬП
40
ел
to
U)
to
о
-4
to
00
UJ
-4
-4
LA
to
-4
4^
О
U)
ел
00
-4
to
to
to
о
—J
to
00
to
U)
—J
40
4^
to
-.1
00
4^
ел
о
00
ел
to
'—'
to
о
00
to
00
U)
U)
00
to
U)
u>
*->
00
(Л
00
4^
to
so
to
to
о
to
о
40
to
00
ЬП
U)
00
t-n
to
4^
^>J
о
4П
4П
to
U)
,60
^
40
to
о
40
to
00
ел
U)
00
00
to
-4
ел
,66
ел
4^
,60
i—>
00
to
^.
о
to
00
00
U)
4П
to
2 о
O га Л
ИСЛ0
пеней
боды f
1—'
о
■
я
<5Х
й о
о п> л
01Д S
h ж h
Е л> О
Sc
t-n
1
я
«
н
Р
а\
S
К
(в
3
S
"О
о
ж
S
О
н
ег
г
re
s
Я
"О
S
!=|
О
«
Я
S

Продолжение
Уровень значимости а
f
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
0,5
18,338
19,337
20,337
21,337
22,337
23,337
24,337
25,336
26,336
27,336
28,336
29,336
30,336
31,336
32,336
33,336
34,336
35,336
36,336
37,335
38,335
39,335
40,335
41,335
42,335
43,335
44,335
45,335
46,335
47,335
48,335
49,335
0,25
22,718
23,828
24,935
26,039
27,141
28,241
29,339
30,435
31,528
32,020
33,711
34,800
35,887
36,973
38,058
39,141
40,223
41,304
42,383
43,462
44,539
45,616
46,692
47,766
48,840
49,913
50,985
52,056
53,127
54,196
55,265
56,334
0,10
27,204
28,412
29,615
30,813
32,007
33,196
34,382
35,563
36,741
37,916
39,087
40,256
41,422
42,585
43,745
44,903
46,059
47,212
48,363
49,513
50,660
51,805
52,949
54,090
55,230
56,369
57,505
58,641
59,774
60,907
62,038
63,167
0,05
30,144
31,410
32,671
33,924
35,172
36,415
37,652
38,885
40,113
41,337
42,557
43,773
44,985
46,194
47,400
48,602
49,802
50,998
52,192
53,384
54,572
55,758
56,942
58,124
59,304
60,481
61,656
62,830
64,001
65,171
66,339
67,505
0,025
32,852
34,170
35,479
36,781
38,076
39,364
40,646
41,923
43,195
44,461
45,722
46,979
48,232
49,480
50,725
51,966
53,203
54,437
55,668
56,896
58,120
59,342
60,561
61,777
62,990
64,201
65,410
66,617
67,821
69,023
70,222
71,420
0,01
36,191
37,566
38,932
40,289
41,638
42,980
44,314
45,642
46,963
48,278
49,588
50,892
52,191
53,486
54,776
56,061
57,342
58,619
59,893
61,162
62,428
63,691
64,950
66,206
67,459
68,710
69,957
71,201
72,443
73,683
74,919
76,154
0,005
38,582
39,997
41,401
42,796
44,181
45,559
46,928
48,290
49,645
50,993
52,336
53,672
55,003
56,328
57,648
58,964
60,275
61,581
62,883
64,181
65,476
66,766
68,053
69,336
70,616
71,893
73,166
74,437
75,704
76,969
78,231
79,490
0,001
43,820
45,315
46,797
48,268
49,728
51,179
52,620
54,052
55,476
56,892
58,301
59,703
61,098
62,487
63,870
65,247
66,619
67,985
69,346
70,703
72,055
73,402
74,745
76,084
77,419
78,750
80,077
81,400
82,720
84,037
85,351
86,661
Справочник по прикладной статистике. Под ред. Ллойда Э., Ледермана У. — М:
Финансы и статистика, 1989.
Таблица За. Критические значения статистики tl для проверки сомнительных вариант
по ранжированному ряду
п
4
5
6
7
Уровни
значимости а, %
5
0,76
0,64
0,56
0,31
1
0,89
0,78
0,70
0,64
п
13
14
15
16
Уровни
значимости а, %
5
0,36
0,35
0,34
0,33
1
0,46
0,45
0,44
0,43
п
22
23
24
25
Уровни
значимости а, %
5
0,29
0,28
0,28
0,28
1
0,38
0,37
0,37
0,36
- 815 -

Продолжение
n
8
9
10
11
12
Уровни
значимости а, %
5
0,47
0,44
0,41
0,39
0,38
1
0,59
0,54
0,53
0,50
0,48
п
17
18
19
20
21
Уровни
значимости а, %
5
0,32
0,31
0,31
0,30
0,30
1
0,42
0,41
0,40
0,39
0,38
п
26
27
28
29
30
Уровни
значимости а, %
5
0,27
0,27
0,27
0,26
0,26
1
0,36
0,35
0,35
0,34
0,34
Мюллер П., Нойман П., Шторм Р. Таблицы по математической статистике. — М.:
"Финансы и статистика", 1982
Таблица 36. Критические значения статистики t2 для проверки сомнительных вариант
по ранжированному ряду
п
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Уровни
значимости а, %
5
0,96
0,81
0,69
0,61
0,55
0,51
0,48
0,45
0,43
1
0,99
0,92
0,80
0,74
0,68
0,64
0,60
0,57
0,54
п
13
14
15
16
17
18
19
20
21
Уровни
значимости а, %
5
0,41
0,40
0,38
0,37
0,36
0,35
0,34
0,33
0,33
1
0,52
0,50
0,49
0,47
0,46
0,45
0,44
0,43
0,42
п
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Уровни
значимости а, %
5
0,32
0,31
0,31
0,30
0,30
0,30
0,29
0,29
0,28
1
0,41
0,41
0,40
0,39
0,39
0,38
0,38
0,37
0,37
Мюллер П., Нойман П., Шторм Р. Таблицы по математической статистике. — М.:
Финансы и статистика, 1982.
Таблица 4. Критические значения статистики парного Т-критерия Уилкоксона
(односторонней критерий)
Число парных
наблюдений п
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Уровни значимости а, %
5
0
2
3
5
8
10
13
17
21
1
—
0
0
1
3
5
7
10
12
Число парных
наблюдений п
14
15
16
17
18
19
20
21
22
Уровни значимости а, %
5
25
30
35
41
47
53
60
67
74
1
16
19
23
28
33
38
42
50
56
Лакин Г. Ф. Биометрия. — М.: Высшая школа, 1990.
- 816 -

Таблица 4 (продолжение), (двусторонний критерий) [9]
Число парных
наблюдений п
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Уровни значимости а, %
5
1
3
5
7
9
12
15
18
22
26
1
—
—
1
3
4
6
8
11
14
17
Число парных
наблюдений п
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
Уровни значимости а, %
5
31
36
41
47
53
60
67
74
82
90
1
21
24
29
33
39
44
50
56
62
69
Примечание. Для п > 25 критические точки tst Т-критерия можно по следующей
формуле [9]:
Kt = "(n + 1) _ t* ln(n+l)(2n+T)
4 V 24
где п — число парных наблюдений, t — предельные значения критерия Стьюдента,
зависящие от уровня значимости а.
Таблица 5. Критические значения статистики U-критерия Уилкоксона—Манна—Уитни
(односторонний критерий, а = 0,01)
n2/nl
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
5
0
0
1
6
0
1
2
3
7
0
1
3
4
6
8
0
2
4
6
7
9
9
1
3
5
7
9
11
14
10
1
3
6
8
11
13
16
19
11
1
4
7
9
12
15
19
22
25
12
2
5
8
11
14
17
21
24
28
31
13
2
5
9
12
16
20
23
27
31
35
39
14
2
6
10
14
18
22
25
30
34
38
43
47
15
3
7
11
15
19
24
28
33
37
42
47
51
56
16
3
7
12
16
21
26
31
36
41
46
51
56
61
66
17
4
8
13
18
23
28
33
38
44
49
55
60
66
71
77
18
4
9
14
19
24
30
36
41
47
53
59
65
70
76
82
88
19
4
9
15
20
26
32
38
44
50
56
63
69
75
82
88
94
101
20
5
10
16
22
28
34
40
47
53
60
67
73
80
87
94
100
107
114
п2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Мюллер П., Нойман П., Шторм Р. Таблицы по математической статистике. — М.:
Финансы и статистика, 1982.
- 817-

Таблица 5 {продолжение). Двусторонний критерий, а = 0,01
n2/nl
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
3
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
4
4
4
5
4
0
0
0
1
1
2
2
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
10
10
5
0
1
1
2
3
4
5
6
7
7
8
9
10
11
12
13
14
14
15
16
17
6
2
3
4
5
6
7
9
10
11
12
13
15
16
17
18
19
21
22
23
24
7
4
6
7
9
10
12
13
15
16
18
19
21
22
24
25
27
29
30
32
8
7
9
11
13
15
17
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
37
39
9
11
13
16
18
20
22
25
27
29
31
34
36
38
40
43
45
47
10
16
19
21
24
26
29
31
34
37
39
42
44
47
50
52
55
11
21
24
27
30
33
36
39
42
45
48
51
54
57
60
63
12
23
31
34
37
41
44
47
51
54
58
61
64
68
71
13
34
38
42
46
49
53
57
60
64
68
72
76
79
14
42
46
50
54
59
63
67
71
75
79
83
88
15
51
55
60
64
69
73
78
82
87
91
96
16
60
65
70
75
79
84
89
94
99
104
17
70
75
81
86
91
97
102
107
113
18
77
87
92
98
104
109
115
121
19
81
93
99
105
Ш
117
123
129
20
105
112
118
125
131
138
n2/nl
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
Таблица 6. Таблица угловой трансформации q> = 2 arcsinVp
р
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0
0,000
0,644
0,927
1,159
1,369
1,571
1,772
1,982
2,214
2,494
1
0,200
0,676
0,952
1,182
1,390
1,591
1,793
2,004
2,240
2,532
2
0,284
0,707
0,976
1,203
1,410
1,611
1,813
2,026
2,65
2,568
3
0,348
0,738
1,000
1,224
1,430
1,631
1,834
2,049
2,292
2,606
4
0,403
0,767
1,024
1,245
1,451
1,651
1,855
2,071
2,319
2,647
5
0,451
0,795
1,047
1,266
1,471
1,671
1,875
2,094
2,346
2,691
6
0,495
0,823
1,070
1,287
1,491
1,691
1,897
2,118
2,375
2,739
7
0,536
0,850
1,093
1,308
1,511
1,711
1,918
2,141
2,404
2,793
8
0,547
0,876
1,115
1,328
1,531
1,731
1,939
2,165
2,434
2,858
9
0,609
0,902
1,137
1,349
1,551
1,752
1,961
2,190
2,465
2,941
Двойрин В. В., Клименков А. А. Методика контролируемых клинических испытаний. —
М.: Медицина, 1985.
Таблица 7. Критические значения Z стандартного нормального распределения
Уровень значимости а
Односторонний тест
Двусторонний тест
0,005
2,567
2,807
0,01
2,326
2,576
0,012
2,257
2,513
0,02
2,054
2,326
0,025
1,960
2,242
0,05
1,645
1,960
0,1
1,282
1,645
0,2
0,842
1,282
-818-

Таблица 8. Значения пробитое
Число тест-
объектов в
группе
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Число тест-объектов, у которых наблюдается изучаемый эффект
0
3,50
3,36
3,25
3,16
3,10
3,04
2,99
2,95
2,90
2,88
2,84
2,81
2,78
1
4,57
4,33
4,16
4,03
3,93
3,85
3,78
3,72
3,67
3,61
3,57
3,53
3,50
2
5,43
5,00
4,75
4,57
4,43
4,33
4,23
4,16
4,09
4,03
3,98
3,93
3,89
3
6,50
5,67
5,25
5,00
4,82
4,68
4,57
4,48
4,40
4,33
4,26
4,21
4,16
4
6,64
5,84
5,43
5,18
5,00
4,86
4,75
4,65
4,57
4,50
4,43
4,38
5
6,75
5,97
5,57
5,32
5,14
5,00
4,89
4,79
4,71
4,63
4,57
6
6,84
6,07
5,67
5,43
5,25
5,11
5,00
4,90
4,82
4,75
7
6,90
6,15
5,77
5,52
5,35
6,21
5,10
5,00
4,92
8
6,96
6,22
5,84
5,60
5,43
5,29
5,18
5,08
9
7,01
6,28
5,91
5,67
5,50
5,37
5,25
10
7,01
6,33
5,97
5,74
5,57
5,43
11
7,10
6,39
6,02
5,79
5,62
12
—
7,12
6,43
6,07
5,84
13
—
—
7,16
6,47
6,11
14
—
—
—
7,19
6,50
15
—
—
—
—
7,22
Таблица 9. Критические значения статистики q' критерия Даннета (а = 0,05)
f
5
6
7
8
9
10
И
12
13
14
15
16
17
18
19
20
24
30
40
60
120
СО
2
2,57
2,45
2,36
2,31
2,26
2,23
2,20
2,18
2,16
2,14
2,13
2,12
2,11
2,10
2,09
2,09
2,06
2,04
2,02
2,00
1,98
1,96
3
3,03
2,86
2,75
2,67
2,61
2,57
2,53
2,50
2,48
2,46
2,44
2,42
2,41
2,40
2,39
2,38
2,35
2,32
2,29
2,27
2,24
2,21
4
3,29
3,10
2,97
2,88
2,81
2,76
2,72
2,08
2,65
2,63
2,61
2,59
2,58
2,56
2,55
2,54
2,51
2,47
2,44
2,41
2,38
2,35
5
3,48
3,26
3,12
3,02
2,95
2,89
2,84
2,81
2,78
2,75
2,73
2,71
2,69
2,68
2,66
2,65
2,61
2,58
2,54
2,51
2,47
2,44
Интервал сравнения
6
3,62
3,39
3,24
3,13
3,05
2,99
2,94
2,90
2,87
2,84
2,82
2,80
2,78
2,76
2,75
2,73
2,70
2,66
2,62
2,58
2,55
2,51
7
3,73
3,49
3,33
3,22
3,14
3,07
3,02
2,98
2,94
2,91
2,89
2,87
2,85
2,83
2,81
2,80
2,76
2,72
2,68
2,64
2,60
2,57
8
3,82
3,57
3,41
3,29
3,20
3,14
3,08
3,04
3,00
2,97
2,95
2,92
2,90
2,89
2,87
2,86
2,81
2,77
2,73
2,69
2,65
2,61
9
3,90
3,64
3,47
3,35
3,26
3,19
3,14
3,09
3,06
3,02
3,00
2,97
2,95
2,94
2,92
2,90
2,86
2,82
2,77
2,73
2,69
2,65
1
10
3,97
3,71
3,53
3,41
3,32
3,24
3,19
3,14
3,10
3,07
3,04
3,02
3,00
2,98
2,96
2,95
2,90
2,86
2,81
2,77
2,73
2,69
11
4,03
3,76
3,58
3,46
3,36
3,29
3,23
3,18
3,14
з,п
3,08
3,06
3,03
3,01
3,00
2,98
2,94
2,89
2,85
2,80
2,76
2,72
12
4,09
3,81
3,63
3,50
3,40
3,33
3,27
3,22
3,18
3,14
3,12
3,09
3,07
3,05
3,03
3,02
2,97
2,92
2,87
2,83
2,79
2,74
13
4,14
3,86
3,67
3,54
3,44
3,36
3,30
3,25
3,21
3,18
3,15
3,12
3,10
3,08
3,06
3,05
3,00
2,95
2,90
2,86
2,81
2,77
16
4,26
3,97
3,78
3,64
3,53
3,45
3,39
3,34
3,29
3,26
3,23
3,20
3,18
3,16
3,14
3,12
3,07
3,02
2,97
2,92
2,87
2,83
21
4,42
4,11
3,91
3,76
3,65
3,57
3,50
3,45
3,40
3,36
3,33
3,30
3,27
3,25
3,23
3,22
3,16
3,11
3,06
3,00
2,95
2,91
Dunnett С. W.
Vol. 20. - Р. 482—
New Tables for Multiple Comparisons with a Control // Biometrics. — 1964. —
491.
-819-

Таблица
(а = 0,01)
9 {продолжение). Критические значения статистики q' критерия Даннета
f
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
24
30
40
60
120
00
2
4,03
3,71
3,50
3,36
3,25
3,17
3,11
3,05
3,01
2,98
2,95
2,92
2,90
2,88
2,86
2,85
2,80
2,75
2,70
2,66
2,62
2,58
3
4,63
4,21
3,95
3,77
3,63
3,53
3,45
3,39
3,33
3,29
3,25
3,22
3,19
3,17
3,15
3,13
3,07
3,01
2,95
2,90
2,85
2,79
4
4,98
4,51
4,21
4,00
3,85
3,74
3,65
3,58
3,52
3,47
3,43
3,39
3,36
3,33
3,31
3,29
3,22
3,15
3,09
3,03
2,97
2,92
5
5,22
4,71
4,39
4,17
4,01
3,88
3,79
3,71
3,65
3,59
3,55
3,51
3,47
3,44
3,42
3,40
3,32
3,25
3,19
3,12
3,06
3,00
Интервал сравнения
6
5,41
4,87
4,53
4,29
4,12
3,99
3,89
3,81
3,74
3,69
3,64
3,60
3,56
3,53
3,50
3,48
3,40
3,33
3,26
3,19
3,12
3,06
7
5,56
5,00
4,64
4,40
4,22
4,08
3,98
3,89
3,82
3,76
3,71
3,67
3,63
3,60
3,57
3,55
3,47
3,39
3,32
3,25
3,18
3,11
8
5,69
5,10
4,74
4,48
4,30
4,16
4,05
3,96
3,89
3,83
3,78
3,73
3,69
3,66
3,63
3,60
3,52
3,44
3,37
3,29
3,22
3,15
9
5,80
5,20
4,82
4,56
4,37
4,22
4,11
4,02
3,94
3,88
3,83
3,78
3,74
3,71
3,68
3,65
3,57
3,49
3,41
3,33
3,26
3,19
1
10
5,89
5,28
4,89
4,62
4,43
4,28
4,16
4,07
3,99
3,93
3,88
3,83
3,79
3,75
3,72
3,69
3,61
3,52
3,44
3,37
3,29
3,22
11
5,98
5,35
4,95
4,68
4,48
4,33
4,21
4,12
4,04
3,97
3,92
3,87
3,83
3,79
3,76
3,73
3,64
3,56
3,48
3,40
3,32
3,25
12
6,05
5,41
5,01
4,73
4,53
4,37
4,25
4,16
4,08
4,01
3,95
3,91
3,86
3,83
3,79
3,77
3,68
3,59
3,51
3,42
3,35
3,27
13
6,12
5,47
5,06
4,78
4,57
4,42
4,29
4,19
4,11
4,05
3,99
3,94
3,90
3,86
3,83
3,80
3,70
3,62
3,53
3,45
3,37
3,29
16
6,30
5,62
5,19
4,90
4,68
4,52
4,30
4,29
4,20
4,13
4,07
4,02
3,98
3,94
3,90
3,87
3,78
3,69
3,60
3,51
3,43
3,35
21
6,52
5,81
5,36
5,05
4,82
4,65
4,52
4,41
4,32
4,24
4,18
4,13
4,08
4,04
4,00
3,97
3,87
3,78
3,68
3,59
3,51
2,42
Dunnett С. W. New Tables for Multiple Comparisons with a Control // Biometrics. — 1964.
Vol. 20.- P. 482-491.
Таблица 10. Плотность стандартного нормального закона распределения p(t), p(t)
1 ft2l
= ехр< - \ (результат в таблице задан цифрами после запятой)
4гк l2J
t
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
Сотые доли t
0
3989
3970
3910
3314
3683
3521
3332
3123
2897
2661
2420
2179
1
3989
3965
3902
3802
3668
3503
3312
3101
2874
2637
2396
2155
2
3989
3961
3894
3790
3653
3485
3292
3079
2850
2613
2371
2131
3
3988
3956
3885
3778
3637
3467
3271
3056
2827
2589
2347
2107
4
3986
3951
3876
3765
3621
3448
3251
3034
2803
2565
2323
2083
5
3984
3945
3867
3752
3605
3429
3230
ЗОН
2780
2541
2299
2059
6
3982
3939
3857
3739
3589
3410
3209
2989
2756
2516
2275
2036
7
3980
3932
3847
3726
3572
3391
3187
2966
2732
2492
2251
2012
8
3977
3925
3836
3712
3555
3372
3166
2943
2709
2468
2227
1989
9
3973
3918
3825
3697
3538
3352
3144
2920
2685
2444
2203
1965
- 820-

^_,
доли
о;
3
Сот
as
оо
r~
ЧО
in
■Ч-
го
ГМ
O
чп
ГО
г—
""■
оо
>П
г—
„
оо
г—
м-
со
оо
чп
гм
оо
as
М-
оо
~
ГМ
г—
00
in
ОЧ
00
а\
■—i
ОЧ
гм
ЧГ
as
ГМ
00
—н
1П
ON
ГО
in
_
чо
in
""■
ГМ
ОО
in
M-
co
ЧО
ЧП
ГМ
ЧО
~
r—
чГ
ЧО
as
ЧО
SO
™
__,
OS
ЧО
™
if
c—
ro
in
1—1
ГО
"
-4-
ro
ro
чГ
VI
ro
■4-
r--
ro
-4-
Os
ro
' '
in
.—.
-4-
>n
ro
-4-
~"
ЧО
I/-»
-4-
ЧО
Г--
-4-
r--
as
vr
tt
r—
гм
—•
in
M-
ro
\n
T~-l
~~
ГМ
oo
—.
со
со
ГМ
' '
as
ГМ
^~*
oo
ГО
гм
r—
in
ГМ
so
r—
ГМ
in
as
гм
in
r—
in
cj\
о
ro
r~
as
о
ov
oo
as
о
чп
о
о
го
гм
о
о
4t
со
г—
1П
о
""■
4t
г—
о
гм
as
о
ОЧ
о
'—1
чо
чг
с ■>
00
о
оо
—<
оо
о
го
го
оо
о
оо
м-
оо
о
го
чо
оо
о
оо
г~
оо
о
ГО
СЛ
00
о
as
<■>
as
о
in
ГМ
as
о
о
чГ
OS
о
с—
as
ЧО
SO
о
__,
oo
ЧО
u
чГ
СЛ
чо
о
г—
с ■>
г~
о
„
гм
г—
о
4t
го
г—
о
00
чГ
г—
о
_,
ЧО
г—
о
in
г—
г—
о
о
оч
с—
о
00
_
in
in
о
ГМ
ЧО
in
<_5
го
г—
in
о
ЧГ
оо
in
о
чп
as
in
о
00
с ■>
ЧО
о
о
ГМ
ЧО
о
гм
СП
ЧО
о
чГ
чГ
чо
О
ЧО
ЧО
о
as
as
чг
чг
о
as
in
чг
о
оо
ЧО
4t
о
оо
г—
4t
о
оо
оо
4t
о
оо
as
М-
о
оо
<г->
in
о
<Т\
~н
in
о
as
rst
in
о
о
м-
1П
о
о
гм
т
чп
г-1
о
г^
г-1
о
as
г^
гп
О
Г--
оо
ГЛ
О
ЧГ)
as
гл
о
м-
о
м-
о
г-1
—н
м-
о
гм
гм
м-
о
„
т
м-
о
о
тГ
4f
о
L
гм
<г>
as
гм
о
|~-
as
гм
о
гл
с ■>
т
о
<г>
^^
r-i
о
|~-
г-1
о
in
гм
гп
о
гм
г-1
го
о
<Т\
гл
ГЛ
о
|~-
м-
гл
о
ЧО
in
m
о
гм
гм
as
гм
гм
о
in
т
гм
о
„
м-
гм
CJ>
ЧГ)
м-
гм
о
гм
in
гм
о
оо
in
гм
о
м-
ЧГ)
гм
о
<•>
|~-
гм
CJ>
|~-
|~-
гм
о
m
оо
гм
о
m
гм
о
00
1—1
о
м-
00
—н
о
as
оо
—н
О
Tf
as
—н
о
ОО
as
—н
О
т
<■>
гм
о
оо
с ■>
гм
о
г-1
1—1
гм
о
<Т\
I—1
гм
о
м-
гм
гм
о
чГ
гм
<Т\
г-1
J—1
о
т
м-
,—1
о
|~-
м-
—н
о
„
in
.—1
о
м-
1П
J—1
о
оо
in
J—1
о
т
so
—*
о
|~-
ЧГ)
I—1
о
_
|~-
1—1
о
in
|~-
1—1
о
in
гм
|~-
о
—н
о
<•>
1—1
о
г-1
1—1
1—1
о
ЧО
.—1
о
as
—н
о
ГМ
ГМ
1—i
о
ЧО
гм
1—1
о
as
гм
о
гм
СП
1—1
о
ЧГ)
СП
I—1
о
ЧО
гм
оо
о
о
м-
оо
с >
о
ЧО
оо
о
о
со
оо
о
о
_н
№
о
о
СП
as
<г->
о
ЧГ)
as
<г->
о
OV
<Т\
о
о
о
о
м-
о
о
t~-
гм
ЧГ)
с >
о
m
ЧГ)
С s
О
1П
ЧГ)
о
о
Г--
ЧГ)
о
о
OV
ЧГ)
о
о
|~-
о
о
г-1
|~-
с >
о
in
|~-
о
о
|~-
|~-
о
о
OV
|~-
о
о
00
гм
ЧГ)
м-
< ■>
о
|~-
м-
о
о
оо
м-
<■>
о
<•>
in
С s
CJ>
_н
in
о
о
го
in
с >
о
in
in
С S
CJ>
ЧО
in
<D
о
оо
in
о
о
о
ЧГ)
о
о
OS
гм
м-
го
о
о
in
го
с >
о
ЧГ)
го
о
о
Г--
го
о
о
оо
го
о
о
OS
го
о
о
м-
о
о
гм
м-
о
о
го
■*
о
о
тГ
м-
о
о
о
ГО
in
гм
со
о
in
гм
о
о
ЧО
гм
со
о
г~~
гм
о
о
оо
гм
со
о
OS
ГМ
со
о
г->
го
со
о
го
со
о
гм
ГО
о
о
ГО
ГО
о
о
„
го
оо
—.
со
о
оо
1—1
<■>
о
as
—н
со
о
со
гм
со
о
со
гм
со
о
гм
со
о
гм
гм
со
о
гм
ГМ
со
о
го
гм
со
о
м-
гм
со
о
гм
го
го
1—1
со
о
го
1—1
со
о
м-
.—1
со
о
м-
со
о
in
со
о
in
1—1
со
о
ЧО
I—1
со
о
ЧО
—ч
о
о
г—
1—1
со
о
г—
о
о
го
го
as
со
о
о
as
со
о
о
со
^^
со
о
со
—•
со
о
со
со
о
1—1
<■>
о
„
.—1
<■>
о
гм
1—1
со
о
гм
1—1
со
о
гм
о
о
чГ
ГО
ЧО
о
со
о
г—
со
о
о
г~
со
о
о
г~.
о
со
о
Г--
со
со
о
оо
со
о
о
оо
о
со
о
ол
со
со
о
ол
со
со
о
as
со
о
о
in
го
м-
со
со
о
in
со
о
о
in
со
о
о
in
со
со
о
in
о
со
о
in
со
со
о
in
со
о
о
ЧО
со
со
о
ЧО
со
со
о
ЧО
со
со
о
ЧО
го
го
со
со
о
го
со
со
о
го
со
со
о
го
со
со
о
м-
со
со
о
м-
со
со
о
м-
со
со
о
м-
со
со
о
м-
со
со
о
м-
со
со
о
с—
го
гм
со
со
о
гм
со
со
о
гм
со
со
о
гм
со
со
о
гм
с:>
со
о
го
со
со
о
го
со
со
о
го
о
со
о
ГО
со
со
о
ГО
о
со
о
00
ГО
о о
о о
о о
„ -
о о
о о
о о
ГМ -н
о о
о о
о о
гм —
о о
о о
о о
ГМ —|
о о
о о
о о
ГМ "
о о
о о
о о
ГМ -н
о о
о о
о о
ГМ -н
о о
о о
о о
гм ~-
о о
о о
о о
гм -^
о о
о о
о о
as о
ГО 4f
S
о
S
ta
е
!_
ж
S
si.
я
ч
-
ев
а
S
ч
ю
нтра-
к-ты,
а>==^1
х о ~>
Прирост ко
ции молочи
ммол
>х
X
е молоч
ОЛЬ
5 s
3 s
ч
сод
пело
СО ч/
о
X
о
•х
S
ата
•в-
о
о
•в-
ж
5 tn
cd ja
р. о
* 2
о Я
ж
cd
N
о.
Сод
ГО
cd
с
о.
U
гм
cd
с
с
гру
m
сз
групп
(N
сз
упп
1—
--1
сз
1—
СП
уппа
D,
U.
(N
с
>.
-^
сз
о.
1—
со
t^
ЧО
<л
тГ
m
г*»
~
in in
-*t го го rs) i—i i—i --
*п in
Tf >Л Tf n >Л >Л П
ОО ON ГО О "ГГ ЧО ГО
О О CS CS ^ -н -ч
00 ON 1П Cs) ГО 1П \0
О О (N -н ^ - -н
I4* Tf ОО «Л ^ МЭ N
СО ON ON —i fS fS ГО
-Ч —. . 1 —.
ОО 00 ON О N N (^
' '
N П Tf in Tt П П
гм
00

Продолжение
Содержание креатинфосфата,
ммоль/г
группа 1
10
11
16
группа 2
9
11
6
группа 3
13
12
11
Исходное содержание молочной
кислоты, ммоль
группа 1
1,3
1,4
2,2
группа 2
2,1
2,0
1,0
группа 3
1,7
1,5
1,6
Прирост
концентрации молочной к-ты,
ммоль/л
группа 2
4
2
5
группа 3
1,5
2
2
Таблица 12.
Центр интервала
Xi
0,75
1,25
1,75
2,25
Фактические
частоты
6
11
9
4

Стандартизованная переменная
-1,61
-0,52
0,57
1,65
Ординаты
нормальной кривой
0,1092
0,3485
0,3391
0,1023
Теоретические
частоты
3,7
11,5
11,2
3,5
Таблица 13
Группа 2 -
0,8
0,9
2,5
1,2
1,3
1,5
1,6
2,1
2,0
1,0
-ДО
Группа 2 - ПОСЛЕ
4,8
5,9
6,5
4,7
6,3
6,5
5,1
6,1
4,0
6,0
Попарные разности di = ХН
4,0
5,0
4,0
3,5
5,0
5,0
3,5
4,0
2,0
5,0
-X2I
Таблица 14.
Исходы
Опытная группа (по)
Контрольная группа (пк)
Всего...
Сон-ДА
9
28
37
НЕТ
16
8
24
Всего
25
36
61
Таблица 15
Исходы
Опытная группа (по)
Контрольная группа (ric)
Всего...
Сон-ДА
15,25
21,96
37,21
НЕТ
9,75
14,04
23,79
Всего
25
36
61
-822-

Таблица 16 (по данным табл. 11 из примера 1).
Параметр XI
8
8
9
10
7
7
9
9
11
6
Параметр Х2
4
5
4
3,5
5
5
3,5
4
2
5
Ранг RX1
4,5
4,5
7
9
2,5
2,5
7
7
10
1
Ранг RX2
5
8,5
5
2,5
8,5
8,5
2,5
5
1
8,5
di = RX1 - RX2
-0,5
-4,0
2,0
6,5
-6,0
-6,0
4,5
2,0
9
-7,5
d2
0,25
16,0
4,0
42,25
36,0
36,0
20,25
4,0
81,0
56,25
Таблица 17
Дозы, мг/кг
1

Наблюдавшийся
эффект
2

Наблюдавшийся
эффект в %
3

Ожидаемый %
эффекта
4
Разность между
ожидаемым и
наблюдавшимся % эффекта
5

Слагаемые для
х2
6
Таблица 18
Момент
времени, t
3
5
6-
7
8
9-
11
12
Наблюдалось к
моменту t, nt
10
9
7
5
3
2
Умерло к
моменту t, dt
1
1
2
1
1
2
Доля переживших
момент t, 1 — dt/nt
0,9
0,889
0,71
0,8
0,67
0
Выживаемость,
S(t)
0,9
0,8
0,57
0,46
0,31
0
-823-

Рис. 1. Кривые нормального распределения при различных значениях среднего
квадратичного отклонения: значения среднего квадратичного отклонения у каждой
представленной кривой больше, чем у предыдущей.
Рис. 2. Двусторонний 95 % интервал для среднего арифметического.
- 824-

Рис. 3. Распределение фактических (светлые столбики) и теоретических (темные)
частот для примера использования критерия согласия.
с;
_ л
%о
«ч
О. 5
1-
нцен
лоты
О О
* S
1- *
Is
kz
С с;
О
5
6
Ь .
4 .
3 .
2 .
1 .
0
0
^^
♦^ч^ ♦
^^^
♦S*
>s>
'^^^
♦
1 1 1 1 1
2 4 6 8 10 1
Содержание креатинфосфата, мМоль
2
Рис. 4. Графическое представление регрессионной зависимости между изучаемыми
параметрами.
- 825-

a
0,8 -
0,6 -
0,4 -
0,2 -
0 -
Доза, D
0,8 -
0,6 -
0,4 -
0,2 -
0 .
б
Hg(D)
Рис. 5. Кривая "доза—эффект".
А — в обычных координатах; Б — в логарифмических координатах.
Время, t
Рис. 6. Типичная кривая выживаемости.
Рис. 7. Кривая выживаемости для примера, ход вычислений показан в табл. 18.
Кривая представляет собой ступенчатую линию, каждая ступень соответствует
моменту смерти животных. Горизонтальная линия — медиана выживаемости.
- 826-

Вероятность ошибки первого рода, а
Область принятия нулевой гипотезы Критическая
область
Вероятность ошибки первого рода, Р
Критическая
область
Область принятия
альтернативной гипотезы
Рис. 8. Односторонний тест для проверки гипотезы о равенстве средних значений.
А — распределение нулевой гипотезы; Б — распределение альтернативной гипотезы.

Руководство
ПО ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМУ
(ДОКЛИНИЧЕСКОМУ) ИЗУЧЕНИЮ НОВЫХ
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДСТВ
Издание второе,
переработанное и дополненное
Корректор Т. А. Кузьмина
Верстка А. В. Чирков
ЛР № 010215 от 29.04.97. Сдано в набор 14.01.2005.
Подписано к печати 12.04.2005. Формат бумаги 70 х 100'/i6-
Бумага офсетная № 1. Гарнитура Тайме. Печать
офсетная. Усл. печ. л. 67,41. Уч.-изд. л. 86,96. Тираж 1000 экз.
Заказ № 762
ОАО «Издательство „Медицина"».
101990, Москва, Петроверигский пер., 6/8.
Издательство ЗАО «Шико».
101990, Москва, Петроверигский пер., 6/8.
Отпечатано с готового оригинал-макета ЗАО «Шико»
в ППП «Типография „Наука"».
121099, Москва, Шубинский пер., 6.
ISBN 5-225-04219-8
Э7852251Ю42196