Биосинтез ферментов микроорганизмами - Коновалов С.А.

Author: Коновалов С.А.

Tags: материальные основы жизни биохимия молекулярная биология биофизика биология микробиология биологические науки естественные науки микроорганизмы

Year: 1972

Similar

Молекулярная биология. Структура и функции белков

Ферменты рестрикции и их применение (Итоги науки и техники. Серия Биотехнология. Том 17)

Основы биологической химии

Биологическая война

Text

С. А. КОНОВАЛОВ
БИОСИНТЕЗ
ФЕРМЕНТОВ
МИКРООРГАНИЗМАМИ
МОСКВА
Издательство „ПИЩЕВАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ"
1972

«Биосинтез ферментов микроорганизмами».
Коновалов С. А. 1972 г.
Книга представляет собой систематизированное
обобщение научно-исследовательских отечественных
и зарубежных работ в области биосинтеза ферментов.
В ней широко отражены теоретические вопросы,
связанные с биохимией и физиологией продуцентов
ферментов. Дается характеристика синтеза белка
(ферментов), генетический контроль,
рассматриваются факторы, влияющие на биосинтез ферментов
микроорганизмами, способы передачи наследственных
признаков, влияние состава среды.
Таблиц 41. Иллюстраций 60. Список литературы —
980 названий.
Рецензенты: д-р биол. наук проф. А. М. БЕЗБОРОДОВ,
д-р сельскохоз. наук проф. А. Я. ПАНКРАТОВ.

ОТ АВТОРА
В книге освещена одна из наиболее сложных проблем
современной биохимии — синтез ферментов. Рассматривая ферменты
как метаболиты клетки, биосинтез их нельзя уяснить в отрыве
от физиологии питания и других процессов обмена веществ
микроорганизмов.
Дать полную и исчерпывающую характеристику
жизнедеятельности даже одноклеточных организмов довольно трудно
из-за недостаточности научных данных по этому вопросу, тем
не менее сущность многих важнейших жизненных процессов
можно объяснить как на клеточном и субклеточном уровне, так и на
уровне молекулярных структур.
Многие вопросы регуляции обмена микроорганизмов можно
объяснить лишь с позиции гетерогенности клеточной структуры,
взаимосвязи между структурой и функцией органелл
микроорганизмов, особенно клеточной стенки, цитоплазматической
мембраны, митохондрий, рибосом и т. д. (гл. I).
Для объяснения жизнедеятельности микробной клетки
большое значение имеет ее химический состав или так называемая
статическая биохимия (гл. II). Процессы ассимиляции и
диссимиляции, распада и синтеза, накопления и потребления энергии
непосредственно связаны с размножением микроорганизмов
(гл. III). При этом, естественно, нельзя обойти и некоторые
вопросы наследственности и изменчивости.
Наряду с освещением общих вопросов механизма и
регулирования биосинтеза ферментов (гл. IV) в книге полно
представлена прикладная энзимология — условия образования амилоли-
тических, протеолитических, пектолитических, целлюлолитичес-
ких и липолитических ферментов (гл. V—IX).

ВВЕДЕНИЕ
Пятилетний план развития народного хозяйства СССР
на 1971—1975 годы предусматривает «увеличить производство
и расширить ассортимент ферментных препаратов для
интенсификации технологических процессов и улучшения качества
продукции в пищевой и легкой промышленности, в сельском
хозяйстве и в других отраслях».
В последние годы для получения различных ферментов
находят широкое применение микроорганизмы, которые
характеризуются ценнейшими свойствами, обеспечивающими за короткий
цикл развития на доступных питательных средах и в
производственных условиях синтез ферментов, необходимых для
народного хозяйства.
Биосинтез многих гидролитических ферментов можно
регулировать и вести направленно, путем подбора соответствующих
условий культивирования и прежде всего — состава питательной
среды. Известно, что многие ферменты в живой клетке
образуются в ответ на действие индуктора, вносимого в питательную
среду, причем активность индуцированного фермента в ответ
на добавление специфического субстрата возрастает в процессе
роста микроорганизма во много раз, тогда как на среде без
соответствующего индуктора фермент образуется в минимальных
количествах.
Особенность микроорганизмов состоит также в том, что они
способны синтезировать внеклеточные ферменты, по активности
во много раз превышающие внутриклеточные. Тем самым при
определенных условиях микробная клетка может осуществлять
«сверхсинтез».
Одноклеточные микроорганизмы обладают очень простым
и интенсивным способом размножения. Этим в значительной
степени определяется и синтетическая деятельность их.
Известно, например, что при определенных благоприятных условиях
роста многие бактерии и некоторые виды дрожжей удваивают
биомассу в 500 раз быстрее, чем самые урожайные
сельскохозяйственные культуры. За одну секунду растущая
бактериальная клетка может создать до 150000 пептидных связей [11] и т. д.
Бактерии, дрожжи, плесневые грибы как бы конкурируют между
4

собой и с клетками животных и растений в быстроте, специфич*
ности и простоте проводимых ими реакций.
Это в равной степени относится к биосинтезу ферментов
и витаминов, к получению белковых кормовых препаратов
и антибиотиков, к образованию стимуляторов роста и
трансформации стероидов. Поэтому многие ценные и необходимые для
человека вещества можно получить только с помощью
микроорганизмов. При этом необходимо иметь в виду, что химический
синтез многих микробных метаболитов-полимеров (белки,
нуклеиновые кислоты, липиды с ненасыщенными жирными
кислотами и другие) не является в полной мере управляемым и
воспроизведение его в лабораторных условиях или вовсе
невозможно, или сопряжено с большими трудностями.
Большим успехом в области биохимии нуклеиновых кислот
следует считать осуществление синтеза гена [7, 12],
ответственного за образование в дрожжевой клетке аланина. Полученный
ген состоял только из 50 нуклеотидов. Представляет интерес
и синтез биологически активной инфекционной ДНК фага.
Из отдельных «деталей» фага, относящихся к неодушевленной
материи, была создана живая «система», обладавшая
способностью к воспроизведению себе подобных. Эти исследования
очень важны для понимания механизма жизни, для
конкретизации наших представлений о специфических процессах,
происходящих в живой материи. Устанавливаются закономерные связи
жизни не только с белком, но и с высшей его формой — нуклео-
протеидом. Имеющиеся данные дополнительно подтверждают
важную роль нуклеиновых кислот в жизнедеятельности любой
клетки и, в частности, в синтезе белка, а следовательно и
ферментов. Для всех организмов, независимо от уровня их организации
(бактерий, грибов, растений, животных), наследственной
субстанцией, обладающей способностью к самовоспроизведению,
являются нуклеиновые кислоты. Совокупность генетической
информации, обусловливающая все признаки данной особи,
находится в молекуле ДНК, которая с функциональной точки зрения
образует самую важную часть хромосом.
Комплементарная природа двуспиральной молекулы ДНК
позволяет объяснить, каким образом происходит ее репликация,
или самоудвоение. ДНК не только «самоудваивается», но и
выполняет «транскрибирование», т. е. передачу генетической
информации на РНК, которая сама потом выступает в роли матрицы,
определяя последовательность соединения аминокислот в
полипептидную цепь. Естественно, что удвоение молекул ДНК и
синтез информационной РНК — очень сложные процессы,
протекающие во взаимодействии с другими процессами обмена веществ
и прежде всего с белками, из которых ферменты оказывают
определяющее действие. В то же время роль ферментов в
синтезе биополимеров и механизм их действия еще совершенно не вы-
5

яснены и расшифровка этих процессов представляет собой
исключительно сложную и трудную научную проблему. Однако
показано, что протекание этих процессов в значительной мере
зависит от внешних факторов и прежде всего от концентрации
ингредиентов питательной среды, в свою очередь влияющей на
образование промежуточных и конечных продуктов обмена. Так,
например, можно вызвать некоторые изменения свойств ряда
микроорганизмов при культивировании их на питательных
средах, содержащих неестественные аналоги пуриновых и пирими-
диновых оснований. Замещение при этом, например, тимина
в той или иной мере чуждым организму основанием (5-бром-
урацилом, 5-аминоурацилом, 2-тиотимином и др.) обусловливает
преобразование свойств микроорганизма, связанное с
появлением разнообразных мутаций [1, 4, 6].
Действие мутагенных факторов в свою очередь вызывает
нарушение, например дезаминирование или выпадение одной
или нескольких пар оснований в кодирующей структуре, т. е.
в молекуле ДНК, что в конечном итоге также вызывает
появление мутаций.
Кроме того даже передача информации с ДНК на и-РНК
косвенно зависит от внешних условий культивирования
микроорганизма. Этот процесс, как известно, контролируется геном-
регулятором, который в свою очередь может взаимодействовать
с соединениями, как индуцирующими синтез фермента, так
и репрессирующими его. Если, например, в клетке конечный
продукт обмена достигает значительной концентрации, то
синтез фермента приостанавливается, при этом блокируется ген-
оператор ' и тем самым репрессор свободно проявляет свое
действие [2. 8]. При уменьшении концентрации конечного продукта
блокировка гена снимается, т. е. в этих условиях репрессор не
работает. Субстрат, наоборот, может снимать репрессию,
деблокировать ген и индуцировать синтез ферментов.
Таким образом репрессия и индукция представляют собой
противоположные явления одного и того же процесса,
осуществляют связь между генетическим аппаратом клетки и обменными
процессами. Эта взаимосвязь очень часто устанавливается
посредством низкомолекулярных соединений — субстратов, а
также конечных продуктов, которые постоянно информируют клетку
о состоянии метаболизма. Характер обмена веществ клетки
зависит от частных реакций, однако направленность и скорость их
определяются количеством и активностью ферментов. В
конечном итоге обменные процессы координируются и направляются
посредством регуляции синтеза клеточных ферментов. В то же
время хорошо известно, что образование индуцированных фер-
1 Ген-оператор контролирует функцию структурного гена, который
ответствен за синтез фермента.
6

ментов в значительной мере определяется условиями
культивирования микроорганизма. Индуцированная ферментативная
активность может быть значительно изменена под влиянием
состава питательной среды, при наличии или отсутствии
специфического субстрата-индуктора. При этом индуцированные
ферменты обладают узкой специфичностью в отношении субстрата,
вызвавшего их образование.
Несмотря на большие вариации в составе среды, допустимые,
например, при выращивании Micrococcus lysodeicticus, в которой
возможно образование ферментов, катализирующих
превращение мочевины, фумаровой кислоты и др., иногда добавление
индуктора (мочевины, янтарной или фумаровой кислоты) не
стимулирует образования уреазы и фумаразы; только внесение
глюкозы в питательную среду значительно повышает активность
уреазы при одновременном торможении активности каталазы.
От указанной закономерности обнаружено отклонение и в
опытах с аргинином, где активность декарбоксилазы оказалась
намного выше при добавлении гидролизата по сравнению с
культивированием бактерий в присутствии одного аргинина.
Очевидно, для синтеза этой ферментной системы требуются
дополнительные вещества.
Некоторые неорганические соли металлов (Са2+, Mg2+, Fe3+)
значительно стимулируют образование желатиназы, а
изменение температуры среды — синтез ряда других индуцированных
ферментов.
Широкая амплитуда условий и факторов, обусловливающих
образование индуцированных ферментов, по-видимому,
объясняется тем, что биокатализаторы сами являются метаболитами,
скорость образования и распад которых варьируют в
зависимости от интенсивности и условий роста микроорганизма, от его
физиологического состояния, что в значительной мере
определяется различной скоростью поступления в клетку веществ,
ингибирующих и активирующих биохимические процессы.
Регулирование и координирование внутриклеточных
биохимических процессов зависит не только от количества ферментов,
но и от их активности, всецело определяемой
физико-химическими условиями и прежде всего рН среды и температурой. Эти
факторы действуют на ферменты непосредственно и необратимо,
понижая как активность, так и «долговечность».
Гетерогенная структура клетки, регуляция синтеза и
активности ферментов, координация их действия, по-видимому, еще
не в полной мере обеспечивают контроль и направление
процессов обмена веществ микроорганизмов.
Сравнительно недавно было высказано предположение, что
микробная клетка имеет дополнительный механизм
регулирования биохимических процессов, осуществляемого с помощью изо-
ферментов.
7

Точными физико-химическими методами за последнее время
удалось подтвердить существование молекулярной
гетерогенности белков и ферментов. Оказалось, что ряд ферментов одной
особи (лактатдегидрогеназа, нуклеаза, амилаза, пепсин, лизо-
цим, транскетолаза и другие) представлен множественными
формами, одинаково действующими на субстрат, но
отличающимися по электрофоретической подвижности и некоторым
кинетическим свойствам.
Вероятно, существование изоферментов объясняется в
значительной степени дифференциацией клеточной структуры,
отличающейся прежде всего физико-химическими условиями. Это,
вероятно, может обусловливать необходимость в синтезе одной
клеткой одновременно разных ферментов, например протеиназ
или фосфатаз, действие которых может проявляться при кислой,
нейтральной и щелочной реакциях среды.
Жизнедеятельность микробной клетки, все ее функции
всецело связаны с клеточной структурой. Структура и функция, или
форма и жизненные процессы — это взаимообусловленные
аспекты жизни.
Усовершенствование методов электронной микроскопии
позволило глубже проникнуть в мир клетки, изучить макромолеку-
лярное строение ее органоидов.
Так, цитологические исследования дрожжевых организмов
подтвердили, что все они высоко дифференцированы и близки
по структурной организации к клеткам высших организмов.
Впервые установлено наличие в дрожжевых клетках
мембранных структур аппарата Гольджи, гранулярных и многослойных
лизосом, напоминающих по организации лизосомы высших
организмов [5, 9]. В дрожжевых клетках, как и в клетках
животных, обнаружена центриоль, т. е. органелла, обеспечивающая
деление клеточного ядра в процессе размножения.
Усилился интерес к вопросам автономии структурных
элементов клетки, и в первую очередь митохондрий. Наступил новый
этап в изучении митохондрий, связанный с открытием в них ДНК
и всех компонентов, обеспечивающих синтез белка. Оказалось,
что митохондрии наделены генетической системой, которая,
хотя и не вполне автономна, вносит самостоятельный вклад
в клеточный геном '. Предполагают, что митохондрии
обеспечивают связь и координацию между двумя фундаментальными
процессами — превращениями энергии в клетке и
воспроизведением клеточных структур [10].
Таким образом проблема биогенеза митохондрий приобрела
в настоящее время исключительную актуальность.
1 Геном — полный комплект наследственных факторов, содержащийся
в гаплоидном (одиночном) наборе хромосом.
8

У представителей разных видов и родов и даже всего класса
Actinomycetae не обнаружено существенных различий в
структурном строении клеток. В целом строение клеток гиф
аналогично строению вегетативных клеток грамположительных
бактерий [3].
Исследования микромолекулярного строения клетки
позволяют глубже познать протекающие в ней биохимические
процессы. Известно, например, что гетерогенность структуры клеток
является важным фактором, обеспечивающим регуляцию
обмена веществ на субклеточном и клеточном уровне.
Дифференцированные в морфологическом и биохимическом отношении
мембраны делят клетку на ряд «пространств», относительно
изолированных одно от другого. Однако наряду со статической
гетерогенностью распределения ферментов, коферментов и
субстратов в клетке допускается и динамичность распределения
веществ между «пространствами» клетки, а также возможность
обратимой миграции их из одного пространства в другое. Такой
взгляд на механизм регуляции обмена веществ заслуживает
внимания и является, вероятно, правдоподобным. Изменение
проницаемости митохондриальных мембран, например для АТФ,
приводит к изменению концентрации ее в цитоплазме или внутри
митохондрий, что в свою очередь связано с усилением или
ослаблением процесса гликолиза.
Последние достижения в области цитофизиологических
исследований дрожжей и бактерий, ассимилирующих
углеводороды, позволяют с новых позиций рассматривать биохимическую
функцию клеточной стенки и, вероятно, цитоплазматической
мембраны.
Специфические условия культивирования дрожжевых
клеток, непосредственное контактирование их с крупными каплями
и твердыми частицами парафинов оказывают влияние на
изменения состава, структуры и физико-химических свойств
клеточной стенки.
В стадии исследования и уточнения находятся многие
вопросы, связанные с механизмом проникновения парафинов в
клетку, ролью структур клеточных стенок в регуляции этого процесса,
локализацией окислительных и окислительно-восстановительных
ферментов, «перегрузкой» углеводородами отдельных органелл
и влиянием этих перегрузок на общее физиологическое
состояние микробной клетки. При этом, естественно, возникает вопрос:
может ли осуществляться транспорт в клетку питательных
веществ на уровне не только молекул, но и «капелек» парафина,
что связано с явлением пиноцитоза, ранее не известным для
микроорганизмов.
Расширение наших представлений о внутриклеточных
биохимических превращениях зависит в определенной мере от факти:
ческого материала, характеризующего так называемую статиче-
9

скую биохимию. Химический состав микроорганизмов и их
органоидов конкретизирует процессы, определяющие
жизнедеятельность микробной клетки. Например, в зависимости
от типа углеродного питания дрожжей количественно меняется
и их липидный состав. При выращивании Candida lipolytica
на среде с гексодеканом они содержали в логарифмической фазе
17,1% липидов, а в стационарной — 7,3%, в то время как при
углеводном типе питания соответственно только 6,2 и 3,6% [14].
Одновременно меняется состав жирных кислот с двойными
связями и состав клеточных стенок. Цитоплазматическая мембрана
содержит при этом наряду с нейтральными, фосфо-, глико-
и сульфолипидами также диольные липиды, в состав которых
вместо глицерина входят этиленгликоль, изопропандиол и
другие спирты.
Тонкий и специфический состав клеточной стенки и цитоплаз-
матической мембраны взаимосвязан с функцией биологического
транспорта или проницаемости их для ингредиентов
питательной среды. Так, чем больше двойных связей содержат молекулы
липидов, входящие в состав оболочки, тем менее жестка ее
структура. Наличие в клеточной системе актиномицетов или
грамположительных бактерий тейхоевой кислоты благоприятно
сказывается на ее проницаемости. Диольные соединения, как
уже отмечалось ранее, в свою очередь изменяют удельное
сопротивление биомембраны. Специфическая связь в молекуле липо-
протеидов, входящих в состав клеточной стенки, также
способствует каким-то образом выполнению ею транспортной
функции [13].
Итак, в основе жизнедеятельности клетки микроорганизмов
лежит сложная совокупность превращений веществ и энергии.
С одной стороны, в живой клетке постоянно идут процессы
распада составных частей цитоплазмы, с другой — восстановление
химического состава клетки за счет веществ, поступающих
из внешней питательной среды.
Микробная клетка сама синтезирует собственные белки,
нуклеиновые кислоты, полисахариды и другие сложные вещества.
Эти синтетические процессы неразрывно связаны с химическим
разложением больших молекул компонентов питательной среды
на мелкие и мельчайшие осколки, фрагменты. Неважно, какие
питательные вещества мы будем рассматривать—белки, жиры,
углеводы или углеводороды. Все эти исходные продукты имеют
молекулярную массу в пределах от 1000 до 100000, их
фрагменты — около 100, некоторые конечные продукты — от 20 до 40.
При химическом разложении молекул питательных веществ
энергия, скрытая в химической форме в исходном соединении,
становится легко доступной для клетки.
Исходным материалом для процессов синтеза служат
сравнительно немногие вещества — метаболиты: пировиноградная
10

кислота, ацетилкофермент А, сукцинилкофермент А, рибоза,
глицин и др. Каждый этап процесса биосинтеза катализируется
отдельным ферментом. При этом необходимо иметь в виду, что
процессы синтеза, как правило, не являются просто обращением
процессов распада.
Так, например, протеазы не участвуют в белковом синтезе,
образование нуклеиновых кислот является процессом, обратным
по отношению к действию нуклеаз, пути синтеза и распада
жирных кислот также совершенно различны.
То же самое справедливо для процессов биосинтеза и
распада аминокислот, нуклеотидов, фосфолипидов и стероидов;
установлен независимый путь синтеза гликогена, не связанный
с действием фосфорилазы.
Таким образом синтез и распад контролируются разными
специальными ферментами, что создает обособленность
механизмов, регулирующих эти противоположно направленные
процессы.
Процесс биосинтеза — это не только построение макромоле-
кулярных компонентов, но и «сборка» из них различного рода
мембран, образующих клеточную стенку и внутриклеточные
органеллы. Составляющие клетку молекулы находятся в
динамическом состоянии. Они постоянно расщепляются и
синтезируются.
В связи с этим даже покоящаяся клетка вынуждена
тратить значительную часть своей энергии на химическую работу
биосинтеза. Интенсивно размножающаяся клетка должна
выделять соответственно наибольшую часть вырабатывающейся
в ней энергии для процессов биосинтеза; так, до 90% этой
энергии расходуется на образование белков.
Из сказанного видно, насколько многообразны и специфичны
биохимические процессы, протекающие в микробной клетке. Они
могут быть познаны только на основе широких исследований
биологической структуры и физиологии клетки, ее статического
состава и динамических изменений и превращений.
В регуляции биохимических процессов ведущую роль играют
ферменты, выполняющие различные функции и локализованные
в различных клеточных структурах [8].
Ферменты как метаболиты клетки подвергаются изменениям
в зависимости от физиологического состояния и условий
культивирования живой клетки. Как правило, все ферментные системы
в клетках индуцированы в том смысле, что их образование
вызывается субстратом, промежуточными продуктами обмена,
физико-химическими условиями. Подбор активных мутантов
и условий культивирования обеспечивает усиленный синтез
соответствующих ферментов.
На этой основе организовано промышленное получение
ферментов микробного происхождения.
11

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Белозерский А. Н. Молекулярная биология — новая ступень
познания природы. Изд-во «Советская Россия», 1970.
2. Б о ген Г. Современная биология. Изд-во «Мир», 1970.
3. Д о р о х о в а Л. А. Тонкое строение репродуктивных структур актн-
номицетов. Автореферат диссертации. Изд. МГУ, 1970.
4. Имшенецкий А. А. Вестник АН СССР, № 11, 1970.
5. К о з л о в а Т. М. Структурная и ультраструктурная организация
дрожжевых организмов и ее перестройка в зависимости от физиологического
состояния. Автореферат диссертации. Институт микробиологии АН СССР, 1969.
6. К о н о в а л о в С. А., К о т о в В. Б. Селекция микроорганизмов —
продуцентов ферментов. Изд. СОНТИ ВНИИсинтезбелок, 1970.
7. К о р а н а Г. Сб. «Ферменты и синтез биополимеров». М., изд-во
«Мир», 1967.
8. Кретович В. Л. Основы биохимии растений. Изд-во «Высшая
школа», 1971.
9. Мейсель М. Н., М е д в е д е в а Г. А. и др. Сб.
«Микробиологический синтез». Вып. 8, 1—8, 1969.
10. Р у д и и Д.. У и л к и Д. Биогенез митохондрий. М., изд-во «Мир», 1970.
11. Сетлоу Р., По л л ар д Э. «Молекулярная биофизика». ИЛ, 1964.
12. К h о г a n a H. G. Journ. Am. Chem. Soc, 88, 819. 1966.
13. Lesslaner W., Wissler F. Prosons D. «Biochim Biophys.
acta», 203, 199, 170.
14. Nyns S. I., С h i a n g N., Wiaux A. L. Antonie van Leeuwenhoek.
Journ. microbiol. and serology, 34, 2. 197, 1968.

ГЛАВА I
УЛЬТРАСТРУКТУРА КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ
Клетки микроорганизмов имеют сложную структуру.
Наблюдается дифференциация в строении и специализация отдельных
структур для осуществления энергетических и синтетических
процессов. Имеющиеся данные позволяют сделать вывод, что
клетки всех микроорганизмов состоят из сравнительно
небольшого количества структурных компонентов, сходных не только
в морфологическом отношении и по субмикроскопической
структуре, но также и по своим функциям. Субклеточные компоненты
(табл. 1) играют вполне определенную роль в общей
деятельности клетки микроорганизмов. Как правило, клетки состоят
из клеточной оболочки с цитоплазматической мембраной,
цитоплазмы, внутри которой расположены ядро или ядерные
структуры, эффективно выполняющие функцию ядра (у бактерий),
митохондрии или мембранные системы (у бактерий), рибосомы
и запасные гранулы. Внутреннее строение клетки бактерии
(рис. 1) и плесневых грибов (рис. 2) более простое, чем
строение дрожжей (рис. 3).
Таблица 1
Размеры и количественное содержание субклеточных компонентов клетки [3]
Показатели
Количество в клетке . .
Ядро
1
2^-5—20
мкм
Митохондрии
500—2000
1—5 мкм
Рибосомы
5-5-50- Ю5
250А
Молекулы
ферментов
5-н50-108
20—100 А
Все субклеточные компоненты, за исключением митохондрий,
которые у бактерий не сформированы, входят в состав клеток
всех микроорганизмов.
За последнее время сравнительно хорошо изучена
структурная и ультраструктурная организация дрожжевых организмов,
13

актиномицетов и некоторых бактерий. Отдельные результаты
этих исследований мы приводим ниже.
Дрожжи имеют органоиды, присущие клеткам высших
организмов, такие, как ядра, митохондрии, рибосомы, эндоплазмати-
ческую мембрану, вакуоли и клеточные стенки. Кроме того, что
очень важно, убедительно показано наличие в дрожжевых
клетках мембранных структур аппарата Гольджи и лизосом как
гранулярного типа, так и многослойных лизосомоподобных
структур, аналогичных по
организации лизосомам
высших организмов [9, 13, 66а].
Удалось установить
наличие в дрожжевом ядре
нитей веретена и
предположить о существовании в
нем центриоли, . т. е. орга-
неллы, свойственной
животным клеткам. Центриоль
находится в цитоплазме около
ядра и формирует веретено
(ряд протоплазматических
нитей) во время митоза и
мейоза, т. е. деления
клеточного ядра в процессе
размножения клеток.
Интересно отметить, что дрож-
жеподобные клетки Histop-
lasma capsulatum также
содержат аппарат Гольджи и
кроме того, что также
представляет интерес, в ядре
этих клеток находится
плотное ядрышко [37].
Актиномицеты. С
помощью электронной микроскопии тонких срезов изучено строение
гиф 11 культур актиномицетов, относящихся к родам
Actinomyces, Micromonospora (Thermoactinomyces), Actinobifida, Ther-
momonospora, Thermopolyspora. Оказалось, что ультраструктура
гиф не имеет существенных различий не только внутр*и видов
и родов, но также у представителей различных семейств и всего
класса Actinomycetae. Строение воздушных гиф всех
исследованных актиномицетов в общих чертах одинаково [8] и
практически не отличается от структуры гиф других актиномицетов
[57, 79, 43]. Схема строения гиф, представленная на рис. 4, в
целом аналогична строению вегетативных клеток грамположи-
тельных бактерий. У всех этих микроорганизмов одним и тем же
путем происходит образование поперечных перегородок.
Рис. 1. Электронная
микрофотография ультратонкого среза сферической
бактериальной клетки:
/ — клеточная стенка, 2 — циюплазма-
тическая мембрана; 3 — диффузная
аморфная цитоплазма, 4 — нуклеоиды
(более светлые зоны).
14

При более детальном изучении можно все же подметить два
основных типа гиф, различающихся по толщине клеточной
стенки и структуре протопласта.
Гифы первого типа (см. рис. 2) имеют более толстую
клеточную стенку, достигающую 190—250 А. Центральную часть гифы
занимает ядерная зона, протянувшаяся вдоль всей клетки и
состоящая из тонких переплетенных нитей. Ядерная зона часто
примыкает к обширным внутриплазматическим мембранным
системам (ВМС), которые иногда бывают отделены от
цитоплазмы трехслойной мембраной.
Гифы второго типа (рис. 2, б) имеют более тонкие клеточные
О
стенки, достигающие 115—150 А. Менее плотные, однородные,
15

тонкозернистые участки цитоплазмы чередуются с более
плотными, состоящими из темных гранул большого размера. Ядерная
зона наблюдается в виде небольших, значительно удаленных
Рис. 3. Электронная микрофотография среза
дрожжевой клетки (по Merchant, Smith, 1967):
/ — клеточная оболочка, 2 — цитоплазматическая
мембрана, 3 — ядро, 4 — митохондрии, 5 — вакуоли, в —
эндоплазматический ретикулум.
один от другого участков, образованных переплетенными
нитями ядерного вещества. Внутрицитоплазматические мембранные
системы невелики по
размерам и образуются в
различных участках гиф.
Возможно, что указанные два типа
клеток представляют собой
лишь разные стадии
развития гиф [11].
В концевых растущих
участках обоих типов гиф
цитоплазма образована
неплотно упакованными рибо-
сомальными гранулами
различного размера.
Споры Micromonospora
vulgaris 1325 (рис. 5)
покрыты толстой оболочкой, которая состоит по крайней мере из
двух слоев: наружного, узкого и более темного, и внутреннего,
широкого и светлого. Общая толщина стенки споры 700—
1000 А.
Рис. 4. Схема строения гиф актиномице-
тов (по Дороховой, 1970 г ):
/ — клеточная стенка гифы (проростка), 2 —-
плазматическая мембрана, 3 — поперечные
перегородки, 4 -— внутриплазматические
мембранные системы, 5 ~- рибосомы, в —
вакуоли, 7 — нуклеоид.
16

Наружная оболочка споры многослойная, она или
плотно прилегает к стенке споры, или между ними образуется
темное пространство. Эти покрытия легко разрушаются
ультразвуком.
Толщина стенки споры данного организма в два и более раза
превышает толщину стенок исследованных ранее актиномице-
тов.- Так, у Act. griseus она составляет 300—400 А, у Act. viola-
о о
ceoruber — 300 А, у Act. olivaceus — 200 А и т. д.
Рис. 5. Строение спор:
/ — Micromonospora echinospora (a — схема, б, в — электронные микрофотографии)
II — Micromonospora vulgaris (схема), /// — Act. raegasporus (схема) (а —первый
тип, б — второй тип):
/ — спорангий, 2 — экзоспорнум, 3 — наружный слой, 4 — промежуточный слой; 5 -
внутренний пластинчатый слой, 6 — стенка опоры; 7 — наружное покрытие; 8 —
плазматическая мембрана, 9 — нуклеоид; 10 — рибосомы; // — вакуоли; 12 —
сердцевина; 13 — кортекс, 14 — пограничная зона между кортексом и сердцевиной
споры, 15 — внутриплазматическне мембранные системы.
По признаку общности тонкого строения спор актиномицеты
можно распределить на 3 группы.
К первой группе относятся организмы (Micromonospora
echinospora, Micromonospora melanospora, Actinobifida chromo-
gena, Thermomonospora curvata и др.), споры которых по
внутреннему строению не отличаются от вегетативных гиф, но
ограничены утолщенной стенкой. Так, например, споры
Micromonospora echinospora (см. рис. 5) окружены утолщенной стеикой,
о
размеры которой не превышают 300—400 А. Отличительной
2 Заказ 7
17

чертой спор этого организма является отсутствие слизистых
оболочек, покрывающих их снаружи.
Ко второй группе микроскопических грибов (Micromonospora
(Thermoactinomyces) vulgaris, Actinobifida dichotomica)
относятся те, споры которых по строению напоминают
бактериальные. Примером могут служить споры Micromonospora vulgaris
(см. рис. 5). Споры этого организма прежде всего ограничены
многослойными внешними покровами, состоящими из иаружно-
о
го плотного слоя (180—210 А), повторяющего внешнюю форму
спор; промежуточного, менее плотного слоя неодинаковой
толщины; внутреннего пластинчатого слоя, состоящего из чередую-
о
щихся с периодичностью приблизительно 60 А светлых и темных
зон; диффузионного слоя, содержащего очень мелкие плотные
гранулы различной формы и размеров, и толстого светлого
неструктурированного кортекса. По строению Micromonospora
vulgaris напоминают споры бактерий рода Bacillus и
Clostridium [93, 42].
И, наконец, к третьей группе актиномицетов (Act. megaspo-
rus, Micropolyspora viridinigra, Act. curvata и др.) относятся
организмы, споры которых по строению отличаются от
указанных выше, а также различаются между собой. Споры Act. mega-
sporus (см. рис. 5) имеют многослойные наружные покрытия.
о
Стенка их толщиной 400—600 А состоит из трех слоев [11, 56].
Цитоплазма спор, как это показано у Micropolyspora recti-
virgula [11], образована мелкими, темными, плотно
упакованными рибосомальными гранулами.
Ядерное вещество образует участки различных размеров
и конфигурации. Внутрицитоплазматические мембранные
системы хорошо развиты, образуя структуры различных размеров
и рисунка; часто они примыкают или выглядят заключенными
в ядерное вещество.
Бактерии. Бактериальные клетки, как и клетки многих других
микроорганизмов, имеют оболочку, цитоплазматическую
мембрану, цитоплазму, ядерный аппарат с фибриллярной
структурой и цитоплазматические включения. У некоторых бактерий,
и, в частности, Вас. subtilis, обнаруживается сферическое
образование, состоящее из мембран, закрученных в завиток,— мезо-
сома. Мезосомы наблюдаются в момент деления и
располагаются около клеточных перегородок.
Клеточная стенка Вас. subtilis имеет два слоя: наружный
и внутренний (рис. 6). Затем слои расходятся так, что наружный
продолжает ход клеточной стенки, а внутренний как бы
врастает в клетку, отделяя полость с содержимым от цитоплазмы
[29]. Цитоплазматическая мембрана меняет свое направление
и, изгибаясь, повторяет ход внутреннего слоя клеточной стенки.
18

Цитоплазматическая мембрана, состоящая из трех слоев,
отделена от клеточной стенки неравномерным промежутком.
Таким образом, клеточная стенка изменена, разрыхлена, в ряде
случаев наблюдается расхождение ее слоев с образованием
полостей, заполненных фибриллярно-гранулярным содержимым.
На поверхности клеток имеется микрокапсула, состоящая из
фибриллярных и пузырьковидных элементов и части
клеточной стенки.
Рис. С. Электронпомикроскопические фотографии Вас. subtilis (по Смирновой
и Кушиареву, 1970):
а (I и II) — ультратоикнй срез клетки (190000 и 120000 X); б — то же. поверхность
клетки покрыта пузырьковидными н фибриллярными выростами, образующими
микрокапсулу (60000Х); а, г — промежуток между цитоплазматической мембраной и
клеточной стеикой заполнен перемычками, которые вплетаются в разрыхленную клеточную
стенку и контактируются с микрокансулон; d — видиы полости, содержащие
фибриллярно-гранулярное вещество; стрелкой указана граница, разделяющая клеточную
стенку на наружный и внутренний слой, цитоплазматическая мембрана повторяет изгиб
внутреннего листка клеточной стенки (I62000X); е — видна обширная полость с
фибриллярно-гранулярным содержимым, ограниченная двумя слоями клеточной стенки
(«0000 X):
/ — клеточная стенка, 2 — микрокапсула, 3 — цитоплазматическая мембрана, 4 —
нуклеонд (ядро с фибриллярной структурой), 5 — мезосомы, 6 — растущая поперечная
перегородка.
Цитоплазма состоит из плотно упакованных рибосом; нук-
леоид занимает центральную часть клетки.
Внутренняя структура автотрофа Thiobacillus ferrooxidans
оказалась более сложной, чем гетеротрофных грамотрицатель-
ных бактерий. Клеточная стенка этих бактерий состоит из трех
2*
19

слоев [88] толщиной по 100 А (по данным других
исследователей — из 6 слоев [1,2, 40]).
Цитоплазматическая мембрана трехслойна и состоит из двух
о
электронноплотных (15—20 А) и одного электроннопрозрачного
о о
слоя (20—25 А) и имеет толщину 50—57 А. Такое строение
цитоплазматической мембраны типично и для других бактерий.
Клетки данной бактерии (рис. 7) богаты внутриклеточными
мембранными структурами.
Рис. 7. Строение клеток Thiobacillus ferrooxidans (по Авакян, Каравайко,
1970):
а — схема клеточной стенки; 6 — схема клетки: / — наружная трехслойная мембрана
клеточной стенки, 2 — электроннопрозрачный слой, отделяющий клеточную стенку от
цитоплазматической мембраны, 3 — электроннопрозрачный слой, 4 — электронноплот-
ный средний слой, 5 — цитоплазматическая мембрана, 6 — электронноплотные
включения, 7 — включения, имеющие внутреннюю структуру, 8 — включения, имеющие
ножку, 9 — рибосома, 10 — мембранные структуры, // — структуры типа мезосом,
12 — ннти ДНК, 13 — ядерная область.
Обнаружены два типа мембранных структур. Первый тип
состоит из 7 трехслойных мембран, тянущихся вдоль клетки
и, возможно, связанных с цитоплазматической мембраной;
второй—мезосомы— представляет собой сложные образования,
связанные с цитоплазматической мембраной. Протоплазма имеет
сравнительно высокую плотность за счет содержания большого
о
количества гранул размером 100—190 А, большинство которых
по величине и форме соответствует рибосомам. Клетки богаты
также и другими включениями разной формы и размера.
Некоторые включения покрыты мембраной с выраженной, хотя
и слабо, внутренней структурой. По всей цитоплазме расположен
нуклеоид [1, 2, 40].
Хорошо изучена клеточная структура бактерии Mycoplasma
gallisepticum (рис. 8). Клетка окружена липопротеидной оболоч-
20

кой и содержит рибосомы. Несмотря на малые размеры клеток
(около 0,25 мкм в диаметре '), в них обнаружено около 40
различных ферментных систем, что указывает на огромную
сложность биохимических процессов, осуществляемых в
элементарных структурах [28].
Все субклеточные структуры заключены внутри системы
мембран, которые также можно отнести к наиболее типичным
компонентам клетки. К
мембранной системе
относятся цитоплазма-
тическая мембрана,
мембраны,
окружающие ядро,
митохондрии, вакуоль, эндо-
плазматический рети-
кулум, мембранная
система аппарата Голь-
джи, а также нити
веретена, определяющие
движение хромосом
при митозе и мейозе.
Даже клеточная
стенка в известном смысле
может являться
субклеточным
компонентом.
Эти мембраны
выполняют
специфическую роль в процессе дыхания: большая поверхность их
повышает интенсивность дыхания и фосфорилирования по сравнению
с другими процессами, происходящими в клетке.
КЛЕТОЧНАЯ СТЕНКА
Основным структурным компонентом клетки большинства
микроорганизмов, за исключением некоторых простейших и ми-
коплазм, является клеточная стенка. Оболочка
микроорганизмов — довольно плотная, прочная и эластичная структура. Как
правило, она состоит из трех слоев (рис. 9) и представляет
собой некое подобие сетки. В ее состав входят углеводы, белки
и липиды главным образом в виде комплексов муко- и липопро-
теидов. Внутренний двойной ряд фосфолипидных молекул
связан между собой, по-видимому, углеводородными цепочками,
1 Размеры бактерий Mycoplasma gallisepticum были установлены с
помощью мембранных фильтров с градуированным диаметром пор.
21
Рис. 8. Схема клетки Mycoplasma
gallisepticum:
/ — липопротеидная оболочка; 2 — рибосома,
3 — растворимая РНК, 4 — растворимый белок,
5 — ДНК, 6 — метаболиты (точки).

как это установлено, например, в цитоплазматических и мито-
хондриальных мембранах.
Толщина клеточной стенки различных микроорганизмов не-
о
одинакова: у дрожжей она составляет 135—230 А, бактерий
о о
около 200 А, гиф микроскопических грибов 115—250 А. В сред-
Рис. 9. Схематическое изображение сложной трехслойной клеточной стенки
граммотрицательных бактерий (а) и структуры гликопротеида микробной
клеточной стенки (б):
а (по Martiny, 1963): / — липопротеидиый слой, 2 — липополисахаридиый слой. 3 —
белковые гранулы, 4 — мукополимер, 5 — цитоплазматическая мембрана (3, 4, 5 —
регидиый слой); Пен — пенициллин (вызывает также деполимеризацию мукополимера
в регидиом слое), Л — лнзоцнм в присутствии Э (ЭДТУ — этилеидиамиитетрауксусной
кислоты, Я — протеаза;
б (по Шарону, 1970): 1 — ацетилмурамован кислота, 2 — ацетилглюкозамин, 3 —
пептидная цепь, 4 — пентаглициновый мостик;
в — схематическое изображение структуры мембраны, состоящей из двух слоев белка,
разделенных бимолекулярными слоями липида: 1 — молекулы белка, 2 — гидрофильная
часть молекулы липидов, 3 — ферменты;
г — микрофотография трехслойной мембраны — светлая линия внутри и две темные
плотные линии по обе стороны от нее.
нем толщина клеточной стенки составляет около 1 % общей
толщины микробной клетки. Исключением являются только
патогенные бактерии [8, 40] и зеленые серобактерии [8, 24], толщи-
о
на оболочек которых составляет 80—90 А, а также нитчатые
серные бактерии Beggiatoa [65, 66], которые, наоборот, имеют
22

наиболее мощную стенку, превышающую 1000 А. Клеточная
стенка составляет около 20—30% сухой массы клетки, а у
Streptococcus faecalis — даже 38%. Однако в зависимости от
возраста микроорганизма и условий его культивирования масса стенки
может варьировать в широком диапазоне — от 10 до 50% массы
клетки [266].
Сравнивая строение клеточных стенок микроорганизмов,
относящихся к различным систематическим группам, можно легко
убедиться в отсутствии строго единой организации ее. В то же
время у всех микроорганизмов клеточная стенка имеет сложно
и тонко организованную структуру, состоящую, как уже
отмечалось, из нескольких молекулярных слоев. Морфологически
наиболее сложную структуру имеют дрожжевые клетки, многие
бактерии и гифы микроскопических грибов, относительно
простую— стенки патогенных и некоторых других грамотрицатель-
ных бактерий, например, гетеротрофных видов псевдомоносов,
выделенных из морей [113]. Клеточные стенки бактерий Thioba-
cillus ferrooxidans, а также Th. thiooxidans близки, однако
отличаются от других бактерий [64]. По своему строению они ближе
о
всего к стенкам Escherichia coli (толщина оболочки 150 А),
Nitrosomonas (160—220 А) и Nitrobacter (130—160 А) [1].
Клеточные стенки бактерий, использующих метан, например
Methylococcus capsulatus, также представляют собой сложную
структуру, включающую основной плотный слой (толщина около
о
30 А) и два более узких плотных слоя, внешних по отношению
к основному и отделенных от него прозрачными зонами. Общая
о
толщина стенки 150—180 А [84]. Снаружи от клеточной стенки
расположены накладывающиеся один на другой слои,
являющиеся веществами капсулы.
Клеточная стенка, являясь прочной структурой,
обусловливает относительное постоянство формы микроорганизмов. Она
выдерживает значительное осмотическое давление,
обусловленное растворимыми веществами, содержащимися внутри хрупкой
цитоплазматической мембраны. Обладая свойством
избирательной проницаемости по отношению к питательным веществам
среды, мембрана тем самым эффективно концентрирует
метаболиты, вследствие чего осмотическое внутриклеточное давление
может достигать 20 атм. Естественно, что такое давление может
выдержать только клеточная стенка.
В то же время клеточную стенку микроорганизмов можно
рассматривать и как один из наиболее важных органоидов,
принимающих участие в обмене веществ [1]. На электронномикро-
скопических фотографиях (рис. 10) иногда удается заметить,
как клеточная стенка отчетливо разделяется на два слоя:
наружный и внутренний, причем последний слой как бы врастает
23

в клетку и сливается с цитоплазматической мембраной. В свою
очередь было замечено, что трехслойная цитоплазматическая
мембрана клетки Вас. subtilis отделена от клеточной стенки
неравномерным промежутком, или перемычками, вплетающимися
в клеточную стенку и образующими единую систему {29].
Аналогичная взаимосвязь между цитоплазматической мембраной
и клеточной стенкой была замечена и у токсигенного штамма
Рис. 10. Электронные микрофотографии:
а — сверхтонкого среза клети Escherichia coli (105000X). / —
внешняя оболочка, отделенная от цитоплазматической
мембраны, 2 — клеточная мембрана:
б — группы клеток; участки сосредоточения ДНК
(светлые области).
Clostridium perfringens [16, 17]. Таким образом, можно полагать,
что клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана и
цитоплазма, физиологические функции которых четко
координированы и взаимообусловлены, представляют собой единое целое.
Клеточная стенка хорошо обеспечивает проникновение, или
транспорт, в клетку не только индивидуальных питательных
ингредиентов на молекулярном уровне, т. е. путем диффузии
через «поры» в ней. Известно также, что многие другие
вещества перемещаются р клетку через липопротеид мембраны с
помощью механизма, известного под названием активного переноса.
Более того, дрожжевые и бактериальные клетки, например,
могут размножаться и вследствие контакта с крупными каплями
или твердыми частицами парафинов. При этом клетки
непосредственно прилегают к каплям парафина и прорастают внутрь'их.
В этих условиях парафины адсорбируются на стенках и даже
24

частично пропитывают их и, возможно, растворяются в липидах,
тем самым изменяя свои физико-химические свойства. На
границе между стенками и наружной цитоплазматической
мембраной происходят, по-видимому, начальные этапы окисления;
здесь локализуются и соответствующие ферменты. Тем самым
клеточная стенка в какой-то мере регулирует проникновение
углеводородов в цитоплазму, хотя при этом они и не
подвергаются существенным изменениям [20]. Таким образом, условия
культивирования оказывают влияние на состав, структуру
и свойства клеточной стенки.
Структура клеточной стенки микроорганизмов обеспечивает
не только транспорт питательных веществ в клетку, но и
экскрецию, т. е. удаление из нее неиспользуемых продуктов обмена,
в том числе и многих гидролитических ферментов, органических
кислот и др. Предполагают, что в клеточной стенке некоторых
микроорганизмов имеются каналы, через которые могут
выходить макромолекулы [65]. Такие каналы были обнаружены также
в клеточной стенке Clostr. perfringens, продуцирующей токсин
[16, 17]. Клеточная стенка клетки Вас. subtilis также пронизана
мембранными элементами, выходящими из подстеночного
пространства, через которые секрецирует щелочная фосфатаза [29].
Клеточная стенка над скоплением фермента, вероятно,
разрушается литическими ферментами, обнаруженными у Вас. subtilis
[115], с последующим восстановлением нормальной структуры.
Это еще раз указывает на высокую пластичность и
приспособляемость микроорганизмов. Как известно, многие
микроорганизмы наряду с фосфатазой интенсивно синтезируют и другие
внеклеточные ферменты: амилазу, протеиназу, пектиназу, цел-
люлазу, лизирующие ферменты и др.
Капсулы и слизистые слои. На жесткой клеточной стенке
многих микроорганизмов расположены капсулы и слизистые слои
(см. рис. 9). Подобно придаткам клеточной поверхности, их
можно удалить, не нарушая жизнеспособности микроорганизма.
Аналитически различают макрокапсулы, которые видны в
световой микроскоп (толщина их по крайней мере 0,2 мкм) и имеют
определенную внешнюю структуру; микрокапсулы,
представляющие собой слой толщиной менее 0,2 мкм и, следовательно,
неразличимые с помощью светового микроскопа (их
идентифицируют иммунологически).
Слизистые слои концентрируются на поверхности
микроорганизма, анатомическое значение их невелико [113а].
Микроорганизмы, способные к образованию капсул, часто
выделяют слой слизи, сходный, по-видимому, по составу с
материалом капсул. Полагают, что капсулы удерживаются на
клеточной стенке в основном с помощью ионных связей, однако
у некоторых микроорганизмов могут существовать ковалентные
связи между компонентами капсулы и клеточной стенки. На-
25

пример, полисахарид, выделенный из капсул Вас. anthracis,
содержал ковалентно связанный гликопептид [90а].
Микрокапсула гемолитического стрептококка группы А
также прочно связана с поверхностью клеточной стенки [126].
Наиболее широко распространенными органическими
компонентами капсул и слизистых слоев являются полисахариды:
глюканы, маннаны, галактаны и др. [96а]. Из них наиболее
изучены глюканы, которые образуются, часто в больших
количествах, в культурах видов Leuconostoc и Pediococcus. Они
представляют собой разветвленные молекулы с преобладанием
а-1,6-связей, но содержат также и а-1,3 и а-1,4-связи [75а].
Некоторые виды Bacillus имеют капсулы, главным
органическим компонентом которых является полиглютаминовая
кислота как таковая или в комплексе с полисахаридом. Некоторые
стрептококки имеют капсулы, содержащие белок, являющийся
М-антигеном данных бактерий.
Макромолекулы, расположенные на поверхности клеточной
стенки или капсулы, заряжены, как правило, отрицательно, так
как среди клеточных компонентов, образующих эту поверхность,
присутствуют соединения, изоэлектрическая точка которых
лежит в кислой зоне рН. Высокий отрицательный заряд мукосоеди-
нений, как это отмечается в следующей главе, определяет,
вероятно, отрицательный заряд клеточной поверхности в целом.
За одним или двумя исключениями (виды Spirochaeta)
отдельные организмы не поляризованы, так как заряд распределяется
равномерно по всей клеточной поверхности [58а].
Электрофоретическая подвижность клетки зависит от ионной
силы и значения рН среды, вида и возраста микроорганизма.
Например, наименьшая электрофоретическая подвижность
Escherichia coli наблюдается в течение ранней
экспоненциальной фазы роста.
ПРОТОПЛАСТ
Клеточную оболочку можно разрушить различными путями
[102а, 1136]. Однако наиболее мягким и перспективным методом
является ферментативный, с использованием лизоцима,
получаемого из клеток ряда микроорганизмов [69, 41, 6а, 14а, 102а]
или пищеварительного сока улитки Helix pomatia [46a, 91, 60,
12а]. С помощью этих ферментов удалось выделить и растворить
клеточные стенки и определить их состав, а также получить
протопласт. Лизирующие ферменты расщепляют полисахаридный
скелет гликопептида, состоящего из чередующихся звеньев
N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты,
связанных р-1,4-связями.
Однако большой чувствительностью к действию лизоцима
обладают стенки только ограниченного числа бактерий — Вас.
26

H NHCOCH3 H О NHCOCHj H NHCOCHj.
Н3С- СН
I
СО
I
L— Ала
I
D—■ Глу
м»о— дак
I
D— Ала
Структура фрагмента гликопептида выделенного из клеточных стенок Esch.
coli: стрелкой указана гликозидная связь, которая разрывается под действием
лизоцима; Ала — аланин, Глу — глютаминовая кислота, ДПК — диаминопиме-
линовая кислота.
megaterium, Micrococcus lysodeikticus, Sarcina lutea. Правда,
протопласты других штаммов бактерий, в частности, грамотри-
цательных, могут быть получены при одновременной обработке
ЭДТА (этилендиаминтетраацетат) или додецилсульфатом
натрия в трансбуфере определенного рН и лизоцимом. Некоторые
грамположительные организмы, например, Staphylococcus aureus
разрушаются лизоцимом только после предварительной
обработки клеток 10%-ной трихлоруксусной кислотой, которая
экстрагирует из клеточной оболочки тейхоевые кислоты [66а, 906].
Для выделения протопластов дрожжей и мицелиальных
грибов используется фермент—стрепзим, образуемый одним из
видов рода Streptomyces.
Итак, протопласт представляет собой клетку, лишенную
клеточной стенки, снаружи ограничиваемую цитоплазматической
мембраной. Таким образом, протопласт состоит из мембраны
и содержимого цитоплазмы. Если растворить лизирующими
ферментами или механически разрушить клеточную оболочку,
то можно выделить протопласт в неповрежденном виде (L-фор-
мы). Однако протопласт бактерий в таких условиях принимает
сферическую форму. Протопласт в осмотически уравновешенной
среде (содержащей 3—20% сахарозы), по-видимому, сохраняет
основные функции целой клетки, в том числе способность к
росту и делению, однако отмечаются иногда и некоторые
морфологические отклонения. Деление может происходить путем
процесса, напоминающего почкование дрожжей, с образованием
очень мелких, даже фильтрующихся форм.
Бактерии, утратившие в силу разных причин способность
к образованию клеточной стенки и полностью лишенные ее, на-
27

зывают также протопластами (PPL01 или L-форма). В
некоторых случаях клеточная оболочка исчезает неполностью. Такую
клетку называют сферопластом. Очень часто и протопласт
называют сферопластом. Пока отсутствуют удовлетворительные
методы фиксации протопластов для электронномикроскопических
исследований [15]. Обычно применяемые методы фиксации
приводят к повреждению структуры. Например, протопласты,
фиксированные четырехокисью осмия или перманганатом, ведут
себя как очень электронноплотные сферические тельца, лишенные
клеточной стенки [74, 55]. Фиксация с помощью глутаральдегида
[112] обеспечивает получение протопластов с нормальным
строением. Это позволяет протопластам сохранить способность
к последующей регенерации, т. е. синтезу de novo клеточной
стенки и образованию в итоге нормальных клеток [73, 104, 68,
74, 75]. Как правило, в протопластах содержится меньше
соединений, чем в целых клетках. Так, например, они содержат на
50—80% меньше полисахаридов, несколько меньше белка и лн-
пидов [60]; уменьшение количества белков объясняется в
значительной степени переходом в раствор ферментов,
локализованных на поверхности клетки [45, 108, 111, 116].
В протопластах Sacch. mellis [111] содержится несколько
меньше неорганического полифосфата и ортофосфата, чем в
целых клетках. Протопласты Endomyces magnusii содержат
меньше общего фосфора [15], а также несколько меньше нуклеотидов,
особенно нуклеозидди- и трифосфатов. По-видимому, эти
соединения локализуются на поверхности клетки и участвуют
в построении клеточных стенок [15]. Поверхностную
локализацию полифосфатов в клетках дрожжей отмечали и другие
авторы [103].
Протопласты, полученные из клеток Neurospora crassa,
содержат почти все фосфорные соединения клеток, включая
нуклеиновые кислоты, фосфолипиды и солерастворимые
полифосфаты. Исчезают в них только высокомолекулярные
полифосфаты, экстрагируемые щелочными растворами и горячей хлорной
кислотой, а также уменьшается содержание АТФ и других
нуклеозидди- и трифосфатов.
КЛЕТОЧНЫЕ МЕМБРАНЫ
В состав клеточных мембран, как уже отмечалось ранее,
входят митохондриальные, ядерные, цитоплазматические, а
также мембранные компоненты эндоплазматического ретикулума
и других внутриклеточных органелл. До сравнительно недавне-
1 PPLO, РРО или L-форма, т. е. особая форма бактерий, лишенных
клеточной оболочки и сходных с возбудителями плевропневмонии (Pleuropneumo-
nialike organisms).
28

го времени считали, что мембраны построены из двух
мономолекулярных слоев липидов, связанных гидрофобными группами
и покрытых с обеих сторон монослоями белка {89].
Предполагалось, что белок, входящий в состав мембраны, находится в
растянутой по поверхности липида форме и имеет Х-конфигурацию.
Это основывалось на том факте, что клеточные мембраны
состоят главным образом из белка (60—65%) и липидов (35—40%)
и имеют, по данным электронной микроскопии, трехслойную
структуру [89, 63].
В последние годы получила признание гипотеза глобулярного
строения мембраны, согласно которой признается, что мембраны
составлены из цепочки глобул, представляющих собой мицеллы
липида. Между этими глобулами вкраплены ферменты [97, 77].
В дальнейшем глобулярность мембран была обоснована и
уточнена. Оказалось, что глобулы имеют не липидную, а белковую
природу [50, 51]. Фосфолипиды, взаимодействуя с глобулярными
субъединпцами мономолекулярного белкового слоя, как бы
пропитывают их поверхность (см. рис. 9).
Электронномикроскопические наблюдения показали, что ци-
топлазматическне мембраны Micrococcus lysodeikticus,
лишенные фосфолипидо^ (ацетоном, этанолом или метанолом),
сохраняют целостность, а субъединицы белка, которые входят в их
состав, могут быть диссоциированы под действием лаурилсуль-
фата натрия и вновь агрегированы при диализе [52].
Фосфолипиды не входят в средний слой мембраны, а смазывают
мономолекулярный слой белка с обеих сторон. Следовательно,
структурный белок составляет основу мембраны и создает целостность
всей структуры, причем как интегральный элемент он участвует
в некоторых ферментных системах мембран [92]. Белок, но-види-
мому, выполняет не только функцию поддержания структуры
мембраны, но одновременно оказывает аллостерическое,
регулирующее влияние на ферментные системы, локализованные
в мембране.
Цитоплазматическая мембрана
Как можно заметить на многих рисунках, мембрана залегает
о
непосредственно под стенкой клетки; толщина ее около 120 А.
У микоплазм, как уже отмечалось, клеточная стенка
отсутствует, поэтому цитоплазматическая мембрана представляет собой
самую наружную структуру клетки. У некоторых простейших
клеточная стенка также отсутствует, но цитоплазматическая
мембрана, известная обычно как плазмалемма, покрыта слизью,
состоящей, вероятно, из мукопротеида.
Основная функция цитоплазматической мембраны
заключается в регулировании проникновения в клетку питательных
29

веществ. В жизни микроорганизмов и прежде всего
бактериальной клетки липопротеидная цитоплазматическая мембрана
выполняет тем самым исключительно важные функции. Этим,
вероятно, и объясняется, что отношение площади, занимаемой
цитоплазматической мембраной, к объему клетки в 10, раз
превышает соответствующую величину для животной клетки [7].
Во всех бактериальных клетках имеется сходная по строению
о
цитоплазматическая мембрана толщиной 75—80А. С ней
анатомически связаны мембранные образования (мезосомы), весьма
разнообразные по структуре. При участии цитоплазматической
мембраны и мезосом осуществляется деление бактериальной
клетки и спорообразование. При делении клетки грамотрица-
тельных бактерий (Spirillum serpens, E. coli и др.), мезосомы
которых развиты слабо или даже отсутствуют, наблюдается
инвагинации цитоплазматической мембраны, т. е. впячивание
участка ее внутрь (цитоплазмы), с образованием двуслойной
чашевидной структуры, напоминающей мезосомы грамположи-
тельных бактерий.
Также отмечается, что синтез белка идет быстрее в
рибосомах, сохранивших связь с цитоплазматической мембраной
и внутренними мембранами в препаратах, полученных из клеток
Streptococcus faecalis [38] и других бактерий [53]. Полисомы
связаны с цитоплазматической мембраной или с внутренними
мембранами клетки Bacillus cereus [82]. Аппарат для синтеза рибо-
сомальной РНК также, по-видимому, связан с мембранами [76].
По-видимому, митохондрии и мембранные образования несут
в себе как черты сходства, так и различия [7]. Возможно, что
мембранные образования не являются обязательным элементом
структуры бактерий, а представляют собой средство усиления
отдельных важных в данный момент функций
цитоплазматической мембраны [71]. Пока отсутствуют методы, которые
позволили бы дифференцировать препаративно отдельные локусы
ферментов в мембране и изолировать мембранные образования
(мезосомы). В то же время систему мембран аэробных и
большинства факультативно-анаэробных бактерий можно,
по-видимому, рассматривать как функциональный аналог митохондрий,
однако функции бактериальных мембран более широкие и
связаны с процессами деления, спорообразования, формирования
клеточной стенки, биосинтеза белка и других полимеров.
По-видимому, все мембраны клеток имеют довольно сходное
строение. Например, клеточную мембрану бактерии считают
аналогом внутренней мембране митохондрий. Состав липидов
их почти одинаков.
Итак, в клетке микроорганизмов цитоплазматическая
мембрана выполняет следующие основные функции: 1) действует
как осмотический барьер организма; 2) выступает как органел-
30

ла, концентрирующая внутри клетки питательные вещества
и способствующая выведению наружу продуктов обмена;
3) представляет собой место, где-происходит биосинтез
некоторых составных частей клетки, особенно компонентов клеточной
стенки и капсулы; 4) является местом локализации некоторых
ферментов органелл, таких, например, как рибосомы [266].
Сборка плазматической мембраны
Поскольку клетки микроорганизма Mycoplasma laidlawii
не содержат оболочки и плазматическая мембрана их обнажена
[86], то именно на этом организме и удалось впервые осуществить
реконструкцию мембраны in vitro [87]. Изолированные
плазматические мембраны после обработки детергентом
диссоциируются на липопротеидные комплексы и субъединичный материал
с константой седиментации около 3S [90]. При диализе солюби-
лизированной (додецилсульфатом натрия) мембраны против
буфера, не содержащего ионов Mg++, образуются лишь очень
малые агрегаты, состоящие из липопротеидного комплекса
с константой седиментации 4,4—4,8S, и только добавка ионов
Mg++ обеспечивает образование мембранной структуры [106, 47],
соответствующей по составу аминокислот и содержанию гексо-
замина исходной мембране [47].
Было осуществлено изолирование плазматической мембраны
Micrococcus lysodeikticus с последующей ее реконструкцией [44,
52]. Мембраны и здесь были диссоциированы детергентом (ла-
урилсульфатом натрия) и затем реагрегированы при диализе
против нейтрального буфера, содержащего двухвалентные ионы.
При этом белковая часть была отделена от липидов, затем
диссоциировали белок до субъединиц и, проведя диализ против
буфера, получили белковую мембрану, которая имела трехслойное
строение.
Проблема сборки мембран только начата, и изучение ее
потребует больших усилий.
ЦИТОПЛАЗМА
Цитоплазма представляет собой сложную по составу
коллоидную систему. Обычно она бывает прозрачной, водянистой или
слегка вязкой, на вид однородной.
При старении клетки цитоплазма становится гетерогенной.
В ней образуются вакуоли, наполненные клеточным соком.
Кроме того в цитоплазме могут быть суспендированы гранулы
различных соединений: запасных питательных веществ
(углеводы), кристаллики солей, серы (у серобактерий), жиров,
пигментов. Среди отложений представляют интерес включения,
называемые волютиновыми зернами, и представляющие собой нуклео-
31

протеиды. Эти зерна чаще всего располагаются на концах
бактериальных клеток и хорошо видны под микроскопом.
Многие более мелкие гранулы имеют непосредственную связь с
ферментами и их активностью.
Как видно из схематического изображения клетки
Escherichia coli (рис. 11), приблизительно Vs часть внутреннего объема
клетки занята ДНК- Вокруг области, занятой ДНК,
располагается 20000—30000 рибосом, которые, как известно, состоят из
белка (около 40%) и РНК (около 60%)- Остальное пространство
Рис. 11. Схематическое изображение клетки Escherichia coli:
/ —клеточная оболочка {толщина 100 А), 2 — клеточная мембрана (толщина 100 А);
3 — ферменты дыхательной цепн. 4 — хромосома длиной Ю7 А, прикрепленная к
клеточной мембране, 5 — полирибосома ■. 6 — отдельная рибосома, 7 — растворимые
ферменты. 8 — молекула м-РНК. 9 — малые молекулы.
в клетке занимают вода и растворенные в ней ферменты, а
также большое число различных малых молекул [25]. Участки
сосредоточения ДНК хорошо просматриваются на электронной
микрофотографии группы клеток Е. coli (см. рис. 10).
Разнообразный состав цитоплазмы уже предопределяет активность
микробной клетки.
В цитоплазме содержатся и другие исключительно
биологически важные гранулы или органеллы; митохондрии, рибосомы,
лизосомы. Как указывалось ранее, в химическом отношении
цитоплазма представляет собой сложную смесь белков, нуклеопро-
теидов, нуклеиновых кислот, жиров, углеводов, аминокислот
и многочисленных других органических соединений,
минеральных веществ и воды. Значительная часть органических веществ
находится в коллоидальном состоянии. В цитоплазме с ее
органоидами, микроскопическими и субмикроскопическими
включениями протекают в основном важнейшие ферментативные
реакции. Цитоплазма непрерывно изменяется, поглощает новые
вещества, подвергает их разнообразным химическим изменени-
32

ям, образуя новую цитоплазму, и превращает в кинетическую
энергию потенциальную энергию, заключенную в крупных
молекулах белков, жиров, углеводов, по мере того как эти вещества
превращаются в другие, более простые соединения.
Протоплазма бактериальных клеток отличается высокой
интенсивностью обмена, тогда как цитоплазма спор, наоборот,
имеет столь низкий уровень обмена, что его с трудом можно
обнаружить. Даже в пределах одного вида организмов
интенсивность обмена может меняться в зависимости от таких факторов,
как возраст, состав среды, содержание кислорода и др.
ЯДРО И ЯДЕРНЫЕ СТРУКТУРЫ
Ядро. Многие микроорганизмы и прежде всего дрожжи
имеют ядро в форме округлого или овального пузырька,
окруженного очень нежной оболочкой (см. рис. 3). Внутри ядра
содержатся хромосомы, представляющие собой нитевидные или
палочковидные тельца, "в составе которых заключена вся
клеточная ДНК- В определенных участках (локусах) хромосомы
расположены гены. Таким образом, хромосомы являются
наиболее значительными компонентами ядра, а из находящихся в них
веществ наибольшее значение имеет ДНК-
Одна из главных особенностей ядра связана с
изменчивостью хромосом. В ядре найдены ферментные системы,
участвующие в синтезе ДНК и РНК; другие ферменты не установлены.
ДНК не только воспроизводит себе подобную молекулу,
но и служит кофактором, обеспечивающим синтез АТФ наряду
с образованием РНК, и белков. Отмечается исключительное
постоянство ДНК в одном ядре клеток.
Кроме ДНК и основных белков гистонов в ядре находится
в небольшом количестве также и РНК, которая, по-видимому,
синтезируется на ДНК. Но РНК в отличие от ДНК содержится
и в цитоплазме, где она, вероятно, регулирует синтез ферментов
и других белков. Однако жизненно важные функции РНК
контролируются ядерной ДНК. Таким образом, роль ядра в
основном ограничивается функциями хранения и передачи
генетической информации при делении клетки. Если ядерная оболочка,
состоящая из двух элементарных мембран, удерживает
хромосомы и другие крупные компоненты, то ее поры обеспечивают
обмен между цитоплазмой и ядром. Через эти поры поступают
в ядро небольшие молекулы, такие, как «строительные блоки»
для синтеза хромосом, а из ядра в цитоплазму выходят ядерные
продукты — РНК и рибосомы. Наружная ядерная мембрана
обычно непосредственно переходит в тяжи эндоплазматической
сети.
Ядерные структуры бактерий. Длительное время ученые
сомневались в наличии дифференцированного ядра в клетке бак-
3 Заказ 7
33

терий, предполагая, что ядерная субстанция их рассеяна по всей
клетке. И в настоящее время достоверно еще не доказано
наличие ядра у бактерий. Однако все же можно считать, что ядро
бактерий, в отличие от других одноклеточных организмов,
обнаруживается в виде структур, расположенных диффузно
(«диффузное ядро»), некомпактно, в беспорядке. Эти структурные
частицы имеют зернистую или волокнистую форму,
по-видимому, представляющую собой ядерное вещество, расположенное
более или менее в центре клетки и не имеющее какой-либо четкой
границы типа ядерной мембраны. Другие исследователи
отмечают, что бактериальное ядро состоит из мельчайших частиц
ядерного материала или гранул хроматина ', прикрепленного
к нитям, спутанным между собой и напоминающим бусы. Перед
делением бактериальной клетки отдельные гранулы хроматина
объединяются в ядра и делятся амитотически, т. е.
перетягиванием посередине и прямым раздваиванием. Таким образом, хро-
матиновые зерна, дифференцируясь («отмежевываясь») от
остальной цитоплазмы, образуют большие скопления и становятся
видимыми в электронном микроскопе.
Многие исследователи обращают внимание на тот факт, что
имеющаяся в бактериальных клетках ДНК располагается
и группируется именно в тех местах, которые соответствуют
клеточным ядрам, или ядерным вакуолям. Но так как отчетливую
ядерную оболочку обнаружить не удалось, то Колленбургер ввел
термин нуклеоплазма, которым обозначаются те структуры
клеток бактерий, которые содержат ДНК и соответствуют ядрам.
Применяют также термин нуклеоид, чтобы подчеркнуть разницу
между этим образованием и настоящим клеточным ядром —
nucleus. Ядерная вакуоль представляется наполненной тончай-
о
шими нитями диаметром 30—50 А, сложное переплетение
которых и образует нуклеоид [39, 73, 15, 21]. Следовательно, нуклеоид
бактериальной клетки состоит из пучков нитей разной толщины.
Минимальный диаметр их соответствует поперечному диаметру
ДНК, а распределение более толстых нитей имеет ряд
максимумов. Возможно, что бактериальная хромосома состоит из
параллельно лежащих и рыхло упакованных однотипных спиралей
ДНК, окруженных белковыми оболочками, или из одиночных
дезоксирибонуклеопротеидных цепочек. За последнее время
установлено, что одна молекула ДНК физически соответствует
одной хромосоме не только в клетках вирусов, но и бактерий,
и даже высокоорганизованных животных. Однако некоторые
авторы считают, что хромосома бактерий может состоять не
менее чем из 200 молекул ДНК [4]. Если нуклеоид представляет
1 Хроматин обычно состоит из нуклеиновых кислот, интенсивно
окрашиваемых основными красителями, например кристаллическим фиолетовым.
34

собой одну высокополимерную молекулу ДНК, то его
размножение можно свести к механизму редупликации ДНК-
В настоящее время преобладает мнение, что нуклеоид
бактерии делится амитотически. Несмотря на простое деление нукле-
оида, воспроизведение молекул ДНК может происходить с такой
же точностью, как и в случае воспроизведения ДНК в процессе
митоза.
Таким образом нуклеоплазма бактерии не имеет оболочки
и не имеет структур, которые бы в точности соответствовали
хромосомам. Тем не менее, в каждой бактериальной клетке
генетический субстрат выступает в виде ДНК, как и у всех других
видов клеток. Однако в бактериях ДНК располагается в неот-
граниченной от цитоплазмы специальными мембранами вакуоли
и организована в виде нуклеоидов, состоящих из тончайших
о
фибрилл диаметром от 20 до 50—60 А.
Несмотря на отсутствие определенных и ясных знаний о
бактериальном ядре, все же следует признать наличие какого-то
образования, каких-то структур, эффективно выполняющих
функцию ядра. Как и в случае митоза, деление бактериальной
клетки должно включать удвоение ядерной структуры и
цитоплазмы, т. е. упрощенный карио- и цитокинез.
Таким образом ядро или ядерные структуры осуществляют
контроль над большинством функций микробной клетки.
Микроскопические грибы, как и бактерии, лишены типичного
ядра с выраженной мембраной; они содержат нуклеоид.
МИТОХОНДРИИ
Митохондрии — сферические или удлиненные
внутриклеточные органеллы, богатые содержанием ферментной системы
переноса электронов и некоторых других ферментов,
обеспечивающих, в частности, окислительное фосфорилирование. Эти
мельчайшие образования находятся во взвешенном состоянии
и вкраплены в цитоплазму клетки. Типичная митохондрия, как
уже указывалось, имеет округлую илн слегка деформированную
и продолговатую эллипсовидную форму (рис. 12). Размер их
о о
около 15 000 А в длину и примерно 5000 А в ширину.
Митохондрия имеет двухслойную оболочку, состоящую из
внешней и внутренней мембран, каждая из которых легко
отличима по морфологическим и ферментативным свойствам [80].
Пространство между мембранами заполнено водянистой
жидкостью, являющейся, вероятно, источником коферментов: НАД,
НАДФ, КоА и др. Каждая мембрана состоит из белка и липидов,
главным образом фосфолипидов. В состав мембранных белков
входят и белки ферментов (около 25%)- Внешние мембраны
митохондрий представляют собой липопротеидную пленку толщи-
3*
35

ной 115 А [107]. Структурный белок составляет около 50% от
общего количества ее белков. Помимо структурного белка, сюда
входят некоторые ферменты (моноаминооксидаза, кинуренингид-
роксилаза, НАД. Н-цитохром с редуктаза и др.).
Установлено, что структурный белок внешних мембран
состоит из двух форм — мономерной (глобулярной) и полимерной
Рис. 12. Схема структуры митохондрия (по Lehninger, 1962 и Рэкер, 1969):
а - общая схема строения, б - схема грибовидных тел внутренних мембран, в н
г - схемы разреза части митохондрия, д - субмитохондриальные частицы,
образованные под действием сильных звуковых колебаний на митохондрнн. / -
наружная мембрана, 2 - внутренняя мембрана, 3 - крнсты, 4 - матрикс5 -
сферические структуры на внутренней мембране, 6 - головка, 7 - стержень, 8 - мем
брана — базальная пластинка.
(фибриллярной). Фибриллы, построенные из субъединиц
диаметром 30—35 А, имеют разную длину и склонны к агрегации [20а].
Внутреннее пространство митохондрии заполнено веществом мат-
рикса, который можно уподобить сети, образованной структур--
ным белком и фосфолипидами. Матрикс окружен двойной
мембраной, пространство между слоями которой, вероятно, заполнено
жидкостью [9].
Внутренняя мембрана, образуя большое число складок,
получивших название крист, заполняет почти всю полость митохон-
36

дрии. На ее поверхности, обращенной внутрь митохондрии,
обнаружены своеобразные грибовидные частицы [48], которые имеют
о - о
головку диаметром 80—100 А и короткий стержень длиной 50 А
о
и диаметром 30—40 А, прикрепляющий головку к поверхности
мембраны. Область мембраны, находящаяся под головкой,
называется базальной пластинкой и рассматривается обычно как
интегральная часть грибовидной структуры.
Таким образом внутренняя мембрана образуется в
результате агрегации тройственных единиц, каждая из которых состоит
из головки, стержня и базальной пластинки. Установлено, что
элементы цепи переноса электронов, включающей 4 комплекса
ферментов [54, 14], локализованы в базальной части
трехслойных единиц. Головочная часть грибовидных тел не имеет
отношения к переносу электронов [44, 101]. Удаление их, не меняя
активности электронного транспорта, устраняет окислительное
фосфорилирование [85].
Головки были идентифицированы как фактор сопряжения Fb
представляющий собой белок с молекулярной массой 284 000
и обладающий АТФ-азной активностью. Из внутренних мембран,
как и из внешних, был выделен структурный белок, не
оказывающий влияния на перенос электронов.
Митохондрии обладают разными функциями: осуществляют
окислительные реакции, являющиеся источником энергии
(электронов); переносят электроны по цепи компонентов,
синтезирующих АТФ; катализируют синтетические реакции, идущие за счет
энергии АТФ; производят синтез части митохондриальных
белков, составляющих основу внутренних мембран.
Таким образом митохондрии — это и «силовые станции»,
и в то же время некий интегрирующий аппарат, обеспечивающий
автономный синтез определенных, хотя и не всех, конститутивных
белков митохондрий, а возможно, и белков других органоидов
цитоплазмы.
Митохондрии имеют собственную ДНК и обладают всеми
компонентами системы синтеза белка [27]. Эта система
обеспечивает кодированием и синтезом только часть митохондриальных
белков, составляющих основу внутренних мембран, а
растворимые белки митохондрий синтезируются в цитоплазме, так же как
компоненты наружной мембраны. Следовательно, за
цитоплазмой осталась функция синтеза растворимых белков для
митохондрий, а за ядром — кодирование синтеза растворимых белков
и функция общей координации. Таким образом, синтез
митохондриальных белков оказался под двойственным ядерно-митохонд-
риальным контролем. На рис. 13 показано взаимодействие
ядерной ДНК, митохондриальной ДНК, цитоплазматических и
митохондриальных рибосом и т-РНК- Энергетически синтез белка
в митохондриях обеспечивается АТФ.
37

Митохондрии содержат разнообразные ферменты,
катализирующие многочисленные реакции. Условия культивирования
микроорганизмов обусловливают структуру и функции
митохондрий. Так, например, анаэробные дрожжевые клетки имеют
лишь митохондриоподобные образования, лишенные крист и со-
Рис. 13. Возможные пути синтеза митохондриальных белков (по Рудину
и Цилки, 1970); жирные стрелки — включение аминокислот; светлые стрелки —
связанные с ними процессы; прерывистыми линиями обозначены участки
образования мембран.
держащие слабо активные ферменты. В частности, «нефункцио-
нирующая» митохондрия не содержит основных компонентов
дыхательной системы, :в том числе и чрезвычайно важной
терминальной оксидазы — цитохромоксидазы. Предполагают, что
отсутствие митохондрий в анаэробных клетках, выращенных на
глюкозе, может быть обусловлено глюкозной репрессией [109].
Однако анаэробные клетки, выращенные на глюкозе, не
являющейся репрессором, также характеризуются отсутствием ряда
дыхательных ферментов [100]. Образование дыхательной систе-
38

мы легко индуцируется даже низкими концентрациями
молекулярного кислорода. При аэробной адаптации клеток за очень
короткий промежуток времени происходит образование
митохондрий, отмечается усиление поглощения Ог, увеличение
активности ферментов электронно-транспортной цепи и цикла Кребса
[99, 102], а также усиление синтеза АТФ-азы [99].
В период усиленного образования митохондриальных
структур и ферментов наблюдается и синтез митохондриальной ДНК
[74]. Интересно отметить, что замена аэробиоза анаэробиозом
сохраняет активность ряда митохондриальных ферментов в
течение 2 ч, т. е. отмечается быстрота синтеза и «долговремен-
ность» проявления указанных факторов [98]. Этот факт может
представлять практический интерес.
За последнее время вновь возродилась гипотеза о
бактериальном происхождении митохондрий [72], рассматривающая их
как примитивные саморазмножающиеся внутриклеточные
тельца — биобласты. Действительно, имеющиеся данные
подтверждают, что установлены некоторые свойства митохондрий, весьма
напоминающие свойства бактерий. Так, например, митохондрии
почти не отличаются по размеру, форме и составу липидов от
палочковидных бактерий: митохондриальная ДНК имеет
кольцевое строение, как и ДНК бактерий; ДНК обычно
располагается в центральной части митохондрий, там, где расположен нук-
леоид у бактерий; в изолированных митохондриях обнаружены
все компоненты системы синтеза белка, сходные с аппаратом
свободно живущих микроорганизмов, и др. [25, 27].
Таким образом общая морфология, локализация ферментов,
химический состав, структура нуклеиновых кислот, свойства бе-
локсинтезирующего аппарата бактерий и митохондрий имеют
ярко выраженные черты сходства. Это послужило основанием
предполагать, что митохондрии произошли от каких-то
примитивных организмов, подобных бактериям, которые проникли
в ядросодержащую клетку и превратились в эндосимбионтов.
Имеющиеся данные позволяют считать, что митохондрии не
образуются de novo из низкомолекулярных веществ.
По-видимому, и цитохромоксидаза может также существовать в
анаэробной клетке в форме нефункционирующего апофермента, который
в ходе адаптации присоединяет порфирин и металл и приобретает
ферментативную активность. Это справедливо и в отношении
других дыхательных ферментов, а также митохондрий, которые
частично или полностью образуются из структурно
организованных предшественников. Так, например, в синтезе митохондрий
дрожжей Torulopsis utilis участвуют мембранные структуры,
которые можно назвать промитохондриальными мембранами
(элементами), содержащие некоторые «первичные» митохондриаль-
ные ферменты, например сукцинатдегидрогеназу, но не
содержащие цитохромов [62]. Вероятно, эти «ретикулярные мембраны»
39

находятся в анаэробных клетках и дифференцируются в зрелые
митохондрии после аэрации культуры. Во время дыхательной
адаптации происходит вначале образование везикулярных
структур, а затем уже появляются митохондрии [83].
Сборка мембран митохондрий
Самосборка — это процесс упорядоченной и спонтанной
молекулярной агрегации, приводящий к образованию биологически
важной структуры. Самосборка является естественной и
безотказно действующей основой всех проявлений биологического
молекулярного морфогенеза. Процесс сборки может начинаться от
простейшего взаимодействия двух субъединиц фермента и
кончаться образованием сложнейших биологически важных
структур, причем самосборка может осуществляться даже на уровне
взаимодействия уже сформированных четвертичных структур.
Сборка внешней мембраны. Можно полагать, что при
достаточно большой концентрации структурного белка внешних
мембран митохондрий одна форма его — фибриллы — может
взаимодействовать с другой мономерной формой и формировать
кристаллоподобные структуры. В отсутствии фосфолипидов
структурный белок, вероятно, образует трехмерную упаковку
[51, 26]. Ферментные системы в интактных внешних мембранах
митохондрий вкраплены, по-видимому, в липидный слой,
которым пропитана поверхность пленки структурного белка.
Итак, процесс сборки внешних мембран разбивается на
3 этапа: 1) образование основы мембраны в виде
мономолекулярной пленки, состоящей из структурного белка, связанного
с фосфолипидами; 2) сборка ферментных блоков и, наконец,
3) интеграция мономолекулярной пленки и ферментных блоков
в общую мембрану.
Возможно сборка внешней мембраны происходит на
внутренней мембране, которая при этом выполняет регулирующую
функцию. В этом случае процесс сборки митохондрий
начинается с образования внутренней мембраны.
Сборка внутренней мембраны. Изучение реконструкции
внутренних мембран базируется прежде всего, хотя и косвенно, на
каталитических свойствах их ферментных белков. При этом
выясняются возможности диссоциации того или иного комплекса,
сопровождающейся изменением или потерей энзиматических
свойств. Так, например, был изолирован представитель
комплекса IV цепи переноса электронов, включающего цитохромоксида-
зу; этот фермент катализирует реакцию: 2 ферроцитохром с +
+ 2Н+ + 7202->-2 ферроцитохром с + НгО. При этом было
показано, что реагрегация комплекса после отделения
фосфолипидов не приводит к образованию мембранной структуры. При
добавлении же фосфолипидов в агрегирующую систему наблю-
40

далось появление пузырьков, поверхность которых очень
походила на исходную мембрану.
Были изучены возможности изолирования и других
комплексов в диссоциированном виде и их реагрегации отдельно [51, 67].
При этом допускалось, что белки комплексов, взаимодействуя
между собой, способны дать трехмерную кристаллическую
упаковку, но этого не происходит в присутствии фосфолипидов,
которые, смазывая поверхность субъединиц с обеих сторон,
создают предпосылки для образования мономолекулярного слоя [51].
По-видимому, и в данном случае структурный белок должен
образовывать мономолекулярный остов мембраны, смазанный
фосфолипидами, а ферментные комплексы вкраплены в эту
фосфолипидную поверхность. Взаимодействие одноименных
субъединиц — структурных белков — будет исключать
образование гетероассоциатов, т. е. полимеризацию различных
белков — структурного и ферментов.
За последнее время удалось осуществить изолирование
головок, соединенных со стержнями, в отдельную фракцию.
Смешивание этой фракции с оставшейся частью мембраны обеспечило
реконструкцию, сопровождавшуюся появлением на мембране
грибовидных тел [85, 61]. Затем были изолированы 4 фракции:
базальная, соединенная со стержнями; стержни, соединенные
с головкой; головки и базальная часть [61].
При смешивании базальной части (диссоциированной)
с фракцией головок, соединенных со стержнями, в присутствии
ионов Mg++ отмечалась самосборка, обеспечившая образование
мембранной структуры двух типов: плоских и замкнутых в виде
пузырьков.
Завершалась реконструкция мембраны и при смешивании
фракции головок с фракцией базальных пластинок, соединенных
со стержнями. Тем самым было установлено, что сборка
внутренней мембраны митохондрий из крупных блоков, содержащих
комплексы ферментных систем, осуществляется спонтанно.
Поэтому в дальнейшем представляет интерес фракционирование
митохондрий на отдельные структурные компоненты и изучение
их свойств.
МЕЗОСОМЫ
Бактериальные клетки и микроскопические грибы содержат
развитые внутрицитоплазматические мембранные системы —
мезосомы (рис. 14), различающиеся по размерам, строению,,
форме и времени возникновения в цитоплазме клетки [7, 126].
Мембранные образования обычно имеют вид органелл,
однако встречаются и простые инвагинации цитоплазматической
мембраны. Мезосомы анатомически связаны с цитоплазматической
мембраной. Сведения о локализации ферментов дыхательной
41

цепи в изолированных мембранных образованиях и
цитоплазматической мембране доказывают, что указанная система мембран
выполняет функции митохондрий.
По-видимому мезосомы и митохондрии несут в себе как
черты сходства, так и различия. Так, например, не удалось
установить связи между степенью аэробности клетки и развитием в ней
мембранных образований. Система мембран найдена у облигат-
ных аэробов, имеющих полную дыхательную цепь, подобную
митохондриальной, и у облигатных анаэробов, лишенных
дыхательной цепи и черпающих энергию из процессов брожения [58,
Рис. 14. Bacillus cereus (а) и Corynebacterium (б) ХЮ0000 и 70000:
/ — мембранные образовании (по Авакяну и др.. 1966), 2 — мезосома, 3
цнтоплазматическаи мембрана (по Павловой, J964).
23]. Мезосомы облигатных анаэробов (Clostridium pectinovo-
rum), можно полагать, связаны с процессом формирования спор,
однако мембранные образования хорошо развиты и у неспорооб-
разующей анаэробной бактерии Bacteroides ruminicola.
По-видимому, мембранные образования разных микроорганизмов
выполняют разнообразные функции. Эти функции связаны с
делением, спорообразованием, обменом с окружающей клетку
средой, биосинтезом, окислительными процессами и др.
Предполагается связь мезосом с процессами деления и
спорообразования грамположительных бактерий, а мезосомы мико-
бактерий продуцируют материал вновь образуемой клеточной
стенки цри делении [49, 26]. Кроме того отмечается
взаимоотношение между мезосомами и ядрами у Вас. subtilis, а также
между ядром и цитоплазматической мембраной через одну или
две мезосомы [94]. Мезосомы образуются, перемещаются и могут
исчезать в цикле деления клетки. Мезосома Вас. subtilis очень
42

прочно связана с ДНК, которая в свою очередь связана с
мембранной системой [41]. Образование (репликация)
бактериальных хромосом и их распределение по дочерним клеткам
происходит при участии мезосом [12].
Подобно цитоплазматической мембране, с которой они
связаны, мезосомы являются местом локализации , ферментных
систем — поставщиков энергии, и в этом смысле они выполняют
функцию, аналогичную функции митохондрий. В то же время
мембранные образования — не обязательный элемент структуры
клетки; они представляют собой средство усиления отдельных
наиболее важных в данный момент функций
цитоплазматической мембраны.
лизосомы
В клетках животного происхождения открыты органеллы,
имеющие меньшие размеры, чем митохондрии, однако довольно
сходные с ними в морфологическом отношении. За последнее
время убедительно показано наличие и в дрожжевых клетках
лизосом, как гранулярного типа, так и многослойных лизосомо-
подобных структур, аналогичных по организации лизосомам
высших организмов [13].
Лизосомы окружены одноконтурной липопротеиновой
оболочкой и заполнены плотным содержимым [10]. Разрыв лизосом-
ной мембраны происходит в клетках, внезапно лишенных
кислорода или подвергнутых действию клеточных ядов,
ионизирующего излучения [33].
Фракцию митохондрий удалось разделить на несколько
субфракций, из которых наиболее легкая субфракция содержала
многие гидролитические ферменты: кислую фосфатазу, кислую
рибонуклеазу и дезоксирибонуклеазу, бета-глюкоронидазу, про-
теиназу, сульфатазу и др. Ввиду богатства структурных
элементов этой субфракции гидролитическими ферментами для них
был предложен термин «лизосомы», представляющие собой
сферические структуры диаметром 0,5 мкм. Полагают, что
ферменты лизосомы гидролизуют белки, нуклеиновые кислоты,
жиры на более простые составные части, которые затем могут
окисляться ферментативными системами митохондрий.
Таким образом лизосома представляет собой как бы
закрытый мешочек, содержащий различные ферменты, каталитическое
действие которых регулируется мембранами (оболочками) этих
органелл. Считают, что в случае разрыва оболочки лизосомы
ферменты проникают в цитоплазму и вызывают растворение
клетки. Тем самым подтверждается, что клетка не выдерживает
воздействия ни одного из указанных ферментов в чистом виде.
Следовательно, содержащиеся в лизосоме ферменты безопасны
43

для здоровой клетки, но быстро разрушают мертвые или
механически поврежденные. Полагают, что эти органеллы связаны
с эндоплазматической сетью.
РИБОСОМЫ
В цитоплазме клетки находятся также и ультрамикроскопи-,
ческие гранулы — рибосомы. Они имеют вид неправильных
шариков, состоящих как бы из двух половинок — большой и
меньшей, размером соответственно около 50 и 30S (рис. 15). Около
Рис. 15. Рибосомы (70 S-частицы),
состоящие из двух субъединиц:
а — схема: / — субчастнца (50S).
содержащая 235' и 55-РНК, 2 — субчастица
(30A'j, состоящая нз молекулы 10S-PIIK;
6 — электронные микрофотографии
субчастицы рибосомы 30S.
85% РНК бактериальной клетки содержится в рибосомах,
которые в свою очередь состоят из 60% рибосомальной РНК и 40%
белка.
В процессе биосинтеза пептидной цепи рибосома движется
вдоль цепи и-РНК- Вслед за первой рибосомой может
прикрепляться и одновременно продвигаться по цепи вторая рибосома,
затем третья и т. д. Таким образом, многие рибосомы
оказываются соединенными в группы, называемые полирибосомами, или
полисомами (рис. 16). Следовательно, в полисоме 2, 3, 4, 5 или
более рибосом как бы нанизаны на нить и-РНК- При действии
на нить рибонуклеазой обнаруживается нарушение
непрерывности ее и освобождение отдельных рибосом.
Рибосомы могут быть связаны с мембранами эндоплазмати-
ческого ретикулума (микросомы), причем они связываются по
мере образования мембран в процессе развития клетки. При
старении клеток рибосомы, связанные с мембранами, могут
вновь освобождаться. Оказалось, что свободные рибосомы содер-
44

ft.-f
"4(J
X tt-PM
i'<.•»/.■■)(-.v. '■■шин-:
\ • .•,■•
*
iii-b.'i'iw''!'.--:-!:.'
Рис 16 Схематическая модель функционирования полисом (по Rich A et. al,
1963).
жат деградировавшую рибосомную РНК и мало активны в
отношении синтеза белка. Такие рибосомы сами находятся в
процессе деградации и тем самым обусловливают старение клетки.
ВАКУОЛИ
Центральную часть клетки занимает вакуоля, заполненная
жидкостью и отделенная от цитоплазмы липопротеидной
оболочкой — тонопластом. Вакуоля поддерживает клеточный тонус,
участвует в осмотической регуляции, является местом
различных окислительно-восстановительных процессов. В ней
содержатся питательные вещества и продукты жизнедеятельности,
а также различные химически активные гранулы, некоторые из
которых имеют непосредственное отношение к образованию
запасов гликогена, волютина, жира.
Вакуоли дрожжей и грибов часто образуются только при
старении клетки; бактерии обычно их не имеют.
ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКИЙ РЕТИКУЛУМ
С помощью электронного микроскопа в клетке обнаружена
целая система пластинок, называемых эндоплазматической
сетью, или эндоплазматическим ретикулумом. На поверхности
многих пластинок видны маленькие зернышки — рибосомы.
45

Есть предположения, что эндоплазматический ретикулум
представляет собой систему сложных канальцев и связан с внешней
плазматической оболочкой. Эта система канальцев облегчает
перемещение веществ внутри клетки.
Эндоплазматический ретикулум обнаружен в дрожжевых
клетках [19, 13], а также у грибов, например Rhizopus и
бактерий. Эндоплазматическая сеть, состоящая из липопротеидных
мембран, в микробных клетках развита относительно слабее,
чем в клетках растений и животных [27а]. Эта сеть делит
цитоплазму на отсеки и часто соединена с некоторыми цитоплазмати-
ческими органеллами. Мембраны эндоплазматической сети
часто расширяются, образуя структуры, которые, собираясь
штабелями, формируют диктиосомы, или тельца Гольджи.
АППАРАТ ГОЛЬДЖИ
В течение многих лет функция этой клеточной структуры
оставалась загадкой. Только в пятидесятых годах с помощью
электронного микроскопа было установлено, что аппарат
Гольджи представляет собой скопление маленьких сплющенных
«мешочков». Они постепенно наполняются светлым материалом
и превращаются в глобулы слизи, состоящей главным образом
из гликопротеида.
В результате длительных исследований выяснена основная
функция этой клеточной структуры. Оказалось, что аппарат
Гольджи является одной из основных клеточных «фабрик»,
обеспечивающих синтез сложных углеводов. Именно в нем
происходит соединение углеводов с белками, приводящее к образованию
гликопротеидов [22]. При этом углеводы присоединяются к белку
лишь после того как молекула белка синтезировалась на
рибосомах. Образование углеводного компонента гликопротеида
слизи происходит из глюкозы, которая сначала превращается
в простые сахара — галактозу, ацетилглюкозамин и сиаловую
кислоту. Из этих простых соединений образуются углеводные
цепочки гликопротеида. Гипотетический гликопротеид
представлен на рис. 17. Полагают, что в некоторых клетках в аппарате
Гольджи могут возникать лизосомы — наполненные ферментом
гранулы, обнаруживаемые в цитоплазме. Возможно, что он
может переключаться на образование гранул другого типа.
Поэтому не случайно, что аппарат Гольджи сравнивают с рибосомами.
Подобно рибосомам, аппарат Гольджи обеспечивает синтез
разнообразных сложных углеводов, выполняющих различные
физиологические функции. Изучение этой мембранной системы
остается все же делом будущего.
Итак, субклеточные компоненты различных микроорганизмов
сходны не только в морфологическом отношении и в отношении
субмикроскопической структуры, но также по химическому со-
46

ставу и функциям. Безусловно, встречаются и исключения из;
этого правила, однако сходство оказывается гораздо большим,
чем различия.
Каждый тип субклеточных компонентов связан с
определенными ферментными системами и играет вполне определенную
роль в общей деятельности клетки. Синтез этих ферментов
находится под контролем ДНК ядра и митохондрий всех микроб-
Рис. 17. Гипотетический гликопротеид (по Дрейпер и Кент):
а — глюкоза; б — сиаловая кислота, в — галактоза, г — N-ацетилглюкозамин, д —
белковый остов с аминокислотными боковыми цепочками, служащими местом
присоединении углеводной цепочки.
ных клеток. Рибосома и, по-видимому, митохондрия составлены
из немногочисленных типов белковых единиц. При этом число
видов неферментных белков в клетке сравнительно невелико —
около 100, тогда как число видов различных ферментных белков
достигает от 1000 до 10 000 [5].
Существует высокоспецифическая регуляция синтеза за счет
механизма репрессии и индукции (дерепрессии). Такая
регуляция является абсолютной по специфичности и быстрой по
времени. Для значительных изменений содержания фермента таким
путем в микробных клетках необходимы минуты, тогда как для
высших растений на это требуются часы. Таким образом,
гетерогенность структуры микробных клеток обеспечивает
«рассредоточение» и распределение в них специфических ферментов
и тем самым позволяет координировать и регулировать обмен
веществ на субклеточном и клеточном уровне. Следовательно,
47

наличие субклеточных структур позволяет клетке осуществлять
регулирование обмена веществ, т. е. процессов синтеза и
распада, или ассимиляции и диссимиляции.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ К ГЛАВЕ I
1. Авакян А. А., К а р а в а й к о Г. И. «Микробиология». Т. XXXIX.
Вып. 5, 1970.
2. Авакян А. А., Павлова И. Б., К а ц Л. Н., Левина Е. Н.
Журнал гигиены, эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. Прага, 1966.
3. Боннер Дж. Сб. «Биохимия растений». Изд-во «Мир», 1968.
4. Б р е с л е р СЕ. Введение в молекулярную биологию. М.— Л.
Изд-во АН СССР, 1963.
5. В а р н е р Дж. Сб. «Биохимия растений». Изд-во «Мир», 1968.
6. Виллануэва X. Р., Гарсиа Аха И. IX Международный
конгресс по микробиологии. Рефераты сообщений. Изд-во «Медицина», А4/35, 85,
1966.
6а. Воротило СП., Коновалов С. А. «Прикладная биохимия
и микробиология». Т. VII. Вып. 4, 1971.
7. Гельман Н. С, Л у к о я н о в а М. А., Островский Д. Н.
Дыхательный аппарат бактерий. М. Изд-во «Наука», 1966.
8. Гор лен ко В. М„ Жилина Т. Н. «Микробиология». Т. XXXVII.
Вып. 6, 1052, 1968.
9. Г р и н Д. В кн.: «Структура и функция клетки». Изд-во «Наука»,
1964.
10. Данилов В. С, Козлов Ю. П., Т а р у с о в Б. Н. ДАН СССР.
Серия биологическая. Т. 190. № 6, 1474, 1970.
11. Дорохова Л. А., А г р е Н. С. и др. «Микробиология». Т. XXXIX.
Вып. 1, 1970; т. XL. Вып. 3, 1971.
12. Ж а ко б Ф., Моно Ж. В кн.: «Молекулярная биология». М. Изд-во
«Наука», 1964.
12а. Заики и а А. И., Лапотышкина. «Микробиология». Т. XXXIX.
Вып. 6, 1970.
126. К а ц Л. Н., Р и ш к у н а с А. «Микробиология». Т. XL. Вып. 3, 522,
1971.
13. Козлова Т. М. Структурная и ультраструктурная организация
дрожжевых организмов и ее перестройка в зависимости от физиологического
состояния. Автореферат диссертации, М., 1969.
14. Ко н о в а л о в С. А. Биохимия бродильных производств. Изд-во
«Пищевая промышленность», 1967.
14а. Коновалов С. А., Воротило СП. Микробиология и научно-
технический прогресс (Тезисы докладов IV съезда Всесоюзного
микробиологического общества). Изд-во «Наука и техника», Минск, 1971.
15. Кул ае в И. С, А ф а н а с ье в а Т. П., Б е л и к о в а М. П.
«Биохимия». Т. 32, 539, 1967.
16. К у ш н а р е в В. М„ Смирнова Т. А., Быков А. С. ДАН СССР.
Серия биологическая. Т. 175, 718, 1967.
17. Кушнарев В. М., Смирнова Т. А., Михайлова И. М.
Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, № 15, 19, 1968.
18. Ленин джер А. Митохондрия. М. Изд-во «Мир», 1966.
19. М е й с е л ь М. Н., В и р ю з о в а В. И. и др. В кн.: «Электронная
и флуоресцентная микроскопия». М. Изд-во «Наука», 1964.
20. М е й с е л ь М. Н., М е д в е д е в а Г. А. и др. Сб.
«Микробиологический синтез». Вып. 8, 1—8, 1969.
21. Нечас О, С в о б о д а А. IX Международный конгресс по
микробиологии. Рефераты сообщений. М. Изд-во «Медицина», А4/34, 84, 1966.
-48

21а. Номура М. В кн.: «Молекулы и клетки». М. Изд-во «Мнр». Вып. 5,
82, [970.
22. Ньютра М., Леблон Ш. В кн.: «Молекулы и клетки». Изд-во
«Мир». Вып. 5, 93, 1970.
23. О п а р и н А. И., Г е л ь м а и Н. С, X а р а т ь я н Е. Ф. ДАН СССР.
Т. 157, 211, 1964.
24. Пешков М. В. В сб.: «Биология сине-зеленых водорослей». Изд.
МГУ, 25, 1964.
25. П и н у с Е. А., М е т л и ц к а я А. 3. «Успехи современной биологии».
Т. 7. Вып. 1(4), 1970.
26. По г л азов Б. Ф. Сборка биологических структур. М. Изд-во
«Наука», 1970.
26а. Рэкер Э. В кн.: «Молекулы и клетки». М. Изд-во «Мир». Вып. 4.
150, 1969.
266. Роуз Э. Химическая микробиология. М. Изд-во «Мир», 1971.
27. Р у дин Д., Уилки Д. Биогенез митохондрий. Изд-во «Мир», 1970.
27а. С а л я е в Р. К. Поглощение веществ растительной клеткой. М. Изд-во
«Наука», 1969.
28. С к о в р о н С. Общая биология. Варшава, 1968.
29. С м н р н о в а Т. А., К у ш н а р е в В. М. «Микробиология». Т. XXXIX.
Вып. 5, 1970.
30. С о л о в ь е в а Ж. В., Ф е д е н к о Е. П. «Микробиология». Т. XXXIX.
Вып. 1, 109, 1970.
31. Соловьева Ж- В., Федоров В. Д. «Микробиология». Т. XXXIX.
Вып. 5, 850, 1970.
32. С у т и н. Микробиология. Изд-во «Медицина», 1966.
33. Та русо в Б. Н., Л омсадзе Б. А., Царцидзе М. А. ДАЧ
СССР. Т. 178, 1418, 1968.
34. Т и х о н е н к о А. С, Беспалова И. А. «Микробиология».
Т. XXXIII. Вып. 2, 353, 1964.
35. Ту м а н я н М. А., Пер шин а 3. Г. и др. «Микробиология».
Т. XXXIX. Вып. 1, 112, 1970.
36. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. М. Изд-во «Мир», 1967.
37. Ф р о б и ш е р М. Основы микробиологии. М. Изд-во «Мир», 1965.
38. Abrams А., N i е 1 s е п L., T h а с m e r t J. Biochim. et Biophys. acta,
80, 325, 1964.
39. Ach a J. Q., Aguirre M. J. R. et al. Nature, 209, 95, 1966.
40. Avakjan A. A., Pavlova J. B. et al. J. Hyg. Epidemiol. Microbiol,
and Immunology, 11, 151, 1967.
41. Bacon J. S. D. et al. Biochem. J., 95, 28C, 1965.
42. Bergere, Hermier 1970.
43. Bradley S. Q., R i t z i D. J. Bacterid., 95, 2358, 1968.
44. В u 11 e r T.F, Smith Q. L., Q r u 1 a E. A. Canad. J. Microbiol 13
1471, 1967.
45. Burger M., Bacon E. E„ Bacon J. S. D., M i 1 1 b a n k J W.
Nature, 205, 622, 1965.
46. С h a n с е В., P a r s о n s D. F., W i 11 i a m s Q. R„ Science, 143, 135
1964.
46a. Eddy A. A., W i 11 i a m s о n D. H. Nature, Lond., 179, 1252, 1957.
47. En gel man D. M., M о г о w i t z H. S., Biochim. et Biophys acta
150, 376, 1968; то же, 150, 385, 1968.
48. F e r n a n d e z—M о r a n H., О d a T. et al. J. Cell. Biol., 22, 63, 1964.
49. Ganesan A., Lederberg J. Biochem. and Biophys. Res Com-
muns, 18, 824, 1965.
50. Green D. E., Perdue J. F. Proa, Nat. Acad. Sci, USA. 55 1295
1966.
4 Заказ 7 49

51. Green D. E., Allmann D. W. et al. Arch. Biochem. and Biophys.,
119 312 1967
52.'Grul a E. A., Butler T. F. et al. Canad. J. Microbiol., 13, 1199,
1967.
53. Hallberg P., Hauge J. Biochim. et Biophys. acta, 95, 80, 1965.
54. Hatefi I., H a a v i к a A. G. et al. J. Biol. Chem. 237, 2661, 1962.
55. H a v e 1 к о v a M. Folia microbiol., VII, 453, 1966.
56. Hanssen A., Schnepf E. Arch. Microbiol., 57, 214, 1967.
57. Hop wood D. M„ Glauert A. M. J. Gen. Microbiol., 18, VI,
1958.
58. Hughes D. J. Gen. Microbiol., 29, 39, 1962.
58a. James A. M. Prog. Biophys. and biophys. Chem., 8, 96, 1957.
59. I m a e d а Т., О g u r a M. J. Bacteriol., 85, 150, 1963.
60. К a ton a E. Radiol. Clin. Biol., 35, 18, 1966; Anal. Biochem., 18, 3, 587,
1967.
61. К о р а с z у к К-, A s a i J., G r e e n D. E. Arch. Biochem. and Biophys,
126, 358, 1968.
62. Linn a ne A. W., Vitols E., Nowland P. G. J. Cell. Biol., 13,
345, 1962.
63. Longley R. P., R о s e M. H., Knights B. A. Biochem. journ.,
108, 3, 401, 1968.
64. Mahoney R. P., E d w a r d s M. R. J. Bacteriol., 92, 487, 1966.
65. Manocha M. S., Solvin J. R., J. Bacteriol., 94, 202, 1967.
66. M a r с h a n t R., S m i t h D. G. Arch. Mikrobiol., 58, 3, 248, 1967.
66a. Martin H. H. Annual. Rev. Biochem., 35, 457, 1966.
66b. M a t i 1 e Ph., Moor H„ R о b i n о w С F. in: The yeasts. Ed.
A. H. Rose and J. S. Harrison Academic Press. London and New York, lv.,
1969.
67. McConnell D. G., Tzagoloff et al. J. Biol. Chem., 241, 2373,
1966.
68. M e i s e 1 M., M e d v e d e v a G. et al. Symposium on yeast
protoplasts, Jena, 1965, Akademie Verlag, Berlin, 1966.
69. Mend os a C. G, Villanueva J. R. Nature, Lond., 195, 1326,
1962.
70. M u г г а у В. В кн.: «The general physiology of cell specialization».
Mc Graw-Hill, 1963.
71. Murray R., Watsch S. W. J. Bacteriol., 89, 1594, 1965.
72. N a s s T. M. K., N a s s S„ A f z e 1 i n s B. A. Exp. Cell Res., 37, 516,
1965.
73. Necas O. Nature, 177, 898, 1956.
74. N e £ a s O., H a v e 1 k о v a M. Symposium on yeast protoplasts, Jena,
1965, Akademie Verlag, Berlin, 15, 1966.
75. N e с a s O., S v о b о d a A. Symposium on yeast protoplasts, Jena,
1965, Akademie Verlag, Berlin, 67, 1966.
75a. Neely W. B. Adv. carbohyd. Chem., 15, 341, 1963.
76. N i e 1 s e n L., A b r a m s A. Biochem. and Biophys. Res. Communs,
17, 680, 2964.
77. N i 1 s s о n S. E. Nature, 202, 509, 1964.
78. N u r m i n e n Т., S u о m a 1 a i n e n H. J. Gen. Microbiol., 53, 275r
1968.
79. Painter R. G., В r a d 1 e у S. G. Bacteriol. Peoc, 25, 1965.
80. Parson D. F. Science, 140, 985, 1963; Ann. N. Y. Acad. Sci, 137, 403,
1966.
81. Pavlova J. В кн.: «Electron microscopy», Prague, Chech. Acad. Sci.,
p. 531, 1964.
82. Pfister R., Lundgren D. J. Bacteriol., 88, 1119, 1964.
83. P о 1 a k i s E. S., В a r 11 e у W„ Meek G. A. Biochem. J. 90, 369,
1964.
50

84. Proctor H., Norris J., R i b b о n s D. J. aplied bacterid., 32, 1,
118, 1969.
85. R а с к е г Е. Federat. Proc, 26, 1335, 1967.
86. R а г i n S. J. Gen. Microbiol., 33, 471, 1963.
87. Razin S„ Morowitz H. J, Terry T. M. Proc. Nat. Acad. Sci.
USA, 54, 219, 1965.
88. Rem sen C. C, Lundgren D. G. J. Bacterid., 92, 1765, 1966.
89. Robertson J. D. Progr. Biophys. and Biophys. Chem., 10, 343,
1960.
90. Rod we 11 A. W., R a z i n S. et al. Arch. Biochem. and Biophys., 122,
621, 1967.
90a. Rogers H. J. in «Function and Structure in Microorganisms»,
Symp. Soc. gen. Microbiol., 15, 186, 1965.
90b. Rogers H.J. Folia microbiol., 12, 191, 1967.
91. Rost K., Venner H. Zeitschr. Phys. Chem. 333, 230, 1964.
92. Roth fie Id L., F i n ke 1 s t a i n A. Annual. Rev. Biochem., 37, 463,
1968.
93. R у t e r A. Ann. Inst. Pasteur, 108, 40, 1965.
94. Ryter A., Jacob F. С r. Acad. Sci., 257, 3060, 1963.
95. S a 11 о n M. The bacteriol cell wall. Amsterdam—London—N. Y.
Elsevier, 1965.
96. S a 11 о n M., N e t s с h e у A. Biochim. et Biophys. acta, 107, 539,
1965.
96a. Sharon N. A. Rev. Biochem., 35, 485, 1966.
97. Sjostrand F. S. Nature, 199, 1262, 1963; J. Ultrastr. Res., 9, 340,
1963.
98. Singer T. et al. В кн.: Flavins and Flavoproteins, ed. E. Slator,
Amsterdam, 391, 1966.
99. Somlo M. Biochim. et Biophys. acta, 97, 183, 1965; Europ. J. Biochem.,
5, 276, 1968.
100. Somlo M., Fukuhara H. Biochem. Biophys. Res. Comm., 19, 587,
1965.
101. Stasny J. Т., Crane F. L. J. Cell Biol., 22, 49, 1964.
102. Stead P., M u г г а у R. G. E. J. Microbiol., 12, 263, 1966.
102a. Stolp H., Starr M. P. A. Rev. Microbiol., 19, 79, 1965.
103. S о u z u H. Arch. Biochem. Biophys., 120, 344, 1967.
104. Svoboda A. Symposium on yeast protoplasts, Jena, 1965, Akademie
Verlag, Berlin, 31; Exp. Cell Res., 44, 640, 1966.
105. Swift H., R a b i n о w i t z M., G e t z G. J. Cell. Biol. 35, 131A, 1967.
106. Terry T. M, E n ge 1 m a n D. M., Morowitz H. J. Biochim. et
biophys., 135, 391, 1968, 35, 131A, 1967.
107. Thompson J. E., Coleman R., Finean J. B. Biochim. hiophys.
acta, 135, 1074, 1967.
108. Trevi thick J. R., Me t z e n b e r g R. L. J. Bacteriol., 92, 1010,
1966.
109. Tustanoff E. R., В art ley W., Biochem. J., 91, 595, 1964.
110. Wei del W., Pelzer H. Advances Enzymol., 26, 193, 1964.
111. Weinberg R., Or ton W. L. J. Bacteriol., 88, 1743, 1964.
112. W e i s s B. J. Gen. Microbiol., 39, 85, 1965.
113. Wiebe W. S., Chapman G.B.J. Bacteriol., 95, 1862, 1874,
1968.
113a. W i 1 k i n s о n J. F. Bact. Rev., 22, 46, 1958.
113b. W i m p e n n у J. W. Т. Proc. Biochem., 2, 41, 1967.
114. Y n d k i n M., D a v i s B.J. Mol. Biol., 12, 193, 1965.
1Г5. Young F. E. J. Biol. Chem., 241, 3462, 1966.
116. Z a 1 oka r M. In Ainsworth G. С a. Sussman A. S. (ed.) «The fungi»,
Acad. Press., N.—Y., 1, 377, 1965.
4*
51

ГЛАВА II
ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ МИКРООРГАНИЗМОВ
В очень малом объеме — одной клетке и ее органоидах —
протекают многочисленные химические реакции, строго
координированные между собой и позволяющие микроорганизму
с большой скоростью размножаться. О сложности
биохимических процессов в клетке можно судить прежде всего по ее
химическому составу, который в свою очередь в той или иной степени
зависит от окружающей среды. При этом микроорганизмы как
бы проявляют способность «унифицировать» питательные
вещества окружающей среды, т. е. преобразовывать их в постоянные
«кирпичики», из которых потом по «шаблону» синтезируют
соединения, входящие в состав цитоплазмы, ядра, клеточной
оболочки и т. д.
Поэтому, например, разнообразные углеродсодержащие
соединения (моно- и дисахариды, органические кислоты, спирты,
углеводороды и др.) подвергаются при участии различных
ферментов диссимиляции, обеспечивающей в конечном итоге
образование постоянных промежуточных продуктов, необходимых
для ассимиляции. Тем самым отмечается проявление единства
во множестве, тождества в многообразии. Этим, по-видимому,
и объясняется относительное постоянство качественного состава
клеток при культивировании их на разных питательных средах.
Более того, установлено, что клетки всех микроорганизмов
сходны по химическому составу и содержат одни и те же типы
макромолекул: белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды, липиды.
В биомассе микроорганизмов обнаружены органогены:
углерод, азот, кислород и водород, количественное содержание
которых составляет 90—97% на сухое вещество. На долю других
также исключительно важных для жизнедеятельности
микроорганизмов элементов —• фосфора, серы, калия, кальция, магния,
Таблица 2
Состав клеточного вещества микроорганизмов (% на сухое вещество)
Элементы
Углерод
Азот
Водород
р2о5
к2о
so3
Бактерии
50,4
12,3
6,8
4,98
2,41
0,29
Плесневые
грибы
(мицелий со
спорами)
47,9
5,24
6,7
4,85
2,81
0,11
Элементы
N20
MgO
CaO
Fe2Os
SiQ2
Бактерии
0,07
0,82
0,89
0,08
0,03
Плесневые
грибы
(мицелий со
спорами)
1,12
0,38
0,19
0,16
0,04
52

железа, натрия, хлора, марганца и т. д.— приходится 3—10%
сухого вещества (табл. 2). В среднем органический состав
клетки микроорганизмов составляет (в %): углерода 51,1;
кислорода 33,7; азота 8,7 и водорода 6,5. Исходя из этого эмпирическую
«формулу биомассы» можно изобразить в следующем виде:
C14H2107N2.
ВОДА
В наибольшем количестве, до 75—85% массы, в клетках
микроорганизмов содержится вода, что приближает их к
растительным организмам. Так как молекулярная масса воды невелика
по сравнению с другими компонентами клетки, то число молекул
воды оказывается относительно большим. Так, в протоплазме
на одну молекулу белка приходится 18 000 молекул воды. Состав
воды клетки постоянно обновляется.
Часть воды в клетке находится в свободном состоянии,
производя диссоциацию электролитов, образуя коллоидные
растворы высокомолекулярных соединений. Другая, большая, часть
воды находится в связанном состоянии и входит непосредственно
в состав молекул белков, жиров, углеводов и продуктов их
распада. Вода является источником водородных и гидроксильных
ионов и тем самым обеспечивает протекание разнообразных
химических и физико-химических реакций в живой клетке.
Споры бактерий и других микроорганизмов, в
противоположность вегетативным клеткам, содержат не более 40% воды,
причем основная часть ее находится в связанном состоянии и не
может принимать участия в тепловой коагуляции белков и тем
самым обусловливает устойчивость спор к повышенной
температуре.
МИНЕРАЛЬНЫЕ И ОРГАНИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА КЛЕТКИ
Сухое вещество микроорганизмов состоит из органических
и минеральных соединений, причем абсолютное и относительное
содержание этих компонентов может колебаться в зависимости
от многих причин: вида и расы микроорганизма, состава
питательной среды, условий культивирования, фаз роста и других.
Вследствие этого содержание сухих веществ в клетке может
варьировать в широких пределах — от 15 до 25% и более.
Сухие вещества микроорганизмов содержат 5—10% золы,
качественный состав которой по элементам довольно закономерен.
Из всех зольных элементов на долю фосфора приходится от 10
до 45%, а у некоторых кислотоустойчивых бактерий даже
до 74%. Обычно содержание общего фосфора в дрожжах и
мицелии гриба, в том числе и в мицелии Neurospora crassa,
составляет около 2% [4,26, 1,3].
53

Сухое вещество клеток микроорганизмов содержит около 90—
95% органических соединений. В состав биомассы входят белки
(40—60%), нуклеопротеиды и нуклеиновые кислоты (около
30%), полисахариды (от 12 до 28%), липиды (от 1,7 до 40%),
свободные аминокислоты (2—8% на сухую массу) и др.
БЕЛКИ
Белковым веществам принадлежит ведущая роль в обмене
веществ. Они являются важнейшей составной частью живой
клетки и в то же время непрерывно разрушаются и создаются
вновь. Белки составляют и основу всех протоплазменных
структур в организме. В зависимости от природы микроорганизма
и условий его культивирования [73] содержание белка в
биомассе может варьировать в широких пределах — от 36 до 63%
(табл. 3).
Таблица 3
Содержание белка в микроорганизмах (%
Источники азота.
мл-экв N л
Гидролизат казеина (50)
NH+ (100)
N07 (Ю)
Neurospora
crassa
42,8
40,1
36,1
сухого вещества)
Pseudomonas
aeruginosa
60,1
63,0
Примечание. Количество белка определяли по методу
Лоури.
При выращивании микроорганизмов на среде, содержащей
различные источники азота, отмечается и разное содержание
белка в биомассе в ранней логарифмической фазе роста.
Оказалось, что хорошо ассимилируемые соединения
обусловливают более высокое содержание белка.
Кроме того состав клеток микроорганизмов изменяется в
зависимости от скорости роста. Быстро растущие клетки имеют
в среднем несколько больший объем и содержат белка (а также
РНК и ДНК) больше, чем медленно растущие [ПО]. Хорошо
ассимилируемые источники азота обусловливают несколько
более высокое содержание белка в микроорганизмах, чем те, при
использовании которых наблюдаются небольшие скорости роста.
Поскольку скорость роста зависит от химического состава куль-
туральной среды, тем самым среда контролирует содержание
биомассы [134, 91] и количественное содержание в ней белка.
Однако решающее влияние оказывает концентрация источника
азота. При недостатке азота уменьшается не только скорость
54

роста, но и содержание белка, при одновременном усилении
биосинтеза липидов. Наряду со снижением содержания
аминокислот [45, 93] обнаруживается и заметное уменьшение количества
РНК- В то же время бесспорно установлена прямая зависимость
между количествами РНК в клетках и скоростью их роста [4, 131у
111, 16].
Уменьшение соотношения белок : ДНК показывает, что
количество ДНК, пересчитанное на белок клетки, даже
увеличивается при недостатке азота [93]. Это соответствует данным,
полученным на Chlorella [66].
С увеличением возраста клеток содержание в них белка,
ДНК и особенно РНК уменьшается, но одновременно
увеличивается содержание резервных и структурных веществ.
Выше было показано влияние на биосинтез белка отдельных
источников азота. В то же время хорошо известно, что в
качестве источника азотистого питания наряду с гидролизатом
казеина, аммиаком и солью азотной кислоты могут использоваться
также и другие органические и неорганические азотсодержащие
вещества, например гидролизаты белка, аминокислоты, аспара-
гин, мочевина, дрожжевой экстракт, аммонийные соли (цитрат,
сульфат, фосфаты и др.). Эти источники азота обеспечивают
высокое содержание белка (> 50%) с хорошим аминокислотным
составом. Содержание белка в клетках Micrococcus cerificans,
выращиваемых на среде с минеральными азотом и с газойлем
(углеводородами) в качестве единственного источника углерода,
достигает 68—75% [62].
Коферменты и ферменты
Следует особо отметить, что при недостатке азота в среде
очень сильно уменьшается содержание в клетках коферментов
[93]. Добавление к среде н-оксибензойной кислоты оказывает
эффективное действие на образование кофермента Q (убихи-
нон). Под влиянием питательной среды концентрация
ферментов может изменяться в 100 раз [ПО]. Этот вопрос подробно
рассматривается в последующих разделах книги.
Протеиногенные аминокислоты
Относительный аминокислотный состав биомассы
микроорганизмов не зависит существенно ни от источника азота, ни от
количества его в среде, ни от возраста культуры. Даже
значительные изменения в количественном содержании белков в биомассе
заметно не отражаются на их качественном аминокислотном со-
ставе (табл. 4) [144, 63, 122, 15, 65].
Это объясняется, очевидно, тем, что состав белка в клетке
наследственно детерминирован. Известно, что последователь-
55

Таблица 4
Аминокислотный состав белка бактерий (% на биомассу)
Виды бактерий
II
-
X
Яцин
о
т
•х
я
«
%
НИН
S
X
X
алан
•я
ра
Brevibacterium insectiphilium
Corynebact. sp
Corynebact. pourometabolum .
Pseudomonas ligustri . . . .
Pseudomonas pseudomonallei .
Pseudomonas orvilla . . . .
Alcaligenes species
Cellumonas galba
53,6
69,0
59,6
60,9
56,8
62,0
70,0
51,4
2,72
2,60
3
2
2
3
4
3
2,0
3,0
2,4
2,0
2,1
2,1
3,0
2,6
2,3
3,0
2,4
1,1
1,9
2,6
3,8
2,5
3,5
4,2
3,7
3,3
3,4
3,4
4,8
3,0
0,7
0,8
0,7
0,6
0,8
0,9
1,2
0,7
1,5
1,9
1,7
1,5
1,6
1,7
1,8
1,7
2,5
3,2
2,6
2,1
2,3
2,1
3,8
2,7
He
определен
To же
»
1,6
0,7
1,1
1,1
1,2
2,4
3
5
4
6
0
0,9
ность и соотношение аминокислот в полипептидной цепи
определяется расположением азотистых оснований в молекуле
информационной РНК, выполняющей при этом роль матрицы. Она
предопределяет состав белковой молекулы. На и-РНК переписан
план синтеза белка с ДНК- Поэтому разные количества
источника азота в среде и различная длительность культивирования
микроорганизма заметно не влияют на качественный
аминокислотный состав белков биомассы.
Многие микроорганизмы характеризуются большим
сходством аминокислотного состава. Как правило, все они содержат
относительно большие количества лизина, аспарагиновой и глю-
таминовой кислот, лейцина, аланина, аргинина и др. и малые
количества цистина, цистеина, метионина, гистидина. Установлено,
что в состав белка микроорганизмов входят все 20 протеиноген-
ных аминокислот.
Свободные внутриклеточные аминокислоты
Каждой фазе роста микроорганизма соответствует
специфический процесс биохимических преобразований и определенный
внутриклеточный аминокислотный состав. Установлено, что
в клетках микроорганизмов постоянно содержатся свободные
внутриклеточные аминокислоты. Количественное содержание их
заметно меняется и всецело зависит от жизнедеятельности
организма, определяемой как фазами роста, так и условиями
культивирования [17, 9, 18].
Так, например, клетки мицелия плесневых грибов,
находящиеся в экспоненциальной фазе роста, содержат свободных ами-
56

Таблица 5
Изменение содержания свободных внутриклеточных аминокислот в процессе
роста (% на сухую биомассу)
Аминокислоты
Продолжительность роста
клеток мицелия, ч
12
24
30
Алании
Аргинин
Аминомасляная кислота
Аспарагиновая кислота
Глютаминовая кислота
Глютамин
Глицин
Лизин -\- гистидин
Метионин -\- валин
Пролии
Серии
Тирозин
Треонин
Фенилаланин -\- лейцин -j- изолеицин
Цистеин
Сумма . .
0,15
0,00
0,17
0,04
0,52
0,71
0,00
0,04
0,00
0,00
0,04
0,02
0,00
0,04
0,00
1,49
0,28
0,00
1,00
3,82
0,68
0,29
0,24
0,10
0,51
0,35
0,36
0,60
0,35
1,73
10,07
1,55
0,38
0,00
0,99
3,80
0,50
0,20
0,35
С л е
0,00
0,32
0,19
0,38
0,40
0,28
1,57
0,28
0,00
0,84
3,68
0,46
0,35
0,37
Д ы
0,00
0,31
0,13
0,32
0,32
0,26
9,34 8,89
1,56
0,35
0,15
0,95
3,52
0,43
0,42
0,38
0,00
0,42
0,12
0,32
0,21
0,24
9,07
Продолжение
Аминокислоты
Продолжительность роста клеток
мицелия, ч
36
42
60
72
Алании
Аргинин
Аминомасляная кислота
Аспарагиновая кислота
Глютаминовая кислота
Глютамии
Глицин
Лизин -j- гистидин
Метионии +валин ,
Пролин
Серии
Тирозин ,
Треонин
Фенилаланин -\- лейцин + изолеицин
Цистеин
Сумма . ,
1,02
0,22
0,13
0,60
2,66
0,24
0,34
0,23
0,00
0,39
0,14
0,20
0,18
0,14
4,99
0,81
0,15
0,19
0,43
1,67
0,18
0,31
0,26
0,32
0,07
0,15
0,19
0,75
0,12
0,11
0,14
0,18
0,04
0,15
0,18
0,43
0,05
0,08
0,13
Следы
0,09
0,30
0,19
0,16
0,23
0,10
0,06
0,08
0,13
0,10
0,16
0,05
0,03
0,06
0,14
0,10
0,15
0,04
5,07
2,41
1,76
0,18
0,04
0,18
0,18
0,45
0,06
0,06
0,21
0,00
0,04
0,15
0,11
0,18
0,05
1,83
57

нокислот, извлекаемых этиловым спиртом, почти в 4—6 раз
-больше, чем клетки конидий или старые клетки мицелия,
соответствующие фазе затухания (табл. 5).
Кроме того было установлено, что мутантный штамм Asp.
•oryzae 251-90 содержит свободных аминокислот в 1,5—2 раза
больше, чем исходный штамм, выделенный из природы. Этот
штамм синтезирует кислую протеиназу также в 5 раз слабее.
чем мутант [14, 14а].
Оказалось, что состав свободных внутриклеточных
аминокислот включает почти весь набор, необходимый для биосинтеза
белка. Установлено, что в клетках мицелия Asp. oryzae
содержится не менее 19—20 аминокислот.
Нуклеопротеиды
Значительная часть белка клетки связана с нуклеиновыми
кислотами, образуя нуклеопротеиды. Схема строения нуклео-
протеидов представлена ниже (см. стр. 59).
Они играют важную роль в жизнедеятельности клеток,
в частности, в явлениях наследственности. В наибольшем
количестве они содержатся в клеточных ядрах и рибосомах.
Нуклеопротеиды наряду с другими белковыми веществами не только
составляют основу всех протоплазменных структур в клетке, но
и определяют скорость, направление и взаимосвязь отдельных
реакций обмена веществ.
Нуклеиновые кислоты
Составной частью сложного белка — нуклеопротеида —
являются нуклеиновые кислоты. Молекулы их состоят из большого
количества нуклеотидов, каждый из которых состоит из
азотистого основания (пуринового или пиримидинового), углевода
(пентоз) и остатка фосфорной кислоты. Различают два типа
нуклеиновых кислот: рибонуклеиновую (РНК) и дезоксирибо-
нуклеиновую (ДНК) (табл.6).
В свою очередь РНК включает 3 разновидности. Из них
в наибольшем количестве (80—90%) клетки микроорганизмов
содержат высокомолекулярную (порядка 10б), или микросо-
мальную (рибосомную) РНК (молекулярная масса 0,5—
1,5 млн.), которая присутствует в клетках в виде рибонуклео-
протеидных частиц, или рибосом.
Другой разновидностью клеточной РНК, составляющей 10—
20% от всей РНК клетки, является транспортная РНК- Она
встречается в цитоплазме. Молекулярная масса ее составляет
25 000—30 000, что соответствует лишь 80—100 нуклеотидам.
Третий вид внутриклеточной РНК — информационная, или
матричная,— присутствует в небольшом количестве, соответст-
58

о"
-о.
то
х
О X
На
Ч¥1
? fAf it
Z X X Т
I I I i g
у—u=u ™ *
II 111
z—u—z =r 9-
X
u
о
I
z z z
z-v=z
I < -S
X
о
I
X
-o
X
и
hQ
;V \
\
-u-O
X
O-
3= (TJ X
О то
£ °
О io
то зс X
X

Таблица 6
Сравнительная характеристика ДНК и РНК

Нуклеиновая
кислота
ДНК
РНК
Химический состав
углевод
Дезокси-
рибоза
Рибоза
азотистые
основания
Аденин,
гуанин,
тимин,
цитозин
Аденин,
гуанин,
урацил,
цитозин
Макромоле-
кулярная
структура
Двойная
полину-
клеотидная
спираль
Одинарная
полинуклео-
тидная
цепь,
образующая
складки
Локализация
в клетке
Ядро

Цитоплазма, ядро
Функция
Хранение
генетической
информации
Передача
информации
от ДНК и а
белок;
обеспечение
специфического
синтеза
белка
вующем примерно 3% от всей РНК- Метаболически она весьма
активна — быстро синтезируется и очень быстро распадается.
В зависимости от условий культивирования и фаз роста
микроорганизмов содержание РНК в них колеблется в широких
пределах — от 5 до 12% на сухую биомассу. Быстро растущие
0J I 3 3 10 20 50 05 I , 5 10 30
Концентрация азота м-экЬ ННч/л
Рис. 18. Зависимость содержания РНК (I) и ДНК (2) от
концентрации источника азота в питательной среде у различных
культур после двух- и трехдневного роста.
клетки содержат относительно несколько больше РНК и даже
ДНК, чем медленно растущие [ПО]. При этом решающее влияние
оказывает концентрация источника азота (рис. 18). При
недостатке азота в среде уменьшается скорость роста
микроорганизма, уменьшается содержание РНК, а также аминокислот.
Взаимосвязь между количеством РНК в клетке и скоростью
роста подтверждена многими исследователями [4, 16, 111, 1311.
2
М
60

Высокое содержание РНК определяет начало и скорость
размножения клеток микроорганизмов. Например, при
непрерывном методе культивирования дрожжевых клеток, находящихся
в одной фазе роста, количественное содержание в них РНК
практически не изменяется или же изменяется в малой степени [16].
В то же время установлено, что синтез РНК регулирует
аминокислотный состав [134, 109, 99]. Более высокое содержание
аминокислот среды индуцирует синтез РНК, а имеющиеся репрес-
соры инактивируются [133], и наоборот, содержание РНК и ДНК
в микроорганизмах снижается при недостатке азота, причем
РНК в большей, ДНК—в меньшей степени, чем содержание
белка.
С увеличением возраста культуры относительное содержание
ДНК и белка в биомассе уменьшается весьма незначительно
и в одинаковой мере, содержание же РНК снижается при этом
гораздо больше [16, 15].
Регуляция синтеза т-РНК и и-РНК происходит независимо
[92] от регуляции рибосомальной РНК (р-РНК). Синтез ДНК
в клетке, по-видимому, так же, как и т-РНК и р-РНК, не
регулируется свободными аминокислотами [64].
Из фосфорных соединений необходимо отметить присутствие
в клетках мицелия кислоторастворимых нуклеотидов, главным
образом уридиловых и адениловых, составляющих до 90% от
общего содержания нуклеотидов в клетках [27, 23, 28].
Кроме того в мицелии грибов обнаружены аденозинмонофос-
фат, сукцининаденозин и сукцининадениловая кислота и
производное цитидиловой кислоты — ЦДФ-холин и ЦДФ-этаноламин
[6, 21].
В мицелии грибов кислоторастворимые нуклеотиды
содержатся в количестве 4—10 мкмоль на 1 г сухой массы [47, 27, 6,
28]. Однако в мицелии Neurospora crassa обнаружено очень
высокое содержание нуклеотидов, соответствующее 24,5 мкмоль
на 1 г сухой массы [20], что близко к содержанию этих
соединений у бактерий [12, 13]. Вместе с тем скорость прироста
биомассы в молодой культуре Neurospora crassa близка к скорости
прироста бактериальных клеток. По-видимому, в интенсивно
растущих микроорганизмах происходит особенно сильное
накопление нуклеотидов [116, 52]. С уменьшением интенсивности роста
при старении культуры содержание нуклеотидов снижается.
Например, 66-часовой мицелий Neurospora crassa,
предрасположенный к спорообразованию, имел нуклеотидов лишь
13 мкмоль.
Известно, что при переходе гриба к
спорообразованию количество нуклеотидов в клетке значительно снижается
[6]. В цитоплазме клеток Neurospora crassa установлена глице-
ринтейхоевая кислота [125, 30, 20], которая не входит в состав ее
клеточной стенки в отличие от многих других грибов.
61

УГЛЕВОДЫ
Особая роль углеводов в клетках микроорганизмов
заключается в том, что, окисляясь, они освобождают значительное
количество энергии, необходимой для проявления
жизнедеятельности. Одновременно они представляют собой строительный
материал, получаемый на различных стадиях распада углеводов
и необходимый для биосинтеза компонентов клетки.
Мукополисахариды, например, выполняют в микробной
клетке разные функции. Являясь составной частью клеточной стенки,
они выполняют опорные функции и одновременно играют роль
регуляторов диффузии. Большой отрицательный заряд мукосое-
динений дает основание полагать, что они функционируют как
естественные ионообменные вещества, регулируя перемещение
и концентрацию катионов [7]. В ряде случаев мукосоединения
выполняют функции регуляторов действия ферментов [125], так
как в модельных опытах они обладали ярко выраженной
способностью подавлять или активировать действие ферментов [107].
В химическом отношении это гетерополисахариды; как
правило, они бывают связаны с белком. Кислые мукополисахариды
содержат наряду с глюкозаминами или галактозаминами также
глюкуроновую кислоту и, по-видимому, хондроитинсерную
кислоту. Нейтральные мукополисахариды в отличие от кислых
являются прочным углеводно-белковым комплексом, структурная
основа которого представлена углеводами. В их состав помимо
глюкозамина входят галактоза, манноза, L-фукоза, а также ней-
траминовая кислота, которая занимает концевое положение
в молекуле комплекса [53, 104].
Представляют интерес данные, подтверждающие
возможность биосинтеза внеклеточных полисахаридов. Так, было
показано, что спорообразующая бактерия, выделенная из почвы,
образует внеклеточный полисахарид в среде, содержащей глюкозу.
Образование полисахарида происходило в аэрируемой культуре,
рост которой осуществлялся в течение 4 дней при 30° С. По
окончании ферментации культуральная жидкость имела вязкость
18 000 спз и содержала 1,6% полимера, состоящего из глюкозы,
маннозы, галактозы и глюкуроновой кислоты [113].
липиды
В эту группу включают разнообразные соединения — жиры,
фосфатиды, стероиды, пигменты и др. Все они нерастворимы
в воде, но растворимы в бензоле, эфире, хлороформе, ацетоне.
Липиды в живой клетке выполняют несколько функций. Часть
липидов может окисляться и компенсировать расход энергии
клеткой. Другая часть оказывается прочно соединенной с
белками клетки и входит в состав цитоплазмы. Этот жир предназна-
62

чен для выполнения очень важной функции, связанной с
переносом электронов и процессом синтеза АТФ.
Липиды участвуют в регулировании проницаемости стенки
клетки для поступающих в нее питательных веществ, а также
в адсорбционных процессах, происходящих в цитоплазме.
Увеличению проницаемости клеточной стенки особенно способствуют
ненасыщенные жирные кислоты, например олеиновая. Жир
является также запасным веществом, накапливающимся в клетках
в виде включений капель иногда в очень больших количествах.
Например, некоторые виды дрожжей, в частности, дрожжепо-
добный гриб Endomyces vernalis, отличается высокой
способностью к образованию жира, содержание которого составляет 30—
50% к массе клеток. Отмечаются значительные качественные
и количественные изменения липидов при культивировании
бактерий рода Nocardia на средах с глюкозой и н-гексадеканом.
Общих липидов в клетках было соответственно 28 и 48%-
Клетки, выросшие на глюкозе, содержали липиды, представленные
глицеридами, тогда как в липидной фракции клеток, выросших
на гексадекане, присутствовало значительное количество воска
R—COOR—38% от общих липидов и преимущественно цетил-
пальмитата. При культивировании на средах, содержащих
пропан, бутан, гексан или тридекан в качестве источника углерода,,
воск не образовывался и липиды были практически такими же,,
как в организмах, выросших на глюкозе [123, 126, 70, 127, 121,.
141].
Внеклеточные липиды
Некоторые виды грибов родов Pullularia, Cryptococcus,
выделенные из растений тропических районов [121], способны
образовывать внеклеточные липиды. Дрожжи Torulopsis magnoliae'
также синтезируют внеклеточные липиды [66]. Установлены
условия образования липидов и изучен их состав [122]. Обычно1
количество внеклеточных липидов составляет 1,5—2,0 г на 1 л
среды, содержащей 5—6 г дрожжей в пересчете на сухую массу.
Липиды состоят из полиолов Сб и С6, этерифицированных
жирными кислотами (3-гидроксипальмитиновая и 3-гидроксистеа-
риновая), при этом некоторые гидроксилированные группы,
ацетилируются [135].
По-видимому, внеклеточные липиды образуются в клетках,,
а затем без изменения структуры выделяются в среду; механизм
прохождения их через оболочку неизвестен. Для получения
внеклеточных липидов необходима интенсивная аэрация культур,,
причем простого барботажа воздуха недостаточно. Состав
среды имеет при этом также большое значение. В частности,
отношение N:C должно быть очень небольшим (не более 1 : 10),
способствующим синтезу белков.
63

Фосфатиды. Стероиды
Кроме глицерина и жирных кислот фосфатиды содержат
также фосфорную кислоту и связанное с ней азотистое
основание — церебрин, коламин или холин. Фосфолипиды в комплексе
с белками обеспечивают перенос электронов в митохондрии при
окислительно-восстановительных реакциях, непосредственно
связанных с образованием богатых энергией связей (АТФ).
Показано, что фосфолипиды в наибольшем количестве
содержатся в клеточных мембранах и стенках бактерий и других
микроорганизмов [72, 126]. Биохимическая роль фосфолипидов
пока не выяснена, но уже сейчас очевидно, что они связаны
с ферментными реакциями, которые приводят к биосинтезу
некоторых компонентов клеточной оболочки микроорганизмов.
В частности, предполагают, что липополисахаридная и фосфоли-
пидная молекулы лежат рядом, внутри общего бимолекулярного
слоя клеточной оболочки.
Стероиды представляют собой физиологически активные
соединения сложной структуры. К ним относятся холестерин, эрго-
стерин (эргостерол), стероиды надпочечников и др.
Пигменты
В жизнедеятельности микроорганизмов важную роль играют
пигменты, из которых необходимо выделить прежде всего каро-
тиноиды, относящиеся к углеводородам с общей формулой
С40Н5бО. Важная физиологическая роль пигментов заключается
в их активном участии в межуточном обмене веществ. В
частности, каротиноиды являются исходными веществами, из
которых образуются витамины группы А. Они, по-видимому,
принимают участие в окислительно-восстановительных реакциях и
процессе роста.
Образование пигментов в клетках микроорганизмов зависит
от условий культивирования, состава питательной среды, ее рН
и т. д. Например, у некоторых микроорганизмов пигмент не
образуется при отсутствии в среде ионов магния, фосфатов и
других минеральных солей, а также аспарагина [32]. Содержание
в среде пептона (0,2—2,0%) и глюкозы (3—4%) обеспечивает
пигментообразование [132].
Даже у одного и того же вида бактерий количество и
интенсивность образования пигмента колеблются в широких
пределах. Многие бактериальные пигменты — красный, желтый
и оранжевый — относятся к группе липохромных соединений,
которые часто содержатся также в цветках растений, масле,
кукурузе. Цитохром — дыхательный пигмент аэробных бактерий
(аналогичен красному дыхательному пигменту крови) —не при-
64

дает видимой окраски бактериям; чаще всего пигмент
располагается внутриклеточно, но иногда находится и вне клетки (пио-
цианин, желтый флуоресцеин и др.).
ПОЛИФОСФАТЫ (ПФ)
Полифосфаты представляют собой соединения, относящиеся
к конденсированным неорганическим фосфатам. Они имеют
линейную неветвистую структуру, схематическое изображение
которой представлено ниже.
о о о
I! I! I!
-О-Р-О-Р-О — Р-О
I' I; II
о о о
Vvie T,Vn
Строение высокомолекулярного полифосфата.
Степень полимеризации п может иметь значение от 2 до 10s.
Основное количество ПФ представлено у грибов сравнительно
высокомолекулярными компонентами с п — 20 [26, 25, 78].
Средняя степень полимеризации высокомолекулярных полифосфатов
достигает в дрожжах 200 [104, 95], в бактериях [76] и простейших
500—800 [125а]. В молодом мицелии Neurospora crassa
количество ПФ составляет около 30% от общего фосфора клеток [20],
из них ПФ кислоторастворимой фракции составляют 8,5%, со-
лерастворимой 6,5% и кислотонерастворимой 17%.
Несмотря на богатое содержание ПФ в большинстве
микроорганизмов удалось получить мутанты, полностью лишенные
даже потенциальной возможности синтезировать в клетках ПФ,
но не утратившие способности к нормальному росту и развитию
[76]. Этот факт затрудняет выяснение вопроса о
физиологической роли полифосфата, однако имеющиеся данные позволяют
все же говорить о важной физиологической роли
неорганических ПФ. По-видимому, как и другие клеточные метаболиты,
полифосфаты полифункциональны и выполняют в
жизнедеятельности микроорганизмов не одну, а несколько функций. При
этом разные функции определяются не только молекулярной
массой ПФ, но и локализацией их внутри клеток [99а, 23а, 27а,
36а], а также атакуемостью ферментами, участвующими в их
превращениях. Прежде всего ПФ обеспечивают регулирование
уровня ортофосфата в микробных клетках [24].
Важность поддержания постоянного и достаточно низкого
уровня ортофосфата в клетке связана с тем, что: 1) концентра-
О
-Р—О-
I;
о
(п.2)'
5 Заказ 7
65

ция ортофосфата в клетке является регулирующим фактором,
очень сильно влияющим на направленность биохимических
процессов; 2) накопление в клетках избыточного количества
ортофосфата может сдвигать величину осмотического давления
и рН; 3) ПФ являются, по-видимому, формой обезвреживания
поступающего в клетку фосфата.
Второй функцией ПФ в жизнедеятельности микроорганизмов
является резервирование внутри клеток значительных количеств
активированного фосфата, содержащего макроэргические
связи. Кислоторастворимые ПФ являются наиболее легко
мобилизуемым резервом активированного фосфата. Солераствори-
мые ПФ, используемые только в условиях продолжительного
роста культуры, являются, по-видимому, специальным резервом
активированного фосфата для синтеза нуклеиновых кислот,
и не случайно, что эта фракция ПФ присутствует в ядрах клеток.
Кислотонерастворимые ПФ, локализованные на периферии
клетки, расходуются в малых количествах даже в растущей
культуре. Возможно, это связано с их участием в поглощении
Сахаров [135, 136, 124, 58].
Таким образом, специальной функцией этих ПФ является
участие в поглощении глюкозы и ее активации в клетках
дрожжей, плесневых грибов и других микроорганизмов. Полифосфаты
волютиноподобных включений могут транспортировать ПФ с
периферии клетки, где они синтезируются, к месту их потребления,
и наоборот, участвуют в механизме транспорта моносахаридов
на периферию клетки для построения полисахаридных клеточных
стенок, а глюкозы (как источник образования рибозо-5-фосфа-
та)—для синтеза РНК. Эти включения могут выполнять
функцию транспортера также и низкомолекулярных метаболитов
[102].
Вероятно, ПФ в одном случае могут использоваться с
помощью полифосфатгексокиназ для прямого фосфорилирования
глюкозы и других гексоз; у других организмов — с помощью
других фосфотрансферазных реакций, приводящих к
образованию АТФ и других макроэргических соединений. Например,
у микобактерий и коринебактерий выявлен фермент полифос-
фатглюкокиназа, осуществляющий фосфорилирование глюкозы
не с помощью АТФ, по хорошо известной схеме, а за счет
высокомолекулярных полифосфатов:
глюкоза + (ПФ)П П0ЛИФ°сФат' _^ глюкозо-6-фосфат + (ПФ)П_1
глюкокиназа
[38, 40]. Кроме того из микобактерий наряду с полифосфатглю-
кокиназой выделен другой фермент, катализирующий реакцию
фосфорилирования фруктозы с образованием фруктозо-6-фосфа-
та за счет фосфора ПФ и также без участия АТФ [138]. Интересно
отметить, что при росте микроорганизмов на среде с глюкозой
полифосфатфруктокиназа не образуется.
66

Таким образом, ПФ могут выполнять ту или иную функцию,
обычно присущую АТФ, а состав питательной среды тонко
регулирует полифосфатный обмен этих организмов.
Установлено, что биосинтез ПФ гетеротрофов и автотрофов
осуществляется за счет гликолитического фосфорилирования
(см. схему). Следовательно, ПФ накапливаются в клетках на
тех этапах роста, когда потребность в энергии, заключенной
в АТФ, снижается, т. е. в период задержки размножения.
Ь '»3 -дифосфоглицериновая
кислота
СОО^Р
Ьпип т ^11Ф L.
сн2ор^
АТФ vx.
(в клетках молодой культуры)
полифосфат
2. (ПФ)П ♦ АТФ ДД
3- фосфоглиивриновая
кислота
полифосфат - СООН
синтетаза 1 , ,
*-UH(Jn * ^||ф)
СН2ОР
(в клетках старой культуры)
СООН
1
снон
1
СН2ОР
3 -фосфоглицериноаая
кислота
— (ПФ)П., + АДФ
Биосинтез полифосфатов микроорганизмами.
Доказано существование у Corynebacterium xerosis полифос-
фатазы, гидролизующей высокополимерные ПФ до ортофосфа-
та [85]. Полифосфатазная активность изменяется в процессе
развития культуры параллельно накоплению в клетках ПФ и поли-
фосфатсодержащих гранул (рис. 19). Это указывает на важную
роль этого фермента в обмене ПФ у бактерий. Кроме того,
у микобактерий и коринебактерий был выявлен еще один
фермент — полифосфат-АМФ-фосфотрансфераза, фосфорилирую-
щий АМФ без участия АТФ за счет неорганического ПФ [138,
58].
Гиперкомпенсация, т. е. накопление «превышающего»
количества ПФ, а также ПФ-киназы и ПФ-азы наблюдается после
непродолжительного культивирования микроорганизма на среде
без фосфора. В этих условиях интенсивное накопление ПФ
связано не с увеличением активности имевшихся ранее ферментов —
ПФ-киназы и ПФ-азы, а с усилением биосинтеза этих ферментов.
Отсутствие фосфата в среде дерепрессировало синтез
ПФ-киназы и ПФ-азы и привело к обильному накоплению этих фермен-
5*
67

тов. Это и обусловило в данном случае очень быстрый синтез
необычайно большого количества ПФ. При гиперкомпенсации
выявляется регуляция обмена ПФ на генном уровне [75]. Фосфорное
голодание приводит также к дерепрессии кислой фосфатазы
у дрожжей Sacch. millis, причем синтез этого фермента не
связан с синтезом и накоплением ПФ. Явление гиперкомпенсации
при накоплении ПФ после
фосфорного голодания у Neuro-
spora crassa вызывает
биосинтез нуклеиновых кислот и фос-
фолипидов при отсутствии в
среде фосфата. По-видимому,
ПФ используются для
биосинтеза указанных соединений не
через АТФ, а путем
постепенной деградации
высокополимерных ПФ до ортофосфа-
та [75].
Итак, ПФ как макроэрги-
ческие соединения должны
выполнять в жизнедеятельности
микроорганизмов функцию
накопителей и донаторов
фосфата и энергии. Их роль в
обмене веществ часто сравнивают
с функцией фосфогенов
животных клеток (креатинфос-
фат, аргининфосфат) и с
терминальными пирофосфчатными связями в АТФ. Расщепление
фосфоангидридных связей ПФ до образования ортофосфата
сопровождается выделением значительного количества тепла.
/ V 4У
/ г у
II Г А\ ^
'А
~| 111II
3.5-
^
в»-
^ ~~
гп-
\ Iй"
, !§
т
110 -^
1Щ i,
л
6 8 Ю 1? % « часы
Рис. 19. Изменение содержания ПФ.
полифосфатных гранул и активность
полифосфатазы у Corynebacterium
xerosis:
/ — активность полифосфатазы; 2 —
полифосфаты, 3 — гранулы, 4 —
прирост биомассы.
СОСТАВ КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК
В течение последнего десятилетия по биохимии клеточной
стенки микроорганизмов и прежде всего бактерий получены
исключительно ценные данные, обогатившие химическую
микробиологию. Эти исследования привели к открытию двух до сих пор
неизвестных классов гетерополимеров — гликопептидов и тей
хоевых кислот [133а, 125а, 43а]. Полученные данные позволили
также высказать предположение о возможности пересмотра
классификации некоторых групп микроорганизмов на основании
сходства в составе клеточной стенки [54а].
Стенки большинства микроорганизмов построены из
компонентов двух основных типов: организованной сети микрофибрилл
которая придает стенке твердость, и матрикса, в который
погружены микрофибриллы [114а, 129а].
68

Стенка бактериальной клетки
Структурными компонентами бактерий являются гликопепти-
ды (мукопептиды, пептидогликаны, гликозаминпептиды, или му-
реины), которые встречаются также в стенках сине-зеленых
водорослей и риккетсий. Содержание гликопептидов в
бактериальных стенках варьирует от 95% (у некоторых грамположительных
бактерий) до 5—10% (у грамотрицательных видов). Гликопеп-
тиды построены из чередующихся звеньев N-ацетилглюкозамина
и N-ацетилмурамовой кислоты (3-О-карбоксиэтильного
производного N-ацетилглюкозамина), связанных (3-1,4-связямн (см.
клише на стр. 27) [37, 123]. Мурамовая кислота (murus-стенка)
была найдена лишь в бактериях и сходных с ними
микроорганизмах, таких, как сине-зеленые водоросли.
Биологическое значение D-изомеров аминокислот остается до
настоящего времени не выясненным, хотя установлено, что
разложение их ферментами почвенных микроорганизмов обычно
затруднено. Такие пептидные связи нечувствительны также к
действию протеолитических ферментов — трипсина, пепсина и др.
Возможно, что устойчивость к ферментам объясняется необычной
D-конфигурацией глютаминовой кислоты и аланина.
Большинство протеолитических ферментов не в состоянии разорвать
пептидные связи между D-аминокислотами, и, быть может, такая
конфигурация представляет собой естественный защитный механизм
бактерий от литического действия этих ферментов. В то же
время показано, что D-формы некоторых аминокислот (серина, ме-
тионина, треонина, фенилаланина, триптофана, гистидина)
вызывают угнетение клеточного деления у бактерий вида Erwinia,
а при концентрации в среде более чем 0,0336—0,0067 М они
подавляют и рост [122]. Предполагают, что D-амннокислоты
нарушают биосинтез клеточной стенки, хотя связь между синтезом
клеточной оболочки и клеточным делением остается неясной [19].
В исследованиях состава клеточной оболочки особую роль
сыграл лизоцим. Бактерия Micrococcus lysodeikticus отличается
особой чувствительностью к этому ферменту. Лизоцим растворяет
клеточную стенку, разрывая химические связи между ее
субъединицами — аминосахарами. Состав пептида, полученного
после гидролиза клеточных стенок Micr. lysodeikticus с помощью
бактериолитического фермента, выделенного из Mycobacterium
[112, 113], представлен ниже (в мкмоль/г клеточных стенок).
Глютамииовая кислота 0,45 L-алании 0,43
Глицин 0,50 D-аланин 0,41
Лизин 0,38 Мурамовая кислота . . 0,42
Алании 0,84 Глюкозамии 0,54
Другие аминокислоты присутствовали в количествах, не
превышающих 2% от содержания любого из перечисленных соеди-
69

нений. Из таких аминокислот встречаются мезо- и L, L — диами-
нопимелиновая кислота (в гликопептидах из стенок Е. coli), 2,4-
диаминомасляная кислота (Corynebact. tritici), 3-окси-2,6-диами-
нопимелиновая кислота (Ampullariella regularis) и т. д.
Методом тонкослойной хроматографии, проведенной с
применением производного динитрофенола (ДНФ) и при анализе
фракций, полученных разделением пептидов на сефадексе Г-25,
удалось установить структуру пептида [90].
Аминокислотой с ЫНг-концевой группой в гликопептиде
стафилококка [125а] является аланин, который присоединяется
к остатку глютаминовой кислоты. Глицин присоединяется при
этом к а-карбоксильной группе глютаминовой кислоты.
Полагают, что пептид состоит из тетра- или пентапептидных
единиц ', которые образуют в клеточной стенке своеобразную
сетчатую структуру. Последовательность расположения этих
аминокислот обычно принимается следующая: L-аланин — глю-
таминовая кислота — диаминопимелиновая кислота — D-аланин.
В составе клеточных стенок отмечаются вариации,
обусловленные разными причинами и прежде всего условиями
выращивания микробов [59, 94, 30]. Различия в составе клеточных стенок
грамположительных и грамотрицательных бактерий отмечают
в следующем:
Грамположительные Грамотрицательные
1. Содержат много муреина 1. Муреина немного (10%), он
(30%), который расположен расположен тонким слоем,
многослойно
2. Обычно содержат тейхое- 2. Не содержат тейхоевой кис-
вую кислоту. лоты..
3. Отсутствуют липопротеиды. 3. Содержат липопротеиды.
4. Содержат заметное количе- 4. Полисахаридов немного,
ство полисахаридов.
Следовательно, в состав матрикса клеточных стенок
грамположительных бактерий входят тейхоевые кислоты. Известны два
типа кислот: 1) рибиттейхоевые кислоты, в молекуле которых
Cj одного остатка фосфодиэфирных групп рибита связаны с Cs
соседнего остатка, причем длина цепи кислоты составляет от 10
до 40—50 остатков, и 2) глицеринтейхоевые кислоты, состоящие
из остатков глицерофосфата; предполагают, что основная цепь
кислоты обычно содержит около 20 остатков спирта [33а, 43а].
Клетки каждого штамма бактерий содержат тейхоевую
кислоту только одного из этих типов. Например, из стенок
Staphylococcus lactis 7944 выделены глицеринтейхоевые кислоты, а из
1 Число пептидных единиц вычисляется по количеству свободных
аминогрупп лизина и карбоксильных концевых групп аланина.
70

стенок Вас. subtilis — рибиттейхоевые кислоты. Единственным
исключением из этого общего правила являются стенки штамма
Streptomyces, содержащие одновременно обе тейхоевые кислоты.
Некоторые из гидроксильных групп глицерина и рибита в
скелете молекулы могут быть связаны с D-аланином или с моно-,
ди- и трисахаридами. Присоединение тейхоевых кислот к глико-
пептидам осуществляется, по-видимому, за счет образования
фосфодиэфирной связи между концевым фосфатом тейхоевой
кислоты и остатком мурамовой кислоты. Большинство грамполо-
жительных бактерий содержит также глицеринтейхоевые
кислоты, расположенные между клеточной стенкой и цитоплазматиче-
ской мембраной. Эти периплазматические кислоты часто
называют мембранными или внутриклеточными.
Таким образом на основании имеющихся данных структура
гликопептида клеточной стенки грамположительных бактерий
представляется в следующем виде: к полисахаридным цепочкам,
состоящим из N-ацетилглюкозамина, N-ацетилмурамовой
кислоты и тейхоевых кислот, присоединяются цепочки из
аминокислотных единиц — пептиды. Пептиды, связанные между собой
пентаглициновыми мостиками, образуют поперечные связи поли-
сахаридных цепочек. Пенициллин, подавляя образование
поперечных связей, блокирует процесс синтеза клеточной стенки
размножающихся бактерий (см. рис. 9). При инкубации
стафилококков в среде с пенициллином происходит накопление ури-
диндифосфата, т. е. соединения, представляющего собой
промежуточный продукт синтеза клеточной оболочки. Полисахариды
матрикса стенок связаны ковалентно с гликопептидом.
Стенки грамотрицательных бактерий имеют более сложный
химический состав. Они содержат, меньше гликопептида, но в то
же время, по-видимому, содержат белок, включающий полный
набор аминокислот. Самый внутренний слой стенки представлен
гликопептидом. Над ним находится более широкий слой,
состоящий из неплотно упакованных молекул белка. Этот слой в свою
очередь покрыт слоем липополисахаридов, имеющим каналы.
Поверхность стенки Е. coli покрыта бляшковидными и сосочко-
видными структурами, состоящими из липопротеида, которые
полностью не закрывают липополисахаридный слой.
При экстракции клеточных стенок трихлоруксусной кислотой
(0,25 н.) выделяются белок, полисахарид и липид, в то время как
при экстракции смесью фенол — вода белок не выделяется.
Возможно, в клеточной стенке липополисахарид соединен с белком
[83а, 996].
Таким образом, молекулярная организация стенок
грамположительных и грамотрицательных бактерий различна. Полагают,
что метод окраски по Грамму, с помощью которого бактерии
делят на две группы, основывается на разнице в проницаемости
клеточных стенок этих бактерий. У грамположительных бактерий'
71

комплекс кристаллический фиолетовый — иод, по-видимому,
удерживается в стенке после промывания этиловым спиртом или
ацетоном; при этом, вероятно, происходит уменьшение диаметра
пор в гликопептиде. Стенки грамотрицательных бактерий,
наоборот, содержат намного меньше гликопептида, молекулы
которого к тому же сшиты гораздо слабее, чем в стенках грамполо-
жительных бактерий. Поэтому даже после обработки этиловым
спиртом поры в молекуле гликопептида грамотрицательных
бактерий остаются достаточно широкими, что позволяет
экстрагировать комплекс кристаллический фиолетовый — иод [125а, 129а].
Стенка клеток плесневых грибов
Стенки клеток или гиф большинства исследованных мицели-
альных грибов содержат микрофибриллы диаметром 15—25 нм.
Например, клеточные стенки грибов Asp. oryzae, Asp. niger
и Penicillium notatum состоят главным образом из полимеров
нейтральных углеводов, составляющих 70—85% сухой массы
(табл. 7) и дающих при гидролизе глюкозу, галактозу, маннозу
и арабинозу, и полимеров гексозаминов (9—13%),
представленных глюкозамином и галактозамином. Полисахариды состоят
главным образом из глюканов, в которых глюкозные остатки
связаны р-1—3 и р-1—6 связями; и маннанов, имеющих связи
а-1—3 и а-1—4, а также из хитина, состоящего из остатков N-аце-
тилглюкозамина, связанных р-1—4 связями [П4а].
Таблица 7
Состав клеточных стенок некоторых плесневых грибов (% на сухой препарат)
Организмы

Углеводы

Хитин
Белки
Липи-
ды
Фосфор

ратурный

источник
Asp. oryzae
споры
клетки
Asp. niger
Penicillium notatum . .
Mucor rouxii
Phytophthora cinnamomi
Saprolegnia farax . . .
Allomyces macrogynus ,
70
80
83
85
56
88
93
74
+
+
+
+
+
+
19
5
0,5—
2,5
8,9
6,3
3,4
1,1
10
—
2,7
1,2
7,8
2,4
1,0
—
4
4,5
0,1
0,7
23,3
0,1
0,12
[137]
[91]
[100]
[99]
[93]
В состав клеточных стенок входят также белки, содержание
которых колеблется в широких пределах — от 0,5 до 20%, в
зависимости от вида гриба и его возраста. Предполагают, что белки
присутствуют в составе клеточных стенок в виде специфических
72

полисахариднобелковых комплексов [94]. Кроме того клеточные
стенки содержат некоторое количество липидов— 1,0—11 % от
сухой массы препарата.
Основными компонентами клеточных стенок Neurospora crassa
являются также хитин и 6-1—3-глюкан, гидролизующиися под
действием р-1—3-глюконазы до глюкозы. Таким образом, стенки
клеток этого микроорганизма состоят из двух компонентов:
1) микрофибрилл, являющихся как бы остовом стенки и
состоящих только из хитина, и 2) аморфного матрикса,
представленного р-глюканом и белками.
В состав белков входят не все протеиногенные
аминокислоты. Глютаминовая и аспарагиновая кислоты содержатся в
больших количествах и главным образом в виде амидов. В то же
время в составе белковой фракции не обнаруживаются оксипро-
лин, цистеин и валин. Часть этих белков, видимо, является
компонентом или связана с системой пор, входящих в состав
матрикса.
В клеточных стенках большинства нитчатых грибов также
обнаруживаются главным образом глюкан и хитин [106], или
целлюлоза и гликан [99].
Содержание фосфора в клеточных стенках колеблется в очень
широких пределах — от 0,03 до 23% от сухой массы
препарата.
В клеточных стенках и целых клетках мицелия грибов не
обнаружены тейхоевые кислоты, хотя в состав стенок актиномице-
тов и бактерий они входят [92, 30, 31]. Фосфор в клеточных
стенках грибов может быть связан с некоторыми гликопротеидными
фракциями или входить в состав маннанов в виде маннозо-6-фос-
фата. Высокое содержание фосфора (20%) в клеточных стенках
связано, по-видимому, с сорбцией полифосфатов и других
фосфорных соединений [21]; при этом могут образоваться комплексы
между белками, а также полимерами из остатков галактозами-
нов, входящих в состав клеточных стенок, и полифосфатами,
диссоциирующими при низких значениях рН [126].
У многих грибов с клеточной стенкой и стенкой гиф связан
ряд ферментов: целлобиаза, мальтаза, трегалаза и р-фруктофу-
ранозидаза (инвертаза): со стенкой могут быть также связаны
некоторые окислительные ферменты. Многие из этих ферментов
не являются, вероятно, неотъемлемой частью структуры стенки,
но локализованы в области, известной как периплазма и
расположенной между внутренней поверхностью стенки и внешней
поверхностью цитоплазматической мембраны. Компоненты
клеточных стенок Sacch. cerevisiae и Candida utilis, по-видимому,
связаны прочными химическими связями, так как в мягких
условиях удается выделить маннан-белковый и глюкоманнан-
белковый комплекс. Глюкозамин служит, вероятно,
компонентом, при посредстве которого осуществляется связь между белком
73

и полисахаридом. В периплазме присутствуют р-фруктофурано-
зидаза и кислая фосфатаза.
Химический состав других структур клетки был приведен
ранее при рассмотрении ультраструктуры клеток микроорганизмов.
В частности, отмечалось, что биологическая мембрана состоит
главным образом из липидов и белков. Содержание белка в
мембранах варьирует примерно от 50 до 75%. Какая-то часть белка
и липидов может присутствовать в виде липопротеидов, но
обычно считают, что основная масса этих компонентов не связана
ковалентными связями. Большинство мембран протопластов
микроорганизмов содержит также небольшие количества углеводов
(2—5%) и гликолипидов, особенно у грамположительных
бактерий [51а]. Так, например, Micrococcus lysodeikticus содержит
маннозилдиглицерид, а у Streptococcus faecalis были
обнаружены моноглюкозилдиглицерид и галактозилглюкозилдиглицерид.
Содержание РНК и ДНК окончательно не доказано. Поры
мембран выстилаются фосфолипидными молекулами [99в, 89а],
а сами поры заполнены молекулами белка — пермеазой.
Основная часть белка мембраны протопласта микроорганизмов
содержит все аминокислоты, обычно обнаруживаемые в белках, в
количествах, также существенно не отличающихся от тех, которые
наблюдаются в белках других типов. В изолированных
мембранах обнаружены многие ферменты. Следовательно, некоторые
белки мембраны являются ферментами. Рибосомы, число
которых в каждой клетке составляет более 1000, состоят на 40—60%
из РНК и 60—40% из белка (по массе). Полагают, что белок,
имеющий молекулярную массу около 25 000, окружает РНК,
образуя как бы неплотно связанную сеть.
Многие рибосомы бактерий и, возможно, также других
микроорганизмов, лежат в цитоплазме свободно. У организмов,
для которых характерно наличие эндоплазматической сети,
рибосомы могут быть связаны с этими пластинками. Фрагменты
этой сети с вкрапленными в них рибосомами осаждаются в форме
микросом. Наиболее важным ферментом, найденным в
рибосомах, является рибонуклеаза. Этот фермент часто присутствует
в латентном состоянии, но в активной форме он может служить
для освобождения рибосом, катализируя гидролиз и-РНК-
Растворимые компоненты цитоплазмы. Жидкость, которая
остается после удаления из суспензии разрушенных
микроорганизмов всех частиц, представляет собой растворимую фракцию,
или клеточный сок. Из веществ с высокой молекулярной массой
в этой фракции большая часть приходится на белок, различные
ферменты и т-РНК, состоящую из 70—80 нуклеотидных остатков.
В растворимой фракции некоторых микроорганизмов
встречаются пигменты: продигиозин, виолацин, пиоцианин, иодинин
и др. К низкомолекулярным соединениям, извлекаемым три-
хлоруксусной кислотой, относятся прежде всего запасные углево-
74

ды, химическая природа которых различна у разных организмов.
Грибы и дрожжи часто содержат дисахарид трегалозу. В
цитоплазме имеется также фонд (пул) аминокислот и нуклеотид. При
этом деление цитоплазмы на отсеки неизбежно приводит к
возникновению ряда совершенно обособленных пулов.
Гетерогенность пулов .аминокислот и нуклеотидов доказывается, в
частности, кинетикой включения в макромолекулы меченых
предшественников [51].
Наличие в цитоплазме низкомолекулярных соединений
создает заметную разность в осмотическом давлении клеточного
содержимого и наружной среды. У грамположительных бактерий
осмотическое давление достигает 30 атм, у грамотрицательных
4—8 атм.
Итак, определенные внутриклеточные структуры, включая ци-
топлазматические мембраны и рибосомы, очень сходны по
размерам и молекулярному строению во всех типах живых клеток.
Другие внутриклеточные структуры, например митохондрии,
имеются только в клетках крупных микроорганизмов (дрожжей,
микроскопических грибов, растений и животных); в более мелких
микроорганизмах, таких, как бактерии, они, по-видимому,
отсутствуют.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ К ГЛАВЕ II
1. Алимова (Лубенец) Е. К. «Биохимия». Т. 5. 785, 1959.
2. А ф а н а с ь е в а Т. П., Кул а ев И. С. и др. «Биохимия». Т. 33,
1968.
3. Б е к к е р 3. Э. Физиология грибов и их практическое использование.
Изд. МГУ, 1963.
4. Белозерский А. Н. Нуклеиновые кислоты. М. Изд-во «Знание*,
1961; 1964.
5. Белозерский А. Н., Кул а ев И. С. «Биохимия». Т. 22, 29, 1957.
6. Белозерский А. Н., Кулаев И. С. Сб. «Проблемы
эволюционной и технической биохимии». М. Изд-во «Наука», 190, 1964.
7. Бычков СМ. «Успехи современной биологии». 56, 305, 1963.
8. В а н В е з е р Д. Р. Фосфор и его соединения. М., ИЛ, 1962.
9. Д о р о х о в В. В. Биосинтез кислой протеиназы плесневыми грибами.
Диссертация ВНИИ ферментной и спиртовой промышленности, 1968.
10. Д о р о х о в В. В., К о н о в а л о в С. А. Кислые протеиназы плесневых
грибов и их использование. ЦИНТИпищепром, 1968.
11. Ев реи нов а Т. Н. и др. «Микробиология», Т. XXIX, 516, 1960;
Т. XXX, 516, 1961; Т. XXXI, 428, 1962; Т. XXXIV, 417, 1965.
12. Зайцева Г. Н. Биохимия азотобактера. М. Изд-во «Наука», 1955.
13. Зайцева Г. Н., Б е л о з е р с к и й А. Н., Новожилова Л. П.
«Биохимия». Т. 24, 1054, 1959.
14. 3 у е в а Р. В. Физиолого-биохимические исследования
экспериментально полученного мутанта Aspergillus oryzae — активного продуцента
кислой протеиназы. Автореферат диссертации. ВНИИсинтезбелок, 1971.
14а. Зуева Р. В., Коновалов С. А. «Микробиология». Т. XL. Вып. 1,
85, 1971.
15. Коновалов С. А. Биохимия бродильных производств. Изд-во
«Пищевая промышленность», 1967.
75

16. Коновалов С. А., Я к у ш е в а М. И. Труды ВНИИФСа. Вып. XIII,
1962.
17. Ко нова лов С. А., Котов В. Б., Дорохов В. В.,
Шахова Т. В., О в ч а р о в А. Сб. докладов IX Международного конгресса по
микробиологии. М., 1966.
18. Коновалов С. А., Д о р о х о в В. В. ДАН СССР. Т. 186, № 1,
208—211, 1969.
19. Коротяев А. И. «Успехи микробиологии». 1967, № 4, 138.
20. Крашенинников И. А. Изучение локализации фосфорных
соединений в клеточных структурах мицелия Neurospora crassa. Диссертация.
МГУ, 1967.
21. К р и ц к и й М. С. Фосфорный обмен в плодовых телах шампиньонов.
М., Ин-т биохимии АН СССР. Автореферат диссертации, 1965.
22. К р и ц к и й М. С, Б е л о з е р с к и й А. Н., К у л а е в И. С.
«Биохимия». Т. 33, 874, 1968.
23. Крицкий М. С, Кул а ев И. С. «Биохимия». Т. 28, 694, 1963.
23а. Крицкий М. С, Чернышева Е. К., К у л а е в И. С. ДАН
СССР, 192, 1166, 1970.
24. Кулаев И. С. Биохимия высокомолекулярных полифосфатов.
Докторская диссертация МГУ, 1969.
25. Кулаев И. С, Афанасьева Т. П., Беликова М. П.
«Биохимия». Т. 32, 539, 1967.
26. К У л а е в И. С, Б е л о з е р с к и й А. Н., М а н с у р о в а С. Э.
«Биохимия». Т. 24, 253, 1959.
27. К v л а е в И. С, Белозерский А. Н., Островский Д. Н.
«Биохимия». Т. 26, 188, 1961.
27а. Кулаев И. С, Крашенинников И. А., К о к у р и н а Н. К.
«Биохимия». Т. 31, 850, 1966.
28. Кулаев И. С, У р ы с о и С. О. «Биохимия». Т. 30, 282, 1965.
29. М а н с у р о в а С. Э., Ш а б а р о в а 3. А., К у л а е в И. С.
«Биохимия». Т. 30, 514, 1965.
30. Наумова И. Б. Сб. «Успехи биологической химии». М. Изд-во
«Наука». VI, 199, 1964.
31. Наумова И. Б., Б е л о з е р с к и й А. Н. IX Международный
конгресс по микробиологии. М. Изд-во «Медицина». Б 1/1, 95, 1966.
32. О м е л я н с к и й В. А. Практическое руководство по микробиологии.
М. Изд. АН СССР, 1940.
33. О р л о в а О. К., Е ф и м ц е в а Е. П. Журнал микробиологии,
эпидемиологии, иммунологии, 3, 89, 1964.
33а. Роуз Э. Химическая микробиология. Изд-во «Мир», 1971.
34. Фердман Д. Л. Химия и биохимия конденсированных фосфатов.
Украинский биохимический журнал, 32, 452, 1960.
35. Фишер П. Н., К а л у и я н ц Н. П., А л я м о в с к а я Т. С, Информ.
сб. «Микробиологический синтез». ВНИИсинтезбелок. Вып. 12, 3, 1966.
36. Ф р о б и ш е р М. Основы микробиологии. М. Изд-во «Мир», 1965.
36а. Чернышева Е. К., К р и ц к и й М. С, К v л а е в И. С.
«Биохимия». Т. 36. вып. 1, 138, 1971.
37. Шарон Н. В кн.: «Молекулы и клетки». Вып. 5, 106—117, 1970.
38. Ш и м о н а О. и др. «Биохимия». Т. 32, № 3, 1967.
39. Е ф и м ц е в а Е. П. «Успехи микробиологии», № 4, 49, 1967.
40. Урысон С. О., Кулаев И. С. ДАН СССР. Т. 183, 957, 1968.
41. Anderson S., M a t s u h a s h i M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci, US,
53, 881, 1965.
42. A n d e г s о n F. В., M i 11 b a n k S. W. Biochemical Journal. 99, 682—
687, 1966.
43. Applegarth D. A. Arch. Biochem. Biophys., 120, 471, 1967.
43a. Archiba Id A. R., Baddiley J. Adv. carbohyd. Chem., 21, 823,
1966.
76

44. А г о n s о n I. M., M a ch 1 i s L. S. Bot., 46, 292, 1959.
45. A u r i с h H. Antonie Van Leeuwenhock, 32, 229, 1966.
46 Bagdian G., D г б g e W. et al. Biochem. Zeitschrift, 344, 197, 1966.
47. Bergkvist R. Acta Chem. Scand., 12, 1549; 12, 1554, 1958.
48. Burger M., В а с о n E. E., Bacon J. S. D„ Mi lib an к J. W.
Nature, 205, 622, 1965.
49. В a r t n i с к i - G a r e i a S. J. Gen. Microbiol., 42, 57, 1966.
50. Bartnicki-Gareia S., NickersonW. J. Bioch. Biophys.
Acta, 58, 209, 1962.
51. Britten R. L. Recent Progress in Microbiology. Vol. 8. ed. by
Gibbons N. E. Toronto. Universily Press, 1963.
51a. В r u n d i s h D. E„ Shaw N.. В a d d i 1 e у J. S. Biochem. J., 18, 308,
1965.
52. Cameron J. L, Fischer W. D. Abst. Fifth. Annual Meeting Am.
Soc, ior. Cell. Biol., 30, 17A, 1965.
53. Chester V. E. Biochem. J., 86, 153, 1963.
54. С г о о к Е. M„ JohnstonJ. R. Biochem. J., 83, 325. 1962.
54a. Cummins C. S. in «Microbiol, classification», Symp. Soc. gen.
Microbiol.. 12, 212, 1962.
55. D a v i s R. Symposium on yeast protoplasts, Jena, 1965, Akademie-
Verlag., Berlin, 195.
56. Davis R., E 1 v i n P. A. Biochem. J., 93, 8 p., 1964.
57. Dawson P. S. Biochim. Biophys. Acta, III, 1, 51—66, 1965.
58. Deierkauf F. A., Booij H. L. Biochim. Biophys. Acta., 150, 214,
1968.
59. Dyke K. G. H. Biochim. Biophys. Acta. 82, 374, 1964.
60. E n s i g n Т., W о 1 f e R. J. Bacteriol., 90, 395, 1965.
61. Ensign Т., W о 1 f e R. J. Bacteriol., 91, 524, 1966.
62. Ertola R. J., Mazza L. A., Balatti P. A., Segovia R. F.
.Journ. term, technol.. 47, 9, 1969.
63. F a 1 i n a N. N„ M a s I о v a R. A., I а к i m о w P. A. Mikrobiologija,
32, 223, 1963.
64. Friesen J. D., M a a 1 о 1 О. Biochim. biophys. Acta, 95, 436, 1965.
65. Fritsche W. Zeitschr. allgemeine Mikrobiol., 8, 2, 91, 1968.
66. Galling G. Flora (Jena), 156, 250, 1965.
67. G h u у s e n S. M, SaltonM. Biochim. Biophvs Acta, 40, 462, 1960.
68. Ghuysen S. M. Biochim. Biophys. Acta, 47. 561, 1961.
69. Ghuysen S. M. et al. Biochemistry, 4, 22, 45, 1965.
70. G о r i n P A. et al. Can. J. Chem., 39, 846, 1961.
71. Green D. et al., 1965, Arch. Biochem. Biophys., 112, 635.
72. Green D., К о р а с z у к. Acta biochimica polonica, 13. 4, 417—427,
1966.
73. Harbert D. Symp. Soc. Gen. Microbiol., 11, 391, 1961.
74. Harold F. M. Biochim. Biophys. Acta, 45, 172 1960.
75. Harold F. M. J. Bacteriol., 83, 1047, 1962.
76. Harold F. M. J. Bacteriol., 86, 216, 1963.
77. H a r о 1 d F. M. Reviews, 30, 772, 1966.
78. H a r о 1 d F. M„ M i 11 e r A. Biochim. Biophys. Acta, 50, 261, 1961.
79. Hayashi G. A., Barkullis D. J. Bacteriol., 77, 177, 1959.
80. Herbert D. Symp. Soc. Gen. Microbiol., 11, 391, 1961.
81. H о b s о n P. N.. M а с P h e r s о n H. Biochem J., 53, 4, 38, 341, 1953.
82. H о 1 d e n M., T г а с с у М. Biochem. J., 47, 407, 1950.
83. H о 1 d s w о r t h. Biochim. et biophys. acta, 8, 110, 1952.
83a. H о г е с к e r B. L. A. Rev. Microbiol., 20, 253 1966.
84. H о r n u n g M. J. Bacteriol., 86, 6, 1345, 1963.
85. Hughes D. E. Muhammed A. Coll. Intern. CNRS, Strasbourg
1961, Ed. CNRS, Paris, 1961, 591, 1962.
77

86. Iizuka H. et al. Journ. gener. and applied Microbiol., 11, 2, 152—
159, 1965.
87. Ikawa M. Biol. Chem., 236, 1087, 1961.
88. 11 о E., S t г о m i n g e г S. J. Biol. Chem., 239, 210, 1964.
89. Johnston M. J. Biochem. Z., 96, 651, 1965; Science, 155, 3769, 1515,
1967.
89a. Kates M. Adv. Lipid. Res., 2, 17, 1964.
90. Katz W., Strom in ger S. Biochemistry, 6, 3, 930—937, 1967.
91. Kjeldgraard N. O. Biochim. biophys. Acta, 49, 64, 1961.
92. Kjeldgraard N. O., Kurland С G. J. Molecul. Biol., 6, 341, 1963.
93. Kleber H., Aurich H. Zeitschr. Allgem. Mikrobiol., 8, 1, 9—18,
1968.
94. К or n E. D., Northcote D. H. Biochem. J., 75, 12, 1960.
95. Langen P. Biol. Rundsch., 2, 145, 1965.
96. Langen P., Liss E., Lohmann K. Colb. Intern. CNRS, Stras-
burg, 1961, Ed. CNRS, Paris, 603, 1962.
97. L a n z i 11 о t i A. et al. J. Am. Chem. Soc, 86, 1880, 1964.
98. L e у h - В о u i 1 1 e M. et al. Biochemistry, 5, 3079, 1966.
99. L i n d i g к е i t R. Abhandl. Dtsch. Akad. Wiss., Erwin Baur Gedachtn-
Verl. 4, 177, 1964.
99a. Liss E., Langen P. Naturwissenschaften, 46, 151, 1959; Biochem.
Z., 333, 193, 1960.
996. L ii d e r i t z O., S t a u b A. M., W e s t p h a 1 О. Вас. Rev., 30, 192,
1966.
99b. LuzzativV., Husson F. J. cell. Biol., 12, 207, 1962.
100. L z а к i K. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. US, 55, 656, 1966.
101. Mandelstam P., Strominger J. Biochem. Biophys. Res. Com-
mun, 5, 466, 1961.
102. Manocha M. S„ S h a w M. Nature, 203, 1402, 1964.
103. Manocha M. S., С о 1 v i n J. R. J. Bacterid., 94, 202, 1967.
103a. M a r t i n H. H. A. Rev. Biochem., 35, 457, 1966.
104. Liss E„ L a n ge n P. Biochem. Z„ 333, 193, 1960.
105. Michel M. F., Goo der H. J. Gen. Microbiol., 29, 2, 199, 1962.
106. Mitchell R., S a b a r N. J. Gen. Microbiol., 42, 39, 1966.
107. M о г а Р. Т., J о u n g В. С J. Biol. Chem. 237, 1870, 1962.
108. M u n о z E. et al. Biochemistry. 5, 3748, 1966; 5, 309, 1966.
109. N e i d h a r d t F. С Biochem. biophys. Rev. Commun, 7, 361, 1962.
110. N e i d h a r d t F. С Ann. Rev. Microbiol., 17, 61, 1963.
111. Neidhardt F. C, Magasanik B. Biochim. biophys. Acta, 42, 99,
1960.
112. N i к a i d o. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 48, 1542, 1962.
113. Ninomiya E, Hanada К. Нихон ногэй кагаку Кайся, 42, 4,
178—184, 1968.
114. N о г t h с о t е г D. Н., Н а г п е R. W. Biochem. J., 51, 232, 1952.
114а. N о г t h с о t e r D. H. Int. Rev. Cytol., 14, 223, 1963.
115. Nyns E. J., Chiang N., Wiaux A. Antonie van Leeuwenhock
journal microbiol., serology, 34, 2, 197—204, 1968.
116. О s a w a S. et al. J. Gen. Physiol., 40, 491, 1957.
117. P h a f f H. J. Ann. Rev. Microbiol., 17, 15, 1963.
118. Perkins H. R. Bacteriol. Rev., 27, 1, 18, 1963.
119. Petit S. F., Munoz E. et al. Biochemistry, 5, 2764, 1966.
120. Pierfitte M., Villoutreix J., BonaiyR. Compt. rendus de
la Societe de biologie, 161, 1650, 1967.
121. Purser D. В., Buechberg S. M. J. Dairy Sci., 49, 81, 1966.
122. Raymond R. L., Davis J. B. Appl. Microbiol., 8, 329, 1960.
123. Ribbons D. W. Chemistry and industry, 26, 867, 1968.
124. Riemersma J. C. Nature. 215, 5105, 1078, 1967.
78

125. Roger H. The Biochemistry of Mucopolysaccharides of connective
Tissue. Cambridge, 1961.
125a. Rogers H. J. in «Function and Structure in Microorganisms»
R. Symp. Soc. gen. Microbiol., 15, 186, 1965.
126. Roth fie id L., T а к e s h i t a M, Pearlraan M, Home R.
Federation proceedings, 25, 5, 1495, 1966.
127. R u i n e n S. Ant. van Leeuwenhock, 15, 81, 1961.
128. Ruinen S„ Dienema M. H. Ant. van Leeuwenhock, 30, 377, 1964.
129. S a 11 о n M. Biochim. Biophys. Acta, 52, 329, 1961.
129a. Sa lton M. R. J. The Bacterial Cell Woll, Amsterdam, Elsevier, 1964.
130. Sal ton M. R., G h й у se n G. M. Biochim. et biophys. acta, 45, 355,
1960.
131. Schaechter M., MaaloeO., Kjeldgraard N. O. J gen.
Microbiol., 19, 592, 1958.
132. Sen S. W. Nature, 199, N 4888, 71—72, 1963.
133. Stent G. S. Abhandl. Dtsch. Akad. Wiss. Erwin Baur Gedachtn-Verl.,
4, 113, 1964.
134. Stent G. S., Brenner S. Proc. nat. Acad. Sci. USA, 47, 2005, 1961.
135. Steveninck J., Van. Biochim. J, 88, 387, 1963; Biochim. Biophys.
Acta, 126, 154, 1966; Biochemistry, 5, 1998, 1966.
136. Steveninck J., Rot stein A. J. Gen. Physiol., 49, 235, 1965.
137. Strom in ger J., Matsuhasoi M., et al. Methods Enzymol., 8,
473, 1966.
138. Szymona O., Szumil T. Acta Biochim. Polon, 17, 129, 1965.
139. Tipper D., Kutz W. et al. Biochemistry, 6, 921, 1967.
140. Trevi thick J. R., Me t z e n b e r g R. L. J. Bacteriol, 92, 1010, 1966.
141. T u 11 о с h A. P., S p e n с e r J. F. T. Can. J Chem., 42, 830, 1964.
142. Z a 1 о к a r M. Am. J. Bot., 46, 555, 1959; In Ainsworth G. С and
Sussm A. S. (ed) «The fungi», Acad. Press. N—Y., 1, 377, 1965.
143. Z e 1 e z n i с к L. D., В о 11 г а 1 i к J. J. Science, 140, 3505, 400, 1964.
144. Z i 11 i к e n F. Federation Proc, 18, 966, 1959.
ГЛАВА III
РАЗМНОЖЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
В процессе размножения микроорганизмов участвует, как
правило, только одна родительская особь, которая делится или
почкуется с образованием двух или большего числа новых
особей, идентичных по наследственным признакам родительской
особи.
По-видимому, основные механизмы регуляции клеточного
деления должны быть в принципе одинаковы во всех клетках. В
основе этих процессов лежат механизмы, вероятно, столь же
универсальные, как и механизмы биосинтеза белка и превращения
энергии. В то же время механизм клеточного деления должен
быть наиболее сложным, дифференцированным и точно
координированным, так как он включает не только процессы синтеза
белка, но и нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов и т. п.,
обусловливающие образование субклеточных структур и
характер энергетических реакций.
79

Таким образом, универсальный механизм регуляции
клеточного деления обусловливается биохимической общностью
организма.
По современным взглядам, клетки микроорганизмов, как
и многочисленные клеточные структуры, не исключая и
плазматической оболочки, не возникают заново, а образуются из
аналогичных существующих структур. Вероятно, и митохондрии как
одна из основных и исключительно важных структурных единиц
(органелл) клетки, также не возникают заново, а берут начало
от существовавших ранее митохондрий. Таким образом, в
процессе деления клеток отмечается воспроизведение органелл,
репликация митохондрий, клеточной стенки, капсул и т. д. [18а].
При размножении дочерняя клетка должна получить от
материнской клетки информацию, позволяющую ей путем
взаимодействия с окружающей средой вырасти в заранее
предопределенный организм. Известно, что клетка любого микроорганизма
отличается исключительной сложностью, и тем самым для
образования новой, себе подобной, клетки требуется сложная и
специфическая информация, так как размножение, или
самовоспроизведение, всегда означает сохранение чистоты вида и даже
штамма.
Информация заключена в клеточном ядре, представляющем
собой плотную центральную область клетки, отграниченную от
окружающей цитоплазмы. Если, например, удалить из клетки
ядро (с помощью микроманипулятора), то прекращаются все
внутриклеточные процессы и клетка в конечном итоге погибает.
При замене собственного ядра одноклеточного микроорганизма
другим, взятым из клетки другого вида, можно заметить, что
вскоре первая клетка приобретает признаки, характерные для
второго микроорганизма. Следовательно, клеточное ядро
определяет не только жизнеспособность микроорганизма, но "и все
характерные для него признаки. Ядро является органом
управления и сосредоточения всей информации о клетке. Прежде чем
клетка начнет делиться, ее ядро расщепляется на два дочерних
ядра. В свою очередь делению ядра предшествует деление
каждой пары хромосом (рис. 20).
Хромосомы содержат все вещество наследственности — ДНК,
которая несет генетическую информацию. Каждый организм
имеет строго постоянное число хромосом, узаконенное и
зафиксированное эволюционно. Каждая клетка данного вида имеет
определенное число хромосом, и они всегда парны. Каждая пара
отличается от других по длине, форме, утолщениям или сужениям
(перетяжкам). При делении ядра никогда не происходит
простого деления ядерного содержимого пополам, хотя бы с помощью
перетяжки. Таким путем нельзя было бы обеспечить точное
распределение генетической информации между дочерними
клетками. Вместо этого ядерное содержимое уплотняется в конденси-
80

рованные структуры — хромосомы, которые, в свою очередь,
состоят из двух продольных половинок, или хроматид.
Половинки каждой хромосомы направляются к противоположным
полюсам ядерной области, где собираются вместе и снова образуют
целые хромосомы, которые окружаются новой мембраной, раз-
Рис. 20. Микрофотографии различных фаз деления ядра:
/ — ядро материнской клетки, 2 — первая фаза митоза (профаза) с уплотненными
хроматиновыми нитями и обособленными хромосомами, 3, 4 — средняя стадия митоза
(метафаза) с попарно расположенными хромосомами; 5 — хромосомы, расположенные
на одной экваториальной плоскости, 6, 7 — пары хромосом разделились и разошлись
к полюсам веретена (анафаза), 8 — образование двух дочерних ядер (телофаза), 9 —
образование двух идентичных ядер.
рыхляются, теряют четкие контуры, и в итоге этого сложного
процесса в клетке образуются два совершенно идентичные ядра
[3, 17].
Между дочерними ядрами в плоскости экватора появляются
пузырьки, которые объединяются между собой, образуя так
называемую клеточную пластинку. Эта пластинка, вначале более
или менее жидкая, затем быстро отвердевает и разрастается,
достигая прежних клеточных стенок. В результате все клеточное
4K^J^^^^fcF
6 Заказ 7
81

содержимое разделено, и таким образом из одной старой клетки
образовались две новые, полностью идентичные друг другу.
Дочерняя, закончившая телофазу клетка начинает расти. Однако
ядро растет медленнее, чем окружающая цитоплазма. Поэтому
соотношения объема, массы и поверхности ядра и цитоплазмы
все время изменяются в сторону, неблагоприятную для ядра.
Полагают, что по достижении какого-то порога некоторые
процессы обмена веществ между ядром и остальной клеткой
изменяются в такой сильной степени, что клеточное ядро оказывается
вынужденным приступить к делению.
Таким образом в процессе клеточного деления каждая
дочерняя клетка получает в точности такое же число и такие же типы
хромосом, какие содержала материнская клетка. Каждая
хромосома синтезирует свою точную копию. Установлено полное
соответствие между отдельными участками хромосом (генотипом)
и признаками организма (фенотипом).
Элемент наследственной информации, ответственный за
признак организма, располагается в определенном участке
определенной хромосомы. Такой элемент информации называется
геном. Установлено, что хотя хромосомы состоят главным образом
из нуклеиновых кислот и белков, однако информация живой
клетки, как это экспериментально доказано, хранится в дезокси-
рибонуклеиновой кислоте (ДНК). Следовательно, в основе
механизма размножения и наследования лежит митоз, или его
аналог, у бактерий — «расхождение» двойной спирали ДНК [3, 1, 28,
26, 27, 30, 24, 2, 14].
Наряду с ДНК и РНК хромосомы содержат, как уже
отмечалось, и разного рода белки. Если во всех клетках данного
организма содержание ДНК в ядре в основном одинаково, то столь
же постоянно и содержание в различных клетках гистонов, т. е.
белков, обладающих основными свойствами, молекулы которых
несут положительный заряд. Напротив, содержание некоторых
других белков и РНК в разных клетках значительно варьирует.
Под действием специфического фермента дезоксирибонукле-
азы можно удалить ДНК из хромосомы, однако при этом
сохраняются как бы «тени» (каркас) хромосомы. Если же
подвергнуть хромосому действию протеолитических ферментов, то она
распадается на фрагменты. Это дает основание полагать, что
в хромосомах имеется непрерывный белковый стержень, вдоль
которого локализуются скопления ДНК. Полагают, что ДНК
й белок в хромосомах соединены через двухвалентные катионы,
такие, как Са и Mg. Под действием версена, который
разрушает солевые связи, эти катионы удаляются, а белок и ДНК
отделяются один от другого.
Хромосомы некоторых наиболее простых организмов,
по-видимому, состоят из одной очень большой молекулы ДНК с
молекулярной массой 1,2 ■ 108 (бактериофаг) или 2 • 109 (Escherichia
82

coli). Молекула ДНК этих организмов, очевидно, имеет
кольцевую структуру, так что у нее нет свободных концов. Видимо,
такая структура предотвращает нежелательную или
несвоевременную репликацию (ауторепродукцию) ДНК и молекула ДНК
переходит из кольцевой формы в линейную только на короткое
время, в период репликации.
Гены — биологические единицы наследственной
информации — расположены в определенных участках (локусах)
хромосом. С некоторой долей достоверности хромосому можно
рассматривать как цепочку генов. При этом ген представляет собой
наименьший участок хромосомы, который может подвергаться
мутации или служить границами мест возможного кроссингове-
ра ', или, наконец, все изменения гена обусловливают специфику
белков.
Ген как функциональная единица (обеспечивающая синтез
ферментов) гораздо длиннее, чем гены, определяемые как
единицы мутации или рекомбинации. По химическому составу ген
представляет собой определенный отрезок цепи ДНК.
Постоянное содержание ДНК, подобное постоянству числа генов, во всех
клетках принимается за доказательство того, что ДНК является
существенной частью гена. В то же время доказано, что ген
состоит из отдельных субъединиц. При этом одни из них — реко-
ны — способны к рекомбинациям и состоят из двух пар нуклео-
тидов; другие, более мелкие — мутоны — не обладают этим
свойством. Изменение мутона ведет к появлению мутантной формы
организма.
Гены, как и хромосомы, обладают способностью к
самовоспроизведению. Однако точность самовоспроизведения не должна
быть абсолютной. Общепризнано, что изменчивость
микроорганизмов (а также растений и животных), лежащая в основе
получения новых вариантов и видов, объясняется случайными
ошибками (мутациями) в самовоспроизведении гена. Как
важнейшие единицы ядра гены, контролирующие появление
соответствующих признаков, одновременно выполняют и другие
функции, обеспечивающие синтез ферментов и других белков, т. е.
соединений, определяющих свойства клетки. Если по какой-либо
причине изменится ген, то при этом должен измениться и белок,
синтезом которого он управляет.
Известная гипотеза «один ген — один фермент» утверждает,
что каждый ген управляет синтезом одного определенного
фермента. Контроль генотипа (набора наследуемых факторов,
определяющих признаки) над фенотипом (всеми внешне
распознаваемыми признаками) осуществляется отдельными генами
посредством структуры ферментов.
' Кроссинговером, или перекрестом, называют процесс, при котором
гомологичные хромосомы обмениваются участками.
6*
83

ДНК КАК ПЕРЕНОСЧИК ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ
В настоящее время считают, что для всех организмов,
независимо от уровня их организации (бактерий, грибов, растений),
наследственной субстанцией, обладающей способностью к
самовоспроизведению, являются нуклеиновые кислоты. Именно ДНК
является основой наследственности. Совокупность генетической
информации, обусловливающая все признаки данной особи,
находится в молекулах ДНК, которые с функциональной точки
зрения образуют самую важную часть хромосом.
Путем подсчета клеток и химического анализа установлено,
что в соматических клетках содержится около 6-10~9 мг ДНК на
1 ядро. Исходя из количества ДНК, приходящегося на одну
клетку, можно определить примерное число пар нуклеотидов
в клетке \ а тем самым и количество генетической информации,
содержащееся в клетках того или иного типа
Содержание ДНК в клетках
Содержание ДНК Число пар нук-
на 1 клетку, мг леотидов на
. -—9 1 клетку
Грибы 0,02—0,17 0,02- 10е
Бактерии 0,002—0,06 2-10"
Водоросли 3 2,8-10е
Высшие растения 2,5—40 2,3- 10е
Генетическая информация передается из поколения в
поколение с помощью ДНК- Прямые данные, подтверждающие это,
были получены в экспериментах на бактериях, плесневых грибах
и вирусах. Так, например, признаки одного из штаммов
пневмококков могут быть перенесены на другой штамм посредством
чистой ДНК, причем эта трансформация носит необратимый
характер, так как новый штамм при размножении дает только
потомство, соответствующее исходному.
Последовательность расположения четырех оснований в
одной спирали автоматически определяет последовательность тех
же соединений в спирали-партнере, как это ясно из рис. 21.
Чередование азотистых оснований в одной цепи обусловливает
чередование их в другой.
Таким образом дочерние молекулы автоматически
получаются точными копиями родительской молекулы, следовательно,
каждая из спиралей ДНК становится матрицей для синтеза
дочерней спирали. В свою очередь дочерняя спираль,
синтезирующаяся вдоль материнской спирали, будет так же соответствовать
1 Признают, что генетическая информация закодирована в
последовательности расположения азотистых основании в иуклеотидах молекул ДНК.
84

матрице, как и отделившаяся спираль. При этом синтез новой
цепи ДНК катализируется полимеразой (2.7.7.7).
Следовательно, в результате процесса дупликации или редупликации вместо
одной спирали появятся две, совершенно идентичные одна
другой.
Итак, при соответствующих условиях в процессе
размножения клетки молекулы ДНК как элементарные единицы
самовоспроизводятся, образуя такие же молекулы. Таким образом
главная функция ДНК — самовоспроизведение — обеспечивает в до-
Рис. 21. Схема, иллюстрирующая специфическое
спаривание оснований в двойной спирали ДНК:
А — адеиии, Г — гуанин, Т — тимин, Ц — цитозин, / — дез-
оксирибоза, 2 — фосфор.
черних клетках синтез ДНК, идентичной ДНК родительской
клетки. Наиболее наглядно последовательность «поколений»
ДНК показана на рис. 22.
Таким образом при помощи механизма попарного
соединения отдельных оснований такая последовательность копируется
и в результате образуется новая молекула ДНК. Этот порядок
расположения азотистых оснований в молекуле ДНК имеет
огромное значение в процессах наследования. Когда наступает
раскручивание двойной спирали ДНК, то каждая одиночная
цепь синтезирует дополнительную цепь и в результате может
наступать воспроизведение наследственного материала, т. е.
репликация генов [12, 23].
Различное чередование относительно небольшого количества
азотистых оснований обусловливает огромное разнообразие
нуклеиновых кислот. Например, ДНК, извлеченные из различных
видов микроорганизмов или растений, отличаются по составу
и прежде всего по содержанию оснований, однако отношение
числа молекул аденина к числу молекул тимина всегда строго
85

Рис. 22. Последовательные «поколения» ДНК, возникающие в результате
репликации (ауторепродукции) матричной ДНК:
/ — материнская ДНК, 2 — дочерние ДНК, используемые как матрицы для синтеза
последующего поколении, 3 — фермент, 4 — полинуклеотндные цепочки вновь
синтезированных цепей двух дочерних молекул.
постоянно и равно единице. Такое же соотношение наблюдается
между числом молекул гуанина и цитозина. Следовательно,
количество А всегда равно Т, а количество Г — равно Ц.
СООТВЕТСТВИЕ МЕЖДУ СТРУКТУРОЙ ДНК (ГЕНОМ)
И СТРУКТУРОЙ БЕЛКА
ДНК не только воспроизводится, но и направляет химические
реакции, происходящие в клетках, и таким путем обусловливает
развитие совокупности наследственных признаков. Генетическая
информация, содержащаяся в ДНК, передается РНК, в которых
материальным ее выражением является определенное
расположение азотистых оснований в структуре молекулы. Иными
словами, под влиянием ДНК образуется соответственная структура
РНК (рис. 23). При этом передача генетической информации
состоит из транскрипции, т. е. переписывания, копирования с
матрицы, которой служит только одна цепь ДНК, на которой
образуется молекула РНК- Присоединение фермента РНК-полимера-
зы к молекуле ДНК расплетает небольшой участок двойной
спирали, после чего свободные основания ДНК могут
спариваться с предшественниками РНК- По мере продвижения фермента
вдоль матрицы растущая РНК отходит от матрицы и двойная
спираль ДНК восстанавливается.
Все описанные выше процессы происходят в пределах
клеточного ядра. Однако на следующем этапе определенное
количество РНК проникает, как принято считать, в цитоплазму и здесь
управляет синтезом соответствующих белков. Таким образом,
молекулы ДНК обладают не только способностью синтеза
собственных молекул, но и способностью контролировать синтез
S6

РНК, которая впоследствии, как отмечалось ранее, проникает
из ядра в цитоплазму, передавая генетическую информацию,
содержащуюся в ДНК- В пределах цитоплазмы происходит
репликация, т. е. воспроизведение новых молекул РНК- Четыре нук-
леотида, расположенные в молекулах РНК в определенной
последовательности, должны определять каждую молекулу
аминокислоты, входящую в состав белковой цепи.
Рис. 23. Синтез молекулы РНК иа
одной из цепей ДНК-матрицы
(транскрипция):
/ — разделение небольшого участка ДНК
с помощью фермента РНК-полимеразы,
2 — спаривание А с У (урацнлом) и Г
с Ц гарантирует правильность
транскрибирования молекулы РНК.
Итак, синтез белка включает три этапа. Генетическая
информация переписывается с двухцепочечной ДНК на одноцепочеч-
ную информационную РНК, которая затем присоединяется к
рибосоме. Перенос аминокислот на рибосому осуществляют
молекулы транспортной РНК (рис. 24, 25).
Каждая аминокислота кодируется, как правило, двумя
различными триплетами. Транспортная РНК содержит кодоны,
комплементарные кодонам информационной РНК- В то время
как одна молекула транспортной РНК, доставившая
предыдущую аминокислоту, удерживает растущую полипептидную цепь,
другая молекула (на схеме показана черным) приносит
следующую аминокислоту, которая должна быть добавлена к цепи.
Следовательно, включение той или иной аминокислоты в состав
полипептидной молекулы определяется комбинацией трех
соседних нуклеотидов, называемых триплетом, или кодоном, в мо-
87
-А
-и
Т
т
и.
л
и
А-У-
г-и-
и-г-
Т-А-
г-и-
i -У-
г-
г
А
А
Г
РНК
днк
г ■
т
и
г
А
и
т

лекуле информационной РНК- Определенному триплету
соответствует определенная аминокислота, включающаяся в
белок [12, 9, 16].
Последовательность отдельных аминокислот в образующейся
молекуле белка соответствует последовательности расположения
оснований в РНК. Специфический порядок следования нуклео-
тидов в рибосомах определяет последовательность аминокислот
в соответственных белках. Функцией растворимой фракции РНК
является введение аминокислот в соответственное место.
ф Углиод А А)еиш
О киаюкв Т Тити
• водороб Г Гуанин
Ш Азот U </ют<да*
О Сева У урицил
• Фосахр
*|#M^^#N^^^#N#^#*^#^
ДНК
i % 1 f\ $ I r$ \ 1 ''
1 ^V#V#1 >#V#Y#"I ,#V#V#1 -
Лик
>
v i\iu
•а
HanpoSnttve синтеза
$ У0 rS
Нвпра&кяа синтеза
ТП
И-Фщшттиюан
А*
i \ 1
v#v#v#- r#v#v#- »#v#v#i г
±±3
MsmuoHW
i" i" I"
tit
лЦЛ
ffi
8imu*
ДНК
^ I
Аминокислоты I
молекулы белков
Рис. 24. Схема синтеза белка:
/ — транскрипция — переписывание информации о данном белке с ДНК на и-РНК;
2 — трансляция — передача информации с языка и-РНК на язык белка; 3 —
триплет ДУГ, обеспечивающий синтез метионина и N-формвлметионИиа; 4 — триплет,
кодирующий валин.
Итак, все признаки организма должны в конечном счете
возникать на базе биохимических признаков. При этом, естественно,
исключительное значение имеет не только синтез ДНК и РНК,
последовательность расположения в их молекулах азотистых
оснований, но и образование белков. Все эти процессы
взаимосвязаны и взаимообусловлены и всецело определяют
наследственность. Однако центральную роль в этих сложных и
координированных процессах все же играет ДНК- Она является не только

материальной основой, но одновременно направляющим и
контролирующим фактором наследственности. Гены представляют
собой определенные отрезки цепи ДНК; хромосома бактерий
Информационная
ДНК рнк
Рис. 25. Синтез белка на рибосомах (по Номура, 1970):
а. 1 — двойная спираль ДНК, в последовательности оснований которой закодирована
генетическая информация, 2 — информационная РНК, в комплементарной
последовательности оснований которой транскрибирована генетическая информация ДНК;
б. / — и-РНК, каждая группа из трех оснований которой (/, 2, 3, 4, 5 и т. д.)
составляет кодой, ответственный за отдельную аминокислоту; // _ молекулы
транспортной РНК (заштрихованы), аитикодон которых состоит из трех оснований,
комплементарных кодонам и-РНК; /// — аминокислота 6, за которую ответственен кодой б,
доставлена т-РНК на рибосому; когда эта аминокислота присоединится к
аминокислоте 5, то рибосома передвинется по и-РНК на длину одного кодона.
состоит из одной молекулы ДНК- Таким образом, законы
наследования признаков оказались едиными для всех живых
организмов.
Деление клеток зависит не только от синтеза ДНК и РНК, но
и от их роста. Если бы делению не предшествовал рост клетки,
то клетки со временем становились бы все меньше и меньше.
89

Зто не исключает того, что в интерфазе клетка должна
достигнуть величины материнской клетки. В то же время легко
объяснить целесообразность исключительно малого размера клеток
микроорганизмов. Известно, что при увеличении размера клетки
биомасса ее увеличивается быстрее, чем поверхность. В то же
время обмен веществ между клеткой и средой может
осуществляться только через ее поверхность. Следовательно, по мере
роста клетки поверхность ее становится недостаточной для обмена.
Если же искусственно задержать деление клеток, не задерживая
их роста, то они могут достигнуть чрезмерно больших размеров
и погибнуть.
В настоящее время признается гипотеза, согласно которой
все клеточные организмы ведут свое происхождение от плазма-
леммы, т. е. поверхности, граничащей с клеточной стенкой.
Полагают, что предшественники, например митохондрии, отшнуро-
вываются в виде маленьких пузырьков от плазмалеммы, подобно
пиноцитозным пузырькам [3]. В конечном итоге, начальная фаза
деления клеток микроорганизмов сводится к процессу
образования в исходной клетке поперечной перегородки из цитоплазмати-
ческой мембраны. Перегородка образуется путем кольцевидного
врастания цитоплазм этической мембраны, а затем она
расщепляется центрипетально растущей клеточной стенкой. Однако
деление клеток может происходить и путем центрипетального
врастания клеточной оболочки без предварительного образования
цитоплазматических перегородок или ядерных пластинок [28,
26, 27].
Цитоплазматическая мембрана, по-видимому, врастает
вместе с клеточной стенкой, образующей перегородку. Перед
делением клеток и образованием поперечных перегородок наблюдается
сгущение ядерной вакуоли (нуклеоидов), разделившиеся
половинки которой потом раздвигаются врастающей между ними
межклеточной перегородкой. В момент деления около клеточных
перегородок располагаются и мезосомы, т. е. сферические
образования, состоящие из мембран, закрученных в завиток.
Вероятно, мезосомы принимают самое активное участие в процессе
деления. Допускают, что наиболее важный из биохимических
процессов деления клетки на два отдельных организма
(цитокинеза) — это закладка новой мембраны для разделения дочерних
клеток [33а]. Тем самым цитокинез рассматривается как процесс
закладки нового мембранного материала между отдельными
ядрами или нуклеоидами.
Процесс деления бактерий представляется как явление,
аналогичное почкованию дрожжей, а одну из образующихся
дочерних клеток также называют почкой. В связи с этим полагают,
что основной рост бактерий происходит только с одного конца,
примыкающего к месту деления, и что этот конец является
вместе с тем областью очень высокой метаболической активности [30,
'90

24]. Однако у отдельных штаммов бактерии Е. coli рост клеток
может происходить и путем удлинения их с обоих концов, что
свидетельствует о диффузном синтезе клеточной стенки.
БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ
КЛЕТОЧНОЕ ДЕЛЕНИЕ
Покоящиеся клетки микроорганизмов способны осуществлять
многие реакции обмена в отсутствие роста и деления. Из этого
следует, что превращение отдельных субстратов и,
следовательно, регуляция соответствующих синтетических и энергетических
реакций являются процессами относительно самостоятельными,
и многие из них достаточно изучены. Однако механизм
взаимодействия большого количества реакций пока не известен. Можно
лишь допускать, что в клетке имеются специализированные
системы, включающие аллостерические переходы и механизмы,
способные воспринимать химические сигналы и отвечать на них
мгновенным подключением новых, подавлением или усилением
протекающих соответствующих звеньев обмена.
В клетке микроорганизма можно, допуская некоторую
условность, выделить ряд основных групп регуляторных механизмов,
обеспечивающих либо угнетение клеточного деления при
сохранении функции роста, либо подавление как роста, так и деления
клетки. Эти регуляторные системы обеспечивают:
1) поступление питательных веществ в клетку из
окружающей среды. Так, например, подавление пермеазной системы
приводит к прекращению роста и деления клетки; питательная
среда, лишенная ионов магния, может вызвать изменение
клеточной проницаемости и торможение деления клетки. Отсутствие
в среде ионов Mg2+ может привести к торможению роста
бактерии не только вследствие изменения клеточной оболочки, но и в
результате снижения содержания рибосом [25]. При прекращении
синтеза белка жизнеспособность организма сохраняется. Через
5—6 ч после добавления ионов магния восстанавливается
количество рибосом и процесс клеточного деления;
2) согласованное взаимодействие реакций энергетического
и конструктивного обмена участвующих в биосинтезе
предшественников белка, нуклеиновых кислот, а также коферментов
и других важных метаболитов, не требующих или требующих
участия генетической системы. Разобщение процессов окисления
и фосфорилирования, например, приводит к прекращению и
роста и деления клетки. Это может иметь место у биохимических
мутантов. У растущей культуры кишечной палочки, зависимой
от лейцина, отмечается в среде без лейцина блокирование
синтеза белка и РНК, а синтез ДНК и клеточное деление
продолжаются, хотя и замедленно [29]. Таким образом, здесь
устанавливается зависимость процесса роста и деления от синтеза пред-
91

шественников белка, нуклеиновых кислот и коферментов.
Нарушение регуляторных систем этой группы может вызвать полное
прекращение роста и деления, либо прекращение роста при
сохранении деления, либо, наконец, прекращение деления при
сохранении функции роста.
Несбаланированный рост отмечается у мутанта кишечной
палочки, у которого были нарушены генетические маркеры. Этот
мутант нуждается в тимине. На бестиминной среде клетки его
увеличиваются в размерах, содержание белка и РНК в них
почти удваивается, а количество ДНК увеличивается всего на
несколько процентов. В результате этого основные метаболические
процессы либо прекращаются, либо искажаются, и если в среду
в этот момент не добавить тимина, то примерно 90% клеток
погибает. Возможно, это объясняется включением в состав ДНК
аналогов оснований. Так, например, дезоксиаденозин в
концентрации 1 :25 X Ю-3 М специфически блокирует синтез ДНК, но
не клеточное деление, в результате чего образуются клетки с
содержанием ДНК вдвое меньше нормального. В концентрации
выше 10~3 М дезоксиаденозин подавляет синтез ДНК, РНК,
белка и клеточное деление [11, 29].
Нарушение синтеза ДНК может быть вызвано различными
аналогами нуклеотидов [13], а также азотистым ипритом и его
аналогами, эмбихином [ди (2-хлорэтил) метиламином] [21, 5].
Было показано, что обработка бактерий в течение 5 мин
эмбихином в концентрации 150 мкг/мл вызывает длительную (не
менее 4 ч) задержку клеточного деления, тогда как синтез белка
и РНК в клетках почти не изменялся. Содержание ДНК при
этом не изменялось в течение 40 мин, а затем синтез ее
восстанавливался и шел с почти нормальной скоростью. Эмбихин не
повреждает какие-либо ферментные системы, участвующие в
синтезе ДНК, а задержка клеточного деления обусловлена прямым
реагированием его с ДНК.
Антибиотик митомицин С (противоопухолевый) в
концентрации 0,1 мкг избирательно подавляет синтез ДНК у Е. coli, St.
aureus и не влияет на синтез белка, РНК и рост клеток [24, 12].
Антибиотики из группы актиномицинов подавляют синтез
информационной РНК и тем самым препятствуют переносу в
рибосомы структурной программы для синтеза соответствующего
белка [31, 15]. Актиномицин С вызывает торможение синтеза РНК,
белка и клеточного деления у Вас. subtilis и St. aureus, лишь
незначительно ослабляя синтез ДНК [31].
Другие антибиотики (хлорамфеникол, тетрациклины, пуроми-
цин) также обладают способностью поражать регуляторные
механизмы и вызывать прекращение роста и деления клеток,
тормозить только функцию деления клетки или нарушать
сбалансированное деление и тем самым снижать количественное
содержание ДНК-
92

Очень мало известно о регуляторных механизмах,
контролирующих биосинтез субклеточных и клеточных структур: рибосом,
митохондрий, цитоплазматической мембраны, клеточной стенки.
Из всех агентов, поражающих синтез клеточной стенки, изучено
лишь действие пенициллина. Установлено, например, что в
присутствии низких концентраций пенициллина тормозится деление
клеток и образуются нитевидные формы. При более высоких
концентрациях клетки приобретают сферическую форму и лизи-
руются. Объясняют это тем, что антибиотик угнетает синтез
основного полимера клеточной стенки мукопептида, интерферируя
(препятствуя) заключительную реакцию уридинового цикла.
Рост клетки при этом происходит до тех пор, пока не произойдет
разрыва неполноценной оболочки.
Некоторые аминокислоты в D-форме (серии, метионин,
треонин, фенилаланин, триптофан, гистидин) угнетают клеточное
деление бактерий вида Erwinia, а при содержании в среде в
концентрациях, превышающих 0,0336—0,0067 М, они подавляют
и рост. Предполагают, что D-аминокислоты нарушают биосинтез
клеточной стенки, хотя связь между синтезом клеточной
оболочки и делением клетки остается неясной.
Вопрос об участии клеточной оболочки в регуляции
клеточного деления представляет интерес в связи с образованием
а-форм бактерий. Известно, что происхождение а-форм связано
с утратой способности бактерий синтезировать клеточную
стенку. По-видимому, это обусловливается утратой какого-то звена
генетического контроля синтеза оболочек или необратимой
утратой метаболических систем, участвующих в синтезе клеточной
стенкн, но без повреждения генетических механизмов. Основной
причиной подавления роста и деления клеток микроорганизмов
все же являются, по-видимому, неспецифические нарушения
метаболизма, не затрагивающие непосредственно системы,
регулирующие собственно процесс деления ядра или цитоплазмы.
Нарушение структуры, а следовательно и функции,
митохондрий неизбежно отразится на процессах роста и деления клеток.
Например повреждение митохондрий (матрикса и крист)
дрожжей Ph. glutinis (аэробы) и Sacch. vini (факультативные
анаэробы) в результате облучения приводило через некоторое время
к резкому торможению деления клеток. Ядра в облученных
клетках продолжали расти, но становились неспособными к
делению и достигали размеров, в десятки раз превышающих
величину ядер нормальных клеток. Образование почек сохранялось,
но они не могли отделяться от материнских клеток. Таким
образом, одной из начальных точек приложения лучевого воздействия
являются митохондрии.
Процесс клеточного деления всецело связан с
биокатализаторами, с ферментативными превращениями. Каждая клетка
микроорганизма содержит богатый набор ферментов, которые ката-
93

лизируют соответствующий тип химических реакций. Таким
образом, основными участниками клеточных превращений
служат ферментные молекулы различных типов, и их присутствие
является основным условием для жизни и роста.
Все части клетки (цитоплазма, ядро) и ее органеллы
непосредственно связаны с образованием ферментов. Поскольку
молекулы ферментов не способны к самовоспроизведению, они
должны быть синтезированы. Функция синтеза ферментов из
аминокислот осуществляется рибосомами и информационной
РНК- Не исключается возможность проявления способности
идентичных белковых молекул к самосборке и образованию
комплексных ферментных систем [18].
Функция ядра состоит не только в производстве рибосом
и и-РНК, но также в репликации вещества наследственности.
Такая репликация ДНК необходима для клеточного деления.
Благодаря ей дочерняя клетка обеспечивается полным набором
генетической информации, т. е. информации о том, как
синтезировать ферменты, необходимые для жизни клетки. В настоящее
время высказывают обоснованные предположения, допускающие
существования митохондрий, содержащих рибосомы и,
возможно, ДНК (митохондриальные ДНК). По-видимому, митохондрии
представляют собой полусамостоятельные структуры внутри
клетки, обладающие способностью синтезировать ферменты,
нужные им для функционирования генерирующей энергию
системы. Таким образом, функции отдельных компонентов клетки
строго координированы и дифференцированы.
Рост микробной клетки всецело связан с синтезом ферментов.
Функциональная сторона жизнедеятельности клетки зависит от
генетической информации (гена), передающейся потомству.
Синтез ферментов обусловливается генами. Упрощенно это выгядит
так: один ген -*- один фермент. Если в клетке имеются все
необходимые ферменты, то она может синтезировать из ингредиентов
среды все нужные ей вещества, все органоиды и расти,
развиваться и размножаться. Таким образом, каждая живая клетка
содержит полную информацию, полный набор генов, а не какую-
то его часть. Эта информация хранится клеткой и в конкретных
условиях обычно используется лишь частично, а все остальное
придерживается в «резерве».
Следовательно, клетка может блокировать гены, а передачу
информации регулировать. Тем самым она располагает
действенными регуляторными системами.
Микроорганизмы, обладая огромной скоростью размножения,
постоянно испытывают конкуренцию в отборе. Каждая особь,
в которой имеются механизмы, работающие более экономно,
сумеет в большей степени приспособиться к постоянно
меняющимся условиям среды. В процессе эволюции идет отбор на
наиболее экономичное проявление жизненных процессов.
94

Самый действенный принцип экономии состоит, вероятно,
в том, чтобы всегда синтезировать только те ферменты, которые
требуются в конкретных условиях, остальные же, напротив,
образовывать в незначительном количестве или не синтезировать
вовсе. Оказалось, что подобные механизмы наследуются, т. е.
соответствующая информация закрепляется в геноме (полном
комплекте наследственных факторов, содержащемся в
гаплоидном наборе хромосом) в виде регулирующего гена или
гена-регулятора.
Рис. 26. Размножение бактерий в среде, содержащей разные источники
углерода:
а — на среде с лактозой как единственным источником углерода: 1 —латентный
период, 2 — момент полного использования лактозы; б — иа среде с глюкозой и
лактозой: / — распад глюкозы при отсутствии латентного периода, 2 — латентный период,
связанный с индуцированным синтезом новых ферментов, 3 — распад лактозы, 4 —
момент полного использования глюкозы, 5 — то же, лактозы.
Зависимость роста микробных клеток от состава питательной
среды можно иллюстрировать известными примерами. Если,
например, бактерии, не адаптированные к лактозе, поместить в
питательную среду, содержащую в качестве источника энергии
только этот сахар, то рост клеток начинается не сразу — ему
предшествует определенный латентный период. Сначала должен
дерепрессироваться оперон и синтезироваться нужные ферменты.
Только после синтеза индуцированных ферментов клетки начнут
размножаться. Рост и размножение прекращаются лишь с
полным использованием лактозы (рис. 26).
Если же бактерии поместить в питательный раствор,
содержащий лактозу и глюкозу, то их рост начинается
незамедлительно. Сначала избирательно диссимилируется глюкоза,
поскольку необходимые для этого ферменты являются
конститутивными.
С полным использованием глюкозы исчезает корепрессор
и на кривой роста появляется плато. В этот момент начинает
95

действовать индуктор (лактоза). Инактивированный репрессор
освобождает оперон, синтезируются ферменты, которые
начинают диссимилировать лактозу. В связи с этим начинается новый
цикл роста бактерий. Таким образом, и здесь отмечается
латентный период, который наступает после истощения в среде
глюкозы.
При распаде лактозы действуют одновременно две системы
ферментов: система разложения лактозы и конструктивные, дис-
симилирующие глюкозу. Вероятно, эти системы не будут заранее
в точности координированы. Если распад лактозы будет идти
Рис. 27. Тонкая регулировка синтеза ферментов промежуточным продуктом
распада лактозы:
В — продукт распада лактозы (корепрессор) соединяется с апорепрессором с
образованием активного голорепрессора; О — выключение геи-оператора и блокировка
синтеза ферментов, разлагающих лактозу.
с небольшой скоростью, то его промежуточные продукты будут
немедленно подключены к глюкозному пути и переработаны.
Если же лактозы будет разложено больше, чем в состоянии
использовать глюкозный путь, то будет включена «тонкая
настройка» — галактоза, т. е. начальный промежуточный продукт
распада лактозы. Галактоза, накапливаясь в среде, действует как
корепрессор. Она оттесняет индуктор (лактозу) от апорепрессо-
ра и связывается с ним, образуя активный репрессор. В итоге
включается ген-оператор, блокируется синтез ферментов и
распад лактозы прекращается на некоторое время — до тех пор,
пока не снизится в достаточной степени концентрация галактозы.
Только после этого настройку можно считать завершенной [3]
(рис. 27).
96

РАЗОБЩЕНИЕ РОСТА И ДЕЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Понятие роста многозначно. Оно включает как увеличение
числа особей какой-либо популяции, например бактерий,
дрожжей и т. д., так и роста, или увеличения размеров, клеток
организма.
В нормальных физиологических условиях делению клетки
всегда предшествует некоторый период увеличения клеточной
массы, т. е. ее рост.
Можно привести достаточное количество данных,
характеризующих разобщенность процесса деления и роста клеток. Так,
например, недостаток витамина В(2 и фолиевой кислоты в среде
подавляет деление, но не рост клеток Lact. delbruckii, в
результате чего образуются нитевидные формы [32]. Разобщение роста
и деления на среде, дефицитной по витамину Bi2, связано с
нарушением биосинтеза ДНК, содержание которой составляло лишь
около 40% по сравнению с обычными клетками.
Как отмечалось ранее, некоторые аминокислоты D-формы
угнетают клеточное деление, не действуя при этом на рост
клеток [30], и т. д. Таким образом, при росте культуры
микроорганизма биомасса и число клеток изменяются независимо друг
от друга.
Если процессу деления клетки всегда предшествует ее рост,
то в свою очередь делению цитоплазмы всегда предшествует
деление ядра. Удвоение ядерной структуры, увеличение
биомассы клетки и деление клетки — это три процесса, из которых
складывается размножение клетки. Эти процессы регулируются
самостоятельными, но соподчиненными и взаимосвязанными
системами. В частности, степень проявления отдельных ферментов
в процессе клеточного деления может меняться в зависимости
от фазы роста микроорганизмов [10, 11].
Скорость размножения различных микроорганизмов
неодинакова. Обычно под скоростью, или временем генерации, понимают
время, которое протекает между двумя делениями. Для
бактерий, например, размножающихся при высоких температурах,
время генерации равно 12—15 мин, для мезофилов оно
составляет 20—30 мин, а для дрожжей 30—60 мин. Если
микроорганизмы Е. coli, Proteus vulgaris, термофил Micromonospora
vulgaris и другие размножаются довольно быстро, то Mycobacterium
tuberculosis, например, размножается исключительно медленно.
Необходимо несколько дней, пока эта микобактерия даст
характерный для нее складчатый рост на поверхности питательной
среды. Однако в общем случае самые мелкие клетки растут
быстрее всего. Если в оптимальных условиях некоторые бактерии
удваивают свое число в течение 12—20 мин, то крупные клетки
млекопитающих по большей части делятся не чаще одного раза
в сутки [20]. Однако независимо от величины интервала между
7 Заказ 7
97

мл среды
1
I'
^
_J
f
J
делениями при каждом делении число всех молекул клетки
должно удваиваться.
Размножение микроорганизмов в питательной среде
подчиняется известной закономерности. Как известно, при
исследовании роста бактерий и других микроорганизмов в питательную
среду вводится определенное количество посевной культуры.
Если затем через некоторые промежутки времени подсчитать
количество клеток в среде и на основании данных подсчета
вычертить кривую, на одной оси которой будет нанесено число клеток,
а на другой — время, в течение
которого проводились подсчеты,
то можно получить характерную
кривую в виде буквы S.
Оказалось, что кривая роста такой же
формы получается при
исследовании роста любой популяции
микроорганизмов. Во всех
случаях кривая имеет форму буквы
S (рис. 28), хотя расположение
ее отрезков будет несколько
отличаться в зависимости от вида
исследуемого микроорганизма.
Изменение размера клеток
многих микроорганизмов по
фазам их роста можно
рассматривать как приспособление
организма к внешним условиям.
Увеличение размера дрожжевых
клеток в лаг-периоде, например,
связано с дополнительным
образованием внутриклеточной РНК, полифосфатов, свободных
аминокислот. При достижении определенного и довольно
высокого содержания этих соединений клетки начинают интенсивно
размножаться, но размер их уменьшается процентов на 30.
Изменение размера клеток связано с изменением их удельной
поверхности, что в свою очередь обусловливает скорость
биохимических превращений. Кроме того увеличение или уменьшение
величины клетки вносит изменения в соотношение
физиологически важных соединений, входящих в состав цитоплазмы.
Таким образом, в экспоненциальной фазе,
характеризующейся наиболее интенсивным размножением клеток,
жизнедеятельность их направлена на полное обеспечение организма
исходными продуктами, необходимыми для биосинтеза нуклеиновых
кислот, полифосфатов, белков, включающих ферменты, причем
количество синтезируемых веществ должно соответствовать
потребностям роста. Поэтому размножение дрожжевых клеток
и, по-видимому, других микроорганизмов связано с
максимально
время, ч
из
Рис. 28. Кривая увеличения
количества бактерий в
свежеприготовленной питательной среде.
98

ным содержанием в них кислоторастворимых фосфатов (около
1,0%), полифосфатов (0,12%), РНК (11,3—11,7%), растворимых
внутриклеточных аминокислот (2,6—3,5% на сухую биомассу)
[10]. Различные по возрасту клетки мицелия (Asp. flavus 74, Asp.
awamori 200, Asp. oryzae 79, Asp. niger 50), как и клетки
дрожжей, различаются между собой по количественному содержанию
свободных внутриклеточных аминокислот. Если, например,
конидии содержат в сумме 1,42—1,73% свободных аминокислот, то
мицелиальные клетки после 12 ч роста содержат их уже 5,24—
10,07%, а после 60 ч снова 0,87—1,76% на сухую массу [7, 8, 11].
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ К ГЛАЗЕ III
1. Байсет К. Э. В кн.: «Анатомия бактерий». М., Медгиз. I960,,
2. Беран К., Штрейблова Е., Л и б л о в а И. X Международный
конгресс по микробиологии. Тезисы докладов. М. Изд-во «Медицина», 1966.
3. Б о г е н Г. Современная биология. М. Изд-во «Мир», 1970.
4. Германов А. Б. «Успехи микробиологии» № 4, 36, 1967.
5. Гольдфарб Д. М. Введение в генетику бактерий. М. Изд-во
«Наука», 1966.
6. Грин Д., Гольдбергер Р. Молекулярные аспекты жизни. М.
Изд-во «Мир», 1968.
7. Д о р о х о в В. В. Биосинтез кислой протеиназы плесневыми грибами.
Диссертация. МТИПП, 1968.
8. Дорохов В. В., Коновалов С. А. «Прикладная биохимия и
микробиология». Т. V. Вып. 3, 265, 1969.
9. Кларк Б., Маркер К В кн.: «Молекулы и клетки». Вып. 4. М.
Изд-во «Мир», 1969.
10. Коновалов С. А. Биохимия бродильных производств. Изд-во
«Пищевая промышленность», 1967.
П. Коновалов С. А., Дорохов В. В. ДАН СССР Т. 186. № 1. 208,
1969.
12. Крик Ф. В кн.: «Структура и функция клетки». М. Изд-во «Мир»,
1964; «Молекулы и клетки». Вып. 3. М. Изд-во «Мир», 1968.
13. Л ар к К Г. В кн.: «Молекулярная генетика». Ч. I. M. Изд-во «Мир»,
1964.
14. Л и б л о в а И., Б е р а н К X Международный конгресс по
микробиологии. Тезисы докладов. М. Изд-во «Медицина», 1966.
15. Медведев Ж. А. Биосинтез белков и проблемы онтогенеза. М.
Медгиз, 1963.
16. М е р р и ф и л ь д Р. В кн.: «Молекулы и клетки». Вып. 4. Изд-во
«Мир», 1969.
17. Мэзия Д. Митоз и физиология клеточного деления. М. ИЛ., 1963.
18. По ги азов Б. Ф. Сборка биологических структур. М. Изд-во
«Наука», 1970.
18а. Роуз Э. Химическая микробиология. М. Изд-во «Мир». 1971.
19. С а з ы к и н Ю. О., Ч е р н у х а А. М. «Антибиотики», № 9, 796, 1963.
20. У о т с о н Дж. Молекулярная биология гена. М. Изд-во «Мир», 1967.
21. Фомич ев Ю. К «Микробиология», Т. XXXII. Вып. 66, 1963.
22. X а г г и с и др. Введение в молекулярную биологию. М. Изд-во
«Мир», 1967.
23. Я н о в с к и й Ч. В кн.: «Молекулы и клетки». М. Изд-во «Мир».
Вып. 3, 61, 1968.
24. Adler H. J., H a r d i g r e e A. A., J. Bacteriol., 87, 1240, 1964.
7*
99

25. Bourgaux P., Bourgaux-Ramoisv D. Ann. Inst. Pasteur,
104, 746. 1963.
26. Chapman G. J. Bacterid., 78. 96. 1959; то же 79. 132, 1960.
27. С о n t i S„ Gettner M. Journ. Bacterid., 83, 544, 1962.
28. G о 11 f r i d B. Jenaer Rundschau, 5, 213, 1960.
29. Goldstein A., G о 1 d s 11 e i n D„ Brown B. I., Chou Shao-Chia.
Biochim. of biophys. acta, 36, 163, 1959.
30. G r u 1 a E. A. Jour. Bacterid., 80, 375, 1960; то же, 84, 599, 1962.
31. Kersten W., Kersten H. Z. physiol. Chem., 327, 234. 1962.
32. Kusaka I., К i t a h a r a K. Journ. Vitaminol., 8, 115, 1962.
33. Lark K. G. In «Molekular genetics», V. 1 J. H. Taylor (Ed.), N. Y.,
Acad. Press, 1963.
33a. M a z i a D. In «Function and Structure Microorganisms» Sym. Soc,
gen. Microbiol. 15, 379, 1965.
34. Moor H. Archiv f. Mikrobiologie, 57, Heft 2, 135, 1967.
35. Reich E., Luck D. I. L. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 55, 1609, 1966;
Reich E. Franklin R. M. et al. Proc. Nat. Acad. Sci, USA; 48. 1238, 1962.
36. Shiba S., Terawaki A. et al. Nature, 183, 1056. 1959.
ГЛАВА IV
РЕГУЛИРОВАНИЕ БИОСИНТЕЗА ФЕРМЕНТОВ
В КЛЕТКЕ МИКРООРГАНИЗМА
В предыдущей главе в общих чертах была отмечена
исключительная роль нуклеиновых кислот в синтезе белка. В
частности, указывалось, что между структурой гена (ДНК) и
структурой белка существует прямое линейное соответствие.
Специфическая последовательность кодонов в «генетической» молекуле
ДНК определяет последовательность аминокислотных остатков
в структуре белковой молекулы. Законченная полипептидная
цепь — одна или в соединении с другими цепями—-образует
белок, спецификация которого первоначально содержалась в ДНК.
Одноклеточные микроорганизмы различают между собой по
числу и активности имеющихся ферментов. Это объясняется
наличием механизма, регулирующего количество каждого
фермента, синтезируемого в данной клетке в данный момент.
Скорость синтеза белка, по-видимому, контролируется отчасти
генетическим аппаратом, а отчасти — факторами внешней среды или,
в конечном итоге, метаболитами.
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ СИНТЕЗА ФЕРМЕНТОВ
Гены, контролирующие появление соответствующих
признаков, одновременно выполняют и функции, обеспечивающие
синтез ферментов и других белков, т. е. соединений, определяющих
свойства клетки. Если по какой-либо причине изменится ген, то
при этом должен измениться и белок, синтезом которого он уп
равляет. Известная гипотеза «один ген — один фермент» предпо-
100

лагает, что каждый ген управляет синтезом одного
определенного фермента.
Однако в геноме — гаплоидном наборе хромосом — функция
отдельных генов дифференцирована. Например, так называемые
структурные гены ответственны за синтез и структуру
ферментов. На соответствующем отрезке генома (рис. 29) четыре таких
гена обозначены буквами Sb S2, 53, 54. Дополнительный
ген-оператор (О), расположенный на одном конце цепи генов,
обеспечивает структурным генам активность (или пассивность) к синтезу
Ген - one
Ген -регулятор ,^ ратор Структурные гены
' О ■ S, S2 Sj St '
шжтмтшттштж
|Г\ ., s\ /~\ /"ч /*\ /"\ /"\ /*\
и-РНП
I Оперон
\ (подавляет оператор и весь оперон)
Ре прессор (голорепрвссор)
Апорепрвссор
(неактивное вещество,
выделяемое регулятором
в цитоплазму)
Лоре/грессор
(конечный продукт цепи
Ферментативных реакций)
Рис. 29. Схема возможного расположения генов на отрезке молекулы ДНК,
обеспечивающих дифференцированный контроль синтеза белка:
R — ген-регулятор, образующий апорепрессор (неактивный) и регулирующий
положение оператора на «включено» или «выключено»; О - геи-оператор, контролирующий
активность структурных генов путем «включения» и «выключения» считывания
генетической информации, необходимой для образования ферментов; S, — S, структурные
гены, определяющие структуру синтезируемых белков.
ферментов или выключает их функцию одновременно. В свою
очередь перевод гена-оператора в положение «включено» или
«выключено» считывание генетической информации
определяется геном-регулятором (/?). Этот ген находится также в геноме,
но располагается на некотором расстоянии от гена-оператора.
Кроме того, если ген-оператор воздействует непосредственно на
соседние структурные гены, то действие гена-регулятора
опосредствуется через какое-то вещество, выделяемое им в
цитоплазму. Это вещество, соединяясь в цитоплазме с
низкомолекулярным конечным продуктом цепи ферментативных реакций,
становится активным и выключает ген-оператор. Выключение
гена-оператора, приводящее к прекращению считывания
информации, вызывает репрессию синтеза ферментов. Репрессор.
подавляющий синтез ферментов, состоит, как указывалось ранее,
из вещества, продуцируемого геном-регулятором R, и
низкомолекулярного вещества (конечного продукта), и по аналогии с го-
101

лоферментом, состоящим из апофермента и кофермента, говорят
об апорепрессоре и корепрессоре.
Ген R производит апорепрессор, неэффективный сам по себе,
который поступает в цитоплазму. Накопившийся корепрессор —
конечный продукт цепи ферментативных реакций — соединяется
с апорепрессором, образуя голорепрессор, который подавляет
ген-оператор, а тем самым и весь оперон, контролирующий
синтез конечного продукта. Если же конечный продукт,
образующийся в последовательности реакций, будет немедленно
перерабатываться дальше, то он не будет накапливаться и,
следовательно, не сможет образовать совместно с апорепрессором активный
репрессор. В результате оператор останется включенным и
синтез ферментов будет продолжаться. Такой механизм регуляции
синтеза конечным продуктом можно дополнительно
иллюстрировать примером образования аргинина.
Подавление синтеза конечным продуктом. Если микробная
клетка в силу каких-либо причин перестает синтезировать белки,
то аминокислоты накапливаются ненужным балластом. Клетка
при этом должна прекратить синтез аминокислот. На примере
только одной аминокислоты — аргинина можно проследить
механизм торможения. Путь биосинтеза аргинина начинается
с глютаминовой кислоты и включает несколько
последовательных этапов, каждый из которых катализируется особым
ферментом. По числу этапов были выделены мутанты; у каждого из них
мутация нарушала ту или иную совершенно определенную
ферментативную реакцию; это дополнительно доказывало, что
синтез каждого фермента контролируется отдельным геном. Синтез
аминокислоты идет по крайней мере в 4 этапа (рис. 30).
Фермент ф, Ф, Ф, Ф4
ill к
Глютаминовал "> ft) (?) W
кислота тггг °риитин !Х!5Ци трулин 77ТТАргиниич'кц"нат :ШГАргил"н
А й <- С D "> Е
Субстрат
Рис. 30. Цепь функционально связанных ферментов Ф\ — Ф4, преобразующих
исходный субстрат А в конечный продукт Е.
У Escherichia coli аргинин как конечный продукт реакции
вызывает репрессию по меньшей мере трех ферментов (1, 2, 4),
участвующих в его биосинтезе. Эти ферменты (ацетилорнитин-
трансаминаза орнитинтранскарбамилаза, сукцинатсинтетаза ар-
гининсукцинатлиаза) действуют согласованно и
последовательно. Так, например, фермент 1 преобразует исходное вещество А
в вещество В, фермент 2 из В производит С, фермент 3 из С —
продукт D и, наконец, фермент 4 превращает D в конечный
продукт Е, который в данном случае представляет собой аргинин.
102

Когда необходимость в аргинине отпадает, ферменты Oi — Ф4
становятся лишними, они распадаются и синтез их прекращается.
Накопившийся при этом аргинин как конечный продукт цепи
ферментативных реакций представляет собой корепрессор,
который, соединяясь с апорепрессором (веществом, выработанным
R), образует голорепрессор. Последний же подавляет
ген-оператор и весь оперон, контролирующий синтез аргинина (рис. 31).
Апорепрессоры и корепрессоры строго специфичны: аргинин
не тормозит синтеза других аминокислот, он соединяется только
со «своим» апорепрессором, последний же действует только на
аргининовый оперон и ни на что другое [3].
корепрессор
(в ванном щчае-аргинин)
Рис. 31. Схема механизма обратной связи при синтезе L-арги-
нина Escherichia coli:
^ — образование неактивного апорепрессора; соединение его с коре-
прессором (аргинином) приводит к образованию голорепрессора;
О — выключение геиа-оператора голорепрессором; прекращение
считывания информации, необходимой для образования фермента.
Механизм торможения синтеза конечным продуктом
регулирует процесс в зависимости от потребления его продуктов: если
потребляется много, образование происходит интенсивно, и на--
оборот, со снижением потребности прекращается синтез.
Следовательно, эта замкнутая система весьма экономична и
эффективна. Недостаток ее заключается лишь в том, что репрессия
функционирует недостаточно быстро.
Известен механизм и более тонкой регулировки. Он
заключается в том, что преобразованный конечный продукт действует
не на систему ферментов (Ф\ — Ф4), а на первый фермент в цепи
(Ф\) непосредственно, а не в качестве корепрессора. Конечный
продукт связывается с Oi и инактивирует его. Соединившись
с конечным продуктом, фермент утрачивает способность
преобразовывать субстрат А и превращать его в продукт В. Из-за
наличия двух стерически различных и строго специфичных центров
связывания (кофермента и конечного продукта) подобные белки
называют аллостерическими.
Блокирование первого фермента конечным продуктом
происходит практически немедленно в результате аллостерического
103

связывания, и сейчас же прекращается образование первого
продукта, а за ним автоматически и всех последующих. Эта
система регуляции — система с отрицательной обратной связью,
так как конечный продукт приостанавливает процесс, а не
ускоряет его, как это происходит при положительной обратной связи.
Итак, регуляция цепей биосинтетических реакций,
осуществляемая с помощью репрессии, т. е. путем блокирования
передачи информации, и посредством механизма обратной связи
(воздействие на ферментативную активность) наиболее эффективна
при совместном действии грубой и тонкой регулировки.
Роль метаболитов в генетическом контроле синтеза
ферментов. Биосинтез ферментов связан с ростом и развитием клеток
микроорганизмов. Образование новых клеток, как уже
отмечалось ранее, можно рассматривать как реализацию генетической
информации, записанной в виде последовательности оснований
ДНК в хромосомах исходных (материнских) клеток,
осуществляемую через синтез белков в новых клетках. В числе многих
белков синтезируются и ферменты, что обусловливает
непосредственную зависимость ферментативной системы клетки от ее
генетического аппарата.
Скорость процессов обмена, обусловливающих
жизнедеятельность и возможность роста и развития микроорганизма,
в значительной степени зависит от свойств и активности
ферментов клетки. Однако количество фермента нельзя рассматривать
как единственный фактор, определяющий скорость размножения
микроорганизма. Немаловажное значение имеют также и разно-
образные метаболиты, оказывающие влияние на физиолого-био-
химическое состояние клетки, в том числе и на биосинтез
фермента.
Отдельные метаболиты могут действовать как индуктор или
как репрессор синтеза того или иного фермента. Следовательно,
взаимодействие отдельных участков молекулы ДНК с
различными метаболитами играет важную роль в регуляции
ферментативной активности клетки. Регулятором биосинтеза и активности
фермента может быть метаболит, образующийся в какой-либо
другой реакции, иногда весьма отдаленной от той, скорость
которой он регулирует. В настоящее время установлено, что
индукторы и репрессоры действуют в конечном итоге на ДНК
клеточного ядра. Действуя на определенный участок молекулы ДНК
(ген), в котором заключена наследственная информация о
синтезе данного фермента, индуктор или репрессор тем самым
влияет на последующий синтез матричной РНК, передающей в
рибосомы информацию, необходимую для синтеза этого фермента.
Таким образом, посредством ДНК осуществляется действие
индукторов и репрессоров и тем самым обеспечивается
регулирование биосинтеза ферментов в рибосоме клетки. Необходимо
отметить, что индуктор или репрессор не воздействуют непосред-
104

ственно на структурные гены, обеспечивающие контроль
биосинтеза фермента, и на оператор, который контролирует действие
структурного гена.
Репрессор, образование которого зависит от гена-регулятора,
может, по-видимому, блокировать как соединения,
индуцирующие синтез конкретного фермента, так и соединения,
репрессирующие образование этого фермента. Вероятно, конечный
продукт длинной цепи биосинтетических реакций может
соединиться с репрессором, усиливать его действие и тем самым
регулировать весь процесс биосинтеза по принципу обратной связи.
1
[Ген-рееулятор
Оператор I Структурный ген А I Структурный ген В
щк::::шщытщАтж >»
La
^mJ лллллллл
/
% 1
- ^Lon—c^
белки
Фермент А
Фермент В
Рис. 32. Схема регуляции белкового синтеза генетическим репрессором
(по Шанже, 1966):
/ — геи-регулятор, контролирующий синтез молекулы репрессора, которая, связываясь
с метаболитом, либо активируется, либо инактивируется, 2 — молекула репрессора,
регулирующая активность структурного гена; 3 — оператор (особый участок
хромосомы), регулирующий активность соседних структурных генов {при связывании его
с репрессором в отсутствии индуктора) и блокирующий последовательность реакций,
ведущих к синтезу фермента.
Активированный репрессор блокирует оператор, который,
в свою очередь, прекращает действие структурного гена, что
вызывает прекращение синтеза соответствующей м-РНК и, в
конечном итоге, биосинтеза соответствующего фермента.
Схематически гипотеза генетического контроля синтеза фер^
ментов с участием метаболитов представлена на рис. 32. Как
показано на рисунке, ген-регулятор всецело регулирует синтез
репрессора, который связывается с соответствующим
метаболитом ' и вследствие этого активируется или инактивируется. Если
репрессор активирован, то он блокирует действие
гена-оператора, а тем самым выключает и структурный ген, от которого
1 Метаболит, который связывается с репрессором, является тем самым
сигнальным.
105

зависит синтез данного фермента. В индуцируемой системе,
наоборот, сигнальный метаболит, связываясь с репрессором,
инактивирует его. Вследствие этого определенный участок ДНК
восстанавливает свою деятельность и снова обеспечивает синтез
м-РНК, от которой, в конечном итоге, зависит синтез
индуцируемого фермента.
Полагают, что в молекуле ДНК заключены «инструкции»
для синтеза самых разнообразных ферментов и биосинтез
каждого из них может быть вызван действием сигнального метабо-
.лита (индуктора) на соответствующий репрессор. Присоединяясь
Фенилалании
Ряс. 33. Репрессия синтеза белка ацетоксициклогексамидом и пуромицииом
(по Агранову, 1969):
а — ацетоксициклогексамид препятствует образованию связей между аминокислотами
в процессе синтеза пептида; б — пуромицин сам включается в цепь пептидной
молекулы, вместо феиилалаиииа и приостанавливает синтез.
к ДНК, репрессор затрудняет ее транскрипцию и уменьшает
число синтезируемых молекул м-РНК, служащих матрицей для
синтеза данного фермента. Например, ацетоксициклогексамид
препятствует образованию связей между аминокислотами,
доставленными на рибосому т-РНК, а пуромицин (напоминающий
по структуре т-РНК, связанную с фенилаланином) сам
встраивается в пептидную цепь и прекращает дальнейший синтез
(рис. 33). Индуктор, наоборот, «включает» активность
структурного гена, контролирующего синтез индуцибельного
фермента [5].
Таким образом, репрессию и индукцию синтеза ферментов
следует рассматривать как противоположные стороны единого
биохимического процесса и как адаптивные процессы,
обеспечивающие выживаемость микроорганизмов. Нецелесообразно для
микробной клетки синтезировать ненужные в данное время
ферменты и тем самым напрасно тратить энергию и субстрат.
106

Совсем недавно полагали, что бактериальная клетка
реализует сразу всю информацию и в ней присутствуют все ферменты,
гены которых имеются в наличии. Когда же в бактериальных
клетках определяют количество отдельных ферментов, то во
многих случаях оказывается, что на долю какого-либо одного
ферментного белка приходится от 5 до 8% общего содержания
белка в клетке. Так, например, на основании данных о длине
хромосомы, согласно которым один ген содержит около 1500 пар
нуклеотидов и кодирует полипептидную цепь из 500
аминокислот, было вычислено, что гены бактериальных клеток кодируют
от 2000 до 4000 различных полипептидов. Предполагают, что для
роста бактерий на глюкозе требуется около 800 различных
ферментов, из которых одни необходимы в больших, а другие —
в малых количествах. Различие в количестве ферментов
обусловливается различиями в скорости их синтеза микроорганизмами,
а не различной стабильностью или скоростью инактивации.
В свою очередь скорость синтеза, как уже отмечалось ранее,
регулируется содержанием информационной РНК в клетке.
Таким образом, для осуществления синтеза ферментов
необходимо наличие в клетке структурного гена. В то же время для
обеспечения биосинтеза ферментов в значительных количествах
в клетке наряду с генами должны присутствовать также и
определенные низкомолекулярные вещества, проявляющие действие
или как индукторы, или как репрессоры. Именно с помощью
внутриклеточных метаболитов обеспечивается деятельность
важного биологического механизма, с помощью которого
регулируется синтез в клетке ферментов в соответствии с
потребностями обмена веществ. В свою очередь на образование метаболитов
оказывают непосредственное влияние внешние факторы. Каждая
клетка, в которой имеются механизмы, работающие более
экономично, сумеет в большей степени приспособиться к новым
обстоятельствам, которые могут возникнуть в результате
изменений условий среды. Самый действенный принцип экономии
состоит именно в том, чтобы всегда синтезировать только те
ферменты, которые требуются организму в данных условиях.
В то же время признают, что каждая живая клетка содержит
полную информацию, полный набор генов, а не какую-то его
часть. Эта информация хранится, и в действительности
используется лишь часть ее, остальная резервируется «на всякий
случай».
Следовательно, ферменты не должны всегда присутствовать
в клетках. Их синтез находится под контролем не только генов,
но и метаболитов. Тем самым клетка обладает способностью
регулировать активность генов. Два основных свойства
характеризуют молекулы репрессорных белков — их сродство к ДНК
и к индуктору.
107

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА БИОСИНТЕЗ ФЕРМЕНТОВ
Выбор и селекция микроорганизмов
На образование фермента и количественный выход его
оказывают влияние многие факторы. Наиболее решающим из них
является особенность данного микроорганизма, его физиолого-
биохимические свойства. Поэтому исключительно важное
значение имеет выбор наиболее активного штамма путем выделения
активных микроорганизмов из природных условий и
значительного улучшения его свойств методом мутаций или
индуцированной селекции. К сожалению, биологическая систематика
микроорганизмов не дает указаний на желаемые ферментные
свойства. Поэтому очень часто микроорганизмы из природных условий
выделяют эмпирически. Естественно, такие поиски штаммов
требуют больших затрат.
Ферментативные свойства многих микроорганизмов можно
значительно улучшить путем мутаций, связанных с изменением
какого-либо гена, локализованного в хромосомах. Ген как
единица наследственности способен изменяться, делиться и
расщепляться. Более того, процессы мутации обусловливаются
изменениями не только целого гена, но и отдельных его участков —
центров.
Следовательно, ген и его субъединицы (реконы и муто-
ны) могут изменяться под влиянием внешней среды, а также
в результате метаболических и энергетических процессов,
происходящих в клетке.
В конечном итоге процесс мутагенеза определяется, как уже
отмечалось ранее, структурой и функциональными свойствами
ДНК, однако заложенная в ней наследственная информация
содержит только условия развития, а для осуществления самого
развития в клетке должны произойти многие сложнейшие
процессы и главное — синтез белка и ферментов.
Итак, от молекул ДНК зависит генетическая
преемственность, т. е. связь между поколениями, и в то же время сама ДНК
допускает «ошибки», приводящие к наследственным изменениям.
При этом несколько пар оснований, а их в каждой молекуле
ДНК 200 тысяч, меняются местами. И тогда происходит
мутация. И сколько бы потом ни самовоспронзводился такой
полимер, он неизменно будет повторять раз допушенную ошибку,
передавая от поколения к поколению новое наследственное
качество. Правда, вероятность этих ошибок ничтожно мала. ДНК
«ошибается» один раз на 1013—1015 случаев, тем не менее факт
этот заслуживает пристального внимания.
Развитие организма определяется условиями среды и вместе
с тем протекает по своим внутренним законам. При этом
отмечается широкая мутационная изменчивость свойств микроорга-
108

низмов. От высших организмов микробы отличаются именно
способностью к быстрым изменениям.
Наследственные изменения, обусловленные изменениями
генетического материала, могут быть индуцированы по крайней
мере пятью различными способами.
1. Генные мутации обычно возникают вследствие ошибок
в спаривании оснований во время репликации, т. е. образования
молекулы одноцепочечной нуклеиновой кислоты (реплики) на
другой комплементарной ей одноцепочечной молекуле
(матрице). Например, пара А — Т, находясь в определенном участке
нормального гена (ДНК), может быть заменена парой Г — Ц,
Ц — Г или Т — А. В результате транскрипции измененной ДНК
будет синтезироваться измененная информационная РНК, а это
приведет к построению пептидной цепи, в которой одна
аминокислота заменена другой. Если измененная аминокислота
расположена в активном центре фермента или около него, то это
может привести к значительному снижению или видоизменению
ферментативной активности измененного белка.
Если бы в молекуле ДНК добавилась или, наоборот, выпала
одна пара нуклеотидов, то границы всех расположенных после
нее кодонов оказались бы сдвинутыми, что совершенно изменило
бы структуру синтезируемой пептидной цепи и ее биологическую
активность. Например, если последовательность ЦАГТТЦАТГ
при ее «считывании» расчленяется на кодоны ЦАГ, ТТЦ, АТГ,
то после добавления Г между двумя Т получилась бы
последовательность ЦАГТГТЦАТГ, которая будет считываться как
ЦАГ, ТГТ, ЦАТ, Г...
Таким образом, генная мутация обусловливается
разрушением или изменением молекулярной структуры ДНК или РНК —
фактической основы наследственности.
Генные мутации можно вызвать путем воздействия на клетки
микроорганизмов химическими или физическими факторами.
2. Трансформация бактерий — наследуемое изменение
свойств одного бактериального штамма под влиянием экстракта,
полученного из клеток другого штамма. Предполагают, что
трансформирующим агентом является ДНК. Перенос
генетического материала (ДНК или РНК) из одной клетки (донора)
в другую (реципиент) не требует контакта между клетками.
Процессы трансформации наблюдаются у различных родов и
видов микроорганизмов: диплококков, стафилококков, кишечных
и других бактерий. Путем трансформации от одного микроба
к другому могут передаваться различные признаки:
устойчивость к антибиотикам, ферментативные свойства, размеры
и морфология колоний и т. п.
3. Трансдукция бактерий представляет собой способ обмена
генетической информацией, при котором роль переносчика
генетической информации от одной бактерии к другой выполняет
109

бактериофаг. При этом фаг передает как эстафету различные
свойства бактерий. При трансдукции изменение
наследственности связано с переносом от одной клетки к другой фрагментов
ДНК и рекомбинаций (перераспределением генов между парой
юмологичных хромосом) генетического вещества донора с
генетическим веществом реципиента.
4. «Инфекционная» наследственность предполагает
включение генетического материала (ДНК или РНК) в геном клетки
в результате заражения так называемым умеренным вирусом,
представляющим собой мельчайший инфекционный агент,
вызывающий в процессе размножения мутацию внутри клетки-
хозяина.
5. Рекомбинация генов, происходящая при слиянии
(конъюгации) клеток и заключающаяся в том, что часть хромосомы от
донора поступает в клетку реципиента, после чего наступает
генетическое перераспределение. Мутацию вызывают изменения
в химической структуре хотя бы одной пары оснований (из 200
тысяч ДНК фага Т—4). Таким образом, стало общепризнанным,
что запись, или «код», наследственности сохраняется в
хромосомах в виде молекул ДНК. От методов селекции и генетики
микроорганизмов как бы протянулись невидимые нити,
обеспечивающие значительное повышение их продуктивности. Имеющиеся
достижения в области селекции и эффективное их использование
позволяет существенно повысить ферментативные свойства
микроорганизмов.
Наряду с селекцией микроорганизмов, синтезирующих
наиболее активные ферментные системы, необходимо одновременно
осуществлять выращивание их в оптимальных условиях,
обеспечивающих высокую активность ферментов.
Влияние компонентов среды
Непосредственное влияние на биосинтез фермента оказывают
условия культивирования. К изменяющимся факторам,
оказывающим воздействие на жизнедеятельность микроорганизма и на
биосинтез фермента, необходимо отнести прежде всего состав
питательной среды. Как известно, микроорганизмы потребляют
различные сахара (глюкозу, лактозу, галактозу и т. п.), а также
могут усваивать целый ряд других субстратов. Все эти вещества
подвергаются ферментативному расщеплению, часто
многоступенчатому. Для того чтобы использовать сложную смесь
питательных веществ, необходимо по меньшей мере 60—80
различных ферментов. Практически редко бывает так, чтобы сложная
смесь питательных веществ присутствовала в среде
одновременно. Кроме того состав среды может быть изменчив. Поэтому
было бы в высшей степени неэкономным, если бы клетка
постоянно держала наготове все 60—80 ферментов, из которых, смот-
110

ря по условиям, требуется в каждом случае одновременно
неболее 4 или 8. Если в природе отбор микроорганизмов идет по
принципу наибольшей экономии, то естественно, для проявления
жизнедеятельности необходимы регуляторные механизмы.
Отдельные компоненты среды могут действовать или как
индукторы или как репрессоры ферментов. Если в состав среды входит
соединение, проявляющее индуцирующее действие на синтез
соответствующего фермента, то такое вещество или продукты его
распада будут тормозить или ослаблять проявление репрессора,
т. е. частично или полностью выключать его действие и тем
самым обеспечивать возможность беспрепятственного синтеза
данного фермента.
Таким образом в зависимости от состава среды репрессоры
могут существовать либо в активной, либо в неактивной форме.
Если репрессор связан с низкомолекулярным специфическим
веществом— индуктором, то его действие при этом блокируется,
т. е. присоединение индуктора ведет к инактивации репрессора.
Например, присоединение лактозы или продуктов распада
крахмала, белка, пектина, жира и т. д. блокирует репрессор и таким
образом создает возможность синтеза соответствующего
фермента: р-галактозидазы, амилазы, протеиназы, пектиназы,
липазы и т. д.
В случае присоединения корепрессора к репрессору,
например к аминокислоте — репрессору, число активных молекул
репрессора увеличивается, а синтез фермента подавляется. Таким
образом регулируется биосинтез ферментов, необходимых в
данное время клетке. Следовательно, многие ферменты в живой
клетке образуются в ответ на действие внешних факторов и
прежде всего — компонентов среды. Активность таких заново
синтезированных или индуцированных ферментов всецело зависит
от состава питательной среды и условий культивирования.
Считают, что до индукции организм содержит, хотя и в
небольших количествах, индуцируемый фермент. Индуктор или.
родственное ему соединение, вносимое в питательную среду,
ускоряет синтез фермента во много раз. Например, многие
плесневые грибы или бактерии при культивировании на питательной
среде, содержащей казеин или пептон, интенсивно синтезируют
протеиназу; на среде, включающей минеральные формы азота
и крахмал или декстрины, образуют преимущественно амилоли-
тические ферменты, а на среде, содержащей пектин или липи-
ды,— активную пектиназу или липазу. На обычной питательной
среде, не содержащей соответствующего индуктора, фермент
образуется в минимальных количествах.
Возможность направленного синтеза ферментов путем
подбора состава питательной среды подтверждается данными,
характеризующими интенсивность образования р-галактозидазы
в зависимости от условий культивирования бактериальной куль-
11Г

туры. Например, очень мало фермента образуется при росге
бактериальных клеток на среде с глюкозой. Но если единствен^ I
ным источником углерода служит лактоза, то микроорганизму
требуется р-галактозидаза, чтобы расщеплять лактозу на
глюкозу и галактозу. В этих условиях р-галактозидаза составляет
примерно 3 и даже 6—7% всего клеточного белка. В каждой
клетке содержится, по-видимому, около 3000 молекул фермента,
т. е. по крайней мере в 1000 раз больше, чем в клетках, расту- |
щих на глюкозе.
Дополнительно можно указать на другой факт,
подтверждающий образование ферментов в зависимости от состава среды.
Было показано, что микроорганизмы, культивируемые на среде
без аминокислот, содержат весь аабор ферментов,
требующихся для всех 20 протенногенных аминокислот. В то же время
добавление к питательной среде одной или нескольких
аминокислот ведет к резкому уменьшению количества ферментов,
необходимых для биосинтеза этих аминокислот.
Следовательно, отдельные компоненты среды могут
специфически стимулировать биосинтез одних ферментов, не влияя при
этом на образование других и репрессируя синтез третьих
ферментов.
Это положение можно иллюстрировать данными табл. 8.
Один и тот же вид или даже штамм плесневого гриба Asp. awa-
mori в зависимости от состава питательной среды синтезирует
в наибольшем количестве индуцируемый фермент. Например,
если питательная среда содержит в качестве источника углерода
и индуктора крахмал, то клетки мицелия интенсивно
синтезируют амилолитические ферменты: а-амилазу, глюкоамилазу и оли-
го-1,6-глюкозидазу. Замена в среде азотнокислого натрия
казеином, являющимся индуктором протеиназы, обеспечивает
повышение синтеза внеклеточной кислой протеиназы, активность
которой возрастает в 5—7 раз по сравнению с получаемой в
среде без индуктора. Внесение в питательную среду пектина или
кашалотового жира повышает в десятки и сотни раз
образование соответственно пектиназы или липазы.
При культивировании Asp. awamori 16 или Asp. awamori 22
поверхностным способом на пшеничных отрубях с добавлением
свекловичного жома активность пектиназы возрастает в 5—б раз
и составляет 1800—2000 edjz вместо 300—400 в контрольном
опыте, где использовались пшеничные отруби без пектина. При
этом желательно добавление в среду аммонийного азота серной,
соляной и фосфорной кислот в количестве 1—2%- Подкисление
среды в процессе роста плесневого гриба с рН 6,2 до 3,8 и
наличие индуктора — пектина способствует усилению синтеза пекто-
литических ферментов [25].
Фермент липаза почти не синтезируется грибом Asp.
awamori на среде без индуктора; внесение кашалотового жира уси-
112

Таблица 8
Направленный биосинтез ферментов в зависимости от содержания в среде соответствующего индуктора
Продуцент
I
Asp. awamori
78-2
Среда
2
Чапека с 0,91%
NaN03, другие соли
и вытяжка из
мицелия
Чапека, в которой
NaN03 заменен
казеином
Чапека без NaN03
с добавлением
казеина и пептона
Чапека
То же
Индуктор
3
Крахмал (6%)
Казеин (0,1%)
Казеин (0,1%)
Пептон (0,1%)
Крахмал (6%)
Глюкоза (6%)
Фермент
4
а-Амилаза
Глюкоамилаза
Олиго-1,6- глюкозида-
за
Кислая протеиназа
Кислая протеиназа
Кислая протеиназа
а-Амилаза
Глюкоамилаза
Олиго-1,6-глюкознда-
за
а-Амилаза
Глюкоамилаза
Олиго-1,6-глюкозида-
за
Активность
внеклеточного
фермента
5
56 ед/100 мл
100 ед/100 мл
2463 ед/100 мл
0,10 мг/мл тирозина
0,52 мг/мл тирозина
0,69 мг/мл тирозина
30 ед/100 мл
14,6 ед/г
994,5 ед/100 мл
485 ед/г
1394 ед/100 мл
680 ед/г
10,5 ед/100 мл 8 ед/г
257 ед/100 мл
104,6 ед/г
586 ед/100 мл
469 ед/г
Литературный
источник
6
[14]
|33]

Продуцент
1
Asp.
awamori 16
Asp. awamori
г
Asp. oryzae
Среда
2
Солодовые ростки
0,5; (NH4)2S04
0,7; KH2P04
0,1; MgS04
0,05%
To же
Чапека с 6%
крахмала
То же, с 6% каша-
лотового жира
Чапека с (NH4)2 S04
(0,3% азота)
То же
»
»
Индуктор
3
Пектин
свекловичного жома
(4%)
Без пектина
Без индуктора
Жир
Крахмал (2%)
Декстрины
Мальтоза
Сахароза
Фермент
4
Пектиназа
Пектиназа
Липаза
Липаза
Амилаза
Амилаза
Амилаза
Амилаза
Активность внеклеточного
фермента
5
25—30 ел/мл
Следы
Следы
512—576 ед/100 мл
93,7 ед/100 мл; 64,2 ед/г
69,1 ед/100 мл; 33,4 ед/г
77,7 ед/100лм; 44,4 ед/г
0,53 ед/100 мл; 0,28 ед/г

Литературный
источник
6
[34]
[2]
[32]

Продуцент
Среда
Индуктор
Фермент
Активность внеклеточного
фермента

Литературный
источник
Asp. awamori 22
Чапека с 6%
крахмала и вытяжкой
из солодовых
ростков
Источник
фосфора
Без источника
фосфора

Внеклеточная
фосфатаза
рН 4,5
рН 7,0

Внутриклеточная
фосфатаза

Внеклеточная
фосфатаза

Внутриклеточная
фосфатаза
рН 4,5
рН 7,0
рН 4,5
рН 7,0
рН 4,5
РН 7,0
79 ед/100 мл
10 ед/100 мл
102 ед/100 мл
6 ед/100 мл
390 ед/100 мл
78 ед/100 мл
680 ед/100 мл
20 ед/100 мл
[22, 7]
[30, 11]

удаление иЩтора
Лг
ливает биосинтез фермента в сотни раз [2]. Этот же вид гриба
в других условиях питательной среды интенсивно синтезирует
другой фермент —кислую и нейтральную фосфатазу. Для
усиленного биосинтеза фосфатазы Asp. awamori 22 необходимо
использовать полусинтетическую среду с 6% крахмала, из которой
полностью исключается минеральный фосфор [11]. По-видимому,
в данных условиях опыта
индуктором служит органический
фосфор, входящий в состав
крахмала (около 0,3%).
Таким образом, при росте
микроорганизма на
специфических субстратах отмечается
усиленный биосинтез
соответствующего фермента. Активность
индуцированного фермента в ответ
на добавление специфического
субстрата возрастает в процессе
' " роста микроорганизма по
крайней мере не менее чем в 5 раз.
Кроме того биосинтез его всегда
связан с лаг-периодом. Так,
например, синтез фермента
бактериальными клетками начинается
через 2—3 мин после внесения
в среду индуктора и
продолжается до тех пор, пока присутствует
индуктор.
На характер кривой,
отражающей образование фермента
во времени, оказывает влияние
рост бактерий, в результате которого число клеток и содержание
белка увеличиваются. Наиболее отчетливой получается кривая,
характеризующая зависимость количества фермента от общего
количества белка, а не от времени (рис. 34). Следовательно
количество синтезированного фермента составляет какую-то
постоянную часть от всего синтезированного белка. Это означает,
что если средняя масса клетки остается постоянной, то и
количество фермента, продуцируемого в минуту в расчете на одну
клетку, также будет постоянным.
Установлено, что индукторы стимулируют синтез амилазы
при культивировании многих микроорганизмов: Asp. oryzae, Asp.
niger, Asp. flavus, Asp. terreus, а также Pseudomonas saccharofi-
la [45]. В то же время показано, что культура Pseudomonas
saccharophila под влиянием целлобиозы индуцирует синтез
исключительно внутриклеточной амилазы [53]. Однако синтез той
же амилазы Clostridium acetobutylicum стимулируется иными
а 30 40 50 60
Суммарный бактериальный белок, мкг
Рис. 34. Ход индуцированного
синтеза фермента. Индукция (5-галак-
тозидазы Esch. coli (no Jacob, Mo-
nod, 1961); стрелка внизу —
момент внесения в среду 5-Ю-2 М
метил-р-Э-тиогалактозидазы —
индуктора; стрелка вверху —
момент добавления 10-2 М фенил-|5-
D-тиогалактозидазы — ингибитора
индуктора после полного
удаления индуктора из системы.
116

соединениями, чем крахмал, такими как фруктоза, манноза, ма-
нитол и целлобиоза при полном отсутствии крахмала [51].
Образование амилазы Вас. amyloliquifaciens стимулируется наиболее
эффективно при использовании лактозы в качестве источника
углерода [40]. Исключением оказались бактериальная культура
Вас. subtilis и культура Asp. kawachii [43], синтез амилазы
которыми не индуцируется какими-либо специфическими
веществами.
s ыю
|
* 400
I
«а 100
4
. 1
3s
i J.
__
W дни
Рис. 35 а-Амилаза в культуре,
полученной на качалке:
1 — присутствие индуктора, активность
а-амилазы; 2 — присутствие индуктора,
сухой мицелий; 3 — отсутствие
индуктора, активность а-амилазы; 4 —
отсутствие индуктора, сухой мицелий.
500
44011
Щ300
§
Сз
аюо
^
>
\
1
г
\
\
сх
-is
1\
2
1'
~П
_й
W
1
№ъ
V
S"
—
г 4 в 8 w ч
Рис. 36. Сравнение индукционной
активности:
/, 1' — изомальтоза; 2, 2' — мальтоза.
Индуцированное образование а-амилазы Asp. oryzae 557
выражено данными, представленными на рис. 40. Гриб
выращивали на среде Чапека, содержавшей 3% глицерина как основного
источника углерода. В качестве индуктора добавляли мальтозу
из расчета 750 мкг/мл.
Интересно отметить, что индуцирующая способность изомаль-
тозы значительно выше, чем мальтозы (рис. 36), хотя
изомальтоза утилизировалась более медленно. Высокий эффект изомаль-
тозы объясняется, по-видимому, тем, что она каким-то способом
определяет индуцирующую активность мальтозы. Установлено,
например, что плесневой гриб продуцирует трансглюкозидазу,
катализирующую превращение мальтозы в изомальтозу, и
наоборот, изомальтозы в мальтозу. Известно в то же время, что
изомальтоза не образуется из глюкозы. Таким образом, синтез
амилазы может стимулироваться истинным индуктором,
который образуется из мальтозы с помощью трансглюкозидазы [54].
Амилоза, как и мальтоза, проявляет индуцирующую активность,
но в присутствии метилмальтозида активность падает.
Индуцирующая активность не проявляется в случае
глицерина, рибозы, маннозы, маннита, глюкозо-6-фосфата, глюконовой
117

кислоты, целлобиозы, сахарозы, мелибиозы, лактозы и
раффинозы. Декстрины с молекулярной массой 111000, 60000 и 10000
в данном случае не показывали индуцирующую способность.
Однако по данным других авторов декстрины индуцируют синтез
амилазы, хотя и в меньшей степени, чем крахмал или мальтоза
[32]. Глюкозо-1-фосфат, а-метилглюкозид и а-фенилглюкозид не
проявляют видимой индуцирующей активности; D-трегалоза
проявляет незначительную способность индуцировать синтез
амилазы.
Глюкоза, а также сахароза, манноза и многие другие
соединения ингнбируют образование амилазы [54, 32]. В то же время
не обнаруживается какой-либо зависимости между ингибирова-
нием синтеза амилазы и концентрацией свободной глюкозы,
устанавливаемой в клетках мицелия. В промышленных
условиях изомальтоза повышает синтез а-амилазы только при
использовании зерновых заторов низкой концентрации. Обработка
мицелия гриба соответствующим индуктором с последующим
культивированием микроорганизма уже на среде с
неспецифическим субстратом, т. е. без свободного индуктора, не устраняет
способности организма к биосинтезу амилазы [54, 32]. Это
подтверждает наличие взаимосвязи между концентрацией
индуктора и скоростью синтеза фермента.
Ранее уже упоминалось, что механизм индуцированного
образования ферментов пока не изучен и природа индуктора не
выяснена. Действие некоторых ингибиторов (лактозы,
галактозы, раффинозы, ксилозы, изомальтозы и др.) пытались объяснить
их низкой метаболической скоростью, благоприятствующей,
якобы, синтезу амилазы, и, наоборот, высокая скорость
метаболизма глюкозы, сахарозы, фруктозы и т. д. вызывает ингибиро-
вание синтеза фермента [56]. В частности, отмечалась обратная
связь между ростом бактериальных клеток Вас. subtilis и
синтезом амилазы, т. е. углеродсодержащие соединения, слабо
доступные в качестве источника энергии для роста
микроорганизма, проявляют индуцирующее действие в отношении синтеза
фермента. Иногда добавление того или иного вещества
индуцирует синтез не одного, а целой группы ферментов, связанных
между собой серией промежуточных продуктов обмена.
Присутствие репрессора в среде подавляет образование
фермента. Иногда репрессор может быть продуктом
ферментативной реакции, тогда сам синтезируемый фермент катализирует
образование репрессора [41] и тем самым бурное образование
фермента прекращается. Если репрессор удаляют из среды, как
это было показано ранее, то скорость образования фермента по
отношению к скорости синтеза суммарного белка сразу же
возрастает, иногда в 1000 раз, и в дальнейшем поддерживается на
этом высоком уровне. Иногда высокий уровень образования
ферментов можно сохранять. Например, при непрерывной смене
118

среды в хемостате, препятствующей накоплению репрессора,
количество синтезируемого фермента будет возрастать линейно.
Таким образом, при репрессии и индукции меняется количество
образующегося фермента, тогда как при инактивации
(торможении) и активации меняется не количество фермента, а его
активность.
По характеру наблюдаемой специфичности индукция и
репрессия напоминают взаимодействие фермента с субстратом,
т. е. молекула индуктора или репрессора связывается со
специфическим рецептором фермента, подобно тому как активный
центр фермента «пригнан» к структуре его субстрата. Поэтому
рецептор фермента должен быть очень сходен с активным
центром, однако отождествлять их нельзя. Известно, например, что
рецептор в белке иногда сохраняется несмотря на утрату
активного центра [50].
В диплоидных клетках, содержащих и нормальный и мутант-
ный ген, индуктор одновременно вызывает образование и
фермента и неактивного белка.
Репрессия отличается от индукции прежде всего тем, что
действие репрессора не вызывает, а предотвращает синтез
фермента и, кроме того, репрессором служит продукт
соответствующей ферментативной реакции или вещество, близкое к нему,
тогда как индуктором является обычно субстрат фермента или
близкое к нему вещество. Таким образом эти два процесса
представляют собой два взаимно связанных регуляторных механизма
биосинтеза ферментов. Если, например, живой клетке не хватает
определенного фермента, то концентрация его субстрата будет
нарастать, что вызовет усиленный синтез данного фермента,
и наоборот, избыток фермента будет вызывать увеличение
продукта ферментативной реакции, что приведет к репрессии
синтеза. Тем самым уровень различных ферментов будет
соответствовать потребностям метаболизма.
Высказывают предположение, что в большинстве случаев
образование индуцируемых ферментов не регулируется репрессо-
рами, т. е. синтез определенного фермента, по-видимому, не
контролируется одновременно этими двумя механизмами.
Влияние дополнительных факторов роста
Многие микроорганизмы, как известно, нуждаются в
дополнительных факторах роста, а поэтому они, как правило, очень
слабо или вовсе не растут на простых синтетических средах,
типа среды Чапека — Докса, в состав которой входят
минеральные соли и источник углерода.
Для интенсификации процесса роста и синтеза ферментов
к синтетическим средам часто добавляют всевозможные
вытяжки или экстракты или же используют естественные среды, при-
119

готовляемые из различных злаков или других продуктов
растительного и животного происхождения. К дополнительным
факторам роста относятся многие соединения, однако здесь мы
отметим лишь некоторые из них, представляющие интерес для
познания процессов регулирования образования ферментов.
Аминокислоты, проявляющие специфичность
индукции и репрессии
Обычно считают, что аминокислота, образующаяся в
процессе метаболизма, служит репрессором ферментов, участвующих
в ее образовании [30, 42]. Так, гистидин способен регулировать
образование своих предшественников, угнетая первый фермент
биосинтеза — фосфорибозин — АТФ-пирофосфорилазу; L-пролин
репрессирует фермент пирролин-5-карбоксилатредуктазу
(1.5.1.2) у Neurospora crassa [57]; L-триптофан репрессирует
гриптофансинтазу (4.2.1.20) у Aerobacter aerogenes [49] и т. д.
Следовательно, на ферменты действует та аминокислота,
которая образуется при их участии.
В то же время известно, что аминокислоты, как и многие
другие низкомолекулярные соединения, легко проникают внутрь
клетки микроорганизма и специфически влияют на образование
ферментов. Поэтому внесение аминокислоты в питательную
среду может вызвать, по-видимому, индукцию или репрессию
синтеза фермента микроорганизмами и прежде всего мутантами
с генетическим блоком, т. е. с утерянным каким-либо
ферментом в метаболическом пути, ведущем к образованию репрессора.
Иногда при добавлении небольшого количества репрессора
для удовлетворения потребностей роста через некоторое время
(когда репрессор будет использован) отмечается замедление
развития клеток микроорганизма и в то же время
исключительное усиление синтеза фермента, количество которого иногда
составляет около 5% всего синтезируемого белка [6]. Имеющиеся
экспериментальные данные позволяют показать, однако, что
аминокислота, вносимая в питательную среду, вызывает
репрессию не только того фермента, который вызывает биосинтез этой
аминокислоты, но, по-видимому, может косвенно репрессировать
образование и других ферментов.
Возможно, некоторые аминокислоты могут проявлять
действия, сходные по конечным результатам с действиями индуктора,
т. е. блокировать репрессор и тем самым усиливать синтез
соответствующего фермента. Другие аминокислоты как корепрессо-
ры могут, вероятно, повышать активность репрессора и таким
образом подавлять биосинтез фермента. Известны также
аминокислоты, которые не индуцируют и не репрессируют синтез
многих ферментов. Так, например, синтез а-амилазы при
культивировании мутанта Asp. awamori 78-2 стимулируется двумя амино-
120

кислотами: глютаминовой кислотой и тирозином; синтез глюко-
амилазы (активность которой устанавливалась по мальтозе) —
4 аминокислотами (глютаминовой, тирозином, аспарагиновой
и р-аланином), а декстриназы (олиго-1,6-глюкозидазы) — 8
аминокислотами (глютаминовой, аспарагиновой, треонином,
аргинином, аспарагином, пролином и р-аланином). При этом
активность каждого из указанных компонентов амилолитических
ферментов повышается на 20—50% и даже больше по сравнению
с активностью, получаемой при росте гриба на среде Чапека без
добавления аминокислот [14].
Другая группа аминокислот (аргинин, аспарагин,
триптофан, аланин, валин) весьма незначительно индуцирует или
сравнительно слабо репрессирует синтез амилолитических ферментов
(табл. 9). Наряду с этим многие аминокислоты (аминомасляная,
Таблица 9
Влияние аминокислот на синтез амилолитических ферментов и рост
мицелия плесневого гриба Asp. awamori 78-2 [14]
Аминокислота
Сухая
биомасса,
г/100 мл
среды
Активность ферментов, edJIOO мл
а-амила-
зы
глюко-
амилазы
олиго-1,6-
глюкози-
дазы

(декстриназы)
Глютаминовая .....
Аспарагинсвая ....
Гликокол
Цистеин
Аспарагин
Аргинин .......
Пролин
Аланин
Среда Чапека (контроль)
Валин
Орнитин
(З-Аланин
Триптофан
Треонин
Аминомасляиая ....
Феннлаланин
Метнонин
Тирозин
Норлейцнн
Лизин
Серии
Гистидин
Цистин
50
06
04
00
94
92
92
92
90
86
86
84
80
,80
,68
46
44
,38
,36
20
,84
,54
,20
44,0
19,2
15,0
9,2
14,4
26,0
18,1
14,4
24,0
14,6
14,1
20,0
14,4
16,2
3,0
5,0
14,4
45,0
5,0
19,4
5,0
14,4
9,0
1240
1180
375
410
520
610
440
520
6*0
520
375
730
550
520
440
390
390
920
200
3S0
510
320
40
2800
2380
1220
820
1590
1600
1600
1030
1410
1200
840
1420
1290
1630
610
400
770
1920
800
980
920
580
210
Примечание: Индивидуальные аминокислоты вносили нз расчета
содержания 20 мг азота соответствующей кислоты в 100 мл среды; только
с метионином внесено азота 13,3 мг/100 мл. Кислотность питательной
среды соответствовала рН 6,0.
121

цистин, фенилаланин, норлейцин, цистеин, серии и др.) очень
сильно репрессируют синтез внеклеточных ферментов,
вследствие чего активность их в 2—3 (и даже до 7) раз ниже, чем
в культуре, выращенной без добавления аминокислоты.
По-разному действуют аминокислоты и на рост плесневого
гриба; при этом между синтезом ферментов и развитием клеток
мицелия иногда проявляется, а часто отсутствует, корреляция.
Например, глютаминовая и аспарагиновая кислоты и аргинин
стимулируют как синтез амилолитических ферментов (амилазы,
глюкоамилазы, олиго-1,6-глюкозидазы), так и рост гриба Asp.
awamori 78-2. Аминокислоты тирозин и р-аланин, хотя и
стимулируют образование ферментов, однако рост плесневого гриба
заметно задерживается. Цистеин, гликокол и аланин, наоборот,
оказывают благоприятное влияние на рост плесневого гриба,
тогда как синтез ферментов они постоянно задерживают. И,
наконец, выделяется большая группа аминокислот, которые
тормозят в равной степени как синтез ферментов амилолитического
комплекса, так и рост микроорганизма. Такими репрессорами
являются прежде всего цистин, гистидин, серии, лизин,
норлейцин, аминомасляная кислота и другие.
Приведенные данные характеризуют действие аминокислот
лишь при определенных и конкретных условиях культивирования
данного микроорганизма. Некоторые аминокислоты (метионин,
р-аланин, лизин, триптофан), задерживающие рост мутанта Asp.
awamori 78-2, в то же время стимулируют рост другого гриба
Asp. batatae 3859 (последний вообще размножается на среде
Чапека заметно слабее и образует в этих условиях меньше
амилолитических ферментов, чем Asp. awamori). Однако
стимулирование аминокислотами, и в первую очередь глютаминовой кислотой,
процесса образования глюкоамилазы и олиго-1,6-глюкозидазы
отмечается и при культивировании Asp. batatae (табл. 10).
Содержание глютаминовой кислоты даже в концентрации
0,05% оказывает благоприятное действие как на рост, так и на
Таблица 10
Влияние глютаминовой н аспарагиновон кислот на синтез глюкоамилазы
и олиго-1,6-глюкозидазы и рост мнцелня плесневого гриба Asp. batatae 3859
Аминокислота
Внесено
азота

аминокислоты,
мг'1 00 мл
Сухая
биомасса.
г/100 >ил
среды
Активность
ферментов, ей/100 мл

глюкоамилазы
олиго-1,6-
глюкози-
дазы
(декст-
рииазы)
Глютаминовая
Аспарагиновая
Среда Чапека (контроль)
15
5
0
1,60
1,21
1,10
518
422
256
1217
1217
730
122

кислотообразование мутантом Asp. niger T [12]. Интересно
также отметить, что глютаминовая кислота по стимулирующему
действию оказалась равноценной водной вытяжке из солодовых
ростков (5—10% по объему), которые характеризуются весьма
сложным химическим составом. Введение вытяжки из солодовых
ростков в среду Чапека по сравнению с глютаминовой кислотой
повышает лишь прирост биомассы и активность амилазы
(табл. 11). Что же касается глюкоамилазы и олиго-1,6-глюкози-
дазы, то их активность в культуральной среде с глютаминовой
кислотой, как правило, бывает не ниже, а иногда даже
несколько выше, чем в среде с солодовыми ростками.
Таблица 11
Амилолнтическая активность при культивировании мутантов Asp. awatnori на
среде, содержащей глютаминовую кислоту (0,16%) или вытяжку из солодовых
ростков (10%) [Н]
Дополн ительи ые
источники питания
Активность ферментов, ед'1 00 мл
глюкоами
лазы
олиго-1,6-
глюкозида-
зы (декст-
риназы)
Сухая
биомасса,
г 100 мг
рН
Глютаминовая кислота
Солодовая вытяжка . .
Контроль
Asp. awamori 224
94
113
18
1335
1078
608
2958
2638
1842
1,6
2,07
1,79
6,0
6,6
4,9
Глютаминовая кислота
Солодовая вытяжка
Контроль
Asp. awamori 78-2
136
42
1526
1416
1045
3432
3232
1900
1,70
1,70
1,58
8,2
7,8
5,8
Аминокислоты питательной среды оказывают специфическое
влияние не только на биосинтез амилолитических ферментов
в процессе роста микроорганизмов, но и на образование кислой
протеиназы [15]. Установлено, что при культивировании мутанта
Asp. awamori 78-2 в глубинных условиях на среде Чапека
добавка аминокислот в количестве 20 мг/100 мл среды по азоту
оказывает различное влияние на рост гриба и синтез кислой
протеиназы. Некоторые из них (аспарагиновая кислота, лизин,
гистидин) стимулируют синтез фермента. Активность кислой
протеиназы повышается на 30—35% по сравнению с
активностью в контрольном опыте, где микроорганизм культивировали
в питательной среде, не содержащей аминокислоты. Многие
другие аминокислоты (глютаминовая кислота, валин, цистеин, се-
123

рин, триптофан) в условиях опыта не оказывали какого-либо
влияния на образование фермента. Значительное количество
аминокислот (тирозин, метионин, аргинин, гликокол, аспарагин,
аланин, фенилаланин) в разной степени подавляет биосинтез
кислой протеиназы, причем некоторые из них — репрессоры
(аланин, аспарагин, гликокол, аргинин), угнетая синтез кислой
протеиназы, в то же время заметно (на 13—33%) стимулируют
рост микроорганизма. Повышенная концентрация тирозина
(0,19%) полностью репрессирует синтез кислой протеиназы
{15, 16].
Представляют интерес данные, характеризующие действие
аминокислот на биосинтез кислой протеиназы при
культивировании разных штаммов и видов плесневых грибов, выделенных
из природных условий (табл. 12). Необходимо прежде всего
отметить, что в опытах с культурами, выращенными на
синтетической среде с пептоном и глюкозой, выявили 8 аминокислот —
стимуляторов биосинтеза кислой протеиназы, из которых только
одна — цистин — стимулирует биосинтез фермента у четырех из
пяти культур: Asp. flavus 74, Asp. flavus 88, Asp. awamori 200
и Asp. niger 50. Только в опытах с культурой Asp. oryzae 79
цистин репрессировал образование кислой протеиназы.
Второй после цистина аминокислотой, обладающей широким
стимулирующим действием, является фенилаланин, который
активирует синтез кислой протеиназы у Asp. flavus 74, Asp. oryzae
79 и Asp. niger 50.
Четыре аминокислоты (валин, норлейцин, лизин и гликокол)
действуют как стимуляторы синтеза фермента в опытах только
с двумя разными культурами, причем валин и норлейцин
стимулируют синтез только у Asp. flavus 74 и Asp. flavus 88, а лизин
и гликокол — у Asp. flavus 88, Asp. niger 50 и Asp. awamori 200.
Две последние аминокислоты — пролин и серии — стимулируют
биосинтез только при культивировании одного штамма
соответственно— Asp. awamori 200 и Asp. niger 50.
Аминокислоты оказывают влияние и на синтез протеолитиче-
ских ферментов термофилом Micromonospora vulgaris 42 [28, 29].
В синтетическую питательную среду добавляли аминокислоту
в количестве 0,005% по азоту. Некоторые моноаминомонокарбо-
новые кислоты, особенно валин, аланин, изолейцин, заметно
способствуют повышению протеолитической активности — в среднем
на 17—30% (табл. 13).
В то же время отдельные из них (аланин, лизин, лейцин)
заметно угнетают рост термофила, вследствие чего прирост
биомассы в расчете на сухую массу снижается на 25—50% по срав-,
нению с контрольным опытом. Другие аминокислоты и прежде
всего треонин, аргинин, серии, цистеин заметно угнетают как
синтез протеазы (на 5—23%), так и рост (на 28—44%) актино-
мицета.
124

Влияние аминокислот-активаторов на синтез кислой лротеиназы и рост
культуры [активность (а) и биомасса (б) выражены в % к контролю]
Таблица 12
Аминокислота
Фенилаланин ....
Asp. flavus 71
а
123
112
115,4
115,4
91,5
94
92
97
б
141,9
132,4
138
87
138,7
192,4
118,4
192
Asp. flavus 88
а
125
100
107
128,5
138
116
107
100
б
170,8
167,8
120
129,8
153,8
120
163,8
160
Asp. awamori 2 00
а
133
35
61,4
49,1
107
128
126
105
б
147,7
95,5
120
120,8
120,8
132
113
76,4
Asp. oryzae 79
а
83,6
127
100
91,5
81,8
58,2
58,2
67,3
б
118
95,4
167
100
117,2
205
191
123,7
Asp. niger 50
а
108,6
113,8
95
95
132,8
77,6
64
120
б
127,7
109
114
114,7
93,0
90
108,5
94,5
Таблица
Влияние аминокислот на синтез протеолитических ферментов и рост Micromonospora vulgaris 42 [28]
Аминокислота
рН
среды
Активность
фермента,
ед.
оптической плотности
(по ФЭК)
Сухая
биомасса,
г/50 1МЛ
среды
Аминокислота
рН
среды
Активность
фермента,
ед.
оптической плотности
(по ФЭК)
Сухая
биомасса
г'50 мл
среды
Валин . . . .
Алании . . .
Изолейцин . .
Фенилаланин
Глютаминовая
Лизин . . . .
Лейцин . . .
Гистидин . .
Контроль . .
6,5
0,82
0,74
0,73
0,70
0,69
0,68
0,67
0,65
0,63
0,24
0,15
0,20
0,20
0,24
0,15
0,13
0,26
0,25
Глицин
Серии .
Аргинин
Треонин
Цистеин
Цистин
Аспарагиновая
Триптофан
0,62
0,59
0,55
0,55
0,48
0,46
0.40
0,36
0,14
0,14
0,18
0,20
0,23
0,19

Резюмируя сказанное, необходимо отметить, что многие
аминокислоты действуют как стимуляторы биосинтеза фермента
одних культур и в то же время как репрессоры других
микроорганизмов. В общей сложности около 10 аминокислот проявляли
себя как репрессоры биосинтеза ферментов.
Аминокислоты-стимуляторы, вероятно, компенсируют
недостающие свободные внутриклеточные аминокислоты,
необходимые для синтеза фермента. Установлено, как будет показано
ниже, что многие аминокислоты —стимуляторы синтеза
фермента— содержатся внутри клеток, как правило, в небольших
количествах, и наоборот, внесение в питательную среду
аминокислоты, содержащейся внутри клетки в значительных количествах t
(глютаминовая и аспарагиновая кислоты, аланин и др.),
приводит только к стимулированию роста микроорганизма, а не к
повышению синтеза фермента.
Некоторые аминокислоты даже в небольших концентрациях
в среде могут репрессировать синтез многих ферментов. Если
содержание такой аминокислоты повышается дополнительно за
счет внутриклеточного количества, то действие ее как репрессо-
ра усиливается.
Пуриновые основания и их производные
Как уже упоминалось ранее, низкомолекулярные соединения,
как и аминокислоты, легко проникают внутрь клетки
микроорганизма и оказывают влияние на биосинтез фермента. Так,
например, при культивировании мутанта Asp. awamori 78-2 на среде
Чапека с добавлением кинетина или аденина отмечается
стимулирующее действие на биосинтез кислой протеиназы, причем
добавление, например, аденина по физиологическому действию
примерно равноценно влиянию казеина (0,1%), вносимого в
среду вместо ЫаЫОз (рис. 37). Эти физиологически активные
соединения усиливают биосинтез фермента в 3—4 раза и
активность его соответствует 0,18—0,23—0,30 ед. оптической
плотности, вместо 0,08 ед. в контрольном опыте, в котором
использовалась среда Чапека с NaN03.
Кинетин (6-фурфурилметиламинопурин), вносимый в среду
Чапека в количестве 2 мкг/мл, также стимулирует синтез кислой
протеиназы, но в меньшей степени, чем аденин и продукты
гидролиза РНК. Ниже приводятся данные, характеризующие
действие пуриновых оснований и их производных на синтез
протеиназы термофилом Micromonospora vulgaris 42.
Кинетин проявляет стимулирующее действие на биосинтез
протеиназы и рост термофильного актиномицета Micromonospora
vulgaris 42. Оптимальная концентрация его для роста термофила
составляет 10 мкг/ЮО мл среды. При этом отсутствует какая-
либо корреляция между синтезом протеиназы и приростом био-
126

массы. Например, если прирост биомассы от кинетина
возрастает лишь на 10—14%, то активность внеклеточной протеиназы
повышается на 100% по сравнению с активностью в контрольном
опыте.
Показано, что действие кинетина не проявляется в
лаг-периоде и экспоненциальной фазе роста. Только в начале
стационарной фазы роста, составляющей 17—20 ч, отмечается заметное
действие [21]. Отмечено стимулирующее действие кинетина на
рост многих других микроорганизмов: Е. coli [35], Вас. megate-
rium [46, 48], дрожжи [46].
■ - акщиИнкть пвотеинпзы
Оказалось, что кинетин стимулирует синтез нуклеиновых
кислот [22, 23] и прежде всего — обмен РНК, вследствие чего
повышается способность многих микроорганизмов к синтезу белка
и ферментов.
6-меркаптопурин является, как и кинетин, физиологически
активным соединением. Полагают, что он относится к
антагонистам пуриновых оснований [37, 47]. Внесение в среду 6-меркап-
топурина в количестве 10—20 мкг/100 мл повышает в 1,8—2,0
раза синтез протеиназы термофилом Micromonospora vulgaris
42. Увеличение концентрации его до 0,16 .иг/100 мл полностью
подавляет рост микроорганизма [29].
Основное действие 6-меркаптопурина заключается в
нарушении реакции взаимопревращения гуаниновых и адениновых нук-
леотидов через гипоксантовое производное [37]. Полагают, что
это действие сказывается прежде всего на подавлении
активности глютаминрибозилпирофосфат-5-фосфат-амидотрансферазы,
т. е. одного из первых ферментов в биосинтезе пуринового
кольца.
127

Поэтому, если при минимальных концентрациях 6-меркапто-
пурин может включаться в состав рибонуклеотида и тем самым
косвенно стимулировать синтез протеолитических ферментов, то
при высоких концентрациях, наоборот, процесс включения
пуринов в рибонуклеотиды и нуклеиновые кислоты может
блокироваться.
Соединения кининового ряда (этиловый эфир пуриниллей-
цин, этиловый эфир пуринил-у-аминомасляная кислота и
бутиловый эфир пуринил-у-аминомасляная кислота) не оказывали
существенного влияния на синтез протеиназы термофилом Mic-
romonospora vulgaris 42 [29].
Аденин и 8-азааденин несколько стимулируют биосинтез про-
теазы, повышая активность ее на 20—30% по сравнению с
активностью в контрольном опыте. Повышение концентрации аде-
нина в среде (до 0,2—0,4 мг/100 мл) резко подавляет как синтез
фермента (в 2,8—3,7 раза), так и рост термофила (до 1,4 раза),
тогда как антагонист аденина — 8-азааденин — не оказывает
заметного действия на рост микроорганизма и очень слабо
тормозит образование протеиназы.
Гуанин и 8-азагуанин по действию на синтез фермента и рост
микроорганизма мало чем отличаются от аденина и 8-азаадени-
на. Низкие концентрации гуанина и 8-азагуанина (10—
20 мкг/100 мл) несколько повышают биосинтез фермента (на
15—30%), а высокие концентрации (200—400 мкг/100 мл),
наоборот, подавляют его, причем гуанин — в наибольшей степени
(табл. 14).
По-видимому, при высоких концентрациях пуриновых
оснований в среде значительная часть их остается неиспользованной
микроорганизмом и может блокировать ферментативные
реакции, ответственные за биосинтез и обмен азотистых оснований,
по принципу обратной связи. Аналоги пурина входят в состав
нуклеиновых кислот, поэтому они оказывают влияние и на их
биосинтез. Так, например, 6-меркаптопурин (6-хлорпурин) в
значительной степени подавляют синтез нуклеиновых кислот в
случае использования глицерина С14 в качестве их
предшественника. При культивировании Вас. cereus на среде с 8-азагуанином
19% гуанина в т-РНК заменяется 8-азагуанином, что
сказывается на процессе включения фанилаланина в рибосомы. Замена
гуанина 8-азагуанином не сказывается на кодовых свойствах
т-РНК [37, 48а], однако это еще не означает, что указанная
т-РНК не может непосредственно или косвенно влиять на
биосинтез протеиназы.
Кроме того, как это установлено, пуриновые основания
принимают непосредственное участие в синтезе изоаллоксазиновой
части молекулы рибофлавина [35]. Многие микроорганизмы
и, в частности, термофил Micromonospora vulgaris 42, нуждаются
в рибофлавине.
128

Таблица 14
Действие пуриновых оснований и их производных на синтез протеин азы
термофильным актиномицетом Micromonospora vulgaris 42 [29]
Концентрация
метаболитов,
мкг 100 мл
10
20
60
160 '
240
Контроль . . .
10
20
60
100
200
Контроль . . .
10
20
60
100
200
Контроль . . .
10
20
60
100
200
Контроль . . .
Активность
протеиназы.
мкг тирозина
Сухая биомасса,
г/50 'мл
К и н е т и н
1890
1890
1380
1040
800
1090
0,26
0,25
0,26
0,27
0,23
0,28
А д е н и н
1450
1420
1300
1200
510
1200
0,25
0,21
0,24
0,26
0,22
0,28
Г у а и и и
1390
1370
1200
1100
450
ИЗО
0,26
0,27
0,25
0,24
0,12
0,28
К с а н т и н
1210
1100
1020
825
300
1170
0,30
0,30
0,28
0,26
0,20
0,29
Активность
протеин азы.
мкг тирозина
Сухая
биомасса,
г'50 мл
6-м еркаптопурин
1880
2340
1260
0
0
1190
0,33
0,34
0,26
0,10
0,10
0,29
8-а зааденин
1350
1300
1300
1280
1240
1300
0,30
0,29
0,30
0,29
0,28
0,30
8-а загуанин
1550
1400
1300
1250
1180
1160
0,29
0,29
0,29
0,28
0,27
0,28
8-а заксантин
1180
1170
1210
1250
1150
1200
0,28
0,28
0,30
0,29
0,28
0,28
Примечание: Культивирование термофила в течение 18 ч при
56°С на питательной среде следующего состава (в %): крахмал 0,15;
пептон 0,15; нитрат калия 0,6; сульфат аммония 0,1; натрий фосфорнокислый
двузамещенный 0,1, сульфат магния 0,05 и сульфат железа — следы; рН
среды 7,0—7,2. Пуриновые основания и их аналоги вносили в стерильную
среду в виде спиртового раствора (70%-ный этанол,), контрольная среда
не содержала пуриновых оснований.
9 Заказ 7
129

Ксантин оказывает на синтез фермента действие,
аналогичное аденину и гуанину. В отличие от других азотистых
оснований ксантин заметно не стимулирует биосинтез протеазы,
однако увеличенные концентрации его в среде (100—200 мкг/100 мл)
репрессируют образование фермента и тормозят рост
термофила; его аналог — 8-азаксантин не оказывает заметного действия
ни на синтез фермента, ни на рост микроорганизма.
РНК и продукты ее гидролиза
Известно, что РНК играет исключительную роль в обмене
веществ. В то же время установлено, что термофильные
микроорганизмы, культивируемые при 50—60° С, содержат
относительно меньше нуклеиновых кислот, чем мезофильные [7, 9].
Претерпевает изменение и нуклеотидный состав. В связи
с этим представляют интерес экспериментальные данные,
характеризующие действие РНК, вносимой в питательную среду, на
биосинтез протеазы термофилом Micromonospora vulgaris 42t
Добавление к среде от 0,1 до 1,0% дрожжевой РНК явно
стимулирует синтез внеклеточной протеазы, повышая ее активность на
60—80% по сравнению с активностью в контрольном опыте
(табл. 15). Одновременно отмечается и рост актиномицета.
Выход сухой биомассы повышается в 1,7—2,4 раза. Таким образом,
при внесении в среду РНК процессы синтеза фермента и роста
Таблица 15
Влияние РНК на синтез протенназы термофильным актиномицетом
Micromonospora vulgaris 42
Концентрация РНК
в среде, %
0,02
0,04
0,1
0,2
0,3
0,5
1,0
1,5
Контроль
рн
7,2
7,6
7,1
6,8
6,8
6,3
5,7
5,3
6,8
Активность
протеазы,
мкг тирозина
I860
2200
2280
2350
2400
2350
2300
2280
1170
Содержание
белка.
■мг'мл
2,8
3,3
7,7
8,5
8,9
10,3
12,1
13,0
2,8
Сухая
биомасса.
г 50 мл
0,31
0,35
0,37
0,41
0,53
0,54
0,80
0,89
0,28
Примечание: Использовалась модифицированная среда Косма-
чева [17], в состав которой входили (в %): крахмал 1,5; нитрат калия 0,6;
сульфат аммония 0,1; нитрат фосфорнокислый (двузамещенный) 0,1;
сульфат магния 0,05; мел 0,4. В качестве контрольной среды использовалась
крахмально-пептонная (соответственно 1,5 и 0,15%) и соли.
130

клеток заметно усиливаются по сравнению с контрольной
средой, состоящей из крахмала и пептона. Наличие РНК в среде
стимулирует не только синтез внеклеточной протеиназы, но
одновременно в 3,5—4,5 раза повышает содержание в культураль-
ной жидкости белка, определяемого по методу Лоури. Это также
указывает на интенсивность
процесса обмена веществ и
прежде всего белка.
При культивировании
мутанта Asp. awamori 78-2 на
среде Чапека с добавлением
дрожжевой РНК или
продуктов ее ферментативного
гидролиза также отмечается
заметное повышение содержания
внеклеточной кислой
протеиназы. Интересно отметить, что
если активность кислой
протеиназы возросла в 2,4—2,8
раза по сравнению с
контрольным опытом, то количество
биомассы осталось без
изменения, т. е. РНК и продукты ее
гидролиза не оказывают
какого-либо заметного действия на
рост мутанта (рис. 38).
Приведенные выше данные,
характеризующие возможность
регуляции клеточного
метаболизма, относятся к внешним
факторам. Совокупность
физических и химических
процессов обеспечивает усвоение питательных веществ и построение из
них составных частей клетки. Внутри клетки протекает
множество разнообразных химических реакций, катализируемых
специфическими ферментами. Процессы обмена веществ
регулируются таким образом, чтобы внутренняя среда клетки оставалась
как можно более постоянной. Это достигается не только
изменением внешних условий, но и внутриклеточной регуляцией.
Свободные внутриклеточные аминокислоты
В живой клетке происходит постоянное новообразование
и обновление белков, в том числе и ферментов. Скорость этих
процессов всецело определяется физиологическим состоянием
микроорганизма. Особенно интенсивно синтез ферментов
протекает в конидиальных и молодых клетках. Изменение химическо-
\%Л Активность протеиназы
\'.\ биомасса
300
и
[200
II
I
100
о
контроль
Гийролтат
РНК
т
|Т1
^
Рис. 38. Влияние РНК и продуктов
ее ферментативного гидролиза на
биосинтез кислой протеиназы
мутантом Asp. awamori 78-2:
/ — активность протеиназы; 2 —
биомасса.
9*
131

го состава клеток зависит от физиологического их состояния,
определяемого условиями культивирования и фазами роста.
Хорошо известно, например, что только при достижении высокого
содержания РНК клетки микроорганизмов вступают в
экспоненциальную фазу роста.
Исключительную роль в жизнедеятельности микроорганизмов
играют промежуточные продукты обмена веществ и прежде всего
свободные внутриклеточные аминокислоты, которые принимают
определенное участие в регулировании биосинтеза ферментов.
В частности, показана зависимость между синтезом кислой про-
теиназы и количественным содержанием свободных
внутриклеточных аминокислот [16]. Удалось установить резкие изменения
в количественном содержании свободных внутриклеточных
аминокислот в различные фазы роста плесневых грибов. Конидиаль-
ные клетки, взятые в качестве посевного материала, содержали
1,57% свободных аминокислот на сухую биомассу. Клетки же
мицелия, находящиеся в экспоненциальной фазе роста, содержат
свободных аминокислот, извлекаемых этиловым спиртом, почти
в 5—6 раз'больше, чем клетки конидий или старые клетки
мицелия, находящиеся в фазе затухания роста (табл. 16).
Весьма характерно, что клетки конидий содержат всего 8,
а мицелиальные клетки 20 протеиногенных аминокислот. Из
восьми аминокислот, содержащихся в конидиальных клетках, на
долю глютаминовой кислоты (0,52%), у~аминомаслян°й
кислоты (0,17%) и моноамида глютамина (0,71%) приходится 81%
от общего их количества. По мере прорастания конидий
отмечается интенсивный синтез 18 аминокислот. Исключение
составляли только у"аминомасляная кислота и глютамин. В течение
первых 12 ч роста гриба количество глютаминовой кислоты
увеличивается в 6,2 раза, а аспарагиновой почти в 18 раз.
Количество других аминокислот: аланина, серина, тирозина, треонина,
цистеина, аргинина — также увеличилось в 10—27 раз. В
количественном отношении доминируют три аминокислоты: глютами-
новая (3,82%), аланин (1,49%) и аспарагиновая (1,00%Т. По
механизму биосинтеза эти аминокислоты, как известно,
отличаются от всех остальных аминокислот. Количественное
соотношение свободных аминокислот в мицелиальных клетках,
находящихся в экспоненциальной фазе роста, приближается к
соотношению, которое существует в белке биомассы гриба.
С прекращением роста мицелия гриба снижается, как уже
отмечалось, и содержание свободных внутриклеточных
аминокислот. Их количество в фазе затухания роста достигает минимума
(1,33%) и в течение последующих 12 ч опыта остается без
изменения.
Ранее уже упоминалось, что количественные изменения в
содержании глютамина и у-зминомасляной кислоты по фазам
роста гриба отличаются от изменений других аминокислот. Если
132

Таблица 16
Изменение содержания свободных внутриклеточных аминокислот в процессе
роста плесневых грибов (в % на сухую биомассу; средние данные,
полученные в опытах с культурами Asp. flavus и Asp. oryzae)
Аминокислоты
Содержание аминокислот при продолжительности
роста, ч
24
30
Алании
Аргинин
V-Аминомасляная . . . .
Аспарагин
Аспарагиновая
Глицин
Глютамин
Глютаминовая
Лизин + гистидин . . . .
Метионин + валин . . .
Пролин
Серии
Тирозин
Треонин
Фенилаланин -)- лейцин +
изолейцин
Цистеин
0,13
0,01
0,17
0,00
0,04
0,00
0,67
0,45
0,02
0,01
0,00
0,03
0,01
0,00
0,03
0,00
1,27
0,22
0,01
0,07
0,71
0,18
0,55
2,77
0,30
0,07
0,05
0,38
0,27
0,25
0,39
0,23
Сумма
1,57
7,72
1,17
0,25
0,05
0,08
0,72
0,13
0,40
2,80
0,33
0,08
0,00
0,21
0,15
0,28
0,30
0,18
1,12
0,20
0,03
0,09
0,58
0,21
0,35
2,59
0,37
0,03
0,03
0,19
0,13
0,24
0,25
0,16
7,13
6,57
1,13
0,23
0,01
0,05
0,58
0,23
0,31
2,44
0,38
0,00
0,00
0,26
0,13
0,25
0,17
0,14
6,31
Аминокислоты
Содержание аминокислот при продолжительности
роста, ч
36
42
48
60
Алании
Аргинин
у-Аминомасляная . . . .
Аспарагин
Аспарагиновая
Глицин
Глютамин
Глютаминовая
Лизин + гистидин . . .
Метионин + валин . . .
Пролин
Серии
Тирозин
Треонин
Фенилаланин + лейцин +
изолейцин
Цистеин
Сумма .
0,79
0,16
0,08
0,08
0,40
0,20
0,22
1,91
0,27
0,00
0,00
0,24
0,12
0,18
0,22
0,08
4,73
0,58
0,11
0,15
0,07
0,26
0,18
0,16
1,26
0,21
0,00
0,07
0,16
0,15
0,13
0,20
0,07
3,76
0,25
0,05
0,13
0,00
0,13
0,07
0,07
0,58
0,11
0,00
0,04
0,06
0,10
0,07
0,14
0,03
1,93
0,15
0,03
0,12
0,00
0,11
0,05
0,03
0,33
0,10
0,00
0,02
0,04
0,12
0,06
0,13
0,03
1,32
0,15
0,03
0,12
0,00
0,10
0,05
0,01
0,33
0,12
0,00
0,01
0,04
0,12
0,07
0,15
0,03
1,33
133

в конидиях обе эти аминокислоты содержатся в наибольшем
количестве, то через 12 ч после прорастания конидий у-аминомас-
ляная кислота исчезает полностью, а содержание глютамина
снижается на 4—7%, а в отдельных опытах на 30% (с 0,62
до 0,42%). Возможно, это объясняется тем, что конидии Asp.
oryzae 79 содержат глютамина относительно меньше (0,62%),
чем, например, конидии гриба Asp. niger 50 (0,84%).
По мере последующего роста мицелия содержание
глютамина постепенно снижается, а в фазе прекращения роста
микроорганизма он или полностью отсутствует или его количество
сводится к минимуму — 0,02—0,04% на сухую биомассу. Эти данные
косвенно подтверждают важную биохимическую роль глютамина
в обмене аминокислот. Одновременно устанавливается
взаимосвязь глютамина с у-аминомасляной кислотой и их важная роль
в образовании других аминокислот. Особо выделяется глютами-
новая кислота, исключительно высоким содержанием которой
отличаются как конидиальные, так и мицелиальные клетки.
Именно эти 3 азотистых соединения — глютамин, глютамино-
вая и у-аминомасляная кислота — обеспечивают биосинтез
многих других аминокислот и жизнедеятельность конидиальных
клеток. Тем самым наши данные подтверждают существующее
мнение о том, что в живой клетке указанные аминокислоты
взаимосвязаны и играют важную физиологическую роль. В
частности, взаимопревращения глютаминовой и у-аминомасляной
кислот и глютамина обеспечивают, по мнению Кретовича, синтез
многих других аминокислот в созревающем колосе пшеницы
и в растущих дрожжевых клетках [19, 13, 20, 18, 4].
Полученные данные позволяют представить взаимосвязь
указанных аминокислот в виде следующей схемы.
Янтарный полуальдегид-
-*Янтарная кислота-
► Цикл Кребса
Аминомасляная кислота
it переаминирование
Глютаминовая кислота*
Кетоглютаровая кислота*
Глютамнн—
• Переаминирование*:
Щавелевоуксусная
кислота
I
4
— Аспарагиновая
кислота
Образование других
аминокислот
Как следует из схемы, обмен у-аминомасляной кислоты,
глютаминовой кислоты и глютамина взаимообусловлен, а через
образование янтарного полуальдегида они могут «самостоятельно»,
134

т. е. независимо от процесса диссимиляции углеводов,
включаться в цикл Кребса. Этим, по-видимому, и объясняется, что у-ами-
номасляная кислота за первые 12 ч прорастания конидий
расходуется полностью, а глютамин в значительной степени идет
на образование других аминокислот, без которых не может
проявляться жизнедеятельность микроорганизма.
Достоверность настоящей схемы, отражающей
биохимические процессы при прорастании конидий, подтверждается
другими наблюдениями. Так, в настоящее время хорошо изучена
реакция переаминирования у-аминомасляной кислоты с кетоглутара-
том, в результате которой образуются янтарный полуальдегид
и глютаминовая кислота. Высказываются мнения о возможности
протекания реакции переаминирования янтарного полуальдегида
с аминокислотами. Установлена реакция непосредственного ами-
нирования за счет аминогруппы многих кетокислот. В частности,
у некоторых видов дрожжей глютамин за счет своей амидной
группы, меченной по азоту, обеспечивает непосредственное пере-
аминирование пировиноградной кислоты с образованием
большого количества аланина [6]. Таким образом, полученные нами
данные еще раз подтверждают, что живая клетка в зависимости
от условий жизнедеятельности может использовать
промежуточные продукты обмена различными путями.
Экспериментально показано, что период активной
жизнедеятельности микроорганизма полностью совпадает не только с
периодом максимального накопления свободных внутриклеточных
аминокислот, но и с интенсивным биосинтезом кислой протеина-
зы. Процессы роста плесневого гриба, образования свободных
внутриклеточных аминокислот и биосинтеза кислой протеиназы
тесно взаимосвязаны.
Особенность внеклеточной кислой протеиназы заключается
именно в том, что она синтезируется, в отличие от амилазы, цел-
люлазы и других ферментов, растущими, стабильными, высоко
жизнедеятельными клетками мицелия гриба, находящимися
в экспоненциальной и отчасти стационарной фазах роста. В то
же время переход конидиальных клеток из лаг-периода в
следующую фазу роста всецело связан с максимальным образованием
свободных внутриклеточных аминокислот. Они предопределяют
жизнедеятельность микроорганизма и синтез кислой протеиназы.
После 12 ч роста плесневого гриба начинается наиболее
интенсивный синтез кислой протеиназы, который связан с
постепенным снижением содержания свободных внутриклеточных
аминокислот. При этом, по-видимому, исключительную роль
играет глютаминовая кислота. Синтез кислой протеиназы, как это
вытекает из приведенных данных, может происходить при
условиях, обеспечивающих относительно высокую концентрацию
свободной глютаминовой кислоты. Например, внутриклеточная
концентрация аминокислоты, соответствующая 3080—
135

2630 мкг/\00 мг биомассы, обеспечивает интенсивный синтез
протеиназы (на 0,13—0,22 ед. оптической плотности на каждые
6 ч роста). Снижение концентрации глютаминовой кислоты до
1428 мкг приводит к ослаблению синтеза фермента. За период
культивирования с 30 до 42 ч содержание глютаминовой
кислоты снизилось в клетках мицелия почти в 2 раза (с 2630 до
1428 мкг), что привело к снижению скорости синтеза
протеиназы в 2—3 раза, т. е. вместо прироста ее активности,
соответствующей 0,13 ед. оптической плотности за 6 ч опыта (с 24 до 30 ч),
она возросла за последующие 12 ч всего на 0,06—0,03 ед. За
последующие 6 ч культивирования, т. е. с 42 до 48 ч, количество
внутриклеточной глютаминовой кислоты снизилось почти
в 2,5 раза (с 1428 до 534 мкг), что обусловило прекращение
дальнейшего образования кислой протеиназы.
Таким образом, резкое снижение количества глютаминовой
кислоты в клетках мицелия за 12 ч культивирования, т. е. с 30
до 42 ч, привело сначала к снижению скорости, а затем и к
полному прекращению синтеза протеиназы. Возможно, что
стабилизация концентрации внутриклеточной глютаминовой кислоты
позволит продлить нужную фазу роста микроорганизма и
биосинтеза протеиназы.
Как следует из сказанного выше, специфическое влияние
отдельных внутриклеточных аминокислот на образование
фермента представляет собой важный биологический механизм, с
помощью которого в живой клетке регулируются процессы синтеза.
ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
Внутриклеточные аминокислоты используются для синтеза
ферментов и других белков. Эти реакции находятся под
контролем генов (ДНК), локализованных в ядре. Синтезированные
ферменты из рибосом перемещаются в другие части клетки. Тем
временем глюкоза превращается в пировиноградную кислоту
и другие продукты ее диссимиляции, а освобождающаяся при
этом энергия аккумулируется в митохондриях, из которых
полезная энергия распределяется по клетке и используется для
приведения в движение всего клеточного механизма. Процессы
жизнедеятельности клетки схематично представлены на рис. 39.
Из имеющихся в клетке субстратов в результате
ферментативных реакций образуются нуклеозидтрифосфаты, необходимые
для репликации ДНК- ДНК сначала синтезирует рибосомы и
информационные РНК, которые совместно осуществляют синтез
ферментных молекул из аминокислот. Ферменты, • в свою
очередь, обеспечивают образование дезоксирибонуклеотидов,
аминокислот и рибонуклеотидов, необходимых для поддержания
всей системы в действии.
136

Таким образом клетка представляет собой не простое
вместилище случайно расположенных химических соединений и не
«мешок ферментов», а сложный и своеобразный агрегат с
упорядоченным и дифференцированным внутренним строением.
Микробная клетка служит превосходным образцом изящного
и тонкого механизма с системами блокировки: каждый участок
клетки для поддержания своей жизнедеятельности нуждается во
всех остальных. Так, например, без АТФ нет синтеза белка, а без
белков — нет АТФ.
Увеличение
н:яичесш5а ДНК при
Делении клеток
дезшириШукпеа
тиды
Рис. 39. Схема окислительного фосфорилирования.
Сложные регуляторные процессы оказались неизбежным
следствием взаимодействия физических структур и ряда
внутриклеточных химических реакций. Решающими в регуляции обмена
должны быть механизмы, действующие на уровне ферментов.
Поэтому регуляторные процессы строго подчиняются законам
математики, которые можно изобразить в виде уравнений.
Одноступенчатая реакция
Например, превращение А в Б можно изобразить реакцией
А-аза
т. е. она катализируется ферментом А-азой. На скорость
превращения А в Б влияет целый ряд условий, а именно: начальные
концентрации А, Б и А-азы в растворе; температура реакцион-
137

ной среды; присутствие кофакторов и ионных активаторов,
отсутствие ингибиторов А-азы. Важно и положение равновесия
реакции: смещено ли оно в направлении полного превращения А
в Б, протекает ли реакция лишь наполовину или Б почти не
образуется.
При незначительном влиянии небольших изменений
температуры и рН, оптимальных концентрациях всех реагирующих
веществ активность А-азы может определяться присутствием иона
магния как активатора. В таких условиях даже очень небольшие
изменения количества магния в среде оказывают огромное
влияние на скорость образования Б.
Многоступенчатая реакция
Теперь рассмотрим некоторые факторы, влияющие на
протекание нескольких последовательных реакций:
В ? А ? Б ? Г.
B-аза А-аза Б-аза
Здесь появляется дополнительный переменный фактор, не
существенный для одноступенчатой реакции.
Известно, что каждая из последующих реакций зависит
также от результатов остальных. Предположим, что реакция,
катализируемая В-азой, чрезвычайно чувствительна к изменению
рН, а конечный продукт реакции Г является кислым веществом.
По мере увеличения количества Г возрастает кислотность
раствора, которая изменяет активность фермента В-азы, и скорость
образования А из В падает; соответственно снижаются
количества Б и Г, что в свою очередь приводит к уменьшению
кислотности раствора. После этого вновь увеличивается скорость
действия В-азы, возрастает количество Г, а следовательно и
кислотность, что снова понижает активность В-азы. В конечном итоге
должно установиться устойчивое равновесие.
Таким образом, образование Г служит регулятором
активности В-азы, и наоборот, скорость действия В-азы определяет
количество образовавшегося Г. Этот тип регулирования
называется механизмом обратной связи. Его можно изобразить так:
В ^ А ^ Б ^ Г (+Н+).
В-аза А-аза Б-аза
Известны два типа обратной связи. Если конечный продукт
реакции (Г) подавляет активность начального фермента
(В-азы), то такая обратная связь называется отрицательной.
Если бы конечный продукт (Г) снижал рН и тем самым
увеличивал активность начального фермента и соответственно
образование Г, то такая обратная связь, естественно, являлась бы
положительной.
138

Во всех подобных реакциях скорость их контролируется
продуктом, непосредственно не участвующим в данной реакции.
Тысячи реакций и сотни многокомпонентных реакционных
систем, встречающихся в клетке, регулируются множеством
различных факторов, которые в свою очередь «саморегулируются»:
подкисляя или подщелачивая окружающую среду, используя
или продуцируя кофакторы, ингибиторы и т. д.
Скорость самой медленной реакции в системе
Рассмотрим в упрощенном виде приведенную выше систему
реакций:
В ^ А ^ Б гг г.
B-аза А-аза Б-аза
Даже в самых благоприятных условиях скорость каждой из
этих реакций будет различной. Предположим, что реакция
В —>- А = 100 произвольным единицам; А ->■ Б = 10
произвольным единицам; Б ->■ Г = 1 произвольной единице.
Следовательно реакция, катализируемая В-азой, протекает
в 10 раз, а с участием А-азы — в 100 раз быстрее, чем реакция,
катализируемая Б-азой. При этом, естественно, В-аза
продуцирует А в 10 раз больше, чем может использовать А-аза, которая
в свою очередь образует Б в 10 раз больше, чем может
использовать Б-аза. Поскольку в ходе реакции образуется огромный
избыток А и Б, с которыми не могут справиться соответствующие
ферменты, скорость превращения В в Г ограничивается только
скоростью реакции Б ^ Г, катализируемой Б-азой.
Таким образом скорость системы последовательных реакций
определяется скоростью самой медленной реакции в этой
системе. При этом образование конечного продукта (Г), хотя и
вызывает изменение рН, достаточное для 10-кратного уменьшения
активности В-азы, однако скорость продуцирования Г все же
остается неизменной, поскольку она зависит от активности
Б-азы, а не В-азы. Тем самым конечный продукт системы (Г)
уже не будет осуществлять контроль за собственным
образованием по принципу обратной связи.
Следовательно самая медленная реакция системы является
единственной, определяющей скорость протекания ряда
последовательных реакций [19, 9, 14, 23]. В соответствии с этим клетка
микроорганизма может регулировать скорость любой системы
реакций, изменяя лишь те факторы, которые контролируют
скорость только одной из реакций системы — самой медленной.
Например в гликолитическом расщеплении глюкозы,
включающем 10 последовательно протекающих реакций, каждая из
которых катализируется специфическим ферментом, самыми
медленными оказались две первые реакции фосфорилирования,
определяющие скорость работы всей системы.
139

Контроль за превращением энергии
Жизнедеятельность живой клетки может проявляться при
наличии энергии. При этом клетка должна регулировать не
только реакции, потребляющие энергию, т. е. анаболические, но
и реакции, производящие энергию. Основные запасы энергии
клетки концентрируются и контролируются внутри митохондрий
за счет синтеза АТФ при окислении субстратов в цепи переноса
водорода. Таким образом энергия, приобретаемая клеткой в
результате окисления, определяется количество накопившегося
АТФ. Распад этого макроэргического соединения на АДФ и
неорганический фосфат приводит к освобождению энергии, которая
может быть использована для метаболического процесса.
Митохондрия должна содержать собственную внутреннюю систему
контроля, которая обеспечивала бы скорость сжигания
«горючего». Окисление субстрата будет задерживаться:
а) от недостатка в системе кислорода, необходимого для
окисления в конце цепи всего восстанавливаемого цитохрома.
Обычно окисление цитохрома а3 не лимитирует процесс
окисления субстрата, если в клетку не введены яды (цианид, окись
углерода);
б) от недостаточного количества неорганического фосфата
и АДФ. В этом случае медленные реакции
Х~1+Р^1~Р + Хи 1 ~Р + АДФг21 +АТФ
не смогли бы осуществляться и тем самым накапливалось бы
промежуточное фосфорилированное вещество X ~ 1, в
результате чего нарушился бы поток атомов водорода от субстрата
к кислороду по цепи переноса.
Таким образом скорость окисления вещества в цепи переноса
электрона регулируется количеством присутствующих в
митохондриях АДФ и неорганического Р. Однако концентрация этих
веществ в свою очередь контролируется процессом непрерывного
образования АТФ с окислением. Это фосфорное соединение не
задерживается в митохондриях, а служит источником энергии
в других частях клетки: АТФ ->■ АДФ + Р [6].
В клетках микроорганизмов протекают два противоположно
направленных и замкнутых в цикл процесса: распад и синтез.
Скорость окисления субстрата зависит от скорости
использования АТФ. Следовательно клетка может изменять скорость
аккумуляции энергии. Это всецело зависит от внутриклеточного
соотношения АТФ (АДФ + Р).
Рассмотрим реакцию образования АТФ:
X ~ 1 + Р^1 ~ Р + Х,
1 ~ Р + АДФ^АТФ + 1.
140

Если АДФ отсутствует, то начинает возрастать концентрация
X ~ 1, а следовательно и других промежуточных веществ.
Увеличение концентрации промежуточного фосфорилированного
вещества X ~ 1 может быть приостановлено за счет присутствия
в клетке АДФ и неорганического фосфора, а также за счет
разобщающего механизма, обеспечиваемого с помощью следующей
реакции:
X ~ 1 + Н2О^Х + 1,
где X ~ 1 гидролизуется, а энергия, заключенная в макроэрги-
ческой связи (~), рассеивается в виде тепла без сопряжения
с синтезом АТФ. Если эта реакция осуществима, окисление
может продолжаться независимо от фосфорилирования. При этом
оба процесса будут разобщены.
Если АДФ, Р и Ог присутствуют в избытке, то ни один из
описанных контрольных механизмов не будет регулировать
скорость окислительного фосфорилирования. Лимитирующим
фактором в этих условиях становится вступление водорода в цепь
переносчиков за счет дегидрогеназных реакций:
АН2 + НАДйА + НАД. Н2.
Если количества АН2 и НАД велики, а количества А
и НАД.Н2 малы, то реакция будет протекать в одном
направлении. Так как во многих дегидрогеназных реакциях поставщиком
Н2 является кофермент НАД, то скорость реакций будет зависеть
от количества присутствующих в системе НАД и НАД.Н2. Если
НАД в избытке, а НАД.Н2 присутствует в незначительных
количествах, то реакции будут протекать в прямом направлении. При
этом подключаются циклы окисления лимонной и жирной
кислот. При избытке НАД.Н2 и недостатке НАД реакция
замедлится, а потом остановится, а транспорт водорода прекратится.
Таким образом соотношение количества НАД и НАД.Н2
является регулятором окисления.
С коферментом НАД тесно связан другой кофермент НАДФ,
который участвует в синтезе жиров, требующих постоянного
притока Н2 для восстановительных реакций. Отношение НАДФ/
/НАДФ.Н2 служит фактором, лимитирующим скорость в
синтетических реакциях. Взаимосвязь указанных кофакторов можно
выразить следующей реакцией:
НАД. Н2+НАДФггНАД + НАДФ. Н2.
В этой реакции один кофермент окисляется, а другой
восстанавливается, что обеспечивает необходимые соотношения
НАД/НАД.Н2 и НАДФ/НАДФ.Н2.
Таким образом фермент трансгидрогеназа обеспечивает
равновесие между деструктивными процессами, способствующими
накоплению энергии, и конструктивными реакциями, потребля-
141

ющими энергию. Максимальное использование свободной
энергии процессов обмена возможно лишь при условии их
обратимости.
РОЛЬ СУБКЛЕТОЧНЫХ КОМПОНЕНТОВ В ПРОЦЕССАХ
РЕГУЛЯЦИИ
Субклеточные компоненты играют, по-видимому, важную
роль в регулировании деятельности микробной клетки,
координации синтеза метаболитов и накоплении полезной энергии.
Клеточные структуры выполняют множество различных
функций, из которых выяснены лишь отдельные. Однако сам факт
абсолютной необходимости множества самостоятельных орга-
нелл и мембран дает основание с большой долей достоверности
полагать, что они принимают непосредственное участие в
управлении жизнедеятельностью клетки.
Если количество митохондрий в клетке составляет, как
правило, 500—1000, то содержание рибосом достигает нескольких
сотен тысяч, варьируя в зависимости от физического состояния
клетки. Количество молекул ферментов в клетке составляет
около миллиарда. При этом следует учесть, что каждая орга-
нелла содержит только ей одной свойственные ферменты и
субстраты. Субстрат, сосредоточенный в какой-либо из органелл,
недоступен для соответствующих ферментов, содержащихся
в других органеллах.
Таким образом клетка состоит как бы из отдельных отсеков,
изолированных и разделенных перегородками, которые
пропускают далеко не все вещества. По обе стороны каждой из таких
перегородок могут быть резко отличные условия и прежде всего
по кислотности или щелочности, температуре, содержанию
соединений с макроэргическими связями, кофакторами, в
частности, магнием. Если в целой клетке содержится высокая
концентрация какого-либо вещества, то отдельные участки ее могут
вообще не содержать его. На первый взгляд может показаться, что
разница, например, в температуре по обе стороны митохондри-
альной мембраны в 0,01 град сама по себе очень незначительна,
однако если ее рассчитать на 1 см, то градиент в этом случае
составляет 10000 град/см. Следовательно в условиях микромира
могут функционировать особые, еще неизвестные, контрольные
системы.
В настоящее время установлен также следующий весьма
интересный факт. Оказалось, что АТФ, синтезированная в
митохондриях в ходе окисления пировиноградной кислоты,
недоступна для глюкозы, находящейся в цитоплазме, тогда как АДФ,
образующаяся в цитоплазме в результате гексокиназной
реакции, не поступает в митохондрии и соответственно не фосфори-
лируется. Поэтому добавление глюкозы не вызывает усиления
142

дыхания. Таким образом митохондриальная мембрана может
препятствовать свободному передвижению синтезированной
АТФ в другие части клетки, и этот мононуклеотид всецело
локализуется в митохондриях.
В свою очередь АДФ не может беспрепятственно проникать
в митохондрию. Поэтому в процессе гликолитического
расщепления глюкозы до пировиноградной кислоты регулирующим
фактором должна быть АТФ, образующаяся на последней фазе
этой системы и расходуемая на фосфорилирование глюкозы.
Следовательно, окисление глюкозы регулировалось бы по
механизму положительной обратной связи. Однако в связи с тем что
глюкоза
Фруктом-1,6 -
ducpoapam
ПиооШограднпя
~ : кислота. —
п
■&-АДР AVP
!__
J—
-С0г мг0
Цитоплазма
Л-
-| 1_
Митохондрия
Рис. 40. Пастеровский эффект — один из примеров участия внутриклеточных
структур в процессах регуляции (по Шиловой, 1967).
к процессу регуляции гликолиза подключаются мембраны,
свободное передвижение АТФ и АДФ блокируется и в
действительности получается регуляция по механизму отрицательной
обратной связи (рис. 40).
Представляют интерес также данные, характеризующие
существование различной внутриклеточной локализации
полифосфатов и расщепляющих их ферментов в клетках грибов Neuro-
spora crassa. Установлено, что полифосфатазы (как эндо-, так
и экзо-) в процессе разрушения мицелия катализируют распад
кислоторастворимых и частично кислотонерастворимых
полифосфатов, не затрагивая при этом полифосфаты солераствори-
мой фракции. По-видимому, эти полифосфаты находятся в
каком-то особом, хорошо защищенном состоянии. Тем самым
разные полифосфаты, локализованные в разных частях клетки и
выполняющие разные функции, могут подвергаться
ферментативному гидролизу с разной скоростью и (при необходимости)
перераспределяться.
1969.
№
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ К ГЛАВЕ IV
1. Агранов Б. В кн.: «Молекулы и клетки». М. Изд-во «Мир». Вып. 4,
2. А р е н д с И. М. «Ферментная и спиртовая промышленность». 1967,
143

3. Б о ген Г. Современная биология. М. Изд-во «Мир», 1970.
4. Б у т о в а С. Н. Глютамин и янтарный полуальдегид в обмене
пекарских и кормовых дрожжей. Канд. дисс. Московский технологический институт
пищевой промышленности, 1967.
5. Грин Д., Гельдбергер Р. Молекулярные аспекты жизни. М.
Изд-во «Мир», 1968.
6. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. 2-ое изд. М. Изд-во «Мир», 1966.
7. Е в р е и н о в а Т. Н., М а с л о в а СВ. и др. «Микробиология».
Т. XXIX, Вып. 4, 516, 1960.
8. Евреинова Т. Н., Марченко И. В., Логинова Л. Г.
«Микробиология». Т. XXX. Вып. 3, 453, 1961.
9. Евреинова Т. Н., Мирошниченко Г. П. «Микробиология».
Т. XXXI. Вып. 3, 428, 1962.
10. Евреинова Т. Н. и др. «Микробиология». Т. XXXIV. Вып. 3, 417,
1965.
11. К а л а шн и ко в а Н. А., Р о д з е ви ч В. И. «Прикладная биохимия
и микробиология». Т. 6. 1970.
12. Касаткина И. Д. «Микробиология». Т. XXX. Вып. 3, 1961.
13. Коновалов С. А. Биохимия бродильных производств. Изд-во
«Пищевая промышленность», 1967.
14. Коновалов С. А., Ш а х о в а Т. В., Б о р о д к и н а В. В.,
Весело в а Л. П. «Прикладная биохимия и микробиология». Т. 3. Вып. 4, 401, 1967:
Труды ВНИИФСа. Вып. XVII, 1967.
15. К о н о в а л о в С. А., Д о р о х о в В. В. ДАН СССР. Т. 186, № 1, 208,
1969.
16. Коновалов С. А., Дорохов В. В. «Прикладная биохимия и
микробиология». Т. 5. Вып. 2, 131, 1969.
17. Космачен А. Е. Термофильные актиномицеты и их
антагонистические свойства. Канд. дисс. Институт микробиологии АН СССР, 1954.
18. Кретович В. Л. Введение в энзимологию. М. Изд-во «Наука», 1967.
19. Кретович В. Л., Яковлева В. И. ДАН СССР. Т. 125. № 1. 210,
1959.
20. К р е т о в и ч В. Л., Б у т о в а С. Н., А у э р м а н Т. Л.
«Микробиология». Т. XXXVII. Вып. 4, 643, 1968.
21. Крицман М. Г., К о н и ко в а А. С. Индукция ферментов в норме
и патологии. М. Изд-во «Медицина», 1968.
22. К у л а е в а О. Н., В о р о б ь е в а И. П. Биология нуклеинового
обмена у растений. М. Изд-во «Наука», 1964.
23. Кул а ев а О. Н., Кляч ко Н. Л. ДАН СССР. Т. 164. № 2, 458,
1965.
24. К У л а е в И. С, К р а ш е н и и к о в И. А., А ф а н а с ь е в а Т. П. ДАН
СССР. Т. 190. № 5. 1238, 1970.
25. Л о с я к о в а Л. С. Сб. «Микробиологический синтез», № 1, 1970.
26. Мардашев С. Р. Некоторые проблемы регуляции обмена веществ
и природные полимеры. М. Изд-во «Медицина», 1965.
27. Н е й ф а х С. А. В кн.: «Молекулярная биология. Проблемы и
перспективы». М. Изд-во «Наука», 1964.
28. Овчаров А. К. Труды ВНИИФСа. Вып. XVII, 1967.
29. Овчаров А. К. Протеолитические ферменты термофильного актино-
мицета. Канд. дисс. Московский технологический институт пищевой
промышленности. 1969.
30. Р о д з е в и ч В. И., Калашникова Н. А., Самарина В. М.
Труды ВНИИФСа. Вып. XIX, 1970.
31. Роуз С. Химия жизни. М. Изд-во «Мир», 1969.
32. Т и х о м и р о в а А. С. Индуцированный синтез амилазы. Канд. дисс.
Институт микробиологии АН СССР, 1964.
33. Ф е н и к с о в а Р. В., М у с а е в а Т. И. Труды ВНИИФСа. Вып. XVII.
6, 1967.
144

34. Херсонова Л. А., Николушкина В. М. «Ферментная и
спиртовая промышленность». 1969, № 2, 15.
35. Ш а в л о в с к и и Г. М. Флавиногенез дрожжей рода Candida и
механизм его регуляции. Докторская дисс. Институт микробиологии АН СССР,
1967.
36. Ш а н ж е Ж. П. В кн.: «Молекулы и клетки». М. Изд-во «Мир»,
1966.
37. Ш а н т р е н Ю. Биосинтез белков. М. Изд-во ИЛ, 1963.
38. X а в к и н Э. Е. Индуцированный синтез ферментов в процессах роста
и морфогенеза растений. М. Изд-во «Наука», 1969.
39. С о h п М., С о h е п G. N., М о п о d J. С. R. Acad. Sci. Paris. 236. 746,
1953.
40. F u k u m о t о J. et al. Int. Symp. Enz. Chem. Tokyo, 1957.
41. Gorini L., Ma as W. K. Biochim. Biophys. acta. 25. 208, 1957.
42. I а с о b F., M о n о d J. Journ. Molec. Biol. 3. 318, 1961.
43. Kanie M. Memoris of Agr. Kadoshima Univ. Japan, 1956.
44. Levin D. N. Biochem. Biophys. Res. Communs. 19, 647, 1965.
45. Markovitz А., К 1 e i п Н. P. Journ. Bacteriol. 70. 641, 1955.
46. Marurrella J. C, Garner J. G. Nature. 200. 4904, 1963.
47. M с Col lister R. J. et al. Journ. Biol. Chem. 239. 5, 1960.
48. McManus M. A., S i 11 i n a n K. Nature. 191. 619. 4788, 1961.
49. M о n о d J., С о h e n - В a z i r e G. С R. Acad. Sci. Paris. 236. 530,
1953.
50. Perrin D., I a cob F., Mo nod J. С R. Acad. Sci. Paris. 251. 155,
1960.
51. Scott D„ Hedrick L. R. Journ. Bacteriol. 63. 795, 1952.
52. Supniewski J., Krupinska J., Supniewska H. Bull. Acad,
polon. Sci. 5. 19, 1957.
53. Thayer P. S. Journ. Bacteriol, 66, 656, 1953.
54. Tomomura K., S u z u k i H. et al. Agr. Biol. Chem. Vol. 25.
N 1—6, 1961.
55. We in stein J. В., Grunberger D. Biochem. Biophys. Res.
Communs. 19. 647, 1965.
56. Welker N. E., С a m p b e 11 L. L. Journ. Bacteriol 86, 681, 1963; 87,
828, 1964.
57. Y u г а Т., V о g e 1 H. J. Journ. Biol. Chem. 234, 335, 1953.
ГЛАВА V
АМИЛОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ
КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ
Амилазы чрезвычайно широко распространены в живой
природе, их находят у микроорганизмов, в тканях животных и
растений. Эти ферменты относятся к классу гидролаз, т. е.
расщепляют внутримолекулярные связи в полисахаридах с участием
воды: R — R' + Н — OH->R — H + R' — ОН. Известны три
типа амилаз: а-амилаза, р-амилаза и -у-амилаза, или глюкоамила-
за. Многие микроорганизмы образуют наряду с амилазами
также олиго-1,6-глюкозидазу (декстриназу), катализирующую
разрыв а-1,6-связи в изомальтозе, панозе, конечных, или лимит-
10 Заказ 7
145

декстринах, глюкозидазу (мальтозу), обеспечивающую гидролиз
мальтозы, и ферменты трансглюкозилазного действия.
а-Амилазы. В комплекс амилолитических ферментов,
продуцируемых микроскопическими грибами, входит, без сомнения,
а-амилаза (3.2.1.1; а-1-4-глюкан-4-глюканогидролаза), которая
катализирует разрыв а-1,4-глюкозидных связей макромолекул
крахмала с образованием мальтозы и конечных декстринов. При
действии на клейстеризованный крахмал а-амилазы не только
его разжижают и декстринируют, но и осахаривают. При этом
они атакуют не только клейстеризованный, но и нативный
крахмал, разрушая крахмальные зерна.
а-Амилазы различного происхождения имеют много общих
черт. Они хорошо растворимы в воде, в сильно разбавленных
растворах солей и этилового спирта [9.8]. Белок а-амилаз
обладает слабокислыми свойствами; изоэлектрическая точка
ферментов колеблется в пределах рН 4,2—5,7 [98]. Молекулярная масса
а-амилаз плесневых грибов 4500—5000 [32, 117]. Многие из
известных ныне а-амилаз получены либо в высокоочищенном, либо
в кристаллическом виде [93, 79, 21].
Как известно, а-амилазы микроорганизмов обычно
проявляют каталитическое действие только в условиях слабокислой
реакции среды. Однако в амилолитическом комплексе черных
аспергиллов содержится декстринирующая а-амилаза, которая
обладает устойчивостью к высокой кислотности среды,
соответствующей рН 2,5—2,8 [148, 132, 92, 89]. Исследования кинетики
инактивации а-амилаз из вытяжек поверхностных культур Asp.
awamori, Asp. batatae, Asp. usamii свидетельствуют, что наряду
с кислотонеустойчивой а-амилазой эти вытяжки содержат в
количестве 5—-10% кислотоустойчивую а-амилазу [21]. В то же
время гриб Asp. niger 475 образует только кислотоустойчивую
а-амилазу (табл. 17), которая не инактивируется при рН 2,5
и 30° С в течение часа [89, 18].
Бактериальные амилазы относятся к а-типу, так как
продуктом гидролиза полисахаридов — крахмала, гликогена,—
осуществляемого ими, является а-мальтоза. Характерные
особенности— высокая разжижающая способность и большая
термостабильность.
Амилазы Вас. subtilis разделены на две группы, из которых
одна гидролизует углеводы (крахмал, декстрины, гликоген,
амилозу, амилопектины) на 30—40% и названа разжижающей, или
декстринирующей, а другая амилаза гидролизует субстрат на
50—60% и названа осахаривающей [159].
а-Амилазы термофильных бактерий, развивающихся при
56° С, проявляют активность при 65—67°С. Внеклеточные
ферменты отдельных термофилов сохраняют активность даже при
90° С. Они характеризуются повышенным содержанием кальция.
Удаление «внешнего кальция» приводит к резкому снижению
146

Таблица 17
Кислотоустойчивость сс-амилаз черных аспергиллов [18]
Культура и штамм гриба
Активность а-амилазы,
ед/мл культуральной
жидкости
общая
декстрини-
рующая

кислотоустойчивая
декстрини-
рующая

Кислотоустойчивая
декстрин и-
рующая
активность,
% от общей
Asp. awamori
Asp. usamii 45 .
Asp. usamii 45-56
Asp. usamii 45-21
Asp. niger 475 .
0,50
0,43
0,50
0,40
0,35
0,08
0,10
0,11
0,06
0,34
16
23
22
15
97
Примечание: Активность а-амилазы определялась на ФЭК по
изменению йодной окраски крахмала методом Рухлядевой и Горячевой [74].
термостабильности молекулы. «Дополнительный» кальций,
обнаруженный для а-амилазы Вас. circulans 186, придает ей
большую устойчивость к высокой температуре. Установлена
зависимость между оптимальной температурой роста термофильных
и мезофильных бактерий и молекулярной массой а-амилаз,
выделенных из этих бактерий. Оказалось, что чем выше
температурный оптимум роста бактерий, тем ниже молекулярная масса
фермента, выделенного из них [54, 55, 29, 28].
Химический состав клеток термофилов также имеет
некоторые отличительные черты, способствующие устойчивости белков
к повышенной температуре и скорости размножения: высокое
содержание нуклеиновых кислот, кальция и калия, а также
связанной воды, и наоборот, относительно небольшое содержание
свободной воды и т. д. Кальций, например, играющий важную
роль в формировании третичной структуры металлоферментов,
по-видимому, наиболее прочно связан в молекуле а-амилазы
термофилов и тем самым обеспечивает ее исключительную
термостабильность.
Бактерии не образуют комплекса ферментов, например ами-
лолитического, гидролизующих один и тот же субстрат, поэтому
использование их в качестве продуцентов ферментов позволяет
получать препараты наиболее быстро, с высоким выходом
и в чистом виде.
Глюкоамилаза. В состав амилолитического комплекса
входит также глюкоамилаза (3.2.1.3; а-1,4-глюканглюкогидролаза),
отщепляющая, согласно новой номенклатуре, глюкозные
единицы от нередуцированного конца а-1,4-глюкозидных связей. При
гидролизе крахмала наряду с глюкозой могут образоваться
также и а-олигосахариды. Экспериментально установлено, что глю-
10»
147

60
40
го
а
V
5
Г
\
\
1
\
W 2,0 3
рн
коамилаза расщепляет также а-1,6-глюкозидные связи в
различных олиго- и полисахаридах [16, 154]. Поэтому для
глюкоамилазы предложено систематическое название а-1,4 : 1,6-глюкан-4 : 6-
глюкогидролаза [158].
Таким образом под рабочим названием глюкоамилазы
следует иметь в виду фермент, расщепляющий в крахмале и олиго-
сахаридах а-1,4- и а-1,6-глюкозидные связи. Однако оказалось,
что глюкоамилазы способны гидролизовать наряду с 1,4- и 1,6-
связями также и 1,2- и 1,3-связи [172, 173, 160, 168]. Тем самым
подтверждена возможность
гидролиза трегалозы (1,2-
связи) глюкоамилазой (рис.
41), а не собственной «тре-
галазой». При этом
зависимости между реакцией
среды и активностью глюко-
амилаз, а также
активностью амилазы, учитываемой
по гидролизу трегалозы,
идентичны.
Другие испытанные виды
плесневых грибов (Asp.
oryzae, Asp. niger, Rhizopus
jawanicus) не обладают
способностью гидролизовать
р-р-трегалозу. Таким
образом данные свойства
являются, по-видимому, отличительным характерным признаком са-
харогенной амилазы Asp. awamon l-B-42 [174].
Наряду с крахмалом глюкоамилаза способна полностью
расщеплять до глюкозы также гликоген, амилопектин, конечный
декстрин, изомальтозу и мальтозу [90, 17, 55, 18, 22, 1].
Глюкоамилазы микроскопических грибов родов Aspergillus и Rhizopus
обладают высокой стабильностью к Н+-ионам [72, 86, 89, 21].
Представляют интерес данные, подтверждающие наличие
в культуре Asp. awamon двух типов глюкоамилазы, различных
по устойчивости в кислой среде [171, 172]. Мутантная форма Asp.
awamori l-B-42, полученная облучением Со60, обладает
способностью к биосинтезу двух типов глюкоамилазы — более
устойчивой и менее устойчивой в кислой среде. Максимальное
количество глюкоамилазы образуется при рН 4,5—5,0. При этом из
общего количества фермента около 65% приходится на долю
кислотоустойчивой амилазы, а остальная часть (35%)—кис-
лотонеустойчивая, полностью инактивирующаяся в течение часа
при 30° С и рН 2,5.
В зависимости от кислотности питательной среды,
применяемой для культивирования мутанта, изменяется и соотношение
Рис. 41. Зависимость между рН
и активностью сахарогеиной амилазы
(/) и амилазы, гидролизующей тре-
галозу (2).
148

между кислотоустойчивой и некислотоустойчивой глюкоамила.
зой. Если рост культуры происходит в среде с рН 2,5, то
синтезируется только кислотоустойчивый фермент, сохраняющий
активность при выдержке в течение 48 ч; при выращивании
гриба в более щелочной среде (рН 6,0—6,5) образуется глюкоами-
лаза, которая инактивируется уже в течение часа. При
оптимальном значении рН среды синтезируются оба типа глюкоами-
лазы [173, 174].
С глюкоамилазой прочно связаны ферменты трансглюкози-
лазного действия. В культуре Asp. awamori обнаружены две
трансгликозилазные системы: одна система синтезирует из
мальтозы продукты с а-1,4-глюкозидными связями, другая — с а-1,6-
глюкозидными связями, причем первая из них полностью
инактивируется при рН 8,55.
р-Амилаза. Окончательно не доказано существование в
грибном амилолитическом комплексе р-амилазы, широко
распространенной в растениях и, в частности, в зерновом солоде. Как
известно, р-амилаза (3.2.1.2) расщепляет крахмал главным
образом до мальтозы и небольшого количества
высокомолекулярных декстринов, которые окрашиваются йодом в синий цвет.
В частности у гриба Asp. oryzae 3-9-15 не обнаружена р-амила-
за, характерная для высших растений [89].
Олиго-1,6-глюкозидаза (декстриназа) катализирует разрыв
а-1,6-связи в изомальтозе, панозе, конечных, или лимитдекстри-
нах. Из рода Aspergillus наиболее активными продуцентами
фермента являются Asp. awamori, Asp. oryzae, Asp. usamii [63,
74, 29]. В свое время этот фермент был получен в
кристаллическом виде [169], тем не менее его существование окончательно еще
не доказано [69, 70, 71, 85].
Многие виды плесневых грибов содержат истинную мальтазу
(3.2.1.20) a-D-глюкозид-глюкогидролазу. Этот фермент, подобно
глюкоамилазе, действует на мальтозу, но не гидролизует
крахмал [166, 122].Некоторые авторы считают, что мальтаза
проявляет еще и глюкозилтрансферазное действие, обладая
способностью переносить остатки глюкозида на сахара и спирты
[166, 155].
Итак, исключительно сложный комплекс амилолитических
ферментов обеспечивает гидролиз углеводов питательных сред,
метаболизм микроорганизмов и широко используется в
промышленном гидролизе крахмала [41, 111, 112, 124].
ПРОДУЦЕНТЫ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
Известны многие микроорганизмы, продуцирующие амилазу.
Наиболее часто как продуценты ферментов используются
плесневые грибы и бактерии. Эффективность использования
микроорганизмов в значительной степени определяется их выбором,
149

поскольку различные виды и даже штаммы одного и того же
микроорганизма продуцируют различные ферменты. Так,
например, отмечается, что из 278 проверенных видов Aspergillus лишь
34 продуцировали а-амилазу и мальтазу в достаточных
количествах; даже у одного вида Asp. oryzae отмечается широкое
варьирование ферментного спектра.
Наиболее широкое применение нашли ферменты амилолити-
ческого комплекса, продуцируемые микроскопическими грибами
родов Aspergillus, Rhizopus, Actinomyces, бактериями рода
Bacillus, а также дрожжеподобными микроорганизмами Endomy-
copsis и Endomyces [7, 12, 77, 15, 22, 24, 31, 62, 1, 5, 125, 120, 53].
Многие плесневые грибы (Asp. awamori, Asp. niger, Asp. usa-
mii, Rhizopus delemar, Rh. tonnensis, Rh. neveus, Rh. japonicum)
обеспечивают активный синтез не только а-амилазы, но и
глюкоамилазы [69, 86, 70, 108, 156]. Так, например, глюкоамилаза
гриба Rhizopus delemar расщепляет мальтозу на 100%, линейные
и разветвленные фракции кукурузного крахмала на 95—96%,
гликоген на 92%, остаточные а-декстрины на 89%. Во всех
случаях конечным продуктом гидролиза была глюкоза [156].
Фермент из Asp. awamori гидролизовал амилопектин на 88% до
глюкозы, гликоген и крахмал риса на 100% [178], а из Asp. niger
[130] и Asp. oryzae [100a] осахаривал крахмал до глюкозы на
80%- По характеру действия на крахмал глюкоамилазы
плесневых грибов делят на две группы: 1) типа Rhizopus delemar,
гидролизующая крахмал до глюкозы на 100% и 2) типа Asp. niger,
гидролизующая на 80% [120]. Ко второму типу глюкоамилазы
относят и фермент из гриба Asp. usamii [131].
Неполнота гидролиза крахмала еще не характеризует
свойства самих глюкоамилаз. Это результат трансглюкозилазного
действия ферментов, возможно, мальтазы, которая наряду
с мальтогидролизующей способностью обладает и
трансдействием. Высокоочищенная глюкоамилаза Asp. awamori, отделенная
от трансглюкозилаз, способна гидролизовать крахмал на 100%
[16]. За последнее время глюкоамилазы плесневых грибов и
прежде всего Asp. awamori и Rhizopus delemar подвергались
широким исследованиям [17, 69, 70, 88, 63, 64, 65, 1, 21].
Дрожжеподобный микроорганизм. Endomycopsis spezies
20—9 является активным продуцентом амилолитических
ферментов. Этот штамм синтезирует глюкоамилазу, а-амилазу, гли-
козилтрансферазу и инвертазу [34, 35, 9, 10, 36]. Глюкоамилаза
этого продуцента обладает широкой специфичностью действия,
она гидролизует а-1,4, а-1,2, а-1,6-связи и при 80% концентрации
глюкозы, используемой в качестве субстрата, может
катализировать реакцию образования изомальтозы. Гликозилтрансфераза
обладает гидролитическим действием на растворах мальтозы
и крахмала низкой концентрации и синтезирующим — при
действии на растворы высоких концентраций этих же субстратов.
150

Фермент обладает также способностью переносить глюкозиль-
ные остатки на воду, углеводы и глицерин [36]. Глюкоамилаза из
Endomyces spezies, отделенная от а-амилазы риванолом, гидро-
лизует крахмал с образованием только глюкозы [125].
С помощью комбинированного воздействия химических и
физических мутагенов получены новые мутанты аспергиллов,
активные по синтезу ферментов амилолитического комплекса. Так,
представляют интерес мутанты Asp. niger S, Asp. niger S-4, Asp.
niger S-4-10 [77], Asp. usamii 3758-45 [49, 42], Asp. batatae 217-61
[76], Asp. awamori 78-2 [8], Asp. oryzae 3-9-15 [14], И-475 и другие.
Известно большое количество бактерий, продуцирующих
амилазу. К наиболее активным из них следует отнести Вас. subtilis,
Вас. mesentericus, Вас. macerans, Phytomonas destructans, Bact
cassavanum, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas saccha-
rophila, Вас. polymyxa и др. Из мезофильных бактерий,
продуцирующих амилазу, наиболее изучена и находит исключительно
широкое применение Вас. subtilis. В Японии из культуры Вас.
subtilis получают десятки тысяч тонн препаратов ферментов
и прежде всего амилазы и протеиназы. Культура Вас. subtilis
является строго аэробным организмом с оптимальной
температурой роста 37° С.
Из термофильных бактерий в качестве наиболее активных
продуцентов амилазы следует отметить Вас. diastaticus, Вас.
stearothermophilus, Вас. coagulans. Заслуживает внимания об-
лигатный термофил Вас. circulans, выделенный из почвы [13].
Этот термофил с оптимумом роста 65—70° С наиболее энергично
образует амилазу все же при 50° С. Поэтому посевной материал
данной бактерии выращивают при 70° С, а накопление амилазы
проводят при 50° С, используя жидкую картофельную среду
с пептоном и мелом. Бактерии являются весьма активными
продуцентами ферментов и обладают большой скоростью роста.
Если, например, длительность роста плесневых грибов
составляет 48 ч и более, то мезофильных форм бактерий 24—36 ч,
а термофильных иногда всего 5—10 ч.
Из актиномицетов заслуживает внимания термофил Micro-
monospora vulgaris 42, образующий наряду с протеиназой и
другими ферментами активную а-амилазу, действие которой
проявляется при 65° С [48].
ВЛИЯНИЕ СОСТАВА СРЕДЫ НА БИОСИНТЕЗ ФЕРМЕНТОВ
Амилазы являются, как это отмечалось ранее,
индуцируемыми ферментами, поэтому культивирование
микроорганизмов— продуцентов амилаз осуществляют в среде, содержащей
специфический субстрат — крахмал, декстрины, мальтозу.
При росте микроорганизмов источником углерода должно
являться соединение, состоящее из остатков глюкозы, соединен-
151

ных между собой как 1,4-связями, так, вероятно, и 1,6-связями.
Кроме того высказаны предположения о механизме
образования индуцированных ферментов посредством их синтеза de
novo из свободных аминокислот, а не путем трансформации
белка-предшественника.
Некоторые бактериальные штаммы, включая и некоторые
виды Вас. subtilis {107] и Вас. stearothermophilus [176],
синтезируют амилазу во время экспоненциальной фазы роста,
следовательно, процессы синтеза амилазы и клеточного роста
осуществляются параллельно.
Влияние различных углеродсодержащих соединений на
образование а-амилазы указанным термофилом оценивалось
измерением различной скорости роста культуры и синтеза
внеклеточного фермента. При этом скорость роста определялась
константой (К), высчитанной по уравнению
dn/dt = КЯ,
где П — плотность культуры;
t — время, выраженное в часах.
Одновременно устанавливалась скорость синтеза фермента
(Ф); она выражалась формулой
d<t>/dll = к,
Следовательно накопление фермента находится в прямой
зависимости от увеличения биомассы, тем самым биосинтез
а-амилазы заканчивается в экспоненциальной фазе одновременно
с прекращением роста культуры и наступлением следующей,
стационарной, фазы развития [122, 107, 176]. Такая
закономерность отмечается и при выращивании термофила Вас.
stearothermophilus на минимальной питательной среде с добавлением
глюкозы (рис. 42).
Однако, по мнению других авторов, максимальное
образование амилазы происходит после того как клеточная популяция
бактериальных культур достигнет пика роста. В частности,
амилаза Bacillus subtilis образуется в культуре, закончившей или
заканчивающей рост. Ни в культуральной среде, ни в самих
клетках молодой культуры амилазу обнаружить не удалось.
Внеклеточная амилаза синтезируется в нестабильной,
переходящей к автолизу клетке. Синтез происходит, по-видимому, на
клеточной мембране или вблизи нее [146].
Около клеточной стенки локализуется лизирующий фермент,
который находится в неактивном состоянии до тех пор, пока не
образуется амилаза. С началом синтеза амилазы лизирующий
фермент активизируется и изменяет структуру клеточной стенки
до степени, обеспечивающей проникновение молекулы амилазы
в окружающую среду. В эту предавтолизную фазу роста
бактериальных клеток их необходимо стабилизировать, продлить та-
152

и
w
V
\0А
кое состояние и задержать автолиз. Такая стабилизация клеток
Вас. subtilis происходит за счет высокого осмотического
давления, создаваемого продуктами расщепления крахмала, высокие
концентрации которого, как известно, вызывают усиление
способности к биосинтезу амилазы. Рост Вас. subtilis на средах
с высокими концентрациями крахмала (до 10%) вызывает
значительное увеличение времени синтеза амилазы. Аналогичное
действие отмечается и в
опытах с высокими
концентрациями (до 15%) полиэтиленглико-
ля, который хотя и является
инертным веществом, однако,
как и крахмал, повышает
осмотическое давление в культу-
ральной среде и тем самым
обеспечивает увеличение
времени генерации вдвое и
удлинение лаг-периода.
Оказалось, что
внеклеточная амилаза синтезируется
постоянно и независимо от
внутриклеточной. Выделение
амилазы в культуральную
жидкость почти полностью
подавляется такими ингибиторами
метаболизма, как цианид, хло-
рамфеникол, стрептомицин,
толуол. В клетках,
предварительно лизированных лизоци-
мом, амилаза содержится в
незначительных количествах, которые не могут обеспечить
содержание высокоактивной внеклеточной амилазы.
Синтез а-амилазы начинается тогда, когда образование
клеточных белков уже закончено или почти закончено и
конкурирует с этим процессом. Так, например, внесение в среду
компонентов, стимулирующих образование клеточных белков (глюкозы,
смеси аминокислот), вызывает одновременно подавление
синтеза амилазы, однако это торможение частично снимается
аналогами аминокислот (этионин, 5-метилтриптофан, р-флюорофенил-
аланин, норлеицин), препятствующими образованию обычных
клеточных белков [146]. В то же время в синтезе амилазы
имеются стадии (в течение первых часов инкубации), в которых
свободные аминокислоты не участвуют. Например, этионин
подавляет на 40—60% включение 535-метионина в белки клеток,
не вызывая при этом подавления синтеза амилазы [98].
Таким образом отмечается корреляция между амилазообра-
зующей активностью и тенденцией к лизису клеток [146]. В эту
0,2
0,1
г
5 "
Рис. 42. Образование а-амилазы Вас.
stearothermophilus, растущей на
минимальной среде с глюкозой (0,5%):
/ — рост, 2 — а-амилаза
153

стационарную фазу роста приостанавливается развитие
микроорганизма и снижается окислительный метаболизм.
Высказывают предположение, что синтез внеклеточной амилазы и
образование лизирующих ферментов, катализирующих автолиз клеток,
являются независимыми процессами, обусловливающимися
условиями роста.
Влияние углеродного питания
Многие микроорганизмы и прежде всего плесневые грибы
могут использовать около 75 безазотистых соединений.
Наилучшими из них являются углеводы, многоатомные спирты и многие
органические кислоты. Важно подобрать источник углерода,
обеспечивающий не только хороший рост мицелия, но и высокое
накопление ферментов. Наилучшими индукторами для их
образования оказались крахмал, декстрины и мальтоза в
оптимальной концентрации (табл. 18).
Таблица 18
Влияние источников углерода на биосинтез амилолитических ферментов
грибом Asp. awamori [87]
(концентрация углерода составляет 6%; возраст культуры 72 ч)
Источиик углерода
Крахмал (контроль)
*= 3
щел1
ере;
О С\1
2,050
2,161
2,100
1,250
0,750
0,370
О
X
Л
«
а
л ь
X я
7,8
7,2
7,4
6,2
6,4
6,3
Актнвность. ед.
а-амилазы
на
100 мл
среды
30,0
27,0
10,0
10,5
6,5
20,0
на 1 г
сухого

мицелия
14,6
12,4
4,9
8,0
9,3
54,3
олиго-1.6-
глюкозидазы
на
100 мл
среды
1394,2
1107,0
338,0
586,5
416,0
410,0
на 1 г
сухого

мицелия
680
510,5
161,0
469,0
555,0
2189,0
глюкоамилазы
на
100 мл
среды
994,5
935,0
147,0
257,0
384,0
147,0
на 1 г
сухого

мицелия
485,0
432,0
170,0
104,0
512,0
408,3
Сахароза, фруктоза и глюкоза, как уже указывалось,
обеспечивают обильный рост гриба, но тормозят образование
ферментов; галактоза плохо усваивается грибом. На среде с
лактозой и маннитом отмечается слабый рост микроорганизма, но
активность а-амилазы была высокой, хотя и уступала
активности, получаемой на средах с индукторами.
При выращивании Asp. awamori поверхностным методом на
среде — заменителе пшеничных отрубей (84,4% березовых
опилок, 15% солодовых ростков и 0,6% азотнокислого аммония,
154

увлажненных до 65%) были испытаны различные источники
углерода — крахмал, декстрины, мальтоза, сахароза и другие.
Углеводы вносили из расчета 10% к массе воздушно-сухой
среды.
В зависимости от источника углерода интенсивность
биосинтеза ферментов на различных средах, по данным Григорова,
можно распределить в следующие убывающие ряды [12]:
1) для а-амилазы: крахмал > декстрины > мальтоза >
лактоза > глюкоза > сахароза > галактоза > маннит > араби-
ноза;
2) для олиго-1,6-глюкозидазы: крахмал > декстрины >
> мальтоза > сахароза > глюкоза > лактоза > галактоза >
> арабиноза > маннит;
3) для а-1,4-амилоглюкозидазы: крахмал > декстрины >
> мальтоза > сахароза > глюкоза > лактоза > арабиноза >
> галактоза > маннит.
Таким образом наилучшими источниками углерода
по-прежнему оказались крахмал, декстрины и мальтоза, причем на среде
с крахмалом Asp. awamori образует такое же количество
ферментов, как и на пшеничных отрубях. Максимальное накопление
«-амилазы наблюдается на среде с начальным значением рН 6,3;
кислая среда (начальный рН 3) благоприятствует синтезу оли-
го-1,6-глюкозидазы и а-1,4-амилоглюкозидазы. В среде с
начальным рН 7,4 биосинтез всех трех ферментов замедляется.
При трехсуточном глубинном культивировании Asp. awamori
образуется почти исключительно внеклеточная а-амилаза, тогда
как 25—30% глюкоамилазы локализуется в клетках мицелия,
а наибольшая часть ее (70—75%) выделяется в окружающую
среду [87]. Активность внеклеточной а-амилазы составляет 30—
36 ед., олиго-1,6-глюкозидазы 1394—1330 ед. и глюкоамилазы
994—1100 ед. на 100 мл питательной среды.
Концентрация крахмала в среде Чапека по-разному влияет
на синтез ферментов, входящих в амилолитический комплекс.
Для максимального образования олиго-1,6-глюкозидазы и
глюкоамилазы достаточно присутствия в среде 3% крахмала, а для
синтеза а-амилазы — 6% крахмала (рис.43).
Дрожжеподобный гриб Endomycopsis species 20-9 проявляет
наибольшую способность к синтезу внеклеточных амилолитиче-
ских ферментов также в средах, содержащих в качестве
источника углерода только крахмал, фосфодекстрины и пентозы
[75]. Оптимальная концентрация крахмала в среде при
глубинном культивировании гриба лежит в пределах 0,5—0,7%.
Исключительное действие на синтез ферментов оказывают
высокомолекулярные жирные кислоты: олеиновая, стеариновая
и миристиновая. Если стеариновая и особенно олеиновая
кислота стимулируют синтез глюкоамилазы в 2,5—3,5 раза, то
миристиновая, наоборот, репрессирует образование внеклеточного
155

фермента. Олеиновая кислота может быть использована в
качестве основного источника углерода, так как оптимальные среды
должны содержать ее в количестве 2—3%.
то
1800
то
я шо
1200 -
I
1000 - 300 ■
12 3 4 5
Содержание крахмала, %
Рис. 43. Влияние концентрации крахмала на
накопление внеклеточных ферментов при росте Asp. awamori:
1 — а-амилаза, 2 — глюкоамнлаза, 3 — олиго-1,6-глю-
козидаза.
При культивировании мутанта Asp. oryzae 3-9-15
синтезируется а-амилаза, активность которой достигает 300 ед/100 мл
(табл. 19).
Для обеспечения такой высокой активности а-амилазы
требуется присутствие в питательной среде 6% крахмала, тогда как
Таблица 19
Биосинтез амилолитических ферментов грибом Asp. oryzae 3-9-15 [15]
Источник углерода
Крахмал, %
6
4
2
1
Активность
ферментов, ед/100 мл
а-амилазы
300
220
110
70
олиго-1,6-
глюкози-
дазы
800
800
800
710
Источник углерода
Мука
кукурузная . .
пшеничная . . .
ржаная ....
Активность
ферментов, ед'100 мл
а-амилазы
250
250
300
Следы
ол нго-1,6 -
глюкоз и -
дазы
760
760
770
810
156

для образования активной олиго-1,6-глюкозидазы достаточно
2%. Биосинтез этого фермента интенсивно происходит даже
в среде из соевой муки, репрессирующие вещества которой
полностью подавляют образование а-амилазы.
В среде Чапека, оптимальной для образования амилолитиче-
ских ферментов, соотношение между крахмалом и азотнокислым
натрием составляет примерно 18 : 1.
Высокая активность внеклеточной амилазы получается при
росте Asp. oryzae 3-9-15 на кукурузной муке (табл. 20).
Питательная среда с 6%
Таблица 20
Образование амилазы грибом
Asp. oryzae 3-9-15 на среде
с кукурузной мукой [84]
Содержание
кукурузной
муки в среде,
/о
Активность
амнлазы,
«а:юо мл
рН среды
330
300
250
213
195
8,1
8,1
8,0
8,0
7,6
кукурузной муки не уступает
по ценности синтетической
среде с 6% крахмала. Если
естественная среда содержит
крахмала в полтора с лишним раза
меньше, чем синтетическая, то
наличие азотистых соединений
и, в частности, аминокислот,
компенсирует это и
обеспечивает интенсивный синтез ад-
амилазы.
Аэробные культуры Pullu-
laria pullulans,
синтезирующие в глубинных условиях
кислотоустойчивую амилазу,
также используют в качестве источника углерода крахмал
(нерастворимый или растворимый), декстрины или мальтозу, а в
качестве источника азота — аммонийные, нитритные соли или
кукурузную замочную воду, содержащую 0,05—0,2% азота. К среде
добавляют в качестве буферных веществ также 0,05—0,1 М
цитрата и 1—4 М фосфата; рН устанавливают в пределах 3,5—4,5.
Затем в такую среду вносят 0,5—2% посевной культуры [92].
Культуру Pullularia pullulans № 97 выращивали (в объеме 6 л)
при 28—29° С при аэрации воздухом 3 л/мин и перемешивании
со скоростью 130 об/мин.
В процессе культивирования рН среды изменяется через 48 ч
до 3,6, а через 72 ч— до 5,4. Максимальной величины
кислотоустойчивая амилаза достигала на третьи сутки.
Гриб Asp. niger 475 (ВНИИ сельскохозяйственной
микробиологии) образует только кислотоустойчивую а-амилазу. Другие
виды и штаммы черных аспергиллов образуют
кислотоустойчивую а-амилазу, входящую в состав амилолитического комплекса
ферментов [89], в небольших количествах; ее активность
составляет 15—23% от общей активности. Наибольшая активность
кислотоустойчивой а-амилазы обнаруживается при
культивировании гриба Asp. niger 475 на измененной среде Миноды,
содержащей экстракт солодовых ростков и MgS04 (0,05%)
157

[137]. При этом образуется только кислотоустойчивая а-амилаза
(0,38—0,57 ед/мл культуральной жидкости).
Наряду с крахмалом, декстринами и мальтозой в качестве
источника углерода эффективно используются также маннит,
манноза, глюкоза, инулин, ксилоза, лактоза, глицерин,
галактоза, лимоннокислый и уксуснокислый натрий [78]. На средах
с глюкозой, фруктозой и ксилозой амилолитическая активность
культуры значительно ниже [123, 87]. Щелочные соли
органических кислот (лактаты, малаты, сукцинаты и цитраты) могут
применяться лишь в небольших концентрациях, так как по мере их
потребления среда подщелачивается, но зато их с успехом
используют в средах, имеющих тенденцию к снижению рН в
процессе роста культуры. Из спиртов маннит является хорошим
источником углерода, сорбит менее эффективен. Не могут быть
единственным источником углерода этанол, гликоль, глицерин,
сорбит и инозит, но этанол и глицерин — хорошие
дополнительные источники. Отмытые клетки Вас. subtilis, перенесенные в
питательную среду с глицерином, имели 6-часовой лаг-период
с последующей индукцией амилазы крахмалом. Эти данные
подтверждают адаптивный характер амилазы. В то же время
незначительное увеличение синтеза амилазы при выдерживании
клеток на специфическом субстрате по сравнению с
неспецифическим позволяет, напротив, отнести этот фермент к числу
конститутивных.
Образование термостабильной а-амилазы Вас. stearothermo-
philus обеспечивается при использовании в качестве источника
углерода глицерина, глюкозы, сахарозы, мальтозы и крахмала.
При этих источниках углерода гидролизат казеина стимулирует
синтез фермента. Добавление гидролизата казеина или
витаминов к культуре само по себе не влияет на синтез амилазы.
Синтез а-амилазы начинается вскоре после добавления индуктора.
в отсутствии которого фермент синтезируется лишь в очень
небольшом количестве. Синтез отмытыми клетками не
индуцируется глюкозой, глицерином и сахарозой, хотя в опытах на
растущих культурах присутствие последней оказывало стимулирующее
действие [176]. Указанный продуцент обладает способностью
синтезировать только внеклеточную а-амилазу и в
экспоненциальной фазе роста.
На фоне естественных сред, например экстракта соевых
бобов, выбор источника углерода не имеет большого значения. Это
может быть крахмал, различные сахара и органические
кислоты, однако на средах с лактозой преимущественно
синтезируется амилаза, а на средах с глюкозой и сахарозой — протеиназа
[121].
Термофилы и, в частности, Вас. stearothermophilus
культивируют часто так же, как и мезофилы, на синтетической глюкозо-
минеральной среде с добавлением аминокислот и витаминов
158

в количестве, соответствующем 0,3% автолизата. Указанный
термофил на среде с крахмалом или мальтозой одновременно
хорошо осуществляет рост и синтез а-амилазы. Сахароза,
фруктоза, наоборот, обеспечивают только хороший рост термофила при
сильном репрессировании синтеза а-амилазы.
На глюкозо-минеральной среде с аминокислотами хорошо
растет и штамм Вас. coagulans, однако для каждого из них
обязательно присутствие в среде лишь нескольких определенных
аминокислот или витаминов [102, 103]. Например, облигатно
термофильная культура Вас. aerothermophilus и термотолерантная
форма Вас. coagulans испытывают особую нужду в аспарагине
(рис. 44) [59], который, возможно, используется как источник
углерода и источник азота.
Рис. 44. Интенсивность роста Вас. aerothermophilus (а) и Вас. coagulans (б)
на синтетической среде Ридер с добавлением отдельных аминокислот в
качестве источника азотного питания:
контрольные среды: КЛ — азот минеральный, КП — среда Ридер без азота, КШ —
добавлено 20 аминокислот, KIV — добавлено половинное количество аминокислот,
KV — среда с дрожжевым автолизатом; добавлено: / — аспарагин, 2 — глнцил +
+ глиции. 3 — пролнн, 4 — аргиннн, .5 — Р-феиил-а-алаини, 6 — валин, 7 — алаиин,
8 — лейцин, 9 — ориитнн, 10 — лизин, 11 — треоиии, 12 — метнонин, 13 — гистиднн,
14 — нзолейцнн, 15 — триптофан, 16 — цистеин, 17 — гликокол, 18 — иорлейцин, 19 —
серии, 20 — глютаминовая кислота.
Термофильная бактерия Вас. diastaticus, рост которой
обеспечивается при 60° С, осуществляет синтез а-амилазы на 5%-ном
картофельном отваре [24, 25]. Термофил обладает
исключительной быстротой роста — 3—5 ч и образует активную амилазу,
названную супербиолазой. Активность а-амилазы культуры,
полученной при росте термофила на среде со спиртовой бардой
(1,4%) и мукой (1,2%), соответствовала 450 е<?/100 мл [53, 57].
Актиномицеты, включая и термофилы, хорошо растут на
средах с крахмалом или глицерином [119, 27, 50, 60], тогда как на
средах, содержащих гексозы. пентозы, органические кислоты,
159

они не растут [26]. Глюкоза, например, подавляет как рост ак-
тиномицетов, так и синтез амилазы. Предполагают, что глюкоза
репрессирует синтез амилазы не непосредственно, а через
промежуточные продукты метаболизма, концентрация которых
превосходит возможности их использования анаболическими
реакциями [145, 114].
Итак, из современных теорий, объясняющих кинетические
зависимости синтеза ферментов микроорганизмами, наиболее
вероятными кажутся модели, в основе которых принимается
корреляция между удельной скоростью роста микроорганизма
и скоростью синтеза фермента. При этом имеется в виду два
типа зависимости между этими процессами. Один из них
сводится к тому, что скорость роста культуры точно соответствует
скорости биосинтеза ферментов. С другой стороны, наблюдается
«остаточный синтез» фермента, не связанный пропорционально
с ростом микроорганизма. Образование «дополнительного»
фермента, синтез которого осуществляется нестабильными,
переходящими к автолизу клетками, находится в зависимости, по
мнению многих авторов, от стабильности информационной или
матричной РНК (и-РНК). В настоящее время установлено, что
молекулы м-РНК даже одной и той же клетки, распадаются
с неодинаковой скоростью, т. е. имеют разное время жизни [162,
161, ПО, 111, 184, 99, 61]. В то же время на основании
экспериментально полученных данных показана прямая зависимость
биосинтеза ферментов, в частности а-амилазы, от стабильности
м-РНК- Таким образом возможность несовпадения фазы роста
микроорганизма с фазой биосинтеза фермента определяется
длительностью жизни м-РНК-
Клетки микроорганизмов могут синтезировать новые
ферменты сразу же после добавления в среду соответствующего
субстрата-индуктора, что можно объяснить наличием в клетке
генетической информации. В отсутствие того или иного субстрата
синтез ферментов, участвующих в его превращении,
репрессирован, так как микробная клетка не имеет ни времени, ни энергии,
чтобы создавать ферменты для тех биосинтетических процессов,
которые ей в данный момент не нужны. Индукция наблюдается
лишь на средах, не содержащих более легко усвояемых
источников углерода и энергии. Индуктор может одновременно
индуцировать синтез нескольких ферментов, причем количественное
образование их координировано [100а].
Влияние азотного питания
Для многих грибов — активных продуцентов амилолитичес-
ких ферментов — хорошим источником азотного питания
является азотнокислый натрий (0,91 %) - При содержании в среде
одновременно аммонийного и нитратного азота (NH4N03) плес-
160

невые грибы используют предпочтительно аммонийный азот [39].
Из восстановленных и окисленных форм азота на синтез а-ами-
лазы благоприятно действуют многие соли (табл. 21), однако
в наибольшей степени синтез активной амилазы обеспечивают
азотнокислый аммоний и нитрат натрия.
Таблица 21
Влияние источников азота на синтез амилазы Asp. oryzae 3-9-15 на среде
с кукурузной мукой [84]
Источи ик азота
NH4N03
NaN03
(NH4)2S04
Активность
ам плазы,
ев/100 мл
среды
400
360
278
Конечный
рн
7,6
7,9
7,3
Источник азота
KN03
MgN03
(NH4)2HP04
Активность
амилазы,
ед 100 мл
среды
255
255
Следы
Конечный
рн
7,3
7,4
5,5
На синтетической среде Чапека, содержащей азотнокислый
натрий, наблюдается значительно лучший рост гриба Asp. awa-
mori и более высокий синтез ферментов, чем в присутствии
других источников азота (табл. 22). Высокая активность ферментов
получается при культивировании гриба на среде, содержащей
0,2—0,3% азота, т. е. при значительном избытке его.
Таблица 22
Влияние источников азота на синтез ферментов грибом Asp. awamori [91]
Источник
NaN03
(NH4)2SO,
NH4NOa
0,3%*
0,2%
0,15%
0,10%
0,05%
Масса
сухого
мицелня,
г 100 1МЛ
1,76
2,16
1,55
1,20
1,27
1,34
1,31
1,00
Активность ферментов,
ед/100 ;мл среды
а-амилазы
23
45
Нет
23
30
13
Следы
0
олиго-1,6-
глюкози-
дазы
2240
1245
1110
3165
2489
1428
689
0
глюко-
амилазы
372
239
186
528
399
339
139
109
рН
5,2
6,1
4,6
5,6
5,8
5,4
4,2
3,8
По азоту.
Однако при росте гриба Asp. awamori наиболее активные
ферменты образуются на среде с азотнокислым натрием и
азотнокислым калием и при концентрации азота 0,15% [87]. На таких
1\ Заказ 7
161

средах активность а-амилазы достигает 26 ед., олиго-1,6-глюко-
зидазы 1142—1081 ед. на 100 мл среды. Концентрация азота
0,05% слишком низка для синтеза а-амилазы, но она
обеспечивает рост гриба. Увеличение концентрации азота в среде с 0,05
до 0,15% повышает активность всех амилолитических
ферментов, но в наибольшей степени — а-амилазы.
Максимальное образование глюкоамилазы, как и а-амилазы,
отмечается при высокой концентрации азота (0,25—0,40%). Все
аммонийные соли неорганических кислот как физиологически
кислые требовали нейтрализации освобождающейся кислоты, но
и при этих условиях они оказались хуже, чем азотнокислый
натрий или калий. Поэтому такие источники азота, как NH4CI,
NH4H2PO4, (NH4)2S04 не могут быть рекомендованы для полу-'
чения активных амилолитических ферментов.
Многие органические источники азота (желатин, казеин,
кукурузный экстракт) обеспечивают хороший рост Asp. awamori,
не усиливая синтеза амилолитических ферментов. Активность
а-амилазы, олиго-1,6-глюкозидазы и глюкоамилазы была ниже,
чем в контроле, в котором в качестве источника азота служил
азотнокислый натрий.
Таким образом полная замена азотнокислого натрия в среде
органическими азотсодержащими веществами не приводит к
повышенному образованию амилолитических ферментов. В то же
время установлено, что добавления экстракта из солодовых
ростков [14] или кукурузного экстракта, а также отдельных
аминокислот [46, 44, 45] повышает биосинтез внеклеточной
а-амилазы.
Влияние аминокислот. Хорошо известно, что аминокислоты
выполняют прежде всего специфические функции,
обеспечивающие биосинтез белков и белковых групп ферментов. В то же
время показано, что аминокислоты неодинаковы по питательной
ценности для микроорганизмов и что применение их в смеси
придает им новые качества [38, 39]. Смесь из двух аминокислот
обладает большей ценностью, чем одна аминокислота; смесь из
трех аминокислот лучше, чем из двух, и т. д.
Благоприятное действие аминокислот на физиологию
микроорганизмов объясняется, по-видимому, несколькими причинами.
Прежде всего установлена возможность прямой ассимиляции
аминокислот многими микроорганизмами [37, 38, 40]. Тем самым
они могут служить одновременно источником углерода, азота
и энергии. Такая возможность подтверждается также и тем, что
по степени окисленности аминокислоты занимают
промежуточное положение между углеводами и жирами. Кроме того
отдельные аминокислоты (глютаминовая, аспарагиновая и другие)
играют исключительную роль в аминокислотном обмене
и, в частности, в биосинтезе многих других аминокислот, в
процессе переаминирования. С помощью некоторых аминокислот,
162

и прежде всего аспарагиновой и глютаминовой, осуществляется
гетеротрофная ассимиляция СОг [97, 96].
Наряду со специфическими функциями аминокислоты
одновременно выполняют и другие неспецифические функции,
непосредственно не связанные с белковым обменом [73]. В частности,
многие аминокислоты входят в состав водорастворимых
витаминов: пантотеновой кислоты, биотина, фолиевой кислоты и
других, имеющих общебиологическое значение [100, 186, 52, 53, 41].
Замечено также, что синтез РНК в клетках некоторых
микроорганизмов зависит от наличия в культуральной среде
аминокислот. При подавлении синтеза белка хлорамфениколом даже
небольшого количества аминокислоты бывает достаточно для
того, чтобы усилить синтез РНК почти до максимальной
скорости. Это объясняется, вероятно, повышением внутриклеточного
фонда аминокислот в связи с торможением синтеза белка
[134,47].
Благоприятное действие на синтез глюкоамилазы и олиго-
1,6-глюкозидазы оказывает глютаминовая кислота,
дополнительно вносимая в питательную среду Чапека в количестве 0; 1—
0,16% [43, 39]. По своему стимулирующему действию
глютаминовая кислота оказалась, как уже отмечалось, равноценной
водной вытяжке из солодовых ростков. Активность многих
ферментов возрастает от глютаминовой кислоты как при
культивировании мутантов (Asp. awamori 78-2, Asp. awamori 224, Asp.
batatae 217-61), так и исходных штаммов Asp. awamori r и Asp.
batatae 3859. Вероятно, аминокислоты с помощью различных
механизмов принимают непосредственное участие в регуляции
обмена у микроорганизмов. Стимулирующее действие на рост
облигатно термофильной культуры Вас. aerothermophilus
оказывает добавление к синтетической среде Ридер нескольких
аминокислот одновременно: аспарагина в сочетании с аргинином,
р-фенил-се-аланином и пролином или аспарагина в смеси с
другими аминокислотами, а также в сочетании с некоторыми
витаминами (тиамином, пиридоксином, биотином) (рис. 45).
Указанные потребности термофильной культуры Вас. aerothermophilus,
а также термотолерантной формы Вас. coagulans не связаны
с температурой роста. Однако если различие в температуре
культивирования не оказывает воздействия на физиологию
питания термофилов, то на термостабильности продуцируемой при
этом амилазы оно сказывается очень сильно. Амилазы из
культур Вас. coagulans и Вас. stearothermophilus, выращенных при
температурах 35 и 55° С, проявляли термостабильность
по-разному. Если амилаза из культуры, росшей при 35° С, теряла за
1 ч инкубации при 90° С около 90—94% первоначальной
активности, то амилаза из культуры, росшей при 55° С, теряла при
этих же условиях всего 10—12% активности [103].
Как источник азотного питания пептон, аминокислоты и бел-
11*
163

ки лучше для роста бактерий и синтеза амилазы, чем соли
аммония, а нитраты и нитриты не могут быть использованы без
добавления других азотистых соединений [121]. Из аминокислот
хорошие результаты обеспечивают аспарагин, глютаминовая
кислота, D.L-серин, гистидин и аланин, однако при
использовании кислотного гидролизата казеина амилолитическая
активность культуры увеличивается вдвое. Благоприятное действие
2,0
1,9
1JB
V
U
{5
1,1
1,3
11
ъ
J о
о,з
0,1 У
о
ш
ш
i
I
1
$ $
к] ки т «г xi ' г з « 5
Рис. 45. Интенсивность роста
Вас. aerothermophilus (а) и
Вас. coagulans (б) при
одновременном внесении в среду
Ридер аминокислот и
витаминов:
контрольные среды: Kl — азот
минеральный, КП — без азота.
Kill — добавлено 20
аминокислот, KIV — добавлено 20
аминокислот в половинном количестве,
KV — среда с дрожжевым автоли-
затом; добавлено: / — аспарагин,
2 — аспарагин + пнридоксии, 3 —
аспарагин + аргинин + (5-фенил-
сс-алаиин + пролин + пиридок-
син + тиамин, 4 — аспарагин 4-
бнотнн 4- тиамин, 5 —
аспарагин + пролин + аргинин -f био-
тнн н- тимии.
оказывает дрожжевой ав-
толизат, который может
быть заменен
глициновыми пептидами [113].
Стимулирующий эффект этих
продуктов объясняется
тем, что в их присутствии
снижается тормозящее действие гистидина на рост
ультрафиолетового мутанта Вас. subtilis.
Из неорганических источников азота лучшим является
фосфат аммония; на среде с достаточным содержанием углерода он
равноценен таким солям, как лактат, цитрат, сукцинат и малат
аммония или глютаминовая кислота. Сульфат аммония и
хлористый аммоний физиологически кислые соли, однако могут
давать хорошие результаты при добавлении избытка фосфата
натрия. Мочевина не может быть единственным источником
азота, но вполне пригодна как дополнительный.
При замене минерального источника азота пептоном или гид-
ролизатом казеина образование глюкоамилазы тормозится. При
нейтрализации мелом среды, содержащей пептон, наблюдается
усиление биосинтеза а-амилазы, тогда как синтез глюкоамилазы
164

остается на том же уровне. Таким образом во всех вариантах
опытов органический источник азота заметно репрессирует
образование глюкоамилазы (табл. 23).
Таблица 23
Образование глюкоамилазы в культуре Asp. awamori на средах с различными
источниками азота [88J

Варианты
1
2
3
4
5
Источники азота
NaN03, 0,15%N
NH4H2P04, 0,3%N ....
Пептон, 0,05%N
Пептон, 0,15%N
Гидролизат казеина, 0,15%N
РН
исходный
5,6
5,2
6,2
5,7
2,5
конечный
8,0
2,8
6,3
4,2
2,3
Активность
внеклеточной
глюкоамилазы,
ед 100 и<->
8600
7800
3400
2800
500
Влияние минерального питания
Из неорганических компонентов в среде для выращивания
Вас. subtilis и других микроорганизмов с активной амилазой
должны присутствовать соли магния, фосфора, кальция, а также
следы марганца, цинка и других микроэлементов.
Добавление ионов магния частично восстанавливает
активность АТФ-азы, инактивированной нагреванием. Поэтому
предполагают, что ионы магния влияют на сохранение стабильности
фермента при нагревании.
Минеральный состав среды Чапека обеспечивает
интенсивный рост плесневых грибов и образование ими амилолитических
ферментов. Отсутствие в среде некоторых минеральных
элементов может вызвать резкое изменение обмена веществ в
культуре. Так, например, отсутствие сернокислого магния отрицательно
сказывается на синтезе всех амилолитических ферментов. При
этом синтез а-амилазы подавляется полностью, а количество
глюкоамилазы уменьшается в десятки раз [87]. Уменьшение
концентрации этой соли в среде уменьшает синтез ферментов. Для
образования а-амилазы и глюкоамилазы оптимальная
концентрация сернокислого магния должна составлять 0,05% [87].
Отсутствие в среде этой соли, а также фосфорнокислого калия
существенно не сказывается на образовании олиго-1,6-глюкози-
дазы [83, 91].
Синтезу амилазы способствует наличие анионов фосфорной
кислоты [123]. Фосфорнокислые соли употребляются обычно
в высоких концентрациях — до 0,15 М. Фосфор необходим для
биосинтеза не только важнейших составных частей
протоплазмы— нуклеиновых кислот, фосфолипидов — но и многих кофер-
ментов — аденозинфосфата, тиамина и одновременно для фос-
форилирования углеводов в процессе их биологического окисле-
165

ния. Фосфор непосредственно влияет на размножение плесневых
грибов и других микроорганизмов и тем самым обеспечивает
синтез амилолитических и других ферментов.
Относительно повышенная активность а-амилазы и олиго-
1,6-глюкозидазы наблюдается все же при 0,1% КН2Р04, а глю-
коамилазы — при 0,2%. Исключение других солей из среды
Чапека не оказывает такого резкого влияния на активность
амилолитических ферментов. В то же время отмечается, что
оптимальная концентрация КС1 для синтеза а-амилазы
соответствует 0,05%, а для образования олиго-1,6-глюкозидазы—0,15%.
Известно, что а-амилазы относятся к истинным металлофер-
ментам, в состав белка которых входит кальций. В частности,
на моль а-амилазы Asp. oryzae приходится 10 г атомов кальция
[54], а Вас. subtilis — четыре [126, 163]. Характер каталитической
активности а-амилазы в процессе полного освобождения
молекулы фермента от ионов кальция показывает, что удаление
последнего атома металла приводит как к инактивации, так и к
денатурации фермента. Поэтому в основе механизма кислотной
инактивации а-амилазы лежит реакция вытеснения из белковой
глобулы фермента ионов Са2+ ионами водорода среды. Это было
показано при инактивации а-амилазы солода [19] и гриба Asp.
awamori [20, 22, 21]. Если при рН > 4,5 кислотная инактивация
а-амилазы определяется исключительно вытеснением Са2+-ионов
Н+-ионами, то при более низких рН наряду с реакцией
вытеснения ионов кальция проявляется также прямое действие Н+-ионов
на белок а-амилазы. Добавление кальция в виде СаСЬ к а-ами-
лазе, частично обедненной ионами этого металла, т. е.
содержащей 1 г-атом кальция на моль белка, придает энзиму
устойчивость к действию повышенных температур [326]. Следовательно
кальций необходим не только для образования активной и
устойчивой а-амилазы, но и для защиты ее от протеиназы [126].
Сера входит в состав важных аминокислот: метионина, цис-
теина, цистина — и стимулирует образование амилазы.
Содержание 0,04 г серы на 100 мл среды обеспечивает максимальное
накопление фермента грибом Asp. oryzae 3-9-15. Активность
амилазы при этом достигала 300—350 ед/100 мл. При снижении
концентрации серы до 0,004% активность амилазы уменьшается
вдвое — до 180 е5/100 мл. Источником серы могут служить
сернокислые соли многих металлов, кроме меди. Наилучшим
источником является аминокислота метионин, в присутствии которой
синтез амилазы происходит значительно быстрее, чем с
сернокислым магнием.
Ионы многих других элементов: цинка, кадмия и никеля —
ускоряют действие ферментов, играющих важную роль в
углеводном обмене.
Наряду с кальцием в молекуле а-амилазы Вас. subtilis
содержатся также и ионы цинка в количестве 0,6 г-спома на моль бел-
166

ка. Сравнение величин константы седиментации до и после
обработки хелатами привело к заключению, что присутствие цинка
вызывает димеризацию молекулы а-амилазы Вас. subtilis.
Схематично димеризация представляется так:
Zn2+
(белок — Сах) — Zn — (белок — Сах) г^ 2 (белок — Сах).
хелатные [164]
агенты
Наличие цинка — отличительная черта амилазы Вас. subtilis.
Ни одна из других известных а-амилаз цинка не содержит. По-
видимому, он играет какую-то роль в образовании ферментно-
субстратного комплекса, т. е. в начальной стадии
ферментативной реакции. Было показано, что цинк не предохраняет амилазу,
как кальций, от воздействия протеазы и не влияет на активность
ферментов. В то же время равновесие мономередимер зависит
от концентраций мономера и цинка, молярного соотношения
цинка и амилазы, ионной силы раствора и рН [183, 129].
Присоединение цинка, вероятно, происходит с помощью
гистидиновых остатков. Из 12 гистидиновых остатков лишь 2 могут
располагаться на поверхности молекулы амилазы и, образуя
внутрикомплексные соединения с ионом цинка, обусловливать
ассоциацию белка.
Микроэлементы, необходимые живым организмам в малых
количествах, играют важную роль в размножении и
жизнедеятельности плесневых грибов. Медь, молибден, цинк, бор,
марганец, железо, кобальт, йод, селен, ванадий повышают активность
многих ферментов и ферментных систем живых организмов.
Ферменты образуют с микроэлементами различные металлоор-
ганические и внутрикомплексные соединения и взаимодействуют
с их ионами, образуя непрочные комплексы, в которых ионы
микроэлементов участвуют в процессах переноса электронов
и в окислительно-восстановительных реакциях, либо служат
промежуточным звеном между ферментом и субстратом, на который
воздействует данный фермент. Входя в состав многих
ферментов, они являются их активаторами. Несмотря на малое
содержание микроэлемента в клетке, роль его в жизнедеятельности
микроорганизма исключительно высока. Так, в клетке
содержится около 50 млрд. молекул белка и несколько атомов кобальта.
Содержание кобальта в клетке может понизиться до 1 атома, но
организм будет жить, тогда как клетка, не содержащая
кобальта, погибнет [67].
При составлении синтетических сред часто используется
дрожжевой экстракт [123, 81]. Среды для выращивания Вас.
subtilis должны иметь реакцию, близкую к нейтральной. Среда
должна быть составлена так, чтобы во время роста культуры рН
культуральной жидкости мог изменяться лишь незначительно.
167

Часто используется соевая среда Номура, содержащая в
качестве основных компонентов щелочной экстракт соевых бобов:
крахмал и двузамещенный фосфат аммония. Существенными для
синтеза амилазы компонентами среды Номура являются соевый
экстракт и крахмал в количестве 8% [136].
На выход амилолитических ферментов влияют не только
выбор субстрата, и в частности источников азота и углерода, но
и условия культивирования. Доказана возможность
использования различных условий культивирования одних и тех же
микроорганизмов в промышленном масштабе для получения
препаратов с различным соотношением ферментов. Так, например, Вас.
subtilis можно использовать для продуцирования
преимущественно амилолитического или преимущественно протеолитического
комплекса ферментов. Для получения оптимального выхода
фермента необходимо осуществлять селекцию, поддерживать
определенные штаммы и стандартизовать условия культивирования.
Поскольку большинство микроорганизмов, используемых при
производстве ферментов, относится к облигатным аэробам, то
обычно производство грибной и бактериальной амилазы
проводится в аппаратах, позволяющих вести процесс при интенсивной
аэрации среды. При этом особое внимание обращается на
предупреждение инфекции [7, 39, 80а, 92а].
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ К ГЛАВЕ V
1. Азарова Г. Г. Исследования по получению амилаз Rhizopus dele-
mar В и их применению в производстве крахмалопродуктов. Диссертация.
Воронежский технологический институт. Воронеж, 1971.
2. Александров В. Я. «Природа», № 3, 2, 1968.
3. Андеркофлер Л. А., Хиккей Дж. Бродильные производства. '
Т. 1. Пищепромиздат, 1959.
4. Б е к к е р 3. Э. Физиология грибов и их практическое использование.
Изд. МГУ, 1963.
5. В о й и о Л. И. Образование амилолитических и протеолитических
ферментов грибом Aspergillus oryzae 8F при поверхностном и глубинном
культивировании. Диссертация. Московский технологический институт пищевой
промышленности, 1970.
6. Боярская Б. Г. Известия АН СССР. Серия биологическая. № 1—2.
49 1942
7.'В я тки и В. В. Труды ВНИИСПа. Вып. III, 1954; Сб. «Непрерывное
брожение и выращивание микроорганизмов». Пищепромиздат, 1960.
8. Г е н д и н а СБ. Труды Московского общества испытателей
природы. Т. XXII. Отдел биологический. Секция генетики, 1966; Труды ВНИИФСа.
Вып. XVIII. 178, 1967.
9. Грачева И. М., Кольцова Э. В., 3 о т о в а Н. Б.
«Микробиологическая промышленность». № 8, 1971.
10. Грачева И. М., С адов а А. И. и др. «Прикладная биохимия
и микробиология». Т. 6. Вып. 5, 1970.
11. Гребешова Р. Н., Тулькес С. Г. Труды Московского
общества испытателей природы. Отдел биологический. Секция генетики, 1966.
12. Григорьев В. С. «Прикладная биохимия и микробиология». Т. IV.
Вып. 4. 384, 1968.
168

13. Гужева Э. П., Логинова Л. Г. «Микробиология». Т. XXXV.
Вып. 3. 427, 1966.
14. Д в а д ц ат ов а Е. А. Сб. «Внедрение ферментных препаратов в
народное хозяйство». ЦИНТИпищепром, 1961.
15. Д в а д ц а то в а Е. А. и др. Труды ВНИИ ферментной и спиртовой
промышленности. Вып. XVII. 3, 1967.
16. Добролинская Г. М. Глюкоамилаза плесневого гриба Aspergillus
awamori. Диссертация. Московский технологический институт пищевой
промышленности, 1965.
17. Д о б р о л и н с к а я Г. М., Родзевич В. И. «Ферментная и
спиртовая промышленность». 1964, № 7.
18. Е р м о ш и н а Г. К. Изучение кислотоустойчивости и действия а-ами-
лазы аспергиллов. Автореферат диссертации. Институт биохимии им. А. Н.
Баха АН СССР, 1970.
19. Жеребцов Н. А. «Известия вузов СССР». Пищевая технология.
№ 4, 55, 1964; «Прикладная биохимия и микробиология». Т. I. 274, 1965.
20. Жеребцов Н. А. «Прикладная биохимия и микробиология». Т. IV..
Вып. 2. 174, 1968.
21. Жеребцов Н. А. Исследование механизма кислотной инактивации
амилаз солода и плесневых грибов рода Aspergillus. Диссертация.
Воронежский государственный университет. Воронеж, 1971.
22. Ж е р е б ц о в Н. А., П а н к р а т о в А. Я. «Ферментная и спиртовая
промышленность». 1967, № 7, 30.
23. И м ш е н е ц к и й А. А. Микробиологические процессы при высоких
температурах. М.— Л. Изд-во АН СССР, 1944.
24. Имшеиецкий А. А., Солнцева Л. И., Броцкая С. 3.
«Текстильная промышленность». 1943, № 11 —12, 11.
25. И м ш е н е ц к и й А. А., Солнцева Л. И. «Микробиология».
Т. XIII. Вып. 54, 1944.
26. Калакуцкий Л. В. «Микробиология». Т. XXVIII. Вып. 5. 655,
1959.
27. Калакуцкий Л. В. «Микробиология». Т. XXXIII. Вып. 5, 858,
1964.
28. Карпухина С. Я. Исследование особенностей строения а-амилазы
термофильных и мезофильных бактерий. Автореферат канд. дисс. Московский
технологический институт пищевой промышленности, 1970.
29. К а р п у х и н а С. Я., С о с ф е н о в Н. И. ДАН СССР. Т. 175. 3. 723,
1967.
30. К в а с н и к о в Е. И. и др. IX Международный конгресс по
микробиологии. Тезисы докладов. М. Изд-во «Медицина», 1966.
31. Кислухина О. В. «Прикладная биохимия и микробиология». Т. I,
278, 1965; там же, т. II, вып. 1, 58, 1966; там же, т. II, вып. 5, 544, 1966; там
же, т. IV, вып. 2, 1968.
32. К н и н Э. Амилазы, их свойства и производство. Химия и технология
крахмала. Сб. статей под редакцией Рольфа В., Керра, Пищепромиздат, 1956.
33. Колчинська И. Д., М е д в и н с ь к а Л. Ю,, "Пньянова Н. 3.
«Микробиологичний журнал». Т. 26. № 4. 29, 1964.
34. К о л ь ц о в а Э. В., С а до в а А. И. «Прикладная биохимия и
микробиология». Т. 6. Вып. 1, 1970.
35. Кольцова Э. В., Веселое И. Я., Грачева И. М.,
Седова А. И. Тезисы докладов на 4-м Всесоюзном микробиологическом съезде.
Минск, 1971.
36. К о л ь ц о в а Э. В. Исследование условий выделения и очистки глю-
коамилазы из культуральной жидкости Endomycopsis sp. 20-9. Диссертация.
Московский технологический институт пищевой промышленности, 1971.
37. Коновалов С. А. «Микробиология». Т. XXI. Вып. 3, 1952; там же,
т. XVIII, вып. 3, 1949.
38. К о н о в а л о в С. А. Биохимия дрожжей. Пищепромиздат, 1962.
169

39. Коновалов С. А. Применение ферментов микробного
происхождения в спиртовой промышленности. ЦИНТИпищепром, 1964.
40. Коновалов С. А. Биохимия бродильных производств. Изд-во
«Пищевая промышленность», 1967.
41. Коновалов С. А. Основы физиологии питания дрожжей.
ЦИНТИпищепром, 1970.
42. Коновалов С. А., Котов В. Б. Селекция микроорганизмов —
продуцентов ферментов. Изд. СОНТИмикробиопром, 1970.
43. Коновалов С. А., Шахова Т. В. Труды ВНИИФСа. Вып. XV,
1965.
44. Коновалов С. А., Ш а х о в а Т. В. и др. Труды ВНИИФСа.
Вып. XVII, 1967.
45. Коновалов С. А., Ш а х о в а Т. В. и др. «Прикладная биохимия
и микробиология». Т. III. 401, 1967.
46. Коновалов С. А., Котов В. Б. и др. IX Международный
конгресс по микробиологии. Тезисы докладов. М. Изд-во «Медицина», 1966.
47. Коновалов С. А., Д о р о х о в В. В. ДАН СССР. Т. 186. № 1,
1969.
48. Коновалов С. А., Д о р о х о в В. В., Сологуб В. П.,
Логинов а Л. Г. «Микробиологическая промышленность». Вып. 5, 1971.
49. Котов В. Б. Экспериментальная изменчивость микроорганизмов —
продуцентов ферментов и антибиотиков. ЦИНТИпищепром, 1966.
50. Красильников Н. А., Кореняко А. И., Никитина Н. И.
Труда Института микробиологии АН СССР. Вып. 8. 56, 1960.
51. Куранова И. П., К а р п у х и н а С. Я. и др. «Микробиология».
Т. XXXV. Вып. 3, 1966.
52. Логинова Л. Г., Верховцева М. И. «Микробиология».
Т. XXXII. Вып. 2. 216, 1963.
53. Л о г и н о в а Л. Г., Г о л о в а ч е в а Р. С, Е г о р о в а Л. А. Жизнь
микроорганизмов при высоких температурах. М. Изд-во «Наука», 1966.
54. Л о г и н о в а Л. Г., К а р п у х и и а С. Я., Гужова Э. П.
«Известия АН СССР». Б. 4. 595, 1967.
55. Логинова Л. Г., К а р п у х и н а С. Я. ДАН СССР. Т. 180. № 1,
1968.
56. М а к с и м о в а В. П. Изучение свойств препаратов амилазы
различного происхождения. Диссертация. Институт экспериментальной ботаники.
Минск, 1968.
57. М а к с и м о в а Е. А. и др. «Прикладная биохимия и микробиология».
Т. IV. Вып. 4. 373, 1968.
58. М о л о д о в а Г. А. Выделение а-амилазы Asp. oryzae и изучение ее
структурных и функциональных особенностей. Диссертация. Московский
технологический институт пищевой промышленности, 1966.
59. Найденова Л. П. «Микробиология». Т. XXXIV. Вып. 3. 424, 1965.
60. Н и к и т и н а Н. И., К о р е н я к о А. И., Красильников Н. А.
Труды Института микробиологии АН СССР. Вып. 8, 1960.
61. О в ч и н н и ко в Л. П. «Успехи биологической химии». Т. 9, 1968.
62. Панкратов А. Я., К и р с а н о в А. В. «Ферментная и спиртовая
промышленность». 1969, № 2.
63. П а н к р а т о в А. Я., А з а р о в а Г. Г. Научно-техническая
информация (спиртовая, ликеро-водочная промышленность). Вып. 2,
ЦИНТИпищепром, 1969.
64. П а н о в В. П. Выращивание плесневого гриба Rhizopus delemar
глубинным способом и изучение некоторых свойств его амилолитическнх
ферментов. Диссертация. Саратовский государственный университет им.
Чернышевского. Саратов, 1970.
65. П а н о в В. П., Кирсанов А. В. и др. «Микробиология».
Т. XXXIX. Вып. 5, 1970.
170

66. П е й в е Я. В. Микроэлементы и ферменты. Изд-во АН Латвийской
ССР. Рига, 1960.
67. П у р м а л ь А. П. Биологические катализаторы. М. Изд-во «Знание»,
1.963.
68. Р а х л е е в а Е. Е. Сб. «Внедрение ферментных препаратов в
народное хозяйство». ЦИНТИпищепром. Ч. II, 167, 1961.
69. Р о д з е в и ч В. И., Б у т о в а С. Н. Труды ВНИИ ферментной
и спиртовой промышленности. Вып. XVI. 10, 1965.
70. Родзевич В. И., Добролинская Г. М. «Пищевая
промышленность». ЦИНТИпищепром. № 2. 7, 1963.
71. Родзевич В. И., Добролинская Г. М. «Ферментная и
спиртовая промышленность». 1966, № 2 и 5.
72. Р о з е н т а л ь Е. Л., П о п о в а И. А. «Успехи биологической хч-
мии». Т. 7. 210, 1965.
73. Рубан Е. Л. «Успехи микробиологии». № 2, 1965.
74. Р у х л я д е в а А. П., Г о р я ч е в а М. Г. и др. Труды ВНИИ
ферментной и спиртовой промышленности. Вып. XVII. 107, 1967.
75. С а до в а А. И. Образование амилолитических ферментов
дрожжами. Автореферат канд. дисс. Московский технологический институт пищевой
промышленности, 1970.
76. С и л и щ е н с к а я О. М. Труды Московского общества испытателей
природы. Т. XXII. Отдел биологический. Секция генетики, 1966.
77. Станьков X. 3. Труды ЦНИИСПа. Вып. VI. 117, 1958; вып. VII,
63, 1959.
78. Т и х о м и р о в а А. С. Сб. «Внедрение ферментных препаратов в
народное хозяйство». ЦИНТИпищепром. Ч. I. 187, 1961.
79. Т у к а ч и н с к и й С. Е. Материалы научной сессии Ленинградского
научно-исследовательского института гематологии и переливания крови.
Ленинград, 1967.
80. Улезло И. В., П а л и ц и н И. П. Сб. «Внедрение ферментных
препаратов в народное хозяйство». ЦИНТИпищепром. Ч. 1. 189, 1961.
80а. Уэбб Ф. Биохимическая технология и микробиологический синтез.
М. Изд-во «Медицина», 1969.
81. Фениксов а Р. В., Тихомирова А. С. «Микробиология».
Т. XXIX. Вып. 6, 1960.
82. Фениксова Р. В., Тихомирова А. С, Рахлеева Е. Е.
«Микробиология». Т. XXIX. Вып. 5. 745, 1960.
83. Фениксова Р. В., Двадцатой а Е. А. ДАН СССР. Т. 128. № 5.
1066, 1959.
84. Фениксова Р. В., Двадцатова Е. А. Труды ВНИИФСа.
Вып. IX. 3, 1960.
85. Ф е и и к с о в а Р. В., М о л о д о в а Г. А. «Микробиология». Т. XXX.
Вып. 3. 543, вып. 4, 607, 1961.
86. Фениксова Р. В., Р ы ж а к о в а В. Г. «Прикладная биохимия
и микробиология». Т. II. Вып. 2. 144, 1966.
87. Фениксова Р. В., М у с а е в а Т. И. Труды ВНИИФСа. Вып. XVII.
6, 1967.
88. Фениксова Р. В., Р ы ж а к о в а В. Г. «Прикладная биохимия
и микробиология». Т. IV. Вып. 2. 167, 1968.
89. Ф е н и к с о в а Р. В., Е р м о ш и и а Г. К. «Прикладная биохимия
и микробиология». Т. VI. Вып. 1. 58, 1970; там же, вып. 2, 168, 1970.
90. Фогель Г. В кн.: «Химические основы наследственности». М. ИЛ,
1960.
90а. Цыперович А. С, Перевозченко И. И. Украинский
биохимический журнал. 1970, № 4, 42.
91. Шилова А. А. Труды ВНИИФСа. Вып. XVII. 27, 1967.
92. Ям а д а - X им рон а ми. Яп. патент. Кл. 36 В 1, № 11046.
92а. Я ровен ко В. Л., К а л у н я н ц К. А., Голгер Л. И. Производ-
171

ство ферментных препаратов из грибов и бактерий. Изд-во «Пищевая
промышленность», 1970.
93 Akabori S., Ikenaka J., Hagichara B. J. Biochem., 41, 557,
1954.
94 Akabori S, Okada et al. J. Biochem. v. 43, 6, 741, 1956.
95 AnbarM., Levitzi A. Radiat. Res., v. 27, 1, 32, 1966.
96 Arai M., Ко у апо Т. et al. J. Agr. Biol. Chem., 32, 507, 1968.
97 Bachanan В. В., Pine L. J. Bacteriol., 89, 3, 723, 1965.
98. Bernfeld P. Adv. Enzymol. Rel. Sybje. Biochem., 12, 380, 1951.
99. В res ni с К-, Wi 1 1 i a ms S„ Mosse H. Information Exchange-
Group. 7, Scient. Mem., 72, 1966.
100. Brown G., Reynold E. Annual. Rew. Biochim. 32, 419, 1963.
100a. В u 11 i n G. С. г. Acad. Sci., 255, 1233, 1962.
101. CaldwellM. I., Dikeys S. et al. J. Amer. chem. Soc, v. 76, 1,
143, 1954
102. Campbell L. L., W i 1 1 i a m s О. В. J. Bacteriol., v. 65, 2, 141, 1953.
103. Campbell L. L. J. Bacteriol., v. 68, 505, 1954; J. Amer. Chem. Soc.
v. 70, 5256, 1954; Arch. Biochem. u. Biophys. v. 54, 154, 1955.
104. Campbell L. L. et al. J. Biol. chom. v. 236, N 11, 2962, 1961; там
же, 236, 2966, 1961.
105. Campbell L. L, Manning G. B. J. Biol. Chem., v. 236, N 11,
2962, 1961.
106. С a z z u 1 о J. J., S t о p a n i A. O. Biochim. et biophvs. acta, 10, N 1,
276, 1965.
107. Coleman G., E 11 i о t W. H. Biochim. J., 83, 256, 1962.
108. Corman J., Lanaluke A. Cereal Chem., v. 25, 190, 1948.
109. Csanyi V. Inform. Exchange Group. 7, Scient. Mem., N 592, 1966.
110. Csanyi V., L а с о b i G., Straub F. Inform. Exchange Group.
N 586, Scient., 1966.
111. Csanyi V. et al. Biochim. et biophys. acta, 145, 470, 1967.
112. Daiwa Kasei (фирма). Research Laboratory, 1957; Technical
Bulletin, N 8.
113. Demain A. L., H e n d 1 i n D. J. Bacteriol. v. 75, N 1, 46, 1958.
114. Dickie N., Liener J. E. Biochim. et Biophys. acta, 64, 41, 1962.
115. Fergus C. L. Can. J. Microbiol., 12, 1067, 1966.
116. Fischer E. H., S u m m e w e 1 1 W. N. et al., 1960. Proc. Intern,
congress. Biochem. 4th. Wienna, v. 8, N 4, 124, 1958.
117. Fischer E. H., Stein E. A. B-Amylases, Enzymes, 4, 313, 1960.
119. Fr adman Т., Gottlieb D. J. Bacteriol., 56, 107, 1948.
120. Fukumoto J. Sci. und Ind. (Japan) v. 36, N 11, 435, 1962.
121. Fukumoto J., Jamamoto T. et al. Proc. internat. symp. on
enzyme. Chemistry. Tokyo—Kyoto, 479, 1957.
122. Greenwood С. Т. Food Technology, v. 18, N 5, 283, 1964.
123. Hagihara B. Ann. report of scientific Works Fac. of science. Osaka,
V. 2, 35, 1954.
124. Hagihara В., N a k а у a m a T. et al. J. Biochem. v. 43, N 4, 469,
1956.
125. Hattory J. Agric. and Biol. Chem. v. 25. N 10, 737, 1961.
126. Hsiu J., Fischer E. H., S t e i n E. A. Biochemistry, v. 3, N 1, 61,
1964.
127. Lacob F., Monod J. Cold Spring Harber Sympos. Quant. Biol., 26,
157, 1961; 26, 193, 1961.
128. К a k i u с h i K. J- Phys. Chem., v. 69, 1829, 1965.
129. Kakiuchi К et al. J. Biochim. v. 55, N 2, 102, 1964; v. 57, N 2,
167, 1965
130. Kerr R. W. et al. J. Am. Chem. Soc, v. 73, N 95, 3916, 1951.
131. Kitahara К J- Fermentation Assoc, v. 13, 50—57, 1955.
132. Kitahara К, К u r u s h i m a M. J. Ferment. Technol., 27, 6, 1949.
172

133. Kumiyama H., Hukinbara Т., Т е г п i G. Presented at the
annual meeting of the Society of Fermentation Technol, Osaca, 11, 1964.
134 Kurland C. G., M a a 1 о e O. J. Molec. Biol., 4, N 3, 193, 1962.
135. Manning G. b., С a m p b e 11 L. L. J. Biol. Chem., 236, 2952, 1961;
236, N 11, 2958, 1961.
136. Mazza L. A., F e r n a n d e z R. Obtention de amilasa bacteriana en
proceso sumergido. Jon, v. 26, N 297, 181, 1966.
137. Minoda I., Tsukamoto J. Nippon Uogei Kagaku Kaishi, 35, 4,
1961.
138. Minoda, Jamada K- Agric. and Biol. Chem., 27, 806, 1963.
139. Minoda I. Koyano T. et al. J. Agr. Biol. Chem., 32, 104, 1968.
140. Minoda I. A r a i M. et al. J. Biol. Chem., 32, 110, 1968.
141. Miyagaw K-, Sannoe K-, Susuki K. Arch. Biochem. Biophys.,
v. 110, N 3, 432, 1965.
142. Moro M., Pomerany J., Shellbenberger J. Cereal
Chemistry, v. 40, N 4, 442, 1963.
143. Mori t a J., Shimizu K., Oh с a M., Korenaga T. Agr. Biol.
Chem., 30, N 2, 114, 1966.
144. Muss J. J. Amer. Soc, v. 76, N 20, 5163, 1954.
145. Neihardt F. C, M a g a s a n i к К. В. Nature, N4537, 178,801,
1956.
146. Nomura M. et al. J. Biochem. v. 43, N 2, 123, 1958.
147. Nomura M., Ioshikawa H. Biochim. Biophys. acta, v. 31, 125,
1959.
148. Okazaki H. J. Agric. Chem. Soc. Japan, 24, 88, 1950.
149. Okazaki H. Arch. Biochem. Biophys., v. N 63, 322, 1956.
150. Ono S., Hiromi K., Zinbo M. J. Biochem., 55, 315, 1964.
151. О n о n с К, О к a d a I., 1 a m a m i r a J. J. Biochem., v. 51.
152. Pan S. C, Nicholson L. W. Arch. Biochem. Biophys., v. 42, N 2,
421, 1953.
153. Pardee А. В. В кн.: The Molecular of Cellular Activiti. N. Y. Mc.
Graw—Hill, 1962.
154. P a z u r J. H., A n d о Т. J. Biol. Chem., vol. 235, 297, 1960.
155. Pazur J. H., An do T. Arch. Biochem. Biophys., v. 93, p. 43, 1961.
156. Phillips Z. Z., Calwell M. Z. J. Am. Chem. Soc. v. 73, 3559,
1951.
157. P о 1 1 о k M. R, Richmond M. N. Nature, 194, 446, 1962.
158. Pomerany J. Biochim. Biophys. acta, v. 77, N 3, 451, 1963; J. Food
Science, v. 28, N 2, 149, 1963.
159. Robyt Т., French D. Arch. Biochem. Biophys., 100, 451, 1963.
160. Sawasaki T. Reports Inst. Phys. Chem. Res., 36, 590, 1960.
161. Schaechter M. et al. J. Molec. Biol., 12, 119, 1965.
162. Soeiro R. et al. J. Biol. Chem., 241, 3525, 1966.
163. Stein E. A. Feder. Proc, v. 16, N 1, part 1, 254, 1957.
164. Stein E. A., Fischer E. H. J. Biol. Chem., v. 232, N 2, 867, 1958;
Bioch. Biophys. acta, v. 32, N 2, 287, 1960.
165. Stein E. A., Fischer E. H. Biochem. J., 8, 34, 1961.
166. Sugawara S., Nakamura G., Schimomura T. Bull. Agr.
Chem. Soc. Japan, v. 23, N 1, 156, 1959.
167. Tunge T. M., Stein E. A. et al. J. Biol. Chem., 234, 556, 1959.
168. Ueyama H., Fukimbara Т., Terui G., J. Ferm. Technol. 43,
481, 1965.
169. Underkofler L., Roy D. Cereal Chem., 18, 1951.
170. U r a t a G. J. Biochem., v. 44, N 6, 359, 1957.
171. Watanabe K., Fukimbara Т. Рикагаку Кэнкюдзе Хококу, 40,
327, 1964.
173

172. Watanabe K-, Fukimbara Т. J. Ferment. Technology, 43, 690,
1965.
173. Watanabe K., Fukimbara T. J. Ferment. Technology, 44, 392,
1966.
174. Watanabe K., Fukimbara T. J. Ferment. Technology, 45, N 4,
1967.
175. Watanabe K., Fukimbara T. Reports Inst. Phys. Chem. Res.,
40, 327, 1964.
176. W e 1 к e r N. E., С a m p b e 1 1 L. L. J. Bacterid., v. 86, N 4, 681, 1963;
86, N 6, 1196, 1963; N 4, 828, 1964.
177. Jamada K., Minoda I. Hakko Kydaishi, 20, 254, 1962.
178. Yamazaki J., U e d a S., Agric. Chem. Soc. Japan, v. 24, 181, 1951.
179. Ymanishi A., Momotani J., Y s e m u г а Т., J. Biochem. Tokyo,
v. 55, N 5, 562, 1964.
180. Ymanishi A., Momotani J., Y s e m u г а Т., J. Biochem., v. 57,
N '3, 417, 1965.
181. Yoshida A. Biochim. Biophys. acta, v. 41, N 1, 98, 1960.
182. Yoshikawa H,Marwo B. Biochim. Biophys. acta, v. 45, N 2,
270, 1960.
183. Ysemura T. et al. J. Biochem., v. 47, 98, 1960; v. 51, N 6, 385, 1962.
184. Y u d к i n M. D. Biochem. J., 100, 501, 1966.
185. Y u n g e J. M., S t e i n E. A. et al. J. Biol. Chem., v. 234, N 3, 556,
1959.
186. Zezins A., Ringelmann E., Lenen T. Biochem. Z., 336, 510,
1963.
ГЛАВА VI
vy ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ
КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ
Протеолитические ферменты, или протеазы (протеиназы
и пептидазы), катализируют гидролитическое расщепление как
пептидной связи (R — СО — NH — Ri) белков, так и некоторые
другие связи, например эфирные, амидные. Протеиназы
принадлежат к наиболее распространенным гидролитическим
ферментам. Они находятся в каждой клетке. Везде, где встречается
белок, имеется возможность его реконструкции. Белок
представляет собой главный структурный компонент клетки, а
протеолитические ферменты играют главную роль в процессе протеолиза.
Иногда возникают целые цепи реакций, в которых одна
молекула белка — фермента, войдя в соприкосновение с другой,
изменяет структуру последней и одновременно делает ее более реак-
ционноспособной, вторая, в свою очередь, изменяет третью и т. д.
Таким образом процесс активирования путем протеолиза играет
важную роль в жизнедеятельности живой клетки. Разнообразие
белков и сложность их строения уже предопределяют трудности
в классификации протеолитических ферментов. В свою очередь
множественность протеолитических ферментов, их
неспецифическое действие наряду с весьма интенсивным влиянием на
специфический субстрат, разнообразие типов этого действия — все это
174

порождает затруднения как в их классификации, так и в
понимании механизма действия.
В отличие от протеолитических ферментов растительного (фи-
цин, папаин, бромелаин) и животного (трипсин, пепсин, реннин)
происхождения, микробные протеиназы являются, как правило,
внеклеточными ферментами и кроме того обладают наиболее
широкой специфичностью. Так, например, препарат протеин,
выделенный из культуральной жидкости Streptomyces griseus,
катализирует гидролиз почти всех пептидных связей; наиболее
глубоко, даже по сравнению с трипсином, гидролизует глобулярные
белки, в том числе и денатурированные, не подвергается
инактивации в мочевине [36]. Из культур Bacillus subtilis получены
кристаллические препараты, названные субтилизин (3.4.4.16)
и BPN-протеаза [86, 87], которые расщепляют казеин,
гемоглобин, овальбумин и желатин [135, 136, 9, 3].
Широкая специфичность протеиназ некоторых плесневых
грибов по сравнению с животными наглядно представлена на
рис. 46 и 47.
На многие пептидные связи (AcN — ГлЫ; Лей-Цис; Цис-Гли;
Сер-Гис и др.) в В-цепи молекулы инсулина протеиназы
животного происхождения не действуют, тогда как протеиназы
плесневых грибов катализируют разрыв этих связей.
Широкой специфичностью обладает стрептококковая пепти-
даза А (3.4.4.18), которая гидролизует пептиды и амиды, но не
атакует связи, смежные с остатками глицина [59а].
Исключением являются лишь некоторые микробные ферменты, которые
характеризуются узкой специфичностью. Так, например, колла-
геназа (клостридиопептидаза — 3.4.4.19) CI. perfringens [73], по~
лученная в кристаллическом виде [122], гидролизует пептиды,
содержащие пролин, в том числе коллаген и желатин [5].
Следовательно фермент действует на участки со структурой — Про —
А — А — Про — [26, 112, 35, 43], где «Про» означает пролин или
оксипролин, а А и А — другие аминокислотные остатки.
Клостридиопептидаза В (3.4.4.20) гидролизует пептиды по связям,
в которых участвуют остатки аргинино [35, 15]. Следовательно-
эти ферменты действуют только на белки группы коллагена
и расщепляют в них только ограниченный вид пептидных
связей.
Эластаза (панкреатопептидаза Е — 3.4.4.7), выделенная из
бактерий [111], проявляет, как и панкреатопептидаза, узкую
специфичность, т. е. катализирует гидролиз по связям,
прилегающим к остаткам нейтральных аминокислот. Установлено, что
протеаза Вас. subtilis и щелочная протеаза Pseudomonas
aeruginosa обладают эластазной активностью. Этим пытались
объяснить сильное обезволашивающее действие (на козьи шкуры)
указанных протеиназ [87], однако такое предположение не
подтвердилось [88]. Аспергиллопептидаза (3.4.4.17) гидролизует
175-

Аспарагиновая кислота Аргинин Валин Тирозин Алании Фенилаланин
с> он
V
I
н-с-н
н нн н
VVc'
0>?чН'4?' %
н
I
н-с-н
Трипсин
Химотрипоин
Каркжсипептидаза А
Рис. 46. Специфичность — важное свойство ферментов (по Нейрату, 1966):
трипсин гндролнзует пептидную связь только справа от остатка аргинина; хнмогрипсин — связь справа
остатка тирозина; карбоксипептидаза Л — концевую пептидную связь слева от остатка фенилалаиииа.

Рис. 47. Место разрыва окисленного инсулина различными протеиназами:
/ — PeniciUium cyaneofulvum, 2— Aspergillus oryzae, 3 — Carica papaya,
4 — Bacillus subtilis, 5 — Aspergillus saitoi.
4
I
NH,
{Тлю *Изол • Вал • />Л7» Лмт^
С Фен »Вал »Асп »Глю»Гив
\ \ % \ %
НИ П I
I
\
т
t
t
ТТ7
1
/i - 4«to
^1 Сер »Лей • /«/7 • /л/а • Л?^ • //w %Асп • /tf,ff • //£■£• • Ас/г • А/Нг» )('^/да/77 ял/^
//w» /4у7 • Лга • Тир • .#«7 . вал %ЦиСчГли\ Глю\*6?
Л 1 F t t i
* ft f\ Ал • ./Ям % Пр • Tp • Гир .
f
t t
t 1
J4
^^
В-цепь
t

пептиды, особенно по связям, в которых участвуют
карбоксильные группы аргинина и лейцина [78, 101].
Таким образом каждый фермент предъявляет совершенно
определенные требования к субстрату и гидролизует только те
пептидные связи в белках, которые удовлетворяют этим
требованиям. В основном они определяются специфическим
расположением аминокислотных остатков, а также пространственной
конфигурацией полипептидной молекулы. Согласно теории Кош-
ланда, пространственное соответствие структуры активного
Рис. 48. Схема, иллюстрирующая теорию Кошланда
о пространственном соответствии структуры активного
центра фермента субстрату:
а — активный центр (А) и отдельные атомные группировки
(В, С), участвующие в катализе, удалены друг от друга;
б — изменение конформации фермента при сближении с
субстратом.
центра фермента субстрату, необходимое для катализа, не пред-
существует, а создается лишь в процессе их взаимодействия, как
это схематично показано на рис. 48. Если до взаимодействия
активный центр (Л) и отдельные группировки (В, С) фермента,
участвующие в катализе, далеко отстоят друг от друга (а), то
в результате приближения субстрата конформация фермента
изменилась, каталитические группы (Л, В, С) сблизились (б)
и заняли положение, обеспечивающее катализ. Следовательно
скорость действия фермента может лимитироваться
способностью молекулы фермента произвести нужное конформационное
изменение, т. е. ее гибкостью.
Если форма и конфигурация молекул протеиназы и белка
сходны, то каталитическое действие активного центра фермента
окажется настолько сильным, что приведет к расщеплению
С — N-связи. Некоторые протеиназы действуют на одну из воз-
178

можных пространственных конфигураций, другие — на группу
их, сходных по структуре и характеризующихся широкой
белковой специфичностью.
Избирательная специфичность протеиназ определяется
процессом образования комплекса фермент — субстрат, а также
изменением электронной конфигурации пептидной связи или
активного центра. Так, например, образование комплекса
фермент— субстрат зависит от геометрии специфической группы
субстрата (белка), тесно прилегающей к поверхности фермента.
Затем образование химической связи между реактивной группой
субстрата (белка) и реактивным центром фермента
(протеиназы) зависит от структурной и электронной конфигурации этого
центра.
В зависимости от особенности строения активного центра
ферментов и специфики их каталитического действия протеоли-
тические ферменты делят на сериновые протеазы (трипсин, хи-
мотрипсин, эластаза и др.), тиоловые протеазы (фицин, папаин,
бромелаин), металлсодержащие пептидазы (аминопептидазы,
карбоксипептидазы) и, наконец, протеолитические ферменты,
действующие в кислой зоне рН (пепсин, реннин и кислые
протеиназы микроорганизмов).
Подобное деление животных и растительных протеаз на
соответствующие типы по общности строения их каталитического
центра можно распространить, по-видимому, и на
протеолитические ферменты микроорганизмов. Установлено, например, что
Вас. subtilis синтезирует протеиназу, в активном центре
которой последовательность аминокислот совпадает с
последовательностью, характерной для активного центра таких протеаз,
как трипсин и химотрипсин. В активных центрах многих
протеиназ актиномицетов также содержится серии, блокировка
которого (например диизопропилфторфосфатом) приводит к
инактивации протеиназ [96, 137]. Следовательно их можно отнести к про-
теиназам серинового типа. Отдельные протеиназы
микроорганизмов можно отнести к тиоловым ферментам, так как их
активность зависит от наличия восстановленной сульфгидриль-
ной группы [64]. В то же время создать классификацию, которая
полно охватывала бы все пептидные гидролазы (3.4.1.; 3.4.2.;
3.4.3.; 3.4.4.), пока невозможно, так как не для всех ферментов
еще установлена специфичность и существование некоторых из
них как индивидуальных не совсем достоверно.
В настоящее время установлено, что многие микроорганизмы
синтезируют различные протеиназы, действующие в широких
зонах рН — от 1,8 до 10,5 и выше. По характерной рН-активно-
сти различают -в комплексе протеолитических ферментов три
типа протеиназ: кислые, нейтральные и щелочные (табл. 24).
Все они обладают, как уже отмечалось ранее, широкой
специфичностью.
12*
179

Таблица 24
Грибные протеолитические ферменты, проявляющие действие в разных
зонах рН
Продуцент
Asp. oryzae
Asp. saitoi
Asp. awamori
Asp. shirousamii
Pen. janthinellum
Asp. ochraceus
Asp. oryzae
Pen. chrysogenum
Asp. oryzae
Ферментный субстрат
и его свойства
Кислый тип
Активирует
трипсиноген
Аспергилпептидаза А
разрывает 16 связей из
29 в инсулине А-цепи;
активирует трипсиноген,
превращая его в
трипсин, не действует на
бензоиларгииил
метиловый эфир
Гидролизует широкий
ряд белков с
незначительным образованием
свободных аминокислот
Гидролизует казеин,
лейцин-глицин, лейцил-
глицил, лейцил-глицил-
глицин
Гидролизует инсулин
А-цепи; активирует
трипсиноген, превращая
его в трипсин. Не
действует на бензоиларгинин-
амид, бензиларгинин-
метиловый эфир, ацетил-
тирозинэтиловый эфир
Нейтральный тип
Гидролизует широкий
ряд белков
То же
Гидролизует широкий
ряд белков
Щелочной тип
Гидролизует широкий
ряд белков; подавляется
ингибитором яичного
белка
Оптимум рН
3,0
2,5—3,0
1,8—3,0
3,0
3,0
7,4
6,0
5—6
8,0
Степень очистки
фермента
Очищенный
при
электрофорезе на бумаге

Кристаллический
Очищенный
Технический
20-кратная
очистка

Кристаллический, очищенный
с помощью
электрофореза
То же
Очищенный

Кристаллический
180

Продолжение
Продуцент
Asp. sojae
Pen. cyanofulvum
Entomophtorales
Mortierella renispora
Ферментный субстрат
и его свойства
Отличается от других
типов щелочных протеи-
иаз; не действует на ди-
и трипептиды; иигиби-
руется диизопропил-
фторфосфатами
Азокол (азопротеиды)
Гемогиомин и
некоторые L-замещенные
пептиды
Оптимум рН
9,5—11.0
9,0
8,5
Степень очистки
фермента

Кристаллический
Очищенный
То же
Итак, гидролиз белковой молекулы сводится к разрыву
пептидной связи, которую различные протеиназы катализируют
по-разному. Определяющим фактором для гидролиза пептидной
связи является природа аминокислотных боковых цепей и
других групп по соседству с гидролизуемой связью (см. рис. 46).
Специфичность действия, естественно, проявляется и протеина-
зами микробного происхождения (см. рис. 47). Протеиназы
обладают видовой специфичностью. В зависимости от
происхождения протеиназы, действующей на белок, продукты гидролиза
(пептоны, полипептиды, дипептиды, свободные аминокислоты)
различаются между собой. Для разных целей и разных белков
используют разные протеиназы.
ПРОДУЦЕНТЫ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
Многие микроорганизмы в состоянии синтезировать
различные по специфичности протеолитические ферменты. Так,
например, желто-зеленые аспергиллы (Asp. oryzae, Asp. flavus, Asp.
fumigatus, Asp. terricola, Asp. sojae, Pen. chrysogenum, Monilia
sitophila) продуцируют протеиназы, зона действия которых
варьирует от рН 3,7 до 10 с проявлением оптимума вблизи рН 6,5
[140, 95]; отмечается слабая активность при рН 3,0. Черные
аспергиллы (Asp. awamori, Asp. saitoi, Asp. usamii, Rhizopus java-
nicus, Pen. expansum, Pen. sponolasum) образуют главным
образом протеиназы с оптимумом рН 2,5—3,0, т. е. характерным
для протеиназ Asp. niger.
Большая группа микроскопических грибов (Pen. luteum,
Rhizopus formosensis, Mucor hiemalis, Mucor racemosus)
синтезирует протеиназу, более активную при рН 6,0, чем при 3,0.
Актиномицеты Streptomyces (Actinomyces) griseus (4 штамма),
Act. streptomicini Kras., Str. fradiae, Str. faecalis продуцируют
нейтральные и щелочные протеиназы с оптимумом рН 7,5—10,8
181

[117, 66], a Asp. sojae — pH 9—10 [91]. Некоторые виды и штаммы
плесневых грибов синтезируют кислую протеиназу как
единственный компонент протеолитических ферментов. К таким
микроорганизмам относятся Asp. saitoi (штаммы R-0221A, R-3813,
мутант UV-13) [140], мутанты Asp. awamori 78-2 [30, 53], Asp.
fumigatus [14] и Asp. oryzae 251-90 [20, 21], Asp. flavus 74 [30, 18].
В настоящее время известны штаммы грибов и бактерий,
которые активно продуцируют ферменты, обладающие
способностью коагулировать белки молока. Для получения микробного
сычужного фермента используют следующие микроорганизмы:
Mucor pusilus F-27 [143], Rhizopus Река 11, Monascus anka,
Ascochyta visa, Sclerotium oryzae — sativa, Colletotrichum atra-
mentarium, Asp. candidus шт. 11 [42, 55, 54], Вас. subtilis, Вас.
mesentericus ПБ [62, 49], Endothia parasitica [120].
Многие микроскопические грибы — Str. grisous [141], Rhiz.
javanicus, Pen. chrysogenum [120, 138], Pen. luteum, Asp. terricola
692-88, Вас. mesentericus ПБ, Micromonospora vulgaris 42, Act.
rimosus ЛСТ [30], наоборот, в состоянии продуцировать
одновременно несколько протеиназ, проявляющих каталитическое
действие при кислой, нейтральной и щелочной реакции среды
[95, 72]. Кроме того препараты протеиназ, выделенные из Str.
griseus (протелин) и Act. rimosus (римопротелин) оказались
весьма активными. В частности, при гидролизе проколлагена
распад достигает 70% полного расщепления до аминокислот [37].
Из бактерий в качестве наиболее активных продуцентов
протеиназ используются следующие виды: Вас. circulans, Вас.
subtilis, Вас. sphaericus [3], Вас. thermophilus, Вас. aerothermophi-
lus, Вас. thermoacidurans [56], Вас. thermoproteolyticus [57], Вас.
brevis № 2, Вас. brevis № 224, Вас. mesentericus [58, 53] и другие
бактерии, относящиеся к роду Bacillus или Thermobacillus. Про-
теиназы, образуемые указанными видами и штаммами,
сохраняют активность в широком интервале рН, с оптимумом при рН,
равном 6,6—7,0 или с небольшими отклонениями.
Анаэробные бактерии CI. perfringens, CI. histolyticum [26, 35,
122, 84, 99] и CI. sporogenes [60a] образуют истинные коллагена-
зы, действующие на коллагены, т. е. фибриллярные белки
соединительной ткани: сухожилий, связок, кожи (дермы). Фермент
проявляет оптимум действия при рН 7,7—8,0; требует
наличия Са2+.
ВЛИЯНИЕ СОСТАВА СРЕДЫ НА БИОСИНТЕЗ ФЕРМЕНТОВ
Питательная среда должна содержать оптимальные
количества всех ингредиентов, являющихся источниками питания
и энергии. Очень важно, чтобы в среде находились соединения,
которые являлись бы индуктором или близким к нему
веществом, обеспечивающим и значительно повышающим синтез про-
182

теиназы. Измененная среда Чапека, содержащая 6% крахмала,
0,9% азотнокислого натрия и другие минеральные соли,
обеспечивающие хороший рост многих плесневых грибов и синтез
амилолитических ферментов, не обеспечивает биосинтеза проте-
иназы, так как она не содержит индуктора, специфически
ускоряющего синтез протеиназы. Ни одна из 50 различных культур,
относящихся к роду Aspergillus и Penicillium, не обеспечивала
на среде Чапека высокий синтез протеиназы [18, 32].
Влияние углеродного питания
Питательная ценность усвояемых источников углерода
зависит как от их химического состава, так и от физиологических
особенностей микроорганизма.
Оказалось, что при культивировании Asp. awamori 200 и Asp.
flavus 74 содержание глюкозы в среде в количестве 5—6%
обеспечивает наиболее активный синтез кислой протеиназы. В то же
время известно, что глюкоза является репрессором синтеза
амилолитических и некоторых других ферментов. Для другого
штамма гриба Asp. flavus — № 716 — оптимальная
концентрация глюкозы, обеспечивающая максимальный синтез кислой
протеиназы, составляет 3%. Увеличение ее до 7% не сказывается
на синтезе фермента, несмотря на прирост биомассы [13].
Для плесневых грибов, как уже отмечалось ранее, хорошими
источниками углерода являются и многие другие соединения,
причем, как правило, они обеспечивают синтез протеиназы
высокой активности.
По действию на биосинтез кислой протеиназы источники
углерода можно распределить в следующие убывающие ряды:
для Asp. фруктоза > маннит > глюкоза > сахароза > мальтоза > рамно-
f lavus 74 за > манноза > галактоза > арабиноза > дульцит > лактоза
для Asp. фруктоза > маннит > сахароза > глюкоза > мальтоза > араби-
awamori 200 ноза > манноза > дульцит > галактоза > лактоза
для Asp. фруктоза ]> сахароза ]> мальтоза > глюкоза > маннит ]>араби-
oryzae 79 ноза > галактоза > лактоза
Как видно из приведенных данных, наилучшими источниками
углерода оказались фруктоза, маннит или сахароза, глюкоза
или мальтоза и т. д., т. е. существенной разницы в ценности этих
источников нет. То же самое можно отметить и в отношении
наихудших источников углерода. Все три вида плесневых грибов
слабо синтезировали протеиназы в среде с лактозой или
галактозой, дульцитом.
В то же время арабиноза, например, при росте Asp. awamori
200 влияла хорошо, а при росте Asp. flavus — плохо, т. е. ее
ценность зависит от вида продуцента.
183

Крахмал как нативный, так и частично и глубоко гидролизо-
ванный амилолитическими ферментами, оказывал разное
действие на биосинтез протеиназы в зависимости от вида
плесневого гриба. Asp. awamori 200 как наиболее активный продуцент
амилазы в равной степени хорошо обеспечивает синтез
протеиназы в среде как с крахмалом, предварительно глубоко прогидро-
лизованным, так и с глюкозой. Остальные грибы (Asp. oryzae 79,
Asp. niger 50, Asp. flavus 88) обеспечивали синтез фермента на
средах с крахмалом, частично или глубоко прогидролизованным.
Продуцент Asp. terricola 3374 синтезирует высокоактивную
нейтральную протеиназу при росте на среде, содержащей 3—6%
крахмала, 0,3% кукурузного экстракта, 0,5% углекислого
кальция. Посевным материалом служила мицелиальная культура,
которую вносили в количестве 4—5% от объема среды, или
водная суспензия конидий, содержавшая 150 000—170 000 кониди-
альных клеток в 4 мл. Продолжительность выращивания 48—
72 ч при 30° С.
Активности внеклеточной протеиназы, полученные при росте
продуцента на средах с крахмалом или кукурузной мукой,
соответствуют 118—144 е(9/100 мл ' (табл. 25).
Таблица 25
Влияние крахмала на образование протеиназы грибом Asp. terricola [44]
Источник углерода
Крахмал ячменный . .
То же
Крахмал картофельный
То же
Кукурузная мука . . .

Концентрация
источника
углерода, %
3
6
3
6
3
6
рН
культу раль-
ной
жидкости
6,6
5,9
6,8
6,3
6,9
7,0
Активность
протеиназы,
едПОО мл
118
136
132
144
128
136
Биомасса,
г'ЮО мл
1,12
1,26
1,21
1,34
1,42
1,56
Добавление к среде кашалотового жира стимулирует синтез
протеиназы; активность ее увеличивается при этом примерно на
30% и составляет 156 ед/ЮО мл.
В качестве источника углерода, азота и других элементов
в питательных средах для получения протеолитических
ферментов используют часто естественные субстраты: ржаную муку,
муку соевых бобов, ячменную и кукурузную, пшеничные отруби
и экстракты из них, экстракты семян рапса и маиса.
При культивировании гриба Asp. oryzae 8FK наибольшее
накопление протеиназы и амилолитических ферментов получается
на среде следующего состава (в %): кукурузная мука 2, соевая
Активность определялась по степени гидролиза желатина.
184

мука 1,0, кормовые дрожжи 0,5, кукурузный экстракт 0,3, СаСОз
0,2; рН начальный 6,25, конечный — 8,25.
Активность внеклеточной протеиназы составляла
120 ед/ЮО мл (по методу Лейлян — Фольгарда в модификации
Бабашиной, 1962), амилазы 90 ед., декстриназы 325 е<3/100 мл.
Содержание биомассы 2,01 г/100 мл. Однако максимальное
накопление биомассы — 2,85 г/100 мл — наблюдалось на среде
другого состава (4% соевой муки, 0,4% кукурузного экстракта
и 0,2% СаС03), в то же время она не обеспечивала в полной
мере биосинтез протеиназы, активность которой соответствовала
всего 68 ед/100 мл [12].
В заводских условиях активность протеиназы в среднем
составляла 130 е<3/100 мл, а содержание биомассы (в пересчете на
сухую) варьировало в пределах 0,9—1,0 г/100 мл; длительность
роста — 30—36 ч. Изменение значения рН питательной среды от
5,5 до 6,25 положительно влияет на синтез протеиназы. В
дальнейшем, применяя математические методы планирования
эксперимента, удалось найти среду, близкую к оптимальной для
образования протеолитических ферментов. В ее состав входили:
1,12% соевой муки, 0,6% кукурузного экстракта и 0,1% СаС03.
При культивировании на такой среде продуцента Asp. oryzae 8F
протеолитическая активность составляла 390 ед. [12].
Бактерии Вас. subtilis наиболее интенсивно синтезируют
протеиназы на среде, где в качестве источника углерода
применяется крахмал [51]. Снижение концентрации крахмала с 8 до 2%
несколько снижает протеолитическую активность. Часто для
биосинтеза протеолитических ферментов используют моно- и ди-
сахариды, например при культивировании Pseudomonas myxo-
genus на средах с глюкозой, причем по мере повышения ее
концентрации с 1 до 10% отмечается усиление биосинтеза
протеиназы [103].
Биомасса микроорганизма при этом не увеличивается,
следовательно, усиливается продуцирующая способность клеток. В то
же время крахмал, декстрины, гликоген, сахароза, рибоза, ара-
биноза и некоторые другие сахара не усваиваются бактериями
[104]. Такие источники углерода, как фруктоза, этанол, глюко-
нат, пируват, лактат, обеспечивают образование протеиназы,
хотя и в небольших количествах.
При культивировании Вас. megaterium глюкоза подавляет
накопление протеолитических ферментов при интенсивном ее
потреблении, тогда как лактоза, наоборот, потребляется бактерией
незначительно, но в то же время стимулирует синтез
протеиназы [129].
Отрицательное влияние глюкозы на синтез протеиназы
отмечено и при выращивании 12 штаммов Вас. larve—продуцентов
протеиназ — добавление глюкозы в среду вызывает подавление
синтеза фермента. Добавление глюкозы в концентрации 0,5%
185

резко угнетает синтез протеиназы, но не сказывается на росте
некоторых штаммов Arthrobacter. Тот же эффект оказывают
галактоза, лактоза, мальтоза и ксилоза в концентрации
0,5% [90].
Различные штаммы Pseudomonas по-разному росли и
продуцировали протеиназы на средах, состоящих из разного
количества глюкозы (от 2 до 7%), СаС03 (от 0,2 до 2%), дрожжевого
автолизата и некоторых основных солей: (NH4)2S04 1%;
Na2HP04-12H20 0,1%; KH2P04 0,2%; MgS04-7H20 0,05%.
Кислотность сред соответствовала рН 7,0. Такие культуры, как
Ps. malvacearum, Ps. striatacien, Ps. graveolus и некоторые
другие не продуцируют заметного количества протеиназ на
указанных средах. Культура Ps. riboflavinum, наоборот, образует
значительное количество протеиназы только на синтетических
средах, тогда как Ps. fluoreiceus и Ps. chlororaphis синтезируют
протеиназы на всех испытанных средах, в том числе и на
естественной, включающей мясной бульон, 1% пептона и 0,8%
глюкозы [105]. Глюкоза наряду с арабинозой и ксилозой оказывает
благоприятное действие на синтез внеклеточной протеиназы при
культивировании бактерии Вас. subtilis 7/3 и Вас. mesentericus
40/1 [48].
При использовании бактерии Вас. mesentericus ПБ,
активного продуцента протеиназы и амилазы, среда Номура
обеспечивает наиболее высокое накопление внеклеточных протеолитиче-
ских ферментов — в пределах 75—100 е<3/100 мл [62]. На
модифицированной среде Номура с 2% крахмала активность
протеиназы несколько повышается и достигает 100—120 е<3/100 мл [51].
Наряду с общей протеолитической активностью Вас.
mesentericus ПБ одновременно синтезирует и фермент, обладающий
высокой свертывающей способностью — 3000—4000 ед/мл [62].
Свертывающая активность культуры или ферментного
препарата устанавливается по времени (в минутах) свертывания 100 мл
молока при 37° С одним миллилитром ферментного раствора.
Однако на естественной среде, в состав которой входят
кукурузная мука (3%), кукурузный экстракт (0,5%), (NH4)2HP04
(0,9%) и СаС12 (0,1%), активность протеиназы повышается на
25% по сравнению с модифицированной средой Номура. Такая
более дешевая и несложная в приготовлении среда
рекомендована для культивирования бактерий в производственных
условиях [62].
Динамика роста бактерий и накопление протеиназы и
свертывающего фермента Вас. mesentericus ПБ в ферментаторе (на
100 мл) с использованием естественной среды представлена на
рис. 49. Оказалось, что в течение первых 6 ч происходит
усиленный рост бактериальных клеток. Экспоненциальная фаза роста
заканчивается к 12 ч культивирования. Эта фаза
сопровождалась быстрым нарастанием протеолитической и свертывающей
186

I 109-
|«?7-
т-
W5-
ftffl-
§30
з-
|5В-
140-
|й»
140
'100
1 60
§4ff
ft?
I 20
1
2
3
активностей, которые составляли за 12 ч роста 70—75% от
максимальной величины. К 24 ч активность ферментов достигала
максимума.
Биосинтез фермента зависит от исходной величины рН
питательной среды и ее изменения в процессе культивирования
бактерий. Максимальное образование протеиназы отмечается
в довольно узком диапазоне исходной величины рН,
соответствующей 7,0—7,5, и конечной — 6,2—6,5. Установлено, что протео-
литическая система препарата из Вас. mesentericus ПБ
действует в широком диапазоне рН —от 5 до 12, проявляя оптимальную
активность в нескольких
зонах. Так, например,
наибольшая активность
протеиназы при действии
ее на желатин отмечается
в слабокислой зоне рН
(5,5—6,5), на казеин — в
нейтральной, а на
гемоглобин — в нейтральной
и щелочной зонах [62, 30].
Наилучшей средой для
роста бактерий Вас. sub-
tilis 7/3 и Вас.
mesentericus 40/1 и для биосинтеза
ими протеолитических
ферментов является
среда, состоящая из мясо-
пептонного бульона и
сусла, взятых в отношении
1 : 1, а также среда с пептоном, казеином и желатином. По
сравнению с мочевиной, разными аминокислотами и их смесями
наиболее эффективными источниками азота для биосинтеза
протеолитических ферментов являются, как уже отмечалось, казеин,
пептон или желатин. При этом отмечается связь между ростом
бактерий и увеличением ферментативной активности. При
спорообразовании внеклеточная активность протеиназы
снижается.
Многие актиномицеты, развивающиеся при повышенной
температуре, обладают высокой способностью к продуцированию
протеолитических ферментов [24, 36, 31, 102, 119, 38, 39].
При культивировании термофильных актиномицетов обычно
используют те же среды, которые известны для мезофильных
форм, однако наиболее интенсивный рост и синтез протеиназы
термофилом Micromonospora vulgaris 42 отмечается на средах
с крахмалом. Увеличение концентрации крахмала с 0,25 до 1,5%
повышает как накопление биомассы, так и синтез
протеолитических ферментов. Дальнейшее увеличение концентрации крахма-
187
5 12 18 11 30 31 42 48 52
Продолжительность культивирования, ч
Рис. 49. Динамика роста и накопления
протеиназы Вас. mesentericus (по Юлиус, 1969):
/ — протеолнтнческая активность. 2 —
свертывающая способность, 3 — число клеток.

ла не вызывает ускорения роста термофила. Отношение
углерода к азоту должно соответствовать 4 : 1 [38, 39]. Необходимо
отметить, что он интенсивно развивается и синтезирует протеи-
назу даже на питательных средах, содержащих в качестве
единственного источника углерода только пептон или казеин.
Для роста и образования протеиназы культурой Micromono-
spora vulgaris благоприятными считают среды следующего
состава (в %):
1) синтетическая: крахмал 1,5; пептон 0,15; (NH4)2S04 0,1;
KN03 0,6; Na2HP04 0,1; CaC03 0,4; MgS04 0,05; pH 7,0-7,2;
2) естественная: кукурузная мука 2,0; кормовые дрожжи
(сухие) 0,5; (NH4)2S04 0,1; СаСОз 0,1 [38, 37, 31].
Питательная среда с мальтозой (от 0,5 до 2%) обеспечивает
нормальное развитие микроорганизма, но репрессирует синтез
внеклеточной протеиназы. На среде, содержащей в качестве
единственного источника углерода сахарозу, лактозу или
раффинозу, актиномицет не развивается. Глюкоза, манноза,
фруктоза и ксилоза, вносимые в среду в концентрациях от 0,5 до 2%,
подавляют развитие актиномицета, причем накопление
биомассы составляет 15—30%, а активность протеиназы 7—12% от
контроля, в котором в состав среды входил крахмал [38].
Глюкоза угнетает рост термофила даже на фоне питательных сред,
содержащих пептон или казеин. Она сильно тормозит синтез
протеолитических ферментов и в процессе культивирования ме-
зофила Act. aureofaciens ЛСБ-2201 [9]. Активность внеклеточной
протеиназы составляла всего 0,375 мг аминного азота на 100 мл
среды, тогда как при росте продуцента на среде с крахмалом она
составляла 0,91 мг. При этом максимумы активности
протеолитических и амилолитических ферментов не совпадают во
времени: максимальная активность протеиназ наблюдается на пятые
сутки, а амилаз — на восьмые.
Установлен состав питательной среды, обеспечивающей
синтез высокоактивной протеиназы мезофильной культурой Act.
fradiae. В ее состав входят (в %): измельченный рог 0,5 и
крахмал 2,0, или соевая мука 1,0 и крахмал 4. Биосинтез
протеолитических ферментов на среде с крахмалом и соевой мукой
увеличивался в 3 раза при добавлении к ней 0,045% КН2Р04,
0,065% (NH4)2S04, 0,002% ZnS04-7H20, 0,001% FeS04-7H20
и 0,001% МпС12-4Н20. На среде с рогом и крахмалом без
добавления указанных солей протеиназы совершенно не
образуются [10].
Использование углеводородов. Показано, что некоторые
штаммы Ps. aeruginosa продуцируют протеиназу, используя
в качестве источника углерода углеводороды. Высокая
продуктивность штаммов наблюдается в среде, содержащей н-парафины
с 12, 14 и 16 атомами углерода, тяжелое масло или пропилен-
гликоль [108]. Pseudomonas aeruginosa может расти и на н-па-
188

рафинах с 7—10 атомами углерода в качестве единственного
источника углерода [123]. О протеолитической активности
судили по количеству тирозина (в мг), выделявшегося за 1 мин из
казеинового раствора при использовании реактива Фолина-
Чекальто [106].
Штамм Ps. aeruginosa 3454, который образует эластазу,
хорошо ассимилирует парафины (С12, С]4 или С[б), если они
применяются в качестве единственного источника углерода; штамм
IFO 3080, не образующий эластазы, обладает этой способностью
в очень незначительной степени. По-видимому, штамм,
образующий эластазу, является более диким, чем штамм, не
образующий ее [107]. Способность образовывать эластазу снижается при
пересевах. Однако штамм Ps. aeruginosa IFO 3455 обладает
большой и почти не изменяющейся со временем способностью
образовывать эластазу, так же как и способностью
ассимилировать парафины нормального строения, несмотря на многолетние
пересевы на скошенный агар.
Известно также, что виды Ps. aeruginosa способны
использовать не только алифатические, но и ароматические углеводороды
в качестве единственного источника углерода. В частности, в
среде, содержащей нафталин, Ps. aeruginosa может накапливать
большое количество салициловой кислоты [142].
Влияние азотного питания
Микроорганизмы используют разнообразные источники
азота, как органические (белки, продукты их гидролиза), так и
неорганические (аммонийные и нитратные соли). Как уже
отмечалось ранее, внутриклеточные вещества содержат обычно азот
только в восстановленном состоянии: — NH2, N — Н, а поэтому
наиболее доступным для потребления является азот аммиачной
формы. Питательная ценность других источников азота
определяется тем, насколько легко от них может отщепляться азот
R форме NH3. Многие микроорганизмы в состоянии использовать
даже азот в окисленной форме (HN03, HN02).
Вопросы азотистого питания и обмена микроорганизмов
рассматриваются во многих статьях и монографиях [46, 23, 34, 27,
28, 4, 17, 25]. На основании многочисленных исследований можно
сделать один основной вывод, подтверждающий необходимость
присутствия в среде органического источника азота как
индуктора протеолитических ферментов. Поэтому вполне закономерно,
что для получения протеолитических ферментов микробного
происхождения рекомендуют использовать прежде всего
естественные или полусинтетические среды, в состав которых вносят
естественные субстраты.
Практически часто используют муку из различных злаков
(кукурузы, сои, пшеницы, ржи), муку земляного ореха, пшенич-
189

ные отруби, экстракты отрубей, солодовых ростков, дрожжевой
автолизат, пептон, белки и т. д. Во всех указанных средах
преобладают органические формы азота, причем с небольшим
содержанием свободных аминокислот. Поэтому при
культивировании плесневых грибов, бактерий и актиномицетов на
синтетических питательных средах необходимо предусматривать в их
составе белки и продукты неполного их распада.
Влияние форм азота при культивировании плесневых грибов.
Для биосинтеза кислой протеиназы различными видами
плесневых грибов (Asp. oryzae, Asp. awamori, Asp. niger, Asp. flavus)
наиболее важным ингредиентом питательной среды является
азот органической формы. Частичное или полное исключение из
среды Чапека NaN03 и замена его казеином заметно повышает
биосинтез кислой протеиназы (табл. 26). Если, например, в
готовой культуре, полученной на среде Чапека, активность кислой
протеиназы соответствовала 0,10 мг тирозина на 1 мл, то в
культуре, полученной на среде, в которой NaN03 заменен казеином,
активность фермента составляла 0,35 мг/мл, т. е. была в 3,5 раза
выше. Внесение в среду Чапека только одной вытяжки из
мицелия плесневого гриба, содержащей 12,6 мг азота на 100 мл
(около 126 мг аминокислот), без казеина не повысило
активности кислой протеиназы, она осталась на уровне, полученном при
выращивании на среде Чапека. Внесение минеральных солей
Таблица 26
Активность кислой протеиназы в зависимости от состава питательной среды
при глубинном культивировании Asp. awamori [32]
Варианты среды
Среда Чапека,
содержащая 6% крахмала, 0,91%
NaN03 и другие соли
То же, с заменой NaN03
казеином (0,1%)
То же, с добавлением
вытяжки из мицелия (12,6 мг
азота)
То же, с добавлением
вытяжки из мнцелия (3,0%),
соответствующей 12,6 мг
азота
То же, с заменой
крахмала глюкозой (5%), NaN03
казеином (0,1%) и пептоном
(0,25%)
рН
культуры
4,8
5,5
4,0
6,3
3,2
Сухая
биомасса,
г/ 100 мл
1,58
1,25
1,68
2,20
1,62
Активность кислой
проте
ед.
оптической
плотности
0,10
0,35
0,40
0,11
0,60
инаэы
тирозин,
мг/)НЛ
0,10
0,38
0,43
0,12
0,64
190

в модифицированную нами питательную среду, содержащую 5%
глюкозы, 0,25% пептона и 0,1% казеина, снижает синтез кислой
протеиназы, хотя при этом и наблюдается прирост биомассы.
Таким образом, если замена в среде Чапека NaN03 казеином
повышает активность кислой протеиназы в готовой культуре
в 3,5 раза, то при дополнительной замене крахмала глюкозой
и введении пептона активность фермента повышается в 6 раз
[29, 30, 32, 58, 18].
При культивировании Asp. flavus № 716 [13] и мутантов Asp.
awamori 78-2 [60, 58] и Asp. oryzae 251-90 [21, 20, 22] —активных
продуцентов кислой протеиназы—.наилучшими источниками
азотного питания и одновременно индукторами также оказались
пептон и белки. Замена белка или пептона хлористым или
сернокислым аммонием приводит к полному прекращению синтеза
кислой протеиназы [20].
Известны данные других авторов [42, 70], подтверждающие
положительную роль белков при использовании их в качестве
единственных источников азота в среде. В то же время имеются
указания на увеличение синтеза кислой протеиназы при
совместном действии органических и неорганических источников азота
[41, 65].
Добавление к среде, приготовленной из пшеничных отрубей
и обезжиренных соевых бобов, минеральной формы азота
повышает синтез кислой протеиназы. Выход фермента при этом
увеличивается на 22—74% за 63 ч роста микроорганизма.
Добавление к среде хлористого аммония или нитрата натрия увеличивает
синтез кислой протеиназы только при культивировании Asp.
saitoi штамм R-3813 и мутанта UV-13. В то же время при
культивировании Asp. inuii 5013, Asp. nakazawai R-6822 указанные
минеральные соли подавляют синтез этого фермента,
стимулируя образование щелочной протеиназы, действующей при
рН 7,5.
Внесение минеральной соли в среды, содержащие в
достаточном количестве органические формы азота, повышает выход
кислой протеиназы на 20—48% по сравнению с контролем,
причем повышение активности отмечается лишь после 50-часового
культивирования [19]. Эффект от неорганического источника
азота (HN03 или NH4 в количестве 0,6—3,8%) отмечается в том
случае, когда он добавляется к среде, содержащей органический
источник азота. При этом выход кислой протеиназы возрастает
до 140—190%) при культивировании многих штаммов плесневых
грибов: Asp. saitoi H-813, Asp. usamii R-0635, R-1031, R-1219,
Asp. aureus 6321 и др. [41].
Влияние аминокислот. В опытах с шестью разными
культурами, выращенными на синтетической среде с пептоном и
глюкозой, выявили 8 аминокислот — стимуляторов биосинтеза
кислой протеиназы (табл. 27).
191

Следовательно, аминокислоты по-разному влияют на
биосинтез кислой протеиназы [30, 18]. Такие аминокислоты, как глицин,
аланин, метионин и лейцин повышают на 9—16% активность
кислой протеиназы у мутантного штамма Asp. oryzae 251-90 и на
7—24% исходного штамма Asp. oryzae 132-63 [20].
«Избирательное» действие аминокислот проявляется и при культивировании
других продуцентов кислой протеиназы. Так, например, лишь
отдельные из 19 испытанных аминокислот (лизин, цнстин, нор-
лейцин, фенилаланин) стимулируют образование протеиназы
как у гриба Asp. fumaricus 12, так и у мутанта этого же гриба
Asp. fumaricus 128 [14]. Многие аминокислоты оказывают
репрессирующее действие на синтез фермента. Например валин,
глютаминовая кислота, изолейцин и другие тормозят синтез
фермента у мутанта Asp. oryzae 251-90 на 22—42%, а у
исходного штамма на 33—50% [20], стимулируя одновременно рост
продуцентов.
При культивировании мутанта Asp. awamori 78-2 только две
из 19 проверенных аминокислот — цнстеин и аспарагиновая —
способствуют повышенному синтезу кислой протеиназы [42а].
Эти аминокислоты-индукторы, имея совершенно разное
химическое строение, оказывают одинаковое действие на синтез
фермента. Такие аминокислоты, как цистин, аргинин, гистидин,
валин (по 16 мг азота на 100 мл среды), аланин (30 мг азота)
и некоторые другие, по-видимому, могут быть приравнены по
своему действию к казеину и пептону. Некоторые
аминокислоты— лизин, у-аминомасляная кислота, тирозин — почти
полностью подавляют как синтез протеиназы, так и жизнедеятельность
организма. При изучении действия аминокислот на биосинтез
кислой протеиназы мутантом Asp. oryzae 251-90 также
установлено, что отдельные из них — глицин, аланин, метионин,
лейцин— вызывают более интенсивный синтез фермента, повышая
его активность на 9—16%, а именно: вместо 3,7 мг тирозина/л<л
в контрольном опыте (с 0,25% пептона и 0,1%) казеина), она
соответствует, например, в опытах с глицином 4,31 мг [20].
Многие аминокислоты и прежде всего в повышенных дозах
угнетают синтез протеиназы и у бактерий [104, 74, 75]. Такие
аминокислоты, как треонин, изолейцин и валин подавляют
синтез фермента при росте Вас. megaterium более чем на 60%-
Глицин и его производные понижают способность клеток Вас. sub-
tilis var. amyloliquifaciens продуцировать протеазу и амилазу
[134]. Глицин репрессирует синтез протеазы и амилазы в
процессе роста Вас. subtilis, причем тормозящее действие его
снимается метионином, глютаминовой кислотой, аланином и лейцином
[133]. Биосинтез протеиназы Ps. myxogenes тормозили цистин,
цистеин и метионин [103]. Однако в некоторых случаях
отмечается и индуцирование протеолитических ферментов отдельными
аминокислотами: метионином, глютаминовой кислотой [98]. Для
192

Таблица 27
Сравнительные данные, характеризующие влияние аминокислот на синтез
кислой протеиназы и рост мицелия при культивировании плесневых грибов [30, 20]
Вид и штамм
плесневого грнба
Амииокнслоты-стимуляторы
синтеза кислой
протеиназы
роста мнцелия гриба
Аминокислоты-репрессоры
синтеза
кислой протеиназы
роста мицелия
гриба
Аминокислоты,
не оказывающие
действия на
синтез кислой
протеиназы
Asp. flavus 74
Валин, норлей-
цин,
фенилаланин, цистин
Аспарагиновая и
глютаминовая кислоты,
глицин, цистеин, (ала-
нин), аспарагин,
лизин, гистидин, изо-
лейцин, фенилаланин
Цистеин, пролин,
аминомасляная,
лизии,
аспарагин, гистидин,
серии
Цистеин,
норленцин
Аспарагиновая
и глютаминовая
кислоты,
гликокол
Asp. flavus
Лизин, валин,
норлейцин,
цистин, глицин
Аспарагиновая к-та,
лизин, валин,
норлейцин, пролин, цистин,
серии, гликокол,
фенилаланин
Цистеин
(Цистеин)
Аспарагиновая
кислота, сернн,
фенилаланин
Asp. awamori 200
со
со
Пролин, цистин,
глицин
Глицин, лизин,
валин, иорлейции,
пролин, цистин
Цистеин
Цистеин, сернн
(фенилаланин,
аспарагиновая
к-та)
Лизин, серии

Продолжение
Вид н штамм
плесневого грнба
Asp. oryzae 79
Asp. niger 50
Asp. oryzae
251-90
Аминокислоты-стимуляторы
синтеза кислой
протеиназы
Фенилаланин
Лизин, цистин,
серии,
фенилаланин
Глицин, аланин,
аргинин, метио-
нин, лейцин
роста мицелия
грнба
Аспарагиновая к-та,
валин, пролин,
цистин, серии, гликокол,
лизин
Валин, цистин,
фенилаланин, норлейцин
Аспарагиновая
кислота, аспарагин,
валин, глютаминовая
кислота, изолейцин,
серии
Аминокислоты-реп рессоры
синтеза кислой
протеиназы
Цистеин,
аспарагиновая к-та,
лизин, пролин,
цистин,
серии, гликокол
Цистеин,
аспарагиновая к-та,
пролин,
гликокол
Гистидин, валин,
цистин, цистеин,
глютаминовая
кислота,
изолейцин
роста мицелия
грнба
(Норлейцин,
цистеин,
фенилаланин)
(Аспарагиновая
к-та), гликокол,
цистеин,
(серии)
Глицин, треонин,
цистеин, аргинин,
норлейцин,
лизин, лейцин,
цистин,
изолейцин
Аминокислоты,
не оказывающие
действия на
синтез кислой
протеиназы
Валин,
норлейцин
Валин
Норлейцин,
треонин,
аспарагиновая
кислота,
пролин, лизин
(В скобках указаны аминокислоты, которые очень слабо тормозили или не оказывали никакого действия на рост
мицелия.)

Auremonas proteolytica присутствие аминокислот или пептидов
также является важным фактором для образования протеаз.
При культивировании термофильного актиномицета на среде
с отдельными аминокислотами (0,2% по азоту) в качестве
единственного источника азота отмечается подавление роста
микроорганизма и биосинтеза внеклеточных протеаз. Исключением
оказалось только положительное влияние аргинина и до
некоторой степени — валина. Так, например, активность протеазы при
культивировании актиномицета на среде с аргинином в 2 раза
превышает активность, получаемую в среде с пептоном, и
составляет 2300 мкг вместо 1200 мкг тирозина в 1 мл. На средах с
некоторыми другими аминокислотами (глютаминовая, фенилала-
нин, глицин, лейцин, изолейцин) и прежде всего с валином,
биосинтез протеазы усиливается лишь по сравнению с
контрольной средой с минеральными формами источников азота. При
содержании в среде аминокислот в количестве 0,005—0,01% по
азоту происходит более интенсивное накопление биомассы (на
20—30%), но синтез протеаз при этом репрессируется в среднем
на 15—20% [38].
Таким образом действие аминокислот на биосинтез
ферментов специфично и индивидуально для разных микроорганизмов.
При рассмотрении репрессирующего действия отдельных
аминокислот, по-видимому, необходимо принимать во внимание
и количественное их содержание внутри клетки [28, 30]. Поэтому
действие свободных внутриклеточных аминокислот может
проявляться одновременно и в сочетании с влиянием аминокислот
питательной среды. Известно, что необходимым условием
репрессирующего действия метаболитов является их избыточное
содержание в среде, когда дальнейший синтез фермента,
вызывающего образование метаболита, становится биологически
нецелесообразным.
Влияние форм азота при культивировании бактерий. При
культивировании бактерий и, в частности, Вас. mesentericus ПБ,
на увеличение синтеза протеиназы наиболее благоприятное
действие оказывает совместное применение органических и
неорганических форм азота. Поэтому для получения высокой
ферментативной активности рекомендуется среда, содержащая крахмал
2% (или кукурузную муку 3%), кукурузный экстракт 1% (или
0,5%), (NH4)2HP04 0,9%, СаС12 0,1%, Ш 0,5% и MgS04 0,15%
(последние две соли вносят только в крахмальную среду). При
этом активность протеолитических ферментов достигает 1,4^-
1,6 ед., молокосвертывающих 4000 ед. и амилолитических
ферментов 4—5 ед/мл [62].
Среды с источником азота в виде хлористого или
сернокислого аммония оказались неблагоприятными для биосинтеза
протеолитических ферментов культурами Вас. subtilis и Вас.
mesentericus [48].

Из минеральных источников азота максимальный биосинтез
ферментов наблюдается только на среде с двузамещенным
фосфатом аммония (0,9%). На средах только с органическими
источниками азота образование протеиназы и амилазы ниже,
чем на среде с (NH4)2HP04 и соевым экстрактом. Другие
соли —NH4C1, (NH4)2S04, NH4NO3, NaN03, KN03, Ca(N03)2
снижают синтез протеолитических ферментов на 30—50%, а
амилазы— в 7—10 раз. Кроме того при исключении из среды
минерального источника азота наблюдается значительное
уменьшение количества клеток — с 1 • 109 -т- 3,1 • 109 до 9- 105. Тем самым
между активностью фермента и накоплением биомассы нет
пропорциональной зависимости.
Двузамещенная фосфорнокислая соль аммония оказалась
лучшим источником азота для биосинтеза протеазы Ps. myxoge-
nes. Биосинтез фермента понижал хлористый аммоний и
заметно тормозили сернокислый аммоний и азотнокислый
натрий [101].
При использовании органических источников азота (казеин,
пептон, желатин, мочевина) вместо (NH4)2HP04 и соевого
экстракта (в сумме 0,21% азота) биосинтез протеолитических и ами-
лолитических ферментов снижается (со 125 до 80 е<Э/100 мл
и с 500 до 120—50 <?<Э/100 мл соответственно). Снижается при
этом и синтез свертывающего фермента (с 1,8 до 15—36 мл/мин).
Относительно лучшие результаты получены при росте бактерии
в среде с пептоном; активность при этом снизилась лишь на 16%
по сравнению с контрольным опытом [соевый экстракт +
+ (NH4)2HP04], тогда как в опытах с казеином и мочевиной она
снизилась на 36% [62].
При исследовании влияния пептона как компонента
питательной среды на образование протеолитических ферментов Вас.
subtilis и Вас. mycoides установлено, что низкая концентрация
пептона давала положительные результаты [118]. Избыток
кукурузного экстракта в среде (0,125 %) понижал синтез
фермента.
Как уже отмечалось ранее, термофил Micromonospora
vulgaris 42 весьма чувствительно реагирует на источники азота и
углерода. Так, азотнокислый калий (0,15% по азоту) заметно
подавляет его рост, в то же время стимулируя синтез
протеолитических ферментов, внеклеточная активность которых
составляет 1100 мкг тирозина в 1 мл. Аммонийные формы азота в
концентрациях от 0,07 до 0,35% по азоту, наоборот, повышают
накопление биомассы (на 20—25%)) и одновременно
репрессируют биосинтез фермента, снижая его активность на 20—30%
по сравнению с активностью при росте на средах с KNO3.
Увеличение концентрации аммонийных и нитратных форм азота (до
0,25—0,30%) подавляет рост микроорганизма и синтез
протеолитических ферментов [38]. Другие авторы отмечают, что рост
196

термофильного актиномицета Micromonospora vulgaris
происходит интенсивно на средах с аммонийными солями, мочевиной пли
аспарагином [80]. В частности, сульфат аммония (0,1 %) в смеси
с дрожжевыми клетками (1,5%), предварительно автолизиро-
ванными, усиливает синтез протеиназ термофилом; из
источников углерода при этом используется крахмал (2%) или
кукурузная мука [32].
Из органических форм азота наиболее эффективным
индуктором протеаз является пептон (0,15%))• Замена его казеином
(0,20%) значительно повышает накопление биомассы, тогда как
протеолитическая активность понижается на 20—30%) по
сравнению с ростом на среде с пептоном. Высокие концентрации
казеина (0,8—1,0%) резко снижают образование протеаз, хотя
развитие актиномицета и накопление биомассы протекают
нормально [38]. Для многих других термофилов также требуются
сложные по составу среды: меласса с дрожжевым экстрактом
[127] или дрожжевой экстракт с вытяжкой из соевой муки [77];
растительные или животные белки — желатин, казеин и др. [24];
препарат NZ-амин-В (0,5—1,0%), полученный путем
ферментативного гидролиза казеина [102].
Отмечается, что потеря способности Neurospora crassa к
биосинтезу протеолитических ферментов приводит к потере
способности ассимилировать пептиды, гидролиз которых
осуществляется внеклеточным ферментом [94].
Различные источники белкового азота (пептон
ферментативный, казеин, альбумин сывороточный, клейковина пшеничной
муки, рог измельченный, соевый шрот, соевая мука и
выделенные из нее фракции альбуминов, глобулинов, нерастворимый
остаток и др.) по-разному влияют на биосинтез протеиназы
культурой Act. fradiae 119 [11].
В состав рабочей среды, содержавшей крахмал (4%) и
минеральные соли [(NH4)2S04 0,065%, КН2Р04 0,045% и др.],
добавляли различные источники органического азота в количестве
0,04—0,08% по азоту. Оказалось, что только при выращивании
актиномицета на средах с рогом, и особенно с соевой мукой или
шротом, биосинтез протеиназы идет интенсивно и направленно,
на что указывает не только большая абсолютная величина
активности протеиназы (2,5—4,2 ед/мл фильтрата), но и высокая
удельная активность фермента (2,3—2,7 ед/мг белка). В то же
время на средах с глобулином и альбумином соевой муки
активность в 1,5—2 раза ниже, чем на среде с соевой мукой.
Добавление к средам с альбумином или глобулином соевой муки
минеральных элементов сои (в виде золы, фракции
низкомолекулярных соединений или сухого экстракта) повышает биосинтез
протеиназы, активность которой близка к полученной на среде
с соевой мукой. Добавление минеральных элементов соевой
муки к средам с казеином и рогом также усиливает синтез про-
197

теиназы, и активность ее вследствие этого повышается
соответственно с 0,8 до 2,2 ед/мл и с 2,1 до 3,2—4,1 ед/мл [11].
Увеличение в 2—3 раза активности внеклеточной протеиназы
(казеиназы) при добавлении зольных элементов соевой муки не
только к средам с белками сои, но также с казеином и рогом,
свидетельствует о том, какое большое значение для синтеза
протеиназы Act. fradiae имеет минеральный состав питательных сред,
и как важно учитывать это при оценке влияния на биосинтез
протеиназы различных белков и, по-видимому, других
компонентов среды. Интересно отметить, что за 48 ч роста актиномицета
активность экзогенной и эндогенной протеиназ была невелика
и распределялась более или менее равномерно. Однако к 96 ч
роста активность экзогенной протеиназы составляет уже 89—
100% от общей активности во всех вариантах опытов; биомасса
при этом была практически одинаковой.
Следовательно изменение интенсивности синтеза
внеклеточной протеиназы, не компенсируемое образованием
внутриклеточной, зависит главным образом от способности клеток
мицелия синтезировать фермент.
Таким образом между концентрацией и формой азота в
среде, с одной стороны, и синтезом протеаз, с другой, существует
определенная закономерность. Так, например, максимальная
протеолитическая активность.у актиномицета St. griseus
достигается при условии наличия в среде аминокислот; на средах
с пептидами ofta снижается и самая низкая наблюдается на
белковых средах [52].
О различном влиянии форм азота на физиологическое
состояние актиномицета можно судить также по его способности
к спорообразованию. Оказалось, что наибольшая способность
к образованию спор проявляется, наоборот, в среде с белками,
меньшая — в среде с пептидами и вовсе отсутствует — в среде
с аминокислотами.
Влияние фосфора и серы
При культивировании гриба Mucor pusillus было замечено,
что содержание фосфора в среде (рР04), равное Ю-3 М,
обеспечивает максимальный синтез кислой протеиназы и интенсивный
рост организма (рис. 50). Повышение концентрации фосфора
сверх оптимальной задерживает как рост, так и образование
фермента [125, 126]. На основании этих данных авторы делают
заключение, что неорганический фосфат оказывает
отрицательный эффект на синтез кислой протеиназы. В то же время
известно, что изъятие из среды любой соли, входящей в состав среды
Чапека (КС1, MgS04, FeS04 и др.), ведет к снижению протеоли-
тнческой активности культуры Asp. terricola 3374. Особенно
заметное падение активности (с 75 до 46 ед.) наблюдается в от-
198

сутствие KH2P04 [44]. Стимулирование синтеза гидролитических
ферментов ортофосфатами объясняется в то же время и буфер-
ностью фосфорных соединений.
Сера в концентрации около Ю-4 М (pS04) оказывает
стимулирующее действие на синтез фермента и рост гриба Mucor
pusillus (рис. 51). Более высокие концентрации ингибируют
синтез протеазы, а концентрация, равная 10~3 М, снижает
образование фермента примерно на 50%, тогда как рост
микроорганизма при этом не подавляется.
I.S
1,
I.
гУ /
J /
/
4 3 2
0Р04. Ю'4И0'гм
Рис. 50. Влияние концентрации
фосфора (растворимый РО4) на рост /
и синтез протеазы 2 (по Somkuti,
Babel, 1968).
w
%и>
^
Ъэ
1
|0,5
L I
У \
У/ \ .
X / \
/
—-S
pSOs
Рис. 51. Рост / и синтез протеазы 2
Mucor pusillus в зависимости от
концентрации серы (по Somkuti, Babel,
1968).
Ингибирующее действие высоких концентраций серы на
образование экзоферментов отмечалось ранее многими авторами
[104, 116, 130, 131]. Так, например, при росте Asp. niger на
средах, богатых и бедных серой, отмечалось, что образование
протеазы (и белка) происходит именно в среде с бедным
содержанием серы, тогда как синтез внутриклеточных ферментов
(кислой фосфатазы) в этих условиях, наоборот, замедляется
[131].
Концентрации серы, репрессивно действующие на синтез
протеиназы, в то же время обеспечивают рост организма (см.
рис. 51).
Таким образом, сера играет исключительную роль в
избирательной регуляции синтеза как внутриклеточного, так и
внеклеточного белка, включая и ферменты [131].
На синтез кислой протеиназы грибом Mucor pusillus
оказывают влияние и некоторые другие ингредиенты питательной
среды [124, 125].
199

Соотношение источников углерода и азота в среде
160
Для интенсивного биосинтеза ферментов имеет
исключительное значение не только количество источника углерода и азота
в среде, но и прежде всего их оптимальное соотношение. На
рис. 52 показана графически зависимость биосинтеза ферментов
от соотношения углерода к азоту среды. Содержание
(NH4)2HP04 в среде варьировало от 0,06 до 0,21% по азоту,
крахмала — от 0,5 до 6%.
Соотношение углерода к
азоту изменялось в
пределах от 2 : 1 до 80 : 1. Из
приведенных данных
следует, что с увеличением
концентрации
минерального азота в среде
возрастает активность как про-
теолитических, так и ами-
лолитических ферментов,
однако увеличение содер-
10 го зо 40 5ё~б0 п во 90 жания крахмала усилива-
вооттшеиие углеродУ'агат/Я7.7,ДОиml) ет биосинтез амилаз
ТОЛЬКО при максимальном ко-
- гт-
-о
I 240
&
1 S Ш-
Й<
S'SffO-
| 80-
1 4В-
5 О
1
120
[
Г \
//\ч
У \ \
// \ V
!/ ' ^\
// \ ч
V \л
Рис. 52. Зависимость биосинтеза протеазы /
и амилазы 2 Вас. mesentericus от
соотношения углерод/азот в питательной среде
(по Юлиус, 1969).
личестве азота (0,21%), а
при концентрации его,
равной 0,15%), активность
амилазы даже при
соотношении 20 : 1 была ниже в 2 раза.
Таким образом оптимальным для образования протеолитиче-
ских ферментов оказалось соотношение источника углерода
и азота в среде от 20: 1 до 40: 1, для амилолитических
ферментов— от 20:1 до 30:1. Оптимальное соотношение углерода
и азота устанавливается и в процессе культивирования
плесневых грибов, причем оно по-прежнему варьирует, в зависимости
от вида микроорганизма, в широких пределах. Например, для
образования амилазы культурой Aspergillus species оптимум
С : N варьирует от 1,2 : 1 до 20 : 1, для максимального синтеза
а-амилазы Вас. subtilis — от 9:1 до 50:1, а при
культивировании Asp. oryzae 7: 1. Для синтеза кислой протеиназы
оптимальное соотношение С : N варьирует от 8 : 1 до 2 : 1.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ К ГЛАВЕ VI
1. Бабакина В. Г. Применение ферментов в производстве кожи
Ростехника, 1962.
2. Б а р к а н С. Л., Р а м а г а н о в а О. X., Ю л и у с А. А. «Известия
вузов. Пищевая технология». № 5, 1964.
200

3. Безбородова В. Г. Тезисы докладов I Всесоюзного
биохимического съезда. Вып. 3, 5. Л, 1964.
4 Беккер 3. Э. Физиология грибов и их практическое использование.
Изд. МГУ, 1963.
5. Ваганова М. С. Исследование способов выделения комплексных
препаратов ферментов из культуральной жидкости Вас. mesentericus ПБ.
ВНИИСинтезбелок, 1969.
6. В е с е л о в И. Я, Д у р о в а Е. И., П е т и н а Т. А. и др. Авторское
свидетельство № 182649.
7. Be сел о в И. Я. и др. «Прикладная биохимия и микробиология».
Т. I. Вып. 1. 52, 1965.
8 Веселое А. И. «Прикладная биохимия и микробиология». Т. III.
Вып. 3. 329, 1967.
9 Вечер А. А., Р я б у ш к о Т. А. «Прикладная биохимия и
микробиология» Т. III. Вып. 4. 492, 1967.
10 Винцюнайте М. М. «Прикладная биохимия и микробиология».
Т. V. Вып. 3. 273, 1969.
11. Винцюнайте М. М., Петрова И. С. «Прикладная биохимия
и микробиология». Т. V. Вып. 4. 421, 1969.
12. В о й н о Л. И. Образование амилолитических и протеолитических
ферментов грибом Asp. oryzae 8F при поверхностном и глубинном
культивировании. Диссертация. Московский технологический институт пищевой
промышленности, 1970.
13. Гернет М. В. Исследование условий биосинтеза протеолитических
ферментов грибами Aspergillus при глубинном методе культивирования для
применения их в виноделии. Автореферат канд. дисс. МТИПП, 1969.
14. Григорян Д. Т., Коновалов С. А. «Прикладная биохимия
и микробиология». Т. 7. Вып. 4. 437, 1971.
15. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М. Изд-во «Мир», 1966.
16. Димитров Д., Be се лов И. Я., Пети на Т. А.,
Типограф Д. Я. «Прикладная биохимия и микробиология». Т. VI. Вып. 2. 173,
1970; т. V. вып. 1, 47, 1969.
18. Дорохов В. В. Биосинтез кислой протеиназы плесневыми
грибами. Канд. днсс. МТИПП, 1968.
19. Дорохов В. В., Коновалов С. А. Авторское свидетельство
№ 210788; № 233591; «Прикладная биохимия и микробиология». Т. V. Вып. 3.
265, 1969; «Микробиологическая промышленность». № 7, 19, 1970; там же,
№ 1, 33, 1971.
20. 3 у е в а Р. В. Физиолого-биохимические исследования
экспериментально полученного мутанта Aspergillus oryzae — активного продуцента
кислой протеиназы. Диссертация. Московский технологический институт пищевой
промышленности, 1971.
21. Зуева Р. В., Ко н о в а л о в С. А. «Микробиологическая
промышленность». № 4, 17, 1970.
22. 3 у е в а Р. В., К о н о в а л о в С. А. «Микробиология». Т. XI, Вып. 1.
85, 1971.
23. Иерусалимский Н. Д. Основы физиологии микробов. Изд-во
АН СССР, 1963.
24. И м ш е н е ц к и й А. А. Микробиологические процессы при высоких
температурах. Изд-во АН СССР, 1944.
25. И н д ж и к я н СМ. Усвоение аланина, валина, лейцина и
некоторых их гомологов дрожжами рода Candida. Автореф. канд. дисс. Ереван,
1969.
26. Казакова О. А. и др. ДАН СССР. Т. 122. 193, 1959.
27. Коновалов С. А. Биохимия дрожжей. Пищепромиздат, 1962.
28. Коновалов С. А. Биохимия бродильных производств. Изд-во
«Пищевая промышленность», 1967.
29. К о н о в а л о в С. А., Д о р о х о в В. В., Шахова Т. В. Тезисы
201

докладов на Межвузовской научной конференции по вопросам применения
ферментных препаратов в бродильной промышленности. Воронеж, 1967.
30. К о н о в а л о в С. А., Дорохов В. В. «Прикладная биохимия
и микробиология». Т. V. Вып. 2. 131, 1969.
31. Коновалов С. А., Дорохов В. В., Шахова Т. В. Труды
ВНИИ продуктов брожения. Вып. XIX, 85, 1970.
32. Коновалов С. А., Ш а х о в а Т. В., Дорохов В. В.,
Веселое а Л. П. «Прикладная биохимия и микробиология». Т. III. Вып. 4, 401,
1967.
33. К о н о в а л о в С. А.., Дорохов В. В., Сологуб В. П.,
Логинов а Л. Г. «Микробиологическая промышленность». № 6, 1971.
34. К р е т о в и ч В. Л. Основы биохимии растений. Изд-во «Высшая
школа», 1971.
35. Кучина О. В., Ш п и к и т е р В. О. «Успехи современной биологии».
Т. 50. Вып. 3(6). 294, 1960.
36. Логинова Л. Г., Ташпулатов Ж- «Микробиология», XXXIV,
вып. 2, 258, 1965.
37. Нестерова Г. А., Каверзнева Е. Д. «Прикладная биохимия
и микробиология». Т. VI. Вып. 1, 62, 1970.
38. О в ч а р о в А. К. Протеолитические ферменты термофильного акги-
номнцета Micromonospora vulgaris 42. Диссертация. Московский
технологический институт пищевой промышленности, 1968.
39. О в ч а р о в А. К., К о н о в а л о в С. А. «Прикладная биохимия и
микробиология». Т. V Вып. 5, 499, 1968.
40. О р е щ е н к о Л. И. Разделение амилолитических и протеолитически.х
ферментов гриба Asp. oryzae. Канд. дисс. Московский технологический
институт пищевой промышленности, 1964.
41. Патент японский. Кл. 3633. № 12287. Опубл. 1/VII 1964.
42. П е т и н а Т. А. Образование сычужного и протеолитического
ферментов грибом Asp. candidus штамм 11. Канд. дисс, МТИПП, 1966.
43. П о п о в а Н. В. «Прикладная биохимия и микробиология». Т. I.
Вып. 481, 1965; «Ферментная и спиртовая промышленность», 1965, № 4.
44. П о п о в а Н. В. Влияние состава питательной среды на прогеолити-
ческую активность Asp. terricola. Канд. дисс. Московский технологический
институт пищевой промышленности, 1968.
45. П о р о ш и н К. Г. и др. «Биохимия». Т. 26. 244, 1961.
46. Р о г а в и ч ю с А. Б. Влияние условий культивирования бактерий
Вас. subtilis, Вас. mesentericus на биосинтез ими протеаз. Дисс, Вильнюс, 1967.
47. Р у б а н Е. Л. «Успехи микробиологии». Изд-во «Наука», № 2, 113,
1965.
48. С т е п а н о в В. М. Исследование структурных и функциональных
свойств пепсина. Докт. дисс. Институт химии природных соединений АН СССР,
1968.
49. Т и н я к о в а О. X. Исследование возможности применения
ферментного комплекса Вас. mesentericus штамм ПБ в качестве свертывающего
агента при производстве голландского сыра. Канд. дисс. Московский
технологический институт мясной и молочной промышленности, 1970.
50. Т и п о г р а ф Д. Я., П е т и и а Т. А. «Прикладная биохимия и
микробиология». Т. П. Вып. 4. 4171, 1966.
51. Фениксов а Р. В., Тихомирова А. С. «Микробиология»
Т. XXIX. Вып. 6. 1960.
52. X а л о у п к а И. «Микробиология». Т. XXVII. Вып. 4, 1958.
53. Ц а п л и н а И. А., К о в а л е в с к а я И. Д. «Прикладная биохимия
и микробиология». Т. V. Вып. 6. 657, 1969.
54. Ч е б о т а р е в А. И., Д у р о в а Ж- И., П е т и н а Т. А. «Прикладная
биохимия и микробиология». Т. V. Вып. 4. 451, 1969.
55. Ч е б о т а р е в А. И. и др. «Прикладная биохимия и
микробиология». Т. П. Вып. 5. 557, 1966.
202

56. Ч е р н и к о в М. П. Протеиназы и механизм их действия. Докт.
диссертация. М., 1959.
57. Цыпе ров и ч А. С. Ферменты в промышленности. Киев. 1962.
58. Ш а х о в а Т. В. Биохимические основы получения кислой
протеиназы при культивировании мутанта Aspergillus 78-2. Диссертация. Горьковский
государственный университет имени Н. И. Лобачевского, 1971.
59. Ш а х о в а Т. В., К о н о в а л о в С. А. «Прикладная биохимия и
микробиология». Т. V. Вып. 3, 52, 1969.
60а. Шведова В. Н. «Прикладная биохимия и микробиология». Т. III.
Вып. 2. 162, 1967.
60. Ш а х о в а Т. В., К о н о в а л о в С. А. «Прикладная биохимия и
микробиология». Т. VI. Вып. 3. 257, 1970.
61. Шишкова Э. А. Изучение и разработка способа получения
антибиотика и ферментов из глубинной культуры Act. rimosus. Автореферат канд.
дисс. МТИПП, 1967.
62. Ю л и у с А. А. Биосинтез некоторых гидролитических ферментов при
глубинном культивировании Вас. mesentericus штамм ПБ. Канд. дисс. МТИПП,
1969.
63. Ю л и у с А. А., Т и н я к о в а О. X. «Прикладная биохимия и
микробиология». Т. II. Вып. 6. 670, 1966.
64. Akatsuka Т., S a t о М. Agr. Biol. Chem., v. 27, 12, 828, 1963.
65. Akiba Т., Tukimbara Т. Journ. ferm. technol., 45, 1, 66, 1967.
66. Akira, Takeshi. Agr. Biol. Chem,, 26, 11, 723, 1963; 26, 11, 784,
1963.
67. Arima K., Y u Y. et al. Appl. Mikrobiol., v. 16, 11,1727, 1968.
68. A r i m а, К i t а о k a S. Nat. Inst. Aminal. Healthanart. 5, 3, 138, 1965.
69. Bender M. X., К о z d у F. J. Arch. Biochem. Biophys. 34, 49, 1965.
70. В e r g m a n n M. Adv. in Enzymol., 1, 48, 1942.
71. В e r g m а п п М. Adv. in Enzymol., 2, 49, 1949.
72. Bergvist R. Acta chem. scand., 17. 1521, 1963.
73. В i d w e 11 E. Biochem. J., 46, 589, 1950.
74. Chaloupka J., Kreckova P., RihovaL. Biochem. Biophys.
Res. Communs. 12, 380, 1963,
75. Chaloupka J., Kreckova P. Folia microbiol., 11, 82, 1966.
76. С h о р г а N. N. Proc. Indian Acad. Sci., 23, 100; 24, 247, 1946.
77. С r a v e r i R„ Pogani H. Anneli di Microbiol, et Enzimologia, 12,
115, 1962.
78. Grewther W. G., Lennox F. G. Natur, Lond., 105, 680, 1950.
79. Elliott S. D. J. exp. Med., 92, 201, 1950.
80. Erik son. Journ. Gen. Microbiol., 6, 286, 1952.
81. Fukumoto J et al. J. agr. Chem Soc. Japan. 32, 230, 233, 1958.
82. Gordon R. E., Smith N. K. J. Bacteriol., 58, 327, 1949.
83. Grassmann W. et al. Z. phys. Chem., 316, 287, 1959.
84. G r a s s m a n n W, Nordwig A. Z. phys. Chem., 322, 267, 1960.
85. G u n t e 1 b e r g A. V., О 11 e s e n M. Nature, 170, 802, 1952.
86. Hagihara В., Matsubara H., Nakai M., Okunuki K.
J. Biochem., 45, 185, 1958.
87. H a g i h a r a B. In «The Enzymes.» 2nd ed., vol. 4, 193, Academic Press.
New York, 1960.
88. Harukazu F., О k i r a F. Bull. Japan. Assoc. Leath technol. 5, 2,
61, 1959.
89. Hay ash i K., F u k u s h i m a D., M о g i K. Agr. Biol. Chem., v. 31,
5, 642, 1967.
90. Hofsten В., Tjedor С Bioch. et biophys. acta, 110, 376, 1965.
91. I g u с h i N„ Y a m a m о t о К. J. Agr. Chem. Soc. Japan, 29, 387, 1955;
20, 65, 1955.
92. К a m e 1 Т. Н. J. Agr. Food. Chem., 8, 156, 1960.
93. Kruger \V„ Krenkel K., Gust H. Die Nahrung, 2, 149, 1959.
203

94. M a t i 1 P. Z. Zellforsch., 65, 884, 1965.
95. Mat su shim a K. J. Agr. Chem. Soc. Japan, 33. 120, 1959.
97. M с С о n n J. D. et al. J. Bio!. Chem., 239, 3706, 1964.
98. M с D о n a 1 d J. J., С h a m b e r s A J. Microbiol., 12, 1175, 1966.
99. M i с h a e 1 s S. et al. BBA, 29, 451, 1958.
100. Mizunuma Т., Iguchi N. Bull. Agr. Chem. Soc. Japan, 22, 35,
1957.
101. Mizunuma Т., I g u с h i N. Report of the Noda Inst. Scientific
Research, 2, 18, 1958.
102. Mizusawa K, I chishima E., Yoshida F. Agr. Biol. Chem.,
30, 1, 35, 1966.
103. Morihara K. Bull, agric .chem. Soc. Japan, 23, 45, 1958.
104. Morihara K. Bull, agric. chem. Soc. Japan. 23, 60, 1959.
105. M о r i h a r a K. Agricol. Biol. Chem., 26, 842, 1962.
106. Morihara K. Biochim. et biophys. acta, 73, 105, 1963.
107. Morihara K. J. Bacteriol., 88, 745, 1964.
108. Morihara K. Applied microbiology, 13, 5, 793, 1965.
109. Morihara К., Ока Т., T s u z u к i H. Agric. and Biol. Chem., 29,
836, 1965.
111. Morihara K-, T s u z u к i H. Biochim. biophys. acta, 118, 215, 1966;
Arch. Biochem. Biophys., 120, 68, 1967.
112. N a g a i Y., N о d a H. BBA 34, 298, 1959.
113. N о m о t о М., N a r a h a s h i Y. Biochemistry, 46, 11, 663; 46, 12. 1645,
1959; Report Inst. Physical a. chem, Res. 35, 90, 1959; 34, 399, 1958.
114. N ото to M., Narahashi Y. J. Biochem., 46, 839; 46, 1481, 1959.
115. Od a K. Symposium on Enzyme Chemistry (Japan) 27, 767, 1963.
116. Oishi M., Ki tayma S. et a!. J. Gen. Appl. microb. 9, 337, 1963.
117. Ouchi T. Agr. Biol. Chem., v. 26, 11. 734, 1962.
118. Pa vloso va E., St ark a J. Folia Microbiol., 4, 308, 1959.
119. Reed L. L, Dussert, Abstracts, 17, 480, 1957.
120. Sacomoto M., Kojima Y. Хакко Кёкайси, 22, 8, 1964.
121. Sardinas Iosephlauis. Англ. патент. Кл. СЗН, А213, 1035897, 1966.
122. S e i f t e r S, G a 1 1 о р P. M. et al. J. Biol. Chem., 234, 285, 1959.
123. Senes J. C, Azoulay E. Biochim. et biophys. acta, 47, 307, 1961.
124. Somkuti G. А., В a b e 1 F. J. Appl Microbiol., 15, 1309, 1967.
125. Somkuti G. А., В a b e 1 F. J. J. Bacteriol., v. 95, 1407, 1968.
126. Somkuti G. А., В a b e 1 F. J. J. Bacteriol., v. 95, 4, 1415, 1968.
127. Tendler M. D., В u r k h о 1 d e r. Appl. Microbiol., 9, 394, 1961.
128. Tespuru D, McConn J. D, Yasunoby К. Т. J. Biol. Chem.,
240, 2415, 1965.
129. Toe da F. Report govt. Chem. inst. Tokyo, 54, 12, 369, 1959.
130. T о m о п a g"a G., О h a m a H., Y a n a g i t a T. J. Gen. Appl.
Microbiol., 10, 373, 1964.
131. T о m о n a g a G. J. Gen. Appl. Microbiol., 12, 267, 1966.
132. Tsugo T. et al. Japan. J. Zootechnica! Sci., 35, 221, 1964.
133. T s u r u D. Agric. Biol. Chem., 26. 388, 1962.
134. Tsuru D., Fukumoto J. Agric. Biol. Chem., 27, 286, 1963.
135. Tsuru D., К i r a H., Yamamoto Т., Fukumoto J. Agric. Biol.
Chem., 30, 856, 1966.
136. Tsuru D„ Kir a H. et al. Agric. Biol. Chem., v. 31, 6, 718, 1967.
137. Wahlby S., Zetterovist O., Engstrom L. Acta Chem. Scand.
19, 1247, 1965.
138. Wang H. L., H e s s e I e f i n e С W. Canad. J. Microbiol., 4, 11, 1965.
139. Yamamoto K., Hayashi K. Symposium on Enzyme chemistry
(Japan), 18, 21, 1961.
140. Yoshida F. Agr. Chem. Soc. Japan, 28, 1956; Bull. Agr. Chem. Soc.
Japan, 20, 257, 1956.
204

141. Yoshiko N., Mas ay a Y. Scient. papers Inst. Phys. and Chem.
Res., 52, 44, 1965.
142. Yshikura Т., N i s h i d a et al. Abstr. Meeting Agr. Chem. Soc.
Japan, Tokyo, 200, 1965.
143. Ywasaka S., Tamura G., Arima K. Agr. bioi. Chem., v. 31, 5,
546, 1967.
ГЛАВА VII
ПЕКТОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ
КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ
Согласно современным представлениям в комплекс
пектолитических ферментов входят:
1) пектинэстеразы (пектазы — 3.1.1.11), катализирующие
разрыв сложноэфирных связей, образованных между метанолом
и карбоксильной группой галактуроновой кислоты по схеме:
Пектин + пН20—>- Метанол + Пектиновая кислота [43, 67];
2) полигалактуроназы (пектиназы — 3.2.1.15), гидролизую-
щие а-1,4-0-галактуронидные связи между молекулами галак-
туроновых кислот в пектинах и других полигалактуронидах;
3) трансэлиминазы, разрушающие, но не гидролизующие
пектиновые вещества [37, 63, 71, 82, 67];
4) протопектиназы, обеспечивающие отщепление арабана
и галактана от протопектина с образованием метоксилированной
полигалактуроновой кислоты, представляющей собой пектин.
Протопектиназы не вошли в последнюю номенклатуру
ферментов, так как их существование ставится под сомнение [42, 48,
58, 64, 13]. Известна и другая точка зрения, признающая
существование протопектиназы как самостоятельного фермента [65, 97,
98]. Из культуры плесневого гриба Rhizopus species получен
фермент, способный гидролизовать межклеточный протопектин
и названный «клетки разделяющий фермент», или протопекти-
наза. Мацерирующий фермент был выделен и из CI. pelsinoum
var. sekokiamim [61], который гидролизовал протопектин.
Отдельные компоненты, входящие в комплекс
пектолитических ферментов, различаются между собой по механизму
действия и субстратной специфичности. Поэтому каждый из них ниже
дополнительно характеризуется.
Пектинэстеразы. Пектинэстераза получена в гомогенном
состоянии из препарата пектолитических ферментов Asp. niger
[86]. При этом было установлено, что N-концевой кислотой в
молекул фермента является фенилаланин. В растениях и плодах
пектинэстераза может находиться без сопутствующего ей
фермента — полигалактуроназы [46, 83, 58] или при незначительной
ее активности [3, 27, 39, 88, 19].
205

Пектинэстераза (ПЭ) омыляет, как уже отмечалось ранее,
сложноэфирные связи пектина (см. схему) и пектовой кислоты
с освобождением эквивалентного количества метанола и
образованием пектовой кислоты, не содержащей сложноэфирных
групп.
COO" COOvCH3 СОфСН3 СОО-СНз /СОО" СОО
Действие Действие
пектинэстеразы полигалактуроназы
Схема строения растворимого пектина и его ферментативного гидролиза.
Механизм действия грибной пектинэстеразы включает
прежде всего гидролиз метилэфирных групп, окруженных с обеих
сторон свободными карбоксильными группами [66, 46]. Фермент
атакует, по-видимому, эфирные группы одна за другой вдоль
линейной молекулы пектина. Показано, что пектинэстеразы
грибного происхождения более глубоко гидролизуют пектин и эфиры
полигалактуроновых кислот, чем растительные. Так,
пектинэстераза из плесневого гриба Con. diplodiella способна гидролизовать
пектин со степенью этерификации 64% на 60% [51]. Активность
пектинэстеразы в значительной мере зависит от степени
этерификации пектина [85, 94], более того, она прямо
пропорциональна ей [15, 22]. Например, для действия пектинэстеразы из Asp.
niger необходим высокоэтерифицированныи пектин, со степенью
этерификации не менее 70%.
Оптимум действия пектинэстеразы грибного происхождения
находится в зоне рН от 4,5 до 5,5, а препарата, свободного от
полигалактуроназы,— от 2,0 до 6,5 [44]. Препарат
пектинэстеразы, выделенный из Fusarium oxysporum, также свободный от
полигалактуроназы, имеет оптимум рН-действия от 5,0 до 7,0
[96]. Действие пектинэстеразы высших растений, в отличие от
грибных, проявляется в зоне рН от 6,0 до 7,5—8,0 [96].
Температурный оптимум действия грибных пектинэстераз
наблюдается в пределах от 40 до 45° С [51, 28]; при 55—62° С они
инактивируются [44], в то время как ферменты высших растений
проявляют оптимум действия при более высокой температуре —
55—60° С [96].
Ионы натрия и особенно кальция [44], а также хлориды
натрия, калия и кальция [51, 28] активируют пектинэстеразы,
полученные из плесневых грибов Con. diplodiella и Asp. niger и,
наоборот, трех- и четырехвалентные катионы (азотнокислые соли
206

ртути, стронция, свинца, сернокислый алюминий и хлорное
железо) ингибируют действие пектинэстеразы [68, 46].
Полигалактуроназы. Достоверно установлено, что полигалак-
туроназа состоит из нескольких компонентов [91, 40, 77, 28, 29].
Разжижающая полигалактуроназа 11 получена из Asp. niger
в гомогенном состоянии [86], а из культуральной жидкости Аего-
cylindrium получена эндополигалактуроназа в кристаллическом
виде [100]. Установлено, что N-концевой кислотой разжижающей
полигалактуроназы является лизин [86].
Механизм гидролиза пектина и полигалактуронидов полига-
лактуроназами чрезвычайно сложен. Он в известной степени
определяется продуктами гидролиза, получаемыми при действии
на пектин и пектовую кислоту препаратами ферментов из
плесневых грибов Bot. cinerea, Con. diplodiella, Asp. niger, Asp. foeti-
dus и др. [38, 40, 42, 82,- 80, 49, 9, 10, 4, 28]. При действии
ферментным препаратом из Con. diplodiella на пектин и пектовую
кислоту отмечается четыре стадии гидролиза, отличающиеся
между собой по скорости процесса и продуктам распада.
Первая стадия характеризуется высокой скоростью
гидролиза и образованием пента- и тетрагалактуроновых кислот. При
этом до 30% глюкозидных связей пентагалактуроновой кислоты
разрушается. Скорость гидролиза во второй стадии
замедляется примерно в 10 раз по сравнению с первой стадией. Субстрат
при этом гидролизуется от 30 до 60%. В основном превращаются
тетрагалактуроновые кислоты в ди- и тригалактуроновые.
Скорость гидролиза в третьей стадии снова замедляется. Основным
субстратом при этом является тригалактуроновая кислота.
Когда пектин прогидролизуется на 75%, то основными продуктами
являются только ди- и моногалактуроновые кислоты. И,
наконец, в последней, четвертой стадии отмечается полный гидролиз
пектина и продуктом гидролиза является моногалактуроновая
кислота [49].
Следует отметить, что моногалактуроновая кислота
обнаруживается на всех стадиях гидролиза пектина. Тем самым
подтверждается, что ферментный препарат, выделенный из Соп.
diplodiella, содержит разжижающую и осахаривающую
полигалактуроназы. Эндополигалактуроназа из Asp. niger гидролизует
пектин на 50%, при этом конечными продуктами являются три-,
ди- и моногалактуроновые кислоты [89]. Гидролиз пектовой
кислоты протекает в три стадии и прекращается, когда будет про-
гидролизовано 70% связей.
Дрожжевая полигалактуроназа неупорядоченно гидролизует
пектовую кислоту до смеси продуктов, состоящих из ди- и моно-
галактуроновых кислот [41]. Оказалось, что дрожжевая
полигалактуроназа не атакует дигалактуроновые кислоты, что
объясняется, по-видимому, тем, что одна концевая группа олиго-
и полиуронидной цепи закрыта для доступа в результате
207

соединения двух ангидридов галактуроновой кислоты, т. е.
имеет место «химическое сродство» субстрата с ферментом. Этим,
по-видимому, объясняется и то, что гидролиз тригалактуроновых
кислот происходит только с одного конца. Окисленные и
восстановленные производные тетра- и тригалактуроновых кислот
вовсе не атакуются ферментом [80]. Однако грибная полигалак-
туроназа гидролизует и восстановленные дигалактуроновые
кислоты [69].
Препараты полигалактуроназ, полученные из глубинной
и поверхностной культуры Asp. foetidus, гидролизуют пектовую
кислоту до три-, ди- и моногалактуроновых кислот, однако
фермент из поверхностно выращенной культуры легко гидролизует
три- и дигалактуроновые кислоты и их окисленные производные
до мономеров [40].
Эндополигалактуроназа, полученная из культуры гриба Con.
diplodiella, отличалась от осахаривающей и разжижающей
полигалактуроназ [50]. Эндополигалактуроназа с трудом действует
на пектин и гидролизует пектовую кислоту не более чем на 35—
40% от общего количества глюкозидных связей. Из Asp. niger
получены три хорошо очищенные эндополигалактуроназы, из
которых одна гидролизовала пектовую кислоту на 70%. вторая—
на 50% и третья —на 20% [28].
В зависимости от источников получения полигалактуроназ
и используемого субстрата они действуют в разных зонах рН.
При гидролизе пектовой кислоты оптимум действия
разжижающей полигалактуроназы (эндо-ПГ) в основном лежит в пределах
рН от 4,0 до 5,5 [29, 40, 50, 51, 5], а при действии на пектин —
5,5—6,0 [92, 87]; для осахаривающей полигалактуроназы (экзо-
ПГ) проявляется в пределах рН от 3 до 4 [89, 42, 28], а при
действии на пектовую кислоту несколько выше — 4,4—4,6 и для
фермента, активированного ртутью,— 5,0—5,1 '[70].
Полигалактуроназы в основном стабильны к рН в зоне от 4 до 6 [51, 28].
Экзополигалактуроназа Asp. niger, активированная ртутью,
стабильна при рН 2,5, а очищенная экзо-ПГП — в щелочных зонах
при рН 7,0 [70].
Температурный оптимум действия для большинства типов
полигалактуроназ наблюдается в интервале 40—45° С. В
интервале этих температур проявляется и термостабильность; инакти-
вируются они при 50 и 55—65° С [51].
Полигалактуроназы активируются, как и пектинэстеразы,
катионами щелочных металлов и аммония, а также анионами
хлора и брома [28]. Экзополигалактуроназа активируется in vitro
ионами ртути. Ингибируется азотнокислым стронцием,
хлористым железом (0,001 г-ион/л) [28].
Трансэлиминазы проявляют то же самое действие, что и
полигалактуроназы, т. е. уменьшают вязкость пектина, образуя при
этом 1 моль восстановленного сахара на каждую прогидролизо-
208

вавшуюся а-1,4-связь. Поэтому ранее могли действие трансэли-
миназы приписывать полигалактуроназе. Например, фермент из
Вас. polymyxa, действие которого проявляется «беспорядочно»
при рН 8,9—9,4 в присутствии Са2+, является, вероятно, истинной
трансэлиминазой [75]. Предварительный гидролиз субстрата пек-
тинэстеразой обеспечивает образование промежуточного
полимера, наиболее легко поддающегося действию трансэлиминаз.
Трансэлиминазы подразделяются по субстратной
специфичности и механизму действия [36, 37, 84]. Ферменты осуществляют
реакцию расщепления пектина или пектовой кислоты с нереду-
цирующего конца цепи, образуя ненасыщенные галактурониды,
с меньшей длиной цепи, или дигалактуроновые кислоты с
двойной связью, в частности, дериват галактуроновой кислоты —
4-диокси-5-кето-галактуроновую кислоту. Разрыв этих
«исключительных» а-1,4-связей катализируется трансэлиминазами,
которые подразделяются на эндопектинтрансэлиминазы (эндо-ПТЭ)
и экзопектинтрансэлиминазы (экзо-ПТЭ), а также эндопектино-
кислоты — трансэлиминазы (эндо-ПКТЭ) и экзопектинокислоты
трансэлиминазы (экзо-ПКТЭ). Схема возможного расщепления
пектина пектинтрансэлиминазой представлена ниже [37].
Н3СО—с=0
н он н3со-с=о н он н3со-с=о
Схема действия пектинтрансэлиминазы на метоксилированный пектин [37].
В результате действия фермента образуется остаток дигалак-
туроновой кислоты с двойной связью между четвертым и пятым
углеродными атомами. Двойная связь находится в а-положении
по отношению к метоксильной эфирной группе и обладает
сильной адсорбцией ультрафиолетового света при длине волны 230—
235 нм. Промежуточными продуктами реакции являются олиго-
эфиры с ненасыщенными связями, которые также подвергаются
действию трансэлиминаз. Фермент гриба Asp. fonsecanes
атакует, по-видимому, только те связи, которые соединяют два этери-
фицированных остатка ангидридгалактуроната. Однако
трансэлиминазы различного происхождения не одинаково атакуют
субстраты [84, 73]. Так, например, трансэлиминазы Вас.
polymyxa атакуют высшие урониды и не атакуют тригалактуроновые
кислоты, а полигалактуронидтрансэлиминазы Erwinia caratovora
катализируют расщепление ненасыщенных дигалактуроновых
кислот, а также обычную дигалактуроновую кислоту на две
молекулы: а-галактуроновой и диоксикетоуроновой кислот [73].
14 Заказ 7
209

Полигалактуроновые кислоты атакуются пектинтрансэлиминазой
в 400 раз медленнее, чем ненасыщенные дигалактуроновые
кислоты.
В отличие от бактериальных трансэлиминаз, грибные
проявляют оптимальную активность при рН 5,2, тогда как
бактериальные — в зоне рН от 7,0 до 8,5. Однако и трансэлиминазы Asp.
fdhseceanes в присутствии катиона натрия проявляют
оптимальное действие при рН 5,2, а в условиях оптимальной
концентрации хлористого кальция — при рН 8,5.
Взаимосвязь между ферментами и субстратами, на которые
они действуют, схематически может быть представлена в таком
виде.
Протопектин
—>Арабан
>Галактан
Протопектииаза
ПЭ-аза
экзо-
ПМГ-
аза
-Пектин-
эндо-
ПМГ-аза
>Пектиновая-
кислота
П ромежуточные
урониды
эидо-
ПГ-аза-
Дигалактуроновая
кислота
>Галактуроновая кислота*
экзо-
ПГ-
аза
Обозначения. Эндо-ПМГ-аза — эндополиметилгалактуроназа; экзо-ПМГ-
аза — экзополиметилгалактуроназа; экзо-ПГ-аза — экзополигалактуроназа;
эндо-ПГ-аза — эндополигалактуроназа; ПЭ-аза — пектинэстераза; светлая
линия — беспорядочный ферментативный гидролиз; жирная —
терминальная (концевая) атака ферментов.
ПРОДУЦЕНТЫ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
Богатейшими источниками ферментов пектинового
комплекса являются плесневые грибы, бактерии, дрожжи. Основными
продуцентами, широко используемыми в промышленности,
являются: Asp. foetidus [40], Asp. niger [34, 25, 16, 33, 5, 11, 28, 7, 91,
89, 42, 70], Sclerotinia libertiana [79], Sclerotinia sclerotiorum [26],
Botrytis cinerea [23, 24, 59], Conithyrium diplodiella [49, 50], Fusa-
rium moniliforme [93], Asp. awamori [17, 21].
210

Пектолитические ферменты гидролитического действия
продуцируют бактерии Erwinia caratovora [65, 77], Bacillus polymyxa
[75, 76], Flavobact. pectinovorum, Klebsiella aerogenes, актиноми-
цеты [62] и дрожжи Sacch. fragilis [82]. Многие плесневые грибы
(Asp. niger, Asp. awamori, Asp. foetidus, Asp. saitoi, Asp. fonsea-
nes, Botr. cinerea, Scl. libertiana, Con. diplodiella и др.)
продуцируют разнообразный комплекс пектолитических ферментов,
другие из них и, в частности, Asp. niger, в основном синтезируют
пектинэстеразу [102, 49], а
плесневые грибы Pen. citri-
mim, Agricus campestris
почти ее не продуцируют.
Грибы Con. diplodiella,
Ag. campestris, Pen. citri-
mim, Scl. libertiana, Bot.
cinerea в основном образуют
полигалактуроназу [38, 54,
40, 53, 45, 99, 77], а дрожжи
Sacch. fragilis — эндополи-
галактуроназу [82] в
качестве единственного
компонента пектолитических
ферментов. Этот фермент
продуцируется дрожжами в
стационарных условиях роста на
синтетической среде и
разрушает пектиновую кислоту
до дигалактуроновых
кислот. Фермент вызывает
быстрое уменьшение вязкости пектиновой кислоты и медленно
увеличивает число редуцирующих групп.
Эндополигалактуроназа по действию на пектиновую кислоту
превосходит в 20 раз действие на тетрагалактуроновую кислоту
и в 1000 раз — на тригалактуроновую кислоту. Оптимум рН-дей-
ствия на пектиновую кислоту соответствует 4,0—4,8, а на
тетрагалактуроновую кислоту —3,3—3,5. Конечный продукт действия
фермента представляет собой смесь ди- и моногалактуроновых
кислот.
Дрожжевая эндополигалактуроназа имеет много сходства
с аналогичным ферментом, выделенным из культуры Asp. niger;
она разрушает олигогалактурониды также при кислом значении
рН с характерными показателями вязкости. Действие эндополи-
галактуроназы Asp. niger на пектиновую кислоту в зависимости
от значения рН показано на рис. 53.
В бактериях Вас. polymyxa [75, 76], Вас. species [57, 74],
Erwinia caratovora [73] и некоторых грибах — Asp. fonceanes [47],
Fusarium sp. [72]—обнаружены в основном трансэлиминазы.
1
а
1
о
Ш
3,0 3,5 4.0 4,5 5,0 5,5 рН
Рис. 53. Влияние рН на активность
эндополигалактуроназы Asp. niger:
/ — уменьшение вязкости 1%-ного
раствора пектиновой кислоты; 2 —
увеличение редуцирующих групп в процессе
действия фермента на О.ОТо-ный раствор
пектиновой кислоты; 3 — изменение
редуцирующих групп при действии на
0,5%-ный раствор тригалактуроновой
кислоты (по Mill. Tuttobello, 196I).
14*
211

Полагают, что бактериальные эндо- и экзотрансэлиминазы
вместе с пектинэстеразой составляют главную ферментную систему,
обеспечивающую гидролиз пектина. В то же время, по мнению
многих исследователей, микроорганизмы способны в основном
синтезировать в комплексе пектинэстеразу и полигалактуроназу
[50, 51, 101, 62, 25, 17, 32, 33, 5, 28]. При эффективном гидролизе
пектина необходимо тесное взаимодействие пектинэстеразы
и полигалактуроназы. В грибах и бактериях пектинэстераза
синтезируется вместе с полигалактуроназами.
ВЛИЯНИЕ СОСТАВА СРЕДЫ НА БИОСИНТЕЗ ФЕРМЕНТОВ
Хороший рост микроорганизма на той или иной среде еще не
может служить показателем максимального образования
нужного фермента. В то же время известно, что направленный синтез
ферментов обеспечивают специально подобранные среды и
прежде всего — источники углерода, азота и фосфора. Биосинтез
пектолитических ферментов микроорганизмами также связан
с присутствием в среде пектина. Пектолитические ферменты
относятся наряду с другими гидролазами к индуцированным
ферментам [99, 105, 32, 33, 34]. Добавляемый в среду пектин
индуцирует образование всего комплекса пектолитических
ферментов — полигалактуроназы [99, 78] и пектинэстеразы [89].
Индуцированный характер синтеза ферментов подтверждается не
только для Asp. niger, но и для других плесневых грибов: для
галактуроназы и пектинэстеразы Penicillium [86], для
пектинэстеразы Botrytis cinerea, для пектиназы Fusarium [90, 6] и Asp.
awamori [21, 16, 17].
Только эндополигалактуроназу, в противоположность экзо-
полигалактуроназе, относят к конститутивным ферментам [89,
42]. Так, например, Asp. foetidus — продуцент пектолитических
ферментов — культивируют на отрубях злаковых культур без
пектина [40], Con. diplodiella [49] и Scl. sclerotiorum — на
молочной сыворотке с лактозой [26]. Однако в основном
пектолитические ферменты получают при культивировании продуцентов
в глубинных и поверхностных условиях на средах, содержащих
пектин.
Влияние углеродного питания
Среди элементов, необходимых для жизнедеятельности
микроорганизмов, углерод занимает, как уже отмечалось ранее,
особое положение. Из органического состава микробной клетки
около 50% приходится на долю углерода [27]. Усвоение углерода
тесно связано с наличием в среде различных источников азота,
микроэлементов и др.
212

При глубинном культивировании плесневого гриба Asp. niger
на среде с глюкозой и фруктозой образуется достаточное
количество пектолитических ферментов; на среде с галактозой синтез
увеличивался в 1,5 раза по сравнению с другими
моносахаридами [99, 78].
На среде с сахарозой также синтезируется пектиназа
высокой активности, как и на среде с глюкозой и фруктозой. Если
накопление биомассы гриба Asp. niger находится в прямой
зависимости от концентрации сахарозы в среде (от 0,5 до 4,0%), то
в отношении биосинтеза пектолитических ферментов такая
зависимость не наблюдается. Оптимальной концентрацией
сахарозы в среде является 1—2%, что связано с показателем рН среды,
равным 4,1—4,8 [32, 33]. Внеклеточная пектолитическая
активность (ПкА) при этом соответствует 7,8—8,0 ед/мл, а
продуцирующая способность 1 г сухого мицелия — около 990 ед. '.
При внесении в среду крахмала образуются высокоактивные
ферменты, как и на среде с глюкозой, однако в опытах других
исследователей пектолитическая активность на средах с
крахмалом и декстринами в 3—5 раз ниже, чем на средах с моно-
и дисахаридами [99].
Плесневой гриб Asp. niger на средах с различными
источниками углерода (пектин, крахмал, инулин, лактоза, сахароза,
мальтоза, фруктоза, галактоза, глюкоза, глицерин в
концентрациях 2; 4 и 6%) образует максимальное количество ферментов
на пектине (418—460 ед/100 мл); на моносахаридах и глицерине
гриб совершенно не синтезирует их [31].
Использование смеси из полисахаридов и пектина позволяет
увеличить внеклеточную пектолитическую активность в 4—6 раз
по сравнению с активностью на средах с теми же источниками
углерода в той же концентрации, но без пектина. С увеличением
концентрации пектина (0,5; 1,0; 1,5%) пектолитическая
активность также возрастает, хотя и незначительно [31].
На фоне моносахаридов добавление пектина в несколько раз
улучшает рост гриба и обусловливает образование ферментов
на средах со всеми испытанными моносахаридами и глицерином
(до 480—636 ед/100 мл), в то время как в отсутствие индуктора
культура неактивна. Среда с лактозой (2%) и пектином (0,5%)
оказалась самой благоприятной для синтеза пектолитических
ферментов, причем внеклеточная активность их достигала
1014 ед/100 мл (а на 1 г сухой биомассы — 3070 ед.).
При изучении углеродистого питания Asp. awamori
установлена аналогичная закономерность, подтверждающая важную
1 Активность определяли объемным медным методом; количество медной
соли пектиновой кислоты устанавливалось иодометрически. Единица ПкА равна
количеству фермента, которое катализирует гидролиз 1 мг свекловичного пек-
типа за 1 ч при 38° С.
213

роль индуктора — пектина в биосинтезе пектолитических
ферментов (табл. 28). Среда с лактозой (2%) и пектином (0,5%)
оказалась для Asp. awamori, как и для Asp. niger, наиболее
благоприятной, обеспечивающей максимальное образование
фермента.
Таблица 28
Влияние источников углерода в среде на рост и образование пектолитических
ферментов при глубинном культивировании Asp. awamori [5]
Источник углерода в среде
4%
4%
4%
Лактоза 2% + пектин 2%
Сахароза 2% + пектин 2%
рН
конечный
5,9
6,0
7,0
7,0
4,2
4.5
3,0
3,5
Масса сухого
мицелия,
г
0,320
0,540
0,020
0,020
0,300
0.500*
1.120
1.250
Пектолитическая активность,
ед.
на 100 мл
среды
385,9
640,2
0,0
0,0
65,0
20,0
1894,2
864,3
на 1 г
сухого
иицелия
1206
1250
0,0
0,0
217
40
1600
690
Различные продуценты, вероятно, по-разному реагируют на
отсутствие в среде индуктора. В частности, активный штамм
гриба Asp. saitoi IAM 2217 — активный продуцент эндополигалакту-
роназы — синтезирует фермент и в отсутствие пектина в среде,
хотя добавление индуктора усиливает до некоторой степени его
синтез [104]. У трех вирулентных штаммов пенициллов (Реп.
italicum, Pen. digitalum, Pen. expansum) на средах с мальтозой,
лактозой и маннитом активность ферментов была или очень
слабая или вовсе отсутствовала [55]. Добавление к
модифицированной среде Чапека (с пектином, виннокислым аммонием, NaN03,
К2НРО4 0,1—0,2% и другими солями) зернового отжима
снижает выход фермента, и наоборот, содержание в среде сахарозы
(4%), пектина (2%) и NaN03 (1,15%) при соотношении С : N,
равном 10, обеспечивает хороший выход эндополигалактурона-
зы. При этом пектин является не только индуктором, но и
универсальным источником углерода для синтеза пектолитических
ферментов [99, 49, 47, 101, 32, 5, 28].
Избыток сахарозы в среде (более 2%) приводит к
торможению индуцированного синтеза пектолитических ферментов.
Глюкоза, добавляемая к среде с лактозой и пектином, также
репрессирует синтез. В этих условиях синтез ферментов тормозится
избытком не только глюкозы, но и фруктозы, сахарозы,
мальтозы и глицерина [31].
214

Торможение синтеза глюкозой и другими легко усвояемыми
источниками углерода необходимо учитывать при подборе
питательных сред для получения ферментных препаратов из
микроорганизмов в промышленных масштабах. По-видимому, это
явление характерно не только для гриба Asp. niger, но и для
Других продуцентов, в частности, для Asp. awamori.
Влияние азотного питания
Установлено, что синтез пектолитических ферментов
происходит при использовании различных источников азота
(нитратных, аммонийных), однако лучше всего он протекает при
наличии двузамещенного фосфата аммония [15, 16, 13], причем по
эффективности эта соль превосходит даже источники азота
органического происхождения — пептон и гидролизат казеина
(табл. 29).
Таблица 29
Влияние источников азота на биосинтез пектолитических ферментов
при глубинном культивировании Asp. niger [5]
Источники азота (0,15% по N)
(NH4)2HP04
NaN03
NH4N03
Гидролизат казеина . . .
Источники азота (0.15% по N)
(NH4)2HP04
NaN03
NH4N03
Гидролизат казеина ....
масса
сухого
мицелия, г
1,200
0,890
0,850
1,500
1,550
масса
сухого
мицелия, г
1,150
0,920
0,980
1,300
1,450
Лактоза 2% -f- пектин 2%
ПкА,
ед/100 мл
1820,7
880,6
810,9
1620,0
1350,0
Сахар
ПкА,
«а/100 мл
820,2
590,4
94,8
750,7
700,3
ПЭ
0,494
0,197
0,163
0,418
0,340
эза 2% +пе
ПЭ
0,163
0,083
Следы
0,160
0,120
пмг
ед'г
0,560
0,310
0,278
0,410
0,450
ктин 2%
пмг
ед г
0,420
0,280
0,060
0,340
0,370
ПГ
0,885
0,560
0,560
0 750
0,800
ПГ
0,580
0 520
0 320
0,500
0,530
Примечание. ПкА — пектолитическая активность устанавливалась
объемным медным методом по количеству нерасщепленного пектина до
и после воздействия на него фермента; ПЭ — пектинэстеразная
активность— по нарастанию кислотности; ПМГ — полиметилгалактуроназная —
по нарастанию редуцирующих групп, образующихся в результате
гидролиза гликозидных связей; субстратом служил пектин; ПГ — полигалакту-
роназная — по нарастанию редуцирующих групп; субстрат — пектовая
кислота.
215

В то же время для гриба Asp. awamori самым
благоприятным источником азота оказался неорганический азот в форме
сернокислого аммония (1890,4 ед/100 мл). Органические
источники азота в виде пептона и гидролизата казеина полностью
репрессировали синтез ферментов, обеспечивая хороший рост
гриба (1,150—1,00 г/100 мл). Сульфат аммония (0,6%)
оказывает благоприятное действие на синтез полигалактуроназы Asp.
foetidus; вытяжка из отрубей (полученная при помощи 10%-ной
глюкозы) и экстракт дрожжей (10%) также обеспечивали
образование активного фермента [2].
При использовании оптимальных источников азота —
(NH4)2HP04 (для Asp. niger) и (NH^SCU (для Asp. awamori)
наблюдается подкисление культуральной жидкости до величины
рН 2,5—3,0.
При таких низких значениях конечной величины рН
отмечается хорошее накопление фермента. Таким образом
рекомендовать единый источник азота для различных видов
плесневых грибов не представляется возможным.
Установлено, что добавление к среде кукурузной муки и
солодовых ростков (от 0,5 до 2%) увеличивает внеклеточную пек-
толитическую активность до 13—14 ед/мл, или на 60% по
сравнению с контролем [32].
Для биосинтеза пектолитических ферментов имеет значение:
также соотношение компонентов среды и прежде всего —
углеводов и азота. По-видимому, оптимум соотношения С : N должен
варьировать в пределах от 7 : 1 до 13 : 1. Необходимо также и
определенное соотношение между пектином и углеводами. В
частности, соотношения 1 : 2; 2 : 2; 3 : 2 и 4 : 2 способствуют созданию
благоприятных условий для роста гриба и синтеза
пектолитических ферментов. Однако при минимальном содержании пектина
(около 0,8%) соотношение между индуктором и сахарозой
должно быть 1 : 2 [32].
Таким образом аммонийные соли серной, фосфорной и
азотной кислот благоприятно влияют на синтез пектолитических
ферментов и являются источниками азота для плесневых грибов,
продуцирующих эти ферменты. Нитратные соли щелочных
металлов подавляют синтез ферментов. Известно, что в
ассимиляции плесневыми грибами аммонийных и нитратных форм азота
большую роль играет реакция питательной среды. Так,
например, нитратный азот потребляется при рН 3,0, а так как при
росте на средах с добавлением нитратных солей щелочных
металлов рН составляет 5,2—5,8, то тем самым способность
продуцента к потреблению нитратной формы азота понижается.
Плесневые грибы в состоянии ассимилировать различные
формы органического азота. В практике часто используют
экстракты арахисовой муки, кукурузный экстракт, соевые бобы,
солодовые ростки, отруби злаковых культур, пептон и др. [99, 5,
216

33, 1, 49, 16]. На синтез пектолитических ферментов
благоприятное действие оказывают органические формы азота в смеси с
минеральными при оптимальном их соотношении.
Влияние минерального питания
Минеральное питание в свою очередь оказывает влияние на
биосинтез ферментов и прежде всего на физиологическое
состояние микроорганизма. При этом необходимым компонентом
среды является фосфор. Содержание его в среде должно быть
не менее 8—11 мг%. При использовании в качестве источника
азота двузамещенного фосфата аммония потребность гриба
в фосфоре целиком покрывается.
С учетом оптимальных соотношений азота и углерода,
пектина и углеводов, была подобрана производственная среда, в
состав которой входили: свекловичный жом (3—4%); кукурузная
мука (0,5%); (NH4)2HP04 (0,7%); MgS04 (0,05%). При
исключении кукурузной муки состав среды необходимо восполнять
солодовыми ростками (0,5%), а аммонийный фосфат —
(NH4)2C204. При возможности можно эффективно использовать
виноградные выжимки или стержни кукурузных початков [18].
Представляет интерес микроорганизм Botrytis cinerea —
активный продуцент пектолитических ферментов [95]. Он образует
комплекс ферментов, активность которых определяет
интенсивность процесса мацерации растительных тканей. Внеклеточные
ферменты этого микроорганизма полностью разрушают ткани
(редиски, моркови, батата, картофеля, дольки апельсина и др.).
Для глубинного культивирования Botrytis cinerea подобрана
питательная среда, состав которой несколько меняется в
зависимости от размера ферментатора.
Состав среды (в г/л) для Состав среды (в г/л) для
культивирования в фермента- культивирования в
ферментаторе на 30 л торе на 500 л
Пектин 12,5 Экстракт пшеничных
Пептон 6,0 отрубей 0,5
NH4N03 0,5 Сахароза 17,5
КН2Р04 0,5 Пептон 6,0
MgSCy7H20 0,2 NH4NO3 0,5
FeS04 Следы KH2P04 0,5
MgSCy7H20 0,2
FeS04 Следы
Примечание. Экстракт пшеничных отрубей готовили
кипячением в течение часа смеси, состоящей из 20 г отрубей
и 1 л водопроводной воды; дробину отделяли фильтрованием.
Установлено, что синтез эндополигалактуроназы (эндо-ПГ),
экзополигалактуроназы (экзо-ПГ) и полиметилгалактуроназы
217

(ПМГ) происходит одновременно (параллельно) с ростом
плесневого гриба и только образование пектинэстеразы (ПЭ)
задерживается, по-видимому, вследствие репрессивного действия
продуктов гидролитического распада пектина. Если
полигалактуроназы могут синтезироваться молодыми клетками за первые 8 ч
роста, то пектинэстераза образуется более зрелыми клетками за
время от 6 до 26 ч развития гриба. Длительность роста
микроорганизма и образования фермента зависит от количества
посевного материала и интенсивности аэрирования среды (табл. 30).
Таблица 30
Рост гриба Botrytis cinerea и синтез им эндополигалактуроназы в зависимости
от количества посевной культуры и степени аэрации
Количество
посевного
материала, %
0,5
2,0
0,8
0,8
1.0
5,0
Количество
воздуха,
Л'ЛШН
10
10
15
20
20
20
Необходимое время
культивирования, ч
для
завершения
роста
58
27
41
36
32
22
для
максимального
получения

эндополигалактуроназы
96
73
75
63
59
46
Сухая
биомасса1
■мг мл
3,25
4,64
5,83
4,18
3,98
4,80
Максимальная
активность,
ед \Мл
280
330
460
420
470
380
Вероятно образование полигалактуроназы и
полиметилгалактуроназы происходит параллельно процессу мацерации
корнеплода батата и коры Ganpi, осуществляемому соответственно
при рН 3,0 и 4,0. Мацерация же клубней картофеля,
наблюдаемая при рН 4,5, совпадает с высокой активностью
пектинэстеразы.
Условия культивирования, безусловно, оказывают влияние
не только на соотношение между пектинэстеразой и полигалак-
туроназой, но и на образование других сопутствующих
ферментов: целлюлолитических, протеолитических и др. Такой богатый
комплекс ферментов образует продуцент Asp. niger при
культивировании на среде, включающей свекловичный жом, пшеничные
отруби и минеральные соли [12].
Условия культивирования плесневого гриба в 30-литровом
ферментаторе, характеризующиеся внесением в среду 10—20 мл
посевного материала на 1 л, скоростью перемешивания
400 обIмин и аэрированием 0,75—1,0 л/л в минуту, обеспечивают
синтез полигалактуроназы и полиметилгалактуроназы высокой
активности. В этих условиях, оптимальных для биосинтеза фер-
218

ментов, достигается одновременно и наиболее высокая мацера-
ционная способность культуральной жидкости.
Оптимальные условия для синтеза полигалактуроназы
грибом Asp. foetidus также создаются при интенсивном
аэрировании, соответствующем 60 л воздуха в час на 1 л среды, и
перемешивании со скоростью 460 об/мин [2], причем применение
кислорода вместо воздуха значительно увеличивает синтез ферментов.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ К ГЛАВЕ VII
1. Астапович Н. И. Сб. «Проблемы современной биологии». Изд-во
АН БССР, Минск, 1967.
2. Балькай А., В а ш К. Сб. «II Международный симпозиум
бродильной промышленности». Лейпциг, 1968.
3. Барнашева Г. С, Сапожникова Е. В. «Прикладная
биохимия и микробиология». Т. 4. Вып. 3. 303, 1968; т. 6, вып. 4, 401, 1970.
4. Бекетова Л. И. Изучение распада пектиновых веществ ягод при
использовании промышленного ферментного препарата. Диссертация. Алма-
Ата, 1968
5. Б л и е в а Р. К. Изучение биосинтеза пектинрасшепляющих
ферментов при глубинном культивировании плесневых грибов из рода Aspergillus.
Канд. дисс. АН КазССР. Алма-Ата, 1967.
6. Б р о у н, В у д Р. Экологическая адаптация грибов. Адаптация у
микроорганизмов. М. ИЛ, 1956.
7. Вербина Н. М., Ц ы п у р а О. И. «Микробиология». Т. XXXVIII,
Вып. 1. 29, 1969.
8. Высоцкая М. А. В сб.: «Внедрение ферментных препаратов в
народное хозяйство». ЦИНТИпищепром, 1962.
9. Г а п о и е н к о в Т. К., П р о ц е н к о 3. И. «Микробиология». Т. XXIX.
Вып. 5. 668, 1960.
10. Г а п о и е н к о в Т. К, Н а г у м а н о в а СТ. «Прикладная биохимия
и микробиология». Т. 4. Вып. 5, 597, 1968.
11. Дианова О. П. Способ повышения пектолитической активности
гриба Aspergillus niger. Канд. дисс. АН КазССР. Алма-Ата, 1968.
12. Ж Д а н о в с к и й В., О с.т а ш е в и ч Д. Сб. «II Международный
симпозиум бродильной промышленности». Лейпциг, 1968.
13. К р е т о в и ч В. Л. Введение в энзимологню. М. Изд-во «Наука», 1967.
14. Л ифшиц Д. Б. и др. Тезисы докладов межвузовской конференции
по вопросам применения ферментных препаратов в бродильной
промышленности. Изд. Воронежского технологического института. Воронеж, 1967.
15. Л ифшиц Д. Б., П л о т н и к о в а Д. Е. и др. «Прикладная
биохимия и микробиология». Т. 5. Вып. 4. 491, 1969.
16. Л о с я к о в а Л. С, М и ш и н а 3. Н. Подбор питательной среды для
выращивания гриба Asp. niger. Сб. «Пищевая промышленность». № 5,
ЦИНТИпищепром. 7, 1964.
17. Лосякова Л. С, М у ш н и ко в а Л. Н., Мишина 3. Н.
«Микробиологический синтез», № 6. 7, 1969; там же, № 6, 1970.
18. Малченко А. Л., X е р с о н о в а Л. А., М о р о з о в а В. Т.
«Ферментная и спиртовая промышленность». 1966. № 2, П.
19. Мельник А. В., А р а с и м о в и ч В. В. «Биохимия плодов и
овощей». Сб. 7, 207, 1962.
20. Микеладзе Г. Г. Основы применения пектолитических фермент-
пых препаратов в производстве плодоягодных соков и безалкогольных
напитков. Докт. дисс. МТИПП, 1969.
21. Мушннкова Л. Н., Лосякова Л. С, Яровенко В. Л. Сб.
«Микробиологический синтез». № 1. 25, 1968
219

22. П л о т н и к о в а Д. Е., Л и ф ш и ц Д. Б. и др. «Прикладная
биохимия и микробиология». Т. 5. Вып. 5. 623, 1969.
23. Попова Е. М. «Микробиология». Т. XV. Вып. 4. 313, 1946.
24. Попова Е. М. «Биохимия виноделия». № 6. 31, 1960.
25. С а л м а н о в а Л. С. Влияние состава среды на ферментативную
активность производственных штаммов плесневых грибов Aspergillus и
получение очищенного препарата пектиназы. Диссертация. МТИПП. 1955.
26. Самцевич С. А., А ст а п о в и ч Н. И. Авторское свидетельство
№ 1240092/28—13, 1969.
27. С а п о ж н и к о в а Е. В.. Т и щ е и к о В. П. «Успехи биологической
химии». Т. 10. 164, 1969.
28. Смирнов В. И. Исследование пектолитических ферментов,
продуцируемых глубинной культурой Aspergillus niger. Диссертация. Кишинев, 1968.
29. С м и р н о в В. И. Сб. «Растительные полисахариды». Изд-во АН
МолдССР. 126. 1970.
30. С о с и и а С. М. и др. Труды ВНИИ по производству пищевых
продуктов из картофеля. Вып. 1. Ill, 1964.
31. Фениксов а Р. В., М ол д а б а е в а Р. К. «Прикладная биохимия
и микробиология». Т. XXXVI. Вып. 3. 283, 1967.
32. X е р с о н о в а Л. А. «Ферментная и спиртовая промышленность».
1964, № 3.
33. X е р с о н о в а Л. А. Исследование процесса образования
пектолитических ферментов при глубинном культивировании Asp. niger П. Канд. дисс.
МТИПП. 1965.
34. Ч е к а и Л. И., 3 а х а р о в И. П. и др. Консультации и обмен
опытом в пивоваренной, безалкогольной и дрожжевой промышленности, 1940.
35. Энкер П. Б. Ферментативное разрушение пектиновых ягод с
участием винных дрожжей. Автореферат канд. дисс. АН КазССР. Алма-Ата. 1968.
36. Albersheim P. Biochem. Biophys. Res. Comm., v. 1, 253, 1959.
37. A 1 b e r s h e i m P., N e u k о m H., Deuel H. Arch. Biochem. Biophys.,
v. 90, 46, 1960; Helv. chim. acta, 43, 1422, 1960.
38. А у r e s A., D i n g 1 e J. et al. Nature v. 70, 834, 1952.
39. Bell Tn. A„ E t ch e 1 1 s F. A-ppl. Microbiol., v. 4, 1956.
40. Brooks J., Re id W. Chemistry and Industry, v. 2, 325, 1955.
41. Demain A., Phaf f H. J. Biol. Chem., v. 210, N 1, 381, 1954.
42. D e m a i n A., P h a f f H. Wallerstein Laboratories communications,
v. 20, N 69, 119, 1957.
44. Calesnick E., H u 1 s H.. W i 11 a m a n J. Arch. Biochem., v. 28,
433, 1950.
45. Ceponis M. I., F r i e d m a n B. A. Phytopatology, v. 49, N 3, 141,
1959.
46. Deuel H., Stuts E. Advances Enzymology, New York, v. 20. 341,
1958.
47. Edsrom R., Phaff H. J. Biol. Chem., v. 239, N 8, 2403, 1964;
v. 239, N 8, 2409, 1964.
48. Ed wads J., Joslyn H. Arch. Biochem. Biophys., v. 39, 51, 1952.
49. En do A. Agr. Biol. Chem., v. 25, N 5, 394, 1961; v. 25, N 5, 389 1961
50. Endo A. Agr. Biol. Chem., v. 27, N 11, 751, 1963.
51. Endo A. Agr. Biol. Chem., v. 28, N 8, 535, 1964.
52. Endo A. Mivra V Agr. Biol. Chem., v. 25, N. 5, 1961.
53. Fergus C, Wharton D. Phytopatology, v. 47, N 11, 635, 1957.
54. Furiichi M., Okomoto T. J. Agr. Chem. Soc. Japan, v. 28. N 9,
1954.
55. Garber E., В e r a h a L., Shaffer S. Bot. Gaz., v. 126, N 1, 36,
1965.
56. H a r a d a V, T a u j a m a N. J. ferment, technology, v. 44, N 11, 1966.
57. Hasegawa S.. N a gel С J. Food Sci., v. 31, N 6. 838, 1966;
Nature, v. 213, N 5072, 207, 1967.
220

58. Н о b s о п Е. Biochem. J., v. 85, N 2, 358, 1963.
59. Jermyn M., Tomkins R. Biochem. J., v. 47, 437, 1950.
60. Johnson M. J. Recent Progress in Microbiology. С Tunevall, ed.
Almquist and Wiksell, Stockholm, 397, 1959.
61. К a j u A. Bull. Chem. Soc. Japan, v. 23, N 2, 1959.
62. К a u n a t A, Helmut R, Bernhard K. Chem. abstracts, v. 72,
29107—n, 1970.
63. К о 11 e r A. Diss. N 3774. Abhandl. Erlang wiirde. Dokt. techn. Wiss.
Techn. Hochschule. Zurich. 1966.
64. Kertesz Z Comprehesive biochemistry, v. 5, N 7, 233, 1963.
65. Kraght A., Starr M. Arch. Biochem. Biophys., v. 42, N 2, 271,
1953.
66. Lineweaver H., Jansen E. Advance Enzymology and Related
subject Biochem.. v. 11, 650, 1951.
67. Luh B. S„ Phaff H. Arch. Biochem. Biophys., 48, 23, 1954.
68. McColloch R., Kertesz Z. Food Technol., v. 3, 94, 1949.
69. McGready R., Seegmiller G. Arch. Biochem. Biophys., v. 6,
N 12, 50, 1954.
70. Mill P. Biochem. J., v. 99, N 3, 551, 1966; v. 99, N 3, 562, 1966.
71. M i 11 P., T u 11 о b e 11 о R. Biochem. J., 79, 57, 1961.
72. Millar R. Phytopathology, v. 55, N 2, 130, 1965.
73. M о r a n F., N a s u m о S., S t a r r M. Arch. Biochem. Biophys., v. 125,
734, 1968
74. Nagel C.Hasegawa S. Arch. Biochem. Biophys., v. 118, N 3,
590, 1967.
75. N a g e 1 C, Vaughn R. Arch. Biochem. Biophys., v. 94, N 2, 328,
1961.
76. Nagel C, Vaughn R. J. gen. microbiol., v. 83, N 1, 1962.
77. Nasuno S., S t a r r M. J. Biol. Chem., v. 241. N 22, 5298, 1966.
78. Nyeste Z., H о 11 о J. Z. Allg. Microbiol., 3. 1, 1963.
79. О i S. Agr. Biol. Chem. Tokyo, v. 29, N 10, 936, 1965.
80. Patel D„ Phaff H. J. Biol. Chem., v. 234, N 2, 237, 1959.
81. Phaff H. Arch. Biochem., 13, 67, 1947.
82. P h a f f H., D e m a i n A. J. Biol. Chem., v. 280, N 2, 875, 1956.
83. Pollards А., К i e s e r M. J. Sci. Food and Agr., v. 2, N 1, 30, 1951.
84. Press y, Ashwell C. J. Biol. Chem., v. 238, 1571, 1963.
85. Reia W. Nature, v. 166, N 4222, 569, 1950; v. 166, 76, 1950.
86. Rexova — Benkova L., SlezarikA. Collect. Czechosl. Chem.
Communs, v. 31, 122, 1966.
87. Roboz E., Barratt R., Tatum E. J. Biol. Chem., v. 195, N 2,
459 1952
88. Rous A., At veins C, Moore E. J. Food Sci., v. 27, N 5, 282,
1962.
89. S a i t о H. J. Gen. Appl. Microbiol., 1, 38, 1955.
90. S a r b h a i R. P., Husain Akhter. Z a b a e v. J. Sci. and Technol.. 2. 30,
1964.
91. Schubert T. E. Nature, v. 169, N 4309, 1952; Helv. chim. acta, v. 37,
N 3 691 1954.
' 92.'Seingle R., Wood R. Ann. Bot., v. 20, 77, 1956.
93. Seegmiller G.. Jansen E.J.Biol. Chem., v. 195, N1, 327,
1952.
94. Solms J., Deuel H. Helv. chim. acta, v. 35, 7, 1952; v. 38, 321,
1955.
95. T a g a w а К., К a j i A. J. Ferment. Technol., v. 45, N 4, 1967.
96. Takahana H., О g u r a N. J. Agr. Chem. Soc Japan, v. 29, N 1,
83, 1955.
97. T о j a m a N., О w a t a s h i H. J. fermentation technology, v. 44, N 11,
1966.
221

98. Т о j a m a N., F u j и N.. О g a w а К. J. fermentation technology,
v. 44, N 10, 791, 1966.
99. Tut t obeli о R., Mill P. J. Biochem. J., 79. 239, 1961.
100. Uchino F., Kurono V о s, Dio Sn. J. Agr. Biol. Chem., v. 30,
1066, 1966.
101. Vasu S. Rew. roum. Biochem., v. 4, N 1. 67, 1967.
102. Waggoner P., Dimond A. Phytopath., v. 45, 79, 1955.
103. Winstead N„ Walker I. Phytopathology, v. 44, N 3, 1954.
104. J a m a s а к i M„ Jasui Т., A r i m a K. Agr. Biol. Chem., v. 30, N 2,
142, 1966.
105. Z и г Н. Arch. Microbiol., 45, 2, 1&63.
ГЛАВА VIII
ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ
КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ
Разложение целлюлозы ферментами микробного
происхождения имеет большое практическое и теоретическое значение.
Целлюлоза (клетчатка) является наиболее широко
распространенным углеводом в природе. Если синтез целлюлозы
осуществляется почти исключительно зелеными растениями, то ее распад
в процессе круговорота веществ в природе — преимущественно
микроорганизмами — продуцентами целлюлазы. В результате
микробного гидролиза клетчатки атмосфера ежегодно
пополняется значительным количеством углекислоты, необходимой
для обеспечения условий жизни на Земле.
Согласно современным представлениям целлюлоза является
ангидроглюкозным полисахаридом, полимерная цепь которого
состоит из глюкозных единиц или остатков целлобиозы,
соединенных р-1,4-глюкозидными связями. Молекулы целлюлозы,
имеющие нитевидную форму, соединены водородными связями
в пучки — мицеллы, или микрофибриллы [69, 70, 2], каждая из
которых состоит приблизительно из 60 молекул. Нерастворимые
волокна целлюлозы создаются, по-видимому, путем
параллельного расположения длинных молекул и устойчивы к внешним
воздействиям благодаря плотной упаковке их. Мицеллы имеют
определенную ориентацию к оси волокна и достигают длины
о о
600 Айв поперечнике 50—60 А; микрофибрилла имеет ширину
100—300 А и толщину 40—100 А.
В растительных тканях клетчатка, как правило, связана с ге-
мицеллюлозами, пектином, лигнинами, которые оказывают
значительное влияние на ее доступность ферментативному
действию. Предварительно неизмененная целлюлоза трудно
подвергается гидролизу ферментами. Деградированная целлюлоза,
222

особенно щелочью, или ее водорастворимые производные на 95%
превращаются в глюкозу.
Ферментативный гидролиз целлюлозы. Многокомпонентность
целлюлазы. Биохимические процессы ферментативной
деградации целлюлозы включают следующие, последовательно
осуществляемые процессы:
1) разделение мицеллярного волокна на отдельные
молекулы; 2) расщепление поперечных связей на линейные цепи ангид-
росахара и 3) гидролитическое расщепление глюкозидных
связей.
Кроме того в кристаллической области целлюлозы должен
произойти разрыв водородных связей, которые представляют
собой вторичные силы, удерживающие молекулы целлюлозы
в правильном порядке. Эти связи действуют между первичными
гидроксильными группами одной цепи и гидроксильными
группами на С-3 соседних цепей. Следовательно, один атом
водорода притягивается двумя атомами кислорода так —О—Н...0—,
что он действует как связь. Энергия, заключенная в водородной
связи, равна приблизительно 5 ккал/моль, тогда как ковалент-
ная связь —О—Н—содержит 110,2 ккал/моль. В свою очередь
силы Ван-дер-Ваальса, участвующие в молекулярных
ассоциациях аморфной области целлюлозы, имеют еще меньшую
величину, чем водородные связи. Это способствует
предпочтительному использованию аморфной части целлюлозы.
Согласно современным представлениям, процесс
ферментативного гидролиза нативной целлюлозы происходит под
действием комплекса целлюлаз, состоящего из Q — С^-ферментов
и р-глюкозидазы, по схеме [79, 64, 82]:
Целлюлоза : >Реактивная : > Целлобиоза : > Глюкоза
>Реактивная-
целлюлоза
С,
р-глюкозидаза
Многокомпонентность целлюлазного комплекса признается
многими исследователями [79, 48, 52, 74, 75, 83, 84, 30, 31, 91, 15,
16, 26, 97, 34, 13]. Признают, что d-фермент, впервые
выделенный из экстракта культуры Trichoderma koningi [5, 4],
превращает нативную целлюлозу в реактивную, которая подвергается
воздействию С^-ферментов, гидролизующих глюкозидные связи
с образованием целлобиозы; последняя расщепляется р-глюко-
зидазой до глюкозы.
Кроме Ci- и Огферментов был выделен также Сг-фермент,
близкий ферменту Q [71]. Под действием Сгфермента нативная
целлюлоза вначале набухает, затем подвергается воздействию
223

С2-фермента и растворяется до целлодекстринов, которые под
действием С^-фермента расщепляются до целлобиозы.
Многокомпонентные целлюлазы были выделены из гриба
Myrothecium verrucaria [67]. При этом первый компонент гидро-
лизовал хлопковое волокно и был назван А-ферментом (мол.
масса 55000); второй компонент, названный Б-ферментом (мол.
масса 30000), обладал высокой активностью по отношению
к Na-KM-целлюлозе (натриевая соль карбоксиметилцеллюло-
зы). Эти ферменты сходны с ранее указанными Ci и С*
ферментами.
Путем электрофореза было установлено 6 белковых фракций
целлюлазы Myrothecium verrucaria, однако из них только
3 компонента активно гидролизовали нативную и растворимую
целлюлозу [49]. У гриба Irpex lacteus были обнаружены даже
9 компонентов с целлюлазной активностью [68], а у гриба Poly-
porus versicolor — 4 компонента, из которых один был р-глюко-
зидазой [74, 75]. Все эти ферменты имели разные молекулярные
массы и отличались между собой как по характеру, так и по
скорости действия на целлюлозу. Компоненты целлюлазы,
выделенные из гриба Trichoderma viride и обладавшие разными
ферментативными свойствами, были названы гидроцеллюлазой,
эндоглюконазой и экзоглюконазой [58, 61]. Гидроцеллюлаза
обладала способностью разрушать кристаллическую целлюлозу
с образованием целлобиозы. Эндоглюконаза оказывала
воздействие на относительно длинные цепи аморфной целлюлозы, эк-
зоглюконаза завершала гидролиз продуктов, полученных в
результате действия как первого, так и второго фермента.
В то же время известна и иная, противоположная точка
зрения, согласно которой признается гомогенность, однокомпонент-
ность целлюлаз [92, 93, 94, 38]. В частности, показана
гомогенность целлюлазы Myrothecium verrucaria [92, 93, 94], Stereum
sanguinolentum [38, 45], Penicillium notatum [77] и термофильных
бактерий [5]. Показано, например, что гомогенная целлюлаза
Муг. verrucaria представляет собой эллипсоидной формы белок
о
с размерами примерно 50 X 200 А и молекулярной массой 63 000
[93, 94] или 49 000. Фермент имеет 14 цистеиновых остатков [95,
96]. Однако признание многокомпонентной целлюлазы позволяет
создать стройную схему гидролиза субстрата, подтверждаемую
многими фактами. Так, например, препарат целлюлазы, полу*
ченный из гриба Trichoderma viride, содержит 4 компонента,
которые синтезируются в разное время роста микроорганизма.
Если активность целлюлазного третьего компонента
проявляется в начале инкубационного периода, то активность компонента
С2 в это время почти не обнаруживается; или значительная
активность С[ отмечается в то время, когда она не
обнаруживается у С2. Некоторые из компонентов целлюлазы разделяются на
224

разных колонках — газовой и ДЭАЭ-целлюлозы [71]. В
зависимости от специфичности действия компонентов целлюлазы их
активность определяется по разным субстратам: так, например,
активность G-фермента—по осахариванию хлопкового
волокна, а активность Сх-фермента — по способности уменьшать
вязкость раствора Na-KM-целлюлозы со степенью полимеризации
347 и степенью замещения 65,3 [23].
Строение целлюлазы. Целлюлолитические ферменты
являются, вероятно, глюкопротеинами [74, 75]. Наиболее часто
встречающимся углеводом в целлюлазе является манноза [54, 46]. Цел-
люлаза гриба Pen. notatum богата кислыми и ароматическими
аминокислотами. Предполагают, что N-конечной и С-конечной
аминокислотой является аланин [76, 77]. Аминокислотный
состав разных препаратов (II, III и IV) Trichoderma viride
подобен и характеризуется высоким содержанием кислых
аминокислот (глицина, серина и треонина) и низким содержанием
основных и содержащих серу аминокислот. Они включают 10—15%
углеводов, состоящих из нейтральных Сахаров и глюкозоамина
[72]. Более полно представлен аминокислотный состав
компонентов целлюлазы Polyporus versicolor. Он включает по крайней
мере 16 аминокислот: лизин, гистидин, аргинин, цистеиновую
кислоту, аспарагиновую кислоту, метионин, треонин, серии, глю-
таминовую кислоту, пролин, глицин, аланин, валин, изолейцин,
тирозин, фенилаланин.
ПРОДУЦЕНТЫ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
Разложение волокон целлюлозы анаэробными бактериями
впервые было установлено Поповым (1875), а грибами — де
Бари (1886). Затем были проведены классические исследования
В. А. Омелянским и С. Н. Виноградским. Микробиология
целлюлозы в отношении бактерий обстоятельно представлена
исследованиями А. А. Имшенецкого и обобщена им в монографии
«Микробиология целлюлозы» [9]. За последнее время проведены
обстоятельные исследования по отбору активных продуцентов
целлюлаз, изучению их физиолого-биохимических особенностей,
условий биосинтеза и свойств целлюлолитического комплекса
[1, 2, 3, 4, 15, 24, 25, 31, 84, 11, 12, 34, 13].
Среди значительного количества микроорганизмов,
принимающих участие в деградации целлюлозы, известны анаэробные
бактерии и аэробные микроскопические грибы. Некоторые из
них приведены ниже.
Наиболее выраженной способностью синтезировать
целлюлолитические ферменты обладают микроскопические грибы рода
Alternaria, Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Penicillium,
Cladosporium и др. Микроскопические грибы, выделенные из
почвы ризосферы, растительных остатков, торфа и других при-
15 Заказ 7
225

Микроорганизмы, разрушающие целлюлозу
Систематическая группа микроскопических _ .
грибов и бактерий Литературный источник
Alternaria tenuis [35, 13, 6]
То же, шт. 56160, 12217, 13869
Aspergillus amstelodamy
Aspergillus fumigatus .... [80, 15, 16]
Aspergillus flavus
Aspergillus luchnensis
Aspergillus niger
Aspergillus oryzae
Aspergillus sydovii
Aspergillus terreus
Ceilvibrio gilvus
Cephalosporium sacchari
[80]
[80]
[80, 42, 30, 31], Ghose, 1968
[55, 6]
[80]
Pal, Ghosh, 1965, [16, 7]
[43]
Sinah, Zal, 1967, Каневская,
1970
Chaetomium globosum [39, 55, 31, 33], Gonatt, 1958
Ch. elatum и Ch. funicolum . . . Punarek, 1967
Chrysosporium lignorum [461
Cladosporium herbarum (11 шт.) . . [13]
Coniophora puteana Punarek, 1967
Fusarium culmorum [78]
Fusarium oxysporum [70], Husain, Dimond, 1960,
Deese, Stahmann, 1962
Fusarium solani Merrill, Frennch, 1966
Helminthosporium sativum (45 шт.) {13]
Irpex lacteus (68]
Merulins lacrymans Punarek, 1967
Myrothecium verrucaria . . [31, 33, 80, 84, 92, 95], Han-
stein, Whitaker, 1963
Penicillium notatum [73, 77, 3]
Penicillium variabile [16, 7]
Periconia stemonites (2 штамма) . [13]
Polyporus versicolor [74, 75]
Pullularia pullulans (35 видов) . . . Robak, 1932
Pyrenochaeta terrestis [53]
Rhizina undulata [69]
Rhizopus species Gose, 1968
Stachybotrys alternans (S. lobulata,
S. atra) [13, 31, 55]
Stemphylium botryosum (3 штамма) [13]
Stemphylium macrosporoidea . . Robak, 1932
Stereum sanguinolentum .... [45, 46, 41, 38]
Stysanus stemonites (3 штамма) . [13]
Trichoderma koningi [90, 54, 97, 34]
Trichoderma lignorum .... [34]
Trichothecium roseum [6]
Trichoderma viride [90, 31, 33, 58, 84, 28, 61]
Verticillium Каневская, 1970
родных источников, как правило, проявляют способность к
синтезу целлюлолитических ферментов [34, 13]. Так, например, из
150 штаммов Alternaria tenuis активно разлагают
фильтровальную бумагу 80%, из 100 штаммов Alternaria circinans — 85%, из
130 штаммов Cladosporium herbarum — 80% и т. д. [11, 13].

ВЛИЯНИЕ СОСТАВА СРЕДЫ НА БИОСИНТЕЗ ФЕРМЕНТОВ
Как уже отмечалось ранее, биосинтез ферментов, в том числе
и целлюлолитических, зависит как от генетических свойств
микроорганизма, так и от условий внешней среды, в частности, от
источников питания.
Влияние углеродного питания
Установлено, что целлюлолитические ферменты обычно
синтезируются микроорганизмами в среде, содержащей целлюлозу
[80, 37]. Так, например, грибы Trichoderma lignorum и Тг. konin-
0 2 U В 8 10 0 2 4 6 8 10
Возраст культуры, сутки
Рис. 54. Биосинтез целлюлаз грибами Tr. lignorum (a)
и Тг. koningi (б). Активность Cs-ферментов выражена
в ед., Сг-ферментов в ед/мл культуральной жидкости.
gi обеспечивают наиболее высокий уровень биосинтеза целлю-
лазы при росте на среде, содержащей в качестве источника
углерода фильтровальную бумагу (рис. 54) [34]. Для
образования целлюлазы грибом Myrothecium verrucaria наилучшим ис*
точником углерода является также целлюлоза в виде
фильтровальной бумаги и целлюлозосодержащие отходы — стержни
кукурузных початков и свекловичный жом [30, 31].
На минеральной среде с хлопковым волокном или
целлюлозным порошком указанный продуцент максимально синтезирует
целлюлазу за 7—8 суток [51, 96]. Однако этот же вид гриба,
а именно Myrothecium verrucaria, максимально синтезирует
Срфермент, определяемый по осахариванию хлопка, на вторые
15*
227

или третьи сутки роста [28]. При этом использовалась
минеральная среда (NH4N03, KH2P04, MgS04, дрожжевой экстракт
0,05%) с различными источниками углерода: бумага, линтер,
крахмал, жом, стержни початков, отруби, целлобиоза, глюкоза,
сахароза. Активность С^-фермента, определяемая вискозимет-
рически, достигает максимума в четырехсуточной культуре
гриба, выращенной на всех испытанных субстратах, за
исключением среды, содержащей в качестве источника углерода глюкозу,
крахмал и сахарозу. Наибольшая активность Сх-фермента
(54,9 ед.) проявляется при выращивании гриба на
фильтровальной бумаге. Для синтеза целлюлазы грибом Trichoderma viride
наилучшим источником углерода из 62 испытанных также
оказалась целлюлоза [64]. Интересно отметить, что первоначально
целлюлаза Тг. viride появляется в культуральной жидкости,
затем в клетках мицелия гриба. У темноцветных гифомицетов
(Alternaria tenuis, Cladosporium herbarum, Stysanus stemonites)
наиболее высокая активность С! и Сх-ферментов отмечается при
культивировании на среде Чапека с фильтровальной бумагой
или отрубями, причем концентрация этих источников варьирует
от 0,5 до 1,0%, тогда как для гриба она повышается до 2—3%
(табл. 31).
Таблица 31
Влияние некоторых источников углерода на образование С, и Сх-ферментов
темноцветными гифомицетами [13]
Источники углерода
Фильтровальная
бумага
Хлопковое волокно
Отруби
Целлофан
Карбоксиметилцеллю-
лоза
Глюкоза
Длительность

выращивания, сутки
6
12
6
12
6
12
6
12
6
12
6
12
Активность1 ферментов, продуцируемых
Alt. tenuis
56160
с,
0,80
0,20
0,60
0,20
12,0
9,50
0,65
0,20
0,40
0,20
0
0
с
X
13,0
7,70
, 8,90
5,10
30,1
17,5
10,4
5,10
6,10
3,00
0
0
С1.
herbarum
8249
с,
0,10
4,40
0,15
0,10
0,30
6,50
0,10
0,30
0,10
0,10
0
0
с
X
0,80
3,30
1,00
0,80
2,00
10,5
0,40
2,00
0,90
0,80
0
0
Peric.
stemonites
5124
С,
1,20
5,80
2,50
4,00
0,80
8,00
0,80
3,50
0,20
0,40
0
0
с
X
6,70
17,9
2,60
6,30
2,60
13,6
3,80
8,50
2,00
2,00
0
0
Stys.
stemonites
5130
с,
0,50
1,20
1,50
3,00
8,00
9,50
0,30
3,50
0,20
0,40
0
0
С
X
2,00
4,10
4,60
8,10
13,8
15,00
0,10
8,50
3,60
7,70
0
0
1 Целлюлазная активность выражена в мг% глюкозы.
Термотолерантный гриб Aspergillus fumigatus максимально
синтезирует целлюлолитические ферменты на третьи сутки на
среде с измельченной пшеничной соломой, а также с фильтро-
228

вальной бумагой и опилками. Мезофильный вариант Asp. fumi-
gatus на средах с указанными источниками углерода макси-
мально образует ферменты лишь на пятые сутки [16]. Для гриба
Asp. terreus лучшим источником углерода является
фильтровальная бумага [18, 7], а для гриба Trichoderma viride — смесь
отрубей и жома [28].
Накопление целлюлолитических ферментов на синтетической
среде плесневыми грибами Trichoderma lignorum и Tr. koningi
сопровождается повышением рН до нейтральных значений [34].
Известно, что при рН выше 7,2 увеличивается выделение
амилазы из мицелиальных клеток в окружающую среду вследствие
изменения концентрации ионов и поверхностного заряда
мицелия. Возможно, аналогичный механизм лежит в основе
повышения содержания экзоцеллюлаз при подщелачивании среды.
Кроме того щелочной характер среды способствует накоплению
экзоцеллюлаз в результате десорбции фермента с остатков
субстрата [83].
Выращивание указанных грибов на соломе, опилках,
верховом торфе показало, что биосинтез целлюлаз на средах с
соломой и опилками протекает более быстро, чем на среде с
фильтровальной бумагой, что может быть обусловлено лучшей
аэрацией среды в начальный период роста гриба. Однако общий
уровень биосинтеза целлюлаз на среде с бумагой выше, чем на
средах с опилками и соломой (табл. 32).
Полученные данные позволяют считать, что биосинтез
целлюлолитических ферментов носит индуцированный характер.
Целлюлоза индуцирует синтез целлюлазы и при
культивировании микроорганизмов родов Penicillium, Streptomyces, Sporocy-
tophaga и др. [31, 34, 13], а также гриба Neurospora species [60,
59, 5]. Наиболее высокая активность целлюлазы, КМЦ-азы
и целлобиазы у термотолерантных грибов Asp. fumigatus
(штаммы 21 Во, 25 Вяз, 91 Bi) и Asp. oryzae проявляется на
среде Чапека — Докса и на среде Уайтейкера с 2—3%
фильтровальной бумаги или хлопкового волокна [25].
В качестве индуктора целлюлазы используются также цел-
лобиозооктаацетат, пшеничные отруби, лактоза, салицин. Для
Stachybotris atra наиболее пригодным источником углерода
оказался крахмал (1,0%). На крахмалсодержащей среде отмечено
наличие в культуральной жидкости и мицелии гриба ферментов
целлобиазы, инвертазы, 2-нафтин-р-галактозидазы, фенил-р-
глюкозидазы и др., а также в небольших количествах фермента,
гидролизующего салицин [55]. Относительно высокая активность
целлюлазы обеспечивается и грибом Myrothecium verrucaria при
росте на среде с крахмалом и менее высокая — с КМЦ,
глицерином и целлобиозой.
Активная внутриклеточная целлюлаза образуется при
выращивания грибов Trichoderma viride и Tr. koningi на увлажнен-
229

Таблица 32
Биосинтез целлюлолитических ферментов грибами Trichoderma lignorum
и Trichoderma Koningi на среде с некоторыми целлюлозосодержащими
субстратами [34]
Источник
углерода
0
X
о.
X
а
2
Возраст культуры, сутки
3
5
4
X
а
и
и'
X
5
ч
а
О4
М
О
Trichoderma lignorum
Бумага 2% . .
Солома 3% . .
Сосиово-еловые
опилки 4% . .
Верховой торф
3% ., . . .
4,9
5,0
4,5
5,1
6,6
5,7
5,5
5,7
6,7
7,5
5,3
3,2
3,16
3,76
4,15
1,58
7,1
5,8
5,7
6,2
13,5
8,5
5,7
4,1
6,10
5,10
4,80
2,90
7,3
5,9
5,8
6,1
18,0
11,8
7,3
3,8
6,90
5,80
5,10
2,20
7,5
6,0
5,9
6,3
19,2
9,5
6,9
3,10
Trichoderma koningi
Бумага 2% . .
Солома 3% . .
Сосиово-еловые
; опилки 4% . .
Верховой торф
3%
4,9
5,2
4,6
6,1
5,8
5,6
0,2
1,2
0,6
0,17
1,44
0,89
6,3
5,8
5.8
1.2
1.5
5,0
1.80
3.12
2.98
7.1
6,0
6,0
6,2
3,5
3.7
4,75
4,20
3,41
7.2
6,0
5,8
11,5
3,7
2,0
7,80
5,60
4,70
1,90
6,30
1,81
2,30
Рост незначительный, целлюлаза не образуется
I I I I I I I I I I I I
Примечание. Полу синтетическая среда включала, г/л: NaN03 —
5,0; КН2РО4 — 4,0; MgS04-7H20 — 0,5; кукурузный экстракт 5,0.
Начальный рН 4,5 и 5,0; температура роста 29 С. Высокая активность ферментов
отмечается на 4—5-е сутки с максимумом на 6—7-е сутки.
ных и подкисленных пшеничных отрубях или их смеси с
опилками (2:1) в течение 3—4 дней при 25—30° С. Водный экстракт
из мицелия указанных грибов обладал высокой амилазной
и целлюлазной активностью по отношению к целлюлозе, карбо-
ксиметилцеллюлозе, целлобиозе и осахаривал различные
природные целлюлозосодержащие субстраты — рисовую солому,
батат с образованием 5—8% редуцирующих Сахаров [90].
Высокий уровень биосинтеза целлюлаз отмечается при
культивировании некоторых видов гифомицетов (Alternaria tenuis,
Cladosporium herbarum, Stemphylium botriosum и др.) на среде
с пшеничными отрубями [13]. Относительно высокая активность
целлюлолитических ферментов на крахмале и более низкая на
Na-KM-целлюлозе у термотолерантного штамма Asp. fumigatus
21 В0 и мезофильного Asp. fumigatus 21 В6 указывает на то, что
230

специфические индукторы, содержащие 1,4-В-связь, не
обязательны для синтеза ферментов [25].
Это справедливо и при росте продуцентов на среде с
лактозой или сахарозой, где проявляется заметно высокая активность,
и наоборот, на целлобиозе, которая должна быть более
специфичной, синтез целлюлазы проходит в 2 раза слабее.
Многие источники углерода (глюкоза, целлобиоза, ацетат,
цитрат, оксалат, сукцинат и другие промежуточные продукты
цикла Кребса) репрессируют биосинтез целлюлолитических
ферментов. Высказывают предположение, что регулятором
синтеза многих ферментов в клетках микроорганизмов может
служить глюкоза [53].
Быстрая скорость усвоения глюкозы связана с образованием
высокой внутриклеточной концентрации репрессоров синтеза
индуцированных ферментов [67, 66, 65, 27, 31].
Подавление биосинтеза целлюлолитических ферментов
лежит в основе индукторно-репрессорного механизма регуляции
образования этих ферментов [53]. Культивирование продуцентов
на среде с постоянным содержанием индуктора, например
фильтровальной бумаги, и возрастающими количествами
глюкозы показало, что при увеличении ее концентрации до 2—3%
наблюдается значительное угнетение биосинтеза отдельных
ферментов целлюлолитического комплекса. Однако при более
низком содержании глюкозы в среде отмечается некоторое усиление
образования целлюлаз, что обусловлено, по-видимому, быстрым
развитием микроорганизма в начальный период роста в
результате улучшения условий питания. В частности, при росте
гриба Pyrenochaeta terrestris накопление в среде на 1 мл более
0,01 мг глюкозы, получаемой при ферментативном гидролизе
целлюлозы, уже оказывает репрессирующее действие. Синтез
целлюлазы грибом Fusarium culmorum также подавляется при
содержании в среде высоких концентраций (до 20 г/л) глюкозы
и сахарозы [78]. Это справедливо и в отношении
термотолерантного штамма Asp. fumigatus 21 Во. Добавление к среде глюкозы
0,5% наряду с фильтровальной бумагой почти не влияет на
образование целлюлолитических ферментов. Увеличение
концентрации добавляемой в среду глюкозы до 1 % заметно
ослабляет синтез ферментов, а 2% — почти полностью подавляет
образование целлюлазы как у термофила, так и у мезофила Asp.
fumigatus 21 В6 [25]. Следовательно на средах, содержащих
легкоусвояемые источники углерода, синтез целлюлазы
осуществляется или очень слабо, или вовсе не проявляется.
Лимонная кислота, как и другие ранее указанные
промежуточные продукты цикла Кребса, также является репрессором
биосинтеза индуцированных целлюлаз для большинства грибов:
Alternaria tenuis, Chaetomium globosum и др. [10]. Глицерин
стимулирует только рост гриба, но не индуцирует синтез фермента.
231

Таким образом культивирование микроорганизмов —
активных продуцентов целлюлаз — необходимо вести на средах с
подобранным специфическим источником углерода.
Бактерии, как и грибы, также проявляют различное
отношение к источникам углерода и в соответствии с этим по-разному
проявляют способность к биосинтезу целлюлаз [9].
Влияние азотного питания
Считают, что каждый грамм использованного
микроорганизмами азота обеспечивает разложение ими в природных условиях
25—35 г целлюлозы [86].
Следовательно целлюлозоразрушающие микроорганизмы
должны потреблять азот в форме неорганических или
органических соединений, однако не все источники азота в равной мере
пригодны для роста микроорганизмов и образования ими цел-
люлазы.
Неорганические формы азота, как правило, способствуют
синтезу целлюлолитических ферментов. Прежде всего это
относится к нитратной форме азота. Он оказывает благоприятное
действие на биосинтез целлюлазы многими микроскопическими
грибами (Actinomyces rosea, Fusarium sporotrichioides, Alterna-
ria tenuis, Chaetomium spiralis и др.). Для образования
целлюлаз Dematium hispidulus многие источники азота оказываются
благоприятными, но относительно лучшие результаты
получаются на средах с нитратным и нитритным азотом [10]. На средах
с нитратом образуется наиболее активная целлюлаза и при
культивировании Alternaria tenuis и Chaetomium spiralis. Для
синтеза целлюлазы грибом Asp. terreus лучшими источниками азота
являются также нитраты, взятые в концентрации 0,05—0,08%
по азоту [7]. Плесневые грибы Trichoderma lignorum и Tr. konin-
gi также наиболее интенсивно синтезируют целлюлазу на среде
с NaN03 (0,05% по азоту): активность Сх-фермента составляла
2,35 ед., а С2-фермента 1,22 ед/мл [34]. Для многих
темноцветных гифомицетов хорошим источником азота после KN03
является также (NH4)2HP04 (табл. 33). Эта соль обеспечивает
синтез как Сь так и Сх-ферментов [13, 12, 11].
Таким образом из минеральных форм азота нитратный
является, как правило, наилучшим источником для образования
целлюлолитических ферментов.
Аммонийный азот не способствует синтезу целлюлазы и очень
часто даже подавляет синтез ферментов и рост бактерий за счет
снижения рН среды; резкое торможение синтеза целлюлазы
отмечается также у многих плесневых грибов. В частности,
аммонийные соли угнетают биосинтез целлюлолитических ферментов
грибом Asp. terreus [7], а также Trichoderma lignorum и
Trichoderma koningi, причем активность Сг-фермента вообще отсутст-
232

Таблица 33
Влияние некоторых источников азота на целлюлазную активность
темноцветных гифомицетов [13]
Источники азота
KN03
(NH4)2S04
NH4NO3
NH4CI
(NH4)2HP04
NH4H2P04
Мочевина
Пептон
Казеин
Аспарагин
Тирозин
Длительность
выращивания,
суткн
6
12
6
12
6
12
6
12
6
12
6
12
6
12
6
12
6
12
6
12
6
12
Активность1 ферментов, продуцируемых
Alternaria
tenuis
1227
С. 1 С*
0,30
0,50
0,17
0,30
0,15
0,20
0,18
0,30
0,30
0,50
0,13
0,30
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,30
0,10
0,10
0,10
0,10
4,30
14,6
2,50
3,20
2,50
4,50
2,70
4,50
4,00
14,3
2,30
5,80
0,10
0,80
0,20
0,80
1,80
3,30
0,10
0,80
0,40
0,80
Cladosporium
herbarum
8249
с,
0,15
0,17
0,10
0,10
0,10
0,10
0,12
0,10
0,18
0,20
0,14
0,12
0,10
0,10
0,12
0,30
0,10
0,18
0,10
0,10
0,10
0,15
С
X
3,90
5,50
2,70
2,80
1,30
1,60
3,20
1,80
5,80
7,80
4,30
3,50
0,10
0,60
0,20
3,10
0,10
2,00
0,20
1,60
0,10
1,80
Periconia
stemonites
5124
С> 1 С*
4,20
3,20
0,30
3,80
0,70
2,80
0,50
3,00
0,60
5,30
0,50
2,50
0,80
3,00
0,60
5,80
0,30
2,80
0,25
4,30
0,60
4,30
11,9
17,3
3,90
5,70
5,10
5,10
4,70
4,80
6,70
15,7
5,70
5,80
7,50
15,5
5,00
11,3
2,40
9,60
3,50
15,5
7,00
20,0
Stysanus
stemonites
5130
С. 1 Яг
3,30
0,80
0,50
0,40
0,40
0,50
0,42
0,60
4,30
5,80
0,80
0,50
0,25
0,30
3,00
5,10
0,50
0,70
0,40
0,40
2,30
3,30
13,8
6,80
5,70
3,60
6,40
4,10
4,40
3,10
14,8
11,3
7,30
3,70
3,30
5,30
4,00
7,70
4,30
7,70
4,00
3,80
3,60
5,10
Активность выражена в мг% глюкозы.
вовала [34]. Когда аммонийный азот и азот нитрата
используются одновременно, то соотношение этих двух ионов оказывает
заметное влияние на скорость синтеза фермента и разложение
целлюлозы грибом Myrothecium verrucaria [86]. Низкий уровень
образования целлюлазы на средах с (NhLtbSC^, NH4NO3 и
NH4H2P04 обусловлен, вероятно, как неблагоприятным
влиянием аммонийного азота на биосинтез фермента, так и
значительным подкислением среды (рН 2,7; 2,4); хотя в среде с мочевиной
рН составлял 7,4, однако синтез фермента почти отсутствовал.
Возможно, при низких значениях рН наступает некоторая
инактивация целлюлазы; кроме того кислый характер среды может
способствовать усилению локализации фермента в клетках
мицелия и тем самым снижать его содержание в культуральной
жидкости.
233

Увеличение содержания в среде КНгР04 от 0,1 до 0,4%
оказывает благоприятный эффект на биосинтез внеклеточных цел-
люлолитических ферментов грибами Trichoderma lignorum и Тг.
koningi [34].
Органические формы азота для многих микроорганизмов не
оказывают благоприятного действия на биосинтез целлюлазы.
В то же время известны плесневые грибы, способность которых
к биосинтезу целлюлазы повышается при росте на среде с
органическими источниками азота. Так, например, образование цел-
люлолитических ферментов Penicillium oxalicum и Helmintho-
sporium cyclop стимулируется присутствием в среде пептона, но
для Myrothecium verrucaria и плесневых грибов родов
Aspergillus и Chaetomium он вызывает угнетение биосинтеза целлюлазы.
При этом интересно отметить, что гриб Myr. verrucaria на среде
с пептоном образует слабоактивный Сх-фермент, а Сг-фермент,
наоборот, синтезируется активным [28].
Добавление к среде, содержащей соли Чапека—Докса и 2%
фильтровальной бумаги, пептона в концентрации 0,1—0,3% не
приводит к положительным результатам, а дозировки 0,5%
оказывают угнетающее действие на рост термотолерантного штамма
(Asp. fumigatus 21 Во) и мезофильного (Asp. fumigatus 21 В6)
и на образование ими целлюлаз.
Следовательно внесение пептона в питательную среду
оказывает различный эффект на образование целлюлолитических
ферментов отдельными видами грибов [37, 89, 31, 25]. Такие
источники азота, как NaN03 и пептон стимулируют образование
целлюлазы Trichoderma lignorum и Тг. koningi [17]. Гриб Hiomastix
convoluta не способен разлагать целлюлозу в среде без наличия
органического источника азота; добавление дрожжевого
экстракта обеспечивает поддержание высокого уровня активности
целлюлазы [86]. Затем было установлено, что указанный гриб
требует наличия в среде азота в органической форме, причем
даже весьма низкая концентрация его обеспечивает обильный
рост.
Мочевина оказывает стимулирующее влияние на биосинтез
целлюлаз грибами Helminthosporium cyclop, Penicillium
oxalicum, Fomitopsis annosa и Fomitopsis pinicola [89].
В то же время для Asp. fumigatus и Myrothecium verrucaria
отмечается снижение активности целлюлазы при росте на среде
с мочевиной по сравнению с другими источниками азота [86, 31].
При росте грибов Trichoderma lignorum и Тг. koningi на среде,
содержащей мочевину, Сг-фермент вообще не синтезируется,
а С*-фермент образуется в незначительных количествах — 0,03
и 0,02 ед. [34].
Источники азота, содержащиеся в кукурузном и дрожжевом
экстракте [84] или в обезжиренной соевой муке и пшеничной
водной вытяжке, обеспечивают синтез целлюлазы. Заметно уско-
234

ряется биосинтез ферментов грибами Asp. niger, Trichoderma vi-
ride на среде с дрожжевым или кукурузным экстрактом, а
также с солодом [85].
Внесение в среду 0,5% кукурузного экстракта значительно
стимулирует накопление целлюлолитических ферментов грибами
Trichoderma lignorum, Tr. koningi [17] и Asp. fumigatus [25].
Интересно отметить, что как для термотолерантного штамма
Asp. fumigatus 21 В0, так и мезофильного штамма Asp.
fumigatus 21 В6 оптимальной средой оказалась среда Чапека — Докса
с 2%) фильтровальной бумаги и добавлением 0,5% кукурузного
экстракта. Для Asp. terreus наилучшим стимулятором
биосинтеза целлюлолитических ферментов является также кукурузный
экстракт в концентрации 0,3—0,5% [7]. При внесении в среду
0,005% дрожжевого экстракта стимулируется образование цел-
люлаз грибом Myrothecium verrucaria [31], а также цитолитичес-
кая активность гриба Trichothecium roseum [6].
Следует указать, что дрожжевой экстракт в основном
стимулирует образование Сж-фермента, а кукурузный — С* и Срфер-
ментов. Образование Сж-фермента разными грибами (Periconia
stemonites, Stemphylium botryosum, Stysanus stemonites,
Alternaria tenuis, Cladosporium herbarum) стимулируется при
различных концентрациях дрожжевого экстракта (0,1; 0,2; 0,4
и 0,8 мг в 10 мл). Активность Q и Сл-ферментов повышается
при внесении в среду разного количества кукурузного экстракта
(0,3—0,5 жг/10 мл), причем при разных дозировках экстракта
биосинтез указанных ферментов протекает неодинаково. Так,
например, при содержании в среде 1 мг кукурузного экстракта
в 10 мл в наибольшей степени повышается активность Срфер-
мента, а при 2 мг/10 мл—Сж-фермента при культивировании
Alternaria tenuis [13]. При внесении кукурузного экстракта
в концентрации 0,25—0,75% наблюдается значительное
повышение уровня биосинтеза целлюлаз грибами Trichoderma lignorum
и Tr. koningi. При этом стимулирующее действие
обусловливается не только содержанием в экстракте органических форм
азота, включая и некоторые аминокислоты, но и наличием
микроэлементов и других факторов роста.
В то же время отмечается, что добавление в среду
дрожжевого экстракта при росте Chaetomium globosus и Chaetomium in-
dianum подавляет синтез целлюлазы [39]. При добавлении к
среде дрожжевого экстракта в широком диапазоне концентраций
наблюдается хороший рост термотолерантного и мезофильного
штаммов Asp. fumigatus (№ 21 В0 и № 21 В6), а активность
целлюлолитических ферментов увеличивается незначительно.
Отмечается, что для образования целлюлазы предпочтительнее
относительно низкое соотношение С :,N.
Аминокислоты. Образование целлюлолитических ферментов
Trichoderma koningi стимулируется добавлением к среде аспа-
235

рагина, валина в концентрации до 0,01%- Аспарагиновая кислота
в количестве 0,01—0,05 г на 100 мл среды увеличивает примерно-
на 40% активность целлюлазы Myrothecium verrucaria [31]. Из
18 аминокислот только лейцин, аргинин, гистидин и цистеин
оказались пригодными для биосинтеза целлюлаз Asp. terreus [7].
Остальные аминокислоты оказывают угнетающее действие. При
культивировании гифомицетов на среде, содержащей аспарагин:
или тирозин, синтез целлюлазы заметно тормозится.
Следовательно не все аминокислоты оказывают положительное действие
на биосинтез целлюлолитических ферментов.
Таким образом из минеральных форм азота нитратный
является, как правило, наилучшим источником для биосинтеза
целлюлазы. Для многих гифомицетов хорошим источником азота
является также кислый фосфорнокислый аммоний (NH^HPQi-
Аммонийный азот оказался мало пригодным для синтеза
целлюлазы. При этом постоянно отмечается повышение кислотности
среды. После абсорбции ионов аммония из среды он заменяется
ионом водорода, что вызывает сдвиг рН в сторону меньших
значений. Это обстоятельство, по-видимому, может не только
тормозить синтез целлюлаз, но и после образования их частично
инактивировать.
Среда с нитратом натрия, наоборот, подщелачивается и тем
самым в большей мере устраняется возможность торможения
биосинтеза целлюлазы. Органические формы азота проявляют
различное действие на образование целлюлазы в зависимости от
особенности микроорганизма. Азотистые вещества дрожжевого
или кукурузного экстрактов усиливают синтез целлюлазы,
однако кукурузный, в отличие от дрожжевого, повышает биосинтез
как Ci-, так и Сх-фермента.
Влияние минерального питания
Минеральный состав питательной среды Чапека обеспечивает
хороший рост продуцентов целлюлаз. Внесение в среду
дополнительного количества калия (или натрия) или исключение их
не сказывается на образовании целлюлаз. Для биосинтеза
целлюлолитических ферментов большое значение имеют
микроэлементы. Внесение Fe, Mn, Zn, Co оказывает существенное влияние
на биосинтез целлюлаз [64].
При добавлении в среду Мп (0,3 мг/л) разложение
целлюлозы грибами возрастает по сравнению с контролем в среднем на
16%. Остальные микроэлементы (В, Мо, Си) в меньшей степени
стимулируют разложение целлюлозы микроорганизмами [8].
Цинк, марганец и железо стимулируют образование
целлюлолитических ферментов и темноцветных грибов — Alterrraria
tenuis, Stemphylium botryosum, Stysanus stemonites. Оптимальная
концентрация цинка для разных видов колеблется от 0,11 до
236

2,2 мг/л, железа — от 2 до 10 мг/л, марганца — от 3,4 до
27,2 мг/л [13].
Витамины. Добавление в среду биотина и тиамина
существенного влияния на биосинтез целлюлаз не оказывает.
рН среды. Биосинтез целлюлаз различными грибами наиболее
интенсивно протекает при величине рН среды от 4 до 6 [79].
Некоторые виды грибов могут разлагать целлюлозу в довольно
кислой среде. Грибы Fusarium oxysporum и Trichoderma koningi
продолжают расти при рН 1,8—2,0 [86]. Некоторые виды рода
Humicola species были одинаково активны при рН 3,5—-8,5.
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА БИОСИНТЕЗ ФЕРМЕНТОВ
Разные виды целлюлозоразрушающих грибов способны
расти и продуцировать целлюлазу лишь в определенных
температурных пределах. Считают, что оптимальной температурой для
роста грибов и биосинтеза целлюлазы является 28—30° С [85, 89].
Активный рост гриба и образование целлюлолитических
ферментов мезофильным Asp. fumigatus происходит при 30°, термотоле-
ратным Asp. fumigatus при 45° С [15, 25], а термофильной
бактерией— при 65° [5].
Наиболее высокой активностью, как целлюлазной и КМ-цел-
люлазной, так и целлобиазной, обладает термотолерантный
штамм Asp. fumigatus 21 В0, несколько меньшая активность
отмечена для мезофильного штамма Asp. fumigatus 21 В6. Для
большинства других грибов, таких как Asp. oryzae 25Bi3, Penicil-
Hurn oxalicum 21 B6, Asp. fumigatus 21 Big выше целлобиазная
и КМ-целлюлазная активность, чем целлюлазная, а для грибов
Trichoderma lignorum 21 В6, Chaetomium globosum 21 В12
активность КМ-целлюлазы и целлобиазы почти одинакова [25].
Рост термотолерантного и мезофильного штаммов происходит
интенсивно на качалке с числом оборотов 180—200 в минуту.
Увеличение числа оборотов до 280—300 подавляет рост грибов
и активность целлюлолитических ферментов. В ферментаторе на
■60 л интенсивность аэрации соответствует 1,5 объемам воздуха
на 1 объем среды в минуту; скорость вращения мешалки
■300 об/мин. Оптимальная реакция среды при этом рН 4,5.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ К ГЛАВЕ VIII
1. Билай В. И. Биологически активные вещества микроскопических
тгрибов и их применение. Изд-во «Наукова думка». Киев, 1965.
2. Б и л а й В. И., Пидопличко Н. М., Та радий Г. В.,
Лиза к Ю. В. Сб. «Молекулярные основы жизненных процессов». Серия
«Молекулярная биология». Изд-во «Наукова думка». Киев, 1966.
3. Билай В. И., Пидопличко Н. М., Т а р а д и й Г. В., Ли-
.з а к Ю. В. Ферментативное расщепление целлюлозы. Изд-во «Наука», 1967.
237

4. Б и л а й В. И., С т р и ж е в с к а я А. Я., Л и з а к Ю. В., Та
радий Г. В. Экспериментальная микология. Изд-во «Наукова думка». Киев,
1968.
5. Верховцева М. И. «Микробиология». Т. XXXIV. Вып. 3. 430, 1965.
6. В е с е л о в И. Я., С а л м а и о в а Л. С. Труды
научно-исследовательского института пиво-безалкогольной и винодельческой промышленности.
Вып. 8, 75, 1961.
7. Зелтинь Р. П. «Микробиология». Т. XXXIX. Вып. 4. 574, 1970.
8. И л ь и н В. Б.,НаплековаН. Н., Степанова М. Д. «Известия
сибирского отделения АН СССР». Серия биологических наук. № 5. 1. 45, 1970.
9. И м ш е н е ц к и й А. А. Микробиология целлюлозы. Изд-во АН СССР.
1953.
10. Кислицына В. П., Козлов К. А. «Прикладная биохимия и
микробиология». Т. 4. Вып. 1. 97, 1968.
11. Лизак Ю. В. Экспериментальная микология. Изд-во «Наукова
думка». Киев, 1968.
12. Л и з а к Ю. В. В кн.: Ферменты в медицине, пищевой
промышленности и сельском хозяйстве. Изд-во «Наукова думка». Киев, 1968.
13. Л и з а к Ю. В. Целлюлолитические свойства некоторых видов темно-
окрашенных гифомицетов. Диссертация. Институт микробиологии и
вирусологии им. акад. Д. К. Заболотного АН УССР. Киев, 1971.
14. Логинова Л. Г., Головачева Р. С, Щербакова М. А.
«Микробиология». Т. XXXV. Вып. 5. 796, 1966.
15. Логинова Л. Г., Ташпулатов Ж. «Микробиология». Т. XXXIV.
Вып. 2. 38, 1965.
16. Логинова Л. Г., Т а ш п у л а т о в Ж. и др. В ки.:
Ферментативное расщепление целлюлозы. Изд-во «Наука». М, 1967.
17. Лобанок А. Г., Шкляр Б. X. Тезисы докладов 2-го Всесоюзного
биохимического съезда. Ташкент, 1969.
18. Логинова Л. Г., Зелтинь Р. П., Калмыкова Г. Я. и др.
«Микробиологическая промышленность». Вып. 1, 1, 1970.
19. М и х л и н Э. Д., Е р о ф е е в Н. Е, Симакова В. Г. В сб.
«Витаминные ресурсы и их использование». Изд-во «Наука», 1967.
20. М и х л и и Э. Д., П р о к о ф ь е в а В. Г., М н ш и н а Г. И.
«Прикладная биохимия и микробиология». Т. 4. 517, 1968.
21. Михлин Э. Д., Улезло И. В. «Прикладная биохимия и
микробиология». Т. 5. Вып. 6, 1969.
22. П и д о п л и ч к о Н. М., Т а р а д и й Г., Лизак Ю. В. Сб.
«Молекулярные основы жизненных процессов». Изд-во «Наукова думка». Киев, 1966.
23. Родионова Н. А., Тиунов а Н. А., Ф е н и к с о в а Р. В. и др.
«Прикладная биохимия и микробиология». Т. 2. 197, 1966.
24. Ташпулатов Ж. В кн.: Ферментное расщепление целлюлозы.
Изд-во «Наука», М., 1967.
25. Т а ш п у л а т о в Ж. Термотолерантный и мезофильиый грибы,
близкие к Asp. fumigatus,— продуценты активных целлюлолитических ферментов.
Канд. дисс. Ин-т микробиологии АН СССР, 1967.
26. Тиунов а Н. А., Родионова Н. А. Сб. «Ферментативное
расщепление целлюлозы». М. Изд-во «Наука». 80, 1967.
27. Т и х о м и р о в а А. С, К У л и к о в а А. К. «Микробиология». Т. XXXII.
Вып. 4. 577, 1963; там же, т. XXXIII, вып. 1, 7, 1964.
28. Улезло И. В. Сб. «Ферментативное расщепление целлюлозы». М.,
Изд-во «Наука», 58, 1967.
29. Улезло И. В. «Прикладная биохимия и микробиология». Т. 4.
Вып. 3. 282, 1968.
30. Ф е н и к с о в а Р. В., Р о д и о н о в а Н. А., Т и у н о в а Н. А., У л е з-
ло И. В. ДАН СССР. Т. 162, 702, 1965.
31. Фениксов а Р. В., Улезло И. В. «Прикладная биохимия и
микробиология». Т. 1. Вып. 4. 406, 1965.
238

32. Ф е н и к с о в а Р. В., У л е з л о И. В., Р у к л и н М. П. «Прикладная
биохимия и микробиология». Т. 5. 278, 1969.
33. Фен и кс ов а Р. В., Улезло И. В., Шаламберидзе Н. Г.
Журнал АН Груз.ССР, 1969.
34. Ш к л я р Б. X. Микроскопические грибы Trichoderma lignorum
и Trichoderma koningi как продуценты целлюлолитических ферментов.
Диссертация. Институт экспериментальной ботаники АН БССР. Минск, 1969.
35. Шумиленко Е. П. «Микробиология». Т. XXVI. Вып. 3. 374, 1957.
36. A m e m u г а А., Т е г и i G. J. Ferm. Techn., 43, 75, 1965.
37. Basu S.N, Ghose R. Canad. J. Microbiol., 6, 265, 1960.
38. Bjorndal H, Eriksson К. Е. Arch. Biochem. Biophys., 124, 149,
1968.
39. В о s e R. G., В a s и S. W. Sci. Culture, 23, 378, 1958.
40. Bose R G., Basu S N. Indian J. exp. Biol., 3, 42, 1965.
41. Bucht В., Eriksson К. Е. Arch. Biochem. Biophys., 124, 135, 1968.
42. Clarke A. E., S t о n e B. A. Biochem. J., 96, 802, 1965.
43. Cole F. E., King K. W. Biochim. Biophys. Acta,81,122,1964.
44. E 1 у a k о w a L. A., S о v a V. V., Vaskovsky V. E. Biochim.
Biophys. Acta, 167, 462, 1968.
45. Eriksson К. Е., Pettersson G. Arch. Biochem. Biophys., 124,
142, 1968a.
46. Eriksson К Е., Rzedowski W. Arch. Biochem. Biophys., 129,
689, 1968.
47. F и j i i N., T о у a m a N.J. Ferm. Technol., v. 45, N 7, 1967.
48. Gil ling W., Reesse E. T. Can. J. Microbiol., 1, 90, 1954.
49. G r i m e s R. M., Duncan G. M., Hoppert C. A. Arch. Biochem.
Biophys, 68, 412, 1957.
50. H а с h i g a M, H a j z s h i K. J. Ferm. Techn, 43, 440, 1965.
51. Hall i we 11 G. J. Gen. Microbiol, 17, 166, 1953; Biochem. J. 79, 185,
1961; ibid, 85, 67, 1962.
52. Hash J., К i n g K.J. Biol. Chem, 232, 395. 1958.
53. H or ion J. C, Keen N. T. Can. J. Microbiol, 12, 209, 1Э66.
54. J w a s a k i T, I k e d a R., H а у a s h i K, F и n a t s и M. J. Biochem,
57, N 4, 475, 1965.
55. Jermyn M. J. Biol. Sci, 8, 541, 1955; 8, 563, 1955; 11, 114, 1958; 12,
213, 1959.
56. Jurasek L, Colvin J. Ross. Whitaker D. R. Advances in
Applied Microbiol, 9, 131, Academic Press, New York and London, 1967.
57. Katz M., Reese E. T. Appl. Microbiol, 16, 2, 419, 1968.
58. King K. W. J. Ferm. Techn, 43, 79, 1965.
59. King K. W, Smibert R. M. Appl. Microbiol, 11, 315, 1963.
60. К и г о d а Н, М о с h i z и k i Т. J. Ferm. Techn, v. 45, N 4, 1967.
61. Li L. H, Flora R. M, King K. W. Arch. Biochem. Biophys, III,
439, 1965.
62. Lyr H, S chanel L. Z. f. Allg. Microbiol, 4, H. 5, 341, 1964.
63. M a n d e 1 s M., Reese E. T. J. Bacteriol., 73, 2, 269, 1957; 1959, 79,
816, 1960; 83, 400, 1962.
64. Mandels M, Reese E. T. Developments indastr. microbiol, 5, 20,
1964.
65. M a n d e 1 s t a m J. Biochem. J, 82, 489, 1962.
66. N e i d h a r d t F. С J. Bacteriol, 80, 536, 1960.
67. Neidhardt F. С, М a g a s a n i k B. Nature, 178, 801, 1956.
68. N i s i z a wa K, Mori mot о J. et al. Arch. Biochem. Biophys. 96, 1,
152, 1962.
69. Norkrans B. Physiol, plantarum, 10, 198, 1957; 16, 11, 1963.
70. Norkrans B. Advances in Applied Microbiol, 8, 91, Academic Press,
New York and London, 1967.
71. Ogawa К, То у am a N. J. Ferm. Technol, 45, N 7, 671, 1967.
239

72. Okada G., Gent а го et al., J. Biochem., 63 (5), 591, 1968.
73. Pettersson G. Arch. Biochim. Biophys., 130, 286, 1969.
74. Pettersson G. Biochim. Biophys. Acta, 77, 4, 665, 1963.
75 Pettersson G., Cowling E.'B. Biochim. Biophys. Acta, 67, 1, 1,
1963.
76. Pettersson G., Andersson L. Arch. Biochem. Biophys., 124, 497,
1968.
77. P e 11 er s so n G., Eaker D. L. Arch. Biochem. Biophys., 124, 154,
1968.
78. Ram V. Phytopathology, 35, 122, 1959.
79. Reese E. T. Appl. Microbiol., 4, 39, 1956.
80. Reese E. Т., S i u R. G. H, Levinson H. S. J. Bacterid., 59, 485,
1950.
81. Reese E. Т., G i 1 1 i g a n W., Norkrans B. Physiol. Plantarum 5,
379 1952.
82. Reese E. Т., M a n d e 1 s M. Canad. J. Microbiol., 2, 103, 1964.
83. S e 1 b у К. В сб. «Biodetermination of materials» Elsevier, Amsterdam,
62, 1968.
84. Selby K., Mai t land С. С Biochem. J., 94, 578, 1965; 104, 716.
1967.
85. Simpson F. Canad J. Microbiol., 5, 99, 1959.
86. Sin R. G. H., Sinden J. W. Amer. J. Bot, 38, 284, 1951.
87. Si son В., Schubert W. Arch. Biochem. Biophys., 78, 563, 1958.
88. Si son В., Schubert W, Nord F. Arch. Biochem. Biophys., 75,
1, 260, 1968.
89. T a h a E. E. M., A b u z i e d A. A. Arch. Microbiol., 44, 240, 1962;
Z. Allgem. Microbiol., 3, 275, 1963.
90. T о у a m a N. Journ. Ferm. Technol., v. 45, N 7, 1967.
91. W а к ab а у a s h i K., Kanda Т., N i s i z a w а к. J. Ferm. Techn..
43 739 1965
92.'Whitaker D. R. Nature, 168, 1070, 1951.
93. Whitaker D. R. Arch. Biochem. Biophys., 43, 253. 1953.
94. Whitaker D. R. Canad. J. Biochem. physiol., 35, 733, 1957.
95. W h i t а к e r D. R. Adv. enzym. hydrol. Ed. E. Reese, Pergamon Press—
London—New York—Paris, 51, 1963.
96. Whitaker D. R., Thomas R. Can. J. Biochem. Physiol., 41, N 3,
667, 1963.
97. Wood T. M. Biochem. J., 109, N 2, 217, 1968.
ГЛАВА IX
ЛИПОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ
КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ
Липолитические ферменты, или липазы, различного
происхождения (микроорганизмов, растений и животных)
объединены по новой классификации ферментов единым шифром 3.1.1.3.
На основании многочисленных данных о субстратной
специфичности липаз различного происхождения высказано
предположение, что они обладают универсальным действием,
распространяющимся на сложные эфиры весьма различного происхождения:
240

природные жиры, масла и синтетические триглицериды [25, 19,
46, 38].
Липазы действуют, например, на триглицериды, таким
образом, что сначала отщепляют один кислотный остаток, затем
второй и, наконец, третий, с образованием соответственно диглице-
рида, моноглицерида или глицерина и жирных кислот. Такое
специфическое действие проявляется прежде всего
панкреатической липазой [62, 64, 69, 19]. При этом триглицериды гидроли-
зуются быстрее, чем диглицериды и т. д.
Фермент предпочтительно разрывает эфирные связи,
расположенные во внешней части молекулы глицерида, т. е. в 1,3-по-
ложении. Бактериальная липаза Geotrichum candidum,
напоминающая по свойствам панкреатическую липазу, обладает также
высокой специфичностью в атакуемости связей олеинового
эфира: независимо от положения углерода в молекуле глицерина
все эфирные связи гидролизуются исключительно быстро, тогда
как эфирные связи, образованные с пальмитиновой кислотой,
атакуются медленно, а со стеариновой — еще более медленно.
Эфиры, содержащие жирные кислоты, с цепью, более
короткой чем Cj—Сю, гидролизуются также медленно [71]. Это
обстоятельство позволило применять ферментативный гидролиз для
исследования структуры жиров [63, 70, 49]. В частности, липоли-
тическим методом определен глицеридныи состав масла семян
Peganum harmala [20].
Подобно другим ферментам липазы растворимы в воде и
глицерине. Даже липазу семян клещевины, которая до последнего
времени считалась нерастворимой, можно перевести в раствор
[21]. В отличие от остальных гидролитических ферментов липазы
действуют на нерастворимый субстрат, т. е. в гетерогенной
системе— эмульсии жира в водной среде — и атакуют молекулы
жира, находящиеся на поверхности жировой капли.
Поверхностно-активные вещества, например, желчные
кислоты в организме животных, уменьшают поверхностное натяжение
жиров и тем самым превращают крупные капли жира в очень
мелкие капельки, т. е. вызывают эмульгирование субстрата,
увеличивая вследствие этого поверхность, доступную действию
липазы, что резко повышает скорость гидролиза жира [80].
Если с помощью соответствующих растворителей
гетерогенную систему перевести в гомогенную, то активность липазы
падает. Так, например, с более растворимым субстратом, каким
является метилбутират, не обнаруживается активности в
области полного его растворения (рис. 55).
Известно, что белки образуют мономолекулярные пленки на
границе раздела между водой и неполярной фазами [53]. Можно
полагать, что липаза активна только на этой границе.
По-видимому, только на поверхности раздела эфир — вода обнажается
ее активный центр.
16 Заказ 7
241

Исходя из этого было предложено использовать величину
концентрации субстрата на границе раздела для подсчета
константы Михаэлиса [68]. Именно благодаря тому, что между
свободным и адсорбированным ферментом устанавливается
равновесие, представилось возможным установить константу
диссоциации комплекса фермент — поверхность раздела вместо
концентрации субстрата. Поверхность раздела зависит от степени
Площадь поверхности раздела
О 100 300 500 700смг/ил
i 1 1—I 1 1 1 1
Растворяется Не растворяется
. «з -* 1 *-
и
в? * Z
% 1
6 о—с
Ь <
О 0,5 КО 0 2,0
Общая концентрация метилдутирагпа, Выраженная
по отношению к концентрации насыщенного растбора,
принятой за 1
Рис. 55. Зависимость скорости гидролиза
от концентрации субстрата (метилбутирата)
при действии панкреатической липазы.
эмульгирования, а также от количества присутствующего
субстрата. Однако поскольку число молекул фермента, способных
одновременно взаимодействовать с 1 см2 поверхности раздела,
определяется главным образом тем, какую площадь занимает
одна молекула фермента, а не площадью, приходящейся на одну
молекулу субстрата, то, вероятно, лучше пользоваться реальной
величиной площади поверхности.
Таким образом, липаза (в отличие от эстераз)
характеризуется тем, что она действует только на поверхности раздела
масло — вода и гидролизует преимущественно внешние (а—)
эфирные связи.
Липазы различного происхождения (микробного,
растительного и животного) различаются прежде всего оптимумами рН
действия. Так, если клещевинная липаза имеет оптимум рН
в кислой среде (4,7—5,0), то липазы поджелудочной железы,
микроорганизмов и пшеничных зародышей действуют в слабо-
242

щелочной среде, при рН около 8—9. Липаза, полученная из
культуры Rhizopus и названная японской фирмой «Нагазе»
«сейкен», проявляет действие в широком диапазоне рН —от 4,0
до 9,0 (рис. 56), однако максимальная активность ее проявляется
при рН около 7,0. Наибольшую активность липаза проявляет
8 9 рН
Рис. 56. Влияние рН на
активность липазы из плесневого
гриба Rhizopus. Субстратом
служило оливковое масло в
виде эмульсии с поливинилалко-
голем; время действия —
10 мин при 37° С.
Рис. 57. Влияние температуры на
липазу плесневого гриба из рода
Rhizopus. Субстратом служило
оливковое масло в виде эмульсин
с поливипилалкоголем; время
действия — 30 мин при 37° С.
при температуре 38—43° С (рис. 57); при 60° С она резко и
полностью инактивируется. Липаза «сейкен» катализирует гидролиз
животных и растительных жиров и масел, в том числе и
минеральных (табл. 34).
Таблица 34
Активность липаз на различных субстратах
Субстрат — эфир
Метил-н-масляная
Трибутират
Оливковое масло . . .
Липаза «сейкен»
мл 0,05н.
NaOH,
пошедшие на
титрование
4,50
46,00
2,60
14,70
16,50
40,00

относительная
активность
100
1020
58
327
366
888
Панкреатин
мл 0,05н.
NaOH,
пошедшие на
титрование
4,50
16,30
8,40
0,10
1,10
5,00

относительная
активность
100
360
186
2
24
111
Примечание. Реакция проводилась при 37°С в течение 60 мин
методом встряхивания. Общее количество фермента 10 мг, субстрата
2,0 мл; рН 6,0.
16*
243

100
1
50
ll
4 X
i \
Й ^ н
<? J
5 6
в
Липаза гидролизует также свиное сало (лярд), китовый жир,
масло соевое, кунжутное и хлопковое масло, масло семян
рапса (рис. 58), причем все субстраты гидролизуются примерно
в равной степени. Следовательно, липаза катализирует распад
не только эфиров, но и масел
и жиров различного
происхождения.
Плесневой гриб из рода
Rhizopus образует
одновременно две липазы с оптимумом
рН действия 4,9 и 6,8, которые
можно разделить.
Кристаллическая липаза
Asp. niger почти полностью
гидролизует кокосовое масло,
тогда как липаза Penicillium
roqueforti гидролизует этот
субстрат лишь на 34% при
7° С и на 45% при 35° С [43].
Другие растительные масла
кристаллическая липаза
гидролизует с разной степенью
полноты: оливковое — на 93%,
масло пшеничного зерна — на
91%, льняное — на 87%,
хлопковое — на 86%, масло
соевых бобов — на 85%, тунговое — на 77%, клещевинное — на
63%. Масла, содержащие гидроокиси или двойные связи
(тунговое, клещевинное, кокосовое), проявляют некоторую
устойчивость к гидролизу. Метиловые эфиры жирных кислот (в
особенности с содержанием в молекуле 10 атомов углерода) и эфир
олеиновой кислоты (триолеин) гидролизуются исключительно
быстро.
Отдельные эфиры (этилацетат, амилацетат, метилмасляной
кислоты) фермент не гидролизует.
Активирующими свойствами обладают не только желчные
кислоты, как это отмечалось ранее, но и альбумины, соли
кальция, которые, по-видимому, соединяются с освободившимися
жирными кислотами, а также аминокислоты и пептиды, среди
которых наиболее активным является L-лейцин-глицил-глицин.
Многие липазы очень чувствительны к малым концентрациям
некоторых антибиотиков, которые ведут себя как конкурентные
ингибиторы фермента.
В табл. 35 приводятся данные, показывающие влияние
различных концентраций пенициллина на активности некоторых
липаз. В зависимости от происхождения фермента проявляется
различная чувствительность к пенициллину.
Рис. 58. Гидролиз различных
субстратов липазой «сейкен», полученной из
культуры плесневого гриба
Rhizopus:
/ — оливковое масло, 2 — подсолнечное
масло, 3 — свиной жир (лярд), 4 — жнр
моржа, 5 — соево-бобовое масло, 6 —
кунжутное масло, 7 — хлопковое масло, 8 —
масло семян рапса.
244

Таблица 35
Ингибирование липаз пенициллином
Источники фермента
Степень ингибирования (в %),
пенициллином в ед!мл
0,1
25
Молочная липаза . . .
Achromobacter lipolytieum
Geotrichium candidum
Asp. niger
Pen. roqueforti
9
3
36
78
34
20
36
40
80
51
35
100
64
88
75
ПРОДУЦЕНТЫ ЛИПОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
Микроорганизмы, синтезирующие липолитические ферменты,
широко распространены в природе. Продуцентами липаз
оказались многие микроорганизмы, относящиеся к различным
таксономическим группам: бактерии, плесневые грибы, актиноми-
цеты [66].
К грибным продуцентам липазы отнесены многочисленные
представители рода Aspergillus: Asp. niger, Asp. flavus, Asp.
fumigatus, Asp. luchuensis [73], Asp. awamori [6], Asp. ferrico-
la, а также Penicillium glaucum, Pen. camamberti [25]. Затем
обнаружили липазу у Bacillus fluorescens, Вас. mesentericus, Oi-
dium lactis, Вас. pyocyaneus [24], Fusarium sporotrichiella, Pen.
chrysogenum, Pen. roqueforti [9]. В последующие годы
обнаружены новые виды микроорганизмов, синтезирующие липазы. К ним
можно отнести прежде всего Rhizopus arrhisus [59], Rhizopus sp.
[2, 3], Asp. terricola [22], Geotrichium candidum, Pseudomonas fra-
gi [43, 45, 60], Streptomyces rimosus [61], Candida lipolytica, Cla-
dosporium herbarum, Staphylococcus aureus [22], Corinebacterium
pyoceanes [74], Achromobacter lypolyticum.
На ферментных заводах Японии и других стран нашли
широкое применение такие продуценты, как Mucor genus, Asp. genus
(фирма «Амано»), отдельные виды рода Rhizopus (фирма «На-
газе»), Candida cylindracea novus sp. (фирма «Мейто Сангио»),
Asp. oryzae («Аскалла») [38] и другие.
Издавна известный продуцент липазы Asp. niger хорошо изу«
чен, а препарат липазы из него очищен и получен в
кристаллическом виде [51, 55].
Активным продуцентом оказалась культура Asp. awamori,
которая по сравнению с другими видами плесневых грибов имеет
ряд преимуществ. Она отличается высокой способностью
синтезировать внеклеточную липазу при глубинном культивировании
(табл. 36). Кроме того культура Asp. awamori обеспечивает
стабильный рост на среде, содержащей в качестве источника угле-
245

рода и индуктора подсолнечное масло [1, 2, 3]. Высокой
способностью к образованию липазы обладают и другие виды и штаммы
Asp. awamori 172-11, Rhizopus species, Asp. terricola 33-74.
Таблица 36
Синтез липазы плесневыми грибами [2]
Asp.
Продуценты
Rhizopus species ....
Asp.
Asp.
Asp.
Asp.
awamori 172-11
terricola 33-74 . .
awamori 16 ... .
awamori 22 ... .
Активность
липаэы
04-
00 мл
аль-
;кости
нг- и;
5 " Ч *
а>в'е;«
§ °&ё
364
358
350
312
260
260
леточ-
г су-
массы
$Ъ*
о. о
>.««
х° о
а я х
52
48
51
36
27
24
Продуценты
Активность
липаэы
в 5 3
Г Ч ^ )С
О ¥ Я Ч
§° S
ш
lii
224-21
Asp. awamori
Asp. flavus . . .
Asp. niger n . . .
Asp. oryzae 3-9-15
Asp. oryzae 153
Asp. awamori 78-2
156
156
156
104
104
104
20
10
10
20
15
10
Для определения активности липазы использовался в данных
исследованиях метод алкалиметрического титрования [13] в
модификации применительно к плесневым грибам [10]. За единицу
липолитической активности принимается такое количество
фермента, которое гидролизует 1 мл подсолнечного масла за 1 ч при
рН 5,3, температуре 30° С и перемешивании на качалке. При
этом принималось во внимание, что 1 г подсолнечного масла,
полностью гидролизованного, соответствует 33,04 мл 0,1 н. КОН,
расходуемым на нейтрализацию освободившихся жирных
кислот.
ВЛИЯНИЕ СОСТАВА СРЕДЫ НА БИОСИНТЕЗ ФЕРМЕНТОВ
Исследования, проведенные со многими микроорганизмами,
подтверждают мнение об индуцированной природе липолитиче-
ских ферментов. Очень многие бактерии, дрожжи и
микроскопические грибы синтезируют липолитические ферменты лишь при
введении в среду жировых субстратов [52, 30, 34, 74, 54, 42, 16,
32, 47, 36, 2, 28]. При этом очень часто в качестве индуктора
используют жиры [27, 34, 2] и различные масла [27]: подсолнечное
[30, 12], оливковое [22, 8], льняное, арахисовое, пальмовое [48]
и др.
Влияние углеродного питания
Липиды и продукты их распада индуцируют образование ли-
политических ферментов различными микроскопическими
грибами: Pen. silvaticum [15], Pen. oxalicum [22], Pen. roqueforti [14],
Act. streptomicini [34].
246

При поверхностном культивировании грибов рода
Aspergillus: Asp. niger, Asp. awamori, Asp. oryzae, Asp. terricola, Asp.
flavus широко используют отходы жирового производства,
в частности, подсолнечный шрот, а также смесь его с отрубями
в соотношении 1 : 1 [35], причем первая среда, содержащая шрот
в качестве единственного источника углерода, оказалась
благоприятной для синтеза липазы Asp. alliacens, вторая — для Asp.
awamori, Asp. niger [36].
Действие индуктора, по данным некоторых авторов [8, 2],
ограничено определенными концентрациями его в среде. При
избытке индуктора происходит торможение синтеза липазы
продуктами его гидролиза. Так, например, при содержании в среде
подсолнечного масла в концентрации 0,8 и 1,6% отмечается
индуцирование синтеза липазы грибом Act. aureofaciens. При
концентрации в среде 3,2% синтез липазы снижается. Для
оливкового масла оптимальное содержание его в среде оказалось
сдвинутым в сторону более низких дозировок — 0,4—0,8%.
Установлено, что тормозящее действие на синтез липазы
оказывают жирные кислоты как продукты гидролиза жира. В
частности, внесение в среду солей олеиновой и пальмитиновой кислот
полностью приостанавливало синтез липазы. Известно, что доля
олеиновой кислоты в подсолнечном масле составляет 42%,
а в оливковом — 81%. Это позволило объяснить подавляющее
действие на синтез липазы даже низких концентраций
оливкового масла по сравнению с подсолнечным [8].
Полагают, что торможение синтеза фермента
обусловливается взаимодействием отрицательно заряженных групп жирных
кислот с основными группами ферментного белка [81]. Однако не
исключается влияние жирных кислот непосредственно на
биосинтез липазы. Если в среде достаточно кислоты, то в большом
количестве образуются корепрессор и активный репрессор и,
следовательно, синтез липазы, расщепляющей жиры, будет подавлен,
так как микроорганизму нет необходимости в синтезе фермента
для усвоения жира, если в его распоряжении в избытке имеются
жирные кислоты, которые он может реализовать с помощью
конститутивных ферментов.
Еще ранее было замечено [24], что увеличение количества
оливкового масла от 1,0 до 4,0% повышает синтез липазы Вас.
pyocyaneus, тогда как дальнейшее увеличение концентрации
масла репрессирует образование фермента; по-видимому, в этих
условиях образуются в избыточном количестве какие-то
метаболиты — репрессоры.
При добавлении к питательной среде жира молока синтез
липазы культурой Achromobacter lipolyticum увеличивается на
25%, при добавлении кукурузного масла — на 68,8%, а
оливкового— на 87%. Биосинтез липазы Staphylococcus повышается
при использовании в средах липидных субстратов: эфиров глице-
247

рина, жирных кислот, некоторых масел, яичного желтка [75,
22, 77].
Культивирование активного продуцента липазы Asp. awamo-
ri на средах с различными источниками углерода обеспечило
наилучшие результаты в опытах с использованием
кашалотового жира (табл. 37). Увеличение концентрации жира от 1,0 до
4,0% способствует усилению синтеза липазы, активность которой
возрастает от 100 до 630 ед/100 мл, т. е. более чем в 6 раз [1, 2,
3]. Рост мицелия в этих условиях изменяется не существенно
и варьирует, судя по биомассе, в пределах 1,00—1,30 г в 100 мл.
Дальнейшее увеличение дозы кашалотового жира до 6% в среде
не благоприятствует синтезу липазы и активность ее
относительно снижается до 597 ед/100 мл вместо 636 ед.
По-видимому, при высокой концентрации жира в среде
образуются в избыточном количестве продукты его распада,
репрессирующие в какой-то степени синтез фермента. Этим, вероятно,
можно объяснить благоприятное действие на биосинтез липазы
дробного, т. е. в три приема, внесения кашалотового жира в
питательную среду. При сохранении общей концентрации жира
в среде, равной 4%, активность внеклеточной липазы
увеличивается на 20—30% [2].
Внесение в питательную жирсодержащую среду
поверхностно-активного вещества — поливиниловый спирт (0,3%),
твин-60 (0,1—0,3%) или фосфатидный концентрат (0,05—0,1%) —
обеспечивает хорошую гомогенизацию жирсодержащей среды
и ее эмульгирование, стимулируя также биосинтез липазы,
вследствие чего ее активность повышается на 25—30% [1, 2, 3].
Биомасса при этом остается примерно на уровне контрольного
опыта (табл. 37).
Действие фосфатидного концентрата, как и других
поверхностно-активных веществ, обеспечивает высокий синтез липазы
даже при содержании в среде 1—2% кашалотового жира.
Уровень активности фермента при этом соответствует уровню,
получаемому при росте продуцента в среде, содержащей 4%
кашалотового жира (табл. 38).
Установлена взаимозависимость между потреблением жира
и биосинтезом липазы (рис. 59). При использовании детергента
в среде ассимиляция жира возрастает и достигает 88%. При
этом показано, что синтез липазы осуществляется
жизнедеятельной культурой. Активность липазы на средах с углеводами
и смешанными источниками углерода значительно ниже, чем на
среде с кашалотовым жиром [1, 2, 3].
Таким образом, возможность усиления биосинтеза липолити-
ческих ферментов микроорганизмами путем введения в среды
жиров или продуктов их гидролиза очевидна. Это касается
прежде всего микроскопических грибов. Однако имеются и
исключения. Так, например, бактерия Pseudomonas fragi в среде
248

Таблица 37
Влияние липидов и глицерина на синтез липазы Asp. awamori [2]
Источник углерода
Кашалотовый жир
Подсолнечное масло
(контроль)
Горчичное масло
Оливковое масло
Пальмовое масло
Хлопковое масло
Бараний жир
Глицерин

Концентрация,
%
1
2
4
6
1
2
4
6
8
2
4
6
2
4
6
2
4
6
2
4
6
1
2
4
6
2
4
6
Активность липазы

внеклеточной.
еЗ'100 мл
100
468
636
597
220
338
358
390
210
184
260
320
78
156
184
52
104
184
117
105
92
156
284
208
184
0
0
0

клеточной, ед/г
сухого
мицелия
23,0
43,0
52,0
23,0
18,5
22,4
23,4
32,5
21,0
17,0
32,0
32,5
12,0
15,0
31,0
7,0
12,0
17,0
12,0
7,0
2,0
18,0
19,5
21,0
22,0
0
0
0

Количество
сухой
биомассы,
г/100 мл
1,00
1,30
1,30
1,90
1,90
2,16
2,26
1,88
1,80
1,15
1,42
1,97
1,20
1,50
2,60
0,90
1,10
1,90
1,30
1,45
1,80
1,20
1,60
1,65
1,90
0
0,07
0,03
рН
культу-
ральной
жидкости
6,5
6,5
6,4
6,4
5,5
5,8
5,9
6,5
6,6
5,5
5,5
5,8
5,9
6,1
6,2
6,0
6,5
7,1
5,8
5,8
5,9
4,0
4,0
4,3
4,8
4,9
4,9
5.1
с триглицеридами синтезирует липазу слабее, чем в среде без
жира [65].
Прибавление свиного сала (лярд) или олеата натрия к
среде, используемой для продуцирования липазы Ps. fragi и Geotri-
chium candidum, приводит к уменьшению накопления
внеклеточной липазы. При этом максимальное продуцирование липазы
Geot. candidum было отмечено на среде с белковым гидролизатом
(2—4%) и глюкозой (0,25%), а также на среде с глюкозой
и аминокислотами [39, 72]. Если свиной жир вносили не в начале
роста, а через двое суток, то высокая активность фермента
к третьему дню падала в 6 раз. Однако наряду с уменьшением
249

активности липазы отмечается повышение содержания
свободных жирных кислот и прежде всего ненасыщенных, которые
и угнетают биосинтез липазы. Это отмечается и при внесении
в среду свободных жирных кислот.
•S
24 Ь8 72 36
Время нулыпибиробания, ч
Рис. 59. Диссимиляция жира и синтез липазы
грибом Aspergillus awamori при культивировании
глубинным способом в среде, содержащей каша-
лотовый жир (4%) и поливиниловый спирт [2]:
/ — потребление жира; 2 — активность липазы.
Таблица 38
Влияние фосфатидного концентрата на биосинтез липазы Asp. awamori [2]
Концентрация, %
кашалотового
жира
1
1
2
2
4
4
4
4
4
4
0
4
(контроль)
фосфатидного
концентрата
0,05
0,10
0,05
0,10
0,05
0,10
0,30
0,50
0,70
1,00
4,00
0
Активность
липазы.
«3/100 мл
1020
1080
1055
1120
1260
1360
1040
950
910
870
140
1040
Количество
сухой биомассы,
г/100 мл
0,80
1,00
1,50
1,00
2,10
2,30
2,20
2,40
2,70
2,80
2,60
2,15
рН культу-
ральиой
жидкости
5,5
5,5
4,7
4,4
5,6
6,1
6,2
6,3
6,3
6,4
5,2
4,4
250
IOUU
то
-| 1ZOO
^ woo
| 800
Ч
„ 500
|
!
■* гоо
/
/
/
/
/
/
V
> --1
/f-7-l
/
/
/
/
/
- ' ■

Углеводы. Для микробного биосинтеза липазы широко
используют и углеводсодержащие среды, включающие крахмал,
декстрины или глюкозу [57, 72, 58]. Плесневой гриб Mucor
lipolytics — продуцент липазы культивируется на среде,
содержащей 4% растворимого крахмала и 3% обезжиренной соевой
муки [18]. Содержание в среде глюкозы и пептона стимулирует
образование липазы Ps. fragi [40], а присутствие ксилозы
повышает синтез липазы Ps. species [76]. Act. aureofaciens
обеспечивает синтез высокоактивной липазы при росте на среде с
глюкозой, глицерином или крахмалом [7], ксилоза, арабан, галактоза,
сорбит, маннит обеспечивают лишь слабый синтез липазы и,
наоборот, замена крахмала мальтозой повышает активность
внеклеточной и внутриклеточной липаз в 1,5 раза.
При глубинном культивировании Candida cylindracea novus
sp. на заводе японской фирмы «Мейто Сангио» используют
питательную среду, состоящую из муки соевых бобов, кукурузного
экстракта, сульфата аммония и соли фосфорной кислоты. За
24 ч роста продуцента активность липазы культуральной
жидкости достигает 800—1000 ед/100 мл. Выход препарата липазы
(30000 ед/г) составляет 1,3% от культуральной жидкости.
Фирма «Дзеннихон Сейкаге» при культивировании
микроорганизма рода Penicillium в качестве питательной среды
использует обезжиренный соевый жмых, крахмал батата,
неорганические соли и любое растительное масло. Фирма выпускает
препараты активностью 2000 ед/г.
При глубинном культивировании других продуцентов (Mucor
genus, Asp. genus) используют среду, включающую
кукурузный экстракт, вытяжку из пшеничных отрубей и различные
неорганические соли (фирма «Амано»); при поверхностном
культивировании— пшеничные отруби. Фирма «Амано» выпускает
следующие высокоактивные препараты липазы, ед/г: 1) «АР» —
40000, 2) «АР-6» — 60000, 3) «М-АР-10» — 100000, 4) «М-
АР-20» — 200000. Однако препараты липазы, выпускаемые
фирмой «Нагазе», выше по активности (500000, 1000000 и даже
3000000 ед/г). При этом используется плесневой гриб рода
Rhizopus.
Угнетающее действие углеводов на образование липазы
иногда связано с их повышенной концентрацией. Так, при
культивировании Acromonas hydrophila синтез липазы заметно снижается
при содержании в среде глюкозы более 0,05% [67, 24].
Смешанные источники углерода. Для синтеза липазы
микроорганизмами нередко используют смешанные источники
углерода и часто углеводы в смеси с жирами. Иногда такое сочетание
оказывает благоприятное действие. Например, добавление
касторового масла к среде, содержащей 2% глюкозы, дает
положительный эффект при синтезе липазы Cand. paralipolytica, в то
время как глюкоза с кокосовым маслом не индуцирует синтез
251

фермента [82]. Та же культура образует высокоактивную липазу
на среде, содержащей 2% растворимого крахмала, 2%
обезжиренной соевой муки и 0,4% оливкового масла [37].
При культивировании Torulopsis ernobii на среде с
обезжиренной соевой и пшеничной мукой добавление оливкового масла
(0,2—0,6%) увеличивает выход внеклеточной липазы в 2 раза.
Добавление к среде олеиновой (0,14%) и пальмитиновой кислот
оказывает действие, аналогичное действию оливкового масла.
Триглицериды и жирные кислоты (пальмитиновая, олеиновая,
6 Г ~\600 <ч
- 400 §
- зоо %
-гоо\
I
- то |
г з ь s
Рис. 60. Зависимость образования липазы от
смешанных источников углерода [2]:
/ — среда с 6% глюкозы, 2 — среда с 4V» глюкозы и
2% жира, 3 — среда с 1% глюкозы и 5»/» жира, 4 —
среда с 0,5% глюкозы и 6% жира, 5 — среда с 6%
жира.
стеариновая в дозе 0,2%) стимулируют накопление липазы,
а кислоты с числом углеродных атомов меньше 12, наоборот,
угнетают синтез фермента.
Результаты, полученные при установлении влияния смешан-
- ных источников углерода — углеводы — жиры — позволяют
предполагать, что углеводы, как более доступная и
легкоусвояемая форма углерода, потребляются быстрее, чем жиры, в связи
с чем индуцирующее влияние жиров и жирных кислот
оказывается значительно слабее. Это можно наглядно
проиллюстрировать данными рис. 60.
Совместное использование кашалотового жира и глюкозы
оказывает иное влияние на биосинтез липазы, чем
использование их в отдельности. На средах с разными источниками
углерода отмечается уменьшение биомассы по сравнению с глюкозной
средой. Однако на среде только с кашалотовым жиром
образуется наименьшее количество биомассы. В то же время при
росте гриба на жирсодержащей среде образуется максимальное
количество липазы, соответствующее по активности 510 е<3/100 мл
252

[2]. Следовательно, увеличение концентрации жира в среде ведет
к угнетению роста гриба, снижению потребления сахара
и уменьшению накопления биомассы по сравнению с
количеством ее, получаемым на глюкозной среде.
Избыток жира на фоне глюкозы действует угнетающе на
синтез липазы [79, 2]. В то же время жиры используются как
источник углерода и при наличии углеводов в среде; в свою очередь
углеводы в отсутствии жира потребляются медленнее, чем в
присутствии его [23]. Следовательно, присутствие жира влечет за
собой использование сахара в большей степени, чем в отсутствии
жира, а присутствие углеводов способствует лучшему
потреблению жира плесневыми грибами. Однако из указанной
закономерности имеются и исключения. Так, прибавление к среде глки
козы повышает потребление оливкового масла Asp. flavus, но та
же глюкоза угнетает потребление масла Pen. silvaticum [15].
С другой стороны, внесение оливкового масла в среду с
глюкозой понижает потребление глюкозы Asp. flavus и мало влияет
на использование сахара Pen. silvaticum. Потребление жира
составляет 70%. При этом грибы переводят почти все связанные
кислоты жира в свободное состояние.
Влияние азотного питания
Как правило, микроорганизмы используют для своего роста
и развития как минеральные, так и органические соединения
азота. В конечном итоге азот любой формы превращается в
аммиак, который используется для синтеза аминокислот и белков,
входящих в состав клетки микроорганизмов. Известно, что для
роста грибов лучшими источниками являются аммонийные соли,
вероятно, в силу своей способности ассимилироваться более
легким путем. Нитраты и нитриты также хорошо потребляются
многими плесневыми грибами, однако не все микроорганизмы и
прежде всего бактерии обладают способностью синтезировать
ферментные системы, катализирующие восстановление нитратов
до аммиака.
В настоящее время установлено, и это нами отмечено в
соответствующих разделах книги, что для биосинтеза амилолитиче-
ских ферментов благоприятной формой азота является
нитратная, для протеолитических — органическая (для
микроскопических грибов) или аммонийная (для бактерий), для пектолитиче-
ских — аммонийная и т. д. Наиболее желательными источниками
азота для биосинтеза липолитических ферментов
микроскопическими грибами, бактериями и дрожжами являются органические
формы: пептон, мочевина, гидролизат казеина, кукурузный
экстракт [31, 67, 37, 12, 78, 2]. Так, например, синтез липазы Реп. го-
queforti на средах с молочным жиром и трибутиратом
усиливается в присутствии органических источников азота (мочевина,
253

казеин) по сравнению с неорганическим [14]. При использовании
различных источников азота синтез липазы Ps. species наиболее
интенсивно протекал в среде с мочевиной по сравнению с азот,
нокислым и сернокислым аммонием. Сернокислый аммоний [17,
56, 28, 58] и азотнокислый аммоний обеспечивают относительно
высокий синтез липазы грибом Mucor и дрожжами Candida по
сравнению с нитратными солями азота. Синтетическая среда,
содержащая 15 аминокислот, оказалась равноценной среде,
включавшей сернокислый аммоний и отдельные аминокислоты
(аргинин, лизин, аспарагин или глютаминовая кислота) при
культивировании Ps. fragi [40]. Положительный эффект
обнаружен при использовании только сернокислого и азотнокислого
аммония (0,1% азота); синтез липазы при этом проходил
относительно интенсивно при росте Act. aureofaciens [8]. Применение
азотнокислого натрия ведет к защелачиванию среды и снижению
вне- и внутриклеточной липазы.
Влияние неорганической формы азота хорошо проявляется
при культивировании активного продуцента Asp. awamori. Все
соли аммония обеспечивают рост продуцента, однако двузаме-
щенный фосфат аммония наиболее благоприятствует не только
росту культуры, но и биосинтезу липазы. Активность
внеклеточного фермента составляет при этом 910 ед/100 мл, тогда как при
росте гриба в среде NH4N03 она соответствовала лишь 117 ед.
(табл. 39).
При использовании всех указанных солей наблюдалось
значительное подкисление культуральной жидкости по сравнению
с контрольным опытом, в котором источником азота служил
нитрат натрия.
Оптимальной концентрацией (NH4)2HP04, обеспечивающего
максимальный синтез внеклеточной липазы, является 0,6% или
0,127% азота в среде. Увеличение до 1,0% не угнетает роста
культуры, но относительно снижает синтез липолитических
ферментов. Трехзамещенный фосфорнокислый аммоний в
концентрации 0,3% обеспечивает синтез липазы, активность которой
достигает 597—827 ед/100 мл. Важную роль при этом играет,
вероятно, не только азот, но и фосфор.
При культивировании гриба на средах, содержащих соль
щавелевой кислоты, отмечается высокий синтез липазы (377—
710 ед/100 мл) при относительно небольшой биомассе (1,0—
1,40 г/100 мл). Это объясняется, вероятно, некоторым
сходством физиологического действия анионов органической и
фосфорной кислоты.
Синтезу липазы в значительной мере благоприятствует
устанавливающаяся величина рН культуральной среды. В частности,
при использовании аммонийных солей фосфорной кислоты
происходит подкисление среды именно до рН 4,4—5,2, т. е.
оптимальной для образования фермента. Из окисленной формы азо-
254

Таблица 39
Влияние аммонийных и нитратных солей на биосинтез липазы культурой гриба
Aspergillus awamori [2]
Источник азота
рН
культу-
ральиой
жидкости

Количество
сухой
биомассы,
г/100 мл
Активность липазы

внеклеточной,
«и/100 мл

внутриклеточной,
«5 г

Продуктивность
1 г
мицелия,
ед
.Восстановленные формы азота
(NH4)2HP04
(NH4)3P04-3H20
NH4H2P04
(NH4)2S04
Щавелевокислый аммоний
NH4C1
NH4N03
NaN03 (контроль) ....
55
77
50
20
40
15
10
80
910
597
416
377
377
260
117
689
Окисленные формы азота
NaN03 .
KN03 . .
С a (N03)2
Контроль
6,4
1,90
1,90
1,60
1,90
630
690
415
668
84
87
38
24
30
12
13
29
17
12
55
17
Примечание. Соли вносили в эквивалентном количестве
равном 0,15%.
444
282
315
340
301
238
118
415
по азоту,
та калиевая соль азотной кислоты обеспечивает синтез липазы,
активность которой соответствует 610—690 ед/100 мл, т. е.
практически не отличается от активности контрольного опыта, в
состав среды которого включался нитрат натрия в качестве
источника азота (668—689 ед/100 мл). При росте гриба на среде
с нитратом кальция активность внеклеточной липазы составляет
лишь 40—60% от активности контроля (272—415 ед/100 мл).
Из сказанного ясно, что аммонийные соли фосфорной
кислоты являются наилучшими источниками азота для биосинтеза
липазы и роста гриба Asp. awamori. Такая закономерность
характерна и для многих других микроорганизмов.
Влияние органических форм азота. Некоторые органические
формы азота (желатин, сухое молоко) почти равноценны по
действию на синтез липазы с действием нитратного азота среды
контрольного опыта. Если активность внеклеточной липазы при
росте гриба Asp. awamori на среде с органическим источником
азота составляла минимум 59 ед. (с казеином) и максимум
520 ед/100 мл (с желатином), то культура, полученная на среде
с NaN03, имела активность 662 ед/100 мл (табл. 40), в то время
как биомасса гриба на среде с пептоном и особенно с сухим мо-
255

Таблица 40
Биосинтез липолитических ферментов грибом Asp. awamori при росте
на средах с органическими источниками азота [2]
Источник азота
NaN03 (контроль) . . .
рН
культуралfa-
ной
жидкости
5,7
5,4
4,7
7,3
6,5
Кол ичество
сухой
биомассы,
г/100 мл
1,88
3,30
2,25
1,96
1,90
Активность липазы

внеклеточной,
ей/100 мл
520
467
377
52
662

внутриклеточной,
ед/г сухого
мицелня
0
80
61
15
14
Примечание. Концентрация азота во всех вариантах опыта
составляла 0,15%.
Таблица 41
Влияние солей среды Чапека на синтез липазы грибом Asp. awamori 259 [2]
Исключенный (—) или добавленный (+)
компонент

Концентрация
солей, %
рН
культу-
ральной
жидкости

Количество
сухой
биомассы,
г/100 мл

Активность
липазы,
«5/100 мл
культу-
ральиой
жидкости
-MgS04
— КС1 и КН2Р04 . .
— КС1
—FeS04
+ MgS04
+ КС1
+ FeS04
Полный состав солей
0,05
0,05 и 0,1
0,05
0,001
0,1
0,1
0,003
4,5
80
20
36
35
50
00
30
45
468
675
900
508
790
758
770
920
Примечание. В состав среды входили: 1) двузамещенный фосфат
аммония (0,6%), 2) кашалотовый жир (4%), 3) полный набор солей.
локом в 1,2—1,7 раза превосходила биомассу, полученную при
росте гриба на среде с NaN03.
Интересно отметить, что активность внутриклеточной липазы
варьирует в широких пределах: от 14 до 80 ед/г сухой биомассы,
а клетки мицелия, полученные в среде с желатином, вообще не
содержали внутриклеточного фермента.
Оптимальное соотношение между углеродом и азотом
(0,150%) составляет 15: 1, при содержании 4% жира
оптимальное соотношение выражается как 26 : 1 и т. д. При оптимальных
256

соотношениях между углеродом и азотом происходит
максимальный синтез липазы. Увеличение концентрации азота до
0,6% на фоне 2%-ной концентрации жира в среде вызывает
вначале усиление биосинтеза фермента (при 13:1), затем
активность липазы немного снижается (при 6 : 1) и далее не
изменяется. Однако увеличение содержания азота более 0,15% при
использовании 4% жира ведет к ослаблению синтеза фермента.
В этих условиях оптимальное соотношение между углеродом
и азотом соответствует 26 : 1 [2].
Влияние минерального питания
Для синтеза липазы грибом Asp. awamori 259 необходимо
присутствие в среде всех минеральных солей, указанных
в табл. 41, за исключением хлористого калия. Отсутствие магния
в среде приводит к ослаблению роста гриба и уменьшению
биомассы в конце культивирования. Неблагоприятные условия
создаются для роста микроорганизма и в отсутствии калия и
железа. Если ион калия необходим для построения белковой
молекулы, то ион магния — для роста самой культуры [26]. Увеличение
дозировок FeS04 и MgS04 сверх 0,001 и 0,05 % соответственно
снижает синтез липазы, судя по ее активности, что
свидетельствует об угнетающем влиянии избытка этих ионов (0,003
и 0,1%) в среде [2, 51].
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ К ГЛАВЕ IX
1. Аренде И. М. Тезисы докладов II Всесоюзного биохимического
съезда. Ташкент, 1969.
2. А р е н д с И. М. Биосинтез липолитических ферментов культурой
гриба Asp. awamori. Диссертация. Московский технологический институт
пищевой промышленности. 1971.
3. А р е и д с И. М. Труды ВНИИ продуктов брожения. Вып. XIX. М.,
1971.
4. А р е н д с И. М., Родзевич В. И. и др. Авторское свидетельство
№ 207352, 1967.
5. Аренде И. М. и др. «Прикладная биохимия и микробиология».
Т. IV. Вып. 3. 340, 1968.
6. А р е н д с И. М., Родзевич В. И. «Микробиологический синтез»,
№ 1, 29, 1968.
7. Безбородое А. М., Смирнова Л. М., Великанова Т. С.
«Микробиологическая промышленность», № 3, 45, 1970.
8. Безбородое А. М., Смирнова Л. М., Великанова Т. С.
Биосинтез ферментов микроорганизмами и применение их в народном
хозяйстве, 1968.
9. Б е к к е р 3. Э. Физиология грибов и их практическое использование.
Изд. МГУ, 1963.
10. Войнарская В. В. Труды ВНИИФСа. Вып. XVI. 64, 1965.
11. Гавриченко Ю. Д., Казаков Е. Д., Стародубцева А. И.
«Прикладная биохимия и микробиология». Т. V. Вып. 3. 324, 1969.
12. Е п ге л ь б ре хт Г., Мах Ф. «Микробиология». Т. XXXVI, вып. 6.
976, 1967.
17 Заказ 7
257

13. И в а и о в Н. Н. Методы физиологии и биохимии растений. Сельхоз-
гиз. М., 1946.
14. Имамура Пунэаки, Катаока Кэй. Japan J. Zootech. Sci., 34,
№ 5, 334, 1963; РЖХим БХ, № 14Ф1872, 1965.
15. К а ц н е л ьс о н Р. С. Известия института им. Лесгафта. Т. XVII,
433. Л., 1934.
16. Кен ни и а Ш. М., Олифсон Л. Е, Жимии А. Н. «Микология
и фитопатология». 4, № 3, 247, 1970.
17. Коити Я., Хор у о М., Тосихико X., Акио К. J. Agric. chem.
Soc. Japan 37, 11, 645, 1963.
18. Ко хата й.. Н а г а о к а Ю., Го и М., Хара К. Японский патент
№ 8912, 1967, РЖХим БХ № 19Ф1893П, 1968.
19. Левицкий А. П. «Биохимия». Т. 30, вып. 45, 1965.
20. М а р к м а и А. Л., Ч е р н е н к о Т. В., У м а р о в А. У. «Прикладная
биохимия и микробиология». Т. V. Вып. 5, 616, 1969.
21. Новицкая Т. В. «Успехи современной биологии» Изд-во АН СССР,
Т. 50. Вып. 1(4), 29, 1960.
22. О к у н е в О. М. Тезисы секционных сообщений II Всесоюзного
биохимического съезда. 10 секция, 91, Ташкент, 1969.
23. Орлова Н. В. «Антибиотики», 6, 495, 1962.
24. П л о т к и н а А. А. Известия НМИ им. Лесгафта. Т. XV. Вып. 1—2,
183, 1929.
25. П о п о в а М. П., Нелюбова Г. М. Сб. «Биохимия зерна». Изд-во
АН СССР. № 4, 173, 1958.
26. П о п о в а Н. В. Влияние состава питательной среды на протеолити-
ческую активность Aspergillus terricola. Диссертация. Московский
технологический институт пищевой промышленности. М., 1968.
27. Р о д з е в и ч В. И., А р е н д с И. М. «Микробиологическая
промышленность», № 4, 1971.
28. Р о д з е в и ч В. И., Аренде И. М., Калашникова Н. А.. Че-
р е м и о в а Т. А. Тезисы докладов IV Всесоюзного микробиологического
съезда. Минск, 1971.
29. Р о м а н к о в а А. Г. Вестиик ЛГУ, № 4, 59, 1954.
30. Рубинштейн Ю. И. «Микробиология». Т. XIX. Вып. 5, 438, 1950.
31. С а то мура Ю. Японский патент №8692, 1957, РЖХим БХ
№ 21Ф1433П, 1964.
32. С е л и б е р Г. Л. Известия естественно-научного института им.
Лесгафта. Т. 5, 147, 1922. Монография НМИ им. Лесгафта «Главнаука». Л., 1926.
33. Состояние и тенденции развития микробиологической промышленности
в капиталистических странах. Изд. СОНТИ микробиопром, 1970.
34. Сурикова Е. И., Н е и а ш е в а А. М., «Микробиология». Т. XXVIII.
Вып. 4, 598, 1959.
35. Т р а й н и н а Т. И. Условия культивирования плесневых грибов рода
Aspergillus в производстве ферментных препаратов. Автореферат диссертации.
Харьков, 1970.
36. Трайнииа Т. И., Г о л у б ч н к М. Г. Вопросы биохимии и
технологии пищевого производства. Изд. Харьковский государственный университет.
Вып. 5, 37, 1967.
37. Я сухи дэ О., Коити Я. J. Agric. Chem. Soc. Japan, 37, 111, 653,
1963; РЖХим БХ, № 22Ф372, 1964.
38. Adams С. W. M., A b d u 11 a Y. H. et al. J. Histochem. and Cytochem.,
14, 5, 385, 1966.
39. Alford J. A., Elliott L. E. Food Res., 25, 2, 296, 1960.
40. Alford J., P i e г с e D. A. J. bacterid., 86, 1, 24, 1963.
41. A 1 f о r d J. A., P i e г с e D. A., S u g g s F. G. J. Lipid. Res., 5, 3, 390,
1964.
42. Andrejew A., DesbordesJ. Rev. immunol., 34, 1—2, 25, 1970.
258

43 Arima K-, N a r a s а к i T. Agr. Biol. Chem., 30, 5, 515, 1966.
44. С a n d a n R. С J. Dairy Sci., 46, 6, 503, 1963.
45. Carini S., G a 11 i A., Vo 1 о n t e r i о G. Ricerca sciet., 38, 10, 990,
1968.
46 De Moerloose P., Josson — Marcaert L. J. pharmac. Belg., 18,
N 9—io, 440, 1963.
47 Dluzewski M. Bull. Acad, polon. Sci. Ser. biol., 11, N 5, 227, 1963.
48. Eg gins H. O. W. Mycopathol. of mycol. appl., 28, N 2—3, 21,
1964.
49. Fette—Seifen Anstrichmittel, 65, 871, 1959.
50. F u к u m о t о J., 1 w a i M., T s u j i s а к a Y. J. Gen. Appl. Microbiol.,
9, 3, 353, 1963.
51. Fukumoto J., T s u j i s а к a Y. Патент США, № 3262863, 195,
1966.
52. Goodman J. J. Science, 112, 176, 1950.
53. H a u г о w i t z F. et al. A.B.B, 59, 52, 1955.
54. H e n d r i x J. W., Appl J. L. Phytopathology, 54, N 8, 987, 1964.
55. 1 w a i M., T s u j i s а к a Y., F u с u m о t о J. J. Gen. Appl.
56. J о i ch i Y., H a r u о М. Патент, кл. 99 (cl2k) № 276549, 1967.
57. J о j i Т., Yukio Y„ К о i с h i Y„ Nature (Engl.), 200, N 4912, 1208,
1963.
58. К о z о N.. Y u j i г о Y., Y о s h i h i s a K. Agric. Biol. Chem., 33, N 3,
299, 1969.
59. Laboureur P., Labrousse M. Bull. Soc. Chem. biol., 18, N 6,
747. 1966.
60. Lu V., Li ska B. L. Appl. Microbiol., 18, N 1, 104, 1969.
61. Lo С u r t о R. В., M a u g e r i T. L., P e r n i с е A. Boll. Inst, sieroterap.
milanese, 47, N 5—6, 229, 1968.
62. M a 11 s о n F. H., В e n e d i с t J. H. et al., J. Nutr., 48, 335, 1952.
63. Mattson F. H., Lutton E. S. J. Biol. Chem., 233, 868, 1968.
64. Matt son F. H., Beck L. W. J. Biol. Chem., 214, 115, 1955; 219, 735,
1956.
65. Nash if S. E, Nelson F. E.J. Dairy Sci., 36, 47!, 1953.
66. R a m a k r i s h n a n С V., В a n e r j e e B.N. Arch. Biochem. Biophys.,
37, 1, 131, 1952.
67. R о d r i g u e z D, Genzalez С Microb. esp., 16, N 3, 149, 1963;
РЖХим БХ, № 14 405, 1964.
68. S a r d a L.Desnuelle P. BBA, 30, 513, 1958.
69. S a vary P.. Desnuelle P. Compt. Rend., 240, 2571, 1955; Biochem.
et biophys. acta, 21, 349, 1956.
70. S a v a r у P. et al. Biochim. et biophys. acta, 24, 414, 1957; 35, 26,
1959.
71. Schonheyder F., Volguartz K. Biochim. Biophys. Acta, 15, 288,
1954.
72. Smith J. L., A 1 f о r d J. A. Appl. Microbiol., 14, N 5, 699, 1966.
73. Smythe С V., D r a k e В. В. Патент США, № 2480090, 195. 1966.
74. S о u с e k A., S о u с k о v a A., M a r а А. Журн. гигиены,
эпидемиологии, микробиологии и иммунологии, 8, № 1, 104, 1964.
75. Stewart G. Т. The lipases and pigments of Staphylococcus. 128, N 1,
132, 1965.
76. T a i k i Т., N a r a s a k i Т.. A r a m a k i K-, T a m u r a G., Arima K.
Agric. Biol. Chem., 32, N 12, 1458, 1968.
77. V a d e h r a D. V., H a r m о n L. G. J. Appl. Bacter., 32, N 2, 147, 1969.
78. V a s u с h i d e O., M a s a r u S., К о i с h i Y. Agric. Biol. Chem. 32,
N 3. 390, 1968.
79. Vol f V, Rouczaj Z. Binl. inform. Inst, antybiot., 7, N 5, 18, 1964.
80. W i 11 s E. D. Biochem. J., 60, 529, 1955.
81. W i N s E. D. Biochem. Pharmacol., 7, 1, 7, 1961.
17*
259

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Основные физиолого-биохимические процессы во всех
организмах, независимо от уровня их развития, протекают либо
тождественными, либо сходными путями. Для всех форм жизни,
существующих на Земле в настоящее время, основные
механизмы распада и синтеза углеводов, жиров, белков, нуклеиновых
кислот одни и те же.
Все молекулы клетки образуются путем химических
превращений из молекул питательных сред, вследствие чего почти все
белки без исключения построены из тех же самых 20
аминокислот, нуклеиновые кислоты — из тех же самых пуриновых и пири-
мидиновых оснований, углеводы — из тех же или очень близких
Сахаров. Небольшие различия могут быть связаны, например,
с последовательностью чередования аминокислот в отдельных
ферментах, тем не менее все пути обмена и реакции,
катализируемые сходными ферментами, остаются одинаковыми для
дрожжей, бактерий и человека.
Можно выделить и очистить фермент из одного организма
и без особых трудностей использовать его для изучения реакции
в другом, сильно отличающемся от первого. Рибосомы, т-РНК,
аминокислоты и др. из одних микроорганизмов способны
осуществлять синтез белков в клетках другого организма.
Принципиальное различие между разными
микроорганизмами кроется в источниках, из которых организм получает
энергию, необходимую ему для поддержания жизнедеятельности.
Влияние среды на размножение микроорганизмов можно
рассматривать как с точки зрения ее состава, так и с точки
зрения количественного содержания в ней веществ. Полноценный
питательный состав среды обусловливает скорость
размножения, но не конечный результат процесса. Недостаточное или
ограниченное содержание в среде питательных веществ,
необходимых для жизнедеятельности клеток, но не синтезируемых ими
самими, задерживает размножение микроорганизмов.
Отсутствие в среде необходимых соединений, но возможность их синтеза
самими клетками сказывается прежде всего на скорости
получения конечных продуктов. Поэтому полноценная среда должна
содержать главным образом те питательные вещества, которые
не могут быть синтезированы клетками и в то же время
обеспечивали бы их необходимой энергией для поддержания
жизнедеятельности и синтеза сложных органических соединений,
входящих в состав биомассы.
Таким образом питательные вещества, необходимые как
источник энергии, влияют в основном на скорость размножения
клеток, а концентрация этих веществ сказывается уже на
количественном выходе биомассы и часто — на содержании
ферментов.
260

В процессе метаболизма судьба большинства молекул
предопределена значительно более строго. Очень часто молекула
может либо превратиться в вещество X, либо быть использована
в качестве промежуточного продукта при биосинтезе вещества
Y, следовательно, она способна специфически взаимодействовать
лишь с двумя различными ферментами. И в этом случае
отчетливо проявляется биохимическая общность организмов.
Питание микроорганизмов можно условно разделить на две
фазы, в одной из которых осуществляется процесс транспорта
веществ через клеточную мембрану, во второй — происходят
сложные и многочисленные биохимические реакции, состоящие
из взаимосвязанных между собой процессов ассимиляции и
диссимиляции. Наряду с экзогенным питанием, при котором
питательные вещества поступают в клетку из внешней среды,
различают также и эндогенное питание, при котором микроорганизм
использует (например, при голодании) свои резервные вещества:
гликоген, трегалозу, липиды, азотистые соединения.
Вопрос о том, может ли какое-либо химическое соединение
использоваться микроорганизмом как питательное вещество,
определяется прежде всего способностью этого соединения
проходить через цитоплазматическую мембрану и проникать внутрь
клетки.
Механизм, с помощью которого осуществляется перенос
растворенных веществ через мембрану, часто отличается высокой
избирательностью. Признают, что все микроорганизмы имеют
барьер, называемый осмотическим, с помощью которого
ограничивается и регулируется проникновение внутрь и выделение
наружу растворимых веществ. Таким осмотическим барьером
у микроорганизмов служит липопротеидная цитоплазматическая
мембрана. Этим объясняется тот факт, что липофильные, т. е.
растворимые в липидах соединения часто проникают в клетки
микроорганизмов быстрее, чем липофобные.
Клеточная стенка в свою очередь является сильным
барьером для диффузии питательных веществ. Так, например,
установлено, что клеточные стенки многих грамположительных
бактерий непроницаемы для декстринов со средней молекулярной
массой 10000, а изолированные клеточные стенки Вас. megate-
rium проницаемы для полимеров, молекулярная масса которых
достигает приблизительно 50000.
Представляется вероятным, что в целом клеточные стенки
грибов и дрожжей оказывают более сильное задерживающее
действие, чем клеточные стенки бактерий.
Наибольшее распространение получили три гипотезы
прохождения веществ через мембраны клеток: 1) пассивный
перенос, 2) активный перенос и 3) пиноцитоз.
Все эти процессы регулируются специальными механизмами,
обеспечивающими метаболизм организма. Как уже отмечалось
261

ранее, синтез каждой полипептидной цепи фермента
контролируется отдельным структурным геном. Тем самым генетический
материал, или геном, состоящий из ДНК, ограничивает в
количественном отношении ферментный состав микроорганизма.
Отсутствие гена данного фермента исключает возможность его
образования. Закодированная в ДНК информация
транскрибируется на молекулу РНК и затем транслируется (переводится)
в молекулы фермента.
Таким образом последовательность аминокислот в
полипептиде определяется последовательностью нуклеотидов в
определенном участке ДНК, который является геном для этого
полипептида.
Последовательность оснований в кодоне, т. е. участке и-РНК,
состоящем из трех соседних нуклеотидов — триплетов,
обеспечивает кодирование каждой из 20 аминокислот, входящих в состав
белков. Итак, каждый микроорганизм может синтезировать
только те ферменты, для которых имеются 'соответствующие
гены. Однако под влиянием внешних факторов могут возникнуть
изменения в составе ДНК- Так, в результате воздействия
различных химических веществ или физических факторов
изменяется первичная структура определенных участков ДНК, что
обусловливает наследственное изменение микроорганизма (мутация).
Кроме того микроорганизмы быстро реагируют на изменение
химических и физических свойств среды. При этом
микроорганизму необходим механизм, с помощью которого обеспечивалось
бы регулирование активности ферментов, позволяющих ему
образовывать достаточное количество различных конечных
продуктов метаболизма. Эти конечные продукты (аминокислоты,
пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды и др.) регулируют
ферментативную активность клетки и тем самым предотвращают
перепроизводство низкомолекулярных промежуточных
продуктов обмена. Регуляция при этом происходит не только путем
ингибирования активности ферментов конечным продуктом, но
и путем репрессии их синтеза.
Присоединение конечного продукта к аллостерическому
центру фермента сопровождается утратой нормальной
каталитической активности, вероятно, вследствие конформационных
изменений структуры белковой молекулы. При ингибировании
ферменты хотя и утрачивают активность, однако синтез их
продолжается. Репрессия же, наоборот, позволяет экономить клеточный
белок, останавливая синтез тех ферментов, которые в данный
момент не требуются клетке.
Синтез ферментов у микроорганизмов можно остановить,
если вводить в среду глюкозу. Если, например, микроорганизм
синтезирует соответствующий фермент (гистидин-аммиак-
лиазу, амилазу, липазу) при выращивании в среде,
содержащей глицерин, крахмал или жир, то синтез фермента почти пол-
262

ностью прекращается в присутствии глюкозы. Этот механизм,
известный под названием катаболитнои репрессии (глюкозного
эффекта), действует одновременно с индукцией и репрессией
синтеза ферментов конечным продуктом.
Если конститутивные ферменты синтезируются
микроорганизмами вне зависимости от химического состава среды, то
индуцированные ферменты образуются только в присутствии
в среде индуктора. Следовательно, синтез ферментов зависит не
только от генетически обусловленных свойств микроорганизма,
но также и от подбора специфических условий культивирования
продуцента.
Влияние состава питательной среды на биосинтез многих
индуцированных гидролитических ферментов нами рассмотрено
в последних главах настоящей книги. Однако наряду с
химическими факторами или составом среды для синтеза ферментов
имеют значение и физико-химические условия культивирования
микроорганизма. Потребность микроорганизмов в кислороде
удовлетворяется главным образом за счет органических
соединений среды, содержащих атомы кислорода. Однако многие
микроорганизмы— продуценты ферментов проявляют потребность
и в свободном 02. Молекулярный кислород в отличие от других
элементов питания сравнительно мало растворим в воде и
поэтому для роста аэробных микроорганизмов должен постоянно
поставляться в культуру. Культивирование микроорганизмов,
растущих аэробно, зависит от 02, растворенного в культураль-
ной жидкости, где его содержание должно постоянно
восполняться.
Поскольку растворимость 02 в воде увеличивается при
понижении температуры, рост микроорганизмов при более низких
температурах не ограничивается содержанием кислорода в
такой степени, как в случае инкубации при более высоких
температурах. Этим объясняется, почему общий урожай организмов,
выращенных при низких температурах, часто оказывается выше,
чем урожай микроорганизмов, выращенных при высоких
температурах, хотя скорость роста в последнем случае может быть
и больше '.
. Аэробные микроорганизмы значительно различаются в
отношении количества 02, необходимого для их максимального
роста. Это количество может не совпадать с тем, которое требуется
для других процессов метаболизма. Так, в процессе образования
производственным штаммом Asp. niger лимонной кислоты для
максимального выхода продукта необходимо большее
количество 02, чем для максимального роста гриба.
Для роста облигатно анаэробных микроорганизмов кислород
токсичен, 'но действие его не летально. Предполагают, что дыха-
1 Sinclair N. A., S t о k e s J. L. J. Bact., 85, 164, 1963.
263

ние в аэробных условиях у этих организмов приводит к
образованию перекиси водорода и, поскольку они не продуцируют
фермента каталазы, Н202 накапливается, и действие ее оказывается
токсичным. Аэрация и перемешивание среды благоприятно
действуют на рост и накопление биомассы многих
микроорганизмов, а также на биосинтез ими ферментов.
Главным фактором аэробной ферментации является перенос
Ог из газовой фазы в раствор вблизи клетки. Оптимальный
уровень аэрации для гриба Asp. oryzae 3-9-15 — активного
продуцента а-амилазы — соответствует 180 мк-моль 02/л.
Максимальная скорость потребления растворенного 02 отмечается
в конце экспоненциальной фазы роста; с наступлением
стационарной фазы скорость потребления 02 понижается.
При культивировании Candida cylindracea novus sp.—
продуцента липазы — в инокуляторе (1 м3) или ферментаторе (10 м3)
расход воздуха составляет 40 м3 на 1 м3 культуральной
жидкости в час при одновременном перемешивании ее мешалкой с
интенсивностью 180 об/мин. Эти условия обеспечивают синтез
липазы, активность которой составляет 800—1000 ед/мл. При
культивировании микроорганизма рода Penicillium расход
воздуха составляет 60 м3/ (м3 -ч).
Для биосинтеза кислой протеиназы грибом Asp. oryzae
132-63, а также мутантами Asp. oryzae 251-90 и Asp. awamori
78-2 требуется вполне определенная корреляция между
скоростью аэрирования и интенсивностью механического
перемешивания культуральной среды. Максимальный синтез протеиназы
(2,55—6,34 мг тирозина/жл) наблюдается при пропускании
одного объема воздуха через равный объем среды в минуту и
перемешивании ее мешалкой со скоростью 180 об/мин.
Культивирование термофильных микроорганизмов требует
больше воздуха, чем мезофильных. Это объясняется тем, что при
относительно высоких температурах (50—65° С) растворимость
Ог в среде понижается, хотя скорость вступления его в
окислительные реакции у термофилов относительно возрастает.
Водородные ионы. Предельные значения рН среды для
микроорганизмов колеблются от 4 до 9. Бактерии размножаются на
средах со значениями рН, близкими к нейтральному, и обычно
не могут переносить среды, значения рН которых ниже 4—5. Из
этого общего правила, однако, имеются исключения, например
уксуснокислые бактерии или отдельные серные бактерии,
окисляющие серу до серной кислоты. Грибы и дрожжи предпочитают
кислую реакцию среды, соответствующую рН 4—6. Значение рН
среды может влиять не только на рост, но и на другие
метаболические процессы и на морфологию организмов.
Поскольку цитоплазматическая мембрана сравнительно мало
проницаема для водородных и гидроксильных ионов, то их
концентрация в цитоплазме, вероятно, остается достаточно постоян-
264

ной, несмотря на то что значения рН среды колеблются в
широких пределах. Величина рН среды может оказывать влияние на
активность ферментов в клеточной стенке и в периплазме.
Температура. Скорости биохимических (как и химических)
реакций возрастают по мере повышения температуры. Влияние
температуры на биохимическую реакцию выражают
температурным коэффициентом Q]0, равным отношению скоростей реакций
при температурах, различающихся на 10 град.
Значения температурного коэффициента обычно лежат
между 3,0 и 4,0 при комнатной температуре (18—22° С) и
уменьшаются при повышении ее. Например, значение Qio для роста
Escherichia coli колеблется от 4,2 при температурах 15—25° С до
1,04 при 35—45° С.
По отношению к температурам, лежащим в пределах
биокинетической зоны, микроорганизмы сильно отличаются один от
другого. Наиболее благоприятная температура в пределах этой
области называется оптимальной. Обычно оптимальной для
роста температурой считают ту, при которой микроорганизм
растет быстрее; максимальный выход биомассы или урожай клеток
бывает очень часто при температуре, на несколько градусов
ниже, чем оптимальная для роста.
Для любого микроорганизма значения температур могут
меняться в зависимости от химического и физического состояния
среды.
Оптимальная для роста какого-либо микроорганизма
температура определяется суммарным влиянием ее на сотни
ферментативных реакций, протекающих в клетке. Вероятно, существуют
определенные ферменты, которые лимитируют и определяют при
этом скорость роста микробной клетки.
Резкое падение скорости роста микроорганизмов при
температурах, превышающих оптимальные, является результатом
обратимой или необратимой денатурации определенных
ферментов, ответственных за ограничение скорости роста, и,
возможно, некоторых других ферментов. При температурах,
максимальных для роста микроорганизмов, эти ферменты очень
быстро денатурируют. Для термофилов характерно наличие
ферментов, которые по сравнению с их аналогами у мезофилов более
устойчивы к тепловой денатурации. Такая устойчивость данных
ферментов объясняется тем, что они обладают более прочными
и удачно расположенными вторичными связями по сравнению
с ферментами других микроорганизмов. У мезо- и психрофилов
денатурируются при температуре, близкой к максимальной,
по-видимому, ферменты, относящиеся к числу дыхательных.
Тепловая денатурация ДНК и РНК также может быть
фактором, определяющим максимальную температуру для роста
некоторых микроорганизмов, хотя нуклеиновые кислоты менее
чувствительны к нагреванию, чем ферменты.
265

Еще меньше известно о физиологических причинах,
обусловливающих ту минимальную температуру, при которой возможен
рост микроорганизмов. Поскольку рост и дыхание представляют
собой химические реакции, то они должны продолжаться и при
уменьшении температуры инкубирования и прекращаться при
замерзании среды, когда она становится твердой. Это
справедливо в отношении психрофильных организмов, минимальные
температуры для роста которых часто лежат ниже нуля. Мезо-
филы не способны к размножению в условиях инкубации уже
при температурах ниже 5—10° С, хотя дыхание за счет
эндогенных источников у них продолжается вплоть до нуля.
Предполагают, что минимальная температура, при которой
возможен рост многих мезофильных микроорганизмов,
определяется той температурой, при которой прекращается перенос
растворенных веществ через цитоплазматическую мембрану.
Было, например, показано, что минимальная температура, при
которой еще продолжается рост некоторых мезофилов,
примерно совпадает с той температурой, при которой
приостанавливается транспорт Сахаров через цитоплазматическую мембрану.
Возможно, отдельные пермеазы мезофилов могут инактивиро-
ваться вследствие конформационных изменений, вызванных
низкими температурами. Функция пермеаз может быть обусловлена
изменениями в организации мембраны. Не исключено также,
что при низких температурах снижается образование и расход
АТФ, необходимой для активного потребления растворенных
веществ среды.
Температура может влиять не только на рост
микроорганизма, но и на различные метаболические процессы. Так, синтез
полисахаридов, как капсульных, так и внутриклеточных,
происходит интенсивнее при более низких температурах, чем при более
высоких. От температуры зависит синтез пигментов некоторыми
микроорганизмами и т. п.
* * *
Изучение за последнее время внеклеточных ферментов,
продуцируемых большим количеством микроорганизмов, послужило
основой для значительного увеличения их выходов и широкого
практического использования.
При рассмотрении общих механизмов биохимических
процессов необходимо иметь в виду, что синтез белков в клетке идет
иным путем, чем их распад, вследствие чего создаются
замкнутые метаболические циклы — гидролиза и синтеза. Изменение
интенсивности и направленности процессов метаболизма
определяется всецело изменениями скоростей ферментативных
реакций.
Скорость ферментативных реакций и есть конечный объект
воздействия регуляторных механизмов. Она зависит, как отме-
266

чалось ранее, от многих причин: концентрации субстрата, ко-
ферментов, скорости устранения конечных продуктов и т. д. Так,
например, скорость реакции цикла трикарбоновых кислот
лимитируется дефицитом субстратов. Частным случаем этого
механизма регуляции является конкуренция различных ферментных
систем за общие субстраты и кофакторы (АДФ, АТФ, НАД,
РНК).
Наличие в клетке полиферментативных систем,
катализирующих многоступенчатые реакции метаболизма, имеет
следствием то обстоятельство, что суммарная скорость процесса зависит
от скорости самой медленной реакции, которая в данном случае
будет лимитировать скорость процесса в целом.
Скорость ферментативной реакции может быть ограничена
не только низким содержанием субстрата или кофермента
в клетке, но и недоступностью их для данной реакции,
обусловленной пространственным разобщением между ферментом,
с одной стороны, и субстратом и коферментами — с другой.
Известен ряд фактов непроницаемости внутриклеточных
мембран для тех или иных веществ. Так, АТФ образуется, как
правило, в митохондриях и ее поступление в цитоплазму и
использование для энергетического обеспечения функций клетки
ограничено. Это касается многих гидролитических ферментов,
локализованных в лизосомах, НАД, НАДФ и т. д.
Таким образом внутриклеточные структуры играют
исключительно важную роль в координации сложных процессов
метаболизма.

ОГЛАВЛЕНИЕ
От автора 3
Введение 5
Список использованной литературы 12
Глава I. УЛЬТРАСТРУКТУРА КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ . 13
Клеточная стенка 21
Протопласт 26-
Клеточные мембраны 28
Цитоплазматическая мембрана 29
Сборка плазматической мембраны 31
Цитоплазма 31
Ядро и ядерные структуры 3$
Митохондрии 35-
Сборка мембран митохондрий 40
Мезосомы 41
Лизосомы 43-
Рибосомы 44
Вакуоли 45
Эндоплазматический ретикулум 45-
Аппарат Гольджи 46
Список использованной литературы к главе I 48
Глава II. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ МИКРООРГАНИЗМОВ ... 52
Вода 53-
Минеральные и органические вещества клетки -53
Белки 54
Коферменты и ферменты 55
Протеиногенные аминокислоты 55
Свободные внутриклеточные аминокислоты 56
Нуклеопротеиды 58
Нуклеиновые кислоты 58
Углеводы .62
Липиды 62
Внеклеточные липиды 63
Фосфатиды. Стероиды 64
Пигменты 64
Полифосфаты (ПФ) 65
Состав клеточных стенок 68
Стенка бактериальной клетки 69
Стенка клеток плесневых грибов 72
Список использованной литературы к главе II 7S
268

Глава III РАЗМНОЖЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ .... 79
ДНК как переносчик генетической информации 84
Соответствие между структурой ДНК (геном) и структурой белка . 86
Биохимические процессы, обеспечивающие клеточное деление . . .91
Разобщение роста и деления микроорганизмов 97
Список использованной литературы к главе III 99
Глава IV. РЕГУЛИРОВАНИЕ БИОСИНТЕЗА ФЕРМЕНТОВ В
КЛЕТКЕ МИКРООРГАНИЗМА 100
Генетический контроль синтеза ферментов 100
Факторы, влияющие на биосинтез ферментов 108
Выбор и селекция микроорганизмов 108
Влияние компонентов среды ПО
Влияние дополнительных факторов роста 119
Аминокислоты, проявляющие специфичность индукции и репрессии . 120
Пурнновые основания и их производные 126
РНК и продукты ее гидролиза 130
Свободные внутриклеточные аминокислоты 131
Внутриклеточные биохимические процессы 136
Роль субклеточных компонентов в процессах регуляции 142
Список использованной литературы к главе IV 143
Глава V. АМИЛОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ 145
Краткая характеристика ферментов 145
Продуценты амилолитических ферментов 149
Влияние состава среды на биосинтез ферментов 151
Влияние углеродного питания .... 154
Влияние азотного питания 160
Влияние минерального питания 165
Список использованной литературы к главе V 168
Глава VI. ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ 174
Краткая характеристика ферментов 174
Продуценты протеолитических ферментов 181
Влияние состава среды на биосинтез ферментов 182
Влияние углеродного питания 183
Влияние азотного питания 189
Влияние фосфора и серы 198
Соотношение источников углерода и азота в среде 200
Список использованной литературы к главе VI 200
Глава VII. ПЕКТОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ 205
Краткая характеристика ферментов 205
Продуценты пектолитических ферментов 210
Влияние состава среды на биосинтез ферментов 212
Влияние углеродного питания 212
Влияние азотного питания . . 215
Влияние минерального питания 217
Список использованной литературы к главе VII 219
269

Глава VIII. ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ
. 222
Краткая характеристика ферментов 222
Продуценты целлюлолитических ферментов 225
Влияние состава среды на биосинтез ферментов 227
Влияние углеродного питания 227
Влияние азотного питания 232
Влияние минерального питания 236
Влияние температуры на биосинтез ферментов 237
Список использованной литературы к главе VIII 237
Глава IX. ЛИПОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ 240
Краткая характеристика ферментов 240
Продуценты липолитических ферментов 245
Влияние состава среды на биосинтез ферментов . 246
Влияние углеродного питания 246
Влияние азотного питания 253
Влияние минерального питания 257
Список использованной литературы к главе IX 257
Заключение 260

СЕРГЕИ АЛЕКСАНДРОВИЧ КОНОВАЛОВ
БИОСИНТЕЗ ФЕРМЕНТОВ МИКРООРГАНИЗМАМИ
Редактор А. И. Ковалевская
Художник С. Н. Орлов
Худож. редактор С. Р. Н а к
Техн. редактор Г. Г. Хацкевич
Корректоры Н. С. Козлова и В. Б. Грачева
Т-07856 Сдаио в набор 6/1—72 г.
Подписано к печати 26/IV—72 г.
Формат 60 X 90'/i6 Бумага типограф. № 2 Объем 17 п. л.
Уч.-изд. л. 19,56 Тираж 2000 экз.
Цена 2 р. 19 к. Зак. 7
(клише изготовлены в типографии № 10).
Издательство «Пищевая промышленность»
Москва, 113035 Ж-35, 1-й Кадашевский пер., 12
Экспериментальная типография ВНИИ полиграфии
Комитета по печати при Совете Министров СССР
Москва, К-51, Цветной бульвар, 30

ИЗДАТЕЛЬСТВО
«ПИЩЕВАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ»
В 1972 году выйдет в свет и поступит в продажу книга
ЗАБРОДСКИЙ А. Г. Производство кормовых
дрожжей на мелассно-спиртовых заводах. 19 л., 3000 экз.,
1 р. 10 к.
В книге помещены сведения о составе и свойствах
кормовых дрожжей, их применении и получении из разных
видов сырья. Рассмотрены физиологические свойства
дрожжей, влияние внешних факторов на
жизнедеятельность и закономерности их роста.
Описаны применяемые методы культивирования
кормовых дрожжей и показана продуктивность этого
процесса при различных условиях. Дана характеристика
мелассы, барды и вспомогательных материалов.
Наибольшее место отведено выбору оптимальных
условий культивирования кормовых дрожжей на меласснои
барде. Подробно изложены технология кормовых
дрожжей на меласснои барде и особенности аппаратурной
схемы производства.
Приведена техническая характеристика оборудования
для цехов кормовых дрожжей различной мощности.
Кратко освещены возможные пути использования после-
дрожжевой барды.
Книга рассчитана на инженерно-технических
работников спиртовой промышленности.
Заказы на книгу (без денежных переводов) следует
направлять по адресу: 113035, Москва, Ж-35, 1-й
Кадашевский пер., дом 12. Отдел распространения.