Text
                    BBieaertb
F.51
УДК 57«6 +3£^6
Рецензенты:
зав. кафедрой пищевой биотехноло-
гии Санкт-Петербургской государствен-
ной академии холода и пищевых техно-
логий, член-корресповдент академии хо-
лода, профессор Василинец И. М.
зав. кафедрой технологии микробио-
логического синтеза Санкт-Петербург-
ского государственного технологического
института, академик МАНЭБ Яковлев
В. И.
Блинов Н. П.
Е51	Основы биотехнологии. Д ля студентов институтов;
аспирантов и практических работников. Издательская
фирма "Наука” СПБ 1995 г.с., 600 стр. 166 ил.
ISBN 5-02-026027-4
Книга включает общую и специальную биотехнологии. В ней рассмотрены
объекты и методы, фундаментальные и прикладные аспекты микро-, фито- и
зообиотехнологии, приведены основные биотехнологические процессы получения
различных веществ с помощью микробных, растительных и животных клеток, дана
характеристика оборудования, используемого в конкретной биотехнологии, указа-
ны пути утилизации и обезвреживания плотных и жидких отходов в соответству-
ющих производствах.
ББК 30.16
ISBN 5-02-026027-4
© Издательская фирма "Наука" СПб 1995

Учителю и организатору первого в стране инженерно-микробиологи- ческого факультета при СПХФИ, з. д. н. РФ, лауреату Государствен- ной премии проф. Павлу Николаевичу Кашкину посвящаю свой труд. Автор
W Щ A ISI
ОГЛАВЛЕНИЕ Предисловие.................................................7 Введение....................................................9 Часть I. БИОТЕХНОЛОГИЯ — КАК НАУЧНАЯ ДИСЦИПЛИНА . . 11 ГЛАВА 1. Предмет, история развития, цели и задачи биотехнологии ... 11 ГЛАВА 2. Объекты и методы биотехнологии.....................22 2.1. Вирусы......................................25 2.1.1. Вироиды...................................26 2.2. Бактерии....................................27 2.3. Грибы.......................................32 2.4. Растения....................................36 2.4.1. Водоросли.................................36 2.4.2. Клетки высших растений....................37 2.5. Клетки животных •...........................38 Часть II. РОЛЬ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ В РАЗВИТИИ БИОТЕХНОЛОГИИ.....................................43 ГЛАВА 3. Фундаментальные исследования в области энзимологии ... 45 ГЛАВА 4. Фундаментальные исследования в области структурно- функциональной организации вирусов, клеток и тканей ... 79 4.1. Акариоты....................................79 4.2. Клетки прокариот............................86 4.3. Клетки эукариот............................. 106 4.4. Некоторые функциональные особенности клеток и клеточных систем........................ 138 ГЛАВА 5. Фундаментальные исследования в области генетики и молекулярной биологии вирусов, клеток и клеточных систем 155 5.1. Природа и передача генетической информации.. 157 5.2. Клонирование генов методами генетической инженерии; рДНК-биотехнология..................... 177 5.3. Изменчивость организмов и ее значение в биотехнологии...................................212 Часть III. ПРОЦЕССЫ И АППАРАТЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ .... 229 ГЛАВА 6. Процессы в биотехнологии...........................229 6.1. Взаимосвязь процессов и биообъектов.........233 6.2. Значение асептики в биотехнологических процессах . . 246 6.3. Борьба с микробами-контаминантами в биотехнологических производствах..........". . . 253 6.4. Биотехнологические процессы в связи с массообменом . 261 6.5. Биотехнологические процессы в связи с особенностями метаболизма клеток................269 6.6. Управление биотехнологическими процессами...275 6.7. Системы GLP и GMP в связи с качеством биотехнологических продуктов................ . . 283 ГЛАВА 7. Техническая вооруженность биотехнологических производств..........................................288 7.1. Аппаратурное оснащение микробиологических производств......................................297 7.2. Некоторые особенности культивирования биообъектов . 306 5
7.3. Тепловые процессы в ферментаторах . . . • 328 7.4. Аппаратурное оформление процессов выделения и очистки некоторых продуктов микробного синтеза . . • 331 7.5. Аппаратурное оснащение фитобиотехнологических производств....................................... 341 7.6. Аппаратурное оснащение зообиотехнологических производств....................................... 343 ГЛАВА 8. Отходы биотехнологических производств, их обезвреживание и утилизация............................ .... 349 8.1. Обезвреживание отходов биотехнологических производств........................................ 353 8.2. Утилизация отходов биотехнологических производств . . 366 Часть IV. СПЕЦИАЛЬНЫЕ БИОТЕХНОЛОГИИ......................................373 ГЛАВА 9. Микробиотехнология............................ . . 374 9.1. Принципы культивирования микроорганизмов . ... 378 9.2. Выделение конечных продуктов ферментации ... 386 9.3. Микробиотехнологические процессы .... ... 392 9.3.1. Получение продуктов брожения ................392 9.3.2. Получение органических кислот................411 9.3.3. Получение антимикробных веществ..............428 9.3.4. Получение аминокислот........................444 9.3.5. Получение витаминов .........................479 9.3.6. Получение микробных препаратов — удобрителей почв, стимуляторов и регуляторов роста растений.....................................455 9.3.7. Получение микробных полимеров ... 459 ГЛАВА 10. Фитобиотехнология ...................................489 10.1 Термины, используемые в фитобиотехнологии .....492 10.2. Вегетативное размножение растений методом культур тканей.....................................500 10.3. Культивирование клеток растений в глубинных условиях ..............................507 10.4. Использование методов генетической инженерии, или рДНК в фитобиотехнологии........................510 10.5. Получение биогаза и удобрений на основе использования растений............................. 520 10.6. Коллекционные центры сохранения генофонда растений............................................526 ГЛАВА 11. Зообиотехнология.....................................532 11.1. Способы выращивания клеток животных...........534 11.2. Эмбриональные и другие ткани для репродукции вирусов и получения вирусных препаратов............544 11.3. Получение инсектопатогенных вирусов в клеточных культурах...............................555 11.4. Интерфероны...................................556 11.5. Получение и использование гомо-, гетеро- и синкариотических гибридов ................562 11.6. Трансгенные животные......................... 581 11.7. Иммуномодуляторы..............................587 11.8. Коллекционные центры клеточных культур, их роль в сохранении генофонда животных организмов 597 Литература ..................................'.................599 6
ПРЕДИСЛОВИЕ Первоначальный вариант этой книги был утвержден Госкомоб- разованией СССР как учебник для студентов, изучающих биотех- нологические производства на соответствующих факультетах вы- сших учебных заведений. Его структура сохранена в прежнем виде. Весь материал книги подразделен на четыре части. В первой из них рассмотрены предмет, история развития, цели и задачи био- технологии; объекты и методы биотехнологии; во второй — роль фундаментальных исследований в развитии биотехнологии; в третьей - процессы и аппараты в биотехнологии; техническая вооруженность биотехнологических производств; отходы биотех- нологических производств, их обезвреживание и утилизация. В четвертой части представлено основное содержание микробиотех- нологии, фитобиотехнологии и зообиотехнологии. В основу книги положен курс лекций, читаемый автором студентам биотехнологического факультета Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института в течение последних 8 лет по утвержденной программе. За это время издан ряд монографи- ческих работ и пособий биотехнологической направленности, од- нако до сих пор не опубликован учебник, в котором были бы объединены микро-, фито- и зообиотехнологии. Первая попытка такого рода всегда сопряжена с возможными недочетами и несо- вершенством, поэтому все критические и конструктивные замеча- ния будут приняты нами с признательностью. В подготовке 7-й главы учебника активное участие приняли доценты Р. М. Бакаева и Н. А. Силуянова. При окончательном оформлении книги учтены пожелания и рекомендации профессо- ров, доцентов и ассистентов СПХФИ в составе: проф. Г. А. Битовской, проф. Н. А. Заикиной, доц. В. К. Грековой, доц. М.А. Кашкиной, доц. Ю. Б. Марюхта, доц. И. П. Соколовой, к. б. н. асе. С. В. Гуриной; в подготовке рукописи и иллюстративного материала большую помощь оказали С. В. Волобуева, С. Л. Воротынская, А. О. Григорянц, Н. Н. Блинова, А. В. Караваева, О. А. Кудряшова, Н. В. Разукрантова, М. А Савинова, О. М. Тихомирова, Л. Г. Федорова, В. В. Южанина. Всем названным лицам выражаю свою искреннюю благодарность. Автор также признателен рецензентам проф. И. М. Василинецу и проф. В. И. Яковлеву. Издание учебника было бы просто невозможным без велико- душной спонсорской поддержки директора АП "Новая Заря" Юрия Федоровича Назарова, чье понимание социальных задач и вера в 7
успех подготовки молодых кадров инженеров-биотехнологов в России по новейшим направлениям развития науки и техники явились основным побудительным мотивом содействовать нашим усилиям. Публикация книги в настоящем виде осуществлена в сжатые сроки благодаря умелой организации и благосклонности генераль- ного директора акционерного объединения "Роспечать" Белгород- ской области Виктора Васильевича Гончарова, директора Белго- родской областной типографии Галины Николаевны Левиной, технического редактора Валентины Степановны Просековой, кор- ректора Светланы Сергеевны Кухаревой. 7 Заслуженный деятель науки России, академик СПбИА, проф. Н. П. Блинов— 8
ВВЕДЕНИЕ Современный уровень развития биотехнологии обусловлен общим прогрессом науки и техники, особенно — в течение послед- них 50 лет. Достаточно отметить лишь такие события, как установ- ление структуры и функций нуклеиновых кислот, обнаружение ферментов рестрикции ДНК и выявление их значения в жизни клеток с последующим использованием в генно-инженерных ра- ботах, создание гибридом и получение моноклональных антител, внедрение ЭВМ и компьютерной техники в биотехнологические процессы и т. д. Изучение биотехнологии невозможно без знания основ хими- ческих дисциплин и, прежде всего, органической, биологической и коллоидной химии, ряда биологических дисциплин (общей био- логии, микробиологии, ботаники, генетики, иммунологии, эколо- гии), а также процессов и аппаратов химической и биологической технологии и ряда других общеинженерных дисциплин. Биотехнологию относят к числу приоритетных наук, где можно прогнозировать более быстрые и важнейшие достижения для социально-экономического прогресса общества. Ведущее положение в области внедрения биотехнологических разработок ныне занимают США, где к концу 80-х. годов биотех- нологическими проблемами было занято 349 компаний, включая 296 — чисто биотехнологических, расходовавших на эти цели, например, в 1987 г. 1 млрд. 200 млн. долларов. Среди них можно назвать Genentech Inc., Alza corp., Amgen Inc., Cetus corp., Biogen, Ceptocor Inc., Chiron corp., Xoma corp., Immunex corp., DNA Plant Technology, Celgene corp., Damon Biotech Inc., и др. При этом области исследования включали: создание лекарств и диагности- ческих средств (467 млн. долларов), специальных химических соединений (144 млн. долларов); животноводство и растениеводст- во (168 млн. долларов); оборудование (48 млн. долларов) и т. д. Food and Drug Administration (FDA) в 1982 г. одобрила и разрешила применение первого биотехнологического продукта — генно-инженерного инсулина; в последующие годы было разреше- но применять еще 8 биотехнологических препаратов: два варианта гормона роста человека, два варианта 2а-интерферона для лечения волосатоклеточной лейкемии, активатор тканевого плазминогена (ТРА) для лечения тромбоза коронарных сосудов, вакцину против гепатита В, фактор VIII для лечения гемофилии, мышиные моно- клональные антитела для предупреждения отторжения почечных трансплантатов. 9
К 1988 г. в США свыше 80 лекарственных веществ и вакцин были объектами биотехнологических разработок, 14 из которых были представлены на утверждение в FDA: тромболитические агенты; ферменты дисмутазы, предупреждающие клеточные по- вреждения, наступающие при реперфузии гипоксических тканей; гормон эритропоэтин, стимулирующий эритропоэз; эпидермаль- ный ростовой фактор для ускоренного заживления ран; монокло- нальные антитела для трансплантации костного мозга, лечения септического шока, рака и патологических состояний от передо- зировок лекарств и др. (к 1988 г. было одобрено 300 наборов моноклональных антител). К 1995 г. стоимость поступающих на рынок только моноклональных антител прогнозировалась в 6,4 биллиона долларов. Из научных учреждений России ведущее место по биотехно- логии занимает институт биохимии и физиологии микроорганиз- мов РАН (ИБФМ), сотрудники которого, например, совместно с учеными научно-исследовательского вычислительного центра (НИВЦ) в 1985 г. создали автоматизированный комплекс "Фермен- тер-ЭВМ", что обеспечивает возрастание эффективности управле- ния процессом биосинтеза; существенный вклад в решение био- технологических проблем в России внесли коллективы ВНИИ "Синтез-белок”, ВНИИ биотехнологии, ВНИИА, Сибирское отде- ление РАН, институт молекулярной биологии РАН, институт гене- тики и селекции промышленных микроорганизмов и др. В России давно и хорошо известны предприятия, выпускающие биотехнологическую продукцию (антибиотики, ферменты, различ- ные дрожжи и т. д.). Это же можно сказать и о предприятиях в странах СНГ. Основной вклад в подготовку кадров инженеров-биотехнологов с 1945 г. вносил и продолжает вносить Санкт-Петербургский химико-фармацевтический институт; с начала 80-х годов подготов- ка таких специалистов была расширена за счет открытия новых биотехнологических отделений и факультетов в других вузах страны. Сегодня изучение биотехнологии является "велением вре- мени” для высших и средних специальных учебных заведений, в которых подготавливаются молодые специалисты для соответству- ющих отраслей производства. Объем и программы курсов могут варьировать в зависимости от профилизации учебного заведения. В настоящем издании, по возможности, затронуты все основные аспекты биотехнологии, и поэтому эта книга может быть исполь- зована также и сотрудниками учреждений, призванных выпускать биотехнологическую продукцию. ю
Часть I Биотехнология — как научная дисциплина Глава 1 ПРЕДМЕТ, ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ, ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ БИОТЕХНОЛОГИИ Биотехнология — это наука об использовании биологических процессов в технике и промышленном производстве. Название ее происходит от греческих слов bios — жизнь, teken — искусство, logos — слово, учение, наука. К числу биологических процессов п
относят те из них, в которых применяют биологические объекты различной природы (микробной, растительной или животной), например, производство ряда продуктов медицинского, пищевого и другого назначения — антибиотики, вакцины, ферменты, кор- мовой и пищевой белки, полисахариды, гормоны, гликозиды, ами- нокислоты, алкалоиды, биогаз, удобрения и пр. В соответствии с определением Европейской Федерации Био- технологов (ЕФБ, 1984) биотехнология базируется на интегральном использовании биохимии, микробиологии и инженерных наук в целях промышленной реализации способностей микроорганизмов, культур клеток тканей и их частей. Уже в самом определении предмета отражено его местоположение как пограничного, благо- даря чему результаты фундаментальных исследований в области биологических, химических и технических дисциплин приобрета- ют выраженно прикладное значение. Биотехнология непосредст- венно связана с общей биологией, микробиологией, ботаникой, зоологией, анатомией и физиологией, биологической, органиче- ской, физической и коллоидной химией, иммунологией, биоинже- нерией, электроникой, технологией лекарств, генетикой и другими научными дисциплинами. Человек, рождающийся для познания мира (в том числе — и самого себя), давным-давно освоил на практике различные процес- сы биотехнологии, не зная по существу, что они относились к такому разряду. В самом деле, с библейских времен известно виноделие, тысячелетия насчитывает хлебопечение и т. д. Познавательная деятельность людей непосредственно сказыва- лась на уровне социального развития общества. Недаром вторую половину XX столетия мы называем периодом научно-технической революции. Наука сегодня имеет огромное значение в жизни людей, и научный подход к решению любой задачи — веление и требование времени. Наука формировалась и эволюционировала по мере формиро- вания и развития человеческого общества. Это, в частности, не- посредственно относится и к биотехнологии. Ее возникновение, становление и развитие условно можно подразделить на 4 периода: эмпирический, этиологический, биотехнический и генотехниче- ский. Эмпирический (от греч. empeirikos — опытный) или доисто- рический период — самый длительный, охватывающий примерно 8000 лет, из которых более 6000 лет — до' нашей эры и около 2000 лет — нашей эры. Древние народы того времени интуитивно использовали приемы и способы изготовления хлеба, пива и 12
некоторых других продуктов, которые теперь мы относим к раз- ряду биотехнологических. Кризис охотничьего промысла (хозяй- ства) стал побудительным мотивом революции в изготовлении продуктов питания. Эта революция началась около 8000 лет назад и привела к изобретению техники земледелия — началу произво- дительного ведения хозяйства (неолит и бронзовый века.) Стали формироваться так называемые приречные цивилизации Месопо- тамии, Египта, Индии и Китая. Шумеры — первые жители Месо- потамии (на территории современного Ирака) создали цветущую в те времена цивилизацию. Они выпекали хлеб из кислого теста, владели искусством готовить пиво. В этом следовали им ассирийцы и вавилоняне, жившие также в Месопотамии, египтяне и древние индусы. В течение нескольких тысячелетий известен уксус, издрев- ле приготавливавшийся в домашних условиях, хоуя о микробах — индукторах этого процесса мир узнал в 1868 г. благодаря работам Пастера, и это несмотря на существование с XIV в. так называемого "Орлеанского способа" приготовления уксуса; первая дистилляция вина осуществлена в XII в.; водку из хлебных злаков получили в XVI в.; шампанское известно с XVIII в., но получение почти абсолютного этанола впервые удалось в XIV в. испанцу Раймунду Луллию (ок. 1235 — 1315) благодаря перегонке вина с негашеной известью. В те древние времена продукты питания растительного и животного происхождения использовались не только в пищу, но и для лечебных целей. Например, в ассирийской столице Ниневии (8 — 7 века до н. э.) была царская библиотека, насчитывавшая более 30 000 клинописных табличек, из которых в 33 имелись сведения о лекарственных средствах и их рецептуре, и в самом городе размещался сад лекарственных растений. тому же эмпирическому периоду относятся: получение кис- ломолочных продуктов, квашеной капусты, медовых алкогольных напитков, силосование кормов, мочка лубоволокнистых растений. Длительное накопление фактов происходило и в области ми- кологии (от греч. го у Kes — гриб). Сведения о грибах можно найти в писаных источниках древности, а Луций Лициний Лукулл (106 — 56 гг. до н. э.), славившийся богатством, роскошью и пирами ("лу- куллов пир”), предпочитал всем съедобным грибам кесарев гриб (Amanita cesarea, L.). Древние евреи хорошо знали ржавчину хлебных злаков и головню. В IV — I веках до н. э. были собраны интересные материалы о грибах, нашедшие отражение в работах Аристотеля, Диоскорида, Плиния Младшего, Теофраста. В после- 13
дующие века нашей эры микология стала самостоятельной наукой — велика роль в этом Д. Персоона и Э. М. Фриза, по праву считающихся отцами систематической микологии. Таким образом, народы исстари пользовались на практике микробиологическими процессами, ничего не зная о микробах. Эмпиризм также был характерен и в практике использования полезных растений и животных. Второй, этиологический (от греч. aitia — причина) период в развитии биотехнологии охватывает вторую половину XIX века и первую треть XX века (1856 — 1933 гг.). Он связан с выдающимися исследованиями великого французского ученого Луи Пастера (1822 — 1895) — основоположника научной микробиологии и ряда микробиологических дисциплин (промышленной, медицинской, химической, санитарной). С аналитической микробиологией не- посредственно связано открытие Пастером молекулярной ассимет- рии (стереоизомерии). Это, по существу, бриллиантовый век мик- робиологии. Пастер вскрыл микробную природу брожений, дока- зал возможность жизни в бескислородных условиях, эксперимен- тально опроверг ходячее тогда представление о самопроизвольном зарождении живых существ, создал научные основы вакцинопро- филактики и вакцинотерапии; предложил метод стерилизации, называемый по его имени пастеризацией и т. д. Немеркнущая слава Пастера не затмила имен его выдающихся учеников и сотрудников: Э. Дюкло, Э. Ру, Ш. Э. Шамберлана, Ж. А. Вильемена, И. И. Мечникова. В этот же период творили Р. Кох, Д. Листер, Ш. Китазато, Г. Т. Риккетс, Д. И. Ивановский, А. Лаверан и другие. Параллельно с Пастером трудился в Германии, а позднее — во Франции, выдающийся миколог А де Бари (1831 — 1888) — основоположник физиологической микологии. Изучив стадии раз- множения и историю индивидуального развития грибов (онтоге- нетический метод), с учетом их взаимоотношений с другими видами, а также цитологических и биологических особенностей, де Бари создал классификацию, которая и сегодня лежит в основе современных классификационных схем микро- и макромицетов. Де Бари — основоположник микофитопатологии — науки о грибных болезнях растений (от греч. fiton — растение, pathos — болезнь), под его руководством сформироваласьплеяда выдающих- ся ученых (в том числе — из России): Ф. М Бальфур, И. В. Баранецкий, М. Бейеринк, О. Брефельд, М. С. Воронин, А. Кох, А С. Фаминицин и др. 14
В биотехнологии важными являются питательные среды для культивирования ряда биообъектов. Уже Л. Пастер приготовил первую жидкую питательную среду в 1859 году, метод выращива- ния грибов на желатине предложил О. Брефельд в 1864 г., Ж. Ролен сообщил о жидких средах для выращивания нитчатых грибов в 1870 г., Р. Коху в 1876 г. удалось вырастить бациллы сибирской язвы в капле водянистой влаги, извлеченной из глаза погибшей коровы. В 80-е годы XIX столетия Р. Кох предложил метод культи- вирования бактерий на стерильных ломтиках картофеля и затем — на агаризованных питательных средах. В настоящее время, предлагая самые сложные и необычные в каком-либо отношении среды для выращивания биообъектов, мы опираемся на основополагающие результаты этих выдающихся ученых. Аналогичным образом можно сказать и о вариантах способов стерилизации питательных сред, имея в виду тиндализа- цию, кипячение, дробную стерилизацию и др. Все они основыва- лись на необходимости уничтожения посторонней микрофлоры, которая попадала в среды в процессе их изготовления. В ряду открытий всемирного значения стоит обнаружение в 1892 г. вируса мозаичной болезни табака Д. И. Ивановским (1864 — 1920). Последовавшие за этим обнаружения других вирусов обеспечили становление новой научной дисциплины — вирусоло- гии: Ф. Леффлер и П. Фрош в 1898 г. открыли вирус ящура, Д. Кэррол в 1901 г. — вирус желтой лихорадки, ф. Туорт в 1915 г. и Ф. д'Эрелльв 1917 г. — вирусы бактерий (бактериофаги). Большой вклад в вирусологию был внесен отечественными и зарубежными учеными — Л. А. Зильбером, А. А. Смородинцевым, М. П. Чума- ковым, А. Борелем, К. Левадити, К. Ландштейнером, В. Стэнли, П. Лейдлоу, П. Руа, П. Ф. Эндерсом и многими другими. Этиологический период знаменателен тем, что удалось доказать индивидуальность микробов и получить их в чистых культурах. Более того, каждый вид мог быть размножен на питательных средах и использован в целях воспроизведения соответствующих процес- сов (бродильных, окислительных и др.). Например, маслянокислые бактерии и вызываемое ими маслянокислое брожение, лактобак- терии и молочнокислое брожение, дрожжи — сахаромицеты и спиртовое брожение, уксуснокислые бактерии и окисление этано- ла до уксусной кислоты и т. д. В этот период было начато изготовление прессованных пищевых дрожжей, а также некото- рых продуктов обмена (метаболизма) — ацетона, бутанола, лимон- ной и молочной кислот; во Франции приступили к созданию 15
биоустановок для микробиологической очистки сточных вод. Знание причин биологических процессов еще не исключало нестерильные операции, хотя и стремились к использованию чистых культур микроорганизмов. Для всестороннего изучения морфолого-физиологических свойств и продуктов обмена, прежде всего, микробов все ранее предложенные способы их выращивания оказались малопригод- ными. Более того, накопление однородной по возрасту большой массы клеток оставалось исключительно трудоемким процессом. Вот почему требовался принципиально иной подход для решения многих задач в области биотехнологии. В 1933 году А. Клюйвер и Л. X. Ц. Перкин опубликовали работу "Методы изучения обмена веществ у плесневых грибов", в которой изложили основные технические приемы, а также подходы к оценке и интерпретации получаемых результатов при глубинном культивировании грибов. С этого времени начинается третий период в развитии биологи- ческой технологии — биотехнический. Началось внедрение в биотехнологию крупномасштабного герметизированного оборудо- вания, обеспечившего проведение процессов в стерильных усло- виях. Особенно мощный толчок в развитии промышленного био- технологического оборудования был отмечен в период становления и развития производства антибиотиков (время второй мировой войны 1939 — 1945 гг., когда возникла острая необходимость в противомикробных препаратах для лечения больных с инфициро- ванными ранами). Все прогрессивное в области биологических и технических дисциплин, достигнутое к тому времени, нашло свое отражение в биотехнологии. Следует отметить, что уже в 1869 г.. Ф. Мишер получил "нуклеин" (ДНК) из гнойных телец (лейкоци- тов); В. Оствальд в 1893 г. установил каталитическую функцию ферментов; Т. Леб в 1897 г. установил способность к выживанию вне организма (в пробирках с плазмой или сывороткой крови) клеток крови и соединительной ткани; Г. Хаберланд в 1902 г. показал возможность культивирования клеток различных тканей растений в простых питательных растворах; Ц. Нейберг В 1912 г. раскрыл механизм процессов брожения; Л Михаэлис и М. Л. Ментен в 1913 г. разработали кинетику ферментативных реакций, а А. Каррел усовершенствовал способ выращивания клеток тканей животных и человека и впервые применил экстракт эмбрионов для ускорения их роста; Г. А. Надсон и Г. С. Филлипов в 1925 г. доказали мутагенное действие рентгеновских лучей на дрожжи, а в 1937 г. Г. Кребс открыл цикл трикарбоновых кислот (ЦТК); в 1960 16
г. Ж. Барски и др. впервые обнаружили соматические гибриды опухолевых клеток мыши. Следовательно, накопленные научные факты стали побудительным мотивом для разработки способов крупномасштабного культивирования клеток различного проис- хождения. Это необходимо было д ля получения различных клеточ- ных продуктов и самих клеток для нужд человека, и, прежде всего, в качестве или в составе лечебных и профилактических средств: пенициллина, стрептомицина, тетрациклинов, декстрана, ряда ами- 1 нокислот и многих других веществ. К 1950 г. Ж. Моно (Франция) разработал теоретические основы непрерывного управляемого культивирования микробов; в 50-е годы вопросам практической реализации непрерывного культивирования микроорганизмов по- святили свои исследования М. Стефенсон, И. Малек, Н. Д. Иеру- салимский и др. Примерно за 40 лет третьего периода были решены основные задачи по конструированию, созданию и внедрению в практику необходимого оборудования, в том числе главного из них — биореакторов. Это оборудование используют и в настоящее время. Четвертый период в биотехнологии — генотехнический (от греч. genesis — происхождение, возникновение, рождение) начал- ся с 1972 г. В этом году П. Берг со своими сотрудниками в США создали первую рекомбинантную молекулу ДНК. Однако следует отметить, что в 1969 г. Дж. Бекуит с коллегами выделил в химически чистом виде лактозный 1ен из кишечной палочки, показав тем самым возможность направленных манипуляций с генетическим материалом бактерий. Естественно, что без фундаментальной работы Ф. Крика и Дж. Уотсона (1953) по установлению структуры ДНК было невозмож- ным достигнуть современных результатов в области биотехноло- гии. Выяснение механизмов функционирования и регуляции ДНК, выделение и изучение специфичных ферментов привело к фор- мированию строго научного подхода к разработке биотехнологи- ческих процессов на основе генно-инженерных работ. В этом суть генотехнического периода. Уже в 1982 г. поступил в продажу человеческий инсулин, выработанный кишечными палочками, несущими в себе искусст- венно встроенную генетическую информацию об этом гормоне. На таком же уровне или с близким к тому заделом находятся следующие генно-инженерные препараты: интерфероны, фактор некротизации опухоли (TNF), интерлейкин-2, соматотропный гор- мон человека и аналог его соматомеднп Ц и другие^ _ -----~~~ 17 I Г' Г'’" '’ ’' Л i v - <. н эй . u i м С К О И < А Д Е У :';И
Зная строение аппарата наследственности у разных организ- мов, удается манипулировать не только нуклеиновыми кислотами, но и целыми хромосомами (хромосомная инженерия) и клетками (клеточная инженерия). Для генотехнического периода характерны: разработка интен- сивных процессов (вместо экстенсивных) на основе направленных фундаментальных исследований (с продуцентами антибиотиков, ферментов, аминокислот, витаминов), получение суперпродуцен- тов; создание продуцентов, несущих в себе бессмысленную гене- тическую информацию (например, гены интерферона человека в клетках Pseudomonas aeruginosa); создание необычных организ- мов, ранее не существовавших в природе (неклубеньковых расте- ний, несущих гены азотобактерий, ответственные за способность фиксировать молекулярный азот из воздуха); разработка и внед- рение экологически чистых и, по возможности, безотходных тех- нологий; разработка и внедрение в практику специальной аппара- туры блочного (сменного) типа для различных биотехнологических схем; автоматизация и компьютеризация биотехнологических про- цессов; создание экономически оптимальных производственных процессов при максимальном использовании сырья и минималь- ном потреблении энергии. Вот почему инженер — биотехнолог в современном пониманикгдолжен быть широко и глубоко подготов- ленным специалистом, в распоряжении которого оказываются сложнейшие биологические системы (или аналоги их), синхронно работающие в заданном направлении. В любом биотехнологиче- ском процессе наиважнейшим звеном является биообъект, "кап- ризы" которого по любому поводу могут пагубно сказаться на результатах этого процесса. В течение последних 10 — 15 лет текущего столетия происхо- дило бурное развитие биотехнологии, определились сферы при- оритетного внедрения конкретных результатов биотехнологиче- ских разработок, и, как следствие, появились такие названия, как медицинская биотехнология, иммунобиотехнология (от лат. immunus — невосприимчивый), биогеотехнология (от греч. geo — земля), инженерная энзимология (от греч. еп — в, zyme — заква- ска) . Одни из них прочно входят в лексикон специалистов, напри- мер, иммунобиотехнология, инженерная энзимология, другие на- звания приживаются плохо или с трудом (медицинская биотехно- логия, биогеотехнология). К медицинской биотехнологии относили те производственные процессы, которые завершались созданием с помощью биообъектов средств или веществ медицин- ского назначения (прежде всего профилактического или лечебного 18
действия на организм человека). Это — антибиотики, некоторые витамины, коферменты и ферменты, отдельные микробные пол- исахариды — как самостоятельные препараты или вспомогатель- ные вещества при создании различных лекарственных форм, аминокислоты, нуклеозиды и др. Иммунобиотехнология объединяет производства вакцин, иммуноглобулинов крови, иммуномодуляторов, иммуно- медиаторов, моноклональных антител и некоторых других. Можно заметить, что на основе иммунобиотехнологических процессов создаются также профилактические и лечебные средства, объеди- няемые под эгидой медицинской биотехнологии. Следовательно иммунобиотехнология представляется здесь частным случаем ме- дицинской биотехнологии. Вместе с тем, иммунобиотехнологиче- ские процессы по целевым продуктам вышли за пределы медицин- ского назначения (например, в иммуноферментном анализе, им- муноблотинге). В равной мере большинство ферментов (как и аминокислот или некоторых других продуктов) производится не для целей здравоохранения. Поэтому термин "Медицинская био- технология" представляется во многом искусственным и, очевидно, отсюда плохо приживающимся. Напротив, вычленение иммуноби- отехнологии в качестве самостоятельной научной субдисциплины является обоснованным, и производственные процессы здесьчетко ограничены использованием иммунной системы того или иного макроорганизма или отдельных компонентов ее (макрофаги, лим- фоциты, различные иммуноглобулины). Биогеотехнология — это субдисциплина, ранее называвшаяся геологической микробиологией. Сущность ее сво- дится к использованию микроорганизмов для добычи полезных ископаемых, например, цветных металлов, нефти; для окисления метана в угольных шахтах и пр. Спектр биогеотехнологических производственных процессов невелик, но очень важен для жизне- обеспечения народного хозяйства. Необходимо подчеркнуть, что не все процессы, относимые ныне к биогеотехнологическим, яв- ляются сугубо технологическими (например, окисление метана с помощью специальных микроорганизмов). Обычно принято счи- тать, что в результате биотехнологического процесса образуется какой-то целевой продукт, используемый на практике. В приведен- ном примере окисления метана преследуется иная цель — сниже- ние концентрации метана до безопасного (например, для шахте- ров) уровня. Хотя и в этой реакции образуются конечные продук- ты, которые могут быть использованы на практике: СН4 + О2—• СО2 + 2Н2 19
Инженерная энзимология — это отрасль биотехнологии, базирующаяся на использовании каталитических функций ферментов (или ферментных систем) в изолированном состоянии или в составе живых клеток для получения соответст- вующих целевых продуктов. Биообъект здесь — фермент (или комплекс ферментов). На практике обычно используют иммоби- лизованные ферменты (реже — иммобилизованные клетки), бла- годаря чему стабилизируется и пролонгируется их ферментативная -активность. Иногда инженерную энзимологию отождествляют с биотехнологией. В этом содержится большая доля истины, так как все реакции в клетках катализируются ферментами. Однако слово "инженерная" привносит свою специфику, заключающуюся в акценте на создание конструкции (от франц, engin — машина), в данном случае — на конструирование биокатализаторов с задан- ными свойствами с последующим использованием в биотехноло- гическом процессе. В научной литературе можно встретить и другие названия биотехнологических процессов, например, "Биотехнология живо- тной клетки", "Экономическая микробиология", "Ферментация и биоинженерия”, "Промышленная микробиология", "Сельскохозяй- ственная биотехнология", "Биохимическая инженерия" и др. Более того, в принципе можно говорить и писать о биотехнологии каждого индивидуального продукта, образуемого каким-либо мик- робом, какими-либо клетками растений и животных, или появля- ющегося под каталитическим воздействием фермента; в равной мере речь может идти и о биотехнологии продуцентов каких-либо веществ, например, о Panax ginzeng (жень-шень), о Rauwolfia serpentina (Раувольфия змеевидная), об Actinomyces spp. (актино- мицеты) и т. д. Поэтому наиболее рациональным является подраз- деление биотехнологии на микробную биотехнологию, раститель- ную, или фитобиотехнологию, и животную, или зообиотехноло- гию, включающую также и биотехнологические процессы, осно- ванные на использовании клеток человека. Из приведенной схемы видно, что наибольшее число реализо- ванных процессов имеет место в микробной биотехнологии. Мно- гие микроорганизмы обладают заметным преимуществом перед растительными и животными объектами по таким показателям, как скорость размножения, лабильность и быстрота адаптации к изменяющимся условиям среды обитания. Этим и определяется диапазон применения микробов в различных отраслях производ- ственной деятельности человека, то есть все то, что составляет 20
микробиотехнология Биотехнология — фитобиотехнология зообиотехнология использование в легкой промышленности, в пищевой промышленности, в медицинской промышленности, в химической промышленности, в металлургии, в нефтедобывающей промышленности, в водном хозяйстве, в защите окружающей среды, в энергетике, в косметической промышленности в агропромышленном комплексе, в медицинской и косметической промышленности в животноводстве, в медицинской промышленности, в пищевой промышленности предмет "Промышленная микробиология". Это можно представить в следующем виде (таблица 1). Какие же основные цели и задачи стоят перед биотехнологами? Во-первых, поддержание и активация путей обмена клеток, веду- щих к накоплению целевых продуктов при заметном подавлении других реакций обмена у культивируемого организма; во-вторых, получение клеток или их составных частей (преимущественно — ферментов) для направленного изменения сложных молекул (на- пример, рестриктазы, изомеразы и т. д.); в-третьих, углубление и совершенствование рДНК-биотехнологии и клеточной инженерии на предмет получения особо ценных результатов в фундаменталь- ных и прикладных разработках; в-четвертых, создание безотход- ных и экологически безопасных биотехнологических процессов; в-пятых, совершенствование и оптимизация аппаратурного офор- мления биотехнологических процессов с целью достижения мак- симальных выходов конечных продуктов при культивировании естественных видов с измененной наследственностью методами клеточной и генной инженерии; в-шестых, повышение технико- экономических показателей биотехнологических процессов по сравнению с существующими. 21
Таблица 1 Процессы в промышленной микробиологии Характеристика процесса Целевые продукты Названия целевых [ продуктов или процессов Биосинтез Метаболиты: преметаболиты Аминокислоты ? Нуклеозиды j Нуклеотиды || первичные Нуклеиновые кислоты || Ферменты вторичные Алкалоиды Антибиотики Гиббереллины j Гликаны и гликоконъюгаты в Органические кислоты, кетоны, спирты, Липиды Аминокислоты, пептидные гормоны Клеточная масса Пекарские и пивные дрожжи 1 Кормовой и пищевой белок Вакцины и антигенные вещества Трансформация Неорганические вещества Обнаружение металлов Обогащение металлов ! Преимущественно органические вещества Компостирование отходов, получение биогаза [ Детоксикация, дезодорация « и обезвреживание, например, ! ПАВ (поверхностно-активных в-в) | Определение (анализ) веществ по | продуктам трансформации | Кисломолочные продукты и сыры Хлебно-булочные изделия Квашение и соление овощей || Силосование кормов Мочка льна и джута J Ферментация чая, табака, кофе, [ какао, маслин [ Пивоварение, виноделие, | винокурение j Глава 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Объектами биотехнологии являются вирусы, бактерии, грибы — микромицеты и макромицеты, протозойные организмы, клетки 22
(ткани) растений, животных и человека, некоторые биогенные и функционально сходные с ними вещества (например, ферменты, простагландины, лектины, нуклеиновые кислоты и др.). Следова- тельно, объекты биотехнологии могут быть представлены органи- зованными частицами (вирусы), клетками (тканями) или их мета- болитами (первичными, вторичными). Даже при использовании биомолекулы как объекта биотехнологии исходный биосинтез ее осуществляется в большинстве случаев соответствующими клет- ками. В этой связи можно сказать, что объекты биотехнологии относятся либо к микробам, либо к растительным и животным организмам. В свою очередь организм можно образно характери- зовать как систему экономного, сложнейшего, компактного, само- регулируемого и, следовательно, целенаправленного биохимиче- ского производства, устойчиво и активно протекающего при оп- тимальном поддержании всех необходимых параметров. Из такого определения следует, что вирусы не являются организмами, но по содержанию молекул наследственности, приспособляемости, из- менчивости и некоторым другим свойствам они относятся к пред- ставителям живой природы. Как видно из приводимой схемы, объекты биотехнологии исключительно разнообразны, диапазон их распространяется от организованных частиц (вирусов) (рис. 1А) до человека. Вирусы занимают положение между живой и неживой приро- дой, у них нет ядра, хотя имеется наследственный ядерный мате- риал — рибонуклеиновая кислота (РНК) или дезоксирибонуклеи- новая кислота (ДНК). В отличие от микробов клеточной организации РНК и ДНК в вирусных частицах вместе никогда не обнаруживаются. Из сказанного следует, что названия "биологическая техноло- гия, или биотехнология" и "биохимическая технология" тождест- венны, так как биологические процессы, используемые в технике и промышленном производстве, базируются на биохимической основе. В настоящее время большинство объектов биотехнологии со- ставляют микробы, относящиеся к трем надцарствам (безъядер- ные, предъядерные, ядерные) и пяти царствам (вирусы, бактерии, грибы, растения и животные). Причем первые два надцарства состоят исключительно из микробов, тогда как третье — преиму- щественно из растений и животных. 23
Микробами среди растений являются микроскопические водо- росли (AJgae), а среди животных — микроскопические простейшие (Protozoa). Из эукариот к микробам относятся грибы и, при опре- деленных оговорках, лишайники, которые являются природными симбиотическими ассоциациями микроскопических грибов и мик- роводорослей или грибов и цианобактерий. В первой половине XIX в. было сделано одно из самых основных обобщений биологии — клеточная теория (М. Шлейден, Т. Шванн, Р. Вирхов), которая стала общепризнанной. Она же оказалась фундаментом науки — цитология (от греч. kitos — полость). Из всех объектов биотехнологии лишь вирусы, вироиды и биомоле- кулы не имеют клеточной организации. Однако вирусы, находясь в клетках, ведут себя как живые существа — они реплицируются ("размножаются") и их генетический материал функционирует, в 24
основном^ по общим законам, присущим клеткам любого проис- хождения. По мере совершенствования методов и техники цито- логических исследований ученые глубже проникают в сущность организованных частиц и клеток, а в результате такого проникно- вения удается обосновать принадлежность всех живых существ к трем надцарствам: Acaryotae — безъядерные, Procaryotae — предъ- ядерные и Eucaryotae — ядерные (от греч. а — нет, pro — до, ей — хорошо, полностью, кагуоп — ядро). К первому относятся организованные частицы — вирусы и вироиды, ко второму — бактерии, к третьему — все другие организмы (грибы, водоросли, растения, животные). Несмотря на то, что представители всех надцарств содержат генетический материал, различные акариоты лишены какого-либо одного типа нуклеиновой кислоты РНК или ДНК. Они не способны функционировать (в том числе — реплицироваться) вне живой клетки, и, следовательно, правомочно именовать их безъядерными. Бактерии имеют клеточную организацию и у них имеются нуклеиновые кислоты обоих типов — РНК и ДНК, из которых ДНК представлена в виде одиночной (кольцевидной) хромосомы. Боль- шинство из них размножается на питательных средах (вне орга- низма), а если среди бактерий и есть безусловные (облигатные) паразиты, приближающиеся по данному признаку к вирусам (хла- мидии, спироплазмы, риккетсии), то паразитизм их отличается по своему механизму — его можно назвать клеточным. Паразитизм вирусов развивается на генетическом уровне. Таким образом, бактерии — это организмы, состоящие из функционально связан- ных структур, в том числе, генетических. Несмотря на то, что генетические структуры бактериальной клетки функционируют полноценно, они не сгруппированы в форме отграниченного ядра, и поэтому бактерии отнесены к предъядерным (прокариотическим) организмам. Клетки грибов, водорослей, растений и животных имеют на- стоящее, отграниченное от цитоплазмы, ядро и поэтому их относят к эукариотам. 2.1. Вирусы. Среди микробов вирусы характеризуются наименьшей величиной — они измеряются в нанометрах (нм.), и облигатным паразитизмом. Последний признак положен в основу классификации их на вирусы бактерий, или бактериофаги, вирусы растений и вирусы животных; имеются также и вирусы грибов. Как уже было сказано, структурно вирусы представляют собой организованные частицы, содержащие один какой-либо тип нук- леиновой кислоты (РНК или ДНК), не обладающие собственным 25
обменом веществ, но способные к репликации в клетках организ- ма-хозяина или интеграции с его геномом, ведя при этом "скрытое существование”. Под организованностью вирусной частицы пони- мают специфическое построение, или архитектонику (от греч. archi — начальный, главный, первый, tecton — искусник, мастер) струк- турных блоков, характерную для того или иного вируса, сущест- вующего вне организма — в и р и о н (см. рис. 22а). Каждый вирион в очищенном виде представляет собой истинный кристалл, кото- рый построен из нуклеиновой кислоты и белка, не связанных друг с другом ковалентными связями. Понятие "вирион" относится к интактной вирусной частице (от лат. intactus — нетронутый, неповрежденный), способный к инфицированию или заражению (от лат. infectiosus — заразный). Нуклеиновые кислоты — вещества наследственности вирусов. По типу нуклеиновой кислоты их подразделяют на РНК-содержа- щие вирусы и ДНК-содержащие вирусы. К первым относят все вирусы растений, ко вторым — большинство бактериофагов, ряд вирусов человека и животных (аденовирусы, вирусы герпеса, осповакцины и др.). Белок структурируется вокруг вирусной нуклеиновой кислоты (генома) в виде оболочки и называется капсидом. Форма вириона определяется его капсидом. Вместе с нуклеиновой кисло- той капсид образует н у к л е о к а п с и д. Примерный перечень вирусов включает 17 семейств вирусов позвоночных и 7 семейств вирусов беспозвоночных животных, 10 семейств вирусов бактерий. Описаны 20 родов вирусов растений и 5 родов вирусов грибов. Классификационные схемы вирусов до конца еще не устоявшиеся, к тому же открывают новые для науки вирусы (пример с вирусами эбола, иммунодефицита человека — ВИЧ). Представителями ДНК-содержащих вирусов являются ви- русы контагиозного моллюска, оспы, герпеса, большинство фагов бактерий; РНК-содержащими являются вирусы растений, вирусы гриппа человека, бешенства, полиомиелита и др. 2.1.1. Вироиды. В 1971 г. Т. О. Динер (США) впервые описал субвирусный возбудитель (патоген) веретеновидности клубней картофеля (ВВКК), названный вироидом. К 1984 г. было известно 10 болезней культурных растений (в том числе — зерновых), вызываемых вироидами. По молекулярной структуре вироиды представляют собой одноцепочечные, ковалентно замкнутые, коль- цевые молекулы РНК, лишенные капсидов. Число нуклеотидов в таких РНК находится в пределах 240 — 400. По форме вироиды 26
могут быть линейные и кольцевидные, они способны принимать шпилечную, квазидвухцепочечную конформацию (от лат. quasi — якобы, как-будто, почти, близко; conformatio — форма, расположе- & >: а iW Рис. 1. Бактериофаг Т2(А): 1 — капсомеры, по- крывающие головку, 2— воротничок, 3 — шей- ка, 4 — полый стержень, 5 — чехол, 6 — нити, 7 — икосаэдрическая головка; мендсикуты Б (а- д): галобактерии (а), метанобактерии (б), вегета- тивные формы (в) и покоящиеся формы (г); термоацидофилы (д); тенерикуты (е): микоплаз- мы (ж), спироплазмы (з). ние). Каждый тип вироида, например ВВКК или вироид экзокор- тиса цитрусовых (ВЭЦ), содержит уникальный, только ему прису- щий, особый вид низкомолекулярной РНК. Размеры вироидов находятся в пределах 15 нм. В чувствительных клетках растений- хозяев они сосредоточиваются в ядре, ассоциируясь с ядрышком в виде белково-нуклеинового комплекса, и реплицируются авто- номно-целиком при помощи предсуществутощих или активирован- ных ферментов хозяина. Вироиды не транслируются! Это подтвер- ждается структурным сходством их между собой и отсутствием у ряда вироидов кодонов-инициаторов. В то же время репликация происходит благодаря транскрипции последовательностей вироид- ных РНК с РНК-матриц при участии РНК-полимераз. 2.2. Бактерии — существа клеточной организации, у которых ядерный материал не отделен от цитоплазмы элементар- ными мембранами и не связан (!?) с какими-либо основными белками. Цитоплазма в них с нерегулярно разбросанными рибо- сомами (705-типа) неподвижна, клетки не обладают способностями к эндо- и экзоцитозу. В большинстве своем бактерии одноклеточны, наименьший диаметр их 0,2 — 10,0 мкм. Все бактерии составляют единое царство Bacteria, хотя одни из
них — археобактерии (Archaeobacteria) заметно отличаются от других, названных эубактериями (Eubacteria) (От греч, ей — хоро- шо). Очевидно, археобактерии являются более древними предста- вителями прокариот, чем эубактерии. Они обитают в средах с экстремальными условиями (от лат. extremus — крайний) — высо- кие концентрации неорганических солей, повышенные темпера- туры, оксид и диоксид углерода — как единственные источники углерода. К археобактериям относятся галобактерии, термоацидо- фильные бактерии и метанобразующие, или метаногенные бакте- рии (рис. 1Б). Дендрограмма (от греч. dendron — дерево, gramma — описание) прокариот может быть изображена следующим об- разом: Галофильные Термоацидофиль— Метаногенные фототрофные Хемотрофные бактерии ные бактерии бактерии бактерии бактерии Эубактерии Предковые формы Фототрофными бактериями являются оксигенные цианобакте- рии, аноксигенные пурпурные и зеленые бактерии; хемотрофными — грамположительные и грамотрицательные бактерии и бациллы, миксобактерии, стебельковые и почкующиеся бактерии, вибрио- ны, спириллы, спирохеты, актиномицеты, коринебактерии, мико- бактерии, риккетсии, хламидии, микоплазмы и спироплазмы. Галобактерии включают роды Haloarcula, Halobacterium, Halococcus, Natrobacterium, Natrococcus. Они обнаруживаются в морских солеварнях (оптимум натрия хлорида для них 3,5 — 5 М). Термоацидофильные бактерии обитают в кислых горячих ис- точниках при pH 2 — 3 и температуре 70° — 90°С (Sulfolobus acidocoldarius), в самонагревающихся терриконах угольных шахт при pH 1 — 2 и температуре 59°С (Thermoplasma acidophilum), в горячих источниках на дне морей и на склонах вулканов при температуре 85 — 105°С (Thermoproteus tenax, Т. neutrophilus и ДР-)- Метаногенные бактерии, к которым относятся кокки (Methanococcus vannielli), сарцины (Methanosarcinabarkeri), палоч- ки (Methanobacteriumformicicum, Methanobrevibacterruminantium), спириллы (Methanospirillum hungatei) и другие формы, являются анаэробными микроорганизмами. Они обитают в отстойниках сточных вод городов и населенных пунктов, в навозе, в осадках на дне прудов и озер, в рисовых полях, в лиманах и эстуариях (от лат. aestuarium — берег, заливаемый приливом), в рубце жвачных 28
животных. Приуроченность их к широкому диапазону температур естественна, учитывая среды обитания. Тем не менее, например в рубце жвачных животных температура достаточно постоянная. . Согласно определителю Д. X. Берги (1984, 1986) археобактерии относятся к отделу мендосикутов, все другие бактерии, или эубак- терии — к отделам: грациликутов, фирмикутов и тенерикутов (от лат. mendosus—ложный, фальшивый, gracilis—стройный, тонкий, firmus — прочный, tener—чувствительный, нежный, cutis—кожа). Грациликуты объединяют грамотрицательные бактерии с двух- слойной клеточной стенкой (они, как правило, содержат фосфо- липидную мембрану во внешнем слое клеточной стенки). Форма клеток у них различная — от сферической до палочковидной, от прямых до искривленных (изогнутых); подвижные или неподвиж- ные; не образуют эндоспор, размножаются делением (некоторые — почкованием); многие обладают пилями (волосками, или фимб- риями). По типам питания к грациликутам относятся фототрофы (включая цианобактерии) и хемотрофы, по типам дыхания — аэробы, анаэробы и факультативные анаэробы, по патогенности — сапрофиты и паразиты. Микроорганизмы с многослойным муреиновым каркасом от- носятся к фирмикутам. Все они грамположительные, спорообра- зующие или не образующие спор; сюда же включены актиноми- цеты и родственные им бактерии. Форма клеток различная — круглые, палочковидные, ветвящиеся, нитевидные, неветвящиеся. По типу питания — преимущественно хемогетеротрофы, по типу дыхания — аэробы, анаэробы и микроаэрофилы, патогенные и сапрофиты. К тенерикутам относятся микоплазмы и спироплазмы (от греч. тукев — гриб, plasma — вязкая, эластичная; speira — завиток, спираль, кольцо) (рис. 1Б). Это мельчайшие свободноживущие полиморфные бактерии, без клеточной стенки, сгруппированные в классе Mollicutes (от лат. mollis — мягкий). Воспроизводятся они почкованием, делением, сегментацией ветвистых структур; цитоп- лазматическая мембрана трехслойна; все известные виды микоп- лазм патогенны. Диаметр их 0,15 — 0,25 мкм, хотя полиморфизм по длине клеток весьма широкий. Микоплазмы полностью устой- чивы к пенициллину; растут на специальных агаризованных сре- дах. К мендосикутам относится единственный уже рассмотренный класс археобактерий, заметно отличающийся от других микроор- ганизмов. Известны еще так называемые мини- и макси-клетки бактерий, 29
в частности, Е. coli. Установление, что клетки кишечной палочки, несущие две мутации (min А и min В) делятся ассиметрично и в каждое второе деление образуется круглая безъядерная мини-клет- ка (примерно в 3 раза меньше родительской клетки по размеру). Мутации в генах гес А и uvt А сопровождаются инактивацией основных систем репарации и существенным возрастанием чувст- вительности клеток к ультрафиолетовым лучам. Клетки Е. coli при этом увеличиваются в размерах (макси-клетки). Мини- и макси- клетки используются для включения многокопийных плазмид при постановке генно-инженерного эксперимента. Бактерии подразделяют на группы по источникам энергии, углерода и донорам электронов (таблица 2), благодаря чему можно выделить типичных представителей в каждой из них. Так, цианобактерии относят к первой подгруппе, зеленые несерные бактерии — к второй, нитрифицирующие бактерии — к третьей, водородные бактерии — к четвертой и, наконец, бациллы и другие микроорганизмы — к пятой. Для сравнения можно указать, что дрожжи и нитчатые грибы из эукариот также отно- сятся к хемогетероорганотрофам. ' В учебной и научной литературе можно встретить и такие термины, как прототрофы, метатрофы, паратрофы, миксотрофы. Следует подчеркнуть, что все эти термины были предложены в начале XX в. в связи с разделением бактерий на группы по типам Таблица 2. Деление микробов на группы по источникам энергии, углерода и доноров электронов. Группа Источник Номер и название подгруппы 1 энергии углерода доноров электронов (водорода) Фотот- рофные бактерии Свет Неоргани- ' Неорганические 1. Фотоавтолито- чески й Органи- ческий вещества Органические вещества трофы 1 2. Фотогетероор- ган отрофы+ Хемот- рофные бактерии Химичес- кие реакции окисления - восста- новления Неоргани- Неорганические 3. Хемоавтолито- ческий Органи- ческий вещества Неорганические трофы 4. Хемогетероли- вещества Органические вещества тотрофы 5. Хемогетероор- ганотрофы Примечание: От греч. photos — свет, autos — сам, lythos — камень, trophia — питание, etheros — иной, другой, organicos — органический. 30
питания. Так А. Фишер в 1903 г. предложил различать прототрофы (автотрофы —' по В. Пфеферу), не нуждающиеся в готовом орга- ническом веществе для питания, метатрофы (гетеротрофы — по В. Пфеферу), нуждающиеся в органическом веществе — это большинство сапрофитных микроорганизмов, и паратрофы, пита- ющиеся живым белком и обитающие лишь в организме других существ — это все облигатные болезнетворные микробы; те виды, которые могут расти на питательной среде в пробирке (in vitro) и в организме чувствительного животного (in vivo), были названы В. Пфефером миксотрофами (от лат. mixtus — смешанный). Приве- денные названия (прототрофы, метатрофы и миксотрофы) теперь имеют больше исторический смысл. В 1946 г. была предложена классификация микробов по способам питания, или трофики, которой пользуются и в настоящёе время (таблица 3). Таблица 3. Деление микробов по трофике Признак Тип питания Источник энергии 1) живой организм 2) химическая реакция 3) фотохимическая реакция Источник углерода 1) диоксид углерода 2) органические вещества Донор электрона 1) неорганический 2) органический Паратрофия Хемотрофия Фототрофия Автотрофия Гетеротрофия Литотрофия Органотрофия Применительно к характеристике способностей микроорганиз- мов питаться живым белком in vitro или, чаще in vivo, используют термин патогенность (от греч. pathos — болезнь, genesis — воз- никновение, происхождение), то есть способность вызывать забо- левание. Поэтому все бактерии по признаку патогенности подраз- деляют на две большие группы — сапрофитные (неболезнетвор- ные, от лат. saprotes — гниение, гниль) и патогенные (болезнетвор- ные). Между ними находятся промежуточные виды — облигатные и факультативные паразиты (от лат. obligatus — обязательный, безусловный, facultativus — факультативный, возможный в изве- стных условиях). Облигатными являются, например, спирохеты сифилиса, гонококки, факультативными — синегнойная палочка, вульгарный протей. Следовательно, облигатные, или безусловные паразиты не развиваются вне организма или развиваются с трудом на питательных средах с нативными белками; факультативные 31
паразиты растут и размножаются во внешней среде, но при некоторых обстоятельствах (например, при снижении защитных сил макроорганизма) они могут быть причиной инфекционного (заразного) заболевания. У фототрофных и хемотрофных бактерий, различающихся по источникам потребляемой энергии, существенно различны и ре- акции, лежащие в основе энергетического и конструктивного обменов. В любом случае разнообразие бактериальных видов настолько велико, что даже ничтожно малая доля их, используемых в биотехнологических целях, требует к себе исключительного внимания. Достаточно назвать из числа эубактерий такие далеко отстоящие микроорганизмы, как Micromonospora sp. из группы актиноплан, Hydrogenomonas (Alcaligenes) eutropha из группы во- дородных бактерий, Lucibacterium harveyi из группы светящихся бактерий, палочку туберкулеза — Mycobacterium tuberculosis, не- которых псевдомонасов (например, Pseudomonas aeruginosa), эше- рихии (Escherichia coli) и многие другие, то становится понятной исключительная важность бережного (можно сказать — любовно- го) обращения с каждым биообъектом для сохранения стабильно- сти его морфо-физиологических свойств и продуктивности в со- ответствующих условиях. 2.3. Г р и б ы. К царству низших эукариот — Mycota относятся микромицеты, то есть микроскопические грибы (например, дрож- жи, пенициллы, аспергиллы и др.) и макромицеты, формирующие в процессе своего роста и развития визуально наблюдаемые пло- довые тела — трутовики, агариковые грибы и др. Микро- и макромицеты могут быть объектами биотехнологии. Примечательно, что грибы имеют сходство и с растениями (верхушечный, или апикальный рост, прочная клеточная стенка, наличие вакуолей и поперечных перегородок у многих из них) и с животными (гетеротрофный тип питания, большая или мёныпая потребность в витаминах, наличие хитина или хитозана, синтез гликогена). Следовательно, грибы эволюционно произошли рань- ше — до дивергенции растений и животных в самостоятельные царства. В то же время лишь грибам присуще мицелиальное строение и, как следствие, абсорбционный способ питания (осмот- рофия); для них известны явления дикариозиса (раздельное на- хождение двух ядер в одной клетке, способных к одновременному делению и имитирующих диплоидное ядро) и гетерокариозиса (нахождение разнокачественных ядер в одной клетке). Основные таксономические группы грибов (от греч. taxis — 32
приведение в порядок, устройство, nomos — закон) являются достаточно устоявшимися, однако предлагаемые разными автора- ми классификационные схемы весьма многочисленны и, порой, во многом различны. В этой связи целесообразно и научно оправданно придерживаться следующей схемы. Царство грибов включает два отдела — Myxomycota и Eumycota, то есть грибы-слизевики (от греч. пгуха — слизь) и настоящие грибы (от греч. ей — хорошо, в смысле — типичный, хорошо развитый). Первые из них немного- численны и представлены "голой" плазменной массой — плазмо- дием. Они претерпевают своеобразный цикл развития и образуют половые аттрактанты (от лат. attractio — притяжение, тяготение). Отдел эумицетов включает 7 классов: Chytridiomycetes, Hyphochytridiomycetes, Oomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes и Deuteromycetes. К хитридиевым (от греч. chytridion — капелька, что отражает содержание капли жира в зооспорах) относится более 500 видов грибов, в основном пред- ставленных плазмодиальными образованиями, то есть у них пол- ностью отсутствует мицелий, а если он есть, то находится лишь в зачаточном состоянии. Зооспоры и планогаметы (клетки размно- жения) располагают только одним задним бичевидным (плетевид- ным) жгутиком, что имеет определенное таксономическое значе- ние. Гифохитридиевые имеют зооспоры с одним передним биче- видным жгутиком, нити их не имеют перегородок, класс представ- лен немногими видами. Оомицеты также включают свыше 500 видов. Это водные грибы, объединяемые на основании оогамии — полового процесса. Бесполые зооспоры их обладают двумя разными жгутиками, один из которых передний сверкающий (блестковидный, перистый), другой — задний бичевидный. Зигомицеты, включающие свыше 500 видов, полностью утра- тили подвижные стадии в циклах развития. Половой процесс у них — зигогамия. Мицелий, как правило, хорошо развит и, в основном, без перегородок. Нередко, в отечественной и зарубежной учебной и научной литературе все, преимущественно водные, грибы (включая и "вы- шедших на сушу" зигомицетов) объединяют в один класс Phycomycetes (от греч. phycos — водоросль). Все водные грибы либо лишены мицелия, либо он в зачаточном или развитом состо- янии, но не имеет перегородок (септ) или они редкие — такие грибы относят к низшим. Нитчатые грибы с перегородками в 2 т. 8524 33
мицелии относят к высшим. Не путать эти понятия с понятиями совершенные и несовершенные грибы, из коих первые обладают половым процессом размножения, вторые — не обладают им. Например, Mucor rouxii является низшим совершенным грибом, а, например, Stilbella aurantica является высшим несовершенным грибом. Следовательно, к высшим грибам относят аскомицеты, или сумчатые грибы; базидиомицеты, или базидиальные грибы и дей- теромицеты, или несовершенные грибы (Fungi imperfecti). Сумчатые грибы — наиболее обширный класс, включающий свыше 15 000 видов самых различных строения, формы и место- обитания. Отличительным признаком их являются сумки, образу- ющиеся на аскогенных гифах в результате полового процесса. В сумках формируются половые споры, с помощью которых они размножаются. Чаще образуется 8 спор, хотя нередки и исключе- ния из этого правила. Мицелий у них септированный (от лат. septum — перегородка), в септах имеются центральные поры, обеспечи- вающие сообщения между клетками и обмен клеточным содержи- мым. Сформировавшиеся сумки образуют плодовые тела, которые могут быть закрытыми (клейстотеции, или клейстокарпии, от лат. cleistos — могущий закрываться, смыкающийся; teke — капсула, покрышка, мешок; carpos — плод), грушевидными с круглой по- рой-остиолой наверху —перитеции (от греч. peri — вокруг) и открытыми блюдцевидными или чашевидными апотециями (от греч. приставки аро — со значением удаления или отделения, обратности или возвращения и др.). Для сумчатых грибов харак- терно и бесполое размножение с помощью конидий, образующих- ся на гаплоидном мицелии. Следовательно, в цикле развития аскомицетов имеются половые и бесполые стадии (рис. 2). Базидиальные грибы. Насчитывается свыше 30 000 видов ба- зидиомицетов (от греч. basis — основание), различающихся боль- шим разнообразием по строению, форме и размерам.-Для базиди- омицетов так же характерны половая и бесполая стадии развития. Первая завершается формированием базидии — репродуктивного органа, на котором образуются, как правило, по 4 споры (базиди- оспоры), сидящих на стеригмах. Бесполая стадия кратковременна — она представлена прорастающими трубками спор и позже — дикариотическим мицелием. Из этого последнего возникает пло- довое тело — базидиокарп, на котором затем образуются базидии. Для многих базидиомицетов характерны пряжки (рис. 3), об- разующиеся на мицелии и участвующие в синхронном процессе деления ядер, а в мицелиальных септах — долипоры (см. рис. 32). 34
Рис. 2. Цикл развития аскомицетов на примере Pyronema species: 1-мицелий, 2-ко- нидии, образующиеся на гаплоидном мицелии, 3-( + ) и (-) типы спаривания (соот- ветственно мужские и женские клетки), 4-аскогенные гифы (а-д), 5-сумки со спо- рами, 6-аскоспоры. Дейтеромицеты (от греч. _______ deiteros — второй) — сбор- < Т*" ный класс грибов, поскольку в него включены все те пред- ставители микромицетов, у которых не обнаружен поло- ________ вой процесс развития. Если же половая стадия выявляет- ся, ТО такой гриб сразу же Рис. 3. Пряжки у базидиальных грибов, переносят в соответствую- щий ему класс. Насчитывают многие тысячи видов несовершенных грибов. Им присущ хорошо развитый септированный мицелий и конидиальное (бесполое) спороношение. У несовершенных грибов могут иметь место гетерокариоз и парасексуальный цикл. Лишайники (от лат. Lichenes) — это естественные симбионты грибов (микобионтов) и водорослей (фикобионтов) или грибов и цианобактерий (бактериобионтов). Лишайники выделяют в само- стоятельную группу организмов, изучаемую в специальной науч- 35
ной дисциплине—лихенология. В настоящее время известно около 30 000 видов лишайников. Микобионтами у них выступают пре- имущественно аскомицеты (исключительно редко — базидиоми- цеты), фикобионтами и бактериобионтами — зеленые и желто-зе- леные водоросли, цианобактерии. Называют лишайники по мико- бионту. Лишайники подразделяют по форме на листоватые (в том числе — кочующие), кустистые и корковые (накипные). Размно- жаются они бесполым (кусочками, конидиями) и половым путем за счет микобионта (рис. 4). Рис. 4. Лишайники: корковый или накипной - 1, листоватый - 2, кустистый - 3, кочующий - 4. Из сказанного можно составить представление о том, что потенциальных биообъектов для использования в производстве самых различных веществ обильное множество и большинство из них лежит пока нетронутым кладом для будущих поколений кла- доискателей. 2.4 Растения. Царство растений Plantae включает подцарства багрянок (Rhodophyta), водорослей (Phycophyta) и высших расте- ний (Embryophyta). У первых двух нет дифференциации тела на органы и ткани — они представляются слоевищем (thallus) и обитают главным образом в воде. Тело высших растений расчле- нено на органы и ткани. К настоящему времени насчи- тывают сотни тысяч видов растений, многие из которых исполь- зуют в различных отраслях народного хозяйства. Для растений характерны: способность к фотосинтезу, наличие целлюлозы, биосинтез крахмала. 2.4.1. Водоросли. К водорослям относятся: багрянки, пиррофитовые, золотистые, желто-зеленые, эвгленовыеихаровые. 36
Как правило, водоросли являются водными организмами, их на- считывают около 100 000 видов. Все они пигментированы за счет хлорофилла, каротиноидов, ксантофиллов, фикобилинов. Водорос- ли — важный источник различных полисахаридов и других био- логически активных веществ. Размножаются они вегетативно, бесполым и половым путями. Как биообъекты используются недо- статочно, хотя, например, ламинария под названием морской капусты производится промышленностью различных стран. Хоро- шо известны агар-агар и альгинаты, получаемые из водорослей. 2.4.2. Клетки высших растений. Высшие растения (порядка 300 000 видов) — это дифференцированные многоклеточ- ные, преимущественно наземные организмы. Способы их беспо- лого и полового размножения хорошо описаны в учебниках бота- ники. В процессе дифференциации и специализации клетки рас- тений группировались в ткани (простые — из однотипных клеток, и сложные — из разных типов клеток). Ткани, в зависимости от функции, подразделяют на образовательные, или меристемные (от греч. meristos—делимый), покровные, проводящие, механические, основные, секреторные (выделительные). Из всех тканей лишь меристематические способны к делению и за их счет образуются все другие ткани. Это важно для получения клеток, которые затем должны быть включены в биотехнологический процесс (см. спе- циальную часть), Клетки меристемы, задерживающиеся на эм- бриональной стадии развития в течение всей жизни растения, называются инициальными, другие постепенно дифференцируются и превра- щаются в клетки различных постоянных тканей — конечные клетки. В зависимости от топологии в растении мери- стемы подразделяют на верхушечные, или апи- кальные (от лат. apex — верхушка), боковые, или латеральные (от лат. lateralis — боковой) и про- межуточные, или интеркалярные (от лат. intercalaris — промежуточный, вставной) (рис. 5). В 1902 г. Г. Хаберландт впервые сделал попыт- ки культивировать клетки растений. В середине текущего столетия промышленное производство декоративных и плодоовощных культур в ряде стран мира базировалось преимущественно на Рис. 5. Меристемы растительные: вер- хушечные — 1. бо- ковые — 2, проме- жуточные — 3. 37
методе культур тканей и органов растений — были получены линии с заданными характеристиками. Здесь следует отметить, что Г. Хаберландт впервые выдвинул гипотезу о тотипотент- ности любой живой клетки растения. Тотипотентность — это свойство соматических клеток растений полностью реализовать свой потенциал развития вплоть до образования целого растения. Любой вид растения может дать в соответствующих условиях неорганизованную массу делящихся клеток — каллус (от лат. callus — мозоль), особенно при индуцирующем влиянии растительных гормонов. Массовое производство каллусов с дальнейшей регене- рацией побегов пригодно для крупномасштабного производства растений. Вообще каллус представляет собой основной тип куль- тивируемой на питательной среде растительной клетки. Каллусная ткань из любого растения может длительно рекультивироваться. При этом первоначальные растения (в том числе и меристемати- ческие), дедифференцируются и деспециализируются, но индуци- руются к делению, формируя первичный каллус. Кроме выращивания каллусов удается культивировать клетки некоторых растений в суспензионных культурах. Важными биообъектами представляются также и протопласты растительных клеток. Методы их получения принципиально сход- ны с методами получения бактериальных и грибных протопластов. Последующие клеточно-инженерные эксперименты с ними заман- чивы по возможным ценным результатам. 2.5. Клетки животных. Из царства Animalia биообъектами могут быть простейшие организмы — Protozoa и высшие животные. И если сегодня о биотехнологии Protozoa мало что-либо известно, то применительно к биотехнологии животных имеются внедрен- ные развитые технологические процессы, написаны соответству- ющие монографии в нашей стране и за рубежом. Тем не менее, высокие дифференциация и специализация эукариотических кле- ток животных объясняют те трудности, с которыми приходится сталкиваться исследователям и практическим работникам, имея дело с подобным материалом. Простейшие (Protozoa) — это одноклеточные микроскопиче- ские животные. В данном отделе различают классы жгутиковых (Flagellata, или Mastigofora, от лат. flagellum — бич, жгут, masticatus — жевательный, от греч. foros — нести), саркодовые (Sarcodina, от греч. sarcos — мясо), споровики (Sporozoa) и реснитчатые (Ciliofora, 38
или Ciliata). Простейшие широко распространены в природе, некоторые из них обитают и в теле человека. По своему строению клетки их напоминают клетки животных и содержат все основные структурные элементы (органоиды и включения). Многие протозоа активно передвигаются с помощью ложноножек, жгутиков и ре- сничек. По типу питания они являются гетеротрофами, обладаю- щими специальными структурами для захвата пищи или поглощают ее посредством фагоцитоза. Культивирование протозоа in vitro не простое, однако доступно при необходимом усердии, а препарат "круцин" из Trypanosoma kruzi является свидетельством удачного использования этого орга- низма в биотехнологии. В начале XX в. Р. Гаррисон и А. Каррель установили факт возможного культивирования клеток животных in vitro, то естьони доказали способность животных клеток к независимой жизни в питательной среде вне живого организма. С учетом всех особенностей животных клеток (в отличие, например, от растительных и бактериальных) порой невозможно отказаться от них во избежание каких-то чрезвычайных затрудне- ний, так как лишь только с их помощью можно получить какой-то особый продукт (вещество). Для примера назовем моноклональные антитела, получение трансгенных животных и т. д. Для реализации биотехнологических процессов важными па- раметрами биообъектов являются: чистота, скорость размноже- ния клеток и репродукции вирусных частиц, активность и ста- бильность биомолекул или биосистем. Следует иметь в виду, что при создании благоприятных условий для избранного биообъекта биотехнологии эти же условия, могут оказаться благоприятными, например, и для микробов — контами- нантов, или загрязнителей (от лат. contaminatio — заражение, загрязнение). Представителями контаминирующей микрофлоры оказываются вирусы, бактерии и грибы, находящиеся в культурах растительных или животных клеток. В этих случаях микробы-кон- таминанты выступают вредителями производств в биотехнологии. При использовании ферментов в качестве биокатализаторов воз- никает необходимость предохранения их в изолированном или иммобилизованном состоянии от деструкции банальной сапрофит- ной (не болезнетворной) микрофлорой, которая может проникнуть в сферу биотехнологического процесса извне вследствие несте- 39
рильности системы, например, из-за негерметичности в каком-ли- бо узле. Скорости размножения клеток и репродукции вирусных час- тиц прямо пропорционально сказываются на возрастании клеточ- ной массы и образовании метаболитов или, применительно к фагам, на возрастании массы лизирующихся клеток. В этом смысле подавляющее большинство микроорганизмов выгодно отличается от клеток растений и животных. Однако не следует упускать из виду важность конечного продукта. Например, уже упомянутые моноклональные антитела можно получить лишь с помощью жи- вотных клеток, когда длительность культивирования их не приоб- ретает самодовлеющего значения. Активность и стабильность в активном состоянии биообъектов — одни из важнейших показателей их пригодности для длительного использования в биотехнологии. Таким образом, независимо от систематического положения биообъекта, на практике используют либо природные организо- ванные частицы (фаги, вирусы) и клетки с естественной генети- ческой информацией, либо клетки с искусственно заданной гене- тической информацией, то есть в любом случае используют клетки, будь то микроорганизм, растение, животное или человек. Для примера можно назвать процесс получения вируса полиомиелита на культуре клеток почек обезьян в целях создания вакцины против Рис. б. Биореактор фир- мы Inceltech для выращи- вания бактерий и грибов (общий вид). Рис. 7. Биореактор для растений (общий вид). 40
этого опасного заболевания. Хотя мы заинтересованы здесь в I накоплении вируса, репродукция его протекает в клетках живо- !тного организма. Другой пример с ферментами, которые будут использованы в иммобилизованном состоянии. Источником фер- ментов также являются изолированные клетки или специализиро- г ванные ассоциации их в виде тканей, из которых изолируют - нужные биокатализаторы. Биотехнологии присущи свои специфические методы — это крупномасштабное глубинное культивирование биообъектов в пе- риодическом, полунепрерывном или непрерывном режиме; выра- щивание клеток растительных и животных тканей в особых усло- виях. Биотехнологические методы культивирования биообъектов выполняются в специальном оборудовании, например, в фермен- таторах выращивают бактерии и грибы при получении антибио- тиков, ферментов, органических кислот, некоторых витаминов (рис. 6); в подобных же ферментаторах выращивают некоторые клетки человека (бласты) для получения белка— интерферона. Раститель- ные клетки чаще выращивают в стационарных условиях на среде . с уплотненной (например, агаризованной) подложкой в стеклян- ных или полиэтиленовых емкостях, хотя некоторые виды расти- тельных клеток можно культивировать в специальных фермента- торах (рис. 7). В стеклянных роллерах культивируют и большинство живо- тных клеток или, например, в куриных эмбрионах. Другие методы, используемые в биотехнологии, являются об- щими, например, с методами в микробиологии, биохимии, биоин- женерии, органической химии и других науках. Тем не менее, следует особо выделить методы клеточной и генной инженерии, когда в экспериментальных условиях удается создавать клетки с заведомо известными свойствами. Так осуще- ствлены соматическая гибридизация клеток картофеля и томата (гибрид назван "помато”), перенос генетической информации о синтезе человеческого или животного гормона инсулина в бакте- риальные клетки (кишечной палочки), способных затем продуци- ровать полипептидные цепи инсулина. Эти методы и, прежде всего, генно-инженерные легли в основу современной биотехнологии. Более того, некоторые ученые стре- : мятся отождествить генную инженерию и биотехнологию, а это 41
неправильно, поскольку генная инженерия представляет методи- ческую сущность биотехнологии. Наука не может быть наукой, если в ее определении отсутствуют специфичные, только ей при- сущие, объекты и методы. Однако даже в случае реализации генно-инженерных разрабо- ток измененная наследственная информация на уровне молекул инкорпорируется затем в клетках, с которыми и приходится иметь дело в биотехнологическом процессе. Из этого можно вывести представление об уровнях биотехнологии: клеточном и молеку- лярном. Тот и другой определяются биообъектами. В первом случае дело имеют с клетками, например, актиномицетов при получении антибиотиков, микромицетов при получении лимонной кислоты, животных при изготовлении вирусных вакцин, человека при из- готовлении интерферона. Во втором случае дело имеют с молеку- лами, например, с нуклеиновыми кислотами в так называемой"ре- комбинантной ДНК-биотехнологии” (рДНК-биотехнология), бази- рующейся на генной инженерии и составляющей сущность пред- мета "Молекулярная биотехнология"; или на использовании отдель- ных ферментов (ферментных систем), например, протеаз в мою- щих средствах, липаз для модификации вкуса молочных продуктов и т. д. Однако необходимо помнить, что в начальной или конечной стадии молекулярный уровень трансформируется в клеточный. Так, ферменты продуцируются клетками, а при генно-инженерных разработках реципиентом новой генетической информации стано- вится также клетка. Особенность методов, используемых в биотехнологии, заклю- чается в том, что они должны выполняться, как правило, в асеп- тических условиях (от греч. а — не, septicos — гнилостный), то есть при исключении возможности попадания в среду культиви- рования биообъекта болезнетворных (патогенных) и неболезнет- ворных (сапрофитных) микроорганизмов. Патогенные виды пред- ставляют непосредственную опасность для занятых в производстве людей и для потребителей конечных продуктов; сапрофитные виды могут выступать конкурентами за питательные субстраты, антаго- нистами, продуцентами токсических веществ, включая пирогены. 42
Часть IL Роль фундаментальных исследований в развитии биотехнологии Подразделение научных исследований (равно как и наук) на фундаментальные и прикладные в какой-то мере условно, хотя фактически эти термины в достаточно широком ходу. Более того, фундаментальные и прикладные исследования включают в перс- пективные планы научных разработок в соответствующих акаде- мических и отраслевых учреждениях. Принято считать, что фундаментальные (от лат. fundamentum- основа, опора, основание) исследования изначально нацелены на решение основополагающих проблем, а конкретные результаты, вытекающие из них, составляют суть прикладных исследований. Это можно показать на следующих примерах (таблица 4). 43
Таблица 4. Соотношение фундаментальных и прикладных исследований Научные исследования фундаментальные прикладные Открытие Г. Менделем единиц наследственности у садового гороха; исследования Т. Моргана и сотрудников с мушкой дрозофилой, приведшие к всеобщему признанию законов Менделя. Вскрытие Л. Пастером причины болезни шелковичных червей во Франции. Обезвреживание болезнетворных микробов при сохранении их антигенности. Выведение М. Фарадеем законов электролиза на основании изучения действия электрического тока на водные растворы различных веществ. Открытие радиоактивных элементов Марией и Пьером Кюри. Формулирование проблемы антагонизма между микробами и ее экспериментальное подтверждение. На основании принципов Менделя - Моргана были созданы рациональные методы селекции в растениеводстве и животноводстве, в микробиологии. С помощью этих методов были выведены новые сорта сельскохозяйственных растений, новые породы домашних животных, высокопродуктивные штаммы микроорганизмов; выявлены наследственные болезни у человека, определены пути и созданы методы рациональной их профилактики и терапии. Разработаны и осуществлены меры по спасению производства шелка. Создание профилактических и лечебных иммунопрепаратов (вакцин, сывороток, иммуноглобулинов). Создание методов и приборов для выделения веществ при электролизе, для определения электропроводности, для профилактической и терапевтической электростимуляции при некоторых патологических состояниях у людей и т. д. Создание и применение рентгеновских методов исследования, радиотерапия раковых заболеваний, эксплуатация атомных электростанций и др. Создание промышленности антибиотиков и применение антибиотических препаратов в здравоохранении. Подобного рода примеры весьма многочисленны и множество их убедительно доказывает скорость и глубину социального про- 44
гресса человечества на долгом пути его эволюции. И наука здесь выступает решающим фактором, так как наука - это отрасль человеческой деятельности, направленная на познание мира (ми- роздания). Фундаментальные исследования завершаются, как правило, установлением или доказательством новых фактов, закономерно- стей в соответствующей отрасли знаний. Рано или поздно эти факты (закономерности) находят практическое воплощение. Тем не менее, нельзя противопоставлять фундаментальные и приклад- ные исследования, так как на определенном этапе нередко можно видеть трансформацию их в противоположном направлении. На- пример, на основании обобщения полученных сведений о нукле- иновых кислотах Дж. Уотсон и Ф. Крик смогли предложить природную модель двойной спирали ДНК и, тем самым, подвели материальный фундамент под ранее известный якобы "мифиче- ский" ген. На этой основе возникли многочисленные практические разработки по молекулярной биологии гена и, в том числе, напри- мер, по мутагенезу. С другой стороны, практические разработки по выделению и манипулированию с ДНК различного происхож- дения стали основой для постулирования общегенетических зако- нов, присущих всему живому. Вот почему и сегодня справедливы слова великого Л. Пастера, сказанные по этому поводу: "Нет, тысячу раз нет, не существует ни одной категории наук, которой можно было бы дать название прикладых наук. Существуют науки и приложение наук, связанные между собой как плод и породившее его дерево". Биологическая технология - как наука является воплощением симбиоза теоретических исследований и практической реализации предварительно полученных фактов в работах с организованными частицами (вирусами), клетками и тканями, с первичными и вто- ричными метаболитами, с генетическим материалом. Глава 3 Фундаментальные исследования в области энзимологии Любая клетка - целостная система, составные части которой структурно и функционально взаимозависимы. Эта зависимость выражается прежде всего в генетически обусловленном синтезе белковых молекул - преимущественно ферментов. В хронологиче- ском порядке только белки - продукты матричного синтеза должны 45
относиться к разряду первичных; все другие молекулы, возника- ющие под каталитическим .действием ферментов, оказываются вторичными. Выдающийся шведский химик И. Я. Берцелиус, предложивший в 1836 г. термин "катализ" (за 35 лет до выявления М. Манасеиной каталитических функций дрожжевого сока в 1871 г.), пророчески писал: "У нас есть все основания предполагать, что в тканях и жидкостях растений и животных происходят тысячи каталитических процессов”. И это в то время, когда ферменты еще не были известны науке. Теперь, например, утверждается, что в мельчайшей клетке (0,1 мкм в диаметре), относящейся к Mollicutes, содержится более, чем 100 ферментов, то есть столько, чтобы клетка могла самостоятельно функционировать как организм. Ес- тественно, что в клетке других прокариот и эукариот насчитывают более 1000 биокатализаторов. Большинство микробов лишено спе- циализированных структур, хотя бы отдаленно напоминающих органы дыхания, пищеварения и другие, присущих высшим эука- риотам. Поэтому основная метаболическая нагрузка (метаболизм - это биологический обмен веществ и энергии) в процессах их роста, развития и размножения падает на ферменты. В любой живой клетке находятся малые и большие (полимерные) молекулы различных веществ. Они должны синтезироваться в клетке, а некоторые секретироваться из нее (нередко, распадаясь перед этим на более мелкие составные части или их производные). Во всех таких процессах участвуют ферменты. Уже сегодня известно около 2000 индивидуальных ферментов и это не предел. В клетках прокариот и эукариот ферменты распределены и локализованы целесообразно, например, в цитоплазме находятся почти все фер- менты гликолиза, в матриксе митохондрий - ферменты цикла трикарбоновых кислот и р-окисления жирных кислот, ферменты окислительного фосфорилирования - во внутренней мембране митохондрий. В клетке E.coli нить ДНК имеет размеры 1,4«106хЗ,0 нм, а массу 1»1014 г. В разомкнутом состоянии длина ее составит примерно 1,4 мм, то есть подобная ДНК приблизительно в 500 раз длиннее бактериальной клетки, вмещающей эту ДНК. Такая хромосома кишечной палочки заключает в себя- информацию, достаточную для кодирования 4500 белков, значительная часть которых будет представлена ферментами. Ферменты составляют основную массу клеточных белков. На долю одного фермента приходится от сотых долей процента (у некоторых вирусов) до 10 -12% (у ряда микроорганизмов клеточной организации, например у E.coli). В то же время хромосомная ДНК не есть простая последовательность множества генов. Поэтому 46
нельзя считать, что количество хромосомной ДНК, например у представителей эукариотических организмов пропорционально уровню их эволюционного развития. В таком случае некоторые ля1ушки и рыбы были бы развиты более, чем животные и человек, поскольку уних размер генома достигает 10'°-10” пар нуклеотидов (пн), а у млекопитающих и человека он на 1 - 2 порядка ниже (109 - 1О10 пн). Суть здесь в том, что у высокоразвитых существ значительная часть ДНК оказываетсяя молчащей, так как она образована не генными последовательностями (у человека к этому типу относится 80 - 90% всей ДНК) или повторяющимися огромное число раз идентичными последовательностями. Все это не может не сказываться на ферментном наборе в клетках, органах и тканях, равно как и на их функциональной активности. Ферменты давно являются объектами биотехнологии - их ин- дустрия зародилась в начале XX в., и объемы ферментного произ- водства продолжают нарастать, а что касается публикаций о био- катализаторах, то в мире появляется более 10 000 статей ежегодно. Ферменты присущи любой живой клетке и, в небольшом ассорти- менте - организованным частицам (вирусами). Наука, изучающая ферменты, называется энзимологией, а инженерная энзимология - это ветвь или субдисциплина биологической технологии, изуча- ющая биотехнологические процессы, в которых используется ка- талитическое действие ферментов. Главная задача инженерной энзимологии заключается в практической реализации фермента- тивных процессов в целях экономичного получения различных веществ и энергии для нужд народного хозяйства. Чтобы выйти на уровень инженерной энзимологии, необходи- мо решать многие основополагающие проблемы и задачи, к кото- рым можно отнести: 1) способы выделения и очистки ферментов в зависимости от их топологии в биообъекте или при выделении в среду обитания; 2) определение состава и строения фермента; 3) особенности кинетики ферментативного действия в зависи- мости от внешних условий; 4) оценку активности ферментов в зависимости от их чистоты или, напротив, от наличия естественных примесей или искусствен- ных добавок; 5) механизмы и пути регуляции синтеза и активности фермен- тов; 6) моделирование действия ферментов в иммобилизованном состоянии, учитывая при этом иммобилизацию индивидуальных ферментов и полиферментных систем, каковыми являются живые клетки; 47
7) аппаратурное оформление ферментативных процессов; 8) экономичность ферментативных процессов, рекомендуемых к внедрению в производство. Некоторые из этих проблем и задач будут рассмотрены в данном разделе, другие (6-8) - во второй части учебника. Распределение ферментов в клеточных структурах неравноз- начное, и независимо от того, что биосинтез их осуществляется в элементах ядерного аппарата, часть ферментов секретируется внеклеточно - преимущественно гидролазы. Это обусловлено не- обходимостью расщепления полимерных веществ до такого уров- ня, чтобы продукты гидролиза могли поступить в клетку для конструктивного и/или энергетического обменов. К ферментам внеклеточного типа можно отнести микробные амилазы, липазы и пептид-гидролазы, катализирующие реакции гидролиза соответственно крахмала; жиров и белков. Животная протеаза (пепсин) условно также может быть причислена в разряд внеклеточных, так как она поступает из соответствующих клеток (главных клеток слизистой оболочки желудка) в полость желудка; то же можно сказать и о ферментах поджелудочной железы, поступающих в просвет двенадцатиперстной кишки. Следует иметь в виду, что многие ферменты синтезируемые в клетках, являются зимогенами, или неактивными ферментами, и для трансформации их в активные формы необхо- дим ограниченный (специфический) посттрансляционный проте- олиз. В любом случае получение экзо- и эндоферментов на опреде- ленных этапах как бы унифицируется, когда все стадии выделения и очистки будут определяться лишь их физико-химическими ха- рактеристиками. Так, при выделении экзофермента клетки проду- цента становятся отходом, а культуральная жидкость или, в другом случае, желудочный сок - целевым продуктом-сырцом. Если речь идет о необходимости получения эндоферментов, то содержащие их клетки и ткани измельчают (дезинтегрируют) и экстрагируют подходящим растворителем. Полученный раствор также представ- ляет собой полупродукт — сырец. И если речь здесь идет об одном и том же ферменте,- но разного происхождения и топологии (экзо- и эндо-), то, начиная с сырца, технологические схемы их выделения будут во многом тождественными. В этом случае можно использо- вать такие подходы, как высаливание, сепарирование в градиентах плотности каких-либо веществ, мембранную фильтрацию,- гель- хроматографию, афинную хроматографию, ионный обмен и дру- 48
гие. При необходимости выделют ферменты, локализованные в каких-либо структурах клетки. Тогда, с учетом физико-химических характеристик таких структур (размер, плотность, форма), приме- няют дифференциальное центрифугирование после дезинтегра- ции клеток (тканей). При этом сферические частицы различной плотности и/или размера будут перемещаться в центрифужной пробирке на одно и то же расстояние за разное время. Время прохождения частицы из одного положения (и) в другое (гг) можно определить, исходя из следующего уравнения: t 9 Я г Г2 2 со R (Pp-pf) Л где t — время, ц — вязкость центрифугируемой жидкости, со — угловая скорость, R— радиус частицы, рр — плотность частицы, р/ — плотность центрифугируемой жидкости, — коэффициент силы тяжести. Форма выделяемых частиц не всегда сферическая, и тогда в используемые методы вносят необходимые поправки, или выбира- ют какие-либо другие способы изоляции и расчета. Ферменты — глобулярные белки, поэтому при их разделении играют роль, в основном, молекулярные массы (ММ) молекул, а не число субъ- единиц (С) в них. В качестве примера можно назвать химотрипсин (ММ = 24500 Да, С = 3), щелочную фосфатазу (ММ = 80000 Да, С = 2), лактатдегидрогеназу (ММ = 140000 Да, С = 4), триптофаназу (ММ = 220000 Да,С = 8), и др. Более того, известны ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию в организме одного вида, но представляющие собой различные молекулярные формы. Их называют изоферментами, выделение которых по высказанным причинам заметно осложняется. Большие по размеру компоненты (интактные клетки, неразру- шенные частицы ткани, ядра) осаждаются при дифференциальном центрифугировании быстрее — их собирают в осадок при срав- нительно невысоких скоростях; супернатант (от. лат. supematans — всплывающий), или надосадок подвергают последующему цен- трифугированию при более высоких скоростях. При этом в осадке могут быть митохондрии. В случае дальнейшего центрифугирова- ния при еще более высоких скоростях вращения ротора центри- фуги можно собрать рибосомы. Во время вращения ротора с большой угловой скоростью со развивается центробежное ускорение (G), во много раз превосхо- дящее силу тяжести и способное достигать величин 600—600000 g 49
(g=ускорение силы тяжести). G = со2г (г — расстояние, пройден- ное частицей). Так, для выделения ядер из дезинтеграта эукарио- тических клеток требуется 10 минут центрифугирования при 600 д, для изоляции лизосом и митохондрий — 5 мин. при 15000 д, для выделения рибосом — 1 час при 100000 д. Скорость продвижения частицы в направлении г (Vr) описывается уравнением Vr = (t — время) Центрифугирование дезинтеграта клеток или тканей при боль- ших скоростях в водной суспензии представляет собой турбулен- тный поток и сила сопротивления движению различных частиц ("твердых тел") определяется не вязкостью жидкости (ц), а ее плотностью (р), тогда сила сопротивления называется гидравличе- ской и описывается формулой F = CfSpv2, где F — гидравлическая сила сопротивления, Cf — коэффициент, зависимый от формы твердого тела, S — площадь поперечного сечения тела. Для сфери- ческого тела значения Cf находятся в интервале 0,05 — 0,2 в зависимости от характера поверхности (гладкая, шероховатая); для тонкого диска, перпендикулярного потоку, Cf равна примерно 0,55. Относительная роль динамического сопротивления и вязкого трения сказывается на поведении движущейся жидкости и харак- теризуется безразмерным числом Рейнольдса: Re=^pf = T]7v т] где 1 — характерный линейный размер. При обтекании тел 1 — это длина или поперечный размер, при течении в длинных трубках 1 — это диаметр трубки. В условиях центрифугирования скорости частиц и, следовательно, их числа Рейнольдса очень малы. Поэтому для определения силы сопротивления среды, действующей на частицу, пользуются законом Стокса. Согласно этому закону сила сопротивления, испытываемая твердым шаром при его медленном поступательном движении в неограниченно вязкой жидкости, описывается выражением Р = 6тгцРу, где R — радиус шара, т} —коэффициент вязкости жидкости, v — скорость движения шара. Параметры движения частицы можно вычислить по следующе- му уравнению, исключив из него коэффициент силы тяжести, поскольку направление г перпендикулярно направлению силы тяжести: G(pp-pp), где Vr скорость частицы в направлении г, G — центробежное ускорение, рр — плотность частицы, рр— плотность жидкости, т] — вязкость жидкости, R — радиус частицы. 50
При подходе к выбору биообъекта — продуцента того или иного энзима важно иметь хорошую (по скорости роста, продуктивности и активности фермента) культуру — штамм (не клон), так как поддерживать его в лабораторных и производственных условиях легче, чем клон. К тому же клоновые культуры используют, как правило, для генетических целей. Необходимо иметь в виду и такие факты, как полифермент- ность культуральных жидкостей или тканевых экстрактов, из которых предстоит выделить те или иные ферменты в индивиду- альном виде. Это особенно относится к гликансинтетазам и глика- назам, что является своеобразным отражением разветвленности углеводных полимеров (участие в синтезе более, чем одной синте- тазы) и их полидисперсности (опосредованность действия генети- ческого кода на процесс синтеза полисахарида во время роста и развития культуры клеток или ткани, то есть здесь имеет место нематричный синтез углеводного полимера). В таких случаях це- лесообразно применить афинную хроматографию (от англ, affinity — сродство). Афинная хроматография основана на специфичности биомо- лекул. Принципиально этим методом возможно получение абсо- лютно чистых веществ. В нативном состоянии ферменты за счет своего активного центра и регуляторного участка (одного или более) взаимодействуют с небольшим числом лигандов, которые представляют собой субстраты, либо эффекторы. Благодаря высо- кому сродству активного участка фермента к лиганду, их обрати- мому связыванию и отсутствию какой-либо другой реакции между лигандом и матрицей возможно эффективное проведение афинной хроматографии. В качестве лиганда обычно используют конкурентный обрати- мый ингибитор (см.), его ковалентно сшивают с соответствующей нерастворимой матрицей так, чтобы он не терял своей способности связываться с ферментом. Матрицей с лигандом в соответствую- щем буферном растворе заполняют колонку, а затем через нее пропускают раствор фермента, подлежащий очистке. В колонке задерживается лишь специфический фермент, а все другие при- меси уходят. После этого проводят элюцию специфического фер- мента, используя раствор субстрата в среде с другим pH и (или) ионной силой. При разделении ферментов методом афинной хро- матографии необходимо знать все кинетические параметры целе- вого фермента, располагать хорошей матрицей и удачно подобран- ным лигандом. В качестве примера приводим схему путей сшива- ния лиганда с одной из возможных гидроксильных групп полиса- 51
харида агарозы (или сефарозы) через удлиняющие мостики, на- пример диаминов типа H2N(CH?)xNH2 (х = 2 — 6) и £-аминокапро- новой кислоты: н,с—сн—сн,—сн,—сн,—с ООН 3 I Z Z Z NH2 Е- -аминокапроновая кислота агарозная матрица I I " I— —Г он он ОН ОН NH R - ЛИГАНД I R ,CNBr/R(CH,),NH бромциан C=NH (СН2)Х R производные изомочееины Хорошей матрицей для афинной хроматографии является три- сакрил марки GF 2000 (Франция), получаемый сополимеризацией 1Ч-акрилоил-2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиола и гидро- ксилированного акрилового бифункционального мономера. Три- 52
сакрил — высоко гидрофильный сополимер за счет вторичных амидных и первичных гидроксиметильных групп. Последние на- ходятся на поверхности молекулы, тогда как полиэтиленовый кор (от англ, core — сердцевина) полностью скрыт внутри. HN—С—СН2ОН HN——СН20Н со сн,он с0 сн2он I I --сн—СН2—сн—СН2---сн— СН2—сн—сн2— со-----------------со I сн9он I сн^он I I 2 I I 2 HN-C—CH2OH HN—С—СН2ОН сн2он сн2он трисакрип GF2000 Рис. 8. Получение некоторых сорбентов для а финной хроматографии на основе трисакрила GF 2000 (КДА — карбонилдиимидазол, НФХФ — нитрофенилхлоро- формиат, БЭ — бисэпоксироны, ГА — глутаралгдегид, М-Э-2ЭХ — N-этоксикарбо- нил -2-ЭТОКСИ-1, 2-дигидрохинолин, АЯК — ангидрид янтарной кислоты). Трисакрил стабилен при разных температурах — до 121°С и при рН1— 11, равно как устойчив к диссоциирующим агентам и поверхностно-активным веществам. В целях использования его для 53
афинной хроматографии проводят активацию такими веществами, как глутаральдегид, эпихлоргидрин, дивинилсульфон, р-нитрофе- нил-хлороформиат, карбонилдиимидазол, этилендиамин и др. (рис. 8). Активированный трис акрил используют затем для сшивания с лигандом. В качестве примера можно привести иммобилизацию лиганда на трисакриле, активированном глутаральдегидом (рис. 9). о сно сно > -C-NH”CH-CH-(CH2)2-CH=C-(CII2)2-C.HO + H^N-j лиганд!-* («Уз СНО о сно сно II I I -С-КН-СН-СННСН^-СН-СННСН^-СНО (СН2)3 NH СНО | ЛИГАНД | Рис. 9. Схема иммобилизации лиганда с трисакрилом, активированным глутараль- дегидом. В любом случае выделение и очистка ферментов — это наука, граничащая с искусством. В самом деле, если химическая реакция протекает с выходом 0,1% и с сотней побочных продуктов, то вряд ли химик-органик проявит интерес к процессу получения (и, тем более, очистки) целевого продукта. Но именно такие задачи встают перед биотехнологами, желающими получить индивидуальный бе- лок. В работе с биологическим материалом необходимы и важны знания предварительных характеристик по содержанию белка в различных биообъектах (даже в органах и тканях одного и того же вида животного). От этого зависит выбор материала, его предва- рительная подготовка для включения в технологический процесс. Молекулы ферментов чувствительны к различным воздействи- ям, поэтому при их выделении и очистке требуется соблюдать необходимые меры предосторожности: контролировать темпера- туру (нередко поддерживать ее близкой к точке замерзания ис- пользуемого растворителя), pH (как правило — с помощью буфер- 54
ных растворов), концентрацию белка, ионную силу раствора, концентрацию ионов тяжелых металлов (удаляют их с помощью комплексообразователей, например ЭДТА), значение окислитель- но-восстановительного потенциала (Ео), который должен поддер- живаться на низком уровне (например, с помощью меркаптоэта- нола). Следует иметь в виду и тот факт, что многие белки в разбавленных растворах проявляют склонность к денатурации — устойчивость возрастает в присутствии их субстратов. Из вспомогательных приемов очистки ферментов часто поль- зуются диализом, лиофилизацией, пропусканием растворов через соответствующие молекулярные сита (гелевые, мембранные). В качестве примера очистки гипотетического фермента приведена таблица 5. Из данных в таблице обращают на себя внимание сокращение объемов раствора, содержащего целевой продукт (в 200 раз), уменьшение содержания белка в 5 раз при заметном возрастании активности фермента в 100 раз (в расчете на 1 мг белка). Т а б л и ц а 5. Сравнительная характеристика методов очистки фермента "X” Содер- жание белка, мг/мл Активность Сум- марный выход, % Сте- пень (крат- ность) очист- ки Стадии очистки Объем раствора, л Ед/мл удель- ная, Ед/мг белка Экстракт белков - сырец 200 2,5 100 100 100 1 Высаливание аммония сульфатом 80 1,25 200 160 80 4 Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе 20 1,0 500 500 37,5 12,5 Препаративный электрофорез 5 1,0 1500 1500 37,5 37,5 Изоэлектрическое осаждение 3 0,3 2000 6700 30 167 Кристаллизация 1 0,5 5000 10000 25 250 55
Суммарный выход достаточно высокий, а степень очистки превосходная - в 250 раз. Но такие показатели далеко не типичны для разных ферментов. В качестве критериев чистоты ферментов используют данные электрофореза, ультрацентрифугирования (седиментограмма), оп- ределения молекулярной массы различными методами, по раство- римости (кривые растворения), оценки полидисперсности с опре- делением специфической активности каждой фракции, хроматог- рафирования на различных носителях и в нескольких системах, аминокислотного состава (особенно — при обнаружении белковых примесей), включая секвенирование (от англ, sequence — после- довательность) на автоматизированных приборах - секвенаторах, и т. д. В последние годы продолжает расти интерес к внеклеточным ферментам микроорганизмов, поскольку микробы — продуценты относительно легко культивируются в контролируемых условиях и подвергаются направленному изменению в сторону получения высокопродуктивных вариантов. У грамположитёльных бактерий экзоферменты топологически могуг быть строго внеклеточными (многие протеазы, гликозидазы и др.) и локализованными с наружной стороны клеточной мемб- раны, например, ос-глюкозидаза у Вас. licheniformis (это можно доказать при протопластировании клеток, когда ферменты пере- ходят в окружающую среду после удаления клеточной стенки). Грибы в отношении секреции экзоферментов уподобляют грам- положительным бактериям. У грамотрицательных бактерий экзо- ферменты дополнительно могут находиться в периплазм атическом пространстве. Казалось бы, что такие ферменты должны рассмат- риваться внутриклеточными, однако они достаточно легко осво- бождаются при осмотическом шоке или в результате протоп- ластирования клеток. Строго внеклеточных ферментов у грамположительных бакте- рий больше, чем у грамотрицательных, однако среди последних имеются выраженные продуценты их (аэромонасы, псевдомонасы, некоторые энтеробактерии и др.). Каким же образом секретируемые белки транспортируются через структуры клеточной оболочки? В конце 70-х годов XX в. была предложена так называемая сигнальная гипотеза (Г. Блобелидр., 1979). Согласно этой гипотезе 56
секретируемый белок через ЬтН?-конец удлиняется на 15—30 аминокислот, вкупе составляющих лидерный, или сигна- льный пептид, направляющий рибосому, из которой он появляется, к мембране. В мембране лидерный пептид вместе с другими мембранными белками формирует канал, стабилизирую- щийся при присоединении рибосомы. Рибосома синтезирует бе- лок, и он тут же экспортируется через пору. Этот механизм называется котрансляционной секрецией. После частичного или полного экспорта белка сигнальный пептид удаляется с помощью специфической сигнальной эндопептидазы. Решающую роль в секреции играет гидрофобная центральная часть сигнальной по- следовательности размером около 5,5 нм (от 15 до 19 аминокислот) и находящаяся в высокоупорядоченной конформации. NH?-Конец в составе гидрофильного домена (от англ, domain — регион, область) присоединяется к отрицательно заряженной внутренней поверхности цитоплазматической мембраны. В ходе трансляции белка гидрофобный участок сигнальной последовательности по- степенно внедряется в мембрану до появления участка расщепле- ния в форме петли на ее внешней стороне. После этого сигнальная эндопептидаза отщепляет сигнальную последовательность от рас- тущей цепи полипептида, способствуя тем самым котрансляцион- ной секреции белка (рис. 10). К настоящему времени доказано, что котрансляционная секре- ция присуща прокариотам и эукариотам. Таким путем секретиру- ются, например, а-амилаза у Bac.subtilis, 0-лактамаза у Bac.licheniformis, экзотоксин у Corynebacterium diphtheriae. После завершения котрансляционного транспорта рецептор- ные белки мембраны освобождаются и могут функционировать в плоскости мембраны. У прокариот и эукариот имеется также другой тип секреции —посттрансляционный, когда через мембрану транспортируется завершенный белок. Механизм транспорта объясняется либо с привлечением триггерной гипотезы У. Уикнера (1979), либо ранее рассмотренной сигнальной гипотезы (рис. И). Согласно обеим гипотезам роль белка - предшественника, обладающего сигнальной последовательностью, весьма велика. В первом случае эта после- довательность обеспечивает скручивание полипептида так, что гидрофобные области его связываются с мембраной. Затем белок может освобождаться из мембраны благодаря отделению сигналь- 57
Рис. 10. А - экспорт белка через мембрану путем котрансляционной секреции (1 —рибосомы, 2 — мембрана. 3 — пора в мембране, 4 — сигнальная последо- вательность, 5 — сигнальный пептид, 6 — рецептор сигнального пептида, 7 — сайт действия сигнальной эндопептидазы, 8 — рецептор рибосомы); Б — строение сигнального пептида белка 1am В Escherichia coli (А — гидрофильный сегмент, Б — гидрофобный сегмент, p-сайт расщепления; последовательность а инокислот; 1—метионин, 2 — изолейцин, 3 — треонин, 4 — лейцин, 5 — аргинин, 6 — лизин, 7 — аланин, 8 — валин, 9 — глицин, 10 — серин, И — глутамин, 12 — пролин); С — секреция белка через мембрану (М) по типу петли (1 — NH? - конец, 2 — гидрофобный участок, СП — сигнальная пептидаза). 58
ной последовательности за счет эндопротеолиза. Во втором слу- чае сигнальная последователь- ность полной полипептидной це- пи вместе с рецепторными бел- ками мембраны формирует по- ры. Бедок развертывается и про- исходит перемещение (трансло- кация), сопровождаемая удале- нием сигнальной последователь- ности. Для эукариот доказано, что их эндоплазматический ретику- лум содержит для работающей рибосомы своеобразные "при- чальные белки", к которым при- соединяется комплекс рибосомы с частицей, узнающей сигналь- Рис. 11. Схема посттрансляционного транспорта белков через мембрану со- гласно "триггерной гипотезе" по Уикне- ру (1979) — I и "сигнальной гипотезе" по Блобелу и др. (1979) — П. ную последовательность. Частица включает шесть полипептидных цепей и небольшую молекулу РНК с константой седиментации 7S. Причаливание рибосомы с частицей индуцирует трансляцию при последующей секреции растущего белка (рис. 12) до момента появления сигнального пептида из рибосомы, когда происходит блокада трансляции. На основе рассмотренной "сигнальной гипотезы" мож- но сформулировать следую- щие основные положения: 1) процесс экспорта бел- ков эволюционно консерва- тивен (прокариотические клетки узнают сигнальную последовательность эукариот и наоборот); 2) в мембране существует некий механизм экспорта, или аппарат секреции; I п Рис. 12. Начальные этапы векторного пере- носа белков в эукариотических клетках: I — блокирование трансляции, II — снятие блока трансляции после “причаливания” рибосомы — 1, сигнальная последовательность — 2; частица, узнающая сигнал — 3, "причаль- ный" белок — 4, мембрана — 5, сигнальный пептид — 6. 3) свободные рибосомы в цитоплазме клетки и рибосомы, связанные с мембраной, не раз- личаются между собой; 59
4) у эукариот на эндоплазматическом ретикулуме имеются так называемые причальные белки для функционирующих рибосом, соединенных с частицами, узнающими сигнальную последователь- ность; 5) секретируемые белки синтезируются обычно в форме более длинного предшественника; 6) белки, как правило, секретируются котрансляционно (реже — посттрансляционно), то есть растущий полипептид переносится через мембрану по мере трансляции; 7) в структуре подлежащего секреции белка может существо- вать "стоп"-последовательность, останавливающая секрецию и да- ющая начало интегральному мембранному белку. Следует вспомнить, что молекулярные массы (ММ) ферментов достаточно большие и находятся в пределах примерно от 12 до нескольких тысяч килодальтон (кДа). Ферменты с ММ более 100 кДа обычно представлены субъединицами (двумя и более). Нелегко себе вообразить, например, что кишечная палочка, размножающаяся в течение 20—30 минут, реализует множество направленных и строго избирательных биокаталитических процес- сов. Прямыми и косвенными доказательствами в опытах с фер- ментом трансаминазой аспарагиновой кислоты установлено, что отдельные стадии каталитической реакции протекают в простран- стве около нескольких сотен кубических миллимикрометров (нм) за время от десятитысячных до миллионных долей секунды. Для того, чтобы управлять действием ферментов, необходимы фундаментальные исследования по расшифровке молекулярных основ ферментативного катализа. Многое уже сделано в данном направлении, но это лишь начало, а желательно знать как можно больше о всех группах ферментов. Согласно классификации (КФ) ферменты подразделяются на шесть главных классов, каждый из которых включает подклассы и подподклассы: I. Оксидоредуктазы (КФ1.) — катализируют окислительно-вос- становительные реакции; II. Трансферазы (КФ2.) — катализируют реакции переноса функциональных групп (фосфатных, ацильных, гликозильных, аль- дегидных и др.); III. Гидролазы (КФЗ.) — катализируют реакции гидролиза 60
(перенос функциональных групп на молекулу воды); IV. Лиазы (КФ4.) — катализируют реакции присоединения по двойным связям и обратные реакции; V. Изомеразы (КФ5.) — катализируют реакции изомеризации, то есть перенос групп внутри молекулы с образованием изомерных форм; VI. Лигазы (КФ6.) — катализируют реакции образования связей С — С, С — S, С — ОиС — N, сопряженных с расходованием энергии АТФ или других нуклеозидтрифосфатов. Под класс и подподкласс ферментов соответственно обозначают вторым и третьим числами; порядковый номер фермента - четвер- тым числом в его подподклассе. Например, бетаин-гомоцистеин- метилтрансфераза имеет кодовый номер (шифр) — КФ 2.1.1.5, то есть согласно классификации (КФ) этот фермент относится к трансферазам (П-й главный класс), переносящим одноуглеродные остатки (первый подкласс) в форме метила — метилтрансферазы (первый подподкласс), номер конкретного фермента 5 (бетаин: L-гомоцистеин S-метилтрансфераза), катализируемая реакция здесь следующая: coo" сн,—SH I I CHj-N+=(CHj)3 + CHj , НС-NH, бетаин | * соон COOH CHj-S—CHj CH2-N=(CH3)2 + CH2 CH-NHj диметилглицин | соон L-гомоцистеин L- метионин Классификация и номенклатура ферментов имеют универсаль- ное значение, то есть они распространены на все ферменты, независимо от источника их получения. Со времени выделения Дж. Б. Самнером в 1926 г. уреазы в кристаллическом виде несомненно признавалось, что все фермен- ты — это простые или сложные белки. В 1981—1982 гг. Т. Р. Чех с сотрудниками открыл каталитическую активность у рибонукле- иновой кислоты. Этим опровергается универсальность принципа "фермент — это белок", а кроме того привносятся новые концепции в ранние этапы эволюции живой материи. Некоторые исследова- тели (Дж. Дарнелл-младший) считают, что первым веществом наследственности была РНК, а не ДНК, поскольку ей присуща 61
большая функциональная универсальность — она способна хра- нить информацию, воспроизводиться, направлять синтез белка и вести себя как фермент. Вместе с тем следует оговориться, что диапазон реакций, катализируемых РНК, еще недостаточно велик, чтобы указанное выше опровержение принималось сегодня в "конкурентный расчет". В отличие от небиологических катализаторов ферменты — высоко специфичны, они имеют активные центры, многие из них проявляют свою активность в присутствии коферментов (коэнзи- мов) небелковой природы, то есть в таких случаях ферменты являются сложными белками. К сожалению, до сих пор нет достаточной четкости в определениях коферментов и кофакторов. Одни авторы отождествляют эти понятия, другие используют лишь один термин — коферменты, третьи выделяют ионы некоторых металлов в разряд активаторов, прямо не связывая их с кофермен- тами, и т. д. Накопленный фактический материал служит веским основанием подразделять белки-ферменты на две группы — про- стые ферментные белки и сложные ферментные белки, из которых сложные содержат в своем составе неорганические и/или органи- ческие небелковые структуры — коферменты. Коферменты могут обратимо или необратимо (простетические группы) связываться с белковой частью — апоферментом. Полный ферментный комплекс называют холоферментом. Если же действие некоторых фермен- тов лишь активируется неорганическими ионами или атомами металлов и не снимается полностью в их отсутствии, то такие активаторы следует называть кофакторами. Функции контакта с субстратом и катализа у простых фермен- тных белков выполняют боковые радикалы аминокислот в пол- ипептидной молекуле; в сложных ферментных белках эти функции выполняют преимущественно коферменты. Коферменты классифицируют по каталитическим и структур- но-функциональным признакам. Например, коферментами окси- до-редуктаз являются: НАД, НАДФ, ФАД, ФМН, липоевая кислота и др.; коферментами трансфераз-пантотенат, УДФ-глюкоза, ЦДФ- холин, тетрагидрофолиевая кислота и др. Ряд коферментов явля- ются производными витаминов: тиамина (декарбоксилазы а-кето- кислот, транскетолазы), рибофлавина (ФМН, ФАД), пантотеновой кислоты (кофермент А), никотинамида (НАД, НАДФ) и т. д. Отсюда 62
понятна необходимость отдельных витаминов в питательных сре- дах для биообъектов. Достаточно много ферментов (порядка 25%) относится к метал- лоферментам, представляющим собой одну из групп металлобио- молекул. Такие ферментные белки без металлов не проявляют фермен- тативной активности. В тех же случаях, когда ионы металлов не выполняют роли коферментов (металлы-кофакторы), а лишь акти- вируют ферментативные реакции, то такие ферменты по сути Металлоби о молекулы Ферментные белки Оксщщредуктазы Оксидазы (Fe.Cu.Mo) Дегидрогеназы (Fe,Cu.Mo) Гидроксилазы (Fe,Cu,Mo) Оксигеназы (Fe) Супероксид— дисмутаза (Cu,Zn,Mn) Нитрогеназы (Fe,Mo) Гидрогеназы (Fe) Транспортные и аккумулирующие белки 4 Переносчики электронов Цитохромы (Fe) Fe — S(Fe)— белки Си—белки Аккумулирующие, уравсреррцыг It Структурные Ферритин (Fe) Трансферрин (Fe) Церулоплазмин (Fe) Небелковые молекулы Фотовосстанав — _лйвающй_е." Хлорофилл (Мд) и Фотосистема II (Мп, Мд) Транспортирующие металлы и структур — .мгё. Сидерофоры (Fe) Скелетные (Ca,Si) Гидролазы Карбоксипепти— даза (Zn) Аминопептидазы (Мд, Мп) Фосфатазы (Mg,Zn,Cu) Связывающие О2 Миоглобин (Fe) Гемоглобин (Fe) Гемеритрин (Fe) Гемоцианин (Fe) Изомердзы _и_синтетазы Витамин В12—белок Коэнзимы (Со)—белки 63
своей не являются металлоферментами. Их следует называть ме- таллоактивйрованными ферментами. Можно утверждать, что в металлоферментах ионы металлов выполняют и каталитическую и структурную роли, тогда как в металлоактивированных ферментах — преимущественно катали- тическую. Тем не менее металлы в качестве коферментов и кофакторов в какой-то части сходны в своих функциональных проявлениях. Для металлоактивированных ферментов возможны 4 схемы трехчленных комплексов, участниками которых являются фермент (Ф), субстрат (С) и металл (М) в стехиометрическом соотношении 1:1:1. М 1) Ф—С—М, 2) Ф—М—С, 3) М—Ф—С, 4) Ф [ С В первой схеме мостиковое положение занимает субстрат, во второй — металл, в третьей — фермент и в четвертой — металл в циклическом комплексе. Металлоферменты, например, не форми- руют комплекс Ф—С—М, так как при очистке они выявляются в форме Ф—М. Металлоферментами являются так называемые геминовые ферменты (каталаза, пероксидаза, цитохромоксидаза), в составе которых имеется простетическая железопорфириновая группи- ровка, или гем; трансферазы, у которых коферментная форма витамина В12 представлена 5'-дезоксиаденозилкобаламином. Все ферменты с коферментом В12 катализируют реакции об- мена водорода, связанного с углеродом, на какую-либо иную 64
Витамин Bi2 группу (алкильную, аминную, гидроксильную, карбоксильную). Другая коферментная форма витамина В12 — метил-кобаламин (группа CN в коррине замещена метилом) участвует в реакциях переноса метильных групп. Кофермент В12 в определенной степени сходен с гемом, однако вместо железа в нем содержится кобальт. В настоящее время стали известны и новые коферменты. Например, корфин (фактор 430) представляет собой никельтетра- пиррол и напоминает рассмотренные выше макроциклические структуры гема и коррина. Корфин выступает коферментом окси- доредуктазу метанобразующих бактерий, связанных с окислитель- но-восстановительным превращением одноуглеродного субстрата. 3 т. 8524 65
В метанообразующих бактериях найдены также фактор 420, оказавшийся гидридным донором, и фактор, восстанавливающий диоксид углерода. У метилотрофных бактерий, окисляющих метан, обнаружен кофермент метоксатин, содержащий в своей молекуле ортохино- новую простетическую группу. Оксидоредуктаза — глюкозодегид- рогеназа Acinetobacter calcoaceticus содержит сходную ортохино- новую простетическую группу. Вот почему такие ферменты пол- учили название хинобелки. 66
фактор, восстанавливающий COj Механизм действия этих коферментов точно пока неизвестен. Кофакторами в металлоактивированных ферментах часто вы- ступают ионы магния, цинка, кальция, то есть металлы с постоян- ной валентностью. Например цинк активирует алкогольдегидроге- назу, щелочную фосфатазу; кальций - а-амилазу; магний — АТФ- азу, гексокиназу и многие другие ферменты; марганец (или магний) — енолазу; калий — пируваткиназу, и т. д. Из сказанного о металлоферментах и металлоактивированных ферментах следует, что наличие определенных ионов в среде культивирования биообъектов строго обязательно. Кинетические характеристики биокатализаторов, определяю- щие активность и длительность работы ферментов в различных условиях, являются важными показателями и при промышленном получении ферментов. Все эти данные подробно рассматриваются в курсе биохимии. Здесь же мы останавливаемся лишь на важней- ших параметрах, без которых биотехнология ферментов будет недостаточно охарактеризованной. В процессе биокатализа активность ферментов и, следователь- но, их каталитические функции снижаются. Кажущаяся структур- ная громоздкость их в нативном виде (от лат. nature — природа) с лихвой компенсируется эффективностью катализа, если сравни- вать их с неорганическим ("простыми") катализаторами. Однако в изолированном виде ферменты достаточно легко инактивируются, что приобретает важное значение для практики. Отсюда возникает проблема стабилизации активности ферментов в случаях их про- мышленной эксплуатации. Следует заметить, что in vivo инактива- ция и активация ферментов, равно как и синтез их de novo или denuo (по-лат. — заново), регулируется самим организмом. К тому же в организме (клетке, ткани) многие ферменты находятся в связанном состоянии. Очевидно, что при этом их конформации больше или меньше изменяются, что не безразлично для клетки с 67
функциональной точки зрения. Из практической работы известно немало случаев, когда неполностью очищенные ферменты были какое-то время активнее и стабильнее чистых образцов биоката- лизаторов. На этом основании можно предполагать, что так назы- ваемые примеси создавали благоприятное окружение ферменту и, очевидно, выгодное потребителю. Стабилизация ферментов могла быть обусловлена разными факторами, например, иммобилиза- цией на мембранных структурах, соединением с высокополимер- ными углеводами или гликоконъюгатами и пр. Подобная стабили- зация сродни консервации белковой молекулы, так как здесь речь идет о сохранении фермента какое-то (обычно более или менее длительное) время со всеми присущими ему параметрами. В любом случае при получении ферментов в производстве необходимо опираться на воспроизводимые результаты, заложен- ные в регламенте. Активность и стабильность — как параметры важны и для вновь внедряемых в производство ферментов, поскольку предполагаемая их "выходная активность” приобретает существенное значение с точки зрения выбора (или проектирования) конструкции реактора, оснащении его необходимой контрольно-измерительной аппарату- рой и т. д. (в частности, для исключения быстрой инактивации фермента). Активность биокатализаторов измеряют в международных еди- ницах (ME) — 1 ME соответствует количеству фермента, превра- щающему 1 микромоль (мк/моль; 10’6 моль) субстрата в 1 мин. в стандартных условиях. Единицы активности могут быть выражены в мкЕ, нЕ и пЕ, то есть соответственно в микро-, нано- и пикоеди- ницах с учетом превращения 10'6, 10'9 или 10'12 моля субстрата в 1 мин. Удельную активность выражают в единицах на 1 мг белка. С 1973 г. введена единица ферментативной активности катал (кат.), соответствующая количеству катализатора, способного превра- щать 1 моль субстрата в продукт за 1 секунду. Тогда соотношения катал и ME будут следующими: 1 кат= 1 моль субстрата • С'1 = 60 моль» мин1 =60»106 мкмоль» мин-1 = 6»107 ME, 1 МЕ= 1 мкмоль* мин ‘= 1/60 мкмоль* с’* = 1/60 мккат= 16,67 нкат= 16670 пкат. Все это косвенно подтверждает факт трудности выделения ферментов в чистом виде и на практике приходится чаще иметь дело с группой белков в продукте — сырце или в исходном материале, или, наконец, в других партиях материала, подлежащих разделению. В лабораторных и производственных условиях нередко прихо- 68
дится иметь дело с денатурацией ферментов в зависимости от ряда факторов, например, биологических — гидролиз целевого продукта какой-либо пептид-гидролазой, находящейся в исходном сырье или привнесенной случайно, например, при микробном загрязнении; физических — неадекватное температурное, механическое, ради- ационное воздействия; химических — pH, комплексообразовате- лей, растворителей, ионогенных поверхностно-активных веществ, тяжелых металлов и т. д. Естественно, что от качества выделения и очистки фермента зависит надежность анализа его структуры. Тем не менее, следует помнить, что одинаковые ферменты, выделяемые из различных источников, могут иметь разные аминокислотные последователь- ности и, следовательно, они не тождественны — их каталитическая активность и свойства будут различными. В качестве примера можно назвать вид Вас. coagulans, образующий глюкозоизомеразу; этот фермент активируется ионами Со2+ , а такой же фермент, продуцируемый мутантом данного вида при pH более 8, не нуж- дается в ионах кобальта. Вот почему точность имеющейся инфор- мации об источнике фермента, его технологии, паспортных данных приобретает исключительную важность при сравнении фермента, выпущенного разными фирмами-изготовителями. М. Левитт и К. Чотиа в 1976 г. подразделили структурно известные белки по наличию и расположению сс-спиралей и (3-слоев на пять классов: I — белки, состоящие только из ос-спиралей, уложенных вместе в глобулярную структуру; И — белки, состоящие только из (3-слоев и формирующие глобулу в форме бочонка; III — белки, включающие ос-спирали и (3-слои (а + (3-белки), но разобщенные в третичной структуре; IV — белки сс/(3, в которых а- и ^-структурные участки чере- дуются в первичной структуре, формируя третичную структуру, в центре которой находятся обычно параллельно уложенные (3-слои, окаймленные с обеих сторон ос-спиралями; V — обычно малые молекулы с многими -S—S-мостиками или ассоциированные с крупным кофактором "неупорядоченные бел- ки", обладающие слабой вторичной структурой. На рис. 13 представлены схемы Дж. Ричардсон (1981) для различных белков, отнесенных к какому-либо одному из пяти вышеназванных классов. 69
Рис. 13. Пять классов белков по Дж. Ричардсон (1981): А — миохемеритин (класс I), Б -— Си, Zn—супероксиддисмутаза (класс II), В -— лизоцим (а+Р-структура, III класс), Г и Д — две ортогональные проекции НАД—свя- зывающего домена лактатдегидрогеназы (IV класс), Е — тризофосфатизомераза (IV класс), Ж — нейраминидаза вируса гриппа (V класс). ж Более или менее длинные цепи белков, как правило, формируют домены, представляющие собой свернутую в пространстве струк- туру, имитирующую маленькую белковую молекулу. Доменам присущи функции связывания, и в ферментных белкюс активный центр располагается преимущественно на границе между двумя или большим числом доменов. К настоящему времени установлено, что домены способны перемещаться друг относительно друга в процессе функционирования содержащей их молекулы. В трипси- ногене домен из неупорядоченного состояния переходит в упоря- доченное в ходе активации зимогена. 70
Заметный прогресс в изучении структуры белков начался с конца 70-х годов текущего столетия. Если до этого структуры их выводили на основании метода диффракции нейтронов, карт распределения электронных плотностей с введением в молекулы белков тяжелых атомов, то в последующие годы были развиты методы синхронной радиации, методы с использованием компью- терной техники, что сослужило огромную службу кристаллогра- фии данных биополимеров. В этой связи статичный метод рентге- ноструктурного анализа одиночного кристалла способен дать ди- намичную информацию. На основании указанных методов пока- зано, например, что фермент лизоцим имеет оболочку из 33—35 прочно связанных молекул воды и менее упорядоченную область из 95—105 молекул воды, соединенных с белком лишь одной водородной связью. Около 60—80% остальной воды распределено в промежутках между кристаллами и не влияет на электронную плотность белка. Молекулы белков не являются жесткими структурами — они подвижны л, следовательно, достаточная лабильность молекул ферментов (молекулярная вибрация) играет важную роль в узна- вании субстрата и стабилизации переходного состояния. Чтобы увидеть ферменты в действии стали использовать метод рентгеноструктурного анализа при низких температурах (криоэн- зимология) — можно сделать "стоп-кадры" в кинетически значи- мых точках катализируемой реакции. Теперь хорошо известно, что ферменты, внедряемые в про- мышленность выгодно отличаются от неорганических (или синте- тических) катализаторов рядом преимуществ, существенным из которых следует назвать низкую энергоемкость ферментативных процессов, то есть сравнительно небольшие затраты внешней энергии. На каталитические процессы в промышленности прихо- дится 80—90% и доля их продолжает возрастать. В неорганическом синтезе, например, получают контактным способом десятки мил- лионов тонн серной кислоты в год. При контактном процессе окисление SO2 в SO3 протекает в присутствии катализатора V2O5 с добавлением К2О и других оксидов. В органическом синтезе на никелевых катализаторах осущест- вляют многие реакции гидрирования соединений, включающих С = С, С= С, С = О, NO2 — группы. Для примера назовем алюмо- молибденовые, алюмохромовые и алюмоплатиновые катализато- ры, применяемые для дегидрирования линейных и разветвленных алканов в олефины. Так, катализаторы на основе оксида хрома, применяемые в реакции превращения бутана в бутен, работают при температуре около 600°С, а регенерация их протекает при 640—650°С. Оксидные катализаторы окисления С03О4, СщОз, NiO 71
эффективны также при температурах 250—600°С. Лишь отдельные катализаторы полимеризации (ВЁз) проявляют свое действие при —80°—100°С, например, при получении полиизобутилена. Однако чтобы добиться понижения температуры до —80° или —100° С, также необходима затрата энергии. Напротив, все биохимические реакции в живых системах потекают при сравнительно низких температурах. Например, фер- менты микроорганизмов — сапрофитов, живущих в почве средних широт нашей страны, относятся к мезофилам, то есть их ферменты эффективно действуют в пределах от + 10 до +50°С (с преимуще- ственным интервалом от + 20 до + 30°С). Нечто аналогичное можно сказать и о ферментах растений. Ферменты животных более эффективны при нормальной температуре тела. Тем не менее, следует помнить, что для каждого фермента есть свои так называемые кардинальные точки температуры, pH и др. (minimum, optimum, maximum). Необходимо также отметить и тот факт, что скорости фермен- тативных реакций при оптимальных условиях многократно превы- шают скорости реакций, в которых используются неорганические (синтетические) катализаторы. Ферменты, с точки зрения энергетики, заметно снижают энер- гию активации химических реакций. Под энергией активации понимают количество энергии в Джоулях, необходимое для при- ведения всех молекул 1 моля вещества при определенной темпе- ратуре в состояние критического энергетического уровня (пере- ходный уровень), при котором начинает происходить химическая реакция. Если не все молекулы вещества достигают переходного уровня, то скорость химической реакции снижается. Основные пути повышения скоростей реакции — это либо использование температурного фактора, либо катализаторов. В случае применения неорганических или синтетических катализа- торов необходимо использовать в большинстве случаев высокие температуры. Как уже было сказано, биокатализаторы эффективно работают при сравнительно низких температурах. Скорости реак- ций зависят от концентраций субстратов. Когда фермент насыщен субстратом, он не может функционировать быстрее — это и есть максимальная скорость реакции (Vmax), то есть, когда доля свобод- ного фермента оказывается предельно низкой. Общая скорость ферментативной реакции должна быть про- порциональной концентрации фермент-субстратного комплекса ES (Е — энзим, S— субстрат). Зависимость скорости фермента- тивной реакции от концентрации субстрата графически представ- ляется гиперболической кривой (рис. 14). Км на рисунке представ- ляет собой константу Михаэлиса—Ментен, то есть концентрацию
Рис. 14. Зависимость скорости (V) ферментативной реакции от концентрации субстрата специфического субстрата, при которой конкретный фермент обеспечивает скорость реакции, равную половине Vmax- До насто- ящего времени анализ кинетики всех ферментативных реакций проводят на основе следующего математического уровнения Ми- хаэлиса—Ментен: v _ Vmax [-S] ° Км + [S] где Vo — начальная скорость при концентрации S, Vmax — максимальная скорость и Км — константа Михаэлиса—Ментен для данного фермента, соответствующая определенному субстрату. Нередко прибегают к преобразованиям уравнения Михаэли- са—Ментен для получения каких-либо преимуществ при изучению кинетики ферментативных реакций. В частности, к таким преоб- разованиям относится уравнение Лайнуивера-Бэрка: 1 _ Км 1 1 Vo Vmax [S] Vmax Согласно этому уравнению, по графику, построенному в двой- ных обратных координатах, можно более точно определить Vmax (рис. 15). На основании взаимодействия фер- ментов и специфичных им субстратов, а также учитывая множество фермента- тивных реакций в клетке или в организ- ме, и, наконец, принимая во внимание другие взаимодействия в биосистемах (антигены-антитела, токсины и их рецеп- торы и т. д.), можно говорить о компле- ментарности как основе биологической специфичности. В большинстве случаев имеет место молекулярная комплемен- тарность. Такие взаимодействия проте- кают согласно законам термодинамики. Однако известны взаимодействия фер- ментов с другими веществами, кото- рые сопровождаются снижением J ш полным подавлением активности био- катализаторов. Вещества, подавляю- щие ферментативные реакции, назы- вают ингибиторами (от англ, inhibit — препятствовать, сдерживать). Они из- бирательно взаимодействуют с фер- ментами, например, цианиды, оксид углерода, азид натрия ингибируют оп- 73 Рис. 15. График двойных обрат- ных координат.
ределенные окислительно-восстановительные ферменты; иодаце- тамид, ртутные и мышьяковистые соли блокируют тиоловые фер- менты; амины, гидразиды и др. взаимодействуют с карбонильной группой ферментов и, как следствие, ингибируют их активность. Очевидно, что в живой клетке на принципе "активация-ингибиро- вание" проявляется и требуемая клетке функциональная актив- ность в соответствующих условиях существования. Все ингибиторы подразделяют на обратимые и необратимые: среди обратимых выделяют конкурентные и некон- курентные. Обратимые ингибиторы образуют непрочные комплексы с ферментами [EI], которые способны распадаться на исходные компоненты. Е+1 <-> EI Мерой ингибирования является та концентрация ингибитора, которая вызывает угнетение фермента наполовину (I50). Отсюда, чем меньше величина I, тем сильнее ингибитор, а чем больше I, тем слабее. В случае взаимодействия необратимых ингибиторов комплексы [EI] не распадаются и реакция протекает лишь вправо Е + I —► EI Конкурентный ингибитор связывается с активным центром фермента и далее, в отличие от фермент-субстратного комплекса, не подвергается ферментативной трансформации. Следовательно, конкурентный ингибитор выступает конкурентом субстрату за связывание с активным центром. Изменяя концентрации субстра- та, можно вытеснить из комплекса ингибитор. Примером конку- рентного ингибитора сукцинатдегидрогеназы является малонат (в норме — субстратом выступает сукцинат). Неконкурентный ингибитор связывается где-то в другом месте фермента, а не с активным центром. При этом изменяется кон- формация всей молекулы фермента, сопровождающаяся обрати- мой инактивацией его каталитического центра. Неконкурентные ингибиторы взаимодействуют и со свободным ферментом и его фермент-субстратным комплексом: Е + 1**Е1 ES+I о ESI Комплексы EI и ESI становятся неактивными. Из сказанного можно сделать вывод о том, что в работу ферментов может вмешиваться множество различных веществ, с помощью которых регулируется их биосинтез и активность. Био- синтез ферментов будет рассмотрен позднее в этой главе. Что же 74
ПВ отходы Рис. 16. Идеализированная клетка в устойчивом состоянии (ПВ — питательные вещества). касается регуляции активности биокатализаторов, то, наряду с большим накопленным материалом в этом-направлении, открыва- ются новые пути обмена, в регуляции которых участвуют фермен- ты, и познание которых становится насущно необходимым; давно возникла потребность полнее изучить взаимодействие между известными ме- таболическими циклами с определением роли и механизмов энзиматического ре- гулирования такого взаимодействия, а также исследовать глубину участия раз- личных ферментов в поддержании гоме- остаза организмов (от греч. oemoios — подобный, одинаковый, stasis — состоя- ние, неподвижность), то есть устойчи- вость их внутренней среды. Любая живая клетка представляется устойчивой системой, поддерживаю- щейся однонаправленным потоком ме- таболитов (рис. 16). В зрелых клетках концентрации ме- таболитов относительно постоянны. Гибкость устойчивой системы, каковой является зрелая клетка, подтверждается слабыми изменениями и уравновешива- нием сдвигов, благодаря чему организм поддерживает постоянство внутренней среды вопреки широкому разнообразию питательных веществ, качества воды, внешней тем- пературы и т. д. При переходе от одноклеточных организмов к многоклеточным регуляторные механизмы ферментативных процессов существен- но усложняются, хотя основные концепции приложимы к сущест- вам любой организации. В лабораторных или производственных условиях трудно или невозможно увязать изменение ферментативной активности в клетке (ткани) с каким-либо одним (из двух) процессом — возра- станием количества фермента или возросшей эффективностью биокатализатора. Более определенно можно говорить о повышении или понижении активности в тех случаях, когда имеют дело с ферментом в системе (-ах) in vitro, тем более, что большинство результатов по оценке регуляции их активности получены в таких системах. В механизмах регуляции ферментативной активности у эука- риотических клеток (в отличие от прокариот) существенна роль физического разграничения (компартментализация) внутреннего 75
содержимого (протопласта). Организация набора ферментов, ка- тализирующих соответствующую последовательность метаболиче- ских реакций, в виде макромолекулярного комплекса координи- рует ферменты и "канализует" интермедиаты (промежуточные продукты) по данному метаболическому пути. Более того, конфор- мационные изменения в одном компоненте комплекса может передаться благодаря бёлок-белковому взаимодействию другим ферментам комплекса. Вследствие этого возможно приумножение регуляторных эффектов. Велика роль ионов металлов в металлоферментах и металлоак- тивированных ферментах, в которых аденозин-трифосфат (АТФ) выступает субстратом. Когда комплекс "АТФ-ион металла" оказы- вается субстратом реакции, то обычно максимальная активность наблюдается при молярном соотношении АТФ и металла близким к единице. При избытке того или иного из этих ингредиентов отмечается ингибиторный эффект. Поскольку нуклеозидди- и три- фосфаты образуют стабильные комплексы с дивалентными кати- онами, постольку внутриклеточные концентрации нуклеотидов могут влиять на внутриклеточное содержание свободных ионов металлов и, как следствие, на активность определенных ферментов. Например, конфигурация глутаматсинтетазы кишечной палочки в отсутствие ионов металлов релаксирует ("расслабляется") и стано- вится каталитически неактивной; добавление Мо2+ или Мп2+ вос- станавливает активность фермента. Каталитическая активность и регуляция активности ферментов могут протекать в форме мгновенного обратимого ингибирования по типу обратной связи (Feedback inhibition) с использованием аллостерических эффекторов небольшой молекулярной массы, не имеющих структурного сходства с субстратами или коферментами и связывающимися с аллостерическими сайтами (не активными центрами) ферментов. д Ф1 _ Ф2 _ ФЗ г Ф4 .. А------>Б------>В----->Г------>Д Это — механизм грубого контроля регуляции активности фер- ментов. В указанной схеме продукт Д способен связываться с первым ферментом (Ф1) или ингибировать его. Следовательно, Д — это отрицательный аллостерический эффектор или Feedback- ингибитор Ф1 и таким образом может регулироваться синтез Д. В качестве примера такой регуляции можно назвать ингибирование триптофаном антранилат-синтетазы у микроорганизмов на пути 76
синтеза триптофана, где промежуточным продуктом является ан- траниловая кислота. Различают кумулятивную, мультивалентную (согласованную) и кооперативную Feedback-ингибиции. В первом случае два или более конечных продукта ингибируют строго аддитивно один регуляторный фермент; во втором — два и более конечных про- дукта находятся в избытке и только при этом условии происходит полная ингибиция реакции; при кооперативной ингибиции един- ственный конечный продукт, присутствующий в избытке, тормо- зит действие регуляторного фермента, но когда, при наличии двух и более конечных продуктов, торможение заметно превышает аддитивные эффекты кумулятивной Feedback-ингибиции. В отличие от Feedback-ингибиции Feedback-репрессия заклю- чается в том, что производное (дериват) конечного продукта (ре- прессор) подавляет образование ферментов (а не влияет на их активность) в данном метаболическом пути: А Ч1 ,б Ф-2 ,В—^Г-24-ffl (конечный . \ \ I / Г продукт) --------------J---репрессор | аминокислоты] Регуляторную роль в каталитической активности может играть так называемая ковалентная модификация, когда к ферменту присоединяется фосфатная группа (обычно у эукариот) или нук- леотид (обычно у прокариот). Ферменты, подвергающиеся кова- лентной модификации, сопровождаю- щейся модуляцией их активности, на- зываются интерконвертирующими. Они существуют в двух активных со- стояниях — высокой и низкой катали- тической активности (рис. 17). В ряде случаев конечный или про- межуточный продукт используется в ка- честве активатора какого-либо фермен- та — это аллостерическая активация или Feedback-активация. Наряду с грубой регуляцией актив- ности ферментов по механизму Feedback-ингибиции известен тонкий контроль, в котором ферменты — алло- стерические белки имеют не только ка- талитические центры для связывания с субстратом, но и близко расположен- ные другие места (одно или более), с 77 Е НДФ ФФн\£ НТФ Mg h-* НМФ-Е Рис. 17. Регуляция фермента- тивной активности ковалент- ной модификацией (Е-фермент; НТФ, НДФ и НМФ-соответст- венно нуклеозид три-, ди- и мо- нофосфаты, ФФн-неорганиче- ский пирофосфат).
которыми связываются небольшие молекулы — эффекторы. При- соединяясь к своему месту, эффектор вызывает конформационное изменение в ферменте. При этом родство каталитического центра фермента к субстрату либо уменьшается — наступает аллостери- ческая ингибиция, либо, напротив, возрастает — наступает алло- стерическая активация (рис. 18). Рис. 18. Схематичное изображение модификации активного центра (АЦ) фермента (Ф) с помощью эффектора (Э), взаимодействующего на аллостерическом сайте (А); S-субстрат, (а)—аллостерическая ингибиция, (б)—аллостерическая активация. При реализации инженерно-энзимологических процессов важ- но знать и, следовательно, применять эффекторы на практике. Вследствие компартментализации клеточных процессов у эукариот остаются неизвестными концентрации эффекторов (а нередко — и сами эффекторы) в клетках. Ярким примером здесь служит фосфофруктокиназа - давно и хорошо изученный фермент глико- лиза. Оказалось, что она имеет эффектор — фруктозб-2,6-дифос- фат, открытый лишь 10 лет назад X. Г. Херсом, Л. Хью и Е. Ван Шафтингеном. Очевидно, что во всех рассмотренных примерах регуляции активности ферментов важное значение имеет чувствительность биокатализаторов к регуляции, то есть нередко усиление (ампли- фикация) "сигнала" может оказать решающее влияние на включе- ние—выключение каскада реакций. 78
Глава 4 ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ОБЛАСТИ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ВИРУСОВ, КЛЕТОК И ТКАНЕЙ Чтобы с максимальной, продуктивностью использовать биообъ- ект в биотехнологическом процессе, необходимо знать и учитывать его структурно-функциональные особенности применительно к конкретным условиям производства. В большинстве случаев каче- ство и количество целевого продукта в значительной степени находятся в прямо пропорциональной зависимости от качества и количества продуцента. Совершенно очевидно, что подходы здесь к акариотам, прокариотам и эукариотам должны быть различными, поскольку первые, например, являются облигатными паразитами и могут развиваться лишь в живых клетках (тканях); бактерии структурно менее дифференцированы, чем эукариоты и поэтому они в большинстве своем менее требовательны к условиям обита- ния, чем грибные, растительные и животные организмы. 4.1. Акариоты. Ряд бактериофагов, вирусов растений и млеко- питающих широко используют в биотехнологии, особенно — в рДНК-биотехнологии (см. ). У них наследственный материал уст- роен наиболеё просто и работа с ним по этой причине несколько облегчается, хотя понятно, что она на самом деле "ювелирная". Как уже было сказано в главе 2, вирион представляет собой нуклеокапсид и архитектоника вирусных частиц не одинаковая (см. рис. 1а и 226). Многие вирусы животных представляют собой "голые" нуклеокапсиды (аденовирусы), тогда как другие (вирусы герпеса и оспы) имеют дополнительную оболочку (суперкапсид), нередко приобретаемую во время освобождения нуклеокапсида из клетки организма-хозяина. "Голый" спиральный нуклеокапсид ви- руса табачной мозаики — ВТМ (вирион) имеет молекулярную массу (ММ) 39» 106 дальтон (Да), а его единственная молекула РНК — 2,06*106 Да. Некоторые вирусы имеют двухнитевую РНК, на- пример, реовирусы, ММ которой равна 9*106 Да. У большинства вирусов, содержащих ДНК, нуклеиновая кис- лота является двухнитевой (равно как и у многих бактериофагов). В качестве исключения можно назвать парвовирусы и coli-фаг <рХ 17 4, имеющих однонитевую ДНК. Молекулярные массы ДНК различны и достигают следующих величин: у coli-фага <рХ174 — 1,7*10® Да, у четных бактериофагов Т2, Т4 и Те — 1,2*10® Да, у герпесвирусов — 1*10® Да, у вируса оспы — 1,5*10® Да и т. д. Капсид любого вируса построен из 5—6 белковых субъединиц — капсомбров; это - морфологические единицы, расположенные, 79
Рис. 19. Схема строения вируса мозаики табака: А — вид сбоку, В — вид сверху; 1 — одноцепочечная РНК, 2 — Белковые субъединицы. как правило, строго регуляр- но, благодаря чему капсид приобретает специфический тип молекулярной симметрии — спи- ральный или куби- ческий. Например, вирус табачной мозаики имеет спи- ральный тип симметрии. Его спиралевидная РНК упакова- на в винтообразно располо- женные капсомеры и, в целом, вирион представляется палоч- ковидным (рис 19). Спираль- ный тип симметрии характерен также для вирусов: бешенства, гриппа, желтухи свеклы, кори, ложной чумы кур, парагриппа, паротита, сендай, чумы рогатого скота, чумы собак и др. Кубический тип симметрии является наиболее распространен- ным среди большинства известных ныне вирусов. Из трех типов Рис. 20. Икосаэдр с тремя осями симметрии (а, б, в). фигур с кубической симметрией: тетраэдр (оси симметрии 2:3, минимальное число структурных единиц 12), октаэдр (оси симмет- рии 4:3:2, число структурных единиц 24) и икосаэдр, или правиль- ный многогранник (оси симметрии 5:3:2, число структурных еди- ниц 60) последний наиболее част у вирусов. Это объясняется тем, что в случае икосаэдра минимальное число структурных единиц оказывается наибольшим, и, следовательно, данный тип симметрии пространственно наиболее экономичен (не требуется изготовления крупных молекул при сборке вибриона). На рис. 20 изображен икосаэдр с тремя осями симметрии (5:3:2). В правильном икосаэдре имеется 6 осей симметрии пятого порядка, проходящие через 80
вершины (а), 10 осей симметрии третьего порядка, проходящие через центры треугольных граней (б) и 15 осей симметрии второго порядка, соединяющих середины ребер (в). Икосаэдр обладает 12 вершинами, 20 гранями и 30 ребрами. Капсиды некоторых вирусов "осложнены" дополнительными структурами. Так, например, у аденовируса капсид формируется в виде икосаэдра с 6 капсомерами вдоль каждого ребра; всего в капсиде 252 капсомера, из которых 240 имеют сферическую форму и располагаются вдоль ребер и на гранях икосаэдра. Каждый капсомер соседствует с 6 другими капсомерами, поэтому они называются гексамерами, или гексонами (в рассматриваемом примере их 240). Остальные 12 капсомеров располагаются на 12 вершинах икосаэдра и соседствуют с 5 капсомерами (п е н т а м е р, или пентон). Эти 12 капсомеров (пентонов) состоят из сферического основания и длинной нити, которая может обеспечивать прикрепление вириона к клетке (рис. 21). Рис. 21. Схематичная модель аденовируса с внутрен- ним ДНК-протеиновым кором и внешним капсидом — икосаэдром (П-гексон — 120000 Да; Ш-пентоновое основание — 85000 Да; Ша, VI-, VIII и 1Х-белки, ассоциированные с гексоном, имеющие ММ соответ- ственно 66000 Да, 24000 Да, 13000 Да и 12000 Да; IV-белковая "нить" — 62000 Да, V и VII-протеины кора с ММ 48000 Да и 18000 Да). Сложные капсиды присущи и бактери- офагам, например, Т-четным coli-фагам (см. рис. 1а), у которых имеется икосаэд- рическая головка и гексагональный отро- сток. В таблице 6 приведен перечень неко- торых вирусов прокариотических и эукариотических организмов с различными типами симметрии капсидов. Необходимо подчеркнуть, что вирусы не размножаются, а репродуцируются, или воспроизводятся, то есть правильнее гово- рить не об их потомстве, а их "копиях" (братьях и сестрах). Репродукция происходит только в живых клетках (тканях) и поэ- тому биотехнологические процессы, основанные на использовании вирусов, исключительно дорогостоящи. Достаточно сравнить, на- пример, кишечную палочку и вирус гриппа. Первая растет на мясопептонном бульоне, второму необходимы куриные эмбрионы; чтобы проконтролировать рост кишечной палочки и увидеть ее в 81
среде, необходим обычный "световой” микроскоп, а чтобы увидеть вирусные частицы, нужен электронный микроскоп, стоимость которого во много раз превосходит стоимость светового. Подобные сравнения можно продолжать и далее, и в этом смысле выгоды будут складываться в пользу бактерий. Однако создание противо- гриппозных биопрепаратов (вакцин) сегодня более насущная за- дача, чем борьба с заболеваниями, вызванными энтеропатогенны- ми кишечными палочками и родственными ей бактериями. Кроме того, решение многих фундаментальных проблем в области моле- кулярной биологии нередко возможно исключительно на вирусных Таблица 6 Общая характеристика некоторых вирусов Вирусы Наличие (-1-) или отсутствие (-) и ММ (Да) хЮ6 Супер- капсид Тип симмет- рии Вирион ДНК РНК ММ (Да) хЮ6 Средний размер, нм Бактерий (бактериофаги) 1. Колифаг <рХ174+ 2. Колифаг Л + 3. Колифаг Тг 4. Колифаг MS=2+ Растений 1. Мозаики табака (ВТМ) 2. Желтой мозаики турнепса Животных 1. Восточного энцефаломиелита лошадей+ 2. Обезьян SV-40 Человека 1. Аденовирусных инфекций 2. Гриппа+ 3. Полиомиелита4" ( + ) 1.6 ( + ) зз ( + ) 130 Н Н Н (-) ( + )3,2 ( + )23 (-) Н Н (-) (-) ( + ) 1 ( + )2,1 ( + ) 1.7 ( + )2 (-) (-) ( + )4 ( + )2,2 Отсут- ствует Име- ется Отсут- ствует Имеет- ся ке и _ 1» к с к с к 6,2 100 300 3,6 40 5 50 3 177 300 6,8 (100x50) х(80х95- 100) ' 25 15-17 хЗОО 30 50-70 40-50 70-90 80-120 28 Примечание: -I---одноцепочечная нуклеиновая кислота, К — кубический (у фа- гов в головке), 0 — с отростком(-ами), С — спиральный 82
системах (см. раздел 5.1). Репродукцию вирусов можно подразде- лить на семь этапов: адсорбцию, пенетрацию (проникновение вируса в клетку), транскрипцию, трансляцию, репликацию, сборку вирусных частиц и выход организованных вирусных частиц из клетки. На каждом этапе совершаются многоактовые процессы, зависимые как от вирусов, так и от клеток — их реципиентов. На рис. 22 а, б представлены схемы строения вируса гриппа (а) и ретровируса — ВИЧ (вирус иммунодефицита человека) — воз- будителя СПИД (б). При репродукции вируса гриппа генетическая информация передается по схеме РНК —► РНК —- Белок. У них биосинтез РНК осуществляется на матрице вирионной РНК под каталитическим действием вирионной РНК-зависимой РНК-пол- имеразы, или вирионной транскриптазы. У ВИЧ генетическая информация передается по схеме РНК—'ДНК—»РНК—►Белок, то есть вначале по матрице РНК синтезируется ДНК с помощью фермента обратной транскриптазы, а затем все протекает по универсальной схеме ДНК—РНК—►Белок. Структурный материал в обоих приводимых случаях используется из содержимого реци- пиентных клеток. Рис. 22. Схемы строения вирусов гриппа (а): 1 — гемаглютинин, 2 — нейраминидаза, 3 — липидный бислой, 4 — белковый слой, 5 — рибонуклеопротеин; и ретровируса ВИЧ (б): 1 — гликопротеин-120, 2 — сердцевина, 3 — гликопротеин-41, 4 — липоидная мембрана, 5 — РНК, 6 — обратная транскриптаза. Рибонуклеиновая кислота вируса гриппа состоит из 8 сегмен- тов, каждый из которых на З'-конце заканчивается уридиновым остатком. Общая молекулярная масса РНК составляет 2 — 4 тыс. 83
кДа. Вследствие такой сегментированное™ геном вируса гриппа отличается высокой частотой рекомбинации, способностью к ре- активации и синтезировать гемагглютинин и нейраминидазу после химического подавления вирусной инфекционности. Частицы ВИЧ образуются из трех различных по составу и молекулярной массе белков — протеина 25(24), гликопротеинов 41 и 120. Первый из них р25(24) входит в состав сердцевины вириона, гликопротеины (др41 и др 120) формируют "шипы” оболочки час- тицы. В сердцевину также входят однонитевая РНК, несущая генетическую информацию, и фермент обратная транскриптаза, под действием которой синтезируется провирус — ДНК-копия вирусной РНК. Провирус встраивается в хромосомную ДНК клет- ки — реципиента и персистирует (от лат. persistens — стойкий, сохраняющийся, остающийся) до того времени, пока не будет активирован. После такой активации происходит его репродукция. Если ретровирусные РНК структурно заканчиваются прямыми повторами нуклеотидов числом 10 — 80 пар, то свободные линей- ные двухнитевые ДНК-копии заканчиваются длинными одинако- выми повторами — LTR (от англ, long terminal repeat) числом 250 — 1400 нуклеотидных пар, укороченных на две пары с каждого конца (рис. 23). Y3’ S Y5’ LTR 9а9 ро1 Y3' S Y5' провирусная ДНК LTR Рис. 23. LTR в составе линейной ДНК копии РНК вируса иммунодефицита человека Сборка новых вирионов происходит на клеточной мембране. В процессе агрегации вирусных белков она начинает набухать и выпячиваться, высвобождал! в конечном итоге новоорганизован- ные частицы вирусов. Вирусы прокариот, или бактериофаги, в большинстве своем имеют структурно-функциональное сходство. В частности, они содержат лишь один какой-то тип нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК в качестве генетического материала (у большинства фагов имеется двунитевая ДНК); нуклеиновая кислота упаковывается в головку фага; преобладающее большинство фагов имеет хвостовой отросток для прикрепления к поверхности реципиентной клетки; наконец, бактериофаги сходны по характеру индуцируемых ими событий, развивающихся в клетке после ее заражения — фаги являются облигатными паразитами. Различия бактериофагов обусловлены тонкой структурой нук- леиновых кислот (в последовательности нуклеотидов, наличием 84
или отсутствием липких концов, в линейности или кольцевидной замкнутости и пр.), типами молекулярной симметрии капсидов, деталями строения хвостовой части, специфичностью действия в отношении чувствительных клеток. Известны три состояния, в которых могут находиться недефек- тные фаги и три типа влияния фаговой инфекции на судьбу зараженной клетки. К числу первых относят: свободное состояние, вегетацию и состояние профага (для так называемых умеренных фагов); к числу вторых — гибель зараженной клетки (фаги здесь называют истинно вирулентными); переход клетки, несущей уме- ренный фаг (профаг), на путь лизогенного развития, или, в случае индуцибельности профага и воздействия индуцирующими факто- рами (УФА, некоторые мутагены и др.) — на путь лизиса; наконец, при третьем типе влияния фаговой инфекции не наблюдается каких-либо заметных отклонений в характере поведения заражен- ных клеток — гибели их не происходит; фаги при этом могут высвобождаться из клеток или постоянно реплицироваться, нахо- дясь внутри их и слегка замедляя скорость размножения клеток. Учитывая сказанное, следует подчеркнуть, что бактериофаги име- ют большое значение в биотехнологии еще и потому, что они могут выступать ощутимыми вредителями в микробиологических произ- водствах, базирующихся на эксплуатации прокариотических орга- низмов. Результаты фундаментальных исследований структуры вирои- дов упрочили самостоятельность этой группы микробов в царстве Vira. Ныне вироиды подразделяют на три группы согласно нукле- отидных последовательностей в их РНК: 1) группа ВВКК, включающая вироиды веретеновидности клуб- ней картофеля и все другие вироиды кроме ВКККП и ВСПА (см. ниже); у них имеются значительные области гомологии последо- вательностей (50 — 80%) и относительно протяженная полипури- новая последователь- ность; они содержат высококонсерватив- ную центральную об- ласть (рис. 24); 2) виро- иды болезни каданг-ка- Рис. 24. Вироиды: 1 — линей- ные и 2 — кольцевые формы денатурированных молекул вироида ВВКК (электронно- микроскопический снимок) (по Т. О. Динеру, 1984). 85
данг кокосовой пальмы (ВКККП), содержащий консервативную центральную область, короткую последовательность пуринов, а за пределами центральной области проявляет малую гомологию по- следовательностей; 3) вироиды болезни "солнечная пятнистость авокадо" (ВСПА) с небольшой центральной консервативной областью и малой го- мологией последовательностей с последовательностями у любого другого вироида. Высказывается предположение в том, что вироиды произошли от интронов (см.) и что недалеко то время, когда они будут рекомендованы в качестве векторов в фитобиотехнологии реком- бинантных ДНК. 4.2. Клетки прокариот. Почти во всех больших траксономиче- ских группах имеются представители, с успехом использующиеся в соответствующих биотехнологических процессах — будь это сапрофитные или патогенные виды. Для сравнения можно указать на лактобактерии и туберкулезные микобактерии. Первые исполь- зуются для приготовления молочнокислых продуктов и в силосо- вании кормов, вторые — для приготовления вакцины BCG и туберкулина (диагностическое средство при туберкулезе). Из ар- хеобактерий большое значение имеют метаногенные бактерии — продуценты метана. Пневмококки используются для изготовления полисахаридных вакцин, применяемых для профилактики и лече- ния пневмоний, вызванных различными сероварами Streptococcus pneumoniae. Археобактерии заметно отличаются от эубактерий по химическому составу клеточной стенки и клеточной мембраны, по последовательности нуклеотидов в рибосомных нуклеиновых кис- лотах, или рРНК (в 5S- и 16S рРНК) и по некоторым другим признакам. Так, в кле- точной стенке у них отсутствует типичный пептидогликан — муреин, хотя у некото- Н.ОН рых археобактерий имеется псевдомуре- ин, в котором вместо ацетилмурамовой кислоты содержится талозаминуроновая кислота; интерпептидные мостики вклю- талозаминуроновая кислота чают лишь L-аминокислоты, так как D-ами- нокислоты отсутствуют в псевдомуреине. У метанококков клеточная стенка формируется из белка, у мета- носарцин — из нейтральных углеводов, уроновых кислот и ами- носахаров, у метаноспирилл имеется полипептидный чехол. Особенностями химического состава клеточной стенки архео- бактерий можно объяснить неэффективность пенициллина, цефа- 86 соон н н
лоспорина и D-циклосерина против этих микроорганизмов. Иначе говоря, для данных антибиотиков отсутствуют мишени в клетках археобакгерий. Клеточная мембрана их также существенно отли- бифитанил-диглицерин (бифитанил-диглицерол-тетраэфир) чается от клеточной мембраны эубактерий. В частности, в ней не обнаружены фосфатидилглицерины, но содержатся бифитанил (С 20)-(изопреноид)-глицерин, а у некоторых представителей архе- обактерий — бифитанил (С40)-(изопреноид)диглицерин. Обнару- жены и нейтральные липиды в форме свободных С15- и Сзо-изо- преноидных углеводородов (сесквитерпены и тритерпены). Рибосомы археобакгерий и эубактерий сходны между собой, н2с=с-сн=сн-сн=(р-сн=сн-сн=с-сн=сн2 сн3 сн3 сн3 сесквитерпен (С]5) тритерпен (Сзо) по константе седиментации относятся к типу 70S, но последова- тельность оснований в 5S- и 16S- рибосомных РНК у археобакгерий 87
рифампицин-3=(4'-метил-1 '-пиперазинилиминометил)-рифамицин SV иная. ДНК-зависимые РНК-полимеразы, в отличие от эубакгерий, состоят у них из более чем четырех субъединиц, и эти ферменты не чувствительны к антибиотику рифампицину. В геноме археобактерий выявлены интроны, что ранее рассмат- ривалось принадлежностью генома эукариот. Поэтому в настоящее время сформировалось два направления по трактовке места архе- обактерий и их происхождения. Ученые — приверженцы первого направления считают, что интроны в геноме эукариот есть резуль- тат эндоцитоза древними эукариотическими микроорганизами клеток прокариотических археобактерий, которые впоследствии (в процессе эволюции) трансформировались в митохондрии. При- верженцы второго направления считают археобактерий прароди- телями эубактерий, то есть по их мнению эволюция шла по линии: Археобактерий —> Эукариоты Эубактерии. Промежуточное положение эукариот в приведенной последо- вательности как бы разрывает одно надцарство прокариот на два, однако принципиальная организация ядерного аппарата у архео- бактерий и эубактерий во многом сходна , следовательно, приве- денная схема эволюционных событий представляется как бы не- достаточно обоснованной. С учетом современных знаний о прока- риотах эволюцию их можно представить в двух следующих вари- антах (см. стр. 89). Во второй схеме отсутствует прямая связь между археобакте- 88
I) Археобактерий-------» Эубактерий •Эукариоты Эукариоты Прокариоты или Археобактерий Эу бактерии Древние предковые формы риями и эубактериями. Не следует забывать и того факта, что без бактерий жизнь всех других, более высоко организованных (эука- риотических) существ на Земле, вообще прекратилась бы. Из приведенных данных следует, что представления об эволю- ции микроорганизмов (равно как и других существ) до сих пор остаются во многом не разрешенными. Тем не менее, сегодня мы больше знаем, чем два — три десятилетия назад, о структурно-фун- кциональной организации клеток различных организмов и заметно расширили арсенал промышленно полезных видов. Эубактерий включают все прокариоты кроме археобак- терий. Их подразделяют на две группы — фототрофные и хемо- трофные бактерии. Этим подчеркивается их принципиальное раз- личие по используемому источнику энергии. Фототрофы исполь- зуют кванты солнечного света, тогда как хемотрофы — энергию химических связей в различных химических соединениях. Среди фототрофов различают оксигенные цианобактерии, в процессе жизнедеятельности которых выделяется молекулярный кислород (1), и аноксигенные пурпурные и зеленые бактерии, не выделяю- щие кислорода (2а,б,в). В реакциях 2а,б,в донорами электронов соответственно явля- ются сероводород, газообразный водород и изопропанол. Цианобактерии являются важными поставщиками кислорода в атмосферу, а из атмосферы они поглощают (фиксируют) моле- кулярный азот. Хемотрофные эубактерий могут образовывать (или не образу- ют) эндоспоры. Клетки их весьма разнообразны по морфологии: прямые, изогнутые, палочковидные, круглые, овальные, бобовид- ные, спиралевидные, нитевидные и др. Удельный вес микробной клетки составляет примерно 1,038 — 1,065. Тогда, исходя из средних 89
1. 6Н7О+6СО7 ---------------------- (СН7О),+6О2 Здесь донор электронов - вода. Следует иметь в виду, что среди цианобактерий есть виды, способные окислять сероводород и переходить на фотосинтез без выделения кислорода. 2. 2H,S+CO7 --------------—---------------* CH7O+H7O+2S 2 I пурпурные серные и зеленые Z 2 серные бактерии, некоторые цианобактерии Сера затем окисляется до сульфата. Тогда суммарная реакция будет следующей: L v 2а) H7S+2CO7+2H7O -------------—----------» (CH7O)7+H7SO4 4 4 4 пурпурные серные н зеленые 4 4 4 серные бактерии, некоторые цианобактерии 2б) 2Н, + СО7 --------—--------* СН7О+Н7О 7 Z Z пурпурные несерные и Z Z зеленые несерные бак- терии 2в) 2СН3СН(ОН)СН3+СО2 nypnyphHVb,e не. ^СНгО+ДСН^СО-ьН/) изопропанол сеРные бактерии ацетон размеров бактерии 2 х 0,5 мкм, вес ее составит 4,12» 10'10 мг, то есть в 1 г будет содержаться 2,42«1012 таких клеток. Важным параметром, характеризующим большинство прока- риотических клеток, является скорость их размножения, измеря- емая минутами (в среднем от 8 — 10 мин до 30 — 40 мин). Это важно в тех случаях, когда биомасса клеток является целевым продуктом в конкретном производстве, или когда количество образующегося метаболита (целевого продукта) находится в пря- мопропорциональной зависимости от количества вырастающих клеток за конкретный временной интервал. 90
Все обменные процессы развивающихся прокариотических клеток осуществляются с участием клеточной мембраны. Через мембрану поступают внутрь клетки питательные вещества, через нее же секретируются определенные продукты из клетки в окру- жающую среду; мембраны участвуют в регуляторных процессах и энергообеспечении клетки. Вот почему, начиная с 70-х — 80-х годов XX в., когда удалось в чистом виде изолировать и исследовать мембранные фракции различного происхождения, интерес к мем- бранам резко возрос. Сформировалась самостоятельная научная дисциплина — мембранология, а специалисты, работающие в этой области, стали называться мембранологами. Клеточная стенка прокариот занимает свое особое место в структуре и архитектонике клеток. Ее нельзя исключать из мета- болических процессов, так как она занимает пограничное положе- ние между внутренней (протопласт) и внешней средами, и через нее должны проходить различные вещества в обоих направлениях. Однако главные функции ее — поддержание формы клетки и защитная, тогда как основная функция клеточной мембраны — регуляторно-метаболическая. Клеточная стенка и клеточная мем- брана вместе формируют оболочку. В эволюционно-биохимическом плане клеточная стенка у про- кариот претерпела структурные изменения в направлении: Архе- обактерии —> Грамположительные бактерии Грамотрицатель- ные бактерии. У археобактерий нет типичного пептидогликана, хотя задатки к нему имеются; пептидогликан у грамположительных бактерий многослоен, тогда как у грамотрицательных бактерий он однослоен. Лишая клетки прокариот клеточной стенки, их относи- тельно легко удается получать в виде протопластов или сферопла- стов, которые могут быть использованы в клеточно-инженерных работах. Вместе с возможным капсульным слоем на оболочку приходит- ся 20% и более сухой массы клетки. В оболочке имеются поры для транспорта питательных веществ (диаметр их от 0,001 до 0,01 мкм) и рецепторы (белки- порины) для фагов и бактериоцинов, а также места взаимодействия с антителами и комплементом. В оболочках грамотрицательных бактерий содержатся токсические и аллерген- ные соединения. Электронно-микроскопические снимки поверхностей прока- риотических клеток отличаются большим разнообразием. Причем, 91
в противоположность сравнительно тонко очерченной поверхно- сти у грамположительных бактерий, большинство представителей грамотрицательных видов имеет исключительно складчатую по- верхность. У многих прокариот кнаружи от клеточной стенки располага- ется капсульн...й материал, состоящий в большинстве случаев из полисахаридов — гликанов (например, у Acinetobacter spp.), либо — из протеинов (например, у Вас. licheniformis). Клеточная стенка утолщается с возрастом клетки и может достигать, например у Lactobacillus acidophilus, 0,8 мкм. Клеточная мембрана, напротив, остается более или менее постоянной по толщине вовсе периоды развития прокариотических клеток (0,0075 мкм) и с более или менее постоянными порами диаметром около 1 нм. В клеточной стенке грамоположительных бактерий сосредото- чен пептидогликан — муреин, имеются тейхоевые кислоты, белки; у стрептококков группы А в диффузно-распределенном виде в наружном слое клеточной стенки Находится также М протеин, являющийся фактором вирулентности этих микробов. М протеин может быть гидролизован с помощью трипсина без нарушения жизнеспособности клеток. У грамотрицательных бактерий четко обозначается трехслой- ность клеточной стенки: липополисахаридный слой (О-антиген), наружный слой (нередко обозначаемый как "внешняя мембрана"), состоящий из двух фосфолипидных листков, и подлежащий липоп- ротеиновый слой. Липополисахарид проявляет свойства эндоток- сина, он занимает пограничное положение между внешней средой и подлежащим фосфолипидом (преимущественно — фосфатиди- лэтаноламином). Липополисахариды получают в производственных условиях В качестве средств, обладающих различными биологическими свой- ствами: токсическими (связанными с Липидом А в липополисаха- риде), пирогенными, митогенными (для мышиных лимфоцитов), стимуляторами развития клеток костного мозга, активаторами фактора VII свертывания крови (фактор Хагемана) в тромбоцитах и комплемента; липополисахарид в концентрации 1*1012 г вызы- вает свертывание лизата амебоцитов дальневосточного краба Limulus poliphemus. Реакцию широко используют при выявлении липополисахарида в каких-либо субстратах, лекарственных сред- ствах и др. Взаимодействие между эндотоксином и лизатом аме- боцитов протекает по следующей схеме: 92
LAL= профермент эндотоксин активироваиный( — е) фермепт(ы) активированные ферменты коагулоген лизат белковые агрегаты Фосфолипидный слой имеет внешний и внутренний "листки", из которых внешний содержит значительную долю липополисаха- ридных молекул. В целом этот слой имеет жидкостно-мозаичную структуру, содержащую набор из 3 — 4 мажорных белков, погру- женных в фосфолипидный матрикс, и на долю которых приходится до 70% всех белков наружного слоя, а также набор из 10 — 20 минорных белков. С фосфолипидным слоем (его внутренним листком) нековалентно связан липопротеин из третьего слоя. Липопротеиновый слой выступает как бы посредником, неко- валентно связывающим наружный слой с пептидогликаном. Он включает жирные кислоты, аминокислоты, глицерин; молекуляр- ная масса его порядка 7 кДа. Так липопротеин клеточной стенки Escherichia coli содержит 15 аминокислот в разной повторности (всего 58 аминокислотных остатков), среди которых не обнаруже- ны гистидин, глицин, пролин, триптофан и фенилаланин. Он представляется в виде блочной структуры, на конце которой имеется глицерил-цистеин, этерифицированный остатками жир- ных кислот. Значительная часть такого липопротеина (4,8* 105 мо- лекул на клетку) находится в свободном состоянии, меньшая часть (2,4* 105) ковалентно связана с пептидогликаном (с диаминопиме- линовой кислотой в тетрапептиде муреинового "каркаса"). Белки клеточной стенки отличаются от белков клеточной мем- браны. Ранее упомянутые белки-порины образуют трансмембран- 93
ные диффузионные каналы для прохождения неспецифических малых гидрофильных молекул, некоторые из них выступают ре- цепторами фагов. Выделяют мажорные, или отр-протеины (от англ, one of major protein), и минорные, или малые протеины. По кодирующим структурным генам мажорные белки подразделяют на omp А, отр С, отр F, отр Н:1°; они имеют различную молекулярную массу (от 16 кДа до 42 кДа). Первый из них (отр А) выступает местом взаимодействия с F-пилями при конъюгации бактерий; omp С и отр F (белки-порины) в комплексе с пептидо- гликаном формируют поры, отр Н:1° обладает катионными свой- ствами и причастен к ионным взаимодействиям в среде обитания клетки. Минорные белки участвуют в транспорте специфических малых молекул через наружный слой и в рецепции фагов, некото- рых бактериоцинов (например, рецептор для фага Тб и колицина "заинтересован" в транспорте нуклеозидов). Минорные белки вовлекаются в транспорт мальтозы, комплексов Fe2+, витамина В12. Белки внешнего слоя выполняют и некоторые другие функции. Среди протеинов клеточной стенки грамотрицательных бакте- рий обнаруживаются многие ферменты (аспарагиназа, фосфатазы, эндонуклеаза и др.). Клеточную стенку удается достаточно легко отделить от содер- жимого клетки, окруженного клеточной мембраной (протоп- ласт). Если часть клеточной стенки каким-то образом удержива- ется на клеточной мембране, то в этом случае говорят о с ф е - ропласте. Имеются разноплановые мнения о легкости формирования протопластов у грамположительных или, напротив, у грамотрицательных бактерий. Очевидно, и протопласты и сфе- ропласты могут быть дериватами тех и других бактерий — все зависит от особенностей штамма (вид, возраст, условия культиви- рования, используемый стабилизатор — сахароза или какие-либо соли, и т. д.), воздействующего агента (лизирующий клеточную стенку фермент, блокатор биосинтеза компонента или компонен- тов клеточной стенки). Между клеточной стенкой и клеточной мембраной имеется так называемое периплазматическое пространст- в о, лучше выявляемое у грамотрицательных бактерий. Это оче- видно связано с тем, что внутреннее осмотическое давление выше у грамположительных бактерий [(8,1 - 20,2)«105 Па[, чем у грамот- рицательных [(3,03-5,05)«105 Па]. В периплазматическом простран- стве обнаружены ферментные и неферментные белки. Известны прокариоты, оболочки которых существенно отли- чаются по составу от оболочек грамположительных и грамотрица- тельных бактерий. В качестве примера можно назвать кислото- устойчивые микобактерии (таблица 7). Из таблицы видно, что 94
Таблица 7 Компонентный состав оболочек грамположительных, грамот- рицательных и кислотоустойчивых бактерий Бактерии грамположительные кислотоустойчивые грамотрицательные Пептидогликан (многослоен, толщина 0,02-0,6 мкм) Пептидогликан (однослоен!?, толщина 0,01 мкм) Пептидогликан (однослоен, толщина 0, 01 мкм) Протеины Полипептиды Липопротеины Липотейхоевые кислоты Миколовая кислота - * гликолипиды Фосфолипиды Тейхоевые кислоты Арабиногалйктаны Липополисахарид Тейхуроновые кислоты Воск Д Протеины Полисахариды Корд-фактор Сульфолипиды МИКОЗЦДЫ Полисахариды различия в компонентном составе клеток, относящихся к разным группам, достаточно велики. Например, оценивая строение пепти- догликанов у Е. coli и Staphylococcus aureus, можно видеть различия между ними в характере интерпептидных мостиков. Так, у Е. coli (равно как и у всех грамотрицательных бактерий, коринебактерий дифтерии, нокардий, микобактерий и видов, относящихся к роду Bacillus) пептидогликан относится к типу А (рис. 25а), у Staphylococcus aureus (стрептококков, микрококков) — к типу В (рис. 256); пептидогликан типа С (рис. 25в) обнаруживается редко. Рис. 25 Схемы (а, б, в), построения трех типов пептидогликанов (А, В, С) в которых М—N-ацетилмурамовая кислота, Г—N-ацетилглюкозамин; 1,2,3,4-тетрапептид, со- стоящий из L-аланина (1), D-iso-глутаминовой кислоты (2), meso-DAP (или L-лизина) (3), D-аланина (4), х и z-интерпептидные мостики, У-амидный заместитель, связанный с а-карбоксигруппой D-iso-глутаминовой или 3-гидроксиглутаминовой кислоты. 95
Инвариантность тетрапептида обусловлена постоянным нали- чием D-аланина, выступающего связующей единицей между цепя- ми пептидогликана. Дисахаридные блоки МГ (см. рис. 25а, б, в) численно варьируют от менее 10 до более 170, что зависит от вида бактерий. С учетом сказанного можно изобразить связь пептидо- гликана с липопротеином в клеточной стенке Е. coli (рис. 26). Рис. 26. Фрагмент пептидогликана Е. coli, связанный с липопротеином через meso-DAP в тетрапептиде (обозначения смотри на рис. 25). Углеводные звенья в пептидогликанах могут быть различными. Например, имеются О-ацетильные группы в мурамовой кислоте или глкжозамине, в эндоспорах бацилл может присутствовать лактам мурамовой кислоты. н о гликолилмурамовая кислота, где R - гпикопип лактам мурамовой кислоты макнозамим мурамовой кислоты 96
Находят (около 2%) маннозамин мурамовой кислоты, например у М. luteus. У микобактерий и некоторых нокардий (N. kirovani) присутствует N-гликолилмурамовая кислота. В позиции С6 гидро- ксильных групп мурамовой кислоты или глюкозами на могут нахо- диться фосфодиэфирные остатки, которые у грамположительных бактерий способны связывать тейхоевую, тейхуроновую кислоты, ?н НО-Р-О-СН,-СН-СН-СН-СН,-СР-О-СН,-СН-СН-СН-СН,-О II III “ III Р-О-СН -СН-СН-СН-СН,ОН II 1 1 1 III 0 1 О OR О О OR О О ° OR О О СО СО со 1 । । CH-NH7 CH-NH7 Iх Iх ch-nh9 1 1 1 сн3 сн3 снз 7 рибиттейхоевая кислота Вас. subtilis, R - остаток глюкозы (Р) а также другие полисахариды. С полисахаридами клеточных стенок у микобактерий и некоторых нокардий связаны эфирной связью миколовые кислоты. Они же могут быть компонентами свободно тейхуроновая кислота из клеточных стенок бацилл экстрагируемых гликоли- пидов, известных как к о рд-факторы (от англ, cord — веревка, струна), которые выявлены также у некислотостойких пато- генных для человека ко- ринебактерий. Число уг- леродных атомов в кори- немиколовых кислотах достигает 32 — 36, в но- кардиомиколовых кисло- тах примерно 50, в мико- ловых кислотах микобак- терий порядка 90. Мико- ловые кислоты являются о-замещенными Р-гидроксижирными кислотами с общей формулой: R-CH(OH)-CH(Ri)-COOH 4 т. 8524 97
Различают а-, 0- и у-миколовые кислоты туберкулезных мико- бактерий; первые содержат от 78 до 88 углеродных атомов, вторые — от 83 до 89, третьи — 91. СН3-(СН,) -CH-CH-(CH,)V-CH-CH-(CH7) -СН-СН-СООН \/ 7 \/ I I сн2 сн2 он с24н49 ct-миколовая кислота CH3-(CH2)x-CH-CH-(CH2)y-CH-CH-(CH2)z-CH-CH-COOH сн3осн3 сн2 он с24н49 р-миколсвая кислота CHj-fCH^T- СН-(СН2)19-СО-СН-(СН2)]9-СН-СН-СООН сн3 СН3 ОН С24Н49 у-миколовая кислота Корд-факторы представляют собой 6,6'-димиколиловые эфиры ос,ос,-1, Г- диглюкозы (трегалозы). микояовая кислота миколовая кислота Корд-фактор обладает токсичностью, которая потенцируется сульфогликолипидами, локализующимися с ним в клеточной стен- ке микобактерий (например, у М. tuberculosis сульфогликолипид представляет собой 2,3,6,6'-тетраацетилтрегалозо-2'-сульфат). В клеточной, стенке микобактерий имеются еще микозиды, ответственные за рецепцию бактериофагов. Микозиды содержат 6-дезокситалозу и ее О-метиловые эфиры, фукозу, рамнозу. Раз- личают микозиды А, В и С. Микозиды А и В являются фенольными гликолипидами, микозиды С — пептидогликолипидами. 98
co—сн3 о—CH2 OSO3NH4 сульфогликолипид из М. tuberculosis При оценке биологических свойств продуктов клеточных сте- нок микобактерий вначале предполагали, что иммуноадьювантной активностью обладают их уникальные липидные компоненты. Однако на основании детального анализа установлено, что таким действием обладают водорастворимые пептидогликаны, содержа- щиеся в клеточных стенках большинства бактерий. Самый малый активный фрагмент оказался мурамилдипептидом, представляю- щим собой М-ацетил-мурамил-Е-аланил-П-изоглутамин. Мурамил- дипептиды — высокоактивные иммуноадьюванты нашли практи- ческое применение, в том числе — в качестве компонентов вакцин, рекомендованных для профилактики и лечения СПИД. сн3 сн I сн2он М—о соон H3COCN мурамиддипеп тид Клеточная мембрана прокариот принципиально сходна по ар- хитектонике с мембраной эукариотической клетки. Тем не менее, она не является тем трехслойным сэндвичем (от англ, sandwich — бутерброд), о котором говорили до недавних пор. В состав мембран входят фосфолипиды с полярными "головками", обращенными кнаружи; взаимодействующие между собой их гидрофобные хво- сты из остатков жирных кислот обращены внутрь. Мембранные 99
белки полностью или частично погружены в липидный слой (рис. 27), в котором имеют место гидрофобные взаимодействия между белками и липидами. Гидрофильные участки белков взаимодейст- вие. 28. Жидкостно-мозаичная модель клеточной мембраны. вуют с полярными головка- ми фосфолипидов; Мемб- рана в целом приобретает жидкости о-мозаичную структуру (рис. 28), в кото- рой имеющиеся слои пред- ставляют собой нековален- тно собранные термодина- мически стабильные, но метаболически лабильные структуры. Белковые молекулы как бы заякорены в мембране и несут специ- фические функции. Лишь гликопротеины в мембране не сопряже- ны с другими компонентами и могут диффундировать латерально в плоскости мембраны; другие, напротив, интегрированы с мат- риксом мембраны прочно. Не исключена возможность их роли в признании и селекции функциональных молекул, в которых про- является (или должна проявиться) заинтересованность клеточной мембраны. Контактирующие с ней ферменты и ферментные сис- темы подвергаются специфическим конформационным изменени- ям, что сказывается на характере их взаимодействия с субстратами и лигандами. Другими словами, клеточная мембрана выступает организатором и регулятором активности связанных с нею фер- ментов и ферментных систем. При этом на уровне мембраны происходят химические и физические процессы. Какие же принципиальные различия существуют между кле- точными мембранами прокариот и эукариот? Эти различия каса- ются химического состава и функций (таблица 8). По химическому составу клеточные мембраны представляют собой гликопротеоли- пиды или гликолипопротеины, или, наконец, липогликопротеины, юо
что зависит от таксономического положения организма. В клеточ- ной мембране золотистого стафилококка на долю углеводного компонента приходится до 40%, столько же — на долю белкового компонента и лишь 20% — на липидный компонент. В усредненном варианте содержание указанных компонентов в клеточной мембране большинства исследованных прокариот распределяется следующим образом: белки — до 50%, липиды — до 30%, углеводы — до 20% (из расчета на сухую массу); для эукариот эти данные соответственно таковы: белки — до 70-80%, липиды — До 15 — 25%, углеводы — до 5 — 15%. Однако применительно к структуре различных мембран указанные вели- чины могут сильно различаться и, например, на липиды может приходиться до 50% от сухой массы мембранной фракции эндоп- лазматического ретикулума, тесно связанного с клеточной мемб- раной. А в миелиновых мембранах нервных волокон содержание липидов достигает 80%. Клеточные мембраны у всех организмов проявляют полифун- кциональные свойства: осморегуляция, барьерные функции с се- лективной проницаемостью за счет пор, насосов, рецепторов; транспорт веществ (в том числе активный с затратой энергии), участие в создании мембранного потенциала, в превращении энергии при фотосинтезе и окислительном фосфорилировании. Глубокое знание структуры и функции оболочки бактерий (или клеточной мембраны у видов, лишенных клеточной стенки) облег- чает использование биообъектов в конкретных целях, например, для получения вторичных метаболитов (см.), когда процессы пере- носа вещества в клетку (равно как и секреторные процессы) выступают на первый план. В целях сравнения можно привести пример с Leuconostoc mesenteroides и Xanthomonas compestris. В определенных условиях первый из них секретирует фермент декстрансахаразу, с помощью которой возможен синтез полиса- харида декстрана без участия клеток, то есть in vitro; второй вид синтезирует полисахарид ксантан, но уже на уровне клеточной мембраны и в этом случае без клеток X. campestris биосинтез in vitro невозможен. Следовательно подходы здесь к осуществлению процессов биосинтеза полимеров различны, поскольку механизмы функционирования соответствующих биосистем (в том числе — оболочки бактерий) неравнозначны. 101
Таблица 8 Основные различия между клеточными мембранами и их про- изводными у прокариот и эукариот. Признак Прокариоты „ 1 Эукариоты Мезосомы Тилакоиды Фикобилисомы Аэросомы Хлоросомы Карбоксисомы Гидрогеносомы Лизосомы Пероксисомы Гликосомы Митохондрии Эндоплазматичес- кий ретикулум (ЭПР) Компартмента- лизация клетки за счет ЭПР Система внутрицитопла- зматической мембраны (не ЭПР) Комплекс Гольджи Хитосомы Ломасомы Вакуоли Хлоропласты Эндоцитоз Экзоцитоз Насыщенные и мононенасы- щенные жирные кислоты Полиненасы- щенные жирные кислоты Простагландины Имеются преимущественно у грамположительных бактерий Имеются у цианобактерий Имеются у фототрофов Имеются у зеленых фототрофных бактерий Имеются у фототрофов и некоторых хемолитотро- фов Отсутствуют Отсутствует Имеется у метанокисляющих, нитрифицирующих и фототрофных бактерий Отсутствует Отсутствуют Не образуются у большинства бактерий Отсутствуют Отсутствует 11 Имеются Отсутствуют0 Отсутствуют Имеются у некоторых трихомонасов Имеются п Имеются у Protozoa Имеются Имеется Отсутствует Имеется Имеются у грибов Могут образовываться за счет ЭПР Имеются в клетках растений (хроматофоры у водорослей) Присущ Отсутствуют Имеются Имеются у некоторых грибов 102
(продолжение таблицы 8) Признак Прокариоты Эукариоты Кардиолипин Фосфатидилглицерин Липотейхоевые кислоты Моногалакто- зилдиглицериды Дигалактозилдиг- лицериды Сульфохиново- зилдиглицериды Ундекапренол Долихол Сфингомиелин Стерины Связь с ядерной ДНК Отсутствует Имеется Имеются у грамположительных бактерий Имеются (у зеленых бактерий и цианобактерий) Имеются у цианобактерий Имеется Отсутствует Отсутствуют+ Имеется Имеется Отсутствует или имеется в следовых количествах Отсутствуют Отсутствуют Отсутствуют Отсутствует Имеется Имеются Отсутствует 6 кроме цианобактерий, способных синтезировать полиненасыщенные жирные кислоты. Микоплазмы могут включать экзогенные стерины в состав мембраны. Клеточные мембраны после выделения из клеток и тщательной очистки остаются связанными с рибосомами и ДНК, представляя собой мембранополирибосомо-ДНКовые агрегаты. Рибосомы в прокариотической клетке (числом порядка 104 на клетку) состоят приблизительно из 30% белка и 70% РНК, что в расчете на всю клетку с оставляет до 40% белка и 90% РНК. "Мягкий" лизис растущих клеток сопровождается выделением почти всех рибосом в виде полирибосомомембранных агрегатов, содержащих все компоненты белоксинтезирующей системы. Полирибосомы представляют собой цепочки, состоящие из 70S рибосомных мо- номеров с диаметром порядка 0,02 мкм, присоединенных к мРНК. При низких концентрациях ионов магния — меньше 10‘4 М 70S рибосомы диссоциируют на 30S и 50S субъединицы. Размер первых приблизительно 0,007 — 0,016 мкм, молекулярная масса 800 кДа. Каждая 30S субъединица включает одну молекулу 16S РНК с ММ около 500 кДа и 21 молекулу разных белков; 50S субъединица размером 0,014 — 0,016 мкм имеет ММ 1,8»103 кДа и содержит юз
одну молекулу 23S РНК с ММ 1,1 х 103 кДа, 5S РНК с ММ 40 кДа и 34 молекулы разных белков. Участие рибосом в матричном синтезе белка см. в разделе 5.1. Ядро прокариот (нуклеоид) представляет собой тонкую, непра- вильную, фибриллярную сеть из ДНК, часто располагающуюся параллельно осевой линии клетки. Во многих случаях ДНК-связы- вающей структурой выступает мезосома. Замкнутость нити ДНК в виде кольца доказано с помощью радиоавтографии. Это и есть единственная хромосома в бактериальной клетке. На нее прихо- дится 2-3% клеточной массы и 10% или более объема клетки. В такой хромосоме у Е. coli имеется от 20 до 70 суперспирализован- ных доменов. До недавнего времени признавали, что нуклеосомы (см.) присущи только эукариотам. Однако нуклеосомоподобные структуры, как оказалось, обнаруживаются и у прокариот. Из ДНК Е. coli отделены 4 гистоноподобных белка. Они были обозначены как HLPlla, HLPUb, HLPI и Н-протеин. У первых двух аминокис- лотный состав подобен аминокислотному составу гистона Н2В у эукариот, а белок Н перекрестно реагирует с антителами против гистона Н2А из зобной железы телят. Названные гистоноподобные белки помогают ферменту гиразе, или топоизомеразе II стабили- зировать суперспирализацию ДНК. ДНК-гираза способна вводить отрицательную суперспирализацию в релаксированную (от лат. relaxatio — уменьшение напряжения, расслабление) кольцевую молекулу ДНК (рис. 29). Одна мо- лекула фермента вводит до 100 спиралей в 1 минуту. Кроме гистоноподобных бел- ков — HLP (от англ, histone-like protein) в клетках прокариот име- ются полиамины, связанные с ри- босомами и мембранами. Главные из них — путресцин и спермидин: H2N—(СН2)з—NH2; путресцин H2N— (СН2)4—NH— (СН2)з—NH2 рыва с внешней стороны. спермидин Эти полиамины характеризуются антимутагенным эффектом, способностью повышать устойчивость протопластов к осмотиче- скому лизису, стабилизировать 70S рибосомы (предупреждают их диссоциацию на субчастицы). В цитоплазме прокариот могут накапливаться гликоген, напри- 104 Рис. 29. Инверсия положительной су- перспирали двухцепочечной ДНК при участии ДНК-гиразы: 1 — стабилизация положительного витка, 2 — разрыв в заднем сегменте, 3 — "залечивание" раз-
мер у энтеробактерий (до 40% массы клеток). Спорообразующие бактерии и псевдомонасы накапливают до 30% и более поли-Р-гид- роксимасляной кислоты, у большинства прокариот выявляются полифосфаты, волютин, липиды. Рис. 30. Эндоспора: 1 — кор. или цитоплазма споры; 2 — стенка споры; 3 — оболочка споры; 4 — кортекс; 5 — экзоспориум. Отдельные прокарио- ты образуют внутрикле- точные споры (эндоспо- ры). Аэробные из них представлены видами ро- дов Bacillus и Sporosarcina (S. ureae), микроаэрофи- лы — видом Sporolacto- bacillus inulinus, анаэроб- ные — видами родов Clostridium, Desulfo- tomaculum. Размер, фор- ма и расположение споры в клетке (терминальное, субтерминальное, цент- ральное) достаточно по- стоянны и поэтому ис- пользуются для характе- ристики видов. Содержа- ние в спорообразующих клетках пар нуклеотидов ГЦ достаточно низкое, особенно — у клостридий (22-28%); у них, аланиновая субъединица тетрапептидная субъединица гликолактамовая субъединица фрагмент пептидогликана в кортексе спор бацилл 105
как правило, отсутствует meso-ДАП в муреине. Эндоспоры — сложные образования и, как видно из рис. 30, эндоспора Вас. cereus представляется сферическим многослойным телом, формирование которого, как правило, диктуется неблагоприятными условиями. В кортексе спор у большинства спорообразующих видов найден специфический пептидогликан. В цитоплазме спор содержится до 15% дипиколината кальция. В белках оболочек споры отмечается повышен- ное количество гидрофобных амино- кислот и цистеина. В связи со споро- образованием культуры ряда бацилл и клостридий образуют белки, которые имеют важное народнохозяйственное значение (циклопептидные антибиоти- дипиколинат кальция ки, энтобактерин). С другой стороны, спорообразующие прокари- оты могут быть вредителями биотехнологических процессов. Спо- ры отличаются высокой устойчивостью к различным внешним факторам, хорошо переносят их воздействия и поэтому могут попасть в ферментационные среды или в готовый продукт при несоблюдении правил асептики, антисептики и стерилизации. Некоторые прокариоты (отдельные актиномицеты) могут обра- зовывать экзоспоры, которые выступают у них репродукционными образованиями и покоящимися формами одновременно (эндоспо- ры — это покоящиеся формы и/или формы дифференцировки в ходе развития и созревания клеток, например, у Вас. subtilis). Покоящимися формами являются и цисты, которые могут образовываться азотобактериями, миксобактериями, риккетсия- ми, спирохетами. 4.3. Клетки эукариот. В биохимической технологии используют эукариотические клетки различного происхождения. Источниками их являются виды, относящиеся к царствам Mycota, Plantae и Animalia. К настоящему времени ассортимент первых более ши- рокий, чем ассортимент растительных и животных клеток, эксплу- атируемых в производстве. Клетки эукариот во многом сходны между собой, тем не менее, имеющиеся различия привносят свои особенности, сказывающиеся на их структуре и функциях. На рис. 31 достаточно объективно отражены фактические данные, накоп- ленные исследователями при изучении строения клеток эукариот. Клетки грибов и растений обладают прочной клеточной стен- 106
кой, которая отсутствует у клеток животного проис- хождения. При этом мар- керной структурой для большинства грибов стано- вится хитин, для большин- ства растений — целлюлоза. Молекулярные массы их близки и достигают величи- ны порядка 500-600 кДа. Клеточные стенки грибов и растений — двухфазные си- стемы. Одной фазой явля- ются микрофибриллярные структуры, второй фазой — аморфный наполнитель. Следовательно, грибная и растительная клеточные стенки являются природны- ми композитами, в химиче- ском составе которых пре- обладают углеводные ком- Рис. 31. Клетка эукариот: 1 — плазматическая мембрана, 2 — пероксисома, 3 — ядро, 4 — ядрышко, 5 — аппарат Гольджи, 6 — шерохо- ватый эндоплазматический ретикулум, 8 — центриоль, 9 — цитоскелет, 10 — секреторная гранула, 11 — экзоцитотический пузырек, 12 — эндоцитотический пузырек, 13 — эндосома, 14 — лизосома, 15 — цитозоль, 16 — митохон- дрия, 17 — рибосомы. звено хитина звено целлюлозы поненты. Из других веществ в ней обнаружены гликопротеины, белки, в незначительных количествах — липиды и липоконъюгаты. В связи с меньшей дифференциацией клеточных структур у грибов в сравнении с растениями, можно привести усредненные данные по составу компонентов в клеточных стенках грибов (таблица 9). 107
Таблица 9 Химический состав клеточных стенок некоторых грибов, % Компонент Виды грибов Allomyces macroginus Mucor rouxii (нитчатая форма) Saccharomyces cerevisiae 1 Азот Белок Глюкан Липиды Маннан Фосфаты Хитин Хитозан Другие углеводы Сумма углеводных компонентов 5,5 10,0 16,0 58,0 74,0 6,3 7,8 3,8 23,3 9,4 32,7 9,5 55,4 2,1 13,0 28,8 8,5 31,0 0,31 1,0 60,8 Из таблицы видно, что у некоторых видов грибов (мукоровых) в клеточной стенке присутствуют и хитин и хитозан (деацетили- рованная форма хитина), у других — только хитин. Как уже было сказано, целлюлоза — маркерный компонент клеточных стенок растений, однако в незначительных количествах она обнаруживается, например, у акразиевых, гифохитридиевых, сапролегниевых, пероноспоровых грибов. Уроновые кислоты и лигнин достоверно никто не обнаруживал в клеточной стенке грибов, но многие выявляли пигменты, в том числе — меланиновые. Меланины, включающие в свой состав остатки 5,5-индолхинона и пирокатехина, обычно связаны с бел- ками (меланопротеины) или с гликопротеинами (меланогликопро- теины), и, наряду с ферментами — супероксиддисмутазой (СОД), каталазой и пероксидазами, обладают функцией протекторов (за- щитников) от кислородных радикалов (О2) и синглетного кисло- рода ( О2), являющихся сильными окислителями. Различные грибы имеют капсулы, образующиеся в результате гиперпродукции углеводных полимеров (Aureobasidium spp., Cryptococcus spp., Rhodotorula spp. и др.). Эти полимеры приобрели или приобретают важное значение для народного хозяйства (в нефтедобыче, здравоохранении, косметике). Как и у грибов в клеточной стенке растений преобладают углеводные полимеры — целлюлоза, гемицеллюлозы, пектины. К гемицеллюлозам относятся полисахариды (гликаны), входящие в 108
состав клеточных стенок растительных тканей и способные рас- творяться в разбавленных растворах щелочей и гидролизоваться разбавленными растворами кислот в мягких условиях. Это — арабинаны, галактаны, ксиланы, маннаны, фруктаны. Гемицеллю- лозы находят широкое применение в народном хозяйстве. Пектины — это полигалактурониды, входящие в состав клеточ- ных стенок и сока всех высших и низших растений. Галактуроно- вая кислота главный мономер пектинов (до 92%). Часть уроновых кислот может этерифицироваться по карбоксигруппе метанолом; остатки ее соединены С1----С4 гликозидными связями. Пектины широко используются в пищевой промышленности. Следует особо выделить лигнин — полимер полифе- нольной природы, образую- щийся только у растений. Его содержание у некоторых ви- дов может достигать 38% и с ним связано одревеснение растений (лигнификация). По распространенности среди природных биополимеров он уступает место лишь гликанам. Лигнин относится к нерегулярным разветвленным полимерам, состоящим преимущественно из остатков замещенных фенолспир- тов: n-гидроксикоричного, или п-кумарового; 3,5-диметокси-4-гид- роксикоричного, или синапового (синапинового) и 3-метоксигид- рОкоричного, или кониферилового. п-ГЯДрОКенкоричный, 3,3-дим«токси-4- 3-маточсигидроксикоричный, или кумаровый спирт гидроксчкоричный, или конифариловый спирт или синаповый (си- напиновый) спирт ----- Механизм биосинтеза лигнина окончательно не выяснен, хотя доказано, что исходным продуктом является глюкоза, а непосред- ственным предшественником его транс-кумаровый, транс-синапо- вый и транс-конифериловый спирты. 109
В древесине он связан с гликанами, главным образом — с гемицеллюлозами преимущественно тремя типами связей — гли- козидными, сложноэфирными и простыми бензилэфирными. Лигнин получают в качестве побочного продукта в целлюлоз- ном и гидролизном производствах (более двух миллионов тонн в год лишь в государствах бывшего СССР) и широко используют в народном хозяйстве. Клеточные стенки растений могут покрываться снаружи таки- ми липидами, как воск и кутин или пропитываться суберином. Все эти соединения выполняют главным образом защитную роль. Воска — сложные эфиры длинноцепочечных жирных кислот — насы- щенных или ненасыщенных (число углеродных атомов от 14 до 36) с длинноцепочечными спиртами (число углеродных атомов от 16 до 22). О &н3-(сн2)^-сн=сн-сн2— (снг)—с^4о -(с^^-сн =сн-(сн2)7—сн31 остаток линолевой кислоты остаток олеинового спирта воск (сложный эфир линолевой кислоты и олеинового спирта) Кутин (от лат. cutis — кожа) состоит из смеси высших жирных кислот и их эфиров; суберин (от лат. suber — корковое дерево) — эфир жирных кислот и суберилового спирта (циклогептанола). Клеточные стенки растений могут утолщаться за счет утолще- ния внутренних слоев, прилегающих к клеточной мембране — формируется вторичная клеточная стенка (в противоположность первичной — без внутренних от- ICHOH ложений). Такая стенка несет, u u / как правило, механическую фун- 2 2 2 кцию. В ней количество целлю- лозы может достигать 50% от су- субериповый спирт х°й массы клетки. Животные клетки лишены клеточных стенок. Лишь отдельные протозоа способны в опреде- ленных условиях образовывать так называемые цисты (дизенте- рийная амеба, кишечная балантидия и др.), которые покрываются одно-трехслойной, преимущественно белковой природы, оболоч- кой. сн2—сн2—сн2\ ио
Между клетками у грибов и растений существуют сообщаю- щиеся отверстия — п о р ы. У большинства грибов имеются простые поры (рис. 32а). Базидиальным грибам присущи сложные поры, или долипоры (от лат. dolium — бочонок) (рис. 326). Предполагают, что долипоры способствуют сохранению мицелия базидиомицетов в дикариотическом состоянии и поэтому такие "запирающие" перегородки формиру- ются во вторичном и третичном мице- лии; в первичном мицелии перегород- ки простые. Во вторичных клеточных стенках соседствующих клеток растений так- же образуются поры, в которых раз- деляющими клетки структурами явля- ются лишь первичная оболочка и се- рединная пластинка (рис. 33а, б). Различают простые поры с одина- ковым диаметром по всей длине и окаймленные поры, расширяющиеся на месте "вхождения" в клетку, где она приобретает форму сводчатого окайм- Рис. 32. Поры в перегородках грибов — у сумчатых (а): простая пора (1) в септе (2) между двумя клетками; у базидиальных (б): до- липора с ее элементами (пора — 1, парентосома — 2, долипоровая перегородка — 3). ления. Срединная пластинка — продукт деления меристемных (см.) клеток. Она состоит главным образом из аморфных пектиновых веществ равномерно (со сто- роны каждой клетки) "обрастающих" ге- мицеллюлозами. Образуется первичная клеточная стенка, в которой свободно переплетаются целлюлозные волокна ди- аметром порядка 10 нм и содержащие 8-12 тыс. остатков глюкозы. Центральная часть таких волокон имеет кристалличе- скую структуру и диаметр около 4 нм. В состав первичной клеточной стенки двудольных растений входят ксилоглю- каны (в боковых цепочках которых со- держатся ксилоза, галактоза, фукоза), а также арабиногалактаны и рамногалак- туронаны, ковалентно связанные друг с другом и целлюлозными фибриллами. Позднее формирующаяся вторичная 111 Рис. 33. Схематичное изобра- жение простой (а) и окаймлен- ной (б) пор у некоторых рас- тений (продольный разрез): 1 — срединная пластинка вме- сте с первичной клеточной стенкой, 2 — свод окаймлен- ной поры, 3 — окаймленная пора в плоскостном изобра- жении.
галакто» клеточная стенка состоит из многочисленных слоев плотно упако- ванных послойно разнонаправленных фибрилл. Такие фибриллы чаще состоят из целлюлозы, но могут включать и другие полиса- хариды, например, ксилан и маннан у некоторых водорослей. Таким образом, углеводные полимеры и лигнин составляют основное содержание клеточных стенок растений. В качестве минорного компонента в них обнаруживается гликопротеин — экстензии, содержащий в большом количестве аминокислоту 4- гидроксипролин. Олигосахаридные остатки в экстензине состоят из арабинозы и галактозы. Несмотря на наличие разделительных перегородок (септ) меж- ду клетками, они сообщаются между собой благодаря цитоплазма- тическим нитям — плазмодесмы. н0 н »1 Для грибов и растений типичным является об- кн соон разование тканей. Ткань — это большая группа 4-гидроксичюпии клеток, единого (общего) происхождения, облада- ющая сходными структурами и функциями. Дру- гими словами такие клетки, обладающие генетической и структурно-функциональ- ной общностью, формиру- ют систему — ткань. Раз- личают ложные и ис- тинные ткани. Ложные ткани образуются из групп нитей (филаментов), кото- рые могут переплетаться или срастаться клеточными стенками, но сохраняют свою самостоятельность, например, при поперечном делении. Такая ткань присуща грибам и называют ее п л е к- тенхимой, или псевдопаренхимой (от лат. plexus — сплетение, parenchyma — живая ткань, паренхима, от греч. pseudes — ложь, фальшь). Она напоминает меристему растений лишь морфологически и типична для плодовых тел базидиальных грибов, склероциев аскомицетов. Истинные ткани у грибов выяв- ляются редко, однако они имеются в перитециях сумчатых грибов (на ранних стадиях их формирования), в пикнидах у несовершен- ных грибов. Растениям присущи истинные ткани — простые (из одной системы клеток) и сложные (из разных систем клеток). Ложные и истинные ткани подразделяются по функциям на 6 112
групп: образовательные (меристемы), покровные, проводящие, ме- ханические, секреторные (выделительные) и базисные (основные). Образовательные ткани, или меристемы (от греч. meristos — делимый) состоят из активно метаболизирующих клеток, способных делиться и образовывать новые клетки. Те из них, которые служат родоначальницами всех других клеток, диф- ференцирующихся и превращающихся в клетки постоянных тка- ней, называются инициальными (отлат. initialis — первичный, начальный). У грибов настоящие меристемы не развиты, деление клеток сосредоточено на верхушках гиф. Топологически, или по местоположению у растений (рис.34) различают меристемы верхушечные, или апикальные (от лат. apex, apicis — верхушка); боковые, боковой); промежуто intercalaris — промежуточ- ный, вставной). Верхушеч- ные меристемы обеспечива- ют рост растений в длину, они же образуют конусы корней; боковые обеспечи- вают рост растений в тол- щину (к боковым меристе- мам относятся прокамбий, камбий, перицикл, фелло- ген; от лат. cambium — сме- на, обмен; от греч. pro — пред, вперед, ранее, реп — вокруг, около; kiklos — круг, цикл; fellos — пробка; genos — род, происхождение). В основаниях черешков или латеральные (от лат. lateralis — н ы е, или интеркалярные (от лат. Рис. 34. Топология меристем в растениях. Схе- матичный продольный разрез растительной почки: 1 — верхушечная меристема, 2 — лис- товые побеги, 3 — конус нарастания. листьев, в междоузлиях локализуются промежуточные меристемы. Клетки меристемы тотипотентны (от лат. totum — все, . целое, potentium — способность, потенция), то есть они полностью реализуют свой потенциал развития с образованием целого орга- низма. В биотехнологии особое значение приобрела верхушечная меристема (см. рис. 34), так как она всегда остается свободной (здоровой) от фитопатогенных микроорганизмов, например, виру- 113
сов (даже в тех случаях, когда все растение поражено патогеном). Культивирование in vitro меристемных клеток от больного расте- ния в стерильных условиях завершается получением здорового растения — посадочного материала. Известны еще так называемые раневые меристе- м ы, образующиеся в местах повреждения органов и тканей растений. В таких поврежденных участках разрастаются однород- ные паренхимные клетки, прикрывающие повреждения. Такие ткани называются каллусами (от лат. callus — мозоль). Каллусные ткани стали широко культивировать на питательных средах в целях получения посадочного и прививочного материала, а также ценных метаболитов. С меристемной тканью связан рост растений. Так, у большин- ства из них стебли и корни обладают верхушечным ростом, листья нарастают благодаря базальному росту; в стеблях злаков преобла- дает промежуточный рост. Для грибов также характерен верху- шечный рост. В общем виде он протекает следующим образом. В молодой нити гриба на всем ее протяжении достаточно легко отдифференцировать три зоны: апикальную, субапикальную и вакуолизированную дистальную (рис. 35). В апикальной зоне скап- ливается большое количество везикул (пузырьков), в субапикаль- ной - ядра, рибосомы, митохондрии, эндоплазматический ретику- лум, микротельца, микротубули и т. д. Субапикальная зона пере- ходит в зону вакуолизации (дистальную), которая тем выраженнее, чем дальше расположена от верхушки. В ней возрастает также содержание липидов. Апикальные везикулы, образующиеся в суб- апикальной' зоне и перемещающиеся к верхушке, участвуют в синтезе клеточной стенки. Там они секретируют свое содержимое или сливаются с мембраной. В них так же могут быть экзофермен- ты, способные к экструзии (от лат. extrusio — выталкивание) на кончике гифы (рис. 36). Как видно из рисунка везикулы, воз- ш п I Рис. 35. Апикальная — I, суб- апикальная — II, вакуолизиро- ванная — III зоны в молодой растущей гифе одного из ни- зших грибов (схема). никающие из эндоплазматического рети- кулума, сливаются и образуют цистерну внутренней (проксимальной) части дик- тиосомы; содержимое цистерны и мемб- раны последовательно трансформируют- ся, перемещаясь к наружной (дистальной) части диктиосомы в связи с продолжаю- 114
Рис. 36. Схема формирования и перемещения апикальных визикул из субапи- кальной зоны к верхушке гифы (КС — клеточная стенка, М — клеточная мембрана, В — везикулы, Д — диктиосомы, Р — рибосомы, ЭР — эндоплазма- тический ретикулум, Ц — цистерны). щимся образованием новых цистерн. Здесь цистерны превраща- ются в пузырьки, а затем — в секреторные везикулы, которые мигрируют к верхушке гифы. Некоторые из везикул увеличива- ются в размере, другие сливаются между собой и таким образом формируются большие секреторные везикулы. Отдельные везику- лы непосредственно достигают клеточной мембраны и сливаются с ней. Слившиеся с мембраной визикулы освобождают свое со- держимое в периплазматическую область апикальной части гифы, где осуществляется синтез клеточной стенки и сбалансированный лизис скелетных микрофибрилл. У всех высших грибов в апикальных частях мицелиальных нитей имеется так называемое верхушечное тельце сферической формы (рис. 37). При остановке роста гифы оно исчезает. Поло- жение тельца на верхушке служит направляющим вектором про- странственного роста гифы. Например, эксцентрическая позиция его указывает на то, что верхушка изогнется в ту же сторону. Хотя гифы всех грибов растут за счет апикальных частей (а к- ропетальный или базифугальный рост; от греч. acros — самый высокий, верхушка, кончик; petalon — лист; basieos — основание, fugas — изгоняющий), утолщение клеточных стенок может наблюдаться и около верхушек, а иногда — ив дистальных частях, например, при образовании гемм у Aureobasidium pullulans. Тем не менее, если неограниченный рост мицелия в длину потен- циально возможен, то увеличение ширины его весьма лимитиро- вано. Верхушечный рост растений морфологически сходен с вер- 115
тельце Рис. 37. Схематическое изображение апикальных частей у оомицетов (А), зигомицетов (Б) и высших грибов (В). хушечным ростом грибных нитей, однако у растений он характеризу- ется более выраженной ритмично- стью с чередованием процессов ус- коренного и замедленного роста при возможном переходе всего рас- тения или его каких-либо частей в состояние покоя (семена, клубни). Ростовые ритмы могут быть эндо- генного и экзогенного происхожде- ния. Причем воздействующие внешние факторы могут быть одни- ми и теми же, например, свет и температура. Так, у некоторых гри- бов проявляются ростовые зоны при освещении культур через опре- деленные промежутки (чередование темноты и света). Причем на одинаковое физическое возбуждение ответная реакция грибов весьма различная. На этом основании грибы условно подразделяют на три главные группы: 1) грибы, не отвечающие на свет и тепло, их ростовые зоны, относимые к эндогенным ритмам, всецело являются ответной функцией на условия обитания в питательной среде. К этой группе относятся Ascochyta chrysanthemi, некоторые мутанты Ascobolus immersus, Pestalotia annulata и Podospora anserina; 2) грибы, ростовые зоны которых, относимые к экзоген- ным ритмам, возникают в ответ на физические возбуждения. Сюда относятся Alternaria tenuis и Trichoderma viride, чувствительные к фотоциклам, Aspergillus ochraceus и A. niger, чувствительные к фото- и термоциклам; 3) в эту группу включены грибы, которые при слабом физическом возбуждении проявляют зональный рост как экзогенный ритм, в то время как сильное возбуждение прово- цирует эндогенный ритм (зональный рост), который продолжается некоторое время после прекращения стимула. Эндогенный ритм, наведенный разовым освещением Sclerotinia fructigena, S. laxa и Leptospheria michotii, имеет период в 24 часа. Культуры S. fructicola, один раз освещенные достаточно интенсивным белым светом или светом с длиной волны меньше 500 мкм, а затем оставленные в темноте или при очень слабом освещении, проявляют суточный ритм в течение трех дней. 116
Ежедневное освещение интенсивностью 1000-3000 лк в течение нескольких секунд вполне достаточно, чтобы индуцировать зональ- ный рост у Fusarium discolorsulfureum, Trichotecium roseum и Verticillium lateritium (экзогенные ритмы). Фототропизм присущ и грибам (например, фикомицетам) и растениям. Так называемые циркадные ритмы (от лат. circus — круг) связаны со сменой дня и ночи, иногда — с длительностью дня (фотопериодизм). Они контролируются у всех эукариотических организмов специальным внутренним механизмом, называемым ф и з и о л о г и ч е с к и м и, или б и- ологическими часами. В регуляции ростовых ритмов существенна роль фитогормонов — ауксинов, гиббереллинов и кининов (цитокининов). Из ауксинов (от-греч. аихо — выращиваю, увеличиваю) наиболее распростра- ненным является гетероауксин — ИУК (3-индолилуксусная кисло- та), из гиббереллинов (продуцент Gibberella fujikuroi) — гибберел- ловая кислота (ГАз), из кининов (от греч. kineo — двигаю, побуждаю — кинетин (6-фурфурилметиламинопурин). Все названные выше ритмы отражают адаптивные (приспосо- бительные) потенции наследственно компетентных организмов, обитающих на разных географических широтах земного шара. Покровные ткани имеются у грибов (на склероциях, на шляпках плодовых тел базидиомицетов и других образованиях). Они воз- никают из плектенхимы. У растений покровные ткани имеют меристемное происхождение. К ним относятся: эпидерма с устьи- цами, трихомами (от греч. trichos — волос) и эмергенцами (от англ, emergency — крайность) на листьях и молодых побегах, нередко покрытая кутикулой или воском, с полисахаридами, кристаллами в клетках или кремнеземом — в качестве пропитки; перидерма (от греч. peri — вокруг, derma — кожа) с чечевичками — вторичная покровная ткань на корнях и стеблях преимущественно у много- летних растений (пробка); корка на ветвях, корнях и стволах многолетних деревьев. Механические (опорные) ткани у грибов представлены гифами с утолщенными клеточными стенками в плодовых телах у труто- виков, в тяжах у домового гриба, в ножках апотециев у некоторых сумчатых. У растений известны два основных тийа опорных тканей — колленхима (уголковая, пластинчатая, рыхлая) и склеренхима (от греч. kolla — клей, skleros — твердый, enchima — налитое, здесь 117
— ткань). К склеренхиме относятся волокна (лубяные, древесин- ные) и склереиды — структурные элементы механической ткани. В промышленности используют преимущественно лубоволокни- стые растения (лен, липа, кенаф, конопля и др.). Проводящие ткани в виде дифференцированных структур от- сутствуют у грибов. Сами мицелиальные нити обеспечивают по- ступление и проведение влаги между клетками. Тем более, что у высших грибов септы не обладают абсолютной герметизацией, а у низших они отсутствуют или встречаются редко по ходу гиф. У растений имеются специализированные ткани — ксилема, флоэма (от греч. ksilon — дерево, floos — кора, лыко) и проводящие пучки. Ксилема состоит из трахеидов — омертвевших клеток, суженных на концах; сосудов — полых трубок, и сердцевинных лучей, состоящих из тонкостенных паренхимных клеток. К флоэме относятся живые (не омертвевшие) ситовидные элементы, парен- химные клетки (лубяная паренхима), сердцевидные лучи и меха- нические элементы. В стеблях флоэма локализуется кнаружи от ксилемы. Проводящие пучки представляют собой обособленные тяжи, состоящие из элементов ксилемы и флоэмы. Ксилема обеспечивает восходящий ток (от корня к листьям) водных растворов солей, флоэма — нисходящий ток продуктов фотосинтеза. Секреторные (выделительные) ткани в виде специализирован- ных морфологических структур отсутствуют у грибов, хотя экзо- цитоз (см.) присущ клеточной мембране и по этой функции она уподобляется секреторной ткани. Из клеток грибов секретируются многие первичные и вторичные метаболиты (ферментные и не- ферментные белки, пигменты и другие вещества). Структуры, подобные млечникам у растений, имеются у некоторых базидио- мицетов (скрипица, рыжик). В этих случаях между гифами и окружающими их клетками образуются ситовидные пластинки и гифы становятся как бы млечными трубками, содержащими млеч- ный сок (эмульсия смол, масел, пигментов, горьких и других веществ в воде). У растений различают ткани наружной и внутренней секреции. К числу первых относятся гидатоды (от греч. odos — путь), выделяющие водно-солевые растворы; железистые трихомы (же- лезки, нектарники, головчатые волоски). Ко вторым относятся клетки — идиобласты (от греч. idios — своеобразный, особенный, blastos — отросток, побег), располагающиеся среди других тканей и накапливающие жидкие или плотные секреты — преимущест- ве
венно продукты вторичного метаболизма (оксалат кальция, по- лифенольные соединения, слизи, таннины, терпеноиды); смоляные ходы, эфиромасляные каналы, млечники, пронизывающие все растение. Базисные ткани относятся к разряду мало специализирован- ных, возникающих у растений из клеток апикальных меристем; у грибов имеются немногие соответствующие органоиды (не ткани), которые функционально сходны с базисными тканями — это преимущественно вакуоли с запасными питательными вещества- ми. У растений выделяют ассимиляционную (хлоренхима), возду- хоносную (аэренхима) и запасающие ткани, все относящиеся к базисным. В запасающих тканях откладываются белки, вода (на- пример, у кактусов), жиры, пигменты, углеводы и др. Ткани высокоорганизованных животных организмов подраз- деляют на 4 группы: эпителиальные (ведущая роль их — отграни- чивающая), ткани внутренней среды с сильно развитым межкле- точным веществом в виде волокнистых структур и аморфной субстанцией (кровь, рыхлая и плотная соединительная ткань, хрящевая и костная ткани, репродуктивная ткань), мышечные ткани и нервная ткань. Органы животных и человека могут состоять из разных тканей (аорта, органы пищеварительного трак- та) или почти целиком из одной ткани (кость, печень, сухожилия и др.). Целостный организм — как система высшего порядка "диктует" запросы органам, структурными компонентами которой они являются. У человека различают двенадцать систем органов: покровная, опорная (скелетная), мышечная, кровеносная, дыхательная, пище- варительная, выделительная, нервная, сенсорная (от лат. sensorius — чувствительный), эндокринная (от греч. endon — внутри, krino — отделяю), иммунная и репродуктивная. В настоящее время успешно культивируют in vitro клетки и ткани (преимущественно эмбриональные) в соответствующих ус- ловиях, что приобрело большое значение в биотехнологии. Клетки млекопитающих существенно различаются по химиче- скому составу, поскольку они достаточно сложны по набору орга- нелл, а кроме того клетки специализированы в соответствии с принадлежностью к органам и системам органов, к видам живо- тных и т. д. Тем не менее, в усредненном варианте состав их следующий (таблица 10). 119
Таблица 10 Усредненный химический состав клеток млекопитающих Компонент содержание % пикограммы (10‘12 г/клетка) пределы размаха величин усредненно в клетке Вода 2700-4800 2900 82,9 Белки 200-300 250 10-20 Углеводы 40-200 150 1-5 Липиды 100-200 120 1-2 РНК 20-40 25 0,7 ДНК 8-17 10 0,3 Как видно из таблицы наименьшее количество массы клетки приходится на ДНК, то есть на тот компонент, который определяет ее наследственные особенности. Эта закономерность присуща всем представителям живых существ. Некоторые свободно живущие клетки эукариот склонны к хемотаксису (от греч. taxis — расположение), то есть передвигаться к химическому (хемотаксическому) сигналу. Это, например, типично для лейкоцитов крови, выходящих из сосуди- стого русла к очагу воспаления. Хемотаксис присущ и прокарио- там. К 1984 г. большинство цитологов утвердилось во мнении, что в эукариотической клетке имеющийся цитоскелет играет важнейшую роль в различных биологических явлениях. Цитоске- лет - это внутриплазматическая Рис. 38. Клетка млекопитающего животно- го (на основании иммунофунофлуорес- ценного анализа): цитоскелет - 1, ядро-2. поддерживающая система пере- крещивающихся плотных воло- кон (филаментов) и полых тру- бочек (тубул, микротрубочек) — "балки и канаты" — по К. Де Дюву (1987). Используя метод иммунофлуоресценции, удает- ся выявлять цитоскелет клеток во всем многообразии (рис. 38). В 1987 г. был предложен термин "цитоскелетология" (В. Бирх- майер), относящийся к части на- уки о клетке. С начала 70-х годов стали выделять новые белки, ас-
социированные с цитоскелетом, например, белок глиальных эле- ментов, образующий промежуточные филаменты в глиальных нервных клетках; спектрин — основной белок цитоскелета мемб- ран эритроцита; динеин — высокомолекулярные белки с АТФ-аз- ной активностью; винкулин — белок, присутствующий в факаль- ных контактах фибробластов, образует пучки актиновых филамен- тов; и другие. Много лет тому назад были открыты актин, миозин, сс-актинин, тубулин, тропонин, тропомиозин. Структурно-функци- ональные особенности их изучены в достаточной степени, что показано в таблице 11 на примере миозина, актина и тубулина. Таблица 11. Некоторые характеристики актина, миозина и тубулина в элементах цитоскелета животных клеток. Элементы цитоскелета характеристика структурная функциональная диаметр, нм состав- ляющий белок ММ белка, кДа агенты СВЯЗЬ диссо- циа- ции ассоци- ации Микрофила- менты 2 миозин <150 АТФ с актином и Са+ + в сократит, акте Микроволокна 6-7 актин 42-46 цито- холазин В АТФ с цитокине- зом, пино- и эндоци- тозом Микротру- бочки 25-28 тубулин 120 вин- блас- тин, вин- крис- тин, колхи- цин ГТФ с митоти- ческим верете- ном Л* центри- олями, реснич- ками, жгутика- ми и экзоци- тозом 121
Миозин в виде двойной молекулы формирует стержень, рав- ного которому по длине нет в природе аналогичных молекул ("цитомышца"). На рис. 39 представлен поперечный срез актоми- озина, где показана ассоциация шести тонких актиновых фила- ментов с толстым миозиновым филаментом. В зависимости от диаметра филаменты подразделяют на тонкие (до rtf 6-7 нм), промежуточные (8-10 нм) и толстые (15-20 нм). Рис 3®' Схематичное строение актомиозинового пучка в попе- СцТу'"' речном разрезе: 1 -актин, 2-миозин. Актиновые филаменты ("цитокости"), чаще группирующиеся в форме тонких пучков, составлены из глобулярных белков. Такие глобулы имеют полярный и боковой сайты связывания, благодаря которым они растут в длину в виде двойной цепи. В желобке двухспирального филамента актина располагается тонкая белковая нить тропонина (рис. 40), образующего вместе с миозином тропо- миозин (от греч. tropos — поворачивать, mis — мышца). Микроволокна актина могут разобщаться при вза- имодействии с цитохолазином В, или фомином [7,20- дигидрокси-16-метил- 10-фенил-24-окса- [ 14 J-цитохала за - 6(12),13(E),21(Е)-триен,1,23-дион]. Цитохолазин В образуется грибами Helminthosporium dematioideum и Phoma exigua. В ряду цитохолазинов известны А, В, С, D, Е, F, G, Н, J, родственными им явяются хетоглобо- зины. Со времени открытия цитохолазинов в 1964 г. выполнено большое количество работ с ними. Показа- Рис. 40. Тро- помизин (1), располагаю- щийся вок- руг актино- вого фила- мента (2). цитохолазин В но, что все они тормозят процессы, происходящие в цитоплазме (не в ядре), а в относительно больших дозах вызывают энуклеацию клеток, что особенно наглядно проявляется на клетках млекопитающих. 122
винбластин: И=СНз винкристин: R= СНО Тубулин входит в состав микротрубочек. Это глобулярный белок с диаметром порядка 4 нм, но после сборки 13 его протофи- ламентов (от греч. protos — первый, от лат. filamentum — ниточка) в цилиндрическую структуру, внешний диаметр ее составляет 28 нм (внутренний — 14 нм). Тубулин диссоциируется при действии алкалоидов индольного ряда(винбластина.винкристина) и трополона (кольцо С в колхици- не). Белки цитоскелета по своим функциям могут быть подразделе- ны на гелеобразующие, фрагментирующие, кэпирующие (от англ. cap—шапка, кепка, колпак), адгезирующие, регулирую- щие и другие. С учетом новых групп белков, выявленных в цито- скелете, становится очевид- ным, что само название ка- жется не совсем адекват- ным, поскольку цитоскелет — это не неподвижный кар- кас, или скелет, а сложная и гибкая система, способная в ряде случаев к фрагмента- ции и самосборке, к сколь- жению и другим функциям. Тем не менее, определенные элементы цитоскелета дей- ствительно служат для со- здания статичного остова клетки (кератин в клетках эпителия, десмин в мышеч- ных клетках, и т. д.). При выделении молекулярных компонентов клетки и тополо- гической привязки их в фиксированных клетках необходимо учитывать тот факт, что цитоскелетные структуры находятся в процессе постоянных сборки и разборки в живых клетках. В настоящее время выделяют 5 основных классов белков, образующих так называемые промежуточные фила- менты: виментиновые (ММ=55 кДа) в ткани мезенхимы (зародышевая соединительная ткань большинства многоклеточных животных и человека), глиальные (ММ=53 кДа) в клетках глии 123 колхицин
(клетки в головном и спинном мозге), десминовые (ММ = 52 кДа) в мышцах, нейронные (три белка с ММ = 70 кДа, 150 кДа и 200 кДа) в нейронах, кератиновые (около 20 белков с ММ от 40кДа до 70 кДа). Функция их окончательно не установлена. Предполагают, что они причастны к митозу, к развитию клеток в норме и при опухолевой патологии, выполняют роль механического скелета. Элементы цитоскелета поддерживают клеточную мембрану, взаимодействуют с мембранами органелл и, как считают, участву- ют в трансмембранной передаче сигналов в обоих направлениях, что исключительно важно при объединении отдельных клеток в ткани. В трансмембранной передаче сигналов участвуют мембран- ные гликопротеины, или гликопротеиновые рецепторы, контакти- рующие с филаментами. Эти последние индуцируют систематиче- ское движение рецепторов. За обратимое "заякоривание" рецеп- торов ответственны тубулы, или микротрубочки. Эти данные представляют большой интерес не только с точки зрения раскры- тия и познания фундаментальных биологических явлений, но и с практической точки зрения, например, при использовании лекти- нов (от лат. legere—читать, отбирать, выбирать) — как митогенных, токсических и цитолитических агентов. Цитоскелетные структуры имеют прямые связи, например, микротрубочки с митохондриями, синаптическими пузырьками (области контактов нервных клеток, или нейронов друг с другом и с клетками исполнительных органов), ядром; промежуточные филаменты — с ядром. Эукариотические клетки многоклеточных организмов отлича- ются друг от друга в зависимости от ткани (органа), из которой они изолированы. Например, у млекопитающих клетки кожи отличаются от клеток печени, у растений клетки эпидермы отли- чаются от клеток колленхимы, у грибов рода Penicillium зароды- шевые клетки — экзоспоры, или конидии отличаются от клеток вегетативного мицелия. Клетки эукариот в большинстве своем крупнее клеток прока- риот по диаметру и объему, пространственно более организованны и дифференцированны, чему во многом способствует цитоскелет. Внутреннее содержимое клетки разделено на отграниченные мем- бранами пространства — отсеки, или компартменты (от англ, compartment — отделение, купе, отсек). Поэтому компартментали- зация типична для эукариотической клетки и несвойственна по- давляющему большинству прокариотических клеток. Клеточная мембрана эукариот сходна по составу и строению с 124
клеточной мембраной прокариот — в ней содержатся белки (в том числе — маркерный фермент — 5'-нуклеотидаза), липиды и угле- воды. Однако компонентный состав каждого из названных пол- имеров у эукариот и прокариот не идентичен. Например, ключе- вым гликозиллипидом мембраны прокариот является бактопренол (ундекапренол). Это — С55-соединение, содержащее 9 цис-двойных связей и 2 транс-двойные связи и относящееся к изопреноидным липидам. Бактопренол участвует в процессах биосинтеза О-анти- генов грамотрицательных бактерий, а так же пептидогликанов в клеточных стенках грамположительных бактерий. бактопренол В клеточной мембране дрожжей содержится долихол, сходный с бактопренолом, но не тождественный ему. Долихол, будучи гликолипидом, также является изопрениловым спиртом, способ- ным фосфорилироваться и участвовать в синтезе маннопротеинов клеточной стенки и неорганических полифосфатов (рис. 41); в нем содержится 16-20 пренильных остатков и в среднем 80-100 угле- родных атомов. сн3 сн3 сн3 сн3 zCHj н2 сн СН2 СН£ с=сн — сн2—о он—р=о ?н3 сн ЖЗс/ 7-S о Man Дрожжевая долихолфосфатманноза 125
Гидрофобная часть изопреноидов закрепляется в мембране, а гидрофильная — выступает в цитоплазму. Рис. 41. Схема строения клеточной стенки у Saccharomyces cerevisiae (по В. Фаркашу, 1985). витамины К (п-1-6) витамин К1 (филпохинон) Долихолы являются также участниками реакций переноса ман- нозильных и N-ацетилглюкозильных единиц на гликопротеины в клетках млекопитающих. К производным полмпреноидов относятся такие БАВ, как ви- тамины К, убихиноны, пластохиноны, токоферолы (в частности, витамин Е), каротиноиды, фитольная группа хлорофилла, способ- 126
ОС. - токоферол (в^-токэфероле содержится Н в позиции 7; вЯ-токофвропв содержится Н в позиции 6; в^-тоиоферопе содержится Н в позициях 5 и 7) каротин из зеленых листьев растений - предшественник витамина А у животных Н С—СН—(СН ) —СН—(СН ) —СН—(СН ) —С=СН—СН,О—СО—R 3 I -с 3 I 2 3 | 2 3 | 2 сн3 СН3 CHj CHj остаток фитола R - Mg-порфириновый скелет ствующая встраиванию пигмента в липидный слой мембраны, эфирные масла. В состав эфирных масел входят монотерпены и сесквитерпены, относящиеся к классу терпеноидов, то есть соединений, кратных по составу изопрену (С5Н8). скелетная формула монотерпенов типа п-ментана (ментол, цинеол, лимонены, И др ) скелетная формула секвитерпенов типа кадинана (кадинены, калакарен и др.) Почти все мембранные образования внутри клетки являются либо производны- ми клеточной мембраны или непосредственно связаны с ней: комплекс Гольджи (дик- тиосома у грибов и расте- ний) и эндоплазматический 127
Рис. 42. Основные мембранные структу- ры в эукариотической клетке: 1 — кле- точная мембрана, 2 — мембрана мито- хондрий, 3 — ядерная мембрана, 4 — мембрана эндоплазматического ретику- люма, 5 — мембрана диктиосом, 6 — мембрана вакуоли. ретикулум (ЭПР), эндосомы и ли- зосомы, пероксисомы и др. Иск- лючение представляют митохон- дрии, о возникновении которых сказано ранее (рис. 42). Комплекс Гольджи — пред- ставляется параллельными труб- чатыми структурами, связанны- ми с шероховатым ЭПР (шерохо- ватость ЭПР обусловливается присоединенными к его наруж- ной поверхности рибосомами). Принадлежностью мембраны комплекса Гольджи являются специфические гликозилтранс- феразы, катализирующие реак- ции присоединения моносахари- дов из УДф- или ЦМФ-сахаров к белкам с помощью гликозидных связей — через гидроксильную группу серина или треонина, ре- же — через амидную группу ас- парагина. Синтезированный гли- копротеин может выделяться из клетки благодаря экзоцитозу или отлагаться до времени в вакуолях комплекса Гольджи в виде гранул или, наконец, переноситься в другие места клетки. В растительных и грибных клетках аналогом комплекса Гольджи является диктио- сома — немногочисленные параллельные дисковидные пластинки, по периферии которых имеются валикообразные расширения и множество разной величины пузырьков. Не исключается возмож- ность участия диктиосомы в синтезе и секреции компонентов клеточных стенок. ЭПР — мембранная структура, локализующаяся вблизи ядра. Считается, что секретируемые белки мембран синтезируются при участии шероховатогоЭПР, а белки, которые используются клеткой — на свободных рибосомах. Без присоединенных рибосом ЭПР называют гладким. В нем локализуются различные ферменты, включая оксидазы, участвующие в детоксикации ядо- витых для клетки веществ. При участии гладкого ЭПР осуществ- ляется синтез липидов и гидролитическое расщепление гликогена (гликогенолиз). 128
Эндосома — это мембранная везикула (от лат. vesicula — пузырек), возникающая в результате эндоцитоз а; под термином эндоцитоз понимают проявления общего механизма захвата плот- ных частиц (фагоцитоз, от греч. phagos — поедание), вирусов — виропексисот лат. pexis (в конце слова) — соединение, скрепление, коллоидов (коллоидопексис)и капелек жидкости (пиноцитоз, от греч. pino — пью, впитываю). Однако чаще захват водонерастворимых веществ (микробов, эритроцитов и других частиц с диаметром более 1 мкм) с образованием фаго- сомы относят к фагоцитозу, тогда как поглощение водораство- римых веществ с ММ от 180 до 150000 Да и более (антитела, гормоны, маннит, пептиды, сахароза, ферменты) с образованием пиносомы относят к пиноцитозу. Пиноцитоз может быть неселективным (жидкостно-фазным), когда поглощаемое вещество предварительно не связывается с мембраной, и с е- лективным (неспецифическим, адсорбционным и рецепторно-опосредованным), когда вещество предварительно связывается с определенными участками мембраны. Следовательно, эндосома возникает при эндоцитозе благодаря инвагинации (впячиванию) клеточной мембраны, проявляющей свойства текучести и самозамыкания (жидкостно-мозаичная структура). Во многих случаях эндоцитоз опосредуется рецептора- ми, находящимися на поверхности мембраны (мембранные "пэт- чи", от англ, patch — лоскут, обрывок, заплата). У простейших и низших позвоночных эндоцитоз является единственным механиз- мом питания. На поверхности клетки может располагаться множе- ство рецепторов. Например подсчитано, что на одном нейтрофиле размещается порядка 2» 10s рецепторов лишь для фракции компле- мента 5а, а клетка Candida albicans связывает около 2,5-3» 10s молекул СЗ-фракции комплемента. Рецепторами в гепатоцитах (клетки печени) являются структуры, распознающие галактозу и N-ацетилгалактозамин в гликопротеинах (Гал/Гал-ИАц-рецепто- ры), в том числе — в IgG-иммунных комплексах; секреторные компоненты, связывающие IgA-иммунные комплексы; рецепторы, специфичные для маннозо-6-фосфата, и т. д. Рецепторы животных организмов подразделяют на э к с т е- рорецепторы и интерорецепторы. Первые из них воспринимают сигналы извне: слуховые, обонятельные, вку- совые, тактильные (от лат. tactilis — осязательный), и др.; вторые воспринимают из внутренней среды — гормональные, медиатор- ные. Так, наиболее чувствительные к нервным медиаторам участки между нервными волокнами и клеточной мембраной называют 5 т. 8524 129
медиаторными рецепторами, а мембранные сайты, чувствительные к гормонам, называют гормональными рецепторами. Иногда используют термин химичес- кие рецепторы, когда хотят сказать о биомолекулах клетки, взаимодействующих с лекарственными или токсическими вещест- вами. Так, веротоксин Е. coli 0157:Н7 взаимодействует с рецепто- рами ряда клеточных линий, включая Hela и Vero. Вначале его В-субъединица присоединяется к специфическому рецептору на поверхности клетки с интернализацией (от лат. intemus — внут- ренний) активной субъединицы А, которая прерывает функции клетки благодаря взаимодействию со специфическими компонен- тами субклеточной "машины". Указанный выше рецептор специ- фичен для веротоксинов 1, 2 и Shiga-токсина. Он представляет собой гликолипид — глоботриозилцерамид (СЬЗ). Рецепторами также могут быть сульфгидрильные, карбониль- ные, аминные и другие функциональные группы. Однако рецеп- торы обладают не только химическими группировками или моле- ОН NH-COR I I НзС-ССН^ 2-сн=сн-сн-сн-сн2он церамид (R-остаток жирной кислоты) Рис. 43. Синаптические бляш- ки на нервной клетке в ганг- лии сердца лягушки (1 — си- наптическая щель, 2 — мы- шечное волокно, 3 — синапти- ческая бляшка, 4 — тело по- стсинаптической клетки, 5 — пресинаптический аксон, 6 — постсинаптический аксон). кулами взаимодействия с лигандами, но и своей архитектоникой (от греч. architectonike — строительное искусст- во). Так, в вегетативной нервной системе место контакта нервных элементов — синапс включает: пресинаптическое нервное окончание, в котором синтези- руется медиатор; синаптическую щель, куда поступает медиатор; постсинаптиче- скую мембрану, в которой имеются ре- цепторы, взаимодействующие с медиато- рами (рис. 43). Широко известными ме- диаторами являются адреналин, норадре- налин, ацетилхолин. Поэтому говорят об адренорецепто- рах и холинорецепторах (рис. 44). Изве- стны al-, a2-, pi-, Р2- и у-адренорецепто- ры, а также холинорецепторы нервно- мышечных синапсов (рис. 45). Одни хо- линорецепторы проявляют Ьысокую чув- 130
ствительность к алкалоиду мускарину, поэтому их называют м-холинорецепторами, другие — к алкалоиду никотину, их называют н-холи-норецепторами. На примере н-холинорецептора из электрического органа электрического ска- та доказано, что рецептор существует в виде розеток в двух формах —i легкой (95 кДа) и тяжелой (135 кДа); первая — мономер, вторая — димер (рис. 46). Специфическими лигандами для рецепторов в «-бунгаротокси- не являются аминокислоты Арг-37 и Асп-31. а-Бунгаротоксин образуется крайтом Bungarus (змея — аспид); он представляет адреналин норадреналин / Н3О—СО—О—(СН2)2—Ns (CHj)3 ацетилхолин собой полипептид из 71-74 аминокислотных остатков, стабилизи- рованный четырьмя дисульфидными мостиками (жесткая структу- ра). Рис. 44. Адренорецепторы (а и р) в стенке артерии: 1 — стенка артериаль- ного сосуда, 2 — миофибриллы, 3 — адренорецепторы, 4 — возбуждение, 5 — сокращение, 6 — торможение, 7 — расслабление. Рис. 45. Схематичное строение нервно- мышечного синапса по С. Куфлеру и Дж. Николсу (1979): 1 — частички, 2 — ямки, 3 — синаптические визикулы, 4 — пресинаптическая мембрана, 5 — постсинаптическая мембрана, 6 — складки постсинаптической мембраны, 7 — синаптическая щель.
Из рис. 46 следует, что ионный канал в н-холинорецепторе создается самим рецептором. Теперь доказано, что женщины, болеющие раком молочной железы и не имеющие на раковых клетках рецепторов эстрогена, излечиваются эндокринными пре- паратами лишь в 10% случаев. Напротив, при наличии таких рецепторов излечиваются подобными средствами в 50-65% случаев и более. Заболевания типа тяжелой миастении (Myastenia gravis) и редкой устойчивой к инсулину формы диабета обусловливаются аутоиммунными реакциями, когда собственные антитела блокиру- ют рецепторы, вызывают их транспозицию (перемещение) внутрь клетки и разрушение. Рис. 46. Н-холинорецептор электрического ската; молекулы рецептора в составе фосфо- липидных пузырьков (А); розетка рецептора (Б) с двумя местами связывания a-бунгароток- син а. Рецепторы, соединяю- щиеся с молекулами — ли- гандами, группируются в образовывающихся в мемб- ране окаймленных ямках, или углублениях. Диаметр углублений около 100 нм. В структуре их выделяют тя- желые (ММ= 180 кДа) и лег- кие (ММ= 35 кДа) цепи клат- ринов (от лат. clathrum — решетчатый барьер), формирующих ассамблею протомеров в форме корзинок, которые и покрывают окаймленные углубления. При эндоцитозе клатриновая клетка — ловушка втягивает внутрь участок мембраны — пэтч. При этом углубления как бы опускаются внутрь клетки, края их сужаются, остается маленькое отверстие, которое вскоре исчезает, и мемб- рана становится гладкой. Мембрана таким образом лишается пэтча, трансформировавшегося внутри клетки в свободно передвигаю- щуюся везикулу (пузырек). В зависимости от процесса (фагоцитоз, пиноцитоз) везикулу называют: "фагосома”, "пиносома", "фагоци- тарная", "пиноцитарная” или "эндоцитарная вакуоль", эндосома. Окаймленные ямки дают начало окаймленным пузырькам, теряю- щим впоследствии клатриновое покрытие и способным сливаться с другими неокаймленными везикулами — эндосомами, лизосома- ми по цис- и транс-м еханизмам. Цис-механизм заключается в слиянии поверхностей мембран, непосредственно контактирую- щих с цитоплазмой. Транс-механизм заключается в сближении наружных поверхностей мембраны. По цис-механизму протекает 132
экзоцитоз, слияние везикул в цитоплазме, поглощение одной ве- зикулы другой (аутофагия), почкование; по транс-механизму про- текают: захват мембранных везикул, разделение везикул, эндоци- тоз. Функция эндосомы — первичная внутриклеточная переработка захваченных веществ при pH ниже 7,0 с последующим транспор- том их в лизосомы или, обходя последние, в места хранения (гранулы). Эндосомы могут сливаться с клеточной мембраной, и тогда их содержимое выводится из клетки — экзоцитоз. Участки мембраны (пэтчи) могут' отделяться с частью содержимого от эндосомы и возвращаться в одних случаях — на прежнее место (такой процесс называется регургитацией, от франц, regurgitation — излияние, извержение), в других случаях — на противоположную сторону клетки, где сливаются с мембраной и немодифицированный материал выводят наружу — д и а ц и- т о з (от греч. dia — через). Продукты экзоцитоза (литические ферменты, гормоны и другие вещества) поступают в околоклеточ- ные пространства, в кровяное русло, в специализированные сек- реторные протоки (например, слюна, секрет поджелудочной же- лезы и т. д.). В некоторых случаях эндосомы на время превращаются в вакуоли, то есть когда по каким-либо причинам слияние их с лизосомами приостанавливается. Регуляторами таких процессов могут выступать некоторые гликопротеины (например, конканава- лин А), микобактерии туберкулеза и другие факторы. Весьма существенной для жизнедеятельности эукариотических клеток является способность мембран любых компартментов клет- ки сливаться и разъединяться. Поэтому регулируемый поток в мембранных образованиях в направлении: клеточная мембра- на (эндоцитоз) —> эндосома —> лизосома —> комплекс Голь- джи -> ЭПР —> коплекс Гольджи -> секреторная гранула (экзоцитоз) в основном экспериментально установлен и, следова- тельно, реален. Лизосомы (0,5 х 2-3 мкм в диаметре) происходят из эндосом. Их число в клетке может достигать нескольких сотен. Лизосомы характеризуются большим полиморфизмом и размерами. Они представляют собой мембранные образования, в которых проис- ходит "переваривание" поступающих в клетку веществ с помощью гидролаз при pH =3,5-5,0. В лизосомах обнаружено свыше 50 133
гидролитических ферментов. Продукты гидролиза ранее поступив- шего материала проникают через мембрану лизосом во вне — в цитозоль (основной наполнитель клетки, состоящий из воды с водорастворимыми компонентами), в том числе — связанные с выработкой энергии (гликолиз). Известны лизосомотропные вещества, которые в непротони- рованной форме (незаряженной) проникают через мембрану ли- зосом и могут накапливаться в них. Они, как правило, являются лиофильными слабыми основаниями и могут быть использованы в практических целях. К их числу относятся противомалярийный NH—CH—(CH ) — N=(C,HJ, препарат хлорохин —про- I I 23 z 5 2 ИзВОдное 4-аминохиноли- на. Накапливаясь в лизо- kJLj Л сомах, хлорохин блокиру- ем ет Метаболизм гемоглоби- Рис. 47. Лизосома — протонная ловуш- ка; П —препарат. ПН — протонизиро- ванный препарат, 1 — быстрое проник- новение, 2 — протонный насос, 3 — медленный выход. на — единственного ис- хпорохим точника питания малярий- ного плазмодия. Лизосомотропизм слабых оснований базируется на механизме протонной ловушки. Такой механизм присущ и эндосомам, неко- торым отделам комплекса Гольд- жи. (рис. 47). В клетках печени и почек мле- копитающих, растений и грибов имеются пероксисомы — неровные округловатые мембран- ные образования 0,5-10 мкм в ди- аметре, заполненные компактным аморфным матриксом с плотной кристаллоидной сердцевиной. В них осуществляется окислитель- ный метаболизм, главным участником которого высту- пают пероксисомальные ок- сидазы и каталаза: Можно О О2 2Н2°' где АН2 А ан2 А полагать, что "пероксисо- мальный тип дыхания" (не А и А" — субсраты (А‘ — низкомолекулярный) 134
экономичный, но простой по реализации) возник задолго до того, как были "включены" в аэробное дыхание митохондрии. Перокси- сомы — органеллы, возникшие в ответ на появление кислорода в атмосфере. В пероксисомах происходит р-окисление жирных кис- лот. Субстратами окисления (кроме жирных кислот) могут быть разные соединения, включая D- и L-аминокислоты, гидроксикис- лоты, спирты, амины, пурин, но никогда НАД»Н, который окисля- ется в митохондриях. Пероксисомы участвуют также в синтезе углеводов. У инфузорий (Tetrahymena pyriformis) пероксисомы называют глиоксисомами, в которых содержатся лишь два фермента глиоксилатного пути окисления веществ — изоцитрат-лиаза и малат-синтаза. У некоторых протозойных организмов имеются одномембран- ные органеллы — гликосомы и гидрогеносомы. В первых протекает гликолиз, во вторых — окисление пирувата, сопряженное с синтезом АТФ (у Trichomonas vaginalis нет мито- хондрий, но есть пероксисомы). При аэробных условиях высво- бождающиеся при окислении электроны передаются на кислород с образованием Н2О; при анаэробиозе электроны переходят к протонам (Н+) и образуется водород (Н2). В этойпоследней реакции участвуют гидрогеназа и ферредоксин (белок с низким окисли- тельно-восстановительным потенциалом). У грибов имеются хитосомы, содержащие фермент хитинсинтазу, катализирующую реакцию синтеза микрофибрилл хитина. Хитосомы транспортируют микрофибриллы к клеточной стенке, где и собирается хитин. Так же у грибов известны л о- м а с о м ы, располагающиеся между клеточной стенкой и клеточной мембраной. Как производные клеточной мембраны они могут возникать в результате дисбаланса пластичности и тургора клеток, то есть когда мембрана образуется "с избытком". Функция их окончательно не выяснена, но, очевидно, ломасомы могут быть причастными к процессам экзоцитоза и секреции веществ, хотя такой вывод не является окончательным. При выделении органелл и последующей работе с ними опи- раются на маркерные структуры, топологически привязанные или ассоциирующиеся с ними. Чаще всего такими маркерами являются ферменты (таблица 12). 135
Т а б л и ц a 12. Маркерные ферменты клеточных органелл Фермент - маркер Классификационный номер фермента (КФ) Органелла 1 Аденилатпиклаза 4.6.1.1 Клеточная мембрана (базолатеральная) Na+, К+- АТФ - аза 3.6.1.37 ” 5' - Нуклеотидаза 3.1.3.5 Клеточная мембрана (апикальная) Лейцинаминопептидаза 3.4.11.1 -— " — Т - Глутамилтранспептидаза 2.3.2.12 — " — Глюкозо-6-фосфатаза 3.1.3.9 ЭПР НАДФ»-цитохром- О-редуктаза 1.6.2.4 — — Эпоксигидролаза 3.3.2.3 — " — Галактозилтрансфераза 2.4.1.38 Аппарат Гольджи Сиалилтрансфераза 2.4.99.1 — — НАД ф-фосфатаза 3.6.1.22 — " — Сукцинатдегидрогеназа 1.3.99.1 Митохоцдрии (внутренняя мембрана) Цитохромокисидаза Ротенон+-нечувствительная НАД»Н-цитохром 1.9.3.1 с-редуктаза 1.6.99.1 — — Моноаминооксидаза 1.4.3.4 Митохондрии (наружная мембрана) Кинуренин + + -3-гидроксилаза 1.14.13.9 — •’ — Кислая фосфатаза 3.1.3.2 Лизосомы Р - Глюкуронидаза 3.2.1.31 — — Каталаза 1.11.1.6 Пероксисомы Лактатдегидрогеназа 1.1.1.22 Цитозоль Примечание: + Ротенон является производным изофлавона, ++Кинуренин — производ- ное триптофана В последние годы широко используется термин г л и к о к а - лике (от греч. glykis — сладкий, calix — оболочка) преимущест- венно в отношении животных клеток, хотя нередко используют его и в более обобщенном виде, то есть когда гликокаликсом называют наружную часть клеточной мембраны эукариот, вклю- 136
чающую гликопротеины и гликолипиды, предназначенную для узнавания однотипных и чужеродных клеток. Иногда вместо на- звания "гликокаликс" пользуются термином "пушистая оболочка", особенно тогда, когда идет речь о толстой оболочке, выстилающей кишечник. Как бы то ни было, термин "гликокаликс" приложим ко всем клеткам (в том числе — безъядерным как, например, эритроциты), у которых мембранные олигосахаридные цепи в гликоконъюгатах выполняют функции признания (рекогниции). Из мембранных гликопротеинов наиболее полно изучены г л и- кофорин и фибронектин (от греч. foros — нести, от лат. fibra — волокно, necter — связывать, присоединять). Первый из них содержится в эритроцитах, в нем около 50% углеводов и 130 аминокислотных остатков, ММ его 30 кДа. Фибронектин содержится в клеточных мембранах других клеток, он обладает выраженной адгезивностью (от лат. adhaesio — слипание, сращение) и способствует конглютинации (от лат. conglutinatio — склеивание) гомологичных клеток. К мембранным белкам относятся также лектины, выпол- няющие функции признания и защиты. Известны бактериолекти- ны, миколектины, лихенолектины, ихтиолектины, зоолектины (все- го порядка 1000 лектинов). Ряд из них широко используется на практике для исследования клеточных мембран, в гистохимии, в структурной химии углеводов и т. д. Эукариотическая клетка содержит ядро, состоящее из ДНК, РНК, белков и ряда низкомолекулярных веществ. Низшие грибы полинуклеарны. Ядро окружено двухслойной липопротеиновой мембраной, в которой имеются ядерные поры — поросомы. ДНК вместе с гистонами (нуклеосомы) формируют хромосомы, число которых различно у разных организмов (чаще число их находится между 10 и 50). Ближе к центру каждой хромосомы располагаются центромеры, связывающиеся с ахроматиновым веретеном в пери- од деления клеток. Оформленное ядро эукариотической клетки содержит ядрышко, в котором сосредоточены гены, кодирующие синтез 28S, 18S и 5,8S рРНК. Ядрышко является также местом образования рибосом. Около ядра клетки располагаются две цен- триоли, представляющие собой белковые микротрубочки, содер- жащие белок тубулин (в растительных и грибных клетках центри- оли не обнаружены). Центриоли входят в состав митотического аппарата — биполярной структуры в форме веретена. Рибосомы эукариот по морфологии и функции напоминают рибосомы прокариот. Однако они сами и их субчастицы характе- ризуются другими константами седиментации — для недиссоции- рованных рибосом 80S, для большой субчастицы 60S, для малой 40S. 137
В цитоплазме эукариотической клетки находится большое ко- личество (до нескольких тысяч) энергообеспечивающих структур — митохондрий, возникших эндосимбионтно. Средние прибли- женные размеры их равны 1x7 мкм. Это — двухмембранная Рис. 48. Эукариотические клетки: I — грибная, II — растительная, III — животная. (1 — клеточная стенка, 2 — клеточная мембрана, 3 — ядро, 4 — ядрышко, 5 — конденсированный хроматин, 6 — рибосомы, 7 — пол- ирибосомы, 8 — шероховатый эндоп- лазматический ретикулум, 9 — аппа- рат Гольжди (диктиосома — у грибов и растений), 10 — митохондрии, 11 — ядерные поры, 12 — вакуоль, 13 — пиноцитозный пузырек, 14 — окаймленный пузырек, 15 —лизосо- ма, 16 — окаймленная ямка, 17 — волокнистая область, 18 — тонофи- ламенты, 19 — десмосома, 20 — плаз- модесма, 21 — плотный контакт, 22 — жировая капля, 23 — центриоль (триплеты микротрубочек). отехнологического процесса, органелла, причем внутренняя мем- брана выраженно складчатая. Складки ее, называемые крис- тами (от лат. crista — гребень), образуют митохондриальный мат- рикс, внутри которого локализуют- ся рибосомы и кольцевидно-замк- нутая ДНК, кодирующая некото- рые митохондриальные белки (ми- тохондрии во многом сходны с бак- териальным протопластом). Во внутренней мембране локализует- ся цепь переноса электронов и фер- ментный комплекс, катализирую- щий реакции образования макро- эргического АТФ. На рис 48 показано принципи- альное сходство эукариотических клеток млекопитающих, растений и грибов. 4.4. Некоторые функциональ- ные особенности клеток и клеточ- ных систем. Биотехнология базиру- ется на практической реализации метаболической активности кле- ток, выделенных из природных суб- стратов или экспериментально со- зданных в лабораторных условиях. В зависимости от целевого продук- та, получаемого при реализации би- поддерживают соответствующий уровень метаболической активности биообъекта. Если речь идет о каком-либо метаболите, тогда задают такие параметры культиви- рования, которые обеспечивают максимальный выход данного вещества. Если же конечным продуктом является биомасса клеток 138
или тканей, то в процессе выращивания создают условия для максимального выхода их в расчете на число одиночных клеток, на вес массы по отношению к объему среды, либо количеству потребленного субстрата (экономический коэффициент). Питательные среды, рекомендуемые для культивирования представителей акариот, прокариот и эукариот принципиально отличаются между собой в том смысле, что для "выращивания" акариот необходимы живые клетки или ткани. Так, вирусы гриппа накапливают в куриных эмбрионах, вирус табачной мозаики — на растениях табака, фаги — в клетках бактерий и т. д. Большинство прокариот достаточно легко культивируется на доступных питательных средах, однако среди них есть виды, которые с трудом или совсем не растут в таких условиях — им, как и акариотам, нужны живые ткани (некоторые спирохеты, пневмоцисты, риккетсии, хламидии). Такие виды называют обли- гатными паразитами, что необходимо учитывать при организации соответствующих производств. Эукариотические клетки, как правило, удается культивировать в лабораторных и производственных условиях с большим или меньшим успехом. При сравнении, например, клеток дрожжей — сахаромицетов, используемых в производстве вин, и клеток — бластов человека, применяемых в производстве интерферона, культивирование последних сопряжено с большими трудностями, чем культивирование первых. В такой же мере можно говорить о различиях клеток растений и животных. Для клеток растений характерна тотипотентность, то есть способность любой отдельной растительной клетки в соответствующих условиях культивирова- ния трансформироваться в целое растение. Клетки животных не обладают такой способностью и выращивать их труднее, чем клетки растений. Питательные среды для прокариот и эукариот должны содер- жать все необходимые ингредиенты, используемые в конструктив- ном и энергетическом обмене (источники азота, углерода, серы, кислорода, водорода, фосфора, витамины). В качестве примеров можно привести питательные среды для Escherichia coli, Penicillium chrysogenum, культур клеток табака и В-лимфобластов человека (таблицы 13-16). Е. coli широко используют в биотехнологии, в частности, штаммы, несущие чужеродную генетическую инфор- мацию о синтезе человеческого гормона соматотропина, или штам- 139
мы, секретирующие энтеротоксин, и другие; отдельные виды пенициллов являются продуцентами антибиотиков пенициллино- вого ряда: бензил-, оксибензил-, феноксиметил-, 82-пентил-, п-геп- тил-, п-амил-, аллилмеркаптометилпенициллинов с общей форму- лой: где R - один из названных радикалов Культуру клеток N. tabacum используют для пол- учения алкалоида никотина, а культуру клеток лимфобла- стов, например, В-ряда — для получения белка «-ин- терферона. Т а б л и ц а 13. Состав питательной среды для Escherichia coli Ингредиент Миллимоли мг/л Н2О мГ% Мясной экстракт — 1»104 1»103 Пептон — 1»104 1»103 Натрия хлорид 51 з»ю3 300 Натрия 14 2*103 200 гидро фосфат Таблица 14. Состав питательной среды для Penicillium chrysogenum Ингредиент МИЛЛИМОЛИ мг/л Н2О МГ% Кукурузный — 3»103 300 экстракт Гидрол — 5»103 500 Лактоза 8,7 з»ю3 300 Аммония нитрат 15 1,25*103 125 Натрия сульфит •5НгО 4,6 1*103 100 Натрия сульфат •1ОН2О 1,6 500 50 Магния сульфат •7Н2О 1 250 25 Марганца сульфат • 5Н2О 0,008 20 2 Цинка сульфат 0,1 20 2 Калия дигидрофосфат 14 2»103 200 Кальция карбонат 30 з»ю3 300 Кислота фенилуксусная 7 1»103 100 140
Питательная среда Т. Мурасиге и Ф. Скуга (MS) для культиви- рования клеток N. tabacum включает следующие компоненты (таблица 15). Таблицам Питательная среда для N. tabacum Ингредиент Миллимоли мг/л НгО МГ% Калия нитрат Аммония нитрат Магния сульфат «УНгО Кальция хлорид »2НгО Калия дигидрофосфат Марганца сульфат »4НгО Цинка сульфат »4НгО Кислота борная Калия иодид Меди сульфат »5H?O Натрия молибдат »2НгО Кобальта хлорид *6НгО Железа закисного сульфат «УНгО Натрия ЭДТА* «2Н2О Мезоинозит Тиамин гидрохлорид Пиридоксин гидрохлорид Ксилота никотиновая Глицин Гидролизат казеина Сахароза БАП* НУК ДФУК 19 20 1,5 2,9 1,2 0,1 0.003У 0,1 0,005 0,0001 0,001 0,0001 0,1 0,1 0,6 0,0014 0,0024 0.004 0.02У 8У,У 0,002 0,0053 0,0009 1900 1650 ЗУО 440 1У0 22,3 8,6 6,2 0,83 0,025 0,25 0,025 2У,8 ЗУ,3 100 0,4 0,5 0,5 2 10000 30000 0,5 1 0,2 190 165 ЗУ 44 1У 2,23 0,86 0,62 0.083 0,0025 0,025 0,0025 2,У8 3,УЗ 10 0,04 0,05 0,05 0.2 1000 3000 0,05 0,1 0,02 Примечание:* ЭДТА — этилендиаминтетраацетат; БАЛ (цитокинин) — 6-бензиламинопу рин; НУК (ауксин) — а-нафтилацетат; ДФУК (ауксин) — 2,4-дихлорфеноксиацетат. MS-среда многоцелевая, универсальная, подходит для каллусо- образования и индуцирует морфогенез многих двудольных расте- ний. Среды для культивирования клеток животных являются более сложными по сравнению с приведенными выше средами, предназ- наченными для бактерий, грибов и клеток табака. Так, X. Игл предложил минимальную незаменимую среду (МЕМ), вариант которой по Р. Далбекко (ДМЕМ) содержит следующие компоненты (таблица 16). 141
Таблица 16. Состав среды ДМЕМ для культивирования В-лимфоцитов человека Ингредиент Миллимоли мг/л НгО мГ% Глюкоза 5,5 1000 100 Натрия пируват 1 ПО И L-Аргинин гидрохлорид 0.4 84 8,4 L-Валин 0,3 94 9,4 L-Гистидин гидрохлорид • НгО 0,2 42 4,2 Глицин 0,4 30 3 L-Глутамин 4 584 58,4 L-Изолейцин 0,8 104,8 10,48 L-Лейцин 0,8 104,8 10,48 L-Лизин гидрохлорид 0,86 146,2 14,62 L-Метионин 0,2 30 3 L-Серин 0,4 42 4,2 Тирозин (двунатриевая соль) 0,4 89,5 8,95 L-Треонин 0,8 95,2 9,52 L-Триптофан 0,078 16 1,6 L-Фенилаланин 0,4 66 6,6 L-Цистеин дигидрохлорид 0,2 62,6 6,26 i-Инозитол 0,044 7,2 0,72 Никотинамид 0,03 4 0,4 Кальция пантотенат 0,0096 4 0,4 Пиридоксаль (гидрохлорид) 0,02 4 0,4 Рибофлавин 0,001 0,4 0,04 Тиамин гидрохлорид 0,013 4 0,4 Кислота фолиевая 0,006 4 0,4 Холин битартрат 0,02 7,2 0,72 Натрия хлорид 109,4 6400 640 Калия хлорид 5,4 400 40 Кальция хлорид 1,8 200 20 Магния сульфат 0,8 97,7 9,77 Натрия дигидрофосфат • 2НгО 0,8 125 12,5 Натрия гидрокарбонат 21,4 1800 180 Железа закисного нитрат 0,0002 6.1 0,01 •9Н2О Феноловый красный 0,02 5 0,5 По сравнению со средой МЕМ в среде ДМЕМ почти в два раза увеличино содержание аминокислот и в 4 раза — витаминов. Ее используют для культивирования различных видов клеток. С учетом особенностей клеток в среды МЕМ и ДМЕМ можно вносить какие-либо добавки, например, трансферрин, инсулин, бычий сывороточный альбумин, цельную или диализованную сы- воротку крови (5-10% по объему). Кроме подобных сред предложены также бессывороточные 142
среды, в которых сыворотка крови замещается смесями из очи- щенных белков, пептидов, липидов, микроэлементов и других веществ. Однако они, в большинстве своем, не являются универ- сальными. Разнообразие питательных веществ в средах для культивиро- вания клеток млекопитающих служит предпосылкой к строгому соблюдению мер предосторожности в целях предотвращения за- грязнения их вирусами, микоплазмами, бактериями, грибами. В сравнительном плане клетки прокариот и эукариот заметно раз- личаются по скорости роста. Поэтому, например, животные и большинство растительных клеточных систем уступают в конку- ренции микробным системам. С биотехнологической точки зрения важными являются поня- тия о первичных и вторичных метаболитах или о реакциях первичного и вторичного обмена, которые сходны у всех живых организмов. К реакциям первичного обмена относят образование и расщепление нуклеиновых кислот и оснований, белков и их предшественников, а также большинства углеводов, липидов, не- которых карбоновых кислот. К реакциям вторичного обмена от- носят те из них, которые сопровождаются образованием алкалои- дов, антибиотиков, триспоровых кислот, гиббереллинов и некото- рых других веществ, расцениваемых несущественными для про- дуцента. Более того, образование вторичных метаболитов свойст- венно не всем видам, а лишь только некоторым. Реакции первичного и вторичного обмена трудно дифферен- цируемы, а существенность или несущественность вторичного метаболита для продуцента оценивается весьма субъективно и нередко без учета роли его в естественных ассоциациях различных организмов. Вот почему научно более обоснованным является представление о первичных метаболитах как продуктах матрично- го синтеза, то есть белках (преимущественно — ферментных), а вторичные метаболиты представляют собой продукты реакций, катализируемых ферментами (Н. П. Блинов, 1979): ।------------------► Преметаболиты <------------------ |---------► Интермедиаты, или прометаболиты Г Информационные I молекулы * ---- —» Первичные-метаболиты а) ферментные белки * б) неферментные белки Вторичные метаболиты •«----- Преметаболиты в схеме представляют собой простые питатель- ные вещества, поступающие извне (аммоний, ионы металлов, углекислота, сульфаты, фосфаты, нитраты, для гетеротрофов — моносахариды и некоторые другие). 143
К интермедиатам, или прометаболитам относятся простые са- хара, аминокислоты, нуклеиновые основания и др. Информацион- ные молекулы ДНК и РНК вычленены из состава других реакций, хотя их синтез и распад (прерывистые стрелки) также катализи- руются ферментами. Важно подчеркнуть, что, в отличие от пер- вичных метаболитов образование вторичных метаболитов непос- редственно не кодируется ядерной или цитоплазматической ДНК. Согласно такому представлению все живые организмы синтези- руют присущие им первичные и вторичные метаболиты. /’'На основании положений, сформулированных В. Н. Шапошни- ковым (1939), каждый продуцент в своем развитии проходит две фазы, названных Ж. Д. Бу'Локком (1961, 1967) трофофазой и идиофазой (от греч. trofe —- питание, idios — свой, специфический). В период трофофазы активно протекают конструктивный и энер- гетический обмен — в клетках преобладают синтетические про- цессы, нарастает количество первичных метаболитов и ряда внут- риклеточных вторичных метаболитов — липидов, гликанов, глико- конъюгатов; скорость роста и размножения организма при этом высокая, а продукция экзогенных вторичных метаболитов низкая, и, напротив, в идиофазу скорость роста и размножения низкая, а продукция экзогенных и эндогенных вторичных метаболитов вы- сокая (рис. 49). Продуктивность культуры может быть повышена за счет внесения предшественников метаболитов (преимуществен- но в период времени, приходящийся на конец идиофазы). Рис. 49. Соотношение биомассы клеток (а) и метаболитов (первичных — б, вторичных — в) в культурах Saccharomyces cerevisiae (A), Penicillium chrysogenum (Б), Nicotiana tabacum (В), кератоцитов (Г); М — масса высушенных клеток, М‘ — число животных клеток, t — время в сутках, I — трофофаза (заштрихованная часть), II — идиофаза. 144
Из рис. 49 видно, что продолжительность трофофазы более короткая у дрожжей, чем у пеницилла и клеток табака. Накопление этанола S. cerevisiae сопровождается возрастанием ингибирующей активности его на продуцент и поэтому кривые, приходящиеся на идиофазу идут почти параллельно, повторяя характер кривой для первичных метаболитов, биосинтез которых начинается в период трофофазы.) Биосинтез фибринолитического фермента (первичный метабо- лит) клетками кератиноцитов млекопитающих полностью корре- лирует с ростом числа клеток (2) и не коррелирует с числом их в стационарной фазе (3) или, тем более, в фазе отмирания (4). Пенициллин, синтезируемый Р. chrysogenum, и не ингибирую- щий продуцент, выражение накапливается в идиофазу. Алкалоид никотин синтезируется клетками табака замедленно и при переходе культуры в стационарную фазу выход его заметно уменьшается. В каждом из приведенных примеров можно отметить свои особенности биосинтеза первичных и вторичных метаболитов, что определяется возрастанием сложности клеточных систем при пе- реходе в ряду —> Mycota —> Plantae —> Animalia среди представителей эукариот. В любом случае первичные и вторичные метаболиты образуются клетками как естественные продукты в процессе их культивирования в соответствующих средах и под каталитическим действием ферментов. Эти последние могут инги- бироваться с помощью специальных веществ, называемых анти- метаболитами, имеющими структурное сходство с метаболитами. Такие вещества являются исключительно важными для выяснения и познания путей обмена веществ, а также для использования наиболее активных из них как лечебных средств. В качестве примеров можно попарно назвать следующие метаболиты и анти- метаболиты: СООН (сн2)2 I СООН СООН сн2 СООН янтарная кислота (метаболит) малоновая кислота (антиметаболит) 145
NH=C—NH—(CH,)—СН—СООН I 23 I NH2 NH аргинин (метаболит) СООН NH=C—NH—0—(CH )-CH-COOH I 22 I nh2 nh2 канаванин (антиметабопит) никотиновая пиридин-3-сульфоновая кислота кислота (метаболит) (антиметаболит) п-аминобензойная сульфаниламиды кислота (метаболит) (антиметаболиты) 6-меркаптопурин (антиметабопит) С учетом более медленного (примерно в 100 и более раз) роста и размножения клеток животных и растений в сравнении с микробными клетками трофофаза и идиофаза у них значительно растянуты во времени. Тем не менее всегда следует стремиться к сокращению временных интервалов трофофазы, поскольку это поможет сократить срок проведения всего биотехнологического процесса и удешевить конечный продукт. При выращивании клеток в культурах следует иметь в виду их следующие особенности: 1. дифференцированность, 2. склонность к аггломерации, 3. изменение размеров и цитоархитектоники в процессе развития, 4. дизруптивность, 5. способность к трансформации. Клетки многоклеточных растений и животных, в противопо- ложность одноклеточным видам, по мере роста и развития орга- низма становятся все более специализированными, возникают ткани с конкретными функциями (дифференциация). В диффе- ренцированных клетках специализация функций обусловливается генетической детерминированностью, проявляющейся в феноти- пах. Иными словами — дифференциация является результатом различной экспрессии генетической информации в разных клет- ках. 146
С другой стороны с дифференциацией связаны биосинтез и накопление вторичных метаболитов. В качестве примеров можно назвать образование и отложение лигнина в сосудистых элементах ксилемы и трахеидах растений, биосинтез андрогенных гормонов в клетках половых желез у мужских особей животных, и т. д. Торможение или подавление дифференцировки может сопро- вождаться существенным изменением в характере реакций вто- ричного обмена. Например установлено, что каллусы дифферен- цирующихся корней растения красавки (Atropa belladonna) синте- зируют так называемые тропановые алкалоиды (атропин; скопо- ламин; гиосциамин — аналог атропина, содеращий L-троповую CH.-CH-CH, I сн2-сн-сн2 сн-сн2 N-CH, сн-сн2 сно-со-сн / I сн2о атропин скополамин кислоту): Те же, но не дифференцированные культуры, не синтезируют названные алкалоиды. В других случаях не дифференцированные культуры тканей способны синтезировать вторичные метаболиты, но в меньших количествах, чем дифференцированные аналоги их (например, алкалоид никотин, образуемый Nicotiana tabacum). Применительно к бактериальным культурам можно назвать Вас. thuringiensis, формирующей при дифференциации — фаза спорообразования белковый ромбовидный параспоральньГй кри- сталл, обладающий токсическим действием ‘преимущественно в отношении насекомых из отряда чешуекрылых, и поэтому исполь- зующийся в борьбе с вредителями, например, лесного хозяйства. В отличие от бактерий грибы более дифференцированные организмы, и у них также отмечена зависимость синтеза ряда вторичных метаболитов от степени дифференцировки. Например, биосинтез пигментов у большинства дейтеромицетов приурочен к началу конидиеобразования или, у некоторых видов (Aureobasidium pullulans), он связан по времени с формированием хламидоспор. Казалось бы, что приведенные примеры могут служить дока- зательством существования общей закономерности, относящейся 11/
к прямо пропорциональной зависимости синтезируемого вторич- ного метаболита от уровня дифференцировки клеток, то есть, чем выше дифференцировка, тем больше образуется метаболита. Во многих случаях зто так и есть. Однако, что касается растений, то имеются многочисленные данные о высокой активности дедиффе- ренцированных культур, например раувольфии змеевидной (Rauwolfia serpentia), синтезирующих индольные алкалоиды. Оче- видно, тотипотентность клеток растений является одним из важ- нейших задатков способности их синтезировать вторичные мета- болиты при подборе адекватных условий культивирования и сти- мулирования, то есть воздействуя на триггерные (от англ, trigger — спусковой крючок) или эффекторные механизмы метаболиче- ских путей вторичного обмена. Растительные и животные клетки примерно в 10 - 100 раз больше по размерам, чем клетки бактерий и грибов, диаметр многих из них варьирует в пределах 20 - 150 мкм. Однако только животные клетки и прокариотические микоплазмы лишены ригид- ной клеточной стенки. Тем не менее прокариотические и эукари- отические клетки в процессе роста и развития стремятся к орга- низационной завершенности (бактериальные — в пределах минут- часов, грибные — в пределах часов-суток, растительные и живо- тные — в пределах нескольких суток). В случаях поддержания многоклеточных популяций в гистоло- гически организованной форме, соответствующей исходным тка- ням, и при сохранении специализированных для этих тканей функций, говорят о культурах тканей. При диссоциации тканей на клетки с утратой ими гистологической организации и специа- лизированных функций при выращивании in vitro говорят о куль- турах клеток. Разъединение клеток стимулирует их рост. При выращивании животных клеток в культуре в целях пол- учения специальных продуктов необходимо принимать во внима- ние и учитывать их генетическую нестабильность и, как следствие, вариабельность фенотипической экспрессии с последующими ста- рением и отмиранием. Всего этого удается избегать при использо- вании гибридомных клеток. Если старение и гибель клетки были бы предопределены гене- тически, то это значило бы, что позитивная дифференциация является логическим следствием роста и развития клетки, достиг- шей высшей стадии специализации, и она завершается смертью. Согласно все более подтверждающейся на практике клонально-се- лекционной (стохастической, от греч. stochasticos — случайный, вероятностный) теории смерть клетки происходит вследствие по- 148
степенного накопления трансляционных ошибок в работе генома под влиянием инфекций, радиационного облучения и других му- тагенных воздействий, то есть когда наступат критическое возра- стание энтропии. Кроме дифференциации клеток важной особенностью их яв- ляется склонность к аггломерации (от лат. agglomeratus — скоп- ление). Это может происходить в различных условиях и с клетками различного уровня организации — прокариотами и эукариотами. Те из них, которые имеют клеточную стенку, чаще аггломерируют за счет химических компонентов, локализованных в ней. Причем процесс "скучивания" является физико-химическим (адсорбция, ионное и ковалентное взаимодействия), зависящим не только от особенностей клеток, но и от компонентов среды, используемой для их культивирования. Поэтому аггломерация может быть след- ствием: 1. адгезии (от лат. adhaesio — склеивание, слипание) клеток друг к другу или к поверхности культурального сосуда за счет веществ — адгезинов, расположенных на их поверхности, и других причин; 2. агглютинации по схеме "антиген-антитело", когда в качестве антигена оказываются культивируемые клетки, а в каче- стве антитела — гомологичные или гетерологичные агглютиниру- ющие иммунные сыворотки; 3. слияния клеток с образованием гибридов. Известные к настоящему времени адгезины, например, в клет- ках дрожжей и ряде растений представляют собой преимущест- венно гликопротеины. В поверхостных структурах гриба Histoplasma capsulatum за адгезию к эпителиальным клеткам от- ветственны галактоза, манноза и фукоза (в меньшей степени — глюкоза), но не N-ацетилглюкозамин. На поверхности ростковых трубок Candida albicans располага- ются антигенные эпитопы, или детерминанты (от греч. epi — на, поверх, к; topos — место; от лат. determinatio — определение) с ММ 60-230 кДа, проявляющие адгезию к фибриногену. Такие эпитопы называют еще фибриногеносвязывающими факторами. На каждой ростковой трубке располагается до 4000 мест фиксации фибриногена. На поверхности дрожжевых псевдомицелиальных клеток того же вида располагается маннопротеин (ММ 60 кДа), белковая часть которого может связываться с производным СЗ- фракции комплемента (iC3b), проявляя свойства адгезина. У бактерий и некоторых грибов функцию адгезинов выполняют белки фимбрий. Вместе с тем у грамотрицательных бактерий могут образовываться так называемые локальные зоны адгезии между клеточной мембраной и клеточной стенкой, лишенной пептидог- ликанового слоя. В этих зонах два фосфолипидных слоя входят в 149
соприкосновение друг с другом (рис. 50). Таких зон может быть порядка 200-400 на клетку (около 5% поверхности клеточной мембраны). Локальные зоны адгезии служат воротами для транс- порта в обоих направлениях. 4 .4 Рис. 50. Схема образования локальной зоны адгезии в оболочке грамотрицательных бактерий (в направлении а - в): 1 — мембранный фосфолипид, 2 — периплазмати- ческое пространство, 3 — пептидогликан, 4 — фосфолипидный слой, 5 — белок, 6 — углевод. Клетки животных, находясь в системах органов и тканей, взаимодействуют между собой за счет ионов, десмосом, электо- ронноплотных гликопротеинов. Следует иметь в виду, что клетки прокариот и эукариот имеют отрицательный заряд и поэтому ионные взаимодействия, сущест- вующие между ними, присущи так же клеткам и субстратам, несущим электрический заряд. Если этот заряд отрицательный (как и заряд клетки), то в среде должны быть двухвалентные катионы и адгезии, например, фибронектин клеточного или плазматическо- го происхождения. Фибронектин — гликопротеин с ММ 200-250 кДа. Он найден на поверхности глиальных клеток и фибробластов, в плазме, амниотической и спинно-мозговой жидкостях. Реакция агглютинации клеток специфическими антителами (иммуноглобулинами — 1g) с давних пор используется в иммуно- логии. Антитела взаимодействуют с антигенными детерминантами, локализующимися на клеточной поверхности. При этом отмечает- ся аггломерация клеток, где связующими звеньями выступают 1g. Вследствие различной антигенной структуры микробов в их агг- лютинации принимают участие антитела различной специфично- сти. Прилипание прокариот к поверхности В-лимфомицитов про- исходит, например тогда, когда животное, от которого взяты лимфоциты, было предварительно иммунизировано этими же бак- териями. Это так называемый феномен иммуноклеточного при- липания. Вариантом его является непрямая гемадсорбция, когда вместо клеток прокариот используют, например, гаптены, которые сорбируются на эритроцитах in vitro. Такие эритроциты формиру- ют розетки вокруг лимфоидных клеток животного, ранее иммуни- зированного микроорганизмом, из которого выделен гаптен. 1.Ю
Что касается спонтанного слияния клеток прокариот или эука- риот, то такие процессы происходят редко и преимущественно между макрофагами или миобластами (от лат. myo — мышечный, blastus —зародышевая' материнская-клетка) с образованием мно— гоядерных клеток — синтиций (от лат. syncytium — многоядерная протоплазматическая масса). Частоту слияния можно существенно повысить, направленно используя для этого полиэтиленгликоль, лизолецитин, ДНК-содер- жащие вирусы герпеса или РНК-содержащие вирусы Сендай. НО—(СН2СН2—О)п-Н Лизолецитин — это продукт, образую- полиэтиленгликоль Щийся из лецитина под действием леци- тиназы. В случае образования гетерока- рионов и последующей пролиферации гибридной клеточной линии (увеличение числа клеток), то хромосомы будут частично теряться, в то время как оставшиеся хромосомы будут определять один или комбинацию других признаков. Это важно для экспрессии генов (в том числе — генов злокачественности). О гибридизации клеток см. также 5.2.1. В процессе роста и развития клеток происходят изменения в размерах и архитектонике структурных компонентов клеток. Для прокариот такие изменения трудно уловимы при их быстром размножении простым делением. В случае спорообразования такие изменения можно уловить с большей определенностью. Используя цейтраферную киносъемку удается четко зафиксировать проис- ходящие события, например, через интервалы времени, равные нескольким секундам. Грибные, растительные и животные клетки в этом смысле оказываются более удобными объектами для наблю- дения. Можно проследить их рост по размерам, равно как и формирование дифференциальных структур в течение часов и суток. Животные клетки образуют псевдоподии (ложноножки), с помощью которых передвигаются по субстрату. Псевдоподии об- ладают адгезинами. При образовании или наличии второй клетки, с которой контактирует первая, их псевдоподии осуществляют движения в противоположном направлении — наступает контак- тное ингибирование. Развиваясь в виде монослоя, клетки полно- стью перестают двигаться и приостанавливают свой рост. Плот- ность клеток может возрасти и за счет многослойности их в культуре. Одиночная оплодотворенная яйцеклетка служит источ- ником всех 1014 клеток в организме взрослого человека и некоторая часть из них делится (всего по расчетам, происходит 206 делений в секунду). Здесь исключительно важна роль ЦНС, гормонов и других регулирующих факторов. 151
Дизруптивность (от лат. disruptio — разрыв) клеток прокариот и эукариот — еще одна их особенность. Причем нельзя провести четкой границы между представителями этих надцарств по диз- руптивности. Понятно, что клетки, имеющие клеточную стенку, значительно устойчивее клеток, не обладающих ею (для сравнения можно назвать микоплазмы, протопласты и сферопласты, клетки Е. coli, конидии Aspergillus niger, меристемные клетки картофеля — Solanum tuberosum, Т-лимфоциты человека). Даже при разру- шении в дезинтеграторах различного типа бактериальные клетки несколько менее устойчивы на разрыв, чем грибные. Клетки животных без клеточных стенок относятся к разряду высоко дизруптивных, тогда как большинство микробных клеток — к разряду низко дизруптивных. Этот показатель имеет особое значение для организации соответствующих производств, в кото- рых предусматриваются перемешивание и барботаж культураль- ной жидкости, а также при реализации конечного продукта в виде клеток, когда, например, они должны быть разрушены и примене- ны в качестве белковых добавок к кормам для животных. Без дизрупции клетки пройдут через пищеварительный тракт, остава- ясь мало измененными. В этой связи перспективны способы ферментативного гидролиза клеточных стенок. Причем лизис кле- ток может происходить двояко — за счет собственных ферментов (автолиз) и под воздействием внешних ферментов (гликозидаз, гликозаминидаз, амидаз, пептидаз) — экзолиз. Глубина лизиса клеток зависит от ряда превходящих факторов: химического со- става и архитектоники клеточных стенок, температуры и состава окружающей среды, возраста клеток и других. При полном осво- бождении от стенки клеточного содержимого, окруженного мем- браной, образуются протопласты; при частичном — сферопласты. Без стабилизаторов в среде время существования тех и других весьма ограничено. В нашей стране и за рубежом ферментная промышленность производит отдельные литические ферменты для продажи. К числу их относятся дрожжелитин, лизосубтилин, лизоцим, проназа и другие. Солюбилизирующим действием на клетки обладают некоторые органические соединения (мочевина и ее производные, толуол, бутанол, диметилформамид, поверхностно-активные вещества и другие). В ряде случаев важна синхронизация клеток, когда большин- ство из них находятся в одинаковом фазовом состоянии. Этому соответствует экспоненциальная фаза размножения одноклеточ- ных видов. Синхронизации микроорганизмов добиваются следу- 152
ющими методами: сменой температурных режимов выращивания, голоданием с последующим переносом на полные среды, фильтра- цией клеток одинаковых размеров. В синхронизированном состо- янии они сохраняются в течение 2-4 генераций, после чего пере- ходят к асинхронному росту, развитию и размножению. В случаях синхронизации клеток млекопитающих применяют сепарацию и индукцию. В первом случае проводят дифференци- альное центрифугирование в градиентах бычьего сывороточного альбумина, сахарозы или фиколла (синтетический высокомолеку- лярный сополимер сахарозы и эпихлоргидрина. При этом отделяются, в основном, клетки одинакового возраста и объема, перешедшие из фазы митоза в фазу G-2 (см. раздел 5.1.), С1-СН2-СН-СН2 эпихлоргидрин О когда их объем возрастает примерно вдвое. Синхронизированные клетки составляют! 65-70%. Во втором случае (при индукции) блокируют клетки в определенной фазе жизненного цикла с помощью ингибиторов синтеза ДНК (аметоптерина, 5-аминоура- цилла, гидроксимочевины) или ингибиторов митоза (винобластин — см. раздел 4.3, колхицин и его производные). аметоптерин (метотрексат; Л-амино-N -метил фолиевая кислота) 5-амин оурацил nh2 со I NHOH гидрокси- мочевина Клетки затем промывают для освобождения от ингибиторов (блокаторов) и дают им синхронно развиваться, учитывав тот факт, что после одной-двух генераций они становятся асинхронными. При индукции достигают меньшей синхронизации клеток (2-50%), чем при сепарации, однако данный показатель можно повысить при осуществлении повторных блокировок. Степень синхронизации определяется митотическим индексом (MI), то есть индексом частоты митозов на 1000 клеток (оценивают в окрашенных препаратах): MI = 1000:МС, где МС — число клеток с признаками митоза. Зависимость здесь обратно пропорциональ- ная — чем меньше Ml, тем синхронизация больше. 153
Для некоторых представителей эукариот (не прокариот) изве- стны фазовые состояния, сопровождающиеся изменением росто- вых характеристик — трансформация. Так, отдельные грибы являются диморфными, то есть фенотипически двойственными, растущими либо в мицелиальной форме, либо в дрожжевой (Aureobasidium spp., Histoplasma spp., Candida spp., Mucor spp. и др.). Так, например, A pullulans — продуцент экзогликана в глубинных условиях растет в виде одноклеточных, почкующихся дрожжевых клеток, тогда как на поверхности агаризованных питательных сред дрожжевые клетки трансформируются в мице- лиальные, мало или совсем не образующие экзогликана. Подобная морфо-физиологическая трансформация является обратимой. В этой связи выделяют три главные группы диморфных грибов — температурозависимые (Blastomyces dermatitidis), зависимые от температуры и от питательных веществ (Histoplasma capsulatum), и зависимые только от питательных веществ (Candida albicans). У животных клеток трансформация — процесс необратимый. Он может протекать под влиянием онкогенных РНК- или ДНК-ви- русов и называется вирусной трансформацией. К РНК-онкоген- ным вирусам относятся лейковирусы кошек, мышей и птиц, вирус опухоли Биттнера, поражающий млекопитающих, вирусы сарко- мы; к ДНК-онкогенным вирусам относятся: аденовирусы, вирусы папилломы, полиомы и SV-40 (от лат. simian virus — вирус обезьян) из группы папова-вирусы, герпес-вирусы и вирусы оспы. Следует иметь в виду и тот факт, что ДНК нормальных клеток могут содержать в себе провирусный материал и поэтому такие клетки способны к необратимой трансформации под влиянием физиче- ских и химических мутагенов. Провирусные сегменты ДНК назы- вают онкогенами. В условиях, ограничивающих рост нормальных клеток, транс- формированные клетки как менее требовательные к факторам роста, пролиферируют до более высокой плотности и они стано- вятся способными культивироваться в глубинных условиях (сус- пензионные культуры) при изменении своей формы до сфериче- ской. Следовательно, и у грибных, и у животных, а также у ряда растительных клеток их морфологическое сходство (сферичность, округлость) в глубинных условиях выращивания находится под контролем генотипа и сопровождается изменением преимущест- венно клеточной мембраны. Трансформированные in vitro клетки представляют собой по- тенциально важные объекты для выбора оригинальных продуцен- тов ценных веществ. 154
Глава 5. ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ОБЛАСТИ ГЕНЕТИКИ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ВИРУСОВ, КЛЕТОК И КЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМ Генетика — наука о наследственности прошла сложный путь своего развития; фактические данные и обоснованные гипотезы в ней были, к сожалению, использованы даже для утверждения таких социально-политических доктрин, которые противоречили науч- ным истинам, этике и здравому смыслу (например, попытка обос- нования превосходства одних рас людей над другими; полное отрицание генов как якобы надуманных, "мифических" и несуще- ствующих структур в зародышевых клетках любых организмов; доминирующую зависимость наследственности от условий внеш- ней среды обитания того или иного вида; отрицание внутривидовой борьбы и признание межвидовой в параллели с борьбой классов в человеческом обществе, и т. д.). Подобные грустные страницы в истории генетики канули в вечность и этому помогло выдающееся событие в науке, когда Дж. Уотсон и Ф. Крик в 1953 г. расшифро- вали двойную спираль ДНК и подвели материальную базу под ранее упомянутый "мифический” ген — материализация гена. С тех пор прошло более 40 лет, и трудно охватить все области генетической науки, где бы ни были сделаны открытия или которые не получили бы мощного стимула для своего развития, включая современную биотехнологию. Однако на фоне всех достижений в течение последних 20 лет, нельзя забывать о том, что М. Фишер еще в 1868 г. открыл нуклеин, Ф. Гриффит в 1928 г. описал явление трансфор- мации у бактерий, а О. Т. Эйвери, К. М. Мак-Леод и М. Мак-Карти в 1944 г. доказали, что трансформирующим агентом является ДНК; Ж. Ледерберг в 1947 г. открыл процесс конъюгации у Е. coli, а позже было доказано, что спаривание клеток бактерий обусловле- но генетически. К времени расшифровки ДНК Э. Чаргафф (1950) уже сформу- лировал свои правила, согласно которым: 1) число оснований с аминогруппами в шестой позиции равно числу оснований с кетог- руппами в той же позиции, то есть А (аденин) + Ц (цитозин) — Г (гуанин) + Т (тимин); это единственное правило, приложимое к ДНК и к большинству типов РНК, в которых Т заменен на У (урацил); 2) молярное содержание аденина равно молярному содержа- нию тимина (А=Т или А/Т= 1); 155
3) молярное содержание гуанина равно молярному содержа- нию цитозина (Г = Ц или Г/Ц= 1); 4) сумма пиримидиновых оснований равна сумме пуриновых оснований, то есть Ц + Т = А+Г (Пир/Пур= 1); 5) у бактерий отношения А/Т и Г/Ц близки единице, тогда как отношение А/Г изменяется в интервале 0,4—2,7. Интервал изме- нения А/Г для растений (1,1—1,7) и животных (1,3—2,2) меньше, чем для ДНК бактерий. По соотношению нуклеотидов выделены АТ-тип ДНК, когда А + Т > Г + Ц, или ГЦ-тип ДНК, когда Г + Ц > А + Т. Последующие успехи в области генетики нарастали исключи- тельно быстро: в 1956 г. А Корнберг выделил ДНК-полимеразу, в 1961 г. М. Ниренберг предложил подходы и сам участвовал в расшифровке генетического кода, в 1964 г. осуществлен первый синтез полирибонуклеотидов (X. Г. Корана), в 1965 г. В. Арбер открыл ферменты-рестриктазы, или рестрикционные эндонуклеа- зы, в 1969 г. Дж. Бекуит с сотрудниками выделил из кишечной палочки лактозный оперон, в 1970 г. Г. Темин и Д. Балтимор открыли ревертазу, или обратную транскриптазу, в 1972 г. П. Берг с сотрудниками выполнили первый генно-инженерный экспери- мент — объединили ДНК R-плазмиды (плазмида множественной устойчивости к лекарственным веществам) с ДНК мушки дрозо- филы и размножили рекомбинант в кишечной палочке. В 1975— 1978 гг. ученые овладели методами выделения из хромосомной и плазмидной ДНК любых генов и исследования их структуры (У. Гилберт, Р. Дейвес, Ф. Курильский, П. Ледер, А. Максам, Т. Манниатис, Б. Мах, Ф. Ружон, Ф. Сэнгер, С. Тонегава). Каждый год удваивается число прочитанных генов у разных организмов, которое собирается в банках данных. Эти банки накопили уже порядка 2,5 • 10® пн суммарного текста, пользование которым стало возможным лишь с привлечением ЭВМ. В 1976 г. была основана фирма "Генентек" в г. Сан-Франциско (США),' а в 1977 г. в этой фирме был осуществлен синтез челове- ческого соматотропного гормона — соматостатина клетками Е. coli в ферментаторе объемом 8 л.; в 1978 г. там же был получен гормон инсулин при выращивании Е. coli в глубинных условиях. В начале 80-х годов так же с помощью Е. coli были получены эндорфины (эндогенные пептиды мозга с подобным морфину действием). В 1980 г. в компании "Биоген" (США) впервые получили с помощью биосинтеза (продуцент — кишечная палочка) интерферон. Таким образом, расшифровка строения ДНК стала эпохальным 156
событием не только в генетике, но и в биологии в целом. Общая генетика и общая биология обогатились фундаментальными дан- ными по строению и составу ядерного аппарата, по углублению подходов к пониманию эволюции жизни на Земле, по изменчиво- сти и наследственности организмов и по другим направлениям. Частные генетика и биология (например, микроорганизмов, рас- тений, животных) получили почти неограниченные возможности манипулировать с генетическим материалом, определять механиз- мы и диапазон его контролирующих функций в процессах мета- болизма. Биологическая технология как пограничная научная дисципли- на с 1972 г. перешла на новый генотехнический уровень (см. главу 1), когда методы генной инженерии были перенесены из лабора- торных условий в производственные —получила развитие реком- бинантная ДНК-биотехнология, или сокращенно рДНК-биотехно- логия. По существу рДНК-биотехнология базируется на природных возможностях наследственных структур различных представите- лей живого мира, даже когда приходится вводить чуждую реципи- енту, но воспринимаемую им генетическую информацию. Такая рецепция генетического материала и определяется природными возможностями реципиента. 5.1. Природа и передача генетической информации. Исходя их установленных данных о том, что ДНК, в силу комплементарности нуклеиновых оснований, представляет собой двойную спираль, что в бактериальных клетках эта спираль кольцевидно замкнута и составляет единственную хромосому, что в клетках любых орга- низмов имеются механизмы синтеза и гидролиза ДНК с помощью специфических ферментов, и, наконец, что процессы размножения обусловлены и непосредственно связаны с функцией ДНК микро- организмов или зародышевых клеток макроорганизмов, целесооб- разно расширить представление о ядре и ядерном аппарате клеток, считая первое составной частью второго. В таком случае к ядерному аппарату должны быть отнесены все те структуры, которые обес- печивают его запрограммированные функции — у прокариот: нуклеоид, рапидосомы (у некоторых видов), перегородочные ме- зосомы, рибосомы; у эукариот: ядро, ядрышко, нуклеолемма, по- росомы, центриоли, митотический аппарат, рибосомы. Биохимическим выражением наследственности является мат- ричный синтез специфического белка согласно уточненному прин- ципу Дж. Бидла и Э. Тейтама "один ген — одна белковая молекула". 157
Матричный синтез подразделяют на ре- пликацию, транс- крипцию и трансля- цию. На уровне транс- крипции (по крайней мере, у прокариот) осуществляется в ос- новном контроль экс- прессии генов, а у эукариот — и на уров- не трансляции. .При матричном синтез^матрйцейвы- ступает одна из нитей ДНК, "слепок" с кото- ти^а * рои — комплементар- ная матричная (ин- формационная) РНК, или мРНК, обеспечивает синтез белковой молекулы в рибосомах с участием транспортных РНК (тРНК) и соответствующих ферментов — полимераз. Участок мРНК, комп- лементарный участку смысловой цепи ДНК, называется транс- криптом. Показанная на рис. 51 схема синтеза белковой молекулы в действительности значительно сложнее. Вспомним, что среди по- следовательно расположенных генов в хромосоме имеются гены — регуляторы, операторы, структурные, терминаторы, и что каж- дая хромосома представлена одной молекулой ДНК. Поскольку хромосомы в клетках находятся в незамкнутом состоянии, постоль- ку у них имеются 3' и 5' свободные концы, которые отсутствуют в единственной кольцевидно замкнутой хромосоме прокариотиче- ской клетки или организованной вирусной частицы (таблица 17). Различают следующие формы ДНК по архитектонике двойной спирали: В, А, С, Z и SBS. В форме В на шаг спирали (3,4 нм) приходится 10 пн (пар нуклеотидов), располагающихся перпенди- кулярно к оси спирали; форма А является трансформантом формы В при снижении влажности ее ниже 75%; шаг спирали уменьшается до 2,8 нм, на виток приходится уже 11 пн, располагающихся под утлом 20° к оси спирали, а длина цепи укорачивается примерно на 25%. Форма С имеет шаг спирали, равный 3,3 нм и на один виток 158
SgT а б л и ц а 17. Характеристика молекул днк в некоторых хромосомах ¥ Организм/ вирион Хромосомы Среднее •д форма длина, см число пар оснований в 1 ЧИСЛО (гаплоид) ДНК на хромосому, х103кЪ 1 Человек Saccharomyces 23 незамкнутая 4.1 125 000 1 cerevisiae Esctiexichia 17 — " — 0,33 1 000 coli Бактериофаг 1 замкнутая 0,14 4000 X174 1 и 0,00018 5,4 Примечание: кЬ-килооснования (от англ, kilobases). ее приходится 9 пн. Форма Z (зигзаг) присуща углеводно-фосфат- ному остову ДНК в участке с чередующимися последовательностя- ми гуанина (Г) и цитозина (Ц). Это левая спираль (все предыдущие формируются в виде правых спиралей) с 12 пн в одном витке, форма SBS (от англ, side by side — бок о бок) лишена взаимозак- рученности цепей в двойную спираль, что важно для биосинтеза ДНК. Названные выше гены в хромосомной ДНК обладают специ- фическими функциями (средний размер гена оценивают в 1500 пн). Ген-регулятор определяет синтез белка-репрессора, способно- го связываться с оператором (см.) на ДНК или с РНК, предотвращая соответственно транскрипцию или трансляцию. Ген-оператор — участок ДНК, связываясь с которым белок-репрессор предотвра- щает инициацию (начало) транскрипции на прилежащем промо- торе, ответственном за связывание фермента РНК-полимеразы, инициирующей транскрипцию гена. На промоторе гена эукарио- тической клетки имеется специфический локус (участок), в десят- ки—сотни тысяч раз повышающий число посадок РНК-полимера- зы на промотор ближайшего гена. Этот локус называется энхан- сером, или усилителем (от англ, enhancer — усилитель). Энхансеры тканеспецифичны. Они представляют собой большую разнообраз- ную группу регуляторных элементов клетки. Другими словами это элементы позитивного контроля. К элементам негативного конт- роля относятся сайленсеры (от англ, silencer — глушитель), угне- тающие транскрипцию. Энхансеры и сайленсеры обладают только цис-действием, влияя на гены, локализующиеся на той же молекуле 159
ТАА ЦЦГЦ ГГЦГЦГ ТПТ ^ТТГАЦЛ ТАТААТ ЦАТ АТТА АТТ В5’Ф;атл^у г Nil; Аттгтптгпттгтгтатзтпг^ СООН Л NHj -*ТЛЛПП ft о о а? ЛГВТЯЛПГЗгяпГ'! СООН Рис. 52. Схематичное строение (а) и экспрессия (в-д) гена прокариотической клетки: Р-промотор, СР-сайт связывания, ИК-кодон инициации и ТК-кодон терми- нации транскрипции, t —терминатор транскрипции; б — некодирующая нить ДНК с характерными сай- тами; координаты нуклеотидов промотора имеют от- рицательный знак (-10 для последовательности При- бноу, -35 для последовательности Хогнесса); транс- крибируемые нуклеотиды — положительный знак; в-матричная РНК, г-белок-предшественник, д-актив- ный белок; п-палиндром, SD — последовательность Шайна-Далгарно. СР'ИК. ДНК, где располагают- ся названные элемен- ты. Структурные гены ответственны за син- тез белковых молекул (рис. 52). Ген-термина- тор блокирует транс- крипцию и прерывает синтез белка. К этому гену примыкает тер- минатор (стоп-сигнал), состоящий из опреде- ленной последователь- ности нуклеотидов в ДНК. У Е coli он эф- фективен только в присутствии р-факто- ра белковой природы с ММ 50 кДа, не свя- занного с РНК-пол- имеразой. В терминации у Е. coli участвует и другой белок, названный к-частицей. Оперон — это группа сцепления структурных генов, находя- щихся под контролем гена-оператора и гена-регулятора, а также контролирующих элементов, узнаваемых продуктами регулятор- ного гена. На рис. 52 изображена схематичная структура гена прокариотической клетки. В его состав входят участки, располо- женные перед кодирующей последовательностью (лидерная 5'-об- ласть) и после нее (концевая З'-область); синтез мРНК происходит в направлении от 5'-конца к З'-концу. Отсчет нуклеотидов в генах ведут от первого транскрибируемого нуклеотида, обозначаемого как +1 (или 1); отсчет в противоположную сторону начинают с —1. Нд и РЬ на рисунке обозначают консервативные последова- тельности Хогнесса и Прибноу соответственно. Первая из них представляет собою гексамер 5'ТТГАЦАЗ', локализующийся около координаты —35. Последовательность Хогнесса необходима для узнавания промотора РНК-полимеразой. РЬ-последовательность является также гексамером 5'ТАТААТЗ', локализующимся около координаты —10. Эта последовательность необходима для тесного связывания с РНК-полимеразой. За ней закрепилось название 160
"TATA-box", или "ТАТА-блок". Ядром последовательности SD (Шай- на—Далгарно) служит тетрамер 5'АГГАЗ’ на мРНК, являющийся местом (сайтом) связывания рибосом. Всего в SD= последователь- ности имеется 5—9 нуклеотидов. В ДНК некоторых прокариот (археобактерий), в ядре и мито- хондриях эукариот кодирующие области прерываются большими некодирующими ДНК-последовательностями (до 5000 пар нуклео- тидов). По предложению У. Гилберта (1978) кодирующие области называют экзонами, или доменами, некодирующие — интронами. Например, в генах тяжелой Н-цепи иммуноглобулинов (1g) нахо- дится не менее 4 интронов и 5 экзонов, в гене яичного белка (овальбумина)? интронов и 8 экзонов; из 3,5 биллионов пар нук- леотидов в ДНК гаплоидного генома человека кодирующими явля- ются менее 10%. Прерывистость генов у эукариот — явление обычное, хотя известны гены, в которых подобная прерывистость не обнаружена (в генах интерферона, гистонов). В интронах отсутствует более или менее заметная гомология между двумя концами их, а на границах с экзонами в разных генах присутствует так называемая каноническая (усредненная) после- довательность нуклеотидов (относительно короткая) — нередко GT—слева и AG—справа: КП КП I I I------1 A64G73G1OOT100A62A68T63 ... 6Ру?4—87 NC65A100G10 0 N I 11____________________ _________________________। । экзон интрон экзон КП обозначает каноническую последовательность, цифры — проценты случаев обнаружения оснований на границе экзон-ин- трон. Экзоны во много раз меньше (1000 пн) интронов. Интрон пред- ставляет собой транскрибируе- мый (но не кодирующий) участок ДНК, который удаляется из со- става транскрипта при сплайсин- ге (от англ, splicing — сплетение, сшивание). Сплайсинг протекает в ядре, и он заканчивается объе- динением экзонов в зрелую Рис. 53. Сплайсинг (процессинг) РНК: 1 — транскрипция, 2 -— трансляция, а, б, в — экзоны, г, д — интроны; I — ДНК, II — РНК, III — мРНК, IV — Белок. мРНК (рис. 53). Участок ДНК между правым концом интрона и левым концом экзона называется акцепторной точкой сплайсинга. В ДНК митохондрий интроны кодируют синтез отдельных белков,
которые сами могут участвовать в последующем вырезании инт- ронов. Некоторые молекулы белков (ферментов) кодируются од- новременно экзонами и интронами, например, матураза (от англ, mature — созревать). Возможно, что для каждого интрона сущест- вует своя матураза. Интроны митохондриальной ДНК похожи на бактериальные транспозоны и, возможно, матуразы происходят из транспозаз (см.). Утверждается, что существуют белки, кодируемые ядерными экзонами и интронами (м-белки), которые принимают участие в Рис. 54. Выведение зрелой мРНК через пору ядерной мембраны по П. Слонимскому (1985). образовании и перено- се мРНК через ядер- ную мембрану (П. П. Слонимский, 1980). При этом часть белка, кодируемая интроном, включает преимуще- ственно гидрофобные аминокислоты, вслед- ствие чего охотно ло- кализуется в богатой липидами ядерной мембране и притяги- вает мРНК. Часть м- белка, кодируемая эк- зоном, притягивает но- вую полипептидную цепь, транслирующуюся с того же экзона. На уровне ядерной мембраны находится ферментный комплекс сплай- синга интронов. По мере прохождения сплайсинга зрелая мРНК (без интронов)выводится через пору ядерной мембраны (рис. 54). В процессе дифференцировки эукариотических клеток обна- ружена неоднотипность сплайсинга, а именно то, что в одном случае предстает интроном, в другом может оказаться экзоном, и наоборот. В частности, доказано, что интрон цитохрома Ъ - это экзон, кодирующий матуразу. Следовательно, существуют гены, способные кодировать не один белок. Например, один из генов тканевой совместимости кодирует 2 белка; один из прерывистых генов крысы кодирует синтез парат-гормона в паращитовидной железе и нейропептида — в гипофизе. Поэтому нельзя абсолюти- зировать понятие "один ген — одна белковая молекула". В биохи- мической технологии интроны привносят определенные затрудне- ния при экспрессии (проявление, выражение свойств) эукариоти- ческих генов в клетках многих прокариот, лишенных аппарата сплайсинга мРНК. 162
Некоторые из нуклеотидных фрагментов входят не только в состав интронов, или фланкирующих (от англ, flank — бок, сторона, прикрывать с фланга) последовательностей мРНК, но и могут выполнять функции сигнальных последовательностей, узнаваемых белками (промоторы транскрипции, точки начала ре- пликации ДНК, сайты скручивания хромосом и др.). Все эти сигнальные последовательности, повторяющиеся в геноме в виде идентичных или сходных тандемных (от англ, tandem — гуськом, цугом) копий, имеют небольшую длину. При разделении ДНК в градиенте плотности хлористого цезия сигнальные последователь- ности (порядка 5%) удается отделять от основной массы ДНК в виде сателлитной ДНК (дополнительный(е) пик(и) при центрифу- гировании). Эти ДНК могут быть тяжелее или легче основной фракции ДНК и могут быть метилированными. Множество тан- демных повторов в сателлитной ДНК придает ей определенную аномальность при центрифугировании (сходство поведения с ос- новной ДНК в градиенте плотности хлористого цезия). В таких случаях говорят о криптической (от лат. cryptus — скрытый) сателлитной ДНК. Установлено, что высокоповторяющиеся последовательности в сателлитных ДНК обычно не транскрибируются. Следует отметить, что сателлитные ДНК локализуются в области центромеры хромо- сомы (выполняет структурную функцию). Предполагается, что сателлитные ДНК произошли от мозаики последовательностей, состоящих из 9 пн в трех повторах: В начале 80-х годов в геноме человека были А TGA обнаружены последовательности ДНК, обладаю- GAAA А щие свойствами структурного полиморфизма — Т ACT это так назЫваемые гипервариабельные области (ГВО), обычно содержащие короткие, ГЦ-обога- щенные и тандемно повторенные единицы. ГВО рекомендуются в качестве маркеров-зондов при картировании генов. Варианты кор-последовательности ГВО гена человеческого миоглобина были названы минисателлитными. В 1985 г. был предложен метод "генетической дактилоскопии — ДНК" (от греч. dactilos — палец, scopein — смотреть) в целях оценки эволюции человека по отцовской и материнской линиям (А. Дж. Джеффрис, У. Уилсон, С. Л. Тейн). В последовательностях ДНК отражаются происшедшие в прошлом мутации или, по Ф. Крику, "замороженные события”. Это, в частности, поможет кар- тировать варианты последовательностей в локусе минисателлит- ной ДНК. Эволюцию по женской линии удобно картировать по 163
митохондриальной ДНК, так как в сперматозоидах практически нет митохондрий, но ими "начинены" яйцеклетки. Вот почему ДНК клеточного ядра является сочетанием материнской и отцовской ДНК, тогда как ДНК митохондрий передается только яйцеклеткой. Отсюда становится понятным, почему в конце 70-х годов текущего столетия возникла новая научная дисциплина молекулярная ант- ропология. В ДНК различных организмов содержатся еще так называемые палиндромы (от греч. palindrome — перевертыш) — последова- тельности, повторяющиеся в обратном порядке: ________А__________ 5* - ЦТТЦГАТГГААГ - 3’ - ' — - . - т д 3’ - ГААГЦТАЦЦТТЦ - 5’ Б 5’ дтц ГААГ I 3’ В суперспирализованном состоянии длинные палиндромы (10 и более пар оснований) образуют крестообразные структуры, служащие сигналами для узнавания определенных участков ДНК ферментами-метилазами, рестриктазами и регуляторными белка- ми, регулирующими действия генов. В хромосомных ДНК прокариотических и эукариотических клеток имеются также контролирующие или так называемые "прыгающие" подвижные гены — транспозоны (Тп), впервые открытые Б. Мак-Клинток в 1940 г. у кукурузы. Они находятся на значительном расстоянии от других генов, на которые оказывают влияние. Благодаря мутациям, названным "транспозонными взры- вами", возможно массовое и в известной мере направленное перемещение генетических элементов. Транспозоны способны реплицироваться и внедряться (инсерция) в виде одной из копий в новое место генома (ДНК ядра). У бактерий преобладающая часть транспозонов кодирует фермент транспозазу, катализирующую реакцию встраивания транспозона в ДНК. В последнее время их отождествляют с интронами, рассмотренными выше. При сравнении последовательности нуклеотидов в хозяйской ДНК до и после встраивания транспозона оказывается, что не- сколько нуклеотидов этой ДНК после встраивания удваиваются — дуплицируются. Эти дупликации ДНК окаймляют транспозон. 164
Причем, для каждого транспозона характерно определенное коли- чество дуплицированных нуклеотидов. Принято считать, что при встраивании транспозонов хозяйская ДНК перед этим фермента- тивно расщепляется с образованием липких концов, к выступал! которых присоединяется транспозон, а оставшиеся бреши затем заполняются нуклеотидными последовательностями, в результате чего и образуются небольшие дупликации. Следует подчеркнуть, что транспозонов много и они различны (лишь перечень Tn-ов у дрозофилы составит целую книгу). Следо- вательно необходима точная классификция их, и, возможно, в недалеком будущем удастся ее создать. К настоящему времени принято считать, что механизм транс- позиции заключается в удвоении подвижных элементов и после- дующем встраивании одной из копий транспозона в новое место генома, а другая копия остается в прежнем месте. Вот почему термин "транспозиция" неточен, поскольку транспозон не покида- ет своего первоначального места, или сайта. Более правильно рассматривать транспозицию процессом, в результате которого возрастает число копий транспозона. Во благо сохранения струк- туры генома (консерватизма его) транспозиции происходят очень редко. Так, в среднем, частота их сравнима с частотой спонтанных мутаций, то есть 10'5—10‘7 на поколение, а частота реверсии путем делеций, или выпадений, отмечается еще реже (10’6—1О'10). Обращает на себя внимание тот факт, что Tn copia из мушки дрозофилы ведет себя и как транспозон, и как ретровирус (к их числу, кстати сказать, относится вирус иммунодефицита человека — причина СПИД). В та- ких вирусах интеграция ДНК осуществляется способом, сходным с транспозицией. Поэтому небеспочвенной стала гипотеза о том, что виру- Рис. 55. Встраивание транспозона в ДНК-мишень (схема): I — транспозон, 2 — центральная часть, 3 — концевые повторы, 4 — дупликация ДНК-ми- сы — это транспозоны, приобретшие дополни- тельные функции или, напротив, транспозоны шеви. — это выродившиеся вирусы. Проблема остается открытой. Тем не менее, обнаружены самые короткие транспозоны, кодирующие 165
Рис. 56. Ori-сайты в плазмиде pSClOl E.coli (цифры по внешнему кругу 1—6 обозначают места действия различных ферментов-ре- стриктаз). белки, которые участвуют только в транспозиции. Сле- довательно ДНК таких транспозонов можно отне- сти к разряду "эгоистиче- ской”, работающей лишь на себя, то есть она функцио- нирует во имя собственного размножения. Схематичное встраива- ние транспозона (после ре- пликации) в ДНК-мишень изображено на рис. 55. Репликация, или самоудвоение присуще ДНК и РНК, то есть в таких случаях происходит перенос генетической информации соответственно от ДНК к ДНК или, например у ряда вирусов, от РНК к РНК. Репликация осуществляется полуконсервативным способом, когда двухспиральная ДНК деспирализуется и каждая нить индуцирует синтез комплементарной себе нити при участии ДНК- или РНК-полимеразы. Геномы бактерий и фагов реплицируются как единое целое, то есть как организованные единицы репликации, или репликоны. Каждый репликон содержит место (точку) инициации Ori (от англ, origin — начало) — ориентированное направление репликации, например OriC у Escherichia coli (рис. 56). В некоторых репликонах содержится около 240—600 пн. В отдельных репликонах сущест- вует два Ori, например, в так называемых челночных векторах, способных реплицироваться в клетках прокариот и эукариот. Инициация репликации осуществляется с помощью специфиче- ских белков. Репликация ДНК необходима функционирующей клетке для восстановления (репарации), обмена генами между участками хромосом (рекомбинация) и перемещения генов (транспозиции). В течение однократного деления прокариотической или эука- риотической клетки, независимо от числа хромосом в ней, весь геном ее реплицируется также один раз, и только после завершения репликации может произойти последующее деление. Удвоенный геном подразделяется (сегрегирует) поровну в каждую дочернюю клетку. Единицей сегрегации является хромосома, а единицей репликации — репликон. Кроме точки Ori в репликоне имеется 166
12 3 --1-1- Рис. 57. Две репликационцые вилки в ДНК: I и 3 — нереплицированная ДНК, 2 — репликаци- онный глазок, 4 — стационарная точка начала, 5 — движущаяся репликационная вилка, 6 — две репликационные вилки. также точка (место) оста- новки репликации ter (от лат. terminalis — конечный, пограничный). Единицы сегрегации и репликации в бактериальной хромосоме совпадают, поскольку бак- териальная хромосома со- держит только один репли- кон. В то же время каждая плазмида, если она имеется в бактериальной клетке, представляет собой авто- номную кольцевидную ге- нетическую структуру и является самостоятельным репликоном. Плазмиды, представленные в бактериальной клетке лишь в одной копии, называются однокопийными, другие плазмиды, пред- ставленные более чем одной копией, называются многокопийны- ми. В эукариотической клетке содержится большое число репли- конов и единица сегрегации у них включает много единиц репли- кации. Все компоненты аппарата ре- пликации называют реплисомой. Ре- пликация ДНК начинается в стартовой точке, или репликационной вилке, в одном (однонаправленная реплика- ция) или в двух противоположных (двунаправленная репликация) на- правлениях. В последнем случае будет две репликационных вилки (рис. 57). Реплицированная часть ДНК приобре- тает форму "глазка", представляюще- гося 0-структурой. В случае кольцевой матричной структуры ДНК точка роста одной раз- резанной цепи спирали "скользит" вокруг второй кольцевой матричной цепи. Возникает структура катящегося кольца (рис. 58). Рост клеток бактерий и репликация ДНК в них тесно связаны между собой. Рис. 58. "Катящееся” кольцо мат- ричной цепи. 167
25 Точка начала 35/0 р Концевая точка Рис. 59. Цикл деления Е. coli -— образование хромосомы со многими вилками в процессе репликации (а — инициация, б — деление, в — терминация); цифры обозначают минуты кле- точного цикла. Цикл клеточного деления на примере Е. coli можно представить двумя временными интервалами, обозначаемыми латинскими бук- вами С и D. Первая из них обозначает фиксированное время, необходимое для репликации всей бактериальной хромосомы (на- пример, 15 мин.), что соответствует скорости движения отдельной репликационной вилки с присоединени- ем около 50000 пар оснований в 1 мин.; D соответствует промежутку времени (порядка 20 мин.) между завершением репликации ДНК и делением клетки — это как бы накопительный период. Сле- довательно, весь так называемый корот- кий клеточный цикл деления Е coli ук- ладывается в среднем в 35 минут (рис. 59). Длинный цикл клеточного деления наблюдается тогда, когда велико время до начала инициации. Для диплоидных клеток эукариот характерно митотиче- ское деление ядра с последующим обра- зованием новых (дочерних) клеток. Этот митотический цикл подразделют на 4 фазы: Gi, S, G? и М. Фаза Gi обозначает время роста клетки до синтеза ДНК (от англ, дар — пробел); в фазу S происходит синтез ДНК (от англ, synthesis); G2 — вторая фаза роста в период , после синтеза ДНК; М — фаза митоза (от англ, mytosis). На рис 60 представлена схема цикла эукариотических клеток с обозначением продолжительности фаз в культивируемых линиях дрожжевых клеток Schizosaccharomyces pombe и клеток млекопитающих. На весь цикл деления клеток эукариот усредненно приходится следующая доля времени: на 1 г Рис. 60. Схема цикла клеточного деления эукариотических клеток: 1 Schizosaccharomyces pombe, 2 — клетки млекопитающих. фазу Gi — 30—40%, на фазу S — 30—50%, на фазу G2 — 10—20%, на фазу М — 5—10%. 168
За время движения репликационных вилок в клетках эукариот присоединяется от 1000 до 3000 пн в 1 минуту — у млекопитающих и до 1000 пн/мин — у растений (здесь не исключается роль пониженных температур для размножения клеток растений). Синтез комплементарных цепей во время репликации двухни- тевой ДНК у прокариот и эукариот катализируется ферментами, называемыми ДНК-полимеразами. Их известно 3 (pol I, pol II и ро] III у прокариот; а, b и у - у эукариот). Характеристика ДНК-по- лимераз приведена в таблице 18. Таблица 18. Характеристика прокариотических и эукариотических ДНК- полимераз ДНК-полиме- раза Размер, кДа Состав Ферментативная активность 1 из клеток Е. coli: 109 одна цепь а) элонгация в направлении 5' —> 3' от 3' - ОН - затравки б) 3' —> 5' - экзонуклеаза в) 5’ —» 3’ - экзонуклеаза I II 120 — см. для I б) 3' —> 5' - экзонуклеаза III 250 гетеро муль- тимер а - в) см. для I 1 из клеток млекопита- ющих: 110-120 несколько субъединиц репликативный синтез | ядерной ДНК (ядерная ДНК- 1 репликаза) - 80% а р 45 I субъединица репарация сегментов | поврежденной ДНК Y 60 2 репликативный синтез митохондриальной ДНК - ' 2-15% = На раскрученной ДНК происходит непрерывный синтез веду- щей цепи в направлении 5' —> 3', тогда как на комплементарной цепи имеет место прерывистая репликация, то есть в направлении 169
5' —> 3' на ней синтезируется серия фрагментов ДНК (фрагменты Оказаки), которые затем соединяются, формируя отстающую цепь (рис. 61). Фрагменты Оказаки содержат примерно 1000—2000 Рис. 61. Фрагменты Оказаки, присоединенные к РНК — инициатору: а — матричная ДНК, б — комплементарная ДНК, в — РНК—праймер, НТ—входящий нуклеозид- трифосфат. нуклеиновых оснований, и синтез фрагментов под каталитическим действием ферментов РНК-полимераз, включая праймазу (ММ-60 кДа), инициируется РНК—затравками, каждая из которых по длине соответствует приблизительно 10 основаниям. РНК—затравка уд- линяется под действием ДНК-полимеразы III, катализирующей синтез цепи ДНК. РНК удаляется под действием ферментов экзо- нуклеаз. В так называемую затравочную реакцию вовлекается комплекс белков — праймосома. Например, праймосомный белок SSB свя- зывается с одноцепочечной ДНК, стабилизируя ее; белок Dna В образует предпраймерную РНК и участвует в передвижении прай- мосомы; белок Dna С действует в комплексе с Dna В; белок Lig сшивает разрывы между фрагментами Оказаки; белок п'-АТФ-аза, белки пип" образуют предзатравочную РНК, и др. Предполагают, что праймосома собирается в каком-то одном участке с последующим перемещением по одноцепочечной ДНК к сайтам,где инициируется синтез затравки. Направление движе- ния праймосомы противоположно направлению синтеза ДНК от- стающей цепи, но синхронно движению репликационной вилки. По расчетным данным репликация ДНК у прокариот (вместе с 170
раскручиванием молекулы по 10 нуклеотидных пар одномоментно) должна происходить со скоростью 400 000 оборотов в секунду, что явно превышает реальную скорость репликации. Поэтому было предположено, что должны существовать фиксаторы, включающи- еся в молекулы ДНК у всех организмов. Такие фиксаторы были обнаружены. К ним относятся ферменты — топоизомеразы. От- дельные из них катализируют реакции объединения молекул ДНК в зацепленные кольца — катенаны, топоизомераза II, или гираза, катализирует суперспирализацию ДНК, топоизомераза I способна разрезать одну из цепей суперспирализованной ДНК, при этом цепи раскручиваются и число супервитков уменьшается, после чего этот же фермент устраняет разрыв в нити ДНК. Двигателем в распределении реплицированных молекул ДНК по дочерним клеткам (по крайней мере - у прокариот) выступает клеточная мембрана, к которой прикрепляется ДНК. Таким образом, весь катализируемый ферментами процесс репликации ДНК можно подразделить на 3 этапа: инициацию, элонгацию (рост цепи) и терминацию. В процессе инициации происходит разделение нитей ДНК с образованием репликацион- ной вилки, формирование праймосомы и синтез затравочной РНК. Этап роста цепи, или элонгации, реализуется в синтезе ДНК с помощью ДНК-полимераз. Терминация, или окончание синтеза ДНК, происходит благодаря выключению реакции с помощью специфического "стоп-сигнала" от специального кодона (термина- тора) в матричной цепи. Такие же 3 этапа выделяют в процессах транскрипции и трансляции ДНК. Транскрипция — это процесс переписывания закодированной в ДНК информации и перенос ее к месту синтеза белка (на рибосомы). Этап инициации при транскрипции заключается во взаимодействии РНК-полимеразы с ДНК-матрицей; элонгация - в ферментативном синтезе мРНК на матрице ДНК; терминация — в остановке синтеза мРНК благодаря "стоп-сигналу" от гена —- терминатора. Трансляция заключается в переводе закодированной в мРНК информации в полипептидную цепь. Организующими центрами процесса трансляции являются рибосомы. При трансляции на этапе инициации происходит активация аминокислот с помощью ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз (АРСаз) при использовании энергии АТФ с последующим образованием комплекса инициации, включающего 3 фактора инициации (IF-1, 1F-2, 1F-3 — у прокариот, eIF-2, eIF-3, eIF-5 и др. — у эукариот), мРНК, 171
гуанозилтрифосфат (ГТФ) и 30S(40S) — субчастицу рибосомы. Указанный комплекс соединяется с 50S(60S) — субчастицей рибо- сомы и формирует функциональную 70S (80S) рибосому. На этапе элонгации в ходе трансляции осуществляется синтез полипептид- ной цепи функционирующей рибосомой с участием факторов элонгации (EF-Tu, EF-Ts, EF-G — у прокариот; EF-1 и EF-2 — у. эукариот). Указанные факторы не входят в структуру рибосом, а присоединяются к ним на определенных этапах. Во время синтеза белка рибосомы движутся вдоль мРНК, последовательно считывая триплеты и поэтапно наращивая по- липептидную цепь. У мРНК, как правило, имеется постоянная рамка считывания — кодон AUG. При элонгации одна мРНК связывается с несколькими рибосомами, образуя функционирую- щий комплекс - полирибосомы, или полисомы. Из указанных трех этапов с наибольшей скоростью протекает элонгация. Терминация процесса трансляции осуществляется стоп-кодоном в мРНК. Как следует из представленных выше данных РНК занимает место посредника между ДНК и белком. Причем эта центральная функция присуща мРНК, тогда как тРНК и рРНК являются транс- криптами, обладающими активностью как завершенные в постро- ении и функции молекулы. Исключение представляют некоторые РНК — содержащие вирусные геномы, по матрице которых син- тезируется РНК, причем реализация генетической информации может осуществляться по схемам: для одних вирусов, у которых отсутствует транскрипция, РНК -> Белок (вирус полиомиелита и др.), для других, располагающих собственной вирионной РНК — зависимой РНК-полимеразой, или вирионной транскриптазой, РНК -» РНК -» Белок (вирусы гриппа, кори и др.), и, наконец, для третьих — РНК -> ДНК —> РНК —> Белок (ретровирусы, в том числе — ВИЧ, или вирус СПИД). мРНК, рРНК и тРНК у бактерий синтезируются под каталити- ческим действием одной и той же РНК-полимеразы (ММ-480 кДа). В клетках эукариот обнаружены три ядерные РНК-полимеразы (I, II и III), а также РНК-полимеразы митохондрий и хлоропластов. Установлено, что РНК-полимераза I, находящаяся в ядрышке, отвечает за синтез про-рРНК, из которой впоследствии образуются 28S и 18S рРНК; РНК-полимераза II катализирует реакцию синтеза про-мРНК и только с этим ферментом связано так называемое кэпирование РНК. А. Шаткин в 1976 г. впервые описал характер- ную группировку, присоединяющуюся к 5'-концу фактически всех про-мРНК и мРНК посттранскрипционно. Автор назвал ее КЭПом 172
(от англ, cap — шапка, кепка). КЭП повышает устойчивость про-мРНК и мРНК к действию ряда рибонуклеаз и других гидро- лизующих агентов. Пример КЭПа: 7meG5' ррр5' Nf^p ,..(7'-метил- гуанозил-5'-трифосфорил-5'-нуклеозил-метилрибозил-фосфорил -нуклеотид...); локализация КЭПа и предшествующие ему нуклео- тидные последовательности в ре- комбинантной плазмиде рТК 1 показаны на рис. 62. З'-Конец мРНК, как правило, полиадени- лирован. РНК-полимераза III катали- зирует синтез 5S РНК, всех тРНК, ряда малых РНК, а также часть гяРНК. Скорость синтеза белков у различных представителей над- царств прокариот и эукариот варьирует в широких пределах. Это зависит от многих внутрен- них и внешних факторов. Тем не менее, у бактерий при 37°С за 1 секунду может включаться в рас- тущую полипептидную цепь от 10 до 20 аминокислот. Подсчита- но, например, что белковая мо- лекула, включающая 300 амино- Рис. 62. Локализация КЭПа в рекомби- нантной плазмиде рТК1 (показаны нук- леотидные последовательности, участву- ющие в регуляции экспрессии гена ти- мидинкиназы — tk; нумерация нуклео- тидов проставлена относительно КЭП- участка; буквами внутри круга показаны места действия соответствующих фер- ментов-рестриктаз; Amp — устойчивость к ампициллину. кислот, синтезируется бактериальной клеткой за 20 секунд. Скорость синтеза белков в эукариотических клетках заметно ниже (в среднем, за 1 секунду присоединяется 1—2 аминокислоты к растущей цепи полипептида). Здесь следует иметь в виду и тот факт, что для синтеза белка с прерывистого гена, включающего экзоны и интроны, требуется дополнительное время. Ген вначале транскрибируется целиком (со всеми экзонами и интронами) в пре-мРНК, которая затем в ходе сплайсинга освобождается от интронов и превращается в мРНК (см. рис. 53), в которой экзоны соединены последовательно конец в конец. Только после этого образованная мРНК включается в процесс синтеза белка. Следует иметь в виду, что, например, у человека 80—90% ДНК оказывается некодирующей. Вырезание интронов из пре-мРНК происходит с участием ферментов, распознающих границы интронов. Если это распозна- ние окажется неточным, то соединившиеся экзоны будут кодиро- вать другой белок — произойдет сдвиг рамки считы - 173
вания. Свершившуюся поломку в механизме биосинтеза полипептида можно сравнить с типографским браком. Например, в словах "копна сухого сена" сдвинули рамку считывания и пол- учили бессмыслицу — "коп насухо госена" (интервалы между словами засчитываются за одну букву). Механизмы сплайсинга могут быть различными в зависимости от типа генов (ядерных и внеядерных) и классов интронов (рис. 63). С распознаванием механизмов сплайсинга связано выдающееся открытие конца 1982 г., когда Т. Чех с сотрудниками выявил авторестрикцию (самовы- резание) интрона в гене рРНК у одного из видов Protozoa. При этом не требовалось каких-либо ферментов и приложения энергии Дрожжи Не La Tetrahymena Рис. 63. Транскрибирование гена (сравнение механизмов сплайсинга тРНК в дрожжах, в экстрактах клеток HeLa и самосплайсинга рРНК Tetrahymena). Символы вокруг фосфатных групп отражают судьбу каждой из них в ходе реакции. 174
извне. Этим доказываются автокаталитические свойства нуклеи- новых кислот, и предложенный Т. Чехом термин "рибозим" не представляется алогичным. Компартментализация эукариотической клетки служит веским доказательством специального (более высокого, чем у прокариот) разграничения функций и привязки их к определенным структу- рам. Это относится и к белковому синтезу. Мономерные рибосомы, в отличие от полисом, находятся в цитоплазме клетки в свободном состоянии. Полисомы, как правило, располагаются либо цепочкой ближе к ядерной мембране (связанные полисомы) и в тех местах, где мРНК входит в цитоплазму, либо они (так называемые "сво- бодные полисомы") ассоциируются через посредство мРНК с клеточным цитоскелетом (см.). Это обусловлено качеством синте- зируемых белков на полисомах. В 1980 г. Трифонов и Зусман выяснили, что в геноме человека пары адениновых нуклеотидов встречаются с периодичностью 10,5 на протяжении любой последовательности ДНК, которая взаимо- действует с единицей гистонового ок- тамера и образует нуклеосому. Эта периодичность хорошо коррелирует с периодичностью завитков в В-спирали (см.) молекулы ДНК. Указанная пери- одичность адениновых пар кодирует закручивание спирали ДНК в одном направлении вокруг комплекса гисто- новых октамеров (рис. 64) и этот код был назван "хроматиновым" или "код упаковки хроматина". Высказано предположение, что в структурах бло- ков тандемно повторяющихся после- довательностей потенциал скручива- ния спирали как бы амплифицируется (от англ, amplification — обилие). Более того, показано, что и при альтернатив- ных вариантах закручивания спирали (например, левостороннем) обнару- живаются тандемные блоки пурино- пиримидиновых оснований. Очевидно блоки тандемных повторов кодируют локус-специфичную упаковку ДНК и структуру хроматина в ядре клеток человека. Рис. 64. Упаковка хроматина на примере нуклеосомы: 1 — гистон Н1, 2 — двухнитевая ДНК, обви- тая вокруг структуры, содержа- щей 8 молекул гистонов — по 2 молекулы Н2А, Н2В, НЗ и Н4, 3 — спейсерный участок ДНК. 175
Локус-специфичный "код упаковки хроматина" участвует не только в структурной организации хромосом в ядре клетки, но может выступать как "код экспрессии гена", "код репликации” (сайты репликации на протяжении данной повторяющейся после- довательности) и "код рекомбинации". Суммируя основные представления о структуре и функциях генома акариотических, прокариотических и эукариотических ви- дов, необходимо подчеркнуть следующие его особенности: 1) Геном акариот и прокариот, а также митохондрий и пластид эукариот является компактной совокупностью генов с небольшим содержанием структурных повторов, что характеризует его эко- номичность. Он кольцевидно замкнут (непрерывен), интервалы между генами минимальны. Например, вся генетическая инфор- мация умеренного фага Л. размещается в кольцевой молекуле ДНК длиной в 50 kb, где содержится порядка 40 генов; плазмидная ДНК из 95—97 kb включает до 100 генов; замкнутая ДНК Е. coli из 400 kb может содержать до 3000 генов (примерно 1500 пн составляют один ген); 2) Генетический аппарат в клетках эукариот организован в форме нескольких линейных хромосом, в которых ДНК прочно связана с белками-гистонами, обеспечивающими упаковку и упо- рядочение ДНК в виде структурных единиц—н уклеосом (учитывая при этом "код упаковки хроматина” и экстраполируя его на клетки большинства эукариот). Так, в гаплоидной клетке Saccharomyces cerevisiae содержится 17 хромосом, в каждой из которых детектировано 1000 kb и, следовательно, число генов могло бы достигать в такой клетке 11 000; для 23 хромосом в гаплоидной клетке человека, где в одной хромосоме содержится 125 000 kb, число генов должно бы возрасти до 2 млн. Предположительно близкое число генов могло бы оказаться в гаплоидных клетках кукурузы, где имеется 10 хромосом, в клетках кролика с 22 хромосомами, или мыши с 20 хромосомами. Однако, в хромосомах эукариотических организмов содержится генов меньше, чем неко- дирующих участков (спейсеров, или разделителей), и также име- ется масса сходных между собой фрагментов ДНК, повторяющихся десятки-сотни тысяч раз. Вот почему, например, у человека лишь 10 - 20% всей ДНК относится к разряду кодирующей. Но и в этом случае число генов в 23 хромосомах гаплоидной клетки может достигать порядка 200 000. 176
3) Гены эукариот, нередко располагаясь в хромосомной ДНК рядом, образуют мультигенные семейства, состоящие из небольшого числа родственных последовательностей. Напри- мер, гены, кодирующие рРНК у млекопитающих, обнаруживаются в геноме сотнями своих копий, сгруппированных в зоны, а это свидетельствует об избыточности генетических программ у вы- сших организмов (создание "повышенной прочности"). 4) Представители микробного, растительного и животного мира имеют в составе генетического материала одни и те же строитель- ные блоки, то есть их "кодовый словарь” в основном однотипен, или универсален, и функционирует преимущественно в соответ- ствии с центральными постулатом молекулярной генетики, сфор- мулированным Ф. Криком в 1967 г.: генетическая информация переносится по схеме ДНК -» РНК -» Белок (у вирусов может быть несколько видоизменена), но никогда — от белка к РНК. 5) Каждый ген проявляет себя (экспрессируется) путем обра- зования, или биосинтеза мРНК (транскрипция гена) с последую- щим переводом (трансляция) информации в специфическую по- липептидую цепь, фактически являющуюся продуктом гена. Ген и его продукт колинеарны, то есть последовательность кодонов (триплетов) в гене точно соответствует последовательности амино- кислот в белке. 6)’ Ген кодирует строение белковой молекулы и регулирует процесс ее синтеза. В таблице 19 суммированы основные представления о строении и функциях генетического аппарата клеток разного уровня орга- низации. Зная строение и функцию генов, а также владея методами их выделения и переноса в различные клетки или молекулы нуклеи- новых кислот, можно с достаточной уверенностью подходить к постановке генноинженерных работ. 5.2.КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ МЕТОДАМИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ; рДНК-БИОТЕХНОЛОГИЯ 5.2.1. Общая характеристика генетической инженерии. Гене- тическая инженерия — это методы получения рекомбинантных ДНК, объединяющих последовательности разного присхождения. Некоторые ученые трактуют генетическую инженерию "как ис- кусство использования знаний, методов и техники физико-хими- ческой биологии и молекулярной генетики для конструирования 177
организмов с заданными наследственными свойствами” (В. Н. Рыбчин, 1986). Таблицам. Основные характеристики генетического аппарата у прокариот и эукариот Характеристика Прокариоты Эукариоты генов по строению непрерывны прерывны (содержат интроны) по стабильности стабильны возможны перестройки по координации экспрессии опероны (регулоны) управляются операторами и сайтами связывания регуляторных белков оперонов нет. В индуцибельных генах имеются регуляторные элементы про- це- ссов транскрипции по числу' РНК-полимераз одна три по наличию энхансеров отсутствуют имеются. Энхансеры тканеспецифичны по строению промоторов типичен единый план строения; наличие двух консервативных последованостей: ТАТААТ (-10) и ТГГАЦА (-35) промоторы генов, кодирующих белки, имеют одну консервативную последователь- ность ТАТА (А/Т) А(А/Т) (-30) и богатый ГЦ-участок (-40... - 100) по мРНК колинеарна гену или оперону первичный транскрипт колинеарен гену. ’'Зрелая" мРНК образуется в процессе сплайсинга 1 трансляции по константе седиментации рибосом 70S (50S и 30S) 80S (60S и 40S) по сайту связывания рибосом последователь- ность с ядром АГГА консервативной последователь- ности не выявлено .по ко- 1 донам1 инициации АУТ, редко ГУТ АУГ терминации УАЛ, УАГ, УГА УАА, УАГ, УГА 178
Очевидно, что под искусством автор понимает умение органи- зовать и методически реализовать генноинженерную задачу — получить рекомбинантную ДНК с последующим включением ее в реципиентную клетку или осуществить перенос целых хромосом от клеток-доноров в клетки-реципиенты. Иногда понятия "генная инженерия" и "биотехнология" отож- дествляются (А. А. Баев, 1984), хотя несомненно генная инженерия представляет собой один из методов науки биотехнология. В основу генноинженерных методов заложена способность ферментов — рестриктаз расщеплять ДНК на отдельные нуклеотидные последо- вательности, которые могут быть использованы для встраивания их в геномы бактериальных плазмид и фагов с целью получения гибридных, или химерных форм, состоящих из собственной ДНК и дополнительных встроенных фрагментов несвойственной им ДНК. Поэтому методами генетической инженерии добиваются клонирования генов, когда выделяют нужный отрезок ДНК из какого-либо биообъекта и затем получают любое количество его, выращивая колонии генетически идентичных клеток, содер- жащих заданный участок ДНК. Другими словами клонирование ДНК — это получение ее генетически идентичных копий. Генетическую инженерию подразделяют на генную инжене- рию, геномную инженерию и хромосомную инженерию. Сущ- ность первой состоит в целенаправленном использовании пере- строек естественного генома, осуществляемых in vivo или in vitro, для изменения генетических характеристик известных вирусов и клеток. В качестве примеров генной инженерии in vivo можно назвать: транслокацию (перемещение) в вирусные геномы некото- рых клеточных генов, придающих вирусам свойства онкогенности; трансдукцию (перенос) клеточных генов от клеток-доноров в клет- ки-реципиенты с помощью фагов, и др. Примером генной инже- нерии in vitro является создание молекулярных химер из фрагмен- тов ДНК разного происхождения, включение их в реципиентные клетки Е. coli, Вас. subtilis и др. с последующим культивированием этих организмов в целях получения необходимых белковых про- дуктов (пептидных гормонов, ферментов и т. д.). Сущность геномной инженерии заключается в целенаправлен- ной глубокой перестройке генома акариот, прокариот или эукари- от, вплоть до создания новых видов. При геномной инженерии добиваются внесения большого количества дополнительной гене- тической информации и в результате получают гибридный орга- низм, отличающийся от исходного по многим признакам. Гибриды 179
оказываются жизнеспособными лишь в тех случаях, когда они содержат все безусловно необходимые (облигатные) гены, когда у них налажены и взаимно согласованы регуляторные связи между совмещенными генами, и, наконец, когда имеется структурное соответствие между продуктами матричного синтеза (белками). При геномной инженерии возможно получение половых (сли- яние гамет) или соматических (слияние неполовых клеток) гибри- дов. Половые гибриды получают либо в естественных, либо в искусственных (экспериментальных) условиях. Соматические гиб- риды способны формироваться лишь в искусственных условиях у прокариот и эукариот, то есть у клеточных форм (клеточная инженерия). Примером естественной (природной) геномной инженерии является рекомбинация геномов вирусов гриппа, относящихся к типу А. На основании антигенных характеристик рибонуклеопро- теинов выделяют вирусы гриппа А, В и С. Изменения антигенных свойств постоянно происходят у вирусов типа А, меньше — у типов В, тогда как вирусы типа С являются антигенно стабильными. К тому же известны штаммы вируса гриппа А, изолируемые от свиней, лошадей, уток, цыплят. Некоторые изоляты вируса от животных антигенно подобны штаммам, циркулирующим среди людей. Поэтому более полно изученными к настоящему времени также оказались вирусы типа А. Их геном состоит из 8 различных однонитевых сегментов РНК с общей молекулярной массой 2— 4-103 кДа (см. рис. 22а). Большая часть полинуклеотидов, состав- ляющих вирусные РНК-сегменты, содержат уридин на З'-конце. С вирусным геномом ассоциирована РНК-зависимая РНК-полимера- за. Рибонуклеопротеин окружен белковым слоем (М), образующим внутреннюю часть вирусной оболочки. Белок М включает малый протеин с ММ 26 кДа, составляющим 40% от всего белка вирусной частицы. Порядка 20% массы частицы приходится на липидный бислой, который, по-видимому, имеет клеточное происхождение. Гемагглютинин отвечает за агглютинацию эритроцитов вирусом А. Он представляет из себя гликопротеин с ММ 75 кДа. Нейрами- нидаза ответственна за рецепторцо-разрушающую активность ви- руса, обеспечивая ему выход из эритроцита или клетки-,,хозяина”. Нейраминидаза состоит из четырех полипептидных молекул с ММ порядка 60 кДа, и, наряду с гемагглютинином, обладает антигенной активностью. Их используют для регистрации и объяснения анти- генных изменений вируса. К началу 90-х годов было известно 11 подтипов гемагглютинина (Н1—Hl 1) и 8 подтипов нейраминидазы 180
(N1—N8) у вирусов А. Поэтому система обозначения вируса гриппа включает название штамма, номера субтипов гемагглютинина и нейраминидазы. Например, вирус гриппа А(свиной) Тайвань /l/70(H3N2). Это значит, что вирус изолирован от свиней на острове Тайвань в 1970 году, содержит гемагглютинин З(НЗ) и нейраминидазу 2 (N2). Оба антигена (Н и N) формируются и контролируются генами (РНК-фрагментами) независимо друг от друга. Вследствие сегментарности генома вирус проявляет реком- бинацию с высокой частотой и, как следствие, происходят изме- нения в антигенных свойствах вирусов (прежде всего — по гемагглютинину и нейраминидазе). В экспериментальных условиях возможно проведение РНК — РНК-гибридизации с последующим определением профилей плав- ления молекул гибридных РНК в присутствии формальдегида. Известны некоторые вирусы бактерий, объединяющие в себе свойства фагов и плазмид. Их назвали фазмидами. Они могут быть природного и экспериментального (искусственного) происхожде- ния. К природным относятся некоторые умеренные coli-фаги (N15, Р1), к искусственным — фазмида col 106, способная при 32°С проявлять свойства плазмиды, а при 37°С индуцирует лизис реци- пиентных клеток. Благодаря высокой степени генетической гомологии Е. coli, Salmonella spp. и Shigella spp. можно получать хромосомные гиб- риды между ними: Доноры ДНК (хромосомы) Реципиенты ДНК (хромосомы) Е. coli Различные штаммы Е. coli Shigella spp. Salmonella spp. Salmonella typhimurium Различные виды и штаммы Salmonella spp. Shigella flexneri Е. coli, Salmonella typhi и др. В этих целях чаще прибегают к методу конъюгации бактерий. Однако следует иметь в виду, что виды с небольшой генетической гомологией (тем более — при отсутствии ее ) слабо конъюгируют или не конъюгируют совсем и обмена генами между ними прак- тически не наблюдается. Здесь перспективным оказывается метод слияния протопластов, ныне широко используемый в работе с прокариотами и эукариотами. 181
Клеточные стенки обычно у молодых клеток частично или тотально лизируют с помощью гидролитических ферментов. Воз- никающие протопласты затем подвергаются слиянию в среде с полиэтиленгликолем и соответствующими стабилизаторами про- топластов, либо используют электрическое или температурное воздействие в целях деполяризации мембраны. Таким образом можно создавать межвидовые и, даже, межродовые гетерокарио- тические гибриды. Другими словами, таким путем удается совме- щать в одной клетке геномы клеток (организмов) с половой несов- местимостью. Например, удается слить протопласты клеток мор- кови и ячменя, кукурузы и сои, дурмана и красавки, картофеля и томата (pomato), некоторых бактерий и растений, мыши и моркови, мыши и человека. Однако в большинстве случаев такие гибридные клетки не развиваются в полноценные организмы. К тому же стабильность (жизнеспособность) гибридов находится в обратно- пропорциональной зависимости от эволюционной отдаленности гибридизуемых видов, то есть эволюционно далекие виды менее жизнеспособны в гибридном состоянии, чем близкородственные виды. Жизнеспособные гибриды сохраняют большую часть генома одного из слившихся партнеров. Поэтому соматическая гибриди- зация практически реализуется пока на ограниченном числе видов и родов. Так, используя протопласты из листьев петунии дикого типа одного вида и "альбиносные" протопласты суспензионных культур другого вида, удалось сконструировать амфидиплоидные (от греч. amfi— с обеих сторон, diploos — двойной, eidos - вид), или аллотетраплоидные соматические гибриды с 28 хромосомами, способные трансформироваться в цветущие растения: а) вид Petunia parodii (2n= 14) б) вид Petunia hybrida (2n= 14) • в) вид Petunia inf lata (2n= 14) Соматические гибриды: 1) P.parodii x P.hybrida (4n = 28) 2) P.parodii x P.inflata (4n = 28). К. Келер и Ц. Милыптейн в 1975 г. смогли впервые получить соматические гибриды клеток млекопитающих — гибридо- м ы, продуцирующие так называемые моноклональ- ные антитела. В иммунном организме антитела образуются плазматическими клетками, возникающими в результате диффе- ренциации В-лимфоцитов в ответ на антигенную стимуляцию. В-лимфоциты — высоко специализированные клетки, их в орга- низме порядка 107 клонов и каждый клон синтезирует антитела 182
только одной специфичности — моноклональные антитела (вари- антов антител может быть также 107). Если антиген содержит несколько специфических (детерминантных) групп, то антитела образуются против каждой детерминанты. В-лимфоциты не удает- ся поддерживать в культуре. Если В-лимфоцит перерождается и трансформируется in vivo в злокачественную опухоль, то такая опухоль — миелоМа синтезирует большое количество антител, специфичность которых неизвестна. Однако возникают и такие варианты миеломных клеток, в которых отсутствует экспрессия генов в отношении синтеза тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Миеломные клетки могут поддерживаться в культуре неопределенно долго. Совместив способность миелом к длительному культивированию в условиях in vitro и способность В-клеток продуцировать моно- клональные антитела, Келер и Милыптейн получили гибрид, сек- ретирующий моноклональные антитела. Для этих целей они ис- пользовали мышиные клетки миеломы и нормальные В-клетки селезенки мыши, иммунизированной заданным антигеном (см. специальную часть). Подобные гибридомы широко используются теперь для получения различного рода моноклональных антител, применяемых в диагностических, лечебных и других целях. Необходимо иметь в виду, что, в отличие от половой гибриди- зации, соматическая гибридизация эукариотических клеток завер- шается объединением под одной мембраной не только ядерных геномов двух (или более) особей, но и генов цитоплазмы (митохон- дриальных, хлоропластных, емкостью в 1000—2000 генов), что может отразиться на функциональной активности гибрида. У межвидовых гибридов часть хромосом может утрачиваться за счет элиминации, которая оказывается видоспецифичной. Так в гибри- дах протопластов клеток "мышь х человек” и "человек х комар" элиминируются хромосомы человека и комара соответственно. При морфологическом различии хромосом такие гибриды удобны для картирования генов. Напомним, что в соматических клетках мыши содержится 20 пар хромосом, в клетках человека 23 пары хромосом и три пары — в диплоидных клетках комара. Таким образом, на практике стремятся осуществлять сомати- ческую гибридизацию для заметного расширения рамок скрещи- вания, для включения (переноса) внеядерных генов и их функций в гибридное потомство и для локализации генов в хромосомах. В случае переноса изолированных хромосом от клетки-донора 183
одного организма в клетку-реципиент другого организма говорят о хромосомной инженерии. О. Мак Брайд и X. Озер впервые в 1973 г. осуществили такой перенос хромосом (в стадии метафазы) китайского хомячка в клетки мыши. Хромосомная инженерия — ветвь генетической инженерии. Объектами ее являются хромосомы клеток прокариот и эукариот. Донорами хромосом могут быть различные суспензионные и суб- страт-зависимые клеточные линии. Из клеток прокариот хромосо- му (ДНК) выделяют из супернатанта после центрифугирования дезинтеграта или лизата клеток (протопластов). Клетки эукариот блокируют на стадии мейоза, хромосомы выделяют, применяя "гипотонический шок" и гомогенизацию с последующей очисткой их дифференциальным центрифугированием. Хромосомы осажда- ют на поверхности реципиентных клеток хлоридом кальция и через несколько часов клетки обрабатывают реагентом — "перфорато- ром" (например, глицерином). Реципиентные клетки могут содер- жать донорный материал в широком диапазоне (встроенным в геном, изолированно). Благодаря хромосомной инженерии стали возможными пол- учение высокомолекулярных БАБ, присущих человеку, лечение наследственных заболеваний, селекция пород домашних живо- тных и различных видов растений. Естественное или искусственное скрещивание растений и жи- вотных, когда происходит оплодотворение женской гаметы муж- ской, по сути своей касается переноса и слияния хромосом с последующим возникновением жизнеспособных гибридов. Меж- видовое скрещивание как правило сопровождается худшими ре- зультатами — получаемые гибриды обладают сниженной плодови- тостью или могут быть совершенно бесплодными. Целые наборы хромосом от разных видов могут соединяться вместе и в результате возникают аллополиплоидные формы (от греч. alios — другой). Можно соединять и неполные хромосомные наборы. Так, при скрещивании 42-хромосомной пшеницы с пше- нично-ржаным амфидиплоидом, содержащим 56 хромосом, возни- кает гибрид с 49 хромосомами, у которого 42 хромосомы принад- лежат пшенице и 7 хромосом принадлежит ржи. При искусственном скрещивании растений или животных стремятся получать в потомстве комбинацию различных ценных родительских признаков. Теоретически любые клетки могут бь!ть использованы либо в качестве донора хромосом, либо в качестве реципиента их, хотя 184
на практике стремятся иметь подходящие реципиентные линии клеток, акцептирующие чужеродную ДНК с повышенной актив- ностью, например, клетки карциномы мочевого пузыря человека (линия EJ). В процессе выделения хромосом из клеток на стадии митоза эксперименты проводят при пониженных температурах ( + 4°С), используя пластиковые пипетки во избежание деструкции хромо- сом. Перед механическим разрушением клеток их суспендируют (107 клеток/мл) в гипотоническом растворе, а затем центрифуги- руют при 2500 g на холоду (примерно 25 мин. при 4°С). Выход хромосом составляет около 10% от всех хромосом клеток-доноров. Очищенные хромосомы должны быть использованы в опытах по переносу в реципиентные клетки (трансфекция) немедленно. Хромосомы можно выделять из клеток, блокированных в ме- тафазе, различными способами, в том числе с помощью щадящих поверхностно-активных веществ, например, стероидного сапони- на-гликозида дигитонина, представляющего собой пентагликозид дигитогенина. Олигосахаридная часть присоединяется через гид- роксил в позиции СЗ агликона. Она включает 1 остаток ксилозы и по 2 остатка галактозы и глюкозы. Таким образом, соподчиненность генной, геномной и хромо- сомной инженерий можно представить в виде схемы: ^^Генетическая инженерия^^^ генная инженерия геномная инженерия хромосомная инженерия половая соматическая гибриди- гибридизация зация (клеточная инженерия) Такое подразделение генетической инженерии и терминология 185
достаточно условны, поскольку, в конечном итоге, результаты манипуляций с рекомбинантной ДНК получают на клеточных культурах. Поэтому при выделении двух уровней биотехнологии — молекулярный и клеточный (включая клеточ- но-инженерный) следует иметь в виду, что первый относится к получению и клонированию рекомбинантной ДНК, второй — к выращиванию вирусов, клеток и тканей (клеточно-инженерный — к протопластированию и гибридизации протопластов), хотя, как уже было сказано, все уровни можно свести к одному — клеточ- ному. А А А А А мРНК ревертаза, или обратная транскриптаза; нуклеозидтрифосфаты; олигодезокситимидин (dT) А А А А А мРНК II II II II II _________—________—_______ Т Т Т Т Т комплементарная цепь денатурация ДНК=полимераза I (фрагмент Кленова) + дезоксинуклеозидтри- фосфат (dHT4>) А А А А А II II II II II -№Кс одноцепочечной т т т т т петлей нуклеаза S1 из Aspergillus oryzae А А & & А двуцепочечная компле- Т Т Т Т Т ментаРная ДНК(кДНК) терминальная трансфераза, dL(T<t> ЦЦЦЦЦЦЦ. АААААЦЦЦЦЦЦЦ II II II II II т т т т т фрагмент ДНК с го- мополи- мерными последо- ватель- ностями ЙЦ Рис. 65. Схема получения из мРНК фрагмента ДНК, пригодного для клонирования. 186
5.2.2. рДНК-биотехнология. Практическое использование ре- комбинантных ДНК различного происхождения составляет основу так называемой "рекомбинантной ДНК-биотехнологии", или со- кращенно рДНК-биотехнологии. Теоретически все 50—200 тысяч структурных генов человека доступны экспериментальному ана- лизу, хотя это еще не было бы проникновением в природу человека в целом. Тем не менее, с помощью рДНК-биотехнологии открыва- ются невиданные доселе перспективы производства различных веществ для народного хозяйства. рДНК-биотехнологию подразделяют на следующие этапы: по- лучение чужеродной ДНК, разрезание полученной ДНК на фраг- менты и их очистка, включение фрагмента чужеродной ДНК в векторную плазмиду и получение рекомбинантной ДНК, или рДНК, введение рДНК в пермиссивные клетки и клонирование генов, амплификация и экспрессия рДНК. Получение чужеродной ДНК. Чужеродную ДНК можно по- лучить с помощью химического или ферментативного синтеза, либо из любого организма или из вирусов с последующим опре- делением ее первичной структуры. Если ДНК выделяют из клеток эукариот, то для клонирования, амплификации и экспрессии не нужны интроны. Поэтому в таких случаях используют мРНК, образующуюся в процессе сплайсинга (рис. 65). Как видно из рис. 65,терминальная трансфераза катализирует реакцию присоединения гомополимерных последовательностей дезоксицитидина. Таким образом создаются предпосылки для по- следующего клонирования, в частности, используя плазмидный вектор (см.) PBR322, несущий гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину. После расщепления рестриктазой (см.) Pst 1 (из Providencia stuartii) эта плазмида имеет гомополимерные последо- вательности dT: Pstl —Ц—Т—Г—Ц—А—Г —Г—А—Ц—Г—Т—Ц— I Pst 1 За счет этого вектор можно использовать для встраивания полученного фрагмента ДНК с гомополимерными последователь- ностями dL[. Для изоляции неповрежденных генов из ДНК можно исполь- зовать ультразвук или гидродинамическое дробление ДНК в соот- ветствии с нижеследующей последовательностью этапов. В соответствии с особенностями структуры полученного фраг- 187
мента его включение в pColi Е1 будет обеспечиваться связыванием типа поли-dA—dT. ДНК из E.coli ^гидродинамическое дробление (или ультразвук) фрагменты ДНК 5'— рестриктаза фага X дополнительная специфическая фрагментация dA терминальная трансфераза, <1АТф ~| ДНК,пригодная для включе- ния вплазмидный вектор, например, Coli Е1 Разрезание ДНК на фрагменты. Любая нативная ДНК может быть "измельчена" с помощью ферментов эндонуклеаз, среди которых особое место занимает рестриктазы (рестрикционные эндонуклеазы). Биологическая роль их, например, в клетках про- кариот заключается в гидролизе чужеродной ДНК, проникающей в клетки извне. Собст- венная хромосомная ДНК при этом остается незатронутой рестрик- тазами, что обусловле- но наличием фермен- тов, называемых моди- фикационными мети- лазами, узнающими одинаковые с рестрик- тазами сайты. Назван- ии— СН—(СН2)2- соон SAM ные метилазы катализируют реакции метилирования А или Ц в немногих специфических сайтах в хромосомах, в результате чего метилированная ДНК оказывается нечувствительной к атаке ре- стриктазами. Переносчиком метильных групп выступает S-адено- зил-Б-метионин (SAM). В настоящее время известно свыше 500 рестрикгаз и для многих из них определены узнаваемые последовательности. Значительное число рестриктаз производится в качестве конечных продуктов биотехнологии, например, такими компаниями как Sigma (США), 188
Pharmacia (Швеция), Serva (Германия) и др. Эти ферменты способ- ны узнавать специфические места (с а й т ы) и расщеплять нуклеотидные последовательности в ДНК, индуцируя формирова- ние тупых или липких концов. Рестриктазы вначале подразделяли на 3 группы в зависимости от длины узнаваемой последовательности: I — узнают тетрануклеотиды, например Alu I из Arthrobacter luteus, II — узнают пентануклеотиды, например Есо RII из Е. coli, III — узнают гексануклеотиды, например Есо RI из Е. coli; Alu I катализирует расщепление последовательности А^Д^Ц'Г с образованием тупых концов во фрагменте ДНК, EcoRII и EcoRl расщепляют последовательности^^- ЦЦ(А/Т) ГГ и -ААТТЦ соответственно с образованием липких концов во фрагментах ДНК. В настоящее время рестриктазы подразделяют на три класса с учетом RMS-системы, в которой RMS — белки рестрикции, мети- лирования (модификации) и посадки соответственно. К первому из них относят те рестриктазы, которые расщепляют ДНК в произвольных точках с образованием различных фрагментов ДНК (для обеих нитей ДНК известны системы R2M2S); ко второму классу (их известно около 500) относят ферменты, для которых сайты рестрикции и посадки совпадают — RS и MS. Образующиеся при этом фрагменты (рестрикты) воспроизводятся по длине. Рестриктазы этого класса, объединяющие рестриктазы вышеука- занных трех групп, преимущественно используются на практике. Рестриктазы III класса (например из фага Р1, системы 2R MS) объединяют все прочие рестрикционные эндонуклеазы. Отдель- ные из них, например, не узнают сайтов посадки. Их редко используют на практике. По предложению X. Смита и Д. Натанса (1973) номенклатура рестриктаз строится по следующему принципу: название фер- мента складывается из букв и цифр: первая буква принадлежит родовому названию источника рестриктазы, две другие буквы относятся к названию вида источника; в некоторых случаях дополнительно указы- вают штамм или серовар; далее следуют 66. взаимодействие Есо обозначения RM-системы (не всегда) и ну- ri с днк: а — вид сверху, б мерация фермента (таблица 20). — вид сбоку. Из таблицы видно, что число узнаваемых рестриктазами нук- леотидных последовательностей варьирует от 4 до 13 (преимуще- ственно 4—6). На рис. 66 показано взаимодействие Есо RI с ДНК. 189
В зависимости от источника ДНК число расщепляющихся сайтов в ней будет неодинаковым. Например, действию рестрик- ционных эндонуклеаз подвергаются ДНК фага X (инфицирует Е. coli К — 12), аденовируса 2 и вируса SV — 40; в этом случае число расщепляющихся сайтов соответственно будет следующим: для Alul - более 50, более 50, 32; для BamHI — 5,3,1; для Ball — 15,17,0; для Hind III — 6, И, 6; для Mbo I — 50,50,6 и т. д. Т а б л и ц а 20. Характеристика некоторых рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз) Наименование фермента Источник получения Сайт узнавания в последовательности ДНК Aatll Acetobacter aceti 5х - ГАЦГТ/Ц - 3х Асе I Acinetobacter calcoaceticus 5Х - ГТ/(А, Ц) (Г, Т) - АЦ - 3х Alu I Arthrobacter luteus 5х - АГ/ЦТ - 3х Ava I Anabaena variabilis 5х - Ц/РуЦГРиГ - 3х Ava II — ” — " — 5х - Г/Г(А, Т) ЦЦ - 3х Bal I Brevibacterium albidum 5х - ТГГ/ЦЦА - 3х Bam HI Вас. amyloliquefaciens H 5х - Г/ГАТЦЦ - 3х Ban II Вас. aneurinolyticus 5х - ГРиГЦРу/Ц - 3х Bel I Вас. caldolyticus 5х - Т/ГАТЦА - 3х Bgl I Вас. globigii 5х - rL(L[NNNN/Nrn_( - 3х Bgl II _ " — " — 5х - А/ГАТЦТ - 3х | BstEII Вас. stearothermophilus ET 5х - Г/ГПЧАЦЦ - 3х Cla I Caryophanon latum L 5х - АТ/ЦГАТ - 3х Dpn I (должно быть согласно принятой номенклатуры Spn I) Diplococcus pneumoniae (Streptococcus pneumoniae) 5х - ГМА/ТЦ - 3х Dral Deinococcus radiophilus 5х - ТТТ/ААА - 3х Eco RI (рекомбинант) E. coli, несущая плазмиду гиперпродукции Eco RI 5х - Г/ААТТЦ - 3х Eco RI E. coli RYI3 5х - Г/ААТТЦ - 3х Eco RV E. coli 5х - ГАТ/АТЦ - 3х ! 190
Продолжение табл. 20 Наименование фермента Источник получения Сайт узнавания в последовательности ДНК Fsp I Fischerella species 5Z - ТПД/ГЦА - 3Z Нае II Haemophilus aegyptius 5Z - РиГЦГЦ/Ру - 3Z Нае III И 11 5Z - ГГ/ЦЦ - 3Z Hhal — ” — haemolyticus 5Z - ГЦГ/Ц - 3Z Hine II — “ — influenzae Rc 5Z - ГТРу/РиАЦ - 3Z Hind III Из штамма E. coli, несущего плазмиду гиперчувствительности Hind III 5Z - А/АГЦТТ - 3Z Hinf I Haemophilus influenzae серовар f 5Z - Г/АМТЦ - 3Z Hpa I Haemophilus parain fluenzae 5Z - ГТТ/ААЦ - 3Z Hpall 5Z - Ц/ЦГТ - 3Z Kpn I Klebsiella pneumoniae 5Z - ГТТАЦ/Ц - 3Z Mbo I Moraxella bovis 5Z - N/ГАЦТ - 3Z Mbo II •• n 5Z - ГААГА (N)8/ - 3Z Mln I Micrococcus luteus 5Z - А/ЦГЦГТ - 3Z Msp I Moraxella species 5Z - Ц/ЦГГ - 3Z Neo I Nocardia carollina 5Z - Ц/ЦАТГГ - 3Z Nde I Neisseria denitrificans 5Z - ЦА/ТАТГ - 3Z Pst I E. coli, несущая плазмиду гиперпродукции Pst I 5Z - ЦТГЦА/Г - 3Z Pst I Providencia stuartii 5Z - ЦТГЦА/Г - 3Z Pvu I Proteus vulgaris 5Z - ЦГАТ/ЦГ - 3Z Pvu II 11 II 5Z - ЦАГ/ЦТГ - 3Z Sma I Serratia marcescens Sb 5Z - ЦЦЦ/ГТГ - 3Z Xbal Xanthomonas bardii 5Z - Т/ЦТАГА - 3Z Примечание: 1) в скобках указаны альтернативные нуклеотиды. 2) Ри.Ру — любое пуриновое, пиримидиновое основание, 3) N — любой нуклеотид, 4) Гм — метилированный гуанин, 5) (N)e — нуклеотид, повторяющийся 8 раз. 191
Расщепление сайтов может происходить симметрично (см. Alu I, Bal I, Dpn I и др.) с образованием тупых концов в ДНК и асимметрично (Aat II, Асе I, Ava I, II, Bam HI и др.) с образованием липкихконцов: Hine II —ЦТАГГЦАГЦТГ Г АЦГТ— - Г АТЦЦ Г ТЦ Г АЦЦ Т Г ЦА— Hinc II ДНК -ЦТАГГЦАГ ЦТГГАЦГТ— • •••• • рГАТЦЦГТЦ, ,ГАЦЦТГЦА- । фрагменты ДНК с тупыми концами Hind III / - ГТЦГТААГЦТТЦЦГТ Г — - ЦАГЦАТТЦГ^АГГЦАЦ- Hind III ДНК - ГТЦГТА АГЦТТЦЦГТГ- |-ЦАГЦАТТЦГА ! । АГГЦАЦ- фрагменты ДНК с липкими концами Рестриктазы расщепляют ДНК примерно через 250 нуклеоти- дов, исходя из формулы 4П (4 — нуклеотиды — А, Г, Т, Ц; п — число повторов сайтов в ДНК). Фрагменты ДНК, полученные тем или иным методом, разделя- ют с помощью электрофореза в гелях (агарозном, полиакриламид- ном — ПААТ), из которых их экстрагируют, вырезая соответству- ющие участки геля; эти участки геля, например агарозного, рас- плавляют в пробирках при 68°С и ДНК экстрагируют фенолом, затем концентрируют изобутанолом, переосаждают этанолом и проводят анализ выделенных и очищенных фрагментов. При не- 192
обходимости можно дополнительно провести препаративный гель- электрофорез. Из 160 мкг ДНК нематоды Caenorabiditis elegans удается получать 2-4 мкг какого-либо одного фрагмента. Рестрикты (особенно — с липкими концами) могут быть сшиты с помощью ДНК-лигаз. При необходимости липкие концы отжи- гают (отжиг—это специфическая реассоциация комплементарных цепей с образованием двухцепочечных молекул): -••5-Т ------> Ц - Т • А • Г • А - 3’- + • • -З’-А • Г А Т • Ц Т - 5‘- > ... 5'-т * ц. т А Г А - 3'- З'-А — Г• А-Т• Ц Т —5'- Т реассоциант с пробелами между Т и Ц в обеих нитях ДНК В пробелах между нуклеотидами отсутствуют фосфодиэфир- ные связи, которые могут быть воссозданы с помощью ферментов лигаз, катализирующих реакции синтеза за счет З^гидроксильной и 5/-фосфатной групп 7 т. 8524 193
Таким путем восстанавливаются ковалентные связи в пробелах: • ’' 5х—Т—Ц—Т—А—Г—А—3х • • • II III IIII III II • • ’3х—А—Г—А—Т—Ц—Т—5х' • • Для сшивания фрагментов ДНК используют также линке- ры и адаптеры. Линкер (от англ, link — соединять) — это синтетический, короткий двухцепочечный олигонуклеотид, содер- жащий сайты узнавания для ряда рестриктаз; он может быть присоединен к концам фрагмента ДНК, полученного с помощью какой-либо рестриктазы, в процессе реконструирования рДНК. Например, линкер Есо RI представляет собой ds (ГГААТТЦЦ)3. Адаптер — это линкер, содержащий больше, чем один сайт узнавания рестриктазой, и обеспечивающий получение фрагмен- тов от действия одной рестрикционной эндонуклеазы для включе- ния в сайт другой рестриктазы, то есть адаптер предназначен для объединения фрагментов с несовместимыми концами. Пример адаптера Есо RI к Sma I: (ААТТЦЦЦГГГ). Тупые концы ДНК, образованные после рестрикции, могут относительно легко сши- ваться под действием ДНК-лигазы фага Т4. Метод клонирования широко используют для выделения инди- видуальных генов прямо из генетического материала, располагая при этом высокоспецифичными радиоактивными РНК- и ДНК-зон- дами. Эти последние взаимодействуют только с определенными последовательностями и гибриды их с генами регистрируются радиоавтографией на рентгеновских пленках. Пример анализа по Саузерну (по англ, southern-blotting — промокание по Саузерну) показан на рис. 67. Аналогичный подход применим и для анализа РНК (метод Нозерн* -блотинга). В генетической инженерии следует различать копийную ДНК (кДНК), являющуюся копией мРНК, и векторы, несущие клоны геномной или хромосомной ДНК. При клонировании всего генома ("шотган-эксперимент", от англ, shotgun — дробовик) его разделяют с помощью рестриктазы, узнающей короткую (4 пн) последовательность нуклеотидов. Раз- рушение проводят в таких условиях, чтобы осуществлялась час- * — Здесь использована игра слов Southern и Northern, то есть южный и север- ный, хотя в первом из них отражена фамилия ученого. 194
Рис. 67. Схема выделения фраг- ментов ДНК из смеси рестриктов ДНК по Саузерну: 1 — расщепление геномной ДНК на случайные фраг- менты с помощью рестриктазы (Р), 2 — электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле, 3 — недифференци- рованное пятно ДНК, 4 — тепловая денатурация ДНК с образованием од- ноцепочечных фрагментов и nepei юс их на нитроцеллюлозный фильтр для фиксации (blotting), 5 — гибридиза- ция с радиоактивным зондом, 6 — ] 6 гибридные последовательности, вы- явленные с помощью радиоавтогра- фии, 7 — выделение фрагментов из агарозного геля для исследования. тичная рестрикция ДНК. Образующиеся при этом фрагменты будут разной длины, но каждый из них заканчивается одной и той же последовательностью. Наличие во фрагменте липкого конца делает его удобным для клонирования. Разделенные фрагменты всего генома встраивают затем в клонирующий вектор с образо- ванием набора химер, который может храниться в течение неог- раниченного времени. Такой набор клонированных фрагментов ДНК называют библиотекой генома. С помощью нового (оригинального) зонда библиотека может быть сразу же использо- вана для поиска специфического фрагмента. Включение фрагмента чужеродной ДНК в векторную плазмиду На латинском языке vector значит везущий, несущий; в мате- матике вектор — это прямолинейный отрезок, которому придано определенное направление. Понятие "вектор” в молекулярной биологии объединяет сущность данных выше двух определений и название "Вектор для клонирования" введено М. Томасом в 1974 г. для ДНК, способной переносить в клетку — реципиент чужерод- ную ДНК любого происхождения. Вектор — самый важный ком- понент процесса клонирования. Он должен удовлетворять следу- ющим требованиям: 1) относительная легкость накопления и вы- деления его в достаточном количестве, 2) он должен содержать генетические маркеры для отбора последующих трансформантов, 3) наличие в векторных ДНК нескольких сайтов узнавания различными рестриктазами в целях получения для клонирования серии разных молекул ДНК. 195
Следовательно, векторы — это молекулы ДНК, обеспечиваю- щие амплификацию фрагмента (образование дополнительных ко- пий его) в растущей популяции клеток соответствующего вида организма. Для клонирования ДНК например в клетках Е. coli можно использовать два класса векторов — плазмиды и фаги. Из числа ДНК-плазмид для практических целей рекомендованы и имеются на рынке следующие: Col EI из Е. coli штамм С600, Col EI Amp из Е. coli штамм KR245, резистентный к антибиотику ампициллину; pBR322 из Е. coli штамм RRI, резистентный к ампициллину и тетрациклину; pBR325 из Е. coli штамм НВ101, резистентный к ампициллину, тетрациклину и хлорамфениколу (левомицетину); pUC-плазмиды (pUC8, pUC9, pUC18, pUC19) из E coli штамм RRI, резистентный к ампициллину и дефектный по Р-галактозидазе; pUBl 10 из Вас. subtilis штамм BD170, резистентный к канамицину; рУАС-клонирующие векторы, впервые предложенные в 1987 г. (Д. Т. Бурке, Ф. Г. Карл, М. В. Олсон) — рУАСЗ, рУАС4, рУАС5. Они представляют собой дрожжевую (от англ, yeast), искусственную (А, от англ, artificial) хромосомную (С, от англ, chromosome) кло- нирующую систему для клонирования больших (50-100 кЬ в длину) фрагментов ДНК; Ti-плазмиды (от англ. Tumor inducing — вызы- вающие опухоль) из Agrobacterim tumefaciens (pTi — В6-806) штамм А277, утилизирующий октопин, и pTi — С58 из A. tumefaciens штамм С58, утилизирующий нопалин. h2n-c=nh I NH-(CH2) -СН-СООН NH-CH-COOH I сн3 октопин (синтезируется из аргинина и пирувата) HOOC-CH-NH-CH-COOH I I (сн2)2 (сн2)3 I I СООН NH I nh2-c=nh нопалин 1 196
Октопин и нопалин, равно как и атропин, относятся к группе о к с / \ H2N-CO-(CH2)2-CH о NH СН-(СНОН) -сн,он \ / i 1 агропин опинов — низкомолекулярных веществ, синтезируемых клетками злокачественной опухоли двудольных растений — ко- рончатого галла. В этой связи различают опухолевые клетки агропинного, нопалинового и октопинового типов. Из бактериофагов используют ДНК-содержащие колифаги Т2, Т4, Т5, Т7, фаги X, М13тр8, М13тр9, М13тр18, М13тр19, фХ174; из ДНК вирусов — SV40 и аденовирус 2. Векторные системы можно конструировать из ДНК, несущих маркер(-ы), с последующим включением их, например, в клетки эукариот, в том числе — млекопитающих. В качестве иллюстраций векторных систем приводим рис. 68а, на котором изображены плазмиды Col El, pBR322, вирус SV40 и челночный вектор. Вирусы растений — как векторы обычно мало пригодны из-за своей патогенности для растительных организмов и неспособности встраиваться в хромосомы хозяйской эукариотической клетки. В настоящее время наметились подходы к изучению и оценке трех векторных систем: двухцепочечной ДНК вируса мозаики цветной капусты, одноцепочечной РНК вируса погремковости табака, од- ноцепочечной ДНК вируса золотистой мозаики фасоли. Из них лишь первая оставляет надежды на дальнейшее продвижение этой системы в сторону практической реализации пока в лабораторных условиях. Не исключается возможность объединения ДНК вируса мозаики цветной капусты с Т-ДНК Ti-плазмиды из Agrobacterium и расширить круг растений — реципиентов такой векторной системы. Дж. Коллинс и Б. Хон в 1978 г. впервые ввели в практику так называемый космидный вектор, или cos-вектор, То есть комбини- рованную векторную систему "плазмида-ДНК фага лямбда". Дан- ный вектор способен акцептировать до 40-50 тыс. пн. При этом совмещаются плазмидные репликаторы и cos-сайты фага X в одном 197
геноме. Космидам присущи свойства фагов и плазмид, то есть способности упаковывать свою ДНК в головке фагов и автономно реплицироваться. Свойства фагов и плазмид объединяют в себе ф а з м и д ы, к которым можно отнести и космиды. Включение фрагмента чужеродной ДНК в вектор осуществля- ют по следующей схеме (рис. 686). Многие плазмиды несут транс- позоны. Рис. 68а, б. а — плазмиды: I — Col El; II — pBR322; III — вирус SV40; IV — челночный вектор для кишечной палочки и клеток обезьяны (1 — ori-сайт SV40; 2 — промотор SV40; 3 — вероятная сигнальная последовательность; 4 — последова- тельность, кодирующая гамма-интерферон; 5 — фрагмент кДНК; 6 — оп-сайт pBR322, 7 — ген устойчивости к ампициллину; б — включение чужеродной ДНК в плазмидный вектор (схема): 1 — вектор, 2 — ген, 3 — рестрикты, образовавшиеся под влиянием рестриктазы Есо RI, 4-гиб- ридная (химерная) ДНК, Л-ДНК-лигаза. Клонирование рДНК Для клонирования рДНК используют так называемые пермиссивные клетки (от англ, permission — разрешение). Клон — это большое число молекул или клеток, идентичных 198
’ж исходной родительской молекуле или клетке. К числу пермиссив- ных клеток для включения в них рДНК относятся такие, в которых: 1) не разрушаются чужеродные ДНК или РНК собственными ферментами — нуклеазами, 2) срабатывает механизм репликации вектора, 3) проявляется выраженная активность промотора и/или тер- минатора транскрипции рДНК, 4) отмечается полный сплайсинг мРНК, 5) наблюдается эффективная трансляция мРНК, 6) нет выраженной активности пептидогидролаз, катализиру- ющих реакции гидролиза экспрессируемых чужеродных белков. Излюбленными объектами в генной инженерии являются клет- ки Е. coli, Вас. subtilis, Saccharomyces cerevisiae и некоторые другие. Е. coli — грамотрицательные, перитрихальные, прямые палочки (1,1-1,5x2,0-6 мкм — живые, или 0,4-0,7x1,0-3,0 мкм — высушенные и окрашенные); факультативный анаэроб, хорошо растет на про- стых питательных средах при 37°С, содержание Г+Ц в ДНК 50-51 мол% (по температуре плавления и плавучей плотности). Некото- рые серовары Е. coli патогенны для человека (01, 02, 06, 08, 09, 011, 015, 026, 055, 078, 0111, 0124, 0144, 0148 и др.). Е. coli чувствительна к включению векторов. Вас. subtilis — почвенные, спорообразующие, грамположитель- ные, непатогенные, прямые, перитрихальные палочки (0,7-0,8 х 2,0-3,0 мкм), хорошо растет на простых питательных средах при разных температурах (минимальная 5-20’С, максимальная 45-55°С), содержание Г+Ц в ДНК от 32 до 62 мол%; обладает высокой частотой трансформации (4%), с кольцевой хромосомой, на которой известно более 2000 локусов; содержит сайт-специфические нук- леазы, чувствительна к включению векторов. Saccharomyces cerevisiae — аскомицетные, одноклеточные, сап- рофитные дрожжи (группа низших грибов), широко используемые в микробной биотехнологии для получения разных биологически активных веществ (БАВ). Вегетативные клетки этого вида однокле- точные, почкующиеся, круглые или, чаще, овальные, размером 2,5-11x2,5-30 мкм, хорошо растут на средах Сабуро, с пивным неохмеленным суслом и других при температуре 26°С; содержание Г+Ц в ядерной ДНК колеблется в средних пределах от 48 до 63 мол%; в отличие от бактерий они генетически более стабильны, не подвергаются фаголизису, способны гликозилировать собствен- ные белки (продуцируемые эукариотическими клетками белки, как 199
правило, функционально активны в форме гликопротеинов), их геном лишен оперонов, обладают тремя классами РНК-полимераз, и т.д. Другими словами — сахаромицетные дрожжи являются типичными эукариотами, поэтому в них лучше клонировать гены растений и животных. У S. cerevisiae имеется 17 хромосом, на которых картировано свыше 600 генов. Для клонирования чуже- родных ДНК в дрожжевых клетках нередко используют челночные векторы, имеющие ori-сайты бактериальных и дрожжевых плаз- мид, а поэтому способные самостоятельно реплицироваться в бактериальных и дрожжевых клетках. На рис. 68 схематично изображен челночный вектор иммунного интерферона (INF-y), который реплицируется в клетках обезьяны и Е. coli. В этом векторе содержится фрагмент из 342 пн, который включает ori-сайт и промотор из вируса SV-40; данный фрагмент связан с фрагментом кДНК, включающим кодирующую последовательность npe-INF-y, и с фрагментом pBR322, содержащим ген резистентности к ампи- циллину и ori-сайт репликации pBR322. У дрожжей выявлены 3 вида циклически замкнутых плазмид: двух- и трехмикронная, митохондриальная (длина 24 мкм) ДНК. Первые две относятся к разряду "эгоистических" критических, поскольку биологическое значение их остается скрытым, неясным. Лишенные селективных маркеров они представляют ценность в качестве векторов только после включения в них соответствующих хромосомных генов дрожжей, функционирующих как в дрожже- вых, так и в бактериальных (Е. coli) клетках. К таким генам относятся те из них, которые отвечают за биосинтез таких фер- ментных белков, как аргининсукцинатлиаза, аспартат-транскарба- милаза, галактокиназа, дигидрооротатдегидрогеназа, триптофан- синтаза и др. Известно 5 типов дрожжевых векторов, образующих У-группу (от англ. Yeasts — дрожжи): Yip, YEp, YRp, YCp, YLp. Первые из них (Yip) представляют собой интегративные плазмиды, в которых только один ген принадлежит дрожжевой ДНК, остальные гены относятся к бактериальным. Yip не способны реплицироваться в клетках S. cerevisiae, но осуществляют их трансформацию, интег- рируясь в хромосому через рекомбинацию. Векторы YEp — эписомальные плазмиды, сконструированные на основе двухмикронной плазмиды. Частота трансформации S. cerevisiae этими векторами на три порядка выше, чем в случае использования Yip, но, к сожалению, получаемые трансформанты мало стабильны. 200
Векторы YRp — репликативные плазмиды, включающие хро- мосомные репликаторные последовательности, именуемые ars-no- следовательностями (от англ, autonomously replicating sequence — автономно реплицирующаяся последовательность). Трансформан- ты дрожжей, получаемые с помощью YRp, нестабильны. Векторы YCp в виде кольцевых мини-хромосом содержат цен- тромеры дрожжевых хромосом и репликаторы arsl и ars 2. Они стабильны при митозе и мейозе, и наиболее перспективны для клонирования генов. Векторы YLp — линейные мини-хромосомы, конструируемые на базе YCp. Для этого вводят специфические, шпилечные по форме, нуклеотидные последовательности на концах хромосом (теломеры) в кольцевые плазмиды YCp с последующей линеариза- цией плазмид. Плазмиды и фаги обеспечивают перенос чужеродной ДНК в качестве инертной части генома, поэтому их называют еще кло- нирующими векторами. В биологической технологии выгодны мультикопийные плазмиды (10-20 на клетку). Если же плазмиды находятся под ослабленным контролем репликации, когда прекращается размножение бактерий, то они (плазмиды) накапливаются числом до 1000 на клетку — в результате больше образуется целевого продукта. В отличие от хромосомы репликация плазмиды в пермиссивной клетке может происходить при останов- ке синтеза белка, Вот почему, например, при добавлении левоми- цетина к культуральной жидкости сопровождается заметным воз- растанием числа копий плазмиды (увеличение степени клониро- вания). Для включения рДНК в пермиссивные клетки пользуются различными методами: трансформации, инфекции, микроинъек- ций. При естественной трансформации рДНК может проходить через интактную клеточную стенку Вас. subtilis, Streptococcus pneumoniae, некоторых штаммов Е. coli с ингибированной систе- мой деградации ДНК, и др. В 1970 г. М. Мандель и А. Хига предложили метод обработки бактерий хлористым кальцием на холоду в целях трансформации ДНК фага в клетки Е. coli. Этот метод используется и теперь. Этапы его примерно следующие: 1) выращивание культуры в питательной среде при оптималь- ной температуре в течение суток с последующим разведением примерно в 50 раз свежим питательным бульоном, выращиванием 201
до Абоо=О,2 (показатель плотности) и охлаждение во льду; 2) центрифугирование суспензии при 3000 g 10 мин, темпера- туре 4°С и разведение осадка клеток в 0,1 М CaCh, охлажденного во льду, с последующим центрифугированием при тех же условиях; 3) ресуспендирование осадка в минимальном количестве (на- пример, в 1 мл) охлажденного во льду 0,1 М растворе CaCh, хранение до использования при 4°С. Это и будут пермессивные компетентные клетки, готовые претерпевать трансформацию; если такие клетки, ресуспендированные в 0,1 М CaCh, 30% глицерине заморозить при -70°С, то их можно хранить в течение нескольких месяцев; 4) добавление плазмидной ДНК к компетентным клеткам (при- мерно 0,1 мкг ДНК в 0,2 мл суспензии клеток), выдерживание во льду 1 час; 5) тепловой шок смеси при 42° С 5 мин.; .6) разбавление пробы в 10 раз питательным бульоном, инкуба- ция 1 час на качалке при 37°С; за это время, например, признак резистентности к какому-либо антибиотику успевает экспресси- роваться; 7) посев клеток в серии разведений на чашки Петри с пита- тельным агаром, содержащим соответствующий(-ие) антиби- отик (-и), выдерживание в течение суток при оптимальной темпе- ратуре; 8) изоляция нужной колонии и размножение клона. рДНК можно ввести в клетки млекопитающих путем слияния протопластов, например Е. coli, содержащих рДНК, с культивиру- емыми эукариотическими клетками в присутствии полиэтиленгли- коля, или ПЭГ, способствующего слиянию протопластов. Перенос рДНК в клетки прокариот или введение последова- тельностей клонированной ДНК в рецепторные эукариотические клетки (например, млекопитающих) с помощью фаговых векторов называют трансфекцией. Альтернативный метод — использование вирусов эукариот, то есть когда эукариотическая клетка инфицируется — (заражается) вирусом. В качестве векторов при этом чаще используют литические вирусы типа вируса полиомы и SV40, а также челночные векторы, сконструи- рованные на основе ретровирусов и папилломавирусов. На растительных объектах можно выполнить генно-инженер- ные эксперименты, используя методы трансформации и инфици- рования (см. рис. 141). 202
Метод микроинъекцйи используют в случаях механического введения ДНК (в том числе рДНК) в ядра культивируемых клеток млекопитающих, растений, используя для этого стеклянные мик- роиглы (рис 69). Этот метод впервые продемонстрировали Дж. Е. Мерц и Дж. Б. Гердон в 1977 г. на ооцитах лягушек Xenopus. Рис. 69. Микроинъекция в ядро ( чЯездЦ) 4 ооцита (1 — ооцит, 2 — пигментиро- \ ванная половина, 3 — микропипет- \ ка, — ядро ооцита, 5 — часть _____ х5 нейлоновой сетки для чашки Петри). рДНК можно переносить в пермиссивные компетентные клет- ки с помощью липосом, приготавливаемых из смеси фосфатидил- серина и холестерина (1:1). Например, удается ввести ген Р-лакта- мазы из плазмиды pBR322 в отрицательно заряженные липосомы при обработке их ультразвуком. Последующая инкубация "озву- ченных" липосом с клетками различных культур сопровождается приобретением р-лактамазной активности у этих клеток. На плот- ной питательной среде клетки, несущие рДНК, размножаются и огромное потомство их (при этом все клетки тождественны) назы- ваются клоном. Сумму всех клонов, в которую входят почти все кДНК, соответствующие множеству разных мРНК, образуемых клеткой, называют "библиотекой кДНК". Амплификация и экспрессия генов Амплификация — это образование дополнительных копий хромосомных последовательностей. Обычно в биотехнологии при- меняют малые плазмиды длиной около 3 мкм в разомкнутом состоянии. Такие плазмиды не передаются при конъюгации, например, прокариотических клеток. Эти плазмиды называют нетрансмиссибельными. Однако они могут быть переданы методом трансформации. В результате амплификации на одну клетку нередко приходится 10-30 копий нетрансмиссибель- ных плазмид, что существенно повышает клеточную продуктив- ность применительно к целевому продукту (белку). Схематично амплификация представлена на рис. 70. 203
Рис. 70. Амплификация нетрансмиссибельной плазмиды в реципиентной про- кариотической клетке (схема): 1 — клетка-донор (а — нуклеотид, б — нетрансмис- сибельная плазмида), 2 — клетка-реципиент, 3 — лизис, 4 — обработка раствором кальция хлорида на холоду (или протопластирование, голодание, обработка ионами лития), 5 — клетка реципиент с “разрыхленной” клеточной стенкой, 6 - трансформация, 7 - клетка-реципиент с переконструированной клеточной стенкой, содержащая плазмиду, 8 - реконструкция клеточной стенки, 9 - клетка-реципиент с реконструированной клеточной стенкой, содержащая плазмиду, 10 - амплифи- кация плазмиды, 11 - плазмиды (25), образовавшиеся в реципиентной клетке в результате амплификации. Множественные (аплифицированные в миллион раз) копии определенных фрагментов ДНК получают in vitro с помощью широко используемой в настоящее время полимеразной цепной реакции, или ПЦР. Ее впервые описали в 1985 г. Р. К. Сейки, С. Шарф, Ф. Фалуна, К. Б. Муллис, Г. Т. Хорн, X. А. Эрлих и Н. Арнхейм. ПЦР высоко специфична и чувствительна, с ее помощью можно обнаружить, размножить и исследовать даже единичную копию гена в исходном материале. В течение трех часов обычно протекает 30 циклов, амплификации. Для постановки ПЦР необходимо знать последовательность как минимум 17 пн с обеих сторон исследуемого фрагмента ДНК. Обычно синтезируют два дезоксинуклеотида длиной 20-30 основа- ний, представляющие собой концевые последовательности инте- ресующего нас фрагмента ДНК. Используя комплементарные к этим участкам олигомеры — праймеры, запускают амплификацию. Избыточные количества праймеров смешивают с геномной ДНК, а затем последовательно осуществляют реакции денатурации, от- жига (реассоциации) и наращивания цепи (удлинение праймера). Тепловая денатурация сопровождается расплетением двойной спи- рали ДНК. При снижении температуры имеет место отжиг олиго- нуклеотидов, то есть происходит гибридизация олигонуклеотидных праймеров со своими комплементарными последовательностями. Наращивание цепи праймеров катализируется ДНК-полимеразой
в присутствии дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, и в результате достраивается новая комплементарная цепь ДНК. При повторных циклах тепловой денатурации, отжига и синтеза образовавшиеся новые нити ДНК выступают в качестве шаблонов (матриц) для праймеров, что вызывает экспоненциальное нараста- ние участка ДНК, ограниченного праймерами, входящими в состав этих фрагментов. К завершению 20-30 циклов амплификации фрагменты ДНК представлены с избытком в сравнении с остальной геномной ДНК со свободными концами и образовавшейся в первом цикле ампли- фикации (рис. 71-1). Практически эффективность каждого цикла амплификации составляет 20-50% от теоретически возможной (2го > 106при 100%-й эффективности). Следовательно, можно получить возрастание ко- личества специфической последовательности кратное миллиону. В случаях амплификации геномной ДНК из клеток (тканей) позвоночных животных иногда происходит накопление фрагмен- тов неясного происхождения. Тогда проводят серию дополнитель- ных амплификаций, применяя другой набор олигонуклеотидных праймеров — "nested primers” (от англ, nest — гнездо, гнездиться, primer — начальный, основной). В этой связи и метод называют nested oligo" (от греч. oligos — малый). В данном методе продукт первичной ПЦР используется в качестве матрицы в последующих циклах ПЦР, но уже с двумя другими олигонуклеотидами, имею- щими гомологии с участками ДНК внутри первичного амплифи- цированного фрагмента. При этом получается множество укоро- ченных (по сравнению с исходным) фрагментов индивидуальной последовательности ДНК, которые затйэм подвергаются необходи- мому анализу. Таким образом, под названием ПЦР понимают основной цикл денатурации, отжига и синтеза фрагментов ДНК в присутствии ДНК-полимеразы, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и прайме- ров. Процесс по существу является цепным, так как продукты данной реакции служат матрицей для последующих реакций. На первых этапах использовали в ПЦР так называемые "кле- новские фрагменты" ДНК-полимеразы I Е. coli (названы по фами- лии ученого — X. Кленова), которые оказались термолабильными, и после каждого цикла денатурации необходимо было добавлять новую порцию фермента. Кроме того, при пониженной темпера- туре отжига снижалась специфичность амплификации. С выделением термостабильных ДНК-полимераз, в частности, из бактерий Thermos aquaticus (Тад-полимераза)и Pyrococcus 205
t=j 1=1 = а | Цикл 1 Цикл 2 Циклы 3-25 □ = 6 DDDDDD = в □ODDDOD [> = г ГГНУ1ЧП ммм^м2 <-2 в 30 (0,5 рМ) O.SpMDS ДНК 1 ааммавма 5-10 РМ SS ДНК Рис. 71. Схема полимеразной цепной реакции (ПЦР): I — в классическом исполнении (а—ДНК-мишень, б — праймер в ПЦР. в — новая ДНК, г — направление амплификации, дс — денатурация и синтез); II — заякоренная ПЦР (1 — мРНК. 2 — синтез кДНК, 3 — наращивание полидезоксигуанозинового конца, 4 — приго- товление заякоренного полидезоксицитидинового праймера и синтез второй нити ДНК, 5 —добавление специфического праймера, амплификация при использовании обоих праймеров, 6 — концевой праймер, 7,8 — якорный праймер); III — инверти- рованная ПЦР (1 — кор с известной нуклеотидной последовательностью, 2 — место действия рестриктазы, 3 — "переваривание", 4 — циклизация, 5 — рестрикция в пределах кора, , 6 — добавление праймеров, дезоксинуклеозидтрифосфатов и Taq-полимеразы, 7 — амплифицированная область, фланкирующая кор); IV — асимметричная ПЦР (А — праймер в избытке, 50 пикмолей -рМ; В — лимитирован- ный праймер — 0,5 рМ; ц — циклы, ds — двухнитевая ДНК, ss — однонитевая ДНК). woesii (Pwo-ДНК-полимераза), существенно возросла эффектив- ность ПЦР. Taq-полимераза сохраняет активность после тепловой денатурации ДНК и не возникает необходимости заменять фер- 206
мент после каждого цикла. Температурный оптимум реакции составляет 70-75’С, что значительно повышает специфичность, количественный выход и возможную длину копий амплифициру- ющихся фрагментов ДНК. На рис. 71-1 полностью показаны лишь два первых цикла. Начиная с третьего цикла, не отражена судьба исходной ДНК и продуктов достройки, синтезированных на ее цепях. Длинные ! фрагменты, синтезируемые на исходной цепи, накапливаются в / арифметической прогрессии, тогда как короткие фрагменты, ог- раниченные на концах праймерами и впервые появляющиеся в X конце третьего цикла амплификации, накапливаются в геометри- ! ческой прогрессии. Недостатки ПЦР: возможное загрязнение при взятии образцов ! материала для анализа, для каждой пары праймеров требуются индивидуальные условия реакции, ПЦР опирается только на точ- ную информацию о секвенировании последовательностей. Однако преимущества ПЦР несомненны и практические воз- можности ее огромны. Затравочным материалом для ПЦР можно использовать мРНК. Тогда с помощью обратной транскриптазы ; f синтезируют кДНК, которую затем используют в качестве матрицы [ для амплификации. В случае применения одного известного прай- } мера, второй праймер будет искусственным, представляющим собой якорную последовательность, присоединенную к гомополи- | мерному "хвосту". Такой подход называют якорнойПЦР (рис. | 71-П). Известна еще инвертированнаяПЦР, когда пара i праймеров отжигается с известной последовательностью, но ори- I ентируется таким образом, что синтез идет в противоположном направлении через зону с неизвестной последовательностью (рис. 71-Ш). В 1988 г. описана асимметрическаяПЦР, в которой происходит амплификация однонитевой ДНК (рис. 71-IV). р В 1987 г. фирмой Perkin-Elmer Cetus (США) разработана авто- j матизированная приборная техника для ПЦР, которая благотворно сказалась на генетических исследованиях. В 1991 г. этойже фирмой предложена вторая генерация ПЦР-технологии с использованием амплификатора 9600 (Gen Amp PCR System 9600), благодаря кото- рой удалось достичь новых порогов чувствительности и продук- тивности ПЦР (таблица 21). Фирма "Ока" (г. Пущино, Московская область) предлагает собственный оригинальный амплификатор высокого качества, по стоимости более дешевый, чем зарубежные аналоги. 20/
Т а б л и ц а 21. Сравнительные данные ПЦР при использовании автоматизиро- ванных приборов — амплификаторов первого (ДНК-термоцик- лера 480) и второго (Gen Amp PGR System 9600) поколений. ПЦР, мишень t°,°C Скорость цикла (мин.) в: термоциклере 480 генном амплификаторе 9600 единичного полного единичного ПОЛНОГО Фаг X 94 1 4,33 0,1 2,42 68 2 4,33 1,25 2,42 ИЛ1 а 94 1 4,8 0,25 2,05 68 1 4,8 0,25 2,05 ВИЧ-1 95 1 5,0 0,25 2,62 60 2 5,0 1,0 2,62 HLA-DQa 94 1 4,58 0,5 1,92 60 0,5 4,58 0,16 1,92 72 0,5 4,58 0,16 1,92 Функциональная активность генов проявляется в периоды транскрипции и трансляции и называется экспрессией генов. Степень сродства РНК-полимеразы к промотору оперона обусловливает эффективность транскрипции, а стабильность мРНК и ее способность связываться с рибосомами обусловливает эффективность трансляции. Экспрессия прокариотических генов преимущественно зави- сит от выбора промотора в клонируемых генах тех же или близ- кородственных видов. Чем отдаленнее геномы прокариотических клеток друг от друга, тем система "транскрипции-трансляции" генов срабатывает хуже или вообще не срабатывает. Вот почему здесь важными оказались векторы. Экспрессия эукариотических генов в прокариотических клет- ках не реализуется или реализуется с большим трудом. В ядерных генах эукариот имеются интроны, а у бактерий нет системы сплайсинга, поэтому образующиеся чужеродные конечные про- дукты в бактериальных клетках, как правило, неактивны. Однако использование векторных систем (в том числе "челночных") и ПЦР позволило успешно решать проблемы, связанные с созданием рДНК их клонированием и экспрессией в различных реципиент- ных клетках (прокариотических и эукариотических). Экспрессия генов сопровождается, как правило, выработкой белковых молекул. Поэтому важно использовать такие клетки, 208
несущие рДНК, которые секретировали бы белок во внешнюю (культуральную) среду. Если этого не происходит, то для получения целевого продукта приходится разрушать (дезинтегрировать) клет- ки и уже из "экстракта" — дезинтеграта выделять соответствующий белок. Е. coli, выступая на первых порах в качестве монопольной "рабочей лошадки" биотехнологии, оказалась затем менее пригод- ной, чем, например, Вас. subtilis, Р. aeruginosa, S. cerevisiae и другие виды, в отличие от которых Е. coli почти совсем не секретирует белки. Лишь недавно с помощью BRP-векторов удалось преодолеть барьерную функцию оболочки Е. coli и трансформировать ее в секретирующую клетку (от анг. Bacteriocin Release Protein). В настоящее время, на основании экспрессии соответствующих генов в рДНК удалось внедрить в производство штаммы бактерий и дрожжей, продуцирующие инсулин, соматотропин, интерферо- ны, интерлейкины и т. д. Получены штаммы — суперпродуценты некоторых веществ; выведены бактерии, способные очищать ка- менный уголь от серы и превращать его в жидкое и газообразное топливо. Применительно к фитобиотехнологии удалось создать растения повышенной кормовой и питательной ценности, с воз- росшей активностью фотосинтеза и азотофиксации, резистентные к некоторым микробам — фитопатогенам и др. Генно-инженерные разработки в области зообиотехнологии (в частности^ соматотропином, или гормоном роста) оказались важ- ными для животноводства (возрастание привесов животных, лак- тации). Используя метод микроинъекций рДНК в зародышевые клетки млекопитающих (в пронуклеусы оплодотворенных ооцитов, или в яйцеклетки) удается получать так называемых транс- генных животных. Клоны реципиентных клеток, содержащие донорный хромосомный материал, или трансгены, различаются по количеству его в широком диапазоне, и если функциональная активность и регуляция экспрессии клонированных генов изуча- ются на целом организме, то и говорят о трансгенном организме. Схема получения, например, трансгенных мышей введением клонированной ДНК в оплодотворенное одноклеточное яйцо приведена на рис. 72. С получением трансгенных животных открываются перспек- тивы развертывания заманчивых исследований на рубеже XX и XXI вв. Уже сегодня имеется информация о том, что в Эдинбурге (Великобритания) есть стадо овец, несущих гены человека, инду- цирующие выработку факторов свертываемости крови (борьба с гемофилией у человека благодаря, например, использованию в 209
линия C57BL/B6 линия PARKES линия CBA/J спаривание самец гиперовуляция * псевдобеременная реципиентная самка коллекция преимплантированных эмбрионов оплодотворенное одноклеточное яйцо мышь-кормилица выделение и очистка ДНК | микроинъекции | кесарево сечение и вскармливание рождение естественным путем выделение ДНК из тканей хвоста *— анализ выделенной ДНК идентификация трансгенных мышеи скрещивание анализ экспрессии генов Рис. 72 Схема получения трансгенных мышей. 210
пищу овечьего молока, где содержались бы такие факторы); удалось ввести ген гормона роста крупнорогатых животных в геном клеток поросят, заставили расти их быстрее и с меньшим количеством жира. Однако подобные результаты, очевидно, будут сопряжены и с неудачами. Необходимы кропотливые исследования во всех направлениях генетической инженерии, чтобы добиться успехов в практическом воплощении наиболее приемлемых результатов в биологическую технологию. В связи с экспрессией генов большое значение приобретает "белковая инженерия”, дорожку которой проторила генетическая инженерия, первая вытекает из второй и, следовательно, белковая инженерия также является методом науки "Биологическая техно- логия". Целевые установки здесь сводятся к изучению и понима- нию главного звена в структуре ферментов (почему они функци- онируют так, а не иначе?), к возможности научиться видоизменять природные белки или, того больше, уметь их заново проектировать, к выяснению причин и механизмов изменения фенотипа под влиянием генотипа. Природные белки имеют свою молекулярную архитектонику — то это вытянутые, то специфически изогнутые или скрученные структуры. Поэтому в научной литературе, посвященной белковой инженерии, можно встретить выражение "архитектурный дизайн”, кода говорят о конструировании молекул белков с заданной архи- тектурой по заведомо и специально подобранным аминокислотным текстам. Белковая инженерия в любом проявлении будет базиро- ваться в основном на продуктах экспрессии естественных и ре- комбинантных генов. Таким образом, последовательность этапов клонирования и экспрессии гена может протекать в следующей очередности: 1) сортинг хромосом (может быть автоматизированным) и получение ДНК (или только выделение ДНК, например, из прока- риотических клеток); 2) введение ДНК в вектор (плазмидный); 3) трансформация (трансфекция, инфекция, инъекция); 4) обнаружение и накопление клона (клонирование) клеток; 5) выделение рДНК (плазмиды); 6) определение нуклеотидной последовательности в клониро- ванном фрагменте рДНК (может быть автоматизировано); 7) конструирование и построение плазмиды для экспрессии ее функций; 8) трансформация; 211
9) обнаружение и накопление клона; 10) выделение плазмиды; 11) проверка нуклеотидной последовательности в рДНК (может быть автоматизировано); 12) трансформация; 13) выращивание культуры на предмет получения экспресси- руемого белка; 14) выделение белка. Каковы же место и роль рДНК-биотехнологии в человеческом обществе? На фоне растущих народонаселения на планете Земля и эко- логических бед место и роль рДНК-биотехнологии определяются потребностью людей в пищевых продуктах и, прежде всего, в белках, в различных лекарствах; в исправлении многочисленных наследственных заболеваний. В общенаучном плане важными являются исследования: а) процессов переноса генетической ин- формации между видами и расшифровки механизмов функциони- рования клеток; б) путей и методов создания новых существ — химер и новых организмов, возможно — монстров; в) эволюции различных существ, включая человека (при допу- щении альтернативной оценки всего живого как вечной материи, подвергающейся изменчивости в пространстве и времени). 5.3. Изменчивость организмов и ее значение в биотехнологии. С каждым годом взаимоотношения различных организмов с окру- жающей средой все более осложняются—растет народонаселение Земли и неуклонно истощаются ее ресурсы. Уже сегодня количе- ство веществ, загрязняющих биосферу, трудно поддается учету или, в ряде случаев, не поддается совсем. По имеющимся данным первое место среди загрязнителей природы занимают пестициды (от лат. pestis — зараза, caedo — убиваю), второе — тяжелые металлы. С 1985 по 1990 год химическая промышленность произ- водила ежегодно не менее 250 млн. тонн продукции, из которых до 30% поступало в окружающую среду. Несмотря на резкое отрицательное отношение людей к атом- ным электростанциям, не просматривается альтернативы термо- ядерной энергии, которая вместе с генной инженерией могут надолго обеспечить выживание человечества на нашей планете. С другой стороны, возрастание в обществе роли ядерных изотопов влекут за собой увеличение числа нежелательных мутаций (от лат. mutare — превращаться) в соматических и половых клетках. Все 212
это не может не отразиться на изменчивости организмов, включая и те из них, которые используются в биотехнологии. Под изменчивостью понимают возникновение организмов с новыми свойствами (признаками) среди существующего разнооб- разия живых организмов. Из трех типов изменчивости — моди- фикации, длительные модификации, мутации — наибольшее зна- чение для биотехнологии имеют мутации. Индуцированные мутан- ты теперь широко используются в производстве антибиотиков, аминокислот, ферментов и других продуктов. Длительные модификации присущи только клеточным формам из надцарств прокариот и эукариот, но не акариот. При этом генотип клеток остается неизменным, а измененный фенотип, проявляющийся в формировании какого-либо устойчивого мета- болического цикла, кажущегося независимым от внешних условий, выступает мерилом автономности внутриклеточной среды. При многократных пересевах происходит как бы разбавление цитоп- лазмы в ряду последующих поколений клеток и исходные метабо- литы материнской клетки достигают ниже порогового предела, когда указанный выше метаболический цикл исчезает. В других случаях такой же эффект наблюдается при создании окружающих условий, не поддерживающих один из типов метаболизма и клетки из состояния длительной модификации возвращаются в исходное с присущей виду комбинацией признаков (фенотип). Таким обра- зом, при возникающих или исчезающих модификациях наблюда- ются массовые однонаправленные изменения клеток однородного генотипа, находящихся в среде обитания. Особенности генотипа определяют фенотипические проявле- ния организма в заданных условиях. Поэтому и адаптацию можно определить как приспособление наследственно компетентной клет- ки (культуры, организма) к конкретным условиям существования. При мутациях изменяется генотип, или наследственная консти- туция клетки (организма). Мутации могут быть неконтролируемы- ми (спонтанными) и контролируемыми (индуцированными). Пер- вые происходят с частотой 1 • 10’5 — 1 • 10'7 на одну генерацию для разных организмов; это значит, что за одну генерацию ненаправ- ленно изменяется одна клетка из 100 000 или из 106 клеток. Частота индуцированных мутаций возрастает в десятки-тысячи раз. Факторы, вызывающие мутации, относят к разряду физиче- ских, химических или биологических, и называют мутагенами. Мутагены по действию подразделяют на два класса — прямого (на нуклеиновые кислоты) и непрямого, или опосредованного дейст- 213
вении из клеточной воды свободных радикалов, вступающих в реакции с кислородом клеточных структур (образование переки- сей), с органическими молекулами или взаимодействующих между собой. Происходит окисление или передача энергии молекулам ДНК (РНК). Свободно-радикальные процессы могут завершиться дезаминированием и дегидроксилированием оснований, разрывом N-гликозидных связей между основаниями и пентозой, деструк- цией пиримидинов, окислением пентозы, высвобождением пиро- фосфата. Вот почему различные излучения могут индуцировать самые разнообразные мутации. Так, например, одновременный разрыв сестринских хроматид у традесканции составил (по числу разрывов на 100 клеток/г) 0,99 — для нейтронов (Li + D); 2,1 — для ос-частиц (родон) и 3,02 — для тепловых нейтронов; 0,27; 0,26 и 0,44 — для рентгеновских лучей с X 0,015нм, 0,15нм и 0,41 нм соответственно. Соотношения УФЛ и ионизирующих излучений приведены в таблице 22. Т а б л и ц а. 22. Некоторые характеристики части электромагнитного спектра Название диапазона Д лина волны, нм. Частота, гц Энергия кванта, эв Далекая область инфракрасного излучения 3-105 • 1012 — Инфракрасныйдиапазон (от 770 до 4 • 10* нм) 3-104 1013 — Инфракрасный з-ю3 1014 1 Видимый свет (от 390 до 770 нм) 3-102 ю15 10 Ультрафиолетовый диапазон (от 13,6 до 390 нм) 30 1016 ю2 Мягкие рентгеновские лучи 3 10П 103 Средние рентгеновские лучи 0,3 ю18 ю4 Жесткие рентгеновские лучи 0,03 ю19 10s Жесткие рентгеновские и у-лучи 0.003 0,0003- 0,000003 ю20 1021- ю23 106 ю7- ю9 Применительно к ультразвуковым колебаниям (акустические колебания частотой свыше 2 • 104 герц, гц) считают, что под их влиянием наблюдаются последовательные изменения вначале в пиримидинах, , а затем — в пуринах. 216
Ежегодно в мире синтезируется не менее 250 тысяч новых химических веществ, многие из которых (особенно — при круп- номасштабном производстве) попадают в окружающую среду. Подсчитано, что примерно 10% человечества подвергается дейст- вию потенциально мутагенных и токсичных химических соедине- ний. Становление и развитие работ по химическому мутагенезу связано с исследованиями отечественных генетиков: В. В. Сахарова (1933), М. Е. Лобашова (1934), И. А. Рапопорта (1938), а также зарубежных ученых: Ш. Ауэрбах (1940), Вестергаард (1959), Мандол и Гринберг (1960) и др. В 1966 г. И. А. Рапопорт предложил термин "супермутагены" для веществ, обладающих исключительно высо- кой мутагенностью и заметно не влияющих при этом на жизне- способность клеток и организмов. К химическим мутагенам относят: ингибиторы синтеза нукле- иновых кислот (НК), аналоги азотистых оснований, алкилирующие соединения, окислители, восстановители, свободные радикалы, акридиновые красители, некоторые антибиотики (таблица 23). Т а б л и ц а 23. Некоторые химические мутагены и супермутагены Группа Мутаген Супер- мутаген По химическому устроению 1 2 3 4 ’ Ингибиторы синтеза предшественников НК Азасерин Азогуанидин 2-Амино-6-гидроксила- минопурин (АГАП) Бензимидазол 5-Бромурацил 2,6-Диаминопурин Гидразиноурацил N-6-Г идроксилами- нопурин (ГАП) Кофеин 6-Меркаптопурин Параксантин Тетраметилмочевая кислота Уретан 5-Фтордезоксиуридин Этил-уретан 8-Этоксикофеин II 1 1 1 1 1 Illi 1 + 1 + 1 Диазосоединение Пурин Пурин Бензимидазол Пиримидин Пурин Пиримидин Пурин Пурин Пурин Пурин Пурин Карбаминовая к-та Пиримидин Карбаминовая к-та 1 Пурин 217
(Продолжение таблицы 23) 1 2 3 4 Алкилиру- Азасерин — Диазосоединение ющие соединения Афлатоксин Bi 1,4-Бис-диазоцетилбутан + Производное фурана (ДАБ) + Диазоалкан Бутилхлорэтилсульфид — Хлорэтилсульфид Глицидол — Эпоксид Диметилсульфат — Диалкилсульфат Ди этилнитро зам ин + N-Нитрозозамещенное соединение Диэпоксибутан — Эпоксид Диэтилоксибутан + Алкан Диэтилсульфат — Диалкилсульфат Иприт N-Метил-бис /хлорэтил- + Хлорэтилсульфид амин '(аналог иприта) + Хлорэтилсульфид Метилметансульфонат ЬБМетил-М'-нитро-ЬГ- — Алкилалкансульфонат Нитрозозамещенное нитрозогуанидин + соединение Митомицин С — Антибиотик 1Ч-Нитрозо-1Ч-метилуретан М-Нитрозо-М-этил- + Диазосоединение мочевина + N-Нитрозозамещенное соединение Нитрозометилоксаимид + N-Нитрозозамещенное соединение Пропиленоксид — Эпоксид Р-Пропиолактон Фенол (карболовая Лактон кислота) — Фенол Формальдегид — Альдегид Эпихлоргидрин — Эпоксид Окислители Азотистая кислота — Кислота Гидроксиламин — Амин Диоксид водорода — Перекись Удлинители нитей ДНК Акридиновый оранжевый — Акридиновый краситель Бромистый этидий — Производное изохинолина Профлавин — Акридиновый краситель Ингибиторы синтеза РНК Актиномицины — Антибиотики Комплексное Н, ОН — Свободные радикалы действие на ДНК. Стрептомицин,гигро- мицин В и др. Антибиотики 218
Как видно из таблицы 23 среди ингибиторов синтеза предше- ственников НК имеются антиметаболиты (азогуанидин, 5-аминоу- рацил, 6-меркаптопурин, 5-фтордезоксиуридин). Нуклеозиды, со- держащиеся в клетках или добавляемые извне, играют роль анти- мутагенов, снижающих мутагенный эффект названных веществ. На примере 5-аминоурацила — аналога урацила можно показать путь возникновения 50% потомков после двух циклов репликации му- тировавшей клетки под действием мутагена. 5-Аминоурацил по хими- ческому строению близок к тимину и поэтому легко комплексируется с аденином. Кето-форма 5-аминоу- рацила более стабильна, чем его энольная форма, однако последняя образуется и существует какое-то время, в течение которого он мо- жет спариваться с гуанином — это так называемая ошибка включе- 5-аминсурацил (кето-форма) 5-аминоурацил (енольная форма) гуанин ния. Тогда очевидно, что вместо пары Г-Ц появится пара А-Т или А-5аминоУ (А-амУ). Аналогичная ситуация мо- жет складываться при использовании 5-брому- рацила (5-БУ) и прибавка в числе мутантов будет однократной. Мишень действия этого мутагена — фермент рибонуклеотидредукта- за. Мутации подобного рода происходят с не- большой частотой, поскольку они всецело за- висят от времени существования аналога нук- леинового основания в энольной форме (а время это, как прави- ло, небольшое). Смещение в комп- лементарности пар, или ошибка реплика- ции может происхо- дить по другой схеме: 219
xr> АЛ? Мутация здесь сохраняется до конца репликации ДНК, содер- жащей 5амУ (или БУ) и общее число мутаций возрастает с ростом числа циклов репликаций. Подобный мутагенный эффект оказыва- ют и другие аналоги НК, например 6-мер- капто- или 6-аминопурин. Мутагенное дей- ствие 2-аминопурина проявляется на бакте- риях и бактериофагах, хотя в норме он имеется в цианофагах. Будучи аналогом азо- тистых оснований нуклеиновых кислот, 2- аминопурин (Ап) индуцирует ошибку вклю- Hjlv XN U 2-амююпурин чения. В обоих случаях произош- ли мутации типа транзиций (см.). Ап может вызывать также и му- тации типа трансверзий (см.), Хо- тя и редко. Для всех аналогов азотистых оснований характер- ны прямые и обратные мутации типа простых замен, например А=Т на Г = Ц или Ц = Г на Т=А (обратные мутации здесь Г s Ц ошибка включения заменяется наА=ТиА=Т — на Г=Ц). Азасерин относится к двум подгруппам (см. таблицу 23). Его мутагенный эффект связывают с нарушением биосинтеза пуринов de novo и с радиомиметическими свойствами (от греч. mimicos имитирующий). Афлатоксин Bi вызывает сдвиг рамки считывания ДНК. Это можно показать на следующем примере: ТГГГГАТГЦ АЦЦЦЦТАЦГ выпадение одного Г добавление одного Г Супермутагены часто приводят к мутациям, возникающих на пути 2. Кофеин в больших дозах оказывает прямой мутагенный эффект, вызывая разрывы хромосом, например в клетках дрозо- 220
филы, человека и других эукариот. В меньших концентрациях он действует как синергист с радиацией, ингибируя репарирующие ферменты. В основе алкилирования НК лежат такие реакции как депури- низация с разрывом сахарно-фосфатной цепи в ДНК; взаимодей- ствие алкилирующих агентов с адениловой, цитидиловой и тими- диловой кислотами с последующей утратой способности алкили- рованных А, Ц и Т спариваться с комплементарными основаниями; взаимодействие с фосфатными группами НК; взаимодействие двух функциональных групп алкилирующего агента с нуклеофильными труппами НК. Так, например, в случае удаления .гуанина из ДНК под влиянием какого-либо алкилирующего агента могут обнару- житься различные варианты изменений: восстановление исходной пары Г - Ц, ее выпадение, перекрестная замена Г = Ц на Т = А или на Ц = Г, простая замена Г = Ц на А = Т. Супермутагены, вызывающие до 24% летальных мутаций, в основном относят к труппе алкилирующих агентов. Эту группу подразделяют на следующие подгруппы: 1. Металлорганические соединения R-Me, где R— органический радикал; например метилированная ртуть; 2. Галоидные алкилы (Алк) — (nH2n+i)R, где R — фтор, хлор, бром, йод; например, 1,2-дихлорэтан, 1,2-дибромэтан, 1,3-дихлорп- ропан; 3. Производные этилена (СН2 = СН-R, где R — двуокись азота, двуокись серы и др.); например, акрилоилэтиленимин; 4. Альдегиды (R-СОН, где R=H, СН2-СН- и др.); например, формальдегид, акролеин; 5. Уретаны (Н^МСООАлк); например, этил-уретан; 6. Диазоалканы (Алк=N + = N-); например, диазоуксусный эфир, диазометан, 1,4-бисдиазоацетилбутан; 7. Нитрозозамещенные соединения ( *2 где Ri-H, Алк, a R2-Aak, остаток уретана, мочевины, гуанидина); например, нитрозометилуретан, нитрозогуанидин, нитрозоалкил- мочевины; Алк—О л° 8. Диалкилсульфаты ^8^ Алк—О О например, диметил- и диэтилсульфаты; 221
9. Алкилалкансульфонаты (эфиры сульфоно- О вых кислот с общей формулой, например, метил- метансульфонат и этилмеметансульфонат); 7 л Апк О 10. Эфиры фосфорной и фосфористой кислот АЛК-О. Алк—О-^Р=О Апк— О АПК—CL ₽—С—Алк Z Алк—О 11. Р -Хлорэтилсульфиды (иприты) с общей формулой и их азотистые аналоги, где R=H, Алк и др.; CI—Алк CI—Алк^ К—R R=H,AnK Cl—Алк 12. Эпоксиды, СН2—CH —R R=H. Апк 13. Лактоны (Сн2)п—С=О где R = H, Алк и др.,: например, этиленок- сид, или окись этилена; например, р-пропиолактон; н 14. Этиленимины 1 , где r.Aak> н и . сн2—сн—R 15. Производные фурана, например аф- латоксин В1, хлорбензфуран и др. 16. Прочие. Указанные соединения относят к разря- ду реактогенных, способных передавать свои радикалы азотистым основаниям в НК и взаимодействовать с остатками фосфор- ной кислоты. афлатоксин В, По числу активных групп алкилирующие соединения делят на моно- , би- и полифункциональные. Моно- функциональными, например, являются диметилсульфат, этилени- мин, этилметансульфонат и др., бифункциональными — Р-хлорэ- тилсульфиды и их азотистые аналоги, полифункциональными — 222
дихлордиэтил-, метилдихлордиэтиламины, эфиры фосфорной и фосфористой кислот. Нитросоединения (нитраты, нитриты, нитрозосоединения, окислы азота и др.) проявляют мутагенную активность на про- и эукариотах. Нитрозосоединения могут образоваться из аминосое- динений и нитритов в кислой среде желудка млекопитающих. Под действием алкилирующих агентов возникают аддукты (от лат. adductus — приведенный, притянутый): 7-алкилгуанин (наи- более часто), 3-метиладенин, 0-6-метилгуанин, 0-4-алкилтимин и др. Малые дозы алкилирующих агентов индуцируют фермент метилтрансферазу, "принимающую на себя" алкильные группы. Клетки в этих случаях выживают. Данный фермент отсутствует у дрожжей, но есть у людей. Еще в 50-е годы был изучен механизм мутагенного действия азотистой кислоты, проявляющийся в окислительном дезаминиро- вании нуклеиновых оснований, то есть в замене аминогрупп на гидроксил или кислород. Тогда аденин трансформируется в гипо- ксантин (Гкс), гуанин в ксантин (Кс), цитозин в урацил. Первый спаривается с цитозином, что приводит к замене А = Т на Г = Ц, ксантин сохраняет способность спариваться (как и гуанин) с цитозином, что сопровождается заменой Г= Ц на А=Т.
Ошибки при спаривании оснований происходят путем транзи- ции или трансверсии. В первом случае один пурин заменяется другим пурином, один пиримидин — другим пиримидином. Во втором случае пурин замещается пиримидином или наоборот — пиримидин замещается пурином. Под влиянием М-метил-М-нитро- N-нитрозогуанидина больше возникает транзиций, чем трансвер- сий. Мутагенный эффект гидроксиламина обусловлен его взаимо- действием с цитозином, тогда как гидразин разрывает кольца урацила и цитозина. Метаболическая активность различных организмов может со- провождаться образованием перекисей, которые в определенных случаях могут быть мутагенами. Более того, перекиси выступают как бы связующим звеном между химическим и физическим мутагенезом (в частности, лучевым), учитывая факт их образования во время облучения клеток или тканей. При этом перекиси оказы- ваются мутагенами первого порядка, а например, калия цианид — мутагеном второго порядка. Это связано с тем, что KCN блокирует фермент каталазу (антимутаген) и, как следствие, клетка лишается защиты против мутагенного действия Н2О2. 2Н2О2 каталаза блокада реакции калия цианидом 2НгО + О2 “1—I—I—I—I—Г A T Ц А Г T II II II III II Т А АОТ Ц А J__I__I_I__[_L Т—I—I—I—I—Г A T Ins А Г T II II II III II Т А АО Т Ц А 1__1_I___I_I_L т—।—I—I—।—г А Т Ц А Г Т II II III И III II Т А Г T Ц А । ВыпадениеL|T А Т А Г Т II II II III-II T А Т Ц А J_____1_I______I—J_ “1—I—I—I—I—Г A T Ins А Г Т II II III II III II T A Ins' T Ц А J__I__J___I____I_L Вставка Ins=Ins’ 1---1 A T А Г Т II II II III II T А Т Ц А J--L4J----1--1---- Выпадение Ins — АО 224
Производные акридина (акридиновый оранжевый — АО, проф- лавин) и некоторые производные изохинолина (бромистый этидий) вызывают удлинение нитей ДНК (растяжение) на 1-2 нуклеотида, что приводит в итоге к выпадению или вставке мононуклеотида (прямые мутации). МИТОМИЦИН С Некоторые антибиотики — как мутагены обладают различными механизмами дейст- вия. Так, например, митомицин С подобен алкилирующим агентам. Он расщепляет двойную спираль ДНК за счет образования перекрестных связей. Антибиотики из груп- пы актиномицинов (в частности, актиноми- цин Д, или дактиномицин), являющиеся ди- олигопептидилактиномицинами, ингибируют ДНК-зависимый синтез РНК. Они специфически взаимо- действуют лишь со спирализо- ванными полидезоксирибонук- леотидами, содержащими гуанин (при этом существенна роль 2- аминогруппы пуринов в образо- вании водородной связи с хино- идным кислородом хромофора дактиномицин В блеомицине А2 радикал R представляет собой - $(СНз)> в блеомицине ДМА2 радикалом является -NH-fCHJj -S-CHj, в блеоммцюга В2 ом следукмций: -NH-JCHjh -NH-C-NH,. и т. д. НН 8 т. 8524 225
актиномицина). Они располагаются в малой бороздке нативной ДНК, мешая функционированию РНК-полимеразе. Гликопептидные антибиотики блеомицины ингибируют синтез ДНК и клеточный митоз. Аминогликозидные антибиотики (гигромицин В, стрептомицин) являются непрямыми мутагенами. Они нарушают белковый синтез благодаря взаимодействию с 30 S субъединицами бактериальных рибосом и предотвращению связывания отдельных тРНК. При этом неправильно считываются пиримидиновые основания. . Ряд алкалоцдов высших растений (из родов Heliotropium — гелиотроповых, Senecio — крестовниковых и др.) и синтетических лекарственных веществ (изониазид, хлорпромазид, нитрофураны и др.) могут обладать мутагенным действием. К биологическим мутагенам относят вирусы (фаги), живые вакцины, некоторые биотоксины, образуемые грибами, протозоа и гельминтами. Так, изменения в хромосомах вызывают цитоме- галовирус, вирус простого герпеса, герпетиформный вирус, вирус Сендай, вирус саркомы Роуса и др. Из грибных токсинов — мутагенов ранее был назван афлатоксин Bi. Можно назвать еще треморген, образуемый рядом аспергиллов и др. Фагоустойчивые мутанты актиномицетов и лактобактерий пред- ставляют интерес для соответствующих производств, например, антибиотиков и молочнокислых продуктов. Мутагены различных классов (физические, химические, биоло- гические) используют в работе с биообъектами. При этом стремят- ся получить штаммы либо с какими-то маркерными признаками, важными для расшифровки механизмов мутагенеза, либо штаммы — суперпродуценты БАВ, существенно увеличивающие выход конечного продукта в сравнении с контролем. При целенаправленном получении мутантов необходим их от- бор, или селекция значение которой исключительно велико в выведении различных пород животных, многих сортов злаковых, декоративных и многих других растений, в получении микробов — суперпродуцентОв БАВ (ряда антибиотиков, аминокислот, вита- минов и других субстанций). Для сравнения можно указать на успехи с селекцией мутантов пеницилла, исходный штамм которо- го, выделенный из воздуха А. Флемингом в 1928 г., продуцировал лишь 50 единиц антибиотика пенициллина в 1 мл культуральной жидкости.- Тяготы второй мировой войны 1939-1945 гг. вынудили ученых вернуться к этому виду гриба и заняться генетико-селек- ционной работой с ним. В 1951 г. путем рассева естественной популяции клеток, выросших в глубинных условиях культивиро- 226
вания Penicillium chrysogenum, был выделен штамм № 1951 с ативностью 100 ЕД/мл. Его колония и стала родоначальницей всех производственных штаммов в различных странах мира. Используя селекцию и комбинированное воздействие различными мутагена- ми (преимущественно — УФА и алкилирующие агенты), уже в начале 60-х годов удалось передать в производство штамм, обра- зующий пенициллин в количестве 5 000 ЕД и более в 1 мл культуральной жидкости. В настоящее время используются штам- мы, продуцирующие десятки тысяч единиц антибиотика в 1 мл среды. Следует различать понятия "селекция" и "интродукция" (от лат. introductio — введение). При селекции используют методы выве- дения новых форм организмов, отличающихся по свойствам от исходных родительских организмов. При интродукции выделяют из естественных (природных) и искусственных (производствен- ных) условий существующие организмы, наиболее пригодные для практических целей. В успехах селекции велика роль контролиру- емого мутагенеза, тогда как успехи интродукции опираются на генофонд, заведомо присущий организму. Селекция и интродукция животных и растений возникли раньше генетики. Основные под- ходы при этом концентрировались преимущественно на скрещи- вании организмов и отборе возникающего потомства. Применительно к микробам сформировалось четыре подхода, используемых в селекционной работе: 1. отбор естественных штаммов, обладающих ценными призна- ками, проявляющимися в конкретных условиях их существования (этот подход во многом аналогичен интродукции высших эукариот); при размножении такой культуры (с учетом частоты спонтанных мутаций) наступает популяционное давление, когда наиболее при- способленная форма вытесняет исходную в популяции. В анализе таких популяций полезны флуктуационный тест (от лат. fluctuatio — колебание) и метод отпечатков. С помощью первого доказывают спонтанность мутаций по маркерному признаку (от англ, mark — знак, метка), с помощью второго отбирают нужные колонии, вырастающие на селективной среде. Этот первый подход опира- ется на естественный ход событий у микроорганизмов в изменен- ных условиях (естественный отбор); 2. искусственный отбор клонов микроорганизмов с полезными для человека признаками, возникшими на основе естественной изменчивости родительских форм. К такому отбору прибегают тогда, когда контролируемый признак биологически малоценен для микроба и поэтому трудно создать условия выращивания культуры, 227
в которых относительно легко удавалось бы выделять нужные варианты. При этом необходимо проверять большое число клонов и субклонов, и если вариации между ними по контролируемому признаку невелики, то успех выборки оказывается мало вероятным или небольшим; 3. ступенчатая селекция — эффективный метод искусственного отбора форм с применением мутагенов (см. ранее приведенный в этом разделе пример с продуцентом пенициллина). С помощью мутагенов увеличивают изменчивость тест-культур, а среди послед- них отбирают наиболее перспективные; такой подход, как правило, использх ют многократно (ступенчато), добиваясь существенного возрастания контролируемого показателя (активность, продуктив- ность и др.); 4. гибридизация — как метод выведения полезных форм мик- роорганизмов. Здесь имеется аналогия с методом скрещивания у высших эукариот. О гибридизации см. в этой главе ранее. Микроорганизмы, как и высшие организмы, способны соби- рать и перераспределять уже имеющуюся информацию между родственными, но генотипически неоднородными клетками. Это происходит при трансформации, трансдукции и конъюгации у бактерий, при половой и соматической гибридизации у растений и животных. Яркий пример здесь с гибридомами, продуцирующи- ми моноклональные антитела (см.). 228
Часть III. Процессы и аппараты в биотехнологии Глава 6. ПРОЦЕССЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ Биотехнология как наука базируется на использовании биоло- гических процессов в технике и промышленном производстве (см. главу 1). Эти процессы (от лат. processus — продвижение) — как совокупность последовательных действий специалистов направле- ны на достижение соответствующих результатов при эксплуатации биообъекта(-ов). Говоря о процессах в биологической технологии, нельзя путать их с процессами в химической технологии. Так, главным компонентом первых является какой-либо биообъект (вирус, бактерия, гриб, растительные или животные клетки, био- молекулы). Такие объекты отсутствуют в химической технологии. Другой пример с высокими температурами, которые, как правило, неприемлемы в биотехнологии, но часто используются в химиче- ской технологии. Наконец, многостадийность и высокие давления также являются атрибутами (от лат. atributio — придаю, наделяю) химической технологии, а не биотехнологии. Однако биохимиче- ские и химические реакции следуют принципу ле Шателье, соглас- но которому равновесие системы смещается в направлении умень- шения эффекта произведенного воздействия. 229
Т а б л и ц а 24. Систематизация биотехнологических процессов 230
Рис. 75. Примерная обобщенная схема процессов в биотехнологии. Исходя из обобщенной схемы, нельзя учесть все виды и разно- видности биотехнологических процессов (сравнить данные на рис. 75 и в таблице 24). В основу подразделения биотехнологических процессов могут быть положены различные принципы, например, оценка: принадлежности биообъектов к надцарствам живых су- ществ (процессы на основе использования акариот, прокариот, эукариот), функциональной активности биообъекта (биосинтез, биотрансформация), возможности вычленения отдельных этапов из биотехнологических схем производства в виде самостоятельных процессов (подготовка питательных сред и оборудования; стери- лизация питательных сред оборудования, воздуха, ферментация (культивирование) биообъекта; выделение, очистка и упаковка готового продукта и т. д. Классификационные схемы подобного рода оправданы и ими можно пользоваться как равноправными. Биотехнологические процессы условно можно подразделить на биологические, биохимические и биоаналогичные. К первым от- носят те из них, которые основываются на использовании акариот, прокариот и эукариот, вторые — на использовании ферментов, и третьи (биоаналогичные) — на химическом синтезе или полусин- тезе веществ, функционально близких или эквивалентных первич- ным или вторичным метаболитам живых, организмов (получение производных пенициллина и цефалоспорина, тетрациклина, нук- леиновых оснований и др.). 231
А /снз C H -CH —CO—NH—CH—CH С__гн R-CO-NH-CH-CH-R, .° 5 2. I I I *-мз I I R X.—N—CH-COOH z-c—N—SO3H o ° бензилпенициллин монобактам В полусинтетических ампициллине, метициллине, оксациллине R представлены соответственно: а - D - (-) - аминобензилом СбН5—CjH—NH2,2,6 - диметоксифенилом СбНз(ОСНз)2—, 5 - метил - 3 - фенил - 4 - изоксиазолилом с6н5 (СН2)3 С—N С-СК-О-СО-СН, и 'V* CH-NH3 0 1 I СООН СООН цефалоспорин В полусинтетическом цефалоглицине радикал R представлен аминобензилом СбН5—СН—NH2, в цепорине (цефалоридине) при- соединены два радикал^ в позициях 3 и 7 zsx О=С—NH—СН—СН СН2 сн2 С—N С-СН2—N СООН цепорин В полусинтетических производных тетрациклина - доксицик- лине и метациклине (рондомицине) Ri—R4 представлены соответ- ственно: —ОН, —СНз, —Н, —Ни —OH(Ri), —СН2—(R2 и R3), —H(R4). 232
И>«Ч*п 64>то₽урвцил •4 R3 r2 ^снз)2 Полусинтетическим аналогом урацила является противораковый Г |Г ПГ | [] препарат 5 - фторурацил и т. д. ^4**^s»fz,'^zZls>>ff^4CONH2 Многие процессы биологиче- он о он о ской технологии являются общими, например на стадии ферментации, поэтому можно выделять общие основы биологической технологии. Это особен- но показательно на аппаратурном офор- млении отдельных стадий биопроиз- водств и, в частности, на выборе биоре- акторов, сепарирующего оборудования; сушилок и т. д. (см. главу 7). Специальные биотехнологические процессы связаны в большей степени с особенностями биообъектов. Достаточно сравнить здесь культивирование вирусов гриппа на куриных эмбрионах для при- готовления вакцин и выращивание пеницилла — продуцента ан- тибиотика бензилпенициллина в биореакторах емкостью до 100 м3 и более; другой пример с гибридомными клетками млекопитаю- щих, продуцирующих моноклональные антитела, и с лейконосто- ком — продуцентом полисахарида декстрана. В каждом из этих процессов имеются свои специфические особенности, благодаря которым выделяют биотехнологический процесс в самостоятельный. С учетом сказанного мы группируем все специальные биотехнологические процессы на микробиологи- ческие, фито- и зообиотехнологические. Другими словами, мы выделяем микробную биотехнологию, фитобиотехнологию и зоо- биотехнологию/ Общие процессы изложены в первой части учеб- ника, специальные - во второй. 6.1. Взаимосвязь процессов и биообъектов. Биообъекты харак- теризуются такими показателями, как уровень структурной орга- низации, способность к размножению (или репродукции), наличие или отсутствие собственного метаболизма при культивировании в подходящих условиях. Что касается характера биообъектов, то под этим следует понимать их структурную организацию. В таком случае биообъекты могут быть представлены молекулами (фермен- ты, иммуномодуляторы, нуклеозиды, олиго- и полипептиды, и т. д.), организованными частицами (вирусы, фаги, вироиды), одно- клеточными (бактерии," дрожжи) и многоклеточными особями (нитчатые высшие грибы, растительные каллусы, однослойные 233
культуры клеток млекопитающих), целыми организмами растений и животных. Молекулярные биообъекты накладывают свой отпечаток на организацию и аппаратурное оформление соответствующих био- технологических процессов. Вирусы и фаги как облигатные паразиты могут культивиро- ваться только на живых клетках и тканях, то есть фактически биотехнологические процессы здесь основываются на использова- нии клеток, зараженных вирусами или несущих вирус(-ы), Одноклеточные виды прокариот и эукариот могут использо- ваться в биотехнологических процессах в виде монокультур или в ассоциациях. Для сравнения можно назвать производство какого- либо антибиотика (пенициллина, рифамицина и др.) с помощью чистой культуры соответствующего продуцента, а также производ- ство кефира с помощью кефирных "зерен" ("грибков"), в состав которых входят лактобактерии и дрожжи. Следовательно, в по- следнем случае применяют природную ассоциацию микроорганиз- мов, и кефир является продуктом смешанного брожения — молоч- нокислого и спиртового. Пировиноградная кислота как ключевой продукт, возникающий из моносахаридов (моноз) после гидролиза лактозы, трансформируется лактобактериями до молочной кисло- ты, а дрожжи "доводят" тот же пируват до этанола. лактобактерии н q и дрожжи "2—------------- лактоза глюкоза и галактоза дрожжи /3—галактозидата -6СО +12Н ;он)соон 6СН3СН +12Н 6СН3СОН----->6СН3СН2ОН 6СН3СОСООН пируват лактобактерии лактат В природных условиях микроорганизмы, как правило, находят- ся в ассоциативных взаимоотношениях, часть из которых несом- ненно может быть привнесена в производство в виде самостоя- тельных биотехнологических процессов. Сегодня такие процессы немногочисленны, так как природные ассоциации изучены крайне 234
недостаточно с точки зрения биологической технологии. К тому же такие ассоциации складываются не только между микробами — микробоценозы, но и другими организмами — микробами и растениями, микробами и животными, между растениями, и т. д.; в таких случаях говорят о биоценозах (от греч. bios — жизнь, coinos — община). Если организмы выживают, но не размножаются в данных конкретных условиях, то под этим подразумевают их нахождение в состоянии анабиоза (от греч. ana — назад, обратное действие, подобно, соответственно). Если же организмы растут, развиваются и размножаются в среде обитания, то под этим понимают их нахождение в состоянии метабиоза (от греч. meta -— между, посредине, изменение, следование в пространстве и вре- мени). Наконец, гибель организма(-ов) в ассоциации или вне ее можно охарактеризовать понятием абиоз (от греч. ап — нет, bios — жизнь). В биотехнологии приходится постоянно встречаться с такими явлениями как метабиоз, абиоз и анабиоз. Имеются и такие ассоциации организмов, когда один (или более) из ассоциантов может расцениваться хищником. Например, гриб Arthrobotrys oligospora формирует сеть из мицелиальных петель — ловушек нематод, в частности, относящихся к числу вредителей растений (лука, клевера и др.). Такой нематодой является Ditylenchus dipsaci — стеблевая нематода. В сельском хозяйстве заметен вред от картофельной нематоды — Heterodera rostochiensis. Поэтому гри- бы-хищники оказываются союзниками человека в борьбе за уро- жаи ряда ценных культур растений, повреждающихся нематодами. Растением-хищником является росянка (насекомоядное расте- ние). У нее на листьях имеются железистые волоски, выделяющие ферментативно активную липкую жидкость, с помощью которой схваченные насекомые прочнее адгезируются и перевариваются. Среди микробов хищником является миксомицет Dictyostelium discoideum, а его жертвой — кишечная палочка. При хищничестве, присущем только эукариотическим организ- мам, жизнь партнера-жертвы ограничена во времени, то есть здесь ассоциация организмов кратковременная. Таким образом, анабиоз, метабиоз, абиоз и хищничество отно- сятся к разряду понятий об уровнях жизнедеятельности организ- мов. При метабиозе всегда предполагается наличие организмов- партнеров, вступающих или вступивших во взаимоотношения. Каковы же эти взаимоотношения? — Фактически их два — симбиоз и антибиоз (таблица 25). 235
Т а б л и ц а 25. Виды взаимоотношений при метабиозе между организмами в природных условиях. Взаимооотношения Вид Подвид Краткая характеристика Симбиоз Комменсализм (от лат. commensalis - сотрапезник) Один вид из ассоциантов живет за счет другого, не причиняя ему вреда Мутуализм (от лат. mutualismus - взаимосвязь, сожительство) Оба ассоцианта помогают ДРУГ другу Нейтрализм (!?) Ассоцианты не влияют друг на друга Паразитизм Один из ассоциантов живет за счет другого, нанося ему вред Антибиоз Собственно антибиоз и антагонизм 1) односторонний (моно- и полинаправленный) Один вид ингибирует развитие другого (других) или убивает его (их) своими метаболитами а) спонтанный (от лат. spontaneus - самопроизвольный, без постороннего вмешательства) В природных условиях б) направленный (насильственный) В искусственных условиях 2) двусторонний Оба ассоцианта ингибируют или убивают друг друга за счет своих метаболитов Аутоантибиоз Один вид или ассоциация видов образует метаболиты, которые ингибируют или убивают их процудент (ы) Симбиотические взаимоотношения типа комменсализма при- сущи, например, рыбам прилипале и акуле, грибу пенициллу, образующему пенициллин, и кишечной палочке, продуцирующей фермент пенициллиназу, которая гидролизует антибиотик до пе- нициллоевой кислоты — он становится не активным. 236
ZS. CH3 пенициллиназа R—CO—NH—CH—^H С—CH3 _________► R— O=C N—CH—COOH A/"’ CO—NH—CH—<j:H c£-CH3 O=c N—CH—COOH LI пенициллин пенициллоевая кислота Оба вида могут расти на мясо-пептонном агаре, но кишечная палочка в этом случае использует вторичный метаболит пеницилла. Третий пример — ассоциация аэробных и анаэробных микроор- ганизмов. Представители второй группы начинают расти на среде лишь тогда, когда аэробы снизят концентрацию кислорода до необходимой им величины. Следовательно, вторые живут за счет функциональной активности первых, не принося им вреда. Яркими природными симбиотическими ассоциациями типа мутуализма являются лишайники, где партнерами выступают ци- анобактерии (или зеленые водоросли) и грибы; муравьи-термиты и некоторые грибы; микробы рубца жвачных животных; грибы- микоризообразователи и соответствующие растения; нитрифици- рующие бактерии-симбионты в клубеньках бобовых растений; отдельные представители нормальной микрофлоры кишечника человека; некоторые бактерии — эндосимбионты внутри клеток простейших, и т. д. При редком явлении — нейтрализме партнеры — ассоцианты ведут себя так же, как если бы их культивировали по отдельности — скорости роста од инаковы в обоих случаях. Напри- мер, молочнокислые бактерии и молочнокислые стрептококки в закваске для кисломолочного продукта (йогурта) не проявляют отклонений в скоростях роста в сравнении с таковыми для культур в изолированном состоянии. По другим показателям (кроме ско- рости роста) данные не накоплены, поэтому возможно "голый" нейтрализм в природных ассоциациях отсутствует. В случаях паразитизма один из ассоциантов всегда наносит вред другому. Среди микробов хорошо известно пораже- ние прокариотических видов фагами; растений, теплокровных животных и человека — вирусами, патогенными бактериями и грибами; комнатных мух — энтомофторовыми грибами (например, Empusa muscae), некоторых холоднокровных животных (лягушек, рыб) грибами из родов Basidiobolus и Saprolegnia, и т. д. В случае использования таких видов (паразитов) в биотехнологии требуются особые подходы и условия работы с ними. 237
Антибиоз присущ многим видам микро- и макроорганизмов. Ведущую роль в подавлении партнера (-ов) в ассоциации могут играть собственно антибиоз и конкуренция за источники питания. Собственно антибиоз обеспечивается пре- имущественно за счет первичных (ферменты) ,или/и вторичных метаболитов, например, токсинов, антибиотиков (или фитонцидов растений — по Б. П. Токину); он может быть односторонним и двусторонним. Пример одностороннего — Streptomyces kanamyceticus образует аминогликозидный антибиотик канами- цин, который губительно действует на партнера—Salmonella typhi; пример второго — разные виды стрептомицетов, угнетающих друг друга при росте на питательной среде, например взаимно антаго- нистичны Streptomyces globivulgaris и Streptomyces griseus, S. globivulgaris и S. levoris, и др. В случае конкурентного антибиоза проявляется антаго- низм (от греч. antagonisma — спор, борьба) между видами прежде всего из-за потребностей в питательных веществах; преимущество получает здесь наиболее приспособленный вид, менее приспособ- ленный угнетается или погибает (при наличии в сре^е Е. coli и Staph, aureus преимущество остается за Е. coli). Антибиоз может быть моно- и полинаправленным, или одно- и многонаправленным, то есть антибиотически или антагонистиче- ски активный вид проявляет свое ингибирующее (губительное) действие лишь в отношении одного вида или более, чем одного вида. Такой эффект зависит от сложив- шейся ситуации в природных усло- виях (спонтанно) или в искусствен- ных условиях — производственных или лабораторных (направленно). В соответствующих экспериментах не- редко определяют активность каких- либо продуцентов антибиотиков в от- ношении многих бактерий и грибов, подсевая их, например, к "штрихово- му росту" такого продуцента (рис. 76). Здесь гриб естественно или вы- нужденно (насильственно) продуци- рует пенициллин, который тормозит рост чувствительных бактерий. По- добные ситуации вынужденного (на- 238 Рис. 76. Полинаправленный ан- тагонизм пеницилла (а) в отноше- нии бактерий: Staphylococcus aureus (б), Streptococcus haemolyticus (в), Escherichia coli (г), Neisseria meningitidis (д), Streptococcus pneumoniae (e). Candida albicans (ж).
сильственного) антибиоза или антагонизма могут возникать не только в природных условиях, но и в макроорганизме (И. Г. Шиллер, 1952). Под аутоантибиозом следует понимать ингибирование или гибель организма(-ов) от действия собственных метаболитов. Например, молочнокислые кокки и бактерии, накапливающие молочную кислоту в среде обитания, погибают в результате дей- ствия этого метаболита. Другой пример с дрожжами — сахароми- цетами, использующимися в производстве этилового спирта. В 1 процессе брожения лишь отдельные расы их могут накапливать до 15% этанола. Более высокие концентрации губительно действуют | на Saccharomyces cerevisiae. Аутоантибиоз во многом зависит от возраста культуры, и он проявляется, как правило, в конце стационарной фазы роста и начале фазы отмирания. Все другие виды ассоциативных взаимо- отношений складываются преимущественно раньше. Следует иметь в виду и адаптивные возможности видов в ассоциациях. Если чистые культуры, используемые в соответству- ющих производствах, не проявляют, например, какой-либо фер- ментативной активности, то это не значит, что в ассоциациях с другими видами они поведут себя аналогичным образом по данно- му признаку. При наличии соответствующего субстрата в среде может индуцироваться выработка адаптивных ферментов, не вы- 1 рабатывавшихся ранее без индуктора. И в результате этого ассо- циант может подвергнуться, например, лизису (растворению). По условиям проведения процесса различают нестериль- ные (крупнотоннажное производство кормовых дрожжей) и I стерильные производства (получение антибиотиков, витаминов, моноклональных антител и др.); аэробные, или с подачей воздуха и анаэробные (без подачи воздуха) — соответственно производства лимонной кислоты и полисахарида , декстрана. 1 Многие каллусные культуры растений выращивают поверхно- стно, то есть используя подложку из питательных сред (чаще — , агаризованную), тогда как микробная биотехнология рассчитана преимущественно на глубинные процессы (погружение биообъек- тов в жидкие питательные среды). При реализации процессов их стремятся вести в одном из трех режимов: периодическом, по л у непрерывном I и непрерывном. В первом случае биотехнологический процесс проводят от начала до конца согласно регламенту, и после 239
завершения всех операций его повторяют. Во втором случае осуществляют так называемый отливно-доливной процесс, когда, например, на "пике" биосинтеза какого-либо антибиотика отбира- ют 25—75% культуральной жидкости и однократно добавляют столько же свежей питательной среды. Непрерывные процессы рассчитаны на непрерывный отбор культуральной жидкости и непрерывное поступление равного количества свежей питательной среды. Непрерывный режим используется в производстве дрож- жей на гидролизатах древесины, в производстве пива, бутанола и ацетона, и др. Выход микробных клеток при непрерывном процессе в срав- нении с периодическим будет выражаться следующими соотноше- ниями (с учетом времени удвоения массы — в. у.); 11,9 (в. у. 0,5); 7,6 (в. у. 1,0); 5,3 (в. у. 2,0); 4,3 (в. у. 4,0). Из этого следует, что с возрастанием времени генерации выходы биомассы в обоих про- цессах уравниваются. Согласно Д. Герберту, Р. Элсуорту и Р. Теллингу при непре- рывном процессе максимальное образование продукта происходит при DmaxX = ЦтаХГ5о(^^-лф)2, где •JO Оо Dmax — максимальная скорость разбавления, % — концентрация микроорганизмов в биореакторе при установившемся режиме, ц max — максимальная удельная скорость роста, Y — выход клеток в расчете на использованный субстрат, So — концентрация суб- страта в подаваемой свежей среде, Ks — константа насыщения. Применительно к фазовому состоянию ингредиентов в биотех- нологических производствах различают твердофазные процессы, например, при флуидизаций (от англ, fluid — жидкость, жидкий) или протеинизации грубых кормов на основе соломы злаковых растений с участием некоторых грибов, получение тка- невых культур лекарственных растений на уплотненных средах, из которых затем экстрагируют действующие вещества, производ- ство сыра из белков молока и др.; газофазные процессы основаны на использовании газа (например, метана) для получения микробного белка с помощью ассоциаций метилотрофных бакте- рий. Наконец, по условиям проведения процессов выделяют од- ноступенчатые, двухступенчатые и много- ступенчатые. Одноступенчатые проводятся, например, при . 240
получении 6-АПК из бензилпенициллина с помощью пеницилли- нацилазы, или пенициллинамидазы на колоннах, содержащих им- мобилизованный фермент. / место действия фермента J ZSK ZCH3 А/СН’ CjHg СНг—СОТ-NH—CH—C^-CHj -----» HH2—CH—CH C—CHj t O=C N—CH—COOH O=C N—CH—COOH + CgHs—CH2—COOH фенилуксусная кислота 6-аминопеницилилланоеая кислота (6-АПК) Двухступенчатые процессы базируются на использовании кле- ток, находящихся в разном фазовом состоянии (в трофофазе и идиофазе, см. 4.4). Так, например, двухступенчатый процесс воз- можен при получении полисахарида курдлана—на первой ступени выращивают продуцент (Alcaligenes faecalis var. myxogenes) на питательной среде, поддерживая его в трофофазе; на второй ступени культуру переносят в другой биореактор, где нет пита- тельной среды, но имеется глюкоза, из которой синтезируется курдлан. Многоступенчатые процессы присущи генетической инжене- рии и рДНК-биотехнологии (см.). Процессы биохимической технологии подразделяют по ста- диям реализаци и технологической схемы производства: подготовка оборудования и питательных сред, их стерилизация, посев биообъекта и ферментация, выделение, очистка, сушка, упаковка. В зависимости от целевого продукта число стадий про- цесса может быть то больше, то меньше. Д ля сравнения можно назвать производство кормовых дрожжей и антибиотика стрепто- мицина. В первом случае целевым продуктом являются дрожжевые клетки, во втором — вторичный метаболит, предназ- наченный для парентерального введения больным людям и живо- тным. При получении антибиотика имеется больше стадий, чем в случае получения дрожжевых клеток. Целевыми продуктами могут быть и первичные метаболиты — ферментные белки. Очевидно, что, например, экзогидролазы тех- нологически получать легче, нежели какие-нибудь эндоферменты, локализующиеся внутри клеток, и число стадий в этом последнем случае может возрастать. Очевидно, что подготовка оборудования, питательных сред, и все другие этапы регламентированной схемы производства како- 241
го-либо целевого продукта различны по многим показателям, если зто будут, например, процессы получения экзотоксинов и органи- ческих кислот. С биотехнологических позиций работа с токсиген- ными культурами должна проводиться на таком уровне, чтобы исключить возможность попадания ее за пределы биореактора в живом состоянии. Строгий контроль осуществляется также за внутрипроизводственной обработкой и транспортировкой культу- ральной жидкости, содержащей экзотоксин. Эксплуатация воз- можностей, например Aspergillus niger продуцировать лимонную кислоту не сопряжена с подобной опасностью. Тем не менее, во избежание рассеивания грибных спор во внешней среде желатель- но и в этом случае ферментацию осуществлять в герметизирован- ных биореакторах. После завершения ферментации отделяют либо клетки (кле- точную массу), содержащие необходимое нам вещество, либо жидкость, в которой накопился конечный продукт. В первом случае отходом является жидкая часть культурального "бульона", во вто- ром — плотная часть (клетки). Культуральная жидкость содержит биообъект, недоиспользованные компоненты питательной среды, продукты метаболизма, включая ожидаемый , конечный (целевой) продукт. От качества целевого продукта зависит выбираемый метод сепарирования клеток. Например, при производстве экзо- полисахаридов, или экзогликанов культуральные жидкости стано- вятся вязкими и, даже, гелеобразными, из которых выделить клетки продуцента удается лишь после разбавления их водой в 10—20 раз с последующим нагреванием, например, до 80°С, и сепарированием в подогретом виде на мощных сепараторах типа "Альфа Лаваль" (Швеция). Полученный разбавленный раствор полисахарида подвергается концентрированию путем мембранной фильтрации и вакуум-упаривания. Если минорные компоненты в полидисперсном полисахариде количественно малы, то такой поли- сахарид может быть использован в качестве готового продукта, например, как вспомогательное вещество при изготовлении раз- личных лекарственных средств. В других случаях необходимо спиртовое осаждение гликана с последующим удалением надосадочной жидкости и высушивание полисахарида, поступающего на хранение и на реализацию. В производстве некоторых антибиотиков используют ротаци- онные вакуум-барабанные фильтры непрерывного действия. Если биообъектами оказываются бактерии или дрожжи, то можно применить центрифугирование в целях концентрирования суспен- 242
зий и отделения клеточной биомассы. Применяют центрифуги непрерывного или осадительного действия. В первом случае клетки выгружаются через сопла, во втором — с помощью шнеков. Клеточную массу можно отделять методом осаждения (седи- ментации), используя коагулянты (например, поликатионные ве- щества). Некоторые штаммы дрожжей, использующиеся в пиво- варении, обладают выраженной флокулирующей способностью, и поэтому они легко могут быть отделены таким способом. В целях концентрирования клеток может быть полезной фло- тация (от франц, flottation — плавание), когда на границе раздела фаз "воздух — жидкость” собираются, например, клетки бактерий (Acinetobacter sp.), рекомендованные в качестве продуцентов бел- ка. В целях выделения конечных продуктов из культуральных жидкостей после сепарирования клеток прибегают к осаждению, экстракции, сорбции, ультрафильтрации (см. 7.4) или их сочета- нию. инозин (рибоксин) Применительно к механизму образования конечных продуктов можно говорить о процессах биосинтеза и биотран- сформации. При биосинтезе имеет место конститутивное или адаптивное образование метаболи- тов, относящихся к числу преметабо- литов, первичных или вторичных ме- таболитов. Так, нуклеозид инозин синтезируется некоторыми бактери- ями (Вас. subtilis, Вас. pumilis, Brevibacterium ammoniagenes и др.). Пентоза в структуре инозина образу- ется в гексозомонофосфатном шунте (путь окисления глюкозы по Вар- бургу- Дикенсу -Хорекеру), а пу- риновое ядро (гипоксантин, или 6-оксипурин) в общем виде синтезируется из глицина (атомы в позициях 4, 5, 7), форми- ата (позиции 2 и 8), диоксида углерода (пози- ция 6), аспарагиновой кислоты (позиция 1) и глутамина (позиции 3 и 9). пуриновое ядро 243
тетрациклин(ы) Из первичных метаболитов можно назвать производство фер- ментов амилаз для хлебопекарной и текстильной промышленности, L-аспарагиназы — для здравоохранения и др. Из вторичных мета- болитов хорошо известны поликетидные антибиотики — тетрацик- лины, продуцируемые некоторыми стрептомицетами. Они образу- ются путем конденсации молекул малонилКоА. Донором метиль- ной группы для некоторых тетрациклинов является метионин, донором ами- ногруппы — глутамин. В процессах биотранс- формации имеет место ви- доизменение какой-либо молекулы — предшествен- ника конечного продукта или превращение одного продукта в другой. Напри- мер, почвенные грибы и некоторые другие микроорганизмы пре- вращают фенолкарбоновые кислоты в другие формы фенолов с помощью реакций окисления, гидроксилирования и декарбокси- лирования. СООН соон галловая кислота шикимовая кислота пирогаллол Биотрансформация имеет место при компостировании отходов, при получении биогаза, силосовании кормов и др. Тем не менее, подразделение процессов в биохимической технологии на биосинтез и биотрансформацию связано в основном с результирующим эффектом, а не с механизмом протекающих при этом биохимических реакций. Подразделение биотехнологических процессов на управ- 244 I
ляемые и неуправляемые опирается на глубину и масштабность контроля, осуществляемого с применением средств автоматики и ЭВМ. К числу неуправляемых процессов можно отнести спонтанно протекающие компостирование плотных отхо- дов в животноводческих комплексах и фермах. К управляемым относятся все производственные процессы, основанные на исполь- зовании микробных, растительных и животных клеток. При этом уровень управления может быть двояким — операторским и автоматическим. В первом случае поддержание заданных режимов осуществляет оператор, во втором — соответствующие контроль- но-измерительные приборы, автоматы, ЭВМ. Некоторые авторы (Ф. X. Дейндорфер, 1960) подразделяют биотехнологические процессы по типу на простые, совместные, последовательные и ступенчатые. Под простыми понимается трансформация питательных веществ в продукты метаболизма без накопления интермедиатов при наличии строго определенной стехиометрии в утилизации субстрата (или клеточном росте) и образовании метаболита. Скорость образования метаболита можно выразить следующим уравнением: г/р= - Yp/Sr, где г — скорость, fp — контролируемый продукт метаболизма, YP/ST — коэффициент отношения метаболита (р) к субстрату (s). В молярном выражении коэффициент Y составляет: Yp/s = где p/s — число молей метаболита, образующегося на 1 моль использованного субстрата, f— метаболит, ns — число атомов углерода в молекуле субстрата, с-число молекул субстрата, пр-число атомов углерода в молекуле продукта. Кинетика простого процесса сопряжена с ростом клеток. Примером такого процесса является получение этанола из глюкозы при спиртовом брожении. Совместными процессами считаются те из них, в которых имеет место превращение питательных веществ в продукты мета- болизма без накопления интермедиатов, но с возможным измене- нием стехиометрии процессов. Следовательно в таких случаях стехиометрию можно выразить только с помощью уравнения реакции конечного продукта. Нередко скорость образования ме- таболита принимается пропорциональной концентрации клеток, а не скорости их размножения. В качестве примера такого типа процессов можно назвать молочнокислое брожение. 245
Последовательные процессы биохимической технологии характеризуются накоплением интермедиатов в ходе трансформа- ции питательных веществ в целевые продукты. Это имеет место, например, при ацетоно-бутиловом брожении, когда вначале из глюкозы образуются интермедиаты — ацетат и бутират, которые затем (наряду с глюкозой) превращаются в конечные продукты — ацетон и бутанол. При ступенчатых процессах биологической технологии питательные вещества вначале полностью трансформируются в интермедиат (и эта трансформация протекает избирательно в какой-либо определенной последовательности) и лишь после этого образуется конечный продукт. Пример — биосинтез лимонной кислоты. 6.2. Значение асептики в биотехнологических процессах. Би- отехнологические процессы, как правило, проводят в асептичных условиях, хотя могут быть исключения для некоторых из них. Например, при культивировании отдельных эукариот (дрожжи) в негерметизированных ферментаторах (нестерильный процесс) происходит заметное снижение pH среды, где доминирующее положение дрожжей не изменяется при попадании контаминиру- ющих бактерий (от лат. contaminatio — загрязнение, заражение, смешение) — они не могут составить конкуренции основному виду. Асептика (от греч. а—не, нет, sepsis—гниение) — это комплекс мероприятий, направленных на предотвращение попадания в среду (объект) посторонних микроорганизмов, включая болезнетворные. Следовательно, асептика в биологической технологии и, например, в хирургии — это не одно и то же понятие. В первом случае предполагают использование какого-либо биообъекта (в том числе — микроба) и полное исключение попадания других микроорга- низмов, являющихся загрязнителями. Во втором случае стремятся исключить любук) возможность попадания патогенных микробов и микробов — контаминантов на операционное поле или в рану. Каждый из материальных потоков в биотехнологических про- цессах — потенциальный источник микробов — контаминантов. Асептика может включать влажную уборку помещений, обра- ботку их ультрафиолетовыми лучами, антисептическими средства- ми, использование стерильных инструментов, сред, технологичес- 246
кой одежды, подачу стерильного воздуха (столы с ламинарным потоком стерильного воздуха в боксированных помещениях, по- ступление в ферментатор стерильного воздуха через барботер — от франц, barbotage — перемешивание) и пр. Следовательно комплекс мер, обеспечивающих асептику биотехнологических процессов, включает: механическую, физическую и химическую защиту биообъекта и среды его обитания, а при необходимости — и конечный продукт. К механической защите относятся: удаление механических примесей, например, из воздуха, культиваторов, герметизация оборудования, изоляция узлов и соединений; к фи- зической — обработка воздуха и поверхностей приборов и аппа- ратов ультрафиолетовыми лучами, кипячение, стерилизация паром под давлением, обработка ультразвуком; к химической — обработ- ка поверхностей химическими антисептиками. В производственных условиях источниками микробов-конта- минантов могут быть почва, вода, окружающий воздух, люди. Из почвы в сферу биотехнологических процессов попадают спорооб- разующие палочки-бациллы, конидии грибов, актиномицеты; эти же микроорганизмы с пылью могут попасть в воздух, через по- средство которого они способны проникнуть в среду выращивания биообъекта или в конечный продукт производства. Качественный состав и размеры частиц в воздушной пыли колеблются в широких пределах. В производственных помещениях это зависит от конструкционных особенностей здания, розы вет- ров, географической зоны расположения города и предприятия, наличия или отсутствия потоков автомобильного и другого транс- порта, количества непосредственно занятых в технологическом процессе людей, характера и локализации складских помещений и т. д. Образующиеся пыль или/и капельки влаги в воздухе, как правило, содержат на своей поверхности слой адсорбированного воздуха и большее или меньшее количество микроорганизмов. Газовая оболочка предохраняет частицы от смачивания. Такие частицы представляют собой дисперсную фазу аэрозоля, устойчи- вость которой зависит от размеров (величины) частиц, их элект- рического заряда и поверхностной энергии. Необходимо помнить, что в случае нахождения на частицах аэрозоля микробных клеток, то их отрицательный электрический заряд будет привносить свою 247
долю в общий заряд частицы. Опираясь лишь на величину аэрозоля, содержащего микроорганизмы, можно выделить три фазы его: крупноядерную (диаметр частиц более 100 мкм), мелкоядерную (диаметр частиц менее 100 мкм) и фазу бактериальной пыли (диаметр частиц от 1 мкм до 100 мкм). Частицы крупноядерной фазы в течение нескольких секунд оседают из воздуха, тогда как частицы двух других фаз могут длительно находиться в воздухе, образуя устойчивую коллоидную систему. В таблице 26 представ- лены данные о скорости седиментации частиц в воздухе и, для сравнения, в воде. Т а б л и ц а 26. Седиментационная скорость (мкм/с) для сферических частиц в воздухе при нормальных температуре и давлении (18°с, 1,01* 105Па) и в воде при 2ГС Диаметр частиц, мкм В воздухе В.воде 0,1 1.0 0,001 1.0 42,0 0,11 5,0 960,0 2.8 10,0 3650,0 11.1 Бактериальная пыль может формироваться из первых двух фаз после их высыхания и повторного попадания в воздух. В разряд частиц с диаметром от 0,001 мкм до 1 мкм подпадают вирусы и некоторые бактерии. Аэрозоли могут быть вредными и для чело- века не только из-за микробов, наход ящихся на частицах пыли или капельках жид кости, но и сами по себе вследствие проникновения в альвеолы дыхательной системы с последующим расстройством ее функций. В таком понимании вредными являются следующие аэрозольные частицы: асбеста, алебастра, абразивного порошка, графита, гипса, д иоксида титана, дорожной пыли, извести, каолина, корунда, карбида кремния, мрамора, оксида олова, стекловолокна и др. В альвеолы проникают частицы размером менее 3 мкм при скорости потока вдыхаемого воздуха уже около 1 см/с. По степени загрязненности воздуха микробами и механически- ми частицами в расчете на 1м3 производственные помещения, в которых асептично изготавливают лекарственные средства, клас- сифицируют по классности следующим образом: 1-й класс чистоты с ламинарным потоком стерильного воздуха — для изготовления стерильных лекарств — не должно быть микробов, а механических частиц размером до 0,5 мкм — не более 3500; 248
2-й класс чистоты — до 50 микробных клеток, до 2500 частиц размером 5 мкм и до 350000 частиц размером 0,5 мкм; 3-й класс чистоты — до 100 микробных клеток (ЗА класс — до 200 и ЗБ класс — до 500 клеток), до 25000 частиц размером 5 мкм и до 3500000 частиц размером 0,5 мкм; 4-й класс чистоты — по ГОСТ 12.1.005 — 86. Для помещений 2-го и 3-го классов чистоты, в которых изго- тавливают нестерильные лекарственные средства, нормирование воздуха по содержанию механических частиц не предусматрива- ется. Лекарственные средства по "микробной чистоте” разделяют на 4 категории: 1) стерильные препараты для инъекций, приготовлен- ные на апирогенной воде; 2) глазные лекарства, препараты для введения в закрытые полости тела, средства для лечения обширных ожогов и открытых ран не должны содержать живых микроорганизмов — они также относятся к разряду стерильных; 3) лекарственные средства для наружного применения и для введения в открытые полости не должны содержать более 100 живых микробных клеток в 1 г(мл) препарата и при безусловном отсутствии в них бактерий, относящихся к семейству Enterobacteriaceae, а также Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus; 4) все прочие лекарственные средства должны содержать в 1 г(1мл) не более 1000 жизнеспособных бактериальных клеток сап- рофитов и не более 100 клеток непатогенных грибов при отсутст- вии болезнетворных и условно патогенных микроорганизмов, включая энтеробактерии, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, аспорогенные дрожжи рода Candida. Работающие в помещениях различной степени чистоты должны одевать рекомендуемую и пригодную для таких целей технологи- ческую одежду (согласно требованиям системы GMP — см.). Так, в помещениях первого класса, где кратность обмена воздуха в час 600—200, одевают стерильный костюм, головной убор должен полностью закрывать волосы, включая бороду, и Заворачиваться под ворот костюма; на лицо одевается маска во избежание попа- дания частиц и капель в окружающую среду; на руки одевают стерилизованные без сыпучих материалов перчатки из каучука или пластичных материалов, на ступни - стерилизованную или продезинфицированную обувь, включая бахилы. Низ брюк подво- 249
рачивают в обувь (как и рукава костюма — в перчатки). От защитной одежды не должны попадать в воздух частицы и волокна, а сама она должна задерживать частицы, исходящие с тела опера- тора. Указанная одежда должна быть разового использования или использоваться в течение одного дня, если результаты проверки подтверждают такую возможность. Перчатки рекомендуется по- стоянно дезинфицировать во время операций, маски и перчатки необходимо менять перед каждой рабочей процедурой. Стериль- ную зону желательно проектировать таким образом, чтобы все операции можно было наблюдать извне. В рабочих зонах таких помещений все открытые поверхности должны быть гладкими, непроницаемыми, неразбитыми, удобными для очистки и дезин- фекции, где и когда это необходимо, без труднодоступных высту- пов и углублений, полок, шкафов, излишнего оборудования, раз- движные двери здесь нежелательны из-за возможности скопления пыли в пазах; сточные и канализационные трубы не должны проходить в стерильных зонах. Комнаты для смены одежды необ- ходимо проектировать и строить с воздушными шлюзами, снабжа- ющимися стерильным воздухом. Двери с воздушными шлюзами не должны открываться одновременно; между шлюзами должна быть система для визуального или аудиоконтроля (от лат. visus — зрение, auditus — слух, слышание). Мытье рук и средства для этого должны быть только в комнате для' смены одежды. В рабочие помещения должен подаваться стерильный воздух под положительным давлением. В помещениях второго класса чистоты с кратностью обмена воздуха 20—60 следует одевать гладкий (без складок), не отделяю- щий ворса, комбинезон, стянутый на поясе, с манжетами, плотно облегающими щиколотки ног; на голову необходимо одевать шлем- капюшон, полностью закрывающий волосы, нос й подбородок; на лицо — маску, не отделяющую ворса; на руки — резиновые (или из эластичных полимеров) перчатки, на ноги — стерильную или продезинфицированную обувь, поверх которой рекомендуется одевать бахилы, полностью закрывающие ступню. Нижняя часть брюк должна заправляться в бахилы, а рукава комбинезона — в перчатки. Ни одна часть тела или разрешенного для использования нижнего белья не должна быть открыта. В помещениях третьего класса чистоты с кратностью обмена воздуха 1—15 рекомендуется одевать не отделяющий ворса ком- бинезон или куртку с собранными рукавами на запястьях и 250
воротником-стойкой, шапочку или косынку, брюки, бахилы и маску. В помещениях четвертого класса чистоты рекомендуется оде- вать комбинезон, или куртку и брюки, или халат, шапочку или косынку из хлопчатобумажных или льняных тканей. Вот почему важно глубоко продумывать размещение помеще- ний в производственных зданиях (особенно — для стерильных лекарств). С водой в сферу технологического процесса могут попасть грамотрицательные бактерии из групп энтеробактерий, псевдомо- насов и некоторых других. В природных открытых водоемах обнаруживаются целлюлозоразрушающие, нитрифицирующие и денитрифицирующие бактерии, цианобактерии, аммонификато- ры, железобактерии и многие другие. Лишь вода артезианских колодцев, глубоких скважин и родников отличается высокой чис- тотой. Следует помнить, что чем больше вода загрязнена органи- ческими веществами, тем больше в ней содержится микробов. По степени загрязненности открытых водоемов различают 3 зоны сапробности (от лат. saprotes — гниль, гниение): полиса- про.бная — сильно загрязненная, содержащая в 1 мл несколько миллионов микробных клеток, включая гнилостные и кишечные бактерии; мезосапробная — умеренно загрязненная, содержащая в 1 мл до 100000 микробных клеток с преобладанием аэробных видов; олигосапробная — зона чистой воды, содержащей в 1 мл не более 1000 микробных клеток из предста- вителей железо-, серобактерий и некоторых других видов. Поли- сапробные зоны характерны д ля рек, протекающих по населенным пунктам или вблизи них, и где в воду попадают жидкие отходы из крупных свиноводческих ферм, канализационные стоки и стоки промышленных предприятий. В такой воде могут быть санитарно- показательные (Е. coli, Streptococcus faecalis), условно патогенные псевдомонасы, протей и другие виды, а также болезнетворные микроорганизмы из группы энтеробактерий. Седиментационная устойчивость бактерий в воде достаточно выраженная (см. таблицу 26). Следует также иметь в виду и минимальные значения активной воды (aw) для различных микро- организмов, под которой понимают отношение давления паров раствора (Vs) к давлению паров чистой воды (Vpw): (таблица 27). Vs aW~ -Tr Vpw 251
Таблица??. Минимальные значения aw для микроорганизмов Группа микробов-сапрофитов Минимальные значения а« Мезофильные бактерии 0,91 Галофильные бактерии 0,75 Психрофильные бактерии 0,75 Дрожжи 0,88 Нитчатые грибы 0,62 - 0,93 Осмофильные дрожжи 0,60 Нитчатые грибы — ксерофиты 0,65 Для сырья опасным уровнем влажности при длительном хра- нении является показатель aw, превышающий 0,6, реже — 0,7. С учетом всех характеристик необходимо осуществлять подго- товку воды для использования ее в биологической технологии. Люди, занятые в биотехнологическом производстве, также могут быть источником контаминирующей микрофлоры — гра- мотрицательных бактерий, кокков, микоплазм, вирусов и др. Толь- ко на поверхности кожи может сосредоточиваться до 1О10 микро- бных клеток. Наиболее загрязненными являются кисти рук, ступ- ни, локти, шея, грудь, промежность, паховые области. Разнообраз- на и многочисленна микрофлора ротовой полости: бактериальные и кокковые формы, вибрионы, спириллы и спирохеты, нокардии, дифтероцды, протозойные организмы, аспорогенные дрожжи рода Candida, микоплазмы, вирусы и др. При разговоре, кашле, чихании микробы в большом числе попадают в воздух. Установлено, что здоровый человек за одно чихание выделяет до 20000 микробных клеток, способных распространяться по горизонтали, в среднем, до 1,5 м. Капельки носовой слизи, слюны и мокроты, подсыхая, образуют частицы, покрытые белковой или гликопротеиновой оболочкой, и содержащие микробные клетки. В таких частицах микроорганизмы длительно сохраняются и могут являться причи- ной нестерильности материалов (объектов) на каких-либо техно- логических операциях. Источником микробов-загрязнителей могут быть некоторые компоненты питательных сред, например, кукурузный экстракт (фаги, дрожжи и др.). Растительные вирусы часто выявляются в культурах каллусных тканей; высокую озабоченность в этом смысле вызывают также культуры клеток животных тканей и клеток человека, будучи исключительно благоприятными средами для контаминирующей микрофлоры. 252
Микробы-контаминанты не только могут подавить развитие и функции биообъекта в силу конкуренции и антибиоза, но и дезорганизовать какую-либо ткань — среду выращивания; более того, некоторые из них способны продуцировать токсические вещества, которые могут попасть в целевой продукт (равно как и сами микробы-загрязнители). 6.3. Борьба с микробами-контаминантами в биотехнологиче- ских производствах. Защита биотехнологических процессов от микробов-контаминантов эффективно осуществляется с помощью различных фильтров. В последнее десятилетие широкое распрост- ранение приобрела мембранная фильтрация в целях получения стерильных воздуха и различных жидкостей (разновидность хо- лодной стерилизации). Более того, мембраны нашли применение в рДНК-биотехнологиии, в дисперсионном и других анализах * биомолекул. Многие термолабильные вещества стерилизуют таки- ми же способами. Следовательно, мембранная фильтрация может рассматриваться как самостоятельный (лабораторный или про- мышленный) процесс. В биологической технологии, независимо от условий проведе- ния процессов (поверхностно и глубинно, в периодическом, полу- непрерывном и непрерывном режимах, в виде твердофазных или газофазных процессов, одно-, двух- и полиступенчато), широко используют стерильный воздух, подаваемый: в ферментаторы для аэробных организмов (клеток, клеточных систем); в специальные помещения в виде ламинарных потоков для асептичного приготов- ления лекарственных средств, в боксы и операционные виварии, в распылительные сушилки для высушивания некоторых веществ, в шлюзы между (перед) асептическими блоками. Стерилизующая мембранная фильтрация здесь оказывается наиболее приемлемой. Промышленный выпуск мембранных фильтров был начат с конца 40-х годов текущего столетия. Согласно Р. Е. Кестингу (1971) наиболее распространенными процессами фильтрации являются обычная фильтрация (ее можно назвать макрофильтрацией, Н. Е.), микрофильтрация, ультрафильтрация, диализ (и обратный осмос). Для макрофильтрации применяют обычно бумажные или стеклян- ные фильтры. При этом отделяют частицы, размеры которых находятся в пределах от 1 до 103 мкм. Для других типов фильтрации используют нитроцеллюлозные, ацетилцеллюлозные, поливиниль- ные, полиамидные, фторуглеводородные мембраны толщиной ме- нее 0,1 мкм с высокой степенью пористости и с диаметром пор в 253
пределах от 10'4 до 10 мкм. В случаях микрофильтрации отделяют частицы размерами 2* 10'2—10 мкм, в случаях ультрафильтрации размеры отделяющихся при этом макромолекул находятся в при- мерных пределах от 0,001 до 0,02 мкм, а их молекулярные массы соответствуют 1—1000 кДа. При диализе через мембраны отделяют небольшие молекулы, сопоставимые по размеру с молекулами растворителя (10 3 мкм и менее, или до 1 нм). Здесь вещества разделяются вследствие различных скоростей диффузии через мембрану. Осмос относится к разряду молекулярно-диффузионных про- цессов, когда через мембрану переносится не вещество (из области высокой концентрации в область низкой концентрации), а раство- ритель. Если заставить двигаться растворитель в обратном направ- лении через мембрану, то это и будет обратный осмос. Превысить осмотическое давление в подобных случаях удается с помощью внешнего повышенного давления. Обратный осмос рекомендуют обычно для понижения концентрации молекул или ионов в водных растворах (таблица 28). В случаях стерилизации растворов фильтрованием они должны содержаться перед розливом и при последующем розливе в асеп- тичных условиях. При этом необходимо помнить и следить за тем, чтобы время между началом приготовления раствора и его стери- лизацией фильтрованием должно быть возможно кратким. Для очистки растворов от бактерий-контаминантов в США, например, выпускают в продажу так называемый Criti Сар-капсу- лы, содержащие двойной слой гидрофильной полисульфоновой микропористой (диаметр пор 0,2 мкм) мембраны, обеспечивающей задерживание бактерий при высоком потоке жидкости. Если применяют какой-либо газ для очистки раствора, то он перед использованием должен подвергаться фильтрующей стери- лизации. В случаях, когда целевой продукт в виде раствора или жидкости нельзя стерилизовать упакованным в контейнеры, то его фильтру- ют через стерильный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм. При обнаружении вирусов и/или микоплазм в растворе (жидко- сти), стерилизуемом (-ой) фильтрованием необходимо предусмот- реть возможность использования дополнительного метода стери- лизации (физического или химического). Нельзя применять асбестовые фильтры для стерилизации инъ- екционных лекарственных форм. 254
Т а б л и ц a 28. Некоторые области практического применения мембранной фильтрации Процесс рабочее давление, МПа Проходящие через мембрану вещества Частицы и вещества, задерживающиеся мембраной Области использования Микрофильтрация, 0,05 Вода, растворенные вещества Суспендированные и коллоидные, частицы, бактерии и другие микробы размером более 0,1 мкм Стерилизация растворов в биотехнологичес ких и химико- фармацевти- ческих производствах, в бактериологии, анализах, при разделении веществ Ультрафильтрация 0,5 Вода, растворенные неорганические вещества Бактерии, коллоидные и суспендированные частицы размером более 1O'J мкм, растворенные органич. полимеры с ММ 1 кДа Очистка растворов биополимеров, концентриро- вание, фракциони- рование, освобождение от пирогенов (депироге- низация) 1 Обратный осмос 5 • Вода, растворенные высоко полярные ни зкомолеку- лярные вещества Бактерии, вирусы, суспендированные и коллоидные частицы, растворенные неорганические вещества, органические вещества с ММ 0,2 кДа Концентриро- вание растворов в биотехнологии, глубокое обессоливание воды и т. д. I Любой фильтр, используемый для стерилизующей фильтрации, не должен качественно и количественно изменять конечный про- дукт (в том числе и антибиотическую активность культуральных жидкостей после их стерилизующей фильтрации через батареи фарфоровых свечей). 255
Качество мембран проверяют обычно биологическим методом, используя для этого виды из родов Pseudomonas и Serratia. При всех положительных качествах стерилизующей фильтра- ции через мембраны нельзя не отметить и недостатки этого способа, к которым относятся: адгезия частиц к мембранам, нео- днородность пор по диаметру ("абсолютных" мембран по стерили- зующей эффективности не существует, но стерильность может быть достигнута и достигается вследствие наложения других при- чин, например, адсорбции частиц на мембране), удержание части стерилизуемой дорогостоящей жидкости на мембране при фильт- рации малых объемов ее, а также возможная селективная адсор- бция ионов (чаще — катионов) из небольших объемов растворов, недостаточная или плохая смачиваемость мембран водой и др. К тому же по-прежнему актуальной остается проблема вирусного загрязнения БАВ и очистки БАВ от вирусов. Ситуация, связанная с очисткой биопродуктов от вирусов, обострилась еще и потому, что появилось сообщение о контаминации гормона роста человека, получаемого из гипофиза, "медленным” вирусом болезни Крейтц- фельда-Якоба, и это на фоне возрастающей роли ретровирусов (включая ВИЧ). Как следствие — усилилась настороженность к препаратам из крови, гормонам, экстрагированным из тканей млекопитающих; рекомбинантным белкам, образуемым культиви- руемыми клетками животных. Более того, ряд вирусов животных являются патогенными для человека (зоонозные вирусные инфек- ции). Потенциальная контаминация названных выше продуктов воз- можна из различных источников: от лиц, чьи клетки используются в биотехнологических процессах; от миеломных клеток, применя- емых для получения гибридов; из питательных сред для культиви- рования клеток млекопитающих, из реагентов, используемых для очистки белковых продуктов, например, моноклональные антите- ла; наконец, несоблюдение требований GMP. Принятая проверка инактивации вирусов-контаминантов в био- продуктах заключается в их температурной или химической обра- ботке. Однако эти методы не универсальны. К тому же выявление вирусов базируется не только на дорогостоящих, но и мало чувст- вительных процедурах. Корпорация "MiHipore" разработала тех- нологию так называемой наноселективной фильт- рации с включением вирусудаляющего модуля (Viresolve/70), снабженного уникальной запатентованной мембраной. Эта техно- 256
логия значительно отличается от технологий с использованием ультрафильтрационных мембран, хотя бы, например, тем, что в модуле не предусматривается применение открытой матриксной поддерживающей структуры, а поры уникальной мембраны иск- лючительно малы, благодаря чему проявляются отличные качества ее по задержке вирусов размерами от 23 нм и выше. За этими пределами остаются тогавирусы (18 нм) и вироиды (15 нм). К тому же однообразный матрикс мембраны обеспечивает эффективный поток жидкости и ее физическую стабильность. Модуль предназ- начен для фильтрации белковых растворов. Они (модули) выпу- скаются с мембранами разных размеров, в зависимости от объемов фильтруемых растворов. В промышленном модуле применена мем- брана с площадью 0,92 м2 для фильтрации нескольких сотен литров. Воздух, подаваемый в ферментаторы, должен быть чистым и стерильным. В этих случаях еще используют и другие фильтрую- щие материалы, которыми заполняются общие и индивидуальные (для каждого ферментатора) фильтры, например, из перхлорвини- ла (в фильтрах Петрянова — ФП), стекловаты и др. Профильтро- ванный воздух сжимается в компрессорах, охлаждается в тепло- обменнике, поступает в ресивер (от англ, reciever — емкость), устраняющий пульсации воздуха, из которого через брызгоулав- ливатель проходит общий и индивидуальный фильтры, и только после этого поступает через барботер в культуральную жидкость. Питательная среда перед засевом каким-либо биообъектом также должна быть стерильной. В таких случаях прибегают к тепловой стерилизации, заботясь при этом о сохранении стабиль- ности ингредиентов среды. В микробной биотехнологии обычно используют методы периодической и непрерывной стерилизации. Первую из них осуществляют в аппаратах малой емкости непос- редственно в ферментаторах глухим или острым паром под давле- нием в течение 30—40 мин. при температуре порядка 134°С (2,02650x10s Па) после удаления воздуха из аппарата при нагреве до 100°С. Затем среду охлаждают водой через змеевик или рубашку аппарата и засевают тем или иным биообъектом. Метод непрерывной стерилизации основан на том, что концен- трат питательной среды подают насосом через систему конструк- ций, включающую нагреватель, выдерживатель (собственно сте- рилизатор) и теплообменник (охладитель, в котором охлаждение среды происходит до температуры, оптимальной для культивиро- вания клеток). 9 т. 8524 257
В лабораторных условиях стерилизацию питательных сред и некоторых других объектов осуществляют в автоклавах. Стерили- зацию проводят паром под давлением, соблюдая необходимые режимы (табл. 29). В отдельных случаях прибегают к сухожаровой стерилизаций. Таблица 29. Режимы стерилизации t°, °C Паром под давлением Сухим жаром, I время, мин. [ время, мин. давление, Па (атм.) 121 15 1,01»105/1) — 126 10 l,414»10S (1,4) — 134 3 2.02.105 (2) — 140 — — 180 150 — — 150 160 -г- — 120 170 — — 60 Различные материалы по-разному влияют на рост и развитие биообъектов, к тому же — не все из них можно подвергать автоклавированию (таблица 30). Таблица 30. Влияние некоторых материалов на рост клеток в культурах и возможность их стерилизации паром под давлением (выборочно) Материал Рост клеток, % к контролю Возмо- жность авток- лавиро- вания мате- риала J бактерий микро- водо- рослей в культуре тканей метано- окисля- ющих- других разных расти- тель- ных живот- ных Стекло (контроль) 100 100 100 100 100 Да Дюралюминий Д1АТ — — 85,9 — — Да Оргстекло 40ПБ 100 — 85 97 60-80 Нет Полиэтиленовая трубка 105 133,8 91,4 43 25-30 Нет Резина белая (пищевая) Резина красная 102 5,7 — 184 100 0 100 0 Да Да Резина черная 6,2 0 0 (вакуумная) 110 76,4 92 50 Да Сталь Х18Н10Т 102 — 112,1 93 60-70 Да Фторопласт-4 Хлорвиниловая трубка 132 — 175 0 0 Нет Эпоксидная смола полимеризованная 120 — — 100 — Да Примечание: (-) — данные отсутствуют, (0) — клетки не растут. 258
Из приведенных в таблице 30 данных видно, что лишь немногие перечисленные материалы могут быть использованы в биотехно- логических процессах-, оставаясь нейтральными в отношении био- объектов (резина пищевая, с оговорками — фторопласт). Названные выше методы обеспложивания относят к числу наиболее распространенных, однако, учитывая необходимость сте- рилизации весьма широкого ассортимента различных материалов, приходится прибегать и к другим способам. Этим подтверждается то положение, что универсальных методов стерилизации не суще- ствует. - Термолабильные Материалы, например, не могут подвергаться тепловой стерилизации и тогда можно использовать холодную химическую стерилизацию, или газовую стерилизацию этиленок- сидом (температура его кипения + 12,5°С) Этиленоксид (окись этилена) относится к раз- СН ряду химических веществ, неспецифически губи- X / тельно действующих на различные микроорганиз- О мы — вегетативные клетки бактерий и грибов, бактериальные споры и грибные конидии, вирусы. Стерилизуемые при этом объекты не должны вступать во взаимодействие с этиленоксидом и должны быть нейтральными, хорошо очищенны- ми, при необходимости — продезинфицированными, соответству- юще упакованными. Не рекомендуется использовать для упаковки пергаментную бумагу, стеклянную и металлическую тару, шелко- вые ткани и некоторые другие, не пропускающие этиленоксид. Упаковка должна обеспечивать диффузию газа и водяных паров к стерилизуемому объекту. В упаковку вкладывают индикатор (на- пример, лакмусовую бумагу, изменяющую свой цвет из желтого в синий при достижении стерильности; это — индикатор типа 1—21 производства "Медикор", Венгрия) и сертификат с указанием номера серии стерилизации и гарантийный срок хранения (обычно — в течение Года) в стерильном состоянии, после чего ее помещают в полиэтиленовый пакет. После стерилизации этиленоксидом упаковки выдерживают на предмет испарения газа. Для этого используют проветривание при температуре не ниже 20°С в течение 4—5 суток, удаление газа в рабочей камере циркуляционного парового стерилизатора при 52—55°С в течение 3—4 суток, удаление газа с помощью проточного вакуума (остаточное давление 101—101,2 кПа) при 52—55°С в течение 2-3 суток. Этиленоксид - токсичный газ, поэтому простерилизованные с 259
его помощью объекты и надлежащим образом проветренные хра- нят в специальном помещении. Эффективность такой стерилизации определяется следующи- ми параметрами: концентрацией окиси этилена, давлением смеси газов, влажностью, температурой и временем стерилизации. Сте- рилизацию проводят в специальных газовых стерилизаторах раз- личной емкости (например, 20—25 л) с длительностью разовой стерилизации при этом до 5 часов, поддерживая температуру 50 ± 8°С (323± 8°К) и концентрацию этиленоксида около 750 мг/л (17,04 моль/м3). Запрещается выводить газовую смесь после стери- лизации в вентиляционную шахту; она не должна попадать в другие помещения; ее следует собирать в виде конденсата. В некоторых случаях применяют для стерили- СН2---СН2 зации p-пропиолактон, который отличается высо- I I кой реакционной способностью и, например, лег- q_____ко взаимодействует с аминами и многими другими веществами. В малых концентрациях он губитель- но действует на вирусы, бактерии и грибы, особен- но — при повышении температуры, однако водные растворы его быстро инактивируются при комнатной температуре. Р-Пропио- лактон токсичен для кожи, агрессивен в отношении некоторых металлов и многих пластмасс, в повышенных концентрациях про- являет свойства мутагена. Поэтому в биологической технологии его не следует применять в качестве стерилизующего агента. В лабораторных и производственных условиях иногда приме- няют ультразвуковые установки, например, для мойки посуды (частота звука здесь выше 20000 гц). В случае распространения звука в воздухе за нулевую отметку принимают порог нормальной слышимости 1000 гц. Более высокие величины оценивают в деци- беллах — дц [от франц, decibel — единица акустической (электри- ческой) мощности, равная 0,1 бела и принятая в электроакустике], и если этот показатель выше 100дц, то звук оценивается вредным для людей и от такого звука следует экранировать занятых в соответствующих производствах операторов (особенно — при длительном воздействии). Ультразвук можно использовать для выделения некоторых действующих веществ из растений (напри- мер, алкалоиды), антигенов из некоторых бактерий. Тем не менее, ультразвуковые генераторы не нашли широкого; распространения в биотехнологии, хотя в отдельных исследовани- ях было показано, что с помощью ультразвука можно стимулиро- 260
вать рост клеток, гасить ленообразование в биореакторах при ферментациях и т. д. Для обработки стен некоторых помещений, мебели — можно использоватькатионные поверхностно-активные вещества—ПАВ, проявляющие губительное действие в отношении широкого спек- тра микроорганизмов. Растворы ПАВ можно применять не только для протирания стен и мебели, но, например, в боксированных помещениях заблаговременно распылять в виде аэрозолей (до прихода оператора). Во избежание микробного загрязнения биотехнологических производств используют и специальные меры, как то медицинский осмотр персонала работниками медицинской службы предприятия и СЭС в целях выявления заболевших и носителей патогенной и условно патогенной микрофлоры и для исключения микробного загрязнения ими целевых продуктов; контроль за водоснабжением, особенно — на тех производствах, в которых воду забирают из открытых водоемов; предупреждение попадания микробов в скла- ды готовой продукции — здесь наиболее эффективен способ подачи воздуха через приточные вентиляционные устройства, в которых предусмотрена фильтрация поступающего воздуха в складские помещения. 6.4. Биотехнологические процессы в связи с массообменом. Принято считать, что диффузионные процессы, протекающие в биореакторах, не накладывают заметных ограничений на макси- мально проявляющуюся функциональную активность клеток и клеточных структур; главное при этом — поддержание массооб- мена (и прежде всего — кислорода в системе "газ-жидкость” применительно к аэробным организмам) на оптимальном уровне. При выращивании биообъекта в реакторе образуется сложная система массопереноса О2, а именно - "газ-жидкость-твердое тело", понимая под твердым телом биообъект. Названная тройная система легко расчленяется на три самостоятельные системы: "газ-жид- кость", "жидкость-жидкость" и "жидкость-твердое тело". Это мож- но продемонстрировать следующим образом (рис. 77). Перемещение О2 в этих системах неравноценно по интенсив- ности и зависит от растворимости газа в жидкой фазе, от мощности барботажа, размера пузырьков, скорости вращения вала и формы мешалки, химического состава питательной среды, температуры, толщины невозмущаемых слоев жидкости вокруг газового пузырь- ка и клетки, от наличия и химического состава капсул, толщины и особенностей клеточной стенки и клеточной мембраны биообъ- екта и некоторых других причин. 261
Рис. 77. Системы, образующиеся в биореакторе (8) при массопереносе кислорода (1) из среды (4) в клетку-продуцент (5); 2 — невозмущаемый слой жидкости, 3 — пограничная область раздела фаз "газ-жидкость", 6 — пограничная область раздела фаз "Жидкость-твердое тело", 7 — условный путь перемещения О2 в системе "жидкость-жидкость" от (1) до (5), где он расходуется в биохимических реакциях. Из рис. 77 можно сделать вывод, что зона 2 вокруг клетки может не формироваться в случаях образования ее вокруг пузырька и клетки одновременно. Тогда и путь перемещения О2 от газового пузырька в клетку сокращается, а его содержание в жидкой фазе (4) не будет коррелировать со скоростью поступления его в клетку для поддержания реакций биологического окисления (в ряде слу- чаев О2 выступает химическим реагентом, обеспечивающим био- трансформацию, например, глюкозы в 5-кетоглюконовую кислоту с помощью уксуснокислых бактерий). Следует иметь в виду, что при избытке растворенного кислорода проявляется его токсиче- ское действие на биообъект. Вот почему желателен автоматический контроль за поддержанием оптимальных концентраций О2 в среде для соответствующих культур. Теперь известны РО-статы (прибо- ры для поддержания необходимого уровня растворимого О2), обеспечивающие подобный контроль. Если молекула кислорода приобретает дополнительный (экс- тра-) электрон, то образуются свободные кислородные радикалы: супероксидный (Ог), гидроксильный (НО ) и синглетный кислород ('Оз). Эти радикалы — потенциальные деструкторы липидов, бел- ков, нуклеиновых кислот. В частности, к ним чувствительны кле- точные мембраны, в которых первичной мишенью выступают липиды, протоны которых взаимодействуют с .радикалами и насту- пает так называемая "липидная пероксидация" с образованием пероксидов. Свободнорадикальное повреждение мембраны схема- тично представлено на рис. 78.
Рис. 78. Поперечный срез клеточной мембраны, повреждающейся от свобод- но-радикальных процессов, индуцируе- мых супероксидным и гидроксильными радикалами, синглетным кислородом: 1 — ядро, 2 — нарушенные белковые нити, 3 — перекрестное связывание липидов, 4 — липидно-протеиновое перекрестное связывание, 5 — поврежденный мемб- ранный липид. Известно, что с возрастанием температуры окружающей среды растворимость кислорода в воде уменьшается. Так, например, при 35°С и давлении кислорода в воде 1,01 • 105 Па его растворимость составляет 1,09 ммоля/л или в соотношении 1:28600; при 20°С растворимость возрастает до 1,38 ммоля/л или в соотношении 1:22640; при 14°С в воде растворяется 1,5 ммоля/л О? или в соотношении 1:21000. В одномолярном растворе натрия хлорида при 25°С растворяется 0,89 ммоля О?/л или в соотношении порядка 1:35000. Таким образом, для переноса кислорода из одной фазы в другую (см. рис. 77) необходимо добиться разницы его концентрации в разных фазах с преобладанием в направлении слева направо, то есть от газового пузырька к клетке. Но поскольку растворимость О2 в воде и водных растворах мала, постольку необходимо подавать его в биореактор в несколько повышенных количествах, добиваясь указанной разницы в фазовых системах. При этом достигается некая критическая концентрация кислорода в культуральной сре- де, когда все аэробные клетки насыщаются Ог- Для клеток микро- организмов показатели таких концентраций приходятся на диапа- зон 0,003—0,05 ммоля/л (примерно 0,1—10% наибольшей раство- римости О2 в воде) или, применительно к воздуху, от 0,5 до 50%-го насыщения. Так, для клеток кишечной палочки кри