ЖАН ХИРЦ
АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ
МЕТАБОЛИЗМА
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ
/
ПЕРЕВОД С ФРАНЦУЗСКОГО
ПРОФЕССОРА С. И. БАЛУЕВА
МОСКВА • «МЕДИЦИНА» -1975
Глава II
▲МИНЫ
Метаболизм многих аминов уже описан, но большинство из них
не является лекарственными веществами. Рассмотрим последовательно
алифатические амины, затем моноамины, диарилалкиламины и, нако-
нец, различные аминосоединения.
АЛКИЛАМИНЫ
Метаболизм бутинамина, обладающего гипотензивными свойст-
вами, был исследован McMahon и Easton [585] на крысах и человеке
с помощью вещества, меченного 14С по N-метильной группе, что позво-
лило изучить его N-деметилирование. Наряду с определением выделяе-
мого радиоактивного СОг производилась тонкослойная хроматография
на силикагеле (бутанол : уксусная кислота : вода 3:1:1), позволившая
выделить бутанамин и N-метилбутинамин.
СН3 СН3 СН3
НС = С — С — N— С — СН3
I	I
сн3	сн3
Бутинамин
Peets и Buyske [704] исследовали метаболизм двух изомеров ( + )
и (—) этамбутола, применив производные с меченными ИС двумя
углеродами этилендиамина.
ОН —СН2 —CH —NH —СН2 —СН2 —NH—СН —СН2 —ОН
I	I
С2н5	С2Н5
Этамбутол
Необработанная моча собаки подвергалась противоточному распре-
делению (бутанол: уксусная кислота : вода 4:1:5; бутанол : аммиак:
вода 4: 1 :5—220 переносов), что позволяет получить наряду с неизме-
ненным исходным веществом два метаболита. Различные соли мочи
влияют на перемещение соединений во время их распределения, поэто-
му их идентификация не может быть вполне достоверной; для подт-
верждения проводится хроматографирование на бумаге.
Установлено, что первый метаболит соответствует этилендиимино-
2,2-димасляной кислоте, которая, будучи синтезирована, мигрирует на
бумаге в пяти различных системах растворителей, так же как и мета-
болит. Кроме того, гидроксамовые производные подлинного вещества
и метаболита имеют одинаковые значения Rf. Второй метаболит, по-
25
видимому, является альдегидом и при окислении превращается в упо-
мянутую выше кислоту. Кроме того, обработка этамбутола перекисью
водорода приводит к образованию двух веществ, соответствующих
обоим метаболитам.
Эта работа была дополнена ферментативными исследованиями.
Этамбутол инкубировался с различными разведениями алкогольдепидро-
геназы в присутствии НАД при pH 8,0.’ За образованием НАД-Н2 сле-
дят по измерению абсорбции при 340 нм. Кроме того, печень крыс го-
могенизируется в 0,25 М растворе сахарозы и центрифугируется в
течение 15 мин при 9000 g. Дальнейшее центрифугирование над-
осадочной жидкости в течение 6 мин при 105 000 g позволяет полу-
чить осадок из микросом и надосадочную жидкость, содержащую
/ растворенные ферменты. При инкубации этамбутола с той или другой
из этих двух фракций в присутствии НАДФ образуется альдегид, со-
ответствующий по противоточному распределению и по данным хрома-
тографирования на бумаге второму метаболиту.
В этих исследованиях in vitro авторы применили в газовой фазе
этамбутол, меченный 3Н, специфическая радиоактивность которого была
выше, чем у препарата, меченного I4C. Peets с соавторами [705] изучили
метаболизм у человека этамбутола, меченного 14С. Метаболиты, нахо-
дящиеся в моче, выделяются путем противоточного распределения необ-
работанной или лиофилизированной мочи (бутанол : аммиак : вода
4:1:5, 200—220 переносов) и идентифицируются методом хроматогра-
фии на бумаге (бутанол : уксусная кислота : вода 4:1:5; бутанол : ам-
миак : вода 4:1:5; изопропанол : аммиак : вода 4:1:5), Выявляются,
таким образом, два метаболита, идентичные тем, которые выделяются
у собаки.
МОНОАРИЛАЛКИЛАМИНЫ
Большинство работ, рассматриваемых в этом разделе, касается
амфетамина, выделение с мочой которого исследовал с 1938 г. Richter
~ СНз “ СН ” NHa
СН3
Амфетамин
1761], применивший для этой цели колориметрическую методику с ис-
пользованием пикриновой кислоты. В 1940 г. Jacobsen и Gad [451]
провели исследования по этой же методике, выделив предварительно
амфетамин путем перегонки с водяным паром.
Harris с соавторами [405] заменили перегонку адсорбцией на окиси
магния метаболитов, содержащихся в моче. Веуег и Skinner [84] полу-
чили комплексное соединение красителя, состоящего из амфетамина и
хлорида паранитробензолдиазония. Эта методика, дополненная очист-
кой перегонкой, позволила McNally с соавторами [589] производить
количественное определение амфетамина в моче, крови и тканях. Kel-
ler и Ellenbogen [500] затем использовали методику Броди с соавто-
рами [139] с применением метилового оранжевого.
Следует отметить, что Axelrod первым предпринял крупные иссле-
дования метаболизма амфетамина и N-метиламфетамина [36], а также
эфедрина и норэфедрина [35]. В этих работах использовалась одна и
та же техника исследования. Основания экстрагируются бензолом из
мочи или подщелоченной плазмы и определяются колориметрическим
26	'
методом с метиловым оранжевым. Оксиамфетамин выделяется этиловым
эфиром при pH 9,0—10,0, оксиэфедрин (или норэфедрин)—изоамиловым
спиртом. Оксиамфетамин определяется колориметрически с помощью
СНз ~ сн ~ NH ~ снз
-	СН3
N-метил амфетамин
нитрозо-|}-нафтола, а оксиэфедрин и оксинорэфедрин — при использо-
вании амино-4-антипирина и феррицианата калия. В этих работах Axel-
rod изолирует и идентифицирует различные вещества и их парагидро-
ксильные метаболиты путем противоточного распределения. Кривые
распределения, дополненные данными хроматографирования на бумаге
в случае амфетамина (бутанол : уксусная кислота : вода 5:4:1) или
элементным анализом, УФ- и ИК-спектроскопией для эфедрина, позво-
ляют с полной достоверностью установить природу выделяемых ве-
ществ.
Axelrod 137] исследовал метаболизм амфетамина in vitro, использо-
вав ту же аналитическую технику; кроме того, он смог показать обра-
зование фенилацетона, получив его динитрофенилгидразон.
Asatoor с соавторами [32] изучили метаболизм амфетамина у чело-
века и крыс методом хроматографии на бумаге, комбинируя с опреде-
лениями неизмененного вещества с помощью метилового оранжевого, а
параоксиамфетамина — экстракцией эфиром в щелочной среде и коло-
риметрией с нитрозо-р-нафтолом. Динитрофенильные производные
амфетамина, приготовленные по методу Эсэтура и Керра [33], подвер-
гались хроматографированию на бумаге, пропитанной жидким парафи-
ном по способу, предложенному Эсэтуром [30]. Амфетамин и окси-
амфетамин могут быть также выделены непосредственно методом двух-
мерной хроматографии (I — изопропиловый спирт : аммиак : вода
8:1:1; II — бутанол: уксусная кислота:вода 12:3:5). Фенолокислоты
исследуются методикой двухмерной хроматографии, предложенной
Armstrong с соавторами [29]. Фенилацетон осаждается в виде динитро-
фенилгидразона по способу Ель Масри с соавторами [307] и хрома-
тографируется на бумаге в системе инверсированных фаз по Эсэ-
ТУРУ [31].
Young и Gordon [1037] проследили во времени судьбу амфетамина,
меченного 14С, в головном мозге крыс. Хроматографирование на бумаге
в различных системах растворителей показало, что радиоактивность,
которая обнаруживается в мозге между 30-й и 60-й минутой после па-
рентерального введения препарата, вызвана в основном неизмененным
амфетамином. Отсутствие параоксиамфетамина доказывается по отсут-
ствию активности фракции, полученной экстракцией эфиром при pH 9,0.
Ellison с соавторами [305, 306] провели параллельные исследования
метаболизма амфетамина у человека, крысы, собаки и обезьяны с по-
мощью препарата, меченного 14С в алифатической цепи. Неизмененное
вещество и его метаболиты выделяются методом хроматографии на бу-
маге (88% муравьиная кислота : изоамиловый спирт : третичный амило-
вый спирт: вода 2:5:5:10). Три метаболита идентифицированы с по-
мощью их разделения в различных системах растворителей и по ИК-
спектрам: это параоксиамфетамин, свободный и связанный с глюкуро-
новой кислотой, а также в небольшом количестве гиппуровая кислота.
Глюкуронид количественно гидролизуется p-глюкуронидазой в течение
27
24 ч при 37° и pH 5,0. Такого же рода исследование было проведено у
человека Baltes с соавторами [48].
В 1966 г. Dring, Smith и Williams [278] провели подробное сравни-
тельное изучение метаболизма амфетамина у человека, крысы, кролика
и собаки. Они использовали меченое вещество (а-метил, [р—иС]-фе-
нилэтиламин) и выделили метаболиты методом хроматографии на бу-
маге (техника не описана). Идентификация производится путем изотоп-
ного разведения. Продукты связывания гидролизуются нагреванием
мочи в течение 2 ч при 100° с таким же объемом 10 н. раствора соляной
кислоты. Таким образом, указанные авторы обнаружили и опреде-
лили наряду с. амфетамином и его парагидроксильным производным
фенилацетон, фенил-1-пропанол-2 и бензойную кислоту. Эти соединения
соответствуют, в зависимости от вида животного, 56—82% дозы вве-
денного вещества.
Eberhardt и Debackere [289] производят экстракцию мочи, содержа-
щей амфетамины или N-метиламфетамины и их метаболиты, обработ-
кой ее при pH 9,0—10,0 смесью метилацетата и эфира, затем проводят
тонкослойную хроматографию на силикагеле (диметилформамид: этил-
ацетат 1:9).
Амфетамин можно выявить в моче, слюне или крови лошадей мето-
дом тонкослойной хроматографии на силикагеле GF 254 смесью бута-
нол : уксусная кислота: вода. Debackere с соавторами [246], развивая
эту методику, изучили также in vitro метаболизм двух энантиомеров
' амфетамина, определяя их по способу Аксельрода [36].	,
Goldstefn и Anagnost [75] наблюдали у крыс и другую реакцию
превращения амфетамина, а именно ( + ) параоксиамфетамин подвер-
гается p-гидроксилированию, переходя в ( + ) параоксинорэфедрин.
После введения крысе амфетамина, меченного 3Н, органы гомогенизи-
руются в 0,4 н. рдстворе хлорной кислоты, амины фиксируются на
колонке Даукс 50Х-8 и элюируются с помощью 2 н. раствора соляной
кислоты при введении веществ-детекторов. Параоксинорэфедрин иден-
тифицируется методом хроматографии на бумаге (толуол : этилацетат :
метанол : вода 9 : 1 : 5 : 5).
При определении амфетамина методом газовой хроматографии
Встречаются, так же как и со всеми аминами, различные трудности:
растянутый пик выходной кривой, частично необратимая адсорбция на
носителе. В связи с этим рекомендуется работать с производными ве-
щества.
Horning с соавторами [432], а также Brooks и Horning [1401 изу-
чили несколько из них. Согласно первой методике, предложенной Bec-
kett и Rowland [62], амфетамины изолируются перегонкой с водяным
паром из подщелоченной мочи и собираются в солянокислый раствор.
Так как одновременно пропускается аммиак, хлоргидрат амфетамина
отделяется от хлорида аммония экстрагированйем хлороформом. Хло-
роформ предварительно очищается нагреванием в течение 12 ч амфе-
тамин-основанием и стабилизируется 2% этанолом для исключения
карбонильных производных, которые реагируют с амфетамином. Амфет-
амин, выделенный триэтиламином, превращается в свое производное
в растворе ацетона и 10% воды. Газовая хроматография на колонке
Целита 545 с 10% полиэтиленгликоля 6000 и.5% карбоната калия
позволяет определить от 1 до 6 мкг амфетамина в 1 мл мочи с выхо-
дом 100±5% при использовании внутреннего стандарта.
Эта методика была усовершенствована и упрощена теми же авто-
рами [63]. Слабо подкисленная моча обрабатывается эфиром, затем
28
сильно подщелачивается и амфетамин экстрагируется эфиром. Скон-
центрированный экстракт непосредственно определяется методом газо-
вой хроматографии. Применение, щелочной основы и ее обработка in
situ гексаметилдизилазаном позволяет получить симметричные пики вы-
ходной кривой, не прибегая к N-аминному производному. Никакого
наложения кривые не отмечается. Стандартная кривая прямолинейна
для концентрации 0,1 и 10 мкг в 1 мл мочи. Выход составляет 100±
±5%, а чувствительность методики достигает 0,1 мкг/мл.
Можно легко идентифицировать амфетамин и отличить его от N-
метиламфетамина благодаря тому, что, образуя N-аминное производ-
ное, его период удерживания увеличивается на 10%, в то время как у
N-метиламфетамина он остается неизмененным. Прямое разделение
смеси амфетамин — N-метиламфетамин не дает удовлетворительных ре-
зультатов, но с их N-аминными производными удается получить хоро-
шие промежутки между пиками. Можно также отделить р-фенилэтил-
амин от амфетамина и N-метиламфетамина в виде N-аминного произ-
водного, время удерживания которого на 60% больше, чем основания.
Эти методики были широко использованы при исследовании мета-
болизма амфетамина и его выделения в зависимости от pH мочи. Bec-
kett с соавторами 1641 показали, что никотин у курильщиков дает пик,
отличный от амфетамина, в то время как оба этих вещества опреде-
ляются вместе колориметрической методикой с метиловым оранжевым.
Подобная методика была опубликована Beckett и Wilkinson 1651
для эфедрина и близких к нему соединений. Реакция с ацетоном поз-
Н Н
С —С —СН,
ОН
(зн
Эфедрин
н н
А — С — СН3
ОН
он н
сн3
Псевдоэфедрин
н н
сн3\н3
Метилэфедрии
Норэфедр ии
воляет отделить эфедрин от псевдоэфедрина, основания которых обла-
дают одинаковым временем удерживания 0в) (табл. 6).
Таким образом, удается определить от 5 до 100 мкг основания в
1 мл мочи.
Таблица 6
Вещество	tR, МИИ.	
	основание	N-амии
Эфедрин	8,2	4,2
Псевдоэфедрин	8,2	3,6
Норэфедрнн	11,3	4,0
Норпсевдоэфедрин	10,5	4,2
Метилэфедрии	6,8	6,8
99
Наконец, Thompson и Smith [902] получили удовлетворительный пик
амфетамина, непосредственно вводя в хроматограф подкисленную мо-
чу. Колонка содержала хромосорб W, на 10% пропитанный 85% кар-
бонатом калия и на 10% —апиезоном L. Этой колонке предшествовала
маленькая колоночка из хромосорба W, на 20% пропитанного 85% кар-
бонатом калия, на которой амфетамин освобождался от своих солей;
2 мкл мочи вводятся непосредственно в предварительную колонку, ко-
торая регенерируется перед каждым анализом 4 мкл концентрирован-
ного раствора аммиака.
Из подщелоченной аммиаком мочи Hall и соавторы [393] экстраги-
руют амфетамин или N-метиламфетамин сероуглеродом, превращая
таким образом амин в его изотиоцианид. Затем это производное хрома-
тографируют в газовой фазе при 118° на колонке из хромосорба G,
промытого кислотой, обработанного диметилхлорсиланом и пропитан-
ного 2% SE 30.
Cartoni и De Stefano [195] выделяют-амфетамин и N-метиламфета-
мин из мочи крыс эфиром при щелочном значении pH, разделяют и
определяют их методом газовой хроматографии (капиллярная колонка,
карбовакс) при 120°. Граница чувствительности соответствует 1 мкг с
ошибкой менее 5%. После введения N-метиламфетамина 5,5% выделя-
ются в неизмененном виде и приблизительно 1 % — в виде амфетамина.
Gordis [379], наконец, удалось осуществить разложение оптических
изомеров амфетамина методом газовой хроматографии. Агентом раз-
ложения является хлорид трифторацетил-Ь-пропила. Бензольный рас-
твор рацемического амфетамина нагревается в течение 1 мин вместе с
реактивом и затем нейтрализуется трибутиламином. Изомеры отделя-
ются на колонке Газ Хром Р с 3% SE 30 при 175°. Можно также полу-
чить эти производные, смешав реактив и раствор амфетамина в шприце
перед введением. Эта техника позволила показать, что после введения
того или другого изомера амфетамина человеку не происходит их раце-
мизации.
Eberhardt с соавторами [290] исследовали фентермин и его мета-
болиты в моче человека, покончившего самоубийством; они производи-
ли экстракцию эфиром и хроматографировали в тонком слое силика-
геля (диметилформамид : этилацетат 1:9).
Dubnick с соавторами [280] изучили распределение хлорфентермина
в организме мышей, проводя определения методикой с метиловым
СН,
Cl/~ S— СН2 — С — NH2
।
сн3
Хлорфентермин
оранжевым, дополнив ее перераспределением между фосфатным буфе-
ром 0,1 М при pH 7,4 и бензолом, а затем и хроматографированием на
бумаге. Таким образом, им удалось показать, что неизмененное вещест-
во накапливается в головном мозге.
30
Метаболизм мефентермина исследовали Walkenstein с соавторами
19651 методом хроматографии на бумаге меченого вещества. При ис-
СН3	7
— СН2 —i —NH —СН3
СН3
Мефеитермии
пользовании в качестве растворителя бутанол : уксусная кислота : вода
4:1:5 получается не очень удовлетворительное разделение:
мефентермин	0,76
параоксимефентермин	0,78
десметилмефентермин	0,79
параакаидесметилмефенте|рм,ин 0,68
Удается различить производные главным образом благодаря реак-
циям окрашивания <с бромкрезоловым зеленым, диазотированной суль-
фаниловой кислотой и диазотированным паранитроанилином.
Метаболизм фенфлурамина изучен Duhault и Fenard [283] также
методом хроматографии на бумаге. Метаболиты извлекались хлоро-
формом из подщелоченной мочи или плазмы. Растворителем являлась
смесь толуол : бутанол : уксусная кислота : вода 2 : 2 : 1 : 1. Для выявле-
ния веществ использовались различные реактивы: бромкрезоловый зе-
леный, реактив Драгендорфа, нингидрин, нитропруссид натрия+ацетон
(реактив для обнаружения вторичных аминов), что позволяет разли-
чить соединения с близкими значениями Rf (табл. 7).
Таблица 7
Вещество
Фенфлурамин
Метатрифлуорометил-фенил-
изопропиламин у
N-этил-фенилизопропиламин
Амфетамин
Параоксиамфетамин
Rf
0,84
0,79
0,80
0,71
0,64
CF.
СН2 —- СН — NH — С2Н3
сн3
Фенфлурамин
Alieva 119] провела сравнительное исследование метаболизма тра-
нилципромина и амфетамина методом хроматографии на бумаге. Оба
вещества, меченные 14С в a-положении бензольного кольца, вводились
крысам. Моча хроматографировалась без предварительной обработки.
СН — СН — NH2
сн2
Траиилципромии
Получаются шесть пиков радиоактивности в системе изоамиловый
спирт: третичный амиловый спирт: вода* муравьиная кислота. Главный
31
(Rf 0,88) из этих пиков соответствует гиппуровой кислоте со следами
бензойной кислоты, о чем свидетельствует проявление в насыщенном
бутаноле' аммиак-карбонатоаммониевым буфером 1,5 н. Наличие гип-
пуровой кислоты подтверждается экстракцией эфиром, хроматографи-
ей на бумаге и образованием его анилида. При этой технике глюкуро-
ниды оксипроизводных не мигрируют и не были изучены. Интерес этой
работы заключается в том, что в ней было показано раскрытие цикло-
пропанового кольца.
Выделение с мочой различных фенилалкиламинов, вызывающих ано-
рексию, изучалось Opitz и Weischer [6941. Эти амины превращают в их
динитрофенильные производные, экстрагируют с помощью циклогекса-
на и отделяют от динитрофенильных производных нормальных компо-
нентов мочи методом тонкослойной хроматографии в силикагеле (кси-
лол; несколько последовательных проявлений). Выделенные вещества
элюируются метанолом и определяются спектрофотометрически.
Параоксифентермин отделяется таким образом от действующего начала
смесью бензол : хлороформ 5 : 1 (экспериментальные данные, касающие-
ся аналитической техники, были опубликованы только в 1967 г.).
Хроматографирование на бумаге или в тонком слое симпатомимети-
ческих аминов может быть осложнено явлением подразделения пятен.
Этот вопрос стал предметом точных исследований, которые изложены в
главе, посвященной аминофенолкатехоламинам.
Метаболизм прокаина (новокаина) прост и легкодоступен аналити-
ческим исследованиям. В последние 40 лет ему были посвящены много-
H2N —Z	СОО — СН2 — СН2 — N '
VsHs
Прокаии
численные исследования, большинство которых не представляло хими-
ко-аналитического интереса. Прокаин исследовался в 1948 г. Brodie с
соавторами [134]. Они выделили неизмененный прокаин дихлорэтаном,
снова его экстрагировали из кислого раствора и определяли .колоримет-
рически по реакции диазосочетания. Метаболитами являются диэтил-
аминоэтанол и парааминобензойная кислота, которые идентифицируются
путем сравнения их коэффициентов распределения в дихлорэтане; вода
при разных pH с образцами чистых веществ. Диэтиламиноэтанол после
экстракции дихлорэтаном определяется методом с метиловым оранже-
вым, а парааминобензойная кислота после гидролиза — колориметри-
чески по реакции диазосочетания. Опыты in vitro показали наличие в
плазме фермента, быстро гидролизующего прокаин.
Техника диазотирования была возобновлена Morvillo и Garattini
1646]. Они разделяли красители, полученные от парааминобензойной
кислоты, парааминогиппуровой кислоты и прокаина, экстрагируя вод-
ный раствор эфиром при pH 2,0 и pH 10,0. Ацетилированные соединения
гидролизуются 2 н. раствором соляной кислоты в течение 1 ч при 100°.
По данным Makisumi с соавторами [592], ’ метаболиты прокаина
могут быть разделены электрофорезом на бумаге. Shlyakhman с соав-
торами [841] вводили крысам прокаин, меченный 14С по карбоксилу.
Моча анализировалась методом хроматографии на бумаге (бутанол:
вода: муравьиная кислота 75:20:5); при этом выявлялось четыре ме-
таболита.' После введения меченого гликокола и немеченого прокаина
удается обнаружить восемь радиоактивных соединений, четыре из кото-
рых соответствуют предыдущим.
32
Kaiser с соавторами 1478] исследовали выделение с желчью прокаи-
на и его метаболитов. Они перфузировали изолированную печень и ис-
пользовали прокаин, меченный 14С. Пять соединений, которые разде-
ляются хроматографическим методом (техника не описана), находятся
в желчи, в том числе прокаин, парааминобензойная и парааминогип-
пуровая кислоты.
ДИАРИЛАЛКИЛАМИНЫ
Метаболизм и выделение орфенадрина исследовались на крысах.
Hespe с соавторами [421] работали в основном с соединением, мечен-
ным 3Н mo СН. Моча, желчь'и ткани подщелачивались и экстрагирова-
СН3
СН — О — СН2 — СН2 —
СН3
Орфенадрин
лись в течение 4—8 ч эфиром, дихлорэтаном или гептаном. Экстрак-
ты хроматографировались на бумаге (бензол : вода : бутанол : уксусная
кислота 9:9: 1 : 1) или в тонком слое силикагеля (бутанол и 2% кон-
центрированного раствора аммиака) (табл. 8).
Таблица 8
Вещество		
	хроматография на бумаге	тонкослойная хроматография
Орфенадрин	0,85—0,95	0,50—0,55
N-деметилорфенадрин	0,85—0,95	0,30—0,35
Ь[,М-дездиметилорфеиадрин	0,85—0,95	0,38—0,43
Метил-2-бензгидрол	0,30—0,50	0,65—0,75
С меченым действующим веществом хроматограммы подвергаются
определению радиоактивности. С немеченым веществом применяется
колориметрическая методика с метиловым оранжевым. Так как она не
позволяет различить орфенадрин от его деметилированных метаболи-
тов, то она была дополнена следующим образом. Салицилальдегид
реагирует с М,1Ч-дездиметилорфенадрином, что позволяет получить сум-
му орфенадрин + N-дезметилорфевадрин. Ацетангидрид реагирует с
двумя N-дезметилированными метаболитами, что позволяет определить
только один орфенадрин. Наконец, очень маленькие количества мета-
болитов в крови могут быть определены путем флуорометрии комплек-
сов, которые они образуют с тинопал GS.
Метаболизм метадона исследован более широко. Way с соавторами
[981] вначале определяли метадон в крови, кале и моче методом с ис-
пользованием метилового оранжевого, предложенным Brodie с соавто-
рами [139]. Мешающие вещества удаляются двукратным промыванием
дихлорэтаном в фосфатном буфере 0,5 М при pH 7,0. Путем противоточ-
ного распределения проверяется, что изолированное таким образом ве-
щество действительно является чистым метадоном.
Rickards с соавторами [762] подвергли критике эту технику из-за ее
недостаточной специфичности. Они предложили осуществлять обработ-
3 Жан Хирц	33
ку тканей путем нагревания с концентрированным
(вместо трихлоруксусной кислоты), экстрагировать
и определять метадон колориметрическим методом,
зования его динитрофенильного производного.
/СО — СН2 — СН8
Лх	/СН3
у \СН2 —CH —
Х=/	I \сн3
СН3
Метадон
раствором щелочи
основания эфиром
посредством обра-
Way с соавторами [979] продолжили свои исследования, применив
противоточное распределение, благодаря чему удалось показать, что
препарат выделяется с мочой в неизмененном виде, а с калом — в виде
метаболитов, идентифицировать которые не удалось.
Метаболизм метадона рассмотрен Vidic [960]. Экстракция мочи
органическим растворителем при pH 9,1 и хроматографирование на бу-
маге (бутанол: муравьиная кислота: вода 12 : 1 :7) выявляют один ме-
таболит, который отличается от исходного вещества несколько иным
значением Rf и реакцией с диазотированной сульфаниловой кислотой.
После диазотирования или метилирования экстракт мочи не дает боль-
ше этой цветной реакции. Больше того, реактивы первичных аминов
дают положительные реакции на хроматограммах. Таким образом,,
можно прийти к выводу, что произошло N-деметилирование, не прибе-
гая специально к выделению метаболитов.
Axelrod [38] также указывает на N-деметилирование метадона фер-
ментами печени: метаболит реагирует с нингидрином и во время инку-
бации выделяется формалин.
Pohland с соавторами [714] синтезировали циклическое соединение,
образующееся в результате дегидратации гемицеталической формы N-
деметилметадона. Они показали с помощью хроматографирования на
бумаге, что оно идентично метаболиту, полученному либо в результате
воздействия ферментов in vitro, либо у собаки.
Schaumann [801] обнаружен другой метаболит метадона после его-
инкубирования со срезами печени. Оказалось, что это производное чет-
вертичного аммония — N-метилметадон. После экстракции метадона
бензолом при pH 5,0 этот метаболит может быть определен с помощью
метилового оранжевого. Он был идентифицирован путем кристаллиза-
ции одной из его солей и сравнением с подлинным веществом. N-метил-
метадон соответствует, вероятно, одному из метаболитов, не идентифи-
цированных Vidic [960].
McMahon с соавторами [584] исследовали ацетилметадон и синтези-
ровали его производные, меченные 14С в положении 1 и по N-метилу, а
также соответствующие дезметилированные соединения. Метаболиты
Экстрагировались хлороформом из мочи или желчи при pH 10,0 и под-
вергались хроматографированию в тонком слое силикагеля в различных,
системах растворителей. Их идентифицировали, добавляя нерадиоак-
О—СО—СНз
ZA	СН—СН2-СН3
\=/\с/	СН3
Vх \сн2—CH—Nx
I \сн3
сн3
Ацетилметадон	1 '
34
тивный метчик, проявляли колориметрически, определяли по их радио-
активности после отделения соответствующей зоны. Эти исследования
были дополнены опытами in vitro, в которых использовались препара-
ты печени нормальных крыс или крыс, которым вводили фенобарбитал
(50 мг/кг внутрибрюшинно в течение 4 дней) для усиления их фермен-
тативной активности.
Судьба пропоксифена в организме изучена Lee с соавторами [5471.
Выделение исследовалось у крыс с помощью вещества, меченного 14С по
/О—СО—СН2—СН3
г-г X	/СНз
/А гм хсн-ch2-n;
\_/“СНз I	\снз
сн3
Пропоксифен
N-метилу, и на людях с нерадиоактивным препаратом. В последнем
случае общее количество выделяемого вещества определялось колори-
метрическим методом по реакции с метиловым оранжевым. Метод опре-
деления неспецифичен — исследование распределения в противотоке
выявило два соединения, реагирующих с метиловым оранжевым. В свя-
зи с тем что при инкубировании со срезами печени крыс образуется
радиоактивный СОг, можно предположить, что деметилирование являет-
ся основным путем метаболизма. Это предположение подтверждается
тем, что увеличивается количество вещества, реагирующего с фторди-
нитробензолом во время инкубации.
Из мочи человека удается изолировать метаболит путем экстракции
четыреххлористым углеродом при pH 9,0 и образованием динитрофе-
нильного производного. Метаболитом является дезметилпропоксифен,
как об этом свидетельствует его ИК-спектр и данные элементного ана-
лиза.
Метаболизм был подтвержден Amundson и соавторами [23] мето-
дом хроматографирования в тонком слое силикагеля; лекарственное
вещество и его метаболит были разделены в системе метанол, насыщен-
ный аммония хлоридом: метанол 1 :2. Никакого дифференциального
определения не проводилось.
Метаболизм дибенамина исследовался Axelrod с соавторами 1401.
Они показали, что образующийся метаболит является дибензиламином,
а не соответствующим спиртом (М,М-дибензил-0-оксиэтиламин), как это
сн,ч
J>N-CH2-CH2-C1
\_/“сн’	. .
Дибеиамин
предполагали раньше. Дибенамин экстрагируется гептаном при pH 3,0
из биологического материала и определяется с помощью метилового
оранжевого. Дибензиламин экстрагируется при pH 7,0 и также опреде-
ляется с помощью метилового оранжевого. Этот метаболит изолируется
путем противоточного распределения. Его можно охарактеризовать по
составу, температуре плавления, УФ-спектру и образованию его бензил-
сульфонильного производного.
Brodie с соавторами [124] исследовали очень близкое соединение —
феноксибензамин, которое проявляет себя аналогичным образом и прев-
ращается в М-феноксиизопропил-М-бензиламин, как было показано
сходными техническими приемами. .	• -	.	-	'
3*
Smith и Grostic [854] кратко сообщили, что ими были изолированы
четыре метаболита М-(о-аминофенил) М-(диметиламино-3-пропил)-ме-
тилантранилата методом тонкослойной хроматографии. Они их иденти-
/~Ъ-сн2х
^N—СН,—СН,—С1
2~°“СН2—сн/
СН3
Фенокснбензамин
фицировали с помощью масс-спектрометрии и ПМР, а также путем
сравнения с синтезированными соединениями.
РАЗЛИЧНЫЕ АМИНЫ
Превращения in vivo амитриптилина изучены Hucker 1434, 438],
который не сообщил данных о методиках, использованных им для изо-
лирования и идентификации дезметиламитриптилина и гидроксильных
производных в 10 и 10,11 положениях и их глюкуронидов.
СОО—СН3
/СН,
:N—СН2—СН2—СН2—
хсн,
\NH2
Ы-(0-аминофенил)Ы-(диметиламиио-3-пропил)’Метилантранилат
II	/СН3
СН—СН2—СН2—N'
Амитриптилин
Cassano с соавторами [196] вводили амитриптилин, меченный 14С,
и производили экстрагирование хлороформом мочи и желчи при pH
9,0—10,0. Действующее начало отделяли от его моно- и дездиметилиро-
ванных производных методом хроматографирования в тонком слое флу-.
оресцирующего силикагеля (бензол: диоксан: аммиак 60:35:5).
Нортриптилин явился предметом исследований McMahon с соавто-
рами [587], которые использовали соединение, меченное 14С по N-мети-
СН—СН2—СН2—NH—СН3
Нортриптилин
лу. Это исследование состояло из раздела чистой радиохимии: выделе-
ние 14СО2, радиоактивность различных тканей, суммарное выделение с
желчью и мочой, поиск метаболитов в моче. Метаболиты не могут
быть непосредственно экстрагированы из мочи, но после гидролиза с по-
мощью глюзулазы (р-глюкуронидаза +сульфатаза) они переходят в
изоамиловый спирт при pH 11,0. Предварительно проведенное хромато-
36
графирование в тонком слое силикагеля (этанол: этилацетат 1:1) поз-
воляет выявить основной метаболит с небольшим значением Rf и пока-
зать, что практически отсутствует нортриптилин или N-ацетилнортрип-
тилин.
Метаболиты подвергаются затем ацетилированию и последующему
мягкому гидролизу для удаления О-ацетилированных соединений, кото-
рые могли образоваться. Только N-ацетилированные производные хро-
матографически разделяются на колонке окиси алюминия. Путем элюиро-
вания растворителем бензол : этилацетат 4 : 6 удается получить первый
метаболит, а смесью этилацетат: этанол 20: 1 выделяется второй ме-
таболит.
УФ, ИК-спектрофотометрия этих двух метаболитов, воздействие ще-
лочной среды на их УФ-спектры, получение О, N-диацетилированных
производных и их мягкий гидролиз позволяют прийти к выводу, что оба
соединения идентичны и являются цис- и трансизомерами окси-10-норт-
риптилина.
Amundson и Manthei [24] изучили метаболизм нортриптилина у че-
ловека, в то время как McMahon исследовал его у крыс. С помощью
хроматографирования в тонком слое силикагеля (изопропанол: вода
88:12 на ]/з насыщенный натрия хлоридом) удается выделить четыре
метаболита из эфирного экстракта подщелоченной мочи. Основным из
них является, по-видимому, окси-10-нортриптилин, остальные не были
идентифицированы. Указанные авторы спектрофотометрией суммарно
определили нортриптилин и его метаболиты.
Drabner с соавторами [276] экстрагировали мочу хлороформом и
проводили хроматографирование в тонком слое и на бумаге. Тонкий
слой состоит из силикагеля с 13% карбоната кальция, а проявляющий
раствор — из метанола и хлороформа 1 :2. Для хроматографирования
Z\Z=\/S
I I !
СН2—СН2—СН2—сн2—сн2—он
Опипрамол
на бумаге используется система с кислой реакцией — бутанол: муравьи-
ная кислота или щелочная система — бутанол, насыщенный 5 н. раст-
вором аммиака. С помощью хроматографирования в тонком слое выяв-
ляются два метаболита, а хроматографированием на бумаге — только
один. Та же техника, примененная к опипрамолу, позволяет выявить
шесть метаболитов в тонком слое и два или три метаболита на бумаге,
в зависимости от того, применяется ли система растворителей с кислой
или щелочной реакцией.
Следует отметить, что амитриптилин и нортриптилин структурно
близки к имипрамину, метаболизм которого будет рассматриваться на-
ми в главе, посвященной дибензазепинам.
Амантадин — несколько особый амин; его метаболизм исследован
Bleidner с соавторами [96] на четырех видах животных и у человека.
Газовая хроматография была использована для исследования мочи,
крови и тканей. Обнаруживалось только активное начало. Оно было
идентифицировано путем превращения в его ацетильное производное,
свойства которого тождественны подлинному соединению.
37
Амантадин
Таким же образом и декаметоний проходит через организм, сущест-
венно не изменяясь.
СН3 СН3
СН-^+НСНД —N+—
I '	I
СН3 СН3 2ОН-
Декаметоний
Liithi и Waser [569] вводили кошкам препарат, меченный 14С по
СНз, и попытались разделить возможные метаболиты с помощью раз-
личных систем растворителей методом хроматографирования на бума-
ге. Полученные ими результаты были подтверждены Christensen [2011,
который использовал меченое соединение и хроматографирование на
бумаге (этанол: вода: аммиак 75:25: 2; бутанол: этанол; уксусная кис-
лота; вода 8:2 : 1 : 3).
Глава III
АМИНОФЕНОЛЫ. КАТЕХОЛАМИНЫ
Среди аминофенолов катехоламины представляют группу ве-
ществ большого биологического значения. В связи с этим их метабо-
лизм послужил предметом многих исследований. Мы не будем касаться
тех работ, которые посвящены метаболизму катехоламинов эндогенного
происхождения, а рассмотрим лишь те случаи, когда эти различные
амины применялись в качестве терапевтических средств.
АМИНОФЕНОЛЫ
Парацетамол является основным метаболитом фенацетина (см.
стр. 97). В качестве активного начала он был изучен Gwilt с соавто-
НО—NH—СО—СН3
Парацетамол
рами (389), которые повторили работу Brodie и Axelrod [127], приме-
нив один из вариантов их аналитической техники. Кровь растирается
с натрия сульфатом и экстрагируется эфиром. Парацетамол переводится
в кислый раствор, обрабатывается а-нафтолом, а продукт цветной реак-
ции экстрагируется бутанолом и определяется при 635 нм. Глюкуроно-
вые и сернокислые соединения не оказывают помех.
Welch с соавторами [995] провели сравнительные исследования на
кошках и других животных. Они производили гидролиз связанных мета-
болитов p-глюкуронидазой или сульфатазой (в течение 24 ч при 37° и
pH 5,0) и определяли колориметрически с метиловым оранжевым сво-
бодный парацетамол, подлинность которого была предварительно уста-
новлена методом хроматографирования в тонком слое окиси алюми-
ния (бензол : толуол : вода : уксусная кислота 2:2: 1 :2; бензол : этанол :
вода; уксусная кислота 20:20:20:1; хлороформ: метанол: вода: уксус-
ная кислота 20 : 10:20: 1).
Параметиламинофенол образует глюкуронид типа эфира, который
Shibasaki и Nakamura [838] изолировали с помощью ацетата свинца
НО—NH—СН3
Параметиламииофенол
по методике Камила и соавторов {480] и перекристаллизовывали из
этанола. После метилирования и ацетилирования его формула была
уточнена элементным анализом и путем сравнения температуры плавле-
ния, ПК-спектра с синтетическим глюкуронидом.
39
Превращения мескалина подробно изучены у человека и разных
видов животных. Как было показано Slotta и Muller (850) еще в 1936 г.,
они сводятся в основном к превращению в результате дезаминирования
сн3О\
CH3O-^2^-CH2-CH3—NH3
сн.о/
Мескалин
в триметокси-3,4,5-фенилуксусную кислоту. Содержание ее в крови и
моче после введения мескалина определено при использовании техники,
предложенной Woods с соавторами [1022]. Она заключается в экстрак-
ции амина хлороформом и, после дегидратации экстракта на колонке
сахарозы, колориметрическом определении с бромкрезоловым пурпуро-
вым. Эта методика специфична для мескалина.
Spector [868] определенно установил наличие триметокси-3,4,5-фе-
нилуксусной кислоты в моче собак, получивших мескалин, меченный 14С
в положении 2. Фракционирование подкисленной мочи на колонке Дау-
экс-1 (4 н. раствор муравьинокислого аммония, 5 н. раствор муравьиной
кислоты, 24 н. раствор муравьиной кислоты) выявляет два пика радио-
активности.
Первый из них, хроматографированный на бумаге (бутанол: уксус-
ная кислота : вода 4:1:4), обладает Rf 0,73, тождественный мескалину.
Второй пик с Rf 0,91 соответствует веществу, которое после очист-
ки перегонкой оказывается идентичным триметокси-3,4,5-фенилуксус-
ной кислоте по температуре плавления, ЙК-спектру и элементному
анализу.
Charalampus с соавторами [199] дополнили эти исследования, про-
следив у человека метаболизм мескалина, меченного 14С в положении 2.
Метаболит выявлен методом хроматографии на бумаге в разных систе-
мах растворителей (табл. 9).
Таблица 9
Система растворителей	Rf	
	триметокси-3,4, 5-феяилуксусиая кислота	мескалина хлоргидрат
Этилацетат : пиридин : вода (2:1:1)	0,78	0,82
Хлороформ : пиридин : вода (40 : 51 : 7)	0,73	0,56
Рутанол : уксусная кислота : вода (4:1:1)	0,87	0,65
Хлороформ ; уксусная кислота : вода (4 : 1:1)	0,80	0,90
Бутанол : уксусная кислота : вода (4:1:5)	0,89	0,64
Хлороформ : уксусная кислота : вода (2: 1 : 1)	0,92	0,71
Изопропанол : аммиак : вода (8:1:1)	0,54	0,82
Изопропанол : муравьиная кислота : вода (8:1:1)	0,86	0,75
Природа метаболита, находящегося в моче и крови, подтверждена
температурой плавления, ИК- и УФ-спектрами.
Метаболизм мескалина в головном мозге является важной пробле-
мой, которую изучал на кошках Neff с соавторами [бВб], применив ак-
тивное начало, меченное 14С в положении 2. Различные отделы голов-
ного мозга гомогенизировались с двойным объемом этанола. Добавля-
лись растворы меченых препаратов (мескалин+ триметокси-3,4,5-фенил-
40
уксусная кислота) и производилось хроматографирование на бумаге с
помощью трех систем растворителей:
I — бутанол : уксусная кислота : вода 4:1:5
II — бензол : уксусная кислота : вода 2:1:1
III —пропанол-2 : аммиак : вода 20 ; 1 : 1
Учитывались*многие метаболиты, но была выявлена только тримето-
ксин-3,4,5-фенилуксусная кислота как в головном мозге, так и в спинно-
мозговой жидкости, крови и моче (табл. 10).
Таблица 10
Соединение	Rf в системе		
	I	11	III
Триметокси-3,4,5-фенилэтиламин	0,74	0,36	0,92
Диокси-3,4-метокси-5-фенилэтиламин	0,40		
Диметокси-3,5-окси-4-фенилэтиламин	0,55		
Диокси-3,5-метокси-4-фенилэтиламин	0,50		
Триокси-3,4,5-фенилэтиламин	0,28		
Окси-3-диметокси-4,5-фенилэтиламин	0,62		
Триметокси-3,4,5-фенилэтанол	0,85		0,95
Триметокси-3,4,5-фенилуксусная кислота	0,91	0,88	0,62
Триметокси-3,4,5-миндальная кислота	0,88		0,64
Seiler с соавторами 1825] разработали приспособление для прямого
флуориметрического определения веществ, выделенных методом хро-
матографирования в тонком слое. Они применили его для определения
мескалина [826], который флуоресцирует при обработке его формали-
ном в присутствии аммиака и нагревании с соляной кислотой. Эта тех-
ника была использована для изучения метаболизма мескалина в голов-
ном мозге мышей [824].
Friedhoff и Hollister [344] сравнили метаболизм мескалина и диме-
токси-3,4-фенилэтиламина у человека. Хлороформный экстракт мочи
анализируется методом газовой хроматографии на колонке из диато-
порта S с 3,8% SE 30 при 210—230°. Для идентификации сравнивают
время удержания и добавляют подлинные вещества к исследуемому ма-
териалу. Таким образом разделяют и определяют мескалин и триметок-
сифенилуксусную кислоту.
Friedhoff и Golstein [343] гидролизуют с помощью глусулазы (р-глю-
куронидаза +сульфатаза) при pH 2,0 мочу крыс, которым предваритель-
но вводился меченый мескалин, и производят хроматографирование на
бумаге этилацетатного экстракта (хлороформ: уксусная кислота: вода
2:1:1; изопропанол : аммиак: вода 8:1:1). Во второй системе они
обнаруживали радиоактивный пик, Rf которого тот же, что и триметок-
си-3,4,5-фенилуксусной кислоты, но пик этот не гомогенный. Соответст-
вующую зону элюируют, затем ацетилируют и экстрагируют хлористым
метилом. Методом хроматографирования на бумаге выявляется вещест-
во, Rf которого соответствует т1риметокси-3,4,5-фенилэтанола; этот мета-
болит является чрезвычайно активным.
В 1958 г. Harley-Mason с соавторами [403] изолировали другой ме-
таболит мескалина, который находится в связанном виде и в неболь-
шом количестве в моче человека. Они нашли его тождественным с ди-
окси-3,4-метокси-5-фенилуксусной кислотой, синтез которой ими описан
[402]. Год спустя Ratcliffe и Smith [745] обнаружили в моче человека
после экстракции смесью дихлорэтана с изоамиловым спиртом и хрома-
тографирования на бумаге, окси-3-диметокси-4,5-фенилэтиламин. После
I
кислотного гидролиза эти авторы, кроме того, нашли следы окси-4-ди-
метокси-3,5-фенилэтиламина. Эти два вещества были идентифицирова-
ны синтезом подлинных соединений.
Daly с соавторами 1241] исследовали in vitro мескалин, меченный
14С в положении 2. Они выделяли различные продукты деметилирова-
ния методом хроматографирования на бумаге (бутанол: уксусная кис-
лота: вода 4:1:5) и идентифицировали их путем сравнения.
В 1966 г. Charalampous с соавторами [200] опубликовали подробное
исследование метаболизма мескалина у человека. Они вводили препа-
рат, меченный 14С в положении 2. Двухмерной хроматографией на бу-
маге (1° — бутанол; уксусная кислота: вода 4:1:1; 2° — бутанол: изо-
пропанол: аммиак: вода 3:1: 1:1) выявлены 12 радиоактивных мета-
болитов в моче. После этого моча фракционировалась на колонке
Дауэкс 50 W-X4 (Н+) путем элюирования водой, а затем 50% этанолом,
содержащим 5% аммиака.
Мескалин экстрагировался этилацетатом из подкисленного этаноль-
ного элюата и его идентифицировали путем определения температуры
плавления, так же как и его производного а-нафтилтиомочевины. Остав-
шаяся нейтральная фракция содержала N-ацетилмескалин, который
охарактеризовали изотопным разведением и сравнением значения Rf
при хроматографировании на бумаге.
Водный элюат экстрагировался этилацетатом при нейтральном, а
затем кислом значении pH. Кислая фракция содержала триметокси-
3,4,5-фенилуксусную кислоту и еще одну деметилированную фенилук-
сусную кислоту, которую выделяли методом хроматографии на бумаге.
Метаболиты, которые не были экстрагированы, являлись вероятно, N-
ацетилдиметокси-3,4-окс1И-5-фенилэтиламином, как это можно предпо-
ложить на основании одного исследования метаболизма N-ацетилмеска-
лина. Те же метаболиты встречаются и в спинномозговой жидкости.
Gold и Stormann 1370] кратко изучили метаболизм гексобендина.
Экстракция мочи этилацетатом при pH 2,0—3,0 и хроматографирова-
ние в тонком'слое силикагеля — одномерная (хлороформ: этилацетат:
уксусная кислота 4:5:1) и двухмерная (1°-этилацетат: метанол: 3 н.
карбонат аммония; диметилформамид 12:2:1:1; 2°-четыреххлористый
Сн,(\	СН3	СН3	/ОСН,
СН3О—COO-(CH2)3-N-CH2-CH2->I—(СН2)— оос~\=/—ОСН3
СН5о/	\осн3
Гексобендин
углерод : метанол : уксусная кислота 77,5 : 20 : 2,5) позволили выявить
триметоксибензойную кислоту.
КАТЕХОЛАМИНЫ
Вначале рассмотрим пирокатехиновые аминокислоты (ДОФА и
производные) перед тем, как перейти к истинным катехоламинам (адре-
налин и его производные).
ПРОИЗВОДНЫЕ ДИОКСИФЕНИЛАЛАНИНА (ДОФА)
Метаболизм ДОФА, т. е. ее декарбоксилирование с образованием
дофамина, послужило предметом многочисленных исследований. Мы их
не будем касаться, так как ДОФА не используется в качестве лекарст-
42
(ОН-). Это вещество элюировалось 2 н. раствором муравьиной кисло-
ты возрастающей концентрации. Таким образом была получена фракция,
сн3—соо	оос—сн3
Дифезатии

содержание в которой дифенола и глюкуроновой кислоты соответствова-
ло одному моноглюкурониду.
ПРОИЗВОДНЫЕ ПИПЕРИДИНА
После введения мепивакаина, меченного 14СН3, отмечается зна-
чительное выделение 14СОз. Hausen с соавторами [401] подвергали
СН3
Мепивакаин
хлороформные экстракты мочи и желчи хроматографированию в тонком
слое силикагеля (хлороформ : метанол 2:1; этанол : ацетон : бензол : ам-
миак 5:40:50:5). Они нашли несколько радиоактивных метаболитов,
один из которых соответствует гидроксилированному мепивакаину в.
положении 4 по фенильному ядру, полученному путем синтеза. Основной
метаболит конъюгирован и может быть гидролизован р-глюкуронидазой.
Петидин также сильно метаболизируется. Way с соавторами [977}
определяли выделяемый продукт по Броди [136] по метиловому оран-
СН3—N
./^СОО—СН2—СН3
Петидин
жевому и проверили специфичность метода противоточного распреде-
ления (дихлорэтан : фосфатный буфер 2 М, pH 5,45—8 переносов).
Н. П. Плотников с соавторами [712] получили производное с N-
14СНз петидина и анализировали метаболиты методом противоточного'
распределения. Таким образом, они идентифицировали, деметилирован-
ный Петидин после того, как N-деметилирование было установлено путем
образования 14СОг. Кроме того, метил-1-фенил-4-изонипекотйновая кис-
лота была выделена в виде пикрата и идентифицирована по температуре
плавления.
16»
Burns с соавторами [155] продолжили исследования Н. П. Плотни-
кова, применив те же методики. Деметилированный петидин был изо-
лирован и затем идентифицирован по температуре плавления и ИК-
спектру и сравнением с подлинным веществом. Кроме того, фенил-4-изо-
нипекотиновая кислота выявлена в связи с тем, что количество
деметилированного' петидина увеличивалось при этерификации.
Н. П. Плотников и соавторы [713] продолжили свои исследования,
чтобы определить сумму введенной радиоактивности. Они использовали
те же методики, что и раньше, а именйо противоточное распределение
и количественное определение с метиловым оранжевым. Кроме того,
они подвергали гидролизу конъюгированные производные с-серной кис-
лотой при 100° в течение 15 мин. Общая сумма определенных веществ
соответствовала 30—100% дозы в зависимости от индивидуальных осо-
бенностей исследуемых лиц.
Анилеридин — вещество с химической структурой, близкой к стро-
ению петидина. Porter [715] исследовал его превращения in vivo.
Анилеридин
Он использовал метод количественного определения диазотированием
по Бреттону и Маршаллу [108] в сочетании с экстрагированием и гид-
ролизом, что позволило определить анилеридин, ацетиланилеридин, две
соответствующие кислоты и одно связанное соединение.
Lin и Way [553] исследовали тот же процесс более углубленно. Ще-
лочная моча крыс экстрагировалась бензолом и после концентрирования
хроматографировалась на бумаге с буфером при pH 6,0 (третичный
амиловый спирт: бутиловый эфир : вода 10:1:5) ив тонком слое сили-
. кагеля (бензол : диоксан : этанол : аммиак 50:40:5:5; бензол : диоксан :
этанол: уксусная кислота 50:40:5:5). Выявлено соединение со зна-
чением Rf, соответствующим деметилированному петидину наряду с не-
измененным веществом и с ацетиланилеридином. Деметилированный
петидин элюировался и идентифицировался по его распределительной
кривой (бензол: фосфатный буфер 0,2 М, pH 7,4—8 переносов), УФ- и
ИК-спектрам и образованию пикратов. Экстрагированием подкисленной
мочи этилацетатом и противоточным распределением или хроматографи-
ей в тонком слое была определена параацетиламинофенилуксусная
кислота, которая (идентифицировалась по значению Rf, кривой распре-
деления и продукту гидролиза парааминофенилуксусной кислоты.
Этогептазин также является соединением, очень близким к петиди-
- ну; он рассматривается в этом разделе, хотя не является производным
, /СОО—с2Н5
СНз—N
Этогептазин
пиперидина. Walkenstein с соавторами [968] исследовали это вещество,
меченное 14С ,в положении 4. С помощью хроматографии на бумаге
(бутанол, насыщенный водой; бутанол, насыщенный ацетатом аммония,
pH 7,0; восходящая) наряду с неизмененным соединением выявлено 5
радиоактивных метаболитов. Последний был экстрагирован из мочи при
170
pH 11,0 толуолом и охарактеризован по значению Rf ИК-спектру и кри-
вой распределения (фосфатный буфер pH 6,0; толуол). Одним из мета-
болитов является гидроксильное производное, которое было изолировано
из мочи путем обработки толуолом и экстракцией эфиром и хлорофор-
мом при pH 5,5. Элементный анализ и ИК-спектр указали на наличие
ОН-группы. Вторым метаболитом является дезэстерированный продукт;
он был превращен в этогептазин действием ксантогената на мочу, ос-
вобожденную от неизмененного вещества и гидроксилированного мета-
болита. Третий продукт является гидроксилированным производным,
соответствующим оксиэтогептазину, что было доказано ИК-спектроско-
пией.
Метилированный в положении 3 этогептазин — прогептазин — иссле-
дован Walkenstein с соавторами [966]. Они использовали вещество,
меченное 14С по кар/боксилу. Хроматографирование на бумаге произво-
СН,—N
СН3
Прогептазин
дилось непосредственно с мочой (метанол:этилацетат:ацетат аммония М,
pH 7,0:26:2:2). При соблюдении предосторожности выявлен N-деме-
тилированный метаболит. Во избежание его гидролиза, моча помеща-
лась во флакон, охлажденный твердой углекислотой. Также были оха-
рактеризованы два продукта гидролиза эфирной группы сравнением с
подлинными образцами.
У крыс метиприлон не подвергается значительным превращениям.
Bernhard с соавторами [80] получили вещество, меченное 14С в по-
ложении 6, и определили неизмененные соединения методом изотопного
Н
ж=0
сн3—
Метиприлон
разбавления. Они же [81] выявили у собак несколько метаболитов мето-
дом хроматографии на бумаге (I бутиловый эфир: изопропиловый
эфир : метилцеллосольв : уксусная кислота 5% 10:1:1:1). Эти метабо-
литы отмечены знаком + в табл. 50. Авторам не удалось очистить
Таблица 50
Rf в системе
Вещество 1	1		II
Метиприлон	0,50	0,90
Диоксо-2,4-диэтил-3,3-метил-5-тетрагидропиридин+	0,72	0,94
Диоксо-2,4-диэтил-3,3-оксиметил-5-тетрагидропиридин+	0,11	0,84
Диоксо-4,6-диэтил-5,5-тетрагидроникотинальдегид	0,63	—•
Диоксо-4,6-диэтил-5,5-тетрагидроникотиновая кислота +	0,34	0,30
Диоксо-2,4-диэтил-3,3-тетрагидропиридин	0,54	—
Триоксо-2,4,6-диэтил-3,3-метил-5-пиперидин+"+	—	0,50
171
глюкурониды методом Камила [480], но они охарактеризовали аглико-
ны после гидролиза хроматографированием на бумаге. Хроматографи-
ческая идентификация дополнена данными элементного анализа и оп-
ределением УФ-и и ИК-спектров.
Bosche и Schmidt [103] хроматографировали эфирный экстракт
(а также хлороформный экстракт) мочи человека на бумаге в системе
растворителей II—- бутанол, насыщенный 5 н. аммиаком. Они разделили-
три ранее охарактеризованных метаболита и нашли четвертое соедине-
ние (табл. 50). На 12 бумажных полосах они изолировали это соедине-
ние и идентифицировали путем элементного анализа, УФ-, ИК- и масс-
спектроскопии с триоксо-2,4,6 + +' производным.
Пирибензил .дает лишь один метаболит как у человека, так и у
крыс. Beckmann [70] проводил исследования с активным началом, ме-
он-
Пирибензил
ченным 3Н на животных и не меченным на людях. Метаболит отделил:
от неизмененного вещества хроматографированием на бумаге (I — пи-
ридин : амиловый спирт:вода 7:7:6; II — бутанол: диоксан : аммиак н.
4:1:5) ив тонком слое целлюлозы (III— бутанол : уксусная кислота :
вода 5:1:4), а также методом электрофореза на бумаге (вероналовый
буфер pH 8,6, 100 V, 16 ч) (табл. 51).
Таблица 5Г
Вещество	Rf в системе			Электрофорети- ческое переме- щение, см
	I	п	ш	
Пирибензил М,Й-диметилоксиметил-2-пи-	0,67	Разл. \ 1	0,15	9
перидии	0,43	0,31	0,67	15
ПРОИЗВОДНЫЕ ИНДОЛА
Harman с соавторами [404] исследовали индометацин, меченный
14С, и нашли два метаболита:, N-дехлоробензоил (А) и О-деметилиро-
ванное производное (В) частично в свободной форме и частично в виде
f и V™3
сн,о—L JI-----!!—сн2—cooh
Индометацин
глюкуронидов. Метаболиты были разделены хроматографированием на
бумаге (I, II, III) или в тонком слое силикагеля (IV, V) (табл. 52).
Метаболиты идентифицированы методом УФ- и ИК-спектроскопии
и сравнением с специально приготовленными для этой цели подлинными
веществами [876]. Глюкуронид индометацина не мог быть очищен и
172
тем определения с помощью метилового оранжевого, после разделения
хроматографией на бумаге. Леваллорфан и два его метаболита суще-
ствуют, как было показано, в связанном виде.
Декстрометорфан изучался сотрудниками фирмы Hoffman of Laroch.
Brossi с соавторами [141] разработали методику хроматографирования
на бумаге дяя возможных метаболитов морфинана (табл. 63). Для раз-
Таблица 63
Rf в системе
Вещество	I	II
Морфин	0,13	0,68—0,73
Окси-З-морфинан	0,37—0,41	0,55—0,59
Метокси-З-морфипан	0,45—0,49	0,74—0,78
Окси-ЗМ-метилморфинан	0,37—0,41	0,84—0,88
Декстрометорфан	0,47—0,52	0,88—0,92
деления пяти производных потребовалось проведение двух различных
хроматографирований: 1) бумага с фосфатным буфером pH 6,32 (т-ами-
ловый спирт : бутиловый эфир : вода 80 : 7 : 13); 2) бумага с цитратно-
фосфатным буфером pH 8,09 (т-амиловый спирт : бутиловый эфир : вода
50:7:43). Эта методика, примененная для исследования декстрометор-
фана, позволила выявить в моче собаки после кислотного гидролиза не
только неизмененное вещество, но и три соответствующих деметилиро-
ванных производных.
Таблица 64
Вещество	Rf
Декстрометорфан	0,66
Метокси-З-морфинан .	0,73
Окси-ЗМ-метилморфинан	0,61
Окси-З-морфинан	0,63
Впоследствии Willner [1010] расширил эти исследования, изучив ме-
таболизм у человека. Он применил методику хроматографирования на
бумаге, предложенную Waldi [964]. Бумага пропитывалась 20% раство-
ром формамида в ацетоне, а проявитель имел следующий состав : гек-
сан : диэтиламин: бензол (ЕЬ 180—230°) 1:1:8 (табл. 64). Выявлены
только два из трех продуктов деметилирования, а именно окси-ЗИ-метил-
морфинан и окси-3-морфинан.
АЛКАЛОИДЫ — ПРОИЗВОДНЫЕ КСАНТИНА
Исследование метаболизма алкалоидов — производных ксантина
было начато вначале; З.того. в.ека Kruger и Schmidt [527, 528]. Наиболее
исследованным оказался Теофиллин. Некоторые работы , исходят из на-
блюдения того факта, что7после введения теофидлина;,цроисходит уси-
ленное выделение с мочой веществ, восстанавливающих.фосфорноволь-
фрамовую кислоту. Из этого был сделан вывод, что присутствует моно-
213
слое силикагеля (I — бутанол : аммиак 25% 98 : 2; II — хлороформ :
ацетон : диэтиламин : аммиак 25% 50 : 35 : 10 : 5). Эти авторы использо-
Дептропин
вали дептронин, меченный 3Н в разных положениях, и выявили при
сравнении с известными соединениями ряд различных метаболитов, при-
веденных в табл. 67. Другие метаболиты (свободные или связанные)
были также обнаружены.
Таблица 67
Вещество	я/		
	на бумаге	в тонком слое	
		I	п
Дептропин	0,85—0,95	0,30—0,36	0,91—0,98
N-деметилдептропин	0,85—0,95	0,21—0,27	0,80—0,86
Тропин	0,85—0,95	0,04—0,14	0,41—0,55
N-деметилтропин	0,85—0,95	0,03—0,07	0,10—0,16
Дибензосуберол	0,30—0,50	0,80—0,90	0,90—0,96
Кокаин не подвергся исследованиям, представляющим интерес для
аналитической химии.
Marsh [606] опубликовал работу, посвященную метаболизму тубоку-
рарииа. Он использовал активное начало, меченное 14С, и отделил его от
Тубокурарин
хондокурарина и диметилового эфира тубокурарина методом хромато-
графии на бумаге (бутанол : уксусная кислота : вода 4:1:5).
Псилоцин непосредственно получается из псилоцибина путем гидро-
лиза и, по-видимому, является активным началом. Его метаболизм ча-
стично выяснен Kalberer с соавторами [477] с помощью вещества, ме-
ченного 14С в положении 2' по боковой цепи и по N-метилу. Проводилось
ОН
Н
•СН3—СН3—N
Псилоцин
221
определение выдыхаемой радиоактивной углекислоты, неизмененного
активного вещества методом изотопного разведения и идентификация ок-
си-4-индолуксусной кислоты хроматографированием на бумаге (пропа-
нол : вода 5:1; бутанол : уксусная кислота : вода 4:1:5). Хроматогра-
фия позволила выявить и другие гидрофильные метаболиты, которые не
были идентифицированы.
Gessner с соавторами |[356] провели сравнительное изучение псилоци-
бина и буфотенина. Псилоцибин показал при хроматографировании на
НОХ
>Р-0
НО/ II I
О /\
I II II
S//N/
н
/СН3
-СН2—СН2—N<
\сн3
Псилоцибин
HO-fAt----й-
i
Буфотенин
бумаге мочи (пропанол : аммиак 4:1, бутанол : уксусная кислота : вода
4:1:5) частичное превращение его в продукт соединения с глюкуроно-
вой кислотой (положительная реакция с нафторезорцинолом) и в кисло-
ту, близкую в окси-5-индолуксусной кислоте. Бифотенин после хромато-
графирования мочи (двухмерная восходящая, I — пропанол : аммиак
9: 1; II — хлорид калия водный 20% раствор) не обнаруживает присут-
ствия глюкуронидов; наряду с неизмененным веществом были выявлены
окси-5-индолуксусная кислота и еще один кислотный метаболит.
Глава X. Сульфаниламиды.................................................131
Параамииббенэольные сульфаниламиды........................_...	131
, Другие сульфаниламиды...............................................143
Глава XI. Имиды.........................................................146
Талидомид ..........................................................146
Глютетимид и его производные........................................149
Глава XII. Гидразиды и гидразины...................................... 153
Изониазид .	.	..........................................153
Другие гидразиды и гидразины........................................158
Глава XIII. Гетероциклические соединения с одним гетероатомом азота .	.	162
Производные пиролидина..............................................162
Производные оксазолвдина............................................163
Производные тиазола.................................................164
Производные пиридина......................................... 165
Производные пиперидина...................................... 169
Производные индола..............................................  .	172
Производные хинолина................................................174
Глава XIV. Гетероциклические соединения с двумя гетероатомами азота	181
Производные пиразола................................................181
Другие производные............................................	187
Глава XV. Гетероциклические соединения, содержащие больше двух гетероато-
мов азота............................................................193
Глава XVI. Гетероциклические соединения, не содержащие азота .	.	.	.	202
Глава XVII. Алкалоиды...................................................205
Алкалоиды—производные фенантрена....................................205
Алкалоиды—производные ксантина......................................213
Резерпин............................................................215
Другие алкалоиды....................................................216
Глава XVIII. Антибиотики................................................223
Хлор амфеникол......................................................223
Тетрациклины .	,..................................................224
Пенициллины..................................'......................226
Эритромицин.........................................................227
Стрептомицин. Канамицин.............................................228
Фузидовая кислота...................................................229
Пуромицин...........................................................230
Г ризеофульвин......................................................230
Пристинамицин............................................... 231
Г л ав а XIX. Гликозиды.................................................232
Гликозиды наперстянки...............................................232
Другие гликозиды....................................................236
Глава XX. Различные лекарственные вещества..............................240
Органические производные серы.......................................240
Металлорганические соединения.......................................243
Производные ртути . •...............................................243
Соединения фосфора..................................................244
Производные мышьяка.................................................246
Г алюгенопраизводные................................................. 246
Различные вещества..................................................247
Литература..............................................................251