Text
                    А. Ленинджер
ОСНОВЫ
БИОХИМИИ


А. Ленинджер ОСНОВЫ БИОХИМИИ
Albert L.Lehninger PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY The Johns Hopkins University School of Medicine Worth Publishers, Inc.
А.Ленинджер ОСНОВЫ БИОХИМИИ в трех томах 2 Перевод с английского М. Г. Дуниной и канд. мед. наук С. Н. Преображенского под редакцией акад. В. А. Энгельгардта и проф. Я. М. Варшавского МОСКВА «МИР» 1985
УДК 577.1 Л44 ББК 28.072 . 1еницджер А. Л44 Основы биохимии: В 3-х т. Т. 2. Пер. с англ.-М.: Мир. 1985.-368 с, ил. Имя крупного американского биохимика А. Ленинджера уже известно советским читателям по его книге «Биохимия», выпушенной в русском переводе издательством «Мир» в 1974 г. Новая книга представляет со- собой фундаментальное учебное пособие, предназначенное для изучения основ биологической химии. Во второй том вошли материалы по биоэнергетике и метаболизму клетки. Рассмотрены роль глюкозы в биоэнергетических процессах, цикл лимонной кислоты, электронный транспорт, окислительное фосфорили- рование, регуляция образования АТФ, окисление жирных кислот в тка- тканях животных, окислительный распад аминокислот, биосинтез углеводов, липидов, нуклеотидов, аминокислот, а также фотосинтез. Предназначена для биологов разных специальностей, медиков, студен- студентов и всех лиц, интересующихся молекулярными основами процессов жизнедеятельности. „2001040000-285 _ 1ПО_ kei/- Л св. пл. подписных издании 1985 г. ЬЬК 041,01/ 85 57.04 Редакция биологической литературы © 1982 by Worth Publishers, Inc. © перевод на русский язык, «Мир», 1985
ЧАСТЬ II БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ И мы, люди, и все другие живые суще- существа устроены очень сложно. Многие смутно осознают, что эта сложность под- поддерживается пищей, потребляемой орга- организмом и в нем перерабатываемой. Для физика, однако, живые организмы соста- составляют проблему, имеющую особый ин- интерес, поскольку их существование, каза- казалось бы, противоречит одному из фунда- фундаментальных законов физики. Согласно этому закону, известному как второй за- закон термодинамики, организованные скопления материи стремятся к дезорга- дезорганизации, т.е. стремятся со временем перейти в более неупорядоченную, неор- неорганизованную форму. Теперь мы знаем, что живые клетки тоже подчиняются это- этому закону. Они только «обходят» его, поддерживая свою внутреннюю упоря- упорядоченность в динамическом стационар- стационарном состоянии за счет питательных ве- веществ и свободной энергии, получаемых из внешней среды и преобразуемых в процессе метаболизма. Чтобы составить себе представление о путях клеточного метаболизма, о его энергетике и динамике, нам следует на- начать наше рассмотрение с энергетических изменений, характеризующих отдельные химические реакции, катализируемые ферментами в условиях постоянства тем- температуры и давления, т. е. в тех условиях, которые существуют в клетках. Мы уз- узнаем при этом, каким образом катализи- катализируемые ферментами реакции могут объе- объединяться в цепи, или системы, благодаря наличию общих промежуточных продук- продуктов, что обеспечивает возможность эф- эффективного переноса химической энер- энергии. Далее мы познакомимся с цент- центральными метаболическими путями, или последовательностями ферментативных реакций, приводящими к расщеплению главных питательных веществ- углево- углеводов, жиров и аминокислот-с одновре- одновременным запасанием части содержащейся в них свободной энергии в форме энергии АТР. После этого мы рассмотрим, этап за этапом, некоторые важные цен- центральные пути биосинтеза, на которых главные макромолекулы клетки строятся из простых молекул-предшественников за счет химической энергии. Скорость этих метаболических путей -как синтеза, так и распада - находится под контролем и регулируется очень тонкими и чувстви- чувствительными механизмами. Результатом всей этой активности, включающей коор- координированную активность сотен фермен- ферментов, является фантастически сложная сеть ферментативных реакций, действую- действующая столь же эффективно, как компью- компьютер, чтобы обеспечить сохранение и под- поддержание внутренней упорядоченности клеток, несмотря на колебания, происхо- происходящие во внешней среде.
_^^" s.¦ "™" '"' ..Г^!/""" '*CC
ГЛАВА 13 МЕТАБОЛИЗМ. ОБЩИЙ ОБЗОР В живых клетках протекает множество ферментативных реакций. Всю совокуп- совокупность этих реакций мы объединяем об- общим понятием метаболизм, однако не- неверно было бы думать, что клетка-это не более чем мембранный мешок, в ко- котором ферменты действуют случайным, неупорядоченным образом. Метаболизм представляет собой высококоординиро- ванную и целенаправленную клеточную активность, обеспечиваемую участием многих взаимосвязанных мультифер- ментных систем. Он выполняет четыре специфические функции: 1) снабжение химической энергией, которая добывает- добывается путем расщепления богатых энергией пищевых веществ, поступающих в орга- организм из среды, или путем преобразова- преобразования улавливаемой энергии солнечного света; 2) превращение молекул пищевых веществ в строительные блоки, которые используются в дальнейшем клеткой для построения макромолекул; 3) сборку белков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов и прочих клеточных ком- Метаболическая карта. Известно уже более 2000 ферментов, участвующих в метаболизме клеток, и многие еще несомненно предстоит открыть. Часть этих ферментов работает на главных, «торных», путях метаболизма. Другие катализируют образование многих спе- специализированных продуктов, требующихся лишь в небольших количествах. Все метаболи- метаболические пути в конечном счете взаимосвязаны. Мы будем изучать метаболизм так, как, напри- например, знакомится с городом человек, впервые попавший в столицу, т.е. мы начнем это изуче- изучение с его главных «проспектов», от которых затем уже можно будет перейти к любым бо- боковым «улицам» или «переулкам». понентов из этих строительных блоков; 4) синтез и разрушение тех биомолекул, которые необходимы для выполнения ка- каких-либо специфических функций данной клетки. Хотя метаболизм слагается из сотен различных ферментативных реакций, центральные метаболические пути, ко- которые нас обычно больше всего интере- интересуют, немногочисленны и почти у всех живых форм в принципе едины. В этой обзорной главе мы рассмотрим источни- источники вешеств и энергии для метаболизма, центральные метаболические пути, ис- используемые для синтеза и распада главных клеточных компонентов, меха- механизмы, участвующие в передаче химиче- химической энергии, и, наконец, те эксперимен- экспериментальные подходы, с помощью которых ведется изучение метаболических путей. 13.1. Живые организмы принимают участие в круговороте углерода и кислорода Наше рассмотрение мы начнем с ма- макроскопических аспектов метаболизма, с общего метаболического взаимодей- взаимодействия между живыми организмами био- биосферы. Все живые организмы можно подразделить на две большие группы в зависимости от того, в какой химиче- химической форме способны они усваивать по- поступающий из среды углерод. Авто- трофные клетки («сами себя питающие») могут использовать в качестве един- единственного источника углерода атмосфер-
376 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ ную СО2, из которой они и строят все свои углеродсодержащие биомолекулы. К этой группе принадлежат фотосинтези- рующие бактерии и клетки листьев зе- зеленых растений. Некоторые автотрофы, например цианобактерии, могут также использовать для синтеза всех своих азотсодержащих компонентов азот ат- атмосферы. Гетеротрофные клетки («пи- («питающиеся за счет других») не обладают способностью усваивать атмосферную СО2 ; они должны получать углерод в ви- виде достаточно сложных органических со- соединений, таких, как, например, глюкоза. К гетеротрофам относятся клетки выс- высших животных и большинство микроор- микроорганизмов. Автотрофы, сами себя обеспе- обеспечивающие всем необходимым для жизни, обладают определенной независи- независимостью, тогда как гетеротрофы, нуждаю- нуждающиеся в сложных источниках углерода, питаются продуктами жизнедеятельно- жизнедеятельности других клеток. Есть между этими двумя группами и еще одно важное различие. Многие ав- тотрофные организмы осуществляют фотосинтез, т. е. обладают способностью использовать энергию солнечного света, тогда как гетеротрофные клетки добы- добывают необходимую им энергию, рас- расщепляя органические соединения, выра- вырабатываемые автотрофами. В биосфере автотрофы и гетеротрофы сосуществуют как участники единого гигантского ци- цикла, в котором автотрофные организмы строят из атмосферной СО2 органиче- органические биомолекулы и часть их при этом выделяет в атмосферу кислород. Гетеро- Гетеротрофы используют вырабатываемые ав- автотрофами органические продукты в ка- качестве пищи и возвращают в атмосферу СО2. Таким путем совершается непреры- непрерывный круговорот углерода и кислорода между животным и растительным ми- миром. Источником энергии для этого ко- колоссального по своим масштабам про- процесса служит солнечный свет (рис. 13-1). Автотрофные и гетеротрофные орга- организмы можно в свою очередь разделить на подклассы. Существует, например, два больших подкласса гетеротрофов: аэ- аэробы и анаэробы. Аэробы живут в среде, содержащей кислород, и окисляют орга- -0, Органические \ I продукты 1 СО, -н2о- Рис. 13-1. Круговорот двуокиси углерода и круговорот кислорода между двумя областями биосферы Земли -фотосинтезирую щей и гете- гетеротрофной. Масштабы этого круговорота ог- огромны. За год в биосфере совершает кругово- круговорот свыше 3,5-10" т углерода. Баланс между образованием и потреблением СО2-один из важных факторов, определяющих климат на Земле. Содержание СО2 в атмосфере возросло за последние 100 лет примерно на 25% из-за все более усиливающегося сжш ания угля и нефти. Некоторые ученые утверждают, что дальнейшее увеличение количества атмосфер- атмосферной СО2 повлечет за собой повышение средней температуры атмосферы («парниковый эф- эффект»); не все, однако, согласны с этим, по- поскольку трудно определить точно количества СО2, образующейся и вовлекаемой в повтор- повторные циклы в биосфере, а также поглощаемой океанами. Для того чтобы вся атмосферная СО2 была пропущена через растения, требуется около 300 лет. нические питательные вещества молеку- молекулярным кислородом. Анаэробам для окисления питательных веществ кисло- кислород не требуется; они обитают в бескис- бескислородной среде. Многие клетки, напри- например дрожжевые, могут существовать как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Такие организмы называют факульта- факультативными анаэробами. Однако для обли- гатных анаэробов, не способных исполь- использовать кислород, последний является ядом. Таковы, например, организмы, обитающие глубоко в почве или на мор- морском дне. Большинство гетеротрофных клеток, в особенности клетки высших ор- организмов,-факультативные анаэробы, но при наличии кислорода они используют для окисления питательных веществ аэ- аэробные метаболические пути. У одного и того же организма разные группы клеток могут принадлежать к
ГЛ. 13. МЕТАБОЛИЗМ. ОБЩИЙ ОБЗОР 377 разным классам. Например, у выси!их растений зеленые хлорофиллсодержащие клетки листа - фотосинтезирующие авто- трофы, а бесхлорофилльные клетки кор- корня - гетеротрофы. Более того, зеленые клетки листьев только днем ведут авто- трофное существование. В темное время суток они функционируют как гетеро- гетеротрофы и добывают необходимую им энергию путем окисления углеводов, син- синтезированных ими на свету. 13.2. В биосфере существует круговорот азота Всем живым организмам помимо ис- источников углерода, кислорода и энергии необходим еще и источник азота. Азот требуется для биосинтеза аминокислот, а также пуриновых и пиримидиновых ос- оснований, т. е. тех азотсодержащих строи- строительных блоков, из которых затем про- производится сборка белков и нуклеиновых кислот. И здесь мы встречаем уже зна- знакомые нам различия: живые организмы сильно различаются в зависимости от то- того, в какой химической форме способны они усваивать азот. Почти все высшие животные должны получать по крайней мере часть необходимого им азота в виде аминокислот. Например, в рацион чело- человека и белой крысы 10 из 20 обычных аминокислот должны входить в готовом виде, потому что их организм не спосо- способен синтезировать эти аминокислоты из более простых предшественников. Расте- Растения могут обычно использовать в каче- качестве единственного источника азота ам- аммиак или растворимые нитраты. Лишь сравнительно немногие организмы обла- обладают способностью усваивать (фиксиро- (фиксировать) газообразный азот (N2), на долю которого приходится около 80% нашей атмосферы. Однако, поскольку в земной коре содержится очень мало неорганиче- неорганического азота в виде растворимых солей, все живые организмы зависят в конечном счете от этого атмосферного азота и от организмов, способных его фиксировать. Азот фиксируют, например, цианобакте- рии (старое их название-сине-зеленые водоросли). Цианобактерии ведут неза- независимое существование, потому что они полностью автотрофны. Они не только усваивают атмосферный азот, но спо- способны и к фотосинтезу, т. е. могут удовле- удовлетворять всю свою потребность в углеро- углероде за счет атмосферной СО2. Почти все другие виды азотфиксирующих бактерий обитают в почве. Некоторые из них жи- живут в качестве симбионтов в корневых клубеньках определенных видов расте- растений, главным образом представителей семейства бобовых, и осуществляют здесь симбиотическую фиксацию азота. Нитрифицирующие бактерии окисляют аммиак до нитритов и нитратов, а дени- денитрифицирующие вновь превращают ни- нитраты в аммиак. Таким образом, помимо гигантских круговоротов углерода и кис- кислорода (рис. 13-1) в нашей биосфере про- протекает еще и круговорот азота, в котором колоссальные количества азота пре- претерпевают циклические превращения (рис. 13-2). Круговороты углерода, кис- кислорода и азота, совершающиеся при участии многих видов живых организ- организмов, несомненно зависят от поддержания определенного баланса между продуцен- продуцентами и консументами в биосфере Атмосферный азот Рис. 13-2. Круговорот азота в биосфере
378 ЧАСТЬ П. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Рис. 13-3. Поток солнечной энергии и кругово- круговорот углерода, кислорода и азота на примере одной из экосистем. В этой изолированной эко- экосистеме в результате фотосинтеза, осуществля- осуществляемого травянистой растительностью, фиксиру- фиксируется атмосферная COj, образуются органиче- органические соединения и выделяется кислород. Поч- Почвенные микроорганизмы фиксируют атмосфер- атмосферный азот, переводя его в аммиак и нитраты, используемые затем растениями в качестве ис- источников азота для синтеза белков и нуклеино- нуклеиновых кислот. Зебры получают кислород из воз- воздуха, а необходимый им углерод и аминокис- аминокислоты-из растений в результате окисления крахмала, белка и других компонентов расти- растительной пищи. Львы поедают зебр, а их экскре- экскременты попадают в почву, где микроорганизмы перерабатывают их, завершая цикл. Движущей силой всего этого круговорота слу- служит солнечная энергия. Однако в каждом звене данной пищевой цепи на построение биомассы расходуется менее 10°о всей получаемой полез- полезной энергии; остальная энергия рассеивается в среде и становится недоступной. Из всей сол- солнечной энергии, достигающей этой экосистемы, в организме львов запасается менее 0,1 %. Вот почему для того, чтобы прокормить стадо зебр, требуется очень обширная территория, а для того, чтобы прокормить двух львов, большое стадо зебр. (рис. 13-3). Эти гигантские по своим масштабам круговороты веществ в био- биосфере сопровождаются таким же гигант- гигантским круговоротом энергии. Фотосинте- зирующие организмы улавливают сол- солнечную энергию и продуцируют богатые энергией углеводы и другие органические соединения, а гетеротрофные организмы используют эти органические соединения в качестве источников энергии. В метабо- метаболизме каждого организма, участвующего в этих метаболических циклах и расхо- расходующего энергию на разного рода рабо- работу, какая-то часть усвояемой организмом (полезной) формы энергии теряется, тог- тогда как количество неусвояемой (недо- (недоступной, бесполезной) формы растет. По- Почти на каждой стадии этих биологиче- биологических циклов тепло и другие формы энергии рассеиваются в окружающей среде, т. е. переходят в неупорядоченную и неусвояемую для живых организмов форму. Таким образом, поток энергии в биосфере-это однонаправленный, а не циклический процесс, поскольку полез- полезная энергия не может быть регенерирова- регенерирована из недоступной, рассеянной. Углерод, кислород и азот совершают непреры- непрерывный круговорот, вовлекаясь во все новые и новые циклы, между тем как по- полезная энергия непрерывно «дегради- «деградирует»-переходит в неусвояемую форму. Перейдем теперь от этих макроскопи- макроскопических аспектов метаболизма к метабо- метаболическим событиям, совершающимся в живых клетках на микроскопическом уровне, не упуская при этом, однако, из виду, что каждый тип клеток характери- характеризуется особыми, ему одному свой- свойственными потребностями в тех или иных источниках углерода, кислорода и азота, а также в соответствующих ис- источниках энергии. Клеточный метабо- метаболизм - это система ферментативных пре- превращений как веществ, так и энергии, начинающихся от исходных продуктов и завершающихся биосинтезом живой материи. 13.3. Метаболические пути представляют собой последовательности реакций, катализируемых мультиферментными системами Ферменты-это простейшие единицы метаболической активности; каждый из них катализирует какую-нибудь одну хи- химическую реакцию. Метаболизм, однако, лучше рассматривать исходя из пред- представления о мультиферментных систе- системах, каждая из которых катализирует по- последовательные стадии данного метабо- метаболического пути. Такие мультифер- ментные системы могут включать от 2 до
ГЛ. 13. МЕТАБОЛИЗМ. ОБЩИ ОБЗОР 379 20 ферментов, действующих совместно, в определенной последовательности, так что продукт реакции, катализируемой первым ферментом, становится субстра- субстратом для следующей реакции, катализи- катализируемой вторым ферментом, и т.д. (рис. 13-4). Продукты последовательных превращений, объединяемых в данный метаболический путь (В, С, D и т.д. на рис. 13-4), называются промежуточны- промежуточными продуктами или метаболитами. На каждой из последовательных стадий того или иного метаболического пути проис- происходит обычно лишь небольшое химиче- Линейный метаболический путь. Предшест- Предшественник А превращается в продукт Е в резуль- результате четырех последовательных фермента- ферментативных реакций. Продукт одной фермента- ферментативной реакции служит при этом субстратом следующей ское изменение, чаще всего-удаление, перенос или присоединение какого-ни- какого-нибудь атома, молекулы или функциональ- функциональной группы. В результате этих упорядо- упорядоченных, поэтапных, изменений исходная биомолекула превращается в соответ- соответствующий конечный продукт. Большей частью метаболические пути линейны, хотя могут быть и циклическими (рис. 13-4). Обычно они имеют развет- разветвления, в которых какие-нибудь про- продукты реакций выходят из цепи реакций данного метаболического пути или, на- наоборот, вливаются в нее. В наиболее упо- употребительном значении термин «метабо- «метаболизм» равнозначен «обмену веществ и энергии»; в более точном и узком смыс- смысле «метаболизм» означает промежу- промежуточный обмен, т. е. превращение веществ внутри клеток с момента их поступления до образования конечных продуктов. С \- D 1- Е Циклический путь. Именно таким путем происходит окисление ацетильных групп до С02 и Н2 О в цикле лимонной кислоты Рис. 13-4. Мультиферментные системы. 13.4. Метаболизм включает катаболические и анаболические пути (процессы распада и процессы синтеза) Промежуточный метаболизм склады- складывается из двух фаз — катаболизма и анабо- анаболизма. Катаболизм-это фаза, в которой происходит расщепление сложных орга- органических молекул до более простых ко- конечных продуктов. Углеводы, жиры и белки, поступившие извне с пищей или присутствующие в самой клетке в каче- качестве запасных веществ, распадаются в се- серии последовательных реакций до таких соединений, как молочная кислота, СО2 и аммиак. Катаболические процессы со- сопровождаются высвобождением свобод- свободной энергии, заключенной в сложной структуре больших органических моле- молекул. На определенных этапах соответ- соответствующих катаболических путей значи- значительная часть свободной энергии запа- запасается благодаря сопряженным фермен- ферментативным реакциям в форме высокоэнер- высокоэнергетического соединения - аденозинтри- фосфата (АТР). Часть ее запасается так- также в богатых энергией водородных атомах кофермента никотинамидаденин- динуклеотидфосфата, находящегося в
380 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ восстановленной форме (вбозначается NADPH) (рис. 13-5). Анаболизм, называемый также биосин- тезом,-это та фаза метаболизма, в кото- которой из малых молекул-предшественни- молекул-предшественников, или «строительных блоков», синте- синтезируются белки, нуклеиновые кислоты и другие макромолекулярные компо- компоненты клеток. Поскольку биосинтез-это процесс, в результате которого увеличи- увеличиваются размеры молекул и усложняется их структура, он требует затраты свобод- свободной энергии. Источником этой энергии служит распад АТР до ADP и неоргани- неорганического фосфата. Для биосинтеза неко- некоторых клеточных компонентов требуют- требуются также богатые энергией водородные атомы, донором которых является NADPH (рис. 13-5). Катаболические и анаболические реакции протекают в клетках одновременно, однако их ско- скорости регулируются независимо. Рис. 13-5. Энергетические взаимосвязи между катаболическим и анаболическим путями. Ка- Катаболические пути поставляют химическую энергию в форме АТР и NADPH. Эта энергия используется на анаболических путях для био- биосинтеза макромолекул из небольших молекул- предшественников. Углеводы Жиры Белки 13.5. Катаболические пути сходятся - образуется лишь небольшое число конечных продуктов Рассмотрим теперь катаболизм более подробно. Ферментативное расщепление тех главных питательных веществ, ко- которые служат клетке источником энер- энергии, а именно углеводов, жиров и белков совершается постепенно-через ряд по- последовательных ферментативных реак- реакций. В аэробном катаболизме различают три главные стадии (рис. 13-6). На стадии I макромолекулы клетки распадаются на свои основные строительные блоки: по- полисахариды распадаются до гексоз или пентоз. жиры-до жирных кислот, глице- рола и других компонентов, а белки-до аминокислот, которых имеется 20 видов. Все эти различные продукты, образо- образовавшиеся на первой стадии катаболизма, на стадии II превращаются в еще более простые соединения, число которых срав- сравнительно невелико. Гексозы, пентозы и глицерол расщепляются до одного и того же трехуглеродного промежуточ- промежуточного продукта -пиру вата, а затем до единственной двухуглеродной формы - ацетильной группы ацетилкофермента Белки Полисахариды .Липиды Нуклеиновые кислоты Катаболизм Ниэкоэнергетические конечные продукты СО2 Н2О NH, Молекулы- предшественники Аминокислоты Сахара Жирные кислоты Азотистые основания
ГЛ. 13. МЕТАБОЛИЗМ. ОБЩИЙ ОБЗОР 381 Глицерол, жир- жирные кислоты Большие молекулы Молекулы, играющие роль строительных блоков Общий продукт расщепления Рис. 13-6. Три стадии катаболических превра- превращений основных питательных веществ клетки. На стадии I сотни белков и многие виды поли- полисахаридов и липидов расщепляются на состав- составляющие их строительные блоки. На стадии II эти строительные блоки превращаются в один общий продукт-ацетильную группу ацетил- СоА. На стадии III различные катаболические пути сливаются в один общий путь - цикл ли- лимонной кислоты; в результате всех этих прев- превращений образуются только три конечных про- продукта. Расщепление нуклеиновых кислот проис- происходит также поэтапно, но здесь этот процесс не показан, поскольку его вклад в удовлетворе- удовлетворение энергетических нужд клетки сравнительно невелик. Простые малые молекулы — конечные продукты катаболизма А (ацетил-СоА). Аналогичное превраще- превращение претерпевают жирные кислоты и углеродные скелеты большей части аминокислот: их расщепление также за- завершается образованием ацетильных групп в форме ацетил-СоА. Таким обра- образом, ацетил-СоА представляет собой об- общий конечный продукт второй стадии катаболизма. На стадии III ацетильная группа аце- тил-СоА вступает в цикл лимонной кис- кислоты -общий конечный путь, на котором почти все виды клеточного «топлива»
382 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Сходящиеся катаболические пути \ U Расходящиеся биосинтетические пути - из небольшого числа предшественников образуется много разных продуктов \ I Конечные продукты катаболизма окисляются в конце концов до двуокиси углерода. Конечными продуктами мета- метаболизма являются также вода и аммиак (или другие азотсодержащие соедине- соединения). Важно отметить, что катаболические пути сходятся, вливаясь на стадии III в этот общий путь - цикл лимонной кис- кислоты. Если на стадии I десятки и даже сотни различных белков расщепляются до аминокислот, которых насчитывается 20 видов, то уже на стадии II из всех 20 аминокислот образуются в основном только ацетил-СоА и аммиак (NH3), а на стадии III ацетильные группы ацетил- СоА, окисляясь в цикле лимонной кис- кислоты, превращаются только в два продукта-СО2 и Н2О. Точно так же многие полисахариды и дисахариды рас- расщепляются на стадии I до нескольких простых Сахаров, а эти сахара на стадии II превращаются в конечном счете в аце- тил-СоА и на стадии III-в СО2 и Н2О. Предшественники продуктов биосинтеза Рис. 13-7. Конвергенция катаболических путей и дивергенция анаболических путей. На первой стадии катаболизма в него вовлекается много различных клеточных компонентов, но в кон- конце все пути сходятся в один общий метаболи- метаболический путь, и число конечных продуктов ока- оказывается небольшим. Конечный путь катаболизма можно упо- уподобить реке в ее нижнем течении, где она расширяется благодаря тому, что ранее вобрала в себя многие притоки (рис. 13-7). 13.6. Биосинтетические (анаболические) пути расходятся - образуется много разных продуктов Анаболизм, или биосинтез, начинаю- начинающийся с малых молекул-предшественни- молекул-предшественников, протекает также в три стадии. Син- Синтез белков, например, начинается с образования ос-кетокислот и других пред-
ГЛ. 13. МЕТАБОЛИЗМ. ОБЩИЙ ОБЗОР 383 шественников. На второй стадии проис- происходит аминирование ос-кетокислот в ре- реакциях с донорами аминогрупп - об- образуются ос-аминокислоты. Наконец, на последней, завершающей стадии анабо- анаболизма из аминокислот строятся полипеп- полипептидные цепи и образуются различные белки. Сходным образом синтезируются липиды. Их синтез начинается с включе- включения ацетильных групп в жирные кислоты и завершается сборкой различных ли- пидных молекул из этих жирных кислот. В отличие от катаболизма для анаболиз- анаболизма характерно расхождение метаболиче- метаболических путей. Из сравнительно небольшого числа простых молекул-предшественни- молекул-предшественников образуется в конечном счете весьма широкий набор разнообразных макро- макромолекул (рис. 13-7). На центральных пу- путях анаболизма имеется много ответвле- ответвлений, что и дает в результате сотни различных клеточных компонентов. Каждая из главных стадий катаболиз- катаболизма или анаболизма данной биомолекулы катализируется мультиферментной си- системой. Последовательности химических превращений на каждом из центральных метаболических путей в принципе у всех живых форм едины. Так, например, рас- расщепление D-глюкозы протекает почти у всех живых организмов одинаково, т. е. через те же реакции и с образованием од- одних и тех же промежуточных продуктов. 13.7. Соответствующие катаболические и анаболические пути различаются, и эти различия имеют важное значение Катаболический путь и соответствую- соответствующий ему, но противоположный по на- направлению анаболический путь между данным предшественником и данным продуктом обычно не совпадают. Могут различаться и промежуточные продукты, и отдельные стадии этих путей. Напри- Например, протекающее в печени расщепление глюкозы до пирувата представляет со- собой процесс, состоящий из 11 последова- последовательных стадий, катализируемых специ- специфичными ферментами. Казалось бы, синтез глюкозы из пирувата должен быть простым обращением всех этих ферментативных стадий ее распада; та- такой путь представляется на первый взгляд и самым естественным, и наибо- наиболее экономичным. Однако в действитель- действительности биосинтез глюкозы в печени проте- протекает иначе. Он включает лишь 9 из 11 ферментативных стадий, участвующих в ее распаде, а две недостающие стадии заменены в нем совсем другим набором ферментативных реакций, свойственным одному только биосинтетическому пути. Точно так же неидентичны и соответ- соответствующие пути катаболизма и анаболиз- анаболизма, связывающие, например, белки с ами- аминокислотами или жирные кислоты с ацетил-СоА. Можно было бы счесть ненужным рас- расточительством наличие двух отдельных метаболических путей между двумя дан- данными пунктами. Есть, однако, важные причины для того, чтобы катаболические и анаболические пути не совпадали. Пер- Первая из них заключается в том, что путь, по которому идет расщепление той или иной биомолекулы, может быть непри- непригодным для ее биосинтеза по энергетиче- энергетическим соображениям. Расщепление какой- нибудь сложной органической молекулы можно сравнить со спуском с горы, а ее биосинтез-с подъемом в гору; в первом случае свободная энергия выделяется, а во втором ее требуется затратить, чтобы осилить подъем. Попробуем пояс- пояснить это с помощью простой аналогии. Если столкнуть с вершины горы валун, то он покатится вниз, теряя при этом энергию. На некоторых, особо крутых участках пути, при отвесном падении, те- теряются сразу большие количества энер- энергии. Втащить валун трактором на верши- вершину по тому же пути, по которому он скатился вниз, скорее всего не удастся. Трактор сможет, вероятно, подняться вверх по более пологой дороге, минуя крутые склоны (рис. 13-8). На этот об- обходный путь потребуется дополнитель- дополнительная энергия. Биосинтетический путь тоже требует дополнительных затрат энергии на преодоление крутых участков энерге- энергетической «горки». Вторая причина, по которой соответ- соответствующие катаболические и анаболиче- анаболические пути неидентичны, состоит в том,
384 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ что эти последовательности реакций дол- должны регулироваться раздельно. Если бы для расщепления и для биосинтеза ис- использовался один и тот же путь, т. е. име- имело бы место простое обращение последо- последовательности реакций, то, например, тор- торможение катаболического пути вслед- вследствие ингибирования одного из его ферментов неизбежно влекло бы за собой также и замедление соответствующего биосинтетического пути. Для того чтобы синтез и распад какого-либо соединения могли регулироваться независимо друг от друга, эти метаболические пути дол- должны быть совершенно различными, а ес- если у них все же имеются какие-то общие ферментативные стадии, то регулировать скорость процесса должны те ферменты, которые в противоположной последо- последовательности реакций не участвуют (рис. 13-9). Иногда противоположно направлен- Рис. 13-8. Аналогия, поясняющая энергетиче- энергетические аспекты катаболизма и анаболизма на примере скатывающегося с горы валуна. Ката- Катаболизм можно сравнить со спуском с горы, так как он сопровождается потерей свободной энергии. Особенно много энергии теряется на крутых, почти отвесных участках пути (обо- (обозначены стрелками). Анаболизм напоминает подъем в гору; он требует затраты свободной энергии, которая может поступать лишь не- небольшими, строго определенными порциями. Трактор, например, смог бы втащить валун об- обратно на вершину горы только при условии, что он пройдет другим, более пологим путем, минуя крутые участки, на преодоление которых потребовалось бы слишком много энергии. ные катаболические и анаболические пу- пути различаются по своей локализации. Так, например, окисление жирных кислот до стадии ацетил-СоА в печени катализи- катализируется набором ферментов, локализо- локализованных по преимуществу в митохон- митохондриях, где условия благоприятствуют окислению; синтез же жирных кислот из Регулируемая А стадия у <Ч\1Б В V \ L I С Катаболи-?;3 | ческий путь I I » Е ч С }:,з Анаболи- it- 1 ческий путь 3 J| ] Е ЕВ(Г Регулируемая "" стадия Р Рис. 13-9. Параллельные катаболические и ана- анаболические пути должны быть различными хо- хотя бы на одной из ферментативных стадий, для гого чтобы они могли регулироваться не- независимо. Показаны два варианта независимой регуляции катаболического и анаболического путей между А и Р. В первом варианте эти пути совершенно различны, т. е. катализируют- катализируются разными наборами ферментов. Во втором анаболический и катаболический пути различа- различаются лишь по одному ферменту. Регулируемые стадии в обоих вариантах обозначены красны- красными стрелками.
ГЛ. 13. МЕТАБОЛИЗМ. ОБЩИЙ ОБЗОР 385 ацетил-СоА, требующий водородных атомов, т.е. восстановительной способ- способности, осуществляется с помощью друго- другого набора ферментов, локализованных в цитозоле, где условия благоприят- благоприятствуют восстановительным реакциям (рис. 13-10). Однако хотя соответствующие катабо- лические и анаболические пути неиден- неидентичны, их связывает общая стадия (ста- (стадия III на рис. 13-6), которая включает в себя цикл лимонной кислоты и неко- некоторые вспомогательные ферментативные реакции. Эту общую стадию называют иногда амфиболическоп стадией метабо- метаболизма (от греч. «атп»-оба), поскольку шится, то в ответ могут произойти изме- изменения в другой части сети, для того чтобы это первое изменение было как-то уравновешено или скомпенсировано. На любом из центральных метаболических путей-катаболическом или анаболиче- анаболическом-скорость может регулироваться в соответствии с сиюминутными потреб- потребностями клетки. Более того, и катаболи- ческие, и анаболические реакции отрегу- отрегулированы, по-видимому, таким образом, чтобы они протекали наиболее эконом- экономно, т.е. с наименьшей возможной затра- затратой энергии и веществ. Например, окис- окисление питательных веществ в клетке совершается со скоростью, как раз доста- Окисление жирных кислот Биосинтез жирных кислот она выполняет двойную функцию. В ката- катаболизме на этой стадии завершается рас- распад сравнительно небольших молекул, образовавшихся на стадии II, а в анабо- анаболизме ее роль заключается в поставке не- небольших молекул-предшественников для биосинтеза аминокислот, жирных кислот и углеводов (об этом мы еще будем гово- говорить далее). Почти все метаболические реакции в конечном счете связаны между собой, поскольку продукт одной ферментатив- ферментативной реакции служит субстратом для дру- другой, которая в данном процессе играет роль следующей стадии. Таким образом, мы можем представить себе метаболизм в виде чрезвычайно сложной сети фер- ферментативных реакций. Если поток пита- питательных веществ в какой-нибудь одной части этой сети уменьшится или нару- Рис. 13-10. Пространственное разделение про- противоположно направленных метаболических путей. Окисление жирных кислот происходит в основном в митохондриях, между тем как их синтез, для которого требуется восстановитель- восстановительная способность, протекает в цитозоле. точной для того, чтобы удовлетворить ее энергетические потребности в данный момент. 13.8. "Энергия перелается от катаболических реакций к анаболическим при помощи АТР Выше мы в общих чертах познакоми- познакомились с тем, как органические питательные вещества претерпевают в процессе мета- метаболизма ряд превращений под действием ферментов. Попробуем теперь просле- проследить, как происходят превращения энер- энергии. Сложные пищевые молекулы, напри- например глюкоза, обладают значительным запасом потенциальной энергии именно в силу сложности своей структуры. При распаде глюкозы в процессе окисления до простых и сравнительно небольших
386 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ молекул, СО2 и Н2О, выделяется значи- значительное количество свободной энергии. Свободная энергия-это та форма энер- энергии, которая может использоваться для выполнения работы при постоянной тем- температуре и постоянном давлении. Одна- Однако если свободная энергия, выделяющая- выделяющаяся при окислении глюкозы, не будет каким-либо способом улавливаться и со- сохраняться, то она попросту перейдет в тепло. Тепловая же энергия, хотя она и необходима для поддержания темпера- температуры тела у высших животных, не может использоваться ни для механической ра- работы мышечного сокращения, ни для хи- химической работы биосинтеза. Тепло мо- может производить работу при постоянном давлении лишь в том случае, если оно передается от более нагретого тела к ме- менее нагретому. В живых клетках это не- невозможно, поскольку они изотермичны, т. е. в любой их части поддерживается од- одна и та же температура. В клетках значи- значительная часть свободной энергии, выде- выделяющейся при катаболизме глюкозы и другого клеточного топлива, сохра- сохраняется благодаря сопряженному синтезу аденозинтрифосфата (АТР) из аденозин- дифосфата (ADP) (рис. 13-11) и неоргани- неорганического фосфата (Pj). ATP, ADP и фос- фосфат присутствуют во всех живых клетках и составляют универсальную систему, Аденин NHa О" О" СГ О—Р+О—Р—О—Р—О—СНг о о о Разрыв связи, приводящий к образованию АПР ADP АТР Рис. 13-11. Аденозинтрифосфат (АТР) в иони- ионизированной форме при рН 7,0. Молекула аде- нозин^ифосфата (ADP) содержит только две фосфатные группы. В качестве органических строительных блоков в молекулу АТР входят пуриновое основание аденин и сахар D-рибоза (см. гл. 14). со D-рибоза ОН ОН АТР ' 1. Биосинтез 2. Сокращение и движение 3- Активный транспорт 4. Передача генетической информации ADP Рис. 13-12. Процессы жизнедеятельности, тре- требующие затраты энергии, получают эту энер- энергию от АТР. распадающегося при этом на ADP и неорганический фосфат. Для последующей регенерации АТР используется энергия, выде- выделяющаяся в процессе катаболизма из клеточно- клеточного топлива. служащую для переноса энергии. Хими- Химическая энергия, запасенная в форме АТР, способна производить работу четырех разных видов (рис. 13-12). 1. АТР поста- поставляет энергию для химической работы биосинтеза. В этом процессе на моле- молекулы-предшественники, или строи- строительные блоки, переносится-под дей- действием соответствующего фермента- концевая фосфатная группа АТР. В результате строительные блоки «акти- «активируются» и в таком активированном ви- виде используются для сборки макромоле- макромолекул. 2. АТР служит источником энергии для процессов движения и сокращения. 3. За счет энергии АТР происходит пере- перенос питательных веществ через мем- мембраны против градиента концентрации. 4. Энергия АТР используется в очень тонких механизмах, обеспечивающих передачу генетической информации при биосинтезе ДНК, РНК и белков; сама ин- информация есть, в сущности, одна из форм энергии. Во всех тех случаях, когда энер- энергия АТР используется для производства работы, концевая фосфатная группа АТР отщепляется (рис. 13-11) в виде не- неорганического фосфата и остается ADP-«разряженная форма» этой си- системы переноса энергии. ADP может быть затем вновь «заряжен» путем при- присоединения фосфатной группы (что при- приводит к регенерации АТР) в реакциях, со- сопряженных с расщеплением клеточного
ГЛ. 13. МЕТАБОЛИЗМ. ОБЩИЙ ОБЗОР 387 топлива, т.е. с процессом, поставляю- поставляющим энергию. В клетках, следовательно, совершается круговорот энергии. АТР в этом круговороте играет роль пере- переносчика энергии и служит звеном, связы- связывающим между собой процессы, идущие с выделением и с потреблением энергии. 13.9. NADPH переносит энергию в форме восстановительной способности Существует и другой путь передачи энергии от катаболических реакций к биосинтетическим, для которых необ- необходима энергия. В этом случае передача совершается через водородные атомы или электроны. При образовании глю- глюкозы из СО2 в процессе фотосинтеза и при синтезе жирных кислот из ацетата, протекающем в печени животных, вос- восстановительная способность в форме во- водородных атомов требуется для восста- восстановления двойных связей. Чтобы быть достаточно мощными восстановителя- восстановителями, атомы водорода должны обладать значительным запасом свободной энер- энергии. Такие богатые энергией водородные атомы образуются из клеточного топ- топлива под действием дегидрогеназ. Деги- дрогеназы отщепляют водородные ато- атомы от молекул клеточного топлива и переносят их на особые кофермен- ты, в частности на окисленную форму Восстановленная форма Окисленная форма -о—р—о—сн2 о Рис. 13-13. Никотинамидадениндинуклеотид- фосфат в восстановленной форме (NADPH). На красном фоне показано никотинамидное кольцо, несушее богатый энергией водородный атом и электроны. Справа никотинамидная часть молекулы показана в окисленной форме.
388 ЧАСТЬ П. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Восстановленное О Катаболизм |—» Оки<=ленНый клеточное топливо L -— I продукт Восстановленный продукт биосинтеза Восстанови- Восстановительные био- биосинтетические реакции (г- Окисленный предшественник никотинамидадениндинуклеотид фосфата (NADP1") (рис. 13-13). Восстановленная форма этого кофермента (NADPH) пере- переносит богатые энергией электроны от ка- таболических реакций к биосинтетиче- биосинтетическим (рис. 13-14), подобно тому как АТР переносит высокоэнергетические фос- фосфатные группы. 13.10. Клеточный метаболизм - это экономичный, строго регулируемый лроцесс Клеточный метаболизм основан на принципе максимальной экономии. Об- Общая скорость катаболизма, обеспечиваю- обеспечивающего клетку энергией, определяется не просто наличием или концентрацией кле- клеточного топлива; она обусловлена по- потребностью клетки в энергии в форме АТР и NADPH. Клетка потребляет в каждый данный момент как раз такое количество питательных веществ, какое позволяет ей удовлетворять свои энерге- энергетические нужды. Точно так же обусловле- обусловлена потребностями данного момента ско- скорость синтеза строительных блоков и макромолекул клетки. В растущих клетках, например, все 20 видов амино- аминокислот синтезируются как раз с такой скоростью и в таких соотношениях, какие необходимы для того, чтобы обеспечить сборку новых белков, Требующихся в данный момент. Таким образом, ни од- одна из 20 аминокислот не вырабатывается в избытке и не остается без использова- использования. У многих животных и растений в ор- организме откладываются запасные пита- питательные вещества, способные служить источником энергии и углерода. Такими запасными питательными веществами являются, в частности, жиры и углеводы. Рис. 13-14. Цикл NADP+ ^ NADPH, при по- помощи которого совершается передача восста- восстановительной способности от катаболических реакций к анаболическим. Что же касается белков, нуклеиновых кислот или простых биомолекул, играю- играющих роль строительных блоков, то они обычно не откладываются в запас и вы- вырабатываются лишь тогда, когда они нужны, и в тех количествах, какие необхо- необходимы. Из этого правила есть, однако, ис- исключение: в семенах растений и яйце- яйцеклетках животных часто содержатся большие количества запасных белков, ко- которые служат источником аминокислот во время развития зародыша. Катаболические процессы отличаются высокой чувствительностью и очень чут- чутко реагируют на любые изменения в энергетических потребностях клетки. У комнатной мухи, например, расход кислорода и потребление клеточного топлива в полете менее чем за секунду увеличиваются примерно в 100 раз из-за резко возросшей потребности в АТР, ко- который расходуется летательными мыш- мышцами. Этот пример показывает, что регу- ляторные механизмы центральных мета- метаболических путей и в первую очередь тех, которые обеспечивают клетку энергией в форме АТР, весьма чувствительны и способны очень быстро удовлетворять меняющиеся метаболические потребно- потребности клетки. 13.11. Регуляция метаболических путей осуществляется на трех уровнях В регуляции метаболических путей участвуют механизмы трех типов. Пер- Первый из них, наиболее быстро реагирую- реагирующий на любое изменение ситуации, свя- связан с действием аллостерических фермен- ферментов (рис. 13-15), каталитическая актив- активность которых может меняться под
ГЛ. 13. МЕТАБОЛИЗМ. ОБЩИЙ ОБЗОР 389 влиянием особых веществ, оказывающих стимулирующее или тормозящее дей- действие (их называют эффекторами или мо- модуляторами; разд. 9.18). Как правило, ал- лостерические ферменты занимают мес- место в начале или поблизости от начала данной мультиферментной последова- последовательности и катализируют ту ее стадию, которая лимитирует скорость всего про- процесса в целом; обычно роль такой стадии играет практически необратимая реак- реакция. В катаболических процессах, сопро- Предшест- венник .¦ > Регулируемая Е, стадия (катализируется аллостерическим ферментом) - К м N Конечный продукт Рис. 13-15. Регуляция катаболического пути по типу обратной связи, т. е. за счет ингибирова- ния аллостерического фермента конечным про- продуктом данного процесса. Буквами J, К, L и т.д. обозначены промежуточные продукты данного метаболического пути, а буквами Е,, Е2, Е3 и т. д.- ферменты, катализирующие от- отдельные стадии. Первая стадия катализируется аллостерическим ферментом (ЕД который ин- гибируется конечным продуктом данной после- последовательности реакций. Аллостерическое инги- бирование показано прерывистой красной стрелкой, которая соединяет ингибирующий метаболит с реакцией, катализируемой аллос- аллостерическим ферментом. Регулируемая стадия (катализируемая ферментом EJ в условиях клетки обычно представляет собой практически необратимую реакцию. вождающихся синтезом АТР из ADP, в роли аллостерического ингибитора одной из ранних стадий катаболизма часто выступает именно этот конечный продукт - АТР. Аллостерическим ингиби- ингибитором одной из ранних стадий анаболиз- анаболизма нередко служит конечный продукт биосинтеза, например какая-нибудь ами- аминокислота (разд. 9.18). Активность неко- некоторых аллостерических ферментов сти- стимулируется специфическими положи- положительными модуляторами. Аллостериче- ский фермент, регулирующий одну из катаболических последовательностей ре- реакций, может, например, подчиняться стимулирующему влиянию положи- положительных модуляторов-ADP или AMP и ингибирующему действию отрицатель- отрицательного модулятора-АТР. Известны также случаи, когда аллостерический фермент какого-нибудь метаболического пути специфическим образом реагирует на промежуточные или конечные продукты других метаболических путей. Благодаря этому оказывается возможной координа- координация скорости действия различных фер- ферментных систем. Второй тип механизмов, регулирую- регулирующих метаболизм у высших организ- организмов,-это гормональная регуляция (рис. 13-16). Гормонами называют особые химические вещества (химические «посредники»), вырабатываемые раз- различными эндокринными железами и вы- выделяемые непосредственно в кровь; они переносятся кровью к другим тканям или органам и здесь стимулируют или тор- тормозят определенные виды метаболиче- метаболической активности. Гормон адреналин, на- например, секретируется мозговым веще- веществом надпочечника и переносится кровью в печень, где он стимулирует рас- распад гликогена до глюкозы, что вызывает повышение уровня сахара в крови. Кроме того, адреналин стимулирует распад гли- гликогена в скелетных мышцах; этот про- процесс приводит к образованию лактата и к запасанию энергии в форме АТР. Адре- Адреналин вызывает эти эффекты, присоеди- присоединяясь к особым рецепторным участкам на поверхности мышечных клеток или клеток печени. Связывание адреналина служит сигналом; этот сигнал передается
390 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Лденилатциклаза Молекула адреналина Рецепторный участок адреналина Клеточная мембрана Циклический аденилат Неактивная гликоген - фосфорилаза i Активная ^-^ гликоген- фосфорилаза Гликоген ^ s Глюкоза во внутренние отделы клетки и вызывает здесь ковалентную модификацию, под влиянием которой гликоген-фосфорилаза (первый фермент в системе, катализи- катализирующей превращение гликогена в глюко- глюкозу и другие продукты; разд. 9.22) перехо- переходит из менее активной формы в более активную (рис. 13-16). Третий тип механизмов, регулирую- регулирующих метаболизм, связан с изменением концентрации данного фермента в клет- клетке. Концентрация всякого фермента в любой данный момент определяется соотношением скоростей его синтеза и распада. Скорость синтеза некоторых ферментов при определенных условиях резко возрастает; соответственно увели- увеличивается и концентрация данного фер- фермента в клетке. Если, например, живот- животное получает рацион, богатый углевода- углеводами, но бедный белком, то в печени у него оказывается крайне низким содержание ферментов, катализирующих в обычных условиях распад аминокислот до ацетил- СоА. Поскольку при таком рационе эти ферменты практически не нужны, они и не вырабатываются в больших количе- количествах. Стоит, однако, перевести животное на рацион, богатый белком, и уже через сутки в его печени заметно повысится со- содержание ферментов, которые потре- потребуются теперь для расщепления перева- перевариваемых аминокислот. Клетки печени, следовательно, обладают способностью включать или выключать биосинтез спе- Внутриклеточный посредник, активирующий в результате ряда реакций гликоген-фосфорилазу Активированная гликоген-фосфорилаза катализирует растепление гликогена до глюкозы, которая попадает в кровь В кровь Рис. 13-16. Гормональная регуляция фермента- ферментативной реакции. В результате присоединения гормона адреналина к специфическим рецепто- рецепторам, находящимся на поверхности клеток пече- печени, образуется при участии связанного с мем- мембраной фермента (аденилатциклазы) цикличе- циклический аденилат. Последний функционирует как аллостерический активатор, или внутриклеточ- внутриклеточный посредник, под действием которого глико- гликоген-фосфорилаза переходит из неактивной фор- формы в активную, что влечет за собой ускорение превращения гликогена печени в глюкозу кро- крови. Подробно этот метаболический путь опи- описан в гл. 25. Рис. 13-17. Индукция ферментов. Высокая внутриклеточная концентрация субстрата А может стимулировать биосинтез ферментов Et, Е2 и Е3. Содержание этих ферментов в клетке возрастает, и тем самым создается возмож- возможность для ускорения тех реакций, в результате которых избыток субстрата А удаляется. Избы- Избыток субстрата А служит, следовательно, для клеточного ядра сигналом, вынуждающим его «включить» гены, контролирующие образова- образование ферментов Е[, Е2 и Е3. Включение генов означает синтез соответствующей матричной РНК; она поступает в рибосомы, и вследствие этого в них осуществляется синтез ферментов Е„ Е2 и Е3.
ГЛ. 13. МЕТАБОЛИЗМ. ОБЩИЙ ОБЗОР 391 цифичных ферментов в зависимости от природы поступающих в них питательных веществ. Это явление носит название индукции ферментов (рис. 13-17). 13.12. Вторичный метаболизм До сих пор речь шла у нас главным бразом о центральных метаболических путях, т. е. о путях превращения основных пищевых веществ клетки-углеводов, жи- жиров и белков. На этих центральных путях потоки метаболитов довольно внуши- внушительны. Например, в организме взросло- взрослого человека ежесуточно окисляется до СО2 и воды несколько сотен граммов глюкозы. Есть, однако, и другие метабо- метаболические пути со значительно меньшим потоком метаболитов; ежесуточный син- синтез или распад измеряется здесь милли- миллиграммами. Эти пути составляют так на- называемый вторичный метаболизм, роль которого состоит в образовании раз- различных специализированных веществ, требующихся клеткам в малых количе- количествах. К вторичным метаболическим пу- путям принадлежит, например, биосинтез коферментов и гормонов, потому что эти соединения вырабатываются и исполь- используются только в следовых количествах. Сотни различных высокоспециализиро- высокоспециализированных биомолекул, в том числе нуклео- тиды, пигменты, токсины, антибиотики и алкалоиды, продуцируются у разных форм жизни на вторичных метаболиче- метаболических путях. Все эти продукты, разумеется, очень важны для тех организмов, ко- которые их вырабатывают, и все они вы- выполняют какие-то определенные биоло- биологические функции. Однако специализиро- специализированные вторичные метаболические пути, ведущие к их синтезу, не во всех случаях хорошо изучены. В этой книге мы ли- лишены возможности рассматривать эти вторичные метаболические пути, по- порой весьма сложные; мы здесь зай- займемся главным образом центральны- центральными, или первичными, путями метабо- метаболизма. 13.13. Метаболические пути могут быть идентифицированы в прямых опытах Для того чтобы выявить последова- последовательность химических реакций, состав- составляющих тот или иной метаболический путь, можно воспользоваться тремя главными экспериментальными подхо- подходами. Первый из них, наиболее прямой, заключается в изучении метаболического пути in vitro (в пробирке), т. е. не в самой живой ткани, а в ее бесклеточном эк- экстракте, сохраняющем способность ката- катализировать весь исследуемый процесс в целом. Еще в середине прошлого века стало, например, известно, что дрожжи сбраживают глюкозу до этилового спир- спирта и СО2- Однако изучение отдельных стадий этого метаболического пути, по- поставляющего анаэробным дрожжевым клеткам почти всю необходимую им энергию, началось по-настояшему толь- только с 1898 г., когда Эдуард Бухнер обнару- обнаружил, что отжатый из дрожжей сок, не со- содержащий живых клеток, тоже способен сбраживать глюкозу до этилового спир- спирта и СО2 (разд. 9.1). Позже выяснилось, что брожение в таких экстрактах проис- происходит лишь при добавлении неорганиче- неорганического фосфата и что по мере потребления глюкозы этот фосфат исчезает из эк- экстракта. Оказалось, что в среде накапли- накапливается при этом какое-то фосфорилиро- ванное производное гексозы, обладаю- обладающее всеми теми свойствами, какими должен обладать один из промежу- промежуточных продуктов на пути превращения глюкозы в этиловый спирт и СО2. После того как этот промежуточный продукт был идентифицирован, в дрожжевом эк- экстракте удалось обнаружить фермент, превращающий его в другой продукт. Этот последний в свою очередь был вы- выделен и идентифицирован. Таким обра- образом, идентифицированными оказались уже два промежуточных продукта рас- расщепления глюкозы. Добавляя к эстрак- там ингибиторы ферментов, исследова- исследователи добивались накопления других про- промежуточных продуктов. В конце концов благодаря комбинированию такого рода приемов удалось выделить и идентифи-
392 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ цировать 11 метаболитов, представляю- представляющих собой промежуточные продукты спиртового брожения глюкозы. Все 11 ферментов, катализирующих эту после- последовательность реакций, были выделены и очищены. Этот же прямой метод при- применяется и при изучении других метабо- метаболических путей. Он позволяет идентифи- идентифицировать один за другим промежу- промежуточные продукты данного процесса и ферменты, катализирующие их образо- образование и распад. После выявления всей по- последовательности реакций процесс мо- может быть воспроизведен в пробирке с использованием очищенных компонен- компонентов. 13.14. Промежуточные стадии метаболизма можно выявлять с помощью мутантных организмов В горой важный подход к выяснению метаболических путей связан с изучением мутантных организмов, не способных синтезировать данный фермент в актив- активной форме. Такой дефект, если только он не является летальным, может проявить- проявиться в том, что у мутанта будет накапли- накапливаться и выводиться из организма суб- субстрат дефектного фермента. Некоторые этапы обмена аминокислот удалось, на- например, выяснить, исследуя у людей вро- врожденные нарушения обмена, при ко- которых в организме не вырабатывается определенный фермент (рис. 13-18). У че- человека такие генетические нарушения встречаются сравнительно редко и вслед- вследствие этого не могут служить объектом систематического изучения. Однако у ми- микроорганизмов их можно вызвать искус- искусственно, воздействуя на клетки раз- различными мутагенными агентами (рентге- (рентгеновскими лучами или определенными химическими соединениями), способны- способными изменять структуру определенных ге- генов в их ДНК. Полученные таким путем мутантные микроорганизмы, утратив- утратившие способность синтезировать тот или иной фермент, могут служить прекрас- прекрасным орудием для изучения метаболизма. Познакомимся теперь с тем, как ис- используются такие мутанты. Нормаль- Нормальные, т.е. немутантные клегки хлебной Фенилаланин Тирозин ч Недостаточность вызывает фенилкетонурию Недостаточность вызывает альбинизм Гидроксифенилпируват 4- Меланин - темный пигмент кожи и глаз Недостаточность вызывает тирозиноз Гомогентизат Недостаточность вызывает алкаптонурию Малеилацетоацетат I I I В цикл лимонной кислоты Рис. 13-18. Случаи генетического нарушения обмена аминокислоты фенилаланина, наблю- наблюдавшиеся у человека. Каждый из таких случаев связан с выпадением функции одного-единст- венного гена. Изучение этих нарушений дало возможность установить природу промежуточ- промежуточных продуктов обмена фенилаланина. плесени Neurospora crassa (рис. 13-19), могут расти на простой среде, содержа- содержащей в качестве единственного источника углерода глюкозу и единственного ис- источника азота - аммиак. Однако если споры этого гриба подвергнуть рентге- рентгеновскому облучению, то среди возник- возникших мутантов обнаружатся и такие, ко- которые уже не способны расти на этой простой среде, но вполне нормально рас- растут на среде, содержащей определенные метаболиты. Так, например, некоторые мутанты Neurospora нормально разви- развиваются на среде, содержащей аминокис- аминокислоту аргинин, которая немутантным клеткам не требуется. Ясно, что у таких мутантов не активен или вообще не вы- вырабатывается какой-то из ферментов, участвующих в синтезе аргинина из ам- аммиака. Из-за отсутствия аргинина му- мутантные клетки не в состоянии образо- образовать белки, в состав которых входит аргинин, и потому не растут. Однако они будут нормально расти, если мы доба- добавим к питательной среде помимо глю- глюкозы и аммиака еще и аргинин. Такие му- мутанты с нарушением какого-либо био-
ГЛ. 13. МЕТАБОЛИЗМ. ОБЩИЙ ОБЗОР 393 Рис. 13-19. Вегетативная форма, или мипелий, хлебной плесени Neurospora crassa. У этого ор- организма легко получить мутантные штаммы, которые оказались весьма полезным инстру- инструментом при изучении некоторых метаболиче- метаболических путей. На основании экспериментов с му- мутантами Neurospora была сформулирована ги- гипотеза «один ген-один фермент». синтетического пути, рост которых мож- можно восстановить, обеспечив их нор- нормальным продуктом данного процесса, называют ауксотрофными мутантами (от греч. «aukso»-повышать; имеются в виду повышенные пищевые потреб- потребности этих мутантов). Не все мутанты Neurospora, утратив- утратившие способность синтезировать аргинин, одинаковы; они различаются в зависимо- зависимости от того, какая стадия биосинтеза ар- аргинина у них нарушена (рис. 13-20). На- Набор различных мутантов, нуждающихся в аргинине, можно использовать для вы- выявления промежуточных стадий в после- последовательности ферментативных реакций, из которых слагается синтез этой амино- аминокислоты. Если мутант I (рис. 13-20) выра- выращивать на среде с очень небольшим (ли- (лимитирующим) количеством аргинина, то клетки растут до тех пор, пока весь имеющийся аргинин не будет израсходо- израсходован на синтез белка. Одновременно в культуральной среде накапливается предшественник D, который не может превратиться в аргинин, поскольку у му- Рис. 13-20. Ауксотрофные мутанты Neurospora crassa, утратившие в результате мутации спо- способность синтезировать один из ферментов (отмечен на рисунке красной полосой), участ- участвующих в биосинтезе api инина (Arg) из пред- предшественника А. Вещества В, С и D играют роль промежуточных продуктов в зтом превра- превращении. У мутанта I отсутствует фермент Е4, но его можно выращивать на среде, обога- обогащенной аргинином. В этих условиях в культу- культуральной среде будет накапливаться промежу- промежуточный продукт D. У мутанта II отсутствует фермент Е3, однако активность Е4 у него сохраняется. Поэтому он может расти, если добавить к среде либо аргинин, либо проме- промежуточный продукт D, вырабатываемый мутан- мутантом I. Аналогичным образом мутант III, ли- лишенный фермента Е2, растет на среде, содер- содержащей С, D или аргинин, поскольку он мо- может превращать в аргинин промежуточные продукты С или D. В D Ar>g Дикий тип Мутант I, которому для роста требуется Arg » Мутант II , которому для роста ° требуется D или Arg в — I D Arg Мутант III, которому для роста требуется С, D или Arg
394 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ танта I блокирована именно та фермен- ферментативная реакция, в результате которой происходит это превращение. Удалим те- теперь фильтрованием из культуральной среды клетки мутанта I и поместим в нее клетки мутанта II, тоже нуждающегося в аргинине, но уже по другой причи- причине-из-за неспособности синтезировать промежуточный продукт D. Культураль- ная среда от мутанта I будет, очевидно, поддерживать рост мутанта II, потому что в ней присутствует предшественник D. Однако отфильтрованная культураль- ная среда мутанта II не должна поддер- поддерживать рост мутанта I. Мы можем поэто- поэтому определить предшественник, накапли- накапливающийся у мутанта I, по скорости роста мутанта П. Именно этим путем удалось в конечном счете идентифицировать все четыре предшественника аргинина-А, В, С и D. В подобных экспериментах по перекрестному питанию с использова- использованием ауксотрофных мутантов Neurospora crassa или Escherichia coli были выяснены пути биосинтеза многих аминокислот. 13.15. Включение изотопной метки-весьма эффективный метод изучения метаболизма Еще один мощный метод, даюший воз- возможность проследить в общих чертах данный метаболический путь, основан на применении изотопов определенных эле- элементов, вводимых в качестве метки в тот или иной метаболит (табл. 13-1). Так, в органические молекулы в качестве мет- метки часто вводят атом радиоактивного изотопа углерода 14С (средняя масса ато- атома углерода равна 12,01). Меченая моле- молекула в химическом отношении не отличи- отличима от нормальной, т. е. немеченой, моле- молекулы, но благодаря радиоактивности ее можно легко обнаружить и проследить за ее судьбой. Можно, например, с этой целью синтезировать уксусную кислоту, у которой углерод карбоксильной группы будет обогащен радиоактивным изотопом 14С. В норме этот изотоп при- присутствует в углеродных соединениях биосферы и геосферы в крайне малых и неизменных концентрациях. Скармли- Скармливая животному 14С-ацетат, можно про- проследить метаболическую судьбу этого соединения. При этом мы убедимся, на- например, что выдыхаемая животным СО2 содержит 14С, и это покажет нам, что не- некоторая часть ацетата претерпевает та- такие метаболические превращения, в про- процессе которых углерод его карбоксиль- карбоксильной группы включается в состав СО2. Если выделить затем у животного из ли- пидов печени пальмитиновую кислоту, то и в ней обнаружится 14С; следователь- Таблица Элемент Н С N О Na Р S К Fe I 13-1. Некоторые Средняя атомная масса 1,01 12,01 14,01 16,00 22,99 30,97 32.06 39.10 55,85 126,90 ИЗО 1ОПЫ. Изотоп, используемые в качестве Тип изотопа используемый в качестве метки 2Н 3Н 13С !4С 15N 18О 24Na 32р 35S 42К 59Fe 1Э1, Стабильный Радиоактивный Стабильный Радиоактивный Стабильный » Радиоактивный » » » » » метки Период полураспада 12,1 года 5700 лет 15ч 14,3 сут 87,1 сут 12,5 ч 45 сут 8 сут
ГЛ. 13. МЕТАБОЛИЗМ. ОБЩИЙ ОБЗОР ЗУ5 н н—с- н Скармливается крысам; из липидов печени этих крыс выделяют пальмитиновую кислоту О О" сн2 <гНг снг сн2 Г' сн2 f2 Ацетат, меченный по углероду карбоксильной группы (выделен красным) т сн2 CHS Рис. 13-21. Применение радиоактивного изото- изотопа углерода для прослеживания метаболиче- метаболической судьбы углеродного атома карбоксильной группы ацетата. Значительная часть радиоак- радиоактивного углерода меченого апетата обнаружи- обнаруживается в выдыхаемой СО2) однако довольно большое его количество попадает также в пальмитиновую кислоту липидов печени. В мо- молекуле пальмитиновой кислоты мечеными ока- оказываются только нечетные атомы углерода (считая от карбоксильной группы; обозначены красным цветом), т.е. данный эксперимент сви- свидетельствует о том, что пальмитиновая кисло- кислота образуется в результате соединения восьми молекул ацетата по способу «голова - хвост». но, карбоксильный углерод ацетата является биосинтетическим предше- предшественником пальмитиновой кислоты. В опытах с химическим расщеплением такой пальмитиновой кислоты выясни- выяснилось также, что избыток 14С характерен не для всех положений атомов углерода в ее молекуле, а только для положений через один углеродный атом, считая от карбоксильной группы (рис. 13-21). Если же скармливать животному ацетат, ме- меченный 14С только по метильной группе, ' то мечеными в молекуле пальмитиновой кислоты снова окажутся чередующиеся углеродные атомы, но на этот раз считая от ос-углерода, или С-2. Эти наблюдения позволили сделать вывод, что все угле- углеродные атомы пальмитиновой кислоты ведут свое происхождение от молекул ацетата и что при синтезе пальмитино- пальмитиновой кислоты углеродные скелеты аце- ацетатных молекул соединяются по типу «голова-хвост». Метод изотопных меток применяется и для определения скорости обменных процессов в целом организме. Одним из самых важных результатов, которые уда- удалось получить с помощью этого очень мощного метода, является открытие то- того факта, что макромолекулярные ком- компоненты клеток и тканей подвергаются непрерывному метаболическому обно- обновлению; иными словами, содержание этих компонентов в клетке в каждый данный момент носит динамический характер, т.е. является результатом непрерывно протекающих процессов их биосинтеза и распада, идущих с одинаковой ско- скоростью. Методом изотопных меток бы- было, например, установлено, что время по- полужизни белков печени крысы равно 5-6 дням (табл. 13-2). В то же время показа- показано, что обновление белков скелетных мышц или мозга происходит гораздо медленнее. Именно методу изотопных меток мы обязаны целым рядом крайне важных на- наблюдений, касающихся метаболизма.
396 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Таблица 13-2. Метаболическое обновление некоторых компонентов тканей крысы (по данным одного из ранних исследований с радиоактивным углеродом) Ткань Печень Общий белок Гликоген Фосфоацилглицеролы Триацилглицеролы Холестерол Время полужизпи, сут 5,0-6,0 0,5 1,0 1-2 1 2 5-7 Митохондриальные белки 9,7 Мышцы Обший белок ~ 50 Гликоген 0,5-1,0 Мозг Триацилглицеролы 10-15 Фосфолипиды 200 Холестерол > 100 13.16. Различные метаболические пути могут быть локализованы в разных участках клетки В гл. 1 мы уже говорили о том, что есть два больших класса клеток -прока- риотические и эукариотические. Предста- Представители этих двух классов сильно разли- различаются по размерам, по своей внутрен- внутренней структуре, а также по генетической и метаболической организации. Прока- риотические клетки, к которым принад- принадлежат бактерии и сине-зеленые водорос- водоросли (цианобактерии),-это очень мелкие клетки, сравнительно простого строения, с одной-единственной мембранной систе- системой, а именно мембраной, окружающей клетку. В прокариотических клетках нет отсе- отсеков, или компартментов, разделенных внутренними мембранами. Однако и у бактерий обнаруживается известная компартментализация некоторых фер- ферментных систем (рис. 13-22). Так, боль- большинство ферментов, участвующих в био- биосинтезе белка, локализуется у них в рибосомах, а некоторые ферменты био- биосинтеза фосфолипидов сосредоточены в клеточной мембране. Эукариотические клетки, к которым относятся клетки высших животных и растений, грибов, высших водорослей и простейших, значительно крупнее про- прокариотических и гораздо более сложно устроены (рис. 13-23). Помимо клеточ- клеточной, или плазматической, мембраны в них имеется еще и окруженное мембра- мембраной ядро, в котором находятся хромо- хромосомы (число их у разных организмов раз- различно; у некоторых оно весьма велико). Есть и другие мембранные органеллы, а именно митохондрии, эндоплазматиче- ский ретикулум, аппарат Голъджи, хло- ропласты клеток зеленых растений. В эу- кариотических клетках ферменты тех или иных метаболических путей часто лока- локализуются в особых органеллах или ком- партментах. Каким образом это стало известно? Клеточные органеллы можно выделить из клеток и тканей центрифуги- центрифугированием (рис. 13-24). Для этого жи- животные или растительные ткани сначала подвергают щадящей гомогенизации в изотоническом растворе сахарозы. Плазматическая мембрана при таком воздействии разрушается, а различные клеточные органеллы по большей части остаются неповрежденными. Сахароза удобна тем, что она сравнительно трудно проходит сквозь мембраны и потому не вызывает набухания таких внутрикле- внутриклеточных структур, как митохондрии или хлоропласты. Разные виды органелл, на- например ядра и митохондрии, различаю- различающиеся по своим размерам и по удельно- удельному весу, а значит, и оседающие в поле центробежных сил с разной скоростью, могут быть выделены после этого из го- могената дифференциальным центрифу- центрифугированием (рис. 13-24). Затем эти ядра, митохондрии и прочие выделенные фрак- фракции исследуют на способность катализи- катализировать определенный метаболический процесс. Именно этот подход и дал воз- возможность установить, что разные мета- метаболические пути локализованы в эука- риотических клетках раздельно (рис. 13-23). Выяснилось, например, что в некоторых клетках все ферменты, уча- участвующие в превращении глюкозы в мо-
ГЛ. 13. МЕТАБОЛИЗМ. ОБЩИЙ ОБЗОР 397 Место локализации системы переноса электронов и механизмов фосфорилиро- вания. Здесь же происходит и синтез липидов. Кроме того,в клеточной мембране локализованы транспортные механизмы, обеспечивающие поглощение питательных веществ и вьщеление продуктов метаболизма Здесь происходят репликация ДНК и транскрипция Здесь протекает гликолиз, а также многие другие метаболические процессы Часто прикреплены к нити мРНК. В рибосомах происходит синтез белка В качестве источника клеточного топлива запасаются полисахариды и некоторые другие полимеры У основания жгутика находится особая турбиноподобная структура, сообщающая жгутику характерное вращательное движение за счет энергии, вырабатывае- вырабатываемой клеткой Рис. 13-22. Локализация некоторых видов ме- метаболической активности в бактериальной лочную кислоту, находятся в цитозоле, т.е. в растворимой части цитоплазмы, тогда как ферменты цикла лимонной кис- кислоты, переноса электронов и окислитель- окислительного фосфорилирования локализованы в митохондриях. Краткое содержание главы Организмы можно классифицировать исходя из их потребности в тех или иных источниках углерода. Автотрофам доста- достаточно двуокиси углерода, а гетеротрофы
398 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ у Гликолиз; многие реакции глю- \конеогенеза; фосфоглкжонатный _ЛзШв^рВ%!«вйая мембрана , путь; активация аминокислот; /Энергозависимые транспортные системы, \ синтез жирных кислот /например система транспорта аминокислот ' и система транспорта ионов Na+ /и К+ при помощи АТРазы !спечивают изоляцию гидро- гидролитических ферментов, таких.как рибонуклеаза и кислая фосфатаза Репликация ДНК; синтез различных видов РНК и некоторых ядерных белков Синтез рибосомных РНК Образование плазматической мем- мембраны и секреторных пузырьков Место локализации ката-.азы и оксидаз аминокислот; в расти- растительных клетках здесь протекают реакции глиоксилатного цикла Синтез белка Энлдплазмдический ретикулум Синтез липидов; синтез стероидов; канализирование продуктов биосинтеза Ферменты синтеза и расщепления гликогена -20 мкм- J должны получать углерод в виде каких- нибудь восстановленных органических соединений, таких, как глюкоза. Для мно- многих автотрофных клеток, например для клеток зеленых растений, источником энергии служит солнечный свет; гетеро- трофы получают необходимую им энер- 1ию в результате окисления органиче- органических пищевых веществ. Метаболизм включает в себя катабо- катаболизм, или расщепление пищевых ве- веществ, богатых энергией, и анаболизм, или биосинтез новых клеточных компо- компонентов. В катаболических и анаболиче- анаболических процессах различают три главные стадии. На первой стадии катаболизма полисахариды, жиры и белки расщеп- Цикл лимонной кислоты; перенос электронов и окислительное фоофорили- рование; окисление жирных кислот; катаболизм аминокислот Рис. 13-23. Компартментализация некоторых важных ферментов и метаболических путей в клетке печени крысы. Электронная микрофо- микрофотография, на основе которой выполнен этот рисунок, приведена в гл. 2 (см. рис. 2-7). ляются под действием ферментов до своих строительных блоков, на второй стадии происходит окисление этих строи- строительных блоков, в результате которого в качестве главного продукта образуется ацетил-СоА, а на третьей стадии ацетиль- ацетильная группа ацетил-СоА окисляется до СО2. Различные катаболические пути сливаются в один общий конечный путь, анаболические же пути расходятся, так что из небольшого числа предшественни- предшественников образуется в конечном счете много
ГЛ. 13. МЕТАБОЛИЗМ. ОБЩИЙ ОБЗОР 399 600 об/мин, При враще- вращении поршня пробирку медленно перемешают вверх и вниз Измельченная ткань 0,25 М раствор сахарозы Гомогенат пропускают через сито, чтобы удалить обрывки кровеносных сосудов и остат- остатки соединительной ткани Тефлоновый поршень Стеклянная пробирка — Гомогенат Рис. 13-24. Фракционирование клеточного экс- экстракта методом дифференциального центрифу- центрифугирования. Клеточная мембрана разрушается силами трения в гомогенизаторе с вращаю- вращающимся поршнем. После удаления остатков со- соединительной ткани и обрывков кровеносных сосудов при помощи сита из нержавеющей стали клеточный экстракт центрифугируют не- несколько раз, постепенно увеличивая скорость вращения ротора. различных продуктов. Соответствующие катаболические и анаболические пути не- неидентичны, т.е. отдельные их фермента- ферментативные этапы не совпадают; регули- регулируются эти пути независимо; часто они локализованы в разных участках клетки. При распаде пищевых веществ часть вы- высвобождающейся из них энергии запа- запасается в форме аденозинтрифосфата (ATP). ATP служит переносчиком энер- энергии от катаболических реакций к процес- процессам, сопровождающимся потреблением энергии, таким, как биосинтез, сокраще- сокращение или движение, перенос веществ через мембрану или передача генетической ин- информации. Химическая энергия передает- передается также от катаболических процессов к анаболическим в форме восстанови- восстановительной способности-через восстанов- восстановленный кофермент NADPH. Регуляция метаболизма осуществляет- осуществляется на трех уровнях: 1) при помощи алло- стерических ферментов, 2) при помощи гормонов и 3) путем регулирования син- 10 мин при 600 __ _ Надосадочная жидкость, фракция 1 Ядра, неразрушенные "*™~ клетки I На.'госадочную жидкость (фракцию 1) I центрифугируют при 15000g 5 мин Надосадочная жидкость, фракция 2 Митохондрии, лизосомы и ^^" микротельца iHaAocaoo4Hyio жидкость (фракцию 2) центрифугируют при 100 000 я 60 мин Растворимая фракция / цитоплазмы (цитозоль) Рибосомы и фрагменты эндоплазматического — ретикулума; эту объединенную фракцию называют микросомной фракцией теза ферментов. Для анализа метаболи- метаболических путей применяют экстракты кле- клеток и тканей, из которых выделяют ферменты изучаемого метаболического пути и его промежуточные продукты. Широкие возможности для изучения ме- метаболизма открывает использование му- тантных микроорганизмов с генетиче-
400 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ скими дефектами, затрагивающими тот или иной метаболический путь (ауксо- трофных мутантов). Весьма эффективен в этом отношении также метод изо- изотопных меток. В эукариотических клет- клетках ферменты различных метаболиче- метаболических путей разделены пространственно, т.е. находятся в разных органеллах-в ядрах, митохондриях или эндоштазмати- ческом ретикулуме; из этих органелл их можно выделять для прямого изучения. ЛИТЕРАТУРА Книги Colowick S. P.. Kaplan N. О. (eds.). Methods in Enzymology, Academic, New York, 1955. Многотомное издание, содержащее об- обзорные статьи по всем вопросам энзимо- логии и метаболизма, а также по методам исследований. Dagley S., Nicholson D. E. Introduction to Metabolic Pathways, Wiley, New York, 1970. (Имеется перевод: Дэгли С, Николсон Д. Метаболические пути.-М.: Мир, 1973.) Сводка метаболических карт. Roodyn D. В. (ed.). Subcellular Biochemistry, v. I-VII, Plenum, New York, 1972-1980. Много томное издание, содержащее об- обзорные статьи по компартментализации различных видов биохимической активно- активности в клетках. Stonier R.Y., Doudoroff M.. AdelbergE.A. The Microbial World, 4th ed, Prentice-Hall, Englewood Cliffs, N.J, 1976. (Имеется пере- перевод: Стейниер Р. и др. Мир микробов. В трех томах.-М.: Мир, 1979.) Хороший учебник по общей микробиологии. Рас- Рассматриваются различные подгруппы авто- трофных и гетеротрофных организмов; об- обсуждается существенный вклад мик- микроорганизмов в общий обмен биомассы земного шара. Статьи Сентябрьский номер журнала «Scientific American» за 1970 г. (т. 223, № 3) целиком посвящен вопросам, касающимся био- биосферы. Особо можно рекомендовать сле- следующие статьи, вошедшие в этот номер журнала: Penman H. L. The Water Cycle, p. 98. Cloud P.. Gihor A. The Oxygen Cycle, p. 110. Bolin B. The Carbon Cycle, p. 124. Delwiche C.C. The Nitrogen Cycle, p. 136. Brown L. R. Human Food Production as a Process in the Biosphere, p. 160. Hall D. 0. Photobiological Energy Conversion, FEBS Lett., 64, 6-16 A976). Общая статья, рассматривающая фотосинтез с точки зре- зрения потребностей человека в пище и энер- энергии. Woodwell G. M. The Carbon Dioxide Question, Sci. Am., 238, 34-43, January 1978. Обсуж- Обсуждаются возможные последствия повыше- повышения содержания СО2 в атмосфере. Вопросы и задачи 1. Анализ метаболического пути. Анализ лю- любого метаболического пути напоминает подведение баланса в приходно-расходной книге. В такую книгу заносят все произве- произведенные в течение месяца операции (в со- соответствующую главу «Приход» или «Расход»), а в конце месяца определяют ито1. Метаболический путь-это тоже ряд «операций», ряд последовательных хими- химических превращений, из которых в конеч- конечном счете и слагается данный метаболиче- метаболический процесс. Подобно бухгалтерским операциям, химические превращения тоже можно охарактеризовать количественно и каждое из них может быть описано уравнением химического баланса. В ин- гактных клетках такой «учет»-далеко не простое дело, поскольку промежуточные продукты данного метаболического пути вовлекаются иногда в другие метаболиче- метаболические процессы. Ниже приведены реакции, из которых складывается процесс фермен- ферментативного превращения глицеральдегид- 3-фосфата в этанол (спиртовое брожение) в дрожжевых клетках. Каждое из приве- приведенных здесь химических уравнений сба- сбалансировано. Следует, однако, иметь в ви- виду, что в лействительности реакции, из которых состоит данный метаболический путь, могут протекать и в иной после- последовательности. Глицеральдегид-3-фосфат + Р,+ NAD+ -» 3-фосфоглицероилфосфат + NADH + Н + Фосфоенолпируват + ADP -» Пируват + + АТР Этанол + NAD+ -» Ацетальдегид + + NADH + H + 3-фосфоглицероилфосфат + A DP -> -> 3-фосфоглицерат + АТР 2-фосфоглицерат ^ 3-фосфоглицерат 2-фосфоглицерат -» Фосфоенолпируват + + Н2О Пируват -+ СО 2 + Ацетальдегид а) Используя все эти уравнения, запи- записанные в словесной форме, и зная хи- химическую структуру каждого промежу- промежуточного продукта, выведите и запишите
ГЛ. 13. МЕТАБОЛИЗМ. ОБЩИЙ ОБЗОР 401 последовательность химических превра- превращений (метаболический путь), из ко- которых состоит процесс расщепления глицеральдегид-3-фосфата до э ганола. б) Напишите суммарное уравнение этого процесса. Для этого вам придется по- поступить так, как если бы вы подбивали итог в приходно-расходной книге, т.е. суммировать все поступления и траты. в) Изобразите данный метаболический путь так, как это сделано на рис. 13-4. •Укажите, как связаны между собой от- отдельные части этого пути. 2. Циклический метаболический путь. Среди бактерий, принадлежащих к роду Pseudomonas, встречаются виды, способные использовать в качестве источника клеточ- клеточного топлива оксалат ("ООС СОО ) соединение, крайне токсичное для боль- большинства млекопитающих. Обмен ок- салата у таких бактерий идет по цикли- циклическому пути, который схематически мож- можно представить следующим образом: Оксалат Формиат NAD* NADH V У го. Формил-СоА СО, Оксалил-СоА Н+ а) Изобразите данный метаболический путь в виде ряда уравнений химическо- химического баланса, в которых продукт одной реакции служит субстратом следующей. Напишите формулы соединений, участ- участвующих в каждой из стадий. б) Напишите сбалансированное суммар- суммарное уравнение процесса расщепления оксалата до СО2, пользуясь струк- структурными формулами. 3. Включение 14С в аминокислоты. В 1955 г. Роберте и его сотрудники опубликовали результаты своих экспериментов по выра- выращиванию Escherichia coli на среде, содер- содержавшей в качестве единственного источни- источника углерода равномерно меченную 14С- глюкозу. Исследователи рассчитывали та- таким способом пометить радиоактивным углеродом биомолекулы клетки. Оказа- Оказалось, что при выращивании бактерий на 14С-глюкозе метка быстро включается во все аминокислоты. Если же в среду, содер- содержащую 14С-глюкозу, добавляли неме- немеченый гистидин (так что источников углерода было уже два; глюкоза и гисти- гистидин), то 14С включался во все аминокис- аминокислоты, за исключением гистидина. Почему при отсутствии немеченого гистидина 14С включался в эту аминокислоту? Поче- Почему в среде, содержавшей немеченый ги- гистидин, метка в гистидин не включалась? Что происходило: ингибирование по типу обратной связи или репрессия ферментов? 4. Регуляция обмена лактозы у Е. coli. Клет- Клетки Е. coli можно выращивать на простой среде, содержащей в качестве единствен- единственного источника углерода лактозу. Необхо- Необходимым этапом обмена лактозы (а следо- следовательно, и необходимым условием выжи- выживания бактерий) является гидролиз лак- лактозы до моносахаридов глюкозы и галак- галактозы, катализируемый ферментом Р-га- лактозидазой. Когда Е. coli выращивают на среде с лактозой, в каждой бактериаль- бактериальной клетке присутствует несколько тысяч молекул этого фермента (см. задачу 1), способных осуществлять гидролиз. Одна- Однако если единственным источником углеро- углерода в среде служит глюкоза или, например, глицерол, то в клетках обнаруживается не более 5-10 молекул р-галактозидазы. а) Каким образом регулируется обмен лактозы? Объясните. б) Почему при замене в питательной сре- среде лактозы на глицерол содержание Р- галактозидазы в клетках снижается? Почему оно не остается на прежнем уровне? в) Если среда содержит в качестве един- единственного источника углерода метил-р- галактозид, то клетки растут быстро и содержат тысячи молекул р-галакто- р-галактозидазы. Если же единственным источ- источником углерода является метил-ос-га- лактозид, то клетки растут медленно и содержат совсем мало р-галактозидазы. Объясните причины этих различий. 5. Сравнение катаболических и анаболиче- анаболических путей. Ниже иа схеме изображено взаимопревращение глюкозы и фрукто- зо-1,6-дифосфата. В обмене углеводов эта последовательность реакций играет клю- ключевую роль. Расщепление глюкозы пред- представляет собой катаболический путь, а ее биосинтез из фруктозо-1,6-дифосфата- анаболический. Одни и те же гексозомо- нофосфаты служат промежуточными про- проектами того и другого пути. Однако, хо- хотя пути эти очень схожи, между ними есть явные различия. Выявите их.
402 ЧЛГТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Глюкоза All' \Ш Катаболический путь \ТР Глюкозо-6- фосфат Фруктозо-6- фосфат Н ,0 АнаПолический путь Н,0 Фруктозо-1, 6-дифосфат а) Напишите уравнения химического ба- баланса для каждой из стадий катаболи- ческого пути. Напишите суммарное уравнение, представляющее собой ре- результат сложения отдельных стадий. б) Проделайте то же самое для анаболи- анаболического пути. в) Укажите различия между катаболиче- ским и анаболическим путями, про- проявляющиеся в их суммарных уравне- уравнениях. Можно ли считать, что каждый из этих путей является простым обра- обращением другого? г) Чем обеспечивается направленность ка- катаболизма глюкозы? Иными словами, что препятствует обращению этого процесса? д) Возможно ли, чтобы один и тот же фермент катализировал и катаболиче- скую, и анаболическую реакции взаи- взаимопревращения глюкозы и глюкозо-6- фосфата? Возможно ли это для взаи- взаимопревращения глюкозо-6-фосфата -j и фруктозо-6-фосфата? 6. Измерение радиоактивности. Количествен- Количественное определение радиоактивных изотопов, обычно используемых в биологических ис- исследованиях CН, 14С, 32Р и 35S), удобнее всего проводить при помощи жидкостно- жидкостного сцинтилляционного счетчика. За едини- единицу радиоактивности (ее называют кюри, Ки; международное обозначение -Ci) принята активность, соответствующая 2,22-1012 распадам в 1 минуту (расп./мин). При использовании жидкостного сцинтил- сцинтилляционного счетчика обычно удается заре- зарегистрировать в виде импульсов только часть общего числа распадов. Поэтому количество радиоактивности часто выра- выражают не в виде числа распадов в минуту (расп./мин), а в виде числа реально реги- регистрируемых данным счетчиком импульсов в минуту (имп/мин). Если известна эффек- эффективность счета, которая определяется по формуле Эффективность имп/мин = — — ¦ 100 0, счета расп./мин то на основании числа регистрируемых импульсов в минуту можно определить число распадов в минуту. Использование радиоактивной мет- метки -очень ценный метод биохимических исследований, потому что по радиоактив- радиоактивности мы можем судить о концентрации данного химического соединения. Под Удельной радиоактивностью соединения понимают активность на единицу массы, объема и т.д. (грамм, моль, эквивалент, миллилитр и т.д.). Пользуясь этим поня- понятием, мы вовсе не предполагаем, что мет- метку несет каждая молекула данного соеди- соединения. Единственное, что требуется,-это чтобы регистрируемое счетчиком число импульсов было пропорционально кон- концентрации меченого соединения; удельная радиоактивность и эффективность счета служат при этом пересчетными коэффи- коэффициентами. а) От поставщика получен препарат '*С- глюкозы в 1 мл водного раствора. Об- Общая радиоактивность препарата 250 мкКи, а его удельная радиоактивность 500 мКи/ммоль. Вычислите концентра- концентрацию глюкозы в полученной от постав- поставщика 1-мл ампуле. б) Сколько импульсов в минуту будет за- зарегистрировано, если из полученного раствора отобрать пробу A0 мкл), вве- ввести ее в счетчик и измерить радиоак- радиоактивность с эффективностью 70%? Измерение концентрации метионина вну- внутри клетки. Когда клетки Е. coli выращи- выращивают на среде, в которой единственным источником серы служит 35SO2 , все серу- содержащие аминокислоты и белки содер- содержат метку 35S. В одном из таких экспери- экспериментов Е. coli выращивали на среде, содержащей 0,85 мМ "SOj". При измере- измерении радиоактивности в 250-мкл пробе этой среды с 87%-ной эффективностью счета было зарегистрировано 4,50 • 105 имп/мин. По достижении максимального роста культуры клетки отфильтровали и промыли холодной водой. Свободные (несвязанные) аминокислоты экстрагиро- экстрагировали из клеток кипящей водой и раздели- разделили методом ионообменной хроматогра- хроматографии. Экстракт из 1,85 г влажных клеток при измерении с 82%-ной эффективностью имел радиоактивность 3.2-105 имп/мин Ь-358-метионина. Вычислите концентра- концентрацию свободного L-метионина внутри клетки, исходя из предположения, что во влажных клетках 80% составляет вода и 20%-сухой остаток.
ГЛАВА 14 АТР-ЦИКЛ И БИОЭНЕРГЕТИКА КЛЕТКИ В наши дни человек особенно остро ощущает, насколько энергия (т. е. способ- способность производить работу) необходима для поддержания всей нашей современ- современной цивилизации. Энергия требуется нам для производства различных товаров, для перевозки людей и материалов, для отопления жилых и рабочих помещений, а также для многих и многих других ме- менее важных дел. Точно так же необходи- необходима энергия и микрокосмосу живой клет- клетки. В живых клетках непрерывно синтези- синтезируются новые вещества, выполняется механическая работа, связанная с движе- движением, происходит транспорт веществ и вырабатывается тепло. За миллиарды лег эволюции клетки научились исполь- использовать энергию более экономно и более эффективно, чем использует ее большин- большинство машин, созданных человеком. Дей- Действительно, на живые клетки мы смо- смотрим теперь, как на модели, с помощью которых нам следует создавать новые, более совершенные устройства для пре- преобразования энергии, и в первую очередь для улавливания энергии Солнца. Раздел биохимии, занимающийся во- вопросами преобразования и использова- использования энергии в живых клетках, носит на- название биоэнергетики. Мы начнем эту главу с рассмотрения нескольких ос- основных принципов термодинамики, т.е. той области физики, которая имеет дело с превращениями энергии. После этого мы обратимся к системе АТР, чтобы вы- выяснить, как с ее помощью совершается в клетках перенос энергии от катаболиче- ских реакций, в которых энергия выде- выделяется, к тем клеточным процессам, для которых она необходима. 14.1. Первый и второй законы термодинамики Энергия известна нам в различных формах; мы знаем электрическую, меха- механическую, химическую, тепловую и све- световую энергию. Мы знаем также, что энергия может переходить из одной формы в другую. Так, в электромоторе электрическая энергия преобразуется в механическую, в аккумуляторе проис- происходит преобразование химической энер- энергии в электрическую, а в паровой турбине в механическую энер1ию преобразуется тепло. Различные формы энергии свя- связаны друг с другом определенными коли- количественными соотношениями: например, 1 кал тепловой энергии теоретически со- соответствует 4,185-107 эр1 механической энергии. Известно, однако, что любой переход энергии из одной формы в другую сопро- сопровождается некоторыми потерями. Элек- Электрический мотор, преобразующий элек- электрическую энергию в механическую, вырабатывает всегда меньше полезной энергии, чем потребляет, потому что из- за трения часть энергии переходит в те- тепло, которое рассеивается в окружаю- окружающем пространстве, и уже не может быть использовано. Практически всякий раз, когда энергия используется для про- производства работы или когда она перехо- переходит из одной формы в другую, часть по- полезной энергии теряется. Во многих машинах на выполнение полезной ра- работы расходуется менее 25° о потребляе- потребляемой энергии. Многочисленные количе- количественные исследования по взаимопревра- взаимопревращению различных форм энергии, выиол-
404 ЧАСТЬ II БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ ценные физиками и химиками, позволили сформулировать два фундаментальных закона термодинамики. Мы попытаемся изложить здесь их суть в наиболее про- простой и доступной форме. а. Первый закон При любом физическом или химиче- химическом изменении общее количество энер- энергии во Вселенной остается постоянным. Первый закон-это закон сохранения энергии; его можно сформулировать и так: энергия не появляется и не исче- исчезает. Всякий раз, когда энергия исполь- используется для выполнения работы или же переходит из одной формы в другую, об- общее количество энергии остается неиз- неизменным. б. Второй закон Все физические или химические про- процессы стремятся идти в направлении, со- соответствующем необратимому переходу полезной энергии в хаотическую, неупоря- неупорядоченную форму. Мерой такого перехода служит величина, которая носит назва- название энтропии. Процесс останавливается, когда наступает состояние равновесия, при котором энтропия имеет максималь- максимально возможное при данных условиях зна- значение. Эта упрощенная и в какой-то мере аб- абстрактная формулировка требует неко- некоторых пояснений. Прежде всего необхо- необходимо более точно определить понятия «полезная энергия» и «энтропия». Есть два вида полезной энергии: 1) свободная энергия, которая может производить ра- работу при постоянной температуре и по- постоянном давлении, и 2) тепловая энер- энергия, способная производить работу толь- только при изменении температуры и давле- давления. Энтропия является количественной характеристикой или мерой неупорядо- неупорядоченной (в известном смысле бесполезной) энергии в данной системе. Строгое опре- определение понятия энтропии требует мате- математического рассмотрения понятия «не- «неупорядоченность». Поскольку мы не имеем здесь такой возможности, попро- попробуем на нескольких простых примерах качественно охарактеризовать понятие энтропии (дополнение 14.1). Дополнение 14-1. Понятие энтропии Термин «энтропия», буквально означающий «внутреннее изменение» или «внутреннее превращение», впервые был введен в 1851 г. немецким физиком Рудольфом Клаузиусом, которому принадлежит одна из первых формулировок второго закона термодинамики. Строгая коли- количественная интерпретация энтропии может быть дана на основе стати- статистических и вероятностных представлений. Качественный смысл этого понятия можно проиллюстрировать на трех примерах, каждый из ко- которых характеризует определенный аспект энтропии. Главное, что всегда связывают с энтропией,-это неупорядоченность системы, кото- которая в разных случаях может проявляться по-разному. Случай 1. Чайник и рассеяние тепла. Известно, что пар, образующий- образующийся при кипении воды, может совершать полезную работу. Представим себе, однако, что, как только температура воды в чайнике (т. е. в «систе- «системе») достигнет 100 С, мы выключим под ним огонь и дадим ему про- просто остыть в кухне (т. е. в «окружающей среде»). При этом не будет про- произведено никакой работы. Вместо этого из чайника в окружающую среду будет переходить тепло, постепенно повышая температуру среды (т.е. кухни) до тех пор, пока, наконец, не будет достигнуто по- полное тепловое равновесие. В этот момент все части нашего чайника и кухни будут иметь практически одну и ту же температуру. Свободная
ГЛ. 14. АТР-ЦИКЛ И БИОЭНЕРГЕТИКА КЛЕТКИ 405 энергия, которая была сконцентрирована в чайнике, когда он был за- заполнен водой, нагретой до 100 С, и которая потенциально могла про- производить работу, исчезла. Эквивалентное ей количество тепловой энер- энергии после охлаждения чайника осталось в системе «чайник + кухня» (т.е. во «Вселенной»), но оно перераспределилось между разными ча- частями системы беспорядочно, или, иначе говоря, равномерно. Эта энергия уже недоступна и не может производить работу, потому что в пределах кухни уже нет перепада температур. Более того, возраста- возрастание энтропии в кухне (в «окружаюшей среде»), обусловленное охлажде- охлаждением чайника, необратимо. Действительно, из повседневного опыта нам хорошо известно, что тепло самопроизвольно никогда не перейдет обратно, т. е. от кухни к остывшему чайнику, и не нагреет в нем воду до 100JC. Случай 2. Окисление глюкозы. Энтропия характеризует состояние не только энергии, но и вещества. Аэробные организмы извлекают сво- свободную энергию из глюкозы, которую они получают из окружаюшей среды. Для того чтобы добыть эту энергию, они окисляют глюкозу мо- молекулярным кислородом, также поступаюшим из среды. Конечные продукты окислительного метаболизма глюкозы, СО2 и Н2О, возвра- возвращаются в окружающую среду. При этом процессе энтропия окружаю- окружающей среды возрастает, а сам организм остается в стационарном со- состоянии и степень его внутренней упорядоченности не изменяется. Возрастание энтропии и в этом случае отчасти связано с.рассеянием те- тепла, но здесь возникает неупорядоченность и другого рода, иллюстри- иллюстрируемая суммарным уравнением окисления глюкозы в живых организ- организмах: С6Н12О6 + 6О2-* 6СО2 + 6Н2О. Схематически этот процесс можно изобразить следующим образом: 12 молекул (газ) I рдос не 12СТВО A A I н,о *¦»-¦>¦ '~r (жидкгать) Атомы, входившие ранее в состав одной молекулы глюкозы и шести молекул кислорода, т. е. составлявшие в общей сложности семь моле- молекул, распределились в результате реакции более равномерно, посколь- поскольку из семи молекул теперь образовалось двенадцать FСО2 + 6Н2О). Всякий раз, когда в результате химической реакции увеличивается число молекул или когда какое-нибудь твердое вещество, например глюкоза, превращается в жидкие или газообразные продукты, моле- молекулы которых обладают большим числом степеней свободы и легче могут перемещаться в пространстве по сравнению с твердым веще- веществом, степень молекулярной неупорядоченности возрастает и энтро- энтропия, следовательно, увеличивается. Случай 3. Информация и энтропия. В «Юлии Цезаре» Шекспира (акт IV, сцена 3) Брут, узнав о том, что на него движется со своей армией Марк Антоний, произносит следующие слова: There is a tide in the affairs of men, Which taken at the flood, leads on to fortune;
406 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Omitted, all the voyage of their life Is bound in shallows and in miseries1. Перед нами богатое информацией сообщение, записанное при помо- помощи букв английского алфавита; всего их здесь 125. Помимо своего пря- прямого смысла эти слова имеют еще и другой, скрытый смысл. В них от- отражается не только сложная последовательность событий в пьесе, но также и мысли автора о столкновении интересов, о честолюбии, о жа- жажде власти. Чувствуется глубокое проникновение Шекспира в челове- человеческую природу. Таким образом, объем заключенной в них информа- информации очень велик. Представим себе теперь, что 125 букв, составляющих эту цитату, рас- рассыпаны в совершенном беспорядке, как показано здесь на рисунке 'с ; (Л О — \ \°" U° С \\ \ •Ч _,, ^ -• о е \ Ч ез X В d Э V I «.¦ V с о с г t * **' 9 ^ -•> о ч о о \ 4 d ? cj *^ О S Весь смысл оказался утрачен. В такой форме эти 125 букв практиче- практически не несу г никакой информации, но их энтропия весьма велика. Из этого следует вывод, что информация представляет собой одну из форм энергии; ее иногда называют «отрицательной энтропией». Действительно, теория информации, т.е. та область математики, на которой базируется программная ло1 ика компьютеров, весьма тесно связана с термодинамической теорией. Живые организмы-это вы- сокоупорядоченные структуры, содержащие колоссальное количество информации и соответственно бедные энтропией. 1 В делах людей прилив есть и отлив, С приливом достигаем мы успеха, Когда ж отлив насгупит, лодка жизни По отмелям несчастий волочится. (У. Шекспир. Полное собрание сочинений, «Искусство», т. 5, с. 303. Пере- Перевод М. Зенкевича.)
ГЛ. 14. АТР-ЦИКЛ И БИОЭНЕРГЕТИКА КЛЕТКИ 407 Есть и другой аспект второго закона, который следует учитывать для понима- понимания того, как действует этот закон, осо- особенно в биологических системах. Введем прежде всего понятие реакционной си- системы, под которой подразумевается со- совокупность веществ, обеспечивающих протекание данного химического или фи- физического процесса. Такой системой может быть, например, организм животного, отдельная клетка или два реагирующих друг с другом со- соединения. Далее мы должны ввести поня- понятие окружающей среды, с которой реак- реакционная система может обмениваться энергией. Совокупность реакционной си- системы и окружающей среды составляет то, что мы называем «Вселенной» "Вселенная" (система + окружающая среда) Рис. 14-1. Схематическое изображение реакци- реакционной системы и окружающей среды. В реак- реакциях, протекающих при постоянной температу- температуре и постоянном давлении, между системой и окружающей средой возможен обмен энер- энергией, однако такой обмен должен происходить в соответствии с законами термодинамики. Первый из них гласит, что общее количество энергии во «Вселенной» (система + окружаю- окружающая среда) остается постоянным. Согласно второму закону, при физическом или химиче- химическом изменении в системе энтропия Вселенной увеличивается; одновременно уменьшается сво- свободная энергия реакционной системы. Наряду с этими изменениями от системы к окружаю- окружающей среде или от окружающей среды к систе- системе может передаваться тепло, как это следует из соотношения AG = ДЯ - T&.S. (рис. 14-1) и что. вообще говоря, вклю- включает в себя земной шар и космическое пространство. Некоторые химические или физические процессы могут, конечно, протекать в замкнутых системах, не спо- способных к обмену энергией с окружающей средой. Однако в реальном мире, и осо- особенно в мире биологическом, системы, в которых протекают химические и физи- физические процессы, обмениваются энергией с окружающей средой. Мы скоро убедим- убедимся, насколько важно это разграничение между системой и окружающей средой, когда речь идет об обмене энергией. Изменения свободной энергии, те- теплоты и энтропии в химических реак- реакциях, протекающих при постоянной тем- температуре и постоянном давлении, т.е. в условиях, характерных именно для био- биологических систем, связаны друг с дру- другом количественно следующим уравне- уравнением: АС = АН - TAS, A) где АС-изменение свободной энергии реакционной системы, АН изменение ее теплосодержания, или энтальпии (от греч. «enthalpo»-нагреваю). Т-абсолют- Т-абсолютная температура, при которой протекает данный процесс, и AS-изменение энтро- энтропии «Вселенной», которая включает в се- себя и данную реакционную систему. По мере того как химическая реакция стре- стремится к состоянию равновесия, энтропия Вселенной (система + окружающая сре- среда) возрастает. Поэтому величина AS в реальном мире всегда имеет положи- положительное значение. В принципе в некой идеальной системе реакция может проте- протекать и без увеличения энтропии. Увеличе- Увеличению энтропии Вселенной при какой-либо реакции должно, согласно уравнению A). соответствовать уменьшение свободной энергии реакционной системы. Поэтому величина AG реакционной системы имеет всегда отрицательное значение. Измене- Изменение энтальпии АН определяется как ко- количество тепла, которое данная реак- реакционная система отдает окружающей среде или получает от нее при постоян- постоянной температуре и постоянном давлении. Если реакционная система теряет (т. е. от- отдает) тепло, то величина АН имеет отри-
408 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ цательное значение; если же система по- получает тепло от окружающей среды, то АН выражается положительной величи- величиной. Для биологических систем существен- существенна еще одна важная особенность измене- изменений энтропии. Согласно второму закону термодинамики, при химических реак- реакциях или физических процессах энтропия Вселенной увеличивается. Из этого зако- закона, однако, не следует, что возрастание энтропии должно происходить обяза- обязательно в самой реакционной системе; оно может произойти в любом другом участке Вселенной. В живых организмах метаболические процессы, т. е. те превра- превращения, которым подвергаются в них пи- пищевые вещества, не ведут к возрастанию внутренней неупорядоченности, или эн- энтропии самих организмов. Из повсед- повседневных наблюдений мы знаем, что лю- любой организм, будь то муха или слон (т. е. в нашем понимании «система»), при всех процессах жизнедеятельности сохраняет присущую ему сложную и упорядочен- упорядоченную структуру. В результате процессов жизнедеятельности возрастает энтропия не самих живых организмов, а окружаю- окружающей среды. Живые организмы сохраняют внутреннюю упорядоченность, получая свободную энергию в виде пищевых ве- веществ (или солнечного света) из окру- окружающей среды и возвращая в нее такое же количество энергии в менее полезной форме, главным образом в форме тепла, которое рассеивается во всей остальной Вселенной. В заключение следует подчеркнуть, что сам по себе рост энтропии, или увеличе- увеличение степени неупорядоченности, нельзя считать совершенно бесполезным. По- Поскольку увеличение энтропии Вселенной при биологических процессах необрати- необратимо, оно создает движущую силу и задает направление всем видам биологической активности. Живые организмы непреры- непрерывно повышают энтропию в окружающей среде, и этим Вселенная расплачивается за поддержание в них внутреннего поряд- порядка. Здесь, по-видимому, целесообразно рассмотреть какую-нибудь конкретную химическую реакцию из числа протекаю- протекающих в клетке, для того чтобы получить представление о возможных величинах изменений разных форм энергии. В аэ- аэробных клетках происходит окисление глюкозы (С6Н12О6) до СО2 и Н2О при постоянной температуре и постоянном давлении С6Н12О6 + '6О2 -» 6СО2 Если принять, что эта реакция протекает в стандартных условиях, а для термо- термодинамических расчетов это значит, что температура равна 25 С, или 298 К, и да- давление равно 1 атм G60 мм рт. ст.), то на 1 моль окисленной глюкозы 6Н2О. ДС = -686000 кал/моль ДН = - 673 000 кал/моль ДН-ДС (свободная энер- энергия системы, т.е. реагирующих мо- молекул, уменьши- уменьшилась) (реагирующие мо- молекулы отдали те- тепло) -673000-(-686000) 298 = +44 кал/моль ¦ град (энтропия Вселен- Вселенной увеличилась) Увеличение степени молекулярной не- неупорядоченности, или энтропии, ко- которым сопровождается окисление глю- глюкозы, можно представить себе достаточ- достаточно наглядно с помощью примера, приве- приведенного в дополнении 14.1. 14.2. Клеткам необходима свободная энергия Тепло не является для клеток сколько- нибудь существенным источником энер- энергии, так как тепло способно производить работу лишь в том случае, если оно пере- переходит от более нагретого тела к более хо- холодному или из зоны с более высокой температурой в зону с более низкой тем- температурой. Кроме того, к. п. д. теплового двигателя зависит, как известно, от раз- разности температур между нагретым и хо- холодным телом; чем эта разность больше,
ГЛ. 14. АТР-ЦИКЛ И БИОЭНЕРГЕТИКА КЛЕТКИ 409 тем большая доля тепловой энергии мо- может быть превращена в работу. Посколь- Поскольку в живых клетках температура в любой точке практически одинакова, они не спо- способны использовать тепловую энергию. Тепло служит им лишь для поддержания оптимальной рабочей температуры. Пригодная для клеток форма энергии, т.е. та форма, которую они и могут, и должны использовать,-это свободная энергия, способная производить работу при постоянной температуре и постоян- постоянном давлении. Гетеротрофные клетки из- извлекают необходимую им энергию из бо- богатых энергией пищевых веществ, а для фотосинтезирующих клеток ее источни- источником служит улавливаемая ими энергия солнечного света. Полученная свободная энергия переводится теми и другими клетками в одну и ту же форму - в хими- химическую энергию, которая затем исполь- используется для выполнения работы в процес- процессах, не связанных со сколько-нибудь заметным перепадом температур. По- Попросту говоря, клетки-это химические двигатели, работаюшие в условиях по- постоянства температуры и давления. Теперь мы познакомимся с тем, как из- измеряют и в какой форме выражают сво- свободную энергию химических реакций. 14.3. Изменение стандартной свободной энергии химической реакции можно вычислить Любая химическая реакция характери- характеризуется определенным изменением стан- стандартной свободной энергии AG0. [Ниже будет показано, что величина AG0 отли- отличается от величины AG, которую полу- получают из уравнения A).] Для данной хими- химической реакции изменение стандартной свободной энергии есть величина по- постоянная; ее можно вычислить из кон- константы равновесия этой реакции для стандартных условий, т. е. температуры 25 С B98 К) и давления 1 атм G60 мм рт. ст.). Константа равновесия Ке^ реакции А + В ?=> С + D равна (разд. 4.5) где [А], [В], [С] и [D]-молярные кон- концентрации реагирующих веществ в со- состоянии равновесия при стандартных ус- условиях. Уравнение реакции, в которой участвует больше одной молекулы ис- исходных веществ и конечных продуктов, имеет вид «А + ЬВ я сС + dD, где а, Ь, с и d- число молекул реагирую- реагирующих вешеств А, В, С и D. В этом случае константа равновесия равна [А] [В]' Теперь, когда мы определили констан- константу равновесия химической реакции, мы можем вычислить изменение стандарт- стандартной свободной энергии для этой реакции, которое принято выражать в калориях на моль реагирующего вещества. Кало- Калория-это единица, чаще всего применяе- применяемая в биологии для измерения энергии. Численно она равна количеству энергии в форме теплоты, которое необходимо для нагревания 1,00 г воды от 15 до 16 С. Изменение стандартной свободной энер- энергии AG0 вычисляют из уравнения AG° = -2,303 R Tig Kcq', где R~газовая постоянная [1,987 кал, /(моль-К)] и 7"-абсолютная температу- температура, в данном случае 298 К. Для химиче- химической реакции, у которой константа равно- равновесия равна 1,0, изменение стандартной свободной энергии AG0 = 0, потому что логарифм 1,0 равен нулю. Если констан- константа равновесия данной реакции больше 1,0, то величина AG0 отрицательна; если же она меньше 1,0, то величина AG0 по- положительна. Полезно также определить изменение стандартной свободной энергии и дру- другим путем. AG°-3to разность между сво- свободной энергией исходных веществ и сво- свободной энергией продуктов реакции при стандартных условиях, т. е. при темпера- температуре 298 К, давлении 1 атм и исходных концентрациях всех компонентов реак- реакции 1,0 М. Отрицательное значение AG0 означает, что в продуктах реакции содер- содержится меньше свободной энергии, чем
410 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ в исходных веществах, а потому при стандартных условиях равновесие будет смещено вправо, т. е. в сторону образова- образования продуктов, поскольку все реакции стремятся идти в направлении, соответ- соответствующем уменьшению свободной энер- энергии системы. Положительное значение AG0 означает, что продукты реакции со- содержат больше свободной энергии, чем исходные вещества. Поэтому реакция при исходных концентрациях компонен- компонентов 1,0 М будет идти в обратном напра- направлении, справа налево. Сформулируем это более четко. При исходных концен- концентрациях всех компонентов 1,0 М реакции, для которых величина AG0 отрицательна. идут в направлении слева направо до тех пор, пока не установится равновесие. Ре- Реакции же, для которых в этих же условиях величина AG0 положительна, идут в обратном направлении, т. е. справа на- налево, до установления равновесия. В табл. 14.1 показана зависимость напра- направления реакции от знака AG0. В сущно- сущности, изменение стандартной свободной энергии любой химической реакции —это просто один из возможных способов ма- математического выражения ее константы равновесия. В табл. 14.2 показаны соотно- соотношения между численными значениями AG0 и К.,;. Таблица 14-1. величинами К' Соотношение и AG0 между и химических условиях реакций при направление стандартных К' ДС° Направление реакции при исходных концентрациях компонентов 1,0 М > 1,0 Отрицательное 1,0 Равно нулю < 1,0 Положительное Слева направо Состояние равнове- равновесия Справа налево Отметим два существенных обстоя- обстоятельства. Поскольку биохимические ре- реакции протекают обычно при значениях рН, близких к 7,0, и нередко сопрово- Таблща 14-2. Соотношение между константами равновесия и величинами изменения стандартной свободной энергии химических реакций К* 0,001 0,01 0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0 ДС0/, кал/моль + 4089 + 2726 + 1363 0 -1363 -2726 -4089 ждаются образованием или потребле- потреблением ионов Н + , в биохимической энерге- энергетике в качестве стандартного принято состояние при рН 7,0. Изменение стан- стандартной свободной энергии биохимиче- биохимических систем при рН 7,0 обозначается сим- символом AG0', которым мы и будем пользоваться в дальнейшем. Второе замечание касается единиц энергии. В Международной системе еди- единиц (СИ) за единицу энергии принят джоуль (Дж). Название это дано в честь английского физика Джеймса Джоуля A818-1889), который впервые получил экспериментальное подтверждение пер- первого закона термодинамики-закона со- сохранения энергии. Однако в медицине и биологии энергию принято выражать в калориях, и этими единицами мы будем пользоваться в нашей книге. Калории легко перевести в джоули: 1,00 кал = = 4,184 Дж. 14.4. Химические реакции характери- характеризуются определенной величиной АС0 Вычислим теперь величину изменения стандартной свободной энергии для ре- реакции, катализируемой ферментом фос- фоглюкомутазоп (о роли этого фермента в клетке мы будем говорить в следующей главе): Фосфоглюкомутаза Глюкозо-1 -фосфат Фосфоглюкомутаза Глюкозо-6-фосфат.
ГЛ. 14. АТР-ЦИКЛ И БИОЭНЕРГЕТИКА КЛЕТКИ 411 Химический анализ показывает, что ес- если исходная концентрация глюкозо-1- фосфата равна, допустим, 0,02 М, то при избытке фермента реакция протекает в прямом направлении (слева направо), а если исходная концентрация глюко- зо-6-фосфата равна 0,02 М, то реакция протекает в обратном направлении (справа налево), причем конечный резуль- результат оказывается одинаковым: в равно- равновесной смеси при 25JC и рН 7,0 концен- концентрации глюкозо-1-фосфата и глюкозо-6- фосфата составляют соответственно 0,001 и 0,019 М. (Вспомним, что фермент не смещает равновесие данной реакции, а только ускоряет его достижение.) Рас- Рассчитаем из этих данных константу равно- равновесия фосфоглюкомутазной реакции Таблица 14-3. Изменения стандартной сво- свободной энергии для некоторых химических реакций при рН 7,0; 25 С [Глюкозо-6-фосфат] ей ~~ [Глюкозо-1 -фосфат] 0,019 0.001 = 19,0. Зная величину Kcq', мы можем опреде- определить изменение стандартной свободной энергии: АС0' = - 2,303 RTig K?q = = - 2,303 ¦ 1,987 ¦ 298 lg 19,0 = = - 1360-1.28 = - 1740 кал/моль. Изменение стандартной свободной жер- гии выражается в этом случае отрица- отрицательной величиной, и, следовательно, превращение глюкозо-1-фосфата в глю- козо-6-фосфат при исходных концентра- концентрациях глюкозо-1-фосфата и глюкозо-6- фосфата 1,0 М протекает с потерей свободной энергии. Для биохимических реакций величины AG0 принято выра- выражать в килокалориях; в нашем примере АС0' = - 1,74 ккал/моль. В табл. 14.3 приведены величины изме- изменения стандартной свободной энергии для ряда характерных химических реак- реакций. Из этой таблицы видно, что гидро- гидролиз таких соединений, как некоторые сложные эфиры, амиды, пептиды и гли- козиды, а также реакции перегруппиров- перегруппировки и элиминирования, сопровождаются сравнительно небольшим изменением стандартной свободной энергии, тогда как гидролиз ангидридов кислот характе- Реакция Гидролиз: Ангидриды кислот: Уксусный ангидрид + Н2О -» -» 2Ацетат АТР + Н2О - ADP + + Фосфат Сложные эфиры: Этилацетат + Н2О -» Эта- Этанол + Ацетат Глюкозо-6-фосфат + Н2О —» -» Глюкоза + Фосфат Амиды и пептиды: Глутамин + Н2О -» Глута- мат + NHJ Глицилглицин + Н2О -» -> 2Глицин Гликозиды: Мальтоза + Н2О -» 2Глю- коза Лактоза + Н2О -» Глюко- Глюкоза + Галктоза Перегруппировка: Глюкозо-1-фосфат -> Глюко- зо-6-фосфат Фруктозо-6-фосфат -» Глю- козо-6-фосфат Отшепление воды: Малат -» Фу марат + Н2О Окисление молекулярным кис- кислородом : Глюкоза + 6О2 -» 6СО2 + + 6Н2О Пальмитиновая кислота + + 23О2 - 16СО2 + 16Н2О ДС°\ ккал/мочь -21,8 -7,3 -4,7 -3,3 -3,4 -2,2 -3,7 -3.8 -1,74 -0,40 + 0,75 -686 -2338 ризуется относительно большой величи- величиной АС0'. Особенно же большим умень- уменьшением стандартной свободной энергии сопровождается окисление органических соединений до СО2 и Н2О. Позже, одна- однако, мы увидим (гл. 15 и 17), что данные об изменениях стандартной свободной энер- энергии, подобные тем, которые приведены в табл. 14.3, ничего в сущности не говорят нам о том, какая часть свободной энер- энергии может реально использоваться в био- биологических системах.
412 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ 14.5. Величины AG0' и AG различаются, и это различие имеет важное значение Следует ясно отдавать себе отчет в том, что изменение свободной энергии AG и изменение стандартной свободной энергии AG°'-3to две разные величины. Как мы уже знаем, при любом спонтан- спонтанном химическом или физическом процес- процессе свободная энергия реакционной си- системы всегда уменьшается, т.е. AG выражается всегда отрицательной вели- величиной. Но мы знаем также, что любой хи- химической реакции соответствует строго определенное изменение стандартной свободной энергии AG0', которое может быть положительным, отрицательным или равным нулю в зависимости от кон- константы равновесия данной реакции. По величине изменения стандартной свобод- свободной энергии AG0' мы судим о том, в ка- каком направлении и как далеко пойдет ре- реакция до того момента, когда в системе установится равновесие, если эта реакция протекает в стандартных условиях, т.е. при исходных концентрациях всех компо- компонентов 1,0 М, рН 7,0 и температуре 25 С Величина AG0', следовательно, есть стро- строго определенная константа, характерная для каждой данной реакции. Истинное же изменение свободной энергии AG для данной химической реакции зависит от условий, при которых эта реакция факти- фактически протекает (т.е. от концентрации ре- реагирующих компонентов, рН и темпера- температуры), а эти условия могут и не совпадать со стандартными. Кроме того, величина AG любой реакции, стремящейся к равно- равновесию, всегда отрицательна и умень- уменьшается по абсолютной величине (стано- (становится менее отрицательной) с приближе- приближением к равновесию; в момент достиже- достижения равновесия она равна нулю, и это свидетельствует о том, что за счет дан- данной реакции больше уже не может быть произведено никакой работы. Значения AG и AG0' для реакции А + + В -> С + D связаны уравнением в котором величины, выделенные красным, характеризуют истинное со- состояние данной системы. Рассмотрим простой пример. Примем. что реакция А + В -> С + D протекает при стандартной температуре B5°С) и стан- стандартном давлении A атм), но что ис- исходные концентрации компонентов А, В. С и D не равны между собой и ни для одного из компонентов не равны стан- стандартному значению 1,0 М. Чтобы опре- определить истинное изменение свободной энергии AG для случая, когда равновесие устанавливается при этих нестандартных исходных концентрациях, достаточно просто подставить в приведенное выше уравнение истинные исходные концен- концентрации компонентов А, В. С и D; вели- величины R, Ти AG0' сохранят при этом,разу- меется, свое обычное значение. Решение этого уравнения дает величину AG. т.е. изменение свободной энергии данной ре- реакции для тех концентраций компонен- компонентов, при которых эта реакция фактически протекает. Величина AG будет отрица- отрицательной и будет уменьшаться во вре- времени, поскольку концентрации А и В по мере протекания реакции будут снижать- снижаться, а концентрации С и D возрастать. Итак, величина AG реально протекаю- протекающей химической реакции всегда имеет от- отрицательное значение и всегда стремится к нулю, тогда как AG0' есть величина постоянная. Важно помнить, что величины AG0' и AG указывают лишь максимальное ко- количество свободной энергии, которое теоретически способна дать рассматри- рассматриваемая реакция. Это количество энергии может быть использовано только в том случае, если в наличии имеется какой-ни- какой-нибудь высокоэффективный механизм, спо- способный уловить эту энергию и направить ее на выполнение полезной работы. Если же такого механизма нет, то при по- постоянной температуре и постоянном да- давлении никакая работа за счет данной ре- реакции не может быть выполнена. 2,3O3RTlg [А] [В]
ГЛ. 14. АТР-ЦИКЛ И БИОЭНЕРГЕТИКА КЛЕТКИ 413 14.6. Изменения стандартной свободной энергии химических реакций аддитивны Рассмотрим две последовательно про- протекающие химические реакции: А - В AG?', В -> С AG5'. Каждая из этих реакций характеризуется определенной константой равновесия и определенным изменением стандарт- стандартной свободной энергии, AG?' и AG°'. По- Поскольку эти две химические реакции про- протекают последовательно одна за другой, мы можем исключить компонент В и за- записать суммарную реакцию в виде А-С. Суммарная реакция также имеет свою константу равновесия, и, следовательно, для нее можно рассчитать изменение стандартной свободной энергии AG°'. Это подводит нас к очень важному свой- свойству изменений стандартной свободной энергии. Оказывается, величины AG0' по- последовательно протекающих химических реакций аддитивны. Изменение стандарт- стандартной свободной энергии суммарной реак- реакции А -> С, которое мы обозначили через AG?', равно алгебраической сумме изме- изменений стандартной свободной энергии двух ее отдельных стадий, т.е. величин AG?' и AG5'. AG?' = AG?' + AG°2'. Это соотношение крайне важно, посколь- поскольку оно дает возможность легко вычис- вычислять изменения стандартной свободной энергии для различных последовательно- последовательностей метаболических реакций. Например, при расщеплении гликогена в мышцах (о котором будет идти речь в следующей главе) протекают две последовательные реакции: Г люкозо-1 -фосфат I AG°'- - 1,74 ккал'моль Фосфоглюкомутаза J, Глюкозо-6 -фосфат Глюкозофосфат- ДС0' = + 0,40 ккал/моль изомераза J, Фруктозо-6-фосфат Уравнение суммарной реакции имеет вид Глюкозо-1-фосфат -» -» Фруктозо-6-фосфат. Изменение стандартной свободной энер- энергии этой реакции можно определить как алгебраическую сумму величин AG0' по- последовательных стадий: AG?' = - 1,74 + ( + 0,40) = = — 1,34 ккал/молъ. Часто оказывается возможным вычис- вычислить изменение стандартной свободной энергии AG0' для какой-либо реакции да- даже в том случае, когда константа истин- истинного равновесия этой реакции нам не из- известна. Это можно сделать, если удастся связать исследуемую реакцию с какой- нибудь другой реакцией (для которой из- известна величина AG0') и определить кон- константу равновесия суммарной реакции 14.7. АТР- главный химический посредник клетки, связывающий между собой процессы идущие с выделением и с потреблением энергии Теперь, познакомившись с некоторы- некоторыми основными законами, которые регу- регулируют обмен энергии в химических си- системах, мы можем обратиться к рассмо- рассмотрению энергетического цикла в клетках. Для гетеротрофных клеток источником свободной энергии, получаемой в хими- химической форме, служит процесс расщепле- расщепления, или катаболизм, пищевых молекул (в основном углеводов и жиров). Эту энергию клетки используют в следую- следующих целях: 1) для синтеза биомолекул из молекул-предшественников небольшого размера; 2) для выполнения механиче- механической работы, например мышечного со- сокращения, 3) для переноса веществ через мембраны против градиента концентра- концентрации и 4) для обеспечения точной передачи информации. Главным связующим зве- звеном между клеточными реакциями, иду- идущими с выделением и с потреблением энергии, служит аденозинтрифосфат (АТР; рис. 14-2). При расщеплении высо- высокоэнергетического клеточного топлива часть содержащейся в этом топливе сво-
414 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Обозначения трех |^осфатныч групп ¦О—Р—)— Р—О—P-i-O—СН Пысокоэнергетическая конисраа фосф пая ,_ группа NH, D-pn6oja ADP Рис. 14-2. А. Структуры АТР, ADP и AMP. Фосфатные группы АТР обозначают гречески- греческими буквами а (альфа), C (бета) и у (гамма). Концевая фосфатная группа АТР может пере- переноситься с помощью ферментов на различные акцепторы фосфата. При рН 7 фосфатные группы полностью ионизованы. Б. Пространст- Пространственная модель молекулы АТР бодной энергии улавливается, в том смы- смысле что она используется для синтеза АТР из аденозиндифосфата (A DP) и не- неорганического фосфата (Р,)-процесса, требующего затраты свободной энергии. Позже АТР, распадаясь на ADP и фосфат (рис. 14-3), отдает значительное количе- количество своей химической энергии тем про- процессам, для которых энергия необходи- Рис. 14-3. АТР-цикл в клетках. ма. Таким образом, АТР выступает в роли переносчика химической энергии, связывающего клеточные процессы, со- сопровождающиеся выделением энергии, с теми главными видами клеточной ак- активности, в которых энергия потребляет- потребляется. АТР поставляет энергию и для таких процессов жизнедеятельности, как люми- люминесценция, которая у светляков служит сигналом для привлечения особей проти- противоположного пола. Впервые АТР был обнаружен в экстрактах скелетных мышц Карлом Ломаном в Германии, и почти одновре- одновременно в 1929 г. два американских иссле- исследователя - Сайрус Фиске и Йеллапрагада Суббароу - выделили это соединение. Сначала думали, что АТР играет важную роль только в процессах мышечного со- сокращения; однако затем выяснилось, что он присутствует в клетках всех типов- животных, растительных и бакте- бактериальных. Обнаружилось также, что АТР принимает участие в клеточных процес- процессах самого разного типа. В 1941 г. Фриц Липман, убедившись в универсальном значении всех этих наблюдений, выдви- выдвинул обобщающую концепцию, согласно которой АТР в клетках играет роль глав- главного и универсального переносчика хи- химической энергии. Он первым высказал предположение о существовании в клет- клетках АТР-цикла (рис. 14.3). D.8. Химические свойства АТР хорошо известны Аденозинтрифосфат (АТР) и продукты последовательных стадий его гидролиза, СО2 АТР Окисление клеточного топлива, сопровождающееся выделением энергии О2' ADP Биосинтез (химическая работа) Активный транспорт (осмотическая работа) Мышечное сокращение (механическая работа)
ГЛ. 14. АТР-ЦИКЛ И БИОЭНЕРГЕТИКА КЛЕТКИ 415 аденозинОифосфат (ADP) и аденозинмо- нофосфат (AMP), принадлежат к классу нуклеотидов (рис. 14-2). Напомним (гл. 3), что молекулы нуклеотидов со- состоят из гетероциклического основания (пурина или пиримидина), пятиуглерод- ного сахара и одной или нескольких фос- фосфатных групп. В молекулах ATP, ADP и AMP роль основания играет аденин (пу- (пурин), а пятиуглеродный сахар предста- представлен D-рибозой (рис. 14-2). Различные виды нуклеотидов, которых известно до- довольно много, отличаются друг от друга природой входящих в их состав азо- азотистых оснований и Сахаров. Нуклео- тиды выполняют в клетке самые разно- разнообразные функции, но более всего они известны как строительные блоки моле- молекул ДНК и РНК, в которых они служат кодирующими элементами. ATP. ADP и AMP (рис. 14-2) обнаружены у всех живых форм, и везде они выполняют од- одни и те же универсальные функции. Эти соединения присутствуют не только в ци- тозоле, но и в митохондриях, и в клеточ- клеточном ядре. В нормально дышащих клет- клетках на долю АТР приходится до 80% и даже более общего количества всех трех адениновых нуклеотидов (табл. 14-4). При рН 7,0 АТР и ADP существуют в виде анионов, несущих несколько заря- зарядов, АТР4 ~ и ADP3 ~, поскольку все их фосфатные группы при этом значении рН почти полностью ионизованы. Однако во внутриклеточной жидкости, для которой характерно высокое содержание ионов Mg2 +, АТР и ADP, присутствуют главным образом в виде комплексов с магнием, MgATP2"~ и MgADP ~ (рис. 14-4). Во многих ферментативных реакциях, в которых АТР участвует в ка- качестве донора фосфатной группы, актив- активной формой АТР является именно его комплекс с магнием, MgATP2 ~ . Концен- Концентрация АТР в клетках поддерживается на относительно постоянном- уровне, по- поскольку скорость его образования при- приблизительно уравновешивается ско- скоростью его распада. Таким образом, концевые фосфатные группы молекул АТР претерпевают непрерывное обно- обновление в процессе метаболизма. Они по- Таб.чш/а 14-4. Концентрация адениновых нуклеотидов. неорганического фосфата и креатинфосфата (КФ) в некоторых клетках, мМ" АТР ADP AMP Р; КФ 3,38 1,32 0,29 4,8 0 Печень крысы Мышцы крысы 8,05 0.93 0,04 8,05 28 Эритроциты человека 2,25 0,25 0,02 1,65 0 Мозг крысы 2,59 0.73 0,06 2,72 4,7 E.coli 7,90 1,04 0,82 7,9 0 11 Для эритроцитов указаны концентрации в цитозоле, поскольку в эритроцитах нет ни ядра, ни митохондрий. Во всех других случаях имеется в виду обшее содержание в клетке, хотя мы знаем, что, например, концентрации ADP в цитозоле и в митохондриях различаются очень сильно. О креатинфосфате (фосфокреатине) мы будем говорить позже в этой же главе. Mg2 Аденин Ь- о- "О—Р—О—Р—О—Р—О— Рибоза II II II О О О MgATP2" Mg2+ Аденин О'" V I I "О—Р—О—Р—О— Рибоза II II О О MgADP- Рис. 14-4. Комплексы АТР и ADP с ионами Mg2+. стоянно отщепляются и замещаются новыми за счет клеточного пула неорга- неорганического фосфата. АТР удалось синтезировать в лабора- лаборатории. Его структура и свойства были подробно изучены. Мы знаем также, что он служит связующим звеном между ре- реакциями, идущими с выделением и с по- потреблением энергии. Эта его роль осно- основана на известных химических принци-
416 ЧАСТЬ II БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ пах, к рассмотрению которых мы теперь и перейдем. 14.9. Характерное значение, стандартной свободной энергии АТР При гидролизе АТР, в результате кото- которого АТР теряет концевую фосфатную группу, превращаясь в ADP и неоргани- неорганический фосфат АТР + Н2О - ADP + Р,, изменение стандартной свободной шер- гии (табл. 14-3) составляет — 7,3 ккал /моль. Определены также изменения стан- стандартной свободной энергии для гидроли- гидролиза ряда других фосфорилированных со- соединений (табл. 14-5). Гидролиз неко- некоторых из этих соединений в стандартных условиях приводит к освобождению не- несколько большего количества свободной энергии, чем гидролиз АТР, а других — меньшего. Например, величина AG0' для ферментативной реакции Глюкозо-6-фосфат + Н2О -» Глюкоэо-6-фосфатаза -. Глюкоза + Фосфат равна — 3,3 ккал, моль, т. е. эта реакция приводит к освобождению значительно меньшего количества свободной энергии, чем гидролиз АТР (AG0' = Таблица 14-5. Стандартная свободная энергия гидролиза некоторых фосфорилированных соединений ДС°, ккал 'моль Фосфоенолпируват — 14,8 3-фосфоглицероилфосфат (-» 3-фосфоглицерат + Р,) — 11,8 Креатинфосфат — 10,3 ADP (->АМР + Р() -7,3 АТР (-ADP+P,) -7,3 А МР (-»Аденозин + Pf) - 3,4 Глюкозо-1-фосфат —5,0 Фруктозо-6-фосфат — 3,8 Глюкозо-6-фосфат . — 3,3 Глицерол-1-фосфат — 2,2 = — 7,3 ккал/моль). Поскольку в ранних исследованиях было установлено, что при гидролизе АТР высвобождается го- гораздо большее количество свободной энергии, чем при гидролизе глюкозо-6- фосфата и ряда других эфиров фосфор- фосфорной кислоты, АТР стали называть высо- высокоэнергетическим фосфорилированным соединением, а глюкозо-6-фосфат -низ- -низкоэнергетическим. Позже выяснилось, что в клетках присутствуют также и некоторые другие фосфорилированные соединения, в частности фосфоенолпи- фосфоенолпируват и 3-фосфоглицероилфосфат (табл. 14-5). гидролиз которых характеризует- характеризуется гораздо более высокой стандартной свободной энергией, чем гидролиз АТР. Их тоже называют высокоэнергети- высокоэнергетическими фосфорилированными соедине- соединениями. Однако эти названия- «высоко- шергетические» и «низкоэнергетичес- «низкоэнергетические»-заслоняют от нас тот факт, что мы имеем дело в сущности с тремя классами фосфорилированных соедине- соединений. Такие соединения, как фосфоенол- фосфоенолпируват и 3-фосфоглицероилфосфат, со значительно большей стандартной сво- свободной энергией гидролиза, чем у АТР, можно было бы назвать сверхвысоко- энергетическими соединениями. Мы ско- скоро убедимся в том, что промежуточ- промежуточное значение AG0' гидролиза АТР очень важно для его биологической функции. Из табл. 14-5 видно, что значения AGU' для гидролиза ADP до AMP и фосфата и для реакции отщепления концевой фосфатной группы АТР одинаковы ( — 7,3 ккал/моль). Таким образом, обе концевые фосфатные группы АТР (Р- и у-) являются высокоэнергетическими. (В то же время величина AG0' гидролиза AMP до аденозина и фосфата намного ниже; она составляет всего - 3,4 ккал/моль, т.е. AMP принадлежит к низкоэнергети- низкоэнергетическим соединениям.) Позже мы увидим (разд. 14.17), что при участии особого фермента эти фосфатные группы могут использоваться в клетке в реакциях, со- сопровождающихся потреблением энергии.
ГЛ. 14. АТР-ЦИКЛ И БИОЭНЕРГЕТИКА КЛЕТКИ 417 14.10. Почему стандартная свободная энергия гидролиза АТР относительно велика? Какими структурными особенностями молекулы АТР следует объяснить тот факт, что при гидролитическом отщепле- отщеплении его концевой фосфатной группы вы- выделяется гораздо больше свободной энергии, чем, например, при гидролизе глюкозо-6-фосфата? Для того чтобы от- ответить на этот вопрос, требуется учесть свойства не только субстрата, но и про- продуктов реакции, потому что изменение стандартной свободной энергии есть раз- разность между свободной энергией ис- исходных веществ и свободной энергией продуктов реакции. Величина стандарт- стандартной свободной энергии гидролиза АТР определяется тремя главными струк- структурными факторами. Первый из них-это степень диссоциации самого АТР и про- продуктов его гидролиза. При рН 7,0 АТР почти полностью ионизован, т.е. суще- существует в виде аниона АТР4 . В результа- результате гидролиза АТР образуются не один, а три продукта: ADP3", НРО|~ и Н+. Суммарное уравнение гидролиза АТР имеет следующий вид: АТР4" + Н2О - ADP3" + В качестве стандартного состояния при- принято такое состояние системы, при кото- котором концентрации АТР4", ADP3 " и НРО2." равны 1,0 М. Однако концентра- концентрация водородных ионов при рН 7,0 (стандартное значение рН для расчетов AG0') составляет всего лишь 10 " 7 М. Та- Таким образом, концентрация водородных ионов очень мала по сравнению со стан- стандартными концентрациями всех других компонентов A,0 М), и, следовательно, по закону действующих масс, при рН 7,0 равновесие реакции гидролиза АТР дол- должно быть очень сильно сдвинуто вправо. В отличие от этого гидролиз глюкозо-6- фосфата при рН 7,0 не ведет к образова- образованию сколько-нибудь заметных количеств ионов Н + : Глюкозо-6-фосфат2" + Н2О -» -> Глюкоза + НРО2.". Вторая причина, обусловливающая от- относительно большую величину AG0' ги- гидролиза АТР, заключается в том, что при рН 7,0 молекулы АТР несут четыре отри- отрицательных заряда, располагающихся до- довольно близко друг от друга, вследствие чего между ними существует сильное от- отталкивание (рис. 14-2). Когда при гидро- гидролизе концевая фосфатная связь разры- разрывается, электростатическое напряжение внутри молекул АТР снимается за счет пространственного разъединения отри- отрицательно заряженных продуктов гидро- гидролиза ADP3 " и НРО^". Эти продукты не- несут заряды одного знака и не стремятся поэтому воссоединиться друг с другом и вновь образовать молекулу АТР. Иначе обстоит дело, когда гидролизу подвер- подвергается глюкозо-6-фосфат. Один из про- продуктов его гидролиза, глюкоза, вообще не несет заряда. Между глюкозой и дру- другим продуктом гидролиза, ионом НРО|~, не возникает поэтому сил оттал- отталкивания, и их стремление к рекомбина- рекомбинации оказывается в этом случае более сильным. Наконец, третья важная причина боль- большой отрицательной величины AG0' ги- гидролиза АТР связана с тем обстоятель- обстоятельством, что два продукта реакции, а именно ADP3 ~ и НРО? предста- представляют собой резонансные гибриды, т.е. такие структурные формы, для которых характерна повышенная устойчивость, поскольку часть их электронов находится в конфигурациях, обладающих значи- значительно меньшей энергией, по сравнению с той, которой они обладали в конфигу- конфигурациях, характерных для молекул АТР. Поэтому, когда АТР подвергается гидро- гидролизу, электроны в продуктах реакции A DP3" и HPOj" могут переходить на более низкие энергетические уровни, чем в негидролизованной молекуле АТР. Вследствие этого отделение друг от дру- друга анионов ADP3 ~ и НРО|~ приводит к уменьшению запаса свободной энергии по сравнению с тем, которым они обла- обладали, когда были объединены в виде аниона АТР4". Про высокоэнергетические фосфори- лированные соединения, т. е. про соедине- соединения, гидролиз которых сопровождается
418 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ значительным уменьшением стандарт- стандартной свободной энергии, часто говорят, что они содержат «высокоэнергетиче- «высокоэнергетическую фосфатную связь» (в структурных формулах ее обозначают символом ~ ;. Хотя это выражение давно используется биохимиками, его нельзя признать удачным. Оно может быть неверно ис- истолковано в том смысле, что энергия за- заключит в самой связи. В действительно- действительности это не так. Известно, что сам по себе разрыв химической связи требует за- затраты энергии. Свободная энергия, выс- высвобождающаяся при гидролизе эфиров фосфорной кислоты, обязана своим про- происхождением не разрыву специфической фосфатной связи, а тому, что продукты гидролиза содержат меньше свободной тергии, чем исходные вещества. Что же касается названия «высоко энергетиче- энергетические фосфорилированные соединения», то применительно к АТР и другим фос- форилированным соединениям, характе- характеризующимся высоким значением AG0' гидролиза, оно вполне уместно. Нам остается отметать еще одно очень важное обстоятельство, имеющее отно- отношение к изменениям свободной энергии при биохимических реакциях. Хотя при стандартных условиях величина АС" ги- гидролиза АТР равна - 7,3 ккал/моль, ис- истинное изменение свободной энергии ги- гидролиза АТР в интактных клетках суще- существенно отличается or этой величины. Объясняется эго гем, что концентрации АТР, ADP и Р, в живых клетках, во- первых, неодинаковы и, во-вгорых, на- намного ниже стандартных концентраций 1,0 М. Расчетным путем можно опреде- определить истинное изменение свободной энергии гидролиза АТР при концентра- концентрациях, отличающихся от стандартных. В дополнении 14-2 в качестве примера приведен расчет величины AG гидролиза АТР в интактных эритроцитах, исходя из 1анных табл. 14-4. Оказывается, эта ве- величина, обозначаемая через AGp, значи- значительно превышает AG0'; для большин- большинства клеток она колеблется в пределах от — 12 до — 16 ккал/моль. Величину AGp часто называют потенциалом фосфори- лирования; мы еще будем говорить о ней позже. 14.11. АТР служит общим промежуточным продуктом в реакциях переноса фосфатных групп Мы видели выше, что в термодинами- термодинамической шкале фосфорилированных со- соединений АТР занимает промежуточное положение, т.е. характеризуется средней величиной AG0'. Именно эта особенность АТР наряду с другими его свойствами позволяет ему служить промежуточным переносчиком фосфатных групп от сверхвысоко-энергетических соединений, т. е. от таких, которые при гидролизе вы- выделяют больше свободной энергии, чем АТР, к акцепторам фосфата, фосфорили- фосфорилированные производные которых характе- характеризуются низким значением AG0' и пото- потому при гидролизе в стандартных усло- условиях выделяют меньше свободной энер- 1ни, чем АТР. Как же именно осуществляет АТР эту свою роль посредника? Мы уже знаем, что метаболические превращения вклю- включают цепь последовательных фермента- ферментативных реакций, связанных общими про- промежуточными продуктами (разд. 13.3); Дополнение 14-2. Свободная энергия гидролиза АТР в интактных клетках Стандартная свободная энергия гидролиза АТР равна — 7,3 ккал/моль. Однако в клетке концентрации АТР, ADP и фосфата не только не равны между собой, но и намного ниже принятого для них стандартного значения 1 М (табл. 14-4). Кроме того, значение рН кле- клеточного содержимого тоже может в какой-то мере отличаться от стан- стандартного значения G,0). Поэтому истинная свободная энергия гидро- гидролиза АТР в условиях, существующих внутри клетки, A(JP, не совпадает
ГЛ. 14. АТР-ЦИКЛ И БИОЭНЕРГЕТИКА КЛЕТКИ 419 со стандартной свободной энергией AG0'. Истинное изменение свобод- свободной энергии при гидролизе АТР в клетке (AGp) нетрудно вычислить. В табл. 14-4 указаны концентрации АТР, ADP и Р,- для эритроцитов че- человека: 2,25,0,25 и 1,65 мМ соответственно. Примем для простоты, что рН и температура имеют стандартные значения (рН 7,0; температура 25°С). Истинная свободная энергия AG гидролиза АТР в эритроцитах определяется в этих условиях из уравнения AG = AG°' + 2,303 R Tig Подставляя в это уравнение соответствующие значения, получаем = - 7300 + 1360 lg 1,83 -10 " 4 = - 7300 + 1360( - 3,74) = = - 7300 - 5100 = - 12 400 кал/моль = - 12,4 ккал/моль. Мы видим, таким образом, что истинное изменение свободной энергии при гидролизе АТР в интактных эритроцитах (—12,4 ккал'моль) значительно превышает изменение стандартной свободной энергии ( — 7,3 ккал/моль). Еще одним доказательством этого служит тот факт, что при синтезе АТР из ADP и фосфата в эритроцитах изменение сво- свободной энергии равно + 12,4 ккал/моль. Поскольку концентрации АТР, ADP и Р,- в клетках разных типов раз- различны (табл. 14-4), эти клетки отличаются друг от друга также и по ве- величине AGP гидролиза АТР. Более того, величина AGp может меняться во времени в зависимости от метаболизма клетки, определяющего в ней концентрации АТР, ADP и фосфата, а также рН клеточного со- содержимого в каждый данный момент. Мы можем вычислить истинное изменение свободной энергии для любой метаболической реакции, протекающей в клетке, если нам известны концентрации всех исходных веществ и продуктов данной реакции, а также другие параметры (тем- (температура, рН или концентрация ионов Mg2 + ). от которых зависит кон- константа равновесия, а следовательно, и величина 0 в такой последовательности продукт ка- шем примере с двумя реакциями проме- ждой предыдущей реакции служит суб- жуточный продукт D может служить стратом для следующей. Например две переносчиком энергии от первой реакции реакции ко второй. АТР в клетке функционирует как об- А + В * С + D Щий промежуточный продукт, перенося- переносящий энергию и связывающий реакции, D + Е * F + G сопровождающиеся выделением свобод- свободной энергии, с теми, в которых потре- связаны общим промежуточным продук- бляется свободная энергия. В процессе том D. При постоянной температуре катаболизма за счет энергии, высвобо- и постоянном давлении химическая энер- ждающейся при распаде органических гия может передаваться от одной хими- питательных веществ клетки, образуются ческой реакции к другой только в том фосфорилированные соединения. При случае, если эти две реакции связаны об- участии специфичного фермента из щим промежуточным продуктом. В на- группы киназ фосфатная группа от тако-
420 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ го сверх высокоэнергетического фосфори- Глюкоза лированного соединения (обозначим его через X — ®) переносится на ADP, в ре- результате чего образуется АТР. На вто- втором этапе другая специфичная киназа переносит концевую фосфатную группу АТР на молекулу, выполняющую функ- функцию акцептора фосфата (обозначим ее через Y), повышая тем самым ее энергию. В результате образуются молекулы Y-® и ADP. Запишем обе реакции: X—(Р) + ADP * X + ( ШШ + Y > ADP + Y—( Промежуточные продукты (сверхвысоко энергетические соединения) АТР АТГ Л акт. it В итоге этих двух реакций, сопряженных через общий промежуточный продукт, АТР, химическая энергия передается от X — (?) к Y посредством переноса фосфат- фосфатной группы. В таких реакциях переноса фосфатных групп почти всегда посредни- посредником является АТР, поскольку клетки обычно не содержат киназ, способных осуществлять перенос фосфатных групп непосредственно от сверхвысокоэнерге- тических фосфорилированных соедине- соединений к низкоэнергетическим акцепторам. 14.12. При расщеплении глюкозы до лактата образуются два сверхвысокоэнергетических фосфорилированных соединения В качестве доноров фосфатных групп для ADP важную роль играют два соеди- соединения: 3-фосфоглицероилфосфат и фос- фоенолпируват (табл. 14-5). Оба эти со- соединения образуются в процессе расще- расщепления глюкозы до лактата (рис. 14-5). сопровождающемся выделением энер- энергии. Об этом процессе, который назы- называют гликолизом, мы будем говорить подробно в следующей главе. Значитель- Значительная часть свободной энергии, высвобо- высвобождающейся при расщеплении глюкозы до лактата, запасается в результате об- образования 3-фосфоглицероилфосфата и фосфоенолпирувата. В клетке эти высо- высокоэнергетические фосфорилированные соединения не подвергаются гидролизу; вместо этого их фосфатные группы-при участии специфичных киназ - переносят- Рис. 14-5. Два вида сверхвысокоэнергетических фосфорилированных соединений, образующих- образующихся в качестве промежуточных продуктов прн растеплении глюкозы до лактата (которое со- сопровождается выделением энергии). Оба эти соединения способны передавать свою фосфат- фосфатную группу на ADP, в результате чего образу- образуется АТР. ся на ADP, в результате чего образуется АТР. Для 3-фосфоглицероилфосфата (рис. 14-6) такая реакция переноса фос- фосфатной группы, катализируемая фосфо- глицераткиназой, может быть записана в следующем виде: 3-фосфоглицероилфосфат + ADP ^ ^± АТР + 3-фосфоглицерат. На ADP переносится при этом только одна из двух фосфатных групп фосфогли- цероилфосфата, а именно та, которая связана с углеродом карбоксильной группы. (Отщепление второй фосфатной группы, при С-3, характеризуется неболь- небольшой величиной ДС0'.) Рассматриваемая киназная реакция обратима, однако при стандартных условиях ее равновесие сильно сдвинуто вправо, поскольку ДС0' гидролиза 3-фосфоглицероилфосфата (—11.8 ккал/моль) больше, чем AG0' ги- гидролиза АТР (— 7,3 ккал/моль). Фосфоенолпируват-второе высоко- энергетическое фосфорилированное со- соединение, образующееся при расщепле- расщеплении глюкозы до лактата,-также отдает свою фосфатную группу молекуле ADP в аналогичной реакции (рис. 14-7), ката- катализируемой пируваткиназой.
ГЛ. 14. АТР-ЦИКЛ И БИОЭНЕРГЕТИКА КЛЕТКИ 421 11изкоэнергетическая группа Высоко энергетическая группа I J 12 1 "о—р—о—сн2—с—с- 3-фосфоглицероилфосфат Фосфогяицераткиназа о- "О—Р—О—СН2—С—С—СГ он о АТР4- Фосфоенолпируват + + ADP -> Пируват + АТР. Равновесие этой реакции при стан- стандартных условиях также сдвинуто впра- вправо, поскольку AG0' гидролиза фосфо- Фосфоенол- пируват j* Пируваткиназа о- СНз—С—С ч Пируват О О АТР4- Рис. 14-7. Перенос фосфатной группы от фос- фоенолпирувага на ADP. 3-фосфоглицерат Рис. 14-6. Перенос фосфатной группы от 3- фосфоглицероилфосфата на ADP. енолпирувата (—14,8 ккал;моль) более чем вдвое превышает AG0' гидролиза АТР. В клетке эта реакция необратима. Таким образом, и фосфоенолпируват, и 3-фосфоглицероилфосфат, т.е. оба со- соединения, заключающие в себе значи- значительную часть химической энергии, выс- высвобождающейся при анаэробном расще- расщеплении глюкозы, могут передавать суще- существенную долю своей энергии молекулам ADP, что приводит к образованию АТР. 14.13. В результате переноса фосфатной группы от АТР на какую-нибудь акцепторную молекулу этой молекуле сообщается энергия АТР может теперь передавать свою фосфатную группу различным акцеп- акцепторным молекулам с образованием низ- низкоэнергетических фосфорилированных соединений, главным образом эфиров фосфорной кислоты (табл. 14-5). Эти ре- реакции также катализируются киназами. Гексокиниза, например, катализирует перенос фосфатной группы от АТР к D-глюкозе Mg2f АТР + D-глюкоза -» ADP + + Г>глюкозо-6-фосфат,
422 ЧАСТЬ II БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ a-D-глюкозо-б-фосфат СН ОН но—с—н о "О—Р—О- L- глицерол-3-фосфат Рис. 14-8. Два низкоэнер! етических фосфори- лированных соединения. Они представляют со- собой сложные эфиры - продукты присоединения остатка фосфорной кислоты к гидроксильной группе. а глицеролкиназа катализирует реакцию Mg2 АТР + Глицерол -> ADP + + Глицерол-3-фосфат. В обоих случаях одна из гидрок- сильных групп молекулы-акцептора фос- форилируется с образованием эфира фос- - 16 р Ф<> форнолмирув it - 14 Стандартная свободная энергия гидролиза, ккал/моль Сверхвысоко- эиергетичес- _ 12 - кие доноры фосфатных групп - 8 -6 -4 -2 0 форной кислоты (рис. 14-8). Поскольку значения ДС0' гидролиза глюкозо-6-фос- фата (ДО0' = — 3,3 ккал/моль) и глице- рол-3-фосфата (ДО0' = — 2,2 ккал/моль) меньше ДО0' гидролиза АТР, обе ука- указанные реакции при исходных концентра- концентрациях субстратов и реагентов 1,0 М проте- протекают слева направо в соответствии с приведенными выше уравнениями. Глюкозо-6-фосфат и глицерол-3-фос- фат содержат больше энергии, чем сво- свободные (нефосфорилированные) глюкоза и глицерол. Мы можем поэтому рассма- рассматривать их как «обогащенные энергией» (энергизованные) формы глюкозы и гли- церола. Они могут вовлекаться в другие ферментативные реакции, в которых они используются в качестве активиро- активированных строительных блоков для синтеза более крупных молекул. Глюкозо-6-фос- фат, например, играет роль активирован- активированного предшественника в процессе био- биосинтеза гликогена, а глицерол-3-фосфат используется как активированный строи- строительный блок при биосинтезе липидов. Таким образом, часть свободной энер- энергии, высвободившейся первоначально при расщеплении глюкозы до лактата и запасенной в форме 3-фосфоглицероил- фосфата и фосфоенолпирувата, может быть передана глицеролу, глюкозе и не- некоторым другим акцепторам фосфата; Рис 14-9. Перенос фосфатных групп от сверх- высокоэнергетических фосфорилированных соединений (доноров фосфата) через АТР к различным соединениям-акцепторам с обра- образованием низкоэнергетических фосфорилиро- фосфорилированных произвочных этих соединений. Этот перенос фосфатных групп, катализируемый ки- назами. сопровождается в конечном итоге в условиях клетки потерей свободной энер1ии. Креатинфосфат в мышечных и нервных клет- клетках служит резервным источником высокоэнер- гетических фосфатных групп. Креатинфосфат АТР 11ичкоон1*рготи- ггкш1 акцепторы фосфатных групп )-фогфат
ГЛ. 14. АТР-ЦИКЛ И БИОЭНЕРГЕТИКА КЛЕТКИ 423 АТР служит при этом промежуточным переносчиком химической энергии в фор- форме фосфатных групп. Протекающие в клетке фермента- ферментативные реакции переноса фосфатных групп представлены на рис. 14-9. Важная особенность этого переноса состоит в том, что почти все сверхвысокоэнерге- тические фосфорилированные соедине- соединения передают свои фосфатные группы низкоэнергетическим акцепторам фосфа- фосфата через АТР, так что передача совер- совершается в два этапа; оба эти этапа катали- катализируются специфичными киназами. 14.14. АТР используется для обеспечения энергией мышечного сокращения АТР не только обогащает энергией мо- молекулы-предшественники и тем самым подготавливает материал для биосинте- биосинтеза различных клеточных компонентов; он также поставляет химическую энер- энергию для двух главных форм выполняе- выполняемой клеткой работы: для механической работы, связанной с мышечным сокра- сокращением, и для осмотической работы, обеспечивающей транспорт веществ про- против градиента концентрации. Сократительная система скелетных мышц включает нити двух типов (рис. 14-10). Толстые нити состоят из пучков, образованных параллельно рас- расположенными палочковидными молеку- молекулами миозина, а тонкие состоят из двух закрученных одна вокруг другой нитей фибриллярного актина (F-актина). F-ак- тин в свою очередь состоит из молекул глобулярного актина (G-актина), соеди- соединенных наподобие нитки бус. В миофи- бриллах толстые и тонкие нити распола- располагаются упорядоченным образом; в сарко- мерах (так называются повторяющиеся участки миофибрилл) они расположены параллельно и в большей или меньшей мере перекрываются. При мышечном со- сокращении толстые нити каждого сарко- мера вдвигаются в промежутки между тонкими нитями, благодаря чему все мы- мышечное волокно в целом укорачивается. Химическую энергию для такого сколь- скольжения нитей поставляет процесс гидро- гидролиза АТР до ADP и фосфата. На рис. 14-10 видно, что у каждой миозино- вой молекулы толстой нити имеется го- головка. Эти головки миозиновых молекул, равномерно распределенные вдоль толстых нитей, представляют собой не что иное, как ферменты. Многократно приходя в контакт с тонкими нитями, они вызывают гидролиз АТР, в результате чего благодаря скользящему усилию толстые нити смещаются вдоль тонких к концам саркомера. Гидролиз АТР со- сопровождается, как полагают, изменением формы, или конформации головки мио- зиновой молекулы, что и приводит к воз- возникновению механической силы. Таким способом миозин и актин, а также другие специализированные белки сократитель- сократительной системы переводят химическую энер- энергию АТР в механическую энергию мы- мышечного сокращения. Сокращение и расслабление скелетных мышц регулируется концентрацией Са2 + в цитозоле. В состоянии покоя концен- концентрация Са2 + в мышце обычно очень низ- низка. При стимуляции мышечного волокна импульсами двигательного нерва Са2 + высвобождается из поперечных мем- мембранных трубочек мышечной клетки. Этот высвободившийся Са2 + связывает- связывается со сложным регуляторным белком тропонином, молекулы которого присое- присоединены через определенные промежутки к тонким нитям. Молекулы тропонина играют роль триггера, т. е. пускового ме- механизма. Они претерпевают конформа- ционное изменение, которое оказывает влияние на миозиновые головки в толстых нитях. В них возбуждается АТРазная активность и таким образом инициируется сокращение. Тропонин остается активным до тех пор, пока в ци- цитозоле мышечного волокна присутствует Са2 +. Расслабление мышцы происходит после того, как нервные импульсы пере- перестают к ней поступать и Са2 + за счет действия находящейся в мембране АТРазы, выполняющей роль кальциево- кальциевого насоса, переносится из саркоплазмы в цистерны саркоплазматического рети- кулума. Таким образом, АТР необходим не только для сокращения мышц, но и для их расслабления. Позже мы уви-
424 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Рис 14-10. Сократительная система скелетных мышц. А. Скелетная мышца состоит из пучков параллельных мышечных волокон Эти волок на представляют собой очень длинные много- многоядерные клетки. Б. В каждом мыше ном волок- волокне содержится множество мнофибрилл пучков параллельно расположенных нитей Миофиб- риллы разделены особыми темными участками (Z-линиями) на саркомеры В. Каждый сарко- мер состоит из правильно расположенных толстых и тонких нитей Толстые нити могут скользить вдоль тонких. Г Толстые нити сла- слагаются из пучков длинных палочковидных мо лекул белка миозина Каждая молекула миози- миозина состоит из двух а-спиральных полипептид- полипептидных цепей, закрученных одна вокруг другой. Один из концов полипептидной цепи (головка) имеет глобулярную структуру; это фермент, катализирующий гидролиз АТР до ADP и Р,. Д. Каждая тонкая нить состоит из двух цепей F-актина, закрученных одна вокруг другой в спираль Каждая такая цепь составлена из гло- глобулярных молекул G-актина, соединенных друг с другом наподобие ниткн бус Е. Глобуляр- Глобулярные миозиновые головки выступают из толс- толстых нитей. Предполагается, что в присутствии АТР эти миозиновые головки действуют как рычаги Прикрепляясь к тонким нитям и при- притягивая их к центру саркомера, они укорачива- ю саркомеры, в результате чего миофибриллы сокращаются. Одновременно миозиновые го- головки осуществляют гидро шз АТР до ADP и Р Этот процесс мышечного сокращения регу- регулируется особым Са2 -связывающим белком, тропонином, молеку ы которого присоединены через равные промежутки к актиновым нитям. \1 )Л( кул 1 r|ioi[OiiHii;i
ГЛ 14. АТР-ЦИКЛ И БИОЭНЕРГЕТИКА КЛЕТКИ 425 Рис. 14-11. Благодаря хорошо скоординиро- скоординированной работе мошных скелетных мышц гепард способен на расстоянии в несколько сотен метров развивать скорость до 125 км/ч. дим, что и для переноса других ионов че- через мембрану также используется энер- энергия, высвобождающаяся при гидролизе АТР. Мышцы различаются по своей специа- специализации. Гладкие мышцы кишечника, на- например, сокращаются крайне медленно, тогда как для летательных мышц таких насекомых, как мухи или комары, харак- характерна чрезвычайно высокая частота со- сокращения и расслабления. Есть мышцы, способные «запираться» в состоянии со- сокращения. Таковы, например, запираю- запирающие мышцы, или мышцы-аддукторы дву- двустворчатых моллюсков, в частности устриц. Для сердечной мышцы характерны ритмические сокращения. Скелетные мышцы в свою очередь разделяются на ряд специализированных групп. Белая скелетная мышца принадлежит к «бы- «быстрым» мышцам, которые могут рабо- работать без кислорода, тогда как для работы красной скелетной мышцы, которая со- сокращается медленно, кислород необхо- необходим. У некоторых животных мышцы не- необычайно мощные и работают очень эффективно (рис. 14-11). Однако незави- независимо от специализации мышц молеку- молекулярными компонентами их сократи- сократительных элементов всегда являются ак- актин, миозин и тропонин; источником же энергии для мышечного сокращения всегда служит АТР. Движения другого типа (гл. 2) осуществляются с помощью ресничек и жгутиков, имеющихся у неко- некоторых эукариотических клеток (рис. 14-12). Расхождение хромосом при митозе, вызываемое сокращением нитей веретена, также совершается за счет энер- энергии АТР, обеспечивающей скручивание и скольжение микротрубочек относи- относительно друг друга. Система актин-миозин-тропонин представляет собой уникальный тип хи- химического двигателя, поскольку она осу- осуществляет непосредственное преобразо- преобразование химической энергии в механиче- механическую при постоянной температуре и постоянном давлении. Ни одна из со- созданных человеком машин к подобном} преобразованию энергии, насколько нам известно, не способна. В живых организ- организмах, следовательно, существует такой тип преобразования энергии, который инженерам пока еще осуществить не удалось. 14.15. Креатинфосфат в мышцах выполняет роль резервуара высокоэнергетических фосфатных групп Среди высокоэнергетических фосфори- лированных соединений имеется одно, играющее особую роль в энергетике воз- возбудимых тканей, таких, как мышечная и нервная. Это соединение, креатинфос- креатинфосфат, или фосфокреатин (рис. 14-13), слу- служит резервуаром высокоэнергетических фосфатных групп. ДС0' гидролиза креа- тинфосфата ( - 10,3 ккал/моль) несколь- несколько превышает ДС0' гидролиза АТР. Креа- Креатинфосфат может передавать свою фос-
426 ЧАСТЬ И. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Наружные (парные) трубочки Отросток Вторичное волокно Центральные микротрубочки Мембран:) А Рис. 14-12. В ресничках и жгутиках эукариоти- ческих клеток механическая сила развивается за счет использования АТР. А. Поперечный разрез реснички. Эти структуры состоят из де- девяти пар микротрубочек, образующих наружное кольцо, н двух одиночных центральных микро- микротрубочек (расположение по типу «9 + 2»; разд. 2.16). Реснички окружены оболочкой, представляющей собой вырост клеточной мем- мембраны. Энергию для характерных движений ресничек (волнообразного, скользящего или вращательного) поставляет гидролиз АТР. Эти движения осуществляются ресничками за счет скольжения илн скручнвання парных мнкро- трубочек, которое весьма напоминает наблю- наблюдаемое в скелетных мышцах АТР-зависимое скольжение толстых и тонких нитей друг от- относительно друга. От наружных (парных) мик- микротрубочек отходят находящиеся на равном расстоянии друг от друга отростки, или высту- выступы, напоминающие миозиновые головки в тол- толстых нитях мышц. Эти выступы состоят из мо- молекул динеина-довольно крупного белка, об- обладающего АТРазной активностью. Катализи- Катализируемый линейном гидролиз АТР поставляет энергию для механического движения-сколь- движения-скольжения или скручивания микротрубочек. Было высказано предположение, что центральные микротрубочки регулируют скорость движения ресничек. В. Отдельные фазы биения реснички в жабрах морского червя, у которого реснички имеют длину около 30 мкм. Эти характерные движения сообщает ресничкам АТР-зависимое скольжение трубчатых нитей друг относитель- относительно друга. фатную группу на ADP в реакции, катализируемой креатинкиназой: Креатинфосфат + + ADP ^ Креатин + АТР. Благодаря креатинфосфату концентра- концентрация АТР в мышечных клетках поддержи- поддерживается на постоянном и притом довольно высоком уровне. Особенно это суще- существенно для скелетных мышц, работаю- работающих с перерывами, но иногда очень на- напряженно с большой скоростью. Всякий раз, когда часть АТР мышечной клетки расходуется на сокращение, в результате гидролиза АТР образуется ADP. Креа- Креатинфосфат при участии креатинкиназы быстро передает свою фосфатную группу молекулам ADP, и нормальный уровень АТР восстанавливается. Содержание креатинфосфата в мышцах в 3-4 раза превышает содержание АТР (табл. 14-4); поэтому в форме креатинфосфата может н сн3 -N-C-N-CH.-C-O- Кроатиифогфат NHS О ADP 1 Крпятинкиназа Н Н—N—С—N—СН2—С—О Креатин L II NH, О АТР Рис. 14-13. Креатинфосфат в мышцах играет роль запасного донора высокоэнергетических фосфатных групп. Он действует как своеобраз- своеобразный буфер, обеспечивающий постоянство концентрации АТР.
ГЛ. 14. АТР-ЦИКЛ И БИОЭНЕРГЕТИКА КЛЕТКИ 427 храниться достаточное количество фос- фосфатных групп, полностью обеспечиваю- обеспечивающее поддержание постоянного уровня АТР в короткие периоды усиленной мы- мышечной активности. Благодаря обрати- обратимости креатинкиназной реакции нако- накопившийся креатин в период восстановле- восстановления вновь фосфорилируется за счет АТР до креатинфосфата. Поскольку другого метаболического пути для образования и расщепления креатинфосфата не суще- существует, это соединение хорошо приспосо- приспособлено для выполнения своей функции - резервуара фосфатных групп. В мышцах многих беспозвоночных роль носителя резервной формы энергии выполняет не креатинфосфат, а аргипии- фосфат. Соединения, служащие, подобно креатинфосфату и аргининфосфату, за- запасными источниками энергии, носят на- название фосфагенов. 14.16. АТР поставляет энергию также и для активного транспорта через мембраны Химическая энергия АТР используется также и для выполнения осмотической работы, т.е. работы, необходимой для переноса каких-либо ионов или молекул через мембрану из одного компартмента в другой, в котором их концентрация вы- выше. Мы можем рассчитать количество свободной энергии, необходимое для переноса 1 моль неионизованного рас- растворенного вещества через мембрану, на- например из окружающей среды в клетку, если нам известны концентрации раство- растворенного вещества в несвязанной форме в окружающей среде и в клетке (рис. 14-14). Для такого расчета восполь- воспользуемся общим уравнением ДС = 2,303/? Tig -^-, где С, - молярная концентрация данного растворенного вещества в окружающей среде, С2-его молярная концентрация в клетке, R — газовая постоянная и Т- аб- абсолютная температура. Пользуясь этим уравнением, можно определить количе- количество свободной энергии, необходимое для того, чтобы переместить 1 моль глю- глюкозы против стократного градиента кон- концентрации, например из среды с исход- исходной концентрацией глюкозы 1,0 мМ в компартмент, где ее конечная концен- концентрация составит 100 мМ. Подставляя в уравнение соответствующие значения, получаем AG = 2,30-1,98-298-lg 0,100 0,001 = 1360 ¦ 2.0 = 2720 кал/моль = = 2,72 ккал 'моль. \1<*мбр;ша При актином транспорте с н'боднан энергия систрмы возрастает Рис. 14-14. Активный транспорт раствореннш о вещества против градиента концентрации. На- Начиная с момента равновесия, т.е. с того мо- момента, когда концентрации данного растворен- Hoi о вещества в обоих компартментах одина- одинаковы, активный транспорт вещества из одного компартмента в другой обеспечивает его пере- перемещение против градиента концентрации. Для создания и поддержания градиента концентра- концентрации какого-либо растворенною вещества меж- между компартией гачи, находящимися по обе сто- стороны мембраны, требуется зат ра та свободной энергии. Если энергия почему-либо перестает поступать, то вещество нз компартмента с более высокой его концентрацией начинает диффундировать обратно, и чиффузия продол- продолжается до тех пор. пока снова не установится равновесие, т е пока концентрации вещества по обе стороны мембраны не сравняются
428 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Изменение свободной энергии выра- выражается в этом случае положительной ве- величиной, и это значит, что 2,72 ккал сво- свободной энергии, которые требуются для переноса 1 моля глюкозы (или любого нейтрального вещества) против стократ- стократного градиента концентрации, должны быть переданы системе за счет какой-то сопряженной реакции, способной слу- служить источником энергии. Градиенты концентрации между двумя сторонами клеточных мембран (транс- (трансмембранные градиенты) варьируют очень сильно. Пожалуй, максимальный градиент концентрации в организме под- поддерживается плазматической мембраной обкладочных клеток слизистой оболочки желудка, секретирующих соляную кисло- кислоту в желудочный сок. Концентрация НО в желудочном соке может достигать 0,1 М (рН 1,0), тогда как концентрация ионов Н + в клетках составляет прибли- приблизительно 10 ~ 7 М (рН 7,0). Это означает, что обкладочные клетки обладают спо- способностью секретировать ионы водорода даже против градиента порядка 106:1. По-видимому, эти клетки имеют какие- то очень активные мембранные «насосы» для секреции ионов водорода, так как для поддержания столь высокого градиента концентрации требуется значительное количество энергии. Перенос веществ че- через мембраны против градиента концен- концентрации называют активным транспор- транспортом. Образование желудочной НС1 сти- стимулируется особым, связанным с мембраной ферментом - так называе- называемой Н +-транспортирующей АТРазой. При образовании желудочного сока на каждую молекулу цитозольного АТР, ги- дролизованного до ADP и фосфата, из цитозоля наружу через плазматическую мембрану выводятся два иона Н+. Другим важным примером активного транспорта может служить перенос ио- ионов Na+ и К+ через плазматическую мембрану во всех животных клетках. Лучше всего изучен этот процесс в эри- эритроцитах. Установлено, что концентра- концентрация К+ в цитозоле эритроцитов дости- достигает примерно 110 мМ, тогда как в плазме крови она составляет всего 3 мМ. В то же время концентрация Na + в плазме крови достигает 140 мМ, а в эритроцитах она равна приблизительно 4 мМ. Для поддержания столь высоких трансмембранных градиентов требуется энергия АТР. В мембране эритроцита со- содержится специализированный фермент, получивший название Na+, К+-транспортирующей AT Разы, ко- который функционирует и как фермент, и как молекулярный насос. Эта АТРаза катализирует гидролитическое расще- расщепление АТР до ADP и фосфата, а высво- высвобождающуюся при этом свободную энергию использует для перекачивания ионов К + из окружающей среды внутрь клетки, а ионов Na+ из клетки в окру- окружающую среду (рис. 14-15). Стадией, на которой происходит передача энергии в этом процессе, является перенос конце- концевой фосфатной группы АТР на молекулу Na+, К+-АТРазы. На следующей стадии связанная с ферментом фосфатная груп- Плачматическая мемлрана Снаружи ШШ Пиутри ADP+P, Рис. 14-15. Схема, поясняющая действие Na+, К+-АТРазы. Для транспорта К+ в клетку (где его концентрация выше, чем в окружающей среде) и транспорта Na+ из клетки в окружаю- окружающую среду (где концен i рация этих ионов выше, чем в клетке) требуется свободная энергия. Источником ее служит гидролиз АТР. На каж- каждую молекулу АТР, гидролизованного до ADP и Р,, из клетки выхолят три иона Na+ и два иона К+ поступают в нее из окружающей сре- среды. Этот транспорт ионов включает два этапа. На первом этапе молекула АТРазы фосфо- рилируется под действием АТР. и это позволя- позволяет ей присоединить ион Na+. На втором этапе присоединяется ион К+, следствием чего ока- оказывается перенос Na+ и К+ через мембрану с отщеплением свободного фосфата, поступаю- поступающего в цитозоль. АТР и продукты его гидроли- гидролиза (ADP и Р() остаются в клетке.
ГЛ. 14. АТР-ЦИКЛ И БИОЭНЕРГЕТИКА КЛЕТКИ 429 па отщепляется и в виде неорганического фосфата переходит в цитозоль, обеспечи- обеспечивая энергией перенос Na+ и К+ через мембрану в противоположных направле- направлениях, но в обоих случаях против градиен- градиента концентрации. Продукты этого про- процесса, ADP и фосфат, вновь «заряжают- «заряжаются», т.е. образуют АТР, за счет энергии, выделяющейся при расщеплении глю- глюкозы. Na+, К+-АТРаза гидролизует АТР лишь в том случае, если в клетке имеются ионы Na+, а в окружающей среде-ионы К + . Молекула Na+, К+-АТРазы, состоя- состоящая из двух а- и двух C-субъединиц, на- насквозь пронизывает плазматическую мембрану. Во время переноса ионов она претерпевает конформационное измене- изменение. В почках, где ионы Na+ переходят в мочу, а ионы К+ должны удерживаться в крови, на активный перенос этих ионов расходуется почти две трети всего АТР, образующегося в процессе дыхания. В различных клеточных мембранах важ- важную роль играют АТРазы, транспорти- транспортирующие другие ионы (табл. 14-6). 14.17. АТР может расщепляться также до AMP и пирофосфата Хотя в клеточных реакциях исполь- используемый АТР расщепляется обычно до ADP и фосфата (Р(), а непосредственным акцептором фосфата в реакциях, сопро- сопровождающихся выделением энергии, слу- служит ADP, известны и такие клеточные ре- реакции, в которых от молекулы АТР отщепляются в виде одного фрагмента обе его концевые фосфатные группы. C и у (рис. 14-2); продуктами расщепления оказываются в этом случае неорганиче- неорганический пирофосфат (РР,) и аденозинмоно- фосфат (AMP). Примером такой реакции может служить ферментативная актива- активация жирных кислот с образованием их СоА-производных (рис. 18-2); жирная кислота приобретает при этом энергию и превращается в соответствующее СоА- производное (рис. 14-16), используемое затем в качестве активированного пред- предшественника при биосинтезе липидов; Таблица 14-6. Мембранные АТРазы, транспортирующие различные катионы Название фермента Тип клеток Локализация Функция Ja*, K + - Большинство животных Плазматическая мемб- АТРаза клеток рана 1 + -АТРаза Обкладочные клетки То же слизистой желудка Н + -АТРаза Животные и раститель- Внутренняя мембрана ные клетки митохондрий Растительные клетки Внутренняя мембрана хлоропластов Бактерии Плазматическая мем- Са2+-АТРаза Животные к легки брана То же Саркоплазмагический ретикулум Поддерживает высокую внутриклеточную кон- концентрацию К + Секретирует Н+ в же- желудочный сок Участвует в окислитель- окислительном и фотосинтетиче- фотосинтетическом фосфорилировании ADP до АТР Выкачивает ионы Са2 * из клеток, способствуя накоплению этих ионов в цитозоле Накачивает ионы Са2+ в цистерны саркоплазма- тического ретикулума, вызывая расслабление мышцы
430 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ АТР + RCOOH + СоА—SH ^± Жирная кислота ^± AMP + PPj + RCO—S-CoA СоА-производное жирной кислоты AG° = + 0,2 ккал/моль Эта реакция активации сопровождается пирофосфатным расщеплением АТР, про- продуктами которого являются пирофосфат и AMP; при обычном же ортофосфат- ном расщеплении от АТР отщепляется СН3 СНг СН2 ь. сн2 сн2 сн, снг сн2 11альмитоиль-СН2 ная группа I,, 1_.п2 СНг СНг СН2 СН2 С=О Кофермент А Рис. 14-16. Пальмитоилкофермент А может служить типичным примером СоА-производно- го жирной кислоты. Гидролиз с разрывом тио- эфирной связи (С—S-связи) между жирной кис- кислотой и коферментом А характеризуется высо- высоким значением ДС°\ равным приблизительно — 7,5 ккал/моль. СоА-производные жирных кислот играют роль активированных предшест- предшественников в процессе биосинтеза липидов. только одна ортофосфатная группа, как, например, в гексокиназной реакции АТР + D-глюкоза -> -» ADP + D-глюкозо-б-фосфат AG0' = — 3,3 ккал/моль Гидролиз АТР до AMP и РР, АТР + Н2О -> AMP 4- РР, характеризуется величиной AG0' = = — 7,7 ккал/моль, что несколько превы- превышает AG0' гидролиза концевой, или у- фосфатной, связи. Неорганический пиро- пирофосфат затем гидролизуется при участии пирофосфатазы с образованием двух мо- молекул неорганического ортофосфата. Пирофосфат + Н2О -» 2Фосфат AG0' = — 6,9 ккал/моль. Суммарная реакция описывается уравне- уравнением АТР + 2Н2О -> AMP + 2Р; AG0 = — 14,6 ккал/моль. Величина AG0' этой суммарной реакции равна алгебраической сумме величин AG0' двух ее последовательных стадий. Нетрудно видеть, что величина AG0' сум- суммарной реакции ровно вдвое превышает величину AG0' гидролиза концевых фос- фосфатных групп АТР и ADP. Расходование двух фосфатных групп АТР на активацию одной молекулы предшественника может показаться рас- расточительством, т.е. может сложиться впечатление, что энергия фосфатных групп расходуется в этом случае неэко- неэкономно. Позже мы увидим, однако, что за этим кроется важный механизм, обеспе- обеспечивающий завершение некоторых био- биосинтетических реакций. Необычным образом используется пирофосфатное расщепление АТР, например, светляка- светляками: оно служит им источником энергии для испускания света (дополнение 14-3). AMP возвращается в АТР-цикл благо- благодаря действию особого фермента, при- присутствующего во всех животных клетках. Этот фермент, аденилаткиназа, катали-
ГЛ 14. АТР-ЦИКЛ И БИОЭНЕРГЕТИКА КЛЕТКИ , - ATI зирует обратимое фосфорилирование AMP до ADP: Г 1 -I .i.i it nm ATP Mg2 AMP ^± ADP + ADP. Образующийся при этом ADP може г за- затем опять фосфорилироваться до AT Р. У аденилаткиназы есть еще одна важ- важная функция: этот фермент способствует поддержанию уровня АТР в клетке, ког- когда катализируемая им реакция протекает в обратном направлении Mg2 2ADP ^± АТР + AMP, т.е. когда он катализирует перенос кон- концевой фосфатной группы от одной моле- молекулы ADP к другой, которая при этом превращается в АТР. Таким образом в сокращающихся мышцах аденилат- киназа позволяет использовать в каче- качестве источника энергии две фосфатные группы АТР, у и Р (рис. 14-17). Следова- Следовательно, действуя на ADP. аденилаткина- ( Ь|Ш II I № Рис. 14-17. Два процесса, обеспечивающие под- поддержание соответствующего уровня АТР в быстро сокращающихся скелетных мышцах, работающих в условиях анаэробиоза. за может пополнять запас креатинфосфа- та, который во время мышечного сокра- сокращения служит источником АТР. Дополнение 14-3. АТР поставляет энергию для биолюминесценции светляков Биолюминесценция, для которой требуются значительные количе- количества энергии, свойственна многим видам грибов, морским микроорга- микроорганизмам, медузам, ракообразным и светлякам (рис. !)¦ У светляков в последовательности реакций, обеспечивающих преобразование хи- химической энергии в энергию света, используется сочетание энергии АТР и окислительной энергии. Уильям Мак-Элрой и его коллеги из Университета Джона Гопкинса выделили из многих тысяч светляков, собранных для этой цели по их просьбе детьми в окрестностях Балти- Балтимора, два главных биохимических компонента, участвующих в процес- процессе свечения: люциферин (рис. 2), представляющий собой карбоновую кислоту довольно сложного строения, и фермент яюциферазу. Для ге- Рис. 1. Свет |як.
432 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ но' "^ ^s Люциферин ОН ¦н I ¦——( —О—Р О Гибоча —Адрнин ¦ ¦Н1 1 О О 1юцифериладенилат AMP Рис. 2. Главные компоненты, обеспечивающие биолюминесценцию светляков. нерации световых вспышек люциферин сначала должен быть активи- активирован в ферментативной реакции с АТР. На этой стадии пирофосфат- ное расщепление АТР приводит к образованию люцифериладенилата (рис. 2). Затем под действием молекулярного кислорода происходит катализируемое люциферазой окислительное декарбоксилирование люциферина, в результате чего образуется оксилюциферин. Именно эта реакция, протекающая через ряд промежуточных стадий, сопровож- сопровождается световыми вспышками (рис. 3). Спектральный состав испускае- испускаемого света у разных видов светляков различен; он зависит, по всей ве- вероятности, от структуры люциферазы. Завершается цикл последова- последовательностью реакций, в результате которых из оксилюциферина вновь образуется люциферин. У других биолюминесцентных организмов свечение обусловливается ферментативными реакциями иного типа. Люциферил - аденилат PP. АТР Люцифераза Люциферии Оксилюциф.-рин Реакции, приводящие к регенерации люциферина Рис. 3. Циклическое превращение компонен- компонентов, обеспечивающих -номинесценцию светля- светляка. Очищенные люциферин и люциферазу светляков используют для из- измерения очень малых количеств АТР. Мерой количества АТР служит при этом интенсивность световой вспышки. Таким способом удается определять количества АТР порядка нескольких пикомолей A(Г12 моль).
ГЛ. 14. АТР-ЦИКЛ И БИОЭНЕРГЕТИКА КЛЕТКИ 433 о- г о о о- 1 5 о—р—о—сна о. о с н |\| 1 он Адрночинтрифосфат (ATI — \ Н XI -Ун он ¦) Рис. 14-18. А. Четыре нуклеозид-5'-трифосфа- та. Каждый из них содержит особое основание (показано на красном фоне). Б. В молекуле Аярнин дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов в положении 2' вместо гидроксила стоит атом водорода. Дезокситимидинтрифосфат служит предшест- предшественником остатков тимидиловой кислоты, вхо- входящих в состав ДНК. В РНК остатков ти- тимидиловой кислоты нет; вместо них здесь при- присутствуют остатки уридиловой кислоты (ее предшественником служит уридинтрифосфат). о—р—о—р—о—р—о—сна Гуанин о о- о О-Р-0—Р—О—Р—О—СНг II II о о о ТУ ^ < с; н не ,1\1 1/1 он Гупно шнтрифосфат (СТР) он 'н Лезоксиаденозинтрифогфат (dATP) о о- ll о—р—о—р—о—р—о—сн2 II II II \у О II О С Н Н Ci |\| 1/1 Питолин о- о- о- I I I -о—р— о—р—о—р—о—снг о I2 он он Нитидинтрифосфат (СТР) Тимин он Лезокгитимидшггрифосфат МТТР) Б Урацил О" О" О III. О—Р—О—Р—О—Р—О—СНг II II II I/ о о о с н I он он Уридинтрифогфат A'ТР) 14.18. Помимо АТР есть и другие высокоэнергетические нуклеотид-5'-трифосфаты Уридинтрифосфат (UTP), гуанозинтри- фосфат (GTP) и цитидинтрифосфат (СТР) представляют собой фосфорили- рованные рибонуклеотиды, по своей структуре сходные с АТР (рис. 14-18) и характеризующиеся такой же величи- величиной AG0' гидролиза. Эти соединения со- содержатся во всех клетках, хотя и в значи- значительно меньших количествах, чем АТР. В малых концентрациях обнаруживают- обнаруживаются в клетках также и соответствующие дезоксирибонуклеозид - 5' - трифосфаты: 2'-дезоксиаденозин-5'-трифосфат (dATP), 2'-дезоксигуа нози н-5'-трифосфат (dGTP), 2'-дезоксицитидин-5'-трифосфат (dCTP) и 2'-дезокситимидин-5'-трифосфат (dTTP). ATP в клетке играет роль главно- 3 950
434 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ го переносчика фосфатных групп. Что же касается перечисленных здесь других ну- клеозид-5'-трифосфатов, то все они вы- выполняют специализированные функции, обслуживая только строго определенные биосинтетические пути. Свои концевые фосфатные группы они получают от АТР в реакциях, катализируемых Mg2+-за- Mg2+-зависимыми ферментами, которые носят название нуклеозиддифосфокиназ. Эти ферменте! катализируют следующие об- обратимые реакции: АТР + UDP ?=± ADP + UTP АТР + GDP ;=i ADP + GTP АТР + CDP ;=± ADP + СТР GTP + UDP ;=± GDP + UTP ATP + dCDP ^=^ ADP + dCTP GTP + dADP = GDP + dATP UTP CTP ATP Продукты биосинтечи • Полисахариды Липиды Белки Разные виды РНК ДНК Рис. 14-19. Различные нуклеозид- и дезокси- нуклеозидтрифосфаты служат теми каналами, через которые энергия АТР направляется на биосинтез тех или иных клеточных компо- компонентов. На рис. 14-19 показано, как через эти раз- различные нуклеозид- и дезоксинуклеозид- трифосфаты энергия и строительные блоки передаются на определенные мета- метаболические пути, где они используются для биосинтеза липидов, белков и в пер- первую очередь для биосинтеза ДНК и РНК. 14.19. Система АТР функционирует в стационарно- динамическом режиме Как можно убедиться в том, что систе- система АТР действительно функционирует в интактных клетках, осуществляя пере- перенос энергии фосфатных групп (см. рис. 14-3)? Ответ на этот вопрос мы мо- можем получить в экспериментах с соедине- соединениями, меченными радиоактивным изо- изотопом фосфора 32Р. Можно, например, используя неорганический фосфат, ме- меченный 32Р, определить оборачивае- оборачиваемость концевой фосфатной группы АТР в клетках или тканях. С этой целью в ды- дышащие клетки вводят меченый неоргани- неорганический фосфат, после чего через короткие промежутки времени отбирают пробы клеток и выделяют из них АТР. Выясни- Выяснилось, что хотя концентрация АТР в клет- клетках при этом не меняется, в его концевой фосфатной группе уже через короткое время обнаруживается радиоактивность, а это свидетельствует о том, что конце- концевая фосфатная группа (у-группа) быстро отщепляется и столь же быстро заме- замещается радиоактивным фосфатом из пу- пула неорганического фосфата. Этот про- процесс обновления концевой фосфатной группы АТР продолжается до тех пор, пока ее удельная радиоактивность не сравняется с удельной радиоактив- радиоактивностью пула неорганического фосфата. Оборачиваемость концевой фосфатной группы АТР очень высока. В дышащих клетках печени период полуоборота кон- концевой фосфатной группы АТР не превы- превышает одной-двух минут, а у аэробных бактериальных клеток, у которых интен- интенсивность дыхания намного выше, чем у животных клеток, он измеряется секун- секундами. Наряду с этим обращает на себя внимание крайне низкая оборачивае- оборачиваемость а-фосфатной группы АТР, присое-
ГЛ. 14. АТР-ЦИКЛ И БИОЭНЕРГЕТИКА КЛЕТКИ 435 диненной непосредственно к D-рибозной части молекулы. Несмотря на очень высокую оборачи- оборачиваемость концевой фосфатной группы АТР в живых клетках, общая концентра- концентрация АТР остается все же постоянной. Это свидетельствует о стационарно-динами- стационарно-динамическом режиме функционирования си- системы АТР. Другими словами, скорость использования АТР в качестве источника энергии в точности уравновешивается скоростью процесса рефосфорилирова- ния ADP до АТР, сопряженного с окисле- окислением клеточного топлива, т.е. с процес- процессом, поставляющим энергию. Синтез АТР, сопряженный с окислением клеточ- клеточного топлива, регулируется, и поэтому скорость образования АТР из ADP и фосфата всегда оказывается достаточ- достаточной для того, чтобы энергетические нужды клетки в любой данный момент могли быть удовлетворены. Краткое содержание главы Химические реакции протекают в ia- ком направлении, чтобы при равновесии суммарная энтропия S системы и окру- окружающей среды была максимальной, а свободная энергия G реагирующих мо- молекул - минимальной. Каждая химиче- химическая реакция характеризуется опреде- определенным изменением стандартной сво- свободной энергии AG0'; в качестве стан- стандартных условий приняты: температура 25°С, давление 1 атм, концентрации всех исходных веществ и продуктов 1 М и рН 7,0. AG0' можно рассчитать по уравнению AG°'= - 2,30 R1\gK'eq, если известна константа равновесия данной реакции КеЯ. Величина AG0' гидролиза АТР до ADP и фосфата равна — 7,3 ккал/моль. У некоторых фосфорилированных соеди- соединений, например у 3-фосфоглицероил- фосфата и фосфоенолпирувата (двух про- промежуточных продуктов на пути расще- расщепления глюкозы до лактата), AG0' гидро- гидролиза выражается гораздо более отрица- отрицательной величиной, чем у АТР; их можно рассматривать поэтому как сверхвысо- коэнергетические соединения. Для неко- некоторых других фосфорилированных со- соединений, например для глюкозо-6-фос- фата, характерны меньшие по абсолют- абсолютной величине значения AG0' гидролиза по сравнению с АТР; их называют низко- низкоэнергетическими соединениями. Под дей- действием специфичных киназ фосфатные группы от сверхвысокоэнергетических фосфатов, образующихся в процессе ка- катаболизма, могут переноситься на ADP, в результате чего синтезируется АТР. Другие специфичные киназы катализи- катализируют перенос концевой фосфатной группы АТР на молекулы-акцепторы, ко- которые превращаются при этом в фосфо- рилированные (низкоэнергетические) со- соединения и оказываются благодаря это- этому активированными; в таком виде они могут вступать в реакции биосинтеза. Следовательно. АТР в процессе метабо- метаболизма играет роль универсального про- промежуточного продукта - переносчика фосфатных групп. АТР также поставляет энергию для функционирования сократи- сократительных актиновых и миозиновых нитей скелетных мышц. За счет этой энергии осуществляется скольжение нитей друг относительно друга и как результат это- этого-сокращение мышцы; при этом АТР гидролизуется до ADP и фосфата. Креа- тинфосфат служит резервуаром высоко- высокоэнергетических фосфатных групп в мы- мышечных и нервных клетках. Под дей- действием креатинкиназы он может переда- передавать свои фосфатные группы молекулам ADP. Химическую энергию для мем- мембранных АТРаз тоже поставляет АТР; это дает им возможность переносить ионы Н+ и некоторые другие катионы че- через мембраны против градиента концен- концентрации. Используемый в биосинтетических ре- реакциях АТР может отдавать либо орто- фосфатную, либо пирофосфатную груп- группу; в первом случае образуется ADP, во втором-AMP. Продукт, образующийся при пирофосфатном расщеплении, AMP, вновь фосфорилируется до ADP в реак- реакции, катализируемой аденилаткиназой: АТР + AMP ^± 2ADP. Переносчика- Переносчиками высокоэнергетических фосфатных групп, направляемых в различные био- биосинтетические реакции, служат также и другие нуклеозид-5'-трифосфаты: GTP, UTP, СТР, dATP, dTTP и т.д.; эти же
436 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ трифосфаты играют роль предшествен- предшественников в биосинтезе нуклеиновых кислот. В интактных дышащих клетках концевая фосфатная группа АТР непрерывно и очень быстро замещается за счет пула неорганического фосфата; в них поддер- поддерживается стационарно-динамическое со- состояние, при котором расход АТР, свя- связанный с отщеплением его концевой фосфатной группы, в точности уравнове- уравновешивается ресинтезом АТР из ADP и фосфата. ЛИТЕРАТУРА Книги Atkinson D. E. Cellular Energy Metabolism and Its Regulation, Academic Press, New York, 1977. Ценная книга, в которой подчерки- подчеркивается важность энергетического заряда клетки для регуляции клеточного метабо- метаболизма. Becker W. M. Energy and the Living Cell, Harper and Row, New York, 1977. В книге поставле- поставлено много проблем и предложены способы их решения. Blum H. F. Time's Arrow and Evolution, 3d ed, Princeton University Press, Princeton, N.J., 1968. Очерки и размышления по вопросу об энтропии в биологии. Broda E. The Evolution of Bioenergetic Pro- Processes, Pergamon, Oxford, 1975. (Имеется перевод: Брода Э. Эволюция биоэнергети- биоэнергетических процессов.-М.: Мир, 1978.) Сравни- Сравнительные и эволюционные аспекты биоэнер- биоэнергетики. Krebs H. A., Kornberg H. L. Energy Trans- Transformations in Living Matter, Springer, New York, 1967. Классический анализ энергетики гликолиза и дыхания. Lehninger A. L. Bioenergetics, 2d ed., Benjamin, Menlo Park, Calif., 1971. Вводный курс, осве- освещающий различные аспекты биоэнерге- биоэнергетики. Lipmann F. Wanderings of a Biochemist, Wiley, New York, 1971. Новое издание классиче- классических статей одного из первых исследовате- исследователей в области биоэнергетики, а также его воспоминания. Miller G. Т., Jr. Energetics, Kinetics and Life, Academic, New York, 1970. Биоэнергетика и экология. Wood W В., Wilson J. H, Benbow R. M., Hood L. E. Biochemistry: A Problems Approach., 2d ed., Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif, 1981. Отдельные статьи Erecinska M., Wilson D. F. Homeostatic Regu- Regulation of Cellular Energy Metabolism, Trends Biochem. Sci., 3, 221-223 A978). Gates D. M. The Flow of Energy in the Biosphere, Sci. Am., 224, 88-100, September 1971. Ingraham L. L., Pardee A. B. Free Energy and Entropy in Metabolism, pp. 1-46. In: D. M. Greenberg (ed.). Metabolic Pathways, 3d ed., vol. 1, Academic, New York, 1967. Satir P. How Cilia Move, Sci. Am., 231, 44-52, October 1974. Tribus M., Mclrvine К. С Energy and Information, Sci. Am, 225,179-188, September 1971. Вопросы и задачи 1. Вычисление величины AG0' по константе равновесия. Вычислите изменение стан- стандартной свободной энергии следующих метаболически важных ферментативных реакций при 25°С, исходя из приведенных значений констант равновесия (рН 7,0): а) Глутамат + Оксалоацетат ^± Аспартатаминотрансфераза ^ Аспартат + + а-Кетоглутарат Кц = 6,8. б) Дигидроксиацетонфосфат ^ Триозофосфат-изомераза Глицеральдегид-3-фосфат щ = 0,0475. в) Фруктозо-6-фосфат + АТР ^ Фосфофруктокиназа ^± Фруктозо-1,6-дифосфат + + ADP K'eq = 254. 2. Вычисление константы равновесия по ве- величине AG0'. Вычислите константы равно- равновесия следующих реакций при рН 7,0 и температуре 25°С используя данные, приведенные в табл. 14-3: а) Глюкозо-6-фосфат + Н2О -» Глюкозо-6-фосфатаза -» Глюкоза + Фосфат. Р-Галактозидаза б) Лактоза + Н2О -» -» Глюкоза + Галактоза.
ГЛ. 14. АТР-ЦИКЛ И БИОЭНЕРГЕТИКА КЛЕТКИ 437 Фумараза в) Малат -» Фумарат + Н2О. 3. Величина AG0' для сопряженных реакций. Глюкозо-1-фосфат превращается во фрук- тозо-6-фосфат в двух последовательных реакциях: Глюкозо-1-фосфат -» Глюкозо-6-фосфат, Глюкозо-6-фосфат -» Фруктозо-6-фосфат. Используя значения AG0', приведенные в табл. 14-3, вычислите константу равнове- равновесия Кёч для суммарной реакции при 25 С Глюкозо-1-фосфат -» Фруктрзо-6-фосфат. 4. Стратегия преодоления неблагоприятных этапов: ATР-заеисимое химическое сопря- сопряжение. Первым этапом катаболизма глю- глюкозы является фосфорилирование глю- глюкозы с образованием глюкозо-6-фосфата. Прямое фосфорилирование глюкозы не- неорганическим фосфатом описывается уравнением Глюкоза + Фосфат -» -» Глюкозо-6-фосфат + Н2О AG0' = + 3,3 ккал/моль. а) Вычислите константу равновесия при- приведенной выше реакции. В клетке пе- печени крысы физиологические концен- концентрации глюкозы и фосфата поддержи- поддерживаются на уровне около 4,8 мМ. Какой будет равновесная концентрация глю- козо-6-фосфата при прямом фосфори- лировании глюкозы неорганическим фосфатом? Можно ли считать при- приемлемым такой метаболический путь для катаболизма глюкозы? Выскажите свои соображения. б) Теоретически можно увеличить концен- концентрацию глюкозо-6-фосфата, сдвинув равновесие реакции вправо за счет по- повышения внутриклеточных концентра- концентраций глюкозы и фосфата. Примем, что концентрация фосфата неизменна и равна 4,8 мМ. Насколько потребуется при этом повысить внутриклеточную концентрацию глюкозы для того, чтобы равновесная концентрация глю- козо-6-фосфата составила 250 мкМ (именно такова его нормальная физио- физиологическая концентрация)? Можно ли считать этот путь приемлемым с фи- физиологической точки зрения, если учесть, что максимальная раствори- растворимость глюкозы меньше 1 М? в) В этой главе мы говорили о том, что фосфорилирование глюкозы сопряже- сопряжено в клетке с гидролизом АТР; таким образом, часть свободной энергии ги- гидролиза АТР используется для осу- осуществления неблагоприятного в энерге- энергетическом отношении фосфорилирова- ния глюкозы. Глюкоза + Фосфат -» -> Глюкозо-6-фосфат + Н2О AG0' = + 3,3 ккал/моль АТР + Н2О -> ADP + Фосфат AG0' = — 7,3 ккал/моль Суммарная + АТР + ADP реакция: Глюкоза + -» Глюкозо-6-фосфат + Вычислите значения AG0' и Кщ для суммарной реакции. При таком АТР- зависимом фосфорилировании глю- глюкозы, какой должна быть концентрация глюкозы для того, чтобы внутрикле- внутриклеточная концентрация глюкозо-6-фосфа- та составила 250 мкМ, если концентра- концентрации АТР и ADP равны соответственно 3,38 и 1,32 мМ? Можно ли считать та- такой сопряженный процесс хотя бы тео- теоретически приемлемым путем для фос- форилирования глюкозы в клетке? По- Почему? г) С термодинамической точки зрения со- сопряжение гидролиза АТР с фосфорили- рованием глюкозы не является невоз- невозможным, но мы не знаем, как оно про- происходит в действительности. Поскольку для сопряжения необходим какой-то общий промежуточный продукт, одна из возможностей заключается в том, что за счет гидролиза АТР увеличивает- увеличивается внутриклеточная концентрация не- неорганического фосфата, и зто облег- облегчает протекание неблагоприятной с термодинамической точки зрения ре- реакции фосфорилирования глюкозы не- неорганическим фосфатом. Предста- Представляется ли вам этот путь подходящим? Аргументируйте свой ответ. д) В клетках печени АТР-сопряженное фосфорилирование глюкозы катализи- катализируется ферментом глюкокиназой. Этот фермент связывает АТР и глюкозу, в результате чего образуется комплекс глюкоза-АТР-фермент и фосфат переносится непосредственно от АТР к глюкозе. В чем заключаются преиму- преимущества такого пути? 5. Вычисление величин AG0' для АТР-сопря- женных реакций. Исходя из данных табл. 14-5, вычислите значения AG0' для реакций:
438 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ а) Креатинфосфат + ADP -» -> Креатин + АТР; б) АТР + Фруктоза г* -» ADP + Фруктозо-6-фосфат. 6. Вычисление ДС при физиологических усло- условиях. Вычислите изменение свободной энергии ДС (не AG0') при физиологиче- физиологических условиях для реакции Креатинфосфат + ADP -» -» Креатин + АТР, протекающей в цитозоле клеток мозга при 25°С и следующих концентрациях компонентов: креатинфосфат-4,7 мМ, креатин-1,0, ADP-0,20 и АТР-2,6 мМ. 7. Потребность в свободной энергии при син- синтезе АТР в физиологических условиях. В цитозоле печени крысы отношение дей- действующих масс равно _[АТР]_ Q [ADP][P,]-5'33 10" Вычислите количество свободной энергии, необходимое для синтеза АТР в печени крысы. 8. Суточная утилизация АТР в организме взрослого человека. а) Количество свободной энергии, необ- необходимое для синтеза АТР из ADP и не- неорганического фосфата (Р,) при концен- концентрациях исходных веществ и продуктов 1 М (стандартное состояние), соста- составляет 7,3 ккал/моль. Поскольку ис- истинные физиологические концентрации ADP, Р; и АТР в клетках отличаются от 1 М. количество свободной энергии, не- необходимой для синтеза АТР при физио- физиологических условиях, отличается от ДС'. Вычислите количество свободной энергии, необходимое для синтеза АТР в клетке печени человека при физиоло- физиологических концентрациях АТР, ADP и Pf, равных соответственно 3,5, 1,50 и 5,0 мМ. б) Здоровый взрослый человек, вес кото- которого составляет около 70 кг, должен ежедневно получать с пищей 2000 ккал. Пищевые вещества расщепляются в процессе метаболизма и высвобо- высвобождающаяся при этом свободная энер- энергия используется для синтеза АТР, ко- который затем расходуется на выполне- выполнение ежедневной работы организма, химической и механической. Вычислите (в весовых единицах) количество АТР, утилизируемого за сутки организмом взрослого человека, если принять, что эффективность превращения заключен- заключенной в пище энергии в энергию АТР рав- равна 50%. Какой процент от веса тела со- составляет это количество АТР? в) Хотя ежедневно в организме взрослого человека образуются значительные ко- количества АТР, вес тела, его строение и состав за этот период существенно не меняются. Как можно объяснить это? 9. Запас АТР в мышечной ткани. Концентра- Концентрация АТР в мышечной ткани (в которой около 70° „ приходится на долю воды) рав- равна приблизительно 8,0 мМ. В периоды усиленной мышечной активности АТР расходуется для мышечного сокращения со скоростью 300 мкмолъ/мин на 1 г мы- мышечной ткани. а) На сколько времени хватает этого запа- запаса АТР спринтеру, бегущему 100-ме- 100-метровую дистанцию? б) Концентрация креатинфосфата в мы- мышечной ткани составляет примерно 40,0 мМ. На какое время позволит креатинфосфат растянуть запас мы- мышечного АТР? в) Что делает возможным марафонский бег при таком запасе АТР? 10. Расщепление АТР в процессе метаболизма до AMP и PPj. Образование активирован- активированной формы ацетата (ацетил-СоА) предста- представляет собой АТР-зависимый процесс Ацетат + СоА + АТР -» -> Ацетил-СоА + AMP + РР,.. а) Величины AG0' гидролиза ацетил-СоА до ацетата и СоА и АТР до AMP и РР,- равны соответственно —7,5 и —7,3 ккал. Вычислите величину ДС" для АТР-зависимого синтеза ацетил-СоА. б) Почти во всех клетках присутствует фермент (неорганическая пирофосфата- за), катализирующий гидролиз РР; до неорганического фосфата (Р(). Как влияет присутствие этого фермента на синтез ацетил-СоА? Дайте полный от- ответ.
ГЛАВА 15 ГЛИКОЛИЗ-ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ Теперь, когда мы познакомились с принципами, лежащими в основе орга- организации клеточного обмена и биоэнерге- биоэнергетики, мы можем уяснить себе, каким образом химическая энергия, заключен- заключенная в структуре молекулы глюкозы, вы- высвобождается в полезной форме, пригод- пригодной для выполнения разнообразной био- биологической работы клетки. Напомним, что глюкоза служит основным «топли- «топливом» у большинства организмов, что она богата энергией и что ее запасы, храня- хранящиеся в виде гликогена, легко могут быть мобилизованы, как только у орга- организма возникнет внезапная потребность в энергии. Эту главу мы посвятим рассмотрению гликолиза -процесса, в ходе которого мо- молекула глюкозы, построенная из шести углеродных атомов, расщепляется фер- ферментативным путем, в десяти последова- последовательных реакциях до двух молекул пиру- вата, содержащих по три углеродных атома. На протяжении этой последова- последовательности реакций значительная часть энергии, высвободившейся из глюкозы, запасается в форме АТР. Гликолиз (от греч. glykys- сладкий и lysis-распад, раз- разложение) изучен лучше других цен- центральных метаболических путей, и пото- потому мы рассмотрим его здесь достаточно подробно; в основе функционирования и регуляции этого процесса лежат некие общие принципы, характерные для всех метаболических путей. Мы обсудим здесь также пути, питающие гликолиз, т.е. пути, ведущие к нему от гликогена, дисахаридов и моносахаридов. 15.1. Гликолиз является одним из центральных метаболических путей у большинства организмов Гликолиз почти универсален как один из центральных путей катаболизма глю- глюкозы: он выполняет эту роль не только в животных и растительных клетках, но также и у многих микроорганизмов. По- Последовательности гликолитических реак- реакций различаются у разных организмов только характером регуляции их скоро- скорости, а также метаболической судьбой образующегося пирувата. Продукт гликолиза-пируват-может использоваться тремя способами. У аэ- аэробных организмов гликолиз составляет лишь первую стадию полного аэробного расщепления глюкозы до СО2 и воды (рис. 15-1). Образовавшийся при глико- гликолизе пируват претерпевает затем окисли- окислительное декарбоксилирование, т. е. теряет СО2, а оставшийся двухуглеродный фрагмент в виде ацетильной группы включается в ацетилкофермент А (см. рис. 10-8). Далее уже эта ацетильная группа полностью окисляется до СО2 и Н2О в цикле лимонной кислоты с уча- участием молекулярного кислорода (рис. 15-1). Таков путь, на который всту- вступает пируват в аэробных животных и рас- растительных клетках. Второй путь заключается в восстано- восстановлении пирувата до лактата. Когда неко- некоторые животные ткани вынуждены функ- функционировать в условиях анаэробиоза, а это особенно характерно, например, для напряженно работающей скелетной
440 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Анаэробные услоьия Спиртовое брожение Гликолич A0 последовательных реакций) Апачробньи1 условия Анаэробный гликолиз в сокращающейся мышце; спиртовое брожение Никл Животные, растительные и лимонной бактериальные клетки при кислоты аэробных условиях Рис. 15-1. Конечный продукт гликолиза пиру- пируват проходит различные катаболические пути в зависимости от вила организма и от условий, в которых протекает метаболизм. мышцы образовавшийся из глюкозы пи- пируват не может быть подвергнут даль- дальнейшему окислению просто из-за отсут- отсутствия кислорода. В этих условиях про- продукт гликолиза пируват восстанавли- восстанавливается с образованием лактата. В ске- скелетной мышце этот процесс, называемый анаэробным гликолизом, служит важным источником энергии АТР при напряжен- напряженной физической работе. У анаэробных микроорганизмов, осуществляющих мо- молочнокислое брожение, продуктом гли- гликолиза является также лактат (рис. 15-1). Молочная кислота, образующаяся из са- сахара в результате деятельности молочно- молочнокислых бактерий, вызывает скисание мо- молока, и эта же кислота придает квашеной капусте ее характерный чуть кислый вкус. Третий путь превращений пирувата за- заканчивается образованием этанола. Су- Существуют микроорганизмы (к ним отно- относятся, например, пивные дрожжи), пре- превращающие пируват, образовавшийся из глюкозы в процессе гликолиза, в этанол и СО2. Этот процесс носит название спир- спиртового брожения (рис. 15-1). Броже- ние- общий термин, которым обозна- обозначают анаэробное расщепление глюкозы или каких-нибудь других органических пищевых веществ для получения из них энергии в форме АТР. При разных типах брожения образуются разные продукты, характерные для организмов, осущест- осуществляющих данный тип брожения. По- Поскольку первые живые организмы появи- появились на Земле в то время, когда ее атмосфера еще не содержала кислорода, анаэробное расщепление глюкозы сле- следует считать наиболее древним из биоло- биологических механизмов, предназначенных для извлечения энергии из органических пищевых веществ.
ГЛ. 15. ГЛИКОЛИЗ-ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ 441 15.2. С гликолизом сопряжен синтез АТР В ходе гликолиза значительная часть свободной энергии, содержащейся в мо- молекуле глюкозы, запасается в форме АТР. Это легко показать, написав урав- уравнение химического баланса для анаэроб- анаэробного гликолиза, протекающего в напря- напряженно работающей скелетной мышце: Глюкоза + 2Р; + 2ADP -> -> 2Лактат" + 2Н+ + 2АТР + + 2Н2О. Как видно из этого уравнения, на каждую расщепленную молекулу глюкозы из ADP и Р( образуются две молекулы АТР. Мы можем вычленить в анаэробном гли- гликолизе два процесса и написать соответ- соответственно два уравнения: 1) для превраще- превращения глюкозы в лактат с высвобождением свободной энергии: Глюкоза -> 2Лактат~ + 2Н+ A) AG?' = - 47,0 ккал/моль и 2) для образования АТР из ADP и фос- фосфата, которое требует затраты энер- энергии: 2Р; + 2ADP -» 2АТР + 2Н2О B) AGf = + 2 ¦ 7,30 = + 14,6 ккал/моль. Эти два процесса не могут идти незави- независимо друг от друга; они обязательно должны быть сопряжены. Однако, напи- написав оба уравнения по отдельности, мы видим, что превращение 1 моль глюкозы в лактат в стандартных условиях приво- приводит к высвобождению гораздо большего количества свободной энергии D7,0 ккал), чем необходимо для образо- образования 2 моль АТР из ADP и фосфата B • 7,3 = + 14,6 ккал). В живой клетке при истинных внутриклеточных концентра- концентрациях АТР, ADP и Р;, а также глюкозы и лактата эффективность запасания вы- высвобождающейся при гликолизе энергии в форме АТР превышает 60%. Пользуясь уравнениями A) и B), мы можем определить также общее измене- изменение стандартной свободной энергии при гликолизе, учитывающее и образование АТР. Это изменение AG°' равно алге- алгебраической сумме величин AG°' и AG^': Глюкоза + 2Pf + 2ADP -> -> 2Лактат- + 2Н+ + 2АТР + C) + 2Н2О AGS0' =AG?' + AG?' = = -47,0 + 14,6 = = — 32,4 ккал/моль. Мы видим, таким образом, что сум- суммарная сопряженная реакция гликолиза сопровождается очень большим сниже- снижением свободной энергии. Как в стан- стандартных условиях, так и в живых клетках гликолиз представляет собой необра- необратимый процесс, идущий практически до конца именно из-за этого большого сни- снижения свободной энергии. 15.3. В продуктах гликолиза сохраняется еще много свободной энергии При гликолизе высвобождается только небольшая часть всей энергии, заключен- заключенной в молекуле глюкозы. Общее измене- изменение стандартной свободной энергии при полном окислении глюкозы до СО2 и Н2О составляет — 686 ккал/моль (табл. 14-3). Следовательно, выход свободной энергии при гликолитическом расщепле- расщеплении глюкозы на две молекулы лактата (AG0' = — 47,0 ккал/моль) равен всего лишь D7/686) • 100 = 6,9% того количе- количества энергии, которое может высвобо- высвободиться при полном окислении глюкозы до СО2 и Н2О. Большая часть биологи- биологически доступной энергии, заключенной в молекуле глюкозы, сохраняется в про- продуктах гликолиза-двух молекулах лак- лактата. Она может высвободиться только в том случае, если продукты гликолиза подвергнутся полному окислению до СО2 и Н2О молекулярным кислородом, играющим роль акцептора электронов (об этом мы будем подробно говорить в следующей главе). И тем не менее этот
442 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ анаэробный гликолиз до стадии лактата цах и диффундирующий в кровь, может никак нельзя считать малоэффективным возвращаться в цикл; он поступает в пе- процессом, в котором энергия расходует- чень и здесь в период восстановления по- ся неэкономно. Напротив, глико- еле напряженной мышечной работы лиз-удивительный по своему совершен- вновь превращается в глюкозу. У неко- ству процесс, поскольку он обеспечивает торых видов животных анаэробный гли- получение энергии из глюкозы без ее колиз играет чрезвычайно важную роль окисления. В организме животных лак- в мышечной активности (дополнение тат, образующийся в работающих мыш- 15-1). Дополнение 15-1. Анаэробный гликолиз, кислородная задолженность, аллигаторы и обитатели больших глубин Большинство позвоночных это по преимуществу аэробные орга- организмы; глюкоза у них сначала правращается в процессе гликолиза в пируват, а затем этот пируват претерпевает полное окисление до СО2 и Н2О под действием молекулярного кислорода. У большинства по- позвоночных, и в частности у человека, анаэробный гликолиз включается только на короткое время при напряженной работе мышц, например при беге на 100 м, т. е. в такие моменты, когда кислород не успевает до- достаточно быстро поступать в ткани и не успевает обеспечивать окисле- окисление пирувата и сопряженный с ним синтез АТР. Мышцы при этом ис- используют в качестве «топлива» имеющийся в них запас гликогена и генерируют АТР посредством анаэробного гликолиза, конечным продуктом которого является лактат. Поэтому при беге на короткие дистанции в крови в весьма значительных количествах накапливается лактат. Позднее, в период восстановления, этот лактат медленно пре- превращается в печени обратно в глюкозу; на протяжении периода восста- восстановления потребление кислорода постепенно снижается до тех пор, по- пока не установится, наконец, нормальная интенсивность дыхания. Избыточное количество кислорода, потребленное за период восстано- восстановления, служит мерой кислородной задолженности. Это количество кислорода требуется для синтеза (в процессе дыхания) соответствую- соответствующего количества АТР, которого должно хватить на то, чтобы попол- пополнить израсходованный запас гликогена в печени и в мышцах, т. е. «лик- «ликвидировать задолженность», возникшую вследствие усиленной работы мышц во время бега. Анаэробный гликолиз как один из источников энергии для мышеч- мышечного сокращения играет особо важную роль в белых мышцах. Боль- Большинство скелетных мышц содержит как белые, так и красные волокна, однако есть и такие мышцы, которые состоят почти целиком из одних только красных или одних только белых волокон. У индеек мышцы крыла белые и летать они могут лишь на очень короткие расстояния. У лошади, способной к длительному непрерывному бегу, мышцы ног состоят преимущественно из красных волокон. Белые мышечные во- волокна, содержащие мало митохондрий, отличаются чрезвычайно высо- высокой частотой сокращений. Источником АТР служит для них анаэ- анаэробный гликолиз, так что работать с максимальной интенсивностью они могут лишь очень короткое время, поскольку имеющийся в них за- запас гликогена используется малоэффективно. В отличие от белых красные мышцы сокращаются медленнее, содержат много митохон-
ГЛ. 15. ГЛИКОЛИЗ ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ 443 дрий и получают энергию главным образом за счет окисления клеточ- клеточного «топлива» кислородом; поэтому они могут работать непрерывно в течение длительного времени. Вообще говоря, у мелких животных кислород доставляется к мыш- мышцам циркуляторными системами достаточно быстро, так что необхо- необходимости в анаэробном использовании мышечного гликогена у них нет. Птицы, например, при своих перелетах часто покрывают огромные расстояния с очень большой скоростью без какой бы то ни было кисло- кислородной задолженности. Красным мышцам многих бегающих жи- животных среднего размера также свойствен но преимуществу аэробный метаболизм. Однако у крупных животных при напряженной и длитель- длительной работе циркуляторная система оказывается уже не в состоянии поддерживать полностью аэробный метаболизм в мышцах. Эти жи- животные движутся обычно медленно, и только крайние обстоятельства вынуждают их к усиленной мышечной активности, поскольку за каждой такой вспышкой активности должен следовать долгий период восстановления, необходимый для погашения кислородной задолжен- задолженности. Медлительны и вялы, например, большую часть времени аллига- аллигаторы и другие крокодилы, однако эти рептилии способны к молниенос- молниеносной атаке и столь же быстрому нанесению опасных ударов мощным хвостом. Такие бурные вспышки активности коротки; за ними неиз- неизменно следует долгий период восстановления сил. Для быстрых движе- движений, когда в них возникает необходимость, АТР генерируется в белых скелетных мышцах этих животных путем анаэробного гликолиза. По- Поскольку запас гликогена в мышцах не очень велик, при напряженной работе мышц он быстро истощается. Кроме того, в мышцах и во вне- внеклеточной жидкости при таких вспышках активности в очень большом количестве накапливается продукт анаэробного гликолиза лактат. В то время как тренированному спортсмену после бега на 100 м для восста- восстановления нормального состояния достаточно каких-нибудь 30 мин, ал- аллигатору после резкого броска может потребоваться многочасовой от- отдых с повышенным потреблением кислорода, для того чтобы из его крови был выведен избыток лактата. а в мышцах восстановился запас гликогена. Аналогичные проблемы определяют характер метаболизма и у дру- других крупных животных, таких, как слоны и носороги, а также у китов, тюленей и прочих морских млекопитающих, подолгу остающихся под водой. У динозавров и других гигантских доисторических животных источником энергии для работы мышц служил, вероятно, анаэробный гликолиз, и значит, им тоже были необходимы длительные периоды восстановления сил, во время которых эти животные легко станови- становились добычей более мелких хишников, способных лучше использовать кислород, а потому и лучше приспособленных к длительной мышечной активности. Глубоководные исследования показали, что на очень больших глу- глубинах, там, где содержание кислорода в воде близко к нулю, обитает тем не менее много видов животных. У этих обитателей больших глу- глубин метаболизм имеет по преимуществу анаэробный характер; расще- расщепление углеводов приводит у них к образованию лактата и некоторых других продуктов, большая часть которых должна выводиться из орга- организма. У некоторых морских позвоночных для получения энергии в форме АТР глюкоза сбраживается не до лактата, а до этанола и СО2.
444 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ 15.4. Гликолиз включает две стадии Прежде чем заняться рассмотрением отдельных ферментативных этапов гли- гликолиза, попробуем охарактеризовать этот процесс в более общем плане. Рас- Расщепление шестиуглеродной молекулы глюкозы на две трехуглеродные моле- молекулы пирувата совершается при участии десяти ферментов. Все они были выде- выделены в чистом виде из разных видов ор- организмов и тщательно изучены. Первые пять этапов составляют подготовитель- подготовительную стадию гликолиза (рис. 15-2). В этих ферментативных реакциях глюкоза фос- форилируется за счет АТР сначала в по- положении 6, а затем в положении 1 с обра- образованием фруктозо-1,6-дифосфата, ко- который расщепляется на две молекулы трехуглеродного соединения - глицералъ- дегид-3-фосфата. Таким образом, про- продуктом первой стадии гликолиза являет- является глицеральдегид-3-фосфат. Отметим, что на активацию молекулы глюкозы и подготовку ее к расщеплению на два трехуглеродных фрагмента должны быть затрачены две молекулы АТР; впослед- впоследствии этот «вклад» принесет весьма со- солидную прибыль. Далее, мы покажем, что и другие гексозы, в частности D-фруктоза, D-галактоза и D-манноза, тоже могут вовлекаться в подготови- подготовительную стадию гликолиза, после того как они подвергнутся фосфорилирова- нию. Подготовительная стадия гликоли- гликолиза служит, таким образом, для того, чтобы превратить углеродные цепочки Рис. 15-2. Две стадии анаэробного гликолиза. Цифры в скобках означают число молекул, вступающих в данную реакцию. Стадия 1: Фосфорилирование глюкозы и ее превращение в глицеральдегид-З-фогфат АТР Глюкоза (I) | Первая пуско- ~~\ вая" реакция, 1 сопровождающая *^ ся расходовани * ем АТР Глюкозо-6-фосфат A) Фруктозо-6-фосфат A) . Вторая пуско - ATP^J вая" реакция, го 1 провождающаяся ADP«< расходованием * ATI Фруктозо-1,6-дифосфат A) ГлиЦер;тьдегид-3-фосфатA) + Дигидроксиацетонфосфат (I) Глицеральдегид-3-фосфат B молекулы) Стадия 2: Превращение глицеральдегид-3-фосфата в лактат и сопряженное обрачованио АТР _^ Глииералъпегмд-3-фосфат B) 2Р. 2АТР t N 3-фосфоглиЦероилфосфат B) 2ADP ^.1 Первая реакция, ^1 сопровождающаяся А образованием АТР 2АТР 3-фогфоглицерат B) 2-фосфоглицерат B) 2NADH + 2Н+ Фогфоенолпируват B) 2ADP ^1 Вторая реакция, ^ сопровождающаяся X образованием АТР Пируват B) ¦2NAD+- 2 Лактит
ГЛ. 15. ГЛИКОЛИЗ-ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ 445 всех метаболизируемых гексоз в один об- общий продукт -глицеральдегид-3-фосфат. Вторая стадия гликолиза, также со- состоящая из пяти ферментативных реак- реакций, представляет собой, образно говоря, выплату процентов; на этой стадии энер- энергия, высвобождающаяся при превра- превращении двух молекул глилеральдегид- 3-фосфата в две молекулы пирувата, запасается (в результате сопряженного фосфорилирования четырех молекул ADP) в виде четырех молекул АТР (рис. 15-2). Общий выход АТР в процессе гликолиза равен, однако, не четырем, а только двум молекулам АТР в расчете на одну расщепленную молекулу глю- глюкозы, поскольку две молекулы АТР были уже израсходованы на первой стадии гликолиза. Гликолиз включает химические пре- превращения трех разных типов: 1) распад углеродного скелета глюкозы с образо- образованием пирувата (путь атомов углерода); 2) фосфорилирование ADP высокоэнер- высокоэнергетическими фосфорилированными со- соединениями с образованием АТР (путь фосфатных групп) и 3) перенос водо- водородных атомов или электронов (путь переноса электронов). Мы проследим все эти пути, когда перейдем к обсуждению отдельных реакций гликолиза. Отметим еще одно обстоятельство. У подавляющей части клеток ферменты, катализирующие гликолитические реак- реакции, присутствуют в растворимой форме в цитозоле, т. е. в гомогенной водной фа- фазе цитоплазмы (разд. 2.18). В отличие от них ферменты, катализирующие те этапы окисления углеводов, которые требуют присутствия кислорода, локализуются в мембранах: в эукариотических клетках в митохондриальных мембранах, а в про- кариотических - в плазматических мем- мембранах. 15.5. В ходе гликолиза образуются фосфорилированные промежуточные продукты Знакомясь с последовательностью гли- колитических реакций, мы прежде всего должны подчеркнуть тот важный факт, что все девять промежуточных продук- продуктов на пути от глюкозы до пирувата представляют собой фосфорилиро- фосфорилированные соединения (рис. 15-2). Фос- Фосфатные группы выполняют, по-видимо- по-видимому, три функции. 1. При рН 7 фосфатные группы пол- полностью ионизованы, и потому они придают каждому из промежуточных продуктов гликолиза суммарный от- отрицательный заряд. Поскольку кле- клеточные мембраны обычно непрони- непроницаемы для молекул, несущих электри- электрический заряд, промежуточные про- продукты гликолиза не могут выйти из клетки. Глюкоза попадает внутрь кле- клеток, а лактат или пируват покидают их только благодаря тому, что в кле- клеточных мембранах имеются особые транспортные системы, способные переносить молекулы именно этих соединений. 2. Вторая функция фосфатных групп оче- очевидна: они являются необходимыми компонентами в процессе фермента- ферментативного запасания метаболической энергии, поскольку они в конце концов передаются на ADP с образованием АТР. 3. Фосфатные группы выполняют функ- функцию узнавания; это связывающие группы, благодаря которым молекулы промежуточных продуктов гликолиза занимают правильное положение от- относительно активных центров со- соответствующих ферментов. Почти все гликолитические ферменты нуждаются для проявления активности в ионах Mg2 +. Известно, что ионы Mg2 + образуют комплексы с фосфатными группами промежуточных продуктов гликолиза, а также с фосфатными груп- группами ADP и АТР (разд. 14.8). Отсюда на- напрашивается вывод, что субстратсвязы- вающие участки многих гликолитических ферментов проявляют специфичность не столько в отношении самих фосфорили- рованных промежуточных продуктов, сколько в отношении их комплексов с ио- ионами Mg2 +.
446 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ 15.6. Первая стадия гликолиза завершается расщеплением углеродного скелета глюкозы На рис. 15-3 показаны отдельные фер- ферментативные этапы первой стадии глико- гликолиза и структурные формулы соответ- соответствующих соединений. Из этой схемы, дополняющей рис. 15-2, видно, каким образом шестиуглеродная цепь глюкозы расщепляется на две молекулы трехугле- родного соединения глицеральдегидфос- фата. а. Фосфорилирование глюкозы На этом первом этапе молекула D-глюкозы активируется для участия в последующих реакциях путем фосфори- лирования за счет АТР в положении 6 с образованием глюкозо-6-фосфата (рис. 15-3). Эта реакция, которая в усло- условиях клетки протекает необратимо, ката- катализируется ферментом гексокипазоп АТР4 + a-D-глюкоза ADP3" 4- a-D-глюкозо-б-фосфат2 + Н+ AG0' = — 4,0 ккал/моль. Гексокиназа присутствует почти во всех клетках - животных, растительных и бак- бактериальных. Она катализирует фосфори- фосфорилирование не только D-глюкозы, но и не- некоторых других обычных гексоз, напри- например D-фруктозы и D-маннозы. Гексо- киназу удалось выделить из дрожжевых клеток в кристаллическом виде, и ее трех- трехмерная структура была детально изучена методом рентгеноструктурного анализа. Связывание гексокиназы с гексозой про- происходит по типу индуцированного со- соответствия: молекула фермента претер- претерпевает при этом глубокое конформа- ционное изменение (см. рис. 12 и 13 к дополнению 9-4). Для проявления ак- активности гексокиназе необходимы ионы Mg2 + , поскольку истинным субстратом для этого фермента служит не АТР4 ~, а комплекс MgATP2" (разд. 14.8). CHs—О U сн2он Дигидро- ксиацетон- фосфат "CILOH н a -D-глюкоча ADP Н ОН ОН Гекгокиназа, глкжокиназа >С=О Н—С—ОН НО—С—Н D-глюкозо-в-фосфат Фосфоглюкоизомераза П-фруктозо-б-фпсфат Л Фосфофруктокиназа О-фруктозо-! .В-дифосфат Н—С—ОН I н—с—он 6сн,—о II Фруктозобигфосфат- альдолаэа Н •С=О н—с—он I изомернза СН2—О—PQ,"" D- глиш-ральдргид- 3-фогфат Рис. 15-3. Последовательность реакций, сос- составляющих первую стадию гликолиза. Назва- Названия ферментов выделены красным. Цифры ука- указывают положение атомов углерода. Глюкозо- 6-фосфат, фруктозо-6-фосфат и фруктозо-1,6- дифосфат представлены здесь для простоты в виде структур с открытой цепью, хотя в дей- действительности они существуют в клетке в виде ос-аномерных форм с замкнутым кольцом.
ГЛ. 15. ГЛИКОЛИЗ-ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ 447 У разных организмов и в разных тка- тканях гексокиназа представлена различны- различными изоформами (разд. 9.23). Хотя все эти изоформы катализируют одну и ту же ре- реакцию (рис. 15-3), они различаются ме- между собой по своим кинетическим свой- свойствам. Гексокиназа мышечных клеток характеризуется, например, низкой вели- величиной Км для глюкозы (около 0,1 мМ), поэтому она фосфорилирует глюкозу крови D-5 мМ) .с максимальной ско- скоростью. Мышечная гексокиназа резко ингибируется продуктом катализируе- катализируемой ею реакции - глюкозо-6-фосфатом. Это обстоятельство наряду с некоторы- некоторыми другими данными позволило сделать вывод, что гексокиназа выполняет в мышцах функцию регуляторного фер- фермента. Глюкозо-6-фосфат является при этом одновременно и продуктом реак- реакции, и аллостерическим ингибитором. Когда концентрация глюкозо-6-фосфата в клетке поднимается выше нормального уровня, он временно и обратимо ингиби- рует гексокиназу, так что скорость его образования приводится в соответствие со скоростью утилизации. В печени присутствует другая форма фермента, получившая название глюко- киназы, которая не обнаружена в других тканях. Глюкокиназа отличается от изо- ферментов группы гексокиназы тремя особенностями: во-первых, она специ- специфична только в отношении D-глюкозы и не действует на другие гексозы; во- вторых, глюкозо-6-фосфат не является для нее ингибитором и, наконец, в-треть- в-третьих, она характеризуется гораздо более высокой по сравнению с гексокиназой ве- • личиной Км для глюкозы (около 10 мМ). Глюкокиназа печени вступает в действие только тогда, когда концентрация глю- глюкозы в крови заметно возрастает, как это бывает, например, после приема пищи, богатой углеводами. В этих условиях глюкокиназа действует на избыточную глюкозу крови и переводит ее в глюко- зо-6-фосфат для отложения в запас в виде гликогена печени. У больных сахарным диабетом количество глюкокиназы сни- снижено, и это имеет для организма очень серьезные последствия. При сахарном диабете поджелудочная железа не выра- вырабатывает достаточного количества ин- инсулина (гл. 25); уровень глюкозы в крови в связи с этим сильно повышен, а в пече- печени из-за недостаточности глюкокиназы образуется мало гликогена. б. Превращение глюкозо-6-фосфата во фруктозо-6-фосфат Фермент фосфоглюкоизомераза (его удалось выделить в высокоочищенном виде из мышечной ткани) катализирует обратимую реакцию изомеризации (рис. 15-3), в результате которой глюко- зо-6-фосфат (альдоза) превращается во фруктозо-6-фосфат (кетозу). Карбониль- Карбонильная группа перемещается при этом из по- положения 1 в положение 2: Mg2 + a-D-глюкозо-б-фосфат ^± Mg2 a-D-фруктозо-б-фосфат АС0 = + 0,4 ккал/моль. Поскольку эта реакция сопровождает- сопровождается относительно небольшим изменением стандартной свободной энергии, она лег- легко протекает в обоих направлениях. Фос- Фосфоглюкоизомераза нуждается в ионах Mg2 + и обладает специфичностью в от- отношении глюкозо-6-фосфата и фрукто- зо-6-фосфата. «. Фосфорилирование фруктозо-6-фосфата с образованием фруктозо-1,6-дифосфата Это вторая из двух «пусковых» реак- реакций гликолиза. Фосфофруктокиназа (рис. 15-3), которой для проявления ак- активности требуются ионы Mg2 +, катали- катализирует перенос фосфатной группы от АТР в положение 1 D-фруктозо-б-фосфа- та, в результате чего образуется фрукто- фруктозе-1 ,6-дифосфат: АТР + D-фруктозо-б-фосфат ADP + 0-фруктозо-1,6-дифосфат + Н + AG0' = — 3,40 ккал/моль.
448 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ В условиях клетки эта реакция практичес- практически необратима. Фосфофруктокиназная реакция-вто- реакция-второй важный «контрольный пункт» глико- гликолиза. Подобно гексокиназе, фосфофрук- токиназа представляет собой регуля- торный фермент (гл. 9); среди известных регуляторных ферментов это один из на- наиболее сложных. Фосфофруктокиназа- главный регуляторный фермент гликоли- гликолиза в мышцах. Всякий раз, когда в клетке начинает иссякать запас АТР или же на- накапливается избыток продуктов его рас- распада, т. е. ADP и AMP (особенно AMP), активность фосфофруктокиназы возра- возрастает. И, напротив, фосфофруктокиназа ингибируется, когда в клетке оказывается достаточно АТР и другого клеточного «топлива», например цитрата или жирных кислот. О регуляторном дей- действии фосфофруктокиназы мы еще будем говорить ниже. г. Расщепление фруктозо-1,6-дифосфата Эта реакция катализируется фермен- ферментом, который называется фруктозоди- фосфаталъдолазой или просто альдола- зой. Фермент легко может быть выделен в кристаллическом виде из экстрактов мышц кролика. Катализируемая альдо- лазой реакция представляет собой обра- обратимую альдольную конденсацию (рис 15-3). Фруктозо-1,6-дифосфат обра- обратимо расщепляется с образованием двух триозофосфатов: глщералъдегид-3-фос- фата (альдозы) и дигидроксиацетонфос- фата (кетозы): О-фруктозо-1,6-дифосфат ^ ^± Дигидроксиацетонфосфат + + D-глицеральдегид-З-фосфат AG0' = + 5,73 ккал/моль. Альдолаза животных тканей не требует ионов Mg2 +, но у многих микроорганиз- микроорганизмов этот фермент содержит ионы Zn2 +. Хотя AG0' альдолазной реакции выра- выражается большой положительной величи- величиной, при внутриклеточных значениях рН и концентрации эта реакция может легко идти как в том, так и в другом направле- направлении. Продукты прямой реакции быстро удаляются (вовлекаются в дальнейшие превращения). д. Взаимопревращения триозофосфатов Из двух триозофосфатов, образую- образующихся в альдолазной реакции, только один, а именно глицеральдегид-3-фосфат способен подвергаться расщеплению в последующих реакциях гликолиза. Од- Однако дигидроксиацетонфосфат может легко и обратимо превращаться в глице- ральдегид-3-фосфат под действием пято- пятого фермента гликолитического пути триозофосфатизомеразы (рис. 15-3) Дигидроксиацетонфосфат ^ ^ D-глицеральдегид-З-фосфат AG0' = + 1,83 ккал/моль. Отметим, что в результате этой реакции 1-й, 2-й и 3-й углеродные атомы исходной глюкозы становятся неотличимыми со- соответственно от 6-го, 5-го и 4-го атомов (рис. 15-4). Этой реакцией завершается первая ста- стадия гликолиза. Таким образом, на первой стадии гликолиза молекула гексозы фос- форилируется по положениям 1 и 6, а за- затем расщепляется с образованием в ко- конечном счете двух молекул глицеральде- гид-3-фосфата. Ниже мы увидим, что и другие гексозы, например D-фруктоза, D-манноза и D-галактоза, также могут превращаться в глицеральдегид-3-фос- фат. 15.7. На второй стадии гликолиза запасается энергия Вторая стадия гликолиза (см. последо- последовательность реакций на рис. 15-5) вклю- включает реакции фосфорилирования, в ходе которых свободная энергия, содержав- содержавшаяся в исходной молекуле глюкозы, вы- высвобождается и запасается в форме АТР. Поскольку из одной молекулы глюкозы образуются две молекулы глицеральде- гид-3-фосфата, обе половины молекулы глюкозы на второй стадии гликолиза во-
ГЛ. 15. ГЛИКОЛИЗ ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ 449 Происходит от углеродного атома глюкочы: 1 2 3 Фруктото-1 ,6-дифосфат От какого углеродного атома глюкты происходит 4 ДигидрокгиаШ'Тон- фосфпт Глицеральдегид- 3-фосфат Триочофосфат — ичомерача Происходит от углеродных атомов глюкочы: Н 4и.Ч 5и2 6и 1 »С=О н—с—он Зснг— о—(р) ГлиЦеральдегид- 3-фосфат Последующие реакции гликолича Рис. 15-4. Судьба атомов углерода глюкозы при образовании глицеральдегид-3-фосфата. А. Альдолазная и триозофосфатизомеразная реакции. Б. В результате триозофосфатизоме- разной реакции две половины исходной моле- молекулы глюкозы превращаются в две молекулы глицеральдегид-3-фосфата. Каждый из трех атомов углерода глицеральдегид-3-фосфата ве- ведет свое происхождение от одного из двух атомов глюкозы, как это показано на рисун- рисунке. Нумерация атомов углерода глицеральде- гид-3-фосфата не совпадает с нумерацией ато- атомов углерода D-глюкозы. Об этом следует помнить при интерпретации результатов экспе- экспериментов с D-глюкозой, в которых метку несет только один из ее атомов углерода. влекаются в одни и те же реакции. Пре- Превращение двух молекул глицеральде- гид-3-фосфата в две молекулы пирувата сопровождается образованием четырех молекул АТР из ADP. Однако сум- суммарный выход АТР на одну расщеплен- расщепленную молекулу глюкозы равен всего лишь двум молекулам, поскольку на первой стадии гликолиза две молекулы АТР рас- расходуются на фосфорилирование моле- молекулы гексозы в положениях 1 и 6.
450 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Зсн2о—роГ iiJLr ОН D-глиперальде - | гия-3-фосфат C—Н II О NAD* *-. NADH + Н* D-глиЦеральдегид- фосфат дегидро - геназа 3СН2О- РОГ 2 I 3-фосфоглице- —С ОН роилфосфат 1с—о—роГ О ADP < Mg'\ Фосфоглицерат - АТР Зсн2о— Н-^С—ОН киназа 3-фосфо- глицграт Фосфоглицерат - мутача 3СНгОН Н—С—О—РОГ 2-фосфо- I глиио.рат 1СОО к-, Мц" It Енолаза СН2 СОО ADP ~> Фосфоеиол- пируват Пируваткиназа АТР СН3 С=О СОО NADH + H+ -к. NAD+ ' СН3 j_[ с—ОН L-лактат соо- Рис. 15-5. Вторая стадия гликолиза. Пируват Лактатдсгидро - геназа и. Окисление глицералъдегид-3-фосфата до 3-фосфог.шцероилфосфата Это первая из двух реакций гликолиза, которые ведут к запасанию энергии в форме АТР (рис. 15-5). Фермент глице- ралъдегидфосфатдегидрогеназакатализи- рует обратимую реакцию D-глицеральдегид-З-фосфат + + NAD+ + Р, ^± ^± 3-фосфоглицероилфосфат + + NADH + Н+ AG0' = + 1,5 ккал/моль. В результате этой сложной реакции аль- альдегидная группа D-глицеральдегид-З- фосфата окисляется, но при этом обра- образуется не карбоновая кислота, как можно было бы ожидать, а смешанный ангид- ангидрид фосфорной и 3-фосфоглицериновой кислот—3-фосфоглицероилфосфат. Тако- Такого типа ангидрид, называемый ацилфос- фатом, характеризуется очень высоким значением AG0 гидролиза (— 11,8 ккал/ /моль), т.е. относится к категории сверхвысокоэнергетических фосфорили- рованных соединений (разд. 14.9). Для второй фосфатной группы 3-фосфоглице- роилфосфата, т. е. для фосфатной группы в положении 3, стандартная свободная энергия гидролиза составляет всего около 3,2 ккал/моль. Таким образом, значительная часть свободной энергии, высвобождающейся при окислении аль- альдегидной группы глицеральдегид-3-фос- фата, сохраняется в высокоэнергетиче- высокоэнергетической фосфатной группе ацилфосфата (при С-1). Роль акцептора водорода в глицераль- дегидфосфатдегидрогеназной реакции играет кофермент NAD+ (рис. 15-6), представляющий собой окисленную фор- форму никотинамидаденинОинуклеотида, со- содержащего витамин никотинамид (разд. 10.6). При переходе NAD+ в восстанов- восстановленную форму (обозначается NADH; рис. 15-6) от альдегидной группы глице- ральдегид-3-фосфата в положение 4 ни- котинамидного кольца NAD+ перено- переносится ферментативным путем гидрид-
ГЛ. 15. ГЛИКОЛИЗ-ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ 451 О—I RH8 Рис. 15-6. А. Структура никотинамидаденин- динуклеотида в окисленной форме (NAD+). Б. Восстановление NAD+ путем переноса гид- гидрид-иона (: Н~) от субстрата RH2 в положение 4 никотинамидного кольца. См. также рис. 10-7. Рис. 15-7. А. Схема, поясняющая механизм действия глицеральдегид-3-фосфатдегидрогена- зы. Между субстратом и SH-группой в актив- активном центре фермента возникает ковалентная связь-образуется тиополуацеталь. Этот проме- промежуточный продукт, представляющий собой фермент-субстратный комплекс, окисляется за счет NAD+, который также связан с активным центром фермента; в результате образуется тиоэфир ковалентный промежуточный про- продукт, называемый ацилферментом. Связь меж- между ацильной группой и тиоловой группой фермента характеризуется очень высокой стан- стандартной свободной энергией гидролиза. На по- последнем этапе тиоэфирная связь претерпевает фосфоролиз, в результате чего происходит регенерация свободного фермента и образуется ацилфосфат, сохраняющий в себе значитель- значительную часть энергии, высвободившейся при окис- окислении альдегидной группы. Б. Иодацетат явля- является мощным ингибитором глицеральдегид- фосфатдегидрогеназы, потому что он образует ковалентную связь с важной функциональной SH-группой фермента и таким образом инак- тивирует фермент. conh2 NAD* NADH ион (:Н ), результатом чего оказывается восстановление в положениях 1 и 4. Вто- Второй водородный атом субстрата перехо- переходит при этом в среду в виде Н+ -иона. Уравнение, описывающее ферментатив- ферментативное восстановление NAD +, отражает это обстоятельство: Субстрат + NAD+ ^± ^± Окисленный субстрат + + NADH + Н + . Механизм действия глицеральдегид- фосфатдегидрогеназы довольно сложен (рис. 15.7). Сначала субстрат взаимодей- ™ Свободный фермент _ Глицеральдегид-3-фосфат (R—С—Н) О Н Тиополуацеталь, образующийся g I при ковалентном связывании - субстрата с сульфгидрильной группой фермента —С—R Ацилфгрмент (тиоэфир) V, (р)— С R З-Фю-фоглицвроилфогфат О * Регенерация свободного фермента (E>-SH Активный фермент 1СН2СОСГ Иодацетат I '"'S —СН2СОО" Неактивный фермент
452 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ ствует с SH-группой остатка цистеина, играющего важную роль в активном центре фермента. Затем фермент катали- катализирует перенос гидрид-иона от ковалент- но связанного субстрата на NAD +, так- также прочно связанный с его активным центром. В ходе этого процесса возни- возникает высокоэнергетический ковалентный ацилферментный комплекс. Этот комп- комплекс взаимодействует с неорганическим фосфатом, в результате чего образуется свободный 3-фосфоглицероилфосфат и регенерирует свободный фермент. NADH, образовавшийся в этой реакции, затем снова переходит в окисленную форму (NAD +), так что он может участ- участвовать в расщеплении многих молекул глюкозы до пирувата. Если бы такого ре- окисления NADH не происходило, то гликолиз быстро прекращался бы из-за исчерпания запаса NAD +, поскольку его количество в клетке невелико. Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа была выделена в кристаллическом виде из скелетных мышц кролика. Ее мол. масса равна 140000. Молекула фермента состоит из четырех идентичных субъеди- субъединиц. Каждая такая субъединица пред- представляет собой одну полипептидную цепь, содержащую около 330 аминокис- аминокислотных остатков. Глицеральдегидфос- фатдегидрогеназа ингибируется иодаце- татом (разд. 9.12), который связывает важную функциональную SH-rpynny фермента и тем самым лишает его возможности осуществлять катализ (рис. 15-7, Б). Обнаружение того, что иод- ацетат подавляет гликолиз, сыграло важную роль в истории изучения фер- ферментных систем (разд. 13.13). б. Перенос фосфатной группы от 3-фосфоглицероилфосфата на ADP Фермент фосфоглицераткиназа ката- катализирует перенос высокоэнергетической фосфатной группы от карбоксильной группы 3-фосфоглицероилфосфата на ADP с образованием АТР и 3-фосфогли- церата: 3-фосфоглицероилфосфат + Mg2+ + ADP ^± 3-фосфоглицерат + АТР AG0' = - 4,50 ккал/моль. Эта реакция гликолиза вместе с пред- предшествующей реакцией обеспечивает со- сопряжение энергии. Если написать подряд уравнения этих двух реакций, то сразу видно, что 3-фосфоглицероилфосфат играет здесь роль общего промежуточно- промежуточного продукта. Он образуется в первой ре- реакции, а во второй его высокоэнергетиче- высокоэнергетическая фосфатная группа переносится на ADP с образованием АТР: Глицеральдегид-3-фосфат + Р, + + NAD+ ^ ^± 3-фосфоглицероилфосфат + + NADH + Н+, 3-фосфоглицероилфосфат + + ADP ^± 3-фосфоглицерат +¦ АТР. Суммарное уравнение двух этих последо- последовательных реакций, сопряженных друг с другом благодаря наличию общего промежуточного продукта C-фосфогли- C-фосфоглицероилфосфата), имеет следующий вид: Глицеральдегид-3-фосфат + Р, + + ADP + NAD+ ^ ^± 3-фосфоглицерат + АТР + + NADH + Н+ AG0' = — 3,0 ккал/моль. Конечный результат этих двух реакций, обратимых в условиях клетки, заклю- заключается в том, что энергия, высвободив- высвободившаяся при окислении альдегидной группы до карбоксильной, оказывается запасенной благодаря сопряженному образованию АТР из ADP и фосфата. Та- Такое образование АТР, сопряженное с ферментативным превращением одно- одного из «субстратов», т. е. одного из проме- промежуточных продуктов метаболизма, на- например глицеральдегид-3-фосфата, назы-
ГЛ. 15. ГЛИКОЛИЗ ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ 453 вают фосфорилированием на уровне суб- субстрата. Ниже мы познакомимся и с другими примерами процессов этого типа. в. Превращение 3-фосфоглицерата в 2-фосфоглицерат Фермент фосфо1 лицератмутаза ката- катализирует обратимую реакцию переноса фосфатной группы из одного положения в другое в пределах молекулы субстрата Mg2* 3-фосфоглицерат ^± 2-фосфоглицерат AG0 = + 1,06 ккал/моль. Для этой реакции, в ходе которой фос- фосфатная группа переносится в молекуле глицерата из положения 3 в положение 2 (рис. 15-5), необходим Mg2 +. Название мутаза часто используют для обозначе- обозначения ферментов, катализирующих внутри- внутримолекулярные перемещения функцио- функциональных групп. г. Дегидратация 2-фосфоглицерата с образованием фосфоенолпирувата Это вторая реакций гликолиза, в ре- результате которой образуется высоко- высокоэнергетическое фосфорилированное со- соединение: фермент енолаза катализирует обратимую реакцию отщепления воды от 2-фосфоглицерата с образованием фосфоенолпирувата (рис. 15-5): Mg2 + 2-фосфоглицерат ^ соединения) эта величина равна прибли- приблизительно — 4,2 ккал, а для фосфоенолпи- фосфоенолпирувата (сверхвысокоэнергетического фос- форилированного соединения) она сос- составляет — 14,8 ккал (разд. 14.9). Общее содержание энергии в 2-фосфоглицерате и фосфоенолпирувате почти одинаково, однако отщепление молекулы воды от 2-фосфоглицерата вызывает перераспре- перераспределение энергии внутри молекулы. Этим перераспределением и объясняется тот факт, что гидролитическое отщепление фосфатной группы от молекулы фосфо- фосфоенолпирувата сопровождается гораздо большим снижением свободной энергии. Енолаза (мол. масса 85 000) была полу- получена в кристаллическом виде из несколь- нескольких источников. Для проявления ее ак- активности необходимы ионы Mg2 + , с которыми фермент образует комплекс, прежде чем присоединить субстрат. Для енолазы характерно ингибирование фто- фторидом (F ) в присутствии фосфата; ис- истинным ингибитором являются при этом ионы фторфосфата, связывающие ионы Mg2 + . д. Перенос фосфатной группы от фосфоенолпирувата на ADP Последним этапом гликолиза является перенос высокоэнергетической фосфат- фосфатной группы от фосфоенолпирувата на ADP (рис. 15-5). Эта реакция, катализи- катализируемая пируваткиназой, представляет со- собой еще один пример фосфорилирования на уровне субстрата. Продукт реакции пиру ват образуется в енольной форме: Фосфоенолпируват + ADP Mg2 ^± Фосфоенолпируват + Н2О AG° = + 0,44 ккал/моль. Несмотря на сравнительно небольшое изменение стандартной свободной энер- энергии в ходе данной реакции, величины AG0 гидролиза фосфатных групп исход- исходного вещества и продукта различаются очень сильно. Для фосфоглицерата (низ- (низкоэнергетического фосфорилировапного к+ Енолпируват + АТР, однако эта енольная форма быстро пере- переходит неферментативным путем в кето- форму, доминирующую при рН 7,0: Сн2=С— СОО — ¦ СН3—С—СОО- ОН Знолнируват О Кетоиируинт
454 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Равновесие этой реакции очень сильно сдвинуто вправо, и это в соответствии с законом действующих масс «тянет» вправо также и предшествующую пиру- ваткиназную реакцию. Суммарное урав- уравнение для пируваткиназной реакции и для неферментативного образования кетопирувата имеет вид Фосфоенолпируват + ADP + Mg2 + + Н Кетопируват + АТР AG° = — 7,5 ккал/моль. Эта суммарная реакция характеризуется очень большой отрицательной величи- величиной AG0', что в значительной мере обус- обусловливается спонтанным превращением енольной формы пирувата в кетоформу. Изменение стандартной свободной энер- энергии при гидролизе фосфоенолпирувата равно — 14,8 ккал/моль. Приблизитель- Приблизительно половина этой энергии запасается в форме ATP (AG0' = — 7,3 ккал/моль), а вторая половина (— 7,5 ккал/моль) сос- составляет ту мощную движущую силу, ко- которая резко смещает равновесие реакции вправо. В условиях клетки пируваткиназ- ная реакция практически необратима. Пируваткиназа была получена в кри- кристаллическом виде (мол. масса 250000). Для проявления ее активности необхо- необходимы ионы К+, а также Mg2 + или Mn2 +. Фермент этот принадлежит к чис- числу важных регуляторных ферментов, и о его действии мы еще будем говорить ниже. е. Восстановление пирувата до шктата Важная роль пирувата в катаболизме углеводов определяется тем, что это со- соединение лежи г в точке пересечения раз- различных катаболических путей. При аэробных условиях в животных тканях продуктом гликолиза является пируват, a NADH, образовавшийся в ходе окисле- окисления глицеральдегид-3-фосфата, реокис- ляется (т. е. снова превращается в NAD +) за счет молекулярного кислорода (гл. 17). Иначе обстоит дело в анаэробных усло- условиях, например в напряженно работаю- работающих скелетных мышцах или в клетках молочнокислых бактерий. В этих усло- условиях образовавшийся при гликолизе NADH реокисляется не за счет кислоро- кислорода (который отсутствует), а за счет пиру- пирувата. восстанавливающегося при этом в лактат. Электроны, перешедшие снача- сначала от глицеральдегид-3-фосфата на NAD + , переносятся в форме NADH на пируват. Восстановление пирувата ката- катализируется ферментом лактатдегидроге- назой; в результате лактатдегидрогеназ- ной реакции образуется L-изомер лакта- та: Пируват + NADH + Н+ ^ ^ L-лактат + NAD + AG0' = — 6,0 ккал/моль. Равновесие этой реакции сильно сдвину- сдвинуто вправо, о чем свидетельствует боль- большая отрицательная величина AG0'. При окислении двух молекул глицеральде- гид-3-фосфата, образующихся из каждой молекулы глюкозы, расходуются две мо- молекулы NAD + и синтезируются две мо- молекулы NADH. Поэтому регенерация двух молекул NAD+ в результате восстановления двух молекул пирувата до лактата означает, что NAD может ис- использоваться в процессе гликолиза многократно. Мы уже знаем (разд. 9.23), что лактат- дегидрогеназа представлена в большей части тканей пятью различными изофор- мами, отличающимися друг от друга по таким признакам, как величина Км для пирувата, число оборотов или Vmaii и сте- степень аллостерического ингибирования пируватом. Изофермент, присутствую- присутствующий в ткани сердца (его обозначают Н4), состоит из четырех идентичных полипеп- полипептидных цепей, принадлежащих к Н-типу. Он характеризуется низкой величиной Хм для пирувата и сильно выраженной способностью ингибироваться пирува- пируватом. Другая изомерная форма этого фер- фермента, содержащаяся в мышечной ткани (ее обозначают М4), характеризуется бо- более высокой величиной Км для пирувата, не ингибируется пируватом и по своей каталитической активности превосходит изофермент, выделенный из сердца.
ГЛ. 15. ГЛИКОЛИЗ-ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ 455 Предпринималось немало попыток с целью найти надлежащее объяснение функции и роли изоформ лактатдегидро- геназы в различных тканях, особенно в ткани сердца, скелетных мышцах и пе- печени. Тем не менее в этом вопросе и сей- сейчас еще много противоречий и споров. Роль изоформ лактатдегидрогеназы и двух генов, ответственных за их синтез, остается неясной. Был обнаружен лю- любопытный факт: у одного из обсле- обследуемых, 64-летнего мужчины, полностью отсутствовала (вследствие генетического дефекта) лактатдегидрогеназа «сердечно- «сердечного» типа; при этом у него не отмечалось ни нарушений сердечной деятельности, ни каких-либо нарушений метаболизма. Это наводит на мысль, что, быть может, не все клеточные ферменты или не все белки действительно необходимы; воз- возможно, среди них есть и рудиментарные, которые теперь уже не используются. ж. Полный баланс гликолиза Мы можем теперь составить полный баланс гликолиза, в котором будут уч- учтены: 1) судьба углеродного скелета глю- глюкозы, 2) путь электронов в окислительно- восстановительных реакциях и 3) расход ADP и фосфата в процессе гликолиза и выход АТР в расчете на одну расщеп- расщепленную молекулу глюкозы. В левой ча- части приведенного ниже уравнения ука- указаны все вещества, используемые в процессе гликолиза, т. е. АТР, Р„ ADP, NAD + , NADH и Н+ (см. рис. 15-4 и 15-5), а в правой части-все продукты гликолиза (напомним, что из каждой мо- молекулы глюкозы образуются две моле- молекулы глицеральдегид-3-фосфата): Глюкоза + 2АТР + 2Р; + 2NAD+ + + 2NADH + 2Н+ + 4ADP -> -> 2Лактат" + 2Н + + 4АТР + + 2Н2О + 2NADH +¦ 2Н+ + + 2NAD+ + 2ADP. Если мы теперь вычеркнем в правой и в левой частях уравнения одни и те же члены, то получим суммарное уравнение анаэробного гликолиза, протекающего в скелетных мышцах в условиях анаэро- анаэробиоза и при молочнокислом брожении: Глюкоза + 2Р; + 2ADP -> -> 2Лактат~ + 2Н+ + + 2АТР + 2Н2О. В результате этого процесса одна мо- молекула D-глюкозы превращается в две молекулы лактата (путь углерода). Две молекулы ADP и две молекулы фосфата превращаются в две молекулы АТР (путь фосфатных групп). Четыре электрона (в форме двух гидрид-ионов) переносятся с помощью двух молекул NAD + от двух молекул глицеральдегид-3-фосфата на две молекулы пирувата с образованием двух молекул лактата (путь электронов). Процесс гликолиза включает два окисли- гельно-восстановительных этапа, однако суммарного изменения степени окисле- окисления углерода в результате этого процесса не происходит. В этом можно убедиться, сравнив эмпирические формулы глюкозы (С6Н,2О6) и молочной кислоты (С3Н6О3). Легко видеть, что соотноше- соотношение атомов С, Н и О в молекулах двух этих соединений одинаково и, следова- следовательно, превращение глюкозы в молоч- молочную кислоту не сопровождается окисле- окислением углерода. Тем не менее при анаэробном гликолизе какая-то часть энергии, заключенной в молекуле глю- глюкозы, все же извлекается; этой энергии достаточно для того, чтобы обеспечить суммарный выход двух молекул АТР в расчете на каждую расщепленную мо- молекулу глюкозы. В аэробных условиях продуктом гли- колитического расщепления глюкозы оказывается не лактат, а пируват. В этих условиях NADH, образовавшийся в ре- результате окисления двух молекул глице- ральдегид-3-фосфата, вновь окисляется не за счет пирувата. Суммарное уравне- уравнение гликолиза в этом случае имеет вид Глюкоза + 2Р; + 2ADP + 2NAD + -> -> 2Пируват" + 2АТР + + 2NADH + 2Н+ + 2Н2О. Две молекулы NADH. образовавшиеся при гликолизе в цитозоле, в аэробных ус-
456 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ ловиях вновь окисляются до NAD +, от- отдавая свои электроны в цепь переноса электронов, которая в эукариотических клетках находится в митохондриях. Здесь электроны передаются в конечном счете на кислород, восстанавливая его до Н2О: 2NADH 2Н + О2 -> 2NAD+ 2Н2О. 15.8. Пути, ведущие от гликогена и других углеводов, к центральному гликолитическому пути Не только D-глюкоза, но и многие дру- другие углеводы вовлекаются после ряда преврашений в гликолиз, высвобождая заключенную в них энергию. Среди этих углеводов главную роль играют за- запасные полисахариды -гликоген и крах- крахмал, дисахариды - мальтоза, лактоза и сахароза и моносахариды -фруктоза, манноза и галактоза. Пути, по которым эти различные углеводы вступают на путь гликолиза, показаны на рис. 15-8. D-глюкозные единицы боковых цепей гликогена и крахмала вовлекаются в гли- гликолиз в результате последовательного действия двух ферментов - гликоген-фос- форилазы (или фосфорилазы крахмала у растений) и фосфоглюкомутазы. Глико- ген-фэсфорилаза, широко распростра- распространенная в животных клетках, катализи- катализирует изображенную ниже общую реак- реакцию, в которой (Глюкоза),, означает боковую цепь гликогена (или крахмала), Рис. 15-8. Вовлечение гликогена и различных гексоз в первую стадию гликолиза р.. 1 Фосфорилаэа иПР-галактоэа Глюкозо-1-фосфат • ' ПР-пюко ча Фосфоглюко- мутаза АТР * «1 КИН; АТР Фруктокиназа '1'руктоэо-1-фосфат Фру ктоэофосфат- Глюкочо- В-ф»сфат ¦I'pVKTO IU- fi-фосфат Ч'р\кточо-1,6-ди- фосфат Гексокинаэа Минн» vi-6-фос фат Фосфоманпо— иэочграза I иш-рл ь итид + Лигидрокси.щетон- фосфат АТР| Триозо- ^Триозофосфат- ^ киназа :1-фосфат
ГЛ. 15. ГЛИКОЛИЗ-ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ 457 состоящую из п D-глюкозных единиц, соединенных осA -»4)-связями, а (Глю- (Глюкоза^ _! -ту же боковую цепь, но толь- только укороченную на одно звено в ре- результате отщепления от ее конца одного остатка глюкозы (структуру гликогена и крахмала см. на рис. 11-15): (Глюкоза),, + Р,- -» (Глюкоза),, _! + + а-О-глюкозо-1-фосфат AG0' = + 0,73 ккал/моль. В условиях клетки, при относительно вы- высокой концентрации фосфата, гликоген- фосфорилазная реакция идет только в сторону распада гликогена и образова- образования глюкозо-1-фосфата. В этой реакции концевая ос A -» 4)-гликозидная связь на нередуцирующем конце боковой цепи Рис. 15-9. Удаление концевого остатка глюко- глюкозы на нередуцирующем конце одной из цепей гликогена под действием гликоген-фосфорила- зы. Этот процесс многократно повторяется, и остатки глюкозы отщепляются один за другим до тех пор, пока концевым не окажется ос- остаток, четвертый по счету от точки ветвления (см. текст). Обратите внимание на условное обозначение гидроксильных групп остатков глюкозы; водородные атомы, присоединенные к пиранозным кольцам, не показаны. Нередуцируюший конец гликогена претерпевает фосфоролиз: под действием фосфата от цепи отщепляется концевой остаток глюкозы с образова- образованием а-О-глюкозо-1-фосфата. Боковая цепь гликогена становится в результате этой реакции короче на одну глюкозную единицу (рис. 15-9). Гликоген-фосфори- лаза атакует нередуцирующие концы бо- боковых цепей гликогена многократно, до тех пор пока она не дойдет до точки, от- отстоящей на четыре глюкозные единицы от а A -» 6)-связи (рис. 11-15). Здесь ее действие прекращается. Для того чтобы расщепление гликоге- гликогена под действием гликоген-фосфорилазы могло продолжаться, на полисахарид должен предварительно подействовать другой фермент, ос A -> 6)-глюкозидаза. Этот фермент катализирует две реакции. В первой из них он отщепляет от цепи три глюкозных остатка из упомянутых четырех и переносит их на конец какой- нибудь другой внешней боковой цепи. Во второй реакции, катализируемой ос A -» -»6)-глюкозидазой, отщепляется че- четвертый глюкозный остаток, присоеди- присоединенный в точке ветвления осA -» -»6)-связью. Гидролиз осA -»6)-связи в точке ветвления приводит к образова- образованию одной молекулы D-глюкозы и от- Полисахаридная Цепь гликогена (Глюкоза) о- Гликоген- фосфорилаза Нередуцируюший конец СН2ОН СН2ОН -О J—О ¦о-Р-о- о Глюкозо-1-фосфат О Та же цепь, укороченная на один остаток (Глюкоза)
458 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ крывает для действия гликоген-фосфори- лазы новый участок цепи, состоящий из остатков глюкозы, соединенных а A -» -»4)-связями. Глюкозо-1 -фосфат - конечный продукт реакции, катализируемой гликоген-фос- форилазой (фосфорилазой крахмала), превращается в глюкозо-6-фосфат под действием фермента фосфоглюкомутазы. Этот фермент (он был выделен в чистом виде из многих источников) катализирует обратимую реакцию: Глюкозо-1-фосфат ^ ^ Глюкозо-6-фосфат AG0 = — 1,74 ккал/моль. 6СН2—О Рис. 15-10. a-D-глюкозо-1,6-дифосфат-один из кофакторов, необходимых для действия фос- фосфоглюкомутазы. Для действия фосфоглюкомутазы необ- необходим в качестве кофактора глюкозо-1,6- дифосфат (рис. 15-10). Роль этого кофак- кофактора станет ясной, если учесть промежу- промежуточные этапы действия фермента. Из приведенной ниже последовательности реакций видно, что фермент пребывает попеременно в одной из двух форм - фос- форилированной и нефосфорилирован- ной, или дефосфорилированной: Фосфофермент + + Глюкозо-1-фосфат ^± ^± Дефосфофермент + + Глюкозо-1,6-дифосфат Глюкозо-1,6-дифосфат + + Дефосфофермент ^± ^± Фосфофермент + + Глюкозо-6-фосфат Суммарное уравнение: Глюкозо-1-фосфат ^± ^± Глюкозо-6-фосфат Фосфоглюкомутаза примечательна и еше в одном отношении: этот фермент является представителем обширного класса ферментов, у которых в активном центре присутствует остаток серина, не- необходимый для каталитической активно- активности. Именно этот остаток серина уча- участвует во взаимодействии с глюкозо-1,6- дифосфатом - его гидроксильная группа этерифицируется фосфорной кислотой. Ферменты серинового класса (рис. 9-12), к которым принадлежит и фосфоглюко- фосфоглюкомутаза, необратимо ингибируются неко- некоторыми органическими фосфатами, таки- такими, как, например, диизопропилфторфос- фат. При этом ингибиторы взаимодей- взаимодействуют с гидроксильной группой упомя- упомянутого остатка серина, в результате чего образуется фосфорилированное про- производное фермента, лишенное каталити- каталитической активности (рис. 9-10). 15.9. В гликолиз могут вовлекаться и другие простые сахара В животном организме гликолизу под- подвергается не только глюкоза, но и другие моносахариды, которые после соответ- соответствующих превращений тоже могут рас- расщепляться и высвобождать заключенную в них энергию (рис. 15-8). D-фруктоза, присутствующая в сво- свободном виде во многих фруктах и обра- образующаяся в тонком кишечнике из саха- сахарозы (называемой также тростниковым или свекловичным сахаром), может фос- форилироваться в присутствии гексоки- назы, которая действует на большое чис- число различных гексоз: D-фруктоза + АТР > > D-фруктозо-б-фосфат + + ADP + Н + . Таков главный путь включения фруктозы в гликолиз в мышечной ткани и в почках.
ГЛ. 15. ГЛИКОЛИЗ-ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ 459 НО—СН2 n iCH2—О—Р—О" о он Рис. 15-11. а-О-фруктозо-1-фосфат-промежу- а-О-фруктозо-1-фосфат-промежуточный продукт на пути превращения фрукто- фруктозы в глицеральдегидфосфат. В печени, однако, для этого существует другой путь. Присутствующая здесь фруктокиназа катализирует фосфорили- рование фруктозы не по 6-му, а по 1-му атому углерода (рис. 15-11): D-фруктоза + АТР > > О-фруктозо-1-фосфат + Ч ADP + Н + . Затем под действием алъдолазы фрукто- зо-1-фосфат расщепляется с образова- образованием D-глицеральдегида и дигидроксиа- цетонфосфата: О-фруктозо-1-фосфат ^ ^ D-глицеральдегид + + Дигидроксиацетонфосфат. Дигидроксиацетонфосфат является, как известно, одним из промежуточных про- продуктов гликолиза, превращающимся в глицеральдегид-З-фосфат. Другой про- продукт изображенной выше реакции, D-глицеральдегид, фосфорилируется под действием фермента триозокиназы за счет АТР, что также приводит к глице- ральдегид-3-фосфату: D-глицеральдегид + АТР * Mg2 + > D-глицеральдегид-З-фосфат + + ADP + Н + . Таким образом, в печени из молекулы D-фруктозы образуются две молекулы глицеральдегид-3-фосфата. D-галактоза, образующаяся в резуль- результате гидролиза дисахарида лактозы (мо- (молочного сахара) сначала фосфорилирует- фосфорилируется по 1-му атому углерода под действием фермента галактокиназы за счет АТР: АТР + D-галактоза > > О-галактозо-1-фосфат + + ADP + Н + . Продукт этой реакции, О-галактозо-1- фосфат, превращается в свой С4-эпимер, т.е. в О-глкжозо-1-фосфат. Превращение осуществляется в несколько этапов (рис. 15-12). В этих реакциях принимает участие уридиндифосфат (UDP), функ- функционирующий в качестве переносчика гексозных групп наподобие кофермента. В печени человека галактозо-1-фосфат взаимодействует с UDP-глюкозой, что приводит к образованию UDP-D-галак- тозы и глюкозо-1-фосфата. Эту реакцию катализирует фермент иОРглюкоза: a-D-галактозо- 1-фосфат уридилилтранс- фераза. Остаток галактозы в молекуле UDP-D-галактозы претерпевает затем катализируемую ферментом 1ЮРглюко- за-эпимеразой (рис. 15-12) эпимериза- цию при 4-м углеродном атоме, в резуль- результате чего образуется UDP-D-глкжоза. иОРглюкоза-пирофосфорилаза катали- катализирует расщепление UDP-глкжозы с образованием О-глюкозо-1-фосфата, который под действием фосфоглюкому- тазы превращается в глюкозо-6-фосфат. Эта последовательность реакций ответ- ответственна не только за превращение D-ra- лактозы в D-глюкозу; она же использует- используется и для обратного процесса-для синте- синтеза D-галактозы в молочных железах (где D-галактоза необходима для образова- образования лактозы, или молочного сахара). Важная роль UDP в качестве переносчи- переносчика гликозильных групп выявлена благо- благодаря работам аргентинского биохимика Луиса Лелуара. Позже мы познакомимся с другими метаболическими путями, где промежуточными продуктами служат также UDP-производные Сахаров. При одной из самых обычных форм та- такого врожденного нарушения обмена.
460 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Полная последовательность реакций снаон IЧ-акция, катализируемая II DP глюкоза-4-эпимрразой НО /н VOH н н ATP Н D-галактиза ОН ОН Галактокинаэа D-галактоэо-! -фосфит СН2ОН ШР-гчюкоза - Глюкозо- 1-фосфат ШРглюкоза: a-D- галактоэо-1-фогфат уридилилтрансфераэа UDP-П-галактоза ЦшРглю- коза-4-чпи "мераза rDP-D-глюкоза РР« N ШРглюкоза- D-глкжозо-! -фосфат О О—Р—О—Р—О о I О—I DDP-галактоза ОН ОН 1ЮРглюкоза- 4-эпимераза (NAD) СН2ОН о. о Фосфоглюкомутаза D-глюкочо-б-фосфат Рис. 15-12. А. Путь превращения D-галактозы в D-глюкозу. Б. Более подробное изображе- изображение иОРглюкоза-4-эпимеразной реакции (на рис. А этот этап выделен рамкой). NAD, который необходим ферменту, катализи- катализирующему взаимопревращение UDP-глюкозы и UDP-галактозы, по-видимому, принимает два водорода от четвертого углеродного атома остатка глюкозы, а затем возвращает их с образованием эпимера по четвертому атому углерода. Недостаточность фермента иОРглюкоза: а-О-галактозо-1-фосфат-уридилилтрансферазы обусловливает галактоземию наследственное заболевание человека, проявляющееся в раннем детстве. Поскольку превращение галактозы в глюкозу при этом нарушено, галактоза и га- лактозо-1-фосфат, образующиеся при перевари- переваривании лактозы, накапливаются в тканях, вызы- вызывая повреждения мозга и печени, а также помутнение хрусталика (катаракту). Свободная галактоза обнаруживается в значительных ко- количествах также и в крови. Одна из более легких форм галактоземии вызывается недос- недостаточностью галактокиназы. ~О—Р—О—Р—О О II I О О—СН2 ИПР-глкжоза ОН ОН как галактоземия, в организме человека вследствие генетической аномалии отсут- отсутствует фермент иОРглюкоза: a-D-галак- тозо- 1-фосфат уридилилтрансфераза. Превращение D-галактозы в D-глюкозу оказывается в таком случае невоз- невозможным. Из-за нарушения способности организма метаболизировать D-галакто- зу и D-галактозо-1-фосфат эти соедине- соединения накапливаются в крови и в тканях. При этом печень и некоторые другие ор- органы увеличиваются, ухудшается зрение из-за помутнения хрусталика (катаракта) и задерживается умственное развитие. Поскольку главным источником D-га- D-галактозы служит лактоза молока, это врожденное нарушение обмена про- проявляется в детском возрасте. Проявления галактоземии могут быть существенно смягчены, если устранить из рациона мо-
ГЛ. 15. ГЛИКОЛИЗ-ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ 461 локо и молочные продукты. Другие формы галактоземии наблюдаются при генетических аномалиях, обусловливаю- обусловливающих недостаточность галактокиназы или иОРглюкоза - 4-эпимеразы. D-манноза, которая образуется при переваривании различных полисахари- полисахаридов и гликопротеинов, содержащихся в пище, фосфорилируется по положению 6 под действием фермента гексокиназы: D-манноза + АТР > Mg2 + -» D-маннозо-б-фосфат + + ADP + Н + . Затем фосфоманноизомераза катализи- катализирует изомеризацию D-маннозо-б-фосфа- та с образованием D-фруктозо-б-фосфа- та, который принадлежит к числу проме- промежуточных продуктов гликолиза: D-маннозо-б-фосфат ^ D-фруктозо-б- фосфат. На рис. 15-8 изображены все эти пути, по которым различные сахара напра- направляются на центральный гликолитиче- ский путь. 15.10. Дисахариды должны предварительно подвергнуться гидролизу до моносахаридов Дисахариды сами по себе не способны включаться в гликолиз. Если, например, ввести их непосредственно в кровь, то они не будут утилизироваться. Для того чтобы организм мог использовать содер- содержащиеся в пище дисахариды, они дол- должны сначала подвергнуться фермента- ферментативному гидролизу в клетках, выстилаю- выстилающих тонкий кишечник, т.е. должны расщепиться до тех гексозных единиц, из которых они состоят: Мальтоза + Мальтаза + Н,О —» D-глюкоза + + D-глюкоза Лактоза + Лактаза + Н2О > D-галактоза + + D-гшокоза Сахароза + Сахараза + Н2О » D-фруктоза + + D-глюкоза Образовавшиеся простые сахара всасы- всасываются затем в кровь и поступают в пе- печень, где они фосфорилируются и превра- превращаются в промежуточные продукты гликолиза, как описано выше. Непереносимость лактозы (разд. 11.5 и 24.1, а) у некоторых групп населения (исключение в этом смысле составляют жители Северной Европы и некоторых районов Африки) связана с полным или частичным исчезновением у взрослых людей лактазной активности в клетках кишечного эпителия. У таких людей лак- лактоза в кишечнике полностью не перева- переваривается и не всасывается, что вызывает у них поносы. Проблема эта не слишком серьезна, поскольку в тех районах, где распространена непереносимость лак- лактозы, взрослые люди не употребляют в пищу молока. Какой-либо связи между непереносимостью лактозы и галактозе- мией не обнаружено; непереносимость лактозы встречается очень часто, тогда как галактоземия - заболевание крайне редкое. 15.11. Вовлечение остатков глюкозы в процесс гликолиза регулируется Скорости главных катаболических ре- реакций, обеспечивающих расщепление глюкозы и извлечение химической энер- энергии в форме АТР, в каждый данный мо- момент регулируются в соответствии с по- потребностями клетки в АТР независимо от того, как будет затем этот АТР ис- использоваться-в биосинтетических реак- реакциях, для активного переноса веществ или для механической работы в сократи- сократительных структурах. Поскольку про- продукты расщепления глюкозы играют важную роль и в качестве предшествен- предшественников, и как промежуточные продукты других метаболических процессов, регу- ляторные ферменты катаболизма углево- углеводов распознают также соответствующие сигналы других метаболических путей и отвечают на эти сигналы. Теперь мы
462 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ познакомимся с теми регуляторными ферментами, которые регулируют ско- скорость расщепления углеводов на глико- литическом пути. Рассмотрим прежде всего, как регули- регулируется само вступление остатков глю- глюкозы на путь гликолиза. Вовлечение глю- козных остатков в процесс гликолиза обеспечивают две важные реакции, и обе эти реакции контролируются регуля- регуляторными ферментами. Первая такая ре- реакция-это катализируемое гексокиназой фосфорилирование свободной глюкозы в положении 6 за счет АТР. В некоторых тканях, например в скелетных мышцах, гексокиназа функционирует как аллосте- рический фермент и ингибируется про- продуктом реакции глюкозо-6-фосфатом, как это показано на рис. 15-13. Всякий раз, когда концентрация глюкозо-6-фос- фата в клетке сильно возрастает, т. е. ког- когда он образуется быстрее, чем потреб- потребляется, наступает ингибирование-гек- ингибирование-гексокиназа под действием глюкозо-6-фос- фата выключается и дальнейшего фосфо- рилирования глюкозы не происходит до тех пор, пока избыток глкжозо-6-фосфа- та не будет использован. В печени, одна- однако, преобладает другой фермент-глю- кокиназа, который не ингибируется глю- козо-6-фосфатом (разд. 15.6,а). Поэтому в печени, способной хранить большие ко- количества гликогена, избыточная глюкоза крови может фосфорилироваться с обра- образованием глюкозо-6-фосфата, который затем через глюкозо-1-фосфат превра- превращается в гликоген, т. е. в запасной поли- полисахарид. При повышении концентрации глюкозы в крови гормон инсулин, выде- выделяемый поджелудочной железой в кровь, стимулирует синтез глюкокиназы. При диабете и во время голодания глюко- киназная активность понижена. Во второй реакции, поставляющей глюкозные остатки для процесса глико- гликолиза, субстратом служит гликоген. Эта реакция катализируется гликоген-фосфо- рилазой, которая также представляет со- собой регуляторный фермент. Как в печени, так и в мышцах гликоген-фосфорилаза занимает стратегически важную пози- позицию между резервуаром топлива-глико- топлива-гликогеном и гликолитической системой, на- Глюкоза Гексокиназа^^ Ч _.Г6Ф I Ф6Ф Фосфофруктокиназа Гликоген р] ф Фосфорилаза а у, Фосфорилаза Ь за, ФДФ I ТФ Нитрат *--— АТР NADH ЗФГ 1 2ФГ I ФЕП Пируваткинаэа^ Жирные Т1^"^ Т™ кислоты J4 Цикл Нитр;гг лимонной кислоты СО Рис. 15-13. Механизм, с помощью которого регулируется включение остатков глюкозы в процесс гликолиза и расщепление их на этом пути. Регуляторное ингибирование обозначено красными прерывистыми стрелками, указываю- указывающими на блокируемый этап (красная полоска поперек стрелки, показывающей направление реакции); регуляторное стимулирование обо- обозначено красными жирными стрелками, парал- параллельными стрелкам, показывающим направле- направление реакции. Г1Ф-глюкозо-1-фосфат; Г6Ф- глюкозо-6-фосфат; Ф6Ф-фруктозо-6-фосфат; ФДФ - фруктоэо-1,6-лифосфат; ТФ - три озофос- фат; ЗФГ-3-фосфоглицерат; 2ФГ-2-фосфо- глицерат; ФЕП-фосфоенолпируват. значение которой состоит в использова- использовании топлива. В скелетных мышцах этот фермент присутствует в двух формах-в каталитически активной фосфорилиро- ванной форме (фосфорилаза а) и в значи-
ГЛ. 15. ГЛИКОЛИЗ ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ 463 Рис. 15-14. Регуляция активности гликоген- фосфорилазы. Молекула этого фермента сос- состоит из двух субъединиц. В каждой из них имеется важный для каталитической активно- активности остаток серина. По гидроксильной группе этого остатка серина обе субъединицы фермен- фермента фосфорилируются под действием киназы фосфорилазы, в результате чего образуется фосфорилаза а. Эта реакция стимулируется ионами Са2+. Дефосфорилирование фосфори- фосфорилазы а подавляется ионами Са2+ и AMP. Фосфорилаза Ь может активироваться также в результате нековалентного связывания AMP в аллостерических участках молекулы фермен- фермента. Конформационные изменения, которые пре- претерпевает фермент, представлены здесь в схе- схематическом виде. 2Н2О Фоефатаэи фосфорилазы тельно менее активной дефосфорилиро- ванной форме (фосфорилаза Ъ). Фосфори- Фосфорилаза а была получена в кристаллическом виде (мол. масса 190000). Ее молекулы состоят из двух идентичных субъединиц, каждая из которых содержит суще- существенный для каталитической активности остаток серина в фосфорилированной форме (рис. 15-14). Скорость превраще- превращения структурных единиц гликогена в глюкозо-1-фосфат регулируется в мыш- мышцах соотношением активной фосфори- фосфорилазы а и менее активной фосфорилазы Ъ. Взаимопревращения двух этих форм гликоген-фосфорилазы происходят под действием специфичных ферментов, ка- катализирующих процесс ковалентной мо- модификации (разд. 9.22) фосфорилазы. Фосфорилаза а превращается в менее ак- активную фосфорилазу Ъ под действием фермента, называемого фосфатазой фос- фосфорилазы а; этот фермент, катализируя гидролитический разрыв связей, удаляет из молекулы фосфорилазы а фосфатные группы, необходимые для каталитиче- каталитической активности (рис. 15-14). Фосфорила- Фосфорилаза Ъ вновь превращается в активную фос- фосфорилазу а под действием фермента, называемого киназой фосфорилазы Ъ; он катализирует реакцию, в ходе которой АТР фосфорилирует остатки серина в ак- активном центре молекулы фосфорилазы Ь, что и приводит к образованию фосфори- фосфорилазы а. Таким образом, благодаря дей- действию двух ферментов, фосфатазы фос- фосфорилазы а и киназы фосфорилазы Ь, соотношение активной фосфорилазы а и сравнительно мало активной фосфори- Фосфорилаза а (активная форма) ADP \ Киинчц фосфорилазы Ковалентная АТР модификация Т снг у Аллостеричегкнр участки нр заполнены AMP ОН Фосфорилаза Ь (неактивная форма) -AMP Псков алентная модификация ОН I сн2 / AMP AMP С аллостери- ческими участ- участками связан ЛМР Фосфорилаза b (активная форма) лазы Ъ в клетке может изменяться. В мышцах действует второй механизм регуляции гликоген-фосфорилазной ак- активности. Фосфорилаза Ъ, сравнительно мало активная форма, может становить- становиться более активной в результате некова- нековалентного связывания с аллостерическим модулятором этого фермента, которым является AMP; концентрация же AMP в мышцах возрастает по мере распада АТР в сократительных системах (рис. 15-14, см. также разд. 14.17). Акти- Активации фосфорилазы Ъ под действием AMP препятствует АТР, выступающий в роли отрицательного модулятора. Та- Таким образом, активность фосфорилазы
464 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Ъ определяется соотношением AMP и АТР. В отличие от фосфорилазы Ъ фос- форилаза а не активируется AMP; поэто- поэтому фосфорилазу а называют иногда АМР-независимой формой, а фосфори- фосфорилазу Ь-АМР-зависимой. Итак, есть два механизма регуляции, которым подчи- подчиняется гликоген-фосфорилаза скелетной мышцы: 1) ковалентная модификация посредством фосфорилирования или де- фосфорилирования остатков серина в ак- активном центре фермента и 2) аллостери- ческая регуляция фосфорилазы h путем нековалентного связывания с AMP или АТР. В покоящейся мышце почти вся фосфорилаза находится в неактивной, или Ь-форме, поскольку в такой мышце концентрация АТР гораздо выше, чем концентрация AMP. 15.12. Взаимопревращения фосфорилазы а и фосфорилазы Ъ регулируются в конечном счете гормонами Выше мы видели, что взаимопревра- взаимопревращения фосфорилазы а и фосфорилазы b в мышцах осуществляются под дей- действием двух ферментов-фосфатазы фос- фосфорилазы а и киназы фосфорилазы Ъ. Их совместное действие и определяет в ито- итоге соотношение фосфорилаз а и Ъ, а сле- следовательно, и скорость расщепления гли- гликогена с образованием глюкозо-1-фосфа- та. Естественно задать вопрос: а чем же в свою очередь регулируется активность фосфатазы фосфорилазы и киназы фос- фосфорилазы? Позднее мы ответим на этот важный вопрос более подробно (гл. 25), сейчас же скажем только, что если организм оказы- оказывается внезапно в критической ситуации, то мозговое вещество надпочечника вы- выделяет в кровь гормон адреналин, ко- который служит молекулярным сигналом для печени и мышц. Под влиянием этого сигнала печень включает свою гликоген- фосфорилазу, в результате чего повы- повышается уровень глюкозы в крови, т.е. мышцы получают топливо. Этот же сиг- сигнал включает в скелетных мышцах расщепление гликогена с образованием лактата, благодаря чему усиливается образование АТР, требующегося для преодоления критической ситуации. Че- Через длинный ряд последовательных реак- реакций (их мы рассмотрим позже) адреналин в конце концов стимулирует активность киназы фосфорилазы Ь, так что отноше- отношение фосфорилазы а к фосфорилазе Ъ ре- резко возрастает. Когда напряжение сни- снимается и адреналин перестает выделять- выделяться в кровь, активность киназы фосфори- фосфорилазы Ъ возвращается к своему исходно- исходному, более назкому, уровню; соответ- соответственно возвращается к норме также и отношение фосфорилазы а к фосфори- фосфорилазе b (гл. 25). В печени гликоген-фосфорилаза также присутствует в а- и b-форме; в принципе ферменты печени функционируют подоб- подобно мышечным, от которых они, впрочем, несколько отличаются по своей структу- структуре и регуляторным свойствам. Расщепле- Расщепление гликогена в печени имеет иное назна- назначение, нежели в мышцах; этот процесс служит источником свободной глюкозы крови. Под действием фосфорилазы пе- печени образуется глюкозо-1-фосфат, ко- который затем превращается в глюкозо-6- фосфат, являющийся уже непосред- непосредственным предшественником свободной глюкозы. Реакция, в ходе которой обра- образуется D-глюкоза крови, катализируется ферментом глюкозо-6-фосфатазой: D-глюкозо-б-фосфат + Н2О -» -> D-глюкоза + Р/. Таким образом, вызываемая в печени действием адреналина стимуляция обра- образования фосфорилазы а из фосфорилазы b приводит к повышению концентрации глюкозы в крови и тем самым подготав- подготавливает организм к преодолению критиче- критической ситуации. О распаде и синтезе гли- гликогена и о регуляции этих процессов мы еще будем говорить более подробно (гл. 20 и 25). 15.13. Сама последовательность гликолитических реакций регулируется на двух главных этапах Скорость гликолиза регулируется не только за счет вовлечения в этот процесс
ГЛ. 15. ГЛИКОЛИЗ-ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ 465 свободной глюкозы или же глюко- зильных остатков гликогена, как это опи- описано выше; биологическому контролю подчиняется и сама последовательность реакций на пути от глюкозо-6-фосфата до пирувата. В этой последовательности имеются два главных регулируемых эта- этапа: один из них катализируется фосфо- фруктокиназой, а другой -пируваткина- зой. Фосфофруктокиназа (ФФК)-это сложный аллостерический фермент, управляемый многими положительными и отрицательными модуляторами. Меха- Механизмам его регуляции (у разных клеток различным) посвящены десятки научных статей. В скелетных мышцах активность фосфофруктокиназы определяется кон- концентрациями субстратов этого фермента (АТР и фруктозо-6-фосфата) и его про- продуктов (ADP и фруктозо-1,6-дифосфата); все эти соединения играют роль аллосте- рических регуляторов. Очень важны так- также в качестве регуляторов AMP, цитрат, ионы Mg2 +, фосфат и некоторые другие метаболиты, присутствующие в мышеч- мышечной ткани (табл. 15-1). Однако, хотя регу- регуляции ФФК зависит от сложного взаимо- взаимодействия ряда факторов, главными отри- отрицательными модуляторами этого фер- фермента являются АТР и цитрат, а самыми активными положительными модулято- модуляторами-AMP и фруктозо-1,6-дифосфат. Всякий раз, когда при очень активном мышечном сокращении концентрация АТР падает, а энергии требуется больше, фосфофруктокиназная активность усили- усиливается, даже если концентрация фрукто- зо-6-фосфата очень низка (об этом свиде- свидетельствует тот факт, что зависимость Таблица 15-1. Некоторые аллостерические активаторы и ингибиторы фосфофруктокиназы Активаторы Ингибиторы AMP ATP Фруктозо-1,6-дифосфат Цитрат ADP Mg2 + Фосфат, К+ Са2 + скорости реакции от концентрации описывается гиперболой; рис. 15-15, А). Если, однако, уровень АТР в клетке уже высок по сравнению с уровнем ADP и AMP, то кажущееся сродство фосфо- фосфофруктокиназы к фруктозо-6-фосфату сильно снижается (на это указывает S- образная форма кривой на рис. 15-15, X). В этом случае фосфофруктокиназа будет катализировать реакцию лишь при срав- сравнительно высокой концентрации фрукто- зо-6-фосфата. Цитрат, один из промежу- промежуточных продуктов цикла лимонной кис- кислоты, усиливает ингибирование фосфо- фосфофруктокиназы высокими концентрация- концентрациями АТР. В то же время повышение кон- концентрации AMP, образующегося в ре- результате аденилаткиназной реакции в сокращающейся мышце (см. рис. 14-17), служит очень мощным стиму- стимулирующим модулятором и противо- противодействует ингибирукЗщему влиянию АТР на фосфофруктокиназную реакцию (рис. 15-15, Б). В результате всех этих сложных аллостерических взаимодей- взаимодействий скорость реакции, катализируемой фосфофруктокиназой, возрастает иногда в сотни раз при переходе скелетной мышцы из состояния покоя к состоянию максимальной активности. Вторым регулируемым этапом глико- гликолиза является пируеаткиназная реакция. Пируваткиназа также принадлежит к числу аллостерических ферментов. Этот фермент встречается по меньшей мере в трех изоформах (разд. 9.23), ко- которые отличаются друг от друга по рас- распределению в тканях и по реакции на раз- различные модуляторы. При высоких кон- концентрациях АТР кажущееся сродство пируваткиназы к фосфоенолпирувату сравнительно невелико и соответственно невелика скорость пируваткиназной ре- реакции при обычных концентрациях фос- фоенолпирувата. Пируваткиназу ингиби- руют также ацетил-СоА и высокомолеку- высокомолекулярные жирные кислоты - соединения, играющие важную роль в качестве топ- топлива для цикла лимонной кислоты. Та- Таким образом, когда в клетке уже велика концентрация АТР или когда в ней уже достаточно топлива для процесса дыха- дыхания, обеспечивающего клетку энергией, 4-950
466 ЧАСТЬ П. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Низкая [ АТР] [ Фруктоэо-6-фосфат] » А гликолиз ингибируется за счет либо фос- фофруктокиназы, либо пируваткиназы (в зависимости от условий). В то же время при низких концентрациях АТР кажущее- кажущееся сродство пируваткиназы к фосфоенол- пирувату возрастает, и это позволяет ферменту переносить фосфатные группы от фосфоенолпирувата на ADP даже при относительно низкой концентрации фос- фосфоенолпирувата. Некоторые аминокис- аминокислоты также действуют как модуляторы пируваткиназной активности, главным образом в печени. Во всех клетках гликолиз регулируется с очень высокой эффективностью, напо- напоминающей действие компьютера, а пото- потому изменения концентрации различных метаболитов могут влиять на его общую скорость. Столь сложная регуляция не должна вызывать у нас удивление, по- поскольку гликолиз-древнейший катабо- лический путь, занимающий центральное место в метаболизме. 15.14. Каким образом можно выявить регулируемые этапы гликолиза в интактных клетках ? Различные регуляторные эффекты на таких аллостерических ферментах, как фосфофруктокиназа, легко можно на- наблюдать в пробирке в опытах с очи- очищенными ферментными препаратами. Возникает, однако, естественный вопрос: откуда, в сущности, нам известно, что и Высокая [AMP] Без AMP [ Фруктозо-1,6-дифосфат] — Б Рис. 15-15. Некоторые факторы, от которых зависит аллостерическая регуляция фосфофрук- токиназы мыши. А. Влияние концентрации АТР и фруктозо-6-фосфата на скорость фос- фофруктокиназной реакции. При низких кон- концентрациях АТР величина Кщ фосфофруктоки- начы для фруктозо-6-фосфата сравнительно не- невелика, и потому этот фермент даже при от- относительно низких концентрациях фруктозо-6- фосфата может функционировать с большой скоростью. При высоких концентрациях АТР Км фермента для фруктозо-6-фосфата резко возрастает, о чем свидетельствует S-образная форма кривой. Б. Влияние AMP, цитрата и фруктозо-1,6-дифосфата. Фруктозо-1,6-дифос- фат является мощным активатором, но для максимальной стимуляции ему требуется при- присутствие AMP. Цитрат же действует как мощ- мощный ингибитор. Здесь представлены лишь немногие из тех сложных взаимодействий, которые могут иметь место между многочисленными аллосте- рическими модуляторами фосфофруктокиназы. фосфофруктокиназная реакция предста- представляет собой один из главных регули- регулируемых этапов гликолиза в интактных клетках? Получить ответ на этот вопрос позволяют измерения, показывающие, как в интактных клетках или тканях из- изменяются концентрации различных про- промежуточных продуктов гликолиза при изменении скорости этого процесса. Обратимся вновь к рис. 15-13. Предста- Представим себе, что мы имеем дело с покоящей- покоящейся мышцей и что гликолиз на всем пути от глюкозо-6-фосфата до пирувата про- протекает в ней с постоянной скоростью, так что и концентрации всех его промежу- промежуточных продуктов тоже постоянны, т.е.
ГЛ. 15. ГЛИКОЛИЗ-ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ 467 поддерживается стационарное состояние. Попробуем теперь внезапно ингибиро- вать фосфофруктокиназную реакцию. При этом резко повысится концентрация ее субстрата, т.е. фруктозо-6-фосфата, который станет накапливаться, и пони- понизится концентрация продукта этого фер- фермента, фруктозо-1,6-дифосфата, а также всех последующих промежуточных про- продуктов гликолиза, поскольку их превра- превращение в пируват будет продолжаться с той же скоростью, что и раньше. Этап, на котором происходит превращение фруктозо-6-фосфата во фруктозо-1„6-ди- фосфат и о котором известно, что кон- концентрация первого из этих веществ воз- возрастает, а второго-снижается, если фос- фофруктокиназа ингибируется, может служить конкретным примером пункта перекреста. Пункт перекреста является тем местом, в котором осуществляется регуляция данной ферментной системы при ее переходах из состояния покоя в со- состояние активности и обратно. Рис. 15-16 поясняет роль пункта перекреста с по- помощью аналогии на модели гидравличе- гидравлической системы. Измеряя концентрации различных промежуточных продуктов какого-либо метаболического пути и вы- выясняя, как изменяются эти концентрации в ответ на изменение общей скорости данного метаболического пути в интакт- ной ткани, мы можем таким способом установить, какие именно из реакций это- этого метаболического пути регулируются. С помощью этого методического подхо- подхода было установлено, что главным регу- ляторным этапом гликолиза в скелетных мышцах, мозге и прочих тканях является фосфофруктокиназная реакция. Для того чтобы определить и сравнить концентра- концентрации всех промежуточных продуктов дан- данного пути в покоящихся и в стимулиро- стимулированных клетках, пользуются следующим способом. Клетки или ткани быстро за- замораживают в жидком азоте и тем самым подавляют в них ферментатив- ферментативную активность (этот метод получил на- название «фиксация замораживанием»). Затем из замороженной ткани экстраги- экстрагируют промежуточные продукты с по- помощью какого-нибудь кислого реактива, который вызывает денатурацию и инак- А Работающая мышца Г^| Г6Ф Ф6Ф Ф1Ф ТФ ЗФГ Пируват В Мышца в состоянии покоя Г6Ф ФСФ Ф 1Ф ТФ ЗФГ Пирунаг П,\нкг перекреста Рис. 15-16. Гидравлическая модель, поясняю- поясняющая роль пункта перекреста в регуляции гли- гликолиза, протекающего в мышце. Измерение концентраций последовательных промежуточ- промежуточных продуктов гликолиза в активной интакт- ной мышце (А) и в мышце, находящейся в сос- состоянии покоя (Б), позволяет выявить регули- регулируемый этап этого процесса. Пункт перекре- перекреста это реакция, катализируемая ферментом, для которого при переходе мышцы из актив- активного состояния в состояние покоя концентра- концентрация субстрата возрастает, а концентрация про- продукта (продуктов) снижается. В данном случае пунктом перекреста сл> жит реакция, катализи- катализируемая фосфофруктокинаэой (ФФК), от кото- которой зависит скорость образования пирувата. Г глюкоза: Г6Ф глюкозо-6-фосфат; Ф6Ф- фруктозо-6-фосфат; ФДФ-фруктозо-1,6-дифос- фат; ТФ-триозофосфат; ЗФГ 3-фосфоглице- рат. Здесь показаны не все промежуточные продукты гликолиза.
468 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ тивацию ферментов, и определяют кон- концентрации этих промежуточных продук- продуктов в тканевых экстрактах. В любой данный момент времени при данных условиях скорость расщепления глюкозы (или гликогена) до пирувата определяется только одной из регуля- торных реакций гликолиза. Почему же в таком случае в гликолизе регулируется не одна реакция, а несколько? Объяс- Объясняется это тем, что метаболизм-очень сложный процесс. При определенных ме- метаболических ситуациях клетке выгоднее регулировать скорость гликолиза за счет скорости вовлечения в гликолиз остатков глюкозы, т.е. через гексокиназную или гликоген-фосфорилазную реакцию. В других условиях более выгодной для клетки может оказаться регуляция через фосфофруктокиназную или пируват- киназную реакцию. Поскольку метабо- метаболические активности и функции, а также «топливные смеси» в различных тканях и клетках не совсем одинаковы, гликолиз при разных метаболических условиях мо- может регулироваться в них через разные регуляторные пункты. Наличие несколь- нескольких регуляторных пунктов на централь- центральном гликолитическом пути обеспечивает клетке большую метаболическую гиб- гибкость. Важно иметь в виду и два других об- обстоятельства, касающихся регуляции гликолиза и вообще любого метаболиче- метаболического пути. 1) Регулируемые этапы како- какого-либо метаболического пути при вну- внутриклеточных условиях обычно необра- необратимы. Фосфорилаза, гексокиназа, фосфо- фруктокиназа и пируваткиназа - все эти ферменты катализируют реакции, сопро- сопровождающиеся в условиях клетки значи- значительным уменьшением свободной энер- энергии и потому практически необратимые. 2) Почти все другие, т.е. нерегули- нерегулируемые, ферментативные этапы гликоли- гликолиза находятся в состоянии равновесия или близки к нему. Однако, поскольку глико- гликолиз включает необратимые этапы, весь этот процесс в целом также должен быть необратим. В интактной клетке многие отдельные ферментативные реакции мо- могут быть близки к равновесию, однако в целом ни сами живые организмы, ни их метаболические функции никогда не на- находятся в состоянии равновесия. 15.15. Спиртовое брожение отличается от гликолиза только на последних этапах У дрожжей и у других микроорганиз- микроорганизмов, сбраживающих глюкозу не до лак- тата, а до этанола и СО2, путь фермента- ферментативного расщепления глюкозы совпадает с описанным выше для анаэробного гли- гликолиза на всем протяжении, за исключе- исключением этапа, катализируемого лактатде- гидрогеназой. В дрожжевых клетках, которые не содержат фермента, анало- аналогичного лактатдегидрогеназе мышечной ткани, этот этап заменен двумя другими реакциями (рис. 15-17). В первой из них продукт расшепления глюкозы пируват теряет свою карбоксильную группу под действием пируватдекарбоксилазы. Эта реакция представляет собой простое де- карбоксилирование; реального окисле- окисления пирувата при этом не происходит; СН3 С=о Пируват Н,О Пируват дзкарбо- ксилаза СН3 q j-j Ацетальдегид II О H+ + NADH NAD* Алкогольдегидро— геназа СНЭ СНа Этанол ОН Рис. 15-17. Конечные этапы спиртового броже- брожения.
ГЛ. 15. ГЛИКОЛИЗ-ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ 469 В клетке эта реакция необратима. Для проявления каталитической активности пируватдекарбоксилазе требуется Mg2 +. С молекулой этого фермента прочно свя- связан кофермент тиаминпирофосфат (о его функции в качестве переносчика ацеталь- дегидных групп мы уже говорили в разд. 10.4). На последнем этапе спиртового броже- брожения ацетальдегид восстанавливается до этанола за счет NADH, образовавшегося при окислении глицеральдегид-3-фосфа- та; эта реакция катализируется алкоголь- дегидрогеназой: СН3—С—Н + NADH + Н* ==: CHS—СНаОН + NAD* О Этанол Таким образом, конечными продукта- продуктами спиртового брожения являются эта- этанол и СО2, а не лактат. Суммарное урав- уравнение спиртового брожения имеет вид Глюкоза + 2Р, 4- 2ADP -> -> 2Этанол + 2СО2 + 2АТР + + 2Н2О. Отметим, что суммарное отношение атомов водорода к атомам углерода не изменяется, когда молекула D-глюкозы (Н/С = 12/6 = 2) сбраживается до двух молекул этанола и двух молекул СО2 (Н/С = 12/6 = 2). И вообще при всех анаэ- анаэробных брожениях отношение Н'С в ис- исходных веществах и в продуктах оказы- оказывается одинаковым. Пируватдекарбоксилаза содержится в клетках пивных дрожжей и других ми- микроорганизмов, осуществляющих спир- спиртовое брожение. В животных тканях этот фермент отсутствует. Лишены пируват- декарбоксилазы также организмы, осу- осуществляющие молочнокислое брожение, например молочнокислые бактерии. Биохимия спиртового брожения лишь недавно изучена настолько хорошо, чтобы можно было представить этот процесс в виде ряда последовательных ферментативных реакций. Что же касает- касается виноделия и пивоварения, то это весь- весьма древние искусства, освоенные людьми за сотни лет до того, как родилась сама наука химия. Более того, сами старинные рецепты приготовления пива и вина сы- сыграли в свое время важную роль, послу- послужив ключом к некоторым фундамен- фундаментальным открытиям на заре развития биологии и биохимии. Так, в 1856 г. Луи Пастер впервые убедительно показал, что сбраживание сахара в спирт вызы- вызывается микроорганизмами, а не какими- то магическими влияниями. Французские виноделы пригласили Пастера для того, чтобы он помог им выяснить, почему в иные годы вино не удается и превра- превращается в уксус. Пастер в своих экспери- экспериментах, ставших классическими, показал, что в стерильных растворах глюкозы брожения не происходит, тогда как в рас- растворах, соприкасающихся с непрофиль- трованным воздухом, брожение идет, и причина этого заключается в том, что в раствор попадают из воздуха споры дрожжей и других микроорганизмов. Из налета на гроздьях свежесрезанного ви- винограда Пастер выделил культуры дрож- дрожжей и доказал, что именно дрожжи ответ- ответственны за брожение, происходящее в соке,, отжатом из раздавленного вино- винограда. Он выяснил также, что превраще- превращение спирта в уксусную кислоту вызывает- вызывается другими видами микроорганизмов- уксуснокислыми бактериями; эти аэ- аэробные организмы окисляют этанол с образованием уксусной кислоты. При пивоварении, которое также принадле- принадлежит к числу древнейших искусств, поми- помимо реакций спиртового брожения проте- протекает еще и ряд других ферментативных процессов (дополнение 15-2). Дополнение 15-2. Пивоварение Пиво изготовляется спиртовым брожением углеводов, содержащих- содержащихся в зерне (обычно для пива берут ячмень). Эти углеводы, предста- представлены главным образом полисахаридами и недоступны действию гли-
470 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ колитических ферментов дрожжей, сбраживающих только дисахариды и моносахариды. Поэтому из ячменя сначала готовят солод. Для этого ячмень проращивают, чтобы в семенах образовались ферменты, необ- необходимые для расщепления полисахаридов клеточных стенок, а также крахмала и прочих запасных полисахаридов. В определенный момент дальнейшее проращивание подавляют нагреванием. Полученный та- таким путем продукт, солод, содержит среди прочих ферментов ое-амила- зу и мальтазу, которые расщепляют крахмал до мальтозы, глюкозы и других простых Сахаров. Присутствуют в солоде также ферменты, специфически расщепляющие р-связи целлюлозы и других полисаха- полисахаридов клеточных стенок семенных оболочек ячменя. Эти оболочки должны быть разрушены, для того чтобы а-амилаза могла подейство- подействовать на крахмал, содержащийся в зерне. Следующий этап-это приготовление из солода пивного сусла, кото- которое и служит питательной средой для дрожжевых клеток, осущест- осуществляющих спиртовое брожение. Для получения сусла солод дробят и смешивают с водой (затирают). Это дает возможность ферментам, образовавшимся в процессе приготовления солода, подействовать на полисахариды зерна и расщепить их до мальтозы, глюкозы и прочих простых Сахаров, растворимых в водной среде. После завершения та- такого ферментативного осахаривания затор фильтруют и жидкое сусло кипятят с хмелем для ароматизации. Затем сусло охлаждают и аэрируют. В подготовленное таким образом сусло добавляют дрожжевые клет- клетки. В аэробном сусле дрожжи растут и размножаются очень быстро, извлекая необходимую им энергию из некоторых присутствующих в сусле сахаров. На этой стадии спирт не образуется, потому что дрож- дрожжи, располагая достаточным количеством кислорода, окисляют обра- образовавшийся в процессе гликолиза пируват через цикл лимонной кис- кислоты до СО2 и Н2О. Аэробный метаболизм дрожжей обусловливает очень быстрый рост клеток, регулируется же этот метаболизм доба- добавлением нужного количества кислорода. После исчерпания всего рас- растворенного кислорода в чане с суслом дрожжевые клетки как факуль- факультативные анаэробы (разд. 13.1) переключаются на анаэробное использование Сахаров. Начиная с этого момента дрожжи сбраживают содержащиеся в сусле сахара с образованием этанола и СО2. Процесс брожения регулируется концентрацией образовавшегося этанола, а также величиной рН и количеством несброженного сахара. В опреде- определенный момент брожение останавливают, удаляют дрожжи, и моло- молодое, или зеленое, пиво поступает на дображивание. Светлое пиво, кото- которое стало теперь очень популярным, содержит меньше сахара и алкоголя, чем обычное, однако по своему аромату оно не отличается от обычных сортов. На последних этапах процесса пивоварения регулируется количество пены, которую образует пиво и которая обусловлена присутствием в пиве растворенных белков. Обычно это свойство пива зависит от дей- действия протеолитических ферментов, появляющихся в процессе приго- приготовления солода. Если эти ферменты действуют на белки пива слиш- слишком долго, то пиво будет мало пениться; если же они, напротив, действуют недостаточно долго, то пиво в холодном состоянии не бу- будет прозрачным. Иногда для получения нужного количества пены к пи- пиву добавляют протеолитические ферменты из других источников. Важ- Важную роль в определении аромата пива играет диметилсульфид,
ГЛ. 15. ГЛИКОЛИЗ-ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ 471 присутствующий в пиве в следовых количествах. В высокой концентра- концентрации это вещество имеет очень неприятный вкус, однако при полном его отсутствии легкое пиво кажется пресным и безвкусным. Диметилсуль- фид образуется под действием ферментов, появляющихся в процессе приготовления солода; концентрацию его приходится очень тщатель- тщательно контролировать. Мы видим, таким образом, что многие важные стороны процесса пи- пивоварения еще не до конца ясны биохимику и здесь по-прежнему глав- главную роль играет мастерство пивовара. Быть может, это и хорошо, что древнее искусство продолжает оставаться искусством! Краткое содержание главы Гликолиз, в ходе которого молекула D-глюкозы превращается в две моле- молекулы пирувата, является для большин- большинства организмов одним из центральных метаболических путей, используемых для получения химической энергии в форме АТР. При анаэробных условиях пируват в большей части животных и расти- растительных тканей восстанавливается до лактата, а в дрожжевых клетках в процес- процессе спиртового брожения превращается в этанол и СО2. Суммарное уравнение для анаэробного гликолиза в мышцах и для молочнокислого брожения, вызы- вызываемого некоторыми видами микроорга- микроорганизмов, имеет вид Глюкоза + 2ADP + 2Р, -> - 2Лактат" + 2Н+ + 2АТР + + 2Н2О. Процесс спиртового брожения описы- описывается суммарным уравнением Глюкоза + 2ADP + 2Р,- -> -» 2Этанол + 2СО2 4- 2АТР + + 2Н2О. В аэробных клетках пируват не восстана- восстанавливается до лактата (или до этанола и СО2), а окисляется в ацетил-СоА и СО2. Таким образом, гликолиз у многих орга- организмов составляет обязательную первую стадию аэробного катаболизма глю- глюкозы. Превращение глюкозы в пируват ката- катализируется десятью ферментами, дей- действующими последовательно. Это пре- превращение слагается из двух стадий. На первой из них, состоящей из пяти фер- ферментативных реакций, D-глюкоза фосфо- рилируется за счет АТР и расщепляется в конечном счете на две молекулы D-гли- церальдегид-3-фосфата. На второй ста- стадии глицеральдегид-3-фосфат окисляется за счет N AD + и присоединяет неоргани- неорганический фосфат с образованием 3-фосфо- глицероилфосфата. Высокоэнергетиче- Высокоэнергетическая фосфатная группа 3-фосфоглице- роилфосфата передается затем на ADP, в результате чего образуются АТР и 3-фосфоглицерат, который претерпе- претерпевает изомеризацию и превращается в 2-фосфоглицерат. Катализируемая ено- лазой дегидратация 2-фосфоглицерата приводит к фосфоенолпирувату, а этот последний отдает свою фосфатную груп- группу ADP и превращается в свободный пи- пируват. На первой сгадии гликолиза ис- используются две молекулы АТР, но на второй стадии из ADP образуются четы- четыре молекулы АТР, так что в итоге на ка- каждую расщепленную молекулу глюкозы образуются две молекулы АТР. В жи- животных тканях в отсутствие кислорода NADH, образующийся при окислении глицеральдегид-3-фосфата, вновь окис- окисляется в NAD+, восстанавливая при этом пируват до лактата; катализирует эту реакцию лактатдегидрогеназа. Остатки глюкозы, из которых по- построены гликоген и крахмал, превра- превращаются в глюкозо-6-фосфат под дей- действием гликоген-фосфорилазы или фос- форилазы крахмала и фосфоглюкому- тазы. Другие гексозы, а именно фруктоза, манноза и галактоза также фосфорили- руются и превращаются в промежу- промежуточные продукты гликолиза. Вовлечение глюкозы в процесс гликолиза при уча- участии фермента гексокиназы регулируется
472 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ глюкозо-6-фосфатом, который играет роль отрицательного модулятора. Гли- коген-фосфорилаза, катализирующая превращение глюкозных единиц гликоге- гликогена в глюкозо-1-фосфат, принадлежит к числу регуляторных ферментов и суще- существует в двух формах: более активной (фосфорилаза а) и менее активной (фос- форилаза Ь); стимулирующее действие на фосфорилазу b оказывает AMP. Роль главного регуляторного фермента в по- последовательности реакций гликолиза играет фосфофруктокиназа, которую ин- гибируют АТР и цитрат и стимулирует AMP. Вторым регуляторным пунктом гликолиза является пируваткиназная ре- реакция. Последовательность реакций спиртового брожения идентична после- последовательности реакций гликолиза на всех этапах вплоть до образования пирувата, однако при спиртовом брожении пируват не восстанавливается до лактата, а декар- боксилируется с образованием ацеталь- дегида, который затем восстанавливает- восстанавливается до этанола за счет NADH в реакции, катализируемой алкогольдегидрогена- зой. ЛИТЕРАТУРА Книги Atkinson D. E. Cellular Energy Metabolism and Its Regulation, Academic, New York, 1977. Интересная трактовка энергетики и регуляции гликолиза. Dickens F.. Randle P.J., WhelanW.J. Carbohydrate Metabolism and Its Disorders, 2 vols., Academic, New York, 1968. Достаточно полное собрание об- обзорных статей. Fruton J. S. Molecules and Life, Wiley, New York, 1972. Книга содержит подробное описание истории изучения гликолиза. Hochachka P. Living without Oxygen, Harva- Harvard University Press, Cambridge, Mass., 1980. Сравнительная биохимия и физиология анаэробного гликолиза у разных организ- организмов. Kalckar H. M. (ed.). Biological Phos- phorylations: Development of Concepts, Prentice-Hall, Englewood Clifs, N.J., 1969. Содержит классические работы по глико- гликолизу. Lehninger A. L. Biochemistry, 2d ed., Worth, New York, 1975. (Имеется перевод: Ле- нинджер А. Биохимия.-М.: Мир, 1976.) В гл. 16 приведены подробные сведения о гликолизе. Newsholme Е. A., Start С. Regulation in Metabolism, Wiley, New York, 1973. В гл. З и 6 описана регуляция гликолиза. Статьи Coulson R. A. Anaerobic Glycolysis: The Smith and Wesson of the Heterotherms, Perspec. Biol. Med., 22, 465-479 A979). Очень интересный анализ сравнительной роли анаэробного гликолиза у крупных животных, в основе которого лежат экс- экспериментальные наблюдения над аллига- аллигаторами и другими животными. Ottaway J. Я., Mowbray J. The Role of Compartmentation in the Control of Glycolysis, Curr. Topics Cell Regulation, 12, 108-195 A977). Вопросы и задачи 1. Уравнение для первой стадии гликолиза. На- Напишите уравнения химического баланса для последовательности реакций, в ходе ко- которых происходит расщепление D-глю- козы на две молекулы D-глицеральдегид-З- фосфата (первая стадия гликолиза). Для каждого уравнения укажите изменение стандартной свободной энергии. Напишите также суммарное уравнение первой стадии гликолиза и укажите суммарное изменение стандартной свободной энергии, соответ- соответствующее этой стадии. 2. Вторая стадия гликолиза в скелетных мы- мышцах. В работающей скелетной мышце при анаэробных условиях глицеральдегид-3- фосфат превращается в лактат (вторая ста- стадия гликолиза). Напишите уравнения хими- химического баланса для последовательности реакций в этом процессе с указанием изме- изменения стандартной свободной энергии для каждой из реакций. Напишите также сум- суммарное уравнение для второй стадии гли- гликолиза и укажите суммарное изменение стандартной свободной энергии для этой стадии. 3. Обмен фруктозы в сперматозоидах. Кон- Концентрация фруктозы в сперме человека и быка равна приблизительно 12 мМ. В сперматозоидах в результате анаэробно- анаэробного расщепления фруктозы образуется АТР, необходимый для движения (биений) жгу- жгутика. Главный катаболический путь от фруктозы к лактату в этих клетках ведет в обход фосфофруктокиназной реакции гликолиза; на этом пути используется фер-
ГЛ. 15. ГЛИКОЛИЗ-ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ 473 мент, расщепляющий фруктозо-1-фосфат на два трехуглеродных соединения (рис. 15-8). Напишите уравнения для после- последовательности соответствующих химиче- химических превращений. Напишите также сум- суммарное уравнение анаэробного катаболиз- катаболизма фруктозы (превращения ее в лактат) в сперматозоидах. 4. Путь атомов углерода при брожении. Опыт с вытеснением радиоактивной метки про- проводится на дрожжевом экстракте в строго анаэробных условиях, обеспечивающих спиртовое брожение. Небольшое количе- количество меченного радиоактивным углеродом субстрата (импульсная метка) инкубируют с дрожжевым экстрактом в течение време- времени, достаточного для того, чтобы каждый из промежуточных продуктов данного ме- метаболического пути успел включить метку. Затем метку «прогоняют» по всему пути, добавляя избыток немеченого субстрата. Это делают для того, чтобы предотвратить участие меченых продуктов в обратных ре- реакциях и отвлечение их на другие метабо- метаболические пути. а) В каком положении обнаруживается метка в продукте брожения-этаноле, если субстратом служит глюкоза, ме- меченная 14С по положению 1? Почему? б) В каком положении должна находиться метка в исходной молекуле глюкозы для того, чтобы вся радиоактивность 14С обнаруживалась в виде 14СО2, вы- выделяющейся при спиртовом брожении? Поясните свой ответ. Задача 4 Н НО СН,ОН 'Н wOH он н он Глюкоза 5. Соотношение между кинетическими харак- характеристиками ферментов и их физиологиче- физиологическими функциями. Концентрация глюкозы в клетках млекопитающих невелика по сравнению с ее концентрацией в плазме крови. Объясняется это тем, что поступле- поступление глюкозы в клетки регулируется, и глю- глюкоза быстро фосфорилируется в результате реакции с АТР Глюкоза + АТР Глюкозо-6-фосфат + + ADP + Н + . В организме млекопитающих эту реакцию катализируют два разных фермента, замет- заметно различающихся по своим свойствам. В скелетных мышцах присутствует только один из них-гексокиназа. Этот фермент ингибируется глюкозо-6-фосфатом и ха- характеризуется величиной Км 0,1 мМ. В пе- печени помимо гексокиназы содержится так- также и глюкокиназа, которая здесь преобла- преобладает. Глюкокиназа характеризуется гораз- гораздо большей величиной Км A0,0 мМ) и не ингибируется глюкозо-6-фосфатом. Какое значение имеет различие в величине Км для гексокиназы мышц и глюкокиназы печени? Как должны сказываться различия в свой- свойствах этих двух ферментов (величина Км и способность ингибироваться глюкозо-6- фосфатом) на их физиологической роли в мышцах и в печени? 6. Роль лактатдегидрогеназы. При напряжен- напряженной работе мышечная ткань потребляет го- гораздо больше АТР, чем в состоянии покоя. В белых скелетных мышцах, например в мышцах ног у кролика или мышцах кры- крыла у индейки, почти весь этот АТР обра- образуется в процессе анаэробного гликолиза. На рис. 15-5 видно, что АТР образуется на второй стадии гликолиза в ходе двух фер- ферментативных реакций, катализируемых фосфоглицераткиназой и пируваткиназой. Представим себе, что в скелетной мышце отсутствует лактатдегидрогеназа. Могла бы мышца в этом случае напряженно рабо- работать, т.е. с большой скоростью генериро- генерировать АТР путем гликолиза? Аргументируй- Аргументируйте свой ответ. Учтите, что лактатдегидроге- назная реакция не требует участия АТР. От ясного понимания ответа на этот вопрос зависит правильное представление о глико- литическом цикле в целом. 7. Арсенатное отравление. В структурном и химическом отношении арсенат сходен с фосфатом (Р,), поэтому многие фер- ферменты, нуждающиеся в фосфате, исполь- используют также и арсенат. Однако органические производные мышьяковой кислоты менее стабильны, чем соответствующие про- производные фосфорной кислоты. Например, ациларсенаты легко разлагаются без уча- участия катализаторов: ? R—С—О—As—О" + Н2О > R—С—О" + HOAsCV" + Н* \ О о- В отличие от них ацилфосфаты, например 3-фосфоглицероилфосфат, более устойчивы и подвергаются в клетке превращениям
474 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ только под действием соответствующих ферментов. а) Как повлияет замена фосфата арсена- том на суммарную реакцию, катализи- катализируемую глицеральдегид-3-фосфатдегид- рогеназой ? б) Каковы последствия замены фосфата арсенатом? Для большинства организ- организмов арсенат крайне токсичен. Чем это объясняется? 8 Потребность в фосфате при спиртовом брожении. В 1905 i. Гарден и Йонг провели ряд работ по спиртовому брожению, став- ставших классическими. Изучая сбраживание D-глюкозы до этанола и СО2 под дей- действием экстрактов пивных дрожжей, иссле- исследователи установили следующее. 1) Для сбраживания необходим неорганический фосфат; по исчерпании запаса фосфата бро- брожение прекращается еще до того, как будет использована вся глюкоза. 2) При броже- брожении в этих условиях накапливаются этанол, СО2 и гексозодифосфат. 3) Если заменить фосфат на арсенат, то гексозодифосфа г не накапливается, но брожение продолжается до тех пор, пока вся глюкоза не превратит- превратится в этанол и СО2. а) Почему при исчерпании запаса фосфата брожение прекращается? б) Почему накапливаются этанол и СО2? Необходимо ли превращение пирувата в этанол и СО2? Почему? Укажите, какой гексозодифосфат накапливается. Почему он накапливается? в) Почему замена фосфата на арсенат предотвращает накопление гексозоди- фосфата, но в то же время обеспечи- обеспечивает завершение брожения, т.е. полное превращение глюкозы в этанол и СО2 (см. п. 7)? 9. Обмен глицерола. Глицерол, образующийся при расщеплении жиров, превращается в результате двух ферментативных реакций в промежуточный продукт гликолиза -ди- гидроксиацетонфосфат. Выскажите свои предположения о возможной последова- последовательности реакций в процессе обмена гли- глицерола. На каких известных фермента- ферментативных реакциях основаны ваши предполо- предположения? Напишите суммарное уравнение превращения глицерола в пируват исходя из своих представлений. Задача 9 ОН I НО—СН2 —С—С"Н2—ОН I н Г.тоцррад 10. Измерение внутриклеточных концентра- концентраций метаболитов. Измерение концентра- концентраций промежуточных продуктов метабо- метаболизма в живой клетке сопряжено с большими экспериментальными трудно- трудностями. Поскольку клеточные ферменты катализируют быстро протекающие мета- метаболические превращения, одна из обы- обычных проблем при всяком эксперимен- экспериментальном вмешательстве в жизнь клетки связана с тем, что данные, полученные пу- путем измерений, отражают не физиологи- физиологические, а равновесные концентрации мета- метаболитов. Поэтому любая эксперименталь- экспериментальная методика будет надежной лишь в том случае, если с ее помощью удастся мгно- мгновенно подавить все ферментативные реак- реакции в интактной ткани и тем самым пре- предотвратить дальнейшие превращения про- промежуточных продуктов метаболизма. Этой цели можно достичь путем быстрого сжатия ткани между большими алюми- алюминиевыми пластинами, охлажденными жид- жидким азотом (- 190гС); такой прием носит название «фиксация замораживанием». После замораживания, мгновенно подав- подавляющего действие ферментов, ткань рас- растирают в порошок и ферменты инактиви- руют путем осаждения хлорной кислотой. Осадок удаляют центрифугированием, а прозрачную надосадочную жидкость анализируют на содержание в ней метабо- метаболитов с помощью специфических фермен- ферментативных тестов. Истинную концентра- концентрацию данного метаболита в клетке опреде- определяют расчетным путем, учитывая общее содержание воды в ткани и данные изме- измерений объема внеклеточного простран- пространства. В табл. 1 приведены кажущиеся вну- внутриклеточные концентрации субстратов и продуктов реакции фосфорилирования фруктозо-6-фосфата, катализируемой фер- Таблица 11) Метаболит Кажущаяся концентра- концентрация, мМ (мкмоль/мл внутриклеточной Н2О) Фруктозо-6-фосфат Фруктозо-1,6-дифос- фат АТР ADP 0,087 0,022 11,52 1.32 11 По Williamson, J. Biol. Chem., 240, 2308, 1965.
ГЛ. 15. ГЛИКОЛИЗ-ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ 475 ментом фосфофруктокиназой в изолиро- изолированной ткани сердца крысы. а) По данным табл. 1 вычислите отноше- отношение действующих масс Q для фосфо- фруктокиназной реакции при физиоло- физиологических условиях [Фруктозо-1,6-дифосфат] [ADP] [Фруктозо-6-фосфат] [АТР] б) Величина АС0' для фсфофруктокиназ- ной реакции равна — 3,4 ккал/моль. Исходя из этого вычислите константу равновесия для этой реакции. в) Сравните величины Q и Ке^. Находит- Находится ли данная физиологическая реак- реакция в состоянии равновесия? Что гово- говорит этот эксперимент о роли фосфо- фруктокиназы в качестве регулятор- ного фермента? 11. Регуляция фосфофруктокиназы. Приве- Приведенный на рисунке график описывает за- зависимость между концентрацией АТР и активностью фосфофруктокиназы, кото- которая представляет собой аллостерический фермент. При данной концентрации фрук- тозо-6-фосфата активность фосфофрук- фосфофруктокиназы с повышением концентрации АТР сначала возрастает, но в какой-то мо- момент наступает перелом-дальнейшее по- повышение концентрации АТР вызывает уже ингибирование фермента. [АГП а) Объясните, как может АТР быть и субстратом, и ингибитором фосфо- фосфофруктокиназы. Как регулируется ак- активность этого фермента с помощью АТР? б) Каким образом регулируется гликолиз в зависимости от уровня АТР? в) Ингибирующее действие АТР на фос- фофруктокиназу проявляется слабее при высокой концентрации ADP. Как можно объяснить этот факт? 12. Ферментативная активность и физиоло- физиологическая функция. Гликоген-фосфорилаза из скелетных мышц характеризуется го- гораздо более высокой величиной Fmax, чем тот же фермент из ткани печени. а) Какую физиологическую функцию вы- выполняет гликоген-фосфорилаза в ске- скелетной мышце и в ткани печени? б) Почему величина Vmali для мышечно- мышечного фермента должна быть больше, чем для фермента из печени? 13. Ферментная недостаточность при угле- углеводном обмене. Ниже описаны четыре кли- клинических случая. Назовите для каждого случая дефектный фермент и дайте со- соответствующие рекомендации, выбрав их из приложенного перечня. Укажите, на чем основано ваше решение. Ответьте на вопросы, приведенные в описании каждо- каждого из четырех случаев. Случай 1. Больной не переносит молока. Как только он его выпьет, у него сразу же начинаются рвота и понос. Проведен тест на толерантность к лактозе. (Испы- (Испытуемый получает при этом определен- определенное количество лактозы, после чего у не- него через соответствующие промежутки времени измеряют концентрацию глю- глюкозы и галактозы в плазме крови. В нор- норме уровень этих Сахаров возрастает до максимума примерно через час, а затем снижается.) У больного в этом тесте концентрация глюкозы и галактозы в крови не возрастала, а оставалась по- постоянной. Объясните, почему у здо- здоровых людей концентрация глюкозы и галактозы в крови сначала растет, а затем снижается. Почему у больного таких изменений ие происходит? Случай 2. У больного с умственной отста- отсталостью молоко вызывает рвоту и понос. В крови концентрация глюкозы низка, а концентрация редуцирующих Сахаров значительно выше нормы. В моче обна- обнаруживается галактоза. Чем объясняется высокая концентрация редуцирующих Сахаров в крови? Почему в моче обна- обнаруживается галактоза? Случай 3. Больной страдает от судорог в мышцах при напряженной физической работе, но в остальном чувствует себя здоровым. Биопсия мышечной ткани выявила, что концентрация гликогена в мышцах этого больного гораздо выше нормы. Почему накапливается глико- гликоген? Случай 4. Больная вялая, апатичная. Пе- Печень увеличена; при биопсии печени об- обнаружен большой избыток гликогена. Концентрация глюкозы в крови ниже нормы. В чем причина пониженной кон- концентрации глюкозы в крови этой боль- больной?
476 ЧАСТЬ II БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Ферменты, активность которых нарушена а) Фосфофруктоки- наза мышц б) Фосфоманноизо- мераза в) Галактозо-1-фос- фатуридилил- трансфераза г) Фосфорилаза пе- печени д) Триозокиназа е) Лактаза в слизис- слизистой кишечника ж) Мальтаза в сли- слизистой кишечника Рекомендации 1. Бег трусцой по 5 км/день 2. Обезжиренная диета 3. Диета с низким содержанием лак- лактозы 4. Запрещается тяже- тяжелая физическая ра- работа 5. Большие дозы ни- ацина 6. Частое и регуляр- регулярное питание 14. Тяжесть клинических симптомов, обусло- обусловленных ферментной недостаточностью. Клинические симптомы двух форм галак- тоземии, одна из которых обусловлена не- недостаточностью галактокиназы, а другая - галактозо-1-фосфат - уридилилтрансфе- разы, резко различаются по своей тяже- тяжести. И в том и в другом случае молоко вы- вызывает у больных кишечные расстройства, но при недостаточности га- галактозо-1-фосфат - уридилилтрансферазы нарушаются также функции печени, почек, селезенки и мозга, а затем наступает смерть. Какие продукты накапливаются в крови и в тканях при недостаточности каждого из этих двух ферментов? Оцените сравнительную токсичность этих продук- продуктов на основе приведенных выше данных.
ГЛАВА 16 ЦИКЛ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ В предыдущей главе мы познакоми- познакомились с тем, как энергия, извлекаемая при расщеплении глюкозы в отсутствие кис- кислорода, запасается в форме АТР. Однако почти все животные и растительные клет- клетки в норме аэробны и свое органическое «топливо» окисляют полностью до двуо- двуокиси углерода и воды. В этих условиях пируват, образующийся при расщепле- расщеплении глюкозы, не восстанавливается до лактата или до этанола и СО2, как в анаэробных условиях. Вместо этого он окисляется до СО2 и Н2О в аэробной ста- стадии катаболизма, которую биохимики называют дыханием. Говоря о дыхании, мы обычно имеем в виду его физиологи- физиологический или макроскопический аспект, т. е. подразумеваем под этим термином про- процесс поглощения О2 и выделения СО2 в легких. Биохимики же и цитологи вкладывают в этот термин другой смысл: они рассматривают дыхание на микроскопическом уровне, т.е. интере- интересуются молекулярными механизмами процессов потребления О2 и образова- образования СО2 в клетках. В клеточном дыхании различают три главные стадии (они показаны на рис. 16-1). На первой стадии органиче- органические соединения, играющие роль клеточ- Рис. 16-1. Стадии клеточного дыхания. Ста- Стадия 1: мобилизация ацетил-СоА из глюкозы, жирных кислот и некоторых аминокислот. Стадия 2: цикл лимонной кислоты. Ста- Стадия 3: перенос электронов и окислительное фосфорилирование. На каждую пару атомов водорода, поступающую в цепь переноса элек- электронов в виде NADH, образуются три моле- молекулы АТР. ного топлива, т. е. углеводы, жирные кис- кислоты и некоторые аминокислоты, окис- окисляются до двухуглеродных фрагмен- фрагментов-ацетильных групп, входящих в со- Сгалия 1 Пируват Амино- s~* кислоты V 4S NH, Жирные кислоты | Ацетил-Co А] Стадия 2 Иэоцитрат а-кетоглутарат Стадия 3
478 ЧАСТЬ II БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ став ацетилкофермента А. На второй стадии эти ацетильные группы вклю- включаются в цикл лимонной кислоты, в кото- котором они ферментативным путем расще- расщепляются с образованием высокоэнерге- высокоэнергетических атомов водорода и высвобо- высвобождением СО2, которая представляет собой конечный продукт окисления орга- органического топлива. На третьей стадии атомы водорода разделяются на про- протоны (Н+ ) и богатые энергией элек- электроны, которые передаются по цепи переносчиков электронов, или дыхатель- дыхательной цепи, на молекулярный кислород и восстанавливают его в Н2О. Перенос электронов сопровождается выделением большого количества энергии, запасае- запасаемой в форме АТР в процессе, получившем название окислительного фосфорилирова- ния. Дыхание-процесс гораздо более сложный, чем гликолиз; было удачно сказано, что дыхание относится к глико- гликолизу так, как современная реактивная турбина к одноцилиндровому поршнево- поршневому двигателю. В этой главе мы рассмотрим открытый Кребсом цикл лимонной кислоты, назы- называемый также циклом трикарбоновых кислот. Это общий конечный путь для окисления ацетильных групп, в которые превращается в процессе катаболизма большая часть органических молекул, играющих роль клеточного топлива - углеводов, жирных кислот и аминокис- аминокислот. 16.1. При окислении глюкозы до СО2 и Н2О высвобождается значительно больше энергии, чем при гликолизе Выше (дополнение 15-1) мы говорили о том, что при расщеплении глюкозы до лактата в процессе гликолиза высвобо- высвобождается лишь очень небольшая часть хи- химической энергии, которая потенциально может быть извлечена из молекулы глю- глюкозы. Гораздо больше энергии извле- извлекается, когда молекула глюкозы окис- окисляется полностью до СО2 и Н2О, в чем можно убедиться, сравнив величины из- изменения стандартной свободной энергии для этих двух реакций: Н Число атомов водорода, присоединенных к углероду Мртан Н—С—Н 4 I Н ы Метанол Н -С—ОН 3 н Формальдегид Ц>—С—-Н. 2 II О i Н -С—ОН 1 II о Муравьиная кислота Двуокись углерода Рис. 16-2. Последовательные этапы окисления метана до СО2. По мере того как четыре атома водорода один за другим отщепляются от углерода, скачкообразно снижается и коли- количество доступной свободной энергии. В прос- простых органических соединениях отношение чис- числа связанных с углеродом атомов водорода к числу атомов углерода приблизительно про- пропорционально стандартной свободной энергии окисления данного соединения до СО2. Глюкоза -> 2Лактат + 2Н+ AG0' = - 47,0 ккал/моль, Глюкоза + 6О2 -> 6СО2 + 6Н2О АС0' = — 686 ккал/моль. Когда в клетках расщепление глюкозы протекает анаэробно, продукт этого рас- расщепления, лактат, содержит в себе при- приблизительно 93% той энергии, которая была заключена в исходной молекуле глюкозы. Объясняется это тем, что мо- молочная кислота-соединение почти столь
ГЛ. 16. ЦИКЛ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 479 же сложное, как глюкоза, а также тем, что реального окисления при гликолизе не происходит. Количество свободной энергии, выделяющееся при полном сго- сгорании какого-нибудь органического со- соединения, приблизительно пропорцио- пропорционально величине отношения между чис- числом атомов водорода, связанных с угле- углеродом, и общим числом углеродных ато- атомов, как это видно из очень простого примера, приведенного на рис. 16-2. Вся биологически доступная свободная энер- энергия высвобождается из глюкозы или из другого органического топлива лишь в том случае, если все водородные атомы, связанные с атомами углерода данной молекулы, будут удалены и заменены кислородом с образованием СО2. 16.2. Пируват должен сначала окислиться до ацетил-СоА и СО2 Углеводы, жирные кислоты и боль- большинство аминокислот окисляются в ко- конечном счете через цикл лимонной кис- кислоты до СО2 и Н2О. Однако, прежде чем эти питательные вещества будут вовле- вовлечены в цикл, их углеродный скелет дол- должен быть разрушен, а его фрагменты должны превратиться в ацетильные группы ацетил-СоА, потому что именно в этой форме цикл лимонной кислоты принимает большую часть поступающе- поступающего в него «топлива». О том, как из жирных кислот и аминокислот обра- образуются ацетильные группы для этого ци- цикла, мы узнаем из гл. 18 и 19. Здесь же мы рассмотрим процесс, в результате ко- которого пируват, образовавшийся при ги- гидролитическом расщеплении глюкозы, окисляется до ацетил-СоА и СО2 при участии набора ферментов, объеди- объединенных структурно в так называемый пи- руватдегидрогеназный комплекс. Эта му- льтиферментная система, находящаяся у эукариотических клеток в митохон- митохондриях, а у прокариотических-в цито- цитоплазме, катализирует следующую сум- суммарную реакцию: Пируват + NAD+ + CoA-SH -» -> Ацетил-СоА + NADH + СО2 AG0' = - 8,0 ккал/моль. В ходе этой довольно сложной реакции происходит окислительное декарбоксили- рование пирувата-процесс дегидрирова- дегидрирования, в результате которого карбоксиль- карбоксильная группа пирувата удаляется в виде молекулы СО2, а его ацетильная группа включается в состав ацетил-СоА. Один атом водорода, отщепляемый от пирува- пирувата, обнаруживается в составе NADH, а другой-в виде Н + . Затем образовав- образовавшийся таким путем NADH передает свои электроны в цепь переноса электронов (рис. 16-1), по которой они в конечном счете передаются на молекулярный кис- кислород. В объединенном процессе дегидриро- дегидрирования и декарбоксилирования пирувата до ацетил-СоА участвуют последова- последовательно три разных фермента: пируватде- гидрогеназа (Et), дигидролипоил-ацетил- трансфераза (Е2) и дигидролипоилдегид- рогеназа (Е3), а также пять кофермен- тов, или простетических групп - тиамин- пирофосфат (ТРР), флавинадениндинук- леотид (FAD), кофермент А (СоА), никотинамидадениндинукяеотид (NAD +) и липоевая кислота. Все эти фер- ферменты и коферменты объединены в мультиферментную систему, которую впервые выделили и подробно исследо- исследовали Лестер Рид с сотрудниками из Те- Техасского университета. Четыре витамина из числа тех, в которых нуждается орга- организм человека, являются необходимыми компонентами именно этой системы. Эти витамины: тиамин (в ТРР), рибофлавин (в FAD), пантотеновая кислота (в СоА) и никотинамид (в NAD+). Кроме того, для реакции требуется еще и липоевая кислота (рис. 16-3); она играет роль необходимого витамина, или фак- фактора роста у некоторых микроорганиз- микроорганизмов, тогда как высшие животные спо- способны ее синтезировать из легко до- доступных предшественников. Пируватде- гидрогеназный комплекс, выделенный из клеток Е. coli, представляет собой части- частицу диаметром около 45 нм, т. е. несколь- несколько большую по своим размерам, чем ри- рибосома. Молекулярная масса этой круп- крупной мультиферментной системы превы- превышает 6 • 106. В центре комплекса, соста- составляя как бы его «ядро», к которому прикрепляются другие ферменты, распо-
480 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ лагается дигидролипоил-ацетилтрансфе- раза (мол. масса 200 000). Ее молекула со- состоит из 24 субъединиц-полипептидных цепей, в каждой из которых к двум специ- специфическим остаткам лизина в активном центре субъединицы присоединены две липоильные группы (присоединение про- происходит путем образования пептидной связи между карбоксильной группой ли- поевой кислоты и Е-аминогруппой остат- остатка лизина; рис. 16-3). К дигидролипоил- ацетилтрансферазе присоединены очень и дегидрирование пирувата. Эта последо- последовательность включает пять стадий. На стадии 1 пируват теряет свою карбок- карбоксильную группу в результате взаимодей- взаимодействия с тиаминпирофосфатом, присоеди- присоединенным к пируватдегидрогеназе (Е,); в результате этой реакции образуется ги- дроксиэтильное производное тиаминпи- рофосфата с гидроксиэтильной группой при тиазольном кольце (разд. 10.4). Пи- руватдегидрогеназа катализирует также стадию 2-перенос атомов водорода сн, сн. соон ? соон Липоевая кислота (окисленная форма) кислота сн-s-c—сн3 г ° сн, соон Ацетиллипоовяя кислота Шгифо. 30 1И1 оильная группа OlTHTOK ЛИ1И1Ш Полипрптидная цепь дигидро - липоил-ацетил- трансферазы крупные молекулы пируватдегидроге- назы и дигидролипоилдегидрогеназы. Пируватдегидрогеназа содержит свя- связанный тиаминпирофосфат, а дигидроли- поилдегидрогеназа - связанный FA D. Липоиллизиновые группы центрального фермента пируватдегидрогеназного ком- комплекса, имеющие длину около 1,4 нм, функционируют как «поворотные кронш- кронштейны», переносящие атомы водорода и ацетильные группы от одной фермент- ферментной молекулы комплекса к другой. К пи- руватдегидрогеназному комплексу при- присоединены еще и два других фермента, регулирующие пируватдегидрогеназную реакцию (о них будет сказано ниже). На рис. 16-4 представлена в схематиче- схематическом виде катализируемая пируватдеги- дрогеназным комплексом последова- последовательность реакций, в ходе которых осуществляется декарбоксилирование Рис. 16-3. Липоевая кислота и ее активная форма, представляющая собой простетическую группу дигидролипоил-ацетилтраисферазы. Ли- Липоевая кислота и липоильная группа могут существовать в окисленной (дисульфидной). восстановленной (дитиоловой) и ацетнлирован- ной формах. Поэтому липоильная группа дей- действует и как переносчик водорода, и как пере- переносчик ацетильных групп. Липоиллизиновая группа, имеющая длину около 1,4 нм, действу- действует как «поворотный кронштейн». Она перено- переносит атомы водорода от пируватдегидрогеназы на дигидролипоилдегидрогеназу, а также аце- ацетильную группу на CoA-SH. Липоевую кислоту называют иногда псевдо- псевдовитамином. и ацетильной группы от тиаминпирофос- фата на окисленную форму липоиллизи- новых простетических групп центрально- центрального фермента комплекса, дигидролипоил- ацетилтрансферазы, с образованием 6-ацетилтиоэфира восстановленных ли- поильных групп. На стадии 3 молекула CoA-SH взаимодействует с ацетильным производным дигидролипоил-ацетил- трансферазы, что приводит к образова- образованию ацетил-S-CoA и к полностью восста- восстановленной, или дитиоловой, форме ли- поильных групп. На стадии 4 на эту восстановленную форму дигидролипоил- ацетилтрансферазы воздействует диги- дролипоилдегидрогеназа, катализирую- катализирующая перенос атомов водорода от восста- восстановленных липоильных групп на FAD, который играет роль простетической группы дигидролипоилдегидрогеназы. На стадии 5 (заключительной в этой по-
ГЛ. 16. ЦИКЛ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 481 Стадия 1. СНз —С—COO" + Н* + (?\У- ТРР «-(еГ)—ТРР—СНОН—СНз + СО2 II w w о 2. SH 3. CoA-SH о + СоА—S— С—СН3 S I сн3—с II о SH SH SH 4. SH SH FADH2 5. ^FADH, + NAD* -FAD + NADH + Суммарная реакция СН,—С—СОО~ + CoA-SH + NAD* CH3—С—S—СоА + СО2 ¦+¦ NADH О Рис. 16-4. Стадии окислительного декарбокси- лирования пирувата до ацетил-Co А - процесса, катализируемого пируватдегилрогеназным комплексом. Для того чтобы можно было лег- легче проследить судьбу пирувата, его превраще- превращения выделены красным цветом. Структура ти- аминпирофосфата и его а-гидроксиэтилъного производного показана на рис. 10-2. Е[-пиру- ватдегидрогеназа; ТРР - тиаминпирофосфат; ТРР-СНОН-СН3-а-гидроксиэтилтиаминпи- рофосфат; Е2-дигидролипои л-ацетилтраисфера- за; Е3 -дигидролипоилдегидрогеназа. следовательности реакций) восстано- восстановленная FAD-группа дигидролипоилде- гидрогеназы передает водород на NAD + с образованием NADH. Важнейшую роль в рассматриваемом процессе играют липоиллизиновые боковые группы дигидролипоил-ацетилтрансфе- разы, передающие от одного фермента к другому атомы водорода и ацетильную группу. Все эти ферменты и коферменты структурно организованы в единый ком- комплекс, благодаря чему простетические группы сближены и промежуточные про- О дукты реакции быстро взаимодействуют друг с другом. Если бы эти очень круп- крупные ферментные молекулы были разоб- разобщены и свободно перемещались в цито- золе, то им пришлось бы в процессе диф- диффузии преодолевать немалые расстояния, прежде чем они могли бы столкнуться и вступить во взаимодействие. На рис. 16-5 приведена электронная микро- микрофотография пируватдегидрогеназного комплекса. Недостаток витамина Bt, или тиамина (разд. 10.4), обусловливает заболевание, известное под названием бери-бери. Те- Теперь нам ясно, что в организме жи- животных, лишенных тиамина, оказывается невозможным нормальное окисление пи- пирувата. Особенно сильно влияет такое нарушение на мозг, который обычно по- получает всю необходимую энергию путем аэробного окисления глюкозы и для ко- которого поэтому окисление пирувата- жизненно необходимый процесс. Харак- Характерный для бери-бери полиневрит
482 ЧАСТЬ II БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ 50 нм Рис. 16-5. Электронная микрофотография пи- руватдегидрогеназного комплекса, выделенно- выделенного из клеток Е. coli. Видно, что частицы комплекса состоят из субъединиц, и общее нарушение функций двигатель- двигательной нервной системы (гл. 10) обусло- обусловлены нарушением функции пируватде- гидрогеназы. Важно отметить, что процесс, катали- катализируемый пирувагдегидрогеназным ком- комплексом, в животных тканях необратим. Это подтверждено изотопным методом, при помощи которого было показано, что радиоактивная СО2 не присоединя- присоединялась вновь к ацетил-СоА, т.е. образова- образования пирувата, меченного по карбоксиль- карбоксильной группе, не происходило. Ниже мы увидим, что регуляция актив- активности пируватдегидрогеназного ком- комплекса составляет один из важных эле- элементов в биологическом контроле дыха- дыхания. 16.3. Цикл лимонной кислоты - это не линейный, а замкнутый путь Теперь, когда мы знаем, каким обра- образом из пирувата образуется ацетил-СоА, мы можем считать себя достаточно под- подготовленными и к рассмотрению цикла лимонной кислоты. Для начала целесо- целесообразно попытаться получить о нем некое общее предствление. Гликолиз включает линейную последовательность фермента- ферментативных реакций, тогда как ферментная система, осуществляющая цикл лимон- лимонной кислоты, работает иначе, в цикличе- циклическом режиме. Цикл (рис. 16-6) начинает- начинается с того, что ацетил-СоА отдает свою ацетильную группу четырехуглеродному соединению - оксалоацетату, в результа- результате чего образуется шестиуглеродное со- соединение- цитрат. Затем цитрат превра- превращается в изоцитрат, также щестиугле- родное соединение, которое дегидрирует- дегидрируется с утратой СО 2 и превращается таким путем в пятиуглеродное соединение -а- кетоглутарат. От а-кетоглутарата отще- отщепляется СО2 (вторая по счету молекула двуокиси углерода), и появляется четы- рехуглеродное соединение- сущи нот. Из сукцината в разультате трех фермента- ферментативных реакций образуется четырехугле- родный оксалоацетат, с которого и на- начался цикл. Каждый оборот цикла сопро- сопровождается, таким образом, регенерацией оксалоацетата; образовавшийся оксалоа- оксалоацетат может теперь вступить во взаимо- взаимодействие с новой молекулой ацетил-СоА, т.е. начать новый оборот цикла. В каждый оборот цикла вступает -в фор- форме ацетил-Co А - одна ацетильная группа (два атома углерода), и при каждом обо- обороте из цикла выводятся две молекулы Гз1 Пируват ь Ацетил-Co А L-малат И J QF] а-Кетоглутарат Сукцинил-Со А Рис. 16-6. Схема цикла лимонной кислоты. В красных рамках указано число атомов угле- углерода в соответствующих промежуточных про- продуктах. Четыре атома углерода сукцинил-СоА содержатся в сукцинильной группе, т. е. в той части молекулы, из которой образуется свобод- свободный сукцинат.
ГЛ. 16. ЦИКЛ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 483 СО 2. На образование цитрата в каждом обороте цикла расходуется одна молеку- молекула оксалоацетата, однако в результате ряда реакций этот оксалоацетат регене- регенерирует. Таким образом, в цикле лимон- лимонной кислоты оксалоацетат не расходует- расходуется. Теоретически одной молекулы окса- оксалоацетата может оказаться достаточно для окисления любого числа ацетильных групп. 16.4. Как родилась сама мысль о существовании цикла лимонной кислоты? Это законный вопрос, поскольку по- подобный цикл-с окислением двухугле- родных ацетильных групп до СО2 через шестиуглеродную лимонную кислоту- может показаться излишне сложным и. следовательно, противоречащим принци- принципу максимальной экономии, заложенно- заложенному в биохимическую логику живой клет- клетки. Впервые предположение о существова- существовании такого цикла для окисления пирува- та в животных тканях было высказано в 1937 г. Гансом Кребсом. Эта идея роди- родилась у него, когда он исследовал влияние анионов различных органических кислот на скорость поглощения кислорода сус- суспензиями измельченных грудных мышц голубя, в которых происходило окисле- окисление пирувата. Грудные мышцы отлича- отличаются чрезвычайно высокой интенсив- интенсивностью дыхания, что делает их особенно удобным объектом для изучения окисли- окислительной активности. Незадолго до описываемых работ Кребса Альберт Сент-Дьёрдьи в Венгрии обнаружил, что некоторые четырехуглеродные дикарбо- новые органические кислоты, присут- присутствующие в животных тканях (янтарная, фумаровая, яблочная и щавелевоуксус- ная), способны усиливать поглощение кислорода мышечной тканью. Кребс подтвердил это наблюдение и показал, что перечисленные органические кислоты стимулируют также окисление пирувата. Кроме того, он нашел, что окисление пи- пирувата мышечной тканью стимулируется шестиуглеродными трикарбоновыми кислотами- лимонной, цис-аконитовой coo- ¦n— но—с—coo CH, coo- 1 coo- СИ, c—coo- CH COO" 1 1 coo H—C—COO- HO—C—H coo- 1 coo- CH, 1 CH, и coo Цитрат «ис-Аконитат Изоцитрат а-Кетоглутарат а-Кетоглутарат 1 соо- СН, Сукцинат СН, соо- нка Малонатный 1 блок соо- сн Фум.фаг НС соо- 1 1 соо- НО—С—Н L-M!" {"¦ СОО" 1 соо- С«=О Оксало- | ацетат СН, 1 COO" Рис. 16-7. Природные трикарбоновые и дикар- боновые кислоты, способные стимулировать окисление пирувата в суспензиях мышечной гкани. Другие встречающиеся в природе орга- органические кислоты, например виннокаменная, щавелевая и кетоадипиновая, такой способ- способностью не обладают. Активные кислоты при- приведены здесь в той последовательности, в ка- какой они появляются в цикле лимонной кис- кислоты. На каждом этапе происходит только одно химическое изменение. Отмечен этап, ин- гибируемый малонатом: в присутствии мало- ната цитрат окисляется до сукцината, который накапливается. и изолимонной, а также пятиуглеродной к-кетоглутаровой кислотой. Структура всех этих кислот представлена на рис. 16-7. Испытаны были и некоторые другие встречающиеся в природе органи- органические кислоты, но ни одна из них не об- обнаружила подобной активности. Обра- Обращал на себя внимание сам характер стимулирующего действия активных кис- кислот: даже малого количества любой из них было достаточно для того, чтобы вы- вызвать окисление во много раз большего количества пирувата. Другое важное наблюдение Кребса ка- касалось действия малоната (рис. 16-8), одного из конкурентных ингибиторов сукцинатдегидрогеназы (разд. 9.13). Вы-
484 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ ленилось, что малонат ингибирует аэроб- аэробное потребление пирувата суспензиями измельченной мышечной ткани независи- независимо от того, какая из активных кислот до- добавлена к суспензии. Это свидетельство- свидетельствовало о том, что сукцинат и сукцинатдеги- дрогеназа составляют необходимое зве- звено в цепи ферментативных реакций, из которых слагается окисление пирувата. Кребс нашел далее, что если ингибиро- вать малонатом аэробное потребление пирувата суспензией мышечной ткани, то в суспендирующей среде будут накапли- накапливаться цитрат, а-кетоглутарат и сукци- сукцинат. Отсюда следовало, что в норме, т. е. в отсутствие малоната, цитрат и а-кето- а-кетоглутарат превращаются в сукцинат. цас-Лконитаг соо 1 СН, СОО соо сн. СИ, соо Малонат Сукцинат Рис. 16-8. Малонат-один из .конкурентных ин- ингибиторов сукцинатдегидрогеназы (см. также рис. 19-12). Обратите внимание на сходство структуры малоната и сукцината. Исходя из этих основных данных и из некоторых других наблюдений, Кребс пришел к выводу, что все перечисленные выше активные три- и дикарбоновые кис- кислоты можно расположить в некой логи- логической химической последовательности, каждый этап которой представляет со- собой простое химическое превращение, ка- катализируемое одним специфичным фер- ферментом (рис. 16-7). Далее, поскольку инкубация пирувата и оксалоацетата с измельченной мышечной тканью при- приводила к накоплению цитрата в среде, Кребс сделал вывод, что эта последова- последовательность является не линейной, а цикли- циклической, т.е. что ее начало смыкается с ее концом (рис. 16-9). Недостающим зве- звеном, замыкающим цикл, должна была служить реакция Пируват + Оксалоацетат -* -> Цитрат + СО2. Изоцитрат а-Кетоглутарат Мвлат Сукцинат 7* Малонатный блок у марат Рис. 16-9. Замыкание цикла в первой из пред- предложенных схем. Когда Кребс обнаружил, что пируват и оксалоацетат взаимодействуют с об- образованием питрата (реакции на красном фоне), то стало ясно, что последовательность реак- реакций имеет циклический характер. Обратите внимание, что сукцинат накапливается при ма- лонатном блоке, когда пируват и оксалоацетат окисляются через цитрат. Описанные выше простые экспери- эксперименты, а также логические рассуждения позволили Кребсу высказать предполо- предположение, что цикл, который он назвал ци- циклом лимонной кислоты, является главным путем окисления углеводов в мышце. За годы, прошедшие со вре- времени открытия этого цикла, выяснилось, что он существует не только в мышцах. Цикл лимонной кислоты обнаружен практически во всех тканях высших жи- животных и растений и у многих аэробных микроорганизмов. За это важное откры- открытие Кребс был удостоен в 1953 г. Нобе- Нобелевской премии, которую он разделил с Фрицем Липманом, «отцом» АТР-ци- кла (разд. 14.7). Цикл лимонной кислоты называют также циклом трикарбоновых кислот Это второе название появилось в связр с тем, что в течение нескольких лет после того, как Кребс постулировал существо- существование цикла, не было полной уверенности в том, какая именно из трикарбоновых кислот (лимонная или, например, изоли- монная) является первым продуктом конденсации пирувата с оксалоацетатом. Эта неопределенность, как мы увидим ниже, теперь устранена. В настоящее вре- время точно известно, что первой из трикар- трикарбоновых кислот образуется именно ли- лимонная кислота. Поэтому лучше всего называть данный метаболический путь
ГЛ. 16. ЦИКЛ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 485 Внутренняя мембрана Аконитаза Сукцииатдегидрогеназа Цепи переноса электронов Рис. 16-10. Фотография сэра Ганса Кребса, сделанная по случаю его восьмидесятилетия в августе 1980 г. Кребс родился в Германии и там же получил медицинское образование. С 1926 по 1930 г. работал в Берлине с Отто Варбургом, который сам был одним из осново- основоположников современной биохимии. В 1932 г., выполняя обязанности ассистента на медицин- медицинском факультете Фрейбургского университета, Кребс совместно с одним из студентов фа- факультета Куртом Хенсейлайтом разработал схему постулированного ими цикла мочевины (гл. 19). В 1933 г. Кребс эмигрировал в Англию и начал работать в Кембриджском универси- университете. Позже он перешел в Шеффилдский университет, где им и была выполнена боль- большая часть работ по циклу лимонной кислоты. В 1954 г. он возглавил биохимический факуль- факультет в Оксфорде. После ухода с этого поста в 1967 г. Кребс вновь целиком посвятил себя исследовательской работе на медицинском фа- факультете в Оксфорде. Он занялся изучением динамики и регуляции метаболизма и работал здесь очень активно вместе с несколькими сотрудниками вплоть до своей смерти в нояб- ноябре 1981 г. Кребс часто выступал с лекциями в университетах всего мира, и лекции его пользовались большой популярностью. Откры- Открытие цикла лимонной кислоты считается одним из важнейших в истории биохимии метабо- метаболизма. циклом лимонной кислоты или просто циклом Кребса. Юджин Кеннеди и Альберт Ленинджер показали позднее, что все реакции цикла лимонной кислоты протекают в мито- митохондриях животных клеток. В изолиро- изолированных митохондриях печени крысы (разд. 2.8) были обнаружены не только все ферменты и коферменты цикла ли- лимонной кислоты; здесь же, как выясни- выяснилось, локализованы все ферменты и бел- Матринс Цитрат-синтаза Изоцитратдегидрогеназа а -Кетоглутаратдегидрогеназный комплекс Сукцинил-Со А-синтетаза Фумараза Малатдегидрогеназа Пируватдегидрогеназный комплекс Рис. 16-11. Локализация ферментов цикла ли- лимонной кислоты в митохондриях. ки, которые требуются для последней стадии дыхания, т.е. для переноса элек- электронов и окислительного фосфорилиро- вания. Поэтому митохондрии с полным правом называют «силовыми станция- станциями» клетки. На рис. 16-11 показано, как размещены в митохондриях ферменты, катализирующие реакции цикла лимон- лимонной кислоты. 16.5. Цикл лимонной кислоты включает восемь стадий Рассмотрим теперь восемь последова- последовательных стадий цикла лимонной кис- кислоты, уделяя особое внимание тем хими- химическим превращениям, в результате ко- которых ацетильная группа ацетил-СоА перестраивается и в конечном счете рас- распадается с образованием СО2 и атомов водорода, улавливаемых в форме восста- восстановленных коферментов NADH и FADH2. На рис. 16-12 и 16-13 приведены сбалансированные уравнения реакций цикла и показана структура промежу- промежуточных продуктов.
486 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ а. Конденсация ацетил-СоА с оксалоацетатом приводит к образованию цитрата Первая реакция цикла, катализируемая цитрат-синтазой, представляет собой конденсацию ацетил-СоА и оксалоацета- та, в результате которой образуется ци- цитрат (рис. 16-12). В этой реакции ме- тильный углерод ацетильной группы ацетил-СоА связывается с карбонильной группой оксалоацетата; одновременно расщепляется тиоэфирная связь и высво- высвобождается кофермент А: Ацетил-S-CoA + Оксалоацетат + Цитрат-сингаза + Н2О -> Цитрат + + CoA-SH + Н + AG0' = - 7,7 ккал/моль. Равновесие этой реакции в клетке по большей части сильно сдвинуто вправо, о чем свидетельствует характеризующая ее большая отрицательная величина стандартной свободной энергии гидро- гидролиза. Высвободившийся CoA-SH может теперь принять участие в окислительном декарбоксилировании новой молекулы пирувата и образовать новую молекулу ацетил-СоА, способную вступить в цикл. Полагают, что промежуточным продук- продуктом в цитрат-синтазной реакции являет- является цитрил-СоА. Он образуется в актив- активном центре фермента и быстро гидроли- зуется, после чего свободный CoA-SH и цитрат отделяются от активного цен- центра. Цитрат-синтаза принадлежит к числу регуляторных ферментов: в клетках мно- многих типов катализируемая ею реакция лимитирует общую скорость цикла ли- лимонной кислоты. б. Цитрат превращается в изоцитрат через цис-аконитат Фермент аконитаза катализирует обратимое превращение цитрата в изо- изоцитрат. В качестве промежуточного продукта (в норме не отделяющегося от активного центра фермента) образуется о I сн, —S—СоА Ацетил-СоА с—соо- сн2 CQO" H2O Цитрат- синтаза I Оксалоацетат а I ее :t- • CoA-SH + Н+ COO" НО—С—СОО" СН2- с Цитрат Аконитаза соо- о||-н,о СОО" I снг С—СОО" С сн соо- -н,о||+н,о СОО" сн2 Н—С—ССХХ но—с—н СОО" «ие-Аконитат (связанный с ферментом) Изоцитрат Изоцитратдегидро- геназа ¦ NAD* (NADP*) >NADH (NADPH) -—• со» СОО" сн2 f-H2 a -Кетоглутарат c=o coo- Рис. 16-12. Первые четыре реакции цикла ли- лимонной кислоты. Приведены уравнения полно- полного химического баланса.
ГЛ. 16. ЦИКЛ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 487 СОСГ сн2 снг с=о а -Кетоглутарат СОСГ а -Кетоглутарат- дегидрогеназный комплекс , CoA-SH Сукцинил-Со А- синтетаза Сукцинатде- гидрогеназа Сукцинил-Со А Сукцинат i—FAD -FADH2 СОСГ CH Фумарат СОО" Фумараза -н.о||+н,о сосг но—с—н сн2 СОО" 1.-малат L-малат- дегидрогеназа NAD" NADH + Н* СОСГ соо- Оксалоацетат Рис. 16-13. Остальные реакции цикла лимон- лимонной кислоты (предшествующие стадии см. на рис. 16-12). при этом трикарбоновая i/wc-аконитовая кислота (рис. 16-12). Аконитаза катали- катализирует обратимое присоединение Н2О по двойной связи i/wc-аконитата (который присоединен к ферменту) двумя разными способами: в одном случае образуется цитрат, а в другом-изоцитрат: -н2о Цитрат ^± [tywc-Аконитат] ^± + н2о + н2о ^ Изоцитрат -н2о Хотя в равновесной смеси при рН 7,4 и 25°С содержание изоцитрата соста- составляет менее 10%, в клетке эта реакция протекает слева направо, поскольку про- продукт реакции, изоцитрат, быстро вовле- вовлекается в последующие стадии цикла. Ако- Аконитаза-довольно сложный фермент. Он содержит железо и кислотолабильные атомы серы, сгруппированные в так на- называемый железо-серный центр (разд. 17.8). Точная функция этого желе- железо-серного центра (который предста- представляет собой, как полагают, простетиче- скую группу фермента) пока не известна. в. Изоцитрат дегидрируется с образованием а-кетоглутарата и СО2 На следующей стадии цикла изоцитрат дегидрируется с образованием а-кетоглу- а-кетоглутарата и СО 2 (рис. 16-12) под действием изоцитратдегидрогеназы. Существует два типа изоцитратдегидрогеназы: один использует в качестве акцептора электро- электронов NAD + , a другой-NADP". В остальном же суммарные реакции, ка- катализируемые изоцитратдегидрогеназа- ми этих двух типов, идентичны: Изоцитрат + NAD+(NADP+) -> -> а-Кетоглутарат + СО2 + + NADH(NADPH) + Н + AG0' = — 5,0 ккал/моль. В митохондриях содержатся изоцитрат- изоцитратдегидрогеназы обоих типов, NAD-зави- симая и NADP-зависимая; первый тип встречается только в митохондриях, а второй обнаруживается как в митохон- митохондриях, так и в цитозоле. В цикле лимон- лимонной кислоты, очевидно, принимают уча-
488 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ стие оба митохондриальных фермента, но преобладает NAD-зависимая изоци- тратдегидрогеназа. Для ее действия не- необходимы ионы Mg2 + или Мп2 +, а так- также ее положительный модулятор A DP, в отсутствие которого фермент практиче- практически не проявляет активности. Наличие в митохондриях изоцитратдегидроге- назы двух типов, возможно, связано с ре- регуляцией цикла. г. а-Кетоглутарат окисляется до сукцината и С02 На следующей стадии цикла происхо- происходит окислительное декарбоксилирование ос-кетоглутарата с образованием сукци- нил-СоА и СО2 (рис. 16-13), катализируе- катализируемое а-кетоглутаратдегидрогеназным комплексом. Реакция описывается урав- уравнением а-Кетоглутарат + NAD+ + СоА -» ->• Сукцинил-СоА + СО2 + NADH. Обратите внимание, что эта реакция практически идентична пируватдегидро- геназной реакции, о которой мы говори- говорили выше; в обоих случаях речь идет об окислении ос-кетокислоты, сопровождаю- сопровождающемся утратой карбоксильной группы в виде СО2. И по структуре, и по функ- функции а-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс очень напоминает пируватде- гидрогеназный комплекс. Он состоит из трех ферментов, аналогичных трем фер- ферментам пируватдегидрогеназной си- системы, и включает также связанные с ферментами кофакторы: тиаминпиро- фосфат, Mg2+, кофермент A, NAD + , FAD и липоевую кислоту. Есть, однако, и важное различие: а-кетоглутаратдеги- дрогеназная система не имеет столь сложного механизма регуляции, какой характерен для пируватдегидрогеназно- го комплекса. д. Превращение сукцинил-СоА в сукцинат Сукцинил-СоА, продукт предыдущей стадии цикла, представляет собой высо- высокоэнергетическое соединение. Гидролиз его тиоэфирной связи, так же как и гидро- гидролиз ацетил-СоА, характеризуется боль- большой отрицательной величиной измене- изменения стандартной свободной энергии. Сукцинил-S-CoA + Н2О ->• -»¦ Сукцинат + CoA-SH + Н+ AG0' = — 8,0 ккал/моль. В клетке, однако, отщепление остатка СоА происходит не путем простого ги- гидролиза, потому что такой путь означал бы растрачивание свободной энергии впустую. Разрыв тиоэфирной связи здесь сопряжен с реакцией, в ходе которой про- происходит запасание энергии с фосфорили- рованием гуанозиндифосфата (GDP) до гуанозинтрифосфата (GTP) (рис. 16-13): Сукцинил-S-CoA + Р,- + Mg24" + GDP -> Сукцинат + GTP + + CoA-SH AG0' = — 0,7 ккал/моль. Участвующий в этой реакции фермент сукцинил-СоА—синтетаза катализирует образование свободного сукцината и одновременно с этим-образование концевой высокоэнергетической фосфат- фосфатной группы GTP из GDP и Р, за счет сво- свободной энергии, высвобождающейся при расщеплении сукцинил-СоА. У этой реак- реакции, сопровождающейся запасанием энергии, есть промежуточный этап, во время которого происходит фосфорили- рование самой молекулы фермента по одному из гистидиновых остатков в его активном центре. Именно богатая энер- энергией фосфатная группа, участвующая в этом фосфорилировании, и переносит- переносится на GDP с образованием GTP. Сопря- Сопряженное образование GTP за счет энергии, выделяющейся при окислительном фос- фосфорилировании ос-кетоглутарата, пред- представляет собой еще один пример фосфо- рилирования на уровне субстрата. Вспомним, что нам уже знаком один при- пример фосфорилирования этого типа, а именно сопряженный синтез АТР за счет энергии, выделяющейся при окисле- окислении глицеральдегид-3-фосфата в ходе гликолиза (разд. 15.7,6). Подобные реак- реакции принято называть фосфорилирова- нием на уровне субстрата, потому что ис-
ГЛ. 16. ЦИКЛ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 489 точником необходимой энергии служит для них окисление одного из органиче- органических субстратов. Объединяя реакции это- этого типа под общим названием, мы тем самым отличаем их от окислительного фосфорилирования, сопряженного с пере- переносом электронов (его называют также фосфорилированием в дыхательной цепи; гл. 17). GTP, образовавшийся под действием сукцинил-СоА-синтетазы, может затем передавать свою концевую фосфатную группу на ADP с образованием АТР; эта обратимая реакция катализируется ну- клеозид-дифосфат-киназой (разд. 14.18) Mg2 + GTP + ADP <=t GDP + ATP AG0' = 0,0 ккал/моль. e. Дегидрирование сукцината с образованием фумарата На следующей стадии цикла (рис. 16-13) сукцинат, образовавшийся из сукцинил-СоА, дегидрируется с образо- образованием фумарата. Эта реакция катализи- катализируется флавопротеином сукцинатдеги- дрогеназой, молекула которого содер- содержит ковалентно связанный флавинаде- ниндинуклеотид. Эта простетическая группа, способная восстанавливаться, служит акцептором водорода в следую- следующей реакции (Е означает здесь фер- ферментный белок): Сукцинат + Е—FAD -» -* Фумарат + Е FADH2. Сукцинатдегидрогеназа прочно связана с внутренней митохондриальной мем- мембраной. Молекулярная масса фермента, выделенного из митохондрий бычьего сердца, равна приблизительно 100000. Одна молекула этого фермента содержит один остаток ковалентно связанного FAD и два железо-серных центра; в одном из этих центров находятся два атома железа, а в другом-четыре. В сукцинатдегидрогеназной реакции эти атомы железа изменяют свою валент- валентность [Fe(II) — Fe(III)], и это позволяет считать, что они участвуют в переносе электронов (гл. 17). Малонат является конкурентным ин- ингибитором сукцинатдегидрогеназы (разд. 9.13 и рис. 16-7); выше мы отмеча- отмечали, что изучение его действия в немалой мере способствовало выяснению общей схемы цикла лимонной кислоты. ж. Фумарат гидратируется с образованием малаша Обратимая гидратация фумарата, вследствие которой образуется L-малат (рис. 16-13) Фумарат + Н2О +* L-малат AG0' =: 0 ккал/моль, катализируется фумарат-гидратазой. Этот фермент, более известный под на- названием фумараза, был выделен в кри- кристаллическом виде из сердца свиньи. Фу- Фумараза высокоспецифична: она гидрати- рует только транс-форму двойной связи фумарата и не действует на его цис-фор- му, а также ни на цис-, ни на транс-форму монокарбоновых ненасыщенных кислот. В обратной реакции (L-малат -» -» Фумарат) фумараза проявляет специ- специфичность в отношении оптических изо- изомеров; она неспособна катализировать дегидратацию D-малата. Молекулярная масса фумаразы равна приблизительно 200000. Молекула фермента состоит из четырех субъединиц (четырех полипеп- полипептидных цепей). Кофермент для фумаразы не требуется. з. Малаш дегидрируется с образованием оксалоацетата На последней стадии цикла лимонной кислоты NAD-зависимая L-малатдеги- дрогеназа, содержащаяся в матриксе ми- митохондрий, катализирует дегидрирова- дегидрирование L-малата с образованием оксалоаце- оксалоацетата (рис. 16-13): L-малат + NAD+ ^± +* Оксалоацетат + NADH + Н+ AG0' = + 7,1 ккал/моль.
490 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Равновесие этой реакции при стан- стандартных условиях (т.е. при концентра- концентрациях всех компонентов 1 М и рН 7,0) сильно сдвинуто влево. Тем не менее в интактных клетках реакция идет слева направо, потому что продукт этой реак- реакции, оксалоацетат, быстро удаляется (расходуется в цитрат-синтазной реак- реакции) и его реальная концентрация в клет- клетке остается все время крайне низкой, меньше 10 " 6 М. 16.6. Общая характеристика цикла Итак, мы закончили описание одного оборота цикла лимонной кислоты. Одна ацетильная группа, содержащая два ато- атома углерода, вступает в цикл, соединяясь с оксалоацетатом. Два атома углерода освобождаются по завершении цикла в виде двуокиси углерода. В конце цикла регенерирует одна молекула оксалоаце- тата. От четырех промежуточных про- продуктов цикла в ферментативных реак- реакциях дегидрирования отделяются четыре пары атомов водорода. Из них три пары используются для восстановления трех молекул NAD+ в NADH, а одна-для восстановления FAD сукцинатдегидроге- назы в FADH2. Четыре пары электронов от этих водородных атомов передаются в цепь переноса электронов и в конечном счете восстанавливают две молекулы О2 с образованием четырех молекул Н2О. Отметим, что два углеродных атома, по- появляющиеся в виде СО2,-это не те атомы, которые вступили в цикл в виде ацетильной группы. Для того чтобы углеродные атомы, вступившие в цикл в составе ацетильной группы, выдели- выделились, наконец, в виде СО2, требуются до- дополнительные обороты цикла, как это видно из рис. 16-12 и 16-13. В качестве побочного продукта цикла образуется одна молекула АТР, синтези- синтезируемая из ADP и фосфата через GTP, ис- источником которого служит сукцинил- СоА-синтетазная реакция. В следующей главе мы познакомимся с тем, каким образом четыре пары электронов, отде- отделившиеся от четырех пар водородных атомов в реакциях дегидрирования, пере- передаются по цепи переноса электронов на молекулярный кислород с образованием Н2О. Хотя в каждом обороте цикла Кребса образуется только одна молекула АТР, четыре реакции дегидрирования, которые включает этот цикл, создают мощный поток высокоэнергетических электронов; эти электроны поступают в дыхательную цепь и таким путем обес- обеспечивают в конечном счете образование большого числа молекул АТР в процессе окислительного фосфорилирования (гл. 17). 16.7. В чем смысл цикла лимонной кислоты? Теперь мы можем задать один важный вопрос. Почему, собственно, для окисле- окисления простой двухуглеродной ацетильной группы требуется столь сложный цикл с последовательным образованием ше- шести-, пяти- и четырехуглеродных проме- промежуточных продуктов? Ответ на этот во- вопрос следует искать в некоторых законо- закономерностях органической химии. Молеку- Молекула уксусной кислоты при своих малых размерах и относительно простом строе- строении отличается тем не менее одной осо- особенностью, которая состоит в том, что ее метальная группа весьма устойчива к хи- химическому окислению. Для прямого окисления ацетата до двух молекул СО2 необходимы очень жесткие условия, со- совершенно несопоставимые с теми, какие существуют в клетках. Живые клетки в процессе эволюции научились исполь- использовать хотя и обходный, но зато более легкий путь, для которого не требуется столь высокой свободной энергии акти- активации. Клетки научились присоединять ацетат к другому соединению (оксалоа- цетату) и получать таким образом про- продукт (цитрат), который гораздо легче, чем сам ацетат, поддается дегидрирова- дегидрированию и декарбоксилированию. И хотя не- некоторые метаболические реакции, в част- частности цикл Кребса, кажутся нам на первый взгляд гораздо более сложными, чем это необходимо, тем не менее при- пристальное изучение таких случаев с точки зрения принципов, заложенных в меха- механизмах органических реакций, показы-
ГЛ. 16. ЦИКЛ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 491 вает, что в каждом из них избран наибо- наиболее легкий в химическом смысле путь, обеспечивающий данное превращение. 16.8. Применение изотопных методов в изучении цикла лимонной кислоты Впервые предположение о существова- существовании цикла лимонной кислоты было вы- высказано на основании экспериментов с суспензиями измельченной мышечной ткани. Подробно ход превращений был выяснен позже с помощью высокоочи- щенных препаратов отдельных фермен- ферментов цикла. Предстояло установить, дей- действительно ли эти ферменты функциони- функционируют в интактных клетках и достаточна ли скорость обращения веществ в цикле лимонной кислоты, чтобы с его по- помощью можно было обосновать суммар- суммарную скорость окисления глюкозы в жи- животных тканях. Для получения ответа на эти вопросы были предприняты исследо- исследования с мечеными метаболитами, таки- такими, как пируват или ацетат, у которых определенные атомы углерода в молеку- молекуле были помечены изотопами 13С или 14С. С помощью изотопных методов во многих строгих экспериментах были по- получены убедительные доказательства как самого существования цикла лимонной кислоты в ичтактных клетках, так и его высокой активности. Некоторые ранние эксперименты с применением изотопов дали, однако, неожиданные результаты, породившие серьезную полемику о путях и механиз- механизмах отдельных реакций цикла лимонной кислоты. Эти результаты свидетельство- свидетельствовали, казалось бы, о том, что лимонная кислота не является первой трикарбоно- вой кислотой, образующейся в цикле. Со- Соответственно и цикл стали называть не циклом лимонной кислоты, а циклом трикарбоновых кислот (сокращенно ЦТК). Позднее, однако, было твердо установлено, что в качестве первого про- продукта конденсации образуется именно лимонная кислота. Подробности, касаю- касающиеся этого эпизода из истории откры- открытия цикла лимонной кислоты, мы приво- приводим в дополнении 16-1. Дополнение 16-1. Действительно ли первой из трикарбоновых кислот образуется в цикле лимонная кислота? Как только стали доступны стабильный изотоп углерода 13С и ра- радиоактивные изотопы этого элемента "Си 14С, исследователи сразу же воспользовались ими для того, чтобы проследить путь атомов угле- углерода в цикле лимонной кислоты. В одном из таких экспериментов, по- положившем начало дискуссии о роли лимонной кислоты, ацетат, ме- меченный по углероду карбоксильной группы (CH/DOO ~ ), инкубирова- инкубировали в аэробных условиях с суспензией ткани. Поскольку ацетат в животных тканях преврашается ферментативным путем в ацетил- СоА (разд. 18.2), такая постановка опыта давала возможность просле- проследить путь карбоксильного углерода ацетильной группы ацетил-СоА в реакциях цикла. После инкубации из препарата ткани выделили сх-ке- тоглутаровую кислоту. Ее подвергли расщеплению в обычных химиче- химических реакциях, чтобы установить положение метки, первоначально на- находившейся в карбоксильной группе ацетата. В результате конденса- конденсации немеченого оксалоацетата с ацетатом, меченным по карбоксиль- карбоксильной группе, должен был образоваться цитрат, меченный только по одной из двух своих первичных карбоксильных групп (рис. 1). По- Поскольку молекула лимонной кислоты не обладает асимметрией, т. е. не
492 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ содержит асимметрического углеродного атома, две ее концевые кар- карбоксильные группы химически неразличимы. Следовательно, одна по- половина меченых молекул цитрата, образовавшихся из меченого ацета- ацетата, должна была, казалось, дать ос-кетоглутарат, несущий метку в а-карбоксильной группе, а другая половина -ос-кетоглутарат с мет- меткой в у-карбоксилъной группе; иными словами, должен был образо- образоваться ос-кетоглутарат, несущий метку в обеих карбоксильных группах. *coo- сн, но—с—coo- , j Меченый цитрат соо- Путь 1 Путь 2 НО—СН соо- *СОО" тСН, ОСН. аС=О соо- Образуется только этот продукт Следует ожидать образования двух форм меченого а-кетоглутарата СОО" *СОО" оС=0 I эсн, гСН, ссю- Рис. 1. Включение меченого атома углерода ацетильной группы в ос-кетоглутаровую кисло- кислоту в цикле лимонной кислоты. Молекула ли- лимонной кислоты, образующейся в цитрат-син- тазной реакции, не содержит хирального цент- центра (т. е. асимметрического атома углерода). По- Поэтому следовало ожидать, что из нее будут получаться два разных вида меченой ос-кето- глутаровой кислоты, как показано на рисунке. В действительности же образуется лишь тот вид, к которому ведет путь 1, т.е. ос-кето- ос-кетоглутарат, меченный по у-карбоксильной груп- группе. Углеродные атомы ацетильной группы, включившейся в цикл, выделены красным. Однако, вопреки ожиданию, оказалось, что выделенный из тканевой суспензии ос-кетоглутарат содержит метку только в одной у-карбок- у-карбоксильной группе (рис. 1). На основании этого было сделано заключение, что ни сама лимонная кислота, ни какое-либо другое соединение с сим- симметрическими молекулами не может быть промежуточным продуктом на пути от ацетата к ос-кетоглутарату. Было высказано предположение, что первым продуктом конденсации ацетата с оксалоацетатом являет- является не лимонная, а какая-то асимметрическая трикарбоновая кислота, по-видимому iyuc-аконитовая или изолимонная. Из-за этого было из- изменено и название цикла-его стали называть циклом трикарбоновых кислот. Однако в 1948 г. А. Огстон, биохимик из Оксфордского университе- университета, указал, что хотя молекула лимонной кислоты и не содержит асим- асимметрического атома углерода, она тем не менее может вести себя как
ГЛ. 16. ЦИКЛ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 493 асимметрическое соединение, если атакующий ее фермент имеет асим- асимметрический активный центр. Огстон предположил, что в активном центре аконитазы (фермента, действующего на новообразованный ци- цитрат) имеются три точки для связывания молекулы цитрата и что эта молекула присоединяется к активному центру фермента специфиче- специфическим образом в трех этих точках сразу. Как видно из рис. 2, присоеди- присоединение молекулы цитрата к трем точкам может реализоваться только одним-единственным путем, и это объясняет нам, почему метка обна- обнаруживается только в одной из двух карбоксильных групп ос-кетоглута- рата. Рис. 2. Лимонная кислота относится к прохи- ральным соединениям. Это ее свойство проще всего объяснить, представив себе, что молекула лимонной кислоты присоединяется к активно- активному центру фермента аконитазы специфическим образом в трех точках. Хотя в этой молекуле нет асимметрического атома углерода, три раз- различных заместителя при ее центральном угле- углеродном атоме могут присоединяться к компле- комплементарным группам активного центра фермен- сн,соО" Б z та только одним-единственным способом. I I А. Структура лимонной кислоты. Б. Схемати- 1 Атакуемая г X у гвяэь Y-^lN ческое изображение молекулы лимонной кисло- Y ты: Х= -ОН, Y= -COO", Z = = — CHjCOO . В. Правильная комплементар- комплементарная «подгонка» молекулы лимонной кислоты Эта связь может занять к связывающему участку (активному центру) Эта связь не может занять ? правильное положение аконитазы. Существует только один способ ипото^невтаГигся лС" М™Т"атакувт присоединения трех специфических групп ли- * | ? монной кислоты к трем связывающим точкам —i—77 Активный центр с активного центра аконитазы. Поэтому акони- I z' /комплементарными таза может взаимодействовать только с одной — / св"то*амиМ" из двух ГРУПП- а именно с группой CHjCOO". Органические соединения, не имеющие в своей молекуле хирального центра, но потенциально способные взаимодействовать с асимметри- асимметрическими активными центрами фермента как асимметрические соедине- соединения, называются прохиральными. 16.9. Превращение пирувата регулируется также прежде всего за счет в ацетил-СоА регулируется скорости образования «топлива» для этого цикла. Этим «топливом» является Из гл. 15 мы знаем, что скорость гли- ацетил-СоА, образующийся при окисле- колиза регулируется на двух уровнях, нии пирувата и жирных кислот (гл. 18). В первую очередь регулируется, как мы На рис. 16-14 показано, как реакция видели, сама подача «топлива» для гли- образования ацетил-СоА, катализируе- колиза. В этой регуляции участвуют два мая пируватдегидрогеназным комплек- регуляторных фермента, контролирую- сом. регулируется в животных тканях при щих вхождение глюкозы в последова- помощи ковалентной модификации это- тельность гликолитических реакций,— го комплекса (разд. 9.22). Когда концен- гексокиназа, катализирующая фосфори- трация АТР в митохондриях относитель- лирование D-глюкозы с образованием но велика и когда ацетил-СоА, а также глюкозо-6-фосфата, и гликоген-фосфори- промежуточные продукты цикла Кребса лаза, катализирующая первый этап обра- имеются в достаточном количестве, обес- зования глюкозо-6-фосфата из гликоге- печивающем удовлетворение энергетиче- на. Скорость цикла лимонной кислоты ских нужд клетки, дальнейшее образова-
494 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ ние ацетил-СоА приостанавливается. В этих условиях, которые служат сигна- сигналом для такой приостановки, АТР является положительным модулятором, активирующим вспомогательный фер- фермент - киназу пируватдегидрогеназы. Этот фермент использует АТР для фос- форилирования остатка серина в актив- активном центре молекулы пируватдегидроге- пируватдегидрогеназы, в результате чего образуется неактивная форма фермента-фосфопи- руватдегидрогеназа (рис. 16-14). Если, однако, потребность в АТР возрастает и уровень АТР соответственно снижает- снижается, то неактивная, фосфорилированная, форма пируватдегидрогеназы может быть вновь активирована. Это происхо- происходит в результате гидролитического отще- отщепления от молекулы пируватдегидроге- пируватдегидрогеназы ингибирующей фосфатной группы. Катализирует эту реакцию другой фер- фермент - фосфатаза фосфопируватдегидро- геназы. Стимулирующее действие на этот фермент оказывает повышение кон- концентрации ионов Са2 +, играющих роль важного метаболического посредника; концентрация ионов Са2 + увеличивается всякий раз, когда возникает потребность в АТР. Киназа пируватдегидрогеназы и фосфатаза фосфопируватдегидроге- назы присутствуют в пируватдегидроге- назном комплексе. Этот комплекс, следо- следовательно, представляет собой очень сложную, независимую и саморегули- саморегулирующуюся систему. Пируватдегидрогеназный комплекс ре- регулируется также путем аллостерической Рис. 16-14. Регуляция пируватдегидрогеназной реакции путем ковалентного взаимопревраще- взаимопревращения активной и неактивной форм фермента. Ионы CaJ+ способствуют образованию актив- активной формы фермента, стимулируя фосфатазу фосфопируватдегидрогеназы. модуляции. Сильное ингибирующее дей- действие оказывают на него (помимо АТР) ацетил-СоА и NADH, которые являются продуктами пируватдегидрогеназной ре- реакции и в то же время играют роль алло- стерических ингибиторов этой системы. Аллостерическое ингибирование окисле- окисления пирувата резко усиливается в присут- присутствии высокомолекулярных жирных кис- кислот; позже мы узнаем (гл. 18), что жирные кислоты тоже служат источни- источником ацетил-СоА. Таким образом, катали- каталитическая активность пируватдегидроге- назного комплекса выключается в тех случаях, когда в клетках имеется доста- достаточно топлива в виде жирных кислот и ацетил-СоА или когда в них повы- повышаются концентрация АТР и отношение NADH/NAD +. 16.10. Цикл лимонной кислоты регулируется Познакомимся теперь с тем, каким образом регулируется сам цикл лимон- лимонной кислоты (рис. 16-15). В большинстве случаев скорость функционирования ме- метаболических циклов определяется их на- начальными этапами. Полагают, что так же обстоит дело и в случае цикла лимонной кислоты. Общая скорость его функцио- функционирования во многих тканях определяет- определяется первой реакцией: Ацетил-СоА + Оксалоацетат ->¦ -» Цитрат + СоА. Разумеется, скорость цитрат-синтазной реакции регулируется концентрацией ее Активная пирув атдегидрогеназа (дефосфорилированная) Фосфатаза [¦ Са 2 фосфо пируватдегидро-11 | геназы '" Неактивная пируватдегидрогеназа (фосфорилированная) АТР Киназа NADH J/ пируватдегидро- пируватдегидрогеназы ADP
ГЛ. 16. ЦИКЛ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 495 Пируват Концентрация оксалоацетата — главный фактор, определяюший скорость образования цитрата Оксалоацетат со,*-' ¦ f--NADH Ацетил-Co A Малат Сукцинил-Со А Ацетил-СоА /',, , .1? ЛлА-производнор жирной кислоты А Цитрат \ Изоцитрат ADPJ \ а-Кетоглутарат Фумарат ^ Сукцинат Сукцинил-Со А j Рис. 16-15. Регуляция цикла лимонной кисло- кислоты при окислении пирувата в животных клет- клетках. ATP, NADH, ацетил-СоА и Са2+ контро- контролируют скорость образования ацетил-СоА из пирувата; скорость же функционирования цик- цикла лимонной кислоты в целом регулируется концентрацией оксалоацетата, а также актив- активностью цитрат-синтазы и изоцитратдегидроге- назы. субстратов, в частности концентрацией ацетил-СоА, а она в свою очередь зави- зависит от активности пируватдегидрогеназ- ного комплекса. Регулируется эта реак- реакция также концентрацией второго суб- субстрата -оксалоацетата; возможно даже, что этот фактор играет главную роль, по- поскольку концентрация оксалоацетата в митохондриях очень низка и зависит от метаболических условий. На активность цитрат-синтазы влияет также концентра- концентрация сукцинил-СоА, одного из более позд- поздних промежуточных продуктов цикла. Как только концентрация сукцинил-СоА превышает нормальный стационарный уровень, цитрат-синтаза сразу же ингиби- руется, поскольку сукцинил-СоА пони- понижает ее сродство к ацетил-СоА. Жирные кислоты, служащие предшественниками ацетил-СоА, тоже ингибируют цитрат- синтазу посредством аллостерических эффектов. В некоторых клетках роль ин- ингибиторов цитрат-синтазы играют ци- цитрат и NADH. У большей части клеток окисление изоцитрата до ос-кетоглутарата и СО2, которое может происходить под дей- действием двух разных изоцитратдегидроге- наз, регулируется, по-видимому, путем аллостерической стимуляции NAD-зави- симого фермента, вызываемой ADP. В то же время NADH и NADPH действуют как отрицательные модуляторы изоци- тратдегидрогеназной активности. Инги- Ингибитором активности а-кетоглутаратдеги- дрогеназного комплекса служит продукт реакции сукцинил-СоА. Таким образом, в цикле лимонной кислоты регулируются по меньшей мере три стадии, и только в своих деталях эта регуляция у разных типов клеток несколько различается. Скорость гликолиза в нормальных ус- условиях согласована со скоростью функ- функционирования цикла лимонной кислоты: в клетке до пирувата расщепляется ровно столько глюкозы, сколько необходимо для того, чтобы обеспечить цикл лимон- лимонной кислоты «топливом», т. е. ацетильны- ацетильными группами ацетил-СоА. Ни пируват, ни лактат, ни ацетил-СоА обычно не нака- накапливаются в аэробных клетках в боль- больших количествах; их концентрации под- поддерживаются на некоем постоянном уровне, соответствующем динамическо- динамическому равновесию. Согласованность между скоростью гликолиза и скоростью функ- функционирования цикла лимонной кислоты объясняется не только тем, что первый процесс ингибируется высокими концен- концентрациями АТР и NADH, т.е. компонен- компонентами, общими для гликолитической и дыхательной стадий окисления глю- глюкозы; определенную роль в этой согласо- согласованности играет также и концентрация цитрата. Продукт первой стадии цикла лимонной кислоты - цитрат - является аллостерическим ингибитором фосфо- фруктокиназы, катализирующей в про- процессе гликолиза реакцию фосфорилиро- вания фруктозо-6-фосфата (разд. 15.13 и рис. 15.15). 16.11. Промежуточные продукты цикла лимонной кислоты используются также и в других метаболических реакциях, а убыль их постоянно восполняется Цикл лимонной кислоты-это один из амфиболических путей (разд. 13.7). Он
496 ЧАСТЬ II БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ используется не только для окислитель- окислительного катаболизма, т.е. для расщепления углеводов, жирных кислот и аминокис- аминокислот, но может служить также первой ста- стадией многих биосинтетических путей, для которых он является источником пред- предшественников. Под воздействием ряда важных вспомогательных ферментов не- некоторые промежуточные продукты ци- цикла лимонной кислоты, главным обра- образом ос-кетоглутарат, сукцинат и оксалоа- цетат, могут удаляться из цикла и использоваться в качестве предше- предшественников аминокислот (гл. 22). Ско- Скорость функционирования цикла лимон- лимонной кислоты при этом, казалось бы, должна снижаться, поскольку такой от- отток промежуточных продуктов из цикла должен понижать их концентрацию в клетке. В действительности же этого не происходит, так как убыль промежу- промежуточных продуктов цикла восполняется благодаря действию другого набора фер- ферментов. При нормальных условиях реак- реакции, отвлекающие промежуточные про- продукты из цикла, и реакции, восполняю- восполняющие их убыль, находятся в состоянии динамического равновесия, так что кон- концентрация этих продуктов в митохон- митохондриях остается более или менее постоян- постоянной. Специальные ферментативные реак- реакции, обеспечивающие пополнение пула промежуточных продуктов цикла лимон- лимонной кислоты, носят название анаплероти- ческих («пополняющих») реакций. На- Наиболее важная реакция такого рода в животных тканях-это ферментативное карбоксилирование пирувата за счет СО2 с образованием оксалоацетата (рис. 16-16); катализирует эту обрати- обратимую реакцию фермент пируваткарбокси- лаза Пируват + СО2 + АТР + Mg2 + + н2о — ^± Оксалоацетат + ADP + Р, + + 2Н + AG0' = - 0,5 ккал/моль. Если для цикла лимонной кислоты не хватает оксалоацетата или какого-ни- АТР + СН3 С=О 1 Ыруват СОО" Ацетил-Co А нго Пируваткарбо - ксилаза Mg2+ Оксалоацетат «Р CHS U coo + ADP + Pi + 2H+ Рис. 16-16. Пируваткарбоксилазная реакция и ее стимуляция положительным модулятором ацетнл-СоА. Включившаяся СО2 показана на красном фоне. будь другого промежуточного продукта цикла, то карбоксилирование пирувата стимулируется и запас оксалоацетата растет. Для ферментативного присоеди- присоединения карбоксильной группы к молекуле пирувата требуется энергия. Источником ее служит сопряженное с данной реак- реакцией расщепление АТР до ADP и фосфа- фосфата. Поскольку суммарная реакция сопро- сопровождается лишь незначительным измене- изменением стандартной свободной энергии, мы можем заключить, что свободная энергия, необходимая для присоединения карбоксильной группы к пирувату, при- примерно равна свободной энергии, выде- выделяющейся при гидролизе АТР. Пируваткарбоксилаза-очень сложный фермент. Его молекулярная масса равна приблизительно 650000. Молекула фер- фермента содержит четыре простетические группы. Каждая из них состоит из одной молекулы витамина биотина (разд. 10.9),
ГЛ. 16. ЦИКЛ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 497 ковалентно связанного (пептидной связью) с е-аминогруппой особого остат- остатка лизина, находящегося в активном цен- центре (рис. 16-17). Свободная СО2, предше- предшественник новой карбоксильной группы оксалоацетата, сначала активируется пу- путем присоединения к одному из атомов азота в молекуле биотина. Эта актива- активация, связанная с расходованием АТР, со- составляет первую стадию реакции, ката- катализируемой пируваткарбоксилазой (Е означает здесь фермент): АТР + СО2 + Е-биотин + Н2О ^± ^ ADP + Р, + Е-биотин-СОСГ + + 2Н + . На второй стадии, протекающей также в активном центре фермента, новая кар- карбоксильная группа, ковалентно связан- |Фермрнт[ Остаток лизина в активном центре фермента i<f Биотинильная '¦/' группа Рис. 16-17. Простетическая группа пируваткар- боксилазы. Карбоксильная группа биотина об- образует пептилную связь с Е-аминогруппой ос- остатка лизина, входящего в состав активного центра фермента. СО2 активируется, образуя N-карбоксипроизводное биотинильной просте- тической группы Затем эта карбоксильная группа непосредственный донор COZ для пи- рувата - переносится на пируват. ная с простетической группой фермента, переносится на пируват с образованием оксалоацетата (рис. L6-16): Е-биотин-СОО" + Пируват ^± ^± Е-биотин + Оксалоацетат. Пируваткарбоксилаза принадлежит к регуляторным ферментам. В отсут- отсутствие аиетил-CoA. который служит для нее положительным модулятором, ско- скорость катализируемой ею прямой реак- реакции, приводящей к образованию окса- оксалоацетата, очень невелика (рис. 16-16). Избыток же ацетил-СоА, поставляющего «топливо» для цикла лимонной кислоты, стимулирует пируваткарбоксилазную ре- реакцию; в результате этого образуется больше оксалоацетата и цикл использует больше ацетил-СоА в цитрат-синтазной реакции. Пируваткарбоксилазная реакция — главная анаплеротическая реакция в пе- печени и почках. В миокарде и в мышцах протекают другие анаплеротические ре- реакции. Одна из таких реакций катализи- катализируется фосфоенолпируваткарбоксикина- зой (гл. 20) Фосфоенолпируват + СО2 + + GDP Мп2 Оксалоацетат + GTP. В этой реакции происходит расщепление фосфоенолпирувата - сверхвысокоэнер- гетического фосфорилированного соеди- соединения, образующегося в процессе глико- гликолиза. Высвобождаемая энергия исполь- используется для карбоксилирования с образо- образованием оксалоацетата. а ее остаток запасается в форме GTP. 16.12. Глиоксилатный цикл- одна из модификаций цикла .Н1МОИНОЙ КИСЛОТЫ У растений и некоторых микроорга- микроорганизмов, например у Е. coli, ацетильные группы часто служат не только высоко- высокоэнергетическим «топливом», но и источ- источником метаболитов, из которых строятся углеродные скелеты углеводов. В таких клетках действуют два варианта цикла лимонной кислоты: 1) обычная последо- 5-950
498 ЧАСТЬ И. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ вательность реакций, в ходе которой про- происходит окисление ацетил-СоА до СО2, свойственная большинству тканей, и 2) особая ее модификация, называемая глиоксилатным циклом (рис. 16-18). Сум- Суммарное уравнение для глиоксилатного цикла, который тоже можно рассматри- рассматривать как анаплеротический путь, имеет вид 2Ацетил-8-СоА + NAD 2H2O Сукцинат + 2CoA-SH + + NADH + ЗН\ нолпируват путем обращения описанной" выше фосфоенолпируваткарбоксикиназ- ной реакции. Фосфоенолпируват исполь- используется в качестве предшественника при биосинтезе глюкозы (гл. 20). У животных глиоксилатный цикл отсутствует; изоци- трат-синтазы и малат-лиазы в животных клетках нет. В организме животных су- существуют другие пути для синтеза угле- углеводов из простых предшественников (гл. 20). В прорастающих семенах глиок- глиоксилатный цикл, напротив, функциони- функционирует очень активно: таким путем из аце- ацетильных групп (источником которых Ацетил-Го А Цитрат- Оксалоацетат синтеза „CoA-SH Изоцитрат- лиаза Аконитаза гграт Сукцинат Малат- синтаза 1 лиоксилат Ацетил-Co А + Н20 В глиоксилатном цикле ацетил-СоА взаимодействует с оксалоацетатом, в ре- результате чего образуется цитрат (рис. 16-18). Однако расщепление изоци- трата происходит не в обычной изоци- тратдегидроненазной реакции, как в ци- цикле лимонной кислоты, а особым пу- путем-под действием фермента изоци- трат-лиазы с образованием сукцината и глиоксилата. Образовавшийся глиокси- лат далее конденсируется с другой моле- молекулой ацетил-СоА, что приводит к обра- образованию малата; эта реакция катализи- катализируется малат-синтазой (рис. 16-19). За- Затем малат окисляется до оксалоацетата, который может конденсироваться с но- новой молекулой ацетил-СоА, начиная тем самым новый оборот цикла. При каждом обороте глиоксилатного цикла в него вступают две молекулы ацетил-СоА и образуется одна молекула сукцината, которая затем используется в процессах биосинтеза. Сукцинат может превра- превращаться через фумарат и малат в оксалоа- цетат, из которого образуется фосфое- Рис. 16-18. Глиоксилатный цикл. Красным выделены реакции, катализируемые изоцитрат- лиазой (ее называют также нзоцитратазой) и малат-синтазой. Все остальные реакции те же, что и в цикле лимонной кислоты. служат жирные кислоты, входящие в со- состав запасных триацилглицеролов) обра- образуется глюкоза. Ферменты изоцитрат- лиаза и малат-синтаза находятся в растительных клетках в особых цито- плазматических органеллах - глиоксисо- мах. 16.13. Вторичные пути катаболизма глюкозы: пентозофосфатнмй путь Большая часть глюкозы расщепляется в животных тканях по гликолитическому пути с образованием пирувата. В свою очередь большая часть пирувата окис- окисляется через цикл лимонной кислоты. Главный смысл расщепления глюкозы в процессе гликолиза заключается в обес- обеспечении клетки энергией в форме АТР. Наряду с этим существуют, однако, и другие, второстепенные, пути катабо- катаболизма глюкозы, имеющие специальное назначение. Эти пути составляют часть
ГЛ. 16. ЦИКЛ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 499 сосг носн НС—СОО I Изоцитрат L.I12 соо- Изоцитрат- лиаза СОО" сн2 сн2 СОО" сно сосг Сукцинат Глиоксилат СН, h S—Co A Ацатил-Со А СНО Глиоксилат I сосг Мапат-синтаза Манат COO" неон coo- CoA-SH Рис. 16-19. Реакции, свойственные только гли- оксилатному циклу. А. Превращение изоцитра- та в сукцинат и глиоксилат. Б. Конденсация глиоксилата и ацетил-СоА. в результате кото- которой образуется малат. вторичного метаболизма глюкозы, на них вырабатываются особые продукты, в которых нуждается клетка. В этом раз- разделе и в следующем мы коротко охарак- охарактеризуем два таких пути. Пентозофосфатный путь, называемый также фосфоглюконатным путем (рис. 16-20), поставляет в животных тка- тканях два специальных продукта: NADH и рибозо-5-фосфат. Напомним, что NADH является одним из переносчиков химической энергии и что он передает эту энергию в форме восстановительной спо- способности (разд. 13.9). Особенно важна эта функция в тех тканях, в которых про- протекает активный биосинтез жирных кис- кислот и стероидов из малых молекул-пред- молекул-предшественников, в частности в молочной железе, жировой ткани, коре надпочечни- надпочечников и печени. При биосинтезе жирных кислот восстановительная способность в форме NADH требуется для восстанов- восстановления двойных связей в молекулах, играющих в этом процессе роль проме- промежуточных продуктов. В тканях, в ко- которых биосинтез жирных кислот выра- выражен слабо, например в скелетных мыш- мышцах, пентозофосфатный путь практически отсутствует. Другая функция этого пути заключается в образовании пентоз (в частности, D-рибозы), которые исполь- используются для синтеза нуклеиновых ки- кислот. Первой реакцией пентозофосфатного пути является ферментативное дегидри- дегидрирование глюкозо-6-фосфата до 6-фосфо- глюконата, катализируемое глюкозо-6- фосфат-дегидрогеназой (рис. 16-20). Ак- Акцептором электронов служит при этом NADP+. В качестве первого продукта образуется 6-фосфоглюконо-Ь-лактон, ги- дролизующийся затем до свободной кис- кислоты под действием специфической лак- тоназы (рис. 16-20). Равновесие суммар- суммарной реакции сильно смешено в сторону образования NADPH. На следующей стадии 6-фосфоглюконат подвергается дегидрированию и декарбоксилирова- нию под действием 6-фосфоглюконатде- гидрогеназы. Эта реакция приводит к образованию кетопентозы D-рибуло- зо-5-фосфата (рис. 16-20) и еще одной молекулы NADPH. Фосфопентозоизоме- раза катализирует превращение D-рибу- лозо-5-фосфата в его альдоизомер, D-ри- бозо-5-фосфат (рис. 16-20), который мо- может использоваться при биосинтезе ри- бонуклеотидов и дезоксирибонуклеоти- дов. В некоторых клетках пентозофос- пентозофосфатный путь на этом кончается, и тогда
500 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ неон 1 NADP+ Н+ Глюкоэо- 6-фосфат CH.OPCV- р+ I ГлЮкоэо-6-фосфат - ] дегидрогеназа NADPH ^ Mg2+ 6-фосфоглюконо- Б-лактон Н'° > Лактоназа 6-фосфоглюконат NADP* ->, Н+ + NADPH 6-фосфоглкжонат - дегидрогеназа СН2ОН =О HCOJ IH D-рибулозо- нсон 54осфаг СН2ОРО.,г- Фосфопентозо- изомераза сно НСОН D-рибозо- НСОН 5-фосфат НСОН Рис. 16-20. Пентозофосфатный путь. его суммарное уравнение может быть за- записано в следующем виде: Глюкозо-6-фосфат + 2NADP+ + + Н2О -> -» О-рибозо-5-фосфат + СО2 + + 2NADPH + 2Н + . В итоге образуются NADPH, который используется для реакций восстанови- восстановительного биосинтеза в цитоплазме, и 0-рибозо-5-фосфат, играющий роль предшественника при синтезе нуклеоти- дов. Пентозофосфатный путь активно ре- реализуется и в эритроцитах человека. Образующийся NADPH предохраняет ненасыщенные жирные кислоты, входя- входящие в состав клеточной мембраны, от аномальных взаимодействий с кислоро- кислородом, и он же способствует поддержанию нормальной степени окисления атомов железа гемоглобина (Fe2 +). Существует группа наследственных болезней челове- человека, при которых активность глюкозо-6- фосфат-дегидрогеназы и некоторых других ферментов пентозофосфатного пути понижена или вообще отсутствует. У таких больных наблюдается патологи- патологический гемолиз-разрушение эритроци- эритроцитов с выделением из них (через повре- поврежденную мембрану) гемоглобина, что приводит к развитию анемии. Состояние резко ухудшается под влиянием неко- некоторых лекарственных препаратов, осо- особенно под влиянием противомалярийно- противомалярийного препарата примахина. В Африке и Азии от этих наследственных болезней страдают многие миллионы людей. Ниже мы рассмотрим другие аспекты пентозофосфатного пути (гл. 23). 16.14. Вторичный путь, по которому происходит превращение глюкозы в глюкуроновую и аскорбиновую кислоты По другому вторичному пути катабо- катаболизма глюкозы в животных тканях обра- образуются два специализированных продук- продукта: И-глюкуронат, важная роль которого связана с обезвреживанием и выведением
ГЛ. 16. ЦИКЛ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 501 из организма чужеродных органических веществ, и L-аскорбиновая кислота {вита- {витамин С) (рис. 16-21). В этом случае О-глюкозо-1-фосфат сначала взаимодей- взаимодействует с UTP и превращается в UDP- глюкозу. Затем глюкозная часть моле- молекулы UDP-глюкозы подвергается фер- ферментативному дегидрированию с обра- образованием UDP-D-глюкуроната. Эта реак- реакция представляет собой еще один пример использования UDP-производных в ка- качестве промежуточных продуктов при ферментативных превращениях Сахаров (разд. 15.9). UDP-D-глюкуронат способ- способствует обезвреживанию некоторых чуже- чужеродных веществ или лекарственных пре- препаратов (например, фенола) и таким образом усиливает их выведение через почки (рис. 16-21). Кроме того, UDP- глюкуронат служит предшественником D-глюкуронатных остатков в молекулах таких кислых полисахаридов, как гиалу- роновая кислота и гепарин (разд. 11.12). D-глюкуронат играет также роль про- промежуточного продукта в процессе пре- превращения D-глюкозы в L-аскорбиновую кислоту. Он восстанавливается за счет NADPH до шестиуглеродной сахарной В-глюкозо-1-фосфат j 1М(Г Рис. 16-21. Вторичный путь превращения глю- глюкозы--через UDP-глюкуроновую кислоту. СНаОН но н Н,О + 2NAD* - ЗН* + 2NADH соо- Н Н О" О- н/1 I I О—Р—О—Р— Уридин ОН О О А 1ШРглюкозодегидрогеназа UDP-глюкоза /н vOH > но UDP Н О" О~ н/ I I О—Р—О—Р— Уридин II II ОН О О U DP-D-глюкуронат х Путь ^J\K L-аскорбату UDP X НС=О НСОН НОСН I НСОН НСОН соо- D-глюкуронат н он Фенолглюкозидуронид (форма, в которой фенол выводится из организма) NADPH Глюкуронатредуктаза соо- носн НОСН НСОН I НОСН сн,он L-гулонат L-гулонат HjO А Альдонолактоназа О=С 1 НОСН НОСН I НС— L-гулонолактон НОСН - СН,ОН 2Н "А Гулонолактоноксидаза О=С 1 носП II о нос | L-аскорбиновая НС ' кислота НОСН СНгОН
502 ЧАСТЬ И. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ кислоты- Ьгулоната, которая затем пре- превращается в соответствующий лактон. L-гулонолактон дегидрируется до L- аскорбиновой кислоты, или витамина С, при участии флавопротеина гулонолак- тон- оксидазы. Именно этим путем син- синтезируется L-аскорбат в растениях и у тех животных, которые способны обеспечи- обеспечивать себя этим витамином. В организме человека, морской свинки, обезьян, неко- некоторых видов птиц и индийской плодояд- плодоядной летучей мыши витамин С не синтези- синтезируется; эти виды должны получать его в готовом виде, с пищей. Человек, мор- морская свинка и разные виды обезьян не синтезируют витамин С потому, что у них отсутствует фермент гулонолак- тон - оксидаза. Можно думать, что неког- некогда все организмы располагали набором ферментов, необходимых для синтеза аскорбата, но затем какие-то виды утра- утратили эту способность к синтезу вслед- вследствие мутации, которая, однако, не оказа- оказалась для них летальной, поскольку обычную пищу данного вида составляли богатые витамином С растения. Доля глюкозы, отвлекаемой на этот вторичный путь, очень невелика по срав- сравнению с большим ее количеством, расще- расщепляемым в процессе гликолиза и через цикл лимонной кислоты. Однако про- продукты таких вторичных путей жизненно необходимы организму. Краткое содержание главы Клеточное дыхание включает три ста- стадии: 1) окислительное образование аце- тил-СоА из пирувата, жирных кислот и аминокислот, 2) расщепление аце- ацетильных остатков в цикле лимонной кис- кислоты, в результате которого образуются СО2 и атомы водорода, и 3) перенос элек- электронов на молекулярный кислород, со- сопряженный с окислительным фосфорили- рованием ADP до АТР. При окислитель- окислительном катаболизме глюкозы выделяется гораздо больше энергии, чем при анаэ- анаэробном гликолизе. В аэробных условиях конечный продукт гликолиза прируват подвергается сначала дегидрированию и декарбоксилированию с образованием ацетил-СоА и СО2. Катализирует этот процесс пируватдегидрогеназныи ком- комплекс, состоящий из трех последователь- последовательно действующих ферментов. Цикл ли- лимонной кислоты протекает в митохон- митохондриях. Он начинается реакцией, в кото- которой цитрат-синтаза катализирует кон- конденсацию ацетил-СоА и оксалоацетата, в результате чего образуется цитрат. В присутствии аконитазы цитрат в обра- обратимой реакции превращается в изоци- трат, который затем дегидрируется с образованием а-кетоглутарата и СО2 с помощью NAD- и NADP-зависимых изоцитратдегидрогеназ. В результате де- дегидрирования и декарбоксилирования а- кетоглутарата образуются сукцинил- СоА и СО2. Сукцинил-СоА взаимодей- взаимодействует при участии сукцинил-СоА - син- тетазы с GDP и фосфатом, в результате чего образуется свободный сукцинат, а также GTP, который затем передает свою концевую фосфатную группу на ADP. Сукцинат окисляется до фумарата под действием одного из флавинсодер- жащих ферментов - сукцинатдегидроге- назы. Фумарат обратимо гидратируется фумаразой с образованием L-малата. ко- который затем окисляется NAD-зависимой L-малатдегидрогеназой. В результате окисления малата регенерирует одна мо- молекула оксалоацетата. Эта молекула мо- может теперь соединиться с новой молеку- молекулой ацетил-СоА и тем самым начать новый оборот цикла. Опыты с изотопной меткой, в которых изотопами углерода были помечены молекулы «топлива» или промежуточные продукты, убедительно доказали, что цикл лимонной кислоты представляет собой главный путь окисле- окисления углеводов в животных клетках. Об- Общая скорость функционирования цикла в печени определяется скоростью превра- превращения пирувата в ацетил-СоА, а также скоростью реакции, в ходе которой из ацетил-СоА образуется цитрат. Эта реак- реакция катализируется цитрат-синтазой, ал- лостерическим ферментом, на который оказывают ингибирующее действие сук- цинил-СоА и некоторые другие вещества, играющие роль отрицательных модуля- модуляторов. Промежуточные продукты цикла ли- лимонной кислоты используются также
ГЛ. 16. ЦИКЛ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 503 в качестве предшественников при био- биосинтезе аминокислот и других биомоле- биомолекул. Их убыль восполняется благодаря анаплеротическим реакциям. Среди этих реакций главную роль играет сопровож- сопровождающаяся расходованием АТР реакция карбоксилирования пирувата, в результа- результате которой образуется оксалоацетат. В растениях и некоторых микроорганиз- микроорганизмах, для которых единственным источни- источником углерода при синтезе углеводов слу- служит ацетат, действует глиоксилатный цикл, представляющий собой модифика- модификацию цикла лимонной кислоты. Этот путь обеспечивает образование из ацетил-СоА сукцината и некоторых других промежу- промежуточных продуктов для нужд биосинтеза. Глюкоза может вступать во вторичные катаболические реакции, в результате ко- которых образуются специальные про- продукты. Пентозофосфатный путь, на- начинающийся с дегидрирования глюко- зо-6-фосфата, поставляет рибозо-5-фос- фат и NADPH. Реакции пентозофосфат- ного пути, приводящие к этим продук- продуктам, протекают в растворимой части цитоплазмы - цитозоле. Рибозофосфаты служат предшественниками при синтезе нуклеотидов и нуклеиновых кислот, a NADPH используется в качестве глав- главного восстановителя при биосинтезе та- таких богатых водородом соединений, как жирные кислоты и холестерол. Из глю- глюкозы образуется и UDP-D-глюкуронат, который способствует обезвреживанию некоторых чужеродных веществ в орга- организме, а также является предшественни- предшественником L-аскорбиновой кислоты (витамина ЛИТЕРАТУРА Книги Goodwin Т. W. (ed). The Metabolic Roles of Citrate, Academic, New York, 1968. Симпо- Симпозиум в честь сэра Ганса Кребса. Lehninger A. L. Biochemistry, 2d ed.. Worth, New York, 1975. (Имеется перевод: Ле- нинджер А. Биохимия.-М.: Мир, 1976.) В гл. 17 содержичся подробное описание цикла. Lowenstein J.M. (ed.). Citric Acid Cycle: Control and Compartmentation, Dekker, New York, 1969. Статьи Hansford R. G. Control of Mitochondrial Substrate Oxidation, Curr. Top. Bioenerget., 10. 217-278 A9801. Подробное рассмотре- рассмотрение регуляции цикла лимонной кислоты. Krebs H. A. The History of the Tricarboxylic Acid Cycle, Perspect. Biol. Med.. 14, 154 170 A970). Увлекательный рассказ об откры- открытии цикла лимонной кислоты. Lowenstein J. M. The Tricarboxytic Acid Cycle, pp. 146 270. In: D.M. Greenberg (ed.). Metabolic Pathways, 3d ed., vol. 1, Academic, New York, 1967. Reed L.J. Multienzyme Complexes, Ace. Chem. Res., 7, 40^6 A974). Srere P. A. The Enzymology of the Formation and Breakdown of Citrate, Adv. Enzymol, 43, 57-101 A975). Williamson D. H. Sir Hans Krebs, the First 80 Years. Trends Biochem.. Sci., 5, vi-viii, August 1980. Краткая биография. Вопросы и задачи 1. Баланс цикла лимонной кислоты. В цикле лимонной кислоты для растепления аие- тил-СоА используются восемь фермен- ферментов: иитрат-синтаза. аконитаза. изоци- тратдегидрогеназа, а-кетоглутаратдегид- рогеназа, сукцинил-СоА-синтетаза. сукци- натдегидрогеназа, фумараза и малатде- i идрогеназа. а) Напишите уравнение химического ба- баланса для реакций, катализируемых каждым из этих ферменюв. б) Какой кофактор (или кофакторы) не- необходим для каждой из этих реакций? в) Для каждого из ферментов укажите, к какому из перечисленных ниже ти- типов принадлежит катализируемая им реакция: конденсация (образование углерод-углеродной связи): дегидрата- дегидратация (отщепление воды); гидратация (присоединение воды); декарбоксили- рование (отщепление СО2); окисле- окисление - восстановление; фосфорилирова- ние на уровне субстрата; изомериза- изомеризация. г) Напишите суммарное уравнение хими- химического баланса для превращения аце- тил-СоА в двуокись углерода. 2. Распознавание окислительно-восстанови- тельных реакций в процессах метаболиз- метаболизма. Биохимическая стратегия живых ор- организмов заключается в постадийном окислении органических соединений до двуокиси углерода и воды. Благодаря со- сопряжению тгих реакций с другими реак- реакциями значительная часть энергии, вые-
504 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ вобождающейся при окислении, запасает- запасается в форме АТР. Важно уметь распозна- распознавать окислительно-восстановительные процессы в метаболизме, исходя из на- наблюдаемых химических превращений. Восстановление какой-либо органической молекулы происходит в результате ги- гидрирования (присоединения водорода Н-Н) по двойной связи A) или по прос- простой связи-в этом случае с ее разрывом B). Окисление же, наоборот, происходит в результате дегидрирования (отщепле- (отщепление водорода Н-Н). В биохимических окислительно-восстановительных реак- реакциях (см. ниже, п. 3) функцию дегидриро- дегидрирования -гидрирования органических моле- молекул выполняют в присутствии соответ- соответствующих ферментов сопряженные пары коферментов: NAD+ -NADH и FAD FADH2. ОН ОН г) СН,—С—С н он он I I 4 • сн,—с—с^ н о Глицериновая кислота Глицеральдегид ОН ОН ОН я) сн,—с—сн, н Глицерол ОН О ОН I II I сн,—с—сн, Дигидрокси;щетон Толуол -/ Хо-н Бензойная кислота О Восстанов- II ление СНз—С—Н + Н—Н ; Ацетальдегид Окисление Н Восстанов- О—Н ление I А СН3-С—Н Окисление I Н Этанол A) О з—С О—Н Уксусная кислота + Н—Н Восстанов- Восстановление Окисление О ,н Восстанов- О Л6НИ6 || у х СНз—С—Н + О Окисление | Н Ацетальдегид Н (Z) Укажите, что именно происходит (окисление или восстановление) в ка- каждом из приведенных ниже метаболи- метаболических превращений. Напишите урав- уравнения химического баланса, добавив Н-Н. а) СН3—ОН Метшюл б) н—с—н о II н—с—н Формальдегид н—с он Формальдегид Муравьиная кислота О н—с н о=с=о .Двуокись углерода Муравьиная кислота V «J о \—сн,—сн,—с о Сукцинат О и СНз—С Н м II О Пировиноградная кислота о- ч. ' О ~О- о - СНз—С о Уксусная Н Фумарат \\ + сог кислота О II II /\ О ч 3. Никотинамидные кофермеиты-перено- кофермеиты-переносчики водорода в обратимых окислитель- окислительно-восстановительных реакциях (гл. 10). Никотинамидные коферменты могут вступать в обратимые окислительно-вос- окислительно-восстановительные реакции со специфичны- специфичными субстратами в присутствии соответ- соответствующих дегидрогеназ. В окислительно-
ГЛ. 16. ЦИКЛ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 505 восстановительной реакции участвует ни- котинамидное кольцо кофермента; остальная часть его молекулы играет роль связывающей группы, которую уз- узнает соответствующая дегидрогеназа. Формально источником водорода (Н - Н; см. п. 2) считается NADH + Н + . Когда кофермент окисляется, одновременно должен восстанавливаться субстрат: Субстрат + NADH + Н+ ^± Окисл. Восст. ^ Субстрат + NAD + Восст. Окисл. Укажите для каждой из приведенных ни- ниже реакций, что происходит с субстра- субстратом, т.е. окисляется ли он, восстанавли- восстанавливается или степень его окисления остает- остается неизменной (см. п. 2). Для тех реакций, в которых происходит окисление или восстановление субстрата, напишите уравнения химического баланса, указав требуемые количества NAD+, NADH, Н + и Н2О. Задача состоит в том, чтобы распознать, нужен ли для той или иной реакции окислительно-восстановитель- окислительно-восстановительный кофермент. о) СН3СН2ОН • СНз—С Этанол Ацетальдегид г"ОзРО—СНг—С—С н 3-фосфоглицероилфосфат e)CB о о II /• I,—С—СНг—С + Н* о- Ацетоацетат • СНз—С—СНз + СО2 Ацетон 4. Стимулирование потребления кислорода оксалоацетатом и малатом. В начале 30-х годов Альберт Сент-Дьёрдьи сооб- сообщил об интересном наблюдении. Он до- добавлял к дышащим суспензиям измель- измельченной грудной мышцы голубя оксалоаце- тат или малат и обнаружил, что потре- потребление кислорода при этом усиливается. При измерении количества потребляемо- потребляемого кислорода было выявлено одно удиви- удивительное обстоятельство: количество по- потребленного кислорода в 7 раз превыша- превышало то, какое требовалось для полного окисления добавленного оксалоацетата или малата до двуокиси углерода и во- воды. а) Почему добавление оксалоацетата или малата усиливает потребление кисло- кислорода? б) Почему количество поглощенного кислорода во много раз превышает то, которое требуется для полного окисления добавленного оксалоацета- оксалоацетата или малата? 5. Число молекул оксалоацетата в мито- митохондрии. В последней реакции цикла ли- лимонной кислоты происходит дегидриро- дегидрирование малата, в результате чего регене- регенерирует оксалоацетат, необходимый для Г/° \ НРО,2" н Глицеральдегид-3-фосфат о в) СН3—С- СНз—С СО, о Н Пируват Ацетальдегид г) СНз—С—С О" V СНз—С СО„ Пируват о- Ацетат О ОН л) -оос—сн2—с—соо-—> -оос—сн2—с—соо- н Оксалоацетат Малат взаимодействия с ацетил-СоА в цитрат- синтазной реакции L-малат + NAD+ -> Оксалоацетат + + NADH + Н+ AG°' = +7,1 ккал/моль. а) Вычислите константу равновесия для этой реакции при 25СС. б) Поскольку величина AG0' относится к стандартному значению рН, т.е. рН 7, константа равновесия, вычис- вычисленная, как в п. «а», равна „ , _ [Оксалоацетат] [NADH] 64 [L-малат] [NAD+ ] ' Как показывают измерения, концен-
506 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ трация L-малата в митохондриях печени крысы составляет приблизи- приблизительно 0,20 мМ, а отношение концен- концентраций NAD + /NADH равно 10. Вы- Вычислите концентрацию оксалоацетата в митохондриях печени крысы при рН 7. в) Митохондрии из печени крысы имеют форму шариков диаметром около 2 мкм. Чтобы правильно оценить кон- концентрацию оксалоацетата в митохон- митохондриях, определите число его молекул, приходящееся на одну митохондрию. 6. Изучение процесса днханич в изолиро- изолированных митохондриях. Можно изучать клеточное дыхание на препаратах изоли- изолированных митохондрий, наблюдая за тем, как изменяется поглощение кислоро- кислорода этими препаратами в зависимости от условий. Если к активно дышащим мито- митохондриям, использующим в качестве единственного источника «топлива» пи- руват, добавить 0,01 М малонат натрия, то дыхание внезапно прекращается и на- накапливается один из промежуточных продуктов метаболизма. а) Какова структура накапливающегося промежуточного продукта? б) Почему он накапливается? в) Почему прекращается потребление кислорода? г) Каким способом (кроме простого уда- удаления малоната) можно снять вызван- вызванное малонатом ингибирование? Пояс- Поясните свой ответ. 7. Опыты с мечеными соединениями на пре- препаратах изолированных митохондрий. Метаболические пути, на которых совер- совершаются превращения тех или иных орга- органических соединений, часто изучают, ис- используя меченые субстраты и прослежи- прослеживая судьбу метки. F—СНоСОО + СоА а) Как определить, действительно ли глюкоза, добавленная к суспензии изо- изолированных митохондрий, расщепля- расщепляется до СО 2 и Н2О? б) К препарату митохондрий добавили пиру ват, меченный 14С по метальной группе. Какое положение займет 14С в оксалоацетате после одного оборота цикла лимонной кислоты? Аргументи- Аргументируйте свой ответ, проследив судьбу метки на всем протяжении цикла. в) Сколько оборотов цикла лимонной кислоты потребуется для того, чтобы весь 14С выделился в виде 14СО2? Ар- Аргументируйте свой ответ. 8. Катаболизм 1-1*С-глюкозы. Активно ды- дышащую бактериальную культуру в тече- течение короткого времени инкубировали с 1-14С-глюкозой, а затем выделили из нее промежуточные продукты гликолиза и цикла лимонной кислоты. Эти проме- промежуточные продукты перечислены ниже. Укажите, какое положение занимает в ка- каждом из них 14С. Учитывайте при этом только начальное включение 14С в моле- молекулу. а) Фруктозо-1,6-дифосфат б) Глицеральдегид-3-фосфат в) Фосфоенолпируват г) Ацетил-СоА д) Цитрат е) а-Кетоглутарат ж) Оксалоацетат 9 Синтез оксалоацетата « цикле лимонной кислоты. Оксалоацетат образуется на по- последней стадии цикла лимонной кислоты в результате NAD """-зависимого окисле- окисления L-малата. Возможен ли синтез окса- оксалоацетата из ацетил-СоА под действием одних только ферментов и кофакторов цикла лимонной кислоты, без траты про- промежуточных продуктов цикла? Дайте подробный ответ. Как пополняется запас оксалоацетата ? 10. Механизм действия cfimopaifemama, при- применяемого в качестве родентицида. Пре- Препарат фторацетата, изготовляемого про- промышленным способом, применяется как средство борьбы с грызунами. В природе фторацетат обнаружен в одном из южно- южноафриканских растений. Проникнув в клет- клетки, он превращается во фторацетил- СоА в реакции, катализируемой фермен- ферментом ацетаттиокицазой -SH + АТР > F—CH..C—S—СоА + AMP + РР "II О Для изучения токсического действия фтор- ацетата был проведен эксперимент на интактном изолированном сердце крысы. После перфузии сердца 0,22 мМ фтораце- татом уменьшалось поглощение глю- глюкозы и снижалась скорость гликолиза, а глюкозо-6-фосфат и фруктозо-6-фосфат накапливались. Концентрации всех про- промежуточных продуктов цикла лимонной кислоты были при этом ниже нормы, и только концентрация цитрата превы- превышала норму в 10 раз. а) В какой точке блокируется цикл ли-
ГЛ. 16. ЦИКЛ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ 507 монной кислоты? Почему цитрат на- накапливается, а запас других промежу- промежуточных продуктов цикла истощается? б) Фторацетил-СоА подвергается фер- ферментативным превращениям в цикле лимонной кислоты. Какова структура конечного продукта обмена фтораце- тата? Почему он блокирует цикл ли- лимонной кислоты? Как можно снять это ингибирование? в) Почему после перфузии сердца фтор- ацетатом уменьшается поглощение глюкозы и снижается скорость глико- гликолиза? В чем причина накопления мо- монофосфатов? г) Почему отравление фторацетатом смертельно? 11. Синтез а-кетоглутарата. а-Кетоглута- рат играет центральную роль в биосин- биосинтезе ряда аминокислот. Предложите по- последовательность известных фермента- ферментативных реакций, результатом которой будет реальный синтез а-кетоглутарата из пирувата. Эти реакции не должны предусматривать потребления каких-ли- каких-либо промежуточных продуктов цикла ли- лимонной кислоты. Напишите суммарное уравнение для предложенной вами после- последовательности реакций и укажите источ- источник каждого реагирующего вещества. 12. Глиоксилатный цикл в семенах растений. Животные не могут синтезировать угле- углеводы из жиров, потому что они не спо- способны превращать ацетил-СоА (продукт расщепления жирных кислот) в пируват или оксалоацетат (соединения, необхо- необходимые для биосинтеза глюкозы). В слу- случае же растений и некоторых микроорга- микроорганизмов дело обстоит иначе. Благодаря имеющимся у них ферментам, изоци- трат-лиазе и малат-синтазе (рис. 16-18), они могут синтезировать оксалоацетат из ацетил-СоА в глиоксилатном цикле. В семенах высших растений содержатся большие количества масел, которые при прорастании служат источником жирных кислот, используемых в качестве предше- предшественников для синтеза целлюлозы на ранних стадиях развития, когда синтети- синтетический аппарат еще не сформировался. Напишите уравнения известных фермен- ферментативных реакций, последовательность которых обеспечивала бы реальный син- синтез оксалоацетата, используемого для биосинтеза глюкозы, из ацетил-СоА. Ва- Ваша схема не должна предусматривать по- потребления какого-либо промежуточного продукта цикла лимонной кислоты. На- Напишите суммарное уравнение образова- образования оксалоацетата из ацетил-СоА. Ука- Укажите источники всех кофакторов. 13. Катаболизм глюкозы. Гликолиз и пенто- зофосфатный путь. Изотопные методы дают возможность определить, какая часть катаболизма глюкозы в данной клетке или в данной ткани идет по гли- колитическому, а какая-по пентозофос- фатному пути. Клетки делят на две пор- порции: одну инкубируют с 1-14С-глюкозой, а другую-с 6-14С-глюкозой. После этого сравнивают начальные скорости появле- появления 14С в СО2, образующейся в резуль- результате окисления глюкозы, у этих двух ва- вариантов. Объясните, в чем заключается химический смысл такого подхода. Каки- Какими должны быть относительные на- начальные скорости образования 14СО2 в клетках печени, если исходить из того, что катаболизм глюкозы распределен по- поровну между гликолитическим и пентозо- фосфатным путями?
ГЛАВА 17 ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНОВ, ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ И РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА АТР В этой главе мы познакомимся с собы- событиями, составляющими кульминацию клеточного дыхания,-с переносом элек- электронов и окислительным фосфорилиро- ванием. Все ферментативные этапы окис- окислительного расщепления углеводов, жи- жиров и аминокислот сходятся в аэробных клетках к этой конечной стадии клеточ- клеточного дыхания, на которой электроны переходят от органических субстратов к кислороду, а энергия, выделяемая при этом, используется для образования АТР из ADP и фосфата. Представление о значении процесса окислительного фосфорилирования в ор- организме человека может дать следующий грубый расчет. Взрослый здоровый чело- человек весом 70 Ki при сидячей работе по- потребляет в день около 2800 ккал. Для то- того чтобы такое количество энергии было получено за счет гидролиза АТР, тре- требуется (в стандартных условиях) 2800/7,3 = 384 моль, или 190 кг АТР. Ме- Между тем в организме человека содержит- содержится всего около 50 г АТР. Ясно поэтому, что для удовлетворения потребности ор- организма в химической энергии эти 50 г АТР должны на протяжении суток тыся- тысячи и тысячи раз расщепиться до ADP и фосфага с последующим ресинтезом. Кроме того, должна, очевидно, в широ- широких пределах меняться и сама скорость обновления АТР в организме-от мини- минимальной во время сна до максимальной в периоды напряженной мышечной ра- работы. А это значит, что окислительное фосфорилирование-не просто непреры- непрерывный жизненно важный процесс, но и та- такой, который должен регулироваться в очень широких пределах. 17.1. Перенос электронов от субстратов на кислород служит источником энергии АТР На рис. 17-1 приведена схема, помо- помогающая понять общую организацию процесса переноса электронов и окисли- окислительного фосфорилирования. В каждом обороте цикла лимонной кислоты специ- специфичные дегидрогеназы отщепляют от из- оцитрата, а-кетоглутарата. сукцината и малата четыре пары атомов водорода. Эти атомы водорода в определенной точке отдают свои электроны в цепь переноса электронов и превращаются та- таким образом в ионы Н +, которые посту- поступают в водную среду. Электроны, пере- переходя от одного переносчика к другому, достигают в конце концов цитохрома аа3, или цитохромоксидазы, при участии которой они и передаются на кислород — конечный акцептор электронов у аэ- аэробных организмов. Всякий раз, ко!да атом кислорода присоединяет два элек- электрона, поступающие к нему по цепи пере- переноса, из водной среды поглощаются два иона Н+, равноценные тем, в которые превратились два атома водорода, отще- отщепленные ранее дегидрогеназами; в ре- результате этого образуется молекула Н2О. Из рис. 17-1 видно, что помимо четы- четырех пар атомов водорода, поставляемых
ГЛ. 17. ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНОВ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ 509 Стадия 1 Стадия 2 Амино- Аминокислоты Пируват Жирные кислоты Стадия 3 Нитрат Никл лимонной кислоты Изоцитрат ,«еание Перенос Убихинон электронов и J> окислительное Цитохром Ь фосфорили- I т Цитохром с Цитохром с Цитохром - оксидаза А +-Jdf Ъ ADP+Pi С Рис. 17-1. Схема процесса дыхания. Указано происхождение пар водородных атомов, от- отщепляемых дегидрогеназами. Эти пары водо- водородных атомов передают свои электроны Bе~) в цепь переноса электронов, по которой они в конечном счете переходят на кислород. Для восстановления каждого атома кислорода требуется 2е~ + 2Н+. Энергия, высвобождаю- высвобождающаяся при переносе одной пары электронов от NADH к кислороду, запасается в виде трех молекул АТР, образующихся в результате окислительного фосфорилирования. Цепь пере- переноса электронов представлена здесь не пол- полностью. каждым оборотом цикла лимонной кис- кислоты, образуются и другие атомы водо- водорода, отщепляемые дегидрогеназами от пирувата, жирных кислот и аминокислот во время расщепления этих соединений до ацетил-СоА и других продуктов. По- Почти все атомы водорода, отщепляемые дегидрогеназами от молекул клеточного топлива в аэробных клетках, в конце кон- концов передают свои электроны в дыха- дыхательную цепь, т. е. на тот общий путь, ко- который ведет к конечному акцептору электроно в - кислороду. Дыхательная цепь состоит из ряда бел- белков с прочно присоединенными просте- тическими группами, обладающими спо- способностью присоединять и отдавать электроны. Эти белки располагаются в определенной последовательности, в которой каждый из них способен при- присоединять электроны от предыдущего и передавать их тому, который следует за ним. Электроны, поступающие в эту цепь переносчиков, богаты энергией, но по ме- мере их продвижения по цепи, от одного переносчика к другому, они теряют сво- свободную энергию. Значительная часть этой энергии запасается в форме АТР с помощью молекулярных механизмов, действующих во внутренней мембране митохондрий. Перенос электронов со- сопряжен с синтезом АТР из A DP и фосфа- фосфата: на каждую пару электронов, пере- переданных по дыхательной цепи от NADH к кислороду, синтезируются три моле- молекулы АТР (рис. 17-1). Три участка дыха- дыхательной цепи, в которых энергия, высво- высвобождающаяся в процессе окисления — восстановления, запасается в форме АТР, называются пунктами фосфорили- фосфорилирования или пунктами запасания энергии. 17.2. Перенос электронов и окислительное фосфорилирование происходят во внутренней митохондриальной мембране В эукариотических клетках почти все специфичные дегидрогеназы, принимаю- принимающие участие в окислении пирувата и дру- другого клеточного топлива через цикл ли- лимонной кислоты, находятся во внутрен- внутреннем компартменте митохондрий - в их матриксе (рис. 17-2). Во внутренней ми- митохондриальной мембране локализуют- локализуются переносчики электронов, составляю- составляющие дыхательную цепь, и ферменты, катализирующие синтез АТР из ADP и фосфата. Молекулы, играющие роль
510 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Внутренняя мембрана: Содержит цепи переноса электронов, сукцинатдегидрогеназу, АТР- синтезируюшие ферменты и различные мембранные транспортные системы. Для большинства ионов небольшого размера она непроницаема Матрикс: Содержит большую часть ферментов Цикла лимонной кислоты, пируват- дегидрогеназную систему, систему окисления жирных кислот и многие другие ферменты. Он содержит также ATP, ADP, AMP, фосфат, NAD, NADP и кофермент А. Здесь же присутствует К+, M2 + C2 + Кристы Наружная мембрана: Легко проницаема почти для всех молекул и ионов небольшого размера. Так же, как и внутренняя мембрана, она содержит некоторые ферменты Пространство внутри крист Межмембранное пространство: Здесь находятся аденилат- киназа и другие ферменты топлива для цикла лимонной кислоты, такие, как пируват, должны попадать из цитозоля, т.е. из того места, где они образуются, в матрикс митохондрии, где им предстоит подвергнуться действию дегидрогеназ; при этом они, разумеется, должны пройти через обе митохон- дриальные мембраны. Точно так же и ADP, образовавшийся из АТР в цито- Молекулы АТР-синтетазы: Их основания находятся во внутренней мембране. АТР синтезируется в матриксе Рис. 17-2. Биохимическая анатомия митохонд- митохондрий. Указана локализация ферментов цикла лимонной кислоты, цепей переноса электронов, ферментов, катализирующих окислительное фосфорилирование, и внутреннего пула кофер- ментов. Во внутренней мембране одной мито- митохондрии печени может находиться свыше 10000 наборов цепей переноса электронов н АТР-синтетазных молекул. Число таких набо- наборов тем больше, чем больше площадь поверх- поверхности внутренней мембраны. Митохондрии сердца с их многочисленными кристами содер- содержат в 3 раза больше таких наборов, чем митохондрии печени. Внутренний пул кофер- ментов и промежуточных продуктов функцио- функционально изолирован от соответствующего пула цитоплазмы. Подробно структура митохонд- митохондрий описана в гл. 2.
ГЛ. 17. ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНОВ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ 511 золе в тех или иных процессах, требую- требующих затраты энергии, должен попасть в митохондриальный матрикс, чтобы здесь рефосфорилироваться до АТР. Но- Новообразованный АТР должен затем сно- снова перейти в цитозоль. Во внутренней ми- тохондриальной мембране имеются спе- специальные транспортные системы (разд. 17.19), которые переносят из цито- золя в митохондрии пируват и другое клеточное топливо, а также обеспечи- обеспечивают в процессе окислительного фосфо- рилирования поступление ADP и фосфа- фосфата в митохондрии и выход АТР в цитозоль. Таким образом, внутренняя мембрана митохондрий состоит из мно- многих компонентов. В нее входят перено- переносчики электронов, ряд ферментов и неко- некоторые мембранные транспортные си- системы. На долю всех этих компонентов приходится в общей сложности до 75% или даже больше от общей массы мем- мембраны; остальную часть составляют ли- пиды. Внутренняя митохондриальная мембрана имеет сложную мозаичную структуру, от целостности которой зави- зависит такая жизненно важная функция, как синтез АТР. 17.3. Реакции переноса электронов - это окислительно- восстановительные реакции Выше мы рассматривали некоторые ферментативные реакции, в которых во- водородные атомы или электроны пере- передаются от одной молекулы к другой. Те- Теперь мы вновь займемся такими реакция- реакциями и рассмотрим отдельные их характе- характеристики с количественной стороны. Хи- Химические реакции, в процессе которых происходит перенос электронов от одной молекулы к другой, называются окисли- телъно-восстановителъными реакциями. Соединения, отдающие электроны в та- такой реакции, называются до}юрами элек- mpoiioe или восстановителями, а соедине- соединения, присоединяющие электроны,-акцеп- электроны,-акцепторами электронов или окислителями. Окислители и восстановители всегда функционируют как сопряженные окисли- окислительно-восстановительные пары (редокс- пары), подобно тому как кислоты и осно- основания функционируют как сопряженные кислотно-основные пары (разд. 4.8). На- Напомним, что кислотно-основные реакции описываются следующим общим уравне- уравнением: Донор протонов ^± Н+ + Акцептор протонов. Такое же обшее уравнение можно напи- написать и для окислительно-восстанови- окислительно-восстановительных реакций: Донор электронов ^± е~ + Акцептор электронов. Типичным примером окислительно-вос- окислительно-восстановительной реакции может служить реакция Fe2+ ^± e" + Fe3+, в которой закисное железо (Fe2 +) играет роль донора электронов, а окисное (Ре3+)-роль акцептора. Вместе ионы Fe2+ и Fe3 + представляют собой сопря- женн \'ю окислительно-восстановитель- окислительно-восстановительную пару. Существует четыре способа передачи электронов от одной молекулы к другой. 1. Прямой перенос электронов. Напри- Например, окислительно-восстановительная пара Fe2 + - Fe3 + может передавать свои электроны паре Си + Си2 + Fe2+ + Си2+ -» Fe3+ + Си + . 2. Перенос в составе атомов водорода. Напомним, что атом водорода со- состоит из протона (Н+) и электрона (е ~). В этом случае общее уравнение имеет вид АН2 ^± А + 1st + 2Н+, где АН2-донор водорода (или элек- электронов), А- акцептор водорода, а вме- вместе они составляют сопряженную окисли гельно-восстановительную па- пару, способную восстанавливать акцеп- акцептор электронов В путем переноса ато- атомов водорода АН2 + В - А + ВН2. 3. Перенос электронов от донора к ак- акцептору в форме гидрид-иона (:Н~), несущего два электрона, как это имеет место в случае NAD-зависимых деги- дрогеназ (разд. 10.6).
512 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ 4. Перенос путем прямого взаимодей- взаимодействия органического восстановителя с кислородом, приводящего к образо- образованию продукта, в котором содержит- содержится ковалентно связанный кислород. Примером такой реакции служит окисление углеводорода до спирта R—СН3 R—СН2—ЙН В этой реакции донором электронов является углеводород, а атом кислоро- кислорода играет роль акцептора. Все эти четыре способа переноса элек- электронов используются в живых клетках. Поэтому для обозначения одного элек- электронного эквивалента, участвующего в окислении-восстановлении, часто пользуются нейтральным термином вос- восстановительный эквивалент. Этот тер- термин ничего не говорит нам о том. в какой форме совершается перенос электрона, т.е. что именно передается-сам элек- электрон как таковой, водородный атом, ги- гидрид-ион или же передача происходит в реакции с кислородом, приводящей к образованию окисленного продукта. Ниже мы увидим, что перенос электро- электронов в митохондриях совершается в раз- различной форме: переносятся гидрид-ионы, водородные атомы и, наконец, просто электроны (на последних стадиях, ката- катализируемых цитохромами). При ферментативном окислении моле- молекул биологического топлива отщепляет- отщепляется обычно по два восстановительных эк- эквивалента и каждый атом кислорода присоединяет к себе тоже два восстано- восстановительных эквивалента. Поэтому «едини- «единицей» биологического окисления принято считать перенос одной пары восстанови- восстановительных эквивалентов от субстрата на кислород. 17.4. Каждая сопряженная окислительно-восстановительная пара характеризуется определенным стандартным потенциалом Способность любой сопряженной кис- кислотно-основной пары обратимо отда- отдавать протон характеризуется константой диссоциации (разд. 4.8). Точно так же можно охарактеризовать количественно, при помощи константы, способность ка- каждой сопряженной окислительно-восста- окислительно-восстановительной пары обратимо отдавать электрон. Эту способность выражают стандартным окислительно-восстанови- тельным потенциалом Eq, величина ко- которого по определению равна электро- электродвижущей силе (э. д. с.) в вольтах, возни- возникающей в полуэлементе, в котором донор электронов и сопряженный с ним акцептор электронов, присутствующие в концентрациях 1,0 М при 25°С и рН 7,0, находятся в равновесии с электродом, способным принимать электроны от до- донора и передавать их акцептору (рис. 17-3). Для того чтобы измерить ве- величину э. д. с, возникающую в таком по- полуэлементе, его присоединяют к стан- стандартному полуэлементу, э.д. с. которого известна (рис. 17-3). В качестве стандарт- стандартного полуэлемента в настоящее время принят водородный электрод, э. д. с. кото- которого при давлении газообразного Н2 1 атм, концентрации ионов Н + 1,0 М (что соответствует рН 0) и температуре 25°С условно считают равной нулю. Скорригированный для рН 7,0 (т.е. для значения рН, принятого в качестве стан- стандарта при биохимических расчетах) стан- стандартный потенциал водородного элек- электрода равен —0,41 В (рис. 17-3). В биохимии для выражения стан- стандартных потенциалов принято пользо- пользоваться понятием восстановительный по- потенциал. Чем более отрицательной вели- величиной выражается восстановительный потенциал системы, тем выше ее способ- способность отдавать электроны; и наоборот, чем более положительной величиной вы- выражается восстановительный потенциал, тем выше способность системы присое- присоединять электроны. Термины стан- стандартный восстановительный потенциал, стандартный потенциал и стандартный окислительно-восстановительный потен- потенциал равнозначны. В табл. 17-1 приведены значения стан- стандартных восстановительных потенциа- потенциалов для некоторых сопряженных окисли- окислительно-восстановительных пар, играю- играющих важную роль при переносе электро-
ГЛ. L7. ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНОВ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ Прибор для измерения э.д.с. 513 Газообразный A,0 атм) Солевой мостик О Раствор КС1 oLJo »' ... Г. Стандартный полуэлемент с известной э.д.с. В качеств?! абсолютного стандарта принят водородный электрод,-).д.(-,.которого при рн 0 считается равной 0,0 В. При рН 7,0 для водородного электрода Е'о = _ о,41 В Полу эле мент, содержащий исследуемую окислительно- восстановительную пару Рис. 17-3. Измерение стандартного восстано- восстановительного потенциала. В правый сосуд поме- помещен раствор, содержащий смесь окисленной и восстановленной форм интересующей нас окис- лительно-восстановигелъной пары в концентра- концентрациях 1,0 М. В этот раствор погружен электрод (обычно плажновый), соединенный внешней цепью со стандартным полуэлсментом (левый сосуд), содержащим окислительно-восстанови- окислительно-восстановительную пару, потенциал которой известен. В качестве абсолютного стандарта принят во- водородный электрод, представляющий собой платиновую пластинку, погруженную в раст- раствор с 1,0 М Н+ (рН 0) и омываемую током газообразного Н2 при давлении 1,0 атм. Стан- Стандартный восстановительный потенциал водо- водородного электрода считается равным нулю. Электроды могут присоединять или отдавать электроны окислительно-восстановительным парам в каждом полуэлементе в зависимости от относительной величины их потенциалов. Солевой мостик, содержащий насыщенный раствор КС1, осуществляв г электрическое со- соединение между исследуемым и стандаршым полуэлементами. Направление потока электро- электронов во внешней цепи зависит от относительно- относительного «давления» электронов, или потенциала обоих элементов, но jtot поток всегда направ- направлен от элемента с более отрицательным потен- потенциалом к элементу с более положительным потенциалом. По измеряемой э. д. с. н извест- известной з. д. с. стандартного нолуэлемента опреде- определяют э.д.с. полуэлемента, содержащего иссле- исследуемую окислительно-восстановительную пару. нов в биологических системах. Они расположены в порядке возрастания по- потенциала, т.е. в порядке снижения спо- способности отдавать »лектроны. Таким образом, сопряженные окислительно- восстановительные пары с относительно большей отрицательной величиной стан- стандартного потенциала будут отдавать электроны парам, расположенным в этом перечне ниже, у которых стан- стандартный потенциал выражается более положительной величиной. Например, у пары изоцитрат/а-кетоглутарат + + СО 2 при концентрациях компонентов 1,0 М стандартный потенциал Е'о равен — 0,38 В. Поэтому в присутствии изоци- тратдегидрогеназы (разд. 16.5) она будет отдавать свои электроны окислительно- восстановительной паре NADH/NAD + , имеющей более положительный потен- потенциал. Вместе с тем большая положитель- положительная величина стандартного потенциала окислительно-восстановительной пары вода/кислород ( + 0,82 В) указывает на то, ч го у этой пары способность отдавать электроны (т.е. способность образовы- образовывать молекулярный кислород) выражена очень слабо. Можно сформулировать это иначе, сказав, что у молекулярного кис-
514 ЧАСТЬ II. БИОЗНЕРГЕ1ИКА И МЕТАБОЛИЗМ Таблица 17-1. Стандартные восстановительные потенциалы Е'о некоторых сопряженных окислите тьно-воссгановигельных пар, играющих важную роль в окислительном метаболизме" Окислительно-восстановительная пара Некоторые субстратные пары Ацетил-СоА + СО2 + 2Ы + 2е о-Кетоглутарат + СО, + 2Н+ + 2е Пируват + СоА -* Изоцитрат ~ -> Глицеральдегид-З-фосфат + Р,- ур З-Фосфоглицероилфосфат + 2Н+ + Пируват + 2Н+ + 2е -> Лактат Оксалоацетат + 2Н+ + 2е -» Малат Фумарат + 2Н+ + 2е~ -» Сукцинат Компоненты цепи переноса электронов 2Н+ + 2е~ - Н, NAD+ + Н+ + 2е" -> NADH NADP+ + Н+ + 2е" -. NADPH NADH-дегидрогеназа (FMN-форма) + 2Н+ + 2е~ -» NADH-дегидрогеназа (FM NH 2-форма) Убихинон + 2Н+ + 2е -> Убихинол Цитохром Ь (окисл) + е -> Цитохром Ь (восст.) Цитохром с, (окисл.) + е -> Цитохром с, (восст.) Цитохром с (окисл.) + е Цитохром а (окис i.) + е Цитохром о3 (окисх) + е 2Н+ 2е Н,О Цр , ( Цитохром с (восст.) Цитохром и (восст.) Цитохром о3 (восст.) -0,48 —0,38 —0,29 -0,19 —0,18 +0,03 -0,41 -0,32 -0,32 - 0,30 +0,04 +0,07 +0,23 +0,25 +0,29 +0,55 +0,82 " Приведены данные, рассчитанные для концентраций всех компонентов 1 М. рН 7,0 и температу- температуры 25 С Показаны протекающие в полуэлементс реакции, которые характеризуют сродство данной системы к электронам. Чем более отрицательной является величина Ев, тем это сродство ниже: и на- наоборот, чем она более положительна, тем выше это сродство. Поэтому электроны будут стремиться пе- переходить от одной окислительно-восстановительной пары к другой в направлении более положительного Е^. Красным выделены потенциалы, занимающие особое, по1раничное, положение, а именно потенциалы окислительно-восстановительных пар Н2 Н* и Н^О/'/г^з- лорода очень велико сродство к электро- электронам или водородным атомам. Стан- Стандартные потенциалы следует выражать в вольтах, однако для удобства их часто указывают в милливольтах. 17.5. Перенос электронов сопровождается изменениями свободной энергии Знание величин ?0 различных окисли- окислительно-восстановительных пар позво- позволяет предсказать направление потока электронов от одной окислительно-вос- окислительно-восстановительной пары к другой при стан- стандартных условиях в присутствии катали- катализатора. (Электроны обычно не переходят от одной окислительно-восстановитель- окислительно-восстановительной пары к другой в отсу гствие фермента или какого-нибудь катализатора, способ- способного ускорять процесс; катализатор, од- однако, не изменяет направления потока и не влияет на положение равновесия.) В таких условиях электроны будут пере- переходить от более электроотрицательной окислительно-восстановительной пары, например от NADH/NAD4" (Ео = = -0,32 В), к более электроположи- электроположительным акцепторам электронов, напри- например к паре восстановленный цитохром с/окисленный цитохром с (Е^ = + 0,23 В). В силу той же причины они будут перехо- переходить и от пары восстановленный цитох- цитохром с/окисленный цитохром с (?q = = + 0,23 В) к паре вода/кислород (?о = = +0,82 В). Эта способность электронов переходить от электроотрицательных си- систем к электроположительным связана
ГЛ. 17. ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНОВ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ 515 с тем, что такой поток сопровождается уменьшением свободной энергии; поток электронов направлен всегда таким образом, чтобы в результате свободная энергия системы уменьшалась. Чем больше разность стандартных потенциа- потенциалов двух окислительно-восстанови- окислительно-восстановительных пар, тем большим оказывается уменьшение свободной энергии при пере- переносе электронов от электроотрицатель- электроотрицательной пары к электроположительной. Пройдя через всю цепь переносчиков электронов, от NADH (Е{,= — 32 В) к кислороду (?q = +0,82 В), электроны те- теряют значительное количество свобод- -о NADH/NAD + (?q = - 0,32 В) к окисли- окислительно-восстановительной паре Н2О/У2 О2 (?о = + 0,82 В) изменение стандартной свободной энергии равно AG0' = - 2 • 23 062 • [0,82 - (- 0,32)] = = — 52,6 ккал. Этого количества энергии E2,6 ккал), высвобождающейся при переносе двух электронов в стандартных условиях от NADH на кислород, более чем достаточ- достаточно для синтеза трех молекул АТР, ко- который в стандартных условиях требует затраты 3-7,3 = 21,9 ккал. -ю -20 Направление потока электронов Рис. 17-4. Направление потока электронов и •энергетические соотношения в дыхательной це- цепи митохондрий. E-FMN означает NADH-де- гидрогеназу; Q-убихинон; Ь, с,, с, и а-ци- ккал гохромы. Обратите внимание, что в дыхатель- •*" ной цепи имеется три участка (красные стрел- стрелки), в которых перенос электронов сопровож- ^0 дается относительно большим снижением сво- свободной энергии. Этн этапы поставляют свобод- 50 ную энергию для синтеза АТР. Значения Е'о для переносчиков электронов приведены в табл. 17-1. ной энергии, поскольку разность между стандартными потенциалами окисли- окислительно-восстановительных пар NADH/ NAD+ и H2O/V2 O2 относительно велика. Определим теперь точно, чему равно количество свободной энергии, высвобо- высвобождающейся при переносе двух электро- электронов от NADH на кислород. Изменение стандартной свободной энергии в реак- реакции, связанной с переносом электронов, вычисляют по формуле AG°'= - где AG0'-изменение стандартной сво- свободной энергии в калориях, и-число перенесенных электронов, F—константа, называемая числом Фарадея [23 062 калДВ ¦ моль)], АЕ^- разность стандартных потенциалов электронодо- норной и электроноакцепторной систем. Стандартные условия предполагают кон- концентрации всех компонентов 1.0 М. тем- температуру 25°С и рН 7,0. Таким образом, при переходе двух электронов от окисли- окислительно-восстановительной пары С помощью той же формулы, AG0' = = — nFAEg, можно рассчитать измене- изменение стандартной свободной энергии для любого отрезка цепи переноса электро- электронов по разности между стандартными потенциалами двух окислительно-вос- окислительно-восстановительных пар - электронодонор- ной и электроноакцепторной. На рис. 17-4 показаны: 1) стандартные по- потенциалы некоторых переносчиков элек- электронов дыхательной цепи, 2) направление потока электронов (поток неизменно на- направлен «вниз», т. е. к кислороду) и 3) от- относительные величины изменения сво- свободной энергии на каждом из этапов. Обратите внимание, что в дыхательной цепи есть три участка, в которых перенос электронов сопровождается большим снижением свободной энергии. Это те участки, где высвобождающаяся энергия запасается, т. е. используется для синтеза АТР.
516 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ 17.6. Цепь переноса электронов включает большое число переносчиков В дыхательную цепь митохондрий вхо- входит большое число различных белков, осуществляющих в определенной после- последовательности перенос электронов от субстратов на кислород. На рис. 17-1 в составе дыхательной цепи показано только семь переносчиков электронов, но, как мы уже отмечали выше, это упро- упрощенное ее изображение. В действитель- действительности в цепи переноса электронов имеет- имеется не менее 15 (а может быть, и больше) химических групп, способных присоеди- присоединять и отдавать восстановительные экви- эквиваленты в последовательности, показан- показанной на рис. 17-5. Обращает на себя внимание разно- разнообразие химических групп, предназна- предназначенных для переноса электронов и всегда связанных с белком. Сюда входят: ни- котинамидадениндинуклеотид (NAD), действующий в составе различных деги- дрогеназ; флавинмононуклеотид (FMN), связанный с NADH-дегидрогеназой; уби- хинон, или кофермент Q (жирораство- (жирорастворимый хинон с изопреноидной боковой цепью) - он может функционировать в со- соединении с одним или несколькими бел- белками ; железосодержащие белки двух раз- разных типов: железо-серные центры (Fe-S) и цитохромы; и, наконец, мебъ цитохро- ма аа3. Третье важное обстоятельство за- заключается в том, что все эти белки, играющие роль переносчиков электро- электронов, нерастворимы в воде и все они «встроены» во внутреннюю мембрану митохондрий. 17.7. Пиридиновые нуклеотиды выполняют коллекторную функцию Большинство электронных пар посту- поступает в дыхательную цепь благодаря дей- действию дегидрогеназ, использующих в ка- качестве акцепторов электронов кофер- менты NAD+ или NADP+ (рис. 17-6). Всю эту группу в целом называют NAD ( Р ^зависимыми дегидрогеназами. Мы уже встречались с отдельными ее представителями, когда рассматривали Субстрат I NAD I Е—FMN 1 Fe-S, Fe-Ss Fe-S., Fe-S« Fe-S5 Участок 1 Fe-S Участок 2 Участок 3 Рис. 17-5. Полный набор переносчиков элект- электронов, входящих в состав дыхательной цепи. На участке 1 имеется не менее пяти различных железо-серных центров. Участок 2 включает две разные формы цитохрома Ъ (с разными макси- максимумами поглощения) и один железо-серный центр, отличный от тех, какие имеются на участке 1. Участок 3 содержит в дополнение к цитохромам а и аъ еще и два иона меди. Ни точной последовательности, ни функции всех этих окислительно-восстановительных центров мы пока еще не знаем. процесс гликолиза и цикл лимонной кис- кислоты. Существует, однако, еще и много других. Некоторые биологически важные реакции, катализируемые такими деги- дегидрогеназами, приведены в табл. 17-2. Де-
ГЛ. 17. ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНОВ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ 517 Никотинамид |v? О Р—О- О—Р—О- ОН ОН "^ положении находится фосфатная группа NADP (табл. 17-2). Часть пиридинза- висимых дегидрогеназ локализована в цитозоле, часть в ми гохондриях, а не- некоторые присутствуют и здесь, и там. Де- гидрогеназы цитозоля способны взаимо- взаимодействовать только с теми пиридиновы- пиридиновыми нуклеотидами, которые находятся в цитозоле; сходным образом обстоит дело и с митохондриальными тегидроге- назами обычно они взаимодействуют только с пиридиновыми нуклеотидами Рис. 17-6. Никотинамидадениндинуклеотид (NAD) н ннкотинамид-адениндинуклеотидфос- фат (NADP). А. Окисленные формы (NAD* и NADP'). Никотинамид (на красном фоне) представаяет собой один из витаминов группы В (разд. 10.6); зто та часть молекулы NAD, ко- которая принимает участие в переносе электро- электронов Б Восстановление никотинамидного коль на NAD* субстратом. Два восстановите тьных эквивалента переносятся от субстрата (обозна- (обозначенного здесь RCH2OH) на NAD* в форме гилрид-иона(: Н ). Второй водородный атом, отщеп 1яемыи от субстрата, превращается в ион Н Н н он 1 СП, + 1 Н( ' НС -с СН ( о NH2 НС НС ( N С—С гн о NH, II I I К NAD NADH гидрогеназы катализируют обратимые реакции, которые в общем виде могут быть записаны следующим образом: Восстановленный субстрат + NADf ^± ^± Окисленный субстрат + NADH + Восстановленный субстрат + NADP ^± ^ Окисленный субстрат + NADPH + + Н Подавляющее большинство таких деги- дегидрогеназ содержит NAD+ (табл. 17-2). У неко горых, как, например, у г.чюкозо-6- фосфатдегидрогеиазы (разд. 16.13), ак- акцептором электронов служит NADP + . И лишь совсем немногие, такие, как глу- таматдегидрогеназа, способны взаимо- взаимодействовать как с NAD + , так и с магрикса митохондрий. Цитозольный и митохондриальный пулы NAD и NADP отделены друг от друга миго- хондриальной мембраной, которая для эгих коферментов непроницаема. Мы еще вернемся к этому вопросу. Среди NAD-зависимых дегидрогеназ, участвующих в углеводном обмене, глав- главную роль играют глицералъдегидфосфат- дегидрогеназа и лактатдегидрогеназа гликолитической системы, локализую- локализующиеся в цитозоле, а также пируватдеги- дрогеназа, находящаяся в митохондриях (табл. 17-2). Три NAD-зависимые деги- дрогеназы участвуют в митохондриях в цикле лимонной кислоты: изоцитрат- дегидрогепаза, <х-кетоглутаратдегидроге- наза и малатдегидрогеназа. К числу дру- других важных митохондриальных дегидро- дегидрогеназ относятся: 3-гидроксиацил-СоА-де-
518 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Таблица 17-2. Некоторые важные реакции, катализируемые NAD(P)-зависимыми дегидрогеназами Локализа- Локализация" NAD-зависимые Изоцитрат + NAD+ ^± а-Кетоглутарат + СО2 + NADH + Н' а-Кетоглутарат + Со А + NAD+ ^ ^± Сукцинил-СоА + СО2 + NADH + Н L-малат + NAD+ ^± Оксалоацетат + NADH + Н* Пируват + СоА + NAD+ ^ Ацетил-СоА + СО2 + NADH + Н+ Гчицеральдегид-3-фосфат + Р, + NAD+ ^ 1.3-дифосфоглицерат + + NADH + Н+ Лактат + NAD+ ^ Пируват + NADU + Н+ NAD Р-зависимые Изоштрат + NADP+ ^ а-Кетоглутарат + СО2 + NADPH + Н+ Глюкозо-6-фосфат + NADP+ ^ 6-фосфоглюконат + NADPH + Н NAD- или NADP-зависимые L-глутамат + Н2О + NAD+ (NADP + ) ^± д-Кето!лутарат + NH3 + NADH (NADPH) + Н+ М М М и Ц М Ц Ц М и Ц Ц М 11 М- митохондрии; Ц-цитозоль. гидрогеназа, участвующая в цикле окис- окисления жирных кислот, $-гидроксибупш- ратдегидрогеназа (гл. 18) и глутаматде- гидрогепаза, функция которой связана с катаболизмом аминокислот (гл. 19). Пиридинзависимые дегидрогеназы от- отщепляют от своих субстратов по два во- водородных атома. Один из них в виде ги- гидрид-иона (:Н ~ ) переносится на NAD + или NADP+, а второй в виде иона Н + переходит в среду. Каждый гидрид-ион несет два восстановительных эквивален- эквивалента; один из них в форме водородного атома присоединяется к четвертому угле- углеродному атому никотинамидного коль- кольца, а второй в виде элек грона передается азоту этого кольца (рис. 17-6). Поскольку большая часть клеточных дегидрогеназ переносит водородные атомы от субстратов на NAD +, можно сказать, что эгот кофермент выполняет коллекторную функцию-собирает пары восстановительных эквивалентов, посту- поступающие от разных субстратов, в одной молекулярной форме, в форме NADH (рис. 17-7). В конечном счете NAD* мо- может собирать в этой форме также и вос- восстановительные эквиваленты от субстра- субстратов, на которые действуют NADP-зави- NADP-зависимые дегидрогеназы. Это оказывается возможным благодаря действию пири- диннуклеотид-тринсгидрогеназы — слож- сложного фермента, катализирующего реак- реакцию NADPH + NAD* ;== NADP+ + + NADH. 17.8. NADH-де! идро! еназа принимает электроны от NADH На следующей стадии переноса элек- электронов (рис. 17-5) пара восстанови- восстановительных эквивалентов переносится от NADH к NADH-дегидрогеназе, находя- находящейся во внутренней митохондриальной мембране. В этой реакции прочно связан- связанная простетическая группа NADH-деги- дрогеназы восстанавливается (рис. 17-8). Роль простетической группы NADH-де- гидрогеназы играет фливинмононуклео- тид (FMN), в состав которого входит мо- молекула витамина В2, или рибофлавина (разд. 10.5). NADH-дегидрогеназа при- принадлежит к классу флавинзависимых де- дегидрогеназ, или флавопротеинов. В ре- результате переноса двух восстанови- восстановительных эквивалентов от NADH на
ГЛ. 17. ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНОВ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ 519 NADPH а-Кетоглутарат Изоцитрат Пируват Р-Гидроксибутират Р -Ридроксиацил-СоА Малат 'NAD' E-FMn] Участок СоА-проиэводное жирной кислоты Глицерофосфат аа, АТР Сукцинат Другие флввинзависимые дегидрогеназы > АТР Участок 3 АТР °2 Рис. 17-7. Коллекторная функция NAD и уби- хннона (О). NAD собирает восстановительные эквиваленты от многих NAD-зависимых субст- субстратов, а также от NADPH. Убихинон собирает восстановительные эквиваленты от NADH-де- гидрогеназы и от различных субстратов, на ко- которые действуют другие флавинзависимые де- дегидрогеназы. Пары восстановительных эквива- эквивалентов, поставляемые большинством флавин- зависимых дегидрогеназ, не проходят через первый пункт фосфорилирования, и поэтому за счет их энергии образуются только две мо- молекулы АТР. NADH-дегидрогеназу (обозначена здесь E-FMN) простетическая группа фермен- фермента FMN восстанавливается в FMNH2: NADH + Н+ + E-FMN =? E-FMNH2. NAD1 В молекуле NADH-дегидрогеназы присутствует помимо флавиннуклеотид- ной простети ческой группы еще несколь- несколько атомов негемового железа. Эти атомы собраны в несколько групп, в которых они объединены с равным числом ато- атомов кислотолабильной серы. Такие группы носят название железо-серных центров (рис. 17-9). Напомним, что же- железо-серные центры имеются также и в молекуле сгкцинатдегидрогеназы (разд. 16.5,е). В [Fe(Il)-Fe(III)]-i№Max, свя- связанных с изменением валентности, атомы железа железо-серных центров передают восстановительные эквива- эквиваленты от восстановленной простетиче- ской группы NADH-дегидрогеназы (FMNH2) на следующий переносчик в дыхательной цепи, убихинон. Таким образом, этот комплекс, состоящий из NADH-дегидрогеназы и белков, содер- содержащих железо и серу (его называ- называют NADH: убихинон - оксидоредукта- зой), включает электронпереносящие структуры двух типов: FMN и несколько железо-серных центров, которые дейст- действуют, очевидно, последовательно. Окисленная форма(FMN) :нон NADH + Н+ Система двойных СНОН связей, где | происходит СНОН присоединение двух атомов водорода NH х=о Восстанов- Восстановленная форма (FMNH2) Рис. 17-8. Перенос восстановительных эквива- эквивалентов от NADH на флавинмононуклеотид (РМ^-простетическую группу NADH-дегид- NADH-дегидрогеназы. R означает здесь пятиуглеродную фосфоричнровачную боковую цепь.
520 ЧАСТЬ II БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ Атом железа Рис. 17-9. Постулированное расположение ато мов железа (красные кружки! и атомов серы (серые кружки) в железо-серных центрах. Число атомов железа и атомов кислотолабильной се- серы в зтих центрах всегда одинаково, но есть центры, в которых содержатся только два ато- атома железа, и есть такие, где их четыре. Здесь представлен железо-серный центр, содер- содержащий четыре атома железа. Атомы серы на периферии принадлежат четырем остаткам цистеина в полипептидной цепи фермента. 17.9. Убихинон представляет собой жирорастворимый хинон Роль следующего звена в цепи перено- переносчиков восстановительных эквивалентов играет убихинон, или кофермент Q (по первой букве слова-quinone). Название «убихинон» отражает универсальное рас- распространение этого кофермента: он най- найден практически во всех клетках. Убихи- Убихинон-это жирорастворимый хинон с очень длинной изопреноидной боковой цепью (рис. 17-10). В большей части тка- тканей млекопитающих присутствует убихи- убихинон с боковой цепью из десяти пятиугле- родных изопреновых звеньев; его обо- обозначают Qlo или CoQ,0. В тканях других животных функционируют убихиноны, в боковой цепи которых имеется только шесть или восемь изопреновых звеньев (Q6 или Q8). Когда восстановительные эквиваленты переходят от восстановлен- восстановленной NADH-дегидрогеназы (E-FMNH2) через железо-серные центры на убихинон, последний восстанавливается в убихи- нол, или QH2 (рис. 17-10) с одновремен- одновременной регенерацией окисленной формы NADH-дегидрогеназы: E-FMNH2 + Q ^ E-FMN + QH2. I I 1- н3с—о—с -с—сн3 сн3 Н3С О—С .С—(СН2—СН=С—СН2)„Н Убихинон (окисленная форма, Q или CoQ) H3C-O-C -C-CH, CH3 H3C—O—i _^C—(CH2—CH=C—СНг)„Н Убихинол (восстановленная форма, QH2 или CoQH2) Рис. 17-Ю. У бихинон, и ли кофермент Q; и - число изопреновых звеньев в боковой цепи (см текст). Группы, изображенные на красном фоне, участвуют в переносе атомов водорода. Обра гите внимание, что при восстановлении убихинона в убихинол изменяется также и по- пожение двойных связей в кольце. Молекулы убихинона, которые гораздо длиннее молекул фосфолипидов, присут- присутствующих во внутренней мембране ми- митохондрий, встречаются и в свободной форме, и в соединении с белком. Убихи- Убихинон выполняет коллекторную функцию, собирая восстановительные эквиваленты не только от NADH-дегидрогеназы, но и от других флавинзависимых дегидроге- наз, находящихся в митохондриях (см. рис. 17-7), в частности от сукцинатдеги- дрогеназы и ацил-СоА-дегидрогеназы, участвующей в цикле окисления жирных кислот (гл. 18). 17.10. Цитохромы-это гемопротеины, осуществляющие перенос электронов Цитохромами называются железосо- железосодержащие белки, окрашенные в красный или коричневый цвет. Действуя в опреде- определенной последовательности, они перено- переносят электроны от убихинона на молеку- молекулярный кислород. Цитохромы принадле- принадлежат к классу гемопротеинов, молекулы которых содержат железо, входящее в со- состав железопорфириновой группы, или гема, напоминающего по своему строе-
ГЛ. 17. ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНОВ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ 521 нию простетическую группу гемоглоби- гемоглобина (рис. 10-26). Цитохромы были откры- открыты давно (сначала их назвали гистоге- матинами), но только в 1925 г. Дэвид Кейлин установил, что функция этих со- соединений связана с биологическим окис- окислением. В летательных мышцах живых насекомых он обнаружил при помощи спектроскопа красно-коричневые пиг- пигменты. Оказалось, что спектр этих пиг- пигментов заметно менялся, когда насеко- насекомое, прикрепленное к предметному стек- стеклу, делало резкие движения, пытаясь вырваться на свободу. Кейлин назвал эти пигменты цитохромами и высказал пред- предположение, что они переносят электроны от пищевых веществ на кислород, претер- претерпевая при этом окисление-восстановле- окисление-восстановление. Существует три класса цитохромов: a, b и с, различающихся по спектрам по- поглощения. У каждого цитохрома в вос- восстановленной (закисной) форме обнару- обнаруживаются три четкие полосы поглоще- поглощения в видимой части спектра (рис. 17-11). Кейлин показал, что цитохромы дей- действуют в определенной последовательно- последовательности и что цитохром, стоящий последним 100 2 50 I ё о Восстановленная форма Окисленная форма 300 400 ¦ 500 Длина волны, нм 600 Рис. 17-11. Спектры поглощения цитохрома с в окисленной (красная линия) и восстановлен- восстановленной (черная линия) форме. Указаны характер- характерные полосы поглощения восстановленной фор- формы-а, р и у. в этом ряду, передает электроны на кислород. Теперь мы знаем, что цитохромы в ды- дыхательной цепи расположены в последо- последовательности Ъ -»Су -»с -»аа3 (рис. 17-1 и 17-7). Цитохром Ь, присутствующий в двух формах, принимает электроны от убихинона и передает их цитохрому с1г который в свою очередь передает их ци- цитохрому с. Каждый из этих цитохромов, находясь в окисной [Fe(lll)] форме, при- присоединяет один электрон и переходит в закисную [Fe(II)] форму. В переносе электронов от убихинона на цитохром с принимает участие также белок, содер- содержащий железо и серу (рис. 17-5). Послед- Последним в ряду переносчиков электронов стоит цитохром аа3, называемый также цшпохромоксидазой, поскольку он пере- переносит электроны прямо на кислород и тем самым завершает процесс пере- переноса. Лучше всего изучен среди цитохромов цитохром с. Это небольшой белок (мол. масса 12 500) с железопорфириновой группой, ковалентно присоединенной к единственной полипептидной цепи (разд. 8.4). Установлена аминокислотная последовательность белка (рис. 6-14) и выяснены все детали трехмерной струк- структуры его молекул (рис. 8-5). Цитохром с, легко экстрагируемый из митохондрий, был получен в кристаллической форме из многих источников. Ранее мы уже упо- упоминали (рис. 6-14), что цитохром с-один из белков, возникших на заре эволюции. На это указывает сходство многих уча- участков его аминокислотной последо- последовательности у всех эукариот: микроорга- микроорганизмов, растений и животных. Цитохром ааг отличается от других цитохромов. В его состав входят две мо- молекулы прочно связанного гема А, отли- отличающегося от протогема гемоглобина наличием у его порфиринового кольца длинной углеводородной боковой цепи. Кроме того, в нем имеются также два атома меди, играющие важную роль. Присоединив электроны, поступившие от цитохрома с, и перейдя таким образом в Ре(Н)-форму. компонент а цитохрома аа$ передает затем эти электроны цито-
522 ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ хрому а3. Восстановленный цитохром а3 в свою очередь передает электроны на молекулярный кислород (О2). В этом процессе вместе с двумя железопорфири- новыми группами участвуют два свя- связанных атома меди, что сопровождается обратимым изменением их валентности [Cu(I)-Cu(II)]. Этот сложный процесс является важным этапом переноса элек- электронов, поскольку на этом этапе четыре электрона должны быть переданы почти одновременно на О2 для того, чтобы образовались две молекулы Н2О (четыре Н + -иона, которые тоже для этого необ- необходимы, поступают из водной среды). Из всех переносчиков цепи переноса элек- электронов только цитохром аа3 способен вступать непосредственно в реакцию с кислородом. 17.11. Неполное восстановление кислорода ведет к повреждению клеток Для клетки очень важно, чтобы моле- молекула кислорода, присоединив четыре электрона, полностью восстановилась до двух молекул Н2О. При неполном вос- восстановлении кислорода в случае присо- присоединения только двух электронов обра- образуется перекись водорода (Н2О2), а в случае присоединения одного электро- электрона- супероксидный радикал (:О^). И пере- перекись водорода, и супероксид крайне ток- токсичны для клеток, потому что они повреждают клеточные мембраны, взаи- взаимодействуя с остатками ненасыщенных жирных кислот мембранных липидов. Аэробные клетки защищают себя от это- этого вредного действия супероксида и пере- перекиси с помощью двух ферментов: супер- оксиддисмутазы (металлсодержащего фермента, превращающего суперок- супероксидный радикал в перекись водорода) и катализы (превращающей перекись водорода в Н2О и молекулярный кис- кислород) 2Н Каталаза Каталаза 2Н,О2 2Н2О + О,. Токсичная перекись водорода находит, однако, своеобразное применение у жу- жуков-бомбардиров. У этих жуков имеется особая железа, состоящая из двух отде- отделов: в одном из них накапливается кон- концентрированный раствор перекиси водо- водорода, а в другом-раствор гидрохинона. Когда бомбардиру угрожает опасность, это удивительное насекомое отпугивает своего врага, выстреливая в него горячей A00 С) струей токсичного хинона, ко- который образуется при мгновенном, «взрывном», окислении гидрохинона перекисью водорода. 17.12. Переносчики электронов действуют всегда в определенной последовательности Какие факты свидетельствуют о том. что переносчики электронов в дыхатель- дыхательной цепи функционируют именно в ука- указанной выше последовательности? Во- первых, именно в этой последовательно- последовательности их стандартные окислительно-вос- окислительно-восстановительные потенциалы (рис. 14-7 и табл. 17-1) становятся все более поло- положительными по мере приближения к кис- кислороду, а этого и следует ожидать, по- поскольку электроны всегда стремятся переходить от электроотрицательных си- систем к электроположительным, что вы- вызывает снижение свободной энергии. Во- вторых, каждое звено этой цепи специ- специфично в отношении определенного доно- донора и определенного акцептора электро- электронов. И, наконец, в-третьих, из митохон- дриальной мембраны удалось выделить структурно обособленные комплексы функционально связанных между со- собой переносчиков электронов (рис. 17-12). Комплекс I состоит из NADH-деги- дрогеназы и ее железо-серных центров, функционирующих в тесной связи друг с другом. Комплекс II включает сук- цинатдегидрогеназу и ее железо-серные центры. В комплекс III входят цитох- ромы бис вместе с одним специфичным железо-серным центром. Комплекс IV
ГЛ. 17. ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНОВ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЬ 523 NADH Комплекс I FMN [Fe-S]n Комплекс III Fe-S NADH: убихинон- оксидоредуктаза (участок 1) Комплекс II - [FeS]«-FAD Сукцинат Сукцинат: убихинон- оксидоредуктаза Убихинол: цитохром с — оксидоредуктаза (участок 2) I Комплекс IV ??эм Цитохромоксидаза . (участок 3) 1 Ог Рис. 17-12. Электронпереносящие комплексы. Они могут быть выделены в виде функцио- функциональных ансамблей. состоит из цитохромов а и и3. У бихинон служит связующим звеном между ком- комплексами I, II и III, а цитохром с связы- связывает между собой комплексы III и IV (рис. 17-12). Изучению переноса электронов в нема- немалой мере способствовал и такой метод, как применение специфических ингибито- ингибиторов, блокирующих определенные этапы этого процесса. Среди них особо ценны- ценными оказались: 1) ротенон, блокирующий перенос электронов на участке от NADH до убихинона (это высокотоксичное ве- вещество, добываемое из растений, употре- употреблялось американскими индейцами в ка- качестве яда для рыб). 2) токсичный антибиотик антимицин А (образуется од- одним из штаммов Streptomyces), блоки- рующий перенос Э1ектронов от убихино- убихинона на цитохром с, и 3) цианид один из самых сильных ядов, блокирующий про- процесс восстановления кислорода, катали- катализируемый цитохромом аа3 (рис 17-13). (Еще одним важным ингибитором цнто- хрома аа3 является окись углерода.) При ингибировании цепи переноса электро- электронов в определенной точке возникает пункт перекреста, как это видно из ги- драв шческой модели, представленной на рис. 17-14 Переносчики электронов, стоящие в цепи непосредственно перед блокированным этапом, становятся бо- более восстановленными, а стоящие после этого этапа-более окисленными. Такие изменения можно обнаружить при помо- помощи спектрофотометра, поскольку у окис- окисленных и у восстановленных форм переносчиков спектры noi чощения раз- различны. NADH Ротенон TMN ! FeS J 1 Q I [ • 1 Антимицин А Амитал ао, О Цианид Окись углерода Сероводород Рис. 17-13. Место действия разтичных ингиои торов, блокирующих перенос элек1ронов Ами- тал лекарственный препарат из группы барби- барбитуратов, Применяемый в качестве снотворного. Мощными ингибиторами цнтохрочоксидачы являются, помимо цианида, также окись >г ie- рода и сероводород
524 ЧАСТЬ И БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ со 8. С и о с CD /00 1 X CD a. С к оГ я о CD О 4 a. са н о ^ 5 CD ев Ч ca S g О1- Пункт перекреста Этап, блокированный антимицином А Рис. 17-14. Гидравлическая модель дыхатель- дыхательной цепи. А. В норме в дыхательной цепи поддерживается стационарное состояние. Сте- Степень восстановчения последовательных пере- переносчиков электронов в популяции митохонд- митохондрий снижается при перено