/
Tags: общая генетика общая цитогенетика иммуногенетика эволюционное учение видообразование филогенез биология генетика молекулярная биология генная инженерия
ISBN: 5-03-002849-8
Year: 1998
Text
ИГЕР, П
ИЗДАТЕЛЬСТ
ГЕНЫ И ГЕНОМЫ
GENES & GENOMES
A changing Perspective
Maxine Singer
President, Carnegie Institution of
Washington Scientist Emeritus,
National Institutes of Health
Paul Berg
Willson Professor of Biochemistry
Director, Beckman Center for Molecular
and Genetic Medicine,
Stanford University School of Medicine
University Science Books
Mill Valley, California
М.СИНГЕР, П.БЕРГ
ОШЕН
В двух томах
Том 1
Перевод с английского
д-ра биол. наук Т. С. Ильиной
д-ра биол. наук Ю. М. Романовой
под редакцией
д-ра биол. наук Н. К. Янковского
МОСКВА «МИР» 1998
УДК 575.113/118
ББК 28.04
С38
Авторы: Сингер М., Берг П.
С38 Гены и геномы: В 2-х т. Т. 1. Пер. с англ.-М.: Мир,
1998.-373 с., ил.
ISBN 5-03-002849-8
Университетское руководство по молекулярной биологии, написанное
выдающимися американскими учеными, членами Национальной академии
наук (П. Берг-лауреат Нобелевской премии). Книгу отличают общебио-
логический подход, глубина теоретических обобщений, изящная и нагляд-
ная форма подачи материала.
В 1-м томе рассматриваются следующие вопросы: строение и функ-
ционирование биологических молекул, участвующих в работе генетиче-
ского аппарата; процессы репликации и экспрессии генов; широкий круг
вопросов, относящихся к технологии рекомбинантных ДНК (ферментные
системы, системы вектор-хозяин, манипуляции с рекомбинантными ДНК).
Для молекулярных биологов, преподавателей и студентов универ-
ситетов. специалистов.
ББК 28.04
Редакция литературы по биологии
Издание осуществлено при поддержке
Российского фонда фундаментальных исследований
по проекту № 98-04-62107
ISBN 5-03-002848-Х (русск.)
ISBN 5-03-002849-8
ISBN 0-935702-17-2 (англ.)
©1991 by University Science Books
© перевод на русский язык издательство
«Мир», 1998
ОТ РЕДАКТОРА
ПЕРЕВОДА
Книга «Гены и геномы» отличается сочетанием
традиционных разделов молекулярной генетики,
таких, как молекулярные основы наследственности,
технология рекомбинантных ДНК, анатомия, экс-
прессия и регуляция генов, с новым взглядом на
молекулярно-генетические проблемы - рассмотре-
нием их в контексте организации и функциониро-
вания целых геномов.
Авторы книги М. Сингер и лауреат Нобелевской
премии по химии П. Берг всемирно известные спе-
циалисты в области молекулярной биологии, одни
из создателей генной инженерии, методической ос-
новы современной молекулярной биологии и гене-
тики. Читатель найдет в книге подробные сведения
о структуре и функциях ДНК, РНК, белков; репли-
кации и функционировании генома, обратной транс-
крипции; модификациях, репарации и рекомбинации
ДНК; о транскрипции и трансляции мРНК в клетках
про- и эукариот; регуляции экспрессии генов; техно-
логии рекомбинантных ДНК. Все эти вопросы об-
суждаются в первых двух частях книги.
Особый интерес для нашего читателя представ-
ляет описание молекулярной анатомии эукариоти-
ческих геномов, интегрирующее современные мо-
лекулярно-биологические знания в данной области
(часть III), поскольку в отечественной литературе
информация по этим проблемам носит фрагмен-
тарный характер. Авторы анализируют структуру
и функции генома как целого и роль геномных
перестроек в функционировании генома в норме и
патологии, подчиняя этой задаче рассмотрение его
элементов (тандемных и диспергированных повто-
ров, центромерных и теломерных областей, транс-
позонов и др.). В заключительной, четвертой части
обсуждаются принципы функционирования и пер-
спективы дальнейших исследований сложных био-
логических систем (мультигенные семейства, ткане-
специфичная экспрессия, эмбриональное развитие
и дифференцировка).
Каждой части предшествует краткий обзор об-
щих принципов и концепций рассматриваемых в
этом разделе вопросов молекулярной генетики; за
ним следует углубленное описание эксперименталь-
ных работ, на основе которых эти концепции были
сформулированы. Завершаются части списком пер-
воисточников по ключевым экспериментальным ра-
ботам данного направления.
Книга может служить руководством для под-
готовки студентов и аспирантов на биологических
и медицинских факультетах вузов, а также поможет
научным работникам ориентироваться в новых об-
ластях исследования, связанных с изучением гено-
мов. Понимание текста облегчают многочисленные
оригинальные иллюстрации и таблицы. Они будут
также полезны преподавателям вузов в качестве
иллюстративного материала при чтении лекций.
Издание русского перевода книги «Гены и ге-
номы» особенно своевременно, поскольку развитие
современной молекулярной биологии идет во мно-
гом через исследования структуры и функций гено-
мов, проводимые в рамках всемирной программы
«Геном человека».
Книгу переводили: Т. С. Ильина (введение к ч. II,
гл. 4 7), Е. А. Кабанова (введение к ч. III, гл. 8),
А. А. Лушникова (гл. 9, 10, ч. III), Ю. М. Романова
(предисловие, благодарности, введение к ч. I, гл. 1-3).
Н. К. Янковский
ПРЕДИСЛОВИЕ
Эта книга посвящена молекулярным структурам
и механизмам, лежащим в основе передачи и
использования генетической информации сложными
организмами. Представляя ее, мы надеемся, что
у читателя возникнет чувство предвкушения того
удовольствия, которое он получит, знакомясь с
открытиями в области рекомбинантных ДНК.
Чтобы подготовить читателя к восприятию этих
новейших достижений, мы остановились во введе-
нии к гл. 1-3 на классических генетических и био-
химических исследованиях, проведенных в период
с начала века до примерно 1972 г. Эти исследования
были выполнены преимущественно на микроорга-
низмах, и благодаря им удалось установить струк-
туру и функции генов и геномов. Разработка в на-
чале 70-х годов методов получения рекомбинантных
ДНК и связанный с этим прогресс в технологии
быстрого определения нуклеотидной последова-
тельности ДНК позволили вскоре применить моле-
кулярные методы и для исследования более слож-
ных геномов. Ядро книги составляют работы,
выполненные менее чем за два десятилетия, которые
показали, какие широкие возможности дает исполь-
зование этих методов в биологии.
Книга создавалась довольно долго. Идея ее на-
писания возникла после того, как один из нас (П. Б.)
прочел серию публичных лекций в университете
Питтсбурга в 1979 г. Попытка подготовить публи-
кацию лекций показала несостоятельность этого
замысла. Когда такие лекции читаются в аудитории
слушателей, не являющихся биологами, приходится
опускать многие интересные детали, и книга, ли-
шенная таких тонкостей, конечно, не может при-
нести удовлетворения. По мере расширения кон-
цептуальной основы книги становилась очевидной
необходимось разделить тяжкий труд по ее напи-
санию с кем-нибудь еще. Так нас стало двое. Мы
вместе прорабатывали весь материал, пытаясь до-
биться унифицированного, согласованного подхода
и стиля. Мы поняли всю безрассудность попытки
дать всестороннее, всеобъемлющее изложение ма-
териала; эта задача была успешно решена до нас
большими группами авторов в нескольких недавних
блестящих изданиях. Нам приходилось постоянно
пересматривать уже написанные главы, чтобы их
окончательный вариант соответствовал последую-
щим разделам, еще находящимся в работе. Чтобы
нас не захлестнул поток постоянно поступающей
новой информации, мы ограничили наши задачи,
сосредоточив внимание на тех проблемах, которые
уже довольно глубоко изучены и наглядно иллюст-
рируют достигнутый прогресс.
Наша главная задача состояла в том, чтобы
раскрыть сущность и глубину экспериментальных
подходов науки, которая была названа молекуляр-
ной генетикой, применительно к эукариотическим
организмам. Чтобы решить эту задачу, а также
облегчить понимание материала читателями, об-
ладающими ограниченным объемом знаний по
биохимии, клеточной биологии и генетике, мы по-
старались изложить основы этих направлений био-
логии двумя способами. Во-первых, в гл. 1, 2 и 3
суммирована наиболее важная информация о струк-
туре ДНК, РНК и белков; о различных клеточных
процессах, протекающих с участием ДНК (репли-
кация, репарация и рекомбинация); об основных
механизмах транскрипции, трансляции и контроле
экспрессии генов. Читатели, хорошо ориентирую-
щиеся в данных вопросах, могут пропустить эти
главы. Во-вторых, во введениях к частям I, II и III
даны исторические экскурсы и общий взгляд на
проблемы, изложенные в главах, составляющих эти
части. В них не говорится детально о том, как были
открыты и доказаны те или иные положения, а де-
лается попытка объяснить, как на основе различных
исследований в области биохимии, генетики, мик-
робиологии, клеточной и эволюционной биологии
был выстроен интеллектуальный каркас совре-
менной биологии. Так, во введении, предваряю-
щем гл. 1, 2 и 3, прослеживается исторический путь,
приведший нас к современному взгляду на на-
следственность. Мы знакомимся с концепцией гена,
трансмиссией и сегрегацией генов, с логическим
переходом от первичного картирования генетиче-
ских детерминант к точной локализации генов на
хромосоме, с идентификацией генов как дискретных
участков молекулы дезоксирибонуклеиновой кис-
лоты и информационными взаимоотношениями
между ДНК, РНК и белками.
В части II (гл. 4-7) описаны подходы к конст-
руированию рекомбинантных молекул ДНК, их
клонированию, отбору и характеристике, а также
другие экспериментальные методы, использую-
щиеся в молекулярной генетике. Основное внимание
уделяется принципам этих методов, а не лабора-
торным приемам. Читатели, которых больше ин-
тересуют методические детали, могут обратиться
к замечательным сборникам, вышедшим за послед-
ПРЕДИСЛОВИЕ
7
ние 10 лет; ссылки на них даны в книге. Во введении,
предваряющем гл. 4-7, особое внимание уде-
ляется истории развития современных подходов
и методов, разработанных на основе огромного
количества казалось бы не связанных между собой
фундаментальных исследований в энзимологии,
генетике бактерий и бактериофагов и биохимии
нуклеиновых кислот.
Основная тема книги раскрывается в части III,
где изложены концепции, лежащие в основе наших
представлений о генетических информационных
системах эукариот. Введение к этой части знакомит
нас с отличительными особенностями геномов
эукариот. Речь идет об интронах и сложных сиг-
налах, регулирующих транскрипцию, а также о
множестве повторяющихся последовательностей в
геноме и связанной с этим ролью обратной транс-
крипции в происхождении сегментов эукариоти-
ческой ДНК. Раздел заканчивается описанием некой
объединяющей концепции, рассматривающей био-
логическую эволюцию как процесс, в основе ко-
торого лежит перестройка нуклеиновых кислот и,
следовательно, изменение структуры белковых
молекул.
В первой из трех глав части III (гл. 8) при-
ведены данные о структуре генов эукариот и со-
временные представления о механизме их экспрес-
сии, в частности сведения о сложных сигналах регуля-
ции транскрипции, а также о происхождении, локали-
зации и структуре интронов и тех механизмах,
с помощью которых интроны удаляются из пер-
вичных транскриптов при сплайсинге. Очень су-
щественным здесь явилось применение обратной
генетики введение специфических мутаций в опре-
деленные сегменты ДНК и последующий анализ
структурно-функциональных взаимоотношений в
генах эукариот. В гл. 9 основное внимание сосре-
доточено на организации сложных эукариотических
геномов. Рассмотрено расположение генов и других
элементов в молекуле ДНК, в частности в центро-
мерных и теломерных областях. Красной нитью
через всю главу проходит концепция генома как
летописи эволюционной истории. В заключение
дано описание геномов внутриклеточных орга-
нелл-митохондрий и хлоропластов. В гл. 10 пред-
ставлены механизмы случайных и неслучайных
перестроек геномной ДНК. Речь идет об ампли-
фикациях, делециях и транспозициях как неза-
программированных и приводящих к мутагенезу,
так и запрограммированных в геноме и осуществ-
ляющих точную регуляцию генной экспрессии, на-
пример изменение типов спаривания у дрожжей
и образование генов иммуноглобулинов.
В части IV дана краткая иллюстрация
применения общих принципов, рассмотрен-
ных ранее, к специфическим сложным биоло-
гическим системам. Показано, что гены рабо-
тают в составе сложных многокомпонентных
взаимодействующих систем. В каждой из таких
систем указанные общие принципы используются
по-своему, что приводит к огромному разно-
образию живого. Ранее это разнообразие опи-
сывалось чисто феноменологически. Теперь фе-
номенологическое описание уступает место описа-
нию регуляции генной экспрессии во времени и
пространстве на молекулярном уровне. В этой части
рассматривается также, как с развитием методо-
логии рекомбинантных ДНК биология преврати-
лась из науки описательной в практическую. Гено-
типы, а следовательно, и фенотипы на уровне ин-
дивидуальных белков, клеток и организмов можно
изменять, что позволяет в будущем исследовать
фундаментальные биологические процессы, а также
решить острые вопросы, стоящие перед челове-
чеством и планетой, которую мы населяем. Многие
из предоставляющихся возможностей можно будет
реализовать только после того, как мы лучше уз-
наем структуру геномов. Это касается определения
точного расположения генов и получения более
полной информации об их нуклеотидных последо-
вательностях. В части IV излагаются также поло-
жения, существенные для картирования и секвени-
рования геномов некоторых видов, в том числе
и человека.
В 1980 г., когда нам впервые пришла мысль
о написании книги, мы, как и многие другие биоло-
ги, только что пережили период, когда научные
издания стали привлекать к себе столь же присталь-
ное внимание, как и общественно-политические.
Ошеломляющие успехи, достигнутые благодаря
применению методологии рекомбинантных ДНК,
были только одним из аспектов того, что называли
«революцией в биологии». Наряду с приходом но-
вой эры в постижении сути живого эта революция
вызвала беспрецедентное беспокойство обществен-
ности о последствиях биологических экспериментов.
Вначале общественный интерес был связан с тем,
что группа ученых-биологов подняла вопрос о без-
опасности экспериментов с рекомбинантными ДНК.
Людей, работающих с патогенными микроорга-
низмами, тоже беспокоила безопасность проведения
лабораторных исследований. Подобная ситуация
уже возникала в 1971 г., когда во всем мире стали
широко использоваться вирусы, индуцирующие
образование опухолей у экспериментальных живот-
ных. Жизненный цикл этих вирусов отличался от
жизненного цикла более привычных вирусов (на-
пример, вирусов кори или полиомиелита), а неко-
торые из них, вероятно, могли индуцировать рак
у человека. Это заставляло обратить самое серьез-
ное внимание на потенциальную опасность таких
вирусов для ученых и студентов. Аналогичные опа-
8
ПРЕДИСЛОВИЕ
сения высказывались и в связи с появлением мето-
дов получения рекомбинантных ДНК. Общая ат-
мосфера озабоченности усугублялась глубоким
чувством социальной ответственности, возникшим
и окрепшим в Соединенных Штатах за предыдущее
десятилетие борьбы за гражданские права и против
войны во Вьетнаме.
Первые эксперименты по созданию рекомби-
нантной ДНК состояли в соединении ДНК, выде-
ленной из вирусов, которые вызывали опухоли у
мелких лабораторных грызунов, с фрагментами
ДНК из хорошо изученных вирусов. Намерения
ввести эти новые молекулы ДНК в бактериальные
клетки вызвали серьезные нарекания, но вскоре
было принято решение приостановить подобные
попытки, и все страсти улеглись. Следующим круп-
ным шагом было конструирование рекомбинантной
ДНК, содержащей ген, который обеспечивал устой-
чивость бактерий к антибиотикам. Возможность
генетической трансформации живых клеток путем
введения необычных молекул ДНК в бактерии по-
ставила вопрос о том, что такие бактерии могут
вызывать развитие опухоли или приобретут резис-
тентность к важным в медицинском отношении
антибиотикам. Эти вопросы обсуждались как на
научных конференциях, так и в частных беседах. На
одной из таких конференций в июне 1973 г. участ-
вующие в ней ученые решили привлечь внимание
Национальной академии наук к этой перспективной
области исследований и попросить провести на-
правленное исследование для оценки потенциальной
опасности манипуляций с рекомбинантными ДНК.
Чтобы придать гласность этому обращению, ученые
опубликовали письмо в журнале “Science”.
Академия, как обычно, сформировала комитет,
куда вошли ученые, активно работающие с реком-
бинантными ДНК и в смежных областях. Члены
комитета встретились в апреле 1974 г. и предло-
жили два основных решения, ставших, к их удив-
лению, новостью номер один. Во-первых, они
призвали объявить всеобщий мораторий на те экс-
перименты с рекомбинантными ДНК, в которых
используется ДНК опухолеродных вирусов или в
бактерии вводятся гены, детерминирующие токсины
или ответственные за резистентность бактерий к
антибиотикам. Во-вторых, они призвали к широ-
кому и свободному международному обсуждению
этих проблем на конференции, которую предпо-
лагалось провести следующей зимой.
Несмотря на ропот недовольства и даже обви-
нения в адрес ученых США в том, что они таким
образом пытаются затормозить работу ученых дру-
гих стран и выиграть гонку в соревновании за
главные открытия, которые могут быть сделаны
благодаря развитию новых методов, мораторий,
насколько это известно, был принят повсеместно.
На конференцию были приглашены молекулярные
биологи, вирусологи, микробиологи и биохимики
США и других стран, а также представители науч-
ной администрации, журналисты и юристы.
Встреча состоялась в феврале 1975 г. в Асило-
маре, шт. Калифорния, в конференц-центре на бе-
регу Тихого океана, несколькими милями южнее
Гопкинсовской океанологической станции в Па-
сифик-Гроу (при Станфордском университете).
Организационный комитет провел предварительные
заседания рабочих групп, и эксперты в различных
областях подготовили документы для представле-
ния на конференции. Состоялась оживленная,
иногда жаркая, дискуссия о том, насколько реальна
опасность подобных экспериментов. Большинство
(но не все) участников признали, что риск появ-
ления особенно опасных организмов существует, но
вероятность этого очень мала. Принятие оконча-
тельного решения о дальнейших действиях было
отложено до тех пор, пока не скажут свое слово
юристы. Юристы же возложили персональную
юридическую ответственность за все последствия,
даже экстраординарные, на ученых. Они также на-
помнили нам, что общество должно быть застра-
ховано от риска, если опасность последствий, пусть
крайне малая, существует. Позиции прояснились.
Необходимо было следовать именно этому осно-
ванному на здравом смысле курсу. В последний день
работы конференции был предложен предвари-
тельный отчет Организационного комитета. Он
всесторонне обсуждался и был в конце концов при-
нят. Рекомендации Асиломарской конференции
получили широкую огласку в прессе и были опуб-
ликованы позже в ряде научных журналов. Не-
сколькими неделями ранее к аналогичным заклю-
чениям пришел и возглавляемый лордом Эшби
правительственный комитет Великобритании.
Рекомендации, принятые в Асиломаре, стали
основой и импульсом для официальных мероприя-
тий в США, начавшихся на следующий же день
после закрытия конференции. Комитет, организо-
ванный Национальными институтами здоровья
(НИЗ), приступил к разработке директив по конт-
ролю за всеми экспериментами с рекомбинантными
ДНК. проводимыми в институтах своего подчи-
нения. Первые инструкции были весьма стро-
гими в расчете на то, что по мере накопления опыта
и знаний они будут пересмотрены. По сей день не
выявлено ни одного нежелательного инцидента ни
с персоналом лабораторий, ни с кем-либо из других
людей, причиной которого были бы эксперименты,
проведенные с рекомбинантными ДНК; а таких
экспериментов насчитывается десятки тысяч. Со-
держащиеся в документе требования к большинству
рутинных экспериментов с рекомбинантной ДНК
изъяты или сделаны менее строгими. Жесткие тре-
ПРЕДИСЛОВИЕ
9
бования, согласно рекомендациям НИЗ, сохра-
няются только к тем экспериментам, в которых
рекомбинантная ДНК содержит протяженные
участки, полученные из ДНК особо патогенных
микроорганизмов (этих рекомендаций придержи-
ваются и во многих других странах). Интересно
отметить, что использование технологии реком-
бинантных ДНК сделало изучение некоторых важ-
ных, но опасных возбудителей инфекционных за-
болеваний человека и животных вполне доступным
и безопасным.
Интерес общественности к экспериментам с
рекомбинантными ДНК сохраняется по сей день
и теперь распространяется также на генную инже-
нерию целых организмов - бактерий, растений и
животных. Сначала этот интерес и беспокойство
были сосредоточены на том же, на чем основыва-
лись интерес и беспокойство большинства ученых-
на возможности создания в эксперименте болез-
нетворных агентов. Местные власти и государст-
венные органы издавали законы и указы, анало-
гичные рекомендациям НИЗ или даже более стро-
гие. В конгрессе обсуждались предложения о при-
дании рекомендациям НИЗ силы закона и уста-
новлении наказания за их несоблюдение, но ни одно
из них не было принято. Огромное количество
независимых дебатов - в разных местах и на разных
уровнях-в конце концов узаконили причастность
НИЗ к данной проблеме как в том, что касается
оценки риска, так и в смысле административной
организации.
Позже дискуссии приняли несколько иной ха-
рактер. Некоторых ученых волнует вопрос о воз-
можных эволюционных последствиях проникнове-
ния ДНК через видовые барьеры, например введе-
ние ДНК человека в клетки бактерий. Эти же
вопросы задают и люди, не являющиеся учеными,
однако данный аспект признан не заслуживающим
большого внимания. В природе возникает неимо-
верное число возможностей для обменов ДНК по-
добного рода, и, по-видимому, они действительно
происходят. Эксперименты с рекомбинантными
ДНК лишь ненамного увеличивают их вероятность.
Кроме того, большинство организмов, несущих
рекомбинантные молекулы ДНК, мало жизнеспо-
собны вне лаборатории. Этот последний довод
приводился и при недавнем обсуждении вопросов,
связанных с необходимостью правительственного
контроля за преднамеренным распространением в
окружающей среде важных в сельскохозяйственном
отношении организмов, полученных методом ген-
ной инженерии. Конечно, подобные проблемы тре-
буют внимания, но предъявление слишком строгих
требований (например, использование защитной
одежды, подобной костюму астронавта) с научной
точки зрения необоснованно.
Постоянно обсуждается вопрос и о возмож-
ности применения техники рекомбинантной ДНК
для создания биологического оружия. США при-
соединились к международной конвенции 1972 г.,
запрещающей проведение подобных работ, а Ми-
нистерство обороны продолжает финансировать
исследования по защите от биологического оружия,
которое может быть создано в других странах. Это
направление тоже интенсивно обсуждается, по-
скольку трудно определить грань, разделяющую
работы, которые направлены на создание средств
нападения и защиты. Такие проблемы одинаково
волнуют как ученых, так и людей, не имеющих
отношения к науке, поскольку они носят полити-
ческий и социальный характер, а не чисто научный,
как и другие проблемы, связанные с развитием
новых направлений биологии. Что принесет чело-
вечеству генная терапия, если станет возможным ее
применение,-пользу или вред? Как справиться
обществу и отдельным гражданам с растущим по-
током информации о человеческих генах, которые
могут быть приобретены в результате применения
новых технологий? Каковы этические проблемы,
связанные с возможным введением генов человека
в организмы животных? Надо ли патентовать жи-
вотных и растения, полученные с помощью генной
инженерии?
Озабоченность общественности, связанная с на-
ступлением биологической революции, породила
негативное отношение к данным исследованиям.
Биологи опасались худшего: введения строгих пра-
вил или инструкций, которые могли серьезно по-
мешать дальнейшей экспериментальной работе и,
следовательно, не позволили бы получить новые
многообещающие результаты и внедрить их в ме-
дицину, сельское хозяйство и промышленность.
Многие ученые выражали сожаление о прекращении
свободных дискуссий на эту тему. Подобные дис-
куссии противостояли демагогическим рассужде-
ниям критиков и стремлениям устраивать шумиху
в средствах массовой информации вокруг этих
вопросов вместо внимательного их анализа. Но все
встало на свои места. Свидетельством тому служат
научные достижения, описанные в этой книге, и
огромное количество очень полезных и важных
продуктов, полученных в новой, бурно развиваю-
щейся биотехнологической промышленности. Мо-
жет быть, мораторий и введенные вначале ограни-
чения и задержали прогресс, но ненадолго. Возник-
шее в то время предубеждение против подобных
исследований, по-видимому, можно оправдать не-
ведением, и теперь с уверенностью можно сказать,
что риск был гораздо меньше, чем мы могли пред-
полагать.
Максин Сингер
Пол Берг
БЛАГОДАРНОСТИ
Вопреки широко распространенному мнению,
наука-это коллективный род деятельности, и мно-
гое в ней зависит от хорошо налаженного сотруд-
ничества и общения между учеными. Эта книга-
не исключение. Мы благодарим за сотрудничество
и помощь наших коллег, прочитавших отдельные
разделы и главы книги и высказавших критические
замечания. Это David Finnegan, Claude Klee,
Arthur Kornberg, 1. R. Lehman, Howard Nash, Bruce
Paterson. Carl Schmid, Robert Tjian. Мы благодарны
также тем, кто предоставил нам неопубликованные
данные и рукописные материалы.
Пятеро наших коллег прочитали почти всю
книгу в первой редакции. Окончательный ее вариант
был значительно улучшен благодаря их ценным
критическим замечаниям. Мы весьма признательны
за этот труд Barbara Н. Bowman, David Dressier,
Paul Schimmel, Jean O. Thomas, William B. Wood.
Нам очень повезло, что мы имели возможность
воспользоваться советами Carol Dempster одного
из тех редких людей, кто с энтузиазмом и в высшей
степени профессионально вникает во многие науч-
ные проблемы. Bruce Armbruster, издатель, прези-
дент издательства University Science Books, позна-
комил нас с Carol Dempster, а также с другими
замечательными членами группы, которые помо-
гали нам выпустить эту книгу: Sylvia Stein Wright,
редактором рукописи; Gary Head, техническим ре-
дактором; Mary Miller, менеджером. Но самым
важным было постоянное внимание и неослабе-
вающий энтузиазм самого Bruce Armbruster, кото-
рые он проявлял, когда другие дела отвлекали нас
от работы над книгой и она замедлялась и практи-
чески останавливалась; мы очень ему за это бла-
годарны.
Молекулярные генетики, говоря о генах и ге-
номах, представляют их зримо. Мы «разглядываем»
ДНК мысленным взором и пытаемся понять, как
она функционирует. Поэтому схемы, приводимые
в научных статьях и книгах, подобных этой, очень
важны для понимания и запоминания материала.
Прекрасные рисунки и диаграммы в этой книге
были сделаны Charlene Kornberg и ее коллегами из
Медицинской школы Станфордского университета.
Эти иллюстрации являются неотъемлемой частью
текста, поясняя и дополняя его. Наши наивные
представления о процессе создания рисунков и наше
настойчивое желание, чтобы их было как можно
больше, сделали работу над рисунками обремени-
тельной и долгой. Мы благодарны всем, кто так
терпеливо работал под руководством Charlene
Kornberg: Meryle Colten, Butch Colyear, Mike May-
stead, Eunice Ockermam, Lois Schoen, Kelly Solis-Na-
varro, Karen Sullivan. Linda Toda. И только мы, а не
они несем ответственность за некоторые оставшиеся
неисправленными ошибки.
Среди тех неоспоримых преимуществ, которые
получили современные биологи, необходимо от-
метить прекрасные библиотеки, предусмотрительно
собранные предыдущими поколениями. При напи-
сании этой книги мы пользовались тремя такими
библиотеками и работали, огражденные от теле-
фонных звонков и повседневных дел. Все сотруд-
ники библиотеки Лаборатории биологии моря в
Вудс-Холе (шт. Массачусетс), Джексоновской ла-
боратории в Бар-Харбор (шт. Мэн) и Гопкинсов-
ской океанологической станции в Пасифик-Гроу
(при Стэнфордском университете, шт. Калифорния)
были неизменно гостеприимны и заботливы.
Harry Woolf, тогдашний директор Института
новейших исследований при Принстонском уни-
верситете (шт. Нью-Джерси), тоже любезно предо-
ставил нам возможность поработать в таком спо-
койном месте. Его доброжелательный интерес,
гостеприимство и дружба, а также прекрасное уго-
щение, которым нас потчевал «мастер на все руки»
Franz Moehn, сделали те дни незабываемыми. Как
это ни парадоксально, мы имели возможность ра-
ботать в Принстоне, не отвлекаясь, также благодаря
тому, что институтские физики и математики почти
не выражали желания беседовать с биологами.
Спокойные дни провел также один из нас (П.Б.),
работая в Клэр-Холл-Колледже Кембриджского
университета. Живое, интеллектуальное общество
во главе с Michael Stoker создавало благоприятный,
способствующий работе климат.
Пока мы писали эту книгу, наука, которая, мы
надеемся, увлечет и вас, шла вперед семимильными
шагами. Непрерывные исправления рукописи ло-
жились тяжелым бременем на людей, ответственно
относящихся к своему делу и обладающих к тому же
чувством юмора, позволявшим им печатать и пере-
печатывать несчетное множество черновых вариан-
тов. Без Eleanor Olson и Dot Potter (в Стэнфордском
университете) и May Liu и Gail Gray (в Бетесде)
работа никогда не была бы доведена до конца.
Милли Берг и Дэн Сингер иногда выражали
недовольство и нетерпение (что вполне понятно), но
всегда с готовностью поддерживали нас. С неиз-
менными любознательностью, энтузиазмом, гор-
достью и любовью относилось к нашей работе
и юное поколение семей Берг и Сингер, хотя ни один
из них не был ни биохимиком, ни молекулярным
биологом.
Часть
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ
НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
ВВЕДЕНИЕ
Систематическое изучение наследственности
начиналось со сложных в генетическом отношении
объектов растений и животных. Благодаря этим
ранним исследованиям была сформулирована кон-
цепция неделимого гена как функциональной еди-
ницы наследственности и принято положение, что
перенос генов от одного поколения к другому под-
вержен действию разных случайных факторов. Од-
нако до понимания химической природы генов и
механизма их функционирования было еще далеко.
Исследование генетических молекул и тонких ме-
ханизмов регуляции наследственности стало воз-
можным лишь тогда, когда в качестве экспери-
ментальных моделей начали использоваться бак-
терии и вирусы, о существовании которых первые
генетики даже не подозревали. Только благодаря
этим организмам впервые было показано, что де-
зоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), рибонуклеи-
новая кислота (РНК) и белок - универсальные
детерминанты генетического поведения. Стреми-
тельность дальнейшего прогресса в этой области
и убедительность полученных результатов стали
реальными благодаря особым биологическим
свойствам микроорганизмов, которые позволяли
проводить манипуляции, необходимые для анализа
генетических структур. Аналогичные аналитические
исследования более сложных генетических систем
тогда были невозможны, поэтому на животных
и растения этот прогресс не распространялся. Раз-
витие технологии рекомбинантных ДНК разрушило
труднопреодолимые технические и концептуальные
барьеры на пути расшифровки и понимания слож-
ных генетических систем. Неудивительно, что наши
взгляды на структуру и функцию генов значительно
изменились, а новое мышление в свою очередь
радикально изменило перспективы биологии.
Некоторые предпосылки последних достижений
можно обнаружить, изучая историю создания фун-
даментальных положений о наследственности и их
последующих изменений. Основным препятствием
на пути формирования единых принципов наследст-
венности служило исключительное разнообразие
живых форм. Первым, кто проследил аналогии
между процессами воспроизведения животных и
растений и ввел слова «самец» и «самка» примени-
тельно к участникам этого процесса, был ученик
Аристотеля Теофраст. Еще раньше греческие фи-
лософы V в., воззрения которых оказали заметное
влияние на последующее развитие научных идей,
пришли к заключению, что, поскольку дети похожи
на обоих родителей, оба пола вносят определенный
вклад в формирование нового индивидуума. Они
полагали, что этим вкладом является своего рода
информация, сконцентрированная в мужском или
женском «семени» и поступившая туда из разных
частей тела зрелых индивидуумов. Демокрит, мне-
ние которого не было общепринятым, предполо-
жил, что информация заключена в частицах, размер,
форма и строение которых влияют на свойства
потомства.
В начале XIX в., после создания более совер-
шенных микроскопов, основной унифицирующей
единицей в биологии стала клетка. Все организмы
могли рассматриваться как одиночные, свободно
живущие клетки или как сообщество клеток. По-
стоянное усовершенствование оптических систем
микроскопа и новаторские методы подготовки и
окрашивания материала позволяли все более де-
тально описывать содержимое клеток (рис. 1.1).
Эти исследования показали, что клетки окружены
мембраной, имеющей определенную структуру, что
они неодинаковы по форме и что в них имеются
четко различимые структуры, среди которых наи-
более удивительной является ядро, содержащее в
свою очередь небольшие, хорошо окрашиваемые
структуры, названные хромосомами. Позднее об-
наружили, что некоторые микроорганизмы (бакте-
рии) не имеют ядра. Было установлено, что новые
клетки появляются только в результате деления
предсуществующих клеток.
ЖИВОТНАЯ КЛЕТКА
Хлоропласт
А
РАСТИТЕЛЬНАЯ КЛЕТКА
ВВЕДЕНИЕ
13
Цитозоль Рибосомы ДНК матическая стенка
мембрана
В
РИС. 1.1.
А. Схематическое изображение типичных
животных и растительных клеток. Б. Схема-
тическое изображение бактериальной клет-
ки. В. Макрофаги (клетки большего разме-
ра) и лимфоциты (клетки меньшего разме-
ра), сфотографированные в электронном
микроскопе при увеличении 6000. (С лю-
безного разрешения Emma Shelton, Jan
Ornstein.)
В настоящее время все живые организмы под-
разделяют на две группы. Первая-эукариоты -
многоклеточные организмы, клетки которых со-
держат оформленное ядро; внутри ядра заключены
хромосомы - хранители генетической информации.
Вторая - прокариоты - представлена одноклеточ-
ными бактериями, лишенными ядра, с хромосома-
ми, находящимися в цитоплазме. За немногими
исключениями, все клетки многоклеточного орга-
низма содержат одинаковый полный набор хромо-
сом. Эукариотические организмы имеют более
сложное строение и, как правило, содержат больше
генетической информации. Кроме тою, эукариоты
способны к истинному половому воспроизведению
и для многих из них этот способ обязателен для
образования потомства. Одним из важных момен-
тов процесса полового размножения является на-
личие в дочерних ядрах двух копий каждой хро-
14
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
мосомы; такие эукариотические клетки называются
диплоидными. Прокариоты, содержащие только
одну хромосому, называются гаплоидами. При
некоторых обстоятельствах у прокариот наблю-
даются процессы, аналогичные по результату про-
цессу оплодотворения у эукариот, вследствие ко-
торых они могут стать частично диплоидными; эти
процессы широко используются в генетических ис-
следованиях.
Сразу после принятия клеточной теории в изу-
чении живых организмов выделились три направ-
ления: исследование хромосом, статистический ана-
лиз наследования одиночных признаков, выделение
и характеристика компонентов хромосом. Эти на-
Митоз: этапы деления диплоидной клетки. А. На схеме
показаны две пары гомологичных хромосом (они выде-
лены разным цветом) Каждый член пары проходит
через митоз как независимая единица. Во время интер-
фазы хромосомы имеют вид тонких, диффузных нитей,
которые в норме трудно визуализировать. В это время
происходит дупликация хромосом. Реплицированные
хромосомы конденсируются в дискретные структуры,
которые в стадии профазы легкоразличимы. В проме-
тафазе хромосомы еще более конденсируются, ядерная
оболочка разрушается и хромосомы оказываются свя-
занными с веретеном. Дуплицированные структуры ос-
таются соединенными друг с другом в районе, называ-
емом центромерой (на рисунке она отмечена точкой)
Обе копии каждой хромосомы-сестринские хромати-
ды разделяются по всей длине, за исключением цент-
ромеры. К метафазе пары сестринских хроматид вы-
страиваются у центра веретена, но их центромеры еще
ВВЕДЕНИЕ
15
Б Метафаза
остаются соединенными. В анафазе пары сестринских
хроматид разделяются и каждый член пары движется
по направлению к полюсу веретена. В это же время
и нити веретена, и клетка начинают растягиваться. Когда
в телофазе хроматиды достигают противоположных
полюсов, вокруг каждого набора хроматид формирует-
ся новая ядерная оболочка и начинается деконденсация
хромосом. Наконец, плазматическая мембрана разде-
ляет два ядра и окружающую цитоплазму на две клетки
(цитокинез). Хромосомы приобретают растянутую,
диффузную форму, типичную для интерфазы, и про-
цесс деления начинается снова. Б. Микрофотографии
митоза в клетках лилии Haemanthus katherinae. Клетки
окрашены иммунозолотом/серебром. Увеличение 600.
(С любезного разрешения A. S. Bajer.)
16
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
правления параллельно развивались и превраща-
лись в важные научные дисциплины до момента их
слияния в середине нашего века.
ХРОМОСОМЫ
Во второй половине XIX в. продолжалось де-
тальное изучение морфологии и поведения хромо-
сом. Оказалось, что во всех клетках любого орга-
низма, за одним лишь существенным исключением,
содержится одно и то же, вполне определенное
число хромосом. Например, плодовая мушка Dro-
sophila melanogaster имеет 8 хромосом, человек и
летучая мышь-46, пшеница-20, носорог-84. Хро-
мосомы на основе сходства их морфологии могут
быть разделены на гомологичные пары: 4 пары
у D. melanogaster, 23-у человека и т. д. Микроско-
пическое исследование фиксированных и окрашен-
ных клеток дает лишь статическую картинку, но эти
картинки можно расположить во временной по-
следовательности, начиная с момента образования
клетки при делении и кончая ее делением на две себе
подобные. И тогда становится очевидным, что
дупликация каждой хромосомы, происходящая в
цикле клеточного деления, приводит к удвоению
числа хромосом (рис. 1.2). При делении этот уд-
военный набор распределяется таким образом, что
каждая из двух дочерних клеток получает такое же
число и тип хромосом, что и родительская клетка.
Весь процесс в целом называется митозом.
Клеточный цикл
События, происходящие в период от одного
клеточного деления до другого, называются кле-
точным циклом (рис. 1.3). Фаза митоза (М-фаза)
цикла охватывает период деления и хромосом, и
клеток. После расхождения клеток (цитокинеза)
каждая дочерняя клетка вступает в период повы-
шенной биосинтетической активности-в так назы-
ваемую Gj-фазу (от англ. gap). Gj-фаза заканчи-
вается перед началом удвоения хромосом, или. в
молекулярных терминах, с началом дупликации
хромосомной ДНК; период репликации генома
называется фазой, синтеза (S-фазой). С момента
завершения S-фазы в клетках инициируются собы-
тия, характерные для митотической профазы,- части
цикла, называемой С2-фазой. В конце концов опять
начинаются митоз и цитокинез, и цикл повторяется.
Как правило, G,-, S- и С2-периоды, вместе состав-
ляющие интерфазу, занимают около 90% времени
клеточного цикла, а М-фаза-менее 10%. Полное
время прохождения клеточного цикла в клетках
разного типа сильно варьирует (от минут до суток)
в зависимости от условий роста. Основным пока-
зателем продолжительности всего цикла является
продолжительность Gj-фазы. Например, покоя-
Митоз
РИС. 1.3.
Клеточный цикл: митоз и цитокинез (клеточное деле-
ние) составляют М-фазу цикла, кульминацией которой
является образование двух дочерних клеток. Каждая
дочерняя клетка вступает в Gt-период интерфазы и мо-
жет начать новый клеточный цикл. За периодом Gt
следует S-фаза, во время которой ДНК и хромосомы
дуплицируются, и далее- фаза G2. Начало митоза озна-
чает конец интерфазы. Покоящиеся клетки задержива-
ются в фазе Gt и, как говорят, находятся в фазе Go.
Обычно эукариотические клетки, которые не останови-
лись в фазе Go, завершают цикл за 24 ч.
щиеся клетки, которые лишены незаменимых пита-
тельных веществ и не могут расти экспоненциально,
задерживаются в Gj-фазе; говорят, что они нахо-
дятся в фазе Go. При появлении питательных ве-
ществ они выходят из С0-фазы и в них возобнов-
ляются процессы, характерные для конца фазы Gt
с переходом в S-фазу.
РИС. 1.4.
Мейоз: этапы деления диплоидной клетки на четыре
гаплоидные дочерние клетки. Этот процесс отличается
от митоза тем. что включает два клеточных деления
и только один «раунд» репликации хромосом. На схеме
показаны две пары гомологичных хромосом (они выде-
лены разным цветом). Во время интерфазы хромосомы
имеют вид тонких диффузных нитей. После репликации
сестринские хроматиды остаются тесно связанными и
начинают конденсироваться, что указывает на начало
профазы. Затем гомологичные пары сестринских хро-
матид приходят в тесное соприкосновение, образуя
тетрады; этот процесс называется синапсисом. Начало
мейотической метафазы I характеризуется дальнейшей
конденсацией хромосом и дезинтеграцией ядерной
мембраны. В анафазе I члены гомологичной лары сест-
ринских хроматид начинают перемещаться к разным
полюсам удлиняющейся клетки. К концу телофазы I и
клеточного деления I образуются две дочерние клетки.
в каждой из которых имеется по одной гомологичной
паре сестринских хроматид. Второй раунд клеточного
деления происходит без дополнительной дупликации
хромосом и начинается с профазы II, с переходом
в мвтафазу II. В стадии анафазы II две сестринские
хроматиды, которые оставались до этого момента вмес-
те, начинают перемещаться к противоположным концам
удлиняющейся клетки После телофазы II и клеточного
деления II образуются четыре гаплоидные клетки-
предшественники половых клеток. В каждую дочернюю
клетку попадает только по одной хромосоме из исход-
ных гомологичных пар.
2 243
18
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
Мейоз и образование гамет
Образование яйцеклеток и сперматозоидов под-
разумевает уменьшение нормального числа хро-
мосом ровно вполовину; этот процесс называется
мейозом (рис. 1.4). Гаметы, или половые клетки,
гаплоидны, т. е. в них содержится по одному члену
каждой пары гомологичных хромосом, и, таким
образом, только половинное число хромосом каж-
дого из родителей попадает во все другие, сома-
тические, клетки организма потомка. Распределение
хромосом в мейозе происходит случайно, поэтому
любой из членов гомологичной пары может ока-
заться во вновь образовавшихся зародышевых
клетках.
При оплодотворении гаплоидные наборы хро-
мосом сперматозоидов и яйцеклеток объединяются
(рис. 1.5). Таким образом восстанавливается пол-
ный набор гомологичных хромосомных пар, каж-
дый из членов которых произошел из яйцеклетки
и из сперматозоида соответствующих родителей.
Диплоидное состояние оплодотворенной яйце-
клетки (зиготы) поддерживается далее во всех
соматических клетках механизмом митотического —
деления. Иногда зрелые организмы могут развиться
из неоплодотворенных гаплоидных яйцеклеток или
из оплодотворенных яйцеклеток с неполным на-
бором родительских хромосом. Как уже отмеча-
лось, любой из членов гомологичной пары может
попасть в функциональную гамету. В зрелую яйце-
клетку или сперматозоид попадает по одному члену
каждой пары в процессе редукции числа хромосом
в мейозе.
Строение хромосом
Легче всего наблюдать метафазные хромосомы.
Под микроскопом их фотографируют или зарисо-
вывают (рис. 1.6). В этой стадии хромосомы наи-
более сконденсированны и образуют дискретные
структуры. У многих организмов индивидуальные
хромосомы и их гомологи легкоразличимы по
размеру и форме. Каждая метафазная хромосома
действительно состоит из двух идентичных частей,
называемых сестринскими хроматидами, поскольку
дупликация хромосомной ДНК протекает как раз
перед метафазой, в S-фазе клеточного цикла.
У хромосомы имеется перетяжка, называемая
центромерой. Положение центромеры для каждой
хромосомы строго определено. С центромерой свя-
заны специфические хромосомные функции; это
последняя точка, соединяющая плечи сестринских
хроматид перед полным расхождением при мито-
тическом или II мейотическом делении (рис. 1.2
и 1.4). Сами плечи имеют вид отдельных образова-
ний задолго до расхождения центромер в анафазе.
РИС. 1.5.
Образование гаплоидных гамет при мейозе и слияние
двух гамет с образованием диплоидной клетки при
оплодотворении. Обратите внимание на то, что у D.
melanogaster, рассмотренной здесь в качестве примера,
как и у других организмов, включая млекопитающих,
две половые хромосомы у самца (X и Y) не гомологич-
ны друг другу. При мейозе формируются два типа
сперматозоидов, из которых один несет Х-, а другой
Y-хромосому. У самок, несущих пару Х-хромосом, в
результате мейоза образуются гаметы одного типа. Пол
потомков зависит от того, какую из хромосом-X или
Y несут оплодотворяющие сперматозоиды. У некото-
рых организмов (например, у птиц) негомологичную,
определяющую пол хромосому несет самка.
ВВЕДЕНИЕ
19
Различие между областью центромеры и пле-
чами хромосом становится очевидным после об-
работки определенными красителями. После окра-
шивания центромеры выглядят более плотными
и компактными по сравнению с плечами (рис. 1.7).
Такие плотные, интенсивно окрашиваемые хро-
мосомные области называются гетерохроматино-
выми. Гетерохроматин центромеры можно наблю-
дать после окрашивания даже в плохо различимых
интерфазных хромосомах. Другие, негетерохрома-
тиновые области хромосом принято называть
эухроматиновыми. Эухроматиновые области окра-
шиваются гораздо менее интенсивно, чем гетеро-
хроматиновые.
Концевые участки хромосом называются тело-
мерами. Часто они тоже гетерохроматиновые.
Нередко (но не всегда) в митотических хромосомах
можно наблюдать небольшие перетяжки, назы-
ваемые районом ядрышкового организатора (ЯОР)
(рис. 1.8). В мейотических хромосомах они имеют
вид утолщений. В пределах данного вида районы
ядрышковых организаторов встречаются на одной
или нескольких специфических хромосомах (и их
гомологах), и если они есть, то всегда находятся
в одном и том же месте. В Gj-фазе клеточного
цикла некоторые ядрышковые организаторы начи-
нают разрастаться; если их больше, чем один, то
такие разросшиеся области объединяются в одну
Центромера
1___' Теломера
Хроматида
РИС. 1.6.
Свойства метафазных хромосом эукариот. А. Схема-
тическое изображение двух копий, или хроматид, дуп-
лицированной хромосомы. Две хроматиды удержива-
ются вместе центромерой, которая в данном случае
находится примерно в центре хромосомы (метацентри-
ческая хромосома). Б. Электронная микрофотография
субметацентрической хромосомы; увеличение 30000.
(С любезного разрешения G. F. Bahr.) В. Фотография
некоторых хромосом человека, полученная с помощью
сканирующего электронного микроскопа. Четко видно,
что хромосомы скручены. [С любезного разрешения
J.B. Rattner. См. J.B. Rattner, С. С. Lin, Cell, 42, (1985),
Р. 291]
Б В
20
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
Продолжение рис. 1.6 Г
Г. Хромосома, представленная на этой фотографии,
содержит меньшее количество гистонов и выглядит, как
спутанный клубок. Вверху справа показана ДНК при
большем увеличении. [Микрофотография получена
U. К. Laemmli; см. работу D. W. Fawcett, The Cell, 2nd ed.
(Philadelphia: W. В. Saunders, 1981) p. 237.]
РИС. 1.7.
Фотография метафазной хромосомы человека N 13.
Видны общее строение хромосомы (Std), характер по-
лос в зухроматиновых плечах, выявляемый после спе-
циального окрашивания (три разных метода окрашива-
ния G, Q и R), гетерохроматиновая область в центроме-
ре, наблюдаемая благодаря применению особой техни-
ки окрашивания (С-окрашивание) и район ядрышкового
организатора (ЯОР), также выявляемый с помощью
специального окрашивания (Ад ЯОР). Положение цент-
ромеры на этой акроцентрической хромосоме отмечено
горизонтальной линией. (С любезного разрешения
Т. A. Donlon.)
ВВЕДЕНИЕ
21
Б
РИС. 1.8.
Фотографии хромосом, на которых видны районы яд-
рышковых организаторов (ЯОР). А. Мвтафазные хро-
мосомы человека, обработанные таким образом, что
ЯОР не окрашиваются (показаны стрелками). Видны не
все ЯОР. (С любезного разрешения Т. С. Hsu.) Б.
Мейотические хромосомы человека, на которых ЯОР
имеют вид утолщений после окрашивания серебром.
[С. Mirre, М. Hartung, S. Stahl, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
77 (1980), p. 6019 ]
или несколько больших, почти сферических струк-
тур - нуклеолей (рис. 1.1). Часто в интерфазном ядре
только нуклеоли и можно видеть, но с переходом
в профазу они постепенно исчезают.
Применение специальных красителей и особых
способов окрашивания, разработанных в послед-
ние несколько десятилетий, дало возможность вы-
явить достаточно тонкие детали в структуре про-
метафазных и метафазных хромосом, даже если это
довольно мелкие хромосомы млекопитающих.
Итак, после окрашивания в каждой хромосоме
можно наблюдать уникальное чередование светлых
и темных полос: гомологичные хромосомы имеют
идентичный рисунок (рис. 1.7). Этот рисунок до-
стоверно воспроизводится, и каждую хромосому
в наборе можно идентифицировать. На рис. 1.9
представлен полный набор прометафазных хромо-
сом в клетке человека. На этом изображении, на-
зываемом кариотипом человека, отражены относи-
тельный размер и форма хромосом наряду с поло-
жением центромеры и характерным видом полос.
В интерфазе хромосомы сильно растягиваются
и, как правило, не видны. Встречаются, однако, и
существенные исключения, которые уже много лет
интенсивно исследуются. Секреторные клетки ли-
чинок некоторых насекомых (например, D. melano-
gaster) разрастаются до огромных размеров и про-
ходят несколько S-фаз без митоза и клеточного
деления. В результате формируется комплекс из
множества, иногда вплоть до тысячи, хроматид,
которые остаются сцепленными и лежат рядом друг
с другом, образуя толстые нити, называемые поли-
тенными хромосомами (рис. 1.10). Так же как и
все интерфазные хромосомы, политенные хромо-
сомы растянуты значительно сильнее, чем конден-
сированные метафазные хромосомы. При окра-
шивании политенных хромосом специальными кра-
сителями выявляется определенный рисунок чере-
дования темных и светлых полос. В отличие от того,
что наблюдается в высококонденсированных ме-
тафазных хромосомах, число полос огромно. На-
пример, на четырех политенных хромосомах D. me-
lanogaster можно насчитать почти 5000 темных по-
лос, а в полном наборе из 23 метафазных хромосом
человека видны по крайней мере 2000 полос.
Четко различимые морфологические признаки
индивидуальных прометафазных и политенных
хромосом стабильно воспроизводятся из поколения
в поколение у данного вида. Необычная форма
хромосом или характер полос наряду с атипичным
числом хромосом сигнализируют о повреждении
хромосомного материала (рис. 1.11). Наличие таких
измененных хромосом часто связано с наследст-
венными заболеваниями. Например, сегмент одной
хромосомы иногда перемещается на совершенно
неродственную хромосому, и такие перестройки
сразу выявляются по необычному размеру или ха-
рактеру полос. Подобные транслокации иногда
бывают реципрокными, т. е. две неродственные
хромосомы могут обменяться фрагментами. Дру-
22
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
Центро-VS— ft----------------//“С"*!
мера Ц \С 5/
1 2 3 4 б
--------Л1 11 л* 4 Г *11*—«?
1| Я II «а э« э- ч
в 7 в 9 10 11 12
—и—14—jt------------1»—К-«—
13 14 1В 1в 17 18
---•<---15--------—• t---11------
19 20 21 22 х у
РИС. 1.9.
Кариотип человека. Горизонтальные линии на
всех фотографиях проходят через центромеры.
Хромосомы пронумерованы в порядке уменьше-
ния их длины. А Полный набор метафазных
хромосом мужчины, окрашенных способом, ко-
торый выявляет особенности рисунка сегмента-
ции. Представлены оба члена каждой гомологич-
ной пары. (С любезного разрешения Uta Francke.)
Б. Идиограмма хромосом, построенная на осно-
вании кариотипа, представленного на рис. А.
[D. G. Harnden, Н.Р. Klinger, eds., Ап International
System for Human Cytogenetic Nomenclature (Basel:
S. Karger, AG., 1985), p 50.]
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
Б
ВВЕДЕНИЕ
23
РИС. 1.10.
Комбинированная фотография (фотомонтаж), на ко-
торой показан полный набор гигантских политенных
хромосом, обнаруженных в клетках слюнных желез D.
melanogaster. Все хромосомы соединены своими цент-
ромерами (хромоцентр). Каждая из этих интерфаз-
ных хромосом состоит из плотно сплетенных мно-
жественных хроматид, которые являются репликами
обоих членов гомологичных пар, лежащих параллельно
друг другу. Полосы выявляются при окрашивании; их
характер и относительная ширина уникальны для каж-
дой хромосомы. Обратите внимание на то, что каждая
полоса проходит через весь пучок. [ G. Lefevre, Jr., as
published in Chapter 2, Figure 3, in M. Ashburner,
E. Novitski, eds., The Genetics and Biology of Drosophila,
volume 1a (London: Academic Press, 1976).]
гим примером изменений, или аберраций, хромосом'
служат делении части нормальной хромосомы,
дупликации некоторых областей и даже инверсии
сегментов. Иногда наблюдаются потери хромосом
или, напротив, появление лишних. Например, за-
болевание человека, известное как синдром Дауна,
обусловлено присутствием трех копий 21-й хромо-
сомы вместо обычных двух (это состояние назы-
вают также трисомией 21-й хромосомы).
Успехи в изучении структуры хромосом опре-
делялись выбором подходящих экспериментальных
объектов. Так, огромные политенные хромосомы
D. melanogaster стали излюбленной эксперименталь-
ной системой еще на заре развития области биоло-
гии, именуемой теперь цитогенетикой; системати-
ческое изучение небольших по размеру хромосом
человека и других млекопитающих могло начаться
лишь с усовершенствованием экспериментальной
техники в начале 50-х годов. Хромосомы прокариот
не видны в световом микроскопе; недоступны для
анализа с помощью светового микроскопа и мелкие,
диффузные хромосомы таких низших эукариот, как
дрожжи и трипаносомы.
НАСЛЕДОВАНИЕ
ОДИНОЧНЫХ ПРИЗНАКОВ
Концепция гена восходит к началу 1860 г. и свя-
зана с именем Грегора Менделя, хотя до тех пор,
пока другие ученые не повторили и не углубили его
исследования в начале XX в., самого этого термина
не существовало. Слово ген было введено В. Иоган-
сеном (W. Johannsen) в 1910 г. и относилось к
гипотетической единице информации, регулирую-
щей наследование индивидуальных признаков ор-
ганизма. Предположение о существовании генов
было высказано на основании данных о статисти-
ческом распределении простых наследуемых при-
знаков в потомстве известных родителей в течение
нескольких поколений. В этих первых исследованиях
генами оперировали как абстрактными статисти-
ческими понятиями, поскольку не было никакой
информации относительно химической природы
изучаемых признаков. Например, форма или цвет
семян или цветков рассматривались как видимый
наглядный наследуемый признак независимо от
химической или метаболической основы этого
A
Нормальная Дефектная
ч» ;♦ i I г » 'И Н fl
1 2 з ’ 1 4 5 '
> * • н Ч 1 1: Ku Ч. |
н I I I • » ♦ »i
6 7 8 9 10 11 12 ‘
Г* н п » 1 ♦ I ц
1 13 14 15 ' 16 17 18
1 * JS • * * н it
' 19 20 ‘ 1 21 22 1 X 1 Y
Центромера
РИС. 1.11.
Аберрантные хромосомы, являющи-
еся причиной некоторых заболеваний
человека. На рисунках А и Б вверху
показаны пары нормальных (слева)
и аберрантных (справа) хромосом,
а внизу соответствующие идиограм*
мы. На этих идиограммах рисунок
сегментации представлен более де-
тально, чем на рис. 1.9. А. Транслока-
ция (стрелка) фрагмента хромосомы
8 на хромосому 14 при лимфоме
Беркитта. Б. Делеция (квадратная
скобка) части хромосомы 11 в клет-
ках опухоли Вилмса у человека. (Рис.
А и Б любезно предоставлены U. Fran-
cke.) В. Три копии 21-й хромосомы
в кариотипе пациентки с синдромом
Дауна. (С любезного разрешения
Т. A. Donlon.)
В
ВВЕДЕНИЕ
25
свойства. Тем не менее логический интеллектуаль-
ный фундамент, заложенный Менделем и его после-
дователями, вполне соответствует нашим тепе-
решним представлениям о химической структуре
генов и тому, как эта структурная информация
воплощается в свойства организма.
Независимая сегрегация
и независимое комбинирование
Взгляд Менделя на наследственность у эукариот
определялся двумя главными обнаруженными им
явлениями. Первое - существование независимой
сегрегации. Любой организм содержит пару генов
для любого одиночного наследуемого признака, при
этом каждый из членов пары имеет либо отцовское,
либо материнское происхождение. В каждом поко-
лении члены каждой пары генов расходятся с обра-
зованием новых яйцеклеток или сперматозоидов,
и во время оплодотворения формируются новые
пары генов. Теперь члены пары называются алле-
лями и особенность признака зависит от объеди-
нения одинаковых аллелей (про организм, несущий
идентичные аллели, говорят, что он гомозиготен)
или различных (тогда организм гетерозиготен). Так,
аллельные пары, детерминирующие некий признак,
могут быть а1 а1, а1 а2 или а2 а2 у разных индиви-
дуумов. Тогда сперматозоиды или яйцеклетки
должны содержать аллель а1 или а2. И хотя
в каждом отдельном организме имеется не более
двух разных аллелей определенного гена, в попу-
ляции данного вида циркулирует много различных
аллелей. Например, могут существовать множест-
венные формы гена я: а1, а2, а3, я4 и т.д., поэтому
отдельные индивидуумы могут содержать такие
пары, как я1 я2, я2я2, я3я2, я1 я4, я4я5 и я4я4.
Второе важное наблюдение Менделя касалось
независимого комбинирования различных аллель-
ных пар генов, каждая из которых определяет раз-
личные признаки. Например, яйцеклетки или спер-
матозоиды в организме, содержащем аллельные
пары я1 я2 для признака а и blb2 для Ь, могут иметь
сочетания аллелей я1/?1, alb2, а2Ь1 или а2Ь2. При
образовании гамет сегрегация аллельных пар «я» не
зависит от сегрегации аллельных пар «/>»; то же
самое можно сказать и о других аллельных парах.
Связь между генами и хромосомами
В начале XX в. была обнаружена корреляция
между физическим поведением хромосом и поло-
жениями менделевской генетики. Каждый член
аллельной пары генов мог быть ассоциирован с
одной из хромосом пары, а независимое распре-
деление аллелей можно было объяснить, если счи-
тать, что различные аллельные пары находятся
на разных хромосомах. Томас Гент Морган и его
коллеги доказали, что у D. melanogaster гены ассо-
циированы с хромосомами. Они выбрали этот ор-
ганизм для генетических исследований, поскольку
короткое время генерации и большое число особей
в потомстве, получаемом от каждого скрещивания,
делает генетический анализ удобным и точным;
кроме того, хромосомы D. melanogaster легкораз-
личимы в световом микроскопе. В ходе экспери-
ментов было установлено, что наследование аллеля,
приводящего к появлению у потомства белых, а не
обычных красных глаз, всегда сцеплено с наследо-
ванием Х-хромосом и никогда-Y-хромосомы.
Были обнаружены и другие аллели, коррелирующие
с разными признаками, также связанные с наследо-
ванием Х-хромосом, и аллели, наследуемые сов-
местно, сцепленными группами, но независимо от
Х-хромосомы. Таким образом, стало очевидным,
что число групп совместно наследуемых аллелей
соответствует числу хромосомных пар. В ходе
исследования было установлено, что аллели, ассо-
циируемые с различными хромосомами, распреде-
ляются в потомстве независимо, а группы аллелей,
связанные с определенной хромосомой, остаются
сцепленными и в потомстве.
Рекомбинация
Почти одновременно с выявлением групп
сцепления были обнаружены и неожиданные исклю-
чения. Например, такие аллели, как я1 и А1 или я2
и Ь2, как правило, наследовались сцепленно, но
иногда появлялись новые сочетания, а1Ь2 и а2Ь1,
которые наследовались в последующих поколениях.
С помощью цитогенетического анализа было уста-
новлено, что при мейозе гомологичные хромосо-
мы обвиваются друг вокруг друга, поэтому Мор-
ган предположил, что они могут обмениваться
между собой частями, давая тем самым новые
комбинации сцепленных аллелей (рис. 1.12). Этот
процесс получил название кроссинговера или ре-
комбинации. Совершенно не зная химической при-
роды этого явления, генетики использовали фено-
мен рекомбинации в качестве основного инстру-
мента генетических исследований. Определение
частот рекомбинации между сцепленными парами
аллелей у D. melanogaster позволило сделать три
важных заключения: гены расположены в линейном
порядке, и члены аллельных пар обычно занимают
одинаковое относительное положение на гомоло-
гичных хромосомах; рекомбинация происходит
только внутри одной группы сцепления (т.е. между
гомологичными хромосомами); частота, с которой
два разных сцепленных аллеля перекрещиваются
(скажем, связываются узелком), зависит от рас-
стояния между ними на хромосоме (чем дальше они
26
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 1.12.
Кроссинговер хромосом, происходящий при мейозе. А.
Схематическое представление процесса. А и а, В и
b пары аллелей. Б. Фотография хромосом кобылки
(Chorthippus parallelus) в диплотенной стадии мейоза
(профаза I). Видны гомологичные пары уже дуплици-
рованных хромосом (см. схему). На некоторых парах
видно несколько точек перекреста (хиазмы). Отдельные
пары уже уплотнились в преддверии метафазы I. (С
любезного разрешения В. John.)
друг от друга, тем выше эта частота). Относи-
тельное положение различных генов на хромосоме
D. melanogaster, а в дальнейшем и других организ-
мов было установлено именно исходя из этих прин-
ципов. К 1922 г. Морган и его коллеги смогли
картировать несколько сотен генов на четырех хро-
мосомах D. melanogaster (рис. 1.13).
Связь между генами и белками
Одно из первых предположений о том, как ин-
формация, заключенная в генах, проявляется в
специфических свойствах клетки и целого организ-
ма, было высказано еще до того, как изобрели слово
«ген». В первом десятилетии XX в. английский врач
Арчибальд Гаррод заметил, что наследование не-
которых метаболических идиосинкразий и других
расстройств у людей происходит в соответствии
с правилами Менделя. Он предположил, что
причиной подобных наследственных расстройств
служит недостаток или отсутствие особых фермен-
тов, необходимых для нормального метаболизма.
Тогда же Гаррод высказал гипотезу, что детерминанты
наследственности контролируют образование фер-
ментов. Таким образом, способность к синтезу осо-
бых ферментов или даже их свойства связывались
с генами. Предположение казалось очень заман-
чивым даже при отсутствии экспериментальных
доказательств, потому что оно связывало имею-
щиеся в то время генетические данные, полученные
для мух и растений, с биологией человека.
Дальнейшее развитие идеи Гарро да могли пог
лучить лишь с появлением новых эксперименталь-
ных подходов. В конце 1930-х годов такие подходы
появились благодаря использованию в качестве
экспериментальных объектов микроорганизмов.
Вначале в центре внимания исследователей оказа-
лись низшие грибы из родов Aspergillus и Neuro-
spora. Эти организмы хорошо росли в определенных
условиях культивирования и достаточно быстро
размножались. К середине 40-х годов было накоп-
лено и проанализировано достаточно генетических
и биохимических данных для того, чтобы прийти
к выводу, что наличие или отсутствие фермента
ВВЕДЕНИЕ
27
РИС. 1.13.
Генетическая карта части Х-хромосомы (политенной) D.
me/anogaster. Обратите внимание, что каждому гену
соответствует определенный участок политенной хро-
мосомы. Мутация в гене w (область ЗС) обусловливает
белый цвет гпаз у мухи. [С. В. Bridges, Journal of
Heredity, 26 (1935), p. 60.]
наследуемо и зависит от экспрессии одного гена.
Джордж Бидл и Эдвард Татум (George Beadle,
Edward Tatum) обобщили связь между ферментом
и геном в виде постулата один фермент один ген.
Поскольку ферменты-это белки, а многие белки
состоят из более чем одного типа полипептидных
цепей, постулат в дальнейшем стал формулиро-
ваться как «один полипептид - один ген». Прове-
денные исследования показали, что некоторые гены
кодируют белки, не являющиеся ферментами (в том
числе гормоны и структурные белки), а другие гены
контролируют образование молекул РНК, которые
необходимы для синтеза белков.
Для обоих компонентов этой информационной
цепочки часто используются такие термины, как
генотип и фенотип, относящиеся соответственно к
гену и признаку, который им кодируется. В общем
виде генотип иногда трактуется как вся генетическая
информация отдельной клетки или организма.
Аналогично и термин фенотип применяется более
широко для описания видимых свойств клетки или
организма, будь то особые белки или функции либо
морфологические и даже поведенческие признаки.
Фенотип, как правило, является результатом взаи-
модействия между генетической информацией и
условиями окружающей среды, в которой она реа-
лизуется. Термин геном применяется к совокупности
хромосом (на молекулярном уровне-к ДНК),
свойственных отдельному организму (или любой
клетке внутри организма), в отличие от термина
генотип, который относится к информации, заклю-
ченной в этих хромосомах (или ДНК).
К 1950 г. была обнаружена еще более заман-
чивая и многообещающая экспериментальная си-
стема для исследования связей между генами и
функциями клетки. Обычная кишечная бактерия
Escherichia coli (E.coli) имеет примитивные пита-
тельные потребности и делится каждые 20-60 мин
(в зависимости от условий культивирования), давая
в потомстве огромное число клеток (109 в 1 мл).
У нее было обнаружено множество легко выяв-
ляемых генетически контролируемых физиологиче-
ских признаков. Кроме того, использование му-
тантов, которые достаточно просто выделить и
охарактеризовать, позволило идентифицировать
гены, кодирующие специфические функции клетки.
Таким образом был открыт путь для более фор-
мального генетического анализа и создания гене-
тической карты единственной хромосомы Е. call.
Еще одним преимуществом Е. coli оказалось то, что
эта бактерия является хозяном для нескольких ви-
русов (бактериофагов) (рис. 1.14), для которых в
свою очередь характерно значительное генетическое
разнообразие инфекционных свойств.
Бактериофаги, или, для краткости, фаги, оказа-
лись еше более удобной системой для генетических
исследований. Два или даже больше фагов могут
обмениваться фрагментами своих гомологичных
геномов, порождая фаговое потомство с новыми
генетическими свойствами (рис. 1.15). Фаговые ге-
номы даже способны к обратимой интеграции с
бактериальной хромосомой. При выщеплении из
хромосомы фаг может включить в свой геном часть
бактериального генома и, таким образом, стать
носителем бактериальных генов. Анализ подобного
обмена генетическим материалом показал, что даже
такие примитивные организмы обладают упорядо-
ченным геномом и индивидуальные гены могут
составить генетическую карту.
ГЕНЫ И ДНК
Современная биохимическая генетика ведет свое
начало от открытия ДНК в 1869 г. Фридрихом
Мишером (Friedrich Miescher). Он установил, что
вещество, экстрагируемое из гнойной массы и кле-
точных ядер, химически отличается от белков как по
содержанию органического фосфора, так и по
28
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
А
РИС. 1.14.
А. Электронная микрофотография бактериофага Т4,
увеличение 200000. (С любезного разрешения
R. С. Williams.) Б. Электронная микрофотография бак-
Б
териофага X, увеличение 77 000. (С любезного разре-
шения A. D. Kaiser.)
РИС. 1.15.
Альтернативные судьбы фаговых хромосом после ин-
фекции. А. Две фаговые хромосомы, несущие различ-
ные пары аллелей генов h иг (hr+ или h+r), инфицируют
одну бактериальную клетку. В фаговом потомстве пос-
ле рекомбинации можно получить четыре разных типа
хромосом: две родительские, Аг+ и h+r (без рекомбина-
ции), и две рекомбинантные, hr v\ h+r+. Б. Фаги с разным
типом хромосом образуют разные бляшки. Бляшки
имеют вид относительно прозрачных пятен на бакте-
риальном газоне. Каждая бляшка начинает образовы-
ваться в тот момент, когда из одиночной инфицирован-
ной клетки высвобождаются фаговые частицы, которые
затем заражают окружающие бактерии и лизируют их.
[Из G.S. Stent, Molecular Biology of Bacterial Viruses (San
Francisco: W. H. Freeman, 1963), p. 335.] В. Рекомбина-
ция между фаговой и бактериальной ДНК. В каждой из
ДНК происходит одиночный разрыв, а затем разорван-
ные концы соединяются так, что фаговая ДНК встраива-
ется в бактериальную. Процесс может быть обратимым:
фаговая ДНК может выщепляться из бактериальной,
причем если зто выщепление происходит неточно, то
фаговая ДНК приобретает один или несколько бакте-
риальных генов, а какие-то фаговые гены остаются
в бактериальной хромосоме.
ВВЕДЕНИЕ
29
устойчивости к расщеплению протеолитическими
ферментами. В течение последующих 85 лет были
разработаны разные методы выделения ДНК с
целью исследования природы ее химических состав-
ляющих и связи между ними. Кульминацией этих
исследований стало установление основной струк-
турной единицы ДНК: она состоит из фосфори-
лированного сахара, дезоксирибозофосфата, со-
единенного с азотистым основанием - либо с одним
из пуринов (аденином или гуанином), либо с одним из
пиримидинов (цитозином или тимином) (рис. 1.16).
Кроме того, с помощью биофизических методов
было становлено, что молекула ДНК - это очень
длинная цепочка, остов которой построен из де-
Е. соН
30
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 1.16.
Основные структурные элементы ДНК деэоксирибонуклеотиды.
Дезоксирибонуклеотиды
зоксирибозофосфатных единиц, соединенных друг
с другом фосфодиэфирными мостиками; к каждой
дезоксирибозной единице цепи присоединено либо
пуриновое, либо пиримидиновое основание (рис. 1.17).
В 1953 г. Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик обобщили
накопленные к тому времени данные о составе
и структуре ДНК, построив ставшую теперь клас-
сической теорию двойной спирали ДНК. Импуль-
сом к ее созданию послужило обогатившее науку
открытие Освальда Эвери (Oswald Avery) и его
коллег, а также Альфреда Херши (Alfred Hershey)
и Маргарет Чейз (Margaret Chase), состоявшее в
том, что только ДНК является носителем генети-
ческой информации. Центральная роль в наследст-
венности, приписываемая хромосомам, могла
быть теперь отнесена к ДНК, которую они со-
держат.
ДНК не единственная нуклеиновая кислота
(или полинуклеотид), обнаруживаемая в клетке.
Близкородственные молекулы- рибонуклеиновые
кислоты (PHК)-отличаются от ДНК в основном
тем, что вместо дезоксирибозы содержат рибозу
и чаще имеют одноцепочечную структуру.
Расшифровка структуры ДНК и установление ее
центральной роли в наследственности увенчали
накопленные наукой данные и позволили генетике
из статистической и феноменологической науки
превратиться в науку с преобладанием химических
и молекулярных направлений развития. Незамед-
лительная бурная реакция ученых на открытие
двойной спирали свидетельствовала об ее адекват-
ности. Модель структуры ДНК не только соот-
ветствовала химическим и физическим данным, но
и полностью отвечала функциям, присущим гене-
тическому материалу. В линейной последователь-
ности четырех пуринов и пиримидинов могло быть
закодировано огромное количество информации,
и в принципе эта структура могла обеспечить свою
собственную репликацию. Расшифровка структуры
ДНК проливала свет на самые разные аспекты
биологии и создавала основу для объяснения
многих разноречивых данных, полученных ранее.
Она обеспечила фундаментальную целостность при
интерпретации огромного многообразия жизненных
форм. Раз и навсегда наследственность связывалась
с определенной молекулярной структурой.
ГЕНЕТИКА-МОЛЕКУЛЯРНАЯ НАУКА
Проблемы механизмов переноса, перераспре-
деления и экспрессии генетических признаков, дол-
гое время не находившие решения, с начала 50-х
годов перешли на молекулярный и химический
уровни. Как реплицируются и рекомбинируют
молекулы ДНК? Каким образом они сохраняются
в последующих поколениях? Каким способом ин-
формация, закодированная в ДНК, обеспечивает
образование фенотипических продуктов - белков?
Как регулируется считывание информации, зако-
дированной в ДНК, в процессе роста клеток или
развития организма и при других физиологических
состояниях? Как нарушаются эти процессы при
заболеваниях? Эти и еще многие другие вопросы
стояли в центре молекулярно-генетических иссле-
дований в течение последних 35 лет. Бурный про-
гресс в первые 20 из них был достигнут благодаря
использованию систем прокариот и связан с иден-
тификацией молекулярных структур, участвующих
в процессах хранения, поддержания, передачи и
использования генетической информации.
ВВЕДЕНИЕ
31
Перенос генетической информации
в клетке
Информационные взаимоотношения между
ДНК, РНК и белками теперь точно установлены
(рис. 1.18). Репликация, с помощью которой со-
здаются идентичные копии родительской молекулы
ДНК, обеспечивает генетическую непрерывность
в ряду поколений. Транскрипция ДНК с образоваием
РНК опосредует трансляцию (перевод) этой инфор-
мации на уровень белков. Итак, ДНК выполняет две
основополагающие функции. Первая-это осу-
ществление своей собственной репликации. Вто-
рая-это формирование фенотипа через образование
молекул РНК, участвующих в трансляции инфор-
мации, содержащейся в ДНК, на язык белков. И,
насколько это известно, только у эукариот инфор-
мация может передаваться в обратном направле-
нии, от РНК к ДНК, посредством процесса, име-
нуемого обратной транскрипцией.
В основе переноса информации от ДНК к РНК
или от РНК к ДНК лежит универсальная способ-
ность нуклеиновых кислот служить матрицей.
Нуклеиновые кислоты направляют сборку идентич-
32
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 1.18.
Информационная связь между ДНК, РНК и белком
и процессы, с помощью которых осуществляется пере-
дача информации. Заметим, что обратная транскрипция
наблюдается только у эукариот.
цитозином. В результате образования таких прак-
тически инвариантных пар последовательность ос-
нований одной цепи однозначно определяет их
последовательность в другой иными словами, цепи
двойной спирали ДНК комплементарны.
Молекулы ДНК выполняют две разные функции.
Первая - последовательность пуриновых и пири-
мидиновых оснований каждой цепи служит матри-
цей, с которой копируется новая цепь. Вторая-
гены, составляющие ДНК, детерминируют синтез
ферментов и других белков, необходимых для
синтеза новых молекул ДНК. При репликации в осо-
бом участке двойной спирали ДНК происходит
расплетание цепей. В результате каждая цепь начи-
нает функционировать как матрица, на которой син-
тезируется новая, комплементарная цепь (рис. 1.19).
Таким образом, каждая из обеих образовавшихся
дочерних спиралей получает одну цепь от роди-
тельской спирали, а другую-образованную в
результате синтеза de novo. Несмотря на кажу-
щуюся логическую простоту, процесс репликации
в действительности очень сложен и для его осу-
ществления необходимо множество белков. Важ-
нейшими из них являются ферменты, называемые
ДНК-полимеразами. Их роль в репликации состоит
в сборке полинуклеотидных цепей из отдельных
них или родственных молекул и непосредственно
участвуют в процессе синтеза белка. Насколько
известно, информация не передается от белков к
нуклеиновым кислотам (т. е. обратной трансляции
не обнаружено). Однако белки помимо самосборки
осуществляют важнейшую функцию катализа и
информационного переноса между нуклеиновыми
кислотами.
Далее мы рассмотрим вкратце ключевые ха-
рактеристики генетического аппарата и его функ-
ционирования: структурные особенности важней-
ших компонентов молекул ДНК, РНК и белков
и то, как они работают, обеспечивая сохранение
целостности генома и трансляцию генотипа орга-
низма в его фенотип. Эти вопросы детально рас-
сматриваются в гл. I, 2 и 3, составляющих первую
часть книги.
Структура и сохранение геномной ДНК
Все клеточные ДНК состоят из двух полинук-
леотидных цепей, закрученных вокруг общей оси
с образованием двойной спирали (рис. 1.19). На-
ружную поверхность спирали составляет остов
каждой цепи, состоящий из повторяющихся остат-
ков дезоксирибозы. Цепи удерживаются вместе
благодаря водородным связям между пуриновыми
основаниями одной цепи и пиримидиновыми -
другой: аденин всегда спарен с тимином, а гуанин-с
Схематическое изображение реплицирующейся моле-
кулы ДНК. Нижняя часть молекулы еще имеет форму
двойной спирали со спаренными основаниями. В верх-
ней части двойная спираль уже расплетена, и на каждой
родительской цепи синтезируется новая цепь.
ВВЕДЕНИЕ
33
мононуклеотидов (дезоксинуклеотидтрифосфатов).
Все ДНК-полимеразы удлиняют полинуклеотидную
цепь последовательным добавлением отдельных
дезоксинуклеотидов.
Выбор нуклеотида, который должен быть при-
соединен к цепи, определяется способностью вхо-
дящего в его состав основания образовывать
комплементарную пару со следующим свободным
основанием цепи-матрицы. Высокая надежность
процесса репликации гарантирует практически без-
ошибочную передачу генетической информации
в ряду поколений.
Одно из открытий, сделанных при изучении
простейших геномов, состояло в том, что они ко-
дируют аппарат для собственного увековечения и
сохранения (т. е. репликации и репарации геномной
ДНК). Более того, генетическая программа допус-
кает возможность перестроек ДНК, и хотя при этом
часто образуются невыгодные, неблагоприятные
перестройки, создаваемые новые комбинации генов
являются материалом для эволюционного экспе-
риментирования. Все геномы содержат информа-
цию, необходимую для синтеза РНК, ферментов
и различных белков, участвующих в этих процессах.
Один из таких процессов генетическая рекомби-
нация, в результате которой происходит обмен
между сегментами гомологичных хромосом. Ранее
мы отмечали, что генетические обмены связаны,
по-видимому, со спариванием хромосом в мейозе;
более того, процесс кроссинговера можно визуа-
лизировать. Если рассматривать эти события на
молекуляном уровне, то рекомбинация происходит
в местах перекреста и состоит в разрыве и воссо-
единении цепей в пределах соответствующих (го-
РИС. 1.20.
Рекомбинация между двумя гомологичными участками
родительских хромосом, несущими разные аллели ге-
нов X, Y и Z. Показаны различные возможные продукты
рекомбинации.
мологичных) областей ДНК рекомбинирующих
хромосом (рис. 1.20). Рекомбинация, также генети-
чески детерминированная, может происходить и
между определенными участками ДНК негомоло-
гичных хромосом; в результате создаются новые
связи между генетическими структурами. Для осу-
ществления различных процессов рекомбинации,
обнаруженных у прокариот, требуется целая армия
ферментов, обеспечивающих спаривание гомологов
или особых последовательностей и катализирую-
щих разрывы и воссоединение цепей.
Существуют также и специальные механизмы
репарации повреждений ДНК. Облучение клеток
ультрафиолетовым светом или рентгеновскими
лучами либо обработка различными химическими
агентами приводят к повреждениям, затрагиваю-
щим основания или остов молекулы ДНК. В ДНК
закодирована информация о синтезе репарирующих
ферментов и белков, поддерживающих целостность
генома любого организма.
Экспрессия и регуляция генов
Белки - основные детерминанты фенотипа ор-
ганизма. Из них построены и ферментативный ап-
парат, обеспечивающий метаболическую, энерге-
тическую и биосинтетическую активность всех кле-
ток, и регуляторные элементы, координирующие
эти виды активности в ответ на эндогенные и экзо-
генные сигналы. Белки являются также основными
компонентами многих структурных элементов, ха-
рактеризующих морфологию клетки и опосредую-
щих ее движение. Говоря в двух словах, орга-
низмы - это в конечном счете те белки, которые они
сами и производят.
Постулат «один ген один полипептид» создал
концептуальную базу для анализа связи генотипа
организма с его фенотипом. Но до решения проб-
лемы структурной организации белков и ДНК, т. е.
до начала 50-х годов, эта теория не имела моле-
кулярной основы. С разработкой новых методов
анализа белковой структуры было установлено, что
каждый белок обладает уникальной линейной ами-
нокислотной последовательностью (рис. 1.21, Л).
Эта последовательность, называемая первичной
структурой, определяет характер укладки полипеп-
тидной цепи с образованием биологически активной
трехмерной формы (рис. 1.21, Б и В). Таким об-
разом, структура белка определяется его амино-
кислотной последовательностью, которая в свою
очередь кодируется генами. Доказательством этому
служит тот факт, что мутации в гене приводят
к изменению аминокислотной последовательности
соответствующего белка. Более того, последова-
тельности мутантных сайтов в генах и последова-
тельности измененных аминокислот в соответст-
3 243
34
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 1.21.
А. Первичная структура белка ингибитора панкреати-
ческого трипсина из клеток быка. Б. Трехмерная
структура белка (ленточная диаграмма). Видны локаль-
ные области вторичной структуры (например, спираль-
ные участки с 47-го остатка по 56-й), а также изгибы
цепи с образованием третичной структуры, стабилизи-
руемой взаимодействиями между аминокислотами, ко-
торые не являются ближайшими соседями вдоль поли-
пептидной цепи. Эти взаимодействия осуществляются
между остатками цистеина (цветные шарики) с по-
мощью дисульфидных связей. В. Молекулярная модель
белка. Ленточная диаграмма на рис. Б представляет
собой вид на эту модель снизу. [С любезного раз-
решения Т. Е. Creighton, J. Mol. Biol., 95 (1975), р. 167.]
вующих белках коллинеарны, т. е. порядок их сле-
дования одинаков. Таким образом, было показано,
что линейное расположение нуклеотидов в ДНК
и аминокислот в белках взаимосвязано, т. е. одна из
характеристик генетического кода установлена.
Идея генетического кода подразумевает сущест-
вование определенного механизма перевода нукле-
отидной последовательности ДНК в аминокислот-
ную последовательность белков. С середины 50-х до
начала 60-х годов молекулярные основы генети-
ческого кода и механизм его расшифровки при
сборке полипептидной цепи были установлены.
Раскрытие этой тайны стало одним из монумен-
тальных достижений молекулярной генетики. Не-
ожиданно код оказался очень простым и абсолютно
одинаковым для всех жизненных форм. Более того,
выяснилось, что универсальны и общие правила
трансляции генетически закодированных посланий.
ВВЕДЕНИЕ
35
AGA
AGG
GCA CGA GGA
GCG CGG GGG
GCT CGT GAT AAT TGT GAA CAA GGT CAT
GCC CGC GAC AAC TGC GAG CAG GGC CAC
TTA
TTG
СТА CCA
ATA CTG CCG
ATT CTT AAA TTT CCT
АТС СТС AAG ATG TTC CCC
AGT
AGC
GTA
GTG TAA
TAT GTT TAG
TAC GTC TGA
ТСА АСА
TCG, ACG
TCT ACT
TCC ACC TGG
Ala Arg Asp Asn Cys Glu Gin Gly His lieu Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Vai stop
РИС. 1.22.
Генетический код.
Генетический словарь состоит из 64 кодонов,
каждый из которых представлен тремя последова-
тельно расположенными нуклеотидами в цепи ДНК
(рис. 1.22). 61 из 64 триплетов кодируют амино-
кислоты, причем каждый триплет только одну
аминокислоту. Один из этих триплетов имеет двой-
ную функцию: кодирует аминокислоту метионин
и обозначает начало фрагмента ДНК, кодирующего
белок. Каждый из трех остальных триплетов может
служить сигналом окончания последовательности,
кодирующей белок. Генетический код вырожден,
поскольку одной и той же аминокислоте может
соответствовать более чем один кодон; но, с другой
стороны, код не двусмысленный, потому что любой
кодон обозначает только одну аминокислоту. Если
известен словарь кодонов, то перевести генную
последовательность в соответствующий белковый
продукт не составляет труда.
Нематричная цепь
Инициация
транскрипции:
расплетание ДНК
в начале гена
Матричная цепь
Перемещение места
синтеза вдоль
молекулы ДНК
Синтез РНК путем
комплементарного
спаривания с
матричной цепью ДНК
Транскрипция
доходит до
конца гена
Отделение молекулы
РНК и восстановление
спиральной структуры
ДНК
РИС. 1.23.
Основные этапы транскрипции. Нуклеотидная последо-
вательность РНК такая же, как у нематричной цепи ДНК.
з*
36
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: О ВЗОР
РИС. 1.24.
Основные этапы трансляции матричной РНК с образо-
ванием белка (полипептидная цепь и мРНК изображены
без соблюдения масштаба). А. Первая рибосома уже
заняла свое место на мРНК; она несет короткий поли-
пептид-начальный участок кодируемого белка. Б.Кар-
тина. наблюдаемая через несколько секунд. Рибосома
Отделившаяся рибосома
перемещается по мРНК, которая диктует последова-
тельное присоединение аминокислот к полипептидной
цепи. Такой же процесс осуществляется с участием
второй, третьей и четвертой рибосом, в результате чего
на мРНК образуется полирибосомный кластер. В. Пер-
вая рибосома завершила сборку полипептидной цепи.
Полипептидная цепь отделяется от рибосомы, а послед-
няя отделяется от мРНК Укладка синтезируемых поли-
пептидных цепей и образование вторичной и третич-
ной структуры начинаются еще до завершения их син-
теза.
Полностью синтезированная
полипептидная цепь
Для экспрессии гена в виде белкового продукта
сначала должна произойти транскрипция ДНК с
образованием РНК (рис. 1.23). Этот процесс
осуществляется с помощью РНК-полимераз - фер-
ментов, катализирующих синтез цепи РНК путем
копирования нуклеотидной последовательности
одной цепи ДНК с помощью комплементарного
спаривания оснований. Гены, кодирующие белки,
детерминируют синтез молекулы «мессенджер»-,
или матричной РНК (мРНК), называемой так по-
тому, что она несет генетическую информацию,
закодированную в соответствующем сегменте ДНК,
и непосредственно участвует в сборке белков.
Некоторые гены не кодируют никаких белков. При
их транскрипции образуются не мРНК, а молекулы
РНК, необходимые для образования зрелых РНК
разного типа и для трансляции мРНК в белки.
Исследование взаимодействия РНК-полимераз
и других вспомогательных белков транскрипции
с ДНК расширило наши знания о специфичности
ВВЕДЕНИЕ
37
и прочности межмолекулярных взаимодействий.
Так, было показано, что осуществляются очень
точные молекулярные контакты между белками и
специфичными группами нуклеотидов в ДНК, а это
в свою очередь открыло новые перспективы в ис-
следовании проблем экспрессии и регуляции генов.
Мы вкратце прокомментируем, как такие взаимо-
действия опосредуют регуляцию работы генов.
В рамках вводной главы невозможно описать
такой совершенный процесс, как трансляция по-
следовательности нуклеотидов матричной РНК в
белковую цепь. Он действительно очень сложен
и состоит из множества повторяющихся этапов
(рис. 1.24). Трансляцию молекул мРНК в белки
катализируют рибонуклеопротеиновые частицы
(рибосомы), содержащие более 50 различных белков
и три вида молекул РНК. Синтез белковой цепи
начинается с присоединения рибосом к матричной
РНК. Белковая цепь удлиняется на одну аминокисло-
ту, когда рибосома продвигается вдоль молекулы
мРНК на один кодон. Ключевой момент трансля-
ции перевод генетической информации, закодиро-
ванной в триплетных кодонах матричной РНК,
в специфические аминокислоты - зависит от комп-
лементарного спаривания оснований. Каждая ами-
нокислота присоединяется к особой, родственной ей
транспортной РНК (тРНК), содержащей триплет
(антикодон), комплементарный кодоновому трипле-
ту в матричной РНК. Благодаря спариванию осно-
ваний между кодоном мРНК и антикодоном тРНК
нужная аминокислота занимает свое место в расту-
щей полипептидной цепи. За один цикл переме-
щения рибосомы по всей длине молекулы мРНК,
кодирующей данный белок, образуется одна мо-
лекула этого белка.
Изучение экспрессии генов-только один из
аспектов исследования механизма их действия.
Другой связан с регуляторными процессами, конт-
ролирующими время и степень экспрессии при
разных условиях. Неудивительно, что прогресс в
понимании механизма транскрипции и трансляции
позволил прояснить и проблему регуляции. Так,
было показано, что у бактерий регуляция экспрессии
генов происходит дифференцированно. Действи-
тельно, при некоторых условиях многие гены не
экспрессируются вовсе, а степень экспрессии других
различается на порядки. Однако изменение условий
может приводить к активации молчавших ранее ге-
нов и, напротив, к репрессии активных. Это предо-
ставляет клеткам широкие возможности для из-
менчивости, обеспечивающей приспособленность их
фенотипов к условиям среды.
Экспрессия генов обычно регулируется на
уровне образования РНК. Как правило, инициация
транскрипции регулируется либо репрессорными
белками, блокирующими транскрипцию, либо
активаторными, необходимыми для ее запуска. В
первом случае экспрессия начинается после снятия
репрессии в результате модификации белка-реп-
рессора. Во втором ген транскрибируется только
в том случае, если активаторный белок находится
в соответствующем функциональном состоянии.
Репрессорные и активаторные белки-не единст-
венные средства регуляции транскрипции. В неко-
торых случаях белки - продукты генной экспресии-
сами служат регуляторами транскрипции собст-
венных генов. Известны также случаи, когда на
эффективность транскрипции влияют структурные
изменения в ДНК. Образование РНК может регу-
лироваться и путем контроля скорости элонгации
или места ее окончания, т. е. транскрибироваться
может весь ген или какая-то его часть при наличии
специфического стоп-сигнала. Экспрессия генов
может также регулироваться на уровне трансляции
матричной РНК в белки. В этом случае специфи-
ческая регуляция тоже обычно осуществляется на
начальных этапах процесса декодирования.
В этом вводном разделе мы кратко описали
зарождение генетики и ее эволюцию, в ходе которой
были созданы молекулярные основы этой науки.
Материал, позволяющий понять эти основы, пред-
ставлен главным образом в гл. 1-3, составляющих
часть I книги. Данные, которые были получены при
использовании микроорганизмов (бактерий и их
вирусов) в качестве объектов исследования, создали
фундамент для изучения более сложных геномов
эукариот. :
Глава 1
МОЛЕКУЛЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА
Генетическая информация у всех клеток зако-
дирована в виде последовательности нуклеотидов
в дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК). Первый
этап реализации этой информации состоит в
образовании родственной ДНК молекулы - рибо-
нуклеиновой кислоты (РНК), которая в свою оче-
редь участвует в синтезе специфических белков.
Фенотипические признаки любого организма в ко-
нечном счете проявляются в разнообразии и коли-
честве белков, кодируемых ДНК. Информационная
связь между молекулами генетического аппарата -
ДНК, РНК и белками представлена на рис. 1.1.
Чтобы генетическая информация могла пере-
даваться от одного поколения клеток к другому,
должна происходить репликация ДНК процесс, в
ходе которого родительские молекулы ДНК уд-
ваиваются и затем распределяются между потом-
ками. Этот процесс должен осуществляться с боль-
шой точностью, а повреждения или случайные
ошибки, возникшие в ДНК во время циклов реп-
ликации или между ними, необходимо исправить
прежде, чем они попадут в геномы потомков.
Кроме того, для формирования фенотипа генети-
ческая информация должна экспрессироваться. У
всех клеточных организмов экспрессия генов вклю-
чает копирование ДНК с образованием РНК (транс-
крипцию) и последующую трансляцию РНК в белки.
Как будет показано в гл. 3, при транскрипции
образуется несколько типов РНК. Одни из них,
матричные РНК (мРНК), кодируют белки, другие
участвуют в различных процессах, необходимых для
сборки полноценного белка. ДНК не только ко-
дирует ферментативный аппарат клетки; она участ-
вует в процессах репарации, а при определенных
условиях в ней могут происходить перестройки.
Репликация, репарация и перестройки ДНК-клю-
чевые процессы, с помощью которых организмы
поддерживают свойственный им фенотип и изме-
няют его.
У многих вирусов генетическая информация
также закодирована в ДНК. Механизмы реплика-
ции, репарации, перестройки и экспрессии вирусной
ДНК аналогичны механизмам, используемым клет-
ками других организмов. Геном некоторых вирусов
представлен не ДНК, а РНК. Геномная РНК таких
вирусов либо непосредственно транслируется в
белки, либо обладает генетической информацией,
необходимой для синтеза молекул РНК. которые
в свою очередь транслируются в белки. Те вирусы,
у которых геном представлен РНК в течение всего
жизненного цикла, должны сами реплицировать
родительскую РНК для получения потомства ви-
русных частиц. Существует класс ретровирусов,
репродуктивный цикл которых начинается с того,
что их генетическая информация в ходе так назы-
ваемой обратной транскрипции переводится на язык
ДНК. Полученные копии ДНК, или провирусы,
способны к репликации и экспрессии только после
интеграции в хромосомную ДНК клетки. В такой
интегрированной форме вирусные геномы репли-
цируются вместе с ДНК клетки-хозяина, и для
образования нового поколения вирусных геномов
и мРНК, нужной для синтеза вирусных белков, они
используют транскрипционный аппарат клетки.
Ключевым моментом в передаче генетической
информации между нуклеиновыми кислотами, будь
то репликация, транскрипция или обратная транс-
крипция, является то, что молекула нуклеиновой
кислоты используется в качестве матрицы в на-
правленной сборке идентичных или родственных
структур. Насколько известно, информация, хра-
нящаяся в белках, не используется для сборки со-
ответствующих нуклеиновых кислот, т. е. обратная
трансляция не обнаружена. Тем не менее белки
играют ключевую роль в процессах передачи ин-
формации как между нуклеиновыми кислотами, так
и от нуклеиновых кислот к белкам.
Обратная РИС. 1.1.
транскрипция Информационная связь между ДНК, РНК и белками
1. МОЛЕКУЛЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА
39
В этой главе мы рассмотрим химические и фи-
зические характеристики ДНК, РНК и белков, по-
скольку секреты генотипических и фенотипических
функций этих молекул скрыты в их молекулярной
структуре и свойствах. Механизмы репликации, репа-
рации и рекомбинации нуклеиновых кислот детально
обсуждаются в гл. 2, а механизмы транскрипции
и трансляции в процессе экспрессии генетической
информации - в гл. 3.
1.1. СТРУКТУРА И ПОВЕДЕНИЕ ДНК
а. Компоненты молекулы ДНК и
соединяющие их химические связи
С помощью химических и физических методов
установлено, что ДНК это полимер, состоящий из
четырех разных, но родственных мономеров. Каж-
дый мономер - нуклеотид - содержит одно из четы-
рех гетероциклических азотистых оснований: аденин
(А), гуанин (G), цитозин (С) или тимин (Т), свя-
занное с дезоксирибозофосфатом (рис. 1.2). Длин-
Сахар (дезоксирибоза)
Нуклеозид (дезоксиаденозин)
Нуклеотид (дезоксиаденозин-Б'-фосфат)
РИС. 1.2.
Дезоксирибонуклеотиды. Цифрами обозначены поло-
жения атомов в гетероциклических кольцах пуринов
(аденин и гуанин) и пиримидинов (тимин и цитозин)
и углеродных атомов в дезоксирибозе
Дезокситимидин -
монофосфат, dTMP
Дезоксигуанозин-
монофосфат, dGMP
Дезоксицитидин -
монофосфат, dCMP
Дезоксиаденозин-
монофосфат, dAMP
ные полинуклеотидные цепи образуются путем
соединения дезоксирибозных остатков соседних
нуклеотидов с помощью фосфодиэфирных связей
(рис. 1.3). Каждый фосфат соединяет гидроксиль-
ную группу (ОН) при З'-углеродном атоме дезок-
сирибозы одного нуклеотида с ОН-группой при
5'-углеродном атоме дезоксирибозы соседнего нук-
леотида.
Частота встречаемости в определенном соседст-
ве любых двух оснований в ДНК бактерий, бак-
териофагов и дрожжей зависит от количественного
содержания этих оснований в ДНК (табл. 1.1).
Частота встречаемости 5'-CG-3' и 5'-GC-3' в ДНК
прокариот почти одинакова и близка к случайной;
то же самое можно сказать и о дйнуклеотидах
5'-GA-3' и 5'-AG-3'. Однако в ДНК животных, ви-
русов животных и растений частоты встречаемости
5'-CG-3' составляют от 1/2 до 1/5 частот 5'-GC-3'.
Таким образом, последовательность 5'-CG-3' встре-
чается в ДНК высших эукариот довольно редко; это
связано со способностью данного динуклеотида
служить мишенью при метилировании и с его
ролью в регуляции экспрессии генов.
После окончания цикла синтеза ДНК некоторые
пуриновые и пиримидиновые основания могут под-
вергаться химической модификации. В результате
в некоторых ДНК содержатся 5-метилцитозин,
5-гидроксиметилцитозин, 5-гидроксиметилурацил
и N-метиладенин (рис. 1.4). В ДНК некоторых
бактериофагов к гидроксиметильной группе гид-
роксиметилцитозина присоединены с помощью
40
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 1.3.
Связь между соседними дезоксирибонуклеотидами в
полинуклеотидной цепи. В правом нижнем углу рисунка
показаны некоторые способы схематического изобра-
жения дезоксирибонуклеотидной последовательности.
Нуклеотидную последовательность принято изображать
слева направо, от 5'- к З'-концу.
Таблица 1.1. Частоты встречаемости некоторых
ближайщих соседей в различных ДНК
Источник ДНК
З'-конец
Вирусы бактерий
Л
Т2
Бактерии
Escherichia coli
Micrococcus lysodeikticus
Bacillus subtilis
Вирусы животных
SV40
Полиомавирусы
Вирус папилломы
Шоупа
Одноклеточные
эукариоты
Saccharomyces cerevisiae
Chlamydomonas
М ногоклеточные
эукариоты
Цыпленок
Человек
Мышь
Корова
Пшеница
Отношение
5'-CG-3’/5'-GC-3' 5'-AG-375'-GA-3'
1,02 0,90
0,82 0,96
0,95 1,0
1,15 0,75
0,82 0,87
0,14 1,35
0,35 1,28
0,44 1,16
0,87 0,96
0,68 1,36
0,21 1,28
0,23 1,15
0,23 1,15
0,36 1,10
0,78 0,97
гликозидной связи моно- или дисахариды. ДНК
большинства низших эукариот и беспозвоночных
содержат относительно мало 5-метилцитозина и
1Ч6-метиладенина. Однако у позвоночных метили-
рование оснований - частое явление, причем наибо-
лее распространен 5-метилцитозин. Показано, что
более 95% метильных групп в ДНК позвоночных
содержится в остатках цитозина редко встре-
чающихся CG-динуклеотидов и более 50% таких
динуклеотидов метилировано. Существуют четкие
указания на то (разд. 8.7), что степень метилиро-
вания некоторых CG-содержащих последователь-
ностей является важным фактором регуляции
экспрессии определенных генов. У растений 5-ме-
1. МОЛЕКУЛЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА
41
5-метилцитозин
5’-гидроксиметилурацил
№-метиладенин
5-гидроксиметилцитозин (НМС)
Г ентиобиозил-НМС
Глюкозил-НМС
мерно перпендикулярны оптической оси спирали.
Спираль делает полный оборот каждые 3,4 нм, т. е.
через каждые 10 оснований. На наружной ее поверх-
ности имеются два желобка-большой и малый.
РИС. 1.4.
Структурные формулы модифицированных пуринов и
пиримидинов, обнаруженных в ДНК.
тилцитозин можно обнаружить в динуклеотидах CG
и тринуклеотидах CNG (N-C, А или Т).
б. Спиральная структура ДНК
С помощью физико-химических, электронно-
микроскопических и рентгеноструктурных мето-
дов показано, что большинство молекул ДНК пред-
ставляют собой протяженные, гибкие, нитевидные
структуры. Этими же методами установлено, что
молекула ДНК имеет почти постоянный диаметр
и состоит из регулярно расположенных повто-
ряющихся звеньев, причем ее структура не зависит
от нуклеотидного состава. Таким образом, в отли-
чие от белков, двух- и трехмерная структура кото-
рых обязательно зависит от состава и порядка
расположения аминокислот (разд. 1.3), молекула
ДНК в обычных условиях при любом нуклеотидном
составе и порядке расположения четырех нуклео-
тидов представляет собой абсолютно регулярную
практически идентичную по всей длине структуру.
Такие в какой-то степени парадоксальные хими-
ческие и физические свойства ДНК порождаются
особенностями ее структуры.
Молекула ДНК обычно находится в форме
двойной спирали, образуемой двумя полинуклео-
тидными цепями, обвивающимися одна вокруг дру-
гой. Два дезоксирибозофосфатных остова, распо-
ложенные по периферии молекулы, имеют анти-
параллельную ориентацию (рис. 1.5 и 1.6). В наи-
более часто встречающейся структурной форме
пуриновые и пиримидиновые основания в каждой
цепи уложены в стопки с интервалом 0,34 нм и на-
правлены внутрь спирали; плоскости колец при-
РИС. 1.5.
Схематическое изображение В-формы двойной спира-
ли ДНК. Видны большой и малый желобки Указаны
расстояние между ближайшими парами оснований и
шаг спирали. [A. Kornberg, DNA Replication (San Fran-
cisco: W. H. Freeman, 1980).]
42
ЧАСТЬ 1 МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВ ЕННОСТИ:ОБЗОР
РИС. 1.6.
Пространственная модель В-формы двойной спирали
ДНК. (С любезного разрешения Dr. Melson Max, Law-
rence Livermore National Labs.)
Азотистые основания четырех нуклеотидов ДНК
не находятся между собой в количественном со-
отношении 1:1, как это представлено на рис. 1.3.
Напротив, молярные отношения двух пуринов,
А и G, и двух пиримидинов, Т и G, различны для
ДНК разных организмов (табл. 1.2). В то же время
соотношение между пуринами и пиримидинами
постоянно и не зависит от источника ДНК, а
именно: содержание пуриновых нуклеотидов (А + G)
всегда равно содержанию пиримидиновых нуклео-
тидов (Т + G); число А равно числу Т, и аналогично
для G и С. Эти факты и легли в основу предполо-
жения, что пуриновые и пиримидиновые нуклео-
тиды в ДНК спарены, а двойная спираль стаби-
лизируется с помощью водородных связей между
пуринами одной цепи ДНК и пиримидинами другой
(рис. 1.5 и 1.6).
Два указанных типа пар оснований, АТ и GC,
обычно называемых комплементарными парами,
преобладают в большинстве ДНК (рис. 1.7). В
АТ-паре основания соединены двумя водородными
связями: одна из них образуется между амино-
и кето-группами, а другая - между двумя атомами
азота пурина и пиримидина соответственно. В
GC-nape имеются три водородные связи: две из них
образуются между амино- и кето-группами соот-
ветствующих оснований, а третья-между атомами
азота. Образование пар между двумя пуринами,
двумя пиримидинами или некомплементарными
основаниями (А + С или G + T) стерически затруд-
нено, поскольку при этом не могут образовываться
подходящие водородные связи и, следовательно,
нарушается геометрия спирали. Модифицирован-
ные пурины и пиримидины, с небольшой частотой
встречающиеся в ДНК (рис. 1.4), образуют такие же
водородные связи, что и их немодифицированные
аналоги: тем самым правило спаривания не нару-
шается. Согласно этим правилам, последователь-
ность оснований в одной цепи определяет их после-
довательность в другой. Комплементарность по-
следовательности оснований в двух полинуклеотид-
ных цепях - ключевое свойство ДНК.
Дополнительная стабилизация двойной спи-
рали обеспечивается межплоскостными взаимо-
действиями ароматических колец соседних основа-
ний. Размеры комплементарных пар оснований
практически одинаковы; примерно одинаковы также
угол и направление связи дезоксирибоза основа-
ние. Расстояние между соседними основаниями
равно 0.34 нм, а угол, на который они повернуты
друг относительно друга, 36й. Из всех этих данных
следует, что диаметр спирали постоянен, а число
пар оснований на виток спирали равно 10 (рис. 1.5).
Точные данные о расположении, ориентации в
пространстве и размерах различных составляющих
ДНК были получены методом рентгеноструктур-
ного анализа волокон ДНК.
в. Альтернативные формы двойной
спирали ДНК
Все, о чем мы говорили, касалось наиболее
распространенной, так называемой В-формы двой-
ной спирали ДНК. Известны также два других
изомерных типа двойной спирали. Они образуются
благодаря тому, что валентные углы между осно-
ваниями и сахаром могут меняться, а дезоксири-
бозное кольцо и сахарофосфатный остов доста-
точно гибки, чтобы могли сформироваться аль-
тернативные конфигурации. Редко встречающаяся
A-форма, существующая только при пониженной
влажности, отличается от В-формы тем, что плос-
кости оснований составляют с перпендикуляром
1. МОЛЕКУЛЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА
43
Таблица 1.2. Нуклеотидный состав различных ДНК
Источник А” G С Т А + Т G +С A + G Т + С G + С. мол. %
Бактериофаг X 26,0 23,8 24.3 25,8 1.08 0,99 48
Бактериофаг Т2 32,5 18,2 16.72’ 32,6 1,862’ 1,032’ 352’
Escherichia coli 23,8 26,0 26,4 23,8 0,91 0.99 52
Bacillus subtilis 29,0 20,7 21,3 29,0 1,38 0,99 42
Вирус папилломы Шоупа 26,6 24,5 24,2 24,7 1.05 1.04 49
Saccharom vce.s cerevisiae 31,3 18,7 17,1 32,9 1,79 1,00 36
Chlam rdomonas 19,6 30.2 ЗО.О31 19,7 0.6531 0.993’ 6031
Цыпленок 27,9 21,2 21,53’ 29,4 I.3431 0.9631 433’
Мышь 28,9 21,1 20,331 30.0 1,443’ 1,0031 4131
Корова 27,3 22,5 22,53’ 27,7 1,223’ 0,9931 4431
Пшеница 27,2 22,6 22.831 27,4 I.203’ 0,9931 4531
11 Использованы общепринятые сокращенные обозначения пуринов и пиридинов
21 5 гидроксиметилцигозин.
” Включая 5-ме1Илнитозин.
к оси спирали угол 20' (рис. 1.8). Поэтому рас-
стояние между парами оснований по вертикали
уменьшается до 0,29 нм, а число пар на виток
увеличивается до 11 12. Какова биологическая
функция A-формы ДНК пока неясно.
Характерной особенностью В-формы ДНК
является то, что сахарофосфатные остовы обеих
цепей образуют правую спираль (рис. 1.5 и 1.6).
Однако при определенных условиях участки ДНК,
для которых характерно чередование пуриновых
РИС. 1.7.
Водородные связи между комплементарными основа- оснований практически одинакова. [A. Kornberg, DNA
ниями в ДНК. Видно, что геометрия двух типов пар Replication (San Francisco: W. H. Freeman, 1980.)]
44
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
А-ДНК
В-ДНК
РИС. 1.8.
Пространственные модели В-, А- и Z-ДНК (каждая из
моделей содержит 20 пар оснований). Атомы фосфора
и связанные с ними атомы кислорода изображены
в виде темных шариков, атомы азота-в виде слегка
затененных шариков. Сплошная линия, соединяющая
фосфатные группы, показывает ход полинуклеотидной
спирали. Обратите внимание на зигзагообразную фор-
и пиримидиновых нуклеотидов, принимают форму
левой спирали. При этом расстояние между сосед-
ними парами оснований увеличивается до 0,77 нм,
а число пар на один виток-до 12. Остов молекулы
ДНК имеет зигзагообразный вид, поэтому подоб-
ная форма получила название Z-ДНК. Вопрос о
том, существует ли Z-ДНК в естественных условиях
и образуется ли она в определенных участках
В-спирали под действием специфических белков,
способных переводить В-форму в Z-форму, сейчас
интенсивно исследуется (гл. 8, разд. 8.7).
г. Размер молекул ДНК
Обычно размер молекулы ДНК выражается в
числе пар нуклеотидов, при этом за единицу берется
тысяча пар нуклеотидов (т. п. н.). Мол. масса одной
т. п. н. В-ДНК равна в среднем 6,6-105, а ее длина
составляет 340 нм. Если принять все необходимые
меры, чтобы не разрушить ДНК при выделении,
и использовать мягкие методы измерения длины, то
обнаружится удивительное соответствие между
z-ДНК
му остова Z-ДНК. А-ДНК короче и толще, а Z-ДНК чуть
длиннее и тоньше, чем В-ДНК. В А-ДНК большой
желобок более глубокий, но зато малый уплощен и
напоминает обвитую по поверхности ленту. У Z-ДНК
желобок только один, он чуть глубже, чем большой
желобок у В-ДНК, но не такой глубокий, как у А-ДНК.
(С любезного разрешения A. Rich.)
длиной молекулы ДНК и массой одной небольшой
хромосомы (табл. 1.3). Так, молекулы ДНК единст-
венных хромосом, из которых состоят геномы бак-
териофагов А и Т4, а также адено- и герпесвирусов,
имеют длину, соответствующую числу пар осно-
ваний в одной хромосоме, составляющей геном
каждого из этих вирусов. Полный геном Е. coli
(~4106п.н.) также представлен единственной
молекулой ДНК и имеет длину 1,4 мм. Есть все
основания считать, что каждая из хромосом дрож-
жей, Drosophila и даже человека состоит из одйой
молекулы ДНК размером от нескольких десятков
тысяч до многих миллионов пар нуклеотидов.
д. Разнообразие форм ДНК
Существовавшее до недавнего времени мнение
о том, что В-ДНК-это совершенная двойная спи-
раль, геометрия которой одинакова независимо от
нуклеотидной последовательности, в действитель-
ности не совсем корректно. Детальный рентгено-
структурный анализ, построение моделей и термо-
динамические расчеты показали, что плоскости со-
1. МОЛЕКУЛЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА
45
Таблица 1.3. Молекулярная масса, длина и тип структуры ДНК различного происхождения
Источник Мол масса Длина Число пар оснований Тип структуры
Бактериофаг фХ174 1,6-106 1,6 мкм 51031’ Кольцевая одноцепочечная
SV40 3,5-106 1,1 мкм 5,2- I03 Кольцевая двухцепочечная
Бактериофаг Т2 1,2-108 50 мкм 2- 10s Линейная двухцепочечная
Хромосома Hemophilus influenzae 7,9-108 300 мкм 1,2-106 Неизвестен
Хромосома Escherichia coli 2,6-109 1 мм 4106 Кольцевая двухцепочечная
Saccharomyces cerevisiae Хромосома 1 1,4-108 50 мкм 2,1-Ю5 Линейная двухцепочечная
Хромосома 12 1.5-109 500 мкм 2,2- I06 То же
Drosophila melanogaster Хромосома 2 4-IO10 15 мм 6,0-107 » »
Хромосома 3 4,2- 1О10 16 мм 6,3 107 » »
Хромосома 4 4- I09 1.5 мм 6-106 » »
11 В данном случае указано число оснований, а не пар оснований.
седних пар оснований не строго параллельны. Каж-
дая комплементарная пара оснований является как
бы клином, отклоняющим ось спирали в одном или
в другом направлении. Наибольший «крен» наблю-
дается тогда, когда два соседних аденина в одной
цепи спарены с двумя тиминами другой. В этом
месте происходит локальное искривление спирали.
Если такие пары встречаются с периодичностью
примерно один раз на 10 пар (т. е. один раз на
каждый виток спирали), то молекула ДНК приоб-
ретает заметно искривленную форму. Искривлен-
ная, или изогнутая, структура была, например,
обнаружена в линейных фрагментах ДНК кине-
топластов трипаносомы Leishmania tarentolae по
аномально малой подвижности этих фрагментов при
электрофорезе в полиакриламидном геле. Изгибы
в молекуле ДНК наблюдаются в тех участках
последовательности, где с необычно высокой час-
тотой встречаются повторы (А-Т)5_6, разделен-
ные GC-богатыми участками из четырех-шести
нуклеотидов. Биологическая роль искривления ДНК
окончательно не установлена. Предрасположен-
ность к такому изгибанию, зависящая от последо-
вательности оснований, может иметь значение при
наматывании молекулы ДНК на гистоновые окта-
меры в хроматине (разд. 1.1.ж). Возможно, изги-
бание ДНК существенно и при специфическом свя-
зывании ДНК с белками в процессе регуляции
экспрессии генов.
ДНК может находиться в линейной или коль-
цевой форме (рис. 1.9). Бактериальные плазмиды,
хромосомы некоторых бактерий, большинство ми-
тохондриальных и хлоропластных ДНК, геномы
вирусов млекопитающих представлены единствен-
ной ковалентно замкнутой кольцевой дуплексной
молекулой ДНК. Хромосома бактериофага X на
разных стадиях жизненного цикла существует то как
линейная молекула, то как замкнутая кольцевая
структура, то как кольцо с разрывами. По-види-
мому, никакого верхнего предела для размера
кольцевой двухцепочечной молекулы ДНК не су-
ществует.
ДНК в клетке обычно находится в комплексе
с белками (см. разд. 1.1.ж). Связанный белок слегка
раскручивает спираль ДНК, соответственно и число
витков спирали на единицу длины становится
меньше, чем у свободной В-ДНК. При удалении
белка восстанавливается обычное число правоза-
крученных (положительных) витков спирали. В
линейной молекуле ДНК это происходит доста-
точно легко, поскольку обе цепи свободно вра-
щаются одна вокруг другой. В замкнутой же коль-
цевой молекуле общее число витков спирали тополо-
гически фиксировано, и число оборотов одной цепи
вокруг другой не может быть изменено без ком-
пенсаторного образования витков противополож-
ного знака где-нибудь в другом месте молекулы.
Итак, когда естественные кольцевые дуплексы осво-
бождаются от белков, с которыми они часто бы-
вают связаны in vivo, происходит следующее:
1) число правозакрученных (положительных) вит-
ков спрали возрастает до величины, характерной
для В-ДНК; 2) в самом дуплексе образуется
столько же витков противоположного знака, чтоб^г
компенсировать увеличение скрученности спирали.
О таких молекулах говорят, что они обладают
отрицательной сверхспиральностью (рис. 1.10). При
внесении одного разрыва в сверхспиральную коль-
цевую ДНК сверхспиральность снимается и коль-
цевая структура переходит в релаксированное со-
стояние. при котором топологические ограничения
отсутствуют. Любые химические или физические
изменения, приводящие к уменьшению числа витков
спирали на молекулу, уменьшают или вообще сни-
мают отрицательную сверхспиральность в замкну-
той кольцевой ДНК.
46
ЧАСТЬ 1 МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
>00000000000000^
РИС. 1.9.
Схематическое представление и электронные микрофото-
графии линейной (А) и кольцевой (Б) двухцепочечной
ДНК фага X. (Электронные микрофотографии любезно
предоставлены L. Chow.) ДНК изображена в виде двой-
ной спирали; такое же изображение для двухцепочечной
ДНК будет использоваться повсюду в этой книге.
Не все ДНК in vivo являются двухцепочечными.
Геномы некоторых мелких вирусов бактерий, рас-
тений и животных представляют собой ковалентно
замкнутые кольца, состоящие только из одной цепи
(рис. 1.11). Все известные одноцепочечные кольце-
вые ДНК относительно малы: ДНК бактериофагов
фХ174 и М13 содержат примерно 5300 и 6000 нук-
леотидов соответственно и имеют длину 1,5- 2 мкм;
длина молекул ДНК парвовирусов животных и не-
которых вирусов растений составляет 2/3 и 1/2
указанных величин соответственно. Однако для
репликации любой из этих вирусных ДНК совер-
шенно необходимо превращение одноцепочечного
кольца в соответствующее двухцепочечное, из ко-
Сверхспиральное
кольцо
РИС. 1.10.
А. Схематическое изображение сверхспиральной коль-
цевой ДНК и релаксированных кольцевых форм, полу-
ченных либо в результате разрыва одной из двух цепей,
либо в результате локального расхождения двух цепей.
Б. Двухцепочечная кольцевая ДНК фага М13 с разной
степенью сверхспиральности. Цифрами обозначено
число сверхвитков в каждой молекуле. (С любезного
разрешения L. Chow.)
1. МОЛЕКУЛЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА
47
РИС. 1.11.
Электронные микрофотографии одно- и двухцепочеч-
ных кольцевых ДНК фага М13. Двухцепочечная ДНК
выглядит более гладкой и вытянутой и ее легче визуали-
зировать, чем одноцепочечную. (С любезного разреше-
ния L. Chow.)
Нативная
ДНК
А
Частично
денатурированная
ДНК
Почти ПОЛНОСТЬЮ
денатурирования
ДНК
торого затем образуются одноцепочечные кольце-
вые ДНК вирусного потомства (гл. 2). Более того,
экспрессия генетической информации в таких гено-
мах всегда осуществляется в фазе двухцепочечной
ДНК, поскольку именно она является субстратом
для транскрипции последовательности ДНК в РНК.
е. Денатурация и ренатурация ДНК
Водородные связи и межплоскостные взаимо-
действия, стабилизирующие двойную спираль, до-
статочно слабы, и при относительно небольших
воздействиях происходит разделение цепей про-
цесс, именуемый денатурацией, или плавлением
(рис. 1.12,Л). Двухцепочечная спиральная ДНК в
растворе легко разрушается при нагревании до тем-
ператур, близких к 100 'С. Денатурация происходит
также при увеличении pH раствора до уровня, при
котором разрушаются водородные связи между
основаниями. Многие факторы (например, одно-
и двухвалентные катионы, полиамины и белки)
80 90
Температура ---►-
РИС. 1.12.
А. Денатурация (диссоциация) двухцепочечной ДНК при
повышении температуры раствора и ренатурация (реас-
социация) двух комплементарных цепей при охлажде-
нии. Б. Кривые денатурации типичной двухцепочечной
ДНК, получаемые при повышении температуры и pH. Тт
и рН„ зто значения температуры и pH соответственно,
при которых ДНК денатурирована (или ренатурирова-
на) наполовину.
ct
Б PH
48
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 1.13.
Зависимость Тт от молярного содержания гуанина и ци-
тозина в ДНК при низкой и высокой концентрации соли.
Точки отвечают индивидуальным ДНК бактерий, бакте-
риофагов, дрожжей, растений и животных. [J. Marmur,
Р. Doty, J. Mol. Biol.. 5 (1962), р. 109.]
влияют на денатурацию, нейтрализуя частично или
полностью отрицательно заряженные фосфатные
группы остова молекулы. Интервал значений тем-
пературы или pH, при которых происходит разде-
ление цепей, очень невелик (см. рис. 1.12, Б, где Гт
и рНт-средняя точка перехода). Поскольку для
разрушения двух водородных связей АТ-пар тре-
буется меньше энергии, чем для разрыва трех во-
дородных связей GC-nap, значения температуры
и pH, при которых происходит денатурация, зависят
от нуклеотидного состава ДНК. Чем выше содер-
жание GC-nap, тем выше Тт или рНт (рис. 1.13).
Денатурация процесс обратимый, последующее
восстановление двухцепочечной структуры ДНК мо-
жет происходить даже при полном расхождении це-
пей. Процесс воссоединения, называемый ренатура-
цией, реассоциацией или отжигом, происходит при
понижении температуры или pH (рис. 1.12). Если
температура или pH понижаются постепенно, то це-
пи соединяются правильно, с восстановлением всех
исходных пар оснований. При резком понижении
температуры или pH правильное воссоединение
комплементарных цепей затрудняется из-за спари-
вания оснований локально комплементарных
участков в пределах одной или разных цепей
(рис. 1.14). Диссоциация (денатурация) и реассо-
циация (ренатурация) ДНК в растворе являются по
сути искусственным воссозданием процессов,
играющих ключевую роль в реализации разнооб-
разных биологических функций in vivo. Очень важ-
ным для дальнейшего изложения представляется то,
что способность двух отдельных комплементарных
цепей нуклеиновой кислоты воссоединяться с обра-
зованием исходной структуры является ключевым
моментом для проведения соответствующих опы-
pH раствора.
РИС. 1.14.
Ренатурация комплементарных цепей ДНК при плавном
(слева) и резком (справа) понижении температуры или
Резкое изменение
1. МОЛЕКУЛЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА
49
тов in vitro, а также для выделения, сравнения
и идентификации специфических нуклеиновых кис-
лот. Уникальная способность нуклеиновой кислоты
образовывать двойные спирали путем ассоциации
одиночных комплементарных цепей имеет огромное
значение для самых разных областей генетики.
ж. Упаковка ДНК в хромосомах
В клетках или вирусах ДНК, по-видимому, ни-
когда не находится в свободной, вытянутой форме.
Она связана с низкомолекулярными катионами
ионами двухвалентных металлов либо с ди- и по-
лиаминами или белками, а возможно, с теми и с
другими. Взаимодействие осуществляется с по-
мощью электростатических сил - отрицательно за-
ряженные фосфатные группы частично нейтрали-
зуются положительно заряженными ионами ме-
таллов и полиаминами или основными аминокис-
лотными остатками белков. В результате таких
взаимодействий происходит конденсация ДНК с
уменьшением объема, занимаемого молекулой,
иногда в тысячу раз. Кольцевая ДНК Е. coli длиной
1,4 мм заключена в клетку, имеющую форму па-
лочки диаметром 1 мкм и длиной 2 мкм; у эука-
риотических клеток ядерная ДНК длиной почти 2 м
в стадии интерфазы заключена в ядре диаметром
менее 10 мкм. Ядерная ДНК в клетках, находя-
щихся в стадии митоза, конденсирована еще больше
и в световом микроскопе имеет вид очень компакт-
ной структуры (рис. 1.7).
Хромосомы н'кариот. Хромосомы эукариоти-
ческих клеток состоят в основном из хроматина
комплекса двухцепочечной ДНК и пяти гистоновых
белков, обозначаемых Hl, Н2А, Н2В, НЗ и Н4
(табл. 1.4). Гистоны могут быть ацетилированы
метилированы, фосфорилированы, poly (АОР)-рибо-
зилированы, а гистоны Н2А и Н2В ковалентно
связаны с белком, называемым убиквитином. Ка-
кова роль воздействия указанных компонентов на
структуру и функции гистонов- до конца не выяс-
нено. Гистон Н1 млекопитающих состоит из при-
мерно 215 аминокислот; размеры других гистонов
варьируют от 100 до 135 аминокислот. Все они
содержат необычно большое количество положи-
Таблица1.4. Типичные характеристики гистонов
млекопитающих
Тип Число амино- кислот Мол. масса, кДа Число основных амино- кислот Отно- шение Lys, /Arg Число кислых амино- кислот
Н1 (кролик) 213 23,0 65 21 12
Н2А (корова) 129 14,0 26 1,2 20
Н2В (корова) 125 13,8 28 2,5 16
НЗ (корова) 135 15,3 32 0,7 18
Н4 (корова) 102 11,3 26 0,8 10
тельно заряженной аминокислоты лизина; НЗ и Н4
отличаются от других тем, что у них достаточно
высок уровень положительно заряженной аминокис-
лоты аргинина. Соотношение между Н2А, Н2В, НЗ
и Н4, содержащимися в хроматине низших эукариот
(дрожжи, плесневые грибы), такое же, как в хрома-
тине млекопитающих.
На электронно-микроскопических фотографиях
в зависимости от условий выделения и степени
растяжения хроматин выглядит либо как длинное
волокно диаметром 10 нм, либо чаще как более
вытянутое волокно с утолщениями - «бусинками»
диаметром 10 нм, нанизанными по всей длине во-
локна с определенными интервалами (рис. 1.15).
Каждая из этих бусинок представляет собой нук-
леосомный кор, на который намотан сегмент хро-
мосомной ДНК длиной 145 пар оснований. Кор
это гистоновый октамер, состоящий из гистонов
Н2А, Н2В, НЗ и Н4, по две молекулы каждого вида
(рис. 1.16). Молекула ДНК, обвиваясь 13/4 раза
вокруг нуклеосомного кора, образует сверхспираль.
Пятый гистон, Н1, не входит в состав нуклео-
сомного кора и не участвует в процессе наматывания
ДНК на гистоновый октамер. Он контактирует
с ДНК в тех местах, где двойная спираль входит
и выходит из нуклеосомного кора (рис. 1.17). В
такой структуре с одним гистоновым октамером
и молекулой гистона Н1 ассоциированы 168 пар
оснований спиральной ДНК. Как мы уже отмечали,
на электронно-микроскопических фотографиях
хроматин часто обнаруживается в двух альтерна-
тивных формах: в форме волокна с четко разде-
ленными нуклеосомами (нуклеосомы имеют вид
бусинок, нанизанных на нитку) или в форме волокна
диаметром 10 нм, в котором нуклеосомы упако-
ваны бок о бок по всей его длине (рис. 1.15).
Волокно диаметром 10 нм может подвергаться
дальнейшей конденсации с образованием структур
более высокого порядка. При этом нуклеосомы, по
всей видимости, образуют соленоид структуру
диаметром 30 нм (рис. 1.18).
В результате взаимодействия ДНК с гистонами
сегмент двойной спирали ДНК из 168 пар оснований
со средним диаметром 2 нм и длиной 57 нм пре- ч
вращается в спираль диаметром 10 нм и длиной
5 нм (рис. 1.18). При последующем сжатии этой
спирали до волокна диаметром 30 нм степень
конденсации увеличивается еще в шесть раз. Та-
ким образом, упаковка дуплекса ДНК с пятью
гистонами приводит к 50-кратной конденсации
ДНК. Однако даже столь высокая степень конден-
сации не может объяснить почти 5000-кратное уп-
лотнение ДНК в метафазной хромосоме.
Эукариотический хроматин содержит и другие
белки, которые обычно называют негистоновыми.
Некоторые из них, например ферменты, необхо-
4 243
50
ЧАСТЬ 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 1.15.
Электронные микрофотографии хроматина. А. Волокно
хроматина диаметром 10 нм из почечных клеток CV1
обезьяны. (С любезного разрешения J. Griffith.) Б. Хро-
матин из эритроцитов цыпленка, имеющий вид нити
с нанизанными на нее бусинками (С любезного разре-
шения Н. Zentgraf.)
РИС. 1.16.
Модель нуклеосомного кора, построенная по данным
кристаллографического анализа низкого и высокого
разрешения. Сегмент ДНК (145 пар оснований), изо-
браженный в виде трубки, обвивает гистоновый окта-
мер, делая вокруг него 13/4 оборота. [R. D. Kornberg,
A. Klug, Sci. Amer., 244 (2) (19В1), р. 52.]
РИС. 1.17.
Гистон Н1 «сшивает» ДНК в местах, где она начинает
и прекращает наматываться на нуклеосомный кор.
[A. Klug, Les Prix Nobel (Stockholm, Sweden, Nobel
Foundation, 1982), p. 93.]
1. МОЛЕКУЛЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА
51
РИС. 1.18.
Структура хроматина с разной степенью конденсации.
В нижней части рисунка представлен хроматин, нахо-
дящийся в растянутой форме; он имеет вид нити с нани-
занными на нее бусинками. Далее изображен хроматин
в частично конденсированной форме, представляющий
собой волокно диаметром 10 нм. В верхней части ри-
сунка представлен хроматин в наиболее конденсиро-
ванном состоянии, когда волокно диаметром 10 нм
образует соленоид диаметром 30 нм. Обратите внима-
ние на взаимодействие молекул гистона Н1, связанных
с каждой нуклеосомой, которое способствует конденса-
ции волокна диаметром 10 нм в более плотную струк-
туру. [Электронные микрофотографии любезно пре-
доставлены A. Klug. Рисунок выполнен по R. D. Kornberg,
A. Klug, Sci. Amer., 244 (2) (1981), р. 52.]
димые для репликации и экспрессии ДНК, могут
связываться с хроматином временно. Белки, при-
нимающие участие в различных процессах регуля-
ции, связываются с ДНК только в специфических
тканях или на определенных стадиях дифферен-
циации. Все эти вопросы, а также роль альтерна-
тивных способов организации хроматина в процес-
сах репликации и экспрессии мы детально рассмот-
рим в последующих главах.
Хромосомы прокариот. Насколько известно, в
упаковке прокариотической геномной ДНК участ-
вуют только два или три белка. О природе взаимо-
действия этих белков с ДНК и о структуре конден-
сированного комплекса белок-нуклеиновая кислота
известно немного. У E.coli, по-видимому, сущест-
вует лишь один белок или один класс ДНК-свя-
зываюших белков, называемых HU-белками; по
своему размеру, содержанию лизина и аргинина,
антигенным свойствам они сходны с эукариотичес-
ким гистоном Н2А. Другой белок, белок II, обна-
4*
52
ЧАСТЬ 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
ружейный у E.coli и цианобактерий, по повышен-
ному содержанию лизина и ДНК-связывающим
свойствам также напоминает эукариотический гис-
тон. Белки HU и II обнаружены в количествах,
достаточных для образования комплекса по крайней
мере с половиной ДНК Е. coli и, по-видимому,
совместно с полиаминами и еще неизвестными нам
белками могут осуществлять те же самые функции
при конденсации и упаковке ДНК, что и пять
эукариотических гистонов.
1.2. СТРУКТУРА И ПОВЕДЕНИЕ РНК
а. Типы РНК и их распространенность
Содержание РНК в любых клетках в 5 10 раз
превышает содержание ДНК. Основная роль РНК
состоит в трансляции генетической информации с
образованием белков. Однако молекулы РНК при-
нимают участие и в осуществлении некоторых спе-
циализированных эндонуклеазных функций, воз-
можно регулирующих различные этапы экспрессии
генов. Молекулами РНК представлены геномы не-
которых вирусов (ретровирусов и множества виру-
сов животных, растений и насекомых с одно- и двух-
цепочечным геномом).
Во всех клетках присутствуют следующие виды
РНК: рибосомная РНК (рРНК), транспортная РНК
(тРНК) и информационная, или матричная. РНК
(мРНК). Большинство (если не все) клеток содержат
также много других малых цитоплазматических
РНК (мцРНК), а в клетках эукариот присутствует
еще и хлалъхх лае^щхх WAS,
Члжа. \5\. ч
ставляют трИ или четыре вида рРНК. а около
15% почти 100 видов тРНК. На долю нескольких
тысяч различных матричных РНК приходится менее
з из лолзо мз-Пзг ядернои
И цитоплззмзтическои РНК. число видов которых
пока неизвестно, менее 2% от обшего количества.
б. Компоненты молекулы РНК
и соединяющие их химические связи
РНК это полинуклеотид длиной от 70 моно-
мерных единиц у некоторых тРНК до 10000 и более
у некоторых мРНК. На рис. 1.19 приведены струк-
турные формулы четырех нуклеотидов, обычно
встречающихся в РНК Два пурина (аденин и гу-
анин) и один пиримидин (цитозин) входят также
в состав ДНК. А вместо тимина (5-метилдикето-
пиримидина) в РНК входит урацил, у которого
5-метильная группа отсутствует. Нуклеотиды в мо-
лекуле РНК соединены в цепочку такими же
5' З'-фосфодиэфирными связями, как и в ДНК
(рис. 1.20). Из-за наличия 2'-ОН-группы связь Р-О
Таблица 1.5. Некоторые основные РНК
Тип РНК Приблизи- тельное число разных видов в к. ветках Приблизи- тельная длина (число нук- зеотидов) Рас- про- стра- нен- ность1’
Транспортная РНК (тРНК) 80 100 75-90 п. э
Рибосомная 5S-PHK (рРНК) 1-2 120 п, э
Рибосомная 5.8S-PHK (рРНК) 1 155 э
Рибосомная I6S-PHK (рРНК) 1 1600 п
Рибосомная 23S-PHK (рРНК) 1 3200 п
Рибосомная I8S-PHK (рРНК) 1 1900 э
Рибосомная 28S-PHK (рРНК) 1 5000 э
Матричная РНК (мРНК) Тысячи Варьирует п. э
Гетерогенная ядерная РНК (гяРНК) » » э
Малая цитоплазмати- ческая РНК (мцРНК) Десятки 90 330 п э
Малая ядерная РНК (мяРНК) 1 П прокариоты. Э эуь » арио। ы. 58 220 э
Некоторые пурины и пиримидины в РНК мод
фицированы; они содержат метил-, тиол-, водоро
и изопентенил-заместители. В РНК присутствен
2-О-\/еГН.7Н\ С' <*<'/.//
Ас>Л/ p/it>c>3bj. ./ г*/аллс* нм» гz.<,w
способ связывания между урацилом и рибозой (так
называемая псевдоуридичовая кислота) (рис. 1.21).
Такие модифицированные нуклеотиды довольно
редко встречаются в рРНК и мРНК и достаточно
часто-в тРНК. Как правило, модификаций осно-
ваний и рибозных остатков происходит после за-
вершения синтеза РНК, а не на стадии биосинтети-
ческих предшественников. Функциональное значе-
ние этого явления установлено лишь отчасти
в. Структура РНК
Большинство клеточных РНК-одноцепочечные
молекулы, хотя некоторые вирусные геномы (в том
числе геномы ретровирусов) представлены двухце-
почечными РНК, напоминающими A-форму ДНК.
В одиночных цепях все время образуются короткие
52
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
ружейный у E.coli и цианобактерий, по повышен-
ному содержанию лизина и ДНК-связывающим
свойствам также напоминает эукариотический гис-
тон. Белки HU и II обнаружены в количествах,
достаточных для образования комплекса по крайней
мере с половиной ДНК Е. coli и, по-видимому,
совместно с полиаминами и еще неизвестными нам
белками могут осуществлять те же самые функции
при конденсации и упаковке ДНК, что и пять
эукариотических гистонов.
1.2. СТРУКТУРА И ПОВЕДЕНИЕ РНК
а. Типы РНК и их распространенность
Содержание РНК в любых клетках в 5- 10 раз
превышает содержание ДНК. Основная роль РНК
состоит в трансляции генетической информации с
образованием белков. Однако молекулы РНК при-
нимают участие и в осуществлении некоторых спе-
циализированных эндонуклеазных функций, воз-
можно регулирующих различные этапы экспрессии
генов. Молекулами РНК представлены геномы не-
которых вирусов (ретровирусов и множества виру-
сов животных, растений и насекомых с одно- и двух-
цепочечным геномом).
Во всех клетках присутствуют следующие виды
РНК: рибосомная РНК (рРНК), транспортная РНК
(тРНК) и информационная, или матричная, РНК
(мРНК). Большинство (если не все) клеток содержат
также много других малых цитоплазматических
РНК (мцРНК), а в клетках эукариот присутствует
еще и множество малых ядерных РНК (мяРНК)
(табл. 1.5). Около 80% массы клеточных РНК со-
ставляют три или четыре вида рРНК. а около
15%-почти 100 видов тРНК. На долю нескольких
тысяч различных матричных РНК приходится менее
5% клеточной РНК, а на долю малых ядерной
и цитоплазматической РНК, число видов которых
пока неизвестно,-менее 2% от общего количества.
б. Компоненты молекулы РНК
и соединяющие их химические связи
РНК это полинуклеотид длиной от 70 моно-
мерных единиц у некоторых тРНК до 10000 и более
у некоторых мРНК. На рис. 1.19 приведены струк-
турные формулы четырех нуклеотидов, обычно
встречающихся в РНК. Два пурина (аденин и гу-
анин) и один пиримидин (цитозин) входят также
в состав ДНК. А вместо тимина (5-метилдикето-
пиримидина) в РНК входит урацил, у которого
5-метильная группа отсутствует. Нуклеотиды в мо-
лекуле РНК соединены в цепочку такими же
5' З'-фосфодиэфирными связями, как и в ДНК
(рис. 1.20). Из-за наличия 2'-ОН-группы связь Р-О
Таблица 1.5. Некоторые основные РНК
Тип РНК Приблизи- тельное число разных видов в клетках Приблизи- тельная длина (число нук- леотидов) Рас- про- стра- нен- ность”
Транспортная РНК (гРНК) 80 100 75-90 п. э
Рибосомная 5S-PHK (рРНК) 1 2 120 п. э
Рибосомная 5.8S-PHK (рРНК) 1 155 э
Рибосомная 16S-PHK (рРНК) 1 1600 п
Рибосомная 23S-PHK (рРНК) 1 3200 п
Рибосомная 18S-PHK (рРНК) 1 1900 э
Рибосомная 28S-PHK (рРНК) 1 5000 э
Матричная РНК (мРНК) Тысячи Варьирует п, э
Гетерогенная ядерная РНК (гяРНК) » » э
Малая цитоплазмати- ческая РНК (миРНК) Десятки 90 330 п. э
Малая ядерная РНК (мяРНК) » 58-220 э
П прокариоты, Э >укариоты.
чувствительна к действию щелочей и ферментов,
расщепляющих РНК.
Некоторые пурины и пиримидины в РНК моди-
фицированы: они содержат метил-, тиол-, водород-
и изопентенил-заместители. В РНК присутствуют
2-О-метилнуклеотиды с модифицированным остат-
ком рибозы, а также может наблюдаться иной
способ связывания между урацилом и рибозой (так
называемая псевдоуридиловая кислота) (рис. 1.21).
Такие модифицированные нуклеотиды довольно
редко встречаются в рРНК и мРНК и достаточно
часто в тРНК. Как правило, модификаций осно-
ваний и рибозных остатков происходит после за-
вершения синтеза РНК, а не на стадии биосинтети-
ческих предшественников. Функциональное значе-
ние этого явления установлено лишь отчасти.
в. Структура РНК
Большинство клеточных РНК - одноцепочечные
молекулы, хотя некоторые вирусные геномы (в том
числе геномы ретровирусов) представлены двухце-
почечными РНК, напоминающими A-форму ДНК
В одиночных цепях все время образуются короткие
1. МОЛЕКУЛЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА
53
Аденозин-5'-фосфат
(АМР)
Г уанозин-5'-фосфат
(GMP)
Уридин-5'-фосфат
(UMP)
Цитидин-5'-фосфат
(СМР)
РИС. 1.19.
Структурные формулы четырех рибонуклеотидов, обыч-
но встречающихся в РНК.
внутримолекулярные двухцепочечные участки. Это
связано с тем, что в большинстве РНК имеются
небольшие комплементарные последовательности,
которые спариваются и образуют петли (рис. 1.22).
В таких двухцепочечных участках А спаривается с (J,
a G с С; G может образовать пару ис U, но GU-napa
менее стабильна, чем стандартная пара GC, по-
скольку ее компоненты соединены двумя, а не
тремя водородными связями. Двухцепочечные об-
ласти, образованные подобным образом, обычно
непротяженны и прерывисты, поскольку спариваю-
щиеся участки редко бывают абсолютно компле-
ментарными. Укладка большинства РНК может
происходить более чем одним способом, однако
биологическое значение образующихся при этом
изомеров установлено только в некоторых случаях.
Например, известно, что адекватная укладка неко-
торых вирусных РНК чрезвычайно важна для экс-
прессии генов, поскольку ответ на ключевые регу-
ляторные сигналы зависит от конфигурации моле-
кулы (разд. 3.11.е). Подобная зависимость функции
от упаковки молекулы наилучшим образом про-
О ОН
I
З'-конец
РИС. 1.20.
Участок рибонуклеотидной цепи
демонстрирована на примере тРНК. Несмотря на
разную нуклеотидную последовательность, третич-
ная структура разнообразных тРНК весьма сходна,
и ее стабилизация, по-видимому, имеет огромное
значение для функционирования этих молекул
(рис. 1.23). Правильная терминация синтеза РНК
и созревание (процессинг) транскрипта тоже часто
зависят от характера укладки РНК.
54
ЧАСТЬ L МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
Рибоза
5,6-Д игидро уридин
(DHU)
5-Метилуридин-
риботимидин (гТ)
S
Рибоза
4-Тиоуридин
(4-thio U)
Рибоза
5-Метилцитидин
(5-теС)
РИС. 1.21.
Структурные формулы модифицированных пуриновых
и пиримидиновых нуклеозидов, в небольших количест-
вах встречающихся в некоторых РНК
О
Рибоза
Инозин (I)
2(\1-Метилгуанозин (^meG )
?N- Метил гуаниловая
кислота
-Метиладениловая
кислота
г. Денатурация и ренатурация РНК
Как и в случае ДНК, двухцепочечные участки
в РНК разрушаются при повышении температуры
или pH, но, в отличие от ДНК, при высоких значе-
ниях pH в РНК разрушаются и фосфодиэфирные
связи. Поскольку протяженность спирализованных
участков в одноцепочечной РНК невелика, а сами
спирали несовершенны, разрушаются они довольно
легко. Однако полностью комплементарная двух-
цепочечная РНК плавится в довольно узком темпе-
ратурном интервале, как и двухцепочечная ДНК.
В результате денатурации образуются две компле-
ментарные одиночные цепи, способные к после-
дующему воссоединению при плавном понижении
температуры. После денатурации двухцепочечных
участков одноцепочечной РНК восстановление тех
же спаренных областей оказывается затрудненным,
и в результате ренатурации могут образоваться
структуры, отличные от исходной.
д. Гибридные спирали ДНК РНК
Полинуклеотидные цепочки РНК и ДНК,
имеющие комплементарные последовательности,
могут образовывать двойную спираль РНК-ДНК
с антипараллельными цепями. Структура таких
комплексов напоминает А-ДНК (рис. 1.8). Спари-
вание оснований в них отвечает правилам Уот-
сона Крика для ДНК: dA спаривается с rU, гА с
dT, dG с гС и dC-c rG. В дуплексах РНК - ДНК
пара оснований rG-dC более стабильна, чем пара
dG • гС, и обе они стабильнее пар dG • dC в ДНК; обе
пары, dT • г А и rU • d А, менее стабильны, чем пара
dA dT в ДНК. Гибридные спирали, или гетеродуп-
лексы, способны к денатурации и ренатурации, как
и дуплексы ДНК. В водных растворах с умеренной
концентрацией солей двухцепочечные комплексы
РНК ДНК денатурируют легче, чем соответст-
вующие спирали, состоящие исключительно цз це-
пей РНК и ДНК. В растворах же, содержащих
формамид и соли в определенных концентрациях,
дуплекс РНК-ДНК стабильнее дуплекса ДНК. Эти
условия могут использоваться для образования и
специфической стабилизации гибридных дуплексов.
Полинуклеотидные цепи РНК или ДНК счи-
таются комплементарными, если они способны
образовать протяженную двойную спираль с уот-
сон-криковскими парами оснований. Две нуклеи-
новые кислоты можно назвать гомологичными, если
их нуклеотидные последовательности идентичны
или очень близки. Гомологичность двух нуклеино-
1. МОЛЕКУЛЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА
55
700ч и'
690
AUCUGGAG
1*11111*
UGGACCUU
1 A
680 j
,720
и
G
GC О.
1 1 л
CGe
G ।
3 730
U-A
G-C
660-С —G.
U —А'
C-G
U-A
G-C-
„А-U
630
и*
*tQc
aaccuggg ugcaucugacuggcaagc
620 —
CAGCUGA
G-330
520—А
LTG
А C-G
«-230
U-A
230-G - C
U V
£ <®о
Г* / Ж
“fee
UCCGG UAUGUGLC
aIo **«**;,
*”° ОС®°С
AGCCUG*UGCA \\JG»
Illi c°
/cgu м
.UaU A-50
X
790
780—(
A—U
800
U
860
CUCA UUGGAT S0°
a*10 920
i Oa . f
*UUG-------
cGGUAr./
St-1
°Uc^'
Gyc'
290-TG
_C
280
220
„ GGgCCUCUU’
l,°-s 1111 -11 -
UCCGGGGAG
AG I
200
G • U
C-G
U-A
A-U-140
C-G ISO
C - C AOOOOOalAACUACUO G ...
— 160
U
РИС. 1.22.
5'-концевой сегмент 16S-pPHK Е.
соП. Видно, что благодаря внутримо-
лекулярному спариванию оснований
происходит укладка цепи. Заметим,
что в стабилизации дуплексной струк-
туры РНК участвуют G U-пары. Не-
сколько оснований могут образовы-
вать петлю, если в противоположной
цепи отсутствуют комплементарные
основания. Цветом выделены первое
основание цепи и место продолже-
ния цепи в З' направлении. (С лю-
безного разрешения Н. NoIler.)
РИС. 1.23.
Структура tPHKAsp и тРНКРЬе, воссоздан-
ная с помощью компьютерной графики.
Остов каждой цепи РНК имеет вид
сплошной трубки. Такая компактная
структура стабилизируется благодаря
спариванию оснований, далеко отстоя-
щих друг от друга в нуклеотидной по-
следовательности. 5'- и З'-концы цепей
РНК находятся в правом верхнем углу
структуры. (Модели и фото предостав-
лены Arthur J. Olson, Ph. D. Copyright
1987, Research Institute of the Scripps
Clinic.)
asp-тРНК
phe-тРНК
56
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
вых кислот можно определить по степени образо-
вания двойных спиралей соответствующими оди-
ночными цепями РНК, ДНК или гибридов РНК-ДНК.
За образованием ДНК-, РНК- и гибридных РНК-
ДНК-спиралей можно следить разными способами.
В качестве зонда для выявления и количественного
анализа гомологичных молекул РНК часто исполь-
зуется одноцепочечная ДНК. Так, степень превра-
щения одноцепочечной РНК в двухцепочечную
форму в присутствии другой нуклеиновой кислоты
является мерой гомологичности их последователь-
ностей. Используя соответствующего партнера по
гибридизации, можно установить протяженность
специфической нуклеотидной последовательности
и гомологичность двух ДНК, РНК и ДНК, а также
двух РНК.
1.3. СТРУКТУРА БЕЛКОВ
а. Компоненты белков
и соединяющие их химические связи
Белки состоят из одной или нескольких поли-
пептидных цепей, каждая из которых в свою очередь
представляет собой длинный неразветвленный по-
лимер, состоящий из аминокислот. Все полипеп-
тиды независимо от источника- от вирусов до че-
ловека-построены из 20 разных аминокислот. В
аминокислотах имеются как одинаковые для всех,
так и уникальные химические группировки: атом
углерода (а-углеродный атом), несущий карбок-
сильную и амино-группы, и определенные замести-
тели, характерные для каждой аминокислоты
(рис. 1.24). Такие «боковые цепи», часто называе-
СОО" СОО" СОО" СОО- СОО" С00- СОО-
H3N-C—Н *H3N-С-Н *H3N-С-Н *H3N-С-Н I +H3N-С-Н +H3N-С-Н *H3N-С-Н
сн3 СН, । СН, । СН, । * СН, । * СН, । * сн2 I *
сн, I С // \ С «\ SH СН, I сн2 I
сн, 0 nh2 0 0" с с
I 2 // \
N-H 0 nh2 0 0"
I
C=NH
I
♦NH3
Аланин (A; Ala) Аргинин (R; Arg) Аспарагин (N; Asp) Аспарат (D; Asp) Цистеин (С; Cys) Г лутамин (Q;Gln) Г лутамат (Е; Glu)
СОО" СОО- соо- соо- СОО- соо- С00"
H3N-С-Н *h3N-С-н +H3N-С-Н *H3N-С - н +H3N-С-Н *H3N-С-Н *H3N-С-н
н СН, I л н—с-сн3 СН, I СН, । * СН, I сн2
С=СН . 1 X сн, I СН / \ СН, I СН, I z
*HN,j. NH С сн3 н3с сн3 СН, I ' S I
Н СН, I сн3
*NH3
Г лицин Г истидин Изолейцин Лейцин Лизин Метионин Фенилаланин
(G;Gly) (h;h<s) (i;ile) (L’.Leu) (KJLys) (FjPhe)
СОО“
I
+H3N-С-Н
COO'
I
+H3N-С-H
CH
/ \
н3с сн3
С00" СОО" С00-
*H,N—С—Н J \ +H,N-С-Н J । +H3N—С—Н л ।
н2сч ,сн2 н-с-он Н-С-ОН
сн2 I н I сн3
СОО“
I
*H3N-C-H
СН2
Т риптофан
(w;Trp)
Пролин Серин Треонин
РИС. 1.24. (piPro) (SJSer) (T'.Thr)
Структурные формулы аминокислот, обычно встреча-
ющихся в белках. Вариабельная часть аминокислот вы-
делена цветом Под формулами даны полное название
аминокислот, одно- и трехбуквенные обозначения. Очень
ОН
Тирозин
(YJyr)
Валин
(v;val)
часто при изображении пептидной или полипептидной
цепи боковые группы аминокислот обозначают буквой
R.
1. МОЛЕКУЛЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА
57
НО Н
I II I
+ NH, -С—С—N-C —СОО~
3 1 II
R1 Н r2
Дипептид
группа
РИС. 1.25.
Структура дипептида. В верхней части рисунка показа-
но. как образуется пептидная связь. Представлены за-
ряженные концевые амино- и карбоксильная группы
и а-углеродные атомы, к которым присоединены боко-
вые группы. В нижней части рисунка указаны углы
вращения (у и <р), характерные для пептидных групп.
R-группы и атомы водорода, связанные с а-углерод-
ными атомами, выступают из плоскости рисунка вверх
или вниз.
мые R-группами, различаются по размеру, форме,
заряду и химической активности.
Остов любой белковой цепи образуется с по-
мощью амидных (или пептидных) связей, соеди-
няющих аминогруппу одной аминокислоты с кар-
боксильной группой другой, соседней аминокис-
лоты. На рис. 1.25 показано простейшее полипеп-
тидное звено - дипептид, а на рис. 1.26 представлены
геометрия полипептидной цепи и положение раз-
личных заместителей гептапептида. Таким образом,
полипептиды это длинные цепи, образуемые с
помощью регулярно повторяющихся пептидных
связей и содержащие набор боковых групп, распо-
ложенных вдоль остова. Полипептидная цепь имеет
определенное направление. На одном ее конце на-
ходится свободная аминогруппа (в нейтральных
условиях эта группа протонируется с образованием
NH3 ); соответствующая аминокислота называется
N-концевой, такое же название-и у данного конца
цепи. На другом конце цепи находится карбоксиль-
ная группа, обычно существующая в виде СОО~-
аниона; аминокислота в этой позиции называется
С-концевой, такое же название имеет и соответст-
вующий конец цепи. В некоторых белках между
цистеиновыми остатками одной цепи образуются
дисульфидные связи, объединяя разные участки це-
пи (рис. 1.27). Такие дисульфидные мостики могут
объединять и разные полипептидные цепи незави-
симо от того, идентичны они или нет. Полипеп-
тидные субъединицы некоторых олигомерных бел-
ков объединены именно таким образом.
В некоторых белках встречаются в небольших
количествах модифицированные формы природных
аминокислот (рис. 1.28). Практически во всех слу-
чаях изменения в структуре аминокислот происхо-
дят лишь после образования пептидных связей:
в результате гидроксилирования уже включенных в
белок пролина и лизина получаются гидроксипро-
лин и гидроксилизин соответственно; при карбокси-
лировании глутамата образуется у-карбоксиглута-
мат, а при фосфорилировании гидроксильных групп
серина и треонина или фенольной группы тирози-
на- фосфоаминокислоты.
Важными компонентами эукариотических клеток
и многих вирусов являются белки, относящиеся
к группе гликопротеинов. Они содержат сложные
углеводы, ковалентно связанные с входящими в
состав белка аспарагиновым, гидроксилизиновым,
сериновым и треониновым остатками. Как и в слу-
чае модификации аминокислот, описанном выше, на
определеных этапах, следующих за сборкой поли-
пептидной цепи, к ней могут присоединяться раз-
личные сахара (разд. 3.10). Реакции гликозилиро-
вания играют важную роль в процессах транспор-
тировки белков от места их синтеза в специфические
клеточные органеллы и к поверхностным струк-
турам клетки; гликопротеины также придают опре-
деленный рисунок поверхности клеток.
N-концевой
остаток
С-концевой
остаток
Пептидные связи
РИС. 1.26.
Структура гептапептида. Обо-
значения такие же, как на
рис. 1.25.
58
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
А-цепь
В-цепь
Cvs
Va
Ser
И
Gu
Arg
РИС. 1.27.
Дисульфидные связи, образующиеся между цепями
в пределах одной цепи бычьего инсулина. A-цепь со-
держит два расположенных недалеко друг от друга
цистеиновых (Cys) остатка, которые образуют внутри-
цепочечную дисульфидную связь. Показаны также два
дисульфидных мостика, связывающих остатки цистеина
А- и В-цепей. Аминоконцевой фенилаланин (Phe)
В-цепи и карбоксиконцевой аспарагин (Asn) А-цепи
являются соответственно N- и С-концами полипептида -
предшественника инсулина.
б. Размер и форма белков
Размеры полипептидов очень сильно разли-
чаются: число составляющих их аминокислот ко-
леблется от 50 до нескольких тысяч. Поскольку
с каждой аминокислотой масса белка увеличивается
примерно на 110 дальтон, мол. масса белков может
варьировать от 104 до 106 дальтон. Одни белки
состоят только из одной полипептидной цепи,
другие-из нескольких одинаковых цепей, третьи
из нескольких цепей разного типа (табл. 1.6). При-
СОО~ 1 соо~ I соо-
+H3N-С-Н J 1 *H3N-C-H I +H,N—С-Н А \
СН, I 4 сн2 Н,С СН, с
СН / \ сн2 / \ н он
оос соо~ но-сн
сн2
7-Карбокси- +NH3
глутамат Г идроксилизин Г идроксипролин
СОО~ 1 СОО~ I СОО'
+H3N-C-H *H3N-С-Н * л । H3N—С—Н
сн2 СН, I л СН, I z
0 СН, А
“О-Р-О- II I 0 V
II 0 -О-Р-О- II 0
0 -О-Р-О-
II
0
Р-серин РИС. 1.28. Р-треонин Р-тирозин
Некоторые модифицированные аминокислоты, встре-
чающиеся в белках.
Таблица 1.6. Размер и субъединичный состав
некоторых глобулярных белков
Белок Источник Мол. масса белка, кДа Число субъединиц Мол. масса субъединиц, кДа
ДНК-ли газа Е. coli 75 I -
ДНК-полимераза I Е. coli Ю9 I
Щелочная фосфатаза Е. coli 86 2 43
Lr/r-penpeccop Е. coli 160 4 40
Р-Г алактозидаза Е. coli 544 4 135
Г лутаминсинтетаза Е. coli 592 12 49
Гемоглобин Млекопита- 64 2а 16
ющие 2р 16
Триптофансинтаза Е. coli 148 2а 29
2р .• 45
Аспартат-транскарба- Е. coli ЗЮ 6(C)11 4 33
милаза 6(R)21 17
РНК-полимераза Е. coli 400 2(а) 40
(основной фермент) 1 (Р) 155
К₽') 165
Пируватдегидрогеназ- Е. coli 4500 243' 91
ный комплекс 244’ 70
125’ 56
” Каталитические субъединицы.
21 Регуляторные субъединицы.
' Пируват декарбоксилазные субъединицы.
4 Дигидролипоилтрансацетилазные субъединицы.
1 Дигидролипоилдегидрогеназные субъединицы.
1. МОЛЕКУЛЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА
59
РИС. 1.29.
Пространственная модель глобулярного белка гексоки-
назы. Вверху показаны молекула гексокиназы и один из
ее субстратов, D-глюкоза, в свободном состоянии. Пос-
ле связывания глюкозы домены белка (темный и свет-
лый цвета) сближаются и закрывают карман, в котором
находится центр связывания. [W. S. Bennett, Jr.,
Т А. Steitz, J. Mol. Biol., 140 (1980), p. 211.]
мером белка, представленного одной полипептид-
ной цепью, служит миоглобин; глутаматсинтетаза
бактерий содержит 12 идентичных полипептидных
цепей. Гемоглобин тетрамер, состоящий из цепей
двух разных видов, а функциональная форма
ДНК-полимеразы Е. coli состоит из полипептидных
цепей по крайней мере четырех разных видов.
В растворе белки имеют строго определенную
конформацию, или трехмерную структуру. Биоло-
гическая активность почти всех без исключения
белков, будь то белки-катализаторы, структурные
белки, белки, ответственные за транспортные про-
цессы, белки, участвующие в формировании опор-
но-двигательного аппарата, или белки-регуляторы,
зависит от сохранения их природной, или активной,
конформации. Белки в соответствии с их конфор-
мацией можно разделить на две категории. Гло-
булярные белки имеют компактную, примерно сфе-
рическую форму, образующуюся в результате не-
регулярной укладки полипептидных цепей (рис. 1.29).
В фибриллярных белках полипептидные цепи распо-
лагаются параллельно друг другу, образуя длинные
нити или слои (рис. 1.30). Большинство ферментов
и растворимых белков имеют глобулярную струк-
туру; такие белки, как коллаген и кератин, обна-
руживаемые в структурных и соединительных тка-
нях, принимают фибриллярную конформацию.
Фибриноген и мышечный миозин могут встре-
чаться как в одной, так и в другой форме.
в. Чем определяется
конформация белка
Структуру белка можно рассматривать на раз-
ных уровнях организации на уровне первичной,
вторичной, третичной или четвертичной структуры.
Первые три относятся к структурным характерис-
тикам полипептидных цепей, четвертый отражает
структуру олигомерных белков, состоящих из двух
или более полипептидных цепей.
Каждый белок обладает уникальной аминокис-
лотной последовательностью (см. рис. 1.27, на ко-
тором показана аминокислотная последовательность
двух цепей бычьего инсулина); порядок располо-
жения аминокислот вдоль полипептидной цепи
называется первичной структурой. Уникальность
первичной структуры впервые была выявлена при
исследовании бычьего инсулина, а затем подтверж-
дена в результате анализа тысяч других белков
разного размера. Первичная структура белка де-
терминируется первичной структурой соответст-
вующего гена. Поэтому при изменении нуклеотид-
ной последовательности гена, кодирующего данный
белок, изменяется и первичная структура белка.
Полипептидные цепи могут укладываться в ре-
гулярные структуры, называемые вторичными.
Наиболее часто встречающимися периодическими
конформациями белков являются правозакрученная
п-спираль и P-слой. В п-спирали остов имеет кон-
фигурацию винтовой спирали с периодичностью
0.54 нм и примерно 3,6 аминокислотными остат-
ками на виток (рис. 1.31). Стабилизация спиральной
структуры осуществляется благодаря образованию
водородных связей между атомом водорода
NH-группы одной аминокислоты и СО-группой
четвертой вдоль цепи аминокислоты. Боковые
группы аминокислот располагаются на наружной-
стороне спирали (рис. 1.32). Длина участка данной
полипептидной цепи, который может принимать
п-спиральную конфигурацию, зависит от амино-
кислотного состава и аминокислотной последова-
тельности цепи. Некоторые аминокислоты или
последовательности дестабилизируют п-спираль, а
если в цепи встречается пролин или гидроксипролин,
то п-спираль прерывается из-за ограничения вра-
щения вокруг пептидной связи и отсутствия атома
водорода для образования водородной связи. Как
правило, п-спиральные участки относительно не-
протяженны и состоят в среднем из 10-20 амино-
60
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
А
РИС. 1.30.
Структуры коллагена. А. Электронная микрофотогра-
фия интактных фибрилл коллагена кожи. (С любезного
разрешения J. Cross.) Б. Тропоколлагеновые волокна,
состоящие из трех полипептидных цепей, сплетенных
в тройную спираль. В. фибриллы образуются п^тем
взаимодействия между несколькими тропоколлагено-
выми тройными спиралями.
кислот. Иногда водородные связи, образующиеся
между боковыми группами аминокислот в двух
а-спиральных сегментах, соединяют расположенные
бок о бок витки спирали одной и той же или разных
полипептидных цепей, и тем самым структура еще
больше стабилизируется Известны случаи (приме-
ром может служить фибриноген), когда множест-
венные а-спиральные сегменты одной полипептид-
ной цепи образуют беспорядочные пучки. У неко-
торых белков, в частности у фермента химотрип-
сина, а-спиральные области отсутствуют; у других,
например у а- и Р-субъединиц гемоглобина, а-спи-
рали встречаются вдоль цепи довольно часто.
Другой тип вторичной структуры белков -
1. МОЛЕКУЛЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА
61
РИС. 1.31.
Различные модели правозакрученной ct-спирали. А. По-
казаны только a-углеродные атомы. Б. Показаны только
скелетные атомы азота (N), a-углеродные атомы
(С„) и атомы углерода карбонильных групп (С). В.
Показана спираль в целом. Ее стабилизируют водород-
ные связи между NH- и СО-группами. [L. Stryer, Bio-
chemistry (San Francisco, W H Freeman, 1981).]
P-слой, названный так потому, что структура на-
поминает полотно. В P-слое в отличие от н-спи-
рали, в которой полипептидная цепь скручена и
образует структуру, имеющую форму стержня, по-
липептидная цепь растянута. Водородные связи в
P-слое образуются между отдаленными друг от
друга аминокислотами одной полипептидной цепи
или между аминокислотами из разных цепей
(рис. 1.33). Ряды из двух-пяти цепей, скрепленных
водородными связями, находящиеся в параллель-
ной друг другу или антипараллельной ориентации,
образуют структуру, напоминающую гофрирован-
ную ткань.
Некоторые белки (в частности, коллаген) со-
держат необычайно много глицина и пролина-тех
двух аминокислот, которые дестабилизируют или
разрушают a-спирали, а также две необычные ами-
нокислоты гидроксипролин и гидроксилизин. По- а
добные белки образуют вторичную структуру
третьего типа; она состоит из трех длинных лево-
закрученных спиралей, сплетенных в виде плотного
каната (рис. 1.34). Структура также стабилизи-
руется водородными связями, образуемыми между
боковыми остатками прилегающих друг к другу
нитей каната.
Почти все ферменты и регуляторные белки
имеют глобулярную форму; это и есть их третичная
структура. Боковые цепи полярных аминокислот
локализуются на поверхности глобулы, контакти-
рующей с растворителем, а боковые цепи неполяр-
62
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 1.32.
Вид на а-спираль сверху. R-группы аминокислот высту-
пают из спирали. Для наглядности внутренняя часть
спирали дана в увеличенном виде. [L. Stryer, Bioche-
mistry (San Francisco: W. H. Freeman, 1981).]
ных аминокислот упрятаны внутри и экранированы
от водной среды. Плотно скрученные полипептид-
ные цепи содержат варьирующее число п-спиралей
и 0-слоев, разделенных неструктурированными об-
ластями, как правило находящимися в местах из-
гибов остова (рис. 1.29 и 1.35). Биологически актив-
ная четвертичная структура белка поддерживается
с помощью разнообразных взаимодействий между
аминокислотами. К ним относятся: 1) взаимодейст-
вия, которые ответственны за формирование п-спи-
ралей и 0-слоев; 2) водородные связи между неко-
торыми боковыми группами аминокислот; 3) ион-
ные связи между противоположно заряженными
боковыми группами; 4) ковалентные дисульфидные
связи между отдаленными друг от друга вдоль цепи
остатками цистеина; 5) гидрофобные взаимодейст-
вия между боковыми группами, более прочные, чем
взаимодействия с водной фазой на наружной по-
верхности белковой глобулы. Относительный вклад
всех этих сил в стабилизацию структуры у разных
белков варьирует.
При нагревании либо повышении или понижении
pH нативная глобула разворачивается (происходит
денатурация). Этот процесс обратим, т. е. третичная
структура может восстанавливаться с образованием
тех химических и физических взаимодействий, ко-
торые стабилизируют нативную компактную кон-
формацию (ренатурация). Механизм правильного
свертывания полипептидной цепи и промежуточные
этапы этого процесса интенсивно изучаются.
Большинство глобулярных белков олигомеры
(т. е. состоят из двух или более идентичных или
разных полипептидных цепей). Примером глобуляр-
ных белков могут служить гемоглобин (рис. 1.36)
и иммуноглобулин (рис. 1.37). Четвертичная струк-
тура подобных белков определяется тем, как взаи-
модействуют между собой в олигомерной структуре
отдельные свернутые полипептидные цепи. В ге-
моглобине, например, благодаря взаимодействию
аминокислот, входящих в состав п-спиралей и
0-слоев, образуется п0-димер, а димеры в свою
РИС. 1.33.
Структура 0-слоя. 0-Слой образуется из нескольких
полипептидных цепей. Его стабилизируют водородные
связи между атомами водорода амидных групп (NH)
одной цепи и атомами кислорода карбонильных групп
(СО) параллельной цепи. Обратите внимание, что вмес-
то внутрицепочечных водородных связей, характерных
для а-спирали в 0-слое образуются межцепочечные
водородные связи. В представленном здесь примере
полипептидные цепи параллельны, однако для некото-
рых 0-слоев характерно антипараллельное расположе-
ние цепей.
1 МОЛЕКУЛЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА
63
ряющийся структурный элемент, состоящий из остатков
глицина и двух остатков пролина. Б. Скелетная модель
трехцепочечной коллагеновой спирали. Каждая цепочка
состоит из нескольких повторяющихся структурных
элементов, указанных на рис. A. [L. Stryer, Biochemistry
(San Francisco: W. H. Freeman, 1981).] В. Пространст-
венная модель коллагена II. Каждая цепочка состоит из
повторяющихся элементов глицин-пролин-гидрокси-
пролин. Шаг спирали равен 2,86 нм. [A. Rich,
F. Н.С. Crick, J. Mol. Biol., 3 (1961), р. 483.]
очередь с помощью дополнительных взаимодейст-
вий объединяются в а202-тетрамер (рис. 1.36). Де-
тальные исследования структуры гемоглобина по-
зволили установить, как изменяются соответст-
вующие взаимодействия при связывании этим бел-
ком кислорода.
Вторичная, третичная и четвертичная структуры
белков тесно связаны между собой и в конечном
счете определяются первичной структурой одной
или нескольких полипептидных цепей. Последствия
такой взаимосвязи очень значительны: информация,
определяющая укладку белковой молекулы и пере-
ход ее в биологически активное состояние, закоди-
рована в его аминокислотной последовательности.
Подтверждением этого принципиального положе-
ния служит то, что химические модификации и
мутационные изменения аминокислотной последо-,
вательности полипептидов сильно влияют на их*
ренатурацию и способность формировать вторич-
ную, третичную и четвертичную структуры с полно-
ценной биологической активностью.
В качестве одного из многочисленных примеров
зависимости структуры и функции белка от его
аминокислотной последовательности можно при-
вести серповидноклеточную анемию. Генетическое
нарушение при этой болезни выражается в замене
глутаминовой кислоты, шестой по счету от N-конца
0-цепи в нормальном гемоглобине, на валин. Из-
менение в первичной структуре 0-глобина приводит
64
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 1.
Схематическое изображение участка ДНК-полимеразы I
Е co/i ct-Спирали изображены в виде цилиндров,
P-слои в виде стрелок. Чем интенсивнее окрашены зти
элементы, тем ближе они расположены к читателю
[D.L. Ollis et al.. Nature, 313 (1985), p. 762.]
РИС. 1.36.
Модель гемоглобина, построенная при
низком разрешении. Гемоглобин это
тетрамерный белок, состоящий из двух
ct-цепей (а, и а2) и двух p-цепей (Р,
и Р2). С каждой из цепей связана гемо-
группа (выделена цветом; прямоуголь-
ник гем, шарик-атом железа). (Copy-
right Irving Geis.)
1. МОЛЕКУЛЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА
65
РИС. 1.37.
Структура иммуноглобулина. А. Иммуноглобулин со-
стоит из четырех полипептидных цепей: двух идентич-
ных легких и двух идентичных тяжелых. Структура ста-
билизируется с помощью дисульфидных связей, обра-
зующихся между двумя тяжелыми цепями и тяжелыми
и легкими. В самих тяжелых и легких цепях также
образуются дисульфидные связи. Б. Модель молекулы
иммуноглобулина, иллюстрирующая переплетение лег-
ких и тяжелых полипептидных цепей. [E.W. Silverton,
М.А. Navia, D. R. Davies, Proc. Natl. Acad. Aci., USA, 74
(1977), p. 5140.]
5 243
66
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
А
В
РИС. 1.38.
Дефекты, возникающие на клеточном и молеку-
лярном уровнях при серповидноклеточной анемии.
А. Микрофотография, на которой видны нор-
мальный (2) и серповидный (1) эритроциты. (С
любезного разрешения S. Schreier.) Б. Гемогло-
биновые волокна в разрушенном серповидном
эритроците. В. Поперечный разрез через гемо-
глобиновые волокна, полученные при оксигена-
ции серповидного гемоглобина. (Фото Б и В лю-
безно предоставлены S. J. Edelstein.) Г. Электрон-
ная микрофотография неокрашенного тяжа сер-
повидного гемоглобина [G. Dykes, R. Н. Crepeau,
S.J. Edelstein, Nature, 272 (1978), р. 509]
к тому, что на поверхности белковой глобулы ока-
зывается аномальная гидрофобная аминокислота,
из-за чего происходит агрегация дезоксигенирован-
ного гемоглобина с образованием олигомерных
структур более высокого уровня организации
(рис. 1.38). В результате форма и пластичность
эритроцитов изменяются, и кровоток через капил-
ляры и мелкие вены затрудняется или вовсе прекра-
щается. Основной вывод, который можно сделать
из этого классического случая, состоит в том, Что
одна-единственная мутация-замена нуклеотида в
последовательности ДНК, приводящая к замене
одной аминокислоты на другую в специфическом
сайте полипептидной цепи,- может оказывать столь
драматическое влияние на конформацию белка и его
физиологическую функцию. В более общем смысле,
таков механизм, связывающий генотипы всех ор-
ганизмов с их фенотипами.
Глава 2
РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ
И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
Генетическая программа клеточных организмов
записана в нуклеотидной последовательности ДНК.
Следовательно, для сохранения уникальных свойств
организма необходимо точное воспроизведение
этой последовательности в каждом последующем
поколении. Е. coli, например, должна дуплицировать
практически без ошибок полный геном размером
4-106 нуклеотидных пар при образовании каждого
последующего поколения; точно так же должны
быть скопированы почти 4-109 пар оснований в 23
парах хромосом человека при каждом акте деления
клеток.
Одной из чудесных особенностей ДНК является
то, что в ней закодирована информация о меха-
низме ее собственного удвоения: одни гены коди-
руют ферменты, синтезирующие нуклеотидные
предшественники ДНК, другие-белки, осуществ-
ляющие сборку активированных нуклеотидов в
полинуклеотидные цепочки. Есть гены, координи-
рующие процесс репликации с другими клеточными
событиями, а также гены, кодирующие белки, ко-
торые упаковывают ДНК в хроматин. Еще одним
необычным свойством ДНК является то, что она
служит матрицей и определяет порядок, в котором
нуклеотиды выстраиваются в новые нуклеотидные
цепочки. Обладая одинаковым аппаратом синтеза,
различные ДНК осуществляют образование только
подобных себе реплик.
В генетической программе предусмотрены фер-
ментативный механизм, который исправляет
ошибки, иногда происходящие при репликации
ДНК, и механизм репарации повреждений, затра-
гивающих основания или спиральную структуру
при облучении рентгеновскими лучами и ультра-
фиолетовым светом или при воздействии различных
химических агентов, а также механизм устранения
дефектов, связанных с некоторыми заболеваниями.
Генетическая программа обеспечивает создание
геномных вариантов и возможность эволюционных
изменений. Определенные гены кодируют белки,
способствующие обмену цепями, принадлежащими
разным молекулам ДНК, и тем самым созданию
новых комбинаций генетического материала,
передаваемых потомству. Известны белки, вызы-
вающие геномные перестройки путем катализа
транслокаций небольших сегментов или даже про-
тяженных участков в пределах одной молекулы
ДНК и между молекулами. С одной стороны, ре-
комбинации и транслокации подобного рода соз-
дают основу для эволюционных экспериментов, а
с другой некоторые перестройки могут быть при-
чиной заболеваний. Как это ни странно, оптималь-
ное функционирование некоторых генетических
программ действительно зависит от специфических
перестроек в ДНК (гл. 10).
В этой главе мы рассмотрим механизмы репли-
кации, репарации, рекомбинации и перестроек- по
существу, генетические манипуляции на уровне
ДНК. В этой главе представлены также данные
о репликации вирусных РНК-геномов, поскольку
некоторые этапы этого процесса сходны с процес-
сом репликации ДНК.
2.1. РЕПЛИКАЦИЯ ДНК
а. Матричная функция ДНК
при репликации
Обнародуя свою модель структуры ДНК в
1953 г., Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик писали:
«Мы не могли не осознавать, что специфическое
спаривание (оснований), постулированное нами,
подразумевает наличие какого-то механизма копи-
рования генетического материала». И через месяц
они углубили эту мысль: «Если известен точный
порядок оснований в одной из цепей, то можно
записать и порядок оснований в другой, поскольку
спаривание оснований специфично. Таким образом,
одна цепь является комплементом другой; именно
это свойство наводит на мысль, что ДНК может
удваивать саму себя».
Уотсон и Крик предположили, что для удвоения
ДНК должны произойти разрыв водородных связей,'
удерживающих вместе спиральный дуплекс, и рас-
хождение цепей. Они также высказали мысль, что
каждая цепь дуплекса служит матрицей при синтезе
комплементарной цепи и в результате образуются
две пары цепей, в каждой из которых только одна
является родительской (рис. 2.1). Таков механизм
точного воспроизведения последовательности нук-
леотидных пар в двойной спирали. Уотсон и Крик
полагали, что репликация ДНК осуществляется
спонтанно, без участия ферментов, но это оказалось
неверно. Тем не менее идея о том, что удвоение
ДНК происходит путем последовательного соеди-
5*
68
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 2.1.
Перед дупликацией ДНК должны произойти разрыв
водородных связей, стабилизирующих двойную спи-
раль, и расплетание цепей. Каждая цепь служит матри-
цей при синтезе другой, комплементарной цепи.
[J.D. Watson, F. Н.С. Crick, Cold Spring Harbor Sympo-
sium, 18 (1953). p. 123.]
нения нуклеотидов в соответствии с правилом
комплементарности, заданным каждой цепью спи-
рали, разрешила концептуальную проблему точного
воспроизведения генов.
С того времени, как было высказано это пред-
положение, матричная природа механизма репли-
кации была подтверждена многочисленными дан-
ными, полученными как in vivo, так и in vitro для
различных организмов. Согласно модели, репли-
кация всех двухцепочечных ДНК полукоисервативна
(рис. 2.2). Существуют ли в природе альтернатив-
ные способы репликации двухцепочечной ДНК (на-
пример, консервативный или дисперсный) неиз-
вестно. Итак, после одного раунда репликации одна
цепь в каждой из двух дочерних молекул является
родительской, т. е. консервативной, а другая - син-
тезированной заново. Если геном представлен од-
ноцепочечной ДНК (как в некоторых вирусах), то
эта единственная цепь служит матрицей для обра-
зования комплементарной цепи, с которой она об-
разует дуплекс, а затем на этом дуплексе синте-
зируются либо дочерние дуплексы, либо одноцепо-
чечные копии одной из матричных цепей (рис. 2.3).
б. Репликация начинается в
определенных точках
Начало репликации (origin). Репликация ДНК
начинается не в любой случайной точке молекулы,
а в специфических местах, называемых точками
начала репликации. Процесс копирования продол-
жается через образование репликативных вилок в
одном или обоих направлениях до тех пор, пока
ДНК полностью не удвоится (рис. 2.4). В замкну-
тых кольцевых дуплексах ДНК новосинтезирован-
ные цепи ковалентно соединяются в местах встречи
увеличивающихся в размере репликативных вилок
или в том месте, где единственная вилка возвра-
щается к точке начала репликации. Дочерние моле-
кулы, как правило, расходятся еще до начала нового
раунда репликации. Такие различающиеся по раз-
меру геномы, как геном вируса SV40 (5,2 т. п. н.),
бактериофага X (48,5 т. п. н.) и E.coli (4- 103 т. п. н.),
воспроизводятся в результате одного инициирую-
щего события, происходящего в определенной
точке.
У про- и эукариот можно встретить различные
вариации на эту тему. Так, каждая из цепей роди-
тельской спирали митохондриальной ДНК живот-
ных (15 т. п. н.) и ДНК плазмиды ColEl (6 т. п.н.)
имеет свою точку начала репликации (рис. 2.5).
Синтез комплементарной цепи некоторых неболь-
ших одноцепочечных фаговых геномов начинается
вблизи одной специфической последовательности,
а репликация полученного дуплекса может иници-
ироваться совсем в другой точке (рис. 2.6). Реп-
ликация линейных дуплексных ДНК также иници-
ируется в особых сайтах. Например, ДНК бакте-
риофага Т7 (40 т. п. н.) реплицируется в двух про-
тивоположных направлениях к разным концам мо-
лекулы, начиная от одной точки (рис. 2.7), а каждая
из двух цепей ДНК аденовируса человека (30-
38 т. п. н.) реплицируется последовательно всегда от
З'-конца (рис. 2.8). s
Для геномов эукариотических клеток (рис. 2.9)
обычно характерно наличие множественных точек
начала репликации, разбросанных по хромосоме на
расстоянии 20 т. п. н. После инициации репликация
продолжается в двух направлениях от каждой точки
до тех пор, пока репликативные вилки двух соседних
точек начала репликации не сольются. Полнораз-
мерные ДНК каждой дочерней хромосомы полу-
чаются путем соединения более коротких, незави-
симо инициированных новосинтезированных цепей.
Скорость репликации генома. Скорость репли-
кации генома регулируется в основном частотой
2. РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
69
Родительская
молекула
РИС. 2.2.
Предполагаемые модели репликации дуплексной ДНК.
В средней части рисунка представлен реальный, полу-
консервативный механизм. Реализуются ли другие воз-
можные механизмы, а именно- консервативный (слева)
и дисперсионный (справа),-неизвестно.
Родительская
молекула
РИС. 2.3.
Репликация одноцепочечных вирусных ДНК. Буквой В
обозначен вирусный геном, буквой К-его комплемент.
70
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
ori
РИС. 2.4.
Репликация инициируется в специфическом участке
ДНК, называемом точкой начала репликации (ori). Рас-
тущие цвпи образуют репликативные вилки. Синтез
новых дуплексов ДНК происходит в репликативных
on
вилках, перемещающихся либо в двух (вверху), либо
в одном (внизу) направлении в зависимости от природы
точки начала репликации.
инициирующих событий. Так, у Е. coli скорость
копирования в каждой репликативной вилке по-
стоянна и равна примерно 1500 п. н. в секунду;
следовательно, полный геном длиной 4 10е пар
реплицируется примерно за 40 мин. Если хромо-
сома реплицируется быстрее, это значит, что уве-
личивается частота актов инициации в той же самой
точке начала репликации при прежней скорости
копирования. Клетки Е. coli делятся каждые 20 мин;
это означает, что репликация ДНК инициируется
в хромосомах, еще не закончивших предыдущий
раунд репликации. Скорость движения репликатив-
ной вилки в эукариотических клетках значительно
меньше (10 -100 п. н. в секунду), но завершение
репликации хромосомы в разумное время обеспечи-
вается одновременной инициацией во множестве
точек. Итак, скорость репликации хромосом конт-
ролируется числом и расположением точек начала
репликации. Например, в ранних эмбрионах дро-
зофилы репликация хромосомы осуществляется
каждые 3 мин благодаря почти одновременной ини-
циации событий в точках, отстоящих друг от друга
на 7000-8000 п.н. В культуре клеток DrosOphila
наблюдается значительно более медленная скорость
дупликации хромосомы, поскольку репликация на-
чинается в гораздо меньшем числе точек, находя-
щихся друг от друга на расстоянии 40 000 п. н.
Следовательно, при фиксированной скорости роста
цепи множественная инициация обеспечивает боль-
шую скорость процесса и уменьшает время, необ-
ходимое для дупликации протяженных участков
хромосом.
Структура точек начала реп шкации. Фрагменты
ДНК, несущие точку начала репликации, выделены
2. РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
71
РНК
РИС. 2.5.
В некоторых кольцевых геномах в каж-
дой цепи имеется своя точка начала реп-
ликации. Здесь в качестве примера рас-
смотрена репликация митохондриаль-
ной ДНК животных. Синтез одной цепи
начинается в точке oriR. Когда новая цепь
доходит до точки oriD, начинается синтез
другой цепи. Синтез инициируется пу-
тем образования праймерной РНК (об
этом подробно говорится в разд. 2.1 .ж).
РИС. 2.6.
Точки начала репликации одноцепочечных геномов бактерио-
фагов. Промежуточным продуктом репликации у бактериофа-
гов fd, G4 и фХ174 является дуплексная ДНК. Инициация
синтеза геномной ДНК (В-цепь) у всех трех бактериофагов
происходит в единственной точке. Синтез же комплементар-
ной цепи (К-цепь) инициируется в одной (fd и G4) или
нескольких (фХ174) точках.
Начало репликации
В-цепи ДНК фага fd
Начало репликации
В-цепи ДНК фага G4
Начало репликации
К-цепи ДНК !
фага G4 \ /
Начало
репликации
К-цепи ДНК
фага ФХ 174
G4
Начало репликации
В-цепи фага ДНК
ФХ 174
ФХ 174
72
ЧАСТЬ 1 МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 2.7.
Репликация линейного дуплексного
генома бактериофага Т7. Синтез
ДНК идет в двух направлениях от
точки ori. Особенности механизма
репликации ДНК таковы, что 5'-кон-
цы новосинтезированных цепей ос-
таются незавершенными. Для обра-
зования полноценного дуплексного
генома фага необходимы дополни-
тельные шаги (разд. 2.1 .з).
5'
3'
Репликация ДНК фага Т7
РИС. 2.8.
Репликация линейного дуплексного генома аденовиру-
са человека. Цепи синтезируются последовательно. Ко-
пирование матричной цепи начинается каждый раз с
З'-конца.
из Е. coli и некоторых колифагов и плазмид, а также
из дрожжей и ряда эукариотических вирусов. В не-
которых случаях место начала репликации имеет
такую нуклеотидную последовательность, что дуп-
лекс принимает необычную конфигурацию, кото-
рую распознают белки, участвующие в инициации.
Природа взаимодействия между точкой начала реп-
ликации и белками и механизм инициации в целом
исследованы очень мало (разд. 2.1. ж), однако
можно сказать, что, по-видимому, они в разных
случаях различны.
«
в. Репликация ДНК полуконсервативна
После начала репликации репликативные вилки
движутся в одном или обоих направлениях вдоль
молекулы ДНК. Чем дальше продвинулась вилка,
тем длиннее новосинтезированный сегмент ДНК.
Прежде чем обсуждать данные о механизмах ини-
циации репликативной вилки и ее движения, полу-
ченные с помощью модельных систем репликации
у прокариот (разд. 2.1. ж), рассмотрим основную
реакцию, протекающую в репликативной вилке в
процессе копирования двухцепочечной ДНК.
2, РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
73
РИС. 2.9.
Репликация хромосомной ДНК эука-
риот. Репликация идет в двух направ-
лениях из разных точек начала реп-
ликации (ori) с образованием «пу-
зырьков». Как видно из рисунка, по
мере движения репликативных вилок
пузырьки увеличиваются в размере
и в конце концов сливаются. На
электронной микрофотографии вид-
ны пузырьки разных размеров в реп-
лицирующейся ДНК Drosophila. (Мик-
рофотография любезно предостав-
лена D.S. Hogness.)
Цепи ДНК синтезируются в результате присо-
единения 5'-дезоксинуклеотидильных единиц дезок-
сирибонуклеозидтрифосфатов к З'-гидроксильному
концу уже имеющейся цепи (праймера) (рис. 2.10).
Следовательно, они синтезируются в направлении
5' -»3' вдоль матричной цепи, ориентированной в
противоположном, 3' -* 5', направлении (рис. 2.11).
Синтез цепей в обратном направлении не происхо-
дит никогда, поэтому синтезируемые цепи в каждой
репликативной вилке должны расти в противопо-
ложных направлениях (рис. 2.12). Синтез одной
цепи (ведущей, лидирующей) происходит непрерыв-
но, а другой (отстающей) импульсами. Такой меха-
низм репликации называется полунепрерывным. Ве-
дущая цепь растет от 5'- к З'-концу в направлении
движения репликативной вилки и нуждается только.^
в одном акте инициации. Рост отстающей цепи
также идет от 5'- к З'-концу, но в направлении,
противоположном движению репликативной вилки.
Для синтеза отстающей цепи должно произойти
несколько актов инициации, в результате чего обра-
зуется множество коротких цепей. Эти цепи, назы-
ваемые фрагментами Оказаки в честь открывшего
их ученого, имеют размеры 1000-2000 нуклеотидов
у прокариот и 100-200 в реплицирующейся ДНК
эукариот. По мере движения репликативной вилки
концы соседних фрагментов Оказаки соединяются
с образованием непрерывной отстающей цепи.
74
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
I
’О-Р=О
I
о
I
Н2С Аденин
О
I
’О-Р=О
I
О
дезоксирибонуклеозидтрифосфат
РИС. 2.10.
Цепи ДНК удлиняются путем последовательного присо-
единения дезоксинуклеотидов к концевой З'-ОН-группе
каждого предыдущего нуклеотида. Донором новых де-
зоксинуклеотидных единиц служат 5'-дезоксинуклеозид-
I
"О-Р=О
I
О
I
Н2С Аденин
и
о
I
“О-Р=О
I
о
I
Н2С Цитозин
ОН 0 0
I II II
“0-Р=0 + ”0—Р—О—Р—0“
I I I
О 0“ О’
трифосфаты. Присоединение каждого нуклеотида со-
провождается высвобождением одной молекулы пиро-
фосфата.
Механизмы инициации репликации в точке на-
чала репликации и при образовании фрагмен-
тов Оказаки в отстающей цепи в принципе анало-
гичны, хотя имеются некоторые тонкие различия
(разд. 2.1. ж). В обоих случаях происходит образо-
вание коротких РНК-затравок (праймеров), компле-
ментарных матричной ДНК, в виде продолжения
которых синтезируется новая цепь ДНК (рис. 2.13).
В дальнейшем короткие вставки РНК замещаются
сегментами ДНК, которые затем объединяются с об-
разованием непрерывной отстающей цепи.
г. Комплементарное копирование
оснований,
перенос дезокси нуклеотидов
и лигирование ДНК при репликации
Нуклеотидная последовательность матричной
цепи задает порядок расположения нуклеотидов в
новосинтезируемых цепях ДНК (рис. 2.11). Не-
смотря на то что правило комплементарности
обеспечивает большую надежность процесса копи-
рования, последний небезошибочен. Из-за слу-
чайных флуктуаций в структуре присоединяемых
оснований и оснований, входящих в состав матрич-
ной цепи, могут происходить ошибочное спаривание
и включение неправильных нуклеотидов (рис. 2.14).
При включении неправильного нуклеотида даль-
нейший рост цепи обычно останавливается. Фер-
менты, катализирующие присоединение нуклеоти-
Праймерная цепь
Матричная цепь
Праймерная цепь
Матричная цепь
5'
О
Цитозин
О
।
О-Р=О
О-Р=О
о
Н2С
он
Аденин
о
о
о
о-р-о-р-О-Р-о-сн2
III г
о
О’
О’
г Тимин
Ок I----
3’
он
Г уанин
3'
5'
о
I
О-Р=О
3
Тимин
0=Р-0
О
сн2
о
Н2О
Присоединяемый
дезоксирибонуклеозидтрифосфат
РИС. 2.11.
Репликация ДНК. Рост праймерной
цепи осуществляется путем компле-
ментарного копирования предсу-
ществующей матричной цепи. Усло-
вились, что праймерная цепь растет
в направлении 5' -> 3', поскольку но-
вые дезоксинуклеотиды присоеди-
няются к З'-концу. Комплементарная
матричная цепь имеет направление
3'->5'. Необходимую для протекания
этой реакции энергию система полу-
чает за счет гидролиза пирофосфата.
О
и
О-Р-ОН
О’
О"
о
I ___________.
Н2С [Цитозин]
О
Г уанин
О
о=Р-0“
О
О
и
О-Р-ОН
о
'О-Р=О
о
Аденин
О=Р-О"
0
О
’О-Р=О
Аденин
О=Р-О'
Г уанин
сн2
о
Пирофосфат
О О
и II
О-Р-О-Р-О’
О" О'
о
Г уанин
О=р-О"
[ Аденин
сн2
о
з-он
СН2
о
о
о
Тимин
СН,
I *
О
5'
Тимин
О=Р-О"
О
й
Сн2
О
О=р-О“
о
сн2
о
О=Р-О“
о
сн2
о
сн,
I *
5'
О
РИС. 2.12.
Синтез обеих цепей ДНК в репли-
кативной вилке идет в направлении
5'-»3'. т. е. удлинение цепей проис-
ходит в противоположных направле-
ниях. Одна цепь-лидирующая син-
тезируется как единое целое, а дру-
гая-отстающая короткими фраг-
ментами, которые впоследствии со-
единяются с образованием непре-
рывной цепи.
76
ЧАСТЬ L МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 2.13.
Инициация репликации ДНК
Синтез РНК-затравки
Начало синтеза
лидирующей цепи
Синтез PH К-затравок
и начало синтеза
отстающей цепи
Образовавшаяся репликативная вилка
перемещается влево (вверху — лидирующая
цепь, внизу — отстающая)
ОБЫЧНЫЕ ПАРЫ
РИС. 2.14.
Сравнение обычных и необычных, редко встречающихся
пар оснований.
НЕОБЫЧНЫЕ ПАРЫ
А-Т -пара
А-С-пара
___,N-H
Дезоксирибоза /
H-N. N^.
Аденин
J Дезоксирибоза
Тимин
Аденин (имино-форма) Цитозин
G-C-пара
G-T-napa
!! Дезоксирибоза Дезокси- N—(
рибоза N—Н
Н
Цитозин Г уанин
J Дезоксирибоза
Тимин
(енольная форма)
2. РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
77
Мат-
ричная
цепь
Прай-
мерная
цепь
АААААААА
РИС. 2.15.
Ошибочное спаривание, происшедшее случайно, приво-
дит к тому, что в цепь ДНК включается неправильный
нуклеотид. При нарушении правильного спаривания ос-
нований между праймерной и матричной цепями рост
цепи останавливается. Синтез может возобновиться
если ошибочно включенный нуклеотид удалить с по-
мощью соответствующей экзонуклеазы. (Отметим, что
примененное здесь схематическое изображение цепей
ДНК прежде часто встречалось в литературе.)
Т Т Т Т Т Т С*
АААААААА
3—5'-Экзонуклеаза
Дальше реакция не идет
дов, обладают эффективной системой коррекции-
они удаляют включенный, но неспаренный нуклео-
тид почти сразу после присоединения его к концу
растущей цепи (рис. 2.15). В общем виде реакцию
присоединения 5'-дезоксинуклеотидной группы к
З'-ОН-группе концевого нуклеотида праймерной
цепи можно представить следующим образом:
[dNMP]„ + dNTP [dNMP]„+ j + PP;,
где dN MP-любой из четырех обычных нуклеоти-
дов. За один акт репликации праймерная цепь удли-
няется на один остаток, при этом одновременно
происходит удаление пирофосфата. Реакция присо-
единения нуклеотида обратима, но в целом она
смещена в сторону синтеза, поскольку неорганиче-
ский фосфат в клетках быстро разрушается. Фер-
менты, катализирующие праймер-зависимую, де-
терминируемую ДНК-матрицей реакцию присоеди-
нения дезоксинуклеотидов, называются ДНК-поли-
меразами. Многие ДНК-полимеразы выделены и
охарактеризованы, и в разд. 2.1.д детально описа-
ны их свойства и реакции, которые они катализи-^
ру ют.
Фрагменты Оказаки, образующиеся при им-
пульсном копировании цепи ДНК, должны впос-
ледствии объединиться в непрерывную отстающую
цепь (рис. 2.12). Эта реакция осуществляется
ДНК-лигазами- ферментами, катализирующими
ковалентное сшивание цепей ДНК в дуплексе;
ДНК-лигазы играют ключевую роль не только в
репликации, но и в репарации повреждений (разд. 2.3)
и рекомбинации ДНК (разд. 2.4).
78
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
д. Ключевые ферменты,
участвующие в синтезе ДНК
Многие известные теперь детали процесса реп-
ликации ДНК удалось установить благодаря ис-
следованию поведения и активности ферментов,
обеспечивающих работу аппарата репликации.
Наиболее полно изучен механизм репликации бак-
териальной ДНК, особенно ДНК E.coli и бакте-
риофагов, которые в ней размножаются. Довольно
хорошо известны и ферменты репликации дрож-
жей, Drosophila, клеток и вирусов млекопитающих.
Здесь мы обсудим механизм действия ДНК-поли-
мераз и ДНК-лигаз, поскольку при синтезе длин-
ных цепей ДНК эти два фермента работают согла-
сованно.
ДНК-полимеразы. ДНК-полимеразы присутст-
вуют во всех прокариотических и эукариотических
клетках. Более того, многие вирусы бактерий и
животных индуцируют образование вирус-специ-
фических ДНК-полимераз или белков, способст-
вующих эффективному участию ДНК-полимераз
клеток-хозяев в репликации вирусной ДНК. Не-
которые прокариотические и эукариотические
ДНК-полимеразы выделены в чистом виде, а их
физические и ферментативные свойства охаракте-
ризованы. И хотя эти свойства не совсем идентичны,
механизм катализа для всех указанных ферментов
в общих чертах одинаков.
Наиболее полно изучена ДНК-полимераза I
(Poll) E.coli. Она представляет собой одиночный
полипептид с мультифункциональными актив-
ностями. В качестве ДНК-полимеразы Pol I катали-
зирует перенос 5'-дезоксинуклеотидильных единиц
дезоксину клеозид-5'-трифосфатов к З'-ОН-группе
в цепи ДНК или РНК, после чего происходит
спаривание перенесенного основания с соответст-
вующим основанием комплементарной цепи ДНК
(разд. 2.1. г и рис. 2.11). Таким образом, для поли-
меризации ферменту необходимы праймер в ка-
честве дезоксинуклеотидного акцептора и матрица,
детерминирующая присоединение нужного нук-
леотида. Помимо полимеризации нуклеотидов, Pol I
катализирует две другие реакции, биологическая
роль которых очень важна (рис. 2.16). В одной из
них происходит гидролиз фосфодиэфирных связей
в одной цепи ДНК или на неспаренном конце
дуплексной ДНК, причем за один акт удаляется
один нуклеотид, начиная с З'-конца цепи (3'-5'-эк-
зонуклеаза). Вторая реакция также состоит в от-
щеплении нуклеотидов, но гидролиз начинается с
5'-конца дуплексной ДНК в направлении к З'-концу
(5' -3' -экзонуклеаза). Эти различные активности
присуши разным сайтам полипептидной цепи Poll.
Если in vitro обработать Poll трипсином, то поли-
пептидная цепь расщепится на большой и малый
фрагменты. Большой, С-концевой фрагмент («фраг-.
мент Кленова») сохраняет ДНК-полимеразную и
3' 5'-экзонуклеазную активности; малый, N-конце-!
вой фрагмент обладает только 5'- З'-экзонуклеазной
активностью.
Poll и присущие ей экзонуклеазные активности’
играют очень большую роль в репликации и репа-»
рации хромосомной ДНК E.coli. 3'-S'-экзонуклеаз-
ная активность обеспечивает контроль за присоеди-
нением каждого нуклеотида и удаление ошибочных
нуклеотидов с растущего конца цепи (рис. 2.15). I
Если эта активность подавлена в результате ка- .
ких-то мутаций в гене, кодирующем Pol I, то при I (
репликации генома часто происходят мутации за-|
мены оснований.
Способность ДНК-полимеразы удлинять З'-ко- ,
нец цепи, спаренной с матричной цепью, позволяет
ей заполнять пробелы между сегментами отстаю- .
щей цепи. Poll удлиняет фрагменты Оказаки с
З'-концов и удаляет рибонуклеотиды, с которых j ’
начинаются 5'-концы соседних фрагментов, что ’
является необходимой предпосылкой для формиро-
вания непрерывной отстающей цепи (рис. 2.13).
Поскольку Poll способна удлинять З'-конец одной
из цепей в месте разрыва в двухцепочечной ДНК
и удалять нуклеотиды с 5'-конца того же разрыва
(процесс, называемый ник-трансляцией), этот фер-
мент играет ключевую роль в репарации поврежден-
ной ДНК (рис. 2.16 и разд. 2.3). Ник-трансляция I
широко используется in vitro для синтеза радиоак-
тивно меченной ДНК (разд. 4.6.6).
У Е. coli имеются и две другие ДНК-полимеразы,
но они присутствуют в клетке в меньших количест-
вах. Poll! присоединяет нуклеотиды значительно
менее эффективно, чем Pol I, и не обладает 5'- З'-эк-
зонуклеазной активностью. Следовательно, Poll!
может заполнять пробелы между фрагментами
ДНК, спаренными с матричной цепью, но не спо-
собна отщеплять РНК-нуклеотиды от фрагментов
Оказаки или осуществлять ник-трансляцию. Роль
Poll! в репликации и сохранении хромосомной
ДНК E.coli до настоящего момента неясна.
Pol III-холофермент это ключевой фермент, ,
ответственный за репликацию хромосомной ДЙК
E.coli. В каждой клетке содержится только 10-20
копий Pol Ш-холофермента, и тем не менее он
является основным компонентом мультифермент-
ного комплекса, инициирующего формирование
репликативных вилок в точках начала репликации,
участвующего в элонгации лидирующей цепи в
вилке и удлиняющего РНК-праймеры с образова- 1
нием фрагментов Оказаки. Но поскольку Pol Ш-хо-
лофермент не обладает 5'-З'-экзонуклеазной актив-
ностью, для репликации отстающей цепи необхо-
димо участие Pol I, чтобы произошло удлинение
продукта, образовавшегося при участии Pol III, и
2. РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
79
3' —► 5'-Экзонуклеаза
5' 3'
СР он о +
5'-Мононуклеотиды
5' 3'
Р | 0,4 0
Р'
3' 5'
5'
(Р
(НО
3'
3'
5'
5'Мононуклеотиды
оно_______
рО
5
Не расщепляет
5' —► 3" -Экзонуклеаза
Ник-трансляция
(НО
5'
3'
5'
(Р
(НО
3'
3'
__________оцО
р7)
5’
3' 5'
( ОН О (Р
5'-Мононуклеотиды
3'
5'
5'-Мононуклеотиды
РИС. 2.16.
ДНК-полимераза катализирует 3' -► 5'- и 5'-* З'-экзо-
нуклеазные реакции. 3' -> 5'-экзонуклеаза расщепляет
одноцепочечную ДНК с З'-ОН-конца, а 5'-» З'-экзонук-
леаза разрушает дуплексную ДНК с 5'-конца. 5' -» З'-эк-
зонуклеазная и полимеразная активности катализируют
процесс, при котором происходят последовательное
отщепление нуклеотидов с 5'-конца одноцепочечного
разрыва в дуплексе и удлинение цепи с 3 -конца. В ре-
зультате место разрыва перемещается по цепи в на-
правлении от 5'- к З'-концу (так называемая ник-транс-
ляция). Для осуществления ник-трансляции необходи-
мы дезоксинуклеозидтрифосфаты.
удаление РНК-праймеров на 5'-конце фрагментов
Оказаки.
Обнаружены изменения в полипептидной цепи
основного (кор) фермента Pol III, известны амино-
кислотные замены, которые позволяют приписать
определенные виды ферментативной активности
конкретным субъединицам ферментного комплекса.
Так, а-субьединица обладает полимеразной актив-
ностью, а е-субъединица 3'-5'-экзонуклеазной.
Однако комплекс а- и Е-субъединиц обладает зна-
чительно более высокой полимеразной и экзонук-
леазной активностями, чем каждая из соответст-
вующих субъединиц в отдельности. Функция тре-
тьей, 6-субъединицы пока неясна.
Помимо субъединиц, составляющих РоНП-кор,
Ро! Ill-холофермент содержит еще семь субъединиц:
т, у, р, ё, б', х и V- Перечисленные полипептиды
также существуют во множестве копий, так что
в результате мол. масса комплекса составляет при-
мерно 103 кДа. Роль Р-субъединицы заключается
в том, чтобы свести к минимуму вероятность от-
деления фермента от матрицы до завершения про-
цесса копирования; точная же функция других
субъединиц неизвестна. Вполне возможно, что
Pol Ш-холофермент существует в двух формах,
каждая из которых содержит определенный набор
вспомогательных субъединиц, придающих фермен-
ту определенные свойства. В одной форме фермент
катализирует синтез непрерывной ведущей цепи,
а в другой - прерывистой отстающей.
Pol Ш-холофермент катализирует те же реакции
синтеза, что и Pol I, но работает примерно в 60 раз
быстрее. Более того, Pol Ш-холофермент обла-
дает повышенным сродством к матрице и обеспе-
чивает более высокую эффективность копирования.
Pol Ш-холофермент может связываться и с другими
белками, увеличивая эффективность процесса копи-
рования благодаря координации некоторых важных
ферментативных этапов репликации. На этом более
высоком уровне организации в комплексы могут
включаться белки, расплетающие спираль ДНК в
точках начала репликации и в репликативных вил-
ках (расплетазы или геликазы), инициирующие об-
разование праймерных РНК (праймазы), обеспечи-
вающие последовательное наращивание цепей ДНК,
терминирующие процесс репликации и разделяю-
щие дочерние спирали ДНК.
ДНК-полимеразы, синтезируемые другими бак-
80
ЧАСТЬ 1 МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 2.17.
Все ДНК-лигазы соединяют 5'-фос
форильную и З'-гидроксильную груп-
пы нуклеотидов, находящихся на про-
тивоположных концах одноцепочеч!
ного разрыва в дуплексе ДНК. Обра
зуется новая фосфодиэфирная связь
разрыв сшивается.
териями и многими бактериофагами, различаются
по своим физической структуре и свойствам. Тем не
менее катализируемые ими реакции практически
идентичны реакциям, изученным у E.coli. У всех
ДНК-полимераз есть корректирующая 3'5'-экзо-
нуклеаза, однако 5'-З'-экзонуклеаза у некоторых
ферментов отсутствует. Например, ДНК-полиме-
раза фага Т4 может осуществлять 3'^'-экзонук-
леазную реакцию коррекции ошибок, но не способна
катализировать 5'- З'-экзонуклеазную реакцию и
поэтому не может обеспечить ник-трансляцию. При
репликации ДНК фага Т4 5'-З'-экзонуклеазную
реакцию удаления РНК-праймеров перед объеди-
нением фрагментов Оказаки катализирует другой
кодируемый фагом белок. В процессе прерывистого
синтеза отстающих цепей и репарации повреждений
ДНК фага Т4 этот фермент работает согласованно
с фаговой ДНК-полимеразой.
В эукариотических клетках идентифицировано
множество ДНК-полимераз, но их физические и
функциональные свойства изучены менее детально,
чем у соответствующих ферментов прокариот. Из
клеток млекопитающих выделены четыре ДНК-по-
лимеразы: а, р и 8 содержатся в ядрах, а у-в ми-
тохондриях. ДНК-полимераза а участвует в репли-
кации хромосомной ДНК. Ее полимеразная ак-
тивность связана с большим полипептидом, но она
существует и, возможно, функционирует как муль-
тисубъединичный белок, аналогично Pol Ш-холо-
ферменту Е. coli. p-Полимераза это одиночный
полипептид, функцией которого является заполне-
ние пробелов при репарации повреждений ДНК.
Митохондриальная полимераза у, состоящая из
четырех идентичных полипептидов, ответственна за
репликацию митохондриального генома. 8-Поли-
мераза похожа на полимеразу а по своим молеку-
лярным и синтетическим свойствам и также участ-
вует в репликации хромосомной ДНК. Поскольку
а-, Р- и у-ДНК-полимеразы млекопитающих ли-
шены 3'- 5'- и 5'-З'-экзонуклеазных активностей,
присущих ферментам E.coli, остается неясно, как
в процессе репликации ДНК у этих организмов
удаляются случайно включенные ошибочные нук-
леотиды и РНК-затравки на концах фрагментов
Оказаки.
Некоторые вирусы животных (например, гер-
песвирус, вирус коровьей оспы и вирус гепатита I
индуцируют синтез особых полимераз для репли-1
кации своих геномов. Другие вирусы образуют
белки, которые стимулируют системы репликацш
клеточной ДНК или участвуют в репликации ви-
русной ДНК. Например, паповавирусы синтезируют
белки, необходимые для инициации репликации I
Аденовирусы человека кодируют белки, «запускаю- pi
щие» инициацию синтеза обеих цепей линейной
вирусной ДНК (разд. 2.1. ж). Они продуцируют так-
же особые ДНК-связывающие белки, облегчающие 1
репликацию.
ДЕ1К-лигазы. ДНК-лигазы необходимы дл J
соединения цепей ДНК при репликации, репарации В
и рекомбинации. Все известные лигазы способны
образовывать фосфодиэфрные мостики между
5'-фосфорильной и З'-гидроксильной группами со-
седних дезоксинуклеотидов в местах разрывов ДНК Я
(рис. 2.17). ДНК-лигаза, индуцируемая в E.coli пос-
ле заражения клетки фагом Т4 (Т4-лигаза), уникаль- И
на по своей способности соединять двухцепочечные И
фрагменты ДНК по концам разрыва (рис. 2.18). И
Физиологическая роль этой реакции неизвестна, но
практическое ее значение в манипуляциях с рекой- gl
бинантной ДНК неоценимо (разд. 4.5 и 6.2).
ДНК-лигазы некоторых бактерий (E.coli и
B.subtilis), бактериофагов (Т4 и Т7) и млекопитаю- ’I
щих выделены и их структура и механизм катали- I
тической активности установлены. ДНК-лигазы
Е. coli, Т4 и Т7 это одиночные полипептидные цепи, !
РИС. 2.18.
ДНК-лигаза, кодируемая ДНК фага Т4, соединяет два
фрагмента дуплексной ДНК конец в конец. В каждой из
цепей образуется новая фосфодиэфирная связь.
2. РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
81
РИС. 2.19.
Никотинамидадениндинуклеотид (NAD).
а структура двух видов ДНК-лигаз млекопитающих
неизвестна. Для образования фосфодиэфирных свя-
зей между соответствующими концами нуклеотид-
ных цепей лигазы используют энергию гидролиза
либо АТР, либо его производного-никотинамид-
адениндинуклеотида (NAD) (рис. 2.19). Реакция
протекает в несколько этапов (рис. 2.20): 1) аде-
нилильная единица NAD (лигазы E.coli и B.subtilis)
или АТР (лигазы фагов Т4, Т7 и млекопитающих)
переносится на Е-аминогруппу лизинового остатка
лигазы с одновременным высвобождением нико-
тинамидмононуклеотида или неорганического фос-
фата соответственно; 2) аденилильная группа пере-
носится от белка на 5'-фосфорильную группу кон-
цевого остатка цепи ДНК с образованием пиро-
фосфорильного производного, аденилил-ДНК;
3) аденилильная группа, связанная с 5'-фосфориль-
ной руппой, замещается З'-гидроксильной группой
прилегающего конца ДНК. В результате этих
реакций происходит образование фосфодиэфирных
связей в цепи ДНК за счет энергии гидролиза
пирофосфорильной связи NAD или АТР. Для об-
разования фосфодиэфирной связи во всех случаях,
кроме лигазы фага Т4, должно произойти соедине-
ние нуклеотида, содержащего акцепторную З'-гид-
роксильную группу, с соседним нуклеотидом, несу-
щим активированную 5'-фосфорильную группу.
ДНК-лигазы Е. coli и фага Т4 могут соединять
(И
NAD+
О О
II II
Ad —Rib —О—Р—О- Р — О—Rib — Nic
I I
O' О
Enz — Lys — NHj
Ad—Rib—О —Р —
о-
О О
II II
О —Р—О—Р—0“
I - I
О- сг
АТР
। || NMN
Enz —Lys —N+—P—О—Rib—Ad + ИЛИ
I I PP,
H O“
Аденилирование
О
(2)
H 0
Enz —Lys—N—P—0 —Rib—Ad +} 0-(8 { (XOH o +Enz-Lys-NH2
H o- V V
z \ z \
O~ 0“ о о
p _
z \ Трансаденилирование
Ad —Rib-O О
О
0-ОН О Оч8 { (Ко-р-очЕ + О—Р—О—Rib—Ad
оХ о-
^0 О 0 Лигирование
X
РИС 2 20. О О —Rib —Ad
Механизм действия ДНК-лигазы (Enz). Сокращения: Ad-аденин, Nic-никотинамид, NMN-никотинамидмо-
Lys лизин, входящий в состав лигазы. Rib-рибоза, нонуклеотид, РР;-пирофосфат.
6 243
82
ЧАСТЬ 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
концы двух разных дуплексных фрагментов или
разорванные концы цепей линейной или кольцевой
ДНК. Таким образом, с помощью ДНК-лигаз мо-
гут образовываться и линейные, и кольцевые дуп-
лексные молекулы ДНК.
е. Для репликации
необходимо раскручивание спирали
Для осуществления комплементарного копиро-
вания цепей двухцепочечная ДНК должна постепен-
но раскручиваться. Раскручивание, или расплетание,
спирали происходит только в локальном участке
репликативной вилки. Расплетание- это не спонтан-
ный процесс, в нем участвуют белки двух типов
(рис. 2.21). Одни из них, называемые ДНК-гелика-
зами. используют для разделения цепей энергию,
высвобождающуюся при гидролизе АТР до ADP.
Геликазы часто функционируют в составе комп-
лекса, осуществляющего перемещение репликатив-
ной вилки и репликацию расплетенных цепей
(разд. 2.1). Вообще говоря, для расплетания доста-
точно одного геликазного белка, но для того, чтобы
максимизировать скорость раскручивания, несколь-
ко геликаз могут действовать совместно. Белки
второго типа, дестабилизирующие спираль,- это
белки, связывающиеся с одноцепочечными участками
и тем самым стабилизирующие расплетенный дуп-
лекс. Итак, геликазы вызывают локальное раскру-
чивание двойной спирали, а другие специфические
белки тотчас связываются с образовавшимися од-
ноцепочечными участками, обеспечивая условия для
комплементарного спаривания.
При репликации хроматиновой ДНК (разд. 1.2. ж)
эукариотических организмов возникают допол-
образуется «шарнир», который дает возможность
нереплицированному дуплексу, находящемуся перед
вилкой, вращаться вместе с ней (рис. 2.23). Такие
разрывы вносятся в ДНК с помощью ферментов,
имеющих общее название ДНК-топоизомеразы.
ДНК-топоизомеразы. Эти ферменты изменяют
степень сверхспиральности и тип сверхспирали. Они
не только приводят к образованию шарнира, ко-
торый создает условия для непрерывного движения
репликативной вилки, но и обеспечивают разделе-
ние или образование катенанов - сцепленных коль-
Матрица
\ для синтеза
X, отстающей
^^еяи, РИС. 2.21.
Расплетание дуплексов ДНК облегчает-
\ 5- ся в присутствии двух белков: геликазы
Хр и белка, связывающегося с одноцепо-
3- чечной ДНК.
нительные сложности. Чтобы расплести ДНК 1
составе хроматина, необходимо разрушить сильно
конденсированный комплекс гистонов и ДНК, а по
завершении репликации вновь упаковать две до-
черние спирали в сложные хроматиновые струк-
туры. Каким образом раскручиваются эукариоти-
ческие хромосомы при подготовке к репликации? Об
этом известно очень мало. Развернутые, прсдсу
ществующие и новые нуклеосомы (собранные из
новосинтезированных гистонов) должны ассоцииро-
вать с синтезированной дуплексной ДНК. Чтобы
предотвратить образование слишком протяженных
участков несвязанной ДНК в период репликации.
сборка хроматина должна происходить параллель-
но образованию дуплексной ДНК. Связываются ли
родительские гистоновые октамеры с одной или
обеими дочерними спиралями пока неизвестно.
Топологические проблемы раскручивания и реп-
ликации ДНК. Процесс раскручивания двойной спи-
ради в репликативной вилке порождает механиче-
ские и топологические проблемы. В принципе рас-
плетание линейной дуплексной ДНК может проис-
ходить благодаря вращению родительской спирали
вокруг собственной оси (рис. 2.22). Однако враще-
ние очень длинных цепей ДНК вокруг длинных же
осей во внутриклеточном пространстве механически
затруднено. При репликации замкнутых кольцевых
ДНК расплетание цепей в вилке создает дополни-
тельные проблемы. По мере раскручивания цепей
степень отрицательной сверхспиральности сегмен-
тов, находящихся перед вилкой репликации, посте-
пенно уменьшается и в них возникает положитель-
ная сверхспирализация. Дальнейшее перемещение
вилки вдоль кольца затрудняется и в конце концов
блокируется. Это блокирование снимается путем
внесения одноцепочечного разрыва. Тем самым
2. РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
83
Здесь должно
происходить
быстрое вращение
спирали ДНК
РИС. 2.22.
Вращение двойной спирали ДНК может снять механи-
ческое напряжение, возникающее при раскручивании
двух цепей в репликативной вилке. [В. Alberts et al.
Molecular Biology of the Cell (New York: Garland, 1983), p.
228.]
Матрица для синтеза
лидирующей цепи
Матрица для синтеза
отстающей цепи
Д Н К-полимераза
3'
Синтезируемая цепь ДНК
5'
цевых ДНК, а также устранение узлов и спутанных
клубков из длинной линейной ДНК. Топоизомеразы
являются также неотъемлемыми участниками не-
которых рекомбинационных процессов (разд. 2.4).
В различных организмах идентифицированы
топоизомеразы двух основных типов. Одни фер-
менты, называемые топоизомеразами типа I, умень-
шают число сверхвитков в ДНК на единицу за один
акт. Эти топоизомеразы надрезают одну из двух
цепей, в результате чего фланкирующие дуплексные
области могут повернуться вокруг интактной цепи,
и затем воссоединяют концы разрезанной цепи
(рис. 2.24). Эта реакция не требует энергии АТР,
поскольку энергия фосфодиэфирной связи сохра-
няется благодаря тому, что тирозиновый остаток
в молекуле фермента выступает то в роли акцепто-
ра, то в роли донора фосфорильного конца разре-
занной цепи. Одиночная цепь спонтанно проходит
через разрез. Отмечены два интересных, но, воз-
можно, не связанных друг с другом различия между
топоизомеразами типа I про- и эукариот: 1) топо-
изомеразы типа I прокариот взаимодействуют с
5'-фосфорильным концом разорванной цепи, а эу-
кариот-с З'-фосфорильным концом; 2) топоизо-
Типичная дуплексная структура
Сверхспиральный
дуплекс
лпч\
Разрыв
Репликация может продолжаться
Восстановление нормальной
дуплексной структуры
нереплицированного участка
РИС. 2.23.
Снятие механического и топологического напряжений
в замкнутом кольцевом дуплексе перед репликативной
вилкой. При внесении разрыва нереплицированная
сверхспиральная часть ДНК может вращаться вместе
с репликативной вилкой. Напряжение, возникающее в
длинных цепях ДНК во время репликации in vivo, сни-
мается именно таким способом.
84
ЧАСТЬ 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
ДНК-топоизомераза
разрезает одну из цепей
и ковалентно связывается
с фосфатной группой
молекулы ДНК
Н
РИС. 2.24.
Реакции, катализируемые топоизомерами типа I.
меразы прокариот устраняют только отрицатель-
ные сверхвитки, а эукариотические как отрица-
тельные, так и положительные.
Топоизомеразы типа II устраняют как отрица-
тельные, так и положительные сверхвитки. В отли-
чие от ферментов типа I топоизомеразы типа II
вносят временные разрывы в обе комплементарные
цепи, пропускают двухцепочечный сегмент той же
самой или другой молекулы ДНК через разрыв,
а затем соединяют разорванные концы (рис. 2.25).
Топоизомеразы типа II тоже используют тирози-
новые остатки (присутствующие по одному в каж-
дой из субъединиц ферментов) для связывания 5'-
конца каждой разорванной цепи в то время, когда
другой дуплекс проходит через место разрыва. В ре-
зультате внесения двухцепочечного разрыва и про-
хождения через него другого дуплекса за один акт
снимаются два отрицательных или положительных
сверхвитка. В некоторых случаях дуплексом, про-
ходящим через место разрыва, оказывается другая
замкнутая молекула ДНК; это приводит к разде-
лению сцепленных кольцевых ДНК или, напротив,!
к образованию таких сцепленных комплексов1
(катенанов). Этот механизм может использоваться1
и для распутывания или запутывания клубков, а
также для раскручивания или конденсации крупных
дуплексных ДНК.
Топоизомеразы типов I и II снимают сверхвитки,
образующиеся при репликации кольцевой ДНК.
Топоизомеразы типа II катализируют размыкание двух
кольцевых дуплексов. [В. Alberts et al„ Molecular Biology
of the Cell (New York: Garland, 1983), p. 229.]
2. РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
85
Однако существует особая топоизомераза II, назы-
ваемая гиразой и обнаруженная пока только у бак-
терий, которая индуцирует образование отрица-
тельных сверхвитков в релаксированных кольцевых
ДНК. Для этого гираза делает двухцепочечные
надрезы и затем особым способом воссоединяет
концы (рис. 2.26, А). Итак, гираза снимает положи-
тельные сверхвитки и вносит отрицательные в ре-
лаксированную ДНК. Сбалансированное действие
топоизомеразы I и гиразы - по крайней мере у бак-
терий-по-видимому, регулирует степень сверхспи-
ральности ДНК и таким образом влияет на ско-
рость движения репликативной вилки. Механизм,
с помощью которого гираза катализирует обра-
зование отрицательных сверхвитков в кольцевой
или другой ДНК с топологическими ограниче-
ниями, до конца не установлен. Гираза E.coli пред-
ставляет собой тетрамер, состоящий из субъединиц
двух типов (а2р2), при этом а-субъединицы содер-
жат сайты ковалентного связывания концов моле-
кулы ДНК. Гираза катализирует образование отри-
цательных сверхвитков, создавая сначала положи-
тельные сверхвитки в определенных областях ДНК,
связанных с ферментом (рис. 2.26, Я). Ориентация
двух спиральных сегментов в этих областях ме-
няется на противоположную при протягивании од-
ного сегмента через «ворота», образовавшиеся в
результате двухцепочечного разрыва в другом. В
конце концов образуются два сверхвитка за один
каталитический цикл. Для реализации всех этих
I
Образование структуры с
положительным сверхвитком
I
Надрезание дальнего дуплекса
♦
Воссоединение дуплекса спереди
I
РИС. 2.26.
В бактериях обнаружена топоизомераза типа II, называ-
емая ДНК-гиразой. А. Схематическое представление
образования отрицательных сверхвитков ( —) в релакси-
рованном кольцевом дуплексе ДНК под действием ги-
разы. Б. Детальное изображение процесса. [A. Morrison,
N. R. Cozzarelli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 (1981),
1416-1420.]
86
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
процессов необходима энергия гидролиза АТР, по-
скольку релаксированная кольцевая ДНК должна
быть переведена на более высокий энергетический
уровень, характерный для сверхспиральной кон-
формации.
ж. Инициация образования
новых цепей ДНК и их рост
в репликативных вилках
Инициация образования новых: цепей ДНК. В от-
личие от РНК, синтез которой инициируется
РНК-репликазами (разд. 2.5) и РНК-полимеразами
(часть III), для инициации синтеза ДНК требуется
затравка (праймер). Сначала синтезируются корот-
кие РНК-праймеры, которые затем наращиваются
в виде цепей ДНК. При переводе кольцевой одно-
цепочечной ДНК фага М13 в двухцепочечную реп-
ликативную форму для синтеза коротких сегментов
РНК в точке начала репликации используется РНК-
полимераза-холофермент (рис. 2.27). При реплика-
ции других одноцепочечных кольцевых фаговых
ДНК (G4) РНК-праймер синтезируется специальной
РНК-полимеразой, называемой праймазой. У друго-
го фага с одноцепочечной кольцевой ДНК (фХ174)
мультиферментный комплекс, содержащий от 15 до
20 полипептидных цепей (праймосома), активирует
матричную цепь, в результате чего праймаза син-
тезирует РНК-затравку. Праймосомо-праймазный
способ инициации применяется и для инициации
синтеза ведущей цепи в точке начала репликации
у Е. coli, а также при образовании фрагментов Ока-
заки при синтезе отстающей цепи.
По-видимому, синтез цепей ДНК инициируется
сходным образом (с незначительными вариациями)
у про- и эукариот, в случае плазмид и вирусов.
Различия могут касаться типов полимераз, син-
тезирующих РНК-затравки, вспомогательных бел-
ков, обеспечивающих инициацию РНК-транскрип-
тов, и либо нуклеотидных последовательностей
per se, либо структурных особенностей, опреде-
ляющих положение точки начала транскрипции.
Длина РНК-праймеров варьирует в зависимости от
особенностей инициации. У бактериофага фХ174 и
E.coli праймаза катализирует синтез РНК-прайме-
ров длиной от двух до пяти нуклеотидов, а при
РИС. 2.27.
Инициация репликации одноцепочечной фаговой ДНК.
Для синтеза праймерной РНК в точке начала реплика-
ции разные фаги используют различные ферменты.
(SSB-белок, связывающийся с одноцепочечной моле-
Праймосома
Праймер
РНК-полимераза
V
2. РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
87
репликации ДНК эукариот праймерные РНК при-
близительно в два раза длиннее. У бактериофагов
М13 и G4 синтез РНК-затравок катализируют
РНК-полимераза и О4-праймаза соответственно;
длина этих затравок колеблется от 20 до 30 нук-
леотидов, и они комплементарны сегментам фаго-
вых ДНК, образующим петли (рис. 2.27). Точная
природа сигналов, определяющих сайты синтеза
праймерной РНК для инициации репликации или
для синтеза отстающей цепи, неизвестна.
Репликация плазмидной ДНК ColEl также на-
чинается с транскрипции РНК (в гл. 5 описано
использование таких плазмид в качестве векторов
для клонирования). Однако в этом случае синтез
праймерной РНК инициируется РНК-полимеразой
в сайте, отстоящем на 555 пар оснований от точки
начала репликации плазмидной ДНК (рис. 2.28).
Транскрипция проходит точку начала репликации,
при этом синтезируется цепь РНК длиной 500 600
нуклеотидов. Затем РНКаза-Н расщепляет боль-
шую часть цепи РНК. Остающийся З'-конец РНК
служит затравкой при синтезе цепи ДНК с по-
мощью Pol I-полимеразы. Эта цепь становится ве-
дущей при репликации всей плазмидной ДНК.
У аденовирусов человека синтез новых цепей
ДНК инициируется неким белком, а не РНК
(рис. 2.29). Аденовирус типа 2 содержит белок с
мол. массой 55 кДа, ковалентно связанный с 5'-фос-
фатом каждой цепи ДНК. Первый этап инициации
синтеза новых цепей состоит в том, что кодируемый
вирусом белок мол. массой 80 кДа связывается
с дезоксинуклеозидтрифосфатом, соответствующим
первому дезоксинуклеотидному остатку в ДНК
(dCTP), с образованием комплекса белок dCMP.
З'-гидроксильная группа связанного с белком де-
зоксицитидинового остатка служит праймером для
удлинения цепей ДНК с использованием компле-
ментарной цепи ДНК в качестве матрицы. В ко-
нечном счете вирусный 80 кДа-белок отщепляется
и с новосинтезированной вирусной ДНК остается
связанным только терминальный белок мол. массой
55 кДа. Аналогичный механизм инициации синтеза
ДНК используется и другими аденовирусами и не-
которыми бактериофагами.
Одновременная репликация обеих цепей в реплика-
тивной вилке. Изучение механизма репликации фа-
говой ДНК с использованием очищенных фермен-
тов из Е. coli позволило построить усовершенство-
ванную модель полуконсервативной прерывистой
репликации ДНК в репликативной вилке (рис. 2.30).
Для расплетания спирали при образовании вилки
необходимо, чтобы в ДНК образовались отрица-
тельные сверхвитки (разд. 2.1,е). Расплетание осу-
ществляется ATP-зависимой геликазой и облегчает-
ся в присутствии белка, связывающегося с одно-
цепочечной ДНК. После инициации репликации
Pol Ш-холофермент удлиняет лидирующую цепь
ДНК до размеров, равных длине хромосомы, путем
последовательного присоединения к З'-гидроксиль-
ному концу дезоксинуклеотидильных единиц.
Синтез отстающей цепи инициируется праймо-
сомо-праймазным комплексом (рис. 2.31). Праймо-
сома, обладающая геликазной активностью, распле-
тает спираль и, возможно, способствует формирова-
нию подходящих структур, позволяющих ассоции-
рованной праймазе синтезировать праймер. Прай-
Синтез праймера
Присоединение
dNMP
с помощью
ДНК-полимеразы I
Элонгация
ДНК,
удаление
праймера и
лигирование
РИС. 2.28.
Инициация репликации плазмид типа Col Е1.
88
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
ОН + РРР
Инициаторный
белок (80 кДа)
-ОН
\
dCTP
Праймер
Белок, связанный с 5'-концом
вирусного генома (55 к Да)
3’ 5‘
РИС. 2.29.
Инициация репликации ДНК аденовируса Ключевым
моментом является связывание инициаторного белка
мол. массой 80 кДа с dCTP и закрепление этого комп-
лекса на З'-конце матричной цепи.
мосомо-праймазный комплекс движется в том же
направлении, что и вилка, останавливаясь только
для того, чтобы расплести дуплекс и синтезировать
РНК-праймеры. Эти короткие фрагменты РНК до-
страиваются затем Pol Ш-холоферментом путем до-
бавления дезоксинуклеотидтрифосфатов с образо-
ванием фрагментов Оказаки длиной от 1 000 до 2000
нуклеотидов (рис. 2.30). Удаление сегментов РНК
с 5'-конца каждого фрагмента Оказаки и заполнение
пробелов между ними катализируется Pol I, способ-
ной удлинять цепи и осуществлять ник-трансляцию.
Когда растущий З'-гидроксильный конец каждого
фрагмента Оказаки доходит до 5'-дезоксинуклео-
тидного конца соседнего фрагмента, вступает в дей-
ствие ДНК-лигаза и образуется непрерывная отста-
ющая цепь. Более сложная, но все же гипотетиче-
ская модель (рис. 2.32) движения репликативной
вилки предполагает формирование реплисомы-
мультиферментного комплекса более высокого уров-
ня организации, состоящего из функционально-
го праймосомо-праймазного комплекса, геликазы,
Pol Ш-холофермента и, возможно, гиразы. Такой
комплекс может обеспечивать удлинение лидирую-
щей цепи и одновременно инициацию праймерной
РНК, а также достраивание ДНК при синтезе отста-
Геликазная субъединица
Праймосома
Праймаза
ДНК, удлиняемая Pol III
Лидирующая цепь
ющей цепи. Две реплисомы, работающие согласо-
ванно в двух вилках репликации, которые движутся
в противоположных направлениях вдоль кольцевой
хромосомы, сделали бы эту модель еще более изящ-
ной.
РНК
ДНК, удлиняемая Pol III
РНК, которая должна
быть удалена Pol I
Разрыв, который
должен быть
зашит лигазой
Отстающая цепь
РИС. 2.30.
Полуконсервативный механизм реп-
ликации ДНК £. coli.
5'
Матрица для синтеза
лидирующей цепи
Матрица для синтеза
отстающей цепи
РИС. 2.31.
Инициация синтеза отстающей цепи. [Из
работы A. Kornberg, DNA Replication, Sup-
plement (San Francisco: W. H. Freeman, 1982),
p. S113, с изменениями.]
2. РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
89
Репликация по типу катящегося кольца. Некото-
рые двухцепочечные кольцевые хромосомы репли-
цируются альтернативным способом, называемым
репликацией по типу катящегося кольца (рис. 2.33).
В этом случае двухцепочечная кольцевая ДНК над-
резается специфическим ферментом в уникальном
сайте одной цепи (точке начала катящегося кольца),
и к образовавшемуся в результате надреза З'-гидро-
ксильному концу с помощью РоНП-холофермента
присоединяются нуклеотиды; при этом матрицей
служит интактная замкнутая цепь. Таким образом,
в вилке синтезируется только лидирующая цепь. По
мере синтеза лидирующей цепи происходит вытес-
нение 5'-конца надрезанного кольца как одиночной
цепи. В результате длина лидирующей цепи может
превышать длину матрицы в два- пять раз.
У фагов М13 или фХ174, чьи зрелые геномы
представлены одноцепочечными кольцевыми ДНК,
Этап I
РИС. 2.32.
Синтез обеих цепей ДНК в репли-
кативной вилке с участием муль-
тиферментного комплекса реп-
лисомы. [Из работы A. Kornberg,
DNA Replication, Supplement (San
Francisco: W. H. Freeman, 1982), p.
S125.]
90
ЧАСТЬ 1 МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ. ОБЗОР
такой способ репликации используется на поздних
стадиях инфекционного процесса, после того как
инфицирующая ДНК превращается в двухцепочеч-
ную кольцевую форму. Постоянно отделяющиеся
одиночные цепи ДНК, образуемые при репликации
по типу катящегося кольца , надрезаются в каждой
точке начала репликации и замыкаются с образова-
нием зрелых форм, упаковываемых в вирусные час-
тицы.
Фаг X использует такой способ репликации при
образовании двухцепочечной линейной вирусной
ДНК (рис. 2.33) Субстратной матрицей в этом слу-
чае является двухцепочечная кольцевая ДНК, кото-
рая была реплицирована после превращения на
ранних этапах инфекции линейной вирусной ДНК
в кольцевую репликативную форму. Для того чтобы
образовалась линейная ДНК потомства, двухцепо-
чечные кольца надрезаются и асимметрично репли-
цируются, как это происходит в случае ДНК фагов
М13 и фХ174. Однако отделяющиеся одиночные
цепи превращаются в двухцепочечные структуры
Сначала во множестве сайтов вдоль одиночной цепи
2, РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
91
праймаза синтезирует короткие сегменты РНК. За-
тем эти сегменты достраиваются Pol Ш-холофер-
ментом, пробелы заполняются, РНК удаляется с по-
мощью Poll и наконец короткие фрагменты ДНК
соединяются ДНК-лигазой. При упаковке ДНК в
фаговые частицы в специальных участках, называе-
мых cos-сайтами и отстоящих друг от друга на
длину вирусного генома, образуются надрезы. В ре-
зультате длинные дуплексы многократно повторен-
ной ДНК фага X расчленяются на фрагменты, соот-
ветствующие по размерам зрелой ДНК, обнаружи-
ваемой в вирионах.
Концевой
вирусный
белок
Зрелая ДНК аденовируса
Поочередная репликация цепей. Репликация ДНК
аденовируса происходит без синтеза отстающей це-
пи и поэтому без образования множественных сай-
тов инициации и фрагментов Оказаки (рис. 2.34).
Вместо этого цепи линейного дуплексного генома
реплицируются попеременно. Сначала через образо-
вание белкового праймера происходит инициация
одной цепи, которая непрерывно удлиняется вплоть
до завершения репликации. Вытесненная новосинте-
зированной цепью, вторая цепь дуплекса служит
матрицей при синтезе таким же способом следую-
щего дуплекса. С какого конца родительского дуп-
3'
Концевой
вирусный
белок
А
Инициаторным
вирусный
белок
РИС. 2.34. Б
Поочередная репликация цепей ДНК аденовируса. А.
Двухцепочечная ДНК аденовируса, у которой с каждым
5'-концевым остатком цитозина связан белок мол. мас-
сой 55 кДа. Б. Синтез цепей ДНК последовательно
инициируется с конца каждой исходной цепи с помощью
комплекса «белок с мол. массой 80 кДа-dCTP». К мо-
менту завершения синтеза цепи этот белок расщепляет-
ся, и часть его с мол. массой 55 кДа остается связанной
с 5'-концом цепи.
92
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
лекса начнется процесс, по-видимому, неважно. Реп-
ликация ДНК аденовируса необычна в двух отноше-
ниях: 1) использование белка для запуска синтеза
цепи ДНК с конца линейного дуплекса; 2) отсутст-
вие прерывистой репликации, опосредуемой РНК-
транскриптами.
5'
з. Терминация репликации ДНК
и расхождение дочерних спиралей
Терминация и расхождение в кольцевых геномах.
Замкнутость структуры многих геномных ДНК уп-
рощает завершение репликации всей нуклеотидной
последовательности. Непрерывный рост лидирую-
щей и отстающей цепей вдоль кольцевой матрицы
неизбежно приводит к совмещению З'-гидрокси- и
5'-фосфорильного концов одной цепи либо в точке
начала репликации, либо при двунаправленной
репликации-в середине кольца (рис. 2.35). Кольца
в этих местах встречи соединяются ДНК-лигазой,
при этом обычно они оказываются попарно сцеп-
РИС. 2.36.
При удалении РНК-затравки с 5'-конца новосинтезиро
ванной цепи ДНК на одном конце дуплекса остаето
пробел.
РИС. 2.35.
Репликация замкнутой кольцевой дуплексной ДНК и
расхождение двух дочерних кольцевых молекул.
ленными, и в дальнейшем должно произойти к
разъединение на отдельные геномы. Это происходи?
с помощью топоизомеразы типа II (рис. 2.25).
Терминация и завершение репликации в линейньа
ДНК. За исключением репликации аденовирусно
ДНК (рис. 2.34), где синтез новых цепей ДНК ини
циируется белковым праймером и матричная цеп:
копируется полностью, во всех других случаях да
репликации необходим РНК-праймер, что создам
особые проблемы при завершении репликации ли-
нейной дуплексной ДНК (рис. 2.36). Дело в том чт<
после инициации синтеза новой цепи и последующе-
го удаления РНК-праймера новосинтезированнаи
цепь содержит пробел на 5'-конце. Поскольку ника-
ких способов удлинения 5'-концов цепей ДНК не
существует, необходимы какие-то иные методы за-
вершения репликации.
Были предложены два способа, с помощью кото-
рых процесс репликации мог бы завершаться. Одш
из них предполагает, что существуют цепи ДНК
с прямыми повторами на концах (рис. 2.37). После
репликации два комплементарных конца обоих не-
завершенных дуплексов могут спариться и образо-
вать линейные конкатемеры с одноцепочечными
разрывами. Остающиеся пробелы могут быть за
полнены путем удлинения цепей в направлении
3' -> 5' с последующим соединением их ДНК-лига-
зой либо путем прямого соединения стыкующихся
концов с помощью ДНК-лигазы с образованием
конкатемеров. После надрезания конкатемера от
цифической эндонуклеазой образуются выступаю-
щие 5'-концы, и ДНК-полимераза может наращи
вать более короткие цепи с З'-конца. Другой способ
предполагает наличие на конце каждой цепи ДНК
2. РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
93
5'
3'
5'
3'
Лигирование
5’
(ab с
аос
а'Ь'с'
3'
аЬсЙ
3'
а'Ь'с"„
5'
3'
5’
3' 5'
Специфическая эндонуклеаза
вносит разрыв
5'
5'
3'
з-
Достраивание
концов
Достраивание
концов
5'
l ab с
3'
а b с()
5'
3'
(а'Ь'с’
3'
a'bJc'()
5’
а Ь с|
a' b'c'Q
3'
5'
РИС. 2.37.
Предполагаемая модель
нейной двухцепочечной
J.D. Watson, Nature, New
завершения репликации ли-
ДНК. [По данным работы
Biology, 239 (1972), р. 197.]
коротких инвертированных повторов, благодаря ко-
торым образуются небольшие петли (рис. 2.38). 3'-
конец петли служит праймером для копирования
нереплицированного участка. Благодаря специфиче-
скому разрыву в начале инвертированного повтора
получается структура, которую можно достроить
с З'-конца до восстановления исходной двухцепо-
чечной концевой последовательности.
Недавно полученные данные свидетельствуют
о том, что концевые области эукариотических хро-
мосом теломеры реплицируются с помощью осо-
бого механизма, отличного от представленных вы-
ше. Концы хромосом дрожжей, беспозвоночных,
растений и позвоночных имеют сходное, весьма
необычное строение (разд. 9.6. б): они содержат
шпилькообразные структуры, в которых 3'- и 5'-кон-
цы дуплекса ДНК оказываются рядом, и много
коротких тандемных повторов. Около петли в од-
ной из цепей в области повторов имеются множест-
венные одноцепочечные разрывы. Вопрос о том, как
подобная структурная организация может способст-
вовать репликации концов дуплексных участков,
выясняется. Если учесть сходство структурных осо-
бенностей конечных областей хромосом, то можно
предположить, что механизм репликации всех эука-
риотических хромосом одинаков (разд. 9.6. б).
2.2. РЕПЛИКАЦИЯ РНК
С ОБРАЗОВАНИЕМ ДНК
а.
Репликация геномов ретровирусов
Геном ретровирусов представлен единственной
молекулой одноцепочечной РНК. После проникно-
вения РНК в клетку хозяина вирусный геном под-
вергается обратной транскрипции, при этом сначала
94
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
3’_____________ 5'
f _______________а b с' с b aQ
( а Ь с c'b'a'Q
5' 3'
Полимераза
РИС. 2.38.
Другая предполагаемая модель завершения репликации
линейной двухцепочечной ДНК. [Т. Cavalier-Smith, Natu-
re, 250 (1974), р. 467.]
образуется дуплекс РНК-ДНК, а затем двухцепо-
чечная ДНК. Эти этапы предшествуют экспрессии
вирусных генов на уровне белков и образованию
РНК-геномов.
Фермент, катализирующий комплементарное ко-
пирование РНК с образованием ДНК, называется
обратной транскриптазой. Он содержится в ретрови-
русных частицах (вирионах) и активируется после
попадания вируса в клетку и разрушения его липид-
но-гликопротеиновой оболочки. Вполне вероятно,
что обратной транскрипции способствуют какие-то
вспомогательные белки, находящиеся внутри вирио-
нов, поскольку в присутствии последних фермента-
тивная реакция протекает гораздо эффективнее и
быстрее, чем в присутствии очищенного фермента.
Появляется все больше данных о том, что обратная
транскрипция происходит в самых разных эукарио-
тических клетках, а обратная транскриптаза игра-
ет важную роль в процессах перестройки генома
(разд. 10.3 и 10.4).
Обратные транскриптазы ретровирусов по суще-
ству являются ДНК-полимеразами, и in vitro могут
использовать в качестве матрицы ДНК. Однако
гораздо эффективнее они работают, если матрицей
является РНК. Как и все ДНК-полимеразы, обрат-
ные транскриптазы не способны инициировать син-
тез новых цепей ДНК. Но если синтез уже иниции-
рован с помощью праймерной РНК или З'-концево-
го участка ДНК, то фермент эффективно осущест-
вляет синтез, используя цепь ДНК как матрицу.
Ретровирусы-это диплоидные организмы, по-
скольку каждый вирион содержит две идентичные
цепи РНК размером от 8000 до 10000 нуклеотидов.
Цепи соединены вблизи своих 5'-концов, однако
природа этого нековалентного взаимодействия не-
известна. Области 5'- и З'-концов обеих цепей моди-
фицированы, как и у всех эукариотических мРНК
(5'-кэпы и З'-полиадениловые хвосты; разд. 3.8. а)
(рис. 2.39). Рассматривая механизм обратной транс-
крипции. необходимо отметить наличие пяти струк-
турных элементов у вирусной РНК: 1) прямые по-
вторы на 5'- и З'-концах РНК (R); 2) последователь-
ность из 80 120 нуклеотидов, соседствующая с 5'-
концевым повтором (U5); 3) последовательность из
170 1200 нуклеотидов, соседствующая с З'-конце-
вым повтором (U3); 4) последовательность из 15-20
нуклеотидов (Р), в пределах которой клеточная
тРНК спаривается с ретровирусной РНК, что созда-
ет праймер для синтеза первой цепи ДНК; 5) сег-
мент Ри, находящийся непосредственно перед по-
втором U3 и являющийся сайтом для праймирова-
ния второй цепи ДНК; такой сегмент одинаков
у РНК всех ретровирусов определенного типа (т.е.
его последовательность практически идентична у
всех вирусов птиц и отличается от подобной после-
довательности у вирусов мышей).
Известны три продукта, образующиеся в резуль-
тате обратной транскрипции: форма А-линейный
РИС. 2.39.
РНК-геном ретровируса. Каждый вирион содержит две
идентичные копии РНК. Обычно в геноме ретровирусов
присутствуют три гена дад, ро! и env; ген pol кодирует
обратную транскриптазу. Имеются также 5'-кэп и З'-по-
лиадениловый хвост (см. разд. 3.8.а). Другие особен-
ности генома (последовательности R, U5 и т.д.) описа-
ны в тексте.
2. РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
95
LU RU,
3-LTR
5'- LTR
ипи
В
РИС. 2.40.
Двухцепочечная ДНК, образующаяся при обратной
транскрипции ретровирусной РНК.
дуплекс ДНК с последовательностью U3RU5 [длин-
ный концевой повтор LTR (от англ, long terminal
repeat)], имеющийся на обоих концах дуплекса; два
кольцевых дуплекса ДНК, производных формы А;
форма В с LTR-повторами на обоих концах и фор-
ма С только с одним LTR (рис. 2.40). Объяснить
образование структур А, В и С при обратной транс-
крипции вирусной ДНК весьма непросто. Процесс,
изображенный на рис. 2.41. начинается с наращива-
ния тРНК-праймера на матрицах U5 и R в направле-
нии 3' -» 5' (этап 1). Затем РНКаза Н, специфичная
к РНК в составе гибридного РНК- ДНК-дуплекса,
расщепляет сегмент РНК этого дуплекса (этап
2). Поскольку на З'-конце РНК имеется повтор R,
новосинтезированная короткая цепь ДНК «пере-
прыгивает» на этот конец молекулы мРНК и спари-
вается там с комплементарным ей участком (этап 3).
Далее происходит удлинение цепи ДНК с использо-
ванием в качестве матрицы остальной части мРНК
(этап 4). К моменту завершения синтеза первой цепи
ДНК большая часть вирусной ДНК разрушается
РНКазой Н. Затем в предполагаемом сайте связыва-
ния праймера (Ри) вблизи повтора U3 инициируется
синтез второй цепи ДНК с использованием новосин-
тезированной первой цепи в качестве матрицы (этап
5). Праймером для синтеза второй цепи может быть
РНК, однако как идет синтез второй цепи непре-
рывно или прерывисто-неизвестно. После реплика-
ции тРНК-связывающей последовательности на 5'-
конце первой цепи ДНК (этап 6) тРНК, по-видимо-
му, удаляется (этап 7). Затем новосинтезированная
вторая цепь ДНК спаривается с тРНК-связывающей
последовательностью первой цепи (этап 8). После
удлинения З'-концов каждой цепи завершается обра-
зование дуплекса ДНК (этап 9). Обратите внимание,
что на каждом конце ДНК-дуплекса имеется прямой
повтор последовательности U3RU5- LTR Кольце-
вые ДНК, представленные на рис. 2.40. по-видимо-
му, образуются либо путем лигирования концов
линейной ДНК (Б), либо путем гомологичной ре-
комбинации (разд. 2.4) между сегментами LTR (В).
Удивительно, что такая сложная последователь-
ность реакций протекает без явного участия фер-
ментов репликации клетки-хозяина (геликазы, прай-
96
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РНК
Геномная РНК
(1) Наращивание
тРНК с ДНК
образованием
ДНК-копии 5' -конца
геномной РНК
(2) РНКаза Н удаляет
г и бри дизовавш у юся
F
C
(3) Первый прыжок:
ДНК гибридизуется
с R-последовательностью
на другом конце мРНК
(41 Наращивание цепи ДНК
(5) Большая часть
гибридизовавшеися РНК
удаляется РНКазой Н
(6) Синтез З'-конца
второй цепи ДНК
(7) Удаление оставшейся части
РНК и тРНК
b
E
Г
I
I
I
I
1
I
i
i
i
(8> Второй прыжок
РИС. 2.41.
Схематическое изображение обрат
ной транскрипции ретровирусной
(9) Синтез обеих
цепей завершен
LTR LTR
РНК, при которой образуется линей-
ная двухцепочечная ДНК, ограничен-
ная LTR-последовательностями.
[J. Darnell, Н. Lodish, D. Baltimore
Molecular Cell Biology (New York:
Scientific American Books, 1986), p
1052.]
2. РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
97
Клеточная ДНК
РИС. 2.42.
Структура ретровирусной ДНК, интегрированной в кле-
точный геном: провирус.
мазы, ДНК-связываюшего белка, лигазы, топоизо-
меразы и т.д.).
Репликация двухцепочечной формы ретровирус-
ной ДНК не начинается до тех пор, пока она не
встроится в клеточную ДНК. Субстратом для тако-
го интеграционного события является продукт об-
ратной транскрипции-линейная дуплексная ДНК,
представленная на рис. 2.40, А. Механизм рекомби-
национного встраивания пока полностью не уста-
новлен. В результате интеграции образуется струк-
тура, представленная на рис. 2.42. При интеграции
на обоих концах интегрированной вирусной ДНК
утрачивается по нескольку нуклеотидов в пределах
LTR-последовательностей и происходит дупликация
3-10 нуклеотидов клеточной ДНК. После интегра-
ции ретровирусная ДНК реплицируется как часть
клеточной ДНК. РНК дочерних вирионов образует-
ся в результате транскрипции интегрированных ко-
пий вирусной ДНК. Инициация синтеза РНК проис-
ходит в крайних левых точках стыковки U3R, а тер-
минация-в крайних правых точках стыковки RU5
(рис. 2.42).
б. Некоторые ДНК-содержащие
вирусы используют для репликации
обратную транскрипцию
Геном вируса гепатита В человека представлен
кольцевой двухцепочечной ДНК с пробелами. Если
вирус находится внутри клетки, то пробелы запол-
няются вирионной ДНК-полимеразой. Такая почти
полноразмерная цепь ДНК играет роль матрицы, на
которой синтезируется РНК. Длина этой РНК равна
длине генома вируса, и она играет роль мРНК
в процессе экспрессии вирусных белков и роль мат-
рицы при обратной транскрипции с образованием
дочерней вирусной ДНК. Аналогичный механизм
реализуется и при репликации вируса мозаики цвет-
ной капусты и других вирусов растений.
2.3. РЕПАРАЦИЯ ДНК
ДНК-это единственная макромолекула клетки,
которая способна устранять (репарировать) повреж-
дения, возникающие в ее структуре Более того,
в ней закодирована информация о механизмах са-
мых разнообразных репарационных процессов.
Комплементарное спаривание лежит в основе не
только репликации ДНК, но и процесса восстанов-
ления исходной структуры ДНК при репарации
повреждений, затрагивающих остов молекулы, мо-
дификаций того или иного основания или ошибоч-
ного спаривания при рекомбинации (разд. 2.4). Од-
новременное повреждение обеих цепей в одном мес-
те и двухцепочечные разрывы часто оказываются
летальными для ДНК, поскольку такие дефекты
репарируются лишь в редких случаях.
Наиболее часто происходит разрыв гликозидных
связей между пурином и дезоксирибозой N (депури-
низация) при повышении температуры (рис. 2.43). За
сутки в клетке человека совершается от 5000 до
10000 актов депуринизации. Если не принимать
никаких мер, то это приведет к нарушению реплика-
ции и экспрессии генов. Кроме того, остатки цитози-
на и аденина могут подвергаться спонтанному деза-
минированию с образованием соответственно ос-
татков урацила и гипоксантина; частота таких собы-
тий составляет примерно 100 на геном в сутки. Если
подобные нарушения в ДНК не будут устранены до
следующего раунда репликации, то они могут по-
служить источником мутаций.
Многие изменения в структуре ДНК происходят
под действием химических веществ, присутствую-
щих в окружающей среде. К таким веществам отно-
сятся алкилирующие агенты (например, азотистые
соединения, алкилсульфонаты и нитрозомочевина),
которые модифицируют предпочтительно гуанино-
вые остатки; соединения, встраивающиеся между
соседними парами оснований и приводящие к появ-
лению вставок и делеций во время репликации;
бифункциональные агенты, способные образовы-
вать ковалентные сшивки между двумя цепями
ДНК и блокировать их расхождение при реплика-
ции. Не менее разрушительными могут быть и фи-
зические воздействия. Поглощение тиминовым или
цитозиновым основанием ультрафиолетового све-
та может приводить к образованию циклобутано-
вых димеров между соседними пиримидинами
(разд. 2.3. а); под действием ионизирующей радиа-
ции, например космических лучей, могут образовы-.
ваться высокореакционноспособные свободные ра-
дикалы, оказывающие на ДНК самые разнообраз-
ные воздействия; при облучении рентгеновскими
лучами в медицинских целях в ДНК могут возни-
кать одно- и двухцепочечные разрывы, а также
другие повреждения, характерные для воздействия
на ДНК свободных радикалов.
Как же ДНК противостоит таким разрушитель-
ным воздействиям? Благодаря какому механизму
восстанавливается нормальная структура нуклеоти-
дов и их последовательность прежде, чем эффект
воздействия закрепится и проявится в виде мутации?
7 243
98
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
Урацил
РИС. 2.43.
Наиболее часто встречающиеся повреждения ДНК. При
нагревании происходит депуринизация. В результате
спонтанного дезаминирования аденина и цитозина об-
разуются соответственно гипоксантин и урацил.
2. РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
99
Фермент SH
с
(О -Метилгуанозин-
алкилт рансфера за)
РИС. 2.44.
Дезалкилирование О6-метилгуаниновых остатков ката-
лизируется специфической ДНК-алкилтрансферазой.
Известны два основных типа репарационных про-
цессов: 1)Гнепосредственное исправление модифика-
ций или неправильных спариваний, не требующее
репликации для восстановления исходной структу-
ры; 2) удаление нуклеотидов, окружающих ошибоч-
но спаренные или измененные пары оснований, и ре-
синтез этого участка путем репликации.
а. Репарация путем прямого
восстановления исходной структуры
Под действием алкилирующих агентов, напри-
мер М-метил-М-нитрозомочевины или N\N-диме-
тилнитрозогуанидина, в ДНК образуются Об-ме-
тил- или Об-алкилзамещенные гуаниновые остатки.
Такие модифицированные остатки гуанина могут
деалкилироваться при участии ферментов, присутст-
вующих в клетках бактерий и млекопитающих. Об-
метилгуанин-ДНК-алкилтрансфераза катализирует
перенос алкильных групп на сульфгидрильные груп-
пы цистеиновых остатков фермента, при этом ак-
цепторный белок инактивируется (рис. 2.44). Содер-
жание алкилтрансферазы в клетках Е. coli увеличива-
ется в присутствии Об-алкилгуанина, но в клетках
млекопитающих аналогичной индуцибельности не
наблюдается.
При облучении ДНК ультрафиолетовым светом
в ней образуются циклобутановые димеры между
соседними пиримидиновыми основаниями (рис.
2.45). Такие соединения блокируют репликацию
ДНК, и для сохранения жизнеспособности клетки их
необходимо удалить. Один из способов удаления
пиримидиновых димеров состоит в ферментатив-
ном превращении их в мономеры при освещении
раствора видимым светом в диапазоне длин волн
300 600 нм (рис. 2.46). Такие фотореактивирующие
ферменты (фотолиазы) имеются у бактерий и низ-
ших эукариотических организмов, но в клетках мле-
копитающих они не обнаружены. Фермент образует
стабильный комплекс с пиримидиновым димером и,
используя энергию поглощенного им света, разру-
шает димер без разрыва цепей ДНК.
РИС. 2.45.
Образование циклобутановых димеров между соседни-
ми тиминовыми остатками, находящимися в одной цепи
ДНК.
7*
100
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
УФ
ССАГааСТ Ай
GCTATTGATC
С G АЛ * А СТ A G
GCT А GA Т С
Фотореактивирующий
фермент
видимый свет
РИС. 2.46.
Образование тиминовых димвров под дей-
ствием УФ-света и их разрушение на свету
при помощи фотореактивирующего фер-
мента.
б. Репарация путем замены
модифицированных остатков
Замена модифицированного нуклеотида обычно
происходит в четыре этапа. Во-первых, фермент
распознает этот нуклеотид и надрезает полинукле-
отидную цепь вблизи него либо разрывает глико-
зидную связь между модифицированным основани-
Образование
повреждения
Надрез
поврежденного
участка
Выщепление
поврежденного
участка
ДНК-полимераза I
заполняет пробел
ДНК-лигаза
сшивает разрыв
РИС. 2.47.
ем и дезоксирибозой. Во-вторых, экзонуклеаза уда-
ляет модифицированный нуклеотид и/или соседние
нуклеотиды, оставляя небольшую брешь. В-третьих,
удаленный участок синтезируется заново с З'-ОН-
конца с использованием в качестве матрицы проти-
воположной цепи. В-четвертых, концы разрыва, об-
разовавшиеся в результате репарации, соединяются
с восстановлением ковалентной целостности репа-
рированной цепи (рис. 2.47).
Сайты, в которых произошла депуринизация или
депиримидинизация, выщепляются ферментами, на-
зываемыми АР(апуриновые и апиримидиновые)-эн-
донуклразами (рис. 2.48, А). В клетках про- и эукари-
от имеется много разнообразных АР-эндонуклеаз
часто по нескольку разных типов. Некоторые АР-
эндонуклеазы надрезают цепь с З'-стороны АР-сай-
та, а другие расщепляют диэфирную связь с З'-сто-
роны; в любом случае образуются З'-гидроксильный
и 5'-фосфорильный концы. Разрыв фосфодиэфирной
связи по одну или другую сторону от места наруше-
ния (а иногда по обе стороны) позволяет экзонук-
леазе удалить прилегающие остатки по обе стороны
сайта расщепления и затем ресинтезировать удален-
ную последовательность.
В репарации N-алкилированных пуринов и дру-
гих модифицированных оснований ключевую роль
играют специфические N-гликозилазы ферменты,
расщепляющие гликозидную связь между модифи-
цированными основаниями и дезоксирибозой (рис.
2.48,5). N-гликозилазы используются и при коррек-
ции нарушений, состоящих в спонтанном дезамини-
ровании цитозина или аденина и превращении их
соответственно в урацил или гипоксантин. Фермен-
ты урацил-К-гликозилаза и гипоксантин-К-глико-
зилаза выщепляют из ДНК соответственно урацил
и гипоксантин, оставляя пробелы в месте выгцепле-
ния. И вновь с помощью механизма выщепления-
ресинтеза восстанавливается исходная последова-
тельность поврежденной цепи.
Урацил-К-гликозилаза играет очень важную ан-
тимутагенную роль и при исправлении ошибок,
происходящих при использовании во время репли-
кации dUTP вместо dTTP. Поскольку спаривание
dUMP с матрицей происходит почти так же хоро-
шо, как и dTMP, Pol III (или Pol I) его не распознает,
и если dUMP не подвергается специфическому вы-
Репарация поврежденной ДНК путем замены модифи-
цированных нуклеотидных остатков.
щеплению, то при последующем раунде репликации
в новую цепь может включиться dGMP. Таким
2. РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
101
I
О
I
О- Р—О
РИС. 2.48.
А. АР-эндонуклеазы узнают сайты, где произо-
шла апуринизация или апиримидинизация, и гид-
ролизуют фосфодизфирную связь либо с 3'-,
либо с 5'-стороны от этого сайта. Б. N-глико-
зилазы осуществляют репарацию, гидролизуя
гликозидную связь между модифицированным
основанием и дезоксирибозой.
Специфические
АР-Д НК-эндо-
нуклеазы
узнают
измененные
участки
О
образом, N-гликозилаза защищает клетки от воз-
можных мутагенных последствий включения в цепь
ДНК JUMP.
Репарация тиминовых димеров может происхо-
дить и в темноте одним из следующих двух спосо-
бов. В клетках Е. coli синтезируются три полипепти-
да, кодируемые генами uvr A, uvrB и uvrC, которые
образуют ферментный комплекс uvrА /?С-эндонукле-
азу. Этот фермент разрезает цепь ДНК, содержа-
щую пиримидиновый димер, на расстоянии восьми
фосфодиэфирных связей с 5'-стороны и четырех или
пяти связей с З'-стороны пиримидинового димера
(рис. 2.49). Удаление поврежденного участка, по-ви-
димому, катализируется геликазой, кодируемой еще
одним геном, uvrD. В результате удаляется тимино-
вый димер и еще примерно 12 окружающих его
нуклеотидов. Образовавшийся пробел заполняется
с помощью Poll, а ДНК-лигаза завершает репара-
цию, соединяя два соседних основания цепи. Неко-
торые организмы используют для репарации по-
вреждений, возникающих при образовании пирими-
диновых димеров, другой механизм. Репарация осу-
ществляется при участии пиримидиновый димер-N-
гликозилазы, которая создает апиримидиновый
сайт. Гликозидная связь между одним из тиминов
и дезоксирибозой разрезается так, что тиминовый
РИС. 2.49.
Первый способ ферментативной репарации
циклобутановых тиминовых димеров. Фер-
ментный комплекс uvrАВС Е.соН иниции-
рует репарацию, гидролизуя цепь на рас-
стоянии восьми фосфодиэфирных связей
от димера с 5'-стороны и четырех-пяти
связей с З'-стороны.
102
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
димер остается на 5'-конце разорванной цепи, а 3'-
ОН-группа-на дезоксирибозе (рис. 2.50). Образо-
вавшийся З'-АР-конец отщепляется с помощью 3'-
5'-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы, а
затем путем ник-трансляции и лигирования удаляет-
ся нуклеотид вместе с прилежащим тиминовым
димером, заполняется образовавшийся пробел и
сшиваются концы цепи.
в. Значение репарации ДНК
У клеток в процессе эволюции выработался
сложный механизм устранения повреждений, возни-
кающих в ДНК под действием самых разнообраз-
ных химических и физических факторов, а также
вследствие ошибок при репликации или рекомбина-
ции. И это вполне понятно: большая часть повреж-
дений блокирует передачу генетической информа-
ции последующему поколению, а остальные, если их
не устранить, сохранятся в геномах потомков и при-
ведут к драматическим изменениям в молекулах
белков, а том числе и ферментов, необходимых для
поддержания жизнедеятельности клетки. При по-
вреждении определенных звеньев системы репара-
ции клетки становятся особенно уязвимыми для
некоторых химических и физических агентов. На-
пример, клетки Е. coli, у которых нарушена система
внесения разрывов в ДНК при выщеплении тимино-
вых димеров, очень чувствительны к УФ-свету.
Клетки, неспособные осуществить ту или иную N-
гликозилазную реакцию, гораздо больше, чем нор-
мальные, подвержены мутагенному или летальному
эффекту алкилирующих агентов или ионизирующей
радиации. У клеток Е. coli, дефектных по Pol I, суще-
ственно снижена выживаемость при облучении низ-
кими дозами УФ-света.
У представителя низших эукариот Saccharomyces
cerevisiae имеется по крайней мере пять генов, коди-
рующих белки, которые участвуют во внесении
разрывов в УФ-облученную ДНК. Нарушение толь-
ко в одном из этих пяти RA D-генов приводит
к тому, что клетки утрачивают способность к внесе-
нию разрывов в ДНК и, следовательно, к удалению
пиримидиновых димеров. У дрожжей существуют
также мутанты с нарушенной способностью к удале-
нию сшивок между цепями, хотя элиминация УФ-
индуцированных повреждений проходит нормаль-
но. Это предполагает, что у дрожжей, как и у чело-
века, для удаления поперечных сшивок, а возможно,
и для исправления множества других химических
модификаций в ДНК существуют специфические,
весьма сложные механизмы репарации.
Люди, страдающие пигментной ксеродермой,
очень чувствительны к ультрафиолетовому свету,
и у них развиваются разные формы рака кожи даже
р',Р
3-
N’ N' N'A A N' N' N'
N N N TaT N N N
| ДНК-гликозилаза,
X специфичная к пири-
’ мидиновым димерам
р ,р ,Р ,Р ,р zp'l p'l рТр
N' N' N'A A N' N' N'
N N N ТАТ N N N
З'-Апиримидин-
эндонуклеаза
N' N' N' А
Р
Р
,Р
,Р
Р
A N' N' N'
т
N N N ТА1 HCNNN
НО- ,
Р
,Р
Р'
Р
J З'-Экзонуклеаза
N' N' N' A A N' N' N’
N
N N N Т аТ
НО^Р
Заполнение бреши
с помощью Pol I,
ник-трансляция
с удалением димера,
лигирование ДНК
р ,р ,р ,р ,р ,р ,р ,р zp
N' N' N' A A N' N' N'
NNNTTNNN
/Р |гР |,Р |,Р |,Р |/Р [,Р
РИС. 2.50.
Второй способ ферментативной репарации циклобута-
новых тиминовых димеров. N-гликозилаза, специфич-
ная к пиримидиновым димерам, инициирует репара-
цию, разрывая гликозидную связь между одним из
тиминовых остатков, входящих в состав димера, и де-
зоксирибозой. Некоторые гликозилазы катализируют
и последующее эндонуклеазное расщепление.
2. РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
103
при очень слабом воздействии солнечного света.
Клетки таких людей несут мутацию, сходную с
/MD-мутацией дрожжей и проявляющуюся в том.
что у них нарушена способность к выщеплению
пиримидиновых димеров из УФ-облученной ДНК.
Заболевание может быть обусловлено мутацией в
одном из по крайней мере девяти генов, что говорит
о достаточно сложном механизме репарации ДНК,
содержащей тиминовые димеры, у человека. Как
правило, заболевание бывает связано с неспособ-
ностью к выщеплению тиминовых димеров. Если
к облученным клеткам в культуре добавить фер-
мент, обладающий тиминдимергликозилазной и
АР-эндонуклеазной активностями, то УФ-повреж-
дения могут быть устранены.
2.4. РЕКОМБИНАЦИЯ ДНК
Генетическая рекомбинация включает несколько
связанных между собой процессов, в результате
которых в клетках или организмах, где они проис-
ходят, создаются новые комбинации элементов-
носителей генетической информации. Рекомбинация
между близко расположенными гомологичными
хромосомами приводит к интенсивной перетасовке
отцовских и материнских генов в ходе мейоза и тем
самым создает предпосылки для эволюционной
проверки новых комбинаций этих генов в потомст-
ве. Как правило, рекомбинационные события, про-
исходящие в соматических клетках либо во время
репликации ДНК, либо после нее и проявляющиеся
в виде обмена сестринских хроматид (рис. 2.51), не
приводят к изменению генотипа или фенотипа клет-
ки. Однако нередко они порождают различные ге-
номные перестройки. Это, например, утрата, при-
обретение или амплификация генетических элемен-
тов и установление новых взаимосвязей между уже
имеющимися, но по-новому расположенными эле-
ментами.
Если использовать молекулярные термины, то
можно сказать, что генетическая рекомбинация со-
стоит в образовании ковалентных связей между
нуклеотидными последовательностями из разных
областей одной и той же или разных молекул ДНК.
А
РИС. 2.51.
Обмен сестринских хроматид. Если использовать спе-
циальную методику, то можно увидеть, как в метафаз-
ных хромосомах происходит обмен между двумя про-
дуктами дупликации хромосом (сестринскими хрома-
тидами). Методика вкратце состоит в следующем: клет-
ки проходят одно деление в присутствии бромдезокси-
уридина, а второе- в его отсутствие. Краситель Hoechst
33258 в комплексе с ДНК, содержащей бромдезокси-
уридин, флуоресцирует значительно слабее, чем в
комплексе с обычной тиминсодержащей ДНК. Поэтому
сестринские хроматиды, образовавшиеся во втором
клеточном цикле, имеют более интенсивную окраску.
Обмен сестринских хроматид выявляется по неравно-
мерности интенсивности флуоресценции А. Хромосо-
мы из нормальных периферических лимфоцитов че-
ловека. Б. Хромосомы из периферических лимфоцитов
больных с синдромом Блума. [S.A. Latt, R. Schreck,
Amer. J. Hum. Genet., 32 (1980), p. 294.] Микрофо-
тографии любезно предоставлены S.A. Latt.
104
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
Все клетки и многие вирусы содержат информацию
о синтезе ферментов, предназначенных не только
для репарации повреждений в собственной ДНК, но
и ферментов, осуществляющих рекомбинацию. На
самом деле некоторые ферменты, участвующие в
репликации и репарации ДНК, играют ключевую
роль и при рекомбинации. В этом разделе мы
рассмотрим механизмы некоторых рекомбинацион-
ных процессов и ферменты, которые их катализи-
руют. Особое внимание будет обращено на реком-
бинацию у бактерий и фагов, поскольку у них эти
процессы довольно хорошо изучены. Несмотря на
то что генетические и морфологические аспекты
рекомбинации в эукариотических клетках известны,
на молекулярном уровне здесь многое остается
неясным.
а. Типы рекомбинации
Существуют три типа рекомбинации: общая, или
гомологичная, сайт-специфическая и случайная, или
негомологичная.
Общая рекомбинация. Общая рекомбинация про-
исходит, как правило, между протяженными участ-
ками идентичных или гомологичных нуклеотидных
последовательностей. Ее часто называют гомоло-
гичной рекомбинацией или кроссинговером. При об-
щей рекомбинации происходит разрыв двух гомоло-
гичных участков ДНК, и каждый из концов одного
сегмента соединяется с соответствующими концами
другого таким образом, что обе образующиеся мо-
лекулы содержат разные фрагменты обеих участ-
вующих в рекомбинации ДНК (рис. 2.52). На самом
деле сайты, по которым происходят разрыв и вос-
соединение каждой из двух цепей, очень часто не
совпадают.
Обычно общая рекомбинация происходит между
гомологичными и аллельными участками разных
молекул ДНК, но она может произойти и между
гомологичными, но неаллельными областями ре-
комбинирующих молекул. В этом случае один из
продуктов рекомбинации утрачивает часть ДНК,
Гомологичная рекомбинация, или кроссинговер.
РИС. 2.53.
Неравный кроссинговер.
а другой приобретает «лишний» сегмент. Такой
процесс получил название неравного кроссинговер^
(рис. 2.53). Иногда рекомбинация происходит меж-
ду неаллельными участками одной и той же хромо-
сомы (например, между повторяющимися последо-
вательностями ДНК) с соответствующей потека,
области, лежащей между сайтами рекомбинации
(рис. 2.54). В отличие от уже рассмотренных случаев
некоторые рекомбинационные события нереципрок-
ны; как следствие, один из образовавшихся продук-
тов идентичен одной из исходных молекул, а другой
отличается от обоих партнеров (рис. 2.55). Такой
процесс часто называется генной конверсией.
Сайт-специфическая рекомбинация. Рекомбина-
ция называется сайт-специфической, если сайты раз-
рыва и воссоединения в двух рекомбинирующих
молекулах или двух фрагментах одной и той же
молекулы ДНК находятся в пределах довольно
коротких специфических гомологичных нуклеотид-
ных последовательностей-как правило, не более 25
нуклеотидов. Такие короткие последовательности
может иметь только один из партнеров (рис. 2.56)
или оба (рис. 2.57). В качестве примера первого
варианта можно привести транспозиции некоторых
мобильных элементов у эу- и прокариот (раэ^. 10.2
и 10.3), а второго-процесс интеграции-выщепления
ДНК фага к из хромосомы E.coli (разд. 2.4. г).
С помощью сайт-специфической рекомбинации про-
исходят запрограммированные перестройки хромо-
сомной ДНК при смене типов спаривания у дрож-
жей; она ответственна также за разнообразие анти-
тел (разд. 10.6). По-видимому, общая рекомбинация
между любыми парами гомологичных последова-
тельностей осуществляется с помощью одного и то-
го же комплекса ферментов; с другой стороны, для
каждого случая сайт-специфической рекомбинации
необходим свой набор ферментов.
2. РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
105
РИС. 2.54.
Внутримолекулярная рекомбинация.
Негомологичная рекомбинация. Рекомбинация
между негомологичными нуклеотидными последо-
вательностями происходит в клетках прокариот и
дрожжей достат очно редко, а в клетках млекопи-
тающих весьма часто. К негомологичной рекомби-
нации можно отнести процесс случайного встраива-
ния вирусной или плазмидной ДНК в ДНК клеток
животных, в результате чего в реплицирующихся
геномах паповавирусов появляется множество деле-
ний и дупликаций. Концы разорванной ДНК могут
соединиться, даже если они негомологичны. В неко-
торых случаях рекомбинация происходит между
последовательностями, содержащими несколько го-
мологичных пар оснований, или между короткими
Нереципрокная рекомбинация, или генная конверсия
Сайт-специфическая рекомбинация, при которой спе-
цифический сайт имеется только в одном участвующем
в рекомбинации фрагменте ДНК. Специфическими сай-
тами рекомбинации являются концы участка Т, а сам
участок может рекомбинировать со случайными после-
довательностями ДНК расположенными например,
между участками В и С [вверху) или в пределах участка
D (внизу).
частично гомологичными участками. Но, как прави-
ло, рекомбинирующие сегменты не имеют гомоло-
гичных последовательностей.
б. Общая рекомбинация между
гомологичными молекулами ДНК
Общая рекомбинация при согласованном внесении
разрывов и воссоединении цепей двух спиралей ДНК
с образованием протяженных гетеродуплексных об-
ластей. Чтобы могла произойти рекомбинация
между двойными спиралями, представленная на
рис. 2.52, каждая из четырех цепей должна быть
разорвана и затем соединена с новым партнером.
Этапы этого процесса показаны на рис. 2.58. Соот-
ветствующие цепи обоих линейных гомологичных
дуплексов ДНК надрезаются и свободные концы
одной спирали спариваются с комплементарными
участками другой (а-г). Перекрест стабилизируется
сшиванием концов донорных цепей со свободными
концами реципиентных спиралей (<Э). Точка пере-
креста обменивающихся цепей перемещается вдоль
106
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 2.57.
Сайт-специфическая рекомбинация, при которой спе-
цифические последовательности имеются в обеих
участвующих в рекомбинации ДНК. На рисунке пред-
ставлена интеграция ДНК фага А с хромосомной ДНК
Е. соН. [В. Alberts et al.. Molecular Biology of the Cell (New
York: Garland, 1983), p. 248.]
Геном бактериофага X
(кольцевая
двухцепочечная ДНК)
последовательности,
по которым
происходит встраивание
----Хромосомная ДНК
Белковый комплекс
катализирует согласованное
образование
двухцепочечного разрыва и
воссоединение дуплексов
спиралей- процесс, называемый миграцией ветви (е).
При этом происходит одновременное расхождение
цепей исходных спиралей и их реассоциация с новы-
ми партнерами с образованием дочерних дуплексов.
Структуры д и е, а также ж называются структура-
ми Холлидея по имени исследователя, впервые их
предложившего.
Структуры Холлидея могут переходить в реком-
бинантные двойные спирали путем внесения разры-
ва и воссоединения цепей двумя альтернативными
способами. Один способ состоит в разрезании и вос-
соединении перекрещивающихся цепей. Два реци-
прокных продукта л и м могут образоваться, если
разрыв и последующее воссоединение цепей прои-
зойдут в точке перекреста в структурах е и д или
по линии пересечения четырех цепей в изомерной
структуре Холлидея и. Размер обменивающихся
фрагментов зависит от расстояния, на которое про-
изошла миграция ветви до акта рекомбинации. Аль-
тернативные продукты н и о образуются в том
случае, если структура Холлидея з переходит в ре-
зультате разрыва в к.
В основе рекомбинации данного типа лежит
гомологичное спаривание цепей, принадлежащих
двум разным спиралям ДНК, поэтому скорее всего
она произойдет в том месте, где такое спаривание
возможно a priori и где гомологичность последова-
тельностей достаточно велика, чтобы могла прои-
зойти миграция ветви в рамках структуры со скрес-
тившимися цепями. Отсюда можно понять, почему
общая, или гомологичная, рекомбинация происхо-
дит также между двумя повторами в пределах од-
ной молекулы ДНК или между аллельными и неал-
лельными элементами одной и той же последова-
тельности в двух разных хромосомах (рис. 2.53 и 2.54).
В ходе миграции ветви при спаривании цепей,
2. РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
107
РИС. 2.58.
Этапы процесса рекомбинации между гомологичными
дуплексными ДНК (объяснения см. в тексте).
принадлежащих разным спиралям, образуются гете-
родуплексы. В таких гетеродуплексах в пределах
сегмента между сайтом начала образования струк-
туры Холлидея и сайтом кроссинговера может со-
держаться по одному или более ошибочно спарен-
ных оснований (рис. 2.58). Они удаляются так же,
как любые модифицированные основания при репа-
рации ДНК (разд. 2.3. б). Однако, поскольку удале-
но может быть любое из ошибочно спаренных
оснований, в обеих рекомбинантных спиралях в дан-
ном сайте могут оказаться одинаковые пары осно-
ваний, т. е. рекомбинация для этого сайта окажется
нереципрокной (рис. 2.59). Таким образом, каждая
из рекомбинантных спиралей может быть похожа на
любой из начальных дуплексов в тех позициях, где
исходно они различались.
Общая рекомбинация с образованием двухцепочеч-
ного разрыва. Альтернативный механизм общей ре-
комбинации включает образование двухцепочечно-
го разрыва в одном из дуплексов-партнеров (рис.
2.60). Далее с помощью экзонуклеаз в месте разрыва
образуется брешь. При спаривании З'-одноцепочеч-
108
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 2.59.
Продукты, образующиеся при неправильном спарива-
нии в процессе гомологичной рекомбинации при репа-
рации гетеродуплексов.
Гетеродуплексы, образующиеся
из структур Холлидея
Исправление ошибок, происходящих при спаривании
кого конца бреши с комплементарной цепью ин-
тактной спирали в последней образуется петля.
Размер этой петли увеличивается по мере того, как
ДНК-полимераза наращивает З'-конец «вклинив-
шейся» цепи. В итоге другой одноцепочечный конец
бреши спаривается с комплементарной последова-
тельностью в перемещающейся петле. В результате
такого спаривания образуется система «праймер-
матрица», и ДНК-полимераза синтезирует недоста-
ющую цепь, заполняя брешь. Лигирование двух
растущих концов с исходными цепями приводит
к образованию двойной структуры Холлидея (т. е.
структуры, в которой две спирали объединены дву-
мя перекрестами, по одному на каждом конце бре-
ши). Миграция ветви в одном или обоих перекрес-
тах передвигает оба места сцепления в любом на-
правлении, при этом в участках, фланкирующих
брешь, могут возникать ошибки. Разделение таких
структур может идти двумя способами с перекрес-
том и без него (рис. 2.58), с образованием четырех
дуплексов (рис. 2.60).
Необходимо отметить некоторые особенности
этого механизма. Образование ошибочных пар (ге-
теродуплексов) в районах, фланкирующих брешь,
обусловливает получение как реципрокных, так и не-
реципрокных рекомбинаций между генетическими
маркерами. Если двухцепочечный разрыв происхо-
дит вблизи (или в пределах) участка, где между
спиралями имеются различия (замены оснований,
делении, вставки, инверсии и т.п.), то рекомбинан-
ты унаследуют нуклеотидную последовательность
партнера, у которого разрыва не происходило. Этот
механизм объясняет многие случаи генной конвер-
сии, особенно те, в которых протяженная последо-
вательность одного дуплекса замещается соответст-
вующей, но отличающейся последовательностью
другого дуплекса.
Нереципрокная общая рекомбинация использу-
ется и при репарации некоторых повреждений ДНК.
Например, если тиминовые димеры не были удале-
ны из УФ-облученной ДНК до того, как к ним
подошла репликативная вилка, то синтез компле-
ментарной цепи в этом участке не может быть
завершен (рис. 2.61). Поскольку тиминовые димеры,
находящиеся напротив бреши, не могут быть вы-
щеплены, остается один путь для спасения хрома-
тиды-использовать генетическую информацию го-
мологичной сестринской хроматиды и заполнить
брешь. Для этого применяется такой же механизм,
как для репарации брешей (рис. 2.60).
в. Ферменты,
участвующие в общей рекомбинации
В общей рекомбинации участвуют два специфи-
ческих фермента и еще несколько ферментов ката-
лизирующих также процессы репликации и репара-
ции ДНК. Энзимология общей рекомбинации изуче-
на только для некоторых прокариотических орга-
низмов, в частности E.coli и ее фагов. Один из
специфических ферментов, необходимых для успеш-
ной гомологичной рекомбинации, называется гесА-
белком. Он катализирует обмен одиночными цепя-
ми, используя энергию гидролиза АТР до ADP
и неорганического фосфата (рис. 2.62). RecA-зави-
симое внедрение одноцепочечных ДНК в дуплекс-
первый этап рекомбинационного процесса в рамках
обеих схем Холлидея (рис. 2.58) и механизма с обра-
2. РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
109
к-----------------------------------------------*6
Двухцепочечный разрыв
к----------------------8i-----------------------
Экзонуклеазное расщепление
0 <‘------------*8
X
Образование петли
(____л о ( -
| Увеличение размера петли
▼ С ПОМОЩЬЮ Pol I
-=8
I Образование конечных
V продуктов
1 —г-—=е
РИС. 2.60.
Общая рекомбинация с образованием двухцепо-
чечного разрыва.
зованием двухцепочечных разрывов (рис. 2.60). Вто-
рой фермент, состоящий из трех отдельных субъеди-
ниц (В, С и D) и поэтому называемый recBCD-нук-
леазой, обладает эндо- и экзонуклеазной, а также
геликазной активностями. Механизм его действия
до конца не установлен, однако известно, что
recBCD-нуклеаза индуцирует разрывы в дуплексной
ДНК и благодаря присущей ей геликазной активно-
сти вместе с гесА инициирует рекомбинационный
процесс. Идентифицирован также фермент, разреза-
ющий узлы в структурах Холлидея; при его участии
образуются липкие концы, соединяемые лигазой.
В общей рекомбинации участвуют также гелика-
зы и белки, связывающиеся с одноцепочечной ДНК
(SSB; от англ, single strand binding); оба они необхо-
димы для обеспечения процесса миграции ветви.
Как известно, перемещению цепей во время мигра-
ции ветви способствует Poll, а в воссоединении
110
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 2.61.
Нереципрокная гомологичная рекомбинация как один
из этапов репарации ДНК в месте образования пирими-
диновых димеров.
ОТХХХГРСХХ ГУ ХТХГПП
разорванных цепей участвует ДНК-лигаза. Для сня-
тия топологических ограничений при раскручивании
спирали и для распутывания перекрученных струк-
тур, по-видимому, нужны топоизомераза типа I и,
возможно, гираза.
г. Сайт-специфическая
рекомбинация
Сайт-специфическая рекомбинация происходит
между специфическими сегментами дуплексов ДНК,
не имеющими протяженных гомологичных участ-
ков. Характерным примером такой рекомбинации
служит интеграция кольцевой ДНК фага X с хромо-
сомой E.coli и ее обратное выщепление. Несмотря
на то что эти рекомбинационные события также
включают разрыв и воссоединение двух спиральных
сегментов ДНК, их механизм абсолютно отличен от
механизма общей рекомбинации. В этом случае
рекомбинация происходит в пределах специфиче-
ской нуклеотидной последовательности ДНК фага
X («//Р-сайт) и уникальной последовательности
ДНК E.coli («//В-сайт) (рис. 2.63). Нуклеотидные
последовательности attP- и «r/В-сайтов (рис. 2.64)
совершенно различны, хотя имеют общее ядро (О)
протяженностью в 15 нуклеотидных пар. AttP
(POP') простирается на 150 нуклеотидов влево (Р)
и на 75 нуклеотидов вправо (Р') от общего ядра,
a «пВ (ВОВ')-это сегмент длиной всего около 25
нуклеотидов, включая и ядро. Рекомбинационные
события, происходящие как при интеграции, так
и при исключении ДНК фага X из хромосомы Е. coli,
изображены на рис. 2.63 (фрагменты ДНК представ-
лены в виде линейных структур).
Поскольку нуклеотидные последовательности,
РИС. 2.62.
RecA-зависимая общая рекомбинация ДНК E.coli. Про-
цесс ускоряется присоединением белка, связывающего-
ся с одноцепочечной ДНК (SSB). [М. Сох, 1. R. Lehman,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 (1981), p. 3433.]
2. РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
111
attR
X
РИС 2 63 Встроенная ДНК фага X
Встраивание кольцевой ДНК фага X в хромосому Есо//.
Сайт а//В расположен между генами да! и Ыо ДНК
E.coli. Для встраивания необходимы белок, кодируемый
фаговым геном /л/, и бактериальный белок HF. Для
выщепления ДНК фага X необходимы эти два белка
и еще один фаговый белок, кодируемый геном xis.
фланкирующие а/rP- и «//В-сайты слева (attL) и
справа (attR), для этих сайтов различаются, меха-
низм рекомбинационного выщепления ДНК фага
X из ДНК Е. coli должен отличаться от механизма их
рекомбинационной интеграции (рис. 2.63). И дейст-
вительно, для рекомбинации между attL и а/zR при
исключении фаговой ДНК помимо белка Int необ-
ходимы фаговый белок xis и клеточный белок HF.
Процесс рекомбинационного выщепления, по-види-
мому, имеет некоторое сходство с процессом интег-
рации, но роль указанных трех белков, особенно
белка xis, все еще изучается.
2.5. РЕПЛИКАЦИЯ
Образование РНК-содержащих вирусов происхо-
дит путем репликации их РНК, тогда как все клеточ-
ные РНК образуются в результате транскрипции
ДНК (гл. 3). Здесь мы рассмотрим лишь процесс
репликации вирусной РНК как таковой, не касаясь
связи репликации с жизненным циклом соответству-
ющих вирусов.
За исключением ретровирусов (разд. 2.2), репли-
кация РНК в основном повторяет процесс реплика-
ции ДНК. Цепи РНК также удлиняются на один
нуклеотид за один акт в направлении 5' -» 3' путем
присоединения рибонуклеотидтрифосфата к З'-ОН-
концу растущей цепи. Как и при репликации ДНК,
порядок расположения нуклеотидов определяется
комплементарным копированием матрицы, в дан-
ном случае обязательно цепи РНК (рис. 2.65). Фер-
менты, осуществляющие этот процесс, называются
РНК-зависимыми репликазами.
РНК бактериальных вирусов R17 и MS2, а также
полиовирусов и вируса Синдбис, инфицирующих
животных, всегда обозначается знаком (+), по-
скольку последовательность их РНК-геномов иден-
Последовательности POP' и ВОВ'
[ССТТТТО---------\ г— ( Т Т А Т А С Т А А(
(CGAAAAAATATG Q-\ \/ /------(а Т Т (
(G С Т Т Т 7 0--11 . *-(Т Т А Т А С Т А А (
( C G A A A A A ATATG()— '--( А Т Т (
В'
РИС. 2.64.
Обычные нуклеотидные последовательности attP- и
анВ-сайтов, по которым происходит сайт-специфиче-
ская рекомбинация.
Последовательности РОВ' и ВОР'
В
112
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
Растущая цепь РНК
5'
О
Матричная цель РНК
3'
- О — Р = О
Аденин '////// У ;лциг>
н2с
НО
о
сн2
РИС. 2.65.
РНК-зависимый синтез РНК
О — Р
о
о
ОН ОН
О
“О-Р-О-Р-О-Р-О -СН
О_ О_
О_
Цитозин '////
ОН он
Присоединяемый
рибонуклеозидтрифосфат
0 = Р-0
СН?
I
О
О
Гуанин
О
О=Р-О‘
Направление
матричной
цепи 5 - 3'
сн2
СН,
Рост цепи в направлении
5'— 3’
НО О
о Сн,
5'
О О
О
тична последовательности мРНК. Таким образом,
геном инфицирующего вируса может служить в ка-
честве мРНК и содержит информацию о синтезе
некоторых, если не всех, вирусных белков. Специфи-
ческая репликаза, кодируемая геномом вируса и об-
разующаяся вскоре после инфекции, связывается
с одним или несколькими белками клетки-хозяина
и инициирует процесс копирования ( + )-цепи с ее
З'-конца с образованием полной ( —)-цепи, ассоции-
рованной с (+ )-цепью-матрицей (рис. 2.66, А). Затем
та же репликаза, возможно вместе с другими вирус-
ными белками, синтезирует множество копий ( + )-
цепи РНК, используя новосинтезированную (—)-
цепь в качестве матрицы. С единственной ( — ^мат-
ричной цепи РНК синтезируется одновременно не-
сколько новых ( + )-цепей (рис. 2.67). У многих виру-
сов копирование ( + )- или ( —)-цепей инициируется
путем спаривания рибонуклеозидтрифосфата с пер-
вым нуклеотидом на З'-конце матричной цепи.
( + )-Цепь РНК полиовируса реплицируется спо-
собом, аналогичным представленному на рис.
2.66, Л, но его геномная РНК имеет одну особен-
ность- к ее 5'-концу с помощью фосфодиэфирной
связи присоединен белок через тирозиновый оста-
ток. У ( —)-цепи, синтезируемой в первом раунде
репликации, этот белок отсутствует. Однако все
2. РЕПЛИКАЦИЯ, СОХРАНЕНИЕ И МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА
113
Репликация плюс-цепи РНК-геномов
Вирусная РНК
I Комплементарное копирование
плюс-пос ледовательности
РИС. 2.66.
Репликация плюс- (Л) и минус-
(6) цепей вирусной РНК по меха-
низму РНК-зависимого синтеза
РНК.
Репликативная
форма
Дочерние РНК
Репликация минус-цепи РНК-геномов
Вирусная РНК
Комплементарное копирование
минус- последовательности
Репликативная
форма
Дочерние РНК
( + )-цепи, образующиеся на (—)-цепи как на матри-
це, содержат 5'-концевой белок, даже когда их длина
еще очень мала. Это позволяет предположить, что
репликаза полиовирусов использует гидроксильную
группу тирозина в качестве праймера при инициа-
ции новых ( + )-цепей, в то время как (—)-цепи
фермент может инициировать de novo.
Геном некоторых вирусов (в том числе вируса
везикулярного стоматита) представлен одной цепью
РНК, нуклеотидная последовательность которой
комплементарна, а не идентична последовательно-
сти мРНК. Такие геномы обозначают знаком (—).
Существуют также вирусы (вирусы гриппа), геном
которых состоит из множественных (— )-цепей РНК,
при этом каждый такой сегмент соответствует одно-
му или двум вирусным генам. Если геном вируса
представлен одной или более (—)-цепями РНК, то
в самом вирионе содержится комплекс геномной
РНК со специфической репликазой. После проник-
новения в клетку комплекс активируется, и на ( — )-
цепях как на матрицах синтезируются (+ )-цепи
(рис. 2.66, Б). Новосинтезированные ( + )-цепи игра
ют роль мРНК для синтеза новых или дополнитель-
ных репликационных белков и роль матрицы при
синтезе дочерних ( —)-цепей. Новые ( —)-цепи син-
тезируются по механизму, представленному на рис.
S 243
114
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
Вирусная РНК
. Комплементарное копирование
I с помощью комплекса
* вирусная репликаза —
белок хозяина
Дочерние
РНК
РИС. 2.67.
Одновременный синтез нескольких плюс-цепей РНК на
единственной РНК-матрице.
2.67 для синтеза (+)-цепей вирусов.
Геном некоторых вирусов (в частности, реовиру-
сов) представлен двухцепочечной РНК, содержащей
и ( + )-, и ( —)-цепи. Репликация у таких вирусов
также инициируется ферментами, содержащимися
в самом вирионе. Эти ферменты копируют (—)-цепь
дуплекса РНК консервативным путем (т. е. исходная
двухцепочечная РНК сохраняется, а новые (+ )-цепи
отделяются). Белки-репликазы, транслируемые с
этих ( + )-цепей мРНК, синтезируют затем компле-
ментарные (—)-цепи, которые, объединяясь с ( + )-
цепями, образуют дочерние двухцепочечные РНК
вируса.
Имеющиеся данные о структуре и функции РНК-
репликаз весьма ограниченны. Наиболее детально
изучена РНК-репликаза, синтезируемая РНК-содержа-
щим колифагом QP. Она состоит из четырех идентич-
ных полипептидов, причем только один из них коди-
руется вирусным геномом. Этот полипептид не спо-
собен реплицировать ( + )-цепи вируса, он может ка-
тализировать только ограниченную реакцию присое-
динения рибонуклеотидов. Остальные три белка, вхо-
дящие в состав РНК-репликазы фага QP, являются
компонентами хозяйского аппарата синтеза белка, и
их точная функция в процессе репликации РНК неиз-
вестна. Инициация и репликация, осуществляемые
РНК-репликазой, кодируемой вирусами животных,
также зависит от активности белков, образуемых
клеткой-хозяином. Отличительная особенность РНК-
репликаз состоит в их необычной способности спе-
цифически узнавать нуклеотидные последователь-
ности на З'-конпах как ( + )-, так и ( —)-цепей, что
гарантирует инициацию синтеза новых цепей.
Глава 3
АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
И ЕГО ЛОГИКА
В основу концепции взаимосвязи генотипа и фе-
нотипа была положена теория «один ген один фер-
мент». Однако эта теория не учитывала молекуляр-
ную природу носителей генетической информации
и способ передачи этой информации от генов к бел-
кам. Не содержала она и никаких предположений
о механизме регуляции экспрессии генов. Прогресс
в этих областях наметился сразу после того, как
были установлены следующие ключевые положения:
1) показано, что гены это участки ДНК; 2) рас-
шифрована молекулярная структура ДНК; 3) уста-
новлено, что структура и функция белков опреде-
ляются их уникальной аминокислотной последова-
тельностью; 4) обнаружено, что передача информа-
ции от ДНК к белкам осуществляется с помощью
РНК; 5) разработаны относительно простые бакте-
риальные генетические системы, позволяющие свя-
зать мутационные изменения в генах со структурны-
ми изменениями в соответствующих белках; 6) раз-
работаны системы для изучения синтеза РНК и
сборки белков in vitro.
ДНК и информационно связанные с ней молеку-
лы РНК и белков можно представить как одномер-
ные структуры, состоящие из множества мономер-
ных единиц. В ДНК информация записана в виде
последовательно расположенных дезоксинуклеотид-
ных пар, образующих длинные цепи, а в РНК в
виде последовательности рибонуклеотидов. Уни-
кальность белков определяется линейной последова-
тельностью аминокислот в их полипептидной цепи.
Природу информационной связи между ДНК и бел-
ками удалось понять, проводя генетические и биохи-
мические исследования мутаций в данном гене и со-
поставляя их со специфическими изменениями в
аминокислотной последовательности соответствую-
щего белка. Благодаря этим исследованиям была
выявлена также коллинеарность последовательно-
стей нуклеотидов в ДНК и аминокислот в белках.
Наличие такой корреляции подразумевало сущест-
вование генетического кода, связывающего нуклео-
тидные и аминокислотные последовательности обо-
их полимеров. Но какова природа этого кода? И в
частности как последовательности ДНК, состоя-
щие всего из четырех нуклеотидов, могут детерми-
нировать белковые последовательности, состоящие
не менее чем из 20 аминокислот? Какие химические
процессы управляют трансляцией генетического ко-
да и как они регулируются при формировании
свойственных разным клеткам и организмам фено-
типов?
Сейчас природа генетического кода известна,
составлен словарь, переводящий нуклеотидную по-
следовательность в аминокислотную. Установлены
и основные особенности различных этапов экспрес-
сии генов и их регуляции, хотя многие молекуляр-
ные детали еще ждут своего разъяснения. В этой
главе мы рассмотрим, как устроен генетический
словарь, и опишем механизмы, используемые клет-
кой для экспрессии генетической информации. Ос-
новное внимание будет уделено прокариотам, но мы
вкратце остановимся на соответствующих процес-
сах и у эукариот. Последние данные об этих процес-
сах у эукариот приведены в гл. 8.
3.1. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ
ПРОЦЕССА ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
Экспрессия генов это процесс реализации ин-
формации, закодированной в структуре ДНК, на
уровне РНК и белков. Прежде чем переходить
к детальному описанию и анализу этих процессов,
мы вкратце рассмотрим суть экспрессии генов-ее
механизм и регуляцию.
а. Транскрипция ДНК в РНК
Экспрессия всех генов начинается с транскрип-
ции их нуклеотидной последовательности, т. е. пере-
вода ее на язык РНК. При этом определенный
участок одной из двух цепей ДНК используется как
матрица для синтеза РНК путем комплементарного
спаривания оснований. В результате транскрипции
генов, в которых закодирована структурная инфор-
мация о белках, образуются молекулы мРНК; дру-1
гие гены кодируют молекулы РНК, являющиеся
частью аппарата, необходимого для трансляции
мРНК с образованием белков. У прокариот, напри-
мер E.coli, ДНК транскрибируется с помощью од-
ного фермента- ДНК-завнсимой РНК-полимеразы,
который участвует в синтезе всех типов РНК. В от-
личие от прокариот эукариоты имеют три разные
ДНК-зависимые РНК-полимеразы, каждая из кото-
рых ответственна за транскрипцию генов, кодирую-
щих разные типы клеточных РНК (гл. 8). Несмотря
на то что механизмы синтеза РНК и матричного
копирования для всех РНК-полимераз идентичны,
8*
116
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
каждый фермент узнает в матрице ДНК свои харак-
терные особенности, определяющие сайты инициа-
ции, терминации и регуляции транскрипции.
б. Соответствие
между нуклеотидными триплетами
и аминокислотами
Генетический код устанавливает соответствие
между нуклеотидной последовательностью данной
мРНК и аминокислотной последовательностью син-
тезируемой на ней полипептидной цепи. Размер
единиц кодирования и сами эти единицы, однознач-
но задающие ту или иную аминокислоту (кодоны),
практически одинаковы у всех живых организмов.
Более того, основные принципы и механизмы пере-
вода генетических посланий также универсальны.
Генетический словарь содержит 64 кодона, каж-
дый из которых образован тремя последовательны-
ми нуклеотидами (триплетами). 61 из 64 кодонов
детерминируют 20 аминокислот, обнаруженных в
белках, один определяет начало большинства после-
довательностей, кодирующих белки, и три обозна-
чают окончания этих последовательностей.
Отличительной особенностью генетического ко-
да является то, что каждый кодон кодирует только
одну аминокислоту, т. е. код однозначен. Следова-
тельно, зная словарь и правила пользования им,
можно перевести нуклеотидную последовательность
мРНК в определенную аминокислотную последова-
тельность. Но генетический код является вырож-
денным. Это означает, что одной аминокислоте
могут соответствовать несколько кодонов. Вырож-
денность генетического кода приводит к тому, что
нельзя однозначно перевести аминокислотную по-
следовательность данного белка в нуклеотидную
последовательность соответствующей мРНК.
в. Расшифровка кода
с помощью тРНК
Аминокислоты не взаимодействуют с соответст-
вующими им кодонами непосредственно. Каждая
аминокислота вначале связывается с адаптером -
родственной тРНК, и образующаяся при этом ами-
ноацил-тРНК узнает «родственный» кодон путем
комплементарного спаривания оснований. Таким
образом, декодирование осуществляется с помощью
спаривания оснований триплетных кодонов мРНК
с триплетными антикодонами в аминоацил-тРНК.
Присоединение аминокислот через карбоксиль-
ные группы к родственным тРНК катализируют
ферменты, называемые аминоацил-тРНК- синтета-
зами. При связывании тРНК с аминокислотой кар-
боксильная группа последней активируется, и в ре-
зультате образование пептидных связей становится
энергетически выгодным. Энергия же, необходимая
для активации аминокислоты при присоединении ее
к тРНК, поступает от гидролиза АТР.
Присоединение аминокислот к родственным
тРНК осуществляется с помощью специфических
ферментов. Так, тирозил-тРНК-синтетаза присо-
единяет L-тирозин только к тем тРНК, которые мо-
гут спариться с тирозиновым кодоном. Аналогично
лейцил-тРН К-синтетаза катализирует присоедине-
ние лейцина к молекулам тРНК, которые узнают
кодоны лейцина. Таким образом, специфичность
декодирования обеспечивается двумя реакциями:
точным присоединением каждой аминокислоты к
родственной ей тРНК и комплементарным спарива-
нием антикодонов аминоацил-тРНК с соответству-
ющими им кодонами в мРНК.
г. Правильная инициация трансляции
Имеются три «рамки считывания», при которых
может осуществляться перевод последовательных
нуклеотидных триплетов мРНК в аминокислоты.
Правильная инициация трансляции чрезвычайно
важна для точной расшифровки генетического кода.
Выбор рамки считывания зависит от того, какое
сочетание из трех последовательных нуклеотидов
выбрано в качестве первого кодона. Ниже приведе-
ны три возможные рамки считывания для последо-
вательности GUACGUAAGUAAGUAUGGACGUA:
Рамка
считывания 1
Рамка
считывания 2
Рамка
считывания 3
GUA CGU AAG UAA GUA UGG ACG
..G UAC GUA AGU AAG UAU GGA CGU
_GU ACG UAA GUA AGU AUG GAC GUA
Обычно аминокислотной последовательности
кодируемой полипептидной цепи соответствует
только одна из рамок. Следовательно, должен суще-
ствовать какой-то способ инициации трансляции
с правильной рамкой считывания. У всех организ-
мов, изученных к настоящему времени,-бактерий,
вирусов и эукариот - правильная рамка считывания
определяется с помощью механизма, распознающе-
го специфический кодон, который детерминирует
концевую аминокислоту синтезируемого белка.
Почти всегда таким кодоном является триплет
AUG, отвечающий метионину. Поэтому образую-
щийся полипептид неизменно содержит на N-конце
метионин, но при последующем удалении амино-
концевой последовательности на N-конце конечного
белкового продукта оказывается аминокислота, на-
ходящаяся изначально внутри синтезированной по-
липептидной последовательности. В рассмотренном
выше примере кодон AUG, с которого может на-
чаться транскрипция, содержит рамка считывания 3.
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
117
д. Трансляция кодонов
и соединение аминокислот
Последовательное спаривание разных аминоа-
цил-тРНК с кодонами мРНК и рост полипептидной
цепи осуществляются с помощью целой серии вза-
имно согласованных реакций. Одним из главных
участников этого в высшей степени скоординирова-
нного процесса является рибосома - особый мульти-
ферментный комплекс, состоящий из нескольких
видов РНК и множества белков. Кроме того, целая
армия ферментов и различных факторов катализи-
рует мириады химических событий, необходимых
для успешного синтеза белка.
Рибосомы, несущие особую инициаторную ме-
ти онил-тРН К, находят инициаторный кодон в
мРНК, AUG, и связываются с ним. Затем с рибосо-
мой связывается аминоацил-тРНК, соответствую-
щая второму кодону, и при участии рибосомной
ферментативной активности остаток метионина со-
единяется со второй аминокислотой, все еще свя-
занной со «своей» тРНК. В результате образуется
дипептидил-тРНК. По мере продвижения рибосомы
по цепи мРНК и считывания каждого последующего
кодона полипептидная цепь удлиняется на одну
аминокислоту за один шаг. Элонгация прекращает-
ся в тот момент, когда рибосома достигает одного
из трех терминирующих кодонов. Завершенная по-
липептидная цепь тотчас же высвобождает послед-
нюю тРНК, и происходит разделение рибосомы
и мРНК.
е. Регуляция экспрессии генов
на разных этапах образования
РНК и белка
Клетки про- и эукариот обладают способностью
к дифференциальной регуляции экспрессии генов.
Так, при определенных условиях многие гены вооб-
ще не экспрессируются, а степень экспрессии других
различается на несколько порядков. Изменение ус-
ловий может привести к активации «молчавших»
ранее генов и репрессии активно работавших. По-
добная способность позволяет клеткам приспосо-
бить свои фенотипы к самым разнообразным усло-
виям окружающей среды и физиологическим воз-
действиям. Дифференцированная экспрессия одного
генома у многоклеточных организмов обусловлива-
ет развитие огромного множества типов клеток,
имеющих специфические функции, из одной или
нескольких зародышевых клеток.
Экспрессия генов, как правило, регулируется на
уровне образования РНК. Обычно регулируемым
этапом является инициация транскрипции, при этом
регуляция осуществляется либо с помощью репрес-
сорных белков, предотвращающих транскрипцию,
либо с помощью активаторных, необходимых для ее
начала. В первом случае транскрипция начинается
только после того, как инактивируется репрессор-
ный белок. Во втором ген транскрибируется лишь
тогда, когда белок-активатор находится в соответ-
ствующем функциональном состоянии. В регуляции
транскрипции генов участвуют не только репрессор-
ные и активаторные белки. В некоторых случаях
сами белки-продукты генной экспрессии-оказыва-
ются регуляторами транскрипции собственных ге-
нов. Эффективность транскрипции зависит также от
конформационного состояния ДНК или РНК. Кро-
ме того, регуляция синтеза РНК может осуществ-
ляться путем контроля скорости ее элонгации или
с помощью «стоп-сигнала» в транскрибируемой по-
следовательности, который может остановить тран-
скрипцию гена. Модификация и/или процессинг,
которые могут предшествовать образованию зре-
лой функциональной РНК, также регулируются.
Экспрессия генов может регулироваться и на
уровне трансляции мРНК с образованием белков.
И в этом случае специфическая регуляция, как пра-
вило, осуществляется на начальном этапе декодиро-
вания. Однако контроль может осуществляться и на
разных этапах сборки полипептидной цепи. Более
того, синтез тех белков, которые претерпевают
посттрансляционные модификации или транспорти-
руются к местам своего назначения внутри клетки,
может регулироваться на каждом из этих этапов.
Позднее, когда мы проанализируем эти процес-
сы подробнее, мы увидим, что механизмы регуля-
ции экспрессии генов весьма разнообразны, много-
численны и очень сложны. И хотя многим из них
присущи общие черты, тонкие механизмы регуляции
всегда уникальны для данного гена, определенного
физиологического состояния организма и условий
окружающей среды. Анализ регуляторных механиз-
мов бактериальных систем позволил выявить широ-
кий спектр способов регуляции и координации экс-
прессии генов. Однако исследование механизма кон-
троля экспрессии генов в клетках эукариот только
начинается, а процессы, ответственные за дифферен-
цировку многоклеточных организмов, пока остают-
ся невыясненными.
3.2. ТРАНСКРИПЦИЯ:
ПЕРЕДАЧА ИНФОРМАЦИИ
О НУКЛЕОТИДНОЙ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК
НА УРОВЕНЬ РНК
В этом и следующем разделах мы рассмотрим
некоторые аспекты переноса информации о нуклео-
тидной последовательности ДНК на уровень РНК-
процесса, ответственного за синтез всех типов кле-
11В
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
точных РНК как у про-, так и у эукариот. Подавля-
ющее число пионерских работ, в которых изучалась
транскрипция,- природа соответствующих реакций
и их субстраты, ферментативный аппарат, сигналь-
ные нуклеотидные последовательности, определяю-
щие, какие области ДНК должны транскрибиро-
ваться, некоторые способы процессинга, превраща-
ющего первичные транскрипты в зрелые молекулы
РНК,- было выполнено на прокариотических систе-
мах. Параллельное проведение генетических и био-
химических экспериментов позволило исследовать
ферменты, участвующие в транскрипции, и меха-
низм самого этого процесса. Предпринимаемые в то
же время усилия по изучению транскрипционного
и регуляторного аппаратов у эукариот были сильно
затруднены и гораздо менее успешны главным
образом из-за того, что компоненты их транскрип-
ционного аппарата- ДНК в форме хроматина и
РНК-полимеразы-были слабо охарактеризованы.
Кроме того, была неизвестна природа транскрип-
ционных единиц, а применение генетических подхо-
дов для их определения было невозможно.
Ситуация резко изменилась с появлением ме-
тодов молекулярного клонирования. Сейчас многие
гены, составляющие различные типы транскрипци-
онных единиц, выделены, секвенированы и да-
же соответствующим образом модифицированы с
целью исследования их функций. Более того, ис-
пользование некоторых современных подходов поз-
волило по-новому посмотреть на транскрипцион-
ный аппарат самых разных организмов-от дрож-
жей до человека. Имеются в виду методы введения
ДНК в культуры клеток млекопитающих (гл. 5)
и даже в клетки целого организма животных, приме-
няемые наряду с традиционными методами исследо-
вания очищенных транскрипционных систем in vitro.
Одновременно был достигнут прогресс в установле-
нии структуры хроматина и свойств эукариотиче-
ских РНК-полимераз. В этой главе мы лишь вкратце
рассмотрим системы транскрипции и соответствую-
щие сигналы у эукариот, в первую очередь останав-
ливаясь на их отличии от прокариотических систем.
Подробные данные о структуре генов, механизме
транскрипции и непосредственно связанных с ней
посттранскрипционных событиях, происходящих
при синтезе РНК у эукариот, приведены в гл. 8.
а. Синтез РНК на ДНК-матрице
Двухцепочечная молекула ДНК - это физиологи-
ческая матрица для синтеза всех клеточных РНК.
Даже если геном, как у некоторых вирусов, пред-
ставлен одноцепочечной ДНК, последняя перед
транскрипцией обязательно переходит в двухцепо-
чечную репликативную форму. Транскрибирована
может быть любая из двух цепей геномной ДНК,
однако матрицей при транскрипции отдельного гена
обычно служит только какая-то одна из них (рис.
3.1). Впрочем, в некоторых случаях (примером мо-
жет служить бактериофаг фХ174) все мРНК транск-
рибируются с одной и той же цепи. Очень редко
транскрипция идет на обеих цепях в одном и том же
месте, так что образующиеся цепи РНК оказывают-
ся комплементарны друг другу; возможно, подоб-
ный способ транскрипции имеет особое регулятор-
ное значение.
Нуклеотидными предшественниками для синтеза
РНК являются четыре рибонуклеозид-5'-трифосфа-
та: ATP, GTP, UTP и СТР (рис. 3.2). Многие РНК
содержат модифицированные нуклеотиды, но изме-
нения в основаниях и рибозных остатках происходят
после полимеризации, т. е. посттранскрипционно.
Тем не менее РНК-полимеразы могут использовать
рибонуклеозид-5'-трифосфаты, отличные от указан-
ных четырех, при условии, что модифицированные
основания обладают способностью к спариванию,
сравнимой с таковой для аденина, гуанина, цито-
зина и урацила.
РНК-полимеразы катализируют реакцию при-
соединения З'-ОН-группы нуклеотида, находящегося
на растущем конце цепи, к а-фосфату следующего
рибонуклеозид-5'-трифосфата (рис. 3.3). Многократ-
ное повторение этой реакции приводит к постепен-
ному удлинению цепи РНК. Образование каждой
новой фосфодиэфирной связи сопровождается вы-
свобождением неорганического пирофосфата; быст-
рый гидролиз пирофосфата до неорганического фос-
фата in vivo делает реакцию образования фосфо-
диэфирной связи энергетически выгодной.
Транскрипция аналогична репликации в том
смысле, что для ее осуществления также нужна
ДНК-матрица (рис. 3.3). Порядок присоединения
нуклеотидов определяется комплементарным спа-
риванием оснований. Чтобы могло происходить
комплементарное спаривание каждого следующего
нуклеозидтрифосфата с матричным транскрибиру-
емым основанием, спираль ДНК во время транс-
крипции должна раскручиваться с помощью ДШС-
полимеразы (рис. 3.4). Растущая цепь РНК остается
связанной с ферментом и спаренной своим расту-
щим концом с участком матричной цепи длиной
20-30 нуклеотидов; остальная часть образовавшей-
ся цепи не связана ни с ферментом, ни с ДНК. По
мере продолжения транскрипции временно разо-
шедшиеся цепи ДНК воссоединяются и восстанав-
ливается исходная дуплексная структура. Таким об-
разом, транскриппия-процесс консервативный, в
котором сохранаяется двойная спираль ДНК, а син-
тезированная цепь РНК отделяется. В противопо-
ложность этому репликация ДНК полуконсерватив-
на, поскольку обе цепи исходного дуплекса распре-
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
119
5' f ATG С A G G АТТАС G ТС AAGGGGCT A Q 3’ Смысловая цепь
3' ( ТА CG ТС С Т AATGCA GT TCCCCG АТ () 5' Несмысловая цепь,
или матрица
5(^GCAG^^£GUcg^^^)3- РНК
А
РНК колируются с любой
цепи дуплекса,
а иногда с обеих цепей
в одной области (А)
РИС. 3.1.
РНК-транскрипты и соответствующие матричные ДНК.
А. РНК-транскрипты комплементарны и антипарал-
лельны матричной цепи и имеют такую же нуклеотид-
ную последовательность (за исключением того, что
место Т занимает U), как и смысловая цепь. Б. Индиви-
дуальные мРНК обычно закодированы в одной из цепей
дуплексного генома, однако для разных мРНК матри-
цей могут служить разные цепи (как у бактериофага
Т4). Таким образом, транскрипция, которая всегда осу-
ществляется от 5'- к З'-концу, может идти в обоих
направлениях. Иногда все транскрипты образуются на
одной цепи генома (как у бактериофага фХ174). В. В тех
редких случаях, когда гены перекрываются, обе цепи
в одной и той же области могут служить матрицами для
молекул РНК, транскрибируемых в противоположных
направлениях.
РИС. 3.2.
Четыре наиболее распространенных рибонуклеозид-5'-
трифосфата: АТР, СТР, GTP и UTP. Рибозилтрифосфат-
ные остатки и соответствующие химические связи во
всех случаях идентичны.
120
ЧАСТЬ 1 МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
Матричная цепь ДНК
Растущая цепь РНК
5' I
О
I
-О-P =о
I
О Урацил
Направление
матричной
цепи 5'—-3'
ОН ОН
I_______________________________I
Присоединяемый
рибонуклеозидтрифосфат
РИС. 3.3
Рост цепи PH К осуществляется путем последовательно-
го присоединения рибонуклеотидных остатков в на-
правлении 5' -* 3'. Последовательность рибонуклеоти-
дов определяется комплементарным спариванием ос-
нований. Присоединение нуклеотида к цепи сопровож-
дается высвобождением одной молекулы пирофосфа-
та. Реакция катализируется РНК-полимеразами.
Рост цепи
в направлении 5'-*-3'
О
деляются по двум дочерним спиралям (рис. 2.2).
Другое существенное различие между репликацией
и транскрипцией ДНК состоит в том, что реплика-
ция не может начаться без затравки- праймера
(разд. 2.1), а инициация синтеза РНК с помощью
РНК-полимеразы происходит de novo, начинаясь
с рибонуклеозидтрифосфата, соответствующего пер-
вому нуклеотиду в цепи РНК.
Наращивание РНК идет в направлении от 5'-
к З'-концу вдоль матричной цепи, ориентированной
в направлении 3' -» 5', т. е. антипараллельно (рис.
3.3). Несмотря на процессивный характер элонгации
(фермент не отделяется от матрицы в течение всего
раунда транскрипции), ее скорость вдоль матрицы
не постоянна. В некоторых местах фермент делает
остановки; возможно, это происходит там, где в
одноцепочечной ДНК или в самой РНК образуются
5'
внутрицепочечные дуплексы, мешающие продвиже-
нию полимеразы. Такие паузы могут при опреде-
ленных обстоятельствах приводить к преждевремен-
ной терминации транскрипции. Как мы вскоре уви-
дим, сигналами для нормальной терминации л от-
деления синтезированной РНК и полимеразы от
матрицы являются особые структуры РНК-
шпильки.
Каков механизм однонаправленного движения
РНК-полимеразы вдоль матричной ДНК. остается
неясным. Не знаем мы пока и того, как расплетается
и заплетается вновь во время транскрипции дуплекс
ДНК и почему восстановление этого дуплекса более
выгодно, чем образование дуплекса ДНК-РНК.
Можно лишь отметить, что, поскольку РНК-поли-
мераза одна осуществляет все эти функции in vitro
даже в случае ковалентно замкнутых кольцевых
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
121
РИС. 3.4.
РНК-полимераза расплетает дуплекс ДНК в том месте,
где происходит транскрипция. В ходе транскрипции
фермент и локально расплетенный участок перемеща-
ются вдоль ДНК и происходит удлинение цепи РНК.
Исследования с применением препаратов, инги-
бирующих РНК-полимеразу, и с ферментами, субъ-
единицы которых были изменены в результате му-
тации, несколько прояснили роль кор-субъединиц.
P-Субъединица скорее всего участвует в связывании
рибонуклеозидтрифосфатов в реакциях инициации
и элонгации. Комплекс а- и Р'-субъединиц (а2Р')
участвует в неспецифическом прочном связывании
с ДНК и в специфическом взаимодействии холо-
фермента с промоторами-сайтами, детерминирую-
щими инициацию транскрипции (разд. 3.2.в). Наи-
более полно по сравнению со всеми другими субъ-
ТаблицаЗ.1. Субъединицы РНК-полимеразы
Е. coli
Субъединицы Число копий в холофер- менте Мол. масса, дальтоны Функция
Альфа (а) 2 36500 Неизвестна
Бета (Р) 1 150000 Связывание рибо-
Бета прим 1 155000 нуклеозидтрифос- фатов и полиме- ризация РНК Связывание ДНК
(Р') Сигма (с) 1 70-80000 Узнавание промото-
Омега (со) 1 11000 ра и инициация Неизвестна
матричных ДНК, все секреты, по-видимому, кроют-
ся в самом этом ферменте. Для сравнения вспом-
ним, что ДНК-полимеразы не способны к инициа-
ции синтеза новых цепей de novo и что в процессах
расплетания и восстановления дуплексов при репли-
кации двухцепочечной ДНК участвуют геликазы
и топоизомеразы.
б. ДНК-зависимые РНК-полимеразы
У прокариот синтез всех видов РНК-мРНК,
рРНК и тРНК, а также более специализрованных
РНК, участвующих в процессинге РНК (разд. 3.3. в),-
катализируется единственной ДНК-зависимой РНК-
полимеразой (РНК-праймеры для синтеза ДНК об-
разуются с помощью специальных РНК-полимераз,
называемых праймазами; разд. 2.1.д). Бактериаль-
ные РНК-полимеразы - это сложные белки, состоя-
щие из нескольких разных субъединиц. Наиболее
изученный фермент - холофермент РНК-полимераза
Е. coli- содержит пять разных полипептидных субъ-
единиц (табл. 3.1): две a-цепи, одну Р- и одну Р'-цепи,
с- и co-цепи (а2РР'стсо). Альтернативная, сосущест-
вующая с первой форма фермента, называемая
кором, лишена ст-субъединицы.
единицами холофермента изучена роль ст-субъеди-
ницы. Кор-фермент, лишенный ст-субъединицы, ка-
тализирует большинство реакций, необходимых для
транскрипции ДНК с образованием РНК, а именно
комплементарное копирование матричной цепи, об-
разование фосфодиэфирных связей и терминацию
цепи РНК. Однако он не может инициировать син-
тез РНК в нужном месте, поскольку не способен
узнавать промоторные сайты (разд. 3.2.в). Точное
связывание и инициация в промоторах происходят
только после добавления к кор-ферменту ст-субъ-
единицы и образования холофермента (рис. 3.5).
Такое поведение можно объяснить, например, тем,
что кор-фермент очень прочно, но неспецифично
связывается с ДНК, а поэтому редко оказывается
в том месте, где находится промотор. И напротив,
холофермент связывается с неспецифическими
участками ДНК непрочно и, последовательно свя-
зываясь с разными областями ДНК, находит про-
мотор и прочно связывается с ним. После образо-
вания нескольких первых фосфодиэфирных связей
(возможно, от 5 до 10) ст-субъединица отделяется от
инициирующего комплекса, и дальнейшая транск-
рипция осуществляется с помощью кор-фермента.
Транскрипция непрерывно продолжается до тех пор,
пока фермент не достигнет сайта терминации тран-
122
ЧАСТЬ 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
«Рабочий цикл» с-субъединицы. Кор-фермент связыва-
ется с с-субъединицей, образуя холофермент, который
прочно связывается с промотором. После запуска
транскрипции с-субъединица отделяется, а кор-фер-
мент катализирует элонгацию цепи.
скрипции. Итак, ст-субъединица обеспечивает эффек-
тивное связывание холофермента с промотором,
а при ее отсоединении полимераза переключается на
элонгапию. ст-Субъединица может снова стимулиро-
вать инициацию, специфически связавшись с другой
молекулой РНК-полимеразы.
Имеются данные о том, что способность РНК-
полимеразы узнавать промотор может изменяться
при связывании с разными о-субъединицами (рис.
3.6). Так, после заражения Bacillus subtilis определен-
ными бактериофагами или на ранних стадиях спо-
руляции экспрессируются разные ст-субъединицы и
В. subtilis В. subtilis о29
О55 кор-фермент
РИС. 3.6.
Схема, иллюстрирующая участие различных с-субъеди-
ниц в споруляции у В. subtilis. Некоторые с-субъедини-
цы, в частности css, присутствуют и в вегетативных
клетках. В условиях, стимулирующих споруляцию (в
частности, голодание), появляется несколько новых
с-субъединиц, например с29, которые и связываются
с кор-ферментом. Образовавшийся холофермент свя-
зывается с промоторами специфических генов споруля-
ции, названных здесь «средними» генами. Затем зкс-
прессируются другие специфические с-субъединицы (в
том числе с33 и с34); в комплексе с кор-полимеразой
они инициируют транскрипцию генов, продукты кото-
рых необходимы для поздних стадий споруляции.
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
123
в результате изменяется порядок транскрипции кле-
точных и вирусных генов. Использует ли РНК-по-
лимераза других прокариот различные ст-субъеди-
ницы для регуляции промоторной специфичности,
пока неизвестно.
Не все РНК-полимеразы прокариот представля-
ют собой мультисубъединичные ферменты. РНК-
полим разы, кодируемые бактериофагами ТЗ и Т7
Е. coli,- это одиночные полипептидные цепи средней
длины (~ 100 кДа). Эти ферменты высокоспецифич-
ны в отношении промоторных сайтов, используе-
мых для транскрипции определенного набора вирус-
ных генов. Такие «упрощенные» ферменты облада-
ют всеми активностями мультисубъединичных
РНК-полимераз. Они катализируют синтез РНК на
ДНК-матрицах и осуществляют правильную тер-
минацию цепей РНК.
в. Транскрипция инициируется
в особых нуклеотидных
последовательностях
Транскрипция инициируется при образовании
стабильного комплекса между холоферментом и
специфической последовательностью, называемой
промотором и располагающейся в начале всех тран-
скрипционных единиц (рис. 3.7). Изучение нуклео-
тидной последовательности более чем 50 разных
промоторных сайтов прокариот и мутационный
анализ выявили только два консервативных участка,
по-видимому играющих ключевую роль в узнава-
нии и функционировании промотора. Одна из этих
последовательностей состоит из шести или семи
пар оснований и расположена на расстоянии при
мерно 10 оснований до того нуклеотида, с которого
начинается транскрипция (+1); этот сигнал обыч-
но обозначают как — 10-последовательность, или
Прибнов-бокс- в честь ее открывателя. Сравнитель-
ный анализ — 10-последовательностей примерно 50
промоторов прокариот показал, что все они немно-
го отличаются от консенсус-последовательности
ТАТААТ (рис. 3.8). Подчеркнутый Т присутствует
почти во всех промоторах, тогда как по другим
позициям в каждом промоторе может наблюдаться
от одного до нескольких вариантов.
Вторая последовательность, длина которой
обычно равна девяти нуклеотидам, расположена на
расстоянии ~35 оснований до сайта инициации
(-35-последовательность) и также встречается в
большинстве промоторов прокариот. Нуклеотидная
последовательность сегмента между -35- и -10-
участками не является критической, важно лишь
расстояние между этими участками. — 35-последова-
тельность участвует в связывании РНК-полимера-
зы, которое предшествует перемещению фермента
в Прибнов-бокс. Возможно, РНК-полимераза вызы-
вает локальное раскручивание спирали, начиная
этот процесс с Прибнов-бокса, и создает условия
для инициации синтеза РНК (рис. 3.9).
Однако остается открытым вопрос, достаточно
ли простого связывания РНК-полимеразы с промо-
тором для локального расхождения цепей вблизи
сайта инициации синтеза РНК или РНК-полимераза
расплетает спираль в стартовом сайте. Независимо
от механизма образование «открытого» премотор-
ного комплекса позволяет РНК-полимеразе осуще-
ствить спаривание первого и второго рибонуклеозид-
трифосфатов с матричной цепью и катализировать
образование первой фосфодиэфирной связи.
Различия в эффективности транскрипции индиви-
дуальных генов отчасти зависят от структуры их
промоторов. Как прочность взаимодействия РНК-
полимеразы с промоторной последовательностью,
так и эффективность образования «открытого» про-
моторного комплекса определяются конкретными
нуклеотидными последовательностями -35-и -10-
участков соответственно. Мутации в этих участках
приводят к значительным изменениям способности
многих промоторов обеспечивать инициацию транс-
крипции (рис. 3.10). В некоторых случаях инициа-
цию транскрипции в малоэффективных промоторах
облегчают вспомогательные белки, связывающиеся
с ДНК вблизи -35-последовательностей (разд.
3.11. в). Суть подобного феномена до конца не
выяснена, но известно, что иногда белки, связываю-
щиеся с -35-последовательностью, увеличивают
вероятность того, что она будет обнаружена РНК-
полимеразой и свяжется с ней. Связывание белков-
активаторов может привести также к изменению
структуры ДНК и тем самым способствовать ини-
циации транскрипции. Изменение топологической
структуры ДНК-особенно увеличение числа отри-
цательных сверхвитков-также может приводить к
повышению или снижению эффективности некото-
рых промоторов.
Стартовый
сигнал
5' (TAGTG|TaTTG -i F^~)TG AT AG AA GC А С T С T А С [у д -j--fl С Т С A ATAG G Т С С AC G Q 3'
3' (АТ САС| йТААС Г i 1 |АСТ А Т С Т Т CG TG AG ATG| А тд"дд| G AG Т Т АТС C~AG GTfe f Q 5'
- 3 5-последова - — 10-последо-
тепьность вательность
РИС. 3.7. Прибнов РНК (А>€и^А>€)
Типичный промотор Е. coli. бокс 5
124
ЧАСТЬ 1 МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
Консенсусная
—35-пос ледо-
вательность
Консенсусная
—10-последо -
вательность
TTGACA-»-------- 11-15 -------»-Т А ТА АТ-*—5 - 8—*-+1
araBAD TTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTT
lacPI TAGGCACCCCAGGC ТТТАСА CTTTA
malT AAAAACGTCATCGC TTGCATTAGAA
up tctgaaatgagctgttgacaattaa
ilvGEDA GGCCAAAAAATATCTTGTAC TATTT
argCBH tttgtttttcattgttgacacacct
bioB ttgtcataatcgac ttgtaaaccaa
recA tttctacaaaacac ttgatactgta
rrnAB PI ТТТТАААТТТССТС ttgtcaggccg
rrnGPI tttatatttttcgcttgtcaggccg
str tcgttgtatatttcttgacaccttt
rpoA ttcgcatatttttcttgcaaagttg
APR TAACACCGTGCGTGTTGACTATTTT
л pl tatctctggcggtgttgacataaat
фх a aataaccgtcaggattgacaccctc
pBRtet aagaattctcatgtttgacagctta
ColEI pi ggaagtccacagtcttgacagggaa
tatcgcaactctc tactgtttctccatacccgttttt
tgcttccggctcg tatgttgtg tggaattgtgagc
aggtttctggcc gacctt ata accattaattacg
tcatcgaactag ttaact agt acgcaagttcacgt
acaaaacctatgg taactc ttt aggcAttccttcga
ctggtcatga tagtat caatattcAtgcagtatt
attgaaaagatt taggtt tacaagtctacaccgaat
TGAGCATACAG ТАТААТ TGC TTCAACAGAACAT
gaataactccc tataatgcgccaccactgacacgg
GAATAACTCCC TATAATGCGCCACCACTGACACGG
tcggcatcgccc taaaattcg gcgtcctcatat
GGTTGAGCTGGC TAGATTAGC CAGCCAATCTTT
acctctggcggt gataatggt tgcatgtactaag
accactggcggt gatactgag cacatcagcagga
ccaattgtatgt tttcaTgcc tccAaatcttgga
tcatcgataagc tttaatgcg gtagtttatcaca
aatgcagcggcg tagctttta tgctgtatataaaa
РИС. 3.8.
Нуклеотидные последовательности смысловой цепи
ДНК до сайта инициации транскрипции для различных
генов Е. coli и бактериофагов. [D. К. Hawley, W. R. McClu-
re, Nucleic Acid Research, 11 (1983), p. 2237.]
Кор-фермент
3' -35 -10 Старт 5'
Образование комплекса между
"открытым" промотором и ферментом
РИС. 3.9.
Связывание холоферментной формы РНК-
полимеразы (показана схематически) с об-
ластью промотора. Считается, что белок
перекрывает область длиной 50 нуклеоти-
дов, начинающуюся немного раньше —35-
последовательности и кончающуюся внутри
транскрибируемого участка. Связывание
стимулирует расплетание спирали и тран-
скрипцию.
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
125
Сайт начала
Область промотора транскрипции
5' / Л 3-
AGTT AGTG TATTGAC A TGATAGAAGCACTCTAC Т АТАТТ СТ С A AT(a]g G Т С С А С G G
(замены
оснований)
G Т
С
G
Т
Слабое влияние
на транскрипцию
G С A G Т
Значительное влияние
на транскрипцию
II
С G -
I 'С А1
РИС. 3.10.
Влияние мутаций в -10- и -35-последовательностях
на транскрипцию. В экспериментах использовался про-
мотор генома фага Р22. Все представленные здесь
мутации подавляют транскрипцию. Некоторые мутации
состояли в замене двух оснований. [Р. Youderian,
S. Bouvier, М. М. Suskind, Cell, 30 (1982), р. 843.]
г. Терминация транскрипции
и отделение цепей РНК
Последовательности ДНК, являющиеся сигнала-
ми остановки транскрипции, называются транскрип-
ционными терминаторами. Обнаружены два типа сиг-
налов терминации - p-зависимый и р-независимый
терминаторы. Оба они имеют некоторые общие
признаки (рис. 3.11). И тот и другой содержат
инвертированные повторы, благодаря чему З'-кон-
цы РНК-транскриптов складываются с образовани-
ем шпилек разной длины. Стебли шпилек р-незави-
симых терминаторов обычно содержат GC-богатые
участки; один из них находится вблизи основания
стебля, и к нему примыкает участок, состоящий из
четырех-шести уридиловых и одного-двух аденило-
вых остатков. В стебле p-зависимых терминаторов,
напротив, содержится лишь несколько GC-nap (а
иногда и не содержится вообще), а уридиновые
З'-хвосты могут отсутствовать.
РИС. 3.11.
Примеры шпилек в p-независимых и p-зависимых тер-
минаторах. [В. Lewin, Genes III (New York: Wiley, 1987),
p. 250.]
( GC
А
и
и —
и иии^)-он (
C
G
C
C
C
G
A
CC
G
c
G
G
G
C
U
U U U U u u0-OH (
C
G
u
A
U
G
U
G
G
C
A
U
A
C
A
U
C AAUC A a0“Oh
р-Независимый
терминатор
р-Независимый
терминатор
р-Зависимый
терминатор
126
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
Точный механизм p-независимой и р-зависимой
терминации транскрипции является пока предметом
дискуссий. Наиболее вероятным представляется сле-
дующее объяснение p-независимой терминации:
РНК-полимераза останавливается после транскрип-
ции инвертированного повтора, потому что шпилеч-
ная структура оказывается помехой. В результате
сразу после остановки процесса РНК отделяется от
матричной цепи вблизи U-богатого участка, кото-
рый относительно слабо спарен с A-богатым участ-
ком матрицы. Этим, по-видимому, объясняется то
обстоятельство, что наиболее часто на конце це-
пи РНК находятся уридиловые или адениловые
остатки.
р это олигомерный белок, прочно связываю-
щийся с РНК и в этом состоянии гидролизующий
АТР до ADP и неорганического фосфата. В одной
из моделей действие р-белка объясняется тем, что
он связывается с синтезируемой цепью РНК и пере-
мещается вдоль нее в направлении 5' -» 3' к месту
синтеза РНК; необходимая для его перемещения
энергия выделяется при гидролизе АТР (рис. 3.12).
Если р-белок наталкивается на образующуюся в
РНК шпильку, он останавливает полимеразу, кото-
рая могла бы продолжать транскрипцию. Возмож-
но, для отсоединения РНК от матрицы достаточно
этой р-индуцированной остановки, но не исключено,
что диссоциации и отделению способствует сам
р-белок.
Терминация транскрипции редко является абсо-
лютно зависимой или абсолютно независимой от
р-белка. Некоторые p-независимые терминаторы
работают в присутствии р более эффективно. А в не-
которых условиях так называемые p-зависимые тер-
минаторы вызывают терминацию и в отсутствие р,
хотя и не столь успешно.
Терминация, как и инициация синтеза РНК, яв-
ляется регулируемым процессом. Существуют бел-
8 РНК-полимераза
транскрибирует ДНК
8 р-Белок присоединяется
к 5'-концу цепи РНК
р-Белок перемещается
по РНК за счет энергии
гидролиза АТР
Полимераза
останавливается
в терминаторе под
влиянием р-белка
_ Терминациятранскрипции
-к и отделение
“ полимеразы и РНК
РИС. 3.12.
Влияние р-белка на остановку РНК-полимеразы в тер-
минаторе. сопровождающуюся терминацией транскрип-
ции с отделением фермента и синтезированной к этому
моменту РНК. [В. Lewin, Genes III (New York: Wiley,
1987), p. 260.]
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
127
ки, функционирующие как антитерминаторы и пред-
отвращающие терминацию в p-независимых терми-
наторах; известны также другие белки, ингибирую-
щие р и тем самым обеспечивающие удлинение цепи
после сигналов терминации. При определенных об-
стоятельствах молекулы РНК могут образовывать
альтернативные шпилечные структуры на особых
последовательностях определенных участков ДНК.
Одни из таких структур могут приводить к абор-
тивной терминации, а другие- к продолжению
транскрипции. Регулируемая терминация как способ
контроля за образованием мРНК обсуждается в
разд. 3.11. г.
3.3. ПРОЦЕССИНГ РНК
У ПРОКАРИОТ
Первичные транскрипты, образующиеся при
транскрипции прокариотических генов, кодирую-
щих белки, функционируют в качестве мРНК без
последующей модификации или процессинга. Дейст-
вительно, трансляция мРНК часто начинается даже
до завершения синтеза З'-конца транскрипта (разд.
3.7. а). Совсем иная ситуация наблюдается для моле-
кул рРНК и тРНК. В этом случае кластеры рРНК-
или тРНК-генов или даже перемежающиеся участки
этих генов часто транскрибируются с образованием
единой цепи РНК. И хотя транскрипция этих генов
всегда начинается на определенных промоторах и
заканчивается на определенных терминаторах, для
образования зрелых функциональных форм должны
произойти специфическое надрезание первичных
РНК-транскриптов и модификация. Подобные мо-
лекулярные события называют общим термином
посттранскрипционные модификации или просто про-
цессинг РНК. Механизмы процессинга рРНК и
тРНК и ферменты, с помощью которых он осущест-
вляется, наиболее полно изучены у E.coli, и для
иллюстрации особенностей посттранскрипционного
процессинга РНК мы используем эту систему. Ана-
логичные модификации эукариотических РНК об-
суждаются в гл. 8; в этом случае помимо процессин-
га рРНК и тРНК используются более сложные
системы созревания транскриптов с образованием
мРНК.
а. Группы генов,
кодирующих рРНК и тРНК
В геноме Е. coli идентифицированы и картирова-
ны семь дискретных транскрипционных единиц,
кодирующих рРНК; на рис. 3.13 они обозначены
rm А Н Каждая транскрипционная единица-это
молекула РНК, которая состоит из ~ 5000 нуклеоти-
дов и содержит по одной копии кодирующих после-
Локализация на хромосомной карте E.coli семи транс-
крипционных единиц рРНК.
довательностей для 5S-, 16S- и 23S-pPHK. Транс-
крипция в этой области осуществляется в направле-
нии 16S -» 23S -» 5S. Помимо этих трех последова-
тельностей, кодирующих рРНК транскрипты содер-
жат вставки разной длины (спейсеры) и одну или
более копий тРНК-генов (рис. 3.14). Спейсеры могут
находиться перед последовательностями для рРНК,
между ними и после них, а тРНК-гены обычно
лежат в пределах вкрапленных или З'-концевых
спейсерных сегментов. Для образования функцио-
нально зрелых молекул РНК должен произойти
процессинг таких транскриптов. До процессинга или
во время него происходит модификация специфиче-
ских оснований в спейсерах, а также в рРНК- и
тРНК-генах.
Промотор
5S
ш-А
РИС. 3.14.
Схематическое представление трех типичных транс-
крипционных единиц рРНК Е. coli. Указаны кодирующие
участки для 5S-, 16S- и 23S-pPHK, молекул тРНК
и спейсерные сегменты.
128
ЧАСТЬ 1, МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
б. Разрезание рРНК-тРНК-
котранскриптов
Начальное расщепление первичных транскрип-
тов на фрагменты, содержащие либо тРНК, либо
16S-, 23S- или 58-рРНК-последовательности, осуще-
ствляет эндонуклеаза РНКаза III. Ее мишенями
служат короткие дуплексы РНК, образующиеся при
внутримолекулярном спаривании оснований в по-
следовательностях, фланкирующих каждый из
рРНК-сегментов (рис. 3.15). Например, комплемен-
тарные участки в спейсерных областях, фланкирую-
щих последовательность 16S-pPHK, образуют сте-
бель шпильки, в петле которой находится последо-
вательность 16S-pPHK. Аналогичные шпильки об-
разуют и последовательности 23S- и 5S-pPHK.
РНКаза III вносит разрывы в двухцепочечный сте-
бель, в результате образуется цепь РНК, содержа-
щая последовательность той или иной рРНК, флан-
кированную короткими спейсерными участками с 5'-
фосфатным и З'-гидроксильным концами. Затем
лишние нуклеотиды спейсерных последовательно-
стей удаляются, возможно с помощью той же самой
РНК-экзонуклеазы, которая катализирует и послед-
ние этапы процессинга тРНК (разд. 3.3. в). В прин-
ципе для того, чтобы произошло ферментативное
расщепление, должны быть транскрибированы толь-
ко те нуклеотидные последовательности, которые
образуют шпильки. Однако процессинг происходит
лишь после завершения синтеза всего первичного
транскрипта, поскольку, по-видимому, для правиль-
ной укладки целого РНК-транскрипта, который и
распознается эндонуклеазой III, необходимы рибо-
сомные или какие-либо другие белки. Процессинг
тРНК-сегментов, выщепляющихся из мультигенных
транскриптов, осуществляется так же, как и процес-
синг тРНК из транскрипционных единиц одиночных
генов (разд. 3.3. в).
в. Образование зрелых тРНК
из более крупных транскриптов
Несмотря на то что некоторые кодирующие
тРНК гены находятся внутри транскрипционных
единиц рРНК и экспрессируются совместно с генами
рРНК, основная часть тРНК-генов представлена
одиночными генами или объединена в кластеры.
Одни кластеры содержат множественные повторы
одних и тех же генов (например, три идентичные
копии гена тРНКТуг), другие - различные и неродст-
венные тРНК-гены (рис. 3.16). В некоторых случаях
каждый кластер транскрибируется как одна боль-
шая молекула РНК, которая подвергается процес-
сингу с последовательным выщеплением зрелых
16S-pPHK
1600 нуклеотидов ।
/
G
С
А
ди
G
А
А
G
С
(J
С
А
С
G
G
G
С
G
U
А
С
U
U
(J
2е
G
gga
С
U
U
А
А
С
С
(J
U
А
С
А
А
23S-PPHK,
~ 2900 нуклеотидов
UcAgc
G
А
А
U
U
G
G
А
G
U
G
U
U
G
РНКаза 111
РНКаза III
AAUG)
(асда
РНКаза III
U
U
С
и
А
С
А
А
А
5' G
(AG
А
А
G
G
U
G
U
U
U
8 ?'
РНКаза III
РИС. 3.15.
Сайты расщепления для РНКазы III
в предшественниках рРНК. Эти сайты
находятся в стебле, образуемом при
внутримолекулярном спаривании ос-
нований спейсерных участков, флан-
кирующих 16S- и 23S-pPHK-nocne-
довательности. [В. Lewin, Genes III
(New York: Wiley, 1987), p. 453.]
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
129
Промотор Терминатор
TPHKTVr tPHKTVr tPHKTVf
hs-———*g=-g ▼ :
Промотор с _ Терминатор
тРНКйег tPHK hr
PPP
tPHKSer
РИС. 3.16.
Типичные кластеры генов тРНК E.coli и их первичные
транскрипты.
тРНК-фрагментов (рис. 3.17). Для образования зре-
лой функциональной тРНК, по-видимому, должны
произойти специфическая модификация оснований
и присоединение одного, двух или всех трех нуклео-
тидов З'-ССА-конца.
Независимо от того, содержит ли первичный
транскрипт одну или более тРНК-последовательно-
стей или эти последовательности внедрены в спей-
серные участки рРНК, 5'-концы всех тРНК образу-
ются при участии одной эндонуклеазы, называемой
РНКазой Р. По-видимому, РНКаза Р узнает харак-
терную свернутую структуру тРНК в полинуклео-
тиде-предшественнике и отщепляет лидерную или
спейсерную последовательности, расположенные пе-
ред 5'-концом зрелой последовательности тРНК.
З'-концы тРНК образуются с помощью нескольких
активностей. До сих пор неидентифицированная
эндонуклеаза расщепляет предшественник в том мес-
те шпильки, где находится З'-конец зрелой тРНК,
а затем другая эндонуклеаза, РНКаза D, завершает
образование правильного З'-конца. В некоторых
случаях экзонуклеазное расщепление прекращается
точно у З'-ССА-конца зрелой тРНК (рис. 3.17), а в
других случаях под действием экзонуклеазы образу-
ется конец, служащий затравкой, к которому тРНК-
нуклеотидилтрансфераза добавляет один или более
tPHKThr
инвариантных концевых нуклеотидов (С и/или А).
Отличительной особенностью РНКазы Р являет-
ся то, что сайт расщепления для нее формируется
в результате правильной укладки молекулы тРНК.
Изменения в нуклеотидной последовательности, не
приводящие к нарушению этой укладки, не сказыва-
ются и на процессинге 5'-конца. Другим необычным
свойством РНКазы Р является то, что она состоит
из белка и РНК. Эта РНК имеет специфическую
последовательность из 377 нуклеотидов и сама
транскрибируется РНК-полимеразой с гена чуть
большего размера и затем подвергается процессин-
гу до размера зрелой молекулы. Удивительной осо-
бенностью этой РНК оказалось то, что она одна
может катализировать такую же эндонуклеазную
реакцию, что и целый рибонуклеопротеин; белок же
не обладает самостоятельной эндонуклеазной ак-
тивностью. Таким образом, эндонуклеазная актив-
ность может быть присуща самой РНК, а белок,
по-видимому, необходим для сохранения структуры
РНК в максимально активной конфигурации.
Зрелые тРНК не только имеют характерную
конформацию, но и содержат модифицированные
нуклеотиды (рис. 3.18). Многие из таких модифика-
ций оказываются существенными для выполнения
некоторых физиологических функций тРНК. Сегод-
ня охарактеризованы лишь немногие из целой ар-
мии ферментов, катализирующих огромное количе-
ство реакций модификации. Однако ясно, что моди-
9 243
130 ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
лидерную последовательность G
длиной 41 нуклеотид G
с образованием 5'-конца тРНК q
G
G
д®н Три остатка,
С отщепляемые
U РНКазой D
15
С G
Модификации оснований ® ®
после транскрипции
СС А
20
G
и54 —и
А и
GC С С
. AGAG
А 25 А
G
С
30 А
G
А
С
U
А 85-<— 3'-конец тРНК
С
С
А
С
С 80
А
С
С
С
С
С
С U U С С
70
U
А
G A A G
С 60
U
U
С.
G г
U G
С
AU
40—Ф 50
А
А—А*
А
сс
G
U
С
U
G
U
1
U
I
Ф
А
G
С
65
РИС. 3.17.
Различные этапы образования зрелой тРНК из пред-
шественника (на примере тРНКт,,г E.coli).
3'
Y-Пиримидин
R-часто пурин
D U-часто дигидроуридин
•-модифицированное основание
Т-тимидин
ф - псевдоуридин
фикации происходят в основном на стадии РНК-
предшественника и в полностью процессированной
тРНК. Такие модифицирующие ферменты представ-
ляют особый интерес благодаря своей необычной
специфичности в отношении определенных последо-
вательностей: например, только отдельные ураци-
ловые остатки превращаются в тиоурацил, метили-
руются до тимина или восстанавливаются до дигид-
роурацила. Еще более загадочным представляется
образование псевдоуридилата при модификации
обычной связи между урацилом и рибозой (рис.
1.21).
3.4. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД
Последовательность аминокислот в белках‘опре-
деляется порядком расположения дезоксинуклеоти-
дов в генах, кодирующих белки, точнее- последова-
тельностью рибонуклеотидов в мРНК-транскрип-
тах. Информационная связь между нуклеотидными
РИС. 3.18.
Схематическое изображение тРНК в форме клеверного
листа. В определенных позициях у всех тРНК находятся
модифицированные основания.
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
131
и аминокислотными последовательностями осуще-
ствляется с помощью генетического кода. Для со-
ставления генетического словаря было проведено
множество специальных генетических и биохимиче-
ских экспериментов. Он включает также и знаки
препинания-начало и конец участков, кодирующих
белки. За исключением незначительных вариаций
в использовании нескольких нуклеотидов для коди-
рования особых аминокислот у митохондрий и не-
которых инфузорий, генетический словарь универса-
лен, т. е. конкретная последовательность нуклеоти-
дов задает одинаковую для всех живых организмов
аминокислотную последовательность.
Наличие подобной системы кодирования подра-
зумевает существование некоего механизма для пе-
ревода информации с языка нуклеотидов на язык
аминокислот. Как и следовало ожидать, этот меха-
низм и реакции, осуществляющие перевод (трансля-
цию), очень сложны. Несмотря на различия между
про- и эукариотами как в том, что касается структу-
ры мРНК (разд. 3.8. а), так и в физическом взаимо-
отношении генов и аппарата трансляции, оба типа
организмов используют весьма сходные механизмы
для расшифровки генетических посланий.
В этом разделе описываются свойства генетиче-
ского кода. Аппарат трансляции и процесс сборки
белка мы обсудим в разд. 3.5-3.8.
а. Аминокислотная
последовательность белков
соответствует нуклеотидной
последовательности
кодирующих их генов
Предположение о коллинеарности нуклеотидных
и аминокислотных последовательностей было вы-
сказано в числе первых в дискуссии о природе
генетического кода. Догадки такого рода возникли
после того, как было показано, что многие мутации
проявляются в замене одной-единственной амино-
кислоты в белках бактерий, растений или животных.
Но гипотеза коллинеарности оставалась непод-
твержденной до тех пор, пока не были проведены
тщательные генетические и биохимические исследо-
вания хорошо охарактеризованных генно-белковых
систем. Например, было показано, что относитель-
ное положение аминокислотных замен в «-субъеди-
нице триптофансинтетазы Е. coli согласуется с отно-
сительной локализацией на карте соответствующих
мутаций в тгрЛ-гене этого микроорганизма. Однако
выделить и охарактеризовать мутантную ДНК в то
время не удалось, поэтому нельзя было установить
соответствие между нуклеотидными последователь-
ностями и аминокислотными.
Теоретический анализ привел к предположению,
что наиболее подходящей по размеру для генетиче-
ской кодирующей единицы, или кодона, является
последовательность из трех нуклеотидов. В основе
Мутант —2 ,GAC, |CUAI ,ACG, [UCA|
+2 t_GC
Мутант *2 ,GAC, ,CUA, ,GCA, ,CGU,
Мутант —2 ,GAC CUA ACG UCA
♦--GC
Дикий тип ,GAC, .CUA, GCA, , CGU
l+A
Мутант + 1 ,GAC, ,CUA, ,QCA, ,CAG,
Мутант.—1 ,GAC, ,CUA, ,GCA CGU,
f*A
Мутант +1 ,GAC, ,CUA, ,GCA, ,CAG,
РИС. 3.19.
Изучение мутаций, сдвигающих рамку считывания, по-
казало, что кодоны состоят из трех нуклеотидов. Ис-
пользовались мутагены (в частности, профлавин), кото-
рые индуцировали делеции или вставки одного или двух
оснований. Образующиеся мутанты синтезировали не-
активные или укороченные полипептиды, поскольку
сдвиг рамки приводит к появлению кодонов, детерми-
нирующих неправильные аминокислоты, или стоп-ко-
дона. Рекомбинация между двумя мутантами, один из
которых содержит делению, а другой в этой же или
близкой позиции-вставку (например, — 1 х +1 или
— 2 х +2), может привести к восстановлению функ-
ционального гена, если несколько концевых, находя-
,GAC, GUG, ,UUU, ,GCU. ,ACG,
♦-♦AC ' "
,CAG, pACG, ,UGU, ,UUG, ,CUA, ,CG-
Lt AC
,GGU GUU, ,UGC, ,UAC, ,G-
CAG GUG UUU GCU ACG
,UCA, ,GGU, GUU, ,UGC, ,UAC, ,G"
f--G
CAG UGU, ,UUG, CUA, ,CG"
-G—f
,UCA, ,GUG, ,UUU, ,GCU, ,ACG,
щихся за рамкой считывания кодонов приходятся на
несущественную часть полипептида. Рекомбинация меж-
ду мутантами, которые оба имеют по одной вставке
( + 1 х +1) или по делеции из двух оснований
( — 2 х —2), не способна исправить мутацию. Напротив,
рекомбинация между генами, имеющими в сумме три
близко расположенных вставочных основания (напри-
мер. + 1 х +2) или три близко расположенных деле-
гированных основания (например, —1 х —2), может
привести к восстановлению функциональных генов,
поскольку за этими измененными участками восстанав-
ливается нормальная рамка считывания.
9*
132
ЧАСТЬ 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
этого вывода лежали три соображения. Во-первых,
четыре нуклеотида, взятые по одному, могут коди-
ровать только четыре разные аминокислоты. Соче-
тания из двух нуклеотидов могут кодировать толь-
ко 42, или 16 аминокислот, а это меньше, чем те
20 аминокислот, которые, как было известно, при-
сутствуют в белках. И только совокупности трех
нуклеотидов дают 64 возможных кодона (43), т. е.
число, более чем достаточное для кодирования 20
разных аминокислот. Генетические эксперименты,
выполненные на мутантах с делениями или вставка-
ми длиной один, два или три нуклеотида в генах,
кодирующих белки, позволили доказать, что наибо-
лее подходящий размер для кодона-три нуклеоти-
да (рис. 3.19). Более того, из этих исследований был
сделан вывод, что нуклеотидная последователь-
ность считывается расположенными один за другим
триплетами с фиксированной точки. Все эти выводы
наряду с данными о том, что полипептидные цепи
синтезируются последовательно путем соединения
аминогруппы одной аминокислоты с карбоксильной
группой другой, послужили краеугольным камнем
в расшифровке генетического кода.
б. Соответствие между
аминокислотами и их кодонами
Одним из загадочных моментов кодирования
было отсутствие структурной комплементарносги
между нуклеиновыми кислотами, с одной стороны,
и аминокислотными цепочками с другой. Выход из
этого концептуального тупика - ответ на вопрос, как
аминокислоты спариваются с соответствующими
кодонами,- был найден, когда появилась идея о су-
ществовании адаптера. Согласно этой идее, амино-
кислоты сначала связываются с молекулами РНК,
а затем такие гибриды выстраиваются вдоль мРНК,
соединяясь с ней путем комплементарного спарива-
ния нескольких оснований в адапторной молекуле
РНК с соответствующим кодоном в мРНК (рис.
3.20). Адапторная гипотеза получила строгое экспе-
риментальное подтверждение после того, как были
обнаружены тРНК и ферменты, ответственные за
связывание аминокислот и тРНК, и показано, что
присоединенные к тРНК аминокислоты являются
прямыми предшественниками при сборке полипеп-
тида.
Если тРНК-это адаптеры, то каждая аминокис-
лота должна присоединяться только к специфиче-
ской тРНК, а каждая тРНК-спариваться только
с одним, соответствующим ей кодоном. Правиль-
ность первого из этих положений была доказана
с открытием особых ферментов-аминоацил-тРНК-
синтетаз, каждый из которых связывает одну-един-
ственную аминокислоту с одной или несколькими
родственными тРНК (рис. 3.21). Эти ферменты и ка-
тализируемые ими реакции более детально будут
рассмотрены в разд. 3.5. а. Здесь достаточно ска-
зать, что связывание аминокислот с молекулами
тРНК-это первый шаг в процессе расшифровки.
Правильность второго положения адапторной гипо-
тезы- о том, что тРНК сама определяет место своей
аминокислоты в полипептидной цепи - была под-
тверждена с помощью простого эксперимента. Одна
из аминокислот, будучи связанной с соответствую-
щей тРНК, была химически превращена в другую.
После включения этой модифицированной амино-
кислоты в белок in vitro была установлена ее лока-
лизация в белковой цепи (рис. 3.22). Оказалось, что
после превращения цистеинил-тРНК Cys в аланил-
тРНКСу5 остаток аланина, связанный с TPHKCys,
обнаруживается в тех сайтах белковой цепи, кото-
рые обычно занимает цистеин, а не в сайтах, где
обычно находится аланин. Стало ясно, что именно
тРНК с присоединенной к ней аминокислотой, а не
сама аминокислота определяет, с каким кодоном
должно произойти спаривание.
в. Расшифровка генетического кода
Предпосылками для расшифровки кода послу-
жили два открытия. Во-первых, было установлено,
что мРНК это информационный посредник между
генами и белками. Во-вторых, обнаружилось, что
мРНК, введенная в бактериальные экстракты, тран-
слируется с образованием соответствующих белков.
Прорыв в этой области произошел, когда с по-
мощью экстрактов из клеток Е. coli была осуществ-
лена трансляция синтетических РНК полиуридила-
та (poly U), полиаденилата (poly А) и полицитидила-
ala
5'
lys
РИС. 3.20.
Адапторная гипотеза. Аминокислоты
присоединяются к специфическим адап-
торным РНК (тРНК), которые затем
выстраиваются вдоль мРНК благодаря
комплементарному спариванию между
кодонами мРНК и антикодонами адап-
тера.
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
133
Тирозил-тРНК-
Tvr синтетаза Tvr
АТР+ L-тирозин ттРНК -------------►!_-тирозил-тРНК + АМР+PPj
Лейцил-тРНК—
, I рп синтетаза |ри
АТР + L- лейцин + тРНК -----------► L-лейцил-тРНК + ДМР + рр.
РИС. 3.21.
Каждая аминоацил-тРН К синтетаза при-
соединяет специфическую аминокис-
лоту к одной или нескольким родствен-
ным тРНК.
Восстановительное десульфирование
СИз Аланил-тРНК CYS
СН
Синтез белка
С2
РИС. 3.22.
Превращение цистеинил-тРНКСу8 в ала-
нил =тРНКСуя приводит к синтезу поли-
пептида. в котором аланин занимает по-
зиции. отвечающие цистеиновому кодо-
ну UGU. Эти остатки аланина обозна-
чены черными кружками, помещенными
в треугольники.
134
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
та (poly С)-с образованием полифенилаланина, по-
лилизина и полипролина соответственно. Это при-
вело к заключению, что триплеты, состоящие толь-
ко из U, А и С, кодируют соответственно фенилала-
нин, лизин и пролин. Затем были проделаны экспе-
рименты с применением смешанных полимеров с
варьирующим соотношением двух и трех нуклеоти-
дов; в результате был определен состав кодонов
(табл. 3.2). Однако эти данные позволили устано-
вить лишь нуклеотидный состав кодонов, но не
порядок следования нуклеотидов в них.
Все кодоны были в конце концов идентифициро-
ваны при помощи следующих двух экспериментов.
В экспериментах первого типа сравнивали амино-
кислотную последовательность полипептидов, по-
лученных in vitro с использованием синтетических
мРНК, содержащих определенные повторы из двух
или трех нуклеотидов (рис. 3.23 и табл. 3.3). В экспе-
риментах другого типа определяли, какая именно из
амииоацил-тРНК связывается с рибосомами в при-
сутствии каждого из возможных тринуклеотидов
(рис. 3.24). Эти эксперименты позволили составить
непротиворечивый словарь, в котором 61 трехнук-
леотидный кодон соответствует 20 аминокислотам,
а три кодона-окончанию кодирующей последова-
тельности (рис. 3.25).
В коде заложена некая неоднозначность, которая
связана с точкой начала трансляции, а не с соответ-
ствием кодон-аминокислота. Эта неоднозначность
обусловлена наличием альтернативных наборов
триплетов, или рамок считывания, для любой поли-
нуклеотидной последовательности (рис. 3.26). Боль-
шинство прокариотических генов транслируется при
одной непрерывной рамке считывания; при альтер-
нативных рамках на каждые 20 нуклеотидов прихо-
дится в среднем по одному терминирующему ко-
дону.
В экспериментах по расшифровке кода, описан-
ных выше, синтетические полинуклеотиды трансли-
ровались в условиях, не требующих точной инициа-
ции. Однако in vivo и в соответствующих условиях
Полимер, состоящий из повторяющихся динуклеотидов
,ugu"gug''ugu"gug"ugu"gug'
। и I' и I' ||
••• Cys Vai Cys Vai Cys •••
Полимер, состоящий из повторяющихся тринуклеотидов
UAC UAC UAC UAC UAC UAC
•••Туг —Туг—Туг—Туг —Туг—Туг •••
• Thr - Thr - Thr - Thr — Thr •••
••• Leu — Leu - Leu - Leu — Leu •••
Полимер, состоящий из четырех повторяющихся нуклеотидов
GUA CGU ACG UAC GUA CGU ACG
••• Vai—Arg—Thr—Туг—Vai—Arg—Thr •••
••• Туг— Vai - Arg - Thr — Tyr— Vai •••
•• Thr— Tyr— Vai — Arg — Thr— Tyr •••
РИС. 3.23.
Некоторые синтетические мРНК, кодирующие опреде-
ленные полипептиды. Синтез этих специфических поли-
пептидов может осуществляться в клеточных экстрактах,
которые катализируют синтез белков. Заметим, что
аминокислотный состав полипептидного продукта зави-
сит от того, какая из трех возможных комбинаций
оснований в poly(UAC)„ реализуется: UAC, ACU или
CUA.
in vitro инициация происходит только с правильной
рамкой считывания. Однозначность прочтения бе-
лок-кодирующей последовательности обеспечивает-
ся тем, что трансляция мРНК начинается только со
Таблица 3.2. Кодирующие свойства случайных сополимеров, состоящих из U (0,76) и G (0,24)
в различных комбинациях
Триплет Расчетная частота триплета Относительная частота Аминокислота Относительная встречаемость в полипептидах Возможный состав кодона
иии 0,44 100 Фенилаланин 100 зи
UUG 0,14 32 Валин 37 2U1G
UGU 0,14 32 Лейцин 36 2U1G
GUU 0,14 32 Цистеин 35 2U1G
UGG 0,044 10 Триптофан 14 1U2G
GUG 0,044 10
GGU 0,044 10 Глицин 12 1U2G
GGG 0,014 3
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
135
leu-тРНК
РИС. 3.24.
Идентификация кодонов, основанная на изучении свя-
зывания специфических аминоацил-тРНК с рибосома-
ми в присутствии синтетических тринуклеотидов. Рибо-
сомы и необходимые растворимые факторы инкубиро-
вали с определенными тринуклеотидами и смесью ами-
ноацил-тРНК, в которой радиоактивно меченной была
только одна аминоацильная единица. С каждым из
комплексов рибосома-тринуклеотид связывалась толь-
ко одна специфическая меченая аминоацил-тРНК (на-
пример, с комплексом рибосома- UCA связывалась ра-
диоактивно меченная пролил-тРНК).
Первая Вторая Третья
позиция позиция позиция
(5') (3'|
u C A G
PHE SER TYR CYS U
i 1 PHE SER TYR CYS £
VJ LEU SER Stop Stop A
LEU SER Stop TRP G
LEU PRO HIS ARG U
LEU PRO HIS ARG c
C LEU PRO GLN ARG A
LEU PRO GLN ARG G
ILE THR ASN SER U
ILE THR ASN SER C
A ILE THR LYS ARG A
MET THR LYS ARG G
VAL ALA ASP GLY U
Q VAL ALA ASP GLY C
VAL ALA GLU GLY A
VAL ALA GLU GLY G
РИС. 3.25.
Генетический код. Верхняя схема построена так, что мы
можем идентифицировать аминокислоту, кодируемую
тем или иным триплетом. Так, триплет CAG можно
расшифровать, найдя точку пересечения С из левой
колонки. А- из верхнего ряда и G - из правой колонки.
Нижняя схема показывает число и состав кодонов,
детерминирующих каждую из аминокислот.
GCA CGA GGA CUA CCA UCA АСА GUA
GCG CGG GGG AUA CUG CCG UCG ACG GUG UAA
GCC CGC GAC AAC UGC GAA САА GGC САС AUC CUC AAA UUC ССС UCC ACC UAC GUC UAG
GCU CGU GAU AAU UGU GAG CAG GGU CAU AUU CUU AAG AUG UUU CCU UCU ACU UGG UAU GUU UGA
ALA ARG ASP ASN CYS GLU GLN GLY HIS ILE LEU LYS MET PHE PRO SER THR TRP TYR VAL Stop
136
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 3.26.
Рамка считывания А
CAG
Рамка считывания В
Рамка считывания С
met
UCU AUG GCA AAU AAG GUA GAC CAU
tyr gly lys стоп
leu trp glu ile arg стоп
Нуклеотидная последовательность может транслиро-
ваться с помощью одной из трех рамок считывания
(трансляция осуществляется в направлении 5' -► 3', сле-
ва направо). В приведенном примере рамки считывания
В и С прерываются стоп-кодонами. «Открытой» является
только рамка считывания А, начинающаяся со стартово-
го кодона AUG.
специфического триплета-AUG, и далее расшифро-
вывается каждый последующий триплет в направле-
нии от 5'-конца молекулы мРНК к З'-концу. Напри-
мер. кодирующая последовательность, приведенная
на рис. 3.27, транслируется начиная с AUG-кодона,
находящегося вблизи 5'-конца мРНК, по направле-
нию к З'-концу, где и заканчивается на одном из
трех терминирующих кодонов. Позднее был разра-
ботан метод быстрого секвенирования нуклеиновых
кислот и белков, который позволил проверить си-
стему кодирования непосредственно, путем сравне-
Таблица 3.3. Включение аминокислот
в полипептидную цепь при использовании
в качестве матрицы синтетических
полинуклеотидов с определенными повторами1’
Повторяющаяся последователь- ность Кодоиы Включаемые аминокислоты
ис иси-сис Ser-Leu
AG AGA-GAG Arg-Glu
UG UGU-GUG Cys-Val
АС АСА-САС Thr-His
UUC UUC; UCU; CUU Phe; Ser; Leu
AAG AAG; AGA; GAA Lys; Arg; Glu
UUG UUG; UGU; GUU Leu; Cys; Vai
САА . САА; ААС; АСА Gin; Thr; Asp
GUA GUA; UAG; AGU Vai; Ser
UAC UAC; ACU; CUA Tyr; Thr, Leu
AUC AUC; UCA; CAU lie; Ser; His
GAU GAU; AUG; UGA Asp; Met
UAUC UAU-CUA-UCU- -AUC Tyr-Leu-Ser-lle
GAUA GAU-AGA-UAG- -AUA Нет
UUAC UUA-CUU-ACU- -UAC Leu-Thr-Tyr
GUAA GUA-AGU-AAG- -UAA Нет
” H.G. Khorana et. al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.,
31, 39 (1966). Черточки разделяют кодоиы в одной н той же рамке
считывания, а точки с запятой в разных рамках.
ния последовательностей ДНК, РНК и кодируемых
ими белков. Сравнительные исследования подтвер-
дили также и то, что кодирующие последователь-
ности действительно читаются от 5'- к З'-концу
мРНК.
г. Избыточность генетического кода
Удивительной особенностью кода оказалось то,
что все аминокислоты, кроме двух, кодируются
более чем одним кодоном. Эти две составляющие
исключение аминокислоты, метионин и триптофан,
встречаются в белках достаточно редко. Наиболь-
шее число кодонов имеют серин и лейцин, которы-
ми белки изобилуют. Такие достаточно часто встре-
чающиеся аминокислоты, как цистеин, аланин, гли-
цин, валин, а также дикарбоновые кислоты и их
амиды, кодируются двумя-четырьмя кодонами
каждая. Из-за такой избыточности разные нуклео-
тидные последовательности могут при трансляции
давать одну и ту же аминокислотную последова-
тельность (рис. 3.28). Итак, если мы знаем нуклео-
тидную последовательность, то можем однозначно
определить последовательность белка, обратное же
проделать невозможно.
Сигналом для остановки синтеза белка служит
любой из трех кодонов: UAA, UAG или UGA.
Кодон AUG выполняет двойную функцию: он де-
терминирует аминокислоту метионин и в определен-
ных последовательностях обозначает начало сегмен-
та, кодирующего белок.
Избыточность кода имеет одну интересную осо-
бенность: наибольшее число вариаций в кодонах,
детерминирующих данную аминокислоту, прихо-
дится на третью позицию (З'-конец триплета). На-
пример, аминокислоты глицин, валин, пролин, ала-
нин и треонин кодируются четырьмя кодонами
каждая, и в каждом случае эти четыре кодона
различаются только нуклеотидами в третьей пози-
ции (рис. 3.25). Если какая-то аминокислота кодиру-
ется двумя кодонами, то последние различаются
только пуринами или пиримидинами, находящими-
ся в третьей позиции. И только кодоны для лейцина,
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
137
3'
Продукт трансляции
РИС. 3.27.
Кодирующая последовательность начинается с кодона
AUG и заканчивается терминаторным (стоп) кодоном.
Она фланкируется 5'- (5'-лидерная последовательность)
и 3'- (З'-трейлерная последовательность) нетранслиру-
емыми участками.
серина и аргинина различаются нуклеотидами, на-
ходящимися в первой, второй или обеих позициях.
Поэтому мутации, приводящие к заменам нуклеоти-
дов в третьей позиции, часто не сопровождаются
изменением аминокислотной последовательности.
Кроме того, код устроен так, что при замене нуклео-
тидов даже в первой или второй позиции некоторых
кодонов в полипептид включается структурно род-
ственная аминокислота, сводя тем самым к миниму-
му нарушения во вторичной структуре белка. Кодо-
ны для гидрофобных аминокислот, например фе-
нилаланина, лейцина, изолейцина и валина, различа-
ются только одним нуклеотидом. Аналогичная си-
туация наблюдается и для кодонов серина и треони-
на или аланина и глицина.
Две разные нуклеотидные последовательности могут
кодировать один и тот же полипептид
д. Универсальность
генетического кода
По-видимому, все прокариоты, а также боль-
шинство эукариот (по крайней мере в том, что
касается ядерното генетического материала) поль-
зуются одним и тем же словарем кодонов независи-
мо от того, представлен ли их геном ДНК или РНК.
В этом смысле нередко говорят, что код универса-
лен. Тем не менее частота использования кодонов-
синонимов варьирует как на уровне организмов, так
и на уровне мРНК. Если действительно какие-то
кодоны используются в большинстве кодирующих
белки последовательностей чаще, чем другие, то это
должно найти отражение в относительном содержа-
нии в клетке различных тРНК, расшифровывающих
кодоны-синонимы. Так. если кодон AGA встречает-
ся в мРНК какого-либо организма сравнительно
редко, то и содержание тРНКАгв, расшифровываю-
щей AGA, должно быть невелико. В некоторых
случаях выбор кодонов для конкретной кодирую-
щей последовательности определяется задачами, не
связанными с их трансляцией. Например, опреде-
ленное взаимное расположение кодонов может бла-
гоприятствовать образованию специфической вто-
ричной структуры мРНК; таким образом, присутст-
вие конкретных кодонов может влиять на готов-
ность мРНК к трансляции и тем самым играть
регуляторную роль. В некоторых случаях экспери-
ментальная замена существующих кодонов их сино-
нимами приводит к изменению стабильности мРНК
при полном сохранении ее способности к правиль-
ной трансляции.
Редкие исключения в стандартном словаре кодо- .
нов обнаружены у инфузорий и в митохондриаль-
ных генах. Например, в митохондриях млекопитаю-
щих кодон UGA читается как триптофан и мито-
хондриальная ДНК кодирует тРНКТгр, чей антико-
дон UCA спаривается с UGA почти так же прочно,
как с нормальным триптофановым кодоном UGG.
В митохондриях млекопитающих кодоны AGA и
AGG прочитываются как сигналы терминации.
AUU, AUC, AUA и AUG служат инициирующими
кодонами, a AUA кодирует метионин вместо изо-
лейцина. В митохондриях дрожжей триплеты CUU,
CUC, CUA и CUG кодируют треонин, а не лейцин.
138
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
3.5. АППАРАТ ТРАНСЛЯЦИИ
Основными участниками процесса считывания
информации, закодированной в последовательности
мРНК, являются аминоацил-тРНК-синтетазы,
тРНК, рибосомы, белки, связанные с рибосомами,
и некоторые другие белки. Они ответственны за
инициацию, элонгацию и терминацию сборки поли-
пептида. В этом разделе мы опишем свойства каж-
дого из перечисленных компонентов, а в следующем
обсудим, как они функционируют на разных этапах
процесса трансляции.
а. Присоединение аминокислот
к «родственным» тРНК
Функционирование тРНК при трансляции сво-
дится к двум уникальным процессам. Первый из них
состоит в присоединении аминокислоты к З'-концу
родственной тРНК с помощью специфической ами-
ноацил-тРНК-синтетазы, второй-в специфическом
связывании аминоацил-тРНК с соответствующим
кодоном мРНК, находящейся в комплексе с рибосо-
мой. Ключевой особенностью обеих реакций явля-
ется их специфичность, поскольку сбои в образова-
нии аминоацил-тРНК или связывании аминоацил-
тРНК с соответствующим кодоном приведут к
ошибкам в экспрессии генов. Поэтому очень важно
понять природу такой специфичности, механизм ее
обеспечения и последствия нарушений точности на
этих двух этапах трансляции.
Основные особенности структуры тРНК. В лю-
бой клетке присутствует очень много разных тРНК.
Молекула тРНК состоит обычно из 75-85 нуклео-
тидов и содержит уникальный тринуклеотид, кото-
рый определяет, какую аминокислоту эта тРНК
присоединяет и с каким кодоном она может спа-
риться. На основании данных о нуклеотидной по-
следовательности более чем 150 отдельных видов
тРНК, выделенных из клеток про- и эукариот, были
построены компьютерные модели внутримолеку-
лярного комплементарного спаривания оснований
в молекуле тРНК. Был сделан вывод, что практиче-
ски все тРНК, независимо от их нуклеотидной
последовательности, обладают характерной вторич-
ной структурой, которую называют структурой
«клеверного листа» из-за наличия в ней трех шпилек
(рис. 3.29). Реальность предсказанной структуры
была подтверждена данными о разной химической
чувствительности оснований, одни из которых спа-
рены, а другие нет (последние образуют так называ-
емые петли).
Большинство молекул тРНК, имеющих форму
клеверного листа, содержат четыре области, каждая
из которых обладает инвариантными свойствами
независимо от аминокислотной специфичности
тРНК. 1. На З'-конце молекулы всегда находятся
четыре неспаренных нуклеотида, причем три из
них-это обязательно ССА. 5'- и З'-концы цепи РНК
образуют акцепторный стебель. Цепи удерживают-
ся вместе благодаря комплементарному спарива-
нию семи нуклеотидов 5'-конца с семью нуклеотида-
ми, находящимися вблизи З'-конца. 2. У всех моле-
кул имеется шпилька ТТС, обозначаемая так пото-
му, что она содержит два необычных остатка: рибо-
тимидин (Т) и псевдоуридин (Т). Шпилька состоит
из двухцепочечного стебля из пяти спаренных осно-
ваний, включая пару G-С, и петли длиной семь
нуклеотидов. Тринуклеотид ТЧ'С всегда расположен
в одном и том же месте петли. 3. В антикодоновой
шпильке стебель всегда представлен семью спарен-
ными основаниями. Триплет, комплементарный
родственному кодону,- антикодон - находится в пет-
ле, состоящей из семи нуклеотидов. С 5'-конца
антикодон фланкируют инвариантный остаток ура-
цила и модифицированный цитозин, а к его З'-концу
примыкает модифицированный пурин, как правило
аденин. 4. Еще одна шпилька состоит из стебля
длиной три-четыре пары нуклеотидов и петли варь-
ирующего размера, часто содержащей урацил в вос-
становленной форме-дигидроурацил (DU).
Наиболее сильно варьируют нуклеотидные по-
следовательности стеблей, число нуклеотидов меж-
ду антикодоновым стеблем и стеблем ТТС (вариа-
бельная петля), а также размер петли и локализация
остатков дигидроурацила в DU-петле.
Рентгеноструктуриый анализ некоторых молекул
тРНК позволил выявить их характерную четвертич-
ную структуру (рис. 3.29, Б Г). Эта структура более
компактна, чем структура «клеверного листа». Она
образуется благодаря внутримолекулярным взаи-
модействиям, сближающим DU- и ТТС-шпильки.
В результате молекула тРНК выглядит так, как
будто она состоит из двух взаимно перпендикуляр-
ных частей-в одной из них находится акцепторный
участок, в другой-антикодон. Из-за такого общего
вида молекулы структура получила название L-кон-
фигурации. L-структура представляется более адек-
ватной, чем «клеверный лист», особенно если учесть,
что тРНК играет роль адаптера при взаимодейст-
вии кодона и антикодона на рибосоме.
Обычно акцепторами для одной и той же амино-
кислоты служат несколько разных тРНК (изоакцеп-
торные тРНК) (рис. 3.30), имеющих разные антико-
доны, что позволяет им спариваться с кодонами-
синонимами. Отчасти этим объясняется и вырож-
денность кода, т. е. способность разных антикодо-
нов детерминировать одну и ту же аминокислоту.
Этерификация молекул тРНК. Для выполнения
функции адаптера в процессе трансляции мРНК
тРНК должна связаться с аминокислотой, соответ-
ствующей своему антикодону. Это происходит в ре-
3 АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
139
3'
А ОН
С Акцепторный
С конец
5' А
G С
С G Акцепторный
С С стебель
G U
А
U
DU-петля (j
DU G m2 А
DU С U С G
U
А Т^С- Т^Спетля
А стебель и mt
G А С А С А
m5 G
G
G
G
. -ми
Антикодоновыи т5
стебель 6 С
U £3т1Ь с
Ф
Вариабельная
петля
Т\[/С-стебель Акцепторный стебель
Антикодоновая
петля
А ф
Сгп А
U Y
-G А А
Б
J
Антикодон
J
В
РИС. 3.29.
Типичная эукариотическая тРНК: дрожжевая тРНКРЬе. А.
Развернутая структура, имеющая форму клеверного
листа. Б. Свернутый «клеверный лист»; рибозофосфат-
ный остов изображен в виде непрерывной ленты, а во-
дородные связи-в виде стержней. В и /"проволочная
и пространственная модели свернутого «клеверного лис-
та» соответственно. Структура тРНК на рис. Г повернута
относительно структуры на рис. Б на 180°. Антикодон во
всех случаях находится внизу структуры. [Рис. Б. В
и Г любезно предоставлены S. М. Kim. См.: S. М. Kim Bt
al.. Science, 185 (1974), p. 435.]
140
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
3'
А—ОН
С
РИС. 3.30.
Изоакцепторные тРНК для валина у Е. coli. Эти две тРНК
различаются своими нуклеотидными последователь-
ностями, антикодонами, типом и положением модифи-
цированных оснований
3'
DU-петля и
п,, А
DU G m2
DU С U С G
сто
U - 5-карбоксиметоксиуридин
гпб
А - N- метипаденозин
т7
G — 7 метипгуанозин
DU- Дигидроуридин
S4
U - 4-тиоуридин
Т — Тимидин
Ф — Псевдоуридин
С
Антикодоновыи А
стебель
А
А
С Акцепторный
С конец
А
С
G Акцепторный
£ стебель
U
U
А ТфС- Т\{/Спетпя
А стебель с и m1
G А С А С А
гп5 G
С и G U G С
С Т
г.
G A G „
q q Вариабельная
петля
и
Антикодоновая и Y
петля
Антикодон
зультате ATP-зависимой реакции, катализируемой
специфическими ферментами аминоацил-тРНК- син-
тетазами (рис. 3.31). В ходе реакции АТР расщеп-
ляется на 5'-адениловую кислоту (АМР) и неоргани-
ческий фосфат (РР,), а высвобождаемая при этом
энергия используется для присоединения карбо-
ксильной группы аминокислоты к одной из гидро-
ксильных групп рибозы на З'-конце тРНК. На самом
деле образование аминоацил-тРНК проходит в два
этапа. На первом этапе карбоксильная группа ами-
нокислоты присоединяется к а-фосфату АТР, что
сопровождается высвобождением неорганического
фосфата и образованием аминоацил-аденилата.
Аминоацил-аденилат обладает очень высокой реак-
ционной способностью и стабилизируется благо-
даря прочному связыванию с ферментом. Второй
этап состоит в переносе аминоацильной группы от
связанного с ферментом аминоацил-аденилата на 2'-
или З'-ОН-группу концевой рибозы тРНК. Потенци-
ала переноса ацильной группы аминоацил-тРНК
более чем достаточно для образования пептидной
связи без дополнительного поступления энергии.
Ключевой особенностью ' реакции, приводящей
к аминоацетилированию тРНК, является специфич-
ность участвующих в ней ферментов. Присоедине-
ние к тРНК каждой из 20 аминокислот, встречаю-
щихся в белках, катализируется определенной ами-
ноацил-тРНК-синтетазой. Фермент должен отли-
чить одну аминокислоту от 19 других и перенести ее
к одной или нескольким изоакцепторным тРНК из
имеющихся примерно 75 других тРНК. Вспомним
при этом, что многие аминокислоты очень сходны
по структуре: лейцин, валин и изолейцин; валин
и треонин; аспарагиновая и глутаминовая кислоты.
Аминоацил-тРНК-синтетазы должны отличить
«свои» тРНК от всех других, несмотря на удиви-
тельное сходство их вторичной и третичной струк-
тур. Поэтому необходимо, чтобы ферменты облада-
ли очень высокой специфичностью, позволяющей
им сделать правильный выбор из столь родствен-
ных структур и избежать ошибок при синтезе белка.
Комментарий по поводу структур аминоацил-
тРНК синтетаз и их способности к узнаванию
аминокислот и родственных тРНК Многие амино-
ацил-тРНК-синтетазы удалось очистить. Некото-
рые из них состоят из одной полипептидной цепи,
другие-из двух или четырех идентичных цепей,
каждая мол. массой от 35 до 115 кДа. Некоторые
димерные и тетрамерные ферменты состоят из субъ-
единиц двух типов. Четкой корреляции между раз-
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
141
Н .°
Аминокислота R-C-C
1 'о-.
+ NH3
О
н
-о-р-сг
6
-О-Р=о
?,0
,Р- Рибозоаденин
АТР
Аминоацил-тРНК—
синтетаза
о- о-
_ _ Неорганический _
„ „ пирофосфат У
"О-P О-Р-О-----------►‘О-Р-ОН
6-
РИС. 3.31.
Образование аминоацил-тРНК. Амино-
ацил-тРНК-синтетаза катализирует обра-
зование ферментсвязанного промежуточ-
ного продукта аминоацил-аденилата, с по-
мощью которого аминоацильная единица
переносится на тРНК.
Синтетаза
н ,р ?
R-C-C - О-Р - Рибозоаденин
। if
+ NH3 О
1
I
мером молекулы фермента или характером его
субъединичной структуры и специфичностью не су-
ществует.
Исследования взаимодействия между амино-
ацил-тРНК - синтетазами и родственными им тРНК
не позволили выяснить природу их высокой специ-
фичности. Большинство работ показало, что специ-
фичность фермента определяется его прочным свя-
зыванием с акцепторным концом тРНК, DU-участ-
ком и вариабельной петлей. Некоторые ферменты,
по-видимому, не распознают антикодоновый трип-
лет и катализируют реакцию аминоацетилирования
даже при измененном антикодоне. Однако отдель-
ные ферменты проявляют пониженную активность
по отношению к таким модифицированным тРНК
и при замене антикодона присоединяют не ту ами-
нокислоту. Следовательно, в некоторых случаях су-
щественным оказывается и взаимодействие с анти-
кодоновой петлей. В любом случае акцепторный
конец тРНК должен быть ориентирован так, чтобы
каталитический центр фермента смог перенести свя-
занный аминоацил-аденилат к концевому нуклеоти-
ду тРНК.
В какой-то степени способность фермента при-
соединять нужную аминокислоту к родственной
тРНК зависит от специфического связывания ами-
нокислоты. Однако, если безошибочное распознава-
ние родственных аминокислот невозможно, синте-
тазы могут исправлять ошибки, происходящие при
присоединении. Например, нельзя полностью ис-
ключить возможность связывания валина изолей-
цил-тРНК синтетазой из-за сходства размера и
структуры изолейцина и валина. Дефект в специфи-
чности обнаруживается в первой же реакции: изо-
лейцил-тРН К-синтетаза образует ферментсвязан-
ный валил-аденилат, хотя и с меньшей эффектив-
ностью, чем изолейцил-аденилат, однако такой акти-
вированный валин не связывается ни с тРНК Val, ни
с тРНК||е. Вместо этого ферментсвязанный валил-
АМР быстро гидролизуется в присутствии тРНК||е.
142
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
и образование валил-тРНК||е предотвращается. По-
добный механизм позволяет валил-тРНК- синтета-
зе различать валин и треонин, а метионил-тРНК-
синтетазе отличать треонин от метионина. Очевид-
но, что аминоацил-тРН К-синтетазы пользуются
механизмом коррекции с целью предотвращения
неизбежных ошибок в аминоацетилировании тРНК.
И напротив, механизм, с помощью которого удаля-
лась бы уже присоединенная к тРНК неправильная
аминокислота, отсутствует. В таких случаях амино-
кислота занимает неправильную позицию в белке.
Частота таких ошибок очень низка. В гемоглобине
кролика, например, валин оказывается в местах,
обычно занимаемых изолейцином, только в одном
из 25 000- 50 000 возможных случаев (число остатков
изолейцина в белке). Таким образом, точность пер-
вого шага на сложном пути считывания генетиче-
ской информации обеспечивается четкой работой
разных аминоацил-тРНК.
б. На рибосомах осуществляются
спаривание аминоацил-тРНК
с кодонами и сборка белковых цепей
Во всех клетках имеются рибосомы, играющие
ключевую роль в синтезе белка; их число колеблется
от 20000 до 50000 в зависимости от белоксинте-
зирующей активности клеток. Рибосомы индиффе-
рентны в отношении синтезируемых ими белков или
тех клеточных мишеней, к которым они направляют
синтезированные продукты. Тип синтезируемого ри-
босомой белка в каждом синтетическом цикле дик-
туется мРНК, с которой рибосома оказалась связан-
ной. Внутри- или внеклеточная локализация белков
определяется их структурными особенностями и-в
зависимости от этих особенностей-характером
взаимодействия со специализированными мембра-
нами и органеллами.
Рибосомы про- и эукариот обладают в общем
очень сходными структурой и функциями. Тем не
менее из-за различий в структуре и организации
про- и эукариотических мРНК и из-за того, что
процессы транскрипции и трансляции у эукариот
являются сопряженными во времени и в пространст-
ве, тонкие различия между рибосомами про- и эука-
риот имеются. Типичными прокариотическими ри-
босомами являются рибосомы E.coli, и поскольку
их структура и функции изучены лучше остальных,
мы используем эту модель в последующем обсужде-
нии. Для сравнения мы остановимся на некоторых
структурных особенностях рибосом эукариот.
Строение рибосомных частиц. Рибосомы прока-
риот (называемые 708-частицами из-за их седимен-
тационных свойств) состоят из малых (30S) и боль-
ших (50S) субчастиц (рис. 3.32). 308-субчастицы со-
стоят из единственной молекулы рРНК (16S) разме-
ром 1542 нуклеотида и 21 белка с разной мол.
массой (S1-S21). 508-субчастицы содержат две
рРНК-большую (23S), состоящую из 2904 нуклео-
тидов, и более мелкие (5S), из 120 нуклеотидов; они
связаны с 34 разными белками (L1-L34). Нуклео-
тидные и аминокислотные последовательности всех
рРНК и белков известны. Электронно-микроскопи-
ческие исследования 708-рибосом (рис. 3.33) и пост-
роения их трехмерных моделей (рис. 3.34) показали,
что малая и большая субчастицы соприкасаются
в нескольких точках, но самой характерной особен-
ностью является наличие бороздки между ними,
необходимой, по-видимому, для размещения в ней
мРНК на время трансляции.
И малая, и большая рибосомные субчастицы
могут диссоциировать на составляющие молекулы
РНК и белка. Более того, даже после отделения друг
от друга молекулы всех РНК и белков способны
восстанавливать исходную функционально актив-
ную рибосомную субчастицу, если их смешать в со-
ответствующих условиях. Это означает, что вся
информация о сборке мультимерного комплекса
заключена в структуре его компонентов. Экспери-
менты по реконструированию рибосом позволяют
лучше понять характер взаимодействия между эти-
ми компонентами и определить возможный поря-
док, в котором собираются белки и РНК in vivo.
Кроме того, в подобных экспериментах можно про-
верить совместимость эквивалентных РНК или бел-
ковых субчастиц из различных источников (напри-
мер, из отдаленно родственных прокариот или из
прокариот и эукариот). Далее, с помощью этого
метода можно оценить способность мутантных
РНК или белков к взаимодействию с восстановле-
нием структуры рибосом и проявлению различных
видов активности, присущих реконструированным
рибосомам.
Рибосомы эукариот, находящиеся в цитозоле,
также состоят из малых (40S) и больших (60S)
субчастиц (рис. 3.32). Малые субчастицы содержат
одну молекулу РНК (18S) размером 1900 нуклеоти-
дов и 30-35 белков; большие-три цепи РНК длиной
120 (5S), 160 (5, 8S) и 4800 (28S) нуклеотидов и 45-50
белков. Рибосомы митохондрий и хлоропдастов
отличаются от цитозольных рибосом. Как правило,
они меньше и содержат меньшее количество белков
и различных рРНК. Данные по физическому и хими-
ческому реконструированию более сложных эука-
риотических хромосом значительно уступают ана-
логичным данным, полученным для E.coli.
Необходимо выделить два важных в функцио-
нальном отношении участка, образующихся при
ассоциации субчастиц в процессе формирования
708-рибосомы (рис. 3.35). Это участки, в которых
происходит связывание двух тРНК- одной, присо-
единенной к растущей белковой цепи (Р-участок),
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
143
21 нм ----1
Мол. масса 1 800 000
5S- рнк 23S- РНК
Мол. масса 1 000 000
16S-РНК
120
нуклеотидов
3000
нуклеотидов
1500
нуклеотидов
160
нуклеотидов
120
нуклеотидов
2000
нуклеотидов
5000
нуклеотидов
30 35 белков
45—50 белков
РИС. 3.32.
Состав типичных рибосом про- и эукариот.
и другой, несущей следующую добавляемую к цепи
аминокислоту (A-участок) (разд. 3.6. б).
Особые тРНК и некоторые вспомогательные бел-
ки, участвующие в трансляции. Как у про-, так
и у эукариот имеются два вида тРНК, которые
связывают метионин. У прокариот они обознача-
ются как тРНКре1 и tPHK£JcI, а у эукариот- соответ-
ственно тРНК^1 и тРНК^е|. Каждая из обоих видов
тРНКМе| как у про-, так и у эукариот аминоацетили-
руется метионином с помощью соответствующих
аминоацил-тРНК-синтетаз. тРНКре‘ прокариот и
тРНК^1 эукариот обладают необычными свойства-
ми, позволяющими им функционировать в качестве
адаптеров при инициации синтеза полипептидной
цепи в соответствующих инициаторных AUG-кодо-
нах. тРНК£)е1 про- и эукариот узнают AUG-кодоны
в белок-кодирующих последовательностях.
У прокариот аминогруппа метионил-тРНКрс1
144
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 3.33.
Электронные микрофотографии рибосом Е. coli. Буква-
ми S и L на нижнем левом фото обозначены соответст-
венно 30S- и 505-субчастицы. Стрелкой отмечена бо-
роздка между двумя субчастицами. На верхней фото-
графии видны 705-моносомы при увеличении 350000.
На фото внизу представлены при большем увеличении
(560000) 705-рибосомы,‘а также большая (50S) и ма-
лая (30S) субчастицы. [М. Boublik, Cytologie 14 (1977).
р. 203 ]
Малая субчастица
РИС. 3.34.
Реконструированные изображения 30S-, 50S- и 705-ри-
босом Е. coli, полученные с помощью данных электрон-
ной дифракции. Субчастицы представлены в двух
взаимно перпендикулярных проекциях. [J.A. Lake,
Scientific American, 245 (1981), р. 84.]
Большая субчастица
(met-тРНК ре‘), но не метионил -тРН К £]е| (met-
tPHK£JcI) формилируется особым ферментом (мети-
онил-тРНК - трансформилазой) до Fmet-TPHKpcl с
использованием в качестве донора формильной
группы М10-формилтетрагидрофолата (рис. 3.36).
Очевидно, трансформилаза отличает met-тРНК р01
от met-тРНК Fmet-TPHKpel используется исклю-
чительно для инициации белковых цепей, а met-
тРНК £JC,~ только для декодирования внутренних
метиониновых кодонов. Несмотря на то что
тРНК|Мс1 эукариот также используется только для
инициации, ее метионильная группа не подвергается
формилированию. Очевидно, некие особые свойст-
ва, присущие тРНК!461 и необходимые для выполне-
ния ею специальной инициаторной функции, связа-
ны исключительно с ее нуклеотидной последова-
тельностью и/или трехмерной структурой.
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
145
РИС. 3.35.
Схема, показывающая расположение Р- и А-участков
в 705-рибосоме Е. coli. В формирование этих участков,
по-видимому, вовлечены как 30S-, так и 50Б-субчасти-
цы. Показана предполагаемая область связывания мРНК.
Известны белки, которые только временно, на
период трансляции, связываются с рибосомами.
Они играют важную роль при инициации, элонга-
ции и терминации синтеза белковой цепи. Прежде
чем подробно обсуждать эти процессы (разд. 3.6),
мы познакомим читателя с такими белками и крат-
ко опишем их свойства и роль в трансляции.
Эти белки, называемые факторами инициации
и обозначаемые IF-1, 1F-2 и IF-3, необходимы для
инициации трансляции мРНК с образованием бел-
ков. IF-1 и IF-3 связываются с 308-субчастицей, что
обеспечивает ее взаимодействие с комплексом, об-
разуемым IF-2 и уникальной инициаторной амино-
ацил-тРНК, Fmet-тРНКрй. Именно комплекс 30S-
субчастицы со всеми факторами инициации и Fmet-
тРНКре| узнает соответствующий AUG-кодон в
н
I
met- тРНК™е* №°-формилтетрагидрофолат
I тегтРНК™е1-формилтрансфераза
СН2
А гн Тетрагидрофолат
М-формил-теХ-тРНК Tet
РИС. 3.36.
Формирование метионил-тРНКр'1 у E.coli.
мРНК. Когда формирование инициаторного комп-
лекса завершается присоединением 508-субчасти-
цы, все три инициаторных белка отсоединяются.
Для доставки следующей аминоацил-тРНК к ри-
босоме нужны два белка, называемые факторами
элонгации, EF-Tu и EF-Ts. EF-Tu с присоединенным
к нему GTP связывает все аминоацил-тРНК, кроме
Fmet-тРНКри доставляет их к A-участку компле-
кса 70S-рибосома мРНК. По ходу процесса образу-
ется EF-Tu-GDP, и для восстановления EF-Tu-GTP
нужен EF-Ts. В элонгации цепи участвует еще один
белок, EF-G; он обеспечивает перемещение рибосо-
мы по мРНК при трансляции кодонов. Для терми-
нации синтеза полипептидной цепи в одном из трех
стоп-кодонов также нужны особые белки, только
временно присоединяющиеся к трансляционному
комплексу. Известны три таких белка: RF-1 вызыва-
ет отделение полипептидной цепи при считывании
кодонов UAA и UAG; RF-2 действует аналогичным
образом при считывании UAA и UGA, а EF-3 может
облегчить работу двух других факторов.
Все многообразие вспомогательных белков, не-
обходимых на различных этапах сборки белков
в клетках эукариот, изучено значительно слабее,
а их функции пока недостаточно ясны. Для инициа-
ции нужно не менее пяти таких белков; некоторые из
них по своим функциям, по-видимому, аналогичны
прокариотическим белкам IF-2 и [F-3. Более сложно
устроен и аппарат элонгации; он снабжен значитель-
но большим количеством белков, участвующих как
в связывании аминоацил-тРНК с рибосомами, так
и в перемещении рибосом. Терминация трансляции
у эукариот также изучена слабо; тем не менее здесь,
по-видимому, необходим только один белок (eRF).
Важным этапом терминации или отделения белко-
вой цепи от мРНК является гидролиз GTP.
3.6. ТРАНСЛЯЦИЯ мРНК
У ПРОКАРИОТ
Зная всех участников процесса, мы можем теперь
приступить к рассмотрению химических реакций,
протекающих при синтезе полипептидов, т. е. реак-
ций, участвующих в собственно трансляции. Не-
смотря на то что этот процесс протекает непрерыв-
но от старта к финишу, обычно выделяют три его
этапа: инициацию, элонгацию и терминацию. Рас-
сматривая каждый из этапов направляемого мРНК
синтеза полипептидной цепи, мы должны учитывать
два основных свойства этого процесса. Во-первых,
полипептидные цепи синтезируются однонаправлен-
но: с амино-конца к карбокси-концу (рис. 3.37). При
этом карбоксильная группа уже образовавшегося
участка полипептидной цепи соединяется с амино-
группой следующей присоединяемой аминокислоты
с помощью пептидной связи. Это может произойти,
10 243
146
ЧАСТЬ I, МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 3.37.
Сборка полипептидной цепи. Кодоны
мРНК считываются один за другим
в направлении 5' -» 3'. начиная с ини-
циаторного кодона AUG, который
связывается с N-формилметионил-
тРНК“е‘. Полипептид синтезируется
от N- к С-концу.
P-участок А-участок
РИС. 3.38.
Этапы пептидилтрансфераэной реакции. Азот амино-
группы присоединяющейся аминокислоты осуществляет
нуклеофильную атаку активированной карбоксильной
группы растущей цепи, в результате чего образуется
новая пептидная связь.
Растущая полипептидная цепь
С
С
А
х—4 Leu,
z—TSerY—Следующая
FmelY^Y тРНК,
V—У несущая
аминокислоту
лишь если карбоксильный конец растущей полипеп-
тидной цепи находится в активированном состоя-
нии. Как мы уже отмечали, необходимая для этого
энергия поступает в результате присоединения кар-
боксильной группы растущей полипептидной цепи
и каждой присоединяемой аминокислоты к тРНК
(рис. 3.38). Во-вторых, считывание мРНК начинает-
ся с кодона AUG, который обозначает 5'-конец
кодирующей последовательности и детерминирует
N-концевую аминокислоту синтезируемого поли-
пептида (рис. 3.37). При инициации первая и вторая
молекулы аминоацил-тРНК спариваются с первыми
двумя кодонами мРНК. Далее трансляция продол-
жается в направлении 5' -> 3' кодон за кодоном до
тех пор, пока не достигнет стоп-сигнала, располо-
женного сразу же за кодоном, детерминирующим
С-концевую аминокислоту.
а. Условия инициации
708-рибосома способна осуществлять трансля-
цию последовательности мРНК, но не может иници-
ировать этот процесс. При связывании инициатор-
ных белков IF-1 и IF-2 с 308-субчастицей происхо-
дит диссоциация 708-рибосомы. 308-субчастица в
комплексе с IF-1 и IF-3 связывает IF-2, GTP и Fmet-
тРНКре1. Такой полный комплекс связывается с
5'-концом кодирующей последовательности мРНК
вблизи кодона AUG (рис. 3.39). Очевидно, IF-2 спо-
собен отличить Fmet-TPHKp61 от met-тРНК £Jet, и эта
специфичность отчасти обеспечивается N-формиль-
ной группой, отсутствующей у met-тРНК £Jet. Фор-
мирование полноценного функционального комп-
лекса инициации завершается ассоциацией 50S-cy6-
частицы с преинициаторным комплексом. С образо-
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
147
РИС. 3.39.
События, предшествующие инициации
трансляции. При связывании IF-1 и IF-3
с ЗОБ-субчастицей происходит диссоциация
70Б-рибосомы. Затем образуется преини-
циирующий комплекс, состоящий из 30S-
субчастицы, М-формилметинил-тРНК“и и
мРНК. Последующая ассоциация этого комп-
лекса с 50Б-субчастицей сопровождается
отделением IF-1, IF-2 и IF-3 и гидролизом
одной молекулы GTP до GDP.
ванием функциональной 708-субчастицы отделяют-
ся все три белка инициации.
Как узнается первый кодон? Связывание 30S-cy6-
частицы с мРНК находится под строгим контролем
нуклеотидной последовательности, расположенной
примерно за 10 нуклеотидов до 5'-конца инициатор-
ного кодона. Взаимодействию способствует компле-
ментарное спаривание этой богатой пуринами по-
следовательности из пяти - восьми нуклеотидов, на-
зываемой последовательностью Шайна-Дальгарно,
с полипиримидиновым участком, находящимся
вблизи З'-конца 16S-pPHK (рис. 3.40). Эффектив-
ность инициации существенно зависит от степени
комплементарности между последовательностями
Шайна-Дальгарно и 16S-pPHK и от расстояния
пурин-богатого участка до кодона AUG. Эта осо-
бенность наряду с другими, о которых будет сказа-
но позднее, и объясняет различия в эффективности
трансляции различных мРНК.
Процесс инициации зависит также от вторичной
5'
Белок
мРН К
S'AAUCUUGGAGG С UUUUUU AUGGUUCGUUCU3' 0X174: А-белок
5’ U AACUAAGGAUGAAAUGCAUGUCUAAGACA3' Qi репликаза
5" U С CUAGGAGGUUUGACCUAUGCGAGCUUUU3' R'7: А-белок
5’AUGUACUAAGGAGGUUGUAUGGAACAACGC3' СГО-белок
РИС. 3.40.
Богатая пуринами последовательность Шайна-Даль- 16S-pPHK E.coli. В нижней части рисунка приведены
гарно, расположенная до инициирущего кодона AUG, типичные последовательности Шайна-Дальгарно в
спаривается с участком, находящимся вблизи 3 -конца мРНК некоторых бактериофагов.
ю*
148 ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 3.41.
Первичная и предполагаемая вторичная структуры
5'-концевой части генома бактериофага MS2. Несколь-
ко инициирующих кодонов (в том числе необычный
кодон GUG вблизи 5'-конца) оказываются экраниро-
ванными при внутримолекулярном спаривании основа-
ний. Только кодон AUG (показан стрелкой), находя-
щийся на вершине шпильки, остается доступным и свя-
зывается с рибосомами сразу после инфекции. Участок
последовательности, начинающийся после кодона AUG,
кодирует белок оболочки MS2. Заметим, что после-
довательность Шайна-Дальгарно, находящаяся перед
кодоном AUG в этой модели, также относительно
доступна; два остатка G образуют слабые водородные
связи с остатками U. (С любезного разрешения
W. Piers.)
и и
и и
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
149
CCCC*UGCCC'JUCCt)*cUV**AUUGCA4
iliit ttuniitibcicuaikkii6i
150
ЧАСТЬ I, МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
структуры того участка молекулы мРНК, в котором
находится инициаторный кодон AUG. Если этот
кодон окажется внутри двухцепочечного участка, то
инициация будет неэффективна или вовсе блокиру-
ется (рис. 3.41). Именно таким образом может регу-
лироваться доступность инициаторного AUG-кодо-
на для 308-рибосомы. AUG становится недоступ-
ным, если он оказывается спаренным при образова-
нии конденсированной формы зрелой мРНК, и, на-
против, доступным для инициации во время транс-
крипции мРНК или во время трансляции других
кодирующих последовательностей на той же моле-
куле мРНК.
б. Элонгация полипептидной цепи
При ассоциации двух рибосомных субчастиц пе-
ред инициацией трансляции образуются два функ-
циональных участка, необходимых для сборки бел-
ка: Р- и A-участки. Fmet-TPHKpet занимает Р-учас-
ток, а для образования первой пептидной связи
необходимо, чтобы аминоацил-тРНК, соответст-
вующая следующему кодону, заняла A-участок. Для
этого аминоацил-тРНК должна сначала связать EF-
Tu и GTP. Образовавшийся тройной комплекс
(аминоацил-тРНК-fEF-Tu-GTP]) и доставляет ами-
ноацил-тРНК к A-участку (рис. 3.42). GTP в это
время гидролизуется, и комплекс (EF-Tu-GDP) от-
деляется от рибосомы. Когда оба участка, А и Р,
заняты, пептидилтрансферазная активность 50S-cy6-
частицы катализирует перенос группы Fmet с ее
тРНК на аминогруппу аминоацил-тРНК, находя-
щейся в A-участке. В результате в A-участке оказы-
вается дипептидил-тРНК, а в Р свободная тРНК.
Для прочтения следующего кодона и удлинения
полипептидной цепи еще на одну аминокислоту вся
серия реакций должна повториться. Однако, прежде
чем это произойдет, тРНК должна освободить Р-
участок, образовавшаяся дипептидил-тРНК должна
переместиться на него, а новый кодон должен быть
готов к тому, чтобы занять освободившийся А-учас-
ток (рис. 3.43). Все эти процессы осуществляются
с помощью EF-G при GTP-зависимой транслокации
рибосомы. Источником энергии для перемещения
рибосомы к следующему триплету кодирующей по-
следовательности и удаления свободной тРНК из
P-сайта служит реакция гидролиза GTP до GDP.
Теперь новый кодон, занявший A-сайт, готов к спа-
риванию с родственной аминоацил-тРНК.
Сразу после связывания аминоацил-тРНК с А-
участком высвобождается комплекс EF-Tu-GDP и
происходит регенерация функционально активного
EF-Tu-GTP (рис. 3.44). При этом EF-Tu-GDP взаи-
модействует с белком EF-Ts, что приводит к отделе-
нию GDP и образованию комплекса EF-Tu-EF-Ts.
Далее EF-Tu EF-Ts взаимодействует с GTP, проис-
Образование первой пептидной связи. Преинициирую-
щий комплекс 705-рибосомы с мРНК и N-формилме-
тионил-тРНКр", находящийся в P-участке, связывает
тройной комплекс аланил-тРНКА|“- EF-Tu-GTP. Аланил-
тРНКА|а перемещается к A-участку и связывается со
вторым кодоном, GCU, с помощью антикодона
5'-AGC-3*. GTP гидролизуется, и комплекс EF-Tu GDP
отделяется. В результате пептидилтрансферазной реак-
ции дипептидил-тРНК занимает А-участок.
ходит регенерация EF-Tu-GTP и отделение EF-Ts,
и оба соединения оказываются готовыми к следую-
щему циклу.
Необходимо отметить несколько особенностей
процесса элонгации. 1. При образовании каждой
пептидной связи расходуется энергия, равная четы-
рем энергетическим эквивалентам (если за один
эквивалент принять энергию образования фосфат-
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
151
EF—G
РИС. 3.43.
Элонгация полипептидной цепи. Фактор EF-G осуществ-
ляет GTP-зависимое перемещение 705-рибосомы вдоль
мРНК. Далее GTP гидролизуется, тРНК удаляется из
P-участка и пептидил-тРНК перемещается из А-участка
на освободившийся P-участок. Теперь A-участок и сле-
дующий кодон готовы принять «сеою» аминоацил-
тРНК.
GDP Pi
EF-Tu-GTP
Перемещение
аминоацил-тРНК
на А-участок
EF-Tu-GDP+Pi
EF-Ts
EF-Tu-EF-Ts + GDP
GTP
EF-Tu-GTP+EF-Ts
РИС. 3.44.
Регенерация EF-Tu GTP после высвобождения EF-
-Tu GDP из комплекса с аминоацил-тРНК
ной связи): два эквивалента АТР потребляются при
аминоацилировании тРНК и два эквивалента GTP
в каждом цикле элонгации. 2. При инициации транс-
ляции IF-2 узнает Fmet-TPHKp'* среди всех других
аминоацил-тРНК, a EF-Tu отличает met-тРНК рс1 от
Fmet-TPHKjJet при внедрении в А-участок. 3. Факто-
ры элонгации EF-Tu и EF-G то присоединяются, то
отделяются от рибосомы в зависимости от того,
связаны ли они с GTP или с GDP соответственно.
4. Растущая полипептидная цепь всегда соединена
своим карбоксильным концом с тРНК, которая
соответствует С-концевой аминокислоте в растущей
полипептидной цепи. 5. Пептидилтрансфераза ката-
лизирует формирование пептидных связей между
карбоксильным концом растущей цепи и амино-
группой аминоацил-тРНК.
в. Терминация элонгации
полипептидной цепи
Процесс последовательной трансляции кодонов
в конце концов доходит до того момента, когда
в A-участке оказывается один из трех терминирую-
щих кодонов- UAG, LJAA или LJGA (рис. 3.45). Из-
за отсутствия тРНК, отвечающих этим кодонам,
полипептидил-тРНК остается связанной с Р-участ-
ком. Здесь вступают в действие специфические фак-
торы RF-1 и RF-2, которые катализируют отсоеди-
нение полипептидной цепи от тРНК, отделение их
обоих от рибосомы, а 708-рибосомы-от мРНК.
RF-1 узнает в A-участке кодон LJAA или LJAG; RF-2
включается в том случае, когда в A-участке оказы-
вается LJAA или LJGA; RF-3 облегчает работу двух
других факторов. Если терминирующим кодоном
является LJAA, то эффективность процесса термина-
ции оказывается наибольшей, поскольку этот кодон
узнают оба фактора- RF-1 и RF-2. Однако, каким
бы из стоп-кодонов ни обеспечивалась терминация,
ее эффективность зависит от фланкирующих эти
кодоны последовательностей в мРНК. Хотя общие
черты и даже некоторые детали процесса термина-
ции известны, точный его механизм и каталитиче-
ская роль факторов RF-1 и RF-2 пока неясны.
3.7. НЕКОТОРЫЕ
ОБЩИЕ ОСОБЕННОСТИ
ПРОЦЕССА ТРАНСЛЯЦИИ
В предыдущем разделе мы подробно рассмотре-
ли события одного цикла трансляции мРНК на
рибосоме. Здесь акцент будет сделан на некоторых
общих принципах процесса в целом и на нарушении
или блокировании его отдельных стадий.
152
ЧАСТЬ 1 МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ; ОБЗОР
РИС. 3.45.
Терминация трансляции. Когда в A-участке оказывается
один из стоп-кодонов, факторы освобождения ини-
циируют серию реакций, приводящую к отделению син-
тезированной полипептидной цепи, тРНК и мРНК от
705-рибосомы.
а. Одновременная трансляция
молекулы мРНК
более чем одной рибосомой
После инициации трансляции 708-рибосома пе-
ремещается от сайта инициации по мере считывания
каждого последующего кодона. Когда расстояние
от рибосомы до сайта инициации достигнет величи-
ны 100-200 нуклеотидов, в этом сайте может про-
изойти новая инициация (рис. 3.46). Более того, как
только вторая рибосома пройдет такое же расстоя-
ние, может произойти третья инициация, и т. д.
Итак, одну и ту же белок-кодирующую последова-
тельность мРНК могут одновременно транслиро-
вать несколько рибосом. Подобные мультирибо-
сомные трансляционные комплексы называются по-
лирибосомами или полисомами. Каждая рибосома
полисомы обязательно целиком транслирует коди-
рующую последовательность с образованием пол-
норазмерного полипептида. От каждой рибосомы
в полисоме отходит полипептид, длина которого
соответствует расстоянию, пройденному рибосомой
от сайта инициации. Эта длина пропорционально
увеличивается по мере продвижения рибосомы по
мРНК, начиная с 5'-конца кодирующей последова-
тельности.
б. Трансляция бактериальных мРНК
может осуществляться параллельно
транскрипции
Образование мРНК при транскрипции гена или
кластера генов начинается с 5'-конца в направлении
к З'-концу (разд. 3.2). Следовательно, формирование
комплекса инициации трансляции может произойти
сразу же после того, как будет транскрибирована
последовательность, в пределах которой находится
инициирующий кодон (рис. 3.47). И в самом деле,
синтез полипептидной цепи обычно начинается до
завершения транскрипции З'-концевой части мРНК.
Если бактериальная транскрипционная единица
содержит более одной кодирующей белок последо-
вательности, как, например, в случае trp- или 1ас-
оперонов (разд. 3.11), то на рибосомах может на-
чаться и даже завершиться трансляция первой из
этих кодирующих последовательностей еще до
окончания транскрипции остальных. Матричные
РНК, состоящие из многих белок-кодирующих
участков, часто транслируются последовательно,
т. е. инициация, элонгация и терминация трансляции
первой кодирующей последовательности сопровож-
даются такими же событиями на втором, третьем
и последующих кодирующих сегментах. После того
как рибосомы доходят до сигнала терминации в
первой или любой другой кодирующей последова-
тельности, они отделяются от мРНК, и со следую-
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
153
Образование полирибосомы. После того как первая
рибосома удалится от сайта инициации на определен-
ное расстояние, вторая образует инициаторный комп-
лекс в том же сайте и начинает трансляцию. То же самое
затем проделывает третья рибосома и т. д. В результате
на одной и той же мРНК могут одновременно синтези-
роваться сразу несколько полипептидов.
щим инициаторным участком связывается новый
комплекс. Однако в некоторых случаях рибосомы
не отделяются от мРНК, а перемещаются вдоль
молекулы, образуя новые комплексы инициации
в других сайтах.
в. Рибосомы начинают новый раунд
после трансляции кодирующей
последовательности
Как мы уже говорили, когда осуществляющая
трансляцию 708-рибосома доходит до терминирую-
щего кодона, полноразмерная полипептидная цепь
отделяется от мРНК, а обе они-полипептид и
тРНК - отделяются от рибосомы, и происходит раз-
деление 708-рибосомы и мРНК. 708-рибосомы не
способны к инициации новых раундов синтеза поли-
пептидов и, следовательно, должны диссоциировать
на составляющие их 50S- и 308-субчастицы. Такая
диссоциация контролируется фактором инициации
IF-3 совместно с IF-1 (рис. 3.48). «Рибосомный»
цикл завершается ассоциацией 508-субчастицы с
308-субчастицей, связанной с мРНК и несущей IF-2,
Fmet-TPHKpcl и GTP, с образованием функциональ-
ного трансляционного 708-аппарата (рис. 3.39). Та-
ким образом, изменяя количество 30S- и 508-субчас-
тиц по отношению к их предшественнику - 708-рибо-
соме,-фактор IF-3 осуществляет общий контроль
уровня белкового синтеза.
г. Взаимодействие кодона
и антикодона
Большинство молекул тРНК спаривается более
чем с одним кодоном. Поскольку кодоны транслиру-
ются при участии антикодонов разных тРНК, мож-
но было бы ожидать, что для каждого из 61 кодона,
детерминирующего аминокислоты, имеется своя
тРНК. Однако не существует ни разных тРНК для
каждого из четырех валиновых или глициновых
кодонов, ни разных тРНК для обоих тирозиновых
или обоих лизиновых кодонов. Действительно, экс-
перименты in vitro и in vivo показали, что некоторые
тРНК могут транслировать более чем один кодон.
Так, кодоны UAU и UAC транслирует единственная
тРНКТуг (рис. 3.49). Поскольку антикодон этой
тРНКТуг имеет последовательность 5'-GUA-3', он
может образовать комплементарные пары с первы-
ми двумя основаниями любого из этих кодонов
(напомним, что спаривание происходит между анти-
параллельно ориентированными последовательно-
стями). Соответственно G способен спариваться как
с U, так и с С, находящимися в третьем положении
кодонов; аналогичным образом U, находясь на
5'-конце какого-либо антикодона, может спариться
и с А, и с G, находящимися на З'-конце соответст-
вующих кодонов. На самом деле трансляция всех
пар кодонов, у которых в третьей (3') позиции стоит
U или С, может осуществляться одной и той же
тРНК, у которой первым основанием в антикодоне
оказывается G или какое-то модифицированное ос-
нование. По-видимому, при спаривании кодонов
и антикодонов в А- и P-участках включаются какие-
то стабилизирующие взаимодействия, отличные от
154
ЧАСТЬ 1 МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
РИС. 3.47.
Транскрипция и трансляция у прокариот идут парал-
лельно. А. Схематическое представление транскрипции
ДНК и параллельной трансляции мРНК полирибосома-
ми. Б. Электронная микрофотография, на которой вид-
ны рибосомы, прикрепившиеся к молекулам РНК, кото-
рые транскрибируются с ДНК E.coli. К более длинным
цепям РНК. находящимся на большем расстоянии от
сайта инициации транскрипции, прикреплено и больше
рибосом (142000 х). [О. L. Miller, Jr., В.А. Hamkalo,
С. A. Thomas, Jr., Science, 169 (1970), р. 392.]
3 АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
155
РИС. 3.48.
«Рабочий цикл» 705-рибосом при синтезе
белка.
мРНК
156
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ ОБЗОР
Тирозиновые кодоны
tyr tyr
РИС. 3.49.
Большинство молекул тРНК спари-
вается более чем с одним кодоном.
Тирозиновые кодоны UAU и UAC
транслируются с помощью одной
тРНКТуг. Аналогично кодоны GAA
и GAG для глутаминовой кислоты
транслируются с помощью одной
тРНКс|“. В то же время тРНКТгр узна-
ет триптофановый кодон UGG, но не
узнает терминирующий кодон UGA.
Кодоны глутаминовой кислоты
5'
glu
Терминирующий кодон
тех, которые имеют место при обычном комплемен-
тарном спаривании оснований.
Анализ генетического кода показывает, однако,
что существуют специфические взаимодействия, по-
зволяющие различать кодоны, у которых в третьей
позиции стоит А или G. Например, тРНК, расшиф-
ровывающая кодон AUG как метионин, должна
отличать этот триплет от кодона AUA, обозначаю-
щего изолейцин, а тРНКТгр должна отличать трип-
тофановый кодон UGG от терминирующего кодона
UGA. Специфичность обеих этих операций декоди-
рования определяется спариванием С антикодона
с G, находящимся в третьем положении кодона
(рис. 3.49).
Модификация оснований в антикодонах может
еще сильнее ограничить диапазон возможных вза-
имодействий кодон - антикодон. Например, гипо-
ксантин (Нх), занимая место аденина в той позиции
антикодона, по которой происходит спаривание с
третьим основанием кодона, может обусловить спа-
ривание такого антикодона с кодонами, у которых
в последней позиции стоят основания U, С или А.
Разнообразие модификаций оснований в антикодо-
нах или-что встречается наиболее часто-основа-
ний, соседствующих с антикодоном, изменяет спе-
цифичность взаимодействия аминоацил-тРНК - ко-
дон. Таким способом обычно предотвращаются
ошибки при считывании третьего основания кодо-
нов и обеспечивается надежность процесса декоди-
рования.
Правила спаривания оснований, согласно кото-
рым молекулы тРНК одного типа могут узнавать
несколько разных кодонов, называются правилами
неоднозначного соответствия (или «качания» от
англ, “wobble” rules) (табл. 3.4). Следует отметить,
однако, что термин «качание», используемый для
описания некоторой свободы спаривания третьего
Таблица 3.4. Пары оснований, которые могут
образовываться согласно теории неоднозначного
соответствия
Основание антикодона, спаривающееся с третьим основанием кодона1’ Третье основание кодона
G U или С
С G
А и
и А или G
Нх A, U или С
11 U. С, A. G четыре обычных основания РНК; Нх дезами-
нированная форма аденина гипоксантин.
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
157
основания кодона, просто как бы затушевывает тот
факт, что мы до конца не знаем, какие именно
химические и структурные особенности обусловли-
вают кодон-антикодоновые взаимодействия в Р-
и A-участках рибосомы.
Мутации в кодонах и антикодонах. Мутации,
затрагивающие различные компоненты трансляци-
онного аппарата, могут изменить результат считы-
вания кодирующей последовательности. Наиболее
драматичные последствия вызывают те мутации
в гене, кодирующем белок, которые превращают
кодон, отвечающий какой-то аминокислоте, в тер-
минирующий кодон и тем самым приводят к преж-
девременному завершению синтеза из-за досрочной
терминации трансляции в мутировавшем сайте
(рис. 3.50). Примером может служить превращение
лизинового кодона ААА в UAA и глутаминового
кодона CAG в UAG. Аналогично любая мутация,
в результате которой происходит замена аминокис-
лотного кодона на кодон UGA, тоже вызовет преж-
девременную остановку синтеза полипептидной це-
пи. Однако, если в результате второй мутации
произойдет изменение соответствующего основания
в антикодоне тРНК, терминация может быть пред-
отвращена, или супрессирована, и образуется полно-
размерный, хотя и измененный, белок (рис. 3.51).
Например, если тРНКТуг, тРНКЕе“ или TPHKSer из-
менятся подобным образом, то они смогут прочи-
тать кодон UAG как аминокислотный. С помощью
различных механизмов может произойти ошибоч-
ная трансляция и таких мутантных кодонов, как
UAA и UGA. Мутации в тРНК-генах, затрагиваю-
мРНК
дикого типа
Мутантная
мРНК1
Мутантная
мРНК2
AUC CUA AAA UCU GUA AUA CAG AUG GGC
Мутации, приводящие
к терминации
AUC CUA UAA UCU GUA AUA CAG AUG GGC
или
AUC CUA AAA UCU GUA AUA UAG AUG GGC
Синтезируемый
полипептид
Полипептид .. , . ,
ile-leu-lys-ser-val-ile-gln-met-oly-
дикого типа
Мутантный ile_leu_coo-
полипептид^
Мутантный ile-leu-lys-ser-val-ile~COO~
полипептиД2
РИС. 3.50.
Мутации, приводящие к превращению внутренних кодо-
нов в терминирующие (стоп) кодоны, обусловливают
преждевременную терминацию трансляции.
щие основания, отличные от тех, которые составля-
ют антикодон, могут привести к изменению специ-
фичности или стабильности взаимодействий кодона
и антикодона. Благодаря таким механизмам может
быть предотвращена преждевременная терминация
синтеза полипептида, если терминирующий кодон
будет прочитан как смысловой. Подобная супрессия
терминации, как правило, не очень эффективна,
поэтому наряду с полноразмерными образуются
и укороченные, преждевременно терминированные
полипептидные цепи. Благодаря относительной не-
эффективности такой трансляционной супрессии не
приносит большого вреда и случайное проскакива-
ние терминирующих кодонов, находящихся на есте-
ственных концах кодирующих мРНК.
Миссенс-мутации, т. е. мутации, приводящие к
аминокислотным заменам и соо . тственно к утра-
те белком его функции, также могут быть реверти-
рованы благодаря супрессорным мутациям, вызы-
вающим ошибочное считывание мутантного кодона
(рис. 3.52). Это может произойти в том случае, если
тРНК, несущая нужную аминокислоту или любую
другую, которая может быть включена в данный
сайт белковой цепи, имеет антикодон, способный
к спариванию с мутантным кодоном. Мутации,
вызывающие сдвиг рамки считывания кодирующей
последовательности, также могут быть супрессиро-
ваны, если мутантные тРНК или рибосомы случай-
но транслируют два или четыре основания вместо
трех.
Итак, ошибки трансляции могут компенсировать
последствия нарушений кодирующей последова-
тельности. Мутационные изменения в антикодоне
тРНК-это наиболее распространенный механизм
супрессии; изменения в других участках молекулы
тРНК могут привести к неправильной этерификации
аминокислот аминоацил-тРНК - синтетазами или
ошибочному спариванию на рибосоме. Ошибки в
трансляции могут возникать и в том случае, если
в результате мутаций происходит изменение белков
или РНК-компонент рибосом, участвующих в ко-
дон-антикодоновом взаимодействии. Точность
трансляции уменьшается и под действием некото-
рых химических соединений (например, стрептоми-
цина), которые связываются с рибосомными белка-
ми в 308-субчастице. Такие случаи нарушения про-
цесса трансляции приводят к более тяжелым послед-
ствиям.
3.8. ТРАНСЛЯЦИЯ мРНК
У ЭУКАРИОТ
Процесс трансляции эукариотической мРНК в
основном аналогичен таковому прокариотической
мРНК. За некоторыми отмеченными выше исключе-
ниями, генетический код универсален и кодоны по-
158
ЧАСТЬ I, МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
Супрессорные тРНК
tyr
РИС. 3.51.
Трансляционная супрессия термини-
рующих кодонов. Мутации, вызыва-
ющие изменения в антикодонах
тРНКТуг, tPHKl'u или tPHKs", приво-
дят к тому, что терминирующие ко-
доны считываются как кодоны, отве-
чающие определенным аминокисло-
там.
Sly
В результате мутации
место глицина занял аргинин
Супрессорный мутант
РИС. 3.52.
Трансляционная супрессия миссенс-мутаций. В тРНКС1у
произошло такое изменение антикодона, что аргинино-
вый кодон был прочитан как глициновый.
Супрессорная тРНК^'У
с измененным антикодоном
узнает аргининовый кодон
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
159
следовательно транслируются с помощью специфи-
ческих аминоацил-тРНК- синтетаз на рибосомах.
Есть, однако, и три явных различия, обусловленных
определенными свойствами эукариотических кле-
ток. Во-первых, аппараты транскрипции и трансля-
ции у эукариот физически разобщены, поскольку
транскрипция осуществляется в ядре, а трансляция-
в цитоплазме. Во-вторых, на 5'- и З'-концах эукарио-
тических мРНК имеются особые структуры. И fl-
третьих, эукариотические мРНК, за исключением
мРНК, транскрибируемых с ДНК геномов вирусов,
обычно содержат только одну белок-кодирующую
последовательность.
Структура и свойства участников трансляции
эукариотической мРНК пока изучены гораздо хуже,
чем у прокариот. И хотя у эукариот выделяют те же
три стадии процесса-инициацию, элонгацию и тер-
минацию,-на каждой из них требуется больше не-
рибосомных белковых факторов. Несмотря на эти
различия, последовательности, кодирующие белки
прокариот, нормально транслируются эукариотиче-
скими системами трансляции при условии соответ-
ствующей модификации их мРНК на 3'- и 5'-концах
(рис. 3.8, Л). И наоборот, кодирующие последова-
тельности эукариот эффективно транслируются си-
стемами прокариот, если у них перед 5'-концом
инициаторного кодона AUG имеется последова-
тельность Шайна-Дальгарно. Это значит, что
трансляционные аппараты обоих типов организмов
могут осуществлять свои функции, несмотря на
особенности нуклеотидных последовательностей
мРНК из разных источников.
а. Особые модификации мРНК
эукариот
У эукариотических мРНК, транскрибированных
с ядерных или вирусных геномов РНК-полимеразой
II, всегда модифицированы 5'-концы, которые в
этом случае называют «кэпами» (рис. 3.53). РНК,
транскрибируемые эукариотическими РНК-полиме-
разами I (в том числе рРНК) и III (5S- и тРНК), не
кэпированы и имеют обычные 5'-фосфатные кон-
цы. У большинства мРНК, синтезируемых РНК-со-
держащими вирусами животных, также имеются
кэпы, хотя они синтезируются вирусными РНК-
транскриптазами. Многие некэпированные мРНК
неэффективно транслируются эукариотическими бе-
локсинтезирующими системами из-за слабого свя-
зывания рибосом с мРНК. Кэпирование происхо-
дит на 5'-нуклеозидтрифосфате вскоре после ини-
циации синтеза РНК-транскриптов и задолго до его
завершения. Детали процесса кэпирования изложе-
ны в разд. 8.3. в.
На З'-концах эукариотических мРНК имеются
еще и полиаденилатные последовательности. Такой
3'-«хвост» из 50-200 аденилатных остатков не коди-
руется смысловыми последовательностями соответ-
Метилгуаниловая кислота (кэп)
РИС. 3.53.
Кэп-структура на 5'-конце большинства эукарио-
тических мРНК. Кроме 7-метилгуаниловой кис-
лоты, присоединенной к первичному транскрипту
с помощью трифосфатного мостика, кэп часто
включает 2'-О-метильные группы, связанные с
первым или с первыми двумя рибозными ос-
татками транскрипта.
160
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
ствующих генов, а присоединяется посттранскрип-
ционно, после разрезания транскрипта в специфиче-
ском месте за сигналом терминации трансляции
(разд. 8.3. в).
б. Инициация трансляции
на 5'-кэпированных концах
малыми рибосомными субчастицами
Как мы уже говорили, обязательным этапом при
инициации трансляции прокариотической мРНК яв-
ляется диссоциация 708-рибосомы; точно так же
и 808-рибосомы должны диссоциировать до начала
трансляции эукариотических мРНК. Малая субчас-
тица (40S) в комплексе со множеством белков-по-
мощников (elF), из которых один или несколько
нужны для диссоциации рибосомы на составляющие
субчастицы, связывает особую инициаторную met-
тРНК1Мс|. И вновь для связывания инициаторной
аминоацил-тРНК необходимы GTP и особый бе-
лок -eIF-2. У эукариот, однако, met-TPHK|Mel не
подвергается N-формилированию; но, как и у прока-
риот, структура тРНК,Ми отличается от структуры
гРНК^1. Комплекс 40S. содержащий тН-тРНК^1,
GTP и целую армию других факторов elF, связыва-
ется с мРНК вблизи кэпированного 5'-конца или
прямо с этим концом; по крайней мере один из этих
факторов узнает кэп и связывается с ним. Малая
субчастица перемещается при помощи неизвестного
пока механизма от кэпированного конца до перво-
го кодона AUG. Никакой последовательности вбли-
зи кодона AUG, аналогичной последовательности
Шайна-Дальгарно, пока не обнаружено. Однако
эффективность работы AUG в качестве инициатор-
ного кодона зависит от наличия определенных
фланкирующих нуклеотидов. Такой преинициатор-
ный комплекс объединяется с 608-субчастицей в хо-
де энерго- и фактор-зависимой реакции с образова-
нием функционального комплекса инициации. Ини-
циация белкового синтеза может регулироваться
фосфорилированием и дефосфорилированием eIF-2.
в. Элонгация и терминация
полипептидной цепи
Поэтапная трансляция последовательных кодо-
нов с помощью аминоацил-тРНК у эу- и прокариот
в принципе сходна. GTP и фактор элонгации eEF-1,
соответствующий прокариотическому комплексу
EF-Tu и EF-Ts, периодически поставляют рибосо-
мам аминоацил-тРНК. GTP и eEF-2, являющиеся
функциональными аналогами прокариотического
EF-G, осуществляют транслокацию. Терминация
трансляции у эукариот также происходит в одном из
трех стоп-кодонов и сопровождается отделением
свободных полипептидных цепей, мРНК и, возмож-
но, 808-рибосом от мРНК. По-видимому, всю се-
рию терминационных событий осуществляют один
фактор eRF и GTP.
Биогенез эукариотической мРНК детально об-
суждается в разд. 8.3. Здесь мы лишь отметим, что
трансляция не начинается до тех пор, пока зрелая
мРНК не достигнет цитоплазмы, где и происходит
инициация. В результате последовательных актов
инициации образуются полисомы и одновременно,
как и у прокариот, начинается трансляция множест-
ва кодирующих белки последовательностей. Замет-
ное отличие трансляции у эукариот состоит в том,
что клеточные мРНК обычно содержат одну-единст-
венную кодирующую последовательность. Если в
мРНК имеется несколько таких областей, то после-
дующие либо вовсе не транслируются, либо транс-
лируются неэффективно.
3.9. ИНГИБИТОРЫ
ТРАНСКРИПЦИИ И ТРАНСЛЯЦИИ
Было исследовано огромное количество природ-
ных и синтетических соединений на их способность
оказывать противомикробное или противоопухоле-
вое действие. Многие из них обладали высокой
ингибирующей активностью в отношении как транс-
крипции, так и трансляции у про- и эукариот.
Действие большинства таких соединений неспеци-
фично, и они слишком токсичны для того, чтобы их
можно было использовать в терапевтических целях.
Однако некоторые из них оказались чрезвычайно
полезны для экспериментальных исследований ап-
паратов синтеза РНК и белка. Здесь мы упомянем
лишь о некоторых из таких соединений.
а. Ингибирование РНК-полимеразы
Актиномицин D, полипептидный антибиотик,
продуцируемый многими видами Streptomyces,
встраивается между двумя соседними парами осно-
ваний двухцепочечной ДНК (рис. 3.54). Он ингиби-
рует все РНК-полимеразы, однако степень этого
ингибирования для разных ферментов существенно
различается. При концентрации актиномицина, при-
водящей к блокированию транскрипции, реплика-
ция ДНК не замедляется. Рифамицин, антибиотик
из Streptomyces mediterranei, или его синтетический
аналог рифампицин блокируют транскрипцию у
прокариот, но ни тот ни другой не влияют на
транскрипцию у эукариот. Эти соединения блокиру-
ют инициацию синтеза РНК, связываясь с Р-субъ-
единицами РНК-полимераза-холофермента. Но ес-
ли синтез РНК уже иницирован, то процесс элонга-
ции оказывается нечувствительным к рифампицину.
Другой антибиотик, применяемый для блокирова-
ния бактериальных РНК-полимераз,- стрептолиди-
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
161
о
II II
-------С сн3 СН3 с---------
'сн-нсх чсн-нсх
СН3—Nz Сн3 СН3Х N —СН3
\=о о=с^
Н2СХ СН2
сн, сн,—г/
о=< \=о
’ Н2С-Н2С>СН <СН^сн2
' -N / 2
сн3 Н2С Чс_о О=С^ CH,J сн3
сн — нс/ сн-нс^
сн, )nh нг/ сн3
J о=с с=о
-----сн —сн нс—нс-------
' ...У
L- метилвалин
Саркозин
L пролин
D-валин
L- треонин
Феноксазоновое
кольцо
РИС. 3.54.
Структура актиномицина D. А. Структурная
формула актиномицина D. Б. Трехмерное
изображение, в котором плоскость фенокса-
зонового кольца перпендикулярна плоскости
страницы. В. Структура, изображенная на рис.
Б, интеркалирует (встраивается) между двумя
соседними GC-парами дуплексной ДНК.
[S.C. Jain, Н. М. Sobell, J. Mol. Biol., 68 (1972),
Р. 1]
б. Ингибирование трансляции
гин из Streptomyces lydicus. Он блокирует элонгацию,
но не инициацию РНК.
Широко используемый ингибитор транскрипции
у эукариот- бициклический октапептид а-аманитин,
получаемый из гриба Amanita phalloides. Из трех
эукариотических РНК-полимераз (разд. 3.1. а) наи-
более чувствительна к а-аманитину РНК-полимера-
за II. РНК-полимераза I не ингибируется совсем,
а РНК-полимераза III ингибируется только при вы-
соких концентрациях антибиотика. Это соединение
очень удобно для разграничения ферментов, ответ-
ственных за транскрипцию конкретных видов РНК.
Здесь мы рассмотрим действие лишь некоторых
широко используемых антибиотиков-ингибиторов
трансляции как у про-, так и у эукариот (табл. 3.5
и 3.6).
Высокооснбвный трисахарид стрептомицин, как
и большинство других аминогликозидов, связывает-
ся только с 812-белком 308-субчастицы бактериаль-
ных рибосом. Одним из результатов такого связы-
вания является подавление образования правильно-
го комплекса инициации и тем самым блокирование
инициации синтеза полипептидной цепи. При связы-
вании стрептомицина с 308-субчастицей происходит
11 243
162
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
Таблица 3.5. Ингибиторы белкового синтеза
у прокариот
Антибиотик
Действие
Стрептомицин
Неомицин, канамицин
Хлорамфеникол
Тетрациклин
Эритромицин
Пуромицин
Фузидиевая кислота
Казугамицин
Линкомицин
Кирромицин
Тиострептон
Связывается с 305-субчастицей и
подавляет связывание
Fmet-TPHK”'1 с Р-участком;
вызывает ошибки в трансляции
То же
Ингибирует пептидилтрансфераз-
ную активность 705-рибосомы
Ингибирует присоединение амино-
ацетилированной тРНК к 30S-
субчастице
Связывается со свободной 50S-
субчастицей и предотвращает
образование 705-рибосомы; на
активную 705-рибосому
не действует
Вызывает преждевременную тер-
минацию синтеза белка, действуя
как аналог аминоацил-тРНК
Подавляет связывание аминоацил-
тРНК с A-участком, блокируя
высвобождение EF-G после
транслокации
Подавляет связывание Fmet-
тРНКр'* с Р-участком
Ингибирует активность пептидил-
трансферазы
Связывается с EF-Tu, стимулирует
образование (EF-Tu)-GTP и
связывание тройного комплекса
с рибосомой, но подавляет
высвобождение EF-Tu
Предотвращает транслокацию,
ингибируя EF-G
также модификация структуры A-участка, что при-
водит к случайным неправильным спариваниям
между аминоацил-тРНК и кодонами. У мутантов
бактерий, устойчивых к стрептомицину, 308-субчас-
тицы изменены таким образом, что они либо не
способны к связыванию со стрептомицином, либо
если связывают его, то мешают его ингибирующему
действию. С рибосомами эукариот стрептомицин не
связывается и поэтому на их функцию не влияет.
Пуромицин из Streptomyces alhoniger блокирует
синтез полипептидов на рибосомах как у про-, так
и у эукариот, имитируя действие аминоацил-тРНК
(рис. 3.55). Попав в клетку, пуромицин занимает
свободный A-участок, и его аминогруппа действует
как акцептор растущей полипептидной цепи, почти
аналогично аминогруппе связанной аминоацил-
тРНК. Поскольку взаимодействие с кодоном отсут-
ствует, образовавшийся полипептидилпуромицин
отделяется от рибосомы, а рибосома-от мРНК.
Следовательно, пуромицин индуцирует абортивную
терминацию синтеза полипептида.
Некоторые антибиотики (в том числе эритроми-
цин из Streptomyces erythreus и фузидиевая кислота
из Fusidium coccineum) блокируют перемещение ри-
босомы после завершения элонгации или пептидил-
трансферазную реакцию. В результате рибосома не
может переместиться к следующему кодону, пепти-
дил-тРНК остается связанной с A-участком и бло-
кируется взаимодействие со следующей аминоацил-
тРНК.
Хлорамфеникол и циклогексимид подавляют
один и тот же этап синтеза белковой цепи. Хлорам-
феникол действует на рибосомы бактерий, мито-
хондрий и хлоропластов, а циклогексимид-только
на рибосомы эукариот, находящиеся в цитоплазме.
Оба соединения влияют на пептидилтрансферазную
активность больших рибосомных субчастиц соот-
ветствующих рибосом, в результате чего элонгация
пептидной цепи блокируется, а А- и P-участки ока-
зываются занятыми.
Таблица 3.6. Ингибиторы белкового синтеза
у эукариот
Ингибитор
Абрин. рицин
Дифтерийный токсин
Хлорамфеникол
Пуромицин
Фузидиевая кислота
Анизомицин
Циклогексимид
Пактами цин
Шовдомицин
Спарсомицин
Интерферон
Действие
Подавляет связывание аминоацил-
тРНК
Катализирует реакцию между
NAD и eIF-2 с образованием
неактивного фактора; подавляет
транслокацию
Ингибирует активность пептидил-
трансферазы митохондриальных
рибосом
Вызывает преждевременную тер-
минацию синтеза белка, действуя
как аналог аминоацил-тРНК
Подавляет транслокацию,
ингибируя eEF-2
То же
Ингибирует активность пептидил-
трансферазы
Препятствует локализации met-
tPHKJ4" на 405-рибосоме
Подавляет образование комплекса
eIF-2-met-TPH K^'-GTP
Подавляет транслокацию
Блокирует инициацию, индуцируя
фосфорилирование eIF-2
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
163
3.10. СУДЬБА СИНТЕЗИРОВАННЫХ
БЕЛКОВ
Соединение аминокислот с образованием поли-
пептидной цепи - это только первый шаг в процессе
формирования многих белков. Полипептидная цепь
должна быть уложена так, чтобы образовались
правильные вторичная и третичная структуры, а в
большинстве случаев отдельные полипептиды долж-
ны объединиться в функциональные олигомерные
комплексы. Являются ли эти процессы полностью
саморегулирующимися или протекают при участии
ферментов пока неясно. До образования функцио-
нально активных белков первичные продукты транс-
ляции часто претерпевают разные сложные изме-
нения. Приведем несколько примеров таких изме-
нений.
а. Посттрансляционная модификация
полипептидных цепей
Функционально активный гемоглобин образует-
ся только после того, как а- и P-цепи объединятся
в а2Р2-структуру и с боковыми группами аминокис-
лот обеих субъединиц свяжется гемогруппа. Для
того чтобы пируваткарбоксилаза и ацетил-СоА-кар-
боксилаза стали активными ферментами, с опреде-
ленными боковыми цепями их аминокислот должен
ковалентно связаться биотин. Некоторые белки,
участвующие в процессе свертывания крови, долж-
ны претерпеть карбоксилирование специфических
остатков глутаминовой кислоты, для того чтобы
образовались центры связывания Са2 + . Для образо-
вания коллагена должно произойти гидроксилиро-
вание специфических пролиновых и лизиновых ос-
татков. Очень важным и широко распространенным
способом регуляции метаболизма являются фосфо-
рилирование и дефосфорилирование определенных
остатков серина, треонина и тирозина особыми
протеинкиназами и протеинфосфатазами соответст-
венно. Многие протеолитические белки, участвую-
щие в процессах пищеварения и свертывания крови,
синтезируются в виде крупных предшественников,
которые далее активируются путем отщепления уча-
стка полипептидной цепи. Инсулин синтезируется
в виде препроинсулинового полипептида и превра-
щается в зрелый инсулин после расщепления цепи
и удаления сначала N-концевого, а затем внутренне-
п*
164
ЧАСТЬ 1 МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
Превращение препроинсулина в инсулин. При трансля-
ции инсулиновой мРНК образуется крупный предшест-
венник препроинсулин. Функциональный гормон, пред-
ставляющий собой гетеродимер, образуется после от-
щепления N-концевого сигнального сегмента и расщеп-
ления молекулы проинсулина в двух местах, в результа-
те чего удаляется центральная часть (С) первичного
трансляционного продукта. Остающиеся А- и В-цепи
активного инсулина удерживаются вместе дисульфид-
ными связями, образовавшимися в исходном полипеп-
тиде.
го сегмента (рис. 3.56). Многие вирусные белки,
гормоны, нейропептиды образуются из первичных
трансляционных продуктов - полипротеинов в ре-
зультате расщепления по многим сайтам и образо-
вания нескольких зрелых белков и пептидов мень-
шего размера.
б. Доставка эукариотических белков
к клеточным мембранам
и проникновение через них
В клетках эукариот помимо плазматических
мембран имеются разнообразные внутриклеточные
мембраны, отграничивающие различные клеточные
органеллы: митохондрии, хлоропласты (у расте-
ний), эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольд-
жи, пероксиомы, лизосомы и секреторные пузырьки
(везикулы) (рис. 1.1. Л). Каким образом белки, пред-
назначенные для столь многочисленных клеточных
мембран и компартментов, попадают к месту сво-
его назначения? Закодирована ли в белковой струк-
туре инф пмация об их внутри- или внеклеточной
локализации? Если да, то какова химическая приро-
да такой информации и как она реализуется?
Сложный транспортный аппарат эукариотиче-
ских клеток. Рибосомы в эукариотических клетках
существуют в двух состояниях: в свободном и свя-
занном с мембранами. Белки, предназначенные для
некоторых органелл и цитозоля водной фракции
цитоплазмы,-синтезируются на свободных рибосо-
мах, а белки, остающиеся в лизосомах, структурах
Гольджи и плазматической мембране, образуются
на рибосомах, ассоциированных с эндоплазматиче-
ским ретикулумом (ЭР)-непрерывной сети внутри-
клеточных мембран, окружающих пространство, на-
зываемое просветом ЭР. Мембраны ЭР, с которыми
связаны рибосомы, называются шероховатым ЭР,
а мембраны, не связанные с рибосомами,-гладким
ЭР (рис. 3.57). Белки, синтезированные на рибосо-
мах, связанных с ЭР, проходят через мембраны ЭР
в просвет ЭР, а «прокладывает» им путь N-концевой
участок (рис. 3.58). Затем этот участок, состоящий
преимущественно из гидрофобных аминокислот,-
сигнальная последовательность-отщепляется специ-
фическими эндопептидазами, локализованными в
просвете ЭР. Такой направленный перенос белков
от рибосом в просвет ЭР начинается уже во время
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
165
Шероховатый
эндоплазматический
ретикулум
Г ладкий
эндоплазматический
ретикулум
РИС. 3.57.
Электронная микрофотография среза печени крысы, на
которой видны гладкий и шероховатый эндоплазмати-
ческий ретикулум (ЭР). Мембраны гладкого ЭР (слева
вверху) почти не содержат связанных рибосомных час-
тиц. Напротив, протяженные мембранные структуры
шероховатого ЭР (справа и внизу) усеяны рибосомами.
Крупные, более плотные структуры-митохондрии. (С
любезного разрешения George Е. Palade.)
синтеза полипептидной цепи и поэтому называется
котрансляционным транспортом.
Направление синтезируемых полипептидных це-
пей в просвет ЭР. Транспорт мембранных и секре-
тируемых белков в просвет ЭР опосредуется вза-
имодействием полипептидной сигнальной последо-
вательности с сигнал-распознающей частицей (СРЧ)
и рецептором этой частицы (СРЧ-Р). Что заставляет
рибосому направиться к ЭР, если белок, который
она синтезирует, должен впоследствии секретиро-
ваться или транспортироваться в лизосомы или
плазматические мембраны? Несомненно, это зави-
сит не от самой рибосомы. Белки цитозоля синтези-
руются на рибосомах, идентичных рибосомам, син-
тезирующим белки ЭР. В самом деле, рибосома,
в одном раунде синтезирующая белок цитозоля,
в следующем может синтезировать мембранный
белок. Попадание белка в ЭР происходит только
в результате взаимодействия СРЧ с сигнальной
последовательностью синтезируемой белковой цепи
(рис. 3.59). Комплекс «СРЧ сигнальная последова-
тельность» взаимодействует впоследствии с рецеп-
тором СРЧ, локализованным в мембране ЭР. Таким
образом, СРЧ служит адаптером между аппаратом
синтеза белка в цитоплазме и аппаратом его до-
ставки и отвечает за попадание белков в просвет
ЭР. СРЧ связывается с сигнальной последователь-
ностью сразу после выхода ее из рибосомы, т. е.
после синтеза сегмента длиной примерно 70 амино-
кислот. Элонгация полипептидной цепи замедляется
до тех пор, пока комплекс СРЧ сигнальная после-
довательность не свяжется с СРЧ-Р в мембране ЭР.
Сразу после этого СРЧ отделяется, скорость синтеза
полипептидной цепи увеличивается и растущая по-
липептидная цепь протягивается сквозь мембрану
в просвет. Итак, ассоциация транслирующей рибо-
сомы с СРЧ-Р приводит к однонаправленному пе-
реносу растущей полипептидной цепи в просвет ЭР.
Особая пептидаза, локализованная в просвете ЭР,
осуществляет специфическое отщепление сигналь-
ной последовательности от новосинтезированного
белка.
СРЧ представляет собой комплекс из шести бел-
ков с мол. массами от 10000 до 75000 Да и единст-
венной молекулы РНК длиной 300 нуклеотидов
7SL-PHK. Ни РНК, ни белки сами по себе не могут
функционировать как СРЧ. Однако при смешивании
РНК и белков in vitro образуется функциональная
СРЧ. В таких экспериментах молекулы 7SL-PHK из
клеток млекопитающих, амфибий и насекомых мо-
гут образовать СРЧ с белками млекопитающих.
Этот факт наряду с данными о близости нуклеотид-
ных последовательностей 7SL-PHK из этих источни-
ков говорит о том, что структура 7SL-PHK эволю-
ционно консервативна. Состоит ли роль 7SL-PHK
в прямом узнавании сигнальной последовательно-
сти или она служит каркасом для сборки разных
белковых субъединиц в функциональной СРЧ, а воз-
40S-
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
167
РИС. 3.58.
Котрансляционный транспорт полипептидных цепей.
Полипептиды, синтезируемые на рибосомах шерохова-
того ЭР, направляются через мембраны в просвет ЭР.
Гидрофобный N-концевой участок нового белка-сиг-
нальная последовательность проходит через мембрану
вскоре после начала трансляции и по мере элонгации
полипептида выходит в просвет ЭР. Синтезированные
белковые молекулы подвергаются в ЭР различным мо-
дификациям в зависимости от их окончательной судь-
бы, однако все они утрачивают свою сигнальную после-
довательность. N'-это новый N-конец, образующийся
после отщепления сигнальной последовательности. На
верхнем рисунке сигнальная последовательность заяко-
рена в мембране; она отщепляется по завершении
трансляции, и полипептид с новым N-концом оказыва-
ется в просвете ЭР. На среднем рисунке сигнальная
последовательность отщепляется еще до завершения
трансляции; С-конец синтезированного полипептида
заякорен в мембране ЭР. На нижнем рисунке сигналь-
ная последовательность отщепляется сразу после попа-
дания полипептида в просвет ЭР.
можно, и то и другое,- пока неизвестно.
Сигнальная последовательность обычно нахо-
дится на N-конце белков, предназначенных для экс-
порта к одной из клеточных мембран или внутри-
клеточным органеллам. В некоторых случаях, одна-
ко, аминокислотная последовательность, узнавае-
мая СРЧ, не является ни N-концевой, ни отщепляе-
мой от транспортируемого белка, а отдельные сек-
ретируемые белки не содержат вообще никакой
сигнальной последовательности.
Длина сигнальной последовательности колеблет-
ся от 15 до 35 аминокислот, и в первых трех ее
четвертях преобладают гидрофобные остатки (рис.
3.60), однако никакой консервативной аминокислот-
ной последовательности этот участок не имеет. Для
узнавания сигнальной последовательности СРЧ ско-
рее важна ее вторичная структура. Интересно, что
сигнальные последовательности белков эукариот
узнаются аппаратом транслокации бактерий, а сиг-
нальные последовательности секретируемых бакте-
риями белков могут проникать через мембранные
компоненты эукариотических клеток.
В пределах сигнальной последовательности на-
ходится также и сайт, распознаваемый сигнальной
пептидазой. Обычно расщепление происходит со
РИС. 3.59.
Перенос синтезированного полипептида в ЭР опосреду-
ется сигнал-распознающей частицей (СРЧ). Показано,
как СРЧ связывается с N-концевой сигнальной последо-
вательностью растущей полипептидной цепи и затем
с СРЧ-рецептором в мембране ЭР, в результате чего
пептид проникает в просвет ЭР.
168 ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ ОБЗОР
Секреторные везикулы,
выходящие с траяс-стороны
РИС. 3.61.
Аппарат Гольджи. А. Электронная микрофотография
экзокринных клеток поджелудочной железы крысы, на
которой видны примыкающие к ЭР цистерны аппарата
Гольджи. Цистерны, расположенные ближе к ЭР, назы-
ваются цис-цистернами, а дальше-транс. Видны вези-
кулы, отпочковывающиеся от элементов ЭР. [Е. М. Ме-
risko, М. Fletcher, G. Palade, Pancreas, 1 (1986), р. 95.
С любезного разрешения M.G. Farquhar.] Б. Схемати-
ческое изображение цистерн и везикул аппарата Гольд-
жи. [J. Darnell, Н. Lodish, D. Baltimore, Molecular Cell
Biology (New York: Scientific American Books, 1986)
и в соответствии с моделью J. Kephart.]
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
169
Клеточная мембрана
Цитозоль
Транспортные везикулы, содержащие полипептиды, ко-
торые должны попасть в лизосомы, плазматические
мембраны или секретироваться, отделяются от ЭР и
сливаются с цис-поверхностью аппарата Гольджи. По-
липептиды проходят через аппарат Гольджи в составе
этих везикул и выходят в цитозоль через транс-поверх-
ность в составе транспортных везикул, отделяющихся от
цистерн Гольджи. Во время прохождения полипептидов
через структуры аппарата Гольджи они претерпевают
такие посттрансляционные модификации, как протеоли-
тическое расщепление и гликозилирование.
стороны С-конца остатков глицина, серина или
аланина, поэтому N-конец многих зрелых секрети-
руемых или мембранных белков соседствует с одной
из этих аминокислот в сигнальной последователь-
ности.
Транспорт 1 белков от ЭР к аппарату Гольджи
и из него. Белки направляются к лизосомам, плаз-
матическим мембранам или секретируются с по-
мощью аппарата Гольджи-набора тесно упакован-
ных, взаимопроникающих, окруженных мембрана-
ми цистерн (рис. 3.61). Перенос белков к аппарату
Гольджи осуществляется с помощью так называе-
мых окаймленных пузырьков (везикул), отпочковы-
вающихся от ЭР и сливающихся с цистернами
Гольджи (рис. 3.62). Белки проходят через аппарат
Гольджи от t/wc-цистерн к транс. Транспорт белков
через цистерны также осуществляется с помощью
окаймленных транспортных везикул.
170
ЧАСТЬ I, МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
Шероховатый ЭР
Г ольджи
О Галактоза
▼ Фукоза
О Сиаловая кислота
® Фосфат
РИС. 3.63.
Гликозилирование белков в шероховатом ЭР и цистер-
нах Гольджи. В ЭР разветвленный олигосахарид, свя-
занный с липидом долихолом с помощью пирофосфат-
ного мостика, переносится на аспарагиновый остаток
белка в последовательности asn-x-ser или asn-x-thr (где
х любая аминокислота). Затем N-сеязанный олигоса-
харид модифицируется в результате последовательных
специфических гликозилгидролазных и гликозидазных
реакций, протекающих либо в ЭР, либо в то время, когда
белок проходит через аппарат Гольджи. Разные белки
содержат различные N-связанные олигосахариды в за-
висимости от первичной и вторичной структуры белка,
а также от наличия или отсутствия специфических фер-
ментов, осуществляющих процессинг олигосахаридов
в клетках [J. Darnell, Н. Lodish, D. Baltimore, Molecular
Cell Bioilogy (New York: Scientific American Books,
1986).]
Белки, предназначенные для секреции, сначала
попадают в секреторные везикулы, которые в конце
концов сливаются с плазматическими мембранами
и высвобождают свое содержимое наружу. Когда
секреция белков индуцируется (как в случае инсули-
на или некоторых нейропептидов), цитозольные сек-
реторные пузырьки сливаются с мембраной и вы-
свобождают содержимое наружу только после ин-
дукции. Как окаймленные везикулы различают бел-
ки, предназначенные для того или иного клеточного
компартмента, неясно. Неизвестно также, различа-
ются ли между собой везикулы, несущие разные
белки, и если различаются, то чем именно.
Гликозилирование. Проходя через ЭР и аппарат
Гольджи, белки подвергаются интенсивной модифи-
кации (рис. 3.63). Специальный фермент ЭР присо-
единяет разветвленный олигосахарид к специфиче-
ским аспарагиновым остаткам транспортируемых
белков. Далее олигосахарид подвергается действию
целого ряда специфических гликозилгидролаз и гли-
козилированию; эти реакции протекают в ЭР и в
то время, когда белки проходят через аппарат
Гольджи.
в. Транспорт белков
в эукариотические клеточные
органеллы
Не все белки, направляемые к внутриклеточным
органеллам, следуют маршрутом, включающим ЭР
и аппарат Гольджи. Большинство белков митохонд-
рий, ядер, хлоропластов растений синтезируются на
свободных цитоплазматических рибосомах либо
сразу в виде зрелых форм, либо в виде предшест-
венников и затем подхватываются соответствую-
щими органеллами. Остальные белки митохондрий
и хлоропластов кодируются ДНК, содержащейся
в этих органеллах, и синтезируются с помощью
аппарата трансляции этих органелл аналогично то-
му, как это происходит в цитоплазме.
Митохондрии, например, имеют несколько ком-
партментов: матрикс, наружную мембрану и меж-
мембранное пространство (рис. 3.64). Белки, коди-
руемые ядерной ДНК, которые должны быть
локализованы в матриксе, синтезируются в виде
предшественника и содержат от 25 до 60 лишних
аминокислот на N-конце. После связывания с ре-
цептором на наружной мембране предшественник
транспортируется в этот внутренний матрикс. Дви-
жущей силой процесса является электрохимический
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
171
потенциал на внутренней мембране, генерируемый
с помощью энергетически выгодных реакций, проте-
кающих в митохондрии. Одновременно с переносом
или сразу после него лишние аминокислоты на
N-конце удаляются специфическими протеазами,
находящимися в матриксе. Некоторые белки оста-
ются во внутренней мембране, а другие проходят
сквозь мембрану и попадают в матрикс. Белки,
синтезированные в цитозоле и направленные в меж-
мембранное пространство митохондрий, переносят-
ся несколькими способами (рис. 3.64). Некоторые
предшественники содержат особый N-концевой сег-
мент и попадают в митохондрии так, как это было
описано выше. У других предшественников отщеп-
ление концевой последовательности приводит к то-
му, что белки остаются временно встроенными во
внутреннюю мембрану; затем следующий процесси-
рующий фермент расщепляет этот промежуточный
продукт, и зрелый белок выходит в межмембранное
пространство. Белки локализуемые в наружной
мембране, транспортируются энергонезависимым
путем и без превращения предшественника в зрелый
белок. В некоторых случаях переносу цитозольного
белка в наружную мембрану способствуют конфор-
мационные изменения белковой молекулы при свя-
зывании простетической группы. Белки закрепляют-
Наружная
мембрана
митохондрий
______Внутренняя
мембрана
митохондрий
N
Белок, включающийся
в наружную мембрану
РИС. 3.64.
Включение белков в митохондрии. В зависимости от способ транспортировки и подвергаются разным мо-
конечной локализации митохондриальных белков (она дификациям.
указана слева) последние используют тот или иной
172
ЧАСТЬ I, МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ. ОБЗОР
ся в мембранах с помощью якорных последователь-
ностей, которые проникают в липидный бислой;
подобные последовательности могут находиться и
на амино-, и на карбокси-конце, и даже в середине
полипептидной цепи.
г. Транспорт белков
в клетках прокариот
И про-, и эукариотические клетки имеют погра-
ничные липопротеиновые мембраны. Внутренняя
мембрана бактериальных клеток отделяет цито-
плазму от межмембранного, или периплазматическо-
го, пространства. Наружная мембрана отделяет пе-
риплазматическое пространство от внешней среды.
Новосинтезированные белки бактерий должны рас-
пределяться между цитозолем, внутренней (плазма-
тической) мембраной, межмембранным пространст-
вом, наружной мембраной и внешней средой. Как
и у эукариот, у бактерий белки, направляемые в
плазматическую мембрану или более отдаленные
места, отличаются от белков, остающихся в цитозо-
ле, тем, что имеют сигнальную последовательность
на N-концё (рис. 3.60). Эта последовательность тоже
отщепляется с образованием зрелых форм белков
внутренней мембраны или межмембранного прост-
ранства. Однако в отличие от эукариотических
мембранных белков бактериальные аналоги не гли-
козилируются. Мембранные белки бактерий тоже
транспортируются через внутреннюю мембрану пу-
тем котрансляционного переноса. Направляется ли
сигнальная последовательность к внутренней мемб-
ране с помощью некой нуклеопротеиновой частицы,
как у эукариот, или в результате прямого контакти-
рования гидрофобного конца с мембраной-неиз-
вестно. В любом случае образующаяся полипептид-
ная цепь протягивается через внутреннюю мембра-
ну по мере синтеза. Связанная с мембраной сигналь-
ная протеаза отщепляет сигнальную последователь-
ность, и зрелый белок остается заякоренным в
мембране или находится в свободном состоянии
в периплазме. Векторный перенос некоторых прока-
риотических белков через мембраны может прои-
зойти и посттрансляционно; в этом случае движу-
щей силой переноса также служит трансмембран-
ный потенциал. При имеющемся сходстве в процес-
сах транспорта у про- и эукариот неудивительно,
что белки, экспортируемые из бактериальных кле-
ток, мэгут экспортироваться также из эукариоти-
ческих 'леток, и наоборот. Неудивительно и то, что
если к цитозольному белку искусственно пришить
соответствующую сигнальную последовательность,
то он сможет транспортироваться к мембране или
даже пройти сквозь нее в зависимости от своей
вторичной структуры.
3.11. РЕГУЛЯЦИЯ ГЕННОЙ
ЭКСПРЕССИИ
Основным свойством как про-, так и эукариот
является их способность осуществлять дифферен-
циальную регуляцию экспрессии генов. Осуществ-
ляя контроль за тем, каким генам экспрессиро-
ваться. а каким нет. а также регулируя уровень
экспрессии различных генов, клетки приспосабли-
вают свой фенотип к определенным условиям внеш-
ней и внутренней среды. Часто гены экспрессируют-
ся последовательно: активация одного гена вызы-
вает экспрессию другого или нескольких генов, при-
водя в конечном счете к каскаду событий. Некото-
рые гены или родственные группы генов экспрес-
сируются координированно, т. е. отвечают на ре-
гуляторный сигнал одновременно и, как правило,
в одинаковой степени. Вероятно, наиболее совер-
шенные регуляторные системы те, которые позво-
ляют плюрипотентным стволовым клеткам диффе-
ренцироваться с образованием клеток разного типа
в процессе развития сложного организма.
Фенотипические признаки клеток разных типов,
а также одной и той же клетки в различных усло-
виях зависят от количества и свойств продуци-
руемых ими структурных, каталитических и регу-
ляторных белков. Регулироваться может какой-то
один или несколько отдельных этапов считывания
генетической информации при синтезе белка. У бак-
терий, например у E.coli, образование белков регу-
лируется главным образом содержанием мРНК,
доступной для трансляции. Дополнительный способ
поддержания нужной концентрации клеточных бел-
ков состоит в регуляции различных этапов трансля-
ции, а также скорости деградации белков. Эука-
риотические клетки обладают более сложными ме-
ханизмами регуляции белкового состава. Содержа-
ние мРНК в цитоплазме регулируется не только
на уровне инициации транскрипции в ядре, но
и на уровне процессинга первичных транскриптов
и транспорта зрелых РНК в цитоплазму. Подобно
прокариотам, эукариотические клетки тоже могут
регулировать как трансляцию, так и скорость
транспорта и деградации белков.
В этом разделе мы на нескольких примерах
проиллюстрируем механизмы регуляции генной
экспрессии, используемые прокариотами, в част-
ности E.coli и ее бактериофагами. Более сложные
механизмы регуляции у эукариот обсуждаются в гл. 8.
а. Регуляция содержания РНК
в процессе биосинтеза
Образование РНК у прокариот чаще всего регу-
лируется на уровне инициации транскрипции не-
сколькими способами. Первый заключается в мо-
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
173
дификации структуры РНК-полимеразы. Так, бета-
(или бета-прим) субъединица РНК-полимеразы
Е. coli изменяется при заражении клеток некоторыми
бактериофагами. Другой пример образование но-
вой, сигма-субъединицы при споруляции определен-
ных штаммов Bacillus. И в том и другом случае
изменяются способность РНК-полимеразы к свя-
зыванию с промотором и скорость транскрипции
соответствующих генов. Второй способ регуляции
заключается в изменении пространственной струк-
туры ДНК, что влияет на способность РНК-по-
лимераз связываться с определенными промотора-
ми и инициировать синтез РНК. И наконец, взаимо-
действие РНК-полимеразы с некоторыми промото-
рами может ингибироваться или стимулироваться
белками, которые связываются с ДНК в месте
присоединения полимеразы или вблизи него. На
связывание таких регуляторных белков- репрессоров
и активаторов - часто влияют определенные метабо-
литы, играющие роль корепрессоров и коактива-
торов.
Скорость элонгации РНК зависит также от вто-
ричной структуры мРНК. Сигналы, которые опре-
деляют, дойдет ли транскрипция до конца или
закончится преждевременно, играют ключевую
роль в регуляции уровня мРНК. В подобных слу-
чаях за прекращение или продолжение транскрип-
ции отвечают определенные нуклеотидные после-
довательности и белки.
Вторичная структура транскриптов может также
влиять на их стабильность, при этом особую роль
в определении продолжительности жизни РНК
в клетке играет структура З'-конца. Одни мРНК
очень стабильны и участвуют во многих циклах
трансляции. Другие, наоборот, быстро разрушают-
ся уже в процессе трансляции. Контроль на уровне
транскрипции особенно важен в случае наименее
стабильных мРНК. Как уже указывалось, зрелые
молекулы рРНК и тРНК-это продукты процес-
сирования первичных транскриптов (разд. 3.3).
Посттранскрипционные события в свою очередь
тоже регулируются, и от них зависит содержание
в клетке функциональных молекул РНК.
б. Согласованная регуляция
экспрессии прокариотических генов
Согласованная регуляция групп родственных ге-
нов. У Е. coli гены, кодирующие белки одного и того
же метаболического пути или определяющие близ-
кородственные функции, часто регулируются согла-
сованно. Это значит, что их экспрессия начинается
и заканчивается или согласованно продолжается
в ответ на один и тот же регуляторный сигнал.
Гены, подчиняющиеся согласованной регуляции,
в геноме часто бывают сцеплены и транскриби-
руются с промотора, находящегося на 5'-конце та-
кой группы генов (кластера), в виде единственной
молекулы РНК, называемой полицистронным (или
полигенным) транскриптом. Группа координиро-
ванно экспрессирующихся генов называется оперо-
ном. Три гена, кодирующие ферменты, ответствен-
ные за метаболизм галактозы у E.coli. организо-
ваны в оперон с промотором (Р) и примыкающим
к нему регуляторным сегментом-оператором (О)
на 5'-конце транскрибируемой последовательности:
galE-galT-galK (рис. 3.65). Синтез ферментов, необ-
ходимых для утилизации арабинозы, регулируется
двумя сопряженными транскрипционными единица-
|--------------------- Галактозный оперон
gal R
I
gal- Репрессор
fla/T
UDP-галактозо-
эпимераза
Уридил-
трансфераза
Галактокиназа
UDP- глюкоза
UDP-галактоза
Г люкозо-1 -Р
РИС. 3.65.
UDP- глюкоза
Г алактозо-1 -Р
Г алактоза
Галактозный оперон (gal) E.coli. Представлены опера-
тор (О), промотор (Р) и три гена оперона- galE, ga/T
и galK. Внизу показаны реакции, катализируемые тремя
генными продуктами галактокиназой, уридилтрансфера-
зой и UDP-галактозоэпимеразой. Все три фермента
транслируются с единственной полицистронной
gal-мРНК. Ген ga/R. кодирующий репрессор gal-
оперона, не сцеплен с опероном.
174
ЧАСТЬ I, МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
Арабинозный оперон
ага BAD mPHK
L-арабиноза
D- ксилулозо-5-Р
РИС. 3.66. АТР
Арабинозный оперон (ага) Е coli и примыкающий к
нему ген ага С. Транскрипция этих двух единиц осу-
ществляется в противоположных направлениях. Они
имеют собственные промоторы и операторы: Ос и Рс
для ага С и OBAD и PBAD для ата-оперона.
ми (рис. 3.66). Первая это пгд-оперон, состоящий
из трех генов, ara В, ara А и ara D, и некоего 5'-конт-
ролирующего участка. Вторая представлена геном
ara С, кодирующим регуляторный белок, необходи-
мый для транскрипции дгд-оперона.
Гены, кодирующие несколько родственных функ-
ций, не всегда образуют единый оперон. Так, гены,
кодирующие 30S- и 508-рибосомные белки, орга-
низованы во множественные опероны, в чей состав
иногда входят гены, кодирующие другие белки,
которые участвуют в транскрипции и/или трансля-
ции (рис. 3.67). Гены, продукты которых необхо-
димы для синтеза аргинина, также разбросаны по
нескольким генетическим локусам, и только один
кластер генов (arg ЕСВН) представлен типичным
опероном. Как правило, отдельные опероны, коди-
рующие родственные функции, имеют одинаковые
или сходные регуляторные последовательности
и поэтому реагируют на определенный регулятор-
ный сигнал сходным образом.
Позитивная и негативная регуляция. Негативная
регуляция инициации транскрипции, или репрессия,
осуществляется белками-репрессорами, которые
связываются с операторами. Поскольку последо-
вательности оператора и промотора часто перекры-
ваются, связывание репрессоров со своими опера-
торами ограничивает доступ РНК-полимеразы
к промотору, подавляя тем самым инициацию
транскрипции. Позитивная регуляция может осу-
ществляться путем связывания специфических бел-
ков с нуклеотидными последовательностями,
расположенными в области промотора. Считается,
что связанный активаторный белок способствует
ассоциации РНК-полимеразы с промотором и, сле-
довательно, увеличивает вероятность инициации
транскрипции.
Гены, кодирующие регуляторные белки, которые
связываются с операторными или активаторными
последовательностями, могут находиться как вбли-
зи контролируемых ими генов, так и далеко от них.
Например, ген, кодирующий репрессор галактоз-
ного оперона (gn/R), не сцеплен с транскрипционной
единицей, состоящей из генов да!Е. даП и gal К
(рис. 3.65). Напротив, позитивная или негативная
регуляция транскрипции арабинозного оперона за-
висит от того, образуется или нет комплекс между
арабинозой и белком, кодируемым только‘сцеп-
ленным с опероном геном агаС (рис. 3.66).
в. Регуляция экспрессии лактозного
оперона
Негативная регуляция. Бактерии Е. coli могут
использовать в качестве единственного источника
углерода и энергии лактозу, поскольку они способ-
ны образовывать в большом количестве 0-галакто-
зидазу-фермент, расщепляющий лактозу на глюко-
зу и галактозу. Однако при росте на других источни-
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
175
РИС. 3.67.
Положение на генетической карте Е. соЧ генов, кодиру-
ющих рибосомные белки. Белки субчастиц 30S и 50S
обозначены соответственно S и L На карте указаны
также позиции генов, кодирующих субъединицы а, р, Р'
и 8 РНК-полимеразы; ДНК-праймазу (dnaG) и тРНК-
метилтрансферазу (f/zwD). G,Tu и Ts-факторы трансля-
ции EF-G, EF-Tu и EF-Ts соответственно Направление
транскрипции (там, где оно известно) показано стрел-
ками.
ках углерода в клетках Е. coli образуется очень
мало Р-галактозидазы. Ген, ответственный за синтез
Р-галактозидазы (lac Z), называется индуцибельным,
поскольку кодируемый им фермент синтезируется
только тогда, когда в клетке присутствуют сахара,
имеющие Р-галактозильные остатки. Помимо р-га-
лактозидазы, р-галактозиды индуцируют образова-
ние еще двух белков: Р-галактозидпермеазы (коди-
руемой геном /дсУ), необходимой для проникнове-
ния Р-галактозидов в клетку, и р-галактозидтранс-
ацетилазы (lac А), фермента с невыясненной пока
функцией (рис. 3.68). В этих трех генах lacZ, lacN
и lac А - содержится вся информация о белках, коди-
руемых /лс-опероном. Они транскрибируются в еди-
ную полицистронную РНК, при трансляции кото-
рой образуются почти одинаковые количества соот-
ветствующих белков. Поэтому можно сказать, что
три гена /дс-оперона экспрессируются согласованно.
Со структурными генами /дс-оперона связаны
несколько типов регуляторных элементов, ответст-
венных за индуцибельность и координированную
регуляцию этих генов (рис. 3.68). Промотор- это
нуклеотидная последовательность, с которой свя-
зывается РНК-полимераза и начинается транскрип-
ция трех структурных генов. Оператор это сайт,
с которым связывается /дс-репрессор, подавляющий
транскрипцию /дс-оперона. Ген /дс1, не входящий
в состав /дс-оперона, кодирует репрессор-полипеп-
тидную цепь с мол. массой 37 000 Да. Репрессор
прочно связывается с оператором, находясь в тетра-
мерной форме.
Поскольку промоторная и операторная после-
довательности перекрываются, связывание репрес-
сора с оператором мешает связыванию РНК-поли-
меразы с промотором, что приводит к блокиро-
ванию транскрипции структурных генов. Транс-
крипцию оперона можно индуцировать, если бло-
кировать связывание репрессора с оператором
(рис. 3.69). Такое блокирование происходит при свя-
зывании одного из Р-галактозидов с той или иной
субъединицей репрессора, что уменьшает сродство
последнего к оператору. После отсоединения реп-
рессора от промотра полимераза может связаться
с промотором и инициировать транскрипцию опе-
рона.
Очень важно сохранение нуклеотидной после-
довательности домена /дс-оператора, связывающего
репрессор. Об этом свидетельствуют результаты
исследования эффективности репрессии in vivo
у мутантов с модифицированными репрессорами
или операторами (рис. 3.70). Интересные данные
были получены и при изучении связывания очищен-
ных репрессорных белков с операторами дикого
типа и мутантными формами in vivo. Мутации,
уменьшающие сродство репрессора к оператору,
приводили к конститутивному синтезу ферментов,
кодируемых /дс-опероном, т. е. к экспрессии /дс-фер-
ментов в отсутствие индуктора. Мутации, сопро-
вождающиеся накоплением репрессора в клетках
или увеличением сродства репрессора к оператору,
делали /дс-оперон неиндуцибельным.
Позитивная регуляция. Для экспрессии /дс-опе-
рона, как и других индуцибельных оперонов, ко-
торые осуществляют контроль синтеза ферментов,
участвующих в метаболизме сахаров, необходимо
не только снять репрессию оперона, но и получить
некий сигнал. Таким сигналом служит комплекс
циклического АМР (сАМР) с белком- активатором
катаболизма (САР, от англ, catabolite activator
protein), который связывается со специфической
последовательностью, находящейся в самом начале
/дс-промотора (рис. 3.71). сАМР, принимающий
участие во многих клеточных процессах, образуется
из АТР (рис. 3.72) в ответ на самые разные вне-
и внутриклеточные события. САР представляет со-
бой димер из идентичных полипептидных цепей
176
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ; ОБЗОР
РИС. 3.68.
Лактозный оперон Е. coli (/ас) и тесно сцепленный с ним
ген /ас-репрессора (/act).
Промотор
Репрессор и оператор <
Структурные гены
мРНК
/ас-репрессора
/ас- Репрессор связывается
с участком Р—О и блокирует
присоединение РНК-полимеразы
и транскрипцию
РИС. 3.69.
Репрессия /ас-оперона гомотетра-
мерным /ас-репрессором (вверху) и
индукция /ас-оперона после связыва-
ния с репрессором р-галактозидного
индуктора (внизу).
Субъединица
/ас- репрессора
Активный
/ас-репрессор
Активный
/ас- репрессор
/3-Г алактозид
Неактивный
/ас- репрессор
РИС. 3.70.
Нуклеотидная последовательность /ас-оператор-
ного участка, связывающегося с репрессором.
Внизу указаны замены пар оснований, понижа-
ющие эффективность связывания репрессора с
оператором. Стрелками показаны инвертирован-
ные повторы. Наличие таких повторов характерно
для операторных последовательностей Е. coli.
[J. D. Watson et al.. Molecular Biology of the Gene,
4 th ed. (Menlo Park, Calif.: Benjamin/Cummings,
1987).]
TGG A ATTGT G AGfibfiATAACAA T TO
ACCTTAACACTCGCCT AT T G T T A AO
I I I I | I I I Замены, понижающие
ATGTTA С T эффективность
I I I I I I ' ' связывания
TACAAT G A
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
177
Промотор
/ас!
Область связывания
САР-сАМР
Место присоединения
PH К полимеразы
Оператор
lacZ
GTGAGTTAGCTCAC
CACTCAATCGAGTG
I|
Участок, занимаемый
САР-сСАМР
caccccagcctttacactttatgcttccggctcgtatcttgtgtggaattgtgagcggataacaatt
GTG6GGTCCGAAAT6IGAAATACGAAGGCGCAGCAUi£AADACACCTTAACACTCGCCTATTCTTAA
L-*. мРНК
Участок,
- занимаемый
репрессором
Участок, занимаемый РНК-полимеразой-------------
ATG
ТАС
LJ
Инициация
трансляции
РИС. 3.71.
Нуклеотидные последовательности, принимающие учас-
тие в регуляции экспрессии /ас-оперона: область связы-
вания с репрессором, -10- и -35-участки промотора
и область связывания комплекса белка-активатора ка
таболизма и сАМР (САР-сАМР).
с мол. массой 22 кДа. Связывание комплекса
САР-сАМР со специфической последовательностью
в начале промотора приводит к усилению транс-
крипции /дс-оперона почти в 50 раз. Сам по себе
САР не способен к такому связыванию и стимуля-
ции транскрипции. Усиление транскрипции с помощью
комплекса САР-сАМР можно объяснить тем. что,
связываясь с ДНК в непосредственной близости от
сайта присоединения РНК-полимеразы, он усилива-
ет сродство этого фермента к промотору (рис. 3.73).
Альтернативная гипотеза заключается в том, что
связывание САР-сАМР с САР-сайтом предотвра-
щает присоединение РНК-полимеразы к располо-
женному поблизости слабому промотору и увели-
чивает тем самым вероятность того, что полимера-
за свяжется с «правильным» промоторным сайтом.
Высказывавшееся ранее предположение, что комп-
лекс САР-сАМР изменяет топологию ДНК, так что
облегчаются связывание полимеразы и транскрип-
ция, кажется несостоятельным.
РИС. 3.72.
Синтез циклического АМР (сАМР) из АТР катализиру-
ется аденилатциклазой
Комплекс САР-сАМР является положительным
сигналом при регуляции экспрессии и других опе-
ронов. в частности тех, которые кодируют фер-
менты расщепления углеводов. Например, для экс-
прессии ага- и дд/-оперонов должны произойти
дерепрессия с помощью индукторов-арабинозы
и галактозы соответственно-и связывание комп-
лекса САР-сАМР с областью промотора. Так, у бак-
терий, растущих на глюкозе, уровень внутриклеточ-
ного сАМР и соответственно комплекса САР-сАМР
очень низок. Поэтому, если даже в среде присутст-
вует арабиноза или галактоза, в клетках не обра-
зуются ферменты, необходимые для утилизации
этих сахаров. При уменьшении количества глюкозы
уровни сАМР и САР-сАМР увеличиваются и оперо-
ны в присутствии необходимых индукторов начи-
нают экспрессироваться. Подобная комбинация по-
зитивной и негативной систем регуляции очень важ-
на, поскольку это предотвращает образование фер-
ментов, потребность в которых в данный момент
отсутствует. Сигнальная система САР-сАМР регу-
лирует также работу оперонов, кодирующих фер-
менты, которые участвуют в деградации аминокис-
лот. пуринов и пиримидинов. Накопление в клетке
САР-сАМР служит сигналом «голодания»: в ответ
на него снижается экспрессия оперонов, кодирую-
щих ферменты расщепления аминокислот, пуринов
РИС. 3.73.
Модель, иллюстрирующая влияние связывания САР-
сАМР со своим участком на присоединение РНК-поли-
меразы к /ас-промотору. Предполагается, что САР и хо-
лополимераза взаимодействуют друг с другом.
I2 243
178
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
и пиримидинов. В этом случае логика работы систе-
мы также состоит в том, чтобы предотвратить
образование ненужных ферментов в период го-
лодания.
г. Регуляция экспрессии
триптофанового оперона
Триптофан синтезируется в E.coli из аромати-
ческого предшественника-хоризмовой кислоты-в
ходе пяти последовательных реакций, катализи-
руемых ферментным комплексом из пяти белков
(рис. 3.74). Эти кодируемые /гр-опероном белки
образуются согласованно, примерно в равных коли-
чествах, при трансляции полицистронной мРНК
длиной 7000 нуклеотидов, транскрибируемой с про-
мотора. При наличии в среде достаточного для
роста бактерий количества триптофана клетки
E.coli образуют ферменты биосинтеза триптофана
в очень малых количествах. Однако если клетки
лишены экзогенного триптофана, то в них начи-
нается довольно интенсивный синтез всех пяти фер-
ментов. Содержание ферментов этой группы в клет-
ках E.coli может различаться до 700 раз в зависи-
мости от внутриклеточного уровня триптофана.
Подобный разброс в уровне экспрессии обуслов-
лен наличием двух практически независимых меха-
низмов регуляции, каждый из которых «подгоняет»
уровень синтеза /гр-мРНК к концентрации внутри-
клеточного триптофана. Один механизм основан на
репрессии, изменяющей эффективность инициации
транскрипции в промоторе. Второй называется
аттенуацией и регулирует транскрипцию с помощью
сигнала терминации транскрипции, расположенного
между промотором и началом первого структур-
ного гена (рис. 3.74). Эффекты этих двух регуля-
торных механизмов комплементарны, мультипли-
кативны и позволяют увеличивать степень экспрес-
сии оперона. Мы обсудим в этом разделе оба
способа регуляции и их вклад в гармоничный про-
цесс биосинтеза триптофана.
Репрессия триптофанового оперона. Транскрип-
ция /гр-оперона блокируется, когда репрессор свя-
зывается с последовательностью /гр-оператора. Ген
trp R, кодирующий репрессорный белок мол. массой
58 000 Да, находится далеко от /гр-оперона. Для
того чтобы trp R-белок мог связаться с оператором.
и действовать как репрессор, он должен образовать
комплекс с триптофаном. Поскольку уровень экс-
прессии trpR очень низок и не зависит от трип-
тофана, концентрация активного репрессора отра-
жает концентрацию внутриклеточного триптофана.
Нуклеотидные последовательности ^-операто-
ра и промотора перекрываются (рис. 3.75), поэтому
связывание комплекса репрессор-триптофан с опе-
ратором препятствует правильному взаимодейст-
5'
мРНК trp- оперона
3'
3'
I Ггр-Лидерная мРНК
Аттенуатор
Промотор <—'—
,--•---; trpL |
5'
trpE
trpD
trpC
trpB
trpA
(____П
X О
Оператор |
Начало
транскрипции
Терминация
транскрипции
C
Терминация
Транскрипции
PR-антрани- Триптофан- Триптофан-
латизомераза— синтетаза Р синтетаза а
индолглицерол- \ /
Антранилат-
синтаза,
компонент II — __
PR-антранилат- фосфатсинтетаза
f трансфераза . .
(Со1)2(Со П)2 / \
РИС. 3.74.
Антранилатсинтаза,
компонент I
Хоризмат
Антранилат-► PR-антранилат—*-CdRP
+ L- глутамин + PRPP
InGP
^2
+ L-серин
L- триптофан
Триптофановый оперон E.coli (frp-оперон). Указаны
генные продукты и катализируемые ими реакции по
превращению хоризмовой кислоты в триптофан. Пять
генных продуктов дают четыре фермента. Представлены
лидерная последовательность trp L и ее транскрипт
(frp-лидерная РНК), а также аттенуатор и полицистрон-
ная мРНК frp-оперона. Сокращения: PR-фосфорибо-
зил, PRPP-фосфорибозилпирофосфат, CdRP-карбок-
сифениламинодезоксирибулозофосфат и InGP- индол-
глицерофосфат. (С любезного разрешения С. Yanofsky.)
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
179
-Область связывания РНК-полимеразы
Промотор
—40 -30 -20 -10 +1 +10
I ____________I I I I I
Т G A G С TGlTTGA С А А|Т Т А АТ С ATCG A ACT AGlT Т А А С TlAG Т A CGCA AGT Т СА С G Т А А А А
ACTCGAC AACTGTT А А Т Т AGTAG CTTG АТС A ATT G А Т С А Т G CGT Т С A AGTG С А Т Т Т Т
I
---------Оператор---------Начало синтеза мРНК
РИС 3.75.
Перекрывающиеся нуклеотидные последовательности
промотора и оператора Zrp-оперона £. соН. Связывание
комплекса frp-penpeccop триптофан с оператором
препятствует присоединению РНК-полимеразы к про
мотору.
вию РНК-полимеразы с промотором. При этих
условиях транскрипция оперона не осуществляется
и ферменты биосинтеза не образуются. В отсутствие
триптофана не происходит и связывания репрессора
с оператором, что позволяет РНК-полимеразе без
помех инициировать транскрипцию на промоторе
и синтезировать мРНК.
Аттенуация экспрессии триптофанового оперона.
Регуляция работы триптофанового оперона с по-
мощью аттенуации осуществляется при участии по-
следовательности, находящейся на расстоянии при-
мерно 100 140 пар оснований от начала транскрип-
ции (рис. 3.74). Этот так называемый лидерный
сегмент, ZrpL, содержит аттенуаторную последова-
тельность, которая вынуждает РНК-полимеразу
прервать транскрипцию как раз перед началом
ZrpE-гена с отделением фрагмента РНК длиной 141
нуклеотид zrp-лидерной мРНК. Подобная терми-
нация происходит при уровнях триптофана в клет-
ках от среднего до высокого. При низком уровне
триптофана терминация транскрипции в пределах
аттенуаторной последовательности в значительной
мере блокируется, и транскрипция проходит через
терминатор с образованием полноразмерной мРНК
zrp-оперона.
Каков механизм регуляции терминации транс-
крипции в аттенуаторе с помощью изменения содер-
жания триптофана? Ответ на этот вопрос был полу-
чен после того, как определили нуклеотидную по-
следовательность аттенуатора и установили, что на
аттенуацию влияет трансляция, идущая одновре-
менно с транскрипцией Участок из первых 145
нуклеотидов транскрипта Zrp-оперона содержит три
необычных по нуклеотидной последовательности
сегмента (рис. 3.76). Один из них кодирует короткий
полипептид из 14 аминокислот, две из которых
являются тандемными триптофановыми остатками.
Два других содержат инвертированные повторы,
из-за чего происходит внутримолекулярное спарива-
ние оснований РНК-транскрипта и образование
двух альтернативных шпилечных структур (рис. 3.77).
Одна из этих структур, в которой спарены сегменты
1 и 2, 3 и 4 соответственно, опосредствует р-неза-
висимую терминацию транскрипции на участке из
нескольких расположенных подряд за четвертым
сегментом остатков урацила (разд. 3.2.г). Другая
шпилечная структура, в которой сегменты 2 и 3 спа-
рены, а 1 и 4 остаются одноцепочечными, разрешает
транскрипции дойти до конца оперона.
Какая именно шпилечная структура образуется
при транскрипции аттенуаторного участка-зависит
от того, транслируется ли рибосомами полная по-
следовательность, кодирующая полипептид длиной
14 аминокислот. Если синтез лидерного полипеп-
мРНК
trp-
Лидерный пептид
оперона
1 10 20 LyS Ala He Phe Val Leu Lys Gly Trp Trp Arg Thr Ser
PPP "AAGUUCACGljAAAAAG G G U 1 U C G A C A A U G A A A G C A A U U U U C G U A C U G A A A G G U СГСГсГи GG CGCACUlTSlUGA
Конец лидерной 140
последовательности , |
Аттенуаторная последовательность
150 160 170
зо
120
40 50 60 70
110 100 90 80
G G GCG AG U A A UCCGC C i GA C U UAA
130
180
UUAGAGAAuAaCAAUGCAAAGACAAAAACCG
Met Gin Thr Gin
Lys Pro
rrpE
РИС. 3.76.
Лидерная Zrp-мРНК кодирует короткий пептид и содер-
жит аттенуаторную последовательность. В лидерном
полипептиде имеются два расположенных рядом трип-
тофановых остатка.
180
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
А
95
Терминирующий сигнал
Аттенуированный
терминирующий сигнал
Альтернативные структуры со шпиль-
ками, которые образует лидерная
Zrp-мРНК. Нумерация нуклеотидных ос-
татков такая же, как на рис. 3.76.
тида инициируется в кодоне AUG (рис. 3.76), то
рибосомы транслируют следующие 13 кодонов при
условии, что имеются все необходимые амино-
ацил-тРНК. При недостатке триптофанил-тРНК ри-
босомы останавливаются, когда доходят до тан-
демных триптофановых кодонов. Если рибосомы
останавливаются в одном из триптофановых кодо-
нов, расположенных в аттенуаторном сегменте 1, то
последовательности сегментов 2 и 3 свободно спа-
риваются и образуют шпилечную структуру, а сег-
мент 4 остается одноцепочечным (рис. 3.78). Эта
структура не препятствует продолжению транскрип-
ции с образованием полноразмерной Zrp-мРНК дли-
ной 7000 нуклеотидов. Если триптофанил-тРНК
имеется в количестве, достаточном для трансляции
тандемных триптофановых кодонов, то рибосомы
движутся до терминаторного кодона лидерного пеп-
тида и, поскольку сегмент 2 ассоциирован с рибо-
сомой, сегменты 3 и 4 образуют шпильку-струк-
туру, способствующую терминации транскрипции.
Таким образом, аттенуатор позволяет РНК-по-
лимеразе опосредованно «почувствовать» концент-
рацию триптофанил-тРНК через расположение ри-
босомы. Возможность трансляции короткой коди-
рующей последовательности в лидерном сегменте
определяет вторичную структуру транскрипта и,
следовательно, выбор между терминацией и прочте-
нием последовательности. Наличие достаточного
количества триптофанил-тРНК стимулирует терми-
нацию транскрипции, при ее недостатке транскрип-
ция проходит весь оперон.
Суммарный эффект аттенуации и репрессии. Ат-
тенуация и репрессия вместе содействуют оптималь-
ной экспрессии zrp-оперона. При избытке трипто-
фана благодаря репрессии блокируется инициация
синтеза мРНК. Снижение концентрации триптофана
приводит к уменьшению содержания функциональ-
ного комплекса репрессор триптофан, и транскрип-
ция возобновляется. Однако при концентрации
триптофана, допускающей инициацию транскрип-
ции, количества триптофанил-тРНК еще вполне до-
статочно для того, чтобы в пределах лидерного
участка в основном происходила терминация транс-
крипции; следовательно, в таких условиях уровень
экспрессии оперона еще очень низок. По мере сниже
ния концентрации триптофана репрессия полностью
снимается: если концентрация триптофанил-тРНК
становится ниже уровня, необходимого для продол-
жения синтеза, то терминация аттенуируется,
а zrp-мРНК и ферменты начинают синтезироваться
с большей скоростью. Таким образом, экспрессия
оперона достигает максимума в отсутствие репрес-
сии и при максимальной аттенуации терминации;
экспрессия минимальна при почти полной репрессии
оперона и отсутствии аттенуации терминации.
Аттенуация как общий механизм. Аттенуация
используется при регуляции экспрессии многих ге-
нов и оперонов как у E.coli, так и у других орга-
низмов. Оперон, кодирующий девять ферментов,
которые участвуют в биосинтезе гистидина, регу-
лируется исключительно с помощью аттенуации;
аттенуатором служит полипептид-кодирующая по-
следовательность с шестью тандемными гистиди-
новыми кодонами (рис. 3.79). У оперонов, функцио-
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
181
Образование разных шпилечных структур лидерной
frp-мРНК. Положение рибосомы определяет, какая
именно из двух альтернативных шпилек образуется.
и тем самым-сформируется ли структура, способству
ющая терминации транскрипции
нирование которых зависит от содержания опре-
деленных аминокислот треонина и изолейцина
(или лейцина), валина и изолейцина,-лидерный
участок буквально «напичкан» кодонами для этих
аминокислот. Антитерминация, т. е. ослабленная
терминация, не требует сопряжения трансляции
и транскрипции. Она может осуществляться неко-
торыми белками, допускающими экспрессию осо-
бых кластеров генов только после того, как син-
тезированы белки, способствующие аттенуации
(разд. З.Н.д).
д. Временная регуляция
генной экспрессии
в жизненном цикле бактериофага X
У бактериофага X есть два альтернативных спо-
соба существования. При литическом пути все
вирусные гены экспрессируются в определенной вре-
менной последовательности, в результате чего обра-
зуется примерно сотня фаговых частиц и происхо-
дит лизис инфицированной бактерии. Развитие ви-
руса, вызвавшего инфекцию, может пойти по лизо-
генному пути, при котором его ДНК встраивается
в ДНК клетки-хозяина в специфическом месте
(разд. 2.4. г). Интегрированная форма вирусного ге-
нома называется профагом. В лизогенных клетках
профаговая ДНК многократно реплицируется при
помощи клеточного аппарата так, как будто она
является частью клеточного генома. При этом, од-
нако, все фаговые гены, кроме одного, выключены.
Лизогенные клетки переключаются на литический
путь либо спонтанно с низкой частотой, либо под
действием различных химических или физических
факторов. Независимо от природы индукции лити-
ческого цикла «молчащие» ранее фаговые гены
включаются, запуская процессы, приводящие к об-
разованию инфекционных фаговых частиц.
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
183
Головка, Рекомбинация, ♦ а/ р • d р т и >^п«/эртс*о
—• — г n«— dll — t. i — /V—г I —cl — Рр»» — ' R~ его — lRl~ Pre - । -О - P~ ' R— ^R"i—S
XBOC1 интеграция и выщепление int L1 L нм п n 1 KE KZ K nd
РИС. 3.81.
Очередность экспрессии мРНК фага X при литическом
пути развития.
продолжает транскрипцию через эти сайты с обра-
зованием мРНК второго типа - задержанных ранних
транскриптов. Более крупный транскрипт, начи-
нающийся с промотора PL (L2 на рис. 3.81), коди-
рует ферменты, участвующие в рекомбинации,
и (что особенно важно) ферменты, катализирующие
встраивание ДНК фага X в ДНК клетки-хозяина.
Задержанный ранний транскрипт, начинающийся
с промотора PR (транскрипт R2), кодирует фер-
менты, ответственные за репликацию фаговой ДНК
(белки О и Р), и еще один регуляторный белок Q.
Белок Q вызывает аттенуацию терминации транс-
крипции в терминаторном сайте (zR3), расположен-
ном сразу за промотором PR.. При транскрипции
с промотора PR. транскрибируются гены (S и R),
ответственные за включение лизиса клеток. Кроме
того, поскольку ДНК фага X сразу после инфекции
замыкается в кольцо (рис. 3.80), S- и P-гены оказы-
ваются рядом с генами, кодирующими белки голов-
ки и хвоста фага. Следовательно, в результате
транскрипции, инициированной в PR и продолжен-
ной через tR3, образуется мРНК, кодирующая белки
лизиса и все структурные вирусные белки. Итак, мы
рассмотрели образование аппарата, необходимого
для литической инфекции: ферментов репликации
вирусной ДНК и вирусных белков, участвующих
в формировании зрелых фаговых частиц.
Лизогенный путь. Как происходит переключение
всей серии событий, настроенных на литический
цикл развития, на путь лизогении? Для того чтобы
понять это, нужно усложнить схему строения про-
моторов РЕ и PR и ввести несколько дополни-
тельных генов, генных продуктов и промоторов.
На самом деле РЕ и PR являются частью сложной
регуляторной области, в которой промоторы пе-
ремежаются с операторными последовательностями
OL и OR соответственно (рис. 3.82). ОЕ и OR
это сайты связывания двух регуляторных белков:
репрессора с! и антирепрессора Сто. Как мы уже
говорили, белок Сго- это продукт трансляции пред-
ранней мРНК, транскрибируемой вправо с промо-
тора PR. Репрессор кодируется геном cl, локали-
зованным между PR и PL/OL (рис. 3.82). г7-мРНК
транскрибируется в направлении влево от промо-
тора PRE, находящегося справа от Сто-гена. PRE сам
активируется двумя «позитивными» регуляторными
белками. сП и сШ, которые синтезируются после
того, как благодаря действию белка N образуются
транскрипты мРНК, инициированные в PR и РЕ.
соответственно.
По мере накопления репрессора с! происходит
его связывание с левым и правым операторными
сайтами, в результате чего подавляется экспрессия
всех генов, транскрибирующихся с PR и РЕ. В этом
случае предпочтительным оказывается лизогенный
путь, поскольку блокируется образование фермен-
тов репликации и структурных вирусных белков,
а небольшое количество интеграционного фермента
Int, синтезированного с задержанной ранней мРНК,
успевает катализировать рекомбинацию между фа-
говой и бактериальной ДНК до момента полной
репрессии фаговых генов. После интеграции состоя-
ние лизогении поддерживается благодаря образо-
ванию в небольших количествах репрессора cl на
мРНК, транскрибируемой с промотора PRM, ко-
торый находится непосредственно справа от струк-
турного с7-гена.
Но может произойти переключение и на лити-
ческий путь, что зависит от антирепрессорных и ак-
тиваторных свойств Сто. Сто также связывается с OR
и ОЕ, предотвращая тем самым связывание с ними
с! и сводя на нет репрессорное действие последнего.
По мере накопления Сго синтез репрессора с! все
больше блокируется и накапливаются белки реп-
ликации, лизиса и структурные фаговые белки.
Связывание Сго и cl с OR и ОЕ Чтобы понять
механизм очень тонкого антагонистического дейст-
вия белков Сго и cl, нам нужно выяснить природу
и расположение сайтов связывания, находящихся
в пределах операторов OR и OL. OR и ОЕ каждый
состоит из тандемного кластера трех субоперато-
ров: 0L1, OL2, ОЕЗ и ORl, OR2 и OR3 соответственно.
ОЕ перекрывается с РЕ, OR-c PRl и OR3-c PRM
(рис. 3.83). И Сго, и с! связываются со всеми субопе-
раторными сегментами, но относительное сродство
184
ЧАСТЬ I МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
СI -мРНК
РИС. 3.82.
Взаимное расположение промоторов и операторов, оп-
ределяющих литический или лизогенный путь развития
бактериофага X после инфекции. Показаны четыре раз-
личных промотора, а также несколько мРНК, кодиру-
ющих регуляторные белки Сго, репрессор cl и белок N.
Cl-мРНК
5'
их к этим сегментам различно. Так, Сго наиболее
прочно связывается с ORi и значительно слабее-
с 0R2 и 0Rl. Связывание белка Сго с 0L умень-
шается последовательно от OL3 к OL2 и далее к 0L1.
Белок Сго накапливается уже на ранних стадиях
инфекции, поэтому он связывается с 0Ri, предот-
вращая транскрипцию с7-гена с PRM . Поскольку 0R1
и 0L1 остаются свободными до тех пор, пока кон-
центрация белка Сго не достигнет достаточно высо-
кого уровня, транскрипция с PR и PL не подавляется.
Участок связывания
РНК-полимеразы
Участок связывания
РНК-полимеразы
(PRM)
Участок связывания
PH К- полимеразы
(PL)
РИС. 3.83.
Участки связывания белка Сго, репрессора cl и РНК-по-
лимеразы в районе операторов OL и OR.
3. АППАРАТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ЕГО ЛОГИКА
185
Напротив, связывание белка Сто с OR3 и OL3 стиму-
лирует транскрипцию с PR и PL соответственно.
Белок cl также обладает разным сродством к суб-
операторам. Наиболее прочно он связывается с суб-
операторами OR, и OL j, поэтому транскрипция с PR
и PL блокируется при низких его концентрациях.
В этом случае связывание cl-penpeccopa с OR1 также
стимулирует транскрипцию cJ-гена с PRM .
Таким образом, выбор между литическим и ли-
зогенным путями развития зависит от относитель-
ной скорости накопления четырех регуляторных
белков: репрессорного белка cl, антирепрессорного
белка Сто и «позитивных» регуляторных белков сП
и сШ. Если доминирует антирепрессорная функция
Cro-белка, то предпочтение отдается литическому
пути. Если успевает установиться репрессия, то
функции, необходимые для реализации литического
пути, блокируются и происходит лизогенизация.
Поскольку равновесие между этими белками очень
неустойчивое, исход зависит от состояния бакте-
рии-хозяина, от культуральной среды и от многих
других факторов.
е. Трансляционная регуляция
экспрессии некоторых генных
продуктов
Как мы уже говорили, экспрессия прокариоти-
ческих генов, кодирующих РНК (например, рРНК,
тРНК), регулируется на двух этапах-на уровне
транскрипции и на уровне посттранскрипционных
модификаций и превращения предшественников
РНК в зрелые формы. Экспрессия некоторых генов,
кодирующих белки, также регулируется двумя пу-
тями. Первый из них состоит в регуляции содер-
жания мРНК (разд. 3.11. в д), второй основан на
репрессии трансляции. Рассмотрим два примера.
1. Геном каждого из близкородственных бак-
териофагов E.coli-MS2, R17 и QP- представлен
единственной молекулой РНК, функционирующей
и в качестве генома, и в качестве мРНК, на которой
синтезируются белки, необходимые для размноже-
ния вирусов. Геном бактериофага MS2, одного из
представителей этого класса вирусов, состоит из
четырех генов (рис. 3.84). Один из них, гер, кодирует
субъединицу комплекса РНК-репликазы, которая
амплифицирует фаговую РНК для того, чтобы,
во-первых, обеспечить высокий уровень трансляции
фаговых генов и, во-вторых, снабдить геномами
фаговое потомство. Второй ген кодирует белок
оболочки (СР), 180 копий которого образуют ви-
русный икосаэдрический капсид. Третий ген коди-
рует белок А, или матуразу, который является
компонентом зрелой вирусной частицы и необходим
для адсорбции и проникновения вируса в клетку.
Четвертый ген детерминирует белок (Lys), обеспе-
чивающий лизис инфицированных клеток и высво-
бождение вирусного потомства. Последователь-
ность, кодирующая белок Lys, начинается на З'-кон-
це гена СР и продолжается до 5'-конца гена гер.
Однако рамка считывания для белка Lys сдвинута
на один нуклеотид относительно кодирующих по-
следовательностей СР и Rep.
При нормальной инфекции СР присутствует
в клетке в больших количествах, Rep и Lys- в
значительно меньших, а А представлен только несколь-
кими молекулами. Дифференциальная экспрессия
вирусных генов осуществляется благодаря тому, что
для рибосом доступен только инициаторный кодон
AUG гена СР. Соответствующие последователь-
ности генов A, lys и гер находятся в двухцепочечных
участках молекулы РНК (рис. 3.41). Рибосомы ред-
ко транслируют ген А. а если быть точными, то
только один раз-в момент синтеза 5'-конца РНК.
Напротив, ген СР транслируется рибосомами мно-
гократно. При трансляции CP-кодирующей после-
довательности рибосомы разворачивают РНК и экс-
понируют инициаторный кодон AUG гена гер,
обеспечивая его трансляцию. Для того чтобы про-
изошла трансляция Lys-кодирующей последова-
тельности, рибосома иногда «неестественно» тран-
РИС. 3.84.
390
Расположение четырех генов РНК-генома бактериофага
MS2 (3569 нуклеотидов). Длины 5'-лидерной последо-
вательности. четырех генов и З'-трейлерной последо-
вательности, а также длины спейсеров между генами
А и СР и генами СР и гер выражены в числе нукпеоти
дов. Спейсер между генами СР и гер-это часть ко
дирующей области гена lys. (См. рис. 3.41.)
186
ЧАСТЬ I, МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
слоцируется (меняет место) при трансляции после-
довательности гена СР, в результате чего вскоре
происходит терминация трансляции. Это приводит
к возобновлению трансляции в «неположенной»
инициаторной последовательности в пределах гена
lys.
По мере увеличения концентрации СР проис-
ходит его связывание с последовательностью,
перекрывающей последовательность инициации
трансляции гена гер. Это предотвращает синтез
репликазы, но не препятствует образованию белков
оболочки. Итак, трансляция гена гер сначала регу-
лируется с помощью структурных ограничений, бла-
годаря которым уменьшается доступность инициа-
торной последовательности для рибосом, и случай-
ного сползания рибосом во время трансляции,
а затем путем репрессии трансляции, обусловленной
связыванием белка оболочки с его инициаторной
последовательностью.
2. Синтез белков, составляющих собственно ап-
парат трансляции, регулируется на уровне трансля-
ции. Гены, кодирующие белки больших (L) и малых
(S) субчастиц рибосомы и некоторых белков, участ-
вующих в процессе трансляции (в том числе EF-Tu
и EF-G), рассеяны по нескольким оперонам
(рис. 3.67). Это позволяет координированно регу-
лировать синтез тех генных продуктов, которые
должны функционировать согласованно. Экспрессия
таких генов как на уровне транскрипции, так и на
уровне трансляции происходит координированно.
Как мы увидим далее, синтез рибосомных белков
частично регулируется также путем изменения со-
держания трех рРНК и кинетических параметров
процесса сборки рибосом.
Контроль трансляции некоторых оперонов ри-
босомных белков осуществляется по одинаковому
механизму (табл. 3.7). Один из рибосомных белков,
кодируемый полицистронной мРНК, связывается со
специфической последовательностью, локализован-
ной либо на 5'-конце мРНК, либо в начале одной
из кодирующих последовательностей в середине
мРНК. В обоих случаях это блокирует доступ ри-
босом к ближайшей инициаторной трансляционной
последовательности. В зависимости от места нахож-
дения сайта инициации трансляции мРНК-вблизи
5'-конца кодирующей последовательности или в од-
ном из внутренних участков блокируется трансля-
ция всей мРНК или ее части. Контроль по типу
обратной связи, при котором продукт регулирует
экспрессию собственного гена, называется аутоген-
ной регуляцией. Регуляция может осуществляться на
уровне транскрипции (например, репрессорный бе-
лок с! фага X регулирует транскрипцию соответст-
вующего гена с Рим) и на уровне трансляции, как
в приведенном примере.
При сборке рибосом некоторые из рибосомных
белков связываются с рРНК. Это наводит на мысль,
что, возможно, свободная рРНК регулирует синтез
рибосомных белков. Как это может происходить?
При наличии достаточного количества рРНК вновь
синтезированные рибосомные белки ассоциируют
с ней, чтобы инициировать сборку рибосом. При
недостатке же рРНК накапливающиеся рибосомные
белки связываются с собственной мРНК вместо
рРНК и соответственно блокируют собственный
синтез и синтез других родственных рибосомных
белков. В результате предотвращается накопление
свободных рибосомных белков. Таким образом,
некоторые ключевые рибосомные белки-это
репрессоры, блокирующие трансляцию кодирую-
щей их мРНК. Одновременно они блокируют синтез
и других белков, кодируемых той же мРНК. Спо-
собность рибосомных белков узнавать как рРНК,
так и сбою собственную мРНК связана с тем, что
обе эти РНК обладают сходными нуклеотидными
последовательностями (рис. 3.85). Так, последова-
тельности, в которых рибосомные белки S8 и S7
связываются с 16S-PHK и своими собственными
Таблица 3.7. Порядок расположения генов, кодирующих рибосомные белки, факторы
белкового синтеза и субъединицы РНК-полимеразы. Гены этих белков распределены
по мРНК, транскрибируемым с различных оперонов1’
Оперон Белки, кодируемые полицистронной мРНК (начиная с 5'-конца мРНК) Белок- регулятор Инициаторная последова- тельность, с которой связывается регулятор
str S12 S7 EF-G EF-Tu S7 S7
spc LI4 L24 L5 SI4 S8 L6 L18 S5 L30 LI5 L30 S8 L5
SIO SIO L3 L2 L4 L23 S19 L22 S3 S17 L16 L29 L4 S10
а S13 Sil S4 a L17 S4 S13
Lil Lil L1 L1 LI1
rif LIO L7/I2 Р Р' L10 L10
11 мРНК представлены в виде набора кодируемых ими белков Первый белок соответствует 5'-концу мРНК.
Белки, гены которых регулируются координированно, подчеркнуты сплошной линией, а соответствующие белки-
регуляторы указаны в 3-й колонке.
Сайт инициации трансляции
для белка S8
мРНК белка S8
для белка S7
Участок связывания
балка S8 с 16S- рРНК
Участок связывания белка S7 с
16S-pPHK
РИС. 3.85.
Иллюстрация положения, состоящего в том, что связы-
вание одного из рибосомных белков с мРНК может
подавлять трансляцию этой мРНК. А. Сходство первич-
ной и вторичной структур S8-MPHK (spc-оперон лоли-
цистронной мРНК) и участка связывания S8 с 16S-
рРНК. Б. Сходство первичной и вторичной структур
участка связывания белка S7 с 16S-pPHK и сайта ини-
циации трансляции S7-MPHK (str-оперон полицистрон-
ной мРНК). Сходные нуклеотидные последовательности
выделены цветом. [М. Nomura et al.. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 77 (1980), p. 7084; J. D. Watson et al., Molecular
Biology of the Gene, 4th ed. (Menlo Park, Calif.: Benjamin/
Cummings, 1987). См. рис. 3.67 и табл. 3.7, где пред-
ставлена более подробная информация об' этих оперо-
нах.]
188
ЧАСТЬ I, МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
мРНК, имеют сходную вторичную структуру, при-
чем петли имеют идентичные последовательности.
Кроме регуляции на уровне трансляции при
образовании рибосомных белков осуществляется
также регуляция по типу обратной связи при транс-
крипции оперонов рибосомных белков. Мы не бу-
дем обсуждать регуляцию этих оперонов на уровне
транскрипции, а лишь отметим, что могут происхо-
дить репрессия и аттенуация транскрипции рибо-
сомными субчастицами или даже целыми рибосо-
мами. Наиболее вероятно, однако, что ключевым
пунктом в регуляции скорости синтеза рибосом
является образование рРНК. Таким образом, синтез
рибосомных белков и тем самым сборка рибосом
регулируются путем изменения содержания рРНК.
Литература
Введение
Приведены классические статьи и книги по генетике
и биохимии, в которых изложены основные концепции
[молекулярной генетики. Список дан в хронологическом
порядке.
G. Mendel. 1866. Versushe uber Pflanzen-Hybriden. Verhand-
lungen der Naturforschenden Verein, Brunn, 4, 3-47 (пере-
печатано в Journal of Heredity, 42, 3-47, 1951). Эта и еще
одна важная работа Менделя, „Uber einige aus kiinst-
licher Befruchtung gewonnene Hieracium-Bastarde", напе-
чатаны по-английски в кн.: С. Stern. Е. R. Sherwood (eds.).
1966. The Origins of Genetics. A Mendel Source Book.
W. H. Freeman, San Francisco.
F. Miescher. 1871. Uber die chemische Zusammensetzung der
Eiterzellen. Hoppe-Seyler’s Medizinish-Chemischen Unter-
suchungen, 4, 441-460.
A.E.Garrod. 1902. Inborn Errors of Metabolism. Lancet, 2,
1616-1620.
H'S. Sutton. 1903. The Chromosomes in Heredity. Biol. Bull.,
4, 231-251.
A.E.Garrod. 1909. Inborn Errors of Metabolism. Frowde,
Hodder, and Stoughton, London.
W. Johannsen. 1909. Elemente der Exakten Erblichkeitslehre.
Fischer. Jena.
Т.Н. Morgan. 1910. Sex-Linked Inheritance in Drosophila.
Science, 32, 120- 122.
TH. Morgan. A. H. Sturtevant, H. J. Muller, C.B. Bridges.
1915. The Mechanism of Mendelian Heredity. Holt, Ri-
nehart & Winston, New York.
B. McClintock. H.B. Creighton. 1931. A Correlation of Cyto-
logical and Genetical Crossing Over in Zea mays. Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 17, 492-497.
B. McClintock. 1934. The Relation of a Particular Chromoso-
mal Element to the Development of the Nucleoli in Zea
mays. A. Zellforsch. u Mikr. Anat., 21, 294-328.
G.W. Beadle, E.L. Tatum. 1941. Genetic Control of Biochemi-
cal Reactions in Neurospora. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,
27, 499- 506.
0. T. Avery, C.M. Macleod. M. McCarty. 1944. Studies on the
Chemical Nature of the Substance Inducing Transforma-
tion of Pneumococcal Types. I. Induction of Transforma-
tion by a Desoxyribonucleic Acid Fraction Isolated from
Pneumococcus Type III. J. Exp. Med., 79, 137-158.
E. Chargaff. R. Lipschitz. C. Green, M.E.Hodes. 1951. The
Composition of the Deoxyribonucleic Acid of Salmon
Sperm. J. Biol. Chem., 192, 223- 230.
D.M. Brown, A. R. Todd. 1952. Nucleotides. Part X. Some
Observations on the Structure and Chemical Behavior of
the Nucleic Acids. J. Chem. Soc., 52-58.
A.D. Hershey, M. Chase. 1952. Independent Functions of Viral
Protein and Nucleic Acid in Growth of Bacteriophage.
J. Gen. Physiol., 36, 39-56.
J.D. Watson, F.H.C. Crick. 1953. Molecular Structure of
Nucleic Acids: A Structure for Deoxynucleic Acids. Nature,
171. 737-738.
J.D. Watson. F.H.C. Crick. 1953. General Implications of the
Structure of Deoxyribonucleic Acid. Nature. 171, 964-967.
kM. Ingram 1957. Gene Mutations in Human Hemoglobin:
The Chemical Difference Between Normal and Sickle Cell
Hemoglobin. Nature, 180, 326-328.
M. B. Hoagland. M. L. Stephenson. J. F. Scott. L. I. Hecht,
P.C. Zamecnik. 1958. A Soluble Ribonucleic Acid Inter-
mediate in Protein Synthesis. J. Biol. Chem., 231, 241 257.
M. Meselson, F. W. Stahl. 1958. The Replication of DNA in
Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 44, 671 -682.
A. Kornberg. I960. Biological Synthesis of Deoxyribonucleic
Acid. Science, 131, 1503-1508.
S. Brenner, F. Jacob, M. Meselson. 1961. An Unstable Inter-
mediate Carrying Information from Genes to Ribosomes
for Protein Synthesis. Nature, 190, 576-581.
F. Jacob. J. Monod. 1961. Genetic Regulatory Mechanisms in
the Synthesis of Proteins. J. Mol. Biol., 3, 318-356.
M.W. Nirenberg, H.J. Matthaei. 1961. The Dependence of
Cell-Free Protein Synthesis in E.coli upon Naturally Oc-
curring or Synthetic Polyribonucleotides. Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A., 47, 1588-1602.
C. Yanofsky, В. C. Carlton. J. R. Guest, D. R. Helinski, U. Hen-
ning. 1964. On the Colinearity of Gene Structure and
Protein Structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 51,
266-272.
The Genetic Code. 1966. Cold Spring Harbor Symp. Quant.
Biol.. 31, whole issue.
В следующих работах описано историческое развитие гене-
тики и биохимии нуклеиновых кислот.
J. S. Fruton. 1972. Molecules and Life. Wiley-Interscience, New
York.
H. Stubbe. 1972. History of Genetics: From Prehistoric Times
to the Discovery of Mendel’s Laws. Translated by
T. R. W. Waters. MIT Press, Cambridge, Massachusetts.
R. Olby. 1974. The Path to the Double Helix. University of
Washington Press, Seattle.
F.H. Portugal, J.S. Cohen. 1977. A Century of DNA. MIT
Press, Cambridge, Massachusetts.
H. F. Judson. 1979. The Eighth Day of Creation. Simon and
Schuster. New York.
Общие работы для всех глав части I
С. R. Cantor. P.R. Schimmel. 1980. Biophysical Chemistry.
W. H. Freeman, San Francisco. [Имеется перевод: Кан-
тор Ч„ Шиммел П. Биофизическая химия: В 3-х т.- М.:
Мир, 1983-1985 гг.]
В. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, К. Roberts, J. D. Watson.
1983. Molecular Biology of the Cell. Garland. New York.
[Имеется перевод: Албертс Б., Уотсон Дж., Моне Дж.
и др. Молекулярная биология клетки: В 5 т. М.: Мир,
1986-1987 гг.]
G. Zubay. 1983. Biochemistry. Addison-Wesley, Reading, Mas-
sachusetts.
J. Darnell, H. Lodish, D. Baltimore. 1986. Molecular Cell Biolo-
gy. Scientific American Books, New York.
D. Freifelder. 1987. Molecular Biology, 2nd ed. Jones and
Bartlett, Boston.
В Lewin. 1987. Genes, 3rd ed. Wiley, New York. [Имеется
190
ЧАСТЬ I, МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
перевод 2-го издания с дополнениями: Льюин Б. Гены.
М.: Мир, 1987.]
J.D. Watson, N.H. Hopkins, J. W. Roberts, J.A.Steitz,
A. M. Weiner. 1987. Molecular Biology of the Gene, 4th ed.
Benjamin/Cummings, Menlo Park, California.
J.D. Rawn. 1988. Biochemistry. Carolina Biological Supply
Co., New York.
L. Stryer. 1988. Biochemistry, 3rd ed. W. H. Freeman, San
Francisco. [Имеется перевод 2-го издания: Страйер Л.
Биохимия. М.: Мир, 1985.]
Литература к указанным разделам глав
1.1.
F.H.C. Crick, J.D. Watson. 1954. The Complementary Struc-
ture of Deoxyribonucleic Acid. Proc. Roy. Soc., 223 (4),
80 96.
F.H.C. Crick. 1976. Linking Numbers and Nucleosomes. Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 73, 2639-2643.
W.R. Bauer. F.H.C. Crick. J. H. White. 1980. Supercoiled
DNA. Sci. American, 243, 118-133.
A. Kornberg. 1980 and 1982 supplement. DNA Replication.
W. H. Freeman, San Francisco. [Имеется перевод изда-
ния 1974 г.: Корнберг А. Синтез ДНК - М.: Мир, 1977.]
R. D. Kornberg, A. Klug. 1981. The Nucleosome. Sci. American,
244, 52-79.
R. E. Dickerson. H. R. Drew, B. N. Conner, R. M. Wing,
A. V. Frat ini. M.L. Корка. 1982. The Anatomy of A-, B-
and Z-DNA. Science. 216. 475-485.
A. Klug. 1982. From Macromolecules to Biological Assemblies.
Nobel lecture. Nobel Foundation, Stockholm, Sweden.
Structure of DNA. 1982. Cold Spring Harbor Symp. Quant.
Biol., 47 whole issue.
J. C. Wang. 1982. DNA Topoisomerases. Sci. American, 247,
94 109.
A. Rich. A. Nordheim, H.-J. Wang. 1984. The Chemistry and
Biology of Left-Handed Z-DNA. Annu. Rev. Biochem., 53,
791-846.
W. Sanger. 1984. Principles of Nucleic Acid Structure. Sprin-
ger-Verlag, New York. [Имеется перевод: Зенгер В.
Принципы структурной организации нуклеиновых кис-
лот.-М.: Мир, 1987.]
С. Felsenfeld. 1985. DNA. Sci. American, 253 (4), 58-67.
D. E. Pettijohn. 1988. Histone-like Proteins and Bacterial Chro-
mosome Structure. J. Biol. Chem., 263, 12793-12796.
К. E. van Holde. 1988. Chromatin. Springer-Verlag, New York.
R. D. Wells. 1988. Unusual DNA Structures. J. Biol. Chem.,
263. 1095-1098 (краткий обзор).
1.2
R. W. Holley 1968. The Nucleotide Sequence of a Nucleic Acid.
Sci. American, 214, 30-39.
A. Rich, U.L. Raj Bhandary. 1976. Transfer RNA: Molecular
Structure, Sequence and Properties. Annu. Rev. Biochem.,
45, 805-860.
H. F. Noller. 1984. Structure of Ribosomal RNA. Annu. Rev.
Biochem., 55, 119- 162.
J. E. Darnell, Jr. 1985. RNA. Sci. American, 253 (4), 68-78.
1.3
R. E. Dickerson, I. Geis. 1969. The Structure and Action of
Proteins. Benjamin/Cummings, Menlo Park, California.
T.E. Creighton. 1983. Proteins: Structure and Molecular Pro-
perties. W. H. Freeman. San Francisco.
R. E. Dickerson, I. Geis. 1983. Hemoglobin: Structure,
Function, Evolution and Pathology. Benjamin/Cummings,
Menlo Park, California.
C. Chothia. 1984. Principles That Determine the Structure of
Proteins. Annu. Rev. Biochem., 53, 537-572.
R. F. Doolittle. 1985. Proteins. Sci. American, 253 (4), 88 99.
R.J. Fletterick, T. Schroer, R.J. Matela. 1985. Molecular Struc-
ture: Macromolecules in Three Dimensions. Blackwell
Scientific Publications, Oxford, England.
M.E. Goldberg. 1985. The Second Translation of the Genetic 1
Message: Protein Folding and Assembly. Trends Biochem
Sci., 10, 388-391.
2.1
J. Cairns. 1966. The Bacterial Chromosome. Sci. American, I
214, 36-44.
W. Gilbert, D. Dressier. 1968. DNA Replication: The Rolling
Circle Model. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 33.
473-484.
J. S. Sussenbach, P. C. Van der Vliet, D. J. Ellens, H. S. Jim:.
1972. Linear Intermediates in the Replication of Adenovirus
DNA. Nature New Biol., 239, 47-49.
J.D. Watson. 1972. Origin of Concatameric T7 DNA. Nature
New Biol., 235, 197-201.
J. D. Wolfson, D. Dressier, M. Magazin. 1972. Bacteriophage T7
DNA Replication: A Linear Replicating Intermediate Proc
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69, 499-504.
l.R. Lehman. 1974. DNA Ligase: Structure, Mechanism and
Function. Science, 186, 790-797.
D. Bastia. M. Sueoka, E. Cox. 1975. Studies in the Late Repli-
cation of Phage X: Rolling Circle Replication. J. Mol. Biol
98, 305-320.
D. M. Rekosh, W. C Russel, A. J. D Bellet, A. J. Robinson. 1977
Identification of a Protein Linked to the Ends of Adeno-
virus DNA. Cell, 11, 283-295.
DNA: Replication and Recombination. 1978. Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol. 43 whole issue.
S.H. Wickner. 1978. DNA Replication Proteins of Escherichia
coli. Annu. Rev. Biochem., 47, 1163-1191.
T. J. Kelly. Jr., R. L. Lechner. 1976. The Structure of Replica-
ting Adenovirus DNA Molecules. Characterization of
DNA-Protein Complexes from Infected Cells. Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol., 43, 721-728.
N.R. Cozzarelli. 1980. DNA Gyrase and the Supercoiling of
DNA. Science, 207, 953-960.
M. Gellert. 1981. DNA Topoisomerases. Annu. Rev. Biochem.,
50, 879-910.
Y. Hirota, M. Yamada. A. Nishimura. A. Oka, K. Sugimoto.
K. Asada, M. Takanami. 1981. The DNA Replication Ori-
gin (ori) of Escherichia coli: Structure and Function of the
ori-Containing DNA Fragment. Prog. Nucleic. Acid. Res.,
26, 33-48.
O. Sundin, A. Varshavsky. 1981. Arrest of Segregation Leads to
Accumulation of Highly Intertwined Catenated Dimers:
Dissection of the Final Stages of SV40 DNA Replicffliin.
Cell, 25, 659-669.
В. M. Alberts, В. P. Bedinger, T. Formosa, С. V. Jongeneel.
K.N. Kreuzer. 1982. Studies on DNA Replication in the
Bacteriophage T4 in vitro Systems. Cold Spring Harbor
Symp. Quant. Biol., 47, 655-668.
B.M. Baroudy, S. Venkatesan, B. Moss. 1982. Structure and
Replication of Vaccinia Virus Telomeres. Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol., 47, 723-729.
B. W. Stillman. F. Tamenoi. 1982. Adenoviral DNA Replication:
DNA Sequences Required for Initiation in vitro. Cold
Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 47, 741-750.
A. Kornberg. 1983. Mechanism of Replication of the E.coli
Chromosome. Eur. J. Biochem., 137, 377-382.
N.G. Nossal. 1983. Prokaryotic DNA Replication Systems.
Annu. Rev. Biochem., 52, 581-615.
В. M. Alberts. 1984. The DNA Enzymology of Protein Machi-
nes. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 49, I 12.
S. Dinardo, K. Voelkel, R. Sternglanz. 1984. DNA Topoiso-
merase II Is Required for Segregation of Daughter Molecu-
les at the Termination of DNA Replication. Proc. Natl.
ЛИТЕРАТУРА
191
Acad. Sci. U.S.A., 81, 2616 2620.
M. Kaguni, A. Kornberg. 1984. Replication Initiated at the
Origin (oriC) of the E. coli Chromosome Reconstituted with
Purified Enzymes. Cell, 38, 183-190.
J. Tomizawa. 1984. Control of Col El Plasmid Replication: The
Process of Binding of RNA 1 to the Primer Transcript. Cell,
38, 861-870.
T. Kirchhausen. J.C. Wang. S.C. Harrison. 1985. DNA Gyrase
and Its Complexes with DNA: Direct Observation by
Electron Microscopy. Cell, 41, 933-943.
C.S. McHenry. 1985. DNA Polymerase 111 Holoenzyme of
Escherichia coli: Components and Function of a True
Replicative Complex. Mol. Cell. Biochem., 66, 71-85.
B.W. Stillman. Y. Gluzman. 1985. Replication and Supercoiling
of SV40 DNA in Cell-Free Extracts from Human Cells.
Mol. Cell. Biol., 5, 2051-2060.
J.L. Campbell. 1986. Eukaryotic DNA Replication. Annu. Rev.
Biochem., 55, 733-771.
H. Echols. 1986. Multiple DNA-Protein Interactions Gover-
ning High-Precision DNA Transactions. Science, 233,
1050-1056.
A. Maxwell, M. Gellert. 1986. Mechanistic Aspects of DNA
Topoisomerases. Adv. Prot. Chem., 38, 69-107.
S.A. Wasserman, N. R. Cozzarelli. 1986. Biochemical Topology:
Applications to DNA Recombination and Replication.
Science, 232, 951 960.
C.M. Joyce. T. Steitz. 1987. DNA Polymerase 1: From Crystal
Structure to Function via Genetics. Trends Biochem. Sci.,
12, 288-292.
T. Kelly. B. Stillman (eds.). 1988. Eukaryotic DNA Replication.
Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
A. Kornberg. 1988. DNA Replication. J. Biol. Chem., 263, 1-4.
2.2
D. Baltimore. 1970. Viral RNA-Dependent DNA Polymerase.
Nature, 226, 1209- 1211.
И.М. Temin. S. Mizutani. 1970. Viral RNA-Dependent DNA
Polymerase. Nature, 226, 1211 1213
E. Giboa, S. W. Mitra, S. Goff, D. Baltimore. 1979. A Detailed
Model of Reverse Transcription and Tests of Crucial
Aspects. Cell, 18, 93-100.
ILS. Mason, J.M. Taylor, R. Hull. 1987. Retroid Virus Geno-
me Replication. Adv. Virus Res., 32, 35-96.
H. Varmus. 1987. Reverse Transcription. Sci. American, 257,
56-64.
2.3
P. Howard-Flanders. 1981. Inducible Repair of DNA. Sci.
American, 245, 72-103.
T. Lindahl. 1982. DNA Repair Enzymes. Annu. Rev. Biochem.,
51, 61-87.
L.A. Loeb, TA. Kunkel. 1982. Fidelity of DNA Synthesis.
Annu. Rev. Biochem., 51, 429-457.
A. Sancar, WD. Rupp. 1983. A Novel Repair Enzyme:
LT'A ABC Excision Nuclease of Escherichia coli Cuts
a DNA Strand on Both Sides of the Damaged Region. Cell,
33, 249- 260.
A. T. Yeung, W.B. Mattes, E. Y. Oh, L. Grossman. 1983. Enzy-
matic Properties of Purified Escherichia coli uvrABC Pro-
teins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 6157-6161.
E.C. Friedberg. 1984. DNA Repair. W. H. Freeman, San Fran-
cisco.
A. Sancar, G.B. Sancar. 1988. DNA Repair Enzymes. Annu.
Rev. Biochem., 57, 29-67.
N. Sigal, B. Alberts. 1972. Genetic Recombination: The Nature
of a Crossed Stranded Exchange Between Two Homolo-
gous DNA Molecules. J. Mol. Biol., 71, 789-793.
S.A. Latt. 1979. Sister Chromatid Exchanges. Genetics, 92,
583-595.
F. W. Stahl. 1979. Genetic Recombination: Thinking About It in
Phage and Fungi. W. H. Freeman, San Francisco.
C. DasGupta. A. Wu, R. Kahn, R. Cunningham. C. Radding.
1981. Concerted Strand Exchange and Formation of Hol-
liday Structures by E. coli RecA Protein. Cell, 25, 507-516.
H. Nash. 1981. Integration and Excision of Bacteriophage л:
The Mechanism of Conservative Site Specific Recombina-
tion. Annu. Rev. Genet., 15, 143-167.
C. Radding. 1982. Homologous Pairing and Strand Exchange
in Genetic Recombination. Annu. Rev. Genet., 16, 405-437.
J. Szostak, T. Orr-Weaver, R. Rothstein, F. Stahl. 1983 The
Double-Strand Break Repair Model for Recombination.
Cell, 33, 25-35.
R. Weisberg, A. Landy. 1983. Site-Specific Recombination in
Phage Ё. In R. Hendrix, J. Roberts, F. Stahl and R. Weis-
berg (eds.), Lambda II, pp. 211 250. Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
M. M. Cox, I. R. Lehman. 1987. Enzymes of General Recom-
bination. Annu. Rev. Biochem., 56, 229-262.
P. Modrich. 1987. DNA Mismatch Correction. Annu. Rev.
Biochem., 56, 435-466.
2.5
S. Spiegelman, I. Haruna. LB. Holland, B. Beaudreau. D. Mills.
1965. The Synthesis of a Self-Propagative and Infectious
Nucleic Acid with a Purified Enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 54, 919-927.
T. Blumenthal, G.C. Carmichael. 1979. RNA Replication: Func-
tion and Structure of QB-Replicase. Annu. Rev. Biochem.,
48, 525-548.
3.1
F. H. C. Crick. 1958. On Protein Synthesis, Biological Repli-
cation of Macromolecules. Symp. Exp. Biol., 12, 138-163.
J. D. Watson. 1963. The Involvement of RNA in the Synthesis
of Proteins. Science, 140. 17 26.
H. Weissbach, S. Pestka (eds.). 1977. Molecular Mechanisms of
Protein Biosynthesis. Academic Press, New York.
3.2
J. W. Roberts. 1969. Termination Factor for RNA Synthesis.
Nature, 224, 1168-1174.
A. A. Travers, R.R. Burgess. 1969. Cyclic Reuse of the RNA
Polymerase Sigma Factor. Nature, 222, 537-540.
C. Lowery-Goldhammer, J. P. Richardson. 1974. An RNA-De-
pendent Nucleoside Triphosphate Phosphohydrolase
(ATPase) Associated with Rho Termination Factor. Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 71, 2003-2007.
M. Rosenberg, D. Court. 1979. Regulatory Sequences Involved
in the Promotion and Termination of RNA Transcription.
Annu. Rev. Genet., 13, 319-353.
R. Losick, J. Pero. 1981. Cascades of Sigma Factors. Cell, 25,
582-584.
M. Chamberlin. 1982. Bacterial DNA-Dependent RNA Poly-
merases. In P. D. Boyer (ed.), The Enzymes, part B, vol. 15,
pp. 61- 108. Academic Press, New York.
R. Rodriguez, M. Chamberlin (eds.). 1982. Promoters: Structure
and Function. Praeger, New York.
D.K. Hawley, W. R. McClure. 1983. Compilation and Analysis
of Escherichia coli Promoter DNA Sequences. Nucleic Acid
Res., 11, 2237-2255.
H. von Hippel, D. G. Bear, W. D. Morgan, J. A. McSwiggen.
“ 1984. Protein-Nucleic Acid Interactions in Transcription:
A Molecular Analysis. Annu. Rev. Biochem., 53, 389-446.
W. R. McClure. 1985. Mechanism and Control of Transcription
Initiation in Prokaryotes. Annu. Rev. Biochem., 54.
171-204.
T. Platt. 1986. Transcription Termination and the Regulation
of Gene Expression. Annu. Rev. Biochem., 55, 339-372.
192
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ. ОБЗОР
С. A. Brennan, A.J. Dombrowski, Т. Platt. 1987. Transcription
Termination Factor Rho Is an RNA-DNA Helicase. Cell,
48, 945-952.
3.3
E. Lund, J. E. Dahlberg, L. Lindahl, R. Jaskunas, P. P. Dennis.
M. Nomura. 1976. Transfer RNA Genes Between 16S
rRNA Gene in RNA Transcription Units. Cell, 7, 165- 177.
J. D. Smith. 1976. Transcription and Processing of Transfer
RNA Precursors. Proc. Nucleic Acid. Res.,16, 25-73.
N. Nakqjima, H. Ozeki. К Shimura. 1977. Organization and
Structure of an E.coli tRNA Operon Containing Seven
tRNA Genes. Cell, 23, 239-249.
P. Gegenheimer, D. Apirion. 1981. Processing of Prokaryotic
Ribonucleic Acid. Microbiol. Rev., 45, 502-541.
S. Altman. C. Guerrier-Takeda, H. Frankfort, H. Robertson.
1982. RNA Processing Nucleases. In S. Linn and R. Ro-
berts (eds.), Nucleases, pp. 243-274. Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
H.D. Robertson. 1982. Escherichia coli Ribonuclease Ill Clea-
vage Sites. Cell, 30, 669-672.
M. Deutscher. 1984. Processing of tRNA in Prokaryotes and
Eukaryotes. Crit. Rev. Biochem., 17, 45-71.
3.4
F.H.C. Crick. 1958. On Protein Synthesis, Biological Replica-
tion of Macromolecules. Symp. Exp. Biol., 12, 158-163.
F.H.C. Crick, L. Barnett, S. Brenner. R.J. Watts-Tobin. 1961.
General Nature of the Genetic Code for Proteins. Nature,
192, 1227-1232.
M.W. Nirenberg, J.H. Matthaei. 1961. The Dependence
of Cell-Free Protein Synthesis in E.coli upon Naturally
Occurring or Synthetic Polyribonucleotides. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 47, 1588-1682.
J. F. Speyer, P. Lengyel. C. Basilica. A.J. Wahba, R.S. Gard-
ner, S. Ochoa. 1963. Synthetic Polynucleotides and the
Amino Acid Code. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.,
28, 559-568.
M. Nirenberg, P. Leder. 1964. The Effect of Trinucleotides
upon the Binding of sRNA to Ribosomes. Science, 145,
1399 1407.
A.S. Sarabhai, A.O. Stretton, S. Brenner, A. Bolle. 1964. Coli-
nearity of the Gene with the Polypeptide Chain. Nature,
201, 13-17.
C. Yanofsky. В. C. Carlton, J. R. Guest. D. R. Helinski, U. Hen-
ning. 1964. On the Colinearity of Gene Structure and
Protein Structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 51, 266-
272.
F.H.C. Crick. 1966. Codon-Anticodon Pairing: The Wobble
Hypothesis. J. Mol. Biol., 19, 548-555.
The Genetic Code. 1966. Cold Spring Harbor Symp. Quant.
Biol., 31, whole issue.
M. Yeas. 1969. The Biological Code. Wiley-Interscience, New
York.
3.5
P. Berg, E.J. Ofengand. 1958. An Enzymatic Mechanism for
Linking Amino Acids to RNA. Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A., 44, 78 86.
M. B. Hoagland, M. L. Stephenson, J. F. Scott, L. I. Hecht,
P.C. Zamecnik. 1958. A Soluble Ribonucleic Acid Interme-
diate in Protein Synthesis. J Biol. Chem., 231, 241-257.
F. Chapeville. F. Lipmann. G.V. Elivenstein. B. Weisblum.
W.J. Ray. Jr. S. Benzer. 1962. On the Г ale of Soluble
Ribonucleic Acid in Coding for Amino A ds. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 48, 1086 1092.
R. W. Holley. 1966. The Nucleotide Sequence of a Nucleic Acid.
Sci. American, 214, 30-39.
M. Nomura. 1973. Assembly of Bacterial Ribosomes. Science,
179, 864-873.
A. Rich, U.L. Raj Bhandarv. 1976. Transfer RNA: Molecular
Structure, Sequence and Properties. Annu. Rev. Biochem.
45, 805-860.
A. Rich, S.H. Kim. 1978. The Three-Dimensional Structure of
Transfer RNA. Sci. American, 238, 56-62.
P. R. Schimmel. D. Sdll. 1979. Amino Acyl tRNA Synthetases:
General Features and Recognition of tRNAs. Annu. Rev.
Biochem., 48, 601 -648.
I. Wool. 1979. The Structure and Function of Eucaryotic
Ribosomes. Annu. Rev. Biochem., 48, 719-754.
J. A. Lake. 1981. The Ribosome. Sci. American, 245, 84 97.
K.H. Nierhaus. 1982. Structure, Assembly and Function of
Ribosomes. Current Topics in Microbiol, and Immun., 97,
82-155.
P. Schimmel, S. Putney, R. Starzyk. 1982. RNA and DNA
Sequence Recognition and Structure-Function of Amino
Acyl tRNA Synthetases. Trends Biochem. Sci., 7, 209-212.
H. G. Wittmann. 1982. Components of Bacterial Ribosomes.
Annu. Rev. Biochem., 51, 155-183.
H.G. Wittmann. 1983. Architecture of Prokaryotic Ribosomes.
Annu. Rev. Biochem., 52, 35-66.
M. Yarus, R. Thompson. 1983. Precision of Protein Biosynthe-
sis. In: J. Beckwith, J. Davies, J. A. Gallant (eds.). Gene
Function in Prokaryotes, pp. 23-63. Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
H. F. Noller. 1984. Structure of Ribosomal RNA. Annu. Rev.
Biochem., 53, 119- 162.
D.M. Blow, P. Brick. 1985. Amino Acyl tRNA Synthetases. In:
F. A. Jurnak, A. McPherson (eds.), The Structure of Biolo-
gical Macromolecules and Assemblies, vol. 2, Nucleic Acid
Binding Proteins, pp. 442-469. Wiley, New York.
J. A. Lake. 1985. Evolving Ribosome Structure: Domains in
Archaebacteria, Eubacteria, Eocytes and Eukaryotes. Annu.
Rev. Biochem, 54, 507-530.
G. R. Bjork, J. V. Ericson, С. E. D. Gustafsson, T. G. Hagerrall.
Y. H. Jonsson. P. M Wilkstrom. 1987. Transfer RNA Modifi-
cation. Annu. Rev. Biochem., 56, 263-288.
P. Schimmel. 1987. Amino Acyl tRNA Synthetases: General
Scheme of Structure-Function Relationship in the Poly-
peptides and Recognition of Transfer RNAs. Annu. Rev.
Biochem., 56, 125-158.
3.6
H.M. Dintzis. 1961. Assembly of the Peptide Chain of He-
moglobin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 47, 247-261.
J. Shine. L. Dalgarno. 1974. The З'-Terminal Sequence of E.coli
16S rRNA: Complementarity to Nonsense Triplets and
Ribosome Binding Sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 71,
1342-1346.
Y. Kaziro. 1978. The Role of Guanosine 5'-Triphosphate in
Polypeptide Chain Elongation. Biochem. Biophys. Acta,
505, 95 127.
M. Grunberg-Manago. 1980. Initiation of Protein Synthesis as
Seen in 1979. In: G. Chambliss, G. R. Craven, J. Davies,
K. Davis, L. Kahan, and M. Nomura (eds.), Ribosomes:
Structure, Function and Genetics, pp. 445-478. University
Park Press, Baltimore.
J. Ofengand. 1980. The Topography of tRNA Binding Sites on
the Ribosome. In: G. Chambliss, G. R. Craven, J. Davies,
K. Davis, L. Kahan, and M. Nomura (eds.), Ribosomes:
Structure, Function and Genetics, pp. 497-530. University
Park Press, Baltimore.
H. Weissbach. 1980. Soluble Factors in Protein Synthesis. In:
G. Chamliss. G. R. Craven, J. Davies, K. Davis, L. Kahan,
M. Nomura (eds.), Ribosomes: Structure, Function and
Genetics, pp. 445-478. University Park Press, Baltimore.
L. Gold. D. Pribnow. T. Schneider, S. Shinedling, B. S. Singer,
G. Starmo. 1981. Translational Initiation in Prokaryotes.
Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403.
R. .4. Garrett. P. Wooley. 1982. Identifying the Peptidyl Trans-
ЛИТЕРАТУРА
193
ferase Centre. Trends Biochem. Sci., 7, 385-386.
A. Johnson, H. Adkins, E. Matthews, C. Cantor. 1982. Distance
Moved by Transfer RNA During Translocation from the
A Site to the P Site on the Ribosome. J. Mol. Biol., 156,
113-140.
M. Kozak. 1983. Comparision of Initiation of Protein Synthesis
in Prokaryotes, Eukaryotes and Organelles. Microbiol.
Rev., 47, 1-45.
C.T. Caskey, W.S. Forrester, W. Tate. 1984. Peptide Chain
Termination. In: B. Clark and H. Petersen (eds)., Alfred
Benzon Symposium, vol. 19, pp. 457-466. Munksgaard,
Copenhagen.
K. Moldave. 1985. Eukaryotic Protein Synthesis. Annu. Rev.
Biochem., 54, 1109-1149.
3.7
K. Moldave. 1965. Nucleic Acids and Protein Biosynthesis.
Annu. Rev. Biochem., 34, 419-448.
F.H.C. Crick. 1966. Codon-Anticodon Pairing: The Wobble
Hypothesis. J. Mol. Biol., 19, 548-555.
Protein Synthesis. 1969. Cold Spring Harbor Symp. Quant.
Biol., 34, whole issue.
В A. Hamkalo, O.L. Miller, Jr. 1973. Electron Microscopy of
Genetic Activity. Annu. Rev. Biochem., 42, 379-396.
R Haselkorn, L.B. Rothman-Denes. 1973. Protein Synthesis.
Annu. Rev. Biochem., 42, 397-438.
V Nomura, A. Tissieres, P. Lengyel (eds.). 1974. Ribosomes.
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New
York.
E. Beronak. 1978. Mechanisms in Polypeptide Chain Elonga-
tion on Ribosomes. Proc. Nucl. Acid Res. Mol. Biol., 21,
63-100.
M Grunberg-Manago, R. H. Buckingham, B. S. Cooperman,
J. W. B. Hershey. 1978. Structure and Function of the
Translation Machinery. Symp. Soc. Gen. Microbiol., 28,
27-110.
D.A. Steege. D.G. Soil. 1979. Suppression. In: R. F. Goldberger
(ed.), Biological Regulation and Development I, pp. 433-
486. Plenum, New York.
H. Ozeki, H. Inokuchi, F. Yamao, M. Kodaira, H. Sakano,
T. Ikemura, Y. Shimura. 1980. Genetics of Nonsense Sup-
pressor tRNAs in E.coli. In: D. Soil, J. M. Abelson,
P. R. Schimmel (eds.), Transfer RNA, Biological Aspects, pp.
341-349. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, New York.
J.R. Roth. 1981. Frameshift Suppression. Cell, 24, 601-602.
M. Yarus, R. Thompson. 1983. Precision of Protein Biosynthe-
sis. In: J. Beckwith, J. Davies, J. A. Gallant (eds.), Gene
Function in Prokaryotes, pp. 23-63. Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
3.8
K. Moldave. 1985. Eukaryotic Protein Synthesis. Annu. Rev.
Biochem., 54, 1109-1149.
3.9
J. H. Goldberg, P.A. Friedman. 1971. Antibiotics and Nucleic
Acids. Annu. Rev. Biochem., 40, 775-810.
H.M.Sobell. 1974. How Actinomycin Binds to RNA. Sci.
American, 231. 82-91.
S. Pestka. \9П. Inhibitors of Protein Biosynthesis. In:
H. Weissbach, S. Pestka (eds.), Molecular Mechanisms of
Protein Biosynthesis, pp. 467-553. Academic Press, New
York.
R.J. Subadolnik. 1979. Naturally Occurring Nucleoside and
Nucleotide Antibiotics. Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol., 22,
193-291.
E. Cundliffe. 1980. Antibiotics and Prokaryote Ribosomes:
Action, Interaction and Resistance. In: G. Chambliss,
G. R. Craven, J. Davies, K. Davis, L. Kahan, M. Nomura
(eds)., Ribosomes: Structure, Function and Genetics,
pp. 377-412. University Park Press, Baltimore.
3.10
S. Michaelis, J. Beckwith. 1982. Mechanism of Incorporation of
Cell Envelope Proteins in Escherichia coli. Annu. Rev.
Microbiol., 36, 435-465.
G. Schatz, R.A. Butow. 1983. How Are Proteins Imported into
Mitochondria? Cell, 32, 316-318 (краткий обзор).
T.J. Silhavy, S.A. Benson, S.D. Emr. 1983. Mechanisms of
Protein Localization. Microbiol. Rev., 47, 313-344.
L. L. Randall, S.J.S. Hardy. 1984. Export of Protein in Bacte-
ria: Dogma and Data. In: B. Satir (ed.), Modern Cell
Biology, vol. 3, pp. 1-20. Liss, New York.
P. Walter, R. Gilmore, G. Blobel. 1984. Protein Translocation
Across the Endoplasmic Reticulum. Cell, 38, 5-8.
J. E. Rothman. 1985. The Compartmental Organization of the
Golgi Apparatus. Sci. American, 253 (3), 74-89.
R. Scheckman. 1985. Protein Localization and Membrane Traf-
fic. Annu. Rev. Cell Biol., 1, 115-143.
M. Schleyer, W. Neupert. 1985. Transport of Proteins into
Mitochondria: Translocational Intermediates Spanning
Contact Sites Between Outer and Inner Membranes. Cell,
43, 339-350.
S.R. Pfeffer, J.E. Rothman. 1987. Biosynthetic Protein Trans-
port by the Endoplasmic Reticulum and Golgi. Annu. Rev.
Biochem., 56, 829-852.
J. E. Rothman. 1987. Protein Sorting by Selective Retention in
the Endoplasmic Reticulum and Golgi Stack. Cell, 50,
521-522.
H.F. Lodish. 1988. Transport of Secretory and Membrane
Glycoproteins from the Rough Endoplasmic Reticulum to
the Golgi. J. Biol. Chem., 263, 2107-2110.
D. Raise, G. Schatz. 1988. Mitochondrial Presequences. J. Biol.
Chem., 263, 4509-4511 (краткий обзор).
3.11
F. Jacob, J. Monad. 1961. Genetic Regulatory Mechanisms in
the Synthesis of Proteins. J. Mol. Biol., 3, 318-356.
S. Adhya, M. Gottesman. 1978. Control of Transcription Ter-
mination. Annu. Rev. Biochem., 47, 967-996.
W. Fiers. 1979. Structure and Function of RNA Bacteriopha-
ges. Comp. Virology, 13, 69-204.
R. F. Goldberger (ed.). 1979. Biological Regulation and Deve-
lopment. I. Gene Expression. Plenum, New York.
J. Miller, W. Reznikoff (eds.). 1980. The Operon. Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
C. Yanofsky, R. Kolter. 1982. Attenuation in Amino Acid Bio-
synthesis Operons. Annu. Rev. Genet., 16, 113-134.
C. Bauer, J. Carey, L. Kasper, S. Lynn, D. Woechter, J. Gard-
ner. 1983. Attenuation in Bacterial Operons. In: J. Beck-
with, J. Davies, J. Gallant (eds.), Gene Function in
Prokaryotes, pp. 65-89. Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, New York.
К. M. Campbell, C. D. Starmo, L. Gold. 1983. Protein-Mediated
Translation Repression. In: J. Beckwith, J. Davies, J. Gal-
lant (eds.), Gene Functii in Prokaryotes, pp. 185-187.
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
New York.
R. W. Hendrix, J. W. Roberts, F. W. Stahl, R.A. Weisberg (eds.).
1983. Lambda 11. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, New York.
О. C. Uhlenbeck, J. Carey, P.J. Romaniok, P.T. Lowary,
D. Beckett. 1983. Interaction of R17 Coat Protein with Its
RNA Binding Site for Translational Repression. J. Biomol.
Structure and Dynamics, 1, 539-552.
B. De Crombrugghe. S. Busby, H. Buc. 1984. Cyclic AMP
Receptor Protein: Role in Transcription Activation. Science.
224, 831-838.
S. Gottesman. 1984. Bacterial Regulation: Global Regulatory
13-243
194
ЧАСТЬ I. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ОБЗОР
Networks. Annu. Rev. Genet., 18. 415-442.
M. Nomura, R. Course, C. Baughman 1984. Regulation of the
Synthesis of Ribosomes and Ribosomal Components. Annu.
Rev. Biochem., 53, 75-117.
C. Pabo, R. Sauer. 1984. Protein-DNA Recognition. Annu. Rev.
Biochem., 58, 293-321.
D. Raibaud, M. Schwartz. 1984. Positive Control of Transcrip-
tion Initiation in Bacteria. Annu. Rev. Genet., 18, 173-206.
M.B. Matthews (ed.). 1986. Translational Control. Current
Communications in Molecular Biology. Cold Spring Har-
bor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
M. Ptashne. 1986. A Genetic Switch, Gene Control and Phage
X. Cell Press and Blackwell Scientific Publications, Palo
Alto, California. [Имеется перевод: Пташне M. Пере-
ключение генов. Регуляция генной активности и фаг X-
М.: Мир, 1988.]
С. Yanofsky. 1988. Transcription Attenuation. J. Biol. Chem.,
263, 609-612.
Часть II
ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
ВВЕДЕНИЕ
Примерно к 1970 г. стали известны основные
свойства генетических систем. Несмотря на отсут-
ствие многих важных деталей, удалось установить
принципы репликации, рекомбинации и репарации
и каждый из этих процессов был воспроизведен in
vitro. Была сформулирована центральная догма,
согласно которой генетическая информация пере-
дается от ДНК к РНК и далее к белку, что создало
основу для определения генотипа и фенотипа орга-
низма на молекулярном уровне. Был идентифици-
рован основной посредник при переносе информа-
ции от ДНК к белку- информационная РНК (мРНК).
Расшифрован генетический код, и в экспериментах
с реконструированными клеточными компонентами
в системе in vitro была получена информация о кле-
точном аппарате и основных механизмах трансля-
ции мРНК в белок. Подтвердилось предположение
о том, что процессы транскрипции ДНК в РНК
и трансляции РНК в белок регулируются и что
существуют позитивный и негативный способы
контроля функций генов. С расшифровкой генети-
ческого кода разрешился имеющий долгую историю
вопрос о связи между химической структурой гена
и кодируемого им белка и стало ясно, что мутации
есть следствие изменений в структуре ДНК. В этот
период выдающихся открытий неожиданной награ-
дой исследователям стала идентификация многих
ферментов, для которых нуклеиновые кислоты
являются субстратом. Получение их в очищенном
виде и определение свойств в значительной мере
облегчило анализ структуры и функций нуклеино-
вых кислот, а применение в дальнейших исследо-
ваниях привело к созданию новой области моле-
кулярной биологии - технологии рекомбинантных
ДНК.
Несмотря на широко распространенное мнение,
что всем генетическим системам присущи одни и те
же основные свойства, процессы, происходящие
в клетках прокариот, изучены значительно глубже,
чем процессы, протекающие в эукариотических
организмах. Действительно, провести генетический
анализ небольших по размеру и менее сложно орга-
низованных бактериальных геномов значительно
проще, чем геномов эукариот. Сравнительно легко
удалось индуцировать и идентифицировать мута-
ционные изменения в специфических генах. Слу-
чайный обмен генетической информацией между
различными бактериями и некоторыми бактериями
и их вирусами (бактериофагами) облегчил карти-
рование этих генов, что в свою очередь позволило
установить организацию бактериальных и фаговых
геномов в целом. Еще более важное значение имело
замечательное взаимопроникновение генетики и
биохимии. Совместное использование генетических
и биохимических методов способствовало разгадке
сложного процесса репликации ДНК и даже позво-
лило осуществить полноценную репликацию in vitro
вирусных геномов. Благодаря объединению этих
методов удалось получить отдельные гены в изо-
лированном виде, что подготовило почву для из-
учения транскрипции и трансляции генов in vitro
и идентификации молекулярных продуктов, участ-
вующих в этих процессах. С помощью того же
двустороннего подхода был установлен меха-
низм регуляции экспрессии генов: было показа-
но, что контроль осуществляется главным обра-
зом путем взаимодействия между специфичными
белками и соответствующими регуляторными по-
следовательностями в ДНК или информационной
РНК.
В то же время успехи в расшифровке молеку-
лярной структуры, организации и функций эука-
риотического генома были весьма скромными.
Сложные генетические карты локусов, содержащих
мутации, удалось составить лишь для тех немногих
эукариотических организмов, с чьими генетически-
ми системами можно было проводить манипуляции
(к их числу относились некоторые виды дрожжей,
Neurospora crassa, D. melanogaster). По сравнению
с ними генетические карты млекопитающих, в част-
ности мыши и человека, представлялись сплошны-
ми «белыми пятнами». Еще более загадочными
13*
196
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
были молекулярная структура эукариотических ге-
нов и их организация в хромосомных ДНК, в
частности наличие множественных повторов неко-
торых сегментов ДНК у большинства эукариот. Без
более полного изучения молекулярной структуры
геномов эукариот дальнейший прогресс в этой об-
ласти был невозможен.
Биохимические исследования экспрессии и регу-
ляции эукариотических генов также зашли в тупик
из-за отсутствия информации о структуре клеточ-
ных генов. Было ясно, что ядерная ДНК эукариот
транскрибируется в РНК и что мРНК транслируется
в белки с помощью цитоплазматических комплексов
рибосома—тРНК, во многом напоминающих про-
кариотические (гл. 3). Однако механизм транскрип-
ции и последующая судьба транскриптов остава-
лись совершенно загадочными. У многих эукариот
только небольшая фракция ядерной РНК (< 10%)
переходит в цитоплазму в виде информационной,
рибосомной и транспортной РНК. Некоторые мо-
лекулы существуют в стабильной форме в виде
коротких цепей РНК в составе рибонуклеопротеи-
новых частиц, однако большинство из них быстро
деградирует, не покидая ядра. Вопросы о природе
быстро распадающейся РНК, ее происхождении и
функции постоянно дебатировались. Проблема био-
генеза информационной РНК также оставалась не-
решенной из-за различий между мРНК про- и эука-
риот. У последних в начале и в конце молекул
имеются особые структуры-так называемые кэпы
и ро1у(А)-хвосты соответственно. Это указывало на
то, что информационная РНК эукариот в процессе
биогенеза подвергается посттранскрипционным мо-
дификациям. Почему, где и как происходят такие
модификации? Каково их значение? Каков путь
превращения первичных транскриптов ДНК в зре-
лые молекулы информационной РНК? Далее, как
осуществляется контроль транскрипции и превра-
щений РНК, образованных на разных генах, в раз-
ных типах клеток одного и того же организма? Чем
различаются механизмы экспрессии и регуляции
генов у про- и эукариот? Из-за отсутствия мо-
лекулярно-генетической информации и методологии
для ее получения эти вопросы первостепенной важ-
ности оставались нерешенными.
На фоне появления все новых данных об органи-
зации и экспрессии генетической информации у про-
кариот отсутствие таких данных для эукариот ста-
новилось все более ощутимым. Для преодоления
такого отставания нужна была общая методология
исследования клеточных геномов эукариот на мо-
лекулярном уровне. В идеале это позволило бы
выделить дискретные гены и определить их моле-
кулярную структуру и организацию геномов. При
наличии таких изолированных генетических элемен-
тов можно было бы затем установить биохимичес-
кие основы механизмов транскрипции и трансляции.
Объективные предпосылки к этому появились лишь
в первой половине 70-х годов, когда была разрабо-
тана технология получения рекомбинантных моле-
кул ДНК. Прежде чем обсуждать эти достижения,
мы рассмотрим концепции и методологию, которые
подготовили почву для решающих экспериментов.
Они ведут начало от экспериментов в сфере бакте-
риальной генетики, и особенно большую роль здесь
сыграла возможность введения молекул ДНК в
клетки бактерий. Такая введенная ДНК независимо
от того, произошла ли она из бактериофага или из
других бактериальных клеток, изменяет генотип,
а нередко и фенотип реципиентной клетки. Гены
донорной ДНК способны экспрессироваться и мо-
гут рекомбинировать с хромосомной ДНК.
ВВЕДЕНИЕ НОВОЙ
ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ
В КЛЕТКИ БАКТЕРИЙ
Бактерии могут приобретать новый генетический
материал несколькими способами. Это: 1) транс-
формация, при которой в клетки проникают моле-
кулы ДНК, добавленные в культуральную среду;
2) конъюгация, в процессе которой ДНК непосред-
ственно переносится от одной клетки к другой;
3) опосредуемая бактериофагами трансдукция, при
которой новая генетическая информация вводится
в клетку с частицей бактериофага. Независимо от
способа попадания в реципиентную клетку донор-
ная ДНК рекомбинирует с гомологичными участ-
ками или специфическими сайтами в геноме реци-
пиентного организма или сохраняется в виде авто-
номной мини-хромосомы, изменяя таким образом
генотип хозяина.
Трансформация бактерий
Трансформация, т. е. изменение генотипа клет-
ки путем внесения в нее молекул ДНК из куль-
туральной среды, была первым из способов вве
дения новых генов в клетки бактерий. Это по
служило также первым доказательством рол!
ДНК как носителя генетической информации
Если в клетки организма с определенным гене
тическим нарушением (например, организма, н-
способного синтезировать триптофан, сбражи
вать галактозу, образовывать какой-то полиса
харид и т.п.) ввести ДНК, выделенную из нор
мальных клеток, то у этого организма нередю
восстанавливаются утраченные функции Така,
трансформация является обычно наследствен
ной и стабильной, поскольку в ее основе лежи
ВВЕДЕНИЕ
197
рекомбинация между функциональным геном (ге-
нами) донорной ДНК и дефектным геном (генами)
реципиента. Однако осуществляемая с помощью
ДНК трансформация оказалась полезной только
при изучении молекулярной генетики прокариот.
В других случаях возможности трансформации
ограничивались трудностями выявления трансфор-
мирующего гена, что делало нереальным опреде-
ление его структуры. Тем не менее принцип транс-
формации нашел применение в другой области.
Например, получение трансформированных клеток
является важным этапом во многих экспериментах
с рекомбинантными молекулами ДНК. Термин
«трансформация» используется в молекулярной
биологии эукариот для обозначения стабильного
изменения генотипа и фенотипа клетки.
Конъюгация
При конъюгации осуществляется прямой перенос
ДНК из одной клетки в другую при их контактиро-
вании. В тех случаях, когда конъюгация происходит
между определенными штаммами E.coli, один из
них выполняет функции донора, другой - реци-
пиента (рис. II. 1). Хромосомная ДНК донорной
клетки переходит в клетку реципиента по мостику,
образующемуся между двумя клетками. Полный
перенос ДНК осуществляется примерно за 90 мин,
однако в случае повреждения мостика конъюгация
прерывается и перенос хромосомы оказывается не-
полным.
Разные штаммы E.coli начинают перенос с раз-
ных точек хромосомы. Следовательно, у различных
доноров ранними или поздними генами во время
конъюгации оказываются разные группы генов.
Однако перенос генов всегда происходит только
в одном из двух возможных противоположных на-
правлений кольцевой хромосомы E.coli (рис. II.2).
Эти эксперименты впервые показали, что все гены
E.coli расположены на одной кольцевой молекуле
ДНК (рис. П.З). Сравнивая время, необходимое для
переноса различных генов во время конъюгации,
можно построить генетическую карту хромосомы
E.coli, т.е. установить порядок следования хромо-
сомных генов.
РИС. 11.1.
Перенос генетической информации между
бактериями при конъюгации. Две клетки
Е. coli. из которых одна передает свою хро-
мосому другой, вступают в контакт с по-
мощью белкового конъюгационного мос-
тика. Репликация донорной ДНК начинает-
ся в особом участке (отмечен точкой), и од-
на из цепей ДНК переносится в клетку
реципиента. Перенос прекращается при
разрыве конъюгационного мостика (при
случайном движении клеток или встряхи-
вании сосуда, в котором эти клетки нахо-
дятся). Чем продолжительнее контакт двух
клеток до разрыва мостика, тем большее
число генов переносится. Перенесенная
ДНК может с помощью рекомбинации за-
менить соответствующую часть генома ре-
ципиентной клетки. У разных штаммов
Е. coli перенос инициируется в различных
хромосомных локусах.
198
ЧАСТЬ II, ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Порядок переноса генов
• -thr -leu-azi- ton-pro- lac-pur-gal- trp- his- gly- str- mal-xyl-mtl-ile- met- thi
• -met-thi- thr- leu- azi- ton-pro-lac- pur-gal- trp- his- gly- str- mal-xyl- mtt- He
• -str- mal-xyl-mtl-ile- met- thi- thr- leu- azi- ton-pro-lac- pur- gal- trp- his- gly
Л-leu-lhr-thi-met-ile-mtl-xyl-mal-str-gly-his-trp-gal-pur-lac-pro-ton-azi
b-his-trp-gal-pur-lac-pro-ton-azi-leu-thr-thi-met-ile-mtl-xyl-mal-str-gly
i-mtl^xyl-mal-str-gly-his-trp-gal-pur-lac-pro-ton-azi-leu-thr-thi-met-ile
Донорный штамм
1
2
3
4
5
6
РИС. 11.2.
Перенос ДНК при конъюгации начинается с разных
генов в зависимости от штамма донора. Например,
штамм 1 начинает перенос с гена thr, а штамм 2 с гена
met. Группы генов всегда переносятся в одном из двух
взаимно противоположных направлений (например, в
штаммах 1, 2 и 3 порядок переноса thr-leu-azr, в штам-
ме 4 перенос начинается между azi и lew, в штаммах
5 и 6 azi-teu-thr, и т.д.)
Трансдукция
Охарактеризованы два типа трансдукции, осу-
ществляемой с помощью бактериофагов,-общая и
специфическая. При общей трансдукции фаговые
частицы, содержащие сегменты ДНК клетки-хозяи-
на, переносят относительно протяженные участки
геномной ДНК от одной бактериальной клетки
к другой. Трансдупирующие фаговые частицы обра-
зуются в ходе определенных инфекционных процес-
сов, когда ДНК клетки эффективно деградирует
и фрагменты, по размеру примерно соответствую-
щие фаговому геному, случайно упаковываются в
зрелые частицы бактериофага (рис. II.4). В резуль-
тате последующего инфицирования клеток бактерий
популяцией фаговых частиц, содержащей трансду-
пирующие фаги, происходит передача ДНК донор-
ных клеток этим инфицируемым клеткам. Рекомби-
нация между введенными фрагментами донорной
ДНК и ДНК клетки-реципиента приводит к измене-
thr leu
Кольцевая генетическая карта Е. coli, на которой указано
положение отдельных генов. Порядок генов в хромосо-
ме соответствует указанному на рис. II.2. Точками отме-
чены области инициации переноса в донорных штам-
мах, представленных на рис. II.2.
нию генотипа последней. Каждая трансдуцирующая
фаговая частица обычно содержит только один
случайный фрагмент исходной донорной хромосо-
мы. Вероятность включения в такую частицу любой
части этого генома примерно одинакова. Однако
благодаря довольно большому размеру трансдуци-
руемых сегментов ДНК (для определенных бакте-
риофагов он составляет около 100 т. п. н„ или 2,5%
всей хромосомы Е. coli} обычно реципиентная клетка
приобретает за один акт трансдукции целую группу
генов. В результате гены, тесно сцепленные друг
с другом в хромосоме донора, с высокой частотой
котрансдуцируются, тогда как гены, удаленные друг
от друга, трансдуцируются независимо (рис. II.5).
Определение частоты котрансдукции генов помога-
ет уточнить генетические карты, позволяя оценить
относительные расстояния между тесно сцепленны-
ми генами.
Трансдукция второго типа, специфическая, свой-
ственна бактериофагам, инфекционный цикл кото-
рых прерывается в результате включения генома
вируса в специфический хромосомный локус ДНК
инфицированной клетки (гл. 2). Бактерии, содержа-
щие такие интегрированные фаговые геномы, полу-
чили название лизогенных. Они несут вирусные ге-
номы как наследственные элементы в своих собст-
венных хромосомах (рис. II.6). В лизогенной клетке
вирусные и клеточные геномы реплицируются как
единое целое и являются взаимно совместимыми.
Интеграция фагового генома с геномом клетки-
хозяина лишает фаг возможности вызывать гибель
клетки и продуцировать инфекционное потомство.
По этой причине бактериофаг, способный лизоге-
низировать, в отличие от вирулентного фага получил
название умеренного. При определенных условиях
индукции лизогенное состояние прерывается и ви-
русный геном вырезается из хромосомы клетки-хо-
зяина. Он реплицируется, образует множество ви-
русных частиц и убивает клетку. Обычно вырезание
вирусного генома происходит очень точно, и обра-
зующийся фаг содержит вирусный геном, полно-
Образование
трансдуцирующих
частиц
Бактерия,
содержащая ген х+
Лизис
Жизнеспособный фаг
Фаг,
несущий
ген х+
Трансдуцирующий фаг
Трансдукция
х—бактерии
х -фагом
Бактерия,
несущая ген х
РИС. 11.4.
Образование фаговых частиц,
осуществляющих общую трансдук-
цию, и введение донорной ДНК
в инфицируемую клетку. Один из
трансдуцирующих фагов несет
бактериальный ген х+ дикого ти-
па, который при последующем
инфицировании вводится в бакте-
риальную клетку, несущую му-
тантный ген х“. В результате ре-
комбинации эта клетка превраща-
ется в х+ -трансдуктант.
Инфицирование
Геном
бактерии
реципиента
Смесь фрагментов
трансдуцирующей
фаговой ДНК
пн
НТО—8
Инфицирование
Бактериальные
трансдуктанты
РИС. 11.5.
Зависимость частоты котрансдук-
ции генов от расстояния между
ними. Гены 7 и j могут трансдуци-
роваться как независимо, так и
совместно, поскольку они тесно
сцеплены друг с другом в бакте-
риальной хромосоме. Ген h нахо-
дится достаточно далеко от обоих
генов и не может быть котрансду-
цирован с ними.
200
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Репликация,
образование
, фаговых частиц
РИС. 11.6.
Основные события, ведущие к установлению лизогенно-
го состояния, индукции лизогенов и образованию фаго-
вого потомства. Перед встраиванием в бактериальную
хромосому инфицирующая ДНК замыкается в кольцо
и после вырезания тоже превращается в кольцевую
форму.
стью соответствующий исходному. Иногда, однако,
фаговый геном вырезается неправильно и в дочер-
ние фаговые геномы включаются хромосомные ге-
ны, прилегавшие к интегрированному вирусному
геному. Эти гены включаются вместо некоторых
вирусных генов (рис. II.7). Во время следующего
цикла инфекции гены клетки-донора переходят
вместе с фаговыми генами в реципиентные клетки.
После включения ДНК трансдуцирующего фага
в геном реципиента клетка приобретает наряду с фа-
говыми генами генетическую информацию преды-
дущего хозяина фага. Таким образом, при специ-
фической трансдукции фаг служит вектором для
переноса генов из одной клетки в другую. С по-
мощью этого механизма трансдуцируются только
те хромосомные гены клетки-хозяина, которые тес-
но сцеплены с сайтом интеграции вирусного генома.
Поскольку различные умеренные фаги встраи-
ваются в разные хромосомные сайты, при их непра-
вильном вырезании образуются фаги, которые
трансдуцируют разные хромосомные гены. Так, фа-
ги X трансдуцируют гены, ответственные за метабо-
лизм галактозы (кдаГ), или гены, контролирующие
синтез биотина (A. bio), а фаги ф80- различное число
генов, кодирующих ферменты биосинтеза трипто-
фана (рис. II.8). Были разработаны определенные
генетические приемы, способствующие приобрете-
нию этими и другими фагами различных генов
Е. coli или генов родственых организмов. Та же
стратегия с небольшими модификациями позволяет
получить трансдуцирующие фаги, содержащие му-
тантные бактериальные гены. Такие трансдуцирую-
щие фаги легко идентифицировать, размножить
и очистить, что позволяет получать значительные
количества аллелей дикого или мутантного генов
E.coli в высокоочищенном виде.
Обогащение бактериальными генами, сопровож-
дающее их включение в геном трансдуцируюших
фагов, имеет важные последствия. Рассмотрим,
например, ген E.coli, кодирующий фермент Р-га-
лактозидазу (/acZ). Этот белок состоит из иден-
тичных полипептидных цепей длиной 1173 амино-
кислотных остатка; следовательно, ген, коди-
рующий этот полипептид, содержит около 36Q0 пар
нуклеотидов. Ген Р-галактозидазы составляет одну
тысячную генома E.coli (3,6-103 из 4,0- 10б п.н.), но
в геноме трансдуцирующего вируса А/ас он зани-
мает 1/15 часть (3,6-103 из 5-104 п. н.). Таким обра-
зом, ДНК фага к lac обогащена р-галактозидазным
геном примерно в 100 раз больше, чем ДНК Е. coli.
Это упрощает выделение Р-галактозидазного гена
и позволяет идентифицировать его регуляторные
участки и определить их нуклеотидную последова-
тельность. Подобным же образом с получением
трансдуцирующих фагов ф80Ггр удалось выделить
и охарактеризовать гены и регуляторные последо-
ВВЕДЕНИЕ
201
РИС. 11.7.
Приобретение клеточных генов трансдуцирующим фа-
гом X.
Лизоген
РИС. 11.8.
Различные фаги, осуществляющие специфическую
трансдукцию, переносят только те бактериальные гены,
которые расположены вблизи сайта их интеграции в
хромосому Показаны сайты интеграции фагов X (X att)
и ф80 (ф80агг).
вательности, которые образуют триптофановый
оперон (разд. 3.11. г). Кроме того, благодаря транс-
дукции появилась возможность изучать влияние
различных мутационных изменений на экспрессию
и регуляцию генов in vivo.
Рассмотрим те свойства фагового генома, ко-
торые ответственны за его способность к специ-
фической трансдукции (рис. П.9). Во-первых, геном
должен быть способен реплицироваться после того,
как произошла инфекция [т. е. в вирусной ДНК
должны сохраняться область начала репликации
(огг) и гены, необходимые для осуществления реп-
ликации]. Во-вторых, он должен приобрести кова-
лентно сцепленный сегмент невирусной ДНК, ко-
торый будет трансдуцироваться. Этот сегмент ДНК
обычно имеет клеточное происхождение, но в прин-
ципе он может быть из любого источника. Он
может включиться в любое место вирусного генома,
если это не влияет на репликацию вирусной ДНК
в инфицированой клетке хозяина или на ее способ-
ность упаковываться в зрелые фаговые частицы.
Будучи составной частью фагового генома, транс-
дуцируемый сегмент ДНК реплицируется вместе
202
ЧАСТЬ II ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Недефектный трансдуцирующий геном
Гены,
кодирующие
Точка
инициации
Гены,
необходимые для
вирусные Экзогенная осуществления репликации
белки вставка репликации (ori)
Дефектный трансдуцирующий геном
РИС. 11.9.
А. Недефектный вирусный геном, содержащий
все гены, необходимые для репликации и упа-
ковки вирусной ДНК. Б. Дефектный геном,
в котором отсутствуют гены, кодирующие ви-
русные белки. Такие белки должны кодиро-
ваться генами клетки-хозяина или коинфи-
цирующего вируса.
Экзогенная вставка
Точка
инициации
репликации
Гены,
необходимые для
осуществления
репликации
с вирусной ДНК. В-третьих, гены, кодирующие
структурные фаговые белки, должны быть функ-
ционально активными либо их роль должен выпол-
нять коинфицирующий фаг или клетка-хозяин.
И наконец, если мы хотим использовать трансдук-
цию, нам нужно найти способ разделения различ-
ных типов вирусных геномов и идентификации ин-
тересующего нас генома, поскольку трансдуциру-
ющие вирусы часто инфицируют клетку совместно
с вирусом дикого типа. Обычно для такого раз-
деления используют клонирование.
ПРИНЦИПЫ КЛОНИРОВАНИЯ
Чтобы понять, как использовались концепции
трансдукции при разработке методов получения ре-
комбинантных ДНК, нам следует ознакомиться
с тем, что представляет собой клонирование. Клон
вируса или клеток - это некая популяция, каждый
член которой ведет происхождение от одного репро-
дуцирующегося вириона или от одной клетки соот-
ветственно. Все члены клона независимо от того,
являются ли они вирусами или клетками, по су-
ществу идентичны вирусу или клетке, которые дали
ВВЕДЕНИЕ
203
начало клону; они также идентичны друг другу. При
клонировании вирусов необходимо, чтобы вирусное
потомство из одной клетки, инфицированной одной
вирусной частицей, размножалось в течение многих
циклов инфекции, не смешиваясь с потомством из
других инфицированных клеток (рис. 11.10). Такие
вирусные клоны образуют прозрачные зоны (или
бляшки) на монослое (или газоне) неинфицирован-
ных клеток. Клонирование клеток можно осущест-
вить только в том случае, если клетки при размно-
жении остаются изолированными друг от друга
(рис. 11.11). Клоны бактериальных клеток или кле-
ток млекопитающих легко образуются при разре-
женном посеве их на чашке таким образом, что они
образуют отдельные колонии.
С помощью клонирования получают чистый
препарат одного генома, поскольку все члены клона
содержат идентичные ДНК. Эта концепция моле-
кулярного клонирования используется и при получе-
нии чистых препаратов определенных молекул ре-
комбинантных ДНК.
КОНЦЕПЦИЯ
РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК
Молекулы ДНК, способные реплицироваться в со-
ответствующих клетках, представленные вирусными
геномами или плазмидами (см. ниже), служат пере-
носчиками, или векторами, «чужеродных» сегментов
ДНК, получивших название вставки. При этом,
вместо того чтобы полагаться на клеточные про-
цессы, ведущие к образованию рекомбинантных
трансдуцирующих геномов, проводят объединение,
или рекомбинацию, соответствующим образом мо-
дифицированных вставок и векторов in vitro с по-
мощью фермента ДНК-лигазы (рис. 11.12). Такие
рекомбинантные ДНК вводят затем в соответст-
вующие клетки, где они амплифицируются в ре-
зультате репликации.
Громадные потенциальные возможности этой
методологии обусловлены не только тем, что с ее
помощью можно конструировать и реплицировать
рекомбинантную ДНК, но и тем. что она позволяет
клонировать отдельные рекомбинантные молекулы
ДНК. Рассмотрим, например, что получается в ре-
зультате объединения смеси случайных сегментов
ДНК какого-либо организма с векторной ДНК
(рис. 11.13). Ассортимент всех возможных рекомби-
нантов чрезвычайно разнообразен; каждый реком-
бинант содержит какой-то определенный сегмент
Методология получения рекомбинантных ДНК
основана на тех же принпипах. что и трансдукция.
РИС. 11.11.
Клеточный клон это популя-
ция клеток, полученная в ре-
зультате множественных кле-
точных делений от одной клет-
ки. Каждый клон представлен
отдельной колонией.
/wvw\ /WW\
Клеточный клон 1
Клеточный клон 2
Клеточный клон 3
Бактериальные клетки
Клетки млекопитающих
Отдельные клетки
Рост клеток и
многократное
деление
Рост клеток и
многократное
деление
204
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Встраивание чужеродных фрагментов ДНК (а и Ь) в
кольцевую и линейную молекулы вирусной ДНК in vitro.
при изучении молекулярной генетики прокариот,
устранило барьер, который препятствовал прове-
дению подобного анализа на эукариотических ге-
номах.
исходной ДНК. Однако при клонировании реком-
бинантных ДНК с образованием отдельных вирус-
ных бляшек в каждой вирусной частице из данной
бляшки содержится уникальная рекомбинантная
ДНК, состоящая из векторной ДНК и одного из
сегментов исходного генома. Таким образом, тех-
нология рекомбинантных ДНК позволяет выделять
отдельные сегменты ДНК из чрезвычайно сложной
смеси сегментов, происходящих из клеточного или
вирусного генома.
В результате переноса какого-то гена E.coli из
бактериального генома в геном трансдуцирующего
фага можно получить примерно 100-кратное обога-
щение по этому гену. По сравнению с тем уровнем
обогащения, которого удается достичь путем моле-
кулярного клонирования сегментов ДНК сложных
организмов, такое обогащение является незначи-
тельным. Например, ген млекопитающих длиной
5 т. п. н. составляет лишь одну миллионную часть
всего генома (5 т. п. н. от ~ 3 • 10б т. п.н.) и примерно
одну десятую часть рекомбинантного генома фага
X. Таким образом, молекулярное клонирование поз-
воляет расщеплять даже самые большие и самые
сложно организованные геномы и получать отдель-
ные сегменты, содержащие один или несколько ге-
нов в чистом виде. Такое относительно простое
применение принципов и методов, разработанных
ВАЖНЫЕ ОТКРЫТИЯ
Как это часто бывает при развитии науки, мето-
дологии рекомбинантных ДНК прокладывали путь
многие открытия, казавшиеся ранее незначитель-
ными и не имеющими отношения к делу. Одним из
таких открытий была трансдукция. Другие связаны
с выделением и изучением свойств бактериальных
плазмид и рестриктируюгцих эндонуклеаз.
Бактериальные плазмиды
Одним из неожиданных следствий использова-
ния антибиотиков для леченя инфекционных забо-
леваний было появление устойчивых штаммов пато-
генных микроорганизмов. Эта очень важная проб-
лема требовала своего решения и стимулировала
интенсивные исследования. Вскоре стало ясно, что
устойчивость к лекарственным препаратам пред-
ставляет собой относительно стабильный генети-
ческий признак, который может быть передан чувст-
вительным бактериальным клеткам способом, напо-
минающим инфекционный процесс. Позже было
установлено, что распространение резистентности
к антибиотикам происходит при контактировании
клеток друг с другом (рис. 11.14). Было показано,
что резистентные к антибиотикам клетки содержат
ВВЕДЕНИЕ
205
Векторная вирусная ДНК
Чужеродная ДНК
. Включение в вирусные
I частицы, растущие на газоне
1 бактериальных клеток
Бляшки
Бактериальный газон
Вирус с фрагментом Ь
Вирус с фрагментом а
Вирус с фрагментом d
РИС. 11.13.
Молекулярное клонирование чужеродной
Вирус с фрагментом С ДНК в вирусном (фаговом) векторе.
генетические элементы плазмиды, не связанные
с хромосомной ДНК, способные реплицироваться
независимо от хромосомы и передаваться от клетки
к клетке при их контактировании. Именно такие
внехромосомные элементы и содержат гены, ко-
торые придают клеткам наследуемую устойчивость
к одному или нескольким антибиотикам. Они полу-
чили название факторов резистентности, или R-фак-
торов.
Механизм распространения R-факторов стал
более понятен после того, как был установлен спо-
соб переноса генетической информации от одной
клетки к другой во время конъюгации бактерий. Из
рис. II. 1 видно, что перенос генетического мате-
риала осуществляется благодаря способности до-
норных клеток реплицировать и переносить свою
геномную ДНК через конъюгационный мостик
в клеки реципиента. Штаммы E.coli, являющиеся
донорами, содержат в составе своего генома ДНК
плазмидного происхождения, названную фактором
206
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
РИС. 11.14.
Распространение плазмиды, несущей гены резистент-
ности к лекарственному препарату, при переносе ее из
клетки в клетку
Резистентное потомство
фертильности, или F-фактором. Такие донорные
хромосомы образуются после приобретения клет-
ками F-фактора и рекомбинации между этой плаз-
мидой и хромосомой клетки. В присутствии интег-
рированного F-фактора облегчаются конъюгация
и перенос хромосомы. Перенос инициируется в сай-
те интеграции F-фактора. Благодаря способности
плазмиды встраиваться в ДНК во многих сайтах
разные штаммы инициируют перенос в различных
сайтах хромосомы E.coli (рис. П.1 и II.2). В неко-
торых случаях F-фактор остается в клетках в виде не-
зависимого внехромосомного элемента - F-плазмиды
(рис. 11.15). Такие клетки, обозначаемые F+, перено-
сят плазмиду F в реципиентные клетки таким же
способом, как в случае переноса R-факторов.
R- и F-факторы представляют собой ковалентно
замкнутые кольцевые молекулы двухцепочечной
ДНК. Оба они содержат гены, обеспечивающие их
репликацию в виде автономных плазмид и их пе-
ренос при контакте с соответствующими реципиен-
тами. R-факторы несут также гены резистентности
к антибиотикам. Одни такие гены изменяют реак-
цию клетки на антибиотик, другие индуцируют
образование белков, вызывающих деградацию или
модификацию определенных антибиотиков. Напри-
мер, одна из R-плазмид кодирует Р-лактамазу, обес-
ВВЕДЕНИЕ
207
Бактерия F'
Репликация
+
Перенос
Конъюгация
Разделение
РИС. 11.15.
Перенос F-фактора между бакте-
риями при конъюгации.
печивающую устойчивость к ампициллину благода-
ря деградации этого антибиотика. Устойчивость
к хлорамфениколу обусловливается ацетилирова-
нием этого антибиотика. Ацетилирование катали-
зируется ферментом хлорамфеникол-ацетилтранс-
феразой, кодируемым плазмидой.
Плазмидные ДНК легко выделить в больших
количествах и получить в очищенном виде, что
позволяет исследовать их потенциальную способ-
ность служить векторами для введения в клетки
новых сегментов ДНК. Соединение плазмидной
ДНК с соответствующим образом модифицирован-
ными вставками можно осуществить in vitro ана-
логично тому, как это происходит в случае соеди-
нения вставок с фаговыми векторами (рис. 11.12).
В этих экспериментах большую роль сыграл опыт
осуществления трансформации клеток с помощью
ДНК. Были разработаны методы включения очи-
щенной плазмидной ДНК в клетки соответствую-
щих бактерий-хозяев. Благодаря наличию в таких
плазмидах генов резистентности к антибиотикам
можно провести отбор клеток, содержащих R-плаз-
миду в качестве стабильно реплицирующейся струк-
туры. Такие клетки живут и делятся в присутствии
антибиотика, а клетки, утратившие эту плазмиду,
погибают. Рекомбинантные плазмидные ДНК сохра-
няются в присутствии антибиотика как некие
автономно реплицирующиеся геномы во время по-
следующих клеточных делений. При клонировании
образуются колонии клеток, содержащих уникаль-
ную рекомбинантную ДНК, потому что каждая
клетка хозяина содержит только одну плазмиду.
Поскольку размер многих плазмидных векторов не
превышает нескольких тысяч пар нуклеотидов, обо-
гащение по сегментам эукариотической ДНК в этом
случае оказывается более высоким, чем при ис-
пользовании фаговых векторов. Именно плазмиды
оказались первыми векторами, с помощью которых
было осуществлено молекулярное клонирование в
клетках бактерий.
Рестриктирующие эндонуклеазы
Одним из наиболее важных результатов гене-
тического изучения бактерий и их бактериофагов
явилось открытие рестриктирующих эндонуклеаз-
ферментов, которые узнают специфические корот-
кие нуклеотидные последовательности и разрезают
обе цепи двойной спирали ДНК в сайте узнавания
или на некотором расстоянии от него. В открытии
этих ферментов ключевую роль сыграло наблюде-
ние, сделанное примерно 30 лет назад. Оно состояло
в том, что бактериофаг, выращенный в клетках
одного штамма, инфицируя клетки других штаммов
этого же вида, часто растет очень плохо. Более того,
выделенные после такой неэффективной инфекции
бактериофаги в свою очередь плохо развиваются
в исходных клетках (рис. 11.16). Этот феномен не
связан с генотипом фага и был объяснен тем, что
в фаге происходят какие-то модификации, контро-
лируемые хозяином. Было высказано предположе-
ние, что некий фаговый компонент, необходимый
для репликации, специфическим образом модифи-
Бактериофаг, выращенный
в штамме А
Я
Пример контролируемой хозяином рестрикции.
208
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Фаговая ДНК
Вирус
Полностью метилированная ДНК
Рестриктирующая
эндонуклеаза
неспособна разрезать
метилированную
фаговую ДНК
СН.-“СН3 СН1СМ
Модификация
с помощью
мети пазы
Инфицирование фагом,
выращенным в другом хозяине
РИС. 11.17.
Роль модифицирующей метилазы и рест-
риктирующей эндонуклеазы в рестрикции,
контролируемой хозяином
Рестриктирующая
эндонуклеаза разрезает
неметилированную ДНК
Неслецифическая
нуклеаза расщепляет
образовавшиеся
фрагменты
Электрофоретическое
разделение фрагментов и
окрашивание ДНК в геле
I'J.WWS
РИС. 11.18.
Рестриктирующие эндонуклеазы раз-
резают молекулу ДНК с образова-
нием специфических наборов фраг-
ментов, которые можно разделить по
размерам с помощью гель-злектро-
фореза.
Размер
фрагмента
Направление
электрофореза
Размер
фрагмента
ВВЕДЕНИЕ
209
цируется в клетках хозяина, так что фаг может
завершить репликацию при повторном инфициро-
вании того же штамма. При этом его рост в не-
родственном штамме ограничивается, поскольку
последний не содержит соответствующей системы
модификации.
Было доказано, что модифицируемым фаговым
компонентом является ДНК, а неспособность фага
реплицироваться в неродственном штамме обуслов-
лена деградацией инфицирующей фаговой ДНК
(рис. 11.17). Расщепление ДНК инициируется вне-
сением нескольких разрывов в высокоспецифичных
сайтах, после чего происходит полная неспецифи-
ческая деградация. Модификацией, защищающей
некоторые инфицирующие фаговые ДНК, а также
геном клетки от разрывов, является штамм-спе-
цифичное метилирование ДНК. С помощью гене-
тических и биохимических исследований установ-
лено, что метилирование ДНК происходит в строго
RE 1 RE 1 pg 2
специфических участках. Рестрикция осуществляется
эндонуклеазами, которые узнают аналогичные ко-
роткие специфические последовательности, лишен-
ные метильных групп. Системы модификации
и рестрикции всегда соответствуют друг другу, т. е.
метилирование и разрезание происходят в одних
и тех же последовательностях ДНК. В каждой систе-
ме в качестве мишеней для штамм-специфичных
систем рестрикции-модификации используются
свои короткие последовательности ДНК. Метили-
рованная ДНК не разрезается по этой последова-
тельности родственной рестриктирующей эндонук-
леазой. Аналогично рестриктирующие эндонуклеазы
разрезают только те ДНК, у которых не модифи-
цированы соответствующие сайты рестрикции.
Регуляция системы рестрикции и модификации
осуществляется с помощью родственных наборов
генов, и такие парные системы имеются у многих
видов бактерий, бактериофагов и плазмид.
RE2
НМН
Разрезание ДНК
рестриктирующими
эндону к леазами
RE1 и RE2
е
а 3' 5' b 3' 5‘ с
Плазмида
Плазмида
Рекомбинация
РИС. 11.19.
Многие рестриктирующие эндонуклеазы
разрезают молекулу ДНК несиммет-
рично, в результате чего образуются
взаимно комплементарные одноцепо-
чечные концы. Любые два сегмента
ДНК, имеющие такие концы, могут ре-
комбинировать tn vitro. Если один из
сегментов способен реплицироваться в
соответствующей клетке-хозяине, то вся
рекомбинантная молекула может быть
клонирована и амплифицирована. В
приведенном примере плазмидные ДНК
соединены с двумя фрагментами, по-
лученными с помощью рестриктирующих
эндонуклеаз (верхняя часть рисунка).
I4 243
210
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
При анализе генетической и физической орга-
низации сложных геномов особенно важными ока-
зываются два свойства рестриктирующих эндонук-
леаз. Первое связано с огромным диапазоном специ-
фичностей, проявляемых в совокупности различны-
ми рестриктируюгцими эндонуклеазами, что позво-
ляет разрезать практически любую ДНК на диск-
ретные фрагменты самыми разными способами.
Эти фрагменты можно разделить по размерам с по-
мощью гель-электрофореза (рис. 11.18). Распределе-
ние фрагменов по размерам, получающееся при
расщеплении данной эндонуклеазной ДНК в специ-
фических сайтах, является своего рода «отпечатком
пальцев», характерным для этой ДНК. Второе свой-
ство эндонуклеаз рестрикции связано со способ-
ностью многих из них осуществлять несимметрич-
ные разрезы двухцепочечной ДНК, в результате
чего образуются фрагменты с комплементарными
одноцепочечными концами (рис. 11.19). Это позво-
ляет проводить рекомбинацию ДНК in vitro. Любые
два сегмента ДНК со взаимодополняющими кон-
цами могут объединиться, в результате чего проис-
ходит встраивание фрагментов в фаговую, плаз-
мидную ДНК или другие потенциальные векторы.
Такие специфические комбинации «вектор вставка»
можно получить в чистом виде путем молекуляр-
ного клонирования и амплификации в соответст-
вующих хозяйских клетках (рис. II. 12).
В последующих главах мы рассмотрим те уни-
кальные свойства рестриктирующих эндонуклеаз,
благодаря которым с помощью молекулярного кло-
нирования удалось выделить специфические гены
даже из наиболее сложных геномов. Вскоре после
этого была получена детальная информация
о структуре генов и их регуляторных элементов
и построены подробные карты их расположения
в геноме. Препятствия, которые стояли на пути
молекулярной генетики эукариотических геномов,
были тем самым устранены.
Развитие методологии рекомбинатных ДНК
и молекулярного клонирования само по себе при-
вело к созданию новых областей биологических
исследований. Однако полная реализация этих но-
вых возможностей зависела от других проводимых
одновременно разработок: развития методов фрак-
ционирования, которые позволяли бы разделять
фрагменты ДНК, лишь незначительно различаю-
щиеся по длине (рис. 11.18); создания относительно
простых и быстрых процедур секвенирования ДНК
длиной несколько тысяч нуклеотидов; получения
специфически модифицированных генов путем вне-
сения мутаций в их клонированные копии in vitro;
генетической трансформации клеток, тканей и всего
организма путем введения клонированных генов
в соответствующие системы.
В четырех главах, составляющих часть II, описа-
ны приемы и методы конструирования, клониро-
вания, отбора и получения характеристик реком-
бинантных ДНК. Приведенный материал не может
служить лабораторным руководством. Основной
акцент делается лишь на рассмотрении ключевых
положений. Часто обращается внимание на ранние
результаты, благодаря которым был разработан
тот или иной метод. Ученые, получившие эти ре-
зультаты, не могли предвидеть, как они скажутся
на развитии технологии рекомбинантных ДНК. Те-
перь мы знаем, что именно успехи в молекулярной
генетике прокариот и в изучении ферментов,
осуществляющих синтез и деградацию нуклеиновых
кислот, открыли путь к исследованию эукариоти-
ческих геномов.
Глава 4
ИНСТРУМЕНТАРИЙ: ФЕРМЕНТЫ
Возможность проведения различных манипуля-
ций с ДНК in vitro всецело зависит от наличия
очищенных ферментов, которые специфическим
образом разрезают, модифицируют и соединяют
молекулы. В настоящее время отсутствуют чисто
химические методы, с помощью которых можно
было бы осуществлять перестройку молекул ДНК
с такими селективностью и разнообразием, которые
характерны для ферментативных реакций. В то же
время даже с помощью довольно небольшого числа
ферментов можно получать рекомбинантные мо-
лекулы ДНК. Большинство этих ферментов были
открыты при обстоятельствах, не связанных с их
использованием при манипулировании с молекула-
ми ДНК. На самом деле каждый фермент играет
важную роль катализатора в том или ином хими-
ческом процессе, протекающем в организме, из
которого он выделен. Использование ферментов
в качестве инструмента при манипулировании
с ДНК зависит, в частности, от их доступности
и стабильности, а особенно от их чистоты, и прежде
всего от того, свободны ли они от примесей,
влияющих на ферментативную активность.
4.1. НУКЛЕАЗЫ
а. Общие свойства
Нуклеазы позволяют специфическим образом
модифицировать молекулы ДНК и РНК. Каждый
фермент может быть отнесен к тому или иному
классу в соответствии с его специфичностью или
типом реакции, которую он катализирует. Так, ряд
ферментов, подобно рестриктирующим эндонуклеа-
зам, действует только на ДНК. Другие, подобно
панкреатической РНКазе, гидролизуют только РНК
(табл. 4.1). Есть ферменты, которые используют
в качестве субстратов как ДНК, так и РНК. Одни
нуклеазы предпочтительно действуют либо на двух-
цепочечные, либо на одноцепочечные полинуклео-
тидные субстраты, другие не проявляют такой вы-
раженной предпочтительности.
Нуклеазы можно также разделить на две следую-
щие категории: экзонуклеазы и эндонуклеазы. Экзо-
нуклеазы расщепляют полинуклеотидные субстра-
ты, имеющие свободные концы, при этом расщепле-
ние идет либо непосредственно с концов цепей, либо
вблизи них. Разные экзонуклеазы расщепляют цепь
предпочтительно либо с 5'-, либо с З'-конца но
иногда они не проявляют такой специфичности.
Эндонуклеазам свободные концы не требуются,
поэтому данные ферменты могут гидролизовать
кольцевые молекулы ДНК. Разрезание осуществ-
ляется по внутренним фосфодиэфирным связям, при
этом образуются фрагменты разной длины. С по-
мощью экзонуклеаз тоже могут образовываться
короткие полинуклеотидные фрагменты, однако ко-
нечным продуктом во многих случаях являются
нуклеозидмонофосфаты, поскольку экзонуклеазы
осуществляют гидролиз, отщепляя последовательно
один остаток за другим.
Наконец, нуклеазы отличаются одна от другой
по тому, с какой стороны от межнуклеотидного
фосфодиэфирного мостика осуществляется гидро-
лиз (рис. 4.1). Одни ферменты делают разрез между
фосфатом и З'-гидроксильной группой с образова-
нием 5'-фосфомоноэфирных продуктов, другие-
между фосфатом и 5'-гидроксильной группой, в ре-
5'-----рА^ рСр--------3'
5'—рА-ОН-3' «• 5'-рСр—3'
Гидролиз связи между
фосфатом и З'-гидроксилом
с образованием
5'-фосфомоноэфирных групп
5'-----рАр^Ср-------3’
5'—рАр-3’ + 5'-НО-Ср—3’
Гидролиз связи между
фосфатом и 5'-гидроксилом
с образованием
- З'-фосфомоноэфирных групп
РИС. 4.1.
Нуклеазы могут расщеплять полинуклеотидную цепь
с одной или с другой стороны от фосфодиэфирного
мостика. Каждый фермент проявляет определенную
специфичность в этом отношении
I4*
212
ЧАСТЬ II ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Таблица 4.1. Типичные нуклеазы
Название0 Источник Специфич- ность Предпочи- таемая структура2* Эндо или экзо Продукт31
*Ва1 31 Alteromonas espejiana ДНК ДНК о.ц. Д. Ц- Эндо Экзо < 1 l3'-5’J 5'-p(Np)„N У-NMP
Exo I Е. coli ДНК о. ц. Экзо (З'-У) У-NMP
Exo III *Ехо VII Е. coli Е. coli ДНК ДНК д. ц. о. ц. Экзо (3'-»5') (У -*3’1 Экзо ( 1 (3'-*5'J У-NMP 5'-p(Np)„N
^.-Экзонуклеаза E.coli (7,-фаг) ДНК Д.Ц- Экзо (5'->3') У-NMP
♦Нуклеаза Phaseolus aureus Проростки Phaseolus aureus ДНК, РНК о. ц. Эндо 5'-p(Np)„N
♦Нуклеаза Neurospora crassa ДНК, РНК о.ц. Эндо 5'-p(Np)„N
Neurospora crassa
Панкреатическая ДНКаза 1 Крупный рогатый скот ДНК О.Ц., Д.Ц. Эндо 5'-p(Np)„N 4
Панкреатическая РНКаза Крупный рогатый скот РНК о.ц. Эндо (Np)„£-p-3'
♦РНКаза Н Клетки РНК-ДНК Д.Ц. Эндо 5'-p(Np)„N
♦РНКаза Н Ретровирус РНК-ДНК Д.ц. Экзо (3' —> 5') 5'-p(Np)„N
♦Нуклеаза S1 Aspergillus orvzae ДНК, РНК о. ц. Эндо 5'-p(Np)„N
Фосфо диэстераза Crotalus adamanteus ДНК, РНК о. ц. Экзо (3'-»5') У-NMP
змеиного яла
Фосфо диэстераза селезенки Крупный рогатый скот ДНК, РНК о. ц. Экзо (5'-»3') 3'-NMP
Стафилококковая нуклеаза Staphylococcus aureus РНК, ДНК о.ц. Эндо (Np)„N-p-3'
° Ферменты, отмеченные звездочкой, описаны в тексте.
2) О.ц. одноцепочечная ДНК, д.ц двухцепочечная.
3> N любой нуклеотид; (Np)„ полииуклеотидная цепь, содержащая п остатков.
зультате чего образуются продукты с З'-фосфомо-
ноэфирными концами.
Большинство ферментов, перечисленных в
табл. 4.1, упоминаются в тексте этой книги. Нук-
леазы, отмеченные звездочкой, используются как
рутинные реактивы в экспериментах по получению
рекомбинантных молекул ДНК и поэтому рассмат-
риваются более детально.
б. Нуклеазы, специфичные
в отношении одноцепочечной ДНК
Эндонуклеазы. Некоторые эндонуклеазы гидро-
лизуют одноцепочечные молекулы ДНК примерно
в тысячу раз быстрее, чем двухцепочечные. Такая
специфичность используется во многих эксперимен-
тах-при конструировании рекомбинантных ДНК,
при гетеродуплексном анализе и даже при анализе
экспрессии генов. Некоторые реакции, катализируе-
мые подобными эндонуклеазами, представлены на
рис. 4.2.
Несколько разных эндонуклеаз такого типа были
достаточно хорошо очищены и охарактеризованы,
чтобы их можно было использовать в качестве
реактивов. Одна из них, нуклеаза S1, получена из
высушенных препаратов плесневого гриба Aspergil-
lus oryzae', источниками двух других широко исполь-
зуемых ферментов являются Neurospora и Mung
beans. Каждый из этих трех ферментов проявляет
максимальную активность и точность распознава-
ния одноцепочечных и двухцепочечных молекул при
определенных условиях. Все три фермента гидроли-
зуют как ДНК, так и РНК. При разрыве фосфоди-
эфирных связей с помощью этих ферментов образу-
ются 5'-монофосфатные и З'-гидроксильные концы.
Экзонуклеазы. Экзонуклеаза E.coli exoVII спе-
цифична в отношении одноцепочечных ДНК. Она
обладает необычной экзонуклеазной активностью
в том смысле, что инициирует отщепление как с 5'-,
так и с З'-концов цепи, в то время как наиболее
известные экзонуклеазы специфичны к какому-то
одному концу (см., однако, описание экзонуклеазы
4. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: ФЕРМЕНТЫ
213
РИС. 4.2.
Некоторые реакции катализиру-
емые эндонуклеазами, специфич-
ными в отношении одноцепочеч-
ных участков А Отщепление од-
ноцепочечных хвостов у дуплекс-
ной ДНК. Б Разрезание дуплекс-
ной ДНК с локально расплетен-
ным участком на два фрагмента.
В. Разрезание дуплексной ДНК со
шпилькой на конце с образова-
нием одного двухцепочечного
дуплекса. Г. Разрезание дуплекса
с пробелом с образованием двух-
цепочечных спиральных сегмен-
тов. Д. Разрезание дуплексной
ДНК с одноцепочечной петлей в
середине на двухцепочечные фраг-
менты.
Bal 31 в разд 4.1. в). Рис. 4.2, Л и 4 3 иллюстрируют
действие ело VII на две разные дуплексные ДНК.
Хотя exo VII распознает концы цепей, она не отщеп-
ляет последовательно по одному нуклеотиду. Про-
дуктами гидролиза отдельных цепей экзонуклеазой
evoVII являются олигонуклеотиды длиной при-
мерно 25 мономерных единиц, которые содержат
5'-фосфомоноэфирные концевые группы.
в Нуклеаза Ва!31
Псевдомонада Alteromonas espejiana секретирует
единственную дезоксирибонуклеазу, получившую
название Bal31 В отношении одноцепочечной ДНК,
в том числе одноцепочечных участков двухцепо-
чечной ДНК, Bal 31 ведет себя как эндонуклеаза,
действуя аналогично другим эндонуклеазам, спе-
цифичным к одноцепочечным ДНК. Однако в отно-
шении интактной двухцепочечной ДНК этот фер-
мент проявляет экзонуклеазную активность, по-ви-
exo VII
о
< 0 ( о
РИС. 4.3. и
Реакция, катализируемая ферментом exoVII. Экзонук-
леаза отщепляет одноцепочечные 5'- и З'-концы с осво-
бождением олигонуклеотидов длиной около 25 остат-
ков.
димому. благодаря тому, что он способен распозна-
вать локальные одноцепочечные участки (или места
нестабильности в дуплексах). Bal 31 разрезает обе
цепи на обоих концах дуплекса, т. е. осуществляет
деградацию одновременно в направлениях 3' -» 5'
и 5' -> 3'. В результате двухцепочечная молекула
постепенно укорачивается (рис. 4.4.). Если эмпири-
чески оценить скорость этого процесса, то с помощью
фермента Bal 31 можно получать фрагменты ДНК
нужной длины. Хотя укорочение разных молекул
ДНК происходит несинхронно, получается набор
фрагментов, длина которых близка к заданной.
В результате исчерпывающего гидролиза с по-
мощью Bal3\ промежуточные олигонуклеотидные
продукты расщепляются до 5’-мононуклеотидов.
| Bal 31
| Bal 31
ft---------8?
РИС. 4.4.
Разрезание ферментом Ва! 31 двухцепочечной линей-
ной ДНК
214
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
г. РНКазы Н
Существует группа ферментов, получивших на-
звание РНКазы Н потому, что они специфически
расщепляют цепь РНК в гибридном дуплексе РНК-
ДНК. РНКаза Н E.coli представляет собой эндо-
нуклеазу, продуктами действия которой являются
олигорибонуклеотиды с 5'-фосфомоноэфирными
концами. Этот фермент широко используется как
реактив (разд. 4.7). Клетки эукариот тоже содержат
подобную эндонуклеолитическую РНКазу Н. РНКаза
Н-экзонуклеолитическая активность присуща экзо-
нуклеазе 111 E.coli (табл. 4.1) и обратным транс-
криптазам, кодируемым ретровирусами (разд. 4.7).
Экзонуклеаза III расщепляет РНК до 5'-нуклеозид-
монофосфатов в направлении 3' -* 5', а продуктами
гидролиза цепи РНК с помощью обратной транс-
криптазы являются 5'-фосфорилированные олиго-
рибонуклеотиды длиной от двух до десяти нуклео-
тидов.
4.2. ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ
Эволюция наделила различные виды бактерий
уникальными эндонуклеазами, позволяющими им
отличать их собственную ДНК от чужеродной. Тем
самым природа снабдила ученых богатым набором
высокоспецифичных реактивов для расщепления
ДНК. При изучении ДНК большое значение имеют
две важные особенности рестриктирующих эндонук-
леаз. Первая связана с замечательной способностью
фермента узнавать специфические короткие нуклео-
тидные последовательности в ДНК. Вторая состоит
в том, что существует большое количество различ-
ных эндонуклеаз рестрикции, каждая из которых
узнает специфическую последовательность.
а. Три типа эндонуклеаз рестрикции
Эндонуклеазы типов I и II. Ферменты, относя-
щиеся к группе эндонуклеаз типов I и II,- это слож-
ные белки, обладающие активностями рестрикти-
руюшей эндонуклеазы и метилазы. Эти интересные
ферменты не используются, однако, при конструи-
ровании рекомбинантных молекул ДНК. Ферменты
типа I связываются с ДНК в специфических участ-
ках и затем производят двухцепочечные разрезы на
разном расстоянии от сайтов узнавания, варьирую-
щем от 400 п. н. до 7 т. п. н. Для осуществления
ферментативного гидролиза ДНК необходимы
Mg2+. АТР и S-аденозилметионин. Последний ак-
тивирует фермент. Разрезание сопровождается гид-
ролизом АТР, при этом фермент утрачивает эндо-
нуклеолитическую активность, но сохраняет АТРаз-
ную. Таким образом, эндонуклеазы типа 1 являются
ДНК-зависимыми АТРазами. Кроме того, они
представляют собой сайтспецифические метилазы,
катализирующие образование 6-метиладениновых
остатков в сайте узнавания. Например, сайтом узна-
вания для фермента из E.coli К12 является
5'-AACNN NNNNGTGC-3'
З'-TTGNN NNNNC ACG-5'
где N-любое основание, a N- комплементарное
ему основание. Эндонуклеаза разрезает цепь на
значительном расстоянии от сайта узнавания, но
при этом метилирование с образованием 6-метил-
аденина происходит в пределах этого сайта (остат-
ки А, помеченные точками). Эндонуклеазная актив-
ность проявляется только при наличии полностью
неметилированного сайта. Сайт узнавания для фер-
мента E.coli К12 состоит из двух коротких
специфических олигонуклеотидов, разделенных
шестью-восемью неспецифическими парами основа-
ний. Такая структура типична для сайтов узнавания
ферментов типа I, обнаруженных у различных
штаммов бактерий. Специфические олигонуклео-
тидные последовательности для разных ферментов
различаются, но метилированные остатки А всегда
находятся в одинаковых позициях.
Родственные системы рестрикции- модификации
типа 1 кодируются аллельными локулами геномов
различных кишечных бактерий (например, Е. coli
и Salmonella typhimurium). С каждой системой свя-
заны три сцепленных гена: hsdR, hsdM и hsdS.
расположенные в порядке, соответствующем поряд-
ку транскрипции. Полипептидные продукты hsdM
и hsdS транслируются с одной двухцистронной
мРНК и вместе составляют метилазу. Первый из
них обладает метилазной активностью, а второй
осуществляет сайтспецифическое узнавание. Про-
дукт гена hsdR обладает эндонуклеазной актив-
ностью. Все три полипептида содержатся в различ-
ных пропорциях в активных препаратах ферментов
типа I.
Ферменты типа III. так же как и эндонуклеаза
типа 1, обладают нуклеазной и метилазной актив-
ностями. Однако несмотря на то, что ферменты
типа III активируются S-аденозилметионином’И для
своей работы требуют АТР, они не катализируют ее
гидролиза. Эндонуклеазы типа III делают двухце-
почечные разрезы в ДНК на расстоянии примерно
25 п. н. от своих сайтов узнавания. В присутствии
АТР и S-аденозилметионина те же ферменты ката-
лизируют сайтспецифическое метилирование. Фер-
менты типа III - гетеродимерные белки. Их субъ-
единицы кодируются двумя сцепленными генами,
локализованными у некоторых штаммов E.coli во
внехромосомных геномах (фаговой ДНК или плаз-
миде). Каждый такой ген представляет собой от-
дельную транскрипционную единицу. Один генный
4 ИНСТРУМЕНТАРИЙ. ФЕРМЕНТЫ
215
продукт узнает специфическую последовательность
и обладает метилазной активностью, другой вы-
полняет эндонуклеазную функцию.
Поскольку ферменты типа 1 не разрезают моле-
кулы ДНК на репродуцирующиеся фрагменты и эн-
донуклеазные активности ферментов типа I и III
конкурируют с метилированием, ни один из них не
используется в качестве реагента при получении
рекомбинантных ДНК.
Эндонуклеазы типа II. Рестриктирующие эндо-
нуклеазы типа II являются основным инструментом
при конструировании рекомбинантных молекул
ДНК и при анализе структуры ДНК. Эти ферменты
способны узнавать специфические короткие нуклео-
тидные последовательности и связываться с ними,
но в отличие от эндонуклеаз типов I и III они
производят двухцепочечные разрезы по специфи-
ческим фосфодиэфирным связям либо в пределах
самого сайта узнавания, либо на вполне определен-
ном небольшом расстоянии от него. Один и тот же
фермент разрезает данную молекулу ДНК с обра-
зованием одинаковых наборов фрагментов. Длина
фрагментов определяется расстоянием между спе-
цифическими последовательностями, узнаваемыми
этим ферментом. Ферменты типа II гидролизуют
фосфодиэфирные связи между З'-гидроксильной
группой и фосфатом, в результате чего образуется
5'-фосфомоноэфирная группа с одной стороны от
разрыва и З'-гидроксильная группа с другой. Для
функционирования ферментов необходим двухва-
Этап 1
Б’ (___pGpApApTрТрСр________Q 3’
3' ( pCpT pT pApApGp 0 5'
. t
Есо Rl I Этап2
Б'( pGO |( pApApTpTpCp Q 3'
--------------------д
3'( рСрТрТрАрАр 0}( Gp 05'
Диссоциация
5' —PGOH-3'
3' —рСрТрТрАрАр Б’
f Реассоциация
Б' pApApTpTpCp— 3'
3'-HOGp 5>
РИС. 4.5.
Сайт узнавания и разрезания для рестриктирующей
эндонуклеазы Есо RI. Разрезание происходит в два эта-
па: сначала гидролизуется одна цепь, потом другая
При обычных условиях продуктами реакции являются
два дуплексных фрагмента с комплементарными одно-
цепочечными концами. В условиях, способствующих
стабилизации водородных связей между четырьмя нук-
леотидами из разных цепей (например, при понижении
температуры), фрагменты могут реассоциировать.
лентный катион, обычно Mg24, но ни АТР, ни
S-аденозилметионин не требуются.
б. Типичная рестриктирующая
эндонуклеаза типа II
Эндонуклеаза Есо RL Широко используемая рест-
риктирующая эндонуклаза Есо RI разрезает ДНК
в тех местах, где встречается последовательность
5'-GAATTC-3' (рис. 4.5). Как и в случае других
рестриктирующих эндонуклеаз типа II, эта последо-
вательность является палиндромом, т. е. в обеих
цепях точно напротив друг друга находятся одина-
ковые последовательности, читаемые в направлении
5' -» 3'. Есо RI гидролизует фосфодиэфирные связи
между остатками G и А в каждой цепи. Поскольку
эндонуклеаза Есо RI разрезает обе цепи в том месте,
где встречается палиндромная последовательность
5'-GAATTC-3', молекула ДНК разрезается на харак-
терный для нее набор фрагментов («фингерпринт»-
«отпечатки пальцев», рис. 4.6).
Липкие концы. Эндонуклеаза Есо RI производит
ступенчатые двухцепочечные разрезы, при этом
у образующихся фрагментов ДНК на концах обра-
зуются короткие комплементарные одноцепочечные
хвосты из четырех оснований- 5'-ААТТ-3' (рис. 4.5).
В зависимости от ионной силы раствора и темпера-
туры эти комплементарные хвосты либо остаются
спаренными, либо денатурируют, и тогда образуют-
ся отдельные фрагменты с короткими одноцепо-
чечными выступами на 5'-концах. При соответст-
вующих условиях комплементарные хвосты воссое-
диняются (рис. 4.5). Одноцепочечные концы, обра-
зующиеся при расщеплении ДНК эндонуклеазой
Есо RI, получили название липких, поскольку они
способны спариваться (как бы слипаться) друг
с другом. Важным следствием образования ступен-
чатых разрывов является то, что фрагменты, полу-
чающиеся в результате обработки эндонуклеазой
Есо RI двух разных ДНК (например, ДНК E.coli
и дрожжей), могут соединяться с помощью липких
концов. При этом различия, затрагивающие двухце-
почечные спиральные сегменты указанных ДНК, на
процесс соединения не влияют.
Фермент. В отличие от рестриктирующих эндо-
нуклеаз типов I и III ферменты типа II, подобные
Есо RI, не катализируют метилирования. Метилаз-
ную активность проявляет другой белок. Активная
эндонуклеаза Есо RI представляет собой димер, со-
стоящий из двух идентичных полипептидных цепей
с мол. массой 31000. Исходя из гомодимерной
структуры можно было бы ожидать, что фермент
будет действовать симметрично на идентичные
последовательности двух частей сайта узнавания
и разрезать обе цепи одновременно. Однако на
самом деле гидролиз происходит последовательно.
216
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
ЕЕ ЕЕ Е
Есо RI
—Wr-----8
РИС. 4.6.
Схематическое изображение разрезания
эндонуклеазой Есо RI протяженной двухце-
почечной ДНК, содержащей несколько сай-
тов узнавания для этого фермента (Е).
Белок взаимодействует с участком около десяти пар
оснований; шесть из них находятся в пределх сайта
узнавания, остальные являются фланкирующими.
Именно эти фланкирующие последовательности,
по-видимому, определяют выбор цепи, которая
будет разрезана первой. Кроме того, фланкирую-
щие пары оснований влияют на общую скорость
разрезания в данном сайте узнавания, так что
в разных сайтах одной молекулы ДНК гидролиз
осуществляется с разной скоростью. Были получены
кристаллы комплекса Есо RI и олигонуклеотида
5'-TCGCGAATTCGCG-3' и проведен их рентгено-
структурный анализ. Это позволило в деталях выяс-
нить способ взаимодействия данного фермента
и ДНК. Было установлено, что между двумя остат-
ками аргинина и одним глутаматом (на каждой
субъединице), с одной стороны, и парами оснований
в сайте узнавания-с другой, образуются водород-
ные связи, в результате чего происходит частичное
раскручивание В-ДНК. О свойствах других рестрик-
тирующих эндонуклеаз типа II известно значитель-
но меньше, но, по-видимому, они аналогичны свой-
ствам Есо RI.
в. Различные группы
рестриктирующих эндонуклеаз
типа II
Боаьшой каталог реактивов. На рис. 4.7-4.9
представлены некоторые из примерно 400 уже опи-
санных рестриктирующих эндонуклеаз. У всех этих
ферментов обнаружено около 90 разных сайтов
узнавания. Каждый из ферментов получен из опре-
деленного прокариотического организма, что
и отражено в его названии. Так, Есо RI ведет свое
происхождение из штамма Escherichia coli К12;
Haell и Haelll из Haemophilus aegyptius\ Ват HI
из Bacillus amyloliquefaciens штамма H; Mbol и
Mfeoll из Moraxella bovis и т. д. Два разных фер-
мента, имеющие одинаковые сайты узнавания, на-
зываются изошизомерами. Однако изошизомеры не
обязательно делают разрез в одном и том же месте;
сравните, например, Xmal и Smal на рис. 4.7 и 4.8
соответственно. Чтобы упростить описание рест-
риктазных сайтов широко применяемых ферментов.
мы используем набор обозначений, представленных
в табл. 4.2.
Палиндромные сайты узнавания и разрезания.
Эндонуклеаза Есо RI- одна из многих рестрикть-
рующих эндонуклеаз типа II (рис. 4.7), которые
узнают различные палиндромные нуклеотидные по-
следовательности и делают разрезы, в результате
чего образуются фрагменты с комплементарными
одноцепочечными хвостами. В пределах этой груп-
пы можно выделить несколько разновидностей фер-
ментов. Например, Есо RI, Hindlll и некоторые
другие эндонуклеазы узнают последовательности из
шести пар оснований; эндонуклеаза Hinjl узнает
пять пар оснований, из которых центральным остат-
ком (на рис. 4.7 он обозначен как N) может быть
любой из четырех нуклеотидов. Эднонуклеаза Bgll
узнает шесть специфических нуклеотидных остат-
ков, но они должны быть разделены в середине
любыми другими пятью парами оснований. Эндо-
нуклеаза Not I имеет сайт узнавания протяжен-
ностью восемь пар оснований; такие ферменты, как
Tag I и Mbo I, имеют сайты узнавания из четырех
Таблица 4.2. Обозначения рестриктазных сайтов
наиболее широко используемых ферментов
Рестриктирующая эндонуклеаза Обозначение Рестриктирую- щая эндонук- леаза Обозначение
Alul Al Kpnl к
Aval A Mbol Ml
BamHl В Mbcll М2
Bell Be Mspl M
Bgll Bg Pstl P
Bglll B2 Pvul Pu
Clal C Pvull Pv
Ddel D Sad Sc
EcoRl E Sall S
EcoRII E2 SauiA S3
EcoRV E5 Smal Sm
Haell He Sphl Sp
Haelll Ha Sstl Ss
Hindi He Taql T
Hindlll H Xbal X
Hinfl Hf Xhol Xh
Hpdl HI Arnalll Xm
Hphl Hp
4. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: ФЕРМЕНТЫ
217
нуклеотидов. Другая известная особенность касает-
ся свойств одноцепочечных концов, образующихся
при действии различных рестриктирующих эндонук-
леаз (рис. 4.7). Эндонуклеазы EcoRI, HindlU, Mbol
и Clal образуют одноцепочечные хвосты, состоящие
Фермент Сайт узнавания и разрезания
♦
BamHI 5' - G|GATC С -
- CCTAQG - 5'
♦ ♦
ВсЛ 5' - T[GATCA -
- A C Т AG|T - 5'
♦ I
ВдП 5' - G С С N N N N|N G G С -
- CGG NffTKrNN С CG - 5'
♦ ♦
C/al 5' - A T(CG А Т -
- Т A GC1T А - 5'
♦ *
EcoRI 5'-G(AATTC-
- С Т Т A AiG - 5'
т
НааН 5'- RGCGCJY -
- YfC G С G R - 5'
МлсЛН 5' - A(AGC Т Т -
- Т TCGAlA -5'
♦ 1
Hinfl 5' - Gft N ТС -
-CTNAjG-5'
♦ ♦
Hpall 5' - C(C G G -
- G GC]C - 5'
♦ ♦
Mbol I 5'-(GATC-
Sau3A - CT AG]- 5'
I f
Mspl 5'- C(CGG -
- G GC)C -5’
♦ ♦
Notl 5' - G C|G G С C G C -
-CGCCGG]CG-5'
♦ ♦
Pstl 5' - С T G C A|G -
- GfA C G T C - 5'
A
Taql 5'- T(CGA
- AGC]T - 5'
♦ ♦
Xmal 5' - C|C C G G G -
- G G GCC]C - 5'
РИС. 4.7. 1
Группа рестриктирующих эндонуклеаз типа II, разреза-
ющих палиндромные последовательности с образова-
нием липких концов. Стрелками указаны точки разре-
зов. Фосфодиэфирный мостик, обозначаемый обычно
буквой «р», на этой и последующих диаграммах не
указан. Очевидно, что при разрезании ДНК рестрикти-
рующими эндонуклеазами всегда образуются 5'-конце-
вой фосфомоноэфир и З'-концевой гидроксил (рис. 4.1)
N-любое основание. N- комплементарное ему основа-
ние. Буквами R и Y обозначены один из пуринов и один
из пиримидинов соответственно.
Сайт узнавания
Фермент и разрезания
Alul 5'-AGCT-
-Т CGA-5'
♦
Мае III 5-GG^CC-
-CCGG-5'
♦
MPa I 5’-GT?AAC-
-CAAT T G-5'
♦
Sma I 5'-CCctjGG-
-GGGCCC-5'
РИС. 4.8. ♦
Группа рестриктирующих эндонуклеаз типа II, разреза-
ющих палиндромные последовательности с образова-
нием тупых концов.
из 5'-концевых остатков каждой цепи, а эндонуклеа-
зы Pstl и 7/йгП из З'-остатков.
Эндонуклеазы, имеющие различные сайты узна-
вания и разрезания, часто образуют идентичные
липкие концы. Например, под действием эндонук-
леаз Mbol, Bell и Earn HI образуются 5'-концевые
5'-GATC-3'. В результате фрагменты, получающиеся
при расщеплении данной ДНК любым из этих
ферментов, при смешивании и отжиге будут соеди-
няться друг с другом. Однако фрагменты, полу-
чающиеся из различных ДНК при разрезании эндо-
нуклеазой Bgl I, вряд ли будут соединяться при
отжиге, поскольку одноцепочечные хвосты могут
содержать любую последовательность из трех нук-
леотидов.
Другие рестриктирующие эндонуклеазы типа II
(рис. 4.8) также узнают специфические палиндром-
ные нуклеотидные последовательности, но разре-
зают фосфодиэфирный мостик в середине узнавае-
мой последовательности, в результате чего обра-
зуются фрагменты ДНК с тупыми двухцепочечными
концами.
Непалиндромные сайты узнавания с разрезанием
на некотором расстоянии от них. Ферменты типа II,
но другой разновидности (рис. 4.9) тоже узнают
специфические нуклеотидные последовательности,
но гидролизуют фосфодиэфирные мостики вне этих
последовательностей. При этом узнаваемая после-
довательность не является палиндромом. В этих
случаях рестриктирующие эндонуклеазы, по-види-
мому, «отсчитывают» точное число пар оснований
от узнаваемой последовательности и затем разре-
зают цепи. Механизм отсчета таков, что места
гидролиза разных цепей смещены одно относитель-
218
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Фермент Сайт узнавания и разрезания
Hph I 5'-GGTGANNNNNNNN-
-CCACTNNNNNNN -5’
f
мьо II 5'-GAAGANNNNNNNlJ-
-CTTCTNNNNNNN -5'
РИС. 4.9. *
Группа рестриктирующих эндонуклеаз типа II, разреза-
ющих цепи ДНК на определенном расстоянии от узна-
ваемой последовательности.
но другого на один нуклеотид. В результате обра-
зуются фрагменты ДНК с одноцепочечными высту-
пами длиной только в один нуклеотидный остаток.
г. Картирование сегментов ДНК
с помощью рестриктирующих
эндонуклеаз типа II
С помощью рестриктирующих эндонуклеаз мож-
но разрезать сложные геномы или длинные сег-
менты ДНК на воспроизводимые наборы более
мелких единиц. В свою очередь такие единицы можно
разделить по размерам с помощью нескольких ме-
тодов. Чаще всего для этого используют электро-
форез фрагментов ДНК в полужидком геле, приго-
товленном на основе агарозы или полиакриламида
(рис.4.10). Обычно подвижность двухцепочечного
фрагмента в электрическом поле обратно пропор-
циональна логарифму его размера. Используя в ка-
честве маркеров фрагменты известной длины, легко
определить размер интересующего нас фрагмента
с помощью линейки и простого графика. Для прове-
дения такого анализа обычно достаточно менее
1 мкг ДНК, поскольку фрагменты легко выявляют-
ся при окрашивании соответствующим красителем,
например бромистым этидием.
Набор фрагментов, получающихся при расщеп-
лении ДНК определенной рестриктирующей эндо-
нуклеазой, является своеобразным «отпечатком
пальцев» этой ДНК. Определяя, какие фрагменты
образуются при расщеплении ДНК несколькими
рестриктазами по отдельности и в разных комби-
нациях, часто удается установить порядок распо-
ложения сегментов в исходной молекуле, т. е. по-
строить физическую карту ДНК, где указано поло-
жение каждого сегмента (рис. 4.11). Сложные ге-
номы или большие молекулы ДНК дают при обра-
ботке рестриктирующими эндонуклеазами сложные
наборы фрагментов, и для их анализа используют
специальные компьютерные программы.
ДНК SV40
Hindlll
Акриламид
РИС. 4.10.
Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК,
получающихся при гидролизе последней рестриктиру-
ющими эндонуклеазами. А. Электрофорез в агарозном
геле смеси фрагментов, образующихся при гидролизе
ДНК бактериофага X ферментом Есо RI. Б. Электрофо-
рез в полиакриламидном геле смеси фрагментов, обра-
зующихся в результате гидролиза ДНК SV40 эндонук-
леазой Hind\\\. В агарозном геле разделяют относи-
тельно крупные фрагменты (23 0,3 т.п.н.), а в полиак-
риламидном более мелкие (6 т.п.н. 2 п.н.). Варьируя
процентное содержание агарозы или акриламида в геле,
можно оптимизировать разделение фрагментов в том
или ином диапазоне длин. Для визуализации полос,
содержащих фрагменты разной длины, гель окрашива-
ют бромистым этидием. В ультрафиолетовом свете
различимы полосы, содержащие всего 50 нг ДНК. Под
каждой из диаграмм приведены графики зависимости
относительной подвижности фрагментов от логарифма
их размеров.
д. Защита ДНК посредством
метилирования
Родственные метилазы. Геномы бактерий, коди-
рующие рестриктирующие эндонуклеазы, защище-
ны от самодеградации с помощью специфических
систем модификации. Метилазы, осуществляющие
специфическою модификацию, узнают те же нуклео-
4. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: ФЕРМЕНТЫ
219
Hmdlll BamHl fcoRl
fcoRl fcoRI BamHl
Hindlll BamHl Hindlll
6,5 5,5 7
3.0 4,5 5
2.5 2,0
РИС. 4.11.
Построение рестрикционной карты кольцевой молекулы
ДНК длиной 12 т.п.н. ДНК гидролизовали указанными
эндонуклеазами по отдельности или в разных комбина-
циях и определяли размер фрагментов (в т.п.н.) с по-
мощью электрофореза в агарозном геле. Зная размер
фрагментов, можно установить положение сайтов узна-
вания для трех представленных ферментов.
тидные последовательности, что и родственные им
эндонуклеазы, и переносят метильную группу от
S-аденозилметионина к специфическому адениново-
му (с образованием Ь16-метиладенина) или цитози-
новому (с образованием 5-метилцитозина) остаткам
в пределах сайта узнавания (рис. 1.4). В результате
эндонуклеазное разрезание блокируется. На рис. 11.17
представлены основные типы соответствующих ре-
акций, а на рис. 4.12- характерные сайты метили-
рования для нескольких систем типа II. Некоторые
метилазы достаточно хорошо очищены и могут
использоваться при конструировании рекомбинант-
ных молекул ДНК (разд. 6.2. б). Метилирование
цепей, как и разрезание эндонуклеазами, происходит
симметрично. Однако метилазы, которые были из-
учены, включая фермент Есо RI,- это мономерные
белки, и метилирование разных цепей осуществля-
ется в два отдельных этапа. Таким образом, не-
смотря на то, что эндонуклеазы и метилазы типа
II узнают одну и ту же короткую последователь-
ность ДНК и, по-видимому, эволюционировали па-
раллельно, это разные белки.
Идентификация метилированных сайтов в ДНК.
Метилирование - это весьма распространенное явле-
ние, совсем не обязательно связанное с рестрик-
цией модификацией. В результате некоторые сайты
рестрикции в ДНК проявляют устойчивость к
действию определенных эндонуклеаз. Например, в
ДНК позвоночных часто встречаются динуклеоти-
ды 5'-meCG-3' (разд. 1.1. а). Если сайт рестрикции
эндонуклеазы Hpall содержит такой метилирован-
ный динуклеотид, то фермент не может разрезать
ДНК в этом месте (рис. 4.13). Этот факт исполь-
зуется для определения в сложных геномах состоя-
ния метилирования таких динуклеотидов 5'-CG-3',
которые находятся в сайтах узнавания Hpall. Не-
смотря на неспособность эндонуклеазы Hpall раз-
резать динуклеотид 5'-CmeCGG-3', ее изошизомер,
эндонуклеаза Mspl, осуществляет такое разрезание
(рис. 4.13). Сравнивая чувствительность фрагментов
ДНК к двум указанным ферментам, можно ло-
Родственные сайты метилирования Рестриктирующая эндонуклеаза
fia/nHI сн3 5'-GGATCC
£со RI CCTAGG-5’ сн3 сн3 5 -GAAT ТС
Есо R11 CTTAAG-5' сн3 сн3 5' - С С * G G
Hae\II G G J С С - 5' СН3 сн3 5' - G G С С
С С G G - 5’ сн3
сн3
Hindlll 5'-AAGCTT
TTCGAA-5'
сн3
сн3
«Pal 5'-GTTAAC
CAATTG-5'
CH3
CH3
Hpall 5'-CCGG
GGCC-5
РИС, 4.12. сн3
Родственные сайты метилирования некоторых систем
рестрикции модификации.
220
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
РИС. 4.13.
Дифференцированное действие Msp\ и Нра\\ на час-
тично метилированный сегмент ДНК. После того как
данный сегмент был клонирован и реплицирован в Е.
coli, оба фермента дали одинаковый набор фрагментов.
поскольку 5-метилцитозин был замещен цитозином.
Внизу схематически представлены результаты гель-
злектрофореза смеси фрагментов ДНК, полученных
после гидролиза в каждом из трех случаев.
кализовать метилированный цитозин на карте. По-
добным же образом часто встречающуюся в ДНК
растений последовательность 5'-CmeCyGG-3'
можно отличить от неметилированной формы,
5'-CCyGG-3', если сравнить продукты, получа-
ющиеся при расщеплении ДНК с помощью изо-
шизомеров B.V/NI и Есо RII (рис. 4.14).
Независимые метилазы E.coli. При включении
фрагментов эукариотической ДНК в бактериальные
векторы и их репликации в клетках Е. coli или других
прокариот характерный для них тип метилирования
утрачивается и они метилируются способом, специ-
фичным для новой клетки-хозяина. Например,
в клетках E.coli динуклеотиды 5'-CG-3' не мети-
лируются, и в результате сайты, ранее защищенные
от действия эндонуклеазы Нра II, становятся
чувствительными к ней (рис. 4.13). Однако два
обычных фермента E.coli'. г/атДНК-метилтрансфе-
раза, которая метилирует остаток А в последо-
вательности 5'-GATC-3', и г/сшДНК-метилтраНсфе-
раза, метилирующая остаток С в последователь-
ности 5'-CCyGG-3',- образуют новые устойчивые
сайты; ни одна из этих метилаз не является частью
системы рестрикции-модификации. Кроме того,
эукариотическая ДНК, реплицированная в E.coli,
становится устойчивой к эндонуклеазам Mbo I и
Bell благодаря тому, что в пределах их сайтов
узнавания находится 6-метиладенин. Заметим, что
тот же самый 6-метиладенин в сайте 5'-GATC-3' не
мешает работе эндонуклеаз Bam HI, Bgll или Saw ЗА;
однако разрезание с помощью Saw ЗА блокируется,
если метилирован остаток С.
4. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: ФЕРМЕНТЫ
221
Нет
Сайт
Разрезание разрезания
5'- но г_____________О-он - 3'
З'-но-Г- СЮН-5’
сн3
5’ - С С G G
G G С С - 5'
сн3
Нра\\
Полинуклео-
тидкиназа
2АТР
СН3
5-CCCGGG *та 1 Sznal
GGGCCC-5’
сн3
СН3
I
5’-CCtGG FcoRII SstNI
GG JCC -5’
РИС. 4.14. СНз
Пары рестриктирующих эндонуклеаз, с помощью кото-
рых можно определить локализацию остатков 5-метил-
цитозина.
4.3. ФОСФОМОНОЭСТЕРАЗЫ
Часто при проведении экспериментов с реком-
бинантными ДНК или при анализе структуры ДНК
приходится отщеплять концевые фосфомоноэфир-
ные группы (рис. 4.15). Известно множество неспе-
цифических фосфомоноэстераз (фосфатаз). Эти фер-
менты, выделенные из клеток E.coli и кишечника
теленка, были получены в высокоочищенном виде.
Фосфатазы гидролизуют как 5'-, так и З'-концевые
.фосфомоноэфиры в ДНК и РНК.
Фосфомоноэфирные группы, находящиеся на
конце одноцепочечных разрывов в дуплексной ДНК
или экранированные нависающей над ними второй
цепью, подобные тем, которые образуются при
разрезании эндонуклеазой Pst I (рис. 4.7), удаляются
с помощью фосфатазы только при слабоденату-
рирующих условиях (например, при повышенной
температуре).
5 — ₽ Н_______________Q-ОН - 3'
3’-НО-( 0“ Р — 5'
+
2ADP
РИС. 4.16.
Присоединение 5'-концевых фосфомонозфирных групп
с помощью полинуклеотидкиназы. В этих опытах ис-
пользуется 32Р-меченная АТР, в результате чего образу-
ется радиоактивно меченная ДНК.
4.4. ПОЛИНУКЛЕОТИДКИНАЗА
Киназы составляют большой класс ферментов,
катализирующих фосфорилирование многих биохи-
мических соединений - от небольших молекул до
очень крупных макромолекул, включая полипепти-
ды и полинуклеотиды.
Полинуклеотидкиназа (рис. 4.16), широко ис-
пользуемая в качестве реактива в экспериментах
с рекомбинантными ДНК, была выделена и очище-
на из клеток E.coli, инфицированных бактериофа-
гом Т4. Фермент кодируется геномом бактериофага.
Донором фосфата служит АТР, а одним из про-
дуктов реакции является ADP. В ходе реакции
специфически фосфорилируются 5'-концевые гид-
роксильные группы молекул ДНК и РНК; З'-конце-
вые гидроксильные группы не фосфорилируются
Одной из важных сфер применения полинуклеотид-
киназы является мечение 5'-конца полинуклеотид-
ной цепи с помощью радиоактивного 32Р с исполь-
зованием АТР, меченной по у-фосфату. Последова-
тельное действие фосфатазы (разд. 4.3) и полинук-
леотидкиназы приводит к замещению немеченого
5'-концевого фосфомоноэфира на радиоактивный
без каких-либо других изменений в цепи.
мощью фосфатазы.
3' 5'
РИС. 4.15. EL.-----он г----он^з;
Гидролиз концевых фосфодиэфирных групп с по-
5' но он но он 3'
3- но он 5'
5' но______________он (р) он 3'
3' но он 5‘
222
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
4.5. ДНК-ЛИГАЗА
Получение рекомбинантных молекул ДНК
включает объединение in vitro сегментов ДНК из
различных источников. Благодаря тому что при
расщеплении ДНК определенными эндонуклеазами
образуются фрагменты с липкими концами, при
отжиге эти фрагменты довольно легко соединяются,
однако водородные связи, удерживающие их вместе,
в обычных условиях оказываются относительно сла-
быми и легко разрушаются. Для ковалентного сши-
вания фрагментов используют ДНК-лигазу, кото-
рая катализирует образование фосфодиэфирных
5'©__________Os-
s' НО 05'
Лигаза фага Т4
РИС. 4.17.
А. Ковалентное сшивание липких концов двухцепочеч-
ных молекул с помощью ДНК-лигазы. Б. Лигаза ката-
лизирует образование фосфодиэфирных связей в месте
одноцепочечного разрыва в двухцепочечной молекуле.
В. ДНК-лигаза фага Т4 сшивает двухцепочечные моле-
кулы с тупыми концами.
связей между соседними нуклеотидами (разд. 2.1. д).
Механизм лигирования представлен на рис. 2.20.
Чтобы лигирование было успешным, в объеди-
няемых цепях должен произойти отжиг комплемен-
тарных («липких») концов; в этом случае происхо-
дит лигирование обеих цепей (рис. 4.17, Л). Если два
одноцепочечных сегмента удерживаются рядом за
счет образования водородных связей с интактной
комплементарной цепью, то образование фосфоди-
эфирной связи происходит только в одной цепи
(рис. 4.17,5). ДНК-лигаза фага Т4 (но не лигаза
E.coli} способна также соединить двухцепочечные
молекулы с тупыми концами (хотя и с низкой
эффективностью), катализируя образование фосфо-
диэфирных связей в обеих цепях (рис. 4.17,5).
4.6. ДНК-ПОЛИМЕРАЗА I
а. Полифункциональный фермент
Механизм, с помощью которого ДНК-полиме-
раза катализирует полуконсервативный синтез но-
вых цепей ДНК, был описан в разд. 2.1. д. Цепи
удлиняются путем последовательного присоедине-
ния нуклеотидов к праймеру со свободной З'-гид-
роксильной группой; выбор нуклеотидного остатка
на каждом этапе определяется ДНК-матрицей.
ДНК-полимераза I Е. coli катализирует и некоторые
другие важные реакции. Две из них имеют особое
значение для экспериментов с рекомбинантными
ДНК: это 3' -> 5'- и 5' -> З'-экзонуклеазные реакции.
В обоих случаях образуются продукты с 5'-фосфо-
моноэфирными концами. Две указанные экзонук-
леазные активности присущи разным участкам мо-
лекулы ДНК-полимеразы I, которые можно разде-
лить, обработав белок протеолитическими фер-
ментами. После разделения обнаруживается, что
3'-» 5'-экзонуклеазная и полимеразная активности
связаны с большим по размеру полипептидом,
содержащим карбоксильную группу на конце,
а 5' -» З'-экзонуклеазная активность со вторым, бо-
лее мелким фрагментом.
б. Ник-трансляция
Реакции, катализируемые ДНК-полимеразой I,
нашли широкое применение. Например, часто ис-
пользуется способность ДНК-полимеразы I ката-
лизировать одновременно как полимеризацию, так
и 5' -> З'-экзонуклеазное расщепление (рис. 4.18).
Фермент, выступая в роли экзонуклеазы, осуществ-
ляет деградацию цепи в 5' -> З'-направлении, начи-
ная с 5'-конца одноцепочечной бреши (ника) в двух-
цепочечной ДНК, а выступая в роли полимеразы,
восстанавливает цепь путем последовательного при-
соединения моно нуклеотидных остатков к свобод-
4. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: ФЕРМЕНТЫ
223
(₽) • . з-
------------------------------------------------------Ьб’
ДНК-полимераза I б'
dATP, dCTP
dGTP, dTTP
dAMP, dCMP
dGMP, dTTP
3' 5'
5'OH P i
3' ( P HO
5' 3'
34 (P) HO
РИС. 4.18. 5-
Ник-трансляция. В результате совместного действия
5'-> З’-зкзонуклеазной и полимеразной активностей
ДНК-полимеразы I Е. coli в присутствии а-32Р-меченных
дезоксинуклеотидтрифосфатов (на рисунке они заклю-
3' 5'
--------
чены в окрашенный прямоугольник) одноцепочечный
разрыв (ник) в двухцепочечной ДНК перемещается
вдоль молекулы ДНК, при этом синтезируется 32Р-ме-
ченная ДНК.
ной З'-гидроксильной трупе на другом конце бреши.
Собственно синтеза ДНК не происходит: брешь
лишь перемещается вдоль цепи, чем и объясняется
название этого процесса ник-трансляция. Проводя
ник-трансляцию в присутствии а-32Р-меченных де-
зоксинуклеозидтрифосфатов, в качестве субстратов
получают меченые фрагменты ДНК с высокой
удельной активностью.
в. Заполнение брешей
ДНК-полимераза способна превращать фраг-
менты ДНК с липкими концами во фрагменты
с тупыми концами при наличии выступающего
5'-конца (рис. 4.19). З'-гидроксильный конец служит
праймером, 5'-выступ матрицей; пробел на З'-кон-
це заполняется путем последовательного присоеди-
нения дезоксинуклеотидных остатков. Для заполне-
ния лучше использовать большой карбокси-конце-
З'-но
^Он-з-
г о
5'
5'
ha
РИС. 4.19.
dATP,
dGTP,
dCTP
dTTP
Образование тупых концов путем синтеза недостающе-
го участка одной из цепей с помощью большого фраг-
мента ДНК-полимеразы I.
вой фрагмент ДНК-полимеразы I, получаемый
в результате протеолиза; это позволяет избежать
5' -»З'-экзонуклеазного расщепления матрицы
(разд. 2.1. д). Липкие концы можно превратить в ту-
пые и с помощью специфичной к одноцепочечной
ДНК нуклеазы, однако в этом случае утрачивается
несколько нуклеотидных остатков (рис. 4.2, А).
4.7. РНК-ЗАВИСИМЫЕ
ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ
(обратные транскриптазы)
Эти ферменты были выделены из РНК-содер-
жагцих опухолеродных вирусов. Они позволяют
синтезировать ДНК на РНК-матрице in vitro
(разд. 2.2). Реакция, катализируемая обратными
транскриптазами, аналогична стандартным реак-
циям с участием ДНК-полимераз и, как в случае
с другими ДНК-полимеразами. нуждается в затрав-
ке (праймере). В качестве матрицы обычно исполь-
зуется одна цепь РНК, на которой синтезируется
комплементарная цепь ДНК. В результате обра-
зуется гибридная молекула РНК-ДНК. Часто
удобным праймером служит короткая цепочка по-
лидезоксириботимидиловой кислоты [poly (dT)]. по-
скольку она способна спариваться с полирибоаде-
ниловой кислотой, обычно находящейся на концах
эукариотических мРНК (рис. 4.20) (разд. 3.8. а); в ре-
зультате такого спаривания инициируется синтез
ДНК-копии этой РНК (кДНК).
224
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
б'Стттт Оон-3'
idATP, dGTP, dCTP, dTTP
Обратная транскриптаза
бЧТТТТТ*- - * 03-
РНКаза Н или щелочь
Оз-
ДНК-полимераза I или
обратная транскриптаза
dATP, dCTP, dGTP, dTTP
3'1 aAAAA
5'(YTTTT------
Специфичная в отношении
одноцепочечной ДНК
нуклеаза
РИС. 4.20.
Схематическое изображение реакции, катализируемой
обратной транскриптазой, и синтеза двухцепочечной
кДНК.
кДНК-копия молекулы мРНК может быть пре-
вращена в двухцепочечную ДНК. Для этого прежде
всего с помощью РНКазы Н или щелочного гидро-
лиза удаляют исходную матричную РНК. Остав-
шаяся одноцепочечная кДНК служит собственным
праймером (а также и матрицей) при синтезе второй
комплементарной цепи ДНК. Как это происходит,
не совсем ясно. Последняя реакция может катализи-
роваться либо ДНК-полимеразой I, либо обратной
транскриптазой. По-видимому, праймером служит
короткая шпилечная структура, образующаяся
вблизи 3-гидроксильного конца первой цепи. Ко-
нечный дуплекс все еще содержит шпильку на одном
из концов, которая разрезается специфичной в отно-
шении одноцепочечной ДНК нуклеазой (см.
рис. 4.2, В) с образованием двух полностью комп-
лементарных цепей ДНК (дуплексная кДНК).
4.8. ТЕРМИНАЛЬНАЯ
ДЕЗОКСИНУКЛЕОТИДИЛ-
ТРАНСФЕРАЗА
а. Полимеризация без матрицы
Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза
(часто называемая терминальной трансферазой) яв-
ляется в определенном смысле полимеразой, по-
скольку она катализирует синтез полидезоксирибо-
нуклеотидов из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов
с высвобождением неорганического пирофосфата.
Подобно ДНК-полимеразам, она не способна ини-
циировать синтез новой полимерной цепи и поэтому
требует присутствия праймера со свободной конце-
вой З'-гидроксильной группой. Однако в отличие от
истинных ДНК-полимераз она не нуждается в мат-
рице и не способна что-либо копировать вообще.
Продукт полимеризации соответствует дезокси-
нуклеозидтрифосфатам, используемым в качестве
субстрата (рис. 4.21). Если в реакции участвует
dATP, то продуктом является полидезоксиадени-
ловая кислота [poly(dA)], находящаяся на З'-конце
праймера; если используется dGTP, то к праймеру
оказывается присоединенной poly(dG). Поскольку
терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза не
копирует матрицу, продуктом синтеза является од-
ноцепочечный полимер. При использовании в ка-
честве праймера двухцепочечной молекулы на каж-
дом конце дуплекса образуются одинаковые З'-хвос-
ты. На самом деле терминальная дезоксинуклеоти-
дилтрансфераза предпочитает одноцепочечные, а не
двухцепочечные праймеры. Если имеется полностью
двухцепочечный фрагмент ДНК, к которому нужно
присоединить одноцепочечные хвосты, можно ис-
пользовать различные методы получения одноце-
почечных концов, способных служить праймерами
(рис. 4.22).
б. Синтез липких концов
С помощью дезоксинуклеотидилтрансферазы
к молекулам ДНК, не имеющим липких концов,
можно присоединить такие концы (рис. 4.23). Тупые
5-~р(
«Оон — з-
Терминальная
де зо к си ну к л еот и дилт ра нефе раза
5-~Р(
РИС. 4.21.
Реакция, катализируемая терминальной дезоксинуклео-
тидилтрансферазой. N - любой из четырех дезоксинук-
леотидов, А, Т, G или С.
4. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: ФЕРМЕНТЫ
225
5'-Р
3‘ —НО
Экзонуклеаза фага X
(5- - 3')
5'-pQ
з-но(
Пон— з'
Dp-5’
он-з РИС. 4.22.
Р-5 Способы получения одноцепочечного праймера, в кото-
ром нуждается терминальная дезоксинуклеотидилтран-
сфераза, на полностью двухцепочечной молекуле ДНК.
Мягкие денатурирующие
условия
Низкая концентрация
солей или ионов Со
5— Р Г
О ОН —3"
3'—НО к.
О Р—5'
З'-НО
dATP
ООН-3'
О Р-5' :
Терминальная
дезоксинуклео-
тидилтрансфераза
5'-Р(
3'—но(
ОН-3'
dTTP
АААААА С
Т) ТТТТТ
' 5'— Р<
з-но-ааааа!
$
Заполнение пробелов
с помощью большого
фрагмента ДНК-полимеразы I
dATP+ dTTP
ААААААА С
3'—НО—аааааС
ОТТТТТТТТ-ОН- 3'
О Р-5'
5'-Р<
3'- ОН-ААААА1
ДНК-лигаза
ААААААА.
£ТТТТТТТТ-ОН-3'
и
РИС. 4.23.
Образование липких концов с
мощью терминальной дезоксинуклео-
тидилтрансферазы. Конечный про-
дукт- линейная молекула легко мо-
жет замкнуться в кольцо.
по-
JkP' А 4 X}
АА
15 24 А
226
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
концы образуются при механическом разрыве боль-
ших молекул ДНК (например, при быстром переме-
шивании раствора или продавливании его через
узкое отверстие), при обработке ДНК с помощью
рестриктирующих эндонуклеаз, дающих тупые кон-
цы, или при действии неспецифических ДНКаз. На-
пример, если к одному набору фрагментов ДНК
присоединить poly (dT), а к другому poly (dA) и сме-
шать эти фрагменты, то произойдет их соединение
друг с другом. Пробелы, образующиеся из-за нерав-
ной длины poly(dT)- и poly (dА)-хвостов, могут быть
заполнены с помощью ДНК-полимеразы I, а концы
соединены ДНК-лигазой. Такой подход использо-
вался при конструирований первой рекомбинантной
молекулы ДНК. И хотя открытие рестриктирую-
щихся эндонуклеаз сильно упростило процедуру
получения липких концов при рекомбинации моле-
кул ДНК in vitro, иногда для их создания все еще
используется терминальная дезоксинуклеотидил-
трансфераза.
4.9. POLY (А)-ПОЛ И МЕРАЗА
Подобно терминальной дезоксинуклеотидил-
трансферазе, ро1у(А)-полимераза присоединяет нук-
леотидные остатки к З'-концу цепи без участия
матрицы. Однако poly (А)-полимераза проявляет
специфичность в отношении РНК. Праймером яв-
ляется полирибонуклеотид, а субстратом-АТР.
При этом GTP, СТР, UTP или dATP не могут
заменить АТР. Ро1у(А)-полимераза выполняет
высокоспециализированную и важную функцию
в экспериментах с рекомбинантными ДНК: ее ис-
пользуют для присоединения ро!у(А)-концов к моле-
кулам РНК при синтезе кДНК (разд. 4.7).
Глава 5
ИНСТРУМЕНТАРИЙ:
СИСТЕМЫ ХОЗЯИН ВЕКТОР
В основе молекулярного клонирования лежит
встраивание нужного фрагмента ДНК (вставки)
в другую молекулу ДНК (вектор), которая способна
реплицироваться в соответствующей клетке-хозяине
(см. рис. 11.12). Такое встраивание осуществляется in
vitro, а затем образовавшиеся рекомбинантные мо-
лекулы ДНК вводятся в клетки. Векторая молекула
должна содержать точку начала репликации (ori).
Кроме того, для репликации нужны специфические
ферменты и другие белки; их поставляет клетка-
хозяин или они кодируются самим вектором. Век-
тором может быть любой небольшой внехромосом-
ный элемент (например, плазмида, ДНК фага или
вируса). Каждый из этих элемен гов встречается
в природе в клетках определенных видов, и боль-
шинство из них реплицируе гей' только в природном
хозяине или клетках близкородственных видов.
В большинстве случаев эволюция механизма репли-
кации протекала в направлении создания оптималь-
ных условий для существования в клетках природ-
ного хозяина внехромосомных генетических элемен-
тов, при этом использовались метаболиты, фер-
менты и другие белки клетки-хозяина, а также ее
аппарат белкового синтеза. Поэтому основным
инструментом молекулярного клонирования всегда
является двухкомпонентная система - совместимая
комбинация хозяина и вектора.
При рекомбинации in vitro обычно образуется
популяция молекул ДНК, в которой лишь неко-
торые имеют нужную структуру. Клонирование
уникальных рекомбинантных молекул должно про-
исходить при соблюдении следующих требований:
1. Условия, при которых популяция рекомби-
нантных ДНК смешивается с популяцией реци-
пиентных клеток, должны быть такими, чтобы
в каждую клетку попало только по одной реком-
бинантной молекуле. Это позволяет изолировать
рекомбинантные молекулы друг от друга.
2. Каждая реципиент ная клетка в популяции
должна быть отделена от всех остальных, чтобы
можно было выделить клон клеток или вирусов,
содержащих уникальную рекомбинантную молекулу.
3. Клетки или вирусы, получившие рекомби-
нантные ДНК, должны отличаться от клеток, их не
получивших, так чтобы их можно было отобрать
либо идентифицировать при скрининге.
4. Клетки, получившие нужную рекомбинант-
ную молекулу, должны отличаться от клеток, содер-
жащих другие рекомбинантные молекулы ДНК,
чтобы можно было отобрать их или идентифи-
цировать при скрининге.
В этой главе мы рассмотрим разнообразные
типичные системы «хозяин-вектор» и первые три
требования, которые имеют к этой теме прямое
отношение, поскольку методы, используемые для
скрининга и селекции, в основном зависят от опре-
деленных свойств используемой комбинации «хо-
зяин-вектор». Методы выделения желаемого ре-
комбинантного клона (требование 4) описаны
в гл. 6. Отобранные нами примеры иллюстрируют
основные принципы, которые применяются в на-
стоящее время при конструировании систем, ис-
пользуемых в сложных экспериментальных ситуа-
циях.-
Наиболее широко применяются такие комби-
нации, когда в роли хозяина выступает штамм
E.coli К12, а в роли вектора плазмиды и фаги
E.coli. Предпочтение, отдаваемое этому штамму,
обусловлено тем, что еще задолго до развития
технологии рекомбинантных ДНК он уже широко
использовался при изучении генетики микробов. Его
генетические и физиологические свойства были де-
тально исследованы и в коллекциях имелись многие
хорошо охарактеризованные мутанты этого штам-
ма. Кроме того, в клетках штамма Е. coli К12 могут
реплицироваться многие бактериофаги и плаз-
миды - потенциально полезные векторы. Знание
свойств этого бактериального штамма и соответст-
вующих векторов и обусловило его преимуществен-
ное использование в экспериментах с рекомбинант-
ными ДНК. Были разработаны также другие систе-
мы хозяин вектор, которые сначала применяли
лишь в особых случаях. Например, если ставилась
задача получить в большом количестве белок, коди-
руемый клонированным геном, имело смысл ис-
пользовать системы с Bacillus subtilis. С распростра-
нением генетических манипуляций на клетки эука-
риот и в особенности с началом исследования
экспрессии генов в клетках дрожжей, растений и жи-
вотных появилась необходимость в разработке под-
ходящих эукариотических систем хозяин - вектор.
Вскоре после того как начались работы с реком-
15'
228
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
бинантными ДНК, ряд ученых выразили беспокой-
ство по поводу того, что клетки или вирусы, содер-
жащие вставки «чужеродной» ДНК, могут прояв-
лять неожиданные и даже опасные свойства. Это
стимулировало поиск ослабленных систем хозяин -
вектор, что уменьшило бы вероятность инфициро-
вания людей, работающих с этими системами,
и других живых организмов. Некоторые природые
или лабораторные варианты штамма E.coli К12 не
способны выживать или широко распространяться
в окружающей среде, поскольку для их развития
необходимы весьма специфические эксперименталь-
но создаваемые условия, обычно не встречающиеся
в природе. С помощью классических генетических
методов и технологии рекомбинантных ДНК были
получены варианты штамма E.coli К12 и других
штаммов, что расширило круг применяемых ослаб-
ленных хозяев. В одних случаях соображения
о необходимости ограничения работ с рекомбинант-
ными ДНК и требования, предъявляемые к экспери-
ментам с этими ДНК, находились в едином русле.
В других же применение ослабленных штаммов
давало неожиданный импульс развитию техники
экспериментирования. В процессе работы накапли-
валось все больше данных о необоснованности мно-
гих опасений (по крайней мере для большинства
проводимых экспериментов), и требования к приме-
нению ослабленных систем хозяин-вектор станови-
лись все менее строгими.
5.1. E.COLI-СИСТЕМЫ:
КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВА
а. Разносторонность хозяина
Несмотря на то что штамм E.coli К12-это
уникальный, отличный от других штамм E.coli, он
не однороден по своим свойствам и на самом деле
представляет собой семейство родственных бакте-
риальных штаммов, происходящих от одного ис-
ходного изолята. Известные в настоящее время
члены этого семейства отличаются друг от друга
мутациями в одном или нескольких генах. Неко-
торые штаммы E.coli К12 получены с помощью
направленного отбора специфических по фенотипу
клонов, но большинство из них имеют неиден-
тифицированные аллельные особенности. Многие из
этих особенностей несущественны для свойств суб-
клона, используемого в качестве хозяина для ре-
комбинантных молекул ДНК. однако некоторые
имеют важное значение. Эти последние свойства
клеток-хозяев, которые проявляются в зависимости
от используемого вектора, можно разбить на не-
сколько классов: одни из них имеют отношение
к точной репликации вектора, другие к успешному
введению рекомбинантных векторов, третьи к
удобному отбору необходимого типа рекомбинан-
тов.
б. «Гостеприимство» хозяина
Клетки хозяина должны обеспечивать все усло-
вия для репликации векторной ДНК и не содержать
элементов, подавляющих репликацию вектора или
мешающих отбору. Так, нельзя использовать клет-
ки, содержащие активную систему рестрикции, по-
скольку это угрожает целостности рекомбинантных
ДНК, содержащих чувствительные сайты рестрик-
ции. Также неприемлемы клетки, содержащие нор-
мальные dam- и </ст-метилтрансферазы E.coli, по-
скольку в этих случаях образуются реплицирован-
ные рекомбинантные ДНК, устойчивые к исполь-
зуемым в экспериментах в качестве инструмента
рестриктирующим эндонуклеазам (разд. 4.2. е).
Применяя клетки, дефектные в отношении нор-
мальных рекомбинационных функций, можно пред-
отвратить возникновение нежелательных изменений
во вставке.
Проявление других важных свойств клетки-хо-
зяина зависит от того, какой используется вектор-
плазмидный или фаговый. Например, если векто-
ром служит ДНК бактериофага Z, то хозяйские
клетки не должны быть лизогенными по этому фагу,
поскольку такие клетки устойчивы к повторному
заражению, что обусловлено присутствием /-ре-
прессора белка cl, который выключает экспрессию
всех генов, необходимых для лизиса (разд. 3.11.е).
Плазмидные векторы обычно содержат маркерные
гены, благодаря которым клетки-хозяева приобре-
тают удобный для отбора фенотип, свидетельст-
вующий о присутствии в них данного вектора.
Поэтому исходные клетки-хозяева не должны иметь
похожего фенотипа. Например, мутантные клетки
Е. coli, нуждающиеся для своего роста в определен-
ной аминокислоте, являются подходящими хозяева-
ми в комбинации с векторами, несущими недостаю-
щий ген. Если высеять культуру клеток, из которых
только часть содержит указанный вектор, на среду,
лишенную данной аминокислоты, то колонии будут
образовывать лишь те клетки, которые несут этот
вектор. Точно так же клетки, чувствительные к опре-
деленному антибиотику или токсину, можно ис-
пользовать в комбинации с векторами, несущими
гены устойчивости к этим агентам. Как правило,
в системах с плазмидными векторами не исполь-
зуются клетки-хозяева, наследующие посторонние
плазмиды, поскольку при этом затрудняется очист-
ка рекомбинантных ДНК, которая зависит от физи-
ческих свойств плазмидной ДНК.
5. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН ВЕКТОР
229
в. Доступность хозяина
Проблема введения изолированных молекул
ДНК в живые клетки E.coli процесс, называемый
трансфекцией,- была решена эмпирически вскоре
после начала работы с рекомбинантными молекула-
ми ДНК. Было показано, что в присутствии СаС12
устойчивые клетки становятся проницаемыми для
ДНК и их трансфекция с помощью фаговой или
плазмидной ДНК осуществляется всего за несколь-
ко минут. Природа этого высокоэффективного про-
цесса остается малопонятной. Еще более эффектив-
ная передача фаговых геномов достигается в том
случае, если они сначала упаковываются в фаговые
частицы in vitro, а затем вводятся в клетку с по-
мощью стандартной процедуры инфицирования
(разд. 5.3). Очень важное требование в этом случае-
способность клеток адсорбировать и реплицировать
бактериофаг, поскольку не все штаммы Е. coli яв-
ляются пермиссивными хозяевами для всех бакте-
риофагов Е. coli.
г. Некоторые примеры
Особые свойства различных вариантов штамма
E.coli К. 12 лучше всего иллюстрирует рассмотрение
некоторых широко используемых производных это-
го штамма (табл. 5.1). E.coli К12 С600 является
одним из стандартных производных штамма К12,
хотя различные клоны С600 имеют неодинаковые
генотипы. Субклон RR1 не способен усваивать га-
лактозиды из среды (обозначение lac Y указывает на
отсутствие функциональной Р-галактозидпермеазы).
Плазмидный вектор, поставляющий Р-галактозид-
пермеазный ген, сообщает реципиентным клеткам
способность усваивать Р-галактозиды, которые за-
тем гидролизуются Р-галактозидазой. Это очень
удобный маркер, поскольку успешно трансфициро-
ванные клетки образуют голубые колонии на агаре,
содержащем 5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-В-галакто-
Таблица 5.1. Некоторые варианты штамма
E.coli К12, широко используемые в качестве
клеток-хозяев
I
I
Вариант Вектор Полезные гены”
С600 Плазмиды, фаг X
RRI Плазмиды lacY, hsdR, end А.
НВ101 » lac'll, hsdR, end A, rec A
7.1776 » dap
71-18 Фаг М13 A[/ac-pro]; F' lac (AM 15)
DH121 Плазмиды hsdR, end A, rec A
11 Эти гены E.coli описаны в тексте.
21 Этот штамм особенно эффективно трансфицируется плаз-
мидными векторами.
зид (названный Xgal) и их легко идентифицировать.
Голубой хромофор образуется в результате гидро-
лиза Xgal Р-галактозидазой. Штамм RR1 несет му-
тацию hsdR, которая инактивирует эндогенную
рестриктирующую эндонуклеазу E.coli К12; это сво-
дит к минимуму деградацию поступившей в клетку
плазмидной рекомбинантной ДНК. Дополнитель-
ная защита от деградации обусловливается тем, что
в клетках этого штамма отсутствует основная де-
зоксирибоэндонуклеаза E.coli end А.. Субклон НВ101,
близкий родственник RR1, имеет еще одно преиму-
щество: он не способен к общей рекомбинации
(гес А).
Штамм /1776 был сконструирован специально
для работы с рекомбинантными ДНК в ответ на
выраженное некоторыми учеными беспокойство
о возможной опасности этих экспериментов. С по-
мощью стандартных генетических методов в ДНК
была внесена мутация (dap), в результате которой
клетки могли синтезировать клеточную стенку толь-
ко в тех случаях, когда в среду добавляли сущест-
венный ее компонент-редкую диаминопимелино-
вую аминокислоту. Эти и другие мутации, при-
водящие к повреждению белков, необходимых для
образования клеточной стенки, делают клетки х! 776
очень чувствительными к некоторым антибиотикам
и к лизису солями желчных кислот (в кишечнике
животных) и ионными детергентами. Эта же чувст-
вительность приводит к необходимости использо-
вать специальные процедуры для проведения ус-
пешной трансфекции.
Удобные векторы были сконструированы на ос-
нове фага М13 (разд. 5.3), представителя группы так
называемых Ff- (т. е. F-специфичных нитчатых) фа-
гов. Эти фаги инфицируют только те клетки Е. coli.
которые несут половой фактор, называемый F-фак-
тором (см. введение к ч. И). Поэтому хозяином для
фага М13 должен быть штамм F+, каким является
штамм 71-18. У E.coli 71-18 /ас-оперон делегирован
(А[/ас-/>го]) из геномной ДНК, но он содержится
в F-плазмиде (F'lac). Для облегчения работы с этим
штаммом F' /ас-плаз миду маркируют делецией
(AM 15), соответствующей N-концу Р-галактозида-
зы. Голубые бляшки, указывающие на присутствие
активной Р-галактозидазы, обнаруживаются на ага-
ре с Xgal только в том случае, если вектор М13
содержит область (lac Za) /аг-оперона, отсутству-
ющую в F' lac. Каждый из двух геномов (F' lac [AM 15]
и М13 lac Za) детерминирует свою часть молекулы
Р-галактозидазы, и в результате их взаимодействия
внутри клетки образуется активная Р-галактозидаза
230
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Таблица 5.2. Модульная организация плазмид
Модули
Модуль репликации
со строгим контролем
(1-2 копии)
Модуль репликации
с ослабленным конт-
ролем (10-30 копий)
Модуль конъюгации
Модуль резистентности
к тетрациклину
Со/-модуль
Модуль резистентности
к ампициллину
Модуль резистентности
к хлорамфениколу
Плазмиды
(приблизительные размеры в т. п. и.)
F (93) R100 (ЮО) ColV (140) ColEl (б) Ар201 (14)
+ + + — —
— — — + +
+ +- + — —
— + + + —
— — — — +
— + — — —
5.2. Е. СО/./-СИСТЕМЫ:
ПЛАЗМИДНЫЕ ВЕКТОРЫ
а. Модульная структура плазмид
Существует много разных способов классифи-
кации плазмид, но, по-видимому, целесообразнее
всего рассмотреть их здесь с точки зрения наличия
в них модульных сегментов ДНК.
В табл. 5.2 суммированы данные о модульных
особенностях нескольких встречающихся в природе
плазмид. Каждый модульный сегмент может со-
держать один или несколько генов, или цис-дейст-
вующих элементов,- таких, например, как область
инициации репликации. Функционально родствен-
ные модули в различных и независимо выделенных
плазмидах часто, но не всегда оказываются и струк-
турно родственными, как если бы они произошли от
одной ДНК. Каждая плазмида должна иметь по
крайней мере один из нескольких репликационных
модулей, которые позволяют ей автономно репли-
цироваться. В одном из классов, типичным предста-
вителем которого являются F-плазмиды. реплика-
ция и сегрегация регулируются согласованно с реп-
ликацией бактериального генома, и в каждой клетке
содержится одна или две копии плазмиды. О таком
типе репликации говорят как о репликации со стро-
гим контролем. Второй тип репликационного моду-
ля свободен от такого контроля, что приводит
к существованию в клетке многих копий плазмид.
Подобный тип репликации получил название репли-
кации с ослабленным контролем.
Наличие других модулей, не связанных с репли-
кацией, не является обязательным для каждой опре-
деленной плазмиды. Половые факторы, т. е. конъ-
югативные (или самотрансмиссивные) плазмиды,
подобные F-фактору, имеют модули, содержащие
гены и регуляторные области, необходимые для
переноса плазмиды из одной клетки в другую (см.
введение к ч. II). Половые факторы, несущие модуль
ДНК, полученный от бактериальной хромосомы,
отмечены апострофом, как в случае F'.
Модули другого типа содержат гены, белковые
продукты которых инактивируют антибиотики.
Плазмиды, несущие такие модули, часто называют
R-плазмидами (от англ, resistance- устойчивость;
табл. 5.3). Часто одна плазмида обеспечивает ус-
тойчивость к нескольким антибиотикам, при этом
все или несколько генов резистентности разного
типа могут быть сгруппированы в одном модуле.
Не все R-плазмиды способны осуществлять функ-
цию полового фактора, которая зависит от наличия
в плазмиде модуля конъюгации. Неконъюгативные
плазмиды (утратившие модуль конъюгации) не спо-
собны к самотрансмиссивности, но некоторые из
них могут быть перенесены из одной клетки в дру-
гую, если они совмещены в донорной клетке с поло-
вым фактором. Половой фактор осуществляет пере-
нос неконъюгативной плазмиды, которую в этом
случае называют мобилизуемой
Таблица 5.3. Гены резистентности к антибиотикам
Антибиотик (ген) Кодируемые белки Механизм резистент- ности
Ампициллин Р-Лактамаза Гидролиз связи С N
(атр) (пенициллиназа) в р-лактамном кольце
Хлорамфеникол Хлорамфеникол- Ацетилирование САМ
(cam) ацетилтрансфе- раза с помощью ацетил- СоА с образованием О-апетил-САМ
Тетрациклин Охарактеризован Уменьшает способ-
(лч) недостаточно ность клеток концентрировать тетрациклин
Стрептомицин Стрептомицин- Фосфорилирование (1)
(хгг) фосфотранс- фераза (1) Стрептомицин- аденилатсин- тетаза (2) или аденилирование (2) ОН-группы стрептомицина с помощью АТР
Канамицин Канамицин-аце- N-ацетилирование (1)
(кап) тилтрансфераза (1) или О-фосфорили- рование (2) этих
Неомицин Аминогликозид- родственных
(пео) фосфотранс- фераза (2) антибиотиков
5 ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН - ВЕКТОР
231
Рост в Proteus mirabilis
или
Salmonella typhimurium
РИС. 5.1.
Схематическое изображение (без соблюдения масшта-
ба) генома типичной конъюгативной R-плазмиды и ее
диссоциации на два независимых репликона: RTF-
и r-плазмиды. Гены резистентности к антибиотикам и их
продукты охарактеризованы в табл. 5.3. Светлыми ова-
лами обозначены области начала репликации (ori). Точ-
ками выделены сегменты, необходимые для конъюга-
ции, а штриховкой мобильные элементы.
Имеется еще один тип модулей, встречающийся
в составе как конъюгативных, так и неконъюга-
тивных плазмид: Со/-модули. Со/-модули кодируют
ген одного из нескольких белков-колицинов (анти-
бактериальных агентов, продуцируемых бактерия-
ми). Колицины различаются по структуре и способу
действия. Плазмиды, кодирующие определенный
колицин, часто содержат гены, обеспечивающие
иммунность к этому колицину, страхуя таким об-
разом клетку-продуцент от повреждений, вызы-
ваемых ее собственным средством защиты.
Некоторые плазмиды содержат также модули,
кодирующие системы рестрикции-модификации.
Одним из таких примеров является система Есо R1.
Типичная плазмида. Модульное строение типич-
ных R-плазмид схематически представлено на
рис. 5.1. Около 50% последовательности из при-
близительно 105 пар оснований этих плазмид го-
мологичны одному из участков F-плазмиды как по
структуре, так и по функциям. Эта область вклю-
чает гены, необходимые для конъюгации (гга) и реп-
ликации со строгим контролем. В F-подобной об-
ласти находится также дополнительный модуль,
содержащий гены, контролирующие резистентность
к тетрациклину. Вторая половина R-плазмиды не
родственна F и содержит модули, ответственные за
резистентность к стрептомицину, сульфанилами-
дам, хлорамфениколу и канамицину.
Модули как подвижные элементы. Плазмиды,
выделенные независимо и даже в различных частях
света, часто содержат близкородственные модули.
Например, многие плазмиды несут одни и те же
гены резистентности к антбиотикам. На основании
этих данных возникло представление о том, что
между геномами происходит обмен некоторыми
генетическими модулями в виде интактных сегмен-
тов ДНК. Сейчас стало ясно, что в бактериальных
плазмидах происходит множество перестроек и об-
менов. Например, R-плазмиды, присутствующие
в клетках определенных бактерий, отличных от
Е. coli, особенно в Salmonella typhimurium или Proteus
mirabilis, могут диссоциировать на две отдельные
плазмиды, каждая из которых содержит одну из
двух разных частей (рис. 5.1). F-подобные последо-
вательности образуют независимо реплицирующу-
юся конъюгативную плазмиду, обозначаемую RTF,
а остальная часть-другую независимо реплици-
рующуюся, но неконъюгативную плазмиду, обозна-
чаемую просто г. Поскольку как RTF, так и г яв-
ляются независимыми репликонами, каждая плаз-
мида должна содержать модуль ДНК, обеспечи-
вающий репликацию. Подобные перестройки не
являются простым лабораторным курьезом: RTF-
и r-плазмиды обнаружены в природе. Быстрое рас-
пространение генов резистентности к антибиотикам
объясняется именно обменом модулями между
плазмидами. Эти и другие данные, полученные при
изучении генетики бактерий, привели к идентифи-
кации дискретных подвижных элементов, названных
инсерционными последовательностями (IS) и транс-
позонами (гл. 10), которые способны перемещаться
не только между плазмидами, но и между плаз-
мидными и клеточными геномами, а также в преде-
" лах самого бактериального генома. Обычно многие
модули в плазмидах являются подвижными элемен-
тами или фланкированы ими (рис. 5.1).
Плазмиды как векторы. Многие плазмиды ис-
пользуются в качестве векторов для молекулярного
232
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
клонирования в E.coli. Плазмиды, исходно обна-
руженные в природе, были впоследствии модифи-
цированы, укорочены, реконструированы и подверг-
нуты рекомбинации как в клетках, так и в экспери-
ментальных условиях. Целью всех этих манипуля-
ций было получение универсальных плазмид или,
напротив, плазмид, предназначенных для решения
каких-то определенных экспериментальных задач.
Лучшие из них содержали генетические маркеры,
позволяющие упростить отбор рекомбинантных мо-
лекул.
венной за устойчивость к тетрациклину. При внед-
рении какого-либо сегмента ДНК в EcoR 1-сайт
после трансфекции образуются тетрациклинустой-
чивые рекомбинанты. В среде, содержащей тетра-
циклин, нетрансфицированные клетки не образуют
колоний в отличие от тех, в которых трансфекция
имела место. Однако так происходит лишь с клет-
ками, содержащими неизмененную плазмиду
pSClOl. Фрагмент ДНК, внедренный в любой из
сайтов рестрикции. Ват Hl, Sall или HindIII,- пре-
рывает и инактивирует гены, кодирующие резис-
тентность к тетрациклину, в результате чего появ-
ляются тетрациклинчувствительные трансфектанты.
б. Конструирование векторов
для отбора
Эффективность трансфекции E.coli К12 с по-
мощью рекомбинантных плазмидных ДНК доволь-
но низка. Какая-то часть клеток-хозяев вообще
избегает трансфекции; другие клетки получают
вектор без вставки, который либо не был разрезан
рестриктирующей эндонуклеазой, либо подвергся
лигированию, не включив вставки (рис. 5.2). Необ-
ходимо было разработать метод, позволяющий
выявить или селективно вырастить те клетки, ко-
торые приобрели рекомбинантные векторы. Для
этой цели в плазмидные векторы вводят гены,
детерминирующие какие-то отличительные феноти-
пические особенности. Получив клетки, несущие
рекомбинантные векторы, идентифицируют те, ко-
торые содержат нужную вставку, и клонируют их.
Методы, используемые на этой конечной стадии
молекулярного клонирования, описаны в гл. 6.
Один селективный маркер. В самых ранних
экспериментах с рекомбинантными ДНК исполь-
зовали плазмидный вектор pSClOl. Он содержит
всю информацию, необходимую для его репликации
в клетках Е. coli, а также гены устойчивости к
тетрациклину. Кроме того, он несет по одному
сайту узнавания для рестриктирующих эндонуклеаз
£coRI, Hind\\\, Ват HI и Sall (рис. 5.3). Последние
три сайта находятся в пределах области, ответст-
РИС. 5.2.
При трансфекции £. coli с помощью реком-
бинантных плазмидных ДНК одни клетки
вообще не приобретают никакой плазмиды,
другие получают исходную векторную мо-
лекулу без вставки, а третьи рекомбинант-
ную молекулу.
Клеточная
ДНК
5. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН-ВЕКТОР
233
РИС. 5.3.
Структура плазмиды pSC101 и фенотипические свойст-
ва £ СО/7К12, трансфицированной этой плазмидой или
различными .ев рекомбинантными производными. В
разных рекомбинантных плазмидах вставка встроена
в разные эндонуклеазные сайты. Клетки £ coli К12, не
содержащие плазмиды, чувствительны к тетрациклину.
Клетки, получившие при трансфекции такую ре-
комбинантную ДНК, отличаются от клеток, по-
лучивших pSClOl, но не отличаются от исходных
тетрациклинчувствительных клеток хозяина. Таким
образом, присутствие в pSClOl только одного
селективного маркера (резистентности к тетрацик-
лину) не позволяет осуществить прямой отбор
клеток, содержащих рекомбинантную плазмидную
ДНК. Этот вектор имеет и другие недостатки: он
содержит излишнюю ДНК, и, что более важно,
регуляция его репликации осуществляется по стро-
гому типу, так что в клетке-хозяине образуется
лишь несколько копий плазмиды, т. е. выход ре-
комбинантной ДНК очень низок.
Два селективных маркера. При наличии двух
селективных маркеров в плазмидном векторе мож-
но провести отбор среди трех типов клеток (рис.
5.2): нетрансфицированных, получивших неизменен-
ную плазмиду или приобретших рекомбинантную
плазмиду. Этот принцип отбора представлен на рис.
5.4, где используются два селективных маркера:
гены устойчивости к антибиотикам тетрациклину
и хлорамфениколу. Отбор основывается на инду-
цируемом вставкой нарушении, приводящем к инак-
тивации только одного из маркированных генов.
В приведенном случае нарушение произошло в гене
резистентности к тетрациклину. Только те клетки,
которые содержат рекомбинантную плазмиду, рас-
тут в присутствии хлорамфеникола и не способны
расти в присутствии тетрациклина.
Помимо того что селективные маркеры позво-
ляют выделять клоны бактериальных клеток, со-
держащие рекомбинантные плазмиды, они выпол-
няют еще одну важную функцию. Если плазмида
не придает клетке-хозяину какие-то важные свой-
ства, то клетки обычно размножаются более эф-
фективно в отсутствие «лишней» внехромосомной
ДНК. Поэтому клетки, утратившие плазмиду, быст-
ро перерастают другие, и в результате рекомбинан-
ты элиминируются. Другое дело, если клетки на-
ходятся в таких условиях, когда их жизнеспособ-
ность зависит от плазмиды. Например, клетки,
содержащие рекомбинантный вектор, несущий ген
резистентности к тетрациклину, успешно растут
в среде, в которую добавлен тетрациклин, а клетки,
утратившие вектор, элиминируются. Такое давление
отбора на хозяйские клетки почти всегда оказыва-
ется необходимым для сохранения рекомбинант-
ного плазмидного вектора.
Свойства идеального плазмидного вектора. Иде-
альный плазмидный вектор для молекулярного
клонирования должен содержать минимальное ко-
личество ДНК, его репликация должна регулиро-
ваться по типу ослабленного, а не строгого контро-
ля, чтобы обеспечить высокий выход ДНК; он
должен содержать по крайней мере два селективных
маркера и иметь только один сайт узнавания для
одной рестриктирующей эндонуклеазы. Последнее
свойство позволяет разрезать кольцевую ДНК
в уникальном сайте, по которому затем и будет
234
ЧАСТЬ II, ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
tetr
Вставка
Трансфекция
tetr
camr
tets
cam*
РИС. 5.4.
Преимущества использования двух селек-
тивных маркеров. При индуцируемом встав-
кой нарушении одного из маркеров все три
типа трансфицированных клеток имеют
разные фенотипы.
осуществлено лигирование со вставкой. Чтобы
максимально облегчить отбор, уникальный сайт
рестрикции необходимо включить в один из двух
селективных маркеров. Вставка не должна преры-
вать последовательность, существенную для сохра-
нения самой плазмиды. Векторы, которые прибли-
жаются к такому идеалу, были сконструированы из
встречающихся в природе модулей ДНК с помощью
классических генетических методов и методов, ис-
пользуемых при работе с рекомбинантными ДНК.
Модули, ответственные за репликацию с ослаб-
ленным контролем, встречаются в различных при-
родных плазмидах. Одна из таких плазмид, colEl
(табл. 5.2), имеет еще одно преимущество: ее репли-
кация осуществляется даже в условиях, когда синтез
белков и хромосомной ДНК Е. coli подавлен с
помощью аминокислотного голодания или анти-
биотика хлорамфеникола (репликация colEl-типа
описана в гл. 2). При таких условиях клетки не
делятся, однако в них накапливается несколько
тысяч копий плазмидного генома (рис. 5.5). В ре-
зультате из 1 л культуральной жидкости можно
с легкостью получить около 1 мг плазмидной ДНК.
Сама плазмида colEl не часто используется в ка-
честве вектора, но модуль colEl-репликации встроен
в большое число других плазмид. Все такие плаз-
миды имеют преимущества, связанные с ослаблен-
ным контролем репликации, т. е. с накоплением
плазмид при подавлении белкового синтеза. Неко-
торые из этих плазмид перечислены в табл. 5.4.
в. Плазмидный вектор pBR322
Из всех векторов при работе с Е. coli чаще всего
используется плазмида pBR322 (табл. 5.4). Этот
вектор был сконструирован с помощью классиче-
ских генетических методов (in vivo) и методов,
применяемых при работе с рекомбинантными ДНК,
и имеет многие свойства идеального плазмидного
5. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН ВЕКТОР
235
вектора для клонирования (рис. 5.6). Установлена
полная нуклеотидная последовательность этого
вектора длиной 4362 п.н. Поскольку pBR322 репли-
цируется по colEl-типу, удается получить плазмид-
ную ДНК с высоким выходом. Кроме того, плаз-
мида содержит два селективных маркера: гены
устойчивости к ампициллину и тетрациклину. Каж-
дый из 12 сайтов узнавания рестриктирующими
вдонуклеазами встречается в молекуле лишь один
раз, и это позволяет получать полноразмерные
линейные молекулы с разнообразными липкими
концами. При трансфекции клеток Е. coli К12 плаз-
мидой pBR322 может образоваться более 108 ус-
пешно трансформированных клеток на 1 мкг плаз-
мидной ДНК в зависимости от используемого
ш гамма и условий. После внедрения сегментов
ДНК в вектор pBR322 in vitro эффективность
трансфекции падает на один или два порядка, что
опять-таки определяется штаммом-хозяином и ус-
ловиями трансфекции.
Таблица 5.4. Некоторые плазмидные векторы, использующиеся при работе с E.coli
Плазмидный вектор Контроль репликации Размер, п.н. Селективные маркеры и некоторые уникальные сайты рестрикции1’
pSClOl Строгий 8700 Ген резистентности к тетрациклину (HiWIII, BamHI, Sfl/I); EcoRI
pUC7 Ослабленный 2700 Ген резистентности к ампициллину /«cZa21 (EcoRI, ZtonHI; Hindi. Pstl)
рМВ9 » 5500 Ген резистентности к тетрациклину (Н/исЛП. EamHI, Sall) Ген резистентности к колицину31; EcoRI; HpaV, Smal
pBR322 » 4362 Ген резистентности к тетрациклину (Я/шЛП, EomHI, Sall) Ген резистентности к ампициллину (Pstl, Pvuiy, EcoRI; Atal; Pvull; Clal
pDF4l Строгий 12800 trpE-ген; EamHl, EcoRI, Hindlll, Sall
pRK250l » II100 Ген резистентности к тетрациклину (Sall) Ген резистентности к канамицину (Hindlll, Xhol)
11 Сайты рестрикции, находящиеся внутри селективных маркеров, указаны в скобках после маркера.
2’ lacZa содержит промотор и аминоконцевую часть р-галактозидазного гена (/ocZ) E.coli (разд. 5.1.1 и 5.2.г).
3) Колицин это токсин, кодируемый некоторыми плазмидами; он активен в отношении E.coli.
236
ЧАСТЬ II ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Pv
(2065)
РИС. 5.6.
Плазмида pBR322. Указаны сайты узнавания для
эндонуклеаз рестрикции, каждый из которых
встречается в молекуле только один раз. Цифры
около сайтов-число пар оснований
Клетки E.coliК12, содержащие pBR322, выра-
щивают в среде, содержащей ампициллин или
тетрациклин либо оба этих антибиотика; при этом
клетки, утратившие плазмиду, не растут в присутст-
вии любого из двух антибиотиков (рис. 5.7). Если
какой-либо сегмент ДНК внедряется в область
pBR322, кодирующую устойчивость к тетрациклину
(например, в сайт рестрикции для BamHl или
Sal 1). то трансформанты сохраняют способность
расти на среде с ампициллином, но не растут на
среде с тетрациклином. Если же вставка происходит
в ампициллиновом гене (по сайтам рестрикции для
Pvu 1 или Pst I), то наблюдается обратная ситуация.
При любой локализации вставки происходит отбор
только тех бактериальных колоний, которые со-
держат рекомбинантную плазмидную ДНК. Отбор
осуществляют, посеяв трансфицированные клетки
Е. coli К12 на чашки с агаром, содержащим анти-
биотик, к которому клетки, несущие плазмиду,
должны быть устойчивы. Все выросшие колонии
будут содержать плазмиду. Клетки из таких резис-
тентных к антибиотику клонов тестируют затем на
способность расти в среде, содержащей второй
антибиотик. Такая проверка позволяет отличить
колонии, содержащие исходную плазмиду pBR322
(есть рост), от колоний, несущих рекомбинантную
плазмиду (нет роста). Все эти операции можно
выполнить за один или два дня с использованием
метода отпечатков (рис. 5.8). Даже одну успешно
трансформированную клетку из 108 высеянных
можно обнаружить по появлению отдельной ко-
лонии. Преимущество использования вектора с
двумя селективными маркерами становится очевид-
ным, если сравнить получение клонов с рекомби-
нантными плазмидами в двух случаях: когда при-
меняются векторы pBR322 или pSClOl (ср. данные,
представленные на рис. 5.3 и 5.7)
г. Другие векторы, используемые
для разных целей
Помимо pSClOl и pBR322 сконструировано
множество других плазмидных векторов, применяе-
мых для различных целей. В табл. 5.4 перечислены
некоторые из них. Вектор pUC7 значительно мень-
ше по размеру, чем pBR322, однако в нем сохранены
необходимые компоненты, включая ген устойчи-
вости к ампициллину. Вторым селективным мар-
кером является часть гена /acZ (ZacZa), которая
вместе с остальной частью /acZ-гена клетки-хозяина
ответственна за голубую окраску колоний, выра-
щиваемых в среде с Xgal (разд. 5.1.г). Все уни-
кальные сайты рестрикции, используемые для внед-
рения фрагмента ДНК, прерывают сегмент lacZa
в векторе pUC7, в результате чего клетки с ре-
комбинантным вектором образуют на среде с Xgal
«белые» (неокрашенные) колонии. Вектор рМВ9
с ослабленным контролем репликации содержит два
селективных маркера, один из которых кодирует
устойчивость к колицину Е1. Клетки, несущие
рМВ9, растут на среде, которая содержит очищен-
ный колицин Е1, а бесплазмидные клетки на этой
5 ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН-ВЕКТОР
237
Рост в присутствии
тетрациклина ампициллина
Клетки
РИС. 5.7.
Фенотипические свойства клеток, содер-
жащих плазмиду рВЯ322 со вставками и
без них.
среде погибают. Модули репликации и устойчи-
вости к тетрациклину у рМВ9 такие же, как у
плазмиды pBR322.
Вектор совершенно другого типа, pDF41, со-
держит модуль репликации, полученный из конъю-
гативной плазмиды F, и хромосомный ген (trpE)
Е. coli. кодирующий фермент, который участвует
в биосинтезе триптофана. Это позволяет отбирать
трансформантов, используя хозяйские клетки trpE~
и среду, лишенную триптофана. Образование ма-
лого числа копий pDF41 оказывается полезным
в экспериментах по изучению регуляции клониро-
ванных бактериальных генов в Е. coli, поскольку при
большом числе копий регуляторные эффекты могут
маскироваться. Вектор pRK2501 ведет свое начало
от плазмиды RK2, относящейся к плазмидам груп-
пы Р. Отличительной чертой Р-плазмид является их
способность к конъюгационному переносу в грам-
отрицательные бактерии многих родов (например,
Serratia marcescens. Pseudomonas aeruginosa). Благо-
даря этому рекомбинантные плазмиды, сконструи-
рованные на основе pRK2501, могут использоваться
в исследованиях, проводимых на многих видах
бактерий.
5.3. Е. СО/./-СИСТЕМЫ:
ФАГОВЫЕ ВЕКТОРЫ
а. Некоторые различия между
плазмидными и фаговыми
векторами
Когда используются фаговые векторы, жизне-
способным продуктом, содержащим сконструиро-
ванную рекомбинантную ДНК. является популяция
фаговых частиц. В отличие от ситуации с плазмид-
ними векторами, когда производятся клонирование
и отбор содержащих их клеток, рекомбинантный
фаговый геном можно клонировать непосредствен-
но. При таком клонировании образуются бляшки на
газоне чувствительных клеток-хозяев (рис. 11.13).
Фрагменты чужеродной ДНК, встроенные в попу-
ляцию фаговых векторных ДНК in vitro, и соответ-
ствующие рекомбинантные фаговые геномы можно
затем ввести в клетки пермиссивного хозяина в виде
изолированной ДНК (трансфекция) или реконст-
руированных вирусных частиц (инфекция). В любом
случае в клетке, инфицированной одной молекулой
238
ЧАСТЬ И. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Чашка с агаром,
содержащим ампициллин
Чашка с агаром,
содержащим тетрациклин
РИС. 5.8.
Выявления колоний, обладающих определенны-
ми фенотипическими свойствами, методом отпе-
чатков. Клетки Е. coli были трансфицированы
плазмидой pBR322. содержащей вставку в тетра-
циклиновом гене (сайт fiamHI). Клетки, несущие
такую плазмиду, образуют колонии на агаре, в ко-
торый добавлен ампициллин (чашка о). Цилиндр,
на торец которого натянут кусок стерильного
бархата, прижимают сначала к агару в чашке а,
3 затем к свежему агару, содержащему тетра-
циклин, но не ампициллин, в чашке б. В результа-
те на чашке б образуется отпечаток, соответству-
ющий распределению колоний на чашке а. Одна-
ко некоторые из колоний (те. которые на чашке
а окрашены) не могут расти на чашке б, посколь-
ку они содержат плазмиду со вставкой, которая
привела к инактивации генов устойчивости к тет-
рациклину.
рекомбинантного вирусного вектора, образуется
вирусное потомство, которое будет инфицировать
близлежащие клетки и в конце концов лизировать
их, приводя к формированию бляшек. Образование
таких бляшек само по себе свидетельствует об
успехе инфекции (или трансфекции). Однако для
идентификации рекомбинантного фага, содержаще-
го нужную вставку, часто бывают нужны дополни-
тельные селективные условия или скрининг бляшек
на содержание определенной последовательности
ДНК (гл. 6).
Выбор типа вектора плазмидного или фагово-
го-зависит от цели эксперимента, размера внед-
ряемого фрагмента и относительного содержания
нужного фрагмента в применяемой смеси фрагмен-
тов ДНК. В целом фаговые векторы более эф-
фективны, чем плазмидные, при клонировании
крупных вставок, и скрининг большого числа нега-
тивных колоний на содержание специфической
вставки провести проще, чем скрининг большого
количества бактериальных колоний (гл. 6). Самыми
распространенными векторами для Е. coli являются
два бактериофага- X и М13.
б. Фаг X
Геном фага X. Наиболее часто применяются
фаговые векторы, полученные на основе умеренного
фага X (гл. 2 и 3). Генетическая карта фага X дикого
типа с указанием сайтов рестрикции для эндонукле-
аз представлена на рис. 5.9. Известна полная
последовательность 48 502 пар оснований, из ко-
торых состоит геном. Молекула ДНК фага X
содержит область начала репликации (ori), а также
гены структурных вирусных белков (головки и
хвостового отростка) и ферментов, участвующих
в репликации ДНК, лизисе инфицированных клеток
и установлении лизогении (разд. З.Н.д). Прибли-
зительно 1/3 генома, представленная непрерывным
внутренним сегментом, находящимся на карте меж-
ду точками 20 и 38 т.п.н., необязательна для
успешной литической инфекции клеток; этот сегмент
содержит гены, необходимые для установления
лизогенного состояния. Необязательной является
и другая небольшая по размеру область вблизи
точки 43 т.п.н. Однако для успешной упаковки ДНК
фага X в вирионе ее длина должна быть больше, чем
38 т.п.н, и меньше, чем 52 т.п.н. Поэтому сущест-
венно, чтобы у всех векторов, сконструированных на
основе ДНК фага X, вся центральная необязатель-
ная область или ее часть была замещена сегментом
соответствующей длины. Обычно многие или даже
все гены, требующиеся для установления лизоген-
ного состояния, удаляются, поэтому инфицирование
всегда сопровождается лизисом клеток хозяина. Для
упрощения конструирования рекомбинантных мо-
лекул используют производные фага X дикого типа.
5. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН-ВЕКТОР
239
Белки Белки
Терминаза головки хвостового отростка
'/Vol A 'wBCDEF "zUVGT HMLKU
ДНК
mt red fl cl I I
attP xis red a cl 11 N cl OP
Лизис
Q ' SR '
РИС. 5.9.
Линейный геном бактериофага X. Заштрихованы гены,
необязательные для литической инфекции. Светлый
овал-область начала репликации. Е-Есо RI-сайты.
утратившие некоторые из обычных сайтов рестрик-
ции. X-Векторы, в которые можно встраивать
сегменты чужеродной ДНК путем замещения необя-
зательной части генома без нарушения существен-
ных областей, были получены из генома дикого
типа с помощью мутаций и рекомбинации in vivo,
а также методов, применяемых при работе с ре-
комбинантными ДНК.
Множественные формы генома. Во время своего
жизненного цикла Х-геном может находиться в
четырех разных формах. Внутри фаговой частицы
ДНК находится в линейной форме (рис. 5.9 и 5.10.а).
Линейная ДНК имеет одноцепочечные концы дли-
Синтез
ной 12 нуклеотидов, способные к взаимному спа-
риванию. При попадании в клетки Е. coli геном фага
X замыкается в кольцо и сшивается с помощью
ДНК-лигазы (рис. 5.10.6). Места спаривания липких
концов получили название сгм-сайтов. Кольцевая
форма обязательна для осуществления репликации
вирусной ДНК; она также служит предшественни-
ком при лизогенной интеграции ДНК фага в геном
хозяина (рис. 1.15, В и ра® 2.4.г). После интеграции
геном фага X снова становится линейным (рис.
5.10.в). Однако благодаря удаленности сайта интег-
рации на фаговой ДНК (attP] от со.т-сайта интегри-
рованная линейная ДНК профага оказывается пер-
мутированной относительно ДНК, находящейся
в фаговой частице. Наконец, во время репликации
ДНК фага X по типу «катящегося кольца» обра-
зуются длинные конкатемеры, состоящие из многих
Левый липкий конец
5’pGGGCGGCGACCT
з Линейная форма,
в которой находится (
геном внутри фаговой Q
частицы
Начало репликации
б Кольцевая форма,
которая образуется .
при попадании фага
в клетку Е. coli
в. Интегрированная
форма (лизогения)
CCCGCCGCTGGAp—5'
Правый липкий конец
РИС. 5.10.
Четыре формы генома бакте-
риофага X. Все обозначения
такие же, как на рис. 5.9.
г. Конкатемерная форма
240
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
копий генома А, (рис. 2.32), которые разрезаются
в ом-сайтах при образовании зрелой фаговой ДНК
(рис. 5 10 г).
в. Векторы, сконструированные
на основе фага X
Типичные векторы. На рис. 5.11 представлен
один из обычных А-векторов. Он короче генома
фага X дикого типа более чем на 10 т.п.н. Неболь-
шая необязательная область вблизи 43 т.п.н. и часть
центральной необязательной области в нем деле-
тированы. Все гены, необходимые для литической
инфекции, остаются интактными, и молекула имеет
достаточно большой размер, чтобы упаковываться
в частицы бактериофага. Сохранены только два из
пяти исходных сайтов для EcoRl; они фланкируют
необязательную часть ДНК протяженностью
7 т.п.н. После разрезания с помощью £coRI обра-
зуются три фрагмента ДНК, один из которых соот-
ветствует левому плечу генома, второй правому,
а третий необязательной центральной области.
Эти три фрагмента можно разделить, поскольку они
различаются по размерам. Чтобы получить реком-
бинантную молекулу, два очищенных плечевых
фрагмента смешивают с фрагментами-вставками,
отжигают и затем лигируют. Встраиваемая ДНК
должна иметь Есо RI-липкие концы и размер от 5 до
17 т.п.н., чтобы образовалась молекула, способная
к упаковке. Следует заметить, что во время отжига
и лигирования фрагменты могут соединяться двумя
разными способами. Встраиваемая ДНК соединяет-
ся с двумя плечевыми фрагментами в любой из двух
ориентаций с помощью липких Есо RI-концов, а
плечевые фрагменты соединяются друг с другом
с помощью своих липких A-концов. Продуктом
объединения является конкатемер предшественник
для упаковки вирусной ДНК в зрелые фаговые
частицы.
Для разных целей было сконструировано мно-
10 20 зо
-1---------1---------1---------- т.п.н
------ША----
t t
Фракционирование
по размеру
РИС. 5.11.
Типичный вектор, сконструированный
на основе фага X. С помощью эндо-
нуклеазы Есо RI из генома фага X
вырезают необязательную централь-
ную часть Боковые участки отжигают
вместе с фрагментом, имеющим
Есо Rl-липкие концы, и лигируют
В результате образуются конкате-
мерные структуры, состоящие из бо-
ковых участков генома фага X и
вставки, которые соединены друг с
другом через липкие концы и cos-сай-
ты.
5. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН-ВЕКТОР
241
жество разных А-векторов. Все они характеризуются
двумя основными свойствами: 1) сами векторные
молекулы могут размножаться, подобно фагу, в
процессе литической инфекции, что позволяет легко
получить векторную ДНК; 2) строго фиксированное
положение сайтов рестрикции позволяет осущест-
вить разрезание или удаление центральной несу-
щественной области, а также получить сайты для
лигирования вставки. Во многих векторах, сконст-
руированных на основе ДНК фага А, используются
не Есо RI-, а другие сайты рестрикции, позволяющие
получить нужные плечевые фрагменты и провести
лигирование с разнообразными вставками. Различ-
ные А-векторы включают вставки разных размеров.
Те векторные молекулы, в которых делегирована
вся несущественная область, способны включать
вставки максимального размера - немногим более
24 т.п.н.
Отбор рекомбинантного фага. Как и плазмидные
векторы, нужные рекомбинантные фаги отбираются
из большого разнообразия побочных продуктов.
Первый этап отбора основан на получении нега-
тивных колоний на газоне чувствительных клеток,
поскольку не все возможные продукты лигирования
способны осуществлять инфицирование. Например,
в случае вектора, изображенного на рис. 5.11,
побочные продукты объединения включают конка-
темеры, содержащие только два плеча фага А.
Поскольку расстояние между ros-сайтами в этих
молекулах меньше 38 т.п.н., они не могут упако-
вываться в фаговые частицы. Если А-векторы со-
держат более протяженные плечевые фрагменты или
если до отжига и лигирования неполностью удален
несущественный сегмент ДНК фага А, необходимо
применять дополнительные методы отбора, по-
скольку и в том и в другом случае фаговая частица,
не несущая вставку, может образовать бляшку.
Чтобы отличить рекомбинантный фаг от нереком-
бинантного, в некоторые А-векторы включают сег-
мент ДНК, содержащий промотор, оператор и ген
Р-галактозидазы (lacZ) из /ас-оперона E.coli (разд.
3.11.в). Большая часть гена lacZ удаляется из
исходной ДНК фага А при вырезании несуществен-
ной центральной области с помощью рестрикти-
рующей эндонуклеазы. Если векторная ДНК соот-
ветствующим образом восстановлена и содержит
ген р-галактозидазы, то на чашках с агаром, со-
держащим Xgal, появляются голубые бляшки; если
же рекомбинантная векторная ДНК не содержит
Р-галактозидазного гена, то на той же среде обра-
зуются бесцветные бляшки. Таким образом, фаг,
содержащий вставку, образует на индикаторных
чашках бляшки другой окраски (разд. 5.1. г).
г. Упаковка Х-векторных молекул
в фаговые частицы
Упаковка in vitro. Большим преимуществом ис-
пользования А-векторных молекул ДНК для мо-
лекулярного клонирования является высокая эффек-
тивность переноса рекомбинантных геномов в клет-
ки Е. coli К12. Теоретически ДНК фага А дикого типа
может дать примерно 2-1O10 бляшкообразующих
единиц на 1 мкг ДНК, поскольку мол. масса генома
составляет примерно 3 • 107 и каждая молекула
способна дать начало бляшке. Однако клетки,
обработанные СаС12 и трансфицированные с по-
мощью »ДНК фага А (разд. 5.1.в), способны обра-
зовать на 1 мкг ДНК только 104- 10б бляшек.
Эффективность ж;е бляшкообразования при исполь-
зовании лигированных рекомбинантных ДНК на
несколько порядков ниже. Такой низкий выход
заставляет использовать относительно большие
количества вставок и векторной ДНК при лиги-
ровании и трансфицировать большое число клеток,
чтобы создать возможность для нахождения нуж-
ного сегмента ДНК. Однако ДНК фага А можно
упаковать с образованием инфекционных фаговых
частиц in vitro, а при инфицировании этими части-
цами образуются 108 бляшек на 1 мкг ДНК фага
А дикого типа или 10б на 1 мкг рекомбинантных
молекул ДНК фага А.
Конструирование фаговых головок и хвостовых
отростков. ДНК фага А упакована в гексагональ-
ную головку, образованную несколькими белками
(рис. 5.12). К головке прикреплен хвостовой отрос-
ток, построенный из других белков. Белки головки
и хвостового отростка кодируются геномом фага
А (рис. 5.9) и синтезируются в клетках бактерий,
инфицированных фагом. При литической инфекции
происходит объединение белков головки с обра-
зованием пустых головок (рис. 5.13). Эти головки
взаимодействуют с комплексом, образуемым кон-
катемерной А-ДНК и фаговым белком терминазой,
которая специфически связывается с ДНК вблизи
со.у-сайтов. Затем ДНК упаковывается в головку,
начиная с левого конца молекулы, при этом пол-
норазмерный линейный геном фага А образуется
в результате эндонуклеазного разрезания в cos-
сайтах, катализируемого терминазой. В результате
образуются липкие концы, типичные для зрелой
линейной ДНК фага А. На последнем этапе проис-
ходит прикрепление к головке уже сформированных
хвостовых отростков, и процесс образования фа-
говой частицы завершается.
ДНК фага А дикого типа или рекомбинантная
ДНК упаковывается in vitro, если смешать при
определенных условиях конкатемерную ДНК и
предварительно сформированные пустые головки,
хвостовые отростки и терминазу. Поскольку при
16-243
242
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
д. Фаг М13
Фаг М13 входит в группу нитчатых бактерио-
фагов E.coli. Его геном представлен одноцепочеч-
ной кольцевой молекулой ДНК длиной примерно
6400 нуклеотидов, который упакован в напоминаю-
щий пробирку капсид, построенный по крайней мере
Белки
головки
Сборка
Белки
хвостового
инфицировании фагом А дикого типа все эти белки
быстро расходуются на образование новых частиц
фага А, для получения достаточных количеств
головок, хвостовых отростков и терминазы, не
связанной с ДНК, требуются специальные условия
Для этого выращивают культуры E.coli. инфици-
рованные двумя разными штаммами фага X, каж-
дый из которых содержит мутацию в определенном
гене (рис. 5.14): один из мутантов не способен
синтезировать белок А (один из полипептидов
терминазы), другой - белок Е головки. Обе куль-
туры содержат большое количество других белков
головки и хвостового отростка, но ни в одной из
них не могут образовываться зрелые фаговые
частицы. При смешивании экстрактов клеток, ин-
фицированных указанными штаммами, образуются
интактные пустые головки. Если в такой экстракт
добавить фаговую ДНК (дикого типа или реком-
бинантную), то произойдет ее упаковка и прикреп-
ление к головке хвостового отростка, т.е. все те
события, которые наблюдаются при инфицирова-
нии клеток бактериофагом дикого типа (рис. 5.13).
РИС. 5.13.
Сборка фага А.
5. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН ВЕКТОР
243
Приготовление экстрактов для осуществления упаковки
in vitro ДНК фага X. Используют два штамма E.coli,
каждый из которых лизогенен в отношении определен-
ного мутантного штамма фага X. Один из мутантов не
способен синтезировать белок А, другой-белок Е. Оба
этих белка необходимы для упаковки ДНК фага X. А--
и Е"-экстракты смешивают и добавляют конкатемерную
ДНК фага X, которая связывается с терминазой прежде,
чем происходит разрезание в cos-сайтах, и упаковы-
вается в фаговые головки.
из трех разных кодируемых фагом белков. Фаг М13
способен инфицировать клетки E.coli только в том
случае, если последние имеют тонкие, напоминаю-
щие волоски структуры, называемые F-пилями.
F-пили необходимы для прикрепления фага к клетке
(рис. 5.15). Поскольку гены, ответственные за синтез
F-пилей, кодируются половым фактором F, только
F+-клетки проявляют чувствительность к фагу М13.
Первым событием при репликации фага М13 в
клетках E.coli является превращение одноцепочеч-
ной ДНК в двухцепочечную кольцевую форму (рис.
2.3; разд. 2.1.ж), т.е. синтез цепи, комплементарной
инфицирующей цепи ДНК. Двухцепочечная ДНК
детерминирует синтез примерно 300 своих копий,
использующихся затем в качестве матриц при
образовании одноцепочечных фаговых ДНК, упа-
ковывающихся в фаговые частицы. Параллельно
транскрибируются и транслируются фаговые гены,
а на внутренней мембране клетки концентрируется
основной капсидный белок. Зрелые одноцепочечные
молекулы фаговой ДНК проходят через мембрану,
захватывая при этом капсидный белок, в результате
чего образуется большое количество зрелых фа-
говых частиц. Хотя инфицированные клетки не
погибают, их рост замедляется, и на бактериальном
газоне образуются мутные бляшки. Двухцепочеч-
ную репликативную форму ДНК можно легко
выделить из инфицированных клеток, с тем чтобы
использовать ее затем в качестве вектора, а од-
ноцепочечная ДНК содержится в большом коли-
честве в фаговых частицах в культуральной среде.
Каждая клетка в каждом поколении высвобождает
несколько сотен фаговых частиц. Одноцепочечные
рекомбинантные молекулы являются особенно
удобным объектом при изучении нуклеотидных
последовательностей (гл. 7).
е. Векторы, сконструированные
на основе фага М13
Как и в случае фага X, путем различных мо-
дификаций генома фага М13 дикого типа (рис. 5.16)
были сконструированы разные удобные векторы.
Для получения рекомбинантов использовались
двухцепочечные репликативные формы, о которых
говорилось выше. Одноцепочечные молекулы ДНК
не применяют в качестве векторов, поскольку обыч-
но их нельзя разрезать с помощью эндонуклеаз
рестрикции типа II. Большая часть генома, состоя-
щего примерно из 6400 нуклеотидных остатков,
содержит гены, кодирующие белки оболочки, а
также белки, участвующие в репликации и сборке.
Область начала репликации состоит примерно из
150 нуклеотидов, находящихся внутри некодирую-
щего сегмента длиной 507 нуклеотидов. В этот
сегмент может быть помещена вставка без нару-
шения способности М13 к репликации.
Типичный вектор. Вектор, представленный на
рис. 5.17, сконструирован на основе ДНК фага М13.
Для того чтобы было удобно проводить отбор
is*
244
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
РИС. 5.15.
Жизненный цикл бактериофага М13. Обратите внима-
ние, что инфицированная клетка и ее потомство непре-
рывно высвобождают новые фаговые частицы.
рекомбинантов, фаговый геном дикого типа мо-
дифицировали, встроив в некодирующую область
длиной 507 п.н. часть /ж-оперона E.coli, включаю-
щую оператор, промотор и 5'-кодирующую область
р-галактозидазного гена. В эту короткую область
в свою очередь был встроен сегмент из 42 п.н.,
который содержал несколько сайтов узнавания для
уникальных рестриктирующих эндонуклеаз. Каж-
—. дый из этих сайтов можно было использовать для
включения фрагментов ДНК с соответствующими
липкими концами. Такой сегмент получил название
полилинкера. Его введение не нарушает ни коди-
рующую рамку, ни активность N-концевой части
р-галактозидазы. В отсутствие вставки в полилин-
кере векторный геном детерминирует синтез N-кон-
цевой части р-галактозидазы, которая вместе с
С-концевой частью Р-галактозидазы, продуцируе-
мой специальными штаммами E.coli (71-18 в табл.
5.1), образует активную р-галактозидазу (разд.
5.2.г). Бляшки, образуемые самим вектором при
выращивании на агаре, содержащем Xgal, окраши-
ваются в голубой цвет. Однако после внедрения
вставки в любой из рестрикционных сайтов по-
лилинкера синтез N-концевой части р-галактозида-
зы нарушается и образуются бесцветные бляшки.
Таким образом, среди большого числа бляшек, об-
разуемых вектором без вставки, легко обнаружить
бляшки, содержащие рекомбинантный вирус. Были
получены производные фага М13. содержащие дру-
гие сайты для рестриктирующих эндонуклеаз и
позволяющие использовать другие приемы для
отбора рекомбинантов. В некоторых случаях отбор
со
М13
РИС. 5.16. } 6 )
Карта генома фага М13. Цифрами отмечены разные
гены (гены 2 и 5 ответственны за репликацию, осталь-
ные детерминируют образование капсида и сборку).
Светлый овал-область начала репликации; некодиру-
ющий участок выделен цветом.
5 ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН ВЕКТОР
245
I Сегмент
1 /ас-оперона Е. coli
РИС. 5.17.
Типичный вектор, сконструированный на основе "фага
М13. В некодирующую область фагового генома встро-
ена часть /ас-оперона E.coli. Затем в ген lacZ встроен
сегмент дг^ной 42 п.н., содержащий несколько сайтов
для эндонуклеаз рестрикции (полилинкер, или мульти-
клонирующий сайт).
К гену 2
К гену 4
основывался на резистентности к антибиотикам,
в других использовались гены, способные удовлет-
ворять потребности соответствующих хозяев в
определенных питательных веществах.
Трансфекция. Как и в случае с плазмидными
векторами, обработка клеток СаС12 (разд. 5.1.в)
позволяет осуществлять трансфекцию чувствитель-
ных Р+-клеток рекомбинантными ДНК фага М13.
После идентификации искомой бляшки и очистки
получают клетки, из которых в процессе их роста
и деления непрерывно высвобождаются фаговые
ча»тицы, содержащие рекомбинантную ДНК. Скон-
струированная рекомбинантная ДНК всегда являет-
ся двухцепочечной молекулой, а ДНК фага М13
одноцепочечной.
Одноцепочечные рекомбинантные ДНК. Системы,
в которых в качестве вектора используется фаг М13,
имеют несколько ценных свойств, характерных
также для систем с плазмидными векторами (на-
пример, сохранение жизнеспособности клеток) и
систем, где вектором служит фаг X (рекомбинант-
ные ДНК содержатся внутри фаговых частиц).
Однако они обладают и некоторыми уникальными
особенностями. Одна из них это способность
включать очень большие вставки, поскольку про-
цесс упаковки ДН К не зависит от размера фагового
генома. Вторая особенность связана со способ-
ностью двухцепочечных рекомбинантных ДНК,
сконструированных на основе репликативного ин-
термедиата, превращаться во множество одноце-
почечных молекул ДНК в фаговых частицах. Кроме
того, система позволяет включать каждую из цепей
ДНК встроенного фрагмента в разные рекомби-
нантные клоны. Векторные молекулы фага М13,
точно так же как плазмидные и ^.-векторы, вклю-
чают вставки в любой из двух возможных ориен-
таций (рис. 5.18). При трансфекции эти рекомби-
нанты попадают в разные клетки и образуют от-
дельные бляшки. Однако, поскольку только одна
цепь двухцепочечной репликативной формы М13 ->
используется в качестве матрицы для синтеза одно-
цепочечной фаговой ДНК, лишь одна из двух цепей
репликативного интермедиата будет представлена
во всех фаговых частицах данной бляшки (см. рис.
2.3). Таким образом, клонирование любой вставки
всегда дает начало двум разным видам фага, каж-
дый из которых содержит одну из цепей вставки.
Это свойство очень удобно для проведения деталь-
ного анализа нуклеотидных последовательностей
и для синтеза специфических радиоактивно мечен-
ных ДНК-зондов (гл. 7).
246
ЧАСТЬ II ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Трансфекция и
клонирование
Pv
РИС. 5.19.
Типичная космида. рВР322-сегменты выделены серым
цветом. Вместо фрагмента с 1461-го нуклеотида по
1688 (см.рис. 5.6) встроен участок генома фага X.
а. Космиды
Разные
дуплексные
-----рекомбинантные_____
молекулы в
разных клонах
Одноцепочечные
фаговые геномы
РИС. 5.18.
Векторы, сконструированные на основе М13, позволяют
включать каждую из цепей встроенного фрагмента ДНК
в разные клоны. Та цепь двухцепочечного вектора, ко-
торая идентична фаговому геному, выделена цветом.
(Процесс репликации описан в разд. 2.1.ж.)
5.4. £. СО/./-СИСТЕМЫ:
ПЛАЗМИДНО-ФАГОВЫЕ ВЕКТОРЫ
Поскольку плазмидные и фаговые векторы име-
ют свои преимущества, важные для молекулярного
клонирования, были сконструированы молекулы
ДНК, объединяющие свойства обоих этих векторов.
Космиды-один из типов гибридных векторов,
которые реплицируются, используя плазмидный
тип репликации, и обладают способностью упа-
ковываться in vitro в оболочки частиц фага X.
Типичная космида (рис. 5.19) обладает способ-
ностью к репликации, содержит уникальные эндо-
нуклеазные сайты и селективные маркеры, принад-
лежащие плазмидной ДНК, которая объединена
с сегментом ДНК фага X, содержащим соединенные
липкие концы (с<и-сайт). Космиды конструируют
с помощью методов, применяемых при работе с
рекомбинантными ДНК. При расщеплении конка-
темерной ДНК фага X с помощью соответствующих
эндонуклеаз (рис. 5.10) образуются саг-сегменты,
которые могут быть включены в стандартный
плазмидный вектор. Для того чтобы могло про-
изойти соединение по co.v-сайту, достаточно фраг-
мента ДНК фага А длиной всего лишь 250 п.н.,
включающего последовательности, необходимые
для связывания терминазы и последующего раз-
резания. Важной чертой большинства космидных
векторов для клонирования является их способность
включать вставки ДНК размером до 45 т.п.н.
Если кольцевую космидную ДНК разрезать по
какому-то уникальному сайту, смешать с фрагмен-
тами ДНК, содержащими соответствующие липкие
концы, и провести отжиг, то образуются длинные
конкатемеры (рис. 5.20). При смешивании этих
конкатемеров с белками, осуществляющими упа-
ковку ДНК фага А (разд. 5.3.г), они разрезаются по
со^-сайтам и ДНК упаковывается обычным путем.
5. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН-ВЕКТОР
247
РИС. 5.20.
Инфицирование
Молекулярное клонирование с помощью космидного
вектора (см. рис. 5.13 и 5.14. на которых показан про-
l."c сборки фага X).
Этот процесс позволяет отобрать вставки большой
протяженности, поскольку для того, чтобы ДНК
могла упаковаться в головки фага X, расстояние
между ros-сайтами должно составлять от 38 до 52
т.п.н. Как и в случае с Х-векторами, смесь кон-
катемеров является сложной и часто содержит
векторные фрагменты без всяких вставок или со
множеством повторяющихся вставок.
Реципиентные клетки-хозяева приобретают упа-
кованные космиды в результате инфицирования
«фальшивыми» фаговыми частицами, причем этот
процесс значительно более эффективен, чем транс-
фекция плазмидной ДНК. На 1 мкг ДНК со встав-
ками можно получить от 1•104 до 5•105 колоний
трансформированных клеток. Попав в клетку-хо-
зяина, рекомбинантная ДНК амплифицируется и
сохраняется в виде плазмиды (рис. 5.20).
б. Фазмиды
Космиды по существу являются плазмидными
векторами, «присвоившими» сох-сайт фага X для
осуществления эффективной упаковки in vitro. Ис-
тинными гибридами между плазмидой и фагом
являются фазмиды-линейные дуплексные молеку-
лы ДНК, концы которых представляют собой сег-
менты ДНК фага X, содержащие все гены, необ-
ходимые для литической инфекции, а средняя
часть-линеаризованную плазмиду. Функции реп-
248
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
ликации как фага, так и плазмиды в фазмидах
полностью сохранены. Обычно вектор содержит
несколько тандемных повторов плазмидного сег-
мента, обеспечивающих необходимую для успешной
упаковки ДНК протяженность генома. Один или
несколько повторов в процессе конструирования
рекомбинантных молекул заменяются вставкой
(рис. 5.21). Подобно рекомбинантам фага I и кос-
мид, фазмидные ДНК упаковываются in vitro перед
инфекцией. Попадая в клетку Е. coli, фазмида репли-
цируется как фаговая ДНК, в результате чего на
газоне чувствительных бактерий образуются бляш-
ки. Однако если вектор содержит ген, кодирующий
репрессор фага X, то фазмида реплицируется как
плазмида, а не как фаг. Кроме того, если ген
репрессора кодирует мутантный белок cl, инакти-
вирующийся при повышенной температуре (темпе-
ратурочувствительный репрессор), то фазмида реп-
лицируется, как плазмида при низкой температуре
и как фаг при повышении температуры на несколь-
ко градусов. Такая маневренность может оказаться
I Повышение
w температуры до 42°
РИС. 5.21.
Типичная плазмида. Участки, выделенные только серым
цветом,-ДНК фага X, заштрихованные участки pBR322.
Овалом отмечены области начала репликации. сГ'-ген
термочувствительного репрессора фага X.
Рост при 42°
5. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН-ВЕКТОР
249
5.5. ДРУГИЕ ПРОКАРИОТИЧЕСКИЕ
СИСТЕМЫ ХОЗЯИН-ВЕКТОР
Системы с другими хозяином и вектором едва ли
когда-нибудь смогут конкурировать с Е. соН-снсте-
мами в том, что касается выделения и очистки
сегментов ДНК. Тем не менее возможность эффек-
тивного клонирования в других видах бактерий
очень важна для изучения генетических свойств
и экспрессии генов у организмов, представляющих
научный, медицинский или промышленный интерес.
Поэтому, несмотря на малое число хорошо оха-
рактеризованных плазмид и бактериофагов и экс-
периментальные трудности при введении молекул
ДНК в некоторые клетки, были разработаны по-
лезные системы, способные служить векторами.
Если отсутствовали подходящие для данного вида
природные плазмиды или фаги, то иногда исполь-
зовали плазмиды и фаги, полученные от других
бактерий. Многие плазмиды и бактериофаги весьма
требовательны и реплицируются только в одном
или нескольких родственных видах клеток, но
некоторые из них на удивление неприхотливы и реп-
родуцируются в широком круге хозяев, принадле-
жащих к разным видам.
а. Грам отрицательные организмы
R-плазмида, изображенная на рис. 5.1, представ-
ляет собой пример плазмиды, способной размно-
жаться во многих грамотрицательных бактериях.
На основе производных таких плазмид можно скон-
струировать рекомбинантные ДНК, клонировать
и амплифицировать их в клетках E.coli, а затем при
необходимости перенести в другие бактерии.
Одна из таких систем клонирования была раз-
работана на основе Hemophilus influenzae и встре-
чающейся в природе неконъюгативной плазмиды
Hemophilus. Плазмида имеет протяженность около
6 т.п.н., содержит ген резистентности к ампицил-
лину и образует множество копий в клетках хо-
зяина. Поскольку Н. influenzae природно компетент-
на в отношении трансформации, никаких специаль-
ных ухищрений при трансфекции не требуется.
Полезные векторы получены также для азотфикси-
рующих бактерий Klebsiella pneumoniae. Они скон-
струированы на основе мелкого бактериофага Р4,
который способен размножаться как в клетках
E.coli, так и в К.pneumoniae и в зависимости от
условий реплицироваться или как фаг, или как
плазмида.
б. Грам положительные организмы
Bacillus subrilis. Векторы, с помощью которых
можно производить генетические манипуляции с
Bacillus subtilis, имеют особенно большое значение,
поскольку этот организм широко используется
в различных процессах ферментации, в частности
при промышленном получении антибиотиков и
ферментов. Кроме того, В. subtilis секретирует син-
тезируемые белки в среду, поэтому его можно ис-
пользовать для выделения продуктов генов, коди-
руемых рекомбинантными векторами. Были выде-
лены бактериофаги и плазмиды, несущие удобные
селективные маркеры, например гены резистентнос-
ти к антибиотикам, и на их основе сконструированы
векторы. Одна из используемых плазмид получена
из другого грам положительно го организма, Staphi-
lococcus aureus. Ее отличает то, что она способна
реплицироваться и сохраняться в клетках как Ba-
cillus subtilis, так и других видов Bacillus (рис. 5.22).
Вектор, созданный на ее основе, имеет размер около
5 т.п.н. и содержит два селективных маркера. Один
из них придает клеткам резистентность к канами-
цину, другой ген В. subtilis необходим для биосин-
теза триптофана. При репликации векторной ДНК
в клетках В. subtilis образуется до 50 ее копий на
клетку. В составе вектора имеется несколько сайтов
для разных эндонуклеаз рестрикции, которые ис-
пользуют для получения рекомбинантов. Встраива-
ние фрагмента ДНК в единственный имеющийся
Bg/11-сайт приводит к инактивации гена резистент-
ности к канамицину, а в уникальный сайт Hind III к
инактивации триптофанового гена, в результате
чего проявляется второй фенотипический маркер
хозяйских клеток, которые сами утратили соот-
ветствующий активный ген. Как и в случае систем
Е. coli, плазмидные векторы с двумя маркерами
позволяют легко идентифицировать и выделять
рекомбинантные молекулы.
В отличие от E.coli виды Bacillus трансформи-
руются даже без применения специальных мето-
дических приемов. Однако эффективность трансфек-
ции заметно увеличивается, если вместо интактных
клеток используют протопласты, которые получают
в результате обработки клеток лизоцимом; при
этом последние утрачивают клеточную стенку.
После инкубации протопластов с трансформирую-
щей ДНК в специальной питательной среде кле-
точная стенка регенерируется. Эффективность
трансфекции варьирует от 100 до 106 трансфор-
мантов на 1 мкг векторной ДНК в зависимости от
системы хозяин вектор и метода трансфекции.
Streptomyces. Представители грамположитель-
ных организмов рода Streptomyces кодируют боль-
шинство известных применяемых в медицине ан-
тибиотиков. Поэтому получение удобных систем
хозяин вектор для Streptomyces очень важно как для
изучения биосинтеза антибиотиков, так и для созда-
ния новых антибиотиков и повышения эффектив-
ности продуцентов. Наиболее разработанные в на-
250
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Разрезание с помощью Bgl 11 Разрезание с помощью Hind 111
Канамицинчувствитепьный
trpC+
Канамицинрезистентный
trpC~
среду происходит регенерация нормальных клеток.
На 1 мкг плазмидной ДНК можно получить около
105 трансформантов.
РИС. 5.22.
Система «хозяин вектор» для Bacillus.
стоящее время векторные системы-это плазмиды,
среди которых имеются как плазмиды с низким
числом копий на клетку, так и плазмиды с высоким
числом копий. При трансфекции и отборе необхо-
димых рекомбинантов используют особые свойства
стрептомицетов. Некоторые из плазмидных векто-
ров Streptomyces являются конъюгативными и могут
передаваться от одного вида к другому при конъю-
гации.
Одним из типичных векторов является плазмида,
представленная на рис. 5.23. Сегмент длиной при-
мерно 11 т.п.н. получен от плазмиды, выделенной из
S. lividans. Другая часть плазмиды содержит ген
устойчивости к антибиотику метиленомицину А,
полученный из хромосомы штамма S. coelicolor.
Второй селективный маркер связан со способностью
клеток, содержащих плазмиду, подавлять рост со-
седних клеток Streptomyces, утративших плазмиду.
При посеве трансформированных клеток на газоне
бесплазмидных клеток трансформанты выделяют из
центра областей с подавленным ростом. Эта и по-
добные ей векторные молекулы можно трансфици-
ровать в протопласты нескольких видов Strepto-
myces. После переноса протопластов в стандартную
в. Челночные векторы
Плазмиды и бактериофаги эволюционируют
синхронно с их природными хозяевами, поэтому
ДНК составляет плазмида, выделенная из S. lividans:
сюда входит область, ответственная за подавление рос-
та соседних клеток Streptomyces. утративших плазмиду.
Остальная часть векторной ДНК получена из S. coelicolor
и содержит ген резистентности к метиленомицину А.
5. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН - ВЕКТОР
251
они реплицируются обычно только в клетках одного
вида бактерий или небольшой группы видов. Векто-
ры, способные реплицироваться в разных хозяевах,
имеют определенные преимущества. Например, кло-
нирование и выделение сегментов ДНК для струк-
турного анализа наиболее удобно проводить, ис-
пользуя системы, где в качестве хозяина выступает
E.coli. Однако, как правило, функциональный ана-
лиз клонированной вставки следует проводить в
клетках того вида, откуда получена вставка. Нуж-
ный сегмент ДНК всегда можно клонировать в клет-
ках Е. coli, выделить его и затем переклонировать в
векторе, совместимом с интересующими нас клет-
ками-хозяевами. Однако значительно проще сразу
провести клонирование с использованием вектора,
который способен без дополнительных манипуля-
ций существовать как в E.coli, так и альтерна-
тивном хозяине и реплицироваться в них. Для таких
целей предназначены челночные векторы, которые
содержат две области ori, соответствующие каж-
дому из двух видов хозяев, а также гены, необ-
ходимые для репликации и не поставляемые хо-
зяйскими клетками. Такие векторы конструируют
с помощью методов, применяемых при получении
рекомбинантных ДНК, и число их уже довольно
велико. Одни из них способны существовать по-
переменно в клетках двух разных видов прокариот,
другие-в двух прокариотических (обычно в E.coli)
и эукариотических клетках (в том числе дрожжевых,
растительных и животных). Большинство эукарио-
тических векторов, описанных в последующих раз-
делах, являются челночными.
Конструирование челночного вектора связано
с решением специфических проблем, поскольку одна
его часть всегда является «чужой», а другая-«род-
ной» в альтернативных хозяйских клетках. «Чужая»
часть не должна мешать репликации, направляемой
«родной» частью вектора. Не следует конструиро-
вать векторы с таким сочетанием последователь-
ностей, при котором он становится нестабильным
в одном из двух хозяев, как это происходит при
наличии последовательностей, мешающих реплика-
Отжиг
Лигирование
РИС. 5.24.
Конструирование челночного вектора путем
ния вектора для Streptomyces (рис. 5.23) и
E.coli. Ген резистентности к тетрациклину
Е coli в челночном векторе инактивирован.
объедине-
плазмиды
плазмиды
252
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
ции или транскрипции в альтернативных хозяевах.
На эффективность челночного вектора может влиять
и присутствие активной системы рестрикции моди-
фикации в одной или другой (или в обоих) из
альтернативных хозяйских клеток. Эту проблему
можно решить, используя мутантные клетки, утра-
тившие активную эндонуклеазу рестрикции.
Один из челночных векторов, способных репли-
цироваться в клетках Streptomyces и E.coli. пред-
ставлен на рис. 5.24. От плазмиды Streptomyces (рис.
5.23) вектор получил сигнальные последователь-
ности, необходимые для репликации в клетках
Streptomyces. и гены резистентности к метилено-
мицину А, а от плазмиды E.coli гены, ответствен-
ные за репликацию, и маркер резистентности к ан-
тибиотику для сохранения в клетках E.coli. С по-
мощью такой плазмиды можно клонировать сег-
мент ДНК Streptomyces в E.coli. а затем, размножив
его, проводить функциональное тестирование в
штаммах Streptomyces.
5.6. ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ
ХОЗЯИН - ВЕКТОР: ДРОЖЖИ
а. Универсальность и удобство
Лабораторные штаммы обычных пекарских
дрожжей, Saccharomyces cerevisiae. являются удоб-
ными хозяевами для проведения экспериментов
с рекомбинантными ДНК. Хотя дрожжи способны
к половому размножению (см. гл. 10), обычно они
размножаются путем почкования. В суспензии
дрожжи растут в виде отдельных клеток, а на
твердом субстрате образуют колонии подобно
Е. coli. В обычной питательной среде время удвоения
клеток составляет 1,5-2,5 ч. Следовательно, отно-
сительно быстро и без особых затрат можно полу-
чить большое количество этих непатогенных орга-
низмов.
Гаплоидный геном Saccharomyces cerevisiae со-
держит 1,4 107 п.н., что примерно в три раза
больше, чем геном E.coli. Все эти пары оснований
распределены по 17 (гаплоидным) хромосомам.
Создана большая коллекция мутантов, дефектных
в отношении метаболизма, биосинтеза или клеточ-
ного цикла, и картированы мутации, ответственные
за эти дефекты. Вирусы, которые инфицировали бы
клетки дрожжей, не обнаружены, но на основе
единственной известной дрожжевой плазмиды скон-
струировано несколько векторов, используемых в
настоящее время для введения рекомбинантных мо-
лекул ДНК в дрожжевые клетки. Имеются также
векторы, которые содержат сегменты дрожжевого
генома, обеспечивающие независимую репликацию
векторной ДНК, а при наличии клонированной
центромерной ДНК векторная ДНК даже ведет себя
подобно хромосомам при мейозе и митозе. Кроме
того, клонированные фрагменты ДНК способны
рекомбинировать с гомологичными сегментами
дрожжевого генома, что приводит к стабильной
сайт-специфической трансформации клеточного ге-
нома независимо от сохранения вектора. Эти ме-
тоды вместе с классическими методами генетики
дрожжей позволяют изучить данный эукариотиче-
ский организм с такой же полнотой, какая ранее
была доступна только для прокариот типа E.coli.
Жесткая полисахаридная клеточная стенка, ок-
ружающая мембраны дрожжевых клеток, создает
барьер для молекул ДНК. Для того чтобы изоли-
рованная ДНК могла проникнуть в дрожжевую
клетку, эту стенку необходимо удалить, но так,
чтобы клетка осталась жизнеспособной. Для этого
используют ферменты, разрушающие полисахари-
ды. После обработки клеток соответствующими
ферментами образуются сферопласты, способные
поглощать ДНК после обработки их СаС12. Если
затем эти сферопласты перенести в специальную
питательную среду, то клеточная стенка восстано-
вится. Проницаемые для ДНК клетки можно также
получить, обработав их ацетатом лития. С по-
мощью некоторых векторов получают около 104
трансформированных клеток S. cerevisiae на 1 мкг
ДНК.
б. Векторы,
способные реплицироваться
в клетках дрожжей
Плазмидные векторы. Некоторые штаммы S. ce-
revisiae содержат кольцевую двухцепочечную плаз-
миду длиной 6318 п.н. Эта так называемая 2 мкм-
плазмидная ДНК содержит область ori репликации
ДНК, другую цис-действующую область (REP3)
и два гена (REP) и REP1). которые вместе обеспе-
чивают стабильное сохранение большого числа
копий плазмиды около 50 на дрожжевую клетку.
Примерно 50% 2 мкм-плазмидной ДНК необхо-
димы для ее репликации и сохранения в клетках,
остальные 50% несущественны. 2 мкм-ДНК не
содержит маркерных генов, которые позволяли бы
отбирать дрожжевые клетки, несущие плазмиду.
Поэтому ни сама плазмида, ни ее существенная
часть не могут служить удобными векторами для
дрожжевых клеток. Однако существенная часть
2 мкм-плазмиды была использована для конструи-
рования челночного вектора путем объединения ее
с плазмидой pBR322, которая содержала дрожжевой
ген (HIS3), кодирующий один из ферментов биосин-
теза гистидина (рис. 5.25). Используя такой вектор
в сочетании с дрожжевым штаммом his3~ в ка-
честве хозяина, можно проводить отбор клеток,
растущих в отсутствие гистидина. Оказалось, что
5. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН-ВЕКТОР
253
ин-
ую
зк,
го
и-
1И
ie
и
РИС. 5.25.
Схематическое изображение челночного вектора для
системы дрожжи-Е coli, сконструированного на основе
дрожжевой 2мкм-плазмиды (выделена цветом). Часть
вектора, произошедшая от Е. со/7, представляет собой
плазмиду pBR322. Области начала репликации обозна-
чены светлым овалом; область HIS3, полученная из
ДНК хромосом дрожжевых клеток, выделена точками.
о
I- дрожжевой ген HI S3 функционален также в клетках
е Его// благодаря тому, что он содержит область,
гомологичную промотору E.coli. Таким образом,
1 дрожжевой ген HIS3 может служить селективным
маркером в бактериальных клетках, утративших
аналогичный ген. Вектор содержит несколько уни-
кальных рестриктазных сайтов, по которым можно
встраивать определенные сегменты ДНК.
Векторы ARS. Дрожжевые векторы второго типа
представляют собой кольцевую двухцепочечную
ДНК, которая содержит область ori репликации
дрожжевого генома. Обычно такие векторы являют-
ся челночными. Рассмотрим вектор, изображенный
на рис. 5.25. Если 2 мкм-сегмент удалить, то ос-
тавшаяся часть будет представлять собой плазмиду
pBR322, у которой в области, ответственной за
резистентность к тетрациклину, содержится вставка
в виде сегмента HI S3 дрожжевого генома. Эта
структура не способна к автономной репликации
в дрожжевых клетках, хотя и может реплициро-
ваться в клетках E.coli. Однако при клонировании
в pBR322 некоторых других генов дрожжевой хро-
мосомы (не HI S3) образующиеся рекомбинантные
молекулы могут реплицироваться автономно в
клетках как E.coli, так и дрожжей! Среди генов,
обеспечивающих способность к репликации, были
TRPI и ARG4, которые кодируют ферменты, необ-
ходимые для биосинтеза триптофана и аргинина
соответственно. Оказалось, что область ori хромо-
сомы расположена достаточно близко от каждого
из этих генов, чтобы включиться в клонируемые
дрожжевые сегменты (рис. 5.26). Размер областей
начала репликации ori не превышает 100 п.н. Такие
области получили название автономно реплицирую-
щихся последовательностей (или ARS). Все Л/?5-пос-
ледовательности содержат одинаковый олигонук-
леотид 5'-уТТТАТдТТТу-3', необходимый для функ-
ционирования. Этот олигонуклеотид длиной 11 п.н.
окружен другими важными в функциональном от-
ношении последователностями, но они варьиру-
ют от одного /1 ES-элемента к другому. Любая
РИС. 5.26.
Плазмидный вектор для дрожжей, содер-
жащий область начала репликации хромо-
сомного происхождения. При выращивании
frp+-трансформированных клеток в при-
сутствии триптофана плазмида утрачивает-
ся.
254
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
S
РИС. 5.27.
Мини-хромосомный челночный вектор для дрожжей.
Сегменты, произошедшие из генома дрожжевых клеток,
выделены цветом, рВИ322-сегменты-серые.
кольцевая двухцепочечная ДНК, которая содержит
ЛЛХ-послсдоватслыюсть, может служить дрожже-
вым вектором и использоваться для непосредст-
венного клонирования в дрожжевых клетках. Такие
молекулы способны стабильно существовать в
клетках S.cerevisiae до тех пор, пока они являются
единственным носителем какого-то необходимого
гена (например, гена TRP\ в клетках trp\~, вы-
ращиваемых в отсутствие триптофана), однако при
снятии селективного давления они быстро утра-
чиваются.
Мини-хромосомные векторы. Дрожжевые векто-
ры третьего типа ведут себя аналогично функцио-
нальной хромосоме, хотя и имеют меньшие раз-
меры. Такие мини-хромосомные векторы реплици-
руются только один раз в каждом поколении кле-
ток, и две образующиеся копии сегрегируют, как
истинные хромосомы, распределяясь по дочерним
клеткам во время мейоза и митоза. Необходимыми
элементами функциональной мини-хромосомы яв-
ляются три небольших сегмента хромосомной ДНК
дрожжей (рис. 5.27). Один из них, ARS, содержит
область ori репликации ДНК, второй создает усло-
вия для отбора. На рис. 5.27 представлена плазмида,
содержащая ген LEU 2, которую можно применять
в сочетании с хозяйскими клетками /ем2~. Третий
сегмент, CEN, регулирует число копий внутри кле-
ток и отвечает за способность к сегрегации в течение
многих поколений. Сегменты ДНК, которые при-
дают мини-хромосоме такое замечательное свойст-
во,-это центромеры, и происходят они из центро-
мерных областей дрожжевых хромосом (отсюда
обозначение CEN). Их размеры не должны пре-
вышать 500 п.н. Связь между структурой и функ-
цией сегментов CEN описана в гл. 9; там же рас-
смотрены и молекулярные свойства дрожжевых
теломер. В гл. 9 описано также, как с помощью
клонирования этих двух важных хромосомных до-
менов удалось реконструировать функциональные
дрожжевые хромосомы с использованием линей-
ных, а не кольцевых ДНК (последние применялись
прежде при конструировании дрожжевых векторов).
в. Стабильная трансформация
при рекомбинации с дрожжевым
геномом
Эта глава посвящена системам, с помощью
которых рекомбинантные векторные молекулы мо-
гут назависимо реплицироваться в соответствую-
щих клетках. Однако большое значение имеет также
способность рекомбинантных молекул осуществ-
лять стабильную трансформацию клеточных ге-
номов путем встраивания их в хромосомную ДНК.
В этом случае новые генотип и фенотип очень
стабильны, не зависят от давления отбора или
сохранения внехромосомной рекомбинантной ДНК
в будущих поколениях. Встроенная ДНК репли-
цируется одновременно с клеточным геномом. Та-
кая стабильная трансформация происходит отно-
сительно редко и зависит от природы как донорной
ДНК, так и реципиентных клеток.
Стабильная трансформация рекомбинантными
плазмидами. Дрожжевые клетки можно стабильно
трансформировать, хотя и с низкой частотой,
с помощью рекомбинантных плазмид, которые
не способны реплицироваться в дрожжах из-за от-
сутствия ori репликации. 1 мкг производной плаз-
миды pBR322, несущей дрожжевой ген LEU 2, мо-
жет трансформировать примерно 1 из 107 дрож-
жевых клеток 1еи2~ в LEU2+. Если рекомбинант-
ный вектор содержит, кроме того, элемент ARS
и может реплицироваться автономно, то стабильная
трансформация происходит с еще большей эффек-
тивностью. Чем выше число копий трансформи-
рующей ДНК, образующихся в клетке, тем больше
вероятность их встраивания в дрожжевой геном.
Встраивание происходит в результате рекомби-
нации между донорной рекомбинантной молекулой
и реципиентным дрожжевым геномом. Рекомбина-
ция может быть неспецифической, когда донорная
ДНК встраивается в случайные хромосомные локу-
сы, однако такие события довольно редки. Чаще
встраивание происходит в специфическом хромо-
сомном локусе, гомологичном последовательнос-
тям дрожжевой ДНК, включенной в рекомбинант-
ную донорную молекулу. Например, плазмида,
несущая дрожжевой ген TRPI дикого типа и репли-
цирующаяся в дрожжевых клетках trpl~, как пра-
вило, рекомбинирует с гомологичным мутантным
локусом trpl в дрожжевом геноме. В результате
происходит стабильная трансформация клетки к не-
зависимому от триптофана состоянию. Встречаются
два разных типа гомологичной (и соответственно
5. ИНСТРУМЕНТАРИЙ СИСТЕМЫ ХОЗЯИН-ВЕКТОР
255
о-
о-
ке
в-
ь
и
Хромосомная
ДНК дрожжей
Кроссинговер
Хромосомная ДНК в
клетках, отобранных
ло признаку стабильной
трансформации к
состоянию TRP +
trpi
Продукт 1
РИС. 5.28.
Реципрокная гомологичная рекомбинация между реп-
лицирующимся плазмидным вектором и хромосомой
дрожжей приводит к стабильной трансформации дрож-
жевых клеток. В приведенном примере вектор несет ген
ТПРУ дикого типа (а также гены, необходимые для
репликации). Гомологичная рекомбинация в мутантном
локусе &р1 дрожжевой хромосомы ведет к появлению
в хромосомной ДНК двух копий триптофанового гена,
функционирующей и нефункционирующей. Образующие-
TRP\ +
Продукт 2
ся клетки стабильно сохраняют фенотип TRP“\ 4 даже
в отсутствие давления отбора (т. е. в присутствии трип-
тофана). В последующих поколениях в результате го-
мологичной рекомбинации между двумя копиями (зто
довольно редкое событие) может произойти делеция
векторных последовательностей вместе с одной из ко-
пий /гр-гена, и тогда образуются либо TRR] 4-, либо
trp1 “-клетки.
сайт-специфической) рекомбинации. При кроссинго-
вере между кольцевыми донорной и реципиентной
молекулами происходит встраивание всего вектора
в соответствующий хромосомный локус (рис. 5.28).
Гомологичная рекомбинация между двумя копиями
/гр-гена может привести в последующих поколениях
к восстановлению нормальной структуры ДНК и
появлению клеток либо дикого, либо мутантного
типа. При рекомбинации другого типа происходит
конверсия гена-нереципрокная рекомбинация, при
которой ген дикого типа в векторе используется для
репарации мутантного сегмента в геноме (разд.
2.4.6).
Сайт-специфическая трансформация с помощью
линейных донорных молекул. Кольцевые плазмиды,
не способные реплицироваться в дрожжевых клет-
ках, являются очень неэффективными донорами для
сайт-специфической трансформации. Однако транс-
формирующую активность таких молекул можно
значительно повысить, если перед трансфекцией ли-
неаризовать их и если эти линейные двухцепочечные
молекулы будут содержать на обоих концах после-
довательности, гомологичные последовательностям
генома мишени (рис. 5.29). Линейную трансформи-
рующую ДНК обычно получают путем эндонукле-
азного расщепления рекомбинантной плазмиды,
полученной после репликации в Е. coli. Между двумя
гомологичными концами может находиться по су-
ществу любая последовательность. Так, в известный
геномный локус можно ввести специфические гены
или нужные гены можно изменить или делетировать.
Таким образом, в настоящее время генетику дрож-
жей можно изучать независимо от того, удается или
нет получить и отобрать специфических мутантов.
256
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Трансфекция дрожжевых
клеток his3~
РИС. 5.29.
Сайт-специфическая трансформация
геномного локуса дрожжей с по-
мощью линейного фрагмента ДНК.
Сегмент дрожжевой геномной ДНК,
происходящий из того участка, ко-
торый хотят трансформировать, кло-
нируют в плазмидном векторе Е. coli.
Затем этот сегмент модифицируют
с помощью инсерции, делеции или
какой-либо мутации и клонируют и
амплифицируют в клетках Е. coli. В
данном случае делетирован ген X и
вместо него встроен селективный
маркер HIS3. Плазмиду разрезают
с помощью рестриктирующей эндо-
нуклеазы в сайтах В и получают
фрагмент дрожжевой ДНК в линей-
ной форме, содержащий участки, го-
мологичные последовательностям ге-
нома-мишени. Трансфицируют дрож-
жевые клетки his3~ и отбирают ко-
лонии HIS3*, утратившие ген X.
Трансформированы могут быть как
гаплоидные, так и диплоидные клет-
ки. В диплоидных клетках встраива-
ние происходит только в одну из двух
гомологичных хромосом, которые
сегрегируют при образовании га-
плоидных спор.
5.7. ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ
ХОЗЯИН-ВЕКТОР: ЖИВОТНЫЕ
а. Трансформация клеток животных
Нестабильная и стабильная трансформация.
Клонирование сегментов ДНК из клеток животных
чаще всего проводят в клетках E.coli, и рекомби-
нантные ДНК, выделенные из этих бактерий, ис-
пользуют для структурного анализа. Однако для
проведения функциональных исследований необхо-
димо трансформировать клетки животных. Как
и в случае дрожжевых клеток, возможна трансфор-
мация нескольких типов. Клетки животных можно
трансформировать путем инфекции или трансфек-
ции с помощью вектора, реплицирующегося неза-
висимо как внехромосомный элемент. Некоторые из
этих векторов представляют собой вирусные ге-
номы, и в результате образуются вирионы с ре-
комбинантными ДНК. В других случаях векторы
ближе по своим свойствам к плазмидам. Часто
такие векторы обладают свойствами челночных
векторов, использующих E.coli в качестве альтер-
нативного хозяина. В отличие от дрожжевых и бак-
териальных клеток в клетках животных реплици-
рующиеся внехромосомные плазмидоподобные век-
торы часто оказываются нестабильными при раз-
множении клеток после трансфекции, причем эта
5 ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН-ВЕКТОР
257
нестабильность проявляется даже в случае приме-
нения селективного давления. Популяции таких
трансформированных клеток часто могут сохра-
няться только временно (в течение нескольких дней),
но этого достаточно для изучения экспрессии генов
в векторной ДНК. На самом деле временную экс-
прессию можно зарегистрировать даже в тех слу-
|чаях, когда вектор не способен реплицироваться
в клетках животных. Тем не менее предпочтительнее
использовать реплицирующиеся векторы, поскольку
они содержатся в клетке в относительно большом
числе копий, что в свою очередь приводит к
увеличению количества генных продуктов и облег-
чает изучение экспрессии.
Некоторые векторы животных все-таки сущест-
вуют в клетках животных в виде стабильно репли-
цирующихся внехромосомных ДНК. К ним отно-
сятся векторы, полученные на основе вируса па-
пилломы крупного рогатого скота (разд. 5.7.в),
и другие векторы, содержащие область ori репли-
кации одного из герпесвирусов - вируса Эпштейна-
Барр. В большинстве случаев стабильная трансфор-
мация связана с рекомбинационным внедрением
трансформирующей ДНК в геном клетки. Как реп-
лицирующиеся векторы, так и нереплицирующаяся
ДНК способны вызывать инсерционную трансфор-
мацию. Интеграция в этих случаях осуществляется
с помощью негомологичной рекомбинации в слу-
чайные участки генома. Именно этим данная си-
туация отличается от ситуации в дрожжевых клет-
ках, где трансформация чаще всего происходит за
счет гомологичной рекомбинации между донорной
ДНК и сайтом-мишенью дрожжевого генома.
Клетки-хозяева. Для трансформации с помощью
рекомбинантных ДНК и для изучения экспрессии
генов чаще всего используют животные клетки,
выращенные в культуре клеток (или, менее строго,
культуре тканей). Подходящую среду для эффек-
тивной экспрессии многих клонированных генов,
в том числе и генов млекопитающих, обеспечивают
также ооциты Xenopus (гл. 7). В последние годы
были разработаны методы введения клонированных
последовательностей ДНК в эмбрионы животных
на ранних стадиях развития и даже в зиготы
млекопитающих. ДНК способна встраиваться в
геном таких эмбриональных клеток, вызывая их
стабильную трансформацию. Получено жизнеспо-
собное потомство, причем в тех случаях, когда
в геноме первичных половых клеток введенная
ДНК стабильно сохраняется, новые генотип и
фенотип наследуются в последующих поколениях
по законам Менделя. В случае плацентарных мле-
копитающих развитие нового потомства зависит от
эффективности имплантации трансформированных
ранних эмбрионов в матку матери. Системы для
такой модификации первичных половых клеток от
животных (трансгенные животные) описаны во вве-
дении к ч. IV. Здесь мы рассмотрим случаи ис-
пользования клеток животных, выращенных в куль-
туре.
Многие типы клеток животных растут и делятся
в подходящих питательных средах. При этом неко-
торые из них прочно прикрепляются к твердым
поверхностям, например к дну пластиковой чашки,
и продолжают делиться до тех пор, пока поверх-
ность чашки целиком не покроется одиночным
слоем клеток (монослоем). Другие типы клеток не
прекращают деление после вступления в контакт
с соседними клетками и образуют на чашке мно-
жество слоев; часто этими свойствами отличаются
клетки ракового происхождения. Некоторые клетки
животных не прикрепляются к поверхности и растут
в суспензии подобно клеткам бактерий и дрожжей.
Первичные клеточные культуры, полученные из
свежих тканей, обычно имеют ограниченное время
жизни. Они делятся всего несколько раз, а затем
рост их прекращается. Однако из таких культур
можно получить перевиваемые клеточные линии,
клетки которых по существу бессмертны. Такие
линии широко используются в экспериментах с ре-
комбинантными ДНК. Они были получены из кле-
ток различных организмов и органов, например из
эмбрионов грызунов, почек обезьян, из Drosophila
и раковых опухолей грызунов и человека.
При определенных условиях изолированные
клетки животных растут и делятся, образуя диск-
ретные колонии или клоны, подобно клеткам бак-
терий и дрожжей. Получить идеальный клон, ве-
дущий начало от одной клетки, т.е. достичь по-
пуляционного единообразия в таких культурах,
удается далеко не всегда. Часто линии клеток
одинакового происхождения, размножавшиеся в
разных лабораториях, проявляют неодинаковые
свойства. Объясняется это скорее всего тем, что
даже при весьма незначительном изменении условий
роста может начаться быстрое размножение клеток,
которые приобрели какую-либо благоприятную
мутацию. Получены линии клеток, несущих спе-
цифические мутации, которые позволяют провести
отбор колоний трансформированных клеток с но-
вым генетическим маркером.
Введение ДНК в клетки животных. В качестве
векторов часто используют геномы вирусов живот-
ных. Соответствующие рекомбинантные молекулы,
содержащие вставку чужеродной ДНК, обычно
упаковываются в вирионы и проникают в клетки
хозяина путем инфицирования. В отличие от фага
X упаковку ДНК вирусов животных in vitro осущест-
вить пока не удается и она всегда происходит in
vivo. Введение рекомбинантных геномов в клетки
животных путем инфицирования представляет со-
бой наиболее эффективный способ (по существу
17 243
258
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
инфицированной оказывается каждая клетка), од-
нако особенности структуры некоторых рекомби-
нантных молекул препятствуют их упаковке. В та-
ких случаях «голые» молекулы рекомбинантных
ДНК могут быть введены в клетки путем трансфек-
ции. Трансфекция оказывается необходимой и в том
случае, когда используемые фрагменты ДНК не
способны реплицироваться (они напоминают фраг-
менты, которые применяются для получения ста-
бильной инсерционной трансформации). Для введе-
ния голых молекул ДНК в клетки животных и их
ядра аналогично тому, как это делается в случае
клеток прокариот и дрожжей, требуются специаль-
ные методические приемы. При необходимости мож-
но осуществить прямую инъекцию ДНК в клетки и
ядра, однако при этом удается трансфицировать
лишь относительно небольшое число клеток. Эту
проблему можно решить, проинкубировав клетки
с частицами, образовавшимися при совместном
осаждении трансфицирующей ДНК и фосфата каль-
ция. Механизм попадания таких частиц в клетки
мало изучен, но интактная ДНК достигает ядра.
Обычно таким способом удается трансфицировать
не более 10% клеток, а для определенных типов
клеток этот метод вообще не работает. В клетки
многих типов ДНК можно ввести, если подвергнуть
смесь клеток и ДНК действию высоковольтного
электрического разряда (2-4 тыс. вольт). В основе
этого метода, получившего название электропора-
ции, по-видимому, лежит образование в мембранах
клеток репарируемых отверстий, через которые
и проникает ДНК.
Фенотипический отбор трансформированных кле-
ток. Обычно после введения чужеродных последо-
вательностей ДНК стабильно трансформируется
менее 0,01% трансфицированных клеток животных.
Выявление столь редких трансформантов среди
миллионов неизмененных клеток и их выделение
возможны лишь при наличии высокоэффективных
методов отбора. В отличие от ситуации с Е. coli для
отбора животных клеток разработано всего не-
сколько методов. Широко используются два ос-
новных подхода: в одном из них применяют му-
тантные реципиентные клетки, в другом нормаль-
ные. Как и в случае бактерий, при наличии у реци-
пиентных клеток мутации в гене, дикий тип кото-
рого находится в составе клонированной трансфор-
мирующей ДНК, трансформанты можно отобрать,
если выращивать клетки в условиях, позволяющих
различать мутантный и дикий фенотипы. Например,
клетки ТК-1 грызунов содержат мутацию, в ре-
зультате которой выводится из строя тимидинки-
наза (фермент, превращающий тимидин в тими-
дин-5'-монофосфат). Такие клетки не способны рас-
ти в присутствии тимидина, если путь биосинтеза
dTMP de novo блокирован аминоптерином, подав-
ляющим регенерацию тетрагидрофолата (рис. 5.30).
Однако клетки, которые трансформированы с по-
мощью ДНК, содержащей функциональный ген
тимидинкиназы, способны расти и образовывать
колонии в присутствии тимидина и аминоптерина
(рис. 5.31). При таких условиях колонии могут
образовываться даже в тех случаях, когда частота
трансформации составляет менее 1- 10 б, т.е. это
крайне чувствительный способ определения и вы-
деления редких трансформантов ТК +. Ген тими-
динкиназы, выделенный из ДНК вируса герпеса
с помощью молекулярного клонирования, широко
используется при этом способе отбора в сочетании
с клетками ТК ~ грызунов. Подобный подход может
найти применение и при других типах мутаций.
К сожалению, из-за ограниченности числа линий
мутантных клеток этот метод не удается широко
использовать. Чтобы преодолеть эту трудность,
часто прибегают к трансфицированию клеток ТК~
векторной ДНК, содержащей наряду с геном ти-
мидинкиназы неселективный интересующий нас ген.
Трансфицированные клетки, отобранные по фено-
типу ТК+, почти всегда содержат ту часть вектор-
ной молекулы, которая несет интересующий иссле-
дователя ген. Фактически такая котрансформация
не зависит от того, связаны ковалентно или не
РИС. 5.30.
de novo
Реутилизация
Синтез dTMP de novo и путем реутилизации Синтез de клетки становятся зависимыми от тимидина и тимидин-
novo блокируется аминоптерином, в результате чего киназы.
5 ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН-ВЕКТОР
259
Рост (de novo +
+ реутилизация)
Рост
(реутилизация)
РИС. 5.31.
Фенотипы ТК+- и ТК“-клеток при росте на различных
средах. Среда HAT содержит гипоксантин, аминоптерин
и тимидин. Гипоксантин добавляют для того, чтобы
обойти блок в пути синтеза пурина de novo, для которо-
го требуется также тетрагидрофолат.
связаны ген тимидинкиназы и упомянутый несе-
лективный ген. Котрансформанты постоянно обра-
зуются при трансфицировании клеток смесью ли-
нейных фрагментов ДНК, содержащих два этих гена
в разных молекулах. Более 50% клеток, отобранных
как ТК +, содержат также и второй ген. Обычно оба
гена интегрируются поблизости друг от друга,
поскольку молекулы имеют тенденцию объединять-
ся после проникновения в клетки до того, как
произойдет интеграция.
Котрансформация увеличивает число генов, ко-
торые с высокой эффективностью могут быть вве-
дены в клетки животных. Однако круг разных типов
клеток ограничивается доступностью соответствую-
щих мутантных линий. Более общий подход осно-
ван на превращении нормальных клеток в клетки,
зависящие от трансфицирующего гена. Например,
клетки многих видов не способны синтезировать
гуаниловую кислоту (GMP) в среде, содержащей
микофеноловую кислоту соединение, специфиче-
ски подавляющее инозинат(1МР)дегидрогеназу
(рис. 5.32). Ингибирование снимается добавлени-
ем ксантина и введением функционального гена
E.coli gpt, кодирующего ксантин-гуанин фосфори-
бозилтрансферазу. Клетки животных обычно не спо-
собны использовать ксантин в качестве предшест-
венника гуаниновых нуклеотидов, так как ксантин
является очень плохим субстратом для аналогич-
ного фермента животных- гипоксантин-гуанин
фосфорибозилтрансферазы. Поэтому клетки, транс-
формированные геном gpt Е. coli и синтезирующие
функциональный фермент ксантин-гуанин- фосфо-
рибозилтрансферазу, можно селективно подрастить
в среде, содержащей ксантин и микофеноловую
кислоту (в отсутствие гуанина). Подобным же обра-
зом ген Е. coli пео, кодирующий аминогликозидфос-
фотрансферазу, можно использовать в качестве до-
минантного маркера в сочетании с аминогликози-
дом, получившим название G-418. Это соединение
является аналогом антибиотиков неомицина и ка-
намицина, которые блокируют синтез белков в эука-
риотических клетках и инактивируются фосфо-
трансферазой (табл. 5.3). Гены E.coli обычно вво-
дятся в клетку с помощью челночных векторов,
которые клонируются и реплицируются в клетках
Е. coli. При конструировании рекомбинантных мо-
лекул нормальные промоторы E.coli замещают на
транскрипционные регуляторные сигнальные после-
довательности, проявляющие активность в клетках
животных. Гены E.coli gpt и neo можно исполь-
зовать для котрансформации нормальных клеток
геном, не имеющим селективного маркера. Доми-
нантными селективными маркерами могут служить
также бактериальный ген резистентности к гигро-
мицину (hph) и ген млекопитающих, кодирующий
устойчивую к метотрексату форму дигидрофолат-
редуктазы.
Векторы. В качестве основы для конструирова-
ния векторных молекул широко использовался
геном одного из паповавирусов приматов-вируса
обезьян 40 (SV40). Те же причины, которые привели
к выбору Е. coli при разработке бактериальных
систем клонирования (этот организм был достаточ-
но хорошо изучен, и с ним было легко манипули-
ровать), обусловили выбор SV40 в качестве вектора
при работе с животными клетками. За годы, про-
шедшие с начала первых разработок векторов на
основе вируса SV40, было получено большое коли-
чество данных о структурной организации и гене-
тических свойствах геномов других вирусов эука-
риот. В настоящее время на основе некоторых из
этих вирусов созданы интересные системы хозяин-
вектор. Для млекопитающих это папилломавирусы,
аденовирусы, вирус Эпштейна- Барр, вирус оспы
17*
260
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Д Нормальные клетки животных
Г ипоксантин
Гуанин
I PRPP
PRPP
Г ипоксантин-гуанин
фосфорибозилтрансфера^а
IMP---------► ХМР -----------► GMP
Б Клетки, рост которых ингибируется микофеноловой кислотой
(в отсутствие гуанина)
Г ипоксантин
IMP------► ХМР
В. Снятие ингибирования микофеноловой кислотой
(в отсутствие гуанина)
Г ипоксантин
IMP
PRPP
ХМР ----------► GMP
Е. coli
Ксантин-гуанин-
фосфорибозилтрансфераза
Ксатин
РИС. 5.32.
Синтез GMP при различных условиях. PRPP-фосфори-
бозилпирофосфат.
крупного рогатого скота и ретровирусы, а для
насекомых бакуловирусы.
Как мы уже отмечали, при работе с животными
клетками используют два типа векторов. В неко-
торых случаях они аналогичны бактериальным
плазмидам или фаговым векторам. После транс-
фекции или инфицирования эти векторы реплици-
руются и сохраняются в виде независимых вне-
хромосомных геномов или упаковываются в ин-
фекционные вирусные частицы. В других случаях
векторы не способны реплицироваться и исполь-
зуются для введения специфических сегментов ДНК
в клетки с целью изучения временной экспрессии
клонированного гена или получения стабильной
трансформации при встраивании вектора в геном
хозяина.
Трансформация без векторов. В этой главе мы
рассматривали векторы, которые представляют
собой молекулы ДНК со специфическими клони-
рованными вставками. Но поскольку клетки могут
быть трансформированы нереплицирующимися сег-
ментами ДНК, в тех случаях, когда имеется доста-
точно чувствительный метод отбора искомых
трансформантов, для трансформации можно ис-
пользовать любой фрагмент ДНК или смесь некло-
нированных фрагментов. Например, при трансфор-
мации мышиных клеток ТК ~ суммарной ДНК цып-
ленка, подвергнутой эндонуклеазному расщепле-
нию, можно выделить колонии клеток, экспресси-
рующих ген тимидинкиназы цыпленка (рис. 5.33).
Ген цыпленка встраивается в ДНК мыши, откуда
его можно выделить путем молекулярного клони-
рования с использованием специфических методов
отбора. Этот подход оказался очень ценным при
клонировании многих важных генов, в том числе
онкогенов, содержащихся в раковых клетках.
б. Векторы на основе SV40
Вирус и его геном. SV40 - это сферический вирус;
его геном представлен одной замкнутой кольцевой
двухцепочечной ДНК (рис. 5.34). Вирусная частица
содержит три структурных кодируемых вирусом
белка. VP1 - главный белок вириона, он является
основной составной частью капсида; VP2 и VP3
представлены в меньших количествах. ДНК в ви-
русной частице находится в форме хроматина и свя-
зана с четырьмя гистонами (гл. 2). Природным
хозяином SV40 являются макаки-резусы (Масаса
mulatto), но в лаборатории в качестве хозяев исполь-
зуют в основном клетки почек африканской зеленой
мартышки (Cercopithecus aethiops). Расшифрована
нуклеотидная последовательность всего генома
SV40, состоящая из 5243 п.н., и установлены участ-
ки, кодирующие пять вирусных белков: малый
Т-антиген, большой Т-антиген, VP1, VP2 и VP3. На
рис. 5.34 приведена карта вирусного генома. Весь
геном разделен на 10 частей; цифры у стрелок
указывают число пар нуклеотидов. Первая пара
находится в точке начала репликации ДНК (ori).
Вирион SV40, проникнув в клетку, направляется
к ядру. Здесь происходит его «раздевание», а затем
в строгой временной последовательности- экспрес-
сия генов. Новые вирусные частицы появляются
примерно через 30 ч после инфицирования монослоя
клеток почки обезьяны, а через 4 сут все клетки
разрушаются. Первыми транскрибируются гены
двух ранних белков, малого и большого Т-анти-
генов, в направлении против движения часовой
стрелки. Сайт полиаденилирования находится на
карте вблизи нуклеотида 2550. Ни малый, ни
большой Т-антигены не входят в состав зрелых
вирусных частиц, однако большой Т-антиген играет
важную роль в репликации вирусной ДНК, начи-
нающейся вскоре после образования ранних белков.
5 ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН-ВЕКТОР
261
РИС. 5.33.
Трансформация ТК”-клеток мыши в клетки ТК+ с по-
мощью ДНК цыпленка. Для трансформирования клеток
ТК”, растущих в культуре, используют суммарную ДНК
цыпленка, подвергнутую эндонуклеазному расщеплению.
После трансфицирования клетки переносят в среду
HAT. Клетки, не получившие ДНК цыпленка или полу-
мившие фрагменты, не содержащие гена тимидинкина- ются.
зы, не способны расти в этой среде, а редкие трансфор-
мированные клетки, в которых произошла интеграция
фрагмента ДНК с нужным геном в геном мыши, растут
и образуют колонии. Следует заметить, что в тех случаях,
когда рестриктирующая эндонуклеаза разрезает ген ти-
мидинкиназы, трансформированные клетки не образу-
Репликация начинается в точке ori, идет в обоих
направлениях и заканчивается в месте встречи
репликативных вилок. Затем происходит сшивание
дочерних двухцепочечных молекул ДНК с обра-
зованием замкнутых кольцевых структур. В каждой
инфицированной клетке образуется более 105 копий
вирусного генома. Вскоре после инициации репли-
кации ДНК замедляется синтез ранних белков
и активизируется транскрипция «поздних» генов,
которая начинается вблизи ori и протекает в направ-
лении движения часовой стрелки, в результате чего
синтезируются поздние белки VP1, VP2 и VP3.
Накопление дочерних молекул ДНК и вирионных
белков завершается сборкой новых вирусных час-
тиц, их высвобождением и гибелью клетки. Ин-
фекционный процесс в полной мере может быть
инициирован в результате трансфекции с помощью
очищенной ДНК вируса SV40.
Несколько типов SV40-eeKmopoe. Общие принци-
пы конструирования векторов на основе SV40
аналогичны принципам, использующимся на основе
фага X. Применяя соответствующие рестриктирую-
щие эндонуклеазы, удаляют определенные области
вирусного генома и замещают их другими сегмен-
тами ДНК. В зависимости от того, какой именно
сегмент вирусной ДНК удаляется, образуется тот
или иной вектор. Различают три типа векторов,
сконструированных на основе вируса SV40. Каждый
из них имеет свои преимущества и недостатки при
использовании в различных экспериментальных сис-
темах. Во-первых, это трансдуцируюгцие SV40-BCK-
торы, реплицирующиеся в соответствующих клет-
ках-хозяевах (клетки почек обезьяны) и упаковы-
вающиеся в вирионы. Они аналогичны специали-
зированным трансдуцирующим фагам и векторам,
сконструированным на основе фага X. Во-вторых,
это 8У40-векторы, способные реплицироваться, но
не упаковываться. Они называются плазмидными
8¥40-векторами. И наконец, существуют пассивные
трансформирующие векторы, которые не способны
ни реплицироваться, ни упаковываться. Они пред-
ставляют собой молекулы, в которые включены
небольшие сегменты генома SV40, способствующие
экспрессии генов.
Трансдуцирующие 8У40-векторы. Чтобы SV40-
вектор мог упаковываться с образованием вирусных
частиц, необходимо выполнение трех важных тре-
бований. Во-первых, вектор должен содержать
сегмент размером 300 п.н., включающий точку ori.
Это необходимо для обеспечения синтеза вирусной
262
ЧАСТЬ II ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Геном SV40. С наружной стороны карты приведены
условные генетические единицы, с внутренней- число
пар оснований. Указаны уникальные рестриктазные сай-
ты. Участки, кодирующие пять вирусных белков, выне-
сены за пределы карты. Заметьте, что большой Т-анти-
ген кодируется двумя отдельными группами генов (см.
гл. 8).
ДНК и регуляторных последовательностей, отве-
чающих за синтез мРНК. Во-вторых, суммарная
длина рекомбинантной ДНК не должна превышать
5300 п.н. и быть меньше 3900 п.н.. т.е. вектор должен
иметь определенный размер, необходимый для
упаковки ДНК в вирусные частицы. В-третьих,
должны быть в наличии белки большой Т-антиген,
VP1, VP2 и VP3, хотя их кодирование самим
рекомбинантным геномом необязательно. К ин-
тактному геному SV40 уже практически невозможно
добавить какой-то фрагмент ДНК, чтобы не было
нарушено условие, при котором может происходить
его упаковка. Поэтому общая стратегия состоит
в делетировании кодирующей области вектора,
замещении ее нужным фрагментом ДНК и обеспе-
чении синтеза продукта утраченного гена с по-
мощью аналогичного гена, входящего в состав
генома либо вируса-помощника, либо хозяина (т.е.
возмещении гена в транс-положении). Например,
вирус-помощник дикого типа способен синтезиро-
вать белки Т или VP1, VP2 и VP3 в количестве,
достаточном для удовлетворения как собственных
нужд, так и нужд рекомбинантного вируса. На рис.
5.35 представлен эксперимент с трансфицированием
клеточного монослоя смесью ДНК вируса SV40
дикого типа и ДНК дефектного вируса, несущей
вставку. Клетки, получившие либо ДНК дикого
типа, либо обе ДНК, подвергаются литической
инфекции, и дочерние ДНК упаковываются в ви-
русные частицы.
Инфицированные клетки в монослое можно об-
наружить по образующимся бляшкам. Отметим,
что отличить бляшки, содержащие смешанное по-
томство, от тех, которые содержат только SV40
дикого типа, довольно трудно. Для этого нужно
провести дополнительный анализ вирионов, полу-
ченных из отдельных бляшек, и идентифицировать
те из них, которые содержат рекомбинантную ДНК.
Однако эту проблему легко решить, если исполь-
зовать вектор, сохраняющий по крайней мере один
функциональный вирусный ген, и вирус-помощник,
дефектный в отношении гена, поставляемого век-
торной молекулой. В этом случае негативные ко-
лонии будут образовываться только теми клетками,
которые трансфицированы обеими ДНК. Напри-
мер, если встроенный сегмент ДНК замещает
участок, кодирующий поздние белки VP1, VP2
и VP3, то соответствующий вирус-помощник дол-
жен иметь мутацию в гене большого Т-антигена.
Рекомбинант обеспечивает синтез большого Т-ан-
тигена, а вирус-помощник отвечает за синтез белков
VP1, VP2 и VP3 (рис. 5.36). И наоборот, если
встроенный сегмент ДНК замещает раннюю об-
ласть SV40, то вирус-помощник должен обеспечи-
вать синтез функционального большого Т-антигена.
но не капсидных белков. В отличие от трансфекции
с использованием в качестве помощника вируса
дикого типа каждая бляшка, образующаяся после
трансфекции векторной и дефектной вирусными
ДНК, содержит смешанное потомство.
Утраченную функцию может возмещать и ген
хозяина (рис. 5.37). Например, COS-клетки - это
клетки почек африканской зеленой мартышки,
у которых в геном интегрирован ген большого
Т-антигена вируса SV40. Они продуцируют доста-
точное количество большого Т-антигена, чтобы
могла происходить репликация молекул, содержа-
щих область ori репликации вируса SV40 размером
примерно 80 пар оснований. Если такой трансду-
цирующий вектор кодирует также белки VP1, VP2
и VP3, то вирусные частицы будут образовываться
в клетках COS даже в отсутствие вируса-помощни-
ка. Поскольку никакой вирус-помощник не требует-
ся, образующиеся вирионы содержат только геном
трансдуцирующего вектора.
8У40-плазмидные векторы. 8У40-векторы второ-
го типа способны реплицироваться в клетках
обезьян, но не могут упаковываться с образованием
вирусных частиц (рис. 5.38). Для них существенно
5 ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН ВЕКТОР
263
Бляшки,
содержащие смесь
вирусов дикого типа
и рекомбинантных
вирусов
Бляшки,
содержащие вирус
только дикого типа
РИС. 5.35.
Комплементация трансдуцирующего SV40-
еектора с помощью вируса SV40 дикого
типа. Монослой клеток почек африканской
зеленой мартышки трансфицируют смесью
ДНК SV40 дикого типа и трансдуцирующе-
го 5\/40-вектора, в котором ранняя область
(кодирующая большой Т-антиген) вирусной
ДНК замещена вставкой чужеродной ДНК.
Отметим, что область начала репликации
вирусной ДНК должна оставаться интакт-
ной. Вставка чужеродной ДНК может за-
мещать и позднюю область, кодирующую
белки VP1, VP2 и VP3. В клетках, получив-
ших ДНК обоих типов, вирусные функции,
утраченные рекомбинантами, восполняет
геном дикого типа. Обе ДНК реплицируют-
ся, и дочерние молекулы упаковываются
в вирионы, которые совместно инфицируют
соседние клетки. Вокруг первой инфициро-
ванной клетки на монослое появляется
прозрачная зона бляшка. Материал, полу-
ченный из некоторых бляшек, представляет
собой смесь вирусов дикого типа и реком-
бинантных вирусов. В других бляшках со-
держатся только частицы вируса дикого
типа.
сохранение как области ori репликации, так и гена
большого Т-антигена, в то время как гены белков
VP1, VP2 и VP3 отсутствуют. С другой стороны,
синтез большого Т-антигена может обеспечиваться
и клетками COS. Плазмидные 8У40-векторы могут
быть челночными и существовать в клетках E.coli
и животных, поскольку никаких ограничений на их
размер, необходимый для упаковки, не налагается.
Рекомбинантные молекулы получают в клетках
E.coli, а затем трансфицируют ими клетки обезья-
ны. Такие клетки могут использоваться для изу-
чения временной экспрессии генов, встроенных
в векторные молекулы. Поскольку при репликации
вектора образуется большое число копий, доза
любого гена, содержащегося в векторе, увеличи-
вается, что облегчает изучение соответствующих
генных продуктов. Было бы очень ценно, если бы
такие 8У40-плазмидные векторы вели себя в клетках
животных аналогично тому, как ведут себя плаз-
миды в клетках бактерий. В этом случае реком-
бинантный геном передавался бы дочерним клеткам
при делении и мы имели бы стабильную систему,
позволяющую изучать экспрессию генов. Однако
плазмидные векторы оказываются нестабильными
в большинстве клеток животных и не могут сохра-
няться в них бесконечно долго. Относительной
стабильности можно достичь, если использовать
клетки COS, поставляющие большой Т-антиген для
репликации, вектор с селективным маркером, ана-
логичным гену neo E.coli, и среду G-418.
Стабильной трансформации удается достигнуть
в тех случаях, когда 8У’40-плазмидные векторы
интегрируют с геном клетки-хозяина. Частота та-
кого события составляет 10“5- 10“3 в зависимости
264
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Вирионы
Б, Замещение области ранних генов SV40
VP2(VP3(
VPl'
Вектор
Мутантный
VP1 -генх<®
Помощ-
ник
Вставка
VP3
VP1
В
VP2
VP3
>-Вирионы
SV40 с
Вставка
РИС. 5.36.
Комплементация трансдуцирующих векторов
помощью дефектного вируса-помощника. А.
чужеродной ДНК замещает область поздних генов
SV40. Последовательности, кодирующие белки VP1,
VP2 и VP3, восполняются геномом помощника, который
содержит мутантный ген большого Т-антигена. Б.
Вставка чужеродной ДНК замещает область, кодиру-
ющую большой Т-антиген. Соответствующие гены по-
ставляет вирус-помощник, содержащий мутацию в гене
белка VP1.
Трансдуцирующий вектор SV40
Трансфекция
Вставка в область
ранних генов
COS-клетки
РИС. 5.37.
COS-клетки комплементируют трансдуцирующий век-
тор SV40, утративший ген большого Т-антигена, место
которого занимает вставка чужеродной ДНК. Гены бел-
ков VP1, VP2 и VP3 не утрачены и нормально функцио-
нируют. Геном COS-клеток содержит функциональный
ген большого Т-антигена, и клетки синтезируют этот
белок (Т). После трансфекции в клетках оказываются
все белки, необходимые для репликации и упаковки
SV40. Все дочерние вирионы представляют собой ре-
комбинантные трансдуцирующие векторы.
Рекомбинант-
ные вирионы
5. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН-ВЕКТОР
265
I от используемой системы. Если вектор содержит
I селективный маркер, то колонии трансформирован-
I них клеток обезьяны можно выделить.
Пассивные трансформирующие векторы. Векторы
I третьего типа не способны к самостоятельной реп-
ликации. Они лишь доставляют в клетку клони-
рованные сегменты ДНК, которые затем внедряют-
ся в клеточную ДНК. Образующиеся стабильно
трансформированные клетки реплицируют приоб-
ретенную ДНК как часть своего собственного
генома. Обычно такие векторы напоминают чел-
ночные, поскольку сначала для клонирования и
выделения рекомбинантных ДНК используют клет-
ки Е. coli, а затем трансфицируют этой ДНК различ-
ные клетки млекопитающих (например, pSV2 в
случае, представленном на рис. 5.38). Используются
не только клетки почек обезьяны, поскольку для
таких векторов не требуются специфические условия
для репликации. Если вектор содержит подходящий
маркер, то можно отобрать колонии трансформан-
тов. Маркером может служить ген тимидинкиназы
вируса герпеса или гены gpt и neo Е. coli. Сегменты
ДНК вируса SV40, включаемые в подобные век-
торы, обычно содержат области регуляции тран-
скрипции и сайты полиаденилирования.
в. Векторы на основе вируса
папилломы крупного рогатого скота
Вирус и его геном. Папилломавирусы провоци-
руют образование бородавок-доброкачественных
новообразований кожи у многих млекопитающих;
они относятся к той же группе, что и SV40. Папил-
ломавирусы характеризуются высокой видоспеци-
фичностью. У них имеется оболочка - капсид; геном
представляет собой замкнутую кольцевую двухце-
почечную ДНК длиной около 8 т.п.н. ДНК вируса
папилломы крупного рогатого скота, как и ДНК
SV40, навита на нуклеосомные коры, образуемые
четырьмя клеточными гистонами. Изучение биоло-
гических и генетических свойств папилломавирусов
сильно осложнялось тем, что отсутствовали кле-
точные линии, способные поддерживать реплика-
цию вируса. Кроме того, вирус приходилось вы-
делять непосредственно из бородавок. Однако с
развитием технологии рекомбинантных ДНК не-
большие количества папилломавирусной ДНК, ко-
торые удавалось выделить из бородавок, были
очищены и амплифицированы с помощью моле-
кулярного клонирования в клетках E.coli. Генети-
ческий анализ показал, что ДНК папилломавирусов
может служить весьма полезным уникальным век-
тором для клеток животных.
Полностью установлена нуклеотидная последо-
вательность ДНК папилломавирусов крупного ро-
гатого скота и человека. Геном папилломавируса
5\/40-плазмидные векторы для клонирования в £ coli.
Эти челночные векторы содержат сегмент длиной при-
мерно 2,3 т.п.н, происходящий из плазмиды pBR322
и содержащий область ori, и ген ампициллиназы. Сег-
мент вектора, происходящий из генома SV40, находится
на генетической карте вируса между нуклеотидами 5171
и 270 и содержит область ori и регуляторные последова-
тельности для осуществления ранней транскрипции; он
присоединен к 5'-концу кодирующей области гена gpt
£ coii. К З'-концу гена gpt тоже присоединены SV40-no-
следовательности, которые на генетической карте виру-
са находятся в окрестности 2500 н.п. Они содержат
сигналы полиаденилирования мРНК в клетках животных
и сигналы, необходимые для созревания мРНК. Эти
векторы были получены клонированием в £ coli. Вверху
представлен вектор pSV2- плазмидный вектор, содер-
жащийся в COS-клетках не способный реплицироваться
в нормальных клетках обезьяны из-за отсутствия боль-
шого Т-антигена. В случае нормальных клеток обезьяны
или других клеток млекопитающих вектор pSV2 исполь-
зуют при изучении временной экспрессии гена gpt или
какого-то другого гена, встроенного, например, в сайт
Ba/n Н1 или Есо RI. Внизу представлен вектор pSV3, не
нуждающийся в клетках COS для репликации и дейст-
вующий как плазмидный вектор в нормальных клетках
обезьяны, поскольку он содержит ген большого Т-анти-
гена. Этот ген вместе с последовательностью, ответст-
венной за регуляцию его транскрипции, встроен в сайт
Bam Н1 плазмиды pSV2. Как pSV2. так и pSV3 могут
включаться в геном клетки-хозяина и вызывать ста-
бильную трансформацию. На 104—10s трансформиру-
емых клеток приходится одна клетка, способная обра-
зовать колонию в присутствии микофеноловой кислоты.
266
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Некодирующий
участок
Гены капсидных
белков
РИС. 5.39.
Схематическое представление генетических карт
папилломавируса крупного рогатого скота (BPV)
и челночного BPV-вектора. Для трансформации
достаточно области, включающей некодирующий
регуляторный сегмент (на рисунке она выделена
цветом). Наиболее вероятное местоположение
области ori отмечено овалом; вторая область ori
способна функционировать при определенных
условиях. С внутренней стороны кольца схемати-
чески представлена транскрипция генов, необхо-
димых для трансформации, и генов капсидного
белка. В еектор включены только трансформиру-
ющие вирусные последовательности, а также сег-
менты pBR322, необходимые для репликации и
отбора в клетках £. coli.
крупного рогатого скога (рис. 5.39) используют
в качестве основы для конструирования векторов
животных. В отличие от вируса SV40 папилло-
мавирус крупного рогатого скота (BPV) реплици-
руется в виде стабильной плазмиды в клетках гры-
зунов и многих клетках быка. Вирионы при этом не
образуются, поскольку экспрессия капсидного бел-
ка, насколько это известно, происходит только
в терминально дифференцированных эпидермаль-
ных клетках. Инфицированные клетки не погибают,
и геном BPV передается дочерним клеткам. Такие
геномы трансформируют клетки, вызывая в них
генетические изменения, в частности превращая
нормальные клетки в раковые. Трансформанты
в таких случаях можно выявить благодаря тому, что
они образуют возвышающиеся над монослоем
колонии, так называемые фокусы. Клоны транс-
формированных клеток можно получить в культуре
аналогично тому, как получают колонии из от-
дельных клеток E.coli. Подобно многим трансфор-
мированным клеткам эукариот, эти клетки растут
быстрее своих нормальных двойников. Для поддер-
жания трансформированного состояния необходи-
мы только те гены, которые на рис. 5.39 обозначены
как «трансформирующие»: на их долю приходится
69% длины всего генома. Стабильная трансфор-
мация с помощью ДНК вируса BPV не связана
с интеграцией вирусной ДНК в геном клетки; доста-
точно. что ДНК находится в клегке в состоянии
плазмиды. Каждая трансформированная клетка
содержит от 10 до 100 копий генома вируса BPV.
Конструирование векторов. Векторы на основе
ДНК папилломавируса можно сконструировать
лигированием чужеродных вставок с «трансформи-
рующим» сегментом вирусного генома длиной
примерно 5500 п.н. (рис. 5.39). Обычно челночные
векторы получают путем клонирования эукариоти-
ческого компонента в плазмидном векторе E.coli
(например, в pBR322). Перед трансфекцией эука-
риотических клеток векторные молекулы можно
разрезать с помощью рестриктирующей эндонук-
леазы, чтобы отделить pBR322 от ДНК BPV (и
вставки), поскольку некоторые плазмидные после-
довательности подавляют репликацию ковалентно
связанной с ними ДНК вируса папилломы. Этими
линейными сегментами ДНК трансфицируют жи-
вотные клетки, при этом сегмент, содержащий
вставку и трансформирующую область вируса BPV,
замыкается в кольцо и реплицируется как неза-
висимая плазмида. На основе BPV-вектора скон-
струировано множество разных вариантов. Напри-
мер, при введении в вектор гена нео E.coli, функ-
ционирующего в клетках животных, трансформи-
рованные клетки можно отбирать на среде с ами-
ногликозидом G-418. Благодаря этому отпадает
5. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН-ВЕКТОР
267
необходимость в идентификации фокуса и тем
самым расширяется круг чувствительных клеток,
в который теперь могут входить клетки, не прояв-
ляющие такого морфологического признака.
г. Векторы на основе ретровирусов
Жизненный цикл ретровирусов (разд. 2.2.а). Реп-
ликация одноцепочечного РНК-генома ретровиру-
сов включает следующие стадии: образование двух-
цепочечной ДНК, являющейся копией РНК, с по-
мощью обратной транскриптазы; встраивание ви-
русной ДНК в геном хозяина; транскрипцию встро-
енной ДНК с образованием мРНК и дочерних
вирусных геномов; синтез вирусных структурных
белков и обратной транскриптазы; сборку новых
вирусных частиц и высвобождение их из клетки
(рис. 5.40). Наряду со структурными белками вирус-
ные частицы содержат обратную транскриптазу,
которая необходима для инициирования жизненно-
го цикла вируса. Интегрированный вирусный геном
получил название провируса. Его включение в геном
клетки вызывает стабильную трансформацию пос-
ледней. Трансформированные клетки часто иденти-
фицируют по появлению плотных фокусов из быст-
рорастущих клеток, напоминающих опухолевые.
Многие ретровирусы являются онкогенными.
Необходимым условием продуктивности жиз-
ненного цикла ретровируса является наличие в его
геноме определенных нуклеотидных последователь-
ностей, способных функционировать только в цис-
положении. В то же время продукты вирусных
РИС. 5.40.
Жизненный цикл ретровируса (более подробно см.
гл. 2). После инфицирования клеток РНК-геном ретро-
вируса превращается в дуплексную ДНК с помощью
обратной транскриптазы, присутствующей в вирионе. В
результате интеграции дуплексной ДНК с клеточным
геномом образуется провирус. ДНК провируса фланки-
рована длинными прямыми концевыми повторами
(5'-LTR и З'-LTR). На Б'-LTR находятся сигналы регуля-
ции транскрипции. В результате транскрипции прови-
русной ДНК образуются мРНК и новые вирусные гено-
мы, а в результате трансляции мРНК-вирусные белки
gag, pol и env. Далее происходит сборка вирусных
частиц, которые отпочковываются от плазматической
мембраны. Экспрессия невирусных генов, встроенных
в центральную кодирующую область, также находится
под контролем 5'-LTR.
268
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
генов-группоспецифичные антигены (gag) и белки
оболочки (env), а также обратная транскриптаза
(pol)-могут поставляться вирусом-помощником
или провирусом, находящимися в транс-положении.
Структурные элементы, которые должны находить-
ся в г/ис-положении, включают: 1) элементы, участ-
вующие в обратной транскрипции (они обозначают-
ся как R, U5, U3, Р и Рп); 2) короткую последо-
вательность V, необходимую для упаковки геномов
в вирионы; 3) две последовательности (S), необхо-
димые для осуществления сплайсинга РНК с обра-
зованием функциональной мРНК, ответственной за
синтез белка оболочки (рис. 5.40). Длинные прямые
концевые повторы (LTR) на одном из концов
дуплексной ДНК вирусного генома и провируса
содержат элементы, ответственные за регуляцию
транскрипции, которые способствуют транскрипции
вирусных генов.
Конструирование векторов на основе ретровиру-
сов. В основе конструирования ретровирусных век-
торов лежат три важных принципа. Во-первых,
векторы должны сохранять последовательности
вирусного генома, необходимые для репликации,
экспрессии генов и упаковки. Синтез вирусных
белков может определяться генами, находящимися
в транс-положении. Во-вторых, чужеродные сегмен-
ты ДНК должны встраиваться в кодирующие об-
ласти генома или отчасти замещать их. В-третьих,
ретровирусные векторы обычно предназначены для
использования в качестве трансдуцирующих векто-
ров с упаковкой рекомбинантного генома в вирион.
Сами ретровирусы представляют собой природные
трансдуцирующие вирусы: они рекомбинируют с
клеточными геномами и трансдуцируют клеточные
гены во вновь инфицируемые клетки как часть
провируса.
РИС. 5.41.
р Ри
мРНК для
селективного маркера
Челночный вектор, сконструированный на основе рет-
ровируса. рВВ322-последовательности позволяют осу-
ществлять отбор, репликацию и клонирование в £ coli.
К этим плазмидным последовательностям присоединен
модифицированный ретровирусный геном, фланкиро-
ванный 5'- и З'-LTR. Вектор содержит и другие последо-
вательности (Р. у, S и Ри), необходимые для реплика-
ции, образования мРНК и сборки ретровируса, а также
селективный маркер (например, гены пео и gpt £ coli
или ген тимидинкиназы вируса герпеса). В уникальный
сайт рестрикции или вместо каких-то участков ДНК
ретровируса могут быть включены другие сегменты
ДНК. После трансфекции клеток животных на 5'-LTR
точке терминации транскрипции, находящейся на’З'-LTR.
Одни транскрипты являются вирусными геномами, ко-
торые упаковываются в белковую оболочку. Белки обо-
лочки кодируются либо вектором, либо генами, нахо-
дящимися в mpawc-положении в составе вируса-по-
мощника или генома клеток-хозяев. Другие транскрип-
ты используются как мРНК. В приведенном примере
селективный маркер находится в положении, обычно
занимаемом геном env. Транскрипты, которые должны
играть роль мРНК для генов этой области, утрачивают
все последовательности, находящиеся между S-сайта-
ми, в результате сплайсинга промежуточной РНК и вос-
соединения двух концов по S-сайтам.
инициируется транскрипция, которая заканчивается в
5. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН-ВЕКТОР
269
РИС. 5.42.
Превращение дуплексной рекомбинантной ДНК
ретровирусного вектора в инкапсидированный
РНК-геном в клетках хозяина, содержащих про-
вирус дикого типа. Клетки в чашке, изображенной
в верхней части рисунка, содержат интегрирован-
ный лровирус дикого типа. В этих клетках синте-
зируются РНК-геномы дикого типа и вирусные
белки и происходит сборка вирионов дикого типа.
Вскоре после трансфекции клеток двухцепочеч-
ным рекомбинантным ретровирусным вектором
(рис. 5.41) в результате транскрипции, идущей от
5'-LTR к З'-LTR, образуется рекомбинантная РНК.
РНК-геномы рекомбинантного и дикого типов
упаковываются в оболочку, состоящую из белков
дикого типа, и в среде накапливается смесь раз-
ных вирионов. Такую жидкую среду используют
в дальнейшем как базовый инокулят, содержащий
рекомбинантный вирус и вирус-помощник, для
инфицирования новых клеток. После обратной
транскрипции в некоторых вновь инфицирован-
ных клетках происходит интеграция как дикого,
так и рекомбинантного провирусов. Такие клетки
используют впоследствии как продуценты вирио-
нов разных типов.
Вирионы
дикого типа
Клетки, содержащие
провирус дикого типа
Трансфекция с помощью
рекомбинантного вектора
Рекомбинантный
вектор
Инфицирование
новых клеток
Вирионы рекомбинантного
и дикого типов
ДНК-форма геномов многих ретровирусов была
клонирована в Е. сой-системах и поэтому доступна
для дальнейших манипуляций. Эти геномы встраи-
вают в рекомбинантные векторы in vitro и полу-
ченные формы клонируют и реплицируют в E.coli.
Типичный вектор содержит: 1) фрагменты плазми-
ды pBR322, необходимые для репликации в клетках
E.coli и отбора; 2) LTR-последовательности (длин-
ные прямые концевые повторы) вирусного генома,
включая сегменты R, U5 и U3; 3) последователь-
ности Р, Рп, ту и S; 4) селективный маркер, например
ген neo Е. coli', 5) по крайней мере один уникальный
сайт для рестриктируюгцей эндонуклеазы, по ко-
торому можно встраивать дополнительные сегмен-
ты ДНК без какого-либо нарушения существенной
части вирусного генома (рис. 5.41).
Векторы, сконструированные путем клонирова-
ния в клетках E.coli, трансфицируются непосред-
ственно в соответствующие клетки животных. На
5'-конце LTR находится элемент, ответственный за
регуляцию транскрипции с помощью РНК-полиме-
разы II, на З'-конце-сигнал терминации транскрип-
ции. Соответственно синтезируемая РНК по сущест-
ву представляет собой вирусный геном (рис. 5.41), за
исключением одного или нескольких невирусных
сегментов, находящихся между 5'- и З'-концами.
Следует отметить, что Е. сой’-последовательности
вектора не транскрибируются и не присутствуют
в рекомбинантной РНК ретровирусного генома.
Рекомбинантная ретровирусная РНК может
быть упакована в вирионы, если в среде присут-
ствуют необходимые вирусные белки. Такие белки
270
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
образуются, если клетки хозяина содержат пол-
ностью функциональный провирус, который обес-
печивает синтез вирусных белков, находясь в транс-
положении (рис. 5.42). В этом случае вирусное
потомство представляет собой смешанную попу-
ляцию рекомбинантных вирионов и вирионов ви-
руса-помощника дикого типа. Такой препарат мож-
но использовать для повторного инфицирования
новых клеток, причем необходимый вирус-помощ-
ник поставляется одновременно с рекомбинантным
вирусом. Можно получить и чистые препараты ре-
комбинантных вирионов, если провирус в исходных
клетках дефектен в отношении упаковки. Такие хо-
зяйские клетки получают при инфицировании их
делеционным мутантом, утратившим у-последова-
тельности (рис. 5.43). Несмотря на неспособность
вирусной РНК, образуемой провирусом у-. упа-
ковываться, рекомбинантные геномы сохраняют
способность к упаковке, инфицированию новых
клеток и установлению провирусного состояния,
поскольку их ^/-последовательность остается ин-
тактной. Вирионы содержат белки, необходимые
для осуществления обратной транскрипции и вклю-
чения в клеточный геном в процессе следующего
инфекционного цикла.
Использование ретровирусных векторов. Транс-
дуцирующие вирусные векторы имеют одно преи-
мущество, связанное с тем, что инфицирование
Пустые капсиды
е„о О о б о
о о о о о
Трансфекция с помощью
рекомбинантного вектора
Клетки, содержащие
-провирус
РИС. 5.43.
Превращение дуплексной рекомбинантной ДНК
ретровирусного вектора в инкапсидированный
РНК-геном в клетках хозяина, несущих провирус
у Клетки в чашке, изображенной в верхней
части рисунка, содержат интегрированный прови-
рус с делегированной у-последовательностью
Несмотря на синтез вирусной РНК и белков,
инкапсидации РНК не происходит. В результате
в среде накапливаются только пустые неинфек-
ционные капсиды. Вскоре после трансфекции с
помощью двухцепочечного рекомбинантного
ретровирусного вектора в результате транскрип-
ции, идущей в направлении 5'-LTR -» 3'LTR, обра-
зуется рекомбинантная РНК. Эта РНК заключает-
ся в оболочку из вирусных белков дикого типа,
и в среде накапливаются рекомбинантные вирио-
ны. Такой инокулят содержит только пустые кап-
сиды и рекомбинантные вирионы. При инфици-
ровании этим инокулятом новых клеток происхо-
дит репликация рекомбинантного генома с по-
мощью вирусной обратной транскриптазы. ДНК
интегрирует как провирус и образовавшиеся
трансформированные клетки экспрессируют ге-
ны, содержащиеся в рекомбинантном провирусе.
Заключение рекомбинантной РНК
в оболочку из белков дикого типа
Инфицирование
новых клеток
Клетки, трансформированные
рекомбинантным вирусом
5ИН СТРУМ ЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН ВЕКТОР
271
Рост на среде с
микофеноловой
кислотой отсутствует
Рост на среде с
микофеноловой
кислотой
Нормальная
клетка
РИС. 5.44.
Отбор клеток, трансформированных ретровирус-
ными векторами. А. Рекомбинантный геном со-
держит ген gpt E.coli. После проникновения ви-
риона в клетку происходит образование дуплекс-
ной ДНК, катализируемое обратной транскрипта-
зой, присутствующей в рекомбинантном вирионе.
Эта ДНК встраивается в клеточный геном, обра-
зуя провирус. Трансформированные клетки мож-
но отобрать благодаря экспрессии гена gpt, сни-
мающей ингибирующий эффект микофеноловой
кислоты. Если в рекомбинантную молекулу вклю-
чен какой-то неселективный ген. он тоже экспрес-
сируется. Б. Ретровирусный геном содержит он-
коген. Трансформированные клетки можно иден-
тифицировать по их способности образовывать
фокусы, тогда как нетрансформированные клетки
образуют лишь монослой. В этом случае в транс-
формированных клетках также экспрессируется
неселективный ген, включенный в трансформи-
рующий геном.
Фокус
значительно эффективнее, чем трансфекция. После
того как получен препарат вновь сконструирован-
ного вектора путем трансфекции клеток, обладаю-
щих функциями помощника, все последующие опе-
рации можно осуществлять с помощью инфици-
рования. Кроме того, если целью эксперимента
является трансформация клетки, то помощник не
требуется. Рекомбинантный геном образует прови-
рус, и клетки стабильно трансформируются. Транс-
формированные колонии можно отбирать несколь-
кими способами (рис. 5.44). В тех случаях, когда
вектор содержит функциональный маркер, подоб-
ный генам пео или gpt Е. coli, трансформируемые
клетки можно отобрать, добавить в среду G-418 или
микофеноловую кислоту соответственно. Отметим,
что последовательности в 5'-LTR, ответственные
за регуляцию транскрипции, способствуют синтезу
функциональной мРНК, направляемому генами
E.coli, в клетках животных. Если ген E.coli (или
любой другой ген) встроен в участок гена env (как
на рис. 5.41), то S-сайты должны оставаться ин-
тактными, чтобы было обеспечено образование
функциональной мРНК. Фокусы, образуемые транс-
формированными клетками, можно идентифициро-
вать по их характерной морфологии, если вектор
сохранил онкоген, присутствовавший в исходном
вирусе. В трансформированных клетках присутст-
вуют также неселективные гены, которые были
встроены в вектор вместе с селективным маркером.
Описанные свойства трансдуцирующих рекомби-
нантных ретровирусов, в особенности эффектив-
ность, с которой осуществляются инфицирование
и трансформация клеток, делают эту систему осо-
бенно пригодной для экспериментальной трансфор-
мации клеток очень ранних зародышей и даже всего
организма животных.
Конструирование рекомбинантного ретровирус-
ного вектора начинают с получения челночного
вектора, который реплицируется в клетках E.coli,
а затем трансфицируется в клетки животных. Од-
нако последовательности Е. co/z-плазмид утрачива-
ются на начальных этапах трансфекции, поскольку
транскрипция в клетках животных протекает только
в направлении от 5'-LTR к З'-LTR (рис. 5.41).
Упаковываемые в вирионы РНК-геномы не содер-
жат сегментов плазмидного вектора. Часто это не
имеет значения для последующего эксперименти-
рования, однако в некоторых случаях возможность
272
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
введения рекомбинантных молекул снова в клетки
Е. coli оказывается существенной. Чтобы решить эту
проблему, сегмент Е. со/г-плазмиды, например плаз-
миды pBR322. встраивают между последователь-
ностями LTR при первоначальном конструировании
(рис. 5.45). В этом случае все формы вирусного
генома-РНК, двухцепочечная ДНК и провирус-1
сохраняют сегмент pBR322. В результате ретро-1
вирусный вектор можно будет -яЯ
клонирования непосредственно в клетках Е. coli, без
проведения его через клетки животных. Двухцепо-
чечная вирусная ДНК или сегменты геномной ДНК.
несущие провирус, замыкают в кольцо, лигируют
и трансфицируют в клетки E.coli, где они репли-
цируются. Новые рекомбинантные молекулы часто
3' - LTR
Одевание
1 Инфицирование новых клеток
Обратная транскрипция
Сайт рестрикции
I
Г -
Провирус
Интеграция
Сайт рестрикции
Клеточная
ДНК
1Рестри ктиру ющая
эндонуклеаза
Рис. 5.45.
Ретровирусный вектор, который мож- I
но выделить из клеток животных и
клонировать в Е. соН. Исходный век- I
тор по существу аналогичен вектору, !
представленному на рис. 5.41, за I
исключением того, что между 5'-LTR
и З'-LTR встроены дополнительные
рВЯ322-поспедовательности, ответст- I
венные за репликацию вектора в
Е. coli. После трансфекции происхо- I
дит транскрипция вектора, идущая в
направлении 5'-LTR -» З'-LTR, с обра- ।
зованием вирусных РНК-геномов,
включающих сегмент pBR322. Гено-
мы упаковываются в оболочку из ви-
русных белков, синтез которых де-
терминируется генами, находящими-
ся в /лронс-положении. В новых
клетках, инфицированных этими ви-
русами, образуются дуплексная ДНК
и провирус, еще сохранивший сег-
- wrem0 РЗЛ2>4.£.—сс, -П ЧК- -ч; им-ди.. *
ную из трансформированных клеток
разрезать с помощью рестриктиру
ющих эндонуклеаз, то образуютс
фрагменты, содержащие провирус,
множество других фрагментов. Пр
замыкании этих фрагментов в кольц
и трансфицировании ими клето
Е. coli к репликации оказываютс
способными лишь молекулы, седер
жащие провирус.
5. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН-ВЕКТОР
273
содержат сегменты геномной ДНК, которые флан-
кировали провирусную ДНК в геноме хозяина.
Поскольку внедрение провируса в функциональные
гены или вблизи них часто вызывает мутагенный
или онкогенный эффект (либо и тот и другой),
анализ таких фланкирующих последовательностей
можно использовать для выделения гена, опреде-
ляющего данный фенотип.
5.8. ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ
ХОЗЯИН-ВЕКТОР: РАСТЕНИЯ
а. Общие положения
Растительные клетки не содержат собственных
плазмид. В этом случае в качестве основы для
конструирования трансформирующих векторных
систем в принципе могут использоваться независи-
мо реплицирующиеся геномы различных раститель-
ных вирусов. Такие системы были созданы на осно-
ве генома вируса мозаики цветной капусты. Однако
все наиболее совершенные системы векторов расте-
ний получены на основе плазмид из семейства не-
обычных бактериальных плазмид, носящих назва-
ние pTi. Эти плазмиды образуют природную систе-
му трансформации, с помощью которой осуществ-
ляется перенос сегментов плазмидной ДНК в гено-
мы разнообразных двудольных растений.
В отсутствие специфического вектора прямая
трансформация по крайней мере некоторых расти-
тельных клеток осуществляется с помощью транс-
фекции фрагментами чужеродной ДНК, добавлен-
ными в культуральную среду. Как и клетки живот-
ных, клетки растений поглощают ДНК и она ин-
тегрирует с клеточным геномом, в результате чего
образуются стабильно трансформированные клет-
ки. Однако эффективность прямой трансформации
весьма низка. Отобрать трансф >рманты, появляю-
щиеся с частотой примерно 1 на 106 обработанных
клеток, можно лишь с помощью высокочувстви-
тельных методов. Для повышения эффективности
прямого введения ДНК в клетки растений можно
использовать метод электропорации. В этом случае
трансформированными становятся до 1% клеток,
а кроме того, такой способ можно применять в
случае как однодольных, так и двудольных рас-
тений. С помощью рекомбинантных ДНК были
трансформированы различные растительные клет-
ки, в том числе клетки табака, петуньи, томатов
и подсолнечника. Для трансформации часто исполь-
зуют протопласты, полученные путем разрушения
жестких клеточных стенок с помощью целлюлазы,
в результате чего клетки становятся проницаемыми
для ДНК. При переносе рансфицированных про-
топластов в соответствующую среду клеточная
стенка восстанавливается.
б. Плазмида pTi-А, индуцирующая
образование опухолей
Семейство конъюгативных плазмид pTi-А об-
наружено в грамотрицательных бактериях Agrobac-
terium tumefaciens. Замкнутые кольцевые двухцепо-
чечные плазмиды pTi имеют размер от 150 до 250
т.п.н. и содержат разнообразные уникальные гены
(рис. 5.46 и табл. 5.5). Бактерии A. tumefaciens по-
падают в пораженные ткани растений, а затем
плазмиды проникают в растительные клетки и
рекомбинируют с клеточной ДНК. В растительном
геноме имеется несколько специфических сайтов
интеграции. Трансформированные клетки образуют
опухоли, получившие название корончатых галлов
(рис. 5.47). Штаммы A. tumefaciens, утратившие
плазмиду pTi, не вызывают образования корон-
чатых галлов. Клетки, выделенные из корончатых
галлов, в отличие от нормальных клеток растений
быстро растут в лабораторной питательной среде
даже в отсутствие гормонов роста растений. Если их
привить на здоровое растение, то образуется новый
галл. Иногда экспрессия опухолевого фенотипа
подавляется и из клеток галла регенерируются
нормальные ткани растений. В лабораторных ус-
ловиях рансформацию осуществляют путем ино-
куляции A. tumefaciens в пораненные растительные
ткани (в ткани стебля, корней или кусочков листьев)
или путем совместного культивирования бактерий
Схематическое и ображ ние генетической кяпты типич-
ной нопалиновой плазмиды pTi. Участок, выделенный
цветом,-сегмент Т-ДНК, встроенный в ДНК клеток ко-
рончатого галла. Некоторые из представленных на схе-
ме генов охарактеризованы в табл. 5.5 (ген адг от-
ветствен за чувствительность к агроцину-84). Стрелками
указаны последовательности из 25 п.н. на правой и
левой границах Т-ДНК. Право торонняя последова-
тельность необходима для интеграции Т-ДНК в рас-
тительный геном. Показано положение области ari (для
репликации в A. tumefaciens).
18 2«
274
ЧАСТЬ II, ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Таблица 5.5. Некоторые гены Ti-плазмид
Октопиновые плазмиды
Шесть генов вирулентности
(vir)
Ген синтеза октопина (ocs)
Ген катаболизма октопина
(осе)
Ген исключения фага API
(аре)
Ген биосинтеза ауксина (iaa)
Нопалиновые плазмиды
Шесть генов вирулентности
(ii>)
Ген синтеза нопалина (nos)
Ген катаболизма нопалина
(пос)
Ген, необходимый для
конъюгации (tra)
Ген биосинтеза ауксина (iaa)
с протопластами клеток растений. При совместном
культивировании трансформируется более 10%
протопластов табака.
Геномы pTi. Обычно в ДНК клеток корончатого
галла бывает встроена лишь небольшая (от 13 до 25
т.п.н.) часть генома pTi, однако эта часть всегда
включает определенный сегмент, получивший наз-
вание Т-ДНК (рис. 5.46). В клетках корончатых
галлов с интегрированной Т-ДНК синтезируются
РНК и белки, которые ответственны за опухолевый
фенотип этих клеток. Кроме того, образуются
ферменты, катализирующие синтез аргининовых
производных, известных под названием опины.
В нетрансформированных клетках опины не син-
тезируются. pTi-плазмиды классифицируют в соот-
ветствии с теми опинами, синтез которых они
индуцируют. Например, октопиновые pTi-плазмиды
индуцируют синтез октопина в трансформирован-
ных клетках растений, а нопалиновые pTi-плазми-
ды - синтез нопалина (табл. 5.5). Однако каждая
pTi-плазмида имеет также гены, экспрессируемые в
A. tumefaciens; они находятся вне Т-ДНК. Некоторые
из них, например гены вирулентности (vir), нужны
для переноса Т-ДНК в клетки растений и, следо-
вательно, существенны для образования опухоли.
Другие связаны с катаболизмом тех же опинов, чей
синтез кодируется Т-ДНК. Экспрессия генов ме-
таболизма опинов индуцируется в клетках бактерий
самими опинами. Таким образом, pTi-плазмиды
обеспечивают клетки бактерий источником мета-
болита (путем трансформации растительных кле-
ток) и механизмом использования этого метаболита
в качестве источника углерода, азота и энергии.
Секреция опинов трансформированными клетками
растений создает для A. tumefaciens очень благо-
приятные условия, поскольку другие распространен-
ные почвенные бактерии не способны метаболизи-
ровать эти необычные соединения.
Система pTi - A. tumefaciens дает замечательный
пример включения прокариотической плазмидной
ДНК в эукариотический геном в природных усло-
виях. В действительности сама плазмида является,
по-видимому, природной химерой. Она содержит
два набора генов, один из которых активен в клет-
ках бактерий, другой в клетках растений. Регуля-
ция работы генов, входящих в состав Т-ДНК, осу-
ществляется с помощью элементов, оперирующих
в клетках растений, тогда как гены в остальной
части плазмиды находятся под контролем бакте-
риальных промоторов. Следует отметить, что для
образования опухоли требуются гены обеих групп.
Нормальная клетка
Трансформированная клетка,
способная образовывать галл
РИС. 5.47.
pTi-Индуцируемая трансформация и образование
корончатого галла
5. ИНСТРУМЕНТАРИЙ: СИСТЕМЫ ХОЗЯИН ВЕКТОР
275
Гены vir, экспрессируемые в клетках бактерий,
существенны для переноса Т-ДНК в растительный
геном. Другие гены Т-ДНК экспрессируются в рас-
тениях и ответственны за опухолевый фенотип кле-
ток корончатого галла. Эти онкогены кодируют
белки, катализирующие образование гормонов рос-
та растений ауксина и цитокинина.
Инсерционная трансформация с участием pTi.
Механизм инсерционной трансформации плазмидой
pTi отличается от механизма трансформации дру-
гих эукариотических систем, описанных в данной
главе, но имеет некоторое сходство с бактериальной
конъюгацией. В хромосоме A. tumefaciens закодиро-
вана информация о функциях, необходимых для
прикрепления бактерий к клеткам растений. Плаз-
мида pTi кодирует цис- и щранс-функции. нужные
для интеграции. Для осуществления интеграции
Т-ДНК на правом ее конце должен присутствовать
сегмент из 25 п.н.; переносятся только те после-
довательности, которые расположены слева от этой
области. Подобная же последовательность встре-
чается на левом конце Т-ДНК. По-видимому, она не
требуется для интеграции, но помогает обозначить
конец интегрируемой Т-ДНК. 7/?анс-функции обес-
печиваются продуктами wr-генов (рис. 5.46). Среди
них имеется сайт-специфическая эндонуклеаза, ко-
торая разрезает нижнюю цепь Т-ДНК в пределах
обеих пограничных последовательностей. З'-конец
ДНК pTi. ближайший к правостороннему разрезу,
служит праймером для синтеза ДНК, замещающей
нижнюю цепь Т-ДНК. Свободная цепь Т-ДНК
переносится в растительные клетки, начиная с
5'-конца правой пограничной последовательности
к З'-концу. Механизм ее включения в случайные
сайты ДНК клеток растений остается неясным.
в. Конструирование векторов
рекомбинантных ДНК
с использованием pTi
Использование плазмид pTi в качестве вектора
рекомбинантных ДНК зависит от того, можно ли
встроить нужный фрагмент в область Т-ДНК, про-
вести отбор и поддерживать рекомбинантные моле-
кулы в клетках A. tumefaciens, с тем чтобы ввести их
затем в клетки растений. Из-за отсутствия уни-
кальных сайтов рестрикции в большой молекуле pTi
прямое включение в нее чужеродной ДНК невоз-
можно, но существует обычный способ встраивания
генов в Т-ДНК. Сама Т-ДНК была вначале клони-
рована в Е. coli (с использованием плазмиды
pBR322). Нужные сегменты ДНК встраивают в
подходящие сайты рестрикции в Т-ДНК выделенной
плазмиды и полученные рекомбинанты повторно
клонируют в Е. coli (рис. 5.48). Если такие плазмиды
ввести путем конъюгации в клетки A. tumefaciens.
которые уже несут плазмиду pTi дикого типа, то
Т-ДНК с встроенным фрагментом перейдет в ре-
зультате гомологичной рекомбинации в область
Т-ДНК интактной плазмиды pTi. Отбор клеток
A. tumefaciens, несущих рекомбинантные плазмиды
pTi, можно осуществить, если в чужеродную ДНК
включить маркирующий ген типа гена neo E.coli.
Репликация рекомбинантной плазмиды pTi в клет-
ках A. tumefaciens и последующее инфицирование
растений ведут к образованию корончатых галлов,
несущих сегмент рекомбинантной Т-ДНК.
Используя те преимущества, которые дает раз-
личие между цис- и нуэанс-функциями плазмиды,
РИС. 5.48.
Конструирование и использование промежуточного
рТ-вектора.
18*
276
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
н
кругом хозяев
РИС. 5.49.
Челночный вектор «Т-ДНК-£. со//». Участок, выделен-
ный серым цветом, происходит иэ R-плазмиды Е. coli
(разд. 5.2), способной реплицироваться в широком
круге грамотрицательных бактерий, включая A. tumefa-
ciens. Он содержит точку ori, гены, необходимые для
репликации и конъюгационного переноса путем моби-
лизации, и ген, ответственный за резистентность к тет-
рациклину (ге/г) и позволяющий проводить отбор.
Стрелками указаны пограничные последовательности
Т-ДНК, которые функционируют как цг/с-последователь-
ности при интеграции с ДНК растительной клетки.
Т-ДНК содержит точку ori репликации pBR322 и ген пео
E.coli, который способен экспрессироваться в расти-
тельных клетках, поскольку он сцеплен с элементом
регуляции транскрипции, обычно инициирующим тран-
скрипцию гена nos плазмиды pTi (направление тран-
скрипции показано стрелкой). Встраивание дополни-
тельных сегментов в Т-ДНК может происходить по
единственному сайту HindXW.
сконструировали относительно простую векторную
pTi-систему. Основной вектор-челночная плазми-
да, способная реплицироваться как в E.coli, так
и в широком круге других бактерий (включая
A. tumefaciens), содержащая оба пограничных сег-
мента Т-ДНК из 25 п.н. (рис. 5.49). Путем клони-
рования в E.coli уже получены производные векто-
ры, содержащие различные вставки слева от пра-
востороннего пограничного сегмента из 25 п.н. Если
перенести такие молекулы конъюгативным путем
в клетки A. tumefaciens, несущие плазмиду pTi дикого
типа, то они реплицируются, а продукты генов,
необходимые для встраивания рекомбинантной пла-
змиды в ДНК растений, будут поставлены генами,
находящимися в транс-положении. Растительные
клетки, инфицируемые такими клетками A. tumefa-
ciens, интегрируют либо Т-ДНК дикого типа, либо
рекомбинантную Т-ДНК, либо и ту и другую.
Функциональные маркерные гены, включенные в
рекомбинантную Т-ДНК, экспрессируются в интег-
рированном состоянии в ДНК растений, если они
оказываются под контролем элементов генома
эукариотической клетки, контролирующих синтез
РНК. Для этого, например, можно подключить
маркерный ген к З'-концу регуляторного участка
гена nos в рекомбинантной Т-ДНК. Если вместо
помощника дикого типа используется плазмида-
помощник pTi, из которой делегированы либо
i/wc-активная последовательность длиной 25 п.н.,
либо весь сегмент Т-ДНК, то способностью к
переносу обладает только рекомбинантная Т-ДНК.
Многие клетки растений тотипотентны (т. е.
способны размножаться, дифференцироваться и
образовывать целые плодоносящие растения). Век-
торные системы, сконструированные на основе
плазмид pTi, в принципе можно использовать для
получения генотипически измененных растений из
трансформированных клеток, и такие опыты уже
поставлены. Кроме того, выполненные исследова-
ния уже позволили получить данные об экспрессии
генов и процессах дифференцировки в нескольких
видах растений.
Глава 6
СРЕДСТВА: КОНСТРУИРОВАНИЕ,
КЛОНИРОВАНИЕ И ОТБОР
РЕКОМБИНАНТНЫХ МОЛЕКУЛ ДНК
В этой главе мы рассмотрим процесс получения
клонированных ДНК. На первом этапе готовят
фрагменты ДНК (вставки), пригодные для после-
дующего лигирования с векторной молекулой. Сле-
дующий этап состоит в самом лигировании. Эти
процессы осуществляются in vitro. Далее рекомби-
нантные молекулы вводят в клетки, где они ампли-
фицируются путем репликации. Затем проводят
клонирование, отбор и дальнейшую амплификацию.
6.1. ВСТАВКИ
а. Общие положения
При конструировании рекомбинантных молекул
обычно используют сложные смеси потенциальных
вставок, и в результате образуется целый набор
клонов, из которого путем скрининга и отбора
получают нужные рекомбинантные молекулы.
Скрининг и отбор можно значительно упростить,
если обогатить исходную смесь нужным сегментом;
в этом случае для выявления искомого рекомби-
нанта приходится проверять значительно меньше
рекомбинантных клонов. С одной стороны, для
конструирования рекомбинантных ДНК можно
использовать очищенные фрагменты ДНК, а с
другой-само молекулярное клонирование является
наиболее простым и эффективным способом очист-
ки фрагментов. Клонирование представляет собой
также наиболее эффективный способ получения
большинства фрагментов геномной ДНК в значи-
тельных количествах.
Существует три источника вставок для клони-
рования: 1) геномная ДНК, фрагментированная
либо с помощью рестриктирующих эндонуклеаз,
либо физическими методами, например с помощью
ультразвука; 2) синтетические фрагменты ДНК,
полученные химическим или ферментативным ме-
тодом либо путем объединения этих двух методов;
3) сегменты ДНК (кДНК), полученные с помощью
ферментативного копирования РНК-матрицы in
vitro. При расщеплении ДНК эндонуклеазами часто
образуются фрагменты, способные к непосредст-
венному лигированию с подходящими липкими или
тупыми концами вектора. В других случаях соот-
ветствующие концы присоединяют к фрагментам
перед лигированием.
б. Вставки геномной ДНК
Эндонуклеазное расщепление. Наиболее прямой
способ получения вставок состоит в расщеплении
суммарной геномной ДНК какого-либо организма
или вируса с помощью рестриктирующей эндо-
нуклеазы. Метод отличается высокой воспроизво-
димостью: специфический фермент разрезает дан-
ную ДНК с образованием уникального набора
фрагментов. Если при эндонуклеазном расщеплении
образуются липкие концы, соответствующие кон-
цам векторной молекулы, то клонирование осущест-
вляют сразу или после обогащения популяции
фрагментами для получения нужной вставки.
Обогащение смеси нужными фрагментами. Для
эффективного разделения сложных смесей фрагмен-
тов используют два метода: электрофорез в по-
лужидкой среде (разд. 4.2.г; рис. 4.10) и жидкостную
хроматографию высокого разрешения с обращенной
фазой. Однако ни один из этих методов не позволяет
получить фрагменты в чистом виде. Обычно пре-
параты содержат примеси других фрагментов,
имеющих близкую длину или обладающих такой же
способностью к элюции. Тем не менее можно по-
лучить значительное обогащение смеси в отношении
нужного фрагмента, что облегчает его выявление
в большой коллекции клонов.
При электрофорезе и хроматографии разделение
фрагментов ДНК основывается на их различии по
размеру и нуклеотидному составу. Если размер
генома невелик, то образуется относительно не-
большое число хорошо разделяющихся фрагментов
(см. рис. 4.10); их легко выделить, собрав нужные
фракции элюата с хроматографической колонки или
вырезав кусочки агарозного геля. Однако если,
расщепляется крупный геном, то хорошо отделяют-
ся лишь некоторые фрагменты. Чаще получается
непрерывный набор фрагментов всевозможных
размеров (рис. 6.1, А). Чтобы понять, в чем тут
дело, проведем простой расчет. Типичный гаплоид-
ный геном млекопитающих содержит примерно
3-109 п.н. Грубую оценку числа фрагментов, обра-
зующихся при исчерпывающем расщеплении эндо-
нуклеазой, можно получить, разделив размер ге-
нома на предполагаемое среднее расстояние (в
парах оснований) между двумя соседними сайтами
для данной рестриктирующей эндонуклеазы (в
278
ЧАСТЬ II, ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Результат электрофореза
суммарной геномной
ДНК. обработанной
рестриктирующей
эндонуклеазой;
окрашивание бромистым
этидием
РИС. 6.1.
Радиоавтограф,
полученный после отжига
препарата А с
З^Р-меченной мРНК
А. Электрофоретическое разделение фрагментов, полу-
ченных в результате расщепления эукариотической ге-
номной ДНК с помощью рестриктирующей эндонуклеа-
зы. Для визуализации фрагментов проводят окрашива-
ние бромистым этидием. Слой геля толщиной от 0,5 мм
до нескольких миллиметров наносят на твердую (на-
пример, стеклянную) подложку. Обычно гели готовят из
полиакриламида или агарозы в забуференном солевом
растворе. Б. Препарат ДНК переносят с геля на нитро-
целлюлозный фильтр по методу, описанному в подписи
к рис. 6.2, и гибридизуют с очищенной 32Р-меченной
мРНК. На рисунке представлен радиоавтограф, полу-
ченный при наложении рентгеновской пленки на нитро-
целлюлозный фильтр.
предположении случайного распределения четырех
оснований). Для фермента, узнающего участок
из шести пар оснований (например, Есо RI или
HindWV), среднее расстояние между сайтами будет
равно 4б (4096) п. н. Если размер сайта узнавания
равен четырем парам нуклеотидов, то он будет
встречаться примерно один раз на каждые 44
(256) п.н. При расщеплении ДНК млекопитающих
ферментами, которые разрезают молекулу по сай-
там узнавания длиной шесть пар нуклеотидов, об-
разуется примерно 7-105 уникальных фрагментов,
а ферментом, сайт узнавания которого составляет
четыре пары нуклеотидов, 12-106 фрагментов. В
результате получается непрерывное распределение
фрагментов по длинам. При этом некоторые фраг-
менты вообще невозможно выявить, поскольку они
представлены в очень малом количестве.
Идентификация специфических фрагментов.
Проблемы, возникающие при идентификации фраг-
ментов, иллюстрирует рис. 6.1, Л. При расщеплении
примерно 50 мкг геномной ДНК и последующем
электрофорезе препарата масса сегмента ДНК дли-
ной 1000 п.н., встречающегося в геноме лишь один
раз, составляет всего 17-ICC 6 mki, или 17 пг. Как
идентифицировать этот специфический фрагмент?
Если имеется гомологичная ДНК или препарат
комплементарной РНК, которые можно использо-
вать в качестве зонда при гибридизации, то ин-
тересующий нас фрагмент можно обнаружить при
отжиге зонда с фрагментами после их денатурации.
Так, в качестве зонда можно использовать очи-
щенную мРНК, соответствующую гену, который
мы хотим клонировать. Иногда в роли зонда вы-
ступает гомологичный ген, клонированный в дру-
гом организме и имеющий достаточно близкую
структуру. Чтобы выявить гибрид, нужно исполь-
зовать меченый зонд. Чаще всего его метят ра-
диоактивным изотопом.
На рис. 6.1, Б представлен результат отжига
в геле 32Р-меченной мРНК, используемой в качестве
зонда, с денатурированными фрагментами (см. рис.
6.1, Л). Геномный фрагмент, комплементарный дан-
ной мРНК, образует с ней дуплекс, и его выявляют
по локализации в геле 32Р-РНК. Определив при-
мерный размер интересующего нас фрагмента,
можно элюировать материал соответствующей об-
ласти другого геля, не прошедшего гибридизацию,
и использовать этот материал для клонирования.
Аналогичным образом можно тестировать фракции
после хроматографического разделения фрагментов
на колонке.
Блоттинг. Почти во всех случаях, подобных
описанным выше, ДНК перед гибридизацией пе-
реносят с геля на более подходящую подложку.
Этот метод (блоттинг) широко используется, на-
пример, для идентификации специфических РНК
и белков после их электрофоретического разделения
(см. разд. 7.7 и 6.4 соответственно). Блоттинг ДНК
назван по имени его изобретателя блоттингом по
Саузерну (или саузерн-блоттингом); соответствую-
щие методики для РНК и белков получили название
нозерн-блоттинга и вестерн-блоттинга.
Гибридизация меченого зонда с фрагментами
ДНК, находящимися в геле, происходит очень
неэффективно. Поэтому перед отжигом фрагменты
переносят из геля на более подходящую твердую
подложку, обычно на нитроцеллюлозный фильтр
или нейлон. Сначала гель обрабатывают щелочью,
чтобы произошла денатурация ДНК. Затем на него
накладывают твердую подложку и пропускают
через гель буферный раствор (рис. 6.2). В результате
фрагменты ДНК переходят на подложку с сохра-
нением их взаимного расположения. Далее инку-
бируют подложку в растворе, содержащем 32Р-зонд,
при такой ионной силе и температуре, которые
обеспечивают образование водородных связей меж-
6. СРЕДСТВА. КОНСТРУИРОВАНИЕ КЛОНИРОВАНИЕ И ОТБОР
279
РИС. 6.2.
Блоттинг ДНК. На пластину геля накла-
дывают нитроцеллюлозный фильтр того
же размера, что и гель, и пропускают
буферный раствор. Фрагменты ДНК
переносятся на нитроцеллюлозный
фильтр и фиксируются на нем. Анало-
гичные процедуры используются и при
переносе РНК и белка с геля на твердую
подложку.
ду зондом и комплементарным фрагментом ДНК.
Чувствительность метода зависит от удельной
радиоактивности зонда и позволяет зарегистриро-
вать фрагменты, когда их количество измеряется
пикограммами. Например, 32Р-меченные зонды,
полученные с помощью ник-трансляции (разд.
4.6.6), имеют удельную радиоактивность более
100 имп./мин на 1 пг, что достаточно для визуа-
лизации радиоавтографов.
Случайная фрагментация геномной ДНК. Длин-
ные молекулы ДНК легко ломаются даже при
незначительных гидродинамических напряжениях,
и их можно подвергнуть случайной фрагментации
с помощью ультразвука, путем быстрого переме-
шивания раствора или пропускания его через не-
большое отверстие. Для получения случайного на-
бора перекрывающихся фрагментов можно исполь-
зовать и рестриктирующие эндонуклеазы, если
проводить опыт в таких условиях, когда расщепле-
ние происходит лишь в небольшом числе имею-
щихся сайтов. Средний размер образующихся
фрагментов зависит от величины прикладываемого
усилия и от концентрации эндонуклеазы. Обычно
ДНК выделяют из большой популяции клеток,
поэтому исходные ее препараты всегда представ-
лены большим числом идентичных геномов. Каж-
дый сегмент ДНК присутствует в конечном наборе
во фрагментах разных размеров, что не позволяет
очистить его перед клонированием. Тем не менее
случайные наборы фрагментов имеют преимущест-
во перед наборами, получаемыми в результате
полного гидролиза рестриктирующей эндонуклеа-
зой, поскольку вероятность нахождения хотя бы
одной копии нужного сегмента целиком в одном
фрагменте у них значительно выше.
Вырезание определенных сегментов хромосом.
Если положение данного гена в хромосоме известно
и хромосома достаточно велика, чтобы проводить
с ней различные манипуляции, можно выщепить ее
часть, которая содержит нужный ген. Этим тре-
бованиям удовлетворяют политенные хромосомы
слюнных желез Drosophila. Каждая такая хромосома
содержит более 1000 копий ДНК, расположенных
параллельно друг другу, так что небольшой сегмент
может включать 1000 копий определенного гена.
Генетические и цитогенетические исследования поз-
волили более или менее точно установить поло-
жение многих генов Drosophila. Используя фазо-
во-контрастную микроскопию, можно локализовать
область хромосомы, содержащую определенный
ген, и вырезать ее тонкой иглой (рис. 6.3). Таким
методом получают сегменты генома длиной около
200 т.п.н., которые далее разрезают рестриктирую-
щими эндонуклеазами и включают в векторные
РИС. 6.3.
Вырезание определенной области политенной Х-хро-
мосомы Drosophila тонкой стеклянной иглой (С любез-
ного разрешения U. Pirotta.)
280
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
молекулы. Достигаемое при этом обогащение весь-
ма значительно, поскольку на долю 200 т.п.н.
приходится лишь около 0,1% от 1,8-10® п.н., состав-
ляющих весь геном.
в. Синтетические вставки
Успехи, достигнутые в создании методов хими-
ческого синтеза, позволили синтезировать из прос-
тых нуклеозидов молекулы ДНК длиной до 50
остатков. Такие молекулы, которые трудно полу-
чить другим путем, можно затем клонировать и
выделить в больших количествах. Например, скри-
нинг определенного гена может оказаться невоз-
можным в отсутствие соответствующего зонда.
Однако такой ген можно синтезировать in vitro, если
исходя из аминокислотной последовательности со-
ответствующего полипептида установить нуклео-
тидную последовательность. Именно таким спосо-
бом были впервые клонированы в клетках E.coli
сегменты, кодирующие гормоны соматостатин и
инсулин. Эти сегменты получали, синтезируя от-
дельные олигонуклеотидные блоки и объединяя их
затем при помощи ДНК-лигазы. На рис. 6.4 показан
процесс синтеза гена соматостатина. Было синте-
зировано восемь коротких одноцепочечных фраг-
ментов ДНК. Их отжигали и получали двухцепо-
чечные молекулы, стабилизированные водородны-
ми связями, образующимися между комплементар-
ными концевыми последовательностями. Поскольку
все синтетические продукты имели на 5'-концах
гидроксильные группы, перед лигированием концы
фосфорилировали с помощью полинуклеотидкина-
зы и АТР. На рис. 6.4 соответствующие фосфатные
группы окрашены. Впоследствии из 66 коротких
синтетических фрагментов был воссоздан ген ин-
сулина длиной 514 п.н. Следует отметить, что
в связи с вырожденностью генетического кода
установление истинной нуклеотидной последова-
тельности гена исходя из известной последователь-
ности аминокислотных остатков в соответствую-
щем полипептиде оказывается невозможным. Тем
не менее удалось определить и синтезировать функ-
циональную кодирующую последовательность.
Синтезировать нуклеотидную последователь-
ность целого гена очень трудно. Однако большую
ценность представляет синтез даже коротких участ-
ков кодирующей последовательности, поскольку
в отсутствие других зондов участки длиной 15-20
нуклеотидов можно использовать в качестве спе-
цифических зондов при гибридизации. Синтетиче-
ские зонды используются при саузерн- и нозерн-
гибридизации, а также для скрининга рекомбинант-
ных клонов (разд. 6.4). Кроме того, короткие син-
тетические последовательности применяются в каче-
стве праймеров при определении нуклеотидных пос-
ледовательностей длинных сегментов ДНК (разд.
7.2), а также при ферментативном синтезе ДНК на
молекулах РНК с помощью обратной транскрип-
тазы. Другой важной областью применения опи-
санной технологии синтеза является получение
коротких сегментов ДНК, содержащих сайты уз-
навания для известных рестриктирующих эндонук-
леаз. Такие сегменты-линкеры лигируют с тупыми
концами фрагментов ДНК, встраиваемых в век-
торные молекулы (разд. 6.2).
Химический синтез полидезоксинуклеотидов. Для
химического синтеза полидезоксинуклеотидов ши-
роко применяют два метода. В обоих случаях
исходными строительными блоками являются де-
зоксирибонуклеозиды, и оба метода включают этап
связывания мононуклеотидов и олигонуклеотидов.
Методы полностью автоматизированы; при этом
используется установка «Синтезатор ДНК».
Независимо от метода первым условием являет-
ся защита тех реакционноспособных групп дезокси-
нуклеозидов, которые не участвуют в связывании.
Так, аминогруппы дезоксиаденозина и дезоксици-
тозина обычно бензоилируют, а к аминогруппе
гуанозина присоединяют остаток изомасляной кис-
лоты (рис. 6.5). Тимидин, у которого аминогруппа
отсутствует, используется немодифицированным.
5'-гидроксильные группы обычно защищают путем
образования эфирной связи с 4,4'-диметокситрифе-
нилметильным соединением, которое называют
диметокситритилом, или сокращенно (МеО)2Тг
(рис. 6.6). По завершении синтеза все присоединен-
ные группы должны быть удалены. Свободные ами-
ногруппы восстанавливаются при мягком щелоч-
ном гидролизе аминоацильных единиц, а димето-
кситритильные группы удаляются с помощью мяг-
кого кислотного гидролиза.
Фосфаттриэфирный (или фосфотриэфирный)
метод. Нуклеозид с присоединенной диметокситри-
___________1__________________________2____________________________3___________________________4______________
5' НО ApApTpTpCpApTpGpGpCpTpGpGpTpTp GpTp ApApGpApApCpTpТрСрТр ТрТ рТpGpGpApApGpApCpTpTpTpCpApCpTpTpCpGpTpGpTpTpGpApTpApG —ОН 3’
3>_ НО GpTpApCpCpGpApCpCpApApCpApTpTpCpTpTpGpApApGpApApApApCpC₽TpTpCpTpGpApApApGpTpGpApApGpCpАрСрАрАрСрТрАрТрСрСрТрApG~OH 5*
I________________________________II________________________II___________________________II----------—-------------1
5 6 7 8
РИС. 6.4.
Синтез гена соматостатина путем лигирования коротких фосфомонозфирные группы (р), присоединенные с
одноцепочечных олигодезокси рибонуклеотидов, синте- помощью полинуклеотидкиназы в присутствии АТР.
зированных химическим методом. Цветные кружки-
6. СРЕДСТВА: КОНСТРУИРОВАНИЕ, КЛОНИРОВАНИЕ И ОТБОР
281
N-бензоилдезоксиаденозин
N-бензоилдезоксицитидин
РИС. 6.5.
N-ацилзащищвнныв двзоксирибо-
нуклеозиды- исходные продукты для
химического синтеза полидезокси-
рибонуклеотидов.
Ы-изобутириддезоксигуанозин
тильной группой можно без каких-либо дополни-
тельных модификаций использовать для синтеза
фосфодиэфира путем присоединения к З'-ОН-груп-
пе, например, w-хлорфенилфосфордихлоридата (рис.
6.7). Этот диэфир может служить прямым пред-
шественником 5'-конца новой цепи. Далее такой
диэфир превращается в триэфир с помощью, напри-
мер, Р-цианоэтанола. Затем 5'-диметокситритиль-
ная группа удаляется путем мягкого кислотного
гидролиза, в результате чего образуется реакцион-
носпособная 5'-гидроксильная группа (рис. 6.7).
Диэфир и триэфир смешивают в присутствии реа-
гентов, стимулирующих их связывание (рис. 6.8),
обычно арилсульфониловых соединений, например
триизопропилбензолсульфонилхлорида. Точный ме-
ханизм связывания неизвестен. Продуктом реакции
(рис. 6.8, А) является полностью защищенный ди-
нуклеотид. При удалении всех защищающих групп
образуется простой динуклеозидмонофосфат (рис.
6.8, Ь). Существенно, что полностью защищенный
динуклеотид является хорошим исходным продук-
том для создания более крупных молекул. При
обработке кислотой (например, бензолсульфоновой)
или ZnBr2 диметокситритиловая группа удаляется
и динуклеотид может играть роль З'-конца растущей
цепи (рис. 6.8, В). При обработке же триэтиламином
преимущественно гидролизуется цианоэтиловый
эфир, в результате чего динуклеотид приобретает
реакционноспособный 3'-конец, который может слу-
он
РИС. 6.6.
носн2 pg
I /°\|
(СНзО)гТг ОСН2 рв
- в
он
Защита 5'-ОН-группы с помощью ди-л-метокситритил-
хлорида. На этом и следующих рисунках РВ-защи-
щенное пуриновое или пиримидиновое основание.
жить 5'-концом удлиняющейся цепи (рис. 6.8, Г).
Связывание двух динуклеотидов дает тетрануклео-
тид (рис. 6.8, Д). Аналогично соответствующим об-
разом защищенные мононуклеотиды и олигонук-
леотиды могут соединяться в длинные блоки. В за-
висимости от выбора исходного материала синтез
цепей ДНК идет в направлении 3' -> 5' или 5' -> 3'.
Фосфаттриэфирный метод можно упростить
и процесс синтеза ускорить, если фиксировать один
из концевых нуклеотидов с помощью гидроксиль-
ной группы на твердом носителе. В принципе
фиксирована может быть любая гидроксильная
группа, но обычно реакция идет лучше, если закреп-
лен З'-гидроксил. Обычно фиксация осуществляется
путем образования эфирной связи между З'-ОН-
группой и карбоксильной группой на носителе,
например на пористом стеклянном шарике (рис.
6.9). В этом случае первый нуклеотид оказывается
фиксированным, а З'-ОН-группа-защищенной. Да-
лее последовательно добавляются нуклеотиды или
олигонуклеотиды с 5'-ОН-группами, защищенными
диметокситритилом. Перед каждым следующим эта-
пом присоединения диметокситритил удаляется
(рис. 6.7), в результате чего образуется свободная
5'-ОН-группа, по которой может происходить даль-
нейшее наращивание цепи. По окончании синтеза
полидезоксинуклеотид отсоединяют от носителя
с помощью щелочного гидролиза (рис. 6.9). При
такой процедуре синтеза не нужно проводить до-
полнительную очистку после каждого акта наращи- •>
вания цепи, как при других способах. Метод с ис-
пользованием фиксации на носителе был автома-
тизирован, при этом синтез полимера длиной 10-20
нуклеотид занимал несколько суток.
Фосфиттриэфирный (или фосфорамидитный)
метод. Основным исходным продуктом в этом
случае тоже являются дезоксинуклеозиды с защи-
щенными аминогруппами и 5'-диметокситритило-
вой группой (рис. 6.5 и 6.6). На схеме, представлен-
ной на рнс. 6.10, З'-гидроксильная группа концевого
нуклеозида защищена путем фиксации ее на твер-
дом носителе с помощью эфирной связи. Пред-
282
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Предшествен-
ник 5'конца
синтетической
полидезокси-
нуклеотидной
цепи
hoch2ch2cn
РИС. 6.7.
Синтез интермедиатов для фосфаттриэфир-
ного метода. Первая реакция синтез за-
щищенного фосфодиэфира с использова-
нием л-хлорфенилфосфордихлоридата. Этот
фосфодиэфир может быть превращен в
фосфотриэфир с помощью Р-цианоэтано-
па, а 5'-ди-л-метокситритильная группа
может быть удалена при мягком кислотном
гидролизе с помощью бензолсульфоновой
кислоты.
I______________________I
Предшественник З’-конца
синтетической полидезокси-
нуклеотидной цепи
шественником следующего остатка является защи-
щенный дезоксинуклеозид-З'-фосфорамидит, кото-
рый активируется с помощью тетразола. Скорость
процесса и его эффективность зависят от фосфор-
амидитов, стабильных и эффективно связывающих-
ся, легко синтезируемых агентов (рис. 6.11). Проме-
жуточным продуктом реакции связывания является
фосфит. Он окисляется до фосфата (триэфира)
с помощью иода. Как и в предыдущем случае,
триэфир защищает новую межнуклеотидную связь
от гидролиза во время последующих этапов син-
теза. По завершении синтеза цепи удаляют раз-
личные защищающие группы и освобождают по-
лидезоксинуклеотид от твердого носителя с по-
мощью щелочного гидролиза. Фосфитный метод
с твердыми носителями, полученными на основе
силикагелей (или с использованием пористых стек-
лянных шариков), применяют при автоматизиро-
ванном последовательном синтезе олигодезоксири-
бонуклеотидов. Присоединение каждого нуклеотид-
ного остатка занимает менее 15 мин, при этом
могут синтезироваться цепи длиной до 50 остатков
с хорошим выходом.
Ферментативные методы. Ферментативный син-
тез коротких полидезоксирибонуклеотидов с задан-
ной последовательностью представляется менее
сложным, чем химический синтез, и соответствую-
щие процедуры более просты в исполнении (если не
применяется автоматический ДНК-синтезатор). Для
ферментативного синтеза не нужно использовать
защитные соединения. Однако реакции имеют свои
ограничения и с трудом поддаются контролю. При
синтезе используется бактериальный фермент поли-
нуклеотидфосфорилаза, специфичный в отношении
рибонуклеотидов, но способный катализировать
и полимеризацию дезоксирибонуклеотидов (хотя
и с небольшой скоростью), если вместо Mg2 +
использовать Мп2+ (рис. 6.12, Л). Субстратами
всегда служат дезоксирибонуклеозидфосфаты, при
этом никакой матрицы не требуется. К праймерам
длиной не менее трех остатков присоединяются за
один раз один или два дезоксирибонуклеотидных
остатка. На рис. 6.12, Б представлен синтез доде-
кануклеотида (полинуклеотида из 12 звеньев), ко-
торый соответствует сегменту гена изоцитохрома
с дрожжей-
Химический и ферментативный методы могут
применяться совместно. При этом используется
либо ДНК-полимераза I, либо обратная транскрип-
таза. На рис. 6.13 представлены два частично
комплементарных олигодезоксинуклеотида, синте-
зированных химическими методами. Дуплексную
молекулу легко получить, используя одноцепочеч-
ные участки в качестве матрицы, на которой син-
6. СРЕДСТВА: КОНСТРУИРОВАНИЕ, КЛОНИРОВАНИЕ И ОТБОР
283
РВ1
РВ2
о
II
3' -о—р—och2ch2cn
o=s=o
Cl
1-(2,4,6)-триизопропилбензолсульфонилхлорид
(ТПС)
РИС. 6.8.
Химический синтез дидезоксирибонуклеотида фосфат-
триэфирным методом. К полностью защищенному ди-
нуклеотиду (рис. А) после удаления защищающих групп
могут присоединяться другие звенья. Показана структу-
ра соединяющего агента, 1-(2,4,6)-триизопропилбен-
золсульфонилхлорида (ТПС). Дезоксирибонуклеотиды
представлены в упрощенном виде.
284
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
' Удаление
защитных групп
РИС. 6.9.
Синтез полидезоксирибонуклеотида
фосфаттризфирным методом на твер-
дом носителе [ТПС-1-(2,4,6)-триизо-
пропил бензол сульфонилхлорид].
РИС. 6.10.
Синтез полидезоксирибонуклеотида на твердом носи-
теле фосфиттриэфирным (фосфорамидитным) мето-
дом.
РВ1
о
ZnBr; ИЛИ ,
PR'
дихлоруксусная Q
кислота
------► -С—О-
5 1-ОТг(ОСН3)2
Lon
СН3О РВ2
I
Р—о—
I
/ \ L-OTr(OCH3)2
Сн сн _
। Дезоксинуклеозид
(СН3)2 (СН3)2 -З'-фосфорамидат
I Тетразолий
о
РВ1
РВ2
—С —о-
осн3
LО—Р—О *-ОТг(ОСН3)2
'г
о
РВ1
—с—о— сн3~о
L-О—р— о
РВ2
—ОТг(ОСН3)2
о
ZnBr 2
о
РВ1
РВ2
СН3О РВ3
о
РВ1
РВ2
РВ3
—с—о—
LO—Р—о
о
р—о—
-ОН
L-OTr(O
(СН3)2
(СН3)2
—с—о—
осн3
L-o—р—о
о
*2
О ОТг(ОСН3)2
в1
в2
В3
о
РВ1
РВ2
РВ3
ОН-
О-
*—О—Р—О
о
о~
*—О—Р—о'
1-ОН
о
2.
3.
Т риэтиламмоний-
феноксид
NH3OH
Уксусная кислота
—с—о-
осн
*-О—Р— о
*-0—
— ОТг(ОСН312
о
о
6. СРЕДСТВА: КОНСТРУИРОВАНИЕ, КЛОНИРОВАНИЕ И ОТБОР
285
(СН3О)2ТгОСН2
(Сн3О)2ТгОСН2
CH3OPN[cH(CH3|2]2
Диизопропиламмоний -
тетразолид
| хСН(СНз)г
СНзО-Р— N
хСН(СНз)г
РИС. 6.11.
Синтез дезоксирибонуклеозид-З'-фосфор-
амидита- интермедиата, использующегося
в фосфиттриэфирном (фосфорамидитном)
методе.
тезируется вторая цепь с помощью ДНК-полиме-
разы I или обратной транскриптазы (см. рис. 4.19).
г. Копирование РНК
с образованием ДНК
Методы, использующиеся для анализа РНК,
менее совершенны, чем аналогичные методы ис-
следования ДНК. Чтобы определить первичную
структуру молекулы РНК, проще всего получить
с нее ДНК-копию, клонировать эту копию и опре-
делить ее нуклеотидную последовательность. Мо-
лекулы ДНК, синтезируемые путем ферментатив-
ного копирования РНК-матрицы, получили назва-
ние кДНК (от «комплементарной ДНК» или «ДНК-
копии»), В качестве матриц могут использоваться
очищенные РНК или смесь молекул РНК, например
мРНК из какой-либо ткани или популяции клеток.
Хорошим источником РНК являются высоко-
дифференцированные ткани и клетки, продуцирую-
щие в большом количестве определенные мРНК.
Например, в первых успешных работах по иссле-
дованию семейства овальбуминовых генов (гл. 7).
в которых была применена техника работы с реком-
бинантными молекулами ДНК, использовали
мРНК, выделенную из специализированных клеток,
синтезирующих в большом количестве определен-
ные белки. Клонированные кДНК использовались
в качестве зондов для выделения соответствующих
генов.
Копирование эукариотической мРНК. Общие
принципы синтеза двухцепочечной кДНК на мРНК
описаны в разд. 4.7 (см. рис. 4.20). На первом этапе
последовательность мРНК копируют с помощью
обратной транскриптазы и получают комплемен-
тарную одноцепочечную ДНК. РНК служит матри-
цей, а в качестве праймера используется короткая
последовательность oligo(dT), комплементарно спа-
ренная с oligo(rA) на конце РНК. На втором этапе
осуществляют деградацию РНК-матрицы либо с
помощью рибонуклеазы, либо путем щелочного
гидролиза. Затем используют одноцепочечную
кДНК в качестве матрицы для синтеза комплемен-
тарной цепи ДНК с помощью ДНК-полимеразы
I или обратной транскриптазы. На этом этапе
праймер не нужен, поскольку на З'-конце первой
структуры временно образуется шпилька варьи-
рующей длины, которая и служит праймером. На
последнем этапе эту шпильку разрезают с помощью
нуклеазы, специфичной в отношении одноцепочеч-
ной ДНК, и получают дуплексную кДНК.
Копирование других РНК. Для получения кДНК
на основе геномов некоторых РНК-содержащих
вирусов или других молекул РНК, не имеющих на
конце oligo(rA), необходимы некоторые ухищрения.
В частности, к З'-ОН-концу РНК можно присоеди-
нить участок poly (А), используя poly (А)-полимеразу
(разд. 4.9) и АТР. Далее всю последовательность
реакций можно проводить так же, как и раньше.
Альтернативный подход состоит в отжиге с данной
РИС. 6.12.
А. Присоединение одного дезоксирибонуклео-
тидного остатка к олигодезоксирибонуклеотиду,
катализируемое полинуклеотидфосфорилазой. Б.
Ферментативный синтез сегмента гена изоцито-
хрома с дрожжей На каждом этапе присоеди-
няются один или два новых дезоксирибонуклео-
тидных остатка.
dCDP dADP
d(pTpTpApG) ——► d(pTpTpApGpC) > d(pTpTpApGpCpA)
IdGDP
d(pTpTpApGpCpApGpApA) * d(pTpTpApGpCpApG)
dCDP I
* dGDP
d(pTpTpApGpCpApGpApApCpC) » d(pTpTpApGpCpApGpApApCpCpG)
286
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
5'-НО- GpGpTpGpTpApApGpApApCpTрТ рСрТ-ОН-3'
3'-HO-CpTpTpGpApApGpApApApApCpC-OH-5'
ДНК-полимераза,
dTTP, dGTP. dCTP, dATP
5-HO-GpGpTpGpTpApApGpApApCpT pT pCpTpT pTpTpGpG-OH-3’
3’-HO- CpCp ApCpApTpTp CpT pT pGpApApGpApApApApCpC-OH-5"
РИС. 6.13.
Синтез полидезоксинуклеотида с помощью хи-
мического и ферментативного методов. Две час-
тично комплементарные цепи (верхняя часть ри-
сунка) синтезированы химическим методом и
подвергнуты отжигу. Образовавшийся несовер-
шенный дуплекс используется в качестве матрицы
и праймера для синтеза полностью дуплексной
молекулы с помощью ДНК-полимеразы I E.coli
или обратной транскриптазы.
РНК олигодезоксирибонуклеотида, комплементар-
ного какому-либо участку молекулы, для образо-
вания праймера.
Осложнения. На рис. 4.20 схематически пред-
ставлена некая идеализированная схема синтеза
кДНК. На практике же на каждом этапе, начиная
с приготовления очищенного препарата мРНК,
возникают сложности, в результате чего конечный
продукт обычно представляет собой смесь молекул
кДНК, большинство из которых оказываются более
короткими, чем полноразмерная РНК. Перечислим
некоторые из возникающих проблем. I. мРНК
может частично деградировать при выделении под
действием рибонуклеаз. 2. мРНК может копиро-
ваться неполностью, в результате чего на 5'-конце
кДНК будет недоставать каких-то последователь-
ностей. Чем длиннее молекула РНК. тем больше
вероятность, что эта проблема возникнет. 3. Синтез
второй цепи ДНК может остановиться прежде, чем
кончится матрица, так что З'-конец РНК будет
пропущен. Оставшийся конец первой цепи будет
удален с помощью нуклеазы, специфичной в от-
ношении одноцепочечных молекул. 4. Нуклеаза
может отщепить не только шпильку, но и концы
дуплекса.
Все это, а также тот факт, что даже высоко-
очищенные препараты РНК никогда не бывают
абсолютно гомогенными, приводит к тому, что
препараты двухцепочечных молекул кДНК всегда
представляют собой смесь разных молекул. Раз-
делить такие смеси невозможно ни физическими, ни
химическими методами. Однако с помощью мо-
лекулярного клонирования кДНК удается получить
абсолютно чистые сегменты ДНК.
Серьезные проблемы, возникшие при синтезе
полноразмерных копий кДНК на РНК-матрицах
с помощью стандартных методов, определили не-
удачу многих экспериментов. Чтобы решить эти
проблемы, пришлось затратить много усилий. Один
из путей состоял в отказе от использования нуклеа-
зы. В этом случае к З'-концу первой цепи ДНК
с помощью терминальной дезоксинуклеотидил-
трансферазы присоединяли poly (dC) и использовали
oligo (dGj-праймер для синтеза второй цепи [можно
использовать также oligo(dA) и oligo(dT)].
На рис. 6.14 представлен другой метод, в ко-
тором устранен главный недостаток, свойственный
стандартному методу,-синтез неполных копий
РНК. Во-первых, oligo(dTj-праймер включается в
состав плазмидного вектора E.coli, так что кДНК
может синтезироваться непосредственно на векторе.
В результате исключаются этапы выделения и
лигирования. Во-вторых, не применяется специфич-
ная к одноцепочечной ДНК нуклеаза, благодаря
чему последовательности, соответствующие 5'-кон-
цу мРНК, не утрачиваются. В-третьих, молекулы
ДНК, синтез которых не доходит до конца РНК-
матрицы, содержат заглубленный З'-конец, который
является неэффективным субстратом для термини-
рующей трансферазы (разд. 4.8). При таком подходе
получают популяцию рекомбинантных ДНК, обо-
гащенную полноразмерными копиями РНК в виде
кДНК, способными осуществлять трансфекцию
клеток-хозяев.
Немного модифицировав этот метод, можно
получить плазмиды, содержащие молекулы кДНК
в форме, способной экспрессироваться в клетках
эукариот. Модификация состоит во включении
эукариотического промотора и сигналов процес-
синга РНК в линкерный сегмент, показанный на
рис. 6.14.
6.2. ЛИГИРОВАНИЕ ВЕКТОРА
СО ВСТАВКОЙ
После того как получены вектор и вставка,
можно приступать к конструированию рекомби-
нантных ДНК. Обычно нужно осуществить только
два двухцепочечных соединения независим'6 от
того, представляет ли собой вектор линейную
плазмиду или вирусный геном или два плеча ДНК
фага А. объединены в одну линейную молекулу по
co.s-сайтам. Если вставки имеют тупые концы, то
перед лигированием для его облегчения к ним часто
присоединяют липкие концы.
а. Соединение концов
Рассмотрим четыре возможные ситуации: вектор
и вставка имеют полностью совпадающие липкие
концы (рис. 6.15, Л); две разные пары совпадающих
6. СРЕДСТВА: КОНСТРУИРОВАНИЕ, КЛОНИРОВАНИЕ И ОТБОР
287
Е. coli
РИС. 6.14.
Клонирование полноразмерных молекул кДНК. Коль-
цевой специально сконструированный плазмидный век-
тор Е. coli, полученный из pBR322, превращают в линей-
ную форму с помощью рестриктирующей эндонуклеазы
(Kpnl), которая разрезает молекулу в одном из сайтов
в несущественной области. С помощью терминальной
дезоксинуклеотидилтрансферазы к З'-концам молекулы
присоединяют остатки dT. Затем один из oligo (dT)-
участков удаляют, используя соответствующую рестрик-
тирующую эндонуклеазу (/7pal), в результате чего об-
разуется тупой конец. При этом способе oligo (dT),
используемый в качестве праймера в первой реакции
обратной транскрипции, является составной частью
плазмидного вектора. Вектор содержит также уникаль-
ный сайт для рестриктирующей эндонуклеазы (в данном
случае Hind III), расположенный вблизи конца, противо-
положного тому, который содержит oligo (dT), в не-
существенной области. После отжига с РНК и синтеза
первой цепи кДНК к соответствующим З'-концам при-
соединяют с помощью терминальной дезоксинуклеоти-
дилтрансферазы «хвосты» oligo (С). Затем лишние ос-
татки С убирают, используя эндонуклеазу Hindlll, и за-
мещают путем лигирования с заранее приготовленным
сегментом с G-«хвостом» на одном конце и липким
/У/лсПII-сайтом на другом. С помощью этого фрагмен-
та два конца конструкции объединяются с образованием
кольцевой структуры. Наконец, с помощью РНКазы
Н удаляют цепь РНК и замещают ее цепью ДНК (при
этом G-«xboct» является праймером для ДНК-полиме-
разы), а кольцевую структуру сшивают ДНК-лигазой.
При всех манипуляциях необходимо поддерживать ус-
ловия, способствующие сохранению гетеродуплексной
структуры, поскольку РНК удерживается на векторе
благодаря комплементарному спариванию. Заметим
также, что гибридная PH К-ДНК устойчива к действию
Hindlll, в противном случае расщепление происходило
бы также по любому из находящихся во вставке
/У/лсП II-сайту.
концов (рис. 6.15, 5); тупые концы (рис. 6.15, В); пару
совпадающих липких и пару тупых концов (рис.
6.15,7Э- Структура вектор вставка, в которой каж-
дый из компонентов содержит один липкий и один
тупой концы (рис. 6.15,7), может образоваться
только одним способом. То же самое относится
к случаю, когда вектор и вставка имеют по два
разных совпадающих липких конца (рис. 6.15, Ь).
В тех же случаях, когда каждая молекула имеет два
идентичных липких конца (рис. 6.15, Л) или два
тупых конца (рис. 6.15, В), вставка может быть
встроена в любой из двух возможных (противо-
положных) ориентаций относительно вектора, в
результате чего образуются два разных продукта.
Липкие концы вектора и вставки соединяют с
помощью ДНК-лигазы в условиях, способствующих
образованию водородных связей между комплемен-
тарными участками. Для объединения тупых концов
ДНК-лигаза Т4 и фрагменты должны присутство-
вать в высоких концентрациях, поскольку лигаза
имеет низкое сродство к тупым концам.
Помимо лигирования вектора и вставки может
288
ЧАСТЬ II ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Отжиг, лигирование
(f. СОИ или Т4)
Лигирование (Т4)
РИС. 6.15.
Лигирование вставки и вектора. Напомним,
что ДНК-лигаза Е. coli не способна катали-
зировать воссоединение фрагментов с ту-
пыми концами (разд. 4.5).
происходить внутримолекулярное лигирование этих
двух компонентов, в результате чего выход ре-
комбинантных молекул снижается (рис. 6.16). Ве-
роятность таких побочных реакций можно умень-
шить, проводя перед лигированием дефосфорили-
рование либо вектора, либо вставки (рис. 6.17).
В отсутствие 5'-фосфомоноэфирных групп внутри-
молекулярное лигирование осуществляться не мо-
жет. Обычно дефосфорилируют векторную моле-
кулу, чтобы свести к минимуму ее способность
к амплификации после трансфекции. Вставка, замк-
нувшаяся в кольцо, не способна к репликации,
поэтому с ней возникает меньше проблем. Как
показано на рис. 6.17, рекомбинантная молекула.
6. СРЕДСТВА. КОНСТРУИРОВАНИЕ, КЛОНИРОВАНИЕ И ОТБОР
289
РИС. 6.16.
Побочные продукты лигирования: внутри-
молекулярное спаривание.
образовавшаяся из дефосфорилированной вектор-
ной молекулы, содержит по одному пробелу в
каждой из цепей. Такие молекулы легко репари-
руются в клетках соответствующих хозяев.
б. Присоединение липких концов
Встраивание сегментов ДНК в векторные мо-
лекулы облегчается, если эти сегменты и вектор
имеют одинаковые липкие концы. Существуют два
удобных способа образования липких концов у
сегментов ДНК с тупыми концами (таких, как
кДНК): образование одноцепочечных «хвостов»
и введение сайтов рестрикции.
Образование одноцепочечных «хвостов». Если с
помощью терминальной дезоксинуклеотидилтранс-
феразы нарастить каждый из З'-гидроксильных
концов двухцепочечной вставки с тупыми концами
и присоединить комплементарные нуклеотиды к
концам линейной векторной ДНК, то при отжиге
образуется кольцевая рекомбинантная молекула
(рис. 6.18). Если размер «хвостов» одинаков, то
концы легко сшиваются ДНК-лигазой. Однако
такая ситуация встречается редко, поэтому перед
РИС. 6.17.
Дефосфорилирование, препятствующее внут-
римолекулярному лигированию векторной
молекулы.
19 243
290
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
5'—р( QOH-3-
3-НО ( о Р- 5
Терминальная
дезоксинуклеотидилтранс-
фераза
5'-Р( АААААГ) ОН-3'
3'-НО(ААААА On- А-
Отжиг
ДНК-полимераза I + dATP+ dTTP
ДНК-лигаза
РИС. 6.18.
Присоединение липких концов с помощью терминаль-
ной дезоксинуклеотидилтрансферазы.
лигированием бреши заполняют с помощью ДНК-
лолимеразы 1. Напомним также, что для терми-
нальной дезоксинуклеотидилтрансферазы требуют-
ся одноцепочечные З'-гидроксильные концы в ка-
честве праймеров и что для эффективного нара-
щивания дуплексных молекул ДНК с тупыми кон-
цами или молекул, у которых З'-гидроксильные
концы заглублены (разд. 4.8), необходимы особые
условия.
Введение сайтов рестрикции. Короткие фрагмен-
ты ДНК с тупыми концами, содержащие после-
довательности с сайтами для специфических рес-
триктирующих эндонуклеаз, получают путем хими-
ческого синтеза. Структуры двух таких «линкеров»
и способ получения с их помощью липких концов
у вставки с тупыми концами показаны на рис. 6.19.
Соединение линкера со вставкой катализируется
Т4-лигазой. Затем эту ДНК обрабатывают соот-
ветствующей рестриктирующей эндонуклеазой,
чтобы получить липкие концы. На этом последнем
этапе возникают проблемы. Если фрагмент, к кото-
рому присоединены линкеры, содержит сайт узна-
вания для используемого фермента, то образование
липких концов приводит к нарушению целостности
фрагмента. Эту проблему можно решить двумя
способами. Первый состоит в использовании дру-
гого линкера. Второй основан на защите внутренних
сайтов путем метилирования с помощью метилазы,
специфичной в отношении данного сайта (рис. 6.20
и разд. 4.2.д).
Линкеры используют также для образования
одинаковых липких концов у молекул вставки
и вектора, имеющих разные липкие концы. Послед-
ние сначала превращают в тупые с помощью спе-
цифичной к одноцепочечным участкам нуклеазы или
путем достройки заглубленных концов с помощью
ДНК-полимеразы I или обратной транскриптазы,
а затем присоединяют линкеры.
6.3. ИНФЕКЦИЯ, ТРАНСФЕКЦИЯ
И КЛОНИРОВАНИЕ
а. Перенос рекомбинантных молекул
из пробирки в клетку
Сконструированные рекомбинантные молекулы
ДНК вводят в клетки или вирусные частицы для
клонирования и амплификации с помощью мето-
дов, описанных в гл. 5. Для разных систем хо-
зяин-вектор применяются разные методы. Напом-
ним, что рекомбинантные ДНК, сконструированные
на основе бактериальных и дрожжевых плазмид или
вирусов эукариот, трансфицируются в хозяйские
клетки только после того, как клеточные мембраны
(или стенки) становятся проницаемыми. Рекомби-
нанты, сконструированные с использованием Х-век-
6. СРЕДСТВА: КОНСТРУИРОВАНИЕ, КЛОНИРОВАНИЕ И ОТБОР
291
Присоединение
Есо RI- линкеров
П рисоединение
Hind\I Клинкеров
5'—р №|fgCTTSS()
3'-НО- fcGTTCGAACCf)
Тд-лигаза
5'—Р yCCAAGCTTGG CCAAGCTTGGT. OH-3
3'—НО—(OGTTCGAACC GGTTCGAACCl) р-5'
Есо RI
5'—р (AATTGC
З'-НО-tti^ Р-5'
5'-p(«oe^d& Oh 3'
3--НО-(.<АОС G6TTg&A%) Р-5-
MndJH
РИС. 6.19.
Образование липких концов с помощью линкеров.
торов или космид, упаковываются в фаговые части-
цы, которые затем используются для инфицирова-
ния пермиссивных клеток E.coli К12.
Обычно трансфекция происходит не очень эф-
фективно. Рекомбинантный геном включается лишь
в часть обработанных клеток. Выращивая клетки
в условиях, при которых проявляется зависимость
от векторных генов, можно идентифицировать
нужные клетки и отобрать их.
Одна молекула ДНК на клетку. При планиро-
вании эксперимента по молекулярному клонирова-
нию и его проведении необходимо соблюдать два
основных принципа. Во-первых, после конструиро-
вания in vitro отдельные молекулы рекомбинантных
ДНК должны быть введены в разные структуры. Ни
одна из клеток не должна получить более одной
плазмидной молекулы или вирусной частицы. Во-
Незащищенная вставка
Защищенная вставка
СН3
£соР1-метилаза
5- аденозил метионин
СН3
ЕсоRI- линкеры
5 р GAATTCC аТГС GGAaI ТТС
(CCIIAACSg CtTAAG tcTTAAGGQ Р-5'
5'-р даствжг
CCTTAAGQ
£coRI-линкеры
сн3
р-5
Есо RI
5'—pfAATTCC GQp-5'
(GG CTTAaD
+
5'—p (aattc ggQ
РИС 6 20 CgTTAAQp-5'
сн3
Есо RI
CH3
5'—p (~AA TCC~ GAATTC Gfe()
fGQ CTTAAG CCTTAAQp-5'
ch3
Сайты для рестриктирующей эндонуклеазы, находящие-
ся во встроенном фрагменте, защищены путем мети-
лирования до присоединения линкеров.
19*
292
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
вторых, эти структуры должны быть способны
к репликации.
В результате трансфекции и инфекции образуют-
ся популяции самых разных клеток либо популяции
вирусов или бактериофагов. Одни члены популяции
содержат нужные рекомбинантные молекулы, дру-
гие несут рекомбинанты, содержащие нежелатель-
ные вставки, или векторные молекулы вообще без
вставки, третьи (если используются плазмиды и
некоторые эукариотические вирусные векторы)
представляют собой неизмененные клетки. Кроме
того, могут встречаться разнообразные непредска-
зуемые и аберрантные рекомбинанты, в том числе
векторы, в которые включены две или более вста-
вок, и рекомбинанты, у которых в результате ре-
комбинации уже в клетке-хозяине произошло из-
менение вставки. Таким образом, трансфекция
и инфекция не являются последним этапом экспе-
римента по получению рекомбинантной ДНК, а
представляют лишь один из его этапов. Далее
нужно провести клонирование и идентификацию
нужного рекомбинанта.
б. Клонирование
Необходимым условием успешного клонирова-
ния является возможность разделения всех транс-
фицированных или инфицированных клеток. Только
в этом случае каждый клон будет представлен
отдельной колонией бактериальной или животной
клетки или негативной фаговой либо вирусной
колонией и будет содержать определенную реком-
бинантную ДНК.
Плазмидные векторы. Трансфицированные клет-
ки высевают на агар таким образом, чтобы они
были полностью изолированы одна от другой
и каждая могла дать начало отдельной колонии.
Обычно векторы содержат по крайней мере один
селективный маркер, по которому проводится от-
бор трансфицированных клеток. При этом нетранс-
фицированные клетки не могут образовывать ко-
лонии в используемой среде.
Фаговые векторы. Инфицированные (или транс-
фицированные) клетки высевают на газоне чувстви-
тельных клеток, на котором в результате инфи-
цирования соседних клеток образуются фаговые
бляшки. Некоторые векторные системы имеют
встроенные маркеры, позволяющие легко отбирать
рекомбинанты среди реконструированных интакт-
ных векторов (разд. 5.3).
Векторы, сконструированные на основе вирусов
животных. Трансдуцирующие БУ40-векторы, спо-
собные продуцировать вирусные частицы (разд.
5.7.6), клонируются так же, как и фаговые векторы.
Однако, поскольку такие 8У40-векторы нуждаются
в вирусе-помощнике, восполняющем утраченные
ими функции, вирусные бляшки (зоны лизиса на
монослое клеток) могут содержать как рекомби-
нантные геномы, так и геномы помощника. Плаз-
мида, сконструированная на основе вируса SV40,
и пассивно трансформирующие векторы, которые не
продуцируют вирусных частиц, сначала клонируют
как челночные векторы в клетках Е. coli. Обычно они
содержат селективный маркер, определяющий фе-
нотип животной клетки, что позволяет отобрать
клоны трансформированных клеток. Аналогично
рекомбинантные векторы на основе папилломави-
русов крупного рогатого скота и ретровирусов кло-
нируют в клетках E.coli как челночные векторы,
а затем трансфицируют ими клетки животных.
6.4. СКРИНИНГ КЛОНИРОВАННЫХ
ПОПУЛЯЦИЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ
МОЛЕКУЛ
а. Обнаружение нужного клона
После разделения рекомбинантных молекул и
получения отдельных клонов встает трудно разре-
шимая задача- обнаружение нужного клона или
клонов. Идентификация клона основывается на том,
что вставка в рекомбинантной ДНК детерминирует
какое-то уникальное свойство содержащей ее клет-
ки. Это свойство может определяться структурой
самой вставки (т. е. нуклеотидной последователь-
ностью) либо быть связанным с ее функцией (т.е.
продуктом экспрессии клонированного гена). На
нем основывается скрининг популяции клонов с
целью идентификации одного нужного клона. Ме-
тоды скрининга должны быть очень чувствитель-
ными, поскольку иногда приходится идентифици-
ровать один клон из сотен тысяч или даже мил-
лионов клонов.
б. Отжиг с комплементарным
п ол и нукл еотидо м
Комплементарные одноцепочечные полинуклео-
тиды. буть то РНК или ДНК, при соответствующих
условиях с легкостью ренатурируют, несмотря на
присутствие большого избытка неродственных це-
пей. Благодаря этому исследователь получает мощ-
ный инструмент для обнаружения специфической
вставки, который можно использовать в разных
ситуациях.
Отжиг с радиоактивным зондом. Предположим,
что мы имеем большую популяцию клонированных
рекомбинантных молекул и проводим отжиг с опре-
деленным полинуклеотидным зондом. Тогда мече-
ными становятся только те рекомбинантные мо-
лекулы, которые содержат последовательности,
комплементарные зонду. Успех эксперимента зави-
6. СРЕДСТВА: КОНСТРУИРОВАНИЕ, КЛОНИРОВАНИЕ И ОТБОР
293
сит прежде всего от наличия нужного зонда.
Для скрининга большого числа колоний, содер-
жащих плазмиды, а также фаговых бляшек разра-
ботаны удобные и быстрые методы. На тех же
принципах основан и скрининг 8У40-бляшек. Метод
состоит в том, что бактериальные колонии или
бляшки переносят с агара на иммобилизованную
подложку, например на нитроцеллюлозный фильтр
(разд. 6.1.6), и подвергают содержащуюся в них
ДНК денатурации. Затем фильтр инкубируют в
растворе, содержащем денатурированный 32Р-ме-
ченный зонд, в условиях, способствующих рена-
турации комплементарных цепей. Если колония или
бляшка содержит ДНК, комплементарную зонду, то
на радиоавтограмме в соответствующем месте
будет наблюдаться потемнение. Несмотря на то что
каждая бляшка или колония содержит лишь не-
большое количество ДНК, ее удается выявить
благодаря высокой удельной радиоактивности зон-
Получить большие коллекции клонированных
колоний или бляшек на нитроцеллюлозных фильт-
рах не составляет труда. Бактерии и дрожжи
хорошо растут на самом нитроцеллюлозном фильт-
ре, помещенном на соответствующий питательный
агар (рис. 6.21). Фильтр, содержащий колонии,
обрабатывают так, чтобы произошли лизис клеток
и денатурация ДНК, отжигают денатурированную
ДНК с зондом, идентифицируют бляшки, ДНК
которых гибридизовалась, и отбирают клетки из
соответствующего участка агара. Фаговые бляшки
переносят на нитроцеллюлозный фильтр, наложив
его на питательный агар (рис. 6.22). За один раз на
фильтр может быть перенесено до 10000 бляшек
с одной чашки диаметром 10 см. Если осторожно
снять фильтр, то ДНК из каждой бляшки останется
фиксированной на нем. После отжига и иденти-
фикации нужных бляшек можно отобрать фаговые
частицы из бляшек, оставшихся на чашке с агаром.
дов.
Перенос колоний
Колонии, отбираемые по
селективному маркеру
(чашка с питательным агаром)
Питательный агар с
покрывающим его
нитроцеллюлозным фильтром
Фильтр, помещенный в
раствор для отжига
Промывание фильтра
Экспозиция рентгеновской пленки
Радиоавтограф
РИС. 6.21.
Скрининг бактериальных (или дрожжевых) колоний,
основанный на гибридизации соответствующей ДНК со
специфическим 32Р-меченным зондом. Нужную вставку
содержат две колонии, 1 и 6.
294
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Фаговые бляшки на
газонечувствительных 32р .ДНК
клеток или
Фильтр, помещенный в
раствор для отжига
Промывание фильтра
Экспозиция рентгеновской пленки
Радиавтограф
РИС. 6.22.
Скрининг рекомбинантных бляшек, основанный на гиб-
ридизации ДНК со специфическим 32Р-меченным зон-
дом. Из изображенных на рисунке десяти бляшек две
содержат нужную вставку.
Аналогичным образом можно выявить упакованные
рекомбинантные молекулы вируса SV40. Питатель-
ный агар, покрывающий инфицированный моно-
слой клеток обезьяны, удаляют, весь монослой
переносят на нитроцеллюлозный фильтр и иден-
тифицируют нужные бляшки путем отжига с соот-
ветствующим радиоактивно меченным зондом. Ви-
рионы, содержащие рекомбинантные ДНК, отби-
рают из агарового слоя.
В качестве зондов можно использовать высо-
коочищенные мРНК и денатурированные гомоло-
гичные (обычно клонированные) ДНК или кДНК.
Особенно удобны одноцепочечные зонды, посколь-
ку их не нужно денатурировать и тестируемые
клонированные ДНК не конкурируют с другими
гибридизующимися цепями ДНК во время отжига.
мРНК-зонды уже являются одноцепочечными, а
одноцепочечные кДНК-зонды легко получить, ско-
пировав только одну цепь (см. рис. 4.20). Одно-
цепочечные РНК-зонды можно также приготовить
из рекомбинантной плазмиды, содержащей после-
довательность зонда, встроенную в специальный
вектор, например pGEM (рис. 6.23). Этот вектор
содержит два разных высокоспецифичных бакте-
риальных промотора, фланкирующих вставку в
рекомбинантных молекулах. Используя очищенную
соответствующим образом линеаризованную плаз-
миду в качестве матрицы in vitro и ту или иную из
РНК-полимераз прокариот, синтезируют РНК, ко-
торая представляет собой копию одной из двух
цепей вставки.
Если известна аминокислотная последователь-
ность полипептида, кодируемого данным геном, то
можно восстановить нуклеотидную последователь-
ность этого гена и затем синтезировать его хи-
мическими методами. Даже в тех случаях, когда
в качестве зонда используется участок ДНК длиной
всего 15 нуклеотидов, можно получить относитель-
6. СРЕДСТВА: КОНСТРУИРОВАНИЕ, КЛОНИРОВАНИЕ И ОТБОР
295
Клонирование и
амплификация
в Е. coli.
32P-NTP 32pNTP
РНК-полимераза Т7 РНК-лолимераза SP6
РИС. 6.23.
Рекомбинантная плазмидная ДНК, на кото-
рой синтезируется радиоактивно меченная
одноцепочечная РНК. Плазмида pGEM со-
держит последовательности, происходящие
из pBR322, и два прокариотических промо-
тора. Промотор SP6 получен из бактерио-
фага SP6 Salmonella typhimurium и спосо-
бен функционировать только со специфич-
ной РНК-полимеразой SP6. Промотор Т7
получен из бактериофага Т7 Е. coli и функ-
ционирует только со специфичной Т7-РНК-
полимеразой. Между этими двумя промо-
торами находится полилинкер, содержащий
множество сайтов для эндонуклеаз рест-
рикции. В данном случае вставка включена
в сайт Ват Н1, но в принципе она может
включиться в любой из этих сайтов. Прежде
чем осуществлять транскрипцию in vitro,
очищенную рекомбинантную плазмидную
ДНК разрезают с помощью рестриктиру-
ющей эндонуклеазы и получают линейные
молекулы. В зависимости от сайта рестрик-
ции. структура которого в свою очередь
зависит от того, какую РНК-полимеразу
используют-БРб или Т7, получают РНК-
копию одной или другой цепи вставки.
но достоверный результат. Из-за вырожденности
генетического кода невозможно точно восстановить
уникальную последовательность кодирующего
участка. Чтобы решить эту проблему, синтезируют
смесь олигонуклеотидов, различающихся одним
или несколькими нуклеотидами (рис. 6.24). Это не
так трудно, как кажется. Вместо того чтобы исполь-
зовать один защищенный мононуклеотид на опре-
деленном этапе химического синтеза, используют
смесь защищенных мононуклеотидов.
Тестирование на синтез специфического полипеп-
тида in vitro. Иногда не удается провести прямой
скрининг клонов потому, что просто отсутствует
в достаточной степени очищенный подходящий,
зонд. В таком случае можно использовать непрямые
методы, хотя обычно они неудобны при массовом
скрининге клонированных популяций. Большинство
обычно применяемых непрямых методов основаны
на двух принципах. Во-первых, можно транслиро-
вать соответствующую мРНК in vitro и получить
идентифицируемый полипептид. Во-вторых, можно
использовать тот факт, что трансляция подавляется,
если одноцепочечная мРНК ренатурирует с комп-
лементарной клонированной ДНК. РНК, входящая
в дуплекс РНК ДНК, не способна функционировать
как мРНК.
296
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Пептид
16 возможных мРНК
glu • phe • trp • met • gly
5' GAA UUU UGG AUG GGN"
G C
16 возможных ДНК-зондов
3' CTT AAA ACC TAC CCN*
C G
РИС. 6.24.
* N — любой из четырех
нуклеотидов
Данному пентапептиду соответствуют несколько нук-
леотидных последовательностей в соответствующей об-
ласти мРНК. Синтезировав химическим путем смесь
олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных этим
мРНК, мы можем получить зонд для идентификации
мРНК и клонов, содержащих сегменты, кодирующие
данный пептид.
мРНК
Отжиг
Трансляция
in vitro
6. СРЕДСТВА: КОНСТРУИРОВАНИЕ, КЛОНИРОВАНИЕ И ОТБОР
297
Если проинкубировать смесь мРНК in vitro
в присутствии необходимых компонентов, то на них
синтезируются соответствующие полипептиды.
Смесь этих полипептидов можно разделить по
размерам с помощью электрофореза. Эффективная
трансляция in vitro осуществляется только с одно-
цепочечных мРНК. Если же до начала трансляции
какая-то мРНК ренатурировала с комплементарной
ДНК и образовался гибридный дуплекс ДНК РНК,
то информация с этой мРНК не будет считываться.
С помощью процедуры, получившей название
HART (от англ, hybrid-arrested translation; рис. 6.25).
клонированные рекомбинантные ДНК очищают,
денатурируют и отжигают (в растворе) с препа-
ратами мРНК до начала трансляции in vitro.
Молекулы ДНК, гомологичные определенному ге-
ну, гибридизуются с мРНК, и среди продуктов
трансляции не обнаруживается соответствующий
полипептид.
Второй метод идентификации рекомбинантных
молекул с помощью трансляции in vitro получил
название гибридизационной селекции (рис. 6.26). Из
популяции рекомбинантов выделяют и очищают
рекомбинантные ДНК. Полученные препараты
ДНК подвергают денатурации и каждый из них
фиксируют на твердой подложке, например на
нитроцеллюлозном фильтре. Каждый из препара-
тов инкубируют со смесью мРНК (в растворе).
Гибридизация и связывание РНК на фильтре проис-
ходят только в тех случаях, когда РНК оказывается
комплементарной иммобилизованной клонирован-
ной ДНК. Все остальные РНК удаляются с фильтра
при промывании. Связанную РНК отделяют от
ДНК и тестируют на синтез специфического поли-
пептида в системе трансляции in vitro. Это позво-
ляет идентифицировать соответствующий рекомби-
нант.
Для облегчения идентификации полипептидов,
образующихся при трансляции смеси мРНК in vitro,
используют разные методы. Если препарат мРНК
обогатить специфической мРНК, то полипептид,
кодируемый такой мРНК, иногда удается иденти-
фицировать среди продуктов трансляции по его
размеру и количеству (рис. 6.27, Л). Когда исполь-
зуется сложная смесь мРНК и полипептидов, ин-
тересующий нас полипептид можно идентифици-
Нитроцеллюлозные
фильтры
Промывание
фильтров
Элюирование
мРНК
Трансляция
in vitro
Электрофорез
РИС. 6.26.
Гибридизационная селекция Денатурированная ДНК из соответственно (дополнительные данные о трансляции
клонов 2 и 3 «отбирает» мРНК для полипептидов а и с in vitro представлены на рис. 6.27).
298
ЧАСТЬ II ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Смесь мРНК,
обогащенная мРНК с
Трансляция in vitro
Выделение полипептидов,
электрофорез и
окрашивание геля
Направление
гель-электрофореза;
уменьшение длины
полипептидов
Смешивание продуктов
реакции с преципитирующим
антителом, специфичным в
отношении полипептида b
Перенос на
нитроцеллюлозный
фильтр
Растворение преципитата
и электрофорез
Реакция с антителом,
специфичным
в отношении
полипептида d
Гель -электрофорез
Белковый блоттинг
Б
В
РИС. 6.27.
Трансляция in vitro смеси молекул РНК. Наряду с РНК
в смеси присутствуют аминокислоты (иногда по край-
ней мере одна из них радиоактивно меченная), АТР
и клеточные экстракты, содержащие другие компонен-
ты, необходимые для синтеза белка (например, фер-
менты. рибосомы и тРНК). А. Каждая мРНК дает начало
соответствующему полипептиду. Эти полипептиды раз-
деляют по размерам с помощью электрофореза и иден-
тифицируют окрашиванием подходящим красителем.
Если используемые аминокислоты радиоактивно ме-
ченные, то можно получить радиоавтограф, наложив на
гель рентгеновскую пленку. В данном случае в смеси
особенно обильно представлена мРНК с и соответст-
венно среди продуктов трансляции наиболее многочис-
лен полипептид с Б Анализ электрофореграммы,
представленной на рис. А, с помощью белкового блот-
тинга. Для трансляции in vitro использовались немече-
ные аминокислоты Полипептиды после электрофореза
были перенесены с геля на иммобилизованную под-
ложку, где они фиксировались в результате адсорбции.
Обычно для переноса используют злектроэлюцию, а не
просто блоттинг. Процесс аналогичен рассмотренному
на рис. 6.2, за исключением того, что гель вместе с
подложкой погружают в буферный солевой раствор
между двумя электродами. Далее подложку с полипеп-
тидами инкубируют в растворе, содержащем соответст-
вующие антитела, в данном случае антитела к полипеп
тиду d При этом можно использовать радиоактивно
меченные или несущие флуоресцентную метку антитела
или антитела, связанные с легко идентифицируемыми
ферментами. Таким способом определяют положение
искомого полипептида в исходном геле. Положение
связанного антитела можно определить также, проин-
кубировав подложку с радиоактивно меченным препа-
ратом белка A Staphylococcus aureus. Этот белок спе-
цифически связывается с иммуноглобулином IgG. В
Для трансляции in vitro использовались радиоактивно
меченные аминокислоты. Образовавшиеся полипепти-
ды смешивали с антителами к полипептиду Ь. Осадок
растворяли и анализировали с помощью гель-электро-
фореза. Полученный радиоавтограф содержал только
одну полосу, отвечающую радиоактивно меченному по-
липептиду Ь.
6 СРЕДСТВА: КОНСТРУИРОВАНИЕ, КЛОНИРОВАНИЕ И ОТБОР
299
ровать по его способности взаимодействовать со
специфическими антителами. В таких случаях при-
меняют метод белкового блоттинга (вестерн-блот-
тинг), аналогичный блоттингу ДНК (рис. 6.27,5).
При другом подходе нужный полипептид осаждают
в присутствии специфических антител из смеси
продуктов трансляции in vitro (рис. 6.27, В), осадок
растворяют и подвергают электрофорезу. В прин-
ципе в геле должны присутствовать только два
белка- интересующий нас полипептид и иммуно-
глобулин.
в. Определение экспрессии гена
в клетках
Экспрессирующийся ген, входящий в состав
рекомбинантной ДНК, при определенных условиях
придает клетке-хозяину специфические фенотипиче-
ские свойства. Метод отбора, основанный на выяв-
лении этого фенотипа, позволяет идентифицировать
и выделять соответствующий клон точно так же. как
стандартные селективные маркеры в векторных мо-
лекулах позволяют отбирать трансформированные
клетки. К стандартным селективным маркерным
системам, приведенным в гл. 5, относятся клетки
E.coli, утратившие Р-лактамазу (и поэтому чувстви-
ельные к ампициллину), которые используются для
отбора трансформантов, содержащих векторы с ге-
ном атр, а также клетки млекопитающих, имеющие
фенотип ТК”, которые позволяют отобрать транс-
форманты, содержащие векторы с геном тимидин-
киназы. С помощью фенотипического отбора можно
отбирать специфические клоны непосредственно из
популяций бактерий, дрожжевых или животных
клеток, трансформированных смесью рекомбинант-
ных векторов, содержащих различные гены бакте-
рий, дрожжей или животных соответственно. Воз-
можность проведения такого отбора зависит от
наличия хозяйских клеток с определенным фено-
типом, чаще всего клеток, дефектных в отношении
продукта гена, который должен быть клонирован.
Другие варианты фенотипического отбора, исполь-
зуемые при работе с клетками эукариот, описаны
ниже и в разд. 5.7. Если отсутствуют нужные
хозяйские клетки, то вместо фенотипического от-
бора можно использовать иммунологический скри-
нинг. В таких случаях клоны отбирают с помощью
антител, специфичных в отношении продукта дан-
ного гена.
Фенотипический отбор. Фенотипический отбор
из популяции трансформированных клеток- это
самый прямой путь выделения нужного клона (рис.
6.28). На практике этот метод, вообще говоря,
ограничивается клонированием прокариотических
генов и некоторых генов дрожжей и других гри-
бов в клетках прокариот и эукариотических ге-
нов в клетках эукариот. В общем виде он был
описан в разд. 5.6. б, когда мы рассматривали спо-
соб конструирования дрожжевого плазмидного
вектора. Чтобы клонировать ген А (или кДНК-А),
смесь фрагментов ДНК (т.е. фрагментов, полу-
ченных из всего клеточного генома) встраива-
ли в векторные молекулы и трансфицировали ими
клетки, мутантные по гену А (А-). Клетки выращи-
вали в условиях, требующих присутствия продукта
гена А, так что колонии могли образовывать лишь
те клетки, в которых синтезируется продукт гена А,
присутствующего в векторе. Наиболее подходящи-
ми для проведения такого отбора являются клет-
ки-хозяева, в которых делетирован либо весь ген А,
либо его часть. В противном случае приходится
выявлять и разграничивать ревертанты и трансфор-
РИС. 6.28.
Фенотипический скрининг
302
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
тами на одном и том же полипептиде. Как и при
скрининге путем отжига с ДНК- или РНК-зондами,
позитивный клон дает четкое темное пятно на
рентгеновской пленке.
Если интересующий нас ген кодирует полипеп-
тид, расположенный на поверхности животной
клетки, то с помощью высокоспецифических ме-
тодов можно провести иммунологический скрининг
и отбор трансформированных клеток. Поверхност-
ные белки могут взаимодействовать со специфи-
ческими антителами, а если эти антитела связы-
ваются с какой-либо флуоресцентной меткой, то
клетки, синтезирующие данный белок, будут от-
личаться от других трансформантов по своим
флуоресцентным свойствам. Жизнеспособные флуо-
ресцирующие клетки выявляют среди громадного
числа нефлуоресцирующих клеток с помощью спе-
циального прибора (FACS, от fluorescence-activated
cell sorter). Далее жизнеспособные клетки размно-
жают и получают популяцию клонированных кле-
ток (рис. 6.30). Некоторые поверхностные белки
являются рецепторами, с которыми связываются
специфические лиганды (например, инсулин). Если
исследуемый ген кодирует такой рецептор, то,
используя флуоресцирующий лиганд, можно отде-
лить трансформированные клетки с помощью при-
бора FACS.
6.5. БИБЛИОТЕКИ
Возможность проведения шотган-экспериментов
рассматривалась еще тогда, когда технология ре-
комбинантных ДНК делала свои первые шаги. Идея
амплификации очень сложных смесей фрагментов
ДНК и последующего обнаружения одного из них
казалась фантастичной, а сейчас она представляется
почти банальной. Основной принцип этого подхода
состоит в создании коллекции рекомбинантных
молекул, составляющих полный геном данного
организма (библиотеки рекомбинантных молекул).
По существу, полный нефракционированный набор
фрагментов ДНК превращают в соответствующий
РИС. 6.30.
Схематическое изображение устройства для
отбора флуоресцирующих клеток. Популя-
цию клеток обрабатывают антителами, спе-
цифичными к определенному поверхност-
ному белку. Антитела связаны с флуорес-
цирующим красителем, так что клетки, не-
сущие антиген, становятся способными к
флуоресценции. Клетки одну за другой
пропускают через узкую насадку, помещен-
ную между лазером и детектором флуо-
ресценции. Клетки, интенсивность флуо-
ресценции которых превышает некий фик-
сированный уровень, отклоняются и попа-
дают в ячейки для культивирования, где они
размножаются и могут быть клонированы.
Нефлуоресцирующие клетки собираются с
помощью аспиратора. Таким методом
можно осуществить скрининг ~ 103 клеток
за 1 с. [D. R. Parks et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A.. 76 (1979), p. 1962.]
6. СРЕДСТВА: КОНСТРУИРОВАНИЕ, КЛОНИРОВАНИЕ И ОТБОР
303
набор стабильных рекомбинантов, который можно
сохранять и многократно использовать для клони-
I рования различных вставок. При этом применяются
Е со/г-системы хозяин-вектор, где в качестве век-
тора используются плазмиды или бактериофаги, по-
скольку они более пригодны для получения боль-
шого числа рекомбинантных молекул и удобны для
хранения.
Наиболее важны два типа библиотек. Одна из
них, создаваемая из суммарной геномной ДНК,
в принципе должна содержать все гены данного
организма. Однако такая цель обычно оказывается
недостижимой, поскольку некоторые последова-
тельности ДНК не удается клонировать. Один из
вариантов геномной библиотеки представляет со-
бой всю ДНК какой-то одной хромосомы. Для
создания такой библиотеки необходимо выделить
ДНК из отдельных хромосом. Хромосомы человека
фракционируют с помощью методов, аналогичных
используемым при сортировке флуоресцирующих
и нефлуоресцирующих клеток. Метод основан на
разной эффективности связывания флуоресцирую-
щих красителей с хромосомами, которая зависит от
размера хромосом и GC-содержания ДНК. Раствор
окрашенных хромосом пропускают с высокой ско-
ростью через узкое отверстие, на которое сфоку-
сирован пучок света, испускаемого лазером. Хро-
мосомы поочередно пересекают этот пучок, кото-
рый индуцирует их специфическую флуоресценцию.
Детектор определяет интенсивность флуоресценции
и изменяет направление движения тех хромосом,
интенсивность флуоресценции которых превышает
заданную величину, таким образом, что они по-
падают в специальный коллектор. Изменяя этот
заранее установленный уровень интенсивности
флуоресценции, можно отбирать разные хромосо-
мы.
Отдельные хромосомы дрожжей и некоторых
простейших невозможно идентифицировать цито-
генетическими методами (т.е. с помощью окраши-
вания и микроскопирования), однако ДНК из них
все же удается выделить. Для выделения применяют
мягкие методы, чтобы избежать разрыва молекул.
Затем ДНК подвергают электрофорезу в агарозном
геле в условиях, позволяющих разделить молекулы
длиной до 2000 т.п.н. (рис. 6.31). Традиционные
методы электрофореза не позволяют разделять
дуплексные молекулы, размер которых значительно
превышает 20 т.п.н. Скорость миграции столь
больших молекул уже не зависит от их размера.
Однако если вместо постоянного однонаправлен-
ного электрического поля, приложенного к обыч-
ному гелю, использовать поле, ориентация кото-
рого многократно меняется, то даже очень большие
молекулы можно будет разделить по размерам.
По-видимому, этот феномен объясняется (по край-
ней мере частично) механизмом прохождения мо-
лекул ДНК через поры агарозного геля. Предпо-
лагается, что молекулы вытягиваются в направле-
нии поля, а затем при изменении этого направления
переориентируются. Время переориентации зависит
от длины цепи и угла между направлениями поля;
они и определяют конечное расстояние, на которое
перемещается молекула. В простейшем варианте
импульсного электрофореза электрический ток по-
дается импульсами, при этом направления поля
примерно перпендикулярны друг другу, а само поле
неоднородно. При более сложных распределениях
РИС. 6.31.
Импульсный электрофорез. Приведена
фотография геля, окрашенного бромис-
тым этидием. Хромосомную ДНК
дрожжей (S. cerevisiae) подвергали
электрофорезу в течение 24 ч в условиях
однородного поля (CHEF hexagonal array
apparatus). Направление поля изменяли
на 120° каждые 80 с. Дрожжевые хро-
мосомы (они обозначены римскими
цифрами) идентифицировали путем
гибридизации с предварительно карти-
рованными зондами. Слева указаны их
размеры в миллионах пар нуклеотидов.
[G. Chu. D. Vollrath, R.W. Davis, Science,
234 (1986) p. 1582.]
Направление
движения
304
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
используют однородные поля и оптимизируют угол
между двумя направлениями, с тем чтобы повысить
разрешение. Импульс обычно длится примерно
минуту.
Библиотеки второго типа включают последова-
тельности, составляющие всю мРНК, обнаруживае-
мую в определенных клетках. В этом случае по-
пуляцию мРНК превращают в популяцию молекул
кДНК, которые затем клонируют. Геномные библио-
теки представляют собой собрание генов и после-
довательностей ДНК; в библиотеках кДНК пред-
ставлены продукты экспрессии этих генов в форме
мРНК.
а. Геномные библиотеки
Геномные библиотеки обычно создают с помо-
щью векторов, сконструированных на основе бак-
териофага X или космиды (рис. 6.32). Эти векторы
содержат большие вставки, благодаря чему мини-
мизируется число рекомбинантов, наобходимых для
составления библиотеки. Например, если создается
Х-библиотека генома млекопитающего, содержаще-
го 3-109 п.н. (на гаплоид) при средней длине встав-
ки 17 т.п.н., то весь геном будет представлен
3-109/1,7-104 = 1,8-105 рекомбинантами. На самом
деле для создания библиотеки, вероятность обна-
ружения в которой определенного сегмента генома
превышает 99%, нужно получить ~ 10б отдельных
рекомбинантных молекул, поскольку лигирование
отдельных фрагментов происходит случайно. Так,
некоторые фрагменты могут быть включены более
чем в одну векторную молекулу, а другие могут
вообще не участвовать в лигировании и упаковке.
Полная космидная библиотека содержит меньше
рекомбинантных молекул, поскольку размер вста-
вок может достигать 45 т.п.н.
Фрагменты суммарной геномной ДНК для кон-
струирования библиотек можно получать несколь-
кими способами. Наиболее удобный из них состоит
в частичном расщеплении ДНК рестриктирующей
эндонуклеазой, сайт узнавания которой содержит
шесть оснований (или более), а образующиеся
липкие концы соответствуют липким концам выб-
ранного вектора. В этом случае разрезание осу-
ществляют лишь в ограниченном числе возможных
сайтов. Поскольку выбор таких сайтов произво-
дится случайно и в используемом препарате ге-
номной ДНК содержится много копий любого
геномного сегмента, практически каждый сегмент
ДНК должен быть представлен во фрагментах
ДНК, пригодных по своему размеру для клони-
рования. При таком подходе, однако, может по-
лучиться неполная библиотека. Те части генома,
в которых сайты узнавания рестриктирующих эн-
донуклеаз находятся слишком далеко друг от
друга, не смогут включиться в жизнеспособный
рекомбинантный фаг. С другой стороны, те области
генома, в которых сайты узнавания тесно сгруп-
пированы, будут разделены на очень короткие
фрагменты, и не все из них будут представлены
в библиотеке.
Вообще говоря, более репрезентативную биб-
лиотеку можно получить при частичной фрагмен-
тации геномной ДНК, осуществляемой более слу-
чайно, чем с помощью фермента с сайтом узнавания
из шести пар оснований. Для этого можно исполь-
зовать гидродинамические методы деградации ДНК
или очень ограниченную обработку эндонуклеазами
с сайтами узнавания из четырех пар оснований,
например Alul и Haelll.
б. Библиотеки кДНК
Для создания библиотек кДНК обычно исполь-
зуют плазмидные или фаговые векторы, сконструи-
рованные на основе бактериофага X. Принципы
конструирования не отличаются от описанных
в разд. 6.1 .г, за исключением того, что в этих
случаях чаще используют смесь разных мРНК, а не
очищенную мРНК. Полученные с помощью спе-
циально сконструированных векторов или опреде-
ленным образом отобранные библиотеки кДНК
могут использоваться для клонирования последо-
вательностей мРНК даже в тех случаях, когда ами-
нокислотная последовательность белка и кодирую-
щая нуклеотидная последовательность неизвестны
и даже отсутствует гомологичный зонд. Соответст-
вующие примеры мы рассмотрим ниже.
Библиотека экспрессирующихся кДНК. Очищен-
ную кДНК или смесь разных кДНК можно лиги-
ровать с векторами, специально сконструирован-
ными для осуществления транскрипции и трансля-
ции кодирующей области кДНК. Нужный клон
идентифицируют с помощью иммунологического
скрининга с применением антител, специфичных
к полипептиду, кодируемому данной кДНк. Эта
весьма удобная методика позволяет осуществить
клонирование даже тогда, когда ничего не известно
о структуре нужного нам гена или белка.
Одним из векторов, широко применяемых для
изучения экспрессии, является производное фага X,
получившее название Xgtl 1 (рис. 6.33). Когда кДНК,
содержащие EcoRI-линкеры, включаются в вектор
Xgtl 1 в его единственном сайте для эндонуклеазы
EcoRI, вставки оказываются в области, кодирующей
бактериальный ген Р-галактозидазы (lacZ). Пример-
но одна из шести кДНК-вставок включается в под-
ходящей для транскрипции ориентации и в фазе
с рамкой считывания р-галактозидазы. (Копирова-
ние мРНК с образованием дуплексной кДНК редко
происходит безошибочно, и лишь одна примерно из
6. СРЕДСТВА: КОНСТРУИРОВАНИЕ, КЛОНИРОВАНИЕ И ОТБОР
305
> 100 т. п.н.
высокомолекулярная
эукариотическая
ДНК (геномная)
Е Е Е
I I I
Л------------------------_fi ,
к 0 А-вектор
| Фрагментация
। Фракционирование
| по размерам
iEcoRl- метилаза
блокирует Есо RI- сайты
СНЭ СНз
СНз СНз
Отжиг
1 ЛИПКИХ КОНЦОВ
Есо Rl-
липкие концы
I Лигирование тупых концов
с синтетическими £coRI-
линкерами
СНз СНз
| Фракционирование
у по размерам
31 т п.н.
(Расщепление с
помощью Есо RI
СНз СНз
fcoRI-липкие
концы
I Лигаза
СН3 СНз ’ СНз СНз
СНз СНз I Упаковка СНз СНз
I in vitro
S)
I
Высевание и скрининг бляшек
РИС. 6.32.
Создание геномной библиотеки. Высокомолекулярную
геномную ДНК фрагментируют путем частичного гид-
ролиза рестриктирующей эндонуклеазой или с помощью
физических методов. Все другие этапы описаны в
гл. 5 и 6. Отметим, что способ получения «плечевых»
последовательностей X-вектора отличается от представ-
ленного на рис. 5.11. В данном случае векторную ДНК
сначала переводят в кольцевую форму путем воссоеди-
нения cos-сайтов. Затем несущественную центральную
часть отделяют от «плечей» с помощью рестриктирующей
эндонуклеазы и проводят фракционирование. Далее
плечевые последовательности соединяют со вставками
с помощью липких Есо Rl-концов. [Т. Maniatis et al.. Cell,
15 (1978), p. 687.]
20 243
306
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
3'......GAC СТТ AAG GCG........5-
СООН ..... .gin phe glu ala........NHj
I EcoRI
GAC CTTAA G GCG
...... x у z Phe Glu Ala
Составной белок
J Все бляшки
Библиотека
Инфицирование клеток
в присутствии ИПТГ
фильтр
Обработка фильтра
раствором антител
и инкубация с
1^5| -белком А
Клонирование кДНК в векторе kgt11 - производном фа-
га X. Длина векторной ДНК составляет 44 т.п.н. ДНК
содержит копию гена Р-галактозидазы (lacZ) E.coli,
вблизи З'-конца которого находится сайт для эндонук-
леазы Есо RI; кДНК с Есо RI-линкерами встраиваются
в этот сайт, и рекомбинантные молекулы упаковываются
в k-частицы in vitro. При встраивании нарушается це-
лостность кодирующей области lacZ. в результате чего
активная Р-галактозидаза не образуется. Однако если
трех молекул кДНК начинает синтезироваться в
правильном сайте.) При индукции Р-галактозидаз-
ного гена с помощью Р-галактозида в /ас-промоторе
начинается транскрипция, которая распространяет-
ся на эукариотический сегмент. В результате транс-
ляции соответствующей РНК образуется гибридный
белок, у которого на N-конце находится Р-галакто-
зидазный полипептид, а на С-конце-эукариотиче-
ский. Библиотека кДНК, созданная с помощью
Xgtll, образует популяцию бляшек, отдельные чле-
ны которой содержат эти гибридные белки. Бляшку,
содержащую интересующий нас белок (и, следова-
тельно, кДНК), идентифицируют по ее способности
связывать соответствующее антитело. На одной
чашке можно выявить одну позитивную бляшку
среди 104 и без труда провести скрининг 10б бляшек.
Библиотеки селективных кДНК. Развитие и диф-
ференцировка сложных многоклеточных организ-
мов из одной оплодотворенной яйцеклетки осущест-
вляются с помощью высокоорганизованной систе-
мы дифференцированной экспрессии генов. Одни
гены экспрессируются только в одном или строго
ограниченном числе типов клеток, другие-в какой-
то определенный период времени. В результате
кДНК встраивается в правильной ориентации и при этом
образуется непрерывная открытая рамка считывания
с кодирующей /acZ-областью. то синтезируется состав-
ной белок, на N-конце которого находится Р-галактози-
дазная последовательность, а на С-конце- эукариоти-
ческий полипептид. Образующиеся рекомбинанты легко
отличить от исходного вектора >.gt11, поскольку они не
продуцируют активной р-галактозидазы. Чтобы исполь-
зовать этот маркер при отборе, фаг высевают на газоне
клеток-хозяев, не несущих функционального гена lacZ
Хозяйские клетки содержат также множество копий
плазмиды с геном /ас-репрессора (/acl), в результате
чего транскрипция гена lacZ в z.gtl 1 подавляется. Это
предотвращает потерю фаговых частиц из-за вредного
воздействия составного белка на клетки или фаг. Далее
собирают фаговые частицы из бляшек и создают биб-
лиотеку. Для выделения и клонирования нужного ре-
комбинанта часть библиотеки используют для инфици-
рования свежих клеток. Бляшки получают на нитроцел-
люлозном фильтре, помещенном поверх агара, в
присутствии изопропилтио-Р-О-галактопиранозида
(ИПТГ) - индуктора транскрипции гена lacZ, в результа-
те чего синтезируется составной белок. Затем нитро-
целлюлозный фильтр обрабатывают раствором, содер-
жащим антитела к интересующему нас полипептиду
и после промывания идентифицируют бляшки, содер-
жащие антитела, по способности антител к IgG связы-
ваться с 1251-меченным белком А из клеток Staphylo-
coccus aureus. Помеченные таким образом бляшки ви-
зуализируют с помощью радиоавтографии и отбирают
из агара.
6. СРЕДСТВА: КОНСТРУИРОВАНИЕ, КЛОНИРОВАНИЕ И ОТБОР
307
Одноцепочечная
кДНК
ДНК-полимераза I
И
Библиотека к ДНК
к ДНК. специфичная
для А-клеток.
не связывается с
гидроксилапатитом
Связывание с
гидроксилапатитом
РИС. 6.34.
Создание библиотеки кДНК. представляющих собой
копии мРНК, специфичных для определенного типа
клеток или тканей. Из клеток или тканей двух родствен-
ных типов, А и В, получают цитоплазматическую мРНК.
Специфическую библиотеку кДНК конструируют для
клеток типа А. На A-мРНК синтезируют одноцепочеч-
ную кДНК. которую затем отжигают с избыточным
количеством B-мРНК, в результате чего образуются
дуплексные гибриды комплементарных А-кДНК и
B-мРНК. А-кДНК, специфичные только для клеток А,
остаются одноцепочечными и могут быть отделены от
дуплексных гибридных молекул и оставшейся РНК с
помощью гидроксилапатита, который при соответству-
ющих условиях связывает гибриды и свободные РНК, но
не одноцепочечную РНК (разд. 7.5.6). Затем одноцепо-
чечную А-кДНК используют в качестве матрицы для
синтеза второй цепи кДНК и получают библиотеку
дуплексных кДНК. Эта библиотека представлена почти
исключительно молекулами кДНК копиями мРНК,
специфичными для клеток типа А. В качестве альтерна-
тивы обогащенную кДНК используют как зонд для
гибридизации с полной библиотекой кДНК, полученной
на A-мРНК, для определения клонов кДНК, соответст-
вующих специфичной мРНК клеток типа А.
20*
308
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
популяции цитоплазматических мРНК в различных
тканях и клетках оказываются представленными
разными молекулами. Такая дифференцированная
экспрессия генов может использоваться для клони-
рования кДНК, соответствующих регулируемым ге-
нам, даже в тех случаях, когда о продуктах этих
генов ничего не известно.
Например, при изучении процессов раннего раз-
вития Xenopus важно знать, какие гены экспрес-
сируются при первых клеточных делениях. Для
этого нужно идентифицировать те мРНК, которые
присутствуют в гаструле, но не в яйцеклетках. Это
можно сделать, создав геномную библиотеку и
проведя раздельный скрининг с использованием
препаратов РНК из яйцеклеток и гаструл. Затем
можно идентифицировать и клонировать фаговые
бляшки, которые дают положительный ответ при
отжиге только с РНК гаструл. Однако данный
метод имеет тот недостаток, что многие из 105 или
более мРНК в двух указанных выше препаратах
являются одинаковыми и приходится проводить
РИС. 6.35.
Е
tat 11
СНз СНз СНз
^Упаковка in vitro
Клонирование генов, кодирующих субъединицы дрож-
жевой РНК-полимеразы II. ДНК из клеток S. cerevisiae
механически разрезают на фрагменты средней длины
5 т.п.н. После заполнения одноцепочечных участков
с помощью ДНК-полимеразы метилируют Есо Rl-сай-
ты, присоединяют Есо Rl-линкеры и встраивают фраг-
менты в ДНК фага Xgt11, предварительно разрезанную
с помощью эндонуклеазы Есо RI и обработанную фос-
фомоноэстеразой. Рекомбинантные ДНК упаковывают
в вирионы фага X in vitro (выход фаговых частиц 2-106)
и инфицируют ими клетки £ coli, имеющие генотипы
sup F (для супрессии амбер-мутации в гене S фага X),
hsdR , hsdM* (для предотвращения рестрикции инфи-
цирующей ДНК), Мас (для идентификации бляшек,
образуемых фагом Xgt11, и бляшек, содержащих встав-
ки дрожжевой ДНК) и содержащие плазмиду pBR322
с геном /ас I (кодирующим /ас-репрессор, благодаря
чему подавляется экспрессия дрожжевых белков, инги-
бирующих рост клеток или фага) На этой стадии биб-
лиотеку размножают и получают фаговый препарат.
Часть препарата, содержащую 106 фаговых частиц, под-
вергают скринингу для выявления фаговых частиц, об-
разующих белки, которые связываются с антителами
к дрожжевой РНК-полимеразе II (см. подпись к рис. 6.33).
Для скрининга используют штамм £ coli, в котором
делегирован важный протеазный ген, Ыоп, чтобы
уменьшить деградацию дрожжевых белков. Повторный
скрининг громадного числа бляшек, чтобы обнару-
жить те немногие, которые проявляют специфич-
ность. Более эффективным является создание биб-
лиотеки кДНК на основе гаструлярной РНК. кото-
Дрожжевая ДНК
Фрагменты длиной 5 т.п.н.
Механическое
разрезание
ДНК-полимераза
ЕсоRI- метилаза
СНз СНз
I I
СНз
СНз СНз
СНз
£coRI- линкеры
2 • 106 фаговых частиц
I Инфицирование Е. coli (sup F,
f hsd R~ hsd M+ , A lac, - lac l+ )
П репарат фага
I Инфицирование E. coli (sup F,
* A lac, lac l+ , A Ion)
Скрининг бляшек,содержащих антитела
к дрожжевой РНК-полимеразе 11
Инкубация с 1251-белком А
I
Авторадиография
Позитивные клоны
скрининг 60 положительных бляшек позволяет отобрать
множество клонов, содержащих кодирующие последо-
вательности для нескольких субъединиц РНК-полиме-
разы II. [R.A. Young, R.W. Davis, Science, 222 (1983), р.
778.]
6. СРЕДСТВА: КОНСТРУИРОВАНИЕ, КЛОНИРОВАНИЕ И ОТБОР
309
Продукты трансляции
полисомной РНК из
растений гороха, выращенных
на свету в темноте
Полисомная РНК из растений,
выращенных на свету
Направление
электрофореза
-32 к Да
20
14
| Обратная транскриптаза
РИС. 6.36.
Клонирование кДНК, кодирующей малую субъединицу
рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы (RuBPCase) из
листьев гороха (Pisum sativum). RuBPCase,-по-видимо-
му, один из самых распространенных на земле белков,-
состоит из восьми идентичных больших и восьми иден-
тичных малых субъединиц. Ген большой субъединицы
(55 кДа) находится в хлоропластной ДНК (разд. 9.7.в),
а ген малого полипептида (14 кДа-цепь, образующаяся
в результате посттрансляционного разрезания пред-
шественника) - в ядерной хромосомной ДНК. Экспрес-
сия генов зависит от освещенности, о чем свидетельст-
вуют данные, представленные в левой верхней части
рисунка. Растения гороха выдерживали 9 сут в темноте
и затем некоторые из них выставляли на свет на 48 ч.
Полисомную poly (А+)-РНК, выделенную из растений
обоих типов, транслировали in vitro. 20 кДа-предшест-
венник малой субъединицы RuBPCase синтезировался
только в тех растениях, которые находились на свету.
РНК из листьев растений, подвергшихся освещению,
использовали для синтеза двухцепочечной кДНК, к ко-
торой были присоединены Н/лс/Ш-линкеры. ДНК лиги-
ровали с разрезанной в Л/7лс/П1-сайте плазмидой pBR322
и полученными рекомбинантными плазмидами транс-
формировали штамм НВ101 Е.соП. Трансформирован-
ные бактериальные колонии, устойчивые к ампициллину,
выращивали на нитроцеллюлозных фильтрах, поме-
щенных на поверхность питательного агара в чашках.
После фиксации ДНК на фильтрах клоны, содержащие
кДНК RuBPCase, идентифицировали по их способности
гибридизоваться с радиоактивно меченной poly (А+)-РНК
из подвергавшихся освещению листьев и по отсутствию
гибридизации с РНК из листьев растений, выращенных
в темноте. Ложные положительные клоны элиминиро-
вали, проводя гибридизацию исходно положительных
клонов с радиоактивно меченной PH К, обогащенной по
мРНК RuBPCase. Обогащение проводили фракциони-
рованием РНК по размерам с помощью электрофореза
в полиакриламидном геле. Искомая мРНК представля-
ла собой молекулу длиной 900 п.н., присутствующую
в подвергшихся освещению (но не в выращенных в тем-
ноте) листьях, при трансляции которой in vitro образо-
вывалась малая субъединица RuBPCase. Наконец, гиб-
ридные клоны были идентифицированы также при гиб-
ридизационной селекции (разд. 6.4.6). [J. R. Bedbrook,
S.M. Smith, R.J. Ellis, Nature, 287 (1980), p. 692.]
Агар + ампициллин
Рост на
нитроцеллюлозе
рая была предварительно обогащена последова-
тельностями мРНК, специфичными для стадии
гаструлы (рис. 6.34). Такое обогащение можно полу-
чить следующим образом. С помощью обратной
транскриптазы на мРНК из гаструл синтезируют
одноцепочечную кДНК. Затем все кДНК, гомо-
логичные мРНК, присутствующим как в яйцеклет-
ках, так и в гаструлах, удаляют путем образования
гибридов кДНК-мРНК между кДНК гаструл и
мРНК яйцеклеток; эти гибриды адсорбируются на -
гидроксиапатите, а в растворе остаются только
одноцепочечные кДНК, специфичные для гаструл
(см. разд. 7.5.6). Из этих кДНК получают обычным
способом дуплексные молекулы кДНК и создают
библиотеку кДНК. Такая библиотека обычно быва-
ет сильно обогащена молекулами кДНК, соответ-
ствующими гаструлоспецифичной мРНК. Анало-
гичный подход можно использовать в случае мРНК,
выделенной из любых двух родственных тканей или
клеток. Вариации на эту тему включают использо-
вание в качестве зондов молекул кДНК, обогащен-
ных описанным выше методом. В этом случае
Этап 1
Т-клеточный
рецептор
Обратная
транскриптаза
Удаление РНК
-----------► V V
Избыток poly (А+ )-
РНК иэ В-клеток
Цитоплазматическая
РНК
СССС
СССС
СССС
СССС??
СССС
СССС
pBR322
dCTP,
терминальная
трансфераза
Отжиг, лигирование,
трансфекция Е. СОИ
Библиотека кДНК
Синтез второй цепи
кДНК с помощью
ДНК-полимеразы
и нуклеазы S1
кДНК, специфичная
для Т-клеток
£>gG
&ggg
Скрининг библиотеки путем
отжига с радиоактивно меченным
зондом, представляющим собой
специфичную для Т-клеток кДНК
о
к ДНК-зонд, специфичный
для Т-клеток
Этап 2
Клоны специфичной
для Т-клеток кДНК
Т-клетка
Т-клеточный
рецептор
Обратная транскриптаза,
32р-меченные dNTP
Удаление
последовательностей
РНК В-кдеток,
как на этапе 1
Связанная с мембраной
Удаление РНК
полисомная poly (А+ )- РНК
(
О (
о
о
РИС. 6.37.
Клонирование кДНК крысы, кодирующей P-цепь Т-кле-
точного рецептора. Т-лимфоциты играют ключевую
роль в клеточном и гуморальном иммунитете. Их функ-
ционирование опосредуется характерным гетеродимер-
ным поверхностным рецептором (разд. Ю.б.в). Первый
этап клонирования гена P-цепи состоит в создании
рВВ322-библиотеки кДНК, обогащенной мРНК, специ-
фичной для Т-клеток. В качестве матрицы для синтеза
первой цепи кДНК используется цитоплазматическая
Т-клеточная poly (А+)-РНК. Молекулы кДНК отжигали
с цитоплазматической poly(A+)-PHK из лимфоцитов
другого типа, В-клеток, и дуплексы РНК-кДНК удаляли
из смеси путем связывания их с гидроксилапатитом
(разд. 7.5.6). При этом удалялось более 95% молекул
кДНК, соответствующих молекулам мРНК, общим для
В- и Т-клеток. Оставшуюся (5%) специфичную для
Т-клеток кДНК использовали в качестве матрицы для
синтеза второй цепи кДНК. После обработки нуклеазой
S1 присоединяли С-«хвосты» и лигировали молекулы с
плазмидой pBR322, предварительно разрезанной в
PsZ 1-сайте и содержащей С-«хвосты». Рекомбинантные
молекулы использовали для получения трансформиро-
ванных колоний Е. coli. Второй этап состоит в получении
радиоактивно меченного зонда для скрининга библио-
теки кДНК. В качестве зонда использовали первую цепь
кДНК, синтезированную на цитоплазматической мемб-
раносвязанной полисомной poly (А+)-РНК из Т-клеток
(Напомним, что, поскольку Т-клеточный рецептор нахо-
дится на плазматической мембране клетки, он трансли-
руется на рибосомах, связанных с мембранами эндо-
плазматического ретикулума.) Для обогащения кДНК
в отношении специфичных для Т-клеток транскриптов
ее гибридизовали с В-клеточной poly(A+)-PHK и дуп-
лексы РНК-кДНК удаляли с помощью гидроксилапати-
та. Оставшуюся в растворе радиоактивно меченную
специфичную для Т-клеток кДНК использовали для
скрининга библиотеки. Из 5000 проверенных клонов
библиотеки 35 были положительными. Пять из них
гибридизовались с В-клеточной РНК на РНК-блотах.
Один из оставшихся 30 содержал последовательности,
кодирующие P-цепь Т-клеточного рецептора. До успеш-
ного клонирования кДНК Т-клеточный рецептор не уда-
валось выделить и о его структуре не было ничего
известно. [S. М. Hedrick et al.. Nature, 308 (1984), p. 149.]
6. СРЕДСТВА: КОНСТРУИРОВАНИЕ, КЛОНИРОВАНИЕ И ОТБОР
311
ЗВ 1-2
<11 II
Н В ННЕ ВН НЕ Н НН
I I III II II I II
Теломера Центромера
i I I
10 20 30 40
т.пн.
Локусы известных мутантов , в которых произошли перестройки
РИС. 6.38.
Клонирование гена, регулирующего ритмичность в по-
ведении Drosophila. Мутации в локусе per области ЗВ1 -2
Х-хромосомы Drosophila melanogaster вызывают анома-
лии циркадных (24-часовых) ритмов, а также изменение
частоты повторения песни ухаживания у мужской особи
Drosophila. Такие мутации часто бывают связаны с хро-
мосомными перестройками. Из этой части нормальной
Х-хромосомы были выщеплены сегменты ДНК, под-
вергнуты частичному гидролизу рестриктирующей эн-
донуклеазой и клонированы в /.-векторе. Клоны с пере-
крывающимися последовательностями идентифициро-
вали с помощью перекрестной гибридизации и обычных
карт эндонуклеазных сайтов (здесь указаны не все
сайты). В результате была построена карта длинного
сегмента ДНК, включающего локус per. Су брониро-
ванные области этого сегмента использовались в ка-
честве зондов для построения карт Х-хромосом, име-
ющих перестройки вблизи локуса per и известных как
рег+, рег~ или per“b (аномальное ритмическое поведе-
ние). Таким способом была установлена корреляция
между утратой нормального фенотипа и сегментом
ДНК длиной 15 т.п.н., находящимся вблизи централь-
ной части карты. Некоторые субклоны при трансдукции
с помощью P-элемента частично восстанавливали цир-
кадные ритмы и периодичность песен ухаживания у мух
с делециями per (см. разд. 10.2.6). Таким образом
Трансдуцирующие субклонированные участки-
Hindi 11 -фрагмент размером
(_____0 _7,1 т.п.н. частично восстанав-
' 0 ливает фенотип per
Ват Н 1-фрагмент размером
С_________0 _9 т.п.н. не восстанавливает
( 0 фенотип per
Есо RI-фрагмент размером
(___________0 —► 8 т.п.н. частично восстанав-
1 0 ливает фенотип рег+
удалось выделить функциональный ген. регулирующий
поведение Drosophila, не зная точно положение этого
гена и не располагая какими-либо данными о его
продукте [Т. A. Bargiello, М. W. Young, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA., 81 (1984), p. 2142; W. Zehring et al.. Cell, 39
(1984), p. 369; Y. Citri et al.. Nature, 326 (1987), p. 42.]
312
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Полисомы из
сетчатки быка
Антитела к
опсину быка
Осаждение полисом,
синтезирующих опсин
а
Пептид: HeMetMetAsnLys
Возможные мРНК: 5'-AUCAUGAUGAaL[aA^-3’
си
Дезоксиолиго:
3’ -TAGTACTACTTGTTC- 5'
Отжиг
Есо Rl-метилаза
Присоединение
* Есо R 1-линкеров
• Клонирование в
Х-векторе
Опсиновая мРНК длиной 2,65 т. н.
2,5 105 бляшек
Обратная транскриптаза
а-32Р- dCTP
Немеченные dATP,dTTP, dGTP
Зонд
Скрининг
РИС. 6.39.
Клонирование генов и кДНК, кодирующих родопсин
быка, человека и Drosophila. Опсины это апопротеины,
входящие в состав фоторецепторов сетчатки (зритель-
ных пигментов). Зрительный пигмент родопсин содер-
жится в палочках сетчатки позвоночных. Установлена
его аминокислотная последовательность. Выделены со-
ответствующие кДНК и ген из клеток быка. Из полисом
сетчатки быка была получена poly (А+)-РНК, обогащен-
ная мРНК опсина. С помощью Х-вектора стандартными
методами была создана библиотека кДНК. Ее скрининг
проводили с использованием специфического зонда,
полученного в два этапа (а и б): о-химический синтез
дезоксиолигонуклеотида длиной 15 остатков, компле-
ментарного мРНК. последовательность которой была
воссоздана исходя из данных о последовательности
пяти аминокислот, находящихся вблизи СН3-конца мо-
лекулы опсина; б-использование этого деэоксиолиго-
нуклеотида иэ 15 звеньев в качестве специфического
праймера для обратной транскрипции мРНК опсина,
присутствующей в сетчатке быка. Зонд был радиоактив-
но помечен при обратной транскрипции с помощью
a-32P-dCTP. Олигонуклеотид длиной 15 звеньев позво-
ляет идентифицировать олеиновые клоны, однако спе-
цифичность теста увеличивается с увеличением длины
зонда. Иэ 2,5 105 клонов библиотеки специфическую
реакцию с зондом дали 0,2%. Анализ нуклеотидных
последовательностей восьми иэ них показал, что они
кодируют части молекулы опсина. Клоны кДНК исполь-
зовали в качестве зондов для скрининга геномных биб-
лиотек Drosophila, быка и человека. В библиотеке
Drosophila никаких положительных рекомбинантов об-
наружено не было, однако с помощью специальных
методов была выявлена последовательность, отдаленно
родственная последовательности Drosophila. кДНК быка
вырезали иэ ДНК Х-вектора с помощью рестриктиру-
ющей эндонуклеазы и повторно клонировали ее в век-
6. СРЕДСТВА: КОНСТРУИРОВАНИЕ, КЛОНИРОВАНИЕ И ОТБОР
313
Получение зонда
для
олеиновых генов
Drosophila
Полимераза SP6
32P-NTP
Отбор гибридов
с помощью дуплексов
РНК РНК
Poly (А+ )- РНК
из голов Drosophila
Отжиг, выделение
дуплексов с помощью
гидрокси л апатита
Обратная транскрипция
32Р -dNTP
digo (dT) ’'
Drosophila
5'( 0 32Р-кДНК
Библиотека зондов
Drosophila
Ген родопсина
Drosophila
торе типа pGEM. Радиоактивно меченную РНК, соответ-
ствующую несмысловой цепи, синтезировали, исполь-
зуя РНК-полимераэу SP6, и отжигали с poly (А+)-РНК,
выделенной из голов Drosophila. Дуплексы РНК-РНК,
содержащие мРНК опсина Drosophila, осаждали на гид-
роксилапатите (разд. 7.5.6). После денатурации дуплек-
сов РНК Drosophila использовали в качестве матрицы
для обратной транскрипции в присутствии oligo (dT)-
праймера и радиоактивно меченных деэоксирибонук-
леотидов, а образовавшуюся радиоактивно меченную
кДНК-для отбора клонов из геномной библиотеки
Drosophila. Успех процедуры зависит от характеристик
дуплексов РНК - РНК Неправильно спаренные дуплексы
РНК-РНК отличаются большей стабильностью, чем
соответствующие неправильно спаренные дуплексы
ДНК-ДНК. [J. Nathans, D.S. Hogness, Cell, 34 (1983), р.
807; С. S. Zuker, A. F. Cowman, G.M. Rubin, Cell, 40
(1085), p. 851.]
314
ЧАСТЬ II, ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
tk Ген
вируса герпеса
антител для окрашивания
клеток, несущих на своей поверх
ности рецептор трансферрина
Флуоресцирующие
клетки
О
э
о
Клонирование
флуоресцирующих клеток
ДНК содержит
более
3 • 103 т.п.н.-.
ДНК человека
на геном мыши
РИС. 6.40.
Клонирование гена человека, ко-
дирующего специфический транс-
ферриновый рецептор, находящий-
ся на клеточной поверхности. Транс-
феррин-это Fe3 +-связывающий сы-
вороточный белок, участвующий в
транспорте железа внутрь клетки.
Поглощение клеткой Fe3 +-транс-
ферринового комплекса опосредует-
ся специфическим рецептором,
представляющим собой гомодимер-
ный гликопротеин клеточной мемб-
раны. А. Для клонирования гена
рецептора мышиные tk~-клетки
котрансфицировали высокомолекулярными фрагмен-
тами суммарной ДНК человека и рекомбинантной
плазмидой, содержащей ген тимидинкинаэы (tk) вируса
герпеса. После отбора в среде HAT ТК+ -клетки смеши-
вали с антителами к рецептору трансферрина человека.
Клетки, связавшие антитела (и, следовательно, несущие
рецептор), обрабатывали флуоресцентной меткой, от-
бирали с помощью сортера и клонировали. ДНК, выде-
ленная иэ клонированных клеток, содержала значительно
ТК
Рецептор
трансферрина человека
Другие
г последовательности
ДНК человека
Выделение ДНК
,_ГА-Ген вируса герпеса
Ген рецептора трансферрина
человека
большее количество ДНК человека (более 3-103 т.п.н.
на мышиный геном), чем требовалось для кодирования
одного гена. (Количество ДНК человека оценивали в
присутствии большого избытка мышиной ДНК путем
отжига с зондом, содержащим последовательности
ДНК, повторяющиеся почти в 106 случайных мест, раз-
бросанных по всему геному человека, и не встречающи-
еся в ДНК мыши [разд. 9.5.в].) Б. Чтобы уменьшить
количество нежелательной ДНК человека, еще раз про-
6. СРЕДСТВА: КОНСТРУИРОВАНИЕ, КЛОНИРОВАНИЕ И ОТБОР
315
Другие последовательности
fr-Ген вируса герпеса
Повторная котрансфекция с
помощью рТК, отбор в среде HAT,
сортировка, клонирование
Ген рецептора трансферрина
человека
ДНК содержит
менее 50 т.п.н.
ДНК человека
на мышиный
геном
Ограниченный гидролиз
с помощью МЬо I,
создание Х-библиотеки
Скрининг с радиоактивно
меченным зондом, содержащим
большое число повторов
ДНК человека
6 рекомбинантных
фагов с перекры-
вающимися
вставками ДНК
человека (в одном
из них содержится
также ДНК мыши)
20
10
Уникальный
сегмент длиной 31 т.п.н.
т.п.н.
ДНК мыши
водили котрансфекцию с участием ДНК из этих клеток,
отбор в среде HAT, сортировку и клонирование. ДНК иэ
полученных вторичных трансформантов, содержащую
менее 50 т.п.н. ДНК человека на мышиный геном,
использовали для создания геномной библиотеки. Было
отобрано шесть фаговых клонов, которые гибридизова-
лись с зондом, содержащим повторяющиеся последо-
вательности ДНК человека, разбросанные по всему
геному. Все шесть клонов содержали перекрывающиеся
сегменты ДНК. Две вставки иэ шести (отмечены звез-
дочками) встраивали в фаговые векторы для воссозда-
ния уникального сегмента ДНК размером 31 т.п.н.,
ответственного эа синтез поверхностного рецептора
трансферрина человека, после трансфекции в мышиные
клетки. [L. С. Kuhn, A. McClelland, F. Н. Ruddle, Cell, 37
(1984), р. 95.]
316
6, СРЕДСТВА: КОНСТРУИРОВАНИЕ, КЛОНИРОВАНИЕ И ОТБОР
библиотеку кДНК подвергают скринингу, выявляя
те клоны, которые гибридизуются с обогащенным
мРНК (или кДНК)-зондом (рис. 6.34).
6.6. НЕКОТОРЫЕ СТРАТЕГИИ
КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНОВ И кДНК
В этой главе мы рассмотрели множество разных
методов, используемых при конструировании, кло-
нировании и отборе специфических рекомбинантных
генов. На основе этих методов можно разработать
множество стратегий для получения определенных
клонированных генов или кДНК. При выборе эф-
фективной и действенной стратегии важно учиты-
вать природу гена и его продукта, а также проис-
хождение вида. Чтобы представить себе все много-
образие методов работы с рекомбинантными моле-
кулами ДНК, лучше всего рассмотреть конкретные
примеры клонирования различных генов и кДНК.
На рис. 6.35-6.40 представлены эксперименты по
клонированию, иллюстрирующие разные стратегии.
Другие примеры описаны в последующих главах.
ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ:
ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
После отбора клонированных рекомбинантных
молекул нужно охарактеризовать содержащуюся в
них вставку. Для этого необходимо ответить на
несколько вопросов. Прежде всего-действительно
ли рекомбинантная молекула содержит нужный сег-
мент ДНК? Далее-включился ли сегмент целиком
или только частично? Соответствует ли он во всех
деталях геномной ДНК, из которой происходит?
Является ли нужная последовательность функцио-
нальной? В этой главе мы рассмотрим разные под-
ходы к характеризации клонированных фрагментов
ДНК. Прежде всего нужно очистить рекомбинант-
ную ДНК от ДНК клеток хозяина, РНК и белков.
Эта процедура довольно проста и включает экстрак-
цию, физическое разделение компонентов и фер-
ментативное расщепление РНК и белков. Так, плаз-
мидную ДНК можно отделить от геномной благо-
даря ее малому размеру и кольцевой структуре
(крупный кольцевой геном, подобный геному Е. coli,
обычно при выделении разрывается на линейные
фрагменты). Фаговую ДНК можно получить в
свободном от клеточной ДНК виде путем очистки
фаговых частиц и последующего выделения из них
ДНК.
7.1. МАКРОСТРУКТУРА
КЛОНИРОВАННОЙ ВСТАВКИ
Для определения макроструктуры вставки сна-
чала устанавливают ее размер и положение сайтов
для рестриктирующих эндонуклеаз. Поскольку кло-
нированные фрагменты геномной ДНК часто быва-
ют длиннее или короче, чем интересующая нас
область, необходимо также определить положение
и длину нужного сегмента внутри вставки.
а. Размер вставки
Размер векторной молекулы обычно бывает
известен, поэтому размер вставки можно оценить,
зная полную длину рекомбинантной молекулы и
предположив, что никакого делегирования во время
клонирования не произошло. Размер многих реком-
бинантных молекул можно определить с помощью
гель-электрофореза. Чтобы получить точные дан-
ные, кольцевые рекомбинантные молекулы превра-
щают в линейные, поскольку электрофоретическая
подвижность кольцевых структур зависит от степе-
ни их сверхспиральности. Стандартные электро-
форетические методы непригодны для тестирования
молекул, длина которых превышает 15 т.п.н,
поскольку крупные молекулы мигрируют в геле
слишком медленно. Поэтому размер многих реком-
бинантных молекул не поддается прямому опре-
делению с помощью электрофореза, если только
не используется импульсный электрофорез (разд.
6.5.а). Альтернативный способ оценки размера
рекомбинантных молекул состоит в измерении их
длины с помощью электронной микроскопии. Здесь
тоже очень важны стандартные размеры, поскольку
число пар оснований в сегменте определенной
длины на электронной микрофотографии может
зависеть от конфигурации молекулы и способа
приготовления препарата.
Другой подход к определению размера вставки
состоит в обращении тех реакций, которые исполь-
зовались при конструировании рекомбинантных
молекул, т. е. в вырезании вставок с помощью соот-
ветствующих эндонуклеаз рестрикции (рис. 7.1, А).
Размер линейной вставки определяют с помощью
гель-электрофореза. Поскольку карта сайтов для
эндонуклеаз рестрикции в векторной молекуле
обычно бывает известна, идентифицировать
встроенный фрагмент довольно легко. Если при
лигировании произошла элиминация эндонуклеаз-
ных сайтов на концах вставки (т. е. лигировались
тупые концы), можно использовать альтернативную
процедуру: разрезать векторную молекулу по сай-
там, находящимся в участках, которые фланкируют
вставку; в этом случае вставка будет вырезана
вместе с сегментами вектора известных размеров
(рис. 7.1,5). Иногда ситуация осложняется тем, что
сама вставка содержит сайты узнавания для ис-
пользуемой эндонуклеазы (рис. 7.1,5). В таком слу-
чае сумма размеров всех фрагментов, образующих-
ся из вставки, даст ее общую длину. Если вставка
слишком велика, то ее разрезание и суммирование
могут оказаться даже необходимыми для более
точного определения длины.
318
ЧАСТЬ II, ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
РИС. 7.1.
Определение размера вставки в рекомбинантной моле-
куле ДНК. А. Обращение процессов, которые исполь-
зовались для лигирования вектора со вставкой при
б. Картирование сайтов для
рестриктирующих эндонуклеаз
Принципы, лежащие в основе построения карты
сайтов для рестриктирующих эндонуклеаз в каком-
либо сегменте ДНК, описаны в разд. 4.2.г. В тех
случаях, когда вектор имеет небольшие размеры
и не слишком сложен, положение сайтов иногда
можно определить непосредственно в самой реком-
бинантной молекуле. Однако часто оказывается не-
обходимым сначала вырезать вставку и очистить ее
от векторных сегментов.
в. Субклонирование
Длинные клонированные вставки, входящие в
состав X- или космидного вектора, часто бывают
весьма неудобными для манипулирования. Поэтому
после построения частичной рестрикционной карты
вставку можно разделить на более мелкие фраг-
менты путем субклонирования. В принципе субкло-
нирование не отличается от других методов созда-
ния рекомбинантных ДНК, просто в этих случаях
в качестве исходного генома используют рекомби-
нантный клон Для субклонирования обычно при-
меняют рестриктирующие эндонуклеазы, сайты
клонировании. Б. Разрезание по сайтам, фланкиру-
ющим вставку. В. Суммирование размеров рестрик-
ционных фрагментов, образовавшихся иэ вставки
узнавания которых состоят из четырех пар основа
ний, поскольку они способны разрезать ДНК во
многих местах.
г. Определение положения
интересующего нас сегмента во
вставке
Для определения положения сегментов в неболь-
ших рекомбинантных геномах используются те же
подходы, что и при нахождении специфических
сегментов в больших геномах до клонирования
(разд. 6.1.б). После построения рестрикционной
карты вставки установить точную локализацию
нужного сегмента не составляет труда. Для этого
нужен только подходящий меченый зонд, аналогич-
ный ДНК- или РНК-зонду, используемому для от-
бора клона в начале клонирования.
На рис. 72 представлены данные, касающиеся
гена овальбумина курицы. Овальбумин - это
белок, состоящий из одной полипептидной цепи
(43 500 Да); он синтезируется в яйцеводе курицы
после стимуляции стероидным гормоном эстро-
геном (или прогестероном) и накапливается в яич-
ном белке. У кур-несушек стимуляция гормоном
происходит в естественных условиях, а у цыплят
7. ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
319
Е Е Е Е
20 2,45 2,0 2,35 11
РИС. 7.2.
Инкубация овальбуминовой мРНК со смесью фрагмен-
тов, образовавшихся при расщеплении ДНК фага X.
Есо Rl-эндонуклеаэой и содержащих последовательно-
сти овальбуминового гена цыпленка. Гидролизат под-
вергнут электрофорезу и блот-гибридизации. Внизу
представлена рестрикционная карта вставки. Цифры
длины фрагментов в т.п.н.
образование яйцевода и синтез овальбумина инду-
цируются при введении эстрогена. Гормон индуци-
рует транскрипцию гена овальбумина, в результате
чего содержание овальбуминовой мРНК в клетке
увеличивается практически от нуля до 50000 моле-
кул через две-три недели и падает до 10 молекул на
клетку после прекращения воздействия эстрогена.
Яйцеводы кур-несушек представляют собой хоро-
ший источник овальбуминовой мРНК, поскольку
она составляет в них около 50% суммарной мРНК.
Очищенную мРНК используют затем для приготов-
ления радиоактивного зонда, применяемого для
идентификации клонированного гена овальбумина.
Зондом может служить радиоактивно меченная
одноцепочечная кДНК, синтезированная непосред-
ственно на мРНК с помощью обратной транскип-
тазы, или клонированная дуплексная кДНК. С по-
мощью таких зондов из популяции Х-векторов,
содержащих вставки геномной ДНК курицы, полу-
ченные при ограниченном гидролизе эндонуклеазой
£coRI, были отобраны клонированные последова-
тельности овальбуминового гена. Вставка, пред-
ставленная на рис. 7.2, имела длину 6,8 т.п.н. Из нее
образовались три EcoRI-фрагмента, при этом толь-
ко фрагмент длиной 2,35 т.п.н. отжигался с оваль-
буминовым кДНК-зондом.
Положение искомой последовательности в кло-
нированном сегменте можно определить также с
помощью электронной микроскопии. Для этого
зонд и рекомбинантную ДНК смешивают, дена-
турируют и отжигают, а затем готовят препарат
для микроскопирования Комплементарные участки
зонда и исследуемой молекулы образуют дуплексы,
которые на электронных микрофотографиях выгля-
дят как относительно толстые нити, а некомпле-
ментарные участки остаются одноцепочечными и
имеют вид более тонких нитей. Гетеродуплекс
(РНК-ДНК), образующийся между овальбумино-
вым рекомбинантом, описанным в разд. 7.2, и
овальбуминовой мРНК, показан на рис. 7.3. Такие
гетеродуплексы формируются при условиях, благо-
приятных для гибридизации типа РНК-ДНК, а не
ДНК ДНК. В сегменте ДНК размером 2,35 т.п.н.,
который гибридизовался с мРНК (рис. 7.2), в обра-
зовании двухцепочечной структуры участвовали
только около 550 п.н. Таким образом, гетеро-
дуплексный анализ гораздо более информативен,
чем определение положения кодирующих последо-
вательностей в клоне. Он показывает, что, хотя
мРНК содержит около 1800 п.н., в клонированном
сегменте ДНК представлено менее трети длины
кодирующих последовательностей гена овальбуми-
на. Кроме того, 550 п.н. в клонированной ДНК,
комплементарные мРНК, не образуют одну непре-
рывную последовательность, а распределены по
четырем участкам, разделенным одноцепочечными
петлями, т.е. кодирующие последовательности ге-
номной ДНК чередуются с некодирующими. Как
описано в разд. 8.5, такие промежуточные последова-
тельности, или интроны, типичны для эукариоти-
ческих генов.
7.2. ТОНКАЯ СТРУКТУРА
КЛОНИРОВАННОЙ ВСТАВКИ:
НУКЛЕОТИДНАЯ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
Чтобы до конца выяснить структуру, функцию
и происхождение клонированного сегмента ДНК,
необходимо установить его первичную структуру-
нуклеотидную последовательность. Быстрые и точ-
ные методы определения последовательностей ДНК
322
ЧАСТЬ II ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Разрезание по пуриновым остаткам
Пиперидин-
формат,
pH 2
О
I
о—Р--О
I
OR
ОН’
Пиперидин
Н +
Разрезание по гуаниновым остаткам
ОН’
Пиперидин
Разрезание по пиримидиновым остаткам
О—Р=О
I
NH2-NH2 о
----------► R’o—Р
Г идразин-|
О
При включении
NaCI реакция
становится
специфичной в
отношении цитозина
I
OR
РИС. 7.6.
Реакции, использующиеся для специфической модифи-
кации оснований.
исходит только по дезоксицитидиновым остаткам.
32Р-мечение конца цепи. Как видно из данных,
представленных на рис. 7.5-7.7, каждая из четырех
реакционных смесей на самом деле представлена
двумя наборами цепей, получающихся в результате
гидролиза препарата ДНК. Один включает все
фрагменты, начинающиеся на 5'-конце исходной
цепи, другой все фрагменты, начинающиеся на
З'-конце. Нужную нам информацию о последова-
тельности можно получить, используя любой из
наборов, и выбор одного из них зависит от того, как
был помечен исходный фрагмент с 3'- или 5'-кон-
ца-перед проведением химических реакций, специ-
фичных в отношении определенного основания. Не-
меченый материал нельзя визуализировать с по-
мощью радиавтографии. Если исходным материа-
лом является дуплексная ДНК, то помечена должна
быть только одна из двух цепей, в противном случае
конечные продукты будут представлены двумя
разными наборами меченых цепей и данные будет
трудно интерпретировать.
7. ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
323
о
II
R — О— Р—О
I
О'
р- Элиминация О
R—О—Р—0“
I
О
Смесь
фрагментов
Введение метки в 5'-конец осуществляют с помо-
щью полинуклеотидкиназы и у-32Р [АТР] (рис. 7.8).
Если присутствуют 5'-концевые фосфомоноэфирные
группы, то их необходимо предварительно удалить
с помощью фосфомоноэстеразы. Одноцепочечные
молекулы секвенируют сразу после введения метки.
Дуплексную ДНК после осуществления киназной
реакции разделяют на две комплементарные цепи
с помощью денатурации и электрофореза (разд.
7.2.в). Меченый двухцепочечный фрагмент можно
также разрезать на две части по определенному
внутреннему эндонуклеазному сайту и образовав-
шиеся фрагменты разделить с помощью электро-
фореза. В этом случае секвенируемые молекулы на
самом деле являются двухцепочечными, но одна из
цепей не содержит метки и поэтому остается «не-
видимой».
Введение метки в З'-концы дуплексных цепей
целесообразно проводить в том случае, когда на
5'-концах имеются выступы. Удлинение более
21*
324
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
5'-pApGpCpTpTpTpCpTpGpApGpApApApCpTpGpCpTpCpTpG-3'
5'-Набор
З'-Набор
5'-pApGp pTpTpTpCpTpGpAGpApApApCpTpGpCpTpCpTpG-3’
5'-pApGpCpTpTpTp pTpGpApGpAGpApApApCpTpGpCpTpCpTpG-31
5'-pApGpCpTpTpTpCpTpGpApGpApApAp pTpGpCpTpCpTpG-3'
5'-pApGpCpTpTpTpCpTpGpApGpApApApCpTpGp pTpCpTpG-3'
5'-pApGpCpTpTpTpCpTpGpApGpApApApCpTpGpCpTp pTpG-3'
РИС. 7.7.
Образование родственных наборов цепей при хими-
ческом секвенировании. В данном примере модифици
руются и элиминируются остатки дезоксицитидина Для
секвенирования могут использоваться или 5'-, или
3 -наборы в зависимости от того, какой из концов (5
или 3') исходной ДНК был радиоактивно помечен
коротких З'-концов катализируется либо ДНК-поли-
меразой I, либо обратной транскриптазой, исполь-
зующими выступающий 5'-конец как матрицу;
32Р включается в цепь в составе соответству-
ющего а-32Р-меченного дезоксинуклеозидтрифосфата
(рис. 7.9,Л). Мечение по З'-концу происходит в каж-
дой из цепей двухцепочечной ДНК, а для секвениро-
вания необходимо иметь препарат, в котором все
молекулы несут метку только на одном конце.
Поэтому меченые двухцепочечные фрагменты рас-
щепляют рестриктазой и фракционируют субфраг-
менты с помощью гель-электрофореза или разделя-
ют цепи ДНК. Однако, если концы дуплексного
фрагмента не идентичны, часто оказывается воз-
можным прямое получение одноцепочечного 32Р-
меченного конца. Например, если один из концов
тупой, то его удлинения не происходит (рис. 7.9,5),
и при соответствующем подборе а-32Р-меченного
дезоксинуклеозидтрифосфата можно пометить
только один из концов (рис. 7.9,В). На рис. 7.10
представлены результаты химического секвенирова-
ния.
в. Ферментативное секвенирование
Получение наборов фрагментов, имеющих общие
концы. Для секвенирования ДНК с помощью фер-
ментативного копирования необходимо иметь одно-
цепочечную ДНК, а также короткий полидезокси-
нуклеотидный праймер, комплементарный неболь-
шому участку ДНК. Одиночная цепь служит матри-
цей, а новая цепь наращивается, начиная с З'-гидро-
ксильной группы праймера путем присоединения
дезоксирибонуклеотидтрифосфатов. При секвениро-
вании проводят четыре типа реакций копирования,
в результате чего образуются четыре набора цепей,
синтез которых остановлен на остатках А, С, G или
Т Остановка синтеза происходит в результате
5'—Р (
З'-НО (
ОН-3'
Р-5'
О Р
ставлены два способа получения фрагментов, содержа-
щих радиоактивную метку только в одной цепи.
РИС. 7.8. Н0 (
Введение 5'-концевой метки в двухцепочечную ДНК,
используемую для химического секвенирования Пред-
7 ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ 325
5'—С GATCC_____________gQ a?2P-dGTP 5- ( GATCC_______________GGO
(G CCTAG Q- 5’ CGG CCTAG 0 - 5'
A
5'- ( AGCTT____________GQ__________<?2P-dATP 5-( AGCTT________________G(?
(A CQ (AA CO
Б
5'- ( AGCTT_____________G() <?2P-dGTP AGCTT_____________GGO
Ца CCTAG o —5' * (a CCTAG Q “5'
В
РИС. 7.9.
Стратегия мечения З'-гидроксильного конца фрагмен-
тов ДНК путем заполнения пробелов а-32Р-меченными
дезоксинуклеозидтрифосфатами с помощью ДНК-по-
лимеразы I или обратной транскриптазы.
присоединения дидезоксинуклеотида, у которого
отсутствует З'-гидроксильная группа, что препят-
ствует дальнейшему удлинению цепи. Реакции про-
водят таким образом, чтобы вероятность остановки
синтеза на любом другом остатке, кроме заданного,
была очень мала.
ДНК-полимераза I (а также обратная транскрип-
таза) может утилизировать 2',3'-дидезоксинуклео-
зидтрифосфатные аналоги нормальных дезоксину-
клеозидтрифосфатных субстратов. Как и при обыч-
ной полимеризации, соответствующий дидезокси-
нуклеотид присоединяется к З'-гидроксильному кон-
цу праймерной цепи (рис. 7.11), однако образую-
щийся при этом продукт не может служить прай-
мером для дальнейшего роста цепи, и реакция
останавливается.
Для проведения четырех разных реакций копиро-
вания комплекс «матрица-праймер» инкубируют
в присутствии всех четырех обычных дезоксирибо-
нуклеозидтрифосфатов и какого-то определенного
дидезоксинуклеозидтрифосфата. Например, в одной
реакции используют ddATP, dATP, dGTP, dCTP,
dTTP, в другой-dATP, ddGTP, dGTP, dCTP, dTTP
и т. д. Удлинение цепи с помощью матричного
копирования происходит до тех пор. пока вместо
очередного дезоксинуклеотида не присоединится
дидезоксинуклеотид; в этот момент рост цепи
прекращается. Поскольку терминация синтеза про-
G
А
А
А
с
С
А
т
с
А
II I I •» И I II И 9 I •• It И"
hi и I I нт и lint min и швнввн вп i« пяи tn «<»<>
I i । it i и a i t si • «+-•
РИС. 7.10. G
Результаты химического секвенирования. Цепи были д
помечены на 5'-концах. Последовательность считывает- J
ся в направлении 5' -► 3'. Надписи над дорожками ука- V
зывают, какие специфические реакции использовались т
в каждом случае. (С любезного разрешения R. Е. Thayer.) а—
326
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Матрица 3' ( GGCTAAGATT Q5'
Праймер 5' £ CCGA О -ОН 3'
ДНК-полимераза
+ ddTTP
dATP
dCTP
dGTP
РИС. 7.11.
Присоединение дидезоксинуклео-
тида к растущей цепи останавли-
вает синтез ввиду отсутствия 3'-
гидроксильной группы, необхо-
димой для продолжения процес-
са.
3' Q GGCTAAGATT Q5'
5' ( CCGAT0 -НЗ'
исходит в случайных сайтах, образуется набор цепей
всех возможных длин, начиная с 5'-конца праймера
до сайтов, соответствующих положению присоеди-
ненного дидезоксинуклеотида (рис. 7.12). Новосин-
тезированные цепи являются радиоактивно мечен-
ными. поскольку в реакции используется по мень-
шей мере один радиоактивно меченный дезокси-
нуклеозидтрифосфат. Часто им является а-32-Р-
дезоксинуклеозидтрифосфат, но это может быть
также 358-(а-тио)-дезоксинуклеозидтрифосфат (рис.
7.13). Иногда используется радиоактивно меченный
праймер. Продукты четырех реакций подвергают
одновременному электрофорезу на отдельных до-
рожках, как при химическом секвенировании. По-
следовательность считывают с радиоавтографа,
который выглядит так же, как и радиоавтограф,
полученный при использовании химического метода
секвенирования (рис. 7.10).
Получение одноцепочечной ДНК для секвенирова-
ния с помощью дидезокси-терминаторов. Молекулы
ДНК обычно являются двухцепочечными; исключе-
ние составляют лишь одноцепочечные ДНК некото-
рых бактериофагов. Как мы уже говорили, физи-
ческое разделение цепей дуплекса не всегда осущест-
вимо (разд. 7.2.а). Для разделения цепей дуплекс
денатурируют нагреванием или обработкой ще-
лочью и проводят гель-электрофорез или хромато-
графию. Разделение двух комплементарных цепей
происходит, по-видимому, благодаря различиям их
конформаций, обусловленным различиями во вто-
ричйой структуре. Если разделения не произошло,
применяют другие методы получения одиночных
цепей. Наиболее эффективный из них состоит в
клонировании фрагмента ДНК в векторе, скон-
струированном на основе бактериофага М13 (разд.
5.3.е). Любая клонируемая вставка всегда будет
фланкирована одними и теми же последователь-
ностями векторной ДНК (рис. 7.14), что позволяет
использовать стандартные праймеры. Их синтези-
руют химическими методами, и всегда можно вы-
брать удобный праймер. Кроме того, не составляет
труда получить отдельные клоны, каждый из кото-
рых содержит одну из двух комплементарных цепей
ДНК (разд. 5.3.е), благодаря чему легко осущест-
вить секвенирование обеих цепей.
Комбинируя клонирование в М13 и секвенирова-
ние с помощью дидезокси-терминатора, мы можем
получить эффективный способ определения после-
довательностей молекул ДНК, длина которых до-
стигает нескольких тысяч пар нуклеотидов. Для
секвенирования длинных дуплексных молекул их
разрезают механически на фрагменты и затем про-
водят клонирование. Каждая образующаяся бляшка
содержит определенные фрагменты или цепи. Слу-
чайно отбирая клоны, определяют последователь-
ность вставок. Поскольку вставки образуются в
результате разрыва исходной молекулы ДНК в слу-
чайных местах, некоторые фрагменты содержат
перекрывающиеся последовательности. С помощью
компьютера сравнивают последовательность каж-
дого фрагмента с последовательностями других
фрагментов (разд. 7.3), выявляют перекрывающиеся
области и располагают отдельные фрагменты в
определенном порядке. Таким способом были опре-
делены последовательности митохондриальной
ДНК человека (16 569 пар нуклеотидов) и ДНК
Х-фага (48 502 пары нуклеотидов).
Другое применение методов секвенирования. Сек-
7. ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
327
dATP + ddATP
dCTP
dGTP
dTTP
Матрица 3- ( TCGGACTCA () 5’
Праймер 5* ( ()
| ДНК-полимераза I
“I 1 I
dATP dATP dATP
dCTP + ddCTP dCTP dCTP
dGTP dGTP + rtdGTP dGTP
dTTP dTTP dTTP + ddTTP
X) 5- ( A ddG () 5' ( AGCCddT Q
5'( AGCCTGddA Г) Б'( AGCddC () ! ( AGCCT ddG () 5 ( AGCCTGAGddT Q
5' ( AGCCTGAGT — () Б' ( AGCCTGAGT ---------»- 1) S’ ( AGCCTGA ddG Д) Б* ( AGCCTGAGT ----------»- ()
I ( AGCCTGAGT -------—Q
Б'
ddA ()
Б* ( AGddC
РИС. 7.12.
ddA ddC ddG odT
Дидезокси-метод секвенирования. Приведено схемати-
ческое изображение получающегося радиоавтографа.
Использовался радиоактивно меченный а-32Р-дезокси-
АТР.
венирование с помощью дидезокси-терминаторов
может применяться для прямого определения после-
довательностей РНК или ДНК, причем даже в том
случае, если в смеси помимо секвенируемой цепи
присутствуют неродственные молекулы. Важным
элементом при этом является праймер, комплемен-
тарный небольшому интересующему нас участку
и лишь с малой вероятностью ассоциирующий с
другими молекулами, присутствующими в смеси.
Подобной специфичностью обычно обладает прай-
мер длиной 20 оснований с уникальной последова-
тельностью. При таких условиях с помощью обрат-
ной транскриптазы синтезируют кДНК. Этот метод
применим только в том случае, если мы уже доста-
точно много знаем об интересующих нас РНК или
ДНК, но круг таких систем все время расширяется.
Метод химического секвенирования может при-
меняться для анализа специфических последователь-
ностей ДНК, присутствующих в смеси наряду с
большим числом разных молекул ДНК, в том числе
даже если речь идет об одном гене в суммарной
геномной ДНК млекопитающих. Прежде всего
ДНК разрезают с помощью рестриктирующей
эндонуклеазы, так что интересующий нас сегмент
оказывается во фрагменте длиной в несколько
сотен пар оснований. Затем проводят химические
реакции, специфичные к определенным основаниям,
в результате чего образуются четыре набора фраг-
ментов. Такие наборы включают все возможные по
длине фрагменты с интересующей нас областью,
начинающиеся в сайте рестрикции, по которому
была разрезана ДНК. Здесь же присутствует мно-
жество других фрагментов из остальной части
генома. Фрагменты разделяют путем электрофореза
в секвенирующем геле, затем переносят на нейло-
новый фильтр и отжигают с 32Р-меченным зондом,
который комплементарен последовательности-
мишени, находящейся вблизи одного из сайтов раз-
О 35g
II II
О
II
"О-Р-О-Р-О-Р-О-
I
о-
^Основание
о-
ОН Н
о-
(а-тио) -дезоксинуклеозидтрифосфат
РИС. 7.13.
Для идентификации синтезированных цепей в дидезок-
си-методе используется один или несколько радиоак-
тивно меченных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Обыч-
но это либо а-32Р-трифосфат, либо 355-(а-тио)-три-
фосфат( представленный здесь). Отметим, что замеще-
ние атома кислорода атомом серы при а-Р лишь незна-
чительно изменяет способность молекулы служить
субстратом для ДНК-полимеразы I.
328
ЧАСТЬ II, ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Последователь -
ность/acZ- ДН К
П раймер
___Направление
секвенирования
РИС. 7.14.
Секвенирование вставок одноцепочечной ДНК, клони-
рованных в векторе М13, с помощью дидезокси-метода
(см. разд. 5.3.е, где описан этот вектор). Независимо от
вставки при секвенировании могут использоваться одни
и те же одноцепочечные праймеры.
резания. Зонд ассоциирует со всеми фрагментами,
образовавшимися начиная с одного конца последо-
вательности-мишени, в результате чего на радио-
автограмме образуется типичная «секвенирующая
лестница». Таким методом можно определить, на-
пример, нуклеотидную последовательность мутант-
ных форм ранее клонированного гена. Он может
использоваться также для определения характера
метилирования специфической, уже клонированной
области генома, поскольку гидразин реагирует с
5'-метилцитозиновыми остатками менее эффектив-
но, чем с цитозиновыми и тиминовыми. О наличии
5'-метилцитозина в геле можно судить по отсут-
ствию цитозинового остатка, представленного в
соответствующем фрагменте ДНК, выделенном
после клонирования и репликации в клетках Е. coli
(см. рис. 4.13).
7.3. КОМПЬЮТЕРНЫЙ АНАЛИЗ
НУКЛЕОТИДНЫХ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК
Простота разделения сегментов ДНК путем
клонирования и их последующий анализ позволили
определить нуклеотидную последовательность мно-
гих ДНК. Но хотя стремление биологов к получе-
нию точных в химическом отношении данных про-
должало стимулировать эти исследования, инфор-
мация оказывалась бесполезной, если не были вы-
явлены какие-то особенности этих последователь-
ностей. На первый взгляд длинные ряды оснований
кажутся совершенно загадочными и не поддающи-
мися расшифровке. К счастью, проблему расши-
фровки можно решить с помощью высокоэффектив-
ных компьютерных программ и для рутинного
использования имеются программы на нескольких
стандартных компьютерных языках. Возможности
различных программ в значительной степени пере-
крываются. Их можно использовать при работе как
на больших компьютерах, так и на мини- и микро-
компьютерах. Вообще говоря, эти программы при-
годны для поиска как структурных, так и биологи-
ческих особенностей последовательностей.
а. Хранение информации
о первичной структуре
Для ввода и хранения данных о последователь-
ностях и последующего поиска, проводимого иссле-
дователем вручную или с помощью специальной
аналитической программы, используются стандарт-
ные процедуры редактирования. Большинство, этих
процедур предусматривают также возможность
коррекции хранящейся информации. Ввод данных
часто осуществляют путем типирования последова-
тельности в компьютерном терминале после про-
чтения и регистрации данных секвенирующето геля.
Однако имеются также программы для прямого
ввода исходных данных. В принципе такие про-
граммы позволяют свести к минимуму ошибки,
допускаемые при неправильном считывании гелей
или неточной регистрации данных. Существует два
подхода к такой автоматизации. В первом случае
детектор автоматически сканирует радиоавтографы
7. ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
329
Нуклеотидная последовательность:
5109 5119 5129
TCCTTTCAAG ACCTAGAAGG TCCATTAGCT
5169 5179 5189
CCATCTTTGC AAAGCTTTTT GCAAAAGCCT
5229 5239 1 6
TGGAATAGCT CAGAGGCCGA GGCGGCCTCG
46 56 66
CCATGGGGCG GAGAATGGGC GGAACTGGGC
106 116 126
GGCGGGACTA TGGTTGCTGA CTAATTGAGA
166 176 186
GAGCCTGGGG АСТТТССАСА CCTGGTTGCT
226 236 246
CTGCCTGCTG GGGAGCCTGG GGACTTTCCA
5 1 39
GCAAAGATTC
5 199
AGGCCTCCAA
1 6
GCCTCTGCAT
76
GGAGTTAGGG
1 36
TGCATGCTTT
1 96
GACTAATTGA
256
САСССТААСТ
5 149
CTCTCTGTTT
5209
AAAAGCCTCC
26
АААТАААААА
86
GCGGGATGGG
146
GCATACTTC Т
206
GATGCATGCT
5 1 59
ААААСТТТАТ
52 1 9
ТСАСТАСТТС
36
AATTAGTCAG
96
CGGAGTTAGG
1 56
GCCTGCTGGG
2 1 6
TTGCATACTT
GACA
Комплементарная цепь:
251 241 231
TGTCAGTTAG GGTGTGGAAA GTCCCCAGGC
191 181 171
САТСТСААТТ AGTCAGCAAC CAGGTGTGGA
131 121 111
ATGCAAAGCA TGCATCTCAA TTAGTCAGCA
71 61 51
CCGCCCCTAA CTCCGCCCAG TTCCGCCCAT
11 1 5234
ATTTATGCAG AGGCCGAGGC CGCCTCGGCC
5194 5184 5174
TTTTTTGGAG GCCTAGGCTT TTGCAAAAAG
5134 5124 5114
AGAGGAATCT TTGCAGCTAA TGGACCTTCT
221 211 201
TCCCCAGCAG GCAGAAGTAT GCAAAGCATG
161 151 141
AAGTCCCCAG GCTCCCCAGC AGGCAGAAGT
101 91 81
ACCATAGTCC CGCCCCTAAC TCCGCCCATC
41 31 21
TCTCCGCCCC ATGGCTGACT AATTTTTTTT
5224 5214 5204
TCTGAGCTAT TCCAGAAGTA GTGAGGAGGC
5164 5154 5144
CTTTGCAAAG ATGGATAAAG TTTTAAACAG
5 1 04
AGGTCTTGAA agga
Последовательность Распределение динуклеотидов:
содержит 404 нуклеотида Число Проценты Ожидаемые проценты
95 (23,5) Аденин АА 32 7,9 5,5
96 (23,8) Цитозин АС 18 4,5 5,6
110 (27,2) Гуанин AG 24 6,0 6,4
103 (25,5) Тимин АТ 20 5,0 6,0
0 Другие СА 21 5,2 5.6
СС 23 5,7 5,6
CG 9 2,2 6,5
СТ 43 10,7 6,1
GA 24 6,0 6,4
GC 35 8.7 6,5
GG 44 10,9 7,4
GT 7 1,7 6,9
ТА 18 4,5 6,0
ТС 20 5.0 6,1
TG 33 8,2 6,9
ТТ 32 7,9 6,5
РИС. 7.15.
Секвенирование области генома SV40, включающей
точку начала репликации Числа обозначают то же, что
и на рис. 5.34. Остаток 1 находится непосредственно
в этой точке и соседствует с остатком 5243 в кольцевом
геноме Вся последовательность читается в направлении
5'-*3', слева направо, сверху вниз. Это типичные дан-
ные на выходе компьютера; сюда входят: последова-
тельность, введенная в компьютер, комплементарная
последовательность, нуклеотидный состав, частота
встречаемости нуклеотидов и частоты, ожидаемые для
последовательности со случайным распределением тех
же нуклеотидов.
330
ЧАСТЬ II, ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
и передает данные непосредственно в компьютер.
Во втором данные автоматически регистрируются
от сенсора, управляемого вручную. При втором
подходе исследователь является арбитром при
любых затруднениях.
б. Структурный анализ
Первичная структура. Если имеются данные о
нуклеотидной последовательности одной цепи,
то большинство программ позволяют построить
комплементарную цепь, вычислить нуклеотидный
состав, выявить участки, богатые пуринами, пири-
мидинами или определенными сочетаниями основа-
ний, и определить частоту встречаемости различных
динуклеотидов (рис. 7.15). Могут быть выявлены
специфические субпоследовательности в пределах
определенного сегмента, что часто используется для
нахождения сайтов для рестриктирующих эндо-
нуклеаз (рис. 7.16). В программу введена информа-
ция о сайтах узнавания для известных ферментов,
и по одной команде выдаются сведения о положе-
нии этих сайтов для каждого из ферментов, числе
ожидаемых фрагментов, образующихся при расщеп-
лении ими ДНК, размере каждого фрагмента в
парах оснований и его процентном отношении к
общей длине сегмента, а также о нуклеотидных
остатках, соответствующих концам каждого фраг-
мента. Существуют также программы, которые
могут предсказать, какие продукты будут получены
при совместном действии двух или нескольких эндо-
нуклеаз. При этом предсказания делаются как для
линейных, так и для кольцевых молекул. Получен-
ная информация может использоваться для под-
тверждения данных секвенирования путем сравни-
тельного анализа ожидаемого и реального резуль-
татов действия эндонуклеаз.
Имеющиеся программы осуществляют также
поиск характерных особенностей последовательно-
стей. включая прямые (рис. 7.17) и обратные
(рис. 7.18) повторы. Выявляются не только пол-
ностью совпадающие сегменты, но и сегменты с той
или иной степенью несовпадения; для этого до-
пускаются определенные отклонения параметров,
заложенных в программу, от фиксированного значе-
ния. В примере, представленном на рис. 7.17, пере-
числены все повторы длиной не менее шести пар
оснований и гомологичные не менее чем на 75%.
Предполагается, что максимальный размер обра-
зующихся петель равен двум основаниям.
Можно получить данные о гомологии или ча-
стичной гомологии различных последовательно-
стей. Эти данные могут касаться структуры одного
и того же гена у двух разных организмов или
родственных генов одного организма. Такой
сравнительный анализ широко используется при
изучении эволюции на молекулярном уровне. Для
сравнения двух последовательностей между собой
или одной последовательности с группой других
последовательностей разработаны специальные
алгоритмы. Может использоваться описанный ра-
нее вероятностный анализ. По результатам сравне-
ния информации о последовательностях, получен-
ной в разных лабораториях, был создан централь-
ный банк данных, из которого всегда можно за-
требовать информацию о тех или иных последо-
вательностях. К 1989 г. в банках имелась инфор-
мация о последовательностях более 20 миллионов
пар оснований, представляющая данные о многих
генах и организмах.
Помимо этого общего применения, обнаружение
сходства различных последовательностей является
Сайты Фрагменты
ALL) 1, ОХА 1, (AGCT) П.Н. Длина Концы
3 П.Н. %
5126 277 (68,6) 5226 260
5172 54 (13,4) 5172 5226
5226 46 (11,4) 5126 5172
27 ( 6,7) 5100 5126
AVA 3 (AT G CAT) 2 126 270 (66,8) 5100 126
198 72 (17,8) 126 198
62 (15,3) 198 260
BGL 1 (GCCNNNNNGGC) 1 5235 268 (66,3) 5235 260
136 (33,7) 5100 5235
DDE 1 (CTNAG) 1 5228 275 (68,1) 5228 260
129 (31,9) 5100 5228
НАЕ 3 (GGCC) 4 5191 254 (62,9) 6 260
5234 92 (22,8) 5100 5191
5243 43 (10,6) 5191 5234
6 9 ( 2,2) 5234 5243
6 I 1,5) 5243 6
HIND 3 (AAGCTT) 1 5171 332 (82,2) 5171 260
72 (17,8) 5100 5171
HINF 1 (GANTC) 1 5135 368 (91,1) 5135 260
36 ( 8,9) 5100 5135
РИС. 7.16.
Компьютерные данные о положении некоторых сайтов
для рестриктирующих эндонуклеаз в сегменте ДНК
SV40, представленном на рис. 7.15. Указаны число сай-
тов (#) для каждого фермента, их положение (п.н.),
а также длина каждого фрагмента, образующегося при
расщеплении исходного фрагмента, как в числе пар
оснований, так и в процентном отношении от длины
всего сегмента (в скобках). Указаны номера остатков на
концах фрагментов.
7. ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
331
49 GAATGGGCGGA 59
91 GA TGGGCGGA 90
О 909 а
ЗЕ 05 Ь
1Е+00 с
52 TGGGCGGA 59
62 TGGGCGGA 69
1 000
4Е-05
2Е+00
53 GGGCGGAACT 62
96 GGGCGGGACT 105
0 900
9Е-05
4Е+00
57 GGAACTGGGCGGAGTTAGGGGCG 79
80 GGA TGGGCGGAGTTAGGGGCG 100
О 913
ОЕ+ОО
ОЕ+ОО
62 TGGGCGGAGTTAGGGGCGGGA 92
83 TGGGCGGAGTTAGGGGCGGGA 103
1 000
ОЕ+ОО
РИС. 7.17.
Компьютерные данные о некоторых повторах, встречающихся в сегменте
ДНК SV40, представленном на рис. 7.15. Программа не учитывала по-
вторы длиной менее 7 п.н., повторы, гомологичные менее чем на 75%
(MINRATIO), а также повторы, вероятность обнаружения которых
(MAXPROBE) при такой же степени совпадений в случайной последо-
вательности превышает 1-10 4 (это условие записывается в виде
9.99Е-05). Реальная гомологичность данного повтора (в %) обозначена
на рисунке буквой а, а вероятность его появления буквой Ь. Ожидаемое
число повторов с такой же гомологией в последовательности со слу-
чайным распределением оснований и такими же нуклеотидным составом
и длиной обозначено буквой с. Максимально допустимый размер петли
равен двум нуклеотидам При b < 1 Ю 5 (1 Е-05) этот параметр при-
нимается равным 0, и с тоже автоматически становится равным нулю.
В анализируемой последовательности выявлено 22 повтора (на рисунке
приведено 8 из них), в то
0Е+0° время как при случайном
-107 tggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacc i78 оаспоеделении оснований их
179 TGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACC 250
1 ооо ожидаемое число равно 4.
ОЕ+ОО
ОЕ+ОО
127 TGCATGCTT TGCATACT 143
208 TGCATACTTCTGCCTGCT 225
0 778
1Е-05
5Е 01
136 TGCATACTTCTGCCTGCT 153
199 TGCATGCTT TGCATACT 215
0 778
IE-05
5E-01
THE NUMBER OF MATCHES IS 22
MAXPRO8 9 99E 05 EXPECT 4 MINRATIO-7 50E-01.
LOOPLENGTH= 2 DISTANCE= 404
составной частью секвенирования очень длинных
последовательностей с помощью дидезокси-метода,
объединенного с клонированием в фаге М13 (разд.
7.2. в). Используя компьютер для обнаружения пере-
крывающихся последовательностей, мы не только
делаем работу менее утомительной, но и можем
THE DYAD SYMMETRIES ARE
5177 TTTGCAAA 5184
5172 AAACGTTT 5165
1 000
4E-05
2E-01
1 GCCTCGGCCTCTG 13
5242 CGGAGCCGGAGAC 5230
1 000
0E+00
0E+00
THE NUMBER OF MATCHES IS 2
MAXPROB- 9 99E 05 EXPECT 0
LOOPLENGTH= 2
MINRATIO= 7 50Е-01.
LOOPDlST= 20.
РИС. 7.18.
Компьютерные данные об обратных повторах в сегмен-
те ДНК SV40, изображенном на рис. 7.15. Обозначения
такие же, как на рис. 7.17.
быстро решить, следует ли нам пытаться получить
дополнительные данные.
Вторичная структура. Разработаны програм-
мы, позволяющие предсказать стабильную внутри-
молекулярную вторичную структуру однопепочеч-
ных РНК или ДНК. Они позволяют, например,
построить модель укладки цепи тРНК и рРНК,
и многие из таких моделей получили эксперимен-
тальное подтверждение в опытах с использованием
нуклеаз, специфичных к одноцепочечным участкам.
Расчеты основаны на предположениях о вероят-
ности образования определенных пар оснований, на
термодинамических свойствах разных пар основа-
ний и данных о стабильности спирали.
в. Биологическое значение
С помощью компьютерных программ можно
перевести информацию с языка нуклеотидов на язык
аминокислот в соответствии с правилами генети-
ческого кода. При этом указываются все три
возможные рамки считывания и стоп-кодоны транс-
ляции. В тех случаях, когда аминокислотная после-
довательность кодируемого полипептида известна,
идентифицировать правильную рамку считывания
не составляет труда. В противном случае правиль-
332
ЧАСТЬ II, ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Трансляция начинается с позиции 1
5'
CGC СТС GGC СТС
ARG LEU GLY LEU
TTG САА
LEU GLN
AAA GCT
LYS ALA
TGG АСС
TRP THR
ТТС TAG
РНЕ END
5214 5184
TGA GCT ATT CCA GAA GTA GTG AGG AGG СТТ ТТТ TGG AGG ССГ AGG СТТ
END ALA ILE PRO GLU VAL VAL ARG ARG LEU PHE TRP ARG PRO ARG LEU
5154 5124
TTG CAA AGA TGG AIA AAG ТТТ TAA АСА GAG AGG ААГ CTT TGC AGC TAA
LEU GLN ARG TRP ILE LYS PHE END THR GLU ARG ASN LEU CYS SER END
5094 5064
GIC TTG AAA GGA GTG CCT GGG GGA АГА ТТС CTC TGA TGA GAA AGG CAT
VAL LEU LYS GLY VAL PRO GLY GLY ILE PHE LEU END END GLU ARG HIS
Трансляция начинается с позиции 2
5' 5213 5183
GCC TCG GCC TCT GAG СТА ТТС CAG AAG TAG TGA GGA GGC TTT TTT GGA GGC CIA GGC TTT
ALA SER ALA SER GLU LEU PHE GLN LYS END ENO GLY GLY PHE PHE GLY GLY LEU GLY PHE
5153
TGC AAA AAG CTT TGC AAA GAT GGA TAA AGT
CYS LYS LYS LEU CYS LYS ASP GLY END SER
5093
GGA CCT TCT AGG TCT TGA AAG GAG TGC CTG
GLY PRO SER ARG SER END LYS GLU CYS LEU
5123
TTT AAA CAG AGA GGA АТС TTT GCA GCT ААГ
PHE LYS GLN ARG GLY ILE PHE ALA ALA ASN
5063
GGG GAA TAT TCC TCT GAT GAG AAA GGC ATA
GLY GlU TYR SER SER ASP GLU LYS GLY ILE
Трансляция начинается с позиции 3
5- 5212 5182
CCT CGG CCT CTG AGC ТАГ ТСС AGA AGT AGT GAG GAG GCT ТТТ TTG GAG GCC TAG GCT TTT
PRO ARG PRO LEU SER TYR SER ARG SER SER GLU GlU ALA PHE LEU GLU ALA END ALA PHE
5152 5122
GCA AAA AGC TTT GCA AAG ATG GAT AAA GTT TTA AAC AGA GAG GAA TCT TTG CAG' СТА AIG
ALA LYS SER PHE ALA LYS MET ASP LYS VAL LEU ASN ARG GLU GLU SER LEU GLN LEU MET
5092 5062
GAC CTT СТА GGT CTT GAA AGG AGT GCC TGG GGG ААГ ATT CCT CTG ATG AGA AAG GCA TAT
ASP LEU LEU GLY LEU GLU ARG SER ALA TRP GLY ASN ILE PRO LEU MET ARG LYS ALA TYR
РИС. 7.19.
Компьютерные данные о трансляции части генома SV40
(остатки 5243-5062, рис. 5.34) при трех возможных
рамках считывания. Представленная цепь ДНК имеет
такую же последовательность, как и мРНК для ранних
белков (смысловая цепь). Правильной является третья
рамка считывания. Инициирующий кодон ATG (AUG)
выделен цветом. Стоп-сигнал трансляции обозначен как
«end».
ную рамку можно выбрать, исходя из ее длины.
Рамки, в которых часто встречаются стоп-кодоны,
вряд ли могут считаться правильными. На рис. 7.19
показаны часть генома SV40, кодирующая участок
вблизи 1ЧН2-конца малого и большого Т-антигенов
(см. рис. 5.34), и полученные с помощью компьюте-
ра аминокислотные последовательности для всех
трех рамок считывания. Правильной является
третья рамка. Можно также рассчитать частоту, с
которой встречается каждый кодон, и таким обра-
зом выявить предпочтительные кодоны для опре-
деленных аминокислот. Обращение этой процедуры
позволяет воссоздать возможные нуклеотидные
последовательности, исходя из известной амино-
кислотной последовательности полипептида, хотя
эта задача не имеет однозначного решения вслед-
ствие вырожденности генетического кода. Централь-
ный банк данных содержит информацию об амино-
кислотных последовательностях всех проанализи-
рованных полипептидов, что позволяет сравнивать
последовательности изучаемого и известных белков.
С помощью компьютеров можно вести поиск
специфических нуклеотидных последовательностей,
например промоторов или участков связывания с
рибосомами. Они позволяют также обнаружить
последовательности со специфическими свойствами.
Например, наличие сходных последовательностей
в разных неродственных во всех других отношениях
генах или вблизи них наводит на мысль об их
возможной регуляторной роли. Точно так же при-
сутствие гомологичных последовательностей в
кодирующих областях различных генов может сви-
детельствовать об общности эволюционного про-
исхождения этих генов. Данный вопрос детально
рассмотрен в ч. III книги. Однако важно осознавать,
что статистический анализ еще не является доста-
точным для того, чтобы делать вывод о биологи-
ческой роли той или иной последовательности. Об
этом можно говорить только после проведения
независимого биологического исследования.
7. ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
333
7.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
КЛОНИРОВАННЫХ СЕГМЕНТОВ
В ГЕНОМАХ
В идеале установление положения клонирован-
ного сегмента ДНК означает определение флан-
кирующих его последовательностей и того хро-
мосомного сайта, по которому этот сегмент был
включен в хромосому. Конечная цель такого кар-
тирования состоит в полном описании структуры
хромосомы.
а. Молекулярная локализация
Характеристика клонированного сегмента.
Прежде всего необходимо доказать, что клониро-
ванный сегмент действительно является репликой
определенного геномного сегмента. Существует ли
в геноме гомологичный сегмент с точно так же
расположенными сайтами для рестриктирующих
эндонуклеаз? Этот вопрос имеет важное значение,
поскольку во время репликации в системе хозяин
вектор иногда происходит клонирование случайных
последовательностей, образовавшихся в результате
рекомбинаций, делеций или мутаций. Основной под-
ход состоит в использовании клонированной ДНК
в качестве зонда для анализа продуктов эндонук-
леазного расщепления суммарной геномной ДНК,
из которой произошел данный клонированный сег-
мент. Такой подход аналогичен описанному в разд.
6.1.6 с тем отличием, что зондом в данном случае
является клонированная вставка, меченная 32Р.
В эксперименте, результаты которого иллюстрирует
рис. 7.20,Б, клонированный зонд представлял собой
субклонированный сегмент (2,35 т.п.н.) овальбуми-
нового гена, показанный на рис. 7.2; материал, под-
вергнутый электрофорезу,-это EcoRI-гидроли-
зат ДНК курицы (рис. 7.20,Л). С зондом гибри-
дизовался материал только одной полосы, пред-
ставляющий собой фрагменты длиной 2,35 т.п.н.
Этот эксперимент показывает, что 1) клонированная
вставка в самом деле является фрагментом ДНК
курицы; 2) в геноме гибридизующийся сегмент рас-
положен между двумя E'cnR 1-сайтами, находящи-
мися друг от друга на расстоянии 2,35 т.п.н.; 3) ни
один из фрагментов любого другого размера не
гибридизуется с зондом. Таким образом, клониро-
ванный фрагмент длиной 2,35 т.п.н., по-видимому,
представляет собой истинную геномную последова-
тельность и два аллеля в диплоиде являются иден-
тичными, поскольку локализация этих EcoRI-сайтов
совпадает.
Еще одна последовательность овальбуминового
гена обнаружена в EcoRI-фрагменте длиной 1,8
т.п.н. После того как он был клонирован и исполь-
зован в качестве зонда для анализа EcoRI-гидро-
ДН К Радиоавтограф, Радиоавтограф,
РИС. 7.20.
Отжиг 32Р-меченных клонированных сегментов оваль-
буминового гена длиной 2,35 т.п.н. (Б) и 1,8 т.п.н. (В)
с Есо Rl-фрагментами суммарной ДНК цыпленка (А).
лизата ДНК курицы, были обнаружены три гибри-
дизующихся фрагмента (рис. 7.20,В) длиной 1,8; 1,3;
0,5 т.п.н. соответственно. Эти данные свидетель-
ствуют о неидентичности двух аллельных оваль-
буминовых генов. Один из них содержит дополни-
тельный EcoRI-сайт, разделяющий фрагмент дли-
ной 1,8 т.п.н. на две части. Интересно, что столь
простая процедура лежит в основе генетического
анализа. Наследование двух или более аллелей
легко прослеживается с помощью эндонуклеазното
расщепления, электрофореза, ДНК-блоттинга и
гибридизации между соответствующим зондом и
ДНК, выделенной из разных источников. Един-
ственным требованием является наличие полиморф-
ных эндонуклеазных сайтов в аллелях любого гена
или сегмента ДНК. Для проведения таких экспери-
ментов достаточное количество ДНК можно полу-
чить из очень небольшого кусочка ткани или из
нескольких миллилитров крови, поэтому метод
может использоваться для анализа ДНК большин-
ства видов, в том числе и человека.
Построение карты молекулы. Имея сравнитель-
но короткие сегменты молекулы ДНК, такие, напри-
мер, как ранее описанный субклонированный фраг-
мент длиной 2.35 т.п.н., можно построить деталь-
ную карту молекулы вплоть до установления ее
нуклеотидной последовательности. Более длинные
клонированные последовательности, подобные тем,
которые присутствуют в Х-векторах или космидах,
334
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
часто содержат несколько генов, а также другие
сегменты ДНК, и могут использоваться для расши-
рения карты. Так, субклонированный фрагмент
овальбуминового гена длиной 2,35 т.п.н. служил
зондом для поиска гомологичных последователь-
ностей в космидной библиотеке, сконструированной
из геномной ДНК курицы. Были отобраны две
космиды с перекрывающимися последовательностя-
ми только в области зонда; вместе они составляли
участок генома длиной 46 т.п.н. (рис. 7.21), из кото-
рых 7,7 т.п.н. принадлежали самому гену оваль-
бумина (включая некодирующие последователь-
ности). Область, содержащая овальбуминовый ген,
была идентифицирована благодаря образованию
гетеродуплекса с овальбуминовой кДНК. Неожи-
данно обнаружилось, что два других участка сег-
мента длиной 46 т.п.н. также гибридизуются с
овальбуминовой кДНК. хотя и в меньшей степени.
При отжиге РНК из яйцевода курицы с космидами
эти два участка гибридизовались также с двумя
другими мРНК, отличными от овальбуминовой.
Было высказано предположение, что в сегменте
длиной 46 т.п.н. локализованы еще два гена,
последовательность которых сходна с последова-
тельностью гена овальбумина. Данное предположе-
ние получило подтверждение после проведения
рестрикционного и гетеродуплексного анализа, а
также после определения нуклеотидной последова-
тельности. Эти два гена, обозначенные как X и Y (их
функции и продукты остаются неизвестными), тран-
скрибируются, как и овальбуминовый ген, в при-
сутствии стероидных гормонов.
Методы, использующиеся при картировании
овальбуминового гена и генов X и Y, лежат в основе
широко распространенного подхода к построению
детальных генетических карт, получившего название
прогулки по хромосоме. Уникальный сегмент ДНК,
примыкающий к одному из концов клонированного
Направление транскрипции генов X, Y и овальбуминового гена
Космида 1
„Овальбуминовый зонд
длиной 2,35 т.п.н.
I__________________|__________________I_________________I__________________I_____________I
О 10 20 30 40 46 т.п.н.
фрагмента, очищают (путем субклонирования) и
используют для зондирования библиотеки геном-
ной ДНК. Одни гибридизующиеся клоны полно-
стью перекрываются с исходным клонированным
сегментом, другие же включают новые сегменты,
в результате чего карта расширяется. При повторе-
нии этой процедуры совершается «прогулка»
на большее расстояние. Данный метод не очень
удобен для картирования тех геномов, которые
содержат большое число рассеянных повторов,
поскольку в этом случае трудно очистить уникаль-
ные последовательности, используемые в качестве
зондов.
б. Хромосомная локализация
Классическое генетическое картирование осно-
вывается на получении определенных мутаций и
анализе частот рекомбинаций (см. введение к ч. I).
У Drosophila генетические карты удалось расширить
и уточнить путем установления корреляций между
генетическими данными и хромосомными аберра-
циями типа делеций, инверсий и транслокаций,
которые визуально проявляются как изменения в
характере исчерченности политенных хромосом.
Однако подобные методы непригодны для анализа
хромосом большинства растений и животных. Гене-
тический анализ немногочисленных популяций с
большим периодом генерации весьма затрудните-
лен, поскольку политенность встречается редко, а
хромосомы довольно многочисленны, имеют не-
большие размеры и с трудом поддаются иденти-
фикации. Например, у млекопитающих установле-
ние корреляции между фенотипическими изменения-
ми и делениями, транслокациями и инверсиями
позволяет локализовать лишь ограниченное число
генов в специфических хромосомах или отдельных
их областях. С развитием методов получения клони-
рованных сегментов ДНК были разработаны уни-
версальные процедуры картирования, которые не
зависят от фенотипического проявления мутаций.
Удалось локализовать многие гены, в том числе
и гены человека, в специфических областях хро-
мосом.
Мы рассмотрим два наиболее распространенных
метода. С помощью одного из них положение
РИС. 7.21.
Используя две космиды с перекрывающимися
последовательностями, можно построить де-
тальную генетическую карту области овальбуми-
нового гена цыпленка. Сегмент размером 46 т.п.н.
помимо гена овальбумина содержит два родст-
венных гена, X и Y, с неизвестными функциями.
[A. Royal et al.. Nature, 279 (1979), p. 125.]
7. ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
335
клонированного сегмента ДНК устанавливают
по его способности гибридизоваться со специфи-
ческим участком в практически интактных хро-
мосомах. Второй позволяет идентифицировать
хромосому, которая несет определенную после-
довательность, путем гибридизации подходя-
щего меченого зонда с гибридными клетками,
содержащими различные наборы лишь из не-
скольких хромосом данного вида. В третьем
методе, описанном во введении к ч. IV, исполь-
зуются клонированные фрагменты ДНК для вы-
явления полиморфизма рестрикционных сайтов
(для примера см. рис. 7.20). Такой полиморф-
ный маркер применяют затем в качестве гене-
тического маркера для построения карт сцепле-
ния эукариотических хромосом аналогично тому,
как в классическом генетическом анализе исполь-
зуют фенотипические маркеры.
Картирование хромосом с помощью гибридиза-
ции. РНК-зонды или денатурированные ДНК-зонды
могут гибридизоваться с соответствующими после-
довательностями денатурированной ДНК, входя-
щими в состав хромосом с характерными морфо-
логическими признаками. Положение радиоактивно
меченного зонда определяют, нанеся на препарат,
подготовленный для микроскопического исследова-
ния, чувствительную эмульсию; в том месте эмуль-
сии, которое контактирует с гибридным участком,
появляются темные зерна серебра. Проведя микро-
скопическое исследование всего препарата, можно
локализовать зонд. Довольно точные данные удает-
ся получить в случае больших политенных хромо-
сом Drosophila в основном благодаря тому, что
положение темных областей можно соотнести с
характером исчерченности хромосом (рис. 7.22,Л).
Однако определение положения единичных генов
в небольших и весьма многочисленных хромосомах
растений и позвоночных путем гибридизации in situ
затруднено по двум причинам. Во-первых, не всегда
легко идентифицировать отдельные хромосомы.
РИС. 7.22.
А
А. Локализация клонированного гена легкой цепи 2
миозина на политенной хромосоме 3 Drosophila с по-
мощью гибридизации in situ. Темные зерна серебра
группируются на участке, гомологичном зонду. [С лю-
безного разрешения J. Toffenetti, D. Mischke, M.L. Par-
due. J. Cell. Biol., 104 (1987), p. 19.] Б. Локализация
единичной последовательности, присутствующей в хро-
мосоме 7 свиньи, с помощью гибридизации in situ.
Зондом служил клонированный участок гена, кодиру-
ющего главный антиген гистосовместимости. Стрелкой
указаны зерна серебра на хромосоме 7. Анализ
распределения зерен по одной хромосоме не позволяет
однозначно локализовать искомую последовательность,
поскольку отдельные зерна встречаются и в других
областях хромосомы. Для этого нужно просмотреть не
менее 100 хромосом. На диаграмме рис. В представле-
но распределение числа зерен по хромосомным сайтам,
построенное по результатам анализа более 100 хромо-
сом 7. У всех остальных хромосом встречаются лишь
отдельные зерна, случайно разбросанные по разным
локусам. [М. Rabin et al., Cytogenet. Cell. Genet., 39
(1985). p. 206.]
336
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Окрашивание
акрихином или
его производными
Короткое плечо
Центромера
Теломеры
Длинное плечо
Окрашивание по Гимза
О-окрашивание G-окрашивание R-окрашивание С-окрашивание
(флуоресценция)
РИС. 7.23.
Разные методы окрашивания хромосом млекопитающих.
Положение полос при Q- и G-окрашивании одинаково,
а при R-окрашивании-обратное. Кариотип человека,
представленный на рис. 1.9, окрашен по Гимза (G-ok-
Это зависит от их размера, положения центромеры
и характерного рисунка из темных и светлых полос,
образующегося после окрашивания фиксированных
метафазных хромосом определенными красителями
(рис. 7.23). Кроме того, сами полосы захватывают
слишком большие отрезки ДНК. Например, 3 • 109
пар нулеотидов гаплоидного генома человека со-
держатся менее чем в 1000 различных полосах
(кариотип человека представлен на рис. 1.9), а у
растений это число даже меньше. В результате
с помощью чувствительной эмульсии можно уста-
новить лишь, в какой области хромосомы находит-
ся интересующий нас сегмент. Более того, размер
зерен серебра и его разброс уменьшают разрешаю-
щую способность примерно до 107 пар оснований.
Вторая проблема-чувствительность зондов.
Масса одной копии фрагмента дуплексной ДНК
длиной 1 т.п.н. составляет примерно 10~12 мкг.
Радиоактивно меченные зонды, полученные с по-
мощью ник-трансляции (разд. 4.6.6), редко имеют
удельную радиоактивность, значительно превы-
шающую 10® расп./мин на 1 мкг. Гибридизация
такого зонда с одним сопоставимым сегментом
в хромосоме дает только 10-4 расп./мин на 1 мкг,
или примерно один распад в неделю. Чтобы достичь
необходимой чувствительности, следует одновре-
менно использовать несколько специальных прие-
мов. Например, чтобы получить зонды с удельной
радиоактивностью примерно 109 расп./мин на
1 мкг, можно провести ник-трансляцию с использо-
ванием в качестве субстрата 1251-5-иод-<1СТР.
Гибридизацию следует проводить в присутствии
декстрансульфата, что увеличивает скорость про-
цесса примерно в 100 раз, в результате чего усилива-
ется сигнал. Число зерен также может возрасти,
раска). При кислотно-щелочном окрашивании по Гимза
окрашивается гетерохроматин центромеры (С-окраска)
(см. также рис. 1.7).
если одноцепочечные последовательности вектор-
ной ДНК, которые сцеплены с гибридизуемой
эукариотической последовательностью в клониро-
ванном зонде, будут в свою очередь гибридизовать-
ся с избытком молекул зонда. Для увеличения числа
зерен серебра можно увеличить время экспозиции
до нескольких недель (рис. 7.22, Б и В). Таким
способом удается определить положение единичных
копий генов в специфических, но весьма обширных
областях хромосом млекопитающих.
Картирование хромосом, основанное на получении
гибридных соматических клеток. Для локализации
клонированного сегмента в определенной хромо-
соме используют межвидовые соматические гибри-
ды. Обычно такие гибридные соматические клетки
содержат полный набор хромосом одного вида
(реципиента) и только одну или небольшое число
хромосом второго вида (донора). Чтобы судить
о наличии данного гена в определенной донорной
хромосоме, анализируют группу разных линий гиб-
ридных клеток и устанавливают корреляцию между
присутствием тестируемого гена и наличием спе-
цифической хромосомы.
Гибридные соматические клетки образуются при
1) слиянии клеток двух разных видов; 2) слиянии
клеток одного вида с мини-клетками другого,
содержащими одну или несколько донорных хро-
мосом; 3) трансфекции реципиентных клеток пре-
паратом очищенных хромосом донора (рис. 7.24).
Чтобы элиминировать неслившиеся донорные и
реципиентные клетки, применяют соответствующие
селективные условия. Например, донорные клетки
могут проявлять чувствительность к определенным
лекарственным веществам, а реципиентные клетки
могут быть мутантами, растущими лишь в особых
7 ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
337
РИС. 7.24.
Образование гибридов соматических клеток
клетки не способны к росту
Деление
условиях (например, клетки ТК “ не способны расти
в среде HAT; см. рис. 5.31). В присутствии таких
препаратов и в среде HAT растут только гибридные
клетки, несущие в донорной хромосоме функци-
ональный ген тимидинкиназы.
Если отобранные гибридные клетки выращивать
в неселективных условиях, то донорные хромосомы
в конце концов утратятся в силу более или менее
случайных причин. Но клоны гибридных клеток
можно получить в любой момент и идентифици-
ровать резидентные донорные хромосомы по харак-
теру исчерченности, выявлению ранее картирован-
ных последовательностей ДНК или ферментатив-
ных маркеров либо (последнее более предпочти-
тельно) с использованием всех трех методов. Таким
способом можно получить банки различных линий
гибридных клеток, каждая из которых содержит
определенный набор донорных хромосом.
Альтернативный подход состоит в сохранении
селективных условий. Поддерживая условия, благо-
приятные для данного гена, в течение многих кле-
точных генераций (например, используя известные
мутантные клетки реципиента и соответству-
ющую среду), можно получить линии клеток толь-
ко с одной стабильной донорной хромосомой.
Другой способ получения гибридных клеток с
одной донорной хромосомой состоит в транс-
фекции препаратом, обогащенным этой хромо-
сомой.
При конструировании гибридов возникает воп-
рос, какой из видов будет служить донором, а
какой реципиентом. Ответ на него обычно можно
найти лишь экспериментальным путем. Как пра-
вило, гибридные клетки «человек-мышь» утрачи-
вают хромосомы человека.
После идентификации чужеродных хромосом в
соматических клетках гибридов используют три
подхода, для того чтобы установить, присутствует
ли тестируемый ген (или сегмент ДНК) в определен-
ной хромосоме. Первый основан на выявлении
корреляции между наличием этой хромосомы и
экспрессией тестируемого гена с образованием
определенного продукта. Для этого измеряют фер-
ментативную активность или выявляют взаимо-
22 243
338
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
действие со специфическими антителами; при этом
необходимо, чтобы используемые методы позволя-
ли различать продукты генов донорных и реци-
пиентных клеток. Например, два белка продукта
генов могут иметь разную электрофоретическую
подвижность, как, например, в случае галактокиназ
грызунов и приматов. При втором подходе исполь-
зуют гибридизацию между клонированным зондом
и набором хромосом гибрида in situ; этот подход
имеет уже описанные ограничения. Третий и наи-
более общий подход связан с идентификацией иско-
мого гена (или сегмента ДНК) путем отжига
соответствующего ДНК- или РНК-зонда с ДНК,
выделенной из гибридных клеток и перенесенной на
нитроцеллюлозный фильтр. Отжиг с эндонуклеаз-
ными фрагментами часто позволяет выявить до-
норный ген во фрагментах, имеющих размеры,
типичные для донорного генома, даже в тех случаях,
если гены донора и реципиента являются перекрест-
но гибридизующимися. Поскольку трудно получить
гибриды с одной донорной хромосомой, обычно
исследуют целый набор гибридных клеток, которые
содержат разные донорные хромосомы. Если этот
набор достаточно обширен, то присутствие последо-
вательности зонда обычно можно связать с присут-
ствием определенной хромосомы.
Используют также гибридные соматические
клетки, содержащие лишь часть определенной хро-
мосомы донора. Например, некоторые линии до-
норных клеток содержат хромосому с делецией или
хромосому, несущую небольшой транслоцирован-
ный участок из другой хромосомы, и за прошедшие
годы были выделены и охарактеризованы многие
линии гибридных клеток, содержащие делегирован-
ные или составные донорные хромосомы. Напри-
мер, с помощью таких гибридных клеток гены
тяжелой цепи иммуноглобулина человека были
локализованы в положении 32 длинного плеча
хромосомы 14 (14q32). Были проанализированы две
линии гибридных клеток мыши и человека, каждая
из которых содержала одну из пары реципрокных
транслокаций между хромосомой 14 и Х-хромо-
сомой. Зонд, представляющий собой клонирован-
ный ген иммуноглобулина, гибридизовался только
с ДНК из гибрида, содержащего часть хромосомы
14, соответствующую q32.
В результате анализа клонов из библиотек,
содержащих ДНК одной хромосомы, были получе-
ны детальные карты участков индивидуальных хро-
мосом (разд. 6.5.а). Наиболее прямой путь получе-
ния таких библиотек состоит в использовании от-
дельных очищенных хромосом. Другой подход
основан на использовании ДНК из гибридных
соматических клеток, содержащих только одну
донорную хромосому. Из такой библиотеки могут
быть отобраны рекомбинанты, содержащие после-
довательности донорной ДНК, по их способности
гибридизоваться с видоспецифичными зондами.
в. Нестабильность при клонировании
Как правило, клонированные вставки представ-
ляют собой точные реплики геномных последова-
тельностей, однако иногда во время клонирования
в этих последовательностях происходят изменения.
Несоответствие размеров клонированной вставки
и сегмента геномной ДНК чаще всего бывает
обусловлено рекомбинациями, делециями или
вставками, произошедшими во время клонирова-
ния. Нередко наблюдаются вариации в размерах
вставки или в ее рестрикционной карте при повтор-
ном выделении. Если клонированный фрагмент
содержит тандемные повторы, то при расщеплении
рекомбинантной ДНК часто получается сложная
смесь рестрикционных фрагментов (рис. 7.25). На-
ДНК, окрашенная
бро ми сты м эти ди ь-м
Радиоавтограф
Х-вектора, во время репликации. Сегмент, содержащий
тандемный повтор, клонировали в /-векторе и после
размножения фага из одной очищенной бляшки выде-
ляли ДНК. Далее ДНК гидролизовали с помощью рест-
риктирующей эндонуклеазы, подвергали электрофорезу
и гель окрашивали бромистым этидием (слева). Затем
осуществляли перенос ДНК по Саузерну и отжигали ее
с клонированным зондом, содержащим такую же пов-
торяющуюся последовательность. Вставка длиной 4,9
т.п.н. содержала большую часть повторяющегося сег-
мента. Однако с зондом ассоциировали и другие фраг-
менты ДНК как более крупные, так и более мелкие
(справа). Такие фрагменты содержались в субмоляр-
ных количествах и не обнаруживались при окрашивании
геля бромистым этидием. Встроенные фрагменты изо-
бражены в виде цветных полосок, /-фрагменты-в виде
черных.
7. ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
339
пример, некоторые фрагменты могут быть пред-
ставлены в количестве меньшем, чем моль-экви-
валент (т.е. в субмолярном количестве). Это тоже
свидетельствует о происшедших во время реплика-
ции рекомбинантной молекулы перестройках, что
приводит к образованию смешанной популяции
рекомбинантов. Перестройка состоит в гомологич-
ной рекомбинации, сопровождающейся делениями
и амплификациями клонированных тандемно по-
вторяющихся единиц. Подобная нестабильность
клонированных повторов в £.«>//-систсмах хозяин
вектор уменьшается, но не устраняется полностью
в клетках, мутантных по функциям рекомбинации
(например, в клетках гес\ , мтВС).
7.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСЛА КОПИЙ
ДАННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
В ГЕНОМЕ
Ген овальбумина присутствует в гаплоидном
геноме курицы в единственном экземпляре, однако
многие гены и некоторые другие сегменты ДНК
встречаются в геноме множество раз (гл. 9). Типич-
ными примерами геномов с многократно повторяю-
щимися последовательностями ДНК являются
эукариотические геномы. Иногда несколько копий
в таком геноме бывают абсолютно идентичны, и
тогда при отжиге смеси рестрикционных фрагмен-
тов геномной ДНК с меченым гомологичным зон-
дом на электрофореграмме наблюдается одна поло-
са, четко видимая даже в том случае, когда коли-
чество расщепляемой ДНК не превышает 1 мкг.
Обычно для обнаружения сегмента, представлен-
ного в геноме млекопитающих лишь однократно,
требуется не менее 10 мкг ДНК, поэтому появление
полосы при количестве ДНК 1 мкг и менее свиде-
тельствует о том, что данный сегмент представлен
в геноме многократно. Если разные копии последо-
вательности различаются по одной или нескольким
парам оснований, то у них могут быть и неодинако-
вые сайты для рестриктирующих эндонуклеаз. В
результате на радиоавтограмме будет присутство-
вать множество полос или она будет представлять
собой одно размытое темное пятно; это зависит от
числа копий повторяющейся последовательности.
а. Оценка числа копий с помощью
гибридизации ДНК ДНК
Число копий можно оценить, проведя денсито-
метрический анализ радиоавтограммы. При этом
для повышения точности в отдельные лунки на этой
же пластине геля вносят известное количество не-
меченой клонированной ДНК как образец геномной
ДНК (рис. 7.26). Плотность радиоавтографа линей-
22*
Число копий
ДНК клонированного
цыпленка сегмента
Определение числа копий. Одна полоска содержит
Есо Rl-гидролизат 30 мкг ДНК цыпленка, другие-кло-
нированный сегмент гена овальбумина длиной 2,35
т.п.н. в количествах, эквивалентных 0,5; 1; 2 и 5 копиям
(на гаплоидный геном) овальбуминового гена в общем
количестве, представленном в 30 мкг ДНК цыпленка.
Электрофорез проводили в агарозном геле. На рисунке
дано схематическое изображение радиоавтографа, по-
лученного после отжига ДНК, перенесенной на фильтр,
с 32Р-меченным фрагментом размером 2,35 т.п.н.
Плотность полоски с ДНК цыпленка соответствует од-
ной гаплоидной копии.
но зависит от количества ДНК в геле, поскольку
зонд присутствует в избытке. Сравнивая между
собой эти показатели для геномной ДНК и ДНК
стандарта, мы можем оценить число копий.
б. Оценка числа копий по кинетике
реассоциации ДНК
Более точную информацию о числе копий можно
получить, исследуя кинетику реассоциации ДНК.
Кинетические методы стали применяться в этой
области по крайней мере на десять лет раньше
методов, описанных в разд. 7.5.а, и именно с их
помощью были получены первые данные о том, что
эукариотические геномы содержат много повторов.
Для того чтобы понять суть кинетического метода,
необходимо вывести несколько уравнений.
Скорость реассоциации отдельных комплемен-
тарных цепей в растворе зависит от концентрации
ДНК и подчиняется кинетике второго порядка. Если
340
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Со и С-это суммарные концентрации денатуриро-
ванной ДНК в момент времени г0 и в момент
времени t после начала гибридизации соответствен-
но, то скорость реакции описывается уравнением
dC/dt = -кС2. (1)
Проинтегрировав это уравнение, получим
С/С° = L 1
кС0 t + 1
При гибридизации 50% денатурированной ДНК
С/Со = 0,5 (3)
(2)
и
Сого.5=1//с, (4)
где С- число молей мононуклеотидов на 1 л, t-
время в секундах.
Величина Со t обычно обозначается словом,
которое пишется и произносится как «Cot» («кот»).
Кинетика гибридизации второго порядка не-
скольких очищенных гомогенных препаратов ДНК
представлена на рис. 7.27. Как и во многих экспери-
ментах по гибридизации, ДНК перед денатурацией
и реассоциацией была разрезана на фрагменты
длиной около 400 пар оснований. Обратите внима-
ние на то, что шкала Cot логарифмическая; это
облегчает сравнительный анализ данных. Соответ-
ствие кинетических кривых простой реакции вто-
рого порядка следует из того, что ренатурация на
90% укладывается в интервал значений Cot, ох-
ватывающий два порядка величины.
Конкретные значения Cot0 5 зависят от общего
размера генома, поскольку С-это суммарная кон-
Размер SV40 Т4 Е. coli
генома (п.н.) 5,2х 103 1,7x10s 4х106
РИС. 7.27.
Кинетика реассоциации денатурированной ДНК SV40,
фага Т4 и Е. coli (смысл всех обозначений описан в разд.
7.5.6). [R.J. Britten, D. Е. Kohne, Science, 161 (1968), р.
529, с изменениями.]
центрация ДНК, хотя, чем больше размер генома,
тем меньше истинная концентрация каждого гибри-
дизующегося фрагмента. Другими словами, в более
сложном геноме каждый гибридизующийся фраг-
мент составляет меньшую часть суммарной ДНК
и поэтому гибридизуется при более высоких значе-
ниях Cot. Таким образом, кинетические кривые
позволяют оценить размер генома, если у нас имеет-
ся препарат геномной ДНК известного размера,
который может служить стандартом, и если кривые
соответствуют кинетике второго порядка. Если Na
и Nb- размеры геномов а и Ь, то
[Cot0.5]„ = Na
[Cot0.5]d N„
Характер кинетических кривых второго порядка
для ДНК SV40, Т4 и E.coli позволяет сделать вывод
о том, что каждый геномный сегмент представлен
в геноме только один раз. Аналогичные кривые для
эукариотической геномной ДНК имеют более слож-
ную форму. В качестве примера на рис. 7.28 при-
ведены данные для ДНК Drosophila. Гибридизация
протекает в широком диапазоне значений Cot, по-
скольку многие сегменты ДНК повторяются, при-
чем одни из них многократно, другие менее часто,
а третьи-лишь несколько раз. Те сегменты, кото-
рые встречаются в геноме только один раз, имеют
низкую концентрацию и гибридизуются при самых
высоких значениях Cot. Большинство высокоповто-
ряющихся последовательностей, концентрация
которых наиболее высока, гибридизуются очень
быстро и характеризуются самыми низкими значе-
ниями Cot. Предположив, что гибридизация сег-
ментов ДНК, представленных в единственном чис-
ле, следует кинетике второго порядка, можно из
сложных Cot-кривых с помощью метода наимень-
ших квадратов выделить отдельную кривую для
однокопийной последовательности и оценить ее Cot.
Для таких последовательностей Drosophila значе-
ние Cot0 5 равно 28,6 моль-с/л при эксперименталь-
ных условиях, которые использовались в случае,
представленном на рис. 7.28. Это значение принято
за стандартное; сравнивая с ним значение Cot0 5 для
какого-то клонированного фрагмента ДНК Drosop-
hila, можно рассчитать число копий этого фрагмен-
та по формуле
28,6
-----------= Число копий. (6)
Cot0 5 (клон)
Вторая кривая на рис. 7.28 относится к гибри-
дизации клонированного фрагмента в присутствии
суммарной геномной ДНК Drosophila. Клонирован-
ный фрагмент помечен радиоизотопом, благодаря
чему кинетику его гибридизации можно регистриро-
вать отдельно. Заметим, что концентрация фрагмен-
7 ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
341
РИС. 7.28.
Кинетика реассоциации суммарной геномной ДНК
D. melanogaster и клонированного фрагмента ДНК Dro-
sophila при избытке ДНК D. melanogaster. Клонирован-
ный фрагмент представлен в количестве 4,5-10-9 М
(см. разд. 7.5.6, где описан этот эксперимент). [J. Lis,
L. Prestidge, D.S. Hogness, Cell, 14 (1978), p. 901.]
Cot
ния высоких значений Cot требуется длительное
время или очень высокие концентрации ДНК. Эта
проблема еще более усложняется, если геном имеет
большой размер, поскольку увеличивается значение
Cot0 5 для однокопийных сегментов. Значение Cot0 5
для таких последовательностей в геноме Drosophila,
имеющем размер 1,7-10® пар нуклеотидов, равно
28,6, а соответствующее значение Cot0 5 для генома
млекопитающих (~ ЗЮ9 п.н.) по меньшей мере
в десять раз выше.
На самом деле кинетический анализ гибридиза-
ции несколько более сложен, чем это здесь пред-
ставлено. Скорость гибридизации зависит не только
от концентрации ДНК, но и от температуры (кото-
( 0 ( О
та достаточно мала, так что его самогибридизацией
можно пренебречь. Эффективная концентрация кло-
нированной последовательности обеспечивается со-
ответствующими последовательностями геномной
ДНК. Поэтому значение Cot по оси абсцисс, исполь-
зуемое для получения значения Cot для фрагмента,
рассчитывается из концентрации геномной ДНК
Drosophila, а С и Со по оси ординат относятся
к фракции клонированной ДНК, которая гибри-
дизовалась. Вот почему значения Cot (ось абсцисс)
действительно относятся к геномной ДНК. Значение
Cot0 5 для клонированной последовательности
(рис. 7.28) равно 1,06, а число копий составляет
28,6/1,06 = 27.
Для определения числа копий от одной до десяти
этот метод малопригоден, поскольку для достиже-
Денатурированная ДНК,
разрезанная в случайных сайтах
Отжиг
( 0 ( о
расщепление с помощью
нуклеазы S1
Связывание с
гидроксила патитом
Дуплексные
продукты
Si-гидролиза
Не связываются
РИС. 7.29.
Исследования кинетики реассоциации денатурирован-
ной ДНК с помощью S1-нуклеазного метода или по
связыванию дуплексных форм с гидроксилапатитом.
Через разные промежутки времени после начала гибри-
дизации отбирают пробы и определяют долю реассо-
циировавшей ДНК. На рисунке сравниваются результа-
ты, полученные этими двумя методами с использова-
нием одного и того же препарата.
Связываются
Дуплексная ДНК
Одноцепочечная ДНК
342
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
рая должна быть ниже температуры плавления дуп-
лексной ДНК; см. рад. 1.1 .е), ионной силы, вязкости
раствора и размера гибридизующихся фрагментов.
Все эти параметры должны быть строго фиксиро-
ванными.
Процент гибридизовавшейся ДНК измеряют
разными способами. Во-первых, можно использо-
вать тот факт, что при определенных условиях
с гидроксилапатитом связывается дуплексная, но не
одноцепочечная ДНК. Во-вторых, можно опреде-
лять в разные моменты времени процент ДНК,
которая становится устойчивой к нуклеазе, специ-
фичной в отношении одноцепочечной ДНК (S1).
Результаты, получаемые с помощью этих двух
методов, различаются, если анализируются слож-
ные эукариотические геномы (рис. 7.29). Нуклеаз-
ный метод позволяет определять только количество
дуплексной ДНК, образовавшейся при реассоциа-
ции, а метод осаждения на гидроксилапатите дает не
только количество дуплексной ДНК, но и ДНК
с неспаренными одноцепочечными хвостами. Такие
дуплексы образуются, в частности, в результате
случайных разрывов одиночных цепей еще до реас-
социации с образованием фрагментов подходящих
размеров, а также благодаря наличию повторяю-
щихся последовательностей. Нуклеаза S1 расщепля-
ет все одиночные нереассоциировавшие цепи, а так-
же все одноцепочечные концы дуплексов. Гидро-
ксилапатит связывает все дуплексные цепи, включая
и цепи с одноцепочечными хвостами, и поэтому дает
более высокую оценку доли гибридизовавшихся це-
пей, чем нуклеазный метод. Иными словами, в опы-
тах с применением гидроксилапатита мы получаем
большую степень реассоциации ДНК и большую
скорость реассоциации, чем в опытах с S1-нуклеа-
зой. Эти различия уменьшаются, если исполь-
зуются относительно короткие фрагменты ДНК
(~ 400 п.н.).
в. Оценка числа копий с помощью
гибридизации в условиях насыщения
Еше один метод оценки числа копий состоит
в определении общего количества ДНК клониро-
ванного сегмента, реассоциирующегося с известным
количеством геномной ДНК. Клонированный сег-
мент должен присутствовать в избытке в отличие от
ситуации, описанной в разд. 7.5.6 (метод кине-
тической реассоциации), где в избытке присутство-
вала геномная ДНК. Гибридизация в условиях на-
сыщения особенно полезна в тех случаях, когда
исследуемый сегмент присутствует в ДНК в очень
малом числе копий и изучение реассоциации за-
труднено.
Эксперимент состоит в следующем. Возрастаю-
щее количество препарата радиоактивно меченного
клонированного сегмента инкубируют с фиксиро-
ванным количеством денатурированной и фрагмен-
тированной геномной ДНК и определяют количест-
во гибридизовавшейся клонированной ДНК (рис.
7.30). Время реакции должно быть достаточным для
достижения насыщения. Лучше, чтобы меченый
фрагмент был одноцепочечным; это позволяет
избежать его самогибридизации при относительно
высоких концентрациях, необходимых для получе-
ния насыщения. В условиях насыщения (плато) все
клонированные геномные сегменты связаны с зон-
дом. Высота плато дает суммарное число гомо-
логичных последовательностей в геноме, которое
можно рассчитать исходя из удельной радиоактив-
ности меченого фрагмента. Для повышения точ-
ности метода проводят калибровочные эксперимен-
ты. в которых к препаратам геномной ДНК до-
бавляют известные количества немеченого клони-
рованного фрагмента. В эксперименте, результаты
которого представлены на рис. 7.30, количество
гибридизовавшегося радиоактивного фрагмента
при насыщении эквивалентно двум копиям гена на
ДНК мыши
1х 2х 1х + 1экв 2х + 2экв
9 % 9
Б
РИС. 7.30.
Оценка числа копий с помощью метода реассоциации
в условиях насыщения. А. Отжиг разных количеств
препарата 3Н-меченной цепи клонированного сегмента
ДНК с одинаковым количеством фрагментированной
денатурированной геномной ДНК (в растворе). Две
верхние кривые отражают ситуацию, когда в реакцион-
ную смесь добавляли клонированный нерадиоактивный
сегмент в количестве, эквивалентном одной и двум
копиям. Б. Фиксация препаратов денатурированной ге-
номной ДНК в виде пятен на нитроцеллюлозном
фильтре (рис. 7.39). После инкубации препаратов с
32Р-меченной ДНК фильтр промывали и либо получали
радиоавтограф (как в данном случае), либо вырезали
пятна и подсчитывали число импульсов в каждом из
них.
7. ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
343
гаплоидный геном. Чтобы упростить эксперимент,
препараты денатурированной геномной ДНК фик-
сируют в виде пятен на нитроцеллюлозном фильт-
ре. В усовершенствованном варианте сначала опре-
деляют насыщающую концентрацию радиоактивно-
го зонда, а затем инкубируют зонд с разным коли-
чеством геномной ДНК, фиксированной на нитро-
целлюлозном фильтре.
7.6. ИЗМЕНЕНИЕ
КЛОНИРОВАННЫХ СЕГМЕНТОВ:
ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТОВ
а. Общие положения
В основе классического генетического анализа
лежит получение случайных мутаций, вызывающих
наследуемые фенотипические изменения. Разработ-
ка новых молекулярно-генетических методов при-
вела к созданию так называемой обратной генетики.
В охарактеризованные клонированные гены вносят
специфические мутации и затем устанавливают кор-
реляцию между изменениями в определенных участ-
ках этих генов и изменением фенотипа или лока-
лизуют регуляторные элементы. Например, если
в кодирующую часть гена внести мутации, то на нем
будет синтезироваться модифицированный поли-
пептид. Это позволяет изучать влияние амино-
кислотной последовательности белка на его кон-
формацию или ферментативную активность. Ана-
логично нуклеотидная замена в предполагаемом
регуляторном участке может привести к подавле-
нию или стимуляции транскрипции, что подтвердит
предположение о функциональной роли данного
участка.
Существуют разные способы внесения мутаций
в клонированные фрагменты или небольшие гено-
мы, но мы рассмотрим лишь немногие из них.
Во всех случаях успех зависит от двух условий.
Во-первых, должна быть хорошо известна струк-
тура исходной ДНК. Как минимум, необходимо
знать подробную карту сайтов рестрикции, но еще
лучше, если известна вся последовательность изу-
чаемого фрагмента. Во-вторых, поскольку все мето-
ды дают некую смесь продуктов, нужный элемент
следует очистить с помощью клонирования, ампли-
фицировать и охарактеризовать. При некоторых
типах мутагенеза мутации образуются в случайных
местах, при других в определенных сайтах; о
последних говорят как о сайт-специфических (или
сайт-направленных) мутациях.
б. Делеционные мутанты
Использование рестриктирующих эндонуклеаз.
Внести делецию в определенный участок можно
в том случае, если клонированный фрагмент ДНК
содержит два близко расположенных уникальных
сайта рестрикции в интересующей нас области
(рис. 7.31, А). После эндонуклеазного расщепления
фрагмента образующиеся «хвосты» отщепляют с
помощью специфичной к одноцепочечным участкам
нуклеазы и тупые концы вновь сшивают. Однако
столь простой подход применим лишь в редких
случаях. Чаще используют другой метод, при кото-
ром делецию создают в окрестности одного уни-
кального сайта рестрикции (рис. 7.31, Б). После
эндонуклеазного разрезания фрагмента соседние
нуклеотиды удаляют с помощью эндонуклеазы
Bal 31 или какой-либо экзонуклеазы, например ехоШ
E.coli, совместно с нуклеазой S1. При последующем
лигировании образуется семейство молекул с деле-
ниями, расположенными вокруг исходного эндо-
нуклеазного сайта. Делеционные мутанты очищают
с помощью молекулярного клонирования. В одном
из вариантов этого метода перед образованием
кольцевой молекулы к концам присоединяют ре-
стриктазные линкеры. При этом в молекулу вводят-
ся эндонуклеазные сайты, которые могут оказаться
полезными для исследования ее свойств, секвениро-
вания и последующего моделирования.
При помощи более сложных манипуляций может
быть получен целый набор делеций разной длины,
берущих начало от одного исходного сайта (рис.
7.32). Для этого рекомбинантную молекулу обраба-
тывают двумя способами. Из одной ее части (А)
удаляют с помощью двух рестриктирующих эндо-
нуклеаз (RE1 и RE2) большой сегмент, включающий
мишень для делеций. Вторую часть (В) линеаризуют
с помощью одного из двух ферментов (RE1) и затем
обрабатывают ферментом Bal 31. Далее в результате
разрезания вторым ферментом (RE2) получают
набор фрагментов уменьшающейся длины (В', В",
В'" на рис. 7.32). Лигирование этих фрагментов с
частью А и последующее клонирование дает набор
молекул с делениями, начинающимися в сайте RE1.
Использование неспецифических эндонуклеаз. В
сверхспиральные кольцевые молекулы могут быть
внесены единичные разрывы с помощью нёспеци-
фических эндонуклеаз, например ДНКазы 1. При
этом образуется целый набор линейных молекул
с разрывами в разных сайтах. После внесения
разрыва и расширения делетированной области
осуществляют лигирование с помощью методов,
описанных ранее для устранения эндонуклеазных
разрывов. При таком подходе используют некото-
рые интересные свойства ДНКазы 1: в присутствии
Мп2+ этот фермент расщепляет сразу обе цепи
дуплексной ДНК, а в присутствии Mg2J гидро-
лизует за один раз только одну цепь, в результате
чего в ДНК появляются одноцепочечные пробелы.
Кроме того, фермент расщепляет сверхспиральную
344
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Рестрикция
Эндонуклеазы 1 и 2
Эндонуклеаза 1
Рестрикция
РИС. 7.31.
Получение делеционных мутантов с помощью рестрик-
тирующих эндонуклеаз. Серым цветом выделена ДНК
плазмидного вектора, коричневым- вставка. А. Использо-
вание двух соседних уникальных рестрикционных сай-
тов- RE1 и RE2. Б. Использование одного уникального
рестрикционного сайта.
ДНК быстрее, чем линейную дуплексную, вслед-
ствие локальной неупорядоченности ДНК в сверхспи-
ральном состоянии. Поэтому после непродолжитель-
ной обработки сверхспиральной ДНК ДНКазой I
в присутствии Mg2 + образуются в основном
полноразмерные линейные дуплексные молекулы.
Обработка их с помощью Bal 31 или экзонуклеазы,
а затем S1-нуклеазы расширяет образовавшийся
ранее пробел. После лигирования отдельные про-
дукты можно получить с помощью молекулярного
клонирования.
в. Инсерционные мутанты
Принципы конструирования инсерционных му-
тантов сходны с описанными выше для делецион-
ных мутантов. Клонированный сегмент ДНК рас-
щепляют по одному из сайтов с помощью рестрик-
тирующей эндонуклеазы или неспецифической эндо-
нуклеазы. При необходимости заполняют пробелы
на концах образовавшейся линейной молекулы или
отщепляют одноцепочечные «хвосты» с помощью
нуклеазы и осуществляют лигирование в присут-
ствии сегмента, который хотят встроить в молекулу.
В качестве вставки может использоваться синтети-
ческий фрагмент, содержащий множество сайтов
для рестрикционных эндонуклеаз,- так называемый
полилинкер. Если первое расщепление было неспе-
цифичным (например, если оно было осуществлено
с помощью ДНазы I в присутствии Мп2 + ), то
появление новых сайтов рестрикции в наборе клони-
рованных мутантов поможет построить физическую
карту мутаций.
г. Точечные мутации
Химический мутагенез. Для получения точечных
мутаций в определенном участке молекулы чаще
всего используют дуплексную кольцевую ДНК,
содержащую короткий одноцепочечный участок.
Один из способов создания таких сайт-специфи-
ческих пробелов состоит в обработке сверхспираль-
ной ДНК соответствующей рестриктирующей эндо-
нуклеазой в присутствии бромистого этидия, кото-
рый встраивается между плоскостями пар основа-
ний и вносит нарушения в структуру дуплекса
(рис. 7.33, А). При этих условиях многие рестрик-
тирующие эндонуклеазы разрезают только одну из
цепей в соответствующих сайтах. По-видимому, при
встраивании бромистого этидия в обычную дуп-
лексную молекулу ДНК разрезания вообще не
происходит, а в сверхспиральной молекуле разреза-
ется только одна цепь. Не все рестриктирующие
эндонуклеазы ведут себя подобным образом, но все
же число их достаточно велико. После разрезания
молекулы с помощью экзонуклеазы в дуплексной
молекуле создают небольшой одноцепочечный про-
бел в месте разреза. Альтернативный способ полу-
7 ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
345
Получение набора делеции разного размера, берущих
начало от одного исходного сайта, находящегося во
вставке. Сайт RE1 после образования кольцевых моле-
кул не восстанавливается. Его положение в этих струк-
турах указано стрелками.
чения дуплексной молекулы с пробелом состоит
в использовании векторной системы на основе фага
М13 (рис. 7.33, £). Для этого создают одноцепочеч-
ный Ml 3-рекомбинант, содержащий нужный сег-
мент, а также другой, двухцепочечный, рекомби-
нант, содержащий такой же сегмент, но с делецией.
Этот двухцепочечный рекомбинант денатурируют
и реассоциируют с одноцепочечным, в результате
чего образуется гетеродуплекс с пробелом.
Если ДНК, содержащую одноцепочечный про-
бел, обработать бисульфитом натрия, то в одно-
цепочечном участке произойдет дезаминирование
остатков цитозина с образованием урацила, т.е.
дезаминируются только определенные остатки
цитозина. Если пробел невелик, а число дезамини-
рованных остатков цитозина ограничено благодаря
малому времени реакции и низкой концентрации
бисульфита, то возникает очень небольшее число
специфических мутаций. Далее пробел заполняют
с помощью ДНК-полимеразы и осуществляют
лигирование. Вместо исходных С • С-пар в молекуле
ДНК теперь содержатся пары U-А, которые после
репликации превращаются в Т-А-пары.
Мутагенное копирование. Специфические мута-
23 243
346
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
А
Рестриктирующая
эндонуклеаза 1,
бромистый этидий
Рестриктирующая
эндонуклеаза 1
Денатурация
ДНК с пробелом
Бисульфит натрия
РИС. 7.33.
Индукция сайт-специфических точечных мутаций в од-
ноцепочечных участках дуплексной ДНК с помощью
бисульфита натрия. Одноцепочечный участок во вставке
получали путем расщепления сверхспиральной дуплек-
сной ДНК рестриктирующей эндонуклеазой в присутст-
вии бромистого этидия и последующей обработки про-
дукта экзонуклеазой III (А) или с помощью образования
гетеродуплекса между интактной вставкой и вставкой
с делецией, клонированными в М13 (Б).
ции другого типа можно получить, если при запол-
нении пробела вместо нормального дезоксирибо-
нуклеозидтрифосфата использовать его мутагенный
аналог. ДНК-полимераза I способна использовать
в качестве субстратов различные аналоги обычных
дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Некоторые из
них являются мутагенами. Например, ТЧб-гидро-
ксидезоксицитидин-5'-трифосфат (НО-dCTP) может
включаться в синтезируемую цепь в положение,
соответствующее А или G в матричной цепи в
зависимости от того, находится ли он в иминной
или аминной форме соответственно (рис. 7.34). Если
пробел в дуплексной ДНК заполняется с помощью
НО-dCTP вместо dTTP, то напротив А будет на-
ходиться HO-dC (рис. 7.35). После трансфекции и
репликации наряду с нормальными формами будут
7 ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
347
Аминная форма. Иминная форма,
спаривается с G спаривается с А
РИС. 7.34.
Таутомерные формы N6-гидроксицитидина.
обнаруживаться мутантные геномы с транзициями
TA-»CG. Проведя отбор, эти мутанты можно
клонировать. Аналогично замещение dCTP на
НО-dCTP приводит к транзициям С • G -» Т • А.
Сайт-специфический мутагенез с применением
синтетических олигодезоксинуклеотидов. Олиго-
дезоксинуклеотиды можно синтезировать в боль-
ших количествах, что позволяет разработать доста-
точно универсальные методы получения сайт-специ-
фических точечных мутаций в клонированных сег-
ментах ДНК. В основе одного из таких методов
лежит образование гетеродуплекса между одно-
цепочечным синтетическим олигодезоксирибонукле-
отидом, содержащим мутантную последователь-
ность, и комплементарной одноцепочечной реком-
бинантной векторной ДНК, несущей соответствую-
щий сегмент дикого типа (рис. 7.36). Для этого ген,
в котором мы хотим получить мутацию, клони-
руют, например, в фаге М13 и получают одно-
цепочечную кольцевую рекомбинантную вирусную
ДНК. Затем с этой кольцевой молекулой отжигают
синтетический олигодезоксирибонуклеотид длиной
от 8 до 20 нуклеотидов, содержащий мутантную
последовательность. Этот олигодезоксирибонукле-
отид выполняет роль праймера, а оставшийся одно-
цепочечным участок- роль матрицы при синтезе
ДНК in vitro с помощью ДНК-полимеразы I. После
копирования всей кольцевой молекулы начало и
конец новой цепи соединяют лигазой. Образовав-
шаяся дуплексная молекула содержит неспаренные
основания в мутантной последовательности. Инте-
ресно, что фаговое потомство, вышедшее из одной
инфицированной клетки, сегрегирует как смешанная
популяция фагов дикого типа и мутантных реком-
бинантов, которые можно разделить при последую-
щем клонировании.
При втором подходе, так называемом кассетном
мутагенезе, участок клонированной ДНК дикого
типа замещают синтетическим дуплексным олиго-
дезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную
последовательность (рис. 7.37). В приведенном при-
мере клонированная вставка встроена в дуплексный
вектор типа pBR322. В простейшем случае для
вырезания участка, в который мы хотим внести
мутацию, используют уникальные рестрикционные
сайты, встречающиеся во вставке, но не в векторе.
Если такие сайты отсутствуют, приходится при-
бегать к дополнительным ухищрениям. Дуплексный
олигонуклеотид получают путем отжига двух син-
тетических комплементарных цепей, каждая из
которых содержит соответствующую замену осно-
вания. Кроме того, эти цепи синтезируют таким
образом, чтобы дуплекс, который они образуют,
имел соответствующие липкие концы. В отличие от
гетеродуплексного метода, при трансфекции и кло-
нировании измененного рекомбинанта геномов ди-
кого типа не образуется. Однако если используют
смесь синтетических олигодезоксирибонуклеотидов,
содержащих альтернативные основания в мутант-
Дикий тип
dATP
dGTP
dCTP
НО-dCTP
ДН К-полимераза
Лигаза
Трансфекция,
внутриклеточная
репликация
РИС. 7.35.
Мутации, возникающие при заполнении пробелов ДНК-
полимераэой в результате включения НО-dCTP вместо
dTTP. После репликации появляются мутантные моле-
кулы с транзициями Т А-» C G
348
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
РИС. 7.36.
Сайт-специфический мутагенез с использованием син-
тетических олигонуклеотидов: гетеродуплексный метод.
Синтетический олигонуклеотид служит праймером при
синтезе мутантной вставки в рекомбинантном М13-век-
торе.
ных участках, то смесь мутантов сегрегирует после
трансфекции и ее можно разделить с помощью
последующего клонирования. Такой подход оказы-
вается полезным, если необходимо получить разные
мутации в одном эксперименте. Напомним, что
синтез таких смешанных олигодезоксирибонуклео-
тидов осуществляется простым использованием на
нужной стадии химического синтеза не одного
мононуклеотида, а их смеси.
7.7. ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИЙ
КЛОНИРОВАННЫХ
СЕГМЕНТОВ ДНК
Нёредкб клонирование определенных сегментов
геномной ДНК, или кДНК, осуществляют с целью
выяснения функций их внутриклеточных двойников.
Исходя из результатов структурного анализа кло-
нированных последовательностей, указывающих на
присутствие в них открытых рамок считывания,
можно предположить, что они содержат гены.
Часто удается выявить специфические промоторные
последовательности и другие регуляторные элемен-
ты. Однако, чтобы подтвердить эти данные, не-
обходимо провести прямые функциональные иссле-
дования. При этом нужно ответить на следующие
вопросы: 1. Транскрибируется ли данная последова-
тельность только в одном или нескольких типах
клеток? 2. Являются ли транскриптами молекулы
мРНК? 3. Влияют ли на транскрипцию изменения,
происходящие в клетке? 4. Содержит ли клониро-
ванный сегмент промоторы, терминаторы или дру-
гие регуляторные сигналы, и если да, то как они
работают? 5. Какова связь между структурой клони-
рованного сегмента и структурой внутриклеточных
транскриптов? 6. Могут ли транскрипты транслиро-
ваться в полипептид? Для ответа на все эти вопросы
используют различные экспериментальные подходы
в зависимости от того, какая именно система ана-
лизируется. Многие из них мы описали в последую-
7 ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
349
РИС. 7.37.
Вставка
Вектор
I Эндонуклеазы
I Есо RI и HindW\
5--agcttgto;gcatatccag
acaG CGTATAGGTCTTAA-5'
5- AGCTTGTCAGCATATCCAG
AC AGTCG TATAGGTCTTAA-5'
Отжиг
5'-AGCTTGTCAGCATATCCAG
5'—AATTCTGGATATGCTGACA
«Кассетный» мутагенез. Участок, в который мы хотим
внести мутацию, вырезают из клонированного реком-
бинантного вектора по двум фланкирующим уникаль-
ным рестрикционным сайтам и вместо него включают
синтетический дуплексный олигонуклеотид, содержа-
щий нуклеотидную замену и имеющий липкие концы,
совпадающие с липкими концами в линейном векторе.
Две цепи синтетического олигонуклеотидного дуплекса
синтезируют раздельно и затем отжигают.
щих главах, но некоторые широко используемые
приемы, лежащие в основе большинства методов,
мы рассмотрим в этой главе.
а. Характеристика внутриклеточных
транскриптов, соответствующих
клонированным сегментам ДНК
Говоря о любом клонированном сегменте гено-
ма, нам прежде всего необходимо ответить на
вопросы, связанные с его транскрипцией in vivo.
Очень важными являются также данные о структур-
ном сходстве между клонированной кДНК и внут-
риклеточными родственными транскриптами. В ос-
нове соответствующих исследований лежат три ме-
тода: РНК-блоттинг, анализ с использованием спе-
цифичных к одноцепочечным ДНК нуклеаз и копи-
рование РНК, выделенной из клеток, с помощью
обратной транскриптазы. Все методы включают
предварительное выделение и очистку РНК из це-
лых клеток или специфических внутриклеточных
органелл, таких, как ядро или цитоплазма. Резуль-
тативность всех методов зависит от способности
РНК образовывать гетеродуплексы с комплемен-
тарной клонированной ДНК.
РНК-блоттинг. Блоттинг РНК (нозерн-блот-
тинг) аналогичен блоттингу ДНК (разд. 6.1.6). Он
350
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Цитоплаз-
Ядерная магическая
РИС. 7.38.
Схематическое представление РНК-блота. Показаны
две дорожки в геле: одна отвечает ядерной, другая - ци-
топлазматической РНК. После электрофореза РНК пе-
реносят на нитроцеллюлозный фильтр, отжигают ее
с 32Р-рибосомной РНК и затем накладывают фильтр на
рентгеновскую пленку. Три полосы на радиоавтографе
ядерной РНК соответствуют 18S-pPHK, 28S-pPHK и их
455-предшественнику (гл. 8). В препарате цитоплазма-
тической РНК 45S-PHK отсутствует.
состоит в следующем. Выделенную РНК разделяют
по размерам с помощью электрофореза в агарозном
геле (рис. 7.38). Обычно электрофорез проводят
в условиях, способствующих денатурации РНК, что-
бы свести к минимуму влияние вторичной структу-
ры молекулы на ее электрофоретическую подвиж-
ность. Щелочные условия для этой цели не подходят
ввиду лабильности фосфодиэфирных связей в моле-
куле РНК в этих условиях. Поэтому используют
такие агенты, как глиоксаль, формальдегид или
мочевину. Затем РНК переносят на иммобилизо-
ванную подложку, стараясь сохранить распределе-
ние молекул РНК. Далее используют меченую ДНК
(например, интересующий нас клон) в качестве зон-
да для выявления на фильтре соответствующих
молекул РНК. Фильтр инкубируют с ДНК в усло-
виях, благоприятствующих гибридизации. Промыв
фильтр для удаления избыточной ДНК, с помощью
радиоавтографии устанавливают положение зонда,
а следовательно, и положение гомологичной РНК
в том геле, в котором проводился электрофорез.
Таким способом выявляют продукты транскрипции
клонированного сегмента ДНК. Если на параллель-
ной дорожке этого же геля одновременно провести
разделение смеси РНК или молекул одноцепочечной
ДНК известного размера, то можно оценить размер
транскриптов. Кроме того, РНК-блоттинг позволя-
ет оценить количество РНК, синтезированной в
клетках, из которых она получена. Метод оценки
аналогичен используемому при определении числа
копий ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах (рис.
7.26). Плотность полосы на рентгеновской пленке
пропорциональна количеству присутствующей го-
мологичной РНК. Для оценки количества специфи-
ческой РНК в смеси можно также использовать
методы, представленные на рис. 7.30 и в разд. 7.5.в
(рис. 7.39). Как и ранее, желательно, чтобы меченый
зонд был одноцепочечным, поскольку он не должен
реассоциировать с комплементарной цепью ДНК
вместо РНК.
С помощью всех этих довольно простых мето-
дов можно получить обширную информацию о
функциональных свойствах клонированного сегмен-
та ДНК. Сюда относятся не только данные о спо-
собности к транскрибированию, но и оценка числа
траскриптов и ее зависимость от типа клеток или
внеклеточной среды. Анализируя РНК из очищен-
ных клеточных компонентов, можно установить, где
локализуются разные транскрипты-в ядре, цито-
плазме или полисомах. Часто очень важным являет-
ся вопрос о полиаденилировании гомологичной
РНК, поскольку полиаденилирование является
характерным признаком большинства эукариоти-
ческих мРНК. Разделить полиаденилированную
[poly(А+)] и неполиаденилированную (poly(А-)]
РНК не составляет труда, поскольку полиаденили-
рованная РНК спаривается при соответствующих
условиях с poly(dT) или poly(rU). Сами полимеры
обычно фиксируют на инертной твердой подложке,
что упрощает отделение несвязанной ро1у(А“)-РНК.
Фракцию ро1у(А+)-РНК элюируют при денатури-
рующих условиях (рис. 7.40). Затем РНК из каждой
фракции подвергают электрофорезу, блоттингу и
Стандарты Исследуемые обрразцы
ДНК, нг Суммарная РНК, мкг
1,5 0,8 0,4 0,2 0,1 0,05 5,0 2,5 1,3
ф ф • * ф • • а
• • * 6
РИС. 7.39.
Оценка количества специфичной РНК в смеси молекул
РНК с помощью «дот-блоттинга». Два препарата РНК
(а и б) в трех вариантах каждый (количества 5,0; 2,5
и 1,3 мкг) фиксировали на нитроцеллюлозном фильтре
и затем отжигали с избытком 32Р-зонда, представля-
ющего собой одноцепочечную ДНК (клонированную
в векторе М13). Количество зонда, гибридизовавшегося
в каждом из этих случаев, определяли с помощью
радиоавтографии. Количество РНК в препарате, комп-
лементарной зонду, оценивали путем сравнения плот-
ности пятен, опытных и контрольных, полученных при
нанесении известных количеств клонированного сег-
мента ДНК. Стандарты готовили из дуплексной денату-
рированной ДНК. (С любезного разрешения J. Skow-
ronski.)
7 ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
351
РИС. 7.40.
Фракционирование смеси poly (AV и poly (А) -РНК.
Смесь пропускают через колонку, содержащую oligo (dT),
связанную с целлюлозой, в условиях, благоприятству-
ющих отжигу oligo (Т) с poly (А)-«хвостами» РНК. РНК,
у которой poly (А)-«хвосты» отсутствуют, проходит че-
рез колонку, не задерживаясь. Затем poly (А)4-РНК
элюируют с колонки при денатурирующих условиях.
тестированию на способность тибридизоваться с
клонированной ДНК. Если РНК, идентифицирован-
ная с. помснало УЩК. надежна та
цитоплазмы и полиаденилирована, то скорее всего
она представляет собой мРНК. Идентификация ста-
новится более надежной, если, кроме того, РНК
связана с полисомами.
Еще одной характеристикой мРНК. гибридизо-
вавшихся с клонированным сегментом ДНК, явля-
ется их размер. Иногда РНК имеет больший размер,
чем клонированный сегмент; это означает, что в
клоне представлена лишь часть гена. В других слу-
чаях РНК оказывается короче клонированного сег-
мента, что свидетельствует о наличии в клониро-
ванной последовательности дополнительных после-
довательностей, не представленных в транскрипте.
Это могут быть геномные последовательности,
фланкирующие транскрибируемую область, или не-
кодирующие последовательности, прерывающие
кодирующую область и подвергающиеся сплайсин-
гу во время созревания мРНК (разд. 7.1.г и гл. 8).
Все эти взаимоотношения между клонированным
сегментом ДНК и гомологичной клеточной РНК
можно установить более точно, используя специ-
фичные к одноцепочечным ДНК нуклеазы или осу-
ществляя обратную транскрипцию.
Исследование родства между клонированным сег-
ментом ДНК и внутриклеточной РНК с помощью
ДНК—РНК-гибридизации и специфичных к одноцепо-
чечным ДНК нуклеаз. Эксперимент включает три
этапа (рис. 7.41). На первом клонированный фраг-
мент ДНК метят радиоактивным изотопом (на-
пример, с помощью ник-трансляции; см. рис. 4.18)
и денатурируют. Можно также (и это более пред-
почтительно) использовать одноцепочечную ДНК.
На втором этапе ДНК гибридизуют с выделенной
клеточной РНК в растворе в условиях, благоприят-
ных для образования ДНК—РНК-гибридов. Лю-
бые последовательности ДНК, присутствующие в
клонированном фрагменте, но не представленные
в РНК, остаются одноцепочечными. Их удаляют
с помощью нуклеазы, специфичной к одноцепочеч-
ной ДНК. И наконец, гибридные молекулы денату-
рируют и подвергают гель-электрофорезу. Размер
образующейся радиоактивной ДНК определяют с
помощью радиавтографии, сравнивая положение
исследуемой ДНК с положением молекул ДНК
известного размера.
Этот основной эксперимент можно проводить во
многих разных вариантах, каждый из которых поз-
воляет выявить свои особенности структуры РНК
в зависимости от того, какая именно нуклеаза ис-
пользуется, является ли РНК суммарной или очи-
щенной цитоплазматической ро!у(А+)-мРНК. Один
из таких вариантов представлен на рис. 7.41, где
в ДНК имеется один протяженный участок, компле-
352
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Радиоактивная
Денатурация
Исходная
ДНК
Г ель-электрофорез
в денатурирующих
условиях
РИС. 7.41. -----
Установление структурного родства между клонирован-
ным сегментом ДНК и гомологичной клеточной РНК
с помощью специфичной к одноцепочечной ДНК нук-
леазы S1. В приведенном примере смесь цитоплазма-
тических молекул poly(AT)-PHK отжигали с денатури-
рованным препаратом радиоактивно меченной клони-
рованной ДНК в условиях, благоприятствующих обра-
зованию дуплексов РНК-ДНК. С помощью нуклеазы S1
удаляли ту часть ДНК, которая не образует гетеродуп-
лекса с гомологичной РНК, присутствующей в смеси.
Затем проводили электрофорез в денатурирующих ус-
ловиях и накладывали на гель рентгеновскую пленку. На
радиоавтографе появлялись две темные полосы. Одна
из них соответствовала исходной цепи ДНК, другая-
реассоциировавшей РНК. Размер РНК можно оценить,
если на параллельной дорожке провести электрофорез
маркерных ДНК известного размера.
ментарный РНК, и не спарены только концы моле-
кулы. Метод позволяет также выявить любую об-
ласть, где отсутствует комплементарность между
РНК и ДНК, в том числе последовательности,
аналогичные представленным на рис. 7.3. Другие
варианты метода описаны в следующих главах. Во
многих экспериментах такого рода используется
специфичная к одноцепочечной ДНК эндонуклеаза
S1 (разд. 4.1.6), поэтому метод называют S1-карти-
рованием.
S1-картирование часто используют для установ-
ления соответствия между началом молекулы РНК
и специфическим сайтом в клонированном сегменте
ДНК. Во многих случаях этот сайт представляет
собой сайт инициации транскрипции. Точность экс-
перимента значительно повышается, если исполь-
зуется небольшой ДНК-зонд, что позволяет изме-
рить длину защищенного сегмента ДНК с точ-
ностью до одного нуклеотида. Для получения та-
кого зонда обычно субклонируют строго опреде-
ленные участки длинного фрагмента ДНК. Размер
защищенного фрагмента ДНК определяют с по-
мощью электрофореза в таких же гелях, что и при
определении нуклеотидной последовательности.
7 ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
353
Обратная транскрипция
dATP dTTP dCTP.dGTP
РИС. 7.42.
Идентификация 5'-конца молекулы
РНК с помощью удлинения прайме-
ра. Относительно короткий синтети-
ческий или субклонированный фраг-
мент ДНК, гомологичный участку ин-
тересующей нас РНК, находящемуся
вблизи 5'-конца, отжигают с РНК.
Затем с помощью обратной транс-
криптазы копируют РНК, используя
фрагмент ДНК в качестве праймера.
Копирование РНК-матрицы останав-
ливается, когда обратная транскрип-
таза доходит до ее 5'-конца. Проводя
гель-электрофорез в денатурирующих
условиях, можно оценить размер уд-
линенной праймерной ДНК и найти
сайт, где начинается РНК. Обычно
используется радиоактивно меченная
праймерная ДНК, что облегчает
идентификацию продукта.
Удлинение праймера: исследование родства меж-
ду внутриклеточной РНК и клонированным фраг-
ментом ДНК с помощью обратной транскриптазы.
Для проведения этого эксперимента необходим от-
носительно короткий ДНК-зонд, который гибриди-
зуется с участком РНК, желательно находящимся на
расстоянии не более 100 пар оснований от предпола-
гаемого 5'-конца РНК (рис. 7.42). ДНК-зонд отжи-
гают с РНК. и он играет роль праймера при обрат-
ной транскрипции, а матрицей служит РНК. По-
скольку обратная транскриптаза прекращает копи-
рование, когда достигает 5'-конца РНК, размер
продукта позволяет установить, где начинается
РНК. Обычно праймер бывает радиоактивно ме-
ченным, что позволяет легко определить положение
продукта в геле. Поскольку ДНК-зонд специфичен
только к конкретной РНК, исследуемый препарат
может представлять собой смесь разных РНК.
б. Функциональное тестирование
клонированной ДНК
Клонированные сегменты ДНК можно транс-
крибировать и транслировать в эукариотических
системах либо in vitro с использованием клеточных
экстрактов или очищенных ферментов, либо in vivo
после введения клонированного сегмента в клетку.
Системы in vitro. Для приготовления бесклеточ-
ных экстрактов, содержащих РНК-полимеразы I, II
и III, обычно используют разнообразные эукариоти-
ческие клетки. В анализируемом сегменте должны
присутствовать последовательности, ответственные
за регуляцию транскрипции, необходимы также
вспомогательные белки (или факторы), стимули-
рующие транскрипцию. При фракционировании
таких экстрактов получают очищенные или частич-
но очищенные полимеразы и факторы, с помощью
которых можно детально изучить механизмы транс-
354
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
крипции (гл. 8). Для осуществления трансляции
мРНК с образованием соответствующих полипеп-
тидов используют другие типы клеточных экстрак-
тов (см. гл. 6).
Системы in vivo. Для изучения функций клониро-
ванного сегмента ДНК лучше всего использовать
целые клетки, поскольку это позволяет следить как
за процессом транскрипции, так и за процессом
трансляции. Наиболее изученной биологической
тест-системой являются ооциты лягушки (Xenopus).
Ооциты это крупные клетки объемом до 1 мкл,
которые можно многократно получать от одной
лягушки. ДНК инъецируют непосредственно в ядро
(так называемый зародышевый пузырек), при этом
обычно достаточно 5 нг препарата. ДНК в комплек-
се с гистонами ооцита упаковывается с образовани-
ем хроматина, далее осуществляются ее транскрип-
ция и трансляция, и в течение нескольких часов
можно идентифицировать продукты экспрессии ге-
нов-мРНК и полипептиды. Для проведения экспе-
римента часто оказывается достаточно того коли-
чества РНК и полипептидов, которое синтезируется
одним ооцитом. Во многих отношениях экспрессия
инъецированных клонированных генов в ооцитах
протекает нормально. Исходные ядерные транс-
крипты генов РНК-полимераз II и III подвергаются
процессингу, а зрелые мРНК и тРНК переходят
в цитоплазму.
Рекомбинантные ДНК могут быть введены и в
эукариотические клетки в культуре. Молекулы мож-
но инъецировать непосредственно в отдельные клет-
ки, однако проще вводить клонированные молекулы
в большую популяцию клеток одновременно. При
этом используется методика трансфекции, описан-
ная в гл. 5 в связи с клонированием в эукариоти-
ческих клетках. По крайней мере часть молекул,
введенных таким способом, достигает ядер.
7.8. СИНТЕЗ ПОЛИПЕПТИДОВ,
КОДИРУЕМЫХ
КЛОНИРОВАННЫМИ
СЕГМЕНТАМИ ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ
ДНК
В предыдущих разделах мы уже не раз остана-
вливались на синтезе in vitro и in vivo полипептидов,
кодируемых вставками в рекомбинантных векторах.
Скрининг по фенотипу зависит от экспрессии инте-
ресующего нас гена в клетках хозяина (гл. 5 и 6).
Отбор нужных клонов такими методами, как HART
и гибридизационная селекция, осуществляется с
помощью трансляции in vitro (разд. 6.4). а функ-
циональный анализ клонированного сегмента после
введения его в исходную клетку основывается
на изучении как транскрипции, так и трансляции
(разд. 7.7.6). Цель многих экспериментов по клони-
рованию состоит в синтезе нужного полипептида,
а иногда в получении его в количествах, доста-
точных для проведения фенотипического анализа.
В ряде случаев цель клонирования состоит в получе-
нии антител. В этом разделе мы опишем некоторые
системы хозяин-вектор, специально созданные для
продукции нужного белка.
Синтез белков, предназначенных для проведения
тех или иных исследований или для применения
в медицине и промышленности,- это одна из самых
первых задач, которые ставились при разработке
технологии рекомбинантных ДНК. В настоящее
время ряд поступающих в продажу ферментов,
используемых для конструирования рекомбинант-
ных молекул ДНК, в свою очередь синтезируются
под контролем генов, клонированных в плазмидных
векторах E.coli. Использующиеся при этом препара-
ты имеют высокую степень очистки, относительно
недороги и включают ДНК-полимеразу I, ДНК-
лигазу E.coli, обратную транскриптазу. Другие бел-
ки и их мутантные формы, полученные после сайт-
специфического мутагенеза соответствующих кло-
нированных генов, используют для установления
связи между структурой белка и его функцией.
К ним относятся алкогольдегидрогеназа, 0-лакта-
маза, цитохром с- и тирозил-тРНК синтетазы.
С помощью методов клонирования были синте-
зированы важные в клиническом отношении белки,
которые трудно было получить иным способом.
Сюда относятся интерфероны, инсулин и гормон
роста человека. Были синтезированы белки, кодиру-
емые некоторыми вирусами животных (в том числе
вирусами человека, такими, как вирус гепатита В)
и простейшими (например, Plasmodium falciparum,
возбудителем малярии человека). Они использова-
лись в качестве антигенов в некоторых вакцинах.
а. Выбор системы экспрессии
Для экспрессии уже клонированного гена выбор
хозяина имеет такое же важное значение, как и при
самом клонировании. Наиболее подходящими
хозяевами для получения белка часто оказываются
клетки E.coli, поскольку с ними просто манипулиро-
вать и их легко выращивать в больших объемах.
После открытия интронов, прерывающих кодирую-
щие участки многих эукариотических генов, для
использования в экспрессирующих векторах чаще
стали применять клонированные кДНК, а не сами
гены. Однако при синтезе активных форм опре-
деленных эукариотических белков в клетках E.coli
возникает ряд проблем. Так, первичные продукты
транс чяции некоторых эукариотических генов долж-
ны подвергнуться специфическим посттрансляцион-
ным модификациям, прежде чем образуются функ-
7 ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
353
Обратная транскрипция
dATP, dTTP, dCTP , dGTP
РИС. 7.42.
Идентификация 5'-конца молекулы
РНК с помощью удлинения прайме-
ра. Относительно короткий синтети-
ческий или субклонированный фраг-
мент ДНК, гомологичный участку ин-
тересующей нас РНК, находящемуся
вблизи 5'-конца, отжигают с РНК.
Затем с помощью обратной транс-
криптазы копируют РНК, используя
фрагмент ДНК в качестве праймера.
Копирование РНК-матрицы останав-
ливается, когда обратная транскрип-
таза доходит до ее 5'-конца. Проводя
гель-злектрофорез в денатурирующих
условиях, можно оценить размер уд-
линенной праймерной ДНК и найти
сайт, где начинается РНК. Обычно
используется радиоактивно меченная
праймерная ДНК, что облегчает
идентификацию продукта.
Электрофорез в
денатурирующих
условиях
транскрипт
Удлинение праймера: исследование родства меж-
ду внутриклеточной РНК и клонированным фраг-
ментом ДНК с помощью обратной транскриптазы.
Для проведения этого эксперимента необходим от-
носительно короткий ДНК-зонд, который гибриди-
зуется с участком РНК, желательно находящимся на
расстоянии не более 100 пар оснований от предпола-
гаемого 5'-конца РНК (рис. 7.42). ДНК-зонд отжи-
гают с РНК, и он играет роль праймера при обрат-
ной транскрипции, а матрицей служит РНК. По-
скольку обратная транскриптаза прекращает копи-
рование, когда достигает 5'-конца РНК, размер
продукта позволяет установить, где начинается
РНК. Обычно праймер бывает радиоактивно ме-
ченным, что позволяет легко определить положение
продукта в геле. Поскольку ДНК-зонд специфичен
только к конкретной РНК, исследуемый препарат
может представлять собой смесь разных РНК.
б. Функциональное тестирование
клонированной ДНК
Клонированные сегменты ДНК можно транс-
крибировать и транслировать в эукариотических
системах либо in vitro с использованием клеточных
экстрактов или очищенных ферментов, либо in vivo
после введения клонированного сегмента в клетку.
Системы in vitro. Для приготовления бесклеточ-
ных экстрактов, содержащих РНК-полимеразы I, I]
и III, обычно используют разнообразные эукариоти-
ческие клетки. В анализируемом сегменте должны
присутствовать последовательности, ответственные
за регуляцию транскрипции; необходимы также
вспомогательные белки (или факторы), стимули-
рующие транскрипцию. При фракционировании
таких экстрактов получают очищенные или частич-
но очищенные полимеразы и факторы, с помощью
которых можно детально изучить механизмы транс-
354
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
крипции (гл. 8). Для осуществления трансляции
мРНК с образованием соответствующих полипеп-
тидов используют другие типы клеточных экстрак-
тов (см. гл. 6).
Системы in vivo. Для изучения функций клониро-
ванного сегмента ДНК лучше всего использовать
целые клетки, поскольку это позволяет следить как
за процессом транскрипции, так и за процессом
трансляции. Наиболее изученной биологической
тест-системой являются ооциты лягушки (Xenopus).
Ооциты это крупные клетки объемом до 1 мкл,
которые можно многократно получать от одной
лягушки. ДНК инъецируют непосредственно в ядро
(так называемый зародышевый пузырек), при этом
обычно достаточно 5 нг препарата. ДНК в комплек-
се с гистонами ооцита упаковывается с образовани-
ем хроматина, далее осуществляются ее транскрип-
ция и трансляция, и в течение нескольких часов
можно идентифицировать продукты экспрессии ге-
нов-мРНК и полипептиды. Для проведения экспе-
римента часто оказывается достаточно того коли-
чества РНК и полипептидов, которое синтезируется
одним ооцитом. Во многих отношениях экспрессия
инъецированных клонированных генов в ооцитах
протекает нормально. Исходные ядерные транс-
крипты генов РНК-полимераз II и III подвергаются
процессингу, а зрелые мРНК и тРНК переходят
в цитоплазму.
Рекомбинантные ДНК могут быть введены и в
эукариотические клетки в культуре. Молекулы мож-
но инъецировать непосредственно в отдельные клет-
ки, однако проще вводить клонированные молекулы
в большую популяцию клеток одновременно. При
этом используется методика трансфекции, описан-
ная в гл. 5 в связи с клонированием в эукариоти-
ческих клетках. По крайней мере часть молекул,
введенных таким способом, достигает ядер.
7.8. СИНТЕЗ ПОЛИПЕПТИДОВ,
КОДИРУЕМЫХ
КЛОНИРОВАННЫМИ
СЕГМЕНТАМИ ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ
ДНК
В предыдущих разделах мы уже не раз остана-
вливались на синтезе in vitro и in vivo полипептидов,
кодируемых вставками в рекомбинантных векторах.
Скрининг по фенотипу зависит от экспрессии инте-
ресующего нас гена в клетках хозяина (гл. 5 и 6).
Отбор нужных клонов такими методами, как HART
и гибридизационная селекция, осуществляется с
помощью трансляции in vitro (разд. 6.4), а функ-
циональный анализ клонированного сегмента после
введения его в исходную клетку основывается
на изучении как транскрипции, так и трансляции
(разд. 7.7.6). Цель многих экспериментов по клони-
рованию состоит в синтезе нужного полипептида,
а иногда в получении его в количествах, доста-
точных для проведения фенотипического анализа.
В ряде случаев цель клонирования состоит в получе-
нии антител. В этом разделе мы опишем некоторые
системы хозяин-вектор, специально созданные для
продукции нужного белка.
Синтез белков, предназначенных для проведения
тех или иных исследований или для применения
в медицине и промышленности, это одна из самых
первых задач, которые ставились при разработке
технологии рекомбинантных ДНК. В настоящее
время ряд поступающих в продажу ферментов,
используемых для конструирования рекомбинант-
ных молекул ДНК, в свою очередь синтезируются
под контролем генов, клонированных в плазмидных
векторах E.coli. Использующиеся при этом препара-
ты имеют высокую степень очистки, относительно
недороги и включают ДНК-полимеразу I, ДНК-
лигазу E.coli, обратную транскриптазу. Другие бел-
ки и их мутантные формы, полученные после сайт-
специфического мутагенеза соответствующих кло-
нированных генов, используют для установления
связи между структурой белка и его функцией.
К ним относятся алкогольдегидрогеназа, Р-лакта-
маза, цитохром с и тирозил-тРНК-синтетазы.
С помощью методов клонирования были синте-
зированы важные в клиническом отношении белки,
которые трудно было получить иным способом.
Сюда относятся интерфероны, инсулин и гормон
роста человека. Были синтезированы белки, кодиру-
емые некоторыми вирусами животных (в том числе
вирусами человека, такими, как вирус гепатита В)
и простейшими (например, Plasmodium falciparum,
возбудителем малярии человека). Они использова-
лись в качестве антигенов в некоторых вакцинах.
а. Выбор системы экспрессии
Для экспрессии уже клонированного гена выбор
хозяина имеет такое же важное значение, как и при
самом клонировании. Наиболее подходящими
хозяевами для получения белка часто оказываются
клетки E.coli, поскольку с ними просто манипулиро-
вать и их легко выращивать в больших объемах.
После открытия интронов, прерывающих кодирую-
щие участки многих эукариотических генов, для
использования в экспрессирующих векторах чаще
стали применять клонированные кДНК, а не сами
гены. Однако при синтезе активных форм опре-
деленных эукариотических белков в клетках E.coli
возникает ряд проблем. Так, первичные продукты
трансляции некоторых эукариотических генов долж-
ны подвергнуться специфическим посттрансляцион-
ным модификациям, прежде чем образуются функ-
7. ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
355
Экспрессирующий вектор прокариот
РИС. 7.43.
Общие свойства экспрессирующих векторов. Да-
же если вектор был сконструирован для экспрес-
сии в клетках эукариот, он обычно является чел-
ночным и содержит последовательности, необхо-
димые для репликации в £. coli. Это позволяет
получить достаточное количество рекомбинантных
молекул. Указаны точка инициации транскрипции
и направление транскрипции от промотора, конт-
ролирующего экспрессию вставки. Ш Д после-
довательность Шайна Дальгарно.
репликации плазмиды
Экспрессирующий вектор эукариот
циональные молекулы. Обычно эти модификации
состоят в протеолизе, фосфорилировании, ацетили-
ровании и гликозилировании. Ферменты, катализи-
рующие эти реакции в клетках Е. coli, обычно отсут-
ствуют. Отчасти для решения этой проблемы были
разработаны эффективные эукариотические системы
экспрессии. В животных системах хозяин-вектор
в качестве кодирующих последовательностей не
обязательно использовать кДНК, поскольку эти
клетки способны удалять интроны.
Векторы, предназначенные для эффективной
транскрипции и трансляции клонированного сегмен-
та, содержат элементы, повышающие эффектив-
ность репликации вектора и экспрессии соответ-
ствующих генов (рис. 7.43). Репликация как таковая
для экспрессии генов не требуется, но, обеспечивая
образование большого числа матриц для транс-
крипции, она повышает содержание мРНК и поли-
пептидов в клетке. Таким образом, экспрессирую-
щие векторы обычно содержат точку начала репли-
кации и кодируют некоторые другие функции, не-
обходимые для эффективной внутриклеточной реп-
ликации и не обеспечивающиеся хозяйскими клет-
ками. Транскрипция зависит от наличия в векторе
промотора, который соответствует присутствующей
в клетках РНК-полимеразе, т.е. промотора E.coli
для экспрессии в клетках бактерий и промотора.
используемого РНК-полимеразой II, для экспрессии
в эукариотических клетках. Этот промотор должен
быть расположен в векторе таким образом, чтобы
клонированный ген мог встроиться в правильной
ориентации и за промотором по ходу транскрипции.
Эукариотические экспрессирующие векторы должны
также иметь сайт для расщепления и полиаденили-
рования транскрипта предшественника функци-
ональной мРНК (гл. 8). Для точной трансляции
в начале кодирующей области должен находиться
кодон ATG, а в конце- один из стоп-кодонов.
Последний обычно содержится в клонированном
сегменте, но стартовый кодон часто отсутствует во
вставке кДНК, поэтому его функции должен выпол-
нять вектор. Для трансляции в Е. coli на 5'-конце на
расстоянии примерно 10 нуклеотидов от иниции-
рующего кодона должен находиться сайт связы-
вания с рибосомой, последовательность Шайна-
Дальгарно (разд. 3.6.а).
В экспрессирующие векторы часто бывают вклю-
чены дополнительные элементы. Обычно они пред-
назначаются для увеличения выхода полипептидов
или для упрощения процедуры очистки нужного
белка ог других клеточных белков. Одним из основ-
ных факторов, ответственных за уменьшение вы-
хода, является нестабильность многих белков в
чужеродной клеточной среде.
356
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Чтобы добиться экспрессии гена (или кДНК),
обычно каждый раз приходится решать уникальную
экспериментальную задачу. Поэтому многие экс-
прессирующие векторы, хотя и обладают некото-
рыми общими свойствами, имеют свои особенно-
сти. Ниже мы рассмотрим системы, в которых
используются оригинальные экспрессирующие век-
торы, предназначенные для конкретных целей.
б. Экспрессирующие векторы,
используемые в E.coli
Векторы, сконструированные для осуществления
эффективного белкового синтеза в E.coli, обычно
происходят от pBR322 или другой высококопийной
плазмиды; это необходимо для получения макси-
мального числа матриц для транскрипции.
Промоторы. Большинство векторов, предназна-
ченных для изучения экспрессии генов, содержат
один из сильных промоторов, описанных в разд.
3.11: /ас-промотор с соответствующим оператором,
Ггр-промотор и оператор, а также Рь-промотор
бактериофага X. Обычно используют мутантный
/яс-промотор, называемый UV5 (рис. 3.7), посколь-
ку это позволяет осуществлять транскрипцию с
большей скоростью, чем в случае промотора дикого
типа, а кроме того, активность сохраняется даже
в отсутствие положительного эффектора САР-сАМ Р
(разд. 3.11.в). Другой часто используемый промо-
тор, lac, представляет собой синтетическую кон-
струкцию: его -35-последовательность представля-
ет собой -35-последовательность Ггр-промотора,
а блок Прибнова (—10-последовательность) соот-
ветствующую последовательность промотора UV5.
Таким образом, toc-промотор идентичен оптималь-
ному промотору E.coli. структура которого была
определена исходя из данных, полученных при срав-
нении последовательностей многих природных про-
моторов (рис. 3.6). Как и ожидалось, он оказался
весьма эффективным.
Помимо такого достоинства, как эффективность,
эти четыре промотора обладают еще одним ценным
свойством: они позволяют осуществлять временной
контроль инициации транскрипции, поскольку свя-
заны с регуляторными элементами. Это очень важ-
но, так как накопление больших количеств чуже-
родного для E.coli белка может подавлять рост
клеток и тем самым ограничивать конечный выход
белка. Впрочем, если клетки удается вырастить до
высокой плотности, а затем индуцировать к опти-
мальной экспрессии клонированного гена, то часто
можно достигнуть оптимального выхода белка.
Если белок, который предполагается синтезировать,
нестабилен в клетках Е. coli, то молекулы, синтезиро-
ванные в начале цикла роста, вероятно, деградиру-
ют ко времени достижения культурой высокой плот-
ности. Поэтому имеет смысл отсрочить экспрессию
до того момента, когда плотность культуры повы-
сится достаточно сильно. Если используются векто-
ры, в которых экспрессия клонированного гена зави-
сит от этих промоторов, то количество нужного
белка обычно составляет от 1 до 10% уровня
суммарного белка в клеточном экстракте.
Экспрессирующий вектор с 1ас-промотором.
Плазмидные векторы, содержащие промотор
/«< UV5, часто содержат также последовательность
Шайна-Дальгарно /ас-оперона и кодирующие по-
следовательности для Р-галактозидазы (рис. 7.44).
Поскольку экспрессия, инициируемая на участке с
/ас-оператором-промотором, находится под конт-
ролем /яс-оперона, транскрипцию можно иницииро-
вать с помощью индуктора изопропил-р-О-тиога-
лактозида (IPTG). В приведенном примере вместо
восьмого кодона р-галактозидазного гена встроен
полилинкер, что нарушает кодирующую рамку.
Клетки E.coli, несущие такой вектор, не способны
синтезировать активную Р-галактозидазу (в пред-
положении, что клеточный геном является lacZ~).
Две части рамки считывания можно совместить,
если в один из рестриктазных сайтов полилинкера
встроить фрагмент с определенной рамкой считыва-
ния. В этом случае трансляция мРНК может ини-
циироваться в начале кодирующего участка Р-галак-
тозидазного гена, проходить через вставку и осталь-
ную часть кодирующего участка этого гена и закан-
чиваться на обычном стоп-кодоне. В результате
клетки, содержащие плазмиду с такой вставкой,
будут продуцировать активную Р-галактозидазу,
поскольку первые восемь аминокислот молекулы
несущественны для активности фермента и чуже-
родные аминокислоты не будут влиять на нее.
Гибридный полипептид можно очистить, при этом
показателем степени очистки будет служить удель-
ная активность Р-галактозидазы. В некоторых слу-
чаях гибридный белок можно расщепить и удалить
протяженную карбоксильную р-галактозидазную
часть. Однако и сами гибридные белки находят
применение: с их помощью получают антитела к
чужеродному белку (а также к Р-галактозидазе).
Экспрессирующий вектор с trp-промотором. В
векторе, представленном на рис. 7.45, перед поли-
линкером находятся /гр-промотор, оператор, после-
довательность Шайна-Дальгарно, аттенуатор, а
также примерно 300 кодонов гена trp Е. Транскрип-
цию можно контролировать, поместив содержащие
плазмиду клетки E.coli, выращенные до высокой
плотности, в среду без триптофана (голодание) и
добавив затем 3-р-индолилакриловую кислоту.
Последняя конкурирует с оставшимся триптофаном
за связывание с Ггр-репрессором, однако образует
неактивный комплекс, в результате чего происходит
дерепрессия промотора. Как и в случае с вектором,
7. ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
357
содержащим /ас-промотор, при встраивании чуже-
родного гена в рамку считывания по одному из
сайтов рестрикции в полилинкере синтезируется
гибридный белок. Трансляция останавливается,
дойдя до случайного стоп-кодона вектора.
В случае, представленном на рис. 7.45, вставка
кодирует обратную транскриптазу ретровируса.
После трансфекции и дерепрессии в клетках E.coli
синтезируется ферментативно активный гибридный
белок. Для повышения стабильности обратной
транскриптазы большую часть избыточных после-
довательностей гена trpE делегируют с помощью
некоторых манипуляций и переклонирования. Не-
сколько аминокислот trpE, остающихся на N-конце
образовавшегося полипептида, слабо влияют на
активность обратной транскриптазы.
Экспрессирующий вектор, использующий PL-npo-
мотор бактериофага к. Вектор, представлен-
ный на рис. 7.46, позволяет синтезировать эука-
риотические белки, не сливающиеся с чужерод-
ным полипептидом. Транскрипция с этого про-
Последовательности, примыкающие к полилинкеру
Кодон 7 0-галактозидаз- BamHI Кодон 913-галактозидазного
ного гена fcoRl , Srna‘ г i гена
5'-СTCifeAAT T dCCGGGGAT CCCGTС-
-GACC Т Т AAGGGCCCC Т AGGGCAG-5'
| £coRI
5'CTGG +ДАТТCCCGGGGATССCGTС-
-GACCTTAA GGGCCCCTAGGGCAG-5'
-------5'-АА Т Т С (N N N)„N G
Лигаза f G(N'N'N')„N'CТТАА-5'
Кодон 7 Кодон 9
5'-С TGGAAT T C(N N N^NGAATTCCCGGGGAl'CCCGTC-
GACC Т Т AAG(N'N'N')nN'C Т T AAGGGCC CCT AGGGCAG-5'
мотора подавляется Х-репрессором, который обра-
зуется профагом, присутствующим в клетке-хозяине.
Применение клеток, лизогенизированных фагом,
который кодирует чувствительный к нагреванию
репрессор (cl's), позволяет индуцировать экспрессию
гена путем переноса клеток, выращенных при 30 °C,
в среду с температурой 42 °C. Кроме промотора
вектор содержит часть последовательности Шайна
Дальгарно гена сП фага X. Между промотором
и этой последовательностью находится группа ре-
гуляторных элементов фаговой ДНК, которые
функционируют в i/wc-положении, ослабляя транс-
крипционную полярность. (Явление транскрипцион-
ной полярности состоит в уменьшении эффектив-
ности транскрипции, которое иногда наблюдается
при увеличении расстояния от промотора.) Эти
последовательности с антиполярным эффектом
функционируют при наличии продукта гена N фага
X, поставляемого лизогенизированными хозяйскими
клетками, которые обычно используются с векто-
ром этого типа. В таком векторе сегмент, содержа-
щий связывающийся с рибосомой участок Ш-Д-
последовательности, включает также кодон ATG
cll-гена фага X. Более того, ATG перекрывает
Веда HI-сайт, унаследованный от плазмиды pBR322
(молекулы, на основе которой сконструирован век-
тор). Эукариотические кодирующие участки встраи-
вают в BamН 1-сайт разными способами, завися-
щими от кодирующей последовательности. Очень
важным моментом является встраивание кодиру-
ющей последовательности таким образом, чтобы
она находилась в рамке с ATG. Таким образом,
вектор поставляет все регуляторные элементы, не-
обходимые для транскрипции и трансляции, за
исключением стоп-кодона, который обычно нахо-
дится в пределах клонированных эукариотических
кДНК.
РИС. 7.44.
Вектор для экспрессии в £ coli, содержа-
щий промотор lac UV5 и последователь-
ность Шайна-Дальгарно, связывающуюся
с рибосомами. Перед седьмым кодоном
Р-галактозидазного гена находится поли-
линкер, в который по любому из рестрик-
тазных сайтов могут встраиваться вставки.
Если в один из таких рестриктазных сайтов
встроить фрагмент с нужной рамкой счи-
тывания, то две части Р-галактозидазного
гена можно соединить с образованием од-
ной длинной непрерывной рамки. В резуль-
тате в клетке будет синтезироваться гиб-
ридный полипептид. В приведенном при-
мере вставка встроена в Есо Rl-сайт; N и
N'-спаренные основания.
358
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
РИС. 7.45.
Вектор для экспрессии в Е. coli, содержащий Ггр-промо-
тор и регуляторные сигналы. В приведенном примере
кодирующая часть гена обратной транскриптазы (роГ)
ретровируса (разд. 5.7.г) встроена в полилинкер, при-
мыкающий к кодирующему участку гена trp Е. Образу-
ющийся гибридный белок функционально аналогичен
обратной транскриптазе, но более стабильный фермент
получается путем делегирования большей части коди-
рующей последовательности trp Е с помощью манипу-
ляций, представленных в нижней части рисунка.
[N. Tanese, М. Roth, S. Р. Goff, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 82 (1985), p. 4944.]
7 ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
359
ш-Д
( GTTATCTAAGGAN,f|ATGGATCC Q
( CAATAGATTCCTN ^TACCTAGG Q
JВат HI
GTTATCTAAGGAK, о ATG О GAT с с Q
CAATAGATTCCTN^ TACCTAG 0 ^0
РИС. 7.46.
Вектор для экспрессии в £. со/7, содержащий промотор
PL бактериофага X. Регуляторная область этого вектора
сконструирована путем лигирования различных элемен-
тов Х-генома с частью плазмиды pBR322. Сразу за
ATG-кодоном генома фага X находится fia/nHI-сайт,
в который могут быть встроены эукариотические коди-
рующие последовательности. Разработано множество
в. Экспрессирующие векторы,
используемые в клетках дрожжей
Наиболее эффективные в отношении экспрессии
генов дрожжевые векторы сконструированы на
основе 2 мкм-кольцевой плазмиды дрожжей (разд.
5.6.6). Эта плазмида обеспечивает образование в
дрожжевых клетках большого числа копий реком-
бинантной ДНК до тех пор, пока сегмент REP'S
находится в t/wc-положении, а функциональные гены
REPI и REP2- либо в цис-, либо в /пране-положении
(например, в составе другой плазмиды). Применя-
ются несколько разных регулируемых дрожжевых
промоторов; в примере, представленном на рис.
7.47, это промотор гена СУС1, кодирующего изо-1-
нитохром с. Этот промотор и связанные с ним
регуляторные сигналы составляют область разме-
ром в несколько сотен пар оснований, что типично
для подобных сложных эукариотических областей,
в которых транскрипция регулируется с помошью
РНК-полимеразы II (гл. 8). Сегменты ДНК, транс-
ляцию которых мы хотим осуществить, встраивают
в рамку считывания в BamHI-сайте. В этом случае
приемов, позволяющих присоединять кодирующую по-
следовательность к вектору таким образом, чтобы но-
вые кодоны находились в одной рамке считывания
с ATG; два из них представлены на этом рисунке
(варианты а и б). [F. М. Rosenberg, Y.-S. Но, A. Shatzman,
Methods in Enzymology, 101 (1983), p. 123.]
РИС. 7.47.
Вектор для экспрессии в дрожжевых клетках. Эта конст-
рукция сходна с дрожжевым плазмидным вектором,
представленным на рис. 5.25. Кроме сегментов плаз-
миды pBR322 он содержит часть 2 мкм-плазмиды,
обеспечивающую образование большого числа копий
рекомбинантной ДНК в клетках дрожжей, селективный
маркер (дрожжевой ген URA3), промотор и регулятор-
ные последовательности дрожжевого гена CYC1, а так-
же удобный для клонирования Ba/nHI-сайт во втором
кодоне кодирующей последовательности СУС1.
360
ЧАСТЬ II ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
они непосредственно прилегают к инициирующему
кодону ATG гена CYC1. Сайт полиаденилирования
в векторе отсутствует, но обычно кДНК содержат
такой сайт, который расположен за стоп-кодоном
трансляции.
г. Экспрессирующие векторы,
используемые в клетках животных
Для экспрессии клонированных генов в клетках
животных были сконструированы два типа векто-
ров; в основе одного из них лежит геном SV40,
а другого-геном папилломавируса крупного рога-
того скота (BPV). Основные свойства этих двух
систем вирусных векторов описаны в разд. 5.7.
Векторы на основе папилломавирусов особенно
полезны для синтеза больших количеств белка, а
векторы на основе SV40 используются во многих
экспериментах.
Типичные векторы содержат либо весь геном
BPV, либо его часть, необходимую для стабильной
трансформации хозяйских клеток, например мыши-
ных клеток в культуре (рис. 7.48). Такие векторы
часто включают эукариотический ген (или часть
гена) вместе с промотором, сигналом полиаденили-
рования и другими регуляторными областями.
Между сайтом инициации транскрипции и старто-
вым кодоном трансляции находится удобный ре-
стриктазный сайт. Когда в этот сайт встраивается
определенная кодирующая последовательность, она
РИС. 7.48.
Экспрессирующий вектор на основе BPV. Вектор со-
держит последовательности плазмиды pBR322, позво-
ляющие ему реплицироваться в £. coli, трансформиру-
ющую область генома BPV, ген мыши, кодирующий
белок металлотионеин. Между сайтом инициации тран-
скрипции и первым кодоном гена металлотионеина
в рестриктазный £?<?/! I-сайт встроена кодирующая по-
следовательность, включающая стартовый и стоп-кодо-
ны. Клетки мыши, трансформированные рекомбинант-
ным вектором, синтезируют мРНК (стрелка с внутрен-
ней стороны кольца), которая включает вставку, и
транслируют ее с образованием соответствующего
полипептида.
BPV
транскрибируется с образованием соответствующей
мРНК. Синтез этой мРНК начинается от стартово-
го кодона транскрипции и заканчивается на сигнале
полиаденилирования, находящемся во вставке или
в векторной последовательности. Кодирующая по-
следовательность должна содержать свой собствен-
ный стартовый и стоп-кодоны. Одним из преиму-
ществ экспрессирующих векторов, созданных на
основе BPV, является то, что трансформированные
ими клетки сохраняются в культуре в течение
многих месяцев. В результате непрерывного деления
клеток постоянно синтезируется нужный белок.
В одном из экспериментов в BPV-вектор была
встроена предварительно клонированная кодирую-
щая часть гена поверхностного антигена вируса
гепатита В. Трансформированные клетки секрети-
ровали около 10 мг антигена на 1 л культуры за
24 ч.
7.9. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ
АМПЛИФИКАЦИЯ СЕГМЕНТОВ
ДНК И РНК
На заре развития методов молекулярного клони-
рования применение альтернативных способов
амплификации специфических сегментов ДНК или
РНК, присутствующих в больших популяциях моле-
кул, казалось маловероятным. Однако в настоящее
время такой метод разработан и широко использу-
ется. Он получил название полимеразной цепной
реакции (ПЦР). С его помощью можно получать
микрограммы ДНК-копии сегментов ДНК или
РНК, даже когда они присутствуют в препарате
в виде единственной молекулы.
Вся полимеразная цепная реакция осуществля-
ется in vitro с использованием ДНК-полимеразы
и олигонуклеотидных праймеров, комплементарных
двум З'-концам участков, ограничивающих ампли-
фицируемый дуплексный сегмент. Таким образом,
разработка ПЦР-метода стала возможной лишь
после того, как были созданы методы быстрого
и недорогого химического синтеза олигонуклеоти-
дов (разд. 6.1.в). Для осуществления реакции не-
обходимо знать нуклеотидную последовательность
того участка, который мы хотим амплифицировать,
чтобы можно было синтезировать соответствующие
олигонуклеотидные праймеры. При творческом
применении ПЦР-метода он существенно дополняет
методы молекулярной генетики, и если бы часть II
книги не была фактически завершена до того, как
этот метод был окончательно разработан, его
основы были бы обязательно изложены в гл. 5-7.
Полимеразная цепная реакция. Для того чтобы
амплифицировать какой-то сегмент ДНК, синтези-
руют два олигонуклеотидных праймера, каждый из
которых комплементарен одному из двух З'-концов
7. ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
361
участков, ограничивающих амплифицируемый дуп-
лексный сегмент. В ходе ПЦР-реакции необходимо
копировать последовательность каждой из цепей,
находящуюся между участками, с которыми спари-
ваются олигонуклеотидные праймеры. После спари-
вания праймеров с денатурированной ДНК, содер-
жащей амплифицируемый сегмент, осуществляют
встречное удлинение праймеров с помощью ДНК-
полимеразы в присутствии четырех дезоксинуклео-
зидтрифосфатов (рис. 7.49). Образующиеся дуплекс-
ные ДНК денатурируют, вновь спаривают с прай-
мерами и проводят ДНК-полимеразную реакцию.
Этот цикл (денатурация, спаривание, синтез) может
быть повторен примерно 60 раз с удвоением в
каждом цикле количества дуплексного сегмента
ДНК. За п циклов образуется 2" копий дуплексного
сегмента, ограниченного праймерами.
Используя термостабильную ДНК-полимеразу,
выделенную из термофильных бактерий Thermits
aquaticus, можно осуществлять множество ПЦР-
циклов при однократном введении фермента.
Сначала смешивают ДНК, избыточное количество
праймерных молекул, дезоксинуклеозидтрифосфа-
ты и полимеразу. Цикл запускают, нагрев смесь до
температуры, обеспечивающей денатурацию ДНК;
затем охлаждают раствор до температуры, необхо-
димой для отжига праймеров. Далее устанавливают
температуру, при которой может происходить син-
тез ДНК. Весь процесс, который длится несколько
часов, можно автоматизировать, используя нагрева-
тели. работа которых регулируется с помощью
компьютера.
Использование ДНК-полимеразы Т. aquaticus не
только позволяет автоматизировать процесс, но
дает и другое преимущество. Этот фермент наи-
более активен в температурном интервале 70 75 С.
При таких условиях спаривание олигонуклеотидных
праймеров (их длина составляет примерно 20 остат-
ков) и ДНК происходит более специфично, чем при
37 “С-оптимальный температуре для ДНК-
полимеразы E.coli. В результате ассоциация прай-
меров происходит более точно, что сводит к мини-
муму амплификацию нежелательных сегментов
ДНК, особенно в присутствии всей геномной ДНК.
Точность отжига повышается также при подборе
оптимального температурного режима, ионной
силы, длины праймера и его нуклеотидного состава.
Специфичность может быть достаточно высокой,
чтобы осуществлялась амплификация двух разных
сегментов в одном и том же препарате ДНК в
присутствии двух пар праймеров.
РНК можно амплифицировать с образованием
дуплексной ДНК аналогичным образом с той лишь
разницей, что в начале первого цикла необходимо
синтезировать кДНК-копию РНК. Если РНК пред-
ставлена молекулами мРНК, то роль одного из
праймеров в ПЦР, а также в реакциях с участием
обратной транскриптазы могут выполнять короткие
ро1у(А)-цепочки.
Разные варианты полимеразных цепных реакций.
Как мы уже говорили, для проведения ПЦР не-
обходимо знать нуклеотидные последовательности,
фланкирующие амплифицируемый сегмент. Это
подразумевает, что ПЦР-метод может применяться
только при наличии предварительно клонированных
и секвенированных сегментов ДНК. Однако с по-
мощью относительно простых модификаций можно
значительно расширить возможности метода ПЦР.
В одном из вариантов можно выделить определен-
ный ген, если известна аминокислотная последова-
тельность лишь короткого участка соответствую-
щего очищенного белка. Например, синтезировав
праймеры длиной 20 пар нуклеотидов на основании
данных о последовательности двух концов пептид-
ного сегмента длиной в 20 аминокислот, можно
амплифицировать геномный фрагмент длиной 60
п.н. Вследствие вырожденности генетического кода
при этом используют смесь праймеров с альтерна-
тивными основаниями в нужных положениях (разд.
6.4.6). После проведения ПЦР амплифицированный
сегмент из 60 п.н. очищают с помощью гель-
электрофореза или клонирования и используют
в качестве зонда для идентификации интересующей
нас последовательности при анализе библиотек
геномной ДНК или кДНК.
Еще один пример универсальности метода ПЦР
дает использование его для амплификации полной
кДНК-копии мРНК исходя из данных последова-
тельности одного небольшого участка либо соответ-
ствующего пептида, либо мРНК. Метод состоит
в следующем. Суммарную мРНК копируют с обра-
зованием одноцепочечной кДНК, используя корот-
кий ро1у(бТ)-праймер. Затем с помощью терминаль-
ной трансферазы к З'-концу кДНК присоединяют
«хвост» (например, poly(dG); разд. 4.8); используя
короткий ро1у(бС)-праймер, синтезируют вторую
цепь ДНК. До этого момента никакой специфич-
ности в отношении определенной мРНК не про-
является. На следующем этапе используют олиго-
нуклеотидный праймер с такой же последователь-
ностью, как и у короткого участка вблизи З'-конца
нужной нам мРНК. С помощью этого праймера
и poly(dC) проводят ПЦР; специфичность оказыва-
ется достаточно высокой для получения практи-
чески чистого продукта, представляющего полно-
размерную мРНК.
В другом варианте в 5'-концы праймеров вклю-
чают последовательности, соответствующие како-
му-либо рестриктазному сайту. При отжиге с ис-
ходной матрицей они остаются неспаренными, но
амплифицируемый фрагмент приобретает концевые
рестриктазные сайты. Они могут оказаться полез-
24-243
362
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Денатурация,
отжиг праймеров
5- (___________________О
3(—Ж-"—'---------------°
ДНК-полимераза,
dATP, dGTP, dCTP, dTTP
- Цикл 1
Денатурация,
отжиг, синтез ДНК
Цикл 2
Цикл 3
7. ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И МАНИПУЛИРОВАНИЕ
363
ними при последующем клонировании или включе-
нии в вектор для изучения экспрессии.
Применение ПЦР. Возможности метода ПЦР во
всей полноте еще не раскрыты, но с его помощью
уже удалось получить новые данные о структуре
разных РНК, генов и геномов, а также о процессах,
протекающих на геномном уровне. Одно из его
очень важных применений состоит в определении
характера мутаций. После того как ген клонирован,
с помощью двух праймеров амплифицируют соот-
ветствующий геномный сегмент, полученный от
разных особей данного вида. Секвенирование этого
сегмента позволяет установить природу мутации,
произошедшей в данном гене, или выявить поли-
морфизм, будь то замена одной пары оснований
или делеция, инсерция или перестройка. Благодаря
простоте метода с его помощью можно диагно-
стировать генетические заболевания и проводить
популяционно-генетические исследования. Исполь-
зуя праймеры, которые специфически ассоциируют-
ся с определенными мутантными формами гена,
можно также классифицировать мутации.
С помощью зондов, комплементарных геномам
таких инфекционных агентов, как вирусы и бакте-
рии, могут быть идентифицированы геномы этих
агентов на фоне значительного избытка ДНК клет-
ки-хозяина. В частности, вполне реальной представ-
ляется диагностика СПИДа с помощью этого мето-
да. Еще одно его применение состоит в анализе
структуры продуктов реакций рекомбинации.
Одним из интересных и потенциально наиболее
эффективных применений ПЦР является амплифика-
ция сегментов ДНК внутри отдельных клеток. Та-
кие опыты проводились как на диплоидных клетках,
так и на сперматозоидах человека. Использование
сперматозоидов имеет особое значение для генети-
ческого анализа видов, включая человека, которые
не могут подвергаться экспериментальному скре-
щиванию. Этот метод позволяет оценить частоту
мейотической рекомбинации непосредственно в
больших популяциях сперматозоидов, если ис-
пользовать пару праймеров, специфичных в отно-
шении полиморфных или мутантных форм сцеплен-
ных генов.
РИС. 7.49.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая
амплифицировать специфический сегмент ДНК. Два
олигонуклеотидных праймера, по одному для каждой
цепи, ограничивают амплифицируемый сегмент. Внача-
ле ДНК денатурируют, затем производят отжиг прайме-
ров. после чего ДНК-полимераза катализирует удлине-
ние цепи в присутствии четырех нуклеозидтрифосфатов
(цикл 1). Второй и последующие циклы запускают
повышением температуры, вызывая денатурацию дуп-
лексных молекул. В каждом цикле количество нужного
сегмента удваивается. После нескольких циклов в смеси
преобладают дуплексы, соответствующие нужному
сегменту (короткие молекулы ДНК). Реакция идет эф-
фективно, если размер амплифицируемого сегмента не
превышает 2 т.п.н.
24*
Литература
Введение
Приведены классические статьи и книги, в которых
описываются эксперименты, заложившие теорети-
ческую и техническую основу методов работы с
рекомбинантными молекулами ДНК. Список дан
в хронологическом порядке.
F. D'Herelle. 1926. The Bacteriophage and Its Behavior.
Williams and Wilkins, Baltimore.
О. T. Avery, С. M. Macleod, M. McCarty. 1944. Studies
on the Chemical Nature of the Substance Inducing
Transformation of Pneumococcal Types. I. Induction
of Transformation by a Desoxyribonucleic Acid
Fraction Isolated from Pneumococcus Type III. J.
Exp. Med., 79, 137-158.
M. Delbruck. 1946. Experiments with Bacterial Viruses
(Bacteriophages). Harvey Lectures, 41, 161-187.
J. Lederberg, E.L. Tatum. 1946. Gene Recombination in
E.coli. Nature, 158, 558. (This paper describes
conjugation.)
N. Zinder, J. Lederberg. 1952. Genetic Exchange in
Salmonella. J. Bacteriology, 64, 679-699. (В этой
статье рассматривается трансдукция.)
L. L. Cavalli- Sforza, J. Lederberg, E. M. Lederberg.
1953. An Infective Factor Controlling Sex Compa-
tibility in Bacterium coli. J. Gen. Microbiol, 8,
89- 103.
A. Lwoff. 1954- 1955. Control and Interrelations of
Metabolic and Viral Diseases of Bacteria. In Harvey
Lectures, series L, pp. 92- 111. Academic Press, New
York.
F. Jacob, P. Schaeffer, E.L.Wollman. 1960. Episomic
Elements in Bacteria. Symp. Soc. Gen. Microbiol.,
10, 67-91.
A. D. Kaiser, D.S. Hogness. 1960. The Transformation
of Escherichia coli with Deoxiribonucleic Acid Iso-
lated from Bacteriophage X-dg. J. Mol. Biol., 2,
392-415.
W. Arber, D. Dussoix. 1962. Host specificity of DNA
Produced by Escherichia coli. I. Host Controlled
Modification of Bacteriophage X. J. mol. Biol., 5,
18-36, 37-49.
T. Watanabe. 1963. Infective Heredity of Multiple Drug
Resistance in Bacteria. Bacteriological Reviews, 27,
87- 115.
W. Arber. 1965. Host Controlled Modification of
Bacteriophage. Annu. Rev. Microbiol., 19, 365-378.
T. J. Kelly, Jr., H.O. Smith. 1970. A Restriction Enzyme
from Hemophilus influenzae. II. Base Sequence of the
Recognition Site. J. Mol. Biol., 51, 393-409.
H. O. Smith, K. W. Wilcox. 1970. A Restriction Enzyme
from Hemophilus influenzae. I. Purification and
Chemical Properties. J. Mol. Biol., 51, 371-391.
K. J. Danna, D. Nathans. 1971. Sequence Specific Cle-
avage of Simian Virus 40 DNA by Restriction
Endonucleases of Hemophilus influenzae. Proc, Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 68, 2913-2917.
J. Hedgpeth, H. M. Goodman, H. W. Boyer. 1972. DNA
Nucleotide Sequence Restricted by the RI Endo-
nuclease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3448-
3452.
D. A. Jackson, R. H. Symons, P. Berg. 1972. Biochemical
Method for Inserting New Genetic Information into
DNA of Simian Virus 40: Circular SV40 DNA
Molecules Containing X Phage Genes and the Ga-
lactose Operon of E.coli. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 69, 2904 2909.
J. E. Mertz, R. W. Davis. 1972. Cleavage of DNA by RI
Restriction Endonuclease Generates Cohesive Ends.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3370-3374.
H. Temin, D. Baltimor. 1972. RNA Directed DNA
Synthesis and RNA Tumor Viruses. Advances in
Virus Research, 17, 129-186.
S. N. Cohen, A. C. Y. Chang, H. W. Boyer, R. B. Hellings.
1973. Construction of Biologically Functional
Bacterial Plasmids in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 70, 3240-3244.
P. E. Lobban, A.D. Kaiser. 1973. Enzymatic End-to-End
Joining of DNA Molecules. J. Mol. Biol., 78,
453-471.
J. F. Morrow, S. N. Cohen, A. C. Y. Chang, H. W. Boyer,
H.M. Goodman, R.B. Helling. 1974. Replication and
Transcription of Eucaryotic DNA in Escherichia coli.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 1743-1747.
В следующих работах описано историческое раз-
витие методов работ с рекомбинантными ДНК.
J. Cairns, G. S. Stent, J. D. Watson (eds.). 1966. Phage
and the Origins of Molecular Biology. Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New
York.
ЛИТЕРАТУРА
365
S.N. Cohen. 1975. The Manipulation of Genes. Sci.
American, 233, 25-33.
M. F. Singer. 1979. Introduction and Historical Back-
ground. In J. K. Setlow and A. Hollaender (eds.).
Genetic Engeneering, vol. 1, pp. 1-13. Plenum, New
York.
Общие работы для всех глав части II
Некоторые монографии и лабораторные руководст-
ва, описывающие основы и практические детали
методов работы с рекомбинантными ДНК.
Р. D. Boyer (ed.). 1981, 1982. The Enzymes, 3rd ed., vols.
14 and 15. Academic Press, New York.
T. Maniatis, E. F. Fritsch. J. Samhrook. 1982. Molecular
Cloning, a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. [Име-
ется перевод: Маниатис T., Фрич Э., Сэмбрук Дж.
Методы генетической инженерии. Молекулярное
клонирование-М.: Мир, 1984.]
S.M. Linn, R.J. Roberts (eds.). 1983. Nucleases. Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
New York.
J.D. Watson, J. Tooze, D.T Kurtz. 1983. Recombinant
DNA, a Short Course. Scientific American Books,
New York.
D.M. Glover (ed.). 1985, 1987. DNA Cloning, vols. 1,
2 and 3. IRL Press, Oxford, England, and Washin-
gton, D.C. [Имеется перевод: Клонирование
ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера - М.: Мир,
1988, 1989.]
R. W. Old. S. В. Primrose. 1985. Principles of Gene Ma-
nipulation, 3rd ed. Blackwell Scientific Publications,
Oxford, England.
P.H. Pouwels, B.E. Enger-Valk, W. J. Brammer. 1985.
Cloning Vectors. Elsevier, Amsterdam.
F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore,
J. A. Smith, J.G. Seidman, K. Struhl (eds.). 1987.
Current Protocols in Molecular Biology. Greene
Publishing Associates and Wiley, New York.
S. L. Berger, A. R. Kimmel (eds.). 1987. Guide to Mo-
lecular Cloning Techniques. Academic Press, San
Diego.
Литература к указанным разделам глав
4.1
R.J. Crouch, M.L. Dirksen. 1983. Ribonuclease H. In
S. M. Linn and R. J. Roberts (eds.), Nucleases,
pp. 211-241. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, New York.
4.2
D. Nathans. 1979. Restriction Endonucleases, Simian
Virus 40 and the New Genetics. Science, 206,
903-910.
S. E. Halford. 1983. How does EcoRI Cleave Its Re-
cognition Site on DNA? Trends Biochem. Sci, 8,
455-460.
C. Kessler, H.J. Holtke. 1986. Specificity of Restriction
Endonucleases and Methylases- A Review. Gene, 47,
1-52.
J. A. McClarin, C. A. Frederick, В. C. Wang, P. Greene,
H.W. Byer, J. Grable, J.M. Rosenberg. 1986. Stru-
cture of the DNA-EcoRI Endonuclease Recognition
Complex at 3 Angstrom Resolution. Science, 234,
1526-1541. [Миниобзор T. J. Richmond, в кото-
ром обсуждается эта работа, был опубликован в
Nature, 326, 18-19 (1987).]
М. Nelson, М. McClelland. 1987. The Effect of Site-
Specific Methylation on Restriction-Modification
Enzymes. Nucleic Acids Res. 15 (supplement)
r219-r230.
B.-Q. Qiang, I. Schildkraut. 1987. Notl and Sfil: Restri-
ction Endonucleases with Octanucleotide Re-
cognition Sequences. Methods in Enzymology, 155,
260-301.
R.J. Roberts. 1987. Restriction Enzymes and Their
Isoschizomers. Nucleic Acids Res. 15 (supplement)
rl89-r217. (Это обширный список рестриктиру-
ющих эндонуклеаз, который ежегодно обновля-
ется.)
J. М. Rosenberg, J. A. McClarin, С. A. Frederick,
В.-С. Wang, J. Grable, Н. W. Boyer, Р. Greene. 1987.
Structure and Recognition Mechanism of EcoRI
endonuclease. Trends Biochem. Sci. 12, 395-398.
4.3
G. Chaconas, J.H. van de Sande. 1980. 5'-32P Labeling
of RNA and DNA Restriction Fragments.
Methods in Enzymology, 65, 75-85.
4.5
I. R. Lehman. 1974. DNA Ligase: Structure, Mechanism
and Function. Science, 186, 790-797.
4.6
P. WJ. Rigby, M. Dieckmann, C. Rhodes, P. Berg. 1977.
Labeling DNA to High Specific Activity in vitro by
Nick Translation in vitro with DNA Polymerase I. J.
Mol. Biol., 113, 237-251.
4.8
R. Roychoudhury, R. Wu. 1980. Terminal Transferase-
Catalyzed Addition of Nucleotides to the 3' Termini
of DNA. Methods in Enzymology, 65, 43-64.
5.1
M. Mandel, A. Higa. 1970. Calcium-Dependent Bacte-
riophage DNA Infection. J. Mol. Biol., 53, 159-162.
366
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
В. J. Bachmann. 1983. Linkage Map of Escherichia coli
К12, Edition 7. Microbiol. Rev., 47, 180-230.
R. Wu, L. Grossman (eds.). 1987. Methods in Enzy-
mology 153.
5.2
S. Falkow. 1975. Infectious Multiple Drug Resistance.
Pion, London. (Книга посвящена открытию
плазмид и их биологии.)
F. Bolivar, К. Backman. 1979. Plasmids of E.coli as
Cloning Vectors. Methods in Enzymology, 68,
245-267.
R.P. Novick. 1980. Plasmids. Sci. American, 243,
102-127.
5.3
J. Messing, J. Vieira. 1982. A new Pair of M13 Vectors
for Selecting Either DNA Strand of Double- Digest
Restriction Fragments. Gene, 19, 269-276.
A. Campbell. 1983. Bacteriophage X. In J. A. Shapiro
(ed.), Mobile Genetic Elements, pp. 65-103. Ada-
cemic Press New York.
M. Feiss. 1986. Terminase and the Recognition, Cutting,
and Packaging of X Chromosomes. Trends in Ge-
netics, 2, 100- 104.
5.4
J. Collins, B. Hohn. 1978. Cosmids: A Type of Plasmid
Gene-Cloning Vector That is Packageable in vitro in
Bacteriophage X Heads. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
75, 4242-4246.
J. Collins. 1979. E.coli Plast ds Packageable in vitro in X
Bacteriophage Particles. Methods in Enzymology,
68, 309-326.
B. Hohn. 1979. In vitro packaging of X and Cosmid
DNA. Methods in Enzymology, 68, 299-309.
S. Brenner, G. Cesareni, J. Karn. 1982. Plasmids: Hyb-
ridsbetween ColEl Plasmids and E.coli Bacterio-
phage X. Gene, 17. 27-44.
5.5
P.S. Lovett, K.M. Keggins. 1979. Bacillus subtilis as
a Host for Molecular Cloning. Methods in En-
zymology, 68, 342-357.
D. A. Hopwood, M.J. Bibb, K.F. Chater, T. Kieser.
1987. Plasmid and Phage Vectors for Gene Cloning
and Analysis in Streptomyces. Methods in
Enzymology, 153, 116-166.
5.6
C. Ilgen, P.J. Farabaugh, A. Hinnen, J.M. Walsh,
G.-R. Fink. 1979. Transformation of Yeast. In
J. K. Setlow and A. Hollander (eds.). Genetic En-
gineering, vol.l, pp. 117 132. Plenum, New York.
D. T. Stinchcomb, K. Struhl, R. W. Davis. 1979. Isolation
and Characterization of a Yeast Chromosomal
Replicator. Nature, 282, 39-43.
L. Clarke, J. Carbon. 1980. Isolation of a Yeast Centro-
mere and Construction of Functional Small Circular
Chromosomes. Nature, 287, 504-509.
J.R. Broach. 1982. The Yeast Plasmid 2ц Circle. Cell,
28, 203-204.
R.J. Rothstein. 1983. One-step Gene Disruption in
Yeast. Methods in Enzymology, 101, 202-211.
K. Struhl. 1983. The New Yeast Genetics. Nature, 305,
391.
R. K. Mortimer, D. Schild. 1985. Genetic Map of Sac-
charomyces cerevisiae, Edition 9. Microbiol. Rev., 49.
181-213.
J. Campbell. 1988. Eukaryotic DNA Replication: Yeast
Bares its ARSs. Trends Biochem. Sci., 13, 212-217.
5.7
S. P. GofJ, P. Berg. 1976. Construction of Hybrid Viruses
Containing SV40 and X Phage DNA Segments and
Their Propagation in Cultured Monkey Cells. Cell,
9, 695-705.
C. Shih. B.-Z. Shilo, M. P. Goldfarb. A. Danenberg,
R.A. Weinberg. 1979. Passage of Phenotypes of
Chemically Transformed Cells via Transfection of
DNA and Chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
76, 5714-5718.
D. H. Hamer. 1980. DNA Cloning in Mammalian Cells
with SV40 Vectors. In J.K. Setlow, A. Hollaender
(eds.), Genetic Engineering, vol. 2, pp. 83-101.
Plenum, New York.
R. C. Mulligan, P. Berg. 1980. Simian Virus 40 Mediated
Expression of a Bacterial Gene in Mammalian Cells.
Science, 209, 1422- 1427.
A. Pellicer, D. Robins, B. Wold, R. Sweet, J. Jackson,
I. Lowy, J. M. Roberts, G. K. Sim, S. Silverstein,
R. Axel. 1980. Altering Genotype and Phenotype
by DNA-mediated Gene Transfer. Science, 209,
1414-1422.
R. C. Mulligan. P. Berg. 1981. Selection for Animal Cells
That Express the E.coli Gene Coding for Xanthine-
Guanine Phosphoribosyl Transferase. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 78, 2072-2076.
В. H. Howard. 1983. Vectors for Introducing Genes into
Cells of Higher Eukaryotes. Trends Biochem. Sci., 8,
209-212.
C.L. Серко, B.E. Roberts, R C. Mulligan. 1984. Con-
struction and Applications of a Highly Transmissible
Murine Retro virus Shuttle Vector. Cell, 37,
1053- 1062.
J. Yates, N. Warren, D. Reisman, B. Sugden. 1984. A
cis-Acting Element from Epstein-Barr Viral
Genome That Permits Stable Replication of
Recombinant Plasmids in Latently Infected Cells.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3806-3810.
H. M. Temin. 1986. Retrovirus Vectors for Gene Trans-
fer: Efficient Integration into and Expression of
Exogenous DNA in Vertebrate Cell Genomes. In:
ЛИТЕРАТУРА
367
R. Kucherlapati (ed.), Gene Transfer, pp. 149-158.
Plenum, New York.
D. DiMaio. 1987. Papillomavirus Cloning Vectors. In:
N. P. Salzman and P. M. Howley (eds.). The Papo-
vaviridae, vol. 2. The Papillomaviruses, pp. 293- 320.
Plenum, New York.
С. Серко. 1988. Retrovirus Vectors and Their Appli-
cation in Neurobiology. Neuron., 1, 345-353.
5.8
M. W. Bevan, M.-D. Chilton. 1982. T-DNA of the Agro-
bacterium TI and RI Plasmids. Annu. Rev. Genet.,
16, 357-384.
M.-D. Chilton. 1983. A Vector for Introducing New
Genes into Plants. Sci. American, 249, 50-60.
P. Zambryski, H. M. Goodman, M. Van Montagu, J. Schell.
1983. Agrobacterium Tumor Induction. In: J. A. Sha-
piro (ed.). Mobile Genetic Elements, pp. 505-535.
Academic Press, New York.
R. B. Horsch, J. E. Fry, N. L. Hoffman, D. Eichholtz,
S. G. Rogers, R. T. Fraley. 1985. A Simple and Ge-
neral Method for Tansferring Genes into Plants.
Science, 227, 1229-1231.
R. Deblaere, A. Reynaerts, H. Hofte, J.-P. Hernalsteens,
J. Leemans, M. Van Montagu. 1987. Vectors for
Cloning in Plant Cells. Methods in Enzymology,
153, 277-292.
M. Fromm, J. Callis. L.P. Taylor, V. Walbott. 1987.
Electroporation of DNA and RNA into Plant Pro-
toplasts. Methods in Enzymology, 153, 351-366.
A. Weissbach, H. Weissbach (eds.). 1988. Methods for
Plant Molecular Biology. Academic Press. Or-
lando.
P. Zambryski, J. Tempe, J. Schell. 1989. Transfer and
Function of T-DNA Genes from Agrobacterium Ti
and Ri Plasmids in Plants. Cell, 56, 193—201.
6.1
E.M. Southern. 1974. Detection of Specific Sequences
Among DNA Fragments Separated by Gel Electro-
phoresis. J. Mol. Biol., 98, 503-517.
H. Okayama, P. Berg. 1982. High Efficiency Cloning of
Full Length cDNA. Mol. Cell. Biol., 2, 161- 170.
V. Pirotta. 1984. Chromosome Microdissection and
Microcloning. Trends Biochem. Sci., 9, 220-221.
M.H. Caruthers. 1985. Gene Synthesis Machines: DNA
Chemistry and Its Uses. Science, 230, 281 285.
R. Wu, L. Grossman (eds.). 1987. Chemical Synthesis and
Analysis of Oligodeoxynucleotides. Methods in En-
zymology, 154, 221-326.
6.4
M. Grunstein. D. S. Hogness. 1975. Colony Hybridiza-
tion: A Method for the Isolation of Cloned DNAs
That Contain a Specific Gene. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 72, 3961-3965.
R. A. Kramer, J. R. Cameron, R. W. Davis. 1976. Isola-
tion of Bacteriophage X Containing Yeast Ribo-
somal RNA Genes: Screening by in situ RNA
Hybridization to Plaques. Cell, 8, 227-232.
W.D. Benton, R. W. Davis. 1977. Screening Xgt Recom-
binant Clones by Hybridization to Single Plaques in
situ. Science, 196, 180- 182.
B.M. Paterson, B.E. Roberts, E.L. Kuff. 1977. Structu-
ral Gene Identification and Mapping by DNA-
mRNA Hybryd-Arrested Cell-Free Translation.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 4370-4374.
M. Grunstein, J. Wallis. 1979. Colony Hybridization.
Methods in Enzymology, 68, 379-389.
R. Wu (ed.). 1979. Screening and Selection of Cloned
cDNA. Methods in Enzymology, 68, 389-454.
R. A. Young, R. W. Davis. 1983. Efficient Isolation of
Genes Using Antibody Probes. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 80, 1194-1198.
6.5
T. Maniatis, R. C. Hardison, E. Lacy, J. Lauer, C. O'Con-
nell, D. Quon, G.K.Sim, A. Efstratiadis. 1978. The
Isolation of Structural Genes from Libraries of
Eucaryotic DNA. Cell, 15, 687-701.
A. Efstratiadis, L. Villa-Komaroff. 1979. Cloning of
Double-Stranded cDNA. In: J. К Setlow and A. Hol-
laender (eds.). Genetic Engineering, vol. 1,
pp. 15-36. Plenum, New York.
T. D. Sargent, I. B. Dawid. 1983. Differential Gene
Expression in the Gastrula of Xenopus laevis.
Science, 222, 135-139.
G. F. Carle, M. V. Olson. 1984. Separation of Chromo-
somal DNA Molecules from Yeast by Ortho-
gonal-Field-Alter nation Gel Electrophoresis.
Nucleic Acids Res, 12, 5647-5664.
D.C. Schwartz, C.R. Cantor. 1984. Separation of Yeast
Chromosome-Sized DNAs by Pulsed Field Gradient
Gel Electrophoresis. Cell, 37, 67-75.
G. Chu, D. Vollrath, R. W. Davis. 1986. Separation of
Large DNA Molecules by Contour-Clamped Ho-
mogeneous Electric Fields. Science, 234, 1582-1585.
R. Wu. L. Grossman (eds.). 1987. cDNA Cloning.
Methods in Enzymology, 154, 3-83.
6.6
E. M. Tobin, J. Silverthorne. 1985. Light Regulation of
Gene Expression in Higher Plants. Annu. Rev. Plant
Physiol., 36, 596-593.
R.J. Konopka. 1987. Genetics of Biological Rhythms in
Drosophila. Annu. Rev. Genet., 21, 227 236.
M. Heisenberg. 1988. Designing Heat-Shock Clocks.
Nature, 333, 19- 20.
7.1
M. Thomas, R.L. White, R.W. Davis. 1976. Hybridiza-
tion of RNA to Double-Stranded DNA: Formation
368
ЧАСТЬ II. ТРИУМФ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
of R Loops. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73,
2294-2298.
R. L. White, D.S. Hogness. 1977. R Loop Mapping of the
18S and 28S Sequences in the Long and Short
Repeating Units of Drosophila melanogaster rDNA.
Cell, 10, 177-192.
L. Grossman, K. Moldave (eds.). 1980. Determination of
Fragment Ordering. Methods in Enzymology, 65,
429-494.
R.C. Parker. 1980. Determination of DNA Fragment
Sizes. Methods in Enzymology, 65, 415-426.
M.M. Gottesman (ed.). 1987. Methods in Enzymology,
151.
R. Wu (ed.). 1987. Methods in Enzymology, 155.
7.2
A. M. Maxam, W. Gilbert. 1977. A New Method for
Sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74,
560-564.
F. Sanger, S. Nicklen, A. R. Coulsen. 1977. DNA Se-
quencing with Chain-Terminating Inhibitors. Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467.
F. Sanger. 1980. Determination of Nucleotide Sequences
in DNA. Nobel Lecture, December 8. Bioscience
Reports, 1, 3-18.
G.M. Church, W. Gilbert. 1984. Genomic Sequencing.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1991-1995.
К. B. Millis, F.A. Faloona. 1987. Specific Synthesis of
DNA in vitro via a Polymerase-Catalyzed Chain
Reaction. Methods in Enzymology, 155, 335-350.
L. M. Smith, R. J. Kaiser, J. Z. Sanders, L. E. Hood.
1987. The Synthesis and Use of Fluorescent Oligo-
nucleotides in DNA Sequence Analysis. Methods in
Enzymology, 155, 260-301.
D.R.Engelke, P.A.Hoener, F.S. Collins. 1988. Direct
Sequencing of Enzymatically Amplified Human
Genomic DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85,
544-548.
R.J. Saiki, D.H. Gelfand, S. Stoffel, S.J. Scharff, R. Hi-
guchi, G.T. Horn, K.B. Mullis, H. A. Erlich. 1988.
Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA
with a Thermostable DNA Polymerase. Science, 239,
487-491.
7.3
T.R. Ginger as, R.J. Roberts. 1980. Steps Toward Com-
puter Analysis of Nucleatide Sequences. Science, 209,
1322-1328.
C. L. Queen, L.J. Korn. 1980. Computer Analysis of
Nucleic Acids and Proteins. Methods in Enzymo-
logy, 65, 595-609.
D. Soil, R.J. Roberts (eds.). 1984. The Applications of
Computers to Research. Nucleic Acids, part I and II.
IRL Press, Oxford, England.
M.J. Bishop, C.J. Rawlings. 1987. Nucleic Acid and
Protein Sequence Analysis: A Practical Approach.
IRL Press, Oxford, England.
R. F. Doolittle. 1987. Of URFS and ORFS: A Primer on
How to Analyze Derived Amino Acid Sequences.
University Science Books, Mill Valley, California.
G. von Heijne. 1987. Sequence Analysis in Molecular
Biology: Treasure Trove or Trivial Pursuit? Aca-
demic Press, New York.
C. DiLisi. 1988. Computers in Molecular Biology:
Current Applications and Emerging Trends. Science,
240, 47-52.
Nucleic Acids Research 16(5A) 1988, весь выпуск.
7.4
M.E. Harper. G. F. Saunders. 1981. Localization of
Single Copy DNA Sequences on G-Banded Human
Chromosomes by in situ Hybridization. Chromo-
soma, 83, 431-439.
F. H. Ruddle. 1982. A New Era in Mammalian Gene
Mapping: Somatic Cell Genetics and Recombinant
DNA Methodologies. Nature, 294, 115-119.
P. D'Eustachio, F. H. Ruddle. 1983. Somatic Cell Gene-
tics and Gene Families. Science, 220, 919-928.
F. M. Rosenburg, Y.-S. Ho, A. Shatzman. 1983. Methods
in Enzymology, 101, 123.
7.5
J. G. Wetmur, N. Davidson. 1968. Kinetics of Renatu-
ration of DNA. J. Mol. Biol., 31, 349-370.
S. S. Longacre, B. Mach. 1979. A Precise Quantitation of
Gene Number by Saturation Hybridization Using
Cloned DNA. Nucleic Acids Res., 6, 1241-1258.
7.6
E. Melgar, D. A. Goldthwait. 1968. Deoxyribonucleic
Acid Nucleases II. The Effects of Metals on the
Mechanism of Action of Deoxyribonuclease I. J.
Biol. Chem., 243, 4409-4416.
T.E. Shenk, J. Carbon, P. Berg. 1976. Construction and
Analysis of Viable Deletion Mutants of Simian Virus
40. J. Virology, 18, 664-671.
C. A. Hutchison III, S. Phillips, M. H. Edgell, S. Gillam,
P. Jahnke, M. Smith. 1978. Mutagenesis at a Specific
Position in a DNA Sequence. J. Biol. Chem., 253,
6551-6560.
R.M. Myers, L.S. Lerman, T. Maniatis. 1985. A General
Method for Saturation Mutagenesis of Cloned DNA
Fragments. Science, 229, 242-247.
D. Shor tie, D. Botstein. 1985. Strategies and Application
of in vitro Mutagenesis. Science, 229, 1193-1201.
M. Smith. 1985. In vitro Mutagenesis. Annu. Rev. Genet.
19, 423-462.
R. Wu, L. Grossman (eds.). 1987. Site-Specific Muta-
genesis and Protein Engineering. Methods in Enzy-
mology, 154, 329-533.
ЛИТЕРАТУРА
369
7.7
A. J. Berk, Р. A. Sharp. 1978. Structure of the Adeno-
virus 2 Early mRNAs. Cell, 14, 695-711.
D. R. Parks, V. M. Bryan, V. T. Oi, L. A. Herzenberg.
1979. Antigen-Specific Identification and Cloning of
Hybridomas with a Fluorescence-Activated Cell
Sorter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1962-1966.
J. B. Gurdon, M.P. Wickens. 1983. The Use of Xenopus
Oocytes for the Expression of Cloned Genes. Met-
hods in Enzymology, 101, 370-386.
P. Kavathas, V. P. Sukhatme, L. A. Herzenberg, J. R. Par-
ties. 1984. [solation of the Gene Encoding the
Human T-Lymphocyte Differentiation Antigen Leu-
2(T8) by Gene Transfer and cDNA Subtraction.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7688-7692.
7.8
W. Gilbert, L. Villa Komaroff. 1980. Useful Proteins
from Recombinant Bacteria. Sci. American, 243,
74- 95.
R. Wu, L. Grossman (eds.). 1987. Expression Vectors.
Methods in Enzymology, 153, 385-563.
7.9
H. A. Erlich, D. H. Gelfand, R. K. Saiki, 1988. Specific
DNA Amplification. Nature, 331, 461-462.
M. A. Frohman, M. K. Dush, G. R. Martin. 1988. Rapid
Production of Full-Length cDNAs from Rare
Transcripts: Amplification Using a Single Gene-
Specific Oligonucleotide Primer. Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 85, 8998 9002.
H. Li., U. B. Gyllensten, X. Cui, R. K. Saiki, H. A. Erlich,
N. Arnheim. 1988. Amplification and Analysis of
DNA Sequences in Single Human Sperm and
Diploid Cells. Nature, 335, 414-417.
N. Gautam, M. Baetscher, R. Aebersold, M.I. Simon.
1989. A G Protein Gamma Subunit Shares Homo-
logy with ras Proteins. Science, 244, 971-974.
E. Y. Loh, J. F. Elliott, S. Cwirla, L. L. Lanier. M. M. Da-
vis. 1989. Polymerase Chain Reaction with a
Single- Sided Specificity: Analysis of T Cell Receptor
6 Chain. Science, 243, 217-220.
Оглавление
От редактора перевода. . . . . 5
Предисловие.............................. 6
Благодарности .... . . . 10
Часть I. Молекулярные основы
наследственности: обзор
Введение............................ . 11
Хромосомы........................ 16
Клеточный цикл . . 16
Мейоз и образование гамет . .18
Строение хромосом............. 18
Наследование одиночных признаков 23
Независимая сегрегация и независи-
мое комбинирование . . 25
Связь между генами и хромосомами 25
Рекомбинация ..................... 25
Связь между генами и белками . . 26
Гены и ДНК............................27
Генетика-молекулярная наука .... 30
Перенос генетической информации в
клетке ... ........... 31
Структура и сохранение геномной
ДНК.............................. .32
Экспрессия и регуляция генов . 33
Глава 1. Молекулы генетического аппарата 38
1.1. Структура и поведение ДНК ... 39
а. Компоненты молекулы ДНК и
соединяющие их химические связи 39
б. Спиральная структура ДНК . . 41
в. Альтернативные формы двойной
спирали ДНК ... 42
г. Размер молекул ДНК .... 44
д. Разнообразие форм ДНК ... 44
е. Денатурация и ренатурация ДНК 47
ж. Упаковка ДНК в хромосомах 49
1.2. Структура и поведение РНК . . . 52
а. Типы РНК и их распространенность 52
б. Компоненты молекулы РНК и
соединяющие их химические связи 52
в. Структура РНК................. 52
г. Денатурация и ренатурация РНК 54
д. Гибридные спирали ДНК-РНК 54
1.3. Структура белков................ 56
а. Компоненты белков и соединя-
ющие их химические связи ... 56
б. Размер и форма белков .... 58
в. Чем определяется конформация
белка............................ 59
Глава 2. Репликация, сохранение и моди-
фикация генома...................... 67
2.1. Репликация ДНК ................. 67
а. Матричная функция ДНК при
репликации ...................... 67
б. Репликация начинается в опреде-
ленных точках.................... 68
в. Репликация ДНК полуконсерва-
тивна ........................... 72
г. Комплементарное копирование
оснований, перенос дезоксинук-
леотидов и лигирование ДНК
при репликации................... 74
д. Ключевые ферменты, участву-
ющие в синтезе ДНК .... 78
е. Для репликации необходимо рас-
кручивание спирали............... 82
ж. Инициация образования новых
цепей ДНК и их рост в репли-
кативных вилках .... 86
з. Терминация репликации ДНК и
расхождение дочерних спиралей 92
2.2. Репликация РНК с образованием
ДНК............................ 93
а. Репликация геномов ретровирусов 93
б. Некоторые ДНК-содержащие ви-
русы используют для репликации
обратную транскрипцию .... 97
2.3. Репарация ДНК................... 97
а. Репарация путем прямого восста-
новления исходной структуры 99
б. Репарация путем замены модифи-
цированных остатков .... 100
в. Значение репарации ДНК . 102
2.4. Рекомбинация ДНК................103
ОГЛАВЛЕНИЕ
371
а. Типы рекомбинации.............104
б. Общая рекомбинация между го-
мологичными молекулами ДНК 105
в. Ферменты, участвующие в общей
рекомбинации.....................108
г. Сайт-специфическая рекомбинация ПО
2.5. Репликация. 111
Глава 3. Аппарат экспрессии генов и его логика 115
3.1. Основные положения процесса экс-
прессии генов....................... 115
а. Транскрипция ДНК в РНК . . . 115
б. Соответствие между нуклеотид-
ными триплетами и аминокисло-
тами ............................ 116
в. Расшифровка кода с помощью
тРНК. ..........116
г. Правильная инициация трансляции 116
д. Трансляция кодонов и соединение
аминокислот ..... 117
е. Регуляция экспрессии генов на
разных этапах образования РНК
и белка......................... 117
3.2. Транскрипция: передача информации
о нуклеотидной последовательности
ДНК на уровень РНК...................117
а. Синтез РНК на ДНК-матрице . 118
б.-ДНК-зависимые РНК-полимеразы 121
в. Транскрипция инициируется в осо-
бых нуклеотидных последователь-
ностях , . . 123
г. Терминация транскрипции и отде-
ление цепей РНК .... 125
3.3. Процессинг РНК у прокариот . . . 127
а. Группы генов, кодирующих рРНК
и тРНК.........................127
б. Разрезание рРНК тРНК-котран-
скриптов.........................128
в. Образование зрелых тРНК из бо-
лее крупных транскриптов . 128
3.4. Генетический код ................130
а. Аминокислотная последователь-
ность белков соответствует ну-
клеотидной последовательности
кодирующих их генов . . . . 131
б. Соответствие между аминокисло-
тами и их кодонами...............132
в. Расшифровка генетического кода 132
г. Избыточность генетического кода 136
д. Универсальность генетического
кода.......................... 137
3.5. Аппарат трансляции.............. 138
а. Присоединение аминокислот к
«родственным» тРНК.............138
б. На рибосомах осуществляются
спаривание аминоацил-тРНК с
кодонами и сборка белковых це-
пей ............................ 142
3.6. Трансляция мРНК у прокариот 145
а. Условия инициации ..... 146
б. Элонгация полипептидной цепи 150
в. Терминация элонгации полипеп-
тидной цепи..................... 151
3.7. Некоторые общие особенности процес-
са трансляции.......................151
а. Одновременная трансляция моле-
кулы мРНК более чем одной ри-
босомой .........................152
б. Трансляция бактериальных мРНК
может осуществляться парал-
лельно транскрипции .... 152
в. Рибосомы начинают новый раунд
после трансляции кодирующей
последовательности 153
г. Взаимодействие кодона и антико-
дона .... .........153
3.8. Трансляция мРНК у эукариот ... 157
а. Особые модификации мРНК эука-
ри от ....... .159
б. Инициация трансляции на 5'-кэпи-
рованных концах малыми рибо-
сомными субчастицами ... 160
в. Элонгация и терминация полипеп-
тидной цепи . ......... 160
3.9. Ингибиторы транскрипции и транс-
ляции ....... 160
а. Ингибирование РНК-полимеразы 160
б. Ингибирование трансляции . . . 161
3.10. Судьба синтезированных белков 163
а. Посттрансляционная модифика-
ция полипептидных цепей . 163
б. Доставка эукариотических белков
к клеточным мембранам и про-
никновение через них............164
в. Транспорт белков в эукариотиче-
ские клеточные органеллы . . 170
г. Транспорт белков в клетках про-
кариот .........................172
3.11 .^Регуляция генной экспрессии . . 172
а. Регуляция содержания РНК в
процессе биосинтеза ... 172
б. Согласованная регуляция экс-
прессии прокариотических генов 173
в. Регуляция экспрессии лактозного
оперона ......... 174
г. Регуляция экспрессии триптофа-
нового оперона ...... 178
д. Временная регуляция генной экс-
прессии в жизненном цикле бак-
териофага X, . . . ... 181
ОГЛАВЛЕНИЕ
372
е. Трансляционная регуляция экс-
прессии некоторых генных про-
дуктов ........................185
Литература 189
Часть II. Триумф рекомбинантных
ДНК
Введение ..............195
Введение новой генетической информации
в клетки бактерий.....................196
Трансформация бактерий 196
Конъюгация ... .197
Трансдукция..................... .198
Принципы клонирования .... 202
Концепция рекомбинантной ДНК . 203
Важные открытия.......................204
Бактериальные плазмиды ... 204
Рестриктируюшие эндонуклеазы 207
Глава 4. Инструментарий: ферменты . . 211
4.1. Нуклеазы............... . 211
а. Общие свойства .................211
б. Нуклеазы, специфичные в отноше-
нии одноцепочечной ДНК . . 212
в. Нуклеаза Bal 31 213
г. РНКазы Н........................214
4.2. Эндонуклеазы рестрикции ... 214
а. Три типа эндонуклеаз рестрикции 214
б. Типичная рестриктирующая эндо-
нуклеаза типа II . . ... 215
в. Различные группы рестриктиру-
ющих эндонуклеаз типа II . . . 216
г. Картирование сегментов ДНК с
помощью рестриктирующих эн-
донуклеаз типа II . . . 218
д. Защита ДНК посредством мети-
лирования . . . . . . 218
4.3. Фосфомоноэстеразы............... 221
4.4. Полинуклеотидкиназа..............221
4.5. ДНК-лигаза . . . 222
4.6. ДНК-полимераза I . . . . 222
а. Полифункциональный фермент 222
б. Ник-трансляция..................222
в. Заполнение брешей ..... 223
4.7. РНК-зависимые ДНК-полимеразы
(обратные транскриптазы) .... 223
4.8. Терминальная дезоксинуклеотидил-
трансфераза ... . 224
а. Полимеризация без матрицы 224
б. Синтез липких концов............224
4.9. ро!у(А)-полимераза . 226
Глава 5. Инструментарий: системы хозяин-
вектор 227
5.1. Е. co/z-системы: клетки-хозяева . . . 228
а. Разносторонность хозяина . 228
б. «Гостеприимство» хозяина . . 228
в. Доступность хозяина . . 228
г. Некоторые примеры ... 229
5.2. Е. со/1-системы: плазмидные векторы 229
а. Модульная структура плазмид 229
б. Конструирование векторов для
отбора....................... 232
в. Плазмидный вектор pBR322 234
г. Другие векторы, используемые для
разных целей . . ... 236
5.3. Е. со/1-системы: фаговые векторы 237
а. Некоторые различия между плаз-
мидами и фаговыми векторами 237
б. Фаг X. . 238
в. Векторы, сконструированные на
основе фага X.................240
г. Упаковка Х-векторных молекул
в фаговые частицы...............241
д. Фаг М13 ... ... 242
е. Векторы, сконструированные на
основе фага М13.............. 243
5.4. Е. со//-системы: плазмидно-фаговые
векторы ............................246
а. Космиды......................246
б. Фазмиды ................... 247
5.5. Другие прокариотические системы
хозяин-вектор ..... 249
а. Грамотрицательные организмы 249
б. Грамположительные организмы 249
в. Челночные векторы .... 250
5.6. Эукариотические системы хозяин-
вектор: дрожжи ... . . 252
а. Универсальность и удобство 252
б. Векторы, способные реплициро-
ваться в клетках дрожжей . 252
в. Стабильная трансформация при
рекомбинации с дрожжевым ге-
номом ........................254
5.7. Эукариотические системы хозяин-
вектор: животные....................256
а. Трансформация клеток животных 256
б. Векторы на основе SV40 . . . 260
в. Векторы на основе вируса папил-
ломы крупного рогатого скота 265
г. Векторы на основе ретровирусов 267
5.8. Эукариотические системы хозяин-
вектор: растения................... 273
а. Общие положения .............273
б. Плазмида pTi-А, индуцирующая
образование опухолей . 273
в. Конструирование векторов реком-
бинантных ДНК с использова-
нием pTi ....... 275
ОГЛАВЛЕНИЕ
373
Глава 6. Средства: конструирование, кло-
нирование и отбор рекомбинант-
ных молекул ДНК................ 277
6.1. Вставки . ......................277
а. Общие положения...............277
б. Вставки геномной ДНК . . 277
в. Синтетические вставки . 280
г. Копирование РНК с образованием
ДНК...........................285
6.2. Лигирование вектора со вставкой 286
а. Соединение концов ... 286
б. Присоединение липких концов 289
6.3. Инфекция, трансфекция и клонирова-
ние .................................290
а. Перенос рекомбинантных молекул
из пробирки в клетку...........290
б. Клонирование 292
6.4. Скрининг клонированных популяций
рекомбинантных молекул . . 292
а. Обнаружение нужного клона 292
б. Отжиг с комплементарным поли-
нуклеотидом . 292
в. Определение экспрессии гена в
клетках . ......... 299
6.5. Библиотеки........... ... 302
а. Геномные библиотеки . 304
б. Библиотеки кДНК......... 304
6.6. Некоторые стратегии клонирования
генов и кДНК . 316
Глава 7. Продукты рекомбинации: характе-
ристика и манипулирование . 317
7.1. Макроструктура клонированной
вставки ............................ 317
а. Размер вставки................317
б. Картирование сайтов для рестрик-
тирующих эндонуклеаз 318
в. Субклонирование .... 318
г. Определение положения интере-
сующего нас сегмента во вставке 318
7.2. Тонкая структура клонированной
вставки: нуклеотидная последова-
тельность 319
а. Общие принципы 320
б. Химическое секвенирование . 321
в. Ферментативное секвенирование 324
7.3. Компьютерный анализ нуклеотидных
последовательностей ДНК .... 328
а. Хранение информации о первич-
ной структуре............... . 328
б. Структурный анализ............330
в. Биологическое значение .... 331
7.4. Определение положения клонирован-
ных сегментов в геномах..............333
а. Молекулярная локализация . . . 333
б. Хромосомная локализация . . . 334
в. Нестабильность при клонировании 338
7.5. Определение числа копий данной
последовательности в геноме . . 339
а. Оценка числа копий с помощью
гибридизации ДНК-ДНК . . 339
б. Оценка числа копий по кинетике
реассоциации ДНК . .... 339
в. Оценка числа копий с помощью
гибридизации в условиях насыще-
ния . . 342
7.6. Изменение клонированных сегмен-
тов: получение мутантов . . 343
а. Общие положения . . 343
б. Делеционные мутанты ... 343
в. Инсерционные мутанты . 344
г. Точечные мутации ..... 344
7.7. Изучение функций клонированных
сегментов ДНК ....... 348
а. Характеристика внутриклеточных
транскриптов, соответствующих
клонированным сегментам ДНК 349
б. Функциональное тестирование
клонированной ДНК 353
7.8. Синтез полипептидов, кодируемых
клонированными сегментами эука-
риотической ДНК . 354
а. Выбор системы экспрессии . 354
б. Экспрессирующие векторы, ис-
пользуемые в Е. coli.............356
в. Экспрессирующие векторы, ис-
пользуемые в клетках дрожжей 359
г. Экспрессирующие векторы, ис-
пользуемые в клетках животных 360
7.9. Ферментативная амплификация сег-
ментов ДНК и РНК................ 360
Литература .... ............ 364
Максин Сингер, Пол Берг
ГЕНЫ И ГЕНОМЫ
В 2-х томах
Том 1
Зав. редакцией канд. биол. наук М.Д. Гроздова
Ведущий редактор Н. Н. Шафрановская
Редактор В. И. Николаева
Художник В. П. Медников
Технический редактор Л. П. Бирюкова
Корректор В. И. Николаева
Лицензия ЛР № 010174 от 20.05.97 г.
Сдано в набор 11.04.95 г. Подписано к печати 3.03.98. Формат 84 х lOe’/ie-
Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура тайме. Объем 11,75 бум. л. Усл.
печ. л. 39,48. Усл. кр.-отт. 79,38. Уч. изд. л. 41,69. Изд. № 4/9020. Тираж 5000 экз.
Зак. № 243. С 031
Издательство «Мир» Государственного комитета Российской Федерации
по печати
129820, ГСП, Москва, И-110, 1-й Рижский пер., 2
ОАО «Можайский полиграфкомбинат»
143200, г. Можайск, ул. Мира, 93
9 785030 028491
(гиг журнала
Academy л
лучипэ Поеэиде»
!Я ь oGs’.acibfl на)
‘шея наградой.
‘нм лицам.
| орке. Окончил
Пснгипьеання В ’952 г
доктора философии
им* Прогснжип салю
I ч ft Институте ю нсмном
44 а. Копенгагене и д Университете
•из **. Се»гЛ*:& Затем nejJC’uen
IH уН Ц»1Ц/ тнТ. ГДА
яйЙепкеглемшшмк '*
' :