/
Author: Перт С.Дж.
Tags: биология клетки и субклеточных частиц цитология вирусология биохимия микробиология монография клеточная биология биотехнологии
Year: 1978
Text
Principles of Microbe and Cell Cultivation
S. JOHN PIRT Professor of Microbiology Queen Elizabeth College University of London
Blackwell Scientific Publications Oxford London Edinburgh Melbourne 1975
С. Дж. Перт
Основы культивирования микроорганизмов и клеток
Перевод с английского канд. физ.-мат. наук Т. А. ПЕТРОВО!! и канд. биол. наук И. Н. ПОЗМОГОВОЙ
Под редакцией проф. И. Л. РАБОТНОВОЙ
Издательство «Мир»
Москва 1978
УДК 576.8.093.3+578.085.23
Монография известного английского микробиолога посвящена культивированию микроорганизмов. Большое внимание уделено влиянию внешних факторов на рост и непрерывному культивированию. Эта область микробиологии имеет не только теоретическое, но и большое практическое значение. Направленное культивирование позволяет получать микроорганизмы, биосинтетические способности которых сдвинуты в желаемую сторону. Достоинством книги является широкое использование методов математического моделирования, которые изложены сравнительно просто и вместе с тем достаточно строго.
Предназначена для микробиологов, вирусологов, иммунологов, врачей, специалистов, работающих в микробиологической промышленности, а также может служить учебным пособием для преподавателей, аспирантов и студентов биологических специальностей.
Редакция биологической литературы
© 1975, Blackwell Scientific Publications
© Перевод на русский язык, «Мир», 1978
П
21007—120
041(01)—78
120—78
ПРЕДИСЛОВИЕ К РУССКОМУ ИЗДАНИЮ
Книга С. Дж. Перта посвящена проблемам культивирования — разделу микробиологии, лежащему в основе изучения и практического применения микроорганизмов. Как это ни парадоксально, но именно этот раздел микробиологии, что справедливо отмечает автор в заключительной части книги, все еще находится в начале своего развития и требует объяснения и формулировки общих принципов.
Такое отставание науки о культивировании от общего фронта развития других разделов микробиологии — систематики, цитологии, биохимии, генетики и т. д. — имеет определенную причину. До недавнего времени основой культивирования с любой целью, в том числе и для всестороннего изучения микроорганизмов, служила периодическая культура. Ее огромные недостатки долгое время оставались в тени — до тех пор, пока не началось интенсивное развитие метода непрерывного хемостатного культивирования. Тогда только с полной очевидностью стало ясно, что периодическая культура не дает возможности выявить влияние внешних факторов на физиологическое состояние клеток и управлять им. Это объясняется тем, что в ней самой непрерывно происходят изменения условий, не поддающиеся или с трудом поддающиеся не только регуляции, но даже простой констатации. Клетки в периодической культуре, по меткому определению Перта, непрерывно находятся в переходном состоянии, и далеко не всегда ясно, какой фактор действует в тот или иной момент их развития.
Развитие метода хемостатного культивирования показало, что можно полностью управлять действием любого фактора среды и их комбинаций. Можно вычленить действие одного фактора и действовать им в любой степени: от едва заметного замедления роста до глубокого стресса.
Таким образом, в культивировании микроорганизмов происходят революционизирующие изменения. Это чревато тем, что некоторые положения цитологии, биохимии и в особенности физиологии потребуют пересмотра и серьезных корректив, в результате которых многие вопросы должны будут изучаться заново с применением новых методов культивирования. Это касается, например, всех сторон изучения состава клеток, который, как теперь установлено, подвержен большим изменениям
6
Предисловие к русскому изданию
под влиянием условий культивирования, а закономерности этих изменений только еще проясняются.
Поэтому книга Перта по существу посвящена вопросам влияния внешних факторов на микроорганизмы. В ней рассматривается влияние кислорода, ионов металлов, элементов питания, температуры, pH, активности воды, тоничности среды и ингибиторов— как образующихся в процессе метаболизма, так и поступающих из среды.
Любое теоретическое обобщение должно выражаться в виде математической модели. Это придает четкость и точность высказываемым соображениям. Математический аппарат необходим для количественных предсказаний поведения исследуемых систем. Кроме того, результат расчета говорит и о качественных явлениях, возможности или невозможности того или иного процесса. Математическая модель может указать на аспекты, ранее ускользавшие от внимания. Математика выступает как метод не только количественного, но и качественного мышления.
В основе книги Перта лежит принцип количественного выражения всех проявлений жизни клетки. Свойства и поведение клеток описываются математическими моделями и теоретическими графиками. Стремление к этому наблюдается в микробиологической литературе в последнее десятилетие. Это стало возможным благодаря применению к объяснению поведения микроорганизмов законов энзимологии и физической химии.
Ж- Моно впервые использовал для изучения скорости роста популяции количественную закономерность энзимологии — зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрйта, сформулированную в уравнении Михаэлиса—Ментен. Он допустил, что скорость ферментативной реакции можно отождествить со скоростью роста популяции, поскольку в клетке действует закон «узкого места», т. е. весь метаболизм равняется на скорость самой медленной реакции.
Это было в 1942 г. Через 20 лет Н. Д. Иерусалимский сделал следующий шаг. Он применил уравнение неконкурентного ингибирования ферментативных реакций к ингибированию роста микробных культур продуктами их метаболизма.
С тех пор появилось множество экспериментальных исследований, свидетельствующих о справедливости для популяций этих закономерностей энзимологии. Перт развил это направление во всей полноте. Он сделал упрощающее предположение, что биомасса ведет себя как фермент, реагирующий с лимитирующим субстратом. Особенно интересны его попытки описать с этой позиции математически и представить графически действие ингибиторов на хемостатные культуры микроорганизмов. Он разбивает ингибиторы на отдельные типы в соответствии с тем, как это делается в энзимологии. Его теоретические пред
Предисловие к русскому изданию
7
сказания ждут экспериментальной проверки. Каждое свойство клетки и кинетика его изменений под влиянием внешних условий описывается Пертом количественно, с помощью уравнений и графиков. Можно сказать, что книга Перта является количественным изложением вопросов физиологии микроорганизмов, связанных с ростом.
В этой книге впервые уделено большое внимание методу культивирования микроорганизмов с добавлением источников питания. Этот способ культивирования занимает промежуточное положение между периодической культурой и хемостатной. Перт предлагает использовать диффузионную капсулу, позволяющую осуществить такое культивирование простыми средствами, что может оказаться очень удобным при необходимости получить культуру, лимитированную источником питания, без сложного хемостата. Большой интерес представляют собой также данные о способности микроэлементов образовывать в культурах микроорганизмов комплексные соединения. Игнорирование этого процесса сильно обесценивает многие прежние исследования роли микроэлементов.
Жаль, что в этой книге несколько робко звучат проблема и перспективы управляемого культивирования микроорганизмов, т. е. возможности сознательного изменения метаболизма в желаемую сторону путем воздействия на популяцию внешними факторами. Это можно объяснить тем, что подготовка книги к печати была завершена еще в 1974 г., а рассматриваемая в ней область исследования развивается очень быстро.
В книге Перта отсутствуют ссылки на работы русских авторов. Между тем по проблемам, затронутым в ней, имеется немало исследований, выполненных в СССР. Поэтому мы сочли необходимым дополнить список литературы работами, опубликованными на русском языке.
И. Л. Работнова
ПРЕДИСЛОВИЕ АВТОРА
Культивирование микроорганизмов как в лабораторных, так и в промышленных условиях все еще относится скорее к области искусства, чем науки; иначе говоря, эта работа больше связана с интуицией, чем с логикой. Основная задача данной монографии состоит в том, чтобы рассмотреть способы управления культурами микроорганизмов и сформулировать, насколько это возможно, схему общих закономерностей и принципов. Такая схема необходима для унификации самой науки и облегчения ее более глубокого проникновения в различные прикладные области— в пивоварение, в пищевую и промышленную микробиологию, в микробиологию сточных вод. Такая схема облегчает, кроме того, изучение поведения микроорганизмов в их естественных средах обитания.
Еще недавно при исследовании динамики роста культур микроорганизмов обычно ограничивались «фазами роста» периодической культуры и лишь иногда упоминали о хемостатной культуре при необходимости обеспечить регуляцию скорости роста или длительное культивирование. Простая периодическая культура — это был единственный способ культивирования, который использовался для изучения динамики роста вплоть до 1950 г. Между тем накопленный экспериментальный материал и его широкое обсуждение уже внесли ясность в вопросы специального применения не только простых периодических, но также и хемостатных культур, в том числе хемостата с возвратом биомассы, батареи хемостатов, тубулярного культивирования, турбидостата, поверхностного культивирования и, наконец, периодического культивирования с добавлением питательных веществ. Каждый из этих способов занимает свое место в исследованиях и промышленном или общественном использовании. В настоящей книге рассматриваются успехи, достигнутые главным образом в третьей четверти нашего столетия, и анализируется их значимость.
Основные факторы, оказывающие влияние на рост и развитие микроорганизмов, можно подразделить на две группы: внутриклеточные факторы, обусловленные структурой и специфическими особенностями организма, и внеклеточные факторы, т. е. условия внешней среды клетки. К внутриклеточным факторам относятся структура клетки, метаболические механизмы, генетический материал. Блестящие обзоры по этим вопросам можно
Предисловие
найти в работах, посвященных цитологическим, биологическим и генетическим исследованиям. В настоящей моногорафии основное внимание уделено внеклеточным факторам. Первоначальный замысел был самым обширным; однако в дальнейшем для сокращения объема книги было решено исключить следующие вопросы: потребность культур в свете, действие света на микроорганизмы, синхронизацию клеточного деления.
Наш главный принцип сводился к тому, чтобы дать максимум информации с минимальной затратой времени. Для этого количественные аспекты роста микроорганизмов рассматриваются на примере математических моделей. Эти модели используются в двух целях: для обобщения результатов и для обоснованного предсказания пока еще неизвестных свойств культуры. Чтобы не витать в облаках, сделать материал доступным и упростить математический аппарат до уровня элементарной алгебры и простых вычислений, не требующих специальной университетской подготовки, я ограничился использованием упрощенных представлений и приближений.
Выяснение количественных аспектов реакции микроорганизма или клетки на воздействие внешней среды пойдет естественным путем — от изучения простых периодических культур к изучению хемостатных культур при использовании периодической культуры с добавлением источников питания в качестве промежуточного или конечного метода культивирования. Несмотря на быстрое, начиная с 1950 г., накопление данных о поведении микроорганизмов, еще имеется большой пробел в изучении воздействия на них температур, значений pH, кислорода и огромного разнообразия источников питания. Кроме того, детальное изучение ограничивается лишь десятком или около того бактериальных типов и еще меньшим количеством грибов, простейших и тканевых клеток, тогда как в действительности существуют миллионы различных типов. Следовательно, можно сказать, что сфера деятельности в этой области науки безгранична.
Я написал эту книгу для студентов-микробиологов; фактически в основу большинства глав легли лекции, прочитанные мною для аспирантов в колледже королевы Елизаветы. Эта книга может заинтересовать также исследователей, работающих с микроорганизмами в бродильной и пищевой промышленности, в области микробиологии сточных вод и очистных сооружений, медицинской и сельскохозяйственной микробиологии, а также в области экологии. В книге мною приведены лишь некоторые примеры культивирования животных и растительных тканевых клеток, но в будущем это должно развиться в огромную прикладную область.
Октябрь 1974 г.
С. Дж. Перт
Глава 1
ВВЕДЕНИЕ
1.1. Природа микробной культуры
Культивирование микроорганизмов и клеток различных тканей связано с особенностями роста и функций живой материи из всех трех царств: царств животных, растений и микроорганизмов. Термин микробы используется обычно как тривиальный синоним слова микроорганизмы, к которым относятся бактерии, грибы и простейшие (Protozoa). Культурами тканевых клеток называют культуры, полученные из растений или животных.
Разные культуры крайне различны по форме и сложности. Простейшей формой культуры является гомогенная суспензия организмов одного типа в водной среде, поддерживаемая в постоянных физических условиях и содержащая минимальное число определенных компонентов. К сложным культурам относятся культуры, содержащие более одного типа организмов, множество различных субстратов и ингибиторов. В сложных культурах среда гетерогенна, а физические условия меняются. Теоретические основы поведения культуры пока что известны в основном только для простейшей формы культуры. Чтобы полностью установить теоретические основы, необходимо прежде исследовать влияние полного диапазона всех условий на все типы организмов не только качественно, но и количественно.
1.2. Историческое развитие
Можно проследить, что основной поток работ, посвященных исследованию культивирования микроорганизмов начинается с 1830 г., когда Каньяр де Латур, Кютцинг и Шван открыли, что в брожении вина и вообще в бродильных процессах повинен рост дрожжей и других микроорганизмов. Химики во главе с Либихом противились этой идее целые десятилетия. В дальнейшем в этой области не было никакого прогресса вплоть до 1850-х годов, когда Пастер начал свои фундаментальные исследования. Пастер исследовал физиологию дрожжей и бактерий, ввел асептические методы, минимальные среды и приступил к изучению пищевых потребностей и роли кислорода.
Первая полная среда определенного состава была получена Ролэном [272] в 1869 г. для культивирования грибов видов
12
Глава 1
Aspergillus. Работа Ролэна была совершенной в том отношении, что он определил пищевые потребности не только качественно, но и количественно, выразив их в виде выхода биомассы (экономического коэффициента). Этой количественной стороной вопроса, к сожалению, пренебрегали во всех последующих исследованиях пищевых потребностей микроорганизмов.
В 1870-х годах Кох ввел метод чистых культур, гарантировавший, что инокулят содержит только известные виды бактерий.
Говоря о замечательных работах Пастера, проведенных им до 70-х годов прошлого столетия, необходимо отметить, что в распоряжении Пастера не было метода чистых культур, дающих исследователю большие преимущества. Возможно, воспроизводимость результатов Пастера зависела от элективности его культуральных сред, обеспечившей достаточное постоянство микробной популяции. Работами Пастера и его ученика Ролэна была установлена потребность в главных и второстепенных компонентах среды (разд. 12.1) и в источниках энергии. Потребность в сложных органических веществах, теперь называемых «факторами роста», впервые была обнаружена Вильдье [345] в 1901 г., когда он открыл витамин В, или факторы «биос», необходимые для роста дрожжей.
В тридцатых годах с введением метода колб на качалках Клювером и Перквином [173] началось развитие более сложной аппаратуры культивирования. Это дало возможность применять лабораторный метод для аэрации глубинных культур, особенно для глубинных культур аэробных грибов, которые раньше выращивались только на поверхности твердых или жидких сред. В поверхностных культурах окружение организма гетерогенно, а в глубинных — гомогенно, поэтому проще для изучения и контроля. Впоследствии глубинные культуры аэробных грибов сыграли значительную роль в развитии промышленного производства антибиотиков. Возрастающее технологическое значение культуры микроорганизмов значительно стимулировало интерес инженеров к этой области и привело в 40—50-х годах к созданию ферментеров полного смешения с автоматической регуляцией условий среды. В настоящее время такое оборудование играет центральную роль при изучении поведения культур микроорганизмов и тканевых клеток.
До 1950 г. исследование кинетических закономерностей культуры'занимало незначительное место. Слейтор [300] выдвинул концепции о взаимосвязях различных параметров культуры. Хиншельвуд [138] предложил ценные модели кинетики реакций в живой клетке. Моно [216] в своей монографии, явившейся значительной вехой в исследовании кинетики, показал, как можно охарактеризовать рост бактерий с помощью экономиче
Введение
13
ского коэффициента, удельной скорости роста и концентрации лимитирующего рост субстрата. Из этого аналитического подхода в дальнейшем [217, 227] последовало развитие теории непрерывного культивирования хемостатного типа. В настоящее время хемостатная культура имеет существенное значение для объяснения взаимоотношений между организмом и средой.
Примерно с 1950 г. отмечается быстрое развитие методов культивирования животных клеток, чему особенно способствовало появление монослойных и суспендированных культур, диспергирование клеточных культур трипсином, а также выяснение пищевых потребностей клеток. Культуры растительных клеток в меньшей степени привлекали внимание исследователей, количественная оценка результатов их исследования кажется менее надежной, чем в случае культур животных клеток.
Теория культивирования микроорганизмов развивалась крайне медленно по сравнению с теоретическими основами физики, химии или экономики, каждая из которых благодаря огромному числу крупных исследователей уже до 1900 г. переросла в самостоятельную область знаний.
Такое отставание в развитии теории культивирования объяснялось отнюдь не тем, что реакция клеток на условия среды, как мгновенная, так и длительная, представляла меньший интерес. Изучение открытых систем, среди которых наиболее важной является хемостат, открыло с 1950 г. новые горизонты как для теоретического развития этих вопросов, так и для экспериментальной проверки теории.
Глава 2
ПАРАМЕТРЫ РОСТА И АНАЛИЗ ДАННЫХ О РОСТЕ
2.1. Параметры
Для многих целей вполне достаточно качественной характеристики роста, т. е. простого наблюдения, имеет ли место вообще рост в культуре. Дальнейшую информацию, которую получают, измеряя рост количественно, обычно выражают в форме графика зависимости биомассы от времени.
Однако результаты количественного изучения роста могут быть представлены более информативно и точно, если анализируются различные параметры роста: удельная скорость роста или время удвоения биомассы, лаг-период, или фаза задержки роста, экономический коэффициент, метаболический коэффициент, характеризующий использование субстрата и образование продукта, сродство субстрата и максимум биомассы.
При определении параметров роста исследуют рост простой гомогенной периодической культуры. Предполагается, что такая система состоит из хорошо перемешиваемой засеянной среды. Предполагается также, что перемешивания достаточно для диспергирования биомассы и что в среде нет перепада концентраций. Конечно, гетерогенная культура, например, растущая на поверхности, имеет более сложную природу (гл. 23).
2.2. Скорость роста
2.2.1. Удельная скорость роста
Для роста биомассы в культуре необходимы следующие условия: а) жизнеспособность засева; б) наличие источника энергии; в) внесение пищевых добавок, содержащих все компоненты, необходимые для синтеза биомассы; г) отсутствие в среде ингибиторов, подавляющих рост клеток; д) поддержание в среде подходящих физико-химических условий.
Если удовлетворены все эти требования, то предполагается, что в течение бесконечно малого промежутка времени dt увеличение биомассы dx должно быть пропорционально количеству биомассы х и интервалу времени, т. е.
dx = p.xdl, (2.1)
Параметры роста и анализ данных о росте
15
откуда
dxjdt = цх. (2.2)
Дифференциальное отношение dx/dt выражает скорость роста популяции. Параметр ц, обозначающий скорость роста единицы биомассы (1/х) (dxfdt), называется удельной скоростью роста и измеряется в единицах, обратных времени (1Д)- Этот параметр аналогичен сложным процентам. Так, например, удельная скорость роста 0,1 ч-1 эквивалентна скорости 10% в 1 ч.
Если и постоянна, то интегрирование уравнения (2.2) дает 1пх = 1пхо +р< (2-3)
где хо — биомасса в начальный момент времени t = 0. График зависимости 1пх от времени будет иметь вид прямой линии с наклоном ц. Приведя логарифмы к основанию 10, из уравнения (2.3) получаем
’gx = -So +1ё*о- (2-4)
Из уравнения (2.3) следует, что
In (х/х0) = pt. (2.5)
Тогда
х — хоец<. (2.6)
Рост, подчиняющийся этому закону, называется экспоненциальным, или логарифмическим ростом. Основным параметром характеризующим скорость роста, служит удельная скорость роста. Остальные параметры роста, которые рассматриваются ниже, могут быть выражены через удельную скорость роста.
2.2.2. Время удвоения биомассы
Зависимость между удельной скоростью роста и временем удвоения (td) биомассы можно получить, подставив в уравнение (2.5)
х = 2х0 и t — td.
Тогда
10^0693.
Н 1* '
2.2.3. Степень размножения
Степень размножения определяется отношением х/хо, которое равно е^ [см. уравнение (2.6)]. С другой стороны, если биомасса претерпевает п удвоений или генераций, мы можем записать
х/х0 = 2ге.
(2.8)
16
Глава 2
Таким образом, п = 3,32 log (х/х0). (2.9)
В экспериментах по культивированию целесообразно использовать засев, количество которого составляет 10% конечного количества биомассы. Тогда п будет равно 3,32.
2.2.4. Обратное время удвоения
Поскольку число удвоений биомассы за время t будет равно tltd, мы можем записать
x = x02tltd. (2.10)
Взяв логарифм по основанию 2 от обеих частей уравнения (2.10), получим
log2x = log2x0 + //^. (2.11)
Наклон графика (1//<г) зависимости log х от времени и есть обратное время удвоения. Некоторые исследователи предпочитают выражать скорость роста через \/td, а не через удельную скорость роста. Однако ц кажется нам предпочтительнее, поскольку этот член входит в основное уравнение (2.2) роста. Об удобстве этого показателя свидетельствует универсальность его применения в теории непрерывного культивирования. Важно четко представлять, какого из этих двух способов следует придерживаться.
2.3. Справедливость закона экспоненциального роста
Закон постоянного экспоненциального роста выполняется, если условия окружающей среды и состав биомассы остаются постоянными. Другими словами, если скорость роста не подчиняется этому закону, то не выполняются либо одно, либо оба из вышеуказанных условий. Наличие экспоненциальной фазы роста хорошо известно в случае бактериальных и дрожжевых культур, но закон постоянного экспоненциального роста универсален и для всех прокариотов и эукариотов при условии, что указанные выше условия выполняются. Справедливость закона применительно к простейшим продемонстрировал Филпс [238], а применительно к животным клеткам — Берч и Перт [21]. Перт и Каллоу [258] установили, кроме того, применимость экспоненциального закона к культурам плесневых грибов в гомогенной перемешиваемой культуре. Рост нитчатых грибов может отклоняться от экспоненциального, что может объясняться либо образованием шаровидных колоний, в которых биомасса распределена не гомогенно в среде, либо тем обстоятельством, что
Параметры роста и анализ данных о росте 17
доставка кислорода становится лимитирующим фактором. Изменения в окружающей среде, пожалуй, чаще всего являются основной причиной, из-за которой не удается поддерживать постоянным экспоненциальный рост. Это неизбежно происходит в периодической культуре — раньше или позже. Вероятно, в дальнейшем изменения в окружающей среде вызовут соответствующие изменения в составе биомассы. Как будет показано в гл. 24, уже из простой модели роста биомассы следует, что в ответ на изменение условий соотношения различных компонентов биомассы будут автоматически подстраиваться так, чтобы скорость роста была максимальна в данных условиях.
2.4. Экономический коэффициент
Экономический коэффициент (или выход биомассы) определяют из уравнения
Ax/As = P (2.12)
где Ах— увеличение биомассы, соответствующее потреблению субстрата в количестве As. Более строго экономический коэффициент определяется пределом, к которому стремится отношение Ax/As при As 0, т. е.
Y — dx/ds. (2.13)
Следует отметить, что если х и s — концентрации биомассы и субстрата соответственно, то
У = — dx/ds.
Знак «минус» вводится потому, что значения х и s изменяются в разные стороны.
Важность экономического коэффициента состоит в том, что он выражает количественные потребности организма в пище. Экономический коэффициент был использован Ролэном [272] для выражения пищевых потребностей грибов. Последующие исследователи-микологи имели тенденцию использовать величину, обратную Y, называя ее экономическим коэффициентом Ч В 1942 г. Моно [216] впервые показал, что если внешние условия в бактериальной культуре поддерживаются постоянными, то экономический коэффициент тоже будет постоянной, количественно воспроизводимой величиной. Таким образом, если Хо и So —начальные концентрации биомассы и субстрата соответственно, а х и s — соответствующие концентрации во время роста в культуре, то
х — х0 = У (s0 — s). (2.14)
1 В советской литературе термином «экономический коэффициент» обозначают не 1/У, a Y. — Прим. ред.
18
Глава 2
Когда биомасса достигает своего максимума хт, концентрация лимитирующего субстрата равна приблизительно 0 (s~0), т. е. мы можем записать
xm — x0 = Ys0.
(2.15)
Следовательно, для лимитирующего субстрата график зависимости хт от So должен быть прямой линией с тангенсом угла наклона, равным У. На рис. 1 изображен пример применения
Содержание холинхлорида, мкг/мл
Рис. 1. Влияние концентрации холина на рост культуры Л£-клеток мыши.
Точками иа графике обозначены средние значения. Вертикальные линии соответствуют разбросу данных [20].
этого отношения для определения экономического коэффициента при культивировании животных (мышиных) клеток в среде с холином.
2.5. Метаболический коэффициент
Скорость потребления субстрата культурой в данный момент времени выражается отношением
ds)dt = qx, (2.16)
где х — биомасса, а коэффициент q известен как метаболический коэффициент, или удельная скорость метаболизма. В качестве хорошо известных примеров можно привести q0 и <7ГЛЮК для потребления кислорода и глюкозы соответственно. Метаболический коэффициент аналогичен ферментативной активности. Если состав биомассы и окружающая среда постоянны, то и q должен быть величиной постоянной.
Параметры роста и анализ данных о росте 19
Для потребления субстрата в небольшой промежуток времени dt мы можем записать
ds = ^dt, (2.17)
откуда
ds/dt = y.x/Y. (2.18)
Сравнивая уравнение (2.18) и (2.16), видим, что
q = li/Y. (2.19)
Уравнение (2.19) используется для определения потребностей в субстрате, особенно в кислороде, при различных скоростях роста.
В гл. 16 будет рассмотрено применение метаболического коэффициента для определения скорости образования продукта.
2.6. Влияние концентрации субстрата на скорость роста
Существование фазы экспоненциального роста в периодической культуре доказывает, что скорость роста может в довольно широких пределах не зависеть от концентрации субстрата. Следовательно, рост в этом случае характеризуется кинетикой нулевого порядка. Можно предположить, что кинетика потребления субстрата будет соответствовать кинетике ферментативной реакции. Тогда, если s — концентрация субстрата, a q— метаболический коэффициент, то
q = qmS/(s + Ks), (2.20)
где Ks, называемая константой насыщения, эквивалентна константе Михаэлиса — Ментен, a qm—максимальное значение q, полученное при s^>Ks-
Подставив в уравнение (2.20) значения q и qm из уравнений q - ц/Т и qm -- Цт/Y, получим
P = pms/(s + ^). (2.21)
Уравнение (2.21) часто называют отношением Моно, так как именно Моно в 1942 г. [216] эмпирически установил, что это выражение хорошо соответствует зависимости скорости роста бактерий от концентрации субстрата (рис. 2). Значение К* обратно пропорционально сродству организма субстрату. Преобразуя уравнение (2.21), получаем
1=-^- + —, (2.22)
Ц SHm Нт
т. е., построив график зависимости 1/ц от 1/s, получим прямую линию, которая пересекает ось абсцисс в точке —l/Ks, а ось
Рис. 2. Удельная скорость роста у как функция концентрации s субстрата в соответствии с уравнением Моно у. = p.ms/(s + Ks) при ym = 1,0 ч~1 и Ks = Ю мг/л. Отметим, что при s = Ks у = 0,5 цт.
Рис. 3. Данные рис. 2 в обратных координатах.
Параметры роста и анализ данных о росте
21
ординат — в точке 1/цт (рис. 3). Линейность графика в случае, когда по оси ординат откладывают обратные величины, служит удобным методом для проверки гиперболической зависимости.
2.7. Значения константы насыщения К3
Данные об определении Ks немногочисленны, поскольку значения Д? крайне малы, часто ниже чувствительности химических методов определения. К тому же, если отбор пробы или
Рис. 4. Метод Вуттона [36] для определения концентрации лимитирующего субстрата (5) при данной удельной скорости роста (у. = D) в хемостате.
Каждая прямая линия изображает зависимость стационарной концентрации биомассы (х) при данной скорости разбавления от различных концентраций лимитирующего субстрата (£) в поступающей среде. Эта прямая линия может быть выражена уравнением x=Y (sr—s), где У—экономический коэффициент. Экстраполируя прямую до х«0, имеем s =s.
сам анализ не будут проведены практически мгновенно, то уровень субстрата может существенно упасть в процессе анализа. Для измерения s при различных скоростях роста обычно используются следующие определения: 1) мгновенно измеряют концентрации лимитирующего субстрата при различных скоростях роста в культуре в хемостате, как это сделал для кислорода Джонсон [160], 2) измеряют начальные скорости роста при различных начальных концентрациях субстрата в периодических культурах, 3) измеряют скорость роста в конце периодического культивирования [216], а концентрацию субстрата определяют из известной концентрации биомассы с помощью уравнения (2.14); 4) измеряют критические скорости разбавления (скорости вымывания) в хемостате при различных концентрациях
22
Глава 2
лимитирующего субстрата в поступающей питательной среде [74]; 5) применяют метод Буттона [36] (рис. 4).
Таблица 1
Константы насыщения (значения Для роста организмов на различных субстратах
Организм (рол) Субстр ат Источник данных
10~5 м
Escherichia ’) Глюкоза 6,8- 1(Г2 3,8- 10~2 [296)
Неизвестная бак- Фенол 9,0- 10-1 1,0 [161]
терия Escherichia Маннит 2,0 1,1 [216]
Escherichia Глюкоза 4,0 2,2 [216]
Aspergillus » 5,0 2,8 [251. 252]
Candida Глицерин 4,5 4,9 [37]
T etrahymena Бактерии 12,0 — [61]
Escherichia Лактоза 20,0 5,9 [216]
Saccharomyces Глюкоза 25,0 14,0 [260]
Pseudomonas Метанол 0,7 2,0 [120]
Pseudomonas Метан 0,4 2,6 [120]
Klebsiella Двуокись угле- 0,4 9- 10~1 Разд. 8.8
Escherichia *) рода Фосфат-ионы 1,6 1,7 [296]
Klebsiella Ионы магния 5,6- 10~1 2,3 [74]
Klebsiella Ионы калия 3,9- 10-1 1,0 [74]
Klebsiella Ионы сульфата 2,7 2,8- 10~‘ [74]
Candida Кислород 4,5- 10~’ 1,4 [37]
Candida » 4,2- 10“2 1,3- ю-1 [159, 160]
Aspergillus2) Аргинин 5,0- 10~‘ 2,9- Ю'1 [251. 252]
Escherichia 2) Триптофан 1,1 10~3 5,4- 10~3 [226]
Escherichia 2) » 4,9- 10 4 3,4- 10~3 [296]
Cryptococcus Тиамин 1,4- 10-7 4,7- 10“‘° [36]
*) Ауксотрофы по аминокислотам.
2) Приведены наименьшие из двух найденных значений.
Значения Ks для источника углерода и энергии близки к 10-5 М (табл. 1). Значения Ks для ионов калия, магния и фос-фат-ионов тоже составляют примерно 10~5 М, а для кислорода—• от Ю'8 до 10~5 М. Значения этого коэффициента для аминокислот и витаминов значительно ниже (на порядок или даже на несколько порядков). Значения Ks для микроэлементов неизвестны и вообще для них не установлена справедливость
Параметры роста и анализ данных о росте
23
соотношения Моно. Значения /Q как для прокариотов, так и для эукариотов одного порядка. Из молекулярных расчетов кажется, что значения Ks для высокополимерного крахмала и мономера у /(. aerogenes приблизительно одни и те же [135]. По расчетам, сделанным на основе веса, значения Ks для бактериального субстрата у протозоа Тetrahymena (табл. 1) сравнимы с значениями Ks для малых растворимых молекул.
В общем, можно считать, что результаты соответствуют отношению Моно [уравнение (2.21)], однако имеются данные, что при высоких скоростях роста наблюдаются отклонения от этого отношения [296]. Это, возможно, объясняется тем, что при различных скоростях роста изменяется сродство организмов к лимитирующему субстрату.
2.8. Определение длительности лаг-периода
Максимальному уровню удельной скорости роста часто предшествует лаг-период. Длительность лаг-периода (Z.) для многих целей удобно определять методом Лоджа и Хиншельвуда
Рис. 5. Определение длительности лаг-периода.
[188] . Если на графике зависимости логарифма биомассы от времени (рис. 5) прямую линию экстраполировать до уровня начальной биомассы, то отрезок, отсекаемый при этом на осп абсцисс, и будет соответствовать L. Соответственно уравнение для роста культуры имеет вид
1п х = ц (t — L) -ф In ,r0. (2.23'»
24
Глава 2
2.9. Предельные границы максимальной концентрации биомассы
О какой бы культуре ни шла речь, максимальная плотность биомассы, которая может быть достигнута в данной среде, определяется одним из четырех условий: 1) количеством лимитирующего субстрата в среде, 2) накоплением ингибирующего продукта, 3) максимальной плотностью упаковки биомассы, 4) отмиранием клеток. Бейл [11] высказывал предположение, что максимальная плотность бактерий, или концентрация «М», в культуре определяется требованиями к «жизненному» или биологическому пространству. В этой довольно-таки туманной концепции предполагается, что биологическое пространство значительно шире физического пространства, занимаемого организмом. Ясно, однако, что подразумеваемая при этом концентрация «М» может быть обусловлена концентрацией компонентов среды (особенно кислорода) или наличием ингибирующего продукта в культуре. Идея Бейла интересна в историческом аспекте, поскольку в течение долгих лет она господствовала среди бактериологов. Идея эта, как нетрудно увидеть, параллельна концепции «контактного угнетения» роста в культурах клеток животных тканей. Установлено, однако, что клетки, которые должны были бы быть объектами «контактного угнетения», непрерывно растут в форме многослойной культуры, если свежая среда доставляется им непрерывно [179]. У других клеток, рост которых будто бы прекратился после контакта, установлено ингибирование, обусловленное образованием кислот [45]. Таким образом, концепция, постулирующая, что контакт между животными клетками прекращает их рост, была опровергнута.
Таб.шца 2
Максимальная плотность упаковки') некоторых микроорганизмов (клетка/см3)
Организм Принимаемая форма Радиус мкм Длина, мкм Объем, мкм’ Максимальная ПЛОТНОСТЬ,-клетка/см^
Serratia marcescens 2) Палочка 0,5 1,7 1,34 7,5- 1011
Klebsiella aerogenes » 0,86 5,4 12,5 8,0- 1010
Bacillus megaterium » 1,2 7,6 34,4 2,9- 1010
Saccharomyces cerevi- Сфериче- 3.5 — 179 5,6- 109
siae ская
L-клетки То же 10,0 — 4190 2,4- 108
’) Вычислено по формуле 10|?/и. где и —объем клетки, выраженный в кубических микрометрах (мкм5).
2) Данные взяты из работы Пауэлла [267].
Параметры роста и анализ данных о росте
25
Предположим, что ингибирования нет, популяция остается жизнеспособной, а с помощью диффузии через полунепроницае-мую мембрану осуществляется неограниченная доставка питательных элементов. Тогда концентрация биомассы будет ограничена только максимально возможной плотностью упаковки организмов или клеток в биомассе. Это предельное состояние устанавливается в растительных и животных тканях. Максимальная плотность упаковки клеток (число клеток в 1 см3) составляет около 1012/щ где v — объем индивидуальной клетки в мкм3. В табл. 2 приводятся некоторые максимальные плотности упаковки, вычисленные по этой формуле для различных организмов. Это максимально возможная плотность популяции соответствует примерно 10% сухого веса от общего объема (вес/объем).
d
Глава 3
ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОМАССЫ
3.1. Факторы, влияющие на выбор метода определения
Биомасса — это общий термин, используемый для обозначения организмов в культуре. При употреблении других терминов, таких, как организмы, клетки, мицелий, плазмодий, подразумевается определенный тип биомассы. Параметр «биомасса» отражает степень интенсивности роста; он входит в очень важные производные параметры, такие, как экономический коэффициент и метаболический коэффициент. Несмотря на фундаментальную важность биомассы, опубликованные результаты исследований, посвященных культивированию микробов, часто не дают точных сведений о количестве образованной биомассы. Это серьезно ограничивает количественную интерпретацию результатов.
В основе методов, используемых для измерения биомассы, лежит определение восьми параметров: массы, объема или линейных размеров, массы некоторых компонентов биомассы, массы потребленного субстрата или образованного продукта, скорости метаболизма, светорассеяния, прямой подсчет клеток или органелл, результатов окрашивания.
Выбор метода измерения имеет решающее значение для успешного применения того или иного подхода к решению проблем исследования культур. Ограничения, свойственные каждому методу, часто затрудняют этот выбор. На выбор метода измерения влияют следующие факторы: 1) свойства биомассы, 2) свойства культуральной жидкости, 3) требуемая точность, 4) требуемая чувствительность и 5) требуемая скорость измерения.
Свойства биомассы, влияющие на выбор, заключаются в следующем: содержит ли она нити или частицы, легко ли биомасса отделяется от среды, возраст биомассы, скорость ее роста. Отделение бактерий от суспензии — процедура довольно утомительная, но в будущем, возможно, ее удастся облегчить с помощью химических методов осаждения или флоккуляции бактерий.
На результаты определения биомассы могут воздействовать также такие факторы, как вязкость и цвет культуры, присутствие твердого или растворимого вещества, реагирующего подобно
Определение биомассы
27
биомассе; присутствие в клетках запасных веществ, таких, как гликоген или поли-р-оксимасляная кислота. Все методы значительно отличаются друг от друга по своей чувствительности, по необходимым затратам времени и по точности. Сравнение наиболее распространенных методов с точки зрения их чувствительности приведено в табл. 3. Наименее чувствительный метод — определение веса сухой биомассы, наиболее чувствительный — подсчет клеток.
Таблица 3
Сравнение чувствительности некоторых методов определения бактериальной биомассы
О п р е де ля емы и параметр
Минимум веса сухой биомассы бактерий, требуемый для определения с ошибкой < 2% - мг
Вес биомассы
Белок (по биуретовой реакции)
ДНК
Белок (по реакции Фолина — Чио-кальто)
Оптическая плотность
Подсчет клеток
50
1,0
1,0
10~'
ю-1
1П-5
Методов измерения биомассы существует немало. Однако это не исключает необходимости в новых и более совершенных методах, позволяющих определять биомассу во всех мыслимых условиях существования.
3.2. Измерение массы и объема
3.2.1. Сухая биомасса
Прямое определение количества сухой биомассы включает в себя отделение организма от среды, отмывание и высушивание его. Отмывание организмов следует проводить так, чтобы избежать лизиса организмов из-за разрывов, вызванных осмотическим шоком. Это может произойти, если биомасса отмывается водой, особенно в том случае, если организмы взяты из быстро растущей культуры. Для предотвращения лизиса отмывание биомассы следует проводить в солевом растворе, близком к изотоническому. При расчетах необходимо учитывать вес солей, присутствующих после высушивания. Обычно биомасса сушится в печи при 105 ±2 °C.
Данный метод непригоден, если, помимо биомассы, среда содержит неизвестное количество каких-либо твердых веществ.
28
Глава 3
Иногда следует вносить поправку в вычисленный вес сухой биомассы из-за присутствия в ней запасных веществ, доля которых может составлять до 50% веса сухой биомассы. Вес биомассы является, вероятно, наиболее четким и ясным параметром биомассы. Главный недостаток данного метода сводится к тому, что для проведения теста требуется довольно большой объем отбираемых проб и много времени.
3.2.2. Сырая биомасса
Если определение биомассы проводят путем прямого взвешивания, опуская этап высушивания, то в результате получают вес сырой биомассы. В сырой биомассе заключена и внутриклеточная и внеклеточная, или интерстициальная, вода. Робертс и др, [278, стр. 63] установили, что объем интерстициальной воды в культуре Escherichia coli составляет от 10 до 25% полного объема плотно спрессованных клеток. Они также определили, что на долю сухой биомассы приходится около 25% сырой биомассы [278, стр. 5]. Центрифугирование или любой другой метод, используемый для получения уплотненной биомассы, следовало бы тщательно стандартизировать. Метод определения количества сырой биомассы не так точен, как метод определения сухой массы, но он требует меньше времени.
3.2.3. Объем
Количества биомасс можно сравнивать, измеряя их объемы, так как по плотности биомассы различаются незначительно. Для измерения небольших объемов клеток можно использовать гематокрит, с помощью которого Веймут [344] прослеживал рост животных клеток в культуре. Для определения объемной биомассы, в чем, например, возникает необходимость при работе с культурами грибов, для быстрого измерения объема часто используются мерные центрифужные пробирки. Этот метод удобен в тех случаях, когда среда содержит другие твердые частицы, такие, как карбонат кальция, плотность которого выше плотности биомассы. Метод измерения объема осаждением, так же как и метод определения сырой биомассы, должен быть стандартизован.
3.2.4. Линейные размеры
Рост обычных или шаровидных колоний биомассы можно проследить, измеряя их линейные размеры. Вычисление на основе этих данных скорости роста обсуждается в гл. 23.
Определение биомассы
29
3.3. Масса клеточного компонента
Для измерения биомассы можно определить количество некоторого компонента клетки, содержание которого относительно всей биомассы постоянно. Для этих целей можно определять клеточный азот, белок и ДНК- Содержание РНК в клетке может служить параметром биомассы лишь в том случае, если скорость роста и температура постоянны.
3.3.1. Клеточный азот
Содержание азота в клетке можно определять с точностью до 1% методом Кьельдаля. Прямая зависимость между количеством клеточного азота и количеством биомассы наблюдается только в ограниченном диапазоне условий. Например, содержание азота в сухом мицелии Penicillium chrysogenum может изменяться от 10% в активно растущих организмах до 6% в мицелии из стационарной фазы.
3.3.2. Белок
Для определения белка биомассы после его солюбилизации в щелочных растворах используется обычно два метода: в основе одного из них лежит биуретовая реакция на пептидные связи [307; 185, стр. 447], в основе другого — реакция тирозиновых и триптофановых остатков на реактив Фолина — Чиокальто [182; 185, стр. 447]. Перспективен, по-видимому, третий метод, основанный на связывании красителя бромсульфалеина основными группами белка [235, стр. 331]. Используемые для определения реактивы обычно стандартизуют по альбумину сыворотки бычьей крови. Результат определения зависит от аминокислотного состава белка, однако этот состав не всегда остается постоянным. Метод Фолина— Чиокальто более чувствителен, чем биуретовая реакция (см. табл. 3). Канна и др. [166] считают, что для определения белка в грибах лучше использовать метод Лоури.
3.3.3. ДНК
Определение ДНК в биомассе основано на колориметрическом определении дезоксирибозы. Использование этого метода применительно к бактериальной массе описали Мейнелл и Мей-нелл [210, стр. 5], а к тканевым культурам — Пол [235, стр. 330]. Поскольку содержание ДНК в биомассе специфично и постоянно, то определение ДНК могло бы служить удобным методом измерения биомассы. Однако этот метод мало используется, что, по-видимому, объясняется его более низкой чувствительностью и большими затратами времени.
30
Глава 3
3.4. Экономические коэффициенты
Образованное количество биомассы Дх можно определить из количества потребленного субстрата (As) или количества образовавшегося продукта (Др). В идеале должна была бы существовать прямая пропорциональность Ax=Yx/s-hs или Дх = = Kc/p-Др, где экономические коэффициенты Yx/s и Yx/P постоянны: однако этого может и не быть, если изменяются условия культивирования. Для определения выхода биомассы можно исходить из накопления конечных продуктов энергетического обмена, таких, как молочная кислота и двуокись углерода.
Потребление субстрата можно оценивать по убыли источников углерода энергии, азота или факторов роста. Часто экономический коэффициент зависит от скорости роста, однако в хемостате, где скорость роста поддерживается постоянной, это влияние можно исключить.
3.5. Скорость метаболических процессов
Количество биомассы (х) можно соотносить со скоростью определенного метаболического процесса. Если q—метаболический коэффициент, а скорость метаболического процесса dy/dt, где у — количество некоторого субстрата или продукта, то х— (l/p) (dyfdt). Примерами процессов, которые можно использовать подобным образом, являются восстановление красителя и образование газа. Скорость восстановления тетразолиума в форму восстановленного формазана была использована для измерения количества животных клеток в культуре [321].
3.6. Метод светорассеяния
3.6.1. История вопроса
Введение в практику измерения количества биомассы бактерий на основе данных о светорассеянии сыграло важную историческую роль: впервые появилась возможность мгновенного измерения биомассы, сослужившая неоценимую службу в объяснении природы роста клеток. Суспензии организмов рассеивают свет и кажутся мутными, если показатель преломления организма отличается от показателя преломления среды. Видимая мутность начинает проявляться, когда плотность бактерий достигает 10е ед/мл. Мутность можно измерять, определяя либо количество света, прошедшего через суспензию (абсорбциометрия), либо количество света, рассеянного суспензией (нефелометрия). Метод светорассеяния применим к суспензиям бактерий, дрожжей, спор и клеток млекопитающих.
Определение биомассы
31
3.6.2. Факторы, влияющие на количество рассеянного света
На степень мутности суспензии организмов может оказы вать влияние целый ряд важных физических и биологических факторов, из которых не все поддаются учету. Соотношение между концентрацией организмов х и длиной светового пути I, а также интенсивность света, падающего /о и прошедшего Л, выражается уравнением
log(Z0//z) = ^4 -x-l.
Значение log (lolh) называется непрозрачностью, оптической плотностью или экстинкцией. Коэффициент А — величина постоянная при небольших концентрациях бактерий, но при больших начинает увеличиваться вследствие вторичного рассеяния, так как свет наталкивается больше, чем на одну частицу. В нефелометрии Л—интенсивность рассеянного света, log (/о/Л) = —В • х I, где В — константа. Абсорбциометрия используется чаще, чем нефелометрия, вероятно, из-за большей доступности абсорбциометров.
Степень и направление рассеянного света зависят от размера и формы частицы, длины световой волны и разницы между показателем преломления частиц и среды. Эти влияния были выражены Пауэллом [267] в виде двух законов:
1. Общее количество рассеянного света увеличивается с увеличением отношения размера частиц к длине световой волны. С этой точки зрения следует выбирать свет с наиболее низкой длиной волны. На практике обычно используется зеленый свет с длиной волны около 540 нм, так как в случае световых волн с более низкой длиной волны может быть избыточное поглощение света.
2. Общее количество рассеянного света тем больше, чем больше различие между показателем преломления у частиц и среды. О влиянии показателя преломления свидетельствует различие в контрасте между колониями разных бактерий и средой на пластинке агара. Стафилококки, например, более контрастны, чем Escherichia coli, так как они характеризуются более высоким показателем преломления. Концентрация твердых частиц в среде может значительно влиять на ее показатель преломления. Гильби и Фью [106] рекомендуют при определении оптической плотности вносить поправку на показатель преломления. Осмотическое набухание бактерий в гипотонической среде может привести к значительному уменьшению оптической плотности, вероятно вследствие уменьшения показателя преломления клеток [106, 197]. Набухание указывает на эластичность клеточных стенок некоторых организмов. Например, у Escherichia
и
32
Глава 3
соН этот эффект наблюдается, а у стафилококков — нет [215]. Чтобы избежать влияния коэффициента показателя преломления и осмотического давления на оптическую плотность, тоничность добавляемой жидкости и клеточной суспензии должна быть одна и та же.
Существует предположение, что оптическая плотность пропорциональна концентрации клеток независимо от числа клеток. Однако относительно этой точки зрения нельзя сделать каких-либо общих утверждений, хотя это, возможно, и справедливо в некоторых специальных случаях [267].
Розенбергер и Элсден [281] установили, что отношение оптической плотности к весу сухой биомассы Streptococcus faecalis не зависело от удельной скорости роста, которая, казалось бы, должна изменять это отношение, поскольку с увеличением скорости роста увеличивается и размер клеток. Было установлено, что в периодической культуре Klebsiella aerogenes это отношение падает на 8% при достижении культурой стационарной фазы [114]. Иногда, прежде чем измерять оптическую плотность, необходимо добавлять в клеточную суспензию токсичные соединения. Для этой цели часто используется раствор формалина (1%). Обработка формалином предотвращает изменение оптической плотности при изменении тоничности среды [197]. Следовательно, обработка формалином может, по-видимому, быть использована для стабилизации оптической плотности.
Предложен метод определения биомассы в эмульсии углеводородов, основанный на измерении мутности. Эмульсия нефть — вода делается прозрачной при добавлении пропионовой кислоты [200].
3.7. Подсчет клеток и органелл
3.7.1. Общая картина и общий подсчет
Биомассу можно определять двумя путями: 1) подсчетом общего числа индивидуальных организмов или органелл (таких, например, как ядра, присутствующие в образцах) с помощью микроскопов или некоторых электронных приборов или 2) подсчетом жизнеспособных колоний, вырастающих из индивидуальных клеток. Недостаток метода подсчета состоит в том, что если число клеток в пробе мало, то ошибка выборки неизбежна. Преимуществом метода является его специфичность и более высокая (по сравнению с другими методами) чувствительность (табл. 3).
Выборки из сосчитанного числа клеток подчиняются закону распределения Пуассона. Если п — число сосчитанных орга
Определение биомассы
33
низмов, то стандартное отклонение 6 = п'/2 и с вероятностью 95% границы доверительного интервала лежат в пределах п ± 26. Это означает, что п должно быть больше 400, если мы хотим иметь 95%-ный доверительный интервал меньше, чем 10% среднего значения. Более подробные сведения об ошибках при методе счета клеток можно найти в работе Мейнелла и Мейнелл [210].
Визуальные подсчеты имеют то преимущество, что наблюдатель может различать виды организмов, которые надлежит подсчитать, и другие типы частиц или организмов в среде. Число животных клеток определяют подсчетом ядер, выделяющихся из клеток при добавлении 0,1 М лимонной кислоты и окрашивании кристалвиолетом [235, 287, стр. 327].
Электронные приборы для счета, такие, как счетчик Коултера, удобны при большом числе измерений и уменьшают ошибку выборки, так как дают возможность просчитать большое число проб. При работе с клетками малых размеров, таких, как бактерии, следует соблюдать особые предосторожности, чтобы избавиться от помех, вносимых фоновым шумом [142].
3.7.2. Подсчет живых клеток
Наиболее важные методы, основанные на способности индивидуальных организмов к размножению и образованию колоний, которые можно подсчитать, описаны Мейнеллом и Мейнелл [210]. Для подсчета живых клеток должны использоваться не минимальные, а богатые среды, поскольку изолированные индивидуальные клетки более требовательны к питанию, среде, чем плотная популяция в целом. С помощью метода элективных сред можно пересчитать организмы разных типов, которые присутствуют в смеси.
Метод подсчета, основанный на разбавлении и используемый при бактериологическом анализе воды, состоит в учете не проросших разведений после высева суспензии организмов в ряд пробирок со средой. Преимущество данного метода состоит в том, что он дает возможность определять малые концентрации организмов (< 1 клетка/мл). Однако поскольку размер пробы мал, то велика ошибка измерения. Вместо метода подсчета с помощью разбавления используется метод фильтрации через мембранные фильтры и выращивание видимых колоний на фильтре.
3.8. Методы окрашивания
Наиболее бесспорный метод определения числа живых и мертвых клеток состоит в сравнении числа колоний и общего числа клеток. В некоторых случаях мертвые и живые клетки
2 Зак. 737
34
Глава 3
могут быть дифференцированы с помощью окрашивания красителями. Живые клетки млекопитающих непроницаемы для гри-пановогс синего, а мертвые клетки воспринимают эту окраску. Для культур дрожжевых клеток аналогично используется эозин.
Красители, окрашивающие только живые клетки, называются витальными красителями. Окрашенные клетки млекопитающих в культуре с нейтральным красным используются как количественный тест для определения клеток, переживающих вирусную атаку [99].
Глава 4
ПЕРИОДИЧЕСКАЯ КУЛЬТУРА И КУЛЬТУРА ПОЛНОГО ВЫТЕСНЕНИЯ (ТУБУЛЯРНАЯ КУЛЬТУРА)
4.1. Открытые и закрытые системы
Культуры микроорганизмов можно подразделять на «открытые» и «закрытые» системы. Открытая система — это система, все компоненты которой могут поступать в систему и покидать ее. Закрытой называют такую систему, в которой хотя бы один из существенных компонентов не может ни поступать в систему, ни покидать ее. Следовательно, непрерывные культуры, в которых происходит, с одной стороны, приток питательной среды, с другой — отток биомассы и других продуктов, являются открытыми системами. Простая периодическая культура, содержащая ограниченное первоначальное количество питательного субстрата, служит примером закрытой системы. В закрытой системе скорость роста биомассы должна стремиться к нулю либо из-за недостатка субстрата, либо из-за непереносимости продукта при его дальнейшем накоплении. Следовательно, такие системы всегда находятся в неустойчивом состоянии. В отличие от этого в открытых системах всегда есть возможность, что скорость превращения субстрата в продукты и биомассу сбалансируется со скоростью выхода, иными словами, всегда может установиться стационарное состояние.
4.2. Фазы роста простой периодической культуры
В простой гомогенной периодической культуре все ее части находятся в одинаковых условиях. На рис. 6 изображены различные фазы роста такой культуры. Эти фазы отражают изменения в биомассе и в окружающей среде. После лаг-периода (гл. 19) наблюдается максимальная скорость роста, затем рост прекращается либо из-за недостатка источников питания, либо из-за накопления ингибирующих продуктов, либо из-за некоторых изменений в физических свойствах среды. После того как биомасса достигнет максимума, наступает стационарная фаза, в которой количество биомассы остается постоянным. Затем, раньше или позже, количество биомассы уменьшается в результате метаболических процессов, связанных с поддержанием жизнедеятельности, или автолиза.
2*
36
Глава 4
Продолжительность экспоненциального роста частично зависит от начальной концентрации субстрата, лимитирующего реет. Рассмотрим случай, когда эта концентрация равна 1 г/л, а Ks = 4 мг/л. Тогда из уравнения (2.21) следует, что ц > 0,95 iim до тех пор, пока не поглощаются 92% субстрата, лимитирующего рост. Следовательно, период, когда недостаток источников питания влияет на рост, ограничен лишь небольшой частью
Рис. 6 Шесть фаз на кривой роста периодической культуры.
7—лаг-фаза; II—фаза ускорения роста; III—фаза экспоненциального роста: /V—фаза замедления роста; V — стационарная фаза; VI—-фаза отмирания.
последней генерации. Это поведение типично для простых периодических культур и говорит о том, что для них характерен режим питания экстремального типа, т. е. рост при избытке субстрата внезапно сменяется голоданием. Следовательно, периоды роста при скоростях ниже максимальной недостаточно длинны для того, чтобы организм мог приспособить свою структуру к оптимальной для данной скорости роста. Это ограничение может быть отчасти преодолено с помощью специально разработанного ведения периодического культивирования (гл. 21), а полностью снять его возможно только в хемостатной культуре.
Поведение нерастущей биомассы, которая представляет собой стационарную фазу роста и фазу отмирания, описано в гл. 18. Кажущееся замедление роста, стационарная фаза и фаза отмирания могут наступить, если возникнут некоторые условия, летальные для организмов. При этом наблюдаемая скорость роста будет определяться разностью между действительной скоростью роста и скоростью отмирания клеток (гл. 7).
Периодическая культура и культура полного вытеснения 37
4.3. Оценка роста по одной точке
Иногда длительность роста в периодических культурах сравнивают не по кривым роста, а по одной-единственной точке роста, определяя ее после некоторого произвольного промежутка времени. Следует отметить, что разность результатов, соответствующих этой единственной точке, можно интерпретировать несколькими способами. Эта разность может отражать различия в длительности лаг-периодов, максимальной удельной скорости роста, максимальной плотности популяции, концентрации ингибирующих продуктов или скорости отмирания биомассы. Следовательно, пока из других данных не станет ясно, какие из этих возможностей следует исключить, оценку роста по одной точке следует принимать как комбинацию всех этих эффектов. Такая оценка не дает возможности вычислить какие-либо параметры роста.
4.4. Математическая модель простой периодической культуры
Если рост периодической культуры ограничен только лишь начальным количеством субстрата, то кривую роста можно предсказать, исходя из параметров роста. В модели, впервые предложенной Моно [216, стр. 123], мы имеем
dxldt = ppc, (4.1)
Н = Pms/(s + Ks), (4.2)
х — х0 = Y (s0 — s), (4.3)
где хо и so —начальные концентрации биомассы и лимитирующего рост субстрата соответственно. Подставляя значение ц и s з уравнение (4.1), получаем
dx/dt = p.m(Ys + х0 — х) x/(KsY + s0Y ф-х0 —х). (4.4)
При интегрировании получим х в зависимости от t
X t
С (KSY + s0Y + х0 —x)dx f.
}-----ySg + Xo J dt. (4.5)
xa 0
Сгруппировав члены левой части уравнения (4.5),.получим Р (— + Q (-v , (4.6)
J х J rs0 -f- хо — х v
где 7э=(/^г5Е-|_5оУ-|_Хо)/(У5с-|--’Со) и Q ~ K.^Y / (У$о -ф- Хо). Решение уравнения (4.5) дает
Р In (х/х0) — Qin {(Ух0 ф- х0 — x)/Ys0} = nmt. (4.7)
38
Глава 4
Уравнение (4.7) дает характерную для периодической культуры сигмоидную кривую, в которой значение х асимптотически стремится к значению (Vso + xo). Моно [216] показал, что это выражение превосходно соответствует экспериментальным данным, полученным при исследовании роста Escherichia coli.
4.5. Модификации кривых роста простой периодической культуры
Кривая роста, приведенная на рис. 6, идеальна. Длительность каждой фазы роста может изменяться от 0 до нескольких дней. Информация, получаемая из таких кривых, является одной из основополагающих в биологии клетки.
Рис. 7. Некоторые наблюдаемые вариации в кривой роста периодической культуры.
Л. Уменьшение оптической плотности перед наступлением стационарной фазы. 5. Синхронизация деления клеток после лаг-фазы. В. Диауксия.
Периодическая культура и культура полного вытеснения 39
Обычные вариации кривой роста показаны на рис. 7. Если бактериальную массу измеряют по мутности, то часто наступлению стационарной фазы предшествует небольшое уменьшение оптической плотности (рис. 7, Д). Это может быть артефактом, вызванным изменением отношения биомассы к оптической плотности. Другим отклонением от идеальной формы кривой роста, представленным на рис. 7, Б, является более быстрое увеличение числа организмов во время первого удвоения, что может быть обусловлено синхронным делением популяции одноклеточных организмов. Обычно деление становится полностью асинхронным примерно после двух генераций. Третий вариант (рис. 7, В), называемый диауксией, свидетельствует о последовательном использовании субстратов. Классическим примером такого случая служит использование сначала глюкозы, потом лактозы у Escherichia coli. Перегиб на кривой роста или даже уменьшение биомассы соответствует моменту, когда исчерпывается первый субстрат и индуцируется новая ферментная система, атакующая второй субстрат. Изучение этого явления при определенных обстоятельствах позволяет внести некоторую ясность в механизмы синтеза белка.
4.6. Культура полного вытеснения (тубулярная культура)
4.6.1. Общие положения
Культура полного вытеснения моделирует периодическую культуру в открытой системе (рис. 8,Л). В идеале инокулят и среда перемешиваются на входе в систему, затем культура без перемешивания с постоянной скоростью течет через ферментер. Таким образом, все элементы культуры должны были бы иметь одно и то же «время удержания» в сосуде при прохождении через сосуд. Если V — объем (л) сосуда для культивирования, F—скорость (л/ч) течения культуры через ферментер, то время «удержания» культуры, или время «замещения» (replacement), дается формулой tr = V/F. В культуре полного вытеснения неизбежно происходит некоторое перемешивание; это вызвано градиентом скорости в любом сечении сосуда с наибольшим значением скорости в центре сосуда. Если при прохождении культуры вдоль ферментера происходит некоторое перемешивание, то время удержания распределено около среднего значения tr по закону Гаусса (рис. 9).
4.6.2. Культура без возврата биомассы
Эта система представлена на рис. 8,А. Если начальная концентрация лимитирующего рост субстрата Sa Ks, то рост биомассы в каждом малом элементе культуры (dv на рис. 8,71)
40
Глава 4
может быть представлен с помощью уравнения периодического роста. При этом ц = рт, до тех пор пока не исчерпан лимитирующий субстрат, тогда
x = xaeUm<, (4.8)
где ха — начальная концентрация биомассы, а х — концентрация биомассы во время t. Если v — объем культуры, полученный
Инокулят dv
s~sw x-xw
Среда.
aFs
s~sw
Б
Рис. 8. Культура полного вытеснения (тубулярная, схематически).
А. Без возврата биомассы. Б. С возвратом биомассы F, F$ и aF$ — скорости потока в различных точках; х — концентрация биомассы; s—концентрация лимитирующего рост субстрата; V — объем культуры; dv— малый элемент объема культуры; С — устройство для концентрирования биомассы.
Рис. 9. Распределение времени удержания в почти идеальной культуре полного вытеснения.
Af—частица первоначально впрыснутого малого объема материала, появляющаяся кз сосуда в каждый интервал времени Д/.
Периодическая культура и культура полного вытеснения
41
из ферментера за время t, то t = v/F =v/V-D, где D — скорость разбавления (dilution); D — F/V. Подставляя выражение для t в уравнение (4.8), получим
In х = In ха + vp.m/DV.
(4.9)
4.6.3. Культура с возвратом биомассы
Ферментер полного вытеснения можно сделать независимым от начального источника инокулята, если часть биомассы после выхода из ферментера возвратить, направить на вход в ферментер, как показано на рис. 8, Б. Общий поток в ферментере дается уравнением
(4.Ю)
Fs = F + aFs,
где а представляет собой часть общей среды, возвращаемую в ферментер. Следовательно,
Fs = F/(\ — а).
(4.U)
Предположим, что биомассу, прежде чем возвращать в ферментер, концентрируют в g раз. Тогда часть биомассы, возвращаемая на вход, равна ag. В стационарном состоянии ха — agxw, где xw — конечная концентрация биомассы. Время t для прохождения некоторого объема v описывается выражением
t — v (1 — a)/F.
Если Ve — объем, в котором происходит исчерпывание (exhaustion) лимитирующего субстрата, то, положив v ™ Ve и подставив значения х и t в уравнение (4.8), для стационарного состояния получим
Если Ее = V, то из уравнения (4.12) имеем
Тогда максимальная концентрация биомассы на выходе будет
(4.14)
Критическая скорость разбавления Dc, когда xw—>-0, дается уравнением (4.13). Если D превосходит Ос, то xw xm, и, следовательно, возврата биомассы будет недостаточно для поддержания xw\ наступает так называемое «вымывание» (см. разд. 6.5).
42
Глава 4
4.7. Применение культуры полного вытеснения
Культура полного вытеснения может служить лишь моделью, подобием периодической культуры. Никаких новых возможностей управления внешними условиями этот метод не приносит. Новое в культуре полного вытеснения состоит лишь в том, что в ней разделены в пространстве фазы, которые в периодической культуре разделены во времени.
В лабораторных условиях невозможно реализовать идеальную культуру полного вытеснения. Главная трудность связана с наличием ламинарного течения в трубах, при этом всегда существует градиент скорости в любом сечении трубы. Поэтому малая скорость течения у стенок сосуда способствует прилипанию биомассы к стенкам трубы. Если же требуется аэрация, то неизбежно происходит некоторое перемешивание. Хорошее приближение культуры полного вытеснения получается при соединении нескольких хемостатов в серии (батареи) (разд. 6.5).
Культуры полного вытеснения в больших масштабах используются при очистке сточных вод. Возврат активного ила рассматривается как возврат биомассы, но было высказано предположение [249], что он может представлять собой также определенную форму концентрирования субстрата. Анаэробную ферментацию при производстве молочных продуктов, таких, как йогурт и сыр, также можно с успехом проводить методом культур полного вытеснения. Еще один возможный путь использования данного метода — это моделирование процессов, протекающих в пищеварительном тракте в результате жизнедеятельности кишечной флоры.
Глава 5
ХЕМОСТАТНАЯ КУЛЬТУРА
5.1. История вопроса
В продолжение более чем полувека обсуждалась возможность продления жизни микробной культуры с помощью непрерывной подачи свежей среды и постоянного отбора образовавшихся продуктов [274]. Было предложено два типа непрерывной культуры — культура полного вытеснения и хемостат.
Рис. 10. Хемостат (схематически).
Ковцентрации биомассы и лимитирующего субстрата в различных точках представлены как х и s соответственно. F —скорость потока, У—объем культуры.
В идеальной культуре полного вытеснения (разд. 4.6) не происходит никакого перемешивания при движении культуры через трубу или канал. Хемостатная же культура, напротив, представляет собой полностью перемешиваемую суспензию биомассы, в которую с постоянной скоростью подается среда и из которой с той же скоростью отбирается культура; общий объем культуры остается постоянным (рис. 10).
Система с полным вытеснением моделирует периодическую культуру и не дает никаких других, более широких по сравнению с периодической культурой возможностей контроля за
44
Г лава 5
окружающей средой. Фундаментальное значение хемостата стало очевидным лишь после создания Моно [217] и Новиком и Сцилардом [227] основной теории хемостата. Первым предсказанием теории было указание на возможность фиксировать удельную скорость роста биомассы на любом значении — от нуля до максимума. Это заключение опрокинуло некий барьер традиционного мышления, безусловное утверждение того, что, по крайней мере для бактерий, возможна одна-единственная постоянная скорость роста — максимальная скорость, соответствующая времени удвоения простой периодической культуры. Хемостатная культура открыла новые горизонты в физиологии микроорганизмов, а история метода показывает, насколько важно, чтобы появление теории предшествовало эксперименту. Метод применим ко всем типам микроорганизмов и клеткам различных тканей животных или растений, какие только могут расти в гомогенной перемешиваемой культуре.
5.2. Теория хемостата
5.2.1. Общие принципы
Хемостат (рис. 10) представляет собой культуру, в которую с постоянной скоростью непрерывно подается свежая среда, а объем культуры поддерживается при этом на постоянном уровне путем непрерывного отлива части культуры. В идеале перемешивание в хемостате должно быть полным, т. е. капли поступающей в сосуд среды должны немедленно и однородно распределяться по всей культуре. На практике это означает, что время, необходимое для перемешивания небольшого объема среды в культуре, должно быть значительно меньше, чем время замещения (replacement time) tr, равное V/F, где V — объем, a F— скорость течения (flow rate) среды.
Рассмотрим некую культуру, в которой рост биомассы лимитируется количеством одного-единственного субстрата, а все остальные компоненты среды находятся в избытке. Предположим, что вначале добавления среды не происходит и рост биомассы протекает так же, как и в периодической культуре. Затем, когда начнется поступление среды, рост культуры будет происходить в соответствии с одной из трех возможностей, изображенных на рис. И. Первая возможность состоит в следующем: скорость вымывания биомассы окажется больше скорости роста и концентрация биомассы будет в результате падать, а концентрация лимитирующего рост субстрата будет стремиться к увеличению до значения sr. Вторая возможность: начальная скорость вымывания биомассы будет точно равна скорости роста. При этом организмы будут расти с их максимальной
Хемостатная культура
45
Рис. 11. Три возможных результата в хемостатной культуре, в которой скорость роста биомассы (х) ограничена концентрацией (s) лимитирующего рост субстрата.
Поток среды, содержащий лимитирующий рост субстрат в концентрации s?, включен в момент времени Различные случаи таковы: 1 — скорость вымывания биомассы превосходит максимальную скорость роста; 2—скорость вымывания равна максимальной скорости роста; 3—начальная скорость вымывания меньше, чем максимальная скорость роста биомассы.
удельной скоростью роста цт- В этом случае установится стационарное состояние, при котором концентрация биомассы и лимитирующего рост субстрата остаются постоянными. Однако такое состояние не будет устойчивым стационарным состоянием, поскольку любое временное изменение условий, влияющее на концентрацию биомассы и субстрата, приведет к непрерывному
46
Глава 5
изменению этих концентраций. Третья возможность осуществится, если скорость вымывания биомассы вначале будет меньше максимальной скорости роста. Тогда концентрация биомассы будет непрерывно увеличиваться. Однако соответствующее уменьшение концентрации лимитирующего рост субстрата приведет к тому, что удельная скорость роста биомассы будет
Рис. 12. Действие временного возмущения стационарных условий в хемостате, если удельная скорость роста биомассы меньше, чем максимальная скорость.
х — концентрация биомассы, «концентрация субстрата.
уменьшаться до тех пор, пока скорость роста биомассы не станет равной скорости вымывания. Дальнейших изменений в концентрации биомассы и лимитирующего субстрата не может быть. В этом случае удельная скорость роста биомассы будет ниже цт и будет определяться скоростью потока среды. Такое стационарное состояние является саморегулирующимся. Последствия возмущений стационарного состояния во времени показаны на рис. 12. Уменьшение концентрации биомассы приведет к увеличению концентрации субстрата, что в свою очередь вызовет повышение скорости роста и обусловит восстановление условий стационарного состояния. Увеличение концентрации биомассы вызовет противоположный эффект.
5.2.2. Удельная скорость роста
Задача количественной теории состоит в том, чтобы предсказать значения скорости роста, концентраций биомассы и субстрата в различных условиях. Пусть р— удельная скорость роста; обозначения для других параметров приведены на
Хемостатная культура
47
рис. 10. Значение F/V = D известно как скорость разбавления: Оно характеризует скорость потока на единицу объема.
Увеличение концентрации биомассы дается уравнением баланса биомассы:
Общее увеличение биомассы = Рост — Отток.
Для бесконечно малого промежутка времени dt для полной культуры этот баланс будет выглядеть следующим образом:
V • dx — V • цх • dt — Fx • dt. (5.1)
Поделив уравнение (5.1) на Vdt, получим dx/dt = (ц — D)x. (5.2)
В стационарном состоянии, когда dx/dt = 0, мы имеем ц = D.
5.2.3. Концентрации биомассы и лимитирующего рост субстрата
Баланс для лимитирующего субстрата дается уравнением Общее увеличение = Поступление — Отток — Субстрат, использованный на рост.
Для бесконечно малого промежутка времени dt этот же баланс для полной культуры выражается уравнением
V • dx = Fsr dt — Fs — V • цх • dt/Y, (5.3)
где У — экономический коэффициент. Следовательно,
ds/dt = D (sr — s) — yx/Y. (5.4)
В стационарном состоянии dx/dt = ds/dt = 0.
Тогда значения стационарных концентраций s и х даются уравнениями
(ц-£>)х = 0 (5.5)
и
D (sr — s) — цх/У — 0, (5.6)
где тильда означает значение в стационарном состоянии. Для того чтобы потучить х и s, подставим выражение для удельной скорости роста:
И = PmS/(« + К s').
(5.7)
43
Глава 5
Подставив в уравнение (5.7) р = 7), получим уравнение для стационарного состояния
S^KsD/(iim-D), (5.8)
а из уравнения (5.6) при подстановке р, = D получим
х = У(5г-з) = У{5г-ад(рт-О)}. (5.9)
5.2.4. Критическая скорость разбавления
При s = sr достигается максимальная скорость роста. Подставив это значение в уравнение (5.7), получим
р. = Dc = llmSr/(sr + Ks),
(5.10)
где Dc — критическая скорость разбавления; при этом значении стационарная концентрация биомассы равна нулю. Если
^0
Рис. 13. Концентрации биомассы (х) и лимитирующего рост субстрата (5) в хемостате в стационарном состоянии в соответствии с уравнениями (5.8) и (5.9).
Параметры: цт = 1,о ч —К = 0,005 гм. Г = 0,5. Концентрация биомассы (ось ординат) выражена как количество (г) сухой биомассы на 1 л.
Хемостатная культура
49
sr Ks, то из уравнения (5.10) следует, что Dc ~ цт. График зависимости х и § от скорости разбавления при типичных значениях параметров приведен на рис. 13.
5.2.5. Определение максимальной скорости роста
Если s S> Ks, то, подставляя р = цт в уравнение (5.2) и интегрируя его, получим
In х = (pm — D)t + 1пх0. (5.11)
Если в хемостате D > Ос, то биомасса культуры уменьшается, или наступает вымывание, в соответствии с уравнением (5.11). Наклон на логарифмическом графике равен (рт — D), откуда получаем значение рт. Этот метод был использован Пертом и Каллоу [258] для определения влияния температуры на максимальную скорость роста плесени Penicillium chrysogenum.
5.3. Производительность хемостата
5.3.1. Определение
Для хемостатной культуры производительность в расчете на единицу объема дается выражением R — Dx, а в стационарном состоянии
R — DY {sr - KsD/(p.m - D)}. (5.12)
На рис. 14 показана производительность в стационарном состоянии как функция D при типичных значениях параметров Культуры. Производительность достигает максимума при скорости разбавления Dm, которая получается при дифференцировании R по D и приравнивании полученного дифференциала нулю. Таким образом, мы находим
с” = |*”{1-Дп<7)''Д <5'13’
Подставляя это значение в уравнение (5.9) для стационарного состояния биомассы, получим
xm = r[Sr + Ks-{KJsr + O,/2]- (5.14)
Если sr » Л\, то для максимальной производительности
Dmxm^DmYsr. (5.15|
50
Глава 5
5.3.2. Сравнение с выходом биомассы в периодической культуре
Как следствие автокатализа, максимальная производительность в хемостатной культуре должна превосходить максимальную производительность в периодической культуре того же объема. Это отражено на рис. 15, на котором наклоны линий А
Рис. 14. Производительность по биомассе в стационарном состоянии в хемостате.
Параметры те же, что и на рис. 13. зг== 1,0 г/л.
и В соответствуют максимальной производительности. В хемостатной культуре может непрерывно поддерживаться рост, соответствующий точке максимальной производительности на кривой (наклон В), в то время как производительность периодической культуры является средним значением скорости образования биомассы за весь период культивирования.
Количественно сравнить производительность можно следующим образом. Допустим, что хт — максимальная концентрация биомассы, а хо — концентрация инокулята. Предположим также, что удельная скорость роста периодической культуры остается на постоянном и максимальном (у,т) уровне до тех пор, пока не исчерпается субстрат. Таким образом, для длительности периодического культивирования получим
+ (5.16)
Нт \ /
Хемостатная культура
51
где ta — время задержки, которое включает в себя длительность лаг-периода и время, необходимое для загрузки и разгрузки ферментера между циклами. Прирост биомассы будет равен Ysr, где sr— начальная концентрация лимитирующего рост
Рис. 15. Сравнение максимальной производительности по биомассе в периодической и хемостатной культурах.
Кривая соответствует росту периодической культуры, а производительность дается наклоном прерывистой линии А. В хемостатной культуре можно поддерживать производительность, равную максимальному наклону кривой (линия В).
субстрата. Таким образом, производительность периодической культуры будет:
(период.) = = ln(-^-) + 1WO}- (5.17)
Полагая, что Dm = цт и сравнивая выражение (5.17) с максимальной производительностью хемостатной культуры [из уравнения (5.15) ], имеем
(хемостат.)
р
(период.)
= In [ — ) 4- ц.mta = In I — 1 у I I Г III U I V
\ Ло / \ Ло
0,693/ a
(5.18)
где /а = 0,693/pm. На практике обычно отношение xm : xa = 10 или больше, чем 10. Тогда, если допустить, что ta = 0, то максимальная производительность хемостата по крайней мере в 2,3 раза превосходит производительность периодической культуры. Однако ta часто оказывается во много раз больше, чем ta.
52
Глава 5
5.4. Распределение времени удержания в хемостате
Благодаря перемешиванию каждый вновь добавленный элемент среды может или сразу же вымыться из культуры, или оставаться в ней неограниченно долгое время. Таким образом, будет существовать некоторое распределение времени удержания. Если то — количество вещества на единицу объема в начальный момент времени, а т —количество вещества в данный момент времени t, тогда количество вещества, покидающего
Рис. 16. Доля е D первоначального материала, который остается в хемостате в зависимости от t/tr.
t — время, i— время замещения,
сосуд, т. е. имеющее время удержания между / и t -\-dt, будет
— dm = Dm-dt. (5.19)
Пусть часть первоначального вещества с временем удержания между t и t-\-dt равна —dm/ma = df, тогда из уравнения (5.19) имеем
df = D — dt. (5.20) Hlo
Поскольку —dm/dt - Dm, mfm^ = e~Dt, отсюда следует, что
df = De~Dtdt. (5.21)
Таким образом, та часть вещества, время удержания которой находится между t и t dt, будет
F==^De-Dtdt. (5.22) 6
Функция De~Bt = df/dt представляет собой функцию распределения времени удержания.
Распределение можно определить экспериментально, если впрыснуть в ферментер небольшое количество красителя и собирать выходящую жидкость небольшими фракциями. График зависимости количества красителя в данной фракции от времени даст распределение времени удержания. Экспоненциальное распределение времени удержания, полученное для хемостата (рис. 16), резко отличается от распределения Гаусса, которое характерно для культуры полного вытеснения (рис. 9). Таким образом, для каждой системы характерно определенное распределение времени удержания.
Хемостатная культура
53
Интегрирование уравнения (5.22) дает
F = e-o/-e-°^. (5.23)
Следовательно, фракция, которая имеет время удержания между 0 и t, равна (1 —e~Dt). Таким образом можно вычислить, что фракции исходного вещества, остающегося в сосуде после 1, 2, 3 и 4 времен замещения, равны соответственно 0,367, 0,135, 0,050 и 0,015. Фракция, имеющая время удержания большее, чем t, т. е. от t до оо, будет равна e~Dt. Можно показать [79, стр. 82], что среднее время удержания всех элементов среды равно 1/Д.
5.5. Отклонения от теории хемостата
5.5.1. Проверки справедливости теории
Формы кривых зависимости количества биомассы и концентрации лимитирующего рост субстрата от скорости разбавления являются важным тестом для проверки справедливости теории. Превосходное соответствие экспериментальных данных простой теории было продемонстрировано [130] при выращивании Klebsiella aerogenes на минимальной среде с глицерином при лимитации ионами аммония. Отклонения от простой теории наблюдаются во многих системах, и изучение этих отклонений представляет собой основной метод определения реакции биомассы на окружающую ее среду.
Контуа высказал предположение [57], что концентрация лимитирующего рост субстрата определяется не только скоростью роста, но и увеличением концентрации биомассы. Это отклонение можно объяснить, исходя из выражения Ks = Bx, где х— концентрация биомассы, а В — некая эмпирическая константа. Полномочность введения этого изменения в теорию более чем сомнительна, поскольку при вычислении концентраций лимитирующего субстрата исходят из предположения, что экономические коэффициенты, рассчитанные по источникам углерода и энергии, постоянны. Однако часто, особенно при высоких концентрациях субстрата, экономический коэффициент падает (см., например, работу Перта [243]), что, возможно, и является истинной причиной наблюдаемого Контуа отклонения.
В некоторых случаях отклонения могут быть вызваны присутствием ингибиторов или стимуляторов роста (гл. 17). Часто наблюдаемое отклонение состоит в том, что экономический коэффициент представляет собой не постоянную величину, а зависит от скорости роста. Одно из отклонений подобного рода обусловлено энергетическими затратами на поддержание жизни. Другие отклонения, отражающие роль различных источников питания, рассматриваются в гл. 12.
54
Глава 5
5.5.2. Влияние недостаточного смешения
Хорошее перемешивание в хемостате означает, что при добавлении малого объема материала время, необходимое для того, чтобы материал гомогенно распределился по всей культуре, должно быть мало по сравнению со средним временем удержания, т. е. по сравнению с 1/D.
В лабораторных условиях с сосудами для культивирования небольшого объема действительно можно получить полное смешение при нормальном перемешивании, конечно, при условии, что в сосуде нет карманов, затрудняющих перемешивание, что биомасса не прилипает к поверхности сосуда и что культура не имеет повышенной вязкости (разд. 10.2).
Если перемешивание будет недостаточным, то в сосуде будут области, скорость разбавления в которых будет либо больше, либо меньше средней скорости разбавления D, равной F/V. Это означает, что скорости разбавления в различных точках сосуда будут распределяться вокруг средней D. Соответственно, если D достигнет критического значения Dc, в сосуде будут точки, в которых D < Dc, и стационарное состояние может поддерживаться при D>DC. Такие отклонения от теоретического поведения были названы «эффектом аппаратуры» [130].
5.5.3. Пристеночный рост
Многие организмы могут прилипать к поверхности стекла и металлов [322]. В непрерывной культуре при длительном выращивании может наблюдаться так называемый пристеночный рост, который может видоизменяться от тонкой пленки биомассы до массивного обрастания биомассой поверхности сосуда.
Влияние пристеночного роста на выход биомассы описывается следующей моделью [322].
Пусть х—стационарная концентрация биомассы в суспензии, xw— количество растущей биомассы, прикрепляющееся к поверхности сосуда в расчете на единицу объема (пристеночный рост). В стационарном состоянии баланс по биомассе и лимитирующему рост субстрату имеет вид
Dx = цх + цхц, (5.24)
и
D (sr — s) = (цх — pxw)/Y. (5.25)
Из уравнений (5.24) и (5.25) получаем
x — Y(sr — s). (5.26)
Подставляя выражение для х в уравнение (5.25) и принимая (1 — pms/ (s + Ks) , получим
HmS DY (sr — §)
s - Y(sr -s) + xw • 1
Хемостатная культура
55
Уравнение (5.27)—квадратичное уравнение относительно 5. Однако, если D < цт, один из двух корней отрицательный и рассматривать следует только положительный корень. Влияние пристеночного роста на стационарную концентрацию биомассы показано на рис. 17.
Чтобы поддерживать в хемостате действительно гомогенные условия, пристеночный рост нужно свести к минимуму. Энергичное перемешивание часто предотвращает пристеночный рост,
Рис. 17. Влияние пристеночного роста на концентрацию биомассы в стационарном состоянии в хемостатной культуре (из работы [322]).
Y=0,5, цт = о,8ч-1, «г = 1,0г/л, Ks = 0,02 г/л, K=xw (г/л).
но происходящее при этом разбрызгивание культуры может привести к тому, что биомасса будет выше уровня жидкости. Прилипание биомассы к стенкам можно временно предотвратить силиконированием поверхности сосуда. Не прилипает биомасса и к тефлону, однако применение стаканов из тефлона и оболочек из тефлона пока ограничено, так как проблемы, связанные с покрытием стенок сосуда слоем тефлона, все еще не решены удовлетворительно.
5.6. Длительность переходных процессов после резкого изменения скорости роста
Время, необходимое для достижения нового стационарного состояния после резкого изменения скорости разбавления с Di на О2, можно приблизительно вычислить из уравнения (5.4),
об
Глава 5
если подставить (sr — s) «sr, x/Y^sr и ц = ца, где ца « Р1 + + £)2)/2, тогда
ds/dt «(D2 - D/) sr/2. (5.28)
А время, необходимое для изменения стационарной концентрации лимитирующего субстрата с $1 на s2, равно 2(s2 — $i)/ /(D2 — Di)sr. Эта приближенная формула показывает, что для процессов, при которых s < sr, время подстройки s и х к любому изменению скорости разбавления будет составлять лишь некоторую часть времени удвоения биомассы. Мателес и др. [205] систематически изучали время ответной реакции культуры Escherichia coli на резкое изменение скорости разбавления в среде с лимитирующей концентрацией аммиака. Они установили, что при изменении D на 0,1 ч~* это время незначительно мало, но при увеличении D на 0,4 ч_) время, необходимое для подстройки, соответствовало примерно времени трех удвоений. Это означает, что организм не может без лаг-периода подстраивать свою скорость роста к резкому сдвигу концентрации субстрата. Согласно теории (гл. 24), этот лаг-период, по-видимому, представляет собой время, необходимое организму для изменения содержания нуклеиновых кислот, ферментов и других соединений до нового стационарного уровня. На практике желательно производить изменения в скорости роста или других условиях небольшими скачками и считать, что время, необходимое для достижения нового стационарного состояния, равно примерно 3/г.
5.7. Специальные цели хемостатной культуры
Ниже сформулированы три уникальных, единственных в своем роде предназначения хемостатной культуры в деле контроля за ростом и поведением микроорганизмов.
1. Хемостат дает возможность изменять скорость роста биомассы, не производя в окружающей среде никаких изменений, кроме изменений концентрации лимитирующего рост субстрата. В простой периодической культуре изменения скорости роста могут быть вызваны только качественными изменениями в составе питательной среды или количественными изменениями физико-химических условий, таких, как температура или pH. Эти методы изменения скорости роста вносят побочные эффекты, маскирующие действие самой скорости роста. Так, изменение температуры, например, независимо действует и на скорость роста и на содержание РНК у бактерий.
2. Хемостат можно использовать и прямо с противоположной целью, а именно фиксировать скорость роста при изменении окружающих условий. Это очень существенно в тех случаях.
Хемостатная культура
57
когда необходимо отдифференцировать влияние изменения условий окружающей среды и влияние изменения скорости роста.
3. Хемостат, кроме того, используется для поддержания постоянной скорости роста при лимитирующей концентрации субстрата, тогда как в периодической культуре рост, лимитированный субстратом, можно получить лишь кратковременно, причем это сопровождается изменением скорости роста. Данная функция хемостата расширяет возможный диапазон постоянных окружающих условий и дает возможность изучать не только избыток или истощение лимитирующего рост субстрата, но и все промежуточные состояния.
В хемостатном методе существенно то, что он упрощает системы культуры и, следовательно, облегчает как изучение реакций организма на его окружение, так и управление процессами, протекающими в самих микроорганизмах. Преимущества этого упрощения приобретают особенно большое значение, когда возникает необходимость в изучении или управлении взаимодействием двух или более видов.
Глава 6
РАЗРАБОТКА ХЕМОСТАТА
6.1. Введение
Развитие хемостатного метода увеличило возможности управления культурой, в особенности в экстремальных условиях, в частности при скорости роста, близкой к максимальной, или при сильно разбавленном субстрате. Вначале Брайсон [35] изобрел турбидостат, по существу представляющий собой тот же хемостат, но снабженный фотоэлектрическим элементом, чувствительным к мутности культуры. Когда плотность биомассы поднимается выше некоторого выбранного уровня, то фотоэлемент запускает подачу среды. Измерения мутности по методу турбидостата имеют ограниченную область применения— только для культур одноклеточных организмов. Наличие в настоящее время других методов определения биомассы расширило применимость метода, хотя общий термин «турбидо-статный контроль» остается правомочным для всех методов. Возвратом биомассы называют концентрирование биомассы в культуре. Возврат биомассы дает возможность повысить концентрацию биомассы выше максимума (»У«Г), возможного без возврата. Использование батареи хемостатов расширяет возможности хемостата и в случае определенных систем имеет преимущество перед одиночным хемостатом. Были разработаны теоретические модели для таких систем, но они до сих пор еща как следует не проверены, вероятно, потому, что экспериментальная работа по реализации этих систем сдерживалась развитием оборудования для культуры.
6.2. Турбидостат
6.2.1. Принцип
Турбидостатный контроль с фотоэлектрическим элементом, чувствительным к плотности биомассы, схематически представлен на рис. 18. Когда оптическая плотность культуры превышает наперед выбранное значение, сигнал фотоэлемента приводит в действие насос, подающий среду. При этом объем среды поддерживается на постоянном уровне при помощи специаль
Разработка хемостато
59
ного приспособления. В соответствии с выражением х = = Y(sr—s) [уравнение (5.9)] устанавливается стационарное состояние. С помощью турбидостатного контроля, таким обра-
зом, устанавливается плотность биомассы, а скорость разбавления сама подстраивается под стационарное значение. Этим турбидостат отличается от хемостата, в котором фиксируется
скорость разбавления, а к стационарному уровню подстраивается концентрация биомассы.
6.2.2. Средства контроля
Турбидостатный контроль с помощью фотоэлектрического элемента устойчив, если при изменении скорости разбавления (D) концентрация биомассы меняется быстро, т. е. когда скорость разбавления близка к критической. Если же при изменении D концентрация биомассы изменяет
Рис. 18. Турбидостат (схематически) с автоматической регуляцией оптической плотности культуры.
1—поступление среды, 2—насос, 3—мешалка, 4—сток культуры, 5—фотоэлемент, 6—источник света.
ся мало, как это показано на рис. 13 для широкого диапазона скоростей роста, то турбидостатный контроль оказывается не
достаточно чувствитель-
ным, чтобы поддерживать скорость разбавления на постоянном уровне. В этом случае предпочтение следует отдавать хемостатному контролю. Технически область применения турби-достатных измерений ограничена только одноклеточными организмами. В случае длительного культивирования применение
турбидостата связано с определенными трудностями, обуслов-
ленными прилипанием организмов к поверхности оптического
элемента.
Турбидостатный контроль может также быть основан на некоторых средствах, чувствительных либо к продуктам, образующимся в процессе роста микроорганизмов, таким, как двуокись углерода или кислоты, либо к поглощению субстрата, используемому для роста. Уотсон [343] использовал для турбидостатного контроля специальный прибор, чувствительный к двуокиси углерода в газовой фазе. Поскольку образование
6
Г лава 6
двуокиси углерода сопряжено с ростом, то при фиксированной скорости истечения газа парциальное давление двуокиси углерода равно: (Рсо2) — k Dx, где k — константа. На рис. 19 показан типичный график зависимости Рсо, от D. В отличие от ситуации, характерной для измерения мутности, в данном случае имеется два возможных стационарных состояния для заданного значения Рсо,- Если контроль задан таким образом, что
Рис. 19. Парциальное давление двуокиси углерода (Рсо2) в потоке газа, выходящем из хемостата, как функция скорости разбавления.
Данные для образования биомассы те же, что и на рис. В; концентрация лимитирующего субстрата на входе составляет I г/л, скорость истока газа—30 л (л культуры«ч)“" , х— кон гентраиия биомассы.
насос для подкачки среды включается только тогда, когда Рсо, превосходит заданное значение, то устойчивое стационарное состояние устанавливается при более высокой скорости разбавления. И наоборот, если контроль задан так, что насос включается только тогда, когда давление двуокиси углерода падает ниже заданного значения, при условии, что РСо, меньше пикового значения, то устойчивое стационарное состояние устанавливается при более низкой скорости разбавления. Таким образом, в отличие от турбидостатного контроля контроль Рсо, дает возможность осуществлять устойчивый контроль в целой области стационарных состояний.
Образование кислот, таких, как молочная кислота, можно регистрировать с помощью pH-электрода, а это также исполь
Разработка хемостата
61
зуется как средство турбидостатного контроля. Для турбидо-статного контроля можно также использовать концентрацию субстрата, если она может быть определена мгновенно. Аналогично было использовано измерение растворенного кислорода с помощью кислородного электрода [144]. В принципе для турбидостатного контроля можно использовать поглощение газообразных субстратов, таких, как кислород или метан, из газовой фазы. Этот метод был бы аналогичен методу, основанному на образовании двуокиси углерода, с той лишь разницей, что парциальное давление газового субстрата изменялось бы в направлении, противоположном изменению концентрации двуокиси углерода.
6.2.3. Внутриклеточный контроль скорости роста
Существует некоторое разногласие относительно того, какой процесс контролирует скорость роста биомассы, когда скорость роста с помощью контроля мутности поддерживается около критической скорости разбавления [130]. Когда концентрация лимитирующего рост субстрата близка к значению Ks, то процессом, лимитирующим скорость роста, или «управляющей» реакцией становится, судя по всему, поглощение лимитирующего субстрата. Если, однако, концентрация лимитирующего субстрата значительно выше Ks, то скорость роста фактически не зависит от концентрации субстрата и управляет процессом уже не одно только поглощение субстрата. В этом случае скорость роста может отражать скорость многих реакций в клетке. Такое поведение описывается с помощью простой модели сложной последовательности реакций [71, стр. 125].
6.2.4. Применения
Турбидостат применяется как средство для поддержания культуры в течение многих генераций при избытке субстрата и постоянных условиях среды. Система будет отбирать более быстро растущие организмы, поскольку скорость роста в системе не фиксируется. Брайсон [35] первым использовал этот метод для автоматической селекции организмов, резистентных к антибиотикам. Увеличение максимальной скорости роста будет результатом действия двух факторов: отбора генетически различных организмов и оптимизации клеточного механизма роста, оптимизации, свойственной, по-видимому, автосинтетиче-ским системам (гл. 24). Турбидостатный контроль можно использовать также, чтобы сделать хемостатные культуры более устойчивыми к ингибирующим субстратам, таким, например, как фенол (разд. 17.8), хотя для этих же целей можно использовать двухстадийный процесс (разд. 6.4.3).
62
Глава 6
6.3. Хемостат с возвратом биомассы
6.3.1. Общее описание
Хемостат, снабженный специальным устройством для увели* чения концентрации биомассы выше значения, возможного для простого хемостата, т. е. выше Y (sr — s), называется хемостатом
hx
Рис. 20. Различные системы возврата биомассы в хемостате.
Л. Внутренняя фильтрация. Б. Внутренняя седиментация. В. Однопоточный возврат. Г. Внешний возврат. F, F^—скорости потока; х —концентрация биомассы; s, —концентрации лимитирующего рост субстрата; с, g, Д—константы (безразмерные); / — перегородка, 2 — зона седиментации, 3— зона роста, 4—мешалка, 5 —сепаратор.
с возвратом биомассы [131, 260]. Концентрирование биомассы достигается различными способами (рис. 20). В системе, показанной на рис. 20, А, поток без клеток или разбавленная биомасса удаляется через фильтр; имеется также выход для концентрированной биомассы. В другом случае (рис. 20, Б) культура подразделяется на две зоны: первая зона гомогенного перемешивания внизу, где и происходит рост, и вторая зона,
Разработка хемостата
63
отделенная от первой перегородкой, называемая седиментационной зоной. В этой зоне фактически роста нет, биомасса седиментируется и возвращается в зону перемешивания. Таким образом, бесклеточный или разбавленный поток биомассы уходит из верхней части ферментера, а концентрированная суспензия биомассы выходит из зоны роста. В «однопоточной» системе (рис. 20, В) предполагается, что биомассу концентрируют с помощью фильтрации или седиментации на выходе потока, при этом для концентрированной биомассы выхода из системы нет. В системе, изображенной на рис. 20, Г, биомасса концентрируется вне ферментера, и культура разделяется на два потока биомассы — разбавленную и концентрированную. Часть концентрированной биомассы возвращается обратно в ферментер. Системы, показанные на рис. 20, Л — Б, представляют собой модели с внутренним возвратом (задержкой), а система, показанная на рис. 20, Г, — с внешним возвратом.
6.3.2. Внутренний возврат (задержка)
Рассмотрим сначала метод фильтрации, представленный на рис. 20,Л. На этом рисунке показаны концентрации биомассы и лимитирующего рост субстрата в различных точках системы. Часть выходного потока, который не фильтруется, равна с, поэтому скорость выходного потока отфильтрованной (разбавленной) биомассы равна (1 — c)F. Концентрация биомассы в разбавленной части потока равна hx. Средняя скорость разбавления дается формулой: FfV = D, где V — объем культуры. Баланс биомассы в культуре описывается уравнением
Общая скорость увеличения = Скорость роста —
— Скорость выхода в концентрированном потоке —
— Скорость выхода в разбавленном потоке.
Для единицы объема культуры
dx[dt = рх — с Dx — (1 — с) Dhx, (6Л)
т. е.
dxjdl — [ц — D {с (1 — h) + /i}] х. (6.2)
В стационарном состоянии при dx/dt = 0 имеем
Р = ЛО, (6.3)
где Л = с(1—ft) + h. Если вытекающий поток отфильтрован полностью, т. е. h = 0, то Л = с. Если же при фильтровании отделяется не вся биомасса, то ft->l, и можно записать, что А ~ h. Отсюда следует, что Л находится в пределах от с до h. При h — 1 возврата нет. Если есть возврат, то ц < D.
64
Глава 6
Поскольку для удельной скорости роста имеем выражение ц = + tfs), то, подставляя значение ц в уравнение ста-
ционарного состояния, получим
H£) = nms(s + O (6.4)
Следовательно,
s = AKMim-AD). (6.5)
Баланс для лимитирующего рост субстрата будет выглядеть так же, как и для простого хемостата [уравнение (5.4)]. Поэтому в стационарном состоянии, когда ц = AD, имеем
x — (sr — s)Y/A. (6.6)
Из уравнения (6.6) видно, что с помощью задержки концентрация биомассы увеличивается в 1/А раз. Коэффициент 1/Л называется «коэффициентом концентрирования». При критической скорости разбавления (Dc) s = sr и, если sr Ks, уравнение (6.4) показывает, что критическая скорость разбавления увеличивается по сравнению с критической скоростью разбавления в простом хемостате в цт/А раз.
Выход биомассы с единицы объема культуры в стационарном состоянии (производительность) дается как
R = {(1 - c)h + c} Dx = ADs. (6.7)
Влияние задержки биомассы на концентрацию биомассы и на производительность представлено на рис. 21. Очень важно, что задержка биомассы приводит к увеличению максимальной производительности, или скорости выхода биомассы в культуре. Задержку биомассы в хемостате с помощью фильтрации экспериментально реализовали Перт и Куровски [260].
Задержку биомассы можно осуществить также с помощью седиментации (рис. 20, Б). Если предположить, что рост происходит только в гомогенной зоне, ниже перегородки, и что седиментированная биомасса немедленно по возвращении в зону роста способна к дальнейшему росту, то рост такой культуры должен соответствовать рассмотренной выше модели с внутренним возвратом.
В однопоточной системе (рис. 20, В) есть выход только для разбавленного потока биомассы. Это требует какой-то седиментации или фильтрации биомассы на выходе потока. Примем, что в такой системе V — объем культуры в зоне роста. Тогда, если возможно осуществление стационарного состояния, то система может быть представлена моделью с задержкой, в которой с — 0 и А ~ h. Ферментер башенного типа, описанный Ройстоном [284], является ферментером такого типа, однако на практике оказывается невозможным осуществлять контроль за ко
Разработка хемостата
65
эффициентом концентрирования и поддерживать стационарное состояние. Таким образом, чтобы контролировать коэффициент концентрирования, необходимо использовать двухпоточную систему с выходами для разбавленной и концентрированной биомассы. Задержку биомассы можно непреднамеренно осуществить в простом хемостате, если устройство для слива позволяет
Рис. 21. Сравнение концентраций биомассы и производительности в стационарном состоянии хемостатной культуры с возвратом биомассы и без возврата.
Xj — концентрация биомассы в хемостате без возврата; хз — концентрация биомассы в хемостате с возвратом: Ri — производительность в расчете на единицу объема без возврата; Ra—производительность с возвратом; ^^=1,00ч-1, $ «1,0г/л, Ks = 0,005 г/л, коэффициент концентрирования (Я или В) равен 2,0.
оседать в ферментере некоторому количеству биомассы или если какое-то препятствие в нем действует как фильтр биомассы.
6.3.3. Внешний возврат биомассы
Хемостат с внешним возвратом биомассы и его параметры показаны на рис. 20, Г. Вытекающая культура проходит через сепаратор, например центрифугу, которая концентрирует биомассу и разделяет потоки разбавленной и концентрированной биомассы. Часть концентрированного потока возвращается обратно в ферментер. Средняя скорость разбавления дается уравнением F/V — D, где V — объем культуры. Скорость выхода культуры из ферментера выражается уравнением
Fs = F + aFs, (6.8)
где а — часть вытекающего потока жидкости, который возвращается обратно. Из уравнения (6.8) следует, что Fs = = aF/(1—а). Сепаратор концентрирует биомассу в g раз, а
3 Зак. 737
66
Глава 6
возвращаемое количество биомассы равно agFs. Следовательно, ag— это та часть выходящей из ферментера биомассы, которая возвращается обратно.
Баланс биомассы для культуры дается уравнением
Общий рост = Рост — Выход + Возврат.
Это же уравнение можно выразить так:
V dx = Vux • dt — Fs • dt + aFsgx dt. (6.9)
Подставив выражение для Fs и разделив обе части уравнения (6.9) на V-dt, получим
dx/dt = цх — Dx/(1 — а) + agDx/(l — а). (6.10)
В стационарном состоянии, когда dx/dt = 0, имеем
(ц-ВО)х = 0, (6.11)
где В — (1—ag)/(l—а). Фактор В имеет положительное значение, поскольку 1 > ag /> а. В условиях, когда ag = l, вся биомасса возвращалась бы обратно и установление стационарного состояния было бы невозможным. В стационарном состоянии ц = BD, таким образом, ц < D.
Подставив ц = pims/(s + Ks), получим
s = BDKs/(iim-BD). (6.12)
Баланс по субстрату, лимитирующему рост, выражается уравнением
Общая скорость увеличения = Скорость входа+
+ Скорость возврата — Скорость выхода —
— Субстрат, используемый для роста.
Таким образом, для единицы объема
ds/dt = Dsr + a Ds/(l — а) — Ds/(l — а) — цхУ, (6.13)
Это уравнение можно упростить до уравнения (5.4) для ds/dt в простом хемостате. Подставив ц — BD в уравнение (5.4), для значения х в стационарном состоянии получим
x = {sr— s)Y/B, (6.14)
где 1/В— коэффициент концентрирования. Критическую скорость разбавления (£)с) получим при s = sr, и, если sr Dc Та ЦтВ.
Концентрацию биомассы в вытекающем разбавленном потоке биомассы (hx) получают из баланса по биомассе:
Fsx = aFsgx + cFgx + (1 — cjFhx, (6.15)
Разработка хемостата
67
и, подставляя выражение для Fs, получим
h = (B — cg)/(\ -с). (6.16)
Производительность по биомассе на единицу объема в системе будет
R — FsxlV -aFsg-x/V, (6.17)
и, подставляя выражение для Fs, находим
R = BDx. (6.18)
6.3.4. Преимущества возврата биомассы
Использование возврата биомассы дает возможность повысить производительность по биомассе и продуктам в хемостате с данной средой. Максимальная скорость выхода при этом может увеличиться в а раз, где а — коэффициент концентрирования. Это полезно, если используется разбавленный лимитирующий субстрат, как, например, в пивоварении или при очистке сточных вод, или в случае малорастворимых субстратов. В пивоварении или при очистке сточных вод коэффициент концентрирования может составлять примерно 100. Система с возвратом биомассы имеет преимущества также в тех случаях, когда следует ограничить концентрацию лимитирующего рост субстрата из-за образования каких-то ингибирующих продуктов. Такая необходимость появляется при окислении закисного железа до окисного микроорганизмами рода Ferrobacillus (Д. Келли, частное сообщение). Кроме того, возврат биомассы может предотвратить «шоковую нагрузку» ингибирующим субстратом, потому что критическая скорость разбавления повышается.
6.4. Батареи хемостатов
6.4.1. Многопоточная система
Соединение двух или более хемостатов в батареи (рис. 22) создает многостадийные процессы, в каждой стадии которых могут иметь место разные условия. Мы рассмотрим здесь двухстадийную систему типа, представленного на рис. 22. Это так называемая многопоточная система, так как питательная среда подается как в первую, так и во вторую стадии. Приведенный ниже анализ системы основан на работе Герберта [132]. Допустим, Foi — скорость притока среды в первую стадию; Fl2— скорость потока культуры из первой стадии во вторую, Fm — скорость притока среды во вторую стадию; объемы культуры в
3*
68
Г лава 6
первой и второй стадии равны соответственно 1Л и Иг. Средняя скорость разбавления во второй стадии дается уравнением
D2 = (F02 + = Fm/V2 + F12/V2 = O02 + D12. (6.19)
Символы D02 и Diz используются для обозначения отдельных скоростей разбавления: притока свежей среды во вторую стадию
Рис. 22. Два хемостата в «многопоточной» системе.
F, V, х и $ — скорость потока, обт ем культуры. конкептра .ни биомассы и лимитирующего рост субстрата соответственно. однопоточной системе скорость потока среды (F02) во вто рую стадию равна нулю.
и потока из первой стадии во вторую. Баланс по биомассе во второй стадии выражается уравнением
Общая скорость увеличения = Скорость роста+
+ Скорость входа — Скорость выхода.
Этот же баланс для единицы объема и малого интервала времени dt имеет вид
dxrjdt = ц2х2 + Di2xi — О2х2 (6.20)
где Xi и х2— концентрации биомассы в первой и во второй стадии соответственно. Для стационарного состояния, когда dx^dt =0, уравнение (6.20) имеет вид
(ц2 — О2)х2 + О12Х| = 0. (6.21)
Следовательно,
ц2 = О2 — D12Xi/x2. (6.22)
Из уравнения (6.22) следует, что ц2 < D2. Преобразование уравнения (6.22) дает
х2 = О12Х|/(/)2 Иг)- (6.23)
Разработка хемостата
69
Следовательно, до тех пор пока х, ограничено, х2 ограничено тоже, как бы велико ни было это означает, что для второй стадии нет критической скорости разбавления.
П2,ч~’
Рис. 23. Значения удельной скорости роста (ц2) и концентрации биомассы (.?) в стационарном состоянии во второй стадии в серии из двух хемостатов, если изменяется скорость разбавления в первой стадии.
ц = [,0ч-1, Ks = 0,005 г/л, sol = so2 = l,O г/л, У = 0,5, Do2=l,O ч~*, D]2 изменяется от О до 1 ч-1, Di — средняя скорость разбавления во второй стадии.
Для второй стадии баланс по лимитирующему субстрату выражается уравнением
Скорость увеличения— Скорость притока из первой стадии+ + Скорость притока свежей среды — Скорость выхода — — Скорость поглощения.
Таким образом, для единицы объема
dsjdt — DnS\ + Oo2s02 — O2s2 — . (6.24)
Для стационарного состояния уравнение (6.24) имеет вид
Dy>S\ Н- = 0- (6.25)
70
Глава 6
Если мы подставим в уравнение (6.25) значение ра из уравнения (6.22), подставив в него значение Х[ из уравнения х = E(soi—Si), то получим
*2 — Е $01 Ч- $02 — $2) • (6.26)
Решив его относительно §2, подставим в уравнение (6.25) значение Ц2 из выражения рг = рт$г/($2 + Ks) Тогда из уравнений
Рис. 24. Значения удельной скорости роста (р2) и концентраций биомассы (х2) и лимитирующего рост субстрата во второй стадии в батарее из двух хемостатов, если скорость потока из первой стадии во вторую (Di2) фиксируется, а скорость добавления свежей среды (D02) варьируется.
£>12=0,5 ч“ , значения других параметров приведены в потписи к рис. 23.
(6.25) и (6.26) получим
п \ । (Цт D2) D02S02
s2 — { I —---------------
— D\2S\ + KSD2 j s2 + Ks (T>!2Si + D02s02) — 0. (6.27)
Решив это уравнение, получим
s2 = {—b — (b2 — 4ac)'l2}/2a, (6.28)
Где G (Pfn 7)2), Ь Pm^l2$01/^2 4“ (Pm T)2) ^02^01ID2 — — D}2S\ + KSD2; c = Ks (O12S1 + Оог^ог)- Другой корень уравнения отрицателен и не имеет практического смысла.
На рис. 23 показано действие изменения скорости потока культуры из первой стадии во вторую (£>12), если скорость притока свежей среды во вторую стадию (D02) фиксирована. Удель
Разработка хемостата
71
ная скорость роста во второй стадии при всех скоростях разбавления поддерживается почти на максимальном уровне (<t 0,94 pm). Другая особенность состоит в том, что в широком диапазоне скоростей разбавления концентрация биомассы довольно постоянна, т. е. устойчива, несмотря на высокую скорость роста.
Влияние изменения скорости притока свежей среды во вторую стадию (Р02) при фиксированной скорости потока культуры из первой стадии во вторую (D12) показано на рис. 24. В отличие от простого хемостата (рис. 13) концентрация биомассы во второй стадии падает постепенно, хотя скорость роста фактически максимальна.
В рассмотренной выше системе аппаратов предполагалось, что ответная реакция организмов на изменение концентрации лимитирующего рост субстрата при переходе из первой стадии во вторую происходит без лаг-периода. Однако известно, что при большом скачке скорости роста вверх организмам требуется значительный лаг-период, чтобы достигнуть новой скорости роста (разд. 5.6). С другой стороны, скачок скорости роста вниз едва ли требует лаг-периода при подстройке новой скорости роста, хотя и здесь могут быть переходные состояния в содержании РНК, а также других компонентов в биомассе.
6.4.2. Система с одним потоком без возврата
В однопоточной системе среда подается лишь на первой стадии батареи. Таким образом, в двухстадийной системе, показанной на рис. 22, Do2 = 0 и D]2 = D2. Тогда уравнение (6.26) принимает вид
x2 = T(soi — s2). (6.29)
Для удельной скорости роста из уравнения (6.22) имеем
ц2 = D2 (х2 — *i)/xi. (6.30)
В большинстве случаев х2 практически не отличается от xt и |12 ~ 0, если скорость разбавления в первой стадии близка к критическому значению или там присутствует ингибитор.
6.4.3. Применение
Конструкция лабораторного оборудования для системы двухстадийных хемостатов была описана Каллоу и Пертом [40]. В однопоточной системе, когда рост лимитирован поступлением единственного лимитирующего субстрата, использование батареи хемостатов практически не дает никаких преимуществ для получения биомассы. Почти во всем диапазоне возможных скоростей разбавления лимитирующий рост субстрат будет
72
Глава 6
практически исчерпан в первой стадии и во второй стадии возникнут условия стационарной фазы.
Однопоточные многостадийные процессы становятся необходимы, когда применяется сложная среда с несколькими источниками углерода или азота и т. д., чтобы обеспечить использование всех субстратов. Например, Харт и Уэбб [126] установили, что при росте Klebsiella aerogenes на смеси глюкозы и мальтозы в хемостате при высоких скоростях роста используется только глюкоза, а потребление мальтозы подавляется. Во второй стадии в батарее из двух ферментеров мальтоза была использована полностью. В общем многостадийные системы дают возможность осуществить различные условия.
Многопоточный процесс представляет собой эффективное средство для поддержания стационарных условий роста, когда в простом хемостате стационарное состояние неустойчиво. Это происходит, если лимитирующий рост субстрат одновременно является ингибитором роста (разд. 17.8). Применение двухстадийного процесса для установления скорости роста бактерий на феноле как • ингибиторном лимитирующем субстрате можно проиллюстрировать на примере работы Джонса и др. [161]. При образовании вторичных метаболитов в хемостатной культуре вторая стадия может быть использована как стадия без роста, в которой образуются вторичные метаболиты (разд. 16.5.4).
Двухстадийные системы расширяют область применения хемостатной культуры, поскольку с помощью второй стадии скорость роста можно довести до нуля и установить устойчивое стационарное состояние с максимальной скоростью роста — в простом хемостате эти условия совместно не выполняются.
6.5. Хемостаты, соединенные в батареи, с возвратом биомассы
Батарея хемостатов с возвратом биомассы изображена на рис. 25. В системе предусмотрен сепаратор для возврата концентрированной биомассы в первую стадию. Такая система интересна в том отношении, что при достаточном числе стадий она моделирует ферментер полного вытеснения. Пауэлл и Лов [268] анализировали поведение системы, однако общие уравнения для равновесных концентраций биомассы и лимитирующего субстрата в r-й стадии аналитически решить невозможно. Полная скорость разбавления выражается равенством D = F/wv, где v — объем культуры в каждой стадии, a w — число стадий. Пауэлл и Лов [268] установили, что критическая полная скорость разбавления выражается следующим уравнением:
(6.31)
I и — & 1 w ) s0 + As
Разработка хемостата
73
где а — часть общего потока жидкости через серию ферментеров, которая возвращается обратно, а b — часть биомассы в
х и S —концентрации биомассы и лимитирующего субстрата в различных точках соответственно. F, Fs и aFs —скорости потока в различных точках, а—часть потока жидкости (^5), который возвращается обратно (FS = F,(1 — а)|.
Рис. 26. Сравнение стационарных значений концентраций биомассы (хе) в стоке.
Л1 —из батареи, состоящей из пяти хемостатов с возвратом биомассы, Р— из идеального ферментера полного вытеснения с возвратом, S —из одиночного ферментера с возвратом ц=|Лш$0/($0 + Ks), где s0—концентрация лимитирующего рост субстрата (=10в добавляемой среде, D — средняя скорость разбавления, У—экономический коэффициент (из работы [2681), а-> 0 означает, что а делается очень малым.
D/p
щ-й стадии, которая возвращается (b = ag, где g— коэффициент концентрирования биомассы, достигаемый в сепараторе); «о—концентрация лимитирующего субстрата в исходной среде. Предел Dc по w при стремлении w к бесконечности получается
74
Глава 6
при введении в уравнение (6.31) предела:
lim (1—bllw) w = log \/b.
Следовательно,
lim Dc —
ЭО
(1 — a) jimSp log 1/& (s0 + Ks)
(6.32)
(6.33)
Глава 7
ОТМИРАНИЕ КЛЕТОК В РАСТУЩИХ КУЛЬТУРАХ
Уравнение (6.33) такое же, как для критической скорости разбавления в ферментере полного вытеснения (разд. 4.6.3). Пауэлл и Лов [268] на вычислительных машинах рассчитали концентрацию биомассы (хе), получаемую в последней стадии батареи из пяти хемостатов с возвратом биомассы. На рис. 26 показаны результаты, полученные Пауэллом и Ловом при сравнении концентраций биомассы, вытекающей из батареи хемостатов, одиночного хемостата и из идеального ферментера полного вытеснения — все с возвратом биомассы. Очевидно, что при малых значениях а и больших значениях & в батарее хемостатов можно получить более полную утилизацию лимитирующего субстрата почти во всем диапазоне скоростей разбавления, чем это возможно для одиночного хемостата. Это преимущество тем больше, чем ниже исходная концентрация субстрата. Пауэлл и Лов установили также, что при малых исходных концентрациях субстрата максимальная производительность по биомассе в батарее хемостатов может превосходить производительность одностадийного хемостата с возвратом биомассы. Эти результаты также свидетельствуют о том, что даже в случае батареи из пяти хемостатов система хорошо приближается к идеальной культуре полного вытеснения.
Многостадийный хемостат с возвратом биомассы описали Китай и др. [170]. Система представляет потенциальный интерес в связи с возможностью преобразования в биомассу очень разбавленных субстратов, а также как средство для реализации культуры полного вытеснения.
7.1. Определение понятия мертвых и покоящихся клеток
Микроорганизмы, которые в условиях окружающей среды, подходящих для роста, теряют способность к росту, должны быть либо мертвыми, либо покоящимися клетками. Отметим существенную разницу между этими двумя понятиями: покоящиеся клетки в определенных условиях могут регенерировать в нормальные растущие клетки или их «вегетативные» формы, а мертвые клетки не могут. Примерами покоящихся форм служат споры бактерий и грибов и цисты простейших. Образование покоящихся форм, как правило, представляет собой свойственный некоторым родам процесс, продолжительность которого длиннее, чем минимальное время удвоения у вегетативных форм. Такое изменение типа клеток в чем-то аналогично дифференцировке тканей у высших животных и растений, хотя было бы неоправданно заходить в этой аналогии слишком далеко, и дифференцировки тканевых клеток здесь мы касаться не будем. Модель процесса дифференцировки бактерий с образованием спор рассматривается в разд. 18.5.
Отмирание микроорганизмов может происходить при воздействии неблагоприятных факторов, таких, как высокая температура, токсические соединения, истощение, или «ошибки» в автосинтезе. В растущей культуре покоящиеся и мертвые клетки ведут себя одинаково, не внося никакого вклада в рост популяции.
7.2. Скорость отмирания
7.2.1. Отмирание клеток в периодической культуре
Предположим, что скорость отмирания пропорциональна числу жизнеспособных клеток (г/„).
Тогда
dyjdt = — kyv, (7.1)
где k — удельная скорость отмирания, величина постоянная. Скорость роста живой популяции дается уравнением
dyvfdt = (y- — k)y„, (7.2)
76
Глава 7
где р— удельная скорость роста. Следовательно,
In = In z/D {0) + (р — k)t. (7.3)
Кажущаяся удельная скорость роста равна (р— k), и до тех пор, пока k < р, жизнеспособная популяция растет экспоненциально. Кажущееся время удвоения равно (1п2)/(р— /г), а истинное время удвоения (1п2)/р.
Скорость увеличения общей популяции клеток (ут) выражается равенством
dyTldt = уу0. (7.4)
Подставляя значение yv из уравнения (7.3), получаем
ут t
$ dyT = ayv (0) J е<“-А>* dt. (7.5)
yT<ffi 0
Следовательно,
Ут — Ут (0) + —k’ Уъ (о) (е0*-***—1). (7.6)
Для увеличения общей популяции возможны три случая в зависимости от того, будет ли k < р, k = р или k > р. Если k < р и t велико, можем положить ут<о) ~0и (e(n-fe)t—() ~ e(u-fc)t# Тогда
Ут~-^У»^-к}'. (7.7)
Следовательно, ут будет увеличиваться с постоянной экспоненциальной скоростью.
Если k — р, то yv — константа, и для ут уравнение (7.6) более неприменимо. Вместо этого из уравнения (7.4) имеем
Ут — Ут (о) + (0)/• (7.8)
Если k > р, то yv -> 0, и из уравнения (7.6) следует, что общая популяция стремится к пределу
lim ут = ут (о) + У-о «»• (7.9)
7.2.2. Отмирание клеток в хемостатной культуре
В хемостате, в котором происходит отмирание некоторых клеток, баланс для популяции жизнеспособных клеток в малый интервал времени dt дается уравнением
dyv — nyvdt — kyvdl — Dyvdt, (7.10)
Отмирание клеток в растущих культурах
77
где k — удельная скорость отмирания, a D — скорость разбавления. Следовательно, мы получаем
dy.Jdt = {(И - k) - D} yv, (7.11)
и отсюда в стационарном состоянии, когда dyvjdt = О, ц = О + (7.12)
Если yv = $Ут, где р — часть жизнеспособной биомассы, то из баланса для общей популяции клеток (уг) имеем
Общий рост = Рост — Выход.
Это означает, что
dyT — у$ут dt — DyT dt. (7.13)
Следовательно,
dyTjdt = № — D)yT, (7.14)
а в стационарном состоянии
ц = О/р. (7.15)
Сравнивая уравнения (7.15) и (7.12), находим, что
й = о(|-1). (7.16)
Итак, если р имеет максимальное значение цт, то из уравнения (7.15) минимальное значение части жизнеспособной биомассы (р) в стационарном состоянии будет выражаться равенством
Pmln = D/ym. (7.17)
7.3. Отмирание клеток во время деления
7.3.1. В хемостатной культуре
В некоторых случаях отмирание клеток в культуре наблюдается даже в оптимальных для роста условиях. Объясняется это, возможно, тем, что для индивидуальной клетки существует определенная вероятность оказаться мертвой при делении,вероятно, в результате ошибок при автосинтезе. Предположим, что некоторое число (yv) клеток растет и, поделившись, образует 2yv новых клеток, из которых 0-я часть жизнеспособна. Тогда в каждой новой генерации образуется 2Qyv жизнеспособных клеток и 2(1—0)уг мертвых клеток. Коэффициент 0, названный индексом жизнеспособности [266], выражает вероятность выживания вновь образованной клетки. Таким образом, если при делении 50 клеток из образующихся 100 клеток 99 оказываются жизнеспособными, то индекс выживаемости составляет 0,99 и вероятность выживания новой! клетки будет такой же. Отсюда
78
Глава 7
следует, что, если 9 < 0,5, число жизнеспособных клеток будет стремиться к 0, если 9 = 0,5, число жизнеспособных клеток остается постоянным, если 0 > 0,5, число жизнеспособных клеток увеличивается.
Чтобы получить баланс для живых клеток, отметим, что в популяции yv живых организмов число клеточных делений в малый интервал времени dt составляет yyvdt. Число образовавшихся новых организмов равно 2p0z/rc^, где 0 — индекс жизнеспособности, a pyvdt старых организмов погибает в процессе деления. Баланс для живых клеток в хемостате будет иметь вид:
Общее увеличение = Число образовавшихся клеток —
— Число клеток, погибших при делении — Выход.
Следовательно,
dy0 — 2yy..,Qdt — yyvdt — Dyvdt. (7.18)
Если живая часть общей популяции равна 0, мы можем подставить у, — $yt и dyv = $dyt. Тогда
dyjdt = 2y9yt — p.yt — Dyt. (7.19)
Следовательно,
dy^dt = {(20 — 1) p, — D} yt. (7.20)
В стационарном состоянии, когда dyt/dt = 0,
Н = /)/(2е-0. (7.21)
Сравнивая уравнения (7.21) и (7.15), видим, что в стационарном состоянии
0 = 20 — 1. (7.22)
Кроме того, минимальное значение 0, как и для случая отмирания клеток из-за неблагоприятных условий среды, дается уравнением (7.17).
7.3.2. В периодической культуре
Появление мертвых клеток при делении в периодической культуре моделируется следующим образом. Если 9 — индекс жизнеспособности, число жизнеспособных клеток, присутствующих в популяции после п генераций, будет выражаться равенством
^ = ув(о)(20Л (7.23)
где г/и(о> — исходное число живых клеток. Уравнение числа мертвых клеток, накопившихся после п генераций, имеет следу-
Отмирание клеток в растущих культурах
79
ющий вид:
Уа = 0 + 2z/0 (о) (1 — 9) + 2z/j, (0)20 (1 — 0) +
+ 2z/j, (0) (20)2(1 - 0) + ... +2г/о(о)(20)л-,(1 - 0). (7.24)
Последовательные члены уравнения (7.24) представляют собой увеличение числа мертвых клеток в каждой генерации, если исходное их число принимается равным нулю. Уравнение (7.24)
Рис. 27. График зависимости логарифма числа живых клеток {yv) и общего числа клеток в периодической культуре, если индекс выживаемости 0 = 0,9.
Доля живых (ft) клеток стремится к 0,8. На оси абсцисс отложены значения где t — время, — истинное время удвоения, которое равно (In 2)/|л.
образует некую геометрическую прогрессию со знаменателем, равным 20. Суммируя прогрессию, получаем
^ = 2(1-0)-^®г/о(О). (7.25)
При п -> оо, если 0 > 0,5, 1 —(20)" ->—(20)" и
2 (0-1) (20)" „
Уа 1—20 ^°'
(7.26)
Часть общей популяции, жизнеспособная после п делений, дается уравнением
Уо2 (0)" г/о(2О)" + yd *
(7.27)
80
Г лава 7
Подставив выражение для ya из уравнения (7.26), получим, что при п —*оо, р—>(29—1). Это и есть стационарное значение, полученное в хемостатной культуре [уравнение (7.22)].
Скорость роста живой популяции дается уравнением
dyv = ixyv2Qdt — iiyvdt, (7.28)
где первый член правой части соответствует увеличению числа жизнеспособных клеток после ц dt клеточных делений, а второй член означает убыль старых клеток в процессе деления. Следовательно, скорость роста для клеток живой популяции будет иметь вид
dyjdt = (20 — 1) уу0. (7.29)
Интегрирование уравнения (7.29) дает
In = In (о» + (20 — 1)ц/. (7.3С)
Уравнение (7.30) показывает, что численность живой популяции будет увеличиваться экспоненциально при условии, что 0 > 0,5, а кажущаяся удельная скорость роста равна (20—1)ц и при увеличении числа генерации приближается к |3ц.
Скорость роста общей популяции клеток дается уравнением
dyt/dl = rfyt. (7.31)
После нескольких делений, если 0 > 0,5, значение р становится почти постоянным, а удельная скорость роста общей популяции приближается к кажущейся скорости роста живой популяции. Действие образования мертвых клеток показано на рис. 27. Очевидно, что при 0 = 0,9 даже после всего лишь трех генераций наклон кривых роста жизнеспособных и мертвых клеток приблизительно одинаков, а р приближается к конечному значению 0,8.
7.4. Влияние отмирания клеток на их рост
С помощью приведенного выше анализа можно предсказать влияние отмирания клеток на рост культуры. Для изучения влияния скорости роста на скорость отмирания удобно было бы использовать хемостат, однако следует отметить, что максимальное значение удельной скорости роста в стационарном состоянии не превышает (цт D).
Отмирание клеток может быть обусловлено автолизом клеток, или выделением в среду каких-либо компонентов клеточного содержимого, что может изменить состав среды и повлиять на метаболизм и скорость роста живущих клеток [264].
Глава 8
ИСТОЧНИКИ ЭНЕРГИИ И УГЛЕРОДА
8.1. Введение
Грибы, простейшие и большинство бактерий относятся к гетеротрофам-, для построения своих клеток они используют углерод органических веществ. Остальные микроорганизмы, т. е. водоросли и некоторые бактерии, ассимилируют углерод из СОг, в связи с чем их называют автотрофами. Помимо углерода, организмы нуждаются в источнике энергии для биосинтеза клеточного материала, для роста и для осуществления так называемых «функций поддержания». Классификация микроорганизмов по их потребности в источниках углерода и энергии, основанная на данных Станиера и др. [305], приведена в табл. 4. Потребности фотосинтезирующих микроорганизмов в световой энергии
Таблица 4
Классификация микроорганизмов по источникам энергии, донорам и акцепторам электронов
Тип мик [-©организма Источник энергии Акцепторы электронов в энергодающих процессах Доноры электронов в энергодающих процессах или при восстановлении СО,
Фотолитотроф-ный Свет — Вода, восстановленные соединении серы
Фотоорга но-трофный Свет — Органические веще ства
Хемолитотроф- Окисление —вое- Кислород, дву- Неорганические сое-
ный становление окись углерода динения (водород, восстановленная сера, восстановленный азот ионы закисного железа)
Хемооргано- Окисление — вое- Кислород, нитра- Органические соеди-
трофный становление ты, сульфаты, органические вещества нения
82
Глава 8
здесь ле рассматриваются; этому вопросу посвящены специальные работы [108, 242]. В энергетическом метаболизме одним из самых обычных акцепторов электронов служит кислород; в отсутствие кислорода эту роль у некоторых бактерий могут выполнять нитрат- или сульфат-ионы. Хемолитотрофы получают энергию, окисляя в аэробных условиях неорганические восстановленные формы азота и серы, ионы двухвалентного железа или водорода. Метанообразующие бактерии — анаэробные автотрофы, которые для получения энергии используют водород, восстанавливая двуокись углерода до метана. Другие микроорганизмы, особенно из числа бактерий и дрожжей, способны добывать энергию в анаэробных условиях за счет различных окислительно-восстановительных реакций органических веществ, т. е. процесса, называемого брожением.
Для количественного определения потребностей микроорганизмов в источниках углерода и энергии необходимо знать величину Ks и значения экономических коэффициентов, рассчитанные по данным об использовании микроорганизмами различных суб-
Таблица 5
Средние значения экономического коэффициента при использовании различных источников углерода н энергии
Организм Субстрат Максимальное значение экономического коэффициента, г/г 3) Источник данных
субстрата углерода субстрата использованного кислорода
Candida utilis Глюкоза 0,51 1,28 1,30 [159]
Penicillium chrysogenum » 0,43 1,08 1,35 [258]
Aerobacter cloacae 0,44 1,10 1,03 [243]
Candida utilis Уксусная кислота 0,36 0,90 0,62 [159]
Candida utilis Этиловый спирт 0,68 1,30 0,58 [159]
Pseudomonas sp. Метиловый спирт 0,41 1,09 0,44 [125]
Bacteria sp. ч-Пентан 0,84 1,01 0,44 [314]
Candida intermedia н-Алканы (Cis—С2г) 0,81 0,96 0,35 [159]
Methyiococcus sp. Метан 1,01 1,34 0,29 [128]
1) Значения экономического коэффициента выражены в граммах сухой биомассы в расчете на 1 г использованного субстрата, углерода субстрата или кислорода.
Источники энергии и углерода
83
стратов. Как видно из табл. 1, величины для разных источников углерода и энергии составляют примерно 10-5М; это самое высокое значение Ks среди всех значений, полученных для любого другого субстрата. Для фосфатов, ионов калия и магния величины Ks имеют примерно такое же значение.
Примеры средних значений экономических коэффициентов при использовании различных источников углерода и энергии приведены в табл. 5. При определении этих экономических коэффициентов учитывалась потребность в углероде для построения клеток, а также потребность в энергии, расходуемой на рост и функции поддержания жизнедеятельности. Как можно видеть, величина экономического коэффициента в расчете на использованный углерод субстрата довольно стабильна, варьируя в пределах от 0,90 до 1,34; следовательно, это дает возможность в какой-то степени предсказать значение этого показателя.
В конечном итоге клетка снабжается энергией в форме АТФ, которая может быть названа энергетической валютой клетки и которая используется для всех процессов, протекающих с затратой энергии.
8.2. Определение количества ассимилированного углерода
Когда субстрат служит одновременно источником углерода и энергии, довольно трудно точно рассчитать, какая часть потребленного источника углерода ассимилировалась, а какая часть была израсходована на получение энергии. Однако часто соответствующие расчеты можно произвести при помощи одного или нескольких из следующих четырех методов.
Первый метод основан на использовании субстрата, меченного по углероду (14С), и последующем определении количества метки, включившейся в клетки. Этот метод был применен в отношении Streptococcus faecalis [17] и дрожжей [177].
Во втором методе ассимилированный углерод субстрата определяется из следующего соотношения:
Общее количе- Количество суб- Количество суб-
ство утилизированного субстрата (AS) страта, израс- страта, пошед-ходованного шее на Энергена клеточный тический метауглерод болизм ' (8.1)
(ASC) (ASe).
Разделив все члены соотношения (8.1) на количество образованной биомассы (Ах), получим
AS/Ax = ASc/Ax + AS£/Ax, (8.2)
84
Глава 8
что можно представить в следующем виде:
\/Y=\/Yc+]/Ye. (8.3)
Если количество углерода потребленного субстрата обозначить как у, а количество углерода биомассы как (3, то получим выражение
P^ = Y. (8.4)
Подставив в уравнение (8.3) значение Yc из уравнения (8.4) и произведя соответствующие преобразования, получим
YE — yY (у — $Y). (8.5)
Этот метод был использован Стаутхамеро.м и Беттенхаузеном
Третий метод, пригодный для аэробных процессов, основан на подсчете Те из стехиометрических отношений поглощенного кислорода и диссимилированного энергетического субстрата. При этом предполагается, что кислород используется исключительно как конечный акцептор электронов в энергодающнх процессах [134]. Это предположение не всегда правомочно, так как в некоторых случаях кислород не только восстанавливается, но и включается с помощью оксигеназ в углеродные соединения. Однако в подобном случае часто наблюдается простое стехиометрическое соотношение между утилизированным углеродом субстрата и включенным кислородом. Например, на одну молекулу н-парафина приходится один атом потребленного кислоро-
Таблица б
Ассимиляция и диссимиляция источника углерода и энергии
Организм Условия Количество ассимилированного углерода глюкозы, % Количество глюкозы, израсходованной на энергетические нужды, % Источник данных
Streptococcus , ае-calis Богатая среда, анаэробные условия 2 98 ПИ
Saccharomyces cerevisiae Богатая среда, анаэробные условия 2 98 [177]
Saccharomyces cerevisiae Богатая среда, аэробные условия 10 90 [177]
Aerobacter cloacae ’) Минимальная среда, аэробные условия 55 45
’) Перт, неопубликованные данные.
Источники энергии и углерода 85
да, что дает возможность отдифференцировать включенный кислород от восстановленного [123].
Четвертым методом, который может быть использован для определения количеств субстрата, израсходованного на энергетические нужды, является измерение количеств конечного продукта энергетического метаболизма: например, молочной кислоты, образованной из глюкозы в молочнокислом брожении, этанола — из глюкозы в дрожжевом брожении и уксусной кислоты, образующейся из этанола уксуснокислыми бактериями. Относительные количества ассимилированного и диссимилированного источников углерода и энергии приведены в табл. 6.
8.3. Энергетические затраты на функцию поддержания жизнедеятельности (энергия поддержания)
8.3.1. Определение
Уже давно было постулировано [244], что микроорганизмы и клетки эукариотов нуждаются в энергии и для роста, и для других процессов, так называемых процессов поддержания жизнедеятельности.
К специфическим функциям поддержания жизнедеятельности относятся: оборот клеточного материала, осмотическая работа для поддержания концентрационных градиентов между клеткой и окружающей средой, подвижность клетки и другие.
Энергия поддержания определяется следующим образом. Предполагается , что общее количество потребленного источника энергии (ASB) частично расходуется на нужды роста (ASg) и частично на процессы поддержания жизнедеятельности (AS.v). Очевидно, что синтез АТФ и его гидролиз могут быть сопряжены не только с процессами роста или функциями поддержания; однако происходящую при этом убыль АТФ трудно отличить от расхода АТФ на функции поддержания. Мы можем написать
YE = Nx/NSe = &xl(bSo + ASM), (8.6)
где Ax представляет собой количество образованной биомассы. Когда энергетические затраты на поддержание равны нулю, т. е. Д5М = 0, мы имеем «истинный» экономический коэффициент, равный
YE0 = \x/\Se. (8.7)
В этом случае мы получаем максимально возможную величину экономического коэффициента при данном источнике энергии. Пусть при биомассе х энергия поддержания расходуется с постоянной скоростью (dsldt)m — mx, где m — постоянная величина, так называемый коэффициент энергии поддержания
86
Глава 8
(maintenance coefficient). Уравнение баланса потребления
источника энергии имеет следующий вид:
Общая скорость Скорость потре- Скорость потребле-
х -4- потреоления источ- бления источника ния источника энер-
нпка энергии энергии расходуе- гии, расходуемой на
мой на рост функцию поддержа-
ния жизнедеятель-
ности
или
рх/у Е = цх/Y EG + тх. (8.8)
Следовательно,
1/У£ = 1/У£0 + т/ц. (8.9)
Можно записать иначе:
qEx = px[Y Еа + тх, (8.10)
где qs — метаболический коэффициент для источника энергии
<7£ = |т/У£0 + т. (8.11)
Из уравнения (8.9) следует, что, если т является константой, график зависимости 1/Ув от 1/ц (рис. 28, А) будет представлять собой прямую линию с наклоном т, отсекающую на оси
Рис. 28. Графические методы определения коэффициента энергетических затрат на поддержание жизни (т) и максимального экономического коэффициента (1/Ув0) на основе уравнений (8.10) и (8.12).
ординат отрезок l/yEG. Величина т может быть найдена также из графика зависимости q от ц (рис. 28, Б). Когда удельная скорость роста изменяется при хемостатном культивировании, то обычно наблюдается линейная зависимость между 1/УЕ и 1/р.
Источники энергии и углерода 87
[244,309]. Ранее [244], согласно уравнению (8.9), при подсчете экономического коэффициента учитывался и ассимилированный углерод источника энергии; в результате значение обратного экономического коэффициента принималось равным 1/Уя+1/Ус [уравнение (8.3)], однако это не годится для вычисления т.
8.3.2. Поддержание как эндогенный расход биомассы
Чтобы объяснить происходящее в процессе роста снижение экономического коэффициента в расчете на источник энергии, Герберт [130] и Марр и др. [204] представили потребность в энергии поддержания как расход биомассы в ходе эндогенных процессов.
Чистый прирост Общий прирост Биомасса, из-
биомассы биомассы расходованная
эндогенно, или dx — pTx-dt— ax-dt, (8.12)
где рт — общая удельная скорость роста и а — так называемая удельная скорость поддержания. Из уравнения (8.12) следует, что dx/dt = (р,т — а)х. (8.13)
Кажущаяся удельная скорость роста определяется как ц = цг — а. (8.14)
Составим баланс для источника энергии: цх-dt утхdt
Y у • (8.15)
Е EG
Подставляя значение цт из уравнения (8.15), получаем 1/У£=1/У£0 + а/цУ£С. (8.16)
При сравнении уравнений (8.9) и (8.16) видно, что
m = a/y£G. (8.17)
Удельная скорость поддержания (а) может рассматриваться как скорость оборота биомассы; это удобный показатель для сравнения скорости оборота компонентов биомассы и потребности в энергии, расходуемой на процессы поддержания.
8.3.3. Величина энергии поддержания и ее контроль
Типичные значения коэффициентов энергии поддержания у микроорганизмов при различных условиях культивирования приведены в табл. 7. Они колеблются в пределах от 0,5 (ммоль
8b
Глава 8
Г аблица 7
Значения энергетических затрат на годдержание жизни у различных микроорганизмов на средах с глюкозой в качестве источника энергии
Организм Условия роста Энергия поддержания Источник данных
т. г/г-ч ’) тАТФ' ММОЛЬ/Г‘Ч 2)
Lactobacillus easel 0.135 О 1,5 |80]
Aerobacier cloacae Klebsiella aerogenes Аэробные условия, лимитация глюкозой Анаэробные условия, 0,094 14 1) [244]
лимитация триптофаном, NH;C1 (2 г/л) 2,88 39 [309]
Klebsiella aerogenes Анаэробные условия, лимитация триптофаном, NH4CI (4 г/л) 3,69 50 [309]
Saccharomyces cere-visiae Анаэробные условия 0,036 0,52 [342]
Saccharomyces cere-visiae Анаэробные условия, NaCl (1,0 М) 0,360 2,2 [342]
Penicillium chryso-genurn Azotobacter vinelan- Аэробные условия Фиксация азота, напря- 0,022 3,2 4) [275]
da жение растворенного кислорода (0,2 атм) 1,5 4) 220 4) [222]
Azotobacter vinelan-dii Фиксация азота, напряжение растворенного кислорода (0,02 атм) 0,15 4) 22 4) [222]
') т выражено в граммах пето шика энергии, израсходованной за I ч в расчете на ' грамм сухой биомассы.
2) ^д_тф выражено в миллимолях АТФ. израсходованного за I ч в расчете на 1 г сухой биомассы.
’8) Предполагается, что на 1 моль глюкозы образуется 26 моль АТФ. т. е. Р/О = 2
4) Предполагается, что на I моль глюкозы образуется 2 моль АТФ
АТФ • г сухой биомассы-1 • ч-1) для дрожжей, растущих без добавления хлористого натрия, до 220 (ммоль АТФ • г сухой биомассы-1 • ч-1) для Azotobacter, фиксирующего азот при высоком напряжении растворенного кислорода. Ясно, что энергетические затраты на поддержание могут составлять значительную часть общего количества потребленной энергии. Так, при анаэробном развитии Klebsiella aerogenes на среде с глюкозой в качестве источника энергии при скорости роста 0,1 ч-1 энергия, израсходованная на поддержание, составляла около 90% всей
Источники энергии и углерода
89
энергии поглощенного источника (стр. 62 в работе [309]). Величина m для A. aerogenes в этом случае [309] превышала в 3—4 раза ранее найденное значение для того же организма [244]. Такое расхождение данных, возможно, объясняется тем обстоятельством, что в одном случае [309] имелся избыток источника энергии, а во втором [244] источник энергии присутствовал в количестве, лимитирующем рост.
Результаты ряда исследований [309, 342], приведенные в табл. 7, свидетельствуют о значительном влиянии ионной силы среды на величину энергии, израсходованной на поддержание. Уотсон [342] установил, что при добавлении в инкубационную среду хлористого натрия (1М) значение гнатф возрастает в 4 раза (при этом изменяются также метаболические пути, что приводит к уменьшенному образованию АТФ из глюкозы). По данным Стаутхамера и Беттенхаузена [309], повышение концентрации NH4C1 от 0,2 до 0,4% приводит к повышению Шатф до 11 (ммоль АТФ • г сухой биомассы-1 • ч-1). Эти наблюдения дают основание думать, что значительная часть энергии, затрачиваемой на поддержание жизнедеятельности, расходуется на совершение осмотической работы, т. е. на установление определенных градиентов концентраций между клеткой и внешней средой.
Влияние температуры и значений pH на потребность в энергии поддержания систематически пока не исследовалось. Литературные данные [121] о стабильности величины экономического коэффициента при росте Escherichia coli на среде с глюкозой в диапазоне температуры от 15 до 36 °C дают основание думать, что температура оказывает незначительное влияние на величину т. Что же касается pH, то те же авторы сообщили о значительном влиянии этого параметра на величину экономического коэффициента при использовании глюкозы. Уменьшение значения pH от 6,6 до 5,4 сопровождалось увеличением qoC, это соответствовало увеличению шатф до 16 (ммоль АТФ-г сухой биомассы-1 -ч-1).
Энергетические затраты на обновление клеточного материала можно определить путем сравнения известных скоростей обновления с удельной скоростью процессов поддержания. По имеющимся данным, скорость обновления белка в растущих бактериях составляет 0,006 ч-1 (0,6%/ч), увеличиваясь в десять раз при прекращении роста [199]. Допустим, что на долю белка приходится 60% биомассы; тогда скорость обновления в растущих клетках будет соответствовать скорости обновления биомассы и будет равна 0,6 • 0,006 ч-1, или 0,0036 ч-1. Удельная скорость поддержания для Е. coli составляет около 0,06 ч-1. Следовательно, на обновление белка расходуется лишь незначительная часть энергии, затраченной на поддержание. При отсутствии
90
Глава 8
роста скорость обновления белка в клетках Е. coli (6%/ч) будет соответствовать удельной скорости поддержания и составит 0,036 ч-1. В условиях, когда энергетический субстрат служит лимитирующим субстратом, его дробная подача приводила к уменьшению значения YE [30]. Этот эффект, возможно, объясняется увеличением обновления белка, сопутствующим остановке роста клеток.
К главным компонентам клетки относится также РНК, скорость обновления которой, по имеющимся данным, составляет в растущих клетках < 0,5%/ч [199]; эта величина слишком мала, и на обновление РНК может быть израсходована лишь незначительная часть энергии поддержания. У некоторых бактерий энергетические затраты на обновление материала клеточных стенок могут составить значительную часть энергии поддержания во время роста [206].
В литературе часто указывается, что культуры видов Azoto-bacter обладают исключительно высокими значениями qo2. Имеются многочисленные данные о том, что эти исключительно высокие значения встречаются только при фиксации бактериями азота в условиях высокой концентрации растворенного кислорода, так как энергия поддержания пропорциональна концентрации растворенного кислорода [222]. Возможно, таким путем клетка защищается от избыточного кислорода, способного ингибировать высоко восстановленную нитрогеназную систему.
По всей видимости, у микроорганизмов большая часть необходимой энергии затрачивается на функции поддержания. Однако значительная вариабельность величины этих затрат, а также регулирующие ее факторы должны быть изучены более систематически.
8.4. Влияние энергетических затрат на поддержание
8.4.1. Зависимость между скоростью роста и концентрацией энергетического субстрата
Потребность клеток в энергетических затратах на поддержание должна оказывать влияние на зависимость между скоростью роста и концентрацией энергетического субстрата. Из уравнений (8.11) и (2.20) мы имеем
9£ = 9/^£о + т = (7отх/(5 + Ks). (8.18)
Следовательно,
9 = 9OTs/(s +/<s) — mYEG, (8.19)
где pm = qmYEG. Когда s S> К,,
Ц = Ц/п — mYE0. (8.20)
Источники энергии и углерода 91
Примем, что когда ц = 0, s == sm, тогда sm = mKsYE0/(pm — mYEG), (8.21)
а при s = О ц = — tnYEQ. (8.22)
Графическое изображение уравнения (8.19) приведено на рис. 29. Согласно данной модели, максимальная скорость роста уменьшается, если имеется потребность в расходе энергии на
Рис. 29. Зависимость [уравнение (8.19)] удельной скорости роста (ц) от концентрации источника энергии (s), когда коэффициент поддержания (т) — величина постоянная.
поддержание, и скорость роста становится равной нулю при ограниченной концентрации (sm) энергетического субстрата. Различия между уравнениями (8.19) и (2.21) будут существенными лишь в том случае, если т очень велико; примером может служить азотфиксация культур Azotobacter при высоком напряжении кислорода.
8.4.2. Рост хемостатной культуры
В связи с самим фактом энергетических затрат на поддержание теорию хемостата необходимо количественно модифицировать. Для выражения скорости роста можно составить уравнение
dx/dt — (ц. — D) х.
(8.23)
92
Г лава 8
Но если энергетический источник является лимитирующим субстратом, тогда
dsjdt = D (sr — s) — px/YE0 — tnx. (8.24)
Подставляем значение ц из выражения (8.19). В стационарном состоянии, когда dx/dt = ds/dt = 0, у = £>,
s = (D + mYEa) Ks/([i,n — тУЕа — D) (8.25)
и
x = DYEa{sr — s)/(D + mYEa). (8.26)
Необходимо заметить, что это последнее выражение для х отличается от выражения, данного ранее [244] и оказавшегося не-
Рис. 30. Концентрация биомассы в стационарном состоянии культуры (х) при различных скоростях разбавления (О) в хемостате, когда имеется необходимость в расходовании лимитирующего рост субстрата на поддержание жизни.
Цт = i,0 ч —Ks=0,0J5 г • л_|, sf = 1,0 г • л -¥££ = 0,5 г биомассы • (г субстрата)-"1, т = 0,08 с субстрата • (г биомассы • ч)“!
верным. Влияние функции поддержания на биомассу в стационарном состоянии в хемостате показано на рис. 30.
8.4.3. Рост периодической культуры
Расход лимитирующего рост субстрата для обеспечения функции
поддержания должен привести к уменьшению у [в соответствии с уравнением (8.19)] и экономического коэффициента. Количество источника энергии, потребленное за период t, может быть определено из следующего равенства:
As£ = (х xti)/YBQ -]-
4- т j xdt, (8.27) Xj
где x0 и x—количество биомассы в начальный момент и через время t. Определив Дуе при двух различных скоростях роста и вычислив интеграл аналитическим или графическим способом, найдем величину т. Моно [216] применил этот метод для определения т у культуры Escherichia coli, изменяя у лимитированием аэрации. Он установил, что если в качестве энергетического субстрата используется лактат, то т павно 0. Тот факт, что
Источники энергии и углерода
93
энергетические затраты на выполнение функций поддержания остались незамеченными, можно объяснить, по-видимому, следующим обстоятельством: либо различие в скорости роста было слишком небольшим, либо ограничение аэрации привело к увеличению выхода АТФ, что маскировало энергетические затраты на поддержание.
8.5. Выход биомассы в расчете на выход АТФ (Уатф)
Бушоп и Элсден [17] определили количество биомассы, синтезированной в расчете на 1 моль АТФ, как
Уатф = MYe/п, (8.28;
где п — число молей АТФ, образующихся при расщеплении одного моля энергетического субстрата; М — молекулярный вес (в граммах) энергетического субстрата и МУЕ — экономический коэффициент в молях, когда YE выражается в граммах образованной сухой биомассы на 1 грамм энергетического субстрата. Указанные исследователи [17] установили, что Уатф составляет приблизительно 10,5 независимо от природы организма и условий культивирования. Если это так, то из уравнения (8.28) следует, что количество энергетического субстрата, необходимого для синтеза данного количества биомассы, должно быть прямо пропорциональным числу (м) молей АТФ, получаемых при метаболизме одной молекулы энергетического субстрата. Факторы, влияющие на образование АТФ, такие, как разобщение окислительного фосфорилирования или изменения в метаболических путях, будут влиять и на значение YE. Энергетические затраты на поддержание также будут оказывать действие и на Уатф, как это следует из уравнения (8.19). Следовательно, максимальная величина Уатф, т. е. Уатф, выражается следующим отношением, полученным из уравнения (8.11):
^тф = 7^г + ^атф = тЛ-- (8.29)
гАТФ ' АТФ
в котором за единицу источника энергии принимается одна грамм-молекула АТФ. Стаутхамер и Беттенхаузен [309] указывают, что влияние энергии поддержания на Уатф очень недооценивается и что эта энергия является одним из факторов, обусловливающих широкий диапазон значений Уатф.
При теоретическом расчете, основанном на данных об энергетических затратах на синтез бактериальных клеток из глюкозы, аммиака и неорганических солей, оказалось, что Уатф равно 28,8 [308]. Замена аммиака на аминокислоты мало влияет на эту теоретическую величину, однако при добавлении азотистых оснований теоретический максимум Уатф увеличивается до 32,1
94
Глава 8
[308] . При добавлении к минимальной среде для бактерий аминокислот, азотистых оснований и витаминов значение Ye практически изменяется незначительно [134]. При синтезе биомассы из двуокиси углерода (автотрофный метаболизм) теоретический максимум Уатф (4,85) оказывается значительно ниже. Если в качестве источника энергии используется уксусная кислота, то значение теоретического максимума составляет 10,0 [308]. Оценивая величину Уатф для клеток, выросших на углеводах, Стаутхамер и Беттенхаузен [309] пришли к заключению, что для бактериальных культур Уатф может достигать 25. Они определили также количество молекул АТФ, образующихся на каждый атом поглощенного кислорода (отношение P/О) у некоторых видов аэробных бактерий. Это число оказалось равным 1,9.
В заключение можно сказать, что, исходя из чистого выхода АТФ (и) в расчете на 1 моль потребленного энергетического субстрата, можно предсказать значение экономического коэффициента при культивировании на данном субстрате и что значение Уатф может варьировать в пределах от 5 до 32 г сухой биомассы на 1 моль АТФ в зависимости от природы использованного источника углерода. Необходимо также иметь в виду, что установленное значение Уатф может оказаться значительно ниже ее максимального теоретического значения, во-первых, в связи с расходом АТФ на процессы поддержания и, во-вторых, в результате разобщения образования АТФ и окисления энергетического субстрата.
8.6. Условия, влияющие на метаболическую судьбу источников углерода и энергии
На пути превращения, конечные продукты и выход АТФ для того или иного источника энергии или углерода большое влияние могут оказывать концентрация растворенного кислорода, значение pH, температура, ионная сила среды и недостаточное содержание в среде микроэлементов. Эти вопросы мы рассмотрим позднее в соответствующих разделах. На метаболизм источников углерода и энергии могут также оказывать влияние удельная скорость роста и содержание источника углерода — присутствует ли он в избытке или в количестве, лимитирующем рост.
От удельной скорости роста зависит судьба глюкозы, сбраживаемой Lactobacillus easel [80]. При низких скоростях роста в качестве конечных продуктов образуются ацетат, формиат и этанол, при высоких же скоростях роста глюкоза полностью перерабатывается в молочную кислоту. В аэробных условиях на среде с глюкозой в хемостатной культуре Klebsiella aerogenes
Источники энергии и углерода
95
(лимитация азотом) образование больших количеств а-кетоглу-тарата наблюдалось при очень низкой скорости роста, но не при высоких скоростях [317].
Когда в культуре К. aerogenes глюкоза и кислород присутствуют в избытке, в культуральной жидкости накапливаются большие количества пирувата; в условиях лимитации роста глюкозой практически все количество источника углерода превращается в биомассу и двуокись углерода [124]. В культуре Aerobacter cloacae при избыточном содержании глюкозы и кислорода накапливается ацетат [243]. Следовательно, когда бактерии развиваются в среде с избыточным содержанием кислорода и источников углерода и энергии, окисление субстрата может быть неполным. Кроме того, когда источник энергии находится в избытке, он может запасаться в качестве энергетического резерва, обусловливая значительную часть веса сухой биомассы [347].
8.7. Потребление двух и более источников углерода
Часто в периодических культурах, содержащих в качестве источников углерода несколько различных субстратов, потребление этих субстратов клетками происходит последовательно. Например, в культуре Escherichia сначала используется глюкоза, а затем лактоза [216]. При этом использование одного субстрата может быть ингибировано другим, что связано с репрессией синтеза ферментов и ингибированием пермеаз [212].
В хемостатных культурах, когда среда содержит два источника углерода и рост лимитирован углеродом, оба субстрата могут потребляться культурой одновременно в широком диапазоне скоростей разбавления. Например, Klebsiella aerogenes потребляет одновременно глюкозу и лактозу [10], глюкозу и мальтозу [126], глюкозу и ацетат [собственные неопубликованные данные]; Escherichia coli одновременно использует глюкозу и ксилозу [304]. Когда источник углерода не лимитирует роста, например при лимитировании роста азотом, наблюдается предпочтительное использование одного из источников углерода. Так, лимитированные азотом виды Pseudomonas потребляли сначала ацетат, а затем глюкозу [223]. При лимитации же культуры углеродом оба указанных источника углерода использовались одновременно (Перт, неопубликованные данные).
8.8. Снабжение культур двуокисью углерода
Потребность в двуокиси углерода объясняется двумя причинами. Во-первых, для автотрофных бактерий и водорослей СО2 служит источником углерода, и, во-вторых, СО2— важный
96
Глава 8
промежуточный продукт метаболизма у любого организма и, следовательно, его присутствие в культуральной среде совершенно необходимо.
Концентрация растворенного СО2 будет зависеть от баланса между образованием СОг и его выведением из жидкой фазы в газовую. Таким образом, для периодической культуры
Скорость на- Скорость об- Скорость выведения
копления разования из жидкости в газо-
(7?) вую фазу,
или
Я = ?СО*_/СЬа(С“СД (8-30)
где Kl — константа, а — поверхность раздела фаз газ — жидкость, приходящаяся на единицу объема, с — фактическая концентрация растворенного СО2, cs— концентрация растворенного СОг в равновесии с газовой фазой (сравните с транспортом кислорода; разд. 9.6.1). Обозначая константу Генри через Н, а парциальное давление СОг в жидкой и в газовой фазах соответственно через pi и pg, напишем уравнение (8.30) в следующем виде:
= Я СО,Х~ ^LaH (р[ — Pg)- <8-31)
Если образования СОг не происходит, т. е. qC02 — 0, то необходимо добавлять в газовую фазу СОг, при этом pg > pt. Для хемостатной культуры в правую часть уравнения (8.30) следует ввести член «—De», чтобы учесть отток растворенной СОг, однако этим членом часто можно пренебречь. Тогда для стационарного состояния при R = 0 из уравнения (8.31) получим
P^Pg + Pco^l^L^- (8-32)
Автоматический контроль растворенного СОг с помощью углекислого электрода осуществили Ишизаки и др. [155].
8.9. Равновесие двуокись углерода — карбонаты в растворах
Растворяясь в жидкости, СО2 дает угольную кислоту, которая, диссоциируя, образует карбонатные и бикарбонатные ионы;
СО2 + Н2О Н2СО3,
Н2СО3 НСОз" + Н+,
НОД ^Н+ + СОз".
Общая концентрация (5) растворенного СО2 включает также и угольную кислоту, т. е.
S = [СО2] + [Н2СО3] = НРСО„ (8.33)
Источники энергии и углерода ЧЯ
где квадратные скобки означают концентрацию, а Рсо2~ парциальное давление растворенного СОг; Н для водного раствора при 30 °C равно 0,030 моль/атм, что приблизительно в 30 раз выше соответствующего показателя для кислорода. Для кон-
стант ионизации Н2СОз мы имеем [Н+] [НСОз] 6,з = Ч = 10 при О 30 °C. (8.34)
Следовательно, log[HCO3’] = logS + pH- (8.35)
где р/С = — log/Cj. Для ионизации НСОз (Н*1[СОГ] _ ,0.э - [нсо3-] 10 при 30 °C. (8.36)
Следовательно, log [СОИ = log [НСО3]3 Н- pH -рк2. (8.37)
Строго говоря, вместо концентрации следовало бы указывать активности, однако в данном случае принимается, что коэффициенты активности равны 1. Вычисленные концентрации би-карбонатных и карбонатных ионов при различных значениях pH и при Рсог=Ю-2 атм приведены в табл. 8. При pH 10 маловероятно, что Рсо2 может поддерживаться на уровне 10-2 атм — из-за высоких концентраций бикарбонатов.
Таблица 8
Концентрация бикарбонатных и карбонатных ионов при различных значениях pH и при парциальном давлении СО2, равном 10~2 атм1)
Значения pH [нсо3]. м [со2-], м
4 1,50- 10-6 7,5- IO-10
7 1,50 • 10~3 4 7,5- ИГ7
10 1,50 7,5 - 10-4
1) Температура 30 °C; концентрации высчитаны из уравнений (8.35) и (8.37) при S=0,03-10~2 м.
8.10. Влияние парциального давления СО2 на рост и метаболизм
Изучение влияния парциального давления двуокиси углерода на рост микроорганизмов, как правило, ограничивается сравнительными исследованиями в присутствии или в отсутствие
4 Зак. 737
98
Г лава 8
СОг. Так, в частности, установлено, что график зависимости скорости роста Klebsiella aerogenes от Рсо, имеет вид гиперболы, причем половина максимальной скорости роста наблюдается при Рсо2 = 3- 10-4 атм, т. е. при парциальном давлении СОг в атмосферном воздухе при 1 атм [63]. Из растворимости СОг [уравнение (8.33)] следует, что Ks*= 0,9 • 10~5 М, т. е. имеет приблизительно такое же значение, как и Ks, для обычных источников углерода. Максимальная скорость роста К- aerogenes наблюдается при Рсо,,равном примерно 10-3 атм. Львов и Моно [192] показали, что при Рсо. =®3- 10-э атм скорость роста Escherichia coli на минимальной среде с глюкозой значительно падает, но этот эффект может быть предотвращен добавлением 10~4 М глутарата, сукцината, аспарагина или глутамата, причем наиболее эффективным оказался глутамат. Этот эффект добавок не был аддитивен. При Рсо, = 6- 10~6 атм рост фактически прекращался и при внесении добавок не восстанавливался. Вероятно, внесенные добавки не могут заменить собой СОг, но способны уменьшить его потребление.
Существует предположение, что Рсо, имеет критическое значение не только для роста, но и для других функций микроорганизмов [350], однако пока еще это не доказано. Вместе с тем экспериментально с помощью автоматического контроля концентрации растворенного СОг обнаружено, что избыточное образование инозина клетками Bacillus subtilis сильно ингибируется при Рсо, >0,03 атм [155]. Более того, результаты этой работы указывают также, что СОг является более сильным ингибитором, чем бикарбонат-ионы.
8.11. Углеводороды как источники углерода и энергии
В связи с широким распространением и относительно низкой ценой углеводороды приобретают все большее значение в качестве субстратов, используемых в промышленности для получения белка одноклеточных и для превращения их в более ценные продукты. Отличительной особенностью углеводородов является их нерастворимость, чем, вероятно, объясняется в какой-то мере недостаток внимания к ним со стороны микробиологов. Максимальная растворимость «-алканов составляет около 60 мг/л при длине цепи от Сг до С4 и снижается при увеличении длины углеродной цепи в соответствии с выражением
log/7 = 4,526 —- 0,588п, (8.38)
где Н — растворимость, выраженная в мг/л, и п — число атомов углерода в молекуле [158]. Данные табл. 9 показывают, что, начиная с октана, растворимость падает ниже 10-5. Поскольку
Источники энергии и углерода
99
Габлица 9
Растворимость и-алканов в воде при 25 °C ')
к-Алкан Конгентрашия насыщенного раствора, М ; н-Алкан Кои»ентрадия насыщенного раствора, М
Гексан Гептан Октан 1,1 иг4 2,6 • 10~5 5,8- 10 ~6 Декан Додекан Тетрадекан 3,1 гл7 1,7- 1(Г8 9,8- КГ'°
*' Данные взяты из работы Джонсона [158].
значение Ks для источников углерода и энергии обычно превосходит 10~5 М (табл. 1), представляется маловероятным, чтобы потребление клеткой растворимых углеводородов (высших гомологов) происходило бы достаточно быстро, чтобы обеспечить рост с удельной скоростью выше 0,2 ч-1. Джонсон [158], исходя из законов диффузии, подсчитал, что «даже в случае, когда константа Михаэлиса равна нулю, при развитии на средах с додеканом и более высокомолекулярными углеводородами нельзя получить сколько-нибудь значительной скорости роста, если только не сработает какой-то специальный механизм потребления субстрата». Этим специальным механизмом может оказаться потребление углеводородов непосредственно из гидрофобной фазы [149]. Следовательно, размеры маслянистых капелек и поверхность раздела фаз масло — вода будут оказывать большое влияние на скорость роста. По существу скорость роста на средах с высшими гомологами алканов может лимитироваться площадью общей поверхности раздела фаз масло — вода, а это находит свое отражение в том, что начинается фаза линейного роста в периодической культуре. На принципе прямого транспорта углеводородов из нерастворимой фазы в клетку были предложены модели для хемостатных культур микроорганизмов [149]. Из обобщенных представлений об ожидаемых результатах при росте в хемостате при разных скоростях разбавления (рис. 31) Хэмфри и Эриксон [149] вывели следующее заключение: «1. Диспергирование фазы при непрерывном культивировании обеспечивает обычно лишь незначительные скорости потребления субстрата, за исключением низких скоростей разбавления. 2. Концентрация клеток уменьшается довольно резко со скоростью разбавления. (Это было подтверждено результатами других исследователей [221].) 3. Оптимальная производительность (Dx) не достигается при условиях, близких к вымыванию. Она достигается при относительно низких значениях ^/ртах — обычно в диапазоне от 0,2 до 0,4».
4*
100
Глаиа 8
Сравнение значения экономических коэффициентов для роста на углеводородах (табл. 5) показывает, что количество углерода субстрата, перешедшего в углерод биомассы, то же, что и для других субстратов, а главным различием между ростом на углеводородах и ростом на углеводах является значительно
Рис. 31. Общее представление о влиянии скорости разбавления на концентрацию биомассы, концентрацию субстрата (углеводорода) и производительность [149].
£> —скорость разбавления, —максимальная удельная скорость роста приросте иа угле
водородах, Z—субстрат, II — производительность, III—биомасса.
большая потребность в кислороде при использовании углеводородов (разд. 9.2). Значение экономического коэффициента в случае сред с углеводородами значительно возрастает, когда вместо простых периодических культур с избытком в среде углеводородов используются периодические культуры «с дробным добавлением питания» (разд. 21.1) и лимитацией роста углеродом [357].
8.12. Диспергирование углеводородов в жидкой среде
Удобным способом введения твердых углеводородов в среду является использование другого инертного углеводорода в качестве растворителя. Так, для растворения Сго н-алканов был использован 2,6,10,14-тетраметилпентадекан [158].
Поверхностно-активные вещества, действуя как эмульгирующие агенты, способствуют увеличению поверхности раздела
Источники энергии и углерода 101
масло — вода. Для этих целей рекомендуют применение поли-оксиэтилен-20-олеинового эфира [175] и полиоксиэтиленполипропиленмоностеарата [303]. Очевидно, дрожжи и бактерии, потребляющие углеводороды, сами синтезируют эмульгирующие вещества. Слизистую вязкообразную фракцию с эмульгирующими свойствами удалось получить из культур видов Pseudomonas, растущих на декане [196]; кроме того, была выделена липидная фракция, содержащая трегалозу и обладающая свойствами эмульгирующего агента, из культур бактерий, растущих на углеводородах [312]. Гома и др. [109] обнаружили, что дрожжи, растущие на гексадекане, образуют вещество, эмульгирующее С16-углеводороды, предпочтительнее, чем другие алканы. Химическая природа этих естественных эмульгаторов пока еще не установлена, но, возможно, они играют большую роль при росте микроорганизмов на средах с углеводородами.
Глава 9
ПОТРЕБНОСТЬ В КИСЛОРОДЕ И ОБЕСПЕЧЕНИЕ ИМ
9.1. Введение
Изучение потребности микроорганизмов в кислороде началось с открытия Пастером использования кислорода дрожжами для окисления источников углерода и энергии. Количественное исследование этого вопроса не приносило никаких результатов вплоть до 20-х годов, когда впервые появилось манометрическое оборудование для изучения интенсивности дыхания и стехиометрии окисления субстрата; манометрический метод, однако, пригоден только для неразмножаюгцихся, «покоящихся» клеток. В 30-х годах для изучения дыхания был использован полярографический метод с кислородным электродом [18], но прошло еще несколько десятилетий, прежде чем кислородный электрод был усовершенствован и нашел широкое применение в изучении влияния кислорода на микроорганизмы. Также в 30-х годах внимание исследователей привлек окислительно-восстановительный потенциал как фактор, способный играть регулирующую роль в процессах окисления источников энергии, однако его истинное значение для культуры микроорганизма все еще остается неясным. Новые представления о роли окислительно-восстановительного потенциала в культурах рассматриваются в разд. 9.5.
Начиная с 40-х годов проблема обеспечения культур кислородом при глубинном выращивании с высокой концентрацией биомассы приобрела важное значение главным образом из-за практической необходимости получения антибиотиков в промышленном масштабе. Аналогичная проблема в производстве пекарских дрожжей была решена эмпирически применением «доливного метода». В сущности с помощью этого метода можно регулировать потребность культуры в кислороде. В настоящее время осуществляется автоматический контроль концентрации растворенного кислорода в глубинных культурах, и метод этот имеет важное значение для выяснения потребностей в кислороде, особенно при стационарном состоянии хемостатных культур.
Потребность в кислороде и обеспечение им
103
9.2. Потребность в кислороде
При аэробном метаболизме кислород выполняет роль акцептора электронов или водорода. Этот процесс совершается при участии фермента оксидазы. Помимо выполнения роли акцептора электронов, кислород может —с помощью оксигеназ — встраиваться в молекулу углеродных субстратов при их катаболизме. По имеющимся данным, оксигеназы участвуют в катаболизме углеводородов и ароматических циклических соединений.
Количественно оценить суммарную потребность в кислороде для энергетического метаболизма можно по стехиометрии окисления. Например, для окисления глюкозы в процессе роста Escherichia coli записываем: СвН120б + 6О2-> 6СО2-ф 6Н2О. Количество окисленного источника углерода считают равным тому количеству, которое требуется для обеспечения энергетических затрат, и, исходя из этого количества, определяют экономический коэффициент (Ye) при росте на данном энергетическом субстрате (разд. 8.2).
Когда в качестве источников углерода используют углеводороды, кислород расходуется не только на процессы образования энергии, но и на повышение уровня окисленности субстрата до уровня биомассы. Из расчета кислородного баланса следует, что при использовании в качестве субстрата углеводородов на образование биомассы расходуется гораздо больше кислорода, чем при выращивании микроорганизмов на углеводах [64]. Необходимое при этом количество кислорода может быть рассчитано следующим образом [158]. Примем, что А— количество кислорода, требуемое для сжигания 1 г субстрата до СО2, Н2О (и NH3, если в субстрате содержится азот); В — количество кислорода, идущее на сжигание 1 г сухой биомассы до СОг, Н2О и NH3; У — экономический коэффициент, выраженный в граммах сухой биомассы, образовавшейся на 1 г субстрата (г/г), и С — количество кислорода, используемое в процессе образования 1 г сухой биомассы. Тогда мы сможем записать баланс:
Количество кисло- Количество кисло- Количество кисло
рода,необходимое рода, расходуемое на рода, идущее на
для образования = сжигание субстрата, — сжигание 1 г су-1 г сухой био- израсходованного на хой биомассы, массы синтез 1 г сухой био-
массы
или
С = A/Y - В.
(9.1)
104
Глава 9
Установлено, что В = 41,7 ммоль кислорода/г сухой биомассы; А = 33,33 ммоль кислорода/г глюкозы или 107 ммоль кислорода/г алкана (СНг). При Y — 0,5 для глюкозы и 0,81 для алкана, количество кислорода, требуемое для роста на алканах, оказывается в 3,6 раза больше, чем для роста на глюкозе. Сравнение значений экономических коэффициентов, определенных по количеству использованного кислорода, приведено в табл. 5. Из сказанного выше следует, что если скорость транспорта кислорода (разд. 9.6.1) ограничивает производительность ферментера, то максимальная производительность при использовании в качестве субстрата глюкозы будет в 3,6 раза выше, чем на среде с н-алканами.
Теоретически максимальное значение экономического коэффициента по кислороду, когда в качестве источника углерода используется глюкоза, можно подсчитать следующим образом. Допустим, что при окислении глюкозы 2 молекулы АТФ образуются за счет использования одного атома кислорода, т. е. Р/О = 2, и 2 молекулы АТФ образуются в процессе гликолиза, тогда общее количество образующегося АТФ составит 26 моль на 1 моль окисленной глюкозы. Приняв, что Уатф = 25 г сухой биомассы/моль АТФ (разд. 8.5), рассчитаем теоретически максимальный экономический коэффициент по кислороду (Ухю)» который будет равен 3,39 г сухой биомассы/г кислорода. Экспериментальное значение Ух/о для бактерий и грибов, использующих в качестве источника энергии углеводы, обычно близко к единице. Большая разница между теоретически рассчитанной и полученной экспериментально величинами Ух/о приписывается энергетическим затратам на поддержание и пониженному образованию АТФ.
В окислительных реакциях, протекающих с участием как оксигеназ, так и оксидаз, между ними возможна конкуренция за кислород. Активность этих двух ферментов можно определить раздельно, если известна стехиометрия оксигеназной реакции. Так, было высказано предположение [123], что при окислении декана видами Pseudomonas скорость потребления кислорода в энергодающем процессе (<7§2) выражается уравнением
^О2 декан’
где — общий метаболический коэффициент для кислорода и ^декан—коэффициент потребления декана; при расчетах эти коэффиценты выражают обычно в молях. При этом предполагается, что декан и кислород включаются в оксигеназную реакцию в эквимолярных количествах. Следовательно, <?Декан будет равным скорости потребления кислорода в оксигеназной реакции.
Потребность в кислороде и обеспечение им
105
9.3. Растворимость кислорода
Растворимость кислорода в водной среде составляет всего лишь несколько миллиграмм на I л при давлении воздуха 1 атм (табл. 10). Это слишком малая величина по сравнению с тем количеством кислорода, которое может быть потреблено культурой. При большой плотности биомассы потребление кислорода может достигать 50 г/л, что вызывает необходимость пополнять среду растворенным кислородом, переводя его из газовой фазы в жидкую.
Таблица 10
Растворимость кислорода в воде и константа Генри (Я)
Температура. °C Концентрация кислорода '). мг/л н, мг/атм
25 8,10 38,8
35 6,99 33,4
1) В равновесии с воздухом при 1 атм Pq9 = 0.209 атм; рассчитано из уравнения (9.3).
Главные факторы, оказывающие влияние на растворимость кислорода, — это парциальное давление кислорода, температура и различные компоненты среды. Влияние парциального давления кислорода в газовой фазе (pg) выражается законом Генри:
cs = Hp4, (9.2)
где cs — концентрация при насыщении кислородом, Я— постоянная Генри. Парциальное давление называют также напряжением кислорода.
Растворимость кислорода понижается при повышении температуры и наоборот. Влияние температуры на растворимость кислорода в воде исследовал экспериментально Трусдейл [331], составивший на основе полученных результатов следующее эмпирическое уравнение:
cs= 14,16-0,3943Г +0,007714Т2 —0,0000646т3, (9.3)
где cs — концентрация при насыщении кислородом (мг/л) в чистой воде при Г °C и давлении воздуха 1 атм (воздух содержит 20,9% кислорода; парциальное давление кислорода == = 158,8 мм рт. ст.). Стандартная ошибка уравнения (9.3) составляет 0,05 мг/л.
106
Глава 9
Активность кислорода в насыщенном растворе определяется выражением a = fcs, где f — коэффициент активности. Активность газа можно выразить через его парциальное давление, допуская a = pg. Тогда константа Генри (//) становится обратно пропорциональна коэффициенту активности. Наличие в растворе солей обычно приводит к уменьшению растворимости кислорода, а следовательно, к повышению активности. Этот эффект может быть весьма значительным. Например, в насыщенном растворе хлористого натрия растворимость кислорода уменьшается примерно в два раза, а это значит, что коэффициент активности удваивается. Зависимость растворимости кислорода от степени солености морской воды исследовали Трусдейл и др. [331].
9.4. Измерение количества растворенного кислорода
9.4.1. Определение концентрации растворенного кислорода
Существуют два главных метода определения концентрации растворенного кислорода. Один из них — титрование, осуществляемое обычно методом Винклера (цит. по [191]), в основе которого лежит окисление закиси марганца кислородом в окись и последующее титрование иода, освобождаемого при этом из йодистого калия. Этот метод дает большие погрешности при наличии в растворе органических веществ, и, следовательно, при исследовании сред для культивирования его применение весьма ограничено. Второй метод основан на газометрии [282]. При использовании данного метода кислород выводится из раствора в результате образования СОг, который и анализируется. При работе этот метод в отличие от первого не зависит от наличия в анализируемой жидкости органических веществ. Однако оба эти метода требуют слишком много времени и не обладают достаточной чувствительностью, чтобы использоваться при диапазоне тех концентраций кислорода, которые обычно лимитируют скорость дыхания микроорганизмов.
9.4.2. Измерение напряжения растворенного кислорода
Напряжение кислорода измеряют электрометрически с помощью кислородного электрода; через электрод проходит ток, сила которого прямо пропорциональна напряжению кислорода. Следовательно, с помощью кислородного электрода можно измерять активность кислорода в растворе, а не его концентрацию. Это, в частности, можно продемонстрировать на примере насыщения воды хлористым натрием: концентрация кислорода
Потребность в кислороде и обеспечение им
107
уменьшается наполовину, не оказывая при этом никакого влияния на показания кислородного электрода при данном давлении газа. Перевод показаний кислородного электрода в концентрацию кислорода дает представление о величине//. Однако в большинстве случаев показания электрода удобно выражать через напряжение растворенного кислорода. Кислородный электрод можно с успехом использовать для измерения и регистрации напряжения растворенного кислорода вплоть до долей миллиметра ртутного столба [196].
Для определения напряжения растворенного кислорода используется также следующий метод. В исследуемую культуру погружают трубку из проницаемого для кислорода материала, такого, как тефлон; затем трубка продувается азотом или каким-либо другим газом, не содержащим кислорода. Поскольку растворенный кислород диффундирует в трубку, то, измерив с помощью какого-либо газового анализатора количество кислорода в потоке газа, полученное значение можно перевести в напряжение кислорода.
9.5. Окислительно-восстановительный потенциал
9.5.1. Определение
Окислительно-восстановительный потенциал характеризует способность раствора отдавать или принимать электроны. Окислительно-восстановительный потенциал измеряют, погружая инертный электрод, обычно из платины, в раствор, и регистрируя разницу в показаниях между платиновым электродом и электродом сравнения.
Обратимый окислительно-восстановительный процесс можно выразить в виде следующего равенства:
а (окислитель) + ЬН+ + пе с (восстановитель),
где а и с — число молей окислителя и восстановителя соответственно и п — число переносимых электронов. Окислительно-восстановительный потенциал (Eh) процесса определяется из уравнения
Eh = Eq + |П [Окислитель]0 [Н1Ь (9,4)
“ и nF [Восстановитель] ’
где квадратные скобки означают концентрации активных реагентов (когда коэффициент активности равен единице, концентрации можно заменять активностями), R—-газовая постоянная и F — количество электричества (фарадей). Реакция водородного электрода имеет следующий вид:
2Н+ -Ь 2е <=* Н2,
108
Г лава 9
для которой
Ел = Е0 + -^1п-^, 0.5)
где Рн2 — парциальное давление газообразного водорода. Стандартный водородный электрод получают при [Н+] — 1,0 М и Рц,= 1 атм. Тогда Eh = Ео, потенциал которого принят за 0. Если потенциал измеряют не против стандартного водородного электрода, а против каломельного или какого-либо другого электрода сравнения, тогда, если Ei — измеряемый потенциал, Ел—потенциал электрода сравнения, то Еь=Е\ + Ел. Значения Eh для различных электродов сравнения приведены в работе Якоба [156, стр. 101].
Из выражения (9.4) следует, что Ел зависит от pH. Выразим уравнение (9.4) в иной форме:
Eh = E0 + 2,30 — log 1°Еислитель1й _ 2,30 . bRT рН. (9.6) nt [Восстановитель]0 nF
Наклон кривой на графике зависимости Ед от значений pH, когда активности окислителя и восстановителя постоянны, должен быть —2,30-bRT/nF, что соответствует изменению Eh при изменении значения pH на 1 единицу. Если Ь/п— 1, то отношение ЛЕл/ДрН равно 58 мВ при 30 °C.
Электрометрические измерения Ел детально рассматриваются в работе Якоба [156]. Результаты измерения величины Ед в большой степени зависят от подготовки платинового электрода, особенно от степени его полировки [156, стр. 100].
В этом же исследовании [156] приводятся индикаторы, которые можно использовать для измерения Eh. Диапазон значений Ел индикатора можно рассмотреть на примере с метиленовой синью, для которой
МВ+ -ф Н+ + 2е =?=* МВН
и
ЕЛ = Ео + 2,30 • -g- log - 2,30 • • pH. (9.7)
То же уравнение, но выраженное в милливольтах будет иметь вид
ЕЛ = Е0 + 29 • log-M. _ 29РН (9.8)
при 30 °C. Значение Ео равно Eh при [МВ+] = [МВН] и pH 0. При pH 7 ЕЛ = Ео = Ео — 203 мВ. Диапазон изменения индикатора должен соответствовать той области значений Ел, в которой количество индикатора в окисленной форме изменяется от
Потребность в кислороде и обеспечение им 109
90 до 10%, т. е. log [МВ+]/[МВН] изменяется до 2. Это означает, что Eh изменяется на 60 мВ, и, следовательно, диапазон для метиленовой сини можно обозначить как Ео или £о±ЗО мВ.
9.5.2. Окислительно-восстановительный потенциал жидких сред, содержащих растворенный кислород
Значение окислительно-восстановительного потенциала культуральной среды, как правило, неясно, так как природа доноров и акцепторов электронов не установлена. Однако удалось показать, что кислород способен контролировать значение Eh в сложной среде [15]. Значение Eh растворенного кислорода можно найти, исходя из реакции
О, + 2Н+ + 4е 2ОН',
для которой мы имеем
RT Р [Н+Р
ЕЛ = £о + —In-g^, (9.9)
где Ро2 — давление растворенного кислорода; предполагается, что реакция находится в состоянии равновесия. Подставив значение [ОН-] из выражения для константы диссоциации воды, т. е. из Kw = [OH_][N+], и переходя к десятичным логарифмам, преобразуем выражение (9.9) и получим
Eh = Е'о + log Р01 + 2,30log [Н+]. (9.10)
Значение Е'о соответствует 1229 мВ [55, стр. 79], в связи с чем выражение (9.10) принимает вид
Eh— 1229+ 14,8 log Ро2-59 pH, (9.11)
где Eh измеряется в милливольтах и Рог— в атмосферах. Экспериментальные данные показывают, что соотношение между Eh и РО1 прямолинейно, соответственно уравнению (9.11) [156]; однако значение Е'о оказывается значительно ниже теоретической величины. При давлении воздуха в 1атм (Ро2 = 0,209 атм) и pH 7 теоретическое значение Eh соответствует 806 мВ, в то время как экспериментально установленное максимальное значение составляет приблизительно 400 мВ [156, стр. 119]. Следовательно, величина Eh растворенного кислорода представляется аномальной и ее следует определять эмпирически. Аналогично этому эмпирически было найдено, что наклон кривой на графике зависимости Eh от logPo, соответствует значению 60 мВ/log Pq2, которое близко к 10~9 атм кислорода [291], однако по расчетным данным уравнения (9.11) эта величина должна
i
1 10
Глава 9
равняться 15 мВ/log Ро2. Это несоответствие между теоретическими и экспериментальными значениями, возможно, объясняется тем, что окислительно-восстановительные процессы в растворе, содержащем растворенный кислород, не равновесны, как это предполагается теорией.
Многие исследователи считали, что значение £/, может служить мерой напряжения растворенного кислорода в культуральной жидкости [156, стр. 116]. Однако при том напряжении растворенного кислорода, которое необходимо в аэробных культурах, определение Eh в связи с логарифмической зависимостью между указанными параметрами оказывается менее чувствительным к напряжению растворенного кислорода, чем измерения мембранным кислородным электродом, сила тока которого линейно зависит от напряжения растворенного кислорода. Напротив, определение напряжения растворенного кислорода по значению Eh может быть использовано, когда логарифм напряжения растворенного кислорода на три единицы ниже, чем в условиях насыщения кислородом при давлении воздуха 1 атм.
9.6. Транспорт кислорода из газовой фазы в жидкую и к биомассе
9.6.1. Транспорт кислорода из газа в жидкость
Несмотря на значительные достижения в наших знаниях о факторах, регулирующих транспорт кислорода из газа в жидкость, этот процесс все еще часто лимитирует скорость аэробных микробиологических процессов. Принципы абсорбции газа, установленные для транспорта кислорода, приложимы к абсорбции и других газов, таких, как метан, двуокись углерода и азот, при развитии культур.
Самое простое представление о процессе абсорбции газа дает теория стационарной жидкой пленки. Согласно этой теории, на границе раздела между газовой и жидкой фазами существует постоянная жидкая пленка, несущая концентрационный градиент растворенного газа (рис. 32,Л). В самой границе раздела жидкость насыщается газом до концентрации cs; в основной части жидкости концентрация газа равна с. Если мы рассмотрим единицу объема жидкости, которая имеет границу раздела а, то скорость поглощения газа на единицу объема будет
de К ,а
= = <9-12)
где h — толщина стационарной пленки и Kl — константа, зависящая от коэффициента диффузии газа. Поскольку величина h.
Потребность в кислороде и обеспечение им
111
как правило, не известна, ее объединяют обычно с Kl и записывают
dc/dt = KLa(cs —с). (9.13)
Выражение (9.13) применяют к случаям диффузии вещества через барьер, где (cs — с) представляет собой движущую силу. Подобно электрическому току, ко-рдЗ й13
Ток —Разность потенциа- д
лов/Сопротивление,
Стационарная жидкая сд
Жидкость С’Р1
коэффициент KLa в уравнении (9.13) можно рассматривать как обратную величину сопротивления транспорту кислорода. Скорость поглощения кислорода выразим через парциальное давление кислорода в газовой фазе и жидкости (pg и pi соответственно) и произведем замену Cs = Hpg и с = Нрг.
dc/dt = KLaH(pg — pi). (9.14)
Эффективность поглощения кислорода выражают обычно как Кьа или KluH. Максимальная скорость поглощения кислорода при данном парциальном давлении кислорода в газовой фазе имеет место в случае с — 0; тогда
(dc/dt)max = KLacs= KLaHpg. (9.15)
Существуют различные варианты теории стационарной пленки [1]. Одна из них — теория двойной
Стационарная газовая р3 пленка__________ „
’ Стационарная жидкая пленка_______________р с
Б Жидкость 1'
_____Жидкость________
Стационарная жидкая s пленка „
Биомасса
Рис. 32. Градиенты концентрации кислорода при его переносе из газа в жидкость и из жидкости в биомассу.
с и Р—концентрация растворенного кислорода и давление кислорода соответственно. А. Градиент концентрации О2 в жидкой пленке при переносе О2 из газа в жидкость. Б. Двухслойная модель —перенос О2 из газа в жидкость. В. Градиент в жидкой пленке при переносе О. из жидкости в биомассу.
пленки. Согласно этой теории, кро-
ме стационарной жидкой пленки, предполагается наличие стационарной газовой пленки на границе раздела (рис. 32,5). Скорость поглощения кислорода в стационарном состоянии мо-
жно представить следующим равенством:
dcjdt = KsaH (pg — pi) = KLaH (p; — pt) = KtaH (pg — pt), (9.16)
где 1/Kg — сопротивление газовой пленки, \/Kl — сопротивле ние жидкой пленки и \/Kt — суммарное сопротивление
!//<<= 1/Kg+1/KL.
(9.17)
112
Г лава 9
В системах с высокой степенью турбулентности сопротивление газовой пленки незначительно [1, стр. 135; 98], и тогда Kt = KL.
В заключение можно сказать следующее: из уравнения (9.14) вытекает, что скорость транспорта кислорода из газа в жидкость пропорциональна площади границы раздела фаз, величине парциального давления кислорода и константе Генри и находится в обратной зависимости от сопротивления жидкой пленки (1/Кь).
9.6.2. Транспорт кислорода от жидкости к биомассе
При транспорте газа через жидкость к поверхности биомассы добавляется сопротивление к диффузии, а именно стационарная жидкая пленка, окружающая клетку (рис. 32, В). Исходя из данных по дыханию суспензии дрожжевых клеток в неподвижной жидкой среде, Финн [98] пришел к выводу, что максимальные концентрационные различия на поверхностях жидкой пленки, окружающей дрожжевую клетку, т. е. (с — Сь) на рис. 32, В, достигают значения 2- КН7 М. В перемешиваемой клеточной суспензии толщина стационарной жидкой пленки и соответственно концентрационные различия на ее противоположных поверхностях должны быть меньше. Рассмотренные концентрационные различия незначительны по своей величине по сравнению со значениями парциального давления растворенного кислорода — около 10-6—10-5 (табл. 1), при которых низкое содержание в среде кислорода начинает лимитировать скорость дыхания [29].
Было высказано предположение, что клетки микроорганизмов способны внедряться в стационарную жидкую пленку на границе раздела фаз газ — жидкость и даже концентрироваться в ней, благодаря поверхностной активности клеток [332]. Это пронизывание жидкой пленки клетками должно уменьшать толщину пленки и, следовательно, увеличивать Къа. Правомочность этой теории подлежит проверке.
9.7. Измерение значений ЬДа при отсутствии биомассы
9.7.1. Измерение с помощью реагентов, абсорбирующих кислород
Для измерения скорости растворения кислорода можно использовать абсорбцию О2 растворами химических реагентов, таких, как пирогаллол [83] и сульфит натрия с ионами двухвалентной меди в качестве катализатора [59]. В основе этих методов лежит тот факт, что скорость окисления реагента лимитируется только скоростью транспорта кислорода из газовой
Потребность в кислороде и обеспечение им 113
фазы в жидкую. Метод, основанный на окислении сульфита, катализируемом ионами меди, широко используется для определения скорости растворения кислорода в ферментерах. При использовании этого метода скорость абсорбции кислорода не зависит от концентрации сульфита, если она превышает 0,01 М [240]. Скорость абсорбции кислорода зависит только от природы катализатора, так как она может быть увеличена в несколько раз при замене ионов двухвалентной меди ионами кобальта (собственные данные). Влияние природы катализатора, возможно, связано с течением химической реакции не только в самом растворе, но и в стационарной жидкой пленке, и поэтому такое увеличение скорости реакции сводится в действительности к уменьшению толщины жидкой пленки. Во время окисления сульфита напряжение растворенного кислорода практически равно нулю, в связи с чем скорость абсорбции кислорода выражается как KLaHpg.
Из-за различий между процессами в жидких пленках указанных систем сопротивление жидких пленок в растворе сульфита и в культуре микроорганизмов не обязательно одинаково. При сравнении максимальной скорости растворения кислорода в культуре бактерий со скоростью окисления сульфита, катализируемого ионами меди, было отмечено, что значение для окисления сульфита в 1,3—2,0 раза выше, чем тот же показатель для культуры [225]. С другой стороны, обнаружено, что значение К та для бактериальной культуры и для культуры мицелиального гриба может быть на 50% выше этого показателя для катализируемого медью (ионами) окисления сульфита [241]. Эти различия могут быть обусловлены изменчивостью или /G., или а.
Скорость растворения кислорода измеряют также при помощи системы окисления глюкозы [148]. В этой системе участвуют три фермента, окисляющие глюкозу до глюконовой кислоты и воды. Скорость абсорбции кислорода устанавливают, титруя образующуюся кислоту. Исходя из значения кажущейся константы Михаэлиса для данной ферментной системы и максимальной скорости окисления, можно рассчитать концентрацию растворенного кислорода (с) и значение КтЩ, используя уравнение (9.13). Найденные таким способом значения Кьа оказались несколько выше, чем для катализируемого ионами меди окисления сульфита.
9.7.2. Измерение с помощью кислородного электрода
Скорость растворения кислорода может быть установлена с помощью быстро реагирующего кислородного электрода путем прямого ее измерения после предварительного продувания через
114
Глава 9
систему инертного газа, не содержащего кислорода. Подставляя dcfdt = Hdpi/dt в уравнение (9.14), получаем
dpi/di = KLa(pg — pi) и в интегральной форме
In (р? — pi) = In (pg — рю) — KLat,
(9.18)
(9.19)
где рю — напряжение растворенного кислорода при /-==0. При нанесении на график значений 1п(рг— pi) против t получим наклон — Къй- Этот метод имеет определенные преимущества перед химическими методами, так как он пригоден в случае самых различных сред и не включает химических реакций, способных изменять сопротивление жидкой пленки. К тому же имеются данные о хорошем совпадении результатов, полученных методом окисления сульфита в присутствии ионов меди и методом с использованием кислородного электрода [47].
9.8. Измерение значений Ki а во время развития культуры
9.8.1. При стационарной кинетике
Значение Къа в развивающейся культуре можно установить достаточно быстро, если использовать хемостатную культуру в стационарном состоянии. Кислородный баланс такой культуры описывается следующим равенством:
Общее Количество Транспорт Поглоще- Потери
накопле- — в подавае—из газовой — ние био- — с вымы-ние мой среде фазы в массой ванием,
жидкую (дыхание)
или
dc/dt = DHpg 4- KLaH (pg — рг) — xqOi — DHpt, (9.20) где D — скорость разбавления, x— биомасса в единице объема, причем делается допущение, что подаваемая среда насыщена кислородом. Для большинства культур первый член правой части уравнения (9.20) ничтожно мал по сравнению со вторым; кроме того, четвертый член ничтожно мал по сравнению с третьим. Поэтому мы записываем
dc/dt = KLaH (pg - pt~) - xqa. (9.21)
В стационарном состоянии dc/dt = 0, следовательно,
Р/ = Pg - ^oJKLaH. (9.22)
Потребность в кислороде и обеспечение им
115
Величину скорости поглощения (при дыхании) кислорода (х<?01) определяют или анализируя состав газа, или нестационарным методом (разд. 9.8.2). При постоянной скорости разбавления значение xq0 может оставаться постоянным в широком диапазоне значений pg, и график зависимости pi от pg будет иметь наклон —ЦКъйН до тех пор, пока недостаточное количество кислорода не начнет лимитировать скорость дыхания. Такая прямая зависимость была получена для культуры Klebsiella aerogenes при уменьшении напряжения растворенного кислорода до уровня ниже 15 мм рт. ст. [124].
9.8.2. При нестационарной кинетике
В условиях периодического культивирования скорость поглощения кислорода на единицу объема культуры выражается следующим образом:
dc/dt = KLa(cs — c') — qox, (9.23)
где х — биомасса за время t. Если снабжение кислородом прекращается, первый член правой части уравнения (9.23) стано-
Рис. 33. Изменение концентраций растворенного кислорода (с), используемых для вычисления К ^а. при кинетике нестационарного состояния (разд. 9.8.2).
вится равным нулю, то есть dc/dt — qQx. Построив график значений с против t (рис. 33), получим прямую, по наклону которой находят скорость поглощения кислорода qox. При возобновлении подачи воздуха концентрация растворенного кислорода увеличивается, согласно уравнению (9.23), и наклон прямой на графике дает значение dc/dt. Преобразуя уравнение (9.23), получаем
C = 7^(£ + V) + C>- <9-24>
из
/лава 9
Из этого соотношения видно, что константа KlU, найденная из графика зависимости с от (dc/dt + qox), будет иметь наклон — \IKLa. Член (dc/dtqox} может изменяться или в зависимости от количества биомассы, или от парциального давления кислорода в газовой фазе. Интервал времени, когда происходит изменение с, должен быть достаточно коротким, чтобы изменения концентрации биомассы были ничтожно малы. Этот метод уже нашел практическое применение [14]. Была также предложена интегральная форма выражения (9.23) для определения KLa [102]:
1п(1 - с/св) = - KLat, (9.25)
где t = 0, с = 0 и св — значение с непосредственно перед отключением подачи воздуха (рис. 33), т. е. когда dc/dt « 0. Подставив выражения с — Hpi и св = HpiB, где р; и ptB— напряжение растворенного кислорода, преобразуем уравнение (9.25)
In (1 — Pi/Pib) = — KLat. (9.26)
Значение Кг.а может быть определено из наклона графика зависимости In (1 —PiIpb) от t, и при этом не нужно знать значение константы Генри, как в случае уравнения (9.24).
9.8.3. При лимитации роста кислородом
Когда происходит лимитация дыхания кислородом и в уравнение (9.23) мы можем подставить с « 0 и dc/dt = 0, то
(9.27)
Скорость поглощения кислорода (qOix) определяют путем анализа газа и, таким образом, высчитывают КьаН или KiA
Глава 10
МЕТОДЫ АЭРАЦИИ И ПЕРЕМЕШИВАНИЯ
10.1. Введение
Простейшим методом аэрации культур микроорганизмов является выращивание на поверхности неперемешиваемой жидкой среды или на плотной среде. Этот метод используют обычно в лабораториях и в промышленных условиях — при получении старым способом уксуса и лимонной кислоты. Первоначально пенициллин также получали при поверхностном культивировании гриба Penicillium, однако необходимость в пенициллине стимулировала изучение глубинного роста аэробных микроорганизмов, и вскоре этот метод лег в основу развития основных принципов аэрирования культур.
Клюйвер и Перквин [173] первыми использовали качалку для выращивания глубинным способом грибов, которые в естественных условиях развиваются на поверхности субстрата. Появление метода качалок явилось очень важным достижением, поскольку дало возможность получать культуры аэробных микроорганизмов, выращенных до больших концентраций в гомогенных условиях, и соответственно упростило изучение физиологии этих организмов.
Современные лабораторные ферментеры с перемешиванием снабжены максимально универсальными и полностью контролирующими средствами для глубинного культивирования как микроорганизмов, так и клеток животных и растительных тканей. Вращающиеся ферментеры (см., например, [336]) были предложены вместо ферментеров с перемешиванием, с тем чтобы избежать применения таких перемешивающих устройств, которые, по имеющимся данным, способны были повреждать организмы. Хотя в некоторых случаях механические повреждения мицелиальных организмов очевидны, отрицательное влияние этих повреждений на функциональные свойства культур не доказано. Даже клетки млекопитающих, которые, судя по всему, представляют собой наиболее чувствительные структуры, успешно росли в лабораторных ферментерах при высокой скорости перемешивания [171]. Вполне возможно, что механические повреждения биомассы являются не первичной причиной ухудшения роста, а только усиливают неблагоприятное действие
118
Глава 10
вредных для роста факторов среды. Когда отрицательное влияние механического повреждения клеток точно установлено, то вместо взбалтывания целесообразно использовать вращающийся ферментер или вибрацию. Вибрационное устройство [337] имеет большое преимущество в связи с отсутствием сальника, который обычно требуется в ферментере для герметизации вращающегося вала и который может служить источником загрязнения ?реды, когда герметизация нарушается.
10.2. Перемешивание и взбалтывание культуры
Взбалтывание культуры микроорганизмов на качалке выполняет две функции: осуществляет массоперенос между различными фазами (газовой, жидкой и твердой) культуры и перемешивает клетки так, чтобы поддерживались гомогенные химические и физические условия; последнее особенно важно для диспергирования биомассы, транспорта тепла и постоянного перемешивания поступающего питательного субстрата.
Эффективность перемешивания может быть измерена по времени, необходимому для диспергирования небольшого объема раствора красителя, добавляемого к жидкости в ферментер [1, стр. 173]. Труднее достичь хорошего перемешивания в ферментерах при увеличении размеров ферментера, повышении вязкости и — если это культивирование с непрерывной подачей субстрата — при уменьшении скорости потока раствора субстрата. Изучение последнего случая показало, что уменьшение эффективности смешивания в 5-литровом хемостате приводило к снижению экономического коэффициента при культивировании дрожжей в среде с лимитирующими концентрациями глюкозы [118]. Это снижение становилось значительным при скорости разбавления <0,03 ч< Установлено, что перемешивание улучшается при моногоканальной подаче источников питания, а не при подаче только по одному каналу.
Взбалтывание влияет на массоперенос из газовой фазы в жидкую по трем основным путям. Во-первых, это — диспергирование газа в мелкие пузырьки, а следовательно, увеличение поверхности раздела фаз. Во-вторых, увеличение времени контакта газ — жидкость при увеличении времени циркуляции газовых пузырьков, вызывающее дополнительное повышение содержания газа в жидкости и называемое «задержкой газа», которую можно изобразить следующим путем. Пусть Vo — объем жидкости без газа, V — объем системы жидкость — диспергированный газ, тогда объем задержанного газа можно выразить следующим равенством:
VH = V - Ио.
(Ю.1)
Методы аэрации и перемешивания
119
Среднее время контакта газа есть VH/F, где F скорость газового потока. Увеличение задержки газа увеличивает поверхность раздела фаз на единицу объема. Изменения объема газа будут также влиять на скорость поглощения кислорода из газа. В-третьих, увеличение турбулентности, происходящее при взбалтывании культуры, будет уменьшать толщину стационарной жидкой пленки и заметно повышать значение Kl (разд. 9.6.1).
10.3. Различные устройства для повышения степени аэрации и перемешивания жидкости: отбойники, вихревое перемешивание, вортекс, «эрлифт»
Жидкость в ферментере с свободно или ударяться об
перемешиванием может двигаться отбойники (рис. 34). Последние
в
Рис. 34. Схемы основных аэрационно-перемешивающих устройств в ферментерах для глубинного культивирования [112].
Л. Система с отбойниками. Б. Система с вихревым воронкообразным перемешиванием (вортексная). В. Система с отбойниками и стаканом. Г. Ферментер «циклического давления», в котором культура циркулирует вокруг сосуда, как показано стрелками.
/—выходящий газ; 2— отбойник; 3— уровень среды, 4 — вход воздуха; 5 —стакан, 6—теплообменник, 7—отходящий газ, 8 —уровень культуры, 9 —вытекающая культура, Ю— втекающая среда, 11— распыленный воздух.
предотвращают образование вихрей и увеличивают турбулентность потока. Чтобы создать хорошую аэрацию в ферментере с отбойниками, необходимо подавать воздух в распыленном состоянии ниже уровня жидкости. В системе с вихревым воронкообразным перемешиванием (вортекс) воздух втягивается в вихрь и диспергируется в жидкости мешалкой. В этом случае
120
Г лава 10
имеет место интенсивная турбуленция в области лопаток мешалки, однако в области жидкости, находящейся несколько в стороне от мешалки, циркуляция происходит с небольшой турбулентностью.
Полная турбулентность достигается использованием 4 одинаковых по размеру отбойников, имеющих в ширину от 0,08 до 0,1 диаметра сосуда и идущих на всю глубину жидкости [98].
В Германии во время второй мировой войны для получения дрожжей использовался ферментер Вальдоффа с дополнительным внутренним сосудом, так называемым «стаканом1» (рис. 34, В); этот стакан создает вихрь, несмотря на наличие отбойников. Было установлено [48, стр. 94], что ферментер Вальдоффа действует как вихревая система объемом 5 л. Было бы интересно знать, остается ли это заключение верным при увеличении размеров аппаратуры.
В химической промышленности Великобритании для получения белка одноклеточных с помощью бактерий, использующих метанол, был выработан принцип «эрлифта» для аэрации и перемешивания в ферментерах большой производительности (рис. 34,/’). Эта система имеет преимущество, поскольку основана на более простой механике, чем большие ферментеры с перемешиванием. Получающееся при этом значение Лфа может быть подсчитано из уравнения (9.22) для процесса на метаноле, если допустить, что Ух/0 ~ 0,44 (табл. 5), ц = 0,2 ч-1, х — = 20 г/л, cs при снабжении воздухом при 3 атм равно 18-10-3 г/л и с = 9-10-3 г/л. Тогда KLa составляет примерно 1000 ч-1, т. е. имеет приблизительно такое же значение, как и в случае ферментера с мешалкой.
10.4. Конструкция мешалки
Наиболее эффективный тип мешалки представляет собой диск с вертикально насаженными лопатками (рис. 35). Оптимальный размер диаметра составляет 0,4 диаметра сосуда. Вращение вертикально посаженных лопаток вызывает центробежное перемешивание жидкости в отличие от аксиальных потоков, создаваемых наклонными лопатками. По скорости окисления сульфита можно заключить, что вихревая система при вращении мешалки с вертикальными лопатками со скоростью 1000 об/мин обеспечивает скорость растворения кислорода в несколько раз более высокую, чем система с наклонными лопатками [48, стр. 88]; однако при скорости перемешивания 2000 об/мин различия незначительны. Следовательно, для обычно применяемой скорости перемешивания в вихревой системе (< 1500 об/мин) конструкция мешалки с вертикально посаженными лопатками является оптимальной.
Методы аэрации и перемешивания
121
При данной скорости перемешивания получаемая скорость растворения кислорода не будет зависеть от местоположения диска с лопатками — посередине глубины жидкости или над самым дном ферментера; однако вихревая система с более
высоко расположенным диском мешалки потребляет меньше мощности [48, стр. 84]. В результате испытания ферментеров в лаборатории авторов было
установлено, что если мешалка находится непосредственно над дном ферментера, то при вихревой аэрации диск стано-
вится ненужным, вероятно, в связи с тем, что его функцию выполняет дно ферментера.
Скорость растворения кислорода, полученная при использовании вихревой системы, при наличии восьми лопаток на диске оказалась в несколько раз выше, чем при наличии четырех лопаток, но разницы не было обнаружено при замене 8 лопаток на 16 ([48], стр. 90); следовательно, оптимальным количеством лопаток на диске является восемь. Оптимальная высота лопасти составляет
Рис. 35. Лопастная диско-
вая мешалка
А. Высота расположения мешалки должна соответствовать системе отбойников, а глубина лопастей мешалки должна быть ниже диска. При использовании системы вихревого воронкообразного перемешивания мешалка имеет обратную конструкцию. Б. Мешалка с 8 лопатками в плане.
1/6 диаметра мешалки [48, стр. 89; 98].
В вихревой системе требуется только одна мешалка. Как было отмечено [48, стр. 82], во время использования лабораторного ферментера с системой отбойников при добавлении нескольких мешалок на различных уровнях не происходило увеличения скорости окисления суль-
фита, хотя потребляемая мощность воз-
растала. При использовании системы с отбойниками в ферментерах большей производительности и особенно при наличии неньютоновской вязкости среды могут понадобиться дополни
тельные мешалки.
10.5. Влияние скорости перемешивания
Влияние скорости перемешивания на скорость растворения кислорода при вихревой аэрации и в ферментере с отбойниками отражено на рис. 36. В системе с отбойниками Ki.a примерно пропорционально №, где N — скорость вращения мешалки, выраженная в оборотах в 1 мин [47, 98]. В вихревой системе существует высокий порог скорости перемешивания; только по
122
Глава 10
достижении этого порога скорость растворения кислорода начинает увеличиваться. Но с этого момента увеличение скорости растворения кислорода идет линейно увеличению скорости перемешивания.
Рис. 36. Влияние скорости перемешивания среды на скорость растворения кислорода при использовании конструкции с отбойниками или системы с вихревым воронкообразным перемешиванием при помощи одной и той же лопастно-дисковой мешалки в лабораторном ферментере [47].
А —система с отбойниками; Б— система с вихревым воронкообразным перемешиванием.
10.6. Влияние распыления подаваемого воздуха
Влияние количества подаваемого воздуха при распылении его перемешиванием вихревой системой или отбойниками показано на рис. 37 и 38. Скорость растворения кислорода в системе с отбойниками быстро приближается к максимуму при увеличении скорости подачи воздуха (рис. 37); следовательно, увеличение скорости потока воздуха может оказаться недостаточным для увеличения скорости растворения кислорода. Данные по аэрации с вихревым перемешиванием [47, стр. 48] свидетельствуют о том, что распыление воздуха рядом с мешалкой может увеличить скорость растворения кислорода в несколько раз. Эти результаты подтверждаются данными [40], представленными на рис. 38.
При использовании системы с отбойниками с одним входным отверстием для воздуха или с входом воздуха через многочисленные отверстия в распылителе не было отмечено разницы в скорости растворения кислорода [48, стр. 78]. Поэтому в маленьких ферментерах используют одно отверстие для входа воздуха. Диаметр этого отверстия может составлять от 1 до 3 мм.
100
О 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Скорость подачи воздуха объем/объем-ч
Рис. 37. Влияние подачи воздуха на скорость растворения кислорода в ферментере с отбойниками [48].
На оси абсцисс показано отношение поступающего в 1 мин объема воздуха к объему ЛСИДКОС1 и.
Скорость подачи воздуха объем/ объем-мин
Рис. 38. Влияние подачи воздуха на скорость адсорбции кислорода раствором сульфита (с медью в качестве катализатора) в ферментере с вихревым воронкообразным перемешиванием [258].
Для входа воздуха—одно вводное устройство; лопастно-дисковая мешалка диаметром 102 мм в сосуде диаметром 228 мм; объем жидкости 12 л.
124
Глава 10
Если для культивирования используют устройство без перемешивания, то применение пористой керамики, металлокерамики или стеклянных распылителей с микроотверстиями увеличивает скорость растворения кислорода в несколько раз по сравнению с подачей воздуха через отверстия макроскопических размеров. Пористые распылители применяют при аэрации без перемешивания, но они имеют тот недостаток, что засоряются частичками биомассы, в частности при выращивании мицелиальных плесневых грибов.
10.7. Влияние температуры и вязкости
При транспорте кислорода в жидкую среду значение Kj.aoc Т'-'г, где Т — абсолютная температура [1, стр. 151]. Это означает, что при температуре около 30°C увеличение температуры на 10° приводит к возрастанию значения К^я приблизительно на 13%.
О’Коннор (цит. по [1], стр. 151) предложил выражение KLaoc (1/т]) % где т]— вязкость среды. Влияние увеличения вязкости среды исследовали, добавляя к среде карбоксиметил-целлюлозу [129]. Результаты показали, что КьЯ ос т]~°,35 для ц<50 сП (сантипуаз) и Кьяосг]~1’1 для ц > 50 сП; таким образом, 50 сП — критическая вязкость, при которой эффект бывает выражен гораздо сильнее.
10.8. Влияние поверхностно-активных веществ и углеводородов
Культуральная среда и продукты метаболизма часто содержат поверхностно-активные вещества, способствующие образованию пены. Влияние поверхностно-активных агентов на значение КьЯ предсказать нельзя. Айба и др. [1, стр. 153] систематизировали имеющиеся по этому вопросу данные. Они отметили, что лаурилсульфат натрия (10 мг/л) уменьшает как KL, так и КьЯ приблизительно на 50%. С увеличением количества детергента значение Kt.а слегка увеличивается, а величина Kl остается постоянной, что объясняется уменьшением размера пузырьков. Уменьшение значения при снижении количества детергента пока остается необъяснимым.
Имеются также данные о том, что при образовании пены неизвестными агентами при вихревой аэрации среды скорость растворения кислорода уменьшается до 1/10 ее нормальной величины [47, стр. 42]. Снятие пены с помощью пеногасителей восстанавливало скорость растворения кислорода до исходной величины. Вполне возможо, что образование пены при вихре
Методы аэрации и перемешивания
125
вой аэрации порождает циркуляцию пены, из которой кислород поглощен, а поступление свежих порций воздуха преграждается этой пеной. Пеногасители уменьшают КьЯ, вероятно, путем увеличения размера пузырьков [241].
Добавление керосина в среду в колбе на качалке чрезвычайно увеличивало значение КьЯ [213]. Этот необъяснимый эффект вызывали большие количества керосина — >10% от объема водной среды. Следует иметь в виду, что растворимость кислорода в нефти примерно в 100 раз выше, чем в воде; следовательно, керосин может являться носителем кислорода в водной среде.
10.9. Влияние биомассы
Присутствие грибного мицелия в среде способно несколько уменьшить величину КьЯ. Мицелий гриба Penicillium в количестве (по сухому весу) 20 г/л снижал значение КьЯ до 50% [47, стр. 43]; мицелий гриба Aspergillus также в количестве 20 г/л уменьшал значение КьЯ па 90%. Грибной мицелий заменяли в среде внесением пульпы из бумаги — эффект был тот же. Вполне возможно, что изменение величины КьЯ под влиянием мицелия в значительной мере обусловлено способностью мицелия создавать большую неньютоновскую вязкость.
10.10. Потребность в мощности
Значение КьЯ прямо пропорционально электрической мощности, подаваемой на единицу объема культуры [47, 98]. Для полностью турбулентной системы с лопастной дисковой турбиной можно записать
KLaH&aPIV, (10.2)
где Р—расход мощности, V— объем жидкости, Н — константа Генри и а — константа, названная коэффициентом мощности [47]. Установлено, что максимальное значение а равно 138 ммоль кислорода/ч-вт-атм кислорода в ферментере объемом 5 л с вихревым перемешиванием [47]; однако при увеличении размеров аппаратуры значение коэффициента мощности падает невероятно стремительно, достигая примерно 0,138 в ферментере объемом 2000 л. С другой стороны, в полной системе с отбойниками а » 100 и не меняется при изменении объема жидкой среды от 5 до 10 000 л. Из этого следует, что аппараты с вихревым перемешиванием высокоэффективны при малых объемах и в отличие от системы с отбойниками не гарантируют эффективности при увеличении размеров.
126
Глава 10
10.11. Пенообразование
Стойкое пенообразование — нежелательное явление, которое имеет место при аэрации сред, содержащих органический материал. Устойчивость пены связана с составом сложных сред или продуктами обмена микроорганизмов, часто неидентифициро-ванными, и борьба с пенообразованием осуществляется чисто эмпирически. Отрицательное влияние пенообразования состоит в следующем: 1) культура с пеной может быть вынесена из ферментера через отверстия для выхода воздуха; 2) снижается величина KlQ (разд. 10.8); 3) в хемостатных культурах изменяется содержание газа и, следовательно, жидкий объем становится неконтролируемым.
Образование пены предотвращается обычно пеногасителями. Рекомендованы механические пеногасители, но их практическую эффективность установить трудно в связи с определенной сложностью их введения. Данные о количестве химических пеногасителей, достаточном для предотвращения образования пены, опубликованы [105; 256]. Используют большое разнообразие пеногасителей, часто неопределенного состава. Полипропилен-гликоль (мол. вес 2000) особенно эффективен и биологически инертен. Однако, несмотря на применение подобных веществ, бороться с пенообразованием трудно; его можно уменьшить достаточно надежно лишь уменьшением потока воздуха через культуру.
10.12. Системы аэрирования и перемешивания в лабораторных ферментерах
Лабораторные ферментеры объемом от 0,1 до 10 л с вихревой системой аэрации и перемешивания более удобны, чем ферментеры с отбойниками, из-за простоты конструкции (отсутствия для устройств дробления воздуха и отбойников). Введение в аппарат с вихревым перемешиванием отверстия для ввода воздуха снизу или рядом с мешалкой может привести к значительному увеличению значения Къа- Отсутствие отбойников особенно важно при длительном непрерывном культивировании, так как микроорганизмы имеют тенденцию концентрироваться на отбойниках. Другим преимуществом вихревой системы перемешивания является меньшее образование пены, чем при перемешивании с отбойниками. Ферментеры с отбойниками более пригодны для опытных установок заводского типа, чем аппараты с вихревым перемешиванием; последние при увеличении объемов становятся менее эффективными. Выращивание мицелиальных грибов в ферментере, снабженном различными датчиками, особенно в условиях хемостата, осуществляют при ис
Методы аэрации и перемешивания
127
пользовании аппаратов с минимальным размером (при объеме сосуда 1,5 л диаметр должен быть 15 см), иначе из-за роста гриба на поверхностях будет невозможно поддерживать культуру в гомогенном состоянии.
10.13. Аэрация в колбах на качалках
Самым простым способом выращивания периодических глубинных перемешиваемых культур является использование колб на качалках. Этот метод впервые был применен в 1933 г. [173] и с тех пор широко используется для выращивания не только микроорганизмов, но и клеток растительных и животных тканей.
Круговые качалки (см., например, [232]) предпочитают раскачивающимся [163] в связи с тем, что при круговом перемешивании исключается в большой степени разбрызгивание жидкости, способствующее выносу клеток из жидкости, а следовательно, росту микроорганизмов на стенках колбы (обрастания) выше уровня жидкости, что особенно характерно для культур мицелиальных грибов. Обрастание частно предотвращают, покрывая стенки сосуда силиконом.
При перемешивании с использованием как круговой, так и раскачивающейся качалки жидкость поднимается в колбе обычно на 25—50 мм. При раскачивании производится, как правило, 100 движений в 1 мин, а круговая качалка дает от 150 до 300 об/мин.
10.14. Факторы, влияющие на скорость растворения кислорода при перемешивании на качалках
10.14.1. Влияние формы сосуда
В результате определения скорости растворения кислорода в жидкой среде одинакового состава и объема, помещенной в колбы одинаковой емкости, но разной формы — круглодонные или конические, — при использовании одной и той же круговой качалки не было найдено существенной разницы [47, стр. 33]. Те же исследователи установили, что при использовании раскачивающейся качалки скорость растворения кислорода в среде в конических колбах в несколько раз больше, чем в круглодонных колбах. Применение колбы с отбойниками на круговой качалке может привести к многократному (более 10 раз) увеличению скорости растворения кислорода [47, стр. 37]. Эффективную роль отбойников могут играть четыре равномерно расположенные впадины глубиной в несколько миллиметров по периметру колбы в ее нижней половине; также можно
128
Глава 10
использовать спираль из нержавеющей стали, преимуществом которой является ее сменяемость [157]. Другая важная функция отбойников состоит в улучшении дисперсии несмешиваю-щихся субстратов, таких, как углеводороды. Самым серьезным недостатком использования колб с отбойниками на качалках является разбрызгивание жидкости, что приводит к обрастанию, особенно мицелиальными грибами, стенок сосуда над средой.
10.14.2. Влияние объема жидкости
Как при использовании круговой, так и раскачивающейся качалки, скорость растворения кислорода падает с увеличением
Рис. 39. Влияние объема жидкости во встряхиваемой колбе на скорость поглощения кислорода раствором сульфита (с медью в качестве катализатора) [301].
Объем колбы—500 мл; круговая качалка —250 об/мин; подъем жидкости по стенкам 50 мм.
объема жидкости. Эффект этот иллюстрируется данными, приведенными на рис. 39 [301].
10.14.3. Влияние скорости и амплитуды качания
Скорость растворения кислорода в жидкости в колбах на качалках возрастает более чем линейно с увеличением скорости или амплитуды качания. При соотношении объема жидкости к объему колбы, равном 1 : 10, установлено [47, стр. 34], что уве
Методы аэрации и перемешивания
129
личение скорости перемешивания с 150 до 300 об/мин при амплитуде 50 мм повышало скорость растворения кислорода в 2,5 раза. Снижение амплитуды от 50 до 32 мм уменьшало скорость растворения кислорода вдвое.
10.14.4. Влияние биомассы
С увеличением количества биомассы скорость растворения кислорода снижается почти линейно. Так, было установлено ([47], стр. 35), что при увеличении сухого веса мицелия гриба Penicillium до 20 г/л максимальная скорость растворения кислорода линейно падала и общее ее снижение достигало 90%. Следовательно, присутствие биомассы способно значительно уменьшить скорость поглощения кислорода в жидкости в колбе при качании.
10.14.5. Скорость диффузии газа через ватную пробку
Колбы на качалках обычно закрывают ватными пробками, которые представляют собой определенное препятствие при диффузии газа из колбы и в нее. Шульц [292] показал, что скорость диффузии кислорода в колбу (/?d ммоль/ч) выражается уравнением
22,4 L Pi)> (10.3)
где Pi и ро — парциальное давление (атм) кислорода внутри и снаружи колбы соответственно; А— поперечная площадь (см2) ватной пробки; L — высота (см) пробки, Da — кажущаяся константа диффузии (см2/с). Используя кислородный электрод, этот исследователь нашел при экспериментальном определении скорости диффузии кислорода, что в случае диффузии через обычную ватную пробку с плотностью 0,05—0,08 г/см3 Da~0,19 см2/с; это составляет приблизительно 90% величины при свободной диффузии. Следовательно, ватная пробка представляет собой очень слабое препятствие для диффузии. Обобщенное выражение для скорости растворения кислорода в колбе при качании Rs ммоль/ч [292]:
= [ 36000аЛ + KLaHVl ] (Pb~Pi\ (10-4)
где Kia — коэффициент транспорта газа в жидкость (ч-1), Н—константа Генри для кислорода (ммоль-мл-1 • атм-1), V;— объем жидкости (мл), pi — давление (атм) растворенного кислорода в жидкости.
5 Зак. 737
130
Глава 10
Применение выражения (10.3) к коническим колбам с ватными пробками размером 31 мм в диаметре и 35 мм высоты показало, что максимальная скорость диффузии кислорода в колбу составляет 19 ммоль/ч при pi = 0 и давлении воздуха снаружи сосуда, равном 1 атм. В колбе, содержащей 25 мл жидкости, скорость диффузии не лимитирует скорости растворения кислорода до тех пор, пока последняя не достигнет значения 760 ммоль/л-ч, что является слишком большой величиной по сравнению с обычно необходимыми скоростями. Однако Шульц [292] отметил следующее: при увеличении объема сосуда и, следовательно, объема культуры отношение AIL становится постоянным и мало влияет на Rd, так что диффузия через ватную пробку в больших колбах способна ограничивать скорость растворения кислорода.
10.15. Аэрация в пробирках на качалке
Пробирочная качалка состоит из нескольких рядов пробирок, которые вращаются параллельно своей оси, обычно с небольшой скоростью (около 60 об/мин), поэтому центробежная сила очень мала. Исследование степени аэрации в пробирках на качалке показало, что максимальная скорость растворения кислорода равна приблизительно 15 ммоль/л-ч и фактически не зависит от скорости качания в диапазоне от 6 до 60 об/мин [117]. Следовательно, скорость растворения кислорода намного меньше значения, которое достигается на круговой или раскачивающейся качалке для колб. Некоторыми преимуществами качалки для пробирок можно считать ее простую механику и более низкую стоимость, чем в случае качалок для колб. Эти качалки удобны для культивирования клеток животных тканей или тех микроорганизмов, которые для своего развития требуют мало кислорода.
10.16. Аэрация в глубинных культурах без перемешивания (стационарные культуры)
В погруженной культуре без перемешивания, например в жидкой бактериальной культуре в пробирке или в однослойной культуре животных клеток при неподвижной жидкости, можно измерить площадь границы раздела газ — жидкость. Допустим, что основная часть жидкости гомогенна, тогда, согласно теории стационарной жидкой пленки, скорость растворения кислорода (ммоль/мин) будет
R = KLa (cs — с), (10.5)
где а —площадь соприкосновения фаз жидкость — газ; найдено [292], что значение Кь равно 1,2-10-3 см/мин для диффузии
Методы аэрации и перемешивания 131
кислорода через неподвижную поверхность при окислении сульфита в присутствии ионов меди. Следовательно, максимальная скорость растворения кислорода (КьйС) в пробирках диаметром 16 мм будет составлять 0,036 ммоль/ч или 3,6 ммоль/л ч, если в пробирке находится 10 мл жидкости и cs = 0,25 мМ; экспериментально найденное значение равно 1,8 ммоль/л-ч [301], т. е. имеет тот же порядок. При таком низком значении KLa (около 10 ч~') в неподвижной культуре в пробирках совершенно очевидно, что быстро наступает лимит по кислороду. Диффузия кислорода в пробирку через важную пробку, как показано выше (разд. 10.14.5), едва ли ограничивает снабжение кислородом культуры в пробирке.
Глава 11
ВЛИЯНИЕ КИСЛОРОДА НА КУЛЬТУРЫ МИКРООРГАНИЗМОВ
11.1. Введение
Изучение действия кислорода на культуры микроорганизмов началось с открытия Пастера, что дрожжи получают энергию для роста или в результате окисления ими сахара кислородом воздуха, или же в результате анаэробного расщепления сахара до этилового спирта и двуокиси углерода. Кислород ингибирует анаэробный процесс и одновременно снижает скорость расщепления глюкозы. Это ингибирующее действие кислорода, известное теперь как эффект Пастера, может служить примером регуляции метаболизма субстратом; однако механизм эффекта Пастера до сих пор не изучен.
Вопрос о том, каковы потребности микроорганизма в кислороде для роста и реализации других функций, рассматривается в разд. 9.2; настоящая глава затрагивает проблему ответной реакции микроорганизмов на различное напряжение растворенного кислорода.
11.2. Лимитация роста кислородом
В периодической культуре с постоянной величиной KLa, когда рост лимитирован кислородом, скорость образования биомассы (dxldt) становится постоянной и удельная скорость роста уменьшается. Для изучения влияния лимитации роста кислородом лучше всего использовать хемостатную культуру в стационарном состоянии, при котором изменения удельной скорости роста можно исключить. Влияние лимитации кислородом на концентрацию биомассы в хемостатной культуре возможно предсказать, исходя из уравнения (9.20). Подставим в это выражение cs = Hpg, с = Hpt,qQ= £)/У0,где Го—выход биомассы в расчете на единицу кислорода, и dcjdt = 0 для стационарного состояния; тогда концентрация биомассы будет равна
х = Уо(^-4- i)(cs-c). (11.1)
Во многих системах Кьа/О^>\, тогда уравнение (11.1) упрощается:
ГД, a
X = ^-(CS-C). (11.2)
Влияние кислорода на культуры микроорганизмов
133
В стационарном состоянии концентрация кислорода выражается уравнением с — Ks/D , где Ks — константа насыщения кислородом. Теоретически рассчитанное изменение концентрации биомассы при лимитации кислородом в хемостатной культуре при разных скоростях разбавления показано на рис. 40;
Рис. 40. Сравнение образования биомассы хемостатной культурой, лимитированной кислородом и источником углерода и энергии (стационарные состояния).
Сплошная линия—лимитация кислородом; прерывистая —лимитация углеродом. Значения параметров, использованных в уравнениях (11.2) н (5.9):
К^а^ЮОч"1, • 10“3 г/л, К5 (кислород) =®8 • 10“5 г/л, ^«1,0, цт==1,0 ч"1; для культуры, лимитированной углеродом, У «0,5, s (источник углерода) = 16,0 г/л, /<$ (углеродный субстрат)®0,01 г/л; предполагается, что энергетические затраты на поддержание близки к нулю.
лимитация кислородом исчезает при низких скоростях разбавления. Этот характер зависимости был обнаружен Пертом [243] для роста Klebsiella earogenes, лимитированного кислородом.
11.3. Влияние напряжения растворенного кислорода на скорость потребления кислорода растущей биомассой
Соотношение между скоростью дыхания биомассы и концентрацией растворенного кислорода выражается обычно уравнением типа Михаэлиса — Ментен:
'/о =СХс/(с + ^)- (н.з)
134
Глава 11
Подставив c=zHpi, где pi— напряжение растворенного кислорода и И— константа Генри, а также KS = HKP, получим
= + Кр)’ (и-4)
где КР — константа насыщения, измеряемая единицами давления. Далее, при удельной скорости роста р и допущении, что
Рис. 41. Влияние концентрации растворенного кислорода на скорость дыхания (<7Ог) [195].
О 20 40 400 600 800
Напряжение растворенного кислорода, мм ртутного столба
Б
А. Соотношение между и напряжением растворенного кислорода и нахождение Oj крнт.
Б. Зависимость скорости дыхания хемостатной культуры видов Pseudomonas (ц = 0,1 ч“ ) с метанолом в качестве источника углерода от напряжения растворенного кислорода. Около «А» величина q® осциллирует.
выход биомассы (или экономический коэффициент) по кислороду (Уо) постоянен, мы можем подставить = ц/У0 и q^a* — = р»п/Уо. Тогда получим
В = PmPlKpl + КР), (11.5)
что дает нам соотношение между и и pi, когда кислород является фактором, лимитирующим рост. Было установлено, что зависимость ц от с для Candida utilis при росте на ацетате в качестве источника углерода отвечает уравнению Михаэлиса — Ментен с Ks = 1,3 • 10-8 М, что соответствует Кр = 0,91 мм рт. ст. [160]. Часто принимают, что скорость дыхания становится независимой от концентрации растворенного кислорода, когда последняя достигает значения, превышающего некоторое значение, обозначаемое Скрпт, которое определяется, как указано на рис. 41, Л. Значение Скрит или соответствующее нзпряжение кислородз Ркрпт будет зависеть от удельной скорости роста. Для суспензий одноклеточных организмов значение ркрит достигает 10 мм рт. ст. [123].
Влияние кислорода на культуры микроорганизмов 135
Влияние повышенных давлений кислорода, когда это давление выше 0,21 атм, или 159 мм рт. ст., на скорость дыхания было исследовано на псевдомонадах, растущих на метаноле [195]. Результаты указанной работы представлены на рис. 41, Б; они показывают, что при парциальном давлении растворенного кислорода от 30 до ~ 400 мм рт. ст. скорость дыхания сохраняется постоянной, но приблизительно с 500 мм рт. ст. ЦОг начинает колебаться, свидетельствуя о нестабильности метаболической регуляции. Выше 560 мм рт. ст. qOj невероятно возрастает с увеличением напряжения растворенного кислорода. Максимальный выход биомассы Yх/0 был обнаружен при напряжении растворенного кислорода ниже 100 мм рт. ст., а при напряжении растворенного кислорода выше 100 мм рт. ст. и особенно когда его значение превышало 560 мм рт. ст., увеличивались энергетические затраты на поддержание, что может быть связано с необходимостью преодолеть токсичность кислорода. Макленнан и др. [195] пришли к выводу о том, что во время изменения во всем диапазоне напряжения растворенного кислорода происходит постоянная смена механизмов в клетке, что можно было бы упустить при ограниченном изучении влияния кислорода — только в его присутствии или в отсутствие.
11.4. Влияние условий роста на скорость дыхания покоящихся клеток
Скорость дыхания покоящихся, т. е. неразмножающихся, клеток является ценным показателем метаболизма. В какой степени условия роста способны влиять на скорость дыхания покоящихся клеток, этому пока еще не уделялось достаточного внимания, однако ясно, что это влияние может быть значительным. Изменение и распад ферментных систем происходят, по всей видимости, сразу, как только прекращается рост [96], и, чтобы уменьшить эти изменения, клетки необходимо переносить как можно быстрее из культуры в аппарат для измерения дыхания. Скорость дыхания бактериальных клеток, лимитированных углеродом, больше, чем у клеток, лимитированных азотом [317]. Из результатов различных исследователей [121, 316] следует, что % покоящихся клеток увеличивается со скоростью роста культур, из которых эти клетки были взяты. Подобные результаты дают основание думать о наличии постоянной регуляции скоростью роста содержания катаболических и дыхательных ферментов.
Величина q0 покоящихся клеток бактерий может сильно зависеть от напряжения растворенного кислорода во время
136
Глава ll
роста. Максимальное значение q0, для клеток Escherichia coli было получено, если культура росла в условиях лимита по кислороду, но для Klebsiella aerogenes парадоксальным образом максимальная величина qOi найдена, когда клетки росли в анаэробных условиях [121].
11.5. Влияние напряжения растворенного кислорода на содержание дыхательных и катаболических ферментов
в клетках
В клетках эукариотов и некоторых бактерий акцепторами водорода в цепи переноса электронов к кислороду являются цитохромы. Для некоторых бактерий, например молочнокислых, путь электронов к кислороду через флавопротеиды изучен еще недостаточно полно. Для Klebsiella earogenes было найдено, что содержание цитохрома аг — терминальной оксидазы — увеличивалось в 200 раз при снижении напряжения растворенного кислорода от 5,3 мм рт. ст. до < 0,4 мм рт. ст. [119]; количества цитохромов b и о мало зависели от напряжения растворенного кислорода. В культуре Candida цитохромы b и с обнаружены в максимальных количествах при напряжении кислорода, равном 1 мм рт. ст., а цитохром а — при напряжении растворенного кислорода ниже 0,1 мм рт. ст. [219].
В клетках культуры Aspergillus nidulans были обнаружены максимальные количества некоторых ферментов гликолиза и гексозомонофосфатного пути при напряжении растворенного кислорода ниже 30 мм рт. ст. [44].
11.6. Переходы от аэробного к анаэробному метаболизму у факультативных анаэробов
При переходе от анаэробного к аэробному росту индуцируется синтез многих различных ферментов и подавляется синтез ферментов, необходимых для анаэробного роста [350]. К ферментам, индуцируемым аэробными условиями, относятся компоненты цитохромного пути переноса электронов, включая убихинон и ферменты цикла трикарбоновых кислот; синтез формиатгидрогенлиазы в этих условиях подавляется.
Метаболизм факультативного анаэроба, такого, как К- aerogenes, в состоянии лимитирования кислородом представляет собой смешанный тип аэробного и анаэробного обмена. При кислых значениях pH эта культура в условиях лимитации кислородом использует глюкозу с образованием исключительно бутиленгликоля и двуокиси углерода; избыток кислорода подавляет образование бутиленгликоля, а анаэробные условия ведут к накоплению в культуральной жидкости как бутиленгликоля, так и этанола [255].
Влияние кислорода на культуры микроорганизмов 137
Были сделаны попытки определить напряжение растворенного кислорода, при котором осуществляется переход от аэробного к анаэробному метаболизму в культурах К. aerogenes, растущих на глюкозе [124]. В результате было установлено, что при значениях напряжения растворенного кислорода от 5 до 15 мм рт. ст. <?Ог не зависит от напряжения кислорода, но дальнейшее снижение напряжения растворенного кислорода приводит к неожиданному увеличению скорости дыхания примерно на 30%; это ведет к колебаниям напряжения растворенного кислорода и р0;. Такая нестабильность в регуляции q0^ может рассматриваться как первый сигнал лимитации кислородом растущей культуры.
Данные других исследований показывают, что время, необходимое для перехода от стационарного состояния анаэробного роста к стационарному состоянию аэробного роста культуры К- aerogenes или Е. coli, приблизительно соответствует времени двух генераций [122]; для обратного перехода от аэробного к анаэробному состоянию требуется время, примерно равное трем генерациям.
11.7. Влияние напряжения растворенного кислорода на прочие функции (кроме дыхания)
Для сохранения жизнеспособности клеток уксуснокислых бактерий необходим кислород: удаление кислорода из растущей культуры хотя бы только на 1 мин вызывало быструю гибель бактерий [147].
Для поддержания максимальной скорости образования антибиотика цефалоспорина грибом Cephalosporium напряжение растворенного кислорода должно было быть не ниже 20 мм рт. ст. [97], в то время как для дыхания критическое напряжение растворенного кислорода составляло 8 мм рт. ст. Систематических исследований влияния концентрации растворенного кислорода на образование антибиотиков и других вторичных метаболитов проведено мало. Определенные данные по этому вопросу могут быть получены, вероятно, лишь при использовании хемо-статных культур в стационарном состоянии. Некоторые примеры таких исследований рассматриваются ниже.
Было найдено, что максимальное образование нерастворимого пигмента меланина в мицелии Aspergillus nidulans происходит при напряжении растворенного кислорода выше 30 мм рт. ст. Ниже 30 мм рт. ст. образуется растворимая форма пигмента, которая выделяется в среду, а максимальное количество обнаруживалось при 18 мм рт. ст. [283]. Максимальное образование дифтерийного токсина коринебактериями начинало происходить, когда напряжение растворенного кислорода находилось в интервале от <0,1 до 100 мм рт. ст.; более высокий
138
Глава 11
уровень концентрации растворенного кислорода ингибировал токсинообразование [276, 277]. Состав липидов Candida utilis зависит от напряжения растворенного кислорода во время роста культуры. Уменьшение напряжения растворенного кислорода от 5 до менее 1 мм рт. ст. уменьшает соотношение жирных кислот (Cis: Cie) и снижает степень ненасыщенности жирных кислот [32]. Уменьшение ненасыщенности может служить признаком замены линоленовой кислоты, имеющей 3 двойные связи, на олеиновую кислоту с одной двойной связью [9]. Образование желтого флавиноподобного пигмента культурой Klebsiella aerogenes увеличивалось при повышении напряжения растворенного кислорода по крайней мере до 450 мм рт. ст. [123]. Эти результаты свидетельствуют о том, что изучение влияния гипербарических давлений кислорода может представить интерес в отношении образования продуктов метаболизма.
11.8. Заменители кислорода
Культура может снабжаться кислородом в форме перекиси водорода, благодаря индукции очень высокого содержания в организме каталазы [133]. В отсутствие кислорода нитраты, феррицианид, тетратионат и некоторые восстанавливающиеся органические соединения, такие, как метиленовая синь и тетра-золий, способны функционировать как конечные акцепторы электронов. Кислород ингибирует клеточные реакции с другими акцепторами электронов. Восстановление нитратов, подобно использованию кислорода, сопряжено с образованием АТФ в клетках Klebsiella при использовании глюкозы в качестве источника энергии. Для этой реакции характерна следующая стехиометрия: NO3 ->NO2 + 3 АТФ [116]. Этот процесс отличается от процесса, протекающего с участием кислорода, в том отношении, что ферменты цикла трикарбоновых кислот в этом случае ингибированы и глюкоза окисляется только до ацетата.
Если в культурах Klebsiella роль кислорода выполняет феррицианид, то ферменты цикла трикарбоновых кислот не подавляются, так что глюкоза окисляется полностью; однако восстановление феррицианида не сопряжено с образованием АТФ [115]. Следовательно, рост Klebsiella на глюкозе в присутствии феррицианида зависит от образования АТФ в ходе гликолиза. Как нитрат, так и феррицианид, подобно кислороду, подавляют синтез фермента формиатгидрогенлиазы.
11.9. Ингибирование кислородом
Имеются немногочисленные данные об ингибирующем уровне растворенного кислорода, однако все они указывают, что для каждого организма характерно определенное напряжение рас
Влияние кислорода на культуры микроорганизмов
139
творенного кислорода, выше которого кислород становится токсичным и подавляет его рост. Различные типы влияния концентраций растворенного кислорода показаны на рис. 42. В случае анаэробных организмов кислород подавляет рост при любом напряжении растворенного кислорода (рис. 42, В). Факультативные анаэробы характеризуются способностью расти как в присутствии кислорода, так и без него. Термин микроаэрофилы
Рис. 42. Влияние напряжения растворенного кислорода на скорость роста различных микроорганизмов.
А—аэроб; Б—факультативный анаэроб; В —анаэроб.
может быть применен к аэробам или факультативным анаэробам, для которых значение ингибирующего напряжения растворенного кислорода составляет меньше чем 0,21 атм, т. е. ниже, чем парциальное давление кислорода воздуха при 1 атм. Для других аэробных организмов значение ингибирующего напряжения растворенного кислорода является гипербарическим, а именно превышает 0,21 атм. Большинство исследований по влиянию гипербарических концентраций кислорода проводилось при контроле парциального давления кислорода в газовой фазе, а не в культуральной среде. Такое исследование количественного соотношения между напряжением растворенного кислорода и ростом не совсем правомочно, если нет гарантии, что уменьшение напряжения растворенного кислорода вследствие его поглощения незначительно. Подобная работа была проведена с колониями Escherichia coli, растущими на агаре при лимитации
140
Глава It
глюкозой; было установлено, что напряжение растворенного кислорода, равное 1 атм, предотвращает рост Е. coli [246]. Рост Pseudomonas, Escherichia и Staphylococcus, по данным других исследователей [351], тормозился также при напряжении кислорода около 1 атм. Рост гриба Penicillium chrysogenum в ферментере с перемешиванием ингибировался напряжением кислорода в 1,5 атм —такое напряжение кислорода вызывало появление гиф с морфологическими отклонениями от нормы (Перт, неопубликованная работа). Таким образом, ингибирующие значения напряжения растворенного кислорода для аэробов могут быть достаточно низкими, чтобы в больших ферментерах индустриального масштаба проявлялась токсичность кислорода, особенно благодаря избыточному давлению, поддерживаемому в верхней части.
Молекулярные основы токсичности кислорода не ясны. Предлагаются различные гипотезы для объяснения действия кислорода, но унифицированной гипотезы пока не выработано. В основе одной из гипотез лежит предположение, что токсичность кислорода обусловлена накоплением перекиси водорода клетками. Такое накопление было обнаружено у Streptococcus faecalis [295]. Перекись водорода может быть удалена и токсичность, таким образом, снижена действием каталазы или пероксидазы, которые способны индуцироваться наличием перекиси. Согласно второй гипотезе, кислород непосредственно ингибирует какой-то важный фермент, связывая или окисляя его. По третьей гипотезе, кислород окисляет кофермент, такой, как ферредоксин, и, следовательно, инактивирует его.
11.10. Анаэробный рост
11.10.1. Методы анаэробного культивирования
Облигатными анаэробами называются организмы, рост которых ингибируется кислородом при любых значениях напряжения растворенного кислорода. Воздух при атмосферном давлении полностью ингибирует рост таких организмов и для многих из них — детален.
Создать более или менее строгие анаэробные условия можно различными методами и средствами [141, 150, 348]. Достаточно эффективна замена воздуха азотом или двуокисью углерода, не содержащими кислорода. В любом случае в газовой фазе должно присутствовать некоторое количество двуокиси углерода (5%). Газовая смесь водород — двуокись углерода удобна для заполнения анаэростатов, в которых остаточный кислород может быть удален путем каталитического связывания с водородом. Анаэробные условия могут быть достигнуты также добавлением
Влияние кислорода на культуры микроорганизмов 141
в среду восстанавливающих агентов, особенно цистеина, сульфида натрия, тиогликолята натрия, дитионита натрия и аскорбиновой кислоты; обычно для этой цели предпочитают цистеин и сульфид натрия. Некоторые среды, такие, как мясные отвары, удобны, может быть, потому, что они содержат восстанавливающие вещества. Рекомендуют использовать предварительное выращивание факультативного анаэроба в среде как средство для достижения анаэробиоза в случае культуры метанобразу-ющих бактерий [141].
Степень анаэробиоза часто определяют, измеряя Eh- Для этой цели в среду могут быть введены окислительно-восстановительные индикаторы. Для определения Eh в качестве индикатора обычно используют резазурин (диазорезорцин) (10-4 г/л), меняющий окраску от розовой до бесцветной при Ео = —51 мВ, pH 7 и 30 °C; бесцветное состояние достигается при Eh около —100 мВ и указывает на наличие анаэробных условий.
11.10.2. Пределы Eh для анаэробного роста
Верхний предел Eh для роста анаэроба впервые был определен при изучении влияния Eh на прорастание спор Clostridium tetani [174]. Верхнее значение Eh, при котором споры не прорастали, составляло 50—100 мВ. Согласно другим данным, верхний предел значений Eh, лимитирующий рост С1. sporogen.es или Cl. saccharobutyricum, составляет —100 мВ [8]; однако начальное значение Eh могло быть повышено до +180 мВ, но в этом случае имел место лаг-период, продолжавшийся до тех пор, пока культура спонтанно не снижала Eh до —100 мВ. Было также установлено, что допускаемое начальное значение Eh уменьшалось с уменьшением количества посевного материала, выраженного в единицах оптической плотности [8]. Культуральная жидкость, полученная после выращивания биомассы, снижала минимальную величину инокулята, при которой был возможен рост с начальным значением Eh 180 мВ. Результаты указанной работы [8] свидетельствуют о том, что клостридии обладают механизмом, ведущим к снижению Eh в среде.
Нижний предел Eh, достигаемый в неаэрируемых бактериальных культурах, специфичен для организма [156]. В культурах Bacillus subtilis значение Eh относительно стандартного водородного электрода (Якоб [156] дает величины относительно каломельного электрода) падало от 400 мВ при засеве до 200 мВ; в культуре Staphylococcus aureus значение Eh падало от 400 до 50 мВ, а в культурах Proteus vulgaris и Escherichia coli происходило еще более значительное снижение Ел: от +400 до —300 мВ. В культуре Clostridium paraputrificum снижение Eh приблизительно от +300 до —300 имело место в течение лаг-
142
Глава 11
фазы, т. е. до начала роста (рис. 43). Эти результаты показывают, что факультативные энтеробактерии способны снижать Ед до значений, при которых возможен рост строгих анаэробов.
Рис. 43. Изменение Ед в процессе роста (по экстинкции) культуры Clostridium paraputrijicum в печеночном бульоне [156].
11.10.3. Верхние пределы концентрации растворенного кислорода для анаэробного роста
Гордон и др. [111] установили значение переносимого парциального давления кислорода в газовой фазе над плотной средой (кровяным агаром) при выращивании культур некоторых клостридий. Для Clostridium, welchii верхний предел находился в области 30—80 мм рт. ст., для С1. sporogen.es — при 4 мм рт. ст. и для Cl. tetani, Cl. botulinum и Cl. oedematiens — при 1—2 мм рт. ст. Напряжение кислорода в среде может быть ниже, чем парциальное давление в газовой фазе, потому что по крайней мере у некоторых клостридий имеется механизм поглощения кислорода. Так, было найдено, что у Cl. sporogenes qQ составляет 30 мл кислорода на 1 г сухой биомассы в 1 ч при использовании в качестве субстрата глюкозы [31]. Это дыхание клостридий может служить таким механизмом клетки, который снижает парциальное давление растворенного кислорода и соответственно Ек до уровня, пригодного для роста. Верхний уровень Eh или напряжение кислорода, ограничивающее развитие культуры,
Влияние кислорода на культуры микроорганизмов
143
ниже которого уже возможен рост, отражает, в какой мере организм может удалять кислород из среды и создавать анаэробные условия. Большинство строгих анаэробов могут не обладать механизмом, обеспечивающим поглощение кислорода.
Во время роста в анаэробных условиях Klebsiella aerogenes напряжение растворенного кислорода было слишком низко, чтобы его измерить, — ниже 0,1 мм рт. ст. [124].
Мы можем оценить концентрацию растворенного кислорода в анаэробных культурах по значению Eh следующим путем. Пусть Eh раствора, насыщенного кислородом при напряжении кислорода 0,21 атм, равно 400 мВ [156]; допустим, что Eh уменьшается на 60 мВ при уменьшении напряжения растворенного кислорода на 1 log (разд. 9.5.2). Тогда уменьшение Eh от +400 до —140 мВ соответствует уменьшению напряжения кислорода на 9 в логарифмической шкале. Поэтому напряжение растворенного кислорода будет соответствовать 0,21 • 10-9 атм. Такое падение в напряжении кислорода означает, что концентрация растворенного кислорода при 25°C будет уменьшаться от 0,25 • 10~3 М до 0,25 • 10-'2 М. Для последней концентрации число молекул кислорода в миллилитрах должно быть N • 0,25 • 10~15, где N — число Авогадро (6 • 1023). Отсюда вытекает, что при значениях Eh, характерных для анаэробного метаболизма, количество бактерий превосходит числом молекулы кислорода, и большинство клеток полностью избавлены от действия кислорода. Этот аргумент опровергает точку зрения, что анаэробы, возможно, нуждаются в кислороде, но при исключительно низком его напряжении.
Глава 12
ОБЩИЕ ВОПРОСЫ ПИТАНИЯ
12.1. Введение
Источники питания, необходимые организму для роста (не считая источников энергии), можно подразделить на следующие группы: 1) источники основных элементов: С, Н, О и N; 2) источники элементов, требующихся в меньшем количестве: Р, К, S, Mg; 3) витамины и гормоны; 4) источники микроэлементов. Термин факторы роста используют для обозначения особенно важных источников питания, таких, как аминокислоты, которые включаются целиком в структуру клетки. Это определение исключает источники углерода и энергии, потому что они катабо-лизируются. Об источниках углерода и энергии, которые часто используются клеткой и как источники кислорода и водорода, речь шла в гл. 8. В настоящей главе обсуждаются вопросы, связанные с источниками азота и других групп питания.
Первоначально микроорганизмы и клетки тканей культивировали на естественных средах, представляющих собой экстракты из растительного или животного материала; в качестве примеров можно назвать виноградный сок, молоко, кукурузный экстракт, пептон и сыворотку. Часто подобные среды удобны, так как они содержат источники всех четырех групп питания, но все они обладают одним недостатком — неопределенностью состава и, следовательно, значительной вариабельностью. Чтобы изучать влияние источников питания, необходимо применять, насколько это возможно, химически определенные или синтетические среды. Первые шаги к определению состава сред для культивирования были сделаны Пастером [234], который ввел полусинтетическую среду (частично известного состава); эта среда состояла из глюкозы, виннокислого аммония и золы дрожжей и использовалась для выращивания дрожжей. Роль винной кислоты не ясна, но она могла придать среде элективность при выращивании дрожжей, так как в то время не было известно каких-либо других способов получения чистых культур. Позже Вильдье [345] показал необходимость в дополнительных источниках витаминов для роста дрожжей. Он нашел, что среда Пастера не могла обеспечить хороший рост дрожжей, если она не содержала органический экстракт из дрожжевых клеток, на
Общие вопросы питания
145
званный биосом. Впоследствии было установлено, что биос — это водорастворимые витамины. Как Пастер достиг успеха в выращивании дрожжей на своей среде без всякого добавления биофакторов? Можно лишь предположить, что это объяснялось использованием большого количества посевного материала, который содержал факторы роста в избытке, или же тем, что он работал со смешанными культурами, среди которых мог быть вид, способный синтезировать факторы роста.
Ученик Пастера Ролэн [272] впервые применил среду полностью известного состава для выращивания культуры Aspergillus niger. Эта среда содержала элементы питания первых двух групп (см. выше), три микроэлемента (Fe, Zn и Si)—все в неорганической форме — и сахар в качестве источника С, Н, О и энергии. Последующая работа подтвердила правильность состава указанной среды, за исключением потребностей в Si в форме силиката; причем, справедливым оказался не только качественный состав среды, но, исходя из экономического коэффициента, было правильно подобрано и количественное содержание каждого источника питания. К сожалению, большинство более поздних исследователей пренебрегали определением экономического коэффициента по элементам питания, что очень важно для выяснения количественных потребностей в источниках. Например, пренебрежение количественной стороной этого вопроса привело к тому, что многие работы по изучению питательных потребностей клеток животных зашли в тупик [22].
«Минимальная» среда содержит лишь источники питания, необходимые для роста. Богатая среда содержит, кроме необходимых для роста источников питания, дополнительные вещества, обычно в форме аминокислот, витаминов, предшественников нуклеиновых кислот и другие промежуточные вещества синтеза клеточных компонентов. Обогащение сред для культивирования приводит к увеличению скорости роста и изменению ферментного состава биомассы.
Потребности организма в питании могут различаться качественно или количественно, в зависимости от условий культивирования. На изменение потребностей в факторах роста способна влиять температура (разд. 13.4), и можно думать, что пищевые потребности должны зависеть от значений pH и осмоляльности среды.
Для начала роста при небольшом количестве посевного материала иногда требуется более обогащенная среда, чем для начала роста с высокой плотностью популяции. Например, не удается получить рост Klebsiella aerogenes на минимальной глюкозно-аммонийной среде при внесении посевного материала в количестве меньшем, чем приблизительно 105 бактерий на
146
Глава 12
1 мл, однако добавление аминокислот (аспарагина или аланина) снижает минимальное количество посевного материала, необходимого для начала роста [188].
12.2. Определение факторов роста микробиологическими методами
Микробиологические методы определения аминокислот, витаминов и других веществ, которые могут выполнять функции факторов роста, основаны на определении выхода биомассы или выхода продуктов, что рассматривается в гл. 2. Исследуемый
Рис. 44. Микробиологический метод определения фактора роста, основанный на измерении образования максимального количества биомассы (х).
По оси абсцисс отложен объем образца. А. Правильное определение. Б. Неправильное определение.
I—стандартные образцы; II— опытные образцы; В, В\, В2 — точки пересечения.
материал используют в качестве лимитирующего рост субстрата, при наличии всех остальных необходимых источников питания в избытке. Теоретически должна получиться линейная зависимость между количеством образующейся биомассы и количеством испытуемого субстрата (рис. 44). Если Xi— биомасса в у мл стандартного раствора фактора роста в концентрации а, х2— биомасса в о мл испытуемого образца с концентрацией фактора роста Сг, У — экономический коэффициент (выход биомассы) при использовании испытуемого материала, тогда можно записать
xx = xB-]-Yc}v, (12.1)
x2 = xB + Yc2v, (12.2)
где хв — холостое определение, когда рост обусловлен наличием фактора роста, присутствующего в посевном материале (х0) и в исследуемой среде (sB) в качестве примесей.
Общие вопросы питания
147
Тогда
xB = x0 + YsB. (12.3)
Отношение наклонов графиков, выражающих уравнения (12.1) и (12.2), будет Ci/C2- Следовательно, можно высчитать с2.
Для правильного анализа экономический коэффициент должен быть один и тот же в стандартном и испытуемом растворах. Если это так, то значение YsB в уравнении (12.3) должно быть одинаковым при определении контрольного (стандартного) и опытного образцов, т. е. определяться равными отрезками на ординате, как показано на рис. 44,А. Если значения экономического коэффициента при использовании различных испытуемых образцов меняются, тогда можно полагать, что в испытуемом образце содержится какой-то дополнительный материал, обладающий активностью фактора роста, и в этом случае определения будут не совсем правильными. Такая неточность в определениях видна по неодинаковым отрезкам (рис. 44, Б), величины которых соответствуют xBi = х0 + YiSB и хВ2 = Хо 4~ где У1 и Y2 есть различные экономические коэффициенты. При этом необходимо выполнение требования, чтобы sB > 0.
12.3. Потребности в азоте
12.3.1. Общие вопросы
Различными микроорганизмами могут быть использованы очень многие, если не все, источники азота, включая неорганические и органические его формы. Метаболизм источника азота обеспечивает главным образом синтез белков, нуклеиновых кислот и полимеров клеточной стенки. Пул аминокислот в цитоплазме составляет 0,25 — 5% веса сухой биомассы [33, 198]. Большая часть пула приходится на долю глутамата. Азот бактериальных клеток составляет до 12% веса сухой биомассы; в грибах — 10% сухого мицелия.
12.3.2. Аминокислоты
Часто аминокислоты служат фактором роста. Для синтеза белка и для многих других целей микроорганизмы нуждаются в L-аминокислотах; однако иногда требуются D-аминокислоты, например, D-аланин и D-аспарагиновая кислота могут включаться в клеточные стенки бактерий. В биомассе аминокислоты могут рацемизироваться, образуя в результате требуемый изомер. В клеточном белке индивидуальные аминокислоты составляют 1—5% от всего белка, на основании чего можно приблизи
10*
148
Глава 12
тельно оценить количество аминокислот, необходимых в качестве факторов роста. Исключение составляет глутаминовая кислота или глутамин, которые количественно играют большую роль в аминокислотном метаболизме и содержание которых в среде должно значительно превышать содержание остальных аминокислот [65, ИЗ].
12.3.3. Пептиды
Некоторые бактерии, нуждающиеся в нескольких аминокислотах, растут лучше при внесении в среду одной или более аминокислот в форме пептидов, например гистидиновых пептидов для Lactobacillus delbrueckil [237]. Рост Lactobacillus casei в среде без пиридоксина происходил лишь при наличии D- и L-аланина, однако D-аланин препятствовал (как антагонист) потреблению L-аланина, и этот антагонизм можно было преодолеть путем добавления L-аланина в пептидной форме [168]. Также потребление серина культурой L. delbrueckil тормозилось как D-, так и L-аланином, а антагонизм преодолевался добавлением серина в виде пептидов [269]. В культуре Streptococcus faecalis тирозин декарбоксилировался клетками в такой степени, что микроорганизм мог испытывать недостаток в тирозине. В этом случае добавление тирозиновых пептидов обеспечивало указанную культуру тирозином [167].
Часто аминокислоты действуют как ингибиторы роста. Ингибирование аминокислотами классифицируется как ингибирование конкурентного типа, если оно может быть снято другими аминокислотами, или неконкурентного типа, если оно не может быть преодолено другими аминокислотами. Антагонизм между аминокислотами при их потреблении наблюдали в следующих группах: 1) фенилаланин, тирозин, триптофан; 2) серин, треонин, аланин, глицин; 3) глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота [302, 186]; 4) валин, лейцин, изолейцин [165, стр. 211]; 5) норлейцин, метионин [165, стр. 211]. Этот антагонизм связан с конкуренцией за общую пермеазу. В культуре Cephalosporium. нитрат-ионы подавляли потребление метионина ауксотрофным штаммом, а с помощью ионов аммония этот антагонизм преодолевался (Нюш, личное сообщение). Ингибирование гистидином роста мутанта Bacillus subtilis снималось при добавлении в среду глицина в виде трипептида [78]. Для некоторых организмов ферментативный гидролизат казеина становился ингибитором роста при концентрациях выше 100 мкг/мл. Неконкурентное ингибирование роста аминокислотами, так же как и другими промежуточными метаболитами, обычно встречается в культурах автотрофных микроорганизмов [164, стр. 47] и бактерий, растущих на Ci-соединениях, таких, как метан [93].
Общие вопросы питания
149
12.3.4. Лимитация роста азотом
При лимитации роста азотом в биомассе содержится меньше белка, чем при лимитации роста углеродом; например, в дрожжах было обнаружено 30% белка при лимитировании культуры аммиаком, в то время как при лимитации глицерином количество белка в биомассе дрожжей составило 50% [187]. Низкое содержание белка при избытке источника углерода является отражением накопления энергетического резерва, такого, как гликоген, в биомассе.
12.4. Потребности в витаминах и гормонах
Термин витамины используется здесь для обозначения факторов роста, отличных от аминокислот. Витамины разбивают на две группы: жирорастворимые и водорастворимые. В жирорастворимую группу входят витамины A, D, Е, К, убихинон, холестерин и ненасыщенные жирные кислоты (олеиновая, линоленовая, линолевая, арахидоновая). Витамины А, Д и Е, которые необходимы для человека и животных, не были отмечены как обязательные для роста микроорганизмов. Потребность в ненасыщенных жирных кислотах обнаружена для некоторых лактобацилл [302] и для видов Sarcina [186]. Жирные кислоты удобно вносить в среду в форме водорастворимых эфиров (твиновые соединения). Холестерин необходим для многих микоплазм.
К водорастворимым витаминам относятся: аскорбиновая кислота, тиамин, рибофлавин, пантотеновая кислота, пиридоксин, никотиновая кислота, биотин, р-аминобензойная кислота, фоле-вая кислота, кобаламин, мевалоновая кислота, холин и мезоинозит. Для некоторых витаминов существуют различные производные, так называемые «витамеры», например пиридоксамин и пиридоксаль — витамеры пиридоксина, и организм может нуждаться лишь в одном специфическом витамере. Все водорастворимые витамины, за исключением аскорбиновой кислоты, как было обнаружено, являются факторами роста для ряда микроорганизмов и клеток тканей животных в культуре. Большинство водорастворимых витаминов — компоненты коферментов. Холин и инозит входят в состав липидов. Из изомеров инозита только мезо- (или мио-) инозит обладает активностью фактора роста. Снабжение конечными продуктами метаболических путей, в которые включается витамин, может в какой-то мере его заменить. Так, для замены биотина могут быть использованы ненасыщенные жирные кислоты [178]. В среде неопределенного состава дрожжевой экстракт используют обычно в качестве источника витаминов.
Количество витамина, необходимое для культуры, редко определяют в виде экономического коэффициента (выхода
150
Глава 12
биомассы). Поэтому не известно количество витамина, требуемое для образования определенного количества биомассы. Некоторые данные о значениях экономических коэффициентов з расчете на потребленный витамин (при избыточном снабжении витамином) приведены в табл. 11. Значение экономического коэффициента по витамину часто бывает выше при лимитировании роста этим витамином, чем при снабжении им в избытке. Экономический коэффициент по витамину может изменяться противоположно изменению скорости роста. Например, экономический коэффициент дрожжей по тиамину уменьшается от 29,0 • 105 до 1,2-105 г сухой биомассы в расчете на 1г тиамина при увеличении удельной скорости роста от 0,3 до 0,8 от ее максимального значения. Потребности в биотине у Corynebacterium glutamicus снижались на 90%, когда рост шел на среде с ацетатом вместо глюкозы [169, стр. 271]. Следовательно, природа источника углерода энергии способна влиять на величину экономического коэффициента (выход биомассы) в отношении потребленного витамина.
Таблица 11
Экономический коэффициент в расчете на использованный витамин
Витамин Микроорганизм или тип клеток Экономический коэффициент, г/г *)
Биотнн Streptococcus [43] 1,08- 10s
LS-клетки мыши [25, 27] 2,0- 105
Фолевая кислота LS-клетки мыши [25, 27] 2,4 • 105
Рибофлавин Streptococcus [43] 7,4- 104
LS-клетки мыши [25, 27] 2,0- 104
Пантотеновая кислота Streptococcus [43] 1,53- 104
LS-клетки мыши [25, 27] 6,0 101
Тиамин Streptococcus [43] 1,16- 104
LS-клетки мыши [25, 27] 3,2- 104
Никотиновая кислота Streptococcus [43] 3,4- 103
Никотинамид LS-клетки мыши [25, 27] 4,8- 102
Пиридоксин То же 4,36 • 102
Мезо-инозит » 1,56- 102
Холин » 0,71 • 102
*) Экономический коэффициент определяли в присутствии избытка витамина как количество грамм сухой биомассы, образованной в расчете на 1 г витамина.
Лимитация роста витаминами систематически не изучалась, хотя очевидно, что она должна оказывать огромное влияние. Например, недостаток биотина явился одним из факторов, ответст
Общие вопросы питания
151
венных за сверхсинтез глутаминовой кислоты клетками Согупе-bacterium glutamicus. Недостаток биотина вызывает, вероятно, увеличение мембранной проницаемости для глутаминовой кислоты, поэтому указанная аминокислота не способна удерживаться в клетке [169, стр. 314]. Лимитация роста LS-клеток мышей в культуре холином или инозитом вызывала образование почкообразных выступов на клетках, что наводит на мысль о повреждении мембран (Блейнер, Товей и Перт, неопубликованные данные).
Между витаминами возможен антагонизм, например между тиамином и пиридоксалем у дрожжей [302]. В настоящее время еще мало данных об ингибирующем действии витаминов на рост, однако известно, что фолиевая кислота или формилтетрагидро-фолиевая кислота в количестве 0,01 мкг/мл полностью подавляет рост Lactobacillus bulgaricus [280].
Не исключено, что любой из компонентов клетки способен выполнять роль ростового фактора. Важными факторами роста являются пурины, пиримидины, гемин [178] и полиамины, путресцин, спермин и спермидин [56].
Изучение роли гормона инсулина, необходимого для клеток человека HeLa в культуре [26], и гормона 2,4-дихлорофенокси-ацетата, в котором нуждаются культуры клеток растений [355], показало, что эти гормоны действуют подобно факторам роста в среде для культивирования.
Потребность клеток HeLa в инсулине может быть достаточно легко исключена. Это видно из того факта, что клетки, взятые из сложной среды, проявляют признаки потребности в инсулине (что заметно по падению скорости роста) только после 13 генераций. Подобное наблюдение дает основание думать, что потребности в факторе роста могут иногда проявляться скорее через уменьшение скорости роста, чем через уменьшение экономического коэффициента.
12.5. Потребности в фосфоре
Фосфор обычно вносят в среду в виде неорганических фосфатов. Кроме того, можно использовать органические фосфаты, такие, как глицерофосфат и фосфолипиды. Фосфор входит в состав нуклеиновых кислот, фосфолипидов, полимеров клеточной стенки; иногда он накапливается в клетке в виде полиметафосфата [202]. Только небольшая часть общего фосфора обнаруживается в форме легко диффундирующих органических фосфатов, таких, как АТФ.
Содержание фосфора в бактериальных клетках равно приблизительно 1,5% веса сухой биомассы, однако содержание его
152
I лава 12
увеличивается со скоростью роста и изменяется обратно температуре. Эти изменения в значительной степени отражают содержание РНК в клетке [315]. У бактериальных клеток существует стехиометрическое соотношение между количествами магния, калия, фосфора и РНК, которое является характерным для различных групп бактерий [315]. Для грам-отрицательных бактерий молекулярное соотношение Mg : К : РНК--нуклеотид : РО4 близко к 1 : 4 : 5 : 8 и не зависит от скорости роста, температуры и субстрата, лимитирующего рост. Для грам-положительных бактерий соотношение Mg : К : РНК-нуклеотид : РО4 составляет приблизительно 1:13:5: 13, за исключением тех случаев, когда рост лимитируется фосфатом и соотношение становится около 1 : 4: 5 :8, т. е. то же самое, что и для грам-отрицательных бактерий. Более высокое содержание фосфата и калия в грам-положительных бактериях объясняется наличием в их клеточных стенках тейхоевой кислоты, содержащей в избытке фосфаты. Однако во время роста грам-положительных бактерий при лимитации фосфором полимер тейхоевой кислоты заменяется тей-хуроновой кислотой, не содержащей фосфат.
12.6. Потребности в калии и натрии
При образовании биомассы микроорганизма потребность в калии соответствует выходу биомассы и приблизительно составляет 60 г сухой биомассы на 1 г калия. Большая часть калия, вероятно, связана с РНК [315], так что потребность в калии увеличивается под влиянием тех факторов, которые, подобно скорости роста, ведут к увеличению содержания РНК в биомассе. Потребность в калии может меняться обратно изменению pH, так как для Klebsiella найдено, что содержание калия увеличивалось приблизительно на 30% в клетках при снижении pH среды от 7 до 6 [88]. Содержание калия в некоторых бактериях увеличивалось в 3 раза при увеличении количества хлористого натрия в среде [318]. Для того чтобы начался рост клеток млекопитающих в культуре, необходимо было превысить нижнюю пороговую концентрацию ионов калия (4 • 10"4 М), а для достижения максимальной скорости роста концентрация ионов калия в среде должна была быть не ниже 5,3 • 10~4 М [22]. Кажется, что такая пороговая концентрация для питания клеток млекопитающих ионами калия и магния является очень высокой. Только один щелочной металл способен заменить собою калий— это рубидий [89], хотя такая замена снижает максимальную скорость роста. Действие ионов калия может тормозиться ионами аммония [81]. Ионы калия способны выполнять роль коферментов и, возможно, играть роль катионов в структуре РНК и других анионных структурах в клетке.
Общие вопросы питания
153
Потребность в ионах натрия для роста микроорганизмов констатируется редко, но, возможно, это объясняется трудностью получения сред, не содержащих ионов натрия. Большую потребность в ионах натрия испытывают, вероятно, галофильные бактерии. Необходимость натрия как микроэлемента рассматривается в разд. 12.9.2.
12,7, Потребность в магнии
Экономический коэффициент в расчете на ионы потребленного магния варьирует от 300 до 900 г сухой биомассы в расчете на 1 г магния и обратно пропорционален количеству РНК в биомассе [315]. В водорослях магний входит в состав хлорофилла. Для~того чтобы начался рост клеток млекопитающих в культуре, необходимо было превысить в среде нижнюю пороговую концентрацию (5 • 10~5 М Mg2+) магния, как и в случае калия, а для достижения максимальной скорости роста концентрация магния должна быть 2 • 10~4 М Mg2+.
Характерной особенностью недостатка магния в хемостатной культуре Agrobacterium tumefaciens является то, что лимит магния вызывает большие колебания в концентрации биомассы отражающие колебания в скорости роста [181].
12.8. Потребность в сере
Экономический коэффициент в расчете на потребленную серу составляет приблизительно 300 г сухой биомассы в расчете на 1 г серы. Сера обычно вносится в среду в форме одного из неорганических веществ, в частности сульфата, или в виде цистеина или метионина. При аэробных условиях цистеин почти нацело превращается в цистин, однако последнее вещество способно заменять цистеин.
Потребление источников серы идет с использованием их главным образом для снабжения серой синтеза аминокислот — L-цистеина и L-метионина. Меньшие количества источников серы требуются для образования сульфогрупп в некоторых коферментах, таких, как биотин, кофермент А, ферредоксин, ли-поевая кислота и тиамин. Лимитация роста серой может вызвать уменьшение синтеза этих ключевых серусодержащих компонентов и повлиять на их функции в клетке. Например, в культуре дрожжей, рост которых был лимитирован серой, происходила потеря одного из пунктов окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи; этот эффект был аналогичен тому, который наблюдался при лимитации роста дрожжей железом [187].
154
Глава 12
12.9. Микроэлементы
12.9.1. Общие вопросы влияния микроэлементов
Микроэлементы, необходимые для роста, а также микроэлементы, необходимость которых предполагается, указаны в табл. 12. Эти элементы располагаются в порядке атомных номеров от 4 (бериллий) до 74 (вольфрам), но почти все входят
Таблица 12
Микроэлементы, которые могут быть необходимы для роста микроорганизма или культуры клеток [7, 152, 306, 315] )
А Элементы, обычно необходимые для роста
Са. Мп, Fe, Со, Си, Zn
Б Элементы, редко требуемые для роста
В, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo, Sn, I
В Элементы, которые, вероятно, редко требуются для роста Be. F, Sc, Ti, Ga, Ge, Br Zr, W
*) В каждой группе элементы расположены в порядке увеличения атомного числа.
в группу с атомным номером от 4 до 35. В основном потребности в микроэлементах установлены только в качественном отношении, и по этой причине они почти неизменно вносятся в среду в произвольном количестве. Как правило, трудно констатировать потребность организма в микроэлементе, так как очень часто микроэлементы присутствуют в достаточных количествах в среде как примеси составляющих ее ингредиентов. Предпринятые попытки определения экономического коэффициента в отношении микроэлементов наводят на мысль, что величина такого экономического коэффициента изменяется в очень широком диапазоне в зависимости от скорости роста и других условий [187]. Приближенная оценка количественных потребностей в более или менее важных микроэлементах следующая (г элемен-та/100 г сухой биомассы): Са — 0,10; Fe — 0,015; Мп — 0,005; Zn —0,005; Си —0,001; Со —0,001; Мо —0,001.
Недостаток микроэлементов в периодической культуре, возможно, отражается в большей степени на лимитации скорости роста, чем на количестве выросшей биомассы, как это показано на рис. 45, А. Такой результат был получен для Agrobacterium tumefaciens [182] при росте на среде с недостаточным содержанием железа и для клеток млекопитающих — также на среде с недостаточным содержанием железа [21]. В хемостатной культуре ограничение микроэлементами вызывало уменьшение количества биомассы в стационарном состоянии с увеличением ско-
Общие вопросы питания
155
роста роста, т. е. выход биомассы изменялся обратно скорости роста без изменения критической скорости разбавления (при которой происходит вымывание) (рис. 45, 5). Дефицит марганца в культуре Agrobacterium влиял на рост так, как это показано на рис. 45, А и Б (Курозски и Перт, неопубликованные данные). Потребность в микроэлементах, как предполагает Хютнер [152, стр. 338], может увеличиваться в несколько раз, когда культура испытывает стресс, подобный тому, который происходит при быстром увеличении температуры выше оптимальной для роста.
Рис. 45. Влияние недостатка микроэлементов на рост микроорганизмов в периодической культуре (Л) и хемостатной культуре (Б).
х — биомасса в периодической культуре; х — биомасса в хемостате (стационарное состояние). /—оптимальное количество микроэлементов; II — недостаток микроэлементов.
Это может помочь в методическом отношении при определении количественных потребностей культуры в том или ином микроэлементе. Очень мало известно относительно токсичных концентраций микроэлементов, хотя обычно считается, что они составляют примерно 10-4 М. Может происходить антагонизм ионов металлов, например между Мп2+ и Zn2+, в культурах видов Rhizobium [349]. Влияние нескольких микроэлементов не бывает «моноспецифическим», так как несколько различных ионов способны качественно воздействовать одинаковым образом [84, стр. 421].
12.9.2. Специфическое воздействие микроэлементов
Микроэлементы группы А, представленные в табл. 12, считаются существенными для роста. Кальций как катион в соли дипиколиновой кислоты присутствует в спорах видов Bacillus. Кальций является также кофактором фермента а-амилазы.
Марганец считается обычно стимулятором роста молочнокислых бактерий и участвует в споруляции видов Bacillus. Недостаток Mg в культуре Agrobacterium tumefaciens приводит
156
Г лава 12
к тому, что сахароза превращается в 3-кетосахарозу вместо ее полного окисления [181]. Недостаток железа и марганца оказывается причиной накопления лимонной кислоты некоторыми штаммами Aspergillus niger [51].
Железо необходимо для многих кофакторов ферментов, выполняющих окислительно-восстановительную функцию в клетке, например для геминовых пигментов цитохромов и каталазы, ферредоксина и флавопротеинов. Ограничение снабжения железом способно нарушить синтез этих кофакторов и ослабить их функции в клетке [187]. Свободные от железа кофакторы могут быть выделены клеткой [325]. Причиной выделения связывающих железо компонентов клетками некоторых бактерий и грибов бывает в ряде случаев недостаток снабжения железом [152]. Эти соединения способны связывать окисное железо в хелаты с высокой специфичностью (log константы стабильности > 30) и функционируют, по всей вероятности, как ионофоры, переносящие железо через плазматическую мембрану клетки [270], Выделение токсина клетками Corynebacterium dlphtheriae происходило только при условии дефицита по железу [276а]. Недостаток в среде железа стимулирует образование рибофлавина некоторыми дрожжами [76]. Высказывалось предположение, что дефицит железа может вызвать переключение транспорта электронов с железосодержащих белков на флавопротеидный путь [77].
Кобальт входит в состав молекулы витамина Bi2 или кобаламина, который синтезируется прокариотами.
Медь содержится в концевой оксидазе дыхательного пути в дрожжах. Недостаток меди или железа вызывает увеличение размеров митохондрий дрожжей [66]; недостаток меди в среде приводит к отбору мутантов дрожжей, лишенных концевой оксидазы [86] и использующих обходные дыхательные пути. Пептидазы могут содержать или ионы меди, или ионы цинка в качестве кофакторов.
К группе Б микроэлементов (табл. 12) относятся те, потребность в которых показать обычно нельзя, но которые необходимы в особых условиях. Так, было обнаружено, что борат существен для роста видов Candida на среде с н-парафинами [288]. Для роста Rhodopseudomonas spheroides необходим Na+ в качестве микроэлемента [299]. Отмечено [228], что во время анаэробного роста культуры Klebsiella aerogenes на цитрате проявляется специфическая потребность в больших количествах Na+ (0,1 М). Ионы натрия необходимы для щавелевоуксусной декарбоксилазы. Эта потребность исчезает во время роста на глюкозе.
Селенит или селенид (но не селенат) нужен для образования формиатдегидрогеназы клеток Escherichia coli при анаэробном
Общие вопросы питания
157
росте, однако недостаток селена не оказывает влияния на рост указанной бактерии [92].
Ионы никеля необходимы для Hydrogenomonas, получающего энергию в процессе окисления водорода [16].
Молибден, вносимый в виде молибдата, является кофактором бактериальной нитрогеназы, которая фиксирует азот, и нитратредуктазы, участвующей в ассимиляции нитратного азота бактериями и грибами. Ванадий оказался менее эффективным при замене им молибдена.
Иодид-ионы необходимы для роста видов Candida на средах с н-парафинами [288].
Знания о потребностях организмов в микроэлементах и о влиянии их недостатка в среде совершенно необходимы для обеспечения их содержания в средах для культивирования.
12.10. Удаление микроэлементов из сред
Микроэлементы могут быть удалены из раствора путем осаждения в виде гидроокисей, фосфатов или карбонатов [306] или как ферроцианиды [51]. Другими методами являются: экстракция растворителем с органическими комплексонами в неполярной фазе [85], абсорбция на окиси алюминия [271] и образование хелатов с помощью смол [225]. Эффект дефицита микроэлементов можно иногда вызвать простым добавлением металлхелатирующего агента к среде, например, дефицит железа, стимулирующий сверхсинтез рибофлавина некоторыми дрожжами, достигается внесением в среду о-фенантролина [76, 77]. Методы удаления из сред металлоидов еще предстоит разработать.
12.11. Связывание в хелаты ионов металлов
12.11.1. Введение
По всей вероятности, в любой среде концентрации ионов металлов, кроме ионов щелочных металлов, изменяются в результате образования хелатов, так как многие обычные компоненты сред и продукты метаболизма, такие, как аминокислоты и оксикислоты, способны образовывать комплексы с ионами металлов. Чтобы предотвратить осаждение микроэлементов и регулировать их концентрацию, необходимо хелатирование ионов металлов добавлением определенного агента. Металлхелатирующие вещества, относящиеся к многоосновным кислотам, например этилендиаминтетрауксусная кислота, действуют как буфер.
158
Глава 12
12.11.2. Устойчивость хелатов металлов
Ион металла (М) обратимо связывается с лигандом (L), согласно уравнению
MfL ML,
где заряд катиона и лиганда опускается. Константа стабильности компонента определяется из уравнения
К = [ML]/[M] [L], (12.4)
где квадратные скобки означают концентрации реагирующих веществ. Константа стабильности обратна константе диссоциации. Чем больше значение
Рис. 46. Влияние различных значений pH на устойчивость комплекса ЭДТА [100]. log Kapp = \og Д—log а.
К, тем больше сродство лиганда к иону металла. Логарифмируя и полагая, что рМ = —log[M], преобразуем уравнение (12.4)
pM = logK + log-j^.
(12.5)
12.11.3. Влияние ионов водорода на рМ
Хелатирующий агент можно себе представить как кислоту HmL, гдет — число водородных ионов, способных соединяться с лигандом L. Водородные ионы конкурируют с ионами металла
за лиганд.
Пусть Lu — сумма всех комплексообразующих агентов, не
соединенных с ионом металла, т. е.
Lu=L + HL + H2L+ Ч,,’.. (12.6)
где заряд лиганда опущен. Тогда
Lu = aL,
(12.7)
где а> 1. Значение а может быть выражено в виде констант стабильности кислот НМ, Н2М и т. д. и концентрации водородных ионов [100, стр. 27]. Подставив значение [L] в уравнение (12.5), получим
pM = logK — log a-Hog-рщ-. (12.8)
Общие вопросы питания
159
При log (К/а) = log KaW> уравнение (12.8) принимает вид
рМ = log Карр + log-p^j-. (12.9)
В сильнощелочных растворах значение а « 1, но оно увеличивается с увеличением кислотности и при низких значениях pH оно значительно снижает значение рМ. Влияние pH на log а для ЭДТА показано на рис. 46.
12.11.4. Подсчет рМ
Пусть [Lt] — общее число присутствующего комплексообра-
зующего агента (связанного пусть [Мт]—общее число присутствующих ионов металла. Когда ионы металла находятся в избытке, т. е. когда [Мт] > [LT], для сильных комплексообразо-вателей можно принять, что концентрация свободных ионов металла выражается следующим равенством:
[М] = [Mr] - [Lr]. (12.10)
В случае избытка комплексообразующего агента, т. е. когда [Lt] > [Мт], подставив в уравнение (12.9) [L] = [Lt] - [Мт] и [ML] = = [Мт], получим
рМ = log Карр +
+ 1о8(-ЦГ±Ь11 (12.11)
I г 'г! )
Когда общее количество комплексообразующего агента равно количеству
и свободного), и аналогично этому
мом/мом
Рис. 47. Влияние увеличивающейся концентрации комплексообразующего агента на рМ ионов двух металлов с различной константой стабильности (/<).
Общее количество ионов металла (свободных и связанных) составляет IO-2 М. По оси абсцисс
отложено отношение количества лиганда к количеству ионов металла.
металла, т. е. когда [LT] = [Мт], то
[L„] = [Lr]-{[Mr]-[M]},
(12.12)
из чего следует, что
[L„] = [M], (12.13)
Подставив значение [Lu] в уравнение (12.9) и приняв, что [ML] = [Мт], получим
pM = y{logKapp — log[Mr]}. (12.14)
3
3
Константы стабильности некоторых комплексообразующих агентов, имеющих важное значение для культуральных сред
Общие вопросы питания
161
Изменение рМ с увеличением количества комплексообразующего агента и влияние различных констант стабильности приведено на рис. 47. При избытке комплексообразующего агента предельное значение рМ приближается к log Карр- В случае таких лиганДов, которые образуют комплексы в форме МЬ2, константу стабильности выражают через |32 (табл. 13), а рМ при избытке лиганда приближается к log р2.
12.11.5. Влияние ионов второго металла
Ионы второго металла способны конкурировать с ионами первого металла за комплексообразующий агент. Если Кх и Ку — константы стабильности ионов металлов вида Мх и Му соответственно, тогда, вводя в уравнение (12.4) концентрации L, получим
[MXL] __ К, [MJ
[МгЕ] Ку ' [Мр] • ' • ’
Из этого уравнения видно, что ионы двух металлов будут эффективно конкурировать за комплексообразующий агент лишь в том случае, когда Кх « Ку. Если Кх Ку и общее количество ионов каждого металла и лиганда приблизительно одинаково, то фактически только Мх может связываться в комплекс. Аналогично, если количество комплексообразующего агента, находящегося в смеси с ионами металлов, увеличивается, то ионы металлов двух типов будут включаться в образование комплекса последовательно; ионы с самой высокой константой стабильности будут включаться в комплекс первыми.
12.11.6. Влияние второго лиганда
В составе культуральной среды часто содержится более одного соединения, способного образовывать комплексы с ионами металлов. Кроме того, и сами организмы могут выделять или содержать агенты, связывающие металлы. Обозначим символом Кр константу стабильности иона металла с лигандом Lp и Kq—-константу стабильности с лигандом Lg. Вводя в уравнение (12.4) концентрации свободных ионов металла для каждого случая, получаем следующее равенство:
= (12 16)
[MLJ Kq [Ц] •
Отсюда следует, что только в том случае, когда значения Кр и Kq приблизительно равны, два комплексообразующих агента будут достаточно эффективно конкурировать за ионы металла. Если КР 3> Kq и при этом каждый лиганд находится в избытке, большинство ионов металла будет связываться в комплекс Lp.
6 Зак. 737
162
Глава 12
12.11.7. Забуферивание металла в культуральной среде
Константы стабильности некоторых биологически важных комплексообразующих агентов приведены в табл. 13. Вещества, пригодные для забуферивания металлов, не должны потребляться организмом. Из органических лигандов наиболее устойчивы к метаболическому разрушению, вероятно, ДЦТА и ЭДТА. Полифосфаты термолабильны и стерилизовать их следует путем фильтрации. К сожалению, информация о влиянии pH на константы стабильности очень незначительна. Как можно видеть на рис. 46, при pH 7 logKapp для ЭДТА равен log К — 3. О свойствах комплексообразующих агентов, приведенных в табл. 13, в целом можно сказать следующее: наибольшее сродство они имеют к Fe3+, а наименьшее — к ионам кальция и магния. Степень связывания железа зависит от того, присутствует ли оно в виде Fe3+ или Fe2+. Экспериментально показано, что бактерии потребляют железо в форме ионов окиси [270]. Те комплексообразующие агенты, которые образуют липофильные комплексы, например ЭДОДА и 8-оксихинолин, могут проникать через плазматические мембраны организма и способствовать поглощению ионов металла [285].
12.12. Подбор среды для культивирования
12.12.1. Минимальная среда
Количество и природа компонентов среды для культивирования определяются величиной выхода продуктов и уровнем скорости роста, которые желательно получить. Выход биомассы (экономический коэффициент) можно рассчитать, исходя из элементарного состава биомассы, а потребности в источнике энергии — из данных о выходе АТФ. В табл. 14 приведен состав химически определенной среды (PI) для культивирования Klebsiella aerogenes; эта среда обеспечивает плотность, достигающую 10 г бактериальной сухой биомассы на 1 л, если имеется избыток кислорода. В отсутствие автоматической регуляции pH значение pH во время роста культуры падает в результате потребления аммиака. Чтобы избежать внесения в среду больших количеств аммонийной соли, хорошо добавлять газообразный аммиак по сигналу pH по мере потребления ионов аммония. В случае некоторых организмов вместо аммиака для поддержания значения pH можно использовать мочевину или глицин. В особых случаях может потребоваться та или иная модификация среды, например в случае использования нитрата в качестве источника азота иногда возникает необходимость в молибдене (в виде молибдата). Если желательно получить в
Общие вопросы питания
163
Таблица 14
Состав синтетической среды (PI) для выращивания Klebsiella aerogenes в концентрации 10 г сухой биомассы на 1 л при культивировании в аэробных условиях
Компонент среды ’) Присутствующий элемент или другая функция компонента среды Экономический коэффициент, г сухой биомассы на 1 г элемента Количество компонента, г/л
Вода дистиллированная)2) — — 1 000
Глюкоза С; энергия 1,10 22,7
NH4C1 N 8,75 4,37
КН2РО4 Р + К 39,1 для Р 1,13 3)
59,5 для К
MgSO4-7H2O s + Mg 333 для S 0,232 4)
430 для Mg
СаС12 • 2Н2О Са 3,33- 103 0,011
FeSO4-7H2O Fe 6,7- 103 0,007
MnSO4 • 4Н2О Мп 2,0 104 0,002
ZnSO4 • 7Н2О Zn 2,0 • 104 0,002
CuSO4-5H2O Си 105 0,0004
СоС12 • 6Н2О Со 105 0,0004
ЭДТА, двузамещенная Комплексообра- — 0,394 5)
Na-соль, дигидрат зование
') Значение pH среды доводится NaOH до «7. Для увеличения буферной емкости добавляют фосфаты натрия (0,1 М), т е. 0,079 М Na2HPO< + 0,021 М NaHaPCh, pH 7,0. Однако увеличение соотношения Na : К может привести к уменьшению экономического коэффициента, подсчитанного относительно К. Напряжение растворимого кислорода должно быть не меньше, чем 15 мм рт. ст., чтобы предотвратить лимитацию кислородом. Теоретически рассчитанное значение осмоляльности среды составляет 313 мосмолей При добавлении 0,1 М фосфатного буфера pH 7,0 осмоляльность среды составляет 592 мосмолей (теоретически), что соответствует активности воды 0,99.
Деионизированная вода может содержать неидентифнцированные нейтральные органические вещества
3) Потребность в калии соответствует 0,586 г КН2РО«.
4) Количества серы н магния одинаковы.
s) 1 моль ЭДТА в расчете на 1 моль Mg или другого нешелочного металла.
больших количествах какие-то продукты (не биомассу), то необходимо внести в среду дополнительное количество субстрата, из которого эти продукты образуются. Если какой-либо из компонентов среды PI требуется сделать лимитирующим рост субстратом, то его содержание следует уменьшать до тех пор, пока концентрация биомассы будет значительно ниже максимально возможного уровня.
Обогащение среды аминокислотами и основаниями нуклеиновых кислот обеспечит более экономное расходование глюкозы,
6*
164
Глава 12
поскольку явится источником ассимилируемого углерода и приведет к увеличению скорости роста [134].
В культуре клеток млекопитающих добавление метаболически инертной метилцеллюлозы (0,1%) к минимальной среде значительно уменьшает продолжительность лаг-фазы, предшествующей росту [21]; механизм этого важного эффекта не известен.
12.12.2. Стабильность среды
Главные факторы, влияющие на стабильность среды, — это природа ее компонентов; способность взаимодействовать друг с другом; температура, особенно во время стерилизации нагреванием; pH среды, кислород, свет. Целесообразно рассмотреть влияние этих факторов на основные группы компонентов используемой среды.
Аминокислоты, в частности триптофан, глутамин и аспарагин, являются наиболее лабильными, и по этой причине их нельзя стерилизовать нагреванием, а используют для стерилизации ультрафильтрование. Глутамин полностью разлагается до у-кетопирролидина при нагревании в водном растворе до 100 °C и pH 7 и выдерживании при таких условиях в течение 3 ч; даже при 37°C разложение глутамина идет с заметной скоростью [113]. Цистеин в присутствии кислорода быстро превращается в цистин, растворимость которого значительно ниже (около 0,2% при 20°C), чем у цистеина. Однако с точки зрения питательной ценности цистеин и цистин взаимозаменяемы.
Из водорастворимых витаминов тиамин, рибофлавин, пиридоксин больше всего подвержены распаду. При доступе кислорода и 37 °C растворенный в воде тиамин окисляется в течение недели приблизительно на 50% и теряет биологическую активность. Он распадается при автоклавировании в течение 5 мин при 121 °C [36]. Рибофлавин разрушается в процессе автоклавирования при 121 °C в течение 1 ч при pH 7, но при кислых значениях pH он более устойчив. Рибофлавин светочувствителен и при 32°C может разрушиться за 1 ч на 50% под действием комнатного рассеянного света [178], однако имеются данные и о менее интенсивном разложении рибофлавина — на 13% за 157 ч [25]. Чувствительностью к свету обладают также фолиевая кислота и пиридоксин, но они теряют активность в меньшей степени, чем рибофлавин [25].
Сахара тоже способны до некоторой степени разлагаться при автоклавировании в присутствии неорганических солей и органических соединений, что часто сопровождается окрашиванием в коричневатый цвет. Глюкозиды с фуранозидными группами, например сахароза, при кислых значениях pH и при нагреве
Общие вопросы питания
165
гидролизуются, что во многих случаях не оказывает пагубного действия на культуру, однако для поддержания постоянных условий этого следует избегать. Чистые растворы сахаров обычно устойчивы к автоклавированию.
Из неорганических солей соли аммония следует автоклавировать при pH ниже 7, иначе некоторая часть амиака улетучивается. В средах определенного химического состава основные потери ионов магния, калия, аммония, натрия и фосфата в форме ионов могут происходить при осаждении недостаточно хорошо растворимых солей: смешанной фосфорнокислой соли магния и аммония, фосфорнокислой соли магния и калия, фосфорнокислой соли магния и натрия. В течение нескольких первых часов после приготовления раствора осаждение может и не происходить. По этой причине соль магния нужно автоклавировать отдельно от фосфатов. Растворимость сульфата кальция составляет примерно 0,2%, а фосфатная соль слабо растворима. В средах, не содержащих комплексообразующих агентов, фактически все ионы железа способны выпасть в осадок, создавая недостаток железа в среде, если не проводят сильного подкисления раствора. Фильтры Зейтца могут абсорбировать ионы железа и создавать таким образом дефицит по железу [182]. Естественные среды содержат обычно аминокислоты и другие соединения, хелатирующие микроэлементы. Многие минимальные среды, рекомендованные в литературе, имеют тот недостаток, что не содержат комплексообразующих агентов, предотвращающих осаждение железа и других микроэлементов. Хатнер [152] рекомендует приготовление смеси микроэлементов в виде сухих порошков. Сухие порошки аминокислот и витаминов очень удобны для приготовления сред для культур тканей.
12.13. Заключение
Большая часть работ о питании микроорганизмов касалась вначале вопросов идентификации факторов роста и выбора оптимальной среды на основе качественных исследований, т. е. на добавлении различных субстратов в более или менее произвольных количествах. Конечная цель должна состоять в подборе оптимальных условий на химически определенной среде, что для большинства процессов еще не выполнено. Использование сложных сред неопределенного состава ведет к тому, что многие важные стороны влияния источников питания остаются незамеченными; ярким примером может служить обнаруженная стимуляция синтеза цефалоспорина норлейцином [87]. Развитие на среде определенного состава, оптимального для данного процесса, будет зависеть от выявления функций всех компонентов
166 Глава 12
среды и их взаимодействия. Изучение лимитации роста различными источниками питания в хемостатной культуре ведет к накоплению необходимых знаний о роли каждого из элементов питания. Подобные исследования проводились главным образом при лимитации роста некоторыми источниками углерода и энергии и ионами аммония, калия, магния, фосфора, в то время как роль факторов роста и микроэлементов не анализировали. Изучение роста, лимитированного субстратом, было ограничено главным образом несколькими бактериальными видами, и его следует распространить на многих прокариотов и эукариотов.
Глава 13
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ
13.1. Влияние температуры на скорость роста
Температура окружающей среды является таким фактором, влияние которого на биомассу неизбежно, поскольку температура клетки должна стать такой же, как и температура культуральной среды. В отличие от этого значение pH или активность воды в клетке не обязательно должны уравниваться со значениями их во внешней среде. Температура влияет на скорость клеточных реакций, природу метаболизма, пищевые потребности и состав биомассы.
Влияние температуры на скорость роста показано на рис. 48. В широком диапазоне температур, лежащих ниже оптимума, температурный коэффициент скорости роста соответствует Qiu, равному приблизительно 2, т. е. при повышении температуры на 10 °C скорость роста увеличивается вдвое. При температуре на 10—25 °C ниже оптимальной скорость роста приближается к нулю. Влияние температуры на длительность лаг-периода параллельно действию на скорость роста (разд. 19.5).
13.2. Энергия активации роста
Скорость химических реакций связана с температурой уравнением Аррениуса
(13.1)
где К — скорость реакции, R— газовая постоянная, Т — абсолютная температура, А— константа, зависящая от частоты образования активированных комплексов реагирующих соединений, £ — константа, известная как «энергия активации» или «температурная характеристика».
Из уравнения (13.1) мы имеем
log £ = log А — £/2,30£7\ (13.2)
Следовательно, график зависимости log К от 1/Т должен иметь вид прямой линии с наклоном Е/2, 30RT. Если в уравнении (13.2) скорость реакции (К) заменить удельной скоростью роста (ц) и построить график зависимости log ц от \/Т,
168
I лава 18
Температура, °C
Рис. 48. Удельная скорость роста (ц) простейших и лейкоцитов мыши как функция температуры.
А. I — Escherichia coli на богатой среде [1541;// — психрофнльная псевдомонада 21-Зс [154]; III—Aspergillus nidulans [326J. Б. Лейкоциты мыши [341J.
то определенный участок графика будет представлен прямой линией (рис. 49). Значения энергии активации роста приведены в табл. 15. По данным Моно [216] для Escherichia coli и Тринчи [326] для Aspergillus nidulans, Е — величина постоянная. Данные Ингрэхема [154] указывают, что у Е. coli энергия активации резко увеличивается при снижении температуры ниже 26°C, а у психрофильной псевдомонады, — при снижении температуры
Влияние температуры
169
ниже 12°C. Значение Е для бактерий в верхней части температурного диапазона равно приблизительно 14000 кал; в нижней
Рис. 49. Применимость уравнения Аррениуса к удельной скорости роста микроорганизмов.
I—Escherichia coli на богатой среде; II — психрофильиая псевдомонада на богатой среде 1154]; 1П—Е. coll на минимальной среде 1216); IV—Aspergillus nidulans. 1326].
части температурного диапазона эта величина почти удваивается. График зависимости logp, от 1/Т для лейкемических
Т аблица 15
Значения энергии активации (£) для роста микроорганизмов
Организм Диапазон температур, °C Е, кал
Aspergillus nidulans1) 20—37 14 000
Escherichia coli2) 23—37 13 100
Escherichia coli3) 26—37 16 200 4)
Escherichia coli3) 12-26 28 600
Психрофильиая псевдомонада ') 12-30 12 600 4)
Психрофильиая псевдомонада ') 2-12 23 800
Klebsiella aerogenes [323] 20-40 14 230
Клетки мышиных тканей [341] 31-38 27 500
’) Из данных, приведенных на рис. 49.
Из данных Моно [216], приведенных иа рис. 49.
’) Из данных Ингрехема [154], приведенных на рис. 49.
ч) Пересчитано из данных Ингрехема [154].
170
Глава 13
клеток мышей подобен соответствующему графику для бактерий, с той лишь разницей, что значение Е постоянно лишь на участке от 37 до 30 °C, а при температуре ниже 30 °C значение Е возрастает [341].
Необходимо отметить, что температурный коэффициент скорости роста, выраженный как <2ю, является функцией температурного диапазона, поскольку из уравнения Аррениуса следует:
log Qto = 2,зор (Г + Ю) т • (13.3)
Поэтому Qio должен меняться обратно температуре, но при нормальных для роста температурах этот эффект будет выражен слабо. Значение энергии активации — очень ценный показатель, поскольку дает возможность предсказать влияние температуры на скорость роста в широком диапазоне температур.
Изменения в энергии активации указывают, что могут происходить изменения в реакциях, контролирующих скорость роста, или метаболической регуляции. В пользу этой точки зрения свидетельствуют данные, показавшие, что у Е. coli репрессия р-галактозидазы под влиянием глюкозы ослабевает при температуре ниже 25 °C, а при 10 °C снимается совсем [224].
Температурный диапазон роста отдельных видов бактерий находится примерно в области 35 °C. Экстремальные психрофилы могут расти в интервале температур между —5 и 30 °C, а экстремальные термофилы — в интервале 55—90 °C. Температурный диапазон для роста грибов находится около 30 °C, для клеток млекопитающих — около 12 °C.
13.3. Верхние экстремальные температуры роста
Уменьшение скорости роста при верхних экстремальных температурах может быть следствием как нарушения метаболической регуляции, так и отмирания клеток. В случае отмирания клеток скорость роста жизнеспособной биомассы (х) выражается уравнением
dxjdt = (ц — k)x, (13.4)
где р, —удельная скорость роста и k — удельная скорость отмирания. При высоких температурах скорость отмирания клеток будет превышать скорость роста, если энергия активации отмирания превысит энергию активации роста. В частности, это было обнаружено в случае Klebsiella aerogenes, у которой энергия активации отмирания составляла 32 900 кал, а энергия активации роста равнялась 14 230 кал [323].
Повышение температуры в конечном итоге приводит к разрушению структуры белка, что в свою очередь оказывает влия
Влияние температуры
171
ние на сродство между субстратом и ферментом. Иллюстрацией этому служит сам факт существования ферментов, чувствительных к температуре. У термофильных бактерий, среди которых есть способные к росту при температурах выше 90 °C, имеются белки, обладающие исключительной устойчивостью к температуре [41]. Но в случае психрофилов не обнаружено структурных изменений, способных обусловить устойчивость к холоду
13.4. Влияние температуры на пищевые потребности
Снижение температуры роста бактерии может привести к большому увеличению (на 10—20%) экономического коэффициента (выхода биомассы), рассчитанного по источнику углерода и энергии. У Klebsiella aerogenes при увеличении температуры экономический коэффициент в расчете на глюкозу уменьшался, что было, по-видимому, обусловлено увеличением энергетических затрат на поддержание [323]; энергия активации поддерживающего метаболизма составляла при этом 9000 кал. Температура может оказывать влияние на путь превращений источников энергии и глюкозы. Например, у Lactobacillus brevis окисление глюкозы при 24 °C идет по пути гетеро-ферментативного молочнокислого брожения, а при 37 °C для окисления глюкозы требуется фруктоза в качестве акцептора водорода (с образованием маннита) [75].
При определенной скорости роста экономический коэффициент, рассчитанный по магнию, калию и фосфатам, при уменьшении температуры снижается, что объясняется увеличением содержания в биомассе РНК [315].
При изменении температуры может изменяться потребность в факторах роста. В качестве классического примера назовем Yersina (Pasteurella) pestis, которой во время роста при 37 °C требовалось больше различных аминокислот, чем при 28 °C [137]. Резкое изменение температуры с 28 до 37°С во время роста культуры Y. pestis оказывало летальное действие; чтобы этого избежать, необходимо было менять температуру постепенно (Перт, неопубликованные данные). Отсюда следует, что синтез ряда ферментов у Y. pestis чувствителен к температуре. Для развития Escherichia coli при температуре 44 °C требуется добавлять в среду глутаминовую кислоту и никотинамид [340]. Saccharomyces cerevisiae для роста при 38 °C, но не при 30 °C нуждается в пантотеновой кислоте и хлористом натрии [19].
1 В последнее время появились работы, авторы которых придерживаются мнения об адаптации белков психрофилов к низким температурам (Александров В. Я., Клетки, макромолекулы и температура, Л., Наука, 1975; Лях С. П., Адаптация микроорганизмов к низким температурам, М., Наука, 1976).—• Прим, перев.
172
Г лава IS
13.5. Влияние температуры на образование продуктов
Влияние температуры на вторичный метаболизм и на сверхсинтез промежуточных продуктов обмена может отличаться от влияния температуры на рост. Так, в хемостатной культуре Aspergillus nidulans, лимитированной глюкозой, скорость образования меланина увеличивалась почти в два раза при изменении температуры культивирования с 23 до 37 °C, скорость же роста оставалась при этом постоянной (0,05 ч-1) [283]. У Ash-bya gossypil сверхсинтез рибофлавина наблюдался только при температуре 28 °C, хотя рост был одинаково хорошим при указанной температуре и при 37 °C. Неразмножающиеся клетки A. gossypil, выросшие при 28°C, обладали способностью к одинаковому сверхсинтезу рибофлавина как при 28, так и при 37°C. Следовательно, рост при более низкой температуре ведет, по-видимому, к нарушению нормальной регуляции синтеза ферментной системы, участвующей в образовании рибофлавина [77]. Результаты, полученные при работе с периодической культурой [231], показывают, что температура, оптимальная для синтеза пенициллина, ниже температуры, оптимальной для роста этого гриба, однако, чтобы установить это более точно, необходимо провести проверочные опыты в хемостатной культуре при стационарном состоянии.
13.6. Влияние температуры на состав биомассы микроорганизмов
Изменение температур культивирования оказывает влияние на РНК, белок и липидный состав клеток бактерий и дрожжей [151]. При одной и той же скорости роста содержание РНК в бактериях или дрожжах при снижении температуры увеличивается в несколько раз. Общее содержание белка в дрожжах при изменениях температуры может увеличиваться или уменьшаться в зависимости от природы лимитирующего субстрата. В липидах дрожжей при снижении температуры повышается содержание ненасыщенных жирных кислот. При повышении температуры сверх оптимальной, обеспечивающей максимальную скорость роста клеток Е. coli, отмечали значительное увеличение содержания пальмитиновой кислоты за счет ненасыщенных гексадекеновой и октадекеновой кислот [203]. Вероятно, при изменении температуры липиды мембранной структуры постоянно модифицируются так, чтобы сохранялась их функция. Разрушение мембранной структуры под влиянием температуры, возможно, приводит к утечке метаболитов и, следовательно, к стимуляции их сверхсинтеза.
При изменении температуры происходят качественные и количественные изменения антигенного состава бактерии. Напри
Влияние температуры
173
мер, некоторые антигены У. pestis, необходимые для проявления вирулентности, синтезируются во время роста при 37 °C, но не при 28°C [263]. Подобные наблюдения дают основание думать, что поверхностные структуры бактерий изменяются при изменении температуры роста.
13.7. Механизмы температурного воздействия
Влияние температуры на рост биомассы и ее активность объясняется, по-видимому, влиянием температуры на структуру клеточных компонентов, особенно белков и липидов, температурные коэффициенты скоростей реакций, зависящих в свою очередь от энергий активации этих реакций. Ответная реакция на первичное воздействие включает, вероятно, много вторичных эффектов, связанных с механизмами регуляции метаболизма, специфичностью ферментативных реакций, клеточной проницаемостью и составом клетки. Вторичные эффекты в определенной степени могут нейтрализоваться особыми условиями окружающей среды.
Глава 14
ДЕЙСТВИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ ВОДОРОДА
14.1. Внеклеточное и внутриклеточное значение pH
Влияние водородных ионов на биологическую активность имеет отношение либо к концентрации водородных ионов [Н+], либо к активности водородных ионов (а^. Эти два параметра взаимнопропорциональны: = / [Н+], где f — коэффициент
активности, который может изменяться в зависимости от ионной силы или от других факторов. Стеклянные электроды регистрируют изменение активности водородных ионов, при этом точно выполняется соотношение pH = —log (ад) и вместо аь можно подставить [Н+] только в том случае, если коэффициент активности равен единице. В разбавленной среде / ~ 1, но если среда представляет собой концентрированный солевой раствор, то это может быть далеко от истины. Когда рассматриваются свойства клетки, активность водородных ионов является более существенным параметром, и действие водородных ионов принято выражать через pH.
Плазматические мембраны трудно проницаемы для водородных и гидроксильных ионов, поэтому внеклеточная и внутриклеточная концентрации водородных ионов не уравновешиваются между собой, и, следовательно, должен, по-видимому, существовать трансмембранный градиент концентрации водородных ионов. В соответствии с химио-осмотической теорией Митчелла [214] этот градиент концентрации водорода совместно с электрическим потенциалом мембраны определяет «протонную движущую силу», которая управляет мембранными реакциями.
14.2. Регулирование pH культуры
Во многих исследованиях микробных культур осуществлялся плохой контроль pH, и pH нельзя было отнести к постоянным факторам. Для того чтобы избежать значительного сдвига pH, следует представлять, какие ограничения присущи имеющимся методам регуляции. pH культуры регулируется либо рН-буфе-ром, либо балансом между образованием и потреблением кислот, либо автоматическим добавлением кислоты или основания.
Действие концентрации ионов водорода 175
Ограничение в применении pH буфера имеет две стороны: диапазон возможных значений pH и способности буфера к поглощению и образованию водородных ионов, а также возможное физиологическое влияние буфера. Фосфатный буфер используется обычно для областей pH от 6 до 8. Для значений pH < 6 использовался фталат, а для pH > 8 — борат. Чтобы избежать сдвигов буферной емкости, образование кислот или оснований следует ограничивать правильным подбором состава среды. Избыток карбоната кальция — эффективный способ нейтрализации большого кислотообразования, однако часто этот метод неудобен.
Образование кислот в культуре можно сбалансировать поглощением анионов, таких, как нитрат и ацетат, которые замещаются гидроксильными ионами. Сбалансировать образование оснований можно поглощением катионов, таких, как ионы аммония, которые замещаются ионами водорода. Часто поглощение иона аммония является единственным источником образования кислот. Этого можно избежать, заменив аммоний мочевиной или глицином.
Ограничения вышеприведенных методов регуляции pH можно преодолеть при помощи автоматического добавления кислоты или основания в зависимости от показаний стеклянного электрода. Обычно добавляют соляную, или серную кислоту и одно из оснований — гидроокись натрия, калия или аммония. Газообразному аммиаку следует отдавать предпочтение перед гидроокисью аммония, так как гидроокись аммония, даже в концентрированном виде (0,880), может быть загрязнена бактериальными спорами. Для изучения действия pH на агаровых средах можно создать градиент pH в пластинке агара. Для этого на скошенный слой питательного агара с определенным значением pH наливают слой агара с другим pH [286].
14.3. Влияние pH на рост и метаболизм
Влияние pH на скорость бактериального роста показано на рис. 50. В отличие от кривой температурного эффекта (рис. 48) эта кривая довольно симметрична. Максимальная скорость роста поддерживается в интервале от 1 до 2 единиц pH, а полная область роста — в интервале от 2 до 5 единиц pH.
Значение pH культуры оказывает большое влияние на конечные продукты анаэробного превращения источников углерода и энергии. В анаэробных условиях или при лимитации кислородом у Klebsiella aerogenes в качестве главного продукта сбраживания сахара при pH 5 образуется 2,3-бутиленгли-коль, а при pH 7 вместо значительной части бутиленгликоля
176
Глапа 14
образуется лактат. При анаэробном метаболизме у многих бактерий при кислом значении pH наблюдается тенденция к образованию нейтральных продуктов, а при щелочных значениях pH происходит образование органических кислот. Однако из этого правила есть заслуживающие внимания исключения; в частности, это молочнокислые бактерии и стрептококки, которые при
Рис, 50. Влияние pH среды на максимальные скорости роста бактерий.
A —Escherichia coli в анаэробной среде гидролизата казеина с забуференным pH (из данных |103]). В — Methylococcus caosulatus, выращенный на метане; регуляция pH осуществлялась при помощи автоматического добавления кислоты или основания [127].
кислых значениях pH сбраживают сахар до молочной кислоты, И Acetobacter, окисляющие спирты до кислот также при кислом pH. pH может оказывать влияние на природу конечного продукта сбраживания сахаров у стрептококков и молочнокислых бактерий: при кислых значениях pH это почти полностью молочная кислота, но при повышении pH образуются уксусная и муравьиная кислоты [75]. Таким образом, при более высоких значениях pH образуется больше кислых эквивалентов на каждый моль субстрата. При сбраживании сахара дрожжами при кислых значениях pH образуется этиловый спирт, а при щелочных значениях pH — глицерин и уксусная кислота. Это свидетельствует о том, что значение pH может воздействовать на энергию поддержания (разд. 8.3.3).
Гэйл и Эпс [ЮЗ] наблюдали, что в периодической культуре Escherichia coli, выращенной на гидролизате казеина, оптимум pH для индукции декарбоксилаз аминокислот лежит в кислой
Действие концентрации ионов водорода 177
области (pH 5), а оптимум pH для индукции дезаминаз — в щелочной области (pH 8). Таким образом, метаболические изменения способствуют регуляции pH среды, сдвигая его в сторону нейтральных значений. Это результаты усложняются изменениями в скорости роста, сопровождавшими изменения pH. Эта трудность может быть преодолена с помощью хемостата. Гэйл и Эпс [103] высказали предположение, что количество ферментов регулируется таким образом, чтобы поддержать постоянную активность и компенсировать влияние pH среды.
pH среды благодаря своему действию на диссоциацию соединений, обладающих кислотными и основными свойствами, может оказывать влияние на ингибиторные или токсичные свойства этих соединений. Например, токсичность слабых кислот, таких, как уксусная, часто зависит от pH. Свободные кислоты обладают более высокой растворимостью в липидах, чем ионизированные формы. Следовательно, снижение pH должно способствовать проникновению кислот в клетку.
Зависимость от pH для вторичного метаболизма может отличаться от зависимости для роста и первичного метаболизма. Это было показано для Aspergillus nidulans, у которого удельная скорость образования меланина остается приблизительно постоянной в пределах значений pH от 3 до 7 и увеличивается в двадцать раз при изменении pH от 7 до 7,9 [283].
14.4. Действие pH на состав биомассы и морфологию
Антигенный состав Yersinia pestis изменяется при изменении pH культуры. Так называемый «антиген 4» образуется только при значении pH ниже чем 6,9, а оптимум находится около 5,9 [263]. Значение pH в культурах вида Bacillus влияет на состав клеточной стенки. При лимитации роста фосфатом тейхуроновая кислота образуется в щелочной зоне pH, а при pH <6 в значительной степени заменяется тейхоевой кислотой. Если же рост лимитируется ионами либо магния, либо сульфата, либо аммония, то тейхуроновая кислота отсутствует, а образуется тейхоевая кислота, причем с уменьшением pH ниже 5,0 число групп аланина, связанных в полимеры, увеличивается [91].
Морфология гифов мицелиального плесневого гриба Peni-cillium chrysogenum, выращиваемого в перемешиваемой погруженной культуре, зависит от pH [257]. При pH 6 образуются длинные тонкие нити, а при увеличении pH до 7 гифы укорачиваются, утолщаются и вакуолизируются. Эти результаты свидетельствуют о том, что состав клеточной стенки плесневого гриба изменяется в зависимости от pH и при высоких значениях pH стенки бывают более слабыми и легко разрываются.
178
Глава 14
В общем значение pH во время роста оказывает значительное влияние на природу клеточной поверхности или материал оболочки.
14.5. Молекулярные основы действия pH
Значение pH культуры оказывает воздействие на состав среды и на характер поверхности микроорганизмов, оказывая влияние на диссоциацию кислот и оснований. Это воздействие на поверхность клеток должно оказывать влияние на такие свойства поверхности, как прилипание к стеклу или металлу и флоккуляция биомассы. От значения pH зависит также степень хелатирования ионов металлов.
Наличие плазматической мембраны может сделать внутреннее содержимое клетки до некоторой степени независимым от pH среды, однако очевидно, что pH окружающей среды легко влияет на метаболизм. Равновесие между внешней и внутренней концентрациями водородных ионов может быть достигнуто с помощью наличия в среде слабой жирорастворимой кислоты, такой, как динитрофенол, который может действовать как проводник протона через плазматическую мембрану [214]. Для некоторых бактерий эффект этот можно объяснить способностью липофильных кислот ингибировать рост [101]. Значение pH может воздействовать на конформацию молекул, которая в свою очередь в случае ферментов может влиять на значение Кт [82].
Становится все более очевидным, главным образом в результате применения приборов автоматической регуляции pH и хемостатной культуры, что свойства клеток могут глубоко изменяться в узкой области значений pH. Однако молекулярные основы этого эффекта пока еще мало изучены.
Глава 15
ДЕЙСТВИЕ АКТИВНОСТИ ВОДЫ И ТОНИЧНОСТЬ СРЕДЫ
15.1. Введение
Вода в живых клетках несет четыре основные функции: 1) как химический реагент в клетке, она вступает в реакции гидролиза и конденсации; 2) служит растворителем для клеточного пула метаболитов, таких, например, как аминокислоты, концентрация которых может иметь критическое значение в метаболической регуляции; 3) играет механическую роль, поддерживая тургор клеток, обусловленный гидростатическим давлением, которое развивается в клетках; 4) играет структурную роль, обеспечивая гидратацию белка и других клеточных компонентов. Последняя функция зависит от способности воды образовывать водородные связи с полярными группами. Хотя вода является существенным фактором роста, высушивание биомассы не всегда приводит к летальному исходу.
Содержание воды в клетке выражается как осмотическое давление (атмосферы), тоничность (осмоли) среды, или активность воды. В случае культур микроорганизмов или тканевых клеток осмотическое давление имеет небольшое значение за исключением того случая, когда нужно определить, выдержит ли клетка данную разность давлений через плазматическую мембрану. Тоничность или активность воды более значимая мера наличия воды.
Термин «ионная сила» широко используется в микробиологии для выражения концентрации солей — почти всегда для указания концентрации хлористого натрия, — но он редко используется в физико-химическом смысле, когда ионную силу определяют с помощью следующего равенства:
i = 0,5 + m2z^ + ... + (15.1)
где mi, т2 и т. д. и zb z2 и т. д. — моляльности и валентности ионов в растворе соответственно. Ионная сила i есть «мера интенсивности электрического поля, обусловленного ионами в растворе» [107, стр. 510]. Это электрическое поле влияет на активность как ионов, так и молекул, находящихся в растворе. В разд. 15.10 суммировано это значение I.
180
Глава 15
15.2. Определение активности воды
Активность воды в растворе можно выражать давлением водяного пара подобно тому, как активность в растворе газа, такого, как кислород, выражается эквивалентным давлением газа. Однако установлено, что более удобно соотносить активность воды в растворе (aw) с активностью чистой воды. В соответствии с этим активность воды в растворе выражается отношением давления водяного пара раствора (ps) к давлению чистой воды (pw) при той же температуре:
Ps/Pw* (15.2)
Отсюда следует, что aw эквивалентна относительной влажности атмосферы в равновесии с раствором.
15.3. Взаимосвязь между активностью воды и концентрацией растворенного вещества
В соответствии с законом Роульта для растворов некоторого идеального неэлектролита относительное уменьшение давления пара растворителя равно молярной доле растворенного вещества, т. е
(pw — psVpw = п/(п + N), (15.3)
где п — моли растворенного вещества, a N — моли воды в растворе. Из уравнения (15.2) и (15.3) следует
аш=1 -п/(п + N) (15.4)
или
aw = N/(n-\-N). (15.5)
Если растворенное вещество — электролит, то вместо «подставляем vn, где v — число ионов на молекулу. Если растворенное вещество ведет себя не как идеальное, то истинное число частиц растворенного вещества будет фуп, где ф— осмотический коэффициент (разд. 15.4).
15.4. Взаимосвязь между активностью воды и осмотическим давлением
В соответствии с законом Вант-Гоффа уравнение для осмотического давления л раствора некоторого идеального неэлектролита будет иметь следующий вид:
л1/=п/?7\ (15.6)
где V — объем раствора, п — число молей растворенного вещества, R — газовая постоянная и Т — абсолютная температура.
Действие активности воды и тоничность среды 181
Более точное уравнение дано Морзом:
nV' = nRT, (15.7)
где V'— объем растворителя. Если растворенное вещество ионизировано, вместо п подставляем vn, где v — число ионов, образованных на каждую молекулу растворенного соединения. Для неидеального растворенного соединения в осмотическое давление вносится поправка на осмотический коэффициент ф.
Тогда
т1У' = фупЯТ. (15.!)
Отклонение поведения растворенного соединения от идеального связано с различиями в степени ассоциации, обусловленной вторичными валентностями, возникающими между молекулами растворенного соединения, между молекулами растворителя и между молекулами растворителя и растворенного вещества. Ассоциация между молекулами растворенного соединения приводит к состоянию, когда Ф <Z 1, а ассоциация между молекулами растворенного соединения и водой — к состоянию ф>\.
Если в уравнении (15.7) V выражается в литрах воды, то п/У' можно заменить моляльностью (хотя, строго говоря, моляльность равна моль/кг воды) и уравнение (15.7) примет тогда следующий вид:
л — mRT, (15.9)
где m — моляльность. Если m=l, R = 0,0821 л-атм-град-1 X X моль-1, то при 0 °C л = 22,4 атм. Следует обратить внимание, что л прямо пропорционально абсолютной температуре, и при 30 °C 1 осмоляльный раствор будет оказывать осмотическое давление 24,85 атм.
Соотношение между активностью воды и осмотическим давлением можно найти из термодинамики (разд. 15.11);
n = --^-lnfla), (15.10)
где У— объем 1 моля воды. Подставив значение л из уравнения (15.9), получим
т0 = хтф =— (1 /V) In aw, (15.11)
где Що — реальная осмоляльность. Изменив основание логарифма на 10 и подставив У — 0,018 л/моль, находим
т0 = — 128 log aw.
(15.12)
182
Глава 15
15.5. Измерение тоничности и активности воды
Известны четыре удобных метода для измерения тоничности (осмоляльности) или активности воды в культуральной среде:
1. Осмотические коэффициенты многих обычных солей и других компонентов среды могут быть найдены в физических таблицах [279], и из этих значений может быть вычислена реальная осмоляльность.
2. Снижение точки замерзания раствора (ДТ) пропорционально реальной осмоляльности, поэтому то = КЛТ. Значение константы К можно найти в физических таблицах. Этот метод пригоден лишь при условии, что до достижения точки замерзания никакой кристаллизации компонентов среды не происходит.
3. В основе изопиестических методов лежит определение, стремятся ли водяные пары выйти из исследуемого раствора в стандартный раствор с известной тоничностью [46, 290].
4. В методе, основанном на точке росы, образец среды уравновешивается с атмосферой в аппаратуре «точки росы». Из точки росы для воды может быть вычислено давление водного пара в растворе. Появление этого метода дало возможность определять активность воды с точностью до ±0,003 [6].
Метод точки росы более удобен в случае растворов с высокой тоничностью, а метод точки замерзания дает более точные результаты в случае разбавленных растворов.
15.6. Использование терминов. Тоничность и активность воды
Параметр «активность воды» оказался очень удобным при изучении концентрированных сред и особенно при изучении порчи продуктов, которая предотвращается с помощью слабой активности воды. В случае таких систем удобным параметром служит также относительная влажность, которую можно приравнять к активности воды. В случае разбавленных сред, используемых для культивирования многих микроорганизмов и тканевых клеток, активность воды мало отклоняется от единицы. Тогда более удобны такие параметры, как тоничность, выраженная в виде осмоляльности.
15.7. Тоничность клеточного содержимого
Исследования набухания бактериальных протопластов в средах разной тоничности показывают, что протопласты ведут себя подобно осмометрам [106]. Целостные клетки Escherichia coli набухают или сжимаются соответственно тоничности среды, что
Действие активности воды и тоничность среды
183
было использовано для изучения проникновения в бактерию компонентов среды [215]. Следовательно, клетки Е. coll, по-видимому, эластичны, в отличие от микрококков, имеющих жесткие клеточные стенки, которые не позволяют клеткам изменять их объем. В целом эти результаты свидетельствуют о том, что между внутри- и внеклеточной активностью воды устанавливается равновесие.
Показано, что у Е. coll внутренняя тоничность равна 0,6 осмоля, а у видов Micrococcus—1,0 осмоль [215]. Соответствующее осмотическое давление при 30 °C составляет 15 и 25 атм. Более высокое значение для микрококков находится в соответствии с их способностью расти при более высокой тоничности среды, чем Е. coli. До какой степени условия роста влияют на внутреннюю тоничность, пока еще не было исследовано.
15.8. Отношение скоростей роста к тоничности и активности воды
Установлению оптимальной тоничности культуральной среды уделялось мало внимания; обычно считалось, что она должна быть примерно такая, как у физиологического солевого раствора, используемого в опытах с животными. Эта точка зрения отражает медицинское происхождение микробиологии. Данные по влиянию водной активности и тоничности среды на скорость роста микроорганизмов приведены на рис. 51 и в табл. 16. Они свидетельствуют о том, что тоничность, оптимальная для
Таблица 16
Оптимальные и минимальные значения активности воды и соответствующие тоничности, требующиеся для роста микроорганизмов
Активность воды Тоничность (mc) ])
Организм оптималь- минималь- оптималь- мииималь
пая пая ная ная
Pseudomonas fluorescens [352] 0,999 0,96 0,05 2,3
Klebsiella aerogenes [353] 0,999 0,95 0,05 2,9
Salmonella newport [290] 0,994 0,95 0,28 2,9
Staphylococcus aureus [290] 0,994 0,86 0,28 8,4
Aspergillus niger [290] 0,975 0,86 1,28 8.4
Aspergillus amstelodami [290] 0,96 0,70 2,15 19,8
L-клетки мыши [262] 0,995 0,993 0,30 0,40
’) Реальная осмоляльность.
184
Глава 15
скорости роста, может значительно отличаться от тоничности физиологического раствора (0,9% хлористого натрия). Плесневый гриб Aspergilus amstelodami относят к ксерофилам, поскольку он способен к росту при очень низкой активности воды. Среди
Активность воды
Рис. 51. Удельные скорости роста как функции активности воды и тоничности среды.
/ — Salmonella newport (из данных Кристиана и Скотта [53]); II—Staphylococcus aureus (из данных Скотта (2891); III — Aspergillus amstelodami (из данных Магвира и Скотта, пит. Скогтом J290]). Реальная осмоляльность вычислена из уравнения mQ = —128 log aw.
микроорганизмов лучше всего переносят низкую активность воды осмофильные дрожжи, для роста которых минимальная активность воды составляет 0,6. Оптимальная активность воды для скорости роста A. amstelodami не зависит от того, использовались ли для создания тоничности сахароза, глюкоза, хлористый магний, хлористый натрий или глицерин. Однако максимальное значение скорости роста зависит от природы растворимого и уменьшается при использовании указанных соединений в приведенном выше порядке, начиная с сахарозы [290].
Действие активности воды и тоничность среды
185
15.9. Влияние тоничности на состав клетки и метаболизм
Увеличение содержания хлористого натрия в среде приводит к увеличению содержания калия у Klebsiella aerogenes в несколько раз [318], таким образом, значение экономического коэффициента по калию зависит от содержания в среде хлорида натрия Очевидно, в данном случае проявляется не специфическое воздействие хлористого натрия, а влияние тоничности [54].
От содержания хлористого натрия в среде зависит состав клеточной стенки Bacillus subtilis. При лимитации роста фосфатом, нейтральном значении pH и концентрации хлористого натрия <1% стенки клеток содержат в качестве главного полимера тейхуроновую кислоту, но при увеличении содержания хлористого натрия в среде от 1 до 6% тейхуроновая кислота заменяется тейхоевой кислотой [90].
Уменьшение активности воды от 0,993 до 0,90 с помощью хлористого натрия в культуре Staphylococcus aureus приводит к тому, что содержание воды в клетке уменьшается до 50%. Это сопровождается увеличение.м внутриклеточной концентрации хлористого натрия и аминокислотного пула [54]. Кроме того, высокая концентрация хлористого натрия в среде приводит к резкому увеличению концентрации L-пролина в аминокислотном пуле некоторых бактерий [52]. Галофильные бактерии [184] требуют для роста больших концентраций хлористого натрия (от 5 до 25%). Но в этом проявляется потребность не непосредственно в высокой тоничности, а специфическая потребность в высокой концентрации хлорида щелочного металла. Эти бактерии имеют необычно высокое содержание ионов калия, натрия и хлоридов; их ферменты отличаются необычной потребностью в высоких концентрациях хлористого калия и натрия для проявления своей активности.
Высокая концентрация хлористого натрия приводит к увеличению энергии поддержания у дрожжей (разд. 8.3.3) и изменению анаэробного метаболизма глюкозы — вместо этилового спирта образуется глицерин [342, 313].
15.10. Механизм влияния тоничности
Действие изменения концентрации растворенного в среде соединения зависит, если, конечно, оно не специфично, или от активности воды, или от ионной силы i, определяемой по уравнению (15.1). До какой степени эти разные факторы участвуют в наблюдаемых изменениях — неизвестно. Предварительное исследование (Парк и Перт, неопубликованные данные) влияния изменения тоничности при добавлении различных электролитов и неэлектролитов к среде для Klebsiella aerogenes показало, что между скоростью роста и ионной силой никакой корреляции
186
Глава 15
нет, хотя между активностью воды и скоростью роста имеется корреляция, подобная той, которая обнаружена у Salmonella (рис. 51).
Нет оснований считать, что набухание клеток само по себе имеет для роста важное значение, хотя неблагоприятное действие гипотонической среды может привести к разрушению клеток. Наиболее вероятно это в случае организмов, не имеющих клеточных стенок для защиты плазматической мембраны, таких, например, как микоплазмы или клетки млекопитающих, или в том случае, если клеточные стенки ослаблены. Концентрирование или разбавление клеточных пулов метаболитов за счет осмотического эффекта при изменении тоничности может, очевидно, повлиять на регуляцию метаболизма с помощью механизмов обратной связи и репрессии. Дегидратация может привести к изменениям в конформации макромолекул и, таким образом, повлиять на их функции.
Не имеется никаких данных, что при данном значении pH эффект электрического поля, связанный с ионной силой i, играет какую-то роль, кроме своего действия на активность воды.
Способность ионов ассоциироваться с молекулами воды и, следовательно, понижать активность воды описывается рядами Хофмайстера: для анионов — сульфат > ацетат > хлорид > нитрат; для катионов — магний > кальций > литий > натрий > > калий. Анионы при этом обладают более сильным действием, нежели катионы [107]. Таким образом, чтобы свести к минимуму влияние ионной силы на активность воды в культуральной среде, следует использовать электролиты, ионы которых расположены в рядах Хофмайстера ближе к концу. В пользу этой точки зрения говорят данные о том, что скорость дыхания нерастущих бактерий в присутствии катионов уменьшается, причем это действие тем заметнее, чем дальше от калия расположен в ряду Хофмайстера используемый ион [153].
15.11. Вывод соотношения между осмотическим давлением и активностью воды
Это соотношение может быть выведено из сравнения общей работы, затраченной на то, чтобы извлечь из раствора 1 моль воды с помощью осмоса, с затратами работы на извлечение той же воды выпариванием и конденсацией. Предположим, что с помощью аппаратуры, изображенной на рис. 52, А, в изотермических и обратимых условиях мы вытесним из раствора 1 моль воды через полупроницаемую мембрану, приложив для этого давление чуть большее, чем осмотическое давление в растворе (л). Затраченная работа будет равна лР, где V — объем 1 моля воды в растворе.
Действие активности воды и тоничность среды
187
Предположим, что выпаривание и конденсация в изотермических и обратимых условиях проводится с помощью аппаратуры, представленной на рис. 52, Б. Создав под поршнем давление немного меньшее, чем давление водяного пара ps, сначала при открытом клапане а и закрытом клапане б из раствора выпаривают 1 моль воды. Затраченная во время выпаривания работа будет psVi = RT, где Pi— объем водяного пара при давлении ps. Затем при закрытых клапанах а и б пар сжимается
А
1 2
Б
Рис. 52.
А. Устройство для обратимого извлечения воды из раствора с помощью осмоса, л—осмо тическое давление в растворе, Р— гидростатическое давление, прикладываемое к поршню. Б. Устройство для обратимого извлечения воды из раствора с помощью выпаривания н конденсации: а и б —клапаны: pg—давление на поршень; ps и pw—давление водяного пара в растворе и воде соответственно. 1 — вода; 2—раствор; 3— полупроницаемая мембрана: Pw и Ps — давление водяного пара воды и раствора соответственно.
от давления ps до давления pw и работа, затраченная на вытеснение 1 моля воды, будет равна RTln(pw/ps). Затем клапан б открывают и пар конденсируют в чистую воду; производимая при этом в системе работа выражается равенством
где V2 — объем 1 моля водяного пара при давлении pw. Работа, затраченная на выпаривание и конденсацию, имеет противоположный знак и сокращается. Таким образом, общая затраченная работа равна RTln(pu,lps'). Поскольку общая работа, совершенная за счет осмоса и выпаривания, должна быть одинакова, то
лР = RJ In (pjps). (15.13)
Следовательно,
л = — -у^1паш. (15.14)
Это выражение также можно вывести из уравнения (15.4), если принять, что
п/{п + N) = n/N,
188
Глава 15
что справедливо для разбавленных растворов; тогда для идеального неэлектролита из уравнения (15.4) следует, что
aw—l—n/N. (15.15)
Приняв, что у = n/N, и прологарифмировав это выражение, получим, что
In aw = In (1 — у).
Из разложения в ряд 1п(!—«/) = —у — у2/2 — у3/3 ... следует, что для малых значений у In (1 — у) ~—у. Подставляя это в уравнение (15.15), получим
\naw = -n/N. (15.16)
Если т — моляльность раствора, то n/N = m/55,5, так как 1 кг воды = 55,5 моля. Подставив это значение в уравнение (15.16) и приведя логарифм к основанию 10, получаем
т = — 128 log Яд,.. (15.17)
Было показано, что это уравнение следует также из уравнения (15.14) (разд. 15.4). Уравнения (15.16) и (15.17) не дают одинаковых значений для активности воды, поскольку при выводе уравнения (15.16) было допущено упрощение. Однако различие в оценках пренебрежимо мало для водных активностей >0,9.
Глава 16
ОБРАЗОВАНИЕ ПРОДУКТА В КУЛЬТУРАХ МИКРООРГАНИЗМОВ
16.1. Введение
Развитие микробиологических процессов для образования продуктов, таких, как антибиотики, аминокислоты, белки, направлено на оптимизацию (максимизацию) трех моментов: выхода продукта в расчете на 1 г субстрата, концентрирования продукта и скорости образования продукта. Основные направления развития одного из таких процессов показаны в табл.17. Не все факторы, указанные в табл. 17, имеют значение в каждом процессе, однако при рассмотрении нового процесса a priori никакой из этих факторов нельзя полностью исключить. Все четыре аспекта развития процесса, приведенные в табл. 17,
Таблица 17
Картина развития ферментационных процессов
I. Первоначальная селекция штамма микроорганизмов
II. Определение оптимальных значений температуры, pH, тоничности и потребности в кислороде
III. Определение оптимального режима питания н концентрирования биомассы
IV. Изменение генетической структуры организма для увеличения образования продукта
в основном относятся к настройке метаболической регуляции в организме. В норме метаболизм настроен так, чтобы производить только минимальное количество необходимых метаболитов; при этом возможно также образование небольшого количества несущественных вторичных метаболитов. Обычно это означает, что практически весь источник углерода превращается в биомассу и в конечные продукты энергетического метаболизма. Успешное управление образованием продуктов сводится к такому вмешательству в метаболическую регуляцию, которая приводит к сверхсинтезу желаемого продукта. Средства, применяемые в ферментационных процессах, для вмешательства в метаболическую регуляцию, рассматриваются в работе Димейна
190
Глава 16
[7 7]. К несчастью, пути биосинтеза продуктов часто изучены недостаточно полно, чтобы целенаправленно изменять регуляторные механизмы в определенных точках. Поэтому для улучшения продуктивности прибегают к селекции при случайном выборе различных внешних условий и использованию мутантов. Наибольший размах целенаправленного изменения метаболической регуляции получили исследования образования аминокислот и нуклеотидов. Димейн [77, стр. 351] ссылался на возможность угнетения синтеза продуктов под действием самих продуктов. В отношении вторичных метаболитов данные о наличии такого же эффекта немногочисленны, но ингибирование образования пенициллина высокими концентрациями пенициллина [НО] может служить его ярким примером.
В табл. 18 приведена классификация продуктов ферментации, основанная на структурном и функциональном значении этих соединений.
Таблица 18
Классификация продуктов ферментации
Класс Примеры
I. Конечные продукты энергетического мета- Этиловый спирт, метан
болизма II. Энергетические запасные соединения Гликоген
Ш Ферменты внеклеточные внутриклеточные IV, Структурные компоненты клетки Амилазы P-Галактозидаза Велки одноклеточных,
V. Промежуточные метаболиты антигены Витамин В52» аминокисло-
VI. Вторичные метаболиты ты, лимонная кислота Антибиотики
VII. Трансформированные субстраты Стероиды
VIII. Вирусы Вирусы полиомиелита
Процессы каждого класса в общем имеют один и тот же принцип контроля, например, соединения, играющие роль энергетического резерва, обычно образуются только, когда источник энергии не лимитирует роста [347]. Продукты могут либо экскретироваться в среду, либо задерживаться в биомассе или на ней. Внеклеточные продукты могут быть растворимыми или нерастворимыми, а чрезмерный сверхсинтез может привести
Образование продукта в культурах микроорганизмов 191
к осаждению продукта, например, при образовании окситетрациклина.
Под термином вторичные метаболиты подразумеваются несущественные метаболиты, например антибиотики и гиберел-лины. Поскольку вторичный метаболизм не является необходимым для роста, то возможен отбор непродуктивных вариантов организмов во время длительного непрерывного роста.
Примечательно, что хемостатная культура не используется для промышленного получения каких-либо микробных продуктов, за исключением белка для кормов и, в небольшой степени, пива. Это отражает сугубо эмпирическую природу периодических процессов и недостаток наших знаний о важнейших контролирующих условиях.
16.2. Отношение скорости роста к скорости образования продукта
16.2.1. Продукт связанный с ростом
Общая скорость образования продукта описывается уравнением
dp/dt — qpx, (16.1)
где р — концентрация продукта, х— концентрация биомассы, a q$— удельная скорость образования продукта. Если продукт «связан с ростом» или «ассоциируется с ростом», то количество образованного продукта прямо пропорционально образованной биомассе. Следовательно,
dp = YPixdx, (16.2)
где Ур/Х — выход продукта, отнесенный к образовавшейся биомассе. Отсюда следует
dp/dt = Ypix dx/dt = Yptxp.x. (16.3)
Если выразим выход продукта по отношению к использованному субстрату, то получим
dp = Yp/s ds, (16.4)
где Уp/s — выход продукта, отнесенный к использованному субстрату. Следовательно,
dp/dt = Ypls ds/dt = Yp/Sp.x/Yxis, (16.5)
где Уx/s —экономический коэффициент, отнесенный к использованному субстрату. Сравнивая уравнения (16.5) и (16.3), видим, что
Ypls/Yxls = Yplx.
(16.6)
192
Глава 16
Как следует из уравнения (16.1) и (16.3), удельная скорость образования продукта дается уравнением
= (16.7)
Процессы, связанные с ростом, — это обычно такие процессы, которые необходимы для функционирования организма. Они включают в себя образование клеточных стенок и необходимых ферментов. Выход продукта Yp/X может быть пропорционален удельной скорости роста; примером является образование РНК-Необычным примером служит фермент глюкозид-3-дегидрогена-за у Agrobacterium tumefaciens, который трансформирует сахарозу в 3-кетосахарозу [180]. В этом случае Y p/s = Ку, где k — константа.
Следовательно,
= = W (I6-8)
16.2.2. Продукт, не связанный с ростом
Образование продуктов, не связанных с ростом, может быть двух типов: или значение <?Р не зависит от скорости роста, или же находится в сложной зависимости от скорости роста. Иллюстрацией первого случая служит образование пенициллина Penicillium, которое не зависит от удельной скорости роста, если она выше 0,015 ч-1. При более низких скоростях роста наблюдается ослабление биосинтетической активности [261].
Значение qp для продукта, не связанного с ростом, может быть сложной функцией удельной скорости роста. Примером такого типа является образование меланина Aspergillus niger [283], которое выражается уравнением
^р = ^рах — (16.9)
где <7Ртах и k — константы. Подобно этому образуются циклодекстрин из крахмала с помощью Bacillus macerans [183] и споры у Bacillus subtilis [69].
Если образование продукта частично связано с ростом и частично не зависит от скорости роста, то
<7Р = ^ + 0. (16.Ю)
Образование конечных продуктов энергетического метаболизма следует этому выражению, где р включает образование продуктов как результат энергетических затрат на поддержание, так и разобщения фосфорилирования. Образование молочной кислоты из сахара видами Lactobacillus также подчиняется этой модели [190].
Образование продукта в культурах микроорганизмов 193
16.3. Скорость распада продукта
Скорость распада продукта будет влиять на скорость накопления продукта, при этом общее выражение для скорости накопления продукта в периодической культуре будет выражаться следующим равенством:
dp/dt = YP/Xp.x + fix — Z, (16.11)
где два первых члена правой части уравнения (16.11) представляют собой образование продукта, связанное и не связанное с ростом соответственно, a Z — скорость распада продукта. Функция Z могла бы быть пропорциональна концентрации биомассы, если процесс распада имеет ферментативную природу. Распад энергетических запасных соединений может наступить быстро, если исчерпался источник энергии, например гликоген у дрожжей [50]. Пенициллин характеризуется значительной скоростью спонтанного распада. Это свидетельствует о ферментативном характере распада пенициллина во время ферментации [ПО].
16.4. Образование продукта в периодической культуре
16.4.1. Во время роста
Образование продукта во время роста в периодической культуре в бесконечно малый промежуток времени dt описывается уравнением
dp — qpxdt, (16.12)
где х — концентрация биомассы (рис. 53). Если qP постоянно, то концентрация продукта через время t будет
р ь
dp = qp х dt.
Ро о
Следовательно,
ц
р = Ро + qp xdt.
о
(16.13)
(16.14)
Значение интеграла в уравнении (16.14) можно получить графически, из области под кривой x(t). Можно также проинтегрировать выражение для х. Если рост экспоненциальный, то можно записать х — Подставив это выражение в уравнение (16.14), получим
Р = Ро + <7рЛ:о(еи'‘— 1)/р.
(16.15)
7 Зак. 737
194
Глава 16
Увеличение биомассы может происходить и по линейному закону, если субстрат, лимитирующий рост, доставляется с постоянной скоростью с помощью диффузионной капсулы (разд. 21.6).
Рис. 53. Накопление продукта в периодической культуре как функция времени.
х —концентрация биомассы, р—концентрация продукта, — удельная скорость образования продукта.
16.4.2. Падение синтетической активности
Скорость синтеза продукта падает после прекращения роста. Ослабление синтеза начинается, вероятно, когда скорость роста падает до критического, близкого к нулю значения. Предположим, что qp постоянна до тех пор, пока во время t рост не прекратится. Затем qp падает (рис. 53). Тогда во время фазы затухания синтетической активности образование продукта в очень малый интервал времени dt будет
dp = xmqpdt, (16.16)
где хт — максимальная концентрация биомассы. Увеличение концентрации продукта описывается уравнением
Рг
\dp = xm
$ <h dt, t,
(16.17)
где pt и p2 — концентрации продукта во время ti и /г соответственно (рис. 53). Интеграл от qPdt есть область под кривой dp(t) от it до /г- Если затухание активности экспоненциально
Образование продукта в культурах микроорганизмов 195
или процесс распада ферментов соответствует реакции первого порядка так, что dqp/dt = Kqp, где К — константа, тогда
?Р = ?Р(о>е-^. (16.18)
Следовательно,
log<7P = log<7p(0) — -2^0 t (16.19)
и наклон графика дает константу скорости затухания К. Полупериод затухания активности будет равен (1п2)//С Экспоненциальное затухание активности синтеза было установлено для глюкозид — 3-дегидрогеназной системы у Agrobacterium [96] при минимальном полупериоде около 8 ч. В случае синтеза пенициллина затухание было ближе к линейному, чем к экспоненциальному [261].
16.5. Образование продукта в хемостатной культуре
16.5.1. Общие принципы
Скорость образования продукта в хемостате описывается уравнением
dpldt = qpx — Dp (16.20)
и в стационарном состоянии, когда dpldt — 0,
p=qp~x!D. (16.21)
Если продукт строго связан с ростом, то концентрация продукта и продуктивность (Dp) будут так же изменяться при изменении D, как и биомасса. Если qp не зависит от скорости роста, то концентрация продукта изменяется обратно пропорционально скорости разбавления, и в широком диапазоне скоростей разбавления скорость выхода постоянна (рис. 54). Однако при £>->0 предположение о том, что qp — константа, становится несправедливым, поскольку либо активность ферментов начинает затухать, либо истощается один из необходимых субстратов.
Если образование продукта частично связано, а частично не связано с ростом [уравнение (16.10)], то при изменении скорости разбавления концентрация продукта будет изменяться, как это показано на рис. 55. При D — 0 продуктивность обусловлена продуктом, не связанным с ростом p.v = $YX/Ssr.
16 5.2. Временное образование продукта
Если в хемостате продукт образуется временно, как показано на рис 56, то кумулятивный выход продукта с момента, когда
7*
196
Глава 16
его образование начинается, описывается уравнением
t,
pc — D^pdt. (16.22)
о
Интеграл р dt будет соответствовать площади под кривой p(t) (рис. 56) между моментами времени 0 и ti. Этот метод был
Рис. 54. Несвязанное с ростом образование продукта в хемостатной культуре, если qp не зависит от скорости роста.
Концентрация субстрата в свежей питательной среде sf = 10t К5==0,01, Уху$ = О,5, Р»т = 1,0, ?р«1,0; р—концентрация продукта в стационарном состоянии, скорость выхода продукта.
использован для определения кумулятивного образования интерферона в хемостатной культуре [324].
16.5.3. Влияние концентрации биомассы
Один из способов повысить скорость образования продукта сводится к повышению концентрации биомассы [уравнение (16.11)]. Для повышения концентрации биомассы используются следующие пути: увеличивают концентрацию лимитирующего рост субстрата, удаляют все продукты, способные ингибировать рост, или же используют один из способов возврата биомассы (разд. 6.3).
Скорость разбавления (D)
Рис. 55. Концентрация (р) и скорость выхода продукта (Dp) в хемостатной культуре, если образование продукта частично связано с ростом, г. е.
= + Р-
Концентрация субстрата в свежей питательной среде sr = 10, К4=0,01, Кх/5==0,5, Кр/х=1,0. 9=0,1.
Рис. 56. Временное образование продукта в хемостатной культуре при постоянной биомассе и постоянной скорости разбавления.
198
Глава 16
Если возврат биомассы используют в условиях, когда выход продукта (Ур/х) представляет собой величину постоянную, а образующийся продукт является внеклеточным и растворимым, то концентрация продукта не может превышать значения УP/Ssr, где sr — концентрация лимитирующего рост субстрата в подаваемой среде. В этом случае увеличение производительности достигается за счет увеличения скорости разбавления.
Если <7р не зависит от скорости роста, то концентрация внеклеточного продукта в хемостате с возвратом биомассы будет
Рис. 57. Концентрация продукта р и выход его Dp в хемостатной культуре с возвратом биомассы (/) и без возврата (II), если qp — постоянно; коэффициент концентрирования биомассы равен 2.
больше, чем в простом хемостате, во столько раз, во сколько различается концентрация биомассы в двух системах (рис. 57). Это отношение практически равно коэффициенту концентрирования, т. е. производительность будет увеличена во столько же раз, во сколько будет увеличена концентрация биомассы.
В таких процессах, как образование пенициллина, для которых существует некоторая удельная скорость, ниже которой начинается затухание синтетической активности, критическая скорость разбавления, необходимая для поддержания значения 9р, будет увеличена в а раз, поскольку в стационарном состоянии п = а/)(где а — коэффициент концентрирования).
16.5.4. Затухание синтетической активности в нерастущей биомассе
При малых скоростях роста, а также при отсутствии роста синтез продуктов, не связанных с ростом, затухает. Затухание активности синтеза в нерастущей биомассе в хемостате моделируется следующим образом. Предположим, что два хемостата
Образование продукта в культурах микроорганизмов
199
соединены в батарею (разд. 6.4.1) так, что рост биомассы и образование желаемого фермента происходит в первой стадии, а образование продукта нерастущей биомассой — во второй стадии. Предположим также, что во второй стадии добавляются все субстраты, необходимые для нужного нам синтеза. Еще предположим, что роста биомассы во второй стадии не происходит из-за исчерпания какого-то субстрата; однако если этот субстрат является источником энергии, то условия для поддержания
Рис. 58. Затухание синтетической активности (qp) в элементе биомассы как функция времени.
жизни удовлетворяются так, что уровень биомассы остается постоянным. Мы полагаем, что активность синтеза в биомассе затухает во времени в соответствии с функцией, приведенной на рис. 58. Пусть df— часть биомассы с временем удержания между t и / + dt, тогда вклад этой биомассы в скорость образования продукта будет
(dp/dt^ = qрх df, (16.23)
где х — концентрация биомассы. Из распределения времени удержания для хемостата мы можем подставить df = De~Dt (разд. 5.4). В стационарном состоянии общая скорость dp/dt образования продукта будет суммой всех отдельных вкладов между временем удержания от 0 до т, где т — время, когда qP = 0.
Следовательно,
т
У' (dp/dtfi — dp/dt = xD qpe~Dt dt. (16.24) о
200
Г лав-а 16
Пусть Dl2 — скорость разбавления при переходе из первой стадии процесса во вторую, тогда производительность для второй стадии в стационарном состоянии описывается балансом
Выход = Вход + Образование, или т
£>2Р2 = ^12Р1 + D2x2 qpe~Dlt dt, (16.25)
о
где pi и рг — концентрация продукта в первой и во второй стадии соответственно, а х2 — концентрация биомассы во второй стадии. Значение qP как функции t можно определить экспериментально из одиночного хемостата, в котором скорость потока среды и прочие условия изменены так, чтобы рост прекратился, т. е. чтобы были имитированы условия второй стадии [26]. Интеграл в уравнении (16.25) может быть найден графически или аналитически. В случае ферментации пенициллина Перт и Риге-лато [261] установили, что скорость уменьшения qp была постоянна в соответствии с уравнением
<7р = <7р(о) —V- (16.26)
Подставляя это выражение для qP в уравнение (16.25), можно предсказать, что концентрация пенициллина во второй стадии будет подчиняться соотношению
P2 — -^-pi + {(е ^р(°)/*р- 1)-^- + <7Р(о)}> (16.27)
где время, в течение которого активность синтеза пенициллина падает до нуля, равно qP(o>lkp-
Если затухание активности происходит экспоненциально, мы можем записать qP — qP(0)e~Kt, где К — константа затухания скорости. Подставив это выражение для qP в уравнение (16.25), для концентрации продукта получим
p2 = ^p1 + -r2Vp(0)/(/< + Z)2). (16.28)
16.6. Регулирование затухания биосинтетической активности
Поддержание биосинтетической активности, не связанной с ростом, является острейшей проблемой ферментации вторичных метаболитов, таких, в частности, как образование пенициллина. Условия, ведущие к потере биосинтетической активности, можно подразделить на четыре основных случая: 1) ингибирование метаболитами или продуктами, 2) утечка промежуточных мета
Образование продукта в культурах микроорганизмов
201
болитов из биомассы за счет диффузии; 3) обратимая ферментативная инактивация какого-либо фермента, как это описано для глутаматсинтетазы [143]; 4) необратимый распад какого-то существенного фермента. Особенно важен четвертый случай [320].
Затухание скорости образования пенициллина у Penicillium chrysogenum происходит при скоростях роста ниже чем 0,014 ч-1 [261], а скорость затухания, если рост прекращается, изменяется обратно пропорционально предшествующей скорости роста. В отличие от этого потеря 3-кетодегидрогеназной активности в нерастущих клетках Agrobacterium не зависит от предшествующей скорости роста [181]. В последнем случае субстрат, лимитирующий рост, имеет некоторое влияние на скорость затухания: она меньше при лимитировании роста углеродом и больше при лимитировании фосфатом.
Нерастущим клеткам свойствен распад ферментов, связанный с обновлением белковых молекул. Поэтому, используя ингибиторы обновления белковых молекул, можно уменьшить распад ферментов. Изменения свойств биомассы при приближении скорости роста к нулю обсуждаются в гл. 18.
16.7. Влияние окружающих условий на образование микробных продуктов
16.7.1. Общие замечания
Влияние факторов внешней среды на образование продуктов при ферментации, за небольшим исключением, можно выразить с помощью конечной или максимальной концентрации продуктов. Однако этот конечный эффект предопределяется следующими независимыми факторами: 1) концентрацией биомассы; 2) удельной скоростью образования продукта <?Р; 3) выходом продукта из субстрата Ур/5; 4) длительностью синтетической активности и 5) скоростью распада продукта. В конечном счете оптимизацию можно анализировать, исходя из этих пяти факторов. Значение удельной скорости роста биомассы связано главным образом с влиянием на qv.
Условия, оптимальные для роста и индукции синтетической активности, могут отличаться от условий оптимальных для образования продукта. Таким примером служит образование рибофлавина (разд. 13.5).
Чтобы увеличить образование продукта, следует использовать влияние самых различных факторов. Влияние физико-химических факторов, температуры, pH, тоничности и напряжения растворенного кислорода обсуждается в специальных главах, посвященных этим факторам. Из питательных веществ важное
202
Глава 16
значение имеют следующие факторы: природа субстратов, особенно в случае источников углерода и азота; концентрации субстратов (находится ли этот субстрат в концентрации, лимитирующей рост организма, или нет); доставка предшественников продукта и стимуляторов.
16.7.2. Источники углерода и энергии
Избыток определенного источника углерода или энергии ингибирует образование продукта, вероятно, с помощью механизма, известного под названием катаболитной репрессии [77]. Примерами катаболитной репрессии могут служить ингибирование избытком глюкозы образования пенициллина и образования дифтерийного токсина [277]. Репрессию можно преодолеть с помощью эмпирического подбора источника углерода, например, для образования пенициллина взять лактозу, а для дифтерийного токсина — мальтозу. Можно также непрерывно добавлять источник углерода, так, чтобы он не был в избытке. Использование смешанных источников углерода может дать лучший выход, чем использование какого-нибудь одного источника углерода. Например, добавление ацетата в среду с глюкозой увеличивает образование глутаминовой кислоты у видов Corynebacterium [5]. Установлено, что для ферментации антибиотиков часто лучшими средами являются смеси углеводов с жирами, чем одни углеводы.
16.7.3. Источники азота
Обычно используют такие источники азота, как аммиак, нитрат, аминокислоты, пептон и белки. У видов Corynebacterium избыток аммиака ингибирует образование глутаминовой кислоты, поэтому аммиак добавляется отдельными порциями [169, стр. 267]. У видов же Brevibacterium, напротив, высокая концентрация ионов аммония благоприятствует образованию L-npo-лина [230]. Комплексные источники азота, такие, как кукурузный экстракт, белки зерновых, рыбная мука, часто стимулируют образование вторичных метаболитов, но механизм этого действия еще не ясен.
16.7.4. Дефицит источников питания
Образование продукта часто стимулируется созданием дефицита источников питания. Лимитация фосфатом стимулирует в некоторых случаях биосинтез антибиотиков [77]. Дефицит по микроэлементам стимулирует образование лимонной кислоты у
Образование продукта в культурах микроорганизмов 203
Aspergillus niger и рибофлавина у дрожжей. Необходимо следить, чтобы действие лимитации субстратом не маскировалось другими ингибирующими эффектами, такими, как катаболитная репрессия, вызванная избытком других субстратов.
Дефицит по биотину стимулирует сверхсинтез глутамата у видов Corynebacterium. Это действие приписывается увеличению проницаемости плазматической мембраны для глутаминовой кислоты [169, стр. 314]. В присутствии избытка биотина внутриклеточная концентрация глутаминовой кислоты повышается, но при этом плазматическая мембрана препятствует выходу этой аминокислоты из клетки [77]. Выделение глутаминовой кислоты из бактерий, растущих в среде с избытком биотина, может быть вызвано добавлением в среду пенициллина или поверхностно-активных веществ. Этот эффект объясняется, по-видимому, разрушением поверхностных слоев бактерий, что сказывается на проницаемости мембран [169].
16.7.5. Предшественники продукта
Добавление предшественника продукта часто стимулирует образование продукта. Лучшим примером служит стимуляция образования пенициллина при добавлении фенилуксусной кислоты, образующей боковую цепь пенициллина G. Предшественник увеличивает gpen в несколько раз и ведет к преимущественному образованию пенициллина G по сравнению с другими пенициллинами. Другие примеры предшественников продукта, стимулирующих ферментацию, рассматриваются в работе Димейна [77].
16.7.6. Стимуляторы
Стимуляторами называются соединения, которые, не являясь предшественниками продукта, способны стимулировать образование специфичных продуктов. Обзор данных об использовании таких стимуляторов можно найти в работе Перлмана [236]. Ярким примером служит использование метионина или его аналога норлейцина для стимуляции образования цефалоспорина С [87]. Барбитураты направляют биосинтез рифамицина в сторону образования его определенного производного [201]. Окисление микроорганизмами холестерина в андростадиен-3,17-дион стимулируется комплексообразующими агентами [236]. Образование лимонной кислоты у Aspergillus стимулируется метанолом и пропанолом [220]; не исключено, что этот эффект обусловлен влиянием на проницаемость мембраны. В связи с этим следует отметить, что поверхностно-активные вещества стимулируют как сверхсинтез рибофлавина у дрожжей [76], так и образование
204 Глава 16
некоторых ферментов, участвующих в первичной атаке субстрата [273]. Бензилтиоционат стимулирует образование хлор-тетрациклина [145]. Образование деметилтетрациклина стимулируется добавлением в культуру сульфонамидов или этионина, ингибирующих ферментативное метилирование. Бензимидазол ингибирует рост Saccharomyces cerevisiae и вызывает выделение ксантина [94]. v
В общем можно сказать, что механизм действия стимуляторов неизвестен и что некоторые из них, по-видимому, действуют путем ингибирования или активации специфических ферментативных реакций.
Глава 17
ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ ИНГИБИТОРОВ И АКТИВАТОРОВ РОСТА
17.1. Введение
В большинстве работ, посвященных метаболическим ингибиторам, внимание исследователей было сфокусировано на их качественном действии и соответствующих молекулярных механизмах. Здесь же особое внимание будет уделено количественным эффектам и возможному использованию ингибиторов для изменения ферментативных процессов (см. также разд. 16.7).
Очевидно, под действием того или иного ингибитора роста происходят и фенотипические изменения и селекция генетических вариантов с повышенной устойчивостью к данному ингибитору, что поддерживает скорость роста на прежнем уровне. Модель автосинтетической системы (разд. 24.2.1) предсказывает, что временно после добавления ингибитора скорость роста будет колебаться. Такое поведение наблюдалось у Klebsiella aerogenes в ответ на добавление барбитона (2 г/л), вызывающего затухающие колебания скорости роста в течение шести генераций [73]. Модель автосинтеза Хиншельвуда (разд. 24.4) предсказывает, что ингибитор роста будет так изменять ферментативную активность клетки, что скорость роста будет максимально возможной в данных условиях. В пользу этого предсказания говорит следующее: активность некоторых ферментов пентозофосфатного пути у К. aerogenes при добавлении барбитона повышалась в 2,4 раза. Простая теория ответной реакции микроорганизмов на ингибиторы роста может быть основана на кинетике ингибирования ферментов. В этом подходе мы делаем упрощающее предположение, что биомасса ведет себя как фермент, реагирующий с лимитирующим рост субстратом. Согласно существующим представлениям, при конкурентном ингибировании ингибитор конкурирует с лимитирующим субстратом за поглощение биомассой. При неконкурентном ингибировании ингибитор, по-видимому, реагирует с биомассой в другом участке, отличном от того, в котором происходит поглощение субстрата, и не оказывает влияния на сродство биомассы к субстрату. Ингибирование, сочетающее в себе особенности конкурентного и неконкурентного типа, не рассматривается в данной модели. Однако влияние налидиксовой кислоты на рост Klebsiella, лимитированный
206
Глава 17
магнием, относится, по-видимому, к этому типу, поскольку проявляется в увеличении Ks и уменьшении цт. Кроме ингибиторов, добавляемых в среду, роль ингибиторов могут играть как образующиеся в культуре продукты, так и используемые субстраты. Однако очевидно, что нет достаточных оснований еще более расширять и усложнять модели, если простейшая из них не удовлетворяет экспериментальным данным.
Активаторами роста называют соединения, которые, не будучи необходимыми «ля роста, могут увеличивать максимальную скорость роста. Существование таких активаторов роста установлено еще недостаточно определенно, однако в случае некоторых соединений имеются данные о том, что их можно отнести к этой категории.
17.2. Конкурентное ингибирование
17.2.1. В периодической культуре
По аналогии с кинетикой ферментативных реакций [84, стр. 318] для реакции биомассы с субстратом, лимитирующим рост, можно написать
X-f-S^XS,
(17.1)
откуда следует, что
Ks= [X] [S]/[XS],
(17.2)
где квадратные скобки означают концентрацию, а — константа диссоциации. Для взаимодействия биомассы с ингибитором I имеем
X + I *=* XI,
(17.3)
где предполагается, что I взаимодействует с ферментом в том же участке, что и субстрат. Из диссоциации комплекса XI получаем
К, = [Х][1]/[Х1].
Продукт Р образуется в соответствии с реакцией XS->P + X.
(17.4)
Предполагается, что это процесс, лимитирующий скорость роста, т. е. скорость распада V = /?[XS]. где k — константа. Общая биомасса дается уравнением х = [X] Д- [XS] Д- [XI]. Удельная скорость потребления субстрата будет V/x = q. Из выражений для концентраций реагирующих веществ, как и в кинетике ферментативных реакций [84, стр. 318], мы делаем вывод, что удельная скорость потребления субстрата описывается следующим уравнением:
(17.5)
Q = <7т«/(« + ®^s).
Действия химических ингибиторов и активаторов роста
207
qm здесь — максимальная скорость потребления субстрата, которая получается, если биомасса насыщается субстратом, и а = 1 + i/Ki, где i—концентрация ингибитора. Если Y — экономический коэффициент, то, подставив q — u/Y и qm= pm/Y из уравнения (17.5), получим
Н = P-ms/(s + a/Q. (17.6)
Уравнение (17.6) показывает, что при конкурентном ингибировании Ks испытывает кажущееся увеличение в а раз, а не
Рис. 59. Периодический рост с (+Z) и без (—/) добавления конкурентного ингибитора в среду.
изменяется. Ингибитор может воздействовать на сродство к лимитирующему рост субстрату, взаимодействуя с биомассой в участке, отличном от участка связывания субстрата. В этом случае действие будет проявляться в увеличении Ks, но выражение для а будет другое (см. [84, стр. 320]). В периодической культуре, согласно модели, ингибитор значительно расширяет фазу затухания роста (рис. 59).
17.2.2. В хемостатной культуре
Если конкурентный ингибитор добавляется в хемостатную культуру со скоростью разбавления D, то для стационарного состояния можем подставить ц = D в уравнение (17.6), тогда
s = aKsD/(pm-D), (17.7)
х = Y (sr — s), (17.8)
где Y — экономический коэффициент, sr — концентрация лими
208
Глава 17
тирующего рост субстрата в свежей питательной среде. Критическая скорость разбавления
Окрит = + aKs). (17.9)
Действие ингибитора проявляется в том, что £>Крит уменьшается, а стационарная концентрация биомассы при приближении к Дкрит падает более плавно (рис. 60). График зависимости 1/£>
Рис. 60. Действие конкурентного ингибитора, добавленного в культуральную среду в хемостате: + I — с ингибитором, — i — без ингибитора.
$г==10 г/л, К$в0,01 г/л, г»! г/л, Кг-а0,01 г/л, экономический коэффициент Ух=0,5, = 1,0 ч“*. Непрерывные линии —концентрация биомассы х в стационарном состоянии, прерывистые линии —стационарные концентрации субстрата s.
от 1/5 при данной концентрации ингибитора будет отсекать на оси абсцисс отрезок —aKs- Преобразование уравнения (17.7) дает
s = c + ci/Ki, (17.10)
где с = DKs/(nm — D). Следовательно, если i меняется, a D поддерживается постоянной, то график зависимости s от i будет иметь вид прямой линии с наклоном с/К,- и отсечет отрезок с на оси 5. Ван Уден [338] подтвердил, что уравнение (17.10) выполняется при ингибировании сорбозой поглощения глюкозы дрожжами в анаэробных условиях. Значение Ks для глюкозы было равно 5,6 • 10-4 М, а значение Ki = 1,8 • 10~‘ М.
17.3. Неконкурентное ингибирование
17.3.1. В периодической культуре
При неконкурентном ингибировании ингибитор взаимодействует с биомассой в каком-то участке, отличном от участка связывания лимитирующего рост субстрата. Следовательно, про-
Действия химических ингибиторов и активаторов роста
209
цесс можно описать следующими реакциями: Х + S XS,
X + I XI,
XS + I IXS,
XI + S IXS.
(17.11)
(17.12)
(17.13)
(17.14)
Предполагается, что реакции (17.12) и (17.13) имеют одну и ту же константу диссоциации Kt, ареакции (17.11) и (17.14) — одну
Рис. 81. Периодический рост с (+<) и без (—г) неконкурентного ингибитора добавляемого в среду.
и ту же константу диссоциации Ks- Предполагается также, что комплекс IXS не может распадаться и давать продукт, т. е. продукт получается только в реакции
XS —> X + Р. (17.15)
Считается, что эта реакция ограничивает скорость процесса в целом. Записывая выражения для концентраций реагирующих веществ [84, стр. 322] и подставляя уравнение для удельной скорости поглощения субстрата q через р, получаем
Н = (s + Ks), (17.16)
где, как и ранее, а = 1 + i/Ki- Отсюда следует, что действие ингибитора проявляется в уменьшении максимальной удельной скорости роста, a Ks не изменяется. Если s » Ks, то из уравнения (17.16) получим р. — ц.т/а. Это действие в периодической культуре (рис. 61) наблюдалось при ингибировании роста Escherichia coli сульфонамидами [172]. Действие сульфонамида
210
Глава 17
антагонистично добавлению промежуточного продукта метаболизма— napa-аминобензойной кислоты (ПАБ). Клотц и Гутман [172] показали, что при различных концентрациях ПАБ и данной концентрации сульфонамида i удельная скорость роста удовлетворяет соотношению
= + (17.17)
где b — концентрация ПАБ, а а = 1 -f- i/Kt- Этот результат означает, что ингибитор, неконкурентный по отношению к лимитирующему рост субстрату, может оказаться конкурентным по отношению к промежуточному продукту метаболизма.
17.3.2. В хемостатной культуре
Для стационарного состояния в хемостатной культуре при неконкурентном ингибировании мы можем подставить ц = D в
Рис. 62. Влияние неконкурентного ингибитора, добавленного в культуральную среду в хемостате: +/ — с ингибитором; —I — без ингибитора.
Непрерывные линии — стационарные концентрации биомассы, прерывистые лннни— стационарные концентрации лимитирующего рост субстрата. Параметры s «10 г/л, /<$=0,01 г/л, К;=0,01 г/л, / = 0,01 г/л, Ух=0.5, цш = 1,0ч~‘.
уравнение (17.16) и получить для стационарных концентраций лимитирующего субстрата и биомассы следующие выражения:
S- = DV(^-D), (17.18)
x = F(sr-s). (17.19)
Критическая скорость разбавления будет выражаться следующим уравнением:
Экрит /a(Sr + As). (17.20)
Действие ингибитора на стационарные значения показано на рис. 62. Если sr >> Ks и Окрит ~ Цт/а, то, подставляя а =
Действия химических ингибиторов и активаторов роста
211
= I + i/Ki, получим
(17.21)
Ь'К р И1
Следовательно, если изменяется концентрация ингибитора, то график зависимости i от 1/£>Крит должен иметь вид прямой линии с наклоном КгЦт и отсекать отрезок Ki. Параметр £)крит можно было бы измерить при помощи метода вымывания (нестационарного состояния).
Ингибирование роста бактерий и дрожжей этиловым спиртом вызывает уменьшение ц™ в соответствии с уравнением неконкурентного ингибирования [71, стр. 145; 4]. Эксперименты Аибы и др. [4] с хемостатной культурой дрожжей показали, что этанол не влияет на значение 7G но глюкозе. Применяя модель, рассмотренную в разд. 17.3.2, к результатам Аибы и др., получим для этилового спирта значение Ki = 0,5 М.
17.4. Ингибирование продуктом
Продукты ферментации могут ингибировать рост и конкурируя с лимитирующим рост субстратом, и неконкурентным образом. Продуктом, который может вызвать конкурентное ингибирование роста, являются, например, ионы окисного железа, получаемые при окислении Ferrobacillus ионов закисного железа (Келли, частное сообщение). Этиловый спирт — это пример продукта, который вызывает неконкурентное ингибирование роста у дрожжей. Здесь рассматриваются только те случаи образования ингибирующего продукта, когда или выход продукта, или qp — величины постоянные.
В периодической культуре, если продукт ингибирует рост конкурентным или неконкурентным образом, это должно приводить к непрерывному уменьшению удельной скорости роста, а в экстремальном случае может вызвать полную остановку роста. В стационарном состоянии хемостатной культуры, напротив, ингибирование продуктом по теории будет вызывать различные картины в зависимости от того, связано ли образование продукта с ростом или нет и конкурентным или неконкурентным образом он действует. Если не считать исследования ингибирования роста дрожжей этиловым спиртом [4], экспериментального изучения предсказанных картин ингибирования продуктом в хемостатной культуре не проводилось.
17.5. Конкурентное ингибирование продуктом в хемостатной культуре
17.5.1. Постоянный выход продукта (Ур)
Из уравнения (17.6) получаем, что в хемостатной культуре в стационарном состоянии для конкурентного ингибирования
212
Глава 17
продуктом
ц = О = pms/{s + (1+ plKt) Ks}. (17.22)
Для продукта, связанного с ростом, мы можем подставить р= Yp(sr—s), где Yp — выход продукта. Таким образом, концентрацию лимитирующего субстрата в стационарном состоянии можно выразить следующим равенством:
s = KsD(Ki + YpSr)/{pmKi -D(Ki- KSYP)}. (17.23)
Стационарная концентрация биомассы описывается равенством х= Yx(sr — s), где Yx— экономический коэффициент. Действие
Рис. 63. Влияние конкурентного ингибирования продуктом иа стационарную концентрацию биомассы в хемостатной культуре (Yр постоянно): + р — с продуктом; — р — без продукта.
л «=10 г/л, К,«=0,01 Г/л, У,«=0,5, У„=0,2. цт«=1,0 ч-1. f О Л fJ /<•
ингибирующего продукта на стационарное состояние биомассы показано на рис. 63.
17.5.2. С постоянным qp
Если ингибирующий продукт не связан с ростом, то его концентрацию в стационарном состоянии можно выразить при помощи уравнения р = qPx!D, где qp — удельная скорость образования продукта; предполагается, что она постоянна. Подставив еще х = Yx(sr— §) из уравнения (17.22), получим
§=Ks(DKi + qpYxsr)/{Ki (nm - D) + qpYxKs}. (17.24)
Примем, что для образования ингибирующего продукта совсем не используется лимитирующий рост субстрат. График зависимости концентрации биомассы от скорости разбавления
Действия химических ингибиторов и активаторов роста 213
приведен на рис. 64. При О->0 значение s стремится к конечному значению — в отличие от случая конкурентного ингибирования, связанного с ростом. Однако при увеличении скорости
Рис. 64. Влияние конкурентного ингибирования продуктом на стационарную концентрацию биомассы в хемостатной культуре, если qp постоянно: +р — с продуктом; — р — без продукта.
s,= IO г/л, Л =0,01 г/л, У„ = 0,5, <7„ = 0,2 г/г биомассы • ч, К;«=0,01 г/л, Цт=1,0 ч-1. Г О Л *•
разбавления модель становится несостоятельной, так как р должно стремиться к конечному значению, ограниченному концентрацией субстрата.
17.6. Неконкурентное ингибирование продуктом в хемостатной культуре
17.6.1. Продукт, связанный с ростом (значение Ур постоянно)
Если ингибирующий продукт не конкурирует с субстратом, лимитирующим рост, то для скорости роста в стационарном состоянии имеем
ц ==£)== pms/a (s + Ks), (17.25)
где а = 1 + pIKi. Если продукт связан с ростом, мы пишем p=Yp(sr — s). Использовав это уравнение и преобразовав уравнение (17.25), получим
as2 + bs + c = 0, (17.26)
где а = Ур, b = YpKs + Ki(pm/D — 1) — Ypsr, с ——Ks(Ypsr + Ki). Решение для s будет
- = _ & ± V&2 - 4ас . (17.27)
214
Глава 17
Из двух корней один отрицательный, и на практике им пренебрегают. Стационарное состояние биомассы определяется из уравнения х=Уж(хг — s). Предсказанное действие ингибирующего продукта на рост показано на рис. 65. Кривая, соответствующая концентрации биомассы при ингибировании продуктом, необычна в том отношении, что она обращена выпуклостью к оси биомассы при больших скоростях разбавления. Для этой
Рис. 65. Влияние неконкурентного ингибирования продуктом (Y р постоянно) на концентрацию биомассы в хемостатной культуре.
+ ,?: в присутствии продукта; —р: без продукта. s^=10 г/л; /($ = (),01 г/л; —0,1; = 1,0 г/л; ц=1,0 • ч-1.
части кривой при s Ks уравнение (17.25) можно представить в приближенном виде следующим равенством:
О = М(1+Грх/УхК{), (17.28)
преобразуя которое получаем
х = iimYxKdYpD - YxKi/Yp. (17.29)
Таким образом, график зависимости х от I/O при высоких скоростях разбавления должен быть прямой линией с наклоном HmYxKi/Yp и отсекать отрезок —YxKi/Yp на оси биомассы. На оси I/O график будет отсекать отрезок 1/Окрит. Из данных, приведенных на рис. 65, зависимость х от I/O в виде прямой линии будет сохраняться от Окрпт = 1,0 до О < 0,6 (рис. 66).
17.6.2. С постоянным qp
Если продукт является неконкурентным ингибитором роста, то применяется уравнение (17.25). Приняв, что qP— величина постоянная, получим р = qPxjD.
Действия химических ингибиторов и активаторов роста
215
Предположим, что использование субстрата для образования продукта пренебрежимо мало, тогда х = Yx(sr— s). Подставив выражения для р и х в уравнение (17.25), преобразуем его к
Рис. 66. Соотношение между концентрацией биомассы (х) и I/O для хемостатной культуры при неконкурентном ингибировании продуктом (Ур постоянно), если Ks (из данных, приведенных на рис. 65).
Dc — критическая скорость разбавления.
форме квадратного уравнения as2 + bs + с = О, где a = qPYx, b = Ki(pm~ D) — qpYx(sr — Ks), с =—Ks(DK, + qPYxsr). Из двух корней квадратного уравнения для s [даны в уравнении (17.27)] один отрицательный и на практике им можно пренебречь. Действие ингибирования продуктом такого типа изображено на рис. 67. Если 3 Ks, график зависимости биомассы от скорости разбавления должен иметь вид прямой линии. Это
216
Глава 17
следует из уравнения (17.25); если мы подставим а = = 1 + QpxIKi, то получим
_ цтК, DKj
Чр Чр
(17.30)
Таким образом, график зависимости х от D должен был бы быть прямой линией с наклоном —Kt!qP.
Рис. 67. Влияние неконкурентного ингибирования продуктом на стационар-ное состояние биомассы в хемостате, если qp постоянно.
А—без ингибирующего продукта. sf==10 г/л, /<5=0,01 г/л, У*=0,5, ц =1,0 ч 1. В—с ингибирующим продуктом; параметры те же, что и в случае А, и — 0,02 г/г биомассы • ч*.
=0,5 г/л. С — с ингибирующим продуктом; параметры те же, «0,04 г/г биомассы • ч, Д’. =0,1 г/л.
что и в случае А, и
V-
17.7. Ингибитор, влияющий на экономический коэффициент
Под влиянием ингибитора направление метаболизма может измениться, и поэтому при наличии в среде ингибитора получается другой экономический коэффициент. В периодической культуре, если s 3> Ks, то скорость роста выражается равенством Цт = <7П1'Ух, где qm — максимальная скорость поглощения лимитирующего рост субстрата, a Yx — экономический коэффициент. Предположим, что Уж в присутствии ингибитора уменьшается до У*, а Ят не изменяется, тогда максимальная скорость роста будет уменьшаться до V-lm — qmYx- В хемостатной культуре скорость роста в стационарном состоянии в присутствии ингибитора отвечает равенству:
D = ^s/(s + Ks),
(17.31)
Действия химических ингибиторов и активаторов роста
217
а стационарные значения концентрации биомассы и лимитирующего рост субстрата
и
*=yi(sr-5)-
Действие ингибитора такого типа в периодической и хемостатной культурах показано на рис. 68. Такой тип поведения имеет.
Рис. 68. Влияние ингибитора, который уменьшает экономический коэффициент.
А, В периодической культуре. Б. В хемостатной культуре. 4-t: с ингибитором; —t: без ингибитора. Предполагается, что энергия поддержания равна нулю.
по-видимому, место в тех случаях, когда к культуре, лимитиро-ванной источником энергии, добавляются разобщители окислительного фосфорилирования.
17.8. Субстратное ингибирование роста
17.8.1. Действие на скорость роста
Некоторые субстраты, например спирты, фенолы и углеводороды, ведут себя как ингибиторы роста, если присутствуют в избытке Модель их действия может быть основана на кинетике субстратного ингибирования ферментативной активности [84, стр. 75]. Обозначим через X и S биомассу и субстрат. Тогда
X + S^XS. (17.32)
В этой реакции Ks= [X] [S]/[XS]. Ингибирование поглощения субстрата вызывается, по-видимому, взаимодействием второй молекулы субстрата с комплексом биомасса — субстрат. Ингибирующую реакцию можно записать так:
XS + S«=*XS2. (17.33)
218
Глава 17
Для этой реакции
tfz = [XS][S]/[XS2]. (17.34)
Предполагается, что продукт образуется при распаде комплекса XS в соответствии с реакцией
XS^X + P. (17.35)
Считается, что скорость поглощения субстрата ограничивается
Рис. 69. Действие ингибирующего субстрата на удельную скорость роста. Вш = 1,о, Ks = l, К, = 10.
скоростью реакции, выраженной уравнением (17.35). Эта скорость описывается выражением
V = fe[XS], (17.36)
где k — константа. Из выражений для реагирующих компонентов получим
ц = + ХД, + s2). (17.37)
Соотношение между скоростью роста и концентрацией субстрата будет таким, как показано на рис. 69. Скорость роста увеличивается при увеличении концентрации субстрата до критического значения 5Крит, затем начинает превалировать ингибирующий эффект. Максимальное значение ц можно определить при дифференцировании уравнения (17.37) по s. При dpfds = 0 значение ц максимально и $крит = (KsKi)'12. В периодической куль
Действия химических ингибиторов и активаторов роста
219
туре, если начальная концентрация лимитирующего рост субстрата больше 5Крит, то скорость роста будет увеличиваться до тех пор, пока s < «крит. Уемура и др. [335] установили, что н-пентан для некоторых видов бактерий являлся ингибирующим субстратом, а отношение Ki/Ks составляло при этом « 100. Если Кг и Ks очень различаются, то максимальная удельная скорость роста цт, a Ks а Кг приблизительно равны нижнему и верхнему значению s при ц = цт/2.
17.8.2. Действие в хемостатной культуре
В стационарном состоянии хемостатной культуры скорость роста ц из уравнения (17.37) можно соотнести со скоростью
Рис. 70. Влияние ингибирующего субстрата, лимитирующего рост в хемостатной культуре.
ц,т = 1,0; К5 = 1; /<^ = 10, Ух = 0,5, $г = 28. Непрерывная линия —стационарная концентрация биомассы х, прерывистая линия — стационарная концентрация лимитирующего рост субстрата s. Точки I и II представляют собой верхнюю и нижиюю критические скорости разбавления соответственно.
разбавления D. Таким образом, получим уравнение относительно s в форме as2 + bs Ц- с — 0, где а = 1, b = (1 — pm/D)Ki, с — KiKs. Стационарная концентрация биомассы дается уравнением х = Yx(sr— s), где Yx— экономический коэффициент, а sr — концентрация лимитирующего рост субстрата в поступающей питательной среде. Вид кривых х и § показан на рис. 70. Между скоростями разбавления 1 и 11 на рис. 70 возможно два
220
Глава 17
стационарных состояния. Если « < «Крит, то при увеличении « будет расти скорость роста, и наоборот. Иными словами, культура является саморегулирующейся и стационарное состояние устойчиво. Если s > $крит» то стационарное состояние неустой-чиво, потому что при увеличении « будет уменьшаться скорость роста и культура будет вымываться. Кроме того, в области « > «крит при случайном уменьшении « скорость роста будет увеличиваться, а биомасса будет увеличиваться до значения, соответствующего значению устойчивого стационарного состояния. Устойчивое стационарное состояние для « «крит МОЖНО ПОЛу-ЧИТЬ во второй стадии в батарее из двух хемостатов. Икрит может изменяться в интервале скоростей разбавления от I до II на рис. 70. В нижнем значении £>Крит s=sr, а в верхнем «—«крит-Если « » Ks, то из уравнения (17.37) следует, что
l/jx== 1/Ит-Ь s/p-mKi, (17.38)
т. е. графики зависимости 1/ц от « или 1/D от « должны иметь вид прямых линий с наклоном l/pmKi и отсекать отрезок 1/рт.
С помощью применения батареи из двух хемостатов Джонс и др. [161] установили, что рост некоторых видов бактерий при лимитации фенолом соответствует этой модели лимитации роста субстратом. В такой системе значение Ks для фенола составляло 0,9 мг/л, а Кг = 110 мг/мл. Было найдено также, что при «> «крит экономический коэффициент по фенолу был ниже (0,59), чем при « < «крит (У = 0,9). Поскольку энергия поддержания (выражаемая через потребление фенола) была такая же, как и в других условиях, то отсюда следует, что изменения среднего экономического коэффициента были вызваны изменениями истинного экономического коэффициента [Peg в уравнении (8.9)].
17.9. Активаторы роста
Активатором роста называют такое вещество, которое, не будучи необходимым для роста и не метаболизируясь, может вмешиваться в процесс роста так, что максимальная скорость роста будет увеличиваться. Действие таких веществ моделируется как действие активаторов ферментов [84, стр. 323]. Если X, S, А и Р представляют собой биомассу, лимитирующий рост субстрат, активатор и продукт соответственно, то имеем
X + S^XS, (17.39)
Х + А^ХА, (17.40)
XA + S=f=fcXAS, (17.41)
XS —► X + Р, (17.42)
XAS — ХА + Р. (17.43)
Действия химических ингибиторов и активаторов роста
221
Из уравнения (17.40) следует, что
Ка = [X] [А]/[ХА], (17.44)
где квадратные скобки означают концентрации. Предполагаем, что общую скорость реакции (V) ограничивает скорость распада комплексов XS и XAS в продукт, т. е.
V = k [XS] + fe'[XAS] = qx, (17.45)
где q — удельная скорость потребления субстрата и х — общая биомасса. Если активатора нет и биомасса насыщена субстратом, то [XS] = х и для удельной скорости потребления субстрата qm = k. Если биомасса насыщена субстратом и активатором, положим [XAS] = х, тогда максимальная удельная скорость поглощения субстрата дается уравнением k' = q'm. Примем, что И q'm = Pm/Yх’ ГДе — ЭКОНОМИЧеСКИЙ коэффициент, отсюда следует, что k'/k = ц'т/цт- Выражая [XS] и [XAS] через х, s, Ks и Ка, получим
p = P}xms/(s + Ks),
(17.46)
где
а
н V ка цтл\ ка ;
Таким образом, кажущееся действие активатора проявляется в увеличении щп, значение 7G при этом не меняется.
В пользу этой модели говорит реакция клеток HeLa человека на инсулин [26], поскольку при недостатке инсулина скорость роста была очень низкой. В условиях лимитации клеток Bacillus магнием некоторые виды выделяют вещество, которое действует как активатор [203]. Было высказано предположение, что этот эффект можно смоделировать при помощи выражений, аналогичных уравнению (17.46). Примерами активаторов ферментов служат хлорид-ионы для активации альфа-амилазы и определенные двухвалентные или трехвалентные анионы для фума-ратгидратазы [84, стр. 443].
Глава 18
КУЛЬТУРЫ ПРИ низких И НУЛЕВОЙ СКОРОСТЯХ РОСТА
18.1. Поведение в стационарной фазе
Когда рост прекращается, в культуре устанавливается стационарная фаза. Истинная стационарная фаза вызывается истощением среды, химическим ингибированием роста или физическим стрессом. Фаза отмирания, характеризующаяся автолизом и уменьшением биомассы, может наступить после стационарной фазы или непосредственно после прекращения роста.
Растущие вегетативные клетки теряют свою стабильность, когда по каким-либо причинам рост останавливается. Прекращение роста немедленно вызывает ряд изменений в структуре и функциях организма. Автолиз в фазе отмирания — это экстремальное проявление нестабильности организма после прекращения роста. Поведение организма в стационарной фазе, вероятно, не является однотипным. Проявляющаяся изменчивость картины зависит от природы лимитирующего рост субстрата или от условий ингибирования.
Поскольку теоретически с помощью хемостата скорость роста культуры можно поддерживать около нулевого значения, возникает вопрос: как близка к нулю должна быть удельная скорость роста, прежде чем проявится характерное поведение культуры в стационарной фазе? Или поведение, характерное для стационарной фазы, начинается при некоторой конечной скорости роста? Этот вопрос рассматривается в разд. 18.4.
18.2. Стационарная фаза бактериальной культуры
18 2.1. Общие свойства
В ранней стационарной фазе размер бактериальной клетки достигает минимума. В поздней стационарной фазе, или в фазе отмирания, часто наблюдаются искривленные или разбухшие клетки, называемые «инволюционными формами». Вероятно, эту картину вызывают либо повреждение литическими ферментами клеточной стенки или плазматической мембраны, либо слабая регуляция остаточного синтеза клеточных компонентов. У грам-
Культуры при низких и нулевой скоростях роста 223
положительных бактерий в стационарной фазе обычно наблюдается потеря способности клеток сохранять характер окраски по Граму. Кроме того, сопротивляемость бактерий многим формам физических и химических стрессов, вызванных, например, гипотоничной средой, резкой, внезапной сменой температуры на холодную или высокую, в стационарной фазе выше, чем в логарифмической. Это означает, что структура организма в этих двух фазах различна. Для некоторых групп бактерий в стационарной фазе характерно образование эндоспор или экзоспор. Даже у неспорообразующих типов есть цитологическое свидетельство развития микроцист [23]. Они могут быть резистентными, покоящимися формами бактерий.
18.2.2. Метаболизм
Характерной особенностью нерастущих организмов является потеря ими ферментативной активности [320]. Эта потеря ферментов может быть вызвана обновлением белка, который резко возрастает от уровня 0,5% и меньше в растущих бактериях до 5% в 1 ч, если рост прекращается [199]; однако некоторые ферменты, кажется, исчезают со скоростью, превышающей скорость обновления белка [320].
Эндогенный метаболизм нерастущих бактерий характеризует тип бактерий [67]. При истощении аэробная суспензия грам-положительных бактерий одновременно окисляет пул пептидов и аминокислот вместе с запасными углеводами. Напротив, Escherichia coli окисляет сначала некоторые запасные гликогены, а затем пептиды, хотя общее количество свободных аминокислот остается постоянным.
18.2.3. Выживаемость
Если бактерии, суспендированные в культуральной среде, испытывают голодание по какому-либо элементу, необходимому для роста, то они постепенно отмирают. Если таким элементом является источник углерода или энергии, то при его добавлении отмирание бактерий ускоряется. Это явление называется «ускорение отмирания субстратом» [265, 310]. Этот эффект снимается с помощью 1 мМ циклического АМФ [39].
С помощью меченой по 14С биомассы было показано, что добавление углеродных субстратов к суспензии водорослей, пле-сеневого гриба и дрожжей в буферном растворе стимулирует распад эндогенных субстратов [211, 218]. Возможно, что это способствует «ускорению отмирания субстратом».
Поддержание жизнеспособности стрептококков в нерастущих водных суспензиях повышается с помощью ионов магния [319].
224
Глава 28
Кроме того, жизнеспособность клеток может увеличиться при наличии резервных источников энергии в клетке [310].
18.3. Стационарная фаза в культурах грибов
18.3.1. Без источников углерода и энергии
Тринси и Ригелато [330] вызвали наступление фазы отмирания или автолиза в хемостатной культуре у Penicillium chryso-genum в стационарном состоянии, прекратив подачу глюкозы. Автолиз, начинавшийся без лаг-периода, характеризовался уменьшением сухого веса мицелия с постоянной скоростью 8% в 1 ч. Содержание белка и РНК уменьшалось сначала со скоростью 5% в 1 ч, но через 6 ч убыль была более медленной. Общее содержание углеводов в течение 48 ч не изменялось, но затем уменьшалось со скоростью 0,5% в 1 ч. Содержание ДНК падало на 75% за 12 ч, а потом оставалось приблизительно постоянным. Было показано, что основания нуклеиновых кислот накапливались в среде. Гифы теряли значительную часть цитоплазмы, выходившей через стенки гиф, и набор мембран, вероятно, из органелл. Через 5 дней оставалось немного нормальных фрагментов гиф, никаких конидий не образовывалось, как это было в случае подкормки глюкозой (разд. 18.3.2). В периодической культуре, лимитированной глюкозой, автолиз начинался, когда экспоненциальная фаза резко прекращалась из-за истощения источника энергии.
18.3.2. При добавлении источника энергии, расходуемого на поддержание
Действие ограниченного добавления глюкозы на процессы поддержания в хемостатной культуре Penicillium chrysogenum исследовали Ригелато и др. [275]. Рост культуры был лимитирован глюкозой. В течение первых 12 ч содержание белка, РНК и ДНК интенсивно уменьшалось. Впоследствии содержание белка оставалось приблизительно постоянным, а РНК и ДНК синтезировались вновь, и их количество превосходило исходное значение. Содержание общих углеводов несколько увеличивалось. Дыхательный коэффициент падал от 0,97 до 0,72, свидетельствуя о том, что главные изменения происходили в окислительном метаболизме.
После 24 ч погруженные гифы образовывали конидии с достаточно высокой постоянной скоростью, поддерживающиеся в течение 120 ч.
Если рост Aspergillus nidulans прерывали, прекратив добавление в хемостат глюкозы, то наблюдаемые в культуре измене
Культуры при низких и нулевой скоростях роста 225
ния были аналогичны изменениям у Р. chrysogenum. с той лишь разницей, что не происходило образования конидий [12]. Все это свидетельствует о том, что прекращение роста у плесневого гриба из-за лимитации источником углерода и энергии вызывает глубокие преобразования в мицелии, которые при некоторых обстоятельствах могут привести к образованию конидий.
18.4. Минимальная скорость роста
Ряд сообщений, основанных на экспериментах в хемостате, свидетельствует о том, что стационарные скорости роста нельзя удержать ниже какого-то конечного минимального значения [250]. Темпест и др. [317] систематически изучали действие уменьшения скорости разбавления до некоторого экстремально малого значения в культуре Klebsiella aerogenus, лимитированной глицерином. Их результаты показывают, что удельная скорость роста приближалась к минимальному значению 0,009 ч-1 (td = 80 ч), в то время как максимальная удельная скорость роста составляла примерно 1,0 ч-1 (td = 0,69 ч). В культуре, лимитированной аммонием, скорость роста достигает минимума в 0,007 ч-1. То обстоятельство, что при скоростях разбавления ниже 0,2 ч-1 большая часть бактерий теряла жизнеспособность, было принято во внимание при вычислении удельной скорости роста (разд. 7.2.2). Справедливость такой поправки может оказаться спорной, поскольку в хемостате могли присутствовать покоящиеся, нерастущие бактерии, которые оживают при переносе на пластинку агара. Следовательно, полученное число растущих бактерий могло быть завышенным, а минимальная удельная скорость роста — заниженной. При скоростях разбавления ниже 0,06 ч-1 содержание РНК и ДНК в биомассе падает более резко при уменьшении скорости разбавления, причем энергетические затраты на поддержание также уменьшаются [250]. Эти наблюдения показали, что некоторые свойства бактерии при удельных скоростях роста около 0,06 ч-1 резко изменяются.
Кох и Кофман [176] установили, что в хемостатной культуре Escherichia coli при скорости разбавления 0,029 ч-1 в популяции появляются две фракции, различающиеся по своей способности индуцировать р-галактозидазу. Около двух третей популяции заканчивали индукцию в нормальное время—за 10 мин, а одна треть — за 3 ч. Напротив, при скорости разбавления 0,09 ч-1 популяция не оказывалась гетерогенной и фермент индуцировался в течение 10 мин.
Для объяснения этих данных об изменении свойств Klebsiella и Escherichia при малых скоростях роста (ниже 0,06 ч-1, т. е. 6% от цт) было постулировано, что часть популяции
8 Зак. 737
226
Глава 18
дифференцируется в покоящиеся клетки. Эта часть характеризуется временным прекращением роста, минимальным содержанием РНК и ДНК (около 6 и 2% сухой биомассы соответственно), минимальной или нулевой энергией поддержания и наличием лаг-периода перед началом индукции [J-галактозидазы. Отсюда следует, что для определения истинной удельной скорости роста при малых скоростях роста необходимо определить долю «покоящейся» популяции, а не просто долю жизнеспособных клеток. Постулированная дифференцировка в покоящиеся клетки могла бы дать возможность растущей части популяции поддерживать минимальную скорость роста.
18.5. Кинетика спорообразования у Bacillus
Образование эндоспор у Bacillus обычно связывают со стационарной фазой периодической культуры, однако с помощью хемостатной культуры было показано, что между спорообразованием и скоростью роста существует негативная корреляция [69]. Ниже мы рассмотрим модель Дооза и Торнлея [69], объясняющую кинетику спорообразования.
Предполагается, что в культуре происходят следующие процессы: 1) размножение вегетативных клеток, 2) инициация образования спор, 3) созревание спор и 4) прорастание созревших спор в вегетативные клетки. Считается, что раз инициация спорообразования произошла, то организм должен пройти весь последовательный ряд превращений до созревания споры. Если мы обозначим вегетативную клетку X, инициированную спору — Y, а зрелую спору — Z, то все четыре процесса можно представить соответственно следующим образом:
1) X —> 2Х, 2) X —► Y, 3) Y —> Z, 4) Z —> X.
Далее предположим, что процессы 1, 2 и 4 являются реакциями первого порядка с константами скорости ц, К и а соответственно. Положим п, у и С — число вегетативных клеток, инициированных и зрелых спор в единице объема соответственно, a tm — время с момента инициации спорообразования до созревания споры.
В периодической культуре, в бесконечно малый интервал времени dt увеличение числа вегетативных клеток в единице объема будет
Общее Споры Споры
— Рост — 4-
увеличение инициированные созревшие,
или
dn=^nndt — Kndt + at,dt. (18.1)
Культуры при низких и нулевой скоростях роста 227
Следовательно, dnfdt = (у— К)п-\-а^. (18,2)
Если скорость прорастания at, мала по сравнению с (ц,— К)п, то dnfdt К.) п, (18.3)
т. е. рост будет казаться экспоненциальным, но с кажущейся удельной скоростью роста (ц— /С).
В случае хемостатной культуры баланс для увеличения вегетативных клеток будет иметь следующий вид: Общая Скорость Скорость Скорость Скорость
скорость роста инициации вымывания прорастания,
роста или
dnfdt = цга— Кп— Dn + at,. (18.4)
Следовательно,
dra/Л = (ц — Д — £)) га 4-а£. (18.5)
Баланс для инициированных спор:
Общая Скорость Скорость Скорость
скорость инициации созревания вымывания,
инициации или dyfdt = Кп — — Dy. (18.6)
Член означает число вегетативных клеток во время
(t — tm)- В течение интервала tm некоторые из инициированных спор будут вымываться и доля спор, инициированных во время (t— tm), которые останутся и прорастут, составит e~Dtfn (разд. 5.4). Баланс для зрелых спор будет иметь вид
Общая Скорость Скорость Скорость
скорость созревания вымывания прорастания,
увеличения
или
dt/dt = — Dt,— at. (18.7)
В стационарном состоянии, когда dnfdt = dyfdt = dt/dt = 0, п, уравнения (18.5), (18.6), (18.7) дают
(и — К— D) п + = 0, (18.8)
Кп(Д - е) - Dy = 0, (18.9)
Кпе -(D + a)? = 0, (18.10)
8*
228
Глава 13
— Dt r-
где 6 = e m- Ьсли предположим также, что мы можем измерить долю общей популяции (N), которая состоит из созревших спор, то для стационарного состояния
e = |/jv = g/(« + ^ + |). (i8.il)
Из уравнений (18.8), (18.9), (18.10) и (18.11) получаем
-----пщо + «)-----, D (е — 0) — а0 (1 — е)
р = Z) 4~/( {1—ai-ЦР -j- а)}, (18.13)
= + (18.14)
£ = #«//(£> +а), (18.15)
y = N-n — t (18.16)
Из рассматриваемой модели следует также, что частота образования спор равна Кп, а частота образования вегетативных
0 tm Время
Рис. 71. Хемостатный метод для определения времени созревания спор tm [69].
При (=0 скорость разбавления уменьшается так, чтобы увеличить скорость инициации спор. При t~'tm начинается увеличение числа спор.
клеток — цп. Если при этом учесть, что развитие вегетативных клеток может пойти только по одному из этих двух путей, то вероятность инициации спор будет
ф = КпЦрп + Кп) = Л/(ц + К). (18.17)
Дооз и Торнлей [69] проверили эту теорию спорообразования Bacillus subtilis в хемостате. Скорость прорастания спор а определяли в пробах изолированных спор. При 37 °C она состав
Культуры при низких и нулевой скоростях роста
229
ляла примерно 0,05 ч-1. Значение времени созревания спор tm было определено при помощи хемостатной культуры, использованной по-новому. Если резко уменьшить скорость разбавления, то может произойти резкое увеличение скорости инициации спор, и, следовательно, через время tm число спор увеличится (рис. 71). Таким образом установили, что время созревания спор Bacillus при 37 °C составляет 4 ч. Скорость инициации спор К
Рис. 72. Хемостатная культура Bacillus subtilis, лимитированная глюкозой при 37 °C [69].
Д. Доля созревших спор (0). Б. Вероятность инициации спор (ф).
негативно коррелировала со скоростью роста в соответствии с уравнением К = 0,091 — 0,143ц. Доля спор и вероятность инициации спор в бактериальной клетке показана на рис. 72. Экспериментальные данные хорошо согласуются с этой моделью.
Исходя из распределения споровых форм в каждой фазе развития в хемостатной культуре, Дооз и др. [68] показали, что продолжительность каждой фазы развития описывается следующим равенством:
Т,-, = tm - >(£), (18.18)
где yi — доля клеток в стадии X;, ут — доля клеток, споры которых преломляют свет, а т,_i — время после инициации до начала стадии Xi.
Рассмотренное исследование спорообразования у бактерий иллюстрирует, как можно анализировать количественно происходящие кратковременные процессы в хемостатной культуре.
Глава 19
ЗАДЕРЖКА РОСТА (ЛАГ-ПЕРИОД)
19.1. Введение
Природа и причины задержки роста бактериальных культур (лаг-периода) после инокуляции начиная с 1930 г. привлекали много внимания. Однако вскрытие основных причин стало возможным лишь после того, как были открыты механизмы синтеза ферментов и его контроля. Знание причин, обусловливающих наличие лаг-периода, важно потому, что дает возможность свести этот период к минимуму или регулировать его длительность. В некоторых же случаях лаг-период может быть использовав в качестве параметра влияния внешней среды на организм.
Лаг-период — это переходный период, в течение которого удельная скорость роста увеличивается до максимально возможного в данной среде значения. Количественное определение лаг-периода обсуждается в разд. 2.8.
«Истинный» лаг-период определяется как задержка в росте целой популяции. «Кажущийся» лаг-период имеет место в тех случаях, когда часть популяции с самого начала растет с максимальной скоростью, а у другой части рост отсутствует. Во время лаг-периода в удельной скорости роста могут наблюдаться флуктуации. Одним из типов флуктуации может быть последовательное увеличение числа клеток, обусловленное некоторой синхронизацией деления. Но обычно после одного-двух делений такая синхронизация исчезает. В субкультуре истощенных бактерий или дрожжей может произойти уменьшение жизнеспособной биомассы, что объясняется ускорением отмирания субстратом (разд. 18.2.3).
19.2. Кажущийся лаг-период
Состояние, при котором в культуре растет только какая-то часть инокулята, может быть вызвано отмиранием некоторых организмов или селективностью среды. Если к росту способна только доля а биомассы, то скорость роста биомассы х будет
dxldt — цах, (19.1)
Задержка роста (лаг-период)
231
где ра— «кажущаяся» удельная скорость роста. Если х увеличивается благодаря добавлению новых, жизнеспособных клеток, а-> 1 и ра->р, к истинной удельной скорости роста.
Кажущийся лаг-период может означать, что в популяции могут расти только новые мутанты или генетические варианты. Длинный лаг-период, соответствующий времени примерно 20 генераций в бактериальной культуре, можно использовать в качестве критерия, свидетельствующего, что рост происходит благодаря селекции новых вариантов. В качестве примера можно привести селекцию Escherichia coli, способную расти на лактозе в присутствии 3-фторглюкозы [212].
Было установлено, что задержка роста клеток млекопитающих в определенной безбелковой среде значительно сокращается в присутствии метилцеллюлозы [2]. Механизм этого эффекта не установлен.
19.3. Причины истинного лаг-периода
Основными причинами истинной задержки роста являются: 1) изменение в питании; 2) изменение в окружающих физических условиях; 3) присутствие ингибитора; 4) прорастание спор; 5) состояние засеваемой культуры. В случае первых трех факторов могут потребоваться некоторые фенотипические изменения в биомассе, чтобы биомасса пришла в состояние, оптимальное для новых условий; или же метаболизм биомассы может преодолевать неблагоприятное влияние окружения, например изменением значения pH.
Изменения в питании, вероятно, могут способствовать индукции одного или нескольких новых ферментов, причем время, необходимое для синтеза оптимального количества этих ферментов, может составлять от 10 мин до нескольких часов. У некоторых видов организмов индукция ферментов для использования новых источников углерода и энергии не происходит до тех пор, пока в среде есть хоть малые количества первоначального источника углерода и энергии. Например, переход от использования глюкозы к использованию лактозы у Penicillium chrysogenum может произойти на смеси глюкозы и лактозы, но только не в том случае, когда мицелий, голодавший по глюкозе, добавляется в среду, содержащую лактозу в качестве единственного источника углерода. Адаптация клеток животных к использованию глутаминовой кислоты происходит только в присутствии некоторого количества глутамина [26].
Лаг-период может быть выражением времени, необходимого для инактивации некоторого ингибитора, присутствующего в среде. Токсическое действие микроэлементов, вероятно, будет более заметно на простой минимальной среде, чем на богатых
232
Глава 19
природных средах, поскольку они содержат вещества, такие, как аминокислоты, которые могут образовывать комплексы с ионами металлов. На токсичность органических кислот часто значительное влияние оказывает pH, и при увеличении pH токсичность органических кислот уменьшается. Субстрат может вести себя как ингибитор, и тогда лаг-период будет зависеть от времени, необходимого для уменьшения концентрации субстрата до значений, при которых возможна максимальная скорость роста (разд. 17.8). Ингибирующее влияние на рост могут оказывать продукты метаболизма в инокуляте. Например, некоторые представители Lactobacillaceae при пересеве из анаэробной среды в аэробную могут накапливать перекись водорода, являющуюся сильным ингибитором роста. Перекись водорода индуцирует образование пероксидазы, которая удаляет перекись водорода. Лаг-период, обусловленный перекисью водорода, может увеличиваться с увеличением размера инокулята, поскольку образование перекиси водорода пропорционально концентрации клеток [295].
Если инокулят состоит из споровых форм, то лаг-период, предшествующий вегетативному росту, представляет собой тот отрезок времени, в течение которого происходит прорастание спор.
19.4. Действие инокулята
В основе наших представлений о количественном воздействии «возраста» инокулята на лаг-период в бактериальных культурах лежит главным образом изучение культур Klebsiella aerogenes Лоджем и Хиншельвудом [188]. Они произвольно измеряли возраст инокулята, взятый приблизительно из начала логарифмической фазы, когда плотность бактериальной популяции составляла 10е клеток в 1 мл. Действие возраста, показанное на рис. 73, зависело от того, была ли среда минимальной с глюкозой и аммонием в качестве единственных источников углерода и азота или аммоний заменялся аспарагином. На глю-козно-аспарагиновой среде задержка роста начинала появляться приблизительно тогда, когда культура, из которой брали инокулят, вступала в стационарную фазу, и с увеличением возраста инокулята задержка асимптотически стремилась к максимуму. Однако с увеличением возраста лаг-период воспроизводился хуже, возможно, сказывалось влияние отмирания клеток. Лаг-период в глюкозно-аммонийной среде (рис. 73, Б) был длительным, если источник инокулята находился в начале своей логарифмической фазы роста. Лаг-период достигал минимума, если инокулят брали в конце логарифмической фазы, и увеличивался, если культура, из которой брали инокулят, вступала в стационарную фазу. Таким образом, Лодж и Хиншельвуд
Задержка роста (лаг-период)
233
установили различие между ранним лаг-периодом, наступающим, если инокулят берут из ранней логарифмической фазы, и поздним лаг-периодом, характерным для инокулята из культуры в стационарной фазе.
Наступление раннего лаг-периода можно предотвратить добавлением стерильного фильтрата культуры, взятого из поздней логарифмической фазы или при увеличении размера инокулята. На поздний же лаг-период, или на лаг-период в аспара-
Возраст инокулята, мин Возраст инокулята, мин
А Б
Рис. 73. Лаг-период как функция «возраста инокулята» в культуре Klebsiella aero genes.
А. На глюкозно-аспарагино солевой среде. Б. На глюкозно-аммонийно-солевой среде (188]*
гиновой среде, не влияло ни добавление фильтрата, ни увеличение объема инокулята. То обстоятельство, что ранний лаг-период можно устранить добавлением соединений, таких, как аспарагин, являющихся промежуточными продуктами цикла лимонной кислоты, или увеличением объема засева, напоминает пути устранения эффекта, вызываемого субоптимальной концентрацией растворенной двуокиси углерода (разд. 8.10). Воздух барботировали сквозь культуру К. aerogenes, используемую Лоджем и Хиншельвудом, поэтому можно думать, что ранний лаг-период был вызван недостатком двуокиси углерода. Причины проявления лаг-периода в аспарагиновой среде или позднего лаг-периода в минимальной среде обсуждаются в разд. 19.6.
19.5. Влияние температуры
Влияние температуры на лаг-период в культурах вида Staphylococcus в богатой среде показано в табл. 19. Поскольку отношение длительности лаг-периода к времени удвоения близко к постоянной величине, лаг-период может служить удобным
234
Глава 19
Таблица 19
Влияние температуры на лаг-период у видов Staphylococcus в пептонной среде [60]
Температура, °C Время удвоения мин Лаг-период L, мин
25 64 120 1,9
30 38 66 1,7
35 29 50 1,7
40 27 39 1,5
параметром, характеризующим влияние окружающей среды на удельную скорость роста.
19,6. Метаболические процессы во время лаг-периода
Задержка роста, связанная с инокулятом из стационарной фазы культуры, обусловлена реорганизацией, необходимой клетке для обращения изменений, вызвавших прекращение роста (разд. 19.2). В течение лаг-периода должен частично восстановиться состав ферментов и РНК в клетке. Модель Аибы и др. [3] задержки роста в дрожжевых культурах свидетельствует о том, что длительность лаг-периода определяет синтез РНК- Таким образом, задержка роста является экстремальным случаем явления «скачок вверх» (shift up), описанного Малё и Кьельдгаардом [193, стр. 98]. Эти авторы показали, что скачку вверх в скорости роста бактерии должен предшествовать скачок в содержании РНК в организме.
Гриффитс и Перт [ИЗ] установили, что в культуре клеток мыши поглощение аминокислот во время лаг-периода значительно отличалось от потребления аминокислот во время логарифмической фазы роста. В частности, удельное поглощение различных аминокислот было в несколько раз больше во время лаг-периода по сравнению с логарифмической фазой.
19.7. Заключение
Существует множество причин, вызывающих задержку роста. Для того чтобы избежать или свести к минимуму лаг-период, инокулят следует брать из культуры, находящейся в конце логарифмической фазы, в условиях, как можно более близких к среде, используемой для пересева. Размер инокулята обычно следует брать по возможности побольше, но следует иметь в виду исключение из этого правила, отмеченное в
Задержка роста (лаг-период) 235
разд. 19.3. Добавление фильтрата культуры, иногда называемое «улучшением» среды, может служить тем же целям, что и увеличение объема засева.
Никакого специального изучения задержки роста в связи с природой лимитирующего субстрата в инокуляте не проводилось. Вполне возможно, что в большинстве случаев лимитирующим субстратом служил источник углерода и энергии. Многие эффекты, связанные с сокращением лаг-периода в периодической культуре, соответствуют «скачку вверх» по скорости роста в хемостатной культуре.
Глава 20
СМЕШАННЫЕ КУЛЬТУРЫ
20.1. Введение
Поведение смешанных культур, т. е. смеси организмов различных типов имеет большое значение для экологии микроорганизмов в почве, воде, при изучении болезней и порчи продуктов. Кроме того, смешанные культуры имеют важное значение в приготовлении пищевых продуктов брожения и изготовлении таких, например, микробных продуктов, как аспарагиновая кислота [146]. Исходя из принципов роста смешанной культуры, мы можем предсказать результат загрязнения культуры или селекции какого-либо типа мутанта. Из-за сложности поведения смешанных культур использование математических моделей различных систем для описания и предсказания поведения культуры приобретает особенно важное значение.
Эта глава посвящена в основном обсуждению возможных примеров поведения двух видов в гомогенной культуре. В гетерогенной культуре, такой, как колонии на твердой среде, могут происходить более сложные явления.
Конечный результат смешанной культуры в хемостате может существенно отличаться от результата в периодической культуре. В периодической культуре каждый вид способен увеличить свою биомассу со скоростью, которая будет некоей функцией химических и физических условий окружающей среды, если один из видов не образует агентов, прекращающих рост другого, или если там нет взаимодействия хищник — жертва. Напротив, в хемостатной культуре все виды, удельная скорость роста которых меньше скорости разбавления, будут уменьшать свою численность и вследствие этого могут исчезнуть из культуры
Основные условия, необходимые для поддержания в хемостате двух видов микробов, приведены в табл. 20. Общим условием является требование, чтобы скорость разбавления была меньше, чем меньшая из двух критических скоростей разбавления для каждого вида. Здесь рассматриваются только условия стационарного состояния для смешанных культур в хемостате; однако около стационарных значений могут происходить колебания, и они предсказываются моделями таких систем.
Смешанные культуры
237
Таблица 20
Основные условия для поддержания двух видов микробов в хемостатной культуре ')
I. С одним лимитирующим субстратом:
а) если удельные скорости роста совпадают,
б) если вид, растущий быстрее, ингибируется собственным продуктом, в) если продукт вида, растущего быстрее, активирует рост другого вида
II. С различными лимитирующими субстратами:
а) если в культуру подаются различные лимитирующие субстраты,
б) если продукт одного вида служит лимитирующим субстратом для второго вида,
в) если существует взаимоотношение хищник — жертва
Во всех системах скорость разбавления должна быть меньше, чем критические скорости разбавления обоих видов.
Для того чтобы обозначить разные типы взаимодействия видов, иногда используются различные термины, такие, как комменсализм, симбиоз и паразитизм. Однако эти термины во многом перекрываются по смыслу и не могут удовлетворить некоторым типам взаимодействий, приведенных в табл. 20.
20.2. Конкуренция за один и тот же лимитирующий субстрат
20.2.1. Свободная конкуренция
Результат конкуренции за один лимитирующий субстрат между двумя видами определяется влиянием концентрации ($) этого субстрата на удельную скорость роста (ц) каждого вида. Если зависимость p(s) была бы для каждого вида одинакова, то не было бы никакой конкуренции. Однако, вероятнее всего, эти зависимости различны и являются каким-то из вариантов, показанных на рис. 74. В периодической культуре, если начальная концентрация лимитирующего субстрата значительно превышает значение Ks, каждый вид будет расти с максимальной для него скоростью, до тех пор пока лимитирующий субстрат практически не истощится. В хемостатной культуре, напротив, после начального переходного процесса один из организмов с большей скоростью роста будет вытеснять другой из культуры. Если есть «пересечение» зависимостей |i(s), как показано на рис. 74,5, то какой из видов будет расти быстрее, зависит от скорости разбавления в хемостате. В точке пересечения, где ц = Цх — Dx и s — sx, в хемостате могут
238
Глава 20
поддерживаться оба вида. Вводя выражения для ц [уравнение (2.21)], получим
(Ц/n (Ь)Ка Цт (а)^б)/(Нт (а) Ет (6))> (20.1)
где р.т(а) и цт(Ь) — соответствующие максимальные скорости роста, а Ка и Кь— константы насыщения видов А и В.
Меере [207] сообщил о первом примере «точки пересечения» двух видов в хемостатной культуре. Он обнаружил, что в хемостатной культуре Bacillus subtilis вместе с Candida utilis, лимитированной по магнию при скоростях разбавления ниже 0,08 ч-1,
Рис. 74. Возможные зависимости удельной скорости роста (ц) от концентрации (s) лимитирующего рост субстрата у видов А (/) и В (11).
А. Без пересечения. Б. С пересечением.
вид Candida вытесняет вид Bacillus, а при высоких скоростях разбавления Bacillus вытесняет Candida. Однако здесь проявлялось также влияние объема засева, а именно если Bacillus добавляли в концентрации <108/мл, то в любом случае она вымывалась. Было высказано предположение, что такое влияние объема засева можно объяснить следующим образом: Bacillus, по-видимому, нуждается для своего роста в каком-то продукте, секретируемом в среду, который стимулирует поглощение ионов магния. При малых плотностях культуры этот продукт не может достигнуть достаточной концентрации [168].
20.2.2. Контролируемая конкуренция
При условиях класса 16 (табл. 20) два вида с одним лимитирующим субстратом удерживаются в хемостате, если вид, растущий быстрее, ингибирует свой рост собственным продуктом (рис. 75). Если принять, что продукт вида А конкурентно ингибирует поглощение лимитирующего субстрата видом А,
Смешанные культуры
239
ар — концентрация продукта, то скорость роста для вида, ингибированного продуктом, будет (см. разд. 17.2) выражаться следующим равенством:
На Hm (a)S/(s "1“ ®^Са)> (20.2)
где а = 1 + pIKi- Для другого вида имеем
Нб = Рт (б)5/(« + Кь). (20.3)
Если > ц*, когда р = 0, то при увеличении р возможно На= Н*> т-е- °ба вида Удержатся в хемостатной культуре, и
Рис. 75. Действие ингибитора или активатора на зависимость удельной скорости роста (р) от концентрации (s) лимитирующего рост субстрата для данных видов.
I—с активатором, II— без ингибитора и активатора, 111— с ингибитором.
система должна стать саморегулирующейся. Подобный контроль можно было бы применять при условии, что продукт является неконкурентным ингибитором роста.
В условиях класса 1с (табл. 20) два вида, конкурирующие за один субстрат, удерживаются в хемостатной культуре, если вид А, растущий быстрее, образует активатор роста для вида В (рис. 75). Для зависимостей p(s) для вида А пишем
Ha == Hm (a)S/(s “I- Ка), (20.4)
а для вида В
Рь — РН/п (*)s/(s + Кь), (20.5)
где р — функция, которая увеличивается с увеличением концентрации активирующего продукта (р), как это обсуждалось в
240
Глава 20
разд. 17.9. Предполагается, что при р — 0 р = 1 и при
увеличении р р увеличивается так, что щ = ра.
Брюннер и др. [34] сообщили, что Serratia marcescens и Escherichia coli, очевидно, конкурировали за один и тот же источник субстрата в хемостате, причем устойчивая смешанная культура с преобладанием Е. coli наблюдалась при малых скоростях разбавления, а с преобладанием S. marcescens — при больших. Механизм, позволяющий обоим видам сосуществовать, в этом случае не был установлен.
20.3. Два вида с разными лимитирующими субстратами
Условия для удержания двух видов в хемостатной культуре, отнесенные в табл. 20 к классу II, сводятся к присутствию в среде двух разных лимитирующих субстратов для видов А и В в концентрациях sa и зу соответственно. Это не исключает возможности, что каждый вид может использовать оба лимитирующих субстрата. Полная скорость описывается уравнением накопления лимитирующего субстрата для вида А:
dsaldt = D (sf (а) - sa) - \iaxa/Yala - qbxb, (20.6)
где буквами а и b обозначены параметры видов А и В соответственно. Член Ya/a означает экономический коэффициент вида А по его лимитирующему субстрату. Параметр qtl— метаболический коэффициент для поглощения лимитирующего субстрата вида А видом В. Если xa/Yа/а дьХь, то уравнение (20.6) аппроксимируем:
dsa/dt = D (sr (д) - sa) - Цаха/Уа,а, (20.7)
что идентично выражению для поглощения лимитирующего субстрата в чистой культуре. Если подобное же уравнение можно получить для вида В и его лимитирующего субстрата, то рост двух видов будет суммой роста каждого из них на лимитирующих субстратах.
Подобная система была обнаружена в опытах с Pseudomonas aeruginosa и Klebsiella aerogenes, растущих на глюкозе И n-оксибензоате, при 40°C и pH 7,2, если глюкоза была лимитирующим субстратом для Pseudomonas, а оксибензоат — для Klebsiella (Трилли и Перт, неопубликованные данные). Однако при 37°C и ниже Klebsiella использует оба субстрата и вытесняет Pseudomonas. В такой системе происходит еще и другое взаимодействие: оксибензоат выступает как ингибирующий субстрат для Klebsiella, но не для Pseudomonas. Следовательно, если концентрация оксибензоата достигает уровня, ингибирующего рост Klebsiella, то Pseudomonas может потреблять его больше и тем самым понизить концентрацию до уровня, не ингибирующего рост Klebsiella.
Смешанные культуры
241
20.4. Продукт одного вида как субстрат для другого
В условиях класса Пб (табл. 20) роль лимитирующего субстрата для одного вида играет продукт, образуемый другим
В
Рис. 76. Неконкурентный рост двух видов (/ и II) как функция скорости разбавления (D) в хемостатной культуре.
А. Вид А (I) образует продукт, который является лимитирующим субстратом для вида В (//) (Yp/a постоянно) Б. Вид А образует продукт, который является лимитирующим субстратом для вида В (q постоянно). В. Вид А образует продукт (Ypfa постоянно), который неконкурентно ингибирует свой собственный рост, а для вида В является лимитирующим субстратом {III— рост вида А а отсутствие вида В).
видом. Примером может служить рост пропионовокислых бактерий на молочной кислоте, полученной при росте стрептококков на лактозе в молоке. Другие примеры можно найти в различных работах [49, 146, 297, 356].
Предположим, что в хемостате есть два вида, А и В, и рост вида А лимитирован субстратом, доставляемым в среду в концентрации sr. Концентрация вида А должна быть такой же,
242
Глава 20
как была бы в случае однопопуляционной культуры. Если для вида В лимитирующим субстратом служит продукт вида А, присутствующий в среде в концентрации р, то скорость его накопления будет выражаться с помощью следующего уравнения:
dp!dt = qpxa- Dp-pbxb/Yb/p, (20.8)
где qP— удельная скорость образования продукта. Приняв, что Ypa = dp]dxa и qP = Ур/ара для стационарного состояния, подставим ца=ц.ь=£>, тогда xa = Ya/s(sr— s). Подставляя значения qp и ха в уравнение (20.8), получим для стационарного состояния
^ = Yblp{YPJals^-S)-P}- (20.9)
Предсказанное влияние скорости разбавления на биомассы обоих видов в хемостатной культуре отображено на рис. 76, А. То же, но для случая, если qp не зависит от ца, показано на рис. 76, Б.
20.5. Ингибирующий продукт одного вида как лимитирующий субстрат другого вида
Предполагается, что вид А образует ингибитор своего собственного роста, который присутствует в концентрации р, а вид В использует этот ингибитор в качестве лимитирующего субстрата. Для конкурентного ингибирования продуктом скорость роста вида А описывается следующим уравнением:
На = (a)S/(s + a/Q, (20.10)
а для неконкурентного ингибирования
Ра = ^т (a)S/a(s + Ks), (20.11)
где а — \-\~PlKi- Для скорости роста вида В имеем щ — =Hm(b)P/(p + Дь) • Тогда в стационарном состоянии
p = DKbKpmW-D). (20.12)
Стационарное значение s можно получить из уравнений (20.10) и (20.11), приняв, что D = ра, и подставляя для р выражение из уравнения (20.12); ха = У(sr— s'), а хь дается уравнением (20.9) для продукта, связанного с ростом. Значения биомассы видов А и В как функций скорости разбавления представлены на рис. 76, В.
Примером такого типа смешанной культуры может служить смесь видов Pseudomonas, окисляющих метан, и Hyphomicro-Ыит, использующих метанол [46]. При окислении метана
Смешанные культуры
243
псевдомонады накапливают метанол, который является автоингибитором, a Hyphomicrobium используют метанол, тем самым предотвращая ингибирование псевдомонад.
20.6. Взаимодействие хищник — жертва
Взаимодействие хищников и жертвы можно проиллюстрировать на примере простейших, питающихся бактериями. Система моделируется следующим образом. Пусть г — концентрация хищника в хемостатной культуре. Жертва, присутствующая в концентрации h, использует лимитирующий субстрат, концентрация которого в культуре и в добавляемой среде составляет соответственно s и sr. Зависимость удельной скорости роста жертвы (ц) от концентрации субстрата и удельной скорости роста (Z.) хищника от концентрации жертвы описывается гиперболой:
ц = цт5/(5+^) и \ = KMh + Kh\ (20.13)-
где Ks и Ку — константы насыщения для жертвы и хищника соответственно. Курд и Кокбурн [62] подтвердили справедливость гиперболической формы зависимости K(h) для роста простейшего на бактериальной жертве. Экономический коэффициент определялся как Уг образованной жертвы на 1 г поглощенного субстрата и 1СГ хищика на 1 г потребленной жертвы. Баланс для жертвы:
Общая Скорость Скорость Скорость
скорость роста потребления выхода,
увеличения концентрации жертвы или
dh/dt = ph — Kr/W — Dh. (20.14)
Из баланса для хищника
Общая скорость увеличения концентрации хищника = Скорость роста — Скорость выхода получаем
dr/dt = (X — D) г. (20.15)
Баланс для субстрата, лимитирующего рост бактерий:
Общая скорость увеличения = Скорость входа — Скорость потребления — Скорость выхода, или
dsjdl = Dsr — ph/Y — Ds. (20.16)
244
Глава 20
Чтобы получить стационарные значения, производные dh/dt, dp/dt, ds/dt приравниваем к нулю. Из уравнения (20.15) находим, что в стационарном состоянии к = D и из уравнения (20.14)
И = Д(1+г/Гг), (20.17)
где тильда (волнистая черточка над буквой) означает, что данный параметр относится к стационарному состоянию. Таким образом, в стационарном состоянии удельная скорость роста хищника подстраивается к скорости разбавления, а удельная скорость роста жертвы больше скорости разбавления до тех пор, пока существует активный хищник. Из уравнения (20.13) для стационарной концентрации жертвы получаем
h = DKh/(km-D). (20.18)
Если ds/dt = 0, то, подставляя в уравнение (20.16) выражения для ц и Я, получаем
s2 - {sr - Ks - pMY (кт — D)} s — Kssr = 0. (20.19)
Следовательно, s = — b + л/(Ь2 + 4Kssr)/2, где b——{sr — Ks — —pmKh/Y(km— О)}. Для стационарного состояния баланс для жертвы:
Жертва в потоке, вытекающем из культуры = = Общее количество образовавшихся жертв — Жертвы, потребленные хищником, или
h = Y (sr — s) — r/W. (20.20)
Следовательно,
r = W {Y(sr-s)-h}. (20.21)
Если скорость разбавления больше, чем критическая скорость разбавления Z)c(r) для хищника, он будет вымываться из культуры. При jOC(r) концентрация хищника г = 0 и Я = = Y/(sr— s), что стремится к Ё8(Г), если D^ri ц™ и sr К3. Подставляя h = YsT в уравнение (20.13), получаем
Dc м « kmYsr/(Ysr + Kh). (20.22)
Если Esr Kh, то DC(r) ж кт. На рис. 77 приведены предсказанные значения р, h, s и ц в стационарном состоянии как функции скорости разбавления для культуры, в которой бактерии выступают в роли жертвы, а простейшие — в роли хищника. При скоростях разбавления, превышающих критическую скорость разбавления для простейших, система ведет себя как чистая культура бактериальной жертвы.
Смешанные культуры
245
Каналь [42] и Курд [61], исследуя аналитически и моделируя на ЭВМ дифференциальные уравнения для h, р и s, установили, что в системе может существовать три состояния, зависящие от параметров роста: устойчивые колебания (предельный цикл), затухающие колебания вокруг стационарного
Скорость разбавления, ч 1
Рис. 77. Взаимодействие хищник—жертва в хемостатной культуре [254]. Предсказанные концентрации в стационарном состоянии для хищника-простейшего (г, г/л), жертвы-бактерии (Я, г/л) и субстрата, лимитирующего рост бактерий (s, г/л). ц—удельная скорость роста бактерий; максимальная удельная скорость роста бактерий составляет 1,0 ч“\ максимальная удельная скорость роста простейшего равна 0,4 ч*~ , экономический коэффициент для простейшего равен 0,5 г/г бактерий, экономический коэффициент для бактерий 0,5 г/г субстрата, ^=0,1 г/л, К =0,01 г/л, s =!0 г/л.
значения и асимптотическое приближение к стационарному значению.
Курд [61] установил, что при параметрах роста, близких к показанным на рис. 77, устойчивые колебания были получены при D а; 75% гт и ниже, а при D х Хт модель системы стремилась к стационарному состоянию сначала с затухающими колебаниями, затем асимптотически. Курд нашел также качественное соответствие между теорией и экспериментальной системой, состоящей из Tetrahymena pyriformis, питающейся Klebsiella aerogenes, роль лимитирующего субстрата для которой играла глюкоза. В системе из Dictyostelium и Е. coli (хищник — Dictyostelium, а жертва — Е. coli) наблюдались десятикратные колебания популяции двух видов, причем поглощение
246
Глава 20
лимитирующего субстрата, глюкозы, составляло <10% полного [333].
Из вышеизложенного следует, что хищник может значительно уменьшать популяцию жертвы, а следовательно, и степень поглощения субстрата жертвой. Это очень важно в непрерывных процессах очистки. Перт и Базин [254] предполагают, что простейшие, поедая бактерии, поглощающие материал отходов, могут оказывать неблагоприятное воздействие на очистку. Однако простейшие можно исключить из процесса, повысив скорость разбавления до уровня выше критического. Или, если это необходимо, можно выделить процесс потребления бактерий простейшими во вторую стадию хемостата.
Джост и др. [162] изучали культуру, состоявшую из двух типов бактерий Escherichia coli и Azotobacter vinelandii с глюкозой в качестве лимитирующего субстрата для каждого из них и с Tetrahymena pyriformis как хищника обоих видов.
Важной особенностью этой системы оказалось то, что в отсутствие хищника Е. coli, как и предполагалось, вытесняла Azotobacter, а в присутствии хищника все три вида существовали вместе.
20.7. Определение скорости мутации
Если мутация не проявляет влияния на зависимость удельной скорости роста от концентрации лимитирующего субстрата, то хемостат можно использовать для определения скорости мутации [226]. Пусть N— общее число организмов в 1 мл; т — число мутантов в 1 мл (предполагается, что т мало по сравнению с N)\ ц— удельная скорость роста исходного типа; р — удельная скорость роста мутанта; D — скорость разбавления; X— скорость мутации, выраженная как отношение числа образованных мутантов к числу образованных организмов. Следовательно, в бесконечно малый интервал времени dt в хемостате
dm = hpN dt + prndt — Dmdt (20.23)
или
dmjdt = hpN + (p — D)m, (20.24)
dN — pNdt — hyNdt — DN dt (20.25)
или
dN/dt = {(\ -A)p-D)W. (20.26)
Допустим, что К так мало, что (1—/.) ~ 1 и что р = ц. В стационарном состоянии можем подставить ц = р = D и из уравнения (20.24) получим
dm/dt = Л DN.
(20.27)
Смешанные культуры
247
Интегрирование уравнения (20.27) дает
m = К DNt + /п0. (20.28)
Таким образом, в пределах сделанных предположений число мутантов линейно возрастает во времени, а наклон этой зависимости равен XDN, что дает возможность вычислить X.
С помощью такого метода Новик [226] наблюдал в хемостатной культуре Е. coli В линейное увеличение числа мутантов, резистентных к фагам Т5 и Тб. Было установлено также, что в большом диапазоне скорость мутации в широких пределах была пропорциональна времени генерации И, т. е. /. = atd, где а — скорость мутации в 1 ч.
Если ц не равно р, то будет идти селекция за или против мутанта и его численность не будет увеличиваться с постоянной скоростью. При р > ц число мутантов будет экспоненциально увеличиваться и вытеснять исходную форму, при р < ц в стационарном состоянии, когда р = D, член (р — D) в уравнении (20.24) отрицательный, и если m увеличивается, dmldt-^Q. Тогда число мутантов будет стремиться к предельному значению (Ml), полученному при подстановке dmfdt = Q в уравнение (20.24), т. е.
mL= WV/(1 — р/О). (20.29)
20.8. Заключение
Систематические исследования принципов роста смешанных культур относительно немногочисленны. Взаимодействия между видами лучше всего можно изучать при помощи хемостатной культуры, поскольку многие взаимодействия не будут кажущимися, если рост лимитирован субстратом и если удельная скорость роста организмов может быть изменена.
Шесть основных условий сосуществования двух видов приведены в табл. 20. Комбинируя основные условия, можно стабилизировать систему. Если взаимодействие между двумя видами осуществляется с помощью диффундирующего продукта, то систему можно упростить, разделив чистые культуры с помощью диализирующей мембраны (разд. 21.5). Расширив условия класса Па (табл. 20), можно предположить, что некое число (п) видов может сосуществовать в хемостатной культуре, если для каждого вида имеется свой лимитирующий субстрат, т. е. если имеется п различных лимитирующих субстратов. Для этих целей подходит большой выбор источников углерода, азота и серы, но для других существенных источников питания, а именно фосфата, калия и магния выбор свободных ионов мал. Из этого следует вывод, что максимальное разнообразие популяций будет получено там, где есть множество различных
248
Г лава 20
соединений углерода, азота и серы при избытке фосфатов, ионов калия и магния. С другой стороны, минимальное разнообразие должно быть в том случае, если лимитирующим субстратом является или фосфат, или калий, или магний. Другим способом сохранения двух конкурирующих видов в системе будет присутствие хищника.
Зависимость удельной скорости роста ц от концентрации (s') лимитирующего субстрата является основополагающей для определения результата роста смешанной культуры. В хемостатной культуре, чем выше скорость разбавления, тем меньше видов смогут сосуществовать в гомогенных условиях. Однако зависимость jx(s) можно бесконечно много модифицировать введением ингибиторов, активаторов и изменением температуры или других физических условий.
Глава 21
ПЕРИОДИЧЕСКИЕ КУЛЬТУРЫ С ДОБАВЛЕНИЕМ СУБСТРАТА (FED BATCH CULTURE)
21.1. Периодическая культура с добавлением источников питания
21.1.1. Общее описание
Термин «периодическая культура с добавлением источников питания» ввели Йошида и др. [357] для обозначения периодической культуры, в которую непрерывно добавляется питательная среда (рис. 78). Если часть культуры время от времени удаляется, система становится «отъемно-доливной» (repeated fed batch culture), которую можно поддерживать бесконечно. Изменения объема в культуре с добавлением источников питания отличают ее от хемостата, в котором важно поддерживать постоянный объем культуры. Периодическая культура с добавлением источников питания развивалась эмпирически для некоторых производственных ферментационных процессов, таких, как получение пенициллина, пекарских дрожжей и удаление отходов путем ферментации. Йошида и др. [357] установили, что выход биомассы из углеводородов в такой культуре увеличивается примерно в два раза по сравнению с простой периодической культурой — эффект, который пока еще не удалось объяснить. Ограничение скорости поглощения субстрата скоростью его доставки оказывается способом преодоления «катаболитной репрессии» образования продукта [77]. При производстве пекарских дрожжей потребление кислорода регулируется скоростью добавления сахара. Периодическая культура с добавлением источников питания, кроме того, моделирует некоторые природные микробные системы, как, например, инфекцию мочевых путей [194]. Теория такой культуры [253] показывает, что она должна иметь важное и уникальное применение в управлении ферментационными процессами.
21.1.2. Квазистационарное состояние
Предположим, что имеется гомогенная периодическая культура, рост которой ограничен концентрацией одного субстрата, а все другие субстраты присутствуют в избытке. Пусть sr— начальная концентрация лимитирующего рост субстрата, х—
250
Глава 21
Рис. 78.
А. Периодическая культура с добавлением источников питания. Б Периодическая культура с диализом против среды. В. Диализ периодической культуры против потока среды". / — поступление среды; 2 — мешалка; 3 — культура; 4 — среда; 5 — диализная мембрана;
6 — отток среты
концентрация биомассы во время t. Тогда имеем
х = x.j + У (sr — s),
(21.1)
где Хо — концентрация засева, s — остаточная концентрация субстрата, а У— экономический коэффициент. Предположим, что, когда концентрация биомассы достигает своего максимального значения хт, лимитирующий субстрат практически исчерпывается, то есть s <С sr. Полагая, что засев мал по сравнению с конечной биомассой, имеем хт ~ Ysr.
Периодические культуры с добавлением субстрата 251
Теперь предположим, что при хт « Ухг начинается доставка среды при скорости притока F и с лимитирующим субстратом в концентрации Sr. Общая биомасса в культуре будет X = xV, где V— объем культуры во время t. Поскольку х — XIV, то дифференцирование этого соотношения дает для скорости роста dxldt = {Vdxldt-XdVldt')IV\ (21.2)
Мы можем подставить dX/dt = цХ, где ц — удельная скорость роста, dVfdt — F и FIV — D, где D — скорость разбавления. Тогда уравнение (21.2) дает
dxfdt = ([1 — D) х. (21.3)
Это уравнение справедливо для периодической культуры с добавлением источников питания. Допустим, что зависимость удельной скорости роста от концентрации лимитирующего субстрата определяется уравнением Моно. Тогда
Н = Vms/(s + Ks). (21.4)
Если sr Ks в широких пределах значений ц, отличных от нуля, лимитирующий субстрат будет потреблен почти полностью, так что х = хт ~ dx/dt « 0. Из уравнения (21.3) при этих условиях следует, что р = D.
Пусть S— общая концентрация лимитирующего субстрата в культуре. Тогда баланс по субстрату можно выразить в виде уравнения
Скорость увеличения=
= Скорость входа — Скорость поглощения для роста, т. е.
dS/dt = Fsr - pXlY. (21.5)
Если X = Vxm, фактически весь субстрат поглощается, как только он поступает в культуру, т. е. Fsr « цХ/У. Следовательно, dSjdt и dsjdt также стремятся к нулю. Это состояние, когда dx[dt « 0, ds/dt «О и ц = D, называется квазистационарным состоянием.
Для того чтобы получить концентрацию лимитирующего субстрата как функцию скорости разбавления в квазистацио-нарном состоянии, подставим £> = р в уравнение (21.4); это дает
s^DKsl(vm — D). (21.6)
Скорость увеличения общей биомассы во время квазиста-ционарного состояния будет
dXjdt = FYsr. (21.7)
Следовательно,
X = Xa^FYsrt. (21.8)
252
Глава 21
Сравнивая культуру с добавлением источников питания в квазистационарном состоянии с хемостатной культурой в стационарном состоянии, мы видим, что в обоих случаях у = D, но в хемостате D постоянно, а в культуре с добавлением источников питания D уменьшается, и предполагается, что у уменьшается с той же скоростью. Уникальность культуры с добавлением источников питания состоит в том, что в квазистационарном состоянии биомасса находится в переходном состоянии, а скорость роста — под контролем.
21.1.3. Влияние энергии поддержания
До сих пор мы полагали, что экономический коэффициент У постоянен. Однако если лимитирующий субстрат является источником энергии, то часть его будет израсходована для обеспечения энергией процессов поддержания. В таком случае энергетический баланс будет описываться следующим равенством:
dS/dt = Fsr - цХ/Yq — тХ, (21.9)
где Yg — истинный экономический коэффицент, а т — коэффициент поддержания. При условии, что энергетические затраты на поддержание тХ малы по сравнению с затратами на рост (цХ/Уй), мы можем принять, что Fsr ж уХ/Уй и соответственно у, ~ D. Полагая dsfdt = 0 и подставляя D == у и X = = Ysr, где У — средний экономический коэффициент, из уравнения (21.9) получим
1/У« 1/У0 + т/Е>. (21.10)
Таким образом, культура с добавлением источников питания может быть использована для вычисления энергетических затрат на поддержание, а также для предсказания экономического коэффициента при различных скоростях разбавления.
Если лимитирующий субстрат представляет собой источник энергии, то общее количество биомассы в системе будет иметь максимальное значение, описываемое следующим выражением:
Xm = Fsrlm. (21.11)
21.2. Образование продукта
21.2.1. С постоянным выходом, продукта
В квазистационарном состоянии культуры с добавлением источников питания хт а; У$г концентрация продукта будет р = Yp/Ssr, где Yp/s — выход продукта в расчете на поглощенный лимитирующий субстрат. Производительность будет равна FYp/sSf.
Периодические культуры с добавлением субстрата
253
21.2.2. С постоянным qp
В этом случае скорость увеличения общего количества продукта (Р) в квазистационарном состоянии описывается уравнением
dP/d/ = (?pxmV = (?pxm(Vo + ^), (21.12)
где Ио — объем культуры в начальное время. После интегрирования получим
P = P0 + qPxm(V0 + Fl/2)t, (21.13)
где Ро — общее количество продукта в начальный момент времени. Пусть р и Ро — концентрации продукта в момент времени t и начальный момент соответственно. Подставляя pV = Р, PoVo — Ро, D = F/V, получим
P^PoVo/V + qpxm(V0IV + Dt/2)t. (21.14)
Иногда значения qP и xm в отдельности не известны, поскольку определение биомассы сопряжено с определенными трудностями. Однако, если установлено, что скорость синтеза продукта— постоянна, г = qpxm, мы можем подставить это выражение в уравнение (21.14) и получим
р = роИо/И + г(Ио/И + ад^ (21.15)
С помощью этого уравнения Перт [253] определял возможные титры пенициллина в промышленной периодической культуре с добавлением источников питания.
21.2.3. С qp как сложной функцией ц
Если qP по продукту сложным образом меняется при изменении скорости роста в квазистационарном состоянии культуры с добавлением источников питания, то для увеличения общего продукта в малый интервал dt напишем
dP = qp (t)Xdt,
(21.16)
где qPt — значение функции qP в момент времени t. Для X в момент t в квазистационарном состоянии подставим
X = xmV = xm(Vo+Ft).
(21.17)
Тогда общее количество продукта, образованное за время г, будет
t
P-P0 = xm\qp(t)(V0 + Ft)dt. (21.18)
о
254
Глава 21
Подставляя pV = Р и poVo = Ль получим
t
p^^L + ^^qp(t)(V0 + Ft)dt. (21.19)
О
Если подставим r(t) = qP(t)xm в уравнение (21.19), получим
p=^ + J_\r(t)(Va + Ft)dt. (21.20)
о
Чтобы вычислить интеграл, необходимо определить значения qp как функцию времени в квазистационарном состоянии. Это можно сделать следующим образом. Дифференцируя это выражение для концентрации продукта (р = Р/V), получим
dp/dt = K(rfP/rfZ)~ P(rfV/rf/) _ (21.21)
Подставляя dP/dt = qPX, X = Vxm, P = p/V, dV/dt = F и F/V = D, получим
dp/dt = qpxm — Dp. (21.22)
Следовательно,
qP —(dp/dt + Dp)/xm. (21.23)
Если мы примем, что qPxm = г, то получим
г = dp/dt + Dp. (21.24)
Для того чтобы экспериментально определить qp или г в квазистационарном состоянии культуры с добавлением источников питания, построим график зависимости р от t и из наклона графика определим dpfdt в разное время. Затем с помощью уравнений (21.23) и (21.24) мы можем получить графическое выражение qP(t) и r(t). Таким образом можно графически определить интегралы в уравнениях (21.19) и (21.20).
21.3. Отъемно-доливная культура
В отъемно-доливной культуре часть культуры время от времени удаляется при постоянном поступлении свежей среды. Это означает, что объем культуры и соответственно скорость разбавления и зависящие от нее параметры метаболизма, такие, как, например, удельная скорость роста, будет испытывать периодические изменения. Рассмотрим случай, когда период цикла (tw) — величина постоянная. Примем, что в течение процесса культура находится в квазистационарном состоянии. Если при достижении культурой определенного объема Vw часть культуры удаляется, то объем остающейся части V’o = yl/u;.
Периодические культуры с добавлением субстрата
255
Подставив это значение Ио в уравнение (21.14), для концентрации продукта во время удаления культуры, т. е. перед концом цикла, получим
Pw = ypo +qpxm(y + ~-)tw, (21.25)
где DW = F(VW—скорость разбавления в конце цикла. Период цикла — это время, в течение которого объем культуры увеличивается от yVw до Vw, т. е. tw = (V,„ — yVu)/F. Поскольку F = DWVW, период цикла выражается уравнением
tw = <A-N)/Dw. (21.26)
Подставляя это значение в уравнение (21.25), для концентрации продукта в конце цикла получим
P^ = YPo + 4^(l — Y2)- (21.27)
Если qv не постоянна, а изменяется в течение цикла, то из уравнения (21.19) следует, что концентрация продукта в конце цикла выражается с помощью следующего равенства:
*w
Pw = YPo + xm^qp (0 (у + Dwt) dt. (21.28)
о
Если концентрацию некоторого продукта в начале первого цикла в квазистационарном состоянии обозначим через р0, то концентрация этого продукта после первого цикла описывается следующим равенством:
Po = YPo + tf, (21.29)
в котором
K,=q..xm(\ — y2)l2Dw, (21.30)
где qP постоянно, или
К = Xm ^qp (/) (у + Dwt) dt, (21.31)
о
где qp изменяется в течение цикла. После второго цикла концентрация продукта будет
Рг = YPi += Y2Po + У-^ + Л). (21.32)
После n-го цикла концентрация продукта будет
Pn = ypn-i + К = УпРо + К(уп~1 + + ... +Y+1). (21.33)
256
Глава 21
Суммируя геометрическую прогрессию с постоянным знаменателем у, получим
= (21-34)
Если п велико, у"ро —* 0 и у"-1 —♦ 0. Тогда уравнение (21.34) принимает вид
Pn = ^/(1-Y). (21-35)
Таким образом, следует вывод, что в отъемно-доливной культуре, независимо от начального значения, концентрация продукта стремится к значению рп [определяемому по уравнению (21.35)].
Если <?р — величина постоянная, то, подставив ее в уравнение для К из уравнения (21.30), получим
pn-qPxm(\ +\)/2Dw. (21.36)
Теперь, если мы уменьшаем объем культуры, отбираемый в конце цикла, у —♦ 1 и из уравнения (21.36) следует, что Рп-+ qPXmlDw, а это есть концентрация продукта, ожидаемая в стационарном состоянии в хемостате. Следовательно, если qp постоянно, концентрация продукта, полученного в отъемно-до-ливной культуре, не может превзойти концентрацию продукта в хемостате при D = Dw. Однако квазистационарные условия могут стимулировать образование некоторых продуктов так,что qp при этом превосходит значение его в стационарном состоянии в хемостате (разд. 21.4).
21.4. Применения периодической культуры с добавлением источников питания
Культура с добавлением источников питания — один из методов получения роста, лимитированного субстратом. С помощью этого метода Йошида и др. [357] получили культуру Candida tropicalis, рост которой был лимитирован гексадеканом, и установили, что экономический коэффициент (0,95) в условиях лимитации субстратом был почти в два раза выше экономического коэффициента в простой периодической культуре. Чем обусловлены эти различия, не установлено. Бейнбридж и др. [12] с помощью этого метода исследовали изменения в составе и структуре Aspergillus nidulans при нулевой скорости роста, полученной подачей такого количества глюкозы, которое обеспечивало только функции поддержания. Ограничение скорости подачи субстрата становится выгодным, если скорость переноса кислорода (Кь<з) может лимитировать скорость процесса. Me-
Периодические культуры с добавлением субстрата
257
тод этот играет важную роль в экологических исследованиях, поскольку используется для моделирования инфекции мочевого пузыря у человека [194]. Данные Перта [248] о том, что при добавлении лимитирующего субстрата с постоянной скоростью биомасса увеличивается линейно, подтверждают правильность уравнения (21.8). Главный принцип теории гласит, что в ква-зистационарном состоянии организм автоматически подстраивает свою удельную скорость роста так, чтобы она осталась равной скорости разбавления. Это условие, вероятно, хуже всего выполняется в начале цикла, когда возникает необходимость в резком увеличении удельной скорости роста (скачок вверх). Результаты Мателес и др. [205] свидетельствуют, что в хемостатной культуре бактерий удельная скорость роста может немедленно подстраиваться, если скачок вверх составляет около 20% рт; если же скачок вверх составляет около 40% то для подстройки требуется время, равное периоду трех удвоений. Математическая модель автосинтеза (разд. 24.2.1) утверждает, что скорости подстройки ц в квазистационарном состоянии культуры с добавлением источников питания и в стационарном состоянии в хемостате должны быть различны, поскольку при этих двух состояниях различен ферментный состав. Что касается действия внезапного резкого увеличения скоростей разбавления, то для выяснения этого вопроса требуются дополнительные данные. В случае необходимости резкого скачка вверх в скорости разбавления в конце цикла можно было бы избежать, удаляя часть культуры с контролируемой скоростью.
Ограничение минимальной удельной скорости роста может стать необходимым для предотвращения затухания синтетической активности биомассы, например при образовании пенициллина [261]. Поступают сведения о том, что для биосинтеза пенициллина в промышленных условиях сейчас используется отъемно-доливная культура на чисто эмпирической основе. Минимальная удельная скорость роста, необходимая для предотвращения затухания биосинтеза пенициллина, равна 0,014 ч-1 [261]. Возможные титры пенициллина такой культуры рассматриваются в работе Перта и Ригелато [261].
Наиболее важная особенность периодической культуры с добавлением источников питания состоит в том, что она дает уникальную возможность осуществления переходных условий между фиксированными скоростями роста. Имеются данные, что максимальные скорости некоторых процессов могут достигаться только в переходных состояниях, например при образовании некоторых бактериальных антигенов [263] и образовании пенициллина [354].
Культура с добавлением источников питания технически более проста, чем хемостатная, поскольку избавляет от необхо-
9 Зак. 737
£58
Глава 21
димости поддерживать постоянным объем культуры, что зачастую бывает наиболее трудной частью работы при использовании хемостатной культуры.
21.5. Культура с диализом
21.5.1. Периодический диализ
В такой культуре (рис. 78,5) субстрат (среда) поступает в культуру путем диффузии через диализирующую мембрану. Скорость диффузии растворенных веществ через мембрану пропорциональна разности концентраций [294]. В системе, показанной на рис. 78, 5, предполагается, что гомогенность в среде поддерживается с помощью перемешивания или циркуляции среды и культуры.
Пусть А — площадь диализующей мембраны, s — концентрация лимитирующего субстрата в культуре, sm — концентрация лимитирующего субстрата в среде вне культуры, sm(0)— концентрация лимитирующего субстрата в среде вне культуры в начальный момент времени, X— общая биомасса в момент времени t, Хо— общая биомасса при = О, Vc — объем среды в культуре, Vm— объем среды вне культуры. Предположим, что в начальный момент времени диффузия субстрата через мембрану становится процессом, лимитирующим рост. Тогда скорость роста биомассы будет
-^ = ^AY(sm-s), (21.37)
где ф— коэффициент проницаемости мембраны для определенного субстрата и Y — экономический коэффициент. Примем, что рост лимитируется скоростью диффузии субстрата, s <Csm, т. е. мы можем считать, что (sm— s) ж sm. Тогда
dX/dt = qAYsm. (21.38)
Следовательно, удельная скорость роста будет
ц = фДУ5т/Х. (21.39)
Из баланса субстрата для составляющих среды, если рост лимитирован диффузией, имеем
Vmdsm/dt = -^Asm. (21.40)
Интегрирование уравнения (21.40) дает
sm = sm(o>e-*', (21.41)
Периодические культуры с добавлением субстрата
259
где ф = tyA/V m- Подставляя выражение для sm в уравнение (21.38) и интегрируя его, получим
X = X0 + VmYsmW(l-e->‘). (21.42)
Если лимитирующий рост субстрат не расходуется на энергию поддержания, то при /->оо биомасса стремится к максимуму, выраженному уравнением
Xm = X0 + VmYsmW. (21.43)
Общее количество продукта, связанного с ростом, в момент времени t будет
P = W»Wo+VP/ssm((»(l-e-*'), (21.44)
где Yp/x и Yp/S — значения выхода продукта в расчете на образованную биомассу и поглощенный субстрат соответственно. Если qP постоянно, имеем dP{dt = qPX. Подставляя выражение для X и интегрируя его, получаем
{[Z? ys 1
(1о + УЛ)/ + -2/(е-*'-1) J. (21.45)
Если продукт не может диффундировать через мембрану, то уравнение конечной концентрации продукта будет иметь вид
p^=P/Vc. (21.46)
Если продукт способен диффундировать, то его конечная концентрация описывается уравнением
P = P/(Vc+Vm). (21.47)
Следовательно, диализ культуры увеличивает концентрацию недиффундирующего продукта в (Vc + Vm)IVc раз.
21.5.2. Диализ против потока среды
В системе, изображенной на рис. 78, предполагается, что среда вне культуры полностью перемешивается, а свежая среда добавляется со скоростью F; sr—концентрация лимитирующего субстрата в поступающей среде. Скорость изменения концентрации лимитирующего субстрата в среде вне культуры будет
Vmdsmldt = Fsr — Fsm — ^4(sOT — s). (21.48)
Если рост лимитирован диффузией, то предполагается, что sm^> s. При этих условиях уравнение (21.48) аппроксимируется к
Vmdsm/dl =Fsr — (F 4- фЛ)зт. (21.49)
9*
260
Глава 2/
Интегрируя уравнение (21.49), получим
= [Fsr - {Fsr - (F + ФД) sm (0)} e-*q/(F + фД), (21.50) где ф= (F 4* фЛ)/Vm- Если t oo, е~ф1 —> 0, то из уравнения (21.50) следует, что
sm « Fsr/(F + фД). (21.51)
Если рост лимитирован диффузией и s «0, то скорость увеличения общей биомассы будет
dX/dt = A>AsmY. (21.52)
С увеличением времени sm стремится к значению, приведенному в уравнении (21.51), а скорость увеличения общей биомассы стремится к
{dX!dt)x = фЛт,/(Л + фД), (21.53)
т. е. общая биомасса стремится увеличиваться с постоянной скоростью.
В такой системе общая биомасса будет увеличиваться до тех пор, пока или плотность культуры станет такой, что дальнейшее перемешивание биомассы будет невозможно, или скорость диффузии субстрата через мембрану не станет равной затратам на поддержание. Концентрацию продукта можно вычислить так же, как и в случае культуры с периодическим диализом.
21.5.3. Применение культуры с диализом
Культура с диализом используется в основном в трех случаях:
1. Для осуществления роста, лимитированного субстратом. Следует отметить, что в периодической культуре с диализом, хотя рост и может быть лимитирован субстратом, удельная скорость роста уменьшается во времени в отличие от хемостатной культуры в стационарном состоянии.
2. Для концентрирования биомассы и недиффундирующего продукта. В качестве примеров назовем получение вакцин и ферментов. Геллап и Герхардт [104] показали, что Serratia marcescens можно дорастить в культуре с диализом до концентраций 9 г сухого веса/100 мл, в то время как без диализа — до концентрации 0,8 г сухого веса/100 мл. Таким образом, этот метод дает возможность выращивать культуру до высокой плотности биомассы при разбавленном субстрате.
3. Для уменьшения концентрации диффундирующего продукта, ингибирующего рост. Например, тиобациллы могли достичь на глюкозе высокой плотности при условии, что ингиби-
Периодические культуры с добавлением субстрата
261
руюший продукт, возможно пировиноградная кислота, удалялась из культуры при помощи диализа [28].
Двухфазные культуры. Так Тирелл и др. [334] назвали систему, состоящую из жидкой среды, расположенной слоем над гелевой средой. Эта система подобна периодической культуре с диализом, с той лишь разницей, что сопротивление диффузии субстрата из геля с течением времени увеличивается.
21.6. Диффузионная капсула
Диффузионная капсула (рис. 79) представляет собой устройство, с помощью которого субстрат подается в культуру
с постоянной скоростью, особенно [248]. Капсула имеет маленькое отверстие, затянутое диализирующей мембраной. Если капсула заполнена раствором субстрата и помещена в водную среду, субстрат в течение долгого времени диффундирует с постоянной скоростью, которая пропорциональна начальной концентрации субстрата. Это кажущееся противоречие с законом Фика пока еще не нашло объяснения.
Если скорость диффузии субстрата из капсулы равна G г/ч, то для скорости увеличения общей биомассы в культуре имеем
/ = Х0 + ДГ/, (21.54)
где У — экономический коэффициент. Пусть V — объем культуры, х—концентрация биомассы, уравнение (21.54), получим
в случае колб на качалках
Масштаб ।-------1
10 мм
Рис. 79. Диффузионная капсула для добавления субстрата с постоянной скоростью.
1 — мембрана; 2—кольцо; 3— неопреновая прокладка.
Тогда, подставляя х1/ = А’в
х = х0 4- GYI/V.
(21.55)
Справедливость уравнения (21.55), которое означает, что концентрация биомассы увеличивается линейно, была установлена Пертом [248]. Удельная скорость роста, как это следует из уравнения (21.54), будет
H = GY/Vx. (21.56)
262 Глава 21
Концентрацию лимитирующего рост субстрата можно получить, подставив ц = pms/(s + Ks) в уравнение (21.56). Тогда
s = GYKsl^mVx-GY). (21.57)
Подставляя выражение для х из уравнения (21.55), получаем
^ = Ш(/ + Vx^/GY) - 1}. (21.58)
Если qP постоянно, концентрация продукта в момент времени t будет
p = Pn + qpt{xn + GYtl2V}. (21.59)
О’Салливан и Перт [229] использовали это выражение, чтобы вычислить значение qP для образования пенициллина в колбах на качалке, когда рост был лимитирован глюкозой, поступающей из диффузионной капсулы.
Глава 22
ГЛУБИННЫЙ РОСТ В ВИДЕ ПОГРУЖЕННЫХ ПЛЕНОК ИЛИ ШАРИКОВ БИОМАССЫ
22.1. Погруженные пленки биомассы
Многие микроорганизмы и культуры клеток тканей обладают способностью прикрепляться к твердым поверхностям и там размножаться. Так, бактерии и грибы при длительном культивировании с перемешиванием часто покрывают внутренние поверхности сосудов, в которых развиваются. Классическим примером применения пленок биомассы может служить использование «оросительного фильтра» при очистке сточных вод. Клетки тканей млекопитающих и других животных располагаются при неподвижном культивировании на стеклянной поверхности, по которой они стелются, размножаются и образуют тонкий ровный слой. Такую культуру клеток животных тканей называют монослоем.
Вначале каждая из таких стелющихся клеток полностью обеспечена питательной средой и способна расти и размножаться с максимальной экспоненциальной скоростью. Однако по мере того, как клетки образуют толстую монолитную пленку биомассы, рост лимитируется диффузией субстрата внутрь этой пленки. Упрощенная схема растущей пленки биомассы, лимитированной диффузией субстрата (рис. 80), приводится ниже.
При этом мы исходим из допущения, что система находится в стационарном состоянии, т. е.
Количество субстрата, Количество субстрата,
проникающего в пленку метаболизируемого
пленкой.
Для нижних слоев пленки (на рис. 80 от у = 0 до у) справедливо уравнение
aD'^=qayp, (22.1)
где а — поперечное сечение пленки, D' — коэффициент диффузии субстрата, q—метаболический коэффициент субстрата, лимитирующего рост, р — плотность биомассы. Интегрируя
264
Глава 22
уравнение (22.1), получаем
У а
D' ds = qp у dy.
s у
Следовательно.
°' (»,-»)- т? («»-»’)
(22.2)
(22.3)
Предположим, что q не зависит от s, — упрощенное представление, справедливое для случая, когда концентрация источника углерода и энергии составляет более 20 мг/л, а концентрация
Жидкая
среда
Пленка биомассы
~У~Уа
—У+dy ~~У
Твердая поверхность, на которой происходит рост
Рис. 80. Пленка биомассы на твердой поверхности.
Концентрация лимитирующего субстрата равна s на уровне у, s + ds на уровне y + dy sr на уровне уа
кислорода — более 0,2 мг/л. Пусть s = 0, когда у = 0; тогда уравнение, выражающее максимальную толщину пленки, при которой биомасса еще остается активной, имеет следующий вид:
z/0 = (2D'sr/W),/!. (22.4)
Максимальная толщина дышащего слоя мышечной ткани лягушки при отсутствии лимитации кислородом — в условиях, когда к одной стороне имеется свободный доступ воздуха при давлении 1 атм, — составляла 900 мкм [136]. В отличие от этих данных максимальная толщина бактериальной пленки, образованной Escherichia coli, также не лимитированной кислородом, при свободном доступе воздуха с одной стороны при давлении 1 атм равнялась приблизительно 40 мкм [246]. Эта величина значительно ниже, чем в случае мышечного слоя лягушки, что главным образом объясняется гораздо более интенсивным дыханием у бактерий. При росте грибов, лимитированных концентрацией глюкозы (10 г/л), толщина активного слоя пленки составляла примерно 1000 мкм [245]. Если толщина слоя пленки биомассы превышает максимальное значение .поперечного сечения активной пленки, то, вероятно, ниже активного слоя
Г дубинный рост биомассы
265
будет находиться или неактивный слой, или слой, лимитированный каким-либо субстратом. Следовательно, наружный слой, находящийся в контакте с жидкостью, может быть лимитирован кислородом, а нижний анаэробный слой может испытывать недостаток в углероде.
При моделировании исходят из предположения, что концентрация лимитирующего субстрата в жидкой среде, соприкасающейся с пленкой биомассы, такая же, как и концентрация во всем объеме среды. Это справедливо лишь для случая, когда жидкость находится в подвижном состоянии, обусловленном либо перемешиванием, либо наличием конвекционных потоков. При неподвижной среде концентрация субстрата может падать до нуля не только в самой пленке биомассы, а также в некоторой степени в жидкости над пленкой. Это в дальнейшем вызовет уменьшение толщины активного слоя биомассы. Если процесс аэробный, то очень важным моментом явится диффузия кислорода из газа в жидкость (разд. 22.2.5).
22.2. Микроорганизмы, развивающиеся на наполнителе в колонке
22.2.1. Общая характеристика
Колонки с твердым носителем, представляющим собой поверхность, на которой могут расти микроорганизмы, применяются в оросительных фильтрах, используемых при очистке сточных вод, в процессах быстрого получения уксуса из спирта а также в почве.
Рис. 81. Схематическое изображение теоретических пленок биомассы (4) в колонке, разделенных теоретическими отсеками (/), каждый из которых содержит объем V/ti жидкой среды (3), где п — число теоретических отсеков и К - общий объем жидкости в колонке.
F — скорость потока среды, -начальная концентрация субстрата, s&—концентрация субстрата в потоке, вытекаю щем из колонки, 2 — газ.
F se
266
Глава 22
В модели, предложенной Пертом [251], колонка рассматривается как последовательный ряд «теоретических пленок» биомассы (рис. 81). Жидкая среда стекает вниз по колонке и обеспечивает пленку биомассы питательными веществами. Если процесс аэробный или для его течения необходим какой-то газ, то пустые пространства между материалом-носителем могут быть частично заполнены воздухом или другими газами.
22.2.2. Допущения, принятые в теории Перта
Согласно теории, предложенной Пертом [251], колонка представляет собой какое-то количество п теоретических отсеков, каждый из которых содержит жидкую среду, расположенную над основной теоретической пленкой биомассы с плоскостью поперечного сечения А, равной плоскости сечения колонки. При этом делается допущение, что жидкая среда (объем V) в колонке должна быть распределена равномерно между теоретическими отсеками. Субстраты, растворенные в жидкости, проникают в пленку биомассы только путем диффузии. Делается еще одно допущение, а именно что жидкая среда просачивается вниз по колонке со скоростью потока F; время ее пребывания в каждом отсеке одно и то же (trlri), a tr — время пребывания во всей колонке, так что нет необходимости специально устанавливать, как долго среда находится в каждом отсеке. Следовательно, движение жидкости вниз по колонке можно рассматривать как прерывающуюся систему полного вытеснения; процесс еще более приближается к этой системе, если число теоретических пленок увеличивается. Принимается также допущение, что в каждом отсеке жидкость полностью перемешивается, но между разными отсеками смешения не происходит.
Через некоторое время на свежей колонке образуется пленка биомассы в результате роста микроорганизма на субстратах среды. Со временем толщина пленки увеличивается, однако толщина активного слоя биомассы будет ограничиваться диффузией. Следовательно, в конечном итоге пленка биомассы будет состоять из активного верхнего слоя, находящегося в контакте со средой, а внизу может располагаться слой биомассы, ставший неактивным вследствие того, что фактически весь лимитирующий субстрат израсходован верхним слоем.
22.2.3. Потребление лимитирующего субстрата
Толщина активного слоя биомассы лимитируется диффузией необходимого субстрата в соответствии с уравнением (22.4). Все теоретические пленки биомассы будут полностью вступать в действие по мере того, как доступная поверхность в колонке
Глубинный рост биомассы
267
полностью покроется биомассой и пленка активной биомассы достигнет максимальной толщины. Количество жидкой среды в каждом отсеке составляет (V/n). Рассмотрим переходы объема среды (V/п) от первого до последнего отсека. Пусть количество лимитирующего субстрата, потребляемого на каждом
Рис. 82. Предсказанное падение концентрации субстрата, лимитирующего рост, в действующей колонке со сформированными микробиологическими пленками.
последующем этапе, есть щ, 02, . .., оп. Происходящее при этом уменьшение концентрации субстрата показано на рис. 82. Если sr—начальная концентрация и se—конечная концентрация лимитирующего субстрата, то
Конечная кон- Начальная Уменьшение
центрация концентрация концентрации.
Следовательно,
Se = 5Г — (<Т1 + <т2 + ••• + <7rt)/(V/«)- (22.5)
При этом
ci = qxgltr/n, (22.6)
где q— метаболический коэффициент для субстрата, лимитирующего рост, xgi — количество биомассы в активном слое, tr — общее время пребывания среды в колонке, tr/n — время нахождения среды в каждом отсеке. Количесто биомассы в активном слое выражается следующим равенством:
xgl = Дщр, (22.7)
где А — величина поперечного сечения колонки, yi — толщина активного слоя, р—плотность биомассы. Подставляя значение у\
268
Глава 22
из уравнения (22.4) и значение xgi из уравнения (22.7), получим
^=4S/2- (22-8)
где k = Afr(2D'pq) \ Концентрация лимитирующего субстрата во втором отсеке дается выражением
sr — ах/(У In) = sr — ks'k/V. (22,9)
Количество потребленного субстрата во втором теоретическом отсеке должно быть
^=|(sr-4s^),/2- <22-1о>
Следовательно,
о = A SV, (1 - k/V s'l*}'1*. (22.11)
Примем, что = k/Vs'^. Из биноминальной теоремы при условии, что £—малая величина, (1—£)'/г « 1 — £/2. Отсюда следует, что 02 может быть аппроксимирована
G = As72fi-----* Y (22.12)
п г 2 Их/2 )
Подобным же образом количество субстрата, метаболизированного теоретической пленкой биомассы в n-м отсеке, будет
on = As72|i_(n_i)^.|. (22.13)
п ( 2Vs" )
Сумма ряда о составит:
П
Z'.=7s'’[n“^Fll+2 + 3+ +("-'»]-
<22J4>
п
Поскольку °п — общее количество лимитирующего субстра-п=1
та, потребленного из объема V/n среды в процессе стекания вниз по колонке, мы можем написать
^an = (sr-se)V[n. (22.15)
Из уравнений (22.14) и (22.15) получаем
^7г«2-(17- + 5/2) Vn + Sr-S« = o- (22.16)
Глубинный рост биомассы
269
Решение уравнения (22.16) дает
n = 0,5 + ^[^-{(^ + Sy2)2_Sr + Se pj, (22.17)
где К = A (2D'pq),/г. (Выражение (22.17) называется длинной формулой, если KI4F мало по сравнению с s/2, тогда уравнение (22.17) может быть аппроксимировано в короткую формулу
о = »?) <22.18)
Общая площадь биологической пленки обозначается через nA, и «удельная площадь биологической пленки» равна
aft = nX/Vc> (22.19)
где Ve — объем действующей колонки.
22.2.4. Образование биомассы
Общее количество активной биомассы на всей колонке выражается следующим равенством:
x? = F(sr-se)/7. (22.20)
Если записать q — p/Y g + ₽, где p/Yg— скорость утилизации субстрата только для роста, а р — потребление субстрата для других целей, например таких, как обеспечение энергией процессов поддержания жизни, тогда
__ F{sr- se) s (И/гй+₽)-
(22.21)
Вся биомасса (xj, т. е. сумма активной и неактивной биомассы, увеличивается со скоростью
dxtldt = YF{sr-se), (22.22)
где Y — есть общий экономический коэффициент. Если при этом не будет происходить процесса, подобного автолизу, ведущего к удалению неактивной биомассы, то будет наблюдаться тенденция заполнения пустых объемов з колонке. Если же скорость вымывания неактивной биомассы представить какЬ(Х)—xg), где b — величина постоянная, то
dxt/dt = YF (sr ~se) — b (xt - xj (22.23)
и для стационарного состояния, когда толщина пленки остается постоянной (dxt/dt — 0), уравнение общего количества биомассы (лц) будет иметь вид
d(xt-xg) = yF(sr-se). (22.24)
270
Глава 22
22.2.5. Лимитация кислородом
В действующих колонках субстратом, лимитирующим аэробные процессы, как правило, является кислород в связи с его низкой растворимостью. Чтобы колонка работала эффективно при аэробном процессе, в большинстве случаев необходимо аэрировать жидкую среду на всех этапах, по всей длине колонки. При этом предполагается, что транспорт кислорода из газа в жидкую среду идет постоянно в каждом теоретическом отсеке и что скорость процесса лимитируется кислородом. Уравнение баланса кислорода в теоретическом отсеке имеет следующий вид:
Скорость увеличения Скорость Скорость потребления
количества раство- растворения кислорода теоретиче-
ренного кислорода ской пленкой биомассы,
или
^0 = ^La(Cs-C)T-XA- <22-25)
В условиях стационарного состояния, когда Ro = 0,
VKra
х^о=-ЛГ-^-с). (22.26)
Поскольку все активные теоретические пленки должны быть одной и той же толщины, то для целой колонки имеем
nxgi^o2 = VKLa (cs - с). (22.27)
Подставив значение xgl из уравнений (22.7) и (22.4), получаем
п = VKLa (cs - с)/Кс\ (22.28)
где К = A (2Dpqoyi\
Потребление окисляемого субстрата (As) связано с соответствующим поглощением кислорода (ДО2) согласно выражению ДО2 — P(jAs или qO! = P0q, где Ро — константа потребности в кислороде. Скорость потребления окисляемого субстрата во всей колонке равна
F (sr — se) = nxsiq. (22.29)
Подставив значение xgi из уравнения (22.26) и приняв, чтод0 = = Poq, получаем
VKra
sr — se = (cs — с). (22.30)
Тогда из уравнений (22.28) и (22.30) выводим
sr-se = -nKc'i>/P0F. (22.31)
Глубинный рост биомассы
271
22.2.6. Применение
Применение этой теории в случае проектирования подобных колонок для разложения субстратов с помощью микроорганизмов приводит к следующему заключению: если поток среды отклоняется от идеальной системы полного вытеснения, то эффективность действующей колонки будет уменьшаться в связи с тем, что какая-то часть среды с исчерпанным субстратом будет бесполезно занимать место биомассы. В действующей колонке имеется возможность для наличия целой серии зон биомассы, адаптированной к различным функциям, например к последовательному потреблению двух субстратов — X и Y, причем X ингибирует или репрессирует потребление Y. Перт [251] провел сравнительный анализ числа теоретических пленок, необходимых для аэробных и анаэробных условий в колонках. Вычисленные данные свидетельствуют о том, что действующая колонка достаточно эффективна при анаэробных процессах разложения субстратов микроорганизмами, но в аэрируемых колонках может происходит весьма существенная лимитация окислительных процессов из-за низкой скорости растворения кислорода. Количественные испытания подобных моделей еще не осуществлены.
22.3. Рост в виде погруженных шариков биомассы
22.3.1. Общая характеристика
Мицелиальные организмы существуют, как правило, водной из двух различных форм. Первая — это гомогенная волокнистая форма, в виде которой мицелий равномерно распределяется в среде так, что все индивидуальные гифы окружены средой. Вторая форма, называемая шарик или строма, представляет собой более или менее сферическое скопление биомассы, в которой гифы довольно плотно соприкасаются друг с другом ([38], фотографии). Шарики способны вырастать до макроскопического размера, и упаковка гиф может быть настолько плотной, что любой путь проникновения субстрата, кроме диффузии, станет невозможным. Поэтому потребление субстрата в шариках будет лимитироваться его диффузией. С другой стороны, структура мицелиальных шариков может быть достаточно рыхлой, и поток среды проникнет внутрь шарика. Изучение роста биомассы в виде шариков имеет важное значение, поскольку развитие грибных культур в ферментерах происходит обычно именно в такой форме; кроме того, аналогичными свойствами обладают «хлопья» микроорганизмов сточных вод.
Нитевидные формы грибного мицелия растут экспоненциально с постоянной удельной скоростью роста (ц) до тех пор, пока
272
Глава 22
субстрат или обладающий ингибиторными свойствами продукт метаболизма не станет фактором, лимитирующим рост [257]. Рост в форме шариков отклоняется от экспоненциального закона и, по имеющимся данным, следует закону кубического корня ЛГ3 = kt + Л10/з (22.32)
для многих циклов удвоения биомассы [245, 327]. Этот закон будет справедливым, если весь рост происходит на внешней
А. Схема поперечного сечения через центр шарика биомассы с периферической зоной роста, имеющей ширину ш. Б. Поперечное сечение через центр шарика биомассы, расположенного в глубине питательной среды. Концентрация субстрата по радиусам г, г A-dr и Л равна s, s + ds и sm соответственно.
стороне шарика с постоянным утолщением w (рис. 83). Согласно этой модели, скорость увеличения радиуса шарика (г) описывается следующим уравнением:
drfdt = pto, (22.33)
где ц— удельная скорость роста.
Следовательно, г = цда/ + г0. (22.34)
Если М — общая масса п шариков (принимается, что диаметры их одинаковы) и р — плотность биомассы, то М = улг3рц. Подставив значение г из уравнения (22.34), получаем уравнение (22.32), где
k — (4лрп/3)'/’ рю. (22.35)
В случае шариков биомассы Aspergillus nidulans было установлено, что их радиусы увеличиваются в соответствии с линейным законом [уравнение (22.34)] [327]. Изменение удельной скорости роста под влиянием температуры показало, что k <х ц. согласуется с уравнением (22.35). Значение w практически постоянно при 0,45 мм и, следовательно, не зависит от изменений
Г дубинный рост биомассы
273
р.. Следует отметить, что значение w приблизительно равно половине ширины периферической зоны роста колонии этого же организма, растущего на агаризованной среде того же самого состава (см. разд. 23.4.2). Было также показано в соответствии с предсказанием уравнения (22.35), что keen'13 [327]. В этой же работе было отмечено следующее: периоду, когда рост шариков A. nidulans подчиняется закону кубического корня, предшествует период экспоненциального роста. Этот период экспоненциального роста, в течение которого практически все гифы были растущими, заканчивался, когда диаметр шарика достигал примерно 4 w.
22.3.2. Лимитация диффузией субстрата
Если биомасса в шарике настолько компактна, что субстрат может поступать внутрь только путем диффузии, то размер шарика, при котором диффузия становится фактором, лимитирующим рост, определяется следующим путем. Рассмотрим баланс субстрата в зоне от центра шарика по радиусу г (рис. 83, Б), Сделаем упрощающее допущение, что метаболический коэффициент (q) для лимитирующего рост субстрата — величина постоянная и не зависит от концентрации субстрата до тех пор, пока последняя не достигнет практически нуля; допустим также, что система находится в стационарном состоянии, при котором
Диффузия субстрата Потребление субстрата внутрь зоны радиуса г в зоне радиуса г.
Это баланс можно представить в виде уравнения
4лг2/У “ту = у лг3Р7, (22.36)
где D' — коэффициент диффузии субстрата, р — плотность биомассы.
Следовательно, мы имеем
sm R
\ds = ^-{r dr, (22.37)
J ou J
S r
откуда
sm-S = ^(/?2-r2). (22.38)
Радиус шарика достигает «критического» значения (/?<) тогда, когда диффузия субстрата становится фактором, лимитирующим рост шарика, т. е. когда концентрация субстрата в центре
274
Глава 22
шарика достигает нуля. Следовательно, R—Rc, когда s —0 и г — 0; подставляя эти значения в уравнение (22.38), получаем
Rc = (6Z)'Sm/p<7)'/2 = (бО'Г^/рцЛ (22.39)
где ц— удельная скорость роста и У — экономический коэффициент. Вероятнее всего роль лимитирующего рост субстрата при аэробном культивировании играет кислород. Экспериментально установлено, что при напряжении растворенного кислорода в среде 0,21 атм величина критического радиуса шариков Penicillium chrysogenum достигает приблизительно 0,1 мм [239]; это хорошо согласуется с теоретическим значением. Если бы роль лимитирующего фактора играла глюкоза (1%), то, по подсчетам Перта [245], значение критического радиуса составляло бы от 1 до 2 мм. Более строгий и тщательный теоретический анализ диффузии кислорода внутрь шариков был выполнен другими исследователями [2]. В отличие от низкого значения критического радиуса для Penicillium chrysogenum было установлено, что в случае Aspergillus nidulans рост шариков не лимитируется кислородом до тех пор, пока размер радиуса не превысит 2,5 мм [327]. Из этого можно сделать следующий вывод — шарики Aspergillus имеют значительно более рыхлую, открытую структуру, чем шарики Penicillium.
В центре плотных шариков гриба происходит автолиз гиф с вытеканием цитоплазмы наружу [38]. Это явление связано, вероятно, с недостатком кислорода внутри шариков и свидетельствует о том, что мицелий в форме шариков может становиться более гетерогенным по сравнению с мицелием нитевидной формы
22.3.3. Причины, обусловливающие образование мицелием шариков
Какие факторы определяют, пойдет ли формирование развивающегося мицелия по пути образования шариков или волокон, точно не известно. По-видимому, имеет значение и количество посевного материала и природа субстратов [38]. В указанном исследовании было обнаружено, что Penicillium chrysogenum образовывали шарики, когда количество конидий в посевном материале было ниже критической концентрации, составлявшей около 0,3-106/мл минимальной среды и 10®/мл богатой среды (кукурузный экстракт). Для Aspergillus nidulans при развитии на минимальной среде отмечено устойчивое образование шариков независимо от концентрации конидий до 2,3-106/мл [327]. Отношение числа образованных шариков к числу внесенных конидий составляло приблизительно только 10~5. Остальная часть конидий была агрегирована внутри ша
Глубинный рост биомассы 275
риков. Тринчи [327] высказал предположение, что способность конидий собираться в виде хлопьев может быть важным фактором в образовании шариков. Интенсивность аэрации и образование при этом завихрений слоев жидкости способны также влиять в значительной степени на формирование мицелиальных шариков, однако эти факторы, очевидно, еще не исследовались. Перт и Кэллоу [257] отмечают, что в хемостатной культуре Penicillium chrysogenum образование шариков индуцировалось значениями pH выше 7,0, но не более низкими значениями.
Глава 23
РОСТ КОЛОНИЙ микроорганизмов НА ПОВЕРХНОСТИ ПЛОТНЫХ СРЕД
23.1. Введение
По своей способности заселять, образовывать колонии на поверхности различных материалов микроорганизмы поистине вездесущи, а выращивание колоний микроорганизмов на плотных средах — один из основных методов изучения поведения микробов при исследованиях в лабораториях. Следовательно, принципы роста колонии имеют фундаментальное значение. С 1925 г. [95], когда было установлено, что разрастание колонии гриба по поверхности субстрата происходит с постоянной скоростью, для изучения различных факторов, влияющих на рост грибов, стали использовать показатели скорости роста колонии. Более поздние теоретические и экспериментальные исследования способствовали более глубокому пониманию сущности скорости роста колонии. Рост колоний бактерий более сложный процесс, чем рост колонии грибов, однако в некоторых условиях увеличение размеров бактериальной колонии происходит путем линейного роста [246].
23.2. Модель роста колонии
Перт [246] предложил модель, с помощью которой можно количественно охарактеризовать скорость роста колонии. В этой модели предполагают, что вначале, когда внесено небольшое количество клеток микроорганизма в качестве посевного материала для образования колоний на питательном агаре, размножение протекает так, что все клетки в одинаковой степени участвуют в увеличении популяции. Соответственно рост всей популяции идет с максимальной экспоненциальной скоростью до тех пор, пока концентрация источников питания остается значительно выше константы насыщения (значения питательных веществ из агара является причиной создания Ks) и пока среда не ингибирует роста. Потребление колонией этих веществ создаст в агаре градиент концентрации (рис. 84, А). Вероятно, рост колонии по направлению вверх быстро падает почти до нуля из-за противодействия диффузии питательных веществ, что соответствует теории диффузии субстратов в слой
Рост колоний микроорганизмов на поверхности плотных сред 277
ткани (см. разд. 22.1). В конечном итоге поверхностный рост колонии будет зависеть, очевидно, от экспоненциального роста, ограниченной периферической зоны с постоянной шириной w и площадью поперечного сечения Да (рис. 84. В). Ширина w растущей зоны находится в прямой зависимости от баланса диф-
Рис. 84. Поперечные разрезы через модели колоний микроорганизмов, растущих на поверхности питательного агара (диаграммы не выдержаны по масштабу).
Прерывистая линия в каждом случае показывает глубину, на которой обнаруживается концентрационный градиент питательной среды; $0—начальная концентрация источника питания. А. Колония во время экспоненциального роста. Б. Рост лимитирован диффузией субстрата шириной w. Вероятно, между а и б скорость роста лимитирована диффузией субстрата настолько, что практически равна нулю. В. Глубина концентрационного градиента питательной среды ограничена глубиной агара.
фузии питательных веществ в эту растущую зону и их потребления. При этом делается допущение, что микроорганизмы не способны проникать внутрь питательного агара.
Пусть m — общее количество биомассы колонии, mg — количество растущей биомассы, содержащейся в периферической зоне роста с шириной w (рис. 84, Б). Тогда рост колонии можно представить как
dmldt = \Mng, (23.1)
где ц — удельная скорость роста организма. Предположим, что w очень мало по сравнению с радиусом г колонии; следовательно, можно записать
mg = 2лг Дар (23.2)
и
т = лг2Лр, (23.3)
278
Глава 23
где р— плотность биомассы. Из уравнения (23.3) следует, что dm/dt = 2лгЛр dr/dt. (23.4)
Подставляя значения dmidt и mg в уравнение (23.1) и интегрируя его, получим
r = (-lJVZ + ro- (23.5)
Если мы примем упрощающее предположение, что поперечное сечение зоны роста имеет форму прямоугольника, т. е. Да = wh, тогда
г = p.wt + г0. (23.6)
Следовательно, из действия закона линейного роста по уравнению (23.6) следует, что колония будет разрастаться радиально с постоянной скоростью цш = Кг.
По аналогии с диффузией субстрата в слой ткани (разд. 22.1), можно ожидать w ос (s0/qy^, где so — начальная концентрация субстрата, лимитирующего рост, a q— метаболический коэффициент. Пренебрегая некоторым количеством субстрата, необходимым для обеспечения процессов поддержания жизни, можем получить <? = р/У, где У — экономический коэффициент. Следовательно, найдено, что w = £i(so/j*)l/2, где kt — константа и
Кг = цда = ki (ад)72- (23.7)
23.3. Экспериментальное изучение характера роста бактериальных колоний
23.3.1. Закон линейного роста
При изучении кинетики роста бактериальной колонии Перт [246] проверил предложенную им модель, рассматриваемую в разд. 23.2. Использование простого проекционного микроскопа (shadomaster) сделало возможным точное и быстрое измерение диаметра колонии. С момента начала роста колонии, когда количество клеток было приблизительно 106, и в течение примерно 30 ч скорость увеличения радиуса колонии была постоянной, что соответствовало закону линейного роста, затем скорость радиального роста уменьшалась. Подобные наблюдения были сделаны и другими исследователями [58, 233]. По данным Перта [246], ширина зоны роста w, по которой считают скорость радиального роста во время линейной фазы, составляет 46 мкм для Escherichia coli и 25 мкм для Streptococcus faecalis. Значения w, принятые Пертом [246] первоначально, в 2 раза превосходили значения, приведенные выше, поскольку Перт считал, что поперечное сечение периферической ростовой
Рост колоний микроорганизмов на поверхности плотных сред
279
зоны имеет форму треугольника. Были получены убедительные данные [58] о том, что биомасса бактериальной колонии, расположенная в центре, не участвует в процессе радиального разрастания колонии. Об этом свидетельствовала неподвижность маленьких и легких частичек графита, которые были нанесены на центральную часть колонии и которые не изменили положения по отношению друг к другу. Высота колоний (0,5 мм) оставалась приблизительно постоянной, так что колонии имели вид дисков одинаковой высоты. На более поздних стадиях роста в колониях появлялись углубления в центре.
Во время периода замедленного увеличения радиуса колонии, последовавшего за периодом постоянной скорости роста, скорость увеличения площади колонии была постоянной [58], поскольку значение квадрата радиуса возрастало во времени линейно. Согласно предположению, выдвинутому Купером и др. [58], такое поведение согласуется с моделью, если в модель ввести допущение, что w становится обратно пропорциональным радиусу.
Если мы подставим ba = bhlr в уравнение (23.2), где b — константа, то получим
г2 = 2ц6/ + ^; (23.8)
это уравнение называется законом площадей.
23.3.2. Влияние глубины агара на скорость роста колонии
Перт [246] обнаружил, что скорость радиального роста бактериальных колоний достигает максимума в том случае, если глубина агара превышает 3,4 мм. В дальнейшем Перт (неопубликованные данные) установил, что использование более глубокого слоя питательного агара ведет к увеличению длительности линейной фазы роста. Экспериментально показано, что увеличение глубины агара до 12 мм при лимитации роста глюкозой создает условия, позволяющие колонии расти с максимальной радиальной скоростью в течение 150 ч вместо 35 ч при глубине агарового слоя 3,2 мм. Эти результаты свидетельствуют о том, что переход от закона линейного роста к закону площадей связан, по-видимому, с концентрационным градиентом субстрата, лимитирующего рост, который распространяется до самого нижнего слоя агара, как это показано на рис. 84, В. Этот вывод подтверждается результатами расчетов скоростей диффузии [58], показавших, что закон площадей применим при концентрационном градиенте глюкозы, достигающем дна чашки Петри. Как можно видеть из рис. 84, В, такое условие приведет к уменьшению ширины периферической зоны, полностью снабжаемой питательными веществами.
280
Глава 23
23.3.3. Влияние концентрации лимитирующего субстрата
По данным Перта [246], показано, что если начальная концентрация (So) в среде глюкозы, используемой в качестве источника углерода и энергии, такова, что она становится фактором, лимитирующим рост, то скорость радиального роста можно выразить как /<г ос s0‘/2 (рис. 85). Согласно этому закону, верхние пределы s0 для роста колоний Klebsiella aerogenes,
50
Концентрация глюкозы, г/л
Рис. 85. Влияние различных концентраций глюкозы на скорость радиального роста (Л?г) колоний Escherichia coli при разных парциальных давлениях кислорода [246].
I — рост в воздухе при 1 атм или в воздухе + 4,5% СО2 при 1 атм; II— 95,5% кислорода + + 4,5% СО2 при 1 атм; /// — 100% кислорода при 1 атм.
Escherichia coli и Streptococcus faecalis составляют 5,0, 2,5 и 1,25 г/л соответственно в атмосфере воздуха при давлении 1 атм. Более точно
(23.9)
где &2 — константа и Si— пороговая концентрация, первоначально называемая «лаг»-концентрацией; только выше этой концентрации начинался рост. Значения пороговых концентраций (s,) для К. aerogenes, Е. coli и S. faecalis составляют 0,013, 0,090 и 0,005 г/л соответственно. По всей вероятности, наличие пороговой концентрации специфично для роста бактериальной колонии; для нитчатых грибов она не обнаружена (разд. 23.4.3). Причины такого существования пороговой концентрации не ясны. Возможно, это связано с энергетическими затратами на поддержание жизни или с токсическим действием кислорода (разд. 23.3.4). Зависимость Кг от s0, возможно, отражает тот факт, что wcKs'tf, что и предполагается по модели [уравнение (23.7)].
Рост колоний микроорганизмов на поверхности плотных сред
281
23.3.4. Лимитация кислородом и токсичность кислорода
Установлено, что в случае колоний Е. coli увеличение парциального давления кислорода (Ро2) от 0,21 до 0,955 атм сопровождалось увеличением верхнего предела концентрации глюкозы (So) [уравнение (23.9)] от 2,5 до 10,0 г/л [246]. Однако то же самое увеличение парциального давления кислорода приводило также к повышению и нижней пороговой концентрации глюкозы (s,) от 0,09 до 1,7 г/л (рис. 85). Эти результаты можно объяснить тем, что верхние предельные концентрации глюкозы, согласно уравнению (23.9) определяются образованием таких токсичных продуктов обмена, как спирты и органические кислоты, появляющиеся при лимитации метаболизма кислородом. Повышение пороговой концентрации глюкозы при повышении Ро, может быть связано с токсичностью кислорода, так как существует предположение, что, чем выше Ро2, тем больше должна быть скорость диффузии глюкозы, в результате которой происходит снижение Ро, до уровня, который уже не является ингибирующим.
23.3.5. Влияние удельной скорости роста
С целью изучения влияния удельной скорости роста (ц) Перт [246] изменял величину ц с помощью различных факторов—использованием ингибитора (сульфаниламида) или изменением температуры. Когда скорость роста изменялась под действием ингибитора, величина радиальной скорости роста (Кг) была прямо пропорциональна ц'1'2, что отвечало модели [уравнение (23.7)]. Однако при изменении ц под влиянием температуры пропорциональность между Кг и ц1''2, как правило, отсутствовала; причины такого отклонения от модели не выяснены.
23.3.6. Неравномерность краевого роста
На более поздних стадиях роста бактериальной колонии, обычно после того, как рост больше не подчиняется линейному закону, круглая форма колонии начинает искажаться и периметр становится неровным. С точки зрения Купера и др. [58], такая неравномерность может быть связана с лимитацией роста диффузией субстрата. Если это так, то любые разрастания колонии от какой-то точки на периметре могут быть следствием улучшенного снабжения питательными веществами в этой точке с дальнейшим разрастанием от нее биомассы в виде отдельной лопасти.
282
Глава 23
28.4. Экспериментальное изучение роста колонии гриба
23.4.1. Закон линейного роста
Скорости роста колоний нитчатых грибов могут быть установлены путем измерения радиального разрастания колоний на средах в чашках Петри или по скорости роста колоний по поверхности агара в пробирке [326]. Для большинства целей
агара
Б
Pir. 86. Поперечный разрез через модели колоний грибов, растущих на питательном агаре и врастающих в агар.
А. Форма колонии на глубоком слое агара, Б. Форма колонии на мелком слое агара. Пунктиром показаны внутренние границы растущей единицы, т. е. растущая часть гиф
самым удобным методом является использованиеагаризованных сред в чашках Петри с проекционным микроскопированием при измерении размеров колонии. Рост колоний нитчатых грибов отличается от роста колоний одноклеточных бактерий по нескольким важным аспектам. Поскольку грибная гифа растет, удлиняясь в верхушке, рост колонии направлен наружу от центра. Кинетика роста колоний видов, относящихся к родам Aspergillus, Penicillium, Mucor, Geotrichum и другим, исследовал Тринчи [326, 328]. Результаты этих исследований показали, что после лаг-периода, отражающего время прорастания ино-кулированных спор, имеется короткий период экспоненциального увеличения радиуса колонии, затем скорость радиального роста становится постоянной и остается такой неопределенное время. Установлено также, что скорость линейного роста, как
Рост колоний микроорганизмов на поверхности плотных сред 283 правило, не зависит от глубины агара; исключение из этого правила составляют некоторые морфологические мутанты [329]. Следовательно, для колоний грибов время роста по линейному закону не ограничено, при том что для бактериальных колоний найден вполне определенный период роста, подчиняющийся линейному закону.
Кроме того, в отличие от бактерий мицелий грибов проникает в глубину агара, причем со скоростью, почти равной скорости радиального разрастания колонии по поверхности агара. Вследствие этого, если глубина агара достаточна, то колония растет в форме полусферы в слоях питательного агара, лежащих ниже его поверхности (рис. 86). При этом плотность гиф уменьшается в логарифмической прогрессии с глубиной проникновения мицелия в агар.
23.4.2. Ширина зоны роста w
Этот показатель был определен Тринчи [328], который, разрезая вдоль хорды колонии круглой формы, отрезал гифы различной длины; рост колонии прослеживали путем фотографирования. Минимальная длина кончика гифы, обеспечивающая скорость роста, равную Кг, принималась за w. Таким образом было установлено, что длина w растущей гифы, или «растущая единица», зависела от вида и штамма гриба и варьировала приблизительно от 10 мм для Neurospora crassa до 0,4 мм для Geotrichum lactis. Было также установлено, что при изменении скорости роста под влиянием различных температур или при воздействии ингибитора (циклогексимида) значение w остается ПОСТОЯННЫМ, Так ЧТО Кг ПрЯМО ПрОПОрЦИОНаЛЬНО Ц.
От каких факторов, свойственных данному штамму, зависит ширина ростовой зоны w, не известно, однако, по всей видимости, на ширину w оказывает влияние частота ветвления гиф. Так, было отмечено, что мутантный штамм Aspergillus nidulans отличался от родительского штамма более низким значением w и более высокой способностью к ветвлению, а следовательно, и большей плотностью гиф [13].
Тринчи [327] сравнивал скорости радиального роста шариков биомассы A. nidulans, погруженных в жидкую перемешиваемую среду, со скоростью радиального роста колонии на агаре при использовании той же самой среды. В результате было найдено, что скорость радиального роста колонии на поверхности приблизительно вдвое выше скорости радиального роста погруженных в жидкую среду шариков биомассы. Эти данные свидетельствуют о том, что ширина зоны роста погруженных колоний (шариков) составляет около половины величины зоны роста колоний, растущих на поверхности агара. Причина
284
Глава 23
подобных различий в регуляции длины растущей единицы глубинных шариков биомассы и воздушных гиф остается неизвестной. Эти данные можно объяснить, если для определения скорости роста биомассы гриба исходить из уравнения dx/dt — = рптих, где обе величины — п (число ветвящихся гиф на единицу биомассы) и ти (масса растущей единицы)—переменны.
23.4.3. Влияние концентрации субстрата
Влияние концентрации глюкозы на скорость роста колонии Aspergillus nidulans изображено на рис. 87. Подобные кривые с небольшими модификациями были получены и для других
Рис. 87. Влияние различных концентраций глюкозы на скорость радиального роста (/) и плотность гиф (//) колоний Aspergillus nidulans [326].
грибов [326]. В отличие от того, что наблюдается в случае бактериальных колоний, отношение скоростей роста колоний гриба к концентрации субстрата (s0) не соответствует выражению Kr s^2. Перт [252] пришел к выводу, что при более низких концентрациях субстрата это отношение согласуется с уравнением Моно, т. е.
Кг = Kr (тах)^О/(sQ + Ks). (23.10)
При Кг = цйу следует, что если w постоянно, то, исходя из уравнения (23.10), можно рассчитать константу насыщения (Ks), измеряя скорости роста колонии. Полученные таким образом величины для гриба были приблизительно такими же, какие приведены в табл. 1 для других микроорганизмов.
Значения для /G(max), полученные из графика зависимости lJKr от 1 /s0 [252], очень близки к максимальным значениям,
Рост колоний микроорганизмов на поверхности плотных сред 285 полученным экспериментально. При концентрации глюкозы выше значения, обеспечивающего максимальную скорость роста колонии, Кг может уменьшаться. Было установлено, что такое снижение вызывалось уменьшением w у Aspergillus nidulans [328].
A. nidulans — организм исключительный в том отношении, что при увеличении концентрации глюкозы выше 10 г/л вновь наблюдается увеличение Кг- Это явление связано с уменьшением плотности гиф. Следует отметить, что довольно часто некоторый рост гриба на агаре наблюдается и в отсутствие глюкозы. Это, вероятно, можно объяснить либо наличием в агаре каких-то примесей, используемых в качестве источника углерода, либо использованием самого агара в качестве источника углерода. Такие результаты совершенно неожиданно свидетельствуют о том, что градиент концентрации питательного субстрата около растущих гиф грибной колонии на агаре может быть очень незначительным; это наблюдается и в погруженной культуре (разд. 9.6.2). Необходимо исследовать влияние давления двуокиси углерода, поскольку вполне вероятно, что при росте в условиях лимитации источниками углерода колонии не смогут генерировать углекислоту в таком количестве, которое будет необходимо, чтобы она не стала фактором, лимитирующим рост (разд. 8.10).
23.5. Заключение
Закон линейного роста для бактериальных и грибных колоний описывается моделью, рассмотренной в разд. 23.2, однако значения константы скорости радиального роста (Кг) для колоний бактерий и для колоний нитчатых грибов различны. Показано, что в случае грибов Кг зависит от удельной скорости роста (ц) и ширины периферической зоны роста (to), где р, = pmso/(s + Ks) и So — начальная концентрация субстрата, лимитирующего рост. Для бактерий, по всей вероятности, Кг с< ц'/2 (s/2— sY2], где Si — пороговая концентрация лимитирующего субстрата. Установив зависимость между значениями Кг от удельной скорости роста, можно провести более широкие исследования количественного изучения скоростей роста колонии при воздействии факторов питания, ингибиторов или стимуляторов роста.
Глава 24
МАТЕМАТИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ АВТОСИНТЕЗА БИОМАССЫ
24.1. Введение
Поскольку рост живых клеток является процессом автосин-тетическим, постольку он должен подчиняться закономерностям химического автосинтеза. Поэтому познакомимся с моделью автосинтеза и посмотрим, может ли она добавить что-либо к нашим представлениям о процессах роста и поможет ли предсказывать некоторые свойства биомассы. Ниже обсуждаются модели автосинтеза, впервые предложенные Хиншельвудом [71]. Эти модели необычайно упрощены, но, несмотря на это, сообщают значительные сведения о поведении растущей биомассы, в особенности для условий стационарного состояния, которое может быть достигнуто в хемостате. Однако переходные условия, которые типичны для периодической культуры, представляют собой значительные сложности и ограничивают область применения моделей.
24.2. Взаимозависимые синтезы
24.2.1. Циклы взаимозависимых синтезов
Автосинтез биомассы представляет собой результат взаимозависимых синтезов, простейшим примером которого может служить двухкомпонентная система (рис. 88,А). В частности стрелка X+-Y означает, что синтез компонента X зависит от действия компонента Y. Это отнюдь не значит, что X обязательно должен быть продуктом Y. Примеры циклов взаимозависимых синтезов, которые могут быть абстрагированы из синтеза биомассы, показаны на рис. 89. Рассматриваемая двухкомпонентная система состоит из синтеза ДНК, который зависит от ДНК-полимеразы, и синтеза ДНК-полимеразы, который в свою очередь зависит от ДНК, необходимой для образования информационной РНК.
Если общую биомассу мы обозначим буквой х, то во время экспоненциального роста при постоянных окружающих условиях
х— xhe:lt,
(24.1)
Рис. 88. Диаграмма автосинтетических систем.
X и У— символы, представляющие некоторые структуры в клетке, такие, как ферменты, ДНК и рибосомная РНК. Стрелки между двумя структурами, например X+-Y, означают, что синтез X зависит от действия Y. Все системы состоят из циклов взаимозависимых синтезов. А. Двухкомпонентный цикл. Б. «-компонентная структура в цикле. В н Г Разветвленные никлы.
Фермент!-»—
Аминокис-лота I рРНК —Фермент!!-»—Фермент !П
Аминокислота II
Б
Рис. 89. Примеры взаимозависимых синтезов.
А. Двухквмпонентная система: синтез ДНК зависит от ДНК-по.шмера >ы. а сиптеиз ДНК-полимеразы зависит от ДНК, необходимой для образования информационной РНК. Б. Четырехкомпонентная система. Синтез фермента I зависит от рибосомной р-РНК’, синтез РНК зависит от фермента И; синтез фермента П зависит от фермента III, потому что он образует аминокислоту I, которая необходима для синтеза фермента И; синтез фермента III зависнт»от фермента I, который образует аминокислоту II, необходимую для синтеза фермента III.
288
Глава 24
где ц—удельная скорость роста. Следовательно, количество каждого компонента системы, если он образует постоянную часть биомассы, будет увеличиваться с постоянной удельной скоростью роста ц.
Взаимозависимость скоростей синтеза X и У в двухкомпонентной системе (рис. 88,Л) выражается уравнениями
dX/dt = aY (24.2)
и
ЙУ/Л = РХ, (24.3)
где X и Y— количества соответствующих компонентов, а а и Р — константы, значения которых зависят от условий окружающей среды, включая доставку диффундирующих промежуточных соединений, например мРНК на рис. 89, А и аминокислот на рис. 89, Б.
Решение уравнений (24.2) и (24.3) дает
Х = 4(Хо + |Го)^ + 4(Хо--|Го)е-« (24.4)
и
У = Т (У« + Т Х°) еЫ + 4 (У° “ I Х°) е~М’ <24'5)
где ар =/г2, а Хо и Уо— количества X и У в нулевой момент времени. Если t велико, член е~м исчезает и отношение X : У становится равным
4-(%» + |>'.)/(1'. + 4х0)-|. (24.5)
т. е. отношение X : У стремится к постоянному значению. Если часть системы изолировать и начать с начальных значений, для которых Хо/Уо = а/Х, то уравнения (24.4) и (24.5) редуцируют- ь ся в следующее: *
X = Xoefe' и У = Уое*< (24.7)
Следовательно, данная модель объясняет экспоненциальный рост, а поскольку все компоненты системы должны иметь ту же самую удельную скорость роста, что и биомасса, отсюда следует, что k = ц. I
Найденный результат имеет общий характер в том смысле, что применим к случаю, когда мы имеем п компонентов системы (рис. 88, Б), где dXi/d/== aiX2, йХ2/Л = а2Х3, . . ., dXj/dt = «jXj+1 и, наконец, dXjdt = an/Xi, где ai, a2 и т. д.— константы. Для стационарного состояния можем подставить dXjdt — цХ1, dXz/dt = цХ2 и т. д., откуда следует, что отношение количества Xj kX)+i—величина постоянная,Xj/Xj+1 == aj/ц, где
р, = a,a2 • . . ап.
(24.3)
Математические модели автосинтеза биомассы
289
Если система состоит более чем из двух структурных компонентов, то решение уравнения для переходного состояния содержит член sin kt [70, 139]. Этот член показывает, что отношение компонентов будет колебаться, прежде чем достигнет стационарного значения.
24.2.2. Разветвленные существенные циклы
Синтез сложных структурных компонентов, таких, как ферменты, происходит, как правило, в результате разветвленных циклов взаимозависимых синтезов. Простейшим случаем может служить трехкомпонентная система, приведенная на рис. 88, В. Разветвленные циклы могут относиться к одному из двух типов: в одном случае каждый цикл является существенным, а во втором — циклы представляют собой системы альтернативных синтезов (разд. 24.5). Пример существенных циклов показан на рис. 88, В, где R— количество рибосомной РНК, X и У— количество ферментов, «поставляющих» нуклеотиды для синтеза РНК- В системе существенных циклов, изображенной на рис. 88, В, цикл R— X моделируется следующими уравнениями: dX/dt — aR и dR/dt = рХ. В стационарном состоянии, если dX/dt — рХ и dR/dt = y.R, находим
X/R = а/ц и ар = ц2. (24.9)
Для другого существенного цикла dY/dt = aR и dR/dt — bY-, тогда в стационарном состоянии будем иметь
Y/R — a/y, и ab—y2. (24.10)
Следовательно, ц2 = ab — ар. Отсюда вытекает, что X/Y = = а/а. Таким образом, хотя отношение X : R и У ; R может меняться с удельной скоростью роста, отношение X : У не зависит от ц.
24.3. Автоматическая подстройка к изменению окружающих условий
Влияние изменения окружающих условий на автосинтетиче-ские процессы выводится следующим образом [71, стр. 130]. Допустим, что в двухкомпонентной системе, приведенной на рис. 88, А, структура X есть некоторый фермент, обеспечивающий синтез диффундирующего метаболита, необходимого для синтеза второго фермента Y. Общее количство фермента в популяции клеток обозначим X, а число растущих клеток — п. Тогда количество фермента в клетке равно Х/п. Аналогично количество второго фермента в расчете на клетку составит У/п.
10 Зак. 737
290
Глава 2't
Пусть с — концентрация диффундирующего метаболита в клетке, тогда для общей скорости накопления метаболита в одиночной клетке имеем
б/с/Л = А (Х/п) - В (Y/п) с - Сс, (24.11)
где А, В, С — константы. В уравнении (24.11) первый член правой части представляет собой скорость образования метаболитов, второй член — скорость поглощения, а третий — убыль промежуточного соединения, обусловленную его расщеплением или другими механизмами. Сделаем упрощенное предположение, что стационарное состояние наступает тогда, когда образование промежуточного продукта в точности сбалансировано с поглощением и потерями, т. е. когда dc/dt = 0. Следовательно, в стационарном состоянии
dX/dt = kiX (24.12)
и
dY/dt = k2Yc, (24.13)
где ki и k2— константы. Уравнение (24.13) выражает условие, что синтез Y зависит как от своего собственного количества, так и от количества диффундирующего метаболита. Далее мы предположим, что деление клеток начинается, как только концентрация Y достигает критического значения 0= У/n, где р— константа. Подставляя выражение для п в уравнение (24.11), получим
c — aX/Y, (24.14)
где а — новая константа. Из уравнений (24.13) и (24.14) получаем
dY/dt = k2aX. (24.15)
Допустим, что v = Х/Y, тогда при дифференцировании получим dvldt=Y{dXldt}-^dY/dt} , (24.16)
или
dv/dt = v (/г, — k2av). (24.17)
В стационарном состоянии, если ц— удельная скорость роста биомассы, из уравнений (24.12), (24.13) и (24.15) следует, что
|Л = k< - k2c = k2av. (24.18)
Тогда
dv/dt = 0.
Предположим теперь, что под влиянием некоторого агента, например какого-нибудь токсического соединения, концентрация (с) метаболита уменьшается. Это означает, что dv/dt
Математические модели автосинтеза биомассы
291
уменьшается [из уравнения (24.14)], а следовательно, очевидно [из уравнения (24.17)], что dv/dt становится положительной. Отсюда отношение Х/У = v будет увеличиваться до тех пор, пока вновь не наступит состояние, когда k^v = ki = р, т. е. скорость роста восстанавливается, но при новом стационарном состоянии Х/Y. Следовательно, модель предсказывает, что такая автосинтетическая система, как биомасса, будет реагировать на изменение условий, вызывающее изменения относительной доли структурных компонентов, таким образом, чтобы восстановить скорость роста.
24.4. Степень воздействия внешней среды на скорость роста
Рассматриваемая модель показывает, как изменение в количестве какого-нибудь одного фермента или другой существенной структуры в цикле взаимозависимых превращений воздействует на удельную скорость роста р. Из уравнения (24.8) мы имеем p=(ai«2 ... an)1/n. Значение коэффициентов а будет отражать наличие промежуточных продуктов метаболизма. Предположим, что некоторый ингибитор или какой-либо другой фактор среды приведет к такому уменьшению содержания метаболита, что значение коэффициента ai уменьшается в пять раз по сравнению с начальным значением. Из уравнения (24.8) следует, что отношение нового значения р к исходному его значению будет составлять (0,2)'/п. Таким образом, если число структур в цикле равно 20, отношение нового значения р к старому будет (0,2) °’05 = 0,91, т. е. значение р уменьшается только на 9%. Отношение структур Xi и Хг будет изменяться от ai/p до 0,2 cci/p. Таким образом, модель указывает, что соотношение ферментов в биомассе может значительно изменяться, не оказывая заметного воздействия на скорость роста.
24.5. Альтернативные циклы взаимозависимых синтезов
24.5.1. Разветвленные альтернативные циклы
В системе разветвленных циклов взаимозависимых синтезов, показанной на рис. 88, В, каждый цикл альтернативен другому. Эта система моделируется так: dX/dt == a/?, dYjdt — aR и dR/dt = pX + b где a, a, p и b — константы. В этой системе а и а определяют конкурентные или альтернативные зависимости. В конечном стационарном состоянии X/R = a/р и Y/R = a/p,, а удельная скорость роста р выражается равенством [140]
p2 = ap + ad. (24.19)
10*
292
Глава 24
Следовательно, и эта система также соответствует общему результату, а именно относительные количества структур будут стремиться к постоянным значениям.
24.5.2. Теорема сети
Другой важный вывод, следующий из модели, касается развития альтернативных ферментных путей [71, стр. 111]. Во взаимозависимостях, приведенных на рис. 88, Г, предполагается, что для синтеза фермента X, требуется метаболит С, образуемый либо ферментом XJ+i, либо ферментом У2, который получается в другой ветви системы. Пусть локальная концентрация метаболита — с, тогда для стационарного состояния будем иметь
dcldt = $Xi+{ + у^! — 6с = 0, (24.20)
где р, у, 6 —константы. Первый член правой части представляет собой образование с, обусловленное X3+i, второй член — образование с, обусловленное Yit а третий — поглощение С в синтезе Х3-, и некоторые потери С. Отсюда следует, что
с = (р/6)Х/+1 + (у/6)Уь (24.21)
и если dXj/dt пропорционально с, то
dXJdt = О/Х/+! + р/Уь (24.22)
где ctj и Pj — новые константы. Из уравнения для взаимозави-симостей в сети, приведенной на рис. 88, Г, следует, что dX^dt = cxiX2 и т. д. до dXn/dt = anXlt a dY^/dt = b\Y2 и т. д. до dYmfdt == bmYj+i, из уравнения (24.22) следует, что в стационарном состоянии, когда мы можем подставить dX^/dt = y.Xi и т. д.,
ц" = а1а2 ... ау-Да/ . .. а/+1-! + р/61 ... bmiil-m~l)al+l ... а„.
(24.23)
Если мы имеем просто У, соединяющий Х3 и Хз+2, то уравнение (24.23) принимает вид
ц" = а1а2 ... ctj-tfafaj+i + P/^i)a/+2 ... ап. (24.24)
Отсюда следует, что какое-либо уменьшение значения а3- или ая-1 можно компенсировать увеличением р или bi. Действие изменения внешней среды, которое оказывает влияние только на одну ветвь, можно вывести следующим образом. В стационарном состоянии aX-Jdt — цХу.
Математические модели автосинтеза биомассы
293
Тогда из уравнения (24.22) получим
= + (24-25)
При некотором определенном наборе условий внешней среды член может быть очень мал, так что действие компо-
нента Xj + i будет преобладать над действием компонента У1. Такое изменение условий, которое ведет к уменьшению коэффициента а, до малого значения, будет вначале уменьшать скорость роста биомассы, но затем образование У1 будет стимулировано в соответствии с автоматическим механизмом, рассмотренным в разд. 24.3. Таким образом, постепенно скорость роста должна будет восстановиться до своего первоначального уровня, при этом действие компонента У1 будет преобладать над действием Х,+1. Это утверждение, называемое теоремой сети [71, стр. 113], предсказывает поведение, аналогичное индукции и репрессии ферментов.
24.6. Заключение
Исходя из основной концепции, что рост живой материи зависит от связанных циклов взаимозависимых синтезов, кинетика Хиншельвуда предсказывает, что при постоянных условиях внешней среды и стационарном состоянии биомассы соотношения различных ее компонентов стремятся к постоянным значениям. Другое поразительное свойство кинетики автосинтеза— это способность к саморегуляции процесса. Эта саморегуляция в ответ на изменение окружающей среды вызывает такие изменения в относительном содержании ферментов, нуклеиновых кислот и других существенных структурных компонентов, которые поддерживают скорость роста биомассы, и, наоборот, при изменении скорости роста изменяется состав биомассы. Экспериментально показано, что содержание РНК и ферментативная активность биомассы изменяются со скоростью роста [247]. Действие меняющихся условий питания и физических условий на ферментативную активность при постоянной скорости роста в хемостатной культуре пока еще мало изучено. Уменьшение парциального давления растворенного кислорода сильно изменяет активность некоторых ферментов (раз. 11.5). Неопубликованные работы в лаборатории автора (Watts Evans and Pirt) показывают, что количество некоторых гликолитических ферментов в стационарном состоянии в хемостате у Lactobacillus при изменении значения pH изменяется в несколько раз и в два раза — при изменении температуры. Некоторые факты, полученные при изучении хемостатной культуры, свидетельствуют о том, что ингибиторы изменяют количество
294
Г лава 24
ферментов в клетках (разд. 17.1). Изучение действия таких ингибиторов показывает также, что колебания скорости роста, наступающие немедленно после добавления ингибитора, можно предсказать с помощью кинетики переходных состояний. Таким образом, динамическое состояние биомассы во время роста, предсказываемое моделью автосинтеза, качественно согласуется с экспериментальными наблюдениями.
Как указывают Дин и Хиншельвуд [71, стр. 113], вполне возможно, что рассмотренная модель очень упрощает природу взаимозависимостей. Однако маловероятно, что это привело к предсказанию несуществующих возможностей. Поведение живой материи, вероятно, в самом деле обладает более тонкой адаптационной способностью, чем мы это можем предвидеть. Механизмы репрессии, а также ингибирования с помощью обратной связи и активации предшественником можно рассматривать как микрорегуляцию, предназначенную для того, чтобы дополнить, сделать более чувствительной макрорегуляцию автосинтеза биомассы.
Глава 25
ВЫВОДЫ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Для количественного выражения роста и функции биомассы и влияния на них окружающих условий среды используются следующие параметры: лаг-период, удельная скорость роста, экономический коэффициент, метаболический коэффициент для субстрата и продукта, константа насыщения (К3) и концентрация биомассы. Зависимость между метаболическими коэффициентами и концентрацией субстрата выражается гиперболой (кинетика Михаэлиса — Ментен или Моно).
Определение биомассы является ключевым методом в количественном изучении культивирования микробов. Для определения биомассы в минимальной гомогенной жидкой среде применяется большое множество различных методов, но с увеличением сложности среды, а также в случае смеси различных микробных видов выбор метода может быть резко ограниченным. Необходимо разрабатывать другие методы определения биомассы. Ее можно определять с помощью любых параметров, которые достаточно точно связаны с биомассой.
Культуры в закрытых системах, такие, как простая периодическая культура, всегда находятся в переходном состоянии, при котором скорость процесса стремится к нулю. В простой периодической культуре преобладает два последовательных состояния. Первое —экспоненциальная фаза роста, в которой организм с избытком обеспечен субстратом и рост происходит с максимальной скоростью. Второе — это стационарная фаза, которая характеризуется нулевой скоростью роста и реорганизацией или деградацией структуры биомассы.
Рост, лимитированный субстратом, используется, вероятно, чаще, чем рост при избытке субстрата. Он достигается с помощью разных форм непрерывного добавления субстрата. В простой периодической культуре рост, лимитированный субстратом, обычно бывает кратким — в конце последнего удвоения биомассы. Длительность роста, лимитированного субстратом, можно увеличить, добавляя субстрат. Такая культура называется периодической культурой с добавлением источников питания. Если часть такой культуры периодически отбирается,
296
Глава 25
получается отъемно-доливная культура, в которой периодически воспроизводятся переходные состояния между двумя различными удельными скоростями роста.
Диализная культура — особая форма периодической культуры с добавлением питания, которая позволяет концентрировать биомассу и недиффундирующие продукты, образованные в разбавленной среде. Кроме того, это средство для уменьшения в культуре концентрации диффундирующих ингибирующих продуктов.
В хемостатной культуре для любой скорости роста можно обеспечить любой диапазон необходимых окружающих условий. Кроме того, эти специальные условия можно поддерживать неограниченное время. Таким образом, уникальной особенностью хемостата является возможность изменения скорости роста при постоянных окружающих условиях и, наоборот, возможность изменения окружающих условий при постоянной скорости роста.
Турбидостат представляет собой видоизмененный хемостат с тем преимуществом, что он позволяет поддерживать постоянной биомассу там, где простой хемостатный контроль уже нестабилен, например вблизи максимальной скорости роста. Концентрирование биомассы при помощи возврата биомассы имеет преимущество для увеличения скорости процессов в разбавленных средах и делает культуру более устойчивой к стрессовому воздействию ингибиторов. В батарее из двух хемостатов вторая стадия может быть использована как для поддержания нулевой скорости роста, так и для получения устойчивой культуры при максимальной удельной скорости роста.
Тубулярная культура (полного вытеснения) моделирует в непрерывном процессе условия простой периодической культуры, разные фазы которой пространственно разделены. Истинную культуру полного вытеснения осуществить методически более сложно, чем хемостатную. Однако в батарее хемостатов можно получить достаточно хорошее приближение к культуре полного вытеснения.
Если в культуре постоянная часть образующихся клеток оказывается нежизнеспособной, логарифмический рост все же бывает возможен. Если мертвые клетки автолизуются или клеточное содержимое выходит из клетки, то условия среды изменяются.
Для роста и поддержания биомассы требуется энергия. Количество необходимой энергии можно предсказать, вычислив количество АТФ, нужное для синтеза биомассы (выражается как 1/Уатф) и для поддержания (гиатф). Значение Уатф зависит от питания организма. Для гетеротрофов, использующих
Выводы и заключение
297
в качестве источника энергии углеводы, Уатф близко к 25 г сухой биомассы/моль АТФ. Для автотрофов Уатф близко к 5 г сухой биомассы/моль АТФ. Значение энергии поддержания при изменении условий окружающей среды может меняться во много раз, и это вызывает значительные изменения общего значения КАТФ.
На судьбу метаболизма источников углерода и энергии оказывают влияние скорость роста и условия окружающей среды. Главное действие оказывают парциальное давление кислорода, значение pH, температура, активность воды или осмоляльность и питание. Что касается метаболического взаимодействия смешанных источников углерода, то, кроме репрессии синтеза ферментов и ингибирования, связанного с диауксией, вопрос этот изучен плохо. Однако в хемостатной культуре, лимитированной углеродом, смешанные источники углерода могут использоваться одновременно.
Систематических исследований влияния напряжения углекислого газа на рост микроорганизмов проводилось мало. Значение Ks для двуокиси углерода соответствует его значению для углекислого газа в воздухе при 1 атм. Таким образом, образование углекислого газа организмом необходимо, вероятно, для поддержания оптимального значения его давления. Потребление нерастворимых углеводородов происходит, вероятно, в результате прямого контакта нефти с биомассой.
Максимальная скорость потребления кислорода культурой обычно регулируется тремя основными факторами: парциальное давление кислорода в газовой фазе, поверхность раздела газ — жидкость и сопротивление переносу кислорода через поверхность раздела. Для многих целей можно считать, что сопротивление переносу кислорода в стационарной пленке жидкости, окружающей биомассу, пренебрежимо мало.
В аэробных культурах напряжение растворенного кислорода точно измеряется с помощью кислородного электрода. Для измерения напряжения растворенного кислорода используется также окислительно-восстановительный потенциал. Однако этот способ менее чувствительный, чем использование кислородного электрода, поскольку ответ получается в логарифмической шкале. Исключение составляют экстремально малые значения напряжения кислорода, близкие к анаэробным условиям.
Взбалтывание необходимо как для перемешивания, так и для аэрации культуры. Перемешивание особенно важно в хемо-статных культурах, чтобы обеспечить хорошее смешение поступающей среды с культурой. Для систем малых размеров (до Юл) более удобна вортексная система, чем система аэрации с отбойниками. Последняя система используется для того.
298
Г лапа 25
чтобы получить высокие скорости переноса кислорода при минимальной потребляемой мощности.
Рост аэробных организмов, лимитированный кислородом, наступает при напряжении растворенного кислорода, примерно равном 10 мм рт. ст.; действительное значение будет зависеть от удельной скорости роста. Значение Ks по кислороду для растущей культуры лежит в пределах от 10-5 до 10~6 М. На скорость дыхания нерастущих микробных клеток сильно действуют предшествующие условия роста. Переход от аэробного к анаэробному метаболизму у растущих культур факультативных анаэробов происходит при давлении кислорода около 5 мм рт. ст. В отсутствие кислорода его могут заменить феррицианиды и некоторые другие акцепторы электрона.
Содержание дыхательных и других ферментов в биомассе в большей степени испытывает влияние широкого диапазона напряжения кислорода, чем скорость роста. Для микроорганизмов всех видов кислород может рассматриваться как ингибирующий субстрат. Для обычных аэробов ингибирующее напряжение кислорода менее 1 атм. Анаэробами называют организмы, рост которых ингибируется кислородом при любом его напряжении. Менее строгие анаэробы — это, вероятно, организмы, у которых есть механизм для поглощения кислорода, а следовательно, и для снижения напряжения до переносимого уровня.
Качественные аспекты микробного питания исторически привлекали к себе наибольшее внимание. Количественные требования к питанию, выраженные с помощью «экономического коэффициента», теперь считаются наиболее важными. На экономический коэффициент оказывают влияние другие компоненты питания, физико-химические условия среды и удельная скорость роста. Если потребности в аминокислотах, витаминах и других факторах роста сложны, то происходит взаимодействие между влиянием различных компонентов питания. Использование сред определенного состава все еще ограниченно. Неудачи при получении роста некоторых видов организмов или максимальной производительности на средах определенного состава отражают наше пренебрежение качественными или количественными требованиями к компонентам питания. Знание роли и количественных требований к питанию расширяется в результате изучения роста, лимитированного субстратом. Менее всего известно о влиянии на рост лимитации органическими факторами роста или микроэлементами.
Концентрация ионов микроэлементов в среде неизбежно подвергается изменениям и забуфериванию хелатирующими агентами. Контроль с помощью хелатирования металлов требует систематического изучения.
Выводы и заключение
299
При составлении среды для культуры исходят из совокупности всех имеющихся данных о качественных и количественных потребностях в питании, действии ингибиторов культуры, взаимодействии субстратов,_ физических условий и стабильности среды.
Температура действует на потребность в источниках питания, состав биомассы и природу метаболизма в культурах. Действие широкого диапазона температуры на скорость роста можно предсказать исходя из энергии «активации» для роста. Эта зависимость нарушается вблизи верхней и нижней границ роста. При температурах выше оптимальной процессы распада клеток, вероятно, преобладают над процессами роста. Вблизи нижней температурной границы может нарушиться регуляция метаболизма.
Внутри- и внеклеточное значения pH, очевидно, различны. pH среды действует и на состав биомассы и на природу метаболизма, но молекулярное действие этого влияния не выяснено. Возможно, pH среды действует на протонную движущую силу через плазматическую мембрану в химио-осмосе.
Влияние воды на культуры выражается с помощью активности воды или осмоляльности. Активность воды — более удобный параметр в ксерофильных условиях, однако для многих обычных организмов оптимум активности воды больше чем 0,99, и для них предпочтительнее оказывается параметр осмоляльности. Активность воды влияет на удельную скорость роста, состав биомассы и метаболизм.
Общее количество продуктов метаболизма, образованных при ферментации, зависит от четырех основных факторов: концентрации биомассы, удельной скорости образования продукта (7р), продолжительности биосинтетической активности и скорости распада продукта. Значение qP определяется геномом, субстратами, действием ингибитора и других факторов среды. Между значением qp и удельной скоростью роста может быть три вида зависимости: 1) qP увеличивается при увеличивании скорости роста, что характерно для первичного метаболизма, 2) qP не зависит от удельной скорости роста выше критического значения, 3) qP в зависимости от скорости роста меняется сложным образом. Факторы, контролирующие длительность синтетической активности биомассы при нулевой скорости роста, все еше не раскрыты.
Действие ингибиторов роста проявляется в уменьшении максимальной скорости роста в простой периодической культуре. В хемостатной культуре ингибиторы роста будут оказывать влияние на зависимость стационарного состояния биомассы от скорости разбавления, причем это влияние будет характерно для способа ингибирования: конкурентно оно поглошению субстрата или нет. В течение небольшого периода времени после
300
Глава 25
добавления ингибитора роста в удельной скорости роста могут происходить колебания. Любой продукт, ингибирующий рост в периодической культуре, будет постепенно уменьшать скорость роста. А в хемостатной культуре предсказывается, что ингибирующий продукт может влиять на зависимость концентрации биомассы в стационарном состоянии от скорости разбавления. Это влияние будет проявляться характерным образом в зависимости от того, конкурентно ли ингибирование продуктом или нет, а также в зависимости от соотношения и удельной скорости роста ц.
Субстратное ингибирование роста вызывает характерную картину изменения зависимости стационарного состояния биомассы от скорости разбавления. От неустойчивости хемостатной культуры при лимитации ингибирующим субстратом можно избавиться во второй стадии хемостата.
Возможность увеличения максимальной удельной скорости роста с помощью веществ, которые действуют как активаторы, еще нужно исследовать.
Имеются данные, что по крайней мере для бактериальной биомассы существует минимальная скорость роста. Это может быть незаметно из-за одновременного присутствия в культуре растущих и покоящихся (нерастущих) клеток. И у бактерий, и у дрожжей при очень малых скоростях роста происходят значительные изменения в их структуре и функциях. В некоторых случаях эти изменения приводят к преобразованию биомассы в споровые формы. Если рост резко прерывается из-за прекращения доставки энергетического субстрата, то начинается автолиз, однако если энергия поддержания доставляется, то автолиз ингибируется.
Лаг-период, предшествующий росту культуры, может быть обусловлен различными причинами. Так называемое действие инокулята, которое проявляется, если инокулят был взят из стационарной фазы культуры, представляет интерес с точки зрения физиологии, поскольку во время задержки происходит избирательная стимуляция некоторых ферментативных процессов. «Ранняя задержка» — результат недостатка промежуточных метаболитов. В некоторых условиях лаг-период пропорционален времени удвоения биомассы во время логарифмического роста в той же самой среде.
Взаимодействие видов в смешанных культурах до сих пор мало подвергалось систематическому изучению. Теоретические модели подсказывают, что взаимодействие видов лучше определять в хемостате, чем в простой периодической культуре. Если в системе происходит неконтролируемая конкуренция за один и тот же субстрат, то в гомогенной открытой системе могут остаться лишь виды с наибольшим сродством к субстрату.
Выводы и заключение
301
Конкуренция может регулироваться присутствием ингибиторов или активаторов, если эти вещества образуются соответствующими видами. В результате действие видов согласуется так, чтобы каждый поддерживал другого в популяции. Устойчивые смешанные популяции существуют, кроме того, в том случае, когда для каждого вида имеется свой лимитирующ'ий рост субстрат. Если два вида не конкурируют за общий лимитирующий субстрат, один может помогать другому, либо «поставляя» ему важный для него компонент питания, либо уничтожая ингибитор. Присутствие вида хищника может уменьшить степень использования лимитирующего рост субстрата. В культуре хищник — жертва для полного превращения лимитирующего субстрата через жертву в биомассу хищника необходимы две стадии процесса. Хищник может стабилизировать популяцию двух других конкурирующих организмов.
Культивирование в колонке с наполнителем имеет большое значение для почвенной микробиологии и в оросительном методе непрерывной очистки сточных вод. Поведение такой культуры предсказывается из многочисленных «теоретических пленок» биомассы, каждая из которых имеет поверхность, равную поперечному сечению колонки, с толщиной, равной глубине диффузии лимитирующего рост субстрата. В аэробных процессах этим субстратом будет, вероятно, кислород.
Рост биомассы в виде шаровидных колоний характерен для многих нитчатых грибов. При росте, лимитированном диффузией источников питания к периферическому слою, когда размеры шариков достигают критического значения, шарики становятся гетерогенными.
Рост поверхностных колоний микроорганизмов связан с ростом периферической зоны постоянной ширины w. Колонии грибов расширяются с постоянной скоростью, которая связана с удельной скоростью роста р и шириной w растущей зоны. Считается, что ширина w должна быть длиной растущего кончика гифы, т. е. «единицей роста». Колонии бактерий растут вширь на пластинке агара с постоянной скоростью за время, которое определяется глубиной пластинки. После того как период линейного роста заканчивается, квадрат радиуса колонии, или площадь поверхности колонии, увеличивается с постоянной скоростью.
Зависимость линейной скорости роста колонии грибов от начальной концентрации лимитирующего рост субстрата при малых концентрациях субстрата выражается гиперболическим уравнением Моно. Во время периода постоянного линейного роста колонии бактерий линейная скорость роста пропорциональна квадратному корню из начальной концентрации
302
Глава 25
лимитирующего субстрата и, вероятно, квадратному корню из удельной скорости роста.
Простейшая модель роста биомассы основана на системе автосинтеза, состоящей из двух структур с взаимозависимым синтезом. Расширенную модель клетки можно представить как разветвленную сеть структур с взаимозависимым синтезом. Модель предсказывает, что количество ферментов и других структур в системе будет стремиться к постоянному соотношению, характерному для данной окружающей среды, соотношению, обеспечивающему максимальную скорость роста в данной среде. Далее модель предсказывает, что изменение окружающей среды будет автоматически изменять соотношение ферментов для того, чтобы поддержать максимальную скорость роста. При наличии в системе альтернативных ферментов и синтеза метаболита, необходимого для синтеза другого фермента, модель предсказывает, что изменение условий, которое позволит работать одному синтетическому циклу, а не другому, автоматически стимулирует синтез того фермента, который должен функционировать, и репрессирует синтез другого фермента. Это составляет кинетическую основу целительных свойств природы. Такая саморегуляция, присущая автосинтетической системе, осуществляется, вероятно, медленно, и для осуществления более чувствительной и быстрой регуляции требуется наличие хорошо известных репрессий ферментов и механизма ингибирования по принципу обратной связи.
Наука о культивировании микробов все еще находится у своего начала; все рассмотренные принципы требуют дальнейшей проверки и развития. Поскольку число видов микробных и тканевых клеток, культивируемых в контролируемых условиях, составляет лишь малую часть целого, разнообразие поведения биомассы в чистых и смешанных культурах требует объяснения и формулировки общих принципов.
ПРИЛОЖЕНИЕ
Обозначения и сокращения
Обозначения, наиболее часто встречающиеся в этой книге, имеют следующий смысл, если они не оговариваются специальным образом.
АТФ Аденозинтрифосфат
ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК Рибонуклеиновая кислота
а Удельная скорость поддержания ( = mYEa)
aw Активность воды
сП Сантипуазы (вязкость)
D Скорость разбавления (= F/V)
Dc Критическая скорость разбавления (при ц максимальном)
D' Коэффициент диффузии
E-t Окислительно-восстановительный потенциал [уравнение (9.4)]
F Скорость подачи среды
Н Константа Генри [уравнение (9.2)]
i Ионная сила [уравнение (15.1)]
Ка Константа активации [уравнение (17.44)]
К, Константа ингибирования (разд. 17.2.1)
KLa Коэффициент транспорта газа [уравнение (9.13)]; а — площадь поверхности раздела фаз газ — жидкость, I/Kl = сопротивление диффузии газа
Kg Константа насыщения [уравнение (2.21)]
Кг Скорость радиального роста колонии
L Лаг-период до начала роста
In Логарифм с основанием е (натуральный логарифм)
log Логарифм с основанием 10 (десятичный логарифм)
т I. Коэффициент поддержания (разд. 8.3.1) (коэффициент энергетических затрат на поддержание жизни) II. Моляльность (число молей растворенного вещества в 1 кг воды)
М Молярность (число молей растворенного вещества в 1 л)
т0 Осмоляльность или тоничность (одноосмоляльный раствор
оказывает осмотическое давление 22,4 атм при 0°С).
р Концентрация продукта
Р Общее количество продукта (КР)
304
Приложение
Ро Константа потребности в кислороде, число молей поглощенного кислорода на 1 моль потребленного окисляемого субстрата
рМ —logme, где те — молярность ионов металла
qp, qs Метаболические коэффициенты, соответствующие
1/х • dpidt и \/х • ds/dt, сокращенно обозначенные q
s Концентрация субстрата
S Общее количество субстрата в культуре (Vs)
sr Концентрация субстрата в питательной среде
t Время
Т Температура
td Время удвоения биомассы или время генерации
tr Среднее время удержания или замещения при непрерыв-
ном культивировании (= V//7)
V Объем культуры
х Концентрация биомассы
Уатф Выход биомассы в расчете на АТФ (г образованной сухой биомассы/моль АТФ) f
Уатф Истинный выход биомассы в расчете на АТФ, т. е. за | вычетом количества энергии, затраченной на поддержание
У с Ух/s, когда субстрат служит источником углерода, но не [
энергии [уравнение (8.4)]
У£ Общий экономический коэффициент, Yx/S,когда субстрат является источником энергии
YЕа Истинный экономический коэффициент, Yx/S, когда субстрат является источником энергии и m = 0
Yp/S Выход продукта (—dp/ds), сокращенно обозначаемый
УР (где указано)
Ур(х Выход продукта (dp/dx), сокращенно обозначаемый Ур (где указано)
Ух/s Экономический коэффициент (—dx/ds), обозначаемый Т
Ух или У (где указано)
Удельная скорость роста, \fx-dxldt
цт Максимальная удельная скорость роста, определяемая по уравнению (2.21)
л Осмотическое давление (атм).
</> Осмотический коэффициент [уравнение (15.8)] [
оо Бесконечность •
Пропорционально
> Больше, чем
> Значительно больше, чем
< Меньше, чем
<С Значительно меньше, чем
Приблизительно равно
~ Над символом указывает, что данное значение относится
к стационарному состоянию.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Aiba S., Humphrey A. E., Millis N. F., Biochemical Engineering, Academic Press, New York. 1965.
2 Aiba S., Kobayashi K., Biotech. Bioeng., 13, 583 (1971).
3. Aiba S., Nagatani M., Furuse M., J. Ferm. Technol. (Japan), 45, 475 (1967).
4. Aiba S., Shoda M., Nagatani M„ Biotech. Bioeng., 10, 845 (1968).
5. Aida K., in: The Microbial Production of Amino Acids, ed. Yamada K. et al., p. xiii, John Wiley, New York, 1972.
6. Anagnostopoulos Q. D., J. gen. Microbiol., 77, 233 (1973).
7. Amon D. I., Amer. J. Bot., 25, 322 (1938).
8. Aubel E„ Rosenberg A. J., Grunberg M., Helv. Chim. Acta, 29, 1267 (1946).
9. Babij T., Moss F. J., Ralph B. J., Biotech. Bioeng., 11, 593 (1969).
10. Baidya T. K. N., Webb F. C., Lilly M. D., Biotech. Bioeng, 9, 195 (1967).
11. Bail 0., Z. f. Immunitatsforschung, 60, 1 (1929).
12. Bainbridge B. W., Bull A. T., Pirt S. J., Rowley B. L, Trinci A. P. J., Trans. Br. mycol. Soc., 56, 371 (1971).
13. Bainbridge B. W., Trinci A. P. J., Trans. Br. mycol. Soc., 53, 473 (1969).
14. Bandyopadhyay B., Humphrey A. E., Taguchi H„ Biotech. Bioeng., 9. 533 (1967).
15. Barnes E. M., Ingram M., J. appl. Bact., 19, 117 (1956).
16. Bartha R., Ordal E. J„ J. Bact., 89, 1015 (1965).
17. Bauchop T., Elsden S. R., J. gen. Microbiol., 23, 457 (1960).
18. Baumberger J. P., Cold Spring Harb. Symp., 7, 195 (1939).
19. Beque W. J., Lichstein H. C., Proc. Soc. exp. Biol. Med., 114, 625 (1963)
20. Birch J. R., Pirt S. J., J. Cell Sci., 5, 135 (1969).
21. Birch J. R„ Pirt S. J., J. Cell Sci., 7, 661 (1970).
22. Birch J. R., Pirt S. J., J. Cell Sci., 8, 693 (1971).
23. Bisset K- A., J. gen. Microbiol., 4, 413 (1950).
24. Bjerruin J., Schwarzenbach G., Sillen L. G., Stability Constants, Part I: Organic Ligands (Special Publication No. 6). Part II: Inorganic Ligands (Special Publication No. 7), Chemical Society, London, 1958.
25. Blaker G. J., The Vitamin Nutrition of Mammalian Cells in Culture. PhD Thesis, University of London, 1971.
26. Blaker G. J., Birch J. R., Pirt S. J., J. Cell Sci., 9, 529 (1971).
27. Blaker G. J Pirt S. J„ J. Cell Sci., 8, 701 (1971).
28. Borichewski R. AL, Umbreit W. IV., Arch. Biochem. Biophys., 116, 97 (1966).
29. Borkowski J. D., Johnson M. J., Appl Microbiol., 15, 1483 (1967).
30 Brooks J. D., Meers J. L., J. gen. Microbiol., 77, 513 (1973).
31. Bromel M., Teodoro R., Bact. Proc. p. 78 (1966).
32. Brown С. M„ Rose A. H., J. Bact., 99, 371 (1969).
33. Brown С. M., Stanley S. O., J. appl. Chem. Biotechnol., 22, 363 (1972).
34. Brunner R., Oberzill W., Menzel J., in: Continuous Cultivation of Microorganisms ed. Malek 1. et al., p. 323, Academia, Prague, 1968.
1 1 Зак. 737
306
Список литературы
35. Bryson К, Science, 116, 45 (1952).
36. Button D. К., J. gen. M.icrobiol., 58, 15 (1969).
37. Button D. K„ Garver J. C., J. gen Microbiol., 45, 195 (1966).
38. Camlet L., Sermonti G., Chain E. B., Bull. Wld Hlth Org 6 265 (1952).
39. Calcott P. H., Postgate I. R.. J. gen. Microbiol., 70, 115 (1972).
40. Callow D. S., Pitr S. J., J. appl. Bact., 24, 12 (1961).
41. Campbell L. L., Pace B., J., appl. Bact., 31, 24 (1968).
42. Canale R. P., Biotech. Bioeng., 12, 353 (1970).
43. Carlsson J., J. gen. Microbiol., 67, 69 (1971).
44. Carter B. L. A., Bull A. T., Biotechnol. Bioeng;, 11, 785 (1969).
45. Ceccarini C., Eagle H., Proc. nat. Acad. Sci., 68, 229 (1961).
46. Cejkova A., Folia Microbiologica, 10, 246 (1965).
47. Chain E. B., Gualandi G., Rend. 1st. Super. Sanit. (English edn), 17, 5 (1954).
48. Chain E. B., Paladino S., Callow D. S., Ugolini F., van der Sluis J , Bull. Wld Hlth Org„ 6, 73 (1952).
49. Chao C„ Reilly P. J„ Biotech. Bioeng., 14, 75 (1972).
50. Chester V. E., Biochem. J., 86, 153 (1963).
51. Choudhary A. Q., Pirt S. J., J. gen. Microbiol., 43, 71 (1966).
52. Christian J. H. B., Hall J. M., J. gen. Microbiol., 70, 497 (1972).
53. Christian J. H. B., Scott W. J., Aust. J. Biol. Sci., 6, 565 (1953).
54. Christian J. H. B., Waltho ]. A., J. gen. Microbiol., 35, 205 (1964).
55. Clark W. M., Oxidation reduction Potentials of Organic Systems, Williams & Wilkins, Baltimore, 1960.
56. Cohen S. S., Introduction to the Polyamines, Prentice-Hall, New Jersey, 1971.
57. Contois D. E., J. gen. Microbiol., 21, 40 (1959).
58. Cooper A. L., Dean A. C. R., Hinshelwood C., Proc. roy. Soc. B, 171, 175 (1968).
59. Cooper С. M., Fernstrom G. A., Miller S. A., Ind. Eng. Chem., 36, 504 (1944).
60. Cooper К. E., in: Analytical Microbiology ed. Kavanagh F., p. 46, Academic Press, New York, 1963.
61. Curds C. R., Water Research, 5, 793 (1971).
62. Curds C. R., Cockburn A., J. gen. Microbiol., 54, 343 (1968).
63. Dagley S., Hinshelwood C. N., J. Chem. Soc., 1936—1942 (1938).
64. Darlington W. A., Biotech. Bioeng., 6, 241 (1964).
65. Davies H. C., Karush F„ Rudd J. H., J. Bact., 89, 421 (1965).
66. Davison M. J., Downie J. A., Garland P. B., Biochem. J., 129, 46P (1972).
67. Dawes E. A., Ribbons D. IE., Bact. Rev., 28, 126 (1964).
68. Dawes I. IE., Ray D., Mandelstam J., J. gen. Microbiol., 56, 171 (1969).
69. Dawes 1. W., Thornley J. H. M., J. gen. Microbiol., 62, 49 (1970).
70. Dean A. C. R., in: Continuous Cultivation of Micro-organisms ed. Malek I. et al., p. 263, Academia, Prague, 1969.
71. Dean A. C. R., Hinshelwood C. Growth, Function and Regulation in Bacterial Cells, Clarendon Press, Oxford, 1966.
72. Dean A. C. R., Moss D. A., Chem.-Biol. Interactions, 2, 281 (1970).
73. Dean A. C. R., Moss D. A., Biochem. Pharmacol., 20, 1 (1971).
74. Dean A. C. R., Rogers P. L., Biochim. biophys. Acta, 148, 267 (1967).
75. De Ley J., in: Microbial Classification, 12th Symposium Soc. gen. iMicro-biol, Cambridge University Press, Cambridge (1962).
76. Demain A. L., Ann. Rev. Microbiol., 26, 369 (1972).
77. Demain A. L. J. appl. Chem. Biotechnol., 22, 345 (1972).
78 Demain A. L., Hendlin D., J. Bact. 75, 46 (1958)
79. Denbigh K. G., Chemical Reaction Theory, An Introduction, Cambridge University Press, Cambridge, 1965.
Список литературы
807
80 De Vries W., Kapteiin W. M. C., van de Beek E. G., Stouthamer A. H., J. gen. Microbiol., 63, 333 (1970).
81. Dicks J. W., Tempest D. W„ Biochim. biophys. Acta, 136, 176 (1967).
82. Dixon M., Biochem. J., 55, 161 (1953).
83. Dixon M„ Elliott К. A. C. Biochem. J., 24, 820 (1930).
84. Dixon M„ Webb E. C., Enzymes, 2nd edn., Longmans, London, 1967. (M. Диксон, Э. Уэбб, Ферменты, изд-во «Мир», М„ 1966.)
85. Donald С., J. gen. Microbiol., 7, 211 (1952).
86. Downie J. A., Garland P., Biochem. J., 129, 47P (1972).
87. Drew S. W., Demain A. L., Biotech. Bioeng., 15, 743 (1973).
88 Eddy A. A., Carroll T. C. N., Danby C. J., Hinshelwood C., Proc. roy. Soc. B, 138, 219 (1951).
89 Eddy A. A., Hinshelwood C., Proc. roy. Soc. B, 138, 237 (1951).
90. Ellwood D. C., Biochem. J., 121, 349 (1971).
91. Ellwood D. C., Tempest D. W., J. gen. Microbiol., 73, 395 (1972).
92. Enoch K. G., Lester R. L„ J. Bact., 110, 1032 (1972).
93. Eroshin V. K., Harwood J. H., Pirt S. J., J. appl Bact., 31, 560 (1968).
94. Evans С. H., Brown E. G., Proc. Biochem. Soc. December (1973).
95. Fawcett H. S., Annals Appl. Biol., 12, 191 (1925).
96. Fensom A. H., Pirt S. J., In: Fermentation Technology Today, Proc. IV I. F. S„ p. 51, Society of Fermentation Technology, Japan, 1972.
97. Feren C. J., Squires R. W. Biotech. Bioeng., 11, 583 (1969).
98. Finn R. K., Bacterio!. Rev., 18, 254 (1954).
99. Finter N. B., J. gen. Virol., 5, 419 (1969).
100. Flaschka H. A., EDTA Titrations, 2nd edn., Pergamon, Oxford, 1964.
101. Freese E„ Sheu C. W., Galliers E„ Nature, 241, 321 (1973).
102. Fufio У., Samuichi M., Ueda S., J. Ferm. Technol. (Japan), 51, 154 (1973).
103. Gale E. F, Epps H. M. R„ Biochem. J„ 36, 600 (1942).
104. Gallup D. M., Gerhardt P„ Appl. Microbiol., 11, 506 (1963).
105. Ghosh D., Pirt S. J., Rend ist Super. Sanit. (English edn), 17, 149 (1954).
106. Gileby A. R., Few A. V., J. gen. Microbiol., 20, 321 (1959).
107. Glasstone S., Lewis D., Elements of Physical Chemistry, 2nd edn., Macmillan, London, 1964.
108. Gobel F., Pfennig N., in: Continuous Cultivation of Micro-organisms ed. Malek, 1. et al., p. 337, Academia, Prague, 1969.
109. Goma G., Parailleux A., Durand G., J. Ferment. Technol. (Japan), 51, 616 (1973).
110. Gordee E. Z., Day L. E., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1, 315 (1972).
111. Gordon J., Holman R. A., McLeod J. WJ. Path. Bact., 66, 527 (1953).
112. Gow J. S., Littlehailes J. D., Smith S. R. L., Walter F. B., SCP Production from Methanol: Bacteria. International Symposium, May 1973. Massachusetts Institute of Technology (1973).
113. Griffiths J. B., Pirt S. J., Proc. roy. Soc. B, 168, 421 (1967).
114. Hadfipetrou L. P., Gerrits J. P., Teulings F. A. G., Stouthamer A. H., J. gen. Microbiol., 36, 139 (1964).
115. Hadfipetrou L. P., Gray-Young T., Lilly M. D., J. gen. Microbiol., 45, 479 (1966).
116. Hadfipetrou L. P., Stouthamer A. H., J. gen. Microbiol., 38, 29 (1965).
117. Hall В. M., Appl. Microbiol., 8. 378 (1960).
118. Hansford G. S., Humphrey A. E., Biotech. Bioeng., 8, 85 (1966).
119. Harrison D. E. F., Biochim. biophys. Acta. 275, 83 (1972).
120. Harrison D. E. F., J. appl. Bact.. 36, 301 (1973).
121. Harrison D. E. F., Loveless J E. J. gen. Microbiol., 68, 35 (1971).
122. Harrison D. E. F., MacLennan D. G., Pirt S. J., in: Fermentation Advances
ed. Perlman D., p. 117. Academic Press, New York, 1969.
123. Harrison D. E. F., Loveless J. E. J. gen. Microbiol., 68, 45 (1971).
11*
308
Список литературы
124. Harrison D. Е. F.. Pirt S. J., J. gen. Microbiol., 46, 193 (1967).
125. Harrison D E. F., Topiwala H. H., Hamer G., Fermentation Technology Today, Proc. IV I. F. S., p. 491, Society ox Fermentation Technology, Japan, 1972.
126. Harte M. J., Webb F. C., Biotech. Bioeng., 9, 205 (1967).
127. Harwood J. H., Studies on the Physiology of Methylococcus capsulatus growing on Methane. PhD Thesis, University of London, 1970.
128. Harwood ]. H., Pirt S. J., J. appl. Bact., 35, 597 (1972).
129. Hattori K-, Yokoo S., Imada 0., J. Ferment. Technol (Japan), 50, 737 (1972).
130. Herbert D., in: Recent Progress in Microbiology, VII International Congress for Microbiology, ed. Tunevall G., p. 381, Almquist & Wiksell, Stockholm, 1958.
131. Herbert D., in: Continuous Culture, Monograph No. 12, p. 21, Society of Chemistry & Industry, London, 1961.
132. Herbert D., In: Continuous Cultivation of Micro-organisms ed. Malek. I, et al., p. 23, Czechoslovak Academy of Sciences, Prague, 1964.
133. Herbert D., Phipps P. J., Proc. Soc. gen. Microbiol., 1/3 (1974).
134. Hernandez E., Johnson M. J. J. Bact., 94, 996 (1967).
135. Hernandez E., Pirt S. J., J. appl. Chem. Biotechnol (1975), в печати.
136. Hill A. V., Proc. Roy. Soc. B, 104, 39 (1928).
137. Hills G. M., Spurr E. D., J. gen. Microbiol., 6, 64 (1952).
138. Hinshelwood C. N., The Chemical Kinetics of the Bacterial Cell., Clarendon Press, Oxford, 1946.
139. Hinshelwood C. N., J. chem. Soc., 745 (1952).
140. Hinshelwood C. N., J. chem. Soc., 1947 (1953).
141. Hobson P. N., in: Methods in Microbiology 3B, ed. Norris J. R. & Ribbons D. W., p. 133, Academic Press, London, 1969.
142. Hobson P. N., Mann S. O., in: Automation, mechanization and data handling in microbiology. Society for Applied Bacteriology, Academic Press, London, 1970.
143. Holzer H., Dilntze IF., Ann. Rev. Biochem., 40, 345 (1971).
144. Hospodka J., Biotech. Bioeng., 8, 117 (1966).
145. Hostalek Z., Tinterova M., Jechova V., Blumauerovd M., Suchy J., Vanek Z., Biotech. Bioeng., 11, 539 (1969).
146. Hotta K-, Takao S., J. Ferm. Technol. (Japan), 51, 12 (1973).
147. Hromatka O., Chemiker Ztg 76, 776 (1952).
148. Hsieh D. P. H., Silver R. S., Mateles R. I., Biotech. Bioeng., 11, 1 (1969).
149. Humphrey A. E., Erickson L. E., J. appl. Chem. Biotechnol., 22, 125 (1972).
150 Hungate R. E., in: Methods in Microbiology 3B, ed. Norris J. R. & Ribbons D. W„ p. 117, Academic Press, London, 1969.
151. Hunter K., Rose A. H., J. appl. Chem. Biotechnol., 22, 527 (1972).
152. Hunter S. H., Ann. Rev. Microbiol., 26, 313 (1972).
153. Ingram M., Proc, roy Soc. В 134, 181 (1947).
154. Ingraham J. L.y J. Bact., 76, 75 (1958).
155. Ishizaki A., Shibai H., Hirose У., Shiro T., Agric. Biol. Chem., 37, 99 (1973).
156. Jacob H. E., in: Methods in Microbiology, 2, p. 91, Academic Press, London, 1970.
157. Jensen A. L., Darken M. A., Schultz J. S., Shay A, J., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 49 (1963).
158. Johnson M. J., Chem. and Ind. 1532 (1964).
159. Johnson M. J., Science, 155, 1515 (1967).
160. Johnson M. J., J. Bact., 94, 101 (1967).
161. Jones G. K-, Jansen F., McKay A. J., J. gen Microbiol., 74, 139 (1973).
162. Jost J. L, Drake J. F., Fredrickson A. G., Tsuchiya H. M., J. Bact., 113, 834 (1973).
Список литературы
309
163 Kantorowicz О., J. gen. Microbiol., 5. 276 (1951).
164. Kelly D. P„ Sci. Prog. (Oxford), 55, 35 (1967).
165. Kepes A., Cohen G. N., In The Bacteria. IV. The Physiology of Growth, p. 179. Academic Press, New York, 1962.
166. Khanna R., Tewari К- K., Krishnan P. S., Archiv. Mikrobiol., 44, 352 (1963).
167. Kihara H., Klatt O. A., Snell E. E., J. biol. Chem., 197, 801 (1952).
168. Kihara H., Snell E. E., J. biol. Chem., 197, 791 (1952).
169. Kinoshita S., in: The Microbial Production of Amino Acids ed. Yamada K. et al., John Wiley, New York, 1972.
170. Kitai A., Tone H., Ozaki A., Biotech. Bioeng., 11, 911 (1969).
171. Klein F., Mahlandt B. G., Lincoln R. E., Appl. Microbiol., 22, 145 (1971).
172. Klotz I. M„ Gutmann H. R., J. Amer. chem. Soc., 67, 558 (1945).
173. Kluyver A. J., Perquin L. H. C., Biochemische Zeit., 266, 68 (1933).
174. Knight В. C. J. G., Fildes P., Biochem. J., 24, 1496 (1930).
175. Kobayashi K-, Ikeda S., Hirose Y., Kinoshita K., Agric. Biol. Chem., 31, 1448 (1967).
176. Koch A. L., Coffman R, Biotech. Bioeng.. 12, 651 (1970).
177. Kormancikova V., Kovac L., Vidova M., Biochim, biophys. Acta, 180, 9 (1969).
178. Koser S., Vitamin Requirements of Bacreia and Yeasts, Charles C. Thomas, Springfield, Ill, 1968.
179. Kruse P. F., Miedema E., J. Cell Biol., 27, 273 (1965).
180. Kurowski W. M., Transformation of Sucrose to 3-Ketosucrose by Agrobac-terium tumefaciens and Stability of the Glucoside-3-dehydrogenase Activity in Non-growing Cells. PhD Thesis, University of London, 1974.
181. Kurowski W. M., Fensom A. FL, Pirt S. J., J. gen. Microbiol., 75/2. XV (1973).
182. Kurowski W. M., Pirt S. J., J. gen. Microbiol., 68, 65 (1971).
183. Lane A. G., Pirt S. J., J. appl. Chem. Biotechnol., 23, 309 (1973).
184. Larsen FL, Advances in Microbial Physiology, ed. Rose A. H. & Wilkinson J. F.. 1, 97, Academic Press, London, 1967.
185. Layne E., in: Methods in Enzymology ed. Colowick S. P. & Kaplan N. O., p. 447, Academic Press, New York, 1957.
186. Lichstein FL C., Ann. Rev. Microbiol., 14, 17 (1960).
187. Light A., J. appl. Chem. Biotechnol.. 22, 509 (1972).
188. Lodge R. M., Hinshelwood C. N., J. chem. Soc., 213 (1943).
189. Lowry H. O., Rosenbrough N. J., Farr A. C., Randall R. J., J. biol. Chem., 193, 265 (1951).
190. Leudeking R., Piret E. L., J. Biochem. microbiol. Technol. Engng., 1, 393 (1959).
191. Lunge G., Keane C. A., Technical Methods of Chemical Analysis, 1/1, p. 782, Gurney and Jackson, London, 1908.
192. Lwoff A., Monod J., Ann. Inst. Past.. 73, 323 (1947).
193. Maaloe O., Kjeldgaard N. O., Control of Macromolecular Synthesis, Benjamin W. A., New York. 1966.
194. Mackintosh I. P„ Mathematical and Mechanical Models simulating Conditions of Bacterial Growth in the Human Bladder, PhD Thesis, University of London, 1973.
195. Maclennan D. G., Ousby J. C„ Vaseu R. B., Cotton N. T., J. gen. Microbiol, 69, 395 (1971).
196. Maclennan D. G., Pirt S. J., J. gen. Microbiol., 45, 289 (1966).
197. Mager J., Kucznski M.. Schutzberg G., Avi-Dor Y., J. gen. Microbiol., 14, 69 (1956).
198. Mandelstam J., Biochem. J., 69, 103 (1958).
199 Mandelstam L, Bacteriol. Rev., 24, 289 (1960).
200. Manfredini R., Wang D. I. C., Biotech. Bioeng.. 14, 267 (1972).
201 Margaltth P., Pagani H., Appl. Microbiol., 9, 325 (1961).
310
Список литературы
202. Markham Е.. Byrne W. J., In: Continuous Cultivation of Micro-organisms, ed. Malek I. et al., p. 117, Academia, Prague, 1969.
203. Marr A. G., Ingraham J. L., J. Bact., 84, 1260 (1962).
204. Marr A. G., Nilson E. N., Clark D. J., Ann. N. Y. Acad. Sci., 102, Art 3, 536 (1963).
205. Maieles R. I., Ryu D. У., Yasuda T., Nature, 208, 263 (1965).
206. Mauck J., Chan. L., Glaser L., J. biol. Chem. 246, 1820 (1971).
207. Meers J. L., J. gen. Microbiol., 67, 359 (1971).
208. Meers J. L., Brooks J. D., J. gen. Microbiol., 75, viii (1973).
209. Meers J. L., Tempest D. W., J. gen. Microbiol., 52, 309 (1968).
210. Meynell G. G., Meynell E., Theory and Practice in Experimental Bacteriology, Cambridge University Press, Cambridge, 1965. (Дж. Мейнелл, Э. Мейнелл, Экспериментальная микробиология, изд-во «Мир», М., 1967.)
211. Miles R. J., Pirt S. J., Biochem. J., 114, 10P (1969).
212. Miles R. J., Pirt S. J., J. gen. Microbiol., 76, 305 (1973).
213. Mimura A., Kawano T., Kodaira R., J. Ferm. Technol., 47, 229 (1969).
214. Mitchell P., J. Bioenergetics, 4, 63 (1973).
215. Mitchell P., Moyle J., in: Bacterial Anatomy, 6th Symposium Soc. gen. Microbiol., p. 150, Cambridge University Press, Cambridge, 1956.
216. Monod J„ Recherches sur la Croissance des Cultures Bacteriennes. 2nd edn., Hermann, Paris, 1942.
217. Monod J., Ann. Inst. Past., 79, 390 (1950).
218. Moses V„ Syrett P. J„ J. Bact., 70, 201 (1955).
219. Moss F. J., Rickard P. A. D., Beech G. A., Bush F. E., Biotech. Bioeng., 11, 561 (1969).
220. Moyer A. J., Appl. Microbiol., 1, 1 (1953).
221. Munk V., Dostalek M., Volfovd O., Biotech. Bioeng., 11, 383 (1973).
222. Nagai S., Aiba S., J. gen. Microbiol., 73, 531 (1972).
223. Ng F. M. W., Dawes E. A., Biochem. J., 132 (1973).
224. Ng H., Ingraham J. L., Marr A. G., J. Bact., 84, 331 (1962).
225. Noguchi Y., Johnson M. J., J. Bact., 82, 538 (1961).
226. Novick A., in: Continuous Cultivation of Micro-organisms, Symposium, p. 29, Czechoslovak Academy of Sciences, Prague, 1958.
227. Novick A., Szilard L., Science, 112, 715 (1950).
228. O’Brien R. W., Stern J. R., J. Bact., 98, 388 (1969).
229. O’Sullivan C. Y., Pirt S. J., J. gen. Microbiol., 76, 65 (1973).
230. Okumura S., in: The Microbial Production of Amino Acids, ed. Yamada K. et al., John Wiley, New York, 1972.
231. Owen S. P., Johnson M. J., Appl. Microbiol., 3, 375 (1955).
232. Paladino S., Rend. 1st Super. Sanit. (English edn), 17, 145 (1954).
233. Palumbo S. A., Johnson M. G., Rieck V. T., Witter L. D., J. gen. Microbiol., 66, 137 (1971).
234. Pasteur L., Annales de Chimie et de Physique, 3е Serie, 58, 324 (1869).
235. Paul J., Cell and Tissue Culture. 3rd edn., Livingstone, Edinburgh, 1965.
236. Perlman D., Process Biochem., 8/7, 18 (1973).
237. Peters V. A, Prescott J. M., Snell E. E., J. biol. Chem., 202, 521 (1953).
238. Phelps A., J. exp. Zool., 72, 479 (1936).
239. Phillips D. H., Biotech. Bioeng., 8, 456 (1966).
240. Phillips D. H., Johnson M. J., Ind. Eng Chem., 51, 83 (1959).
241. Phillips D. H., Johnson M. J., J. biochem. microbiol. Technol. and Engng, 3, 261 (1961).
242. Piper ll7. O., Appl. Microbiol., 10, 281 (1962).
243. Pirt S. J., J. gen. Microbiol., 16, 59 (1957).
244. Pirt S. J., Proc. roy. Soc. B, 163, 224 (1965).
245. Pirt S. J., Proc., rov. Soc. B, 166, 369 (1966).
246. -Pirt S. J., J. gen. Microbiol., 47, 181 (1967).
Список литературы
311
247. Pirt S. J., in: Microbial Growth, 19th Symposium Soc. gen. Microbiol., Cambridge University Press, Cambridge, 1969.
248. Pirt S. J., Biochem. J., 121, 293 (1971).
249. Pirt S. J., Year Book 1972, p. 119. Association of River Authorities. London, 1972.
250. Pirt S. J., J. appl. Chem. Biotechnol., 22, 55 (1972).
251. Pirt S. J., J. appl. Chem. Biotechnol., 23, 389 (1973).
252. Pirt S. J., J. gen. Microbiol., 75, 245 (1973).
253. Pirt S. J., J. appl. Chem. Biotechnol., 24 , 415 (1974).
254. Pirt S. J., Bazin M. J., Nature, 239, 290 (1972).
255. Pirt S. J., Callow D. S., J. appl. Bact., 21, 188 (1958).
256. Pirt S. }., Callow D. S„ J. appl. Bact., 21, 211 (1958).
257. Pirt S. J., Callow D. S„ Nature, 184, 307 (1959).
258. Pirt S. J., Callow D. S„ J. appl. Bact., 23, 87 (1960).
259. Pirt S. J., Callow D. S., Gillett W. A., Chem. and Ind., 730 (1957).
260. Pirt S. J., Kurowski IF. AL, J. gen. Microbiol., 63, 357 (1970).
261. Pirt S. J., Righelato R. S., Appl. Microbiol., 15, 1284 (1967).
262. Pirt S. J., Thackeray E. Exp. Cell. Res., 33, 396 (1964).
263. Pirt S. J., Thackeray E. J., Harris-Smith R., J. gen. Microbiol., 25. 119 (1961).
264. Postgate J. R., Hunter J. R., J. gen. Microbiol., 29, 233 (1962).
265. Post gate J. R., Hunter J. R., J. gen. Microbiol., 34, 459 (1964).
266. Powell E. O., J. gen. Microbiol., 15, 492 (1956).
267. Powell E. O., J. Sci. Food Agric., 1 (1963).
268. Powell O., Lowe J. R., in: Continuous Cultivation of Micro-organisms ed. Malek I. et al., p. 45. Czechoslovak Academy of Sciences, Prague, 1964.
269. Prescott J. M., Peters V. J., Snell E. E., J. biol. Chem, 202, 533 (1953).
270. Ratledge C., Biochem. Biophys. Res. Commun., 45, 856 (1971).
271. Ratledge C., Chaudhry M. A., J. gen. Microbiol., 66, 71 (1971).
272. Raulin M. J., Annales des Sciences Naturelles, 5е Serie, 11, 93 (1869).
273. Reese E. T., in: Enzyme Engineering, ed. Wingard L. B., Interscience, New York, 1972.
274. Ricica J., in; Continuous Cultivation of Micro-organisms, Symposium, p. 75, Czechoslovak Academy of Sciences, Prague, 1958.
275. Righelato R. C.t Trinci A. P. J., Pirt S. J., Peat A., J. gen. Microbiol., 50, 399 (1968).
276. Righelato R. C., van Hernert P., in: Continuous Cultivation of Microorganisms, ed. Malek I. et al., p. 437, Academia, Prague, 1969.
277. Righelato R. C., van Hemert P. A., J. gen. Microbiol., 58, 403 (1969).
278. Roberts R. B., Abelson P. H.. Cowie D. B., Button E. T., Britten R. J., Studies of Biosynthesis in Escherichia coli, Carnegie Institute Publ., 607, Washington, 1955.
279 Robinson R. A., Stokes R. H., Electrolyte Solutions, Butterworths, London, 1959.
280. Rogosa M., Franklin J. G., Perry K. D., J. gen. Microbiol., 25, 473 (1961)
281. Rosenberger R. F., Elsden S. R., J. gen. Microbiol., 22, 726 (1960).
282. Roughton F. J. W„ Scholander P. F., J. Biol. Chem., 148, 541 (1943).
283 Rowley B. L, Pirt S. J., J. gen Microbiol., 72, 553 (1972).
284. Royston M. G., Process Biochem., 1, 215 (1966).
285. Rubin M„ Fed. Proc., 20 (Suppl 1), 149 (1961).
286. Sacks L. E., Pence J. W., J. gen. Microbiol., 19, 542 (1958).
287. Sanford К. K-, Earle IF. R., Evans V. J., Waltz H. K., Shannon J. E., J. nat. Cancer. Inst., 11, 773 (1951).
288. Sato Л1., Nakahara T., Yamada K,., Agric. Biol, Chem., 36, 2025 (1972).
289. Scott W. J., Aust. J. Biol. Sci.. 6. 549 (1953).
290. Scott W. J., Advances in Food Research., 7, 83 (1957).
312
Список литературы
291. Schuldiner S., Piersma В. J.t Warner T. B., J. electrochem. Soc. 113, 573 (1966).
292. Schultz J. S., Gaden E. L., Ind. Eng. Chem., 48, 2209 (1956).
293. Schultz J. S., Appl. Microbiol., 12, 305 (1964).
294. Schultz J. S., Gerhardt P., Bact. Rev., 33, 1 (1969).
295 Seeley H. U7., Vandemark P. J., J. Bact., 61, 27 (1951).
296. Shehata T. E., Marr A. G., J. Bact., 107, 210 (1971).
297. Shindela A., Bungay H. R., Krieg N. R., Culbert K., J. Bact., 89, 693 (1965).
298. Sillen L. G., Martell A. E., Stability Constants of Metal Ion Complexes, Supplement No. 1 (special Publication No. 25), Chemical Society, London, 1971.
299. Sistrom W. R., J. gen. Microbiol., 22, 778 (1960).
300. Slator A., J. chem. Soc., 119, 115 (1921).
301. Smith C. G., Johnson M. J., J. Bact., 68, 346 (1954).
302. Snell E. E., Ann. Rev. Microbiol., 3, 97 (1949).
303. Someya J., Murakami T., Tagaya N., Futai N., Sonoda Y., J. Ferm. Technol (Japan), 48, 291 (1970).
304. Standing C. N., Fredrickson A. G., Tsuchiya H. M., Appl. Microbiol., 23, 354 (1972).
305. Stanier R. Y., Doudoroff M., Adelberg E. A., General Microbiology 2nd edn., Macmillan, London, 1963.
306. Steinberg R. A., Nat. Acad. Sci.-Nat. Res. Council Publ., 514, 1 (1956).
307. Stickland L. H., J. gen. Microbiol., 5. 698 (1951).
308. Stouthamer A. H., Ant. v. Leeuwenhoek. 39, 545 (1973).
309. Stouthamer A. H., Bettenhausen C., Biochim. biophys. Acta, 301, 53 (1973).
310. Strange R. E., Dark F. A., J. gen. Microbiol., 39, 215 (1965).
311. Strange R. E„ Dark F. A., Ness A. G., J. gen. Microbiol., 25, 61 (1961).
312. Suzuki T., Tanaka K-, Okumura S., Production of Sugars and Amino Acids from Hydrocarbons and Petrochemicals by Microorganisms. Abstract of World Petroleum Congress, Moscow 1971, 1969.
313. Tajima K, Yoshizumi H., J. Ferment. Technol. (Japan), 50, 764 (1972).
314. Takahashi J., Uemura N., Ueda K., Agric. biol. Chem., 34, 32 (1970).
315. Tempest D. W., in: Microbiol Growth, 19th Symposium Soc. gen. Microbiol., p. 87, Cambridge University Press, Cambridge, 1969.
316. Tempest D. W., Herbert D„ J. gen. Microbiol., 39, 355 (1965).
317. Tempest D. W., Herbert D., Phipps P. J., in: Microbial Physiology and Continuous Culture, ed. Powell E. O. et al., p. 240, H. M. S. O., London, 1967.
318. Tempest D. W., Meers J. L., J. gen. Microbiol., 54, 319 (1968).
319. Thomas T. D., Batt R. D., J. gen. Microbiol., 50, 367 (1968).
320. Thurston C. F., Process Biochem., 7/8, 18 (1972).
321. Tjotta E., Acta Path, microbiol. scand., 68, 451 (1966).
322. Topiwala H. H., Hamer G., Biotech. Bioeng., 13, 919 (1971).
323. Topiwala H., Sinclair C. G„ Biotech. Bioeng., 13, 795 (1971).
324. Tovey M. G., Mathison G. E„ Pirt S. J., J. gen. Virol., 20, 29 (1973).
325. Townsley P. M., Neilands J. B., J. biol. Chem., 224, 695 (1957).
326. Trinci A. P. J., J. gen. Microbiol., 57, 11 (1969).
327. Trinci A. P. J., Arch. MikrobioL, 73, 353 (1970).
328. Trinci A. P. J., J. gen. Microbiol., 67, 325 (1971).
329. Trinci A. P. J., Arch. MikrobioL, 91, 113 (1973).
330. Trinci A. P. Righelato R. C., J. gen. Microbiol , 60, 239 (1970).
331. Truesdale G. A., Downing A. L., Lowden G. F., J. appl. Chem., 5, 53 (1955).
332. Tsao G. T., Biotech. Bioeng., 12, 51 (1970).
Дополнительная литература
313
333. Tsuchiya Н. М., Drake J. F., Jost J. L., Fredrickson A. G. J. Bact., 110, 1147 (1972).
334. Tyrell E. A., MacDonald К- E., Gerhardt P., J. Bact., 75, 1 (1958).
335. Uemura N., Takahashi J., Ueda K., J. Ferm. Technol. (Japan), 47, 220 (1969).
336. Ugolini F., Ugolini G., Chain E. B., Selected Scientific Papers, 1st Super. Sanit. II, Part 1, 1, 1959.
337. Ulrich K-, Moore G. E., Biotech. Bioeng., 7, 507 (1965).
338 Van Uden N., Arch. MikrobioL, 58, 155 (1967).
339. Wallace A., in: A Decade of Synthetic Chelating Agents in Inorganic Plant Nutrition, ed. Wallace A. Geigy Agricultural Chemicals, Ardsley, N. Y., 1962.
340. Ware G. C., J. gen. Microbiol., 5, 880 (1951).
341. Watanabe I., Okada S., J. cell. Biology, 32, 309 (1967).
342. Watson T. G., J. gen. MikrobioL, 64, 91 (1970).
343. Watson T. G., J. appl. Chem. Biotechnol., 22, 229 (1972).
344. Waymouth C., J. nat. Cancer Inst., 17, 305 (1956).
345. Wildiers E., Cellule, 18, 311 (1901).
346. Wilkinson T. G., Harrison D. E. F., J. appl. Bact., 36, 309 (1973).
347. Wilkinson J. F., Munro A. C. S., in: Microbial Physiology and Continuous Culture, ed. Powell E. O. et al., p. 173, H. M. S. O., London, 1967.
348. Willis A. T., Methods in Microbiology 3B, ed Norris J. R. and Ribbons D. W., p. 80, Academic Press, London, 1969.
349. Wilson D. O., Reisenauer H. M., J. Bact., 102, 729 (1970).
350. Wimpenny J. W. T., in: Microbial Growth 19th Symposium Soc. gen. Microbiol., p. 161, Cambridge University Press, Cambridge, 1969.
351. Wiseman G. M., Violago F. C., Roberts E., Penn I., Canad. J. Microbiol., 12,521 (1966).
352. Wodzinski R. J., Frazier W. C., J. Bact., 79, 572 (1960).
353. Wodzinski R. J., Frazier W. C., J. Bact., 81, 353 (1961).
354 Wright D. G., Calam С. T. Chem. and Ind.. 1274 (1968).
355. Yasuda S., Satoh K-, Ishii T., Furuya T. Fermentation Technology Today, p. 697, Society of Fermentation Technology, Japan, 1972.
356. Yeoh H. T., Bungay H. R., Krieg N. R. Canad. J. Microbiol., 14, 491 (1968).
357. Yoshida F., Yamane T., Nakamoto K., Biotech. Bioeng., 15, 257 (1973).
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА1
К главе I
Имшенецкий А. А., 50 лет общей микробиологии в СССР, .Микробиология, 36 (5), 766—784 (1967).
Работнова И. Л., Проблемы культивирования микроорганизмов в СССР за 60 лет, Микробиология, 46 (5), (1977).
Раутенштейн Я. И., Советская микробиология за 50 лет, Микробиология, 36 (5), 753—766 (1967).
Управляемый биосинтез. Сб. под ред. Н. Д. Иерусалимского и Б. Г. Коврова, изд-во «Наука», М„ (1966).
К главе 2
Николаев П. И., Соколов Д. П., Кинетические зависимости процессов культивирования микроорганизмов, Прикладная биохимия и микробиология, 4, 365—372 (1968).
1 Список дополнительной литературы составлен редактором русского перевода проф. И. Л. Работновой.
314
Дополнительная литература
Николаев П. И., Соколов Д. И., Определение коэффициентов уравнений, описывающих процессы культивирования микроорганизмов, Прикладная биохимия и микробиология, 5, 562—574 (1968).
Николаев П. И., Соколова Е. А., Аналитический метод определения коэффициентов кинетического уравнения процессов культивирования микроорганизмов, Прикладная биохимия и микробиология, 5, 523—535 (1969),
К главе 3
Практикум по микробиологии. Под ред. Н. С. Егорова, МГУ, М„ 1976.
Л главе 4
Печуркин Н. С., Терское И. А., Анализ кинетики роста и эволюции микробных популяций, изд-во «Наука», СО АН СССР, Новосибирск, 1975.
Работнова И. Л., Некоторые данные о закономерностях роста микроограниз-мов, Ж. общ. биол., 33, 539—554 (1972).
Работнова И. Л., Роль физико-химических условий (pH и гНг) в жизнедеятельности микроогранизмов. Изд-во АН СССР, М., 1957.
Иванова И. И., Шафоростова Л. Д., Работнова И. Л., Сотников Г. Г., Роль катаболических и анаболических процессов в связи с неравномерным ростом Вас. megaterium в экспоненциальной фазе роста, Микробиология, 41, 64—77 (1972).
Шафоростова Л. Д., Иванова И. И., Работнова И. Л., Особенности роста периодической культуры Вас. megaterium. Микробиология. 40, 3, 397— 401 (1971).
Шафоростова Л. Д., Иванова И. И., Работнова И. Л., Изменения химического состава клеток в связи с неравномерностью роста в экспоненциальной фазе периодической культуры Вас. megaterium. ДАН АН СССР, сер. биол., 200, 1449—1451 (1971).
Шафоростова Л. Д., Стейскалова Э., Павласова Э., Бегал В., Нечинова С., Неравномерный рост Е. coli при периодическом культивировании, Микробиология, 44, 780—785 (1975).
Шульговская Е. М., Иванова И. И., Сотников Г. Г., Exponential growth phase of Pseudomonas methanolica batch cultures, Zeitschrift fur Allg. Mikrobiologie, 13, 6, 523—528 (1973).
К главе 5
Динамика микробных популяций в открытых системах. Сб. под ред. Печур-кина Н. С., АН СССР СО, Институт Физики им. Л. В. Киренского, Красноярск (1975).
Иерусалимский Н. Д., Теория и практика непрерывного культивирования микроорганизмов, Микробиология, 30, 818—824, (1961).
Иерусалимский Н. Д., О принципах непрерывного культивирования бактерий. В кн. «Биохимия микробов», изд-во «Мир», М., 1964, стр. 22—37.
Межиня Г. Р., Кристапсон М. М., Савенков В. В.. Виестур У. Э , Теория и практика непрерывного культивирования микроогранизмов. ОНТИТЭИ-микробиопром, М., 1974.
Печуркин Н. С., Терское И. А., Анализ кинетики роста и эволюции микробных популяций, изд-во «Наука», СО АН СССР, Новосибирск. 1975.
Теория и практика непрерывного культивирования микроорганизмов, Микробиология, 4, ВИНИТИ, Итоги науки и техники, М., (1975).
Управляемое и непрерывное культивирование микроорганизмов, Микробиология, 4, ВИНИТИ, Итоги науки и техники, М., (1976).
Физиология и биохимия микроорганизмов. Минвузовский сборник, вып. 2, Сер. биол., Горький (1974).
Дополнительная литература
315
К главе 6
Печуркин Н. С., Терское И. А., В кн. Анализ кинетики роста и эволюции микробных популяций, гл. 4, изд-во «Наука», СО АН СССР, Новосибирск, 1975.
К главе 8
Гельман Н. С., Лукоянова М. А., Островский Д. Н., Мембраны бактерий и дыхательная цепь, изд-во «Наука», М., 1972.
Гельман Н. С., Лукоянова М. А., Островский Д. Н., Дыхательный аппарат бактерий, изд-во «Наука», М., 1966.
Скулачев В. П„ Аккумуляция энергии в клетке, изд-во «Наука», М., 1969.
К главе 9
Балакирева Л. М., Кантере В. Л1., Работнова И. Л., Определение окислительного потенциала в культуре С. utilis, Микробиология, 30, 740—745 (1971).
Балакирева Л. М., Кантере В. М., Работнова И. Л., The redox potential in microbiological media, Biotechnol. and Bioeng. Symp., 4, 769—780 (1974).
Гречушкина H. H., Никитина К. А., Работнова И. Л., Факторы, определяющие снижение окислительно-восстановительного потенциала в культурах споровых аэробных бактерий, Микробиология, 34, 200—203 (1965).
Кантере В. М., Redox potential measurements in microbiological media and some applications, Biological aspects of electrochemistry experientia supp!., 18, 355—366 (1971).
Работнова И. Л., Балицкая Р. М., Белозерская И. А., Дислер Е. Н., Злочев-ская И. В., Прижизненные выделения редуцирующих веществ в культурах микроорганизмов, Микробиология, 30, 3—8 (1961).
Работнова И. Л., Роль физико-химических условий (pH и гН2) в жизнедеятельности микроорганизмов, Изд-во АН СССР, М., 1957.
Работнова И. Л., Плакунова В. Г., Палеева Л1. А., Шендерова Л. В., О причинах снижения окислительно-восстановительного потенциала в культурах микроорганизмов, Микробиология, 32, 954—960 (1963).
К главе 10
Вершков Д. С., Сидоров Е. А., Нестеров Б. Ф., Приборы для культивирования микроорганизмов, в сб. научных работ «Биофизика микробов и биоинженерия», 101—108, Л. (1976).
Вершков Д. С., Гительзон И. И., Гладченко А. М., Ковров Б. Г., Нестеров Б. Ф., Новиков В. Н., Печуркин Н. С., Терское И. А., Шевченко В. Г., в кн. «Биология и культивирование микроорганизмов», Красноярск. 1969, стр. 123—127.
Виестур У. Э., Аэрация и перемешивание в процессах культивирования микроорганизмов, М., 1972, 67
Виестур У. Э., Долгицер Н. С., Способы культивирования микроорганизмов и аппараты., М., 1972, 81.
Гительзон И. И., Терское И. А., Ковров Б. Г., Нестеров Б. Ф., Печуркин Н.С., Вершков Д. С., Гладченко А. М., Шевченко В. Т., в кн. «Инженерные проблемы микробиологического синтеза», изд-во ВНИИА, М., 1969, стр. 101 —105.
Нестеров Б. Ф., в кн. «Непрерывное и периодическое культивирование микроорганизмов», Красноярск, 1972, стр. 207—213.
Николаев П. И., Аппаратурное оформление процессов микробиологического синтеза, журнал Всесоюзного химического общества им. Д. И. Менделеева, 17 (5), 564—573 (1972).
316
Дополнительная литература
Работнова И. Л., Перевезенцев В. И., Лирова С. А., Ферментационная установка Института микробиологии АН СССР для непрерывного культивирования микроогранизмов, Микробиология, 45, в. 4, 729—732 (1976).
К главе 11
Лнсенкова Л. Л., Хмель И. А., Влияние условий культивирования на содержание цитохромов в клетках. Микробиология, 34, 905—909 (1965).
Хмель И. А., Габинская К. И., Иерусалимский И. Д.. Рост и азотфиксация Azotobacter vinelandii в условиях различной аэрации, Микробиология, 34, 689—694 (1965).
Хмель И. А., Гаванская К. И., Влияние аэрации на рост Azotobacter vinelandii при использовании различных соединений углерода, Микробиология, 34, 763—767 (1965).
Хмель И. 4., Иерусалимский И. Д., Влияние аэрации на рост Azotobacter vinelandii в проточной культуре, Микробиология, 36, 632—639 (1967).
Хмель И. А., Коршунов И. С., Влияние аэрации на жизнедеятельность микроорганизмов, Прикладн. биохимия и микробиол., 2, 714—724 (1966).
Шкидченко А. И., Влияние концентрации растворенного кислорода на рост и потребление субстрата Torulopsis latvica, Микробиология, 42, 816— 821 (1973).
К главе 12
Авакян 3. А., Токсичность комплексов меди с аминокислотами для С. utilis. Сб. Рефераты докладов научной конференции молодых ученых МГУ, изд-во МГУ, стр. 131 (1968).
Авакян 3. А., Сравнительная токсичность свободных ионов меди и комплексов меди с аминокислотами для С. utilis. Микробиология, 40 (3), 417—423 (1971).
Авакян 3. А., Работнова И. Л., Сравнительная токсичность свободных ионов меди и комплексов меди с органическими кислотами для С. utilis, Микробиология, 40 (2), 305—311 (1971).
Злочевская И. В., Токсическое действие комплексного соединения свинца с DL-цистеином на Asp. niger, Микробиология, 37, 848—855 (1968).
Иерусалимский И. Д., Азотное и витаминное питание микробов, Изд-во АН СССР, М. — Л., 1949.
Иерусалимский И. Д., Основы физиологии микробов, Изд-во АН СССР, М., 1963.
Кулаев И. С., Биохимия высокомолекулярных полнфосфатов, Изд-во МГУ, М., 1975.
К главе 13
Александров В. Я., Клетки, макромолекулы и температура, изд-во «Наука», Л., 1975.
Андреева Е. А., Позмогова И. И., Ховрычев М. П., Шульговская Е. М. Влияние субмаксимальной температуры на свойства хемостатной культуры Candida utilis, Микробиология. 46 (1), 29—32 (1977).
Залашко М. В., Андреевская В. Д., Образцова И. В., Влияние температуры культивирования на жирнокислотный состав липидов дрожжей, выращиваемых на гидролизатах торфа, Прикладная биохим. и микробиол., 8, 891—895 (1972).
Квасников Е. И., Исакова Д. М., Буракова А. А., Скофенко А. А., Тодоснй-чук С. Р., Качан А. Ф., Влияние температуры на синтез белка и отдельных аминокислот термотолерантными дрожжами Candida tropicalis на средах с углеводородами. Микробиология, 45 (4), 636—639 (1976).
Логинова Л. Г., Головачева Р. С., Головина И. Г., Егорова Л. А., Позмогова И. И., Хохлова Ю. М., Цаплина И. А., Современные представления о термофилии микроорганизмов, изд-во «Наука», М.. 1973.
Дополнительная литература
317
Логинова Л. Г., Позмогова И. Н., Серегина Л. М., Выделение и изучение некоторых свойств дрожжей, растущих при 40—45°, Микробиология, 35 (6), 1024—1027 (1966).
Лях С. П., Адаптация микроорганизмов к низким температурам, изд-во «Наука», М„ 1976.
Позмогова И. Н„ Воздействие температур выше оптимальных на бактерии и дрожжи, Изв. АН СССР, сер. биол., в. 2 (1978).
Позмогова И. Н., Медведева Г. А., Влияние повышенной температуры на цикл развития дрожжей Candida utilis, Микробиология, 4, 47 (3), (1978).
Шульговская Е. М, Позмогова И. Н., Ховрычев М. П., Ибрагимова С. И., Изменение содержания АТФ в клетках хемостатной культуры дрожжей под воздействием субмаксимальных температур, Микробиология, 46 (2), 223—226 (1977).
К главе 14
Андреева Е. А., Шульговская Е. М., Работнова И. Л., Торможение роста Candida utilis Н+ и ОН' ионами, Микробиология, 39, 269—273 (1970).
Андреева Е. А., Лирова С. А., Перевезенцев В. П., Влияние величины pH на свойства хемостатной культуры Candida utilis, Прикладная биохимия и микробиология, 11, 317—321 (1975).
Ибрагимова С. И., Неронова И. М., Работнова И. Л., Кинетика торможения скорости роста Propionibacterium shermanii водородным и гидроксильным ионами, Микробиология, 38, 933—937 (1969).
Ибрагимова С. И., Неронова Н. М., Работнова И. Л., Влияние ионов водорода на некоторые свойства Propionibacterium shermanii, Микробиология, 40, 833—837 (1971).
Иванова И. И., Шафоростова Л. Д., Сахарова 3. Д., Hilliger М., Physiolo-gischer Zustand von Bacillus megaterium im Chemostaten unter alkali-schen Bedingungen, Zeitschrift fur Allg. Mikrob., 16, 33—37 (1976).
Иванова И. И., Шульговская Е. М., Работнова И. Л., Влияние ионов Н* и ОН' на физиолого-биохимические свойства культуры Pseudomonas me-thanolica, Микробиология, 44, 839—843 (1975).
Лирова С. А., Андреева Е. А., Влияние экстремальных значений pH среды на физиологические свойства дрожжей Candida utilis, Микробиология, 40, 659—665 (1971).
Лирова С. А., Андреева Е. А., Таптыкова С. Д., Влияние кислого значения pH среды на физиологические особенности Candida utilis в непрерывной культуре, Микробиология, 42, 661—666 (1973).
Лирова С. А., Юнгникель Ф., Влияние различных значений pH среды на некоторые фосфорные соединеиня у Candida utilis, Микробиология, 42, 940—941 (1973).
Поглазова М. Н., Сахарова 3. В., Влияние ионов водорода иа морфологию и ультраструктуру Bacillus megaterium, Микробиология, 44, 645—650 (1975).
Работнова И. Л., Роль физико-химических условий (pH и гН2) в жизнедеятельности микроорганизмов, М., 1957.
Сахарова 3. В., Торможение роста Вас. megaterium Н+ и ОН' ионами, Микробиология, 39, 978—980 (1970).
Сахарова 3. В., Ибрагимова С. И., Работнова И. Л., Влияние ионов водорода на Вас. megaterium, размножающуюся в хемостате, Микробиология, 42, 1032—1038 (1973).
Сахарова 3. В., Ибрагимова С. И., Влияние низкого значения pH на химический состав хемостатной культуры Вас. megaterium, Микробиология, 44, 91—96 (1975).
Сахарова 3. В., Шафоростова Л. Д., Hilliger М., Перевезенцев В. П.. Wach-stum von Bacillus megaterium im Chemostaten unter alkalischen Bedingungen, Zeitschrift fur Allg. Microb., 16, 49—55 (1976).
318 Дополнительная литература
Сахарова 3. В., Работнова И. Л., Физиолого-биохимические свойства хемостатной культуры Вас. megaterium при различных значениях pH, Микробиология, 46, 15—21 (1977).
главе 16
Ибрагимова С. И., Сахарова 3. В., Ингибирующее действие пропионата натрия на Propionibacterium thermanii, Микробиология, 43, 18—23 (1974).
Иерусалимский И. Д., Неронова И. М., Количественная зависимость между концентрацией продуктов обмена и скоростью роста микроорганизмов, ДАН СССР, 161, 1437—1440 (1965).
Лозинов А. Б., Финогенова Г. В., Глазунова Л. М., Илларионова В. И., Лимитирование роста культуры Candida lipolytica и сверхсинтез некоторых метаболитов, Микробиология, 43 (5), 786—790 (1974).
Неронова Н. М., Ибрагимова С. И., Иерусалимский Н. Д., Влияние концентрации пропионата на удельную скорость роста Propionibacterium sher-manii, Микробиология, 36, 404—409 (1967).
Шапошников В. И., Основные физико-химические закономерности физиологии обмена веществ микроорганизмов, Изд-во АН СССР, М., 1968.
Шапошников В. Н., Физиология обмена веществ микроорганизмов в связи с эволюцией функций, Изд-во АН СССР, М., 1960.
Эгамбердиев Н. Б., Иерусалимский Н. Д., Влияние концентрации этилового спирта на скорость роста Saccharomyces vini, Микробиология, 37, 686— 690 (1968).
К главе 17
Баснакьян И. А., Волкова Н. В., Мельникова В. А., Дубинина Г. П., Биологический анализ и математическое описание жизнедеятельности Salmonella typhi в различных условиях непрерывного культивирования. В кн. Физико-химические исследования патогенных энтеробактерий в процессе культивирования, изд-во Ивановского облисполкома, Иваново, 1974, стр. 7—20.
Баснакьян И. А., Дубинина Г. П., Грунтович В. С., Ильницкая Е. А., Ахундова К- А., Власенко А. П., Запорожцев Л. Н., Шеманова Г. Ф., Волкова Н. В., Влияиние токсина Clostridium perfringens, выделяемого в культуральную среду, на жизнедеятельность микроорганизмов в процессе культивирования. В сб. Токсины и анатоксины, изд-во МНИИВС им. Мечникова, в печати.
Голубович В. Н., Работнова И. Л., Кинетика подавления роста Candida utilis ионами серебра. Микробиология, 43, 1115—1117 (1974).
Голубович В. И., Ховрычев М. П., Работнова И. Л., Связывание ионов серебра клетками Candida utilis, Микробиология, 45, 119—121 (1976).
Лимитирование и ингибирование процессов роста и микробиологического синтеза, Изд-во АН СССР, Пущино, 1976.
Петрова Т. А., Ховрычев М. П., Голубович В. Н., Работнова И. Л., Математическая модель ингибирования роста Candida utilis ионами тяжелых металлов, Микробиология, 45, 224—228 (1976).
Ховрычев М. П„ Работнова И. Л., Кинетика подавления роста Candida utilis ионами меди, Микробиология, 41, 672—674 (1972).
Ховрычев М. П., Федорова Т. А., Работнова И. Л., О влиянии ионов меди на рост С. utilis в непрерывной культуре, Микробиология, 43, 99—102 (1974).
Ховрычев М. П., Иванова И. И., Таптыкова С. Д.. Химический состав и физиологические свойства С. utilis при угнетении роста ионами меди, Микробиология, 43, 479—483 (1974),
Дополнительная литература
319
Ховрычев М. П., Работнова И. Л., Изучение физиологического состояния хемостатной культуры С. utilis при лимитации глицерином и ингибировании медью, Сб, научн. трудов «Биофизика микробов и биоинженерия», Л„ 12—19 (1976).
Ховрычев М. П., Strunk С., Schuhmann Е., Лирова С. А.. Работнова Л. И., EinfluB der Cu2+-Ionen auf den morfologischen, cytologischen und phy-siologischen Zustand von Candida utilis — Zellen bei kontinuirlicher Kultivierung, Zeit. fiir Allg. Mikrob.. 17, 29—45 (1977).
К главе 18
Бехтерева M. И,, Марченко И. В., Галанина Л. А., Миллер Ю. М., О потреблении кислорода суспензиями спор Bacillus anthracoides, Микробиология, 45 (4), 738—739 (1976).
Дуда В. И., Добрица С. В., Корреляция нуклеотидного состава ДНК с физиологическими и цитологическими особенностями спорообразующих анаэробных бактерий. Микробиология, 44 (5), 893—898 (1975).
Крайнова О. А., Бехтерева М. Н., Ферменты катаболизма глюкозы и НАД—Н2-оксидаза в экстрактах спор Bacillus anthracoides. Микробиология, 43 (6), 1111—1112 (1974).
Мейсель М. Н., Функциональная морфология дрожжевых микроорганизмов, Изд-во АН СССР, М. — Л., 1950.
К главе 19
Бекер М. Е., Дамберга Б. Э., Упит А. А., Блумберг Я. Э., Краузе И. Я., Вентиня Э. Ю., Бривкалне И. К-, Попова М. В., Некоторые особенности лаг-фазы развития дрожжей Saccharomyces cerevisiae после обезвоживания, Микробиология. 43 (6), 1028—1033 (1974).
Бекер М. Е., Зоммер 3. К-, Варна Р. Я-, Марауска М. К-, Клинцаре А. А., Потери некоторых клеточных компонентов эпифитиых бактерий Pseudobacterium lacticum при обезвоживании и последующей регидратации, Микробиология, 42 (6), 1044—1048 (1973).
Лаптева Е. А., Агре Н. С., Калакуцкий Л. В.. Восстановление жизнеспособности артроспора Actinomyces streptomycin!, подвергнутых кипячению, Микробиология. 45 ( 3), 559—560 (1976).
Пожарицкая Л. М., Кольтовер В. К., Агре И. С. Калакуцкий Л. В., Характеристика активации спор актиномицета Thermoactinomyces vulgaris с помощью спиновой метки, Микробиология, 40 (6), 1110—1111 (1971).
Работнова И. Л., Торопова Е. Г., Бабаева М. Ю., Потребности анаэробных бактерий в окислительно-восстановительных условиях среды. Микробиология, 24, 525—531 (1955).
Работнова И. Л., Прянишникова И. А., Лаг-фаза и окислительно-восстановительный потенциал в культурах анаэробов, Микробиология, 24, 671 — 676 (1955).
Работнова И. Л., Минеева Л. А., Изучение лаг-фазы у микроорганизмов. I. Влияние внешних условий на длительность лаг-фазы у Т. utilis и Ps. fluorescens, Микробиология, 28, 352—357 (1959).
Работнова И. Л., Зайцева Г. И., Минеева Л. А., Изучение лаг-фазы у микроорганизмов. II. Изменения в клетках Г. utilis и Ps. fluorescens в течение лаг-фазы, Микробиология, 28, 481—487 (1959).
К главе 20
Динамика микробных популяций в открытых системах. Под ред. Печурки-на Н. С.. Красноярск, 1975.
Намсараев Б. Б., Заварзин Г. А., Трофические связи в культуре, окисляющей метан, Микробиология, 41 (6), 999—1006 (1972).
320
Дополнительная литература
Печуркин Н. С., О возможности применения автоселекцпи на протоке для отбора мутантов с измененными биохимическими свойствами. В кн. «Управляемый биосинтез и биофизика популяции», Красноярск, 1969, стр. 184.
Печуркин И. С., Терское И. А., Некоторые вопросы динамики микробных популяций, растущих на протоке В кн. «Управляемый биосинтез и биофизика популяций». Красноярск, 1969, стр. 171 —174.
Печуркин Н. С., Терское И. А., Некоторые вопросы динамики развития микробных популяций, растущих на протоке. В кн. «Периодическое и непрерывное культивирование микроорганизмов», Красноярск, 1972, стр. 5—11.
Печуркин И. С., Терское И. А., Автоселекционные процессы в непрерывной культуре микроорганизмов, М., 1973.
Печуркин И. С., Терское И. А., В кн. Анализ кинетики роста и эволюции микробных популяций, Изд-во «Наука», СО АН СССР, Новосибирск, 1975, гл. 9, 10.
К главе 22
Габинская К. И., Влияние состава питательной среды на характер роста Tio-gemella Hyalospora, Микробиология, 45, 322—325 (1976).
К главе 24
Баснакьян И. А., Бирюков В. В., Крылов Ю. М., Математическое описание основных кинетических закономерностей процесса культивирования микроорганизмов, Микробиология, 5, ВИНИТИ. Итоги науки и техники М„ (1976).
Иерусалимский Н. Д., Степанова Н. В., Чернавский Д. С., Математическое исследование колебательных режимов при непрерывном культивировании микроорганизмов, Биофизика. 13 (6), 313—319 (1968).
Лимитирование и ингибирование процессов роста и микрообиологического синтеза. Сб. АН СССР. Научн. конф. биол. иссл., Пущино (1976).
Математическая теория биологических процессов. Тезисы докладов I конф., Калининград (1976).
Математическое моделирование микробиологических процессов, Пущино (1975).
Печуркин И. С., Терское И. А., Анализ кинетики роста и эволюция микробных популяций, изд-во «Наука» СО АН СССР, Новосибирск, 1975.
Применение математических методов в микробиологии, Пущино (1975).
Романовский Ю. М., Степанова Н. В., Чернавский Д. С., Что такое математическая биофизика, изд-во «Просвещение», М., 1971.
Романовский Ю. М„ Степанова Н. В., Чернавский Д. С., Математическое моделирование в биофизике, изд-во «Наука», М.. 1975.
Управление биосинтезом микроорганизмов — тезисы III Всесоюзного совещания по управлению биосинтезом и биофизике популяций, Красноярск (1973).
Управляемый биосинтез и биофизика популяций, Красноярск (1969).
Чернавский Д. С., Иерусалимский Н. Д., К вопросу об определяющем звене в системе ферментативных реакций, Изв. АН СССР, сер. биол., 5, 665— 672 (1965).
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
Абсорбция, измерение 30
Автолиз 80, 224
Автосинтез, модель 205, 257, 286— 293, 302
— — изменение окружающей среды 289—291
— — теорема сети 292
Автотроф 81, 94, 148
Аденозинтрифосфат (АТФ) 83, 138 — выход биомассы (УАт ) 93, 94, 104
Азот, источники 147, 202
— лимитация роста 149
— фиксация 88
Азотобактер 88—91
Активатор метаболизма 206, 220, 239, 300
---- продукт 239
Активность воды 179, 188, 299
— — изменение 180, 186
---- измерение 182
----ряды Хофмайстера 186
Активный ил, процесс 42; см. также
Очистка сточных вод
Алканы; см. Углеводороды
Аминокислоты, содержание в клетке 147
Анаэробное выращивание 140 Анаэробный рост 140—143
Анаэробы факультативные 136, 139
Антигены 172, 173
Ацетат 95
Аэрация 117—131; см. также Кислород
— вихревая 119
— в колбах на качалках 12, 117, 127—130
— — пробирках на качалках 130
— измерение; см. Кислород, определение концентрации
— с отбойниками 119, 127
Аэробы 139
Бактерии, рост; см. Колонии, пост бактерий
Биомасса, влияние на аэрации 125, 129
— возврат 40, 41, 58, 62—67, 72, 198
— время удвоения 15
— — — кажущееся 76
— — обратная величина 16
— выход 16, 17, 22, 23, 30, 54, 82, 146, 150; см. также Экономический коэффициент
— концентрация 64, 260
--- предельная 24
— максимум 18, 24
— образование 269
— определение 26—34
— пленка 263—271
— — теоретическая 265, 266, 301
— плотность 24, 25
— скорость образования 49—51
— терминология 26
Био-факторы (биос) 12, 144
Бораты 156
Брожение 82
Бутиленгликоль, образование 136
Вегетативная клетка 75
Винклера метод 106
Витамины 12, 144, 149—151
Воздух, поток («эрлифт» — «воздушный лифт») 119
— введение 122
Водородные ионы, концентрация
174—178; см. также pH
Водордный акцептор; см. Электроны, акцепторы
— электрод 107
Время замещения 39, 44
— удвоения; см. Биомасса
— удержания 39, 40
322
Предметный указатель
Вторичные метаболиты 190
Вязкость 121, 125
Выход продукта 191, 198, 211, 213
Газ, абсорбция; см. Кислород, абсорбция, транспорт
— активность 106
— диффузия через вату 129
— поглощение 119
— транспорт; см. Кислород, транспорт
Р-Галактозидаза 170, 225
Генри закон и константа (Н) 105
— — для двуокиси углерода 96
— — для кислорода 105
Гетеротроф 81
Глюкооксидаза 113
Гормоны 144, 151
Грибы, рост; см. Колонии, рост грибов
Давление кислорода; см. Кислород, давление
Двуокись углерода 95—97
— — влияние на рост 97, 98, 285
Двухфазные культуры 261
Диализ, использование для культивирования 258—262
Диауксия 39
Дифференциация в споры 75, 226
Диффузионная капсула 261, 262
Дыхание биологической пленки 264 - скорость 103, 104, 133—136, 186
Дыхательные ферменты 136, 298
Жизнеспособность 77, 223, 224
— индекс 77—80
Закон линейного роста 278, 279, 282
— площадей 279
— кубического корня 272
Закрытая система 35
Запасные продукты (резервы) 27, 95
Инволюционные формы 222
Ингибирование 203—220, 222, 239, 300
— влияние на экономический коэффициент 216
— конкурентное 148, 205, 206, 211 — 213
— микроэлементами 155
— неконкурентное 148, 205, 208—211, 213—216
Ингибирование продуктом 24, 67, 211—216, 239, 243, 260, 261
— скорости роста 281, 283
— спиртом 211
— субстратом 61, 67, 217—220
— температурой 281, 283
Ионозин 98
Инокулят, влияние 141, 145, 146, 232, 238
Инсулин 151, 221
Инфекция мочевого тракта 249
Иод, потребности в питании; см. Питание, потребности
Ионная сила 89, 179, 185, 186
История культивирования микроорганизмов 11
Калий 152, 185
Катаболитная репрессия 202, 249
Каталаза 138
Качалка для пробирок 130
Качалка для колб 12, 117, 127—130
Кетоглутарат 95
Кислород, абсорбция 112
— активность 106
— влияние на жизнеспособность 137
— — — метаболизм 136—138
— давление и напряжение 105
— — повышенное 135
— элементы 138
— ингибирующее действие 138—140;
см. также Кислород, токсичность
— константа насыщения 134
— концентрация 105, 106
— — критическая 134, 137
Кислород, лимитирование роста и метаболизма 116, 132, 270, 281
— образование биомассы 82, 84
— определение концентрации 106, 107
— потребность 103—105
— растворимость 105, 106
— скорость растворения 112—114
— снабжение 297, 298, см. также Кислород, транспорт
— токсичность 281
— транспорт; см. также Аэрация, методы; К г. а 110—112
— — газ — жидкость НО
— — жидкость—биомасса 112
— — потребности в электроэнергии 125
— — сопротивление жидкой пленки
111 — 113
— — теория двойной пленки 111
— — — постоянной жидкой пленки НО
Предметный указатель
323
Кислород, электрод 102, 106, 107
— экономический коэффициент 82, 83
Клетки, подсчет 32, 33
— микроорганизмов, состав 172, 177, 178, 185
— отмирание; см. Отмирание клеток — покоящиеся 102, 135, 186, 223 — фракции 77—79
Клеточные стенки 147, 177, 185
Кобальт 156
Колонии, рост 276—285, 301, 302
— — бактерий 278—281
---- влияние кислорода 281
— — — концентрации субстрата 280, 284
--------удельной скорости роста 281
----— толщины агара 279
Колонии, рост грибов 282—285
— — закон линейного роста 278, 279, 282
----— площадей 279
---- изменение периметра 281
---- модель 276—278
---- пороговая концентрация субстрата 280, 281
Комменсализм 237
Конкурентное ингибирование; см. Ингибирование
Конкуренция между видами; см. Смешанные культуры
Контакт жидкости с газом, время
118, 119
Контактное угнетение роста 24
Константа насыщения Ks 19—22,36,82
---- — измерение 21
---- — полимеров 23
Коэффициент активности газа 106
Критическая скорость разбавления; см. Скорость разбавления
Культивирование, наука 8, 11—13, 43, 302
Культура (ы) диализная 258—262, 296
— однослойная; см. Однослойная культура
— периодическая 14, 35—39, 50, 75, 78, 92, 115, 193, 206, 208, 211, 236, 286, 295
— — добавление питания 249—258, 295
— — отъемно-доливное питание 254, 296
— — математическая модель 37
— смешанные; см. Смешанные культуру
— тубулярная 39—43, 72. 296
— - турбидостатная; см. Турбидостат
— хемостатная; см. Хемостат
Коэффициент мощности 125
— KLa 96, 110—116
— — влияние различных факторов 124, 125
— — значение 111, 112, 114, 120
— — измерение 122—116
Ks; см. Константа насыщения
Лаг-период (лаг-фаза) 23, 35, 36, 71, 230—235, 300
— влияние посевного материала 232
— — температуры 233
— в хемостатной культуре 71
— истинный и кажущийся 230, 231
— метаболические процессы 234
— определение 23
— поздний и ранний 233
— причины 231
Лизис 27
Лимитация роста субстратом 56, 60, 61, 166, 273, 276, 295
— — — в смешанных культурах 237—243
Логарифмический рост; см. Экспоненциальный рост
Магний 153, 238
Манометрический метод 102
Марганец, питание; см. Питание, потребность
Медь 156
Метаболизм 223
— нерастущих клеток 186, 223
— регуляция 294
Метаболический коэффициент (q) 18, 30
--- для источника энергии 86
---— кислорода; см. Дыхание, скорость
Метилцеллюлоза 164
Метиленовая синь 108
Мешалка, схема 121
Микроаэрофилы 139
Микробиологические методы анализа 146, 147
Микробы 11
Микроэлементы 144, 154—157
— удаление из среды 157
Минимальная скорость роста; см.
Удельная скорость роста
Михаэлиса — Ментен константа 19
Молибден 157
Моно отношение 19, 284
— — отклонение от него 23
Морфология 177
Мутации, скорость 246, 247
Мутность 30
— измерение 60
324
Предметный указатель
Натрий 185
— потребность в нем 152
Недостаток питания 202; см. также Лимитация, Рост
Нефелометрия 30
Никель 157
Нитраты 138
Оборот белка 89
— биомассы 87
— веществ клеточной стенки 90
— РНК 90
Обрастание; см. Рост на стенках сосуда
Однослойная культура (монослой)
263
Окисление сульфита 112, 113
Окислительно-восстановительный потенциал (Еь) 102, 107—НО
— — для роста анаэробов 141
— — индикаторы 108
Оксидаза 103, 104, 136
Окраска по Граму 223
— прижизненная 34
Оксигеназа 103, 104
Оптическая плотность 31, 32
Осмотический коэффициент 180
Осмотическое давление и активность воды 180, 181, 186—188
— набухание 31
Осцилляции (колебания) роста 153,
245
Отбор организмов 61
Открытая система 35, 39
Отмирание клеток 24, 75—80
---скорость 75, 170
--- ускоряемое субстратом 223
Отношение Р/О 94, 104
Очистка сточных вод 42, 246
Паразитизм 237
Параметры роста; см. Рост, параметры
Пастера эффект 132
Пена, влияние 124, 126
— гашение 124, 125
— образование 124
Пенициллин 117, 172, 192, 193, 200, 202, 257
Пеногасители 124, 126
Пептиды 148
Перемешивание 54, 118, 297; см. также Скорость перемешивания
— вибрацией 118
Перенос кислорода; см. Кислород, транспорт
Переходное состояние 46. 55, 56, 195
198, 251, 257, 294—296
Периодическая культура; см. Культура периодическая
Пивоварение 67
Пирогаллол 112
Пируват 95
Питание 144—166, 298
— влияние температуры 171
— потребность в витаминах и гормонах 149
-------различных элементах 153— 157, 162, 165
— смешанные источники; см. Углерод, источники
Пленка биомассы; см. Биомасса
Поверхностно-активные вещества 100
101, 124
Подсчет клеток; см. Клетки, подсчет
Показатель преломления 31
Полипропиленгликоль 126
Популяция, скорость роста 15; см. также Удельная скорость роста
Потребности микроорганизмов в элементах питания; см. Питание, потребности
— — — энергии; см. Кислород, транспорт
Продукты, классификация 190
— обмена 299
-----влияние внешних факторов на 201—204
— — в культуре с добавлением питания 252—254
-----временное образование 195
-----выход; см. Выход продукта — — и температура 172
Продукты обмена, концентрирование диализом 259
-----не связанные с ростом 192 211 212, 214
— — образование 193—204, 241, 252
— — — в периодической культуре 193—195
----- — — в хемостатной культуре 195-200
----разложение 193
-----связанные с ростом 191, 212 213
Простейшие 11, 243
Психрофилы 170
Пуассона распределение 32
pH; см. также Водородные ионы 60, 299
— влияние на культуру 89, 174—178, 293
----- — хелатирование металлов 158
Предметный указатель
325
Пуассона градиен 174
— регулирование 174, 175
P/О отношение; см Отношение Р/О
Размножение, степень; см. Степень размножения
Рибонуклеиновая кислота (РНК) 152,
172, 286, 293
Рост, влияние различных факторов 144, 145, 171, 175, 297, 300
— глубинный колониями (шариками) 271-273
— грибной гифы 282—284
— задержка 230—235
— колонии; см. Колонии, рост
— кривая 36
— лаг-период; см. Лаг-период
— лимитируемый субстратом 24, 47, 71, 295; см. также Лимитация
— медленный 222—229
— на стенках сосудов (обрастание) 54, 55
— оценка по одной точке 37
— параметры 14, 295
— скорость; см. Удельная скорость роста
— угнетение; см. Контактное угнетение
— фазы 35, 36
---отмирание 36; см. также Отмирание клеток
— экспоненциальный 15, 296
Селекция; см. Отбор организмов
Селен 156, 157
Сера, питание 153
Симбиоз 237
Силикон 127
Синхронное деление клеток 39
Скорость дыхания; см. Дыхание, скорость
— перемешивания 121; см. также Перемешивание
— — разбавления 41, 47
---критическая 41, 48, 64, 66, 69,
72
— — общая 68, 69, 72, 73
Скорость роста нулевая 72, 222—229;
см. также Удельная скорость роста Смешанные культуры 236—246, 300 — — конкуренция за субстрат 237 — — — контролируемая 238
--- лимитирование продуктами
241-243
Смешанные культуры неконкурентный рост 241 ---- «точка пересечения» 238 Спорообразование, кинетика 226—229 Споры 223, 226, 231
Среда(ы) богатая (естественная) 144 — минимальная 33, 145, 162, 231, 232 — обогащение 163, 164
— определенного состава (синтетическая) 11, 12, 144, 145, 163, 298
— стабильность 164
Сродство к субстрату 19
Стационарная фаза 36, 222—226
Стационарное состояние 45, 47, 72 — — саморегулирующееся 46, 47 Стенка клетки; см. Клеточные стенки Степень размножения 15 Стимуляторы 203
Стресс; см. Устойчивость к стрессу Сульфонамид 209, 210
Тейхоевая кислота 152, 185
Тейхуроновая кислота 152, 185
Температура, влияние 89, 167—173 233, 293, 299
Температурные характеристики; см. Энергия активации
Термофилы 170
Тефлон 55
Токсичность; см. Ингибирование
Турбидостат 58—61, 296 Турбулентность 120
Угнетение роста; см. Контактное угнетение роста
Удельная скорость метаболизма; см. Метаболический коэффициент
— — поддержания см. Энергия поддержания
----роста 14, 46, 288, 291, 300
— — — влияние значений pH 175
---------- на метаболизм 94, 95 — —-------энергии поддержания 90,
91
— — — внутриклеточный контроль 61
—-------кажущаяся 87, 231
— — — колебания (осцилляции) 153, 257
— — — максимальная 49, 71, 72, 152 — — — минимальная 225, 226 --------нулевая 72, 222—229. 295 — — — общая 87 — — — поддержание 87
— — — увеличение и уменьшение 71, 72, 257
Предметный указатель
326
Углеводороды 32, 98—101, 124, 256 — диспергирование 99—101 — потребность в кислороде 100 — растворимость 98, 99 — эмульгирование 100 Углерода двуокись 60, 95 297 -----действие давления 97, 98, 285 — — константа насыщения 97 -----равновесие с карбонатами 96, 97
-----растворимость 96
-----снабжение 95, 96
Углерод, источники 81 —101
— — ассимиляция и диссимиляция 82—85
— — константа насыщения 22
-----смешанные 95, 202
-----экономический коэффициент 82
Уксус, образование из спирта 265
Уксуснокислые бактерии 137
Урожай; см. Экономический коэффициент
Устойчивость к стрессу 155, 223
Фазы роста; см. Рост, фазы — — замедление 36 Фенол 220
Феррицианид 138
Ферментер башенный 64
— Вальдгофа 96
— вращающийся 117, 118
— с перемешиванием 117—121, 126
Фильтр Зейтца 165
Фосфор 151
Фотолитотрофы 81
Фотоорганотрофы 81
Хелаты ионов металлов 157—162 Хемолитотрофы 81 Хемоорганотрофы 81
Хемостат 43—74, 76—78, 80, 91, 114 133, 195—200, 207, 210—216, 219, 225, 236—246, 249, 286, 296
— батареи 67—74, 296
— назначение 56
— отклонение от теории 53—55
— роль аппаратуры 54
— с возвратом биомассы 62—67, 72— 74, 296
— стационарное состояние см. Стационарное состояние
Химио-осмотическая теория 174
Хищник — жертва, взаимоотношения 243—246
Холин 18
Цитохромы 136
Экономический коэффициент 17, 18 30, 53, 82, 73, 145, 147, 150
----истинный 85
Экстинкция 31
Электроны, акцепторы и доноры 81, 82
Энергия активации 167—170, 299
— источники 81—101
---- влияние на образование продукта 204
— — константа насыщения 22, 82
— — экономический коэффициент 82
---- пути метаболизма 94
— накопление; см. Запасные продукты
— поддержания 53. 83, 85—94, 135, 225, 252, 296
— влияние температуры 171
— на ^атф 94
— световая 9, 81
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) 158, 159
Уатф- см- Аденозинтрифосфат, выход биомассы
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие к русскому изданию.......................................5
Предисловие автора.................................................. 8
Глава 1. Введение....................................................И
1.1. Природа микробной культуры................................11
1.2. Историческое развитие ....................................11
Глава 2. Параметры роста и анализ данных о росте....................14
2.1. Параметры ................................................14
2.2. Скорость роста............................................14
2.3. Справедливость закона экспоненциального роста.............16
2.4. Экономический коэффициент ................................17
2.5. Метаболический коэффициент................................18
2.6. Влияние концентрации субстрата на скорость роста..........19
2.7. Значения константы насыщения /С...........................21
2.8. Определение длительности лаг-периода......................23
2.9. Предельные границы максимальной концентрации биомассы . . 24
Глава 3. Определение биомассы.......................................26
3.1. Факторы, влияющие на выбор метода определения.............26
3.2. Измерение массы и объема..................................27
3.3. Масса клеточного компонента ..............................29
3.4. Экономические коэффициенты ...............................30
3.5. Скорость метаболических процессов.........................30
3.6. Метод светорассеяния......................................30
3.7. Подсчет клеток и органелл.................................32
3.8. Методы окрашивания........................................33
Глава 4. Периодическая культура и культура полного вытеснения (тубулярная культура)..................................................35
4.1. Открытые и закрытые системы...............................Зб
4.2. Фазы роста простой периодической культуры.................35
4.3. Оценка роста по одной точке . . 37
4.4. Математическая модель простой периодической культуры . . 37
4.5. Модификации кривых роста простой периодической культуры 38
4.6. Культура полного вытеснения (тубулярная культура) .... 39
4.7. Применение культуры полного вытеснения....................42
Глава 5. Хемостатная культура.......................................43
5.1. История вопроса.......................................... 43
5.2. Теория хемостата..........................................44
5.3. Производительность хемостата..............................49
328
Оглавление
5.4. Распределение времени удержания в хемостате................52
5.5. Отклонения от теории хемостата . . .......53
5.6. Длительность переходных процессов после резкого изменения скорости роста .... 55
5.7. Специальные цели хемостатной культуры......................56
Глава 6. Разработка хемостата........................................58
6.1. Введение...................................................58
6.2. Турбидостат ...............................................58
6.3. Хемостат с возвратом биомассы..............................62
6.4. Батареи хемостатов.........................................67
6.5. Хемостаты, соединенные в серии с возвратом биомассы. ... 72
Глава 7. Отмирание клеток в растущих культурах.......................75
7.1. Определение понятия мертвых и покоящихся клеток............75
7.2. Скорость отмирания.........................................75
7.3. Отмирание клеток во время деления..........................77
7.4. Влияние отмирания клеток на их рост........................80
Глава 8. Источники энергии и углерода................................81
8.1. Введение...................................................81
8.2. Определение количества ассимилированного углерода .... 83
8.3. Энергетические затраты на функцию поддержания жизнедеятельности (энергия поддержания) ................85
8.4. Влияние энергетических затрат на поддержание...........90
8.5. Выход биомассы в расчете на выход АТФ (ХДТф)...........93
8.6. Условия, влияющие на метаболическую судьбу источников углерода и энергии.............................................94
8.7. Потребление двух и более источников углерода...........95
8.8. Снабжение культур двуокисью углерода...................95
8.9. Равновесие двуокись углерода — карбонаты в растворах ... 96
8.10. Влияние парциального давления СО2 на рост и метаболизм . . 97
8.11. Углеводороды как источники углерода и энергии..........98
8.12. Диспергирование углеводородов в жидкой среде..........100
Глава 9. Потребность в кислороде и обеспечение им...............102
9.1. Введение..............................................102
9.2. Потребность в кислороде...............................103
9.3. Растворимость кислорода...............................105
9.4. Измерение количества растворенного кислорода..........106
9.5. Окислительно-восстановительный потенциал..............107
9.6. Транспорт кислорода из газовой фазы в жидкую и к биомассе ПО
9.7. Измерение значений Ki.a при отсутствии биомассы.......112
9.8. Измерение значений K.i.a во время развития культуры . . . .114
Глава 10. Методы аэрации и перемешивания.........................117
10.1. Введение..............................................117
10.2. Перемешивание и взбалтывание культуры.................118
10.3. Различные устройства для повышения степени аэрации и перемешивания жидкости: отбойники, вихревое перемешивание, вор-текс, «эрлифт»................................................119
10.4. Конструкция мешалки ......................................120
10.5. Влияние скорости перемешивания............................121
10.6. Влияние распыления подаваемого воздуха....................122
10.7. Влияние температуры и вязкости............................124
10.8. Влияние поверхностно-активных веществ и углеводородов . . 124
I
Оглавление 329
10.9. Влияние биомассы ..................................125
10.10. Потребность в мощности..................................125
10.11. Пенообразование ..................................126
10.12. Системы аэрирования и перемешивания в лабораторных ферментерах ......................................................126
10.13. Аэрация в колбах на качалках....................127
10.14. Факторы, влияющие на скорость растворения кислорода при перемешивании на качалках . ... .................J2Z
10.15. Аэрация в пробирках на качалке..........................130
10.16. Аэрация в глубинных культурах без перемешивания (стационарные культуры).............................................. 130
Глава 11. Влияние кислорода на культуры микроорганизмов............132
11.1. Введение................................................132
11.2. Лимитация роста кислородом..............................132
11.3. Влияние напряжения растворенного кислорода на скорость потребления кислорода растущей биомассой . . . . 133
11.4. Влияние условий роста на скорость дыхания покоящихся клеток ........................................................ 135
11.5. Влияние напряжения растворенного кислорода на содержание дыхательных и катаболических ферментов в клетках . . . .136
11.6. Переходы от аэробного к анаэробному метаболизму у факультативных анаэробов.......................................... 136
11.7. Влияние напряжения растворенного кислорода на прочие функции (кроме дыхания)...........................................137
11.8. Заменители кислорода ...................................138
11.9. Ингибирование кислородом................................138
11.10. Анаэробный рост.........................................140
Глава 12. Общие вопросы питания....................................144
12.1. Введение................................................144
12.2. Определение факторов роста микробиологическими методами 146
12.3. Потребности в азоте .... 147
12.4. Потребности в витаминах и гормонах......................149
12.5. Потребности в фосфоре . ................................151
12.6. Потребности в калии и натрии............................152
12.7. Потребность в магнии....................................153
12.8. Потребность в сере......................................153
12.9. Микроэлементы...........................................154
12.10. Удаление микроэлементов из сред.........................157
12.11. Связывание в хелаты ионов металлов......................157
12.12. Подбор среды для культивирования........................162
12.13. Заключение..............................................165
Глава 13. Влияние температуры......................................167
13.1. Влияние температуры на скорость роста...................167
13.2. Энергия активации роста.................................167
13.3. Верхние экстремальные температуры роста.................170
13.4. Влияние температуры на пищевые потребности..............171
13.5. Влияние температуры на образование продуктов . . 172
13.6. Влияние температуры на состав биомассы микроорганизмов . . 172
13.7. Механизмы температурного воздействия....................173
Глава 14. Действие концентрации ионов водорода ................... 174
14.1. Внеклеточное и внутриклеточное значение pH..............174
14.2. Регулирование pH культуры...............................174
330
Оглавление
14.3. Влияние pH на рост и метаболизм..........................175
14.4. Действие pH на состав биомассы и морфологию..............177
14.5. Молекулярные основы действия pH..........................178
Глава 15. Действие активности воды и тоничность среды...............179
15.1. Введение.................................................179
15.2. Определение активности воды..............................180
15.3. Взаимосвязь между активностью воды и концентрацией растворенного вещества ................... . . 180
15.4. Взаимосвязь между активностью воды и осмотическим давлением ........................................................ 180
15.5. Измерение тоничности и активности воды...................182
15.6. Использование терминов. Тоничность и активность воды . . .182
15.7. Тоничность клеточного содержимого........................182
15.8. Отношение скоростей роста к тоничности и активности воды 183
15.9. Влияние тоничности на состав клетки и метаболизм.........185
15.10. Механизм влияния тоничности .............................185
15.11. Вывод соотношения между осмотическим давлением и активностью воды................................................... 186
Глава 16. Образование продукта в культурах микроорганизмов .... 189
16.1. Введение.................................................189
16.2. Отношение скорости роста к скорости образования продукта 191
16.3. Скорость распада продукта................................193
16.4. Образование продукта в периодической культуре............193
16.5. Образование продукта в хемостатной культуре..............195
16.6. Регулирование затухания биосинтетической активности . . . 200
16.7. Влияние окружающих условий на образование микробных продуктов ........................................................201
Глава 17. Действия химических ингибиторов и активатоэов роста . . . 205
17.1. Введение.................................................205
17.2. Конкурентное ингибирование ..............................206
17.3. Неконкурентное ингибирование.............................208
17.4. Ингибирование продуктов..................................211
17.5. Конкурентное ингибирование продуктов в хемостатной культуре ... . 211
17.6. Неконкурентное ингибирование продуктов в хемостатной культуре ........................................................ 213
17.7. Ингибитор, влияющий на экономический коэффициент .... 216
17.8. Субстратное ингибирование роста .........................217
17.9. Активаторы роста.........................................220
Глава 18. Культуры при низких и нулевой скоростях роста.............222
18.1. Поведение в стационарной фазе............................222
18.2. Стационарная фаза бактериальной культуры.................222
18.3. Стационарная фаза в культурах грибов.....................224
18.4. Минимальная скорость роста ............................. 225
18.5. Кинетика спорообразвания у Bacillus......................226
Глава 19. Задержка роста (лаг-период)...............................230
19.1. Введение.................................................230
19.2. Кажущийся лаг-период.....................................230
19.3. Причины истинного лаг-периода............................231
19.4. Действие инокулята.......................................232
Оглавление
331
19.5. Влияние температуры....................................233
19.6. Метаболические процессы во время лаг-периода...........234
19.7. Заключение.............................................234
Глава 20. Смешанные культуры.....................................236
20.1 Введение................................................236
20.2. Конкуренция за один и тот же лимитирующий субстрат . . . 237
20.3. Два вида с разными лимитирующими субстратами .... 240
20.4. Продукт одного вида как субстрат для другого.......... 241
20.5. Ингибирующий продукт одного вида как лимитирующий субстрат другого вида . . . ......................... 242
20.6. Взаимодействие хищник — жертва........................243
20.7. Определение скорости мутации...........................246
20.8. Заключение.............................................217
Глава 21. Периодические культуры с добавлением субстрата (fed batch culture)..........................................................249
21.1. Периодическая культура с добавлением источников питания 249
21.2. Образование продукта...................................252
21.3. Отъемно-доливная культура ............254
21.4. Применения периодической культуры с добавлением источников питания .....................................................256
21.5. Культура с диализом...................................258
21.6. Диффузионная капсула...................................261
Глава 22. Глубинный рост в виде погруженных пленок или шариков биомассы ....................................................... .... 263
22.1. Погруженные пленки биомассы............................263
22.2. Микроорганизмы, развивающиеся на наполнителе в колонке . . 265
22.3. Рост в виде погруженных шариков биомассы...............271
Глава 23. Рост колоний микроогранизмов на поверхности плотных сред 276
23.1. Введение ..............................................276
23.2. Модель роста колонии...................................276
23.3. Экспериментальное изучение характера роста бактериальных колоний......................................................278
23.4. Экспериментальное изучение роста колонии гриба.........282
23.5. Заключение ............................................285
Глава 24. Математические модели автосинтеза биомассы.............286
24.1. Введение...............................................286
24.2. Взаимозависимые синтезы................................286
24.3. Автоматическая подстройка к изменению окружающих условий 289
24.4. Степень воздействия внешний среды на скорость роста .... 291
24.5. Альтернативные циклы взаимозависимых синтезов..........291
24.6. Заключение.............................................293
Глава 25. Выводы и заключение....................................295
Приложение.......................................................303
Обозначения и сокращения.........................................303
Список литературы................................................305
Дополнительная литература ...................................... 313
Предметный указатель.............................................321
УВАЖАЕМЫЙ ЧИТАТЕЛЬ!
Ваши замечания о содержании книги, ее оформлении, качестве перевода и другие просим присылать по адресу: 129820, Москва, И-110, ГСП 1-й Рижский пер., д. 2, издательство «Мнр»
ИБ № 1411
С. Дж. Перт
ОСНОВЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ И КЛЕТОК
Редактор Л. Тер-Саркисян Художник Л. Костенко Художественный редактор В. Бисенгалиев Технический редактор Н. Манохина
Корректор К- Водяннцкая
Сдано в набор 17.08.77. Подписано к печати 02.02.78 Гарнитура литературная, печать высокая. Бумага тип. № 1 60X90718= 10,50 бум. л. печ. л. 21,00. Уч.-изд. л. 19,49. Изд. № 4/9119. Цена 2 р. 20 к.
Зак. № 737.
ИЗДАТЕЛЬСТВО <МИР>
Москва, I-й Рижский пер., 2
Ордена Трудового Красного Знамени Ленинградская типография № 2 имени Евгении Соколовой Союзпслиграфпрома при Государственном комитете
Совета Министров СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торгов пн 198052, Ленинград, Л-52, Измайловский проспект, 29.
Отпечатано в Ленинградской типографии № 8 Союзполш рафпрома при Государственном комитете Совета Министров СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торговли 190000, Ленинград, Прачечный пер., 6.
Зак. № 54
APPENDIX
Symbols and abbreviations
The symbols most frequently used in the text have the following meanings unless it is otherwise stated.
a Specific maintenance rate { = mYEG)
aw Water activity
atm Atmospheres (pressure)
ATP Adenosine triphosphate
cP Centipoises (viscosity)
D Dilution rate ( = F/K)
Dc Critical dilution rate (when p is at
maximum)
D' Diffusion coefficient
DNA Deoxyribonucleic acid
DOC Dissolved oxygen concentration
(g/D
DOT Dissolved oxygen tension (mmHg)
Eh Oxidation-reduction or redox potential (Eqn 9.4)
Eqn Equation
F Medium flow rate
H Henry’s constant (Eqn 9.2)
i Ionic strength (Eqn 15.1)
Ka Activator constant (Eqn 17.44)
Inhibitor constant defined in Section 17.2.1
KLa Gas-transfer coefficient
(Eqn 9.13); a = gas-liquid interfacial area; 1/^ = resistance to gas diffusion
Ks Saturation constant (Eqn 2.21)
KT Colony radial growth rate
L Lag period before growth
In Logarithm to base e
log Logarithm to base 10
m Maintenance coefficient
(Section 8.3.1), also molality (moles solute/kg water)
м Molarity (moles/litre)
m0 Osmolality or tonicity (a
1 osmolal solution exerts an osmotic pressure of 22-4 atm at o°C)
mm Millimetres
mmHg Millimetres mercury (pressure)
p Product concentration
P Total amount of product in
culture (Vp)
Po Oxygen demand constant, moles
oxygen consumed/mole of oxidizable substrate consumed pM — log me where me is the molarity of a metal ion
ppm Parts per million
<7P, qs Metabolic quotients, ilx.dp/dt and \]x.ds!dt respectively, abbreviated to q where indicated
RNA Ribonucleic acid
j Substrate concentration
S Total amount of substrate in
culture (Vs)
sr Substrate concentration in
medium feed
t Time
T Temperature
td Doubling time or mean genera-
tion time of biomass
tr Mean residence time or replace-
ment time of a continuous flow culture (= V/F)
V Culture volume
vol. Volume
w/v Weight per volume
w/w Weight per weight
x Biomass concentration
258
259
SYMBOLS AND ABBREVIATIONS
Татр Overall ATP yield (g dry biomass produced/mole ATP) Yxl, Growth yield (—dxjds), abbreviated to Yx or Y where
Jatp True ATP yield, that is excluding indicated
effect of maintenance energy Specific growth rate, ilx.dxjdt
Yc Yx„ where the substrate is the carbon (not energy) source P'm Maximum specific growth rate defined by Eqn 2.21
(Eqn 8.4) y.m Microns
Ys Overall growth yield, where 7T Osmotic pressure (atm)
the substrate is the energy source Ф Osmotic coefficient (Eqn 15.8)
YBa True growth yield, Yxl, where the 00 Infinity
substrate is the energy source and ОС is proportional to
m = o > is greater than
Ypl, Product yield {—dpIds), » is much greater than
abbreviated to Yp where in- < is less than
dicated « is much less than
Ypix Product yield (dpjdx), approximately equals
abbreviated to Y„ where indicated (over a symbol) denotes steadystate value