И. Г. Щербак
БИОЛОГИЧЕСКАЯ
ХИМИЯ
Учебник для медицинских вузов
Создан по поручению Учебно-методической комиссии по преподаванию
химических дисциплин Минздрава РФ и рекомендован Комиссией
(председатель — академик РАО профессор В. А. Попков)
в качестве учебника для студентов медицинских вузов
отсканировал
Санкт-Петербург
Издательство СПбГМУ
2005
УДК 577.1(075.8)
ББК 28.902
Щ 61
Автор И. Г. Щербак
Рецензенты:
профессор Д. М. Зуба и ров. д.м.н„ зав. кафедрой биологической хи-
мии Казанского государственного медицинского университета, За-
служенный деятель науки ТАССР и РФ:
профессор А. И. Карпищенко, д.м.н., начальник кафедры клиниче-
ской биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской
академии;
профессор В. В. Поступаев, д.м.н., зав. кафедрой биологической хи-
мии Дальневосточного государственного медицинского университета;
профессор Е. Г. Скворцевич, д.б.н., зав. кафедрой биологической хи-
мии Санкт-Петербургского государственного университета
Редактор
профессор Л. В. Галебская, д.м.н., зав. кафедрой биологической хи-
мии Санкт-Петербургского государственного медицинского универси-
тета имени акад. И.П.Павлова
Щербак, И. Г.
Щ61 Биологическая химия : Учебник. - СПб. : Издательство
СПбГМУ, 2005. - 480 с.
ISBN 5-88999-052-7
Современный учебник, отражающий новейшие достижения в области фундамен-
тальной медицины. Акцент сделан на изложении основополагающих закономерностей
биологической химии в их логической взаимосвязи и в такой последовательности, ко-
торая, по опыту автора, оптимальна для понимания и усвоения наиболее значимых
основ этой науки.
Учебник предназначен для студентов медицинских вузов, а также факультетов
медико-биологического профиля. Он может быть полезен для аспирантов и препода-
вателей смежных кафедр.
УДК 577.1(075.8)
ББК 28.902
Напечатано в Российской Федерации
Все права защищены. Воспроизведение и распространение в каком бы то ни было виде части
или целого издания не могут быть осуществлены без письменного разрешения автора.
ISBN 5-88999-052-7
© И. Г. Щербак, 2005
© Издательство СПбГМУ, 2005
Истинная наука не может развиваться иначе
как в небрежении к собственной пользе.
И. П. Павлов,
Нобелевский лауреат 1904 года
ПРЕДИСЛОВИЕ АВТОРА
Современная биохимия - чрезвычайно разросшаяся, стремительно развивающаяся область
знания. Ее достижения все более становятся составной частью других медико-биологических на-
ук, таких как физиология и патофизиология, фармакология, медицинская генетика и т.д., не говоря
уже о клинических дисциплинах. Поэтому особую остроту приобретает проблема отбора учебного
материала. С одной стороны, он должен быть достаточным для полноценного изложения наиболее
значимых закономерностей биохимической науки, представляемых в их логической взаимосвязи.
С другой стороны, желательно избегать чрезмерной детализации, ибо частности и отвлечения на
смежные вопросы затрудняют усвоение главной сути описываемого явления.
Структура и содержание предлагаемого учебника отражают многолетний опыт моей препода-
вательской и научной работы на кафедре биологической химии Санкт-Петербургского государст-
венного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова.
Последовательность изложения отличается от традиционной для многих руководств. В част-
ности, нет специальных разделов по гормонам и витаминам. Основные биохимические механизмы
их участия в метаболизме и его регуляции включены в соответствующие главы учебника, а все
остальное - это область физиологии, патофизиологии, гигиены питания.
Впервые введена специальная глава «Протеолиз», отсутствующая в других учебниках в каче-
стве самостоятельного раздела. Целесообразность этого акцента проистекает из того, что послед-
ние достижения биохимии позволяют сформулировать представления о комплексе систем ограни-
ченного протеолиза, которые на основе общих закономерностей реализуют такие частные, хотя и
очень важные процессы, как гемокоагуляция и фибринолиз, регуляция сосудистого тонуса и за-
щита от чуждого материала.
Считаю своим долгом выразить благодарность коллегам по кафедре за деятельное сотрудни-
чество в совершенствовании той методологии преподавания, которая положена в основу настоя-
щего учебника. Кроме того, Е. В. Рюмина, И. Л. Соловцова, Т. Ф. Субботина и Ю. В. Тарасова
взяли на себя труд по критичному просмотру отдельных глав рукописи и дали ценные советы,
способствовавшие улучшению качества изложения, а П. П. Бельтюков, Ю. А. Борисов, Л. А. Ан-
дреева и В. П. Фаенкова оказали немалую помощь в подборе литературы и оформлении иллюстра-
тивного материала.
Особенная моя признательность — профессору Людвиге Вячеславовне Галебской, ныне воз-
главляющей кафедру. Она приняла активное участие в работе над учебником уже на ранних ее
этапах, а в заключение любезно согласилась на непростой труд редактора, который нередко со-
провождался дискуссиями, позволившими четче сформулировать излагаемые вопросы.
Невозможно переоценить личный вклад ректора Университета, академика РАМН профессора
Н. А. Яицкого, которому я обязан заботливым вниманием и неизменной поддержкой на протяже-
нии всего процесса создания книги.
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
АД				—	артериальное давление (крови)
АДГ	—	антидиуретический гормон
о2“ АП	—	а2-антиплазмин
агАТ	—	агантитрипсин
АКТГ	—	адренокортикотропный гормон (кортикотропин)
АЛТ	—	аланин-аминотрансфераза
АМФ, АДФ и АТФ	—	аденозинмоио-, ди- и трифосфат
АО	—	аминокислотный остаток (остатки)
АОЗ	—	антиоксидантная защита
АПБ	-	ацилпереносящий белок
АПК	—	альтернативный путь (активации) комплемента
АПФ	—	ангиотензинпревращающий фермент
ACT	—	аспаргат-амииотрансфераза
АТФаза	—	аденозинтрифосфатаза
АФК	—	активные формы кислорода
АХЭ	—	ацетилхолииэстераза
вкм	—	внеклеточный матрикс
вмк	-	высокомолекулярный кинииоген
ГАП	—	гидроксиапатит
ГБФ-пугь	-	гексозобисфосфатный путь (распада глюкозы)
ГК	—	гексокиназа
ГлбФ		глюкозо-6-фосфат
ГлбФаза	—	глюкозо-6-фосфатаза
ГМГ-КоА	-	Р-гидрокси-0-метилгдутарил-КоА
ГМФ, ГДФ иГТФ	—	гуанозинмоио-, ди- и трифосфат
ГМФ-путь	-	гексозомоиофосфатный путь (распада глюкозы)
ГФДГ	—	глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа
ДГАФ	-	дигидроксиацетоифосфат
ДГБП	-	дигидробиоптерин
ДНК	—	дезоксирибонуклеиновая кислота (кислоты)
ДОФА	-	ди(гидр)оксифенилаланин
ИК	—	. иммунный комплекс (комплексы)
ИМФ	-	инозинмонофосфат
ИЭТ	—	изоэлектрическая точка
а-КГ	-	a-кетоглутаровая кислота (а-кетоглутарат)
КК	—	калликреин
KoQ		кофермент Q (убихинои)
КоА	-	кофермент А (кофермент ацилирования)
КПК	—	классический путь (активации) комплемента
ЛВП	-	липопротеин(ы) высокой плотности
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
5
ЛДГ	-	лактатдегидрогеназа
Л.к.	—	липоевая кислота (липоат)
ЛНП	-	липопротеии(ы) низкой плотности
ЛОНП	—	липопротеин(ы) очень низкой плотности
ЛПЛ	-	липопротеинлипаза
ЛПП	-	липопротеин(ы) промежуточной плотности
ЛТГ	-	липотропный гормон (липотропин)
ЛХАТ	-	лецитии:холестерол-ацилтрансфераза
МАК	-	мембраноатакующий комплекс
МАО	-	моноамииоксидаза
а2-МГ
ММП
МСГ
МтО
ОДК
пвк
ПА
ПАИ
П.о.
ПОЛ
преКК
РНК
сод
То,5
Т3
Т4
тг
ТГБП
ТГФ
ТМФ, ТДФ и ТТФ
УМФ, УДФ и УТФ
фн
ФАФС
ФВ
ФГА
ФГДГ
ФЕП
ФЛ
ФРПФ
ФС
фф
ФФК
ФХ
ФЭ
ХМ
хс
ЦМФ, ЦДФ и ЦТФ
эзк
ЭР
ЭТФ
FeS-P
Gia
Hb
IGF-1
RGD
-	а2-макроглобулин
-	матриксные металлопротеиназы
-	'меланоцитстимулирующий гормон (меланотропин)
митохондриальное окисление
-	окислительное декарбоксилирование а-кетокислот
-	пировиноградная кислота (пируват)
—	плазмииогеи-активатор - тканевый (тПА) или урокиназного типа (уПА)
-	плазмииогеи-активаториый ингибитор(ы)
-	пары (азотистых) оснований [в ДНК]
-	перекисное окисление липидов
-	прекалликреин
—	рибонуклеиновая кислота (кислоты)
—	супероксидднсмутаза
-	период полусуществования
- 3.5,3-трийодтироиин
-	тироксин (3,5,3',5'-тетрайодтироиин)
-	триглицерид(ы)
—	тетрагидробиоптерин
—	тетрагидрофолиевая кислота
—	дезокситимидинмоно-, ди- и трифосфат
-	уридинмоио-, ди- к трифосфат
—	неорганический фосфат (Н3РО4)
—	3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат
-	фон Виллебранда (фактор)
-	фосфоглицеральдегид (глицеральдегидфосфат)
-	6-фосфоглюкоиатдегидрогеиаза
—	фосфое иол пируват
-	’ фосфолипид (ы)
—	5-фосфорибозил-1-пирофосфат
-	фосфатидилсернн(ы)
—	пирофосфат (Н4Р2О7)
—	фосфофруктокииаза
-	фосфатидилхолин(ы)
- фосфатид и лэтаноламин(ы)	- "
-	хиломикрои(ы)
-	холестерол (свободный)
-	цитидинмоио-, ди- и трифосфат
-	энергетический заряд клетки (см. уравнение [5-2])
-	эндоплазматический ретикулум (эндоплазматическая сеть)
-	электронтранспортирующий флавопротеин
-	железо-сериый протеин(ы)
-	у-карбоксиглутамииовая кислота
—	гемоглобин
-	иисулиноподобиый ростовый фактор 1 (insulin-like growth factor-1)
-	последовательность ...-арг-гли-асп-... (центр клеточной адгезии)
ВВЕДЕНИЕ
Биологическая химия (биохимия) — это наука о тех
химических и физико-химических процессах, которые про-
текают в живом организме и лежат в основе буквально
всех проявлений жизнедеятельности.
История становления и развития биологи-
ческой химии охватывает более полутора ве-
ков. Возникла она на стыке органической хи-
мии и физиологии. Органическая химия как
наука о химическом строении и свойствах мо-
лекул, образующихся в живых организмах, до-
вольно скоро стала развиваться преимущест-
венно как химия соединений углерода, уделяя
основное внимание синтезу, изучению свойств
и систематизации все новых веществ, особенно
таких, которые представляли интерес для про-
мышленного производства. Те направления
органической химии, в рамках которых про-
должалось выяснение строения молекул живой
природы, постепенно дополнялись изучением
вообще химического состава живых объектов,
исследованием путей превращения различных
веществ и их роли в процессах жизнедеятель-
ности, особенно у человека. Все это и состави-
ло предмет новой науки, которая поначалу обо-
значалась как «физиологическая химия» либо
«медицинская химия». Лишь в первые десяти-
летия XX века утвердилось современное на-
звание - «биологическая химия» - как резуль-
тат осознания того, что химизм всех объектов
живой природы в основе своей удивительно
единообразен.
На начальном этапе становления биохи-
мии усилия исследователей были сосредоточе-
ны в основном на выделении, расшифровке
строения и изучении свойств различных ве-
ществ, входящих в состав живых организмов.
Эта задача почти полностью решена, в основ-
ном к середине XX века. Попутно исследовате-
лей занимала и другая проблема - выяснение
количественного содержания тех или иных ве-
ществ в живых объектах и их выделениях. Она
также в значительной мере решена, но - на
«макроуровне», в том числе на уровне органов
и тканей в норме и при патологии. Однако ко-
личественная оценка концентраций различных
метаболитов в клетке того или иного типа (тем
более - в субклеточных структурах) до сих пор
остается в большинстве случаев очень трудной
задачей. Особенно это относится к «минор-
ным» компонентам клетки, в том числе имею-
щим белково-пептидную природу. Важность
этой задачи велика, ибо, как известно из общей
химии, направление реакции, характер взаимо-
действия различных молекул и сама его воз-
можность зависят прежде всего от концентра-
ций взаимодействующих веществ.
С начала XX века биохимия постепенно
переходит на качественно новый этап развития
- изучение последовательностей превращения
различных веществ в организме, т.е. исследо-
вание процессов метаболизма. Это стало воз-
можным на основе достижений предыдущего
этапа («статической биохимии») и использова-
ния возможностей параллельно развивавшихся
наук, прежде всего органической химии. Этот
этап («динамическая биохимия»), сильно за-
держанный II мировой войной, привел к выяс-
нению химизма основных путей распада (ка-
таболизма) углеводов, липидов, белков.
Особенно важные успехи были достигнуты
ВВЕДЕНИЕ
7
в 20-30-е годы, когда удалось выяснить глав-
ные пути катаболизма глюкозы, процесс
[3-окисления жирных кислот, последователь-
ность реакций в дыхательной цепи (митохонд-
риальное окисление), реакции цикла трикарбо-
новых кислот и образования мочевины. Гораз-
до позже обозначились первые успехи в изуче-
нии химизма биосинтетических процессов, т.е.
реакций анаболизма. Постепенно стало ясным,
что некоторые метаболические пути легко об-
ратимы и могут функционировать как в на-
правлении распада определенных веществ, так
и в направлении биосинтеза. Такие пути стали
называть амфиболическими.
По мере продвижения в изучении путей
метаболизма стали предприниматься попытки
выяснить, каким образом биохимические про-
цессы обеспечивают ту или иную физиологи-
ческую функцию. Это направление принято
обозначать термином «функциональная био-
химия». Путь этот оказался очень трудным,
тернистым. Несмотря на ряд серьезных дости-
жений, задача выяснения молекулярных основ
той или иной физиологической функции до сих
пор остается одной из центральных проблем
биохимии.
С завершением изучения химизма важ-
нейших метаболических превращений в орга-
низме все большее внимание исследователей
стали привлекать вопросы их регулирования на
молекулярном уровне. Прежде всего - вопросы
о том, как осуществляется согласование про-
цессов распада тех или иных веществ и их био-
синтеза в тех же клетках; как обеспечивается
контроль за соответствием интенсивности ме-
таболических процессов реальным потребно-
стям клетки в разных функциональных состоя-
ниях. Первые серьезные успехи в изучении ме-
ханизмов регуляции были достигнуты при изу-
чении ферментов. Оказалось, что многие из
них чувствительны к воздействию эндогенных
регуляторов, - таких как гормоны, нейроме-
диаторы, другие биологически активные моле-
кулы. Накопление конкретных фактов привело
к принципиально важному обобщению, значе-
ние которого трудно переоценить. Оно заклю-
чается в осознании того, что молекулы многих
ферментов способны не только выполнять
свою функцию (катализировать соответствую-
щую химическую реакцию), но и регулировать
интенсивность выполнения этой функции в
зависимости от достигаемых результатов. Так
возникло понятие о саморегуляции фермента-
тивных процессов, сложившееся примерно к
началу 70-х годов. Довольно скоро стало яс-
ным, что не только ферменты, но и многие
другие белки обладают свойством саморегуля-
ции. Выявление контролирующих (ключевых)
звеньев метаболизма и конкретных механизмов
их саморегуляции стало одним из важнейших
направлений современной биохимии. Продви-
жение в этой области имеет не только познава-
тельное значение. Оно открывает возможности
целенаправленного синтеза новых лекарствен-
ных средств с заранее запланированным меха-
низмом действия. На этом пути уже есть яркие
достижения, используемые в практической ме-
дицине. Например, обратимые ингибиторы ан-
гиотензинпревращающего фермента, широко
применяемые при лечении гипертонической
болезни.
Начало современному этапу исключитель-
но бурного развития биохимической науки по-
ложило открытие двойной спирали ДНК
(Д. Уотсон, Ф. Крик, 1953 г.). Это достижение
не только выявило принцип построения моле-
кул, являющихся материальным носителем на-
следственности. Оно стало еще и мощным
стимулом к разработке новых методических
приемов, к развитию лабораторной техники,
основанной на регистрации ряда физических и
физико-химических параметров сложных био-
логических объектов, в том числе громадных
молекул белков и нуклеиновых кислот. В ре-
зультате в короткие сроки было доказано, что
наследственность есть передача потомкам спо-
собности синтезировать определенный набор
строго специфичных белков. Был расшифрован
генетический код; разработаны эффективные
методы анализа структуры индивидуальных
белков; выяснены молекулярные механизмы
биосинтеза белковых молекул; успешно разви-
ваются исследования механизмов регуляции
биосинтеза белка, лежащие в основе, в частно-
сти, клеточной дифференцировки. Все это со-
ставляет важную часть нового направления -
оно обозначается термином «молекулярная
биология». Формально это - синоним термина
«биологическая химия», поскольку изучением
строения и свойств молекул занимается именно
8
ВВЕДЕНИЕ
химия. Фактически же это - довольно само-
стоятельная область исследований, в рамках
которой разработаны своеобразные методиче-
ские приемы, позволяющие, в частности, выяв-
лять и идентифицировать минорные белковые
компоненты, изучать их роль в функциониро-
вании клетки и организма в целом.
В последние десятилетия стало очевид-
ным. что задачи биохимии не могут быть све-
дены к изучению только химических про-
цессов, т.е. реакций разрыва ковалентных свя-
зей или возникновения новых. Оказалось, что
гораздо более важными, буквально универ-
сальными являются физико-химические
взаимодействия, реализующиеся в виде так на-
зываемых слабых типов связей (например,
ионных связей - взаимном притяжении проти-
воположно заряженных атомов или групп ато-
мов). Любая химическая реакция, протекающая
с участием фермента, осуществляется путем
серии последовательных событий физико-хи-
мического уровня, приводящих в конечном
счете к ковалентным преобразованиям. Более
того, пространственная организация макромо-
лекул (прежде всего, белковых) обеспечивается
в основном именно слабыми физико-химичес-
кими взаимодействиями между разными участ-
ками такой молекулы. Обратимые изменения
этой организации в ходе функционирования
такой макромолекулы, включая ее взаимодей-
ствие с другими молекулами или надмолеку-
лярными структурами, тоже в основе своей
имеют физико-химическую природу. Появи-
лись даже специальные направления в науке -
«физико-химическая биохимия», «физическая
биохимия». Все это делает необходимым обо-
значать теперь биохимию как науку не только
о химических, но и о физико-химических про-
цессах в живом организме.
Современная биохимия - это целый ком-
плекс более или менее самостоятельных на-
правлений. Помимо упомянутой молекулярной
биологии, можно назвать медицинскую биохи-
мию, иммунохимию, биохимическую фармако-
логию, молекулярную генетику, биотехноло-
гию, молекулярные основы конструирования
новых лекарственных веществ и т.д. Четкие
границы между ними вряд ли можно обозна-
чить - настолько все они тесно взаимосвязаны,
взаимно переплетены. В сущности, их можно
рассматривать как специализированные разде-
лы общей биохимии, главнейшие закономерно-
сти каковой являются универсальными. Неуди-
вительно, что среди всех медико-биологичес-
ких наук биохимия идет впереди, причем, с
большим отрывом. Это видно и по темпам раз-
вития, и по числу научных журналов (и публи-
каций в целом), и по весомости достижений, их
значимости для построения фундаментальных
основ практической медицины.
Далеко не на все вопросы, интересующие
врача, может ответить современная биохимия.
Но уже на довольно многие вопросы она спо-
собна дать однозначный ответ, тем самым су-
жая поле для некорректных, ошибочных трак-
товок и представлений. Одной из важнейших
целей преподавания (и изучения) биохимии
является формирование иммунитета к произ-
вольным суждениям, псевдонаучным гипоте-
зам, еще бытующим в такой чрезвычайно
сложной и ответственной сфере деятельности,
как медицина.
Глава 1
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
Представления о первенствующей роли
белков в явлениях жизни, возникшие еще в
XIX веке, окончательно утвердились лишь во
второй половине XX века. Главное же - эти
представления наполнились гораздо более бо-
гатым содержанием, чем просто констатация
их правильности. Теперь мы знаем, что любое
проявление жизнедеятельности, любая физио-
логическая функция в основе своей имеет
вполне определенные (и притом обратимые!)
изменения в пространственной организации
конкретных белков. Эти изменения отражают
отшлифованную эволюцией способность бел-
ковых структур так или иначе реагировать на
малейшие изменения условий среды, а также
передавать возникающий таким образом «сиг-
нал» другим макромолекулам. Цепочка таких
элементарных актов составляет молекулярную
основу любой функции - от восприятия света
или вкуса до мускульной работы или элемен-
тарных актов нервной деятельности. Конкрети-
зация этого общего принципа требует прежде
всего знания главных закономерностей строе-
ния и пространственной организации белковых
молекул. Лаконичное определение этого класса
веществ можно сформулировать так:
Белки (протеины) - это высокомолекуляр-
ные азотсодержащие органические вещества,
структурным элементом которых являются
аминокислоты.
Для понимания особенностей строения
белков и уникальности их свойств целесооб-
разно рассмотреть важнейшие качества амино-
кислот как биологических молекул.
1.1.	СТРОЕНИЕ ПРИРОДНЫХ
АМИНОКИСЛОТ
В живой природе обнаружены сотни раз-
нообразных аминокислот. Однако только 20 из
них используются при построении любого бел-
ка. Их объединяют термином «кодируемые»: в
генетическом коде свое обозначение имеет ка-
ждая аминокислота из этого набора, причем
только из него.
Две структурные особенности присущи
кодируемым аминокислотам:
а)	все они являются а-аминокислотами, то
есть, аминогруппа присоединена в них к угле-
родному атому, соседнему с карбоксильной
группой;
б)	по стереохимической конфигурации а-
углеродного атома все они относятся к L-ряду
(исключение составляет простейшая из них -
глицин, который не имеет стереоизомеров, ибо
содержит два атома водорода при а-углерод-
ном атоме).
Из этих особенностей следует, что все ко-
дируемые аминокислоты имеют совершенно
одинаковый фрагмент молекулы (на рис. 1-1 он
обведен прямоугольником) и различаются
только строением радикала R, присоединенно-
го к Ct-углеродному атому этого стандартного
для них фрагмента.
10
Глава 1
R
, I
!h-c-nh2
I
I COOH
Рис. 1-1. Общая формула кодируемых аминокислот
(прямоугольником выделен фрагмент, который можно
назвать «стандартным», поскольку он одинаков
у всех этих аминокислот).
Формулы всех 20 кодируемых аминокислот
приведены в табл. 1-1. Строго говоря, в белках
встречаются и некоторые другие а-аминокис-
лоты L-ряда. Однако появляются они в резуль-
тате постсинтетической модификации белка,
т.е., преобразования радикалов аминокислот,
уже включенных в состав белковой молекулы.
К числу таких преобразований относятся гидро-
ксилирование пролина и лизина, у-карбокси-
лирование глутаминовой кислоты и ряд других;
они будут рассмотрены в дальнейших разделах.
1.2.	ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
АМИНОКИСЛОТ
Входя в состав белковой молекулы, ами-
нокислоты придают ей многие из своих
свойств. Две характерные черты аминокислот
наиболее важны для белка: растворимость в
воде и способность к ионизации (электролити-
ческой диссоциации).
1.2.1.	РАСТВОРИМОСТЬ
Хорошая растворимость в воде обусловле-
на полярными свойствами аминокислот. Во-
обще полярными называют такие молекулы
или фрагменты молекул, у которых «центр тя-
жести» отрицательных зарядов (т.е., электро-
нов) не совпадает с «центром тяжести» поло-
жительных зарядов (т.е., ядер атомов).
Типичным полярным веществом является
молекула воды. В этом смысле ее правильнее
изображать не симметрично (Н-О-Н), а при-
мерно так:
Асимметричность молекулы обусловлена
тем, что атом кислорода гораздо сильнее при-
тягивает к себе обобществленные электроны,
чем соединенный с ним атом водорода. Поэто-
му электронное облако, формирующее кова-
лентную связь, заметно смещено в сторону ки-
слорода, который приобретает некоторую из-
быточность отрицательных зарядов. Она
меньше заряда одного электрона и потому по-
лучила название «частичный отрицательный
заряд» и обозначается символом «5-». Соот-
ветственно на атомах водорода возникает яв-
ный дефицит электронной плотности — частич-
ный положительный заряд (5+). Таким обра-
зом, в целом молекула воды представляет со-
бой диполь, т.е. частицу с некоторым преобла-
данием электронной плотности на одном по-
люсе и соответствующей избыточностью по-
ложительного заряда - на другом:
Выраженность поляризации зависит от аб-
солютного значения частичных зарядов и от
расстояния между их центрами. Произведение
этих величин обозначается термином диполь-
ный момент и является мерой полярности дан-
ной молекулы (или полярного фрагмента
крупной молекулы).
Молекулы воды обладают высоким ди-
польным моментом (1,84 Дебай). Очевидна
поэтому их склонность к межмолекулярным
взаимодействиям. Электростатическое притя-
жение одного полюса молекулы воды к проти-
воположно заряженному полюсу другой моле-
кулы может привести к формированию, на-
пример. линейных цепочек из множества ди-
полей воды; такие цепочки могут замыкаться
сами на себя, образуя кольцо.
Экспериментально установлено, что, дей-
ствительно. даже в жидком состоянии вода яв-
но структурирована. Расчеты показали, однако,
что сила межмолекулярного притяжения в та-
ких структурах значительно больше (соответ-
ственно. межмолекулярные расстояния мень-
ше), чем это можно объяснить только притя-
жением противоположных зарядов разных ди-
полей. Как оказалось, значительная поляриза-
ция ковалентной связи между водородом и ки-
слородом в молекуле воды приводит к тому,
что появившийся вблизи атом кислорода дру-
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
11
гой молекулы начинает притязать на «чужой»
для него водород. Реализации притязаний бла-
гоприятствуют малые размеры атома водорода,
которые позволяют ему сблизиться с кислоро-
дом другой молекулы воды, «подтянуться» к
нему. Такого рода притяжение обозначается
термином водородная связь. Она во много раз
слабее простой ковалентной связи и обознача-
ется обычно пунктирной линией.
В жидком состоянии на каждую молекулу
воды приходится обычно от 3 до 4 (в среднем
около 3,4) соседних молекул, связанных с нею
водородными связями. Если диполь-дипольные
взаимодействия легко обеспечивают двумер-
ную структуру (например, замкнутую в кольцо
линейную последовательность молекул-дн-
полей), то способность молекулы воды образо-
вывать более двух водородных связей со свои-
ми соседями создает предпосылки для форми-
рования более сложных структур - трехмер-
ных. В жидкой воде возникают упорядоченные
скопления молекул, - так называемые класте-
ры (рис. 1-2).
Кластеры находятся в динамическом рав-
новесии с окружающей их свободной (неструк-
турированной) водой. Средняя продолжитель-
ность жизни кластера меньше миллиардной
доли секунды (порядка 10'1О-10'п с). Однако
молекулы каждого распадающегося кластера
сразу же реорганизуются в новые кластеры,
взаимодействуя с молекулами свободной воды
и других распавшихся кластеров. При этом
очень важную роль играет кооперативный ха-
рактер образования водородных связей: воз-
никновение одного такого межмолекулярного
«мостика» способствует появлению второго,
гретьего и т.д. Таким образом, размеры класте-
ров весьма непостоянны, а границы - довольно
расплывчаты (другое их обозначение - «мер-
цающие гроздья»). Подсчитано, что каждый
кластер содержит в среднем 57 молекул воды.
Несмотря на крайнюю нестабильность каждого
отдельного кластера, само по себе кластерное
структурирование жидкой воды существует
постоянно. При этом обычно около 70% всех
молекул воды структурировано, и лишь при-
мерно 30% пребывает в составе «свободной»
воды. По другим данным, только 15% воды
структурировано при 37°С. Очевидно, наличие
микропримесей, температура и ряд других
факторов могут очень сильно влиять на кла-
стерную организацию жидкой воды.
Схема на рис. 1-2 позволяет убедиться, что
в структуру кластеров могут встраиваться
только такие молекулы, которые сами поляр-
ны. Более того, молекула полярного вещества
хорошо взаимодействует и с неструктурирован-
ной водой, а нередко способна даже стать цен-
тром, вокруг которого формируется структура,
подобная кластеру. Только ее уже не называют
кластером, а обозначают термином «гидратная
оболочка» молекулы полярного вещества.
Рис. 1-2. Схема кластерного структурирования жидкой воды (модель Франка-Уэно)
(затененные пятна - кластеры, остальное - окружающая их свободная вода).
12
Глава 1
Понятным становится, почему именно поляр-
ные вещества хорошо растворимы в воде, т.е.
обладают свойством гидрофильности. Напро-
тив, гидрофобность («неприязнь» к воде, неспо-
собность в ней растворяться) присуща тем орга-
ническим молекулам (или фрагментам крупных
молекул), которые неполярны. Самый яркий
пример этому - углеводороды и их смеси
(нефть, бензин, керосин и т.п.). В молекулах та-
ких веществ атомы водорода очень симметрич-
но расположены вокруг атомов углерода, так
что центр тяжести всех электронов молекулы
совпадает с центром тяжести всех протонов
(дипольный момент равен или очень близок ну-
лю). Такие соединения растворяются только в
себе подобных (неполярных) растворителях, но
не в аоде. Более того, в силу поверхностного
натяжения на границе фаз, они стремятся мак-
симально уменьшить поверхность своего сопри-
косновения с водой. В качестве простой иллю-
страции; если в пробирке встряхнуть смесь рас-
тительного масла с водой, то образовавшиеся
капли масла (имеющие большую площадь со-
прикосновения с водой) будут довольно быстро
сливаться (уменьшается площадь контакта с
водной фазой) и в конечном счете смесь рассло-
ится на воду и масло с минимально возможной
поверхностью их соприкосновения.
Полярными являются все те молекулы или
фрагменты молекул, в которых есть так назы-
ваемые электроотрицательные атомы. Так обо-
значают атом, который сильнее, чем его парт-
нер по химической связи, притягивает к себе
обобществленные электроны, формирующие
эту связь. В аминокислотах (и белках) электро-
отрицательными являются атомы О, N и, в го-
раздо меньшей степени, S. Обладая полярно-
стью, аминокислоты (а, следовательно, и бел-
ки) гидрофильны, т.е. способны растворяться в
воде. Аминокислотам это качество присуще
уже хотя бы в силу высокой полярности их
стандартного фрагмента молекулы (см. рис.
1-1), содержащего два атома кислорода и один
атом азота. Нередко и в составе радикала R
тоже имеются электроотрицательные атомы,
которые усиливают гидрофильность молекулы.
Однако есть и такие аминокислоты, у ко-
торых радикал R построен только из атомов
углерода и водорода. Это делает молекулу ам-
фифильной, т.е., сочетающей в себе участки с
противоположными свойствами: стандартный
фрагмент гидрофилен, а ковалентно соединен-
ный с ним радикал R гидрофобен (растворим в
жирах). Такая двойственность физико-хими-
ческих свойств одной и той же молекулы (её
«двуличие») сильно расширяет диапазон воз-
можностей и играет очень важную роль в ме-
ханизмах её функционирования в живых объ-
ектах. Особенно это относится к белкам, в мо-
лекуле которых причудливо чередуются гид-
рофильные фрагменты и гидрофобные радика-
лы аминокислот.
В сущности, двойственность свойств лю-
бого белка (и иных биологических молекул)
относится к числу фундаментальных принци-
пов, лежащих в основе явлений жизни.
1.2.2.	ЭЛЕКТРОЛИТИЧЕСКАЯ ДИССОЦИАЦИЯ
Другим из упомянутых важнейших физи-
ко-химических свойств аминокислот является
способность к электролитической диссоциации
(ионизации). Благодаря наличию карбоксиль-
ной группы происходит диссоциация по типу
кислоты с образованием аниона и освобожде-
нием протона в среду. Аминогруппа диссоции-
рует по типу основания, - путем присоедине-
ния протона из водной среды с образованием
катиона (положительный заряд на атоме азота).
Вещества, способные диссоциировать и по ти-
пу кислоты, и по типу основания, обозначают-
ся как амфотерные вещества. Продукты пол-
ной диссоциации таких молекул называются
амфотерными ионами, или амфионами (рис.
1-3). Способность аминокислот к ионизации
выражена настолько сильно, что они полно-
стью диссоциированы и пребывают в форме
амфионов не только в физиологических усло-
виях (в живом организме), но даже в кристал-
лическом состоянии.
Таким образом, и по второму из важней-
ших физико-химических свойств - по склонно-
сти к ионизации - каждая аминокислота тоже
проявляет двойственность, будучи способной
диссоциировать и по типу кислоты, и по типу
основания. Естественно, это распространяется
и на белки.
Схема на рис. 1-3 показывает, что диссо-
циация аминокислот, содержащих одну кар-
боксильную и одну аминогруппу, не сопрово-
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
13
h-c-nh2 н
А
О он
R
I +
H-C-NН3
катион Н R
H-C-N+H3
С
R	°Х Х°"
|	амфион
н-с- nh2
Рис. 1-5. Подавление ионизации карбоксильных групп
аспартата постепенным добавлением сильной кислоты
(А - анионная, Б - электронейтральная, В - катионная
формы аминокислоты).
анион
Рис. 1-3. Электролитическая диссоциация
моноаминомонокарбоновой кислоты.
ждается изменением уровня водородных ионов
в среде. Иными словами, при растворении та-
ких аминокислот в воде pH раствора остается
нейтральным, т.е. близким 7. Образующийся
амфион обладает положительным и отрица-
тельным зарядами, которые взаимно уравно-
вешиваются, так что в целом молекула амино-
кислоты электронейтральна.
Однако некоторые аминокислоты имеют
ионизирующиеся группы не только в стандарт-
ном фрагменте молекулы, но и в составе ради-
кала R. Так, аспарагиновая кислота содержит в
нем карбоксильную группу, а лизин - амино-
группу. Эти группы тоже легко диссоциируют.
В результате при растворении, например, аспа-
рагиновой кислоты в воде происходит подкис-
ление среды (отсюда и название этого вещест-
ва), а сама аминокислота находится в растворе
в форме аниона, в котором из двух отрицатель-
ных зарядов только один уравновешен поло-
жительным зарядом на атоме азота (рис. 1-4).
Добавление сильной кислоты к раствору
аспартата подавляет диссоциацию карбоксиль-
ных групп (равновесие реакции, приведенной
на рис. 1-4, сдвигается влево). Постепенным
подкислением можно добиться того, что дис-
социация карбоксильных групп будет подавле-
на ровно наполовину. При этом амфион аспа-
рагиновой кислоты станет электронейтраль-
ным (рис. 1-5, Б), т.к. один оставшийся отрица-
тельный заряд компенсируется положитель-
ным зарядом на атоме азота. В данном случае
это произойдет при значении pH среды, равном
2,77. Если же продолжать добавление сильной
кислоты, то в конце концов можно подавить
диссоциацию и второй карбоксильной группы,
и тогда молекула аспарагиновой кислоты пред-
станет в форме катиона (рис. 1-5, В).
В противоположность аспарагиновой ки-
слоте, лизин при растворении в аоде подщела-
чивает среду, забирая из нее два протона (для
ионизации аминогрупп) взамен одного, осво-
бождаемого при диссоциации карбоксильной
группы. Соответственно, сама аминокислота
пребывает в катионной форме (рис. 1-6).
О ^ОН
хс
I
сн2
h-c-nh2
с
сА хон
°х /°"
с
+ н+
Н—С—N+H3
с
О ХО"
H2C-NH2
сн2
сн2
I +
СН2
h-c-nh2
Н2О
Н2с-Ы*Нз
СН2
СН2
। + НО’
им2
Н-С-ГГНз
Рис. 1-4. Ионизация аспарагиновой кислоты.
Рис. 1-6. Ионизация лизина.
14
Глава 1
Н2С-N Нз
I
СН2
СН2
сн2
H-C-N*H3
С
О Х ХО'
НО~ Jj2O
НО" н2о
Н2С—ЬГНз	Н2С—Nh2
•гн’ но- н2о
сн2 А сн2
Ун2 *но^н2о ^Н2
H-C-NH?	H-C-NH2
с	ХС
tf ХО_	О ХО"
Рис. 1-7. Подавление ионизации аминогрупп лизина
постепенным добавлением щелочи
(А - катионная, Б - электронейтральная, В - анионная
формы аминокислоты).
Диссоциацию аминогрупп лизина можно
подавлять добавлением щелочи, которое ведет к
повышению концентрации гидроксильных ио-
нов НО- в среде. Они «отнимают» протоны от
ионизированных аминогрупп, превращаясь в
воду. При определенной концентрации гидро-
ксильных групп установится такое равновесное
состояние, когда половина аминогрупп будет
пребывать в депротонированном состоянии, так
что молекулы аминокислоты станут элекгро-
нейтральными (рис. 1-7, Б). В растворах лизина
этот момент наступает при pH среды, равном
9,82. Если продолжать добавление щелочи, то
можно достичь практически полного подавле-
ния диссоциации аминогрупп; молекулы лизина
превратятся при этом в свою анионную форму
(рис. 1-7, В).
Итак, каждая аминокислота всегда несет
на себе хотя бы один электрический заряд,
равный по величине заряду электрона или про-
тона. Обычно же имеются и отрицательные, и
положительные заряды в одной молекуле.
Иногда они уравновешивают друг друга, и то-
гда молекула находится в электронейтральном
состоянии, т.е. ведет себя в электрическом по-
ле как незаряженная частица. Наличие (и ха-
рактер) заряда или его отсутствие зависят, с
одной стороны, от соотношения кислотных и
основных групп в молекуле и, с другой сторо-
ны, от pH среды.
Изоэлектрическая точка (ИЭТ) - это то
значение pH среды, при котором молекула ам-
фотерного вещества находится в электроней-
тральном состоянии (т.е., число группировок,
диссоциированных по типу основания, в точно-
сти равно числу групп, диссоциированных по
типу кислоты). По аналогии с pH, значения ИЭТ
выражают отрицательным логарифмом соответ-
ствующей концентрации водородных ионов в
среде и обозначают символом pl.
Из приведенных выше примеров видно,
что для аминокислот, у которых в составе ра-
дикала R имеется кислотная групппа (обычно -
карбоксильная), ИЭТ находится в кислой сре-
де. Если же в составе радикала есть группа,
диссоциирующая по типу основания (напри-
мер, группа -NH2 в молекуле лизина), то ИЭТ
находится в щелочной среде. Наконец, моно-
аминомонокарбоновые кислоты (см. рис. 1-3)
должны иметь р! в нейтральной среде (факти-
чески же ИЭТ таких аминокислот находится в
слабокислой среде - при pH около 6,0 - из-за
того, что способность а-аминогрупп диссоции-
ровать по типу основания выражена заметно
слабее, чем кислотные свойства у карбоксиль-
ных групп).
Таким образом, с помощью параметра сре-
ды (pH раствора в изоэлектрической точке)
можно получить представление о соотношении
кислотных и основных групп в молекуле амфо-
терного вещества. Особенно важно это для
белков, в молекуле которых имеется множест-
во (нередко - десятки) тех и других группиро-
вок. Более того: изменяя pH среды, можно пе-
реводить любые амфионы в электронейтраль-
ное состояние или придавать молекуле в целом
отрицательный либо положительный заряд.
Как видно из приведенных схем, при pH ниже
изоэлектрической точки молекулы амфотерных
веществ (в том числе аминокислот) переходят
в катионную форму, а в среде, более щелочной,
чем pl, — в анионную форму. И чем дальше pH
среды отстоит от ИЭТ, тем большая доля мо-
лекул находится в виде заряженной частицы.
Так, все молекулы лизина электронейтральны
при pH = р! = 9,82. Подкисление среды на
1 или 2 единицы pH (т.е. до значений 8,82 или
7,82) переводит в катионную форму соответст-
венно 75 и 95% молекул этой аминокислоты.
Напротив, подщелачивание среды на 1 или
2 единицы pH переводит соответственно 75
и 95% молекул лизина в форму аниона. Даже
очень незначительный сдвиг pH вблизи р! ока-
зывает существенное влияние. Так, сдвиг отно-
сительно ИЭТ всего на 0,1 единицы pH пере-
водит примерно 6% молекул аминокислоты в
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
15
форму катиона или аниона (в зависимости от
направления сдвига, разумеется).
Электролитическая диссоциация амино-
кислот (и белков) относится к числу наиболее
простых и наглядных проявлений одного из
фундаментальных свойств живой материи -
способности реагировать на изменения усло-
вий среды и отвечать на них вполне однознач-
ным, предсказуемым образом. В частности,
влияние pH среды на степень зараженности
радикалов аминокислот, входящих в состав
белка, отражается прежде всего на суммарном
заряде всей белковой молекулы в целом. Это
важно само по себе. Однако, несравненно ве-
сомее изменения степени диссоциации радика-
ла той аминокислоты, которая играет главную
роль в функционировании данного белка. На-
пример, не случайно в состав каталитического
центра многих ферментов входит гистидин,
имидазольный радикал которого имеет кон-
станту ионизации (рК=6,0), гораздо более
близкую к физиологическим значениям pH
среды, чем у любой другой из кодируемых
аминокислот. Поэтому даже небольшие изме-
нения pH в микроокружении имидазольного
радикала, наступающие, например, под влия-
нием приближающейся молекулы субстрата,
заметно влияют на ионизацию этого радикала
и тем самым позволяют ему участвовать в
осуществлении ферментативного катализа.
1.3. КЛАССИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТ
В первых попытках систематизации амино-
кислот исходили из химического строения мо-
лекул (соотношение амино- и карбоксильных
групп, наличие разветвленных или циклических
структур и т.д.). Однако, современная биохимия
отдает предпочтение классификации, основан-
ной на физико-химических свойствах радикалов
аминокислот. Тем самым ставится акцент на
том, что для функционирования белковых моле-
кул первостепенное значение имеют изложен-
ные выше физико-химические свойства амино-
кислот, входящих в состав белка, а не спектр их
химической реактивности.
По физико-химической классификации
аминокислоты подразделяются на 4 группы, в
зависимости от полярности или неполярности
радикала и наличия в нем группировки, диссо-
циирующей по типу кислоты или основания.
Эта классификация приведена в таблице 1-1
вместе с формулами всех 20 аминокислот, их
общепринятыми названиями и обозначениями,
а также величинами р! и данными о раствори-
мости в воде.
Физико-химическая классификация кодируемых аминокислот
Таблица 1-1
Название аминокислоты	Формула	Краткое обозначе- ние	Символ	Значение ИЭТ (pl)	Растворимость в воде (г/100мл)
1	2	3	4	5	6
1. Аминокислоты с неполярным радикалом R					
Глицин	Н 1 Н-С-А/+Н3 СОО"	Гл и (Gly)	G	5,97	25,0
Аланин	н 1 НзС-С-Л/*Н3 ООО'	Ала (Ala)	А	6,01	16,6
Валин	Н,с / сн-с-л/*н, /	1 НзС СОО'	Вал (Vai)	V	5,96	8,8
Лейцин	HSC	н сн-сн2-с-л/*н, Н3с	СОО-	Лей (Leu)	L	5,98	2,4
16
Глава 1
Продолжение таблицы 1-1
1	2		3	4		5	6
Изолейцин	НзС—CHz сн—< НзС	ч ~/гн3 ;оо"	Иле (Не)	I		5,44	4,1
Метионин	н H3C-S-CH2-CH2-C-W*H3 СОО’		Мет (Mei)	М		5,74	3,5
Пролин	н2с- Н2С с с	сн2 Ж QQ-		Про (Pro)	Р		6,30	162,3
Фенилаланин	н /==х	I %. >-СН2-С-Л/ н3 СОО"		Фен (Phe) [Фал]	F		5,48	2,9
Триптофан		Ч '-N*H3 ;оо-	Трп(Тгр)	W		5,89	1,1
II. Аминокислоты с полярным незаряженным радикалом R							
Серин	он I сн2-<	ч ?оо_	Сер (Ser)	S		5,68	5,0
Цистеин	SH н I ’ сн2-с-л/н3 СОО’		Цис (Cys)	с		5,02	хорошо растворим
Треонин	он I НзС— СН— (	ч '.-N*H3 ЮО~	Тре (Th г)	т		5,64	20,5
Тирозин	н HQ-^^^-CHz-С—N*H3 СОО'		Тир (Туг)	Y		5,66	0,05
Аспарагин	о	н С-СНг-С-ЛГН, Н2М	СОО'		Асн (Asn)	N		5,41	3,0
Глутамин	О	V Т-СН2-СН2-С-Л/*Н3 h2n	СОО'		Глн (Gin)	Q		5,65	4,2
III. Аминокислоты с карбоксильной группой в радикале R							
Аспарагино- вая кислота (аспартат)	°,	" . С-СНг-С-Л/*Н3 ‘°	СОО'		Acn (Asp)	D	2,77		0,5’
Глутаминовая кислота (глутамат)	°, " . С-СНг-СН,- C-N H3 'О 4	СОО'		Глу (Glu)	Е	3,24		0,9*
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
17
Окончание таблицы 1-1
	1	1	 2				3	1	4	|	5			6
IV. Аминокислоты с основной группой в радикале R					
Лизин	н + 1 H3N -сн2-сн2-сн2-сн2-с-лГн3 СОО~	Лиз (Lys)	К	9,59	хорошо растворим
Аргинин	h2n*	н У	1 c-nh-ch2-ch2-ch2-c-/v*h3 H2N	ООО’	Apr (Arg)	R	11,15	15,0
Г истидин	НС	NH Н СН	СОО"	Гис (His)	Н	7.47	4,2
* - хорошо растворим при нейтрализации раствора до pH 7,0.
1.4. ТИПЫ СВЯЗЕЙ МЕЖДУ
АМИНОКИСЛОТАМИ В МОЛЕКУЛЕ БЕЛКА
Все типы связей, которые возникают между
аминокислотами в ходе биогенеза белковой
молекулы, можно разделить на две группы:
ковалентные связи и нековалентные (слабые
типы связей). К пераой из них относятся пеп-
тидная и дисульфидная связи. Ко второй - во-
дородная связь, ионная связь и гидрофобное
взаимодействие.
1.4.1.	ПЕПТИДНАЯ СВЯЗЬ
Пептидная (кислотоамидная) связь соеди-
няет две аминокислоты — одинаковых или раз-
ных. Ее можно представить как результат вы-
деления молекулы воды за счет карбоксильной
группы одной аминокислоты и аминогруппы
другой. В итоге углерод бывшей карбоксиль-
ной группы соединяется ковалентной связью с
азотом бывшей аминогруппы другой амино-
кислоты. Образуемую молекулу обозначают
как ди пептид.
В качестве примера на рис. 1-8 представ-
лено строение одного из дипептидов, которые
могут быть получены при соединении аланина
с глицином. Естественно, на одном конце ди-
пептида остается свободной аминогруппа, на
другом - карбоксильная группа. К любой из
них можно аналогичным образом присоеди-
нить еще одну аминокислоту, и тогда появятся
молекулы двух разных трипептидов (см. рис.
1-8).
Рис. 1-6. Строение дипептида аланил-глицина и продуктов присоединения к нему цистеина.
18
Глава 1
Трипептид можно наращивать далее, по-
лучая последовательно тетрапептиды, пента-
пептиды, гексапептиды и вообще любые поли-
пептиды. Следует, однако, подчеркнуть, что в
живых системах наращивание идет в одном
направлении — путем присоединения новой
аминокислоты к карбоксильной группе преды-
дущей.
Как видно на рис. 1-8, названия пептидов
составляются из названий аминокислот, начи-
ная с той, у которой сохранена свободная а-
аминогруппа. При этом в названиях всех ами-
нокислот окончание изменяется на «-ил». Ис-
ключение составляет последняя по счету ами-
нокислота, название которой не изменяется,
так как ее карбоксильная группа остается сво-
бодной (не вовлеченной в образование пептид-
ной связи).
Лишь в 50-е годы XX века были разрабо-
таны методы, которые позволяют устанавли-
вать последовательность соединения амино-
кислот в любом полипептиде. Применение их к
изучению самых разных белков, а также осу-
ществленный тогда же прорыв в области био-
химической генетики, — все это позволило
окончательно и абсолютно однозначно устано-
вить, что любая белковая молекула всегда пред-
ставляет собой прежде всего длинную поли-
пептидную цепь, насчитывающую десятки,
сотни, а иногда и тысячи аминокислотных ос-
татков. Соответственно, молекулярная масса
таких полипептидов может достигать десятков
и даже сотен килодальтон.
Две определяющих закономерности лежат
в основе структурных особенностей любого
природного полипептида: неразветвленность
полимерной цепи и ее гибкость.
Неразветвленность полипептидной цепи
обусловлена тем, что в образовании пептидной
связи аминокислоты участвуют только своим
стандартным фрагментом, который, как уже
отмечалось, одинаков у всех кодируемых ами-
нокислот. Если же в составе радикала R имеет-
ся еще и «своя» карбоксильная или аминогруп-
па, то она никогда не участвует в построении
природных полипептидных цепей. Эта законо-
мерность гарантируется теми молекулярными
механизмами, которые осуществляют биосин-
тез полипептидных цепей в клетке.
Для иллюстрации на рис. 1-9 приведено
строение небольшой полипептидной цепи, на-
считывающей всего 6 аминокислотных остат-
ков. В их числе - остатки лизина и аспартата, в
боковых радикалах которых содержатся соот-
ветственно аминогруппа и карбоксильная
группа. Эти группы в принципе тоже способны
формировать пептидные связи. Однако систе-
мы биосинтеза белка полностью исключают
такую возможность. Значит, при написании
формулы любого (поли)пептида аминокислот-
ные остатки следует соединять только их стан-
дартными фрагментами.
Рис. 1-9. Строение гексапептида ввлил-лизил-лейцил-гистидил-аспарагил-тирозина
(Затенением выделен остов («стержень») молекулы, абсолютно одинаковый у всех природных полипептидов.
В представленном изображении все пептидные группы и а-углеродные атомы находятся в одной плоскости
(в плоскости рисунка), а радикалы R попеременно либо выступают нед этой плоскостью
(в данном примере - валин, лейцин и аспартат), либо расположены позади нее (лизин, гистидин и тирозин);
водород при а-углеродных атомах направлен в сторону, противоположную направлению радикала R]
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
19
Итак, природные (поли)пептиды пред-
ставляют собой линейную последовательность
аминокислотных остатков, соединенных пеп-
тидными связями, прочно фиксирующими ме-
сто (очередность) каждой аминокислоты в дан-
ной цепи. При этом на одном конце цепи име-
ется свободная а-аминогруппа, а на другом —
свободная карбоксильная группа. Они обозна-
чаются соответственно как N-конец и С-конец,
а расположенные здесь аминокислоты - как
N-концевая и С-концевая. Именно с N-концевой
аминокислоты решили начинать отсчет после-
довательности (нумерацию) аминокислотных
остатков в полипептидной цепи (много позже
выяснилось, что биосинтез таких цепей дейст-
вительно начинается с N-концевой аминокисло-
ты и происходит путем наращивания С-конца).
Неразветвленность полипептидной цепи -
не единственное следствие использования
стандартного фрагмента аминокислот для ее
построения. Не менее важно и то, что в резуль-
тате возникает некий остов («стержень»), оди-
наковый у всех белковых молекул (на рис 1-9
он выделен затенением). Этот «стержень»
представляет собой многократное повторение
последовательности ...-N(H)-C(H)-C(O)-..., в
которой группа -С(Н)- является а-углеродным
атомом соответствующего аминокислотного
звена. Именно на этих группах «стержневой»
части молекулы сидят как боковые веточки,
радикалы 20 разных аминокислот, т.е., 20 ва-
риантов боковой цепи.
Стандартность «стержня» открывает воз-
можность использования единого механизма
для синтеза любых полипептидов. Сопряжение
его с системой отбора очередной аминокисло-
ты для включения ее в состав полимера позво-
ляет разнообразить чередование боковых це-
пей, т.е., обеспечивать специфику синтезируе-
мого полипептида.
Таким образом, несмотря на структурную
однотипность всех природных полипептидов,
имеются неисчерпаемые возможности для по-
строения самых разнообразных молекул. При
этом разные полипептиды могут различаться,
во-первых, общим числом боковых цепей, т.е.,
длиной полипептидной цепи (а, следовательно,
и величиной молекулярной массы). Во-вторых,
даже при одинаковой длине полипептидные
цепи могут различаться соотношением разных
боковых цепей (разных аминокислот). Нако-
нец, даже при совпадении и величины молеку-
лы, и соотношения разных аминокислот в ней,
полипептиды могут различаться последова-
тельностью чередования 20 разных аминокис-
лотных остатков.
Легко сосчитать, что из двух разных ами-
нокислот можно построить 4 различных дипеп-
тида. Аналогично, из трех аминокислот можно
создать 27 разных трипептидов, из четырех —
256 тетрапептидов и т.д. Известен такой под-
счет: при использовании всего лишь 12 амино-
кислот для построения полипептидов с молеку-
лярной массой 34000 Да число теоретически
возможных вариантов составит 1О300! Эту цифру
трудно даже представить. Если взять только по
одной молекуле каждого варианта, то совокуп-
ная масса их достигнет примерно 1О280 г, тогда
как масса всей нашей планеты составляет «все-
го» 1027 г! Иными словами, даже этот масштаб
слишком мал: чтобы построить по одной моле-
куле каждого из возможных вариантов, необхо-
димое количество материала эквивалентно мас-
се 10253 таких планет, как Земля!
Становится очевидным, что живая приро-
да реализует лишь ничтожно малую долю из
возможного разнообразия полипептидных це-
пей. Лишь некоторые, наиболее «удачные» по-
следовательности отобраны и «отшлифованы»
эволюцией в качестве пригодных для выпол-
нения какой-нибудь конкретной функции
(ферментативный катализ, мышечное сокра-
щение, «захват» фотона и преобразование за-
ключенной в нем энергии в иную форму и т.д.).
Нередко природа использует удачно найденное
сочетание конкретных аминокислот в качестве
однотипного фрагмента при создании белко-
вых молекул с совершенно различными биоло-
гическими функциями. Бывает и так, что неко-
торые конструкции повторяются (и неодно-
кратно!) в пределах одной полипептидной цепи
(их так и называют: «повторяющиеся последо-
вательности» или, короче, «повторы»).
Гибкость полипептидной цепи про-
истекает из того, что простая («одинарная»)
ковалентная связь подобна оси, допускающей
свободное вращение соединяемых ею фраг-
ментов молекулы. Поскольку в «стержневой»
части полипептида ковалентные связи направ-
лены под углом друг к другу, вращение вокруг
20
Глава 1
одной из них изменяет направление дальней-
шего хода «стержня», т.е., обеспечивает его
изгиб. Накопление таких изгибов приводит к
тому, что весь «стержень» может принимать
причудливую форму, которая к тому же легко
меняется. В этом и проявляется гибкость поли-
пептидной цепи.
Есть, однако, определенные ограничения
этой гибкости. Главное из них - сами пептид-
ные связи. Они заметно короче простой кова-
лентной связи (например, такой, как связь
...-N(H)-C(H)-... в той же полипептидной цепи),
но длиннее обычной двойной связи. Кроме то-
го, и связь между кислородом и углеродом в
пептидной группе не является чисто двойной:
она заметно длиннее аналогичной связи в альде-
гидах или кетонах, т.е., несколько ближе к про-
стой («одинарной») связи. Такой характер связи,
промежуточный между простой и двойной, по-
казывают пунктиром рядом с черточками, обо-
значающими простую связь (рис. 1-10, Б).
Частично двойной характер пептидной
связи делает невозможным вращение вокруг
нее как вокруг оси. Поэтому все 4 атома пеп-
тидной группы ...-C(O)-N(H)-... лежат в одной
плоскости, т.е., обладают жесткой планарной
(плоской) структурой. В той же плоскости
лежат и оба а-углеродных атома, расположен-
ные по обе стороны от пептидной связи. Одна-
ко их связи с пептидной группой (связи
...-N(H)-C(H)-... и ...-С(Н)-С(О)-...) относятся к
числу простых («одинарных»), т.е., допускаю-
щих вращение вокруг себя как вокруг оси. Зна-
чит, в «стержне» полипептида две из каждых
трех подряд связей допускают осевое вращение.
При этом а-углеродный атом каждой аминокис-
лоты, находясь на стыке соседних планарных
структур, представляет собой как бы шарнир,
вокруг которого примыкающие плоскости могут
поворачиваться относительно друг друга.
Рис. 1-10. Две предельные мезомерные формы (А и В)
пептидной связи и ве гибридная структура (Б);
пептидная связь указана стрелкой.
Рис. 1-11. Структура тетралептида:
линейный вариант (А) и изгиб «стержня» (Б)
вследствие осевого поворота по одной
из связей ...С(Н)-С(О)..-
Для иллюстрации на рис. 1-11 приведен
тетрапептидный фрагмент, в котором жесткие
планарные структуры пептидных групп выделе-
ны затенением. Здесь показано осевое вращение
вокруг той связи, которая соединяет а-угле-
родный атом и карбонильный углерод во втором
(с N-конца) аминокислотном звене. Можно ви-
деть, что такой поворот ведет к изменению на-
правления хода полипептидной цепи: из вытя-
нутой в одну линию она стала несколько изо-
гнутой в пространстве.
Поворот соседних планарных структур от-
носительно друг друга обычно не беспределен:
этому препятствует чрезмерное сближение
аминокислотных радикалов R. Однако сравни-
тельно небольшие повороты не только возмож-
ны, но и осуществляются в действительности.
Если они разнонаправленны и чередуются без
явной регулярности, то в целом ход полипеп-
тидной цепи в пространстве приобретает при-
чудливый характер, создавая впечатление не-
упорядоченности, хаотичности («случайный
клубок», «хаотичный клубок»). Если же в каж-
дом звене поворот осуществляется в одну и ту
же сторону, то становится возможной спирале-
образная форма довольно протяженных участ-
ков полипептидной цепи. В более коротких
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
21
участках накопление небольших поворотов
плоскости каждой пептидной группы относи-
тельно предшествующей планарной структуры
может привести к такому перегибу цепи, в ре-
зультате которого она меняет свое направление
на противоположное. В частности, стандартная
группа одного аминокислотного фрагмента
может сблизиться с аналогичной группой чет-
вертого от нее (по ходу цепи) аминокислотного
остатка, как это изображено (в проекции на
плоскость) на рис. 1-12. Между сближенными
группами >С=О и Н—N< легко образуются во-
дородные связи (см. раздел 1.4.3), которые,
появившись, обеспечивают стабилизацию воз-
никшего изгиба полипептидной цепи в обрат-
ном направлении. Такой способ изменения хо-
да полипептидной цепи на 180°, обнаруженный
при изучении строения белков, получил назва-
ние «p-поворот» (полипептидной цепи); по
внешнему сходству его сравнивают со шпиль-
кой для волос.
Таким образом, закономерность, обуслов-
ленная частично двойным характером пептид-
ной связи, делает структуру полипептидной
цепи полужесткой, позволяет «лепить» из нее
разные «фигуры». Эта полужесткость обеспе-
чивает возможность многообразия вариантов
пространственной организации белковой моле-
кулы. Более того, она обусловливает и доста-
точную стабильность сложившейся структуры,
и, вместе с тем, ее некоторую подвижность в
определенных рамках.
Рис.1-12. «0-Поворот» полипептидной цепи
(«шпилька») в проекции на плоскость.
Аланил-глицин-валил-серин
Аланил-глицил-пролил-серин
Рис. 1-13. Нарушение регулярности «стержня»
полипептидной цепи в зоне пролина
(«пролиновый излом»).
Рассмотренная регулярность структуры
«стержня» полипептидной цепи существенно
искажается в тех местах молекулы, где содер-
жится остаток пролина. Это объясняется тем,
что пролин, строго говоря, является не амино-
кислотой, а иминокислотой, ибо в его общей
части содержится иминоазот. Иными словами,
в молекуле пролина присущий аминокислотам
радикал R своим «дальним» концом замкнут
на атом азота, который в обычных аминокис-
лотах входит в состав а-аминогруппы. Из-за
этого невозможно осевое вращение вокруг свя-
зи ... >N-C(H)-... (указана стрелкой на рис.
1-13, Б). Следовательно, нарушается подвиж-
ность «стержня» полипептидной цепи в этом
месте. Кроме того, жесткость циклического
радикала пролина ведет к искажению обычной
регулярности структуры «стержня», вызывая
его изгиб с некоторым осевым поворотом (см.
рис. 1-13). Особым образом изменяя направле-
ние полипептидной цепи, этот жестко фикси-
рованный изгиб получил название «пролино-
вый излом».
1.4.2.	ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ
Одна из 20 аминокислот — цистеин — имеет
в составе радикала R сульфгидрильную группу
(-SH). Если две такие группы окажутся доста-
точно сближенными в пространстве, то они мо-
22
Глава 1
Рис.1-14. Образование и разрыв дисульфидной связи
(соответственно окислительный и восстановительный процессы).
гут провзаимодействовагь между собой с вы-
делением двух атомов водорода и образовани-
ем дисульфидной связи ...-S-S-... (рис. 1-14).
Дисульфидная связь может возникнуть за
счет двух остатков цистеина, расположенных в
разных местах одной и той же полипептидной
цепи, но сближенных за счет изгибов этой це-
пи. Такую дисульфидную связь называют
внутрицепочечной. Но она может образоваться
и за счет остатков цистеина, принадлежащих
разным полипептидам. Тогда ее называют
межцепочечной. Нередко дисульфидную связь
обозначают термином «дисульфидный мос-
тик», подчеркивая тот факт, что она соединяет
разные полипептиды или разные участки од-
ной полипептидной цепи, причем, не соседние,
а достаточно удаленные по ходу этой цепи.
Дисульфидный мостик - это обычная ко-
валентная связь, т.е., достаточно прочное хи-
мическое соединение соответствующих фраг-
ментов полипептидной цепи (или двух цепей).
Однако биологически она менее устойчива,
чем пептидная связь. Это объясняется высокой
интенсивностью окислительно-восстановитель-
ных процессов в клетке. От редокс-потенциала
микросреды сильно зависит как возникновение
дисульфидной связи (окисление групп -SH),
так и ее расщепление (восстановление мос-
тиков -S-S-).
1.4.3.	НЕКОВАЛЕНТНЫЕ СВЯЗИ
(СЛАБЫЕ ТИПЫ СВЯЗЕЙ)
Сила нековалентных связей — в их слабо-
сти! Это — не преувеличение. Будучи в десятки
раз менее прочными, чем обычная ковалентная
связь, слабые взаимодействия очень чувстви-
тельны к физическим и физико-химическим
параметрам среды. А это качество играет ис-
ключительно важную роль в живых системах с
их способностью (и «обязанностью») реа-
гировать на изменения внешних условий.
Еще одно важное качество слабых типов
связей — ограниченная степень их избиратель-
ности. Ковалентные связи, как известно, воз-
никают между строго определенными химиче-
скими группировками (та же пептидная связь
или дисульфидная). В противоположность
этому, слабые связи соединяют почти любые
химические структуры — лишь бы они облада-
ли определенным физико-химическим свойст-
вом. Например, гидрофобностью. Или заряда-
ми противоположного знака. Иными словами,
нековалентные связи - это, в сущности, не хи-
мические соединения атомов, а некие физико-
химические взаимодействия, возникающие на
основе взаимного влечения (притяжения) в
чем-то родственных структур. Эта невзыска-
тельность влечет за собой высокую чувстви-
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
23
тельность слабых типов связей к появлению в
среде «посторонних» веществ, способных к об-
разованию таких же связей.
Водородная связь может быть опре-
делена как связь, осуществляемая атомом во-
дорода между двумя электроотрицательными
атомами, с одним из которых этот водород
соединен обычной ковалентной связью. Как
уже отмечалось (раздел 1.2.1), в белках такими
атомами являются главным образом О и N. По-
этому водородная связь в белковых молекулах
чаще всего возникает между пептидными груп-
пами (рис. 1-15).
Хотя водородная связь в 10-20 раз слабее
обычной ковалентной связи, многократное ее
повторение между двумя полипептидами до-
вольно прочно удерживает их вместе. Точно
так же водородные связи могут прочно соеди-
нять расположенные рядом участки одной и
той же полипептидной цепи, соответственно
изогнутой в пространстве.
В образовании водородных связей могут
участвовать и радикалы R аминокислот, имею-
щие группу -ОН (серин, треонин, тирозин) или
атомы азота (например, гистидин).
Водородные связи очень чувствительны к
нагреванию (усиливающему тепловое движе-
ние молекул), а также к присутствию веществ,
которые сами легко образуют водородные свя-
зи, а потому способны «вмешиваться» и ослаб-
лять, разрушать аналогичные связи в белковой
молекуле. К числу таких веществ относится,
например, мочевина [H2N-C(O)-NH2] - глав-
ный конечный продукт распада аминокислот у
человека.
Ионная связь — это взаимное притя-
жение разноименно заряженных молекул или
Рис. 1-15. Водородная связь (обозначена пунктиром)
между кислородом одной пептидной группы и азотом
другой, пространственно сближенной.
частей одной большой молекулы, достаточно
сближенных в пространстве.
Почти в любой полипептидной цепи мно-
гие из аминокислотных радикалов R содержат
ионизируемые группы, несущие положитель-
ный или отрицательный заряд. В результате
изгибов такой цепи некоторые разноименно
заряженные группы могут оказаться на дис-
танции, достаточно короткой для образования
ионной связи, которая, возникнув, начинает
удерживать цепь в таком изогнутом состоянии.
Встречаются в белке и другие варианты элек-
тростатических взаимодействий (полярных
связей). Они обозначаются как ион-дипольное
и диполь-дипольное взаимодействия.
Ионные связи очень чувствительны к со-
левому фону среды. Катионы (Na+, К+ и др.)
склонны к экранированию отрицательно заря-
женных групп в молекуле полипептида, а анио-
ны (например, СГ или НСОз ) стремятся бло-
кировать положительные заряды. В результате
ослабляются и разрушаются полярные связи
между белковыми фрагментами.
Гидрофобное взаимодействие от-
личается тем, что возникает между неполяр-
ными структурами. Как известно, неспецифи-
ческое взаимное притяжение любых молекул
называют силами Ван дер Ваальса. Такое при-
тяжение может возникать и между фрагмента-
ми одной крупной молекулы, если они оказы-
ваются достаточно сближенными в простран-
стве. В частности, из-за изгибов полипептид-
ной цепи могут оказаться в достаточной близо-
сти аминокислотные радикалы R, расположен-
ные в разных участках «стержня» этой цепи.
Если же эти радикалы окажутся еще и непо-
лярными, то окружающая вода будет способст-
вовать их сближению и более тесному взаимо-
действию. Иными словами — содействовать
слиянию таких структур, которое сопровожда-
ется вытеснением молекул воды из простран-
ства между неполярными радикалами и, следо-
вательно, уменьшением площади соприкосно-
вения воды с неполярной фазой.
Итак, гидрофобное взаимодействие - это
силы Ван дер Ваальса, дополненные выталки-
вающей силой воды. В водном окружении не-
полярным структурам не остается ничего ино-
го, как тесно сблизиться друг с другом, закре-
пив свое единение явственным взаимным при-
24
Глава 1
Рис. 1-16. Схема гидрофобного взаимодействия
(обозначено затенением) с участием радикалов
фенилаланина и лейцина.
тяжением. В этом им существенно помогает
окружающая вода, «выдавливающая» из себя
чуждые ей гидрофобные структуры.
В полипептидной цепи обычно имеется
довольно много неполярных радикалов амино-
кислот. Из-за их гидрофобности становятся
энергетически выгодными такие изгибы этой
цепи, которые способствовали бы сближению
неполярных радикалов, «слиянию» их в гидро-
фобные конгломераты, внутри которых нет
молекул воды. При этом взаимодействие непо-
лярных структур будет особенно эффективным
в случаях их стерического (пространственного)
соответствия друг другу, - например, при
сближении радикалов фенилаланина и лейцина
(рис. 1-16).
Гидрофобные взаимодействия, естествен-
но, очень чувствительны к присутствию орга-
нических растворителей (н детергентов). В ча-
стности, некоторые проявления алкогольного
опьянения, возможно, обусловлены наруше-
ниями гидрофобных взаимодействий в белко-
вых структурах под действием этанола.
1.5. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ
БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ
Длинная полипептидная цепь представляет
собой линейную последовательность очень
большого числа планарных пептидных фраг-
ментов, которые, как уже отмечалось, соедине-
ны между собой шарнирно. Осевая подвиж-
ность этих соединений обеспечивает (теорети-
чески) почти неограниченную возможность
вариаций пространственного взаиморасполо-
жения различных частей молекулы. Однако в
действительности реализуется небольшое чис-
ло типовых вариаций, часть из которых сочета-
ется в одной и той же белковой молекуле. Что-
бы прояснить иерархию таких вариаций, было
введено понятие о четырех уровнях простран-
ственной организации белковой молекулы. Их
обозначают как первичную, вторичную, тре-
тичную н четвертичную структуру белка.
1.5.1. ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА
Первичная структура — так называют
последовательность аминокислотных остат-
ков в полипептидной цепи, прочно закреплен-
ную пептидными связями. Прочно - ибо эти
связи являются ковалентными, и разорваны
они могут быть только при сильном нагрева-
нии с крепкой кислотой (илн щелочью) либо
под действием специальных ферментов. Ины-
ми словами, первичная структура сохраняется
до тех пор, пока существует данная молекула.
Разрыв хотя бы одной из десятков или сотен
пептидных связей в белковой молекуле ведет к
ее исчезновению и появлению совсем других
молекул - обломков исходной. Продолжитель-
ность существования белковых молекул со-
ставляет в среднем 2-3 недели, хотя для инди-
видуальных белков она варьирует в широком
диапазоне; от нескольких минут (например,
гормон инсулин) до нескольких месяцев (в ча-
стности, гемоглобин или некоторые белки
мышц).
Характер чередования аминокислотных
остатков является решающим фактором, пре-
допределяющим возможный характер структур
более высокого порядка. Действительно, фик-
сируя положение, например, остатков цистеина
в полипептидной цепи, первичная структура в
значительной мере предопределяет характер
возможных изгибов этой цепи, которые могут
привести к сближению цистеиновых остатков и
возникновению дисульфидных мостиков (ко-
торые, естественно, и стабилизируют сложив-
шуюся пространственную форму молекулы).
Фиксируя положение гидрофобных радикалов
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
25
в цепи, аминокислотная последовательность
дает информацию о том, как должна быть изо-
гнута эта цепь в пространстве, чтобы неполяр-
ные группы могли сблизиться и вступить в
гидрофобные взаимодействия. То же самое
можно сказать и о роли положения заряженных
радикалов в полипептидной цепи, гидрофиль-
ных радикалов, а также группировок, пригод-
ных для образования водородных связей.
Таким образом, аминокислотная последо-
вательность полипептидной цепи, детермини-
рованная генетически, несет, в свою очередь,
информацию о том, какой может быть вторич-
ная и последующие структуры данного белка.
На основе знания первичной структуры белка
удается даже предсказать возможный характер
высших структур.
1.5.2. ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА
Вторичная структура — это пространст-
венная организация «стержня» полипептидной
цепи. Различают 4 главных варианта вторичной
структуры: а-спираль, коллагеновая спираль,
структура складчатого листа и нерегулярная
цепь.
А.	а-Спираль
Установлено, что «стержень» полипептид-
ной цепи обычно не просто вытянут в про-
странстве, а имеет тенденцию приобретать
спиралеобразную форму. Чаще всего встреча-
ется очень плотная укладка атомов «стержня»,
без пустот внутри спирали. Из-за единообразия
самого «стержня» такая спираль однотипна у
самых разных полипептидов. Она имеет пра-
вую закрученность (по часовой стрелке, если
смотреть с N-концевого торца спирали). На 5
полных ее витков приходится 18 аминокислот-
ных остатков. Диаметр спирали равен 0,50 нм,
а расстояние между соседними витками (шаг
спирали) составляет 0,54 нм. Аминокислотные
радикалы R, присоединенные к а-углеродным
атомам (Са), располагаются не внутри спирали,
а направлены кнаружи от нее, образуя спира-
леобразный ряд боковых «выростов». Поли-
пептидная цепь с такими стандартными харак-
теристиками получила название «а-спираль».
Ее структуру предсказали Л.Полинг и Р.Кори в
1951 г., за 6 лет до того, как были получены
Рис. 1-17. Схематическое изображение а-спирали.
экспериментальные подтверждения (осуществ-
ленные благодаря развитию метода рентгено-
структурного анализа). Схематически а-спи-
раль изображена на рис. 1-17.
Фиксируется структура а-спирали посред-
ством водородных связей, возникающих между
фрагментами «стержня», а именно: между
группой >С=О одного витка и группой H-N<
соседнего витка спирали. Они проходят прак-
тически параллельно оси спирали. Повторяясь
многократно, эти слабые связи достаточно на-
дежно закрепляют спиралеобразную форму
«стержня». Более того, они удерживают а-спи-
26
Глава 1
раль в несколько напряженном состоянии, на-
поминающем немного сжатую пружину.
Б. Коллагеновая спираль
Как отмечено в разделе 1.4.1, наличие ос-
татка пролина нарушает регулярность хода
«стержня» полипептидной цепи. Поэтому в
участках, где есть эта аминокислота, формиро-
вание а-спиралн невозможно. Вместе с тем,
регулярное повторение «пролиновых изломов»
(см. рис. 1-13) способствует возникновению
спиралеобразной структуры с совсем иными
характеристиками. Ее обозначили термином
«коллагеновая спираль», - по названию глав-
ного белка внеклеточного вещества. Полипеп-
тидная цепь коллагена состоит из примерно
1000 аминокислотных остатков, и каждый тре-
тий из них представлен глицином, а каждый
пятый — пролином (еще около 11% приходится
на долю аланина).
В отличие от а-спирали, коллагеновая
спираль имеет не правую, а левую закручен-
ность. А главное — шаг этой спирали (0,95 нм)
почти вдвое больше свойственного а-спирали
(0,54 нм). Иными словами, коллагеновая
спираль растянута гораздо сильнее (рис. 1-18).
Рис. 1-18. Сопоставление а-спирали (А)
и коллагеновой спирали (Б).
Это препятствует формированию водородных
связей между соседними витками. Фиксируется
же вытянутая структура коллагеновой спирали
за счет водородных связей с соседними поли-
пептидными цепями такого же строения. Есте-
ственно, направлены эти связи поперек оси спи-
рали. Формируются они за счет группы >N=H
остатков глицина одной цепи и групп О=С< в
смежных полипептидах.
В.	Складчатый лист.
Наряду с а-спиралью, Л.Полинг и Р.Кори
предсказали в 1951 г. и 0-структуру белковой
молекулы. Она подтверждена эксперименталь-
но и получила названия «структура складчато-
го листа», «0-складчатый слой», «0-слой».
Главная особенность этой структуры заключа-
ется в том, что «стержень» полипептидной це-
пи не закручен в спираль, а почти полностью
растянут. При этом он имеет зигзагообразный
вид. Структуру 0-слоя проще всего можно
представить в виде длинной полоски бумаги,
сложенной в виде гармошки (рис. 1-19). Рас-
стояние между соседними сгибами гофриро-
ванной полоски (ребрами «гармошки») состав-
ляет 0,35 нм. В плоскости листа, находящейся
между двумя ребрами, располагается одна пеп-
тидная группа (все ее четыре атома). На каж-
дой линии сгиба находится очередной
а-углеродный атом. Присоединенный к нему
радикал R всегда направлен в сторону от «гар-
мошки» (т.е., находится вне пространства,
ограниченного «верхними» и «нижними» реб-
рами складчатого листа). Водород при а-угле-
родном атоме находится в пределах «гармош-
ки» (между ее ребрами).
Фиксируется 0-слой водородными связя-
ми, образуемыми группой >С=О одного фраг-
мента полипептидной цепи и группой H-N<
другого аналогичного фрагмента, находящего-
ся в той же плоскости. Упомянутые группы
могут принадлежать разным полипептидным
цепям, расположенным по соседству. Но очень
часто они принадлежат достаточно протяжен-
ным фрагментам одной и той же полипептид-
ной цепи, разделенным нерегулярным участ-
ком молекулы, в пределах которого осуществ-
ляется поворот цепи в обратную сторону.
Фрагменты полипептидной цепи, объединен-
ные водородными связями в 0-складчатую
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
27
Рис. 1-19. Структура складчатого листа (Р-складчатый слой).
структуру, могут иметь одинаковое направление
(от N-конца к С-концу), и тогда их именуют па-
раллельными 0-слоями (цепи А и Б на рис.
1-19). Антипараллельными называют такие
р-складчатые структуры, в которых полипеп-
тидные цепи имеют взаимно противоположное
направление (фрагменты Б и В на рис. 1-19).
Из приведенных количественных характе-
ристик видно, что в р-складчатой структуре
полипептидная цепь еще более растянута, чем
в коллагеновой спирали. В последней а-угле-
родные атомы отстоят друг от друга на 0,29 нм
(по оси спирали), тогда как в p-слое аналогич-
ное расстояние составляет 0,35 нм, т.е., на 20%
больше. В сравнении же с а-спиралью протя-
женность p-слоя в 2,3 раза больше, если сопос-
тавлять отрезки цепи, одинаковые по числу
аминокислотных звеньев.
Г. Нерегулярная цепь.
И спиралеобразные, и Р-складчатые фраг-
менты полипептидной цепи представляют со-
бой примеры периодичной структуры, т.е.,
многократного повторения одного и того же
варианта пространственной укладки «стерж-
ня». Эта упорядоченность довольно жестко за-
креплена водородными связями, расположен-
ными регулярно внутри цепи или между сосед-
ними полипептидами. Вместе с тем, в белковой
молекуле встречаются и такие участки, в пре-
делах которых отсутствует какое-либо едино-
образие в характере взаиморасположения пеп-
тидных фрагментов.
В общем, линейная вытянутость цепи энер-
гетически невыгодна. Прежде всего этому ме-
шают гидрофобные радикалы аминокислотных
фрагментов, ковалентно закрепленные в разных
местах по ходу цепи. Водное окружение стре-
мится уменьшить площадь соприкосновения с
такими неполярными структурами. Этим созда-
ется главная движущая сила, заставляющая по-
липептидную цепь изгибаться в пространстве
так. чтобы многие (если не все) неполярные ра-
дикалы оказались сближенными между собой и
объединились силами гидрофобного взаимодей-
ствия (вытесняя тем самым воду из промежут-
ков между собой). Сложившаяся форма цепи до-
полнительно закрепляется водородными и ион-
ными связями, возникающими в подходящих
для этого участках, а иногда S-S-мостиками.
В итоге ход полипептидной цепи в про-
странстве принимает энергетически наиболее
выгодный вариант. В нем нет каких-либо регу-
28
Глава 1
ляриых повторов. Он различен в разных ами-
нокислотных последовательностях, но всегда
содержит осевые повороты и изгибы полипеп-
тидной цепи, среди которых нередки повороты
типа «шпильки» (см. рис. 1-12). Все это вместе
дает основание для обозначения описанного
варианта вторичной структуры как «нерегу-
лярная цепь». Менее удачны синонимы «хао-
тичный клубок», «аморфный участок», «беспо-
рядочный клубок», хотя и они встречаются в
литературе.
1.5.3.	ТРЕТИЧНАЯ СТРУКТУРА
Третичная структура - это пространст-
венное взаиморасположение спиралеобразных,
^-складчатых и нерегулярных участков поли-
пептидной цепи. Иными словами — простран-
ственная организация полипептидной цепи в
целом, ее архитектура.
Фиксируется третичная структура всеми
типами слабых связей, а нередко - и дисуль-
фидными мостиками. Естественно, у каждого
белка формируется свой, неповторимый облик
третичной структуры (в значительной степени
предопределенный спецификой первичной
структуры).
Можно выделить два главных типа тре-
тичной структуры. Одному из них присуща
плотная укладка полипептидной цепи в малом
объеме пространства. Поэтому молекула в це-
лом приобретает вид округлой частицы - глобу-
лы. Хотя чаще эти частицы имеют довольно вы-
тянутую (эллипсоидную) форму, такие белки,
тем не менее, называют глобулярными (шаро-
образными). Другому типу третичной структуры
свойственна сильная растянутость полипептид-
ной цепи: она приобретает вид нити или волок-
на. Соответственно белки, построенные из таких
цепей, называют фибриллярными.
1.5.4.	ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА
У многих белков молекула построена не из
одной, а из нескольких полипептидных цепей.
Каждую из них называют субъединицей данно-
го белка (реже — протомером). Термином «чет-
вертичная структура» обозначают и сам
факт наличия несколъкиих субъединиц в моле-
куле, и особенности пространственной орга-
низации всей молекулы, включая характер вза-
имного расположения субъединиц и способы их
взаимодействия. Число субъединиц в молеку-
ле, как правило, четное, — обычно 2, 4, 6 или 8,
но иногда достигает 16 или даже 24. У некото-
рых белков молекула построена из совершенно
одинаковых субъединиц, у других — из разных
протомеров. Белки, молекула которых по-
строена из нескольких полипептидных цепей,
называют для краткости олигомерными.
Решающую роль в объединении субъеди-
ниц играет пространственное соответствие со-
прикасающихся поверхностей. Оно обозначает-
ся термином комплементарность (взаимодо-
полнение частей целого). Будучи генетически
запрограммированной в структуре субъединиц,
их комплементарность друг другу обеспечивает
и строгую определенность взаимной укладки
протомеров, и фиксацию возникающей четвер-
тичной структуры слабыми типами связи, а ино-
гда - еще и дисульфидными мостиками. По-
рознь субъединицы не обладают функцио-
нальной активностью, свойственной олигомеру.
В этом - коренное отличие четвертичной струк-
туры от простой ассоциации белковых молекул,
которая тоже встречается нередко и носит
обычно неспецифический характер.
Глобулярные и фибриллярные белки на-
столько различаются по особенностям третич-
ной и четвертичной структур (да и в функцио-
нальном отношении тоже), что можно говорить
о двух типах пространственной организации
белка, точнее - высших структур белковой мо-
лекулы. Их целесообразно рассмотреть по-
отдельности.
1.6.	ВЫСШИЕ СТРУКТУРЫ
ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ
К глобулярным относится большинство
белков. Только в первом приближении их
можно называть шарообразными. На самом
деле поверхность белковых молекул не бывает
ровной и гладкой. Обычным является наличие
более или менее обширных выступов, значи-
тельно видоизменяющих равномерную округ-
лость молекулы. Часто наблюдаются также
различные углубления, впадины («щели»,
«ниши», «карманы»), что ограничивает доступ
внешних объектов к этим зонам и имеет, как
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
29
правило, важное функциональное значение.
Тем не менее, общие контуры молекулы тако-
вы, что ее размеры в разных направлениях раз-
личаются не очень сильно, - обычно не более
чем в несколько раз. Это возможно лишь при
наличии многочисленных изгибов полипеп-
тидной цепи, ход которой в пространстве вы-
глядит поэтому сложным и запутанным; неред-
ко встречаются p-повороты (см. рис. 1-12).
При всей сложности пространственной ор-
ганизации глобулярного белка, его третичная
структура не сводится только к варианту хао-
тичного клубка. Обычно «стержень» полипеп-
тидной цепи формирует короткие отрезки
а-спирали (как правило, не более нескольких
витков) и р-складчатые структуры примерно
такой же протяженности. Концы этих жестких
фрагментов (их «торцы») соединяются не-
регулярными участками единой полипептид-
ной цепи. Благодаря своим изгибам и поворо-
там вспять, эти нерегулярные участки обеспе-
чивают плотную укладку спирализованных и
складчатых фрагментов в округлую форму
глобулярного белка.
1.6.1.	ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ
МИОГЛОБИНА
Расшифровка трехмерной конфигурации
белковых молекул стала возможной благодаря
разработке метода рентгеноструктурного ана-
лиза кристаллов белка. Первым белком, тре-
тичная структура которого была выяснена, ока-
зался миоглобин (рис. 1-20). Он состоит из
С-конец
1
Рис. 1-20. Схема третичной структуры миоглобина.
одной полипептидной цепи, уложенной на-
столько компактно, что внутри образовавшейся
глобулы почти нет «пустот». Почти 80% ами-
нокислотных остатков (118 из 153) участвуют в
формировании 8 а-спирализованных участков
протяженностью от 7 до 24 звеньев каждый.
Остальные 35 аминокислотных остатков обра-
зуют короткие отрезки нерегулярной струк-
туры между концами последовательных спира-
лей. Спирализованные фрагменты уложены
под разными углами друг к другу в трехмерном
пространстве, так что в целом размеры молеку-
лы составляют 4,5x3,5x2,5 нм (если бы вся
цепь была вытянута в виде а-спирали, то ее
длина составила бы 23 нм).
Важно отметить, что на поверхность гло-
булы миоглобина выступают в основном по-
лярные радикалы аминокислот, обеспечивая
гидрофильные свойства всей молекулы в це-
лом. Глубинные же участки заполнены почти
исключительно неполярными радикалами лей-
цина, валина, метионина, фенилаланина и не
содержат заряженных группировок, а также
аспарагина и глутамина. Такое сочетание гид-
рофильной «внешности» макромолекулы с
гидрофобной сущностью спрятанных в глубине
структур очень типично для глобулярных бел-
ков. В этом — еще одно проявление упоминав-
шейся выше даойственности, столь характерной
для молекул живых систем. В обычных услови-
ях глобулярные белки очень хорошо раствори-
мы в воде и ведут себя как вполне гидрофиль-
ные частицы. Однако определенные воздействия
способны нарушать их третичную структуру, и
тогда неполярные радикалы могут выступить на
поверхность, резко изменяя свойства белка, в
том числе — его растворимость.
Удаленные от окружающей воды непо-
лярные радикалы аминокислот не только уча-
ствуют в фиксации индивидуальных черт тре-
тичной структуры. Нередко они важны и для
функционирования белка. Это относится и к
миоглобину, главным предназначением кото-
рого является обратимое связывание О2 с це-
лью его накопления в клетках (наиболее богаты
этим белком мышцы китов, тюленей и дру-
гих млекопитающих, способных долго нахо-
диться под водой). Происходит это связывание
в строго определенном участке поверхности
белка. Здесь имеется впадина (ниша), выстлан-
30
Глава 1
пая неполярными радикалами. В глубине этой
гидрофобной ниши находится молекула небел-
ковой природы — плоская полициклическая
структура гема, в центре которой расположен
атом Fe2+. Четырьмя связями он соединен с
азотом каждого из пиррольных колец гема
(рис. 1-26), а пятой — с азотом гистидинового
радикала полипептидной цепи. Таким образом,
одна из 6 координационных сфер атома железа
остается свободной, и обращена она ко входу в
нишу. Именно в этом месте к Fe2+ обратимо
присоединяется О2- Из-за тесноты ниши моле-
кула кислорода может приблизиться к гему
только одним своим концом и потому неспо-
собна окислять Fe2+ до Fe3+. Воде, содейст-
вующей такому окислению, нет доступа в ни-
шу из-за гидрофобности ее стенок. Отсюда —
устойчивость восстановленного состояния же-
леза миоглобина даже при высоком содержа-
нии кислорода в окружающей жидкости.
1.6.2.	ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ
ГЕМОГЛОБИНА
Многие глобулярные белки обладают чет-
вертичной структурой. При этом каждая субъ-
единица сохраняет основные черты своей тре-
тичной структуры. Соединяются они между
собой слабыми связями, а иногда — и дисуль-
фидными. Как правило, сохраняется и глобу-
лярный характер укрупненной молекулы, т.е.,
ее шарообразная или эллипсоидная форма.
В качестве примера может служить гемогло-
бин. Его молекула построена из четырех субъ-
единиц. Каждая из них очень напоминает мо-
лекулу миоглобина и по характеру третичной
структуры, и по наличию в ней железосодер-
жащего гема. Вместе с тем, есть и существен-
ные различия в первичной структуре. В соот-
ветствии с ними, разные варианты субъединиц
обозначают буквами греческого алфавита а, р,
у и т.д. У взрослого человека гемоглобин эрит-
роцитов представлен почти исключительно
гемоглобином A] (HbAi), который состоит из
двух a-цепей и двух P-цепей. Характер взаим-
ной комплементарности обеспечивает укладку
4 субъединиц относительно друг друга таким
образом, что их центры находятся приблизи-
тельно в вершинах тетраэдра. В целом образу-
ется сферическая структура диаметром около
5,5 нм. При этом между а- и p-цепями возника-
ет множество нековалентных связей. Четыре
гема расположены на расстояниях около 2,5 нм
друг от друга. Как и в миоглобине, железо гема
способно обратимо связывать молекулу О2
(степень окисления железа не изменяется!).
Однако из-за особенностей четвертичной
структуры гемоглобина его сродство к кисло-
роду гораздо меньше, чем у миоглобина. Ины-
ми словами, доступность железа кислороду у
гемоглобина хуже, чем у миоглобина. Поэтому
молекулы О2, присоединившиеся к гемоглоби-
ну при прохождении кровью капилляров лег-
ких (где кислорода много), легко переходят от
гемоглобина к миоглобину, когда кровь прохо-
дит по капиллярам мышц.
Но самое примечательное заключается не
в этом, а в способности субъединиц гемогло-
бина функционировать кооперативно. Коопе-
ративность проявляется в том, что присоеди-
нение кислорода к одной субъединице гемо-
глобина сильно облегчает его связывание с
другими. В цифрах это выглядит так: в резуль-
тате присоединения первой молекулы О2 срод-
ство остальных субъединиц к кислороду воз-
растает в 500 раз! В данном случае имеет место
положительная кооперативность. Она проявля-
ется сигмоидным характером зависимости сте-
пени оксигенации гемоглобина от концентра-
ции кислорода (от его парциального давления в
среде). Миоглобин, не имеющий четвертичной
структуры, этого качества лишен, как это вид-
но на рис. 1-21.
Приведенный пример свидетельствует, что
субъединицы олигомерного белка способны
сильно влиять на функциональные свойства
друг друга. В этом и заключается кооператив-
ное взаимодействие. Оно присуше только оли-
гомерным белкам: изменения конформации
одной цепи, вызванные связыванием подходя-
щей молекулы, однозначно отражаются на
конформационном состоянии других субъеди-
ниц. Эта закономерность распространяется и
на обратный процесс. Так, в случае полностью
оксигенированного гемоглобина потеря одной
молекулы кислорода при снижении рО2 сильно
облегчает отдачу второй и третьей. Кооператив-
тивность проявляется значительным увеличе-
нием наклона в средней части кривой оксиге-
нации гемоглобина (рис. 1-21, Б), которое по-
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
31
Парциальное давление Ог, мм рт.ст.
Рис. 1-21. Зависимость степени оксигенации
миоглобина (А) и гемоглобина (Б) от парциального
давления кислорода (рОг) в окружающем растворе.
называет, что в этом диапазоне резко усилива-
ется присоединение (отдача) кислорода гемо-
глобином в расчете на единицу изменения рО2-
Вследствие этого гемоглобин, почти полно-
стью насыщаясь кислородом в легких (где рО2
составляет около 100 мм рт. ст.), способен от-
давать его в других тканях тем интенсивнее,
чем больше они его расходуют. Лишь четверть
своего кислорода отдает оксигемоглобин при
снижении рО2 наполовину (точнее, до уровня в
40 мм рт. ст., обычного для почти всех тканей),
тогда как дальнейшее уменьшение рО2 всего на
30 мм рт.ст. (типичное для интенсивно рабо-
тающей мышцы) освобождает еще М50% ки-
слорода, заключенного в оксигемоглобине!
Сравнение кислородсвязывающих белков -
миоглобина и гемоглобина — показывает, что
четвертичная структура придает белку новые
функции, не свойственные его субъединицам. В
случае гемоглобина это, прежде всего, транс-
порт кислорода от легких к тканям, — функция,
которую не могут выполнять ни его субъедини-
цы порознь, ни аналогичный им миоглобин (из-
за его слишком высокого сродства к кислороду).
Кроме того, гемоглобин очень чувствителен к
различным влияниям среды. В частности, даже
небольшое (не выходящее за физиологические
пределы) снижение pH или увеличение концен-
трации СО2 сдвигает кривую оксигенации гемо-
глобина вправо, т.е., уменьшает сродство к ки-
слороду, облегчая тем самым его отдачу тканям.
Таким образом, благодаря феномену коо-
перативности олигомерный белок гораздо чув-
ствительнее к внешним влияниям и эффектив-
нее реагирует на них. Обладание четвертичной
структурой усиливает регуляторные возможно-
сти глобулярных белков, повышая их роль в
регуляции и биохимических процессов (моле-
кулярный уровень), и физиологических функ-
ций (на уровне клеток, тканей и всего организ-
ма в целом).
1.7.	ВЫСШИЕ СТРУКТУРЫ
ФИБРИЛЛЯРНЫХ БЕЛКОВ
Фибриллярными называют белки, длина
молекулы которых в десятки и сотни раз боль-
ше поперечных размеров. Сильно вытянутая
форма, очевидно, не может поддерживаться за
счет связей внутри полипептидной цепи, как
это имеет место при формировании а-спирали
(продольные водородные связи) или нерегу-
лярной пепи (слабые типы связей и дисуль-
фидные мостики между достаточно сближен-
ными участками изгибающейся полипептидной
цепи). Отсюда ясно, что нитевидная форма фи-
бриллярных белков может удерживаться толь-
ко посредством поперечных связей с соседни-
ми полипептидами, тоже вытянутыми. Следо-
вательно, в фибриллярных белках третичная
структура приобретает устойчивость лишь бла-
годаря наличию четвертичной структуры. Чаще
всего такие белки являются объединениями
коллагеновых спиралей (коллагены), протяжен-
ных а-спиралей (кератины, тропомиозин) или
р-складчатых полипептидных цепей (фиброин).
Коллагены - семейство белков, фор-
мирующих основу волокнистых структур меж-
клеточного вещества у позвоночных. В сово-
купности они образуют внеклеточный каркас
тела и составляют около 30% от общего коли-
чества белков (примерно 6% всей массы тела
человека). Особенно много их в коже, сухожи-
лиях, хрящевой и костной тканях, в твердых
тканях зуба (кроме эмали).
Структурной единицей коллагеновых во-
локон является молекула тропоколлагена, син-
тезируемого специализированными клетками
соединительной ткани. Она состоит из трех
очень сходных (или даже одинаковых) поли-
пептидных цепей, издавна обозначаемых как
32
Глава 1
a-цепи. Их первичная структура характеризу-
ется многократным повторением тримера
...-гли-про-Х-... почти по всей длине молекулы,
которая может достигать 300 нм. Поэтому, в
отличие от а-спирали (и несмотря на созвучие),
a-цепь складывается в совсем иную спираль -
коллагеновую (см. рис. 1-18, Б). Как отмечено
выше (раздел 1.5.2, Б), удерживается этот ва-
риант вторичной структуры за счет слабых свя-
зей со смежными цепями аналогичного строе-
ния, примыкающих сбоку. Все три левозакру-
ченные коллагеновые спирали, составляющие
молекулу тропоколлагена, имеют параллель-
ную направленность (от N-конпа к С-концу).
Они обвивают друг друга вокруг общей оси,
образуя правозакрученную тройную суперспи-
раль, расстояние между витками которой со-
ставляет 10 нм (рис. 1-22). Вот эта правая за-
крученность коллагеновой спирали с шагом в
10 нм, формируемая в составе суперспирали, и
характеризует третичную структуру каждой от-
дельной a-цепи. И фиксируется она тоже (как и
сама коллагеновая спираль) благодаря наличию
четвертичной структуры.
Толщина суперспирали составляет всего
1,5 нм. Столь высокая плотность укладки обу-
словлена большей растянутостью коллагено-
Рис. 1-22. Тройная суперспираль тропоколлагена
(схема).

вой спирали (в сравнении с а-спиралью),
а главное — изобилием глицина в коллагенах.
Минимальность размеров радикала у этой ами-
нокислоты (состоящего только из атома водо-
рода) и направленность этого радикала к оси
суперспирали позволяет осуществить очень
тесное сближение всех трех субъединиц вдоль
их общей оси. Таким образом, в тесном про-
странстве внутри суперспирали располагаются
только остатки глицина, а кнаружи обращены
громоздкие радикалы остальных аминокислот,
включая пролин, гидроксипролин и лизин.
Плотная скрученность тройной спирали и оби-
лие поперечных связей между субъединицами
делает молекулу тропоколлагена практически
нерастяжимой и очень упругой.
Кератины - это группа внутриклеточных
белков, синтезируемых клетками эпидермиса.
Молекула такого белка тоже состоит из трех
субъединиц. Однако, в отличие от коллагена,
каждая из них являет собой правозакрученную
а-спираль типичного строения, а три таких
спирали закручены влево вокруг общей оси,
образуя суперспирализованную структуру про-
тяженностью порядка 100 нм. Такая суперспи-
ральная укладка каждой единичной а-спирали
может рассматриваться как ее третичная струк-
тура в составе кератина.
Фиксируется четвертичная структура ке-
ратина посредством дисульфидных мостиков
между соседними субъединицами. Этому спо-
собствует обилие радикалов цистеина в иих. Ко-
валентный характер дисульфидных связей и
многократное повторение их по ходу суперспи-
рали делает молекулу кератина очень прочной.
Помимо цистеина каждая а-спираль кера-
тина очень богата такими аминокислотами, как
фенилаланин, валин, аланин, лейцин, метио-
нин. Их неполярные радикалы сосредоточены
на наружной стороне обвивающих друг друга
субъединиц, обеспечивая гидрофобность всей
суперспирали в целом. Поэтому кератин со-
вершенно нерастворим в воде. Очевидно био-
логическое значение этого свойства (как и
прочности), если вспомнить, что молекулы ке-
ратина являются главным (по количеству) ком-
понентом эпидермиса и его производных (во-
лосы, ногти и пр.).
Перечисленные структурные характери-
стики присущи всем а-кератинам. Однако каж-
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
33
дый конкретный белок этой группы имеет свои
особенности, проистекающие прежде всего из
специфики аминокислотного состава молеку-
лы. Например, кератины панциря черепахи
особенно богаты цистеином, составляющим
почти 20% всех аминокислотных остатков. По-
этому здесь особенно много межцепочечных
дисульфидных мостиков, что обеспечивает
особую прочность и жесткость панциря. В ке-
ратинах эпидермиса содержание цистеина го-
раздо меньше, но достаточно для крепкого свя-
зывания субъединиц. Скопления кератиновых
молекул образуют нерегулярную сеть пучков,
контактирующих на уровне десмосом с анало-
гичными сетями соседних клеток. По мере со-
зревания и отмирания клеток эпидермиса
остаются только их кератиновые скелеты, ко-
торые и обеспечивают прочность и водонепро-
ницаемость защитного слоя на поверхности
кожи, а также образование тонкой жировой
пленки, придающей коже водоотталкивающие
свойства. Иначе выглядит пространственная
организация кератинов, составляющих основ-
ную массу волоса. Здесь каждая трехжильная
суперспираль кератина (обозначаемая терми-
ном «протофибрилла») толщиной 2 нм плотно
упакована с десятью такими же молекулами в
длинное цилиндрическое образование - мик-
рофибриллу, диаметр которой составляет 8 нм.
Пучок из сотен параллельных микрофибрилл
формирует более толстую нить - макрофиб-
риллу, множество которых уложено по длине
волоса и составляет почти всю его структуру.
Тропомиозин относится к мышечным
белкам. Он отличается от кератинов, во-
первых, почти полным отсутствием цистеина
и, во-вторых, наличием не трех, а только двух
субъединиц в молекуле. Каждая из них по всей
длине полностью сложена в обычную правую
а-спираль. Обе спирали параллельной направ-
ленности обвивают друг друга, формируя лево-
закрученную суперспираль, которая имеет вид
стержня диаметром 2 нм и длиной 40 нм. Су-
перспираль сильно вытянута: расстояние меж-
ду соседними витками составляет 14 нм (в 26
раз больше, чем в а-спирали). Фиксируется
четвертичная структура тропомиозина только
слабыми типами связи; из-за отсутствия ди-
сульфидных мостиков она не столь жесткая,
как в кератинах.
Двухцепочечная суперспираль, аналогич-
ная тропомиозиновой, содержится и в одном из
важнейших сократительных белков мышц -
миозине. Здесь ее длина достигает 134 нм.
Однако суперспирализация не распространяет-
ся на короткую (немногим более 10 нм)
N-концевую часть молекулы миозина. Более
того, каждая из расплетенных нитей этого кон-
ца нековалентно соединена с двумя небольши-
ми (около 20 кДа) пептидами, формируя вме-
сте с ними глобулярное образование. Таким
образом, четвертичная структура миозина фик-
сирует необычную форму молекулы, в которой
длинная нить («хвост») сочетается с двумя не-
большими глобулярными головками на одном
ее конце. Необычное строение открывает уни-
кальную возможность совмещения в одной мо-
лекуле совершенно разных функций, — в дан-
ном случае структурной и каталитической.
Фибриллярная часть обеспечивает объедине-
ние множества молекул миозина в особые
внутриклеточные структуры, — так называемые
толстые нити мышечного волокна. А глобуляр-
ная головка является ферментом, катализирую-
щим гидролиз молекулы АТФ до АДФ и фосфа-
та. При этом энергия разрыва макроэргической
связи в молекуле АТФ прямо трансформируется
в механическую энергию мышечного сокраще-
ния. В этой трансформации участвуют и другие
мышечные белки (тропомиозин и два глобуляр-
ных белка - актин и тропонин).
Фиброин - это белок, из которого по-
строены нити шелка и паутины. Каждая его
субъединица организована как P-слой, склад-
чатая форма которого фиксируется водород-
ными связями с соседними такими же цепями
(см. рис. 1-19). Вся молекула фиброина почти
целиком состоит из «штабелей» р-складчатых
полипептидов, имеющих преимущественно ан-
типараллельную направленность. Расстояние
между соседними цепями составляет 0,27 нм
(т.е., длину водородной связи >С=О H-N<).
Столь плотная укладка требует, чтобы боковые
радикалы R в каждой цепи имели не слишком
крупные размеры. Так оно и есть: молекула
фиброина на 50% состоит из глицина, а среди
остальных аминокислот цепи сильно преобла-
дают аланин и серин: цистеин и метионин от-
сутствуют полностью. В первичной структуре
каждой субъединицы регулярно повторяется
34
Глава 1
последовательность ...-гли-сер-гли-ала-гли~
ала-..., причем, остатки глицина выступают с
одной стороны складчатого листа, а радикалы
аланина и серина - с другой. Гидрофобным
характером обращенных кнаружи аминокис-
лотных радикалов обеспечивается нераствори-
мость нитей шелка и паутины в воде. Вместе с
тем, минимальность размеров большинства
радикалов R придает этим нитям довольно вы-
сокую гибкость. Наконец, максимальная рас-
тянутость остова полипептидной цепи, свойст-
венная p-слоям, делает нити шелка и паутины
нерастяжимыми.
Таким образом, во всех фибриллярных
белках именно четвертичная структура обеспе-
чивает саму возможность формирования тре-
тичной структуры своих субъединиц, а иногда
необходима и для фиксации их вторичной
структуры (коллагеновая спираль).
1.8.	КОНФОРМАЦИЯ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ
В органической химии широко использу-
ется понятие о конфигурации молекул. Ее
можно определить как пространственное взаи-
морасположение отдельных частей молекулы,
жестко закрепленное ковалентными связями.
В частности, если при атоме углерода имеются
4 различающихся радикала, то взаимное их
расположение в пространстве может иметь
лишь два разных варианта, каждый из которых
является зеркальным отражением другого. Они
не могут переходить друг в друга самопроиз-
вольно, т.к. для этого необходим разрыв одних
ковалентных связей и формирование новых.
Будучи совершенно идентичными по химиче-
ским свойствам, стереоизомеры сходны и по
большинству физико-химических параметров.
Но они могут быть едва ли не антиподами по
своим биологическим качествам.
В отличие от конфигурации, конформация
- это вполне определенное, но не неизменное
(не зафиксированное ковалентно) простран-
ственное взаиморасположение различных
частей молекулы. Четкое понимание этого
особенно важно применительно к белкам. Как
уже отмечалось, две из каждых трех подряд
ковалентных связей в стержне полипептидной
цепи допускают осевое вращение. Это реально
может происходить в нерегулярных участках
цепи. Поэтому любой полипептид теоретиче-
ски может принимать самую различную фор-
му. Ограничений, в общем-то, немного. Во-
первых, при любых изгибах какая-то часть мо-
лекулы не может совмещаться в пространстве с
другой частью («натыкаться» на нее). Во-
вторых, возникновение слабых типов связи
между достаточно сблизившимися частями по-
липептидной цепи будет способствовать фик-
сации всей цепи в соответствующей форме.
Естественно, более устойчивой будет такая
конформация, которая закрепляется наиболь-
шим числом слабых взаимодействий. В соот-
ветствии с конкретным окружением, сущест-
вующим в клетке, полипептидная цепь по мере
ее биосинтеза принимает энергетически наибо-
лее выгодную конформацию, - ту, которая
обеспечивается максимально возможным чис-
лом нековалентных связей (а иногда - и ди-
сульфидных мостиков) при наиболее «удоб-
ной» для этого укладке стержня полипептид-
ной цепи. В другой среде оптимальной может
оказаться иная конформация. Но даже в диапа-
зоне физиологических условий взаимораспо-
ложение частей белковой молекулы может за-
метно варьировать, - уже хотя бы в силу теп-
лового движения. Эта «колеблемость» затраги-
вает преимущественно четвертичную и в ка-
кой-то степени третичную структуру. Подвиж-
ки в конформационном состоянии белка могут
быть вызваны локальными колебаниями pH,
ионной силы и других факторов, влияющих на
слабые типы связи, как это описано в разделе
1.4.3.
Обобщая, можно сказать, что в физиоло-
гических условиях белковая молекула сущест-
вует в нескольких, энергетически наиболее
предпочтительных конформационных состоя-
ниях, между которыми поддерживается дина-
мическое равновесие. Даже очень небольшие
изменения состава среды способны вызвать
определенный сдвиг этого равновесия в сторо-
ну одной из естественных конформаций, при-
чем этот сдвиг легко обратим. Именно обрати-
мые переходы из одного конформационного
состояния в другое составляют механизм
функционирования белковой молекулы (и ши-
ре - молекулярную основу любой физиологи-
ческой функции организма).
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
35
1.9.	УЗНАВАНИЕ И РЕАГИРОВАНИЕ -
ДВЕ ГЕНЕРАЛЬНЫЕ ФУНКЦИИ
БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ
Из предыдущего изложения следует, что не
только рельеф, но физико-химические свойства
поверхности белковой молекулы очень нерав-
номерны. Обычно здесь доминируют полярные
радикалы аминокислот, в большинстве своем
незаряженные. Вместе с тем, на общем фоне
гидрофильной поверхности местами встречают-
ся положительно или отрицательно заряженные
группы, а в некоторых участках (особенно в уг-
лублениях) — неполярные фрагменты или их
скопления. В этом смысле глобулярный белок
напоминает округлое образование, причудливо
раскрашенное четырьмя красками, каждая из
которых, условно говоря, соответствует катион-
ным или анионным группам, гидрофильным или
гидрофобным зонам. Ясно, что белки могут раз-
личаться по размерам, форме и взаиморасполо-
жению «пятен» разного цвета.
Эта важная особенность лежит в основе
избирательности физико-химического взаи-
модействия белка с другими молекулами.
Иными словами, она обеспечивает одну из
наиболее универсальных функций любого бел-
ка: его способность распознавать другие мо-
лекулы. Реализуется эта способность путем
связывания лишь со строго определенными из
них (именуемыми поэтому лигандами данного
белка).
Пояснить это можно так. Любая отрица-
тельно заряженная молекула, оказавшись в
достаточной близости, может образовать ион-
ную связь с одной из положительно заряжен-
ных группировок огромной поверхности белка.
Это взаимодействие очень слабое и легко исче-
зает даже под влиянием кинетической энергии
теплового движения молекул. Кроме того, оно
неспецифично, так как в белке обычно имеется
множество положительно заряженных атомов, а
в окружающей среде встречаются самые разно-
образные вещества с отрицательным зарядом.
Но если в приблизившейся молекуле есть две
заряженные группировки с расстоянием между
ними, равным дистанции между двумя противо-
положными им зарядами на поверхности белка,
то межмолекулярное взаимодействие может
осуществляться уже в двух точках. Поэтому оно
будет и более устойчивым (хотя и ненамного), и
несколько более специфичным. Если же в ли-
ганде окажется еще и, например, гидрофобный
фрагмент в определенном положении относи-
тельно заряженных групп, а в белке - неполяр-
ная зона в аналогичной позиции к заряженным
участкам, то молекула лиганда может связаться
с белком уже тремя своими участками. Такое
соединение будет существенно более устойчи-
вым (но обратимым, как это следует из слабо-
сти нековалентных связей). А главное - оно
приобретает отчетливый характер избиратель-
ности: белок может объединяться только с та-
ким лигандом, в котором взаиморасположение
«опознаваемых» признаков достаточно строго
соответствует рисунку физико-химических ха-
рактеристик в некоторой зоне белковой поверх-
ности. Эту зону называют участком связывания
(сорбции). Он-то и выполняет функцию узна-
вания определенного лиганда. В основе этой ге-
неральной функции - пространственное соот-
ветствие между объединяющимися структура-
ми, их комплементарность (рис. 1-23).
Ясно, что для реализации функции узнава-
ния необходимо достаточное число «опознава-
тельных знаков». Выше упоминалось, что по
качеству их всего четыре: положительный или
отрицательный заряд, гидрофильные или гид-
рофобные «пятна». Для большей точности сле-
2. взаимодействие сильное, специфическое
Рис. 1-23. Соответствие лиганда структуре участка
его связывания (узнавания):
гидрофобные зоны; |	| - гидрофильные
зоны (незаряженные); Ф - положительно заряженные
зоны; Q- отрицательно заряженные зоны.
36
Глава 1
дует добавить еще электроотрицательные ато-
мы (О, N), пригодные для образования водо-
родной связи (см. рис. 1-15). Но важнее даже не
разнообразие набора «маяков» (впрочем, до-
вольно небогатого), а изобилие возможных ва-
риантов их взаимного расположения. Чем об-
ширнее зона комплементарности и чем уни-
кальнее рисунок из разных «опознаваемых
признаков», тем точнее узнавание белком
именно данного лиганда. В качестве аналогии:
знакомое лицо мы легко распознаем даже сре-
ди множества похожих людей (но если часть
лица прикрыта, то узнавание затруднено или
даже невозможно).
Участки, наиболее точно приспособленные
к структуре определенного лиганда, обладают
и наибольшей избирательностью, т.е., правиль-
ностью опознания нужной молекулы. Их назы-
вают поэтому центрами связывания (узнава-
ния). В ходе эволюции природа специально от-
бирала и «шлифовала» такие структуры. Так
появились, например, рецепторы на клеточных
мембранах. Каждый тип рецепторов представля-
ет собой специализированный белок, который из
всего разнообразия окружающих клетку ве-
ществ узнает (и связывает) только молекулы
определенного, например, гормона.
Как правило, в белковой макромолекуле
имеется только один центр узнавания либо не-
сколько, но разных. С другой стороны, такие
центры занимают лишь очень небольшую долю
поверхности белка. Остальной части тоже при-
сущи и особенности рельефа, и причудливое
чередование функциональных группировок.
Выяснив тонкую структуру любого фрагмента,
в принципе возможно синтезировать молекулу,
комплементарную ему и потому способную
сорбироваться здесь. И тогда этот фрагмент
можно назвать участком связывания искусст-
венно синтезированного лиганда.
Детальное изучение функции узнавания
выявило неожиданный факт: между центром
узнавания и лигандом обычно не бывает зара-
нее готового пространственного соответствия,
- такого, какое существует, например, между
замком и ключом к нему. Парадокс был разре-
шен. когда установили, что обычно центр свя-
зывания сформирован радикалами аминокислот,
расположенных в разных участках полипептид-
ной цепи, но пространственно сближенных ме-
жду собой за счет изгибов этой цепи. Стало по-
нятным, что такая организация не случайна. Она
открывает возможность заметных конфор-
мационных подвижек упомянутых радикалов
относительно друг друга, ибо угол каждого из-
гиба (поворота) цепи может изменяться в замет-
ных пределах.
Таким образом, достаточно точное соот-
ветствие центра связывания строению лиганда
формируется лишь в процессе взаимодействия
между ними. Складывается оно по мере их
сближения и реализуется путем постепенного
приспособления центра узнавания к структур-
ным особенностям лиганда. Как показывает
схема на рис. 1-24, в процессе сближения моле-
кула лиганда индуцирует соответствующую
конформационную перестройку центра своего
связывания. Представления о наведенном (инду-
цированном) соответствии подтверждены экс-
периментально и стали общепризнанными. Сле-
дует отметить, что при этом и молекула лиганда
в определенных случаях тоже претерпевает
конформационные изменения (если она на это
способна). Некоторой аналогией феномену на-
веденного соответствия может быть, например,
процедура надевания перчатки: двигая пальца-
ми, мы постепенно натягиваем ее на руку, при-
давая ей форму нашей кисти.
Рис. 1-24. Индуцированное соответствие центра
связывания в белке (Б) структуре лиганда (Л)
[черными прямоугольниками обозначены
гидрофобные зоны].
Пространственные сдвиги в центре узна-
вания — это необходимая, но не единственная
реакция белка на сближение с лигандом. Ока-
залось, что конформационные подвижки рас-
пространяются и на другие части белковой мо-
лекулы. В каждом случае характер такой пере-
стройки различен, но всегда строго закономе-
рен. Его предсказуемость предопределена
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
37
структурами лиганда и центра узнавания, но
главное - особенностями строения всей белко-
вой молекулы. Очень часто изменение конфор-
мации сопровождается «деблокированием» оп-
ределенных фрагментов белка, т.е., переходом
их из скрытого («латентного») состояния в ак-
тивную форму, которая начинает реализацию
своего предназначения. Именно в этом заключа-
ется вторая из генеральных функций белковых
молекул - функция реагирования. Лиганд, свя-
зывание которого приводит к ее осуществле-
нию, часто обозначают термином эффектор.
Таким образом, природа функции реаги-
рования - физико-химический процесс перехо-
да белковой молекулы из одной конформации
в другую. Важно, однако, подчеркнуть строгую
детерминированность ответа: белковая моле-
кула не может (и не должна!) по-разному реа-
гировать на один и тот же внешний сигнал-
команду. И еще один важный аспект — это об-
ратимость процесса реагирования: после де-
сорбции лиганда белок возвращается в исход-
ное состояние и готов к связыванию новой мо-
лекулы эффектора.
В качестве примера можно привести кле-
точные рецепторы. Каждый из них является
белком, пронизывающим плазматическую
мембрану. Внешняя его часть, выступающая на
поверхность клетки, выполняет собственно
рецепторную функцию. Это значит, что она
содержит центр узнавания определенного ве-
щества, — например, гормона. Обратимое свя-
зывание этого лиганда вызывает такую кон-
формационную перестройку, которая охваты-
вает не только трансмембранную часть белка,
но и внутриклеточный фрагмент, переводя его
в функционально активное состояние. Нередко
эта активность сводится к ускорению опреде-
ленной химической реакции, продукт которой
{вторичный посредник) инициирует дальней-
шую цепочку внутриклеточных последствий,
т.е., обеспечивает реакцию клетки на воздейст-
вие гормона (первичного посредника). Таким
образом, происходит не только передача гормо-
нального сигнала в клетку, но и его преобразо-
вание (трансдукция). Прекращение воздействия
гормона (его удаление или разрушение) приво-
дит к возвращению рецептора в исходную фор-
му, в том числе - к переходу внутриклеточного
фрагмента в неактивную конформацию.
Итак, в основе функций и узнавания, и
реагирования лежат физико-химические взаи-
модействия, которые ведут к определенной
конформационной перестройке макромолеку-
лы. В этом смысле они являются наиболее об-
щими, универсальными функциями, присущи-
ми каждому белку (хотя и в различной степе-
ни). Поэтому их удобно называть генеральны-
ми функциями белковой молекулы. Конкрет-
ные проявления функции реагирования вообще
очень многообразны, но они строго однознач-
ны, жестко регламентированы для каждого
данного белка. У фермента это - ускорение
химических превращений определенного ве-
щества (субстрата), у иммуноглобулинов - ко-
манда на уничтожение конкретного чужерод-
ного вещества, у клеточных рецепторов - пе-
редача внешнего сигнала внутрь клетки, у фо-
торецептора - преобразование энергии фотона
в энергию нервного импульса, у сократитель-
ных белков - укорочение либо расслабление
мышечного волокна, и так далее. Все эти кон-
кретные ответы называют обычно биологиче-
скими функциями соответствующих белков.
1.10.	НАТИВНОСТЬ БЕЛКА
И ЕГО ДЕНАТУРАЦИЯ
Нативность - это тот уникальный
комплекс физических, физико-химических и
биологических свойств, который присущ бел-
ковой молекуле в ее естественном, природном
(нативном) состоянии. Например, для белков
хрусталика глаза (кристаллинов) понятие на-
тивности включает высокую прозрачность об-
разуемых ими структур.
Денатурация - это необратимая ут-
рата белком его нативных свойств. В основе
ее лежит грубое и необратимое изменение чет-
вертичной, третичной, а иногда и вторичной
структуры. Важно подчеркнуть: первичная
структура при этом остается неизменной. Дру-
гими словами, химически белковая молекула
остается прежней. Но пространственная органи-
зация ее нарушена настолько, что резко изме-
няются многие физико-химические свойства, а
главное - полностью утрачиваются биологиче-
ские качества. Например, сильно прогретые
зерна не могут прорасти, сваренное яйцо тоже
бесполезно класть в инкубатор, а яичный белок
38
Глава 1
при этом из прозрачной тягучей жидкости пре-
вращается в плотную белую массу. Хотя хими-
ческий состав остается прежним, включая со-
хранность первичной структуры всех белков
(при разрыве хотя бы одной пептидной связи
белковая молекула исчезает, превращаясь в две
другие, а это уже выходит за рамки понятия
«денатурация»).
Здесь необходимо одно уточнение. Оно
связано с тем, что денатурация - это не одномо-
ментный «перескок» из нативной формы белка в
денатурированную- Обычно она представляет
собой более или менее плавный переход из од-
ного состояния в другое. Начальные стадии та-
кого процесса могут быть обратимыми. Если на
этих стадиях прекратить денатурирующее воз-
действие, то молекула белка может самопроиз-
вольно вернуться в нативное состояние. В таких
случаях часто употребляют термин «ренатура-
ция». Удобный из-за своей краткости, этот тер-
мин, тем не менее, не вполне точен, ибо создает
впечатление обратимости полной денатурации.
На самом деле обращение возможно лишь в
случаях незавершенной денатурации, — пока
процесс не перешел грань необратимости изме-
нений высших структур белковой молекулы.
1.11.	КОЛЛОИДНОЕ СОСТОЯНИЕ БЕЛКА
Водные растворы некрупных молекул
(глюкоза, аминокислоты и т.п.) обычно про-
зрачны (даже если они имеют окраску, как, на-
пример. растворы перманганата или йода). Та-
кие растворы называют истинными, или опти-
чески пустыми, так как они не рассеивают про-
ходящий через них свет. Если же частицы
(молекулы) растворенного вещества имеют
размеры, сопоставимые с длиной волны види-
мого света, то они мешают беспрепятственно-
му прохождению лучей через раствор, отражая
в стороны часть фотонов. Такой раствор назы-
вается коллоидным- В проходящем свете он
выглядит мутным. Если в затемненной комнате
пропустить солнечный луч через сосуд с кол-
лоидным раствором, то ход луча в нем можно
наблюдать со стороны в виде расширяющегося
конуса (явление Тиндаля). Феномен светорас-
сеяния используют в целях определения кон-
центрации коллоидных частиц в растворе. Для
этого с помощью фотоэлемента регистрируют,
какая доля пропускаемого через коллоидный
раствор света рассеивается в стороны, - на-
пример, в направлении, перпендикулярном хо-
ду луча (метод нефелометрии).
Размеры белковых молекул составляют
чаще всего от 2-5 до 100 нм, а иногда и боль-
ше. Поэтому белки неспособны давать истин-
ных растворов, а могут формировать только
коллоидные. Однако, чтобы эта возможность
стала реальностью, необходимы какие-то фак-
торы, которые удерживали бы белок в колло-
идном состоянии, препятствуя выпадению
столь крупных частиц в осадок.
1.11.1.	ФАКТОРЫ СТАБИЛИЗАЦИИ БЕЛКА
В КОЛЛОИДНОМ СОСТОЯНИИ
Среди факторов, способ ньгх препятство-
вать чрезмерному сближению белковых моле-
кул, их «слипанию», наиболее универсальными
являются два: гидратная оболочка и электро-
статический заряд. Оба они обусловлены при-
родными свойствами белков.
Гидратная оболочка представляет со-
бой слой молекул воды, определенным обра-
зом ориентированных вокруг молекулы белка.
Толщина слоя зависит от степени гидрофиль-
ности белковой поверхности. Иными словами,
белки являются- гидрофильными коллоидами.
Вода гидратных оболочек находится в динами-
ческом равновесии с окружающей их свобод-
ной водой. Несмотря на постоянный обмен мо-
лекулами между ними, гидратная оболочка как
таковая существует постоянно. Она как бы
принадлежит белку, а входящая в нее вода об-
ладает особыми свойствами. В частности, она
отличается пониженной температурой замер-
зания, в ней не растворяются соли и другие
хорошо растворимые вещества.
Заряд белковой молекулы проистекает из
ее свойств амфотерного полиэлектролита (см.
раздел 1.2.2). В зависимости от соотношения
ионизируемых групп, изоэлектрическая точка
(pl) у разных белков находится обычно в пре-
делах pH от 4 до 8, но иногда выходит за эти
рамки (табл. 1-2).
Чаще всего преобладают карбоксильные
группы, и поэтому у таких белков pl < 7. К ним
относятся, в частности, белки плазмы крови.
Поскольку pH плазмы обычно составляет при-
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
39
Таблица t-2
Изоэлектрическая точка (pl) некоторых белков
Наименование белка	Pl
Тропоэластин	-13
Салмин	- 12
Цитохром с	10.6
Рибонуклеаза	7,В
Миоглобин	7,0
Гемоглобин	6.9
у-Глобулин	6,3
Карбоксипептидаза	6,0
Альбумин плазмы крови	5,6
Фибриноген	5,5
Уреаза	5,1
Яичный альбумин	4,6
Статерин слюны	4,2
Дентинный фосфофорин	1.1
Пепсин	< 1
мерно 7,36 (т.е., выше, чем pl этих белков), то в
каждой белковой молекуле число отрицатель-
ных зарядов весомо преобладает над числом
положительно заряженных групп. Следова-
тельно, в целом белковая молекула ведет себя
как отрицательно заряженная частица. Одно-
именные заряды, как известно, взаимно оттал-
киваются. Это препятствует слиянию белковых
частиц и тем самым способствует поддержа-
нию коллоидного состояния. При подведении
pH среды к значению pl растворенного белка
устойчивость коллоидного раствора станет ми-
нимальной и будет определяться только степе-
нью выраженности гидратной оболочки. Если
же каким-либо воздействием удалить еще и
гидратную оболочку, то произойдет осаждение
белка из коллоидного раствора.
1.11.2.	СПОСОБЫ НЕОБРАТИМОГО
ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКА
Необратимое осаждение белка всегда яв-
ляется следствием его денатурации. Наиболее
распространенным способом денатурации яв-
ляется нагревание (кипячение). При этом уси-
ливается тепловое движение молекул, в том
числе - подвижность отдельных частей белка
относительно друг друга. Происходящее ослаб-
ление и даже разрыв слабых типов связей при-
водит к увеличению масштабов этих сдвигов. В
результате нарушаются высшие структуры бел-
ка - четвертичная, третичная и даже вторичная.
Легче всего это происходит с глобулярными
белками. Полипептидная цепь теряет свою упо-
рядоченность, ее клубок разворачивается. Как
следствие, на поверхность начинают выступать
и гидрофобные структуры, ранее «замаскиро-
ванные» в глубине молекулы. Это ведет к тому,
что белковая молекула теряет свою безусловную
гидрофильность и лишается гидратной оболоч-
ки. Поскольку нагревают белковый раствор
обычно вблизи изоэлектрической точки, то и
заряд белковой молекулы при этом отсутствует
или не очень значителен. В отсутствие обоих
факторов стабилизации белковые молекулы мо-
гут сближаться друг с другом, формируя круп-
ные конгломераты (хлопья), видимые глазом.
Их образованию способствует и неупорядочен-
ное, хаотичное замыкание слабых типов связи,
уже не только внутри молекулы, но и между
развернутыми полипептидными цепями. Поя-
вившиеся хлопья укрупняются и оседают, осо-
бенно при последующем охлаждении раствора.
Достаточное прогревание растворов белка
всегда ведет к денатурации. Однако осадок об-
разуется не всегда. Если нагревание проводить
в щелочной или в сильно кислой среде, то бе-
лок все равно денатурируется и утрачивает
гидратную облочку, но сохраняет свой заряд
(очень значительный в среде, далекой от pl).
Поэтому выпадения белка в осадок не проис-
ходит даже после охлаждения раствора. Но это
будет уже коллоидный раствор денатуриро-
ванного белка, стабилизированный только
электрическим зарядом каждой частицы. Убе-
диться в этом легко: при добавлении к охлаж-
денному раствору соответственно кислоты или
щелочи наступает образование осадка, усили-
вающееся по мере приближения pH раствора к
pl растворенного белка.
Устойчивость к нагреванию очень различ-
на у разных белков. Некоторые из них денату-
рируются уже при 50-60°С, другие — только
при более высокой температуре (например, при
80°С), а есть и такие, которые устойчивы даже
в кипятке. Все зависит от стабильности внут-
римолекулярной организации белка, особенно
от плотности его пространственной упаковки,
характера и обилия нековалентных связей. Эти
различия иногда используют в эксперимен-
тальной практике. Например, при 56°С в тече-
ние 30 мин полностью денатурируется компо-
40
Глава 1
нент Clq - один из белков системы компле-
мента, сосредоточенных в плазме крови и иг-
рающих незаменимую роль в механизмах им-
мунохимической защиты организма. Два дру-
гих белка этой системы — фактор В и компо-
нент С2 - денатурируются и тоже полностью
теряют биологическую активность в результате
20-мин. прогревания при 50°С. Прогрев сыво-
ротку крови в том или ином режиме, можно
получить реагент, лишенный нативной формы
соответствующего компонента комлемента и
не способный осуществлять иммунный лизис
клеток. Если к такому реагенту добавить пор-
цию интересующей исследователя сыворотки,
то литическая активность вновь станет прояв-
ляться. По количеству исследуемой сыворотки,
необходимому для этого, можно судить о со-
держании в ней того компонента, активность
которого отсутствует в использованном реа-
генте. Описанный способ широко применяется
в биохимии и иммунологии: несмотря на тех-
нические трудности, он несравненно проще и
доступнее любого другого метода количест-
венного определения индивидуального белка в
столь сложной белковой смеси, каковой явля-
ется любой биологический объект.
Дифференцированная денатурация белков
прогреваниием используется и в одном из
способов консервирования пищевых продуктов
- пастеризации. Предложенный Л.Пастером,
он заключается в кратковременном (15-30 мин)
выдерживании, например, молока при темпе-
ратуре 60-70°С. В таких условиях главный бе-
лок молока (казеиноген) сохраняет свою на-
тивность, тогда как некоторые белки микробов
денатурируются, что препятствует размноже-
нию микрофлоры и удлиняет сроки сохранно-
сти пищевого продукта (в стерильных, разуме-
ется, условиях).
Помимо тепловой обработки, известны и
другие способы необратимого осаждения бел-
ка. Нередко они сопряжены с химическим пре-
образованием белковых молекул, что уже вы-
ходит за рамки понятия «денатурация». Обыч-
но речь идет о сильно действующих реагентах:
крепкие растворы серной и других сильных
кислот, щелочей, ряда органических веществ
(пикриновая и сульфосалициловая кислоты,
фенол, некоторые алкалоидные реактивы). Од-
нако один из таких способов следует рассмот-
реть подробнее. Это - осаждение белков соля-
ми тяжелых металлов (Hg, Pb, Си и другие).
Они легко образуют прочные связи с некото-
рыми функциональными группами белковых
молекул, особенно с группами -SH. В результа-
те происходит грубая и необратимая деформа-
ция белка — его денатурация. Важно подчерк-
нуть, что эффект наступает даже при очень
низких концентрациях таких солей. Поэтому-
то они и ядовиты. Особенно сулема - хорошо
растворимый хлорид ртути. Острое отравление
ими угрожает самой жизни. При попадании
таких ядов через рот обычное промывание же-
лудка нежелательно, т.к. создает условия для
лучшего их всасывания в пищеварительном
тракте. Лучше всего быстро ввести в желудок
раствор какого-нибудь белка (нативного!): мо-
локо, белок сырого яйца, сыворотку или плаз-
му крови, наконец. Катионы тяжелых металлов
окажутся прочно связанными с белками, после
чего можно промывать желудок. При хрониче-
ском отравлении малыми дозами денатуриро-
ванные белки быстро расщепляются фермента-
ми клеток, а освободившиеся катионы тяжелых
металлов оказывают свое денатурирующее воз-
действие на новые белковые молекулы. И эта
последовательность повторяется снова и снова.
Отсюда - длительная задержка катионов тяже-
лых металлов в организме, трудность их выве-
дения и кумулятивный эффект повторных доз.
1.11.3.	СПОСОБЫ ОБРАТИМОГО
ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКА
Обратимость осаждения достигается при-
менением «мягких» воздействий. Обычно ис-
пользуют водоотнимающие средства, - веще-
ства с выраженной гидрофильностью, способ-
ные «притязать» на воду гидратной оболочки.
Если это осуществлять в среде, не очень дале-
кой от pl осаждаемого белка, то удается устра-
нить оба фактора стабилизации коллоидного
состояния и получить осадок, в котором белок
сохраняет свои нативные свойства. В качестве
водоотнимающих средств можно применять,
например, этанол или ацетон. Осаждающее
действие они проявляют в концентрациях,
достаточных для их растворения не только в
свободной воде, но и в воде гидратных оболо-
чек. Образующийся осадок белка следует быст-
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
41
ро отделить от надосадочной жидкости. Это не-
обходимо для предотвращения денатурирующе-
го действия органических растворителей: оно
развивается несколько медленнее, чем водоот-
нимающее, и обусловлено их внедрением в гид-
рофобные структуры белковых молекул.
Указанного недостатка органических рас-
творителей лишены способы высаливания бел-
ка. Так называют осаждение его под действием
высоких концентраций нейтральных солей ще-
лочных или щелочноземельных металлов, -
таких как NaCl, Na2SO4 или подобный им
(NH4)^O4. Они очень хорошо растворимы в
воде, но при этом не влияют существенно на
pH среды и, следовательно, на заряд белковых
молекул. В коллоидной системе добавляемые
соли растворяются прежде всего в свободной
воде. Когда концентрация соли в ней становит-
ся достаточно высокой, между белком и солью
начинается конкуренция за обладание водой
гидратных оболочек. Исход этого состязания
зависит, с одной стороны, от степени гидро-
фильности осаждаемого белка и, с другой сто-
роны, от степени гидрофильности и от концен-
трации используемой соли. Чем меньше срод-
ство данной соли к воде, тем более высокая
концентрация ее необходима для осаждения
белка. Например, осаждение глобулинов сыво-
ротки крови происходит при полунасыщении
раствора сульфатом аммония, но лишь при
полном насыщении хлоридом натрия. Альбу-
мины, составляющие (по массе) более полови-
ны всех белков сыворотки, осаждаются лишь
при полном насыщении раствора сульфатом
аммония (и не осаждаются хлоридом натрия).
Это свидетельствует об очень высокой гидро-
фильности альбуминов.
Убедиться в обратимости высаливания
легко. Достаточно уменьшить концентрацию
соли в растворе. Этого можно достичь, напри-
мер, путем диализа или добавлением воды.
Осадок белка при этом вновь перейдет в рас-
твор. А главное - белок сохранит свои натив-
ные свойства, в том числе присущую ему био-
логическую активность (ферментативную, гор-
мональную и т.д.).
Важная особенность высаливания заклю-
чается в том, что по достижении критичной
концентрации соли в осадок переходят «вдруг»
сразу все молекулы соответствующего белка.
Если в растворе содержатся и другие белки (бо-
лее гидрофильные), то они остаются в коллоид-
ном состоянии. Для их осаждения необходимо
повысить концентрацию соли в растворе. Мож-
но осуществить это после отделения предыду-
щего осадка (например, центрифугированием).
Отсюда становится очевидной возможность
дробного осаждения белков. Имеется в виду
осаждение и отделение сначала наименее гид-
рофильных белков, затем все более и более гид-
рофильных. Так можно разделить сложную
смесь белков на ряд порций (фракций). Каждая
из них представляет собой обычно группу инди-
видуальных белков, сходных по выраженности
гидрофильных свойств. Для дальнейшего разде-
ления белков любой из фракций можно исполь-
зовать не гидрофильность, а какое-либо из дру-
гих физико-химических свойств макромолекул.
Одно из ранних применений метода выса-
ливания в медицине - очистка лечебных сыво-
роток (антисывороток). Получают антисыво-
ротку путем иммунизации животных опреде-
ленным инфекционным агентом (например,
дифтерийным токсином). Полученная сыворот-
ка крови иммунизированного животного со-
держит антитела к этому агенту (антигену).
Парентеральное введение ее человеку оказыва-
ет лечебный эффект при соответствующем за-
болевании (в приведенном примере - при диф-
терии). Однако лечебная сыворотка помимо
антител содержит большое количество других
белков. В ответ на эти чужеродные белки у че-
ловека развиваются иммунные реакции, кото-
рые могут обесценить лечебный эффект анти-
сыворотки. Поскольку все антитела содержатся
во фракции глобулинов, то отделение их путем
высаливания хотя бы от альбуминов дает воз-
можность наиболее простого получения очи-
щенной антисыворотки. Позднее было уста-
новлено, что глобулины - это тоже смесь раз-
нородных белков, а антитела сосредоточены
только в сравнительно небольшой фракции у-
глобулинов. Были разработаны более сложные
приемы очистки, которые позволяют получать
именно эту фракцию, наиболее безопасную в
плане побочных эффектов.
Высаливание пригодно не только для раз-
деления белковых смесей. Его применяют и
для осаждения индивидуальных белков, пред-
варительно отделенных от всех других. Опре-
42
Глава 1
деленный режим высаливания очищенного
белка позволяет осадить его из раствора в кри-
сталлической форме, которая свидетельствует
о максимальной степени очистки. К тому же,
именно кристаллы необходимы для проведе-
ния рентгеноструктурного анализа, открывше-
го возможность изучения пространственной
организации белковой молекулы, включая
оценку количественных параметров вторичной
и более высоких структур.
Достижения техники позволили разрабо-
тать еще один способ обратимого осаждения
белков. Он заключается в вымораживании бел-
ковых растворов в условиях вакуума. При этом
осуществляется замораживание раствора, а за-
тем сухое испарение (возгонка) льда. По суще-
ству, это уже не осаждение белка, а его высу-
шивание («лиофильная сушка»). Многие белки
полностью сохраняют при этом свои нативные
свойства. Растворением сухого порошка можно
восстановить его исходное коллоидное состоя-
ние. В сухом виде препараты белка сохраняются
гораздо дольше (особенно, на холоде и при со-
блюдении стерильности). Из-за хорошей рас-
творимости в воде их часто называют лиофили-
зированными препаратами. В таком виде вы-
пускаются теперь различные белковые вещест-
ва, применяемые в медицине (гормоны белко-
вой природы; многие ферментные препараты;
фибриноген и другие белки плазмы крови).
1.12.	РАЗДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА БЕЛКОВ
Почти любой биологический объект - от
слюны и плазмы крови до цитозоля и над-
молекулярных структур - представляет собой
сложную, многоликую смесь разнообразных
белков. Все они обладают практически одина-
ковым набором химических свойств. Поэтому
традиционные методы химии (например, хи-
мическая реакция со специфическим реаген-
том) непригодны для выделения и очистки ин-
дивидуального белка. Они позволяют лишь
обнаружить наличие некоторых химических
группировок (аминогруппа, дисульфидная
связь и т.д.), каковые, как оказалось, есть прак-
тически у всех белков. Невозможность получе-
ния достаточно очищенных препаратов разных
белков длительное время сдерживала изучение
их строения и индивидуальных свойств. Про-
блема эта постепенно решалась по мере разви-
тия методов (и соответствующей аппаратуры),
которые позволили использовать даже не-
большие различия в физико-химических и фи-
зических особенностях разных белков. Однако
и до сих пор не существует какого-либо уни-
версального метода, который позволял бы в
один прием получать любой белок в высоко-
очищенном состоянии. Необходимо проводить
разделение и очистку в несколько последова-
тельных этапов. На каждом из них использует-
ся наиболее подходящий из известных методи-
ческих приемов. Принципиальные основы не-
которых из них изложены выше (избиратель-
ная денатурация, дробное фракционирование
высаливанием или путем использования неко-
торых органических растворителей). Осталь-
ные методы можно свести в 3 группы: ультра-
центрифугирование; электрофорез; хромато-
графия.
1.12.1.	УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
Первую высокоскоростную центрифугу
создал в 1923 г. шведский ученый Т. Сведберг.
С ее помощью он установил молекулярную
массу гемоглобина (68 кДа). За эти работы
ученый был удостоен Нобелевской премии
1926 г. Конструкция прибора постепенно со-
вершенствовалась, и современные ультрацен-
трифуги обеспечивают скорость вращения ро-
тора до 80 000 об/мин. Центробежная сила при
этом в сотни тысяч раз превышает силу земно-
го тяготения. В этих условиях белковые моле-
кулы (вместе со своими гидратными оболоч-
ками) постепенно оседают на дно центрифуж-
ной пробирки. Естественно, скорость оседания
тем выше, чем крупнее частицы белка. По этой
зависимости можно рассчитать молекулярную
массу белка. Кроме того, смесь белков можно
разделить на фракции: во время центрифугиро-
вания постепенно формируется зона наиболее
крупных частиц (самая удаленная от оси враще-
ния центрифуги), тогда как менее крупные бел-
ки образуют зоны, продвигающиеся медленнее.
Разработаны и иные варианты метода
ультрацентрифугирования. Например, седи-
ментационное равновесие. В этом случае ско-
рость вращения ротора должна быть сравни-
тельно небольшой, а продолжительность про-
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
43
цедуры измеряется обычно не часами, а днями.
В конечном счете устанавливается равновесие
между оседанием белковых частиц и процес-
сом их диффузии, которая противодействует
оседанию. По скорости достижения равновесия
можно рассчитать молекулярную массу белка.
Преимуществом этого способа является неза-
висимость результатов от степени гидратации
белка (т.е., «толщины» гидратной оболочки).
Еще один вариант — центрифугирование в гра-
диенте плотности. В этом случае в центрифуж-
ную пробирку помещают слои раствора с раз-
ной плотностью (например, растворы сахарозы
разной концентрации). Наибольшей она долж-
на быть у дна пробирки, наименьшей - в верх-
ней части. Затем сверху осторожно наслаивают
исследуемый белковый раствор. При ультра-
центрифугировании белки распределяются по
слоям в соответствии с плотностью частиц
(белковая молекула плюс гидратная оболочка).
Сыграв важную роль в истории науки,
ультрацентрифугирование теперь имеет огра-
ниченное применение. В основном оно исполь-
зуется для исследования очищенных препара-
тов индивидуальных белков с целью изучения
размеров, формы и степени гидратации натив-
ных белков. Для разделения смесей применя-
ются другие способы, более простые и эконо-
мичные, а главное - с большей разрешающей
способностью.
1.12.2.	ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Методы электрофореза основаны на реги-
страции движения заряженных частиц в элек-
трическом поле к аноду (анионы) или к катоду
(катионы). Скорость продвижения прямо зави-
сит от величины заряда частицы и от напряжен-
ности электрического поля, но обратно пропор-
циональна сопротивлению трения. Электрофо-
рез оказался очень эффективным средством раз-
деления белков. Во-первых, потому, что сум-
марный заряд молекулы различен у разных бел-
ков, ибо зависит от соотношения катионных и
анионных групп (которое характеризуется вели-
чиной pl, - см. табл. 1-2). Во-вторых, этот заряд
можно изменять в широких пределах, применяя
буфер с заданным значением pH.
Первым применил электрофорез для раз-
деления белков А. Тизелиус (1937 г.), удосто-
енный в 1948 г. Нобелевской премии. С тех пор
было разработано множество модификаций
метода, в том числе - для применения в клини-
ческих лабораториях.
Технология метода обычно состоит в том,
что небольшую порцию исследуемой белковой
смеси наносят на подходящую подложку (но-
ситель), пропитанную буферным раствором, и
пропускают через нее постоянный электриче-
ский ток. Проще всего в качестве подложки
использовать полоску бумаги. Концы ее опус-
кают в сосуды с тем же буферным раствором, в
один из которых помещают катод, а в другой —
анод электрической цепи. Во избежание пере-
грева и денатурации белка следует обеспечить
достаточное охлаждение системы. После за-
вершения процедуры разгонки носитель высу-
шивают и обрабатывают подходящим красите-
лем на белок. Белковые фракции обнаружива-
ются в виде окрашенных полос, если анализи-
руемая проба была нанесена на подложку в
виде поперечной полоски. Направление и дли-
на пробега от старта зависят от характера и
величины заряда белков каждой фракции, а
также от pH буфера.
Высокая разрешающая способность мето-
да электрофореза ярко проявилась в работах
Л. Полинга и его сотрудников. В 1949 г. они
обнаружили, что при одном из наследственных
заболеваний — серповидноклеточной анемии —
гемоглобин отличается по своей электрофоре-
тической подвижности от гемоглобина здоро-
вых людей. Выявление особой формы белка
при врожденной патологии породило новый
термин - «молекулярная болезнь». Дальней-
шими исследованиями установлена суть гене-
тического дефекта. Оказалось, что в каждой из
одинаковых половин молекулы гемоглобина,
состоящих из 287 аминокислотных остатков,
имеет место одна-единственная замена (вслед-
ствие точечной мутации соответствующего ге-
на): глутаминовая кислота в положении 6 р-це-
пи гемоглобина заменена валином. Следова-
тельно, вся молекула аномального белка со-
держит не 60, а только 58 кислотных групп
(при сохранении всех 92 группировок, способ-
ных диссоциировать по типу основания). Этого
очень небольшого различия оказалось доста-
точно для выявления его методом электрофо-
реза! Успехи в изучении молекулярных основ
44
Глава 1
серповидноклеточной анемии стимулировали
бурное развитие нового направления - молеку-
лярной патологии. К настоящему времени
только для гемоглобина человека обнаружено
более 150 аномальных вариантов. К счастью,
лишь несколько из них вызывают болезнь.
Развитие техники электрофореза привело к
разработке более совершенных модификаций.
Важной вехой явилось создание нового препа-
рата - полиакриламидного геля (ПААГ). Варь-
ируя условия его синтеза, легко регулировать
размеры пор этого геля и даже создавать гра-
диент пористости. Тем самымгеоздана основа
для проведения электрофореза не только на
поверхности носителя, но и в его толще (в мас-
се пористого геля). Это увеличивает влияние
размеров молекул белка на скорость их про-
движения. Стало возможным ие только разде-
лять белковые смеси, но и определять молеку-
лярную массу белков каждой фракции.
Следующим важным шагом оказалась раз-
работка серий специальных амфолитов (их на-
звали амфолинами). Они представляют собой
близкие по строению низкомолекулярные ве-
щества, различающиеся по величине изоэлек-
трической точки. При электрофорезе каждое из
них занимает то место в пространстве между
электродами, которое строго соответствует ве-
личине его pl (так как именно в этом участке
амфолин электронейтрален). Тем самым созда-
ется градиент pH. Каждый белок концентриру-
ется при электрофорезе в той зоне градиента,
pH которой совпадает с величиной pl данного
белка. В результате достигается очень четкое
распределение белков в соответствии со значе-
ниями их изоэлектрических точек. Отсюда и
название метода - изоэлектрофокусирование.
Наиболее высокой разрешающей способ-
ностью при разделении природных белковых
смесей обладает метод двумерного электрофо-
реза, разработанный в 1975 г. В данном вари-
анте процедуру электрофореза осуществляют
сначала в одном направлении, а затем - в на-
правлении, перпендикулярном первому. При
этом стремятся сочетать разные модификации
электрофореза. Например, сначала производят
изоэлектрофокусирование, а затем - разделе-
ние по величине молекул в пористом ПААГ.
В качестве второй стадии можно использовать
и иммуноэлектрофорез, который осуществля-
ется в геле, содержащем поливалентную анти-
сыворотку (смесь антител к разделяемым бел-
кам). Эффективность двумерного электрофоре-
за видна из следующего сопоставления. В сы-
воротке крови содержится более 100 белков.
При электрофорезе на бумаге их удается раз-
делить на 5, а в ПААГ - примерно на 20 фрак-
ций. Применение же двумерного электрофоре-
за позволяет получить свыше 30 фракций.
Аналогичным методом полипептидные цепи
клеточных белков кишечной палочки удалось
разделить почти на 2 000 фракций!
1.12.3.	ХРОМАТОГРАФИЯ
В самом начале XX века М.С.Цвет, рабо-
тавший тогда в Санкт-Петербурге, установил,
что зеленый цвет листьев растений обусловлен
наличием не одного, а нескольких разных пиг-
ментов. Выявить это удалось путем разделения
красящих веществ, оказавшихся очень близки-
ми по строению и свойствам. Исследователь
применил разработанный им совершенно не-
обычный метод. В длинную стеклянную труб-
ку с фильтром у нижнего отверстия помещает-
ся взвесь порошка мела в водной фазе. После
оседания частиц излишек жидкости следует
аккуратно удалить через нижнее отверстие,
т.е., пропуская ее через всю колонку до тех
пор, пока над осадком не останется очень тон-
кий водный слой. Затем в верхнюю часть труб-
ки аккуратно наслаивается раствор, получен-
ный при экстрагировании зеленых листьев
петролейным эфиром. При открывании нижне-
го отверстия жидкость из колонки вновь начи-
нает вытекать. По мере ее убыли следует по-
стоянно доливать растворитель (или иную под-
ходящую жидкость), не давая обнажиться
верхнему слою мела. Окрашенный экстракт,
проходя по колонке с током пропускаемой
жидкости (элюента), постепенно разделяется
на несколько окрашенных полос. В описанном
опыте М.С.Цвета быстрее всего продвигалась
полоса желтой окраски (обусловленной нали-
чием каротина). Затем, все более отставая, сле-
довала еще одна зона желтой окраски (прису-
щей содержащимся здесь ксантофиллам). На-
конец, медленнее всего перемещались зеленый
и желто-зеленый участки, которые содержали
два разных варианта хлорофиллов. Каждый из
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
45
разделенных слоев можно изолировать и из-
влечь содержащиеся в нем компоненты (в дан-
ном случае - окрашенные) для дальнейшего
изучения их структуры и свойств.
Поскольку изначально метод М.С. Цвета
был применен для разделения окрашенных ве-
ществ, ему дали название хроматография (от
греческого «хромое» — цвет). Почти полвека
понадобилось, чтобы он оказался востребован-
ным. Мощный стимул этому дали успехи в раз-
работке способов определения первичной
структуры белка. Для их реализации надо было
уметь получать очищенные препараты индиви-
дуальных белков. Принцип хроматографии
оказался для этого наиболее подходящим, тем
более что он обеспечивает нативность полу-
чаемых белковых препаратов. Быстро было
разработано множество модификаций. Главные
из них различаются характером используемого
носителя (неподвижной фазы). Благодаря это-
му теперь можно фракционировать сложную
смесь молекул по их величине (гель-фильт-
рация, или метод молекулярных сит), соотно-
шению ионогенных групп (ионообменная хро-
матография), способности удерживаться на
тех или иных адсорбентах (адсорбционная хро-
матография), распределению в несмешиваю-
щихся жидкостях (распределительная хро-
матография).
Хроматографическое разделение можно
осуществлять не только в колонках, но и на
полосках бумаги или тонкого слоя иного носи-
теля (тонкослойная хроматография).
Самой высокой избирательностью от-
личается аффинная хроматография (хромато-
графия по сродству). Для ее проведения ис-
пользуют носитель, к которому прочно (кова-
лентно) присоединен лиганд белка, подлежа-
щего очистке. Например, аналог субстрата при
выделении соответствующего фермента. Или
антиген - при выделении специфичных к нему
антител. Важным преимуществом этого спосо-
ба является возможность за один прием выде-
лить из сложной смеси нужный белок: пропус-
тив белковый раствор через колонку и отмыв
ее подходящим элюентом от неспецифически
связавшихся примесей, снимают затем избира-
тельно задержанный белок с помощью ве-
ществ, влияющих на слабые связи между ним и
фиксированным на колонке лигандом.
1.13.	НОМЕНКЛАТУРА И КЛАССИФИКАЦИЯ
БЕЛКОВ
Разделение белков и их изучение началось
за много десятилетий до того, как были уста-
новлены полипептидная природа этих молекул и
другие детали их устройства. Поэтому названия
вновь открываемых белковых веществ склады-
вались произвольно, по усмотрению первых ис-
следователей: амилаза, пепсин, трипсин, катала-
за, бычий альбумин, овальбумин (альбумин ку-
риного яйца), глобулин, миозин и т.д.
Отсутствие номенклатурной системы в
обозначении белков сохраняется до сих пор,
несмотря на колоссальные успехи и изобилие
возможностей в изучении строения этих мак-
ромолекул. По-прежнему учитываются обычно
лишь источник получения выделенного белка и
свойство, по которому он обнаружен; иногда
принимают во внимание самые яркие струк-
турные особенности. Поэтому очень часто воз-
никают разные названия для одного и того же
белка, и все они аккуратно перечисляются в
справочной литературе (правда, обычно отме-
чается наиболее предпочтительное). Бывают и
попытки переименования. Так, лет 40 тому на-
зад была обнаружена способность сыворотки
крови подавлять ферментативную активность
очищенного трипсина. Действующим началом
оказался белок из фракции сц-глобулинов. По-
этому новому ингибитору дали название аг
антитрипсин. Позднее было установлено, что
он угнетает активность и многих других проте-
олитических ферментов, но особенно эффекти-
вен в отношении эластазы нейтрофилов. Кон-
центрации, в которых он присутствует в крови,
достаточны для инактивации именно эластазы,
но не других протеиназ. Поэтому некоторое
время его называли антиэластазой. Поскольку
такое название сильно сужало действительный
спектр эффектов этого белка, его стали имено-
вать di-протеиназным ингибитором. Однако и
этот термин не стал общепринятым, ибо дан-
ный ингибитор отнюдь не универсален, а угне-
тает только протеиназы трипсиноподобного
действия. В итоге предпочтительным осталось
исходное наименование - оц-антитрипсин.
Трудности в создании рациональной сис-
темы обозначения (номенклатуры) различных
белков имеют объективную основу. Они обу-
46
Глава 1
словлены громадным разнообразием их строе-
ния. С одной стороны, все белки - это поли-
пептиды, обладающие абсолютно одинаковым
строением ковалентного стержня молекулы.
С другой стороны, необозримые вариации со-
отношения и порядка чередования боковых
аминокислотных радикалов R делают практи-
чески невозможной систематизацию по этому
признаку. Тем более, что небольшие различия
в аминокислотной последовательности зачас-
тую почти не сказываются на пространствен-
ной организации макромолекулы, но могут вы-
звать нарушение ее функционирования.
Все это затрудняет не только разработку
общих правил наименования белков, но и со-
здание научно обоснованной классификации
белковых молекул. Тем не менее, усилия в
этом направлении продолжаются. Нацелены
они на поиск структурных особенностей, кото-
рые помогли бы объективно подразделять бел-
ки на определенные группы или классы.
В поисках таких «знаковых» примет было
установлено, что нередко часть полипептидной
цепи (насчитывающая обычно от 50 до 150
аминокислот) состоит из нескольких коротких
участков а-спирали и/или ^-складок, форми-
рующих компактное образование глобулярного
характера. Плотность упаковки обеспечивается
изгибами нерегулярных отрезков цепи (пере-
мычек). Существует немного устойчивых ти-
пов таких образований (модулей), которые по-
вторяются, с некоторыми вариациями, в самых
разных белках. Для обозначения такого обо-
собленного элемента структуры используют
термин домен (в буквальном переводе - некая
область, участок). Он представляет собой ти-
повую укладку жестких элементов (спирапизо-
ванных и/или складчатых), соединенных ко-
роткими перемычками нерегулярного характе-
ра. Иными словами, это уже не вторичная
структура, но еще не третичная (поскольку
охватывает только часть молекулы). Поэтому
домены относят к числу вариантов так назы-
ваемой надвторичной структуры.
Вообще-то, домен - это термин, который и
исходно не отличался однозначностью. Со
временем он стал еще менее определенным,
более «размытым», в том числе из-за употреб-
ления в иных смысловых значениях, понятных
только в контексте. В частности, многие белки
содержат коллагеноподобный домен. Он не
складывается в компактную глобулу, но и на
коллагеновую a-цепь похож довольно отда-
ленно - главным образом, изобилием радика-
лов глицина и пролина. Поэтому его иногда
называют не доменом, а коллагеноподобным
регионом. Примером может служить фермент
ацетилхолинэстераза, в которой коллагенопо-
добный фрагмент «привязывает» каталитиче-
ские субъединицы к базальной мембране си-
напсов. Со временем термин «связывающий
домен» стали применять даже в тех случаях,
когда структурные основы избирательности
связывания еще не ясны. Так возникли назва-
ния гепарин-связываюгфцй домен, фибрин-
связывающий и т.д.
Одинаковые домены могут встречаться в
пределах одной полипептидной цепи, будучи
разделенными достаточно длинными участка-
ми нерегулярной структуры. Такие белки на-
зывают мультидоменными. Нередко в белке
имеются разные домены (модули); это находит
отражение в терминах «модульное строение
белка» и «мозаичный белок».
Существует и другой подход к системати-
зации белков. Он основан на выявлении общ-
ности их происхождения в ходе развития жи-
вой материи.
Семейство — это группа родственных бел-
ков, появившихся в результате эволюции об-
щего прародительского гена. Нередко эволю-
ционное расхождение достигает такой степени,
что возникает серия обособившихся семейств,
составляющих суперсемейство.
Хорошим примером является суперсемей-
ство глобинов. Оно объединяет большую груп-
пу гем-содержащих белков, которые обеспечи-
вают связывание и/или транспорт Ог. Часть из
них свойственна животным (например, гемо-
глобины и миоглобины позвоночных), тогда
как другие встречаются только в растениях или
у бактерий.
Другой пример - суперсемейство лекти-
нов. Так называют белки, имеющие центр свя-
зывания строго определенных углеводных ком-
понентов, в том числе - ковалентно включенных
в другие белки (например, в рецепторы). Откры-
тые поначалу в семенах бобовых, лектины ока-
зались широко распространенными и в растени-
ях, и в животном мире. По характеру центра
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
47
распознавания и связывания углеводов выделя-
ют 2 главные группы: семейство лектинов
С-типа и семейство лектинов S-типа. Последние
называют еще галектинами - из-за высокой из-
бирательности к р-галактозцдным структурам.
Их углевод-связывающий центр обязательно
содержит гексапептцдную последовательность
...-трп-гли-арг-глу-глу-арг-..., в которой арги-
нин в третьей позиции нередко заменен на се-
рин, глутамат или пролин, а в шестой - на ли-
зин или аспарагин. Недавно установлено, что
одни из галектинов (LEG8) специфичен для ра-
ковой опухоли предстательной железы (увели-
чения его в сыворотке не наблюдается при доб-
рокачественной гиперплазии).
Несмотря на общее свойство лектинов -
высокое сродство к определенным углеводам -
конкретные функции у индивидуальных бел-
ков этого суперсемейства очень различны.
Многие из них выполняют роль клеточных ре-
цепторов, иные участвуют в обеспечении про-
цессов экзоцитоза или фагоцитоза. Встречают-
ся и такие, которые обладают ферментативной
активностью (в частности, протеолитической).
Уникальную группу составляют аквапорины.
Эти лектины формируют в клеточной мембра-
не особые каналы, избирательно пропускаю-
щие воду (по градиенту осмотического давле-
ния). В таком белке сочетаются внеклеточные,
трансмембранные и цитоплазматические до-
мены (поэтому аквапорины нередко относят к
семейству трансмембранных белков).
Исследование структурно-функционал ь-
ных признаков сходства и различия белковых
молекул пока еще не привело к созданию чет-
ких и ясных основ классификации белков. Од-
нако оно показало неубедительность система-
тизации их по биологическим функциям (белки
ферментные, регуляторные, транспортные, за-
щитные, токсические, рецепторные и т.д.), по-
скольку такое деление совсем не совпадает с
распределением белков по семействам или по
специфике их доменов. Например, некоторые
белки осуществляют ферментативную деток-
сикацию опасных продуктов, тогда как другие
защитные белки не только не являются фер-
ментами. но и сильно различаются между со-
бой по строению и механизмам действия.
И самое важное: многие белки можно назвать
мультифункциональными, т.е., имеющими не
единственное предназначение. Так, амилаза
слюны не очень-то и нужна в своем качестве
фермента (гидролизующего крахмал), но игра-
ет важную роль в неспецифическом связыва-
нии микроорганизмов, а также в формировании
защитной пленки на зубной поверхности.
Вследствие описанных сложностей, до на-
стоящего времени находит применение доволь-
но несовершенная систематизация белков, воз-
никшая век тому назад. В соответствии с нею
все белки подразделяют на простые (построен-
ные только из аминокислот) и сложные (содер-
жащие еще и другие компоненты). Первые
группируют на основе их' физико-химических
свойств (иногда - с указанием на локализацию в
клетке или организме). 'Сложные белки разли-
чают по строению небелкового компонента.
1.13.1.	ПРОСТЫЕ БЕЛКИ (ПРОТЕИНЫ)
В течение многих десятилетий простые
белки подразделяли на «спаренные» группы:
альбумины и глобулины; гистоны и протами-
ны; проламины и глютелины. Причиной тому
были не только черты сходства, но и совпаде-
ние природной локализации белков каждой
пары. И еще: все эти белки являются глобуляр-
ными. Остальные белки долго не поддавались
изучению известными методами. Поэтому их
относили к отдельной группе, которую обозна-
чали как «протеиноиды» («белковоподобные»)
или «склеропротеиды» (белки соединительной
ткани). Теперь эти названия стали анахрониз-
мом и заменены более однозначным термином
- фибриллярные белки. Характеристика их
приведена в разделе 1.7, и поэтому здесь пой-
дет речь только о глобулярных белках.
Альбумины н глобулины - широко рас-
пространенные белки, нередко сопутствующие
друг другу. Так, в плазме крови человека
содержится обычно 35-55 г/л альбумина,
а остальные 25-40 г/л представлены глобули-
нами.
Альбумины составляют довольно немного-
численную группу очень сходных белков. Мо-
лекула их состоит из одной полипептидной
цепи небольших размеров (до 70 кДа), содер-
жащей мало триптофана и метионина, но бога-
той цистеином и заряженными радикалами,
особенно анионными. Обилием дисульфидных
48
Глава 1
мостиков обеспечивается стабильность белка,
включая устойчивость к нагреванию до почти
80°С. Альбумины обладают высокой гидро-
фильностью (их гидратная оболочка составля-
ет 30% от массы белка) и потому трудно под-
даются высаливанию (см. раздел 1.11.3). Они
легко связывают ионы кальция, магния, меди,
никеля, ртути и им подобные, а также различ-
ные органические вещества. В частности, выс-
шие жирные кислоты способны сорбироваться
на катионных группах белка. Наступающие
при этом конформационные изменения сопро-
вождаются раскрытием гидрофобных карма-
нов, в каждом из которых довольно прочно
фиксируется углеводородная часть жирной ки-
слоты. Молекула альбумина может удерживать
до 6 молекул жирных кислот. В результате бе-
лок становится более кислым (р! достигает
значения 4,8 вместо р! = 5,6 у обезжиренного
альбумина). Связывание жирных кислот спо-
собствует сорбции и других неполярных со-
единений (стероидные гормоны, билирубин,
многие лекарственные препараты). Тем самым
альбумины выполняют роль резервуара для
сорбируемых веществ и участвуют в их пере-
носе с током крови.
Будучи низкомолекулярным белком, аль-
бумин довольно легко проникает в ткани
(а затем и обратно), так что общее количество
этого белка вне сосудов даже больше, чем в
крови (у взрослого человека - соответственно
230 и 150 г). За время существования молекулы
(в среднем 27 дней) она успевает примерно
15 раз «посетить» межклеточные пространства.
Синтезируется альбумин плазмы клетками пе-
чени (около 14 г в сутки).
Белки, сходные с альбумином плазмы кро-
ви, обнаружены также в молоке (лактальбу-
мин) и птичьих яйцах (овальбумин). Первый из
них синтезируется в молочной железе как ре-
гуляторная субъединица фермента, обеспечи-
вающего синтез лактозы, а в составе молока
выполняет роль Са2+-связывающего белка.
Второй является главным протеином яичного
белка и способен подавлять активность проте-
олитических ферментов.
Глобулины, в отличие от альбуминов,
представляют собой обширную группу очень
разнообразных белков, молекулярная масса
которых превышает 150-200 кДа, а у некото-
рых достигает 700 кДа (макроглобулины). Их
неоднородность выявляется уже при дробном
высаливании. Методы электрофореза, приня-
тые в клинико-биохимических лабораториях,
позволяют разделять белки сыворотки крови на
альбумины и 4 фракции глобулинов, которые
обозначаются как аг, а2-, р- и у-глобулины.
Самой крупной и наиболее гетерогенной явля-
ется последняя фракция: в ней сосредоточены
фибриноген, многие факторы свертывания
крови, а также почти все разнообразие раства-___ -
римых антител, которые теперь обозначают
как иммуноглобулины. В семенах растений то-
же выявляются отдельные глобулины, но они
сильно отличаются от глобулинов животного
мира и выполняют, судя по всему, роль пита-
тельного резерва.
Гистоны и протамины - это белки, со-
средоточенные почти исключительно в ядрах
клеток. Они содержат много аргинина и лизина
(до 25% в гистонах и около 70% в протами-
нах). Поэтому самой яркой чертой этих белков
является щелочной характер (высокое значение
pl), придающий им способность довольно
прочно связываться с полианионами, - такими,
как молекулы дезоксирибонуклеиновой кисло-
ты (ДНК).
Гистоны различаются по величине моле-
кул (от 11 до 21 кДа), по степени преобладания
катионных аминокислот над анионными (в
2-6 раз), по другим особенностям состава. В
наиболее крупных гистонах (Н1) лизин резко
преобладает над аргинином и содержится мно-
го аланина, хотя в целом доля неполярных
аминокислот минимальна (около 10%). Преоб-
ладание лизина невелико в гистонах Н2А и
Н2В, первые из которых богаты лейцином,
а вторые - серином и совокупностью неполяр-
ных радикалов (24%). Наконец, «аргининовые»
гистоны, в которых этой аминокислоты на
20-40% больше, чем лизина, различаются по
обилию глутамата (Н3) или глицина (Н4). Со-
всем не содержат гистоны триптофана и, как
правило, цистеина. Вообще, эти белки чрезвы-
чайно консервативны: по первичной структуре
большинства из них даже растения почти не
отличаются от животных.
Общей чертой гистонов является поляри-
зация первичной структуры: преобладание ка-
тионных радикалов в N-концевой части моле-
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
49
кулы и неполярных - в С-концевой (в группе
Н1 - наоборот). Молекулы гистонов (кроме Н1)
легко взаимодействуют друг с другом, образуя
димеры, которые объединяются в октамеры.
Протамины — ограниченная группа очень
небольших белков (< 5 кДа), выявленных впер-
вые в зрелой сперме некоторых рыб. В ядрах
клеток они замещают собой гистоны во время
гаплоидной фазы сперматогенеза. Наиболее
изученные представители (салмин и клупеин
из молок соответственно семги и сельди) со-
держат в своей молекуле 30-32 аминокислоты,
из которых 20-21 приходятся на долю аргини-
на. Домен подобия салмину выявлен в некото-
рых крупных белках, включая ряд ферментов
митохондрий. В последнее время ряд протами-
нов идентифицирован и у млекопитающих,
включая человека, причем, не только в ядре, но
и в полирибосомах.
Проламины н глутелины - белки расти-
тельного происхождения. Больше всего их со-
держится в зернах злаков, где они выполняют
роль запаса питательных веществ, используе-
мых при прорастании семян. От других белков
отличаются растворимостью в присутствии
70-80% этанола. Различные проламины содер-
жат много глутамина (до 30%) и пролина
(10-15%), а также цистеина, за счет которого
образуются внутрицепочечные дисульфидные
связи. Типичным для глутелинов является мно-
гократное повторение последовательности
...-про-про-про-гис-вал-лей-..., а иногда - еще
и наличие домена, состоящего из двух подряд
последовательностей .. .-гл н-про-гис-про-цис-
про-цис-глн-... (глутелин из зерен кукурузы).
В заключение следует отметить, что по
мере изучения простых белков выяснялось, что
многие из них содержат и небелковые компо-
ненты. Так, большинство глобулинов (если не
все) содержит углеводный или липидный
фрагмент. То же установлено и для некотороых
проламинов и глутелинов.
Наконец, гистоны и протамины, как прави-
ло, существуют в виде комплексов с нуклеино-
выми кислотами. Тем не менее, традиция разли-
чать перечисленные группы белков сохраняется
до сих пор, особенно в целях обозначения физи-
ко-химических свойств белковой части сложных
белков.
1.13.2.	СЛОЖНЫЕ БЕЛКИ
(УСТАРЕЛОЕ НАЗВАНИЕ - ПРОТЕИДЫ)
Для обозначения небелковой части моле-
кулы сложного белка принят термин просте-
тическая группа. Если соединение с белком
осуществляется не ковалентными, а слабыми
типами связей, то ее обычно называют кофак-
тором. Белковую часть молекулы сложного
белка обозначают как апопротеин. В зависи-
мости от строения простетической группы,
принято различать следующие группы слож-
ных белков:
-	фосфопротеины;
—	гликопротеины;
—	липопротеины;
-	нуклеопротеины;
-	хромопротеины;
-	металлопротеины.
Фосфопротеины несут в себе остатки
фосфорной кислоты (Н3РО4). С белком она со-
единяется ковалентно, образуя сложноэфир-
ную связь с радикалом серина, треонина, реже
- тирозина. В физиологических условиях обе
свободные гидроксильные группы фосфата
почти полностью диссоциированы, придавая
белковой молекуле сильный отрицательный
заряд. Этот новый «опознавательный знак»
может оказаться необходимым для узнавания
определенного лиганда или, напротив, «отпу-
гивать» его. Но наиболее важным эффектом
является изменение конформации белковой
молекулы, которое может сильно повлиять на
интенсивность ее функционирования. Поэтому
природа широко использует такую простую ре-
акцию - фосфорилирование (или дефосфорили-
рование) - для управления активностью фер-
ментов, преобразования (трансдукции) внешних
сигналов внутри клетки и вообще для регулиро-
вания многих функций. Конкретные примеры
будут рассмотрены в дальнейшем изложении.
Иногда в молекуле белка имеется множе-
ство фосфатных остатков. Это относится, в ча-
стности, к казеину - главному белковому ком-
поненту молока. С фосфатными группами лег-
ко связываются ионы Са2+. Поэтому казеин не-
редко рассматривают как транспортную форму
кальций-фосфата. Аналогичную роль играет
фосвитин яичного желтка, который содержит
50
Глава 1
до 10% фосфора. В костной ткани и зубах
фосфопротеины участвуют в процессе отложе-
ния кристаллов фосфорнокальциевых солей.
Гликопротеины названы так по наличию в
их молекуле хотя бы одного углеводного фраг-
мента. Присоединяется он к белку за счет своего
полуацетального гидроксила. Иными словами,
формируется не сложноэфирная (как в фосфо-
протеинах), а гликозидная связь. Для ее образо-
вания апопротеин «предоставляет» обычно гид-
роксильную группу серина или треонина
(О-гликозидное соединение), но нередко - амид-
ную группу радикала аспарагина (N-гликозид-
ное связывание). Изобилуя кислородом, угле-
водные компоненты усиливают гидрофильные
свойства поверхности белковой молекулы.
Простетическая группа редко бывает
представлена одним моносахаридом (обычно
это L-фукоза, D-глюкоза или N-ацетил-В-
глюкозамин, присоединяемые О-гликозидной
связью). Как правило же, апопротеин несет на
себе одну или несколько олигосахаридных це-
почек, насчитывающих до 20 моносахаридных
звеньев. Концы этих цепочек могут быть раз-
ветвлены, образуя «усики» («антенны»). Ино-
гда на этих «усиках» бывают фосфатные груп-
пы. В состав гликопротеина часто входят раз-
ные как О-, так и N-олигосахариды.
Хотя в природе обнаружено около 200 мо-
носахаридов, практически только 8 из них ис-
пользуются для построения олигосахаридных
цепочек гликопротеинов (рис. 1-25). Этого, од-
нако, вполне хватает, чтобы обеспечить огром-
ное разнообразие гликановых фрагментов. Оно
используется при построении клеточных рецеп-
торов, а также для обеспечения избирательности
белок-белковых взаимодействий и специфично-
сти контактов клеток между собой и с внекле-
точными белками. Еще одна важная функция
углеводных цепочек заключается в защите сво-
их апопротеинов от разрушения ферментами
протеолиза на путях миграции этих белков
внутри клетки, их сортировки и секреции, пре-
бывания вне клеток. Именно поэтому гликопро-
теинами являются почти все внеклеточные бел-
ки, включая глобулины плазмы крови.
В гликопротеинах белковая часть молеку-
лы обычно сильно преобладает над углевод-
ной. Гораздо позже были обнаружены макро-
молекулы с обратным соотношением этих
компонентов. Их назвали протеогликанами.
Углеводы здесь представлены неразветвлен-
ными полисахаридными цепями длиной в де-
сятки и даже сотни моносахаридных звеньев.
Как и в гликопротеинах, одним своим концом
гликановая цепь присоединена к апопротеину
О-гликозидной связью (иногда - N-гликозид-
ной). Обычно в молекуле протеогликана со-
держится от 50 до 200 полисахаридных цепей,
а нередко — еще и множество олигосахаридных
НОСНг	НОСНг	НОСНг
D-Глюкоза	D-Галактоза	D-Манноза
НОСНг
н NH2
Глюкозамин
(2-амино-О-глюкоза)
(М-Ацетил)галактозамин
L-Фукоза
(6-дезокси-1_-галактоза)
R= Н-С-ОН
н-с-он
I
СНгОН
(М-Аиетил)нейраминовая
кислота
Рис. 1-25. Моносахариды и их производные, обнаруживаемые в олигосахаридных цепочках гликопротеинов.
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
51
фрагментов. В итоге совокупная масса глика-
нов превышает (иногда - очень значительно)
массу белкового компонента. Это и стало кри-
терием для разграничения гликопротеинов и
протеогликанов.
Со временем, однако, этот критерий утра-
тил свою однозначность. С одной стороны,
оказалось, что ряд протеогликанов содержат
лишь несколько полисахаридных цепей, так
что белковая часть в них сильно преобладает.
С другой стороны, недавно установлено, что
муцин (главный белок слизистых выделений),
хотя и содержит до 90% углеводов, не имеет в
своем составе полисахаридных цепей: вся его
небелковая часть представлена только олиго-
сахаридами. Стало ясным, что принадлежность
к протеогликанам определяется наличием по-
лисахаридных цепей, а не долей углеводов в
молекуле. Почти все протеогликаны сосредо-
точены в межклеточном веществе, поэтому де-
тали их строения будут рассмотрены в главе
«Соединительная ткань» (раздел 10.3.3.).
В настоящее время все чаще употребляют
термин «гликоконъюгаты» для общего обозна-
чения и гликопротеинов, и протеогликанов.
Липопротеины резко выделяются среди
всех других белков. Причиной тому является
высокая гидрофобность небелкового компо-
нента. Иногда он представлен нейтральными
жирами (триацилглицеролами), но чаше - бо-
лее сложно устроенными липидами, в составе
которых, впрочем, тоже преобладают неполяр-
ные структуры.
Подробно строение липидов будет рас-
смотрено в главе 3. А пока отметим лишь одну
особенность: нековалентный характер соеди-
нения липидов со своими белками (их теперь
часто обозначают как аполипопротеины).
Определенный вклад в такое объединение мо-
гут вносить ионные и водородные связи, фор-
мируемые с участием полярного фрагмента
липидных молекул. Но главную роль играют
гидрофобные взаимодействия липида с непо-
лярными зонами белка. Остальной (гидрофиль-
ной) частью молекулы аполипопротеин «мас-
кирует» гидрофобную природу ассоциирован-
ного липида, создавая для него возможность
существования в водной среде. Амфифиль-
ность липопротеинов позволяет им соединять-
ся в надмолекулярные образования, под гид-
рофильной поверхностью которых складиро-
вано значительное количество липидов. Благо-
даря этому, липопротеины обеспечивают транс-
порт липидов от мест их образования (печень)
или поступления в организм (кишечник) к мес-
там депонирования (жировые клетки) или ути-
лизации. При электрофорезе большинство
транспортных липопротеинов плазмы крови об-
наруживается во фракциях а- и р-глобулинов.
Еще более значимую роль играют липо-
протеины в качестве исполнителей многих из
важнейших функций биологических мембран, 
обязательным компонентом которых они яв- l
ляюгся (раздел 3.2.2).
Нуклеопротеины представляют собой не-
ковалентные комплексы нуклеиновых кислот с
гистонами (реже - с протаминами). В каждом
таком комплексе множество белковых молекул,
прочно соединяясь с длинной цепью нуклеино-
вой кислоты, вносит решающий вклад в про-
странственную организацию «своей» простеги-
ческой группы. Учитывая уникальность биоло-
гической роли нуклеиновых кислот, их строе-
нию и механизмам функционирования специ-
ально посвящена следующая глава.
Хромопротеины («цветные белки») своей
окраской обязаны простетической группе.
В зависимости от ее строения, различают ге-
мопротеины и флавопротеины.
Гемопротеины содержат конструкцию из
4 пиррольных колец, лежащих в одной плоско-
сти и объединенных метенильными мостиками
в большое порфириновое кольцо (рис. 1-26),
внешний контур которого представляет собой
систему сопряженных двойных связей. Цен-
тральное место в нем занимает атом металла,
соединенный со всеми четырьмя азотами пир-
рольных колец. В молекулах гема (которому
кровь обязана своим красным цветом) таким
атомом является железо. Хлорофиллы содер-
жат магний и различаются боковыми радика-
лами порфиринового кольца; эти зеленые пиг-
менты участвуют в поглощении света и ис-
пользовании его энергии для проведения реак-
ций фотосинтеза.
В гемопротеинах животного организма
чаще всего встречается гем b (именно его фор-
мула показана на рис. 1-26). Он входит в состав
упоминавшихся гемоглобина и миоглобина,
обеспечивающих перенос кислорода кровью и
52
Глава 1
Рис. 1-26. Строение гема Ь.
Примечание: в молекуле формилпорфирина (гем а)
вместо метильной и винильной групп в положениях 8 и 2
находятся соответственно формильный остаток -С(О)Н
и изопреноидная цепь -СН(ОН)-[СН2-СН2-СН-С(СН3)]з-СНз
накопление его миоцитами (раздел 1.6). В этих
молекулах железо всегда двухвалентно. Введе-
ние в кровь даже «мягких» окислителей чрева-
то опасностью появления метгемоглобина, ко-
торый отличается от гемоглобина только сте-
пенью окисления железа гема (Fe3+), но, тем не
менее, непригоден для транспорта кислорода.
С другой стороны, в некоторых белках
особенности строения апопротеина и его со-
единения с гемом обеспечивают поддержание
окисленного состояния железа. От этого зави-
сит активность таких ферментов, как каталаза
и пероксидаза. Оба они разрушают пероксид
водорода, обезвреживая тем самым этот опас-
ный метаболит (см. раздел 5.5.2).
Наконец, гем b входит в состав и некото-
рых цитохромов - внутриклеточных фермен-
тов, участвующих в переносе электронов от
окисляемых веществ в конечном счете на ки-
слород. Впрочем, другие цитохромы содержат
гем о, немного отличающийся от гема b строе-
нием боковых радикалов порфиринового коль-
ца. Несмотря на эти различия, специфика всех
цитохромов заключается в переменной валент-
ности железа гема: принимая электрон, оно
восстанавливается до Fe2+, а отдавая его затем
на очередной цитохром (или на молекулу ки-
слорода), вновь переходит в окисленное со-
стояние (Fe3+).
Все эти примеры показывают, что именно
белковая часть молекулы гемопротеинов «дик-
тует», как именно использовать возможности
простатической группы: либо просто для
транспорта и накопления молекул кислорода,
либо для вовлечения в различные окислитель-
но-восстановительные реакции, связанные с
переносом электронов.
Растительные магнийпорфирины, несмот-
ря на заметные отличия от гема, тоже участву-
ют в метаболических превращениях кислорода.
В самых общих чертах это выглядит так: вме-
сте со своими апопротеинами хлорофиллы
обеспечивают захват фотонов и утилизацию их
энергии для расщепления воды до О2 и атомов
водорода; последние, в свою очередь, исполь-
зуются в сложных системах хлоропластов для
восстановления молекул СО2 до моносахари-
дов (например, глюкозы).
Здесь уместно отметить, что порфирины
пищевых продуктов не могут всасываться в
кишечнике. Поэтому в ходе биогенеза гемо-
протеинов в нашем организме необходимые
для иих простатические группы должны синте-
зироваться из более простых веществ. При
этом атом железа включается лишь на заклю-
чительной стадии, после завершения биосинте-
за порфиринового кольца.
На молекулу гема очень похож витамин
В12 (кобаламин). Фактически это группа ве-
ществ, однотипность которых обусловлена на-
личием частично восстановленного порфири-
нового кольца с атомом кобальта в его центре
(лиганды при этом атоме бывают разными).
Такого рода структура содержится в небелко-
вой части ряда ферментов (их называют коба-
мидными). Несмотря на значительное сходство
с гемопротеинами, ферменты этой группы уча-
ствуют не в процессах биологического окисле-
ния, а преимущественно в реакциях внутри- и
межмолекулярного переноса метильных и не-
которых других группировок. Всасывание ви-
тамина В12 в кишечнике обеспечивается осо-
бым гликопротеином желудочного сока, име-
нуемым внутренним фактором.
Флавопротеины содержат в составе про-
статической группы рибофлавин (витамин В2).
На рис. 1-27 показана фосфорилированная фор-
ма этого витамина, который представляет собой
полициклическое азотистое основание флавин с
присоединенным к нему пятиатомным спиртом
рибитолом (продукт восстановления моносаха-
рида рибозы в положении 1). Этот рибофлавин-
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
53
Рис. 1-27. Строение флавин моно нуклеотид а
(рибофлави н-5’-фосфат)
5'-фосфат чаще обозначается как флавинмоно-
нуклеотид (ФМН) и является простейшим вари-
антом простатических групп флавопротеинов.
Во всех таких группах роль реактивного центра
выполняет азотистый гетероцикл изоаллоксази-
на. Желтая окраска присуща ему в окисленном
состоянии (рис. 1-27), но исчезает в результате
присоединения двух атомов водорода к атомам
азота, выделенным жирным шрифтом.
Именно из-за способности легко восста-
навливаться (присоединяя два атома водорода)
и снова окисляться (передавая их на подходя-
щий акцептор) рибофлавин используется в ка-
честве простатической группы многих фермен-
тов, которые так и называют - флавиновые
ферменты. Нередко они содержат еще и моле-
кулу гема (флавогемопротеины) либо ионы
некоторых металлов (металлофлавопротеины).
Металлопротеииы очень разнообразны и
по содержащимся в них ионам металлов, и по
способу их связывания с апопротеином, и по
функциональному предназначению макромоле-
кулы.
Некоторые из них являются транспортной
формой соответствующего минерала. Наиболее
известен трансферрин. Этот гликопротеин вы-
рабатывается клетками печени и секретируется
в кровь, где составляет главную долю фракции
Р-глобулинов плазмы. Он имеет два центра
связывания, способных прочно удерживать по
атому Fe3+ в сочетании с присоединением анио-
на (обычно НСОз-) в расположенном по сосед-
ству участке. Трансферрин захватывает ионы
железа, всасываемые в кишечнике или освобо-
ждаемые в местах деградации гема, и осущест-
вляет их перенос к местам депонирования и
утилизации. Аналогичный белок фракции
аг-глобулинов — церулоплазмин — обладает
8 участками связывания меди и обеспечивает
транспорт этих ионов в организме.
Другая группа металлопротеинов предна-
значена для накопления («складирования») то-
го или иного металлоиона в клетках. Наиболее
ярким примером является ферритин. В его со-
ставе Fe3+ депонируется в селезенке, клетках
костного мозга, слизистой оболочки кишечни-
ка. Но богаче всего этим белком печень, где с
его участием может накапливаться до 700 мг
железа (для сравнения: в гемоглобине крови
взрослого человека содержится около 3 г желе-
за, что составляет 60-70% от общего количества
его в организме). По мере надобности оно ис-
пользуется для синтеза гема. Это осуществляет
специальный фермент митохондрий (гемсинте-
таза), который принимает Fe3+ от ферритина и
включает его восстановленную форму (Fe2+) в
молекулу готового порфиринового кольца.
Наконец, самую разнообразную группу
металлопротеинов составляют ферментные
белки. Во многих случаях они очень прочно
связывают ион металла, который не может
быть заменен аналогами и непосредственно
участвует в акте катализа. Особенно это отно-
сится к атомам железа, меди, цинка, магния,
кальция, кобальта, молибдена, марганца.
Неорганические компоненты сложных
белков могут быть представлены не только ио-
нами металлов, но и другими элементами. Так.
йодтироглобулин (предшественник гормонов
щитовидной железы) содержит атомы йода,
ковалентно соединенные с радикалами тирози-
на. Другой пример: гпутатионпероксидаза
имеет в своем составе остаток цистеина, в ко-
тором атом серы заменен на селен, причем,
селеноцистеин прямо участвует в реакции раз-
ложения Н2О2, катализируемой этим защитным
ферментом. Есть и ряд других ферментов, яв-
ляющихся селенопротеинами.
Представленные сведения о сложных бел-
ках указывают на несовершенство традицион-
ной их классификации. Тем не менее, принци-
пиальные ее основы используются до сих пор.
Помимо «смешанных» названий вроде фосфо-
гликопротеинов и других, упомянутых выше,
появляюгся и совсем новые группы (например,
сульфопротеины, в которых эфирные связи с апо-
протеином образуют остатки серной кислоты).
Глава 2
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
Впервые нуклеиновые кислоты были вы-
делены из ядер клеток (1869 г) в виде соедине-
ния с белком, названным нуклеином. Они ока-
зались крупными полимерами, содержащими
много фосфатных групп (более 20% по массе).
Этим обусловлен полианионный характер та-
ких макромолекул, чем и объясняется проч-
ность их связывания с катионными белками
(представленными, как теперь известно, в ос-
новном гистонами). Потребовалась разработка
жестких методов воздействия (вплоть до дена-
турации апопротеинов), чтобы из нуклеопро-
теинов выделять очищенные препараты нук-
леиновых кислот, сохраняющих ковалентную
структуру молекулы.
Исследованиями последних десятилетий
установлено, что нуклеиновые кислоты очень
разнообразны. Размер их молекулы может со-
ставлять от нескольких десятков до десятков
тысяч килодальтон. Тем не менее, все они по-
строены по единому плану, представляя собой
полимеры (полинуклеотиды), составленные из
небольшого набора структурных единиц - мо-
нонуклеотидов.
2.1. СТРОЕНИЕ МОНОНУКЛЕОТИДОВ
Каждый мононуклеотид состоит из трех
компонентов: азотистого основания, углевода
(конкретнее - пентозы) и фосфорной кислоты.
Набор используемых оснований невелик.
Он включает два производных пурина (аденин
и гуанин) и три пиримидиновых структуры
(цитозин, урацил, тимин). Они часто обозна-
чаются первыми буквами названий — соответ-
ственно А, Г, Ц, У, Т. Их формулы приведены
на рис. 2-1.
Другие производные пурина или пирими-
дина встречаются в нуклеиновых кислотах не
всегда и в малых количествах («минорные»
основания); они появляются только в результа-
те модификации «главных» оснований в соста-
ве уже готовых полимеров.
Пентозным фрагментом мононуклеотида
бывает либо D-рибоза, либо ее производное —
2-дезокси-й-рибоза (рис. 2-2). Они соединяют-
ся р-гликозидной связью с азотом в положении
1 пиримидинового кольца или в положении 9
пуринового ядра. Образуемые продукты обо-
Рис. 2-1. Строение пуриновых и пиримидиновых
оснований
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
55
Рис. 2-2. Строение р-форм D-рибозы (I)
и 2-дезокси-О-рибозы (II).
значают общим термином нуклеозиды (рис.
2-3). Конкретные названия формируются в со-
ответствии с содержащимися в них основания-
ми А, Г, Ц, У, Т:
аденозин	цитидин
гуанозин	уридин
тимидин
Фосфорная кислота присоединена всегда к
углеводной части нуклеозида, образуя сложно-
эфирную связь, как правило, с 5-м углеродным
атомом пентозы (5-фосфат). Это приводит
к превращению нуклеозидов в соответствую-
щие мононуклеотиды (рис. 2-4). Их наимено-
вания составляются прибавлением окончания
«-монофосфат» к названию соответствующего
нуклеозида:
аденозинмонофосфат (АМФ); [адениловая к-та]
гуанозинмонофосфат (ГМФ); [гуаниловая к-та]
цитидинмонофосфат (ЦМФ); [цитидиловая к-та]
уридинмонофосфат (УМФ); [уридиловая к-та]
тимидинмонофосфат (ТМФ); [тимидиловая к-та]
Рис. 2-4. Строение аденозин-5’-монофосфата (АМФ)
Все приведенные обозначения применимы
только к тем нуклеозидам и нуклеотидам, уг-
леводный фрагмент которых представлен ри-
бозой. Если же вместо нее содержится дезок-
сирибоза, то к перечисленным названиям до-
бавляется приставка «дезокси-» или ее сокра-
щение «d-» (например: дезоксиаденозинмоно-
фосфат, d-АМФ). Следует, однако, оговорить-
ся, что тимидиновые нуклеотиды содержат
всегда только дезоксирибозу. Имея это в виду,
для удобства обозначают их нередко без при-
ставки «дезокси-» или «d-».
Таким образом, есть два ряда мононуклео-
тидов. Их так и называют: рибонуклеотиды и
дезоксирибонуклеотиды. Последние гораздо
стабильнее. Они не синтезируются из более
простых веществ, а образуются из уже готовых
рибонуклеотидов путем восстановления рибо-
зы в положении 2 специальными ферментными
системами.
НО ОН
I
Рис. 2-3. Строение пуриновых и пиримидиновых
нуклеозидов на примере соответственно аденозина (I)
и уридина (II).
2.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ
МОНОНУКЛЕОТИДОВ
Природное предназначение мононуклео-
тидов не сводится только к тому, чтобы быть
строительным материалом для создания нук-
леиновых кислот. Не менее фундаментальной
функцией является их участие в процессах пре-
образования энергии, без которых жизнь
невозможна. Кроме того, некоторые из них ис-
пользуются в системах передачи внешних сиг-
налов на исполнительные структуры клетки.
Наконец, нуклеотидные компоненты включены
и в состав небелковой части ряда важных фер-
ментов.
56
Глава 2
2.2.1. НУКЛЕОТИДНЫЕ КОМПОНЕНТЫ
ФЕРМЕНТОВ
Очень многие ферменты являются не про-
стыми, а сложными белками. Небелковая часть
бывает разной. Нередко она содержит мононук-
леотидный фрагмент. Примером может слу-
жить кофермент А (КоА). Как видно на рис. 2-5,
нуклеотидным его компонентом является АМФ,
дополнительно фосфорилированный в позиции
3 рибозы (З'-фосфо-АМФ). Остальная часть ко-
фермента А представлена фосфопантотеином,
который своей фосфатной группой соединен с
5'-фосфатом в молекуле З'-фосфо-АМФ. Ои со-
держит пантотеновую кислоту (витамин Вз),
которую можно представить как р-аланин, со-
единенный пептидной связью с диметилмасля-
иой кислотой, гидроксилированной в положе-
ниях 2 и 4. Последний из этих гидроксилов не-
сет фосфатную группу (через которую осущест-
вляется связь фосфопантотеина с З'-фосфо-
АМФ), а кислотный радикал пантотеновой ки-
слоты соединен пептидной связью с тиоэтано-
ламином (продукт декарбоксилирования цис-
теина). Его тиольная группа (-SH) и является
реактивным центром кофермента А, присоеди-
няющим органические кислоты на время пере-
носа их с одних веществ на другие (КоА - это
сокращение от слов «кофермент ацилирова-
ния»). Такую же функцию выполняет и сам фос-
фопантотеии, входя в состав некоторых фер-
ментов (речь об этом пойдет в разделе 7.4.3).
У ряда других ферментов небелковая часть
представляет собой соединение АМФ с очень
похожей на него структурой. Одна из таких
остаток
никотинамидного
мононуклеотида
остаток
адениловой
кислоты (АМФ)
Рис. 2-6. Строение никотинамидадениндинуклеотида
(НАД). Примечание: в молекуле НАДФ атом водорода,
указанный стрелкой, замещен фосфатной группой -РОзН2
надстроек отличается только тем, что в качест-
ве пиримидинового основания содержит амид
никотиновой кислоты, который (как и сама ни-
котиновая кислота) является витамином РР.
Поэтому такую структуру можно назвать нико-
тинамидным мононуклеотидом. При соедине-
нии его с АМФ образуется никоптинамид-
адениндинуклеотид (НАД, рис. 2-6). Он выпол-
няет роль кофермента никотинамидных дегид-
рогеназ, названных так по способности отни-
мать атомы водорода от окисляемых веществ.
К адениловому фрагменту молекулы НАД мо-
жет быть присоединена дополнительная фос-
фатная группа (в положении 2 рибозы); такой
кофермент обозначается как никотинамидаде-
ниндинуклеотидфосфат (НАДФ).
Еще один пример - молекула флавинаде-
ниндинуклеотида (ФАД). Как показано на рис.
2-7, он является соединением адениловой кис-
лоты с флавинмононуклеотидом (ФМН), пред-
ОН
ОН
HS—CH2—СН2—N—С—СН2—CH2—N—С
сн3
сн—с—сн2—о—р—о—р—о—сн2
I
о
ОН СНз
Остаток тиоэтаноламина
Остаток пантотеновой кислоты
Остаток фосфолантотеина
|з-
НО.
О=Р—6
НО^
ОН
о
о
н
Н
I
о
Остаток З'-фосфо-АМФ
Рис. 2-5. Строение кофермента А (КоА; HS-KoA)
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
57
Рис. 2-7. Флавинадениндинуклеотид (ФАД)-
ставленным на рис. 1-27. Во многих флавино-
вых ферментах именно ФАД (а не ФМН) вы-
полняет функцию простетической группы, спо-
собной временно присоединять 2 атома водо-
рода в ходе переноса их от одного вещества к
другому.
Заслуживает внимания тот факт, что и в
ФАД, и в НАД мономеры соединены своими
фосфатными «хвостами», а совсем не так, как
мононуклеотиды в нуклеиновых кислотах (см.
раздел 2.3). Из этого следует, в частности, что
такого рода динуклеотиды не могут входить в
состав природных полинуклеотидов (и появ-
ляться при их расщеплении).
2.2.2. РОЛЬ МОНОНУКЛЕОТИДОВ
В ЭНЕРГЕТИЧЕСКОМ МЕТАБОЛИЗМЕ
К фосфатной группе любого нуклеозидмо-
нофосфата может присоединяться остаток еще
одной, а к нему — и третьей молекулы фосфор-
ной кислоты. Так образуются соответствующие
нуклеозиддифосфаты и нуклеозидтрифосфаты:
аденозиндифосфат (АДФ),
аденозинтрифосфат (АТФ);
гуанозин дифосфат (ГДФ),
гуанозинтрифосфат (ГТФ);
цитидиндифосфат (ЦДФ),
цитидинтрифосфат (ЦТФ);
уридиндифосфат (УДФ),
уридинтрифосфат (УТФ);
тимидиндифосфат (ТДФ),
тимидинтрифосфат (ТТФ).
Все перечисленные нуклеозидфосфаты от-
носятся к числу мононуклеотидов, вне зависи-
мости от количества фосфатных групп. Однако
есть одна очень существенная деталь. Она вид-
на на примере молекулы АТФ, формула кото-
рого приведена на рис. 2-8. Здесь только пер-
вый фосфатный остаток присоединен (к рибо-
зе) сложноэфирной связью (обозначенной, как
и обычно, черточкой). А вот соединение вто-
рой фосфатной группы с первой (а также
третьего фосфата со вторым) представлено в
виде волнистой линии (~). Так принято обо-
значать макроэргические связи, то есть такие
связи, при гидролизе которых выделение сво-
бодной энергии превышает 30 кДж/моль (в рас-
чете на стандартные условия). Для сравнения:
при расщеплении обычной фосфоэфирной связи
в различных молекулах этот параметр составля-
ет от 9 до 20 кДж/моль, а конкретно в молекуле
АМФ (связь между фосфатом и рибозой) - око-
ло 12 кДж/моль.
Таким образом, макроэргической называ-
ют связь, обладающую значительно повышен-
ным запасом свободной энергии, пригодной
для выполнения полезной работы. В молекуле
АТФ (и ее аналогов) такой потенциал полезной
энергии сосредоточен в кислотоангидридных
связях, возникающих при соединении двух ос-
татков фосфорной кислоты. Энергетически эк-
вивалентны им макроэргическая связь в моле-
куле пирофосфата (Н4Р2О7) и тиоэфирные свя-
зи органических кислот с коферментом А. Еще
выше потенциал в молекулах фосфоамидов,
смешанных ангидридов фосфорной и карбоно-
вых кислот (40-50 кДж/моль), а также енол-
фосфатов (более 60 кДж/моль).
Каждое из макроэргических веществ пере-
численных групп занимает свое место в био-
химических процессах. И только АТФ причас-
тен к самым разным реакциям, идущим с боль-
шими перепадами свободной энергии (и пото-
Рис. 2-8. Строение аденозинтрифосфата (АТФ).
58
Глава 2
му практически необратимым). Обычная кон-
центрация этого макроэрга в клетках млекопи-
тающих составляет около 1 ммоль/л.
Как правило, именно АТФ возникает за
счет энергии, выделяемой в экзэргонических
реакциях катаболизма^ т.е., расщепления пи-
щевых веществ до более простых соединений
(в конечном счете - до СО2 и Н2О). При этом
почти вся энергия, заключенная в химических
связях органических молекул пищи, освобож-
дается на окислительных этапах их разложе-
ния. Более половины ее используется клетками
для синтеза АТФ из АДФ и неорганического
фосфата (Фн)- Механизмы трансформации
энергии биологического окисления в энергию
макроэргических связей АТФ будут рассмот-
рены в главе 5. Здесь лишь отметим, что пря-
мое преобразование освобождаемой энергии в
энергию молекул АТФ обладает исключитель-
но важными преимуществами.
Во-первых, преобладающая доля энергии,
выделяемой в реакциях катаболизма, уберега-
ется от рассеивания в виде тепла, которое «бес-
полезно» для организма (в том смысле, что не
может быть использовано для совершения по-
лезной работы из-за изотермичности живых
существ). Во-вторых, молекулы АТФ доста-
точно устойчивы, чтобы быть средством нако-
пления (депонирования) химически связанной
полезной энергии и даже переноса ее к участ-
кам потребления. Наконец, именно макро-
эргические связи АТФ почти всегда служат
клетке наиболее доступным поставщиком
энергии для осуществления эндэргонических
процессов (т.е., требующих затраты энергии).
Все разнообразие таких процессов можно све-
сти в три группы:
—	синтез сложных органических молекул
из более простых предшественников (процессы
анаболизма);
-	механическая работа, в том числе со-
кращение и расслабление мышц, движение
внутриклеточных органелл;
-	трансмембранный перенос веществ,
включая активный транспорт ионов и молекул
против градиента концентрации (создание ко-
торого для ионов Na+ и К+ лежит в основе
электрических явлений, — таких как возникно-
вение и распространение нервного импульса).
Важно подчеркнуть, что во всех этих энер-
гоемких процессах происходит прямая переда-
ча энергии от АТФ, не требующая реакции
гидролиза макроэргической связи за счет воды.
Для пояснения можно привести в общем
виде реакцию синтеза вещества С-D из более
простых предшественников:
I: С-ОЯ + С-Я —С-Б + Я2О
Она явно относится к эндэргоническим.
Если затраты энергии на ее реализацию со-
ставляют. например, 12 кДж/моль, то спонтан-
но она протекать не может. Однако возможно
образование С-D путем двух последовательных
реакций:
Па: С-ОН + АТФ -> С-О-РО3Н2 + АДФ
ПЬ: С-О-РО3Я2+ D-Я -> С-D + Н3РО4
Па + ПЬ: С-ОН + D-Я + АТФ -*
—»C-D + АДФ + Н3РО4
Приведенный пример показывает, что син-
тез молекул С-D (расход 12 кДж/моль) легко
осуществим за счет сопряжения его с распадом
АТФ до АДФ и Фн (освобождающим примерно
32 кДж/моль): суммарный итог процесса сво-
дится к выделению около 20 кДж энергии на
моль синтезированного С-D (в расчете на стан-
дартные условия). Такой уровень экзэргонич-
ности практически полностью смещает равно-
весие сопряженных реакций в сторону синтеза
вещества С-D за счет энергии распада АТФ до
АДФ и Н3РО4-
Очень важно обратить внимание, что вода,
необходимая для такого распада, отсутствует в
левой части итогового уравнения. И действи-
тельно, утилизация макроэргической связи для
обеспечения энергоемких процессов происхо-
дит не путем гидролиза (освобождающего всю
полезную энергию в виде тепла), а совсем ина-
че. В данном случае концевая фосфатная груп-
па АТФ сначала (реакция Па) переносится на
один из субстратов (такого рода реакции ката-
лизирует масса ферментов, обозначаемых тер-
мином киназа с добавлением названия фосфо-
рилируемого субстрата). Затем, на стадии ПЬ,
фосфорилированный субстрат соединяется с
другим предшественником (D-Я), освобождая
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
59
молекулу фосфорной кислоты (Фн). Получает-
ся, что для превращения АТФ в АДФ и Ф1( ис-
пользуется «скрытая» вода, - та, элементы ко-
торой {-ОН и -Н) находились в составе мо-
лекул-предшественников и «изымались» из них
в состав АДФ и Н3РО4.
Нередко использование АТФ в целях
энергообеспечения реакций синтеза осуществ-
ляется иным способом. А именно: к одному из
исходных веществ присоединяется не фосфат-
ная группа, а аденозильная часть макроэрга.
Тем самым резко повышается реакционная
способность этого вещества. Иными словами,
оно преобразуется в «активную форму», спо-
собную легко реагировать с другим веществом.
В частности, путем передачи ему определенно-
го фрагмента своей молекулы.
В качестве примера на рис. 2-9 приведена
реакция активации метионина. Точнее, в дан-
ном случае повышенную реакционную способ-
ность приобретает не вся аминокислота, а
только ее метильная группа, ковалентно при-
соединенная к атому серы.
Уникальность этой реакции заключается в
том, что ей сопутствует отщепление от АТФ не
одного и даже не двух, а всех трех фосфатных
остатков: два из них освобождаются в форме
пирофосфата (ФФ). а третий — в виде Фн (реак-
ция 1). В результате аденозильный фрагмент
молекулы АТФ оказывается присоединенным к
атому серы метионина, делая весьма неста-
бильной связь этого атома с метильной груп-
пой. Катализирует весь этот процесс специаль-
ный фермент — метионин-аденозиптрансфера-
за. Образующийся S-аденозил метионин явля-
ется главнейшим донором метильных фрагмен-
тов, переносимых различными метилтрансфе-
разими на соответствующие акцепторы (А-Н на
рис. 2-9). Теряя метильную группу, S-аденозил-
метионин превращается в S-аденозилгомоцис-
L-Метионпн
СНз
с
|	АТФ+HzO	ФФ+Фн
сНз \	7
?Нг ф
hc-nh2
соон
(.-Гомоцистеин
SH
L, Аденозин HzO
СГ12	Ц-	,
СН,	<.V-------V
HC-NH, (3)
СООН
Рис. 2-9. Активация метионина (1), его использование в реакциях метилирования (2)
и последующий гидролиз с освобождением гомоцистеина (3).
60
Глава 2
теин (реакция 2). Гидролиз этого метаболита
(реакция 3) ведет к освобождению гомоцистеи-
на (который может быть использован для реге-
нерации метионина специальными фермент-
ными системами).
Аналогично приведенным примерам про-
исходит преобразование потенциала макроэр-
гической связи АТФ и в другие формы энергии
(механическую, осмотическую): и в этих слу-
чаях АТФ расщепляется до АДФ и Фн, но не
путем простого гидролиза водой.
Таким образом, в энергетическом мета-
болизме АТФ выполняет роль своеобразного
аккумулятора полезной энергии: АТФ образу-
ется в клетках из АДФ и Фн за счет окисления
органических молекул пищи (зарядка «аккуму-
лятора») и распадается вновь до АДФ и Фн,
отдавая свою энергию на все виды работы (раз-
рядка «аккумулятора»).
Более того, АТФ является универсальным
накопителем энергии. Его аналоги (ГТФ, УТФ
и др.) образуются лишь в ограниченных объе-
мах и утилизируются в довольно редких реак-
циях. Вместе с тем, все мононуклеотидные
макроэрги тесно взаимосвязаны.
Специальные ферменты (нуклеозидмоно-
фосфаткг/нязы) катализируют обратимый пере-
нос фосфатной группы (вместе с ее макроэрги-
ческой связью) с АТФ на ГМФ, ЦМФ и т.д.,
превращая их в соответствующие дифосфаты.
Последние, в свою очередь, за счет еще одной
молекулы АТФ могут превращаться в свои
трифосфатные формы (под действием нуклео-
зиддифосфаткдиш). Можно сказать, существу-
ет целый «клуб» мононуклеотидов, члены ко-
торого легко обмениваются макроэргическими
фосфатными группами.
И здесь снова приходится отметить осо-
бую роль АТФ. Как уже отмечалось, его обра-
зование, обеспечиваемое реакциями окисли-
тельного катаболизма, происходит путем фос-
форилирования молекул АДФ. Молекулы
АМФ, образуемые во многих реакциях утили-
зации АТФ, непригодны для такого способа
регенерации АТФ. Поэтому из всех нуклео-
зидмонофосфаткиназ наиболее востребована
аденилаткиназа, которая есть почти в любой
клетке и катализирует обратимую реакцию об-
разования двух молекул АДФ из АМФ и АТФ:
АМФ + АТФ <--------> 2 АДФ [2-1]
Представленная уравнением [2-1] аде-
нилаткиназная реакция обеспечивает, по суще-
ству, регенерацию АДФ из АМФ. Иными сло-
вами, она необходима для возврата АМФ в
энергетический кругооборот. Но есть у нее еще
одна смысловая нагрузка: устранение мощного
активирующего (или угнетающего) влияния,
которое АМФ оказывает на ряд ключевых фер-
ментов энергетического метаболизма (см. раз-
делы 6.5.3 и 6.7.2).
2.2.3.	ЦИКЛИЧЕСКИЕ ФОРМЫ
МОНОНУКЛЕОТИДОВ
Крупным достижением биохимии явилось
открытие аденилатциклазы (1960). Этот фер-
мент, встроенный в плазматическую мембрану
с ее внутренней (цитоплазматической) сторо-
ны, катализирует отщепление пирофосфатного
остатка (ФФ) от молекулы АТФ. Реакция эта,
показанная на рис. 2-10, требует присутствия
ионов Mg2+. Необычность ее в том, что осуще-
ствляется она без участия воды или еще каких-
либо молекул: фосфатная группа, остающаяся
в 5-м положении рибозы, замыкается (после
отделения ФФ) еще и на 3-ий углеродный атом
той же рибозы (но уже не кислотоангидридной,
АТФ	цАМФ	АМФ
Рис. 2-10. Образование и гидролиз циклического аденозин-3',б’-монофосфата (цАМФ)
лод действием аденилатииклазы (I) и цАМФ-фосфодиэстеразы (II) соответственно.
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
61
как было, а сложноэфирной связью). Значит,
появляется не моноэфир аденозина (как в
обычном АМФ), а диэфирное соединение фос-
фатной группы и с 5-м, и с 3-м углеродными
атомами его рибозы. В результате этого, наря-
ду с тремя циклическими структурами обыч-
ной («линейной») молекулы АМФ, появляется
еще один гетероцикл - шестичленный, вклю-
чающий атом фосфора, два атома кислорода и
трехуглеродный фрагмент рибозы (на рис. 2-10
атомы этого цикла выделены курсивом). Пол-
ное название этого необычного продукта - цик-
лический аденозин-3',.5'-монофосфат. Обычно
употребляют сокращенное название (цикло-
АМФ) или краткое обозначение (цАМФ). Кон-
центрация цАМФ в клетках на 3 порядка ниже
уровня АТФ и составляет около 1 мкмоль/л.
Позднее был открыт аналогичный фермент
(гуанилатциклаза), превращающий ГТФ в пи-
рофосфат и циклический гуанозин-3'^'-моно-
фосфат (цГМФ).
Для нуклеозидтрифосфата отщепление
ФФ означает потерю двух макроэргических
связей (одна из них сохраняется в молекуле
пирофосфата Н4Р2О5). Это указывает на высо-
кую экзэргоничность процесса, обеспечиваю-
щую необратимое течение реакции в сторону
образования цАМФ (или цГМФ). Отмеченная
необратимость усиливается гидролизом ФФ до
двух молекул Н3РО4, осуществляемым пиро-
фосфатазой.
Тем не менее, циклические формы нуклео-
зидмонофосфатов недолговечны- Будучи диэфи-
рами, они легко гидролизуются до обычной
(«линейной») формы АМФ (ГМФ) под действи-
ем фосфодиэстеразы (см. рис. 2-10), эффект
которой тоже необратим. Известен ряд вариан-
тов этого фермента, различающихся по пред-
почтению к цАМФ или к цГМФ, а также по
чувствительности к регуляторным влияниям (в
том числе - со стороны ионов Са2+).
Биологическое предназначение цикличес-
ких нуклеотидов - выполнять роль вторичного
посредника (см. раздел 1.9) в системах переда-
чи внешнего сигнала от возбужденного им ре-
цептора на те внутриклеточные макромолеку-
лы, которые реализуют ответную реакцию
клетки. Набор таких сигнальных путей относи-
тельно невелик.
Аденнлатцнклазная система - один из
наиболее распространенных путей сигнальной
трансдукции. Через нее осуществляют свое
влияние многие гормоны, воздействующие на
клеточные рецепторы. К их числу относятся ад-
реналин (для которого известна серия разных
адренорецепторов), глюкагон, соматостатин,
паратгормон, вазопрессин, ряд тропных гормо-
нов. Из-за сложности этой системы целесооб-
разно подразделить ее работу на три последова-
тельных этапа: организация выработки цАМФ;
регулирование его концентрации в клетке; реа-
лизация конечных эффектов гормона.
Выработку цАМФ инициирует распо-
знание рецептором соответствующей сигналь-
ной молекулы. Сорбция ее на центре узнава-
ния, имеющемся во внеклеточном участке ре-
цептора, вызывает конформационную пере-
стройку, которая охватывает и его внутримем-
бранную часть, а также внутриклеточный до-
мен. Более того, она вовлекает еще и особый
регуляторный белок, примыкающий к рецепто-
ру со стороны цитоплазмы. Он состоит из трех
разных мономеров (а. р и у) и обозначается как
G-протеин, поскольку в его а-субъединице
есть центр связывания молекулы гуанозинди-
фосфата (ГДФ).
Изменение конформации G-протеина при-
водит, во-первых, к «отказу» от ГДФ с заменой
его на ГТФ (имеющийся в цитозоле, как и дру-
гие мононуклеотиды). Во-вторых, комплекс
а-субъединицы с ГТФ отделяется от остальной
части G-протеина, получая возможность сво-
бодной миграции. Встретившись с одной из
ближайших молекул аденилатциклазы, ком-
плекс объединяется с нею, в результате чего
фермент переходит в активную форму. Так
осуществляется запуск ферментативной реак-
ции превращения АТФ в цАМФ в ответ на
стимуляцию рецептора. Интенсивность выра-
ботки цАМФ зависит от числа вовлеченных
молекул аденилатциклазы и от уровня их ак-
тивности, которая зачастую чувствительна к
регуляторным влияниям таких факторов, как
аденозин, Mg2+, Мп2+, Са24.
Регулирование концентрации цАМФ
осуществляется двумя независимыми механиз-
мами.
Один из них предотвращает бесконечную
продукцию цАМФ в ответ на однократную
62
Глава 2
(«мимолетную») стимуляцию рецептора. Он
обеспечивается способностью а-субъединицы
G-протеина не только присоединять к себе мо-
лекулу ГТФ, но и гидролизовать ее до ГДФ и
Фн. Эта ферментативная активность а-субъеди-
ницы очень невелика. Поэтому комплекс ее с
ГТФ продолжает некоторое время пребывать в
объединении с аденилатциклазой и поддержи-
вать ее в активном состоянии, стимулируя вы-
работку все новых порций цАМФ. Но как
только гидролиз ГТФ свершится, а-субъеди-
ница оказывается в комплексе не с ним, а
с ГДФ. В такой форме она не может сохранять
контакт с аденилатциклазой и покидает ее,
В итоге фермент возвращается в неактивную
форму и прекращает выработку цАМФ. Следо-
вательно, комплекс а-субъединицы с ГТФ дей-
ствует как своеобразный таймер: длительность
стимулирующего действия на аденилатциклазу
предопределена сроком, требуемым комплексу
для самоинактивации (реализуемой путем гид-
ролиза ГТФ).
Но и это еще не все. Расщепив ГТФ и
удерживая возникший ГДФ, а-субъединица
может теперь воссоединиться с покинутыми
ею р- и у-мономерами, а реставрированный в
итоге G-протеин способен вновь примкнуть к
рецептору. Если тот уже успел освободиться от
гормона, то на этом все и завершится: рецептор
останется в готовности в очередной раз выпол-
нить свою функцию распознания лиганда (при
его новом появлении). Если же сигнальная мо-
лекула еще не успела покинуть рецептор, то
«возвратившийся» к нему G-протеин сразу же
подвергиется конформационной перестройке с
заменой ГДФ на ГТФ, — и все повторится сна-
чала, Значит, пока рецептор «занят» первич-
ным посредником, а-субъединица будет снова
и снова перемещаться от него к аденилатцик-
лазе и обратно, обеспечивая продолжение вы-
работки вторичного посредника (в данном слу-
чае - цАМФ),
Совершенно иной механизм контроля
осуществляет фосфодиэстераза, которая, как
уже отмечалось, гидролизует цАМФ до обыч-
ной («линейной») формы АМФ (см. рис, 2-10).
Этим обеспечивается довольно быстрое сни-
жение уровня цАМФ, накапливаемого в ходе
гормональной стимуляции аденилатциклазной
системы. Вместе с тем, различные формы фос-
фодиэстеразы тоже являются объектами кон-
троля со стороны ряда гормонов, включая те,
что регулируют концентрацию ионов Са2+ в
цитозоле (от которой сильно зависит фермента-
тивная активность некоторых фосфодиэстераз).
Влияют на этот фермент и отдельные экзоген-
ные вещества. В частности, такие производные
пурина, как кофеин и теофиллин, вызывают
обратимое угнетение фосфодиэстераз. Тем са-
мым они тормозят убыль цАМФ, имитируя со-
стояние возбуждения соответствующих кле-
точных рецепторов.
Реализация внутриклеточных эф-
фектов происходит путем влияния цАМФ на
конформационное состояние определенных
белков. Едва ли не единственной способностью
этого вторичного посредника является его ак-
тивирующее воздействие на протеинкиназу А.
Так обозначают группу ферментов, каждый из
которых катализирует перенос фосфатного ос-
татка с АТФ на тот или иной белок (точнее, на
гидроксильную группу серина или треонина в
составе этого белка-«мишени»), В итоге обра-
зуется фосфорилированная форма «атакован-
ной» макромолекулы:
АТФ АДФ
БЕЛОК-ОН	> БЕЛОК-ОРО3Н2 [2-2]
Протеип-
киназа
Реакция эта протекает за счет энергии
макроэргической связи АТФ и потому необра-
тима. Гидролитическое расщепление образо-
вавшейся в белке фосфоэфирной связи воз-
можно под действием другого фермента -
фосфопротеинфосфатазы. Эта реакция тоже
необратима. Она осуществляет обратный пере-
ход фосфорилированного белка в его дефосфо-
рилированную форму:
Н2О Н3РО
БЕЛОК-ОРО3Н2	> БЕЛОК-ОН [2-3]
Фосфопротеин-
фосфатаза
Смысл этих довольно простых преобразо-
ваний в том, что они вызывают такую конфор-
мационную перестройку белка, которая карди-
нально изменяет его функциональную актив-
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
63
ность. Очень часто в роли избирательной «ми-
шени» выступает определенный фермент, ра-
ботоспособность которого усиливается (или
тормозится) в результате фосфорилирования;
отщепление фосфатной группы фосфопротеин-
фосфатазой восстанавливает исходную актив-
ность. Нередко протеинкиназа фосфорилирует
не сам фермент, а белок, являющийся его акти-
ватором или ингибитором. Наконец, некоторые
цАМФ-зависимые протеинкиназы катализиру-
ют фосфорилирование так называемых факто-
ров транскрипции, — особых белков, чья функ-
ция состоит в том, чтобы «открывать» либо
«приостанавливать» доступ к информации, за-
ключенной в определенных генах.
Описанный вариант вклада аденилатцик-
лазной системы в преобразование внешних
сигналов реализуется с участием р2-адрено-
рецепторов (типичных для печеночных клеток
и скелетных мышц). Другой вариант сопряжен
с а2-адренорецепторами. Они находятся в кон-
такте с G-протеином иного строения, - таким,
а-субъединица которого (в комплексе с ГТФ)
оказывает не активирующее, а подавляющее
действие на аденилатциклазу (следовательно,
возбуждение а2-адренорецепторов не повыша-
ет, а снижает концентрацию цАМФ в клетке).
В этом контексте уместно упомянуть и про
oil-адренорецепторы, хотя связанный с ними
G-протеин вообще не взаимодействует с аде-
нилатциклазой: они инициируют совсем иной
путь преобразования сигнала, а именно - фос-
фоинозитидный каскад (раздел 3.3.4). Вторич-
ными посредниками в нем выступают не цикли-
ческие нуклеотиды, а совсем другие молекулы.
Однако и здесь необходимым соучастником яв-
ляются специфические протеинкиназы, группо-
вое название которых - протеинкиназа С.
Гуаннлатцнклазная система необычна
разнообразием своих воплощений. Вариант,
наиболее близкий аденилатциклазному пути,
оказался независимым от G-протеина. Ибо
здесь сам клеточный рецептор (точнее, его ци-
топлазматический фрагмент) является фермен-
том - гуанилатциклазой. Она становится ак-
тивной в результате конформационной пере-
стройки рецептора, вызываемой первичным
посредником. Молекулы цГМФ, генерируемые
возбужденным рецептором, оказывают активи-
рующее действие на протеинкиназу G. От про-
теинкиназ А и С она отличается своей «клиен-
турой», - спектром белков, приемлемых для
нее в качестве объекта фосфорилирования.
К ним относятся, в частности, белки, обеспечи-
вающие секрецию Na в почечных канальцах,
а также сократительные белки гладких мышц.
Через эти исполнительные молекулы реализу-
ются главные рецептор-опосредуемые эффекты
натрийуретического фактора предсердий
(группа небольших пептидов, выделяемых при
увеличении объема крови). Они сводятся к уси-
лению почечной экскреции Na (а с ним - и
воды), расширению сосудов вследствие рас-
слабления мышечных клеток их стенки и сни-
жению артериального давления крови.
Совсем иначе функционирует гуанилат-
циклазная система фоторецепторных клеток
сетчатки глаза. Начать с того, что рецептор
здесь локализован не в плазматической мем-
бране, как обычно, а в стопке уплощенных
мембранных мешочков (дисков), погруженных
в цитозоль. В ней и сосредоточены молекулы
трансмембранного белка родопсина (зритель-
ный пурпур). Этот светочувствительный пиг-
мент состоит из небольшого белка опсина и
витамина А (ретинол), — точнее, одной из его
альдегидных форм, обозначаемой как 11-цис-
ретиналь (рис. 2-11). Именно простетическая
группа, обладая системой сопряженных двой-
ных связей, поглощает квант света, который
превращает ее в алло-тиртс-ретинаиь, отде-
ляющийся от опсина из-за несоответствия его
центру связывания. Сопоставление изомеров
на рис. 2-11 показывает, что поглощенный фо-
тон фактически преобразуется в движение
концевого фрагмента полиеновой цепочки от-
носительно остальной части молекулы.
Такое изменение геометрии ретиналя при-
водит к быстрому (~ 1 мс) освобождению
а-субъединиц из ~ 500 молекул трансдуцина
(специальный G-белок). Как и обычно, они свя-
зываются с ГТФ и выполняют роль биологиче-
ского таймера. Однако эти субъединицы со-
вершенно уникальны тем, что в комплексе с
ГТФ активируют не протеинкиназу, а цГМФ-
фосфодиэстеразу! Следовательно, возбуждение
фоторецепторов ведет не к приросту молекул
цГМФ, а к быстрому падению их концентрации
в цитозоле. Это, в свою очередь, изменяет кон-
формацию белков, образующих натриевые ка-
64
Глава 2
Ретинол
алло-гдз/с-Ретиналь
Рис. 2-11. Ретинол (витамин А) и его альдегидные формы.
налы в плазматической мембране. Наступаю-
щее уменьшение потока Na+ в клетку приводит
к увеличению электроотрицательности внут-
ренней поверхности этой мембраны (относи-
тельно наружной), что воспринимается окон-
чаниями зрительного нерва как сигнал к гене-
рированию нервного импульса, который затем
передается в мозг.
Гуанилатциклазная система фоторецепто-
ров не только улавливает и преобразует свето-
вые сигналы, но и действует как очень эффек-
тивный фотоумножитель: поглощения единст-
венного фотона достаточно для возбуждения
всей светочувствительной клетки и возникно-
вения нервного импульса. Готовность рецепто-
ра к восприятию нового фотона обеспечивается
регенерацией 11-г/ис-ретиналя в серии фер-
ментативных реакций. При этом алло-транс-
ретиналь сначала подвергается восстановле-
нию до алло-/ирянс-ретинола, который затем
изомеризуется в И-цис-ретинол с последую-
щим окислением его спиртовой группы до аль-
дегидной.
Наконец, еще один вариант гуанила-щик-
лазной системы. Его реализует свободная фор-
ма фермента, растворенная в цитозоле. Не бу-
дучи связанной с мембранами, эта форма гуа-
нилатциклазы функционирует сама по себе,
вне зависимости от клеточных рецепторов. Она
реагирует на простейшую из всех известных
сигнальных молекул — оксид азота (NO), вы-
рабатываемый многими типами клеток с по-
мощью специальной ферментной системы (см.
главу 5, рис. 5-47). Благодаря хорошей раство-
римости в липидах, оксид азота легко проника-
ет через мембраны. Вместе с тем, он быстро (в
течение секунд) окисляется до NO2 и NO3. По-
этому в качестве медиатора NO успевает по-
влиять только на клетки, близкие к месту его
выработки. Простетической группой раствори-
мой гуанилатциклазы является гем (см. рис.
1-26), который очень легко улавливает молеку-
лу NO, благодаря чему активность фермента
может возрастать в сотни раз. Образующийся
при этом цГМФ способствует расслаблению
гладких мышц, снижению сосудистого тонуса.
Впрочем, растворимая аденилатциклаза явля-
ется, по-видимому, далеко не единственной
мишенью оксида азота.
Тирозин киназная система заслуживает
краткого описания в ряду других путей сиг-
нальной трансдукции, хотя и обходится без
привлечения циклических нуклеотидов. Она
располагает рецепторами для большинства так
называемых факторов роста и для некоторых
гормонов, таких как инсулин. Каждый рецептор
этой системы представляет собой трансмем-
бранный белок, внешняя часть которого содер-
жит центр распознавания сигнальной молекулы,
а обращенный к цитоплазме фрагмент функ-
ционирует как фермент тирозинкиназа. В отли-
чие от других протеин киназ, она переносит
фосфатную группу с АТФ на радикал тирозина,
а не серина или треонина. Более того, модифи-
цируемые ею остатки тирозина принадлежат не
каким-либо белкам, а самому рецептору (его
цитоплазматическому фрагменту). Иными сло-
вами, тирозинкиназа осуществляет аутофосфо-
рилирование. Происходит оно в условиях акти-
вации фермента, вызываемой димеризацией ре-
цептора (сближением соседних молекул), кото-
рая наступает под влиянием соответствующего
гормона или иной сигнальной молекулы.
Множественное самофосфорилирование
димерной тирозинкиназы стимулирует ее про-
теинкиназную активность в отношении опре-
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
65
деленных белков цитоплазмы. Часть из них
относится к ферментам, фосфорилирование
которых изменяет их каталитическую актив-
ность и, следовательно, скорость соответст-
вующего пути метаболизма. Результатом про-
теинкиназного фосфорилирования других бел-
ков-мишеней становится «включение» того
направления сигнального пути, которое ведет
от мембранного рецептора к ядру клетки и за-
вершается активацией определенного фактора
транскрипции- Это сложный, зачастую много-
ступенчатый процесс, изученный пока не во
всех деталях. Установлено, однако, что здесь
нет вторичных посредников малого размера:
все его звенья являются белками. Среди них -
небольшой мономерный Ras-белок. Он анало-
гичен а-субъединице G-протеина других сиг-
нальных систем, в том числе — по исполнению
таймерной функции. Объединяясь с рядом дру-
гих цитоплазматических белков (один из кото-
рых сначала сорбируется на фосфорилирован-
ном рецепторе), Ras-белок (в комплексе с ГТФ)
инициирует активацию каскада протеинкиназ
серин/треонинового типа. Конечным звеном
каскада становится фосфорилирование белка,
контролирующего тот или иной участок моле-
кулы ДНК. Такая нацеленность тирозинкиназ-
ного пути на регуляцию генетического аппарата
делает неудивительным тот факт, что аномалии
белковых звеньев этого пути часто бывают он-
когенными, приводя к неуправляемому делению
клеток.
2.3.	СТРОЕНИЕ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ
Нуклеиновые кислоты представляют собой
линейные (неразветвленные) полимеры нуклео-
зидмонофосфатов. Любой полинуклеотид по-
строен либо из рибонуклеотидных мономеров,
либо из дезоксирибонуклеотидных. Этому соот-
ветствуют и названия: рибонуклеиновые кисло-
ты (РНК) и дезоксирибонуклеиновые кислоты
(ДНК). Последние сосредоточены в ядрах кле-
ток (если не считать митохондрии, которые, как
и хлоропласты, обладают специальными моле-
кулами ДНК для собственных нужд).
2.3.1.	РИБОНУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
При биосинтезе рибонуклеиновых кислот
в их состав включаются 4 рибонуклеотида, а
именно: АМФ, ГМФ, ЦМФ и УМФ. Исходным
материалом при этом служат трифосфатные
формы мономеров. Создание полинуклеотид-
ной цепи осуществляет РНК-полимераза. Этот
фермент, отщепив ФФ от нуклеозидтрифосфата,
соединяет фосфатный конец оставшегося нук-
леозидмонофосфата с 3-м углеродным атомом
рибозы другого мононуклеотида (рис. 2-12). Та-
ким образом, пентозные фрагменты мономеров
АТФ
Рис. 2-12. Образование межнукпеотидной 5'—►З'-фосфодиэфирной связи.
66
Глава 2
оказываются соединенными через фосфатную
группу, которая образует две эфирные связи: с
5-м углеродным атомом рибозы (5*) одного мо-
нонуклетотида и 3-м атомом рибозы (3') друго-
го. Первая существовала в бывшем нуклеозид-
трифосфате, а вторая возникла заново (под
действием фермента). Иными словами, РНК-
пол имераза формирует 5 —>3 -фосфодиэфирное
соединение соседних мононуклеотидов. Быст-
рый гидролиз выделившегося ФФ, реализуе-
мый пирофосфатазой, закрепляет необрати-
мость образования такого соединения.
Аналогичным образом РНК-полимераза
может присоединять к полученной молекуле
третью мононуклеотидную единицу, к ней -
Рис. 2-13. Схема первичном структуры фрагмента
молекулы РНК.
четвертую, затем пятую и т.д. Каждый раз оче-
редное звено фиксируется своей 5-фосфатной
группой на 3-м углеродном атоме рибозы пре-
дыдущего мононуклеотида. Пока оно остается
концевым, это звено обозначается как 3'-конец
полимера. Именно с этой стороны «дозволено»
наращивание полинуклеотидной цепи, по-
скольку расположенная здесь рибоза имеет
свободную группу -ОН в положении 3. На дру-
гом конце, обозначаемом как 5'-конец, рост
цепи невозможен, т.к. З'-гидроксильная группа
здесь уже вовлечена в межнуклеотидную связь.
Эту часть молекулы обозначают как начало по-
линуклеотидной цепи. Трифосфатный «хвост»,
показанный в положении 5' на рис. 2-12, отще-
пляется после завершения биосинтеза полиме-
ра, так что в готовых молекулах полинуклеоти-
дов в позиции 5' обычно тоже находится сво-
бодная гидроксильная группа.
Молекула РНК может насчитывать от
многих десятков до нескольких тысяч моно-
нуклеотидных единиц. И всегда она содержит
длинную цепь чередующихся остатков рибозы
и фосфата, составляющую единообразный
стержень (остов) любой РНК (рис 2-13). С каж-
дым из рибозных фрагментов этого остова со-
единен остаток того или иного из 4 азотистых
оснований. Если не считать величину молекул,
то различаются РНК лишь тем, в какой после-
довательности 4 разных основания чередуются
по длине стандартного остова. Порядок чере-
дования и обозначается как первичная струк-
тура молекулы РНК.
2.3.2.	ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
По общему плану устройства первичной
структуры молекулы ДНК не имеют принци-
пиальных отличий от РНК. Есть лишь две осо-
бенности. Во-первых, вместо рибозы в молеку-
лах ДНК содержится дезоксирибоза. Во-вто-
рых, в них отсутствует урацил, но есть 5-ме-
тилурацил, именуемый обычно тимином (см.
рис. 2-1).
С учетом этих нюансов, все изложенное
про структуру РНК полностью распространя-
ется и на ДНК. Это касается и способа соеди-
нения мономеров, которое тоже происходит в
направлении 5'—>3' (хотя ферментом в данном
случае является ДНК-полимераза}.
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
67
Главные различия начинаются с простран-
ственной организации макромолекул. Если
РНК представляет собой единственную поли-
мерную цепь, то молекула ДНК всегда (за ис-
ключением ДНК некоторых вирусов) состоит
из двух полинуклеотидных цепей, располо-
женных параллельно- Они не одинаковы по
строению и даже не являются зеркальным от-
ражением одна другой. Вместе с тем, эти цепи
строго соответствуют друг другу. Высокую
точность их взаимной комплементарное™
обеспечивает одна структурная закономер-
ность: против крупного (бициклического) ос-
нования одной цепи всегда находится менее
объемное пиримидиновое основание, принад-
лежащее смежной цепи. Точнее, пуриновые
основания образуют с пиримидиновыми только
такие пары: А..Т и Г..Ц (рис. 2-14). Именно
в этих парах основания комплементарны друг
другу и, будучи соединены водородными свя-
зями, точно укладываются в расстояние между
двумя параллельными пентозофосфатными
«стержнями» молекулы ДНК (дистанция меж
глиикозидными связями их пентоз составляет
около 1,1 нм).
Таким образом, молекулу ДНК можно
представить как две-нити. Обе формируются
н
Аденин
...Чх	/СНа
---Na	еС-Н
У2 ’kiZ
С —	|
Д	Пентоза
I
ТИМ4Н	Фосфат
Н
N—Н..О
: v.c:
Н
с—С
//5 4 \>
Н — Св 3N.Н—N’
>’~Ч	>
о..н—N
N- /
?N
'Пентоза
Фосфат
Пентоза
Н
Фосфат
I Цитозин
Гуанин
Рис. 2-14. Комплементарные пары азотистых
оснований в молекуле ДНК
(А соединяется с T двумя водородными связями,
а Г с Ц - тремя).
5‘-конец	3-конец
/Ч А А Ут . п"
Ф.	________ Я>
п|Д~- I fin
Хч г
ф _________________   ф
ХП-| Т /•••/ А |-П^
Хч	г	п"0
ф _________________   ф
ХПЧ А \-\ Т 1-П
ф^	________
,п 1~Ц rLn
З'-конец	5-конец
Рис. 2-15. Фрагмент двухцепочечной молекулы ДНК
(схема).
чередованием остатков фосфата и дезоксири-
бозы и имеют боковые «веточки» в виде А, Г,
Ц или Т на каждом пентозном звене (рис.
2-15). Благодаря комплементарности в парах
А.Т и Г.Ц комплементарными между со-
бой оказываются и сами цепи: порядок чередо-
вания азотистых оснований в одной из них
строго соответствует последовательности их в
другой (но не тождественен ей!). Важно отме-
тить, что эти цепи антипараллельны: если в
одной из них направление 5'—>3' обращено, на-
пример, сверху вниз (как на рис. 2-15, слева),
то в другой (изображенной справа) оно ориен-
тировано наоборот - снизу вверх.
Двухцепочечное строение молекулы ДНК
постулировали в 1953 г. Джеймс Уотсон и
Френсис Крик. Под впечатлением только что
опубликованных гипотез о возможных вариан-
тах вторичной структуры белка они подвергли
анализу ставшие известными картины дифрак-
ции рентгеновских лучей на нити ДНК. На
этой основе ученые предложили структурную
модель, согласно которой молекула ДНК со-
стоит из двух полинуклеотидных цепей, закру-
ченных вокруг общей оси (рис. 2-16). Самым
3 -конец
Рис. 2-16. Схема двойной спирали ДНК
по Дж. Уотсону и Ф. Крику.
68
Глава 2
ценным в этой модели двойной спирали
ДНК явилось обоснование комплементарное™
цепей как результата комплементарное™ пар
азотистых оснований, сидящих на спирализо-
ванном пентозофосфатном остове каждой из
них. При этом пуриновые и пиримидиновые
основания находятся внутри спирали, а высоко
гидрофильные пеитозофосфатные цепи обви-
вают их снаружи. Имея плоскую, преимущест-
венно неполярную структуру, каждое азоти-
стое основание одной цепи соединено водо-
родными связями с парным ему основанием
другой цепи, находящимся в той же плоскости,
перпендикулярной оси спирали. Поэтому про-
странственная организация молекулы ДНК
фиксируется не только водородными связями
(А с Т, Г с Ц), направленными поперек цепей,
но и гидрофобными взаимодействиями, кото-
рые возникают между плоскостями азотистых
оснований, уложенных стопкой внутри двой-
ной спирали.
Правильность модели, предложенной Дж.
Уотсоном и Ф. Криком, вскоре получила экс-
периментальные подтверждения. Дальнейшие
исследования позволили значительно развить
представления о пространственной организа-
ции молекул ДНК. В частности, была установ-
лена вариабельность конформации двойной
спирали. Вариант правозакрученной спирали,
описанный первооткрывателями, насчитывает
10 пар оснований (п.о.) в одном витке, а шаг ее
составляет 3,4 нм при толщине 2 нм. Эта форма
считается доминирующей в физиологических
условиях и теперь обозначается как В-форма.
Другой из известных теперь вариантов
(A-форма) имеет несколько меньший диаметр и
содержит 11 п.о. в каждом витке протяженно-
стью 2,8 нм (по оси спирали). Выявлен и лево-
закрученный вариант спирали (Z-форма): при
толщине 1,7 нм она содержит 12 п.о. на каж-
дый виток.
Даже будучи скрученной в двойную спи-
раль, молекула ДНК остается чрезвычайно
длинной, достигая 8 см (в хромосоме 2 челове-
ка). При поперечнике 2 нм это делает ее крайне
уязвимой. Поэтому важное значение имеют
высшие структуры ДНК, призванные обеспе-
чить компактную укладку. Начальным элемен-
том упаковки являются нуклеосомы. Сердцеви-
ну каждой из них составляет октамер, образуе-
мый четырьмя димерами гистонов Н2А, Н2В,
НЗ и Н4. Вокруг такого белкового комплекса,
богатого положительными зарядами, участок
двойной спирали длиной около 150 п.о. делает
почти два оборота. Начало и конец этих оборо-
тов фиксируются на нуклеосоме гистоном Н1.
В результате каждая нуклеосома почти в 7 раз
укорачивает «свой» фрагмент ДНК и, кроме
того, защищает его от воздействия ферментов.
Участки двойной спирали (длиной в десятки
п.о.), расположенные между соседними нук-
леосомами, называют линкерными.
Образованная структура похожа на цепь
бусинок толщиной около 10 нм. Она затем
складывается (возможно, спиралеобразно) в
более толстую нить (диаметром до 30 нм), ко-
торая образует сильно вытянутые боковые пет-
ли (500-1000 п.о. каждая). Основания этих тес-
но уложенных петель закреплены на централь-
ном остове из негистоновых белков, пока еще
почти не изученных. Перечисленные уровни
конденсации ДНК позволяют сократить линей-
ные размеры молекулы на 4 порядка, уместив
ее пределах хромосомы.
2.4.	ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
МОЛЕКУЛ ДНК
Длительное время считалось, что носите-
лем наследственности являются хромосомные
белки. Такому пониманию способствовали и
успехи иммунологии, демонстрировавшей не
только видовые различия этих макромолекул,
но и специфику белков каждого индивидуума.
Лишь в 1944 г. было показано, что с помощью
ДНК, выделенной из патогенных пневмокок-
ков, можно передавать наследуемые признаки
(вирулентность, способность синтезировать
капсулу) непатогенному, бескапсульному му-
танту этих бактерий. Более того, оказалось, что
перенесенные вместе с ДНК качества закреп-
ляются в потомстве. Через 8 лет определяю-
щую роль ДНК в наследственности подтверди-
ли и опыты с мечеными атомами - 32Р (для
ДНК) и 35S (для белков). Когда Дж. Уотсон и
Ф. Крик предложили модель двойной спирали
ДНК, сразу же стала очевидной ее пригодность
для объяснения механизма точного копирова-
ния этих молекул, наступающего при делении
клеток. Они постулировали, что двойная спи-
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
69
раль может расплетаться, позволяя полинук-
леотидным нитям расходиться так, чтобы на
каждой из них, как на шаблоне (матрице), мог-
ла синтезироваться новая нить, полностью ком-
плементарная своей матрице (рис. 2-17). В ре-
зультате появляются две новые двухцепочеч-
ные молекулы, являющиеся точными копиями
исходной (родительской) ДНК. При этом каж-
дая из копий содержит одну родительскую
нить, а вторую — вновь синтезированную, точ-
но повторяющую ту цепь, которая оказалась в
другой дочерней молекуле ДНК.
Среди атрибутов подлинной науки — ее
предсказательная сила. Модель двойной спи-
З'-конвц	5-конец	з-конец	5-конец
Рис. 2-17. Принцип удвоения (репликации) молекулы ДНК:
А - расхождение полинуклеотидных цепей родительской
ДНК (выделены затенением); Б - построение новых цепей,
комплементарных каждой из исходных «половинок».
рали ДНК открыла путь к разработке немыс-
лимых ранее методов, многие из которых ис-
пользуют принцип комплементарности. Уси-
лиями мирового научного сообщества вскоре
были не только раскрыты молекулярные осно-
вы наследственности и механизмы биосинтеза
белка, но и обеспечено бурное развитие всего
комплекса биологических наук, включая соз-
дание различных направлений современной
биотехнологии.
Теперь мы знаем, что наследственность -
это способность передавать потомству ин-
формацию о строении белковых молекул, спе-
цифичных для данного организма.
Материальным носителем этой информа-
ции являются молекулы ДНК (у некоторых ви-
русов - молекулы РНК). Она закодирована в
них характером чередования четырех азоти-
стых оснований на стандартном пентозофос-
фатном остове. Совокупность .всех молекул
ДНК клеточного ядра обозначается как геном.
Собственной ДНК (довольно скромных разме-
ров) обладают также митохондрии (и хлоро-
пласты).
Полностью расшифровать геном человека
удалось уже к 2001 году. Оказалось, что он со-
держит почти 3 млрд пар азотистых оснований
(в эухроматических участках ДНК хромосом)
и несет информацию о структуре примерно
26,5 тысяч белков. Для записи этой информа-
ции используется лишь 25% общей протяжен-
ности всех ядерных ДНК.
Роль любой молекулы ДНК двуедина. Во-
первых - хранение наследственной информа-
ции и безошибочная передача ее при смене по-
колений. Это обеспечивается дублированием
информации в комплементарных цепях ДНК.
Оно открывает возможность самовоспроизвод-
ства (репликации) каждой молекулы ДНК при
делении клетки (см. рис. 2-17).
Другой аспект функционального пред-
назначения ДНК - передача генетической ин-
формации системам, строящим белковые моле-
кулы. Она реализуется путем синтеза молекулы
РНК, комплементарной тому или иному участ-
ку одной из цепей молекулы ДНК. У эукариот
каждый такой участок — ген — несет информа-
цию о структуре одной полипептидной цепи и
является минимальной единицей наследствен-
ной информации. Сам процесс считывания ука-
70
Глава 2
заний, заключенных в структуре гена, обозна-
чается термином транскрипция (переписыва-
ние), а образующийся продукт {транскрипт)
получил название информационной РНК
(иРНК), поскольку она переносит информацию
от ДНК к месту синтеза белка. Чаще ее обозна-
чают как мРНК, производя это сокращение от
распространенного термина мессенджер-РНК
{messenger — связной, посыльный, курьер) либо
от названия матричная РНК, принятого в рус-
ской литературе и отражающего тот факт, что
мРНК синтезируется на ДНК как на матрице и,
в свою очередь, служит матрицей для наработ-
ки молекул соответствующего белка.
2.4.1.	РЕПЛИКАЦИЯ (СИНТЕЗ ДНК)
Удвоение наследственного материала, ко-
торое предшествует делению клеточного ядра,
а затем и всей клетки, осуществляется путем
репликации каждой молекулы ДНК. Процесс
этот очень сложный и обеспечивается большой
группой ферментов и других белков. Он требу-
ет расхождения двух нитей ДНК с тем, чтобы
на каждой из них можно было синтезировать
комплементарную ей половину.
Инициирование репликации ДНК на-
ступает в S-фазе клеточного цикла. Оно проис-
ходит путем локального разделения полинук-
леотидных цепей в пункте, именуемом точкой
начала репликации. Здесь имеется специфиче-
ская последовательность оснований с повы-
шенной долей пар А.....Т, обеспечивающая
возможность сорбции особых белков, которые
способствуют расхождению цепей. Один из
них - фермент хеликаза — расплетает двойную
спираль, используя для этого энергию расщеп-
ления АТФ. Другие белковые молекулы (SSB-
белки - Single Strand Binding Proteins) связы-
ваются с каждой одиночной цепью, препятст-
вуя реставрации двойной спирали.
От точки начала репликации процесс рас-
плетения постепенно продвигается вдоль моле-
кулы ДНК в обе стороны. В каждой из них на-
чальный участок, где двуспиральная ДНК раз-
деляется на одиночные нити, обозначается как
репликативная вилка (рис. 2-18). Именно здесь
располагается хеликаза. Она продолжает рас-
кручивать двойную спираль со скоростью око-
ло 50 п.о. в секунду (у эукариот).
Обе репликативных вилки, удаляясь друг
от друга, проходят не всю молекулу ДНК, а
лишь расстояние до таких же вилок, движу-
щихся навстречу от соседних точек начала ре-
пликации. Полагают, что в молекуле эукарио-
тической ДНК более тысячи таких точек, и все
они включаются в процесс одновременно. По-
этому полная репликация генома млекопитаю-
щих завершается довольно быстро (8-9 ч), не-
смотря на медленное продвижение реплика-
тивных вилок.
Хеликаза не может вращать всю громад-
ную молекулу ДНК, особенно если учесть и
высшие структуры полимера. Поэтому ее про-
движение не только ведет к разделению цепей,
но и порождает тенденцию к усилению скру-
ченности впереди хеликазы. Проблему снимает
топоизомераза. Этот фермент способен разры-
Рис. 2-16. Синтез дочерних цепей ДНК на расплетенном участке родительской ДНК
[вертикальными прерывистыми стрелками отмечено положение репликативных вилок,
горизонтальными - направление их продвижения вдоль оси двойной спирели;
затенением выделены РнК-праймеры лидирующих цепей (А) и фрагментов Оказаки (Б)].
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
71
вать фосфатную перемычку в одной из цепей
ДНК. Тем самым создается возможность сво-
бодного вращения вокруг фосфоэфирной связи,
находящейся на таком же уровне в другой це-
пи. Это помогает дальнейшему раскручиванию
двойной спирали под действием приближаю-
щейся хеликазы.
Важно, что топоизомераза разрывает по-
линуклеотидную цепь не путем гидролиза, а
посредством «переключения» З'-фосфоэфир-
ной связи с дезоксирибозы на группу -ОН ра-
дикала тирозина в молекуле самого фермента.
Поэтому реакция легко обратима: после завер-
шения проворачивания фосфодиэфирный мос-
тик восстанавливается (без затраты энергии),
а освободившаяся топоизомераза может повто-
рять свою акцию в других участках двойной
спирали. Известна и такая топоизомераза, ко-
торая разрывает обе полинуклеотидные цепи,
а после «проворачивания» двойной спирали
вновь сшивает их.
Синтез новой цепи ДНК на одноце-
почечной матрице требует наличия всех четы-
рех субстратов - d-АТФ, d-ГТФ, d-ЦТФ и
d-ТТФ. Осуществляется он под действием
ДНК-полимераз. Их известно несколько типов.
Как и РНК-полимераза, все они образуют фос-
фодиэфирные связи только в направлении
5'—>3’ (см. раздел 2.3.1). Однако, в отличие от
нее, ДНК-полимеразы не могут соединить два
мононуклеотида (т.е., инициировать синтез но-
вой цепи), а способны лишь удлинять уже су-
ществующую цепь, даже если она является ри-
бонуклеотидной. Такая начальная цепь, обозна-
чаемая термином праймер (затравка), синтези-
руется с участием особой РНК-полимеразы,
которую именуют праймазой. Субстратами ее
являются, естественно, рибонуклеотиды в их
трифосфатной форме. Они фиксируются водо-
родными связями на родительской (дезокси-
рибонуклеотидной!) цепи, образуя комплемен-
тарные пары оснований (против Г оказывается
Ц будущего праймера, против Ц - Г, против
Т - А, но против А размещается У, а не Т, по-
скольку ТМФ не включается в состав РНК). По
мере выстраивания рибонуклеотидов на дезок-
сирибонуклеотидной матрице праймаза осуще-
ствляет замыкание фосфоэфирных связей
5'—>3' (как это было показано на рис. 2-12).
И только после завершения синтеза праймера
(длиной от 2 до 10 рибонуклеотидных звеньев)
дальнейший рост начинает осуществлять
ДНК-полимераза. Она продолжает наращива-
ние 3-конца новообразуемой цепи, но уже де-
зоксирибонуклеотидными мономерами, кото-
рые поочередно выстраиваются на одноцепо-
чечной нити родительской ДНК.
Синтез дочерней полинуклеотидной цепи
начинается в репликативной вилке сразу после
ее возникновения и продолжается по мере ее
продвижения. - сначала в форме затравочной
РНК (праймера), а затем в виде ДНК, копи-
рующей родительскую нить. Эта копия форми-
руется в антипараллельном направлении, как
это и свойственно двойной спирали ДНК.
Иными словами, синтез дочерней цепи в на-
правлении 5'—>3' происходит вдоль направле-
ния 3'—>5' одиночной нити материнской ДНК,
как это показано на рис. 2-18. Образующаяся
дочерняя копия этой нити обозначается терми-
ном лидирующая цепь. Другая нить материн-
ской ДНК не может удваиваться таким спосо-
бом, ибо ее расплетение протекает в направле-
нии 5'—>3' и, следовательно, синтез дочерней
ДНК на ней возможен только в направлении,
обратном движению репликативной вилки (см.
рис. 2-18). Создание этой дочерней нити (обо-
значаемой как запаздывающая цепь) начинает-
ся в виде отдельных отрезков, которые затем
соединяются между собой (не покидая матри-
цу). Эти отрезки называются фрагментами
Оказаки (в честь открывшего их ученого); их
длина составляет от 100 до 200 мононуклео-
тидных звеньев. Именно с таким интервалом
появляется (по мере продвижения репликатив-
ной вилки) каждый новый праймер запазды-
вающей цепи (см. рис. 2-18). По завершении
синтеза праймера дальнейшее наращивание
этой цепи осуществляет уже ДНК-полимераза
(тоже в направлении 5'—>3'), продолжая это
почти вплоть до достижения праймера преды-
дущего фрагмента Оказаки (возникшего ранее).
Оставшуюся небольшую брешь достраивает
ДНК-полимераза другого типа. Достигнув пре-
дыдущего праймера, она поочередно отщепля-
ет от него рибонуклеотидные звенья, заменяя
их соответствующими дезоксирибонуклеотид-
ными. Когда весь праймер будет заменен, осо-
бый фермент - ДНК-лигаза - соединяет
З'-конец вновь образованного отрезка с 5'-кон-
72
Глава 2
цом предыдущего фрагмента Оказаки (эта ре-
акция несвойственна полимеразам нуклеино-
вых кислот и требует затраты энергии в виде
расщепления АТФ до АМФ и ФФ).
Как отмечалось, от каждой точки начала
репликации расходятся две репликативных
вилки, движущихся в противоположных на-
правлениях. Поэтому дочерняя цепь ДНК, ко-
торая синтезируется как лидирующая вслед за
движением одной вилки, со стороны другой
репликативной вилки формируется (на той же
родительской цепи) как запаздывающая цепь
(т.е., прерывисто), и самый ранний из ее фра-
гментов Оказаки стыкуется с лидирующей ча-
стью цепи тоже ДНК-лигазой (см. рис. 2-18).
В ходе репликации ДНК расплетение
двойной спирали является окончательным: воз-
врата одиночных цепей родительской ДНК в
исходное состояние невозможно, т.к. на каж-
дой из них возникает новая цепь, которая вме-
сте с родительской образует дочернюю двой-
ную спираль, совершенно идентичную роди-
тельской. Это совершенство обеспечивается
многими механизмами контроля. Одни из них
реализуют упомянутые выше ДНК-поли мера-
зы. Как оказалось, эти ферменты не только на-
ращивают полинуклеотидную цепь, но и спо-
собны исправлять свои ошибки. Если послед-
ний из включенных в цепь мононуклеотидов
окажется почему-либо некоплементарным мат-
рице, то ДНК-полимераза сразу же замечает
свою ошибку и отщепляет (путем гидролиза)
неверно вставленный фрагмент, а потом заме-
няет его «правильным» мономером, и только
после этого способна продолжать наращивание
цепи. Механизм коррекции неточного спа-
ривания оснований дополняется системами
репарации повреждений ДНК, вызываемых
УФ-излучением, ионизирующей радиацией,
химическими мутагенами и другими фактора-
ми. Эти системы осуществляют распознавание
неправильностей в структуре любой из цепей
двойной спирали, после чего вырезают более
или менее длинный участок, содержащий по-
вреждение, а затем (с участием ДНК-полиме-
разы и ДНК-лигазы) заполнять возникшую
брешь, используя неповрежденную цепь в ка-
честве матрицы.
Регуляция репликации тесно связана
с контролем клеточного цикла. Недавно в этой
области достигнут значительный прогресс.
У эукариотов выявлено целое семейство бел-
ков - циклинов, которые участвуют в регуляции
деления ядерной клетки. Одни из них (Gi/S)
обеспечивают начало перехода фазы Gj в син-
тетическую (S) фазу клеточного цикла, во вре-
мя которой и осуществляется синтез ДНК (ре-
пликация). Белки другой группы - циклины
G2/M - необходимы для инициирования мито-
за; они постепенно накапливаются на протяже-
нии фазы G2 и резко исчезают (разрушаются) в
конце М-фазы (в регуляции мейоза участвует
особый вариант - циклин АД
Все циклины действуют не в одиночку, а в
виде комплексов с другими белками, среди ко-
торых наиболее изучены цикли н-зависимые
протеинкиназы. По существу, циклины явля-
ются регуляторными субъединицами этих фер-
ментов, переводя их в активное состояние.
Чаще всего протеинкиназы, образующие ком-
плексы с циклинами Gi/S, катализируют
фосфорилирование определенных участков
РНК-полимеразы, тем самым позволяя ей при-
ступить к синтезу праймеров. Но есть и такие,
которые аналогичным образом активируют ту
или иную ДНК-полимеразу, обеспечивая даль-
нейшее развитие процесса репликации. Нако-
нец, некоторые циклиновые комплексы не ак-
тивируют, а подавляют полимеразу, - путем
либо ее дефосфорилирования, либо фосфори-
лирования в «неудобном» месте.
Циклины группы G2/M тоже взаимодей-
ствуют с определенными протеинкиназами, об-
разуя белок-белковые комплексы, которые
стимулируют переход в фазу митоза. Каждый
такой комплекс обозначают как фактор, спо-
собствующий созреванию.
Все приведенные сведения отражают лишь
начальный этап выяснения регуляторных ме-
ханизмов репликации. Исследования по их
уточнению ведутся очень интенсивно.
2.4.2.	ТРАНСКРИПЦИЯ (СИНТЕЗ мРНК)
Сама ДНК непосредственно в синтезе бел-
ков не участвует. Возможно лишь снятие с нее
копий, которые и отправляются в цитоплазму,
доставляя к рибосомам генетическую инфор-
мацию, считанную с ДНК. Каждая такая копия
представляет собой молекулу мРНК. Копире-
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
73
вание - транскрипцию гена - ведет одна из
ДНК-зависимых РНК-полимераз (у эукариот ее
называют РНК-полимеразой II), а сам процесс
совершенно аналогичен процедуре описанного
выше синтеза праймера. Только размеры син-
тезируемой мРНК несравненно больше: ее цепь
может насчитывать многие тысячи мономер-
ных звеньев.
Инициация копирования происходит в
стартовой точке транскрипции, которая со-
ответствует началу гена (5'-концу формируемой
молекулы мРНК). РНК-полимераза II почти сра-
зу же обозначает этот 5'-концевой нуклеозидтри-
фосфат особой меткой. Она создается путем от-
щепления от него последней (по счету) фосфат-
ной группы, которую заменяет остаток ГМФ,
присоединяемый своей фосфатной частью. По-
является редкостная структура — 5'-5 -трифос-
фатная связь между двумя мононуклеотидами
(рис. 2-19). Далее следует метилирование при-
соединенного гуанина в положении 7, а также
рибозы бывшего 5'-концевого нуклеозидтри-
фосфата в положении 2 (нередко и рибоза сле-
дующего звена тоже подвергается аналогичному
о сн,
1Т">
цепь мРНК
Рис. 2-19. Строение «кэпа» на 5'-конце молекулы мРНК.
метилированию). Возникшую метку называют
кэп (от англ, cap - шапка, кепка); она обозначает
начало синтезируемой цепи мРНК.
Каждый акт транскрипции представляет
собой снятие копии лишь с одного гена. Поэто-
му, в отличие от репликации, разделение цепей
ДНК в ходе такого копирования является вре-
менным и не требует участия дополнительных
белков: сама РНК-полимераза II расплетает
двойную спираль (примерно на полтора витка) и
начинает здесь синтез мРНК на одной из оди-
ночных цепей ДНК. По мере продвижения фер-
мента к 5'-концу матрицы, двойная спираль рас-
плетается перед ним, но вновь закручивается
позади полимеразы, освобождаясь при этом от
готовой цепи мРНК на расстоянии 12 оснований
от ее наращиваемого 3'-конца (рис. 2-20). Таким
образом, зона расхождения нитей ДНК переме-
щается вместе с РНК-полимеразой, удерживая в
виде комплекса с цепью ДНК лишь короткий
головной (растущий) отрезок мРНК.
Завершается синтез молекулы мРНК в
терминаторной области, которая у прокариот
имеет типовые особенности строения. У эука-
риот сигналы прекращения транскрипции не
столь однотипны, но вполне узнаваемы для
факторов терминации транскрипции. Эти
белки способствуют отделению (от ДНК) син-
тезированного транскрипта, который затем
подвергается полиаденилированию. Оно осу-
ществляется независимым от матрицы фермен-
том, который поочередно присоединяет до
200 остатков АМФ со стороны З'-конца моле-
кулы мРНК. Полагают, что возникший
полиА-«хвост» нужен для ее зашиты от расще-
пления ферментами и, кроме того, участвует в
образовании комплексов с белками.
Ту цепь ДНК, на которой формируется
мРНК, называют обычно матричной цепью.
Синтезируемая молекула рибонуклеиновой
кислоты комплементарна ей, а потому иден-
тична другой, нематричной цепи ДНК, повто-
ряя ее и по последовательности чередования
азотистых оснований (если «смириться» с за-
меной Т—>У), и по положению концов 5' и 3'.
Поэтому именно нематричную цепь часто на-
зывают кодирующей (или смысловой) цепью.
Следует подчеркнуть, что цепь, являющаяся
матричной для одних мРНК, может оказаться
нематричной при копировании других генов.
14
Глава 2
кодирующая
(смысловая)
3’
Рис, 2-20. Схема синтеза мРНК. осуществляемого ДНК-зависимой РНК-полимеразой.
У эукариот молекула мРНК, синтезирован-
ная на матричной цепи ДНК, как правило, не
является окончательной. Участки, кодирующие
структуру определенного фрагмента будущей
полипептидной цепи (они именуются экзонами),
чередуются в ией с так называемыми интрона-
ми. Последние представляют собой довольно
протяженные последовательности (иногда до
многих тысяч мономерных звеньев), которые не
нужны при синтезе белка. Теперь установлено,
что в геноме человека из тех 25% общей протя-
женности ДНК, которые кодируют более 26 ты-
сяч белков, лишь 1,1% приходится на долю эк-
зонов; остальные 24% занимают интроны.
Еще до выхода мРНК из ядра клетки спе-
циальные нуклеопротеиновые комплексы, в
которых содержатся малые ядерные РНК
(мяРНК), вырезают все интроны (роль которых
пока еще так и неясна) и сшивают между собой
оставшиеся экзоны. Механизм этого процесса
сводится к реакции трансэстерификации (пере-
носа фосфоэфирной связи с одной пентозы на
другую в той же цепи), не требующей затрат
энергии. Распознавание интронов обеспечива-
ется тем, что каждый из них начинается с ди-
мера ГУ, а завершается фрагментом АГ (при-
мыкающие к ним нуклеотиды тоже довольно
консервативны). В целом этот процесс дозре-
вания {процессинга) синтезированной молеку-
лы мРНК получил специальное название
сплайсинг (сращивание, - имеется в виду
«склеивание» экзонов). И только после его за-
вершения молекула зрелой мРНК в виде ком-
плекса с определенными белками транспорти-
руется через поры ядерной оболочки в цито-
плазму. Нередко экзоны сшиваются не все
и/или ие только в том порядке, в каком они
следуют в исходной молекуле мРНК. Это явле-
ние обозначается как альтернативный сплай-
синг. Есть гены, мРНК-копии которых реали-
зуют его регулярно. Тогда ген (как и синтези-
рованная на нем мРНК) является источником
информации для построения не одной, а раз-
ных полипептидных цепей, хотя и близких по
строению и функциональной роли.
Период полужизни зрелой мРНК составля-
ет у эукариот десятки или сотни минут. После
прекращения транскрипции гена остановка
синтеза соответствующего белка происходит
поэтому ие сразу, а спустя время, требуемое
для деградации молекул мРНК.
Регуляция транскрипции исключи-
тельно важна в связи с тем, что гены (у эукари-
от) подвергаются транскрипции не все сразу, а
каждый в своем режиме. Для многих {консти-
тутивные гены) копирование в виде мРНК
протекает постоянно (хотя и в разном темпе) и
мало зависит от функционального состояния
клетки. Другие проявляют себя только в спе-
циализированных тканях или только на опре-
деленной стадии клеточной дифференциации.
Но есть еще и индуцируемые гены, — те, транс-
крипция которых запускается (или прекраща-
ется) под действием некоторых гормонов или
других ре1уляторных факторов (включая экзо-
генные).
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
75
Ведущую роль в регулировании транскрип-
ции играет промотор. Так называют отрезок
двойной спирали ДНК длиной в 100-200 п.о.,
примыкающий к контролируемому им гену,
т.е., к стартовой точке его транскрипции (она
соответствует 5'-коицу будущей мРНК). Наря-
ду со специфическими последовательностями
нуклеотидов, в разных его местах имеются
сайты (от англ, site - местоположение, участок
для чего-либо), обязательные для почти любого
промотора. Чаще всего такой сайт представлен
последовательностью -Т-А-Т-А- (и парным
ему фрагментом -А-Т-А-Т-). На нем сорбиру-
ется ТАТА-связывающий белок, к которому
присоединяется целая серия так называемых
общих факторов транскрипции (имеющихся
во всех клетках). В этот комплекс встраи-
ваются РНК-полимераза II и еще ряд белков,
завершая формирование инициаторного фак-
тора. Главная его задача - распаковывание
нуклеосомы, ибо она блокирует область ини-
циации любого промотора, удерживая гены в
«выключенном» (репрессированном) состоя-
нии. И еще одна задача: она заключается в том,
чтобы создать возможность сорбции специфи-
ческих факторов транскрипции. Каждый из
них имеет не менее двух центров распознава-
ния, один из которых взаимодействует с ком-
понентами инициаторного фактора, а другой -
с определенным участком ДНК.
Как правило, специфические факторы
транскрипции находятся в неактивном состоя-
нии. Связывание с инициаторным фактором
требует поэтому их предварительной активации,
- например, посредством взаимодействия с оп-
ределенным гормоном. Кроме того, это должно
сопровождаться локальным изгибом молекулы
ДНК (формированием петли), тем более что на
инициаторном факторе могут одновременно
сорбироваться несколько разных специфиче-
ских факторов транскрипции. Есть основания
считать, что между ними возможна конкурен-
ция, а некоторые из сорбируемых здесь белков
(их называют репрессорами) способны не ини-
циировать, а блокировать транскрипцию гена.
2.4.3.	ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ
Многие вирусы не содержат ДНК, а в ка-
честве генетического материала имеют лишь
РНК, нередко представленную одиночной це-
пью. В зараженной клетке такая РНК либо не-
посредственно выполняет роль мРНК (исполь-
зуемой рибосомами клетки для наработки бел-
ков, необходимых для репродукции вируса),
либо предварительно подвергается транскрип-
ции под действием РНК-зависимой РНК-поли-
меразы, привнесенной вирусом. Смысл такой
транскрипции - получение копии, которая не
только комплементарна молекуле вирусной
РНК, но и приемлема для рибосом клетки в
качестве мРНК.
Есть, однако, особый класс РНК-вирусов -
ретровирусы (к ним относится и вирус имму-
нодефицита человека, вызывающий СПИД).
Наряду с РНК, они содержат еще и уникальный
белок - РНК-зависимую ДНК-полимеразу. Ча-
ще его называют обратной транскриптазой,
т.к. этот фермент использует вирусную РНК
для синтеза двухцепочечной ДНК (которая
способна встраиваться в геиом инфицирован-
ной вирусом клетки). Поначалу признанию
возможности обратной транскрипции мешал
авторитет авторов модели двойной спирали
ДНК, провозгласивших в качестве «централь-
ной догмы молекулярной биологии» свое убе-
ждение в том, что информация идет только в
одном направлении: от ДНК к РНК и далее к
белку. И лишь лет через 10 после опубликова-
ния гипотезы о существовании обратной транс-
криптазы значимость открытия американских
исследователей Г.М. Темина и Д. Балтимора
была отмечена присуждением Нобелевской
премии (1975 г.).
Ретровирусы обычно не убивают заражен-
ную ими клетку. Более того, ретровирусная
ДНК, встроенная в геном благодаря обратной
транскриптазе, не только участвует в наработке
новых вирусных частиц, но и вовлекается в
процесс репликации (в составе клеточной
ДНК), а потому сохраняется и в клетках-по-
томках.
2.5.	УЧАСТИЕ РНК В БИОСИНТЕЗЕ
БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ
Помимо мРНК еще две группы рибонук-
леиновых кислот непосредственно вовлечены в
реакции белкового синтеза. Их обозначают как
рибосомные РНК (рРНК) и транспортные
76
Глава 2
РНК (тРНК)- Подобно мРНК, все они синтези-
руются на матричной ДНК, но на других ее
участках. Функциональное их предназначение
различно.
Молекулы рРНК являются важной частью
белок-синтезирующей системы. На них прихо-
дится более 50% состава рибосом-, остальное
представлено белками массой от 6 до 75 кДа.
Именно эти органеллы служат местом синтеза
белков. Число рибосом в клетке эукариот мо-
жет достигать 100 000, а размеры - около
20 нм. Каждая из них представлена двумя суб-
частицам н. одна из которых вдвое крупнее
другой. Малая - это комплекс более 30 белков
с молекулой РНК, насчитывающей 1900 моно-
мерных звеньев. Большая построена из 3 моле-
кул РНК (длиной в 120. 160 и 4700 мононук-
леотидов) и почти 50 белковых молекул. Все
рРНК образуются из общего предшественника,
синтез которого на ДНК происходит под дей-
ствием специальной ДНК-зависимой РНК-по-
лимеразы (ее называют РНК-полимеразой I).
Гены рибосомных РНК имеются в ДНК в сот-
нях копий. В ходе посттранскрипционного про-
цессинга происходит интенсивное метилиро-
вание пентоз и азотистых оснований в опреде-
ленных зонах цепи, после чего почти половина
молекулы подвергается деградации (в неме-
тилированных участках). Нетронутыми оста-
ются только 4 отдельных фрагмента, т.е., упо-
мянутые выше 4 варианта зрелой рРНК. Каж-
дый образует комплексы с белками, посту-
пающими из цитоплазмы. Так возникают рибо-
сомные субчастицы, которые через поры в
ядерной мембране переходят в цитоплазму.
В целом молекулы рРНК составляют около
80% от общего количества РНК в клетке.
Молекулы тРНК невелики по размерам.
Они состоят из 80-90 мононуклеотидных зве-
ньев, последовательность которых кодируется
специальными участками ДНК. Здешней экзо-
тикой является внутригенное расположение
промотора, который к тому же подлежит
транскрипции. Более того, он сохраняется и в
зрелой молекуле тРНК, участвуя в формирова-
нии ее третичной структуры. Синтез всех тРНК
ведет РНК-полимераза III. Как и обычно, пер-
вичный транскрипт избыточен. Последующий
процессинг включает удаление излишних фраг-
ментов и модификацию ряда оснований (в ча-
стности, их метилирование). Завершает созда-
ние зрелой тРНК специальный фермент, кото-
рый наращивает З'-конец молекулы последова-
тельностью ЦЦА, так что у всех тРНК этот
участок одинаков. На долю тРНК приходится
10-15% всей РНК клетки.
Несмотря на название тРНК, данное им
при открытии, выполняют они не только
транспортную функцию. Собственно, в этом
нет и необходимости, ибо любая аминокислота
есть в окружающей среде - в цитозоле. Главная
их задача - преобразовать информацию, дос-
тавленную к рибосоме молекулой мРНК, в
строгую инструкцию об очередности соедине-
ния аминокислот, т.е., о первичной структуре
будущего белка. Иными словами - обеспечить
перевод генетической информации с четырех-
буквенного языка нуклеиновых кислот на
20-буквенный алфавит полипептидных цепей.
Это действительно центральный момент фено-
мена наследственности. Поэтому весь сложный
процесс биосинтеза белков в рибосомах полу-
чил название трансляция, что в оригинале
имеет оттенки перевод (с языка на язык), тол-
кование (смысла), претворение (в жизнь).
Таким образом, тРНК должна обладать,
как минимум, двумя функциями. С одной сто-
роны, она должна уметь читать генетический
код, т.е. узнавать тот участок в цепи мРНК, ко-
торый соответствует месту каждой аминокис-
лоты в первичной структуре синтезируемого
белка. С другой стороны, каждая молекула
тРНК распознает только одну из 20 кодируе-
мых аминокислот. Связываясь с нею, тРНК за-
одно осуществляет и ее активацию, вследствие
чего доставляет к рибосомам активированную
аминокислоту (т.е. уже подготовленную к
включению в синтезируемую полипептидную
цепь).
2.5.1.	РАСПОЗНАВАНИЕ И АКТИВАЦИЯ
АМИНОКИСЛОТ
Аминокислоту идентифицирует, строго
говоря, не сама тРНК, а специальный фермент
- аминоацил-тРНК-синтетаза. Именно он
«узнает» аминокислоту, фиксируя ее на своем
активном центре (рис. 2-21, 1а). Рядом сорби-
руется и молекула АТФ (рис. 2-21, 16), адени-
ловый фрагмент которой (АМФ) переносится
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
77
аа-тРНК-синтаза
комплекс фермента
с аминоацил-аденилатом
Рис. 2-21. Механизм действия аминоацил-тРНК-синтетазы (аа-тРНК-синтаза): активация аминокислоты (1а,б,в)
и перенос ее на молекулу тРНК (На,б,в).
затем иа карбоксильную группу аминокислоты,
присоединяясь к ией своим фосфатным концом
(рис. 2-21, 1в). При этом одна из макро-
эргических связей бывшей молекулы АТФ со-
храняется в возникшем аминоациладенилате.
Другая остается в отщепившемся пирофосфате
(ФФ), который, как обычно, гидролизуется пи-
рофосфатазой, что делает всю реакцию необра-
тимой. Так происходит активация аминокисло-
ты, остающейся пока в соединении с активным
центром фермента (рис. 2-21, 1в). На второй
стадии процесса другой активный центр фер-
мента распознает молекулу нужной тРНК и
тоже фиксирует ее (рис. 2-21, Па). Это способ-
ствует ие только вытеснению АМФ из амино-
ациладенилата, но и «переброске» аминоа-
цильного фрагмента на З'-концевой аденозил
молекулы тРНК (рис. 2-21, Пб). Точнее, иа
3'-гидроксигруппу его пентозы (с сохранением
макроэргической связи при карбоксильной
группе аминокислоты, т.е., активированного
состояния этой кислоты). Возникшая молекула
аминоацил-тРНК отделяется от фермента (рис.
2-21, Пв) и поступает к рибосомам.
Известно более 60 разных тРНК. Это озна-
чает, что некоторые аминокислоты могут транс-
78
Глава 2
портироваться к рибосомам не одной, а несколь-
кими тРНК (т.е. располагают двумя или более
персональными «каретами»). Вместе с тем, раз-
ных аминоацил-тРНК-синтетаз только 20, - по
числу кодируемых аминокислот. Специфич-
ность трансляции во многом обусловлена тем,
что каждая аминоацил-тРНК-синтетаза очень
точно распознает только одну из кодируемых
аминокислот и присоединяет ее только к той
(или тем) из молекул тРНК, которые предназна-
чены исключительно для этой аминокислоты.
2.5.2.	ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД
Проблема расшифровки генетического ко-
да была принципиально решена уже в первое
десятилетие после открытия комплементарно-
сти цепей в двухспиральной структуре ДНК.
В основе лежало простое соображение: одной
буквой четырехбуквенного алфавита нуклеи-
новых кислот можно обозначить только 4 раз-
ных аминокислоты, двумя буквами - 4-4=16
аминокислот, и лишь трехбуквенных слов дос-
таточно (4-4-4=64), чтобы каждую из 20 амино-
кислот назвать своим именем (или даже не-
сколькими именами). Это было подтверждено
разнообразными экспериментами, которые по-
зволили расшифровать смысл каждого три-
плета (последовательность трех подряд азоти-
стых оснований в полинуклеотиде). Такой
фрагмент в кодирующей цепи ДНК (или в эк-
вивалентном ей участке мРНК), читаемый в
направлении 5'—>3', стали обозначать термином
кодов. Перечень всех 64 кодонов с указанием
смыслового значения каждого из них получил
название генетический код. Он приведен в табл.
2.1 в том виде, какой имеет в молекулах мРНК
(в ДНК вместо У всегда находится Т). Можно
видеть, что только для метионина и триптофана
имеется по одному кодовому слову, а почти по-
ловина аминокислот шифруется двумя кодона-
ми каждая. Еще пять аминокислот имеют по 4, а
аргинин, лейцин и серин - даже по 6 кодонов.
Вместе с тем, есть триплеты (УАА, УДГ и
УГА), которые не обозначают никакой амино-
кислоты, а играют роль стоп-сигналов: любой из
них вызывает терминацию полипептидной цепи
(т.е., дает «команду» о завершении ее синтеза).
Генетический код
Таблица 2-1
ААА - лизин	АГА - аргинин	АЦА - треонин	АУА - изо лейцин
ААГ -лизин	АГГ - аргинин	АЦГ -треонин	АУГ - метионин*
ААЦ - аспарагин	АГЦ - серин	АЦЦ - треонин	АУЦ - изолейцин
ААУ - аспарагин	АГУ - серин	АЦУ - треонин	АУУ - изолейцин
ГАА- глутамат	ГГА - глицин	ГЦА - аланин	ГУ А - валин
ГАГ - глутамат	ГГГ - глицин	ГЦГ - аланин	ГУГ - валин
ГАЦ- аспартат	ГГЦ - глицин	ГЦЦ - аланин	ГУЦ - валин
ГАУ - аспартат	ГГУ - глицин	ГЦУ - аланин	ГУУ - валин
ЦАА - глутамин	ЦГА-аргинин	ЦЦА - пролин	ЦУА - лейцин
ЦАГ - глутамин	ЦГГ - аргинин	ЦЦГ - пролин	ЦУГ -лейцин
ЦАЦ - гистидин	ЦГЦ - аргинин	ЦЦЦ - пролин	ЦУУ - лейцин
ЦАУ - гистидин	ЦГУ - аргинин	ЦЦУ - пролин	ЦУЦ - лейцин
УАА - стоп**	УГА-стоп**	УЦА - серин	УУА - лейцин
УАГ - стоп**	УГГ - триптофан	УЦГ - серин	УУГ - лейцин
УАЦ - тирозин	УГЦ - цистеин	УЦЦ - серин	УУЦ - фенилаланин
УАУ - тирозин	УГУ - цистеин	УЦУ - серин	УУУ - фенилаланин
Примечание: * - у прокариот в начале транслируемой цепи мРНК кодирует молекулу формилметионина,
отмечающую инициацию трансляции; ** - стоп-триплет не кодирует аминокислот, а указывает на завершение
(остановку) синтеза создаваемой полипептидной цепи.
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
79
Кодоны, символизирующие одну и ту же
аминокислоту, называют синонимами. Как вид-
но из табл. 2.1, в большинстве своем они раз-
личаются лишь последним (З'-концевым) осно-
ванием триплета (поэтому синонимы почти
всегда располагаются в одной клетке таблицы).
Изобилие синонимов при однозначиом смысле
каждого из них позволяет в значительной мере
преодолевать негативные последствия точеч-
ных мутаций.
Твердо установлено, что генетический код
универсален (одинаков у всех живых существ)
и непрерывен (кодоны следуют один за другим
без каких-либо интервалов или «знаков препи-
нания»). Кроме того, он является неперекры-
вающимся. Это означает, что каждый новый
кодон не наслаивается на предыдущий, а «всту-
пает в силу» только после полного считывания
предшествующего триплета. Например, чере-
дованием оснований ААГЦУГЦАЦ кодируется
трипептид лизил(ААГ)-лейцил(ЦУГ)-гисти-
дин(ЦАЦ), но не тетрапептид лизил(ААГ)-
аланил(ГЦУ)-цистеил(УГЦ)-гистидин(ЦАЦ) и
не октапептид лизил-серил-аланил-лейцил-
цистеил-аланил-гистидил-треонин (отражаю-
щий считывание кодонов ААГ-АГЦ-ГЦУ-ЦУГ-
УГЦ-ГЦА-ЦАЦ-АЦх).
Из-за неперекрываемости генетического
кода добавление (вставка) или выпадение (деле-
ния) одного-двух оснований кодона (вследствие,
например, мутации) приводит к сбою, который
обозначают как сдвиг рамки считывания. Так,
если в приведенной выше последовательности
ААГЦУГЦАЦ исчезнет основание Ц в позиции
4 или появится добавочное А после первого ко-
дона, то вместо трипептида лизил-лейцил-гисти-
дин окажутся закодированными соответственно
лизил-цистеил-треонин (ААГ-УГЦ-АЦх) или
лизил-треонил-аланин (ААГ -ЛЦУ-ГЦА-Ц...).
Иными словами, окажется ошибочной вся ами-
нокислотная последовательность, синтезируе-
мая после точки сбоя рамки считывания.
2.5.3.	АДАПТОРНАЯ РОЛЬ тРНК
Внешний вид молекулы тРНК очень свое-
образен. Она как бы сложена пополам и вдоба-
вок несколько скручена. Поэтому в некоторых
участках происходит спаривание комплемен-
тарных оснований с образованием двухспи-
ральной структуры. Между ними остаются пет-
ли одиночной цепи. В целом получается подо-
бие «стебля», согнутого в верхней части в
форме буквы Г. Как показано на рис. 2-22, го-
ризонтальную часть этой «буквы» образуют
оба конца полинуклеотидной цепи молекулы
тРНК. При этом 5'-конец короче, чем высту-
пающий З'-конеи, последние звенья которого
всегда представлены стандартным триплетом
-ЦЦА. К его завершающему (адениловому)
звену и присоединяется активированная форма
аминокислоты (как это описано выше).
Петля, наиболее удаленная от обоих кон-
цов молекулы тРНК, содержит триплет, специ-
фический для каждой тРНК. Его обозначают
общим термином антикодон (рис. 2-22), т.к. он
комплементарен тому кодону, который соот-
ветствует аминокислоте, переносимой молеку-
лами данной тРНК.
Если распознавание «своей» аминокис-
лоты молекула тРНК осуществляет с участием
специальной аминоацил-тРНК-синтетазы, то
соответствующий кодон она узнает вполне са-
мостоятельно, имея в своей структуре антико-
дон. Благодаря такому сочетанию, молекула
тРНК способна говорить на аминокислотном
«языке» белковых молекул (с помощью ами-
ноацил-тРНК-синтетазы) и, вместе с тем, точ-
но «понимает» указания генетического кода,
безошибочно объединяя оба информационных
потока. Эту функцию «переводчика» принято
называть адапторной ролью молекул тРНК.
Рис. 2-22. Схематическое изображение
структуры молекул тРНК.
80
Глава 2
2.5.4.	МЕХАНИЗМ ТРАНСЛЯЦИИ
Рибосомы не просто являются тем местом,
где происходит белковый синтез, но и вносят
важный вклад в его осуществление. В частно-
сти, они содержат специальные центры связы-
вания, предназначенные для точной взаимной
ориентации молекул мРНК, аминоацил-тРНК и
точки роста созидаемой белковой цепи. Один
из них (А-участок) фиксирует молекулу ами-
ноацил-тРНК в таком положении, чтобы стало
возможным возникновение водородных связей
между ее антикодоном и очередным кодоном
молекулы мРНК, расположенной рядом. Дру-
гой центр связывания — пептидилъный (П-учас-
ток) — «держит» аналогичным образом моле-
кулу пептидил-уРНК., т.е., такую тРНК, амино-
кислота которой соединена с уже построенным
фрагментом будущего белка.
Наиболее ответственным моментом транс-
ляции является точное узнавание самого пер-
вого кодоиа (соответствующего N-коицевой
аминокислоте будущего белка). Только от без-
ошибочности этого узнавания зависит пра-
вильность установки рамки считывания и, сле-
довательно, строгое соответствие строящегося
белка структуре зрелой мРНК. Между тем, оба
конца мРНК имеют нетранслируемые участки.
Более того, в генетическом коде нет специаль-
ного триплета, который отмечал бы начало
трансляции. Выяснилось, что стартовой точкой
трансляции является АУТ, - единственный ко-
дон для обозначения метионина. Значит, синтез
любой полипептидной цепи начинается с ме-
тионина (у эукариот). Чтобы отличить его от
других молекул метионина, встраиваемых в бе-
лок, клетки «обзавелись» двумя совершенно
разными тРНК, обладающими антикодоном для
метионина (ЦАУ. если читать в антипараллель-
ном кодону направлении 5'—>3'). Лишь одну из
них распознает специальный белок — инициа-
торный фактор 2 (ИФ-2), и только в комплексе
с ним молекулу инициаторной метионил-тРНК
способен принять свободный П-участок (когда в
нем окажется кодон АУГ), при условии, однако,
незагруженное™ и A-участка (другая из метио-
ниновых тРНК пригодна только для свободного
A-участка, даже если П-участок тоже свободен).
Соединению инициаторной метионил-
тРНК с рибосомой предшествует фиксация
мРНК на малой субчастице рибосомы, реали-
зуемая благодаря группе специальных белков
(включая кэп-связывающие). Они образуют
комплекс, который обеспечивает правильное
положение 5'-конца молекулы мРНК на малой
субчастице и способствует связыванию ини-
циаторной метионил-тРНК (вместе с ИФ-2)
этой органеллой (рис. 2-23, А). В результате
малая субчастица, объединенная с метионил-
тРНК, получает возможность продвигаться
вдоль мРНК к ее 3'-концу. Перемещение про-
исходит с помощью АТФ-зависимого меха-
низма и продолжается до встречи с первым же
кодоном АУГ. Связывание с ним антикодона,
инициаторной метионил-тРНК служит сигна-
лом к объединению малой субчастицы рибосо-
мы с большой (одновременно с вытеснением в
цитоплазму ИФ-3, ИФ-2 и других белков, вы-
полнивших свою роль). Так завершается ини-
циация трансляции - сборка рибосомы, еоеди-
H.N-CH
сн.
I
снг
S-CH
S-CH3
Рис. 2-23. Инициация трансляции
[А - фиксация мРНК и инициаторной метионил-тРНК на
малой субчастице рибосомы с участием кэп-связывающих
белков и других инициаторных факторов (ИФ);
Б - полная сборка рибосомы на инициаторном комплексе
у первого кодона АУГ]-
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
8J
ненной с мРНК и несущей инициаторную ме-
тионил-тРНК на своем П-участке (рис. 2-23, Б).
Следующая фаза трансляции - образова-
ние пептидных связей между аминокислотами,
доставляемыми в составе тРНК. Иными слова-
ми, происходит ступенчатое удлинение синте-
зируемой полипептидной цепи {элонгация). В
начале процесса свободный A-участок рибосо-
мы занимает молекула той аминоацил-тРНК,
антикодон которой комплементарен кодону в
зоне этого участка (в примере на рис. 2-24,1
здесь находится аланил-тРНК). Теперь очередь
за пептидилтрансферазой, которая является
компонентом большой субчастицы. Она разры-
вает сложноэфирную связь аминокислоты с
т-РНК в пептидильном участке и переносит
«изъятый» аминоацильный фрагмент (в данном
случае - метионильный) на A-участок. И не
просто переносит, а присоединяет его к «-ами-
ногруппе находящейся здесь молекулы ами-
ноацил-тРНК, превращая ее в дипептидил-
тРНК (на рис. 2-24,11 — в метионил-ал анил-
тРНК). После этого специальный белок -
транслоказа - производит перемещение рибо-
сомы на один кодон вдоль цепи мРНК (в на-
правлении 5'—>3')- Это не нарушает связи ко-
дона мРНК с антикодоном молекулы дипепти-
дил-тРНК, которая поэтому оказывается уже в
зоне П-участка (вытесняя отсюда тРНК, остав-
шуюся от инициаторной метионил-тРНК). В
примере на рис. 2-24,111 это отражено перехо-
дом метионил-аланил-тРНК из A-участка в
пептид ильный центр рибосомы. Благодаря это-
му в зоне освободившегося A-участка оказыва-
ется очередной кодон, готовый принять новую
аминоацил-тРНК (на рис. 2-24JV таковым яв-
ляется кодон серина - УЦА).
Следующий раунд элонгации сводится к
повторению таких же актов: фиксация молеку-
лы очередной аминоацил-тРНК на А-участке;
превращение ее в трипептидил-тРНК за счет
переноса дипептидильного фрагмента из
П-участка; смещение трипептидил-тРНК в
П-участок с освобождением A-участка для сле-
дующего кодона и соответствующей ему ами-
ноацил-тРНК. Аналогично трипептид превра-
щается затем в тетра-, пента-, гексапептид и
так далее, вплоть до полного синтеза полимера,
отвечающего структуре зрелой мРНК. В при-
веденном на рис. 2-24 примере третье, четвер-
тое и пятое место от начала цепи должны за-
нять серин, аргинин и валин (в соответствии с
обозначенными на рисунке кодонами).
В чередовании перечисленных актов уча-
ствуют не только структурные компоненты
рибосом, но и специальные белки цитоплазмы.
Из них наиболее изучены факторы элонгации
(ЭФ). Они являются регуляторными молекула-
ми из семейства G-протеинов. Как уже отмеча-
лось (раздел 2.2.3), так обозначают белки, спо-
собные в ассоциации с ГТФ объединяться с бел-
ками-мишенями, активируя их (или блокируя).
При этом G-протеины и сами претерпевают
конформационную перестройку, усиливающую
их способность расщеплять ГТФ до ГДФ и
фосфата. Так реализуется таймерная функция
G-протеинов: в ассоциации с ГДФ они выходят
из комплекса с белками-мишенями, которые из-
за этого возвращаются в исходное состояние (а
факторы элонгации освобождаются в цитоплаз-
ме от ГДФ и могут вновь соединяться с ГТФ).
Один из факторов элонгации (ЭФ-1), свя-
завшись с ГТФ, образует комплекс с молекулой
аминоацил-тРНК, помогая ей соединиться с
рибосомой и расположиться на соответствую-
щем кодоне. Когда фиксация в А-участке
свершится, ЭФ-1 гидролизует «свою» молеку-
лу ГТФ и с оставшимся ГДФ покидает рибосо-
му. Только тогда становится возможным пере-
нос пептидильного остатка и образование но-
вой пептидной связи.
Другой фактор - ЭФ-2 - содействует акту
транслокации. В ассоциации с ГТФ он необхо-
дим при перемещении удлинившейся молеку-
лы пептидил-тРНК (вместе с удерживаемым ею
кодоном) из A-участка в пептидильный центр.
После этого ЭФ-2 расщепляет молекулу ГТФ и
в связанном с ГДФ виде тоже покидает рибо-
сому. Таким образом, оба фактора элонгации
не могут одновременно фиксироваться на ри-
босоме. Выполняя свою таймерную роль, они
соединяются с нею только попеременно, чере-
дуя тем самым акты транслокации и связыва-
ния следующей молекулы аминоацил-тРНК.
Если суммировать затраты АТФ на обра-
зование молекулы аминоацил-тРНК и расход 2
молекул ГТФ в рибосомах, то становится яс-
ным, что энергоемкость процесса образования
одной пептидной связи эквивалентна гидроли-
зу 4 макроэргических связей.
82
Глава 2
Рис. 2-24. Синтез пептидной связи на приме-
ре обрезования метионил-аланил-тРНК:
I - связывание аланил-тРНК со своим кодоном
ГЦА в А-участке рибосомы;
II - результат переноса метионильного остатке
на аминогруппу аланина в А-участке;
III - сдвиг метионил-аланил-тРНК в П-участок
при движении рибосомы вдоль мРНК;
IV - связывание серил-тРНК с очередным кодо-
ном УЦА в освобожденном А-участке.
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
83
Процесс наращивания белковой молекулы
(и продвижения рибосомы вдоль мРНК) про-
должается до тех пор, пока в районе А-участка
не окажется один из стоп-кодонов (УАА, УАГ
или У ГА). Для них нет подходящего антико-
дона в молекулах существующих тРНК. Из-за
незаполненности A-участка происходит оста-
новка синтеза полипептидной цепи. Кроме то-
го, возникшая на нем «пустота» служит сигна-
лом для привлечения особого цитоплазматиче-
ского белка - фактора освобождения (фактор
терминации трансляции). Связываясь с пепти-
дилтрансферазой, этот белок «побуждает» ее
гидролизовать эфирную связь между концевой
группой -СООН полипептидной цепи и 3'-кон-
цом молекулы тРНК, доставившей к рибосоме
последнюю аминокислоту построенного поли-
мера. Рибосома отделяется от мРНК (и тРНК).
после чего диссоциирует на свои субчастицы
(раздельное их существование поддерживается
фиксацией ИФ-3 на малой субчастице).
Таким образом, все рибосомы функциони-
руют однотипно. Каждая из них является уни-
версальной машиной для синтеза любого бел-
ка, - в зависимости от строения используемой
мРНК. Нередко еще задолго до завершения
элонгации на освободившемся 5'-конце моле-
кулы мРНК снова образуется инициаторный
комплекс. В результате на одной мРНК оказы-
вается две рибосомы, продвигающиеся на не-
котором расстоянии друг от друга. Вторая из
них тоже синтезирует полипептидную цепь, -
независимо от первой и с небольшим отстава-
нием от нее. В зависимости от длины мРНК, на
ней может находиться до десятка рибосом. Та-
кой комплекс обозначают термином полисома.
Этот механизм призван обеспечить интенсифи-
кацию белкового синтеза на молекуле мРНК.
Молекулы конкретного белка нередко на-
зывают генным продуктом. Их появление (на-
работка) является свидетельством экспрессии
гена, содержащего информацию о структуре
данного белка. В этом смысле говорят о высо-
ком (или низком) уровне проявления гена (ли-
бо вовсе об отсутствии экспрессии). Если ген
экспрессируется — значит, успешно протекают
все этапы биосинтеза соответствующего белка,
от трвнскрипции до выхода полипептида из
рибосом. Обычно бывает и постсинтетическая
доработка белка.
2.6.	ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ
МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКА
Многие из синтезированных белков осво-
бождаются прямо в цитоплазму. Другие пред-
назначены для встраивания в различные мем-
браны, включения в некоторые субклеточные
образования (например, в лизосомы) или сек-
реции во внеклеточную среду. Большинство из
таких белков вырабатывается не свободными
рибосомами, а фиксированными на мембране
эндоплазматического ретикулума (ЭР). Обыч-
но они образуют локальные скопления на
внешней (цитоплазматической) стороне мем-
браны, формируя участки шероховатого ЭР
(шЭР). Существуют механизмы, направляю-
щие растущую полипептидную цепь через
мембрану во внутреннее пространство шЭР. И
есть специальные системы, которые произво-
дят посттрансляционную модификацию белка,
а также доставку готовых молекул к конечным
пунктам назначения. Посттрансляционные пре-
образования (нередко их называют постсинте-
тическими) очень разнообразны. Наиболее уни-
версальны процессы, которые обеспечивают
правильное складывание (фолдинг) полипеп-
тидной цепи в индивидуальный облик трехмер-
ной конфигурации. Почти со всеми белками
происходит также протеолитическая доработка
(процессинг), т.е., дозревание молекулы. Нако-
нец, реакции ковалентной модификации амино-
кислотного радикала: они разнообразны, но ка-
ждая касается лишь части белков. Совокупность
всех постсинтетических преобразований пре-
вращает полипептидную цепь в окончательный
(зрелый) белок, готовый к исполнению своего
функционального предназначения.
2.6.1.	ФОЛДИНГ
Среди постсинтетических преобразований
молекулы белка важную роль играют некова-
лентные видоизменения. Они составляют ос-
новное содержание процессов, обеспечивающих
правильную укладку длинной полипептидной
цепи в элементы вторичной и третичной струк-
тур. Конечно, оптимальные варианты вторичной
структуры и характер их взаиморасположения в
значительной мере предопределены особенно-
стями аминокислотной последовательности. Од-
84
Глава 2
нако, поскольку цепь строится постепенно, на-
чальным ее отрезкам непросто дождаться пол-
ного завершения процесса, чтобы иметь воз-
можность взаимодействовать и с конечными ее
фрагментами (а не создавать локальные «фигу-
ры», каких нет в нативном белке). Препятство-
вать «рискованным» контактам фрагментов в
пределах еще недостроенной цепи призваны
молекулярные шапероны (в очень вольном пере-
воде - молекулы-наставницы). Так называют се-
мейство особых клеточных белков, которые,
образуя нековалентный комплекс с растущей
полипептидной цепью, как бы «предостерега-
ют» от ошибочных вариантов ее сворачивания,
особенно тех, что могли бы зафиксироваться
слабыми типами связи или дисульфидными
мостиками. Удерживая незавершенный белок от
неудачных случайностей, шапероны обеспечи-
вают более легкое и быстрое складывание выс-
ших структур сразу же в правильном виде (а не
методом проб и ошибок). Они ускоряют фол-
динг, но не влияют на конечный результат, ибо
общая архитектура молекулы уже предопреде-
лена характером первичной структуры.
Нередко третичная структура белка фик-
сируется не только слабыми типами связи, но и
дисульфидными мостиками. В таких случаях
эффект шаперонов дополняется действием
протеиндисулъфид-изомеразы. Этот фермент
осуществляет перегруппировку дисульфидных
связей, устанавливая их в позиции, свойствен-
ные нативному белку.
Важность шаперонной функции стала оче-
видной при изучении прионов (белковые моле-
кулы, которые при попадании в организм с
пищей вызывают заболевания, подобные ин-
фекциям, — такие как «болезнь коровьего бе-
шенства», куру у человека, почесуха у овец и
мышей). Хотя механизм инфекционности при-
онов не вполне ясен, уже установлено, что они
могут отличаться от своих нормальных эквива-
лентов всего лишь (!) необычностью простран-
ственной организации полипептидной цепи.
Аномальность высших структур не только ста-
бильна, но и препятствует ферментативному
расщеплению пептидных связей. Так, у одного
из прионов обнаружена высокая доля (3-скла-
док, которых вовсе нет в нормальной молекуле
с абсолютно такой же первичной структурой.
Более того, при совместной инкубации моле-
кулы нормального белка тоже приобретают
аномальную конфигурацию приона. Эти факты
позволяют предполагать, что именно шаперо-
ны защищают от спонтанного возникновения
прионных модификаций нормального белка.
Участие в фолдинге - не единственная
функция шаперонов. Установлено, что они мо-
гут содействовать и восстановлению нативно-
сти клеточных белков, находящихся на началь-
ных (обратимых) стадиях денатурации (см.
раздел 1.10). Ее вызывают, в частности, тепло-
вые воздействия. Было замечено, что быстрый
нагрев культуры Е. coli до 42 °C сопровождает-
ся всплеском синтеза клеточных белков. Их
назвали белками теплового шока. Выяснилось,
что они являются шаперонами. Временное
усиление их биосинтеза вызывают и иные не-
благоприятные воздействия (такие как ультра-
фиолет, ионизирующая радиация, азотистое
голодание). Поэтому возник более широкий
синоним - белки стресса.
Помимо перечисленного, шапероны участ-
вуют также в мечении состарившихся белков
(для последующей их деградации); в формиро-
вании четвертичной структуры («состыковка»
субъединиц); в трансмембранной проводке ряда
белковых молекул; в контроле конформацион-
ных переходов активная/неактивная форма бел-
ка. Такому многообразию функций соответ-
ствует специализация разных групп шаперонов.
2.6.2.	ПРОЦЕССИНГ
Первым белком, выделенным в очищен-
ном виде (1922 г.) и даже в форме кристаллов
(1926 г.), стал инсулин, гормон поджелудочной
железы. Через 30 лет он оказался первым бел-
ком, для которого удалось полностью расшиф-
ровать строение, а затем и осуществить хими-
ческий синтез. Выяснилось, что этот белок со-
стоит из двух полипептидных цепей (21 и 30
АО), соединенных двумя дисульфидными мос-
тиками. Лишь с развитием новых технологий
было установлено (1967 г.), что изначально ин-
сулин синтезируется в виде одной полипептид-
ной цепи, вдвое более длинной (у человека —
110 АО). Более того, такая избыточность ока-
залась обшим правилом: многие белковые мо-
лекулы синтезируются не сразу в окончатель-
ном виде, а как более крупный предшественник
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
85
(пре-белок). Термином лидерная последова-
тельность принято обозначать его начальный
(N-концевой) фрагмент, насчитывающий чаще
всего от 15 до 35 аминокислотных остатков.
Нередко его называют сигнальным пептидом,
т.к. он содержит информацию о пункте назна-
чения создаваемого полимера. Ее «понимают»
определенные белки, которые и начинают це-
левое перемещение (транслокацию) полипеп-
тидной цепи.
Лидерную последовательность белков,
подлежащих, подобно предшественнику инсу-
лина, отправке в просвет ЭР, распознают осо-
бые рибонуклеопротеины цитоплазмы. И не
только распознают, но и «доставляют» ее к
мембране ЭР и даже связывают с трансмем-
бранным белком, формирующим сквозную по-
ру для проводки полипептидов. Все это проис-
ходит задолго до завершения трансляции, а
потому прикрепленной к мембране оказывает-
ся не только полипептидная цепь (своим сиг-
нальным пептидом), но и сама рибосома, из
которой эта цепь в виде петли продвигается
сквозь пору в просвет ЭР. Еще до окончания
синтеза полипептида специальный фермент —
сигнальная пептидаза — расщепляет связь меж-
ду ненужным уже сигнальным пептидом и ос-
тальной частью молекулы, облегчая ей даль-
нейшее складывание (фолдииг) с участием ша-
перонов.
Сходным образом реализуется транспорт
белков в митохондрии, в которых, как извест-
но, менее 5% необходимых им протеинов вы-
рабатывается в собственных рибосомах (по
информации, поступающей в виде мРНК от
молекулы митохондриальной ДНК). Основная
же масса их синтезируется на свободных рибо-
сомах цитоплазмы с участием ядерных мРНК.
Лидерная последовательность в этих случаях
отличается своеобразием, представляя собой
а-спираль. одна сторона которой гндрофобна,
а другая несет положительные заряды. Такая
амфипатическая структура легко фиксируется
на рецепторах наружной мембраны митохонд-
рий. направляя остальную часть белковой мо-
лекулы внутрь органеллы через пору, располо-
женную в участке контакта обеих мембран.
Лишь после этого происходит ферментативное
отщепление сигнального пептида. Предшест-
венники белков межмембранной зоны мито-
хондрий содержат 2 сигнальных пептида. Уда-
ление первого (обеспечившего обычное посту-
пление пре-белка в матрикс) ведет к раскры-
тию второго, который через внутреннюю мем-
брану митохондрий направляет полипептид-
ную цепь в межмембранное пространство (где
и подвергается затем отщеплению).
На свободных рибосомах цитоплазмы син-
тезируются также все белки клеточного ядра.
Для прохождения через поры ядерной оболочки
лишь небольшие молекулы гистонов не нужда-
ются в лидерной последовательности. В осталь-
ных ядерных пре-белках она обычно очень ко-
ротка, а в предшественниках белковых факторов
транскрипции расположена не с N-конца, а
внутри полипептидной цепи.
Рис. 2-25. Процессинг препроинсулина человека
[затенением выделены сигнальная последовательность
(24 АО) и связующий пептид (35 АО);
светлыми кружками обозначены цепь А (21 АО)
и цепь В (30 АО) зрелого инсулина].
86
Глава 2
Отщепление сигнального пептида - не
единственное проявление процессинга белков.
Зачастую необходимо гидролизовать еще одну
или несколько пептидных связей, чтобы пе-
ревести белок в функционирующее состояние.
Например, упомянутый предшественник инсу-
лина превращается после удаления сигнально-
го пептида не в готовый гормон, а в неактив-
ный проинсулин. В просвете ЭР эта молекула
сначала подвергается складыванию (с участием
шаперонов и протеиндисульфид-изомеразы).
Затем, уже в аппарате Гольджи, происходит
«прицельное» расщепление определенных пеп-
тидных связей (они указаны стрелками на рис.
2-25), в результате чего вычленяется срединная
часть молекулы («связующий пептид» — С-пеп-
тид) протяженностью более 30 АО. Столь вы-
борочный гидролиз пептидной связи из множе-
ства имеющихся в молекуле белка обозначают
термином «ограниченный протеолиз». Его осу-
ществляют высокоспецифичные протеиназы (к
их числу относятся и сигнальные пептидазы).
Ограниченный протеолиз проинсулина
превращает его в готовую молекулу гормона.
Она-то и состоит из двух полипептидов, соеди-
ненных двумя S-S-мостиками (см. рис. 2-25) и
обозначенных как A-цепь и В-цепь в 1955 г.,
еще до выявления того, что они являются
фрагментами одной исходной молекулы - пре-
проннсулина. Зрелый инсулин накапливается в
секреторных пузырьках, откуда выделяется в
кровь по мере надобности.
Бывает и так, что одна полипептидная
цепь разделяется в ходе процессинга на не-
сколько самостоятельных белков, выполняю-
щих совершенно разные функции. Наиболее
яркий пример - препроопиомеланокортин,
синтезируемый в передней и промежуточной
долях гипофиза. У человека этот предшествен-
ник состоит из 267 аминокислотных звеньев.
После удаления сигнального пептида (26 АО)
возникший проопиомеланокортин становится
мишенью для ряда высокоизбирательных про-
теиназ. Набор их и очередность действия раз-
т-мсг
Рис. 2-26. Биоактивные продукты процессинга препроопиомеланокортина человека
(цифрами дана нумерация аминокислотных остатков в исходной цепи) [пояснения приведены в тексте].
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
87
личны в клетках разного типа. Как показывает
схема на рис. 2-26, на определенном этапе ог-
раниченный протеолиз может привести к рас-
членению предшественника на три самостоя-
тельных полипептида. Один из них (N-кон-
цевой) составляет половину исходной молеку-
лы, другой является адренокортикотропным
гормоном (АКТГ; кортикотропин), а третий
обозначают как липотропный гормон (ЛПГ;
липотропин). Каждый из этих «обломков» про-
опиомеланокортина содержит фрагмент, обла-
дающий активностью меланоцитстимулирую-
щего гормона (МСГ; меланотропин). На рис.
2-26 эти фрагменты выделены горизонтальной
штриховкой. Они заметно различаются по пер-
вичной структуре, из-за чего введено дополни-
тельное обозначение буквой греческого алфа-
вита (а-, Р- и у-).
Продукты начальной серии реакций огра-
ниченного протеолиза подвергаются затем воз-
действию других протеиназ, тоже высокоизби-
рательных. При этом из N-концевой половины
предшественника вычленяется молекула
у-МСГ, а также три довольно крупных пептида,
предназначение которых пока неясно (они по-
мечены вопросительным знаком). Из молекулы
АКТГ удалению подвергается срединный пен-
тапептид, в результате чего освобождаются
а-МСГ и пептид, в определенной степени со-
храняющий активность кортикотропина и по-
тому обозначаемый как кортикотропиноподоб-
ный промежуточный пептид (КПП; часто ис-
пользуется англоязычное сокращение CLIP).
Наконец, на этом этапе происходит аналогич-
ное расчленение ^-липотропина на у-ЛПГ и
Р-эндорфин (как это показано в третьей сверху
строке на рис. 2-26). В свою очередь, у-ЛПГ
подвергается укорочению до Р-МСГ, а моле-
кула Р-эндорфина — до у-эндорфина. Последние
два продукта (как и чуть более короткий их
аналог а-эндорфин) по своему болеутоляюще-
му эффекту в десятки раз сильнее морфина (от-
сюда и название эндогенные морфины). Близ-
кими нейромедиаторными свойствами обладают
и энкефалины, которые возникают в виде пен-
тапептидов, отщепляемых от N-конца эндорфи-
нов (на рис. 2-26 энкефалиновый фрагмент вы-
делен затенением).
Очень часто про-белки не подвергаются
заключительному протеолизу в клетке, а секре-
тируются в среду. Иными словами, они превра-
щаются в активную форму не заранее, а непо-
средственно в том месте, где и должны функ-
ционировать. Ранее всего это было установлено
для ферментов пищеварительных соков. Многие
из них выделяются в виде проферментов {зимо-
генов)-. пепсиноген, трипсиноген, химотрипси-
ноген, проэластаза, прокарбоксипептидаза. Ак-
тивация их происходит путем ограниченного
протеолиза, благодаря которому удаляется
фрагмент (рропеппгид), прикрывающий («мас-
кирующий») активный центр фермента. В част-
ности, трипсиноген активируется энтерокиназой
кишечного сока, обеспечивающей отщепление
N-концевого гексапептида. Аналогичным обра-
зом образовавшийся трипсин катализирует уда-
ление пропептидов из молекул остальных упо-
мянутых зимогенов (кроме пепсиногена). Вме-
сте с тем, трипсин способен отщеплять гекса-
пептид от молекул трипсиногена. .Этот феномен
присущ и пепсиногену, первые порции которого
активируются неферментативно (под воздейст-
вием соляной кислоты желудочного сока).
2.6.3.	КОВАЛЕНТНОЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЕ
РАДИКАЛОВ АМИНОКИСЛОТ
Большая группа реакций постсинтетиче-
ской модификации белка связана не с разрывом
полипептидной цепи (процессинг), а с преобра-
зованием аминокислотных радикалов R.
Обычно оно протекает по мере продвижения
белковой молекулы по трубочкам и цистернам
ЭР и в аппарате Гольджи. Именно в мембранах
этих структур локализованы ферменты, распо-
знающие нужные локусы в молекуле белка и
катализирующие соответствующее преобразо-
вание строго определенных аминокислот.
Чаще всего наблюдается присоединение
углеводных фрагментов, которое превращает
простые белки в гликопротеины или протео-
гликаны (см. раздел 1.13.2). Нередко присое-
диняется фосфатный остаток (чаще к радика-
лам серина или треонина). В некоторых белках
костной ткани происходит фиксация сульфат-
ных групп на радикалах тирозина.
Строго говоря, перечисленные (и им по-
добные) реакции не отражаются на структуре
самого радикала аминокислоты, а заключаются
лишь в обратимом присоединении к нему того
88
Глава 2
или иного фрагмента. Имеются ферменты, ко-
торые легко удаляют такую «добавку» (обычно
- путем гидролиза), возвращая аминокислот-
ный радикал в исходное состояние.
В подлинном смысле слова ковалентное
преобразование аминокислоты состоит в транс-
формации ее в совсем другую, причем, не от-
носящуюся к числу кодируемых. Так, в ходе
биогенеза коллагеновых волокон обязательным
является предварительное окисление части ра-
дикалов лизина и пролина до 5-гидроксилизина
и 3- или 4-гидроксипролина. Детали этого про-
цесса (идущего с участием витамина С) будут
рассмотрены в разделе 5.4.3 на примере гидро-
ксилирования лизильных звеньев (см. рис.
5-50). Совершенно аналогичные ферментные
системы внедряют гидроксигруппу в положе-
ние 3 или 4 радикалов пролина (рис. 2-27).
Важно еще раз подчеркнуть, что перечислен-
ные аминокислоты подвергаются гидроксили-
рованию не в свободном виде, а только в со-
ставе белковой молекулы. Более того, даже
весьма стабильные молекулы гидроксипроли-
нов, появляющиеся при распаде собственных
или пищевых белков, никогда не включаются в
синтезируемую полипептидную цепь (ибо для
них нет специальных кодонов).
Многие белки становятся функционально
полноценными только после превращения
определенных глутамильных звеньев их моле-
кулы в радикалы у-карбоксигпутаминовой ки-
слоты (Gia). Оно заключается в присоедине-
нии молекулы СОг к у-углеродному атому ата-
куемого радикала глутамата. Итоговое уравне-
ние этой реакции приведено на рис. 2-28.
В действительности же механизм такого кар-
боксилирования очень сложен. Оно сопряжено
Рис. 2-27. Гидроксилированные формы радикалов
пролина в составе белковой молекулы.
с утилизацией молекулы кислорода, вовлекае-
мой в реакции монооксигеназного типа (раздел
5.4.3), но требующих участия витамина К (см.
формулу на рис. 5-4). Поэтому белки, содер-
жащие радикалы Gia, часто называют витамин-
К-зависимыми протеинами. Внедрение второй
карбоксильной группы в у-положение глута-
мильного радикала приводит к резкому усиле-
нию его способности связывать ионы Са +. Не-
удивительно, что скопление множества остат-
ков Gia в небольшом участке макромолекулы
типично для ряда белков, участвующих в про-
цессе минерализации костной ткани. Многие
компоненты системы свертывания крови также
обладают функционально важными зонами
изобилия радикалов Gia, которые располагают-
ся вплотную или разделены одним-двумя ос-
татками иных аминокислот.
Но самое необычное происходит в ходе
биогенеза тироидных гормонов. Они форми-
руются в составе тироглобулина — специально-
го гликопротеина щитовидной железы, со-
стоящего из двух одинаковых субъединиц мас-
сой более 300 кДа, в каждой из которых насчи-
тывается свыше 60 остатков тирозина. Иодиро-
вание некоторых из них кладет начало конст-
руированию гормональных молекул. Особый
фермент — йодидпероксидаза - внедряет атом
йода в положение 3 фенильного кольца ради-
калов тирозина, а зачастую еще и в положение
5 (механизм реакции предстаален на рис. 5-55).
Этот же фермент переносит затем цикличе-
скую структуру с одного из йодированных ра-
дикалов на гидроксильную группу другого. Так
возникают йодтиронины, пока еще входящие в
состав тироглобулина. В основном они пред-
ставлены тироксином. Формула на рис. 2-29
ОН	но ОН
I	I I
(р=о	О=С\ /С=О
сн2 +СОг	сн
сн?	сн2
сн	... сн
N С	N С
I II	I II
но	но
Глу	Gia
Рис. 2-28. Преобразование глутамильного фрагмента
(Глу) в радикал у-карбоксиглутаминовой кислоты (Gia).
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
89
НС—nh2
СООН
Рис. 2-28. Строение тироксина
(3,5.3',5'-тетрайодтиронин; Т4).
показывает, что он является продуктом кон-
денсации двух радикалов дийодтирозина, т.е.,
является 3,5,3',5'-тетрайодтиронином (краткое
обозначение — Т4).
Установлено, что все дийодтирозильные
звенья, которые становятся акцепторами фе-
нильного ядра йодированного тирозина, лока-
лизованы в строго определенных местах каж-
дой субъединицы йодтироглобулина, а именно
в положениях 24, 1310, 2573, 2587 и 2766 бел-
ка-предшественника. Лишь первые 4 из них
превращаются в тироксин (Т4), тогда как по-
следнее принимает на себя не дийодтирозиль-
ный фрагмент, а 3-монойодированный аналог.
В итоге димерная молекула зрелого йодтиро-
глобулина несет в себе 8 остатков тироксина
и 2 остатка З^З'чприйодтиронина (Т3).
Синтезируемый клетками тироглобулин
секретируется во внеклеточный коллоид. В мо-
лекулах этого белка, примыкающих к люми-
нальной поверхности тироцитов, происходит
йодирование и конденсация тирозильных ра-
дикалов. Эти процессы реализует упомянутая
йодидпероксидаза, встроенная в апикальную
мембрану клеток. Зрелый йодтироглобулин
накапливается в фолликулярном коллоиде же-
лезы. По мере надобности он захватывается
тироидными клетками, где в составе фаголизо-
сом подвергается полному протеолизу до ами-
нокислот. Освобожденные при этом тироидные
гормоны Т4 и Тз выводятся через базальную
мембрану клеток и переносятся кровью почти
исключительно в виде комплексов с белками
(главным образом, с тироксинсвязывающим
глобулином).
Со временем было установлено, что
тироксин является фактически прогормоном,
т.к. все гормональные эффекты наиболее энер-
гично реализует трийодтиронин (Тз). Превра-
щение предшественника (Т4) в гораздо более
активную форму Т3 происходит путем восста-
новительного отщепления йодида Г под дей-
ствием специальной дейодиназы, зависимой от
НАДФ-Нг- Она фиксирована на мембране ЭР и
сосредоточена в основном в печени и почках.
Нервная ткань обладает своим вариантом этого
фермента, продукция которым трийодтиронина
особенно важна в критичные периоды развития
мозга.
Дейодирование молекул Т3 осуществляют
другие дейодиназы (в печени, почках, самой
ЩЖ). Образующиеся ди- и монойодтиронины
полностью лишены гормональной активности
и подвергаются дальнейшей метаболической
деградации.
Итак, стандартную процедуру синтеза
белковых молекул на рибосомах природа до-
полнила механизмом ковалентной модифика-
ции аминокислот, уже включенных в полипеп-
тидную цепь. Это позволяет сузить круг «из-
бранных» макромолекул и обеспечить выпол-
нение ими нетривиальных функций, будь то
надмолекулярное структурирование коллагено-
подобных белков, локальное накопление свя-
занного кальция (Gla-протеины) или создание и
депонирование тироидных гормонов (йодтиро-
глобулин).
В заключение следует отметить, что пост-
синтетическая модификация белка — это столь
же необходимый этап его биогенеза, как и все
предыдущие. Ее нарушения (например, из-за
генетических дефектов соответствующих фер-
ментов) так же чреваты появлением неполно-
ценного белка, как и сбои на уровне транс-
крипции или трансляции.
Глава 3
ЛИПИДЫ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
Главные макромолекулы клетки — белки и
нуклеиновые кислоты - ведут себя как гидро-
фильные частицы. Еще лучше растворимы в
воде углеводы, особенно мономерные. Поэто-
му для обособления от окружающей среды (как
правило, водной) клетки должны обладать по-
верхностным слоем, разграничивающим обе
водные фазы — внутреннюю и внешнюю. Не-
удивительно, что для его построения природа
избрала вещества, совершенно нерастворимые
в воде. Ими являются липиды. Сооружаемые из
них пограничные слои обозначают как биоло-
гические мембраны. Они обособляют не только
клетку (плазматическая мембрана), но и почти
каждое субклеточное образование (клеточное
ядро, митохондрии, лизосомы и ряд других).
Разделяя внутриклеточное пространство на
отсеки (компартменты), биомембраны обеспе-
чивают при этом строго контролируемое
трансмембранное перемещение нужных ве-
ществ, а также передачу внешних сигналов.
3.1. СТРОЕНИЕ ЛИПИДОВ
Липиды - это класс органических ве-
ществ, которые нерастворимы в воде (но рас-
творимы в неполярных жидкостях) и по
своему строению являются, как правило,
сложными эфирами высших жирных кислот и
какого-либо из немногих спиртов.
В этом определении главенствуют жирные
кислоты. Так обозначают длинные алифатиче-
ские цепи с карбоксильной группой на одном
из концов. В природных липидах эти цепи поч-
ти всегда линейны и содержат четное число
углеродных атомов. Чаще всего оно составляет
16, 18 или 20 (табл. 3-1). Более длинные цепи
встречаются в основном в липидах нервной
ткани, а также в рыбьем жире (получаемом из
печени трески).
Двойные связи, встречающиеся в составе
некоторых жирных кислот, имеют, как прави-
ло, г/дс-конфигурацию, которая обусловливает
Таблица 3-1
Наиболее распространенные высшие жирные кислоты
Число атомов С и двойных связей	Название кислоты	Формула
С (16):0	Пальмитиновая	СНз-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-(СН2)7-СООН
С (16):1	Пальмитолеиновая	СН3-СН2-СН2СН2-СНг-СН2-СН=СН-(СНг)7-СООН
С (18):0	Стеариновая	СНз-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-(СН2)7-СООН
С (18):1	Олеиновая	СНз-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-СН=СН-(СН2)7-СООН
С (18):2	Линолевая	СНз-СН2-СН2-СН2-(СН2-СН=СН)2-(СН2)7-СООН
С (18):3	а-Линоленовая	С Нз- (СН2-С Н=СН )з- (СН2)7-СООН
С (20):0	Арахиновая	СНз-СНг-СН2-СН2-(СН2-СН2-СН2)4-(СН2)з-СООН
С (20):4	Арахидоновая	СН3-СН2-СН2-СН2-(СН2-СН=СН)4-(СН2)з-СООН
ЛИПИДЫ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
91
н2с-он
нс-он
н2с-он
Глицерол (глицерин)
СН3-(СН2)12-СН=СН-СН-ОН
HC~NH2
н2с-он
Сфингозин
сн3-(сн2)п--сн2он
Алифатический спирт
(п = 14,16.18 и более)
Холестерол
(пространственное представление)
Рис. 3-1. Главнейшие спирты, входящие в состав липидов
изгиб углеродной цепи под углом 120°. В поли-
еновых кислотах такие изгибы повторяются,
делая молекулу более объемистой (ио и более
короткой). Поэтому растительные масла, в со-
ставе которых преобладают моно- и полиено-
вые кислоты, имеют более низкую температуру
плавления, чем жиры животного происхожде-
ния, в которых ненасыщенных жирных кислот
гораздо меньше. Как показано в табл. 3-1,
двойные связи в жирных кислотах не бывают
сопряженными, т.к. они всегда разделены ме-
тиленовой группой -СН2-
В качестве спиртовой части молекулы ли-
пиды содержат обычно трехатомиый спирт гли-
церол (глицерин), реже — двухатомный амино-
спирт сфингозин или полициклический одно-
атомный спирт стерол и совсем редко - алифа-
тический спирт с длинной цепью (рис. 3-1). По
этому признаку липиды разделяют на ряд
групп. Дальнейшую детализацию производят с
учетом иных структурных элементов, имею-
щихся в некоторых липидах.
3.1.1.	ВОСКА
Молекула воска представляет собой слож-
ный эфир высшей жирной кислоты (длиной до
36 атомов углерода) и высшего жирного спир-
та, содержащего от 16 до 30 углеродных ато-
мов (см. рис. 3-1). Например, одним из главных
компонентов пчелиного воска является эфир
мирицилового спирта и пальмитиновой кисло-
ты: СзоНб1-0-С(0)-С15Нз1- Иными словами, мо-
лекула воска является линейной цепью из 30-50
метиленовых звеньев, которая где-то посереди-
не прерывается сложноэфирной группой. Такие
липиды наиболее трудно растворимы даже в
органических растворителях. Это относится и к
тем воскам, спиртовый фрагмент которых со-
держит еще одну гидроксильную группу (по
соседству с первой) и потому может соединять-
ся с двумя молекулами жирных кислот.
По сравнению с другими липидами, воска
играют довольно ограниченную роль. У позво-
ночных они секретируются кожными железами
и покрывают водозащитной пленкой кожу, во-
лосы, шерсть, перья. Листья, плоды многих
растений тоже имеют восковый налет. Будучи
пластичными при температуре ниже точки их
плавления, воска выполняют также роль сма-
зывающего и смягчающего покрытия. В каче-
стве источника энергии эти вещества выраба-
тываются и используются только морскими
организмами, особенно планктонными.
3.1.2.	АЦИЛ ГЛИЦЕРОЛЫ (НЕЙТРАЛЬНЫЕ ЖИРЫ)
Будучи трехатомным спиртом, глицерол
(см. рис. 3-1) может присоединять одну, две
или три молекулы жирных кислот (одинаковых
или разных). Образуемые сложные эфиры обо-
значаются как моно-, ди- и триацилглицеролы.
Для последних применяют и прежние термины:
триглицериды^ жиры., нейтральные жиры.
В простых триглицеридах все три ацильных
92
Глава 3
11	1	П
СН3-(СНг)к-С-О-СН2	СН3-(СН2),,-С-О-СН2
сн3-(сн2)и-с-о-сн	сн3-(сн2)7-сн=сн-(сн2)7 -с-о-сн
о н^-о-с-(сн2)к-сн3	& Нгс-о-счсн^-снз
О	о
Т ристеармн	1 -Пальмито-2-олео-З-стеарин
Рис. 3-2. Строение триацил глицеролов (триглицеридов).
остатка одинаковы. Отсюда и названия: паль-
митоилглицерол, олеоилглицерол, стеароилг-
лицерол и т.д. Чаще используют более краткие
обозначения - трипальмитин, триолеин, три-
стеарин. Смешанными триацилглицеролами
называют такие, которые имеют разные ациль-
ные остатки, как, например, пальмитодистеа-
рин или пальмитоолеостеарин. При этом сред-
ний углеродный атом глицерола становится
оптически асимметричным, а ферменты распо-
знают иеидентичиость крайних, даже если те
соединены с остатками одной и той же жирной
кислоты. Поэтому углеродные атомы глице-
рольного фрагмента обозначают цифрами (в
обычном изображении нумерацию ведут свер-
ху вниз, — рис. 3-2).
Природные жиры (сливочное масло, рас-
тительные жиры, свиное или говяжье сало и
пр.) являются обычно смесью различных, пре-
имущественно смешанных триглицеридов,
ацильные фрагменты которых варьируют и по
длине цепи, и по числу двойных связей.
Ацилглицеролы составляют самую рас-
пространенную группу липидов. Главнейшая
их роль - участие в энергетическом метабо-
лизме. На пищевые жиры приходится весомая
часть калорийности суточного рациона. Кроме
того, эти вещества легко синтезируются в ор-
ганизме человека и животных (в основном, из
углеводов). Избыток глицеридов легко накап-
ливается в жировых депо. Здесь они служат не
только энергетическим резервом, ио и попутно
защищают от механических воздействий и теп-
лопотерь (подкожная жировая клетчатка), вы-
полняют опорную функцию (например, око-
лопочечная клетчатка).
3.1.3.	ФОСФОЛИПИДЫ
В отличие от нейтральных жиров, фосфо-
липиды (фосфатиды) содержат заряженные
группы, среди которых обязательно имеются
остатки фосфорной кислоты. В качестве спир-
товой части молекулы выступает либо глице-
рол, либо сфингозин (см. рис. 3-1). Соответст-
венно этому, фосфолипиды разделяют на
2 подгруппы.
Глицерофосфолипиды являются про-
изводными фосфатидной кислоты (рис. 3-3).
Она представляет собой 1,2-диацилглицерол,
образующий сложноэфирную связь с фосфор-
ной кислотой, которая, в свою очередь, соеди-
нена (тоже сложноэфирной связью) с амино-
кислотой серином, продуктом ее декарбокси-
лирования этаноламином либо трижды N-ме-
тилированным производным последнего - хо-
лином (см. рис. 3-3). Иногда их заменяет шес-
тиатомиый циклический спирт инозитол. Со-
ответствующие глицерофосфатиды обознача-
ются как фосфагидилсерины, фосфатидилэта-
ноламины, фосфатидилхолины и фосфатиди-
линозитолы (фосфоинозитиды). Множествен-
ным числом каждого названия подчеркивается
вариабельность состава жирных кислот в этих
группах молекул.
Иногда в положении 1 глицерола вместо
жирной кислоты содержится остаток альдегида
с длинной цепью. Такие аналоги именуют
плазмалогенами (см. рис. 7-24).
Не совсем обычную структуру имеет кар-
диолипин (см. рис. 7-21). Он представляет со-
бой глицерол, крайние спиртовые группы ко-
торого соединены с фосфатными остатками
двух молекул фосфатидной кислоты. Этот ди-
фосфатидилглицерол характерен для внутрен-
ней мембраны митохондрий и впервые был
выделен из сердечной мышцы.
Сфингофосфолипиды являются про-
изводными длиниоцепочечного двухатомного
аминоспирта сфингозина. Обе спиртовые груп-
пы и аминогруппа между ними находятся на
одном из концов линейной цепи из 18 углерод-
ЛИПИДЫ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
93
О
II
R'—С—О—СН2
R’’-С-О-СН
II I
О Н2С-О-Р-Х
II
о
Общая формула
глицерофосфолипидов
(R’ - остаток насыщенной
жирной кислоты,
Я" - ненасыщенной)
Строение фрагмента -X	Названия фосфоглицеридов
-ОН	Фосфатидная кислота
-O-CH2-CH-N+H3 1 COO	Фосфатидилсерины
- o-chz-ch2-n*h3	Фосфатидил этанол амины (кефалины)
СНз 1 - O-CHz-CH2-N+-CH3 1 СНз	Фосфатидилхолины (лецитины)
ОН он 	21.он -о\дн у он	Фосфатидилинозитолы
Рис. 3-3. Структурные компоненты глицерофосфолипидов (фосфоглицеридов).
ных атомов. Если ее представить в таком виде,
как на рис. 3-1, то станет очевидным сходство с
глицеролом, точнее - с моноацилглицеролами.
Подобно им, здесь имеется алифатическая цепь
из 15 углеродных атомов, присоединенная в
позиции, аналогичной первому углеродному
атому глицерола. Присоединена она, однако, не
эфирной связью, а непосредственно к этому
углероду (спиртовая группа при нем остается
незанятой). Еще одно отличие заключается в
том, что в положении, соответствующем атому
2 глицерола, сфингозин имеет ие спиртовую, а
аминогруппу. Именно к ней во всех сфинголи-
пидах присоединяется жирная кислота, форми-
руя кислотоамидную связь. Это - первое ис-
ключение из общего правила о сложноэф ирном
строении липидов. Впрочем, оно не очень су-
щественное, ибо оба типа связи близки по сво-
ей природе, да и многие ферменты успешно
гидролизуют ту и другую.
Соедииеиие сфингозина с жирной кислотой
(содержащей обычно L8-26 углеродных атомов)
обозначают термином церамид (рис. 3-4). Фос-
форилирование его концевой спиртовой груп-
пы (которая аналогична такой же группе в по-
ложении 3 глицерола) ведет к образованию
продукта, очень сходного с фосфатидной ки-
слотой. Подобно ей, он может соединяться сво-
им фосфатным остатком с холином, превраща-
ясь в сфингомиелин. На рис. 3-4 такая молекула
представлена в форме, наиболее приближенной
к реальности: две длинные гидрофобные цепи
вытянуты параллельно друг другу в сторону от
высокополярной «головки», содержащей к тому
же и заряженные группировки. Аналогичную
форму имеют в природных условиях и молеку-
лы глицерофосфолипидов: объемная полярная
«головка» и длинный гидрофобный «хвост».
Пространственное разделение полярного и
гидрофобного фрагментов придает молекуле
амфипатические свойства и тем самым обес-
печивает фосфолипидам ведущую роль в по-
строении биологических мембран. Кроме
структурной они выполняют и регуляторную
роль, содействуя селективности функций этих
мембран. А вот в качестве источника энергии
фосфатиды почти не используются (в противо-
положность жирам).
94
Глава 3
СН3-(СН2)12-СН=СН-СН-ОН
CH3-(CH2)n-C-NH-CH
о Н2С-ОН
Церамид
СН3-(СН2)12-СН=СН-СН-ОН
CH3-(CH2)n-C-NH-CH О
О НгС-О-р-ОН
он
Фосфорилированный церамид
(аналог фосфатидной кислоты)
СН3-(СН2)12-СН=СН-СН-ОН
СНз-(СНг)„-С-МН-СН О
О	Н2С—О—Р—О-СН2- СНг-N*
ОН	(СН3)3
Сфингомиелин
Рис. 3-4. Строение сфмнгофосфолипидов
(сфингофосфатидов).
3.1.4.	ГЛИКОЛИПИДЫ
Вместе с фосфолипидами, гликолипиды
относят к сложным липидам, т.е., таким, кото-
рые содержат еще какой-либо компонент кроме
спирта и жирной кислоты.
По строению гликолипиды близки сфин-
гомиелинам и тоже являются мембранными
липидами. Только вместо фосфатной группы
здесь содержится углеводный фрагмент, при-
соединенный к церамиду гликозидной связью.
Для цереброзидов характерно наличие остатка
глюкозы или галактозы (рис. 3-5). Их ацильный
остаток чаше представлен цепью С(24). Галак-
тозилцерамидами богаты мембраны миелина.
Включение сульфатной группы в галактозу
превращает их в сульфамиды (они типичны
для белого вещества мозга).
Олигосахаридные аналоги цереброзидов
называются ганглиозидами. Их углеводный
фрагмент нередко содержит остатки N-ацетил-
галактозамина и N-ацетил нейраминовой ки-
HO-CH-CH=CH-(CH2)i2-CH3
он
Рис. 3-5. Строение галактозилцерамида.
слоты (см. рис. 1-25). Сосредоточены ганглио-
зиды в плазматической мембране нейронов
(6% ее липидов), но встречаются и в клетках
иного типа.
3.1.5.	СТЕРОЛЫ И СТЕРИДЫ
У животных преобладающим стеролом яв-
ляется холестперол (холестерин). Он представ-
ляет собой четыре сконденсированных кольца,
первое из которых содержит гидроксильную
группу (в положении 3), а последнее (в поло-
жении 17) - боковую цепь из 8 углеродных
атомов. На рис. 3-1 холестерол представлен и в
общепринятом плоскостном изображении, и в
той вытянутой пространственной конфигура-
ции, какую он принимает в своем естественном
окружении. Таковым обычно являются другие
мембранные липиды, так что жесткая форма
растянутого блока кольчатых структур легко
смыкается с неполярными «хвостами» фосфо-
и гликолипидов, объединяясь с ними гидро-
фобными взаимодействиями (объединению
способствует и гибкость боковой цепи в поло-
жении 17).
В растительном мире преобладают стеро-
лы несколько иного строения; животные не-
способны усваивать их.
Стериды - это сложные эфиры стерола с
какой-либо жирной кислотой. В организме они
легко возникают и столь же легко гидролизуют-
ся ферментами. Свойства стеролов и их эфиров
очень близки. Соотношение тех и других, а так-
же суммарное содержание их довольно сильно
варьирует в разных биологических структурах,
соответствуя их функциональной специфике.
Все это служит основанием относить стеролы
(наравне со стеридами) к числу липидов, хотя
они и не являются эфирами. Модификация бо-
ковых радикалов холестерола лежит в основе
биогенеза гормонов коры надпочечника и поло-
вых желез, а также желчных кислот. Витамин D
тоже относится к числу стеролов.
3.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
Основу биологической мембраны состав-
ляет липидный бислой. Непроницаемый для во-
ды и гидрофильных молекул, он выполняет
барьерную функцию, поддерживая различия в
ЛИПИДЫ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
95
химическом составе разделяемых водных фаз.
С мембранными липидами ассоциированы спе-
циализированные белки, часть из которых спо-
собна формировать каналы (поры), пронизы-
вающие мембрану и избирательно проницае-
мые для гидрофильных молекул. Рецепторные
белки тоже пересекают липидный бислой, но
ие образуют пор, а являются своеобразными
проводниками, передающими внешний сигнал
внутрь клетки. Наконец, многие белки, встро-
енные в мембрану, являются ферментами. Их
мембранная фиксация необходима для про-
странственного разграничения метаболических
процессов, в том числе разнонаправленных. До-
ля белковых компонентов сильно варьирует.
Так, в миелиновых оболочках нервов она со-
ставляет меиее 20%, в эритроцитах человека -
около 50%, тогда как во внутренней мембране
митохондрий - более 75%. Толщина биомем-
браны составляет обычно от 5 до 10 нм.
3.2.1.	ЛИПИДНЫЙ БИСЛОЙ
У животных преобладающими липидами
биомембран являются глицерофосфатиды, доля
которых варьирует от 35-40% в плазматиче-
ских мембранах до более чем 70% в мембранах
митохондрий. Сфингофосфолипиды составля-
ют почти 20% в плазматических мембранах и
ие обнаруживаются в митохондриях. Гликоли-
пиды, типичные для мембран миелиновой обо-
лочки нервов (до 30% их липидного состава),
слабо представлены (или почти отсутствуют) в
других мембранах. Доля холестерола достигает
20-25% в плазматических мембранах и миели-
не, но не превышает нескольких процентов в
митохондриях и ЭР.
В водной среде амфипатическая природа
перечисленных липидов вынуждает их объеди-
няться своими гидрофобными фрагментами,
оставляя в контакте с водой лишь полярные
«головки» молекул. Даже в искусственной сре-
де (вне клеток) можно создать условия, при
которых амфипатические липиды совершенно
самостоятельно образуют два слоя молекул,
обращенных друг к другу своими углеводород-
ными «хвостами», а к водной фазе — гидро-
фильными «головками» (рис. 3-6). В каждом
моиомолекулярном слое неполярные участки
молекул объединяются между собой силами
гидрофобного взаимодействия. Эти же силы
связывают воедино неполярные «хвосты» одно-
го слоя с такими же структурами другого. Кро-
ме того, в пределах своего монослоя все поляр-
ные «головки» взаимодействуют с соседними
посредством ионных и водородных связей.
Таким образом, липидный бислой пред-
ставляет собой нековалентное объединение
множества молекул, упорядоченность которого
предопределена их амфипатичностью. Струк-
турное сходство мембранных липидов и неспе-
цифичный характер соединяющих их слабых
типов связи, - все это позволяет каждой моле-
куле легко меняться местами со своими сосе-
дями по моиослою (до 10 млн раз ежесекунд-
но). В результате такой латеральной диффузии
скорость перемещения липидных молекул
вдоль монослоя может превышать 0,1 мм/мин.
Высока и интенсивность их вращения вокруг
своей продольной оси. Вместе с тем, перескок
липидов из одного монослоя в другой (флип-
флоп) в зрелой мембране — крайне редкое со-
бытие (меиее 2 молекул в месяц), ибо требует
прохождения полярной «головки» через зону
гидрофобных «хвостов».
а)

Рис. 3-6. Схема строения липидного бислоя:
а - поперечный срез; б - фрегмент бислоя в трехмерном изображении.
96
Глава 3
Рис. 3-7. Правильное (а) и «вывернутое» (6) замыкание обрывка биомембраны
(на примера мембраны эндоплазматического ретикулума).
Состав липидного бислоя асимметричен.
Так, в плазматической мембране эритроцитов и
других клеток холестерол и холиновые фосфо-
липиды содержатся преимущественно в на-
ружном монослое, тогда как во внутреннем
сильно преобладают этаноламиновые и несу-
щие отрицательный заряд сериновые фосфати-
ды. Гликолипиды же вообще локализованы
только во внешнем моиослое клеточной мем-
браны.
Естественным атрибутом биологической
мембраны является ее непрерывность: липид-
ный бислой не может иметь «краев», он замы-
кается сам на себя, в виде бимолекулярной
пленки окружая ограничиваемое им простран-
ство. Нарушение целости биомембраны ведет к
спонтанному слиянию мест разрыва, которое
реставрирует безусловную непрерывность ли-
пидного бислоя (рис. 3-7). Во времена изуче-
ния органелл клетки, разделяемых ультрацен-
трифугированием, была обнаружена фракция
мелких пузырьков (везикул), названных микро-
сомами. Впоследствии оказалось, что в натив-
ной клетке микросом не существует, а образу-
ются они самопроизвольно, из обрывков мем-
браны эндоплазматического ретикулума (ЭР),
возникающих при механическом разрушении
клеток. Как показано на рис. 3-7, ориентация
мембраны в «микросомах» может быть «пра-
вильной» (такой, как в нативном ЭР) либо вы-
вернутой наизнанку (когда цитоплазматическая
сторона мембраны ЭР оказывается внутри мик-
росомной везикулы, а снаружи находится то,
что в нативной мембране обращено в просвет
ЭР). Изучение «вывернутых» пузырьков ие
только подтвердило представления о даижущих
силах самосборки биомембран, но и помогло
выявить структурные различия между их внеш-
ней поверхностью и внутренней. И хотя микро-
сомы в клетках не существуют, их название со-
хранилось в таких устойчивых терминах, как,
например, микросомальное окисление.
К числу функционально важных свойств
биомембраны относится способность к отпоч-
ковыванию своих фрагментов в виде мембран-
ных везикул. Как показано на схеме (рис. 3-8),
процесс начинается с появления выпячивания,
края которого затем смыкаются, образуя пере-
мычку. Она состоит из двух липидных бисло-
ев, слияние которых завершается восстановле-
нием непрерывности исходной мембраны и
замыканием самостоятельного бислоя отшну-
ровавшейся везикулы. Внутреннее ее содержи-
мое отвечает составу среды с той стороны
мембраны, которая противоположна направле-
нию ее выпячивания. Если везикула формиру-
ется с внутренней стороны плазматической
(клеточной) мембраны, то этот процесс обо-
значают термином эндоцитоз (или фагоцитоз,
если из среды захватываются крупные частицы
или даже целые клетки). Таким способом в
клетку переносятся извне объекты, для кото-
рых нет иного механизма проникновения через
биомембрану. Принципиально тот же процесс,
ио протекающий в обратном направлении, на-
зывается экзоцитозом. Ои обеспечивает выде-
ление компонентов клетки в окружающую сре-
ду. Обычно в экзоцитозе участвуют специаль-
ЛИПИДЫ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
97
Рис. 3-8. Схема отпочковывания фрагмента биомембраны
ные внутриклеточные пузырьки. К ним отно-
сятся, в частности, секреторные везикулы., кото-
рые возникают путем отпочкования от аппарата
Гольджи и заключают в себе белки, подлежа-
щие отправке в межклеточную среду (например,
проколлаген). Сливаясь затем с оболочкой клет-
ки, везикулы отдают свое содержимое во вне-
клеточную среду, а их мембрана становится ча-
стью плазматической мембраны. Здесь есть од-
на тонкость: при отпочковании везикул внут-
ренняя сторона цистерн Гольджи остается об-
ращенной внутрь пузырька, а при его слиянии с
клеточной оболочкой она становится наружным
моиослоем плазматической мембраны.
Помимо плазматической мембраны, окру-
жающей клетку, собственную бислойную мем-
брану имеют и некоторые внутриклеточные ор-
ганеллы. К ним относятся, в частности, лизосо-
мы, богатые ферментами внутриклеточного пи-
щеварения (которые подвергают гидролизу и
содержимое фагосом, сливающихся с лизосо-
мами). Образуются лизосомы отпочкованием
участков мембраны аппарата Гольджи. Из глад-
ких участков ЭР таким же способом возникают
пероксисомы, несущие в себе ферменты окисли-
тельной деградации органических молекул. Од-
нако есть в клетке н такие органеллы, которые
окружены двойной мембраной, т.е., двумя само-
98
Глава 3
стоятельными (замкнутыми на себя) липидными
бислоями. К ним относятся ядра клеток и мито-
хондрии (в растениях - еще и хлоропласты).
В митохондриях наружная мембрана име-
ет довольно ровную поверхность и нигде ие
смыкается с внутренней: оба бислоя разделяет
межмебранное пространство. Внутренняя мем-
брана не просто окружает содержимое мито-
хондрии (матрикс), а направляет в него мно-
жество глубоких складок, которые обознача-
ются как кристы. Они почти в 5 раз увеличи-
вают площадь этой мембраны (в сравнении с
наружной), но уменьшают объем матрикса.
Тем не меиее, именно в нем сосредоточено до
70% белков митохондрии.
В отличие от митохондрий, наружная
мембрана клеточного ядра местами сливается с
внутренним бислоем, образуя ядерные поры.
Размеры их достаточны для прохождения мо-
лекул РНК (в виде нуклеопротеиновых ком-
плексов) из ядра в цитоплазму, а гистонов и
других ядериых белков — в обратном направле-
нии (см. раздел 2.4.2). Но самое уникальное за-
ключается в том, что наружная ядерная мембра-
на формирует обширные, сильно ветвящиеся
тупиковые выросты в виде чередующихся тру-
бочек и уплощенных расширений (цистерн).
Совокупность их обозначается как ЭР. Понятно,
что мембрана этой сети представлена одиноч-
ным бислоем. Несмотря на обилие складок и
изгибов, он образует непрерывную поверхность,
которая ограничивает единое пространство (по-
лость ЭР), продолженное в межмембранную
часть ядерной оболочки. Эта полость ненамного
превышает 10% клеточного объема, тогда как
мембрана ЭР составляет более половины пло-
щади всех мембран клетки (доля внутренней
мембраны митохондрий — от 20 до 30%).
Гладкие участки ЭР являются источником
формирования аппарата Гольджи. Его упло-
щенные дисковидные цистерны образуются в
результате слияния транспортных везикул,
отделяющихся от ЭР.
3.2.2.	МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ
Биологическая мембрана - это не только
липидный бислой, ио и ассоциированные с иим
белковые молекулы. Как показано на рис. 3-9,
некоторые из иих фиксируются ионными и во-
Рис. 3-9. Способы ассоциации мембранных белков
с липидным бислоем: а - поверхностный белок;
б - интегральные белки, не пронизывающие весь бислой;
в - трансмембранный белок; г - поверхностный белок,
фиксированный на трансмембранном; д - белок,
ковалентно связанный с якорной молекулой.
дородными связями на полярных «головках»
мембранных липидов. Другие обладают непо-
лярным участком, способным проникать в гид-
рофобную внутренность бислоя. Известен ряд
белков, амфипатические свойства которых по-
зволяют им ие только проникать в липидный
бислой, но и создавать в нем сквозные’отвер-
стия (поры). Обычно они формируются множе-
ством сомкнувшихся молекул белка, одна сто-
рона которых (неполярная) взаимодействует с
гидрофобными «хвостами» внутри бислоя, а
другая (полярная) обращена в просвет поры.
Есть и такие трансмембранные (интегральные)
белки, молекула которых, пронизывая бислой,
концами своими выступает из него, обычно по
обе стороны мембраны. Некоторые из поверх-
ностных мембранных белков ассоциированы
не с липидами, а с внемем бранной частью ин-
тегрального белка. Иногда фиксация белка
осуществляется ковалентным соединением со
специальной якорной молекулой, другим кон-
цом погруженной в бислой или закрепленной в
нем ковалентно.
Трансмембранный участок белков имеет
довольно жесткую структуру а-спирали или р-
складок, которая фиксирована внутренними
водородными связями и экспонирует свои не-
полярные радикалы аминокислот в сторону
гидрофобной зоны бислоя. Такие участки не
имеют изгибов и по протяженности равны тол-
щине этой зоны. У многих рецепторных белков
срединная часть полипептидной цепи прони-
зывает мембрану многократно, делая изгибы
(повороты) за пределами бислоя.
Как и липидные молекулы бислоя, мем-
бранные белки могут вращаться вокруг оси,
перпендикулярной его поверхности, хотя и го-
ЛИПИДЫ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
99
раздо медленнее. Их латеральная диффузия
варьирует в очень широких пределах, но всегда
сильно уступает подвижности липидов. Диф-
фузия белков плазматической мембраны резко
тормозится, если они ассоциированы с фила-
ментами цитоскелета или с белками соседних
клеток, и вовсе прекращается в зоне межкле-
точных плотных контактов. Эта зона отделяет
апикальную область клеточной мембраны от
базальной и препятствует диффузии белков из
одной области в другую. Тем самым обеспечи-
вается своеобразие белкового спектра разных
частей клеточной мембраны.
Мембраны, ограничивающие клеточные
органеллы, гарантируют пространственное
обособление тех или иных биохимических про-
цессов. При этом специализация каждого
отсека клетки обусловлена, прежде всего, спе-
цификой набора ферментов и других белков.
Так, синтез жирных кислот из активированной
формы уксусной кислоты (ацетил-КоА) проис-
ходит в цитозоле, тогда как окислительная де-
градация их до ацетил-КоА и далее до СОг и
Н2О осуществляется в матриксе митохондрий,
где в процесс вовлечены не только раствори-
мые ферменты, но и встроенные во внутрен-
нюю мембрану этих органелл.
В качестве другого примера можно при-
вести синтез мембранных липидов. Этот про-
цесс реализуется комплектом ферментов, каж-
дый из которых насквозь пронизывает мембра-
ну ЭР, но своим активным центром ориентиро-
ван в сторону цитоплазмы. Черпая из нее
«строительный материал» в виде фосфоглице-
рола, жирных кислот (предварительно активи-
рованных) и проч., эти ферменты уже с самого
начала синтеза внедряют образуемые продукты
(фосфатидная кислота, церамид) в структуру
наружного монослоя мембраны, а затем посте-
пенно достраивают липидную молекулу (пере-
вод таких молекул во внутренний монослой
осуществляется избирательно и только в пери-
од построения мембраны ЭР; механизм этой
процедуры пока неясен). На внутренней сторо-
не мембраны ЭР локализованы фермеиты вне-
митохоидриального (микросомального) окис-
ления, в том числе те, которые участвуют в
биосинтезе холестерола и его производных.
Еще одно проявление трансмембранной
асимметрии заключается в том, что ферменты
постсинтетической модификации белков лока-
лизованы в просвете ЭР и обычно встроены в
мембрану. Среди них наиболее многочисленны
гликозилтрансферазы, осуществляющие по-
строение разнообразных углеводных фрагмен-
тов на молекулах большинства белков (и неко-
торых липидов). Подробнее эти реакции глико-
зилирования будут изложены в разделе 10.3.4.
А пока важно подчеркнуть, что протекают они
только на внутренней стороне мембраны ЭР и
аппарата Гольджи. Поэтому в любых мембра-
нах углеводные цепочки сосредоточены лишь
на той стороне, которая не прилежит к цитозо-
лю. В ходе экзоцитоза секреторных везикул их
содержимое (включая гликоконъюгаты) посту-
пает в межклеточную среду, а мембрана
встраивается в плазматическую мембрану. При
этом углеводные фрагменты гликопротеинов и
гликолипидов оказываются на внешней сторо-
не клеточной оболочки, составляя от 2 до 10%
ее массы. Нейраминовая кислота в их составе в
основном и ответственна за наличие отрица-
тельных зарядов на поверхности клеток.
3.3.3. ТРАНСПОРТ ВЕЩЕСТВ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНУ
Липидный бислой практически непрони-
цаем для полярных молекул. Исключение сос-
тавляют вода и газы (О2, N2, СОг и т.д.), а так-
же нейтральные органические вещества, моле-
кулярная масса которых не превышает 100 Да
(мочевина, этанол, глицерол и им подобные).
Макромолекулы и надмолекулярные образова-
ния преодолевают мембрану посредством от-
почковывания везикул и их слияния (эндоци-
тоз, экзоцитоз, образование лизосом, фаголизо-
сом и т.п.). Некоторые из них (включая транс-
феррин, липопротеины плазмы крови, ком-
плексы антиген-антитело, многие вирусные
частицы и токсины) попадают в клетку путем
рецептор-опосредованного эндоцитоза.
Для всех остальных веществ проникнове-
ние через липидный бислой возможно только с
участием особых белков. Часть из них способ-
на формировать в нем упомянутые выше поры
(каналы), пригодные для прохождения тех или
иных молекул или иоиов. Но чаще перенос
реализуется гораздо более сложными механиз-
мами, не требующими создания канала. Иногда
они сопряжены с перемещениями белка-пере-
100
Глава 3
носчика относительно бислоя. В других случа-
ях белок, образовав комплекс с переносимым
веществом по одну сторону мембраны, претер-
певает такую конформационную перестройку,
благодаря которой освобождается от него по
другую сторону бислоя (возвращаясь при этом
в исходное конформационное состояние). Но
всегда именно мембранные транспортные бел-
ки обеспечивают избирательность процесса и
часто снабжены специальными механизмами
контроля, регулирующими интенсивность
трансмембранного потока.
Перенос какого-либо вещества бывает од-
нонаправленным (унипорт) либо возможным в
обоих направлениях. Некоторые белки-пере-
носчики осуществляют котранспорт, при ко-
тором перемещение одного вещества сопряже-
но с одновременным (или поочередным) пере-
носом другого либо в том же направлении
(симпорт), либо во встречном (антипорт).
Во многих случаях трансмембранное про-
движение молекул и ионов осуществляется пу-
тем простой диффузии. Происходит она по гра-
диенту концентраций, а для заряженных частиц
- по электрохимическому градиенту, который
определяется еще и разностью потенциалов по
обе стороны мембраны. Участие транспортных
белков позволяет ускорять физическую диффу-
зию веществ (механизм облегченной диффузии).
От перечисленных способов пассивного
транспорта принципиально отличаются сис-
темы, обеспечивающие перенос веществ про-
тив их электрохимического градиента. Работа
по преодолению концентрационного (и элек-
трического) барьера требует затраты энергии.
Отсюда и название — активный транспорт.
Источником энергии для него чаще всего слу-
жит попутное расщепление АТФ до АДФ и
фосфата. Фермент, обеспечивающий такой
процесс, обозначается как транспортная аде-
нозинтрифосфатаза (АТФаза).
К наиболее распространенным относится
натрий-калиевая АТФаза (Na+,K+-АТФаза).
Этот трансмембранный белок широко пред-
ставлен в плазматической мембране животных
клеток и очень чувствителен к концентрациям
ионов Na’’ и К+. Внеклеточный его фрагмент
имеет центр связывания для К+, а на цитоплаз-
матической стороне находятся участки, специ-
фичные для Na+ и АТФ. Связывание внутри-
клеточного Na+ стимулирует АТФазную актив-
ность, в результате чего освобождается моле-
кула АДФ, а фосфатный остаток остается со-
единенным с ферментом. Наступающие при
этом конформационные изменения белка вы-
зывают выброс Na+ из клетки наружу, за чем
следует присоединение внеклеточного К+. Это,
в свою очередь, ведет к отщеплению фосфат-
ной группы (во внеклеточную среду), которое
способствует «переброске» К+ внутрь клетки с
возвратом №+,К+-АТФазы в исходное конфор-
мационное состояние. В каждом цикле пере-
численных событий гидролиз одной молекулы
АТФ сопряжен с выбросом трех ионов Na+ из
клетки и «накачиванием» в нее двух ионов К+.
Эта неэквивалентность обмена - главная при-
чина дефицита катионов внутри клетки. Иными
словами, плазматическая мембрана оказывает-
ся поляризованной', цитоплазматическая сторо-
на ее заряжена отрицательно по отношению к
наружной. Благодаря непрерывной работе
Ыа+,К+-АТФазы, трансмембранная разность
электрических зарядов (потенциал покоя) под-
держивается на постоянном уровне, вопреки
неизбежным «утечкам» Na+ и, особенно, К+,
происходящим путем простой диффузии.
Содержание Na+ во внеклеточных средах в
десятки раз превышает концентрацию ионов
К+, а внутри клеток наблюдается обратное со-
отношение. Системы, которые создают такой
градиент, нередко называют насосами. В дан-
ном случае - натрий-калиевый насос (Na+,K+-
насос). Значение его видно уже из того, что на
перекачивание ионов Na+ и К+ расходуется бо-
лее 30% АТФ, утилизируемого клеткой на свои
нужды в состоянии покоя.
В нейронах трансмембранный градиент
концентраций этих ионов необходим для реа-
лизации элементарного акта нервной деятель-
ности, каковым является возникновение и рас-
пространение нервного импульса. Роль пуско-
вого фактора играют чаще всего особые на-
триевые каналы, которые в покое непроницае-
мы для ионов, но мгновенно раскрываются в
ответ на воздействие нейромедиатора или ино-
го раздражителя. Локальный прорыв в клетку
даже малой порции катионов (несколько тысяч
ионов Na+ за одну миллисекунду) вызывает
скачкообразную деполяризацию мембраны,
означающую смену потенциала покоя потен-
ЛИПИДЫ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
101
циалом действия. Очевидно, в таких каналах
должны быть некие «ворота», которые быстро
распахиваются под действием раздражителя,
но почти сразу же вновь захлопываются, оста-
навливая поток ионов. В данном случае закры-
тие «воротных каналов» происходит под влия-
нием развивающегося потенциала действия.
Тем самым обеспечивается предельная кратко-
временность нервного импульса.
Изменение трансмембранного электриче-
ского потенциала в зоне возникновения им-
пульса создает соответствующую разность за-
рядов вдоль мембраны, т.е., относительно
смежных ее участков. В них из-за этого тоже
раскрываются «ворота» для Na+ и происходит
скачок трансмембранного потенциала (с неко-
торой, естественно, задержкой относительно
локуса начальной деполяризации). Таким спо-
собом потенциал действия постепенно охваты-
вает всю остальную поверхность клетки (и ее
отростков), пробегая по ней в виде волны элек-
трического тока (ибо ионный поток - это род
электрического тока). Аналогией может слу-
жить движение огня по бикфордову шнуру.
Однако шнур при этом сгорает, а в био мембра-
не локальный сдвиг мембранного потенциала
сразу же компенсируются работой Na+,K+-Ha-
соса, возвращающего состояние готовности к
возникновению и проведению новых импуль-
сов. На эту работу нейроны расходуют до 70%
синтезируемого ими АТФ.
Система Na+,K+-Hacoca и воротных кана-
лов действует не только в нервной, но и в дру-
гих возбудимых тканях, включая мышечную.
Вместе с тем, градиент концентраций, созда-
ваемый №т,К+-АТФазой, многие клетки не
применяют для генерирования волны возбуж-
дения, а используют в качестве движущей силы
(вместо АТФ) для активного транспорта неко-
торых веществ. Так, всасывание глюкозы эпи-
телиальными клетками тонкой кишки осущест-
вляется не только путем пассивной диффузии,
но и в значительной степени благодаря сопря-
жению с транспортом ионов Na+, устремляю-
щихся в клетку по градиенту их концентрации.
Как полагают, белок-переносчик имеет разные
участки для связывания Na+ и глюкозы. Чем
больше различие в содержании Na+ внутри и
вне клетки, тем интенсивнее поступает в нее
глюкоза (и натрий, естественно). Подобный
механизм активного транспорта за счет гради-
ента концентрации Na+ осуществляется также
при реабсорбции глюкозы в почечных каналь-
цах. Во всех этих случаях дальнейший переход
моносахарида из клетки в кровь происходит
путем пассивной диффузии по градиенту его
концентрации. Известны Ыа+-зависимые пере-
носчики и для других сахаров, а также для
аминокислот. Надо заметить, однако, что в ко-
нечном счете источником энергии для таких
систем является выкачивание Na+ из клетки,
обеспечиваемое работой На+,К+-АТФазы.
Среди других ионных насосов наиболее
важную роль играет кальций-зависимая
АТФаза (Са2+-АТФаза, Са2+-насос). Встроен-
ный в плазматическую мембрану, фермент на-
столько энергично выкачивает Са2+, что его
концентрация в цитозоле эукариотических кле-
ток на 3-4 порядка ниже, чем во внеклеточных
средах (где она находится обычно на уровне
1-2 мМ). Быстрый поток ионов Са2+, устрем-
ляющийся в клетку при определенных воздей-
ствиях, служит одним из важных способов
трансмембранной передачи сигналов.
Скелетная мышца демонстрирует наиболее
выразительный пример управления клеткой
посредством ионов Са2+. Крайне низкий уро-
вень их в цитозоле поддерживается работой не
только Са2+-АТФазы плазматической мембра-
ны (сарколеммы). Значительный вклад вносит
также фермент, встроенный в мембрану сарко-
плазматического ретикулума (СР) и состав-
ляющий до 90% всего белка этой мембраны. За
каждый цикл работы этот Са2+-насос, гидроли-
зуя со стороны цитоплазмы молекулу АТФ,
перекачивает два иона Са2+ внутрь цистерн СР,
делая из них своеобразное хранилище внут-
риклеточного Са2+ (10*3 М). Потенциал дейст-
вия, возникающий при возбуждении мышечной
клетки, распространяется по сарколемме и об-
разуемым ею Т-трубочкам, достигая участков
их контакта с мембраной СР. Здесь электриче-
ский импульс вызывает быстрое раскрытие
«воротных» каналов, через которые поток на-
копленного в цистернах Са2+ устремляется в
цитозоль. Это служит сигналом для укороче-
ния миофибрилл, ибо достаточный уровень ио-
нов Са2+ (1О'б-1О'5 М) стимулирует АТФазную
активность комплекса сократительных белков
мышцы. Иными словами, только в присутствии
102
Глава 3
указанных концентраций Са2+ эти белки спо-
собны превращать энергию расщепления мак-
роэргической связи АТФ в механическую ра-
боту укорочения мышечного волокна. Расслаб-
ление мышцы, как оказалось, тоже требует за-
траты энергии АТФ: она нужна для обратного
откачивания ионов Са2+ в цистерны СР. Осуще-
ствляет этот обратный процесс Са2+-ЛТФаза,
которая сильно активируется избытком Са24 в
цитозоле и поэтому быстро снижает уровень
этого иона в нем до 10'7 М или еще ниже (что и
приводит к расслаблению миофибрилл).
Приведенные примеры показывают, что
системы трансмембранного переноса вешеств
очень разнообразны. Они различаются и своей
избирательностью, и способами функциониро-
вания, и механизмами регулирования. Их со-
гласованная работа обеспечивает специфику
состава и соотношения растворимых веществ в
различных отсеках клетки.
3.3.4. ТРАНСМЕМБРАННАЯ СИГНАЛИЗАЦИЯ
От мембранных белков, реализующих
прохождение определенных молекул (ионов)
сквозь липидный бислой, отличаются те, кото-
рые осуществляют трансмембранную передачу
не веществ, а информации. Источником ее ча-
ще всего являются сигнальные молекулы (гор-
моны и другие химические медиаторы), по-
средством которых одни клетки могут воздей-
ствовать на поведение других, - тех, что обла-
дают соответствующими рецепторами. Являясь
трансмембранными белками клеточной обо-
лочки, рецепторы, тем не менее, не образуют
каналов в липидном бислое. Как уже отмеча-
лось (раздел 1.9), свою роль «проводника» они
выполняют путем конформационной пере-
стройки, которая наступает под действием
внешнего сигнала и распространяется на внут-
риклеточную часть белка-рецептора, сущест-
венно изменяя ее свойства. Следствием этого
становится цепочка преобразований внутри-
клеточных «партнеров» данного рецептора,
ведущая в конечном счете к кратковременной
стимуляции (или угнетению) соответствующей
функции клетки.
В большинстве своем системы трансдук-
ции (внутриклеточного преобразования внеш-
него сигнала) используют в качестве вторично-
го посредника циклическую форму нуклеоти-
дов - цАМФ или цГМФ. Главные аспекты их
функционирования изложены в разделе 2.2.3.
Здесь уместно рассмотреть еще одну важную
систему - фосфоинозитидную. Она использует
компонент липидного бислоя, причем, только
одну группу мембранных липидов - фосфати-
дилинозитолы (см. рис. 3-3). Предварительно
молекула такого липида должна превратиться в
фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат (рис.3-10).
Этот процесс протекает путем переноса фос-
фатного остатка с АТФ на спиртовые группы
инозитола в положениях 4 и 5. Есть данные,
что его «организует» внутриклеточный домен
рецепторов, распознающих некоторые факторы
роста или гормоны белковой природы.
Из трансмембранных белков, реализую-
щих фосфоинозитидный путь, наиболее изуче-
ны di-адренорецепторы и гладкомышечные
рецепторы антидиуретического гормона (вазо-
прессина). Их возбуждение вызывает актива-
цию особого G-протеина, который, наряду с
обычной таймерной функцией аллостерически
активирует фосфолипазу С. Этот фермент,
встроенный в плазматическую мембрану с ее
внутренней стороны, катализирует гидролиз
фосфатидилинозитол-4,5 -бисфосфата до ино-
зитол-1,4,5-трифосфата и диацилглицерола (см.
рис. 3-10). Каждый из продуктов реакции вы-
полняет роль вторичного посредника, демонст-
рируя еще одну особенность фосфоинозитид-
ной системы. Кратковременность действия
обоих посредников обеспечивают ферменты их
гидролитического расщепления.
Гидрофобный диацилглицерол остается в
липидном бислое и способен активировать
встроенную в него протеинкиназу С. Фактиче-
ски это группа близких ферментов, которые
фосфорилируют (за счет АТФ) определенные
белки и тем самым изменяют их активность.
К мишеням протеинкиназы С относятся, в ча-
стности, некоторые факторы роста.
Другой из вторичных посредников - ино-
зитолтрифосфат - гидрофилен и поэтому легко
переходит в цитозоль, где и выполняет свое
предназначение. Оно заключается в том, чтобы
открывать воротные механизмы кальциевых
каналов, пронизывающих бислойные структу-
ры плазматической мембраны, ЭР, митохонд-
рий. Это приводит к быстрому снижению
ЛИПИДЫ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
103
II
R'-C-O-CH2
R"—с-О-СН
II I
о н2с-о
Фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат
Инозитол-1,4.5-трифосфат
II
R'-C-O-CH2
I
R"-С- О-СН
II I
О Н2С-ОН
Диацил глицерол
Рис. 3-10. Гидролиз фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата фосфолипазой С.
трансмембранного градиента ионов Са2+ за
счет увеличения их содержания в цитозоле.
Такой скачок концентрации вызывает самые
разнообразные последствия (за что Са2+ иногда
называют третьим посредником фосфоинози-
тидного пути). Некоторые из них обусловлены
собственно кальцием (в частности, сорбция его
протеинкиназой С усиливает активацию этого
фермента диацилглицеролом). Однако боль-
шинство эффектов кальций вызывает не сам по
себе, а в виде комплексов с кальций-связываю-
щими белками.
Наиболее распространенным из белков,
обладающих строгой избирательностью к каль-
цию, является кальмодулин (на его долю при-
ходится до 1% суммарного содержания белков
в клетке). При сравнительно небольших разме-
рах (около 17 кДа), он содержит 4 центра, каж-
дый из которых состоит из 12 АО и обладает
высоким сродством к ионам Са2+. Сорбируя их,
белок претерпевает существенные конформа-
ционные изменения, становясь способным ви-
доизменять (модулировать) функциональную
активность ряда ферментов и иных белков. В
частности, именно кальций-кальмодулин вы-
зывает упомянутую выше активацию некото-
рых мембранных Са2+-АТФаз, наступающую
при повышении уровня Са2+ в цитозоле. Анало-
гичный регуляторный эффект, аллостериче-
ский по механизму действия, кальмодулин мо-
жет проявлять и в отношении аденилат- и гуа-
нилатциклаз, фосфодиэстеразы циклических
мононуклеотидов, ряда ферментов метаболиз-
ма углеводов. В гладких мышцах комплекс Са2
с кальмодулином активирует киназу легких це-
пей миозина, которая, фосфорилируя эти цепи,
инициирует процесс сокращения (аналогично
регулируется и сократительная активность ак-
томиозиновых систем немышечных клеток).
Иногда кальмодулин вообще является посто-
янным компонентом фермента, входя в его со-
став в качестве регуляторной субъединицы
(пример - киназа фосфорилазы).
В заключение следует отметить, что не все
внешние сигналы воздействуют именно на
внеклеточный сегмент трансмембранного бел-
ка-рецептора. Некоторые из них в силу своей
гидрофобности и небольших размеров способ-
ны проникать через липидный бислой и лишь
затем избирательно связываться с белком-
мишенью. Известные данные об одной из та-
ких сигнальных молекул - оксиде азота - при-
104
Глава 3
ведены в конце раздела 2.2.4. К числу осталь-
ных относятся стероидные гормоны, йодтиро-
нины и ряд других органических веществ, вы-
полняющих сигнальную функцию. Как прави-
ло, их эффекты реализуются посредством не-
ковалентного объединения со специфичным
белком (внутриклеточным рецептором), кото-
рый вследствие этого обретает (или теряет)
способность связываться с определенным уча-
стком ДНК и тем самым регулирует инициа-
цию транскрипции соответствующего гена.
Рецепторы для гормонов внутриклеточного
действия находятся в цитозоле или непосред-
ственно в ядре клетки. Каждый из них сущест-
вует обычно в форме комплекса с белками-
шаперонами, которые поддерживают опреде-
ленную конформацию рецепторного белка. Ее
изменения вызываются связыванием рецептора
с сигнальной молекулой и, в свою очередь,
приводят к отделению шаперонов. В результа-
те становится открытым тот участок рецептора,
который предназначен для взаимодействия с
фрагментом молекулы ДНК, контролирующим
экспрессию определенного гена.
Глава 4
ФЕРМЕНТЫ
Белковые молекулы выполняют в живом
организме самые разнообразные функции. Ка-
ким образом они это делают - эта проблема
впервые стала успешно решаться при изучении
ферментов. Со временем были разработаны
разнообразные способы и методы количест-
венного анализа ферментативных процессов.
Теперь они позволяют не только регистриро-
вать конечный итог «работы» фермента, но и
получать количественную оценку ряда качест-
венных характеристик такой деятельности.
Эти достижения способствовали успехам и* в
изучении других белков, — тех, которые не яв-
ляются ферментами. Выяснилось, что меха-
низмы и параметры функционирования таких
белков очень часто тоже могут быть количест-
венно оценены с помощью приемов, разрабо-
танных применительно к ферментам. Особенно
большую роль сыграло открытие феномена
саморегуляции ферментов, который, как оказа-
лось, свойственен и многим другим белкам.
Ферменты (энзимы) - это высокоспеци-
фичные белки, выполняющие функции биологи-
ческих катализаторов.
Как известно, катализатором называют
вещество, которое ускоряет химическую реак-
цию, но само в результате реакции не расходу-
ется.
Чтобы представить себе механизм такого
ускорения, целесообразно рассмотреть природу
химического катализа вообще.
4.1. СУЩНОСТЬ ЯВЛЕНИЯ КАТАЛИЗА
Любые химические превращения пред-
полагают прежде всего сближение (столкнове-
ние) реагирующих молекул. Но не всякое их
соударение будет эффективным, т.е., завер-
шится химическим преобразованием. Прежде
всего, в момент контакта молекулы должны
обладать таким энергетическим потенциалом
(энергия столкновения), который достато-
чен для обеспечения химических превраще-
ний. Конкретная величина этого потенциала
зависит от природы реагирующих молекул и
характера их преобразования. Поэтому ее мож-
но обозначить как энергетический уровень ре-
акции. Этот параметр является константой,
т.е., внутренней характеристикой, свойствен-
ной от природы каждой данной химической
реакции. Естественно, что для разных реакций
эта константа в общем случае различна.
С другой стороны, эффективность химиче-
ской реакции зависит от того запаса энергии,
которым фактически обладают молекулы в
момент соударения. Однако эта характеристика
— энергетический уровень молекул — не являет-
ся неизменной, а относится к разряду величин
вероятностных (статистических). Действитель-
но, уже хотя бы в силу теплового движения
молекул потенциал каждой из них непостоянен
во времени (наглядный пример - броуновское
движение частиц). Сталкиваясь с другими, от-
дельная молекула «летит» то быстрее, то мед-
леннее, а то и вовсе на мгновение почти «зам-
106
Глава 4
рет» на месте. Тем не менее, ее энергетический
потенциал колеблется около определенного
значения, которое обозначается как средний
энергетический уровень молекул (Еср). Этот па-
раметр характеризует достаточно большую со-
вокупность данных молекул в данных конкрет-
ных условиях (температура, концентрация мо-
лекул и т.д.). С течением времени каждая из
них чаще всего оказывается именно в состоя-
нии, близком к среднему значению энергетиче-
ского потенциала всех молекул данной сово-
купности. И чем дальше от этого среднего зна-
чения (в любую сторону), тем реже каждая
конкретная молекула обладает таким потен-
циалом. Отсюда следует, что в любой момент
времени наибольшая доля молекул несет в себе
именно тот запас энергии, который обозначен
как средний. И чем дальше от него, тем меньше
доля молекул, пребывающих на таком энерге-
тическом уровне. Эта зависимость выражается
законом распределения Максвелла-Больцмана.
Графически она представлена на рис. 4-1.
Таким образом, несмотря на непостоянст-
во судьбы каждой отдельной молекулы, в дос-
таточно большой их совокупности постоян-
ная доля молекул обладает тем или иным
энергетическим потенциалом. В том числе -
таким, который не ниже, чем энергетический
уровень данной реакции. Соударения именно
таких молекул - достаточно энергичных в дан-
ный момент могут завершиться химическим
их преобразованием, т.е., стать «эффектив-
ными» (с позиций химической реакции). Раз-
ность между энергетическим уровнем реакции
Рис. 4-1. Кривая Максвелла-Больцмана (распределение молекул по их энергетическому потенциалу)
в «обычных» условиях (А) и после некоторого повышения температуры (Б).
Каждая точка кривой представляет долю молекул N, (ордината), обладающих соответствующим энергетическим
уровнем Е> (абсцисса). Площадь, ограниченная кривой и абсциссой, отражает общее число молекул данной совокупности.
Доля реакционноспособных молекул обозначена штриховкой.
ФЕРМЕНТЫ
107
и средним энергетическим уровнем молекул
составляет энергию активации (Еакт), или энер-
гетический барьер данной реакции. Если эта
разность велика (рис. 4-1, А), то лишь неболь-
шая часть молекул будет обладать энергией,
достаточной для реализации химических пре-
вращений (на рисунке она обозначена штри-
ховкой). Соответственно, из всего множества
случайных столкновений молекул «эффектив-
ными» окажутся сравнительно немногие. Зна-
чит, химическая реакция будет протекать до-
вольно медленно. Напротив, чем меньше вели-
чина энергии активации, тем больше будет до-
ля достаточно «энергичных» молекул и тем
выше станет скорость химической реакции.
Важно подчеркнуть, что преобразования
наиболее «энергичных» частиц в ходе реакции
не приводят к полному исчезновению только
активных молекул, т.е., к «обрыву» кривой рас-
пределения по линии энергетического уровня
реакции. Ибо по мере уменьшения общего
количества непрореагировавших молекул вся
кривая распределения снижается по высоте, но
в целом сохраняет свой вид. Иными словами,
определенная доля молекул всегда будет
обладать энергией, достаточной для химиче-
ского взаимодействия. И это - несмотря на
уменьшение (в процессе реакции) абсолютной
величины как общего числа молекул, так и ко-
личества достаточно «энергичных» молекул.
Естественно, это сопровождается постепенным
уменьшением скорости реакции, - в соответст-
вии с законом действующих масс.
Из изложенного ясно, что для ускорения
химической реакции необходимо уменьшить
величину энергии активации. Один путь к это-
му очевиден: следует повысить энергетический
потенциал молекул. Это можно сделать, на-
пример, нагреванием. Тогда вся кривая распре-
деления сместится вправо, в сторону более вы-
соких уровней энергии (рис. 4-1. Б). Соответ-
ственно повысится значение среднего энерге-
тического уровня молекул (Еср). В результате
гораздо большая часть их окажется в числе тех,
чей энергетический потенциал выше энергети-
ческого уровня данной реакции (отмечено
штриховкой на рис. 4-1, Б). Следовательно,
возрастет доля «эффективных» соударений мо-
лекул, и скорость реакции станет более высо-
кой, чем до нагревания (или воздействия дру-
гих факторов, - например, облучения). Такой
способ ускорения реакции широко применяет-
ся на практике. Однако он неприемлем для жи-
вых организмов, способных существовать
лишь в довольно узком диапазоне температу-
ры, давления и т.д.
Казалось бы, есть и другой путь к умень-
шению энергии активации: снижение энерге-
тического уровня реакции. Однако такой путь
принципиально невозможен, ибо этот пара-
метр, как отмечалось выше, является констан-
той, характеризующей внутреннюю сущность
каждой данной химической реакции.
Природа, однако, нашла нетривиальный
путь ускорения реакций, - такой, который не
требует высоких температур или других жест-
ких воздействий. Суть его поясняют реакции,
уравнения которых в общем виде представле-
ны на рис. 4-2.
Уравнение I показывает, что некие моле-
кулы А и В способны вступать в химическую
реакцию, превращаясь в соединение АВ.
В принципе возможно подобрать определенное
вещество К, образующее с молекулой А про-
межуточный продукт АК (уравнение Па), кото-
рый под действием В превращается в АВ с ос-
вобождением вещества К в его исходном виде
(уравнение ПЬ). Суммарный итог двух послед-
них реакций такой же, как и в реакции I, но
образование молекул АВ происходит здесь в
присутствии (и при участии!) вещества К, ко-
торое, однако, остается в итоге неизменным.
I. А + В—Е‘кт- >АВ
Па. А+К—>АК
ПЬ. АК+В >АВ+К
Итоговое уравнение реакции П: А + В ———> АВ
Рис. 4-2. Химические реакции между веществами А и В: прямая (I) и опосредованная веществом К (II).
108
Глава 4
Значения энергии активации всех трех
упомянутых реакций в общем случае различ-
ны. И все возможные соотношения между ни-
ми можно свести в две группы:
1. Величины энергии активации реакций Па
или ПЬ (либо обеих) больше, чем Е^.
В соответствии с этим, реакция Па или ре-
акция ПЬ (либо обе) будут протекать мед-
леннее, чем реакция I. Значит, в любом из
таких вариантов суммарная реакция П бу-
дет осуществляться медленнее, чем прямая
реакция между А и В без участия вещества
К. В таком случае вещество К следует на-
звать (и называют) ингибитором данной
химической реакции. Будучи добавленным
в систему, оно отвлекает на себя какое-то
количество молекул А и/или В и тем са-
мым уменьшает возможности их прямого
взаимодействия между собой, - т.е., за-
медляет и собственно реакцию I.
2. Величины и Е'1^ и Е^(т.е., каждая из
них) меньше, чем величина Е’^.. В такой
ситуации и реакция Па, и реакция ПЬ бу-
дут протекать быстрее, чем реакция I. Зна-
чит, возникновение продукта АВ с участи-
ем вещества К (суммарная реакция II) ста-
нет происходить эффективнее, чем при
прямом взаимодействии А и В (реакция I).
А посредник К, облегчающий образование
конечного продукта АВ, обозначается как
катализатор (ускоритель) данной хими-
ческой реакции.
Итак, катализатор — это вещество, ко-
торое направляет химическую реакцию по об-
ходному пути, причем такому, на котором
энергетические барьеры ниже.
Для наглядности на рис. 4-3 приведена
схема, поясняющая суть явления катализа. Она
не только иллюстрирует то, что изложено вы-
ше. Здесь ясно видно также, что энергия акти-
вации - это как бы временный кредит, который
молекулы полностью возвращают в процессе
реакции. А энергетический итог реакции пред-
ставляет собой разницу между величинами
среднего энергетического уровня исходных
молекул и конечных продуктов. Он не зависит
от величины энергии активации и, следова-
тельно, от участия катализатора.
Общие законы термодинамики, включая
понятие о свободной (полезной) энергии, пред-
сказывают принципиальную возможность (или
невозможность) самопроизвольного протека-
ния того или иного процесса (например, скаты-
вания частиц по склону вулкана либо спон-
танного возвращения их назад). Кинетические
же параметры (в том числе энергия активации)
определяют, с какой скоростью может проте-
кать термодинамически возможный процесс.
Следовательно, энергетические барьеры - это
те препятствия, которые стоят на пути ко все-
общему термодинамическому выравниванию,
усреднению всего и вся. Ограждая энергетиче-
ские «ловушки», эти барьеры на какой-то срок
«сохраняют» их содержимое, препятствуя рос-
ту энтропии - степени неупорядоченности.
Именно благодаря энергетическим барьерам
возможно существование даже такого уни-
кального отклонения от абсолютной хаотично-
сти. каким является живой организм.
Изложенные представления об энергии ак-
тивации и сущности катализа несколько упро-
щены ради наглядности. В частности, при хи-
мическом взаимодействии (в том числе с уча-
стием катализатора) происходит не просто со-
ударение молекул, но и формирование проме-
жуточного комплекса (обычно его называют
«активированным комплексом»). Энергетиче-
ские характеристики молекул тоже не сводятся
только к кинетической энергии теплового дви-
жения. Тем не менее, суть явлений изложена
достаточно верно, в том числе и применитель-
но к формированию и распаду промежуточных
комплексов. Строго она выражается уравнени-
ем Аррениуса, которое может быть представ-
лено в следующем виде:
V = А • е RT ,
где: v - скорость химической реакции; А - пре-
дэкспоненциальный множитель; е - основание
натуральных логарифмов; R - универсальная
газовая постоянная; Т - температура в абсо-
лютной шкале.
Предэкспоненциальный множитель А
включает в себя концентрации реагирующих
веществ и ряд других сомножителей. В их чис-
ле - «стерический фактор», отражающий веро-
ФЕРМЕНТЫ
109
ятность «оптимальной» ориентации молекул в
момент их сближения (особенно важен он для
крупных молекул, в том числе - для фермен-
тов). Еще одни сомножитель учитывает изме-
нения энтропии в ходе реакции. Он показыва-
ет, почему иные реакции с малой Еакт осущест-
вляются медленно (энтропийный фактор очень
велик) или ряд реакций с высоким значением
ЕаКт протекает довольно быстро (энтропийный
фактор очень мал).
В уравнении Аррениуса значение ЕаКт вхо-
дит в показатель степени. Значит, даже очень
небольшим различиям в величине Еакт соответ-
ствуют значительные различия в скорости ре-
акции. Далее: перед показателем степени стоит
знак «минус». Следовательно, чем больше ве-
личина Еа1СТ, тем медленнее течет реакция (что
и отмечалось выше). Наконец, в уравнении Ар-
рениуса значение энергии активации дано в
расчете на произведение универсальной газо-
вой постоянной R и температуры в абсолютной
шкале Т. Иными словами, значение Еакт следу-
ет рассчитывать относительно неких стандарт-
ных условий. Действительно, в общепринятом
Рис. 4-3. Схема, иллюстрирующая природу каталитического эффекта.
На схеме условно изображен срез вулкана, проходящий вертикально через его кратер. Слева - шкала энергети-
ческих уровней (Е). Высота лавы в кратере условно обозначает средний энергетический уровень исходных моле-
кул, а уровень подножья горы — средний энергетический уровень продуктов реакции. Крея кратера неровные. Их
высота символизирует энергетический уровень реакции в отсутствие катализатора (справа) или в его присутствии
(слева). Ясно, что лишь некоторые из частиц, выбресываемых кипящей лавой, имают шанс преодолеть край кре-
тере и скатиться к подножью. Слева таких частиц окажется гораздо больше, чем спрева. Поэтому реакция с уча-
стием катализатора идет быстрее, чем без него. На схеме видно также, что энергия, затраченная на подъем час-
тиц над краем кратере, полностью компенсируется при самопроизвольном их скатывании по склону вулкана до
уровня лавы в нем. Остальная часть энергии, освобождаемой при скатывании к подножью, обозначается как
энергетический итог реакции. Видно, что он не зависит ни от величины энергии активации, ни от пути, по кото-
рому прошла реакция.
Можно отметить, что в принципе частицы вновь могут быть заброшены в кратер. Для этого необходим, однако,
внешний (для системы) источник энергии. На схеме видно, что энергетический итог обратного процесса оказыва-
ется точно таким же, как и в прямой реакции, но с обретным знаком (что указывает на необходимость расходова-
ния внешней энергии). Попав снова в кратер, частицы не могут просто так опять покинуть его. Они будут пребы-
вать в этой энергетической «яме» («ловушке»), пока не получат импульс, соответствующий величине энергии ак-
тивации. Понятно, что длительность их пребывания здесь зависит от высоты энергетических барьеров.
но
Глава 4
понимании Еакт является не просто разностью
между энергетическим уровнем реакции и
средним энергетическим уровнем молекул (как
это было сформулировано выше), а этой разно-
стью, отнесенной к стандартному значению
среднего энергетического уровня молекул. Та-
кое стандартизованное значение энергии акти-
вации тоже является (как и энергетический
уровень реакции) постоянной величиной (кон-
стантой), характеризующей каждую конкрет-
ную химическую реакцию.
4.2.	ОБЩИЕ СВОЙСТВА КАТАЛИЗАТОРОВ
Изучение катализа позволило выявить ряд
общих принципов каталитического действия.
Установлено, что любой катализатор (в том
числе фермент):
1)	не ВЫЗЫВАЕТ химическую реакцию,
а лишь УСКОРЯЕТ реакцию, которая в прин-
ципе возможна и без катализатора (хотя иногда
протекает настолько медленно, что ее практи-
чески не удается зарегистрировать); иными
словами, невозможно создать такой катализа-
тор, который осуществил бы реакцию, не соот-
ветствующую законам термодинамики;
2)	не влияет на энергетический итог реак-
ции;
3)	в обратимых реакциях ускоряет и пря-
мую, и обратную реакцию, причем - в
ОДИНАКОВОЙ степени; из этого следует, что
катализатор:
а)	не влияет на направление обратимой ре-
акции (оно определяется лишь соотношением
концентраций исходных и конечных продук-
тов); следовательно, направление реакции не
зависит от концентрации катализатора-,
б)	не влияет на положение равновесия об-
ратимой реакции, а лишь ускоряет достижение
этого равновесия {степень этого ускорения
возрастает с увеличением концентрации ка-
тализатора).
4.3.	ОСОБЕННОСТИ ФЕРМЕНТОВ
КАК БИОЛОГИЧЕСКИХ КАТАЛИЗАТОРОВ
Развитие энзимологии подтвердило, что
ферменты обладают всеми свойствами, прису-
щими катализаторам вообще. Вместе с тем,
ферменты - это белки, т.е., громадные, высо-
коорганизованные молекулы, очень чувстви-
тельные к условиям среды. Отсюда проистека-
ет ряд особенностей, свойственных именно
ферментам. К их числу относятся:
-	чрезвычайная эффективность катали-
тического действия;
-	высокая чувствительность к неспеци-
фичным физическим и физико-химическим
факторам, - таким, как температура, pH среды,
ионная сила окружения и т. п.;
-	исключительная «требовательность»
как к строению субстрата (субстратная спе-
цифичность), так и к типу катализируемого
превращения этого субстрата (специфичность
действия)',
—	высокая и очень избирательная чувстви-
тельность к физико-химическим влияниям тех
или иных веществ (лигандов), способных неко-
валентно влиять на конформацию белка-фер-
мента, повышая его эффективность (актива-
тор) или уменьшая ее (ингибитор фермента).
4.3.1.	ЭФФЕКТИВНОСТЬ
ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА
Ферменты могут ускорять катализируе-
мую ими реакцию в миллионы, миллиарды и
даже в триллионы раз (106-1014 раз). Далеко не
каждый фермент столь высоко эффективен. Но
всегда фермент ускоряет реакцию несравненно
значительнее, чем любой из простых (небелко-
вых) катализаторов. Например, в водном рас-
творе без примесей пероксид водорода подвер-
гается спонтанному разложению очень мед-
ленно (константа скорости реакции составляет
10'6 с'1) и потому может храниться длительное
время. При добавлении солей двухвалентного
железа скорость распада Н2О2 возрастает в 60
тысяч раз. Такое же (по молярности) количест-
во каталазы из эритроцитов ускоряет эту ре-
акцию примерно в 7 миллиардов раз. Легко
подсчитать, что этот фермент «работает» более
чем в 100 тысяч раз эффективнее неорганиче-
ского катализатора. Такой размах скоростей
просто огромен на фоне умеренных различий в
величинах энергии активации: стандартное ее
значение составляет для этих трех реакций со-
ответственно 75, 40 и 7 кДж/моль.
Еще один пример - мочевина. Это очень
простое вещество (рис. 4-4) является одним из
ФЕРМЕНТЫ
111
nh2
O=c( + H2O уреа3а >СО; + 2 NH3
NH.
Рис. 4-4. Реакция расщепления мочевины
под действием уреазы.
конечных продуктов метаболизма и выводится с
мочой в количестве примерно 30 г в сутки (у
взрослого человека). Оно очень стабильно и не
разлагается заметно в процессе формирования
мочи и ее накопления в мочевом пузыре. Одна-
ко, некоторые микроорганизмы обладают уреа-
зой — ферментом, который в 1013 раз (!) ускоряет
реакцию спонтанного разложения мочевины до
СОг и аммиака. Поэтому при инфицировании
мочевых путей такими микробами моча приоб-
ретает резкий аммиачный запах. То же бывает и
при хранении мочи в нестерильных условиях.
4.3.2.	ВЛИЯНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ
ФАКТОРОВ СРЕДЫ
Как уже отмечалось (раздел 1.8), конфор-
мационное состояние белка очень чувстви-
тельно к физическим и физико-химическим
условиям среды, - температуре, pH, ионной
силе и т.д. Все эти неспецифические факторы
так или иначе влияют на пространственную
организацию макромолекулы и могут даже
способствовать развитию денатурационных
процессов. Поэтому для любого белка (в том
числе — фермента) существует оптимальный
диапазон каждого из перечисленных парамет-
ров среды, в рамках которого молекула сохра-
няет нагивность и наилучшим образом выпол-
Рис. 4-5. Типичная кривая зависимости скорости
ферментативной реакции (v) от температуры среды.
няет свое функциональное предназначение
(для ферментов - функцию катализа).
Влияние температуры на скорость
ферментативной реакции характеризуется
куполообразным графиком (рис- 4-5). Вершина
купола соответствует диапазону температур,
оптимальному для данного фермента. У тепло-
кровных животных температурный оптимум
большинства ферментов находится в пределах
35-45°С. Для ферментов растений он обычно
смещен в зону 25-20°С или даже ниже. Шири-
на купола бывает разной. Она зависит от
устойчивости фермента к тепловой денатура-
ции. При повышении температуры за пределы
оптимальной происходит более или менее
плавное снижение скорости ферментативной
реакции, а в определенной зоне (разной для
разных ферментов) наступает полная денату-
рация белка и, следовательно, необратимая ут-
рата каталитической функции. Снижение тем-
пературы от оптимальной до нулевой также
сопровождается постепенным замедлением
ферментативной реакции, но оно носит об-
ратимый характер: последующее согревание
ведет к полному восстановлению свойств фер-
мента. Поэтому все процедуры по выделению и
очистке ферментных препаратов проводят
обычно на холоду (от 0° до +4°С); это относит-
ся и к хранению очищенных белков.
Влияние pH на функционирование фер-
ментов очень значительно. Подкисление или
подщелачивание среды усиливает диссоциацию
соответственно основных или кислотных групп
белковой молекулы, вызывая более или менее
значительные изменения ее конформационного
состояния. В случае фермента это приводит
сначала к плавному, а затем все более резкому
уменьшению каталитической эффективности. В
некотором диапазоне аблизи оптимума pH эти
изменения обратимы. Однако чрезмерные сдви-
ги pH приводят к необратимой потере активно-
сти фермента вследствие его денатурации.
Многие ферменты сильно различаются и
по значению оптимума pH, и по характеру рН-
зависимости (примеры приведены на рис. 4-6).
Очень часто ионизирующиеся группировки
входят в состав активного центра фермента,
т.е., непосредственно участвуют в акте катали-
за. Степень их диссоциации гораздо сильнее
сказывается на каталитической эффективности.
112
Глава 4
Относительная
Рис. 4-6. Влияние pH среды на скорость ферментативной
реакции: 1 - пепсин; 2 - лизоцим; 3 - амилаза слюны;
4 - аргиназа.
чем изменения общего заряда всей белковой
молекулы в целом. Поэтому пик оптимума pH
у таких ферментов гораздо более узок, чем у
остальных.
Ионная сила раствора также небезраз-
лична для функционирования фермента, по-
скольку уровень концентрации электролитов
существенно отражается на слабых взаимодей-
ствиях в молекуле белка, - особенно на ионных
связях. В целом, зависимость здесь тоже имеет
куполообразный характер, подобный показан-
ным на рис. 4-5 и 4-6. Иначе говоря, для каж-
дого фермента есть свой диапазон оптималь-
ных значений ионной силы среды, и по мере
удаления от этого оптимума скорость фер-
ментативной реакции все больше уменьшается.
В некоторых пределах эти изменения обрати-
мы, но при слишком больших отклонениях мо-
гут стать и необратимыми.
Подводя итог, следует отметить, что каж-
дый из ферментов успешно функционирует в
довольно узком диапазоне физических и физи-
ко-химических параметров среды. Оптималь-
ное их сочетание необходимо для обеспечения
такого конформационного состояния нативно-
го белка, которое наиболее благоприятно для
проявления его каталитических свойств.
4.3.3.	СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ
ФЕРМЕНТОВ
Каждый фермент способен ускорять хи-
мические превращения далеко не любых ве-
ществ, а только вполне определенных. Их на-
зывают субстратами данного фермента. Из-
бирательность к субстратам может быть очень
высокой. Например, упомянутый выше фер-
мент уреаза распознает только одно-единствен-
ное вещество — мочевину, катализируя ее рас-
щепление до СО2 и аммиака (см. рис. 4-4). Этот
фермент совершенно не влияет на превращения
каких-либо других веществ, даже если они
очень похожи на мочевину. У млекопитающих
к числу столь высокоизбирательных ферментов
относится аденилатциклаза (см. раздел 2.2.3),
для которой АТФ в качестве субстрата не мо-
гут заменить даже ближайшие ему по строе-
нию нуклеозидтрифосфаты. Такого рода мак-
симально строгая «требовательность» фермен-
та к структуре своего субстрата называется аб-
солютной субстратной специфичностью. Од-
нако встречается она редко.
Обычно же субстратная специфичность
бывает относительной (групповой). Это озна-
чает, что фермент способен ускорять однотип-
ную реакцию у группы веществ, сходных по
строению. Такой способностью обладают, в ча-
стности, пищеварительные ферменты. Напри-
мер, трипсин катализирует гидролиз пептидных
связей, образуемых карбоксильной группой ли-
зина или аргинина с аминогруппой почти любой
другой аминокислоты. Более того, он может
гидролизовать связи этих карбоксильных групп
не только с аминокислотами, но и со многими
аминами. Вместе с тем, фермент не способен
расщеплять пептидные связи, образованные
аминогруппой лизина или аргинина.
Следует отметить, что ферменты с груп-
повой специфичностью все-таки делают опре-
деленные различия между своими субстратами.
Так, глюкозооксидаза — фермент, содержащийся
в некоторых грибках, — оказывает явное пред-
почтение D-глюкозе, обеспечивая ее окисление
(за счет кислорода) до глюконовой кислоты.
Такие же превращения 2-дезокси-D-глюкозы,
2-дезокси-6-фторО-глюкозы и 6-метил-В-глю-
козы этот фермент катализирует со скоростью,
соответственно в 4, 33 и 54 раза меньшей. Окис-
ление ряда сходных веществ глюкозооксидаза
катализирует в 100-1000 раз медленнее, а мно-
гие десятки других исследованных изомеров
или аналогов глюкозы совершенно нечувстви-
тельны к присутствию этого фермента.
К ферментам с наиболее широкой суб-
стратной специфичностью относятся, например,
фосфатазы. Те из них, которые проводят гидро-
ФЕРМЕНТЫ
113
лиз эфиров фосфорной кислоты с простыми ор-
ганическими веществами, как правило, не очень
требовательны к структуре спиртовой части
субстрата. Их обычно и обозначают такими тер-
минами, как щелочная фосфатаза, кислая
фосфатаза, т.е. без указания на предпочтитель-
ный субстрат (хотя им и свойственно заметное
предпочтение к эфирам некоторых спиртов).
Выделяют также стереохимическую спе-
цифичность ферментов. Она проявляется в тех
случаях, когда субстрат может существовать в
форме разных пространственных изомеров. Как
правило, фермент «признает» только один из
них. Важно отметить, что стереохимическая из-
бирательность - это не только предельный ва-
риант абсолютной субстратной специфичности.
Она типична и для ферментов с групповой спе-
цифичностью. В частности, некоторые клетки
содержат два разных фермента - оксидазу
L-аминокислот и оксидазу D-аминокислот. Каж-
дый из них катализирует окислительное отщеп-
ление аминогруппы от почти любой аминокис-
лоты, но только в пределах либо L-, либо D-ряда.
4.3.4.	СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ
ФЕРМЕНТОВ
Если субстратная специфичность разных
ферментов варьирует в очень широких преде-
лах, то специфичность действия всегда со-
блюдается очень строго. Она проявляется в
том, что фермент способен ускорять только
одну из всех реакций, в которые может всту-
пать его субстрат. Примером такого субстрата
является глюкозо-6-фосфат. В одной и той же
клетке эта молекула может подвергаться раз-
личным превращениям. И каждое из них тре-
бует участия специального фермента. В част-
ности, гидролиз глюкозо-6-фосфата до глюко-
зы и фосфата осуществляет глюкозо-6-фос-
фатаза. Перенос фосфатной группы из 6-го в
1-е положение реализует совсем другой фер-
мент - фосфоглюкомутаза. Изомеризацию во
фруктозо-6-фосфат производит фосфогексои-
зомераза. Наконец, окисление альдегидной
группы глюкозо-6-фосфата для превращения
его в 6-фосфоглюконовую кислоту протекает
благодаря глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназе.
Приведенный пример - лишь иллюстрация
общей закономерности: разные типы реакций с
одним и тем же субстратом катализируют со-
вершенно различные ферменты.
4.3.5.	ОБРАТИМЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
ФЕРМЕНТА С ЛИГАНДАМИ
Функциональные группировки на поверх-
ности белковой молекулы фермента способны
нековалентно взаимодействовать с веществами
самого различного строения, лишь бы те обла-
дали подходящими физико-химическими харак-
теристиками (гидрофильность-гидрофобность,
способность формировать водородную связь,
наличие заряда и его знак). Обычно это никак не
отражается на эффективности ферментативного
катализа. Однако иногда такое взаимодействие
происходит в «стратегически важных» участ-
ках фермента, вызывая существенную конфор-
мационную перестройку белковой молекулы.
Это может привести к усилению-или ослабле-
нию его каталитического действия. Вещества,
вызывающие такие эффекты, называются соот-
ветственно активаторами и ингибиторами
данного фермента. Их действие является обра-
тимым. поскольку осуществляется (для рас-
сматриваемых здесь веществ) только за счет
слабых типов связи. Поэтому удаление таких
лигандов (например, путем диализа) ведет к
полному восстановлению исходной каталити-
ческой способности фермента (об эффекторах
необратимого типа речь пойдет отдельно).
Избирательность обратимых активаторов
и ингибиторов бывает очень высокой. Она от-
носится к самым наглядным проявлениям
генеральных функций белка - способности
к узнаванию и реагированию (см. раздел 1.9).
4.4.	НОМЕНКЛАТУРА, КЛАССИФИКАЦИЯ
И ИНДЕКСАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ
Во времена становления энзимологии от-
крываемые ферменты именовались обычно по
названию субстрата, к которому добавляли
окончание «-аза». Многие из таких терминов
сохранились до сих пор. Например, амилаза (от
amylum - крахмал) - фермент, катализирующий
гидролиз крахмала; фосфатаза (гидролизует
эфиры фосфорной кислоты); уреаза (расщепляет
мочевину); протеиназа (осуществляет гидролиз
белков). С приумножением выявляемых фер-
114
Глава 4
ментов стали возникать названия, ничего не го-
ворящие ни о субстрате, ни о природе катализи-
руемой реакции. Так появились обозначения
«каталаза», «диафораза», «промежуточный фер-
мент», «желтый фермент Варбурга» (который
пришлось обозначать как «старый желтый фер-
мент» после открытия нового «желтого фермен-
та») и т. д. Постепенно эти не очень внятные
термины заменялись более точными. И все же,
нередко какой-либо фермент получал разные
имена или, напротив, одинаковое название да-
вали разным ферментам.
В 1956 г. Международный биохимический
союз учредил Комиссию по ферментам. Она
составила список более 700 известных тогда
ферментов и разработала принципы их систе-
матизации и рационального обозначения. Соз-
данная на этой основе Классификация и но-
менклатура ферментов утверждена на V Меж-
дународном биохимическом конгрессе (Моск-
ва, 1961 г.). Она действует поныне, постоянно
пополняясь вновь открываемыми энзимами (за
40 лет общее их число возросло пятикратно,
достигнув почти 3,5 тысяч).
По новой номенклатуре наименование
фермента должно состоять из названия его суб-
страта и обозначения типа катализируемой ре-
акции, которое завершается окончанием «-аза».
Если в реакции участвуют два субстрата, то
приводятся названия обоих (разделенные двое-
точием). Отсюда - громоздкость систематиче-
ских наименований. Поэтому было решено
«узаконить» употребление и многих традицион-
ных (рабочих) названий, которые привычнее, а
главное - гораздо короче. В самом деле, удобнее
пользоваться краткими терминами «глюкозо-
оксидаза» или «аденилатциклаза» вместо их на-
званий в систематической номенклатуре:
«p-D-глюкоза: кислород-1 -оксидоредуктаза» и
«АТФ-пирофосфатлиаза (циклизирующая)».
В отличие от принятой в химии система-
тизации веществ по строению (составу) их мо-
лекул, рациональная классификация ферментов
может быть построена только на основе их
функции. Действительно, катализируемая ре-
акция - это тот всеобщий признак, по которому
один фермент отличается от других. При этом
учитывают только суммарное химическое пре-
вращение, выражаемое формальным итоговым
уравнением.
В соответствии с международной Класси-
фикацией ферментов (КФ), по типу катализи-
руемой реакции все ферменты подразделяются
на 6 классов, за каждым из которых закреплен
свой порядковый номер:
1.	Оксидоредуктазы — катализируют реакции
окисления-восстановления.
2.	Трансферазы - реализуют межмолекуляр-
ный перенос групп атомов (метильных, гли-
козильных, фосфатных, аминогрупп и т.д.).
3.	Гидролазы — катализируют гидролитическое
расщепление сложноэфирных, пептидных,
гликозидных и ряда других связей.
4.	Лиазы — обеспечивают расщепление связи
углерода с кислородом, азотом, серой или
другим углеродом без участия воды.
5.	Изомеразы — проводят реакции внутримоле-
кулярного переноса (рацемазы, мутазы,
внутримолекулярные оксидоредуктазы и
ряд других).
6.	Лигазы (синтазы) - допустимо название
синтетазы’, проводят реакции синтеза за
счет энергии расщепления макроэргиче-
ской связи (в АТФ или его аналогах).
Первые три класса содержат почти по ты-
сяче ферментов каждый, последние - от одной
до нескольких сотен. Разнообразие ферментов в
каждой из этих крупных групп потребовало
дальнейшей градации классов на подклассы, а
тех - на подподклассы. Главными критериями
при этом служат характер атакуемой связи или
функциональной группировки в молекуле суб-
страта, наличие второго субстрата, природа ак-
цептора (если он есть), строение переносимой
группы и т. д. Наконец, каждый подподкласс
состоит из перечня индивидуальных ферментов
с закрепленным для каждого из них порядковым
номером. Вновь открываемые ферменты зано-
сятся в соответствующий подподкласс под оче-
редным номером (т.е., последовательность их
носит чисто хронологический характер).
К числу преимуществ КФ относится воз-
можность обозначать каждый фермент инди-
видуальным шифром (индексом). Он состоит
из четырех чисел, первое из которых обознача-
ет номер класса, второе - номер подкласса,
третье — номер подподкласса и, наконец, чет-
вертое - порядковый номер фермента в его
подподклассе. Эти числа отделяются друг от
ФЕРМЕНТЫ
115
друга точкой. Например, индекс глюкозоокси-
дазы (КФ 1.1.3.4) указывает, что этот фермент
относится к подклассу 1 класса оксидоредуктаз
(т.е., действует на группу СН-ОН в молекуле
окисляемого вещества); что акцептором двух
атомов водорода, отнимаемых от субстрата,
является молекула кислорода (такие ферменты
в подклассе 1 оксидоредуктаз составляют под-
подкласс 3) и, наконец, что в этом подподклас-
се глюкозооксидаза имеет порядковый номер 4.
Таким образом, индекс фермента не толь-
ко точно обозначает его (а также указывает на
официальное признание этого энзима), но и
дает представление о типе катализируемой ре-
акции и характере атакуемых связей (отсюда —
и о возможных продуктах реакции).
Современная Классификация ферментов
«помехоустойчива»: любой вновь открытый
фермент можно вставить в соответствующий
подподкласс под очередным номером. Если
понадобится - можно ввести в нее новый под-
подкласс или даже подкласс. По мере углубле-
ния знаний некоторые ферменты приходится
исключать из общего списка либо переносить в
другой разряд. Естественно, при этом индекс
фермента изменяется. Во избежание путаницы,
прежний индекс сохраняется в перечне фер-
ментов, но с пометкой «исключен» (deleted).
Все новшества оперативно отражаются на спе-
циальных сайтах в Интернете, посвященных
ферментам, - таких как Enzyme Nomenclature
или ExPASY-ENZYME, содержание которых
контролируется Комитетом по номенклатуре
Международного союза по биохимии и моле-
кулярной биологии.
4.5.	СТРОЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ
Макромолекула белка может взаимодейст-
вовать с молекулой субстрата, естественно, не
всей своей поверхностью, а только относитель-
но небольшим ее участком. И не любым, а
вполне определенным. Он обозначается как ак-
тивный центр фермента. В его пределах выде-
ляют две функционально различные зоны - ад-
сорбционный центр (участок) и каталитичес-
кий центр (участок). Кроме того, вне пределов
активного центра может быть один или несколь-
ко так называемых аллостерических центров.
4.5.1.	КАТАЛИТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР
Каталитическим центром фермента обозна-
чают совокупность тех фрагментов белковой
молекулы, которые непосредственно участвуют
в химических преобразованиях субстрата. Фор-
мируется он радикалами обычно двух или трех
аминокислот, расположенных в разных местах
полипептидной цепи, но пространственно
сближенных между собой благодаря изгибам
этой цепи (т.е., благодаря особенностям третич-
ной структуры белка). Непосредственное уча-
стие в акте катализа принимают чаще всего гид-
роксильная группа серина, имидазольное коль-
цо гистидина, группа -SH цистеина, карбок-
сильная группа аспартата (глутамата). Приме-
ром может служить ацетилхолинэстераза
(АХЭ), - фермент, способный гидролитически
расщеплять сложноэфирную связь между ук-
сусной кислотой и спиртом холином. Каталити-
ческий участок этого фермента представлен ра-
дикалами серина, гистидина и глутамата, кото-
рые у человека занимают в полипептидной цепи
положения 203, 447 и 334 соответственно (рис.
4-7, А). Под влиянием субстрата происходит
перераспределение слабых взаимодействий в
этой «каталитической триаде», которое способ-
ствует «переброске» ацетильного остатка с хо-
лина на радикал серина-203 (рис. 4-7, Б и В).
Затем место холина, покидающего ацил-фер-
мент, занимает молекула воды, вызывая новую
череду перемещений нековалентных и кова-
лентных связей (рис. 4-7, Г). Она завершается
гидролитическим отщеплением уксусной ки-
слоты от серина-203 и возвращением каталити-
ческого центра в изначальное состояние (рис.
4-7, Д). Иными словами, элементы каталитиче-
ского участка АХЭ сначала вытесняют из суб-
страта спиртовую «половину», ковалентно со-
единяясь с ацильным его фрагментом, а потом
с участием воды отщепляют временно захва-
ченную кислоту (в данном случае - уксусную).
Ферменты, сходные с АХЭ по строению
каталитического центра (а, значит, и по меха-
низму его функционирования), часто называют
серин-гистидиновыми или, более кратко, сери-
новыми. К ним относятся не только различные
эстеразы, но и многие протеиназы, — фермен-
ты, гидролизующие пептидную связь (которая
по своей природе очень близка сложноэфир-
116
Глава 4
HC=N*...н-о-сн2
Глузз4-сн2-СН2-С-О"..Н-N >Н Сер203
О	I
Гис447-СН?
н,с\
H,C-W-CH2-CH.-0-C-0
nsc'	) (,
HC-N-H.....0-CH2
ГЛУ334-СН2-СН2-С-О-Н..N* >н Сер2И
О	|
Гис447-СН2
«13V' «V	L/ П	/->< <
H>C	HC=N’	I 3
I	x	C=0
Глузз-СН2-СН2-С-СГ....H-N /Н	£
°
CH3
H-0....C-0
:	I
HC-N-H.....O-CH2
ГлУэз4-СН2-СН2-С-О-Н....A; >H Cep203
О	T
Гис447-СН2
Д-
CH,
H*O’-C-0
HC=hQ-..Н-О-СНг
ГлуззГсН2-СН2-С-О-..H- A>H Cep203
О	I
Гис^-СНг
Рис. 4-7. Ацетилхолинэстераза (АХЭ): схема строения каталитического центра (А) и основные стадии акта катализа (Б-Д).
Каталитический центр АХЭ человека состоит из радикалов сер-203, гис-447 и глу-334, расположенных на вершинах
трех петель полипептидной цепи, но пространственно сближенных между собой за счет особенностей третичной струк-
туры белковой молекулы фермента. Такая ориентация делает возможным нековалентное притяжение одного азота
имидазольного кольца гистидина к карбоксильной группе глутамата, а другого - к гидроксилу серина. Благодаря этому,
«каталитическая триада»> формирует систему переноса заряда (А), которая резко повышает реакционную способность
серина-203. Приближение молекулы субстрата (ацетилхолин, - на рисунке он выделен курсивом) вадет к перераспре-
делению заряда в этой системе, что провоцирует перегруппировку нековалентных и ковалентных связей в пределах
фермент-субстратного комплекса (Б). Как следствие, облегчается передача водорода гидроксильной группы серина-203
на кислород спиртовой части субстрата, вызывающая разрыв сложноэфирной связи в молекуле ацетилхолина. В ре-
зультате спирт (холин) отделяется в качестве одного из продуктов холинэстеразной реакции, а ацетильный фрагмент
оказывается ковалентно связанным с серином-203, образуя с ним сложноэфирную связь (В). Затем место освободив-
шегося холина занимает молекула воды (выделена жирным шрифтом), заполняя собой просвет между гис-447 и аце-
тилсерином (О. Это опять-таки ведет к перераспределению заряда, которое теперь уже «возвращает» водород гидро-
ксильной группе серина-203 с передачей остальной части молекулы воды ацетильному остатку, удаляемому в виде ук-
сусной кислоты в качестве второго продукта реакции (Д). В конечном итоге гидролиз субстрата до холина и ацетата за-
вершается переходом активного центра в исходное конформационное состояние, обеспечивающее готовность взаимо-
действовать с новой молекулой субстрата.
ФЕРМЕНТЫ
117
ной). В частности, каталитический центр хи-
мотрипсина состоит из радикалов серина-195,
гистидина-57 и аспартата-102 (нумерация дана
по их положению в цепи предшественника -
химотрипсиногена). Аналогичной триадой об-
ладают трипсин, эластаза, ферменты свертыва-
ния крови и т.д. Помимо сериновых протеиназ,
существуют и протеолитические ферменты с
иной структурой каталитического центра. На-
пример, в молекуле пепсина его роль выполня-
ет тандем аспартата-94 и аспартата-277. Такого
рода ферменты называют аспартатными (или
карбоксильными) протеиназами.
Непосредственно участвуя в ковалентных
превращениях субстрата, именно каталити-
ческий центр предопределяет специфичность
действия фермента.
Нередко фермент является не простым, а
сложным белком. В таких случаях небелковая
часть молекулы (простетическая группа) обыч-
но тоже участвует в работе каталитического
центра и, следовательно, в обеспечении специ-
фичности действия фермента. Если такая груп-
па соединена с белком не ковалентными связя-
ми, а слабыми физико-химическими взаимо-
действиями, то она легко диссоциирует и мо-
жет быть полностью отделена от белка (напри-
мер, путем диализа). Такую нековалентно при-
соединенную простетическую группу стали
обозначать термином кофермент. Было уста-
новлено, что ни белковая часть фермента (апо-
фермент), ни кофермент порознь не обладают
способностью ускорять химическую реакцию.
Это может делать только их объединение -
«полный» фермент (холофермент). Постепен-
но противопоставление терминов «простетиче-
ская группа фермента» и «кофермент» утрати-
ло новизну открытия, и теперь коферментом
часто называют любую небелковую часть фер-
мента, независимо от прочности ее связи с бел-
ком (если по контексту нет необходимости
привлечь внимание к характеру связи белка с
небелковой группой фермента).
Для многих ферментов роль кофермента
выполняет один из витаминов или его произ-
водное (нередко обозначаемое как «активная»
форма этого витамина).
Витамины — это органические вещества
разнообразного строения, которые не синте-
зируются в организме, но жизненно необходи-
мы ему, а потому должны обязательно посту-
пать с пищей, хотя и в очень малых количест-
вах.
Главной (если не единственной) биологи-
ческой функцией почти всех витаминов являет-
ся выполнение коферментной роли. Этим и объ-
ясняется минимальная потребность в них. ко-
торая у человека не превышает, как правило,
2-5 мг в сутки.
Из приведенного определения явствует,
что перечень витаминов не универсален и мо-
жет иметь видовые особенности. Так оно и есть.
Например, аскорбиновая кислота является ви-
тамином только для человека, обезьян, морской
свинки и индийского крылана, тогда как все
другие животные способны синтезировать ви-
тамин С (из глюкозы) и не нуждаются в поступ-
лении его с пищей. Теперь окончательно уста-
новлено, что человек нуждается в 13 витаминах.
Четыре из них обозначают как жирораствори-
мые витамины (A, D, Е, К). Еще 9 составляют
группу витаминов, растворимых в воде. К ним
относятся витамины В| (тиамин), В2 (рибофла-
вин), РР (никотинамид), С, В3 (пантотеновая
кислота), В(, (пиридоксин), биотин (вит. Н), В12
(кобаламин) и фолиевая кислота (вит. Вс). Све-
дения о некоторых витаминах даны в разделе
2.2.1. Коферментная роль других будет изложе-
на в последующих главах при описании соот-
ветствующих биохимических процессов.
4.5.2.	АДСОРБЦИОННЫЙ ЦЕНТР
Как видно из его названия, адсорбционный
центр предназначен для формирования слабых
типов связей с молекулой субстрата. Тем са-
мым реализуется функция распознавания суб-
страта - то, с чего начинается действие любого
фермента.
Формируется адсорбционный участок за
счет радикалов одной или нескольких амино-
кислот, непосредственно примыкающих к ка-
талитическому центру, а иногда еще и тех, ко-
торые расположены на некотором удалении от
него. Даже «непосредственно примыкающие»
не обязательно являются соседями по стержню
полипептидной цепи. Напротив, - обычно они
встроены в отдаленные звенья этой цепи, но
118
Глава 4
благодаря третичной структуре приближены к
элементам каталитического центра.
Например, в адсорбционном участке АХЭ
главную роль играет так называемый анионный
центр. По современным данным, он представ-
лен радикалом триптофана-86, ароматическое
ядро которого несет частичный отрицательный
заряд (диффузно распределенный по индоль-
ному кольцу) и окружено гидрофобными ради-
калами соседних аминокислот. В целом такая
структура комплементарна триметиламмоние-
вой группе («катионной головке») ацетилхоли-
на (см. рис 4-7, б). Кроме того, по другую сто-
рону серина-203 находится небольшое гидро-
фобное углубление, по размерам соответст-
вующее метильной группе ацетильного остат-
ка. Оно тоже способствует притяжению суб-
страта, но главное - совместно с анионным
участком обеспечивает правильную ориента-
цию ацетилхолина относительно каталитиче-
ского центра фермента.
Многие из сериновых эстераз не имеют
анионного участка в активном центре. Поэтому
подходящим для них субстратом является ие
ацетилхолин, а молекула эфира, не несущая
заряда. Например, гидролиз эфиров холестерола
с высшими жирными кислотами катализирует
холестеролэстераза. Ее адсорбционный центр
представлен обширными гидрофобными зона-
ми, одна из которых фиксирует полицикличе-
скую структуру холестерола, а другая сорбирует
углеводородный «хвост» жирной кислоты.
У ряда сериновых протеиназ главную
часть адсорбционного центра составляет осо-
бое углубление («ниша», «карман»), стенки
которого выстланы неполярными радикалами
аминокислот. Проникать в такую полость спо-
собны только гидрофобные фрагменты суб-
страта. В активном центре химотрипсина раз-
меры «ниши» таковы, что размещаться в ней (и
удерживаться силами гидрофобного взаимо-
действия) могут достаточно крупные радикалы
таких аминокислот, как, например, фенилала-
нин (рис. 4-8). При этом пептидная связь, обра-
зуемая его карбоксильной группой, оказывает-
ся в зоне каталитической триады (такой.ориен-
тации способствуют и другие элементы ад-
сорбционного центра, влияние которых обо-
значено пунктирными линиями). Наступающий
затем гидролиз этой связи (на рис. 4-8 она ука-
зана зигзагом) приводит к расщеплению моле-
кулы белка-субстрата на два полипептидных
Рис. 4-8. Схема фиксации белкового субстрата на активном центре химотрипсина.
Впадина («ниша»), примыкающая к каталитическому центру, выстлана неполярными радикалами аминокислот
(условно обозначено затенением) и приспособлена для сорбции радикала фенилаланина (показан на схеме) ли-
бо тирозина, триптофана или лейцина. Превильному расположению их на активном центре способствуют слабые
связи (показаны пунктиром) белка-субстрата с другими элементами адсорбционного центра. В итоге каталитиче-
ской триаде «преподносится» пептидная связь (отмечена зигзагом), обрезованная карбоксильной группой амино-
кислоты, попавшей в «нишу». Расщепление этой связи достигается обычным для сериновых эстераз способом
(см. рис. 4-7). Сначала происходит вытеснение аминогруппы (в качестве N-конца того из продуктов реакции, ко-
торый на схеме выделен жирным шрифтом). Этому сопутствует передача серину-195 той карбонильной группы,
которая принадлежит аминокислоте, фиксированной в «нише». На следующей стадии эта группа покидает серин
(путем гидролиза сложноэфирной связи, только что образованной им), т.е., освобождается второй продукт реак-
ции, - в виде полипептида, у которого С-концевой аминокислотой является в приведенном примере фенилала-
нин (а в других случаях может оказаться тирозин, триптофан или лейцин). Следует еще отметить, что химотрип-
сину, в общем-то, безразлично, какая аминокислота выступает в качестве R' (т.е., станет N-концевой в первом из
двух продуктов расщепления пептидной связи в молекуле белка).
ФЕРМЕНТЫ
119
фрагмента, в одном из которых С-концевое по-
ложение занимает (в данном примере) фенил-
аланин. Таким образом, химотрипсин способен
расщеплять молекулу белка во всех тех местах,
где имеются остатки фенилаланина (а также
тирозина, триптофана или лейцина, обладаю-
щих столь же крупными неполярными радика-
лами, приемлемыми для гидрофобной «ни-
ши»).
В активном центре трипсина тоже имеется
аналогичная «ниша», примыкающая к катали-
тическому центру, но на дне ее расположена
карбоксильная группа аспартата, несущая от-
рицательный заряд. В таком адсорбционном
центре могут размещаться лишь радикалы ли-
зина или аргинина, полиметиленовые цепочки
которых оканчиваются положительным заря-
дом на атомах азота. Следовательно, в белко-
вой молекуле субстрата трипсин будет гидро-
лизовать только те пептидные связи, которые
образованы с участием группы -СООН лизина
или аргинина. Этот фермент, как и химотрип-
син, безразличен к структуре другого участни-
ка атакуемой пептидной связи (R' на рис. 4-8).
Таким образом, именно адсорбционный
центр предопределяет субстратную специ-
фичность фермента. Иначе говоря, своеобра-
зием своей структуры этот участок формули-
рует на языке физико-химических свойств пе-
речень тех требований, которым должна отве-
чать молекула субстрата. Но это еще не все. Он
не только «узнает» молекулу, пригодную в ка-
честве субстрата, но и ориентированно связы-
вает ее, — как бы «преподносит» каталитиче-
скому центру в наиболее удобном для него по-
ложении.
Сорбция субстрата на адсорбционном цен-
тре фермента - процесс обратимый, ибо осу-
ществляется за счет только нековалентных свя-
зей. По мере их возникновения (в одной точке,
другой и т.д.) происходит правильное разме-
щение субстрата на активном центре, которое
стимулирует вполне определенную конформа-
ционную подвижку элементов активного цен-
тра (включая его каталитический участок). Это
приводит к обеспечению более точного соот-
ветствия между пространственными структу-
рами субстрата и активного центра. Следова-
тельно, - и к более успешной работе каталити-
ческого центра.
Вещества, похожие на субстрат, тоже могут
связываться с адсорбционным центром. Однако
затем такая подмена обнаруживает себя. На-
пример, если фермент катализирует гидролиз
какого-либо сложного эфира R'-C(O)-O-R", то
молекула простого эфира аналогичного строе-
ния (R'-CH2-O-R") имеет высокие шансы неко-
валентного связывания с адсорбционным цен-
тром этого фермента. Однако тогда в зоне ката-
литического участка окажется не сложноэфир-
ная группировка «истинного» субстрата, а про-
стая эфирная связь, не поддающаяся расщепле-
нию данным ферментом. Занимая адсорбцион-
ный центр, такой аналог препятствует взаимо-
действию фермента с настоящим субстратом.
Тем самым он затрудняет работу всего активно-
го центра, т.е. является ингибитором данного
фермента. Причем, обратимым ингибитором
(т.е., соединяющимся с ферментом нековалент-
но). Такого рода обратимые ингибиторы назы-
вают конкурентными, ибо они «соперничают» с
субстратом за обладание активным центром. До-
бавление субстрата способствует вытеснению
им молекул ингибитора из активного центра и,
следовательно, ослаблению угнетающего эф-
фекта. В конечном счете все большим повыше-
нием концентрации субстрата можно совсем
вытеснить ингибитор из активного центра и
восстановить изначальную работоспособность
фермента.
4.5.3.	АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ЦЕНТРЫ
В свое время было замечено, что многие
обратимые ингибиторы вовсе непохожи на
субстрат. Их назвали аллостерическими инги-
биторами. имея в виду совсем иную простран-
ственную организацию таких молекул в срав-
нении с субстратом данного фермента. Несоот-
ветствие структур (отсутствие комплементар-
ности) препятствует формированию стойких
физико-химических взаимодействий между
ними и активным центром. Угнетающее дейст-
вие таких ингибиторов не удается ослабить по-
вышением концентрации субстрата. Следова-
тельно, они являются неконкурентными инги-
биторами. Очевидно, они должны связываться
не с адсорбционным участком, а где-то в ином
месте, вне активного центра фермента. Эти
места (сайты, — от английского site) стали на-
120
Глава 4
зывать аллостерическими центрами. Сорбиру-
ясь на определенном сайте, неконкурентный
ингибитор вызывает такие конформационные
изменения белка, которые вовлекают и актив-
ный центр фермента, затрудняя его функцио-
нирование- Степень угнетения в данном случае
не зависит от количества субстрата и определя-
ется только концентрацией ингибитора и сте-
пенью его сродства к данному ферменту.
Бывает и так, что взаимодействие какого-
то лиганда с соответствующим ему аллостери-
ческим участком не затрудняет, а, напротив,
облегчает работу активного центра, вызывая,
можно сказать, «благоприятные» конформаци-
онные подвижки в молекуле фермента. Оче-
видно, такое вещество следует называть акти-
ватором. Важно подчеркнуть, что многие ак-
тиваторы ферментов оказывают свое влияние
именно через аллостерические воздействия и,
следовательно, относятся к эффекторам некон-
курентного типа.
От термина «аллостерический центр» не
стали отказываться даже после того, как выяс-
нилось, что иногда его структура очень близка
строению адсорбционного участка. Не обладая
элементами каталитического центра, такой не
совсем обычный аллостерический участок спо-
собен связывать субстрат, но не подвергает его
химическим превращениям. При достаточном
избытке субстрата могут произойти конформа-
ционные изменения фермента, отражающиеся
на его работоспособности. Обычно она снижа-
ется. Тогда говорят об угнетении фермента из-
бытком субстрата. Это - своеобразный вариант
аллостерического угнетения. У некоторых
ферментов наблюдается обратный эффект — не
затруднение, а улучшение работы активного
центра. Такой феномен называют аллостериче-
ской активацией фермента собственным суб-
стратом.
К числу ферментов, угнетаемых избытком
субстрата, относится уже упоминавшаяся аце-
тилхолинэстераза Помимо анионного центра в
адсорбционном участке, она имеет еще и пе-
риферический анионный центр (ПАЦ), кото-
рый находится за пределами активного центра,
но тесно примыкает к нему. Решающими
компонентами ПАЦ являются радикалы трп-
286 и асп-74, а также трех остатков тирозина (в
положениях 72, 124 и 341). Фиксация ацетил-
холина на ПАЦ несколько изменяет ориента-
цию трп-86 адсорбционного участка, тем са-
мым затрудняя работу всего активного центра.
Однако по сродству к ацетилхолину ПАЦ су-
щественно уступает адсорбционному участку
АХЭ. Поэтому замедление гидролиза ацетил-
холина начинается лишь при высоких концен-
трациях этого субстрата.
Аллостерические центры бывают (точнее —
известны) далеко не у каждого фермента.
Обычно они присущи достаточно сложно уст-
роенным белковым молекулам, особенно тем,
которые обладают четвертичной структурой (и
потому легче поддаются весомым конформа-
ционным перестройкам). В молекуле может
быть один, а может быть и несколько аллосте-
рических центров, обычно очень разных. Бла-
годаря их избирательности, активность фер-
мента по-разному меняется под действием раз-
личных эффекторов, в роли которых могут вы-
ступать те или иные метаболиты, вторичные
посредники, лекарственные препараты и т.д.
При этом принципиально важна обратимость
вызываемого эффекта. Ферменты, способные
обратимо изменять интенсивность своей функ-
ции под действием определенных метаболитов,
называются регуляторными.
Можно заключить, что природа в ходе эво-
люции специально «отбирала» и «шлифовала»
удачные фрагменты белковой молекулы, кото-
рые мы теперь называем аллостерическими
центрами. Шлифовала их (и не только у фер-
ментов!) именно как инструмент для реали-
зации посреднической миссии молекул-«ин-
форматоров». В этом смысле вполне оправдан
термин «центр» - то есть, участок, специально
созданный для выполнения какой-то конкрет-
ной функции (в данном случае - узнавание
строго определенного вещества и жестко за-
данный характер реагирования на его воздей-
ствие). Вместе с тем, сложность и разнообразие
рельефа белковой молекулы делают возмож-
ным синтез какого-либо вещества, комплемен-
тарного достаточно протяженному участку по-
верхности фермента. Его взаимодействие с
этим участком может вызвать конформацион-
ные сдвиги, отражающиеся на эффективности
ферментативного катализа. Именно так дейст-
вуют многие искусственно синтезированные
лекарственные препараты. Соответствующие
ФЕРМЕНТЫ
121
участки фермента тоже называют аллостериче-
скими центрами, хотя в данном случае природа
не «придумывала» их специально, а просто
удалось создать комплементарное им вещест-
во-эффектор. Детальное выяснение устройства
поверхности белковой молекулы, ее третичной
и четвертичной структуры позволяет предска-
зывать строение веществ, которые могут ока-
заться эффективными лигандами. Целенаправ-
ленный синтез веществ с заданными физико-
химическими характеристиками (и последую-
щее испытание серии таких веществ) является
наиболее перспективным направлением в раз-
работке лекарств новых поколений. Оно уже
дает свои плоды: десятки препаратов, создан-
ных таким путем, применяются в практической
медицине.
В заключение раздела важно подчеркнуть,
что активному и всем аллостерическим цен-
трам вместе принадлежит ничтожная доля мо-
лекулы фермента. Неверно, однако, было бы
расценивать остальную ее часть просто в каче-
стве инертного носителя этих функционирую-
щих группировок. Эти остальные структуры
тоже существенны для работы фермента. В ча-
стности, именно их особенностями предопре-
деляется характер возможных конформацион-
ных подвижек как в ходе ферментативного ка-
тализа, так и в реализации регуляторных воз-
действий активаторов и ингибиторов, особенно
аллостерических.
4.6.	ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ
ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА
Любая ферментативная реакция протекает
через серию промежуточных стадий - так на-
зываемых элементарных актов. Но все они мо-
гут быть сведены к трем основным, принципи-
ально различным этапам (рис. 4-9).
Этап I - сорбция субстрата (S) на активном
центре фермента (Е) с образованием фермент-
субстратного комплекса (Е-S). Реализуется пу-
тем формирования слабых типов связи, а пото-
му протекает легко и полностью обратим. Кон-
формационные подвижки в процессе сорбции
усиливают пространственное соответствие ак-
тивного центра структуре субстрата. Приспо-
собление («подгонка») их друг другу обеспечи-
вается в основном адсорбционным центром и
характеризует эффективность его работы.
Этап II - ковалентные преобразования суб-
страта в составе фермент-субстратного ком-
плекса, в результате чего появляется комплекс
фермента с химически измененным субстратом
(Е • S’), т.е. с почти готовым продуктом (Р).
В этом этапе участвует каталитический центр.
Он обеспечивает разрыв одних ковалентных
связей, формирование других. Поэтому данный
этап необратим (за исключением тех реакций,
которые по природе своей обратимы, - для них
в схеме на рис. 4-9 обозначены пунктиром
стрелки в обратном направлении). Необходи-
мость ковалентных превращений субстрата
делает этот этап, как правило, гораздо более
трудным и медленным, чем этап I (да и чем
этап III тоже). Поэтому константа скорости
этого этапа (к+2) обычно гораздо меньше всех
остальных частных констант скорости (к+ь к.ь
к+3). Иными словами, именно этап II определя-
ет (лимитирует) скорость всей реакции в це-
лом, а величина к+2 дает количественное пред-
ставление об эффективности работы каталити-
ческого центра.
Этап III - десорбция готового продукта ре-
акции (Р) из комплекса Е  S’, которая сопро-
вождается освобождением фермента в его
исходном виде. Чаще всего этот этап протекает
легче предыдущего, но, как и этап И, является
необратимым (опять же, за исключением слу-
чаев катализа обратимой химической реакции).
Здесь уместно отметить, что многие бел-
ковые молекулы связываются со своим специ-
фическим лигандом примерно так же. как фер-
мент сорбирует молекулу субстрата на этапе I.
E + S ktl > Е S k« > E S k” > Е+Р
к,	"	'
<-- I —»!<— п —> <— ш —>|
Рис. 4-9- Основные этапы ферментативного катализа.
122
Глава 4
Отличаются же они неспособностью хи-
мически преобразовывать молекулы связанно-
го лиганда. К наиболее известным представи-
телям таких белков относятся гемоглобин, ко-
торый нековалентно присоединяет кислород в
легких и разносит его по организму. Другой
пример — клеточные рецепторы, которые обра-
тимо связывают определенный гормон или ме-
диатор, а наступающей при этом своей кон-
формационной перестройкой передают соот-
ветствующий сигнал внутриклеточным струк-
турам. Все белки такого рода являются как бы
ферментами, реализующими этап I, но неспо-
собными осуществлять каталитическую функ-
цию (т.е., этапы II и III). Поэтому к ним приме-
нимы те методы кинетической характеристики,
которые разработаны для количественной
оценки функциональных возможностей этапа I
ферментативной реакции.
4.7.	КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНОГО
КАТАЛИЗА
Кинетика вообще - это учение о скоростях
процессов. В химических реакциях скорость
измеряется по убыли субстрата в единицу вре-
мени или, что то же самое, по приросту про-
дукта реакции во времени. Здесь необходимы
два уточнения. Во-первых, регистрировать
следует так называемую начальную скорость
реакции, т.е., за тот отрезок времени, пока кон-
центрация субстрата снизится не настолько,
чтобы это привело к заметному замедлению
реакции в соответствии с законом действую-
щих масс (обычно скорость практически неиз-
менна до расщепления не более 20% субстра-
та). Во-вторых, для ферментативных реакций
всегда нужна поправка на скорость спонтанно-
го процесса. Иными словами, работа фермента
характеризуется скоростью реакции в присут-
ствии фермента за вычетом ее скорости без
фермента (при прочих равных условиях).
В дальнейшем изложении под скоростью фер-
ментативной реакции будет подразумеваться
именно начальная скорость с поправкой на не-
ферментативные превращения (которая иногда
бывает весьма существенной).
Единицы измерения скорости реакции мо-
гут быть разными. Количество превращаемого
вещества лучше всего выражать в молярных
единицах, а время - в секундах или минутах.
Соответственно в качестве единиц скорости
можно использовать такие, как ммоль/мин или
мкмоль/с и т.п. Непосредственные измерения
хода реакции удобно проводить путем регист-
рации изменений какого-либо физического па-
раметра, свойственного субстразу или обра-
зующемуся продукту. Например, если один из
них имеет окраску, то скорость процесса удоб-
но измерять по динамике светопоглощения
раствора, в котором протекает реакция (при
этом единицы светопоглощения при желании
можно перевести в молярную концентрацию
анализируемого вещества, воспользовавшись
соответствующей калибровочной кривой).
Как известно, скорость любой химической
реакции определяется законом действующих
масс: она пропорциональна произведению кон-
центраций реагирующих веществ. Фермента-
тивные реакции отличаются в этом плане неко-
торыми особенностями. Во-первых, одно из
реагирующих веществ - это фермент, концен-
трация которого, как правило, на много поряд-
ков меньше, чем концентрация субстрата. Во-
вторых, фермент, как и всякий катализатор, не
расходуется в ходе реакции, а потому его ко-
личество в ходе реакции остается неизменным
(точнее, постоянной пребывает совокупная
концентрация свободного фермента и связан-
ного в комплексах с субстратом и продуктом).
Рассмотрим выражение закона действую-
щих масс применительно к простейшей (одно-
субстратной) ферментативной реакции:
r = k+2- [Е]  [S]
Анализ этого уравнения позволяет вскрыть
своеобразие кинетики ферментативного ката-
лиза.
4.7.1.	ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ РЕАКЦИИ
ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ ФЕРМЕНТА
Эксперименты in vitro позволяют изучать
ферментативную реакцию в стандартных усло-
виях, варьируя тот или иной параметр при со-
блюдении постоянства остальных. В частности,
можно варьировать количество фермента,
обеспечив постоянную (но достаточно высо-
кую) концентрацию субстрата. Такие опыты
показывают, что скорость превращений суб-
ФЕРМЕНТЫ
123
страта прямо пропорциональна концентрации
фермента (его количеству в инкубационной
смеси стандартного объема). Это проявляется
линейностью графика зависимости v от [Е] в
довольно большом диапазоне концентраций
фермента (рис. 4-10).
При очень высоких значениях [Е] нередко
наблюдается отклонение от линейности. Не
вдаваясь в причины этого, следует отметить
главное: для получения воспроизводимых ре-
зультатов измерять скорость реакции следует
только при таких концентрациях фермента,
которые не выходят за рамки линейной зави-
симости. Поэтому, начиная работу с каким-
либо ферментом (или биопробой, содержащей
фермент, - например, с сывороткой крови),
всегда предварительно следует эксперимен-
тально установить тот диапазон, в пределах
которого скорость реакции пропорциональна
концентрации данного фермента. Это позволя-
ет в дальнейшем измерять скорость реакции
только при одной, произвольно взятой концен-
трации фермента (желательно - в средней час-
ти линейного диапазона). Разделив измерен-
ную при этом скорость на количество (концен-
трацию) фермента, получают параметр, име-
нуемый активностью фермента. По сути, это -
тангенс угла наклона линейного участка к абс-
циссе (тангенс угла а на рис. 4-10): он одно-
значно характеризует положение всего линей-
ного участка на таком графике.
Рис. 4-10. Зависимость скорости ферментативной
реакции (и) от концентрации фермента ([Е])
при достаточно высокой концентрации субстрата.
Итак, активность фермента - это ско-
рость ферментативной реакции в расчете на
единицу количества фермента (в стандарт-
ном объеме инкубационной смеси)
Измерять активность фермента можно
в разных единицах, в зависимости от того, в
каких единицах представлены убыль субстрата,
время и количество фермента. Очень часто ко-
личество фермента выражают в миллиграммах
белка. Тогда единица активности может выгля-
деть, например, так: мкмоль/(мин.мг). Это
означает: мкмоли субстрата, превращаемого за
1 минуту в расчете на 1 мг белкового препара-
та, содержащего данный фермент. По мере
фракционирования биопробы с целью удаления
«посторонних» белков регистрируемые вели-
чины такой удельной активности фермента
будут возрастать. Это позволяет судить об эф-
фективности каждой из процедур очистки изу-
чаемого фермента.
Оптимальной единицей является молеку-
лярная активность фермента. Она означает
количество молекул субстрата, превращаемых
одной молекулой фермента за 1 мин при 30 °C
в условиях, наиболее благоприятных для дан-
ного фермента (включая оптимальную концен-
трацию субстрата). Естественно, в таких еди-
ницах можно выражать активность лишь тех
ферментов, для которых известна молекуляр-
ная масса. Зато становится возможным не
только сравнивать активность одного и того же
фермента из разных источников, но и сопос-
тавлять каталитическую эффективность со-
вершенно разных ферментов. Так, молекуляр-
ная активность (прежнее обозначение - число
оборотов) каталазы эритроцитов человека со-
ставляет 1 200 000. Это значит, что одна моле-
кула этого фермента за 1 мин при 30 °C расще-
пляет 1,2 млн молекул пероксида водорода (до
воды и молекулярного кислорода). Среди дру-
гих наиболее активных ферментов можно на-
звать уже упоминавшуюся ацетилхолинэстера-
зу (1 500 000), а также карбоангидразу, которая
катализирует обратимую реакцию превраще-
ния углекислого газа и воды в угольную кисло-
ту (ее молекулярная активность достигает
60 000000!).
Многие десятилетия понятие «активность
фермента» использовали как синоним термина
124
Глава 4
«количество фермента» (или его концентрация)
в исследуемом биологическом объекте. Дейст-
вительно, если активность какого-то фермента
в расчете на 1 мл исследуемой сыворотки кро-
ви у одного человека вдвое ниже, чем у друго-
го, то из линейности графика на рис. 4-10 сле-
дует, что у первого из них сыворотка содержит
вдвое меньше фермента, чем у второго. Строго
говоря, трактовка не вполне корректна, ибо
активность - это показатель не количества
фермента, а его эффективности (которая может
меняться). Хотя и до сих пор нередко (даже в
учебниках) пишут «активность повышена»,
имея в виду повышение концентрации фермен-
та (например, в сыворотке крови).
Чтобы обеспечить однозначность терми-
нов, было решено ввести понятие «количество
фермента» и измерять его скоростью катализи-
руемой реакции, измеренной при 30°С и про-
чих оптимальных значениях pH и других пара-
метров среды. Международная система единиц
(СИ) рекомендует в качестве такой единицы
катал (кат).
Катал - это то количество фермента,
которое преобразует 1 моль субстрата за 1
секунду.
Для биологических объектов эта единица
измерения чрезмерно велика. Поэтому исполь-
зуют в миллиард раз меньшую мерку — нано-
катал. Однако, обычно применяют более удоб-
ную единицу — юнит (в зарубежной литературе
- unit, что в английском и означает «единица»).
Юнит - это то количество фермента,
которое преобразует 1 мкмоль субстрата за
1 мин.
Таким образом, если в расчете на 1 мл ис-
следуемой сыворотки крови некая фермента-
тивная реакция протекает со скоростью 1,
2 или 5 мкмоль/мин, то это означает, что в 1 мл
этой сыворотки содержится 1, 2 или 5 юнит
данного фермента, а его концентрация состав-
ляет соответственно 1, 2 и 5 юнит/мл.
Легко подсчитать соотношение разных
единиц:
1 юнит = 16,67 нанокатал;
1 нанокатал = 0,06 юнит.
Очевидно: чем больше молярная масса
фермента (при сходстве чисел оборотов), тем
больше весовых единиц его (например, милли-
граммов) приходится на 1 юнит (или 1 кат).
Итак, измерение скорости ферментативной
реакции позволяет количественно оценить со-
держание соответствующего фермента в анали-
зируемом биологическом материале. Такие из-
мерения невозможно произвести в живом объ-
екте, - они осуществимы только в опытах in
vitro. При этом регистрируется функционально
полноценный фермент, но не его генетически
дефектные формы, не обладающие полноцен-
ной ферментативной активностью. Они могут
быть определены иммунологическими метода-
ми. которые, однако, обычно не позволяют
оценить функциональную активность фермента
(да и других белков тоже).
4.7.2.	ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ РЕАКЦИИ
ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ СУБСТРАТА
Влияние концентрации субстрата можно
исследовать путем измерения скоростей реак-
ции в серии пробирок, содержащих одинако-
вую порцию фермента, но возрастающие коли-
чества субстрата. Естественно, с увеличением
концентрации субстрата скорость реакции ста-
новится все выше. Однако эта зависимость не
является линейной. Соответствующий график
(рис. 4-11) представляет собой часть равнобоч-
ной гиперболы и описывается уравнением Ми-
хаэлиса-Ментен:
где:
[S] - концентрация субстрата в отдельном
эксперименте;
v - скорость реакции при данной конкрет-
ной концентрации субстрата;
и Км - главные кинетические кон-
станты, характеризующие фермент в его реак-
ции с данным субстратом.
График в координатах Михаэлиса-Ментен
представляет собой типичную кривую насы-
щения (в данном случае - фермента субстра-
том): с увеличением значений абсциссы значе-
ния ординаты постепенно приближаются к не-
которому пределу (насыщению).
ФЕРМЕНТЫ
125
Рис. 4-11. Влияние концентрации субстрата ([S])
на скорость ферментативной раакции (*>)
[черными кружочками показаны результаты измераний
в эксперименте in vitro].
Vmax - это то предельное значение, к ко-
торому стремится скорость реакции при бес-
конечно большом увеличении концентрации
субстрата (см. рис. 4-11). Этот кинетический
параметр характеризует максимально возмож-
ную работоспособность данного фермента и
называется максимальной скоростью данной
ферментативной реакции.
Как уже отмечалось, скорость фермента-
тивной реакции лимитируется, как правило,
константой скорости ее этапа II, т.е., величи-
ной к+2- Следовательно, Vmax характеризует со-
бой эффективность именно этого этапа (чаще
всего). Вместе с тем, Vmax — это не то же самое,
что к+2 . Последняя отражает скорость реакции
в расчете на стандартные условия (включая
требование 1 М концентрации каждого из уча-
стников реакции). Величина же VniHX - это мак-
симально возможная скорость, оцениваемая в
опытах с каким-то определенным количеством
фермента. Иными словами, она пропорцио-
нальна концентрации фермента:
V„.=k42-[E]	[4-2]
Экспериментально найденная величина
Vmax может быть пересчитана на единицу коли-
чества фермента, и тогда она представляет со-
бой его максимальную активность. Она может
быть рассчитана на единицу количества иссле-
дуемого объекта, — например, на 1 мл плазмы
крови, на 1 г анализируемой ткани, на I клетку.
Тогда Vmax характеризует максимально возмож-
ную скорость данной ферментативной реакции
в соответствующем объеме биологического
объекта (1 мл, 1 г, одиночная клетка). Если при
этом скорость представлена в мкмоль/мин, то
получаем выраженное в юнитах содержание
данного фермента в проанализированной био-
пробе, т.е., его концентрацию в ней.
Другая из главнейших кинетических ха-
рактеристик любого фермента - это константа
Михаэлиса (Км).
Численно Км равна той концентрации
субстрата, при которой скорость реакции
составляет половину от максимально возмож-
ной (см. рис. 4-11). Это легко проверить, под-
ставив в уравнение [4-1] значение и = 0,5  Vmax.
Физический смысл Км заключается в том,
что она представляет собой константу равнове-
сия между реакцией образования фермент-
субстратного комплекса Е  S и двумя реакция-
ми, ведущими к его распаду (см. рис. 4-9):
к-, + к.2
k.i
Как отмечалось выше, к+2 обычно много
меньше, чем k+i (или другие частные констан-
ты скорости). Следовательно, величина Км, как
правило, очень близка отношению kj/k+i. Это
отношение является константой равновесия эта-
па I ферментативного катализа и называется
субстратной константой (Ks). Ее величина ха-
рактеризует положение равновесия обратимой
реакции, составляющей этот этап (см. рис. 4-9):
Чем больше величина к+1 преобладает над
значением к.[ , тем больше равновесие этапа I
сдвинуто вправо, в сторону образования ком-
плекса Е  S. Значит, чем меньше величина суб-
стратной константы, тем более значительная
доля фермента пребывает в составе фермент-
субстратного комплекса, или, как часто гово-
рят, — тем выше сродство между данными фер-
ментом и субстратом. В свою очередь, чем
большая часть фермента связана с субстратом,
тем выше концентрация комплекса Е  S и, сле-
довательно, быстрее протекает самый трудный
этап II, а, значит, и вся ферментативная реак-
ция в целом.
Верно и обратное: если субстратная кон-
станта велика, то это свидетельствует, что ком-
плексы Е  S, образующиеся на этапе 1, гораздо
126
Глава 4
легче распадаются на исходный субстрат и сво-
бодный фермент, чем вступают в химические
преобразования, знаменующие этап II. Это и
означает низкое сродство фермента к данному
субстрату: молекулы фермента предпочитают
«уклоняться» от работы в составе комплекса
Е • S, и поэтому этап II и реакция в целом осу-
ществляются сравнительно медленно.
В стационарном режиме протекания фер-
ментативной реакции очень быстро устанавли-
вается постоянная концентрация комплекса
Е • S. Это обеспечивается высокой скоростью
достижения равновесия на этапе I при гораздо
более медлительном процессе химических пре-
образований на этапе II. Поэтому величины Км
и Ks обычно практически совпадают или очень
близки, что позволяет сделать следующие за-
ключения.
Чем ниже величина Км, тем меньшие кон-
центрации субстрата достаточны для эф-
фективного протекания реакции, в том числе
— для достижения максимально возможной
скорости реакции (Vnax).
И еще; чем меньшие концентрации суб-
страта «замечает» (и «перерабатывает»)
фермент, тем более высоким является его
сродство к данному субстрату.
Таким образом, Км и Vinax - это наиболее
важные кинетические константы. Они дают ко-
личественную оценку таким фундаментальным
качествам фермента, как его сродство к данному
субстрату и максимально возможная работоспо-
собность (соответственно - эффективность эта-
пов I и II ферментативного катализа).
Сопоставление значения Км с реальной
концентрацией субстрата в клетке открывает
уникальную возможность: по параметрам, из-
меренным in vitro, судить о том, в какой степе-
ни фермент реализует свою работоспособность
в реальных условиях in vivo.
4.8. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ГЛАВНЫХ КИНЕТИЧЕСКИХ КОНСТАНТ
Для расчета субстратной константы Ks не-
обходимо уствновить частные константы ско-
рости к+1 и к.1, что требует очень сложных экс-
периментов. Величину Км определить несрав-
ненно легче, - достаточно измерить скорость
реакции при разных концентрациях субстрата.
Поэтому предпочитают пользоваться именно
константой Михаэлиса, тем более что она
обычно почти совпадает по величине с суб-
стратной константой.
Вместе с тем, как видно на рис. 4-11, точ-
ность определения Vnwx (а отсюда и Км) срав-
нительно невелика. Во-первых, из-за экспери-
ментальных погрешностей, присущих любым
измерениям, нет уверенности, что проведенная
кривая действительно достигла предела. Во-
вторых, не всегда удается создать достаточно
высокие концентрации субстрата (например,
из-за плохой его растворимости). Преодолеть
эти затруднения можно путем преобразования
графика Михаэлиса-Ментен в линейную фор-
му. Одну из таких возможностей реализовали
Г. Лайнуивер и Д. Берк. Предложенный ими
способ двойных обратных величин основан на
известном правиле: если две величины равны
между собой, то равны и обратные им величи-
ны. Следовательно, уравнение [4-1] может
быть представлено в таком виде:
1, Км
Это соотношение удобнее переписать в
несколько иной форме:
Этим преобразованием достигается линеа-
ризация кривой Михаэлиса-Ментен, повы-
шающая надежность усреднения эксперимен-
тальных измерений, а тем самым — и точность
экстраполяции их к высоким концентрациям
субстрата, которая необходима для определе-
ния значений и V^, и Км.
Итак, график зависимости 1/t? от 1/[SJ
представляет собой прямую линию (рис. 4-12).
Ее продолжение пересекает ординату в точке,
равной 1/Vmix (она соответствует нулевому зна-
чению абсциссы 1/[S], т.е., бесконечно боль-
шой концентрации субстрата, которую вообще
невозможно создать в эксперименте). Абсциссу
же экстраполяция этой линии пересекает при
(1/f) = 0, т.е. в точке, отвечающей значению
(-1/Км), как это следует из уравнения [4-3].
ФЕРМЕНТЫ
127
Экспериментальное определение главных
кинетических констант в присутствии эффек-
торов дает возможность количественно оце-
нить их способность к нековалентному взаи-
модействию с ферментом. В частности, оно
позволяет довольно просто устанавливать тип
угнетающего действия обратимых ингибиторов
и определять константу угнетения.
4.9. КИНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ОБРАТИМЫХ
ИНГИБИТОРОВ
Эффект обратимого ингибитора может
ослабевать с повышением концентрации суб-
страта. Такой тип угнетения называют конку-
рентным. Его отличает то, что в присутствии
ингибитора график Михаэлиса-Ментен (рис.
4-13, а) стремится к тому же пределу (Vmax),
который наблюдается без ингибитора (кривая
1). Однако достигается этот предел при гораздо
более высоких концентрациях субстрата. Соот-
ветственно, увеличивается значение константы
Михаэлиса, определяемой в присутствии инги-
битора (так называемая «кажущаяся» констан-
та Михаэлиса, - Км.каж)- Степень увеличения
легко определить, применив способ Лайнуиве-
ра-Берка (рис. 4-13, б). Она зависит от концен-
трации ингибитора ([!]) в среде и от его срод-
ства к данному ферменту, которое оценивается
ингибиторной константой К,:
Км.„,=Км(1 + ^)
IV,
Из этого соотношения можно рассчитать
значение К, (зная использованную в опыте кон-
центрацию ингибитора):
К
К,=[1]--------[4'4]
К- М,каж К- М
В примере, приведенном на рис. 4-13, зна-
чения Км и Км.каж (при расчете их способом
Лайнуивера-Берка) равны соответственно
-(-1/0,05) = 20 и -(-1/0.28) ~ 36 мМ (округлен-
но). Поскольку ингибитор в этом эксперименте
был использован в концентрации 0,4 мМ, его
ингибиторная константа К, составляет 0,5 мМ
(расчет приведен на рис. 4-13, б).
Очевидно, что при конкурентном угнете-
нии константа К; характеризует легкость взаи-
модействия ингибитора не вообще с фер-
ментом. а с его активным центром.
В отличие от конкурентных, ингибиторы
неконкурентного типа проявляют свое действие
вне зависимости от концентрации субстрата.
Поэтому максимально возможная скорость ре-
акции в присутствии обратимого ингибитора
(Vmanja») никогда не достигает уровня, наблю-
даемого без ингибитора. Вместе с тем, на вели-
чине Км неконкурентный ингибитор не сказы-
128
Глава 4
Рис 4-13. Графики Михаэлиса-Ментен (а) и Лайнуивера-Берка (б) для ферментативной реакции без эффекторов (1)
и в присутствии 0,4 мМ конкурентного обратимого ингибитора (2).
а)	б)
Рис 4-14. Графики Михаэлиса-Ментен (а) и Лайнуивера-Берка (б) для ферментативной реакции без эффекторов (1)
и в присутствии 0,4 мМ неконкурентного обратимого ингибитора (2).
вается (как это видно на рис. 4-14, а). Иными
словами, он не влияет на сродство фермента к
субстрату, а лишь снижает его каталитическую
эффективность. Поэтому в координатах Лай-
нуивера-Берка (см. рис. 4-14, б) экстраполяция
обеих линий приводит на абсциссе к одной и
той же точке (отражающей значение -1/Км),
а ординату на более высоком уровне пересекает
та прямая, которая проведена по результатам
измерений в присутствии ингибитора. Это по-
вышение в обратных координатах свидетель-
ствует, что сама величина Утах.каж меньше, чем
Vmax. Расчеты показывают, что значения этих
величин (в данном эксперименте) составляют
соответственно 1:0,02 = 50 и 1:0,125 =
80 мкмоль/мии. Зависимость степени этого
уменьшения от концентрации неконкурентного
ингибитора выражается довольно простым со-
отношением:
V =V •
тах.каж max
Для расчета величины К, используют
обычно уравнение:
V
тах.каж
К, =[1]
V -V
max тах.каж
[4-5]
В конкретном примере, приведенном на
рис. 4-14, она составляет около 0,67 мМ. Это
заметно выше, чем величина К> для конкурент-
ного ингибитора, результаты опытов с которым
ФЕРМЕНТЫ
129
были показаны на рис. 4-13. Значит, из двух
исследованных ингибиторов неконкурентный
обладает меньшим сродством к изученному
ферменту, чем конкурентный.
Таким образом, константа неконкурентно-
го обратимого ингибитора тоже характеризует
степень сродства ингибитора к соответствую-
щему ферменту, но уже не к его активному
(адсорбционному) центру, а к тому аллостери-
ческому участку, с которым взаимодействует
неконкурентный ингибитор.
Далеко не всегда действие обратимых ин-
гибиторов бывает чисто конкурентным или
строго неконкурентным. Зачастую их действие
носит более сложный («смешанный») характер.
При этом в присутствии ингибитора изменяют-
ся величины и Км, и VinM. Определение степе-
ни этих изменений позволяет оценить вклад
конкурентного и неконкурентного компонен-
тов в итоговое угнетение фермента.
В сущности, константа обратимого угне-
тения характеризует положение равновесия в
реакции фермента с ингибитором. Выражают
ее обычно как константу диссоциации возни-
кающего комплекса Е I, т.е., как отношение
произведения концентраций свободных Е и I к
концентрации E.I в состоянии равновесия меж-
ду участниками реакции:
К, =-
[В] [I]
[EI]
[4-6]
Знание величины К; позволяет сопостав-
лять эффективность различных веществ. В ча-
стности, среди обратимых ингибиторов данно-
го фермента наиболее эффективными («силь-
ными») окажутся те, у которых ингибиторная
константа меньше, чем у остальных. С другой
стороны, обратимый ингибитор, способный
угнетать разные ферменты, будет отдавать
предпочтение тому из них, для которого значе-
ние Kj наименьшее (если для остальных значе-
ния этой константы во много раз больше, то та-
кие ферменты вообще не будут угнетаться в ре-
альных физиологических условиях организма).
Определение значений К, дает еще и воз-
можность по результатам опытов in vitro про-
гнозировать возможную эффективность испы-
туемого вещества при введении его в организм
(in vivo). Именно такого рода «пробирочные»
исследования различных, специально синтези-
рованных веществ совершенно необходимы на
ранних этапах работы по созданию любого ле-
карства нового поколения.
Теперь уже известно, что эффекты лекар-
ственного вещества, как правило, обусловлены
его воздействием на ферменты (или на белки,
функционально сходные с ними, - например,
на клеточные рецепторы). В большинстве слу-
чаев это воздействие обратимо. Но самое при-
мечательное заключается в том, что лечебные
средства почти всегда являются не активатора-
ми, а ингибиторами ферментов (применитель-
но к рецепторам их обычно называют блокато-
рами, невзирая на обратимость действия). Этот
парадокс нашел простое объяснение: замедляя
некий биохимический процесс, ингибитор спо-
собствует более значительному проявлению
противоположно направленных реакций. Наи-
более яркий пример - кофеин и.близкие ему
вещества, содержащиеся в чае, кофе и ряде дру-
гих растительных экстрактов. Давно замечено,
что их прием вызывает состояние, подобное
легкому эмоциональному возбуждению, кото-
рое, как теперь известно, вызывается «выбро-
сом» в кровь адреналина. Оказалось, что кофеин
и подобные ему «тонизирующие» вещества об-
ратимо угнетают фосфодиэстеразу (см. раздел
2.2.3). Замедляя действие этого фермента, такие
ингибиторы способствуют более длительному
сохранению молекул цАМФ. Тем самым они
имитируют действие адреналина (точнее, обес-
печивают более стойкий эффект обычных кон-
центраций адреналина в крови).
4.10, НЕОБРАТИМЫЕ ИНГИБИТОРЫ
ФЕРМЕНТОВ
Далеко не все вещества взаимодействуют с
молекулой фермента нековалентно. Многие со-
единения способны химически реагировать с
белком. Если вызываемая ими ковалентная мо-
дификация фермента ведет к потере каталитиче-
ской активности, то такие вещества относятся к
ингибиторам необратимого типа. Некоторые
из них вызывают денатурацию белка, т.е. инак-
тивируют практически любой фермент. Поэто-
му их называют неспецифическими ингибито-
рами. К таким относятся, в частности, катионы
тяжелых металлов (ртуть, свинец, медь и др.).
130
Глава 4
Есть, однако, и такие необратимые инги-
биторы, которые в большей или меньшей сте-
пени обладают избирательностью действия.
Она обусловлена способностью таких эффек-
торов реагировать не с любыми белками, а
только с вполне определенными группировка-
ми в активном центре или в других участках
молекулы конкретного фермента (или группы
близких по строению ферментов).
Взаимодействие фермента с необратимым
ингибитором представляет собой односторон-
нюю бимолекулярную реакцию:
E+I—>Е-1
Поскольку концентрация ингибитора
обычно значительно превышает концентрацию
фермента, рано или поздно весь фермент пре-
вратится в неактивное производное Е-I. В та-
кой ситуации разные ингибиторы, взятые в
одинаковых концентрациях, различаются лишь
временем, необходимым для достижения пол-
ного угнетения фермента: более сильные дела-
ют это быстрее. Измеряя ферментативную ак-
тивность через разные сроки от начала инкуба-
ции фермента с определеиной концентрацией
такого ингибитора, можно рассчитать констан-
ту скорости необратимого угнетения:
к, =-Е- In А,	[4-7]
[I]•t V,
где: [I] — концентрация ингибитора в инкуба-
ционной смеси; t - время от начала инкубации
(обычно - в минутах); го - скорость фермента-
тивной реакции в отсутствие ингибитора; ц -
скорость реакции после инкубации с ингибито-
ром в течение времени t; In - натуральный
логарифм.
Чем меньше ингибитора и/или времени
требуется для развития его действия, тем он
эффективнее и, значит, тем больше величина
константы необратимого угнетения (в отличие
от обратимых ингибиторов, она является кон-
стантой скорости, а не равновесия).
Избирательность некоторых необратимых
ингибиторов обусловлена их сходством с суб-
стратом соответствующего фермента. Однако в
отличие от субстрата, такие ингибиторы обра-
зуют прочную ковалентную связь с радикалом
той или иной аминокислоты в составе активно-
го центра и тем самым блокируют его работу.
При этом, как и в случае обратимого угнетения
конкурентного типа, высокие концентрации
субстрата затрудняют доступ ингибитора к ак-
тивному центру и, как следствие, ослабляют
его угнетающее действие («защищают» свой
фермент).
Своеобразным механизмом действия обла-
дают фосфорорганические ингибиторы (ФОИ).
Некоторые из них были специально синтезиро-
ваны в качестве боевых отравляющих веществ
нервно-паралитического действия (табун, за-
рин), инсектицидов (дихлофос, карбофос и др.),
а некоторые - и как хорошие смазки в различ-
ных мехаиизмах. Многие из них являются
сильными ингибиторами ацетилхолинэстеразы
(АХЭ), поскольку обладают сходством с ее
субстратом - ацетилхолином (формула его по-
казана на рис. 4-7). Только вместо ацетильного
остатка они содержат фосфорильную группу,
соединенную сложноэфирной связью с холи-
ном или каким-либо другим спиртом (Х-ОН):
R
/
Х-О-Р = О	[4-8]
\
R"
Радикалы R фосфорильной группы (она
выделена жирным шрифтом) могут быть пред-
ставлены алкилами, алкоксилами, алкиламина-
ми, которые легко сорбируются вблизи серина-
203 активного центра, где, как выяснилось,
имеются достаточно обширные гидрофобные
зоны. Это способствует «правильной» ориен-
тации сложноэфирной группы ингибитора на
каталитическом участке фермента. Как и в слу-
чае истинного субстрата (ацетилхолина), на-
чальная стадия акта катализа (см. рис. 4-7)
приводит к отщеплению спирта (Х-ОН) и ко-
валентному присоединению кислотного фраг-
мента к серину-203. И только теперь обнару-
живается «подмена» истинного субстрата: вме-
сто остатка уксусной кислоты ковалентно свя-
занным с серином-203 оказывается производ-
ное гораздо более сильной кислоты - фосфор-
ной. Этот фосфорильный фрагмент почти со-
всем не поддается удалению с активного цен-
тра и тем самым прекращает его работу. Ана-
логично действуют и такие ФОИ (обычно еще
ФЕРМЕНТЫ
131
более токсичные), которые вместо сложно-
эфирной связи с Х-ОН содержат кислотоан-
гидридную связь фосфорильного фрагмента с
HF или HCN.
Как известно, холинэргическая передача
нервного импульса осуществляется путем вы-
броса нервным окончанием порции ацетилхо-
лина. Этот медиатор обратимо воздействует на
холинорецепторы клетки-мишени, но одновре-
менно подвергается гидролизу под действием
АХЭ. Высокой активностью мембранной АХЭ
обеспечивается быстрое разложение ацетилхо-
лина (ведущее к удалению его с рецепторов) и,
следовательно, гарантируется кратковремен-
ность передачи импульса. Угнетение АХЭ под
действием яда приводит сначала к усилению
возбужденности клеток-мишеней, а затем - к
полной дезорганизации работы холинэргиче-
ских структур. К этому сводятся главные эф-
фекты ФОИ в организме. Однако многие из
таких ядов могут воздействовать и на другие
белки, в том числе — на сериновые протеиназы.
Во всех этих случаях молекула ФОИ рас-
щепляется ферментом точно так же, как и мо-
лекула настоящего субстрата, но один из обра-
зующихся продуктов остается ковалентно свя-
занным с ферментом и полностью блокирует
его работу. Такого рода ингибиторы называют
«ложными» субстратами (псевдосубстратами)
Ингибиторами псевдосубстратного дейст-
вия бывают не только искусственные соедине-
ния, как ФОИ. Не так давно выяснилось, что и в
живой природе вырабатываются вещества, на-
званные эндогенными ингибиторами за их спо-
собность угнетать тот или иной фермент собст-
венного организма (или попавший извне). По
своему строению они обычно являются белками
(или пептидами). Многие из них обладают вы-
раженным предпочтением к протеолитическим
ферментам, что обычно зафиксировано в назва-
ниях соответствующих белков плазмы крови:
сц-антитрипсин, агантихимотрипсин, антитром-
бин, а2-антиплазмин, а2-макроглобулин. Оказа-
лось, что по механизму угнетающего действия
они относятся к «плохим» субстратам. Осуще-
ствив расщепление одной из пептидных связей
в молекуле такого белка-ингибитора, протеина-
за не может затем избавиться от «обломков»
расщепленного псевдосубстрата и остается
блокированной. Эндогенные ингибиторы вно-
сят очень важный вклад в регуляцию различ-
ных процессов.
4.11.	АКТИВАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ
Термином «активация фермента» обозна-
чают повышение каталитической эффективно-
сти и без того активного энзима. Типичный
пример - активация амилазы слюны ионами
СТ. Часто активаторами выступают ионы ме-
таллов (Са2+, Mg2+, Мп2+, К* и другие). Очень
важно, что некоторые метаболиты обладают
способностью обратимо активировать тот или
иной фермент собственного организма, стано-
вясь участниками регуляции биохимических
процессов. Важнейшие из конкретных приме-
ров будут рассмотрены в последующих главах
при изложении основных путей метаболизма.
Действие активирующих веществ обычно
обратимо, и для их оценки используют в прин-
ципе те же приемы, которые описаны выше
применительно к обратимым ингибиторам.
Только вместо равновесных констант угнете-
ния (Ю обратимые активаторы характеризу-
ются аналогичными константами активации
(Ка). Следует, однако, отметить, что кинетика
Михаэлиса-Ментен не всегда применима к ак-
тиваторам ферментов, и тогда требуются иные,
более сложные подходы.
Не так давно установлено, что ковалент-
ные преобразования фермента тоже могут вы-
зывать его активацию. Например, внедрение
фосфатной группы, осуществляемое протеин-
киназой, или удаление таковой из ранее фос-
форилированного фермента под действием со-
ответствующей фосфатазы (см. раздел 2.2.3).
Природа широко использует такие реакции для
управления интенсивностью и направлением
метаболических процессов. В частности, рас-
пвд гликогена в клетках катализирует глико-
генфосфорилаза. Димерная форма этого фер-
мента (фосфорилаза Ь) малоактивна. Присо-
единение фосфатной группы к каждой из субъ-
единиц (катализируемое киназой фосфорила-
зы) вызывает их ассоциацию с образованием
тетрамера (фосфорилаза а), обладающего го-
раздо более высокой активностью (обратный
процесс - возврат к малоактивной форме фос-
форилазы Ъ - происходит под действием фос-
фатазы фосфорилазы, гидролитически отщеп-
132
Глава 4
ляющей фосфатные группы). Напротив, глико-
генсинтетаза, которая катализирует необра-
тимую стадию процесса биосинтеза гликогена,
становится малоактивной после присоединения
фосфатной группы (осуществляемого киназой
гликогенсинтетазы), но возвращается в более
активную форму при удалении этой группы
фосфатазой гликогенсинтетазы. Самое инте-
ресное заключается в том, что обе протеинки-
назы активируются аденилатциклазной систе-
мой, управляемой через Рг-адренорецепторы
(см. раздел 2.2.3). Значит, возбуждение этих
рецепторов (например, адреналином) не только
ведет к усилению распада гликогена в клетках,
но и попутно тормозит его биосинтез. Тем са-
мым обеспечивается настолько резкое смеще-
ние баланса этих процессов, что возникает эф-
фект «переключения» с одной направленности
метаболизма (биосинтетические процессы, —
анаболизм) на противоположную (процессы
распада веществ — катаболизм).
В последнее время термин «активация
фермента» стали применять и в совсем ином
смысле, обозначая им образование активной
формы энзима из неактивного предшественни-
ка. Обычно речь идет о превращении профер-
мента (зимогена) в «готовый» фермент, кото-
рое осуществляется путем ограниченного про-
теолиза (см. раздел 2.6.2). По существу, оно
является последней «ступенькой» процессинга
- заключительного этапа в биогенезе белковой
молекулы фермента. Об «активации» при этом
можно говорить, чтобы подчеркнуть факт по-
явления зрелого фермента не в месте его био-
синтеза в клетке, а в зоне применения (для пи-
щеварительных ферментов - просвет желудоч-
но-кишечного тракта) либо в период востребо-
вания (для ферментов свертывания крови -
момент его инициации).
4.12.	АВТОНОМНАЯ САМОРЕГУЛЯЦИЯ
ФЕРМЕНТОВ
К числу уникальных особенностей белков
относится их способность не только выполнять
какую-то конкретную функцию, но и регули-
ровать интенсивность ее исполнения в зависи-
мости от складывающихся условий. Иными
слоаами, белковым молекулам изначально
присуще свойство саморегуляции.
В общем смысле саморегуляция - это ре-
гуляция, осуществляемая за счет самих участ-
ников процесса. Применительно к ферментам
это означает регуляцию за счет только самого
фермента, его субстрата (субстратов) и его
продукта (продуктов). Она автономна, так как
реализуется даже в отсутствие внешних воз-
действий со стороны, например, гормонов и
других биологически активных веществ. Это
не означает полной независимости от механиз-
мов других уровней. Напротив, гормональные
факторы, сигнальные молекулы межклеточного
общения, а также регуляция на генетическом
уровне (изменения скорости биосинтеза фер-
ментного белка и/или протеиназ, его разру-
шающих), — все это может налагаться на само-
регуляцию ферментов, «настраивая» ее на бо-
лее точное соответствие текущим потребно-
стям клетки и организма в целом. И не только
может, но и действительно имеет место. Более
того, многие эффекты гормонов реализуются
именно через их избирательное воздействие на
регуляторные звенья ферментных систем.
С другой стороны, многим молекулярным ме-
ханизмам в регуляции биогенеза белка (генети-
ческий уровень), выработки гормонов и иных
медиаторов (нейро-гормональный уровень)
присущи черты автономной саморегуляции.
Конкретные проявления автономной само-
регуляции ферментных систем очень многооб-
разны. Но в основе их лежат два основопола-
гающих качества ферментов.
Это, во-первых, кинетические свойства
фермента, количественно характеризуемые ве-
личинами главных кинетических констант -
Км и Vrriax. Механизмы кинетического типа в той
или иной степени присущи каждому ферменту.
Во-вторых, это аллостерические свойства
фермента, точнее - его чувствительность к
аллостерическим эффектам своего собственно-
го субстрата и/или продукта. Механизмы алло-
стерического типа свойственны далеко не лю-
бому ферменту. Но если они есть, то создается
возможность «корректировки» механизмов ки-
нетического типа. Зачастую это придает регу-
ляторным возможностям фермента очень свое-
образные черты.
Разнообразие проявлений автономной са-
морегуляции ферментов целесообразно рас-
смотреть на примерах общего плана.
ФЕРМЕНТЫ
133
4.12.1.	ПРОСТЕЙШАЯ ФЕРМЕНТНАЯ СИСТЕМА
Минимальный состав ферментной сис-
темы — сам фермент (Е), его субстрат (обозна-
чим его символом А) и продукт преобразова-
ния этого субстрата (В):
A—>В
Обычно кинетика такой реакции описыва-
ется уравнением Михаэлиса-Ментен и соответ-
ствующей ему кинетической кривой. Характер
этой кривой (см. рис. 4-11) показывает, что
фермент как бы сопротивляется как повыше-
нию концентрации субстрата, так и его полно-
му истощению. Действительно, усиленное об-
разование субстрата (или приток в клетку) не-
избежно ведет к повышению скорости его ути-
лизации. т.е., вызывает противодействие его
накоплению. При остановке выработки (или
доставки) субстрата концентрация этого мета-
болита в клетке постепенно уменьшается, но
соответственно замедляется и скорость его
превращений; в конечном счете, субстрат ути-
лизируется все медленнее, но никогда не исче-
зает полностью. В итоге даже при больших ко-
лебаниях интенсивности появления метаболита
концентрация его в клетке автоматически под-
держивается на уровне, более или менее близ-
ком значению Км.
На этот механизм кинетического типа мо-
гут «наслаиваться» аллостерические эффекты.
Например, нередко субстрат является аллосте-
рическим ингибитором своего фермента. Тогда
наблюдается эффект торможения избытком
субстрата, и кинетическая кривая приобретает
куполообразный характер (рис. 4-15). Это
означает, что после достижения некоторого
Рис. 4-15. Эффект угнетения фермента
высокими концентрациями субстрата.
уровня концентрации субстрата дальнейшее ее
нарастание сопровождается все большим за-
медлением реакции. Концентрация субстрата,
при которой скорость реакции достигает мак-
симума (пик кривой на рис. 4-15), называется
оптимальной. Очевидно, такой способ саморе-
гуляции выработан для тех ситуаций, когда
чрезмерное накопление продукта реакции бо-
лее нежелательно, чем избыток субстрата.
Аналогичный куполообразный характер
кинетическая кривая приобретает и тогда, ко-
гда аллостерическим ингибитором фермента
является не субстрат, а продукт реакции. Такая
система тоже эффективно сопротивляется
чрезмерному накоплению продукта реакции.
Но здесь эффект «защиты от избытка продук-
та» достигается более прямым путем, т.е., ал-
лостерическим влиянием самого продукта.
Этот вариант обладает тем преимуществом,
что угнетения фермента не наступает даже при
высоких концентрациях субстрата, если обра-
зующийся продукт достаточно быстро утили-
зируется последующими реакциями. Иными
словами, такая система реагирует не просто на
скорость образования продукта, а на баланс
реакций его возникновения и дальнейшего
преобразования.
Иные соотношения наблюдаются, если
субстрат является аллостерическим активато-
ром своего фермента. Тогда кинетическая кри-
вая приобретает S-образный вид, т.е., имеет
2 перегиба (рис. 4-16). Это означает, что с при-
бавлением субстрата скорость реакции возрас-
тает поначалу плавно, в соответствии с кине-
тикой Михаэлиса-Ментен. Однако на каком-то
этапе начинает проявляться активирующий эф-
фект, в результате чего все более значитель-
ным становится прирост скорости реакции в
ответ на увеличение концентрации субстрата.
Это выражается первым перегибом на кинети-
ческой кривой и последующим более крутым
наклоном ее. После достижения наибольшей
крутизны (максимального эффекта активации)
плавно наступает второй перегиб кинетической
кривой, означающий переход ее в форму, ха-
рактерную для заключительного отрезка обыч-
ной кривой Михаэлиса-Ментен. Таким обра-
зом, в целом система весьма успешно сопро-
тивляется как накоплению субстрата, так и его
чрезмерному истощению. В диапазоне между
134
Глава 4
Рис. 4-16. Аллостерическая активация фермента
субстратом.
перегибами фермент гораздо энергичнее обыч-
ного реагирует на малейшие изменения кон-
центрации субстрата. Это позволяет стабили-
зировать ее гораздо эффективнее и в более уз-
ком интервале (между двумя перегибами), чем
в отсутствие аллостерической активации суб-
стратом (ср. рис. 4-11).
Наконец, аллостерическим активатором
своего фермента может оказаться не субстрат,
а продукт реакции. В таком случае с увеличе-
нием концентрации субстрата скорость реак-
ции возрастает сначала постепенно, а по мере
достаточного накопления продукта начинает
сказываться его активирующее воздействие на
фермент. Этот эффект не безграничен, а пото-
му кинетическая кривая в целом имеет такой
же характер, как и при активации фермента
субстратом (см. рис. 4-16).
4.12.2.	СИСТЕМА ДВУХ ФЕРМЕНТОВ
ДЛЯ ОДНОГО СУБСТРАТА
Если один и тот же субстрат А может пре-
вращаться в два разных продукта (В и С), то,
естественно, катализировать эти реакции долж-
ны разные ферменты (Е( и Е2):
[4-9]
В общем случае кинетические константы
ферментов Ei и Е2 будут разными. Следова-
тельно, не совпадут и соответствующие им ки-
нетические кривые. Они могут оказаться, на-
пример, такими, какие показаны на рис. 4-17.
Тогда в диапазоне малых концентраций суб-
страта А будет преобладать первая реакция,
т.е., образование продукта В. По мере увеличе-
ния [А] доля превращения его в вещество С
будет нарастать. Когда концентрация субстрата
достигнет значения N (соответствующего точке
пересечения кривых), скорости обеих реакций
сравняются: половина реагирующих молекул
будет превращаться в продукт В, другая —
в продукт С. Если концентрация субстрата ста-
нет и далее нарастать, то его превращение в С
будет становиться все более преобладающим.
Такая система особенно важна в тех слу-
чаях, когда нежелательно накопление не толь-
ко продукта В, но и субстрата А. Решение про-
блемы природа нашла в том, чтобы направлять
избыток субстрата на образование вещества,
безопасного даже в больших количествах (про-
дукт С на рис. 4-17). Поэтому путь превраще-
ния А в С стали называть резервным путем ме-
таболизма, а не просто одним из альтернатив-
ных направлений. Хотя нередко такая «резерв-
ная» возможность выступает в более весомой
роли, а именно — как способ накопления запас-
ных питательных веществ (гликоген, жиры и
другие).
Рис. 4-17. Графики зависимости скорости превращения
субстрата А в продукт В (ферментом Е,) или в продукт С
(ферментом Е2) [в приведенном примере кинетические
константы для Е! и Е2 составляют соответственно:
Км - 4 и 50 мМ, Vmax - 30 и 80 мкмоль/мин].
ФЕРМЕНТЫ
135
Описанный механизм кинетического типа
нередко дополняется аллостерическими влия-
ниями. Они могут сделать более надежной за-
щиту от чрезмерного повышения концентра-
ций и субстрата, и продукта В. Такой эффект
достигается, если, например, продукт В являет-
ся аллостерическим активатором фермента Ег
либо ингибитором «своего» фермента Ер Оба
варианта ведут к повышению эффективности
переключения метаболизма на альтернативный
путь (образование продукта С). Более того,
может оказаться сдвинутым положение точки
«переключения», — например, в сторону более
низких концентраций субстрата, чем значение
N на рис. 4-17. Тогда переход на резервный
путь станет наступать раньше, а концентрация
продукта В будет лимитироваться строже.
4.12.3.	ИЗОФЕРМЕНТЫ
Нередко бывает и так, что одну и ту же
реакцию катализируют два разных фермента:
Такие ферменты стали называть изофер-
ментами. Следует подчеркнуть, что это — не
изомеры в обычном для химии понимании, а
разные молекулярные формы одного и того же
фермента. Обычно они несколько различаются
по аминокислотному составу. Этих небольших
отклонений достаточно для появления разли-
чий и в ИЭТ, и в оптимуме pH, и в спектре суб-
стратной избирательности. Как правило, раз-
ными оказываются и кинетические константы в
отношении одного и того же субстрата. Поэто-
му кинетические кривые для него могут разли-
чаться так же значительно, как и в примере,
приведенном на рис. 4-17.
Суть изложенного не меняется от того, что
нередко изоферменты различаются не амино-
кислотным составом, а соотношением субъе-
диниц разного типа. Так, креатинкиназа ске-
летных мышц состоит из двух субъединиц типа
М (от англ, muscle - мышца). Ее изофермент,
содержащийся в мозгу, построен тоже из двух
субъединиц, но несколько других - типа В (от
англ, brain - мозг); он обладает гораздо боль-
шей подвижностью при электрофорезе (этот
изофермент обнаружен также в яичниках, мо-
лочной и предстательной железах). Наконец,
третий изофермент - креатинкиназа МВ - со-
держит субъединицы разного типа (и потому
обладает промежуточной электрофоретической
подвижностью). Этот изофермент типичен для
клеток миокарда. Он практически отсутствует в
плазме (и сыворотке) крови здоровых людей, но
обнаруживается в первые часы после острого
инфаркта миокарда (что используется в диагно-
стических целях).
Для лактатдегидрогеназы (ЛДГ) обнару-
жено 5 изоформ. Их принято обозначать циф-
рами - от ЛДГ-1 до ЛДГ-5 (по результатам
электрофореза). Все они построены из 4 субъе-
диниц двух типов — Н и М. В миокарде и эрит-
роцитах преобладает ЛДГ-1, .состоящая из
субъединиц типа Н (Н4), а в скелетной мышце -
ЛДГ-5, построенная только из субъединиц типа
М (М4). Остальные изоферменты (Н3М1, Н2М2
и Н[Мз), обладающие промежуточной элек-
трофоретической подвижностью, встречаются
в самых разных тканях, причем, в разнообраз-
ных соотношениях. Например, печеночные
клетки, наряду с ЛДГ-5, содержат значитель-
ное количество ЛДГ-4.
Если изоферменты распределены по клет-
кам разного типа, то они обеспечивают специ-
фику метаболизма своих клеток (или особен-
ности метаболических процессов в тех субкле-
точных структурах, где они локализованы).
Если же разные изоферменты находятся в
одной и той же клетке, то их кинетические
кривые становятся неразличимыми, ибо и суб-
страт для них один и тот же, и продукт тоже.
Общий итог зависимости скорости реакции от
концентрации субстрата таков, как будто инди-
видуальные кинетические кривые, суммируясь,
слились в единую, более сложную. Она харак-
теризуется двумя крутыми подъемами (в диа-
пазоне Км каждого из изоферментов) с более
пологим участком между ними (особенно яв-
ным он становится при очень большом разли-
чии между величинами Км)- Такой тандем изо-
ферментов природа «изобрела» для ситуаций,
когда клетке приходится работать в условиях
колоссально широкого диапазона колебаний
136
Глава 4
притока субстрата. Описанная система успеш-
но перерабатывает субстрат и при довольно
малых, и при чрезвычайно высоких концентра-
циях субстрата.
Наиболее яркий пример сочетания двух
изоферментов представляют печеночные клет-
ки. В них, как и во всех других клетках, есть
фермент гексокиназа. Она катализирует пер-
вую реакцию утилизации глюкозы, превращая
ее (за счет АТФ) в глюкозо-6-фосфат. Сродство
гексокиназы к глюкозе очень велико: значение
Км составляет около 0,01 мМ. Это примерно в
500 раз меньше реальной концентрации глюко-
зы в клетках. Отсюда следует, что гексокиназа
любых клеток (пока они живы) всегда рабо-
тает со свойственной ей Vmax, т.е., на пределе
своих возможностей.
Однако, в печеночных клетках (и только в
них!) есть еще один фермент, катализирующий
ту же реакцию, - глюкокиназа. Фактически он
является изоферментом гексокиназы (во време-
на их открытия еще не было понятия об изо-
ферментах, поэтому и названия этих киназ ока-
зались разными). Глюкокиназа отличается по
ряду свойств, в том числе - по спектру суб-
стратной специфичности в отношении разных
моносахаридов. Однако самое важное отличие
заключается в несравненно меньшем сродстве к
субстрату: значение Км для глюкозы на три по-
рядка выше и достигает 20 мМ! Это более чем в
4 раза превышает обычную концентрацию глю-
козы в клетках. Поэтому в обычных условиях
глюкокиназа работает не более чем на 1/8 (12%)
от своих максимальных возможностей (а собст-
венные потребности гепатоцитов удовлетворя-
ются в основном гексокиназой).
На первый план роль глюкокиназы высту-
пает в период пищеварения, когда с током кро-
ви в печень поступают очень большие количе-
ства глюкозы (а гексокиназа не может усилить
свою работу, всегда исполняемую на уровне
Vmax). Если концентрация глюкозы в крови во-
ротной вены (и, следовательно, в гепатоцитах)
возрастет в 4 раза, достигнув значения Км для
глюкокиназы (20 мМ), — даже в этих условиях
глюкокиназа будет работать лишь вполовину
от свойственной ей Vmax- И у нее останется
значительный резерв мощности на случай еще
большего поступления глюкозы в печень. Пе-
рерабатываемый при этом избыток глюкозы
гепатоциты превращают в основном в глико-
ген, который откладывается в них про запас
(резервный путь метаболизма!). По мере за-
вершения пищеварения (снижения содержания
глюкозы в крови воротной вены) работа глю-
кокиназы соответственно замедляется, — и так
до нового приема пищи.
Таким образом, благодаря наличию такого
изофермента, как глюкокиназа, печень не толь-
ко оказывается в готовности к резким перепадам
концентрации глюкозы в крови воротной вены,
но и задерживает (в виде гликогена) основную
массу всасываемой в кишечнике глюкозы, пре-
дотвращая ее прорыв в общий кровоток.
Пример глюкокиназы примечателен де-
монстрацией того, что в живых системах есть и
такие резервы мощности, которые не требуют
усиления функции уже работающего механиз-
ма, а сводятся к вовлечению в общий труд но-
вых исполнителей, находящихся обычно как
бы в «дремлющем» состоянии. И - самое глав-
ное — это включение резервного механизма
происходит не по какой-то специальной ко-
манде, а совершенно автоматически, в силу
природных свойств и «обычных», и «добавоч-
ных» исполнителей.
4.12.4.	НЕРАЗВЕТВЛЕННАЯ
МУЛЬТИФЕРМЕНТНАЯ СИСТЕМА
Почти любой метаболический процесс
протекает через множество промежуточных
стадий. Каждая из них катализируется своим
ферментом. Совокупность таких ферментов,
действующих последовательно один за другим,
называется мультиферментной системой.
На рис. 4-18 представлен простейший из
таких вариантов — неразветвленная (линейная)
мультиферментная система.
А Е' >В Е» >С Ё> >D—Е|->F—М Ед—>N
Рис. 4-18. Схема неразветвленной мультиферментной системы.
ФЕРМЕНТЫ
137
Две очень важные особенности присущи
любой такой системе.
1. Концентрация каждого промежуточного
метаболита (от В до М включительно) будет
поддерживаться довольно постоянной даже в
условиях очень больших колебаний скорости
всего процесса в целом. Действительно, уско-
рение реакции на первой стадии (например, из-
за повышения концентрации метаболита А)
должно привести к увеличению концентрации
метаболита В, которое автоматически «заста-
вит» работать быстрее и фермент Е2; накопле-
ние вещества В будет, таким образом, преодо-
леваться. И так - по всей цепочке. Отсюда яс-
но, что концентрация любого промежуточного
метаболита не зависит от скорости всего про-
цесса. Она предопределена только соотноше-
нием кинетических констант двух ферментов —
того, который ведет к образованию данного
метаболита, и того, который обеспечивает его
дальнейшее превращение. Например, кон-
центрация метаболита В обусловлена соотно-
шением кинетических констант ферментов,
обозначенных на схеме как Е] и Е2. Оба они,
как вся цепочка в целом, могут работать быст-
рее или медленнее, но концентрация метаболи-
та В останется практически неизменной. Эта
особенность, обусловленная только природны-
ми качествами ферментов, лежит в основе фе-
номена гомеостаза — постоянства состава внут-
ренней среды организма.
2. Значения кинетических констант у всех
ферментов метаболической цепи в общем слу-
чае различны. Очевидно, у какого-то из них
величина окажется наименьшей среди
партнеров. Следовательно, именно этот фер-
мент (точнее, его V^) определяет максималь-
но возможную скорость всего процесса в це-
лом. Поэтому его называют лимитирующим
ферментом данной мультиферментной систе-
мы. Такой фермент катализирует всегда необ-
ратимую реакцию (для простоты в схеме на
рис. 4-18 не обозначено, что большинство ста-
дий метаболической цепи являются обратимы-
ми). Как правило, лимитирующим является тот
фермент, который находится в начале цепи.
Обычно это либо Еь либо Е2 (в приведенной
схеме). И еще одна закономерность: именно на
лимитирующее звено нацелены регуляторные
влияния (чаще всего - аллостерические). Они
могут быть «внешними» (для данной системы),
— например, гормоны, лекарства и т.д. Но бы-
вают они и «внутренними», т.е., метаболитами
самой системы, начиная от исходного субстра-
та А и кончая конечным продуктом N. Понят-
но, что только второй вариант относится к сфе-
ре автономной саморегуляции мультифермент-
ной системы. Хотя аллостерическое воздейст-
вие оказывается только на один фермент, из-за
лимитирующей его роли регулируется факти-
чески работа всей мультиферментной системы
в целом. Объединяя и лимитирующую роль, и
регуляторную функцию такого фермента, его
называют ключевым ферментом данной мета-
болической цепи. Именно через такие решаю-
щие звенья осуществляется метаболический
контроль (получается — самоконтроль!) за ин-
тенсивностью биохимических процессов.
Нередко аллостерическим эффектором вы-
ступает не субстрат или непосредственный
продукт ключевого фермента, а более отдален-
ный метаболит, зачастую — конечный продукт
цепи (метаболит N в приведенной схеме). Если
он является ингибитором ключевого фермента,
то имеет место саморегуляция по механизму
отрицательной обратной связи: на каком-то
уровне накопления конечного продукта начи-
нается торможение всех реакций метаболиче-
ской цепи, начиная с лимитирующего звена.
В этом случае функционирование всей систе-
мы характеризуется такого же вида графиком,
как и кривая для простейшей системы на рис.
4-15. Если же конечный продукт оказывается
аллостерическим активатором ключевого фер-
мента. то говорят о саморегуляции по принци-
пу положительной обратной связи. Такой сис-
теме свойственна готовность к самовозбужде-
нию: при накоплении некоторой критичной
массы продукта начинается лавинообразное
ускорение работы всей мультиферментной це-
пи в целом.
4.12.5. РАЗВЕТВЛЕННАЯ МУЛЬТИФЕРМ БИТНАЯ
СИСТЕМА
Линейная метаболическая цепь чаще бы-
вает всего лишь фрагментом более сложных
биохимических «блоков», среди которых пре-
валируют разветвленные мультиферментные
системы. Особенности саморегуляции таких
138
Глава 4
А
-Ь—>D—F -4... -> М > N
>S- Е' >Т->...->Х—> >Y
Рис. 4-19. Схема разветаленной мультиферментной системы.
систем видны уже на примере простейшей из
них, имеющей только одну точку ветвления
(хотя их может быть несколько).
В такой системе (рис. 4-19) ключевой
фермент (Ei) находится, как обычно, в самом
начале, т.е., до точки ветвления. В этом поло-
жении он контролирует совокупную скорость
превращений исходного метаболита А всеми
существующими путями.
Главной особенностью разветвленных це-
пей является наличие «дополнительных» клю-
чевых ферментов. Как правило, они располо-
жены сразу или вскоре после точки ветвления
(в приведенной схеме это могут быть, напри-
мер, Ез и Eq). Такие ключевые звенья называют
пунктами вторичного контроля. Каждый из
них лимитирует скорость только своей ветви
метаболизма (и обеспечивает ее регуляцию).
Нельзя сказать, чтобы пункты вторичного
контроля были совсем независимыми друг от
друга и не влияли бы на состояние начального
фрагмента, общего для всех путей. Напротив.
Например, торможение Е3 приведет к накопле-
нию его предшественников. Наступающее при
этом повышение концентрации метаболита В
чревато ускорением его превращений по аль-
тернативному пути, контролируемому фер-
ментом Еч. Если же вещество В окажется еще и
аллостерическим ингибитором фермента Е[, то
накопление В, вызванное угнетением фермента
Ез, приведет к замедлению суммарной скоро-
сти превращений субстрата А всеми путями
(при этом утилизируемое все же количество
вещества А станет направляться преимущест-
венно по пути образования конечного продукта
Y. Конкретные примеры изложенных взаимо-
отношений будут представлены, в частности,
при рассмотрении главных путей метаболизма
глюкозы (раздел 6.8).
В заключение необходимо подчеркнуть,
что все изложенные механизмы автономной
саморегуляции строго детерминированы. Не-
возможно «отменять» их или произвольно «за-
ставлять» работать иначе; недопустимо припи-
сывать им несвойственные параметры функ-
ций. Ибо обусловлены они самой природой
конкретных белковых молекул, трансформация
свойств которых возможна только путем соот-
ветствующих изменений на генетическом
уровне. Описанные «модели поведения» явля-
ются теми элементами, из которых слагается
сложная и чувствительная к внешним воздей-
ствиям система регуляции всего метаболизма и
любых физиологических функций клеток, тка-
ней, организма в целом.
Глава 5
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
В научном понимании биоэнергетика
означает совокупность знаний о превращениях
энергии в живом организме. В той или иной
степени энергетические преобразования сопро-
вождают практически любую функцию живой
системы - от ферментативного катализа или
восприятия фотонов до таких сложных, как
процессы возникновения, распространения и
передачи нервных импульсов или сокращение
и расслабление мышц.
Однако обычно термин «биоэнергетика»
употребляют в гораздо более узком смысле,
обозначая им лишь те наиболее универсаль-
ные процессы, которые поставляют энергию,
необходимую для жизнедеятельности. У жи-
вотных ее источником служат органические
вещества (углеводы, липиды, в гораздо мень-
шей степени - белки). Все они поэтапно пре-
образуются ферментами в небольшой набор
более простых молекул, подвергаемых затем
биологическому окислению. Почти вся энер-
гия, освобождаемая при расщеплении пита-
тельных веществ, выделяется именно на окис-
лительных стадиях. А весь комплекс реакций
распада сложных молекул до конечных про-
дуктов (в основном до СО2 и Н2О) получил на-
звание «.энергетический метаболизм» (углево-
дов, жиров, аминокислот).
Термином «биологическое окисление» объ-
единяют все те окислительные процессы, ко-
торые протекают в живом организме с уча-
стием кислорода. Они осуществляются внутри
клеток, во всех тканях. Отсюда - давний сино-
ним: «тканевое дыхание» (в отличие от «легоч-
ного»).
Как известно, окисление одних веществ
невозможно без сопутствующего восстановле-
ния других. Эта абсолютная сопряженность на-
шла отражение в более точном термине — окис-
лительно-восстановительные процессы. В жи-
вом организме они изобильны и очень разнооб-
разны. Однако в понятие «биоокисление» целе-
сообразно включать только ту часть этих про-
цессов, которая требует вовлечения кислорода.
5.1.	ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ
УЧЕНИЯ О БИООКИСЛЕНИИ
Сущность биологического окисления ста-
ла проясняться к концу XVIII в., благодаря ра-
ботам великого французского ученого Антуана
Лавуазье. Он установил, что дыхание живот-
ных сопровождается потреблением кислорода
воздуха, которому сопутствует образование
СО2 и воды. Так возникло представление о то-
ждественности процессов дыхания горению
веществ вне организма. Позднее это подтвер-
дили и опыты со срезами живых тканей. Одна-
ко очевидными были и «странности»: тканевое
дыхание протекало в водной среде и не вело к
воспламенению. Его назвали поэтому «мед-
ленным горением».
Более века прошло до первых попыток
раскрыть механизм необычного «горения».
140
Глава5
Выдающуюся роль в этом сыграл Алексей Ни-
колаевич Бах (1857-1946).
В молодости А.Н.Бах увлекся идеями борьбы с
самодержавием. За участие в революционном
движении был отчислен нз Киевского универ-
ситета, отбыл ссылку, затем стал народоволь-
цем (подпольная кличка — «Кащей бессмерт-
ный»). Автор знаменитой брошюры «Царь-
голод» (1883). Вынужденный эмигрировать,
занимался в химической лаборатории в Пари-
же, затем трудился в США. В почти 40-летнем
возрасте поселился в Женеве, где занялся
экспериментами в созданной им домашней ла-
боратории. На их основе разработал ориги-
нальную концепцию, получившую название
перекисной теории А.Н.Баха. В канун 60-летия
ему был вручен диплом почетного доктора Ло-
заннского университета. Вскоре он вернулся в
Россию, где продолжил активную деятель-
ность, стал академиком, основал ряд научных
учреждений. Имя А.Н. Баха носят два круп-
нейших института биохимии (в Москве и Кие-
ве), а также организованный им журнал «Био-
химия», один из ведущих в России.
Учитывая изрядную инертность моле-
кулярного кислорода, А.Н.Бах исходил из те-
зиса о необходимости его предварительной
активации. Он предположил, что в живых объ-
ектах есть особые легкоокисляемые вещества —
оксигеназы. В их структуре содержится нена-
сыщенная связь, по месту которой сравнитель-
но легко присоединяется молекула Ог:
Образовавшаяся перекись высокореактив-
на и способна окислять другие, более стойкие
вещества. Иными словами, образование пере-
киси рассматривается как явление активации
кислорода. С участием особых ферментов -
пероксидаз — он передается затем окисляемым
субстратам, которые сами по себе неспособны
окисляться молекулярным кислородом в усло-
виях живой клетки.
Концепция А.Н.Баха получала подтвер-
ждения и в работах других исследователей.
Особенно значительными были результаты,
которых достиг выдающийся немецкий ученый
Отто Варбург (1883-1970). В 1926 г. он открыл
особый фермент, участвующий непосредст-
венно в активации кислорода. За открытие это-
го «железосодержащего дыхательного фермен-
та» О.Варбург был удостоен Нобелевской пре-
мии 1931 г. Одновременно английский иссле-
дователь Дэвид Кейлин (1887-1963) показал,
что такого рода ферментов много разных и что
они по строению простетической группы сход-
ны с гемоглобином (и потому тоже имеют ок-
раску). Он предложил называть их цитохрома-
ми; этот термин общепринят до настоящего
времени.
Почти сразу же после публикаций А.Н.Баха
возникли и альтернативные взгляды. Первым их
сформулировал и обосновал Владимир Ивано-
вич Палладии (1859-1922).
Выпускник Московского университета
В.И. Палладии работал под руководством
К.А. Тимирязева, изучая разные аспекты роли
кислорода в растениях. После защиты доктор-
ской диссертации возглавлял кафедры физио-
логии растений в Харьковском, затем в Вар-
шавском ис 1901 г. - в Петербургском универ-
ситете, где и разработал концепцию, обозна-
ченную как «теория активации водорода». Ака-
демик с 1914 г.
В.И. Палладии экспериментально проде-
монстрировал, что процессы биологического
окисления могут заключаться не в присоеди-
нении кислорода, а в отнятии водорода от
окисляемого вещества. Соответствующие фер-
менты он назвал редуктазами. Водород, отни-
маемый от субстрата, они способны передавать
не только на кислород, но и на другие вещест-
ва. Их он назвал «дыхательными хромогена-
ми». Эти пигменты после восстановления (при-
соединения водорода) становятся бесцветны-
ми, что позволяет визуально оценивать их уча-
стие в процессах биоокисления. В отсутствие
кислорода восстановленные пигменты так и
остаются неокрашенными. Если же открыть
доступ кислороду, то дыхательные хромогены
вновь перейдут в окрашенную форму. Отсюда
следовало, что при тканевом дыхании кисло-
род не присоединяется к окисляемым органи-
ческим веществам, а служит лишь конечным
акцептором для отнимаемого от них водорода.
Если в систему ввести другой акцептор, то
окисление субстратов может протекать в от-
сутствие кислорода (в анаэробных условиях).
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
141
Среди наиболее известных сторонников
теории активации водорода был крупный не-
мецкий ученый Генрих Виланд (1877-1957).
Еще в начале XX века он выполнил выдающие--
ся работы по исследованию желчных кислот, за
что в 1927 г. был удостоен Нобелевской премии.
Однако к этому времени он уже перешел на
изучение механизмов тканевого дыхания и по-
лучил новые свидетельства того, что процессы
биоокисления начинаются с отнятия водорода
от окисляемого вещества. Ученый дал более
точное название соответствующим ферментам -
дегидрогеназы. Он экспериментально доказал,
что обогащение субстрата кислородом может
происходить не путем внедрения этого окисли-
теля, а путем присоединения молекулы воды с
последующим отнятием двух атомов водорода.
Так спирт и альдегид могут превращаться в кар-
боновую кислоту (рис. 5-1).
Дискуссии между сторонниками двух на-
правлений в изучении тканевого дыхания были
очень острыми. Кульминации они достигли в
начале ЗО-х годов. Отто Варбург, внесший
крупный вклад в обоснование теории актива-
ции кислорода и именно за эти работы удосто-
енный Нобелевской премии (1931 г.), уже в
1932 г. обнаружил (вместе с В. Христианом)
новый фермент, названный «желтым дыха-
тельным ферментом Варбурга» {«флавиновый
фермент», по современной терминологии). Но
самое главное - оказалось, что этот белок яв-
ляется переносчиком атомов водорода! Откры-
тие было «ужасным»: оно опровергало преж-
ние взгляды ученого и доказывало правоту его
оппонентов. Одно время авторы даже считали
его артефактом. Однако вскоре О. Варбург вы-
явил еще одну группу ферментов - никотина-
мидные дегидрогеназы. Более того, именно
они первыми отнимают водород от ряда суб-
стратов и передают его затем на флавиновые
ферменты.
он	о<—п	он	о
Н-С-Н	Н-MbH Н-С-ОН -2Н с—он
сн2	—А	сн2 —»	сн2	—4	СН2
R	R	R	R
Спирт	Алъаегид	Гидратированный	Карбоновая
альдегид	кислота
Рис. 5-1. Окисление спирта до кислоты путем
последовательных реакций дегидрогенирования
с промежуточным присоединением молекулы воды.
Постепенно стало окончательно ясным,
что реакции биологического окисления проте-
кают, как правило, путем отнятия водорода от
субстрата и постепенного переноса его через
серию посредников в конечном счете на
кислород с образованием воды. Соответствую-
щие ферменты сосредоточены во внутренней
мембране митохондрий. Поэтому процесс в
целом стали обозначать терминами «дыха-
тельная цепь» и «митохондриальное окисле-
ние» (МтО). Освобождаемая при этом энергия
используется для преобразования АДФ в АТФ.
Заключительную стадию - перенос водорода
непосредственно на молекулу кислорода - не-
которое время еще называли «активацией ки-
слорода», но это было скорее лишь данью ува-
жения к приверженцам перекисной теории.
Эта «дань» оказалась нелишней. Со вре-
менем было установлено, что в митохондриях
утилизируется примерно 90-95% кислорода,
потребляемого организмом. Остальная часть
используется в процессах внемитохондриалъ-
ного окисления. Их называют обычно «микро-
сомальным окислением», поскольку многие из
них сосредоточены в ЭР (обрывки которого и
составляют фракцию микросом, см. раздел
3.2.1). Соответствующие реакции не высвобо-
ждают нужную организму энергию в виде АТФ
или других макроэргов. Они используются в
иных целях. В основном - для крайне необхо-
димых преобразований очень устойчивых ве-
ществ, именуемых трудноокисляемыми. К их
числу относятся превращение пролина в окси-
пролин (необходимый этап биосинтеза колла-
гена), образование или инактивация некоторых
гормонов, разрушение чужеродных веществ (в
том числе — многих лекарственных препара-
тов). Очень часто микросомальное окисление
сводится именно к внедрению кислорода в мо-
лекулу окисляемого вещества. Это - прямое
подтверждение обоснованности воззрений
А.Н. Баха и его последователей. Более того, во
многих таких реакциях образуется или исполь-
зуется перекись водорода, для регистрации ко-
торой ученый разработал специальный метод.
Значит, представления, зародившиеся под на-
званием «перекисной теории», и в современной
науке сохраняют свою особую нишу, претер-
пев, естественно, соответствующее развитие. В
настоящее время очень много исследований
142
Глава 5
посвящено так называемому перекисному
окислению липидов.
Таким образом, в животном мире можно
выделить два типа процессов биологического
окисления. Один из них — митохондриальное
окисление - сильно преобладает и может быть
назван энергетическим типом окисления, т.к.
поставляет почти всю энергию, необходимую
для процессов жизнедеятельности (энергию в
форме АТФ и его аналогов). Другой тип - вне-
митохондриальное («микросомальное») окисле-
ние - не может служить источником энергии и
используется во множестве разнообразнейших
реакций, которые в совокупности потребляют,
однако, лишь 5-10% кислорода, утилизируемого
клетками. Эти реакции имеют либо биосинтети-
ческую направленность (включая образование
биологически активных веществ), либо разру-
шающую, катаболическую (деградация, в част-
ности, чужеродных соединений).
5.2.	МИТОХОНДРИАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ
Все ферменты дыхательной цепи мито-
хондрий являются сложными белками. Их не-
белковые фрагменты способны принимать элек-
троны, а затем отдавать следующему партнеру.
Благодаря этому возможно возникновение пото-
ка электронов от окисляемого субстрата к моле-
куле кислорода Он направлен в сторону воз-
растания редокс-потенциала участников процес-
са (стандартный окислительно-восстановитель-
ный потенциал пары окислитель/восстанови-
тель). Именно в такой последовательности целе-
сообразно рассмотреть главные звенья системы
митохондриального окисления (МтО): никоти-
намидные дегидрогеназы, флавиновые фермен-
ты, убихинон, цитохромы. Многие из этих ком-
понентов образуют прочные комплексы с осо-
быми белками — «железо-серными».
5.2.1.	ФЕРМЕНТЫ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО
ОКИСЛЕНИЯ
Никотинамидные дегидрогеназы (НД).
Составляют большую группу ферментов, полу-
чивших название по своей главной функции -
отнимать водород от окисляемого метаболита.
Обладают высокой субстратной избирательно-
н
I
НС С—с; +(2Н,2ё)--------->
I II knh2
НЧ+/СН
N
I
R
НАД
(или НАДФ)
Н Н
X
НС	с—с'
II II , xnh2
нс он
R
НАД-Нг
(или НАДФ-Н?)
Рис. 5-2. Никотинамидные фрагменты окисленной
и восстановленной форм никотинамидных коферментов.
стью, диктуемой спецификой строения адсорб-
ционного центра. Но в качестве кофермента
всегда используют либо НАД, либо НАДФ,
хотя некоторые НД способны функциониро-
вать с любым из них.
Описание обоих коферментов дано в раз-
деле 2.2.1. Там же показано строение этих мо-
лекул (см. рис. 2-6). Ведущую роль в них игра-
ет никотинамидная группа (витамин РР).
Именно к ней присоединяются отнимаемые от
субстрата два атома водорода, т.е., два элек-
трона и два протона. Точнее, оба электрона
переходят к азоту гетероцикла, восстанавливая
его из пятивалентного до трехвалентного со-
стояния (рис. 5-2), тогда как лишь один из про-
тонов фиксируется коферментом (присоединя-
ясь в пара-положении относительно этого азо-
та, с перераспределением двойных связей в
кольце), а другой остается в растворе (среда
при этом подкисляется). Тем не менее, для
краткости удобнее обозначать восстановлен-
ные формы НАД и НАДФ в виде НАД-Я2 и
НАДФ-йз соответственно.
Если обозначить окисляемый субстрат как
А-/72, то реакцию, катализируемую никотин-
амидными дегидрогеназами, можно предста-
вить в виде общей схемы:
НД
Л-Н2 + НАД(Ф) ----=--> А + НАД(Ф)-Я2
В этой схеме использован частый прием:
сокращения НАД(Ф) и НАД(Ф)-/72 применяют
тогда, когда имеют в виду любой из этих ко-
ферментов (без конкретизации их).
Почти все клетки содержат больше НАД,
чем НАДФ. Внутриклеточное распределение их
(и соответствующих дегидрогеназ) очень нерав-
номерно. НАД сосредоточен главным образом в
матриксе митохондрий, в НАДФ - в цитоплазме.
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
143
ФМН (или ФАД)
ФМН Н2(или ФАД-Н2)
Рис. 5-3. Окисленная и восстановленная формы редокс-центра флавиновых дегидрогеназ.
Флавиновые ферменты {флавопротеины -
ФП). Сложные белки, простатическая группа
которых прочно связана с апоферментом и со-
держит производное рибофлавина (вит. В2).
У одних ферментов ею является флавинмоио-
нуклеотид (ФМН), изображенный иа рис. 1-27,
у других — флавинадениндинуклеотид (ФАД),
который показан на рис. 2-7.
По своей функции ФП относятся к дегид-
рогеназам {флавиновые дегидрогеназы). Они
отнимают два атома водорода от субстрата и
присоединяют их к своему редокс-центру
(представленному атомами азота изоаллокса-
зинового гетероцикла); это сопровождается
перегруппировкой в нем системы двойных свя-
зей, как показано на рис. 5-3.
К числу важнейших ФП относится
НАД-Н2-дегидрогеназа, содержащая ФМН в ка-
честве простетической группы. Субстратом
этого фермента является восстановленная фор-
ма НАД, образующаяся в матриксе митохонд-
рий при окислении ряда метаболитов:
НАД-Я2 + ФМН -------> ФМН-Я2 + НАД.
Молекулы ФП имеют крупные размеры и
обычно встроены во внутреннюю мембрану
митохондрий. Нередко они содержат не ФМН,
а ФАД и используют в качестве субстрата не
НАД-Я2> совсем другие молекулы. В мембра-
ны ЭР (и его производных) также включены
специфические ФП, в том числе ФАД-содер-
жащие флавиновые ферменты, которые суб-
стратом «признают» не НАД-Т/г» а НАД(Ф)-//2
и принимают участие во многих реакциях мик-
росомального окисления.
Убихинон. Так называют повсеместно рас-
пространенный бензохинон с четырьмя боко-
выми радикалами (рис. 5-4). Один из них -
очень длинная полииенасыщенная цепь, кото-
рая состоит из повторяющихся изопреноидных
единиц. Аналогичная цепь встречается и в
структуре витаминов группы К, а также в ви-
тамине А (см. рис. 2-11) и иных каротиноидах.
Рис. 5-4. Строение убихинона (KoQ) и витаминов группы К.
Изопреновая группировка в боковой цепи повторяется в молекуле KoQ, как правило, 10 раз (л = 10), а в витаминах К2
- от 6 до 9 раз. Несмотря на очень большое сходство с KoQ, эти витамины вовсе не вовлекаются в дыхательную
цепь. Они локализованы не в митохондриях, а в мембранах ЭР (где выполняют роль кофермента при карбоксили-
ровании глутамильных радикалов в процессе постсинтетической модификации ряда белков, как это показано на рис.
2-28)
144
Глава 5
о	он
II	I
/сх	/Ч
Н,СО— С	С—СНз	Н3СО—С	С —СН3
ФП нг +	II II ---------»	| II + ФП
н3со—с	с—R	н3со—с	с—R
Убихинон (KoQ)
Убихинол (KoQ  Нг)
Рис. 5-5. Восстановление убихинона флавиновым ферментом.
Убихинон - единственный компонент сис-
темы МтО, не имеющий собственного апофер-
мента. Тем не менее, ои сохраняет изначальное
название кофермент Q (по первой букве слова
«quinone»). Гидрофобность и малые размеры
обеспечивают ему мобильность в неполярной
среде. Поэтому кофермент Q (KoQ) способен,
мигрируя в пределах мембраны, принимать
восстановительные эквиваленты (атомы водо-
рода) от одних участников дыхательной цепи и
передавать их другим сложным протеинам, -
обладающим более высоким значением редокс-
потенциала («оправдывая» тем самым звание
кофермента).
Обычным «поставщиком» водорода для
убихинона являются восстановленные формы
флавиновых ферментов (ФП’/б)- Принимая
от них два электрона и два протона, хинонная
структура кофермента Q превращается в гидро-
хинонную (убгошнол), как это показано на
рис. 5-5.
Цитохромы. Так обозначают сравнительно
небольшие белки (обычно 15-45 кДа), простети-
ческая группа которых почти или совсем иден-
тична гему Ь, содержащемуся в гемоглобине
(см. рис. 1-26). Нередко их называют белками,
содержащими гемовое железо.
По мере открытия цитохромов, их обозна-
чали латинскими буквами. Выявление все но-
вых аналогов потребовало добавления цифро-
вых символов к уже принятым буквенным.
В дыхательной цепи МтО функционируют
цитохромы b. Ci, с и аа3. Первый из них коор-
динационно связывает 2 молекулы гема Ь. Ци-
тохромы Ci и с обладают таким же гемом, но
фиксированным ковалентно, тиоэфирными свя-
зями. А вот цитохром аа3 содержит две молеку-
лы гема а, который немного отличается от гема
b (см. подпись к рис. 1-26). Эти молекулы в нем
обозначаются как гем а и гем с3 из-за неравно-
ценности их свойств, обусловленной, похоже,
разным расстоянием от атома меди (Cu2+/Cu+),
связанного с этим гемопротеином через радика-
лы цистеина и гистидина.
Главным функциональным центром цито-
хромов является железо гема. В отличие от ге-
моглобина, здесь оно довольно легко может
менять свою валентность. Принимая электрон,
окисленное железо феррицитохрома (Fe3+) пе-
реходит в восстановленную форму (Fe2+). От-
давая затем электрон подходящему акцептору,
возникший ферроцитохром вновь превращает-
ся в ферри-форму:
Вариации в строении гема, в способах его
связывания с белком, а также в структуре при-
легающих фрагментов апопротеина, - все это
заметно отражается на степени сродства желе-
за цитохромов к электронам. Приведенный
выше перечень цитохромов дан в порядке воз-
растания их редокс-потенциала. Поэтому
именно в такой последовательности компонен-
ты системы цитохромов транспортируют элек-
троны от убихинола в конечном счете на
молекулярный кислород (рис. 5-6).
KoQ-H2 Дит. Ъ —* цит. cj —> цит.с —*
—> цит. аа3 —» О2
Рис. 5-6. Путь электрона по системе цитохромов.
Железо-серные белки (FeS-протеины;
FeS-P). Так называют небольшие белки (по-
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
145
Рис. 5-7. Схема строения железо-серного кластера
типа 2Fe-2S.
рядка 20 кДа), содержащие негемовое железо и
неорганическую серу. Обычно в молекуле име-
ется один железо-серный центр, включающий
по два атома железа и серы (2Ре-28-протеины).
Как показано на рис. 5-7, каждый атом железа
в нем. помимо связей с сульфидной серой, ком-
плексирован еще и с группами -SH двух ради-
калов цистеина (вместо одной из них возможен
радикал гистидина). Вся эта структура локали-
зована в петле, выступающей на поверхность
бочкообразной молекулы 2Ре-2в-протеина. Не-
редко встречаются и белки с двумя такими
кластерами (4Ре-48-протеины) либо с непол-
ным удвоением их.
Подобно цитохромам, железо-серные белки
тоже осуществляют одноэлектронный транс-
порт. Одиако делают это они не самостоятельно,
а в составе неразрывных комплексов с другими
компонентами дыхательной цепи - флавопро-
теинами или цитохромами. Влияние партнера в
таком комплексе, как и специфика собственного
апопротеина, - все это сильно отражается на
величине редокс-потенциала железо-серного
центра: в разных FeS-белках он составляет
обычно от -0,30 до -0,15 В. Неудивительно, что
FeS-P со столь различающимися характеристи-
ками «встроены» в совершенно разные звенья
дыхательной цепи.
5.2.2.	ПОЛНАЯ ЦЕПЬ СИСТЕМЫ
МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ
Систему, в которой участвуют все пере-
численные компоненты митохондриального
окисления, целесообразно назвать полной ды-
хательной цепью. В виде общей схемы она
изображена на рис. 5-8. Эта давняя схема
удобна своей наглядностью. Во-первых, она
демонстрирует, что окисление одного компо-
нента цепи невозможно без одновременного
восстановления другого (это отражено обяза-
тельным соприкосновением полукруглых стре-
лок). Во-вторых, здесь виден (светлые стрелки)
путь электронов (и протонов) от исходного
субстрата (PcHi) в конечном счете на молеку-
лу О2. Приведенные на схеме цифры показы-
вают, что этот путь пролегает в направлении
постепенного увеличения редокс-потенциала -
от -0,32 В для пары НАД / НАД- Н2 до +0,82 В
для пары ИО2/ О .
Наконец, схема отражает эксперименталь-
ные данные о том, что в трех участках цепи
перенос пары электронов с одного звена на
другое сопряжен с синтезом молекулы АТФ.
Это сопряжение происходит лишь на уровне
тех звеньев, где перепад редокс-потенциала
наиболее значителен (порядка 0,2 В): именно в
этих пунктах освобождаемая порция энергии
достаточна для обеспечения синтеза одной мо-
лекулы АТФ из АДФ и фосфата.
Таким образом, митохондриальное окис-
ление представляет собой по существу реак-
цию гремучего газа:
Н2 + Vz О2 = H2O + 230 кДж/моль.
Разница заключается в том, что в мито-
хондриях используется не молекула газообраз-
ного водорода, а даа атома водорода, изымае-
мые у окисляемого субстрата. Но самое глав-
ное отличие - в том, что дыхательная цепь рас-
членяет реакцию гремучего газа на множество
промежуточных стадий. Из-за этого энергия
выделяется не мгновенно (как при взрыве гре-
мучей смеси) и не столь интенсивно, как при
горении струи водорода в воздухе, а - посте-
пенно, небольшими порциями. Некоторые из
них достаточны для трансформации в энергию
макроэргических связей АТФ. Она составляет
—30 кДж/моль в стандартных условиях (в ре-
альной среде митохондрий - и того больше:
до 42 кДж/моль). Следовательно, при окисле-
нии субстрата полной дыхательной цепью из
230 кДж/моль освобождаемой энергии не ме-
нее 3x30 = 90 кДж/моль концентрируется в мо-
лекулах АТФ. Это очень высокий коэффициент
полезного действия - более 40%! Остальная
энергии рассеивается в форме теплоты (хотя и
146
Глава 5
Рис. 5-8. Полная цепь митохондриального окисления (схема).
она небесполезна, ибо пригодна для терморе-
гуляции организма).
Синтез АТФ из АДФ и Фн кратко обозна-
чают как реакцию фосфорилирования (подра-
зумевая фосфорилирование молекулы АДФ
неорганическим фосфатом).
Окислительным фосфорилированием
называют образование АТФ, сопряженное с
работой дыхательной цепи (т.е., за счет энер-
гии, освобождаемой в процессах митохондри-
ального окисления).
Критерием эффективности окислитель-
ного фосфорилирования служит количество
АТФ, вырабатываемое на единицу утилизи-
руемого О2. Как показывает схема (см. рис. 5-
8), на пути двух атомов водорода от субстрата
до кислорода образуются 3 молекулы АТФ
(т.е., используется 3 молекулы Фн в расчете на
каждый атом потребляемого кислорода). Этот
критерий - отношение фосфор/кислород (ко-
эффициент Р к О) — предложили в 1939 г. В.Н.
Белицер и Е.Т. Цибакова. Экспериментальные
измерения in vitro поначалу подтверждали, что
в полной дыхательной цепи коэффициент Р/О
равен 3.
В митохондриях содержатся никотинамид-
ные дегидрогеназы для многих веществ. Однако
преобладающими субстратами полной дыха-
тельной цепи являются всего только 5 метабо-
литов, - те, которые в организме человека окис-
ляются сотнями граммов (первые три из приве-
денного списка) или десятками граммов в сутки:
-	изолимонная кислота (изоцитрат);
—	яблочная кислота (малат);
-	0-гидроксиацил-КоА ф-гидроксипроиз-
водное активированных жирных кислот);
-	0-гидроксимасляная кислота ф-гид~
роксибутират);
-	глутаминовая кислота (глутамат)..
Митохондриальное окисление именно
этих веществ поставляет клеткам основную
массу АТФ. Соответствующие дегидрогеназы
локализованы в митохондриальном матриксе.
По существу, вырабатываемый всеми ими
НАД7/2 оказывается единым субстратом для
полной цепи МтО. И даже если в митохондри-
ях появляются молекулы НАДФ-//2, которые
возникают в отдельных реакциях, они легко
отдают водород молекулам НАД благодаря
имеющейся здесь НАД(Ф)-трансгидрогеназе:
НАДФ-Яг + НАД <-> НАДФ + НАД-Я2- [5-1]
Со временем было установлено, что мем-
бранные белки, переносящие электроны (часть
из них - и протоны), организованы в блоки,
каждый из которых сохраняет свою функцию
даже после выделения из митохондрий. Блоки
оказались устроенными гораздо сложнее, чем
это показано на рис. 5-8, и были названы ком-
плексами МтО. Современные данные о них
обобщены в табл. 5-1. В работе полной дыха-
тельной цепи участвуют, однако, не все элек-
трои-транспортные белки мембраны, а только
комплексы 1, III и IV. Рисунок 5-9 в самом
общем виде показывает очередность их вовле-
чения в процесс переноса электронов (и прото-
нов). Детальнее роль каждого звена представ-
лена на рис. 5-10.
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
147
Таблица 5-1
Блоки электрон-транспортных белков внутренней мембраны митохондрий
Название	Локализация, состав, функции	Редокс- центры	Транс- локация
А. НАЧАЛЬНЫЕ (альтернативные) звенья митохондриального окисления			
Комплекс 1 (НАД-Н2- убихинон- оксидоредуктаза)	Трансмембранный комплекс из десятков субъединиц. Предна- значен для окисления молекул НАД-Н2, продуцируемых рас- творимыми (внемембранными) никотинамидными дегидрогена- зами	1 ФМН 4 FeS- белка 2 KoQ	4 Н*
Комплекс II (сукцинат- дегидрогеназа)	Состоит из серии субъединиц, внедренных во внутреннюю мембрану со стороны матрикса; переносит 2 ё и 2 Н+от янтар- ной кислоты (сукцинат) на мобильный убихинон липидного бислоя	1 ФАД 3 FeS- белка 1 гем b	0
ЭТФ-дегидро- геназа	ФАД-содержащий железо-серный белок, обладающий транс- мембранным участком. Генерирует убихинол за счет окисления ЭТФ (электронтранспортирующий флавопротеин), восста- навливаемого различными ФАД-зависимыми дегидрогеназами митохондрий	1 ФАД 4 FeS- центра	0
Б. ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ (общие) звенья системы митохондриального окисления			
Комплекс III (цитохром Ьсг, убихинол-цито- хром-с-редуктаза)	Трансмембранный белок из 11 субъединиц, включая цитохром Ь (с двумя молекулами гема Ь), цитохром Ci (с ковалентно свя- занным гемом Ь) и FeS-белок. Они образуют цепочку пооче- редного транспорта каждого электрона от KoQ-H2 на цитохром с межмембранного пространства, примыкающий к мембране	3 гема b 1 FeS- белок	2 Н+
Комплекс IV (цитохром- оксидаза)	Ансамбль из 6 субъединиц. Из них каталитическая богата трансмембранными доменами (12) и содержит не только два гема, но и атом меди (медь В). С привлечением «иной» меди (медь А) другой субъединицы, она обеспечивает поток элек- тронов от цитохрома с снаружи мембраны на молекулу О2 в матриксе	1 гем а 1 гем аз 1 медь «А» 1 медь «В»	4 Н+
Комплекс I является начальным из мем-
бранных звеньев полной дыхательной цепи,
выполняя роль посредника между никотина-
мидными дегидрогеназами матрикса и мобиль-
ным KoQ мембраны. Он обозначается как
НАД-Нг-дегидрогеназа и представляет собой
крупное (до 900 кДа) объединение десятков
разных субъединиц, семь из которых кодиру-
ются митохондриальной ДНК. Многие субъе-
диницы гидрофобны и организованы в транс-
мембранные а-спирали. На весь комплекс при-
ходится одна молекула ФМН, которая иекова-
лентно, но прочно связана с гидрофильным
фрагментом фермента, выступающим в мат-
рикс, и является первичным акцептором элек-
тронов от НАД-Я2 (см. рис. 5-10). Следующее
затем поочередное восстановление FeS-центров
соответствующих субъединиц, сопряжено с
протонированием определенных группировок
апопротеина. Обладая редокс-погенциалом от
-0,37 до -0,15 В, эти центры образуют цепочку
одноэлектронного транспорта в конечном счете
на две молекулы убихинона, связанных с белка-
ми комплекса прочно, но по-разному (а потому
различаются и их свойства). Возникший убихи-
иол передает потом атомы водорода тем моле-
кулам KoQ, которые свободно мигрируют в
мембране (см. рис. 5-10).
Комплекс Ш, тоже трансмембранный, яв-
ляется следующим звеном системы МтО. Он
состоит из серии субъединиц общей массой
около 250 кДа. Главную роль играют 3 из них:
железо-серный белок 2Fe-2S, цитохром b (со-
держащий два близких по свойствам гема Ь) и
цитохром Ci (отсюда другое название комплек-
са - цитохром b-Су). Как показано на рис. 5-10,
все они образуют цепочку редокс-центров, ко-
торая реализует перенос электронов от
Субстрат НД —> Комплекс I KoQ —> Комплекс III —> Цит. с —> Комплекс IV -> О2
Рис. 5-9. Последовательность включения дыхательных комплексов в работу полной цепи системы МтО.
Рис. 5-10. Мембранные дыхательные комплексы и участки выброса протонов из матрикса.
[ОДК - мультиферментный комплекс окислительного декарбоксилирования а-кетокислот].
Глава 5
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
149
KoQ-Яг» мигрирующего в пределах внутренней
мембраны митохондрий, на молекулы цито-
хрома с, примыкающие к ее внешней стороне
(протоны при этом остаются в среде). Ос-
тальные субъединицы комплекса III нужны
для его структурирования, а также для обеспе-
чения контакта цитохрома Ъ с донором элек-
тронов (KoQ-Яг) или цитохрома С\ с цитохро-
мом с (их акцептором). Последний представля-
ет собой небольшой белок, способный пере-
мещаться в межмембранном пространстве,
контактируя с внутренней мембраной мито-
хондрий. По существу, он является внемем-
бранным связующим звеном между комплек-
сами III и IV.
Комплекс IV (цитохром-с-оксидаза) — это
конечное звеио в цепи электронного транспорта
от исходно окисляемого метаболита на молеку-
лярный кислород. Состоит из нескольких субъ-
единиц, одна из которых (25 кДа) содержит
атом меди, связанный с двумя радикалами гис-
тидина и двумя - цистеина. Этот атом (медь А)
участвует в переносе электрона с цитохрома с
на гем а трансмембранной субъединицы. Буду-
чи самой крупной (57 кДа), она имеет еще один
редокс-центр, который включает а себя гем а3 и
атом меди (медь В), и осуществляет передачу
электрона непосредственно на кислород. Не-
смотря на одноэлектронный механизм транс-
порта по системе цитохромов, комплекс IV
обеспечивает единовременную передачу сразу
4 электронов на молекулу кислорода, восста-
навливая ее до воды (чтобы не усложнять схему,
на рис. 5-8 показан единичный акт отнятия пары
атомов водорода от субстрата, - с переносом
двух электронов на «половинку» молекулы О2).
Важно отметить, что последнее звено -
цитохром оксидаза — обладает чрезвычайно вы-
соким сродством к кислороду. Поэтому дыха-
тельная цепь функционирует со свойственной
ей максимальной скоростью (Vtrax) вплоть до
почти полного исчерпания О2 в митохондриях.
Схема иа рис. 5-10 ясно показывает функ-
циональные связи между звеньями дыхатель-
ной цепи. Следует, однако, подчеркнуть, что эти
связи не закреплены структурно: даже крупные
комплексы свободно перемещаются в липидном
бислое (в среднем - на расстояние не менее соб-
ственного диаметра за 1 мс). На порядок выше
скорость диффузии молекул убихинона и цито-
хрома с, которые в ходе хаотичных контактов с
крупными комплексами обеспечивают, тем не
менее, продвижение по дыхательной цепи от 50
до 200 электронов в секунду.
На пространственную обособленность ком-
понентов дыхательной цепи указывает и факт
неэквивалентности их соотношения. По некото-
рым данным, в расчете на комплекс I внутрен-
няя мембрана содержит 3 комплекса III. но 7
комплексов IV, и все они разделены значитель-
ными промежутками, для преодоления которых
электронами предназначены 9 молекул цито-
хрома с и 50 молекул KoQ (в расчете тоже на
каждый комплекс I).
5.2.3.	УКОРОЧЕННАЯ ЦЕПЬ
МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ
У ряда веществ, окисляемых в митохонд-
риях, редокс-потенциал существенно выше
значения -0,32 В, присущего никотинамидным
коферментам. Например, у янтарной кислоты
его уровень (+0,03 В) почти такой же, как и у
KoQ. Следовательно, эта кислота (сукцинат) не
может быть субстратом полной дыхательной
цепи. Установлено, что она окисляется непо-
средственно флавиновым ферментом, - анало-
гичным тому, который показан как второе зве-
но в схеме на рис. 5-8. Иными словами, здесь
отсутствует никотинамидный компонент. Од-
нако это не просто «укорочение» полной цепи:
сукцинат окисляется не частью комплекса I,
а вполне самостоятельным ансамблем, кото-
рый содержит ФАД (а не ФМН!) и обозначен
как комплекс П (см. табл. 5-1). Поскольку он
тоже переносит два атома водорода от субстра-
та (но своего1) на мобильный KoQ мембраны,
комплекс II следует считать особым - альтер-
нативным комплексу I - вариантом начально-
го участка дыхательной цепи. Тем не менее,
термин укороченная дыхательная цепь целесо-
образно сохранить. Хотя бы потому, что в ней
действительно нет никотинамидного звена.
И, как следствие, величина коэффициента Р/О,
установленная экспериментально, оказалась
равной 2, а не 3 (то есть, эффективность окис-
лительного фосфорилирования на треть мень-
ше, чем в полной цепи). Наконец, комплекс II
строго избирателен к сукцинату, а для ряда
150
Глава 5
других субстратов существуют свои флавопро-
теиновые системы, но - совсем иной структуры
(см. табл. 5-1). Термин «укороченная дыха-
тельная цепь» позволяет объединить все эти
варианты общим названием, отражающим их
однотипность. Наиболее значимыми субстра-
тами такой цепи являются 3 метаболита (пер-
вые два из которых окисляются сотнями грам-
мов в сутки):
-	янтарная кислота (сукцинат);
-	ацил-КоА (активированная форма жир-
ных кислот);
-	глицерол-3-фосфат (фосфоглицерол).
Комплекс II {сукцинатдегидрогеназа),
как упомянуто выше, способен окислять толь-
ко янтарную кислоту (уравнение реакции при-
ведено на рис. 5-22). У эукариот ои представ-
ляет собой объединение нескольких белков,
встроенное во внутреннюю мембрану мито-
хондрий, но не пронизывающее ее (см. рис.
5-10). Самый крупный из иих (60-70 кДа) вы-
ступает в матрикс и содержит молекулу ФАД,
ковалентно соединенную с радикалом гистиди-
на. Другую часть комплекса составляют субъе-
диницы, несущие три FeS-кластера и гем Ь.
Именно "в такой последовательности эти ре-
докс-центры участвуют в передаче двух элек-
тронов от сукцината на мобильный убихинон
(чему сопутствует перенос на него и двух про-
тонов).
Апил-КоА-дегидрогеназа представляет
собой другой вариант начала укороченной це-
пи. Этот фермент локализован в матриксе и
катализирует отщепление двух атомов водоро-
да от жирной кислоты в составе ацил-КоА
(рис. 7-6). Их он присоединяет к собственной
молекуле ФАД, а затем передает на особый
электронтранспортирующий флавопротеин
(ЭТФ). Этот белок играет роль специального
акцептора восстановительных эквивалентов от
ряда флавиновых дегидрогеназ митохондрий.
Реоксидацию его ФАД осуществляет еще один
флавопротеин - ЭТФ-дегидрогеназа внутрен-
ней мембраны (см. табл. 5-1). Помимо ФАД,
она обладает тремя FeS-центрами, которые по-
могают ей использовать восстановленную
форму ЭТФ для превращения KoQ липидного
бислоя в KoQ-Яг-
Фосфоглицеролдегидрогеназа производит
окисление третьего из перечисленных субстра-
тов укороченной цепи — глицерол-3-фосфата -
до фосфоглицеральдегида (ФГА) или изомерно-
го ему дегидроксиацетон-фосфата (ДГАФ).
Уравнение этой обратимой реакции, показанное
на рис. 5-33, характеризует НАД-зависимую
форму фермента, которая сосредоточена в цито-
плазме. Митохондриальная же фосфоглицерол-
дегидрогеназа является флавиновым фермен-
том: ту же самую реакцию она реализует с уча-
стием не НАД, а ФАД. Этот фермент встроен во
внутреннюю мембрану митохондрий с внешней
ее стороны и состоит из трех субъединиц. Одна
из них иековалентно связывает молекулу ФАД,
другая содержит два FeS-центра. Последние
способствуют восстановлению мобильного
KoQ, которое осуществляется, вероятнее всего,
с участием ЭТФ и ЭТФ-дегидрогеназы (как и в
случае ацил-КоА-дегидрогеназы).
Таким образом, все три названных вариан-
та начала укороченной цепи обеспечивают (как
и комплекс I) восстановление мобильного KoQ
(см. рис. 5-10). Но энергетический баланс этого
процесса недостаточен для синтеза АТФ.
Дальнейший путь электронов от K0Q7/2 до Oi
протекает так же, как и в полной дыхательной
цепи, с использованием заключительных зве-
ньев системы МтО (комплекс III, цитохром с и
комплекс IV). Именно на этом отрезке пути
происходит освобождение всей той энергии,
которая может быть использована для синтеза
АТФ (две молекулы АТФ на каждый акт окис-
ления субстрата).
Помимо перечисленных метаболитов, уко-
роченными путями окисляются также минорные
субстраты (в данном контексте имеются в виду
вещества, суточная утилизация каждого из кото-
рых составляет около 1 г). В основном это про-
дукты частичной деградации таких аминокис-
лот, как лейцин, лизин, триптофан. Их окисление
не дает ощутимого вклада в общую выработку
АТФ, но является составной частью нормального
катаболизма названных аминокислот.
5.2.4.	МЕХАНИЗМ СОПРЯЖЕНИЯ ОКИСЛЕНИЯ
С ФОСФОРИЛИРОВАНИЕМ
Долгое время оставалось загадкой, каким
образом энергия, освобождаемая при биологи-
ческом окислении, трансформируется в энер-
гию макроэргических связей АТФ. Многие вы-
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
151
дающиеся биохимики пытались обнаружить и
выделить «сопрягающие» ферменты или обра-
зующиеся с их участием промежуточные про-
дукты. Прорыв наступил в 1961 г., когда анг-
лийский исследователь Питер Митчел опубли-
ковал короткую статью «Сопряжение окисле-
ния и фосфорилирования механизмом хемиос-
мотического типа».
Судьба П. Митчела сложилась так, что ос-
новные эксперименты он выполнил в своей
домашней лаборатории (как в свое время
А.Н. Бах), в оборудовании которой едва ли не
самым главным прибором был обычный
pH-метр. Ученый сумел перевести проблему
в совсем другую, совершенно неожиданную
плоскость. Его публикации вызвали очень
острую и длительную полемику. Большую
роль в доказательстве правоты П. Митчела
сыграли эксперименты группы московских
ученых во главе с В.П. Скулачевым (ныне
академиком РАН, председателем Российско-
го биохимического общества). В 1978 г.
П. Митчел был удостоен высшей научной на-
грады - Нобелевской премии.
Суть хемиосмогической теории сводится к
тому, что в местах сопряжения (отмеченных на
рис. 5-8) происходит не фосфорилирование как
таковое, а просто выброс протонов из матрикса
в межмембранное пространство. В результате
создается трансмембранный градиент концен-
трации протонов: снаружи их в 10 раз больше
(pH =^7), чем в матриксе (pH ~8). Возникающий
градиент электрохимического потенциала
(Ар.Н+ ) является движущей силой, стремящейся
вернуть протоны в матрикс, т.е., устранить рез-
кий перепад их концентрации. Однако возврат-
ное движение ионов Н+ возможно только через
специальные трансмембранные каналы. Энер-
гия «прорыва» протонов по ним используется
для синтеза АТФ (как поток воды по каналам в
теле плотины - для выработки электроэнер-
гии). Важно подчеркнуть, что это - поток
«обезличенных» протонов, т.к. невозможно
определить, на каком участке дыхательной це-
пи выброшена из матрикса та или иная пара
ионов Н+ (все они образуют совокупный пул
протонного градиента).
Преодоление П.Митчелом рамок традици-
онной научной парадигмы привело к быстрому
прогрессу в раскрытии механизмов окисли-
тельного фосфорилирования. Теперь уже точно
известно, что оно осуществляется не в тех трех
участках, которые отмечены в схеме на рис.
5-8, а в других местах - с внутренней (мат-
риксной) стороны протонных каналов. Указан-
ные же на этой схеме участки сопряжения яв-
ляются лишь пунктами выкачивания протонов
из матрикса. Ими становятся один за другим
трансмембранные комплексы I, III и IV сис-
темы МтО (как это отмечено на рис. 5-10). В
каждом из них передача электронов по редокс-
центрам обеспечивает транслокацию протонов
из матрикса наружу. И хотя детали этого про-
цесса еще не вполне ясны, можно считать ус-
тановленным количество ионов Н+, удаляемых
из матрикса при прохождении комплекса па-
рой электронов. Как показано в последней
графе табл. 5-1, для комплекса I оно составляет
4 протона, для комплекса III — 2 протона и для
комплекса IV - снова 4 протона.
Комплекс V - так обозначен крупный (поч-
ти 500 кДа) надмолекулярный ансамбль, фор-
мирующий в мембране особый канал, в котором
поток протонов по градиенту концентрации
обеспечивает реакцию синтеза АТФ из АДФ и
Фн. Полное название комплекса - протон-
транспортирующая двухсекторная АТФ-аза.
Фактически это и есть фактор сопряжения.
Часть его — сектор Fo — состоит из более чем де-
сятка субъединиц (почти все они одинаковы),
образующих цилиндрической формы трансмем-
бранный канал для прогонов. На нем, как на
оси, фиксирован сектор Fj, который выдается в
матрикс в виде округлого расширения («шляпка
гриба»). По окружности этой «шляпки» равно-
мерно распределены три одинаковых гетероди-
мера, состоящих из а- и р-субъединиц (55 и
50 кДа соответственно). Каждая из них содер-
жит нуклеотид-связывающий центр для АТФ и
АДФ. В центре этой трехсекционной «шляпки»
находятся три меньшие субъединицы, некова-
лентно соединяющие ее с Fo.
Функционально субкомплекс Fi представ-
ляет собой фермент, катализирующий реакцию
фосфорилирования молекулы АДФ (т.е., пре-
вращение ее в АТФ). Обычно его обозначают
термином протонная АТФ-синтетаза, ибо
энергию, необходимую для синтеза АТФ, по-
ставляет здесь поток ионов Н+ через протон-
ный канал Fo (рис. 5-11).
152
Глава 5
Межмембранное пространство
ЗН+ Матрикс митохондрии
(рН»6)
Рис. 5-11. Схема функционирования протонной
АТФ-синтетазы (слева) и АТФ/АДФ-транслоказы (справа).
По современным представлениям, веду-
щую роль в механизме синтеза АТФ играет
вращательное движение комплекса FoFi вокруг
продольной оси. Движущей силой является по-
ток протонов через Fo, вызывающий его рота-
цию, которая увлекает за собой и сектор Fb
Вращение последнего происходит ступенчато,
с «длительными» (~1 мс) остановками после
каждого поворота на 120° (т.е., на протяжен-
ность димера ар). В итоге за один оборот ди-
мер трижды претерпевает конформационную
перестройку (вызываемую сменой «обстанов-
ки», т.е., ближайшего окружения). В одном из
конформационных состояний димер сорбирует
молекулы АДФ и Фн, в следующем формирует
макроэргическую связь между ними (образуя
молекулу АТФ с выделением Н2О) и, наконец,
в третьем — освобождается от синтезированной
молекулы АТФ, переходя в состояние готовно-
сти снова повторить весь этот цикл. Таким об-
разом, в любой момент времени все три димера
ар, расположенные по окружности субком-
плекса Fi, находятся в разных конформацион-
ных состояниях, а синтез АТФ идет непрерыв-
но, пока достаточен протонный градиент по
обе стороны мембраны. Максимальная ско-
рость процесса может достигать —600 молекул
АТФ за 1 секунду.
Сравнительно недавно стало очевидно, что
через протонные каналы проходят далеко не
все ионы Н+, удаляемые из матрикса транс-
мембранными комплексами I, III и IV. Ибо в
живой клетке энергия ДцН+ частично исполь-
зуется и на другие нужды. В частности, на дос-
тавку в матрикс анионов фосфата, требуемых
(вместе с АДФ) для материального обеспечения
биосинтеза АТФ (см. рис. 5-11). Иными слова-
ми, соотношение между «выбросом» протонов
из митохондрий и «прорывом» их обратно по
протонным каналам отнюдь не является сте-
хиометрическим (т.е. таким, которое выражается
коэффициентами уравнения химической реак-
ции). Оно заметно варьирует в разных типах
клеток и в зависимости от их функционального
состояния. Современные исследователи пришли
к согласию в том, что прежние значения коэф-
фициента P/О (упомянутые в разделах 5.2.2 и
5.2.3) явно завышены, а более реальными явля-
ются Р/О = 2,5 для полной дыхательной цепи
(окисление НАД7/2) и Р/О = 1,5 - для укоро-
ченной (окисление ФАД772). Эти «консенсусные
величины» приняты теперь (взамен ранее уста-
новленных 3 и 2 соответственно) для расчета
энергетической эффективности процессов ката-
болизма (таких как распад глюкозы или высших
жирных кислот).
В заключение следует отметить обрати-
мость механизма синтеза АТФ за счет энергии
протонного потенциала. Процесс может пойти
вспять при накоплении АТФ на стороне распо-
ложения Fj. В этих условиях синтез АТФ сменя-
ется его гидролизом, из-за чего наступает рота-
ция всего комплекса FoFi в обратном направле-
нии и, как следствие, градиент протонов не
уменьшается, а нарастает. Такое «обратное со-
пряжение» фосфорилирования с наработкой
протонного градиента действительно реализует-
ся в ряде живых объектов. В частности, так ра-
ботает протонная АТФ-синтетаза в плазматиче-
ской мембране бактерий, способных подкислять
среду, а также в мембране везикул с кислым со-
держимым (таких как лизосомы). Таким обра-
зом, комплекс V объединяет в себе два двигате-
ля: мотор Fo, движимый потоком протонов по
градиенту их концентрации, и мотор Fj, вра-
щаемый в обратную сторону гидролизом АТФ,
что ведет к увеличению этого градиента.
5.2.5.	ДЫХАТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ
У животных митохондрии являются глав-
ным производителем молекул АТФ, а почти
все потребители энергии АТФ (см. раздел
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
153
2.2.2) находятся в других участках клетки.
Следовательно, этот макроэрг, синтезируемый
в матриксе, должен перемещаться в межмем-
бранное пространство, откуда ему легко диф-
фундировать в цитозоль. Преодоление внут-
ренней мембраны облегчает специальная
АТФ/АДФ-л2/?«нсу/окш«, которая «выпускает»
из матрикса АТФ строго в обмен на АДФ. По-
путно в матрикс переходит эквивалентное ко-
личество Фн (см. рис. 5-11), сопровождаемого
протоном. Тем самым компенсируется дефи-
цит отрицательных зарядов в молекуле АДФ (в
сравнении с АТФ), а также обеспечивается ма-
териальный баланс: в матрикс поступает
столько (АДФ + Фн), сколько необходимо для
синтеза выводимого АТФ. Благодаря слажен-
ности АТФ-синтетазного и транслоказного ме-
ханизмов соотношение [АТФ] / [АДФ] в цито-
золе в 10 раз больше, чем в матриксе.
Но самое главное заключается в том, что
осуществляемое транслоказой поступление
АДФ в матрикс является непременным услови-
ем для поддержания не только реакции фосфо-
рилирования, но и работы самой дыхательной
цепи. Действительно, в отсутствие АДФ синте-
зировать АТФ не из чего. Поэтому трансмем-
бранный градиент [Н1 [, создаваемый дыха-
тельной цепью, не «разряжается» через протон-
ные каналы, а нарастает, все более затрудняя
дальнейшую «перекачку» протонов из матрикса
(вплоть до ее остановки). В результате тормо-
зится поток электронов (и протонов) по дыха-
тельным цепям, т.е., прекращается утилизация
кислорода (тканевое дыхание). Однако и фос-
форилирование, и дыхание возобновляются, ес-
ли добавить в систему АДФ (и Фи) либо обеспе-
чить распад внемитохондриального АТФ до
АДФ и фосфата (которые станут поступать в
матрикс в обмен на синтезируемый там АТФ).
Не только в этих опытах на модельных
системах in vitro, но и в физиологических
условиях показано, что расходование АТФ в
процессах жизнедеятельности, приводя к обра-
зованию АДФ, тем самым автоматически сти-
мулирует выработку АТФ и утилизацию кис-
лорода в митохондриях. Эта зависимость ско-
рости клеточного дыхания от скорости образо-
вания АДФ получила название дыхательный
контроль. Благодаря ему интенсивность про-
цессов митохондриального окисления и фосфо-
рилирования диктуется фактическими затратами
АТФ в каждый данный момент. Потребление
клеткой энергии (в виде АТФ) нередко изменя-
ется в десятки раз, но соответственно этому ме-
няется и скорость утилизации кислорода, гак
что соотношение концентраций АТФ и АДФ
остается почти постоянным, колеблясь в очень
узких пределах. Это соотношение принято вы-
ражать коэффициентом, обозначаемым как
энергетический заряд клетки (ЭЗК):
[АТФ] 10^-[АДФ]	|521
[АТФ] + [АДФ]+[АМФ]
Введенный в числитель коэффициент 0,5
перед обозначением концентрации АДФ ука-
зывает на то, что две молекулы АДФ (с одной
макроэргической связью в каждой) эквива-
лентны одной молекуле АТФ (с ее двумя мак-
роэргическими фосфатными группами). Их
взаимопревращения катализирует аденилатки-
наза (см. уравнение [2-1]).
Фактически ЭЗК отражает степень «на-
полнения» адениннуклеотидной системы мак-
роэргическими связями. В случае полного ис-
черпания таких связей вся система окажется
представленной только молекулами аденило-
вой кислоты (АМФ), а значение ЭЗК упадет до
нуля. Если же, напротив, полностью профос-
форилировать адениннуклеотидный фонд
(превратив все его компоненты в АТФ), то
ЭЗК станет равным единице. Обычное значе-
ние ЭЗК варьирует в разных клетках от 0,85 до
0,95 (в состоянии покоя). Это свидетельствует
о почти полном насыщении адениннуклеотид-
ной системы энергией макроэргических связей.
5.2.6.	РАЗОБЩЕНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО
ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ
Концепция П.Митчела позволила объяс-
нить давно известный феномен нарушения со-
пряженности фосфорилирования с окислением.
Он заключается в том. что в присутствии неко-
торых веществ, не препятствующих процессам
окисления, выработка АТФ в митохондриях
ослабевает (уменьшается коэффициент Р/О).
Такие вещества назвали разобщающими аген-
тами. К ним относятся, в частности, динитро-
фенол, салициловая кислота, дикумарол. Рас-
стройство сопряжения процессов окисления и
154
Глава 5
фосфорилирования наступает также при избы-
точности тироидных гормонов - тироксина и
трийодтиронина (структурно похожих на ди-
нитрофенол).
Эффектом разобщения объясним ряд ведущих
проявлений гиперфункции щитовидной желе-
зы (базедова болезнь; тиротоксикоз: болезнь
Грейвса). Из-за снижения коэффициента Р/О
при этой патологии образуется меньше АТФ и
больше теплоты, чем обычно (в расчете на
единицу окисляемых продуктов). Как следст-
вие, развивается повышенный аппетит и насту-
пает усиленное потребление кислорода. Тем не
менее, такие больные очень худощавы, если не
сказать - истощены. Увеличение общего коли-
чества потребляемой пищи н повышение доли
энергии, рассеиваемой в виде тепла, приводит
к избыточной теплопродукции: таким больным
все время жарко («симптом простыни»), а тем-
пература тела постоянно держится на слегка
повышенном уровне (субфебрилитет). Объек-
тивным критерием диагностики служит повы-
шение основного обмена (количество кислоро-
да. потребляемого натощак в состоянии покоя
в расчете на единицу поверхности тела).
Несмотря на большие различия в строении
известных разобщающих агентов, все они об-
ладают двумя особенностями. Во-первых, они
относятся к числу слабых кислот, а потому
степень их диссоциации растет с увеличением
pH среды. Во-вторых, им присущи гидрофоб-
ные свойства (из-за наличия крупных неполяр-
ных структур), благодаря чему такие молекулы
довольно легко проникают сквозь липидный
бислой, причем, даже в ионизированной (ани-
онной) форме. Попадая в матрикс (pH ~8), та-
кая кислота диссоциирует сильнее, чем по дру-
гую сторону мембраны (pH ~7), а это значит -
отдает часть своих протонов. Смещение равно-
весия в пользу анионной формы способствует
диффузии последней из матрикса в межмем-
браниое пространство, где эти анионы, прини-
мая избыточные здесь протоны, снова перехо-
дят в форму неионизированной кислоты, кото-
рая вновь диффундирует в матрикс, и все по-
вторяется опять (рис. 5-12). Иными словами,
слабая кислота оказывается в роли переносчика
протонов извне в матрикс. Этот перенос не при-
вязан к каким-либо особым участкам внутрен-
ней мембраны и ведет к тотальному уравнива-
нию концентрации ионов Н+ по обе ее сторо-
н+
Н++НО~---->НяО
Межмембранное
пространство
Внутренняя мембрана
митохондрий
Матрикс
Рис. 5-12. Механизм разобщающего действия
слабых органических кислот.
ны, т.е., к устранению протонного потенциала. В
результате ослабевает поток ионов 1Г через
каналы Fo, из-за чего субкомплекс Fi лишается
источника энергии, необходимой для синтеза
АТФ. Таким образом, реакция фосфорилирова-
ния АДФ замедляется, тогда как окисление суб-
стратов и потребление кислорода не только не
уменьшаются, но даже возрастают (благодаря
стимуляции накапливающимися АДФ и Фн).
Этот эффект пытались было использовать для
лечения ожирения. Применение динитрофенола
действительно приводило к снижению избыточ-
ного веса (благодаря непродуктивному «сгора-
нию» жира). Одиако вскоре стали появляться
сообщения о тяжелых нарушениях и даже ле-
тальных исходах, и «быстрое лекарство» было
запрещено. Для тех, кто занимается разработкой
новых лекарственных препаратов, эта история
послужила серьезным уроком на будущее.
Разобщающий эффект оказывают не толь-
ко чужеродные вещества типа салицилата. Он
достигается и собственными регуляторами,
контролирующими теплопродукцию. Наиболее
ярким примером служат клетки бурого жира.
Во внутренней мембране митохондрий, кото-
рыми они особенно богаты, есть специальный
белок - тпермогенин (содержащий, как и
АТФ/АДФ-транслоказа, много глицина и про-
лина). Функционирует этот белок как димер,
способный создавать трансмембранные каналы,
которые позволяют протонам проникать извне в
матрикс. Тем самым «обесценивается» работа
дыхательной цепи по созданию протонного гра-
диента: его энергетический потенциал использу-
ется не для синтеза АТФ, а рассеивается виде
тепла. В сущности, бурая жировая ткань реали-
зует механизм прямой генерации тепла, выпол-
няя роль своеобразной печки, которая защищает
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
155
организм от переохлаждения. Особенно важна
она у новорожденных с их несовершенной сис-
темой физиологической терморегуляции, а так-
же у зимнеспящих животных.
5.2.7.	УДЛИНЕННАЯ ЦЕПЬ
МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ
Помимо ряда уже упоминавшихся суб-
стратов МтО, сотнями граммов в сутки обра-
зуются в организме человека и такие метабо-
литы. как пировиноградная кислота (ПВК) и
а-кетоглутарат (а-КГ). Редокс-потенциал каж-
дой из этих а-кетокислот (-0,7 В) намного ни-
же, чем у никотинамидных коферментов (-0,32
В). Такая разница создает большой энергетиче-
ский ресурс, которым природа не могла не
воспользоваться. Если обычные субстраты
полной цепи поставляют НАД7/2 комплексу I
с помощью простых («одноступенчатых»)
Н АД-дегидрогеназ, то для а-кетокислот в мат-
риксе митохондрий существуют специальные
надмолекулярные ансамбли. Каждый из них
производит НАД’Яг -лишь после предваритель-
ного декарбоксилирования а-кето кислоты (от-
щепление СО2). Отсюда и название - мульти-
ферментный комплекс окислительного декар-
боксилирования а-кетокислот (на рис. 5-10 он
обозначен как ОДК). Реализуя многостадий-
ный процесс, этот комплекс, по существу, уд-
линяет начальное звено полной дыхательной
цепи, а главное - использует освобождаемую
при этом энергию для образования макроэрги-
ческих соединений. Поэтому всю систему
окисления а-кетокислот (включая мембранные
комплексы I, III и IV) удобно обозначать тер-
мином удлиненная цепь митохондриального
окисления (имея в виду, что путь пары атомов
водорода к комплексу I длиннее, чем в полной
дыхательной цепи).
Комплекс окислительного декарбоксили-
рования объединяет три разных фермента, ка-
ждый из которых содержит свою простетиче-
скую группу. Кроме того, в его работу вовле-
чены еще и два кофермента - НАД и КоА,
строение которого показано на рис. 2-5. Там же
отмечено, что реактивным центром КоА (ко-
фермент ацилирования) является группа -SH.
Поэтому в уравнениях реакций его обычно
представляют как HS-KoA.
Простетическая группа одного из фер-
ментов (Ei) представлена тиаминдифосфатом
(ТДФ) - фосфорилированной формой витами-
на В] (рис. 5-13). В этой молекуле углерод,
заключенный между атомами азота и серы тиа-
золового кольца, обладает высокой реакцион-
ной способностью. Именно к нему присоеди-
няется субстрат в ходе ферментативной реак-
ции. Поэтому тиаминдифосфат кратко обозна-
чают как ЯС=ТДФ (как это сделано на рис.
5-15).
Другой фермент комплекса (Е2) имеет в
качестве простетической группы липоевую ки-
слоту (рис. 5-14), которая соединена кислото-
амидной (пептидной) связью с одним из ли-
зильных радикалов апофермента. Функцио-
нально активной частью липоевой кислоты
(Л.к.) является дисульфидная группа, способ-
ная легко восстанавливаться, присоединяя два
атома водорода (см. рис. 5-14).
Наконец, третий фермент комплекса (Е3) в
качестве простетической группы содержит
молекулу ФАД (см. рис. 2-7).
Объединение ферментов в стабильный
комплекс является залогом быстрого и у поря-
Витамин В t (тиамин)
Рис. 5-13. Строение тиаминдифосфата (активная
форма витамина Bi) [жирным шрифтом выделен высоко-
реактивный атом углерода тиазолового кольца].
s—сн2
I xCHa
S—сн
СН2 СН2 СООН
сн2 сн2
А
HS—сн2
^сн2
HS—сн
Хн2 сн2 соон
XXX/
сн2 сн2
Б
Рис. 5-14. Окисленная (А) и восстановленная (Б) формы
липоевой кислоты (Л.к.) и их сокращенные обозначения
(В и Г).
156
Глава 5
доченного течения последовательных стадий
катализируемого процесса. При этом продукт
действия одного фермента сразу же поступает
на активный центр следующего, чем предот-
вращается рассеяние промежуточных метабо-
литов в окружающей среде.
Известны два комплекса окислительного
декарбоксилирования а-кетокислот, а именно:
пируват-дегидрогеназный и а-кетоглутарат-
дегидрогеназный. Они различаются строением
белковой части двух из трех своих ферментов
(Ei и Е2), ио не коферментами или простетиче-
скими группами. Механизм их функциониро-
вания представлен на рис. 5-15 на примере
окислительного декарбоксилирования ПВК.
Первой на субстрат воздействует пируват-
декарбоксилаза (Ei), которая производит от-
щепление СО2. Как показано на рис. 5-15
(стадия 1), сначала ПВК углеродом своей кар-
бонильной группы присоединяется к ферменту
(точнее — к активному углероду его тиаминди-
фосфата), а затем теряет карбоксильную груп-
пу в виде углекислоты, превращаясь в гидро-
ксиэтильный фрагмент, ковалентно связанный
сТДФ.
СН3 л
I «
соон
ОН
СН3 ОН
V_______
нх
ПВК
Гидроксиэтил-ТДФ-Ei
сн3/°н
2	-->
Из
->s—<  _  
Липоил-Е2
СН3
-> хс'
НООСХ
Ацети л-дигидро липои л - Е2
СН3 ____________ СН3
С^9-"'	_+_«S-KoA -------> с^°	+
HS ^Л]к^Д|	Ацетил-КоА
Дигидро липои л - Е2
Дигидрол ипоил- Е2
5	+ НАД ----> НАД • н2 + gwi
Липоил-Е2
Итоговое 9нз	СН3
уравнение: с=О + Hg_KoA + НАД ----------> с02 +	+ НАД  Н2