основы
ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ
СПЕКТРОСКОПИИ
Principles of

Fluorescence

Spectroscopy

Joseph. R. Lakowicz

University of Maryland School of Medicine
Baltimore, Maryland

Plenum Press • New York and London
Дж. Лакобич

ОСНОВЫ
ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ
СПЕКТРОСКОПИИ

Перевод с английского

канд. физ.-мат. наук М.В. Козьменко

канд. хим. наук А.П. Савицкого
под редакцией

д-ра хим. наук, проф. М.Г. Кузьмина

Москва «Мир» 1986
ББК 28.072
Л19

УДК 543.426

Лакович Дж.

Л19 Основы флуоресцентной спектроскопии. Пер. с англ. — М.: Мир,
1986. — 496 с., ил.

Книга известного специалиста из США в области применения люми-
несцентных методов в биологии и медицине представляет собой пособие для
изучения основ флуоресцентной спектроскопии и ее приложений как для
начинающих работать в этой области, так и для специалистов, желающих более
детально ознакомиться с возможностями современных флуоресцентных ме-
тодов.

Предназначена для химиков, биологов, технологов, медиков - научных
работников, преподавателей и студентов высших учебных заведений.

Л

1805000000-243
041 (01)-86

102-86, ч. 1

ББК 28.072

Редакция литературы по химии

Монография

Джозеф Лакович

ОСНОВЫ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ

Научный редактор Н.А. Козырева
Мл. редактор Т.Ю. Дехтярева
Художник Н.И. Василевская
Художественный редактор М.Н. Кузьмина
Технические редакторы Т.А. Чистякова, М.А. Анциферова
Корректор Т.Е. Луганова

ИБ № 5617

Подписано к печати 18.06.86. Формат 60 90/16
Бумага офсетная № 1 Печать офсетная. Объем 15,50 бум. л.

Усл. печ. л. 31,00.Усл. кр.-отт. 31,00.

Уч.-изд. л. 33,24. Цзд. № 3/4178
Тираж 2900 экз. ЗакЛ/3 Цена 5 р. 30 К.

Набрано в издательстве ’’Мир” на участке оперативной
полиграфии

129820, ГСП, Москва, 1-й Рижский пер., 2

Тульская типография Союзполиграфпрома при
Государственном комитете СССР
по делам издательств, полиграфии и книжной торговли.
300600, Тула, проспект им. В.И. Ленина, 109.

©1983 Plenum Press, New York

© перевод на русский язык, ’’Мир”, 1986.
Люминесцентные методы исследования с каждым годом находят все бо-
лее широкое применение в химии, биологии, медицине, различных областях
техники. Эти методы обладают исключительно высокой чувствительностью
и дают уникальные возможности изучения возбужденных состояний моле-
кул, фотохимических реакций, динамики быстрых молекулярных процессов,
структуры и свойств сложных химических и биологических объектов.

Книга "Основы флуоресцентной спектроскопии" написана известным
специалистом в области применения люминесцентных методов в биологии
и медицине, профессором отделения биохимии медицинского факультета
Университета Мэриленд (Балтимор, США) Джозефом Р. Лаковичем. В ней
не только изложены физические основы явления флуоресценции и основные
законы флуоресценции, описаны экспериментальные методы и применяе-
мая аппаратура, но и детально, на обширном и самом современном мате-
риале рассмотрено влияние различных свойств среды па флуоресцентные
характеристики веществ и использование флуоресцентных методов для изу-
чения микроструктуры белков, мембран и динамики молекулярных процес-
сов. В отличие от традиционных изложений учения о люминесценции теоре-
тические аспекты в книге Дж. Лаковича рассмотрены в основном феноменоло-
гически и главное внимание уделено не внутримолекулярным фотопроцео-
сам и зависимости флуоресцентных свойств от структуры молекул, а влия-
нию свойств и структуры среды и динамики межмолекулярных взаимодей-
ствий и химических реакций на спектры, кинетику и анизотропию флуорес-
ценции. Поэтому книгу нельзя рассматривать как универсальный учебник
по флуоресцентной спектроскопии.

Написанная весьма доступно, но без ущерба для строгости изложения,
книга может служить пособием начинающим работать в этой области для
изучения основ и приложений флуоресцентной спектроскопии. В то же вре-
мя она может быть весьма полезной и специалистам, которые найдут в ней
подробное рассмотрение методических вопросов и современные данные о
процессах релаксации среды, тушения флуоресценции, переноса энергии,
деполяризации флуоресценции, адиабатических реакциях в возбужденном
состоянии, флуоресцентных свойствах белков. Книга сйабжена большим
количеством четких, наглядных рисунков, диаграмм, спектров, таблиц,
многие из которых взяты из оригинальных работ. К большинству глав да-
ны задачи и упражнения, а в конце книги разобраны их решения.

Большое внимание автор уделяет методам измерения спектров и кинетики флу-
оресценции. Читатель найдет детальное обсуждение требований, предъявляемых ко
всем компонентам аппаратуры, применяемой для этих измерений, сравнение воз-
можностей, достоинств и недостатков различных методик измерений, опи-
сание способов юстировки и калибровки аппаратуры и корректировки по-
лучаемых данных, перечисление требований к правильной постановке экс-
периментов и рассмотрение источников возможных ошибок и методов обра-
ботки результатов измерений. Все эти сведения очень важны для правиль-
ного использования флуоресцентных методов и получения достоверных
результатов, но их почти невозможно разыскать в современной литерату-
ре, тем более в таком компактном виде. Эта часть книги может служить
прекрасным методическим пособием для исследователей, использующих в
своей работе люминесцентные методы. Особое внимание уделяется фазово-
модуляционному методу, который автор сам широко использовал в своих
исследованиях.

Измерение спектров и анизотропии флуоресценции в стационарном, им-
пульсном и модуляционном режимах позволяет в настоящее время изучать
широкий спектр структурных и динамических свойств молекулярных систем:
локализацию и доступность флуорофоров в макромолекулах, мембранах и
других микрогетерогенных системах, их организацию и структуру, прони-
цаемость, коэффициенты распределения и сегрегацию веществ в таких
системах, микровязкость, вращательную диффузию и сегментальную под-
вижность, заторможенное и ограниченное вращение групп, процессы релак-
сации, димеризации, связывания, ассоциации и денатурации. Изучая релак-
сацию спектров и анизотропию флуоресценции, можно получить информа-
цию о ближайшем окружении флуорофора (1-2 молекулярных слоя}; изу-
чая перенос энергии, тушение и реакции возбужденных молекул, можно
зондировать уже больший объем вокруг флуорофора (до 10 нм). Как это
сделать практически, можно научиться по книге Дж. Р. Лаковича. Конеч-
но, данная область находится лишь в начале своего развития . Многие
возможности пока ещё не реализованы, многие трудности и ограничения
пока не до конца осознаны, иногда появляется излишний оптимизм и дела-
ются довольно смелые выводы. Со временем все эти трудности роста при
широком применении флуоресцентных методов будут преодолены. Безуслов-
но, можно надеяться, что именно флуоресцентные методы позволят полу-
чить более глубокую информацию о структуре и свойствах организован-
ных молекулярных систем - как природных, так и синтетических, - научить-
ся управлять ими и создавать эффективные системы для преобразования
солнечной энергии в химическую, записи и обработки информации, молеку-
лярной электроники.

М. Кузьмин
Флуоресцентные методы все шире применяются в биохимических, ме-
дицинских и химических исследованиях. Причиной этого служат присущая
этим методам высокая чувствительность, а также удобный временной
диапазон:" испускание флуоресценции происходит через с (10 нс)
после поглощения света. За этот промежуток времени может произойти
множество различных молекулярных процессов, которые способны повли-
ять на спектральные характеристики флуоресцирующего соединения. Такое
сочетание чувствительности с подходящим временным диапазоном способ-
ствует тому, что флуоресцентные методы обычно используют для изучения
белков и мембран и их взаимодействий с другими макромолекулами.

Данная книга посвящена изложению фундаментальных основ метода
флуоресценции и его приложений к биохимическим исследованиям. В нача-
ле каждой главы приводятся теоретические основы рассматриваемого яв-
ления, после чего на примерах иллюстрируется его применение для иссле-
дования проблем в области биохимии. Книга снабжена большим .количест-
вом иллюстраций. Очевидно, что графическое представление данных спо-
собствует тому, что текст легче читается и лучше усваивается. Отдель-
ные главы в книге посвящены вопросам поляризации флуоресценции, вре-
менам затухания, процессам тушения, переноса энергии,влиянию раство-
рителей, а также реакциям в возбужденных состояниях. Чтобы повысить
роль данной книги как учебника, в нее включен ряд задач, относящихся к
проблемам, обсуждаемым в каждой главе. Кроме того, одна из глав целиком
посвящена описанию аппаратуры для флуоресцентной спектроскопии. Эта
глава будет особенно полезна тем, кто проводит или собирается проводить
измерения флуоресценции. Измерения такого рода могут оказаться невер-
ными, если недостаточно полно учитывать многие простейшие факторы.

Насколько это возможно, мы старались упрощать изложение материал
ла, минимально используя теорию и математический аппарат. В тех мес-
тах, где применены сложные уравнения, природа и значение таких выраже-
ний подробно описаны в тексте. Содержащийся в данной книге материал
должен быть полезен как для тех, кто интересуется применением флуорес-
центных методов, так и для опытных исследователей,желающих расширить
свой кругозор.

Автор крайне обязан многим людям за их помощь и поддержку. Особой
благодарности заслуживает знающий библиотекарь г-жа Джин Ван Грасстик.
Автор признателен также докторам Карлоте Сумбилла, Ричарду Томпсону .
и Сьюзен Китинг за комментарии и советы по исправлению текста книги.
И наконец, автор благодарит American Heart Association, National Institute
of Health и National Science Foundation за поддержку исследований,пред-
ставляющих интерес в данной области. Безусловно, неоценимым является
терпение моей семьи.

Джозеф Р. Манович
Обозначения

АА	- аЦетилантраЦен
АСТИ	~ адренокортикотропный гормон
ADH	~ алкогольдегидрогеназа
Асг	- акридин и АсгН+ - ион акридиния
АМР	- аденозинмонофосфат
AN	- анилинонафталин
1,8-ANS	- 1-анилино-8-нафталинсульфоновая кислота
3-АР	- З-амино-^метилфталимид
12-AS	~ 12-( 9-антроилокси) стеариновая кислота
ATP	- аденозинтрифосфат
АТРаза	- аденозинтрифосфатаза
ВгРС	- 1,2- бис(9,10-дибромост еароил) глицерол- 3- фосфорилхолин
BSA	- бычий сывороточный альбумин
DBA	- дибензоЕ а,h ] антрацен
DBC	- дибензоЕ с, g]карбазол
4-DEAMP	- 4-диэтиламино-№-метилфталимид
DENS	- 2-диэтиламино-5-нафталинсульфоновая кислота
DMI	- диметилиндол
DMPC	- димиристоил -L-a-фосфатидилхолин
DNA	- дезоксирибонуклеиновая кислота
DNS	- 1-димети ламино-5-нафталин сульфоновая кислота
DNS-Cl	- дансилхлорид
DPBS	- 4-(диэтиламино) ф енилазобензол- 4- суль фонил
DPE	- маркированный дансилом фосфатидилэтаноламин
DPH	- 1,6- дифени лгексатриен
DPPC	- дипальмитоилфосфатидилхолин
EB	- этидийбромид
EPE	- эозинфосфатидилэтаноламин
FAD	- флавинадениндинуклеотид
FMN	- флавинмонону.клеотид
HSA	- человеческий сывороточный альбумин
GMP	- гуанозин-5’-монофосфат
IAEDANS	- 5-Е- 2-(иодацетил) амино этил]- 5- аминонафталин- 1-сульфокис-
	лота
IAF	- иод ацетамидофлуоресцеин
LADH	- алкогольдегидрогеназа из печени лошади
LAURDAN	- 6-лауроил-2-(диметиламино)нафталин
2-MA	- 2-метилантрацен
MAC	- хлорид 10-метилакридиния
MBP	- щелочной белок миелина
MDB	- 2-метил-4-диметиламинобензонитрил
(M e)2 POPOP-1,4- би cE 2-(4-метил- 5- фени локсазо лил)] бензол	
9

Обозначения

NAD +	- никотинамидадениндинуклеотид
NADH	- восстановленная форма NAD+
NATA	- N-ацетил-Ьтриптофанамид
NATrA	- N-ацетил-Ь-тирозинами д
ONS	- ^октадецилнафтил-2-амино-6-сульфоновая кислота
POPC	- пальмитоилолеоилфосфатидилхолин
POPOP	- п-бис[ 2-(5-фенилоксазолил)]бензол
PPD	- 2,5-дифенил-1,3,4-оксадиазол
PPO	- 2,5-д'ифенилоксазол
PRODAN	- 6-пропионил-2-(диметиламино)нафталин
RNA	~ рибонуклеиновая кислота
RNAaaa	- рибонуклеаза
TM	- тетраметилдиаминодифенилметан
TMA	- триметиламмоний
TNS	- 2-толуидинил-6-нафталинсульфоновая кислота
tRNA	- транспортная рибонуклеиновая кислота
ГЛАВА 1.

Введение в флуоресценцию

Люминесценция - испускание фотонов из электронно-возбужденных
состояний - делится на два типа в зависимости от природы основного и
возбужденного состояний. В синглетном возбужденном состоянии электрон
на энергетически более высокой орбитали и второй электрон на орбитали
с более низкой энергией имеют противоположную ориентацию спинов. Гово-
рят, что эти электроны спарены*. В триплетном состоянии эти электроны
не спарены, т.е. их спины имеют одинаковую ориентацию. При возвращении
электрона из возбужденного синглетного состояния в основное ориентация
его спина не должна меняться. Изменение ориентации спина необходимо
при переходе из триплетного состояния в синглетное основное состояние.
Флуоресценция - это испускание, происходящее при возвращении спаренно-
го электрона на более низкую орбиталь. Такие переходы квантовомехани-
чески ''разрешены", а типичные величины скоростей испускания для них
'НО8 с-1. Высокие значения скоростей испускания приводят к временам за-
тухания флуоресценции~40-в с (10 нс). Время жизни -г это средний период
времени, в течение которого флуорофор находится в возбужденном состоя-
нии.Фосфоресценция- это испускание, происходящее при переходе между
состояниями различной мультиплетности**, как правило из возбужденного
триплетного состояния в синглетное основное. Такие переходы не разреше-
ны, и константы скорости испускания малы. Типичный диапазон времени
затухания фосфоресценции - ,от миллисекунд до секунд, что главным обра-
зом зависит от вклада других процессов дезактивации. В данной книге
повсюду мы в первую очередь будем рассматривать более быстрый процесс
флуоресценции.

В веществах, проявляющих значительную флуоресценцию, электроны
в.основном делокализованы и формально расположены на сопряженных двой-

•Правильнее было бы сказать, что спины этих электронов спарены. Спаренны-
ми обычно называют электроны, находящиеся на одной и той же орбитали. — Прим,
ред.

“ Мупьтиппетностью состояния называют величину tn= 2s +1, где s — суммар-
ный электронный спин данного состояния. Так, для синглетных состояний т- 1 и
s =0, для триплетных — т= Зи s - 1. — Примчреди
ных связях. Структуры некоторых типичных флуорофоров представлены на
рис. 1.1. Одним из широко распространенных флуорофоров является хинин,
который добавляют в тонизирующие напитки. Если посмотреть на стакан
тоника, выставленного на солнечный свет, часто можно увидеть слабое го-
лубое свечение. Оно наиболее заметно, если на стакан смотреть под прямым
углом к направлению солнечного света, а также если диэлектрическая пос-
тоянная уменьшена благодаря присутствию добавок. Хинин, возбуждаемый
ультрафиолетовым излучением солнца, при возвращении в основное состоя-
ние испускает голубой свет с длиной волны около 460 нм. Явление флуо-
ресценции часто может быть обусловлено некоторыми добавками. Напри-
мер, зеленое или красно-оранжевое свечение, наблюдаемое иногда в анти-
фризе, вероятно, вызвано следовыми количествами флуоресцеина или род-
амина соответственно (рис. 1.1). Многоядерные ароматические углеводоро-
ды, такие, как антрацен или перилен, также флуоресцируют, чем может
частично определяться голубая флуоресценция бензина. И наконец, сильно
флуоресцируют Факие соединения, как РРО и РОРОР, используемые в
’’сцинтилляционных'’ растворах и биохимических исследованиях. Другие
примеры будут даны в книге со ссылками на полезные свойства индивиду-
альных флуорофоров. В отличие от молекул органических ароматических
соединений атомы* в основном не флуоресцируют в конденсированной фазе.

РОРОР

РИС. 1.1. Структуры типичных флуоресцирующих соединений.

Антрацен	РРО

Автор здесь имеет в виду ионы различных элементов. — Прим» ред
Длина волны, нм

350	370 330 410	450	490	530 570

32000

24000

J? 16000
k

ii'
5l

$	8000

s

00,0

28800	26800	24800	22800	20800	18800	g

280	320	360	400 440 480 520	600 I

35500	31500	27500	23500	19500	15500

волновое число, см~1

РИС. 1.2. Спектры поглощения и испускания флуоресценции перилена и хинина
(по данным [2]).

Спектры испускания не могут быть правильно изображены одновременно в шка-
ле длин волн и в шкале волновых чисел, В данном случае использовано правильное
изображение в шкале волновых чисел. Длины волн приведены для удобства (см. гл. 2).

Единственным заметным исключением является группа элементов, обычно
называемых лантаноидами [ 1]. Флуоресценция ионов европия и тербия выз-
вана переходами электронов между f -орбиталями, которые экранированы от
растворителя более высокими заполненными орбиталями.

Флуоресцентные спектральные данные обычно представляют в виде
спектров испускания. Спектр испускания флуоресценции - это зависимость
интенсивности флуоресценции от длин волн (в нанометрах) или волновых чи-
сел (в см-1). Два типичных спектра испускания флуоресценции приведены
на рис. 1.2. Спектры испускания сильно изменяются и зависят как от хими-
ческой структуры флуорофора, так и от растворителя, в котором флуоро-
фор растворен. Спектры некоторых соединений, таких, как перилен, име-
ют четкую структуру, обусловленную отдельными колебательными уров-
нями энергии основного и возбужденного состояний*. Другие соединения,
такие, как хинин, имеют спектры без колебательной структуры.

1.1.	Диаграмма Яблонского

Поглощение и испускание света хорошо иллюстрирует диаграмма уров-
ней энергии, предложенная Яблонским [ 3]. Основное, первое и второе
электронные состояния обозначают So, Sj и$3 соответственно (рис. 1.3).
Каждый из этих уровней энергии может состоять из множества колебатель-
ных энергетических уровней, обозначаемых 0, 1, 2 и т. д. Влияние раство-
рителя во внимание не принимается, оно будет подробнее рассмотрено в
гл. 7. Переходы между различными электронными уровнями обозначены
вертикальными линиями. Такое представление используется, чтобы нагляд-

* Колебательная структура спектров испускания определяется колебательными
подуровнями основного, а не возбужденного электронного состояния (подробнее
см„ ниже), — Прим. ред.
но показать мгновенную природу поглощения света. Этот процесс происхо-
дит примерно за 10 ~16 с, время, слишком короткое для заметного смеще-
ния ядер (принцип Франка - Ковдона).

Энергетическая щель между различными колебательными уровнями
энергии видна из спектра испускания перилена (см. рис. 1.2). Отдельные
максимумы испускания (а следовательно, и колебательные уровни энергии)
отстоят друг от друга примерно на 1500 см-1. Относительное число мо-
лекул перилена, находящихся в колебательных состояниях 0 и 1, описыва-
ется распределением Больцмана. Отношение R числа молекул в двух сос-
тояниях с разностью энергий ДЕ дается выражением

К = е-Д£/АТ	(1.1)

где k - константа Больцмана; Т - абсолютная температура, К. При ком-
натной температуре 300 К отношение R равно~0,01. Следовательно, боль-
шинство молекул будет находиться в самом нижнем колебательном сос-
тоянии; именно такие молекулы и поглощают свет. Из-за большой разнос-
ти энергий между уровнями и St, по существу, ни у каких флуорофоров
состояние Sj не может быть заселено термическим путем. Интересно от-
метить, что даже малое термически активированное заселение первого
возбужденного колебательного состояния молекул можно зарегистрировать
используя различие спектров поглощения при разных температурах.

За поглощением света обычно следует несколько других процессов.
Возбуждение флуорофора, как правило, происходит до некоторого высшего
колебательного уровня состояний (S* либо S2).3a некоторыми редкими ис-
ключениями, для молекул в конденсированной фазе характерна быстрая
релаксация на самый нижний колебательный уровень состояния Sv Этот
процесс называется внутренней конверсией и происходит большей частью
за 10"12 с. Поскольку типичные времена затухания флуоресценции близки
к 10-8 с, внутренняя конверсия обычно полностью заканчивается до про-
цесса испускания. Следовательно, испускание флуоресценции чаще всего
осуществляется из термически равновесного возбужденного состояния.
Аналогично поглощению обратный переход электронов на самый нижний
электронный уровень также приводит к колебательно возбужденному сос-
тоянию (рис. 1.3). Термическое равновесие достигается за время порядка
10"12с. Интересным следствием из такого рассмотрения является то, что
спектр поглощения молекулы отражает колебательную структуру возбуж-
денных электронных состояний, а спектр испускания - колебательную струк-
туру основного электронного состояния. В большинстве случаев электрон-
ное возбуждение не сильно изменяет расположение колебательных уровней
энергии. В результате этого колебательные структуры, проявляющиеся в
спектрах поглощения и испускания, сходны.

Молекулы в состоянии S х могут также подвергаться конверсии в пер-
вое триплетное состояние Испускание из Ти называемое фосфоресцен-
цией, обычно сдвинуто в сторону больших длин волн (меньших энергий)
по сравнению с флуоресценцией. Конверсия из Sj в Т\ называется интер-
комбинационной конверсией. Переход из Т\ в основное состояние запрещен,
в результате чего константа скорости такого испускания на несколько
порядков меньше соответствующей константы для флуоресценции. На ис-
пускание флуоресценции могут влиять и другие факторы, не показанные в
явном виде на рис. 1.3: влияние растворителей, релаксация растворителя,
тушение, а также реакции, происходящие в возбужденных состояниях. Все
они будут рассмотрены детально в последующих разделах книги.

1.2.	Характеристики испускания флуоресценции

Для явления флуоресценции известно несколько основных характе-
ристик. Существуют и исключения, но они редки. Если какая-либо из ниже-
перечисленных характеристик отсутствует у данного флуорофора, можно
сделать вывод о некоторых особых свойствах этого соединения.

1.2.1.	Стоксов сдвиг

Как правило, всегда наблюдается сдвиг испускания относительно пог-
лощения в сторону больших длин волн, т.*е. потеря энергии (исключение -
атомы в газовой фазе). Это явление впервые наблюдал Стокс в 1852 г. в
Кембридже [ 4], используя при этом аппаратуру, принцип действия которой
изображен на рис. 1.4. Источником ультрафиолетового возбуждения слу-
жил солнечный свет, пропущенный через пластинку из голубого стекла. Пе-
ред приемником в качестве желтого фильтра стоял стакан с вином. Флуорес-
ценция хинина лежит в области 450 нм и поэтому хорошо заметна невоору-
женным глазом. В настоящее время для определения величины стоксова
сдвига используют другие методы.

Потери энергии между возб/ждением и испусканием неизменно наблю-
даются для флуоресцирующих молекул в растворах. Одной из основных
причин возникновения стоксова сдвига является быстрая релаксация на
нижний колебательный уровень состояния Sv К тому же обычно происходит

Солнце

Фильтр воаВужде-
ни ч из голудоео стенла

ЧОО нм)

Фильтр испускания
(эюелтый- стакан
с вином)

Наблюдатель

РИС. 1.4. Схема первой установки для обнаружения стоксова сдвига.
переход на возбужденные колебательные уровни состояния So (см. рис. 1.3)
что приводит к дополнительной потере колебательной энергии. Вдобавок
к этому стоксов сдвиг может быть еще более увеличен благодаря влия-
ниям растворителя на флуорофоры и реакциям в возбужденных состояниях.
В газовой фазе у атомов и молекул не всегда имеется стоксов сдвиг.
Испускание без сдвига наблюдают тогда, когда концентрации газа доста-
точно малы для того, чтобы возбужденные молекулы не претерпевали
столкновений с другими молекулами до процесса испускания. Такие стол-
кновения приводят к релаксации. В жидкой фазе процессы соударения про-
исходят непрерывно.

1.2.2.	Независимость спектра испускания от длины волны
возбуждения

Спектр испускания флуоресценции обычно не зависит от длины волны
возбуждения. При возбуждении на высшие электронные и колебательные
уровни избыток энергии быстро расходуется, переводя флуорофор на
самый нижний колебательный уровень состояния Эта релаксации про-
исходит за время порядка 10-12 си является, по-видимому, результатом
сильного перекрывания множества состояний с примерно равными энергия-
ми. Благодаря такой быстрой релаксации длина волны возбуждения обычно
не влияет на спектр испускания. Существуют исключения (например азу-
лен), когда испускание может происходить как из $3-, так и из S г состояния
Кроме того, возбуждение на красном крае спектра поглощения часто ве-
дет к сдвигу флуоресценции в длинноволновую область. Этот сдвиг обус-
ловлен тем, что возбуждение на красном краю спектра избирательно воз-
можно для тех флуорофоров, которые наиболее сильно взаимодействуют с
растворителем.

1.2.3.	Правило зеркальной симметрии

Обычно спектр испускания флуоресценции представляет собой зер-
кальное отражение спектра поглощения, точнее, того поглощения, которое
соответствует переходу из So в Это особенно наглядно в случае пери-
лена (см. рис. 1.2). Симметричная природа этих спектров определяется тем,
что и поглощение, и испускание обусловлены одними и теми же перехода-
ми, а также сходством колебательных энергетических уровней состояний
So и SP Для многих молекул различное распределение электронов в сос-
тояниях и существенно не влияет на эти уровни энергии. Согласно
принципу Франка - Кондона, все электронные переходы происходят без из-
менения межъядерного расстояния. В результате, если данная вероятность
перехода (фактор Франка - Кондона) между нулевым и вторым колебатель-
ными уровнями максимальна при поглощении, соответствующий переход
будет наиболее вероятен также и в испускании (рис. 1.5).
РИС. 1.5. Правило зеркальной симметрии и факторы Франка - Кондона.

Необходимым условием для зеркальной симметрии является представ-
ление спектров поглощения и испускания в соответствующих единицах. Наи-
лучшая симметрия должна существовать между модифицированными спек-
трами e(v)/v и F(v)/v3, где e(v) - коэффициент поглощения, соответствую-
щий волновому числу v, a F(v) - относительный поток фотонов в интерва-
ле волновых чисел Ду [5]. Соответствие между такими спектрами обычно
наблюдается для полиядерных ароматических углеводородов.

Несмотря на то, что правило зеркальней-! симметрии часто выполняет-
ся, из него существует множество исключений. В качестве примера па
рис. 1.6 приведены спектры флуоресценции дифенила. В спектре испуска-
ния видна колебательная структура, которая отсутствует в спектре погло-
щения. Такое; отклонение от правила зеркальной симметрии обычно указы-
вает на различное геометрическое расположение ядер в основном и воз-

Jr

М,- чна волны, нм

240	260	280	300	720 340 360

8000

4000 Н

Й 12000

Ь; к

>

1,о 7*

S'?

|

0,6 & §
*

0,4 гу §
ГД

«у

4 « зоо

*0300	36300	32300	38300

Волновое число , см -

РИС. 1.6. Спектры поглощения и испускания дифенила (по данным I 2]).


бужденном состояниях. Смешение ядер может произойти до процесса ис-
пускания из-за относительно большого времени жизни состояния В слу-
чае дифенила, вероятно, отдельные кольца становятся более копланарвыми
в возбужденном состоянии, в результате чего спектр испускания становит-
ся более структурированным по сравнению со спектром поглощения. Дифе-
нил не только представляет собой пример отклонения от правила зеркаль-
ной симметрии, он необычен еще и тем, что его спектр испускания имеет
более четко выраженную колебательную структуру, чем спектр поглощения.
Обычно наблюдается противоположная картина.

Кроме геометрических перегруппировок отклонение от правила зер-
кальной симметрии могут вызвать также реакции в возбужденных состо-
яниях., Так, например, для фенола и тирозина наблюдается по две полосы ис-
пускания, причем длинноволновое испускание более заметно при высоких
концентрациях акцепторов протона (см., рис. 11Л8). Величина рКя феноль-
ной гидроксильной группы уменьшается от 11 в основном состоянии до 4 в
возбужденном состоянии.,

Вслед за возбуждением фенольный протон переходит к акцепторам про-
тона в растворе,. В зависимости от концентрации этих акцепторов в спектре
испускания может преобладать флуоресценция либо фенола, либо фенолята..
Примечательно то, что, даже несмотря на отсутствие активных групп, мно-
гие полиядерные ароматические углеводороды также вступают в реакции в
возбужденных состояниях., Так, например, молекулы пирена в возбужденном
состоянии объединяются в комплексы, называемые эксимерами (сокращение
от excited dimers - возбужденные димеры). Испускание эксимеров смешено
в длинноволновую область по сравнению с испусканием мономеров пирена, и

РИС.-1.7. Спектры испускания пире-
на и его эксимера (по данным [ б]).

Относительная интенсивность в мак-
симуме флуоресценции эксимера (470 нм)
уменьшается при понижении концентра-
ции пирена от 6 • .10~3 М (верхняя кривая)
До 0,9 • ,10“1М (нижняя кривая).
в нем отсутствует колебательная структура (рис» 1»7).> Такие полиядерные
ароматические углеводороды, как пирен, перилен и антрацен, образуют с ами-
нами комплексы с переносом заряда Комплексы, образующиеся в возоужден-
ном состоянии, называют эксиплексами

1.3.	Времена затухания и квантовые выходы флуоресценции

Часто измеряют времена затухания и квантовые выходы флуоресцирую-
щих соединений. Смысл этих параметров хороню виден из модифицированной
диаграммы Яблонского (рис. 1.8). На этой диаграмме мы не указываем по-
дробно отдельные процессы релаксации, приводящие к релаксированному
состояниюSj, а обращаем большое внимание на процессы, которые ответст-
венны за возвращение в основное состояние. В частности, нас интересует
константа скорости излучательной дезактивации флуорофора (Г) и констан-
та скорости безызлучательной дезактивации в состояние 50(/<).

Квантовый выход флуоресценции - это отношение числа испущенных фо-
тонов к числу поглощенных. Обе константы скорости Гий соответствуют
процессам уменьшения заселенности возбужденного состояния. Доля молекул
фнуорофора, которые дезактивируются с испусканием, а следовательно, и
квантовый выход определяются выражением

<ЬГ/(Г+Й)	(1.2)

Квантовый выход близок к единице в том случае, если константа скорости
безызлучательной дезактивации много меньше константы скорости испуска-
ния, т. е. k  Г. Заметим, что энергетический выход флуоресценции всегда
меньше единицы из-за стоксовых потерь. ,Для удобства мы сгруппировали
все возможные процессы безызлучательной дезактивации в одну константу
скорости й.

РИС. 1.8. Модифицированная диаграмма Яблонского.
Время жизни возбужденного состояния определяется как среднее время,
в течение которого молекула находилась в возбужденном состоянии до того,
как вернуться в основное состояние. Обычно время затухания флуоресцен-
ции'ЧО нс. Для флуорофора, описываемого диаграммой Яблонского (рис. 1.8),
время затухания равно

т=1/(Г +Л)	(1-3)

Необходимо помнить, что испускание флуоресценции - это случайный про-
цесс и не все молекулы испускают фотоны при t = т. Время жизни - это
средняя продолжительность пребывания в возбужденном состоянии. В приме-
ре для одноэкспоненциального затухания, приведенном в гл. 3/, 63% молекул гибнет
за время t = т, а 37 % - за время t > т. Время жизни флуорофора в отсутствие
безызлучательных процессов, называемое собственным временем жизни*,
т0, равно

т0 = 1/Г	(I-4)

Отсюда вытекает обычное соотношение между квантовым выходом и време-
нем жизни:

Q = т/т0	(1.5)

Квантовый выход и время жизни могут изменяться под действием лю-
бых факторов, влияющих на константы скорости. Например, молекула может
оказаться неспособной флуоресцировать из-за большой скорости внутренней
конверсии либо малой скорости испускания. Сцинтилляторы обычно выбира-
ют за их высокие квантовые выходы, которые являются результатом боль-
ших значений Г. Им обычно соответствуют короткие времена жизни, поряд-
ка 1 нс. Флуоресценция ароматических соединений, содержащих группы NO2,
обычно слаба, в первую очередь из-за большой величины k. Переход триплет-
синглет запретен по симметрии, и константы скорости спонтанного испус-
кания составляют ~103 с-1 или меньше**. Поскольку значения k близки к
109 с-1, квантовые выходы фосфоресценции малы при комнатной температу-
ре. Из уравнения (1.2) можно получить квантовые выходы фосфоресценции,
равные! О”6.

•Правильнее называть его радиационным (излучательным) временем жизни. -
Прим. ред.

•‘Автор приводит слишком большое значение k для внутримолекулярной безыз-
лучательной дезактивации триплетных состояний, которая встречается редко - лишь
для молекул, претерпевающих химические превращения (в частности, изомеризацию).
Из-за спинового запрета безызлучательный интеркомбинационный переход Ti -> s0
для большинства молекул имеет константы скорости k < 10я с-1. Однако в жидких
растворах вследствие тушения триплетных состояний примесями (особенно кислоро-
1.4.	Анизотропия флуоресценции

Флуорофоры преимущественно поглощают те фотоны, электрические век-
торы которых направлены параллельно моменту перехода флуорофора. Момент:
перехода имеет определенную ориентацию в молекуле флуорофора. В изотроп-
ных растворах молекулы флуорофоров ориентированы случайным образом.
При возбуждении поляризованным светом селективно возбуждаются те моле-
кулы флуорофора, для которых дипольный момент перехода при поглощении
параллелен электрическому вектору возбуждающего света (см. разд. 5.2.1).
Такое селективное возбуждение частично ориентированного набора флуоро-
форов (фотоселекция) приводит к частично поляризованному испусканию флу-
оресценции. Для каждого флуорофора моменты перехода для поглощения и
испускания имеют фиксированную ориентацию, и угол между ними определя-
ет максимальную измеряемую анизотропию \г0, см. уравнение (5.20)]. Ани-
зотропия ( г) и поляризация (Р) флуоресценции выражаются уравнениями

г Д| . Р_ ~f±-

/||	+ (l

(1.6), (1.7)

где /ц и /]_ - интенсивности флуоресценции вертикально (II) и горизонталь-
но (1) поляризованного испускания в случае возбуждения образца вертикаль-
но поляризованным светом. Анизотропия и поляризация - это выражения од-
ного и того же явления, поэтому их можно взаимозаменять, используя урав-
нения (5.3) и (5.4). Некоторые факторы могут уменьшать измеряемую вели-
чину анизотропии до значений ниже максимального. Самый распространен-
ный из них - вращательная диффузия, которая происходит за время жизни
возбужденного состояния и смещает испускающий диполь флуорофора. Из-
мерение этого параметра дает информацию об относительном угловом сме-
щении флуорофора в интервале между поглощением и испусканием. Перенос
энергии возбуждения между флуорофорами также приводит к уменьшению
анизотропии.

Предположим, что единственным существенным процессом, приводящим
к уменьшению анизотропии, является вращательная диффузия. Тогда изме-

дом), присутствующими даже в ничтожных концентрациях « 10“5 М), времена жизни
триплетных состояний обычно составляют 10~6 — 10-4 с. Поэтому квантовые выхо-
ды фосфоресценции в жидких растворах обычно меньше Ю"3,. При очень тщательной
очистке растворителей удается наблюдать фосфоресценцию и в жидких растворах,
например кетонов в воде. Для некоторых соединений (например, диацетила), имею-
щих повышенные константы скорости испускания фосфоресценции и малые констан-
ты скорости тушения триплетных состояний кислородом, наблюдается фосфоресцен-
ция и в жидких растворах в обычных условиях. — Прим. ред.
ряемая анизотропия определится выражением

гдег0 - анизотропия, которая должна была бы измеряться в отсутствие вра-
щательной диффузии, аф - время корреляции для процесса диффузии, опре-
деляемое как

Ф = r\V/kT	О*9)

где р - вязкость раствора; /? - константа Больцмана; Т - абсолютная темпе-
ратура; V - объем вращающегося фрагмента* Рассмотрим белок с молеку-
лярной массой 50 000. Поскольку удельный объем белков составляет
-'0,73 мл/г, можно легко подсчитать, что при 25° С в водном растворе
(р = 0,00894 П) ожидаемое время корреляции составляет 13 нс для безводной
сферы. Поскольку белки гидратированы, фактическое время корреляции, не-
видимому, должно быть больше. Однако существенным является то, что вре-
мена вращательной корреляции для большинства белков сравнимы с типич-
ными временами штухания флуоресценции. Поэтому результаты измерения
анизотропии флуоресценции зависят от всех факторов, влияющих на скорость
вращательной диффузии. По этой причине измерения поляризации флуорес-
ценции широко используют для изучения гидродинамических свойств макро-
молекул.

1.5.	Временная шкала молекулярных процессов в растворе

Флуоресцентная спектроскопия - эффективный метод исследования ди-
намических процессов в растворах, представляющих интерес для биологов.
Такая возможность связана в первую очередь с временем жизни возбужден-
ных состояний. Вследствие принципа Франка - Кондона абсорбционная спек-
троскопия может дать информацию только об усредненных характеристиках
основного состояния молекул, поглощающих свет. Поскольку только те мо-
лекулы растворителя, которые непосредственно соседствуют с поглощающими
частицами, будут влиять на их спектр поглощения, абсорбционная спектро-
скопия может дать информацию лишь о некоторой средней сольватной оболоч-
ке растворителя, соседствующей с хромофором, и не отражает молекуляр-
ную динамику. •

В противоположность этому параметры флуоресцентной спектроскопии
являются чувствительными функциями всех процессов, протекающих за вре-
мя жизни возбужденного состояния, причем в этих процессах могут участ-
вовать молекулы, находящиеся в момент возбуждения на расстояниях до
100 А от флуорофора. Хотя может показаться, что 10 пс - слишком корот-
кий промежуток времени, фактически это большое время по сравнению с вре-
менем движения малых молекул в жидком растворе. Вращательная диффу-
зия связанных с белками и мембранами флуорофоров также укладывается
в этот временной диапазон.

Тушение флуоресценции молекулярным кислородом по механизму стол-
кновений является показательным примером размеров пространственного и
временного диапазонов, представляемых временем затухания флуоресцен-
ции. Если флуорофор, находящийся в возбужденном состоянии, сталкивает-
ся с молекулой кислорода, он возвращается в основное состояние без испус-
кания фотона. Коэффициент диффузии кислорода в воде при 25°С равен
2,5 • 10~5 см2/с. Среднее расстояние [ (Ах2)и], на которое может диффун-
дировать молекула кислорода за 10~8 с, определяется уравнением Эйнштейна:

△х2 = 2От

(1Л0)

о

Расстояние [(Ах2)1^] составляет ~ 70 А, что сравнимо с толщиной биологи-
ческой мембраны или диаметром белка. Для некоторых флуорофоров време-
на жизни достигают 400 нс, поэтому ^ожно наблюдать диффузию молекул
кислорода на расстояния свыше 450 А. Напротив, измерения поглощения
дают сведения лишь о непосредственном окружении флуорофора и, следова-
тельно, о мгновенном усредненном окружении.

Влияние молекулярной динамики на спектры флуоресценции также обна-
руживается при рассмотрении энергий. Органические молекулы, как правило,
поглощают свет в диапазоне длин волн 200 - 500 нм, что соответствует
энергиям от 140 до 60 ккал/моль. Вслед за поглощением у флуорофора из-
меняется (обычно возрастает) дипольный момент. Если молекулы
растворителя также имеют дипольные моменты, они переориентируются во-
круг диполя возбужденного состояния, понижая тем самым его энергию.
Этот процесс называется релаксацией растворителя и происходит в жидких
растворах за 10-12 с. Релаксация растворителя может приводить к значи-
тельным стоксовым сдвигам» В белках триптофановые остатки поглощают
свет с длиной волны ^280 нм, а испускают флуоресценцию при ~350 нм.
Таким образом, за несколько наносекунд, проходящих до процесса испус-
кания, расходуется-20 ккал/моль.

В основе любого эксперимента лежат измерение некоторой величины и
корреляция полученных результатов с явлением, представляющим интерес
для исследователя. Временной диапазон между поглощением света и после-
дующим его испусканием достаточен для протекания нескольких процессов,
каждый из которых приводит к ослаблению наблюдаемых спектральных ха-
рактеристик флуоресценции. К таким процессам относятся столкновения с
тушителями, вращательная и поступательная диффузия, образование комп-
лексов с растворителями или с растворенными веществами и переориента-
ция окружения молекулы в возбужденном состоянии с измененным диполь-
ным моментом. Эти динамические процессы могут влиять на анизотропию
флуоресценции, квантовые выходы, времена жизни и спектры испускания.
В результате спектральные характеристики флуорофоров могут дать большую
информацию о динамических процессах, протекающих за время испускания
флуоресценции.

1.6.	Флуорофоры

1.6.	1,. Природные флуорофоры

Из большого числа молекул биологических веществ многие являются
природными, или естественными, флуорофорами. Мы кратко суммируем ин-
формацию о широкоизвестных флуорофорах, что дает основу для последую-
щих глав. Такое конспективное изложение не является исчерпывающим.

белки. Триптофан - наиболее интенсивно флуоресцирующая аминокисло-
та в белках. Около 90% всей флуоресценции белков обычно обусловлено
триптофановыми остатками. Этот природный флуорофор крайне чувствителен
к полярности окружающей среды. Спектральные сдвиги часто являются след-
ствием нескольких явлений, среди которых можно выделить связывание
лигандов, ассоциацию белок - белок и денатурацию. Кроме того, максиму-
мы испускания белков отражают среднюю доступность их триптофановых
остатков в водной фазе. Белки поглощают свет вблизи 280 нм, а максимумы
спектров флуоресценции лежат в области 320 -350 нм. Времена затухания
флуоресценции триптофановых остатков лежат в диапазоне 1-6 нс.

Тирозин интенсивно флуоресцирует в растворе, однако в белках его флу-
оресценция значительно слабее. Денатурация белков обычно усиливает ис-
пускание тирозина. Как и для фенола, рКа тирозина очень сильно уменьшает-
ся при возбуждении,и может происходить ионизация в возбужденном состоя-
нии.

нуклеиновые кислоты. Нуклеотиды и нуклеиновые кислоты обычно не
флуоресцируют. Тем не менее существуют некоторые исключения. tRNAPhe
из дрожжей содержит интенсивно флуоресцирующее основание, известное
какУ-основание, которое имеет максимум испускания вблизи 470 нм, а вре-
мя жизни ~6 нс.

кофакторы. NADH флуоресцирует сильно, и максимумы его поглощения
и испускания находятся при 340 и 450 нм соответственно. NAD+He флуорес-
цирует. Время затухания флуоресценции NADH в водном буфере составля-
ет примерно 0,4 нс. Флуоресцирующей группой является восстановленное
никотинамидное кольцо, причем его флуоресценция частично потушена за
счет столкновений с остатком аденина. При связывании NADH с белками
квантовый выход его флуоресценции увеличивается обычно в четыре раза.
Такое увеличение выхода обычно интерпретируют как следствие связывания
NADH в вытянутой конформации, что подтверждается изучением дифракции
рентгеновских лучей на гидрогеназах*

РИБОФЛАВИН и FAI). Рибофлавин, FMN (флавинмононуклеотид) и FAD
(флавинадениндинуклсотид) поглощают свет в видимой области (~450 нм) и
испускают в области 515 им. .Типичные времена жизни для FMN и FAD сос-
тавляют 4,7 и 2,3 нс соответственно. Как и для NADH, флуоресценция фла-
вина динамически тушится аденином. Далее, FAD также образует комплек-
сы-ассоциаты, в которых флуоресценция флавина потушена аденином (ста-
тическое тушение). Флавопротеины в основном нс флуоресцируют, однако
опять же существуют исключения.

1.6.2. 'Искусственные фпуорофоры

Часто естественные флуоресцентные свойства макромолекул но позволя-
ют получить из эксперимента желаемую информацию. Так, например, флуо-
ресценция белка и даже поляризация этой флуоресценции не отражают явле-
ние, которое хотят охарактеризовать количественно* В таком случае выби-
рают флуорофоры, которые хотя и являются посторонними по отношению
к исследуемой системе, но имеют лучшие спектральные свойства.

изоцианаты и изотиоцианаты флуоресцеина и родамина. Эти краси-
тели широко используют в качестве меток для белков. Меченные флуорес-
цеином иммуноглобулины - коммерческие реактивы; их часто используют
в флуоресцентной микроскопии. Именно эти вещества выбирают из-за вы-
соких квантовых выходов и устойчивости к фотообесцвечиванию. Кроме
того, благодаря большим длинам волн поглощения и испускания (рис. 1.9)
сведена к минимуму проблема фоновой флуоресценции биологических об-
разцов и можно избежать применения кварцевой оптики. Изоцианатная или
изотиоцианатная группы находятся либо в мета-, либо в пара-положении по
отношению к карбокси-группе (см. рис. 1.1). Коммерческие меченые реа-
генты представляют собой смесь изомеров. Эти красители реагируют в
первую очередь с лизиновым или цистеиновым участком белков. Времена
затухания флуоресценции красителей около 4 нс, а их спектры испускания
мало чувствительны к полярности растворителя. Эти красители очень под-
ходят для количественного определения степени ассоциации небольших ме-
ченых молекул с белками на основании изменения поляризации флуоресцен-
ции.

ДАНСИЛХЛОРИД. Дансилхлорид (DNS-C1) широко используют в качестве
метки для белков (рис. 1.10), особенно в тех случаях, когда проводят изме-
рения поляризации. Это Вещество давно известно [8] и имеет удобное про-
ся жизни флуоресценции (~ 10 нс). Па спектр испускания дансильной груп-
пы сильно влияет полярность растворителя.
РИС. 1.9. Спектры возбуждения и испускания бычьего у-гпобулина, меченного
изотиоцианатом флуоресцеина (по данным I ?!)-

2,6-TNS

сн

сн=сн2

9-Винилантрацен

сн
।
сн
II
сн

сн

II
сн

ПРИ

сн

«н
сн
I
сн
II
сн

CH3-N-CH3

ТМА -DPH

СН3

РИС. 1.10. Часто используемые искусственные фпуорофоры.
нафтил аминсульфоновые кислоты, 1-Анилино8-нафталинсульфоно-
вая кислота (1,8-ANS или ANS), 2-п-толуидинцлнафтш1ин-6-сульфоновая
кислота (2,6-TNS или TNS) и их производные часто используют в качестве
нсковалентно связанных зондов для белков и мембран. Эти зонды почти не
флуоресцируют в воде, но интенсивно флуоресцируют либо при растворении
в неполярных растворителях, либо когда они связаны с макромолекулами.
Низкий квантовый выход в водной фазе позволяет во многих случаях не
учитывать чту часть флуорофора, что упрощает эксперименты. Подобные
флуорофоры связываются с сывороточными альбуминами, липопротеина-
ми, апомиоглобином, иммуноглобулинами и липидными бислоями. Места
связывания имени', по-видимому, как полярную, так и неполярную природу.

ГИДРОФОБНЫЕ МЕМБРАННЫЕ ЗОНДЫ. Линид1я обычно не флуоресциру-
ют. Мембраны часто мстят такими зондами, как перилен, 9-випилантрацсн
и 1,6-дифенилгексатриеп (1)1’11) (рис. 1.10). Эти зонды нерастворимы в во-
де и встраиваются в гидрофобные участки мембран. Незамещенные много-
ядерные ароматические, углеводороды и DPH малочувствительны к поляр-
ности растворителя. Их используют в первую-очередь для оценки внутрен-
ней вязкости двойных слоем» по измерениям поляризации их флуоресценции
(разд. 5.7.1). Путем целенаправленного изменения химического строения
зонды могут быть локализованы па избранных участках мембраны. Одним
из таких примеров является тримотил аммониевая соль ПРИ (TMA-DP11).
Полагают, что заряженный атом азота приводит к локализации ТМА-
1)1’11 в области лнпидпо-родной границы мембран [ 14].

Другие зонды, как, например, PATMAN (рис. 1.11), очень чувствитель-
ны к фазовому состоянию липидных бислоев [ 9]. При температуре перес-
тройки мембран спектр испускания PATMAN сдвигается на 40 нм в длинно-
волновую область: от 425 до 4(15 нм. По-видимому, этот зонд реагирует па
релаксацию мембраны вокруг ,тиноля возбужденного состояния флуорофора
(разд. 8.6). Выли предложены и другие зонды. Чувствительность к потен-
циалу мембраны может быть связана с измененном ориентации зонда или
его локальной концентрации в мембране [ 10], а также с влиянием электри-
ческого поля на электронное распределение в зонде [ 11|. И наконец, можно
выделить зонды, которые подвергаются реакциям в во ю\ жданном состоянии.
В возбужденном состоянии зонд Р2 -С.л может образовывать внутримоле-
кулярный эксимер, и доля образовавшихся эксимеров определяет вязкость
в их ближайшем окружении.

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, При введении этил* нового мостика флуорес-
ценция ДТП и его производных становится более интенсивной [12]. Такие
производные е-АТР (рис. 1.11) чувствительны к вязкости растворителя,
имеют высокую продельную поляризацию флуоресценции, и времена затуха-
ния их флуоресценции близки к 23 нс. Нуклеотидные аналоги активны во
PATMAN

сн3

N-CHg-CHg N*(CH3)3

OH OH

£-ATP

CHg	сн3

^-S-C3 ~(5)

du- 5-ASP

лин-бензо-АМР

РИС. 1.11.Часто используемые искусственные флуорофоры.

многих реакциях, катализируемых ферментами. Кроме того, были синтези-
рованы такие аналоги нуклеотидов с вытянутой конформацией, как лин-бен-
зо-АМР. Эти аналоги флуоресцируют [ 13] и сохраняют способность к обра-
зованию водородных связей немодифицированных нуклеотидов.

Подводя итоги, можно сказать, что флуоресценцией обладают разнооб-
разные молекулы и на спектральные свойства флуорофоров влияет целый ряд
факторов и процессов. Как следствие этого, флуоресцентные методы полез-
ны для изучения свойств растворов и биологических макромолекул.
ГЛАВА2.

Аппаратура для флуоресцентной спектроскопии

/1ля успешного применения флуоресцентных методов необходимо хоро-
шее знание аппаратуры и умение обращать внимание на детали эксперимен-
та» Для этого существуют две причины. Во-первых, флуоресценция - очень
чувствительный метод. Почти всегда можно получать наблюдаемые
сигналы, увеличив коэффициент усиления приборов. Одпако эти
сигналы могут быть обусловлены не только используемым флуорофором:
наблюдаются сигналы фоновой флуоресценции растворителей, просачиваю-
щегося в прибор света, побочное рассеяние света от мутных растворов, рэ-
леевское или/и комбинационное рассеяние (названы лишь некоторые из
помех). Во-вторых, идеальных спектрофлуориметров не существует. Из-за
неоднородного спектрального состава источников света и зависимости чув-
ствительности монохроматоров и фотоумножителей от длины волны на при-
борах нельзя получить истинных спектров возбуждения и испускания. На
измерения интенсивностей флуоресценции могут влиять также поляриза-
ция и анизотропия испускаемого света. Поэтому для получения надежных
спектральных данных надо постоянно осуществлять контроль за многочис-
ленными факторами. В этой главе рассматриваются особенности отдель-
ных узлов спектрофлуориметра, а также те свойства образцов, которые
влияют на измеряемые параметры. Основной упор будет сделан па измере-
ние спектров возбуждения и испускания. Однако аналогичный подход ва-
жен и при измерениях времен жизни и анизотропии (гл. 3 и 5).

2.1.	Спектры возбуждения и испускания

Чаще всего необходимо измерять как спектры возбуждения, так и спект-
ры испускания. Спектр испускания представляет собой зависимость интен-
сивности испускания от длины волны при фиксированной длине волны воз-
буждающего света. Спектр возбуждения - это зависимость интенсивности
испускания при определенной длине волны от длины волны возбуждения.
Спектры изображаются либо в шкале длин волн, либо в шкале волновых чи-
сел. Свет определенной энергии можно описать длиной волны X, частотой
v или волновым числом?. Длину волны обычно измеряют в нанометрах, а
волновые числа — в обратных сантиметрах, /(липы волн и волновые числа —
взаимообратные величины: например, 400 нм (хютвет(ггву(т (400' Ю“7емГ’1 -
25000 см - ’. Такое альтернативное изображение спектров флуоресценции
было предметом больших споров. Общеизвестно что, шкала волновых чи-
сел линейна по энергии. Однако большинство приборок, выпускаемых
промыш ченностьк), градуировано'р шкале длин ноли, поэтому такие спект-
ры более привычны, кроме того, их легче визуально интерпретировать. По-
скольку при текущих исследованиях обычно не обязательно нужны исправ-
ленные спектры, а также по той причине, что получить их трудно, мы пред-
почитаем использовать непосредственно записанные на приборе спектры в
шкале длин волн.

1	.тя идеального прибора непосредственно записанный спектр испускания
должен был бы соответствовать потоку фотонов, испущенных на каждой
длине волны, приходящемуся на интервал длин волн и определяемому шири-
ной щели и дисперсией монохроматора испускания. .Аналогично, спектр
возбуждения должен был бы представлять собой зависимость относительно-
го квантового выхода для каждой длины волны возбуждения*. Дия большинст-
ва флуорофоров квантовые выходы и спектры испускания не зависят от дли-
ны волны возбуждающего света. Следовательно, спектр возбуждения флуо-
рофора обычно совпадает с его спектром поглощения. Паже при идеальных
условиях для такого совпадения необходимо присутствие единственного
флуорофора, а также отсутствие осложняющих картину факторов, таких,
как нелинейность, связанная с большой оптической плотностью образца.

На рис. 2.1 изображена схема наиболее распространенного спектрофлуо-
риметра. В качестве источника возбуждающего света в приборе использует-
ся ксеноновая лампа. Такие лампы удобны благодаря высокой интенсивнос-
ти излучения при всех длинах волн от 250 нм и выше. Прибор снабжен мо-
нохроматорами для выделения как возбуждающего, так и испускаемого
света. Применение двух решеток в монохроматоре возбуждения повышает
монохроматичность возбуждающего света. Дополнительным преимуществом
является то, что вогнутые дифракционные решетки, изготовленные голо-
графическим способом, уменьшают рассеянный свет. В следующем разде-
ле этой главы Гу 1,ет показано, насколько важна монохроматичность для
сведения к минимуму влияния рассеянного света. Оба монохроматора снаб-
жены моторами, что обеспечивает автоматическое сканирование по дли-
нам волн. Флуоресценция попадает на фотоумножители и затем количест-
венно измеряется с помощью соответствующих электронных устройств.
Выходной сигнал обычно представляется графически и может быть зане-
сен в память компьютера.

* Это утверждение автора неверно, поскольку спектром возбуждения называ-
ют зависимость интенсивности испусканий от частоты или длины волны возбуждаю-
щего света при постоянном потоке фотонов, падающих на образец. Напротив, кван-
товый выход определяют как отношение числа испущенных фотонов к числу погло-
щенных фотонов. Из-за этого спектр возбуждения сильно зависит от поглощения
(оптической плотности) образца, что и используют в ряде аналитических мэтодов.
Идеальный спектрофпуориметр должен был бы давать зависимость отношения чис-
ла испускаемых фотонов к числу падающих на образец фотонов от' частоты возбуж-
дающего света, компенсируя изменение с частотой интенсивности возбуждающего
света,, - Прим. ред.
РИС. 2.1. Блок-схема спектрофлуориметра (воспроизведено из рекламного прос-
пекта фирмы SLM Instruments).

На схеме (рис. 2.1) показаны также детали оптической части при-
бора, находящиеся вблизи держателя образца. Спектрофлуориметр для
научно-исследовательских работ должен быть снабжен универсальными и
надежными оптическими деталями. Оптический модуль, показанный на
рис. 2.1, включает множество удобных деталей, наличие которых необходи-
мо учитывать при приобретении или изготовлении прибора. Для зашиты от
возбуждающего света или для перекрывания канала, по которому идет свет
люминесценции, использованы затворы. На пути потока возбуждающего
света помещают систему растепления светового пучка. Она отражает часть
возбуждающего света на эталонный образец, который, как правило, пред-
ставляет собой устойчивый эталонный флуорофор. Система расщепления
состоит из тонкого куска прозрачного кварца, который отражает ~ 4 %
падающего света. Этого количества обычно достаточно для эталонного
канала, в котором монохроматор не используется. Измеренная интенсив-
ность флуоресценции эталонного образца пропорциональна интенсивнос-
ти возбуждающего света. Поделив интенсивность люминесценции образ-
ца на соответствующую величину для эталона, можно учесть колебания ин-
тенсивности излучения дугового источника.

Па пути возбуждающего и испускаемого световых потоков ставят по-
ляризаторы. Чаще всего поляризаторы отодвинуты; их вводят только для
измерений анизотропии флуоресценции или когда необходимо выделить оп-
ределенным образом поляризованную компоненту испускаемого и/ или воз-
буждающего света. Для точного измерения анизотропии флуоресценции
требуется расположение поляризаторов под определенным углом, поэтому
оправы поляризаторов должны быть хорошо закреплены и тщательно програ-
дуированы. Оптический модуль (рис. 2.1) имеет дополнительный оптический
путь с правой стороны от держателя образца. С его помощью можно про-
водить измерения анизотропии флуоресценции двухканальным методом
(гл. 5), более точным, чем одноканальный метод, в котором этот дополни-
тельный оптический канал нс требуется (разд. 5.4).

2.1.1.	Идеальный спектрофлуориметр

Пусть нужно записать’спектры возбуждения и испускания, в которых
отражена относительная интенсивность фотонов в единичном интервале
длин воли (см. выше). Для получения таких "исправленных” спектров ис-
пускания отдельные детали прибора должны иметь следующие характерис-
тики:

1.	Источник света должен иметь постоянный выход фотонов на всех
длинах волн.

2.	Монохроматор должен пропускать фотоны всех длин волн с равной
эффективностью.

3.	Эффективность монохроматора не должна зависеть от поляризации.

4.	Приемник (фотоумножитель) должен регистрировать фотоны всех
длин волн с одинаковой эффективностью.

Эти характеристики для идеальных оптических систем представлены на
рис. 2.2. К сожалению, источники света, монохроматоры и фотоумножите-
ли не обладают такими идеальными характеристиками. В результате прихо-
дится идти на компромисс в выборе отдельных деталей и исправлять неиде-
альные сигналы, полученные на приборе.

' Спектрофотометры для измерения поглощения света имеют те же са-
мые узлы, однако на них удаётся правильно измерять спектры поглощения,
поскольку обычно измеряют отношение интенсивности света, пропущенно-
го изучаемым образцом, к интенсивности света, пропущенного образцом, не содер-
жащим флуоресцирующего вещества. Такие относительные измерения проводят при
одинаковых условиях и при одной и той же длине волны, поэтому неидеальность ап-
паратуры аннулируется. Иное положение при измерении испускания флуоресценции,
Источник света

Монохроматор	Фотоумножитель

Длина волны	Длина волны

РИС. 2.2. Характеристики идеальных составных узлов спектрофлуориметра.

Длина волны

так как измерения интенсивности флуоресценции абсолютны, а не относительны.
Сравнение флуоресцирующего образца с образцом, не содержащим флуорофора, бес-
полезно, поскольку последний не дает никакого сигнала и поэтому нечувствителен
к зависимости отдельных компонентов оптической системы прибора от длины волны.
Следовательно, возможность внутренней компенсации ограничена

2.1.2.	Искажения спектров возбуждения и испускания

Для записи спектра возбуждения монохроматор испускания устанав-
ливают на желаемую длину-волны, в большинстве случаев - па максимум
испускания. После этого осуществляют сканирование светового потока из
монохроматора возбуждения по полосам поглощения флуорофора. Наблюда-
емый сигнал может искажаться по следующим причинам:

1.	Интенсивность света от возбуждающего источника является функ-
цией длины волны. Даже если возбуждающий свет пропускают через систе-
му расщепления пучка, показанную на рис. 2.1, и его интенсивность кор-
ректируют путем деления (см. выше), отношение'сигналов может зависеть
от длины волны.

2.	Эффективность монохроматора является функцией длины волны.

3.	Оптическая плотность образца может выходить за пределы линейной
области, которая охватывает ~ 0,1 единицы оптической плотности и зави-
сит от геометрии образца.

Спектры испускания записывают, выбирая подходящую длину волны
возбуждения и сканируя испускание по длинам волн. В добавок к указанным
выше факторам спектр испускания искажается еще и вследствие того, что
эффективность монохроматора испускания и чувствительность фотоумно-
жителя зависят от длины волны.

Рассмотрим теперь основные характеристики отдельных деталей спект-
рофлуоримотра, а также причины, по которым'выбирают именно эти кон-
кретные устройства.

3-413
2.2.	Источники света

КСЕНОНОВЫЕ ЛАМПЫ. Наиболее универсальными источниками света яв-
ляются ксеноновые (Хе) дуговые лампы высокого давления. Они обеспечи-
вают почти непрерывный спектральный выход в области 270 — 700 нм
(рис. 2.3); за исключением нескольких узких линий вблизи 450 нм. Испус-
кание света ксеноновыми дуговыми лампами происходит за счет рекомби-
нации электронов с ионизованными атомами Хе. Эти ионы образуются при
столкновениях атомов Хе с электронами в дуге. Непрерывный спектр ис-
пускания возникает при полном удалении электронов из атомов. Атомы Хе,
находящиеся в возбужденном состоянии, дают линии в спектре, а не широ-
кие полосы; этим обусловлены пики вблизи 450 нм. Интенсивность испус-
кания резко падает в области < 280 нм. При работе многих ксеноновых
ламп не происходит образования озона в окружающем воздухе. Кварцевый
баллон таких безозонных ламп не пропускает света с длиной волны короче
250 нм, и выходной поток таких ламп быстро падает при уменьшении дли-
ны волны.

Зависимость излучения ксеноновой лампы от длины волны является ос-
новной причиной искажений спектров возбуждения соединений, поглощаю-
щих в ультрафиолетовой области. Для иллюстрации величины такого эффек-
та на рис. 2.4 приведены исправленные и неисправленные спектры возбуж-
дения флуоррсцеина. Неисправленный спектр возбуждения имеет пики в
области 450 нм, обусловленные излучением ксеноновой лампы (рис. 2.3).
На рис. 2.4 показан также спектр возбуждения, скорректированный по
спектральному выходу ксеноновой лампы, зависящему от длины волны. В ка-
нал сравнения был помещен счетчик квантов для получения сигнала, пропор-
ционального интенсивности излучения лампы, на который делилась бы ин-
тенсивность свечения образца (разд. 2.7.1). В исправленном спектре воз-
буждения пики уже отсутствуют; этот спектр больше похож на спектр по-
глощения флуоресцеина. Заметная разница между исправленным и неисправ-

РИС. 2.3. Спектральные выходы ртутно-ксеноновой (а) и ксеноновой (б) дуговых
ламп (воспроизведено из проспекта Kratos).
РИС. 2.4. Неисправленный (?) и исправленный (2) спектры возбуждения флуо-
ресцеина (по данным [э]).

ленным спектрами иллюстрирует важность специфических свойств лампы
для спектров возбуждения.

Кожухи дуговых ламп выполняют несколько функций. Газ в ксеноновых
лампах находится под высоким давлением (около ~ 10 атм), и поэтому
существует опасность взрыва. При работе с такими лампами необходимо
надевать защитные очки. К кварцевому кожуху нельзя прикасаться; отпечат-
ки пальцев будут обугливаться, приводя к горячим пятнам на кварце и к
возможному повреждению лампы. Если соприкосновение произошло, необхо-
димо протереть кожух растворителем, например этанолом. Кожух служит
также для того, чтобы направлять на лампу воздух и удалять избыток теп-
ла и озона. На ксеноновую лампу нельзя смотреть без защиты глаз, так
как ослепительно яркий свет может повредить сетчатку глаза, а ультрафио-
летовое излучение - роговицу. Полезное время работы ксеноновых ламп
обычно не превышает 2000 ч. Чтобы предотвратить возможность работы с
уже использованной лампой, можно обернуть лампу в толстую бумагу и
разбить кварцевый баллон.

Источники питания дуговых ламп, производящие ток в 25 А при напря-
жении 20 В для типичных 450-ваттных ламп, также крайне опасны. Для за-
пуска ламп необходимо напряжение 20 - 40 кВ. Такое напряжение может
повредить кожу, а возникающие большие токи при этом могут быть смер-
тельными.
РТУТНЫЕ (Bg) ЛАМПЫ высокого ДАВЛЕНИЯ, Излучение этих ламп бо-
лее интенсивно, чем ксеноновых, но они имеют линейчатый спектр. Обычно
необходимо бывает выбрать ту длину волны, которая нужна для данного
флуорофора, а не наоборот. Следовательно, такие лампы годятся только
в том случае, если ртутные линии имеют подходящую длину волны для воз-
буждения данного флуорофора.

РТУТНО-КСЕНОНОВЫЕ дуговые ЛАМПЫ имеют более высокие интен-
сивности излучения в ультрафиолетовой области, чем ксеноновые лампы,
а присутствие Хе приводит к более широкому спектральному выходу. Од-
нако распределение интенсивности не такое плавное, как у ксеноновых
ламп (рис. 2.3).

ртутные лампы низкого давления дают очень узкие линии спектра
ртути, которые используются главным образом для целей градуировки.
Детали такой процедуры описаны в разд. 2.3.1.

2.3.	Монохроматоры

Монохроматизация светового потока в большинстве спектрофлуоримет-
ров осуществляется не с помощью призм, а дифракционными решетками.
В технических условиях работы на монохроматоре указываются дисперсия
и уровень рассеянного света. Дисперсия чаще всего приводится в. нм/ мм,
когда ширина щели выражена в миллиметрах. При выборе монохроматора
для флуоресцентной спектроскопии нужно обращать внимание на то, чтобы
уровни рассеянного света были низкими, тем самым уменьшаются помехи
от рассеяния света. Кроме того, монохроматор должен иметь высокую эф-
фективность, благодаря чему увеличивается возможность измерения сла-
бых световых потоков. Разрешающая сила обычно имеет второстепенное
значение, поскольку ширина линий в спектрах испускания редко бывает мень-
ше 5 нм. Ширину щелей обычно можно менять, и типичные монохроматоры
имеют две щели: входную и выходную. Интенсивность света, проходящего
через монохроматор, приблизительно пропорциональна квадрату ширины ще-
ли. Более широкие щели повышают уровень сигнала и, таким образом, отно-
шение сигнал/шум. При меньших ширинах щелей повышается разрешение, но
при этом уменьшается интенсивность света. Если возможно фотообесцвечивание об-
разца, его можно свести к минимуму уменьшением светового потока. Фото-
обесцвечивание можно также свести к минимуму легким перемешиванием
образца, поскольку освещается только часть образца и обесцвеченная его
часть непрерывно заменяется новой порцией.

Решеточные монохроматоры могут иметь плоские или вогнутые решетки.
Плоские решетки обычно изготовляют механическим способом, и некоторые
штрихи в них имеют дефекты. Вогнутые решетки делают с помощью голо-
графии и фоторезистов; дефекты при этом сравнительно редки. Дефекты
Длина волны, нм

РИС. 2.5. Эффективности решеток с максимальным блеском при 300, 500 и
1000 нм.

решеток - это основной источник рассеяния света в монохроматорах и
побочных изображений. По этой причине для флуоресцентной спектроскопии
предпочтительнее голографические решетки. Однако для измерений ани-
зотропии флуоресценции чаще выбирают плоские решетки (см. рис. 2.6).
Эффективность пропускания решеточных монохроматоров является функци-
ей длины волны (рис. 2.5). При механическом производстве решеток эффек-
тивность для данной длины волны можно максимально увеличить подбором
угла блеска, который определяется формой и углом инструмента, приме-
няемого при изготовлении решетки. Подбором этого угла можно достичь
максимальной эффективности в данной области длин волн, но при этом для
других длин волн эффективность будет меньше. Обычно выбирают монохро-
матор возбуждения с высокой эффективностью в ультрафиолетовой облас-
ти, а монохроматор испускания - в видимой области спектра. Поскольку
голографические решетки изготавливают другим способом, они не имеют
угла блеска, но форму штрихов можно менять. Как правило, максимальная
эффективность пропускания таких решеток меньше, чем плоских, но они
более эффективны для работы в широкой области спектра, чем плоские ре-
шетки.

Важной характеристикой решеточных монохроматоров является зависи-
мость эффективности пропускания от поляризации света, показанная на
рис. 2.6 для плоской и вогнутой решеток. Вследствие этого наблюдаемые
интенсивности флуоресценции могут зависеть от поляризации испускаемой
флуоресценции. Кроме того, спектр испускания образца может быть сдви-
нут по длинам волн и иметь измененную форму в зависимости от того,
при каких условиях поляризации произведена запись. Рассмотрим, например,
спектр испускания, записанный с одним и тем же типом решетки, но с по-
мощью поляризатора, ориентированного вертикально (II) и горизонтально
(1)	(рис. 2.6). Спектр, полученный с помощью вертикально ориентированно-
го поляризатора, должен быть смещен в сторону коротких длин волн по
сравнению со спектром, полученным при использовании поляризатора в гори-
зонтальном положении. Причиной является то, что эффективность пропуска-
ния для вертикально поляризованного света выше на коротких длинах волн.
Такой спектральный сдвиг можно наблюдать независимо от образца и от то-
го, поляризовано или нет испускание.

В качестве другого примера для иллюстрации этого факта на рис. 2.7
приведен спектр испускания N-ацетил-L-триптофанамида (NATA). Это сое-
динение является производным триптофана, и его можно рассматривать для
иллюстрации спектров испускания, ожидаемых для белков (гл. 11). Возбуж-
дающий свет поляризован вертикально, а спектр испускания записан с поля-
ризатором, ориентированным вертикально (В) и горизонтально (Г). Эти
спектры явно различаются. Как и ожидалось, спектр, наблюдаемый через
вертикально ориентированный поляризатор, сдвинут в коротковолновую об-
ласть по сравнению со спектром, наблюдаемым при горизонтальной ориен-
тации поляризатора испускания. Дополнительный пик при 390 нм обуслов-
лен только пропускающей способностью монохроматора. Полученные резуль-
таты свидетельствуют о том, что можно сравнивать только те спектры, ко-
торые записаны в одинаковых условиях, в том числе и при одинаковой ори-
ентации поляризаторов. Важно помнить, что если поляризация флуоресцен-
ции образца меняется, например вследствие изменения вязкости, то наблю-
даемый спектр испускания может быть другим из-за зависимости эффек-
тивности пропускания от длины волны и от поляризации. Более того, вяз-
кость и сама по себе может влиять на спектр испускания.

Возможный способ избежать этих трудностей - это использовать опре-
деленную ориентацию поляризаторов при записи спектров испускания. Од-

Длина. волны, нм

РИС. 2.6. Эффективность линейных и голографических решеток.

Изображены эффективности пропускания вертикально (и) и горизонтально (1) по-
ляризованного света. Кружком отмечена кривая эффективности пропускания неполя-
ризованного света, а - голографическая решетка 1800 штрих/мм;б — плоская ре-
шетка 1200 штрих/мм с углом блеска, подобранным для 500 нм. (Воспроизведено из
проспекта фирмы Spex.)
ним из наиболее предпочтительных методов является метод, в котором соз-
даются условия так называемого "магического угла": вертикально поляри-
зованное возбуждение и поляризатор испускания, ориентированный под уг-
лом 54,7° к вертикали. При этом сигнал пропорционален полной интенсив-
ности флуоресценции которая равна сумме 1ц +21±, где и /ц -
интенсивности горизонтально и вертикально поляризованного испускания.
Однако такие предосторожности используют только в случае необходимости.
Важно отметить, что наличие поляризаторов как в потоке возбуждающего,
так и в потоке испускаемого света приводит к уменьшению интенсивности
сигнала по крайней мере в четыре раза.

Отметим, что поляризатор в пучке испускаемого света можно исполь-
зовать для уменьшения количества рассеянного света, попадающего в
приемник. Использование в пучке испускаемого света поляризатора с
горизонтальной ориентацией почти полностью устраняет рассеянный свет

РИС. 2.7. Спектр испускания флуоресценции И-ацетил-Ь-триптофанамида.

Буфер — 0,1 М раствор фосфата натрия, pH 7,5; 25° С, Длина волны возбуждения
280 нм. Ширина полос возбуждения и флуоресценции 8 и 4 нм соответственно. Усло-
вия поляризации относятся к ориентации поляризаторов возбуждения и испускания
(В — вертикальная, Г — горизонтальная). Образец содержал небольшие количества
гликогена (для рассеяния света).
(рис. 2.7). В приведенном примере количество гликогена в образце было
подобрано таким образом, что интенсивность рассеянного света при длине
волны возбуждения была примерно равна максимальной интенсивности ис-
пускания.

На измерения поляризации флуоресценции сильно влияют поляризацион-
ные характеристики монохроматоров. При этом необходимо вносить поправ-
ки на изменение эффективности каждой составляющей, выражаемое G-фак-
тором (разд. 5.4). Однако и некоторые свойства голографических решеток
(рис. 2.6) могут привести к трудностям при измерении поляризации флуо-
ресценции. Предположим, например,, что нужно измерить поляризацию при
длине волны испускания 450 нм. Эффективность пропускания перпендикуляр-
ной компоненты при этой длине волны крайне мала, что приводит к уменьше-
нию точности измерения. Теперь предположим, что необходимо возбудить
флуорофор светом с длиной волны 370 нм. В этом случае подходит верти-
кально поляризованный свет. Однако измерение G-фактора обычно проводят,
используя горизонтально поляризованный свет, а интенсивность этой ком-
поненты низка.

Можно обойти эту проблему, используя для измерения G-фактора раз-
личные длины волн возбуждения, поскольку G-фактор - это характеристика
монохроматора испускания, а не длины волны возбуждения. Эта точка зре-
ния может быть проиллюстрирована следующим примером. При измерении
поляризации флуоресценции белка (340 нм) часто используют длину волны
возбуждения 300 нм. При этой длине волны свет, выходящий из монохрома-
тора возбуждения, почти полностью поляризован в вертикальном направле-
нии, в результате чего интенсивность излучения в горизонтальном направ-
лении недостаточна для измерения G-фактора. Поэтому для измерения нуж-
но использовать несколько различных длин волн возбуждения, обычно 280,
285, 290 и 295 нм, и затем усреднить величину G-фактора. На практике эти
величины почти одинаковы, но усреднение повышает точность определения.

Для измерений флуоресценции, пожалуй, самым важным параметром
является уровень рассеянного света. Рассеянный свет - это любой свет,
проходящий через монохроматор, отличающийся от излучения нужной длины
волны. Рассмотрим сначала монохроматор возбуждения. Полный световой
поток от источника света попадает в монохроматор. Для возбуждения часто
используют длины волн в ультрафиолетовой области, а интенсивность ультра-
фиолетового излучения ксеноновой лампы может быть в 100 раз'меньше ин-
тенсивности видимого света. Далее, интенсивности флуоресценции часто
низки, поэтому рассеянный свет больших длин волн может пройти через мо-
нохроматор возбуждения и иметь интенсивность, сравнимую с интенсивнос-
тью самой флуоресценции. Кроме того, многие биологические образцы мало-
прозрачны. В результате проходящий рассеянный свет с длиной волны, сов-
падающей с длиной волны испускания, может препятствовать измерениям
интенсивности флуоресценции. Чтобы избежать таких помех, применяют моно-
хроматоры с двумя решетками, особенно для возбуждения. Уровни рассеян-
ного света для таких монохроматоров часто составляют Ю*-8 - 10~12 мак-
симальных интенсивностей. Однако монохроматоры с двумя решетками ме-
нее эффективны, и приходится мириться с низкой чувствительностью.

Теперь обсудим эффективность монохроматора испускания. Обычно
флуорофоры поглощают очень небольшую часть возбуждающего света, а
квантовые выходы флуоресценции могут быть невелики. Случаи, когда сиг-
нал флуоресценции в 1.000 раз менее интенсивен, чем возбуждающий свет,
довольно распространены. Пусть, например, исследуются мутные суспензии
мембран для наблюдения флуоресценции связанных с этими мембранами
белков. Длины волны возбуждения и испускания должны быть около 280 и
240 нм соответственно. Посклъку монохроматор испускания неидеален, не-
которое количество рассеянного света с длиной волны 280 нм может прой-
ти через монохроматор испускания, установленный на‘длину волны 340 нм.
Предположим, что монохроматор испускания, установленный на 340 нм, про-
пускает свет с длиной волны 280 нм с коэффициентом 10-4. Интенсивность
рассеянного света с длиной волны 280 нм легко может в 1000 раз превысить
интенсивность испускания флуоресценции с длиной волны 340 нм. Следова-
тельно, 10 % излучения, которое мы принимаем за флуоресценцию, может в
действительности быть рассеянным возбуждающим светом. Важно также
помнить, что рассеянный свет сильно поляризован (обычно на 100%). Та-
ким образом, из-за высокого уровня рассеянного света измерения анизотро-
пии флуоресценции часто затрудняются или становятся невозможными.

Во всех экспериментах по измерению флуоресценции важно исследовать
контрольные образцы, которые во всем идентичны исследуемым образцам,
но не содержат флуорофора ("холостой" опыт). Такие образцы позволяют
оценивать рэлеевское и комбинационное рассеяние и устранять их влияние.
Кроме того, при проведении "холостого" опыта можно обнаружить присутст-
вие флуоресцирующих примесей. При исследовании контрольных образцов
необходимо иметь в виду, что рассеянный свет полностью поляризован.
Важность этого фактора иллюстрирует рис. 2.7, на котором приведены спект-
ры испускания NATA. Для увеличения интенсивности рассеянного света в
опыте было добавлено небольшое количество гликогена. Спектры испуска- a
ния записаны при вертикальной и горизонтальной ориентации поляризатора испуска-
ния. Рассеянный возбуждающий свет хорошо заметен, когда поляризатор ориен-
тирован вертикально. Напротив, почти никакого рассеянного света не наб-
людается при ориентации поляризатора в горизонтальном направлении. От-
сюда можно сделать несколько выводов. Предположим, что проводятся из-
мерения анизотропии флуоресценции. Если спектры "холостых" проб рас-
сматривают при горизонтальной ориентации поляризатора испускания, можно
ошибочно заключить, что количество рассеянного света незначительно. При
проведении измерений в присутствии рассеянного света лучше всего ставить
оба поляризатора в вертикальное положение, чтобы можно было заметить,
есть ли мешающий сигнал. Наоборот, горизонтальную поляризацию пучка ис-
пускаемого света можно использовать для уменьшения влияния рассеянно-
го света в том случае, если необходимо измерить только спектры испуска-
ния.

Голографические решетки устраняют рассеянный свет лучше, чем лино-
ванные. Ясно, что большое значение имеют дефекты решеток, приводящие
к побочным изображениям, которые могут выходить из монохроматоров.
В случае использования голографических решеток таких изображений мень-
ше, поскольку эти решетки совершеннее. Кроме того, в монохроматорах с
голографическими решетками меньше отражающих поверхностей. Это связа-
но с тем, что решетка может также работать как линза, и для фокусировки
не требуется больших вогнутых зеркал. При меньшем числе отражающих по-
верхностей вероятность прохождения рассеянного света через монохрома-
тор уменьшается.

градуировка монохроматоров. Градуировку монохроматоров по
длинам волн надо проводить регулярно, особенно для тех монохроматоров,
где "градуировку" осуществляют с помощью электроники, а не путем прямо-
го механического соединения. Для градуировки применяют ртутные пальчи-
ковые лампы. Ртутную лампу низкого давления изготавливают в форме ци-
линдра диаметром 5 мм. Такие лампы хорошо входят в кюветное отде-
ление. Для того, чтобы стационарно установить лампу, используют метал-
лический блок, в который плотно входит лампа. Этот держатель имеет те
же размеры, что и кювета. На одной из его сторон есть диафрагма, кото-
рая позволяет ограничивать световой поток, попадающий в монохроматор
испускания. Для того чтобы повысить точность определения длины волны
и уменьшить интенсивность света, устанавливают небольшую ширину щели.
Важно ослабить световой поток, чтобы не повредить фотоумножитель и/ или
усилитель. После выполнения указанных предосторожностей устанавливают
наиболее сильные ртутные линии, используя монохроматор испускания. Изме-
ренные длины волн сравнивают с известными величинами, которые приведе-
ны в табл. 2.1. Если наблюдаемые значения отличаются от табличных на пос-
тоянную величину, градуируют монохроматор еще раз до получения совпаде-
ния. Более серьезные проблемы возникают, если шкала длин волн нелинейна,
т. е. измеренные длины волн отличаются от приведенных в таблице на вели-
чину, которая зависит от длины волны. В этом случае монохроматор обычно
возвращают изготовителю для переделки.

После градуировки монохроматора испускания можно провести градуи-
ровку монохроматора возбуждения, используя первый в качестве стандарта.
Ширины щелей обоих монохроматоров должны быть одинаковыми (небольшими)
в соответствии с интенсивностью света. В кюветное отделение помещают
разбавленную суспензию гликогена, чтобы рассеивать возбуждающий свет.
Если монохроматор возбуждения проградуирован хорошо, максимальная ин-
тенсивность рассеянного света наблюдается тогда, когда указанные па моно-
Таблица 2..7. Длины волн и относительные интенсивности ртутных
линийа

Длина волны, нм	Относитель- ная интенсив- ность	Длина волны, нм	Относитель- ная интенсив- ность
253,7	100,0	366,3	0,1
296,5	0,6	404,7	0,9
302,2	1,1	435,8	1,7
312,6	0,7	546,1	1,2 .
313,2	1.1	577,0	0,2
365,0	0,9	579,0	0,2
365,5	0,2	—	——

Мальчиковая лампа производства Ultra-Violet Products
(Сан-Габриель, Калифорния, США), Значения относительных интен-
сивностей даны приблизительно.

хроматорах длины волн совпадают. Линейность шкалы длин волн можно оп-
ределить путем установки монохроматора испускания на различные длины
волн. Преимущество такой процедуры заключается в том, что нет необходи-
мости убирать источник света. Вместо ксеноновой лампы можно было бы ис-
пользовать ртутную, но ксеноновую лампу надо убирать.

2.4.	Оптические фильтры

Основным источником ошибок при всех флуоресцентных измерениях слу-
жит рассеянный или побочный свет. Его влияние можно свести к минимуму,
используя в дополнение к монохроматорам оптические полосно-пропускаю-
щие фильтры. На рис, 2,8 показаны типичные спектры испускания и кривые
пропускания для некоторых фильтров. Узкий высокий пик слева обусловлен
рассеянным возбуждающим светом, широкий пик - флуоресценцией, а ма-
ленький узкий пик - комбинационным (рамановским) рассеянием (КР). Необ-
ходимо учитывать КР от растворителей. Для воды этот пик появляется на
3600 см-1 ниже волнового числа возбуждающего света. При возбуждении
светом 280 нм пик КР от воды находится при 311 нм, что можно ошибочно
принять за флуоресценцию тирозина. У сильно флуоресцирующих образцов
интенсивность флуоресценции обычно значительно превышает пик комбина-
ционного рассеяния. Однако если повышают коэффициент усиления прибора
при работе с разбавленными растворами или в случае низких квантовых вы-
ходов, комбинационное рассеяние может оказаться значительным и иска-
зить спектр испускания. Поскольку пики КР всегда наблюдаются на посто-
янном расстоянии от пиков возбуждающего света, такое рассеяние можно
идентифицировать путем изменения длины волны возбуждения.

Для того чтобы показать полезность полосно-пропускающих фильтров,
рассмотрим случай расположения фильтра па пути возбуждающего света
(рис. 2.8). С помощью такого фильтра, как I, можно убрать побочный свет,
налагающийся на длину волны, при которой проводится измерение, до его
попадания на образец и рассеяния. В этом случае блокируется побочный
свет, пропущенный монохроматором возбуждения. Фильтры могут также за-
держивать рассеянный свет, чтобы он не попал в монохроматор испускания.
Для достижения этой цели пригодны фильтры 2 или 3. Фильтр 2 не искажает
спектра испускания, тогда как фильтр 3 селективно уменьшает испускание
в коротковолновой области.

Если исследуется испускание флуоресценции вне зависимости от его
распределения по длинам волн, монохроматор испускания можно убрать из
системы и наблюдать флуоресценцию через фильтр, не пропускающий рас- '
сеянного света. Такой прием может значительно повысить чувствительность,
поскольку расширяется полоса пропускания для наблюдаемого света и умень-
шается ослабление светового потока монохроматором. Однако при этом
важно подобрать такой фильтр для испускания, который исключал бы как
рассеянный падающий свет, так и комбинационное рассеяние. Фильтр 3
уменьшает комбинационное рассеяние, тогда как фильтр 2 пропускает эту
компоненту.

При измерениях поляризации и анизотропии чаще применяют фильтры,
а не монохроматоры. Рассеянный свет поляризован на 100% (г « 1,0). Сле-
довательно, небольшой процент рассеяния может привести к серьезным
ошибкам. Например, предположим, что мы используем фильтр 2 и что 10%

Длина волны

РИС. 2.8.Уменьшение побочного света при использовании оптических фильтров.
1 — фильтр для возбуждающего света; 2,'3 — фильтры для излучения флуорес-
ценции.
наблюдаемой интенсивности обусловлено комбинационным рассеянием .Да-
лее предположим, что реальная анизотропия образца в отсутствие рассеяния
составляет 0,10. Наблюдаемая анизотропия определяется выражением

гнабл “ /рсгрс + /срлгфл	(2.1)

где /рс определяет относительный вклад рассеянного света, a - относитель-
ный вклад флуоресценции ; ГфЛ - анизотропия флуоресценции; грс - анизо-
тропия рассеянного света. Подставляя заданные величины в уравнение (2.1),
получаем г набп	0,19. Следовательно, 10%-ная доля рассеянного света

может дать при измерении анизотропии ошибку почти в два раза. Относитель-
ная ошибка становится еще больше, если значение r$n меньше. Такие же
рассуждения применимы как для комбинационного, так и для рэлеевского
рассеяния.

2.5.	Фотоумножители

Почти во всех флуориметрах в качестве приемников используются фото-
умножители (ФЭУ), поэтому необходимо знать их возможности и ограниче-
ния. Лучше всего рассматривать ФЭУ в качестве источника тока, пропорцио-
нального интенсивности падающего света. Хотя ФЭУ реагирует па отдель-
ные фотоны, обычно регистрируется некий усредненный сигнал.

ФЭУ состоит из фотокатода и ряда динодов, которые образуют каскад
усиления (рис. 2.9). Фотокатод представляет собой тонкую планку металла
на внутренней стороне окна. Падающие фотоны вызывают эжекцию электро-

Динод 1 Динод 2

Отрицательное
высокое напряжение

РИС. 2.9. Схема устройства фотоумножителя и его динодной цепи.


нов с этой поверхности. Эффективность испускания фотоэлектронов зави-
сит от длины волны падающего света. Фотокатод поддерживается под высо-
ким отрицательным напряжением, обычно от -1000 до -2000 В. На диноды
также подают отрицательное напряжение, однако его величина уменьшает-
ся до нуля вдоль цепочки динодов. Разность потенциалов катод - первый
динод обычно постоянна (фиксируется с помощью диода Зинера) и лежит в
диапазоне -50 4- -200 В. Разность потенциалов вызывает ускорение
эжектируемых электронов на пути к первому диноду. При столкновении с
первым динодом фотоэлектрон вызывает дополнительную эжокцию от 5 до
20 электронов в зависимости от разности потенциалов для этого динода.
Этот процесс продолжается вдоль всей цепочки динодов до тех пор, пока
импульс тока не доходит до анода. Величина результирующего импульса
зависит от суммарного напряжения, поданного на ФЭУ. Чем выше напряже-
ние, тем больше число электронов, эжектируемых с каждого динода и, сле-
довательно , тем больше усиление.

ЛИНЕЙНОСТЬ чувствительности. Для количественных измерений необ-
ходимо, чтобы анодный ток был прямо пропорционален интенсивности све-
та. Нелинейная зависимость может являться результатом избыточного тока
с фотокатода. При высоких интенсивностях освещения потенциал фотокато-
да может уменьшаться из-за того, что его допустимая токовая нагрузка ог-
раничена. В результате уменьшается разность потенциалов между катодом
и первым динодом, что в свою очередь снижает коэффициент усиления. Кро-
ме того, избыточные фототоки могут повредить чувствительные к свету
фотокатоды, что приведет к уменьшению коэффициента усиления и избыточ-
ному темновому току. Темновым током ФЭУ называется ток в отсутствие
падающего света.

Для сохранения линейности необходимо также, чтобы напряжения на дино-
дах оставались постоянными независимо от интенсивности падающего света
и анодного тока. Цепь динодов конструируют таким образом, чтобы полный
ток через нее был по крайней мере в 100 раз больше максимального анодно-
го тока. Для шестикаскадной трубки (рис. 2.9) при использовании сопротив-
лений в 100 кОм динодный ток должен был бы быть равен 1,6 мА при напря-
жении 1000 В. Следовательно, максимальный анодный ток должен быть ра-
вен 16 мкА.

ИСТОЧНИКИ ПИТАНИЯ для ФЭУ. Для получения постоянного коэффициен-
та усиления с помощью ФЭУ необходим тщательный контроль за напряже-
нием на динодах. Типовой фотоумножитель обеспечивает коэффициент
усиления 3 на каждые 100 В. Следовательно, при изменении напряжения на
1 В коэффициент усиления меняется на 3%. Необходимо, чтобы высоко-
вольтный источник питания обеспечивал постоянное, непульсирующее иапря ~
жение, стабильное в течение длительных промежутков времени.
ЗАВИСИМОСТЬ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ФОТОКАТОДОВ ОТ ДЛИНЫ ВОЛНЫ.
Квантовые эффективности фотокатодов сильно зависят от длины волны
(рис. 2.10). Чувствительность в УФ-области ограничивается в основном мате-
риалами, используемыми для окон. Фотоумножитель 9635 QB с кварцевым
окном часто применяется для измерений флуоресценции благодаря его вы-
сокой квантовой эффективности, большому коэффициенту усиления и мало-
му темновому току. Такие темновые токи имеют порядок 10-° А и, таким
образом, в 1000 раз меньше типичных анодных токов (порядка микроампер).
Для работы в ультрафиолетовой области выбирают ФЭУ с кварцевыми окнами.

Заметим, что квантовая эффективность практически равна нулю при
длинах волн > 650 нм*. Существуют ФЭУ, чувствительные и при больших
длинах волн (в красной области), однако у них более низкие полные кванто-
вые эффективности и большие темновые токи. Следует также отметить,
что квантовая эффективность непостоянна внутри любого разумного интер-
вала длин волн. Этот факт вместе с зависимостью эффективностей моно-
хроматоров от длины волны, является причиной неидеальной чувствительнос-
ти спектрофлуориметров к длинам волн.

РИС. 2.10. Зависимость эф-
фективности фотоумножителя от
длины волны для бищелочного фото-
катода К -Cs.

1-	фотоумножитель 9635Q В
с кварцевым окном; 2 —’ фотоум-
ножитель 9635 В (9635 — номер
по каталогу).

'Для данного фотоумножителя 9635QB. — Прим» ред.
ВРЕМЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФОТОУМНОЖИТЕЛЕЙ. Пролетное Время
фотоумножителей - это временной интервал между попаданием фотона на
катод и подходом усиленного импульса к аноду. Типичные времена пролета
близки к 20 нс (рис. 2.11). Время нарастания - это то время, которое необ-
ходимо для увеличения сигнала па аноде от 10 до 90 % от его конечного
уровня. Время нарастания в первую очередь определяется вариациями пролет-
ного времени в ФЭУ, т.е. разбросом пролетного времени вокруг среднего
значения. Разброс происходит из-за того, что фотоэлектроны могут прохо-
дить от фотокатода к аноду по различным траекториям, либо выходить из
различных областей фотокатода, либо иметь различные траектории, выходя
из одной и той же области фотокатода. Разброс пролетного времени можно
уменьшить, используя фотокатод и динод с такой геометрией, которая мак-
симально уменьшит разницу траекторий. Этого можно достичь, освещая
меньшие площади, а также направляя полет электронов с помощью магнитно-
го или электрического полей. Такие процедуры обычно применяют, когда
важны временные характеристики ФЭУ, например при измерениях времен
затухания флуоресценции.

Вторым главным источником временной зависимости сигналов ФЭУ яв-
ляется сам фотокатод. Обычно его временная характеристика зависит от
длины волны падающего света. Это свойство называется цветовым эффек-
том. Очевидно, энергия эжектируемых электронов зависит от длины волны
падающего света. Цветовой эффект не имеет значения при стационарных
измерениях, однако может служить источником существенных ошибок при
измерениях времен жизни (гл. 3).

2.6.	Сравнение методов счета фотонов и аналогового

детектирования флуоресценции

Фотоумножители могут работать либо в аналоговом режиме, либо
в режиме счета фотонов. В данном разделе рассматривается стационар-
ный режим регистрации флуоресценции; разрешенные во времени измерения
методом счета фотонов будут описаны в гл. 3. В режиме счета фотонов
регистрируют и считают отдельные импульсы с анода, обусловленные каж-
дым фотоном. В этом случае система регистрации работает вблизи теоре-

Напряжение на ФЭУ, в

JLJ
1500

РИС. 2.11. Зависимость пролетного
времени и времени нарастания от напря-
жения для типичных фотоумножителей.
тического предела чувствительности. Помимо увеличения чувствительности,
можно повысить стабильность системы регистрации. Это результат того,
что ФЭУ работает при постоянном высоком напряжении и небольшой дрейф
напряжения не приводит к значительным изменениям эффективности счета
каждого фотона. По этой причине регистрацию методом счета фотонов час-
то используют, когда уровни сигналов низки и когда необходимо усреднять
периодически повторяющееся сканирование по длинам волн, с тем чтобы
увеличить отношение сигнал/ шум. Недостатком метода счета фотонов яв-
ляется то, что нельзя изменять коэффициент усиления ФЭУ путем измене-
ния приложенного напряжения. Другой недостаток метода - ограниченная
область интенсивностей, внутри которой скорость счета линейна. Если два
импульса поступают на анод с малым интервалом времени, они будут по-
считаны как один импульс. Анодные импульсы от одного фотона имеют
обычно длительность 10 нс. Это ограничивает частоту откликов ФЭУ значе-
нием 100 МГц (108 Гц) для периодического сигнала. Для регистрации
случайных событий необходимо, чтобы скорость счета была примерно в
100 раз меньше, чтобы избежать одновременного прихода двух фотонов.
Следовательно, скорости счета ограничены величиной J МГц или меньше.
В типовых приборах линейность нарушается при скорости счета выше
100 000 фотонов в секунду. Таким образом, регистрация методом счета фо-
тонов неудобна, когда уровни сигналов высоки. Для того чтобы остаться в
линейном диапазоне, необходимо регулировать ширину щелей или интенсив-
ности флуоресценции (используя нейтральные фильтры). Кроме того, отно-
шение сигнал/ шум становится неудовлетворительным при скоростях счета
ниже 10000 фотонов в секунду. Такая ограниченная область интенсивностей
является помехой для регистрации методом счета фотонов в случае ста-
ционарных измерений флуоресценции.

В аналоговом режиме отдельные импульсы усредняются. Поскольку ток
от каждого импульса вносит вклад в средний анодный ток, одновременный
приход импульсов не создает затруднений. При аналоговом детектировании
коэффициент усиления системы детектирования можно регулировать изме-
нением либо коэффициента усилителя, либо напряжения на фотоумножителе.
Благодаря этому можно регистрировать сигналы в широком диапазоне
уровней, не беспокоясь о нелинейности. Кроме того, точность отдельных из-
мерений оказывается выше, чем в методе счета фотонов, в основном из-за
более высоких полных уровней сигналов. Заметим, что для высокоточных
аналоговых измерений требуются стабильные усилители и высоковольтные
блоки питания, однако это в настоящее время не является серьезным огра-
ничением. Для измерений методом счета фотонов такие условия не требуются.

признаки повреждений фотоумножителей. С фотоумножителями надо
обращаться очень осторожно. На их внешних поверхностях не должно быть
пыли и отпечатков пальцев; эти поверхности нельзя трогать голыми рука-
ми. Фотокатод чувствителен к свету, поэтому все манипуляции с ним луч-
4-413
ше проводить в полутьме» Следует знать обычные признаки повреждений
ФЭУ. Первый признак - появление импульсов тока, когда приложенное на-
пряжение велико. При более низких напряжениях он проявляется как неста-
бильность сигнала. Например, за период 2 - 20 с коэффициент усиления
может измениться на 20% или даже в несколько раз. Причиной этого час-
то, по не всегда, является проникновение газа внутрь трубки ФЭУ. Трубку
нельзя ремонтировать и необходимо заменить. В некоторых случаях эта
трубка может удовлетворительно работать при меньших напряжениях.

Второй признак - большой темновой ток. Он проявляется как избыточ-
ный уровень сигнала, когда никакого света на ФЭУ не попадает. Высокие
темновые токи обычно появляются, когда трубка долго подвергается дей-
ствию света. Наибольшая опасность возникает, если в это время к фотоум-
ножителю приложено напряжение. В этом случае также не существует дру-
гого средства, кроме замены ФЭУ или работы при более низких напряжениях.

Уровни сигналов могут быть нестабильными не только из-за порчи
фотоумножителя. Если наблюдается нестабильность сигнала, надо опреде-
лить, не проникает ли в прибор свет и правильно ли функционируют высоко-
вольтный источник питания и усилитель. Кроме того, необходимо должным
образом проверить, почистить и уплотнить штырьки и гнезда ФЭУ, посколь-
ку окисление металла может приводить к ухудшению электрического кон-
такта. Далее, нарушить работу прибора может фотообесцвечивание образца.
Например, интенсивность флуоресценции может уменьшаться со временем
из-за обесцвечивания, а затем вновь повышаться благодаря конвекционным
потокам, приводящим к замене обесцвеченной части образца новой порцией.

2.7.	Исправленные спектры флуоресценции

Многочисленные исследования были направлены на разработку методов
получения спектров возбуждения и испускания, скорректированных на эффек-
ты, зависящие от длины волны. Вообще ни один из этих методов не является
полностью удовлетворительным, особенно если исправленные спектры необ-
ходимо иметь регулярно*. Прежде чем исправлять спектры, исследователь
должен проанализировать, необходима ли такая корректировка. Часто быва-
ет нужно лишь сравнить спектры испускания с другими спектрами, получен-
ными на том же приборе, что можно сделать без исправления спектров. Да-
лее, на многих типовых спектрофлуориметрах, собранных из однотипных де-
талей, получаются сходные результаты, и эти данные часто можно сравни-
вать со спектрами, приведенными в литературе. Конечно, спектральное рас-
пределение и положение максимумов испускания будут слегка различаться,
однако зачастую совсем не нужно, чтобы спектры, полученные' в различ-

* Многие проблемы, рассматриваемые автором, значительно упрощаются вве-
дением автоматизированных узлов. Современные приборы оборудованы встроенны-
ми микропроцессорами, и компьютерами. — Прим. рвд.
ных лабораториях, строго совпадали друг с другом. Исправленные спектры
важны для расчетов квантовых выходов и интегралов перекрывания (гл. 10),
поэтому здесь будут кратко описаны методы, которые нам кажутся наибо-
лее полезными.

2.7.1.	Исправленные спектры возбуждения

Спектр возбуждения искажается прежде всего потому, что интенсив-
ность возбуждающего света зависит от длины волны. Эту интенсивность
можно превратить в сигнал, пропорциональный числу падающих фотонов,
используя счетчик квантов. Удобным счетчиком квантов служит раствор
родамина С в этиленгликоле (3 г/л) [ 1], который поглощает практически
весь падающий свет в области 220 - 600 нм. В указанной области кванто-
вый выход и максимум испускания 630 нм) в основном не зависят от
длины волны возбуждения, поэтому получается сигнал с постоянной длиной
волны, причем интенсивность сигнала пропорциональна потоку фотонов воз-
буждающего света. Поскольку спектр испускания родамина С не зависит
от длины волны возбуждения, счетчик квантов позволяет избежать помех,
вызванных зависимостью чувствительности стандартного фотоэлемента
от длины волны. Счетчики квантов можно изготовить, используя умеренно
концентрированные растворы хининсульфата или флуоресцеина. Хининсуль-
фат (4 г/л в 1 н. H2SO4) применяют при длинах волн возбуждения 220 -
340 им; флуоресцеин (2 г/ л в 0,1 н. NaOH) пригоден для работы в этой же об-
ласти, но иногда (менее надежно) в области 340 - 360 нм [ 1).

Для получения исправленных спектров возбуждения счетчик квантов
помещают в канал сравнения спектрофлуориметра (см. рис. 2.1). Однако
из-за высокой оптической плотности эталона держатель модифицируют та-
ким образом, чтобы можно было наблюдать испускание с той же поверхнос-
ти счетчика квантов, на которую падает свет. Между счетчиком квантов и
ФЭУ помещают фильтр, задерживающий рассеянный свет, но пропускающий
излучение флуоресценции. Устанавливают счетчик квантов и получают ис-
правленный спектр возбуждения, сканируя излучение, выходящее из монохро-
матора возбуждения и измеряя отношение интенсивностей флуоресценции
образца и счетчика квантов. Зависимость сигнала, выходящего из монохро-
матора испускания и регистрируемого фотоэлементом, от длины волны в дан-
ном случае неважна, поскольку длина волны испускания не меняется в про-
цессе сканирования по длинам волн возбуждения. Такой точный способ был исполь-
зован для записи исправленного спектра возбуждения флуоресцеина (см.
рис. 2.4). При получении исправленных спектров возбуждения необходимо
проверить, действительно ли система регистрации и электроника могут
обеспечивать запись истинного отношения в широкой области интенсивнос-
тей сигналов.
2.7.2.	'Исправленные спектры испускания

Для расчета исправленного спектра испускания необходимо знать, как
зависит эффективность системы регистрации от длины волны. Непосредст-
венное измерение поправочных коэффициентов для каждого данного спект-
рофлуориметра - процедура достаточно сложная и требующая больших за-
трат времени. Даже после тщательных исправлений точность результатов составляет
± 10% . По этой причине обычно приводят наблюдаемые рабочие спектры. В случае
необходимости можно применить один простой и надежный метод получения необхо-
димых поправочных коэффициентов путем сравнения спектра испускания стандарт-
ного вещества с исправленным спектром того же вещества. Такие спектры
опубликованы для наиболее распространенных флуорофоров, таких, как
хининсульфат, р-нафтол, 3-аминофталимид, л-нитродиметиланилин и 4-ди-
метиламино-4 '-нитростильбен [2-5]. Длины волн испускания этих соедине-
ний перекрывают диапазон 300 - 800 нм, а данные представлены в виде
таблиц или графиков. Для получения поправочных коэффициентов записыва-
ют спектр испускания эталона и сравнивают его со стандартным спектром.
С помощью такого простого метода сравнения можно избежать трудностей,
свойственных другим, более точным методам, описанным ниже, р-Нафтол,
вероятно, не следует использовать в качестве стандарта, поскольку при
описанных выше условиях наблюдается флуоресценция как самого нафтола,
так и его ионной формы. Двойная флуоресценция — это результат реакции в
возбужденном состоянии, степень которой трудно контролировать.

коррекция с использованием стандартной лампы. Поправочные
коэффициенты можно также найти, определив зависимость сигнала от ка-
либрованного источника света от длины волны. Распределение интенсив-
ности света от вольфрамовой ленточной лампы по длинам волн можно аппрок-
симировать черным телом эквивалентной температуры. Стандартные лампы
известной цветовой температуры поставляются Национальным бюро стандар-
тов и другими организациями. В основном используют приводимые в паспор-
те данные о спектральном выходе излучения лампы [ ЦА)], поскольку урав-
нение черного тела не строго выполняется для вольфрамовой лампы. Систе-
ма регистрации в этом случае градуируется следующим образом:

1.	Используя систему регистрации спектрофлуориметра, измеряют за-
висимость интенсивности стандартной лампы от длины волны 1 (А).

2.	Чувствительность системы регистрации S (А) рассчитывают по урав-
нению

S(A)=Z(A)/L(A)	(2.2)

3.	После этого получают исправленные спектры делением измеренных
спектров на эти поправочные коэффициенты,

Важно помнить, что при работе со стандартной лампой необходим пос-
тоянный точный контроль цветовой температуры. Кроме того, спектральный
выход лампы может меняться со временем и в процессе ее использования.
ИСПРАВЛЕНИЕ СПЕКТРОВ ИСПУСКАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СЧЕТЧИКА
КВАНТОВ И РАССЕИВАТЕЛЯ,, Можно также определить спектральный выход
ксеноновой лампы и после этого использовать такую лампу в качестве
градуированного источника света [ 1]. Помещая счетчик квантов в кюветное
отделение, можно найти относительный выход фотонов L(A). После того, как
такое распределение интенсивностей получено, направляют излучение ксе-
ноновой лампы па детектор, применяя при этом рассеивающий экран из ок-
сида магния. Считается, что MgO рассеивает все длины волн с одинаковой
эффективностью. Поправочные коэффициенты в этом случае находят сле-
дующим образом:

1.	Сканируют длину волны возбуждения, поместив счетчик квантов в кю-
ветное определение. Полученный сигнал дает спектральный выход лампы
ЦА).

2.	Рассеиватель помещают в кюветное отделение и сканируют излуче-
ние монохроматоров возбуждения и испускания синхронно. Эта процедура
дает произведение Д(А)5 (А), где 5 (А) - чувствительность регистрирующей
системы.

3.	Деление S(A)L(A) на Д(А) дает поправочные коэффициенты 5(A).

Наиболее сложным аспектом этого способа является изготовление под-
ходящего рассеивателя. MgO должен быть свежеприготовленным и не содер-
жать примесей. Хотя процедура и кажется простой, трудно получить падеж-
ные поправочные коэффициенты. Более того, даже сравнение результатов,
полученных в разных лабораториях, существенно не улучшает положения вви-
ду индивидуальной природы поправочных коэффициентов в каждом случае.
Поэтому предпочтительнее использовать стандартные спектры.

переход от длин волн к волновым числам. Иногда желательно пред-
ставлять спектры в шкале волновых чисел (v), а по в шкале длин волн (А).
Длины волн легко перевести в волновые числа, просто взяв обратные вели-
чины» Однако, когда данные получены с постоянным разрешением в длинах
волн, что обычно бывает в случае использования решеточных монохромато-
ров, интервал волновых чисел непостоянен. Например, рассмотрим постоян-
ный интервал ДА = Аа — Аг, где Aj и А3 - длины волн по обе стороны мак-
симума испускания (рис. 2.12). При 300 нм интервал (ДА) в 2 нм эквивален-
тен 222 см”1. При ООО нм тот же интервал эквивалентен разрешению Дч

55 см”1. Следовательно, при увеличении длины волны интервал в обрат-
ных сантиметрах уменьшается пропорционально квадрату длины волны. Та-
ким образом, если спектры получены в обычной форме, т. е. в интервале
длин волн, при переходе к шкале волновых чисел надо каждое значение ин-
тенсивности умножить на А2:

/(v)« A2Z(A)	(2.3)

Переход от длин воли к волновым числам показан на рис. 2.12. Умножение
па А2 приводит к избирательному увеличению интенсивности в длинноволио-
АХ

Л2'

Волновое число, см-1



вой части спектра испускания и к сдвигу видимого максимума испускания.
Необходимо отметить, что даже после того, как коррекция произведена, раз-
решение спектра все еще меняется с изменением волнового числа.

2.8.	Влияние условий освещения образца

Наблюдаемая интенсивность флуоресценции и спектральное распределе-
ние могут зависеть от оптической плотности образца и от того, как осве-
щается образец. Наиболее удобно при измерениях флуоресценции наблюдение
под прямым углом к середине центрально освещенной кюветы (рис. 2.13, а).
Другие варианты геометрического расположения включают фронтальное ос-
вещение и нецентральное освещение. Нецентральное освещение уменьшает
длину пути, чего также можно достичь, используя кюветы длиной менее 1 см.
Эти способы обычно используют для уменьшения эффектов внутреннего
фильтра (см. ниже), обусловленных большими оптическими плотностями или
мутностью образца.

Фронтальное освещение часто осуществляют, используя либо треуголь-
ные, либо квадратные кюветы, ориентированные под углом 45° по отноше-
нию к падающему свету (рис. 2.13, t - е). По нашему мнению, такое расположение
неприемлемо, так как большое количество света отражается при этом прямо
в монохроматор испускания, увеличивая вероятность того, что побочный
свет будет мешать измерениям. Когда необходимо фронтальное освещение,
мы предпочитаем ориентировать освещаемую поверхность под углом около
РИС. 2.13. Различные способы ос-
вещения образца для наблюдения флуо-
ресценции.

30° к падающему свету* Такой способ имеет два преимущества. Во-первых,
меньше отраженного света попадает в монохроматор испускания. Во-вторых,
падающий свет распределяется по большой площади поверхности, поэтому
точное расположение кюветы внутри держателя не играет существенной ро-
ли. Одним из неудобств такой ориентации является уменьшение чувствитель-
ности измерений из-за того, что большая часть падающего света отражает-
ся от поверхности кюветы.

Необходимо учитывать, что интенсивность флуоресценции пропорциональ-
на концентрации лишь в ограниченном диапазоне оптических плотностей.
Рассмотрим кювету 1x1 см, которую освещают по центру, а наблюдение
ведут под прямым углом (рис. 2.13, б). Предположим далее, что оптическая
плотность при длине волны возбуждения равна 0,1. Из определения оптичес-
кой плотности (1g,/0// и D) следует, что интенсивность света в центре кю-
веты (/) равна 0,88 /0, где - интенсивность света, падающего на кювету*
Поскольку наблюдаемая интенсивность флуоресценции пропорциональна ин-
тенсивности падающего света, кажущийся выход будет примерно на 10%
меньше, чем наблюдаемый для бесконечно разбавленного раствора. Этот
эффект называется эффектом внутреннего фильтра. Такие эффекты могут
уменьшить либо интенсивность возбуждения в точке наблюдения, либо
наблюдаемую флуоресценцию из-за того, что часть ее поглощается. Относи-
тельный вклад каждого из процессов зависит от оптических плотностей об-
разца на длинах волн возбуждения и испускания.

Для иллюстрации влияния оптической плотности на интенсивность флуо-
ресценции на рис. 2.14 представлены данные для хипинсульфата. Измеряе-
мая интенсивность пропорциональна оптической плотности только до значе-
ния D = 0,05. Линейную область этой зависимости для интенсивностей флуо-
ресценции можно расширить, используя нецентральное облучение, которое
уменьшает эффективный путь света. Поправки на величину эффекта внутрен-
него фильтра можно внести следующим образом. Предположим, что образец
имеет значительную оптическую плотность как при длине волны возбужде-
ния, так и при длине волны испускания Рвоз$ и Оисп соответственно). Зна-
РИС. 2.14. Влияние оптической плотности на интенсивность флуоресценции хи-
нинсульфата.

1 - измеренные интенсивности; 2 — исправленные интенсивности, вычисленные
по уравнению (2,4) с 1>исп ~ О.Эти данные получены для кюветы 1 х 1 см2 при цент-
оальном освещении.

чения оптических плотностей ослабляют интенсивности возбуждения и ис-
пускания на Ю"^^036 и 10“^^сп соответственно. Исправленная интенсив-
ность флуоресценции в этом случае приблизительно равна

Г	р 1ftfDB036 +/)ИСП>/2	/9.4)

'испр га'набл "'

Исправленные интенсивности для хипинсульфата показаны на рис. 2,14, из
которого видно, что рассчитанные значения ложатся на прямую, являющую-
ся продолжением начального линейного участка экспериментально наблюда-
емой кривой. Для нахождения точных поправок желательно иметь градуиро-
вочные кривые, которые строят, используя стандарты в условиях, близ-
ких к условиям текущих экспериментов.

Интересно отметить, что при фронтальном освещении интенсивность
при больших оптических плотностях не зависит от концентрации [6]. При
этих условиях весь падающий свет поглощается вблизи поверхности кюветы.
Фронтальное освещение хорошо также использовать для измерения оптичес-
кой плотности таких образцов, как суспензии макрочастиц [ 7] и гемоглобин
[ 6]. В работе [ 6] указывается, что интенсивность пропорциональна отноше-
нию оптической плотности флуорофора к оптической плотности образца.
РИС. 2.15. Влияние самопоглощения
на спектр испускания' антрацена.

Концентрации в этаноле: 1 - 10’6М;

2 - 10~4 М; 3 - 4 • 10~4 М. Кювета

1 х 1 см2.' Наблюдение велось под прямым
углом.

При использовании фронтального освещения полная оптическая плотность
может быть очень велика (20 или больше), но уровень сигнала остается не-
изменным.

Высокие оптические плотности могут искажать спектры испускания. На-
пример, когда наблюдение ведут под прямым углом, коротковолновые поло-
сы испускания антрацена избирательно уменьшаются (рис. 2.15). Это проис-

РИС. 2.16. Влияние длины волны
возбуждения на самопоглощение флуо-
ресценции для 9,10-дифенипантраценч
при фронтальном освещении излучени-
ем указанных длин волн (по данным
18]).

Длина волны, нм
ходит потому, что испускание коротких длин волн поглощается антраценом.
Уменьшение голубого края спектра испускания наиболее сильно проявляет-
ся для флуорофоров, у которых спектры поглощения и испускания сильно пе-
рекрываются. Флуорофоры с большим стоксовым сдвигом менее чувствитель-
ны к этому явлению.

При фронтальном освещении спектры испускания могут искажаться так-
же и при высоких концентрациях. Например, спектр испускания 9, 10-дифенил-
антрацена зависит от длины волны возбуждения (рис. 2.16). Если возбужде-
ние происходит при 365 нм, коротковолновая часть спектра уменьшается,
чего не наблюдается при длине волны возбуждения 265 нм. Оптическая
плотность меньше при 365 нм, чем при 265 нм. В результате пучок возбужда-
ющего света с длиной волны 365 нм глубже проникает в образец, при этом
вероятность реабсорбции излучения люминесценции возрастает. Не сущест-
вует простых и надежных методов точного определения величин концентра-
ционных эффектов и введения поправок на них. Лучше избегать связанных
с этим проблем, работая с разбавленными растворами.

2.9.	Поглощение света и отклонения от закона Ламберта - Бера

2.9.1.	Поглощение света

Основным аспектом флуоресцентной спектроскопии является измерение
поглощения света. Для получения правильных результатов необходимо учи-
тывать множество факторов, которые могут ввести в заблуждение экспери-
ментатора. В этом разделе выводится закон Ламберта - Бера и указывают-
ся причины, вызывающие отклонения от него.

Рассмотрим тонкий слой раствора толщиной dx, содержащий п моле-
кул/ см3 (рис. 2.17), и предположим, что а (см2) — эффективное сечение пог-
лощения. Число фотонов di, поглощенных в слое dx, пропорционально интен-
сивности падающего света/, а также ст и п, где п - число молекул в I см3:
dl/dx =-/ an.	(2.5)

РИС. 2.17. Схема, иллюстрирую-
щая поглощение света.
После перегруппировки, интегрирования и подстановки граничных условий
/ »lQ при х » 0 получаем

In -А- » a nd,	(2.6)

где d - толщина образца. Это и есть уравнение Ламберта - Бера, обычно ис-
пользуемое в несколько иной форме:

10

ie-p-..i=D	(2.7)

где е - молярный коэффициент поглощения (экстинкции) в М"1 - см-’*;
с - концентрация, моль/л; D - оптическая плотность. Из уравнений (2.6)
и (2.7) находим

ст = 2,303ес/п. .	(2.8)

Поскольку п =» AW103, где W - число Авогадро, имеем

ст « 3,82 • 10-и а.	(2.9)

Интересно подсчитать сечения поглощения для типичных ароматических
соединений. Молярные коэффициенты поглощения антрацена равны 160 000
и 6 300 моль"1 • см"1 для 253 и 375 нм соответственно. Эти значения соот-
ветствуют сечениям поглощения 6,1 и 0,2$ Аа соответственно. Если принять,
что сечение молекул антрацена равно 12 А2, видно, что при 253 нм антрацен
поглощает ~ 50% фотонов, с которыми он сталкивается, а при 375 нм -- 2%
фотонов.

2.9.2.	Отклонения от закона Бера

Согласно закону Вера, оптическая плотность прямо пропорциональна кон-
центрации поглощающих частиц. Отклонения от закона Бора могут быть
связаны как с природой исследуемых веществ, так и с прибором.

рассеяние света. Биологические образцы часто мутны из-за наличия
макромолекул или других больших агрегатов, рассеивающих свет. Оптичес-
кая плотность, вызванная рассеянием, пропорциональна 1/ X4 (рэлеевское
рассеяние), и, таким образом, ее легко можно определить как некое фо-
новое поглощение, быстро увеличивающееся при уменьшении длины волны.

*В системе СИ размерность десятичного молярного коэффициента поглощения
м2 • моль”1, что в 10 раз больше исторически сложившейся и используемой прак-
тически во всех публикуемых работах курьезной размерности дм3  моль"1 • см”1,
содержащей две различные десятичные доли одной и той же единицы длины. - Прим,
ред.
флуоресценция. Если оптическая плотность образца велика, а погло-
щающие частицы флуоресцируют, испускаемое ими излучение может попасть
в детектор, что вызовет отклонения от закона Бера;график будет отклонять-
ся в сторону оси концентраций. Но поскольку побочная флуоресценция на-
правлена во вое стороны, тогда как падающий свет сосредоточен вдоль оси,
ее влияние можно уменьшить, располагая детектор на определенном рас-
стоянии от образца.

АССОЦИАЦИЯ. Если растворимость поглощающих частиц невелика, они
могут ассоциировать в растворах при высоких концентрациях. Спектры пог-
лощения ассоциатов и мономеров могут различаться. Например, раствор
распространенного красителя бромфенолового голубого при концентрациях
порядка 10 мг/мл имеет красный цвет, а при меньших концентрациях - го-
лубой. В зависимости от длины волны, выбранной для наблюдения, отклоне-
ния от закона Бера могут быть либо положительными, либо отрицательными.

Описанные выше факторы обусловлены собственными свойствами об-
разца. Несовершенства аппаратуры могут также привести к нелинейной за-
висимости оптической плотности от концентрации. Это в особенности спра-
ведливо при больших оптических плотностях. Например, рассмотрим раствор
индола с D = 5 при длине волны 280 нм. Для того чтобы измерить такую оп-
тическую плотность, спектрофотометр должен очень точно регистрировать
интенсивности /0 и I. Последняя в 10“s раз меньше, чем интенсивность па-
дающего света /0 . Обычно интенсивность побочного света, пропущенного
монохроматором, на тех длинах волн, где вещество не поглощает, больше,
чем 1. Следовательно, невозможно надежно измерять большие оптические
плотности, если не приняты все предосторожности, чтобы свести к миниму-
му побочный свет.
ГЛАВАЗ.

Измерение времен~затухания флуоресценции

Время затухания флуоресценции вещества обычно представляет собой
средний промежуток времени, в течение которого молекула остается в воз-
бужденном состоянии, прежде чем вернуться в основное состояние. Во флуо-
ресцентной спектроскопии очень часто приходится измерять времена жизни,
поскольку из таких данных можно найти частоту столкновений с молекулами
тушителей (гл. 9), скорость переноса энергии и скорости реакций в возбуж-
денных состояниях (гл. 10 и 12). Кроме того, знание времен жизни необхо-
димо при расчете времен вращательной корреляции из анизотропии флуорес-
ценции (гл.5 и 6). Точное знание закона затухания флуоресценции мо-
жет дать детальную информацию о взаимодействии флуорофора с его
окружением. Например, многоэкспоненциальный закон затухания мо-
жет быть результатом того, что молекулы флуорофора находятся в несколь-
ких различных окружениях, лйбо явиться результатом процессов, проте-
кающих в возбужденных состояниях. Измерение времен затухания флуорес-
ценции достаточно сложно, так как эти величины обычно составляют ~ 10 нс,
поэтому требуется использование сверхбыстрых электронных устройств и
детекторов. Однако иэ-за важности этих данных много усилий было затра-
чено на разработку надежных способов измерения времен затухания флуо-
ресценции. В этой главе будут детально рассмотрены теория и практичес-
кие аспекты измерений времен жизни.

Существуют два широко используемых метода измерений времен за-
тухания флуоресценции: импульсный и фазово-модуляционный (или гармо-
нический). В импульсном методе образец освещают короткими импульсами
света и измеряют зависимость интенсивности флуоресценции от времени.
В гармоническом методе образец возбуждают синусоидально модулирован-
ным светом. Фазовый сдвиг и степень демодуляции испускания по отноше-
нию к падающему свету используют для расчета времени затухания. Каж-
дый из методов имеет свои преимущества и недостатки, которые будут об-
суждены в данной главе.

3.1.	Импульсные измерения времени затухания

Рассмотрим возбуждение флуорофора бесконечно коротким импульсом
света, приводящее к первоначальной заселенности возбужденного состояния
флуорофоров (Wo). Скорость гибели первоначально возбужденных молекул
равна

dW(t) .

тг— .-(r+4w)

(3.1)

где N(i) - число возбужденных молекул спустя время t после возбуждения;
у - скорость испускания; k - константа скорости безызлучательной гибели.
Подставляя начальное условие W(f) = % при t = 0 и интегрируя уравнение
(3.1), получаем

N(t) = %е~1/т	(3.2)

где т = (у + /Д"1 - время жизни возбужденного состояния. Следовательно,
интенсивность флуоресценции F(t), которая пропорциональна заселенности
возбужденного состояния (F(t) = yW)b затухает экспоненциально (рис. 3.1, а).
Время затухания флуоресценции обычно Приравнивают к времени, необходи-
мому для уменьшения интенсивности в е раз по отношению к первоначальной
величине, и оно равно (у + А)”1. Иначе говоря, время жизни можно опреде-
лить из наклона зависимости IgF(f) от t (рис. 3.1, б)«

Время жизни можно также рассматривать как средний промежуток вре-
мени, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии.
Такая средняя величина определяется выражением

< t>=

(3.3)

Для большого числа молекул флуорофора и малого временного интервала
эта сумма становится следующей:

/ tN(t)dt he-^^dt

w	ОО

f N(t)dt	fe-^dt

°	n

РИС. 3.1. Графическое изображение зависимостей в импульсных методах из-
мерения времен жизни.
Видно, что знаменатель равен т. Интегрируя числитель по частям, находим,
что он равен т2. Следовательно, для экспоненциальной гибели среднее время,
в течение которого флуорофор находится в возбужденном состоянии, равно
его времени жизни:

I

< t > = т	(3.5)

Важно отметить, что уравнение (3.5) несправедливо для более сложных за-
конов затухания, в частности для много- или неэкспоненциального распада.
Среднее время жизни всегда можно рассчитать на основе наблюдаемого
закона затухания, используя уравнение (3.4). Однако среднее время жизни
может быть сложной функцией параметров, описывающих действительный
закон затухания [ уравнение (3.53)]. Поэтому средние времена жизни необ-
ходимо интерпретировать осторожно [ (см. также разд. 6*1 и уравнения (6.6)
и (6.7)].

3.2.	Фазовые и модуляционные измерения времен
затухания флуоресценции

Вторым методом, с помощью которого обычно измеряют времена
затухания, является фазово-модуляционный метод. Образец возбуждают
светом, интенсивность которого модулирована по синусоидальному закону
(рис. 3.2). Испускание - это вынужденный отклик на возбуждение, и поэто-
му испускание модулировано с той же круговой частотой (со= 2 т х частота
в герцах). Из-за конечной величины времени жизни возбужденного состояния
модулированное испускание отстает по фазе на угол ф относительно воз-
буждения. Далее, испускание менее модулировано (демодулировано) по срав-
нению с возбуждением, т. е. относительная амплитуда переменной части испус-
кания (Р/Д) меньше для испускания, чем для возбуждения (6/а). Как фазо-
вый угол (<р), так и коэффициент демодуляции (m« Ba/Ь А) измеряют и
используют для расчета модуляционного (т m) и фазового (т*5) времени:

tg9=WT^; «• w-1tg9	(3.6)

m«[l + й?(т"г)2]-^; т"г-со~1[(1/т2) - 1]*	(3.7)

Зависимость интенсивности от времени для этих измерений показана на
рис. 3.2, а . Предполагается, что частота модуляции равна 30 МГц, а время
модуляции - 9 нс. Используя уравнения (3.6) и (3.7), легко можно вычислить,
что фазовый угол равен 59,5°, а коэффициент демодуляции составляет 0,5.
(Напомним, что со« 2тг • 30 МГц.)

Принципы фазово-модуляционных измерений иллюстрируются графиками
б и в на рис. 3.2. Здесь представлена зависимость m и ф от времени затуха-
ния флуоресценции при  частотах модуляции 10 и 30 МГц. Ясно видно, что
г, нс

Г, НС

РИС. 3.2. Графическое представление зависимостей в фазовых и модуляцион-
ных методах измерения времен жизни.

фазовый угол увеличивается, а коэффициент демодуляции уменьшается при
увеличении времени жизни. Для получения измеримых значений <р и т надо
использовать частоту модуляции, сравнимую со скоростью гибели. Для поо
тоянного времени жизни увеличение частоты модуляции приводит к большим
фазовым сдвигам и к большим значениям степени демодуляции (рис. 3.2).

Некоторые особенности фазово-модуляционных измерений часто служат
источниками ошибок, и их следует особо упомянуть. Так, если фазовый угол
больше - 70° (либо из-за большого времени жизни, либо из-за высокой час-
тоты модуляции), на расчетное значение фазового времени затухания влияют
даже небольшие ошибки в измерениях фазового угла. Это показано на
рис. 3.2, а и в, горизонтальными и вертикальными штриховыми линиями.
Для частоты модуляции 30 МГц и времени затухания ~ 5 нс неточность в из-
мерении фазового угла в 2° соответствует ошибке примерно 0,35 нс в
рассчитанном значении времени затухания. Если времена затухания ~20 нс,
неточность составит 2,8 нс. Небольшие систематические погрешности в из-
мерениях фазового угла легко могут сделать неверными измерения таких
больших времен затухания. Наоборот, измерение коротких времен методом
демодуляции часто затруднено. Степень демодуляции мала, если время
жизни короткое, и даже небольшие ошибки в коэффициенте демодуляции
могут привести к тому, что величины тт будут лишены всякого смысла.
Например, рассмотрим попытку измерить время затухания 3 нс, используя
частоту модуляции 10 МГц. Такое время сравнимо с величинами, найден-
ными для флуоресценции триптофана и белков. Используя уравнение (3.7),
легко можно рассчитать коэффициент демодуляции, который будет равен
0,983. Рассмотрим теперь небольшую ошибку в 1 % для этой измеренной
величины, т.е. значения либо 0,993, либо 0,973. Такие значения соответ-
ствуют временам затухания 1,9 и 3,8 нс соответственно* Следовательно,
погрешности в 1 % при измерении величины m может привести к 50 %-ной
ошибке в рассчитанных временах затухания. Практические ошибки в
измеренных значениях т, вероятно, превышают 1 %, и, следовательно,
когда времена жизни короткие, необходима крайняя аккуратность при
измерениях величин тт.

/(ругая важная особенность фазовых и модуляционных измерений сос-
тоит в том, что наблюдаемыми величинами являются фазовый угол и сте-
пень демодуляции. Времена затухания не измеряют - их рассчитывают из
измеренных значений <р и т. Для одпоэкспопепциалыюго затухания имеем

т Р тт = т	(3.8)

где т - действительное значение времени затухания флуоресценции. Одна-
ко если закон затухания более; сложный, рассчитанные времена затухания-
это только кажущиеся величины. Если такое затухание обусловлено смесью
флуорофоров (многоэкспоненциальное затухание с положительными пред-
экспонентами), то < тт. Эти результаты будут описаны в рцзд, 3.7.4.
Реакции в возбужденных состояниях могут привести к еще более сложным
зависимостям.

Уравнения (3.6) и (3.7) можно вывести несколькими способами. Мы
приводим прямой, но алгебраически сложный вывод этих уравнений. Рас-
смотрим возбуждение образца синусоидальпо-моду лированным светом, за-
висимость интенсивности которого от времени выражается уравнением

/ (t) - a + b sin co t	(3.9)

Степень модуляции света определяется отношением b/а = mL (рис. 3.2, а).
Для полностью модулированного света Ь = а. Испускание флуоресцен-
ции вынуждено происходить с той жо частотой, но сдвиг по фазе и степень
модуляции могут быть иными. Предположим, что

N(t) А + В sin (w t -ф)	(3.10)

b-4I3
и определим связь между временем затухания флуоресценции и величина-
ми фазового сдвига (ф) и степени демодуляции (го).

При условии синусоидального возбуждения уравнение (3.1) преобразу-
ется в

1_N(O +f(t)	(3-11)

CLI	т*

Подставив уравнение (ЗЛО) в (3.11), получим

= —— [Л + В sin (coi - ф)] + a + b sin oof = co fl cos (oof - ф) (3.12)

dt т

После математических преобразований получаем

a — (1/ т)Л = О	(3.13)

СО COS ф — (1/ т)з1Пф = 0	(3.14)

СО ЯЙ1ф +(1/t)cos ф = Ь/В	(3.15)

Из уравнения (3.14) легко вывести обычное соотношение

= tg» =	(3.16)

СОвф

Возводя уравнения (3.14) и (3.15) в квадрат и складывая, находим

[ со2 + (1/т)2] = (6/В)2	(3.17)

С учетом Л = ат [ уравнение (3.13)] имеем

т=^Л£ = [1 + „2(тт)2]-И	(3.18)

b/a

Это и есть обычная зависимость между временем затухания и коэффициен-
том демодуляции.

3.3.	Импульсные измерения времени затухания и .
используемая аппаратура

При измерении времен затухания флуоресценции импульсным методом
необходимо количественно измерять затухания интенсивности флуоресцен-
ции с временным разрешением. Такие измерения трудны по нескольким
причинам. Во-первых, доступные источники света дают импульсы длитель-
ностью в несколько наносекунд*, поэтому простую теорию, описываемую

•Временное разрешение импульсного флуориметра обусловлено отнюдь не толь-
ко конечной длительностью вспышки лампы, но и временным разрешением ФЭУ, ко-
торые сравнимы между собой. Поэтому одного лишь сокращения длительности воз-
буждающего импульса, возможного при использовании, например, лазеров, совер-
шенно не достаточно для повышения временного разрешения этого метода. Необ-
уравнениями (3.1) и (3.2), применять нельзя. Вместо этого наблюдаемое
затухание флуоресценции необходимо исправлять на длительность импуль-
са лампы. Такую же процедуру обычно называют обратной сверткой, но
реально используют метод итерационной свертки. Трудности, вызванные
конечной длительностью импульса, могут быть сведены к минимуму при ис-
пользовании пикосекундных импульсных лазеров. Однако такое оборудова-
ние технически сложно и дорогостояще и поэтому не столь широко доступ-
но. К счастью, благодаря использованию операций обратной свертки мож-
но измерять времена жизни в 1 нс при длительности вспышки лампы 2 нс
при условии постоянства формы вспышки для большого числа импульсов.

Вторая трудность при измерении времен затухания импульсным мето-
дом вызвана сложностью измерения полной кинетики затухания при исполь-
зовании только одного возбуждающего импульса. Такие измерения потре-
бовали бы системы регистрации с большим коэффициентом усиления и с
субнаносекупдным временным разрешением,. Чтобы обойти эту трудность,
образец обычно возбуждают повторяющимися импульсами. Естественно,
что при этом время между импульсами должно быть примерно в пять раз
больше времени затухания для того, чтобы сигналы флуоресценции от двух
последовательных импульсов не накладывались. При периодически повторя-
ющихся импульсах затухание флуоресценции регистрируют либо стробоско-
пическим методом, либо методом счета фотонов. Эти методы, которые мы
обсудим ниже, ранее были детально описаны в литературе [ 1, 2]. При-
менение таких методов позволяет обойтись без системы, необходимой для
измерения полной кривой затухания при возбуждении единственным импуль-
сом.

В стробоскопическом методе фотоумножитель периодически включает-
ся на короткое время в течение затухания флуоресценции (разд. 3.3.2). Ис-
пользование пульсирующего напряжения увеличивает коэффициент усиления
ФЭУ на короткий период времени, когда происходит затухание флуоресцен-
ции (обычно 0,2 - 1 нс). Время подачи этого анализирующего импульса пос-
тепенно смещается таким образом, что после каждого последовательного
импульса регистрируются различные участки кривой затухания. Если интен-
сивность и форма возбуждающего импульса постоянны, при большом числе
стробирующих импульсов, каждый из которых регистрируют через разные
промежутки времени после возбуждения, можно получить полную кривую за-
тухания флуоресценции во времени.

ходимо использовать и фотодетекторы с лучшим временным разрешением, которые
разработаны в последние годы. Для этой цели успешно применяют электронно-оп-
тические преобразователи с временной разверткой, так называемые оптические
многоканальные анализаторы, которые обеспечивают разрешение в пикосекундной
области. - Прим. ред.
Метод счета фотонов используют более широко, чем описанный выше
метод стробирования. Образец также возбуждают световым импульсом„ но
регистрирующая система измеряет время между этим импульсом и прихо-
дом первого фотона. Интенсивность света можно подобрать таким образом,
чтобы на каждые 20 импульсов наблюдался лишь один фотон. Такая низкая
скорость счета нужна для того, чтобы быть уверенным , что на каждый
импульс, для которого фотон подсчитывают, приходится только один фотон.
Если число фотонов па импульс больше, закон затухания искусственно
сдвигается в сторону более коротких времен. Это происходит потому, что
подсчитывается лишь первый из пришедших фотонов. Когда приходит толь-
ко один фотон, время его прихода отражает действительный закон затуха-
ния. Если же приходит много фотонов, в целом закон затухания сохраняет-
ся, но кривая затухания представляет собой распределение времен прихо-
да, так как первый фотон приходит раньше, чем средний. Время между воз-
буждающим импульсом и приходом первого фотона измеряют для большого
числа фотонов, обычно около 10е.

Целью описанных выше измерений является выявление изменения ин-
тенсивности флуоресценции во времени [ F(t)]. Для единственного флуоро-
фора, затухание которого происходит по экспоненциальному закону, нахо-
дят, что

F(i) = yNoe-t/-r=:Foe-t/T	(3.19)

где Ео - интенсивность флуоресценции в момент времени t = 0. Часто кри-
вые затухания нельзя описать единственной экспонентой. В этих случаях
наблюдаемую кинетику обычно можно представить в виде суммы экспо-
нент:

(3.20)
где а(. _ предэкспоненциальпый коэффициент, определяющий относительный
вклад в кривую затухания компоненты с временем затухания т. . Необхо-
димо понимать, что в зависимости от природы исследуемого образца ве-
личины af и т,' могут иметь физический смысл, а могут и не иметь его*
Например, затухание флуоресценции может быть неэкспоненциальным, т.е.
его нельзя правильно описать суммой экспонент. Неэкспоненциальные за-
коны затухания ожидают и часто наблюдают для флуорофоров, когда
происходит либо тушение по механизму переноса энергии, либо процесс
релаксации растворителя (гл. 10 и 8). Всегда можно подобрать для изме-
ренного затухания уравнение, аналогичное (3.20), и при этом для описания
экспериментально наблюдаемой кривой обычно достаточно двух или трех
компонент. В этих случаях подобранные параметры (а; и т(.) не обязатель-
но соответствуют какому-либо из спектральных свойств исследуемой мо-
лекулы или образца. Не следует предполагать, что величины ai и тг пред-
ставляют собой единственные компоненты для образца, если нет других
факторов, подтверждающих такую интерпретацию.

Известен один важный случай, когда величины а • и т,- имеют физи-
ческий смысл, - ото случай смеси ие взаимодействующих между собой флуо-
рофоров. В смеси может быть несколько различных флуорофоров либо один
и тот же флуорофор, по в различных окружениях. Такие образцы мы будем
рассматривать как неоднородные или обнаруживающие свойство гетеро-
генности в основном состоянии. Д ля гетерогенных образцов, в которых
затухание каждой частицы подчиняется экспоненциальному закону, общий
закон затухания можно описать уравнением (3.20). Времена т. представ-
ляют собой времена затухания каждой из индивидуальных частиц. Относи-
тельная интенсивность fi для каждого вида частиц определяется выраже-
нием

Таким образом, кинетику затухания флуоресценции можно использовать
для того, чтобы обнаружить и исследовать гетерогенное испускание. Од-
нако отмстим еще раз, что совпадение наблюдаемого закона затухания с
уравнением (3.20) ие доказывает того, что действительно существуют от-
дельные частицы, описываемые подобранными параметрами.

Важным аспектом измерений времени жизни является эффект враща-
тельной диффузии. Использование монохроматоров возбуждения и/или ис-
пускания обычно приводит либо к частичной поляризации возбуждающего
света, либо к повышению вероятности наблюдения одной из поляризован-
ных компонент испускания. Если скорость затухания сравнима со скорос-
тью вращательной диффузии, что очень часто бывает для флуорофоров,
связанных с биологическими макромолекулами или растворенных в вяз-
ких растворителях, тогда затухание индивидуальных поляризованных ком-
понент испускания является многоэкспопепциальным (гл. 6). Этот эффект
не играет роли, если скорость вращательной диффузии либо много меньше,
либо много больше скорости затухания, т.о. для стеклообразных или жид-
ких растворов. Один из способов устранения этих эффектов - использо-
вание поляризатора для возбуждающего света, ориентированного вертикаль-
но, и поляризатора для испускаемого света, ориентированного под углом
54,7° к вертикали. Важно, что многоэкспопенциалыюе затухание флуорес-
ценции известно даже для случая единственного флуорофора, затухание
которого экспоненциально, если селективно наблюдать индивидуальную по-
ляризованную компоненту. Вращательная диффузия флуорофоров может
влиять также на измерения фазово-модуляционным методом.
3.3.1.	Импульсные лампы

Импульсные лампы короткой длительности необходимы как в методе
счета фотонов, так и в стробоскопическом методе. Эти лампы различают-
ся газом-наполнителем и бывают "самопроизвольно включающимися" или
"запускаемыми". Тип газа определяет спектральное распределение вы код-
ной мощности лампы. Азот дает множество высокоинтенсивных линий
(рис. 3.3). Непрерывный набор линий в ультрафиолетовой области получают,
используя водород или дейтерий, но интенсивность таких ламп почти в 10 раз
меньше.

В САМОПРОИЗВОЛЬНО ВКЛЮЧАЮЩИХСЯ ИМПУЛЬСНЫХ лампах разряд
(и вспышка света) происходят тогда, когда электроды заряжены до напря-
жения пробоя. Это напряжение зависит от типа газа, его давления, а так-
же точной геометрии межэлектродного промежутка. Число импульсов в се-
кунду определяется емкостью лампы и напряжением пробоя. В результате
не имеется возможности независимого управления частотой импульсов. За-
мена газа, либо изменение давления приводят к изменению частоты. По
этой причине самопроизвольно включающиеся лампы неудобны и мало ис-
пользуются в настоящее время. Однако разрабатываются усовершенство-
ванные устройства для работы при постоянной и переменной скоростях пов-
торения (Дж. Игерабид, частное сообщение).

В запускаемых Лампах разряд управляется тиратроном. Частота им-
пульсов контролируется независимо от емкости, газа и его давления.
Эти лампы, как сообщают, обеспечивают более высокую интенсивность и
воспроизводимость каждого импульса. Запускаемые лампы легко купить;
при этом некоторые кожухи ламп сделаны таким образом, что очень прос-
то заменить газ или изменить его давление.

Огромные усилия были затрачены на получение возможно более ко-
ротких импульсов вспышки. Обычные лампы дают длительности импульсов
порядка 2 нс (рис. 3.4). Большинство ламп имеет малоинтенсивный хвост
при больших временах. Из-за относительно большой длительности вспышки,
а также из-за наличия хвоста эти лампы не обеспечивают возбуждения
бесконечно коротким 6-образным импульсом. Следовательно, необходимо
производить корректировку на временной профиль вспышки, а такая про-
цедура сильно зависит от стабильности профиля во времени. Поэтому
профиль вспышки необходимо измерять каждый раз при получении повой
кривой затухания, и он должен оставаться примерно постоянным во вре-
мя измерения. Если это не выполняется, процедура обратной свертки при-
ведет к ошибочным результатам. Форма вспышки и стабильность импуль-
сных ламп, вероятно, сильно зависят от электродов. Их необходимо часто
чистить и юстировать, иначе форма вспышки искажается, а стабильность
Длина волны, нм

РИС. 3.3. Спектральный выход азотных и дейтериевых импульсных ламп.
(С разрешения авторов работы [ 2] и Academic Preus, Inc.)

лазеры и СИНХРОТРОНЫ. Возможно, что в будущем импульсные лампы
заменят другие источники света. Один из таких источников - импуль-
сные лазеры. Например, лазер па ионах аргона может иметь селекцию
мод в ультрафиолете и давать импульсы с длиной волны 351 нм и
длительностью 100 нс при частоте повторения 76 МГц [28]. С помо-
щью такого источника возбуждения можно разрешить две экспоненты в
кривой затухания флуоресценции NADH с временами затухания 0,2 и 0,7 не
[ 28]. Среднее время затухания NADH составляет 0,4 нс, Можно также по-
Номер напала

РИС. 3.4. Типичный профиль вспышки импульсной азотной пампы.
(0 разрешения авторов работы [ 2] И Academic Press, Inc.)

лучить субнаносекундиые световые импульсы, используя лазеры на краси-
телях, накачиваемые другими ионными лазерами с селекцией мод. Преиму-
щество лазеров на красителях заключается в том, что в определенных пре-
делах можно менять длину волны, получая нужную величину. Однако та-
кие приборы имеют низкие скорости повторения, обычно менее 1000 Гц.
Поскольку в методе счета фотонов необходимо, чтобы на каждую вспышку
регистрировался, самое большее, один фотон, низкие скорости повторения
приводят к большим временам регистрации. Другим ограничением лазеров
является большая трудность получения возбуждающих импульсов в ультра-
фиолете по сравнению с видимой областью спектра.

Многообещающим источником импульсного возбуждения является син-
хротронное излучение. Когда электроны проходят по круговой орбите со
скоростями, близкими к скорости света, они испускают излучение всех длин
волн, обычно используемых для возбуждения флуоресценции. Преимущест-
ва синхротронного излучения следующие. Длительность импульса может
быть очень мала, обычно 0,6 нс. Форма вспышки стабильна во времени и
имеет гауссову форму. Стабильность во времени позволяет успешно прово-
дить операцию обратной свертки. Гауссова форма лучше, чем обычная фор-
ма вспышки импульсных ламп (рис. 3.4), поскольку имеет менее интоцсив-
ный хвост. Для синхротронного излучения характерна высокая скорость
повторения (обычно 10 МГц), а также широкий диапазон доступных длин
волн. Высокая скорость повторения обеспечивает более быстрое получение
данных, и можно выбрать любую длину полны возбуждения, удобную для эк-
сперимента. Конечно, доступность синхротронов для использования ограни-
ченна.

3.3.2.	, Импульсный стробоскопический метод

Импульсный стробоскопический метод был развит раньше, чем метод
счета фотонов [ 3]. До настоящего времени стробоскопический метод ис-
пользовался менее широко, вероятно, из-за отсутствия в продаже оборудо-
вания. Этот метод действительно имеет некоторые вполне понятные преи-
мущества, в частности возможность непосредственного получения мгно-
венных спектров испускания [ 4, 51. Такие непосредственно записанные
спектры искажаются длительностью вспышки лампы. Мгновенные спектры
можно получить непосредственно и методом счета фотонов [ 2], но в этом
случае обычно лучше рассчитывать эти спектры из полученных импульс-
ных функций отклика [6]. Графическое представление импульсного стробо-
скопического метода приведено па рис. 3.5. Вверху рисунка изображена
кривая затухания, которую надо получить. После каждой возбуждающей
вспышки ({ютоумножитель включается па короткое время, которое значительно мены
ше времени затухания. Интересно отмстить, что в каждый данный момент времени
весь ФЭУ не отперт. Импульс высокого отрицательного напряжения проходит
через цепочку динодов (см. рис. 2.9), что обеспечивает одну стадию уси-
ления в каждый данный промежуток времени. Такой способ обеспечи-

РИС. 3.5. Графическое представление импульсного стробоскопического метода
(по данным работы [ 1 ]).

Штриховой пинией показана форма вспышки лампы.
вает большее временнбе разрешение. Анодный ток в каждом импульсе
измеряется и запоминается в многоканальном анализаторе (МКА). После
следующей возбуждающей вспышки опять регистрируют испускаемый свет,
по уже через другой промежуток времени после возбуждения. После бол1>-
шого числа повторяющихся вспышек получают отдельные участки кривой
затухания для различных времен затухания, после чего можно анализиро-
вать всю кривую.

Важно отметить, что конечная длительность вспышки лампы приводит
к искажению кривых затухания флуоресценции. Это показано на рис. 3.5,
где видно, как закругляется максимум и как перекрываются вспышка
лампы и испускание флуоресценции. Эти результаты можно сравнить с те-
ми, которые получились бы при 8-образной вспышке (см. рис. 3.1). Спо-
собы корректировки данных на конечную величину длительности вспышки
будут описаны в разд. 3.4. Отметим также, что в стробоскопическом ме-
тоде обычно регистрируют много фотонов на один импульс. Фактически
необходимо, чтобы испускалось много фотонов, иначе в тот короткий про-
межуток времени, когда ФЭУ отперт, может вообще не быть никаких фото
нов. Сигналы от этих фотонов усредняются за период длительности стро
бирующего импульса.

Вместо периодического включения фотоумножителя можно использо-
вать стробирующий электронный осциллограф [ 39]. Принцип его работы ана-
логичен изображенному на рис. 3.5, за исключением того, что коэффици-
ент усиления ФЭУ постоянен, по сигнал с ФЭУ регистрируют через различ-
ные промежутки времени после возбуждающего импульса. Такие приборы
непрерывно усовершенствуются, и в настоящее время стробирующие им-
пульсы могут быть очень короткими - например, до 30 пс [ 40]. Эта аппа-
ратура удобна, так как имеется в продаже и непосредственно соединяется
с компьютерами. Поэтому можно ожидать, что стробирующие осциллогра-
фы будут использовать шире, чем периодически включающиеся фотоумно-
жители.

3.3.3.	Метод счета единичных фотонов

Цель метода счета единичных фотонов та же, что и в стробоскопи-
ческом методе, а именно измерение кривой затухания флуоресценции. Од-
нако здесь используют другой способ регистрации. Образец возбуждают
вспышкой света и измеряют интервал времени между вспышкой лампы и попаданием
па анод ФЭУ импульса тока. Интенсивность подбирак/г таким образом, чтобы этот
импульс был обусловлен единичным йютоном, попадающим на фотокатод. Напомним,
что испускание флуоресценции - случайное событие. Если испускается только один
фотон, вероятность этого испускания будет в различные моменты време-
ни той же, что и вероятность 'затухания флуоресценции для большого чис-
ла флуорофоров. В методе счета единичных фотонов уровень интенсивное-
ти необходимо подбирать таким образом, чтобы наблюдать не более одно-
го фотона на каждые 20 импульсов.

Интервал времени между вспышкой лампы и анодным импульсом из-
меряют с помощью время-амплитудного преобразователя (ВАП) (рис. 3.6).
Импульс лампы запускает ВАП, который генерирует линейно растущее со
временем напряжение. Анодный импульс, обусловленный одиночным заре-
гистрированным фотоном, запирает ВАП. Напряжение в приборе в момент
запирания пропорционально времени между этими двумя событиями. Если
не регистрируется никаких фотонов (запирающий импульс), в приборе уста-
навливается нуль. Зарегистрированные импульсы записываются в цифро-
вой форме в импульсном многоканальном анализаторе амплитуды импуль-
сов (ИМКААИ). Например, если регистрируют фотон, пришедший через 50 нс
после возбуждающей вспышки лампы, единичный отсчет запоминается в
ячейке памяти ИМКААИ, соответствующей 50 нс. Это положение обозначе-

РИС. 3.6. Схема аппаратуры и графические зависимости в методе счета еди-
ничных фотонов.

ВАП — время-амплитудный преобразователь; ИМКААИ — импульсный многока-
нальный анализатор амплитуды импульсов; АЦП — аналогово-цифровой преобра-
зователь. (С разрешения авторов работы^ 2] И Academic Press, Inc.)
но стрелкой на рис. 3.6. Такой цикл повторяют до тех пор, пока не будет
зарегистрировано большое число фотонов, обычно 106 или больше. Число
отсчетов, соответствующих каждому напряжению, генерируемому ВАП,
представляется в форме гистограммы с помощью ИМКААИ. Эти данные
и отражают закон затухания, который, безусловно, искажен коночной дли-
тельностью 1 вспышки лампы. В случае, изображенном на рис. 3.6, для ка-
налов с номерами 0 - 10 не было измерено никаких импульсов, поскольку
лампа еще не зажглась. Видно, что максимальное число отсчетов находит-
ся вблизи канала с номером 30, который примерно соответствует времени
максимума возбуждающей вспышки. Момент времени е 0 трудно опреде-
лить, за исключением случая 5-образной вспышки. Для больших номеров
каналов, соответствующих большим временам, число отсчетов меньше.

Метод счета единичных фотонов имеет несколько преимуществ. Вре-
менное разрешение весьма хорошее, вероятно ~ 0,2 по. Такое разрешение
возможно потому, что электроника должна обеспечить только измерения
времени импульса, а не его точной формы.Во-втррых, высококачественные,
электронные компоненты и даже готовые приборы имеются в продаже.
В таких счетчиках фотонов качество электронных узлов обычно выше, чем
оптических. Наконец, метод счета единичных фотонов высокочувствителен.
Необходимо только работать с разбавленными растворами, а из-за низких
интенсивностей возбуждающего света обычно устраняются проблемы, свя-
занные с фоторазложением флуорофоров.

3.4.	Анализ кривых затухания флуоресценции

Кривые затухания флуоресценции измеряют для того, чтобы определить
импульсную функцию отклика F(t)> Это то затухание, которое наблюдалось
бы для бесконечно короткого возбуждающего импульса либо для импульса,
имеющего длительность, намного меньшую времени затухания флуоресцен-
ции образца. К сожалению, часто длительности импульсов сравнимы с вре-
менами затухания, что показано па рис. 3.7 для случая фосфолипидных
везикул, помеченных зондом 2-толуидинил-б-нафталинсульфоновой кислоты
(TNS). Из-за конечной длительности вспышки лампы не определяется ну-
левой момент времени, и поэтому для определения времен затухания нель-
зя просто оценить интенсивность на уровне 1/е. Далее, испускание дан-
ного образца нельзя представить с помощью одпоэкспонопциальпого зако-
на затухания, что опять ограничивает возможности определения интенсив-
ности на уровне 1/е, а также возможности подсчета наклона зависимости
1g/ДО ОТ t.

Зависимость интенсивности вспышки от времени [ L(t)] обычно опреде-
ляют в отдельном эксперименте. Поскольку форма вспышки меняется со
временем, измерения необходимо проводить непосредственно до или пос-
ле измерения затухания флуоресценции. Обычно L(t) измеряют, используя
РИС. 3.7. Графическое выражение закона затухания флуоресценции фосфоли-
пидных везикул с метками TNS (по данным [ б]).

1 - измеренная форма вспышки лампы; 2 - затухание флуоресценции меченых
везикул. Кривая з, полностью совпадающая с кривой 2, - рассчитанная величина
К (t), полученная с использованием трехкомпонентного анализа. Кривая 4 ~ от-
клонение в процентах [к (t) -	На вставке изображена автокорреляцион.

ная функция разностей, с'ломощью которой регистрируют систематическое откло-
нение к (t) от R(t ).

раствор, рассеивающий свет. Пусть /?(<) — наблюдаемое затухание флуо-
ресценции и нам необходимо определить из данных П(О и R(t) функцию
отклика F(t)» Известно, что /?(«) определяется сверткой вспышки с функ-
цией отклика образца, а именно:

R(t)

о

(3.22)

Вывод этого выражения хорошо описан несколькими авторами [2, 38I. Им-
пульс лампы можно рассматривать как большое число коротких импульсов,
приходящих во время и имеющих равную длительность kt (причем го-
раздо меньше времени затухания флуоресценции образца). Каждый такой им-
пульс вызывает импульсный отклик образца:



(3.23)
Член (i -t-) появляется потому, что затухание флуоресценции необходимо
рассматривать по отношению к моменту возбуждения, которое в данном слу-
чае равно ti Ясно, что для t < tf R, (0 = 0- Измеряемое затухание являет-
ся суммой этих индивидуальных импульсов:

i =tt-

R(t) = S L^F^t
t = о

(3.24)

Когда Lt приближается к нулю, уравнение (3.24) преобразуется в интеграл
свертки, описываемый выражением (3.22). Для удобства выбирают перемен-
ную таким образом, чтобы в функцию отклика не входил член (t -if). Ис-
пользуя замену переменной t' = t - ц, получаем из уравнения (3.22)

R(t) = .fL(t -n)F(p)dp	(3.25)

о

Задача состоит в определении импульсной функции отклика из данных
свертки.

3.4.1.	Анализ затухания флуоресценции методом
наименьших квадратов

Было предложено множество методов расчета импульсной функции от-
клика F(t) из измеренных кривых затухания R(t) и профиля вспышки L(t)t
обзор которых приведен в статье О’Коннора и др. [7]. Для большинства це-
лей, вероятно, наиболее падежные результаты можно получить с помощью
метода наименьших квадратов [8], используемого и в имеющихся в прода-
же устройствах для обработки данных. До настоящего времени этот спо-
соб наиболее широко применяли для данных, полученных методом счета
единичных фотонов.

Основу метода наименьших квадратов составляет расчет ожидаемой
величины R(t) из подобранных значений а{ и т>- [уравнение (3.20)]. В част-
ности, рассчитывают интеграл свертки (3.25), используя предполагаемые
значения а . и т,- и измеренный профиль вспышки лампы. Рассчитанные
величины [Rc (и)] сравнивают с наблюдаемыми [R(t)]. Значения а,- и т,-
варьируют до получения наилучшего совпадения расчетных и эксперимен-
тальных кривых. Среднеквадратичное отклонение (х2) находят по формуле

Х2 = ^ wf[R(t)-Rc(0]2, где Ki = l/R(t)	(3.26), (3.27)

cot- представляет собой-статистический весовой фактор для учета ожидае-
мых погрешностей для каждого значения R(t). Важно использовать подхо-
дящие весовые факторы; в противном случае не избежать серьезных оши-
бок [ 8]. Минимальное значение х2 указывает на наилучшее совпадение.
Если х2 > 2, говорят о плохом совпадении, при х2 < 1,2 - о хорошем.
Этот способ часто называют обратной сверткой, что является неточ-
ным. В действительности предполагаемый закон затухания подвергают
свертке с £.(/), а результат сравнивают с H(t). Таким образом, он под-
ставляет собой одну из итерационных повторяющихся сверток. Везуслог-
но, необходимо использовать компьютер, поскольку требуется проводить
множество вычислений.

Данные по затуханию флуоресценции для 9-цианоаптрацена показаны
на рис. 3.8. Слева изображены наблюдаемая кривая затухания и наилучшим
образом подобранная одпоэкспопенциальная кривая (11,8 нс). Опи перекры-
ваются практически полностью. Точность подбора иллюстрируется близос-
тью совпадения R(t) с расчетными данными. Сильное перекрывание этих
кривых метает визуальному анализу данных. Поэтому было разработано
несколько методов, позволяющих исследователю идентифицировать разли-
чия между R(t) и Rc (t). Одним из методов является анализ "разностей"

Д) - /?(£)]. /(ля 9-циаиоантрацена разности между рассчитанными (од-
на экспонента, т 11,8 нс) и экспериментальными значениями случайным
образом распределены около нуля, что указывает на хорошее совпадение.
Такое случайное распределение также иллюстрируется автокорреляционной

З-Ираноантпрацен

Однозкипинвнциалинь/й закон

РИС. 3.8. Затухание флуоресценции 9-цианоантрацена в этаноле.

Разности и автокорреляционная функция (приведена на вставках) рассчитаны
для одноэкспоненциального затухания с временем жизни 11,8 нс (левая часть ри-
сунка). Справа приведены данные, полученные в предположении двухэкспоиенциаль-
ного закона затухания. (С разрешения авторов работы [ 2| и Artidrrnh Pi 1и< .)

Двушит поныциалкныи иикин

12в00г

10000 -

7000

0000 ’

2500 ~

0/0	23в	828	Ofti

Номер канала
функцией разностей [8], которая изображена на вставке. Опять-таки, слу-
чайное распределение этих величин говорит о том, что R(t) адекватно опи-
сывает предполагаемый закон затухания.

В правой части рис. 3.8 приведены аналогичные данные, по закон за-
тухания предполагается двухэкспоненциальным:

F(t) = a je 1 + а 2е 2

С помошыо вычислительной техники рассчитывают интеграл

(О - f Ц( -ц)[а ,ГЦ/ ’> + а^”"7’3)^
О

(3.29)

и сравнивают его с Затем варьируют величины 04, а2, тд и та до тех
пор, пока х2 не достигнет минимума. Для 9-циапоаитрацена (рис. 3.8) при
усложнении вида предполагаемого закона затухания совпадение ио улуч-
шилось, что видно из аналогичных значений разностей и автокорреляцион-
ной функции. Это говорит о том, что затухание 9-цианоаптрацена адекват-
но описывается одной экспонентой.

9- Цианоантрацен + антрацен

РИС. 3.9. Кинетика затухания флуоресценции эквимолярной смеси антрацена
(4,2 нс) и 9-цианоантрацена (11,8 нс)

Слева - рассчитанные кривые для одноэкспоненциального затухания, справа -
для двухэкспоненциального затухания. (С разрешения авторов работы [21 и Aeade
mic Press, Inc.)
Для того чтобы проиллюстрировать влияние! гетерогенности на кривые
затухания, Бадеа и Бранд [ 2| исследовали смесь антрацена (4,2 нс) и 9-циа-
ноантрацена (11,8 нс). В разбавленном растворе, когда пет реабсорбции и
взаимодействий, каждый флуорофор в смеси показывает свое характер-
ное время затухания. Кривая затухания флуоресценции и паилучшим обра-
зом подобранная теоретическая кривая приведены слева на рис. 3.9. Вид-
но значительное несовпадение B(t) и А’(. (г). Необходимо отметить, что
без расчета величины /?(. (/) с помощью компьютера, а также без анализа
разностей и автокорреляционных функций было бы трудно заметить, что
величина R.(t) не является одноэкспопепциальпой. Фактически R(t) никог-
да не является строго одноэкспопенциальной, за исключением случая
бесконечно короткой вспышки лампы. Правая часть рис. 3.9 иллюстриру-
ет совпадение, полученное в предположении двухэкспоненциалыюго за-
тухания [ уравнение (3.28)]. В этом случае1, явно заметно улучшение карти-
ны. Разности и автокорреляционные функции теперь показывают случай-
ное распределение ошибок. Такое улучшение совпадения свидетельствует
о том, что для описания этого образца необходима по крайней море; днух-
экспоненциальная модель. Еще раз отметим, что улучшение совпадения
всегда будет получаться для более сложной модели. В случае, изображен-
ном на рис. 3.9, двухэкспонопциальпоо затухание, несомненно, обусловле-
но гетерогенностью. Однако для многих флуорофоров законы затухания
по являются одноэкспоненциальными, даже если флуорофор находится в
гомогенном окружении. Множество процессов, протекающих в возбужден-
ных состояниях, может привести к сложным законам затухания, причем
величины а,- и т,- не могут служить характеристиками одиночного флуо-
рофора или одного состояния флуорофора.

3.4.2.	Метод преобразования Лапласа

/(ля анализа кривых затухания метод, предложенный в работе [ 9],
имеет преимущества перед методом свертки. Преобразование Лапласа
функции определяется выражением

Z-[M(it)] - М(л-)-. JM(4)	(3*30>

о

где s - произвольно выбранная переменная. Предположим, что две функ-
ции связаны с помощью свертки в данном интервале времен. Теорема сверт-
ки утверждает, что эти функции связаны в виде произведения в пространст-
ве Лапласа. Применение этой теоремы к уравнению (3.25) дает

/?(Л.) L(s)F(s)	(3.31)

Преобразование Лапласа истинного закона затухания получают делением
R(,s) на К сожалению, трудно провести обратное преобразование Лап-
ласа F(s), для того чтобы получить F(t). Вместо этого данные анализиру-
ют в пространстве преобразований Лапласа. Преобразование Лапласа
многоэкспопепциальной функции затухания определяется выражением

Используя этот метод, рассчитывают Fc ($) для 2п значений s. Для двух-
экспоненциального затухания используют четыре значения s.Получают ряд
линейных уравнений [ уравнение (3.32)], которые решают относительно
a i ит; . Для более детального ознакомления с методом мы отсылаем
читателя к оригинальной работе [ 9].

3.5.	Мгновенные спектры испускания

В предыдущем обсуждении мы предположили, что каждая флуоресци-
рующая частица может быть охарактеризована временем жизни, не зави-
сящим от длины волны испускания. Однако существует множество случа-
ев, когда это предположение не выполняется. Это, например, реакции в воз-
бужденных состояниях, такие, как отщепление протона от фенола и нафто-
ла; образование комплексов с переносом заряда, например между антра-
ценом и аминами; дипольная релаксация растворителя, которая приводит к
зависящим от времени спектральным сдвигам для многочисленных флуо-
рофоров, чувствительных к природе растворителя. Во всех этих случаях
спектры испускания смещаются в сторону больших длин волн со временем,
прошедшим с момента импульсного возбуждения. В некоторых случаях,
например при переносе протона или образовании комплексов, испускание
из первоначально возбужденного состояния исчезает, а возрастает флуо-
ресценция продукта (гл. 12). В случае релаксации растворителя спектры
могут перемещаться в сторону больших длин волн со временем, прошед-
шим с момента импульсного возбуждения (гл. 8). В любом случае жела-
тельно иметь возможность наблюдать эти временные сдвиги, для того
чтобы понять природу процессов в возбужденных состояниях. Один из спо-
собов наглядно представить себе такие сдвиги - это измерить мгновен-
ные спектры испускания (МСИ). По существу, это спектры, измеряемые
через разные промежутки времени после возбуждающей вспышки. Такие
спектры можно получить, используя как стробоскопический метод, так и
метод счета фотонов. В первом способе большинство спектров записыва-
ют непосредственно, тогда как с помощью метода счета фотонов результа-
ты получают главным образом путем некоторых расчетов. Характеристи-
ки мгновенных спектров испускания приведены на рис. 3.10. Следующие
за вспышкой возбуждающего света нормированные по интенсивности спект-
ры испускания смещаются в сторону больших длин волн. Кроме того, их ин-
тенсивность постепенно падает из-за того, что уменьшается заселенность
РИС. 3.10. Мгновенные спектры испускания.

Сплошной линией показаны нормированные спектры, штриховой — ненормирован-
ные.

возбужденного состояния флуорофоров. При временах наблюдения, много
больших времени затухания флуоресценции, интенсивность становится
очень малой и спектры уже не видны.

Легко показать, каким образом можно получить такие спектры, исполь-
зуя стробоскопический метод. Интенсивность флуоресценции можно изме-
рять через любой желаемый промежуток времени, прошедший после воз-
буждения (см. рис. 3.5). Вместо обычного способа варьирования временной
задержки е« фиксируют на каком-то определенном значении. Тогда испус-
кание наблюдают через монохроматор, как обычно, сканируя по длинам
волн. Типичные спектры для 4-аминофталимида показаны на рис. 8.11. При
температурах, использованных в этих исследованиях, время релаксации
растворителя сравнимо с временем затухания. Через меньшие промежутки
времени после импульса возбуждения наблюдается сдвинутый в коротко-
волновую область спектр, который соответствует нерелаксироваипому сос-
тоянию флуорофора. При больших временах испускание сдвигается в сто-
рону больших длин волн, что указывает на процесс релаксации.

Аналогичную процедуру можно использовать в методе счета единичных
фотонов. В этом случае из выходных импульсов ВАП выбирают те, ампли-
туды которых лежат в ограниченном интервале. Например, область напря-
жений 4,95 - 5,05 В должна была бы соответствовать временному интер-
валу продолжительностью 1 ис, начало которого задержано на 50 нс от про-
извольно выбранной точки нулевого отсчета времени (см. рис. 3.6). Этот ме-
тод не нашел широкого применения; чаще используется расчетный метод, описанный
ниже.

Необходимо учитывать, что МСИ,полученные любым из этих методов,
искажены сверткой со вспышкой лампы. Поэтому данные, полученные че-
рез короткие времена после возбуждения, содержат особенно много ошибок.
Бранд с сотр. [ 6] описали метод получения истинных МСИ. Опи примени-
ли такой способ к результатам, полученным методом счета единичных
фотонов, но его в равной степени можно использовать при анализе данных,
найденных стробоскопическим методом. Для выполнения такой процедуры
необходимы автоматизация установки и компьютер.

Записывают кривые затухания флуоресценции при определенных длинах
волн, выбираемых на разных участках всего спектра испускания. На
рис. 3.11 показаны типичные кривые затухания для фосфолипидных везй-

РИС, 3.11. Иллюстрации к расчету мгновенных спектров испускания.
(С разрешения авторов работы [2] и Academic Press, Ine.)
кул, помоченных флуоресцентным зондом 2-анилинон(Крталином, получен-
ные для длин волн 394, 409 и 435 нм I 2]. *>ги результаты можно интерпретиро-
вать следующим образом. При более, коротких длинах ноли флуоресценция
затухает как вследствие испускания, так и вследствие смещения спектра
испускания в сторону от длины волны наблюдения. В результате кажущая-
ся скорость затухания будет больше. Такое' более быстрое затухание хо-
рошо видно как из /?(А, t}, так и из выведенной импульсной функции откли-
ка Е(М <)• При больших длинах воли регистрируется испускание, только тех
молекул флуорофора, которые уже; отролаксировали,и, следовательно, толь-
ко тех, которые испускают через большие! промежутки времени после воз-
буждения. Таким образом, кажущаяся скорость затухания будет меньше.

Кривые затухания флуоресценции используют для получения импульс-
ных функций отклика для каждой длины волны испускания /''(А, 0* Приме-
няют теоретическую функцию, являющуюся суперпозицией нескольких экс-
нопент с пятью независимыми членами, и уравнения (3.25) - (3.27). Вели-
чинам а,, и Tt- по придают никакого физического смысла. Их просто ис-
пользуют для того, чтобы точно представить зкспериментальные данные.
Полученные кривые Е(А, с) приведены па рис. 3.11. Заметим, что теперь
по оси х отложено время. Такая замена была произведена, поскольку эти
функции являются производными импульсных функций отклика, /(ля наб-
людаемого затухания время на оси х прямо по указано, поскольку конеч-
ная длительность вспышки лампы приводит к неопределенности пулевой
точки отсчета времени. Важная особенность таких импульсных функций от-
клика - возрастание интенсивности, наблюдаемое для данных, полученных
для большой длины полны (435 нм). Такое, увеличение соответствует члену
с отрицательным предэкспоноицшиьным множителем (а,- ) в уравнении
(3.20). Наличие же такого члена свидетельствует о том, что протекают не-
кие процессы в возбужденных состояниях. Если бы образец обладал только
свойством гетерогенности в основном состоянии, кинетические кривые за-
' тухапия зависели бы от длины волны, по никакого увеличения интенсивнос-
ти по наблюдалось бы (гл. 12).

Импульсные, функции отклика на каждой длине, волны испускания те-
перь подбирают по величине таким образом, чтобы они соответствовали
спектру стационарного состояния, измеренному на этом же приборе. Зту
операцию проводят, определяя

/7(А) __Ж.--------- (3.33)

Г Е(А, t)ih
о

где /"’(А) - интенсивность в стационарном состоянии па длине волны А, а
Е(А, i) - импульсная функция отклика па той же длине волны. Импульсные',
функции отклика, нормированные па спектр стационарного состояния, он-
роделяются выражением

~H(h)F(K, t)	'	(3.34)

Некоторые из таких подобранных по интенсивности функций приведены па
рис. 3.11. Максимум испускания образца находится в области 409 нм, и, сле-
довательно, импульсная функция отклика па этой длине волны имеет мак-
симальную амплитуду. Па других длинах волн амплитуда стационарного
состояния меньше, и таким же образом ведут себя подобранные интенсив-
ности этих импульсных функций отклика. Более полный набор мгновен-
ных спектров испускания для меченных TNS липидных везикул представ-
лен па рис. 8.18.

И наконец, изображают спектры испускания в любой момент времени
после возбуждения, выбирая сечения временной шкалы. Зависящие от вре-
мени смешения спектров трудно отчетливо представить себе, рассматри-
вая полную совокупность данных. По этой причине МСИ нормируют к од-
ной и той же интенсивности в максимуме (рис. 3.11; см. также рис. 8.19).
В начальные моменты времени наблюдается коротковолновый сдвиг'
спектров, а затем они постепенно сдвигаются в сторону больших длин волн.
Из анализа таких спектров можно получить информацию о временных зави-
симостях процессов, протекающих в возбужденных состояниях. В биохими-
ческих исследованиях скорости таких реакций используют для определе-
ния динамических свойств биополимеров.

Недавно Бранд с сотр. описали другой метод анализа гетерогенных об-
разцов 144]. Для таких образцов затухание флуоресценции каждой компо-
ненты обычно не зависит от длины волны испускания. Предположим, что
проводится детальный анализ закона затухания па некоторых длинах волн,
где испускают оба флуорофора.Его результатом является определение ин-
дивидуальных времен затухания, после чего можно рассчитать спектр испус-
кания компоненты, имеющей соответствующее время затухания. Полученные
таким образом спектры называют спектрами с данным временем затухания.
Метод требует проведения сложных расчетов, однако с его помощью можно
рассчитывать спектры с данным временем затухания, не измеряя кривых
затухания на каждой длине волны. Это расширяет использование импульс-
ных методов для анализа гетерогенных смесей.

3.6.	Измерение времен затухания флуоресценции по фазовым
сдвигам и демодуляции

Сущность фазовых и. модуляционных измерений времен затухания флу-
оресценции состоит в следующем. Образец возбуждают светом, интенсив-
ность которого модулирована по синусоидальному закону (см. рис. 3.2).
Из-за того что испускание запаздывает по времени относительно поглоще-
ния, оно имеет задержку по фазе и демодулировапо относительно падаю-
щего света. Задержку по фазе (ср) и степень демодуляции (т) можно исполь-
зоватъ для расчета времени затухания флуоресценции [ уравнения (3.6) и
(3.7)1* Фазовый метод хронологически предшествовал импульсному: первый
прибор для фазовой флуорометрии был создал Гавьола в 1926 г. (10].

В дальнейшем были разработаны различные фазовые флуорометры [ 13 - 161.
Наиболее распространенными и имеющимися в продаже, являются приборы,
основанные па схеме, описанной Спенсером и Вебером [17]. В этом прибо-
ре использован ультразвуковой модулятор Дебая - Сирса [ 18] для получе-
ния необходимого модулированного света, а регистрация происходит в ре-
жиме взаимной корреляции. Последнее упрощает конструкцию прибора и
работу с ним, а также повышает точность и надежность измерений.

В предыдущих разделах было показано, как с помощью аппроксимации •
можно получить истинный закон затухания, зная экспериментально изме-
ренную кривую затухапйя. Легкость интерпретации 'законов затухания повы-
сила интерес к методам временного разрешения. В принципе закон затуха-
ния можно также получить из данных по фазовой модуляции: рассчитывают
величины ai и т,- , входящие в уравнение (3.20), а затем ужо эксперимен-
татор решает, имеют ли они физический смысл. Для расчета закона зату-
хания из фазовых и модуляционных данных необходимо использование не-
скольких частое м<шуляции. К сожалению, технические причины ограничи-
вают создание приборов с варьируемой частотой модуляции. В большинст-
ве используемых в настоящее время устройств число частот модуляции
ограничено двумя или тремя фиксированными значениями. При благоприят-
ных условиях измеренных на этих частотах величин <р и m достаточно для
того, чтобы получить компоненты затухания в гетерогенной системе
[ 19, 20]. Основным ограничением для использования дополнительных час-
тот модуляции является отсутствие подходящих модуляторов или модули-
рованных источников света. Были описаны некоторые устройства с изме-
няющейся частотой [21, 22, 45J, но они отсутствуют в продаже; кроме то-
го, для пих в основном требуются лазерные источники света. Когда появится
возможность варьирования частоты модуляции, метод фазовой модуляции
будет по крайней мере сравним с импульсными методами. Ситуация такая
же, как при использовании пикосекупдных лазеров для импульсных изме-
рений. Технически это осуществить возможно, но пройдет еще несколько
лет, пока такие приборы станут вполне доступными.

Фазово-модуляционные методы даже при использовании фиксированных
частот имеют ряд преимуществ. С помощью фазового метода можно лег-
ко измерять короткие (субпаносекундпыс) времена затухания, которые труд-
но измерить, используя импульсные методы, поскольку длительность им-
пульсов ламп составляет обычно 2 пс. Фазовые и модуляционные измере-
ния являются быстрыми: лишь секунды необходимы для получения данных.
Для получения же кривых затухания импульсным методом необходимо зна-
чительно большее время. И наконец, новый метод, в котором осуществля-
стоя фазочувствительная регистрация флуоресценции, вероятно, повы-
шает значение фазово-модуляционных методов для анализа гетерогенных
образцов. Используя этот метод, при одной частоте модуляции можно не-
посредственно записать индивидуальный спектр испускания каждого из
двух флуорофоров в их смеси (гл. 4). Потенциальные возможности такой
методики еще предстоит реализовать, что в сочетании с возможностью при-
менения варьируемой частоты привело бы к впечатляющим результатам.
Эта методика сравнима с расчетом спектров с данным временем затухания
(разд. 3.5).

3.6.1.	Модуляторы света

Модулированный свет можно получить различными способами. В первых
приборах использованы ячейки Керра [ 10], модулированные лампы [ 11] и
ячейки ПокелсаГ 12, 14]. Для работы ячеек Керра и Покелса нужная моду-
ляция создается с помощью сильных электрических полей. Ячейки Керра не
пропускают ультрафиолетового света, а при работе с ячейками Покелса
необходимы сильно коллимированные пучки света. Высокие напряжения,
необходимые для питания этих ячеек, часто мешают регистрации слабых
сигналов флуоресценции. Для имеющихся в настоящее время ячеек Покел-
са нужно меньшее напряжение. Такие устройства пропускают ультрафиолет
и могут работать при варьируемой частоте [ 45]. Однако источники света
должны быть сильно коллимированы, что достигается при использовании
лазеров в качестве источников возбуждения. Применение лазерных источ-
ников приводит к ограниченному набору длин волн возбуждения.

Все еще популярны ультразвуковые модуляторы Дебая - Сирса, по-
скольку они пропускают ультрафиолет и могут модулировать любой источ-
ник света. При этом требуется весьма умеренная коллимация света. Мо-
дулятор состоит из кварцевого кристалла, помещенного в резервуар
(рис. 3.12), в котором содержится смесь этанол + вода. Ранее использова-
ли смесь метанола с водой [ 46]. Стоячая волна возникает между вибрирую-
щим кристаллом и отражающей пластиной, расположенной на противопо-
ложной стороне резервуара. Из-за того что в устройстве используется крис-
талл, оно может работать лишь на нескольких фиксированных частотах
(основной частоте и одной или двух гармониках).

Стоячие волны образуют области высокого и низкого давления в жид-
кости, находящейся в резервуаре. Эти области имеют различные коэффи-
циенты преломления, благодаря чему они образуют частую преломляющую
решетку, перпендикулярную падающему свету. Жидкая решетка появляется
и исчезает с двойной частотой колебаний кристалла. При нулевом уровне
стоячей волны дифракция света отсутствует и через щель проходит свет
максимальной интенсивности. При пике стоячей волны по обе стороны от
щели происходит дифракция максимального количества света. В результа-
Источник
света

Стоячая волна

шнсение
щели

РИС. 3.12. Схема устройства ультразвукового модулятора.

1 - кристалл; 2 - окно; 3 - отражающая пластинка; 4 - линза; 5 - щель.

те свет, вышедший через щель, модулирован синусоидально. Обычно свет
модулирован примерно на 50%.

Для получения надежных результатов за ультразвуковым модулятором
необходимо регулярно следить. Надо постоянно заменять водно-спиртовую
смесь. В нашей лаборатории это делают по крайней море раз в педелю.
Кроме того, для получения максимальной модуляции отражающую пластину
необходимо каждый день регулировать, так как степень модуляции меняет-
ся со временем. Регулировка положения пластины частично компенсирует
это изменение, одпако все равно со временем происходит некоторое изме-
нение степени модуляции. Мы предпочитаем располагать модулятор и опти-
ку таким образом, чтобы псдифрагированный пучок света попадал в центр
щели. Можно достичь высокой степени модуляции, центрируя щель па одну
из дифракционных картин или сдвигая фокус по любую сторону от щели. Од-
нако мы этого избегаем, поскольку в таких случаях меньше интенсивность
света, а также потому, что такой способ может привести к песинусоидаль-
пой модуляции.
3.6.2.	Регистрация в режиме взаимной корреляции

Для того чтобы получить измеримые величины фазового сдвига и сто-
пени демодуляции, частоты модуляции должны составлять МГц. Мож-
но проводить фазовые и модуляционные измерения на таких высокочастот-
ных сигналах, однако подобное усложнение не всегда необходимо. Спенсер
и Вебер [ 17] разработали эффективную методику, с помощью которой высо-
кочастотные сигналы преобразуются в сигналы о частотой ~ 10 Гц. По-
лучаемые низкочастотные взаимнокоррелированные сигналы содержат ту
же информацию о фазе и степени модуляции, что и исходный высокочастот-
ный сигнал. Такое преобразование проводится непосредственно в фотоум-
ножителе. Разность фаз и степень модуляции низкочастотных сигналов лег-
ко измеряются с помощью простых счетчиков временных интервалов и циф-
ровых вольтметров..

Регистрация в режиме взаимной корреляции осуществляется модуляци-
ей коэффициента усиления фотоумножителя частотой, отличающейся на ве-
личину Лист частоты падающего света. Напомним, что испускание описы-
вается уравнением

F(t) - А + f?sin(w? -ф)	(3.35)

Коэффициент усиления фотоумножителя меняют, модулируя напряжение па
одном из динодов. Это напряжение изменяется с частотой со+ Део.Тогда
коэффициент усиления ФЭУ [ G(t)) меняется согласно выражению

G(t) ~ а + (3sin(w+ △w)f

(3.36)

Результирующий фототок [ S (t)] можно определить, интегрируя интенсив-
ность за один полный цикл (17]:

t + 2ТГ/ со

$(*) = f F(t')G(t')dt

(3.37)

t

1

2

5 (<) = a A +

(3 В cos<pcos(Acoif

-<p)

(3.38)

где m- cos ф = [ 1 + ю2т2]~и.Слсдовательно, взаимнокоррслировапный сиг-
нал [5 (f)] имеет низкую частоту (Део) и содержит обе величины (ф и от), ко-
торые надо измерить.

3.7.	Анализ фазовых и модуляционных данных

По сравнению с измерениями временных зависимостей, использование
фазово-модуляционной флуорометрии для разрешения флуоресценции гете-
рогенных объектов находится еще на самом начальном уровне развития.
Существует несколько методов для определения величин амплитуд аг- и вре-
мен затухания тг- , но еще преждевременно говорить о том, какой из этих
методов лучший. Любой из них может устареть, как только станут доступ-
ными приборы с переменной частотой модуляции. Для каждого из этих ме-
тодов разрешение амплитуд и времен затухания плохое. Рассмотрим вели-
чины разности фаз и степени модуляции, полученные при двух частотах мо-
дуляции. Этих четырех экспериментальных точек в принципе достаточно для
расчета и т,- при двухэкспоненциальном законе затухания. Однако не-
большие ошибки в каждом из этих измерений могут свести на нет весь ре-
зультат эксперимента.

Измеренные значения разности фаз и степени модуляции для любого
образца можно использовать для расчета времен затухания, согласно урав-
нениям (3.6) и (3.7). К сожалению, эти уравнения предполагают, что флуо-
ресценция образца затухает экспоненциально с единственной константой
скорости. Если это условие выполняется, уР == тт и представляет собой
действительное время затухания. Предположим теперь, что затухание не
описывается одной экспонентой. Это утверждение, обычно следует из не-
эквивалентности величин Д’ и тт. Для гетерогенного образца [ уравнение
(3.20), в котором все оц> 0], кажущиеся значения фазовых времен затуха-
ния, обычно крроче кажущихся значений модуляционных времен. Далее,
увеличение частоты модуляции приводит к одновременному уменьшению ве-
личин уР и ут. Обратите внимание, что мы говорим об этих измеренных
значениях времен затухания, как о "кажущихся'’. При работе с фазово-мо-
дуляционным флуорометром важно но забывать о том, что величины уР и
ут истолковываются как измеренные значения $ и т»

3.7.1.	'Анализ фазовых и модуляционных данных
методом моделирования

Рассмотрим многоэкспоненциальный закон затухания, описываемый
уравнением (3.20). Фазовый сдвиг < ф > и степень модуляции - т> для
такого образца описываются уравнениями

tg < ф > = N/D - сртР	(3.39)

< т> = [№ + [)*№ . [ 1 4 со2(т«)2]“И	(3.40)

ГЛС	С0Я(* и D яД/.С08 2ф.	(3.41), (3.42)

Величины ф. представляют собой фазовые углы для отдельных флуорофо-
ров [ 19]. Вклады интенсивностей флуоресценции от каждой компоненты
в полное испускание в стационарном состоянии f- связаны с предэкспо-
понтами а,- уравнением (3.21).. Важно отметить, что уравнения (3.39) -
(3.42) применимы только к случаю гетерогенности в основном состоя-
нии когда г. сояф,- •’(I 4 со2т2)~'4. Для описания процесса в возбужден-
ном состоянии, Для которого m:- / cos ф,- (гл. 12), требуются более ело ж-
ные выражения. В работе [23] уравнения (3.39) - (3.42) использованы для
опенки величин т™ и т£ в предположении двухэкспонснпиалъпого затухания.
Измеренные при двух частотах-модуляции величины тР и тт сравнивали с
рассчитанными значениями, а среднеквадратичное отклонение при этом оце-
нивали по формуле

где Ср и от - оцененные ошибки измерения фазового и модуляционного вре-
мен затухания. Это уравнение аналогично тому, которое используют для
оценки величины х2 при анализе временного закона затухания. Пока еще
слишком рано говорить о том, будет ли этот метод полезен в общем случае.
В противоположность анализу импульсной кинетики затухания флуоресцен-
ции в литературе не появилось пока детального описания фазово-модуляци-
онных методов анализа простых смесей флуорофоров. Далее, очевидно,
что весовые факторы, используемые в уравнении (3.43), не подходят. Воз-
можно, этот метод необходимо модифицировать, чтобы использовать ошиб-
ки в измерении величин < $ > и < т>. Как было показано ранее в этой
главе, погрешности в<ф>и<т>не переносятся линейно на ошибки в
тР и тт.

3„7»2. Непосредственный расчет величин а. и т;

Недавно Вебер описал прямой метод расчета величин а,- и т. для ^экс-
поненциального затухания из известных значений сдвига фаз и степени мо-
дуляции, полученных при N частотах модуляции [ 19]. Используемые в этом
методе уравнения крайне сложны, поэтому интересующиеся этим вопросом могут об-
ратиться к оригинальной работе Вебера. Такой метод использовали да расчета за-
висящих от pH времен затухания флуоресценции триптофана [ 20]. При значениях pH,
близких к нейтральным, время жизни пвиттер-иопной формы триптофана составляет
3 нс. При pH ~ 10 время жизни отрицательно заряженной формы равно примерно 9 нс.
При промежуточных значениях pH присутствуют обе формы. Эти формы не переходят
друг в друга за время жизни возбужденного состояния, и, следовательно,
такие растворы триптофана гетерогеппы в основном состоянии. Из данных
о сдвиге фаз и степени модуляции, полученных при двух частотах модуля-
ции, Джеймсон и Вебер смогли рассчитать точные значения а{- и Ti
Расчетные ошибки при этом были примерно в 10 раз больше погрешностей
измерения. Следовательно, экспериментальные данные необходимо полу-
чать с большой точностью, так как небольшие систематические ошибки мо-
гут сильно исказить результаты.
3.7.3.	'Анализ данных по сдвигу фаз и степени модуляции,
полученных при варьируемой частоте

Описанные^ выше методики были разработаны для оперирования с огра-
ниченным числом данных, полученных для двух или трех частот модуляции.
Широко известно, что возможность использования варьируемой частоты
модуляции позволила бы рассчитать импульсные функции отклика. Но поско-
льку пригодная соответствующая аппаратура пока еще не получила широко-
го распространения, этой проблеме уделялось мало внимания. В следующих
разделах будет приведено описание одного из возможных методов анализа
таких данных, который привлекателен своей прямотой. Однако с опытом
могут возникнуть и другие методики.

Вебер [ 24] на основе предложения Солодовникова [ 25] описал общую
методику, с помощью которой для любой заранее предположенной импульс-
ной функции отклика можно предсказать зависящие от частоты значения
разности фаз и степени модуляции. Например, предположим, что импульс-
ную функцию отклика образца для любой данной длины волны можно рас-
считать по формуле

F(A, ?) = £а1.(л)о~‘/'г,'<Л>	(3.44)

где af (Л) и т,- (Л) - просто эмпирические параметры, выбранные таким обра-
зом, чтобы можно было примерно оценить вид закона затухания. Для слу-
чаев переноса энергии, реакций в возбужденном состоянии, релаксации рас-
творителя и зависящего от времени тушения флуоресценции при столкнове-
ниях следовало бы записать более сложные законы. Однако вне зависимос-
ти от степени сложности закона затухания с помощью уравнения (3.44) всег-
да можно провести разумную оценку, если использовать при этом нужное
число членов. 'Зависящие от частоты величины сдвига фаз и степени моду-
ляции можно получить из тригонометрических преобразований импульсных
функций отклика. Запишем

/ F(X, f)sin со* dt

N(K = -1--------------------

W, 1)Л

О

оо

/ t)cos co? dt

D(A, co) ~ _2-----------------

/F(A, t)dt
о

(3.45)

(3.46)
Подставляя уравнение (3.44), получаем

\ Ъ а»(х)"тЛ*)2 , ”

ЛДЛ, <») = 2 --------------------/ S

1=1 1 4-<х»2т; (Л)2	‘ я 1

О(Л, со) =

” «i-Uhf(A)

= 1 1 + CO2Ti (Л)3 i~

(3.47)

(3.48)

Зависящие от частоты и длины волны величины фазового угла и степени
модуляции при этом равны



(3.49)

т(Л, со) = [ D (Л, со)2 + М(А, со)2 F

(3.50)

Для согласования наблюдаемых величин <р(Л, со) и т(Л, со) с рассчитан-
ными из уравнений (3.45) - (3.50) необходимо использовать метод наимень-
ших квадратов. Импульсные функции отклика должны при этом быть исправ-
лены с учетом тех значений а,. (Л) и т(- (Л), которые обеспечили бы наилуч-
шее согласование данных. В некоторых случаях эти величины могли бы
иметь физический смысл. Однако выведенные значения для at- (л) и тДЛ)
могли бы служить просто для эмпирического изображения импульсных функ-.
ций отклика. А затем эти функции можно анализировать по методу, опи-
санному Брандом и др. [6] и применимому для расчета мгновенных спект-
ров испускания. Следовательно, и импульсный, и фазово-модуляционный
методы могут дать одну и ту же информацию.

3.7.4.	Влияние гетерогенности в основном состоянии на
кажущиеся фазовые и модуляционные времена
затухания

Полезно рассмотреть тачные выражения, которые получаются для слу-
чая двухэкспоненциального закона затухания флуоресценции. Такие выра-
жения связывают уравнения (3.45) - (3.50) с полученными ранее уравнения-
ми (3.39) - (3.42). Для простоты не будем записывать точные выражения
для зависимости сдвига фаз и степени модуляции от частоты. Для двухэкс-
поненциального закона затухания из уравнений (3.47) и (3.48) имеем

а .сот"
/V(aiTi + а2т2) = -------—

1 + (»2Т2

а2ют^

1 +со2т|

(3.51)

«1Т1

1 + со2т2

a2T2

1 +со2т2

(3.52)

flfaiTi + a2T2) =
Напомним, что для случая гетерогенности в основном состоянии вклады
интенсивностей от отдельных состояний равны Д- » alTl-	и,кроме

того, тп,- = cos<р,- - (1 + со2!*3)4*. Следовательно, легко заметить, что урав-
нение (3.52) идентично уравнению (3.42). Аналогично доказывается идентич-
ность уравнений (3.51) и (3.41), если учесть соотношение для cos<p(- и тот
факт, что tg9f = sinф,-/cos ф,- .

Также полезно и показательно провести сравнение точного выражения
для фазового времени затухания с уравнением, которое получается для
средних) значения времени затухания. Для двухэкснонеипиального затухания флуо-
ресценции [ уравнение (3.28)] среднее время затухания можно рассчитать из уравне-
ния (3.4). Такой расчет дает

alTl + a2T2

Кажущееся значение фазового времени затухания можно получить из урав-
нения (3.49) при использовании равенства tg(ф) « сотР:

Sfaf.T?/(l+co\?)

тР= ---------------!—	(3.54)

т,- /(1 + Л*-)

В атом выражении весовой фактор для каждой компоненты равен
at- / (1 + со2т2), а не а(- , поэтому компоненты с более короткими временами
затухания имеют большие весовые факторы, а величина чР будет меньше
среднего времени затухания < т >. При увеличении частоты модуляции по-
вышается относительный вклад быстро затухающей компоненты, что приво-
дит к уменьшению кажущейся величины тЛ Используя основанные на анало-
гичных рассуждениях, но более сложные уравнения [ 43], можно показать,
что кажущееся модуляционное время затухания, рассчитанное из уравнений
(3.50) - (3.53), будет больше среднего времени затухания [ уравнение (3.53)].

Такое общее влияние гетерогенности в основном состоянии на кажущи-
еся значения фазового и модуляционного времен затухания показано на
рис. 3.13 и ЗД4. На рис. 3.13 проиллюстрирован случай смеси двух компо-
нент, когда интенсивности флуоресценции каждой из компонент равны. Ес-
ли принять времена затухания для этих компонент равными 4 нс, то
тР = т™=< т > независимо от частоты модуляции. Такое равенство указы-
вает на одноэкспоненциальный закон затухания флуоресценции. Когда же
времена затухания отдельных компонент различаются, величины тР и тт уже
не равны друг другу. Увеличение частоты модуляции приводит к уменьшению
кажущихся значений фазовых и модуляционных времен затухания. Фазовый
метод дает более короткие времена затухания, которые меньше среднего
времени затухания. Модуляционный метод более избирателен к долгоживу-
4	4

5	3

в	2

7	1

8	О

R1 Z 3	4	5	6	7

Мажущееся время затухания} нс

РИС. 3.13. Кажущиеся значения фазовых и модуляционных времен затухания
для смеси компонент с равными интенсивностями, но с различными временами за-
тухания (по данным [ 43]).

Данные получены для частот модуляции 14 и 28 МГц. Вклады интенсивностей от
каждой компоненты составляют 0,5. Значение < т > указано штриховой линией.

щим частицам, и полученные при этом величины тт больше среднего време-
ни затухания.

Эти рассуждения ил люстрирует рис. 3.14, на котором представлены
ожидаемые величины для случая смеси двух компонентов с временами за-
тухания 1 и 8 нс. В этом случае варьировали относительную интенсивность
каждого компонента. Для каждого раствора, в котором присутствует толь-
ко один компонент, четыре кажущихся значения времен затухания равны

Мажущееся Зремя затухания, нс

РИС. 3.14. Кажущиеся значения фазовых и модуляционных времен затухания
для двухкомлонентной смеси (1 и 8 нс) с различными вкладами интенсивностей от
отдельных компонент (по данным [43]).

Значение < т> показано штриховой пинией.
РИС. 3.15. Кажущиеся фазовые и модуляционные времена затухания для омеои
TNS и LAIJRDAN (поданным [42]).

Растворитель - этанол при 10°С. Времена затухания измерены относительно
эталонного соединения РОРОР при ~ 1,35 нс (разд. 3.8.1).

между собой. Когда присутствуют оба компонента, опять видно, что
т-Р < тти 0$е величин1>| уменьшаются при увеличении частоты модуляции.
Максимальная степень гетерогенности наблюдается в том случае, когда
оба компонента в смеси присутствуют примерно в равном количестве
(/; я. 0,5).

Влияние гетерогенности в основном состоянии на фактически изме-
ренные фазовые и модуляционные времена затухания показано на рис. 3.15.
Приведены данные для смеси TNS и LAURDAN. В таком растворе инди-
видуальные времена затухания равны примерно 8 и 4 нс соответственно.
Эти значения определены с помощью как фазового, так и модуляционного
методов на коротковолновом и длинноволновом краях спектра испускания.
В голубой области преобладает испускание TNS , а в красной - LAURDAN.
В центральной области перекрывания двух спектров (вблизи 460 нм) полу-
чают обычное соотношение между кажущимися величинами фазового и мо-
дуляционного времен затухания. В частности, фазовый метод, дает более
короткие кажущиеся значения времен затухания, чем модуляционный ме-
тод. Кроме того, увеличение частоты модуляции приводит к уменьшению
времен затухания, полученных обоими методами.

7-413
3.8.	Цветовой эффект фотоумножителей

Как для импульсных, так и для фазово-модуляционных измерений необ-
ходимо точно определять зависимость интенсивности возбуждающего све-
та от времени. Для импульсных измерений это временная зависимость ин-
тенсивности вспышки лампы. В фазово-модуляционном методе необходимо
установить фазу возбуждающего света и степень его модуляции. Такие
измерения для возбуждающего света обычно проводят , используя рассеян-
ный свет, поскольку он имеет нулевое время затухания. Чаще всего приме-
няют суспензии гликогена или коллоидный раствор диоксида кремния
(лудокса) в воде. Напомним, что временное разрешение ФЭУ зависит от ос-
вещаемой площади фотокатода, а также и от некоторых других факторов.
Поэтому при измерении флуоресценции и рассеянного света важно поддер-
живать постоянную геометрию системы. Для этого рассеивающий раствор
помещают в кювету и все наблюдения ведут в одних и тех же условиях,
однако регистрацию проводят не при длине волны испускания, а при длине
волны возбуждения. В зависимости от используемого метода измеряют ли-
бо профиль вспышки лампы, либо фазу и степень модуляции возбуждающе-
го света. Из-за влияния геометрии системы на временную характеристику
ФЭУ обычно лучше использовать рассеиватели, а не отражатели света.

Как было описано в гл. 2, на временные характеристики фотоумножи-
теля может влиять длина волны. Это, вероятно, является результатом за-
висимости энергии электронов, вылетающих с поверхности фотокатода, от
длины волны. Если имеется такая зависимость, то при сравнении флуорес-
ценции с рассеянным светом будут допущены ошибки, связанные с величи-
ной этого ’’цветового эффекта". Влияние этих факторов может быть весь-
ма значительным. Например, для разности длин волн 150 пм [26] вполне
возможны различия в 1 нс. Вероятно, так называемый цветовой эффект обу-
словлен как зависимостью временной характеристики фотокатода от длины
волны, так и оптическими факторами, связанными с тем, что рассеянный
свет и излучение флуоресценции дают различные изображения на фотокато-
де [ 27]. В предыдущих разделах уже отмечалось, что как в импульсных , так
и в фазово-модуляционных методах для определения величин ai и т; необ-
ходимо использовать данные, полученные с большой точностью. Очевидно,
что "цветовой эффект" может сильно затруднить такой анализ. К счастью,
существуют методы, позволяющие свести к минимуму влияние этого эффек-
та. Однако прежде всего необходимо максимально уменьшить наличие по-
бочных эффектов.

Для измерения времен затухания нужно выбирать фотоумножители
с минимальным "цветовым эффектом". Поскольку этот эффект вызван раз-
личием траекторий электронов, логичнее всего попытаться такое различие
уменьшить. Это осуществляют двумя путями. Во-первых, фотоумножитель
должен быть сконструирован так, чтобы можно было приложить высокую
разность потенциалов между фотокатодом и первым динодом, причем ое
надо постоянно поддерживать на постоянном высоком уровне - например,
используя диоды вместо резисторов. В этом случае эжектируемые элект-
роны очень быстро ускоряются на пути к первому диоду, что уменьшает
влияние различия в их траекториях. Во-вторых, в некоторые фотоумножите-
ли встраивают магнитные линзы, чтобы регулировать полет электронов.
Путь более быстрых электронов к первому диноду удлиняется, что пример-
но уравнивает времена пролета для всех электронов. Фотоумножители,
в которых приняты такие меры предосторожности и цветовой эффект сос-
тавляет только 50 пс для разности в длинах волн 100 нм, уже созданы.

3,8.1	„ Введение поправок на цветовой и/ или геометрический
эффекты при измерении времен затухания

Разработаны методы введения поправок во временные зависимости дан-
ных, полученных с помощью импульсных флуорометров [ 29, 30]. Они вклю-
чают умеренно сложные математические преобразования внутри и вне вре-
менного интервала. Эти методы не получили широкого распространения.
Кроме того, при их использовании надо получать больше данных и проводить
больше расчетов. По существу, необходимо установить тот факт, что для
стандартного соединения получаются приемлемые результаты (см. разд.3.9).
Если это не так, надо регулировать оптику и/или электронные устрой-
ства ФЭУ таким образом, чтобы зависящие от длины волны сдвиги не пре-
вышали 0,2 нс. Правд и др. [ 31] использовали простые поправки первого
порядка. Они предположили, что профиль вспышки лампы сдвигается во вре-
мени как целое из-за влияния цветового и/ или геометрических факторов.
Используя стандартное вещество с известным временем затухания, варьи-
руют временное смещение вспышки до тех пор, пока не достигнут мини-
мального значения х2. При этом требуемые смещения обычно составляют
~ 0,1 пс.

Значительно легче вводить поправки на указанные эффекты при изме-
рениях фазово-модуляционными методами. Длину волны наблюдения под-
бирают, используя эталонные соединения. Зная времена затухания флуорес-
ценции этих соединений, рассчитывают фазу и степень модуляции падающе-
го света, теперь уже не зависящие от описанных выше артефактов. Подоб-
ные "обратные" расчеты не были описаны для преобразования профиля вспыш-
ки лампы, полученного в виде сигнала от эталонного соединения.

Вместо обычных рассеивающих свет растворов можно применить стан-
дартные флуорофоры с известными временами затухания [ 27]. Такие стан-
дартные растворы позволяют получать сигналы, для которых известны соот-
ношения между фазой и степенью модуляции возбуждающего пучка света,
и тем самым избежать обычных проблем, встречающихся при использовании
рассеянного света. Флуоресценцию как стандарта, так и образца наблюдают
через интерференционный фильтр или через монохроматор, благодаря чему
сравнение этих двух сигналов незначительно меняет распределение по дли-
нам волн, регистрируемое с помощью фотоумножителя. И наоборот, срав-
нение рассеянного света с флуоресценцией приводит к значительным раз-
личиям в наблюдаемых длинах волн и полосах пропускания. Более того, ио-
пользование флуоресценции вместо рассеянного света уменьшает разницу
в пространственном распределении, которая возникает при сравнении флуо-
ресценции и рассеянного света [ 37] и приводит к ошибкам, связанным с
освещением различных участков фотокатода. Измеренные величины фазо-
вого угла и степени модуляции для эталонного образца, а также известное
значение его времени затухания используют для расчета фазы и степени
модуляции возбуждающего пучка света.

Из-за того что образец сравнения имеет конечное время затухания,
наблюдаемая разность фаз (фнабл) будет меньше той, которую наблюдают
в случае рассеянного света. Эту разность фаз можно исправить, зная
сдвиг фаз, обусловленный временем затухания эталонного флуорофора
(tr). Фазовый угол для эталонного раствора <pR, рассчитанный из извест-
ной величины времени затухания [ уравнение (3.6)], используют для рас-
чета реальной величины фазового угла <р для образца:

Ф = Фнабл+Фд	(3.55)

На основе исправленного значения фазового угла рассчитывают затем
фазовое время затухания исследуемого образца (т₽). Аналогично степень
модуляции для исследуемого образца, измеренная относительно флуорофо-
ра сравнения (тнабп), будет больше той, которая получилась бы при исполь-
зовании рассеянного света. Это происходит потому, что сигнал от образ-
ца сравнения сам демодулирован. Исправленное значение степени демоду-
ляции определяется выражением

т=шнабл(1 +	(3.56)

После этого степень демодуляции включают в расчет модуляционного вре-
мени затухания [ уравнение (3.7)]. Обе поправки можно вводить автомати-
чески, задавая единственное значение для tr.

Некоторые из удобных эталонных соединений приведены в табл. 3.1, а
их спектры испускания изображены на рис. 3.16. Для этих веществ можно
добиться высокой степени чистоты; их растворы легко приготовлять, и
они устойчивы. Кроме того, на времена затухания этих флуорофоров не
влияют тушение кислородом, длина волны регистрации и температура.
Все растворы готовят в этаноле (в продувке инертным газом нет необхо-
димости). Для каждого стандартного раствора можно использовать одно
эталонное значение времени затухания в температурном интервале от
Табпица 3..1, Эталонные соединения для
фазово-модуляционной
флуорометрии (по данным
[27])

Соединение Область длин волн, т> нса
нм

п-Т ерфенил6	310 - 410	1,05
РР1)	310 - 440	1,20
РРО	330 - 480	1,40
РОРОР	370 - 540	1.35
(Ме)2РОГОР	390 - 560	1,45

аТочнссть ! 0,2 нс при 10 и 30 МГц.

б Данные для растворов в абсолютном
эталоне; можно использовать одно и то
же эталонное время затухания для интер-
вала температур —55 -г +55°С..

Интенсивность флуоресценции (нормированная)

Длина. Волны, нм

РИС. 3.16. Спектры испускания флуоресценции короткоживущих эталонных
соединений.

(С разрешения авторов работы [ 27] И Elsevier Biomedical Press-)
-55 до+ 55°С при всех длинах,волн. Оптические плотности эталонного
раствора и исследуемого образца должны быть примерно одинаковы, чтобы
изображения на фотокатодс также были однотипны.

3.9„ Оценка характеристик аппаратуры для измерения

времен затухания

Описанные выше цветовые эффекты, а также другие факторы, такие,
как стабильность ламп и модуляторов света, могут привести к ошибкам в
измерении времен затухания. Без соответствующей проверки данного при-
бора незадолго до измерений и сразу после них трудно приписать опреде-
ленный физический смысл параметрам наблюдаемого многоэкспонснциаль-
ного закона затухания. Это справедливо как для импульсных, так и для фа-
зово-модуляционных измерений. В предыдущем разделе мы привели описа-
ние методов введения поправок на эти эффекты. Однако наиболее падеж-
ным методом, позволяющим судить о качестве аппаратуры, является ис-
следование соединений с известными временами затухания, для которых
закон затухания можно описать одной экспонентой. Для таких соединений
импульсная аппаратура должна дать только одно время затухания (см.
рис. 3.8). При использовании фазово-модуляционной аппаратуры должны по-
лучаться-одни и те же значения фазовых и модуляционных времен затуха-
ния независимо от частоты модуляции. Конечно, надо рассматривать произ-
ведение времени затухания на частоту и ограничения, накладываемые на
эти измерения (см. выше рис. 3.2 и связанное с этим вопросом обсуждение).

Для оценки качества аппаратуры удобно иметь набор стандартных сое-
динений с различными временами жизни. В табл. 3.2 приведены соединения,
которые мы считает подходящими для этих целей. Для указанных соедине-
ний характерен определенный диапазон времен затухания, что является важ-
ным аспектом при оценке любого прибора. Например, соединения с малыми
временами затухания (NADH и NATA) полезны при импульсных измерениях,
когда важно узнать, не вносит ли свертка закона затухания с функцией
вспышки лампы каких-либо ошибок в результаты. Такие соединения с малы-
ми временами затухания могут также принести пользу при оценке (разо-
вых измерений, так как короткие времена затухания должны хорошо вос-
производиться с помощью фазовых данных. Эти соединения полезны также
при оценке модуляционных измерений. Обычно степень демодуляции слиш-
ком мала для получения точных значений модуляционных времен затухания.
Однако эти кажущиеся значения времен должны находиться в области вбли-
зи истинного значения. Если это не выполняется, метод модуляции нена-
дежен для измерений других похожих времен затухания.

В табл. 3.2 мы также приводим ряд эталонных соединений с большими
временами затухания, таких, как DENS и хинин, особенно пригодных для
критической оценки фазовых измерений. Фазовые углы велики, и поэтому
Соединение	Растворитель	т, нс	Литература
N АПН а	Фосфат натрия 0,1 М, pH 7,5; 20 °C	0,4	17, 28
NATA6	Фосфат натрия 0,1 М, pH 7; 20 ° С	3,0	32, 33
9-Цианоантра- цен	Абсолютный этанол, в присутствии кис- лорода воздуха; 20°С	11,8	2, 27
Хининбисуль- фат	IIaSO4 0,1 н; 23°С	18,9	34, 35
DENS а	Трис 0,01 М с КС1 0,05 М, pH 7,5; 20°С	29	27, 36

^Затухание NADH может не быть одноэкспоненциальным ([28]), но он яв-
ляется удобным стандартом с коротким временем затухания.

Я

Время затухания NATA зависит от температуры, поэтому необходим
тщательный контроль температуры. Во многих лабораториях считают, что
затухание N АТА является одноэкспоненциальным. Затухание триптофана
может быть двухэкспоненциальным ([ 32]), но амплитуда короткоживущей
компоненты мала.

BDENS можно также растворять в 0,05 М фосфате,pH 7,8 ([Зб]).

небольшие ошибки в величине ф приводят к большим ошибкам в расчетных
значениях времен затухания (см. рис. 3.2). 9-Пишюантрацен - хороший
стандарт для области средних значений времен затухания, поэтому
для широко используемых частот модуляции (6 - 30 МГц) можно ожидать
совпадения величин тР и тт. Аналогично при импульсных измерениях долж-
на получаться единственная константа затухания.

Задачи

3-1. Зависимость фазовых и модуляционных измерений времен затухания от
частоты. Предположим, что фазовый флуорометр может работать на трех часто-
тах: 1, 10, и 100 МГц. Кроме того, предположим, что нужно измерить время за-
тухания флуоресценции белка (около 2 нс), связанной с белком DNS (-'•'20 нс) и
связанной с белком пиренмасляной кислоты (	200 нс). Какая частота и какой

метод (фазовый или модуляционный) дали бы наиболее точные результаты для
каждого из образцов ?

а)	Рассчитайте фазовый угол и степень демодуляции для каждого времени за-
тухания и для каждой частоты.
б)	Предположим, что измерения фазового угла проведены с точностью ±1°, а
степени демодуляции - с точностью ±0,01. Рассчитайте ожидаемый разброс для
каждого образца при каждой из частот.

в)	Укажите частоту и метод, выбранные для каждого образца.

3-2. 'Влияние рассеянного света н а измерения времен затухания. Предполо-
жим, что измеряют время затухания флуоресценции связанного с мембраной бел-
ка, действительное время затухания которого предполагается равным 4,0 нс. Об-
разец мутный и рассеивает 10% падающего на него возбуждающего света. Предпо-
ложим, что о присутствии этого рассеянного света не подозревают и регистрируют
его как испускание.

а)	Предскажите значения величин фазового и модуляционного времен затухания,
которые наблюдались бы при использовании частоты модуляции 30 МГц, и сравни-
те эти величины со средним временем затухания.

б)	Какой метод более чувствителен к присутствию рассеянного света?

в)	Объясните гомогенность образца из измеренных значений времен затуха-
ния.

г)	Предскажите вид импульсной функции отклика, которая должна получить-
ся из обратной свертки с помощью метода наименьших квадратов. Предположите
при этом, что нулевая компонента времени затухания представляет собой компо-
ненту, с небольшим временем затухания т = 0,1 нс.

3-3. 'Влияние гетерогенности в основном состоянии на измерения времен зату-
хания. Предположим, что имеется смесь антрацена (4,2 нс) и 9-цианоантрацена
(11,8 нс).

а)	Предскажите вид закона затухания на длине волны, где вклад каждого фпуо-
рофора в интенсивность в стационарном состоянии составляет 50%.

б)	Предскажите величины фазового и модуляционного времен затухания для
частот модуляции 10 и 30 МГц, а также величину среднего времени затухания.
ГЛАВА4.

Фазочувствительный метод
регистрации флуоресценции

Фазочувствительный метод регистрации флуоресценции (ФЧРФ), раз-
работанный сравнительно недавно, перспективен для физических, химичес-
ких и биологических исследований. Он основан на принципах, обсуждавших-
ся в гл. 3 (измерения времен затухания флуоресценции фазовыми и модуля-
ционными методами). В данной главе будет рассмотрено применение метода
для анализа образцов, гетерогенных в основном состоянии. В одной из
следующих глав мы обсудим возможности изучения реакций в возбужденных
состояниях»

Как и при измерениях времен затухания флуоресценции методом фазо-
вого сдвига, образцы возбуждают светом, интенсивность которого модули-
рована по синусоидальному закону. Интенсивность флуоресценции регист-
рируют с помощью фазочувствителыюго детектора (задираемого усили-
теля). При этом селективно ослабляют сигнал от отдельных флуорофоров в
зависимости от их времен затухания или, правильнее, от фазовых углов,
измеренных по-отношению к фазе модулированного возбуждающего света*
Можно, используя метод ФЧРФ, подавить испускание одного какого-либо
вида частиц или, точнее, подавить испускание с каким-либо определенным
фазовым углом. Тогда регистрируется фазочувствительный спектр испус-
кания остальных флуорофоров. Для двухкомпопептной смеси можно подавить
испускание одного из компонентов, чтобы наблюдать спектр испускания толь-
ко другого компонента* Этот способ экспериментально прост, и для его
осуществления можно использовать имеющееся в продаже оборудование.

Фазочувствительпая регистрация флуоресценции впервые была приме-
нена в биохимических исследованиях лишь недавно (1, 2]. Тем не менее со-
вершенно очевидно, что возможности метода довольно широки. С юда вхо-
дят идентификация и выделение гетерогенной флуоресценции белков и мемб-
ран, количественные исследования реакций связывания макромолекул, а
также изучение реакций в возбужденных состояниях и дипольной релакса-
ции растворителя. Со всеми этими явлениями часто встречаются при приме-
нении методов флуоресцентной спектроскопии в биохимических исследова-
ниях, и в таких случаях очень полезно использовать метод фазочувстви- '
тельной регистрации флуоресценции.
4.1.	Теория фазочувствительного метода регистрации
ф луоресценции

В фазовом флуорометре образец облучают светом, интенсивность кото-
рого модулирована по синусоидальному закону с круговой частотой моду-
ляции ы (рис. 4.1,пунктирная линия). Известно, что независимо от слож-
ности (подчиняется ли испускание одно-, много- или неэкспоненциалыюму
закону) оно также будет меняться по синусоидальному закону, но будет

возбуждение

Испускание

Фазочувс/пбительные спектры флуоресценции

Фл-Фа*90°	фо~ срд-90°

РИС. 4.1. Схематическое списание метода фазочуествитепьной регистрации
флуоресценции.

(С разрешения авторов работы [ 1] и Elsevier Biomedical Press.)
сдвинуто на фазовый угол ср и демодулировано с коэффициентом m по отно-
шению к возбуждающему свету (рис. 4.1, сплошная линия), /(ля затухания,
описываемого одноэкспонепциальпым законом, которое можно ожидать
для чистых флуорофоров в жидком гомогенном окружении, время затуха-
ния флуоресценции т можно рассчитать, зная фазовые сдвиги и коэффици-
енты демодуляции. При этом используют следующие соотношения:

tgcp  сот ; ш -- (1 -I oo2T2)~w	(4.1), (4.2)

Однако если образец представляет собой или смесь двух флуорофоров или
один флуорофор, вступающий в возбужденном состоянии в одностадийную
реакцию, закон затухания флуоресценции будет двухэкспопенциальным..
Мцогоэкспонопциальные законы затухания могут появиться в случае много-
стадийных реакций, а еше более сложные законы затухания наблюдаются
при континуальной релаксации. При этом все еще можно измерять фазовые
углы и коэффициенты демодуляции, но эти величины, интерпретируемые с
помощью уравнений (4.1) и (4.2), дают только кажущиеся, по не реальные
времена затухания. В принципе величины ф и т, особенно измеренные при
различных частотах модуляции, можно использовать для расчета истинных
значений времен затухания и относительных интенсивностей флуоресценции
испускающих частиц (см. разд. 3.7). Практически же измерения крайне слож-
ны, и требуется большая точность измеряемых величин. Именно поэтому
фазовые методы не использовались достаточно широко для изучения флуо-
ресценции гетерогенных образцов.

Фазовый флуорометр, снабженный аппаратурой для фазочувствитель-
ной регистрации флуоресценции, может быть использован для разделения
гетерогенной флуоресценции. Рассмотрим образец, содержащий флуоресци-
рующие частицы одного вида с временем затухания т. При возбуждении си-
нусоидально модулированным светом интенсивность флуоресценции будет
меняться по закону

F(f) Н M/jnsin(coi —<р)	(4.3)

где mL - степень модуляции возбуждающего света; тп- коэффициент де-
модуляции, обусловленный конечным Е?ременом затухания флуоресценции;
со - круговая частота модуляции.

4’;си)чувств1гг1'лып>1й детектор дает прямой токовый сигнал, пропо[>
циональпый амплитуде модуляции и косинусу угла, равного разности фазо-
вых углов детектораф/? и образца. Если, используя фазочувстнительпую
регистрацию, сканируют по спектру испускания, то наблюдают зависимость

/‘(А, Фр)~ A/' (A)cos (фу - ф)	(4.4)

где /'’(А) - спектр стационарной флуоресценции; А - длина волны; k - кон-
станта, в которую входят обычные сомножители, характеризующие обра-
зец и измерительную аппаратуру, а также постоянный множитель С по-
мощью уравнения (4.4) можно определить форму фазочувствительного
спектра однокомпонентного раствора при различных фазовых углах детек-
тора. Можно ожидать, что интенсивность спектра будет меняться как
cos(<pD - ф), а спектральное распределение останется неизменным.

Предположим теперь, что образец представляет собой смесь двух флуо-
рофоров (Л и В), времена затухания флуоресценции которых тл и тв не за-
висят от длины волны испускания (рис. 4.1). Для того чтобы при измерени-
ях методом ФЧРФ спектры Л и Рне налагались, фазовые углы (фл и срв)
или времена затухания должны быть различными. Предположим, что
тл < Тд. Зависимость флуоресценции от времени определяется выражением

F(A, f) = FA(A)rn4sm(cot -фЛ) + FB(A)mB sim(coi -cpB)	(4.5)

где Fa (А) и FB(A) - интенсивности, соответствующие компонентам Л и В
при длине волны X в стационарном спектре. Важной характеристикой моду-
лированного испускания является то, что оно представляет собой суперпо-
зицию синусоидальных волн одной и той же частоты, но с различными фан-
зовыми углами, каждая из которых соответствует одному из флуорофоров
(рис. 4.1). Модулированное испускание удобно исследовать с помощью фа-
зочувствительного детектора или запираемого усилителя. Результирую-
щий демодулированный сигнал можно записать в виде

Р(Х, <pD) = Гд(Л)тл соб(фр -Фд) + FB(A)7nBcos(<pD -фВ)	(4.6)

Уравнение (4.6) иллюстрирует важное положение. Детектор фазы мож-
но подобрать таким образом, что он будет находиться в противофазе
1 ф/ - ф£)( -- 90° с испусканием любой компоненты. Для случая смеси флуо-
рофоров детектор может находиться в противофазе с испусканием одного
из компонентов смеси. Тогда результирующий фазочувствительный спектр
содержит вклады только остальных компонентов смеси. В случае образца, представ-
ляющего собой, смесь двух флуорофоров, можно подавить флуоресценцию любого
из компонентов смеси. Тогда записанный фазочувствительный спектр будет
представлять собой стационарный спектр второго компонента. Это явление на-
зывается фазовым подавлением. Например, рассмотрим спектр частиц Л
(рис. 4.1). Если фо = фл + 90°, частицы Л не дают вклада в фазочувстви-
тельный спектр. При таком фазовом угле фазочувствительный спектр оп-
ределяется выражением

^(А, фл + 90°) = /?в(Х)тВ81п(фв -фл)	(4.7)

Сканирование по длинам волн дает 1?в(л) — стационарный спектр частиц В.
Наоборот, если фр =	- 90°, имеем

^(А, фв — 90°) = FA(h)mA81п(фв -фл)	(4.8)
Испускание частиц Н подавлено, и сканирование по длинам волн испуска-
ния даст стационарный спектр Ед(л) частиц Я.

Заслуживают упоминания некоторые аспекты фазового подавления
спектров. Как уже было показано, для двухкомнонентпой смеси подавление
испускания каждого из компонентов приводит к ослаблению испускания дру-
гого компонента. Точнее, исходная модулированная интенсивность каждо-
го спектра уменьшается пропорционально sin(<p -<р4). Следовательно,
разделение спектров компонентов зависит лишь от разности фазовых углов
между двумя испусканиями, а но от абсолютных величин *л’их фазовых углов
или времен затухания. Фазовое разделение спектров сильно затруднено, ког-
да фазовые углы или времена затухания флуоресценции компонентов ста-
новятся одинаковыми. Очевидно, если срй • подавление испускания од-
ного из компонентов приводит к одновременному подавлению спектра другого компо-
нента. Необходимо также понимать, что спектр каждого из компонентов затем ослаб-
ляется пропорционально коэффициенту тА или тд, которые связаны с временами за-
тухания флуоресценции компонентов Л и В уравнением (4.2). Это означает
что фазочувствительный сигнал от частиц с большими временами затуха-
ния будет меньше сигнала от частиц с более коротким временем затухания.
Если же хотят на основе фазе чувствительных интенсивностей провести
оценку количества каждого компонента в смеси, необходимо учитывать
коэффициенты демодуляции [ 11].

Важно, что для смеси флуорофоров па основе выбранных фазовых уг-
лов можно рассчитать времена затухания флуоресценции частиц каждого
вида. Если известен стационарный спектр одного из видов частиц, можно
подобрать cpD таким образом, чтобы фазочувствительный спектр наложился
па стационарный спектр. Например, если известен F4(A), можно выбрать
<PD так, чтобы получить фазочувствительный спектр, перекрывающийся с
/'д(А), Выбранный фазовый угол должен иметь разность фаз 90° с испуска-
нием частиц F, и его можно использовать для расчета времени затухания
флуоресценции этого вида частиц. Везуслошю, с помощью обратной проце-
дуры можно получить время затухания флуоресценции частиц А, В случае
двухкомпонентной смеси метод фаючувствительной регистрации флуоресценции поз-
воляет определить времена затухания обоих компонентов смеси, если известен
стационарный спектр одного из компонентов. Это минимальное требование;
удовлетворяется во многих экспериментальных случаях.

Фазочувствительную регистрацию флуоресценции легко осуществить
на фазовом флуорометре, к которому присоединен запираемый ускоритель. 'Какие*
приборы похожи на стационарные флуорометры, за исключением того, что в
них имеются модуляторы света и устройства, позволяющие количественно
определять фазовые углы и коэффициенты демодуляции (рис. 4.2). Обычно
используют диапазон частот модуляции G - 30 МГц, поскольку такие часто-
РИС. 4.2, Блок-схема фазового флуорометра с фазочувствительным детекто-
ром.	(.

Хе — ксеноновая лампа; М — монохроматор; МДС - модулятор Дебая - Сирса;
РЛ - устройство для расщепления светового пуча; Ф — оптические фильтры; О — об-
разец; ФЭУ — фотоумножитель; Ст - эталонный фпуорофор. (С разрешения авторов
работы [ 1] И Elsevier Biomedical Press.)

ты дают возможность измерять сдвиги фаз и коэффициенты демодуляции
для образцов с типичными временами затухания, равными ~1() пс [ уравне-
ния (4.1) и (4.2)]. Во многих приборах значения <р и тине измеряют при та-
ких высоких частотах. Лучше, чтобы коэффициент усиления фотоумножите-
ля был модулирован с несколько иной частотой и результирующий взаимно-
коррелированный сигнал содержал информацию об исходной фазе и модуля-
ции (см. разд. 3.6.2). Во многих приборах частоты взаимной корреляции
близки к 20 Гц. Однако фазочувствительная регистрация низкочастотных
сигналов позволяет проводить разделение спектров, показанное на рис. 4.1.
Ее легко осуществить, причем нет необходимости учитывать возможные ис-
кажения, вызванные настроенными высокочастотными контурами. Сигнал
сравнения поступает в фазочувствительный детектор от второго фотоумно-
жителя, регистрирующего испускание флуорофора сравнения (рис. 4.2). Пос-
ле выбора фазового угла детектора фазочувствительные спектры получают
обычным образом, сканируя испускание по длинам воли.

4.2.	Анализ гетерогенной флуоресценции с помощью метода
фазочувствительной регистрации

Одним из применений метода ФЧРФ является анализ образцов, содержа-
щих несколько флуорофоров. Такие образцы часто встречаются при биохи-
мических исследованиях (например, белки с двумя или более триптофане-
ными остатками). Белок, содержащий два триптофановых остатка, можно
легко смоделировать, используя смесь индола и диметил индола. Спектры
испускания и времена затухания флуоресценции индола и диметилиндола
различаются (рис. 4.3}; подобная ситуация может иметь место в случае,
когда триптофановые остатки находятся в различных областях молекулы
белка. В выбранном растворителе времена затухания для индола и DMI сос-
тавляют 9 и 2,5 нс, тогда как максимумы испускания находятся около 306
и 323.нм соответственно.

/(ля непосредственной записи спектров индола и DMI , находящихся в
смеси, можно применить метод фазочувствительной регистрации флуорео 1
ценции. Удобно использовать растворы, содержащие только один из флуо-
ресцирующих компонентов; тогда можно выбрать фазовый угол детектора,
отличающийся по фазе на 90е' от испускания частиц этого вида. Это экви-
валентно тому, что мы знаем время затухания для одного компонента и
подбираем фазовый угол детектора, чтобы он находился в противофазе с
этим временем затухания или фазовым углом. В рассматриваемом приме-
ре, исходя из раствора индола, подобрали фазу детектора так, чтобы он
находился в противофазе с этой спектральной компонентой. Далее было об-
наружено, что фазочувствительный спектр смеси в точности совпадает со
стационарным спектром DMI (рис. 4.3). Наоборот, когда была выбрана фа-
за детектора, находящаяся в противофазе с испусканием DMI , было найде-
но, что фазочувствительный спектр смеси совпадает со стационарным спек-
тром индола. При описанной выше методике использовали фазы индивиду-
альных соединений, чтобы подавить каждое из испусканий. Другой способ -
регистрация стационарных спектров индивидуальных соединений. В этом
случае следовало бы анализировать фазочувствительные спектры, получен-
ные при нескольких значениях фазового угла детектора, и выбрать тот фа-
зовый угол, при котором наблюдается совпадение с нужным стационарным
спектром. В любом случае фазовые углы, выбранные для подавления флуо-
ресценции тех или иных частиц,можно использовать для расчета затухания
флуоресценции тех частиц, испускание которых подавлено. Например, при
частоте модуляции 10 МГц фазовый угол, соответствующий времени зату-
хания 2,5 нс для DMI , равен 8,9°. Когда фазовый детектор смещен от это-
го значения примерно на 90°(9,7° + 90°), испускание DMI подавлено и фа-
зочувствительный спектр представляет собой спектр индола...Наоборот,
фазочувствительный спектр смеси подобен стационарному спектру DMI
в том случае, когда фазовый детектор смещен на 90° по отношению к фа-
зовому углу индола (28,6° - 90°). Этот фазовый угол соответствует подав-
лению флуоресценции соединения, имеющего время затухания 9 нс, что при
таких условиях равно времени затухания индола.

Важно понимать, что на данном этапе развития метод ФЧРФ с одной
частотой модуляции нельзя применять для определения обоих спектров и
времен затухания флуоресценции компонентов в двухкомпонептпой смеси.
РИС. 4.3. Стационарные и фазочувствительные спектры испускания индола,
диметилиндола и их смеси (по данным [ 2]).

Использованы растворы в додекане(2О °C ), из которых пропусканием азота
удален растворенный кислород.

Для полного разделения спектров в такой смеси необходимо из дополни-
тельных независимых измерений знать либо один из спектров испускания,
либо одно из времен затухания. Несмотря на это ограничение, метод ФЧРФ
может оказаться весьма полезным для установления гетерогенности ис-
пускания данного образца, даже если индивидуальные спектры или времена
затухания неизвестны и не разделены однозначно. Для решения подобной
задачи записывают фазочувствительные спектры при различных фазовых
углах. Время затухания для каждого отдельно взятого соединения обычно
не зависит от длины волны испускания. Безусловно, существуют исключе-
ния для вязких растворов, для реакций в возбужденных состояниях и даже
для чистых соединений. Для флуорофоров, имеющих единственное не зави-
сящее от длины волны время затухания флуоресценции, можно ожидать,,
что распределение интенсивности в фазочувствительных спектрах не будет
co
1
rfb-



Co

РИС. 4.4. Фазочувствительные спектры испускания индола и диметилиндола [ 2].
Фазочувствитель на я срлуорес ценция

Рис. 4.5. Фазочувствительные спектры испускания смеси индола и диметипиндопа [2].
зависеть от фазового угла детектора <pD. Это может быть связано с тем,
что испускание на каждой длине волны имеет одинаковый фазовый угол и,
таким образом, полный спектр испускания изменяется с <pD согласно урав-
нению (4.4). Такая картина наблюдалась для растворов и индола, и DMI
(рис. 4.4). Конечно, интенсивность в фазочувствительном спектре меняется
как cos (<pD -<pf), но анализ спектра показывает, что его форма и положе-
ние максимумов испускания (см. рис. 4.6) не зависят от фо. Наоборот, при
исследовании смеси флуорофоров обнаружено, что фазочувствительные
спектры зависят от фазовых углов детекторов. Это показано на рис. 4.5
для смеси индола и DMI . Максимумы фазочувствительных спектров находи-
лись при 320 и 310 нм для фазовых углов детектора, равных соответствен-
но 165 й 120°. На рис. 4.6 приведена зависимость положения максимумов
фазочувствительных спектров от фазового угла детектора. Явная зависи-
мость положения максимумов испускания от фазы детектора для смеси и
отсутствие такой зависимости для индивидуальных соединений может слу-
жить критерием для распознавания гомогенных и гетерогенных образцов.

Разделение спектров методов ФЧРФ основано на различии времен за-
тухания флуоресценции двух компонентов. Интересно оценить, каково долж-
но быть это различие для того, чтобы можно было провести достаточно хо-
рошее разделение спектров.'Возможность применения этого метода для
разделения компонентов с примерно одинаковыми временами затухания по-
казана на примере смеси производных триптофана и тирозина. В качестве последних
служили К-йпетил-ЬТирозинамид (NATrA) и Н-ацетил-Ь-Триптофанамид (NATpA). Ана-
лиз такого образца методом ФЧРФ является трудной задачей, поскольку его необхо-
димо возбуждать ультрафиолетом и особенно потому, что соединения имеют
сходные времена затухания флуоресценции, различающиеся лишь на 1 нс.
Фазочувствительные спектры смеси NATrA и NATpA приведены на рис. 4.7.
На нижней части рисунка изображены стационарные спектры NATrA и
В 4ТрА, из рассмотрения которым видно, что спектр может совпадать со
стационарным спектром производного триптофана, когда фазовый угол де-
тектора равен 109°. При таком угле подавлено испускание тирозина. Мож-

РИС. 4.6. Определение гетеро-
генной флуоресценции по положению
максимумов фазочувствительных
спектров флуоресценции [ 2].

| 320

§

Й £

6 Й

i I

£ 310

300

Фазовый угол детектора, град
РИС. 4.7. Разделение флуоресценции тирозина и триптофана методом фазочув-
ствительной регистрации флуоресценции [г].

Растворы содержали 0,025 М трис-хлорида, pH 7,5; 20 °C. Длина волны возбужде-
ния 280 нм. Оптические плотности NATr А и NATpA в смеси 0,42 и 0,10 соответст-
венно.

но подсчитать, что для этого компонента время затухания будет равно
1,8 нс. Когда же<р0 = 121°, фазочувствительный спектр аналогичен стацио-
нарному спектру тирозина. Время затухания для соединения, флуоресцен-
ция которого при таком фазовом угле подавлена, равно 3,2 нс. Рассчитан-
ные значения времен затухания флуоресценции хорошо совпадают с непос-
редственно измеренными для NATr А (1,8 нс) и NATpA (2,9 нс).
В качестве последнего примера разделения гетерогенной флуоресцен-
ции методом ФЧРФ приведем случай прямой зашей спектров смеси дибензо-
[ с, ^карбазола (DBC) и дибензо[а, h] антрилена (DBA) рис. 4.8). Спектры испуска-
ния каждого из 'утих соединений сильно структурированы и имеют ряд различных
максимумов испускания. При непосредственной записи спектре! смеси эти максимумы
еще видны. Данным примером мы хотим показать, что разрешение по дли-
нам волн, которое можно получить методом ФЧРФ, по существу идентично
разрешению, получаемому при использовании методов стационарного сос-
тояния. Кроме того, он дает возможность сравнить метод ФЧРФ с импульс-
ной флуорометрией. Для разрешения индивидуальных спектров с помощью
последнего метода потребовалось бы провести измерения кривых затуха-
ния флуоресценции при каждой выбранной длине волны испускания. Естест-
венно, что для этого требуются большие затраты рабочего времени. Напро-
тив, скорость записи фазочувствительного спектра примерно та же, что и

Длина Оолнь/, нм

РИС. 4.8. Стационарные спектры и спектры, полученные подавлением фазы, для
смеси дибензо[ с, g]Kap6a3ona и дибензо[ а, Ь];антрацена.

(С разрешения авторов работы [ 1] И Elsevier Biomedical Press.)
стационарного спектра. Для полноты описания отметим также, что недав-
ние исследования в области импульсной флуорометрии привели к значитель-
но более быстрому разделению на отдельные спектральные компоненты на
основе индивидуальных значений времен затухания [ 3].

4.3.	Перспективы применения метода ФЧРФ для разделения
гетерогенной флуоресценции

Поскольку применение метода ФЧРФ находится еще на самом начальном
этапе, нам представляется очень важным суммировать все его потенциаль-
ные возможности и ограничения. Приведенные выше результаты были по-
лучены без усреднения сигнала, а интенсивность испускания без какой-ли-
бо необходимости была уменьшена в семь раз. Обычно отношение сигнал/шум
в фазочувствительных спектрах превышает то, которое показано на
рис. 4.3 и 4.8. Из анализа степени совпадения фазочувствительных спект-
ров со спектрами стационарной флуоресценции отдельных компонентов яс-
но, что времена затухания необходимо определять с точностью ±0,1 нс [1].
Безусловно, для этого надо знать и стационарный спектр каждого компонен-
та. Потенциальное разрешение по временам затухания вместе с разрешени-
ем по длинам волн, сравнимым с разрешением в стационарных спектрах,
должно обеспечить регистрацию небольших изменений в значениях времен
затухания или квантовых выходов флуоресценции компонентов. Такая чувст-
вительность должна свидетельствовать о ценности данного метода для ана-
лиза любого образца с гетерогенным испусканием.

Существующие в настоящее время фазовые флуорометры работают только на
фиксированных частотах модуляции. При этом ограничении кажется маловероятным
успешное проведение анализа смесей, состоящих более чем из двух компо-
нентов. Поэтому особенно многообещающим является комбинация фазочувст-
вительного детектора флуоресценции с фазовым флуорометром с изменяе-
мой частотой модуляции. Уже создано несколько приборов с изменяемой
частотой ([ 4}; Греттон, частное сообщение), и, по-видимому, не существует
каких-либо технических трудностей, которые бы помешали присоединить к
такому флуорометру фазочувствительный детектор.

Интересно также сравнить метод ФЧРФ с другим, импульсным методом
получения мгновенных спектров испускания (МСИ) [ 5, 6]. При использова-
нии МСИ образец возбуждают коротким импульсом света, затем записывают
спектры через определенные заданные промежутки времени после момента
возбуждения. Техника мгновенных спектров флуоресценции обладает огром-
ными потенциальными возможностями и имеет большое практическое значе-
ние, и мы здесь не будем сравнивать эти методы. Однако одно преимущест-
во метода ФЧРФ заслуживает упоминания. В методе МСИ в любой момент
времени оба флуорофора дают вклад в испускание. Можно выбрать некото-
рый интервал времени для частичного выделения флуоресценции любого из
флуорофоров, но с помощью такой методики полностью провести разделение
спектров невозможно. Более того, разделить спектры таким образом ока-
зывается еще труднее, когда времена затухания флуорофоров становятся
сравнимыми. Напротив, с помощью метода ФЧРФ можно почти полностью
подавить испускание одного из компонентов. Кроме того, легко провести
разделение спектров флуорофоров, имеющих близкие времена затухания
флуоресценции, что было показано на примере спектров испускания произ-
водных тирозина и триптофана (см. рис. 4.7). В настоящее время разделе-
ние спектров методом ФЧРФ проводится гораздо быстрее, и мало вероят-
но, что это преимущество данного метода в будущем исчезнет, так как
оно связано с высокой циклической производительностью фазовых изме-
рений по сравнению с импульсными. В методе ФЧРФ данные получают поч-
ти непрерывно. Напротив, в методе МСИ большая доля полного рабочего
времени уходит на ожидание прихода фотона. Новые методы анализа кри-
вых затухания [ 3] могут уменьшить время, необходимое для исследова-
ния гетерогенных в основном состоянии образцов.

В конечном счете разрешение по длинам волн и по временам затухания
флуоресценции, которое можно получить методом ФЧРФ, по-видимому, не
ограничивается только возможностями прибора, а связано главным об-
разом с гетерогенными свойствами самих флуорофоров. Например, даже
в белках, содержащих единственный триптофановый остаток, времена за-
тухания зависят от длины волны испускания [7]. Более того, другие авто-
рькотмечали, что затухание флуоресценции триптофана и белков описыва-
ется многоэкспоненциальным законом [8 - 10]. Различия во временах
затухания, полученных при разных длинах волн наблюдения (~ 1 нс), пре-
вышают разрешающую силу метода ФЧРФ (< 1 нс). Эта внутренняя гетеро-
генность, вероятно, и является главным препятствием, мешающим разре-
шить гетерогенную флуоресценцию белков методом ФЧРФ. Однако в рав-
ной степени очевидно, что этот метод упростит анализ такого сложного
испускания.

И наконец, метод ФЧРФ, вероятно, принесет большую пользу при ана-
лизе связывания лигандов с биологическими макромолекулами или факти-
чески при анализе любого равновесия между двумя состояниями. Спект-
ральные свойства флуорофоров часто изменяются при связывании или при
изменении природы окружения. Высокая чувствительность флуоресцентных
методов позволяе,т изучать флуорофоры в разбавленных растворах, кото-
рые необходимы при измерениях больших констант ассоциации. Польза ме-
тода ФЧРФ для таких исследований очевидна [ 11]. В общем случае при свя-
зывании флуорофоров с макромолекулами изменяются времена затухания
флуоресценции. Флуоресценцию лигандов, находящихся в свободном и в
связанном состоянии, можно либо раздельно регистрировать, либо, наобо-
рот, подавлять, выбрав определенный фазовый угол детектора. В подобных
исследованиях можно использовать контрольный образец, представляющий
собой либо несвязанный, либо полностью связанный флуорофор. С его по-
мощью подбирают фазу детектора таким образом, чтобы подавить испуска-
ние одной из форм. В этом случае интенсивность фазочувствительной флуо-
ресценции пропорциональна концентрации флуорофора, флуоресценция ко-
торого не подавлена.

Задачи

4-1» На рис. 4.9 изображены спектры стационарной флуоресценции TNS ,
PRODAN и смеси этих двух флуорофоров. Фазочувствительные спектры смеси сов-
падают со стационарными спектрами чистых соединений (рис. 4.10) при указан-
ных значениях фазовых углов детектора, которые приведены по отношению к фа-
зе падающего овета. Рассчитайте времена затухания флуоресценции TNS и
PRODAN.

4-2. 'Предположим, что флуоресцентный зонд 1-диметиламино-5-нафталин-
сульфоновая кислота (DNS) связан с молекулой сывороточного альбумина (BSA).
Предположим далее, что квантовый выход флуоресценции DNS увеличивается при
связывании в два раза и что времена затухания для свободной и связанной форм
равны сортветственно 5 и 10 нс. Используйте следующие данные дпя расчета про-
центного содержания свободной DNS и связанной с молекулой альбумина в случае,
последнего из указанных ниже растворов:
to

TNS a PRODAN

&

<ь
л
h
Л 5

?
N

с»

&
Q
%-

102,8 °

(^д53,5°

WO	4W

WO	520	560

Длина волне/, нм







РИС, 4.10. Фазочувствительные спектры смеси TNS и PRODAN.
(С разрешения авторов работы [ 1 ] И Elsevier Biomedical Press.)

Образец

DNS (10~в М)

DNS (10-6 М) + избыток BSA'

DNS (10~в М) + Ю-^М BSA

С

Интенсивность
фазочувствительной флуоресценции при
<PD = 17,4° + 90° фр = 32,1 ° — 90°

0	1,0

1,776	0

0,806	0,50

Частота модуляции равна 10 МГц. Объясните также разницу в интенсивностях дпя
первых двух растворов.
ГЛАВА5.

Поляризация флуоресценции

При возбуждении поляризованным светом испускание флуоресцирующе-
го образца также поляризовано. Поляризация является результатом фото-
отбора флуорофоров в соответствии с их ориентацией по отношению к нап-
равлению поляризованного возбуждения. Испускание может быть деполяри-
зовано по ряду причин, относительная важность которых зависит от иссле-
дуемого образца. Вращательная диффузия флуорофоров - одна из общих
причин деполяризации. Измерения поляризации или анизотропии выявляют
среднее угловое смещение флуорофора, которое происходит между поглоще-
нием и последующим испусканием фотона. Оно зависит от скорости и степе-
ни вращательной диффузии за время жизни возбужденного состояния. Диф-
фузионные движения в свою очередь зависят от вязкости растворителя и
размеров и формы диффундирующих частиц Например, для флуорофора, на-
ходящегося в растворе, скорость вращения зависит от вязкого сцепления,
накладываемого на флуорофор растворителем. В результате изменение вяз-
кости растворителя будет приводить к изменению анизотропии флуоресцен-
ции. Обнаружение зависимости анизотропии флуоресценции от вращательной
диффузии привело к многочисленным применениям этого метода в биохими-
ческих исследованиях. В качестве примера отметим, что измерение анизо-
тропии флуоресценции использовалось для количественной оценки денату-
рации и реакций ассоциации белков с лигандами, изучения скорости враще-
ния белков. Кроме того, на основе анизотропии мембранно-связан- '
ных флуорофоров были установлены внутренняя вязкость мембран и влияние сос-
тава мембран на их фазовые переходы.

В этой главе будут описаны основы теории стационарных измерений
анизотропии флуоресценции и приведены избранные примеры применения
метода в биохимии. В следующей главе мы рассмотрим теорию и приме-
нение кинетических измерений анизотропии флуоресценции.

5.1.	Определения поляризации и анизотропии

Принцип измерения поляризации флуоресценции или анизотропии иллюст-
рирует рис. 5.1. Образец возбуждается вертикально поляризованным све-
том, причем электрический вектор возбуждающего пучка ориентирован па-
раллельно оси z. Затем измеряется интенсивность испускания через поляри-
РИС. 5.1. Схема измерения анизотропии флуоресценции.

затор. Когда регистрирующий поляризатор ориентирован параллельно (||) на-
правлению поляризованного возбуждения, то регистрируется интенсивность
/и . И наоборот, когда поляризатор перпендикулярен (1) к возбуждению,
интенсивность называется / р Предполагается, что эти интенсивности мо-
гут быть измерены без помех, вызываемых поляризационными свойства-
ми оптических компонент, в особенности монохроматора испускания (гл. 2).
В разд. 5.4 будут приведены методы корректировки для этой задачи. По-
ляризация Р и анизотропия г определяются следующим образом:

/ и	-li

/ц + /|	+ 211

(5.1), (5.2)

Поляризация и анизотропия могут быть взаимозаменены при использо-
вании выражений

Р =

Зг___

2 + г

г ==

2Р

3 — Р

(5.3), (5.4)

Для полностью поляризованного света = 0 и Р = г = 1 (это значение
обычно получают для, рассеянного светг0. Значение Рили г, равное едини-
це, никогда не получается для флуорофоров в растворе; измеряемые значе-
ния обычно меньше из-за зависимости фотоотбора от угла\(разд. 5.2). Для
естественного или неполяризовапного света /ц = и Р = г = 0. Однако важ-
но отметить, что Р и г не равны между собой для промежуточных значений.
В ранних работах чаще приводились значения поляризации, но в настоя-
щее время возрастает использование анизотропии. Использование анизотро-
пии предпочтительнее, поскольку большинство теоретических выражений в
этом случае значительно проще. Это было впервые отмечено Александром
Яблонским [ 1]. Как пример такого упрощения рассмотрим смесь флуорофо-
ров, каждый из которых имеет поляризацию Pi и долю от общей интенсив-
ности флуоресценции fi . Поляризация для смеси Р дается выражением [ 2]

( 1 -	1	V1	- 2 fi

VF"	3	) i	(1/р.	-1/3)	(б,5)

В противоположность этому средняя анизотропия 7 определяется как

г=2/.г.	(5.6)

i

где rf - анизотропия индивидуальных форм. Ясно, что последнее выраже-
ние предпочтительнее. Более того, затухание анизотропии флуоресценции
[г (г)] сферы после импульсного возбуждениялзаписывается в виде

r(t) = гое~г/<?	(5.7)

где г0 - анизотропия в момент t = 0; <р - время вращательной корреляции
сферы. Затухание поляризации не подчиняется одноэкспоненциальному за-
кону даже для сферической молекулы.

ПРОИСХОЖДЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЙ ПОЛЯРИЗАЦИИ И АНИЗОТРОПИИ. Может
вызвать удивление, почему для одного и того же явления существуют две
широко используемые меры. Как?, так и г имеют рациональное происхож-
дение. Рассмотрим частично поляризованный свет, направленный вдоль оси
х (рис. 5.2) и предположим, что измеряют интенсивности /г и 1у детектором,
ориентированным вдоль оси х. Поляризация этого света определяется как
доля света, который поляризован линейно. Иначе говоря,

Р = р/(р+п)	(5.8)

где р - интенсивность поляризованной составляющей; п — интенсивность
естественной компоненты, которая дается выражением п = 2Остающаяся
интенсивность является поляризованной составляющей и равна
вертикально поляризованного возбуждения и

ly = /j_. Подстановка в уравнение (5.8) дает уравнение (5.1), которое и яв-
ляется стандартным определением поляризации.

Анизотропия г источника света определяется как отношение поляри-
зованной составляющей к общей интенсивности I -

общ*
Источник

РИС. 5.2. Схематическое представление поляризации и анизотропии света,,

Ч + ^общ

(5.9)

Если возбуждение поляризовано вдоль оси z, то оно симметрично по отно-
шению к х и у. Как результат, дипольное излучение флуорофора также
симметрично по оси z. Следовательно, I* 1у. Учитывая, что /у = и
® /ц , получаем уравнение (5.2).

Поляризация - более полезный и удобный параметр для описания ис-
точника света, когда свет направлен вдоль выбранного направления, как по-
казано в верхней части рис. 5.2. В этом случае pin- общая интенсивность
и Р - отношение избыточной интенсивности вдоль оси z, поделенной на об-
щую интенсивность. В противоположность этому излучение, испускаемое
флуорофором, симметрично распределено вдоль оси z (нижняя часть рис. 5.2).
По этой причине общая интенсивность дается не выражением /ц + /± , а
/общ = /ц + 2 Zjl • Это происходит потому, что свет, излучаемый диполем,
равномерно распределен вдоль осей х и у. Следовательно, анизотропия пред-
ставляет собой отношение избыточной интенсивности, которая параллельна
оси z, к общей интенсивности. С этой точки зрения параметр поляризации,
возможно, неудобен для описания испускания флуоресценции. Однако он был
принят в оригинальной литературе, и большинство теорий изложено с исполь-
зованием этого термина. Этот параметр все еще широко применяют, но воз-
растает и использование анизотропии. Вероятно, одной из причин предпоч-
тения, отдаваемого поляризации, была та, что возбуждение направленным
пучком правильнее описывается параметром поляризации. Понятно, что тот
же самый параметр затем был применен для описания испускания флуорес-
ценции, хотя пространственное распределение этого испускания другое.

5.2.	Теория поляризации для разбавленных растворов,
находящихся в стеклообразном состоянии

Анизотропия флуоресценции, измеряемая в разбавленных стеклообраз-
ных растйорах, определяется собственными спектральными свойствами флуо-
рофоров. Это происходит потому, что высокая вязкость раствора препятст-
вует заметной вращательной диффузии до испускания. Более того, в очень
разбавленных растворах ни перенос энергии, ни реабсорбция не могут выз-
вать деполяризацию испускания. Этот особый случай будет описан детально
потому, что его обсуждение без чрезмерного усложнения выявляет фунда-
ментальные свойства анизотропии.

Теория поляризации флуоресценции основывается на рассмотрении флуо-
рофора как осциллирующего диполя, имеющего момент

а = HocosM£ t

где wL _ круговая частота испускаемого света; t — время. Естественно,
флуорофор испускает отдельные фотоны. Однако пространственная зависи-
мость энергии точно описывается классическими (не квантовыми) теория-
ми электричества и магнетизма. Предположим, что данный флуорофор
ориентирован вдоль оси z, как показано на рис. 5.2. Пространственное
распределение энергии, излучаемой осциллирующим диполем, идентично
распределению излучения антенны, которая также является осциллирую-
щим диполем. Электрическое поле А такого диполя на определенном расстоя-
нии пропорционально sin Т, где Y - угол по отношению к оси z:

А - AoSin^
Испускаемая энергия и, следовательно, наблюдаемая интенсивность / про-
порциональны квадрату интенсивности электрического поля. Следовательно,

/12 Д 2 sin2 f

Применительно к поляризации флуоресценции наиболее важной харак-
теристикой излучаемого света является его круговое симметричное распре-
деление вдоль оси z. Для диполя, ориентированного вдоль оси z, следует
ожидать одинаковой интенсивности света в направлениях у их. Интересно
отметить, что в направлении оси z нельзя наблюдать этот осциллирующий
диполь, так как вдоль этого направления энергия не излучается. Мы будем
говорить о моментах переходов при возбуждении и испускании как о погло-
щающих и испускающих диполях.

Рассмотрим флуорофор, диполи поглощения и испускания которого па-
раллельны. Это практически верно для 1,6-дифенилгексатриепа (рис. 5.3),
который широко используется как зонд при изучении биологических мембран*
В данный момент примем, что эта молекула ориентирована под углом е по
отношению к оси z и ср - по отношению к оси у. Естественно, молекулы DPH
будут случайным образом ориентированы в изотропном и гомогенном стекло-
образном растворителе, и возбуждение поляризованным светом отбирает оп-

РИС. 5.3. Система координат для флуорофора.
ределенпый диапазон ориентаций (разд. 5.2.1). Пусть нужно вычислить ани-
зотропию, которая наблюдалась бы для этой молекулы в стеклообразном
растворе. Предварительное условие параллельности диполей, неподвижность
и случайный характер ориентации упрощают вывод. Тем не менее рассмот-
рение этого простого случая иллюстрирует смысл измеряемого значения
анизотропии.

Интенсивность света, излученного диполем, пропорциональна квадрату
проекции его вектора на ось наблюдения. Следовательно,

1ц (0, ф) = cos20; /±(0, ф) = sin20sirAp

(5.10), (5.11)

В реальных экспериментах возбуждение будет направлено вдоль оси х. При
этом с одинаковой вероятностью должны возбудиться все молекулы, имею-
щие равные углы 0, т.е. популяция возбужденных флуорофоров будет сим-
метрично распределена вокруг оси z. Любая экспериментально доступная
популяция молекул будет ориентирована так, что угол ф будет принимать
значения от 0 до 2тг с равной вероятностью. Следовательно, мы можем ис-
ключить зависимость от ф в уравнении (5.11). Среднее значение sir?<p опре-
деляется выражением

2 ТТ

/ з1п2ф<&р

-2____________ = i-	(5.12)

2 ТТ

/ dq
о

и, следовательно,

(1 (9) = cos20; (0) =
И!

A- sin20
2

(5.13), (5.14)

Теперь предположим, что наблюдаем набор флуррофоров, которые ориенти-
рованы по отношению к оси z с вероятностью f (0). В следующем разделе
будет рассмотрен вид f (0), предполагаемый для случайного распределения.
Измеряемые интенсивности флуоресценции для этого набора молекул равны:

ТТ/2	-------

Ml f(0)cos 20d0 = cos20	(5.15)

' J ТГ/2	, -------

'1 = — f f(0)sin2OdO =— sin20	(5.16)

о	2

где f (0)d0 — вероятность того, что флуорофор ориентирован между 0 и
0 + de. Используя уравнение (5,2) и равенство sin20 1 - сое20, можно по-
казать, что

г = (Зсо8 2е -1)/2	(5.17)

Следовательно, величина анизотропии на самом деле является мерой сред-
него значения cos 20, где 0 - угол диполя испускания по отношению к оси z.
Это происходит потому, что наблюдаемые интенсивности /ц и /|_ пропорцио-
нальны квадрату проекций индивидуальных моментов перехода на оси х и z
(см. рис. 5.2). Полезно рассмотреть взаимосвязь между гиб. Рассеянный
свет полностью поляризован, следовательно, 0 = 0 и г =1,0. Полное исчез-
новение анизотропии эквивалентно 0 = 54,7°. Это не означает, что каждый
флуорофор поворачивается на 54,7°, по среднее значение cos20 = 1/3, где 0 -
угловое смещение между диполями возбуждения и испускания. Напомним, что
при выводе уравнения (5.17) предполагалось, что эти диполи параллельны. Не-
сколько более сложное выражение необходимо практически для всех флуоро-
форов, поскольку диполи редко бывают параллельны. К тому же мы еще не
рассмотрели влияние фотоотбора на величину анизотропии.

ВОЗБУЖДЕНИЕ И ФОТООТБОР ФЛУОРОФОРОВ. Для наблюдения флуорес-
ценции флуорофоры, разумеется, необходимо возбудить. Электрический
диполь флуорофора не обязательно должен точно совпадать с направлением
оси z для поглощения света, поляризованного вдоль этой оси. Вероятность
поглощения пропорциональна cos20, где 0 - угол, образуемый диполем пог-
лощения с осью z [ 3]. Следовательно, возбуждение поляризованным светом
приводит к появлению популяции возбужденных флуорофоров, которая сим-
метрично распределена вокруг оси z (рис. 5.4). Это явление называется фо-

РИС. 5.4. Схемы, иллюстрирующие фотоотбор и вероятность распределения флуо-
рофоров.

Ллощадь - sin9-eld

9-413
тоотбором. Распределение cos20 видоизменяется в дальнейшем путе.м учета
вероятности того, что молекула образует угол 0 с осью z. Для случайного
распределения, которое должно существовать в неупорядоченном растворе,
число молекул с величиной угла между 0 и 0 + de пропорционально sin0d0, а
также площади поверхности на сфере внутри угла от 0 до 0 + de. Следо-
вательно, распределение возбужденных вертикально поляризованным све-
том молекул выражается как
f(e)de - cos20 sin© de	(5.18)

Распределение вероятности, даваемое уравнением (5.18), определяет мак-
симум отбора, который может быть достигнут при использовании оптичес-
кого возбуждения изотропного раствора. Напомним [уравнение (5.17)], что анизотро-
пия является просто линейной функцией cos20. Следовательно, для одно-
направленных диполей поглощения и испускания максимальные значения
cos 20 даются выражением

ТГ/2

J cos20f(0)d0
cos20=-2------------------ (5.19)

ТТ/2
/ f(0)d0
о

Подстановка (5.18) в (5.19) дает cos20 = 3/5. С учетом уравнения (5.17) мож-
но найти максимальную анизотропию, равную 0,4. Это значение получается,
когда диполи поглощения и испускания параллельны и нет других процессов,
приводящих к деполяризации. Легко заметить, что это значение (0,4) гораз-
до меньше, чем возможное для рассеянного света (1,0). Фактически, если
измеренная анизотропия для случайно ориентированного образца больше чем
0,4, можно уверенно сделать вывод о присутствии рассеянного света в до-
полнение к флуоресценции. Максимальное значение анизотропии 0,4 для па-
раллельных диполей поглощения и испускания является следствием того,
что вероятность поглощения света равна cos2 0.

5.3.	Спектры поляризации флуорофоров

Обычно диполи поглощения и испускания флуорофоров не параллельны, а
образуют угол а в плоскости флуорофора. В предыдущем разделе [ уравнения
(5.10) - (5.17)] было показано, что смещение диполя испускания на угол 0 от
оси z приводит к уменьшению анизотропии на множитель ~~ (3cos 20 - 1).
Подобно этому, смещение диполей поглощения и испускания на угол а приво-
дит к дальнейшему уменьшению анизотропии. Наблюдаемая в стеклообразном
разбавленном растворе анизотропия определяется произведением потери ани-
зотропии из-за фотоотбора (2/5) на потерю анизотропии из-за углового сме-
щения диполей. Следовательно,
2	/ 3cos2 « -1

(5.20)

Обозначение г0 использовано для анизотропии, наблюдаемой в отсутствие
других деполяризационных процессов, таких, как вращательная диффузия
или перенос энергии. Для некоторых молекул угол а близок к нулю. Напри-
мер, для DPH экспериментально получено достаточно высокое значение
г0, равное 0,39, хотя часто сообщаются более низкие значения [ 13]. Анизо-
тропия 0,39 соответствует углу 7,4° мсЬкду диполями, тогда как а = 0 соот-
ветствует углу 0°. Интересно отметить, что анизотропия равна 0, когда
а = 54,7°. Если а превышает это значение, то анизотропия становится
отрицательной. Максимальное отрицательное значение (-0,2) получено для
а « 90°. Значения для rQ и PQ приведены в табл. 5.1. Необходимо отметить
пределы этих значений для изотропного раствора: -0,2 <- г0< 0,4 и
-0,33 < Ро < 0,5. Значения вне этого диапазона являются результатом
артефактов. •

В стеклообразном растворе, таком, как пропиленгликоль при -70°С,
флуорофоры остаются неподвижными в течение времени нахождения в воз-,
бужденном состоянии. В этих условиях измерение значения анизотропии
rQ позволяет определить угол между диполями поглощения и испускания
[ уравнение (5.20)]. Так как ориентация диполей поглощения различна для
каждой полосы поглощения, то угол а меняется с длиной волны. Следова-
тельно, г0 также должна варьироваться с изменением длины волны возбуж-
дения. Спектр поляризации - это график зависимости поляризации или ани-
зотропии флуоресценции от длины волны для флуорофора в вязком раство-
ре. Для получения истинного спектра поляризации необходимо использовать

Таблица 5.1. Соотно-
шения между угловым
смещением диполей
поглощения и испуска-
ния («а) и значениями

а,гр ад	ГО	
0	0,40	0,50
45	0,10	0,14
54,7	0,00	0,00
90	-0,20	-0,33
достаточно разбавленные растворы, чтобы не происходил перенос энергии
или реабсорбция флуоресценции. Обычно анизотропия не зависит от длины
волны испускания, поэтому приводятся только спектры поляризации возбуж-
дения. Так как испускание почти всегда происходит из нижнего синглетно-
го состояния, то предполагается независимость анизотропии от длины вол-
ны испускания. Если испускание происходит из нескольких состояний и ес-
ли эти состояния имеют разные спектры испускания, то анизотропия может
зависеть от длины волны испускания. Такая зависимость может также наблю-
даться в случае релаксации растворителя (гл. 8), причем анизотропия мо-
жет уменьшаться с увеличением длины волны, потому что среднее время
затухания больше для больших длин волн [уравнение (5.44)].

Наибольшее значение г^, как правило, наблюдается для наиболее длинно-
волновой полосы поглощения. Это связано с тем, что флуоресценция обычно
происходит из низшего синглетного состояния, а оно также соответствует
длинноволновой полосе поглощения (правило зеркальной симметрии). Следо-
вательно, в поглощение и испускание вовлекается один и тот же электрон--
ный переход, который имеет приблизительно однонаправленные моменты.
Большие значения а (меньшие значения г0) получаются при возбуждении в
высшие электронные состояния, из которых обычно не происходит испуска-
ния флуоресценции, поскольку флуорофоры быстрее релаксируют в низшее
синглетное состояние. Следует учесть, что поляризационный спектр воз-
буждения выявляет углы между моментами переходов в поглощении и испус-
кании. Однако направления этих моментов собственно в молекуле не опре-'
деляются. Для их определения необходимо изучать упорядоченные системы,
такие, как кристаллы.

Общие свойства поляризационных спектров иллюстрируются на приме-
ре перилена в пропиленгликоле [ 4] (рис. 5.5, а). Диполи поглощения и испус-
кания находятся в плоскости кольца, как и почти для всех флуорофоров.
При длинах волн возбуждения > 360 нм наблюдается PQ « 0,46, что указыва-
ет на практически параллельные осцилляторы. Значение PQ постоянно при
возбуждении в диапазоне длин волн 360 — 460 нм, так как возбуждение про-
исходит в низшее синглетное состояние. При длинах волн возбуждения
< 360 нм Ро заметно уменьшается, что указывает на увеличение а. Угол
а приблизительно равен 45° (Ро = 0,14) при 300 и 320 нм,-54,7° (Ро = 0) при
275 нм и — 90° (Ро = -0,33) при 255 нм. При указанных длинах волн флуо-
рофор возбуждается в высшие электронные состояния, но эти состояния
релаксируют к нижнему возбужденному синглетному состоянию до испуска-
ния. В разд. 5.6.1 мы увидим, как можно селективно наблюдать различные
вращательные движения путем выбора а или Ро> т.е. путем выбора длины
волны возбуждения.

Поляризационный спектр возбуждения перилена почти идеален, посколь-
ку значения PQ практически постоянны в пределах длинноволновой полосы
поглощения. Для большинства флуорофоров наблюдается постепенное умень-
РИС. 5.5. Спектры поляризации перилена (а) и 9-винипантрацена (б) в пропиленгпиколе
при —50°С. (С разрешения авторов работы L 4J И American Chemical Society»)
РИС. 5.6. Спектр поляризации индола в пропилен гликоле при -58°С [б].

(С разрешения American Society for Photobiology.)

шение PQ по мере уменьшения длины волны возбуждения. Этот факт иллюст-
рируется на примере 9-винил антрацена (рис. 5.5, б). Из приведенной зависи-
мости видно, что если по условиям эксперимента требуется точное знание
Ро, то необходимо тщательно контролировать длину волны возбуждения.

Поляризационный спектр возбуждения индола в пропиленгликоле еще
более сложен (рис. 5.6). В этом случае поляризация резко меняется при воз-
буждении в длинноволновой полосе поглощения. Такая зависимость объясня-
ется существованием двух возбужденных состояний индола (*1, и 1Lb ),
которые ответственны за поглощение в диапазоне 250 - 300 нм. Полагают,
что осцилляторы поглощения должны быть расположены под углом 90° друг
к другу. Испускание индола происходит в основном из состояния xLa.

АНАЛИЗ ЭЛЕКТРОННЫХ СОСТОЯНИЙ ПО СПЕКТРАМ ПОЛЯРИЗАЦИИ. Ва-
лер и Вебер [ 5] использовали спектр поляризации индола для того, чтобы
различить в'спектре поглощения состояния iLa и Мы приводим этот
пример из-за его дидактического значения и важности для детального пони-
мания флуоресценции триптофановых остатков в белках (гл. И). При любой
длине волны возбуждения А наблюдаемая анизотропия равна

^o(A) = fa(A)rOa 4MrQb	(5.21)
где /,• (Л) отражает долевой вклад i -го состояния в общее поглощение на дли-
не волны Л; г01- - предельная анизотропия этого состояния. Было сделано
предположение, что гОа и rob не зависят от длины волны и что испускание
происходит только из состояния 1La. Если возбуждение и испускание про-
исходят из одного и того же состояния, следует ожидать, что осцилляторы
будут однонаправлены и г0 0,4. Однако было получено максимальное зна-
чение г0 = 0,3, и оно было приписано rOa, т.е. поглощение состояния yLa
предполагается главным образом при длинах волн > 300 нм. Выбор значе-
ния rQb более труден, так как не очевидна длина волны, при которой преоб-
ладает поглощение *Lb. Валер и Вебер использовали результаты другой
лаборатории, из которых следовало, что осцилляторы *La и ’Ц взаимно
перпендикулярны. Предполагаемая анизотропия для *Lb может быть пред-
сказана по уравнению (5.20), которое описывает уменьшение анизотропии
из-за углового смещения двух осцилляторов по известному углу между ни-
ми. В этом уравнении максимальное значение г0 (0,4) заменяется на г0 .
Следовательно,

г„ь „ о,зо( fofo.rl..)	(5.22)

При а = 90° можно получить гоЬ •.=: -0,15. Известные значения rQa и rQb
используются в уравнении (5.21) вместе с ограничением, согласно которому
сумма долей поглощения равна единице [fa (Л) + fib (Л) = 1], для того чтобы
вычислить долю поглощения каждого состояния как функцию длины волны.
Преобразование уравнения (5.21) дает

Го (А) - гоЬ _ ГО(А) + 0,15

гоа ~~гоь	0,45

гоа -го(^)	0,3 — Г0(Х)

гоа ~гоь	0,45

(5.23)

(5.24)

И наконец, спектр поглощения каждого состояния определяется, как

Ла(М = /а(АИ(А); ^Ь(Л)»/Ь(Л)Л(Л)

(5.25), (5.26)

где Л(Л) - суммарный спектр поглощения. Разделенные спектры приведены
на рис. 5.7. Поглощение lLb имеет структуру, но оно менее интенсивно,
чем поглощение 1La. Максимум при 290 нм в спектре поглощения индола,
по-видимому, имеет место благодаря состоянию и этот пик поглоще-
ния соответствует минимуму значения г0 (см. рис. 5.6). Выше 295 нм пог-
лощение обусловлено только состоянием tL .
РИС. 5.7. Разложение спектра индола на поглощение lL и 1L на основании

Г — I	Ь

поляризационного спектра возбуждения L 5J.

Кривая без точек соответствует спектру поглощения индола. (С разрешения
American Society for Photobiology.)

Из приведенного примера видно, как поляризационные спектры выявля-
ют электронные свойства флуорофоров. Подобный анализ может быть про-
веден и для перилена (рис. 5.6), но широкое разнесение состояний S, и $2
делает этот случай менее наглядным. Легко заметить переход от Sj к S2 в
диапазоне длин волн вблизи 300 нм, где общее поглощение мало.

5.4.	Измерение анизотропии флуоресценции

Прежде чем продолжить дальнейшее обсуждение факторов, приводящих
к деполяризации флуоресценции, полезно разобраться в методах, которые
используют для измерения анизотропии или поляризации. Мы коснемся здесь
стационарных измерений, но подобное изложение применимо и к кинетичес-
ким измерениям анизотропии. Обычно используют два метода: однолучевой
(L-формат), в котором используется один канал регистрации испускания, и
двухлучевой (Т-формат), в котором параллельная и перпендикулярная сос-
тавляющие наблюдаются одновременно в разных каналах. Каждый метод
имеет свои преимущества. Методика, описанная ниже,.введена для коррек-
тировки различной чувствительности прибора при регистрации по-разному по-
ляризованных составляющих испускания (гл. 2).

5.4.1.	Однолучевой метод, или L-формат

Этот метод используется наиболее часто, так как большинство флуори-
метров имеет только один эмиссионный канал. Рассмотрим схематичес-
кую диаграмму, приведенную на рис. 5.8. Напомним, что длины волн воз-
РИС. 5.8. Схематическая диаграмма измерения анизотропии флуоресценции од-
нолучевым методом.

М - монохроматор.

буждения и испускания обычно варьируют с помощью монохроматоров. Мо-
нохроматор возбуждения частично поляризует падающий свет. В результа-
те вращение поляризатора возбуждения в горизонтальное (Г) или вертикаль-
ное (В) положение дает разную интенсивность падающего света, даже если
источник излучает деполяризованный свет. Подобно этому, монохроматор
эмиссии имеет различную эффективность пропускания для вертикально и го-
ризонтально поляризованного света. Следовательно, вращение поляризатора
испускания изменяет эффективную чувствительность канала испускания. Та-
ким образом, измеряемые интенсивности - это не искомые параллельные и
перпендикулярные составляющие. Целью является измерение действитель-
ных интенсивностей /ц и Ц , независимых от детектирующей системы.

Для указания ориентации поляризаторов возбуждения и испускания бу-
дем использовать два индекса. Например, /|-в соответствует горизонталь-
но поляризованному возбуждению и вертикально поляризованному испуска-
нию. Эти обозначения легко запомнить, так как индексы располагаются в
том же порядке, в котором свет проходит через два поляризатора. Пусть

и Sr - чувствительности канала испускания к вертикально и горизонталь-
но поляризованным составляющим соответственно. Для вертикально поляри-
зованного возбуждения наблюдаемые поляризованные интенсивности будут
следующими:

=	(5.27), (5.28)

где k - коэффициент пропорциональности, учитывающий квантовый выход
флуорофора и другие инструментальные факторы. Деление (5.27) на (5.28)
дает

2ВВ ^B^ll	Zll

Для того чтобы вычислить действительное отношение интенсивностей
(1ц /1[), необходимо определить G-фактор, который представляет собой отно-
шение чувствительностей детектирующей системы для вертикально и горизон-
тально поляризованного света:

G = Sg/Sr	(5.30)

Пусть, например, G = 1,9. Это означает, что монохроматор испускания про-
пускает вертикально поляризованный свет при выбранной длине волны в
1,9 раза эффективнее, чем горизонтально поляризованный свет. Важно от-
метить, что G-фактор зависит от длины волны испускания и в определенной
степени от полосы пропускания монохроматора. Часто измерения анизотро-
пии проводят, используя на испускании фильтр, а не монохроматор. Для
простоты мы полагаем, что к поляризации чувствителен только монохрома-
тор, но в общем случае это не так. Фильтры обычно не оказывают замет-
ного поляризационного влияния, и, таким образом, следует ожидать G = 1,0.
Тем не менее этот фактор нужно всегда определять, так как при вращении
поляризатора испускания может смещаться положение фокусированного
изображения флуоресценции, изменяя кажущуюся чувствительность.

G -фактор легко измерять, используя горизонтально поляризованное
возбуждение, когда и горизонтально, и вертикально поляризованные компо-
ненты пропорциональны 1± (рис. 5.8). Эго происходит потому, что обе ориентации пер-
пендикулярны к поляризации возбуждения. Таким образом, любое измеряемое различие
между /гв и Z|-|- должно определяться свойствами детектирующей системы как

7гв Ml $В

~~~ -G <“>
(5.32)

(5.33)

(5.34)

То, что интенсивность возбуждения изменится при вращении поляризатора
возбуждения в горизонтальное положение, не имеет значения* Это измене-
ние - постоянный множитель в числителе и знаменателе уравнения (5.31)
и, следовательно, сокращается. Когда известен G-фактор, отношение
/|1 / Zj может быть вычислено при использовании следующего уравнения:
^вв 1
zBr G h

Анизотропия дается выражением
Г =	_ .

I /1Х) + 2 .

которое час^о используется в другом виде:

Т ж /ВВ ~G/b>~

^ВВ + 2G/Br

5.4.2.	Двухлучевой метод, ;или Т-формат

В двухлучевом методе одновременно измеряют интенсивность парал-
лельной и перпендикулярной составляющих с использованием двух отдель-
ных систем регистраций (рис. 5.9). Поляризаторы испускания остаются в
неизменном положении, следовательно, нет необходимости измерять отно-
сительную интенсивность для каждого поляризатора. Однако необходимо
измерение относительной чувствительности двух детектирующих систем,
что выполняется с использованием горизонтально поляризованного возбуж-
дения. Измерения проводят следующим образом. Поляризатор возбуждения
сначала ставят в вертикальное положение и измеряют отношение параллель-
ных и перпендикулярных сигналов /?в, которое определяется как
кв s Gn zii/gi h	<5*36)

где G| । и Gj - усиление параллельного и перпендикулярного каналов соот-
ветственно.' 2?в может быть установлено равным единице, но практически
это отношение легче измерить, что достигается использованием горизон-
тально поляризованного возбуждения. В этом случае в обоих эмиссионных
каналах регистрируется (рис. 5.9). Следовательно, отношение интенсив-
ностей равно

Kr = Gll/Gi	(5.36)

Деление (5.35) иа (5.36) дает выражение

Кв//?г“/П А	(5.37)
РИС. 5.9. Схематическая диаграмма измерения анизотропии флуоресценции двух-
лучевым методом.

Дет — детектор; G - корректировочный фактор.

которое может быть использовано для вычисления анизотропии [ уравнение
(5.33)]. Снова отметим, что интенсивность возбуждения может меняться
при вращении поляризатора возбуждения. Этот фактор сокращается при вы-
числении отношения. Однако в том случае, если свет от возбуждающего
монохроматора полностью поляризован либо в вертикальном, либо в горизон-
тальном направлении (гл. 2), могут возникать трудности: либо /?в, либо
Rp не могут быть измерены из-за неадекватности источника света. Труд-
ности такого рода могут быть исключены при использовании разных длин
волн возбуждения, при которых получаются сравнимые интенсивности для
каждого поляризатора. Это приемлемо, поскольку /?в и Rp определяются
свойствами только детектирующей системы и не зависят от длины волны
возбуждения или степени поляризации, проявляемой образцом. Отметим,
что теоретический максимум для 1ц//| равен 3(г « 0,4). Отношение

> 3 обычно указывает на артефакт — как правило, на рассеянный
свет. Рассеянный свет поляризован на 100% (/ц/^ « «», г » 1,0), и неболь-
шой процент такого света может серьезно исказить значения анизотропии.

5АЗ. 'Сравнение одно- и двухлучевого методов

Для флуориметра с одним каналом для регистрации испускания выбора
нет, и используется метод I «-формата. Эта методика требует четырех от-
дельных измерений:/вв> /вг, /гв и/[-[-. По последним двум определяет-
ся G-фактор, который нс нужно измерять каждый раз. Для двухлучевого
метода необходимы только два измерения, каждое из которых представляет
собой отношение. Вследствие одновременности измерений флуктуации интен-
сивности лампы вычитаются при измерениях в режиме Т-формата. Более то-
го, если происходит фотообесцвечивание раствора, то этого эффекта легче
избежать в измерениях двухлучевым методом. В целом, измерения в двух-
лучевом методе, по-видимому, более точны, хотя различия для имеющихся
в настоящее время источников света и электронных компонент малы.

5.4.4., Юстировка поляризаторов

Для правильных измерений анизотропии флуоресценции необходимо, что-
бы поляризаторы были точно установлены в вертикальном и горизонтальном
положении. Точность положений может быть легко проверена и настроена
при использовании разбавленной суспензии гликогена в воде. Рассеянный
свет поляризован на 100 %, так что р = г « 1,0. В своей лаборатории мы счи-
таем точность положений достаточной, когда измеряемое значение состав-
ляет 0,98 и больше. Важно использовать разбавленную суспензию гликогена.
В противном случае многократность рассеяния одного и того же кванта при-
водит к уменьшению значения поляризации.

Юстировка может быть осуществлена следующим образом. Поляризатор
возбуждения вращают до приблизительно вертикального положения. Точное
вертикальное положение пе обязательно, так как рассеянный свет поляризо-
ван вертикально. Угловую настройку поляризатора испускания проводят так,
чтобы получался минимум интенсивности. Это — горизонтальное положение.
Желательно использовать этот минимум интенсивности. Максимум для вер-
тикальной компоненты определяется менее четко. Конечно, следует прове-
рить, должным ли образом подобрано вертикальное положение. Теперь при
вращении поляризатора испускания максимум и минимум интенсивности
должны наблюдаться, когда поляризатор находится в вертикальном и горизонтальном
положениях соответственно. Такую настройку проводят либо без .монохроматора ис-
пускания, либо вьюирают его длину волны так, что эффективность пропускания для
вертикально и горизонтально поляризованного снега приблизительно одинакова.
В противном случае его поляризационные свойства будут влиять на юстировку. Для
выбора длины волны можно использовать либо горизонтально поляризованное возбуж-
дение, чтобы получить /| । = /± либо образец, испускание которого jie поляризовано,
например раствор 9-цианоантрацена в жидком растворителе - этаноле.

Настройка поляризатора возбуждения проводится так же. Поляризатор
испускания устанавливают в вертикальное положение. Минимум и максимум
рассеянного света должны наблюдаться, когда поляризатор возбуждения
находится в горизонтальном и вертикальном положениях соответственно.
Снова следует учесть поляризационные свойства монохроматора возбужде-
ния.

5„4О5„ Устранение влияния поляризации на интенсивность
флуоресценции и измерение времен затухания.

Условия для магического угла поляризатора

В гл. 2 было показано, что эффективность монохроматоров зависит от
поляризации света. Следовательно, обычно наблюдается не /обЩ|, а
некоторая комбинация /ц и При использовании поляризаторов измеренная
интенсивность может быть равна /ц + 2/j. безотносительно к степени поля-
ризации образца. Для того чтобы достичь этого, поляризатор возбуждения
ориентируют в вертикальном положении, а поляризатор испускания - на .
54,7° от вертикали. Так как cos 2 54,7° = 0,333, a sin254,7°= 0,667, то такая
установка поляризаторов приводит к увеличению в два раза по сравнению с
/’ll , давая, таким образом, корректную сумму для /общ.

5.5„	Внешние причины деполяризации флуоресценции

В предыдущем обсуждении мы коснулись главным образом внутренней
деполяризации, которая является результатом углового смещения между
диполями поглощения и испускания. Предполагалось, что флуорофоры не-
подвижны и возбужденное состояние остается локализованным на первона-
чально возбужденном флуорофоре. Внешние причины деполяризации - это
те, которые действуют в течение времени жизни возбужденного состояния [ 3]: враща-
тельная диффузия флуорофоров и безызлучательный перенос энергии между
флуорофорами (гл. 10). Оба процесса приводят к дополнительному угловому
смещению осциллятора испускания и, следовательно, к понижению анизотро-
пии.

Влияния вращательной диффузии и переноса энергии легко разделяются
рациональным выбором экспериментальных условий. Например, броуновское
вращение вызывает пренебрежимо малую деполяризацию, когда скорость
вращения значительно меньше скорости испускания флуоресценции. Это ил-
люстрируется уравнением Перрена:

г0/т = 1 + (т/ф)	(5.38)
где т - время затухания флуоресценции; ф - время вращательной корреля-
ции. Ясно, что, когда <р » т, наблюдаемая анизотропия равна г0.

Безызлучательный перенос энергии происходит только в концентри-
рованных растворах, где среднее расстояние между молекулами флуоро-
фора сравнимо с характеристическим радиусом Ко, который обычно состав-
ляет ~ 50 А. Можно легко вычислить, что для получения такого среднего
расстояния необходима концентрация порядка 0,013 М*. Эта концентрация
значительно больше, чем обычно необходимо для флуоресцентных изме-
рений (Ю*43 М). Таким образом, безызлучательный перенос энергии лег-
ко исключается при использовании разбавленных растворов. Внешние при-
чины деполяризации флуоресценции объединены в табл. 5.2, составленной
по данным Вебера [ 3].

Вероятно, из условий, указанных в табл. 5.2, наиболее интересны
разбавленные невязкие растворы, в которых анизотропия обусловлена глав-
ным образом вращательным движением флуорофора. Для маркированных

Таблица 5«2. Внешние причины деполяризации [з]

Условия
наблюдения

Результат

Определяющий фактор
на молекулярном уррене

Разбавленный вязкий раст-
вор (пропипенгпиколь;

-70 °C)

г0 или cos а

[ уравнение (5.20)]

Угол между диполями
поглощения и испуска-
ния как функция длины
волны возбуждения

Концентрированный
вязкий раствор

О < | г | < | т0|, анизотро-
пия уменьшается за счет
миграции энергии

Зависящий от расстояния
безызлучательный пе-
ренос энергии

Разбавленный невязкий раствор (И20,, спирт; ком- натная температура)	0 < | г |<|г0| > анизотропия Размеры и форма молекул уменьшается из-за броунов- флуорофора  ского вращения

* Такая оценка не учитывает наличие распределения по расстояниям и возмож-
ность диффузии молекул за время жизни возбужденного состояния. Фактически,
чтобы наверняка избежать процессов переноса энергии, необходимо использовать
концентрации менее Ю""1 М„ — Прим,. ред«
белков это движение определяется наряду с другими факторами,размерами,
формой и степенью агрегации белка. Для мембран анизотропия зависит от хи-
мического состава и фазового состояния мембраны. Использование такого
типа зависимостей будет обсуждено в разд. 5.7.

ТРИВИАЛЬНЫЕ ПРИЧИНЫ ДЕПОЛЯРИЗАЦИИ. К таким причинам ОТНОСЯТСЯ
рассеяние света, реабсорбция и разъюстировка поляризаторов. Это, конечно,
нетривиальные экспериментальные проблемы, но указанные эффекты зави-
сят от оптических условий эксперимента и не дают полезной информации о
молекулярных свойствах или динамике исследуемого флуорофора.

Биологические образцы, такие, как водные суспензии мембран, часто
бывают мутными. Мутность приводит к рассеянию как падающего света,
так и испускаемых фотонов. Рассеяние падающего света может сказывать-
ся на возбуждении, а излученные фотоны могут рассеиваться до наблюдения.
Считается, что каждый акт рассеяния снижает анизотропию рассеянных
фотонов до 0,7 первоначального значения [6] и что из-за мутности наблюда-
емая анизотропия (г ') уменьшается линейно в зависимости от оптической
плотности D:

т ' = г -Г • 2,303D	(5.39)

В этом уравнении г - анизотропия, не возмущенная рассеянием. Недавние
исследования подтвердили предсказываемую линейную зависимость г'от
мутности [7]. Однако истинная константа пропорциональности индивидуаль-
на для каждого исследуемого образца. Поэтому целесообразно изучать
влияние мутности для каждого образца. Это обычно достигается разбавле-
нием. Если при разбавлении изменение анизотропии пренебрежимо мало, то
маловероятно, что имеется существенная деполяризация, вызванная рассея-
нием.

Может показаться странным, что столько внимания уделяется деполяри-
зации, в то время как в гл. 1 и разд. 5.4.2 утверждалось, что рассеянный
свет может приводить к ошибочно высоким значениям измеряемой анизотро-
пии. Оба утверждения верны, что связано с сильной поляризацией рассеян-
ного света. Предположим, что оптические условия не устраняют весь рассе-
янный свет. Если некоторая часть рассеянного света измеряется как флуо-
ресценция, можно легко показать из уравнения (5.6), что измеряемая ани-
зотропия будет слишком большой. Альтернативно предположим, что созда-
ны такие оптические условия, которые предотвращают попадание в детектор
какого-бы то ни было рассеянного света. Если раствор мутный', флуорофоры
могут возбуждаться рассеянными фотонами или испускание может быть рас-
сеяно до того, как оно достигнет детектора. В любом из этих случаев испус-
кание будет деполяризовано. Регистрация рассеянного света как флуорес-
ценции увеличивает значение измеряемой анизотропии, но рассеяние как па-
дающего света, так и флуоресцентного испускания уменьшает измеряемое
значение анизотропии.
Спектры испускания флуорофоров часто перекрываются с их спектрами
поглощения (как покачано для перилена на рис* 5.5), поэтому второй тривиаль-
ной причиной деполяризации является реабсорбция флуоресценции, которая
может происходить, если велики спектральное перекрывание, оптическая плот-
ность и длина оптического пути для испускания.Флуорофоры, которые воз-
буждаются излученными фотонами, также могут флуоресцировать. Эти вто-
ричные фотоны деполяризованы в избыточной степени как за счет угловой
зависимости процессов поглощения, так и за счет вращательной диффузии,
для которой в этом случае имеется большее время. Как и для деполяризации,
вызванной рассеянным светом, реабсорбция легко устанавливается либо пу-
тем разбавления, либо использованием более короткого оптического пути
для испускания.

И наконец, значения анизотропии могут быть слишком низкими из-за
разъюстировки или неэффективности поляризаторов. Поляроидные пленки
при коротких длинах волн становятся менее удобными для работы. Выявить
подобные осложнения можно путем исследования разбавленных рассеиваю-
щих растворов (разд. 5.4.4).

5.6.	Влияние вращательной диффузии на анизотропию
флуоресценции. Уравнение Перрена

Главная причина деполяризации флуоресценции - вращательная диф-
фузия флуорофоров. Этот вид деполяризации описывается уравнением Перрена
которое может быть выведено несколькими способами [ 3, 8]. Мы предпочи-
таем прямой вывод, основанный на том факте, что после возбуждения
5-импульсом кинетика затухания анизотропии т (t) для сферической моле-
кулы описывается одноэкспоненциальным уравнением:

г(<)-гое~е/<Р	'	(5.40)

В -угом уравнении <р - время вращательной корреляции флуорофора, которое
зависит от вязкости ц, температуры Т раствора и объема вращающейся об-
ласти г7:

<р - xyV/RT	(5.41)

Одноэкспонепциалыюе затухание т (t) верно только для сферических моле-
кул. Для несимметричных частиц или молекул предсказываются более слож-
йые выражения.

Пусть / (t) отображает кинетику затухания общей интенсивности флуо-
ресценции [/ц(«) +2 /j (0]. Стационарное измерение анизотропии является
в действительности усреднением r(t) с весом I (t). Таким образом,

'/ )dt
r _ о

’ - ------------ (5.42)

ОО	'

Г / (t)dt
о
Для флуорофоров в гомогенном окружении можно ожидать, что затухание
I (€) будет одноэкспоненциальным:



(5.43)

где т - время затухания флуоресценции. Подстановка уравнений (5.40) и
(5.43) в (5.42) дает уравнение

Г = Го/[ 1 + (т/ф)]

(5.44)

которое и является одной из форм уравнения Перрена.

Полезно рассмотреть влияние вращательной диффузии, или, иначе говоря, време-
ни вращательной корреляции, на стационарную анизотропию. Рассмотрим два случая:
сильно вязкий раствор, где Ф » т и измеряемое значение равно г0,и молекулу в жид-
ком растворе, где ф « т, а наблюдаемая анизотропия будет равна нулю. В качестве при-
мера мы можем использовать уравнение (5.41), для того чтобы вычислить
время вращательной корреляции перилена в этаноле при 20 °C, которое равно
0,092 нс. Для этих вычислений принимаем молярную массу равной 252 г/моль,
плотность - 1,35 г/мл, д = 1,194 сП, Т = 293 К, V = 187 сма/моль и
R = 8,314 • 107 эрг/(моль • К). При г0 = 0,36 и т = 6 нс получаем, что анизо-
тропия должна быть равна 0,005. Если перилеп растворен в пропиленглико-
ле при 25 °C (ц = 32 сП), анизотропия должна быть примерно 0,1. Это как
раз та зависимость анизотропии от времени вращательной корреляции, ко-
торая является первопричиной широко распространенного применения
этих измерений для изучения размеров и формы макромолекул, равно как и
их динамических свойств в наносекупдной временной шкале. Степень деполя-
ризации можно связать со средним значением cos 2у, где у - угол,на который
флуорофор поворачивается в течение времени нахождения в возбужденном
состоянии:

3cos2 у — 1

(5.45)

Если вращения нет, то у = 0 и г = г0. Анизотропия равна пулю, когда
у = 54,7°. Однако, подчеркиваем, более точной интерпретацией условия
г = 0 является равенство среднего значения cos2y = 1/3.

Уравнение Перрена часто записывают в другом виде. Наиболее типич-
ные формы следующие:

(5.46), (5.47)

(5.48)
Л________Ц ( 2________1Уь 3-1}	(5.49)

\р з/ \ Ро	Р7

где R - скорость вращения флуорофора (ф-1 - 6R); R& - универсальная га-
зовая постоянная; р - время вращательной релаксации (р = 3<р). Ясно, что
выражения в единицах анизотропии проще, но уравнения (5.48) и (5.49) час-
то встречаются в литературе.

РАЗДЕЛЬНОЕ НАБЛЮДЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ СКОРОСТЕЙ ВРАЩЕНИЯ ПУ-
ТЕМ ПОДБОРА ДЛИНЫ волны ВОЗБУЖДЕНИЯ. В нашем выводе уравнения Пер-
рона мы предполагали, что затухание анизотропии флуоресценции, следую-
щее за S-импульсом возбуждения, подчиняется одноэкспоненциальному зако-
ну. Это предположение эквивалентно допущению, что деполяризационные вра-
щения флуорофора симметричны или изотропны. Часто молекулы не симмет-
ричны, и следует ожидать различных скоростей вращения вокруг каждой мо-
лекулярной оси. Интересен в этом отношении перилен, дискообразная молекула которо-
го (рис. 5.10) может вращаться вокруг оси, перпендикулярной к плоскости молекулы.
Такое вращение называется вращением в плоскости (Япл). Это вращение
может происходить без заметного смещения ближайших молекул раствори-
теля. И наоборот, перилен может вращаться так, что плоскость молекулы
сместится; такое вращение называется внеплоскостным (Нвп). Возможны
два типа таких движений, по для простоты они предполагаются равными.
Вцеплоскосгное вращение требует большего смещения растворителя, чем плоскоо
ное, и следовательно, ожидают, что скорость /?пл будет вьюн?, чем К Можно полу-
чить опенку этих индивидуальных скоростей вращения, измеряя анизотропию при
разных длинах волн возбуждения [10, Ц].

В разд. 5.3. было указано, что значение г 0, измеренное в разбавленном
стеклообразном растворе, служит мерой угла а между моментами перехо-
да в поглощении и испускании. Так какг0 - функция длины волны возбуж-
дения, то можно выбрать а путем подбора длины волны. Строго говоря,
возбуждение при длинах волн, когда г() = 0,4, 0,1 и -0,2, позволяет оценить
(ЯЛл + Явп и ^Пл соответственно [ 10]. Это приближение в точнос-
ти выполняется только для'малых угловых смещений флуорофора. Выбор
типов вращения иллюстрирует рис. 5.10. Рассмотрим, во-первых, возбуж-
дение в длинноволновой области поглощения, где т0 приближается к 0,4.
Плоскостное вращение, так же как и одно из внеплоскостных вращений, \
смещает момент перехода, поэтому оба вращения активны в процессе де-
поляризации. Второе внеплоскостное вращение вокруг оси z не смещает
диполь испускания и, таким образомдюактивно при деполяризации. Следо-
вательно, наблюдаемая деполяризация связана только с двумя движениями,
хотя считается, что существуют три возможных вращательных движения.
Наблюдаемая скорость вращения < R > равна, таким образом, (/?пл + /?вп)/2.
Подобными рассуждениями можно показать, что при г0 = -0,2 при деполяри-
зации активно только 7?пл. Для этого значения г0 моменты поглощения и
РИС. 5.10. Схема отбора плоскостных и внеппоскостных вращений путем выбо
ра г() или длины волны возбуждения на примере перилена.
испускания находятся под углом 90° друг к другу. Кпп смещает момент ис-
пускания, и, таким образом, активно. Однако для а = 90° два впеплоскост-
ных вращения неактивны. Вращение вокруг оси х не смещает Е. Вращение
вокруг оси z неактивно потому, что благодаря симметрии популяция воз-
бужденных молекул всегда случайно ориентирована вокруг оси z. В резуль-
тате наблюдаемым типом вращения для г0 -0,2 является Епл.

И наконец, для г0 = 0,1 только Евп активно при деполяризации. Вне-
плоскостное вращение вокруг оси z снова неактивно из-за симметричного
распределения возбужденных флуорофоров вокруг этой оси. Плоскостное
вращение вокруг оси у неактивно потому, что для этого особого случая
а = 45°, и популяция возбужденных флуорофоров снова симметрична относи-
тельно этой оси. Движением, которое смещает Е, является только вращение
Евп вокруг оси х. Следовательно, подбирая г0, можно изучать анизотропию
вращения флуорофора. Для симметрично вращающейся молекулы изменение
г0 не будет оказывать влияния на наблюдаемую скорость вращения. Однако,
если деполяризующие вращения не изотропны, то вариации г0 будут изме-
нять кажущуюся скорость вращения. Еще раз отметим, что такое рассмот-
рение строго применимо только для малых степеней деполяризации, или, что
то же самое, для самых малых угловых смещений.

5.7.	Применения измерений анизотропии в биохимии

Измерение анизотропии флуоресценции широко используется в биохими-
ческих исследованиях. Это происходит потому, что любые факторы, которые
влияют на размер, форму и сегментальную гибкость макромолекулы, будут
влиять на наблюдаемую анизотропию. Вышеперечисленные свойства макро-
молекул могут изменяться под воздействием pH, температуры, вязкости,
денатурирующих агентов и из-за реакций ассоциации. В следующих разделах
будет приведен ряд результатов, которые иллюстрируют использование и ин-
терпретацию измерений анизотропии.

5.7.1,, Оценка микровязкости клеточных мембран

В предыдущем разделе указывалось, что анизотропия флуоресценции
сильно зависит от вязкости раствора, в котором растворен флуорофор. Имен-
но эта зависимость привела к использованию измерения анизотропии для
оценки микровязкости в области ацильных боковых цепей клеточных мемб-
ран. Выбирают флуорофор, который распределяется в такое неполярное
окружение. Как правило, для этой цели служат перилеп, 9-вииилантрацен,
2-метилантрацен [ 4, 12] и дифенилгексатриеп [13]. Последнее из указанных
веществ наиболее широко используется в настоящее время по соображениям,
которые будут обсуждены ниже. Первоначально выбирают подходящий раство-
ритель сравнения и строят градуировочную кривую — зависимость измерен-
ных значений анизотропии флуоресценции от известной вязкости раствори-
теля сравнения. Типичная градуировочная кривая приведена на рис. 5.11.
Ю^'Тт/ц, град-с/П

РИС. 5.11. Градуировочная кривая
для оценки микровязкости мембран [12].

Приведены данные по анизотропии
перипена (1), 2-метипантрацена (2) и
9-винилантрацена (3) в минеральном масле.

Затем измеряют анизотропию флуоресценции для того же флуорофора, рас-
пределенного в области ацильных боковых цепей липидного бислоя. Внут-
ренняя вязкость бислоя оценивается при сравнении с градуировочной кривой.
Для малых ароматических молекул, по-видимому, наиболее вероятно то,
что их эффективный молекулярный объем V будет один и тот же в раст-
ворителе и в липидном бислое. В результате градуировочная кривая зави-
симости г от т] в растворителе известной вязкости позволяет связать
анизотропию мембранно-связанного флуорофора с микровязкостью мемб-
раны.

Типичные результаты по микровязкости, полученные при использова-
нии перилена, показаны на рис. 5.12. Яичный фосфатидилхолин представ-
ляет собой смесь ненасыщенных фосфолипидов, которые не претерпевают
фазовых переходов в изученном температурном диапазоне. Кажущаяся мик-
ровязкость низка (кривая 2) и монотонно возрастает с изменением К-1. Ди-

пидных мембран по измерению анизотропии перипена [12].

Приведены кажущиеся микровязкости для дипальмитоилфосфатидилхолина (7),
яичного фосфатидилхопина (2) и смесей DPPC + холестерин (3, 4), для которых ука-
заны молярные соотношения.
пальмитоилфосфатидилхолин - насыщенный фосфолипид, фазовый переход
которого отражается в резком уменьшении микровязкости, наблюдаемом
вблизи 37 °C (кривая /). Ниже температуры перехода липидные бислои, сос-
тоящие из насыщенных липидов, должны быть довольно вязкими. На рис. 5.12
также показана кажущаяся микровязкость смесей DPPC + холестерин (кри-
вые <3, 4). Холестерин обычно увеличивает кажущуюся микровязкость мем-
бран. Для определения микро вяз костей, приведенных на рис. 5.11 для всех
трех флуорофоров, в качестве растворителя сравнения было применено
минеральное масло. Эквивалентные микро вязкости были получены для каж-
дой из этих систем, что увеличивает достоверность яолученных значений.
Однако было бы более желательно использовать три разных растворителя
сравнения, чем изучать три разные системы, так как в этом случае экспе-
рименты выявили бы связь между скоростью вращения флуорофоров и мак-
роскопической вязкостью растворителей [ 14].

После этих начальных наблюдений измерения анизотропии флуоресцен-
ции стали широко использоваться для исследования динамики мембран. Не-
которые благоприятные характеристики метода, а именно относительно
простая теоретическая основа, несложное и сравнительно недорогое обору-
дование и высокая чувствительность измерений, способствовали его широ-
кому распространению. Благодаря высокой чувствительности появилась
возможность проведения экспериментов в разбавленных суспензиях мем-
бран, содержащих только следовые количества зондов. Типичное молярное
соотношение липид/зонд находится в диапазоне 200 •: 1 - 2000 •: 1, а типич-
ная концентрация липидов составляет 0,1-10 мг/мл.

Па протяжении последнего десятилетия наиболее широкоиспользуемым
зондом для оценки вязкости мембран был DPH. Это, по-видимому, вызвано
несколькими причинами. У DPH высокий коэффициент экстинкции
(~80000 М-1 . см-1), что позволяет исследовать разбавленные растворы,
а предельная анизотропия постоянна в диапазоне 320 - 380 нм, что опреде-
ляет выбор длины волны возбуждения. Деполяризационные вращения ПРИ,
по-видимому, изотропны. Вращение вокруг длинной оси молекулы может
быть быстрым, но оно не смещает момента перехода, и, следовательно, та-
кое вращение неактивно в деполяризации. (Искривления, заметные на
рис. 5.11 для других зондов, происходят частично из-за анизотропных
вращений несимметричных молекул.) И наконец, отчетливо проявляются фа-
зовые переходы мембран. Этот факт иллюстрирует рис. 5.13, па котором при-
ведены микровязкости, определенные с помощью DPH, для фосфолипидных
везикул различного химического состава [ 15]. Из полученных данных видно,
что кажущаяся микровязкость бислоев сильно зависит от их фазового сос-
тояния. Интересно отметить, что с другими флуорофорами, такими, как
12-антроилоксистеарат, 1-анилино-8-нафталипсульфопат, М-фенил-1-нафтил-
амин. перилен и 9-винилаптрацен, наблюдаются менее резкие изменения.
Температура, °C

Г03/Т, К~/

РИС. 5.13. Значения кажущейся микровязкости, полученные из измерений анизо-
тропии DPH [1б].

Приведены значения натурального логарифма кажущейся микровязкости от обрат-
ной температуры для малых однослойных везикул, приготовленных из DOPC (1),
DMPC (2), DPPC (3), DSPC (4).

Очевидно, что измерения анизотропии флуоресценции могут значи-
тельно расширить возможности изучения физико-химических свойств ли-
пидных бислоев. Однако важно понять и запомнить допущения, которые
были сделаны при оценке микровязкости. Главное из них состоит в том, что
градуировочная кривая, построенная при использовании изотропного раст-
ворителя сравнения, пригодна для флуорофоров, распределенных в анизо-
тропное окружение липидных бислоев. Приходится принимать, .что деполяриза-
ционные движения флуорофора идентичны в таком разном окружении. Это
предположение было проверено несколькими другими методами (разд. 6.2.1),
и в настоящее время известно, что оно некорректно: в липидных бислоях
диффузионные движения флуорофоров обычно затруднены, т.е. флуорофоры
не могут вращаться больше чем на определенный угол. В изотропном раст-
ворителе сравнения подобных угловых ограничений нет. Это не умаляет
пользы измерений анизотропии для изучения клеточных мембран, но показы-
вает, что нужно быть осторожным в интерпретации получаемых значений
микровязкости.

5.7.2	„ Вращательная диффузия белков

Первым биохимическим применением метода поляризационной флуорес-
ценции была оценка времен вращательной корреляции белков [ 16]. Общепри-
нятым подходом является ковалентное маркирование белка внешним флуоро-
фором. Флуорофор выбирают главным образом на основании времени зату-
хания флуоресценции. Время затухания должно быть сравнимо с предпола-
гаемым временем вращательной корреляции белка. Таким образом, анизотро-
пия будет отражать изменение этого параметра [уравнения (5.44) и (5.49)].
Обычно поляризация флуоресценции определяется из ее зависимости от
Т/q. Температуру изменяют обычным способом, а вязкость - путем добав-
ления сахара. График строят в координатах либо (1/Р- 1/3), либо 1/г от
Т/д (рис. 5.14). Экспериментально доступен только ограниченный диапазон
значений Т/д. При высокой температуре ограничение связано с нестабиль-
ностью белков, а при низкой - с замерзанием и изменением растворимости.
Отсекаемый отрезок па оси у должен быть равен (1/Р0 - 1/3)’ или (1/г 0)> где
Ро и г 0 - значения, получаемые для того же флуорофора в стеклообразном
растворе. В первом приближении PQ(r0) можно считать свойством флуорофора
Ближайшее окружение может влиять на Ро, но влияние обычно мало и срав-
нимо по величине с влиянием растворителя па спектр поглощения флуорофо-
ра. В следующем параграфе мы обсудим причины различий в экстраполиро-
ванных значениях Ро. Если время затухания флуоресценции известно, объем
молекулы белка может быть вычислен из наклона и отсекаемого отрезка
графика Перрена (рис. 5.14). Объем связан с временем вращательной корре-
ляции белка уравнением (5.41).

Для глобулярных белков время вращательной корреляции приближенно
связано с молекулярной массой М белка соотношением

РИС. 5.14. График Перрена для оценки молекулярных объемов.

Штриховой пинией показано влияние сегментальных движений зонда.
где? - удельный объем белка; h - величина гидратации (обычно 0,2 г Н2О
на 1 г белка). По уравнению (5.50) можно найти, что время корреляции гид-
ратированного белка приблизительно на 12 % больше, чем предполагается
для безводной сферы. Обычно наблюдаемые значения <р приблизительно в
два раза больше, чем предполагаемые для безводной сферы [ 17]. Большие
наблюдаемые значения являются, вероятно, результатом того, что боль-
шинство белков имеет несферическую форму и эффективная оболочка
растворителя больше для вращательной диффузии, чем для гидратации.

В реальных экспериментах часто получаются разные результаты в зави-
симости от того, что именно варьируется - температура или вязкость. Ти-
пичные результаты для иммуноглобулина G, маркированного диметиламино-
нафталин-5-сульфохлоридом, приведены на рис. 5.15. Главным и в то же вре-
мя вводящим в заблуждение свойством координат Перрена является увели-
чение экстраполируемого значения 1/Р0 (уменьшение значения Ро) по мере
увеличения температуры. Такое поведение обычно приписывают гибкости
зонда на макромолекуле.

РИС. 5.15. Поляризация флуоресценции ГЖЗ-у-иммуногпобмпина [18].

а - прямые проведены через точки, полученные при одной и той же температуре.
б — прямые проведены через точки, измеренные при разных температурах. На обо-
их рисунках одни и те. же данные.
На вопрос, какое значение Ро следует использовать для вычисления вре-
мени вращательной корреляции белка - экстраполированное (Ро') или зна-
чение для замороженного раствора (Ро), - полностью корректного ответа нет,
и нужно рассматривать специфические особенности каждого отдельного экс-
перимента. Обычно экстраполированное значение PQ' дает лучшую опенку <р,
поскольку в нем учитывается сегментальное движение зонда и частично вычи-
тается влияние этого движения па вычисленное значение <р. Например, предпо-
ложим, что сегментальное движение флуорофора значительно быстрее, чем вра-
щательная диффузия белка. Тогда значение Ро эффективно снижается:

2

3 COS 2 Р — 1

(5.51)

РИС. 5.16. Г рафик Перрена для комплекса DNA с профлавином [24].
где штрихом отмечено экстраполированное значение, ар- угол, на который
флуорофор свободно вращается (см. рис. 5.14). Подобным же образом сег-
ментальные движения снижают экстраполированную анизотропию г

(5.52)

При очень быстром сегментальном движении (<р « т) и наклон, и отсе-
каемый отрезок на графике Перрена меняются. Член (1/ Ро' -1/3) сокращает-
ся при расчете молекулярного объема, и вычисленное время корреляции
отражает общую скорость вращения белка. Важно отметить, что если <р
не намного меньше, чем т, а это часто встречается, то кажущееся время
корреляции может существенно изменяться под влиянием сегментальных
движений [19, 20).

Не следует пренебрегать информацией, получаемой из сравнения зна-
чений Ро и Ро* ^слиРо намного меньше, чем Ро, то можно сделать вывод о
существовании сегментальных движений зонда на макромолекуле. Протя-
женность этих движений может быть оценена при использовании уравнений
(5.51) - (5.52). Другое явление, часто встречающееся на графиках Перрена, -
быстрое увеличение 1/Р- 1/3 при высоких температурах, как это показано
на рис. 5.16 для денатурации двойной спирали DNA. Увеличение 1/Р обычно
является результатом денатурации макромолекулы, приводящей к увеличению
сегментальной подвижности флуорофора.

5.7.3	. Реакции ассоциации

Измерение поляризации флуоресценции или анизотропии широко исполь-
зуется для количественной оценки реакций ассоциации биологических
макромолекул. Связывание антигена с антителом [21], ассоциация белков
[22], ассоциации лигандов с белками и нуклеиновыми кислотами [23, 24] —
вот только несколько примеров. Предположим, что флуорофор может нахо-
диться либо в свободном виде, либо может быть связан с макромолекулой.
Наблюдаемое значение анизотропии флуоресценции, когда присутствуют
обе формы, дается выражением

г =/свобгсвоб + /связгсвяз	(5.53)

где гсвоб и гсвяз - анизотропии свободного и связанного флуорофоров со-
ответственно: /своб и fC0H3 - доли от общей флуоресценции, соответствую-
щие каждой форме флуорофора. Естественно, f своб + f свяэ = 1. Предполо-
жим далее, что для данного случая квантовый выход флуорофора не изме-
няется при связывании и/своб и /связ соответствуют долям от общего
количества флуорофора, находящегося в свободном и связанном состоянии.
Этой информации достаточно для вычисления константы диссоциации реак-
ции.
Рассмотрим равновесие между лигандом Ln белком Р:

L i Рг=Р - L

(5.54)

Константа диссоциации для этой реакции записывается в виде.

3 [ р -1, ]

(5.55)

Доля связанного флуорофора равна

ДзВНЗ

[P-L]	[/’]

[ М [ Р] + К

(5.56)

где [ Lq] « [ L] + [ Р - L] - общая концентрация лиганда или флуорофора.
Уравнение (5.53) легко преобразовать к виду

f СВЯЗ ~ (Г — ГСВОб)/(ГС0ЯЗ гсвоб)

(5.57)

В общем случае можно получить значения гсвоб и гсвяз, исследуя флуорофор
в отсутствие белка и при высоких концентрациях белка, достаточных для
полного связывания флуорофора. По измеренному значению г можно вычис-
лить /связ и /СВОб* )'ги значения затем используются для вычисления, кон-
станты связывания. Наиболее удобная форма уравнения связывания опреде-
ляется спецификой анализируемого объекта.

Ценность измерения анизотропии для изучения реакций ассоциации w-
тоит в том, что пет необходимости в изменении интенсивности флуоресцен-
ции или спектра испускания флуорофора. Фактически если происходят та-
кие изменения, то необходимо более сложное выражение для вычисления
f связ и:! средних значений анизотропии. Если при связывании происходят
изменения квантового выхода, анизотропия может изменяться значительно
сильнее. Например, рассмотрим связывание профлавина с DNA [ 24]. Извест-
но, что поляризация профлавина в воде почти равна нулю, а поляризация
формы, связанной с DNA, близка к 0,37. Следовательно, даже если кванто-
вый выход или спектр испускания профлавина при связывании остаются пос-
тоянными, анизотропия по-прежнему может быть использована для вычисле-
ния степени связывания.

Часто квантовый выход флуорофора при связывании изменяется.
В этом случае необходимо использовать другую форму уравнения (5.57),
учитывающую это изменение. Примем, что R <7связ/<?своб - отноше-
ние квантовых выходов связанной и свободной форм. Среднее значение
анизотропии связано с долей от общего количества флуорофора, находя-
щегося в связанном состоянии, выражением

(ГСВЯЗ“г)^+г ~гсвоб

При R = 1 это выражение сводится к уравнению (5.57). Если же при
связывании происходят значительные изменения в квантовом выходе, то
их можно использовать для количественной характеристики реакции ассо-
циации. Когда изменения малы (в два раза или меньше), предпочтительнее
использование анизотропии, особенно если при связывании сильно меняет-
ся г. Более того,измерения анизотропии не зависят от общей интенсивнос-
ти флуоресценции, благодаря чему можно использовать анизотропию в тех
случаях, когда трудно измерить интенсивность из-за свойств образца или
особенностей прибора.

СВЯЗЫВАНИЕ ЛУМАЗИНА (2,4-ПТЕРИДИНДОЛА) С ЛУМАЗИНОВЫМ БЕЛКОМ.
Для того чтобы проиллюстрировать влияние связывания белка с лигандом
на анизотропию флуоресценции, воспользуемся некоторыми результатами
из работы [ 23]. Авторы работы изучили связывание лумазина (L) с лума-
зиновым белком (Р) с молекулярной массой 22 000, образующим комплекс
(L -Р). При связывании лумазина с белком квантовый выход флуоресцен-
ции лумазина увеличивается в ~1,4 раза. В табл. 5.3 показаны стационар-
ные анизотропии для комплекса L -Р, измеренные при различных концен-
трациях. Из приведенных данных ясно, что анизотропия флуоресценции
раствора уменьшается при разбавлении образца. Это уменьшение объясня-
ется диссоциацией комплекса на белок и свободный лумазин, поэтому дан-
ные могут быть использованы для вычисления константы диссоциации комп-
лекса. В этом частном случае концентрации L и Р равны. Ясно, что
[ LP] = [ Р]общ/связ И [£»] = [ Р] = [ ^общ^1 ~~ ^связ)» ^Дб [ Р] общ ~~ общая

Таблица 5.3. Влияние разбавления
на анизотропию флуоресценции
комплекса лумазин—белок [23]

~Р]общ,	Анизотропия при	
мкМ	4 °C	21 °C
5,44	0,153	0,129
0,69	0,130	0,047
0,09	0,039	—
концентрация белка. Константа диссоциации, таким образом, равна:

IL,[P1 f'W -/связ)2
\исс--п7г- ------------------------- (5.59)

Доля связанного лумазина может быть вычислена из данных
табл. 5.3. Предположим, что при общей концентрации 5,44 мкМ весь лума-
зип связан с белком. Тогда гсвяз - 0,153. Далее предположим, что анизо-
тропия свободного лумазина была изморена и найдена равной 0,003. Это
значение г своб. Используя эти числа и другие значения анизотропии из
табл. 5.3, вычислим #дисс. Например, при концентрации 0,69 мкМ и 21 °C
анизотропия равна 0,047. Подстановка в уравнение (5.58) дает /С0ЯЗ 0,229,
а при подстановке итого значения в уравнение (5.59) получим /<дисс
1,79 мкМ.

Концепции, описанные в предыдущем параграфе, приводятся в литературе
в различных формах, обычно точно соответствующих конкретному набору
экспериментальных условий. Не ставя целью рассмотрение сложности свя-
зывания лиганда с белком, мы хотим проиллюстрировать возможность при-
менения среднего значения анизотропии для определения относительных ко-
личеств флуорофора в каждом из двух окружений. Если это известно, то вы-
числение соответствующих констант можно провести ио любому приемлемому
выражению, описывающему связывание лиганда с белком.

Представляется также интересным обсудить влияние несвязанного
флуорофора на кинетику затухания анизотропии флуоресценции. Теория
кинетики затухания анизотропии будет описана более детально в следующей
главе. Здесь рассмотрим флуорофор, находящийся в двух состояниях -
свободном и связанном. Кинетика затухания ;шизотропии дается выражением

rit\ -г f р-4/(Рсвоб , r f ~£/Фсвяз
г'-£) ’ го'свобс	+го/связс

(5.60)

где Фсвоб и Фсвяз ~ времена вращательной корреляции для флуорофоров
в свободном и связанном виде соответственно. Выражение (5.60) справедли-
во только в том случае, если время жизни флуорофора одно и то же в обоих
состояниях . Предположим, что фсвоС очень короткое (< 1 пс) из-за неболь-
шого размера флуорофора. Тогда для наблюдаемого затухания можно за-
писать:

r(t) - f /<рсвяз

' ' О'СВЯЗ v

(5.61)

Наблюдаемое затухание анизотропии будет одпоэкспоненпиальным с временем
корреляции <рсвяз. Несвязанный флуорофор не будет влиять на <рсвяз, но его
присутствие будет сказываться па кажущемся значении г(«), равном
го/С0яз ПРИ f = 0> и понижать кажущееся значение начальной анизотропии.
Интересно проанализировать общий случай, когда время затухания
флуоресценции флуорофора неодинаково в разных состояниях. Тогда кине-
тика затухания флуоресценции описывается уравнением

НО = асвобе Рво6 + аСвязР~*/Тсвяз	(5.62)

где асвобтсвоб ~ Азвоб и о:связтсвяз ~ /связ* Кинетика затухания анизотро-
пии равна

r(f) = асвобе СВ°бгсвоб(О + асвязе СВЯгЧвяз(0	(5.63)

«своё0"4 /Тсво6 + “связ е~*/Т°ВЯЗ

Это выражение иллюстрирует потенциальную сложность природы г (t) при
наличии двух классов флуорофоров. Например, примем, что время зату-
хания связанной формы тсвяз больше, чем время затухания свободной
формы тсвоб, что типично для зоцца,чувствительного к растворителю в
области гидрофобного связывания. При длительных временах после импуль-
са возбуждения r(t) увеличивается из-за увеличения доли вклада интенсив-
ности связанных форм флуорофора. Кинетика увеличения г (t) часто интер-
претируется как результат анизотропного вращения флуорофора. Действи-
тельно, анизотропные вращения могут определять кинетику увеличения
r(i), но, прежде чем давать такую интерпретацию необходимо убедиться,
что причиной не является гетерогенность.

5„7„4» Денатурация DNA.

В качестве заключительного примера использования метода поляриза-
ции приведен температурный график Перрена для комплекса профлавин -
DNA [24] (рис. 5.16). Профлавин встраивается между парами оснований
двойной спирали DNA. При такой локализации его вращательное движение
строго ограничено. Наблюдаемое значение поляризации ~0,36 при
Ро = 0,474 показывает, что профлавин практически неподвижен, когда он
связан с DNA. Наиболее отличительной чертой этих данных является рез-
кое увеличение 1/Р - 1/3, наблюдаемое при 60 °C, которое вызвано терми-
ческой денатурацией DNA, сопровождающейся высвобождением связанного
профлавина.

Задачи

5-1, 'Используйте данные рис. 5»15 для вычисления эффективного объема IgG
при 10, 20, 35 и 45 °C и угла, в пределах которого дансильная метка свободно враща-
ется (дополнительно к общему вращению белка) в течение времени жизни возбужден-
ного состояния. Примите для IgG т = 10 нс и плотность 1,2 г/сми. Считайте также,
что флуорофор не имеет внутренней подвижности при 10 °С„ Сравните вычисленный
объем с тем, который следует ожидать для сферической молекулы с молекулярной

массой 150 000,.

5-2., Пусть зонд 1-диметиламино-5-нафталинсупьфокислота (DNS ) связывается
с бычьим сывороточным альбумином (BSA).

а)	В предположении, что связывание не влияет на квантовый выход зонда, ис-
пользуя следующие данные, вычислите константу диссоциации ^дисс комплекса
DNS - BSA по формуле

К „ [BNS][ BSA]
дисс [ DNS ~ BSA]

(5.63)

б)	Теперь предположим, что квантовый выход DNS увеличивается в два раза
при связывании с BSA. Чему равна КдцСС в этом случае?

в)	Как вы определите, изменяется ли квантовый выход DNS при связывании с
BSA?

г)	Предскажите кинетику затухания анизотропии для каждого из указанных
растворов при 20 °C;

[ BSA]	[DNS]	р
0	1 • 10~7 м	0,0149
2 • Ю"г’ М	1 • 10~7 м	0,2727
" ДИСС	1 . 10“7 м	0,3913

Примите р 0,3913 для IMS. Считайте, что время вращательной корреляции DNS
и BSA хорошо аппроксимируется временами, предсказываемыми для безводной
сферы. Молекулярная масса BSA составляет 64000. Используйте вязкость и плот-
ность из задачи 5-3.

5-3, Предположим, что есть три белка — рибонуклеаза, химотрипсин и /-гло-
булин и нужно количественно оценить их химическую сшивку в димеры, для чего
можно использовать три зонда: флуоресцеинизотиоцианат, дансилхлорид и ангид-
рид пиренмаспяной кислоты. Молекулярные массы рибонуклеазы, химотрипсина и
/•глобулина равны 12 642, 22 600 и 150 000 соответственно. Вычислите уменьшение
анизотропии вследствие вращательной диффузии и влияние димеризации на наблю-
даемые значения анизотропии. Подберите зонды для белков, так чтобы получить
максимальную чувствительность анизотропии к димеризации и объясните причину
выбора. В вычислениях примите,что время вращательной корреляции увеличивает-
ся при гидратации на 50% по сравнению с безводной сферой. Вязкость воды при
25°С 0,694 сП (г . см"1 . с-1). Плотность белков может быть принята равной
1,2 г/сма. Времена затухания флуоресценции белков, меченных флуоресцеином,
дансилом и пиренбутиратом равны 4, 10 и 100 нс соответственно. Примите для
этих же зондов, что г0 равно 0,38, 0,30 и 0,15 соответственно.

5-4. Используйте данные табл. 5.3 для решения следующих задач о комплексе
лумазинового белка с пумазином.

а)	.Вычислите константу диссоциации пумазин-бепкового комплекса при 4 °C.
Примите Я -= <7связ/</св0б -• 1,5 и используйте данные для 0,09 мкМ.

б)	Значение PQ для пумазина равно 0,45. Вычислите время вращательной кор-
реляции лумазинового белка при 4 °C. Время затухания флуоресценции несвязан-
ного пумазина равно 12,3 нс.
в)	Предскажите кинетику затухания анизотропии флуоресценции для раствора
с концентрацией 0,09 мкМпри 4 °C. Примите, что время затухания < 1 нс не может
наблюдаться на имеющемся приборе.

5-5. Предположим, что флуорофор имеет одно и то же время жизни т в двух
разных окружениях, но разные времена вращательной корреляции, т.е.

=	*/ф1 +^е~*/ф2)	(5-64)

где f1 — доля флуоресценции, соответствующая флуорофорам в окружении 1. Естес-
твенно, + /2 = 1. Выведите уравнение, которое связывает стационарную анизо-
тропию с долями интенсивности и корреляционными временами <р, индивиду-
альных форм. Покажите, что это уравнение упрощается до уравнения Перрена при
Л = 1.
ГЛАВА6.

Кинетика затухания
анизотропии флуоресценции

В предыдущей главе были рассмотрены измерение и интерпретация дан-
ных по стационарной анизотропии флуоресценции, полученных при непрерыв-
ном освещении. Интерпретация этих значений основывается на уверенности
в правильности предполагаемого кинетического закона затухания анизотро-
пии [г («)] г- закона, который не наблюдается непосредственно в эксперимен-
те. Это иллюстрируется уравнениями (5.40) -- (5.44), в которых уравнение Пер-
рена выведено на основе предположения, что r(t) затухает до нуля как одно-
экспоненциальная функция. Значительная дополнительная информация может
быть получена при анализе кинетики затухания анизотропии флуоресценции.
Кинетику затухания можно измерять вслед за импульсным возбуждением, и
r(t) выводится с помощью тех же методов, которые использовались при из-
мерении времен затухания флуоресценции (гл. 3). Вид г(г) может быть про-
верен косвенно путем измерения фазового сдвига между параллельными и
перпендикулярными составляющими испускания. Вид г (г) можно также оце-
нить и при определении стационарной анизотропии, используя тушение при
столкновениях.

Изучение кинетики затухания анизотропии дает также информацию о диф-
фузионных движениях флуорофора и позволяет установить, поворачивается ли
флуорофор свободно на любой угол, или окружение накладывает на флуоро-
фор ограничения в его угловых смещениях. Путем измерений можно дополни-
тельно выявить, зависит ли затухание анизотропии от одной скорости вращег
ния, или имеется несколько вращательных процессов. Множественность вре-
мен затухания r(t) может быть результатом сегментальных движений флу-
орофора в макромолекуле. В этом случае затухание анизотропии происходит
и вследствие быстрых сегментальных движений и из-за общего вращательно-
го движения флуорофора. Многоэкспоненциальное затухание r(t) может быть
также следствием анизотропии вращений, т.е. вращения флуорофора с разны-
ми скоростями вокруг трех молекулярных осей.

6.1.	Теория кинетики затухания анизотропии
флуоресценции

Кинетика затухания анизотропии флуоресценции измеряется при импуль-
сном возбуждении, как это описано при обсуждении измерений времен зату-
хания (гл. 3). Для отбора необходимой поляризованной составляющей возбуж-
дения или испускания служат поляризаторы. Измеряют кинетики затухания
параллельной /ц («) и перпендикулярной составляющих и кинетику
анизотропии г(«) вычисляют по формуле

<(«)= J------i—= ад_	(6.i)

/„ (О *27х(»>	(„(«)

Следует ожидать, что для флуорофоров одного типа общая интенсивность
/0(«) будет подчиняться одноэкспоненциальному закону затухания:

/„(«)	(6.2)

где т - время затухания флуоресцении.

Понимание кинетики анизотропии облегчается при анализе отдельных •
членов' в уравнении (6.1). Используя определение анизотропии [ уравнение
(5.2)], легко показать, что непрерывное стационарное возбуждение парал-
лельной и перпендикулярной составляющих испускания дается выражениями

= у /„ (1 + 2г); /±= у /0(1 - г)	(6;3), (6.4)

где г - стационарная анизотропия. Обоснованность этих выражений может
быть показана подстановкой уравнений (6.3) и (6.4) в уравнение (5.2).

Рассмотрим молекулы, вращение которых симметрично (изотропно) и не
затруднено. Этот простой случай хорошо иллюстрирует смысл кинетических
данных. Для таких идеальных молекул известно, что после бесконечно узко-
го возбуждающего импульса (5-импульса) анизотропия затухает, следуя од-
ноэкспоненциальному закону:

г(«) =	= r0	(6.5)

В этом уравнении ф - время вращательной '.корреляции флуорофора; R -
его скорость вращения (6/? = ф-1); rQ - анизотропия, которая наблюдалась
бы в отсутствие вращательной диффузии. Для несимметричных молекул по-
лучаются более сложные выражения.

На основании этих выражений можно предсказать кинетики затухания
индивидуальных поляризованных составляющих испускания: '

;Н <0 = J ^(^U +2г(£>] .	(6.6)

<□_<*>= 4" 'о(г,[1-НЫ	(6'7)

Важной особенностью этих выражений является то, что затухание интен-
сивности флуоресценции не зависит от затухания анизотропии флуоресцен-
ции. В общем этого и следовало ожидать, так как маловероятно,что враща-
тельная диффузия флуорофора будет изменять его скррость затухания. Од-
нако при определенных обстоятельствах это может быть и неверно. Напри-
мер, вращательная диффузия может быть связана с изменением усредненно-
го окружения флуорофора, что в свою очередь изменяет время жизни. Тем
не менее такое событие маловероятно.

Физический смысл уравнений (6.6) и (6.7) иллюстрирует рис. 6.1. В мо-
мент t = 0 после 5-импульса для интенсивностей параллельной и перпенди-
кулярной составляющих можно записать:

/„ (< = 0) =	+ 2г0)	(6.8)

'±(« = 0)= -'-'о (’->„)	(6.9)

Если предположить, что rQ >' 0, то в момент времени t = 0 интенсивность
параллельной составляющей больше, чем перпендикулярной. Если rQ < 0, то
верно противоположное утверждение. В момент t = 0 при г Q = 0,4 парал-
лельная составляющая в три раза более интенсивна, чем перпендикулярная
составляющая.

Естественно, инструментальные ограничения делают обычно невозмож-
ными детальные наблюдения в момент t = 0, но полезно рассмотреть этот
идеальный случай. Во времена, большие чем t = 0, первоначальное различие
в интенсивности между /ц (z) и /д_(д) исчезает вследствие как вращатель-

РИС. 6.1. Графическое представление кинетики затухания анизотропии флуорес-
ценции.
ной диффузии флуорофора, так и общего затухания испускания. Начальная
скорость затухания («) превышает скорость затухания /0 (t), которое про-
исходит как вследствие затухания флуоресценции, так и вследствие вращательной диф-
фузии [уравнение (6.6)]. Начальная скорость затухания /1 (z) меньше, чем /0( z), пото-
му что происходит переход ориентации вращения флуорофоров из параллельной в пер-
пендакулярную. При больших временах после выравнивания заселенности популяций воз-
бужденных состояний благодаря вращательной диффузии /)( (z) и /JO име-
ют близкие скорости затухания, каждая из которых равна скорости затуха-
ния /Q(z).

Часто кинетику анизотропии представляют в логарифмической шкале
(рис. 6.1). Для одноэкспоненциального затухания анизотропии график hr (г) от
t линеен; его наклон равен -1 . Иногда приводят разность D(t). Различие

между поляризованными составляющими дается выражением

^и(«)-4(0- 0(z) - /огое*р -4—

LY

ф ).

(6.10)

Следовательно, D(z) уменьшается быстрее, чем /ц (г) или /| («), так как D(t)
уменьшается как вследствие общего затухания (т~х), так и^в результате до-
полнительного затухания анизотропии (ф-1)- Обычно член, связанный с об-

щим затуханием, исключают делением на /Q(z):

D(t)

г /1	1

/огоехр -Ц— +• —

L \ т	<р

(6.11)

~ гое

4е

Важно понимать, что наблюдаемыми величинами являются /ц(«) и I±(t) и
что D(t) или r(z) вычисляются по разности между этими индивидуальными
затуханиями. Надежные значения D(t) и r(z) могут быть вычислены только
для времен, при которых наблюдается значительное испускание флуоресцен-
ции. По этой причине обычно выбирают флуорофоры со временем затухания,
сравнимым с предполагаемым временем корреляции. Если т « <р, то интен-
сивность флуоресценции затухает раньше, чем произойдет заметная потеря
анизотропии. В этом случае Z)(z)~7o(z) и г(z)«r0. И наоборот, если время вра-
щательной корреляции очень короткое (<р « т), то Z>(t)=0. Полезные и ин-

тересные данные получаются в промежуточном диапазоне, где т«ф и вра-
щательная диффузия дает вклад в кинетику затухания анизотропии.

В ином виде кинетика затухания анизотропии изображена на рис. 6.2.
Предположим, что образец возбуждается бесконечно коротким импульсом
света. Напомним, что в момент t = 0 популяция возбужденных молекул сим-
метрично распределена вокруг оси z . Из-за зависимости вероятности воз-
буждения от cos 2 6 (разд. 5.2.1) полное совпадение направлений возбужден-
ных молекул с осью z невозможно. Представляя анизотропию в виде r(z)/rQ,
можно эффективно исключить фактор деполяризации, связанный с фотоот-
РИС. 6.2. Зависимость деполяризации флуоресценции от времени.

бором. Вслед за возбуждением распределение возбужденных молекул во-
круг оси z уширяется из-за вращательной диффузии флуорофоров. Средняя
анизотропия в любой момент времени будет равна среднему углу в соответ-
ствии с уравнением (5.45), в котором у обозначает угловое смещение дипо-
лей поглощения и испускания вследствие вращательной диффузии. В момент
t = 0,1 ф флуорофоры вращаются в среднем на 14,6°, при t = 2ф средний
угол равен 49,4°. Полная деполяризация достигается при 54,7°. Эти средние
"углы” обозначены для пояснения концепции анизотропии. Важно понять, что
анизотропия является мерой среднего значения соз 2 у. Среднее значение
cos2y может быть переведено в соответствующее угловое значение, которое,
однако, не является точным значением углового смещения.

6.1 Л. Несимметричные флуорофоры

Важно понять, что г (t) затухает по одноэкспоненциальному закону толь-
ко для молекул, вращение которых не затруднено и характеризуется одним
временем вращательной корреляции. Затухание г(г) может усложняться по
I	1

ряду причин, одной из которых является анизотропия вращений, т.е. разная
скорость вращений вокруг разных осей молекулы. Например, молекула пери-
лена дискообразна (см. рис. 5.10), и можно ожидать, что плоскостные враще-
ния должны быть -быстрее, чем внеплоскостные. Внеплоскостные движения
должны смещать плоскость молекулы, для чего требуется смещение моле-
кул растворителя. Для внутриплоскостпого вращения, вероятно, необходи-
мо меньшее смещение молекул растворителя, и, таким образом, следует ожи-
дать, что оно должно быть более быстрым (разд. 5.6.1 и 6.3.3). Такие моле-
кулы рассматриваются как несимметричные, и говорят, что их вращение долж-
но быть анизотропным. Обычно макромолекулы несимметричны, так что не
следует ожидать одинаковых скоростей вращения во всех направлениях.

Предсказанные кинетики затухания для анизотропных молекул часто про-
тиворечивы [ 1 - 6]. В настоящее время общепринято [1-3], что анизотро-
пия должна затухать, как сумма экспонент:

—t /ф-

r(t)=	(6.12)

I

где может быть до пяти экспоненциальных членов для асимметричного тела.
Значения gt- и q>t- представляют собой сложные функции скоростей враще-
ния вокруг молекулярных осей несимметричного тела и ориентаций диполей
поглощения и испускания по этим осям. На практике редко удается выделить
более двух экспонент, однако важно знать, что анизотропные вращения могут
приводить к многоэкспоненциальному затуханию анизотропии. Для малых мо-
лекул в растворе скорости вращения вокруг разных осей редко различаются
более чем в 10 раз. Разделить такие близкие скорости кинетическими мето-
дами трудно. Существование анизотропных вращений было обнаружено диф-
ференциальным фазовым методом (разд. 6.3) и недавно импульсными мето-
дами [39]. Макромолекулы могут быть сильно асимметричны, что может при-
водить к сложному затуханию анизотропии. '

6.1.2.	Флуорофоры с затрудненным вращением

Затухание анизотропии флуоресценции может быть сложным и для изо-
тропно вращающихся молекул в том случае, если эти молекулы находятся в
анизотропном окружении. Например, диполь испускания DPH ориентирован
приблизительно в направлении его длинной молекулярной оси (см. рис. 5.3),
и следует ожидать, что вращения, которые смещают этот диполь, должны

РИС. 6.3. Графическое представление кинетики затухания свободного (7) флуоро-
фора и флуорофора с затрудненным вращением (2).
быть изотропны, потому что молекула практически симметрична' относитель-
но этой оси. Вращение вокруг длинной оси молекулы должно быть более
быстрым, чем другие вращения. Однако это быстрое вращение не смещает
диполь испускания и, следовательно, не деполяризует испускания.

Было найдено, что анизотропия не затухает до нуля, когда вращатель-
ные движения флуорофора затруднены. Под затруднением мы подразумева-
ем, что угловой диапазон вращательных движений ограничен. В таких слу-
чаях предельная анизотропия наблюдается при больших временах, чем
времена затухания флуоресценции. Сравнение кинетйк затухания анизотро-
пии для свободного и затрудненного флуорофора приведено на рис. 6.3. Как
обычно, r(t) для свободной молекулы затухает экспоненциально до нуля. В
противоположность этому г(е) для затрудненного вращения может описы-
ваться выражением

г(«) = (г0 _ ^)е-бЛг + Гоо	(6ЛЗ)

В этой простой приближенной модели для затрудненного вращения предпола-
гается, что затухание от г Q до г(Х) все еще происходит экспоненциально.
При строгом анализе может появиться необходимость в более сложной интер-
претации [ 7], но реальные данные редко бывают достаточны для проведения
сложного анализа. Во многих случаях уравнение (6.13) дает адекватное опи-
сание. Постоянный член г'™ интерпретируется как результат энергетическо-
го барьера, который предотвращает вращательную диффузию флуорофора, вне
пределов некоторого угла. Смысл значений будет обсужден в разд. 6.2.1.1.

6.1.3.	Сегментальная подвижность флуорофора,
связанного с биополимером

Рассмотрим флуорофор, связанный с макромолекулой, и предположим,
что возможны сегментальные движения с временем корреляции фф. Пусть
ФБ - время корреляции для вращения макромолекулы как целого. Существу-
ет ряд теоретических подходов к обсуждаемому вопросу [8 - 10]. Более стро-
гие подходы приводят к различным выражениям для r(t), большинство из ко-
торых хорошо аппроксимируется простыми выражениями, приведенными ни-
же. Предположим, что сегментальные движения флуорофора происходят неза-
висимо от вращательного движения макромолекулы. Тогда анизотропия в лю-
бой момент времени t выражается произведением отдельных факторов, от-
ветственных за деполяризацию:

r(f) = г0[«	+ (1—а)]е б/ф|Б	(6.14)
Это можно рассматривать как несколько более сложный случай затрудненно-
го вращения, в котором анизотропия быстро затухает до roo= rQ(l - а) в ре-
зультате сегментального движения. Однако анизотропия продолжает затухать
до нуля в результате вращения макромолекулы как целого (е“*/фБ ). Интерес-
но отметить, что многоэкспоненциальное затухание г (г) наблюдается тогда,
когда быстрые движения затруднены (а < 1). Если сегментальные движения
были бы полностью свободны, т.е. а = 1, то анизотропия должна была бы за-
тухать с одним кажущимся временем корреляции <ркаж , которое в свою оче-
редь определялось бы выражением фкаж = фБфф/(фб +• фф). Сегментальное
движение будет проявляться только при малых значениях фкаж по сравнению
с временем корреляции, предполагаемым для макромолекулы.

Важно понять, что при анализе кинетик затухания анизотропии наблюда-
емые величины обычно выражают в виде суммы экспоненциальных затуханий.
Тогда затухание, соответствующее уравнению (6.14), обычно выражают в виде

* f дол с'‘/Ф»°")	(6.15)

где индексы "кор" и "дол" соответствуют коротким и долгим временам кор-
реляции соответственно. Из сопоставления уравнений (6.14) и (6.15) можно
вывести следующие взаимосвязи между параметрами:

^кор а ’ fдол 1 “

(6.16)

1

фкор

фБ фдол ФБ

(6.17)

1



Из уравнения (6.17) видно, что вполне допустимо приравнять большее время
корреляции к времени корреляции вращательного движения как целого. Од-
нако короткое наблюдаемое время корреляции не равно точно времени кор-
реляции сегментальных движений. Однако если <рф « <рБ , то фкор = фф.

6.1.4.	Кинетика затухания анизотропии для смеси
фпуорофоров

В заключение рассмотрим кинетики затухания интенсивности флуорес-
ценции, ожидаемые для смеси флуорофоров. Предположим, что имеются два
флуорофора или один флуорофор, но в двух разных окружениях. Кинетика
затухания равна

—t / Т .	/т 2

/o(t) = «ie + а2е

(6.18)

где Tj и т2 - индивидуальные времена затухания флуоресценции. Вклад
доли каждого компонента в общее испускание в любой момент времени t ра-

вен

-i /т^

(6.19)

Следовательно, используя закон аддитивности анизотропии [ уравнение
(5.6)], получаем

Это выражение сравнительно сложное, но есть интересные предельные слу-
чаи, например единственный флуорофор, находящийся в виде двух форм: сво-
бодной - в растворе (1) и связанной с белком (2). Для простоты предполо-
жим, что времена затухания одинаковы для обеих форм. Свободный флуоро-
фор, по-видимому, имеет короткое время корреляции, так что rl(t) = 0 на
протяжении всего времени наблюдения. Для этого простого случая можно
записать следующую зависимость:

-е/Ф2

а1 + “2

(6.21)

Свободный флуорофор не влияет на измеряемое время корреляции, но кажу-
щееся значение го снижается в а2/(а х + а 2) раз по сравнению с ожида-
емым значением, которое равно “2т2/(я1т1 + а2т2) для случая, когда
т — т .

1	2

Предположим теперь, что времена затухания не равны или что мы не
можем принять г = 0. В этих случаях г (г) будет зависеть от времени
и из-за вращательной диффузии, и из-за зависящих от времени изменений
в относительной интенсивности каждой популяции флуорофоров. Интерес-
но отметить, что такая гетерогенность может сказаться на значениях r(t),
которые возрастут со временем вместо того, чтобы уменьшаться, как при
обычном затухании. Например, предположим, что флуорофор находится в
равновесии с макромолекулой и что время затухания и анизотропия увели-
чиваются при связывании. При коротких временах испускать могут главным
образом короткоживущие формы, которые имеют также и низкую анизотропию
По мере увеличения времени в испускании могут начать преобладать связан-
ные формы, и, следовательно, r(t) может увеличиваться со временем.

Из теоретических положений, изложенных выше, ясно, что из измерений
кинетик затухания анизотропии может быть получена значительная информа-
ция. В следующем разделе будут приведены результаты, которые иллюстри-
руют полезность таких измерений.

6.2.	Использование измерений кинетики затухания
анизотропии в биохимии

6.2.1.	Липидные бислои, маркированные
дифенилгексатриеном

Как было описано в разд. 5.7.1, измерения стационарной анизотропии ши-
роко применяются при оценке микровязкости мембран и мицелл. Для такой
оценки строят градуировочную кривую зависимости анизотропии от вязкости,
используя растворы сравнения с известной вязкостью. Затем измеряют ани-
зотропию для того же флуорофора, распределенного в неполярную область
мембран. Микровязкость мембран вычисляют методом сравнения. В этой ме-
тодике используется уравнение Перрена, которое описывает зависимость ани-
зотропии от вязкости и других факторов (разд. 5.6). Как указывалось, урав-
нение Перрена в действительности является прямым следствием предполага-
емого экспоненциального затухания г (г) для сферических молекул. Вообще,
в этом методе принимается, что природа вращательной деполяризации иден-
тична для растворителя сравнения и для мембран. Как и следовало ожидать,
измерения кинетики затухания анизотропии были использованы для проверки
этого предположения.

На рис. 6.4 приведены значения r(t) для DPH в минеральном масле, ко-
торое обычно используют в качестве растворителя сравнения [11]. Это вычис-
ленные импульсные функции отклика для г(«). Видно, что по мере увеличения
температуры г(г) затухает быстрее. Важно, что r{t) затухает с одним вре-
менем корреляции и затухает до нуля. Совсем другая картина была получена
РИС. 6.4. Графическое представление кинетики затухания DPH в минеральном
масле [11].

Приведены вычисленные импульсные функции отклика для r(i).

для DPII, распределенного в гидрофобную область модельных мембран (рис. 6.6).
На этом рисунке приведены данные для фосфолипидных везикул димиристоил-L-а-фос-
фатидилхолина [ 12].. Боковыми заместителями в DMPC являются насыщенные
жирные кислоты, и везикулы этого липида претерпевают фазовый переход
вблизи 24 °C. При температуре выше температуры перехода (Тс) анизотропия
затухает приблизительно до нуля.

РИС. 6.5. Графическое представление кинетики затухания анизотропии ПРИ в
фосфолипидных везикулах димиристоил-Е-(а)-фосфатидипхопина.

(С разрешения авторов работы [12] и Elsevier Biomedical Press.)
Поразительным контрастом к идеальному затуханию r(t), найденному
для DPH в минеральном масле, является то, что г(«) для DPH в липидах
не затухает до нуля. Такое поведение особенно очевидно ниже температуры
фазового перехода везикул. Было найдено, что значения анизотропии, вмес-
то того чтобы стремиться к нулю, достигают предельного значения и г(«)
хорошо соответствует уравнению (6.13). Такое же поведение наблюдалось для
широкого набора фосфолипидов и в других лабораториях [11- 14]. Главный
вывод, который можно сделать из всех этих результатов, - то, что диффу-
зионные движения флуорофора различны в растворителе и в мембранах. В
растворителе сравнения диффузионные движения не затруднены, а в мембра-
нах - сильно затруднены. Такое поведение, замеченное и для других флуоро-
форов, связанных с мембранами [ 15 - 16], по-видимому, представляет со-
бой общую отличительную черту кинетик затухания в маркированнных мем-
бранах. Несомненно, что оценки мембранной микровязкости дали вклад в
понимание свойств как модельных, так и природных клеточных мембран. При
помощи кинетик затухания выявляется следующий главный момент: экспери-
ментально наблюдаемый параметр - анизотропия, по-видимому, заслужива-
ет большего доверия, чем производные от него параметры микровязкости.

Полезно рассмотреть затухание индивидуальных поляризованных состав-
ляющий ।(г) и А (0, так как они служат фактическими данными для вы-
числения г (с). Действительный вид этих индивидуальных кинетик затухания
определяется уравнениями (6.38) и (6.39), которые получаются при подстанов-
ке уравнения (6.13) в уравнения (6.6) и (6.7). Нетрудно разобраться, исходя
из уравнений (6.6) и (6.7), что причиной ненулевого значения является из-
быточная интенсивность /ц (е) с (jJ«), поскольку /ц(г) не затухает вслед-

РИС. 6.6. Графическое представление кинетики затухания поляризации и анизо-
тропии DPH в везикулах DMPC [ 12].

Один канал соответствует 0,203 нс.
ствие какой бы то ни было наблюдаемой вращательной диффузии. Индивиду-
альные кривые затухания для везикул, маркированных DPH , приведены на
рис. 6.6. При низких температурах (14,8 °C) /ц («) остается больше /. (t) в
течение всего времени наблюдения. Хотя это не показано на рис. 6.6, но при
более высокой температуре (37,2 °C) поляризованные интенсивности быстро
выравниваются благодаря вращательной диффузии. Смысл этих результатов
заключается в том, что вращательные движения DPH затруднены при темпе-
ратурах ниже фазового перехода везикул.

6.2.1.1.	Интерпретация значений гк

Значительное внимание было уделено интерпретации предельной анизотропии
на молекулярном уровне. Оно возникло из желания понять свойства мемб-
ран, которые влияют на затруднение вращения. В одной из работ [7] счита-
ется, что стержнеподобная молекула DPH находится в квадратной потенци-
альной яме, так что ее вращение не затруднено, пока не достигнут опреде-
ленный угол ©с . Предполагается, что вращение вне этого угла должно быть
энергетически невозможно. В этой модели предельная анизотропия связана
с коническим углом 0 следующим соотношением:
। с
г
о°	.

~ (со» ее)(1 + сое е^)]2	(6.22)

-о	2

Совершенно незатрудненное движение получается при = 90°. Одной из
трудностей модели является то, что вычисление 0с из /г зависит от на-
личия квадратной потенциальной ямы в мембранах. Тот факт, что наблюда-
ется ненулевое значение , еще не доказывает существования такого зна-
чительного потенциального барьера. По этой причине следует соблюдать ос-
торожность при интерпретации значений 0С , вычисленных из наблюдаемых
значений г*.

С другой стороны, было показано, что при временах, значительно превы-
шающих времена вращательной корреляции, связана с параметром упоря-
доченности зонда [ 10, 13, 17, 18]:.

где скобки означают усреднение по всем флуорофорам. Этот результат, ло-
ви дим ому, не зависит от предполагаемой модели.

6.2.2.	Сегментальная подвижность молекул антител

Молекула иммуноглобулина G(IgG) Y-образна; молекулярная масса при-
близительно 150000. В обеих верхних частях Y находится центр связывания
антигена. Глобулярная область, содержащая этот центр, называется /'^-фраг-
ментом. IgG может быть расщеплен протеазами, образуя либо Fab, либо
(Fab}2. Каждый фрагмент Fab имеет молекулярную массу-^50 000. Для иссле-
дования сегментальной подвижности IgG была использована кинетика зату-
хания анизотропии флуоресценции [19].. Полученные результаты поучитель-
ны и показывают, что молекула IgG обладает значительной внутренней гиб-
костью. В работе [20] подвергается сомнению точная интерпретация этих
данных, но не выводы в целом. Авторы работы [20] использовали антитела,
которые были выработаны против дансильного (5-диметиламинонафталин-1-
сульфонил) гаптена. Было найдено, что очищенные молекулы IgG прочно свя-
зывают дансил-лизин. Скорости вращательной диффузии устанавливали на ос-
нове кинетики затухания флуоресценции дансила. Типичные данные для /ц(«)
и /^(«) приведены на рис. 6.7. Различие между параллельными и перпенди-
кулярными интенсивностями сохраняется дольше для IgG, чем для меньшего
Fa^-фрагмента, потому что последний вращается быстрее; О(г) для димера
(rafc)2 находится в промежутке между этими крайними случаями. Эта зави-
сящая от времени разность вместе с /п(г) + 2 /^(t) была использована для
вычисления кинетики затухания анизотропии (рис. 6.8). Наблюдалось хоро-
шее соответствие с уравнением (6.15). Для Fab затухание г (с) было прибли-
зительно одноэкспоненциальным с <р.кор = 33 нс. Используя уравнение (5.40),
можно рассчитать,что для молекулярной' массы 50 000 (й = 0,73 мл/г, ц = 0,94 сП
при 23 °C) ф = 14 нс. Такой результат типичен для глобулярных белков. Гид-
ратация и потеря сферической симметрии обычно приводят к тому, что изме-
ряемое время корреляции приблизительно в два раза больше, чем вычислен-
ное для безводной сферы.

В отличие от Fa^-фрагментов было найдено, что затухание r(t) для це-
лого IgG двухэкспоненциально. Для его описания подходит уравнение (6.15)
° фкор = 33 нс и фдоп= 168 нс. Короткое время корреляции приписывается
сегментальным движениям Ffc-фрагмента, а фдол - общему вращению бел-
ка. Наличие и короткого, и долгого времени корреляции для одной и той же
молекулы было принято за доказательство сегментальных движений области
Fab в целой молекуле IgG. Интересно, что длительное время корреляции су-
щественно больше, чем предсказываемое даже для гидратированной молеку-
лы с молекулярной массой 150 000. Используя уравнение (5.40) и соотношение
V = M(v +• h ), где h - степень гидратации, можно вычислить ф = 53 нс для
h = 0,2 мл/г белка. Большое значение фдол было объяснено песферической
формой молекулы IgG. Недавние эксперименты [20] также показали два вре-
мени затухания для r(t). Однако эти времена были, как правило, в два раза
короче, чем наблюдалось ранее. Для интерпретации таких еще больших ско-
ростей деполяризации было предположено, что сегментальная гибкость моле-
кулы IgG значительно больше, чем это описывалось выше.

Можно использовать фактор /дол для того, чтобы вычислить угловое
смещение, определяющее'короткие движения. Рассмотрим уравнение (6.15).
Очевидно, что фактор / описывает анизотропию, остающуюся после за-
вершения быстрых движений. Используя уравнение (5.45), можно получить
выражение

COS 2у =

2Г 1

' ДОЛ

(624)

Случай /доп = 0 соответствует быстрому движению с неограниченным уг-
лом (сов2у = 1/3 или у = 54,7°); /дол = 1 соответствует случаю, когда быст-
рое движение не дает вклада в потерю анизотропии (cos 2у = 1 или у = 0°).

Для IgG /дол - 0,56. Эти результаты были интерпретированы как быстрое вра-
щение Fab-области IgG на угол 33°. Следовательно, сегментальные движе-
ния /^-области существенны, /(ля точности отметим, что с помощью угла у
интерпретируется регистрируемый параметр /	. В действительности в

экспериментах по анизотропии измеряют не углы, а среднее
значение cos2 0[ уравнения (5.15) - (5.19)]. Переведение наблюдаемого пара-
метра сов2 9 в 0 делается для наглядности измеряемых величин. '
Анизотропия испускания

РИС. 6.8. Графическое представление кинетики затухания анизотропии флуо-
ресценции дансип-лизина, связанного с IgG и его фрагментами [19].

Fab го = °’32 и ’ = 33 нс.- Для ^кор = °’44’ W = О-56 • ’кор = 33 нс и
’дол 138 нс.
6.2.3.	Деполяризация Y-бснования в дрожжевой tRNA
фенилаланина (tRNAP11*5). •

Как правило, нуклеиновые кислоты не проявляют заметной флуоресцен-
ции. Однако tRNAPhe из дрожжей имеет необычное сильно флуоресцирующее
основание, названное Y-основанием. По кинетикам затухания анизотропии
флуоресценции было изучено влияние Mg2+ на вращательную диффузию tRNA.
Результаты показывают, что Y-основание подвижнее, чем предполагалось
для сферы равного объема. Следовательно, можно считать, что Y-основание
вращается независимо от молекулы tRNA в целом [21].

На рис. 6.9 приведено затухание («) - /Jt), которое происходит как
в результате вращательной диффузии, так и в результате затухания флуорес
центного испускания:

ад = /п(0 -	= &е-«/фе^/т = Ь"* А'	(6.25)

где k - условная константа пропорциональности. Кажущееся время затуха-
ния D(t), равное 3,8 нс, определяется выражением

1/т'= 1/<р 4- 1/т	(6.26)

Общая флуоресценция (/ц + 2 /jJ затухает с одним временем т - 6,2 нс, и,
следовательно, $ = 9,8 нс. Это значение может быть сопоставлено со значе-
нием, предполагаемым для молекулы с такой ж? молекулярной массой, как
tRNA(26400), если использовать соотношение <р = r\V/RT, При ц = 0,89 сП
[г/(см-с)]

РИС. 6.9. График наносекундной деполяризации Y-основания tRNAphe [21].
1 нс = 2,11 канала.
и плотности 1 г/см3 получаем q> = 9,5 нс для безводной сферы. Мо-
лекула tRNA не является сферической, и, таким образом, следует ожидать
большего значения <р. Более того, гидратация будет приводить к увеличению
значения <р. Реальное время вращательной корреляции, по-видимому, -18 нс,
и для tRNA, маркированной этидийбромидом, из затухания анизотропии было
получено время корреляции, равное 25 нс. Следовательно, наблюдаемое зна-
чение 10 нс, вероятно, указывает на сегментальную подвижность У-основа-
ния.

Интересно отметить, что в этом случае многоэкспоненциального затуха-
ния r(t) не наблюдалось. Конечно, перепроверка r(f) может показать, так
ли это. Важно то, что можно сравнить кажущиеся времена корреляции с вы-
численными по уравнению Стокса - Эйнштейна [уравнение (5.40)]. Измерен-
ные значения, которые меньше, чем вычисленные времена корреляции, по-ви-
димому, указывают на сегментальную подвижность. При подобном грубом
сравнении степень подвижности и ее время корреляции не определяются. Тем
не менее можно получить общую оценку гибкости биополимера.

6.3.	Разностная поляризационно-фазовая флуорометрия.

Разностная поляризационно-фазовая флуорометрия (РПФ) представляет
собой один из методов изучения кине тик затухания анизотропии. В этом ме-
тоде образцы возбуждают поляризованным синусоидально-модулированным
светом и измеряют разность фаз (△ = <р± — фц ) между перпендикулярной и
параллельной компонентами испускания. Эта разность фаз зависит от rQ,
частоты модуляции, скорости вращения флуорофора, свободы и изотропности
вращений. Следовательно, можно получить информацию о виде r(t). Как и в
случае измерения времен затухания флуоресценции фазовым методом (гл.З),
получают косвенную информацию, особенно когда измерения проводят с ис-
пользованием одной частоты модуляции. И тем не менее, в этих измерениях
содержится ценная информация об анизотропии [ 22, 23] и затрудненности вра-
щений [24] и могут быть измерены скорости быстрых вращений [ 25]..

6.3.1.	Измерение разностных фазовых углов

Блок-схема разностного фазового флуорометра приведена на рис. 6.10.
Модулированное возбуждение поляризовано вертикально. Как правило, испус-
кание регистрируется одновременно двумя детекторами [23], поэтому изме-
рения называют разностными*. Испускание в обоих каналах наблюдается че-
рез поляризаторы. Фазовый угол между параллельной и .перпендикулярной
составляющими измеряется следующим способом. Во-первых, измеряют раэ-

Иногда такого рода измерения называют дифференциальными, что может вы-
зывать ассоциацию с дифференциалом или производной. Более правильным представ-
ляется называть их разностными (от математического рермина разность), что со-
ответствует сути метода измерения. — Прим, перев.
РИС. 6.10. Блок-схема разностного поляризационно-фазового флуорометра.

ность фаз, когда оба поляризатора находятся в одной и той же ориентации.
При этом фазовый угол обоих каналов идентичен и наблюдаемая разность
<Рц связана только с инструментальными факторами. Затем один поляриза-
тор ставят в горизонтальное положение. Измеряемый фазовый сдвиг ф^за-
висит как от инструментального фактора, так и от фазовой разности между
/j_h /ц . Вычитание инструментального фактора из второго измеренного зна-
чения дает △ = cpj_- ф и .

6.3.2.	Теория разностной поляризационно-фазовой
флуорометрии

На первый взгляд теория РПФ кажется сложной [26]. Однако Вебер
[ 22] предложил простую методику, которая позволяет вычислять тангенс
разности фаз tgA для любой предполагаемой импульсной функции отклика
т(t). В гл. 3 было описано предсказание фазового угла фг для любого ис-
пускания на основании синуса и косинуса, полученных из импульсных функ-
ций отклика / (t), описывающих общее испускание. Фазовый угол равен:

IgT,. =	(6.27)

\ (t)sinuldl и С, = f I Al)cr>su>tdt	(6.28),(6.29)

о	0

где co - круговая частота модуляции. Нас интересует tgA = tфц ).
Тангенс разности равен

tgtPL-tgq,,,
tg(q>] -Фц) = --------------- = --------------

1 + tgT±tg<pn ,vn 'к f DwD

(6.30)

Импульсные функции отклика параллельной и перпендикулярной составля-
ющих легко предсказать из уравнений (6.6) и (6.7). Для удобства будем пи-
сать их в развернутом виде. Мы предположили, что затухание как анизотро-
пии флуоресценции, так и интенсивности описываются одноэкспоненциальны-
ми функциями [ г (г) = rQexp (-67?г) и I(t) = /0 exp (-г/т)]. Для краткости за-
писи примем Г = 1/т и = 1. Последнее предположение правомерно, так
как мы будем использовать только отношение разложения интенсивности на
синус и косинус. Поэтому

* }'0е-,Г+881‘	(6-3D

Л (<) =2-	- 1- гое-<Г + W	(6.32)

О	и

Вычисление преобразований /ц(«) и /Jt) с последующей подстановкой в урав-
нение (6.30) дает выражение для tgA:

(2Ят) сотг0

tgA= --------------------------------------------- (6.33)

(1/9) m0(l + со2т2) + [(2Лт),/3](2 1- r0) + (2R т)2

где mQ = (1 + 2г 0) (1 - г0). Значение tgA является функцией скорости вра-
щения (/?), г0, т и со. Максимальное значение tgA равно

Зсот г0

1 g △ max =----------------------------

(2 + ro) + 2[ mQ (1 + со2т2)]И

Видно, что .оно не должно зависеть от скорости вращения. Отметим, что эти
выражения верны лишь для изотропного вращения с одним временем затуха-
ния флуоресценции. Максимальный разностный тангенс зависит только от т,
г0 и со. Для .значений г Q > 0 анизотропные и/или затрудненные вращения вы-
зывают уменьшение tgA^ .

Интересно рассмотреть влияние различных параметров на tg А. Анализ
уравнения (6.33) показывает, что значения tgA положительны, когда rQ>0.
Для перпендикулярной составляющей испускания фазовый угол больше, чем
для параллельной, так как флуорофор должен повернуться в другую плоскость
для того, чтобы его можно было наблюдать через перпендикулярный поляри-
затор. Время задержки перпендикулярной составляющей вытекает из урав-
нения (6.33) и из рис. 6.1, который иллюстрирует влияние отрицательного
предэкспоненциального фактора, фц < ф^, потому что параллельная состав-
ляющая затухает вследствие как затухания интенсивности, так и вращения
из плоскости наблюдения. Это также ясно из рис. 6.1. Второй член в уравне-
нии (6.31) уменьшается быстрее, чем затухает общая интенсивность флуорес-
ценции. Рассмотрим случай, когда 67? »Г или 67? « Г . В любом случае вра-
щательный процесс не дает зависящего от времени различия между /ц (г) и
Zjl(«), приводящего к tgA = 0. Фазовый сдвиг между этими составляющими на-
блюдается только тогда, когда параллельные и перпендикулярные составля-
ющие изменяются во временной шкале, сравнимой с временем затухания флу-
оресценции.

Зависимость tgA от /?, и и т иллюстрирует рис. 6.11, из которого вид-
но, что эта зависимость квадратичная. Для любого измеренного-значения tgA
существуют два возможных значения /?. Обычно правильное значение выбира-
ют по температурной зависимости R, стацирнарной'анизотропии или по дру-
гим экспериментальным данным. Для вычисления 7? из tgA необходимо, что-
бы т и г0 были известны.

(27? т )2 + (2/?т)|

tgA

мт Ь _L mQ (1 + со2т2) = 0 (6.35)

Важной особенностью разностных тангенсов является их зависимость
от частоты модуляции [22, 27]. Увеличение частоты модуляции повышает
значения tgA и сдвигает профиль tgA к большим скоростям вращения (при
постоянном времени затухания) (рис. 6.11). Эту зависимость в течение мно-
гих лет игнорировали, однако важно помнить, что на фазовом флуорометре
измеряются фазовые углы, но не времена затухания. Справедливости ради
следует указать, что в ряде работ [28 - 31] изучалось влияние вращатель-
ной диффузии на кажущиеся времена затухания параллельной (т-ц ) и перпен-

0,01 0,1	1	10	100

2 От

РИС. 6.11. Графические зависимости
расчетных разностных тангенсов от 27?т
для сферического флуорофора [ 22].
дикулярной (tjJ составляющих испускания. Эти кажущиеся времена затуха-
ния вычислялись из tgipu = сотц и tgq>^= сот^. Естественно, затухания
/|। (z) и не являются одноэкспоненциальными, так как, строго говоря,
Тц и т^не существуют. В ранних работах эти измеряемые величины были
приравнены к среднему времени пребывания в возбужденном состоянии, вы-
числяемому по формулам

f t /ц (z) dt
о

ТП =---------------

ОС

Г /ц (t)dt

О

1 = ~

f Л_(«)Л
о

(6.36),(6.37)

В приведенных формулах нет зависимостей от частоты модуляции. Это кор-
ректные выражения для средней продолжительности нахождения в возбужден-
ном состоянии, но нужно помнить, что средняя продолжительность не измеря-
ется фазовым флуорометром. Наши комментарии не означают критики ран-
них пионерских работ по изучению вращательной диффузии методом фазовой
флуоресценции. Скорее мы хотим подчеркнуть необходимость правильной ин-
терпретации данных, полученных методом фазовой флуорометрии, при кото-
ром исследователям необходимо помнить, что измеряемыми величинами яв-
ляются фазовые углы, но не времена затухания флуоресценции.

Интересно сравнить результаты, которые предположительно можно полу-
чить для одного и того же образца кинетическими и разностным фа-
зовым методами. Такое сравнение сделано на рис. 6.12. Кинетические зави-
симости для анизотропии приведены слева. По мере уменьшения времени кор-
реляции затухание r(z) ускоряется. Когда ср велико, r(z) затухает медлен-
нее. Когда ср намного больше, чем т, и когда ф «т, tgA приблизительно

РИС. 6.12. Сравнение данных по вращательной диффузии, полученных кинети-
ческими и разностным фазовым методами.
равен нулю. tgA достигает своего максимального значения, когда т и ф
сравнимы по величине. Интересно, что наличие затрудненных вращений
(rj приводит к одинаковому уменьшению tgA в пределах всего диапазона значе-
ний ф. Значение tgAmax уменьшается приблизительно линейно с уменьшени-
ем г^/tq до нуля [32]. Смысл такого уменьшения tgAmax с увеличением
затруднений состоит в том, что затрудненные движения флуорофоров могут
рассматриваться как движения, в ходе которых невозможно достигнуть мак-
симальных значений tgA, предсказываемых уравнением (6.34).

6,3.3.	Влияние анизотропных вращений на tgA

Разностные тангенсы успешно используются для обнаружения анизотроп-
ных движений флуорофоров [23]. В основе методики лежит то Обстоятельст-
во, что максимум tgA может быть предсказан из уравнения (6.34). tg^max
является функцией величин rQ, ы и т, каждая из которых легко измеряется.
Влияние анизотропных деполяризующих вращений проявляется в уменьшении
тангенса, т.е. в исчезновении равенства наблюдаемого значения tgA пред-
сказываемому уравнением (6.34). Сравнительные данные для изотропного и
анизотропного вращений показаны на рис. 6.13. Приведенные значения tgA
для DPII и перилена в пропиленгликоле иллюстрируют характерные особен-
ности разностных тангенсов. Значения tg А приближаются к нулю как при
низких, так и при высоких температурах. Увеличение частоты модуляции при-
водит к большим значениям разностных тангенсов, как и следует из теории,
изложенной в уравнениях (6.27) - (6.34).

Деполяризующие вращения DPH изотропны, и, как и предполагается, на-
блюдаемые и вычисленные значения tgA равны. В противоположность этому,
значения tgA для перилена существенно меньше, чем предсказываемые. Па-
дение тангенса вызывается анизотропной вращательной диффузией дискооб-

РИС. 6.13. Сравнение разностных тангенсов для DPII и перилена.

Прямыми пиниями показаны вычисленные значения tgA . (С разрешения ав-
торов работ [ 23,33] и American Institute of Physics.)
разной молекулы перилена. Эти результаты показывают, что на разност-
ный поляризационно-фазовый угол влияют различные скорости вращения
флуорофоров.

6.3.4.	Влияние затрудненных вращений на разностные тангенсы

Для случая затрудненного изотропного ротатора измерения tg △ могут
быть использованы для вычисления степени затруднений, как это описыва-
ется . Зонд DPH, связанный с мембранами, попадает в этот класс. Зна-
чение tgA для затрудненного ротатора легко предсказать, используя разло-
жение на синус и косинус импульсной функции отклика [24].. Эти функции мо-
гут быть получены из уравнений (6.6), (6.7) и (6.13):

/||(<)=± (1 t 2Го.)е-Г‘	2 (г0 - г,)е-<Г+М,г	(6.38)

= 1 (1- Гм)е-Г,-1 (,0_ г>-<Г+в*)‘	(6.39)

О	и

Подстановка (6.38) и (6.39) в уравнения (6.28) - (6.30) дает разностный тан-
генс для затрудненного ротатора:

~ т0(1 + со2т2) — $(2/?т) + тх (2 /?т) 2

У	3

где (1 + 2гоо)(1 -Ге0) и S = 2 +• г0 - Гоо (4г 0 - 1).

Максимальное значение tgA равно

Зшт(г0 - гм)
------------------------- (6.41)
S 4- 2[ т0 тх (1 + м2т2)]^

При гж = 0 эти уравнения упрощаются до выражений, соответствующих не-
затрудненному ротатору [уравнения (6.33) и (6.34)].

Интересной особенностью значений tg А для затрудненного ротатора
является то, что падение тангенса может быть значительно больше, чем
это найдено для анизотропных вращений, для которых падение тангенса
редко превышает 25% [23]. Напротив, затрудненное вращение может приво-
Температура, ° с

Температура, °C

РИС. б.'14. Графические зависимости разностных тангенсов и предельных ани-
зотропий от температуры для DPH в везикулах DMPC [ 34].

(© 1978, American Association for the Advancement of Science.)

деть к уменьшению тангенса на величину до 100%. Это видно из уравнения (6.41): ес-
ли = г0> то tgAmax = Значительное уменьшение тангенса наблюдалось для DPH.
в мембранах; эти данные были использованы для установления того, что DPH
в липидных бислоях является затрудненным ротатором. Температурная зави-
симость значений tgA для везикул димиристоилфосфатидилхолина, маркиро-
ванного DPH, приведена на рис. 6.14 [34]. Видно, что при температуре фа-
зового перехода значения tgA сильно возрастают. Однако максимальное зна-
чение (tgAmax) составляет только 57% от значения, ожидаемого для свобод-
ного изотропного ротатора. Еще большее снижение получено для везикул дру-
гих липидов [33]- Падение слишком велико, чтобы оно было следствием вра-
щательной анизотропии, и,, таком образом, его приписали затрудненному вра-
щению флуорофора. Используя такие данные, можно рассчитать предельную
анизотропию; вычисленные значения приведены На рис. 6.14. Результаты для
точно соответствуют значениям, полученным из кинетических измерений

r(t). Уравнения, необходимые для расчета гте , описаны в следующем разделе.

6.3.4.1. Вычисление скоростей вращения и значений Гоа
из данных по разностям фаз

В липидных бислоях максимальное значение tgA наблюдается вблизи
температуры перехода. Обычно хотят знать и скорость вращения зонда (R),
и степень, в которой это вращение затруднено (г^). Анализ уравнения (6.40)
показывает, что максимум tgA может быть результатом изменений либо
R, либо . Следовательно,'значения tgA сами по себе не могут быть ис-
пользованы для определения ни Я, ни . Эта неопределенность может быть
исключена при независимом определении стационарной анизотропии (г). Вы-
числение R и для затрудненного ротатора сравнительно сложное [ 33, 34],
но легко автоматизируется. Скорость вращения получают из решения сле-
дующего квадратного уравнения:

(mtgA)(2/?T)2 i- (CtgA - 4)(2Ят) + (DtgA - В) = 0	(6.42)

где Л = 35= сот (гд - г); С =	(2г - 4г 2 + 2); D = —- (т + т0со2т2);

т ~ (1 +• 2г) (1 — г).

Обычно одно из значений R отрицательно и, следовательно, неприемлемо.
Вычисленное значение R затем подставляют в уравнение (6.46) вместе со
стационарной анизотропией для нахождения .

6.4. Измерения анизотропии при изменении
времени затухания флуоресценции

В предыдущих разделах были описаны инструментальные средства для
получения информации о кинетике затухания анизотропии. Такую информацию можно
получить, не проводя временных измерений, если существует метод, в ко-
тором время затухания флуоресценции можно варьировать [35, 36].. Туше-
ние флуоресценции при столкновениях дает именно такую возможность (гл. 9).
Целый ряд молекул действуют как тушители при столкновении, например мо-
лекулярный кислород. В присутствии кислорода время затухания флуорес-
ценции т равно

т= т0/(1 + К[О2])	(6.43)

где т - время затухания в отсутствие тушителя; К - константа тушения
при столкновениях. Тушение флуоресценции при столкновениях дает способ
изменения т и, следовательно, среднего времени деполяризации. Стаци-
онарная анизотропия г(т) получается усреднением кинетики анизотропии, из-
меренной путем импульсного отклика, по отношению к общей интенсивнос-
ти флуоресценции:

f r(t) е * ^dt
г (т) = 2------------ (6.44)

ОО

f е-*/т dt

о

Предположим, что r(t) затухает до нуля одноэкспоненциально. Комбинация
РИС. 6.15. Графические зависимости анизотропии DPH в минеральном масле и
в фосфолипидных везикулах DMPC, полученные методом изменения времен затуха-
ния флуоресценции.

(По данным [ Зб] с разрешения American Chemical Society.)

уравнений (6.44) и (6.5) с последующей перегруппировкой дает

г = (г0 ~ г)/б/?т	(6.45)

График зависимости г от (г0 - г)/т для незатрудненного вращения имеет
наклон (б/?)""1 и отсекаемый отрезок, равйый нулю. Теперь предположим,
что затухание анизотропии определяется уравнением (6.13), т.е. вращение
флуорофора затруднено. Из уравнения (6.44) для такого закона затухания с
последующей перегруппировкой получим

Г ~	+ (г о - r>/6 /?т	(6.46)

На графике зависимости г от (,г0 _ г)/т наклон снова равен (6/?)”1', но от-
секаемый отрезок на оси г теперь равен гж . Уравнение (6.46) может быть
записано в Другом виде:

г= 'ооНго- rj/(l + 6Лт)	(6.47)

Можно видеть, что при такой форме записи не зависит от скорости вра-
щения, которая влияет только на вклад (rQ - г*) в стационарную анизотро-
пию.

Характерные анизотропии при изменении времени затухания флуорес-
ценции для DPH приведены на рис. 6.15. Выше было показано, что в раство-
рителе сравнения - минеральном масле г(г) затухает до нуля (см. рис. 6.4).
Следовательно, можно ожидать, что отсекаемый отрезок на оси у будет ра-
вен нулю; это и является наблюдаемым результатом. Кроме того, график
зависимости г от (rQ - г)/т линеен [ 36]. Такая линейность в области вре-
мен затухания эквивалентна экспоненциальному затуханию анизотропии во
временной области. Следовательно, в минеральном масле DPH вращается
незатрудненно и изотропно. Совершенно иные результаты наблюдаются для
DPH, связанного с « везикулами DMPC. В этом случае наблюдаются значитель-
ные ненулевые значения , что очевидно из ненулевого отрезка, отсека-
емого на оси у. Значения находятся в точном соответствии с результа-
тами, полученными кинетическими и дифференциально-фазовым методами.
Ценность этих результатов состоит в том, что даже стационарные методы
могут давать надежную информацию о кинетике затухания, если имеется
подходящий способ изменять времена затухания флуоресценции.

СРАВНЕНИЕ ТРЕХ методов определения г(«). В предыдущих разделах мы рас-
смотрели три независимых метода определения кинетики затухания анизотро-
пии. Ясно, что приборы с временным разрешением дают наиболее прямые и
легко интерпретируемые результаты. Однако такие измерения занимают мно-
го времени и часто ограничены длительностью импульса ламп. В результате
кинетические методы широко не использовались для количественного измере-
ния анизотропных вращений или коротких времен корреляции. Недавно ани-
зотропные вращения перилена были обнаружены и импульсным методом [ 3'9].
Разностный фазовый метод дает труднее интерпретируемые результа-
ты, но позволяет обнаруживать анизотропные вращения и измерять скорости
вращения в субнаносекундном временном диапазоне.

Разностная поляризационно-фазовая флуорометрия оказывается более
быстрым методом, чем кинетический метод или метод, основанный на измене-
нии времени затухания флуоресценции. Данные, адекватные определению
и R , могут быть собраны за несколько минут, в то время как измерения ки-
нетическими методами могут длиться часами. Такое временное различие свя-
зано с тем, что кинетики затухания анизотропии получают при низких скорос-
тях счета. Для того чтобы определить , необходим длительный период сбо-
ра данных, так как нужно получить достаточное количество импульсов при вре-
менах, больших времени затухания. Заметим, что в настоящее время мы не
в состоянии интерпретировать результаты разностно-фазовых измерений для
флуорофоров, вращающихся анизотропно и затрудненно. Многие зонды, кото-
рые связываются с макромолекулами, вероятно, должны относиться к этому
теоретически сложному классу флуорофоров.

Методы, основанные на изменении времени затухания флуоресценции, до-
полняют кинетические методы в том смысле, что тушение понижает время за-
тухания. В результате экспериментальные данные отражают главным обра-
зом начальный участок г (г). В противоположность этому ширина импульса
вспышки лампы часто делает неясной эту часть затухания r(t). Во всех трех
методах возникают трудности в количественной оценке скорости вращения ме-
ток R в условиях, когда гм приближается к г 0 . Ситуация не является неожи-
данной, поскольку эти условия связаны с малой деполяризацией за время за-
тухания флуоресценции и, следовательно, только с малыми изменениями зна-
чений r(t), на основании которых вычисляется /?.

Задачи

6-1. При использовании двухпучевого поляризационного инструмента получены
следующие данные для дифенилгексатриена (индексы Г и В обозначают ориентацию
поляризатора возбуждения):

Условия		(7п /7jJb
—60°C в пропиленгли-	0,450	1,330
копе		
Везикулы DMPC,23°C	0,850	1,450

а)	Вычислите rQ и PQ ДПя ПРИ.

б)	Найдите, чему равен угол а между осцилляторами поглощения и испускания.

в)	Вычислите R, <р и у (среднееугловое смещение флуорофора между поглоще-
нием и испусканием) для DPII в DMPC при 23°С, = 0 и т = 10 нс.

г)	Вычислите Я, <р и у при = о,13 и т = 10 нс.

д)	Считая, что С = В.бИО5 П/(град»с) для DPH, определите, чему будет равна
кажущаяся микровязкость бислоя в предположении затрудненной и незатруд-
ненной моделей. Учтите, что rQ/r - 1 + СТт/ц , где С — параметр, связан-
ный с эффективным молярным объемом флуорофора.

6-2. Следующие задачи решаются с использованием данных таблиц 6.1 и 6.2.

а)	Вычислите углы между диполями поглощения и испускания N-ацетил- L-триптофан-
амида при возбуждении на 300 и 292 нм. Вычислите также угол между диполя-
ми, поглощающими при 292 и 300 нм.

б)	Вычислите время вращательной корреляции (<р) NATА в пропиленгпиколе при
25°C. Сравните рассчитанный результат сс значением, ожидаемым для сферы
такого же диаметра. Используйте следующие данные: д (пропиленгликоль, 26°C) =
= 32 сП. кристаллическая плотность 1,2 г/мп, молярная масса 245 г/моль. Про-
комментируйте'изотропность деполяризационных вращений на основании гра-
фика зависимости г”1 от т.

в)	Вычислите плоскостные (/?лл) и внеплоскостные (R ) скорости вращения пе-
рилена в пропиленгпиколе при 25 °C. Для того чтобы аппроксимировать Р = 0,14
используйте данные для 320 нм (Ро.= 0,154). При 435 нм PQ составляет 0,444.

г)	Сравните кажущийся молярный объем, наблюдаемый при возбуждении на 435 нм,
с фактическим объемом. Прокомментируйте любые наблюдаемые различия. Мо-
лярная масса перилена 252 г/моль; его плотность 1,35 г/мл.
Таблица 6.1. Значения поляризации и анизотропии, пре-
дельные и полученные при изменении вре-
мени затухания флуоресценции, для N-аце-
тил-Ъ-триптофанамида в пропиленгпикопе
при 25°С [ 37]

Длина волны, нм		го	
292	0,176	0,125	
300	0,370	0,281	
Ро , фунт/дюйм2 а  2	т, нс	Р	Г
0	4,94	0,1025	0,0708
68	3,75.	0,1111	0,0796
172	2,88	0,1317	0,0918
418	1,86	0,1624	0,1145
1484	0,73	0,2305	0,1665

а1 атм = 14,696фунт/дюйм2 (Гордон А., Форд Р.

Спутник химика. Пер. с англ. — М.: Мир, 1976). — Прим, перев. ,

Таблица 6.2. Значения поляризации, полученные для
перилена в пропиленгпикопе методом
изменения времени затухания флуорес-
ценции при 25 °C [Зб]

Рп , фунт/дюйм2 а и2	т, нс	Поляризация при	
		320 нм	435 НМ
0	5,39	0,0425	0,0555
85	4,18	0,0486	0,0631
226	3,17	0,0554	0,0761
531	2,08	0,0702	0,0964
1481	1,00	0,0923	0,1459

аСм. сноску к табл. 6.1. - Прим, перев.
6-3. Везикулы DMFC маркированы дифенилгексатриеном, и данные по анизотро-
пии и квантовым выходам получены в условиях тушения кислородом. По данным из
табл. 6.3 вычислите и время вращательной корреляции. Отметим, что необходи-
ма поправка на статическую составляющую в наблюдаемом тушении. Используйте
г0 = 0,362.

Таблица 6.3. Поляризованные интенсивности флуорес-
ценции для везикул DMPC, маркированных
DPH

Давление О2, Горизонтальное Вертикальное
атм	возбуждение	возбуждение

	7Г	7В	7Г	7В
	Т =	19°С, т0	= 9,2 нс	
0,0	46710	33350	24250	35900
3,4	30300	21590	15670	23620
7,8	20500	14500	10505	16150
19,4	10405	7400	5360	8860
47,4	4355	3110	2250	3810
105,1	1965	1370	1005	1645
	Т =	45°С, т0 =	7,8нс	
0,0	66300	53570	34350	32200
3,5	34200	27050	17070	17180
6,5	21600	17000	10720	11410
11,4	13010	10300	6480	7440
20,3	7100	5620	3530	4530
31,5	4165	3205	2030	2790 .
50,6	2325	1780	1140	1695

13-413
ГЛАВА7.

Влияние растворителей
на спектры флуоресценции

На спектры флуоресценции многих флуорофоров влияет полярность ок-
ружающей среды. Например, при исследовании спектров испускания такого
зонда, как 1-анилино-8-нафталинсульфоновая кислота (ANS), в растворителях
различной полярности можно заметить, что спектр испускания сдвигается в
сторону коротких длин волн ("голубой" сдвиг) при уменьшении полярности
растворителя. Наоборот, увеличение полярности растворителя чаще всего при-
водит к смещению спектра испускания в длинноволновую сторону ("красный"
сдвиг). Типичные спектры чувствительных к растворителю флуорофоров при-
ведены на рис. 7.2 и 7.5. Красные сдвиги часто, но отнюдь не всегда, сопро-
вождаются уменьшением квантового выхода флуоресценции.

Спектры испускания можно считать наиболее легко измеряемыми спек-
тральными характеристиками. Этот факт,'а также общая чувствительность
флуорофоров к влиянию растворителей послужили причиной многочислен-
ных публикаций, в которых проводится анализ спектров испускания флуоро-
форов, связанных с белками, мембранами, нуклеиновыми кислотами и более
сложными совокупностями макромолекул. В основном стараются использо-
вать чувствительность флуорофора к растворителю для того, чтобы сделать
вывод о полярности места присоединения к макромолекуле. Например, най-
дено, что спектр испускания ANS , присоединенной к апомиоглобину, силь-
но сдвинут в коротковолновую область; это позволило предположить, что
ANS связана с гемовой частью и недоступна для внешней водной фазы (разд. 7.5.2).

В последующих разделах будет рассмотрена физическая природа таких
зависящих от полярности спектральных сдвигов. Эти сдвиги являются резуль-
татом как взаимодействий дипольных моментов флуорофоров с реактивны-
ми полями, индуцируемыми в окружающем растворителе, так и специфичес-
кого химического взаимодействия флуорофора с одной или более молекула-
ми растворителя. Описывая влияния растворителя, мы проиллюстрируем ин-
терпретацию спектров испускания, касающуюся локализации флуорофоров,
связанных о белками и мембранами. Зависящие от растворителя сдвиги тре-
буют реорганизации ячейки растворителя, в которой находится флуорофор,
и поэтому зависят от времени. Динамика процессов релаксации раствори-
теля будет обсуждаться в гл. 8 в предположении, что взаимодействие раст-
воритель - флуорофор достигает равновесия до процесса испускания. Такое
предположение является разумным для случая невязких растворителей при
температуре, близкой к комнатной.
7.1.	Стоксовы сдвиги и релаксация растворителя

Испускание флуоресценции обычно происходит при длинах волн, больших,
чем' те, которые соответствуют поглощению. Такая потеря энергии между
процессами поглощения и переиспускания, или стоксов сдвиг, - это резуль-
тат нескольких динамических процессов. Сюда относятся потери энергии вслед-
ствие диссипации колебательной энергии, перераспределение электронов в ок-
ружающих флуорофор молекулах растворителя, вызванное изменением (ча-
ще всего увеличением) дипольного момента флуорофора при возбуждении, пе-
реориентация молекул растворителя вокруг возбужденного диполя, а также
специфические взаимодействия между флуорофором и растворителем или
растворенными веществами. В понятие специфических взаимодействий вхо-
дит образование водородных связей и комплексов с переносом заряда. Прак-
тически невозможно дать полное количественное описание всех этих процес-
сов и их влияния на спектральные свойства флуорофоров, что не удивитель-
но, если принять во внимание структурное разнообразие флуорофоров. Точная
интерпретация чувствительности флуорофоров к растворителю требует деталь-
ного понимания влияния растворителей на уровни энергий как основного, так
и возбужденного состояния флуорофоров. Тем не менее мы можем использо-
вать простейшие теории, описывающие взаимодействие растворитель - флу-
орофор, чтобы интерпретировать спектральные свойства в терминах усред-
ненного окружения флуорофора.

Поглощение света происходит примерно за 10~15с, т.е. за время слишком
короткое, чтобы успело произойти значительное смещение ядер (принцип Фран-
ка - Кондона), но вполне достаточное для перераспределения электронной
плотности. Обычно в электронно-возбужденных состояниях у ароматических

РИС. 7.1. Диаграмма Яблонского, иллюстрирующая явление флуоресценции.
соединений дипольные моменты (ц*) больше, чем в основном состоянии (ц).
В результате при поглощении флуорофором фотона, по существу, происхо-
дит мгновенное образование диполя, который оказывает возмущающее дей-
ствие на окружение флуорофора. Вслед за процессом возбуждения происхо-
дит реорганизация клетки растворителя, окружающей флуорофор. Этот про-
цесс называется релаксацией растворителя (рис. 7.1), масштаб времени ко-
торой зависит от физических и химических свойств растворителя.

общие И специфические влияния растворителя. Известно, что спектры
испускания многих флуорофоров, особенно содержащих полярные замести-
тели в ароматическом кольце, зависят от химических и физических свойств
растворителей. На эту тему опубликовано множество детальных работ, пред-
метом которых является объяснение влияния растворителей на спектры флу-
оресценции в рамках единственного формализма.

Предлагаемые теории чаще всего слишком сложны для обычного использования.
Мы предпочитаем более простой подход, в котором влияние растворителей на спект-
ры флуоресценции делится произвольным образом на общее и специфическое. Под-
общими эффектами мы подразумеваем те, которые зависят от показателя
преломления п и диэлектрической постоянной е - физических констант,
отражающих свободу движения электронов в молекулах растворителя и ди-
польный момент этих молекул. Специфические влияния растворителей мы
связываем со специфическими химическими взаимодействиями между флуорофо-
ром и молекулами растворителя (это, в частности, образование водородных
связей и комплексов). Как общие, так и специфические влияния растворите-
лей могут приводить к значительным спектральным сдвигам. Разделение этих
эффектов на две категории удобно из-за различной природы спектральных
сдвигов. Можно полагать, что общие эффекты всегда будут присутствовать. В
противоположность этому специфические эффекты будут зависеть от конкрет-
ной химической структуры молекул растворителя и флуорофора.

Отметим, что величины спектральных сдвигов, обусловленных специфи-
ческими взаимодействиями растворителя и флуорофора, часто превышают
соответствующие величины, связанные с общими взаимодействиями. Кроме
того, специфические эффекты, как правило, проявляются для флуороф'оррв,
используемых в биохимических исследованиях. По этим причинам разделение
влияния растворителей на такие две категории удобно и информативно. Для
количественного описания общих эффектов растворителей будет приведена
одна простая теория, в рамках которой специфические эффекты легко оценить
как отклонения от нее.

7.2.	Общие влияния растворителей на спектры флуоресценции.

Уравнение Липперта

Для описания влияния физических свойств растворителей на спектры ис-
пускания имеется множество уравнений. Эти выражения, как правило, слож-
ны, но часто недостаточно раскрывают природу влияния растворителей. Мы
приведем только наиболее широко используемое выражение, предложенное
Липпертом и др. [1 - 3].. Для знакомства с более сложными уравнениями мы
отсылаем читателей к работам Бахшиева [6 — 8], посвященным этому вопро-
су. В цитируемых работах растворитель рассматривается как некий конти-
нуум, содержащий молекулы флуорофора. При таком упрощенном подходе об-
ласть применения уравнений, вероятно, ограничена вследствие того, что из
рассмотрения исключаются специфические взаимодействия флуорофор -
растворитель, которые могут оказывать значительное влияние на спектры
испускания. Однако общйе влияния растворителей всегда проявляются, поэто-
му количественная оценка величины ожидаемых эффектов дает границы, в ко-
торых можно анализировать экспериментальные Данные.

Взаимодействие между молекулами растворителя и флуорофора оказы-
вает влияние на разность энергий между основным и возбужденным состояни-
ями. В первом приближении эта разность энергии (в см”1) зависит от показа-
теля преломления п и диэлектрической постоянной е растворителя и описы-
вается уравнением Липперта [1-3]

Г	- и2)

“	/ Нс \ 2е f 1	2п2 + 1J а3

+ const

(7.1)

где h - постоянная Планка; с - скорость света; a - радиус полости, внут-
ри которой находится флуорофор; и vy - волновые числа, соответству-
ющие поглощению и испусканию (см”1). Хотя уравнение (7.1) является толь-
ко приближенным, существует разумная корреляция между наблюдаемыми и
расчетными значениями потерь энергии в апротонных растворителях. Под
апротонными растворителями мы подразумеваем растворители, не содержа-
щие гидроксильных или других групп, способных образовывать водородные
связи. В этом уравнении пренебрегают членами высшего порядка, которые
могли бы обусловить эффекты второго порядка, в частности появление ин-
дуцированных дипольных моментов в отдельных молекулах растворителя в
результате влияния дипольных моментов возбужденного состояния, и наобо-
рот.

Полезно рассмотреть противоположное влияние величин е и п на сток-
сов сдвиг. Увеличение п будет уменьшать его величину, тогда как рося' е приводит к
увеличению va - \у. Такое различие является следствием принципа Франка - Кондо-
на и лучше всего объясняется при выводе уравнения Липперта (разд. 7.3). Вкратце его
можно представить следующим образом. Увеличение показателя преломле-
ния приводит к мгновенной стабилизации как основного, так и возбужденного
состояний, обусловленной смещением электронов в молекулах растворителя.
Перераспределение электронной плотности приводит в свою очередь к умень-
шению разности энергий основного и возбужденного состояний. Увеличение
е также способствует стабилизации основного и возбужденного состояний.
Однако уменьшение энергий возбужденного состояния происходит только по-
сле переориентации диполей растворителя, для чего необходимо движение
всей молекулы растворителя, а не только ее электронов. В результате ста-
билизация основного и возбужденного состояний флуорофора, которая зави-
сит от диэлектрической постоянной е , является функцией времени, а ско-
рость стабилизации зависит от температуры и вязкости растворителя (гл. 8).
Следовательно, время понижения энергии возбужденного состояния сравни-
мо со временем переориентации диполей растворителя. При выводе уравне-
ния Липперта (разд. 7.3), а также по всей данной главе предполагается, что
релаксация растворителя происходит полностью до процесса испускания флу-
оресценции.

Член в скобках в уравнении (7.1) называется ориентационной поляризу-
емостью и обозначается △/\ Первый член [ (е — 1)/(2е t 1)] относится к
спектральным сдвигам, обусловленным как переориентацией диполей раст-
ворителя, так и перераспределением электронной плотности в молекулах
растворителя. Второй член [ (п2 - 1)/(2п2 +• 1)] соответствует только пе-
рераспределению электронной плотности. Разность этих двух членов объясня-
ет спектральные сдвиги, определяемые переориентацией молекул растворите-
ля. Согласно этой простой теории, к значительным стоксовым сдвигам при-
водит только переориентация растворителя. Перераспределение электронной
плотности происходит мгновенно, и как основное, так и возбужденное состо-
яния приблизительно в равной мере стабилизируются этим процессом. В ре-
зультате перераспределение электронной плотности оказывает сравнитель-
но слабое влияние на стоксов сдвиг.

Полезно также рассчитать, какие величины спектральных сдвигов могут
вызвать общие эффекты растворителей. Предположим, например, что диполь-
ный момент меняется на (ц* - ц) = 20 дебаев (D) и что радиус полости ра-
вен 4 А. Такое значение сравнимо с радиусом типичных ароматических флу-
орофоров. 4,8 D - это дипольный момент, соответствующий переходу еди-
ничного заряда (4,8*1О~10 ед. СГСЭ) на расстояние 1 А (10“8 см). Следова-
тельно, 20D соответствует переносу единичного заряда на 4,2 А - рассто-
яние, сравнимое с размером молекулы флуорофора. Такое предполагаемое
значение (ц* - ц) аналогично величинам, наблюдаемым для флуорофоров, ко-
торые часто используют в качестве меток в биохимических исследованиях и
рассматривают как индикаторы полярности растворителя. Например, раз-
ность ц* - ц = 20D была получена [9] .для 2-анилинонафталина, а 15 D —
для 2-га-тблуидинилнафталин-6-сульфонамида. Такие большие значения, как
44 D наблюдали для 2-анилино-б-нафталинсульфоновой кислоты, но они могут
быть результатом специфических, а не общих взаимодействий с растворите-
лем. 1

Для излагаемой модели расчета стоксовых потерь сравним неполярный
растворитель гексан с полярным растворителем метанолом. Неполярные
Таблица 7»1. Стоксовы сдвиги, ожидаемые для случая общих влияний
растворителя

Растворитель

va“vf Лтах
СМ"1 6

Гексан	1,874	1,372	0,0011	35	350,4

Метанол	33,1	1,326	0,3098	9740	531,1

®Из уравнения (7.1) в предположении, что р* — ц = 20D , а ра-
диус полости 4 А. 4,8D — дипольный момент, получающийся при раз-
делении заряда, равного единице заряда (4,8ИО"1®ед. СГСЭ) на 1 А
(IO”8 см).

8 В предположении, что максимум поглощения равен 350 нм.

растворители, такие, как гексан, не имеют дипольного момента. Следова-
тельно, в данном случае не существует диполей, которые могли бы переори-
ентироваться относительно возбужденного состояния флуорофора. Это физи-
ческое свойство гексана выражается в том, что е = п2. Из уравнения (7.1)
можно получить небольшое значение ориентационной поляризуемости и
можно ожидать, что ~а -Ту будет мало или равно нулю. Например, если
предположить, что модельный флуорофор поглощает при 350 нм, рассчитан-
ная длина волны испускания в гексане будет равна 350,4 нм (табл. 7.1). Од-
нако даже в неполярных растворителях не наблюдается такого близкого сов-
падения максимумов поглощения и испускания. Возбуждение обычно проис-
ходит на более высокие колебательные уровни, и. избыток энергии быстро
диссипирует в жидких растворах (за 10"12с). Процесс испускания обычно
происходит после дезактивации возбужденных колебательных состояний
(см. рис. 7.1).'В результате поглощение и испускание обычно сдвинуты друг
от друга на величину, по крайней мере равную колебательной энергии,-т.е.
наМ500 см"1. Такие потери энергии входят в постоянный член уравнения
(7.1) и должны были бы для нашего модельного флуорофора сместить мак-
симум испускания к 370 нм.

В полярных растворителях, таких, как метанол, можно ожидать значи-
тельно больших стоксовых потерь (табл. 7.1). Например, ожидаемое положе-
ние максимума для рассматриваемого модельного флуорофора составит в
полярном растворителе 531 нм. Такой сдвиг обусловлен большей ориентаци-
онной поляризуемостью в метаноле, являющейся результатом дипольного мо-
мента этого растворителя. Чувствительность величин стоксовых сдвигов к
полярности растворителя служит причиной того, почему спектры флуорес-
ценции часто используют для определения полярности окружения флуорофора.

Известно, что на спектры испускания многих флуорофоров влияет по-
лярность растворителя. Например, в большинстве случаев флуоресценция
белков обусловлена индольным кольцом триптофановых остатков (гл. 11). По-
ложение максимума испускания индола меняется от 297 нм в циклогексане
до 347 нм в воде [ 11]. Для природных белков найдено множество максиму-
мов испускания, и денатурация этих белков обычно приводит к сдвигам до
таких же или больших длин волн испускания. Таким образом, считают, что
максимумы испускания белков отражают среднюю степень доступности трип-
тофановых остатков для водной фазы. Другим примером использования спект-
ров испускания для оценки полярности может служить зонд TNS, который
широко применяется для этой цели начиная с работы Вебера и Лоуренса [12].
TNS и сходные с ним молекулы в основном не флуоресцируют в водном раст-
воре, но проявляют интенсивную флуоресценцию в неполярных растворителях
или при связывании с белками и мембранами. С помощью высокочувствитель-'
ных зондов можно получать информацию о полярности их непосредственного
окружения. Например, максимум испускания TNS сдвигается от 413 нм в ди-
оксане. до 500 нм в воде [ 13]. Известны и еще более чувствительные зонды,
такие, как 6-пропионил-2-(диметиламино)нафталин (PRODAN), описанный
Вебером и Фаррисом [ 14]. Спектры испускания PRODAN в различных
растворителях приведены на рис. 7.2. Видно смещение максимума испускания
от 392 нм в циклогексане до 523 нм в воде. Высокая чувствительность PRODAN
к полярности растворителя определяется большим изменением дипольного мо-
мента при возбуждении. Объяснением этого может служить локализация поло-
жительных и отрицательных зарядов на амино- и карбонильной группах соот-
ветственно [15]..Эти группы расположены на противоположных концах нафта-
линового фрагмента, и поэтому в результате разделения зарядов происхо-
дит значительное изменение дипольного момента.

Количественному изучению спектральных сдвигов посвящено множество
исследований, что вполне можно понять, поскольку спектр испускания легко
измеряется. Однако часто возникают обратные задачи. Например, что можно
сказать на основе спектра испускания флуорофора, связанного с макромоле-
кулой, о природе места его присоединения? Является ли оно полярным, непо-
лярным или средней полярности? Доступно ли оно для воды или находится внут-
ри белка или мембраны? Жестко ли оно во временной шкале испускания флуо-
ресценции или подвижно и чувствительно к возбуждению флуорофора?

На подобные вопросы трудно ответить, имея в распоряжении только дан-
ные о спектрах испускания. Трудность интерпретации связана со сложностью
процессов взаимодействия флуорофора.*с окружающей средой, а также с вли-
янием процессов, происходящих в возбужденном состоянии (таких, как нано-
РИС. 7.2. Спектры испускания флуоресценции PRODAN [14].

Растворители (слева направо): циклогексан, хлорбензол, диметилформамид, эта-
нол, вода.

секундная релаксация спектра), на наблюдаемые спектры испускания. Из срав-
нения спектров испускания флуорофоров, находящихся в растворах и связан-
ных с макромолекулами, часто предполагают, что процессы релаксации раст-
ворителя заканчиваются полностью до процесса испускания. Если процессы
релаксации не закончились, наблюдается испускание излучения нерелаксиро-
ванных флуорофоров [16], которое сдвинуто в коротковолновую область по
сравнению с релаксированным состоянием. Далее, при таких корреляциях пред-
полагают, что наблюдаемые спектральные сдвиги обусловлены только общи-
ми эффектами растворителя. Для многих обычно используемых флуорофоров,
таких, как TNS и 2-AN, к значительным спектральным сдвигам могут при-
водить и специфические влияния растворителей. Эти эффекты могут затруд-
нить сравнение спектров, наблюдаемых для одного и того же флуорофора в
растворах и связанного с макромолекулой.

7.3.	Вывод уравнения Липперта

Физические и химические взаимодействия между флуорофором и моле-
кулами растворителя, обуславливающие общие влияния растворителей на
спектры, иллюстрирует уравнение Липперта. Оно записывается в виде

AcAv= (ц* — ц) ^ ~	(7.2)

аэ
где Ду - частотный сдвиг между поглощением и испусканием (в см-1); △/ -
ориентационная поляризуемость; ц* и ц - дипольные моменты возбужден-
ного и основного состояний соответственно. Уравнение Липперта [ (7.1) и
(7.2)] можно вывести, рассматривая взаимодействия дипольного момента
флуорофора с растворителем и времена этих взаимодействий. Необходимо
вспомнить принцип Франка - Кондона, который гласит, что ядра не переме-
щаются за время электронного перехода (10~15 с,). Напротив, электроны мо-
лекул растворителя могут перераспределяться за это время вокруг нового
возбужденного диполя. Кроме того, напомним, что из-за относительно боль-
шого времени жизни возбужденного состояния (-ЧО"8 с) молекулы раство-
рителя могут переориентировать свое равновесное положение вокруг флуо-
рофора до процесса испускания.

Вывод начнем с рассмотрения точечного диполя в непрерывной диэлект-
рической среде (рис. 7.3). Энергия диполя в этой среде определяется выра-
жением

£диполь=	^-3)

где 7? - реактивное поле, индуцированное диполем в диэлектрике. Реактив-
ное поле параллельно и противоположно диполю по направлению и пропорци-
онально величине дипольного момента:

Л=2и//а3	(7.4)

где f - поляризуемость растворителя; a - радиус полости. Поляризуемость
растворителя - это результат как подвижности его электронов, так и диполь-
ных моментов его молекул. Каждая из этих компонент имеет различную за-
висимость от времени; например, переориентация электронов растворителя
в основном происходит мгновенно. Высокочастотная поляризуемость f (п)
является функцией показателя преломления:

fln) = (n2 - l)/(2n2 + 1)	(7.5)

Диэлектрическая постоянная определяет поляризуемость растворителя,, вклю-
чающую влияние переориентации молекул растворителя. Из-за того что пере-
ориентация молекул происходит медленнее, эта компонента называется низ-
кочастотной поляризуемостью растворителя и определяется формулой

/(е> = (в -1)/(2е + I)	(7.6)

Разность между этими двумя членами равна Д/:

△/• = !—? п- L
z 2е + 1	2П2 + 1

(7.7)

называется ориентационной поляризуемостью. Если растворитель не име-
ет постоянного дипольного момента, е«п2 и △/ «0. В табл. 7.2 приведены
₽ИС. 7.3. Диполь в диэлектрической среде.

характерные величины е , п и А/. По значениям А/ можно судить о том, что
спектральные сдвиги (А“) будут значительно больше в воде, чем в гексане.

Взаимодействие флуорофора с растворителем можно описать, используя
его дипольные моменты в основном (ц) и в возбужцешюм (ц*) состояниях и
реактивное поле, окружающее диполи. Все поле можно разделить на два: од-
но - обусловленное электронными факторами (Re и R *) и второе *- обуслов-
ленное реорганизацией растворителя (Rr и R*). Эти поля определяются вы-
ражениями

о - 2ц	2Ц*

“ —г f \п ); К* " ~т~ f
а3	а3

(7-8)

R = Af; R * = It^Af
г а3	а3

На рис. 7.4 изображена схема процессов, протекающих в этих полях при воз-
буждении и испускании. Энергии основного (£) и возбужденного (£*) состо-

Таблнца 7.2. Характеристики поляризуемости не-
которых широко используемых раст-
ворителей

	Вода	Этанол	Эфир  1	Г ексан
f	78,3	24,3	4,35	1,89
п	1,33	1,35	1,35	1,37
	0,32	0,30	0,25	0,001
РИС. 7.4. Схема, иллюстрирующая влияние электронного и ориентационного
реактивных полей на энергию диполя в диэлектрической среде.

яний для процесса поглощения света равны

£*	= Е* - u*R - u*R*

ПОГЛ V р лг р л е

(7.9)

^погл “ F'V

(7.Ю)

где - уровень энергии флуорофора в газовой фазе, не возмущенный
влиянием растворителя. Энергия поглощенного света уменьшается под дейст-
вием электронной составляющей реактивного поля, индуцированного дипо-
лем в возбужденном состоянии (Я*). Это происходит потому, что электро-
ны растворителя могут следовать за быстрым изменением электронного рас-
пределения в флуорофоре. Напротив, ориентация молекул растворителя не
может изменяться в процессе поглощения света. Таким образом, влияние
ориентационной поляризуемости определяется произведением цЯг, а ц*Я
отражает только ориентационное реактивное поле основного состояния. Та-
кое разделение эффектов обусловлено, конечно, принципом Франка - Кон-
дона. Вспомнив, что энергия связана с волновым числом соотношением
v = LE/hct и вычитая уравнение (7.10) из (7.9), получаем уравнение для энер-
гии поглощения:

hc^„ = he <va )v - (ц* - p) Rr - ц*Я* + u Re	(7.11)
где he Cva )v - разность энергий в газовой фазе, когда влияние растворите-
ля отсутствует. Аналогичным способом можно получить выражение для энер-
гии двух электронных уровней для процессов испускания:

Чсп = E*v -	- »*К*е	<7-12)

£исп = Ev - цй? -	(7.13)

При выводе этих выражений предполагалось, что растворитель релаксирует
быстро по сравнению с временем нахождения в возбужденном состоянии, так
что первоначальное ориентационное поле Rr меняется до значения R* до
процесса испускания. Мы еще раз использовали принцип Франка - Кондона:
электронное поле меняется в процессе испускания, а ориентационное поле ос-
тается неизменным. Частота испускания определяется выражением

hevr = hc(vf)v - (ц*-ц)Яг* - ц*Я* + Р7?в	(7.14)

В отсутствие влияния окружения можно ожидать, что для атомов в газовой
фазе va =	, а для сложных молекул, которые претерпевают колебательную

релаксацию, разность va - vf должна быть постоянной. Следовательно, вы-
читая уравнение (7.14) из (7.11), получаем

v„ -\й,	— (ц* “ п)(Л - R* )+ const	(7.15)

a f he

Подстановка в (7.15) выражения (7.8) приводит к уравнению Липперта

~	_	-2

Va-Vy-—---------- (ц* - |д)(рД/ _ц*Д/)	(7.16)

пса	'	'

7 =	(и* “ g)2

7 Аса3

(7.17)

Отметим, что уравнение Липперта не отражает полностью и точно общие
эффекты растворителя. Бахшиев приводит Другое выражение [7, 8]:

hc&v = Аб	\ -1	п2 -1	(2n2 + I)2	- + const	(7.18)
	e t 2	п2 + 2	(п2 + 2)2		

где Аб =2----(ц2- ц*2 - 2up*cO8a)	(7.19)

hca 3

и a - угол между ц и ц*. Бахшиев доказывает, что общие эффекты раство-
рителя должны зависеть от угла между дипольными моментами флуорофора
в основном и в возбужденном состояниях и поэтому уравнение Липперта нель-
зя считать строгим. Вероятно, это справедливо, но, как мы увидим из по-
следующего обсуждения, другие специфические взаимодействия между раст-
ворителем и флуорофором приводят к значительным спектральным сдвигам,
величину которых невозможно удовлетворительно объяснить в рамках суще-
ствующих теорий. Поэтому использование наиболее простой концептуальной
модели Для описания общих эффектов растворителя кажется оправданным.
Более того, простая теория полезна при интерпретации экспериментальных
данных и в тех случаях, когда нужно оценить наличие и относительную важ-
ность специфических эффектов растворителя.

ПРИЛОЖЕНИЯ УРАВНЕНИЯ ЛИППЕРТА. Уравнение Липперта - общее вы-
ражение, описывающее стоксов сдвиг, который можно ожидать для данного
флуорофора в средах различной полярности. Можно полагать, что чувстви-
тельность флуорофора к полярности растворителя будет пропорциональна
(ц* - ц)2. Ожидается, что этот член постоянен для данного флуорофора и,
следовательно, можно построить градуировочные кривые зависимости
(va - vy) от △/. Если теперь флуорофор поместить в неизвестное окруже-
ние, полярность этого окружения можно рассчитать, зная (va - \у). И на-
оборот, влияние на стоксов сдвиг величины △/ можно использовать для оцен-
ки изменения дипольного момента при возбуждении. Флуорофоры, дипольный
момент которых сильнее меняется при возбуждении, должны быть более чув-
ствительны к полярности растворителя.

По этой причине N-ариламинонафталинсульфонаты широко использова-
лись в качестве индикаторов полярности мест присоединения к белкам и мемб-
ранам. Широкое использование этих зондов обусловлено как их чувствитель-
ностью к полярности растворителя, так и низкими квантовыми выходами флу-
оресценции в водном растворе. Например, квантовый выход 1-анилинонафталин-
8-сульфоната (1,8-ANS) равен 0,002 в водном буфере, но близок к 0,4 в том
случае, когда 1,8-ANS связано сывороточным альбумином-Такое увеличе-
ние квантового выхода в 200 раз очень полезно, поскольку флуоресценция сме-
сей краситель + белок и краситель + мембрана определяется почти исключи-
тельно красителем, связанным с биополимером. В результате спектральные
свойства связанной фракции можно исследовать без помех, вносимых свобод-
ным красителем.

Влияние полярности растворителя на спектры испускания этих зондов мож-
но проиллюстрировать следующим примером. Сдвиг максимума испускания 2-ани-
линонафталин-6-сульфоната от 416 нм в ацетонитриле до 500 нм в воде (рис. 7.5)
[17] является результатом изменения дипольного момента при возбуждении
и последующей переориентации полярных молекул растворителя. Похожие, но
сдвинутые спектральные распределения в различных растворителях указывают
на то, что что причиной длинноволнового сдвига спектров служат общие эф-
фекты растворителя. Наличие специфических эффектов растворителя иногда
с очевидностью вытекает из изменений формы спектра испускания (разд. 7.4).

Чувствительность флуорофора к полярности растворителя можно оценить
с помощью графика Липперта, представляющего собой зависимость разности
РИС. 7.5. Нормированные спектры испускания 2-анилино-6-нафталинсульфоновой
кислоты [17].

Растворители:'/ - ацетонитрил; 2 - этиленгликоль; 3 — смесь 30% этанола + 70%
воды; 4 - вода.

(vfl -	) от ориентационной поляризуемости △/. Наиболее чувствительны

те флуорофоры, у которых дипольный момент при возбуждении сильно меня-
ется. Типичные зависимости Липперта для двух производных нафтиламина
приведены на рис. 7.6 [ 9]. Ясно, что N-фенил-производное 2-аминонафта-
лин-6-сульфоновой кислоты более подвержено влиянию полярности растворите-
ля, чем незамещенное аминопроизводное. Обычно присоединение к аминогруп-

РИС. 7.6. Графики Липперта дпя двух производных нафтиламина: М-фенил-М-ме-
тил-2-аминонафталин-6-сульфоната (7) и 2-аминонафталин-6-сульфоната (2) (по дан-
ным [9]).
Таблица 7>3, Рассчитанные значения изменений дипольных моментов флуорофоров

____________при возбуждении в смеси этанол 4- вода [ 9]____________________

Молекула	Онзагеров- ский ра» диус, А	(ц* - |Д),‘ D
2» А ми нонафтал ин^бсул ьфон ат	3	9
М,М-Диметил-2"’аминонафталин-6"сульфонат	3	19
N-ф ен и л»2«>ами но н афтал и н	4	20
И-Циклогексил-г-аминонафталин-б-сульфонат	5	23
М-Фенил-2-аминонафталин-6-сульфонат	5	40
М-Фенил°Р?~метил»2“аминонафталиН”6 сульфонат	5	46
М«(о-Толуил)-2-аминонафталин-6-сульфонат	5	49
Н-(м-Толуил)«2-аминонафтаЛйн-6-сульфонат	5	42
М-(п«.Тол у и л )-2-ам и н он афт ал и н-6-су льфон ат	5	44

пе боковых цепей, особенно ароматических групп, повышает чувствительность
к полярности растворителя. Эту общую тенденцию можно проследить, анали-
зируя данные табл. 7.3, в которой приведены значения (ц* - ц) для некото-
рых производных нафтиламина, полученные из графиков Липперта. Наличие
ароматических боковых цепей может увеличить степень разделения зарядов
в возбужденном состоянии по сравнению с незамещенными производными ами-
нонафталина. Линейность таких графиков часто можно рассматривать как до-
казательство того, что преимущественное влияние на спектральные сдвиги
оказывают общие эффекты растворителя. Специфические эффекты раствори-
теля приводят к нелинейности графиков Липперта (разд. 7.4). Для получения
данных, приведенных на рис. 7.6, был использован ограниченный ряд похожих
растворителей. Точнее, это были смеси этанола и воды; во всех этих смесях
могли иметь место одни и те же специфические эффекты, обусловленные во-
дородными связями.

7.4.	Специфические влияния растворителя

В предыдущих разделах были описаны общие взаимодействия между флу-
орофорами й растворителями. Они приблизительно отражаются уравнением
Липперта и представляют собой суммарное влияние на флуорофор всех окру-
жающих его молекул растворителя. Общие эффекты определяются электрон-
ной поляризуемостью растворителя, которую характеризует показатель пре-
ломления п , и молекулярной поляризуемостью, являющейся результатом пе-
реориентации диполей растворителя. Молекулярная поляризуемость - функ-
ция статической диэлектрической постоянной е. Напротив, специфические вза-
имодействия происходят с одной или несколькими соседними молекулами и
зависят от специфических химических свойств как флуорофоров, так и раство-
рителей [ 10, 18]. Специфические эффекты могут быть обусловлены водород-
ными связями, кислотно-основными взаимодействиями или взаимодействиями
с переносом заряда (указано только несколько процессов). Спектральные сдви-
ги, вызванные такими специфическими взаимодействиями, могут быть значи-
тельными. Их игнорирование ограничивает детальную интерпретацию спектров
флуоресценции.

Специфические взаимодействия растворитель - флуорофор часто можно
идентифицировать, изучая спектры испускания в ряде растворителей. На рис. 7.7
приведены типичные данные для 2-анилинонафталина в циклогексане. Добав-
ки низких концентраций этанола (которые слишком малы, чтобы изменить
объемные свойства раствора) приводят к значительным спектральным сдви-
гам' [17]. Например, менее 3% этанола приводит к сдвигу максимума испус-
кания от 372 до 400 цм. При увеличении концентраций этанола от 3 до 100%
происходит лишь незначительный добавочный сдвиг спектра До 430 нм. Неболь-
шой процент этанола в смеси (3%) обусловливает 50% общего спектрального
сдвига. При добавлении следовых количеств этанола интенсивность первона-
чального спектра уменьшается и появляется новый спектр, сдвинутый в длин-
новолновую область. Можно привести сравнение со спектрами для PRODAN
(см. рис. 7.?) или ANS (см. рис. 7.5), в которых происходит постепенное сме-
щение при изменении растворителя. Появление новой компоненты в спектре
и характеризует специфические влияния растворителя. 2-Анилинонафталии бли-
зок по свойствам к широко используемым N-ариламинонафталинсульфоновым
кислотам, поэтому на спектры испускания этих соединений также могут ока-
зывать влияние специфические эффекты растворителя. Важно помнить, что
чувствительные к растворителям флуорофоры могут давать неверную инфор-
мацию о полярности окружения в том случае, если между флуорофором и его

РИС. 7.7. Спектры испускания флуоресценции 2-анилинонафталина [ 17].

Приведены спектры в циклогексане с добавками этанола в количестве 0% (1);
0,2% (2); 0,4% (3); 0,7% (4); 1,7% (5) и 2,7% (6). Стрелкой указано положение макси-
мума испускания в 100%-ном этаноле.

14-413
окружением существуют специфические взаимодействия, либо если релакса-
ция растворителя не происходит полностью.

Поскольку влияния специфических взаимодействий растворитель - флу-
орофор на спектры испускания крайне важны, рассмотрим еще несколько до-
полнительных примеров. Черкасов привел пример существенных специфичес-
ких влияний растворителя [19]. Найдено, что спектр испускания 2-ацетил-
антрацена сильно зависит от растворителя. При замене гексана на более поляр-
ные растворители происходят значительные спектральные сдвиги и исчезно-
вение структуры спектров испускания, т.е. разрешение колебательной струк-
туры (рис. 7.8). Можно также обнаружить наличие специфических взаимодей-
ствий растворитель - флуорофор по зависимости максимумов в спектрах ис-
пускания от состава растворителя. Например, Черкасов нашел, что максимум
испускания в гексане постепенно смещается по мере добавления диоксана до
100% (рис. 7.9). Вызванные присутствием диоксана сдвиги, вероятно, обус-
ловлены общими эффектами растворителя. Например, практически весь спект-
ральный сдвиг, которого можно было бы ожидать в присутствии метанола,
вызывается добавками лишь 1 - 2% метанола. Это количество спирта слишком
мало, чтобы повлиять на показатель преломления и диэлектрическую постоян-
ную растворителя. Далее, такие следовые добавки не оказывают накакого вли-
яния на спектр поглощения флуорофора, что свидетельствует, вероятно, об
отсутствии взаимодействий в основном состоянии между 2-аЦетилантраценом
и метанолом. Наблюдаемые спектральные сдвиги были объяснены образовани-
ем водородной связи между карбонильной группой флуорофора и спиртом, кото-
рое происходит за время жизни возбужденного состояния. В этом случае оче-
видно, что основной причиной спектральных сдвигов является специфическое
взаимодействие флуорофор - растворитель. Отсутствие изменений в спект-
рах поглощения может указывать на отсутствие взаимодействий в основном
состоянии. С другой стороны, в основном состоянии могут возникнуть слабые

I

О'.

1
I
§

f,0
о,a
Ofi

O,Z

— н-Гвнсан

• ••• Ацетон

—— BO0Q

25	23	21	19	17

Волновое число, 1Q3сгч"1

РИС. 7.8. Графики, иллюстрирующие влияние растворителя на спектры испуска-
ний 2-ацетипантрацена (по данным [19]).
Добавка второго растворителя, %

РИС. 7.9. Г рафики, иллюстрирующие влияние состава растворителя на положе-
ние максимумов испускания 2-ацетилантрацена [19].

водородные связи, причем их прочность может увеличиваться при возбужде-
нии. В любом случае, когда на флуорофор, связанный с макромолекулой, ока?
зывают влияние специфические взаимодействия, интерпретация спектра ис-
пускания будет сложной. Спектр испускания молекулы (например, 2-ацетил-
антрацена), присоединенной к гидрофобной части белка, может быть похож на
ее спектр в воде только потому, что вблизи карбонильной группы находится
единственная молекула воды.

Наличие специфических взаимодействий растворитель - флуорофор мож-
но также определить, используя графики Липперта. На рис. 7.10 и 7.11 при-

РИС. 7.10. График, иллюстрирующий влияние полярности растворителя на сток-
совы сдвиги для 1-аминонафталина [ 20].

Точки 1, 2, 3 соответствуют н-пропанолу, формамиду и метанолу соответствен-
но. Остальные растворители — апротонные.
с-1 пг-1
2с-Г 2п2*1

РИС. 7.11. График, иллюстрирующий стоксовы сдвиги для метилового эфира
траценкарбоновой кислоты в протонных и апротонных растворителях [21].

Растворители: 1 — этиловый эфир; 2 — бензонитрил; 3 — метилформиат; 4 -
N.N-диметилформамид; 5 - ацетон; 6 - ацетонитрил; 7 - 80% диоксана + 20% во-
ды; 8 - 60% диоксана + 40% воды; 9 - 40% диоксана + 60% воды; 10 — 20% ди окса-
на + 80% воды. На структурной формуле показано предполагаемое распределение
зарядов в возбужденном состоянии.

ведены примеры для 1-аминонафталина и метилового эфира 9-антраценкарбоновой
кислоты соответственно. В обоих случаях для некоторых растворителей сток-
совы сдвиги пропорциональны ориентационной поляризуемости, однако неко-
торые другие растворители приводят к аномальным стоксовым сдвигам. От-
личающиеся от ожидаемых сдвиги были найдены для тех растворителей, ко-
торые способны образовывать водородные связи. Например, избыточные сдзви-
ги для 1-аминонафталина наблюдались в пропаноле, формамиде и метанол©
(рис. 7.10), а для эфира 9-метилантраценкарбоновой кислоты - во всех смося х
диоксан * вода, но ни в одном Другом растворителе. В перечисленных случа-
ях дополнительные сдвиги объясняли образованием водородных связей меж-
ду полярным растворителем и полярной группой флуорофора. В случае эфира
9-антраценкарбоновой кислоты их приписывали локализации отрицатель-
ного заряда на атоме кислорода (рис. 7.11) и образованию водородной связи
между этой группой и протонным растворителем. Следовательно, спектры ио-
пускания флуорофоров зависят как от ориентационной поляризуемости раст-
ворителя, так и от тонкой химической структуры флуорофоров и растворите-
лей. Отметим, что метиловый эфир 9-антраценкарбоновой кислоты можно рассмаит-
ривать в качестве исходного соединения для 12-(9)-антроилоксистеарата и
его изомеров [22], которые широко применяют в качестве зондов для изу-
чения структуры биологических мембран. Влияние специфических взаимодей-
ствий флуорофора с растворителями можно рассматривать либо как пробле-
му, либо как благоприятное обстоятельство. Оно является проблемой, так
как незнание природы этих эффектов мешает правильной интерпретации спект-
ров испускания с помощью ориентационной поляризуемости макромолекулы.
Но ситуация благоприятна, поскольку благодаря наличию специфических вза-
имодействий в протонных растворителях может быть обнаружена доступность
связанного с макромолекулой зонда для водной фазы.

Каким же образом можно надежно использовать данные, полученные при
исследовании спектров флуоресценции, для определения полярности мест при-
соединения, имея в виду потенциальную важность специфических взаимодей-
ствий с растворителем? В настоящее время, вероятно, еще нет достаточно
совершенного метода. Однако, исследуя с большой тщательностью влияние
растворителей на флуорофоры, можно получить разумные оценки. Рассмот-
рим следующий гипотетический эксперимент. Допустим, что 2-ацетилантра-
цен сильно связывается с двойными липидными слоями, так что практичес-
ки все молекулы 2-АА присоединены к мембране. Кажется вероятным, что
вне зависимости от локализации 2-АА в двойном слое количество воды будет
Достаточным (либо тогда, когда флуорофор находится в основном состоянии,
либо в течение времени нахождения его в возбужденном состоянии), для то-
го чтобы вызвать насыщение величины специфических эффектов, показанных
на рис. 7.8 и 7.9. В итоге чувствительность данного флуорофора к раствори-
телю лучше всего видна на той части рис. 7.9, где концентрация растворите-
ля больше 10 - 20%. Отметим, что в этой области для метанола, октанола и
диоксапа наблюдаются примерно одинаковые наклоны, свидетельствующие об
одном и том же механизме, который представляет собой общий эффект раст-
ворителя. По-видимому, влияние специфических взаимодействий с раствори-
телем можно довести до насыщения или вообще устранить, подходящим обра-
зом подобрав растворитель. Все сказанное свидетельствует о том, что с по-
мощью зонда только, тогда можно получить полезную информацию о полярнос-
ти, когда рассматривают относительный вклад общих и специфических вза-
имодействий.

Такой подход полезен для интерпретации спектров испускания флуорофо-
ров, связанных с макромолекулами. Рассмотрим работу [23], в которой изу-
чались меченные 2-анилинонафталином мембраны, образованные димиристо-
ил-Ь-а-фосфатидилхолином (DMPC). Спектры испускания 2-AN изображены
на рис. 7.12. Ясно видно, что спектр испускания 2-AN в DMPC значительно
смещен в длинноволновую область по отношению к испусканию в Циклогекса-
не и в коротковолновую область - по отношению к воде. Указывает ли это на
то, что окружение 2-AN в мембранах имеет среднюю полярность? Интерпре-
тация спектров испускания меченых мембран осложнена зависимостью спект-
ральных сдвигов от времени, однако этот факт мы в данный момент не бу-
дем принимать во внимание. Выше отмечалось (см. рис. 7.7), что 2-AN силь-
но чувствителен к небольшим концентрациям этанола. Из рассмотрения спект-
ров испускания в циклогексане, содержащем более <3% этанола, вероятно, мож-
РИС. 7.12. Спектры испускания флуоресценции 2-анилинонафталина в раство-
рах и связанного с везикулами димиристоил-Ь-а-фосфатидилхолина [ 23].

Штриховой линией показан спектр в циклогексане с добавкой з% этанола.

но заключить, что это предпочтительный эталонный растворитель для окру-
жения низкой полярности. В нем влияние специфических взаимодействий до-
стигает насыщения (соответствующий спектр изображен штриховой линией на
рис. 7.12). Учитывая это, можно сделать вывод, что окружение, в котором
локализован 2-AN, большей частью неполярное, но место присоединения флу-
орофора доступно для молекул воды. Дальнейшее подтверждение вывода да-

РИС. 7.13. Зависимость от времени максимумов испускания 2-анилинонафтали-
на в везикулах DMPC и в глицерине [ 23].
ет рассмотрение мгновенных спектров испускания. На рис. 7.13 показано по-
ложение максимумов испускания через различные промежутки времени по-
сле импульсного возбуждения. Даже через наиболее короткое наблюдаемое
время (порядка 1 нс) м ксимум испускания мембраны с 2-AN совпадает с
максимумом в протонном растворителе - глицерине. Такое начальное зна-
чение максимума испускания сравнимо также со случаем 2-AN в циклогек-
сане, содержащем 0,1 М этанола, когда имеет место полная релаксация, соот-
ветствующая насыщению влияния специфических взаимодействий. Получен-
ный результат свидетельствует о том, что в мембранах специфические вза-
имодействия с водой и с другими полярными группами, связанными водо-
родными связями, могут достигать насыщения. Зти взаимодействия могут
осуществляться либо в основном состоянии, либо в оубнаносекундном диапа-
зоне, где времена слишком короткие, чтобы их можно было разрешить в дан-
ном конкретном эксперименте. В любом случае очевидно, что легче и разум-
нее интерпретировать спектры испускания 2-AN, связанного с модельными
мембранами, сравнивая их со спектрами в эталонных растворителях, где вли-
яние специфических взаимодействий достигло насыщения.

7.5.	Практическое применение влияния растворителей

в биохимических исследованиях

7.5.1.	Локализация связанных с мембранами флуорофоров

В предыдущем разделе были перечислены трудности, встречающиеся при
строгой интерпретации спектров испускания флуоресценции, а также приме-
ры, иллюстрирующие наиболее существенные спектральные сдвиги, которые
являются результатом специфических взаимодействий флуорофоров с раст-
ворителями и поэтому требуют осторожности при интерпретации данных. Не-
смотря на существование как общих, так и специфических взаимодействий с
растворителем, обычно можно получить информацию о свойствах среды, ок-
ружающей флуорофор, из анализа его спектров испускания. В этом аспекте
особенно показательна работа [ 25]. Были исследованы три связанных с мемб-
ранами зонда: 12-(9-антроилокси)стеариновая кислота (12-AS), N-дансилфос-
фатидилэтаноламин (DPE) и !Ч-октадецилпафтил-2-амино-6-сульфоновая кисло-
та (ONS). Зонды были внедрены в модельные мембраны, а информацию о месте
их присоединения по отношению к поверхности раздела липидная фаза - вода
получали из анализа их спектров испускания, которые сравнивали со спектра-
ми аналогичных эталонных соединений в растворителях с варьируемой поляр-
ностью. Структурные формулы эталонных соединений показаны на рис. 7.14.

Спектральные дйнные для 12-AS приведены на рис* 7.15» В верхней части ри-
сунка изображены спектры испускания 12-AS в растворителях различной поляр-
ности. При увеличении полярности спектры испускания сдвигаются в сторону
ббльших длин волн. Максимум спектра испускания AS, связанного с двойным
слоем фосфатидилхолина, занимает промежуточное положение между максиму-
мами испускания AS в гексане и бензоле. Из этих данных авторы заключают,
что флуоресцирующая часть молекулы AS локализована на жирной ацильной
О

R-C-0-CH2

R~C—О—СН о
II I II
о H2C~0—P-0
I

S02
I
—ch2ch2nh

DPE

РИС. 7.14. Структурные формулы флуоресцентных зондов для мембран.

Соединения IV и V использованы в качестве эталонных для анализа зависимос-
ти спектров испускания от природы растворителя. (С разрешения авторов работы
[ 25].)

цепочке мембран и не подвергается влиянию полярного водного растворителя.
Были измерены также времена затухания флуоресценции AS . Увеличение по-
лярности растворителя приводит к уменьшению времени затухания. Время за-
тухания флуоресценции 12-AS в мембране нб больше, чем в любом из эталон-
ных растворителей (рис. 7.15,в). Этот результат является дополнительным
подтверждением того, что AS локализована в области неполярных цепочек
мембран и может служить в качестве зонда для этой области мембран.
Максимум испускания, нм

РИС. 7.15. Спектральные свойства 12-АЯ в растворах и связанного с мембрана-
ми.

а — спектры испускания; б — положение максимумов испускания в различных
растворителях; в - иллюстрация законов затухания флуоресценции при временах
затухания: 1,6 (М); 3,4 (Э); 5,6 (Бу); 8,5 (Г); 12,4 нс (ФХ). Сокращения: Г - гексан,
Б — бензол, Э — этанол, М — метанол, Бу —бутанол,ФХ — фосфатидилхолин, (С раз-
решения авторов работы [25].)

Интересно отметить, что локализация антроильного кольца в неполярной
области мембран происходит только при наличии цепочки стеариновой кисло-
ты. Такой вывод сделан на основании изучения положения максимумов ис-
пускания соединений IV и V (рис. 7.14), связанных с мембранами ФХ (рис. 7.15).
Максимумы испускания подобных соединений с меньшей молекулярной массой
указывают на их более высокую полярность, чем у AS . Зависимость спектров
Максимум испускания, нм

РИС. 7.16. Положение максимумов испускания мембранных зондов в различных
растворителях и двойных слоях ФХ [25].

Сокращения те же, что и на рис. 7.15. В — вода.

от растворителя была получена для каждого из соединений (AS, IV и V), что
очень важно, так как даже, казалось бы, небольшие изменения структуры мо-
гут привести к смещению спектров испускания. Этот факт иллюстрирует
рис. 7.15. Положение максимумов спектров испускания соединений AS, IУи
V по-разному зависит от полярности растворителя.

Авторы работы [ 25] исследовали также положение максимумов испуска-
ния DPE и ONS и сравнили эти величины с полученными для тех же флуоро-
форов в различных растворителях (рис. 7.16). Максимум испускания ONS, свя-
занного с ФХ, аналогичен найденному для ONS в смеси метанол + вода, из
чего можно сделать вывод о том, что при связывании с мембраной флуорофор
попадает в окружение высокой полярности. Немного менее полярное окруже-
ние было обнаружено для DPE . Из этих данных авторы заключили, что ONS
является зондом для поверхности раздела липидная фаза - вода, DPE -
для глицериновой цепочки, a AS - для ацильных боковых цепочек мемб-
ран.

7.5.2.	Локализация связанных с белками флуорофоров

Соображения, аналогичные изложенным в предыдущем разделе, исполь-
зовали, чтобы показать, что ANS связывается с гемовой частью апомио-
глобина и что в основном ANS недосягаема для водной фазы [ 26]. На рис.
7.17 изображены спектры ANS в одноатомных спиртах с различными моле-
кулярными массами. При увеличении длины молекулы спирта относительный
квантовый выход возрастает, а максимум испускания сдвигается в сторону
коротких длин волн. В октаноле максимум испускания ANS находится вбли-
зи 462 нм. При добавлении апомиоглобина к водному раствору ANS интен-
400 420 440 450 480 500 520 540 560 580
Длина бонны испускания, нм

РИС. 7.17. Спектры испускания флуоресценции ANS в различных спиртах.

При уменьшении полярности растворителя квантовый выход увеличивается, а
максимум спектра испускания сдвигается в сторону коротких длин волн. Сокращения
ЭГ - этиленгликоль, М — метанол, Э— этанол, П - пропанол, Бу — бутанол и О — и-чк-
танол, (С разрешения авторов работы [ 2в] и Academic Press, Inc.)

сивность флуоресценции возрастает в 200 раз (рис. 7.18k Максимум испус-
кания находится при 454 нм, что даже короче, чем для ANS в октаноле. В
воде квантовый выход флуоресценции ANS составляет ~0,004, а максимум
испускания приходится на 515 нм. Относительный квантовый выход флуо-
ресценции для раствора ANS + апомиоглобин выше, чем для октанольного
раствора (0,98. и 0,63 соответственно). Тот факт, что увеличение кванто-
вого выхода и коротковолновый сдвиг спектров при смешивании ANS с апо-
миоглобином обусловлены присоединением к гемовой части молекулы, под-
тверждается влиянием гемина на флуоресценцию ANS . Добавка 1 моль ге-
мина на моль апомиоглобина, приводит к полному исчезновению возрастания
флуоресценции ANS . На основании этих результатов авторы делают вывод
о том, что ANS была связана в неполярной части молекулы апомиоглобина,
вероятнее всего - в щели гема.

ANS и сходные с ней соединения широко используют из-за малых кван-
товых выходов флуоресценции в воде. Однако иногда требуется еще большая
чувствительность спектров испускания к полярности, и выше мы отмечали,
что крайне высокой чувствительностью к природе растворителя обладает
PRODAN (см. рис. 7.2). Спектр испускания FRODAN очень сильно смещает-
ся в сторону коротких длин волн при связывании его с бычьим сывороточ-
ным альбумином. Как и в случае ANS, квантовый выход PRODAN возрас-
340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540
Длина волны, нм

РИС. 7.18. Спектры испускания и возбуждения флуоресценции ANS, связанной с
апомиоглобином.

(С разрешения авторов работы [2б] И Academic Press Inc.)

РИС. 7.19. Спектры испускания флуоресценции PRODAN в воде и связанного с
бычьим сывороточным альбумином.

1-3 мкМ PRODAN в воде; 2 - 5 с добавками 38 (2), 76 (3), 150 (4) и 300 (5) мкМ
бычьего сывороточного альбумина. (С разрешения авторов работы [14] и American
Chemical Soeiety.)

тает при присоединении его к гидрофобной части белка [14]. В отличие от
ANS интенсивность увеличивается только в три раза, поэтому отчетливо
наблюдается испускание как связанных, так и свободных молекул (рис. 7.19).
Это свойство может быть ценным, если необходимо измерить концентрации
как свободного, так и связанного зонда.
Вебер рассчитал полуширины спектров испускания свободных и связан-
ных молекул PRODAN, т.е. ширину (в см-1) исправленного спектра испус-
кания на половине высоты (50% интенсивности). Было найдено, что полуши-
рина связанной формы больше, чем для PRODAN в водном растворе. В сле-
дующей главе будут рассмотрены наносекундные процессы релаксации в
качестве одной из причин увеличения полуширины спектра для связанного
флуорофора (релаксация протеиновой матрицы относительно дипольного мо-
мента возбужденного состояния PRODAN). Поскольку релаксация происхо-
дит со скоростью, сравнимой с временем затухания флуоресценции, испус-
кание происходит из набора частично релаксированных состояний. Извест-
но, что полуширина для такого усредненного испускания увеличена. Пору-
ченные результаты свидетельствуют о сложности интерпретации спектров
флуоресценции для зондов, связанных с белками и мембранами. Если ре-
лаксация вокруг возбужденного состояния флуорофора происходит не пол-
ностью, спектры флуоресценции в стационарном состоянии не совсем точ-
но отражают полярность окружающей среды.

Задачи

7-1. Влияние растворителей на спектры флуоресценции PRODAN. Используйте при-
веденные ниже данные (табл. 7.4) для расчета изменения дипольного момента при
возбуждении. Сделайте вывод о наличии специфических влияний растворителя и про-
комментируйте относительную важность их по сравнению с 2-анилинонафталином и
2-ацетилантраценом.

Таблица 7,4. Спектральные характеристики
растворов PRODAN

№ п/п	Растворитель	Максимум поглощения, нм	Максимум испускания, нм
1	Циклогексан	342	401
2	Бензол	355	421
3	Триэтиламин	343	406
4	Хлорбензол	354	430
5	Хлороформ	357	440
б	Ацетон	350	452
7	Диметилформамид	355	461
8	Ацетонитрил	350	462
9	Этиленгликоль	375	515
10	Этанол	360	496
11	Пропиленгликоль	370	510
12	Метанол	362	505
13	Вода	364	531
ГЛАВА8.

Механизмы и динамика
процессов релаксации растворителей

В гл. 7 были рассмотрены механизмы взаимодействий растворителей
с флуорофорами и влияние этих взаимодействий на спектры испускания. Спект-
ры испускания могут сдвигаться в сторону меньших энергий в результате ли-
бо общих эффектов растворителя, либо специфических взаимодействий, осно-
ванных на химических реакциях между флуорофором и растворителем. Обсуж-
дая эти проблемы, мы предполагали, что флуорофор находится в жидком раст-
воре и что время релаксации растворителя т5 много меньше времени затухания
флуоресценции т. При этом испускание происходит из релаксированного состо-
яния, когда достигается равновесие растворителя с новым распределением
электронов возбужденного флуорофора. Реорганизация растворителя вокруг
диполя в возбужденном состоянии является реакцией в возбужденном состо-
янии. В гл. 12 будет описано влияние простой реакции, включающей два сос-
тояния, на спектральные свойства флуорофоров. В этом случае законы зату-
хания флуоресценции и данные фазово-модуляционных измерений дают ряд об-
щих и полезных характеристик, которые в дальнейшем можно использовать для
выяснения того, происходит ли реакция в возбужденном состоянии, а также
для определения кинетических констант этой системы. Модель двух состояний
относительно проста, поскольку в ней подразумеваются только две испуска-
ющие частицы, времена затухания флуоресценции которых не зависят от дли-
ны волны испускания. Во многих отношениях модель двух состояний может
служить в качестве некой концептуальной основы, на базе которой можно рас-
сматривать любые процессы, протекающие в возбужденных состояниях.

Эта глава посвящена более сложным, но часто встречающимся явлениям,
связанным с зависящими от времени процессами релаксации растворителя. Ки-
нетика релаксации растворителя чаще всего проявляется в температурной за-
висимости спектров испускания флуоресценции. Одним из примеров может
служить хорошо известный коротковолновый сдвиг флуоресценции при стек-
ловании растворителей. Такие сдвиги наблюдаются при низких температурах
из-за того, что время, необходимое для переориентации молекул растворите-
ля при этих температурах, становится больше времени, которое нужно, чтобы
произошло испускание [ 1 - 3]. Следовательно, в этом случае наблюдается
испускание из нерелаксированного состояния. Причиной низкотемпературных
коротковолновых сдвигов является то, что ориентационная поляризуемость
△/ не успевает измениться под влиянием диполя в возбужденном состоянии.
Безусловно, могут иметь место и специфические взаимодействия с раствори-
телем, и они также могут происходить со скоростями испускания.
По сравнению с реакциями, в которых участвуют два состояния, релак-
сация растворителя - явление гораздо более сложное. Релаксация происхо-
дит в результате множества взаимодействий растворителя с флуорофором.
Следовательно, испускание может идти из целого ряда различных, частично
релаксированных состояний, как показано на рис. 8.1. Буквами F и R обо-
значены гипотетические спектры, соответствующие испусканию из первона-
чального возбужденного и релаксированного состояний соответственно. Ког-
да процессы испускания и релаксации растворителя происходят со сравнимы-
ми скоростями, обычно наблюдают промежуточный спектр (показан штриховой
линией на рис. 8.1). Отметим, что полуширина этого спектра больше, чем спект-
ров F и R. Такое явление часто наблюдают, когда среднее время жизни т
сравнимо с временем спектральной релаксации тл . При этом наблюдают ис-
пускание как из обоих состояний F и R, так и из множества частично релак-
сированных состояний, благодаря чему результирующее испускание имеет уши-
ренное спектральное распределение.

Обсуждая перечисленные проблемы, будем использовать обозначения -гF
и xR для кажущихся времен жизни первоначально возбужденного и релакси-
рованного состояний соответственно, причем каждая из этих величин измеря-
ется относительно функции возбуждения. Однако спектральная релаксация мо-
жет быть непрерывным процессом, и, вероятно, существует большое число
частично релаксированных состояний. В общем случае невозможно наблюдать
каждое из этих состояний в отдельности. Экспериментально лучше всего из-
мерять кажущиеся времена жизни на выбранных длинах волн. Естественно
ожидать, что испускание из нерелаксированного состояния будет преобладать
на коротковолновом краю спектра, а из релаксированного - на длинноволно-
вом краю того же спектра. Мы будем часто говорить о соответствующих гра-
ничных значениях rF и тд . Однако надо отметить, что измеренные для этих
длин волн величины могут и не соответствовать времени жизни флуоресцен-
ции для какого-либо одного состояния флуорофора.

РИС. 8.1. Схематическое представле-
ние релаксации растворителя.

F и R - гипотетические спектры флуорес-
ценции из первоначально возбужденного и
релаксированного состояний соответствен-
но. Появления спектра стационарной флуо-
ресценции (штриховая пиния) можно ожи-
дать при Т ~ Т . ;
Важно понимать, что кроме упомянутых сложностей, связанных только
с одним типом взаимодействия растворителя с флуорофором, могут возникать
еще и другие типы взаимодействий. Более того, скорости общих и специфи-
ческих взаимодействий с растворителем могут определяться различными мо-
лекулярными процессами, благодаря чему их зависимость от времени и тем-
пературы может быть различной. Поэтому неудобно использовать единый ап-
парат для объяснения таких разнородных явлений. Тем не менее спектраль-
ные свойства флуорофора, вступающего в реакции, включающие два состоя-
ния, служат удобной основой для рассмотрения процессов релаксации раство-
рителя. В качестве введения к настоящей главе читатель может использовать
обзор, приведенный в разд. 12.1.

Изучение кинетики спектральной релаксации представляет также инте-
рес для биохимии, поскольку из нее можно получить информацию о физичес-
ких свойствах макромолекул. Так, наблюдение зависящих от времени спект-
ров испускания для флуорофоров, связанных с белками и мембранами [4, 5],
указывает на протекание процессов спектральной релаксации в наносекунд-
ной области, и их детальный анализ позволяет оценивать скорости релакса-
ции этих макромолекул после мгновенного возбуждения при поглощении света.

8.1. Влияние релаксации растворителя на спектры испускания
в стационарном состоянии

Чаще всего измеряют спектры испускания в стационарном состоянии, при-
чем при изучении таких спектров обнаруживается множество интересных эф-
фектов. В последующих разделах этой главы будет рассмотрено влияние ре-
лаксации растворителя как на импульсные, так и на фазово-модуляционные из-
мерения законов затухания флуоресценции. Обычно при уменьшении темпера-
туры спектры испускания сдвигаются в коротковолновую область. Типичный
пример приведен на рис. 8.2 для N-ацетил- L-триптофанамида в пропиленглико-
ле [6]. Конечно, этот флуорофор моделирует испускание, наблюдаемое у бел-
ков, в флуоресценцию которых основной вклад дают триптофановые остатки.
При понижении температуры максимум испускания непрерывно смещается от
350 до 325 нм. Такой низкотемпературный коротковолновый сдвиг связывают
с неспособностью молекул растворителя переориентироваться за время жизни
возбужденного состояния, которое для NATA в этом растворителе равно -5 нс.
Заметим, что спектр сдвигается постепенно при понижении температуры, при-
чем не наблюдается исчезновения одного спектра и появления другого. Это
сильно отличается от того, что происходит в случаях реакций, включающих два
возбужденных состояния (гл. 12), или специфических взаимодействий с раство-
рителем (гл. 7), когда часто удается выделить отдельные спектральные компо-
ненты.

Дальнейшее подтверждение такого толкования можно получить из зависи-
мости коротковолновых сдвигов от растворителя. В глицерине, вязкость кото-
рого при одних и тех же температурах больше, чем у пропиленгликоля, корот-
коволновые сдвиги происходят при несколько более высоких температурах
РИС. 8.2. Спектры испускания флуоресценции М-ацетил-Ь-триптофанамида.

Стрелками указаны длины волн, выбранные для подавления фазы. См.

рис. 8.16 и его описание в’тексте. (По данным работы [б1 с разрешения American
Society for Photobiology.)

15-413
(рис. 8.2). Аналогичную зависимость от вязкости можно наблюдать для ряда
растворителей. В более текучих растворителях коротковолновые сдвиги наблю-
даются при более низких температурах. Однако не существует точной корре-
ляции между временами диэлектрической релаксации растворителя и времена-
ми спектральной релаксации. Причина заключается как в сложности природы
процессов диэлектрической релаксации даже в простых, растворителях, так и
в различиях перемещений молекул растворителя при диэлектрической и спект-
ральной релаксации. Эти вопросы будут рассмотрены ниже более подробно
(разд. 8.3).

В спектрах NATA в глицерине видно также появление фосфоресценции
при низких температурах. Именно из-за фосфоресценции NATA появляется
длинноволновое испускание при -60°C (рис. 8.2). В жидких растворах фосфо-
ресценция обычно не наблюдается, так как, по-видимому, тушится кислородом
и движением молекул растворителя. Благодаря значительно большим временам
затухания флуоресценции (низким скоростям испускания) безызлучательная
дезактивация может привести к крайне малым квантовым выходам. Чтобы по-
низить скорости этих безызлучательных процессов и иметь возможность на-
блюдать флуоресценцию, нужно работать при низких температурах.

Рассмотрим следующий пример, .иллюстрирующий влияние специфических
взаимодействий с растворителем и их Динамики на спектры в стационарном
состоянии. Известно, что спектры испускания NATA и индола, растворенных
в неполярных апротонных растворителях, таких, как гексан, имеют колебатель-
ную структуру. Добавление небольших количеств спиртов приводит к исчезно-
вению этой структуры (см. [7, 8] и рис. 11.5). Однако даже при температурах,
достаточных для того, чтобы замедлить релаксацию растворителя в пропилен-
гликоле и глицерине, такие структурированные спектры испускания для NATA
не наблюдаются (рис. 8.2). Исчезновение колебательной структуры под влия-
нием спиртов связывалось с образованием комплексов в возбужденных состо-
яниях (эксиплексов) между индолом и молекулами полярного растворителя. Ве-
роятно, в протонных растворителях (пропиленгликоле и глицерине) специфичес-
кое взаимодействие, связанное с образованием эксиплекса, завершается даже
при тех температурах, когда общие процессы релаксации подавлены. Отсюда
видно потенциальное различие скоростей и температурных зависимостей общих
и специфических взаимодействий с растворителем. На этот факт мы указывали
выше при обсуждении специфических влияний растворителя для 2-анилинонафта-
лина в различных растворителях и связанного с липидными двойными слоями
(см. рис. 7.12 и 7.13).

В предыдущей главе были обсуждены спектральные данные для 2-ацетил-
антрацена. Как мы видели, добавки небольших количеств протонных (образу-
ющих водородные связи) растворителей к неполярному растворителю приводят
к значительному сдвигу спектров флуоресценции этого флуорофора. Спектраль-
ные сдвиги нельзя объяснить изменением объемных физических свойств раст-
ворителя, поэтому их причиной считали образование водородных связей между
полярным растворителем и ацетильным фрагментом 2-АА. Наличие как общих,
так и специфических взаимодействий с растворителем следует также из тем-
пературной зависимости спектров 2-АА (рис. 8.3). Из приведенных спектров
видно, что различные молекулярные процессы, например образование водород-
ных связей и полная реорганизация растворителя, могут по-разному зависеть
от температуры и химических свойств растворителей. В спектрах испускания
2-АА в н-бутаноле (рис. 8.3, а) [ 9] при низких температурах (-183 °C) наблюда-
ется структурированный спектр испускания, такой же, как у антрацена. При по-
вышении температуры до -24°С структура исчезает и появляется смещенный
в длинноволновую область спектр испускания, соответствующий релаксирован-
ному состоянию. Этот спектр уже не имеет колебательной структуры. При
-105 °C можно заметить как структурированное, так и бесструктурное испус-
кание. Вероятно, на ацетильном фрагменте при возбуждении появляется час-
тичный отрицательный заряд, после чего фрагмент образует водородную связь
с гидроксильными группами растворителя. В глицерине (рис. 8.3, б) наблюда-
ется бесструктурное испускание даже при самых низких температурах, при ко-
торых проводили измерения. В глицерине удельное содержание гидроксильных
групп больше, чем в н-бутаноле, и, по-видимому, они образуют водородные
связи с ацетильным кислородом даже при крайне низких температурах. Веро-
ятно, для такого специфического взаимодействия с растворителем необходи-
мы более слабые движения молекул, чем для полной переориентации молекул
растворителя как целого. Следовательно, специфические взаимодействия флу-
орофора с растворителем могут происходить при меньших температурах, ког-
да общая релаксация растворителя подавлена.

Как отмечалось выше, колебательная структура спектров испускания 2-АА
сильнее размыта в глицерине, чем в н-бутаноле. Эти результаты были объяс-
нены большей вероятностью специфических взаимодействий флуорофора с раст-
ворителем в глицерине, где средняя концентрация гидроксильных групп выше.
Если это так, то можно ожидать, что спектры 2-АА в спиртах будут зависеть

РИС. 8.3. Спектры испускания флуоресценции 2-ацетилантрацена [ 9].

Приведены спектры в н-бутаноле (а) и глицерине (б) при указанных температу-

рах.
от относительной концентрации гидроксильных групп и алкильных цепочек, т.е.
от размера алкильных цепочек в одноатомных спиртах. Спектры 2-АА в мета-
ноле, этаноле, пропаноле и гексане при -183 °C приведены на рис. 8.4 [9]. По
мере увеличения содержания гидроксильных групп испускание становится все
менее структурированным. Отсюда видно, что на степень специфического вза-
имодействия флуорофора с растворителем может сильно влиять химическая
структура растворителя. Безусловно, аналогичные эффекты должны наблю-
даться и для флуорофоров, связанных с макромолекулами. В этом случае сте-
пень специфических взаимодействий флуорофоров с растворителями, вероят:
но, будет зависеть от степени контакта флуорофора с растворителем и от при-
сутствия в макромолекуле соседних групп, которые могут взаимодействовать
с флуорофором.

Из сказанного выше можно сделать вывод, что повышение температуры
всегда приводит к увеличению скорости релаксации и к длинноволновому сдви-
гу спектров испускания. При изучении биологических макромолекул темпе-
ратурный диапазон ограничен нестабильностью этих молекул при высоких тем-
пературах. Внутри этого диапазона при повышении температуры можно ожи-.
дать сдвига спектров испускания в сторону больших длин волн. Однако, ког-
да работу ведут в широком температурном диапазоне, увеличение температу-
ры растворителя не всегда приводит к длинноволновому испусканию. При вы-
сокой температуре тепловое движение может препятствовать полному упо-
рядочению диполей растворителя вокруг флуорофора в возбужденном состо-
янии, что проявляется в уменьшении диэлектрической постоянной' раствори-
теля [10]. Такой высокотемпературный коротковолновый сдвиг спектров 2-АА
в глицерине при 234 °C показан на рис. 8.3, б. При более высокой температу-
ре вместо смещения спектра в сторону низких энергий происходит частичное
смещение в обратную сторону. Высокотемпературные коротковолновые сдвиги
отмечены также для производных фталимида [ И] и для 6-пропионил-2(ди-
метиламино)нафталина [ 12]. В общем случае наиболее заметные длинновол-
новые сдвиги наблюдаются при температурах, когда растворитель еще до-
статочно текучий для того, чтобы переориентация закончилась до процесса
испускания флуоресценции, но когда тепловая энергия еще не столь велика,
чтобы нарушить эту ориентацию.

РИС. 8.4. Спектры испускания флуорес-
ценции 2-ацетилантрацена при —183°С
[9].

1 - 96%-ный метаноп; 2 - 96%-ный
этанол; 3 — н-пропанол; 4 — гексан.

о, 8
РИС. 8.7. Зависимости фазовых углов З-амино-Ь'-метилфталимида в гексане,
содержащем пиридин, от волнового числа [18].

1 - в чистом гексане; 2 - 4 в гексане с добавкой пиридина:О,О1% (2); 0,10% (3)
и 0,5% (4); 5 - в чистом пиридине. Частота модуляции 11,2 МГц. -

личину константы скорости такого специфического взаимодействия с раство-
рителем из величины фазовых углов при 26 000 см”1. Как следует из изучения
спектров испускания 3-АР в различных растворителях, при этом волновом
числе испускание обусловлено главным образом не связанным в комплекс
3-АР. При добавлении пиридина фазовый угол незакомплексованного 3-АР умень-
шается, что указывает па сокращение времени затухания. Время затухания
уменьшается из-за того, что появляется другой процесс, снижающий заселен-
ность возбужденного состояния. Напомним, что т = (Г +/с1)‘1,гдо Г -ско-
рость затухания в отсутствие тушителя, a /q - константа скорости процесса
специфического взаимодействия. Небольшие количества пиридина не должны
влиять на основные свойства растворителя, и поэтому изменение величины Г
маловероятно. При 26 000 см"1 фазовые углы равны 16 и 20° при добавлении
0,1% и 0% пиридина соответственно. Для необратимой реакции (гл. 12) время
затухания флуоресценции первоначально возбужденного состояния можно точ-
но рассчитать из измеренной величины фазового угла. При использованной
в этих исследованиях частоте модуляции (со = 2тг* 11,2 МГц) фазовые
углы соответствуют временам затухания 4,1 и 5,8 нс. Напомним, что время
затухания в отсутствие процессов в возбужденном состоянии (т0) определя-
ется выражением Г = т^1, откуда константа скорости /q = 5,2ИП7 с"1. Кон-
центрация пиридина составляет 0,1% «0,013 М. Следовательно, константа скорос-
ти бимолекулярной реакции равна примерно 4'109М"1.с~1. Полученная вели-
чина близка к .диффузионной *. Это подтверждает предположение о том, что
зависимость фазового угла от длины волны - результат протекания процес-
сов в возбужденном состоянии.

* На самом деле эта величина почти на порядок меньше диффузионной констан-
ты скорости в гексане. — Прим. ред.
8.3.1.	Доказательство протекания процессов в возбужденном
состоянии по данным о фазовых углах и степени модуляции

Широко известно, что сами по себе фазовые измерения, проведенные с
одной частотой модуляции, не могут дать информации о законе затухания
флуоресценции образца. Следовательно, можно сказать, что увеличение фа-
зового угла в зависимости от длины волны определяется двумя совокупнос-
тями флуорофоров с разными временами жизни. Уменьшение фазового угла
при 26 000 см"1 свидетельствует против такого предположения, но отнюдь не
опровергает его. Веселова и др. [18] привели изящное доказательство про-
текания реакции в возбужденном состоянии. Они сравнили величины фазово-
го угла q> и степени модуляции т на длинноволновом краю спектра испус-
кания (18000 см"1). Найденное значение m/cos<p> 1 служит доказательст-
вом того, что наблюдаемый спектр испускания - результат реакции в воз-
бужденном состоянии (см. разд. 12.3). Наоборот, отношение m/cosq> всегда
меньше единицы для непосредственно возбужденных частиц с различными
временами жизни. В методе фазово-модуляционной флуорометрии т/сдаср > 1
эквивалентно появлению члена с отрицательным предэкспоненциальным коэф-
фициентом в импульсном методе измерения законов затухания флуоресценции.
Наблюдаемые значения m/cos <р при 18 000 см-1 были равны 1,07; 1,07 и 1,05
при 0,05; 0,1 и 0,3% пиридина соответственно. Авторы с осторожностью заме-
чают, что эти результаты служат доказательством протекания процессов в
возбужденном состоянии, которыми обусловлена по крайней мере часть длин-
новолнового испускания. Некоторое комплексообразование в основном сос-
тоянии между 3-АР и пиридином также может иметь место, а сила водород-
ной связи может меняться при возбуждении. Важным моментом в этих иссле-
дованиях было установление различий между процессами в возбужденном сос-
тоянии и гетерогенностью в основном состоянии с помощью измерений фазо-
вого угла и степени модуляции. Вероятно, это - первое использование дан-
ных о фазовом сдвиге и степени демодуляции для разделения зависящих от
времени спектральных сдвигов и гетерогенности в основном состоянии.

Касаясь истории вопроса, интересно отметить, что еще раньше Черка-
сов [21] измерил различия в величинах фазовых углов на коротковолновом
и длинноволновом краях спектра испускания 2-ацетилантрацепа в глицери-
не. Различные значения фазового угла в разных спектральных областях на-
блюдали лишь при промежуточных температурах (около - 10°C), когда .
При более высоких и более низких температурах, когда преобладает испус-
кание из релаксированного и нерелаксированного состояний соответствен-
но, различия в фазовых углах были меньше. В этом случае не полностью
исключалось влияние гетерогенности, но такое объяснение кажется малове-
роятным. Эти данные приведены в задаче 8-1 в конце главы.
8.3.2.	Разделение на индивидуальные спектры с помощью
фазово-модуляционных данных

В статье Веселовой и др. [18] изложены еще две новые концепции: рас-
чет спектров испускания входящих и не входящих в комплекс частиц по дан-
ным о фазовых углах и степени модуляции и использование разделениях спект-
ров для выбора подходящей модели (двух состояний, множества состояний
или континуальной). Было найдено, что в присутствии пиридина фазовые уг-
лы па коротковолновом и длинноволновом краях спектра приближаются к по-
стоянному значению (рис. 8.7), что позволяет приписывать испускание в
этих спектральных областях преимущественно одному виду частиц. При этих
условиях можно использовать данные по зависимости фазового угла и степе-
ни модуляции от длины волны для расчета спектра испускания каждого ком-
понента. Вклад испускания от каждого вида частиц fi в стационарный спектр
/ (7) определяется выражениями

m(v)sin[<p(v) -фЯ]

/?(’)= ------—----------;—	(8.8)

/я/гsin (ф/г - ФЛ)

m(v )sin [фг - ф ( v ) ]

= ---------------------- (8.7)

и/? Sin (ф/г - (рц)

где индексы F и R относятся к первоначально возбужденным (незаком-
плексованным) и отрелаксировавшим (закомплексованным) частицам соот-
ветственно1. Рассчитанные таким образом спектры для растворов, содержащих
0,5% пиридина, приведены на рис. 8.8. Аналогичные измерения и расчеты бы-
ли проведены для растворов, содержащих различные количества пиридина и
«-бутанола. На рис. 8.9 приведены максимумы спектров испускания для продук-
та взаимодействия и максимумы, наблюдаемые для стационарных спектров.
Рассчитанный максимум спектров испускания для закомплексованных частиц
в растворах, содержащих пиридин, находится на одном и том же месте при
всех концентрациях пиридина [рис. 8.9, а, (кривая 2)]. Напротив, для раство-
ров, содержащих бутанол, максимумы испускания продукта взаимодействия
постепенно смещаются в сторону больших длин волн при увеличении концен-
трации бутанола (рис. 8.9, б). Результаты для пиридина указывают на-присут-
ствие только одного продукта взаимодействия, а для бутанола -- на присут-
ствие по крайней мере двух продуктов взаимодействия, соотношение вкладов
от которых меняется при изменении концентрации бутанола. В частности, при
низких концентрациях бутанола длинноволновое испускание в основном обу-
словлено комплексом 3-АР с одной молекулой бутанола, тогда как при высо-
ких концентрациях бутанола длинноволновое испускание, вероятно, можно при-
писать более сильно закомплексованным молекулам 3-АР. Из анализа спект-
РИС.8.8. Разделение на индивидуаль- $
ные спектры для З-амино-М-метилфталими-
Да [ 18].

1 — рассчитанные спектры для незаком-
плексованных частиц; 2 - для частиц в ком-
плексе с пиридином; 3 - спектр стационар-
ной фпуоресценции 3-АР в гексане, содер-
жащем 0,05% пиридина. Приведены также
величины фазовых углов, зависящих от
длины волны и степени модуляции для это-
го раствора.

РИС. 8.9. Сдвиг максимума испускания 3-АР относительно раствора в гексане
[18].

7 - данные для максимума спектра стационарной фпуоресценции; 2- рассчи-
танные по фазово-модуляционным данным значения для частиц, образовавшихся в
резупьтате реакции.

ров, полученных с помощью фазово-модуляционных измерений, авторам ра-
боты [ 18] удалось отличить модель двух состояний от более сложных моделей,
описывающих процессы релаксации. Независимо от того, насколько строги их
выводы, концепции, использованные при анализе результатов, являются край-
не полезными и новыми. Отметим, что зависимость данных фазовых и моду-
ляционных измерений от длины волны можно легко получить с помощью до-
ступной в настоящее время аппаратуры. Следовательно, описанный выше спо-
соб можно использовать для изучения зависящих от времени процессов в прос-
тых растворах, а также для изучения макромолекул.

Основная трудность при использовании уравнений (8.6) и (8.7) заключает-
ся в определении требуемых величин фазовых углов и степеней модуляции на
коротковолновом и длинноволновом краях спектров испускания. Во многих случаях
спектральное разрешение для отдельных состояний слишком мало. Индивидуальные
спектры могут перекрываться при всех используемых длинах волн испуска-
ния, что может привести к искажениям в измеренных величинах фазовых уг-
лов и степеней модуляции. В результате этого разложение на индивидуаль-
ные спектры не является единственным. Однако даже произвольное разложе-
ние спектров может служить в качестве полезного приближения, до тех пор
пока не окажется возможным единственное разложение.

8.3.3.	Применение фазовой флуорометрии для установления
различия процессов релаксации, описываемых моделью
двух состояний, от процессов, описываемых континуальной
моделью

Последнее, что нам хотелось бы обсудить в работе Веселовой и др. [ 18], -
это используемый ими метод различения процессов релаксации, описываемых
с помощью двух разных моделей: модели двух состояний и континуальной. Пред-
полагается, что в континуальной модели центр тяжести спектра испускания
смещается от значения 70 , полученного после возбуждения, до конечной ве-
личины 7м по зкепононциалыюму закону за время тл (разд. 8.2.1). Конечно,
даже для простых растворителей может понадобиться несколько значений вре-
мен спектральной релаксации, чтобы описать происходящие процессы. Исполь-
зуя континуальную модель релаксации, авторы работы [ 18] предсказали, что
фазовый угол для непрерывно релаксирующего спектра Должен монотонно
уменьшаться до пуля при увеличении волнового числа. Это наблюдалось для

й,

РИС. 8.10. Графическая зависимость фазовых углов З-амино-Ы-метилфтапими-
да в н-бутанопе от волнового числа ] 1б].	Г)

Приведены данные для з-АР в w-бутаноле при -183, -90, -70 и + 20 С.

16-413
3-АР в н-бутаноле при -90 и-70 °C (рис. 8.10). Было найдено, что фазовые
углы примерно постоянны при-183 и 20 °C, когда релаксация растворителя
происходит много медленнее или соответственно быстрее, чем испускание.
Противоположная картина наблюдается для 3-АР в гексане и пиридине: фа-
зовые углы приближаются к постоянному значению на коротковолновом краю
спектра испускания. В целом же описанные выше результаты иллюстрируют
потенциальные возможности фазово-модуляционной флуорометрии для деталь-
ного выяснения кинетики и механизмов процессов релаксации растворителя.
После обсуждения изучения процессов релаксации растворителя с помощью
импульсного измерения кинетики флуоресценции мы перейдем к рассмотрению
биохимических данных, полученных обоими методами.

8.4.	Изучение процессов релаксации растворителя с помощью
импульсного метопа измерения флуоресценции

Авторы работы [22] исследовали релаксацию спектров флуоресценции
производных фталимида [22] с использованием импульсных методов измере-
ния флуоресценции. Они применяли стробоскопический метод и измеряли ин-
тенсивность через заданные промежутки времени после импульсного возбуж-
дения (разд. 3.3.2). Таким образом, записывались спектры испускания, соот-
ветствующие напосекундным интервалам после возбуждающего импульса. Мы
детально обсудим эти результаты, поскольку они являются крайне поучитель-
ными.

Проводились исследования 4-аминофталимида (4-АР) в м-пропаноле, про-
пиленгликоле и глицерине в определенном интервале температур. На рис. 8.11
приведены характерные мгновенные спектры в пропаноле. При-132 и 25 °C
спектры испускания не зависели от времени. Напротив, при-70 °C, когда вре-
мя релаксации сравнимо с временем затухания флуоресценции, спектр испус-
кания сдвигается в сторону меньших энергий для больших промежутков време-
ни. Результаты интерпретируются следующим образом. В первом приближении
вероятность испускания не зависит от степени релаксации. При малых време-
нах (4нс) растворитель еще ие переориентировался вокруг флуорофора и по-
этому испускание происходит с более высоких энергетических уровней. При
больших временах (23 нс) переориентация растворителя уже произошла и дли-
ны волн испускания становятся больше- В пропиленгликоле зависимость спект-
ров от времени лучше всего проявляется при -30 °C, а в глицерине - вблизи
0 °C. Эти растворители более вязки, чем пропанол, поэтому времена релакса-
ции растворителя становятся сравнимыми с временем затухания флуоресцен-
ции при более высоких температурах.

Важно отметить, что полуширина мгновенных спектров испускания не
меняется. Это указывает на то, что в данном случае процесс релаксации мож-
но описать в основном с помощью континуальной модели Бахшиева и др. [14].
Применение модели континуальной спектральной релаксации к 4-АР в я-про-
паноле представляется оправданным, особенно если учесть результаты фазо-
вых измерений для 3-АР в бутаноле, (см. рис. 8.10). Монотонное уменьшение
Длина Зол но/, нм

РИС. 8.11. Мгновенные спектры флуоресценции 4-аминофталимида в м-п рол аноле
при —70 и—132°С [ 22].

На рисунке указано время, прошедшее от момента возбуждения до записи спект-
ра испускания.

фазового угла в коротковолновой части спектра испускания доказывает, что
происходит непрерывная, а не ступенчатая релаксация.

Из мгновенных спектров испускания видна также значительная разница
во временных диапазонах для специфических и общих взаимодействий с раст-
ворителем. Тот факт, что 4-АР чувствителен к специфическим взаимодейст-
виям с растворителем, иллюстрирует рис. 8.12. Для 4-АР в толуоле неболь-
шие добавки пропанола приводят к большим спектральным сдвигам, чем мож-
но было бы ожидать при учете влияния изменений диэлектрической постоян-
ной и показателя преломления растворителя. При добавлении небольших кон-
центраций пропанола полуширина спектров стационарного состояния увели-
Длина волны, нм

РИС. 8.12. Спектры стационарной флуоресценции 4-аминофталимида 122].

1~ в чистом толуоле; 2, 3 - в толуоле, содержащем добавки пропанола 0,075 (2)
и 0,3 М (3); 4 - в чистом пропаноле.

чивается, что свидетельствует об испускании более чем одного вида частиц.
Важно отметить, что увеличение полуширины стационарных спектров должно
происходить в случае как непрерывной, так и ступенчатой релаксации. В про-
тивоположность мгновенным спектрам испускания увеличение полуширины
стационарных спектров не позволяет сделать выбор между двумя моделями.

Ожидается, что для непрерывного процесса релаксации с единственным вре-
менем релаксации т5 центр тяжести спектра испускания “m(t) будет сме-
щаться согласно уравнению (8.1). Положение центров тяжести было оценено
на основании максимумов спектров испускания (Лтах) и зависимости Л тах
от времени, изображенной на рис. 8.13. Как и ожидалось, повышение тем-
пературы увеличивает скорости релаксации, а сама спектральная релакса-
ция происходит примерно по экспоненциальному закону. Следовательно, под-
ходящей оказывается модель Бахшиева. Однако при температурах выше 
-90 °C положение максимума испускания при экстраполяции к нулевому мо-
менту времени не совпадает с тем, которое можно ожидать в отсутствие ре-
лаксации. Для последнего оценка дала величину 428 нм при -196 °C, т.е. при
той температуре, когда можно ожидать, что релаксация будет происходить
много медленнее испускания. Полученные данные указывают на быструю ре-
лаксацию, происходящую за субнаносекундные времена и приводящую к сдви-
гу максимума спектра испускания от 430 до 450 нм. Континуальная модель
Бахшиева хорошо объясняет наблюдаемые вслед за первоначальной быстрой
релаксацией сдвиги спектров во времени. Эти результаты демонстрируют воз-
можность насыщения специфических взаимодействий с растворителем и вы-
деления таким путем более общих взаимодействий. Они также показывают
различие в интервалах времени, в течение которых могут проявляться спе-
цифические и общие взаимодействия с растворителем.
время, нс

РИС. 8» 13. Зависимость от времени максимумов спектров испускания 4-амино-
фтапимида в пропаноле (по данным [22]).

В работе [22] также сравниваются наблюдаемые времена релаксации
спектров т5 с известными временами диэлектрической релаксации раство-
рителей т^ . В целом значения т$ были почти в 10 раз меньше, чем -rd ,
причем последние в два раза сильнее зависели от температуры. Авторы объяс-
нили такой результат тем, что для каждого типа релаксации необходим свой
тип движений молекул. Для диэлектрической релаксации может потребовать-
ся согласованное движение нескольких ассоциированных молекул раствори-
теля, тогда как для спектральной релаксации - лишь небольшие смешения
той молекулы растворителя, которая находится в присущем данному флуо-
рофору окружении. Такое различие в величинах т и предсказали ра-
нее Бахшиев и Мазуренко [15, 23].

Известно, что даже в простых растворителях, таких, как пропанол, на-
блюдается несколько значений времен диэлектрической релаксации. Мазу-
ренко и др. [24, 25] проанализировали влияние этих индивидуальных времен
релаксации на спектральную релаксацию 4-АР. В работе [ 22] первоначаль-
ные потери энергии в пулевой момент времени связаны с образованием эк-
сиплексов, а более медленный сдвиг спектров - с общей релаксацией раст-
ворителя. Мазуренко изучил мгновенные и стационарные спектры 4-АР в
пропаноле и описал эти данные тремя временами спектральной релаксации.
При этом предполагалось, что каждое из времен релаксации соответствует
потере части полной энергии Av , обусловленной релаксацией раствори-
теля. Эти дйнные подставляли в следующее уравнение:
— — —
vm=v0O + AvS—---------	(8.8)

гДо rdi ~ индивидуальные времена диэлектрической релаксации.
Таблица В.1. Времена диэлектрической
релаксации спиртов [ 2б]

Спирт	Г, °C	т, нс		
		1	2	3
н-Пропанол	20	0,43	0,02	0,002
	40	0,29	0,02	0,002
н-Октаноп	20	1,78	0,04	0,003
	40	0,67	0,03	0,003

Для того чтобы проиллюстрировать сложности, которые могут возник-
нуть даже для случая простых растворителей, полезно рассмотреть диэлек-
трические свойства спиртов. Известно, что для пропанола есть три значения
времени диэлектрической релаксации. Типичные величины приведены в табл. 3.1
[26]. Самое большое значение слишком велико для вращения всей молекулы спир-
та в целом, и его приписывают вращению молекулы спирта, сопровождаемому
разрывом водородной связи. Среднее значение относят к вращательной диф-
фузии свободной молекулы спирта, а самое короткое время соответствует
вращению гидроксильной группы вокруг связи углерод—кислород. Исполь-
зуя эти времена корреляции, Мазурепко с соавторами отмстили хорошее со-
ответствие между наблюдаемыми в опыте и предсказанными положениями
максимумов испускания как для стационарных спектров, так и для мгновен-
ных спектров испускания. Однако, если принять во внимание неточную кор-
реляцию между измеренными значениями времен диэлектрической и спектраль-
ной релаксации [15, 23], описанное выше согласие теории с экспериментом
может быть случайным. Тем не менее полученные результаты показывают
чувствительность спектров испускания флуоресценции к слабым изменениям
физических свойств окружения, что, таким образом, свидетельствует о воз-
можности использования этих спектральных характеристик для исследования
свойств среды, окружающей флуорофор .*

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПРОЦЕССОВ РЕЛАКСАЦИИ, ОПИСЫВАЕМЫХ МОДЕЛЯМИ
ДВУХ СОСТОЯНИЙ И КОНТИНУАЛЬНОЙ, С ПОМОЩЬЮ МГНОВЕННЫХ СПЕКТРОВ
испускания. Де Тома и Бранд [ 27] показали,.что мгновенные спектры ис-

* См. также: Кузьмин М.Г., Садовский И.А. Исследование кинетики быстрых
реакций возбужденных молекул методом наносекундной импульсной флорометрии. ~
Химия высоких энергий, 1975, т. 9, № 4, с. 291. - Прим. ред.
пускания можно использовать для того, чтобы сделать выбор между моделя-
ми Двух состояний и континуальной в случае процессов релаксации одной if
той же молекулы в разных растворителях. Авторы использовали метод сче-
та единичных фотонов для измерения зависимости закона затухания флуорес-
ценции от длины волны. Из этих Данных были получены мгновенные спектры
испускания методом, описанным в разд. 3.5. Был исследован 2-анилинонаф-
талин, структура которого аналогична широко распространенным зондам TNS
и ANS и который сам использовался в качестве зонда при изучении физичес-
ких свойств мембран [ 28]. В циклогексане спектр испускания 2-AN сдвинут
в коротковолновую область и может иметь некоторую колебательную струк-
туру (см. рис. 7.12). Добавление небольших количеств полярного растворите-
ля этанола приводит к значительным спектральным сдвигам (см. рис. 7.7), ко-
торые были объяснены образованием водородных связей между этанолом и
возбужденной молекулой 2-AN.Были найдены два не зависящих от длины вол-
ны времени затухания флуоресценции 2-AN в циклогексане, содержащем 0,1 М
этанола, причем вклад каждого компонента в общую кривую затухания зави-
сит от длины волны испускания. При длинах волн, больших 395 нм, отмечено
отрицательное значение предэкспонснциальпого множителя. Как описано в гл. 12,
эти результаты соответствуют обратимой реакции, включающей два состояния,
когда время жизни для каждого из состояний не зависит от длины волны. На-
против, для 2-AN в глицерине как значения времен затухания, так и вклады
компонентов зависят от длины волны испускания, что указывает на более
сложный закон затухания.

Авторы отмечают, что в глицерине даже при максимально коротких вре-
менах максимум испускания 2-AN находится примерно там же, что и для рав-
новесного состояния, наблюдаемого для 2-AN в циклогексане с добавками
этанола (см. рис. 7.13). Такие потери энергии в глицерине, происходящие за
субпаносокундные времена, авторы приписали быстрому образованию ком-
плекса, спектр которого смешен в длинноволновую область. Безусловно, уже
в основном состоянии 2-AN может быть связан водородными связями с гли-
церином, а при возбуждении энергия водородной связи может измениться.
В любом случае релаксация растворителя, следующая за образованием ком-
плекса, происходит по экспоненциальному закону.

Как указывалось в разд. 8.2.3, полуширины мгновенных спектров испус-
кания должны оставаться постоянными в случае непрерывной релаксации и
должны зависеть от времени, если справедлива модель двух состояний. За-
висимость этих полуширин от времени изображена на рис. 8.14. Видно, что
они постоянны в глицерине, что согласуется с континуальной моделью. Та-
ким образом, континуальная модель может объяснить эту часть релаксации
растворителя, по, вероятно, непригодна для объяснения более быстрого про-
цесса образования комплекса. Как видно из данных для циклогексана, содер-
РИС. 8.14. Зависимость от времени полуширины спектров 2-анилинонафталина
[27].

Приведены данные длл 2-AN в глицерине и в циклогексане, содержащем 0,1 М
этанола.

жащего добавки этанола, полуширина сначала увеличивается, а затем умень-
шается. При коротких временах преобладает испускание незакомплексован-
ных молекул, а при более длительных временах - закомплексованных. При
промежуточных временах (*3 нс) видно испускание от обоих видов частиц,
благодаря чему спектр уширяется. Такая зависимость полуширины спектров
от времени согласуется с моделью двух состояний для спектральнрй релак-
сации. Эти результаты показывают возможности применения мгновенных спект-
ров испускания для детального изучения природы спектральной релаксации.

8.5.	Исследование релаксации растворителя методом изменения
времени затухания флуоресценции

Кинетику релаксации растворителя можно изучать не только методами
импульсной и фазово-модуляционной флуорометрии, но и влияя на время зату-
хания флуоресценции. Из уравнения (8.5) очевидно, что положение максиму-
ма стационарного спектра испускания флуорофора зависит от соотношения
между временем затухания флуоресценции т и временем спектральной релак-
сации ts . Мы показывали, каким образом можно изменить ts , варьируя тем-
пературу. Напротив, в растворе с постоянным значением т5 наблюдаемое
соотношение испускания из релаксированного и нерелаксированного состояний
можно изменять, варьируя среднее время затухания флуоресценции. Когда
оно много короче тя , преобладает испускание из нерелаксированного состо-
яния. Если же время жизни больше чем ts , преобладает испускание из ре-
лаксированного состояния.

Альтернативным методом измерения скоростей релаксации растворите-
ля является диффузионное тушение флуоресценции или тушение при столкно-
вениях. Как описано в гл. 9, тушение при столкновениях может вызываться
различными тушителями. В присутствии тушителя время затухания флуорес-
ценции уменьшается согласно уравнению

т= т0/(1 + /<[(?])	(8.9)

где т0 - время затухания в отсутствие тушения; К - константа тушения
при столкновениях; [ (Л — концентрация тушителя. Строго говоря, при рас-
чете т в присутствии тушителя необходимо различать константы статичес-
кого и динамического тушения (разд. 9.4). Для достаточно эффективного ту-
шения вязкость растворов должна быть сравнительно небольшой, чтобы ту-
шитель имел возможность быстро диффундировать. Метод тушения особен-
но полезен при исследовании биологических макромолекул. Это связано с
тем, что с его помощью можно измерять скорости релаксации, не меняя
температуру, поскольку в случае белков и мембран изменения температуры
сами по себе могут влиять па скорости релаксации. Еще одним преимущест-
вом метода, основанного па варьировании времени затухания, является то,
что достаточно проводить измерения лишь в стационарном состоянии в предполо-
жении, что т0 и А известны.

Особенно полезным для исследования релаксации растворителя методом
изменения времени затухания оказывается тушение флуоресценции кислоро-
дом. При этом можно варьировать время затухания в широком диапазоне,
лишь слегка меняя состав растворителя, так как в большинстве растворите-
лей небольшие полярные молекулы кислорода диффундируют быстро. Кроме
того, кислород очень хорошо растворим в органических растворителях и пред-
ставляет собой эффективный тушитель при столкновениях с флуорофором. Все
это позволяет получить большой набор времени затухания. Например, время
затухания флуоресценции индола в обескислороженном этаноле составляет
5 нс. При уравновешивании с давлением кислорода 100 атм время затухания
уменьшается до ~0,036 нс [29]. Использование легко воспламеняющихся раст-
ворителей при повышенном давлении кислорода представляет собой некоторую
опасность, поэтому не рекомендуется проводить соответствующие опыты без
принятия надлежащих мер безопасности. Поскольку время затухания, получен-
ное при тушении, сравнимо с ожидаемым временем диэлектрической релакса-
ции этанола, из уравнения (8.5) можно предсказать коротковолновый сдвиг
стационарного спектра испускания.

Стационарные спектры испускания потушенного кислородом индола изо-
бражены па рис. 8.15. При постепенном тушении флуоресценции кислородом
действительно наблюдаются ожидаемые коротковолновые сдвиги. Если пред-
положить, что франк-кондоновское состояние аппроксимируется спектром
испускания индола в додекане (максимум испускания при 302 нм), а центр тя-
жести спектра однозначно определяется положением его максимума, можно
рассчитать, что время спектральной релаксации в этаноле при 25 °C будет
равно 13 нс.
Длина волны, нм

РИС. 8.15. Спектры испускания индола в этаноле при 25°С с различными време-
нами затухания флуоресценции: 5 нс, 106 пс и 36 пс соответственно равновесию с
давлением кислорода 0, 3,34 и 10,15 Ша.

(С разрешения авторов работы [ 29] И Elsevier Biomedical Press.)

Спектры испускания флуоресценции с различными временами затухания,
полученные методом тушения кислородом, использовали также для того, что-
бы следить за быстрой переориентацией молекул в возбужденном состоянии
[30]. 2-Метил-4-диметиламинобензонитрил (MDB) испускает двойную флуорес-
ценцию: полоса высокой энергии соответствует изомеру, в котором метильные
группы копланарны ароматическому кольцу, а полоса низкой энергии - изоме-
ру, в котором неподеленная пара электронов аминогруппы коплапарна коль-
цу. После возбуждения происходит быстрая перегруппировка молекулы MDB
в последний из изомеров, испускание которого и преобладает в непотушенном
растворе благодаря быстрой переориентации. При тушении избирательно ту-
шится флуоресценция именно этого изомера, что приводит к увеличению отно-
сительной интенсивности испускания изомера с копланарными метильными груп-
пами. Используя эти относительные интенсивности, Роткевич и др. [30] опре-
делили, что переориентация, связанная со скручиванием, происходит за время
11 пс. Таким образом, видно, что с помощью спектров, полученных измене-
нием времени затухания, можно получить информацию о процессах релакса-
ции в субнаносекундном временном диапазоне. Такую быструю релаксацию
обычно нельзя наблюдать, исследуя кинетику затухания флуоресценции, в пер-
вую очередь потому, что возбуждающая вспышка имеет конечную длительность
(обычно 2 нс), а также из-за временного разрешения фотоумножителей.
8.6.	Анализ релаксации растворителя методом фазочувствительной
регистрации флуоресценции

В качестве последнего метода исследования релаксации растворителя
мы опишем использование фазочувствительной регистрации флуоресценции
(ФЧРФ) (гл. 4). В настоящее; время появилось лишь несколько таких исследо-
ваний, а применение ФЧРФ Для изучения процесса релаксации растворителя
еще только начинается, /(ля иллюстрации применения метода мы приводим
данные для \-ацетил-1,-тринтофанамида в пронилепгликоле [ 6|. Эта система
была выбрана как модель флуоресценции триптофана в белках. На рис. 8.2
были показаны спектры стационарной флуоресценции NATA. При высоких
температурах (40 °C) максимум испускания находится при 350 им. При пони-
жении температуры максимум испускания сдвигается в сторону более корот-
ких длин волн, и при -68 °C он находится при 325 нм. При промужуточпых тем-
пературах (-30 °C) спектр также занимает промежуточное положение с мак-
симумом при 336 им. Низко- и высокотемпературные спектры можно рассматри-
вать как принадлежащие /'- и //-состояниям соответственно. Анализ спектров,
приведенных на рис. 8.2, показывает, что "нерелаксировшшое" испускание; пре-
обладает в спектре с максимумом при 310 им, а "релаксированное" - при410нм.

Напомним, что с помощью метода ФЧРФ можно подавить флуоресценцию
с любым фазовым углом (гл. 4). В рассматриваемом случае метод фазочувст-
витсльной регистрации флуоресценции использовали, чтобы раздельно подав-
лять флуоресценцию при 310 и при 410 им. Из зависимости стационарных спект-
ров от температуры было показано, что испускание на этих длинах воли соот-
ветствует нсролаксированпому и релаксированному состояниям. Подавления
испускания добивались, подбирая фазовый угол детектора так, чтобы он отли-
чался на 90° от фазы испускания.

Фазочувствитсльные спектры NATA в пронилепгликоле приведены на
рис. 8.16. При-68 °C подавление фазы либо для 310 нм, либо для 410 нм при-
водит к полному подавлению испускания. Это связано с том, что при -68 "С
испускание происходит только из перелаксированпого состояния, а время жиз-
ни этого состояния не зависит от длины волны. При повышении температуры
подавление фазы для 310 и 410 нм приводит к появлению фазочувствитель-
пых спектров с максимумами испускания вблизи 350 и 330 пм соответствен-
но. Относительная интенсивность коротковолновой компоненты преобладает
при более низких, температурах, а длинноволновой - при более высоких тем-
пературах (рис. 8.16). Эти фазочувствитольные спектры авторы приписали
испусканию из перелаксироваппых и релаксированных сольватов молекул
NATA . При более высоких температурах подавление фазы либо для 310, либо
для 410 пм опять приводит к полному исчезновению спектра испускания. При
высоких температурах растворитель релаксирует практически полностью и
испускание в первую очередь происходит из релаксированного состояния, вре-
мя жизни которого также не зависит от длины волны.

Заслуживает упоминания высокое значение отношения сигпал/шум в фа-
зочувствительных спектрах. Такая чувствительность хорошо иллюстрирует-
ся разрешением, полученным при 20 °C, т-е. при той температуре, когда ре-
лаксация почти полная. Тем не менее спектральную компоненту, соответст-
вующую нерелаксированному состоянию, все еще можно увидеть. Следова-
тельно, этот способ, вероятно, будет полезен при изучении релаксационных
процессов в биологических макромолекулах.

Длина Волны, нм

РИС. 8.16. Фазочувствительные спектры флуоресценции Г<-ацетил-Ь-триптофан-
амида в пропиленгпикопе [ б].

При каждой температуре интенсивность совпадающей по фазе флуоресценции при
360 нм нормирована к единице. Длины волн, выбранные для подавления фазы, показа-
ны стрелками на рис. 8.2. (С разрешения American Society for Photobiology.)
8.7.	Анализ спектральной релаксации в модельных
мембранах и белках

Поглощение света флуорофором приводит к мгновенному изменению элек-
тронной плотности и Дипольного момента. Если флуорофор присоединен к бел-
ку или мембране, макромолекула подвергается небольшим, но заметным воз-
мущениям. После возбуждения может происходить релаксация макромолекулы
вокруг возросшего дипольного момента возбужденного флуорофора. Динами-
ческие свойства макромолекулы тесно связаны со скоростью спектральной ре-
лаксации, которая отражает способность макромолекулы реагировать па мгно-
венное возмущение. Флуорофор может быть частично погружен в растворитель,
и поэтому свойства поверхности раздела макромолекула — растворитель также
могут оказывать влияние на скорости спектральной релаксации. В следующих
разделах мы обсудим примеры зависящих от времени спектральных сдвигов, ко-
торые наблюдались для флуорофоров, связанных с белками или мембранами. В
настоящее время в литературе имеется относительно немного сообщений на эту
тому, причем большинство зависящих от времени спектральных сдвигов было
измерено для флуорофоров, связанных с мембранами. Для оценки времен спект-
ральной релаксации использовались все описанные ранее методы: импульсный
и фазово-модуляционный, а также метод изменения времени затухания флуорес-
ценции и фазочувствительный.

8.7.1.	Мгновенные спектры испускания меченых мембран

Бранд с сотр. [ 17] детально изучили фосфолипидные везикулы, меткой
для которых служила 2-л-толуидинил-6-нафталинсульфоновая кислота (TNS).
Молекула TNS отрицательно заряжена, и поэтому можно ожидать, что она бу-
дет локализоваться на поверхности раздела липид/вода двойного слоя. Типич-
ная зависимость интенсивностей мгновенных спектров приведена на рис. 8.17.
На коротковолновом краю спектра (390 нм) кажущееся время затухания было
довольно коротким (~1 нс). При увеличении длины волны наблюдения оно воз-
растало до -6 нс при 435 нм. Мы говорим об этих временах как о кажущихся,
поскольку они но описывают затухания полного испускания. Было найдено, что
закон затухания всей флуоресценции - мпогоэкспоненциальный [17]. На длин-
новолновом краю спектра испускания интенсивность свечения сначала возрас-
тала, а затем затухала обычным образом. Этот эффект согласуется с обеими
моделями релаксации: континуальной и двух состояний [14, 31]. Независимо
от типа релаксации отрицательный предэкспонепциальный множитель свидетель-
ствует о том, что испускание при 530 нм, по крайней мере частично, опреде-
ляется процессами, протекающими в возбужденном состоянии. Одним из них,
вероятно, является релаксация мембраны вокруг возбужденного диполя TNS .

Аналогичные данные, но для большого числа длин волн были использованы
для построения мгновенных спектров испускания. Методика была описана в
разд. 3.5. По существу, формируют ряд данных по импульсным функциям от-
клика при различных длинах волн испускания. Характерный набор данных по-
казан на рис. 8.18 [32]. Если внимательно рассмотреть этот рисунок, можно
РИС. 8.17. Флуоресцентные импульсные функции отклика TNS, связанной с ве-
зикулами яичного лецитина [ 171.

Зависимость интенсивности от времени приведена для 390, 435 и 530 нм.

РИС. 8.18. Зависимость интенсивности флуоресценции TNS, связанной с везику-
лами яичного лецитина, от времени и от волнового числа [ 32].
заметить, что флуоресценция при 340 им (25,64’10”5 см*4) затухает быстрее,
чем при 530 нм (18,87* 10~3см”1). Отчетливо виден также начальный рост ин-
тенсивности при 530 им.

Зависящие от времени сдвиги спектров яснее видны из нормированных
мгновенных спектров испускания (рис. 8.19). Опи построены с использованием
данных по зависимости интенсивности от длины волны для одного и того же
момента времени с последующей нормировкой этих величин до одинаковой ин-
тенсивности в максимуме спектров. Мгновенные спектры испускания, изобра-
женные на рис. 8.19, согласуются с моделью непрерывной релаксации, соглас-
но которой спектральное распределение и полуширина не меняются со време-
нем. Бранд с сотр. не смогли подобрать для зависящих от длины волны им-
пульсных функций отклика два не зависящих от длины волны времени зату-
хания флуоресценции, как это удалось сделать для 2-апилипонафталина в
циклогексане, содержащем 0,1 М этанола. Существование двух не зависящих
от длины волны времен затухания характеризует реакцию, включающую два
возбужденных состояния. Таким образом, эти данные не подтверждают мо-
дель двух состояний для релаксации мембраны. Более того, было обнаружено,
что полуширина полосы испускания пе зависит от времени (рис. 8.20), что так-
же согласуется с моделью непрерывной релаксации, а пе с моделью двух сос-
тояний.

Зависящие от времени спектральные сдвиги использовали для оценки вре-
мени спектральной релаксации, т.е. величины, которая должна была отражать
динамические свойства модельных мембран. Значения этих времен были полу-
чены из скорости смещения максимума спектра испускания в длинноволновую
область (рис. 8.20). Найдено, что увеличение температуры приводит к умень-
шению времен релаксации, что свидетельствует о понижении жесткости мем-

РИС 8.19. Мгновенные спектры испускания TNS, связанной с везикулами яичного
летицина [ 17]. 

Приведены спектры, записанные через 1, 3 и 12 нс после момента возбуждения.
РИС. 8.20. Зависимость от времени максимума испускания и полуширины полос
испускания для TNS, связанной с везикулами яичного лецитина [ 17].

бранного окружения. Важно, что спектральная релаксация наблюдается фак-
тически. В случае очень вязких или очень жидких мембран нельзя было бы
ожидать появления зависящих от времени спектральных сдвигов. Следователь-
но, на основании этих результатов можно сделать вывод, что области мем-
бран, представляющие собой поверхность раздела липидная фазд/вода, име-
ют по крайней мере одно характеристическое время диэлектрической релак-
сации в наносекундной области. Полученные результаты не исключают нали-
чия других, более медленных или более быстрых процессов релаксации.

8.7.2.	Фазово-модуляционные измерения спектральной
релаксации в мембранах

Методы измерения фазовых сдвигов и степени демодуляции флуорес-
ценции также были использованы для регистрации зависящих от времени
спектральных сдвигов в меченых мембранах [33]. Таких данных значитель-
но меньше, чем результатов, полученных импульсным измерением кинети-
ки затухания, по в основном оба метода согласуются между собой. На рис. 8.21
изображены графические зависимости кажущихся фазовых гР и модуляци-
онных т171 времен затухания флуоресценции для TNS, растворенного в гли-
церине и связанного с везикулами диолеил-ь-а-фосфатидилхолина. Было най-
дено, что на длинноволновом краю спектра испускания тР > тт. Это соот-
ветствует появлению члена с отрицательным предэкспоненЦиальным множи-
телем в законе затухания (см. рис. 8.17) и свидетельствует о том, что про-
РИС. 8.21. Графические зависимости времен затухания от длины волны и спект-
ры флуоресценции TNS [ ЗЗ].

Кажущиеся значения фазовых и модуляционных времен затухания измерены при
30 МГц. Сплошной линией показаны нормированные спектры испускания TNS в
глицерине и связанного с везикулами ВОРС, штриховой — TNS в риоксане при 25 "С.

цесг, протекающий в возбужденном состоянии, по крайней мерс частично, яв-
ляется причиной испускания с длинами волн '•> 500 пм. Гетерогенность ос-
новного состояния может также проявиться в зависимости вромон затухания
от длины волны, однако в этом случае т*1 всегда будет меньше, чем тт
(гл. 12). Таким образом, фазовые и модуляционные данные свидетельствуют
о том, что протекает процесс в возбужденном состоянии и что зависимость
времен затухания от длины волны не обусловлена присутствием смеси флу-
орофоров в разных состояниях с разными временами затухания. Отметим,
что в зтаполо не наблюдалась зависимость вромон затухания от длины волны
поскольку в этом растворителе релаксация происходит намного быстрое, чем
испускание. То же наблюдается в неполярном диоксапо, где пет заметной ре-
лаксации.

17-413
8.7.3.	Спектры испускания с различными временами затухания
флуоресценции, полученные для меченых мембран

В двух предыдущих разделах были обсуждены зависящие от времени
спектральные сдвиги для связанных с мембранами флуорофоров, полученные
как импульсным, так и фазово-модуляционным методами. По спектрам ис-
пускания с различными временами затухания, наблюдаемым при тушении флу-
оресценции кислородом, можно количественно оценить скорости релаксации
другим способом. Путем тушения можно уменьшить время жизни возбужден-
ного состояния, что приведет к понижению среднего времени релаксации раст-
ворителя [ уравнение (8.5)]. На рис. 8.22 приведены стационарные спектры образцов с
потушенной и непотушенной флуоресценцией, представляющих собой помеченные
T.NS мембраны. Видно, что при уменьшении среднего времени затухания от
6,7 до 0,53 нс стационарные спектры смещаются на 13 нм в сторо-
ну коротких длин волн. Тушение флуоресценции происходит при случайных
столкновениях молекул TNS и кислорода- С большей вероятностью тушению
подвергаются те молекулы, которые дольше находятся в возбужденном сос-
тоянии. Большее время затухания имеют те флуорофоры, окружение которых
отрелаксировало более полно. Наличие процесса тушения селективно препят-
ствует возможности наблюдения флуоресценции таких сильнее отрелаксиро-

РИС. 8.22и Графическая иллюстрация влияния тушения кислородом на спектры
испускания флуоресценции везикул смеси DMPC+ холестерин (3 : 1), помеченных
TNS [34].

Вертикальными сплошной и штриховой линиями отмечены центры тяжести спект-
ров испускания (V ) в нанометрах. (С разрешения American Chemical Society.)
Время затухания флуоресценции , нс

РИС. 8.23. Мгновенные положения центров тяжести спектров испускания ве-
зикул смеси DMPC + холестерин [ 34].

(С разрешения American Chemical Society.)

вивших флуорофоров. В результате этого спектр испускания смещается в сто-
рону коротких длин воли.

Зависящие от времени затухания спектры можно использовать для изме-
рения времен спектральной релаксации (рис. 8.23). Сплошными линиями, про-
веденными через экспериментальные точки, показано наилучшос совпадение,
полученное при использовании уравнения (8.5). Интересно отметить, что все
времена релаксации попадают в узкий интервал 8,6 - 0,46 нс в зависимости
от химической структуры мембран. Более того, в данном случае зависимость
времен спектральной релаксации от температуры менее ярко выражена, чем
температурная зависимость анизотропии флуоресценции. г)то, вероятно, свя-
зано с различием молекулярных процессов, необходимых для деполяризации
флуоресценции и для спектральной релаксации. Кроме того, молекула TNS ло-
кализована на поверхности раздела липидная фаза/вода в мембране. Напро-
тив, типичные зонды микровязкости локализованы на жирных цепочках мем-
бран-

8.7.4.	Спектральная релаксация в меченых белках

Изучению процессов спектральной релаксации it белках посвящено гораз-
до меньше работ, чем -мембранам, к тому же эти работы охватывают меньшее
число проблем. Приведем краткий обзор полученных результатов- Бранд с сотр-
измерили законы затухания флуоресценции TNS, связанной с бычьим сыворо-
точным альбумином [ 35] и с апомиоглобином [36]. В последнем случае пред-
полагалось, что зонд локализован в неполярной небелковой области, недоступ-
ной для внешнего растворителя [37]. В обоих случаях были построены мгно-
венные спектры испускания, и было обнаружено, что спектры испускания сме-
щаются в длинноволновую область, при увеличении промежутка времени после
момента возбуждения. Ни в одном из случаев не появились члены, содержащие
отрицательные предэкспопенциальные множители, - вероятно, по причине пе-
рекрывания спектров, соответствующих различным состояниям. Впоследствии
Для апомиоглобина, меченного TNS , было показано, что причиной зависимос-
ти времен затухания от длины волны являются реакции в возбужденных сос-
тояниях [ 38]. Найдено, что на длинноволновом краю спектра испускания
zn,/cos<p > 1 •

Зависимость времен затухания от длины волны часто наблюдается для
триптофановых остатков белковых молекул. В одном случае наблюдался член
с отрицательным предэкспоненциальным множителем. Однако вклад в зависи-
мость времен затухания белков от длины волны обусловливает также гетеро-
генность основного состояния. Подробнее эти результаты будут обсуждены
в гл.11.

Задачи

8-1 .На рис. 8.24 приведены данные для 2-ацетилантрацена в глицерине: темпе-
ратурная зависимость максимума спектра испускания (кривая 1) и разность фазовых
углов А<р между коротковолновой и длинноволновой частями спектра (кривая 2).

а)	Объясните ход температурной зависимости vmax »

б)	Объясните ход температурной зависимости Аф.

РИС. 8.24. Максимумы испускания и разности фаз для 2-ацетилантрацена в гли-
церине [ 21].

1 - температурная зависимость положения максимумов испускания; 2 - разность
фазовых углов между коротковолновой и длинноволновой частями спектра испуска-
ния. частота модуляции 12,6 МГц.
в)	В предположении, что на измеряемые величины Аф перекрывание спектров не
влияет, объясните, что представляет собой собственное время жизни состояния
R (тот?)1 то/? ~ вРемя жизни релаксированного состояния, когда оно было получено
при непосредственном возбуждении. Более полное определение приводится в гл. 12.

8-2. Используйте данные рис. 8.17 для расчета времени спектральной релакса-
ции мембран, меченных TNS. Предположите, что при 390 нм преобладает испускание
из исходного возбужденного состояния F и что испускание при 435 нм представляет
собой полное испускание, не затронутое релаксацией.
ГЛАВА9.

Тушение флуоресценции

Тушением флуоресценции называют любые процессы, которые умоныип
ют интенсивность флуоресценции данного вещества. К тушению может прово-
дить множество процессов, в том числе реакции в возбужденном состоянии,
перенос энергии, образование комплексов и тушение при столкновениях. Эта
глава посвящена главным образом тушению, связанному со случайными столк-
новениями между флуорофором и тушителем, которое называется динамичес-
ким, или тушением при столкновениях. Мы также рассмотрим статическое ту-
шение, которое связано с образованием комплекса. Статическое тушение час-
то является осложняющим фактором в анализе динамического тушения. В до-
полнение к процессам, упомянутым выше, может встречаться кажущееся ту-
шение вследствие оптических свойств образца. Например, высокая оптическая
плотность или мутность могут приводить к уменьшению интенсивности флуо-
ресценции. Это тривиальный тип тушения, который несет мало информации о
молекулярных процессах. В данной главе предполагается, что не эти триви-
альные эффекты определяют наблюдаемые изменения интенсивности флуоре-
сценции.

Тушение флуоресценции широко изучено как в теоретическом аспекте,
таки в приложении флуоресценции к биохимическим проблемам, причем при-
ложения связаны со свойствами процесса тушения. Для тушения (и статичес-
кого, и динамического) требуется контакт между молекулами флуорофора и
тушителя. В случае динамического тушения тушитель должен диффундировать
к флуорофору в течение времени нахождения в возбужденном состоянии. В
результате контакта флуорофор возвращается в основное состояние без излу-
чения фотона. В случае статического тушения между флуорофором и тушите-
лем* образуется комплекс, который не флуоресцирует. В любом случае, что-
бы произошло тушение, флуорофор и тушитель должны контактировать. Это -
основное требование, которое проявляется в различных приложениях тушения.
Например, измерением тушения можно выявить доступность флуорофоров для

*

В основном состоянии, до поглощения возбуждающего флуоресценцию фотона.
— Прим. ред.
тушителей. Если данный растворитель очень вязок, то диффузия замедляется
и тушение ослабевает. Следовательно, изучив тушение, можно определить
скорости диффузии тушителей. Предположим, флуорофор связан либо с бел-
ком, либо с мембраной. Если белок или мембрана непроницаемы для тушите-
ля и флуоро фор локализован внутри макромолекулы, то не может быть пи дина-
мического, пи статического тушения. Исходя из этих соображений, тушение
можно использовать для выяснения локализации флуорофоров в белках и мем-
бранах и их проницаемости для тушителей.

Другой важный аспект динамического тушения - увеличение объемов и
расстояний в растворе, влияющих на экспериментальные данные, которыми
являются интенсивность или время затухания флуоресценции. Среднеквадра-
тичное смещение (Дх2)'72, па которое тушитель может продиффундировать
за время жизни возбужденного состояния т, составляет (Дх2) =: 2/)т, где
D - коэффициент диффузии. Рассмотрим молекулу кислорода в воде при
25°С (D = 2,5 < Ю"5 см2/с). В течение типичного времени затухания флуоре-
сценции (4 нс) молекула кислорода может нродиффундировать на 44 X.
Если время затухания длительнее, может наблюдаться диффузия на еще. боль-
шие расстояния. Например, для времен затухания 20 и 100 нс средние рассто-
яния диффузии кислорода составляют 100 и 224 X соответственно. Так как
одного диффузионного столкновения с кислородом достаточно для тушения
большинства флуорофоров, измерение тушения флуоресценции выявляет диф-
фузию тушителей па сравнительно больших расстояниях. Эту ситуацию можно со-
поставить с релаксацией растворителя. Спектральные сдвиги, связанные с
переориентацией молекул растворителя, определяются главным образом соль-
ватной оболочкой, непосредственно соседствующей с флуорофором.

9.1.	Тушители фпуоресценции

Изучению тушения благоприятствует то, что многие вещества действуют
как тушители флуоресценции. Один из наиболее известных динамических ту-
шителей - молекулярный кислород [ 1 ], который тушит флуоресценцию почти
всех известных флуорофоров. Чтобы получить достоверные значения кванто-
вых выходов или времен затухания флуоресценций, для многих образцов часто
бывает необходимо удалить растворенный кислород. Механизм, по которому
кислород тушит флуоресценцию, был предметомлйногочисленных исследований,
и в настоящее время ясно, что для тушения необходим контакт между моле-
кулами кислорода и флуорофора. Ароматические и алифатические амины - эф-
фективные' чушители для ’флуоресценции большинства незамещенных аромати-
ческих углеводородов [ 2]. Например, флуоресценция антрацена эффективно
тушится диэтиланилипом. В этом случае тушение происходит за счет образе-
вания комплекса с переносом заряда*. Флуорос|х>р в возбужденном состоянии
акцептирует электроны амина. В неполярных растворителях часто наблюдает-
ся флуоресценция комплекса о, переносом заряда (эксиплекса), и этот процесс
можно рассматривать как ре акцию в возбужденном состоянии, а не как туше-
ние. [3 полярных растворителях излучение эксиплекса обычно потушено, так
что взаимодействие флуоро<]х>р - амин проявляется как истинное тушение.
Другие диффузионные тушители: ксенон ( .4], пероксид водорода ( 4], акрил-
амид [51, ВгО~]6], Т“[7], оксид диазота, нитрометан [ 8], питроксиды
[9, 10]. Тушителями являются даже некоторые олефины [ 11 - 13] и стериче-
ски затрудненные насыщенные углеводороды [ 14].. Например, а-цианопафта-
лип тушится некоторыми олефинами. В дополнение к вышеперечисленным со-
единениям в качество диффузионных тушителей можно назвать многие, гало-
генсодержащие вещества: хлороформ, три хлор от анол [ 15], бромбепзол [ 16],
хлорид метилртути [ 17] и различные соединения, содержащие более одного
атома хлора [ 18]. Тушение тяжелыми галогенами, такими, как бромид и ио-
дид, может быть результатом интеркомбинациошюй конверсии в триплетное
состояние, ускоряющейся за счет спин-орбитальпого взаимодействия возбуж-
денного в синглетном состоянии флуорофора и галогена [ 19 ]. Так как испус-
кание из триплетного состояния медленное, то оно сильно тушится другими
процессами. Однако для хлор содержащих веществ механизм тушения, вероят-
но, другой. Индол, карбазол и их производные уникально чувствительны к ту-
шению хлорированными углеводородами [ 18] и акцепторами электронов, та-
кими, как протоны, гистидин, цистеин, NO” фумарат, Cu2+, РЬ24, Cd2+ и
Мп24' [20]. Тушение этими веществами, вероятно, включает перенос электро-
на от флуорофора па тушитель. Кроме этого, индол, триптофан и их произ-
водные тушатся сукцинимидом, дихлорацетамидом, гидрохлоридами пиридина и
имидазола, метионином, Eu3l\ Ag+ и Cs+ [ 21 ]. Следовательно, множество
тушителей пригодно для изучения флуоресценции белков, в особенности при
рассмотрении поверхностной доступности триптофановых остатков и проницае-
мости белков для тушителей.

Тушителями могут быть также пурины, пиримидины [ 22, 23], N-метилни-
котипамиды и N-ал кил пиридиниевые и пиколиниевыо соли [ 24, 25]. Например,
флуоресценция флавинадениндинуклеотида (FAD) и восстановленного пикотин-
амидадениндинуклсотида (NADH) тушится адениновой частью молекулы. Ту-
шение флуоресценции флавина происходит вследствие как статических, так и
динамических процессов, в то время как тушение дигидропикотинамида явля-
ется в основном динамическим. Тги ароматические соединения проявляют * В

*

В возбужденном электронном состоянии. - Прим. ред.
склонность к образованию комплексов с переносом заряда, что и вызывает ту-
шение флуоресценции. В зависимости от точной структуры изучаемых соеди-
нений внутримолекулярный комплекс в основном состоянии может быть доста-
точно устойчивым,. Вследствие, этого в FAD и NADH часто наблюдается и ди-
намическое, и статическое тушение.

Из-за того, что многие вещества могут действовать как тушители, часто
можно легко подобрать комбинацию флуорофор — тушитель для решения по-
ставленной задачи. Важно отметить, что пе все флуорофоры тушатся любыми
перечисленными выше веществами. Тгот факт иногда можно использовать для
селективного тушения определенного флуорофора. Эффект тушения зависит
от его механизма, обусловленного структурой индивидуальных молекул. Дк-
тальный анализ механизма тушения сложен. В этой главе мы займемся глав-
ным образом природой явления, т.е. выяснением того, является ли природа
тушения динамической или статической. В последней части главы будет приве-
дено несколько наиболее информативных биохимических приложений эффекта
тушения.

9.2.	Теория динамического тушения

Динамическое тушение флуоресценции описывается уравнением Штерна -
Фоль мера:

F /F- 1 + k т IQ1 . 1 + К [Q] .	(9.1)

О'	(] о	ДИН 4-	'	'

где F и F - интенсивности флуоресценций в отсутствие' и в присутствии ту-
шителя соответственно; - биомолекулярная константа скорости тушения;

tq - время затухания флуоресценции в отсутствие тушителя; [Q] концент-
рация тушителя; К -	- штерп-фольмеровская константа тушения, Дан-

ные Ио тушению обычно представляют в координатах F /F от [Q]поскольку
F /F, как ожидается, должно линейно зависеть от концентрации тушителя.
График дает отсекаемый отрезок на оси у, равный единице, и наклон, равный
А’ (рис. 9.1). Полезно отметить, что равна концентрации тушителя,
при которой F /F = 2, т.е. тушится 50% интенсивности флуоресценции. Прямо-
линейная зависимость в координатах Штерна - Фольмсра обычно указывает
па существование в растворе одного типа флуорофоров, одинаково доступных
для тушителя .Если присутствуют два типа флуорофоров и один из них недо-
ступен для тушителя, то штерн-фольмеровский график отклоняется от линей-
ности в сторону оси х. Такой результат часто встречается при тушении флу-
оресценции триптофана в белках полярными или заряженными тушителями.
Эти молекулы с трудом проникают внутрь гидрофобных белков и тушат толь-
ко остатки триптофана на поверхности белка.
Динамическое тушение

Статическое тушение

(F-Q)*

ftt)

РИС. 9.1. Сопоставление динамического и статического тушения.

I

без испускания
бсг I

Важно знать, что линейность, наблюдаемая в координатах Штерна - Фоль-
мера, еще ие доказывает, что происходит динамическое тушение флуоресцен-
ции. В последующих разделах (разд. 9.3) будет показано, что статическое
тушение также дает прямую линию в координатах Штерна - Фольмора. В об-
щем случае различить статическое и динамическое тушение можно но их за-
висимости от температуры и вязкости или, что более предпочтительно, но из-
мерению времени затухания флуоресценции.

9.2.1.	Вывод уравнения Штерна — Фольмера

Уравнение Штерна - Фольмера может быть выведено несколькими спо-
собами. Прежде всего рассмотрим интенсивность флуоресценции в отсутст-
вие и в присутствии тушителя. Интенсивность флуоресценции, наблюдаемая
для флуорофора, пропорциональна его концентрации в возбужденном состоя-
нии F*. При непрерывном облучении устанавливается стационарная концент-
рация возбужденных флуорофоров и, следовательно, d'[F*] /dt = 0. В отсут-
ствие и в присутствии тушителя дифференциальные уравнения, описывающие
F* представляются в виде

d[F*]/dt -f(t)- r[F*]o=.0	(9.2)

F*]/dt ~ f (t) ~ (Г f kq[Q]) [ F*J = 0	(9.3)

где f (t) - постоянная функция возбуждения флуоресценции, которая легко
исключается из этих уравнений. Г == т'1 представляет собой константу ско-
рости дезактивации флуорофора в отсутствие тушителя. Из уравнений (9.2) и
(9.3) получаем уравнение Штерна - Фольмера

"р “ г----------- ‘ 1 * VofQ1	<9Л)

Это уравнение может быть также выведено путем рассмотрения доли воз-
бужденных флуорофоров, дезактивирующихся путем излучения, по отношению
к общему числу возбужденных флуорофоров. Доля Fq/F определяется отноше-
нием скорости затухания Г флуоресценции к общей скорости затухания в при-
сутствии тушителя (Г t k [ Q ]):

F [-	।

" ' ™ “‘ч	III п , -	.... ... Д.ФИШЧ|!»Ч>Д«ЧЧИ| и.™	( )

1*Кяин[01

Это выражение также является уравнением Штерна - Фольмера.

Так как динамическое тушение - конкурирующий процесс, который дез-
активирует возбужденное состояние, время затухания в отсутствие (т ) и в
присутствии (т) тушителя дается выражениями

т0 „.Г-1; Т. (Г + ^101)-’	(9.6), (9.7)

и,следовательно, tq/t = 1 + A^tJQ].	(9.8)

Последний вывод иллюстрирует важную характеристику динамического туше-
ния, которая состоит в одинаковом уменьшении интенсивности и времени за-
тухания флуоресценции (рис. 9.1):

(9-9>

Уменьшение времени затухания происходит из-за того, что тушение представ-
ляет собой дополнительный конкурирующий процесс, дезактивирующий возбуж-
денное состояние без испускания флуоресценции, что ведет к уменьшению
квантового выхода. Благодаря этим ценным свойствам тушение при столкно-
вениях используют для контроля времени затухания с последующим определе-
нием природы наносекундпой кинетики затухания анизотропии (разд. 6.4) или
временной зависимости релаксации растворителя (разд. 8.5).

9.2.2.	Интерпретация бимолекулярной константы
скорости тушения

Частота столкновений флуоро фора с тушителем дается выражением

Z AJOJ	(9.10)
где kQ - диффузионно-контролируемая бимолекулярная константа скорости,
которая может быть вычислена по уравнению Смолуховского:

4tt/V

k = 4rrRDJV/1000 = -----(R +R)(Df + D)	(9.11)

0	1000 f q f q

где R - радиус столкновения; D - сумма коэффициентов диффузии флуоро-
фора (О?) и тушителя (D^); N - число Авогадро. Радиус столкновения обыч-
но принимается равным сумме молекулярных радиусов флуорофора (Ji?) и ту-
шителя Вывод этого выражения будет рассмотрен более подробно в
разд. 9.7. Уравнение описывает диффузионный поток молекул с коэффициен-
том диффузии D через поверхность сферы радиуса Я. Фактор 1000 необходим
для соблюдения размерности в тех случаях, когда концентрация выражена в
молях на литр: умножением на (N/1000) молярность пересчитывают в молеку-
лы/см3.

Частота столкновений связана с бимолекулярной константой скорости ту-
шения через эффективность тушения у:

= Г*о	(9.12)

Например, если у = 0,5, то только 50% диффузионных столкновений приводят
к тушению и Л должно быть равно /<о/2. Так как kQ определяется с доста-
точной точностью, наблюдаемое значение k может быть использовано для
оценки эффективности тушения. У тушителей, подобных кислороду и I " эф-
фективность обычно близка к единице , а у более легких галогенов меньше.
Эффективность тушения аминами зависит от восстановительного потенциа-
ла флуорофора, флуоресценция которого должна быть потушена, что и сле-
дует ожидать для реакций с переносом заряда.

Эффективность тушения может быть рассчитана па осяюво наблюдаемо-
го значения к , если известны коэффициенты диффузии и молекулярные ра-
диусы. Радиусы можно найти из молекулярных моделей или молекулярных
масс и плотностей исследуемых веществ. Коэффициенты диффузии моЯшо вы-
числить по уравнению Стокса - Эйнштейна:

D = АТ/бттт]/?	(9.13)

где k - константа Больцмана; д - вязкость растворителя. Часто при расчен1
тах но уравнению Стокса - Эйнштейна недооцениваются коэффициенты диф-
фузии малых молекул. Например, для тушения кислородом флуорофоров, раст-
воренных в различных спиртах, было вычислено, что эффективность тушения
составляет 2 - 3 [ 26].. Столь невероятно большие значения были получены
потому, что коэффициент диффузии кислорода на самом деле в несколько раз
больше, чем предсказываемый уравнением (9.13). Это уравнение описывает
диффузию молекул, по размерам превышающих молекулы растворителя, ио-
атому оно неприменимо для кислорода в этаноле. Коэффициенты диффузии
можно также получить из номограмм, основанных на термодинамических и
физических свойствах систем I 27 ]., Одна такая номограмма показана на
рис. 9.26. Если коэффициенты диффузии известны, то бимолекулярную кон-
станту скорости тушения для у 1 можно предсказать, используя уравнение
Смолуховского [(9.11)].

Поучительно обсудить типичные! значения k и концентрации тушителя,
необходимые для проявления заметного тушения. Рассмотрим тушение трип-
тофана кислородом [28].. При 25°C коэффициент диффузии кислорода в воде
составляет 2,5 • 10“6 см2/с, а триптофана - 0,66 • ,10“Б см2/с. Если при-
нять радиус столкновения равным 5 А, то подстановка в уравнение (9.11) да-
ет k к 1,2 . 101 0 М~1 . с~1. Наблюдаемое значение константы Штерна - Фоль-
мера для тушения кислородом составляет 32,5 М"1. Так как время затухания
для триптофана в отсутствие тушителя - 2,7 нс, то = 1,2 . 1010 М~1 < с"1,
что находится в прекрасном ссхитетствии с предсказанным значением. Следова-
тельно, по существу, каждое столкновение кислорода с триптофаном приво-
дит к тушению, т.е. у - 1. Бимолекулярная константа скорости тушения поряд-
ка 1 • 1О10 М-1 • с“1 может рассматриваться как наибольшее из возможных
значений для водных растворов. Несколько большее значение для тушения
кислородом (порядка 2 • 1010 М“1 • с*"1) можно получить в углеводородных
растворителях [ 26]. В случае тушения другими веществами ожидается мень-
ший диффузионный предел для константы скорости тушения, потому что ко-
эффициенты диффузии этих тушителей меньше. Например, эффективность
тушения флуоресценции триптофана акриламидом также порядка единицы, но
« 5,9 - ЛО9 МГ1 • с”'*1 [5].. Эго несколько меньшее значение получается
вследствие меньшего коэффициента диффузии акриламида по сравнению с
кислородом.

9.3.	Теория статического тушения

В предыдущем разделе рассматривалось тушение, связанное с диффузи-
онными столкновениями между флуорофором и тушителем в течение времени
жизни возбужденного состояния, - процесс, зависящий от времени. Тушение
может также происходить в результате образования нефлуоресцирующего
комплекса в основном сюстояпии между флуорофором и тушителем. Как толь-
ко произошло поглощение света, комплекс немедленно возвращается в основ-
ное состояние без испускания фотона (рис. 9.1).

Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации тушителя лег-
ко вывести, используя константу ассоциации комплекса, записываемую еле,-
дующим образом:

К а [F~Q]
СТЙ [F][Q]

(9-14)

где[Г -Q] - концентрация комплекса; [F] - концентрация несвязанного
флуорофора. Если закомплексованная форма не флуоресцирует, то доля остав-
шейся флуоресценции (F/F ) определяется той частью от общего количества
флуорофоров, которая не закомплексована (f), т.е. f -= F/F . Общая концент-
рация флуорофора [ F ] равна

(Fo] Е[F] UF-Q].	(9.15)

Подстановка в (9.14) дает

[F0]^[F] [Fo]	1

ст= TFHQ]	= [F][Q]	[Q]

(9.16)

Концентрации флуорофора можно заменить на интенсивности флуоресценции
и преобразовать выражение (9.16) к виду

F/F=1 + Kt[Q]	(9.17)

Отметим, что зависимость FQ/F от [ Q] идентична зависимости, получаемой
для динамического тушения, за исключением того, что константа скорости
тушения здесь заменяется константой ассоциации. Данные по тушению флуо-
ресценции, полученные по измерению интенсивности в случае, если пет допол-
нительной информации, можно объяснить либо динамическими, либо статичес-
кими процессами. Для идентификации статического и динамического тушения
можно использовать времена затухания или зависимость тушения от темпера-
туры или вязкости. Измерение времени затухания флуоресценции - наиболее
четкий метод для различения статического и динамического тушений. Из-за
статического тушения часть флуорофоров не наблюдается. Связанные в комп-
лекс флуорофоры не флуоресцируют, и наблюдается флуоресценция только
несвязанных флуорофоров. Не связанная в комплекс часть флуорофоров не
возмущена, и, следовательно, для нее время затухания равно т . Таким об-
разом, для статического тушения tq/t = 1 (рис. 9.1), в то время как для дина-
мического тушения F/F = то/т.

СРАВНЕНИЕ СТАТИЧЕСКОГО И ДИНАМИЧЕСКОГО ТУШЕНИЯ. Отличие СТЭ-
тического тушения от динамического часто может быть установлено не толь-
ко измерением времен затухания, но и путем рассмотрения других факто-
ров. Динамическое тушение зависит от диффузии. Поскольку повышение
температуры приводит к увеличению коэффициентов диффузии, можно ожи-
дать, что бимолекулярная константа скорости тушения возрастет с увеличе-
нием температуры (рис. 9.1), Точнее, следует' ожидать, что k будет пропорциональ-
на 77ц, так как коэффициенты диффузии пропорциональны этому отношению
[уравнение (9.13)1. Напротив, при росте температуры скорее всего уменьша-
ется стабильность комплексон и тем самым значения констант статического
тушения.

Еще одним дополнительным методом для отличия статического тушения от
динамического может служить тщательный анализ спектра поглощения флуо-
рофора. Динамическое тушение влияет только на возбужденные состояния
флуорофоров, и можно полагать, что оно но изменит спектры поглощения» В
противоположность этому образование комплекса в основном состоянии часто
приводит к возмущению спектра поглощения флуорофора.

9.4.	Смешанное динамическое и статическое тушение

Во многих случаях флуорофор может быть потушен за счет как столкнове-
ний, так и образования комплекса с тушителем. Характерная особенность гра-
фика Штерна - Фольмера в таких случаях — отклонение вверх и вогнутость но
отношению к оси у (рис. 9.2). Остаточная флуоресценция (F/Fq) определяется
произведением доли, не связанной в комплекс (/), и доли, не потушенной диф-

CQJ

(F-fi)*

Не флуорес-
цирующий

ttu

+

F-Q.

Наклон

РИС. 9.2. Графические зависимости для смешанного динамического и статичес-
кого тушения флуорофоров одного вида.
фузионными столкновениями. Следовательно,

F	г

—- = f_________	(9.18)

рв Г +%[<>]

В предыдущем разделе было показано, что + К [ Q], Инверсия урав-
нения (9.18) и перестановка в правую часть последних членов даст

F /F. (’ «К„„„[Q])d * K[QD	(9.19)

и	ЦИ П	ь I

Эта модифицированная форма уравнения Штерна - Фольмера является уравне-
нием второго порядка относительно [ Q], что объясняет изгиб графика квер-
ху, наблюдаемый, когда флуорофор одновременно тушится как по статическо-
му, так и по динамическому механизму.

Доля динамического тушения в наблюдаемом уменьшении флуоресценции
может быть определена по изменению времен затухания, т.е. по зависимости
tq/t к 1 + К [Q]. Если таких данных нет, то уравнение (9.19) может быть
преобразовано для графического определения Кст и ^дин« После перемножения
членов в скобках получится

u ^«ЛЛа'ЛиЛЯг =	<9'20>

”1 + Кк.ж[Ч’	(9'21>

F /F - Г

*каж - (“дин * Кст> * W	(9.22)

Кажущаяся константа скорости тушения &каж вычисляется для каждой кон-
центрации тушителя. График зависимости Ккаж от [Q] представляет собой
прямую линию с отсекаемым на оси у отрезком, равным Ксг + ^дин, и накло-
ном, равным КС7Л ин (рис. 9.2). Индивидуальные значения констант могут
быть получены из двух решений квадратного уравнения [ уравнение (9.23)]. Ди-
намическую составляющую обычно выбирают либо как решение, сравнимое по
величине с ожидаемым диффузионно-контролируемым значением, либо по зави-
симости от температуры или вязкости, либо по другой имеющейся информации.

9.5.	Примеры статического и динамического тушения

Прежде чем перейти к другим теориям и примерам, связанным с тушени-
ем, рассмотрим несколько примеров, которые иллюстрируют статическое и
динамическое тушение. Данные по тушению триптофана кислородом приве-
дены на рис. 9.3 [ 28]. График в координатах Штерна - Фольмера представля-
ет собой прямую, что указывает на проявление только одного механизма ту-
РИС. 9.3. Графическое представление тушения флуоресценции триптофана кис-
лородом, наблюдаемое по изменению времен затухания в возбужденном состоянии
и квантовых выходов флуоресценции.

(По данным 1 28] С разрешения American Chemical Society.)

шепия. Пропорциональное уменьшение премени затухания и квантового выхода
флуоресценции показывает, что наблюдаемый тип тушения обусловлен диффу-
зионным процессом. Из наклона графика Штерна - Фольмера можно вычислить
Л’дин :!2,5 М"1, или что' 50% флуоресценции тушится при концентрации кисло-
рода 0,031 М. Значений Кдин и времени затухания флуоресценции доста-
точно для вычисления бимолекулярной константы скорости тушения. По-
лучаем Л 1,2 -1010 М"1 • с.-1. Такое большое значение указывает на эффек-
тивное тушение молекулярным кислородом.

На рис. 9.4 приведены данные по тушению П-ацетил-ь -триптофанамида
акриламидом ] 5], который также эффективно тушит флуоресценцию триптофаг
на. В этом случае на графике Штерна - Фольмера виден существенный изгиб
кривой к оси у. В противоположность ожидаемому причиной отклонения графи-
ка Штерна - Фольмера в положительную сторону не является образование
комплекса. Предполагается, что при высоких концентрациях тушителя часть
флуорофоров оказывается соседствующей с тушителем в момент возбужде-
ния и, таким образом, мгновенно дезактивируется. Этот эффект будет более
подробно описан в разд. 9.6. Доля динамического тушения акриламидом мо-
жет быть вычислена путем деления на переменную $ lf описывающую эф-
фект близости, и, таким образом, получают прямую в координатах Штерна -
РИС. 9.4. Графическое представление тушения N-ацетил-1.-триптофанамида
акриламидом в 55%-ном глицерине [б].

Фольмера. Измерение времен затухания подтвердило, что эта часть тушения
имеет динамическую природу. Бимолекулярные константы тушения, опреде-
ленные в ряде растворителей, приведены на рис. 9.5. Эти константы приблизи-
тельно линейно зависят от Т/т], что служит хорошим доказательством диффу-
зионной природы тушения акриламидом. Противоположные данные были полу-
чены по тушениюН-юреяг-бутилоксикарбонилтриптофапа ионами ртути, как по-

РИС. 9.5. Зависимость тушения N-ацетил-Е-триптофанамида акриламидом от
температуры и вязкости.

1 - водный раствор при различных температурах; 2 — различные солевые раст-
воры; 3— 55%-ный глицерин при различных температурах. (С разрешения авторов
работы [б] и American Chemical Society.)
казано на рис. 9.6 [ 29]. Приблизительно 50% флуоресценции тушится при кон-
центрации [Hg2+] « 20  10~ь М, и, следовательно, константа тушения равна
5000 М”1. Если принять во внимание время затухания флуоресценции N-mpew-
бутилоксикарбонилтриптофана, составляющее 8 нс, то кажущаяся бимолеку-
лярная константа тушения окажется равной 6,25 • 1011 М~1 • Полученное
значение больше, чем ото возможно для диффузионно-контролируемой реак-
ции, поэтому следует предположить образование комплекса между Hg2t и
производным триптофана. Измерение времен затухания флуоресценции под-
тверждает, что тушение имеет статическую природу. Время затухания не ме-
няется в присутствии ионов ртути (рис. 9.6). В противоположность действию
кислорода или акриламида тушение ионами ртути происходит вследствие об-
разования пефлуоресцирующего комплекса между Hg2+ и N-mpem-бутилокси-
карбопилтриптофаном.

Тушение хлорида 10-метилакридиния (МАС) нуклеотидом гуанозин-5'-мо-
пофосфатом (GMP) дает прекрасный пример сочетания статического и дина-
мического тушения в приблизительно одинаковой степени [30]. График Штер-
на - Фольмера приведен на рис. 9Л, и кривая для отношения F /F имеет яв-
ный изгиб кверху при высоких концентрациях GMP. Для этого случая есть

ГНд(гюДй1, 1О5м

РИС. 9.6. Графические зависимости для статического тушения N-трет-бутил-
оксикарбонилтриптофана ионами ртути [29].
РИС. 9.7. Зависимость тушения хлорида 10-метилакридиния гуанозин-5'-моно-
фосфатом от концентрации СМР[ 301-

РИС. 9.8. Графическое разделение динамической и статической констант туше-
ния МАС гуаноэин-5'-монофосфатом [зо].
данные, по временам затухания,, Константа динамического тушения была не-
зависимо определена из данных ио временам затухания, и £дин была найде-
на равной 143 М”1. Используя 'значение времени затухания в отсутствие ту-
шителя (32,9 пс,), можно определить k .. 4,3 . 109 М"1 . с~’. Принимая во вни-
мание большие размеры молекул МАс/и GMP, диффузионное тушение можно
считать аффективным.

Константы статического и динамического тушения могут быть определе-
ны из графика зависимости А'каж от концентрации GMP (рис. 9.8). Наклон S
и отсекаемый отрезок / составляют 9220 М“2 и 208 М"1 соответственно. Вве-
дя обозначения I К i К и 5 - А" А т, получим
дип UI	Дип GI

кст ~ Kcr{ +'S - 0	(9.23)

Решение итого квадратного уравнения дает значения К =• 144 и 64 М~1. Из
ст 1

данных но временам затухания известно, что К 143 М , и, следователь-
но константа статического тушения должна быть равна 64 М . При концент-
рации GMP 0,016 М 50% MAC образует комплекс в основном состоянии и не
флуоресцирует. Следует отметить, что спектр поглощения МАС возмущен
гуанозин-5 -монофосфатом, как и должно быть при взаимодействии в основ-
ном состоянии. Однако спектр возбуждения МАС не возмущен GMP. Это про-
ис,ходит потому, что флуоресцируют только несвязанные флуорофоры, а по-
скольку они не с,вязаны, их спектр поглощения но возмущен.

9.6.1	Отклонения от уравнения Штерна — Фольмера.

Сфера тушения

При больших степенях тушения часто наблюдается положительное откло-
нение от уравнения Штерна - Фольмера. Один из типичных случаев ~ туше-
ние; порилопа в додекане кислородом (рис. 9.9). Подобные результаты были
приведения ранее для тушения N-ацетил-Ь -триптофаиамида акриламидом (см.
рис. 9.4). Данные по перилену показывают, что природа кажущейся статиче-
ской компоненты не обязательно должна быть связана с образованием комп-
лекса. Определение констант статического и динамического тушения по урав-
нению (9.22) дает КдИН 112, 4 М~1 и Кст и 2,6 М~1. Бимолекулярная констан-
та тушения равна 2,1 . 1О10 М~1 - с”1. Интересно вычислить значение кон-;
станты в предположении диффузионно-контролируемой реакции. Вязкость
додекана при 25 °C составляет 1,374 сП. Принимая молекулярные радиусы
О

равными 4 и 2 А для перилепа и кислорода соответственно, можно вычислить
[по уравнению (9.13)], что коэффициенты диффузии составляют 3,96 > КГ6 и
7,94 • Ю“6 см2/с, Подстановка этих значений в уравнение Смолуховского дает
kq 5,4 • 109 М“1 • с "1. Таким образом, измеренное значение в 3,9 раза больше,
РИС. 9.9. Графическое представление тушения флуоресценции перилена кисло-
родом в додекане. (По Данным [281 С разрешения American Chemical Society.)
т

чем ожидаемое для 100%-ной эффективности диффузионно-контролируемой ре-
акции. Это расхождение связано с невозможностью точно предсказать, ис-
ходя из уравнения Стокса - Эйнштейна [уравнение (9» 13)], коэффициенты диф-
фузии молекул, которые по размерам меньше молекул растворителя.

Низкое значение кажущейся константы статического тушения позволяет
понять его природу. Для того чтобы 50% молекул перилена образовали "комп-
лекс", необходима концентрация кислорода 0,38 М. При этой концентрации
о
среднее расстояние между молекулами кислорода составляет всего 16 А.
Очевидно, что статическая составляющая в тушении связана не с комплек-
сообразованием, а с тем, что молекулы кислорода соседствуют с флуорофо-
ром в момент возбуждения. Процент таких "закомплексованных" флуорофо-
ров возрастает по мере увеличения мольной доли кислорода в растворе.

Это явление часто интерпретируют в терминах "сферы тушения’’, внутри
которой вероятность тушения равна единице. Модифицированная форма урав-
нения Штерна - Фольмера, которая описывает эту ситуацию, имеет следующий
вид:

F /F с.(1 + К [ Q])exp ([Q]rW/1000)	(9.24)

и	Дип

где v - объем сферы [31].. Данные на рис. 9.9 соответствуют сфере с радиу-
О

сом 9 А, что чуть больше, чем простая сумма радиусов флуорофора и тушите-
ля. Если флуорофор и тушитель находятся так близко друг к другу, то с высо-
кой степенью вероятности тушение произойдет прежде, чем молекулы продиф-
фундируют в разные стороны. Рассматриваемое явление пе следует путать с
тушением на расстоянии, поскольку имеющиеся данные показывают, что для
тушения необходим контакт между флуорофором и тушителем.

ВЫВОД уравнения для СФЕРЫ ТУШЕНИЯ. Предположим, что существует сфе-
ра объема v, внутри которой вероятность мгновенного тушения равна единице;.
Ясно, что если флуорофор возбуждается, когда в непосредственной близости
находится тушитель, то этот флуорофор тушится и, следовательно, не может
наблюдаться. Наблюдаются те флуорофоры, вблизи которых нет тушителя. Мо-
дифицированная форма уравнения Штерна - Фольмера (9.24) выведена путем
вычисления доли флуорофоров, которые, не содержат тушителя внутри окружаю-
щей их сферы тушения.

Из распределения Пуассона следует, что вероятность нахождения объема
ven тушителями равна

А” —А

Р(п} = —— Р	(9.25)

п!

где А - среднее число тушцтелей на объем v. Усредненная концентрация (моле-
кулы/см3) равна ([ Q]/V)/1000, и, следовательно, среднее число молекул в сфе-
ре X (v[ <>]АГ)/1000. Вероятность того, что вблизи флуорофора нет тушите-
лей, определяется выражением

В(0) с~А	(9.26)

Таким образом, существование сферы тушения снижает долю наблюдаемых
флуорофоров пропорционально ехр[ -(гфQ]/V)/1000], откуда и получается
уравнение (9.24).

9.7.	Уравнение Смопуховского

Скорость диффузионно-контролируемой реакции, в которой лимитирую-
щей стадией является частота столкновений реагентов, дается выражением

k и (D + D ) (R + RJ » 4rrR —	(9.27)

о 1000	1	21	2	1000

где D. и R. - коэффициенты диффузии и молекулярные радиусы диффунди-
рующих веществ; D и R - суммы этих величин. Одно вещество можно рассмат-
ривать неподвижным, а второе - диффундирующим с коэффициентом диффу-
зии D. Это уравнение часто интуитивно объясняют как поток диффундирующе-
го вещества через поверхность сферы радиуса R, непосредственно после чего
следует тушение. Это описание вызывает некоторую путаницу, так как диффу-
зионный поток через поверхность пропорционален площади этой поверхности и
D. Площадь поверхности сферы равна 4тгЯ2, но не 4-п-/?, в то время как в
уравнении (9.27) содержится член 4nf?, но не 4тг/?2. По-видимому, более подхо-
дящее объяснение этого расхождения приведено ниже.

Если в растворе молекулы тушителя распределены неравномерно, то воз-
никает поток из более концентрированной в менее концентрированную область
раствора. Поток J (моль/с) равен
/ = -DA[dc/dx]	(9.28)

где А - площадь (см2); D - коэффициент диффузии (см2/с); dc/dx - гради-
ент концентраций [моль/см4 = моль/(см3 • см)].

Частота столкновений Z флуорофора с тушителем может быть приравнена
потоку тушителя через сферу радиуса R:

Z = площадь • D • Градиент концентрации	(9.29)

Z = ArrR2D(dc/dr )R	(9.30)

где (dc/dr)R - градиент концентрации на расстоянии R между флуорофором
и тушителем. По уравнению Смолуховского Z = [Q] 4п7?£М7П)00 и, таким об-
разом,

de \	/V[Q]	концентрация

dr ' R 1000 R	расстояние

(9.31)

Величина (МСШ/Ю00 - это число молекул в 1 см3, &R - расстояние. Следова-
тельно, эффективный градиент концентраций, вызывающий тушение при столк-
новениях, определяется объемной концентрацией, деленной на R; это эквива-
лентно тому, что в центре флуорофора не может быть тушителя. Флуорофоры,
которые соседствуют с тушителями, не флуоресцируют и пе наблюдаются; сле-
довательно, уравнение (9.31) описывает эффективный градиент вокруг непоту-
шенных наблюдающихся флуорофоров. Исчезновение зависимости от R2 в урав-
нении Смолуховского является результатом зависимости градиента концент-
рации от 1?“1. Подробности приведены в работе [32].

9.8.	Применение тушения в биохимии

Тушение флуоресценции широко используется в биохимических исследо-
ваниях. Применения многочисленны и разнообразны, и их практически невоз-
можно суммировать. Поэтому были отобраны результаты, которые наиболее
наглядно иллюстрируют информацию, получаемую из данных по тушению, а
также структурные особенности макромолекул, которые определяют диапазон
тушения.
9.8.1.	Влияние стерических факторов на тушение.

Комплекс DNA — этидийбромид

Планарный флуорофор этидийбромид (РИЗ) встраивается между парами
оснований двойной спирали DNA. Он может также связываться на внешней сто-
роне спирали, но такой тин связывания несуществен для данных, приведенных
па рис-. 9.10. Тушение кислородом флуоресценции ЕВ было использовано для
того, чтобы установить, будут ли пары оснований DNA предотвращать близкий
подход молекулы кислорода к ЕВ. При связывании с- DN A время затухания"
флуоресценции ЕВ возрастает от 1,75 до 20,5 нс. Поэтому для того, чтобы
можно было вычислить бимолекулярные константы тушения, времена затуха-
ния должны быть известны. Па рис. 9.10 времена затухания нанесены на ось
х так, что наклон графика равен! k В отсутствие DNA константа тушения ЕВ
составляет 0,346- Ю10 \1~1 • с."1, что, но-видимому, в три раза меньше}, чем
можно ожидать для диффузионно-контролируемой реакции тушения кислоро-
дом. Такое уменьшение значения А но сравнению с предсказываемым (kQ),
по-видимому, является следствием строения ЕВ и присутствия объемистых
групп, окружающих ароматическую часть молекулы. Столкновения кислорода
с этими несопряжеппыми частями молекулы не приводят к тушению. Такое
явление, наблюдаемое ранее для флуорофоров с объемистыми боковыми заме-
стителями [ 28], показывает, что необходимо проверять тушение любого (])луо-

РИС. 9.10. Графическое представление тушения флуоресценции этидийбромида
в растворе и встроенного в двойную спираль DNA,, (По данным [ 2в1 с разрешения
\iii''i'ieun (’li<‘iniеа 1 Society.)
рофора в растворе перед проведением экспериментов, в которых использует-
ся флуорофор, связанный с макромолекулой.

На рис. 9.10 также приведены данные по тушению ЕВ, встроенного меж-
ду парами оснований двойной спирали DNA. В результате такого встраивания
бимолекулярная константа тушения уменьшается в 30 раз. 7го интерпретиру-
ют как результат стерического экранирования ЕВ, обеспечиваемого за счет
DNA. Пары оснований DNA прилегают к флуорофору с обеих сторон и предот-
вращают столкновения с кислородом. В противоположность атому белки [ 33 j
и мембраны ( 34] высокопроницаемы для молекулярного кислорода. Уменьше-
ние k при связывании с; DNA иллюстрирует эффект стерического затрудне-
ния при тушении. Если макромолекула предотвращает контакт между флуоро-
фором и тушителем, то следует ожидать существенного понижения значе-
ния k .

<?

9.8.2.	влияние заряда на тушение фпуоресценции

Сближению флуорофора и тушителя может препятствовать влияние за-
ряда в такой же степени, как и стерические факторы. Например, I-- отрица-
тельно заряженный тушитель, и можно ожидать, что он будет отталкиваться
отрицательными зарядами окружения флуорофора. Подобным образом 1“ дол-
жен притягиваться к флуорофорам в положительно заряженном окружении.
Притяжение или отталкивание будет зависеть от ионной силы раствора: умень-
шаться с ее увеличением. В противоположность иодид-иопам нейтральные ту-
шители, подобные кислороду, не должны быть чувствительны к заряду окру-
жения флуорофора.

Данные, иллюстрирующие влияние заряда на тушение, приведены па
рис. 9.11 [28]. Были исследованы заряженные полиаминокислоты, каждая из
которых содержала небольшой процент триптофановых остатков в качестве
флуорофора. Один из сополимеров был получен на основе глутаминовой кисло-
ты и, следовательно, отрицательно заряжен при центральных значениях рП.
Другой сополимер - на основе лизина и, следовательно, при нейтральных pH
заряжен положительно. Было проведено тушение флуоресценции триптофана
в этих сополимерах и кислородом, и иодом. Зависимость тушения от заряда
локального окружения флуорофора неодинакова для О2 и 1~ из-за их различ-
ной полярности. Тушение кислородом нечувствительно к заряду сополимера,
как и следует ожидать для незаряженного тушителя. Для обоих сополимеров
получена бимолекулярная константа тушения кислородом порядка !• Ю10 М"*1 • с~
Напротив, тушение 1~ сильно зависит от заряда окружения триптофановых ос-
татков. Для полилизина скорость тушения иодид-иоиами превышает допустимое
для диффузионно-контролируемой реакции значение, что указывает на вредно-
Кислород

Иодид-ион

/Г, М-/ К/^-Ю'10

4-6	2,3

О	О

К, M~Z I го» |Vr0,/y~Zg

Сополимер
LYS97 *-ГЯР3
GLU99~TRP*

20,3	2,0	1,02

15,4	1,2 ± 0,3 1,2 ~ 0,2

РИС. 9.11. Графическое представление тушения заряженных полиаминокиспот,
содержащих триптофан, кислородом и иодид-ионом.

(По данным [ 2в] с разрешения American Chemical Society.)

чтительную локализацию 1~ вокруг положительно заряженного полимера. Для
полиглутамата скорость тушения значительно ниже, чем можно было ожидать
для диффузионно-контролируемой реакции. Эти результаты показывают, что ту-
шение любого флуорофора будет подвержено влиянию локального заряда, кото-
рый может увеличивать или уменьшать концентрацию тушителя в окружающем
пространстве.

9.8.3. Проникновение заряженных и нейтральных тушителей в белки

Внутренние области белков обычно рассматриваются как неполярные.
Триптофановые остатки тоже неполярны. Можно ожидать, что по крайней мере
некоторые из этих остатков должны быть внутри белков и поэтому недоступны
для тушителей во внешней водной фазе. Это предположение проверяется путем
сравнения тушения кислородом и иодидом флуоресценции триптофана в трипси-
ногене (рис. 9.12). Изоэлектрическая точка трипсиногена 9,3, и, таким обра-
зом, он заряжен положительно при pH 3, при котором проводились эксперимен-
ты. Исходя из влияния заряда на тушение, как это наблюдалось для сополиме-
ров аминокислот (разд. 9.8.2), следовало ожидать увеличения тушения ио-
дидом. Тем не менее, наблюдается значительно более сильное тушение кис-
лородом, чем иодидом. Константа тушения для кислорода составляет'* 40% от
ожидаемой для диффузионно-контролируемой реакции. Подобные результаты
были получены для большого числа белков [ 33, 34]. Быстрая диффузия кисло-
рода внутри белков интерпретируется как результат высокой динамической
подвижности матрицы белка, которая флуктуирует в наносекундном временном
диапазоне таким образом, что обеспечивает свободную диффузию кислорода.
В противоположность этому для иодида наблюдается слабое тушение.'Отсутст-
вие в данном случае значительного тушения объясняется тем, что заряженные
и гидратированные иодид-ионы не могут проникать внутрь неполярного ядра
белка. Следовательно, путем сравнения тушения заряженными и незаряжен-
ными молекулами можно выявлять относительную проницаемость макромоле-
кулы для этих веществ.

Методические подробности, приведенные в подписи к рис. 9.12, иллюстри-
руют некоторые важные соображения для любых экспериментов по тушению.
Длины волн возбуждения, выбранные для тушения кислородом и иодидом, соо

РИС. 9.12. Зависимость тушения флуоресценции трипсиногена от концентрации
кислорода или иодид-иона.

Тушение О2: 0,001 М НС1, возбуждение при 280 нм; тушение 1“ : 0,001 М ПС1,
возбуждение при 290 нм; [ КС11 +[К1 ] = 0,5 М; ЮмМ Na2s2O3. Флуоресценцию регис-
трировали при 334 нм для обоих Образцову (По данным [зз] с разрешения American
Chemical Society.)
тавляют 280 и 290 нм соответственно. Большая длина волны возбуждения для
тушения иодидом обусловлена тем, что 1~ поглощает свет при 280 нм. Из-за
этого может возникнуть эффект внутреннего фильтра, который приведет к
кажущемуся уменьшению интенсивности флуоресценции и, таким образом,
исказит данные по тушению. Независимо от того, какой тушитель использует-
ся, важно убедиться в отсутствии эффекта внутреннего фильтра. Если такой
эффект имеет место, наблюдаемая интенсивность флуоресценции должна быть
откорректирована. Следует отметить, что на измерение времен затухания
флуоресценции, как правило, по влияют эффекты внутреннего фильтра, так
как оно практически не зависит от общей интенсивности.

В подписи к рис. 9.12 для опытов по тушению иодидом отмечено использо-
вание КС1 и Na 2S2O . Хлорид калия применяется для поддержания постоянно-
го значения ионной силы при изменении концентрации иодида в растворе, а
N^SjOg необходим для поддержания иодида в восстановленном состоянии. В
противном случае возможно образование реакционноспособного I , который
может проникать в неполярные области белков и мембран.

9.8.4.	Определение поверхностной доступности триптофановых
остатков в бепках по тушению фпуоресценции иодид-Ионами

В предыдущем разделе отмечалось, что степень тушения флуоресценции
триптофана иодидом меньше, чем степень тушения кислородом в эквивалент-
ной концентрации. Такое различие интерпретировалось как результат неспо-
собности иодид-ионов проникать во внутренние области белка. Это наводит на
мысль, что тушение 1~ или другими соединениями, не проникающими в белки,
можно было бы использовать для определения той части общей интенсивности
флуоресценции, которая связана с поверхностно-локализованными остатками.

Хотя ото и не видно из рис. 9.12, тушение флуоресценции триптофана ио-
дидом обычно характеризуется изгибом графика Штерна - Фольмера вниз к
оси х (рис. 9.13). При высоких концентрациях тушителя практически все доступ-
ные остатки потушены. Остаточная флуоресценция связана с недоступными
для тушения остатками, поскольку их флуоресценция не зависит от концент-
рации тушителя.

Тушение двух типов флуорофоров, один из которых недоступен для туши-
теля, можно проанализировать, используя модифицированную форму уравне-
ния Штерна - Фольмера [7 ]. Примем, что существуют два типа остатков трип-
тофана, один из которых доступен (1) для тушения, а другой - недоступен (2)
или "спрятан". Общая флуоресценция в отсутствие тушителя Fq определяется
выражением

Г « F т'Е
О 01	02

(9.32)
РИС. 9.13. Г рафики Штерна — Фольмера (а) и модифицированного уравнения
Штерна - Фольмера (б) для двух типов флуорофоров, один из которых недоступен для
тушителя.

где индексом 0 обозначена интенсивность флуоресценции в отсутствие туши-
теля. В присутствии тушителя интенсивность доступной фракции / уменьша-
ется в соответствии с уравнением Штерна - Фольмера, в то время как "скры-
тая" фракция не тушится. Следовательно,

F =

—— + f

1 + K[Q_]	02

(9.33)

где К - штерн-фольмеровская константа тушения доступной для тушения фрак
ции; [ Q] — концентрация тушителя. Вычитание уравнения (9.33) из (9.32) дает

ДП F -F = F ( -~—.L _ \	(9.34)

0	01 V1+:K[Q]/

Обращением уравнения (9.34) с последующим делением на уравнение (9.32) по-
лучаем

F	1	1

—— = „_____:_____ +_____ (9.35)

△ F	fyK[Q] f,

।

где / - доля начальной флуоресценции, доступная для тушения:

F

(	01	ИХ >)Л\

Эта модифицированная форма уравнения Штерна - Фольмера позволяет опре-
делить графически f 1 и К. На графике зависимости F^/AF от I/IQ1 значение
/1 определяется по отсекаемому отрезку, а (/1Л')“1 - по наклону,. Отсекаемый
отрезок отражает чкстраполяццю к бесконечно большой концентрации тушите-
ля (1/[ Qk й). Значение 0/(^’0 -^) при данной концентрации тушителя соот-
ветствует обратной величине потушенной флуоресценции. При зтой концентра-
ции только недоступные остатки будут флуоресцировать.

Пример разделения остатков триптофана па внутренние и внешние даст ту-
шение лизоцима иодид-ионами [ 7 ]. На рис. 9.14 приведены графики Штерна -
Фольмера для тушения триптофана ионами I ~ в отсутствие и в присутствии 6 М
гуапидипгидрохлорида. ')то вещество денатурирует белок. Изгиб кривой вниз
в отсутствие денатуранта указывает на наличие недоступной для тушения фрак-
ции флуорофоров. Пересчет стих данных по модифицированному уравнению
Штерна -• Фольмера (9.35) дает приблизительно прямую линию. Отсекаемый
отрезок па оси у (/~1) равен 1,5 (рис. 9.14, б), следовательно, 66% общей флуо-
ресценции нативного белка доступно для тушения. В противоположность натив-
ному белку в присутствии 6 М гуапидипгидрохлорида наблюдается прямолинейная
зависимость в координатах Штерна - Фольмера (рис. 9.14, а). Использование
модифицированного уравнения Штерна - Фольмера в атом случае не дает до-
полнительной информации, за исключением подтверждения того, что в денату-
рированном белке f 1, т.ек все триптофановые остатки стали доступны для
иодид-иопов.

'Рушение поверхностно-доступных остатков триптофана в принципе поз-
воляет различить спектры испускания внутренних и внешних остатков. Отно-
сительно селективного тушения поверхностных остатков триптофана иодидом
мы считаем, что остаточная флуоресценция исходит от "скрытых" триптофа-

РИС. 9-14. а - график Штерна — Фольмера для тушения лизоцима иодид-ионами
в присутствии (1) и в отсутствие (2) гуанидингидрохлорида.

б - график в модифицированных координатах Штерна — Фольмера.

(С разрешения авторов работы [ 71 и American Chemical Society.)
новых остатков, и следует ожидать, что их флуоресценция должна быть сдви-
нута в коротковолновую область но сравнению с. потушенными остатками,, По-
следние, как полагают, должны находиться па поверхности белка, и, следова-
тельно, их спектр флуоресценции должен быть сдвинут в длинноволновую об-
ласть. Па рис. 9.15 приведены спектры испускания нативного и денатури-
рованного лизоцима в присутствии и в отсутствие} 0,2 М KI. В результате а
тушения спектр иг,пускания нативного белка сдвигается в коротковолновую
область. Это происходит потому, что цезатушенная флуоресценция обуслов-
лена остатками, "скрытыми" внутри белка. Приводен также дифференциаль-
ный спектр (кривая 3), полученный но разности между пезатушенным и поту-
шенным спектрами испускания и соответствующий спектру испускания поту-
шенных остатков. Как и предполагалось, флуоресценция этих остатков сдви-
нута в длинноволновую область по сравнению с полным спектром испускания.
Такой спектральный сдвиг, наблюдающийся при тушении, доказывает селек-
тивное тушение определенной группы флуорофоров. Дифференциальный спектр
показывает, что максимум испускания потушенных остатков имеет значение
-—350 им - типичное для триптофановых остатков, ‘«свопированных в воду.
Существенно, что при тушении денатурированного белка не наблюдается спект-
ральных сдвигов (рис. 9.15, б). Этого и следовало ожидать, так как все трип-
тофановые остатки экспонированы в растворитель и, следовательно, имеют
одинаковые спектры испускания.

РИС. 9.15. Спектры флуоресценции нативного (а) и денатурированного (-6) лизо-
цима.

1 — в отсутствие тушителя 0,2 М KI; 2 — в присутствии тушителя; 3 — дифферен-
циальный спектр, соответствующий флуоресценции потушенных остатков триптофана;
4 - фон. Денатурация вызывается 6 М гуанидингидрохлоридом. (С разрешения авто-
ров работы [7] И American Chemical Society.)


РИС. 9.16. Г рафики в модифицированных координатах Штерна — Фольмера для
тушения пепсина кислородом и иодид-ионами [зз].

Различное тушение флуоресценции белков полярными и неполярными ту-
шителями выявляется при сравнении тушения пепсина кислородом и иодидом
[33]. В этом случае использовалось модифицированное уравнение Штерна -
Фольмера (рис. 9.16). Пепсин содержит шесть триптофановых остатков. Для
кислорода отсекаемый отрезок на оси у равен 1 (рис. 9.16, б). Следовательно,
все шесть остатков одинаково доступны для тушения кислородом. Принимая,
что по крайней мере один остаток находится внутри белка, можно полагать,
что пенсии проницаем для кислорода. Напротив, для тушения иодидом отсека-
емый отрезок па оси у соответствует доступности только 85% флуоресцирую-
щих остатков (рис. 9.16, д). Этот результат, по-видимому, указывает на то,
что по крайней мере один из шести остатков находится внутри белка, в обла-
сти, непроницаемой для I”.

При разделении общей флуоресценции па доступную и недоступную фрак-
ции необходимо иметь в виду, что может существовать нс два класса трипто-
фановых остатков, а больше. Даже предполагаемая "недоступная" фракция
может быть частично доступной для тушения. Приведенный выше способ обес-
печивает полезное, но произвольное разделение па два условных класса трип-
т о фан о вых о ст ат ко в.

9.8.5.	Установление поверхностной доступности мембранно-бвяз^нных
белков производными пиколиния

В качестве последнего примера использования модифицированной формы
уравнения Штерна - Фольмера приведены данные ио тушению флуоресценции
триптофана мембран саркоплазматического ретикулума перхлоратом N-метил-

1У-413
РИС. 9.17. График в модифицированных координатах Штерна - фольмера для
флуоресценции триптофана в мембранах саркоплазматического ретикулума, ил-
люстрирующий частичную доступность мембранно-связанной Са2+-АТРазы для
тушения [ 25].

1 - в буферном растворе; 2 — для мембран, разрушенных трифторэтанолом.

4-пиколиния [25]. Основным белком этих мембран является Са2+ -АТРаза.
К-Метил-4-пиколиний тушит флуоресценцию триптофана динамическим путем,
по-видимому, по механизму переноса заряда» Катион тушителя хорошо раст-
ворим в воде, и предполагается, что это соединение будет тушить триптофа-
новые остатки только на поверхности мембран» График в модифицированных
координатах Штерна - Фольмера приведен на рис. 9.17. По отрезку, отсекае-
мому на оси у, доля доступных остатков оценивается как 0,54. Разрушение
мембран трифторэтанолом приводит к увеличению доступности триптофановых
остатков для тушителя, растворенного в воде (f = 0,81). В последующей ра-
боте [ 25] авторы использовали другие тушители, которые локализуются па
границе раздела липид - вода и тушат триптофановые остатки в этой специфи-
ческой локализации. Используемые тушители представляли собой гидрофобные
производные 4-метилпиколиния, такие, как М-гексил-4-пиколиний. Путем подоб-
ных исследований можно получить описание структурных особенностей мемб-
ранно-связанных белков с малым разрешением.

9.8.6.	Применение тушения дня выявления локализации
мембранно-бвяззнных флуорофоров

Флуоресцентные зонды широко используют для исследования структур-
ных и динамических свойств мембран. Интерпретация полученных данных об-
легчается знанием локализации флуорофора по отношению к поверхности раз-
дела липид - вода.’Так как тушение зависит от молекулярного контакта меж-
ДУ флуорофором и тушителем, локализация флуорофора может быть установ-
лена, если тушение флуоресценции проводится тушителями с известной лока-
лизацией. Аптроилоксижирные кислоты [ 35] широко используются в качестве
мембранных зондов отчасти из-за того, что доступен ряд производных, в ко-
торых антроилокси-грунна расположена в различных положениях вдоль цепи
жирной кислоты. Структура стих производных приведена на рис» 9.18. Ясно,
что антроилокси-грунна молекул должна тем глубже располагаться в мембране,
чем дальше от карбоксильной группы находится место антроилокси-заместите-
ля в жирной кислоте.

Локализация стих зондов изучалась но тушению Си2+ (рис. 9.19, а). Кажу-
щиеся константы тушения значительно больше, чем можно ожидать для диффу-
зионно-контролируемых реакций, что является следствием связывания Си2+ с
липидами, главным образом на поверхности раздела липид - вода. Время зату-
хания флуоресценции этих зондов в отсутствие тушителя ~ 10 нс. Эффектив-
ность тушения уменьшается в ряду:.2-ЛР > 6-AS •> 9-AS > 12-AS > М-9-А.
Полученные результаты показывают, что аптроилокси-заместители отодвигают-
ся от поверхности раздела линид - вода в той же степени, как это можно пред-
сказать, исходя из их структуры. М-9-А ие является производным жирной
кислоты, по, по-видимому, его незаряженная молекула расположена в центре
бислоя и максимально удалена от поверхности раздела линид - вода.

н

CH, (СН3) С соон  1	*13 1  0 1 С«о  2-АР  Н  СН. (СНр) -С-(СН?) соон 3	*8 I	7  с=о  ОиО  9-AS	Н  СИЛОН,) -С-(СН2) соон  6-AS  О  Н	II  СН,(СН?) —С—(CH-) -с-он -	5 |	ю  0 I с=о  12 -AS

РИС. 9.18. Структура н-9-антроилоксижирных кислот.
[ Си2*], мкМ

РИС. 9.19. Графики для выявления локализации мембранно-связанных флуоро-
форов при помощи полярного тушителя Си2+ (а) и неполярного тушителя диметилани-
гина (б) [ 35].

Локализация этих зондов была также определена при использовании липид-
растворимого тушителя диметиланилина (рис. 9.19, б). Были получены анало-
гичные, но не полностью совпадающие результаты. Те флуорофоры, которые,
как предполагается, наиболее глубоко проникают в мембрану (М-9-А,
12-AS), тушатся в наибольшей степени липид-растворимым тушителем, и снова ка-
жущиеся бимолекулярные константы тушения больше, чем это возможно для
диффузионно-контролируемой реакции. Расхождение связано с тем, что на оси
концентраций (рис. 9.19, б) приведены общие концентрации диметиланилина.
Это неполярное соединение концентрируется в мембранах, что приводит к уве-
личению концентрации тушителя в окружении флуорофора. В разд. 9.8.8.1 бу-
дут описаны методы анализа таких данных с помощью коэффициентов распре-
деления тушащих веществ между липидом и водой. Несмотря на это усложне-
ние, приведенные результаты иллюстрируют возможность получения информа-
ции о мембранно-связанных флуорофорах по тушению флуоресценции.

9.8.7.	Тушение мембранно-бвязднных фпуорофоров кислородом

Прежде чем детально обсуждать, как влияют распределения между водой
и липидом на тушение, полезно рассмотреть тушение, вызываемое слабо рас-
пределяющимся тушителем - кислородом. Тушение кислородом 2-метилантра-
цена - неполярного соединения, концентрирующегося в мембранах в области
ацильных заместителей, в везикулах димиристоил- и динальмитоилфосфати-
дилхолина, приведено на рис. 9.20. В условиях эксперимента (31 °C) везику-
РИС. 9.20. Графическое представление тушения 2-метилантрацена кислоро-
дом в липидных бислоях.

(С разрешения автора работы [45.1 и Elsevier Biomedical Press.)

лы DMPC находятся выше температуры фазового перехода (Т, = 24°С), а ве-
зикулы DPPC - ниже их Тс (37 ° С). В соответствии с оценками, полученны-.
ми из стационарной анизотропии DPII (см. рис. 5.12), микровязкость DMPC
и DPPC составляет 0,98 ~ 8,2 П соответственно. Однако фазовое состояние
бислоев оказывает только двукратное влияние на тушение кислородом (рис. 9.20).
Волое того, константы тушения заметно больше, чем предсказываемые на ос-
новании уравнения Стокса и Эйнштейна [ уравнение (9.13)]. Для вязкости по-
рядка 4 П по этому уравнению и уравнению Смолуховского [ (9.11)] получает-
ся диффузионно-контролируемая константа 0,00025 • :1010 М”’« с~1 в отличие
от наблюдаемого значения 0,3 - .1010 М~1 - с"1. Эти результаты показывают,
что любые значения микровязкости зависят от особенностей молекулярных
движений в процессах, которые использованы для определения микровязкости.
В подобных случаях малые молекулы кислорода могут диффундировать быст-
рее, чем это оценивается на основании данных по вращательной диффузии боль-
ших молекул DPH.

Точная интерпретация приведенных на рис. 9.20 констант бимолекулярно-
го тушения кислородом ограничена отсутствием сведений о растворимости ту-
шителя в мембране. Эффективные концентрации тушителя, приведенные на ри-
сунке, были вычислены в предположении, что коэффициент распределения кис-
лорода между водой и липидом составляет 6,48 и что ото значение не зависит
от фазового состояния бислоев. Интересно рассчитать проницаемость липид-
ных мембран для молекулярного кислорода с учетом этих предположений. Про-
ницаемость Р бислоя может быть аппроксимирована выражением

Р= KD/&X	(9.37)

где D - коэффициент диффузии; К - коэффициент распределения; Ах - тол-
щина мембраны. Бимолекулярные константы тушения 2-МЛ составляют 1/5
диффузионно-контролируемого значения. Так как коэффициент распределения
между липидом и водой также ~ 5, то но уравнению (9.37) получается, что ли-
пидные бислои в той же степени проницаемы для кислорода, как и слой воды
эквивалентной толщины [34]. Следовательно, эти биологические структуры не
затрудняют диффузионного транспорта кислорода.

9.8.8.	Метод определения диффузии и коэффициентов распределения
тушителей по тушению мембранно-йвязанных фпуорофоров

Диффузионное тушение мембранно-связанных флуорофоров очень полез-
но при исследовании диффузий и распределения малых молекул в мембранах.
Достоинства метода состоят в следующем:

1.	Целый ряд молекул, представляющих биологический интерес, могут
служить диффузионными тушителями. Например, ароматические? амины, мно-
гие из которых являются местными анестетиками, тушат флуоресценцию апт-
роильных производных жирных кислот. Карбазол и его алкильные производные
тушатся многочисленными хлорированными углеводородами [ 18] и нейротокси-
ном - хлоридом метилртути [ 17]. Другие примеры описаны в разд. 9.1. Благо-
даря такому разнообразию исследователи не ограничены специальными случая-
ми, например, образованием эксимеров пирена.

2.	Благодаря областям локальной неупорядоченности, создаваемым флуо-
рофорами, наблюдаемые спектральные параметры могут в первую очередь от-
ражать возмущенную область бислоя. Тушение происходит после диффузии ту-
шителя на расстояние 10 - 1000 X, т.е. через невозмущенпую область бислоя.

3.	Константы динамического тушения отражают частоту столкновений
между зондом и тушителем. Так как эта частота пропорциональна локальной
концентрации тушителя, то можно получить информацию и о скорости тушения,
и о коэффициенте распределения тушителей между липидом и водой»

При интерпретации данных по тушению, получаемых для мембранно-свя-
занных флуорофоров, возникает проблема, с которой не сталкиваются в го-
могенных растворах. В общем случае концентрация малых гидрофобных мо-
лекул в мембране и водной фазе неизвестна» Для гидрофобных тушителей и
мембранно-связанных флуорофоров при интерпретации данных по тушению не-
обходимо отличать скорость диффузии тушителя от эффекта его распределе-
ния между липидом и водой. К счастью, это возможно. Болел; того, тушение
позволяет найти коэффициент распределения между липидом и водой.

9.	8.8.1. Тушение при столкновениях тушителем, предпочтительно
распределенным в одной из фаз

Рассмотрим тушитель, распределенный между мембраной и водной фазой.,
В ненасыщенных растворах тушителя его концентрации в водной (вод) и мемб-
ранной (м) фазах связаны коэффициентом распределения:

Р- I QI /[Q]

1 'м71 'вод

(9.38)

Общая концентрация добавленного тушителя [ Q распределяется между
водной и мембранной фазами в соответствии с уравнением

Ы10бЛбщ Ы1Л '	(9.39)

где V - объемы различных фаз.

Введя понятие объемной доли мембранной фазы

Л/^общ	(9.40)

получаем для мембранной концентрации тушителя

Р{ ^10бш

[Q1 .	_____ (9.41)

Pa + (1 — а )
м ' м'

Подстановка этого выражения в уравнение Штерна - Фольмера дает

1

т

1



-- + Л [01 .Л
каж 1^общ

(9.42)

о

где k - бимолекулярная константа тушения для мембранно-связанного флуо-
рофора. Кажущаяся константа тушения представляется в следующем виде:

k ~
каж	м

1

kP
м

(9.43)

Когда флуорофор находится в мембранной фазе, кажущаяся константа туше-
ния зависит от Р, а и k . График зависимости А”’ от а позволяет опре-

М М	К8Ж	М

делить Ри /см. Таким образом, с помощью метода тушения одновременно оп-
ределяются и степень, с которой тушитель распределяется в бислое, и ско-
рость его диффузии в этом бислос.

Приведенный выше метод определения коэффициента распределения во-
да - липид применяется только тогда, когда тушение происходит за счет
столкновений с молекулами тушителя, присутствующими в бислое в момент
возбуждения. Если в таких столкновениях участвуют и молекулы тушителя,
находившиеся в водной фазе, которые диффундируют в липидную фазу в тече-
ние времени пребывания в возбужденном состоянии, то кажущееся тушение
не должно зависеть от концентрации липида. Эта ситуация, когда тушение про-
исходит как в водной, так и в липидной фазах, является более сложной.

9.	8.8.2. Распределение неполярного тушителя между водой
и везикулами DMPC

На примере тушения меченного карбазолом фосфолипида в везикулах
DMPC у-гексахлорциклогексаном (линданом) [36] можно показать примени-
мость уравнения (9.43). В этом случае тушение было определено по измере-
нию времен затухания, что гарантировало наблюдение только динамического
тушения. Большее тушение было обнаружено при низких концентрациях липи-
да (рис. 9.21), когда добавление того же общего количества линдана приводит
к его более высокой концентрации в мембране. Это происходит вследствие ма-
лого количества липида, в котором может растворяться тушитель в соответ-
ствии с коэффициентом распределения. Именно такая зависимость кажущей-

РИС. 9.21. Зависимость времени затухания фпуоресценции р-11-(9-карбазол)унде-
каноилфосфатидилхолина, связанного с везикулами DMPC в присутствии линдана, от
концентрации линдана.

(С разрешения авторов работы [36] И Elsevier Biomedical Press.)
РИС. 9.22. Графическое определение коэффициентов диффузии и распределения
линдана в везикулах DMPC.

(С разрешения авторов работы [зб] И Elsevier Biomedical Press.)

ся константы тушения от концентрации липида позволяет найти коэффициенты
распределения. Для этого строят график зависимости от Ю1общ
(рис. 9.22). Так как коэффициент распределения велик, то наклон приблизи-
тельно равен Отсекаемый отрезок составляет ~ (kMP)~ ’. Из этих дан-
ных можно легко вычислить, что линдан распределяется в везикулах DMPC с
коэффициентом 9500.

Для успешного применения описанной методики необходимо, чтобы диа-
пазон концентраций липида укладывался в диапазон частичного распределения
добавленного тушителя. Доля тушителя, связанного с мембраной (/^), дается
выражением

Рос

f » _________________ (9.44)

Для случая, представленного на рис. 9.22, изменяется от 0,49 до 0,98.
Если коэффициенты распределения превышают 104, необходимы более раз-
бавленные суспензии мембран.

9.8.9.	Влияние вязкости на эффективность тушения

В некоторых случаях, например для мембранно-связанных флуорофоров
и тушителей, желательно использовать наблюдаемые бимолекулярные копе-
танты тушения для вычисления коэффициента диффузии тушителя» Для этого
должна быть известна эффективность тушения у и необходимо, чтобы эта эф-
фективность была одинакова во всех исследуемых образцах» Так, эффектив-
ность тушения для конкретной комбинации флуорофор - тушитель можно вы-
числить из экспериментов в растворах с известной вязкостью. Затем туше-
ние этого же флуорофора может быть изучено, когда он связан с мембраной
или белком» Иногда изменение вязкости может приводить к изменению эффек-
тивности тушения. Зависимость у от вязкости можно пояснить следующим об-
разом» Рассмотрим схему реакции

F* 4- Q —(F - Q)* -Л F + Q 4-:теплота

Г [	*1

F + /г v

(F - Q)* - возбужденный комплекс флуорофора и тушителя, который еще не
дезактивировался» Для реакций в возбужденном состоянии, таких, как образо-
вание эксиплекса с амином, (F -Q)* может быть эксиплексом» Однако мы
будем рассматривать только случай, когда (F -Q)* не флуоресцирует» Если
(F — Q)* флуоресцирует, необходимо более сложное выражение» При k2 >>
тушение очень эффективно и константа тушения определяется kQ [ уравнение
(9.11)]. Однако для менее эффективных тушителей может быть сравнима с
k2, тогда константа тушения равна

k2

’'4° <9-45>

Следовательно, у = -£/(&, + k2) - доля столкновений, приводящих к тушению.
Из сказанного ясно, что увеличение вязкости может повышать эффективность
тушения слабыми тушителями, так как оно замедляет разобщение флуорофора
и тушителя. Увеличение продолжительности каждого диффузионного столкно-
вения приводит к повышению вероятности тушения за время столкновения»

Мы отмечали, что это простой случай. Кажущаяся бимолекулярная констан-
т.1 рушения может быть сложной и зависеть от концентрации тушителя, вязко-
сти и спектральных свойств комплекса, образующегося при столкновении» До-
полнительное обсуждение этого вопроса проведено в работах [ 21, 37 - 40]..
При благоприятных обстоятельствах такие усложнения могут быть исключены
путем использования эффективных тушителей.
9.8.10.	Обмен цитохромом между мембранами

Цитохром b5 (cyt Ь5) ~ интегральный мембранный белок, который состо-
ит из двух различных доменов. Гидрофобный "хвост", включающий приблизи-
тельно 50 аминокислотных остатков, ответствен за связывание cyt Ъ5 с мем-
бранами. Второй домен (гидрофильный) содержит гемовую область, которая
находится, по-видимому, на поверхности мембраны. Обычно гемовые белки
флуоресцируют слабо или не флуоресцируют совсем из-за переноса энергии с
триптофановых остатков на нефлуоресцирующий гем. В cyt b5 расстояние
между гемом и триптофановыми остатками гидрофобного "хвоста" достаточ-
но большое для того, чтобы появилась заметная флуоресценция этих остатков.
Фактически триптофановые остатки гидрофобного "хвоста" являются главной
причиной флуоресценции этого белка. Триптофановая флуоресценция из гем-
содержащей области cyt 1>5 не наблюдается. В cyt b& из печени теленка флуо-
ресцирует главным образом один из трех триптофановых остатков, располо-
женных в гидрофобном "хвосте". Этот остаток находится на 21 X ниже поверх-
ности раздела липид - вода, недалеко от центра бислоя [ 41 ].

Тот факт, что этот остаток обусловливает флуоресценцию cyt Ъ , позволя-
ет разработать простой метод измерения кинетики обмена cyt 6g из печени

РИС. 9.23. Спектр флуоресцен-
ции цитохрома Ь5 [ 431.

Приведены спектры в буферном
растворе в присутствии 0,6 мМ .РОРС
и 0,5 мМ ВгРС, а также контроль-
ные спектры РОРС и ВгрС. (С раз-
решения American Chemical Society.)
теленка между везикулами [42]. Был синтезирован бромсодержащий фосфо-
липид-1,2-бис(9,10-дибромстеароил)-(С4)-глицерин-3-фосфорилхолин* (ВгРС).
При связывании cyt Ь5 с везикулой, состоящей из этого липида, флуоресцен-
ция триптофана из области "хвоста" тушится (рис. 9.23). Напротив, связыва-
ние cyt Ьб с небромированным липидом приводит к усилению флуоресценции
белка. Было найдено, что относительная флуоресценция cyt b5 прямо пропор-
циональна доле cyt b 5, связанного либо с пальмитоилолеоилфосфатидилхоли-
ном, либо с ВгРС (рис. 9.24). При смешивании связанного с РОРС cyt b$ с
везикулами ВгРС наблюдается зависимое от времени уменьшение флуорес-
ценции. Напротив, при смешивании cyt b , связанного с ВгРС, с везикулами
РОРС наблюдается постепенное возрастание флуоресценции со временем. Эти
зависящие от времени изменения происходят вследствие обмена cyt b5 меж-
ду везикулами (рис. 9.25). Полученные результаты, а также данные по линей-
ной зависимости флуоресценции cyt Ьб от его доли в каждом типе везикул бы-
ли использованы для вычисления скорости обмена cyt b$ между этими везику-
лами. Из серии таких измерений был сделан вывод, что cyt b5 обменивается
между везикулами через водную фазу и что прямой контакт везикул д1я обме-
на не нужен. Этот пример показывает, как селективное тушение может быть
использовано для того, чтобы различить, в каком из двух окружений находит-
ся белок, и, таким образом, позволяет легко изучить количественно кинетику
обмена. Поскольку имеется большое число возможных пар флуорофор - туши-
тель, подобная методика может быть применима и в других случаях.

РИС. 9.24. Зависимость относитель-
ной флуоресценции цитохрома bg в смеси
мицелл РОРС и ВгРС от доли РОРС [42].

(С разрешения American Chemical

Society.)

С4 - стероидное число. - Прим, перев.
Время, мин

РИС. 9.25. Графическое представление кинетики обмена цитрхрома Ь5 между
везикулами 1’01’С и ВгРС [ 42].

Г-'набл ~ флуоресценция, наблюдаемая в ходе реакции; Го — флуоресценция в
нулевой момент времени после добавления второго типа везикул; Гравн — флуорес-
ценция в равновесии, наблюдаемом через 7 ч.

1 — донорные везикулы ВгРС, акцепторные — РОРС; 2 — донорные везикулы
РОРС, акцепторные — ВгРС» По-разному обозначены точки, относящиеся к разным
концентрациям везикул и цитохрома bg.

Задачи

9-1. При изучении разделения статических и динамических компонент для туше-
ния акридона иодид-ионами были получены следующие данные (в воде при 26°С)[43];

Г KI], м  0	(KNOJ, 1,10	М	F /Г [ 1,0]
0,04	1,06		4,64
о.ю	1,00		10,59
0,20	0,90		23,0
0,30	0,80		37,2
0,50	0,60		68,6
0,80	0,30		137

KNO2 применяется для поддержания постоянной ионной силы и не тушит флуоресцен-
цию акридона. Решите следующие задачи, приняв 17,6 нс;

1.	Постройте график Штерна — Фольмера.

2.	Определите динамическую (Кдин) и статическую (кст) константы тушения.
Используйте квадратичное уравнение для определения Кдин и Кст из наклона и от-
секаемого' отрезка графика зависимости Ккаж от [ Q ].

3.	Вычислите наблюдаемую бимолекулярную константу тушения.

4.	Вычислите диффузионно-контролируемую бимолекулярную константу тушения
и эффективность тушения, константа диффузии KI в воде равна 2,065 • 10~Б см2/с
для 1 М KI [46].

5.	Объясните полученное значение для сферы действия и статической константы
тушения с учетом природы комплекса.

9-2. Ниже приведены времена затухания и относительные квантовые выходы
флуоресценции хлорида 10-метилакридиния (MAC) в присутствии аденозин монофосфа-
та [30]:

[АМР], мМ	т, нс	F (интенсивность)
0	32,9	1,0
1,75	26,0	0,714
3,50	21,9	0,556
5,26	18,9	0,426
7,00	17,0	0,333

Ответьте на следующие вопросы, касающиеся тушения флуоресценции МАС:

1.	Является ли тушение флуоресценции динамическим, статическим или смешан-
ным?

2.	Чему равны константы тушения?

3.	Чему равна константа ассоциации комплекса МАС — АМР?

4.	Объясните значение статической константы тушения.

5.	Предположим, что комплекс АМР - МАС полностью не флуоресцирует и образо-
вание комплекса сдвигает спектр поглощения МАС. Будет пи корректированный спектр
возбуждения МАС в присутствии ненасыщающих концентраций АМРсравним со спектром
поглощения МАС или со спектром комплекса МАС - АМР?

9-3. Как известно, кислород растворяется в водных и огранических растворах и
является динамическим тушителем флуоресценции, влияя на интенсивности и времена
затухания флуоресценции. Определите, чему равны времена затухания, выше которых
растворенный кислород из атмосферы будет вызывать изменения в интенсивности и
временах затухания флуоресценции, превышающие предел точности 3%? Укажите време-
на затухания для водных и этанольных растворов. Для ответа на этот вопрос исполь-
зуйте следующую информацию: к. |й воде) г. 1 . Ю10М"’ • с"1; k (в этаноле)
= 2 • 10 М -с . Растворимость кислорода в воде составляет 0,001275 М при пар-
циальном давлении 1 атм. В этаноле кислород в пять раз лучше растворим, чем
в воде.

9-4. Флуоресценция флавинадениндинуклеотида тушится как статически в резуль-
тате образования комплекса между флавиновым и адениновым кольцами, так и дина-
мически в результате столкновений между этими двумя частями. Используя следую-
щие данные для FAD и флавинмононуклеотида, вычислите долю комплекса f и констан-
ту скорости дезактивации флавина k при столкновениях с адениновым кольцом:

t(FMN) = 4,6 нс; Q(FMN) = 1,0 (принимается за единицу)

t(FAD) = 2,4 нс; Q(FAD) 0,09

FMN подобен FAD, за исключением того, что в нем нет аденинового кольца. Q — от-
носительный квантовый выход. Обратите внимание, что константа скорости дезактива-
ции измеряется в обратных секундах (с~1).
9-5. Пусть имеется белок, состоящий из четырех идентичных субъединиц, каждая
из которых содержит два триптофановых остатка. Предположим, что они оба флуорес-
цируют при возбуждении на 280 нм. Получены следующие данные для интенсивности
флуоресценции в присутствии иодида:

([-], М	0	0,01	0,03	0,05	0,10	0,20	0,40

/	1,0	0,926	0,828	0,767	0,682	0,611	0,563

Ответьте на следующие вопросы, касающиеся тушения флуоресценции белка;

1.	Какая часть общей флуоресценции триптофана доступна для тушения? Какие
особенности графика в координатах Штерна — Фольмера указывают на существование
недоступной для тушения фракции?

2.	В предположении, что все триптофановые остатки имеют одинаковые кванто-
вые выход и время затухания (5 нс), определите, сколько триптофановых остатков
доступно дпя тушения?

3.	Чему равны бимолекулярные константы тушения дпя доступных и недоступных
остатков?

4.	Предположим, что можно селективно возбуждать доступные триптофановые
остатки при 300 нм. Постройте предполагаемый график Штерна — Фольмера и моди-
фицированный вариант графика Штерна — Фольмера для доступных и недоступных ос-
татков.

9-6. Часто бывает необходимо вычислить эффективность тушения для конкрет-
ной комбинации флуорофор — тушитель, но данных по коэффициентам диффузии флуо-
рофора и тушителя в литературе нет. Оценку этих значений можно провести по номо-
граммам Отмера и Такара (рис. 9.26). Используйте следующие результаты для вычис
пения эффективности, с которой N-этилкарбазоп тушится у-гексахлорциклогексаном
(линданом):	т _	т _

[линдан], М	(этанол, 37°С)	(циклогексан, 37°С)
0,0	12,8	14,7
0,01	11,0	11,36
0,02	9,6	9,26
0,03	8,54	7,81
0,04	7,68	6,76

Для применения номограммы необходимы следующие физические данные:

Вещество	Данные	Литература
N-Этилкарбазол	Мол. масса 195,3 г/мопь;	46

р <: 1,059 г/см3 (4°С); V = 184,4 см3/моль

Линдан	Мол. масса 290,85 г/мопь;	46

р 1,88 г/см3; V 154,7 см3/моль

Этанол	П 1,194 сП (20°С);  △Ир, - 9,22 ккал/моль  (этанол)	9,22  △Ww(BOfla)	9,7171	г 0,949	47
|"| r-г Т-|-| 1"ТТ'|'|-'П^ТТ] | '| |"| | 1"| I Г j ГГПТ!'|"ГГрЧ1 If 11ITJIII 1|1ГГТ^|,11|1Ч1|Чнр| Ггр'П||р|||ТПфТП|

S



Температура раствора, °C

Z.J « Моляльная латентная
теплота раствора

Z w= Моляльная латентная
теплота воды

Линия сравнения /в /

.CJ

„а

jj-вязкость растворителя при 20/С в сП

Температура водь/, °C \

Й $	§	§ \ S S 5§ |

।	I .i..j.i.Ljl_i .1111.1111 i.l.i.i.i.i lii.Ltli.i.i.i l.mj.lj^tilij.i,i.l.Liiiliiiiliiiiliuilniil

Линия сравнения JV~-2	/

Моляльнь/й объем диффундирую-
щего вещества, смэ/моль

ПТФ|11'|’Т1Т|П1|| 111 ЦП i|ipf гто<Сцгртпр 111 |\Г|П1 |Т|1|фр|1|11

* в IS 1 I I

/Коэффициент диффузии, (см z/c)’10s

о> л	5лллл js>\ „е> <э <з

to <5 ч> а са о Q/о	O<oo>s)0i4\^ cj Ъ

iLuilIlIllllIll IiIiIIiIiIIIIiwLbIiiHIi.IJ^LuJ.LiII.I.UII I,J.Illi LbluluilL.U.I,Ul.lLlllln\ll.UlllIlli II,1,1,111

РИС. 9.26. Номограмма для расчета коэффициентов диффузии в разбавленных
растворах [271.
Циклогексан л --- 0,960 сП (20°С); Ан^ = 7,19 ккал/моль	48

АН (циклогексан)
...L_____________= 0,740

АНу (вода)

Для решения этой задачи вычислите сначала коэффициенты диффузии флуоро-
фора и тушителя, а затем бимолекулярную константу в предположении 100%-ной эф-
фективности тушения. Необходимые молекулярные радиусы могут быть найдены из
молекулярных объемов. И наконец, эффективность тушения может быть получена из
сравнения наблюдаемой и вычисленной констант тушения.

20-413
Глава 10

Перенос энергии

Флуоресцентный перенос энергии - это перенос энергии возбужденного
состояния от донора d к акцептору а. Он происходит без промежуточного
испускания фотонов и является в основном результатом диполь-дипольных
взаимодействий между донором и акцептором. Скорость переноса энергии
зависит от степени перекрывания спектра испускания донора со спектром
поглощения акцептора, относительной ориентации дипольных моментов пере-
ходов и расстояния между молекулами. Именно эта зависимость от расстоя-
ния привела к широкому использованию переноса энергии для измерения
расстояний между донорами и акцепторами. Для таких измерений необходи-
мо, чтобы пара d -а была разделена расстоянием, которое но изменялось
бы за время жизни возбужденного состояния донора. В дополнение к этому
мы также рассмотрим применение переноса энергии для определения распре-
деления расстояний между парами d - а, скорости взаимной диффузии d и а
и расстояния максимального сближения. Зависимость флуоресцентного пере-
носа энергии от всех перечисленных факторов обеспечивает значительные
возможности использования метода для биохимических исследований.

В этой главе будет рассмотрен безызлучательный перепое, который про-
исходит в результате диполь-дипольного взаимодействия между донором и
акцептором и не является простым испусканием и перепоглощением фотонов.
Последнее - излучательный перенос, зависящий от менее интересных оптичес-
ких свойств образца, таких, как размер кюветы с образцом, оптические плот-
ности образца на длинах волн возбуждения и флуоресценции и точная геомет-
рия пучков возбуждающего и испускаемого света. В противоположность этим
тривиальным факторам безызлучательный перенос энергии содержит богатую
информацию касающуюся подробностей строения молекул донорно-акцептор-
ных пар. Константа скорости переноса энергии от специфического донора к
специфическому акцептору кт определяется выражением

1 / Р° \6

к =----- (____)	(10.1)

Т ,	' г /

а

где rd ~ время жизни возбужденного состояния донора в отсутствие акцепто-
ра; г - расстояние между донором и акцептором; - характеристическое
расстояние;, называемое форстеровским радиусом, при котором эффективность
переноса составляет 50% [ 1]. Такая зависимость скорости переноса от рас-
стояния привела к многочисленным применениям переноса энергии в биохими-
ческих исследованиях, в особенности потому, что фёрстеровский радиус нахо-
дится в пределах 20 - 50 А. Этот диапазон расстояний сравним с диаметром
большинства белков и толщиной биологических мембран. Любые явления, кото-
рые оказывают влияние на расстояние d - а, будут влиять на скорость пере-
носа энергии, что позволяет их количественно охарактеризовать. Например,
измерение переноса энергии было использовано для опенки расстояния между
связывающими центрами белков, расстояния между хромофорными группами
белков и другими, связанными с мембранами хромофорами, латеральной ас-
социации мембранных компонентов, реакций ассоциации между макромолеку-
лами. В этих приложениях используется степень переноса энергии между
фиксированными донорами и акцепторами для установления расстояния между
ними [ 2,3].

Новое и в равной степени интересное приложение метода переноса энер-
гии - определение статических и динамических конформационных свойств
макромолекул в растворе [ 4]. При детальном анализе кинетики затухания флу-
оресценции донора можно в принципе определить распределение расстояний
между парами d - а и скорость, с которой донор и акцептор диффундируют
относительно друг друга. С помощью таких измерений можно было бы вы-
являть детали структурной гетерогенности макромолекул и структурные флу-
ктуации этих молекул на сравнительно больших расстояниях (~40 А). В настоя-
щее время подобный детальный анализ требует тщательной оценки как при по-
лучении, так и при интерпретации спектральных данных, Тем не менее выяв-
ленные возможности метода переноса энергии скорее всего приведут к не-
прерывному развитию необходимых методов.

В заключение будет рассмотрен перенос энергии в предельном случае
быстрой диффузии. В этом случае не имеют значения ни пространственное рас-
пределение донора и акцептора, пи их скорости диффузии. Эффективность пере-
носа энергии ограничивается только расстоянием максимально возможного
сближения между донором и акцептором. Это явление может быть использова-
но для определения глубины залегания хромофоров в мембранах или белках по
отношению к поверхности раздела макромолекула/вода.

Следует отметить, что изучение переноса энергии дает молекулярную ин-
формацию, отличающуюся от той, которая может быть получена из релаксации
растворителя, реакций в возбужденном состоянии, тушения и поляризации флу-
оресценции. Все перечисленные спектральные свойства флуорофоров характе-
ризуют в первую очередь их взаимодействие с другими молекулами в окружаю-
щей сольватной оболочке. За исключением влияния на спектральные свойства
донора и акцептора, эти взаимодействия менее важны для переноса энергии.
Безызлучательный перенос энергии эффективен на расстояниях до 50 А. Нахо-
дящийся в этом промежутке растворитель или макромолекула слабо влияют на
эффективность переноса энергии, которая главным образом зависит от рассто-
яния d - a. В следующем разделе изложена простейшая теория безызлучатель-
ного переноса энергии и обсуждены те факторы, которые ограничивают ее
использование. Эта теория приложима к парам d - a, находящимся на фикси-
рованном расстоянии. Для анализа других часто встречающихся ситуаций не-
обходимо более сложное математическое описание. Для иллюстрации широких
возможностей метода переноса энергии будут приведены типичные примеры.

10.1.	Теория переноса энергии для донорно-акцепторных пар

Рассмотрим донор и акцептор, находящиеся на фиксированном рас-
стоянии г. Константа скорости переноса энергии от d к а определяется выра-
жением

,	9000 (In 10) к2	Fly), (v)

кТ =---------------- f	„ dv	(10.2)

128тг5 n4 Агбт 0 v4
a

кт =(г-б/к2п“\)'8,71‘1023 с"1	(10.3)

где <prf - квантовый выход донора в отсутствие акцептора; п - показатель пре-
ломления среды; А - число Авогадро; г - расстояние между донором и акцеп-
тором; - время жизни возбужденного состояния донора в отсутствие ак-
цептора; Fd(v) - нормированная интенсивность флуоресценции донора
в шкале волновых чисел в диапазоне от v до v + A ?, причем суммарная интен-
сивность принимается равной единице; е д (v) - коэффициент экстинкции
акцептора, соответствующий волновому числу 7;	(= ф^/т^) - константа

скорости испускания донора; к2 - фактор, описывающий взаимную ориента-
цию в пространстве дипольных моментов переходов донора и акцептора
(рис. 10.1). Интеграл перекрывания J, отражающий степень спектрального
перекрывания между испусканием донора и поглощением акцептора, может
быть записан в другой форме в шкале длин волн (Л):

J =7г(/(Л)ео(Л)Л4А	(10.4)

о
/|'=а 4

К~1

РИС. 10.1. Диполи донора и акцеп-
тора, находящиеся на фиксированном
расстоянии г.

Его размерность М"1- см3. ЕДл) - безразмерная величина. Размерность
еа(Л) ™ М”1 • см""1. Постоянные члены в уравнении (10.2) обычно объединяют
для определения фёрстеровского радиуса Я как расстояния, на котором кон-
станта скорости переноса энергии равна константе скорости затухания
флуоресценции донора в отсутствие) акцептора (Г^ = tJ1). На этом расстоянии
половина молекул донора дезактивируется за счет переноса энергии, а поло-
вина - по обычным излучательным или безызлучательным механизмам. Из
уравнения (10.2) и kT « т”1 получаем

9000(1п 10) к\ - ^d(v)%(v)

____________ у ________________

128тг5/Уп4	0 v4

(Ю.5)

Используя определение и уравнение (10.2), легко показать, что константа
скорости переноса энергии определяется простым выражением:

Постоянные члены в уравнении (10.5) могут быть объединены:

R о « 9,79 • 103(к2 n~4<pd/ )1/в (в ангстремах)	(10.7)

Я® = 8,8 • НГ25 (к2n~4q>dJ) (в сантиметрах)	(10.8)

Часто измеряют эффективность переноса энергии Е, которая определяется
как отношение числа поглощенных донором фотонов к числу фотонов, перене-
сенных на акцептор:

к гр	к т

Е =------- = ---------- (Ю.9)

^+kT rd + kT

Эффективность переноса энергии часто вычисляют, исходя из относительно-
го квантового выхода флуоресценции в присутствии (Fda) и в отсутствие
(Frf) акцептора или времен затухания в этих же условиях и соответ-
ственно):

E-l~^da^d> " Е‘ 1 ~{Fda^d1	(10.10), (10.11)

Уравнение (10.10) можно получить из (10.9), если учесть
т, =	(Г ,	+ кт)	1 И к,г	= т /	—т ?	.

da	' d I	Г da d

Уравнение (10.11) можно вывести, если принять во внимание, что Fda/ Fd
- г d^d + кт^' Эффективность переноса энергии можно непосредственно свя-
зать с расстоянием:

Е =/?бо/(Л® + г6)	(Ю.12)

Это уравнение получается при подстановке (10.6) в (10.9).

Важно осознать, что предположения, использованные при выводе этих
уравнений, применимы только к допорпо* акцепторным парам, разделенным
фиксированным расстоянием. Эта ситуация часто встречается для маркирован-
ных белков, по фиксированных допорпо-акцепторпых расстояний, как правило,
не бывает ни для смеси донора и акцептора в растворе, ни для доноров и ак-
цепторов, равномерно распределенных в мембране. В этих случаях необ-
ходимы более сложные выражения, и их, как правило, выводят путем усред-
нения константы скорости переноса в соответствии с предполагаемым про-
странственным распределением допорпо-акцепторных пар. Далее,фиксирован-
ные расстояния d - а приводят к единственной скорости переноса, и, как
следствие, кинетика затухания интенсивности флуоресценции должна быть
одноэкспоненциальной. Одноэкспопенциальпые кинетики затухания флуорес-
ценции донора не ожидаются и не наблюдаются для случаев, когда расстоя-
ние d - а не является фиксированным (разд. 10.6).

Если считать модель с единственным расстоянием d - а приемлемой, то
легко заметить, что скорость переноса энергии зависит от расстояния /? , ко-
торое в свою очередь определяется величинами к, n, <prf и J , которые должны
быть известны для вычисления расстояния. Показатель преломления обычно
известен из состава растворителя, cprf определяют путем сравнения со стан-
дартными соединениями, а интеграл перекрывания для пары d ~а должен
быть вычислен. Чем больше интеграл перекрывания спектра испускания доно-
ра со спектром поглощения акцептора, тем больше значение /? Акцепторы с
большим коэффициентом экстинкции приводят к большим значениям R&, Важ-
но отметить, что в уравнениях, приведенных выше, предполагается, что при
связывании с акцептором время затухания флуоресценции донора не изменя-
ется по каким-либо иным причинам кроме безызлучательного переноса энер-
гии. Для маркированных макромолекул это пе всегда может быть так. Алло-
стерические взаимодействия между центрами связывания донора и акцептора
могут изменить время затухания для донора за счет или усиления других про-
цессов затухания, или, наоборот, предотвращения этих процессов [6]. В та-
ких случаях необходим более сложный анализ кажущейся эффективности пе-
реноса (разд. 10.7).

Зависимость Я от спектрального перекрывания иллюстрируется рис. 10.2,
на котором представлены данные для переноса энергии от изомеров маркиро-
ванного дансилом фосфатидилэтаноламина (DPE) к маркированному эозином липи-
ду (ЕРЕ). Все изомеры DPE обладают разными спектрами испускания [7]. Чем боль-
ше спектр изомеров DPE сдвинут в длинноволновую область, тем сильнее пере-
крывание со спектром поглощения ЕРЕ и тем больше значение Rq (табл. 10.1),
Видно, что /?0 не сильно зависит от J . Это происходит из-за зависимости от
корпя шестой степени в уравнении (10.7).

Важным в анализе ‘к|)фективности переноса энергии является ориента-
ционный дщктор к2 , который определяется выражением

к2 (cos 0„, — 3 cos 0 , cos 0 )2	(10.13)

/	а а'

где 0f/, - угол между диполем испускания донора и диполем поглощения акцеп-
тора; 0^ и 0(1 - углы между этими диполями и вектором, соединяющим донор
и акцептор (рис. 10.1). В зависимости от взаимной ориентации донора и акцеп-
тора этот фактор может изменяться от 0 до 4. /(ля направленных в одну сто-
рону и параллельных диполей переходов к2 4, для противоположно направлен-
ных и параллельных динолей к2 1. гГак как для вычисления расстояния берет-
ся корень шестой степени, то изменение к2 от 1 до 4 приводит к погрешности
в определении г всего лишь 26%. Однако если диполи ориентированы перпен-
дикулярно один к другому, то к2 = 0, что может привести к серьезным ошиб-
кам при вычислении расстояния. Эта проблема подробно обсуждается в рабо-
тах [8, 91. Измеряя анизотропию флуоресценции донора и акцептора, можно
установить пределы изменения к2 и, таким образом, минимизировать неопре-
деленность в вычислении расстояния. Вообще неопределенность в значении
Относительная интенсивность возВулсвения или испускания

300	400	500	000

Длина волны, нм

РИС. 10.2. Спектры возбуждения и
испускания флуоресценции маркирован-
ных дансилом и эозином липидов [7].

1 - испускание; 2 - возбуждение. Дан-
силом и эозином маркированы произ-
водные фосфатидилэтаноламина. Числа
соответствуют расположению диэтил-
аминоэой и сульфонильной групп в на-
фталиновом кольце. Коэффициент эк-
стинкции ЕРЕ равен 85 000 М"1. см-1
при 527 нм. (С разрешения American
Chemical Society.)

Таблица 10.1» Вычисленные значения/?о [7]

Донор	Акцептор		/, М"1- см3	«0-*
1,5-0РЕа	ЕРЕ6	0,37	2,36 -Ю"13	48,7
2,5-DPE	ЕРЕ	0,76	1,54‘Ю”13	51 „2
2,6-DPE	ЕРЕ	0,71	3,31 -ю-*14	39,1
2,6-DPE	2,5-DPE	0,71	1,3 • 10“15	22,8

Маркированный дансилом фосфатидилэтаноламин.
$ Маркированный эозином фосфатидипэтанопамин.
к2, по-видимому, не приводит к большой погрешности в вычислении расстоя-
ний. Обычно принимают к2 = 2/3, что соответствует беспорядочной ориента-
ции доноров и акцепторов за счет вращательной диффузии до переноса энергии.
Это значение обычно и используют для вычисления Я . Альтернативно можно
принять, что имеется диапазон статических ориентаций донора и акцептора,
нс изменяющихся за время жизни возбужденного состояния. В этом случае
к2 = 0,476 [ 3]. Для флуорофоров, связанных с макромолекулами, сегменталь-
ные движения донора и акцептора могут разупорядочивать ориентацию. Более
того, если поляризация донора и акцептора мала (< 0,3), то погрешность в
расстоянии, вероятно, будет менее 10% [10].

. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ЗАВИСИМОСТИ ПЕРЕНОСА
ЭНЕРГИИ ОТ г6. Согласно теории безызлучательного диполь-дипольпого пере-
носа энергии, для фиксированных расстояний между донором и акцептором
эффективность переноса энергии зависит от г6, где г - расстояние между мо-
лекулами донора и акцептора. Предсказанная зависимость от расстояния была
подтверждена экспериментально, и полученные результаты иллюстрируют ин-
терпретацию данных по переносу энергии. В работах [ 11] и [12] изучены оли-
гомеры поли-ь-пролина, маркированного по противоположным копкам наф-
тилом (донор) и дансилом (акцептор) (рис. 10.3). Число пролиновых остатков (п)
между этими флуорофорами варьировалось от 1 до 12. Поли-ь-пролин обра-
зует жесткую спираль с известными атомными размерами, что обеспечивает
фиксированное расстояние межд^ донорными и акцепторными участками в
диапазоне от 12 А (п - 1) до 46 А (п « 12).

Спектры возбуждения этих производных приведены па рис. 10.4. Эффек-
тивность переноса эпергйи определяли по проявлению флуоресценции акцепто-
ра при возбуждении донора. Дансил-ь-про лилгидразид не содержит донора, и,
следовательно, его спектр возбуждения принимается за спектр, соответствую-
щий 0% переноса. При любой данной длине волны об эффективности переноса
энергии Е можно судить по амплитуде спектра возбуждения акцептора а в со-
ответствии с А ~ е д -t- Eed , где е а и е d - коэффициенты экстинкции акцепто-

РИС. 10.3. Структура дансил (1>-пролил)п-а-нафтила, использованного для изуче-
ния переноса энергии [11].
РИС. 10.4. Спектр возбуждения дансил-пролиловых молекул.

1 - дансил-Ь-пролил-а-нафтил, 100% переноса; 2 — дансил(^-пролнл)п-а-нафтил
(и = 5, 7, 8, 10 и 12); 3 — дансил-Ь-пролилгидразид, 0% переноса. (С разрешения ав-
торов работы [ 11].)

ра и донора соответственно . Для даней л-ь-пролил-а-нафтил а, в котором до-
нор и акцептор расположены близко, эффективность переноса энергии состав-
ляет 100%. Для этой донорно-акцепторной пары наибольшая чувствительность
спектра возбуждения к переносу энергии наблюдается при 290 нм - максиму-
ме поглощения нафтилового донора. Для других производных эффективность
переноса имеет промежуточное значение и зависит от длины прокладки из
ь-пролина. Эффективность переноса энергии определенно уменьшается с уве-
личением длины прокладки.
РИС. 10.5. Зависимость эффективности переноса энергии в дансил(Ь-пролил)-а-
нафтиле от расстояния (п = 1 - 12).

(С разрешения авторов работы [ 11].)

Целью этих экспериментов было определение зависимости безызлучатель-
ного переноса энергии от расстояния. Следовательно, было принято, что
эффективность переноса энергии зависит от расстояния в соответствии с
уравнением

VUr)>

Е^^А—^	(10.14)

(/?0/r)Zl-l

где /? и г имеют их обычный смысл, а / - показатель степени, который не-
обходимо определить из наблюдаемой зависимости Е от т. Преобразование
уравнения (10.14) дает

1g <Е~' - 1) = / lg г -/ 1g /?0 .	(10.15)

Следовательно, график зависимости 1g (£“г - 1) от 1g г имеет наклон /
(рис. 10.5). Наклон равен 5,9 ±0,3 [ 11, 12]. Из этого превосходного соответ-
ствия с предсказываемым значением j « 6 авторы работ [11, 12] заключили,
что перенос энергии описывается теорией Фёрстера. В этих экспериментах по-
ляризация акцептора, возбуждаемого за счет переноса энергии, была равна
нулю, даже когда опа измерялась в застеклованном растворителе. Это указы-
вает на разупорядочивапие поляризации в ходе переноса энергии и корректность
использования vA= 2/3. Важным аспектом рассматриваемых экспериментов яв-
ляется наличие жесткой прокладки между донором и акцептором. Если бы
прокладки были гибкими, то существовало бы распределение расстояний меж-
ду донором и акцептором, что сильно усложнило бы анализ. Более того, если
бы прокладка не была жесткой, то расстояние между парами донора и акцепто-
ра могло бы меняться в течение времени жизни возбужденного состояния, что
также могло бы привести к значительному усложнению анализа данных. В
разд. 10.4 будет показано, как такие усложняющие обстоятельства могут быть
учтены при использовании кийетики затухания флуоресценции донора.

В работе [13] проверялась зависимость скорости переноса энергии в пер-
вой степени от интеграла перекрывания. Эти эксперименты обсуждаются в
задаче 10-1 в конце главы.

10.2.	Измерение расстояний методом переноса энергии

В предыдущем разделе была описана теория, пригодная в случае фикси-
рованного расстояния между донором и акцептором. Измерение скорости пе-
реноса энергии позволяет вычислить расстояние между донором' и акцептором -
метод, широко используемый в биохимических исследованиях. Превосходный
пример применения флуоресцентного переноса энергии для определения рас-
стояния между различными связывающими центрами белка можно найти в ра-
боте [ 14]. При подходящих обстоятельствах по этим расстояниям можно сде-
лать вывод о форме белка и локализации связывающих центров. Был изучен
родопсин - фоторецепторный белок пластинчатых мембран в палочках сетчат-
ки глаза позвоночных. Хромофорной областью родопсина является 11-10с-ре-
тиналь. Хромофор (ретиналь) изомеризуется при поглощении света, и это слу-
жит сигналом поглощения фотона. Максимум поглощения находится при 500 нм,
т.е. в области, благоприятной для проявления ретиналем акцептирующих
свойств по отношению к большому числу флуорофоров.

Родопсин маркировали в трех различных точках (А, Б и В) семью различ-
ными флуорофорами (рис. 10.6). Каждый из этих флуорофоров м^жет дониро-
вать энергию ретиналю с /? находящимся в диапазоне 33 — 51 А. Эффектив-
ность переноса энергии измерялась и по относительным квантовым выходам
в отсутствие (Qb) и в присутствии (Qd) акцептора, и по временам затухания
и Td (присутствие акцептора указывается индексом d). Под воздействием
света ретиналь обесцвечивается (индекс Ь), и исчезает его полоса поглощения
при 500 нм (рис. 10.7). Это благоприятное обстоятельство позволяет измерять
времена затухания и квантовые выходы в отсутствие переноса энергии просто по
обесцвечиванию акцептора. Вслед за обесцвечиванием ретиналя времена зату-
хания и квантовые выходы всех доноров возросли (табл. 10.2). Была получена
совершенно одинаковая эффективность переноса и по временам затухания, и
по измерению квантового выхода. Во всех случаях эффективность была низкой,
- Положение

н

РИС. 10.6. Структуры флуоресцентных зондов, использованных для маркирования положений А, Б и В родопсина.
(С разрешения авторов работы [14].)
450	SOO	550

Длина волны, нм

РИС? 10.7. а - перекрывание спектра испускания донора 1 со спектром поглоще-
ния группы 11-цис-ретин аля родопсина. 6— спектры испускания донора 1 до и после
фотообесцвечивания поглощения ретинапя.

(С разрешения авторов работы [14].)

что для различных донорно-акцепторных пар указывает на расстояния, большие
чем /?о. Как было описано ранее, если связывание жесткое, то относительная
ориентация донорно-акцепторных пар может влиять на значение к2 и, следова-
тельно, па вычисляемые значения расстояний г. В рассматриваемом случае
было использовано несколько разных допоров для каждого центра связывания
и получены приблизительно одинаковые расстояния для каждого центра связы-
вания и для каждого донора. Так как мало вероятно, чтобы относительная
Таблица 10.2. Характеристики переноса энергии на цис-рети-
наль [14]

Донора

7	2	3	4	5	6	7

Характе--------------------------------------------------

ристика	Центр связывания

	А	А	А	Б	Б	В	В
ОЛ  R , А° О'	51	45	41	52	42	33	41
V нс	1	19,4	17,8	2,0	11,5	2,5	3,5	3.6
VHC	21,3	18,5	2,1	17,9	3,2	4,0	4,7
	0,91	0,96	0,96	0,64	0,78	0,88	0,77
Qd,,Jb	0,91	0,94	0,97	0,64	0,80	0,80	0,79
Е, %	9	4	3	36	22	12	23
/ • 1013М~-	‘см3 1,84	1,75	0.31	1,29	2,26	1,38	1,87
г, Я®	75	75	73	57	52	46	49

Формулы соединений приведены на рис. 10.6.

б	2

В предположении, что к -- 2/3 и п - 1,4.

ориентация диполей излучения каждого донора была одна и та же, соответствие
между индивидуальными измеренными расстояниями указывает на то, что вли-
яние фактора ориентации на вычисленные расстояния мало.

Одним из интересных выводов работы [ 14] является большое вычислен-
ное; расстояние между центром А и областью ретиналя, которое составляет
75 А. Если бы молекула родопсина была сферической, ее диаметр не превы-
шал бы 40 - 45 А. Следовательно, расстояние 75 А между центром А и об-
ластью ретиналя указывает на вытянутую структуру молекулы (рис. 10.8).
Было также измерено расстояние между центрами А, Б и В. Измерения прово-
дились на обесцвеченном родопсине, что позволило избежать усложнений, свя-
занных с переносом энергии па ретиналь. В этом случае эффективность пере-
носа между центрами составляла 90% или больше (табл. 10.3). Полученные
результаты говорят о том, что центры находятся близко один от другого, но
все три центра расположены вдали от области ретиналя (рис. 10.8). Авторы ра-
боты [ 14] предположили, что три маркированных центра находятся в гидро-
фильной части родопсина, а Пчдос-ретиналь - в гидрофобной области, кото-
рая погружена в мембрану. Этот набор экспериментальных данных иллюстри-
Таблица 10.3. Характеристики переноса энергий
между хромофорами в центрах А,
Б и В обесцвеченного родопсина
[14]

Характе- ристика	Определенное расстояние		
	А->Б	А->В	Б->В
Пара d - a	1-5	1-7	4-7
„ °а  R , А  0	51	48	47
Т^, нс	21,3	21,3	17,3
т, , нс da	2,1	1,6	1,3
Е, %	90	92	93
MoV см3	1,6	1,14	0,76
Г.	35	32	30

В предположении к2 = 2/3.

РИС. 10.8. Модель молекулы родопсина, базирующаяся на наблюдаемых расстоя-

ниях между центрами.

(С разрешения авторов работы [ 14].)

рует трудности и важные особенности измерения расстояний, которые состоят
в получении однородно маркированных макромолекул с метками, находящими-
ся в известных центрах связывания. Без контроля процедуры маркирования
вычисление расстояний может быть только приблизительным.
10.3.	Обнаружение реакций ассоциации макромолекул по
переносу энергии

10.3.1.	Ассоциация молекул АТРазы в липидных везикулах

Во многих случаях полезная информация об ассоциации макромолекул мо-
жет быть получена методом переноса энергии, даже если эти данные но исполь-
зуются для определения расстояния между молекулами донора и акцептора.
'Гак, авторы работы [ 15] использовали перенос энергии между маркированны-
ми молекулами Mg24-Са24-АТРазы для того, чтобы определить, находятся
ли молекулы ЛТРазы в мембране в агрегированном состоянии.

Mg24-Ca 2+-АТРазы из саркоплазматического ретикулума маркировалась
отдельно 5-[ 2-(иодацетил)аминоэтил-5-аминонафталип- 1-сульфокислотой (1,5-
IAEDANS) и отдельно иодацетамидофлуороспеипом (IAF) (рис. 10.9). IAEDANS
является донором, a IAF - акцептором. Раздельно маркированные молекулы
АТРазы встраивались в разные фосфолипидные везикулы. В результате сме-
шивания раздельно встроенных молекул ЛТРазы было получено, что
спектр испускания представляет собой сумму спектров испускания раздель-
но маркированных молекул. Следовательно, во временной шкале данно-
го эксперимента по происходит переноса энергии между IAEDANS и
IAF. Это указывает па медленный обмен молекулами АТРазы между раздель-
но реконструированными везикулами. Однако если маркированные IAEDANS и
IAF молекулы АТРазы встраиваются в одни и тс же липидные везикулы, то
флуоресценция IAEDANS частично тушится, а флуоресценция IAF усиливается
(рис. 10.9). Эти результаты согласуются с появлением переноса энергии между
молекулами донора и акцептора. Возможно, наблюдаемый перенос энергии
может быть вызван просто близким расположением маркированных молекул
АТРазы при встраивании в одни и те же везикулы. Или точно так же перенос,
энергии может быть обусловлен латеральной диффузией мономеров АТРазы в
плоскости липидного бислоя. Эти возможности были проверены добавлением
избытка липида к разбавленному раствору АТРазы. Добавление липида, приво-
дящее к 10-кратному разбавлению АТРазы, по влияет на степень переноса
энергии. Наоборот, добавление 10-кратного избытка немаркированной АТРазы
ликвидирует перенос энергии. Оба наблюдения находятся в соответствии с об-
разованием агрегатов АТРазы в мембране!.

Эти эксперименты иллюстрируют, каким образом метод переноса энергии
может быть использован для прямой проверки наличия ассоциации между ма-
кромолекулами. Дальнейшая характеристика этой сие,темы требует более де-
тальных экспериментов. Из приведенных данных нельзя сделать вывод, обра-
зует ли АТРаза димер, тетрамер или другие агрегаты. Действительно, в эксцо-
IAEDANS

О

РИС . 10.9. Графическое представление переноса энергии между молекулами
АТРазы, маркированными IAEDANS и I АГ [15].

а - спектр испускания раздельно реконструированных комплексов АТРаза —
липид; б — спектр испускания совместно реконструированных комплексов АТРазы.
Точками показана вычисленная сумма индивидуальных спектров.

риментах не ставилась цель - выявить эти свойства. Степень маркирования
была различной - обстоятельство, которое может сильно усложнить более
тщательный анализ, но не влияющее на приведенные выше выводы.

10.3.2.	Димеризация грамицидина в липидных биспоях

В предыдущем разделе было показано, каким образом метод переноса
энергии может быть использован для выявления ассоциации молекул АТРазы,
но далее мы указали, что для определения стехиометрии реакции ас-
социации необходимы более точные количественные данные и более
специфическое маркирование. В работе [16] перенос энергии между маркиро-
ванными молекулами грамицидина был использован для определения того, что
грамицидин в мембранах образует димеры, а не высшие агрегаты. Грамицидин-
линейный полипептид, состоящий из 15 аминокислот, увеличивает проницаемость
мембран для ионов щелочных металлов и протонов. Концентрационная зависи-
мость проводимости мембран показывает, что проводимость возрастает про-
порционально квадрату концентрации грамицидина. Это свидетельствует о том,
что действующим началом является димер грамицидина.

Стратегией, использованной для изучения ассоциации грамицидина в мем-
бранах, было маркирование фенольного атома кислорода тирозина-11 молеку-
лами либо донора (дансила), либо - акцептора [ 4-(диэтиламино)-фепил-азобен-
зол-4-сульфонила, DPBS] (рис. 10ЛО). Форстеровский радиус для этой донорно-
акцепторной пары составляет 39 А. В использованных мембранах весь грамици-
дин ассоциирован. Если образуются димеры, то формами, присутствующими

РИС. 10-10- Графические зависимости относительных квантовых выходов дан-
силграмицидина от мольной доли акцептора — DPBS-грамицидина [ 1б].

а — теоретические кривые для моделей димера; б — для тримера:, в — для тет-
рамера. Точки соответствуют экспериментальным значениям. Предполагаемая
эффективность переноса энергии для димера и тетрамера приведена в процентах.
в мембране, являются DD, АА и AD-; между ними существует равновесие:
И) a- AD^DD + AA	(10.16)

где О и А обозначают частицы, маркированные донором и акцептором соответ-
ствеппо. Форма димера, содержащая два донора (DD), должна флуоресцировать
в два раза сильнее, чем димер, содержащий только один маркированный доно-
ром мономер. По отношению к такой же отдельной маркированной молекуле ин-
тенсивность флуоресценции AD должна уменьшаться до (1 - Е), где Е - эффек-
тивность переноса энергии. Естественно, А А не флуоресцирует. Принимая во
внимание эти рассуждения, отношение интенсивности флуоресценции F к интен-
сивности в отсутствие акцептора F можно записать в виде

F 2[ПРЬ(1-Е)[ЛО] Е[АЩ	,1П17Х

Fo 2[DI)]+[AD]	2[DD]+[AD]

Для модели димера было'показано, что F/Fq = 1 - Fa, где a - мольная доля
грамицидина, присутствующего в маркированной акцептором форме. Следова-
тельно, интенсивность флуоресценции донора должна уменьшаться линейно в
том случае, когда образуется только димер. Если при ассоциации грамицидина
образуются тример или тетрамер, то должно наблюдаться более быстрое умень-
шение F/F в зависимости от мольной доли акцептора. На рис. 10.10 приведены
экспериментальные данные и теоретические кривые для димеров, тримеров и
тетрамеров. Лучше всего подходит модель димера с эффективностью переноса
энергии 75%, хотя и следует отмстить, что исключение модели тримера только
па основании этих данных проблематично. Однако данные по проводимости так-
же подтверждают модель димера. Используя эффективность переноса 75% и зна-
чение /?о и 39 А, по уравнению (10.12) можно вычислить расстояние между дан-
сильным хромофором и DPBS равное 32,5 А.

10.3.3.	Связывание гемоглобина с мембранами красных кровяных
телец

При подходящих условиях измерение переноса энергии может быть исполь-
зовано для прямого количественного определения ассоциации между белками
и мембранами. Этот метод иллюстрируется связыванием гемоглобина (НЬ )
е обесцвеченными эритроцитами [ 17]. Обесцвеченные эритроциты маркирова-
лись 12-(9-антроилокси)стеариповой кислотой (12-AS), которая из-за отрица-
тельного заряда локализуется главным образом во внешнем слое эритроцит-
пых мембран. Существует значительное спектральное перекрывание испуска-
ния 12-AS г. полосой поглощения Соре гемоглобина (рис. 10.11). В результа-
те можно ожидать эффективного перенос,а энергии от 12-AS к 11Ь . 'Гак как
гемовые кольца в гемоглобине не флуоресцируют, тушение флуоресценции
РИС. 10.11. Спектр испускания обесцвеченных эритроцитов, маркированных
12-AS (7), и спектр поглощения гемоглобина (2) [17].

На оси ординат приведены молярные коэффициенты экстинкции тетрамера.

12-AS должно происходить беи какого бы то пи было появления сенсибилизи-
рованного испускания.

Влияние добавленного НЬ па флуоресценцию маркированных 12-AS мем-
бран показано на рис. 10.12. В этом случае взаимодействие между НЬ и мем-

Время

РИС. 10.12. Графическое представление влияния гемоглобина и соли на ин-
тенсивность флуоресценции обесцвеченных эритроцитов, маркированных 12-AS [17].

(С разрешения s American Chemical Society.)
бранями является в первую очередь электростатическим. Тушение может быть
снято добавлением соли. Это также свидетельствует о том, что тушение не бы-
ло вызвано эффектом внутреннего фильтра. Изменение интенсивности в ходе
титрования различными количествами НЬ можно использовать для опреде-
ления константы связывания и числа центров связывания на обесцвеченных
эритроцитах. Такая общая методика может быть использована и для других
систем. Однако для перехода от степени тушения к расстояниям между хро-
мофорами необходима болео сложная теория.

10.3.4.	Латеральная организация мембран

В качестве последнего примера использования стационарного флуоресцент-
ного переноса энергии обсудим, как такие измерения могут выявить предпочти-
тельное распределение или концентрирование липидов в определенных облас-
тях мембраны. Например, рассмотрим мембрану, содержащую области, кото-
рые находятся в жидком или твердом состоянии при данной температуре. Если
донор и акцептор оба распределяются в одну и ту же фазу, то следует ожидать
увеличения эффективности переноса энергии по сравнению со случайным рас-
пределением донора и акцептора между фазами. Наоборот, если донор и акцеп-
тор распределены в разные фазы, то степень переноса энергии должна умень-
шаться-опять-таки по сравнению со случайным распределением.

Для количественного анализа таких данных требуется знание степени пе-
реноса энергии, ожидаемой для флуорофоров, случайно распределенных на по-
верхности мембраны. Для решения этой сложной проблемы необходимо учесть
геометрическую форму бислоя (планарную или сферическую) и перенос между
донором и акцептором для случая, когда они находятся на одной и той же сто-
роне бислоя, равно как и для случая, когда они находятся на противополож-
ных сторонах бислоя. Были использованы различные подходы [7,17 - 20} и,
как правило, численное моделирование. Эти теории довольно сложны, и трудно
дать их краткий обзор. Однако некоторые результаты поучительны и иллюстри-
руют общий вид ожидаемых зависимостей.

Парис. 10.13 приведены предполагаемые эффективности переноса энергии
для донорно-акцепторных пар, местонахождение которых ограничено областью
бислоя на поверхности раздела липид/вода. Некоторые особенности этих пред-
сказываемых значений следует особо отметить. Эффективность переноса
энергии пе зависит от концентрации донора и растет с увеличением /?о . Толь-
ко малые количества акцептора (0,4%) могут приводить к легко измеряемому
тушению. Довольно легко понять, каким образом данные по эффективности
тушения за счет переноса энергии могут быть использованы для выяснения,
является ли распределение донора и акцептора случайным. Используя вычислен-
ное значение , сравнивают измеренную эффективность за счет переноса
РИС. 10.13..Графическое представление вычисленной эффективности переноса
энергии для донорно-акцепторных пар [17].

Указанные расстояния — это значения RQ для переноса энергии; (акцептор/фос-
фолипид) - мольная доля акцептора по отношению к фосфолипиду. (С разрешения
American Chemical Society.)

энергии с вычисленной. Если измеренная эффективность превышает вычислен-
ное значение, то это указывает на предпочтительное сближение доноров и ак-
цепторов внутри мембраны. Противоположная картина должна наблюдаться в
случае изоляции доноров от акцепторов в различных областях мембраны. Под-
черкиваем, что вычисленные значения строго справедливы только для переноса
энергии между донором и акцептором, иммобилизованными на одной стороне
планарного бислоя. Однако эта простая модель, как утверждают, является хо-
рошим приближением и для сферических бислоев [7]. Для малых значений /?о
перенос через бислой несуществен.

Интересно также проанализировать кинетику затухания флуоресценции доно-
ра в присутствии акцептора (рис. 10.14). Затухание начинает заметно отли-
чаться от экспоненциального, особенно при высоких концентрациях акцептора.
Это связано с зависимостью от времени распределения акцепторов вокруг
возбужденных доноров. В течение короткого времени, следующего за возбужде-
нием, еще существуют доноры с близко расположенными акцепторами, испуска-
РИС. 10.14. Рассчитанная кинетика затухания флуоресценции донора [7].

Вычислено при R()= 40 А. (С разрешения American Chemical Society.)



пие которых и затухает быстрее из-за близко расположенных акцепторов. Через
некоторое время доноры с близко расположенными акцепторами перестают
флуоресцировать, и испускание определяется главным образом донорами, вбли-
зи которых пет акцепторов. Время затухания для таких допоров дольше благо-
даря меньшей скорости переноса энергии. В принципе кинетика затухания
флуоресценции содержит большую информацию, но для реализации этой инфор-
мации требуются высокая точность измерений и усложненная теория. В более
общем случае (разд. 10.4) расстояние между донором и акцептором может
варьировать как в результате исходного набора расстояний, так и из-за диф-
фузии. Оба фактора влияют на скорость переноса энергии, и их необходимо
учитывать в такого рода анализах.

10.4.	Статическая и динамическая подвижность макромолекул,
выявляемая по кинетике затухания флуоресценции донора

Макромолекулы могут существовать в растворе в виде набора конформа-
ций, причем конформация индивидуальной молекулы может изменяться в ре-
зультате ее сегментальной гибкости. Эти различные явления, называемые ста-
тичесжой и динамической подвижностью, могут быть выявлены при измерении
кинетики переноса ‘энергии..

В предыдущих рассуждениях мы полагали, что молекулы донора и акцеп-
тора находятся друг от друга на определенном расстоянии, которое остается
неизменным в течение времени жизни возбужденного состояния донора. Одна-
ко известно много случаев, когда такое предположение неприменимо. Напри-
мер, рассмотрим молекулы донора и акцептора, расположенные па противопо-
ложных концах гибкой полипентидной цепи (рис. 10.15). Следует ожидать, что
существует набор расстояний между концами цепи. В жидкостях расстояние
между концами может изменяться вследствие диффузии за время жизни воз-
бужденного состояния. Так как скорость переноса энергии зависит от рас-
стояния d -а, можно полагать, что данные по переносу энергии будут отра-
жать й набор расстояний d - а, и скорость диффузии. Важность таких измере-
ний для биохимии очевидна. Широкий диапазон расстояний d - а может указы-
вать на набор центров связывания донора и акцептора. Более того, для марки-
рованных макромолекул скорость диффузии донора в направлении акцептора
может отражать зависящие от времени изменения в конформации макромоле-
кулы. В серии изящных экспериментов Стейнберг и соавторы [4, 21 - 23] ис-
пользовали кинетику затухания флуоресценции донора для определения как
вероятности распределения расстояний между концами молекулы, так и коэф-
фициентов диффузии для относительного движения концов макромолекулы.
Теория такого анализа относительно сложна, но идеи, лежащие в основе экспе-
риментов, в общем понятны, поэтому результаты будут подробно описаны.

В качестве модельных соединений были выбраны дансил- и нафтилмарки-
роваппые олигомеры №-(2-гидроксиэтил)-ь-глутамата(рис„ 10.15). Контроль-
ным соединением, пе содержащим акцептора, служило соединение И. В проти-
воположность прокладке из поли-ь-пролина, выбранной авторами работы [ 11],
эта гибкая прокладка позволяла донору и акцептору находиться на различных
расстояниях друг от друга. Были проведены две серии экспериментов. Первая -
в вязком растворителе - глицерине. В нем предполагается существование на-
бора расстояний d -а, но коэффициент относительной диффузии концов мал.
Следовательно, на скорость переноса энергии влияет только набор расстояний.
Во второй серии экспериментов вязкость глицерина уменьшалась за счет до-
бавления трифторэтанола. При низкой вязкости расстояния донор - акцептор
могут значительно изменяться за время жизни возбужденного состояния доно-
ра. Этот процесс увеличивает скорость переноса энергии. В сильно вязком
растворителе распределение вероятностей расстояний между концами f (г) опре-
делялось путем сравнения затухания флуоресценции донора во времени [/(«)]
с ожидаемым для предполагаемой вероятности распределения. Для этого необ-
СНЭ

СН3—С—О—С NH — СН — С

NH—СН—СН2

СНз

(СН2)2

('==()

NH

NH

(СН2>2

(СН2)2ОН

он

О

0

4

РИС. 10.15. Структурные формулы содержащих хромофор олигопептидов, ис-
пользуемых для изучения статической и динамической внутримолекулярной подвиж-
ности методом переноса энергии [21].

Повторяющимся фрагментом является №-(2-гиДроксиэтил)-Ь-глутаминовый
остаток (п= 4 — 9)- в соединении II акцептор энергии отсутствует. (С разреше-
ния John Wiley and Sons.)

ходимо моделирование затухания во времени для предполагаемых значений
f(r)o Типичное модельное распределение приведено на рис. 10.16. Среднее или
усредненное расстояние между донором и акцептором находят по положению
максимума вероятности на оси х. Высота распределения а отражает его шири-
ну , Это просто параболы.

Кинетика затухания флуоресценции донора довольно чувствительна к усред-
ненному расстоянию d - а и к ширине распределения вероятности. Предполагав-
РИС. 10J6. Гипотетическое распределение расстояний между донором и
акцептором.

Функциями распределения являются нормированные параболы вида f(f) = a -
- 1б/9а 8(г -ц)2, где а -высота, ц -середина параболы. Расстояние донор - акцеп-
тор равно г. (С разрешения авторов работы [22].)

мое затухание может быть вычислено по уравнению

00  Г	t

l{t) » к f f(r) exp _-—

0	1	Td

(10.18)

где к — константа. Природа этого выражения может быть понята, если вспом-
нить, что па данном расстоянии г константа скорости затухания донора опре-
деляется как т;1 = т?1 + т?1 (К Л)6- В Уравнении (10.18) индивидуальные кон-
da « а о
станты скоростей затухания усредняются по всему набору возможных расстоя-
ний, и вес каждого расстояния определяется функцией /(г). Моделирование кине-
тики затухания интенсивности приведено па рис. 10.17. Вид этих кинетик слож-
ный, но два факта очевидны. Во-первых, при более коротких средних значениях
расстояния d - а общее затухание / (t) происходит более быстро. Во-вторых,
на кинетику влияет вид /(г), в том числе ширина распределения функции вероят-
ности. Отсюда следует, что вид кинетики затухания может быть подогнан
на основании предполагаемых значений/(г) и действительное распределение
может быть выбрано на основе'наилучшего совпадения с экспериментальными
данными.

Типичные кинетики затухания приведены на рис. 10.18. Для контрольного
соединения [I, не содержащего акцептора, кинетика затухания одпоэкспонен-
циальиа (рис. 10.18, а). Это важный результат, поскольку известно, что для
многих веществ характерна более сложная кинетика затухания, особенно в
вязких растворителях, где времена релаксации растворителя сравнимы с вре-
менами жизни возбужденного состояния. Донор (нафтил) не содержит полярпо-

РИС. 10.17. Моделирование затухания флуоресценции донора l(t) на ЭВМ.

а и ц имеют тот же смысл, что и на рис. 10.16. (С разрешения авторов работы
[22].)
Время, нс

РИС. 10.18. Кинетики затухания соединений II (а) и I)G8N (б и в).

C(t) описывает вспышку лампы, F(t) — наблюдаемое затухание, Vс (i) — вычис-
ленное затухание, а — т = 61 нс для одной экспоненты; б - наилучшее соответствие
для одной экспоненты; в—.наилучшее соответствие при использовании гиперболи-
ческой функции распределения вероятности расстояний между концами. (С разреше-
ния авторов работы [21 ].)
го заместителя в кольце, вследствие чего он должен быть нечувствителен к
релаксации растворителя. Для донорно-акцепторной пары DGgN (дане,ил - глу-
тамин - нафтил) кинетика затухания явно неэкспоненциальна (рис. 10.18,б).
Природа такого сложного затухания определяется набором расстояний между
концами молекулы. В течение короткого времени, следующего за возбуждаю-
щим импульсом, наблюдаемое затухание более быстрое, а при долгих време-
нах - более медленное, чем одноэкспоненциальное. Такое распределение вре-
мен затухания связано с первоначальным быстрым затуханием флуоресцен-
ции близко расположенных пар d - а, за которым следует более медленное
затухание пар d - а, находящихся на больших расстояниях друг от друга. На-
блюдение неэкспонепциального затухания для случая, когда известно, что за-
тухание донора в отсутствие акцептора должно быть одноэкспонснциальпым,
доказывает, что пары d - а не одинаково расположены па одном расстоянии.
Если бы это было так, то существовала бы только одна константа скорости
переноса энергии и затухание для донора было бы одноэкспоненциальным.

Неэкспоненциальное затухание флуоресценции донора легко описать, ис-
пользуя уравнение (10.18), в котором /(г) - параметр подгонки (рис. 10.18, «)„
На основании такого анализа было установлено распределение вероятности рас-
стояний между концами каждого маркированного олигомера (рис. 10.19). По
мере увеличения длины прокладки увеличивается среднее расстояние d - а . но

РИС. 10.19. Распределение вероятности, полученное для маркированных олиго-
меров из кинетики затухания флуоресценции донора.

Предполагается, что f(r) не парабола, а функция вида 4ттг2ехр[-а(г -fe)2].
Числа соответствуют олигопептидам I и П (рис. 10.15). (С разрешения авторов ра-
боты [21].)
более заметно возрастание уширения кривой распределения расстояний. Эти
результаты иллюстрируют возможности метода переноса энергии для установ-
ления подробностей статических конформаций макромолекул в растворе.

После того как было установлено среднее значение расстояния между
концами и распределение вероятности / (г), те же самые маркированные поли-
пептиды были исследованы в растворах с пониженной вязкостью с целью на-
хождения коэффициентов диффузии концов молекулы относительно друг дру-
га. Вязкость уменьшалась добавлением трифторэтанола - растворителя, ко-
торый, как предполагается, не влияет па усредненную конформацию полипеп-
тида. Типичная кинетика затухания для DGgN показана на рис. 10.20. Умень-
шение вязкости приводит к более быстрому затуханию флуоресценции донора.
Контрольные эксперименты с соединением II показали, что изменение в со-
ставе растворителя существенно не влияет на т , а это в свою очередь сви-
детельствует о более быстром затухании флуоресценции донора благодаря
диффузионному транспорту донора по направлению к акцептору. Для модели-
рования / (д) снова были использованы численные методы, на этот раз для
различных значений коэффициента диффузии. Полученные результаты приве-
дены па рис. 10.21. Низкая вязкость (< 15 сП) приводит к усиленному диффу-
зией переносу энергии. Интересно отметить, что донор и акцептор не диф-
фундируют но направлению друг к другу, когда они связаны с короткими оли-
гомерами (п = 4 и 5). По-видимому, короткие олигомеры более жестки, чем
длинные,. Более того, максимальные диффузионные скорости при очень низ-

Время, нс

РИС. 10.20. Кривые затухания флуоресценции DG8N в смесях глицерина
и трифторэтанола [ 23].

Числами указаны проценты (по массе) трифторэтанола.
РИС. 10.21. Зависимость коэффициентов диффузии для концов DG N от вязкос-
ти растворителя [23].

1 - DG4N; 2- DG6N; 3- DG8N; 4- DGg N. (С разрешения John Wiley and Sons.)

кой вязкости примерно в 10 раз меньше, чем можно предсказать для донора
и акцептора в жидком растворе. Это является результатом фрикционного тор-
можения, накладываемого па донор и акцептор аминокислотными прокладками.

Из приведенных результатов ясно, что измерение переноса энергии может
давать детальную информацию о статических и динамических расстояниях меж-
ду концами макромолекул в растворе. Для использования возможностей метода
необходимы точные измерения кинетики затухания, соответствующие контроль-
ные эксперименты и значительный объем вычислений. Тем ие менее метод
очень перспективен, и вполне вероятно, что по мерс совершенствования обо-
рудования усилия в реализации этих возможностей увеличатся,

10.5.	Перенос энергии в приближении быстрой диффузии

В предыдущем разделе говорилось о том, что диффузия доноров и акцеп-
торов может усиливать эффективность переноса энергии; она приводит к слож-
ной кинетике затухания флуоресценции донора и усложняет интерпретацию дан-
ных. Однако ситуация упрощается в приближении быстрой диффузии. При вы-
воде уравнения Фёрстера предполагается, что за время затухания флуоресцен-
РИС. 10.22. Зависимость переноса энергии, лимитируемого диффузией, от рас-
стояния наибольшего сближения.

а — вычисленные эффективности переноса энергии дпя раствора донора и акцеп-
тора с Ro = 50 А и концентрациями акцептора 1,0 (1); 0,1 (2) и 0,01 (3) мМ. б — то же,
но при условии, что акцептор находится на расстоянии а под поверхностью бислоя,
а донор заключен внутри везикулы. Поверхностная концентрация акцептора 0,02 (7);
0,002 (2) и 0,0002 (3); b = 150 А. (С разрешения авторов работы [б].)

ции донора среднее смещение доноров и акцепторов не изменяется. Это эквива-
лентно утверждению, что D-r^/S2 « 1, где D - сумма коэффициентов диффузии
донора и акцептора и S - среднее расстояние между ними. Если D-rd/S « 1,
то эффективность переноса энергии снова перестает зависеть от диффузии.
Предельная скорость переноса в этом случае определяется расстоянием макси-
мального сближения донора и акцептора, которое в свою очередь зависит от
геометрических факторов [ 5]. Применение этого явления в биохимии очевидно.
Например, если использовать доноры, растворимые в воде, и акцепторы, свя-

22-413
занные с макромолекулой, то можно определить, на каком расстоянии от по-
верхности раздела вода/макро моле ку ла находится акцептор.

Для того чтобы обеспечить условия быстрой диффузии, необходимы дол-
гоживущие доноры. Одним из них является ион тербия ТЬ3+, время жизни
возбужденного состояния которого в водном растворе порядка 2 мс. Такое
долгое время жизни связано с низким коэффициентом экстинкции. Возбужде-
ние ТЬ3+ часто осуществляют при использовании хелатов, таких, как дипико-
линий, который сильно поглощает свет и переносит свою энергию на ТЬ3 + .
Интересно отметить, что, несмотря на долгое время жизни для ТЬ3+ и обрат-
ную зависимость кт от -rd, перенос энергии все же заметен. Эффективность
сравнима с той, которая наблюдается для наносекундных времен жизни, пото-
му что эта эффективность определяется отношением скорости переноса к сум-
ме затухания [уравнение (10.9)].

В данном случае выбранной модельной системой был перенос энергии от
комплекса ТЬ 3+ (дипиколинат) , включенного во внутреннюю область везикул,
на эозинфосфатидилэтаноламин, связанный с везикулами. Результаты теорети-
ческого расчета эффективности переноса энергии в зависимости от расстоя-
ния максимального сближения приведены на рис. 10.22. На эффективность пе-
реноса влияют обсуждаемые расстояния и поверхностная плотность акцептора

величество акцепторов на сроссролапид

РИС. 10.23. Эффективность переноса энергии от ТЬ з+(дипиколинат)3 на эозин-
фосфатидилэтаноламин .

Теоретические кривые рассчитаны для указанных расстояний максимального
сближения. (С разрешения авторов работы [ б].)
па мембрана. Увеличение последней приводит к возрастанию эффективности
переноса на больших расстояниях. Измеренная эффективность переноса энер-
гии от Tb3+(DPA)3 на ЕРЕ приведена па рис. 10,.23. Указаны также теоре-
тические кривые для расстояний максимального сближения в 5, 10 и 20 Л.
Очевидно, что моделированное расстояние 10 А хорошо соответствует экспе-
риментальным данным и что расстояние максимального сближения может
быть выбрано с. хорошей точностью.

10.61 Перенос энергии в растворе

Теперь рассмотрим раствор, содержащий и донор,и акцептор, равномерно
распределенные в растворе. Важно отметить, что и кинетика затухания, и от-
носительные квантовые выходы флуоресценции донора представляют собой
сложные функции концентрации акцептора. При возбуждении 5-импульсом ки-
нетика затухания флуоресценции донора определяется выражением [24 - 26]

id(t)=i°d ехр г

где у = [Я]/[Л]о и [Л]о = З000/(2п/а03о)

Относительный квантовый выход составляет

lda

——« 1 — (>/ тт) у ехр (у 2) [ 1 — erf (у) ]

1	<1

где erf (у) = —j ехр (— х2) dx
Vn о

(10.19)

(10.20)

(10.21)

(10.22)

Эти выражения действительны для неподвижных допоров и акцепторов, ориен-
тация которых случайна вследствие вращательной диффузии. Еще более слож-
ные выражения необходимы в том случае, если донор и акцептор диффундиру-
ют в течение времени жизни возбужденного состояния.

Сложное затухание флуоресценции донора отражает зависящее от времени
распределение расстояний пар d - а . Испускание допоров с близко располо-
женными акцепторами затухает быстрее; если доноры отстоят дальше от ак-
цептора, затухание медленнее. Сложность системы усугубляется еще тем, что
уравнение (10.19) справедливо только при возбуждении 5-импульсом. Если ис-
пользуется постоянное освещение, которое выключается в момент времени
t = 0, то закон затухания другой [24]. Это связано с тем, что при использова-
нии непрерывного возбуждения в противоположность 5-импульсам получается
разное начальное распределение расстояний d -а. Возбуждение 8-импульсом
дает случайный набор доноров. Стационарная популяция допоров обогащена
парами донор -- акцептор с большим расстоянием d — а. Любопытно, что одно
и то же выражение для относительного квантового выхода применимо как для
стационарного возбуждения, так и для возбуждения 8-импульсами. В последнем
случае относительный квантовый выход определяется как

I d а

Г Ida (О л
о
—

J / d (t)dt

(10.23)

о

10.7. (Анализ эффективности переноса энергии при наличии
недипольных механизмов тушения

Эффективность переноса энергии Е обычно определяется как отношение
константы скорости переноса-Л; к сумме констант скоростей процессов, ко-
торые дезактивируют возбужденное состояние донора

Е = kT/(l/-r°d + kT)	(10.24)

где т° - время жизни для донора в отсутствие акцептора. Рассмотрим белок
с центрами связывания для донора и акцептора. Обычно эффективность перено-
са Ed вычисляют из интенсивности донора в присутствии (lda) и в отсутствие
акцептора(lrf):
^.(1-^)//.	(Ю.25)

В этих расчетах подразумевается, что связывание акцептора с белком изме-
няет интенсивность или время жизни возбужденного состояния донора толь-
ко при переносе энергии (кт) и никаким другим путем. Однако аллостерические
взаимодействия между связывающими центрами могут вызывать изменения
времени жизни для донора при связывании акцептора. Например, если связыва-
ние акцептора уменьшает т° как за счет механизмов, не связанных с перено-
сом энергии (к }, так и в результате переноса энергии (кт), то кажущееся
значение Ed будет меньше, чем это следует из расстояния между донором и
акцептором.

Такая возможность может быть исследована путем одновременного изуче-
ния эффективности переноса энергии при измерении и уменьшении флуоресцен-
ции донора (Ed) и увеличении флуоресценции акцептора (Е), как было описано
в работе [ 6]. Предполагается, что связывание акцептора с белком приводит к
дополнительному процессу дезактивации, который обедняет популяцию возбуж-
денных допоров с. константой скорости к . Интенсивности флуоресценции донора в
присутствии и в отсутствие акцептора будут пропорциональны следующим величинам:

Л(/

I ~ К(1) )	_ А	(10.26)

Л . + к .
a t

lia	(10.27)

Л , I- к. 1 п т + к
a i I ц

где Л' - константа пропорциональности ; Dd - оптическая плотность;	- кон-

станта скорости испускания; Z-. — константа скорости безызлучательного
затухания в отсутствие акцептора и т® =? (Af/ + к. )“*. Из уравнений (10.25) -
(10.27) можно найти кажущуюся эффективность тушения донора:

Е^ .___________(10.28)

1/т(° + кт т k(j

Для к 0, т.е. когда пет дополнительного тушения акцептором помимо пере-
носа энергии, Е(1 равна истинной эффективности тушения [уравнение (10.24)].
Однако для любых заметных ненулевых значений к значение Ed больше, чем
кинетически определенная эффективность, которая дается выражением

Е . /lT	(10.29)

(Z

ia; -I кг г A-g

Эффективность обозначена Е , поскольку было показано, что эта кинетически
определяемая эффективность может быть измерена по сенсибилизации флуо-
ресценции акцептора.

При наличии аллостерических факторов корректировка их влияния может
быть выполнена при одновременном измерении эффективности переноса энер-
гии как по тушению флуоресценции донора (Ed), так и по усилению флуорес-
ценции акцептора (Е ). Кажущаяся эффективность переноса энергии может
быть вычислена по уравнению

где I). - оптические плотности; / . и I - интенсивности акцептора в при-
I	cZcl CL
сутствии и в отсутствие тушителя соответственно. Фактическая эффектив-
ность переноса энергии равна

a ~E'd + 1	+

где т'1 = к + 1/т° . Это эффективность переноса энергии, которую следует
использовать для вычисления расстояния между донором и акцептором. Прове-
денное обсуждение показывает необходимость при расчете расстояний исклю-
чить тушащие процессы, отличающиеся по своей природе от переноса энергии.

Задачи

10-1. В работе [13] изучено влияние величины интеграла спектрального перекры-
вания на скорость 'флуоресцентного переноса энергии. Были измерены флуоресцентные
времена жизни возбужденного состояния соединений I и П (рис. 10.24). Индольная
часть молекулы является донором, который переносит энергию на кетоновый акцептор.
И спектр поглощения кетона, и спектр испускания индола чувствительны к раствори-
телю: спектр испускания индола сдвигается в область коротких длин волн, а спектр
поглощения кетона - в область больших длин волн по мере уменьшения полярности раст-
ворителя (рис. 10.25). Эти сдвиги приводят к увечилению спектрального перекрывания
при уменьшении полярности растворителя. Используя данные табл. 10.4, покажите, что
к? пропорциональна первой степени интеграла спектрального перекрывания.

РИС. 10.24. Структуры донорно-акцепторной пары (I), стероида, содержащего
только донор (II), и стероида, содержащего только акцептор (III).

(С разрешения авторов работы [ 1 з].)
Тигпене и в поста срлуоресценци о

Длина волны, нм

РИС. 10.25. Перекрывание спектра испускания донора (II) со спектром поглоще-
ния акцептора (III).

Обозначения см. в подписи к рис, 10.24. (С разрешения авторов работы [ 1 з].)

10-2, Предположим, что выделен белок, содержащий единственный триптофано-
вый остаток, который связывает динитрофенол (DNP) в активном центре. Спектр по-
глощения DNP перекрывается со спектром испускания триптофанового остатка. DNP
не флуоресцирует. Интенсивность флуоресценции триптофанового остатка после кор-
ректировки на эффект внутреннего фильтра, связанного с поглощением DNP, состав-
ляет 20,5 и 4,1 в отсутствие и в присутствии DNP соответственно. /?о = 50 А.

Таблица 10.4. Слектрапьно-фпуоресцентные свойства

соединений I и П в некоторых растворителях [13]

Растворитель	т,  I	нс  II	nd	/, см6/ мкМ • 1019
Метанол	5,3	5,6	1,331	1,5
Этанол	5,6	6,5	1,362	3,0
Диоксан	3,6	5,4	1,423	13,0
Этилацетат  Диэтиловый	3,3	4,7	1,372	12,8
эфир	2,1	4,5	1,349	30,0
Г ептан	1,1	2,8	1,387	60,3
а)	Чему равна эффективность переноса энергии?

б)	В предположении, что незатушенное время затухания составляет 5 нс, вычис-
лите, какое должно быть время затухания в присутствии DNP.

в)	Чему равна константа скорости переноса?

г)	Каково расстояние между группами?

д)	Предположим, что условия в растворе изменились таким образом, что рассто-
яние между триптофаном и DNP составляет 20 А. Чему должна быть при этом равна
интенсивность флуоресценции триптофана?	о

е)	Как повлияет на интенсивность флуоресценции того же раствора с г = 20 А при-
месь 1% второго белка, который не связывает DNP? Примите, что этот второй белок
имеет те же самые время затухания и квантовый выход.

ж)	Какое время затухания нужно ожидать для образца, который содержит примеси?
Будет ли это время затухания каким-либо образом указывать на присутствие приме-
сей?
ГЛАВА 11.

Флуоресценция белков

Опубликованы обширные данные по флуоресценции белков и пептидов. Это
связано с тем, что такие природные флуорофоры, как тирозин и триптофан,
присутствуют практически во всех белках. Флуоресценция большинства белков
вызывается в первую очередь триптофановыми остатками, индольные кольца
которых - уникально чувствительные и сложные флуорофоры. Индол, трипто-
фан и их производные очень чувствительны к полярности растворителя и под-
вержены как общим, так и специфическим взаимодействиям с растворителем,
благодаря чему спектр испускания триптофановых остатков может отражать
полярность их ближайшего окружения. На спектры испускания белков влияют
связывание субстратов, реакции ассоциации и денатурации. Измерение поля-
ризации отражает усредненное время релаксации триптофановых остатков, не-
смотря на экспериментальные трудности, вызываемые сложностью их поляри-
зационного спектра. Следовательно, путем измерения поляризации можно
выявлять влияние денатурантов на структуру белка, реакции ассоциации бел-
ков с лигандами и другими макромолекулами. И наконец, триптофан оказыва-
ется уникально чувствительным к тушению различными веществами. В допол-
нение к тушению кислородом и иодад-ионами триптофан тушится такими веществами,
как акриламид, сукцинимид, пероксид водорода, дихлораиетамид, пиридингидрохло-
рид, цистеин, хлорированные углеводороды, NO” Ю” , Cs+, Cu2+, Pb2+,
Cd2+ и Mna+ [1, 2]. Эта чувствительность к различного рода тушителям обу-
словлена склонностью возбужденного индольного ядра донировать электро-
ны во время нахождения в возбужденном состоянии. Чувствительность к ту-
шителям позволяет определять доступность триптофановых остатков в белках
методом тушения.

Детальный анализ флуоресценции белков затрудняется как обилием факто-
ров, которые влияют на флуоресценцию индольной составляющей, так и нали-
чием в большинстве белков нескольких разных триптофановых остатков. Так
как каждый остаток находится в разном окружении, то и спектральные свой-
ства каждого остатка в общем случае различаются. Испускания всех остатков
перекрываются во всем используемом диапазоне длин воли, и довольно слож-
но разделить спектральные вклады каждого из них в многотриптофаповом бел-
ке. Кроме того, спектры испускания и кинетика затухания интенсивности
флуореснениии довольно сложны, как было найдено даже для свобод-
ного триптофана и для белков, содержащих единственный триптофано-
вый остаток. Например, для большинства белков с единственным трипто-
фановым остатком не наблюдается единственного времени затухания флуорес-
ценции. По этой причине нельзя просто интерпретировать мпогоэкспоненциаль-
ную кинетику затухания в терминах поведения индивидуальных остатков в
многотриптофаповых белках. В данной главе дается общий обзор флуоресцен-
ции белков. Детальный обзор данных по флуоресценции аминокислот и белков
был сделан несколькими авторами, и более подробную информацию можно най-
ти в работах [3-5].

11.1.	Спектральные свойства ароматических аминокислот

Белки ' одержат три аминокислотных остатка, которые могут давать вклад
в ультрафиолетовую флуоресценцию: тирозин (Туг), триптофан (Тгр) и фенил-
аланин (Phe). Спектры поглощения этих аминокислот приведены па рис. 11Д.
Флуоресценция белков обычно возбуждается в максимуме поглощения при
280 нм или больших длинах волн. Следовательно, фенилаланин не возбуждает-
ся в большинстве экспериментальных случаев. Более того, квантовый выход
фенилаланина в белках мал, так что испускание этого остатка наблюдается
редко.

Поглощение белков при 28Э нм связано с тирозиновыми и триптофановыми
остатками. При длинах волн > 295 нм поглощает главным образом триптофан.
Поэтому предполагается, что его флуоресценция может быть селективно воз-
буждена в диапазоне 295 - 305 нм, что и было доказано экспериментально.
Однако в следующем разделе мы опишем особенности флуоресценции тирозина-
та при таком длинноволновом возбуждении.

Флуоресцентные спектры испускания ароматических аминокислот приведе-
ны на рис., 11.2. Испускание тирозина в воде происходит при 303 нм и сравни-
тельно нечувствительно к полярности растворителя. Максимум испускания три-
птофана в воде находится при 348 нм и сильно зависит от полярности. Несколь-
ко различающиеся максимумы испускания могут быть получены на различных
приборах в зависимости от спектральных характеристик индивидуальных опти-
ческих компонент. Важно отметить, что тирозиновые остатки могут претерпе-
вать ионизацию в возбужденном состоянии, приводящую к потере протона аро-
матической гидроксильной группой. В основном состоянии для этого гидрокси-
ла рК~ 10, а в возбужденном состоянии рК уменьшается до ~4. Гидроксильная
РИС. 11.1. Спектры поглощения ароматических аминокислот [в].

303 нм

240 280 320 360	400	440

Длина волны, нм

РИС, Флуоресцентные спектры испускания ароматических аминокислот.
(С раз, ЛНИЯ авторов работы [7] И American Press, Inc,.)

группа может диссоциировать в течение времени жизни возбужденного состоя-
ния, что приводит к тушению флуоресценции тирозина. Ранее полагали, что
тирозинат не флуоресцирует, по выяснилось, что он слабо флуоресцирует при
345 нм (разд. 11.3.3).
11.1.1.	Поляризационные спектры возбуждения тирозина
и триптофана

Поляризационные спектры возбуждения для тирозина и триптофана замет,
но различаются. Поляризационный спектр возбуждения тирозина приводе11 па
рис. 11.3. Область относительно постоянной анизотропии наблюдается при
280 ~ 290 нм, что указывает на преобладающий вклад единственного электрон-
ного перехода в области длинноволновой полосы поглощения. При более; корот-
коволновом возбуждении анизотропия монотонно уменьшается до минимума
при 235 нм, который связывают со вторым электронным переходом. В проти-
воположность тирозину триптофан (рис. 11.4) нс имеет постоянной поляриза-
ции в области длинноволновой полосы поглощения. Высокое значение rQ при
возбуждении на 300 нм указывает на приблизительную параллельность диполей
поглощения и испускания. Анизотропия уменьшается до минимума при 290 нм
и увеличивается при длинах волн 280 - 260 нм. Такое сложное поведение при -
писывается присутствию двух электронных уровней (г La и 1 Lb ) в последней
длинноволновой полосе поглощения триптофана. Наличие двух возбужденных
состояний с приблизительно одинаковой энергией привело к значительному

РИС. 11.3. Спектр поляризации флуоресценции тирозина в пропилен гликоле при
—70 °C [в].

Данные пересчитаны из значений поляризации Р t полученных при возбуждении
естественным неполяризованным светом. Их можно перевести в значения рс по-
мощью выражения Р=* 2Рп/(1 +-Рп). Значения Рв свою очередь можно пересчитать в
анизотропию, используя г ® 2Р/(3 — Р}.
РИС, 11.4. Спектр поляризации флуоресценции триптофана в пропиленгпикопе
при -70 °C [ 9].

(С разрешения American Society for Photobiology,)

числу исследований и дискуссий о том, какое из состояний отвечает за испус-
кание флуоресценции. Это разногласие полностью пе устранено и сейчас, но,
по-видимому, в большинстве случаев испускание белков не структурировано
из-за состояния La . Существование минимума г о при 290 им связывают с
переходом lLb, диполь испускания которого приблизительно перпендикулярен
переходу lL и диполю перехода, ответственного за испускание (также ’^0).

11.1.2.	Влияние растворителя на спектры испускания
производных триптофана

Па флуоресцентный спектр испускания триптофана влияют как специфи-
ческие, так и общие взаимодействия с растворителем. Это иллюстрирует
рис. 11.5, па котором приведено влияние бутанола на спектр испускания индо-
ла в гексане. В чистом гексане наблюдается структурированный спектр ис-
пускания, который является зеркальным отражением перехода zLb индола
(см. рис. 5.7). Добавление следовых количеств полярного растворителя м-бу-
h

§ *

Л

Ч> sr
з S»
ъ <Ь
$ §р -

-J_________I_______I—

300	350	400

Длина волны, нм



О

РИС. 11.5. Флуоресцентный спектр
испускания индола [з].

1 —•спектр испускания в гексане;
2— в гексане, содержащем 0,7% н-бу-
танола; 3 — в гексане с 5% н-бутанола;
4 — в 100%-ном бутаноле; 5— в воде.

танола приводит к тушению такого структурированного спектра, сопровожда-
емому появлением бесструктурного длинноволнового спектра испускания, явля-
ющегося зеркальным отражением перехода 1 индола. Эти результаты указывают
на двойное испускание из состояний lLa и , причем па переход lLa раст-
воритель влияет более сильно,-чем на переход lL t и энергия перехода lL
понижается в полярных растворителях. Большая чувствительность состояния
*La к Растворителю кажется вполне обоснованной, так как в переход1L нс-

Длина волны, нм

РИС. 11.6. Спектры поглощения некоторых производных триптофана [ю].

1,2 — н-гексилового эфира К-стеароил-Ь-трилтофвна; 3, 4 — 3-метилиндола.
Спектры 1 и 3 сняты в метилциклогексане; 2 и 4 — после добавления 2,5% н-бутанола.
(С разрешения American Chemical Society).
посредственно вовлечен атом азота индола (см. разд. 5.3.1). Однако, как отме-
чалось, потеря структуры в спектре испускания может быть связана не с
двойным испусканием из состояний 11>а и 7^ , а со специфическим влиянием
растворителя на отдельный электронный переход.

Различная чувствительность состояний lLa к растворителю иллю-
стрируется спектрами поглощения производных триптофана, приведенными па
рис. 11.6 L10]. Напомним, что структурированные пики в поглощении обуслов-
лены состоянием . Добавление 2,5% бутанола приводит к уширению спек-
тра и увеличению поглощения при длинах волн > 290 нм. Полагают, что этот
эффект связан с длинноволновым сдвигом бесструктурного перехода 1La
при взаимодействии с полярной составляющей. Переход 4<ь менее чувстви-
телен к полярности растворителя и поэтому не сдвигается в длинноволновую
область. Эти результаты согласуются со спектрами испускания» Интенсив-
ность структурированного испускания уменьшается, но сдвиг в присутствии
бутанола не происходит (рис. 11.5). В дополнение к этому специфическому эф-
фекту растворителя наблюдается чувствительность индольного кольца к
полярности растворителя, на что указывает дальнейший сдвиг испускания в
длинноволновую область по мере увеличения концентрации бутанола до 100%
(рис. 11.5). Подобные результаты были получены также в работх [11, 12], т.е.
первоначальная потеря структурированного испускания при низких концентра-
циях полярной составляющей сменяется дальнейшим сдвигом в длинноволно-
вую область при высоких концентрациях спирта. Авторы указанных работ
объясняют сдвиг спектра образованием специфического комплекса между
спиртом и производным индола. Образование комплекса кажется очень вероят-
ным, по их точная стехиометрия вызывает сомнения. В любом случае ясно,
что для интерпретации флуоресценции белков требуется рассмотрение и спе-
цифического, и общего влияния растворителя на триптофапсЬые остатки.

11.2.	Общая характеристика флуоресценции белков

11.2,1.	Испускание тирозина и триптофана

При возбуждении на 280 нм в испускании большинства нативных белков
преобладает флуоресценция триптофана. Это иллюстрирует рис. 11.7, на кото-
ром приведен спектр человеческого сывороточного альбумина (HSA), а так-
же спектр испускания триптофана и смеси тирозина с триптофаном в моляр-
ном соотношении 18:1. Испускание триптофана находится в области более корот-
ких длин волн по сравнению с испусканием триптофана в воде. Коротковолно-
вый сдвиг является результатом экранирования триптофановых остатков от
воды белковой матрицей. Несмотря на относительно большое число тирозине-
РИС. 11.7. Флуоресцентный спектр испускания человеческого сывороточного
альбумина и ароматических аминокислот.

1 — спектры испускания HSA; 2 — триптофана; 3 — смеси тирозина и триптофана,
эквивалентной той, которая найдена для HSA. (С разрешения авторов работ [4, 131.)

вых остатков, спектр испускания HSA, по-видимому, - спектр главным обра-
зом триптофана. Это кажется неожиданным, поскольку испускание тирозинов пре-
обладает в указанной смеси тирозина с триптофаном в соответствии с пропор-
цией этих остатков в HSA. В противоположность сильному поглощению при
280 нм и высокому квантовому выходу в водных растворах испускание трипто-
фана в большинстве белков слабое и часто недетектируемое. Отсутствие тиро-
зинового испускания у большинства белков зависит от трехмерной структуры.
Денатурация белков приводит к увеличению испускания тирозинов, но их
вклад обычно меньше, чем найденный для эквимолярных смесей.

В связи с отсутствием тирозиновой флуоресценции в белках был высказан
ряд соображений, в том числе относительно переноса энергии на триптофановые
остатки и тушения близлежащими группами полипептидной цепи. Следует ожи-
дать, что перенос энергии (гл. 10) будет эффективен, тако как форстеровский
радиус для переноса тирозин - триптофан составляет 14 А, и это расстояние
сравнимо с диаметром большинства белков. Однако перенос энергии не главная
причина отсутствия у FISA флуоресценции тирозина. Единственный триптофано-
вый остаток HSA может быть разрушен фотоокислением или удален путем фер-
ментативного расщепления [ 15]. Если бы перенос энергии был главной прими-
ной отсутствия заметной флуоресценции тирозина, то отсутствие акцептора
привело бы к увеличению испускания тирозиновых остатков..Такого увеличе-
ния испускания не наблюдается, следовательно, перенос энергии па триптофа-
новый остаток но единственная принцип тушения флуоресценции тирозина.

Бесспорно, что потеря тирозиновой флуоресценции белками определяется
рядом факторов [16 — 18]. Флуоресценция тирозина может быть потушена близ-
ко расположенными карбоксильными группами или незаряженными аминогруп-
пами. Такое тушение связано с переносом протона па эти акцепторы протонов
в течение времени жизни возбужденного состояния, что было доказано при изу-
чении флуоресценции сополимеров тирозин - глутамат и тирозин - лизин. Кро-
ме того, флуоресценция тирозина тушится также; заряженными аминогруппами
и нейтральными карбоксильными группами. Механизм тушения может включать
перепое протона от фенола либо в основном, либо в возбужденном состоянии.
Образование пептидной связи карбоксильной группой или аминогруппой тиро-
зина еще больше понижает его квантовый выход. В белках гидроксильная груп-
па может образовывать водородную связь с пептидной связью, а связанные
водородной связью фонолы не флуоресцируют [ 18]. Следовательно, флуоресцен-
ция тирозина может отсутствовать или быть минимальной в белках по разным
причинам. /(ля любого индивидуального белка точный механизм тушения тиро-
ниновой флуоресценции ие известен.

Хотя флуоресценция тирозина обычно слаба и нечувствительна к раство-
рителям, часто бывает необходимо полностью исключать такой дополнитель-
ный источник гетерогенности во флуоресценции белков. Обычно это достига-
ется путем возбуждения при 295 им, где поглощение; тирозина (по не тирози-
пата, разд. П.3.3) минимально. Примером может служить пептидный гормон
адронокортикотропина (АСТИ, рис. 11.8). АСТИ содержит тирозиновые остат-
ки в положениях 2 и 23 и единственный остаток триптофана в положении 9. При
возбуждении па 275 им наблюдается испускание и тирозина, и триптофана. При
возбуждении на 295 нм наблюдается только испускание триптофана, поэтому
такое возбуждение полезно выбирать в тех случаях, когда желательно исклю-
чить испускание, с,вязанное с тирозином.

В рассматриваемом примере небольшие размеры и доступность фрагментов АСТ1Г
позволяют определить относительные квантовые выходы тирониновых остатков. Флуо-
ресценция фрагмента, содержащем) Туг-23 ] АС’ГП (4 - 24)], приблизительно эквивален-
тна флуо[хюцепиии полой молекулы. В противоположность этому тирозиновая флуорес-
ценция с|)рагмепта ACTJI, содержащего только Туг-2 [ АСТИ (I - И))], значительно
меньше, чем целой молекулы АСТИ. Таким образом, Туг - 23 имеет зпачитель-
РИС. 11.8. Графики, иллюстрирующие влияние длины волны возбуждения на спектр
испускания адренокортикотропина и его фрагментов [ 14].

Числа соответствуют номерам аминокислот АСТИ (1 — 24), составляющих фраг-
мент. (С разрешения American Chemical Society,,)

но больший квантовый выход, чем Туг- 2. Более низкий выход Туг- 2 связыва-
ют с переносом энергии на Тг р- 9, который в аминокислотной последователь-
ности расположен недалеко.

11.2.2.	Перенос энергии от тирозина к триптофану

Определение эффективности переноса энергии от тирозиновых к трипто-
фановым остаткам в белках было предметом значительного числа исследова-
ний и дискуссий. Интерес был отчасти вызван желанием понять причину низ-
кого квантового выхода флуоресценции тирозина в белках. Как было описано
ранее, денатурация белков приводит к увеличению интенсивности флуоресцен-
ции тирозина, поэтому наблюдаемая интенсивность флуоресценции тирозинов
в белках и пептидах обычно меньше, чем для эквимолярных смесей тирози-
новых и триптофановых мономеров» Одним из возможных объяснений низкого
квантового выхода тирозина может быть эффективный перенос энергии от
тирозиновых к триптофановым остаткам. Если это верно, то можно было бы
использовать известную зависимость переноса энергии от расстояния для
того, чтобы определять расстояния тирозин - триптофан в белках. Диаметры
белков обычно сравнимы с критическим расстоянием переноса (10-18 А)
для данной донорно-акцепторной пары [8, 14].

Анализ тирозин-триптофанового переноса энергии труден, поскольку кван-
товые выходы тирозина низки. К тому же триптофан поглощает свет при всех
длинах волн, при которых поглощает тирозин. Следовательно , прямое воз-
буждение флуоресценции триптофана всегда сопровождается возбуждением
тирозиновых остатков, и просто невозможно увидеть только флуоресценцию
триптофана, сенсибилизированную возбуждением остатков тирозина.

Для того чтобы обойти эти трудности, Эйзингер [ 14] предложил исследо-
вать спектры возбуждения белков. Если не описывать существенные детали, то
эта методика может показаться несложной. В основе лежат следующие прин-
ципы. Рассмотрим раствор, содержащий и тирозин, и триптофан. Используя из-
вестные спектры поглощения индивидуальных остатков, можно вычислить до-
лю поглощения триптофановых остатков при каждой длине волны. Если не про-
исходит переноса энергии от тирозиновых остатков к триптофановым, то отно-
сительный квантовый выход триптофана, скорректированный на общее погло-
щение раствора, пропорционален доле поглощения триптофана. Если эффек-
тивность переноса энергии 100%, то весь поглощенный свет проявится в виде
флуоресценции триптофане! и квантовый выход триптофана не будет зависеть
от длины волны возбуждения, а только от общего количества света, поглощен-
ного раствором.

Эта концепция представлена в количественном виде па рис. 11.9 для экви-
молярной смеси тирозина и триптофана (кривые 1) и для смеси в соотношении
2: 1 (кривые 2). Верхняя кривая 1 отражает долю общего количества света, по-
глощенную триптофаном, которая определяется выражением

а Тгп

f (л)	(111)

1 г р а т (Л) г а т (А)

где а. (Л) - поглощение индивидуальных остатков при длине волны Л. Для про-
стоты в этом выражении опущена малая составляющая, обусловленная погло-
щением фенилаланина. Па рис. 11.9 можно видеть, что чисто триптофановым
является только поглощение с длинами воли > 295 нм. Это может служить ос-
новой для использования этой длины волны для селективного возбуждения
триптофановой флуоресценции. Относительный квантовый выход при возбужде-
нии па длине волны 295 пм выбран в качестве эталонной точки, в которой весь
РИС. 11.9. Парциальное поглощение тирозина, триптофана и фенилаланина в
смеси аминокислот [14].

7—.молярное отношение Туг s Trps Phe » 1 : 1 : 1; 2 — 2:1:1. (С разрешения
American Chemical Society.)

свет поглощается триптофаном. Флуоресценцию записывали при 350 им или
больших длинах волн. При таких длинах волн какой бы то пи было вклад флуо-
ресценции тирозина, по-видимому, должен быть минимальным. Относительный
квантовый выход <р(Л) при любой длине волны можно вычислить по уравнению

о 'г.- (X) + t ci... (Л)

Ф(Л) - т'р	1уг

аТгр(Л) + a Туг(Л)

(11.2)

где t - эффективность переноса энергии. Если t = 100%, то относительный
квантовый выход флуоресценции триптофана не зависит от длины волны воз-
буждения. Если t = 0, то ф(Л) определяется парциальным поглощением трипто-
фана. Точные вычисления относительных квантовых выходов затруднены из-за
необходимости корректировки на изменение поглощения раствора [ 19]. Харак-
терные данные для дипептида Туг - Тгр и для эквимолярной смеси тирозина и
РИС. 11.10. Зависимость относительного квантового выхода флуоресценции ди-
пептида триптофанилтирозина (1) и эквимолярной смеси тирозина и триптофана (2)
от длины волны возбуждения [14].

Линии соответствуют 100%-ной эффективности переноса энергии (Е =1) и отсутствию
переноса энергии (Е ~ 0). (С разрешения American Chemical Society.)

триптофана приведены на рис. 11.10. В дипептиде (кривая 1) донор и акцептор
находятся внутри форстеровского радиуса, и эффективность переноса должна
быть ^ЮО?^. Это подтверждается независимостью квантового выхода трипто-
фана от длины волны возбуждения. Вся поглощенная раствором энергия неза-
висимо от того, поглощается ли свет тирозином или триптофаном, проявляется
как флуоресценция триптофана. Для смеси (кривая 2) относительный квантовый
выход практически совпадает с долей поглощения триптофана, что указывает
па отсутствие заметного переноса энергии.

Путем сопоставления сравнимых данных для белков можно установить
эффективность тирозип-триптофапового переноса энергии. Данные для дрожже-
вой алкогольдегидрогеназы (ADH) приведены на рис. 11.11 [ 19]. ADH содер-
жит 6 триптофановых и 14 тирозиновых остатков. В нативном состоянии отно-
сительный квантовый выход хорошо описывается теоретической кривой для
эффектийности переноса 69%-, Для ADH, денатурированной гуанидангидрохлоридом,
эффективность переноса понижается до нуля. Следовательно, на эффективность
тирозин-триптофанового переноса энергии влияет трехмерная структура белка.
Для ряда из восьми нативных белков было найдено, что эффективность перено-
са энергии варьирует от 0,17 до 0,69, и все эти значения уменьшаются при де-
натурации [ 19].
РИС. 11.11. Зависимость квантового выхода флуоресценции триптофана алко-
гольдегидрогеназы от длины волны [19].

а- для нативной ADH; б— для денатурированной 6 М гуанидингидрохлоридом.
Точками отмечены экспериментальные данные; сплошные линии — теоретические кри-
вые для установленной эффективности переноса энергии:, штриховая линия — тео-
ретическая кривая для эффективности переноса 0%. (С разрешения American Society
for Photobiology.)

Для полноты обсуждения отметим, что существуют значительные расхо-
ждения в оценке степени переноса энергии в белках. Например, опубликован-
ные эффективности переноса находятся в диапазоне от 0 [ 15, 20] до 100% [21].
Эти расхождения, по-видимому, связаны с трудностями измерения относитель-
ных квантовых выходов при различных длинах волн возбуждения и, возможно,
с погрешностью f^rp } вызываемой сдвигом спектров поглощения тирозина и
триптофана в белках по сравнению со спектрами индивидуальных остатков в
водных растворах. Приведенные выше результаты, вероятно, указывают па то,
что степень переноса энергии сильно варьирует среди белков, и дополнитель-
но иллюстрируют, как относительные квантовые выходы могут быть использо-
ваны для изучения переноса энергии при одновременном возбуждении донора
и акцептора.

11.3.	Факторы, влияющие на спектры испускания белков

11.3.1.	Трехмерная структура

Максимумы испускания триптофана и его производных очень чувствитель-
ны к полярности растворителя, равно как и к специфическим взаимодействи-
ям между растворителем и индольным кольцом. Поэтому можно ожидать, что
максимумы испускания белков должны зависеть от тех факторов, которые вли-
яют на экспонирование триптофановых остатков в водную фазу. Например,
спектр испускания человеческого сывороточного альбумина претерпевает ко-
ротковолновый сдвиг по сравнению с испусканием триптофана в воде
(рис. 11.7). Этот коротковолновый сдвиг интерпретируют как результат экра-
нирования триптофановых остатков от водной фазы белков. Как и можно было
ожидать, максимумы испускания белков варьируются главным образом из-за
различий усредненной локализации этих остатков в нативных белках. Максиму-
мы испускания некоторых белков, содержащих единственный триптофановый
остаток, приведены в табл. 11.1. /(ля некоторых белков, таких, как рибонук-
леаза, спектры сдвинуты в коротковолновую область, что указывает па экра-
нирование этих остатков от растворителя. В других случаях (глюкагон и АСТИ)
наблюдается длинноволновый сдвиг испускания. Не удивительно, что для та-
ких небольших белков возможен значительный контакт триптофанового остат-
ка с водной фазой. Подобные различия в максимумах испускания получены для
многотриптофановых белков; например, альдолаза имеет максимум испуска-
ния при 328 им, а бычий сывороточный альбумин - при 343 нм [21]. Денатура-
ция белков гуапидипгидрохлоридом и мочевиной приводит к длинноволновому
сдвигу в спектре испускания и приблизительно к одному и тому же максимуму
испускания для всех белков. Следовательно, различия максимумов испускания
для нативных белков обусловлены их трехмерной структурой. Сильно сдвину-
тый в коротковолновую область максимум испускания азурипа требует специаль
пего комментария. Азурип - это бактериальный медьсодержащий белок, в ко-
тором только один триптофановый остаток. Это единственный в настоящее вре-
мя белок, имеющий структурированный спектр испускания триптофанового ос-

Табпнца 11.1. Максимумы испуска-
ния и времена затухания флуо-
ресценции белков, содержащих
единственный остаток триптофа-
на [22]

Белок	\пах’ нм	т0, нс
		' “• - *
Азурин	308	4,0
Рибонуклеаза Г	324	3,5
11S А	1	342	6 ,0
Нуклеаза	334	5,0
Монеллин	342	2,6
Г люкагон	352	2,8
АСТИ	352	3,1
татка, форма которого подобна форме спектра индола в гексане (рис,. 11.5). К
тому же в его спектре поглощения проявляется четкий пик при 293 пм, подоб-
ный пику, наблюдаемому для производных триптофана в метилциклогексапе
(рис. 11.6). Так как контакт индольного ядра с молекулами полярного раство-
рителя, как известно, приводит к тушению структурированного испускания и
уширению спектра поглощения, то полученные результаты были объяснены по-
терей контакта этого триптофанового остатка с какими бы то пи было полярны-
ми группами. Следовательно, этот единственный остаток должен быть полно-
стью погружен внутрь белка и окружен неполярными аминокислотными остат-
ками. Важно отметить, что триптофановые остатки, погруженные внутрь бел-
ков, не обязательно должны проявлять структурированное испускание. Скры-
тые внутри остатки могут быть связаны водородной связью с полярной груп-
пой, которая также находится внутри белка. Пока еще имеется слишком мало
данных для критической опенки этого интересного, необычного белка.

Спектральные данные для мопеллипа служат хорошим примером влияния
денатурации на спектр испускания белков. Мопеллин - сладкий на вкус белок
(мол. масса 11 000), содержит две субъединицы, один триптофановый остаток
и семь тирозиповых остатков. Спектрально-флуоресцентные свойства моиел-
лина в присутствии и в отсутствие денатурирующих веществ наиболее типичны
для белков и иллюстрируют влияние трехмерной структуры белка.

Флуоресцентный спектр испускания нативного мопеллипа приведен на
рис. 11.12 [24, 25]. При возбуждении па 260 нм небольшая спектральная состав-
ляющая, связанная с флуоресценцией тирозина, видна при 300 пм. Эта слабая
составляющая типична для флуоресценции тирозина в нативных белках. При
возбуждении на 295 пм видна только флуоресценция триптофана. Небольшие пи-
ки при 260 пм и 295 пм обусловлены рассеянным светом на длине волны возбу-
ждения. При записи этих спектров были использованы скрещенные поляриза-
торы для минимизации рассеянного света. Возбуждающий пучок света был по-
ляризован вертикально, а испускание детектировалось через поляризатор с го-
ризонтальной ориентацией. 11апомпим, что рассеянный свет сильно поляризо-
ван в вертикальном направлении, и горизонтальный поляризатор может быть
использован для блокирования этой составляющей (гл. 2).

При денатурации мопеллипа либо гуапидипгидрохлоридом, либо мочевиной
наблюдается резкое увеличение вклада тирозина в спектр испускания
(рис. 11.13). Эти изменения были использованы для проверки зависимости
флуоресценции мопеллипа от концентрации гуанидина (рис. 11.14). В ходе де-
натурации полуширина спектра испускания увеличивается вследствие возраста-
ния относительного вклада тирозиновых остатков в спектр испускания. Макси-
мумы испускания и тирозина, и триптофана относительно независимы от кон-
РИС. 11.12. Флуоресцентный спектр испускания нативного монеллина [25].

РИС. 11.13. Флуоресцентный спектр испускания денатурированного монеллина.
(С разрешения авторов работы [24] И Elsevier Biomedical Press.)
центрации гуанидина, но следует подчеркнуть, что кажущиеся максимумы и<>-
пускания для каждой компоненты в перекрывающемся спектре ие обязательно
соответствуют действительным максимумам испускания этих компонент.

На рис. 11.14, б приведены относительные квантовые выходы q, поляриза-
ция флуоресценции Р и параметр г. Последний представляет собой отношение
интенсивности флуоресценции при 340 нм к интенсивности при 304 им, которая
обусловлена в первую очередь испусканием тирозина. Это отношение уменьша-
ется с увеличением концентрации гуанидина, потому что увеличивается интен-
сивность испускания тирозина. Поляризация уменьшается вследствие диссо-
циации индивидуальных субъединиц и разворачивания полииентидных цепей. При
разворачивании увеличивается свобода движений триптофановых остатков, при-
водящая к понижению значения поляризации. Эти данные наиболее типичны из
тех, которые можно ожидать при денатурации белка, и иллюстрируют полезную
чувствительность спектральных свойств белковой флуоресценции к трехмер-
ным структурам белков.

РИС. 11.14. Спектральные свойства монеллина в присутствии гуанидингидрохло-
рида.

(С разрешения авторов работы [24] И Elsevier Biomedical Press.)
11.3.2.	Связывание белков с субстратами и другими
макромолекулами

Во многих случаях связывание белков с субстратами или другими макро-
молекулами приводит к сдвигу в их спектре испускания. Например, максимум
испускания лизоцима сдвигается от 340 до 331 нм при связывании субстрата
три-М-ацетил-в-глюко-замина. Этот сдвиг интерпретируют экранированием трип-
тофановых остатков в активном центре от воды. Помимо связывания субстра-
тов к значительным изменениям в спектральных свойствах триптофана могут
приводить также другие факторы, в том числе самоассоциация белков и связы-
вание белков с мембранами.

Самоассоциапию мелиттина и связывание его с, бислоями иллюстрируют
типичные спектральные изменения, происходящие при ассоциации. Мелиттин --
пептид пчелиного яда, содержащий 26 аминокислот и единственный триптофа-
новый остаток. Этот пептид самоассоциируется в растворе. Более того, мелит-
тип связывается клеточными мембранами, приводя к их лизису. Иа спектраль-
ные свойства триптофанового остатка влияют и самоассоциация, и связывание
мелиттина с мембранами, что позволяет оценить это явление количественно
[26, 27].

Самоассоциация мелиттина приводит к коротковолновому сдвигу спектра
испускания триптофана (рис. 11.15). В этом случае самоассоциация вызыва-

РИС. 11.15. Графики, иллюстрирующие влияние самоассоциации мелиттина под
воздействием соли на его флуоресцентный спектр испускания.

а — спектр испускания мелиттина в разбавленном буферном растворе (кривая 1)
и в буферном растворе, содержащем 2,4 М Na Cl (кривая 2); б — влияние соли на
сдвиг спектра испускания триптофана. Концентрация мелиттина; 1 — 180 мкМ; 2 —
20 мкМ; 3—1,9 мкМ. (С разрешения авторов работы [2б] и North Holland Publishing Со.)
РИС. 11.16. Влияние концентраций соли (а) и мелиттина (б) на поляризацию
флуоресценции.

Концентрация мелиттина; 1 — 20 мкМ; 2 — 200 мкМ. (С разрешения авторов ра-

боты [27] И North Holland Publishing Со.)

лась увеличением концентрации соли. При высоких концентрациях добавленных
солей мелиттин образует тетрамеры. Однако и увеличение концентрации мелит-
тина вызывает подобный коротковолновый сдвиг. Такие сдвиги интерпретируют
как результат уменьшения степени экспонирования единственного триптофано-
вого остатка при образовании тетрамера. Не только максимум испускания, по
и поляризация флуоресценции триптофанового остатка меняются при образова-
РИС. 11.17. График, иллюстрирующий влияние липида на поляризацию флуорес-
ценции мелиттина.

Rf — молярное отношение липид — белок для фосфатицилсерина (кривая 1) и пизо-
лецитина (кривая 2). (С разрешения авторов работы [27] и North Holland Publishing Со.)

пии тетрамера (рис. 11.16). Видно, что при ассоциации поляризация возрастает
от 0,07 до 0,12. Изменения поляризации происходят главным образом из-за
увеличения кажущегося объема молиттипа при самоассоциации. Эти данные мо-
гут быть использованы для расчета константы связывания. Подобные измене-
ния в спектре испускания и поляризации наблюдаются также при связывании
мелиттипа с липидами (рис. 11.17). Было обнаружено более быстрое увеличение
поляризации для фосфатидилсерипа по сравнению с лизолеиитином, что указы-
вает па более сильное связывание с отрицательно заряженным липидом. Пока
не выяснено, связывается ли мелиттин с мембранами в виде мономера или в
виде тетрамера [28]. В любом случае ясно, что чувствительность триптофано-
вых остатков к полярности окружения или к размерам вращающегося целого
даст большие возможности для количественной оценки реакций ассоциации меж-
ду белками и другими макромолекулами.
11.3.3.	Возможное испускание тирозината в белках

В предыдущем обсуждении полагалось, что максимум испускания тирози-
на находится вблизи 305 нм. Однако имеются сообщения о феномене испускания
тирозинатом при 345 нм [29 - 31]. Спектральные свойства этого испускания
сопоставимы с триптофановыми. Значение рХд гидроксильной группы тирозина
в основном состоянии 10,3, поэтому обычно считают, что ионизация в основном
состоянии не происходит, Тем не менее при возбуждении рКа уменьшается до
4 или ниже и ионизация может происходить даже при нейтральных значениях
pH. Ионизация в возбужденном состоянии облегчается в присутствии близко
расположенных акцепторов протонов, которыми могут быть ионы фосфата бу-

РИС. 11.18. Спектр флуоресценции тирозина [29].

Числа соответствуют концентрации К2НРО4; pH 7,5. (С разрешения American
Society for Photobiology.)
ферного раствора или глутаминовые или аспарагиновые остатки в белке. Водо-
родная связь между этими акцепторами и гидроксильной группой тирозина мо-
жет возникать в основном состоянии, приводя к образованию комплекса, в ко-
тором происходит реакция при возбуждении тирозина. Образование комплекса
в основном состоянии может также вызывать длинноволновый сдвиг в спектре
поглощения тирозина , из-за чего возможна путаница с флуоресценцией трипто-
фана.

Влияние фосфата на спектр испускания тирозина показано на рис. 11.18
[29]. Увеличение концентрации фосфата приводит к постепенному уменьшению

В
i

§

§

<ъ
у
I
§

РИС. 11.19. Спектр поглощения тирозина [29].

Числа соответствуют концентрации К2ПРО4; pH 7,5. (С разрешения American So-
ciety for Photobiology.)
испускания тирозина при 305 нм. Одновременно наблюдается испускание при
345 нм, которое обусловлено тирозинатом. Тушение тирозина фосфатом проте-
кает как по динамическому, так и по статическому механизмам. Важен стати-
ческий механизм тушения, поскольку образование комплекса между тирози-
ном и фосфатом вызывает сдвиг спектра поглощения в область больших длин
волн (рис. 11.19). Напомним, что возбуждение при 290 - 300 нм часто исполы
зуется для достижения селективного возбуждения триптофановых остатков.

Из длинноволнового сдвига спектра поглощения комплекса тирозина (рис. 11.19)
можно предсказать, что испускание тирозината при 345 нм может быть селек-
тивно возбуждено в длинноволновой области спектра.

Тирозин-тирозинатный спектр испускания, имитирующий флуоресценцию
триптофана, был обнаружен для двух цитотоксинов, которые пе содержат
триптофана [31]. Спектры испускания, полученные при возбуждении па 275 и
290 нм, приведены на рис. 11.20. При возбуждении на 275 им ясно виден вклад

Длина волны, нм

РИС. 11.20. Флуоресцентные спектры испускания цитотоксинов, не содержащих
триптофана [31 ].

а - спектр цитотоксина А; б —спектр цитотоксина В. 1 — при возбуждении
на 275 нм; 2 — на 290 нм.
тирозина, величина которого уменьшается при использовании длины возбужде-
ния 290 нм. Это имеет явное сходство с результатами, полученными для белков,
содержащих и тирозин, и триптофан (см. рис. 11.8). В этом случае испускание
при 345 нм, по-видимому, обусловлено тирозиновыми остатками, которые в ос-
новном состоянии связаны водородной связью с. глутаминовыми или аспараги-
новыми аминокислотными остатками белка. Величины тирозинатного испуска-
ния белков пока неизвестны. Обычно тирозинатпое испускание слабое из-за его
низкого квантового выхода и, следовательно, составляет малую долю по отноше-
нию к триптофановому испусканию. Однако возможность такого испускания сле-
дует учитывать в любом детальном анализе спектра испускания и/или времен
затухания флуоресценции белков.

11.4.	Времена затухания флуоресценции белков

Время затухания для триптофана в белках составляет 1 - 7 на в зависимо-
сти от типа белка и ого третичной структуры. Денатурация белков приводит к
практически одинаковым временам затухания порядка 2,5 пс; это указывает на
то, что третичная структура, а пс аминокислотная последовательность являет-
ся причиной разнообразия времен затухания нативных белков [32]. Детальная
интерпретация этих времен затруднена присутствием в большинстве белков
нескольких триптофановых остатков, и даже для белков, содержащих один
триптофановый остаток, наблюдается сложная кинетика затухания флуоресцен-
ции. Рассмотрение данных по восьми белкам, содержащим один триптофановый
остаток, показывает, что кинетики затухания интенсивности флуоресценции
лучше соответствуют мпогоэкспопенциальпому закону затухания, чем одно-
экспопепциальпому [32]. Важно помнить, что полученные значения предэкспо-
пенциального фактора а  и индивидуальных времен затухания т. не доказы-
вают существования индивидуальных излучающих центров с интенсивностями
а , т. или временами затухания т. . На этот момент следует обратить особое
внимание, потому что природа мпогоэкснонопциальпого затухания флуоресцен-
ции белков еще не до конца попята. Существует несколько возможных причин:
гетерогенность основных состояний из-за наличия конформационных изомеров
белка, кинетика релаксации вокруг возбужденной молекулы или внутренняя
гетерогенность флуоресценции триптофана. В разных белках при разных усло-
виях каждый из этих факторов, вероятно, дает некоторый вклад в гетероген-
ность времен затухания флуоресценции белков.

Общепринято, что в нейтральном водном растворе триптофан имеет време-
на затухания 3,1 и 0,5 пс. Короткоживущая компонента находится в коротковол-
новой области испускания с максимумом 330 нм, а компонента 3,1 нс имеет
максимум испускания при 350 нм. Первоначально эти компоненты приписывали
испусканию состояний (0,5 нс) и 1La (3,1 нс) [33], но затем выяснилось,
что они связаны с вращательными конформерами триптофана [34]. Вне зави-
симости от природы этих двух времен затухания следует помнить, что доля
интенсивности короткоживущей компоненты мала и ее количество составляет
менее 5% общего испускания. Более того, время затухания N-ацетил- ь-три-
птофанамида в нейтральном буферном растворе соответствует одпоэкспонен-
циальному закону [ 32, 35]. NAT А может быть лучшей моделью триптофановых
остатков в белках, так как и амино- и карбоксильная группа образуют пептид-
ные связи.

Зависимость времени затухания глюкагона от длины волны была детально
проанализирована [ 36]. Глюкагон - пептидный гормон, содержащий 29 амино-
кислот и один триптофановый остаток в положении 25. Из изучения тушения
акриламидом известно, что этот остаток легкодоступен для водной фазы [ 22].
Снова были получены два времени затухания - 3,26 и 1,11 нс, которые сущест-
венно не изменяются при добавлении 5,5 М гуапидипгидрохлорида. Обе компоненты
имеют максимум испускания вблизи 350 нм, а короткоживущая компонента со-
ответствует ~20% общей флуоресценции. Эти две компоненты времени затуха-
ния были интерпретированы как результат существования различных конформе-
ров индольного кольца по отношению к пептидной цепи. Сходство максимумов
испускания обеих компонент подтверждает скорее модель конформера, а не ре-
лаксацию растворителя как причину гетерогенности времен затухания. Однако
для остатков, погруженных внутрь белков, спектральная релаксация может
происходить в течение времени жизни возбужденного состояния. Следователь-
но, в общем случае можно ожидать сложную кинетику затухания интенсивности
как для экспонированных, так и для погруженных остатков. Для экспонирован-
ных остатков главной причиной гетерогенности могут быть различные конфор-
меры, а для погруженных остатков преобладающей может быть релаксация
растворителя. Для подтверждения или опровержения этих предположений необ-
ходимы дополнительные эксперименты.

ВЛИЯНИЕ ДИПОЛЬНОЙ РЕЛАКСАЦИИ НА ЗАВИСИМОСТЬ ВРЕМЕНИ ЗАТУХА-
НИЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ТРИПТОФАНА ОТ ДЛИНЫ ВОЛНЫ. В разд. 11.5 МЫ обсу-
дим разложение спектра испускания индивидуальных триптофановых остатков
в белках на составляющие части на основании зависимости затухания интен-
сивности флуоресценции от длины волны. При таком разложении предполагают,
что время’ затухания для каждого триптофанового остатка не зависит от дли-
ны волны испускания. Это может быть неверно в том случае, если белковая
матрица релаксирует вокруг возросшего дипольного момента возбужденного (
состояния и если время релаксации сравнимо с временем затухания флуорес-
ценции. Пока еще степень, в которой дипольная релаксация влияет на времена
затухания флуоресценции триптофана в белках, неизвестна. Однако важнд по-
нять, что процессы в возбужденном состоянии могут приводить к резкому
увеличению времен затухания в пределах спектра испускания триптофана.

Для иллюстрации этого положения на рис. 11.21 приведены кажущиеся фа-
зовые времена затухания возбужденного состояния NATA в пропиленгликоле
при различных температурах [ 37]. Наиболее резкая зависимость видна вбли-
зи -9°С, где испускание и релаксация растворителя протекают со сравнимы-
ми скоростями. При этой температуре время затухания возрастает от 3,2 нс
при 317 нм до 8 нс при 400 нм. Важно отметить, что даже при температурах,
когда релаксация растворителя медленная (-55°С) или быстрая (36°С), кажу-

Длина волны, нм

РИС. 11.21. Зависимость кажущихся времен затухания флуоресценции (фазовые,
30 МГц) для М-ацетил-Ь-триптофанамида в пропиленгликоле от длины волны L37].

На точность фазовых измерений указывает постоянство времен затухания для
п-терфенила.
щиеся времена затухания все еще зависят от длины волны испускания. Кине-
тинам затухания таких растворов, вероятно, удовлетворяет многоэкспоненци-
альный закон затухания, но это соответствие не доказывает существования
индивидуальных испускающих центров с найденными временами затухания.
Фактически кинетики затухания NATA в пропилепгликоле были использованы
для разделения спектров испускания NATA с отрелаксировавшим и пеотрела-
ксировавшим растворителем [38] (рис. 11.22). Эти разделенные спектры с мак-
симумами при 350 и 320 нм соответственно сравнимы со спектрами, которые
могут быть получены для погруженных и экспонированных триптофановых ос-
татков в белках. Мы пока не знаем, в какой степени релаксация может влиять
на времена затухания триптофановой флуоресценции белков. Обсуждаемью результа-

РИС. 11.22. Разделение спектра испускания Ы-ацетил-Ь-триптофанамида на
два: первоначально возбужденный и с отрелаксировавшим растворителем.

(С разрешения авторов работы [38] И North Holland Publishing (lo.) >
ты (рис. 11.21 и 11.22) приведены для иллюстрации возможного влияния раство-
рителей и для того, чтобы подчеркнуть сложности при интерпретации зависи-
мости затухания от длины волны на основании только гетерогенности основно-
го состояния.

11.5.	Распознавание индивидуальных аминокислотных остатков
в белках по кинетике затухания флуоресценции

В течение последних нескольких лет делались попытки использовать кине -
тические. методы для разделения спектров испускания и времен затухания ипдивццуяль-
пых триптофановых остатков в белках. Из-за трудностей, присущих таким из-
мерениям, успешным оказалось распознавание лишь для белков, содержащих
два различных остатка. Одно из таких разделений было проведено на алкоголь-
дегидрогеназе из печени лошади (LADH) [ 39]. LADH - димерный белок с мо-
лекулярной массой 80 000. Каждая субъединица содержит два триптофановых
остатка — Тг р-15 и Тгр-314. Один из них (Тгр-15) экспонирован в раствор, в то
время как Тгр-314 погружен в гидрофобный карман на поверхности димера.

Чтобы различить индивидуальные спектры испускания, Бранд с соавторами
[ 39] измеряли кинетики затухания флуоресценции при близко расположенных
длинах волн в спектре испускания. Эти данные соответствовали двухэкспонеп-
циалыюму закону затухания флуоресценции:

-:/т	-«/т2

/(А, «) = а1(А)е + «2(Л) е	(11.3)

Каждое из двух, паилучшим образом соответствующих экспериментальным дан-
ным времен затухания практически не зависело от длины волны в отличие от
предэкспоненциальпых факторов, сильно зависящих от длины волны (рис. 11.23).
Предполагалось, что причиной зависимости времени затухания от длины волны
является гетерогенность основного состояния. Если это действительно так, то
доля интенсивности f. каждого остатка при любой длине волны равна

а 1 т 1

f * (А) « --------——	(11.4)

«1(А)т1 + а 2(Л) т2

«1(А)т1 + а2(А)т2

Спектры, разделенные таким методом, приведены на рис. 11.23. Спектр более
короткоживущей составляющей (3,8 нс) сдвинут в коротковолновую область по сравне-
нию с общей флуоресценцией, и его приписывают остатку, погруженному на
РИС. 11.23. Времена затухания, амплитуда и разложение спектра испускания
флуоресценции апькогольдегидрогеназы из печени лошади [зэ].

(С разрешения American Chemical Society.)

границе раздела субъединицы. Более долгоживущая составляющая (7,22 нс)
имеет сдвинутый в длинноволновую область спектр, приписываемый экспониро-
ванному остатку триптофана. Такое соотнесение было подтверждено детальным
анализом влияния субстратов и тушителей на кинетики затухания.

Подобное разделение было получено для молекул лакрепрессора из£. coll
[40] и 3-фосфоглицераткиназы [41], каждая из которых содержит два разных
остатка триптофана. В обоих случаях времена затухания практически не зави-
сели от длины волны испускания, и сдвинутое в коротковолновую область ис-
пускание было более короткоживущим. В разделе 11.4.1 отмечалось, что ре-
лаксация диполей также приводит к возрастанию среднего времени затухания
с увеличением длины волны испускания. Разложение на индивидуальные спек-
тры с использованием уравнений (11.4) и (11.5) возможно, если причиной зави-
симости времени затухания от длины волны является гетерогенность основных
состояний, а не реакции в возбужденном состоянии. Кроме того, подобное уве-
личение среднего времени затухания наблюдалось и для белков, содержащих
единственный остаток триптофана [37]. Было обнаружено, что такие белки
проявляют многоэкспоненциальные кинетики затухания интенсивности флуорес-
ценции [ 32]. Мы не хотим подвергать критике разложение белковой флуорес-
ценции на компоненты на основании кинетик затухания. Однако следует отме-
тить, что времена затухания индивидуальных триптофановых остатков могут
зависеть от длины волны в результате дипольной релаксации белковой матри-
цы вокруг возбужденного состояния. Если это явление существенно, то урав-
нения (11.4) и (11.5) неприменимы. Мы отмечали, что результаты кинетичес-
ких измерений доказывают существование зависимости времен затухания от
длины волны для индивидуальных остатков, но эти времена были фиксированы
для того, чтобы минимизировать число варьируемых параметров. Также неожи-
данно, что короткоживущая составляющая соответствует коротковолновой со-
ставляющей спектра в каждом из этих белков. Точно такой результат наблю-
дается для релаксационных процессов (рис. 11.21). Для гетерогенности основ-
ных состояний следовало бы ожидать, что короткоживущая компонента может
наблюдаться как в коротковолновой, так и в длинноволновой области спектра
испускания, в зависимости от структуры белка. Эти результаты, основанные
на малом числе белков, проанализированных к настоящему моменту, могут
оказаться ошибочными. Однако более длительные времена жизни при больших
длинах воли, по-видимому, общая отличительная черта флуоресценции белков
как для одно-, так и для многотриптофановых белков [ 32, 42]. Более того, на
основании данных, полученных в растворителях с разной полярностью, можно
ожидать, что, триптофановые остатки, экспонированные в воду, должны иметь
более короткие времена затухания и меньшие квантовые выходы [43, 44].
Следовательно, общее возрастание времени затухания с увеличением длины
волны испускания представляется неожиданным в свете известной чувстви-
тельности индола к полярности растворителя. Однако испускание белков было
разделено на несколько классов, и было найдено, что для внутренних остат-
ков квантовый выход более низок [45]. Таким образом, более короткие време-
на затухания внутренних триптофановых остатков могут быть следствием ха-
рактеристических особенностей флуоресценции белков и не релаксационные
процессы вокруг возбужденного состояния могут обусловливать приведенные
выше наблюдения. Кажется вероятным, что и гетерогенность, и релаксация
дают свой вклад в зависимость времен затухания белков от длины волны.
Относительная важность каждого процесса в настоящее время не ясна, и,
по-видимому, опа различна для разных белков.

11.6* Динамика белков, регистрируемая флуоресцентными
методами

Из-за присущего флуоресцентной спектроскопии естественного временно-
го окна в наносекундной временной шкале она идеально подходит для регистра-
ции процессов в этом временном диапазоне. Известны три типа параметров, ко-
торые показывают, что белки обладают значительной сегментальной подвиж-
ностью в наносекупдном диапазоне: тушение флуоресценции белков кислородом,
кинетики затухания анизотропии флуоресценции и зависимость времен затуха-
ния флуоресценции белков, содержащих единственный триптофановый остаток,
от длины волны. Интепретация последних дискуссионна, потому что зависимость
времени затухания от длины волны может быть результатом либо релаксации,
либо гетерогенности. Опыты по тушению флуоресценции кислородом свиде-
тельствуют о проницаемости белковой матрицы для кислорода в наносекупдном
временном диапазоне. Измерение анизотропии показывает, что угловое смеще-
ние триптофановых остатков слишком быстрое для того, чтобы его можно было
объяснить вращательной диффузией белка. Это избыточное движение варьиру-
ет среди триптофановых остатков и зависит от изучаемого белка и точности
условий эксперимента. Времена затухания флуоресценции белков, содержащих
единственный триптофановый остаток, возрастают с увеличением длины вол-
ны испускания, поэтому можно предположить релаксацию диполей.

11.6.1.	Динамика белков, 'регистрируемая по тушению
фпуоресценции белков

Динамическое тушение флуоресценции определяется частотой столкнове-
ний между флуорофором и тушителем. Рассмотрим триптофановый остаток, по-
груженный в белковую матрицу. Рентгепоструктурным анализом белков уста-
новлено, что аминокислотные остатки плотно упакованы, так что внутри белка
нет свободного пространства для молекулы, подобной кислороду [ 46]. Однако то,
что кислород тушит флуоресценцию триптофана в белках, указывает, что кисло-
род диффундирует сквозь матрицу большинства белков со скоростью, составля-
ющей 20 - 50% скорости диффузии в воде [47]. Для объяснения такой быстрой
диффузии было предположено, что белковая матрица должна флуктуировать в
наносекундном временном диапазоне таким образом, чтобы обеспечить про-
никновение кислорода.

Типичный график Штерна - Фольмера для тушения флуоресценции белка
кислородом приведен на рис. 11.24. Отметим, что константы тушения сравни-
мы с теми, которые наблюдаются для свободного триптофана. Для 12 изучен-
ных белков бимолекулярные константы тушения находятся в диапазоне!
(ОД — 0,5) • 1О10 М-1- с"1. Если бы кислород не мог проникать внутрь белка, следова-
ло бы ожидать, что график Штерна - Фольмера отклонится от прямой в сторо-
ну оси концентраций (разд. 9.8.4). Таких отклонений не наблюдается, что ука-
зывает на приблизительно одинаковую доступность всех остатков в изученных
белках. Более того, не существует корреляции между бимолекулярными ков -
(021, М

РИС. 11.24. Графики Штерна — Фольмера для тушения флуоресценции белков
кислородом [47].

1 — данные для триптофана; 2 — для бычьего сывороточного альбумина; 3 —
для иммуноглобулина G; 4 — для альдолазы; 5 — для а-химотрипсина. (С разре-
шения American 'Chemical Society.)

стантами тушения и максимумами испускания белков (рис. 11.25). Если бы ту-
шились только внешние остатки, то константы тушения для остатков, имеющих
спектр, сдвинутый в коротковолновую область, были бы меньше, что и наблю-
дается для тушения акриламидом [ 22].

Из-за неожиданности этих результатов был проведен ряд экспериментов
для того, чтобы убедиться, что наблюдается тушение при столкновениях, и для
того, чтобы исключить другие возможные артефакты. То, что наблюдаемое
тушение происходят при столкновениях, было доказано сопоставлением кванто-
вых выходов и времен затухания флуоресценции (разд. 9.2.1). Уменьшение вре-
мени затухания пропорционально снижению квантового выхода подтверждает,
что молекулы кислорода диффундируют к флуорофору в течение времени жиз-
ни возбужденного состояния. Перенос энергии между разными остатками, как
существенный фактор в тушении, также исключается. Если бы происходил
быстрый перепое энергии между триптофановыми остатками и поверхност-
ные остатки быстро тушились, то энергия с внутренних остатков могла бы быть
перенесена на внешние остатки и, таким образом, внутренние остатки оказались
РИС. 11.25. Корреляция максимума испускания флуоресценции белков с бимо-
лекулярной константой тушения кислородом [47].

1 — а-химотрипсин; 2—- бычий сывороточный альбумин; 3 — человеческий сыво-
роточный альбумин; 4 — эдестин; 5— карбоангидраза; 6 — альдолаза; 7- карбо-
ксипептидаза А; 8 —трипсиноген; 9 — иммуноглобулин С; 10 — лизоцим; 11 — пеп-
син; 72— трипсин.

бы потушенными. Такая возможность была исключена путем возбуждения флуо-
ресценции на краю длинноволновой области спектра поглощения. По причинам,
которые не вполне ясны, перенос энергии между одинаковыми остатками при
длинноволновом возбуждении не происходит [ 48]. Кроме того, было показано,
что белки все еще сохраняют активность в присутствии наивысших концентра-
ций кислорода [47].

Как было описано для мембранно-связанных флуорофоров (разд» 9.8.8.1),
кажущаяся бимолекулярная константа тушения может увеличиваться, если ту-
шитель предпочтительно распределяется в объем, непосредственно окружающий
флуорофор. Заметное влияние распределения па тушение флуоресценции белков
кислородом кажется маловероятным, поскольку максимальная растворимость
кислорода в неполярных растворителях всего лишь приблизительно в шесть раз
больше растворимости в воде. Если бы существовало некоторое предпочтитель-
ное рапределение кислорода в неполярные области белков, то такая локализация
должна быть отвергнута по соображениям стабильности свернутого белка, струк-
тура которого должна была бы быть разрушена для того, чтобы принять молеку-
лы кислорода. Даже если концентрация кислорода, удерживающегося внутри бел-
ка, несколько возрастет, то скорость диффузии кислорода должна быть слишком
большой для того, чтобы ею можно было объяснить наблюдаемое тушение. Сле-
довательно, данные по тушению кислородом указывают на гибкость белковой
матрицы.
Следует отметить, что к подобным выводам приводит тушение флуоресцен-
ции белков акриламидом, за исключением того, что бимолекулярные константы
тушения сильнее различаются для разных белков и в целом меньше, чем кон-'
станты, наблюдаемые для кислорода [ 22]. Графики Штерна - Фольмера для ту-
шения акриламидом флуоресценции ряда белков, содержащих единственный
остаток триптофана, приведены на рис. 11.26. Некоторые остатки, например
экспонированные в растворитель остатки в АСТН и монеллине, легкодоступны
для акриламида. Другие остатки, такие, как RNAaaa Т и азурин, скорее экра-
нированы от тушения при столкновениях. В противоположность тушению кисло-
родом (рис. 11.25) в данном случае наблюдается четкая корреляция бимолеку-
лярных констант тушения с максимумами испускания белков (рис. 11.27). Это
говорит о том, что акриламид предпочтительно тушит экспонированные остат-
ки триптофана.

Для того чтобы различить тушение экспонированных и погруженных остат-
ков триптофана, было изучено [ 49] влияние повышенной вязкости на тушение
ряда белков (табл. 11.2). Как и предполагалось для экспонированных остатков,
повышение вязкости приводит к уменьшению тушения. Для более погруженных
остатков, таких, как остатки в USA, HNAase Т и альдолазе, влияние вязко-
сти на константу тушения было значительно ниже. Так как на тушение погру-

РИС. 11.26. Зависимость тушения белков, содержащих единственный остаток
триптофана, от концентрации тушителя — акриламида [22].

(С разрешения American Chemical Society.)
РИС. 11.27. Корреляция максимумов испускания белков с константами тушения
акриламидом [22].

1—азурин; 2—H3A-SDS; 3—RNAaaa Т\;4 — нуклеаза ИЗ Staphylococcus аигеиз;
5- HS А при pH 2,5; 6 - HS А при pH 5,5. 7- монеллин; 8 - глюкагон; 9 - АСТН.
(С разрешения American Chemical Society.)

,	Таблица 11.2. Зависимость тушения белков акрил-

амидом от вязкости [49]



	Вода	50%-ный глицерин	%	4,(г)
NATA	17,3	5,4	1,35	4,5
АСТН	13,0	6,0	1,7	3,6
Г люкагон	10,5	5,0	1,7	3,5
Пепсин	9,5	3,5	1.1	3,0
Монеллин	4,2	2,2	1,35	2,6
Нуклеаза	5,2	2,4	1,2	2,6
HSA, pH 2,5	3,4	2,1	1,2	2,0
|3-Трипсин	2,4	1,9	1,25	1,6
HSA, 0,2 М КС1	5,1	3,5	1,2	1,4
RNAaaa 7’ 1	1,1	0,9	1,0	1,2
Альдолаза	0,5	0,55	1,25	1,1

а Относительный квантовый выход в 50%-ном
глицерине [фг  и в воде [ф0].
женных о< л атков общая вязкость раствора не влияет, то авторы работы [49]
вполне обоснованно заключили, что скоростьлимитирующей стадией должна
быть диффузия через белок, но не через раствор. Следовательно, акриламид
тоже может проникать в белковые матрицы.

11.8.2. Кинетика затухания анизотропии флуоресценции

Указания на динамические свойства белков дает также кинетика затуха-
ния анизотропии флуоресценции. Если триптофановый остаток неподвижен
внутри белковой матрицы, то следует ожидать одноэкспоненциального затуха-
ния анизотропии [г гq& ‘ ф] с временем корреляции ф, сравнимым с вычис-
ленным по формуле

ф	(у + А)	(И ,6)

где М — молекулярная масса; v — удельный объем; h — степень гидратации бел-
ка; г| - вязкость растворителя. В противоположность этому, если остаток име-
ет свободу сегментальных движений, то кажущееся время корреляции будет
меньше, чем предсказываемое уравнением (11.6), и затухание может стать мно-
гоэкспоненциальиым (разд. 6.1.3). В белках могут быть как подвижные, так и
неподвижные триптофановые остатки.

Кинетика затухания анизотропии для человеческого сывороточного альбу-
мина HS А, щелочного белка миелина (МЕР) И нуклеазы Staphylococcus aureus
приведены па рис. 11.28 [ 50]. При низкой температуре (8 °C) время корреляции
для затухания анизотропии HSA составляет 31 нс, что сравнимо с вычисленным
значением 40 нс для сферы с М = 6400 и гидратацией 0,2 г на грамм белка. При
повышении температуры наблюдается более быстрая потеря анизотропии за ко-
роткое время, что указывает на более быстрое угловое смещение единственно-
го триптофанового остатка в HSA. Диапазон углов таких смещений должен быть
ограничен, в противном случае более быстрое затухание должно было бы про-
должаться до того момента, пока анизотропия не станет равной нулю. Из этих
данных было вычислено время корреляции для быстрых движений, равное 0,14 нс.

Подобно HSA при низких температурах, триптофановый остаток в нуклеазе
также оказывается неподвижным. Однако важно отметить, что анизотропия в
.нулевой момент времени может быть меньше, чем анизотропия, ожидаемая для
триптофанового остатка в отсутствие каких бы то ни было вращательных сме-
щений. г)то может указывать па возможность некоторых движений этого остат-
ка за времена, слишком короткие для того, чтобы их можно было зарегистри-
ровать на имеющемся оборудовании. Результаты для щелочного белка миелина
Анизотропия

0,25

РИС. 11.28. Кинетика затухания анизотропии фпуоресценции для человеческого
сывороточного альбумина (а), щелочного белка миелина и нуклеазы (б).

(С разрешения авторов работы [ 50].)
существенно отличаются от двух ранее изложенных случаев. Для МВР затуха-
ние анизотропии очень быстрое с,о средним временем корреляции менее 1 ис.
Известно, что в водных растворах МВР находится в основном в бесструктур-
ном состоянии.

Подобные результаты были получены при использовании другой методики
изучения анизотропии с данным временем затухания (разд. 6.4). Измеряется
стационарная анизотропия, причем времена затухания уменьшаются за счет ту-
шения кислородом. Предполагается, что анизотропия г должна зависеть от
времени вращательной корреляции q> в соответствии с уравнением Перрена:

1	1 т

- -= - .  	(11.7)

Г	Г	Г ф

О	(V

где т - время затухания флуоресценции ; г о - анизотропия в отсутствие враща-
тельной диффузии. Предполагается также, что график зависимости г”1 отт
должен быть линейным с отсекаемым отрезком г"1 и наклоном (г ф)”1.Сегмен-
0	о

тальная подвижность триптофанового остатка проявляется при более коротком
измеренном времени корреляции, чем предсказанное уравнением (11.6). Кроме
того, сегментальные движения, слишком быстрые для того, чтобы они могли

РИС. 11.29. Графическая зависимость анизотропии с заданным временем зату-
хания для человеческого сывороточного альбумина от времени затухания флуорес-
ценции в отсутствие и в присутствии денатурантов [51].
быть зарегистрированы при кратчайших затушенных временах жизни, выявляют-
ся из пониженного кажущегося значения г получаемого при экстраполяции к
т = 0. Анизотропия при заданных временах затухания для USA приведена па
рис. 11.29 [ 51]. В согласии с данными кинетических измерений было найдено,
что триптофановые остатки неподвижны при низкой температуре (<р - 45 нс
при 4°С) и эти же остатки довольно быстро вращаются при 44°C (<р - 8,5 пс).
Денатурация HSA гуаиидипгидрохлоридом приводит к значительному понижению
времени корреляции. Отметим, что в дополнение к уменьшению времени кор-
реляции значение г получаемое экстраполяцией, меньше в денатурированном
белке. Это объясняют очень быстрыми движениями триптофанового остатка, ко-
торые не могут быть зарегистрированы при кратчайших затушенных време-
нах жизни.

Анизотропии с заданным временем затухания дляМВР и монеллина показа-
ны на рис. 11.30. Для обоих белков кажущееся время корреляции меньше, чем
следует ожидать для вращательной диффузии белка как целого. Па высокую
сегментальную свободу триптофановых остатков указывает также большое зна-
чение отсекаемого отрезка па оси у (г~!). Следовательно, измерения как кипе-
тики анизотропии, так и анизотропии с заданным временем затухания показы-
вают, что сегментальные движения триптофановых остатков происходят в раз-
ных белках.

Время затухания флуоресценции, нс Время затухания флуоресценции, нг

РИС. 11.30. Графическая зависимость анизотропии с заданным временем за-
тухания от времени затухания флуоресценции для щелочного белка миелина (а) и
монеллина (б) [51].
Имеющиеся в настоящее время данные недостаточны для обобщающих вы-
водов о средней сегментальной свободе триптофановых остатков в белках. Тем
не менее кажется очевидным, что такая свобода варьируется в белках, и, сле-
довательно, вероятно, она различается для разных остатков триптофана в одном
и том же белке. Например, оба триптофановых остатка в алкогольдегидрогена-
зе из печени лошади оказываются неподвижными по отношению к белковой мат-
рице [39, 51]. В качестве гипотезы было принято, что сегментальная свобода
триптофановых остатков может коррелировать со степенью их связанности во-
дородными связями в белковой матрице. Известно, что малые молекулы в раст-
воре вращаются быстрее, чем можно ожидать на основании их молекулярных
объемов, и что образование водородной связи с растворителем устраняет такое
избыточное вращение [ 52]. Точно так же несвязанные индольные остатки могут
проявлять избыточную сегментальную подвижность в белках. Подобные сообра-
жения приводят к неожиданному предсказанию, что триптофановые остатки, по-
груженные в неполярные области белков, могут быть более подвижны, чем ос-
татки вблизи более полярной поверхности раздела вода - белок.

11.6.3.	Зависимость времен затухания флуоресценции
триптофана от длины волны

В заключение раздела о динамических свойствах белков мы опишем из-
вестную зависимость времени затухания флуоресценции от длины волны. На-
помним, что когда скорость дипольной релаксации сравнима со скоростью ио-

РИС. 11.31. Зависимость времен затухания флуоресценции белков от длины вол-
ны [ 37].
пускания флуоресценции, средние времена затухания возрастают с увеличением
длины волны. Именно это и было обнаружено для флуоресценции триптофана в
разных белках, содержащих единственный триптофановый остаток (рис. 11.31).
Для двенадцати различных однотриптофановых белков в диапазоне 320-400 нм
среднее увеличение составило 1,2 нс [42]. Повышение температуры уменьшает
эту разницу во временах затухания, что указывает на практически полное за№|>
шение релаксации до испускания. Времена затухания, приведенные па рис. 11,31,
измерены методом фазового сдвига (разд. 3.2), но подобные результаты были
получены и импульсным методом. Гринвальд и Стейнберг [53] измеряли кине-
тику затухания флуоресценции пепсиногена цыпленка. В длинноволновой об-
ласти испускания наблюдался член с отрицательным предэкспонепциальпым
множителем. Наличие такого множителя доказывает, что процессы в возбуж-
денном состоянии могут приводить к испусканию с большей длиной волны.
Хотя дипольная релаксация вокруг триптофановых остатков, вероятно, проис-
ходит, наблюдение отрицательного члена все же неожиданно. Такой член пе
найден для NATA в пропиленгликоле при ~ 20°С [ 37, 38], хотя ясно, что в этом
растворе релаксация оказывает главное влияние на времена затухания (см.
рис. 11.21). Известно, что спектральное перекрывание неотрелаксировапного и
отрелаксированного испускания может маскировать отрицательный член в ки-
нетике затухания и что такое перекрывание может препятствовать наблюде-
нию этого члена в триптофановой флуоресценции.

РИС. 11.32. Гипотетический спектр
испускания фенола. См. задачу 11-1.
Задачи

11-1. Предположим, что спектр на рис. 11,32 был получен для фенола. Предполо-
жим далее, что незатушенное время затухания фенола tq равно 5 нс и что рКд трис-
буфера равно 7,5.

а)	Какова природа спектра и спектральных изменений?

б)	Какова константа скорости имеющейся здесь в виду реакции? Предположим, что
нейтральный трис - главный акцептор протонов. Сравнима ли эта константа скорости
с константой, ожидаемой для диффузионно-контролируемой реакции?
ГЛАВА'12.

Спектральные характеристики систем,
в которых протекают обратимые реакции
с участием двух состояний

Множество флуорофоров подвергается реакциям в возбужденных состоя-
ниях. К типичным реакциям относятся образование эксимеров и эксиплексов,
протонирование и депротонирование, а также перенос энергии. Поглощение фо-
тона вызывает изменение электронного распределения в молекуле флуорофо-
ра, что часто меняет его химические или физические свойства и может сти-
мулировать протекание реакций с другими компонентами раствора. Во многих
случаях процессы, протекающие в возбужденном состоянии, можно описать
простой схемой, включающей реакцию взаимопревращения двух состояний. В
этой главе приведено детальное описание спектральных свойств такой модели,
составляющих базис, с которым можно сравнивать экспериментальные данные.
При желании можно использовать теоретическое описание этой модели для оп-
ределения кинетических и спектральных констант системы.

Для того чтобы проиллюстрировать протекание любого процесса в возбуж-
денном состоянии во времени и в пространстве, рассмотрим образование эк-
сиплекса между антраценом и диэтиланилипом (DEAJ. В возбужденном состоя-
нии антрацен может отнимать электрон у DEA, образуя комплекс с переносом
заряда, так называемый эксиплекс. В отличие от структурированного испуска-
ния антрацена для эксиплекса наблюдается широкий бесструктурный спектр,
причем эксиплекс испускает флуоресценцию при больших длинах волн, чем ант-
рацен (см. рис. 12.17). Для образования эксиплекса необходимо, чтобы произо-
шло столкновение возбужденной молекулы антрацена с молекулой DBA. Ско-
рость или частота таких столкновений определяются коэффициентами диффузии
реагирующих веществ. В жидких растворителях с вязкостями I сП коэф-
фициенты диффузии равны ~10“5 см2/с. Константа скорости диффузионно-
контролируемой реакции определяется выражением
k = yWW/ЮОО	(12.1)

где R - сумма радиусов молекул; N - число Авогадро; D - сумма коэффици-
ентов диффузии; у - доля столкновений, приводящих к образованию эксиплекса.
Для большинства процессов, протекающих в возбужденных состояниях, у близ-
ка к единице. Принимая эффективные радиусы каждой из молекул равными
4 X, получаем k = 1,2 • 1010 М"1 • :с~1. Доля непрореагировавших молекул ап-
трацепа определяется относительной интенсивностью флуоресценции антраце-
на F/FQ:

. ______J______	(12.2)

bbJDEA]

где т - время затухания флуоресценции антрацена в отсутствие DEA; F и
F - интенсивности флуоресценции антрацена в присутствии и в отсутствие
DEA соответственно. Поскольку время затухания для антрацена ~ 4 нс, 50%
возбужденных молекул антрацена будут образовывать эксиплексы, когда
AtJDEA] » 1 или [DEA] 0,021 М. Следовательно, даже небольшие концент-
рации реагентов могут значительно изменить спектральные свойства флуоро-
форов.

Аналогичный вывод получается при рассмотрении среднего расстояния,
на которое может продиффундировать молекула диэтиланилина за время жизни
возбужденного состояния антрацена. Рассчитывают объемную концентрацию
DEA, необходимую для того, чтобы молекулы DEA находились на таком рас-
стоянии. Среднеквадратичное расстоянис[(Ах2)4], па которое молекула диф-
фундирует за время т можно оценить по уравнению Эйнштейна:

Дх\2/)т0	(12.3)

Принимая/) « 1- Ю~б см2/с и то =- 4,0 нс, находим, что среднеквадратичное
расстояние в этом случае равно 29 А. Объемная концентрация, необходимая
для такого расстояния, составляет л'0,08 М. Следовательно, флуорофоры в
возбужденных состояниях вступают в реакции по двум причинам. Это, во-пер-
вых, изменение химических свойств в возбужденном состоянии, а во-вторых,
молекулярные взаимодействия, которые успевают произойти за время жизни
возбужденного состояния. Из этих рассуждений с очевидностью вытекает, что
возбужденные флуорофоры чувствительны к свойствам того окружения, кото-
рое охватывает несколько большие расстояния и объемы, и дают о нем инфор-
мацию. Например, упомянутое выше расстояние 29 X сравнимо с диаметром
многих белков и равно примерно половине толщины биологических мембран.
Кроме того, в сфере радиусом 15 А содержится около 30 молекул раствори-
теля или растворенного вещества, любая из которых, вероятно, может изме-
нять спектральные свойства флуорофора.

В литературе появилось множество данных, касающихся химических ас-
пектов реакций в возбужденных состояниях, которым посвящены большие
обзоры [1-3]. Кроме того, реакции возбужденных состояний все шире ис-
пользуются для получения информации о свойствах биологических макромоле-
кул L 4, 5 ]« Папример, образование эксимеров в мембранах, меченных флуоре-
сцентными зондами, можно использовать для количественного определения
скоростей латеральной диффузии зондов в мембранах [6,7] «Такие данные
дают информацию о влиянии температуры и химического состава на кажущую-
ся величину микровязкости в гидрофобной области мембран. Еще один тип
реакций в возбужденном состоянии - безызлучательный перенос энергии*
(гл. 10). Это явление широко использовали для измерения статических расстоя-
ний между флуорофорами, связанными с белками или мембранами [8, 9]. Еще
раньше с помощью этого явления была получена информация о расстояниях
наибольшего сближения хромофоров [ 10 ] и о сегментальной подвижности
простых пептидов [ II ]. Последние из упомянутых измерений в конечном сче-
те можно распространить на случай более сложных биологических полимеров,
что даст информацию о скоростях и амплитудах структурных флуктуаций био-
полимеров в растворах. Из приведенных примеров ясно видно, что применение
кинетики возбужденных состояний для характеристики биополимеров может
дать ценную информацию об их структурных и динамических свойствах.

Ввиду большой распространенности процессов, протекающих в возбуж-
денных состояниях, приведем описание характеристик флуорофоров, которые
вступают в такие реакции, в частности детально рассмотрим обратимую реак-
цию взаимопревращения двух состояний (рис. 12.1). Некоторые из упомянутых
выше реакций хорошо описываются этой простой схемой. Безусловно, поведе-
ние молекул может быть гораздо сложнее, но эту простую модель можно ис-
пользовать как основу для изучения более сложных процессов. Флуорофоры,
описываемые в рамках данной модели, имеют много общих спектральных
свойств, не зависящих от природы реакции в возбужденном состоянии и поз-
воляющих отличить процесс, который протекает в возбужденном состоянии,
от простой гетерогенности основного состояния (гл. 3). Мы приведем анализ

РИС. 12.1. Диаграммы уров-
ней энергии и скоростей для обра-
тимой реакции с участием двух
состояний.

*

Безызлучательный перенос энергии — физический процесс, а не химическая
реакция, но описывается сходной кинетической схемой. — Прим. рвд.
таких реакций с помощью как импульсной (мгновенной), так и фазово-модуля-
ционной флуорометрии. Еще раз подчеркнем, что описанные в этой главе спект-
ральные свойства являются общими для любых реакций с участием двух состоя-
ний и не ограничиваются только теми примерами, которые приведены в тексте.

12.1.	Обратимая реакция с участием двух состояний

Модель для обратимой реакции с участием двух состояний возбужденного
флуорофора приведена на рис. 12.1. Обозначения уровней анергии и соответст-
вующие! индексы F и R относятся к первоначально возбужденному и образовав-
шемуся в результате реакции состояниям соответственно. Константы скорости
дезактивации этих состояний равны Г_, »	+ k и г = х + k, где А , и

г г г К R К	F

Ar - излучательные константы скорости, a kp и - константы скорости
безызлучательной дезактивации. относится к прямой реакции, a k2 - к об-
ратной. Для простоты не рассматриваются скорости интеркомбинационной кон-
версии в триплетное состояние, а также скорости релаксации растворителя. В
зависимости от специфики рассматриваемого процесса и k2 могут быть бо-
лее сложными, чем просто константы скорости. Например, в случае обратимой
реакции образования эксимера k = k'[Fl, где А' - бимолекулярная констан-
та скорости, [F] - концентрация возбужденного мономера. Для диссоциации
в возбужденном состоянии « k' [Л ], где [ А ] - концентрация акцептора про-
тона. /[ля простоты во всех уравнениях будут использованы члены и k2.

Обычно интенсивности света при измерениях флуоресценции [ E(t)] низки
по сравнению со скоростями дезактивации возбужденных состояний*. Исклю-
чение составляют случаи лазерного возбуждения. Кроме того, после перехода
в основное состояние быстро восстанавливается равновесие. Поэтому мы не
показали на рис. 12.1 обеднение основного состояния или возможность сущест-
вования двух различных основных состояний флуорофора. Предполагается,
что равновесие в основном состоянии в большей степени сдвинуто в сторону
состояния F.

12.1.1.	Стационарная флуоресценция при протекании обратимой
реакции в возбужденном состоянии

Прежде чем обсуждать изучение реакций в возбужденных состояниях с
помощью импульсной и фазово-модуляционной флуорометрии, полезно привес-

* Это утверждение автора вызывает возражения. В стационарном состоянии
скорость гибели возбужденных молекул всегда равна скорости возбуждения. На
самом деле важно, какая доля молекул переходит из основного состояния в возбуж-
денное, т.е. нужно знать отношение произведения скорости возбуждения на время
жизни возбужденного состояния к концентрации молекул в основном состоянии. —
Прим. ред.
ти краткое описание характеристик спектральных свойств, наблюдаемых при
использовании стационарных методов. Предположим, что существуют такие
длины волн, которые соответствуют испусканию только из исходного возбуж-
денного состояния F и только из состояния R, образовавшегося в результате реакции.
Вначале будем считать, что реакция необратима, т.е. = 0 (рис. 12.1). Отно-
сительный квантовый выход флуоресценции из состояния F равен отношению
излучательной константы скорости к суммарной константе скорости дезактива-
ции состояния F. Таким образом,

f0 =	+ SJ и f = MS +• S S)	(I2-5)

где F и F - интенсивности флуоресценции в отсутствие и при наличии реак-
ции соответственно. Поделив уравнение (12.5) на (12.4), получим

F _	1 ж 1	(12.6)

Fo 1+STOF 1 + МГд)

где tof = (Af + &F)~1 = г~1 - время затухания в отсутствие реакции в возбуж-
денном состоянии. Напомним, что для бимолекулярной реакции	[Л], где

[ А ] — концентрация частиц, вступающих в реакцию с возбужденным флуорофо-
ром. Выход состояния R - это доля молекул, находившихся в состоянии F, кото-
рые вступили в реакцию. Она определяется выражением

А. 1 _	.	1	. k’r°”	(12.7)

«о	’MVor)” , +

где R и /?о - интенсивности флуоресценции прореагировавших молекул в слу-
чае, когда скорость реакции сравнима с обратной величиной времени жизни и
когда k}TQF » J соответственно. В случае образования эксимера при больших
концентрациях мономера должна наблюдаться интенсивность RQ. Если образует-
ся эксиплекс, /?о должна наблюдаться при высоких концентрациях того вещест-
ва, которое образует эксиплекс с флуорофором. Важно отметить различие зави-
симостей интенсивностей флуоресценции из состояний F и R от степени проте-
кания реакции. Интенсивность флуоресценции из состояния F монотонно умень-
шается до нуля по мере того, как константа скорости реакции становится боль -
ше обратной величины времени жизни. Наоборот, интенсивность флуоресценции
из состояния R равна нулю, когда ^toF « 1, и увеличивается до постоянного
значения, когда kyroF » 1. Причина существования этого предела заключает-
ся в том,, что почти все частицы, находящиеся в состоянии F, переходят в со-
стояние R. Однако флуоресценция частиц, образовавшихся в результате реак-
ции, практически может не достигать предельной величины, а даже уменьшать-
ся по мере роста константы скорости прямой реакции. Так, например, Весело-
ва и др. [ 12] при изучении реакции образования эксиплексов производных фтал-
имида с аминами нашли, что уменьшалась при увеличении концентрации
амина. Это могло быть результатом либо тушения флуоресценции эксиплекса
аминами, либо диссоциации эксиплекса [ 14]. Обсуждение будет детально прове-
дено ниже.

Если реакция в возбужденном состоянии обратима, относительный выход
по-прежнему определяется уравнениями (12.4) и (12.5), но смысл константы
тушения k более сложен 114]. Для обратимой реакции

* = Vr/Cr	(12.8)

В предельном случае, когда k2 « г дезактивация состояния R происходит
быстрее, чем обратная реакция, и реакция становится практически необрати-
мой. Тогда наблюдаемую константу тушения можно приравнять константе
скорости прямой реакции В противоположном предельном случае (k2>> rft)
кажущаяся константа тушения дается выражением

*tof -

TOF

TOR

(12.9)

При этом равновесие устанавливается за время жизни возбужденного состояния
[14]. Кажущееся значение константы скорости тушения определяется равновес-
ными заселенностями состояний F и R, которые зависят от констант скорости
прямой и обратной реакций и времен жизни возбужденных состояний. Важно по-
нимать, что для обратимой реакции в возбужденном состоянии кажущаяся кон-
станта Штерна - Фольмера для состояния F не обязательно равна константе
скорости прямой реакции k,.

Интересно отметить, что протекание заметной обратной реакции может
привести к отклонению вниз кривых на графиках Штерна - Фольмера. Точнее,
отношение в правой части уравнения (12.8) меньше единицы, если k2 « |~R.
Изменение, условий, например увеличение концентрации реагирующих частиц
или температуры, может способствовать тому, что обратная реакция станет
значительной.

12.2.	Затухание фпуоресценции дпя обратимой реакции с участием

двух состояний

Приведем теперь описание теории обратимой реакции с участием двух со-
стояний, наблюдаемой методами импульсной флуорометрии*. Предполагается,

* Кинетика флуоресценции в таких системах подробно рассмотрена в работе:
Кузьмин М.Г., Садовский Н.А. — Химия высоких энергий, 1975, т. 9, N» 4, с. 291. —
Прим. ред.
что возбужденная молекула существует в двух состояниях, каждому из кото-
рых соответствует свой спектр испускания, и что кинетические константы для
этих состояний не зависят от длины волны испускания. Эта модель, вероятно,
хорошо описывает реакции диссоциации в возбужденном состоянии, а также
реакции образования эксимеров и эксиплексов [ 15 - 17]. Однако она неприме-
нима для точного описания дипольной релаксации растворителя (гл. 8), которая
может быть лучше объяснена с помощью континуальной или многостадийной мо-
делей [ 18 - 19]. Эту модель нельзя также применять к процессам переноса
энергии в растворах, где имеется набор расстояний между донором и акцепто-
ром (разд. 10.6). В таких образцах затухание флуоресценции донора не явля-
ется экспоненциальным.

Приведенная на рис. 12.1 модель описывается следующими кинетическими
уравнениями:

_	= (rF + kJ [ F] -kjR] — E(t)	(12.10)

dt

-	= (Г- + k,)[R] - A [F]	(12.11)

dt

где [F] и [R] - концентрации соответствующих состояний; E(t) - форма воз-
буждающей вспышки. Решение этих кинетических уравнений было описано для
граничных условий [F] = [F ] и [R] = 0 при t = 0 [ 1, 15]. После возбуждения
5-импульсом затухание флуоресценции из состояний F и R для любого волново-
го числа v выражено как

IF (v, t ) = a1(v)e-f/Ti + a2(U)e"‘/T2	(12.12)

*) = ₽ .(v)e /Z 1 +₽2(v)e	2	(12.13)

zv	1	z

Введя обозначения у s rF 4- А и ук =	4- k2, получаем выражения для вре-

мен затухания в виде

| l(Yr.YR)H(YR-YF)2+«A]“l	(12.14)

а для предэкспоненциальных множителей

(yf -y,Mf-

a (v)-Cfp)[F0] ----------- (12.15)

Л ~ ъ

«2(v) = Cf(v)[Fq] (-y.k7yF)AX	(12.16)

b -ъ
-0^). ₽2(v)«	(1217)

у1 ~ У2	•	’

В этих уравнениях У1 = Т;1 и у2 = т“1; CF(v) и CR(v) - спектры ис-
пускания из состояний F и R, нормированные к единичной площади:

nF<v)	"rW

Cf,(V).-----------; CR(V>= --------------- (12.18), (12.19)

ОО	ОО

С nF(v)civ	f nR(y)dv

о	О

где пр(й) и nR(v) - числа квантов, испущенных при волновом числе v из со-
стояний F и R соответственно,

Для любого данного волнового числа закон затухания флуоресценции за-
писывается как

/(v, Г) = IF(v, t) + IR (v,t)	(12.20)

где каждый из законов затухания отдельно для состояний F и R описывается
уравнениями (12.12) и (12.13), Подставляя их в уравнение (12.20), получаем

[F]

/(v, t)=------- \.CF(y)\F(-YF - y2) - CR(v)^iXRle 1 +

Л -y2

[Fo]

+..........[ CR (v )A p (y —'Y p] G R{y	®	(12,21)

Л -y2

Характерная особенность обратимой реакции возбужденного состояния
очевидна из уравнения (12.21): при любой данной длине волны затухание флуо-
ресценции двухэкспоненциально. Каждое из времен затухания не зависит от
длины волны испускания. К сожалению, оба времени затухания являются слож-
ными функциями четырех кинетических констант системы [уравнение (12.14)].
В разд. 12.2.2 будет показано, как можно уменьшить эту сложность, исполь-
зуя другой метод - обратную свертку кривых затухания при различных длинах
волн [ 20]. Выражения для предэкспоненциальных множителей также сложны и
содержат зависимости как от спектрального распределения, так и от кинети-
ческих констант обоих видов излучателей [уравнения (12,15) - (12.19)]. Их
также можно упростить с помощью методики обратной свертки при различных
длинах волн.

Еще одна важная характерная особенность реакции в возбужденном со-
стоянии хорошо видна из уравнений (12.13) и (12.17). В том случае, когда на
затухание флуоресценции из состояния R не налагается флуоресценция из
состояния F, затухание флуоресценции описывается двухэкспоненциальным
законом с равными, но имеющими разные знаки предэкспоненциальными мно-
жителями. Равенство предэкспонент говорит о том, что наблюдается испуска-
ние только из состояния R. Если есть вклад флуоресценции из состояния F,
р и р не будут равны. Появление отрицательной предэкспоненты, независи-
мо от ее величины, характеризует процесс в возбужденном состоянии. Непо-
средственное возбуждение смеси флуорофоров (случай гетерогенности в ос-
новном состоянии) приведет к многоэкспоненциальному затуханию флуорес-
ценции, но отрицательные предэкспоненциальные множители не появятся. Пе-
рекрывание спектров испускания из состояний F и R может мешать наблюде-
нию затухания, описываемого функцией с отрицательной предэкспонентой. По-
этому отсутствие этого члена в законе затухания флуоресценции не может
служить доказательством того, что процесс в возбужденном состоянии не про-
текает. Напротив, присутствие такого члена однозначно доказывает наличие
процесса.

Дополнительным важным свойством рассматриваемой модели является
влияние обратной реакции на интерпретацию измеряемых времен затухания
т1 и т . Если реакция обратима, времена затухания зависят от четырех кине-
тических констант - rF, rR, и k2. В противоположность этому в случае
необратимой реакции (k2 - 0) из уравнения (12.14) находим т"1 - rR = t”r
и т~1 = Гр + k, = т”1. Для k2 = 0 измеренные значения времен затухания
представляют собой собственное время жизни состояния, образовавшегося
в результате реакции (т R), и время жизни первоначально возбужденного со-
стояния (т ). На затухание флуоресценции из состояния F обратимость реак-
ции также оказывает влияние. Когда k / 0, затухание флуоресценции из со-
стояния F двухэкспоненциально [уравнение (12.12)]. Однако, когда k2 - 0, из
уравнения (12.14) находим, что ур = у , а из уравнения (12.15) а 1 (v) = 0. В
отсутствие обратной реакции затухание флуоресценции из состояния F стано-
вится одноэкспоненциальным.

12.2.1.	Расчет индивидуальных спектров испускания из,законов
здтухания флуоресценции

Обычно законы затухания флуоресценции представляют в виде суммы
экспонент:

/(v, t) = C[4(v-)e-f/Ti + Л (v)e~‘/T21	(12.22)

где С - произвольная константа; А. (б) - предэкспоненциальные множители
для волнового числа v. Из этих данных желательно рассчитать спектры испус-
кания для каждого из состояний. В литературе in; приводятся общие методики
таких расчетов. Относительно просто это можно сделать, если существует
спектральная область, где испускание соответствует только состоянию F[ 20],
что выполняется, к счастью, для множества процессов в возбужденных состоя-
ниях [ 15, 16, 21 - 26]. Важно понимать, что если протекает реакция в возбуж-
денном состоянии, то для расчета спектров испускания каждого из видов частиц
нельзя использовать простые уравнения, применимые для случая гетерогенно-
сти в основном состоянии (гл. 3), - нужны более сложные выражения. Дальней-
шая задача заключается в получении всех необходимых кинетических констант
из измеренных величин т1 и т „ В этом случае также надо выполнить достаточ-
но сложные расчеты. Приведем вначале некоторые из этих усложненных выра-
жений, а затем опишем прямой метод, который позволяет применить более про-
стые уравнения, выведенные для случая гетерогенности в основном состоянии,
и получить спектры испускания частиц, принимающих участие в реакции в воз-
бужденном состоянии.

Из измеренного закона затухания l(y, t ), описываемого уравнением (12.22)
(два времени затухания т1 и т2 и два предэкснонепциальных множителя), можно
рассчитать индивидуальные спектры и одновременно найти уF и yR. Для этого
необходимо наличие спектральной области, где испускают только частицы, на-
ходящиеся в состоянии F. Предположим, что vQ находится в такой спектраль-
ной области. Значение yF можно получить следующим способом. Рассмотрим
закон затухания t) [уравнение (12.21) ]. Поскольку CR(vo) -= 0, имеем

/(v0, *)=....... Ск(?о)[ае-£/т1 + а2е"Мт2]	(12.23)

П-г2

где «1 = уг _ у2 и а2 = у1 _ yF< Член yF можно определить следующим об-
разом:

Л ^2

Из уравнения (12.14) находим

yi + у2 я Ъ’ + Iхк	(12.25)

откуда можно вычислить yR. Доли интенсивностей для каждого типа излуча-
телей теперь составляют
fp (v) = Уд ------------------

^T^Yj + H2(v)y

^(v)(y2 ~ Yr) + 4^ fri - Yr)
^(v)y2 + Л2^Л

(12,26)

(12.27)

Спектры для каждого и’з видов частиц рассчитывают из их вкладов в интенсив-
ность и из спектра в стационарном состоянии / (v):

/F(v)=/F(W);	(12.28) , (12.29)

Уравнения (12.24) - (12.29) можно применять для любой длины волны, для кото-
рой закон затухания является двухэкспоненциальным. Однако обычно сущест-
вует длина волны, для которой затухание одноэкспоненциально. Для этой длины
волны необходимо использовать несколько иной способ [ 20]. Следовательно,
видно, что можно получить спектры из законов затухания, но эта методика до-
статочно сложна. Далее, кинетические константы не получают непосредственно
из эксперимента, и их необходимо рассчитывать из кажущихся значений времен
затухания т и т . В следующем разделе описана более простая методика, ко-
торая позволяет непосредственно находить спектры и желаемые кинетические
константы.

12.2.2.	Обратная свертка кривых затухания при различных
длинах волн

В предыдущем разделе было отмечено, что для обратимой реакции в воз-
бужденном состоянии измеренные величины предэкспоненциальных множителей
и времен затухания являются сложными функциями всех кинетических констант
системы (рис. 12.1). С помощью простого способа сложность такой зависимо-
сти можно уменьшить [ 20]. Для применения методики необходимо, чтобы су-
ществовала спектральная область, где можно наблюдать испускание из состоя-
ния F без перекрывания с испусканием из состояния R. Чтобы лучше разобрать-
ся в методике обратной свертки при различных длинах волн, следует учесть,
что флуоресценция из состояния R затухает по двухэкспопенциалыюму закону,
поскольку это состояние заселяется из состояния F. Поняв это, можно приме-
нить простой метод анализа законов затухания. Напомним, что время жизни
непосредственно возбужденных частиц получается с помощью обратной сверт-
ки из закона затухания с временным профилем возбуждающего импульса (гл. 3).
Аналогично время жизни состояния R можно найти с помощью обратной сверт-
ки его закона затухания с возбуждающей функцией для этого состояния. Ею
является временная зависимость заселенности состояния F, которую, безус-
ловно, можно найти из закона затухания флуоресценции состояния Fa Посколь-
ку область нецерекрывания спектров, соответствующих двум состояниям, часто
находится на коротковолновом краю испускания, зависимость от времени засе-
ления состояния F можно измерить непосредственно. Обратная свертка функции
испускания из состояния R с такой же функцией для состояния/7 дает время
жизни состояния R.

Сказанное иллюстрирует рис. 12.2. Предположим, что испускание с корот-
коволновой стороны спектра соответствует только состоянию F, Закон затуха-
ния интенсивности флуоресценции для волнового числа v представляет собой
функцию заселенности состояния F. Состояние F служит источником возбуж-
дения для состояния R, так же как временной профиль возбуждающей вспыш-
ки описывает зависящую от времени возбуждающую функцию для состояния F.
Известно, что обратная свертка функции испускания из состояния F с воз-
буждающей вспышкой дает константу дезактивации этого состояния Анало-
гично обратная свертка функции, описывающей затухание флуоресценции из
R, с функцией, описывающей затухание из F, дает собственное время жизни
состояния R,

Эта методика упрощает также определение спектров испускания из состо-
яний F и R, которые часто перекрываются. Поскольку испускание из состоя-
ния F используют в качестве "возбуждающей функции", любое перекрывание
его испускания с испусканием из состояния R при меньших волновых числах
v, по-видимому, приводит к тому, что его вклад имеет тот же самый времен -

РИС. 12.2. Графическое представление методики обратной свертки при различ-
ных длинах волн [20].
пой профиль, что и возбуждающая вспышка. Обычно в методе наименьших квад-
ратов [27, 28] используют суммы экспонент. Член, соответствующий спект-
ральному перекрыванию, проявляется как короткоживущая компонента «0(ч) с
кажущимся временем затухания т , близким к нулю (рис. 12,2),. Вклад ампли-
туды этой компоненты дает вклад интенсивности испускания из состояния F
при том волновом числе, где оно перекрывается с испусканием из состояния R.
Далее, ненулевое время затухания - это время жизни состояния /?, которое
наблюдалось бы, если бы это состояние возбуждалось непосредственно
[т = (Г + Л2)_1]. Для получения индивидуальных спектров делают обратную
свертку зависящих от длины волны временных сигналов, используя сигнал,
соответствующий состоянию F. Таким образом, получают aQ(v), tq, aK(v) и тд.
Затем на основе этих данных и спектра в стационарном состоянии, рассчитыва-
ют индивидуальные спектры испускания /^(v) и /R(v). Однако в противополож-
ность сложной методике, описываемой уравнениями (12.23) - (12.29), расчет
ведут по более простым уравнениям, похожим на те, которые применяют в слу-
чае гетерогенных образцов:

(fp) = zp)	(12.30)

%Ж+ “Ж

а o(v)t
7r(v)-Z(v)-----5----1-----	(12.31)

12.2.3.	Диссоциация 2-йафтопа в возбужденном состоянии.

Пример обратимой реакции в возбужденном состоянии

Диссоциация 2-нафтола в возбужденном состоянии - поучительный пример
обратимой реакции с участием двух состояний. При возбуждении рКа нафтола
уменьшается от 9,2 в основном состоянии до 2,0 в возбужденном состоянии
[3]. В кислом растворе наблюдается испускание нафтола с максимумом 357 пм
(рис. 12.3, кривая /), а в щелочном - испускание нафтолят-аниопа, центр кото-
рого находится при 409 нм (кривая 2). При промежуточных значениях pH испус-
кают оба вида частиц. Из рассмотрения спектров видно, что при 350 нм испус-
кание обусловлено только нафтолом, что как раз и требуется для использова-
ния процедуры обратной свертки при различных длинах волн. Реакция диссоциа-
ции нафтола в зависимости от pH может быть либо обратимой, либо необрати-
мой. При значениях pH, близких к 3, реакция обратима, а при pH > 6 необрати-
ма [ 15]. Следовательно, эта система пригодна для демонстрации характерис-
тик как обратимых, так и необратимых реакций.
РИС. 12.3. Спектры стационарной флуоресценции-2-нафтола при 24°С.

1 — в 0,1 М ПС1; 2 — в 0,05 М Na ОН; 3 — в воде при рП 3,0. (С разрешения
авторов работы [20] и North Holland Publishing Со.)

Спектры, приведенные на рис. 12.3, иллюстрируют еще одну особенность
процессов в возбужденных состояниях. При экстремальных pH флуорофор уже
в основном состоянии находится в ионизованной форме и наблюдается флуо-
ресценция только этой формы. Хотя это и не показано на рис. 12.3, спектры
поглощения растворов с низкими и высокими значениями pH могут служить
характеристиками нафтола и нафтолята. При pH 3 па долю каждого вида час-
тиц приходится примерно 50% полного испускания. Однако, поскольку р/^ наф-
тола в основном состоянии равно 9,2, при pH 3 присутствует только неионизо-
ванная форма и спектр поглощения соответствует нафтолу. При таком pH ис-
I	I

пускание нафтолята вызвано молекулами, которые подверглись диссоциации
за время жизни возбужденного состояния» Неизменность спектра поглощения
в тех условиях, когда наблюдается спектр испускания частиц, образовавшихся
в результате реакции, является характерной особенностью реакции в возбуж-
денном состоянии. При некоторых условиях возмущение основных состояний не
может быть легко опознано по спектрам поглощения. Тем не менее это -лег-
ко исследуемая характеристика образца, который подвергается реакции в воз-
бужденном состоянии.,

Зависимость времен затухания флуоресценции 2-нафтола от длины волны
приведена на рис. 12.4. Рассмотрим данные для pH 6,6 (рис. 12.4, а), когда
реакция необратима, т. е. k2 « rR. При этих условиях интерпретация времен

26-413
затухания упрощается. В частности, из уравнения (12.4) имеем

тк = Т1 и rF = т2	(12.32)

Отдельные значения времен затухания являются характеристиками наф-
тола и нафтолята. Как и следовало ожидать, измеренные значения времен за-
тухания не зависят от длины волны. При длинах волн < 330 нм затухание обу-
словлено только состоянием F и является одноэкспоненциальным. Следова-
тельно, для этой области на рис. 12.4, а показано только одно время затухания.
Это характерный признак необратимой реакции возбужденного состояния. Для
= 0 легко можно видеть, почему затухание флуоресценции из состояния F
должно быть одноэкспоненциальным. Двухэкспоненциальное затухание для F
появляется в результате обратимой реакции, что определяется членом Л [/?]
в уравнении (12.10).

При pH 3 реакция обратима. На рис. 12.4, б представлена зависимость вре-
мени затухания от длины волны. В этом случае затухание для состояния F

10

2-Насртол

ТТ

pH 6,6 (необратима)
п . ц о

8

6

I
В

I
§
б

Относительно возбуж-
дающей вспышки

Относительно испускании
при 350 нм

О'

____I______i_______i______i

4

2

0

△ △
------------£•—гг



а

10

2-Нафгпол

pH 3,0 (обратима) |

тт

тт-у— *.°'0 ° 0

8

6

4

2 -

0 -

О

△

аг

---А...............fi
△

Относительно
возбуждающей вспышки

Относительно испускания
при 350нм

S

A*1 ij  А А Д .А........................А .А

। m . л

Т

360	400	440

Длина волны, нм

380	420	460

РИС. 12.4, Зависимость времен затухания флуоресценции 2-нафтола от длины
волны.

Времена затухания получены обратной сверткой с функцией возбуждающей
вспышки и с функцией испускания при 350 нм. (С разрешения авторов работы [ 20]
И North Holland Publishing Со.)
двухэкспоненциально. В области 350 - 370 нм, где испускает только нафтол,
можно наблюдать два времени затухания, В отличие от результатов, поручен-
ных при pH 6,6, когда реакция была необратимой, в данном случае времена
затухания зависят от всех кинетических констант системы [уравнение (12.14)]
и но являются временами жизни ни нафтола, ни нафтолята.

На рис. 12.4, в иг показано упрощение, достигаемое при использовании
обратной свертки с сигналом флуоресценции от состояния F (350 нм). Дря не-
обратимой реакции эта методика приводит к появлению двух компонент й за-
тухании: одной - с пулевым временем затухания, обусловленным перекрыва-
нием со спектром состояния F и второй - с временем 8,7 нс - собственным

РИС. 12.5. Вклады интенсивностей флуоресценции нафтола и нафтолята, полу-
ченные с помощью методики обратной свертки с функцией возбуждающей вспышки
(а) и при различных длинах волн (б),.

(С разрешения авторов работы [ 20] и North Holland Publishing Со.)
временем жизни нафтолята при этих условиях эксперимента. Для обратимой
реакции опять наблюдается компонента с нулевым временем затухания и, кро-
ме того, появляется новая - с временем затухания 7,2 нс, что при данных ус-
ловиях эксперимента соответствует времени жизни нафтолята. Точнее,у"1 =
Знаяуй, у 1 и у2 из обычной обратной свертки с функцией возбуждающей вспыш-
ки, можно рассчитать yf, по уравнению (12.25).

Метод обратной свертки при различных длинах волн также упрощает ин-
терпретацию вкладов интенсивностей а.т.. На рис. 12.5 графически представ-
лены эти вклады, наблюдаемые при свертке с функцией вспышки лампы и с сиг-
налом флуоресценции из состояния F. Интерпретация величину полученных с
помощью обратной свертки при различных длинах волн, достаточно проста. Это
вклады интенсивностей либо из состояния F, 'либо из R [ уравнения (12.30) и
(12.31)]. При 360 нм aQT0 = 1, поскольку в этой спектральной области нафто-
лят не испускает (рис. 12.3). При увеличении длины волны аото монотонно
уменьшается до 0,07 при 460 нм, что свидетельствует о преобладании испускания пафто-
лята на этой большей длине волны. Кроме того, адтд увеличивается с длиной вол-
ны. Вклады интенсивностей ат и а„т , показанные на рис. 12.5, можно ис-

0 О R R'	г

пользовать для расчета спектров нафтолаи нафтолята (рис. 12.6). Распределе-
ние интенсивностей в этих спектрах точно соответствует спектрам стационар-
ной люминесценции нафтолаи нафтолята (рис. 12.3).

Интерпретация величин а£ т^, полученных обратной сверткой с функцией
вспышки лампы, более сложна. Например, при 360 нм оба значения | а 1 и

РИС. 12.6. Разделение спектров нафтола и нафтолята при протекании обрати-
мой реакции в возбужденном состоянии (pH 3,0).

(С разрешения авторов работы [20] и North Holland Publishing Со.)
|а2т2| близки к 0,5, даже несмотря на то, что испускание соответствует толь-
ко нафтолу. Чтобы интерпретировать эти величины через спектральные интен-
сивности, требуются более сложные уравнения [(12.24) - (12.29)]. Кроме то-
го, отдельные значения а. у становятся неопределяемыми вблизи 390 нм, где
затухание почти одноэкспоненциальное. При этой длине волны надо использо-
вать другой метод расчета.

12.3.	Анализ реакций в возбужденных состояниях с помощью
фазово-модуляционной флуорометрии

Применение метода фазово-модуляционной флуорометрии также дает мно-
жество интересных возможностей для анализа реакций в возбужденных состоя-
ниях. Теория подробно описана в работе [ 13]. Здесь мы приведем ее в общих
чертах, обратив внимание на вопросы, связанные со сдвигом фаз и степенью
модуляции для процессов в возбужденных состояниях. Измерение времени за-
тухания флуоресценции фазовым и модуляционным методами было описано в
гл. 3.

Для простоты рассмотрим необратимую реакцию (&2 = 0). Предположим, что с
помощью подходящего подбора оптических фильтров можно раздельно наблюдать
флуоресценцию из состояний F и R. Тогда по отношению к фазовому углу и степе-
ни модуляции возбуждающего света фазовые углы и степени модуляции для
флуоресценции из состояний F и R. можно выразить как

tg<pf = co/(rF + k}) = cotf

co(rF + rK + Ai)
tg<p --------------_

+ у - co2

ГД +	1

(12.33)

(12.34)

(12.35)

(12.36)

Следует сказать о некоторых аспектах этих уравнений. Поскольку мы с само-
го начала предположили, что состояния F и R можно наблюдать по отдельно-
сти и реакция необратима, затухание флуоресценции состояния F будет одно-
экспоненциальным. Следовательно, получаем обычные выражения для расче-
та времен затухания по данным о сдвиге фаз и степени модуляции [29]:
tg<p=coT; т=(1 + И2т2)~й	(12.37), (12.38)
В отсутствие какой бы то ни было реакции (k, = 0) rQF = Г“1. Если реакция
протекает, время затухания F укорачивается до тр « (Гр + Ар-1, что описыва-
ется уравнениями (12.33) и (12.35), Таким образом, для необратимой реакции
наблюдаемые величины <pF и mF можно использовать для расчета истинного
времени жизни первоначально возбужденного состояния. Наоборот, для расче-
та времен затухания флуоресценции из состояния R уравнения (12.37) и (12.38)
нельзя прямо использовать, подставляя в них наблюдаемые величины сдвига
фаз<рк и степени модуляции mR, измеренные относительно возбуждающего
света. Методика определения этих времен затухания описана ниже [уравнения
(12.40) - (12.42)]. Поскольку кажущиеся значения фазового (т^) и модуляцион-
ного (тт) времен затухания обычно рассчитывают из данных о сдвиге фаз и
степени модуляции, эти кажущиеся величины большинству исследователей лег-
че себе представить. Поэтому большинство наших рассуждений будет проведе-
но с использованием кажущихся значений фазового и модуляционного времен
затухания.

Из уравнения (12.34) вытекают важные свойства - Пусть (p0R будет фа-
зовым углом для состояния R, который наблюдался бы при непосредственном
возбуждении этого состояния. Конечно, эта величина связана с временем жиз-
ни непосредственно возбужденного состояния соотношением tg«poR = cotqR.
Запишем соотношение для тангенса суммы и находим <pR:
tg^F +	= tgtpfl или	+ фой	(12.39)

Следовательно, фазовый угол для состояния, появившегося в результате реак-
ции, равен сумме фазовых углов для первоначально возбужденного состояния
(<р ) и состояния R, если бы оно было возбуждено непосредственно (<poR) (все
значения фазовых углов берутся относительно возбуждающего света). Это со-
отношение легко понять, зная, что заселение состояния R идет из состояния
F. Точно такие же рассуждения мы проводили при описании метода обратной
свертки на различных длинах волн. Важное применение этого метода будет
продемонстрировано в разд. 12.6.2. Мы увидим, что если известны индивидуаль-
ные спектры испускания, то с помощью методики фазочувствительной регист-
рации флуоресценции [ 30, 31 ] можно определить фазовые углы для каждого
из видов частиц независимо от перекрывания спектров [32]. Следовательно,
можно измерить разность фаз между флуоресценцией из состояний F и R и оп-
ределить время жизни состояния R. Другой способ - непосредственное опреде-
ление на фазовом флуорометре сдвига фаз между длинноволновой и коротко-
волновой областями спектра испускания. При благоприятных условиях, когда
при этих длинах волн отсутствует перекрывание спектров испускания состоя-
ний F и R, разность фаз будет равна фд - <pF, т.е. представляет собой раз-
ность фаз между испусканием из состояний F и R. Используя выражение для
тангенса разности двух аргументов, а также уравнения (12.33) и (12.34), полу-
чаем

ЧДфд ”ФГ) Ч?Аф = “/гк =	(12.40)

Для необратимой реакции измерение величины Дф дает непосредственно соб-
ственное время затухания испускания флуорофора, образующегося при реак-
ции, не искаженное влиянием реакции.

Другим интересным свойством разности фаз (или степени модуляции)
между состояниями F и К является возможность измерения с ее помощью
константы скорости обратной реакции k2. Для обратимой реакции

1

к

mF UrR + А2)2 + СО21 ,/г

(12.41)

(12.42)

Эти уравнения похожи на обычные выражения для зависимости сдвигов фаз и
коэффициентов демодуляции от скоростей дезактивации возбужденного состо-
яния [уравнения (12.37) и (12.38)], за исключением того, что скорость дезак-
тивации относится к частицам, образовавшимся в результате реакции
(rR + k2)„ Релаксированное состояние заселяется из первоначально возбужден-
ного состояния, а при обратной реакции вновь заселяется состояние F. Одна-
ко кинетические константы для состояния F пе влияют па измерения
tg(?R - ф/г) или mR/mF. Следовательно, измерение либо разности фаз, либо
степени модуляции состояния R по отношению к нерелаксированному состоя-
нию дает время жизни конечного состояния R, которое уменьшается при нали-
чии обратной реакции, аналогично тому как существование процесса с констан-
той А1 уменьшает время жизни состояния F. Если известна скорость дезакти-
вации Гл, можно рассчитать k2. Этот результат был описан ранее [33, 34].
Если испускает только один вид частиц, имеющих единственное время затуха-
ния, аф и m постоянны по всему спектру испускания, то ф^ - фг = 0 и
mR/mp = 1.

Возвращаясь к модели необратимой реакции, отметим интересное свойст-
во фазового угла фй [уравнение (12.34)]: он может превышать 90°. В частно-
сти, если со2 > Г/{(Гр + Ар, то tg<pR < 0 или фй > 90°. Напротив, фазовые
углы непосредственно возбужденных частиц или возникающие при гетероген-
ности флуорофоров не могут превышать 90°, поскольку этот угол соответст-
вует бесконечному времени жизни [34]. Таким образом, наблюдение на опыте
фазового угла, большего 90°, доказывает протекание реакции в возбужден-
ном состоянии.

Коэффициенты демодуляции двух состояний имеют аналогичные свойст-
ва. Из уравнения (12.36) находим, что коэффициент демодуляции релаксиро-
ванного состояния mR равен произведению коэффициентов демодуляции нере-
лаксированного состояния тр и mQR) обусловленного только собственной дез-
активацией состояния R:

(’2'43’

Это мультипликативное свойство для коэффициентов демодуляции и аддитив-
ное свойство для индивидуальных фазовых углов [ уравнение (12.39)] являют-
ся причиной обратной зависимости от частоты кажущихся времен затухания,
измеренных из сдвига фаз и степени демодуляции, и инверсии кажущихся зна-
чений фазового и модуляционного времен затухания на одной частоте по срав-
нению с гетерогенным образцом. Для кажущегося значения фазового времени
затухания т^, рассчитанного из измеренной разности фаз <pft для релаксиро-
ванного состояния, можно записать

tg<PR =	= tg (<pF + <poR)	(12.44)

Вспомнив соотношение для тангенса суммы, получаем

р _ F 1 0R

R 1 — ю2т •

(12.45)

F OR

Из-за присутствия члена R повышение частоты модуляции может при-
водить к увеличению кажущегося значения фазового времени затухания. Этот
результат не совпадает с тем, который получался для случая гетерогенных
испускающих образцов, когда отдельные частицы заселялись непосредствен-
но. Для гетерогенного образца увеличение частоты модуляции приводит к
уменьшению кажущихся значений времен затухания [ 29 ]. Таким образом, за-
висимость кажущихся значений времен жизни от частоты можно использовать
для того, чтобы отличить гетерогенный образец от образца, в котором проте-
кает реакция в возбужденном состоянии. Аналогично кажущееся значение мо-
дуляционного времени затухания определяется выражением

т^[(1/^)-1]-И

Принимая во внимание уравнение (12.36), получаем

т Г 2 z 2 2	2 т 16

Т = I Т + Т + й т т

R L F OR F OR1

(12.46)

(12.47)
Увеличение со опять приводит к увеличению кажущейся величины модуляцион-
ного времени затухания. Такая зависимость от частоты также противополож-
на той, которую можно ожидать для гетерогенного образца, и может служить
доказательством того, что испускание происходит в результате процесса в
возбужденном состоянии. Практически, однако, зависимость т™ от частоты
модуляции менее заметна, чем для т^. Еще раз подчеркиваем, что рассчитан-
ные времена затухания - кажущиеся величины, а не истинные времена.

Информацию, полученную с помощью метода фазово-модуляционной флуо-
рометрии, лучше представлять через наблюдаемые величины ф и т. Для экс-
поненциального затухания, которое ожидается для нерелаксированного состоя-
ния, если релаксация необратима, тр = соафр. Также mQR = совф0р незави-
симо от обратимости реакции. Определять, протекает ли процесс в возбуж-
денном состоянии, удобно по отношению m/cos ф, где т и ф - эксперимен-
тально измеренные значения степени демодуляции и фазового угла соответ-
ственно. Это отношение равно единице для одноэкспоненциального затухания
и меньше единицы для гетерогенного испускания. Напротив, m/cos ф > 1, если
испускающие частицы образуются после возбуждения, как было установлено
в оригинальной работе Веселовой и сотр. [35]. Рассмотрим, например, релак-
сированное состояние. Используя уравнения (12.39) и (12.43) и соотношение
для косинуса суммы, получаем

mR

СОВ фр

СО8ф0р COS фр
сов(фой + фр)

COa<PoR CoS<Pp

с08фонсоафр -8Шфой8Шфр

(12.48)

Поделив

числитель и знаменатель на co8tP0Rcos фр, находим

mR

1

1

COSTR

’ -‘вФ0Н'«Ф,-	’-“4RTF

(12.49)

Если скорость релаксации много меньше скорости испускания, значительной
релаксации не наблюдается. Состояние R нельзя наблюдать, и уравнение
(12.49) неприменимо. Если же релаксация происходит много быстрее испуска-
ния, фр = 0 и тПр/соз фр - 1. Важно, что, если скорости релаксации и испус-
кания близки, отношение mR/cos фд превышает единицу. Таким образом, ес-
ли наблюдается m/cos ф > 1, это служит доказательством реакции в возбуж-
денном состоянии. Однако невыполнение этого соотношения еще не означает,
что реакция не протекает. Гетерогенность, перекрывание спектров или обрат-
ная реакция могут нарушать соотношение m/cos ф > 1.
12.3.1.	Фазовые угпы и степени демодуляции при перекрывании
спектров

В предыдущем разделе было сказано, что, выбрав длину волны наблюде -
ния, можно раздельно наблюдать испускание из состояний F и R. Обычно каж-
дому из этих состояний соответствует определенное спектральное распреде-
ление, но спектры часто перекрываются. Каким же образом фазовые углы и
коэффициенты демодуляции зависят от относительных вкладов F и R при дан-
ном волновом числе v? Несмотря на сложность испускания и независимо от
гетерогенности или временной зависимости процесса, полную интенсивность
при любом данном волновом числе v можно -описать с помощью фазового
угла q>(v) и степени демодуляции m(v). Для модели двух состояний [ 13]
tgtp(v) = /V(v)/D(v)	(12.50)

m(7) = [N(U)2 + D(v)2],/$	(12.51)

где

Dfi) = тп(и)созф(и) = fF(v)mFcos(fF	+	fR(v)mRcoB<?R	(12.52)

N(y) = тп(й)з1Пф (и) = fF(y}mFsinqF	+	fR(v)mRsinyR	(12.53)

afF(v) и fR(v) представляют собой относительные вклады интенсивностей
флуоресценции из состояний F и R:

Важно отметить значение описанных выше членов. Для перекрывающих-
ся спектров фазовый угол ф(й) и степень демодуляции m(v) зависят от относи-
тельных вкладов каждого состояния в полную интенсивность испускания на
наблюдаемой частоте. В модели двух состояний в отсутствие перекрывания
спектров, фазовые углы и коэффициенты демодуляции состояний F и R зави-
сят только от Г\ , ki и со.

Для гетерогенного образца, в котором две частицы с разными времена-
ми жизни возбуждаются непосредственно, можно записать уравнения, анало-
гичные (12.52) и (12.53)« Множители тр и mR заменены па со8фг и сояф^.,
Следовательно,

°(v) = ZF(v)cos 2(pF + /к(у)соя2фк	(12.55)

= fF (v)cos фг81пфк + /д(у)сО8(|^8Шфд	(12.56)

Эти выражения аналогичны приведенным ранее [уравнения (3.41) и (3.42)].
12.3.2.	Раздепение спектров испускания из нерепаксированного
и релаксированного состояний по данным о <p(v) и m(v)

Из рассмотрения уравнений (12.52) и (12.53) видно, что величины m(v)
и <p(v) можно было бы снова использовать для получения fF(v) и fc(v). По
этим относительным вкладам интенсивностей и стационарному спектру мож-
но рассчитать спектры испускания из состояний F и R (/R(v) и Ip(v)]. При-
менение правила Крамера для получения fR(y) п/р(^)п соотношения для си-
нуса разности двух углов дает

zn(v)sin[q>(v) - ф ]

ZF(v) =----------------(12.57)

mFsin((pF -фд)

m(v)sin [ф -ф(й) ]

fR(v) = ----------L---------	(12.58)

mKsin(?F - фй)

Индивидуальные спектры состояний'в этом случае можно найти, используя
стационарный спектр /(v):

/F(v) = /F(v)/(v); /R(v) = fK(v)/(v)	(12.59), (12.60)

Уравнения (12.57) и (12.58) были выведены ранее Веселовой и др. [35]. От-
метим, что эти выражения можно также применять для случая гетерогенно-
го испускания, когда состояние R образуется не в результате релаксации,
а при непосредственном возбуждении. Уравнения‘'(12.57) и (12.60) можно за-
писать в другой форме, исходя из уравнений (12.52) и (12.53) и учитывая,
что fF(y) 4- fR(v) = 1:

m(v)cos(p(v) - тп созф

/F(v)= —_______________-______“	(12.61)

WFCOS<PF " отдсозсРн

7n(v)cos ф(у) — mpcosq>F

fR(v)- _____------__---------- (12.62)

тп созф„ — т_со8ф_
К 1 К г * г

Для получения индивидуальных спектров с помощью этой методики необходи-
мо знать ф и тп для обоих состояний. При благоприятных условиях их можно
найти из измерения испускания в длинноволновой и в коротковолновой облас-
тях, где преобладает испускание частиц одного вида. В общем случае фазо-
вые углы и коэффициенты демодуляции постоянны в коротковолновой и длин-
новолновой частях спектра испускания и измеряемые величины можно иден-
тифицировать как ф. и mi.
Выше мы рассматривали в.первую очередь необратимую реакцию в воз-
бужденном состоянии. Для полноты картины в табл. 12.1 и 12.2 приведены
выражения, по которым можно рассчитать фазовые углы и коэффициенты де-
модуляции в случае обратимой реакции. Особого упоминания заслуживают
два момента. Во-первых, в случае обратимой реакции выражения <р и т для

Таблица 12.1. Выражения для расчета фазовых углов для реакции
с участием двух состояний

Модель			tgAq>
*2 = 0	co	со(2Г +	со
rF = ГЯ = Г	Г + ky	Г (Г + А^) — СО* 2	г
•*2 = o	CO	“С р +	+ *Д	со
vr«	rF+'A1	rK<rF + ‘,)-“2	г R
	“(«Уд -Э + co2)	aco	СО
k £ oa				_ ,- 
	aco2+ (₽ -со2)уй	Р - со2	rR + *2

а Использованы следующие обозначения: а =	+ Гд + ky + k2,

I3 = ГГГД + ГД*1 + ГКА2’ YR= rR+ k2‘

Таблица 12,2. Формулы для расчета коэффициентов демодуляции
для реакции с участием двух состояний

Модель	т,	тп

г	К

А = О	г + k.	г

2	1

'F-rR = r	[(г + а/ +ш2]%	(Г2+Ы2)%

А2 = 0	Г/?	_______ тр -----------5-----

rF^R	r(rF+Ai)2 + M^	(Г/+СО2)*

гк><гя rR [(₽ -»2i2 + «2»2J F [(гй + )92 + <ЛГ

Cm. примечание к табл. 12.1.
состояния F усложняются. Это связано с тем, что в случае обратимой реак-
ции затухание флуоресценции из состояния F становится двухэкспоненциаль-
ным. Во-вторых, выражения для разности фаз между R и F (А<р) и демодуля-
ции R относительно F (mR/mp) довольно просты и содержат только кинети-
ческие константы состояния R. Видно также сходство фазовых и модуляци-
онных измерений при разных длинах волн с методикой обратной свертки при
различных длинах волн. Когда измерения для R проводят относительно F,
уменьшается сложность, неизбежная при непосредственном измерении пара-
метров состояния R. В разд. 12.6.2 будет показано, что при благоприятных
условиях А<р можно измерять независимо от перекрывания спектров. Это до-
стигается с помощью фазочувствительного метода регистрации флуоресцен-
ции. Следовательно, такое упрощение может быть полезным в эксперименте.

12.4.	Мопепьные расчеты в фазрво-йодупяционной флуорометрии

Уникальное влияние реакции в возбужденном состоянии на фазовые и
модуляционные данные лучше всего видно из модельных расчетов. Для иллю-
страции того, какие в этом случае получаются результаты, можно предста-
вить спектры испускания состояний F и R в виде функций Гаусса:

а. (2тг)ц

где q. - относительный квантовый выход; ст.- стандартное отклонение t-ro
распределения. При любом заданном волновом числе относительные вклады
нерелаксированного [/^(v) ] и релаксированного [ fR(y) ] состояний определя-
ются уравнением (12.54). Относительные квантовые выходы для состояний
F и R можно записать в виде

k

q = __L_; q =------------JL	(12.64), (12.65)

Г+Л1 R Г+А1

Для проведения расчетов выбраны параметры, типичные для большинства
флуорофоров. Предполагается, что состояниям F и R соответствуют макси-
мумы испускания при 25 • 103 см”1 (400 нм) и 20 • 103 см”1 (500 нм) соот-
ветственно. Примем также, что ширина каждого спектра <р:- равна 2,5- Ю3 см”1,
что соответствует полной ширине на полувысоте ~ 100 нм. Для того, что-
бы нагляднее показать влияние реакции в возбужденном состоянии на кажу-
щиеся значения фазового и модуляционного времен затухания, будем счи-
тать, что константы скорости испускания и реакции равны между собой, т. е.
rF = rR = и Г = 2 • 108 см”1 или tq - 5 нс, где tq - время жизни того и
другого состояния в отсутствие реакции. Эти значения параметров сравнимы
с теми, которые наблюдаются для типичных флуорофоров. Полученные при рас-
четах данные (рис. 12.7) иллюстрируют некоторые характерные моменты:

1.	Одной из характеристик реакции в возбужденном состоянии является
уменьшение кажущегося значения времени затухания на длинноволновом краю

1,0-

РИС. 12.7. Результаты теоретических расчетов кажущихся значений фазовых
и модуляционных времен затухания и отношения m/coscp для процесса в возбужден-
ном состоянии.

Предполагаемые значения параметров указаны на рисунке. (С разрешения ав-
торов работы [ 1 з] и North Holland Publishing Со.)
спектра испускания. В отсутствие реакции время затухания должно было быть
равным 5 нс. Реакцию можно рассматривать как дополнительный процесс дез-
активации, конкурирующий с испусканием и приводящий к уменьшению време-
ни затухания до 2,5 нс [уравнение (12.33)]. Как обсуждалось ранее для случая
необратимой реакции с участием двух состояний, затухание флуоресценции из
состояния F одноэкспоненциально. Таким образом, величины фазового угла
и степени демодуляции дают действительные значения времен жизни этого со-
стояния = т т. Если скорость реакции много больше скорости испускания,
можно наблюдать только состояние R с его характерным временем жизни.

2.	С длинноволновой и с коротковолновой сторон спектра кажущиеся зна-
чения фазового и модуляционного времен затухания приближаются к постоян-
ным значениям. Это происходит потому, что на краях спектра преобладает ис-
пускание частиц одного или другого вида. Для модели двух состояний этот
результат всегда можно получить с помощью расчетов. Практически области
постоянного значения кажущегося времени затухания невозможно наблюдать
в том случае, когда перекрывание спектров значительно (см. рис. 12.12 и
относящийся к нему текст). Штриховыми линиями на рис. 12.7 - 12.12 указа-
ны те области, где интенсивность < 10% максимальной интенсивности. В
этих спектральных областях экспериментальные данные менее надежны.

3.	Важное свойство фазово-модуляционных данных для процесса в воз-
бужденном состоянии - появление кажущихся величин фазовых времен зату-
хания, болыцих, чем кажущиеся модуляционные времена затухания, что на-
блюдается на коротковолновом краю спектра испускания. В этой спектраль-
ной области испускают молекулы, находящиеся в состоянии R, которые полу-
чаются после возбуждения. Молекулы в состоянии R образуются из флуоро-
форов, первоначально возбужденных в состояние F. Соотношение > хт
не может быть результатом гетерогенности и доказывает, что существует
процесс в возбужденном состоянии, приводящий к испусканию. Кроме того,
фазово-модуляционные данные указывают на гетерогенность (т^ < тгп) в цент-
ральной области длин волн, где испускание происходит от обоих видов частиц.

Везде, за исключением коротковолновой области, где отсутствует пере-
крывание спектров, кажущиеся значения фазового и модуляционного времен
затухания не являются истинными временами затухания. В некоторых случаях
лучше использовать не и тот, а непосредственно наблюдаемые значения
<p(v) и т(у). Это особенно полезно для идентификации процесса в возбужден-
ном состоянии. Как видно из уравнения (12.49), для испускания продукта,
образовавшегося в результате реакции в возбужденном состоянии, отноше-
ние тп/cos ф будет превышать единицу. На коротковолновом краю спектра,
где испускание гомогенно, m/cosqp = 1 (рис. 12.7). При уменьшении волново-
го числа m/созф < 1. При малых волновых числах, когда преобладает испус-
какие из состояния R, m/costp > 1. Это отношение - очень чувствительный
индикатор природы испускания и имеет то преимущество, что в него входят
наблюдаемые величины.

На рис. 12.8 представлены величины <р(?) и т(й), которые можно ожидать
для испускания гетерогенных образцов. Эти результаты необходимо сравнить
с приведенными на рис. 12.7, где представлены те же величины для процес-
са в возбужденном состоянии. Сравнение до некоторой степени носит произ-
вольный характер, поскольку было необходимо выделить собственные време-
на жизни состояний F и R. На рис. 12.8 tr = (г + /ср-1 = 2,5 нс, что совпада-
ет со значением на рис. 12.7. Если предположить, что состояние R полу-
чается при непосредственном возбуждении, его время жизни будет rR = w""AtgcpR,
где <pR совпадает с фазовым углом для релаксированного состояния на
рис. 12.7. Эти величины были выбраны для того, чтобы сделать модельные
расчеты сравнимыми с экспериментальной ситуацией, при которой <р и <pR на-
блюдают, не зная наперед природы сложного испускания. В противоположность
реакции в возбужденном состоянии (рис. 12.7) гетерогенная модель (рис. 12.8)

РИС. 12.8« Рассчитанные значения ?Р, тти m/cos<p для гетерогенного образца.

Времена жизни непосредственно возбужденных частиц == 2,5 нс и tr =* 13,5 нс
можно рассчитать, используя уравнение (12.37) и параметры, указанные на рис. 12.7.
(С разрешения авторов работы [ 1 з] и North Holland Publishing Со.)
дает т^ = тт и m/cos ср = 1 как на длинноволновом, так и на коротковолновом
краях спектра испускания. В этих спектральных областях перекрывание мини-
мально и преобладают сигналы от состояний F и R. В области перекрывания
Д’ < тт и тп/С08ф < 1.

Точный анализ зависимости <p(v) и m(v) от волнового числа позволяет
решить что имению - релаксация или гетерогенность - является причиной
зависимости фазового и-модуляционного времен от волнового числа.

Для процесса в возбужденном состоянии <p(v) и m(v) сильно зависят от
частоты модуляции, что помогает анализировать такие реакции. Результаты
моделирования зависимости от частоты, полученные с использованием тех же
параметров, что и на рис. 12.7, приведены на рис. 12.9. Для необратимой ре-
акции на длинноволновом краю спектра испускания = т,п независимо от

РИС. 12.9. Зависимость кажущихся значений фазового и модуляционного вре-
мен затухания от частоты для процесса в возбужденном состоянии.

Зависимость от частоты противоположна той, которую можно было ожидать для
гетерогенного образца. Предполагаемые значения параметров указаны на рис. 12.7.
(С разрешения авторов работы [1з] и North Holland Publishing Со.)

27-413
частоты модуляции. В области перекрывания спектров опять проявляется ге-
терогенность. Наиболее замечательная особенность заключается в увеличе-
нии обеих величин т^ и тт с ростом частоты модуляции на коротковолновом
краю спектра. Такое увеличение предсказывалось уравнениями (12.45) и (12.47).
Ясно видно, что тр более чувствительно к частоте модуляции, чем тт. Хотя
это и не показано на рис. 12.9, для гетерогенного испускания тр и гт должны
были бы уменьшаться с увеличением частоты модуляции, что противополож-
но предыдущему случаю. Следовательно, на основании зависимости тр и тт
от частоты модуляции можно сделать вывод о протекании реакции в возбуж-
денном состоянии и отличить ее от гетерогенности. Зависимость m/cos ф от
частоты модуляции также противоположна для случаев процессов в возбужден-
ном состоянии и гетерогенного испускания. Для испускания из состояния R
увеличение частоты модуляции приводит к росту отношения m/cos q>. Однако
при низких частотах модуляции m/cos ф может быть близко к единице даже
при значительной релаксации. Если же частота модуляции слишком мала, на-
блюдение соотношения m/cos<p < 1 еще не доказывает отсутствия реакции в
возбужденном состоянии.

В обсуждавшихся выше модельных расчетах (рис. 12.7 - 12.9) не учиты-
валась обратная реакция. Влияние значительной обратной реакции показано
на рис. 12.10. Ожидаемые значения фазовых и модуляционных времен затуха-
ния приведены для /<2 = 0 и /<2 = 108 с~1, что составляет половину предполо-
женных ранее констант скорости затухания и релаксации. Протекание обрат-

РИС. 12.10. Влияние обратной реакции на кажущиеся значения фазового и мо-
дуляционного времен затухания.

См. также рис. 12.7. (С разрешения авторов работы [ 13] и North Holland Pub-
lishing Со.)
ной реакции приводит к интересным и заметным эффектам. В области боль-
ших волновых чисел в спектре испускания увеличение скорости обратной реак-
ции вызывает увеличение кажущихся значений фазового и модуляционного
времен затухания. Кроме того, времена затухания становятся гетерогенны-
ми и при этом тт более чувствительно, чем тА

Из сравнения полученных результатов с моделью необратимой реакции
(рис. 12.7) видно важное различие. Вели реакция необратима, т*'  - т"1 для со-
стояния F. Благодаря такому различию величины и тт на коротковолновом
краю спектра можно использовать для идентификации обратной реакции. Лна -
логичное различие между обратимой и необратимой реакциями было обнаруже-
но для данных, полученных с помощью импульсных методов изучения законов
затухания. Необратимая реакция приводит к одноэкспонепциалыюму затуха-
нию флуоресценции состояния F. При наличии значительной обратной реакции
затухание флуоресценции F становится двухэкспоненциальным. В области ма-
лых волновых чисел из-за обратной реакции уменьшаются видимые значения
времен затухания и устраняются сдвиги фаз, превышающие 90°.

Преимущество фазово-модуляционных методов заключается в возможно-
сти непосредственного измерения разности фаз между состояниями R и F или
демодуляции флуоресценции R относительно F. В зависимости от спектраль-
ных свойств флуорофора это можно осуществить либо методом выбора длин
волн, либо с помощью фазочувствительпых измерений. Такую возможность
иллюстрирует рис. 12.11, где показаны фазовые углы и коэффициенты демоду-
ляции в предположении тех же параметров, которые использовались для обра-
тимой реакции, описываемой рис. 12.10. При непосредственном измерении фа-
зовые углы между состояниями F и R должны были бы быть равны 43,3° для
k2 =. 0 и 32,1° для k = 108 с~1. Эти фазовые углы соответствуют при 30 МГц
временам затухания 5 и 3,33 нс соответственно [уравнение (12.37)], которые
получаются из соотношения tr - (г + А2)"1. Пепосредствешю наблюдаемые
коэффициенты демодуляции между состояниями F и R должны были бы быть
равны 0,73 для k = 0 и 0,85 для /<2 108 с-1. Эти значения опять соответст-
вуют временам жизни состояния R 5 и 3,33 пс [ уравнение (12.38) ]. Из урав-
нений (12.41) и (12.42) видно, что измерение величин tg (ср^ -ф^) или
дает собственное время жизни состояния R, измененное под влия-
нием обратимой релаксации.

Во всех рассмотренных выше примерах выбрана разность между состоя-
ниями F и R, равная 5 • Ю3 см-1. Это приводит к тому, что легко обнаружи-
ваются области, в которых фазовые и модуляционные времена затухания по-
стоянны. Обычно сдвиг спектров, соответствующих двум состояниям, бывает
меньше. Влияние меньших сдвигов па предсказываемые величины -А т т и
РИС. 12.1Влияние обратной реакции на измеренные значения фазовых углов
и коэффициентов демодуляции.

См. также рис. 12.10. (С разрешения авторов работы [ 1 з] и North Holland Pub-
lishing Со.)

m/cos ф показано на рис. 12.12. Спектральные сдвиги, обусловленные реак-
цией, уменьшены до 2,5 • 103 см"1 (рис. 12.12, а) и 1,0 • 103 см"1 (рис. 12.12, б).
Штриховые линии вновь соответствуют областям, где интенсивности испуска-
ния составляют менее 10% максимальной интенсивности. Поскольку в этих
областях трудно получить надежные данные, легко наблюдаемые значения
изображены.сплошной линией. По мере уменьшения обусловленного реакцией
спектрального сдвига постоянство величин т^, тт и m/cos <р становится ме-
нее очевидным. Далее, увеличение перекрывания спектров уменьшает воз-
можность наблюдения соотношений т? > тт или m/cos ф > 1. Следовательно,
перекрывание спектров может мешать получению данных по фазовым углам
и коэффициентам демодуляции, которые в противном случае могли бы быть
использованы для доказательства протекания реакции в возбужденном состоя -
НИИ.
РИС. 12.12. Влияние перекрывания спектров на отношение m/сон <р и кажущие-
ся значения фазового и модуляционного времен затухания.

, Предполагается, что центральная частота для непосредственно возбужденного
состояния равна 25 • doa см""1, а частота для релаксированного состояния 22,5 х
х ю3 см”1 (а) и 24  103 см”1 (б) , Следовательно,спектральные одвиги составляют
2,5 • 103 и 1,0 х Ю8 см”1 соответственно. Все параметры совпадают с приведен-
ными на рис. 12.7. (С разрешения авторов работы [ 131 и North Holland Publishing Со.)

Аналогичная ситуация обнаружена при использовании метода импульсной
флуорометрии. Появление отрицательного предэкспоненциалыюго множителя
служит доказательством протекания реакции в возбужденном состоянии. Од-
нако наблюдению соответствующего члена может мешать перекрывание спект-
ров. При этих условиях заманчиво приписать зависимость времен затухания
от длины волны гетерогенности в основном состоянии. Например, Рос' /Ч>-
[ 37] объяснили зависимость времен затухания спиртовой гидрогеназп1 1
полученных импульсными методами, наличием двух различных трипто(^‘ . 1(1вых
остатков в этой белковой молекуле. Напротив, Лакович и Черек [36] cf>>1
зависимость от длины волны времени затухания, полученного фазовый Nlt'’го-
дом, со спектральной релаксацией. В последнем случае не наблюдало*4’’
m/cos<р > 1, а впервой работе не получен отрицательный предэкспоне,11,‘1’10ль-
ный коэффициент. Следовательно, изучение этих величин не позволил*’ * Сли-
чить случаи спектральных сдвигов, вызванных реакцией в возбужден!**’141 Со-
стоянии, от гетерогенности как основной причины зависимости врем!’’1 Опу-
хания от длины волны. Из результатов модельных исследований, прий1^^ -Иных
на рис. 12.12, ясно, что перекрывание спектров может мешать при р<1*’ли ч<‘~
нии этих двух разных явлений. Аналогично двухэкспопенциалыюе затУ S;iI*Me
флуоресценции триптофана в глюкагоне [38] может быть вызвано либ<’ 1ч,'ге-
рогенностью, либо реакцией в возбужденном состоянии. Стало быть, I***1 Траль-
ной проблемой является перекрывание спектров, которое может сдел*гГ,> Дан-
ные, полученные как импульсными, так и фазово-модуляционными мЛ’^^ми,
неинформативными для разделения гетерогенности и процессов в во’й’У ждан-
ных состояниях.

12.5.	Протонирование акридина в возбужденном состоянии

Типичный вид данных по фазовому сдвигу и коэффициентам демодуля-
ции для образца, подвергающегося необратимой реакции в возбужденном со-
стоянии, иллюстрируется протонированием акридина в возбужденном <’<><’тоя-
нии ионом аммония. В щелочном растворе максимум испускания находится
при 430 нм (рис. 12.13). При подкислении раствора спектр смещается н длин-
новолновую область и имеет максимум при 475 нм. Первый спектр соответ-
ствует нейтральному акридину (Асг), а последний - катиону акридиния (Лег Ц+).
Поскольку для акридина в основном состоянии рК = 5,45, при pH 8,3 присут-
ствуют только нейтральные частицы. Тем не менее увеличение концентрации
ионов аммония приводит при pH 8,3 к постепенному тушению короткополно -
вого испускания, сопровождающемуся появлением флуоресценции иошх акри-
диния (рис. 12.13). Эти спектральные сдвиги являются результатом протопи-
рования возбужденных нейтральных молекул акридина ионами аммони я. 13ели-
чина рКд нейтрального акридина при возбуждении возрастает от 5,45 до
10,7.

Рассмотренная реакция в возбужденном состоянии иллюстрирует «разо-
во-модуляционную теорию, описанную в разд. 12.3. Это процесс с учгютиом
двух состояний, который в основном необратим. В работе [16] нутом и' >уче-
ния законов затухания показано, что при 410 нм затухание одноэкспонепциаль-
но. При 560 нм затухание флуоресценции можно выразить суммой двух экспо-
нент, одна из которых имеет то же время затухания, которое наблюдалось
при 410 нм. Значения этих двух времен затухания не зависят от длины волны,
но такая зависимость существует для предэкспоненциальных множителей.
Эти данные означают, что время жизни каждой из частиц (Лег или АсгП+)
постоянно по всему спектру испускания и что для описания процесса можно
применить теорию, разработанную для необратимой реакции с участием двух
состояний. Из анализа спектров испускания (рис. 12.13) вытекает, что имеют-
ся следующие^ области: испускания только нейтральных частиц (390 - 410 им),
сильного перекрывания спектров (440 - 500 нм) и среднего перекрывания, где
преобладает спектр испускания ЛсгН+ (> 500 им).

На рис. 12.14 представлены кажущиеся значения фазовых времен затуха-
ния для акридина в 0,05 п. Na ОН, 0,1 н» H2SO4 и 2 М NH4NO3. В кислом
и щелочном растворах присутствуют по одному виду частиц как в основном,
так и в возбужденном состояниях и времена затухания (равно как и фазовые
углы) не зависят от длины волны испускания. Наоборот, времена затухания
в 2 М NH4NO3 сильно зависят от длины волны из-за протонировапия акридина
при возбуждении. При коротких длинах волн (410 им), где флуоресценцию испус-
кает нейтральный акридин, время затухания в присутствии ионов аммония
уменьшается. Уменьшение фазового угла (или времени затухания) первоначаль-
но возбужденного состояния - характерное свойство реакции в возбужденном
состоянии. При больших длинах воли кажущееся время затухания увеличива-
ется, достигая почти постоянного значения при А > 500 нм. В этой области
длин воли преобладает испускание иона акридиния. Постоянство времени зату-
хания (или, более точно, фазового угла) на длинноволновом и коротковолно-
вом краях спектра испускания можно рассматривать как доказательство спра-
ведливости модели двух состояний. Такого постоянства не должно быть в слу-
чае, когда спектр испускания смещается как целое в сторону больших длин
волн, согласно континуальной модели Нахимова. Вообще фазовые данные для
акридина можно рассматривать как типичные для реакции с участием двух со-
стояний при умеренном перекрывании спектров. Эти характеристики включают
в себя уменьшение времени затухания на коротковолновом краю спектра, уве-
личение времени затухания с ростом длины волны испускания и примерное
постоянство времен затухания на коротковолновом и длинноволновом краях
спектра испускания.

Интересна еще одна возможность фазовой флуорометрии: непосредст-
венное измерение собственного времени жизни частиц, образовавшихся в ре-
зультате реакции. Под "собственным" подразумевается то время жизни, кото-
РИС. 12.13. Спектры флуоресценции акридина.

а- для нейтральной и протонированной форм; б — для акридина при увеличе-
нии концентрации ионов аммония. (С разрешения авторов работы [17] и North Hol-
land Publishing Со.)

рое наблюдалось бы при образовании этих частиц в результате непосредствен-
ного возбуждения, а не в ходе реакции в возбужденном состоянии. Собствен-
ное время жизни образовавшихся в результате реакции частиц находят по раз-
ности фаз Дф между коротковолновой и длинноволновой частями спектра ис-
пускания (Дф = фд - ф ). Рассмотрим разность фаз,между 400 и 560 нм
(рис. 12.14). Разность фазовых углов Д<р = 51,5° дает время жизни возбуж-
денного катиона акридиния т(АсгН+) согласно уравнению

tgAcp = сот(Асг Н+)	(12.66)

Напомним, что причина такого простого выражения кроется в том, что факти-
чески возбужденные нейтральные молекулы акридина служат источником об-
разования возбужденных ионов акридиния. Зависящее от времени колебание
РИС. 12.14. Графическое представление кажущихся значений фазовых времен
затухания акридина [ 17].

На оси справа — фазовые углы по отношению к возбуждающему свету. Разность
фазовых углов между длинноволновой (ф^) и коротковолновой (<р/?) частями спект-
ра дает время затухания флуоресценции катиона акридиния. По фазовым углам,
измеренным относительно возбуждающего света, нельзя получить истинные зна-
чения времен затухания для катиона акридиния.

заселенности акридина является функцией накачки для возбужденных ионов
акридиния. Протонирование акридина в основном необратимо, но собственное
время жизни образующегося при реакции флуорофора может быть также
измерено и для обратимой реакции в возбужденном состоянии [32]. Рассчи-
танное время жизни в 2 М NII4NO3 равно 20 нс, что значительно короче, чем
для акридиния в 0,1 и. H2SO4 (30 нс). Более короткое время может быть вы-
звано тушением флуоресценции акридиния нитратом аммония, но необходимо
принимать во внимание также перекрывание спектров акридина и акридиния.
Метод, позволяющий обойти проблему перекрывания спектров, описан в
разд. 12.6.2.

ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ПРОТЕКАНИЯ ПРОЦЕССА В ВОЗБУЖДЕННОМ СОСТОЯ “
НИИ ПУТЕМ СРАВНЕНИЯ КАЖУЩИХСЯ ЗНАЧЕНИЙ ФАЗОВОГО И МОДУЛЯЦИОННО-
ГО ВРЕМЕН ЗАТУХАНИЯ. По одним лишь фазовым измерениям, проведенным
с единственной частотой модуляции, нельзя сделать выбор между гетероген-
ностью в основном состоянии и реакцией в возбужденном состоянии. Показан-
ное па рис. 12.14 увеличение фазового угла можно было бы связать также с
вторым непосредственно возбужденным флуорофором, имеющим большее вре-
мя затухания флуоресценции. Безусловно, уменьшение фазового времени за-
РИС. 12.15. Графическое представление кажущихся значений фазового и мо-
дуляционного времен затухания акридина.

Приведена также зависимость m/cos <р от длины волны. (С разрешения авторов
работы [17] И North Holland Publishing Со.)

тухания при коротких длинах волн указывает на процесс тушения. Строгое
доказательство наличия процесса в возбужденном состоянии можно получить,
сравнивая сдвиг фаз и степень демодуляции для того же самого образца. На
рис. 12.15 приведены кажущиеся значения фазового и модуляционного времен
затухания и отношение m/cos <р для акридина в 0,2 М NH NO3. В коротковол-
новой области т^ » тт и m/cos ф » 1, что указывает на однозкспоненциаль-
ное затухание и, таким образом, на необратимую реакцию. В центральной об-
ласти перекрывания т^ < тт и m/cos ф < 1, что свидетельствует об испуска-
нии более чем из одного состояния. При больших длинах воли > тт и
m/cos ф > 1. Эти последние результаты нельзя получить для мпогоокспонеп-
циального затухания при любой степени гетерогенности. Они доказывают, что
испускание при больших длинах волн является результатом не непосредствен-
ного возбуждения, а реакции в возбужденном состоянии.

12.6.	Изучение реакций в возбужденных состояниях фазово-модуля-
ционными методами

Методы измерения фазовых сдвигов и степени демодуляции флуоресцен-
ции обычно полезны для анализа процессов, протекающих в возбужденных со-
стояниях. В следующих разделах будет показано, как можно использовать
эти данные для получения спектров отдельных компонентов, для обнаружения
обратимости реакции в возбужденном состоянии и для установления того, что
в ходе реакции образуется более чем один продукт.

12.6.1.	Разделение спектров испускания антрацена и его эксиплекса
с циэтиланипином

Для протонировапия возбужденного состояния акридина можно исполь-
зовать контрольные образцы, для которых известны спектры испускания каж-
дого вида исследуемых частиц. Это не всегда так, как видно на примере об-
разования комплекса с переносом заряда между антраценом и диэтиланили-
пом, когда длинноволновое испускание эксиплекса нельзя наблюдать в от-
сутствие коротковолнового испускания антрацена. К счастью, можно рас-
считать индивидуальные спектры ио фазово-модуляционным данным для раз-
ных спектральных областей (рис. 12.16). Очевидно, что значения <р и m посто-
янны на коротковолновом и длинноволновом краях спектра, следовательно, в
этих областях преобладает испускание от того или другого вида частиц. При-
писав эти значения состояниям F и R, можно использовать уравнения (12.59) -
(12.62) для расчета спектров испускания как мономерной, так и закомплексо-
ванной форм антрацена (рис. 12.17). Возможность разложения спектра стацио-

РИС. 12.16. Зависимость фазовых углов и коэффициентов демодуляции от дли-
ны волны для антрацена и его эксиплекса с диэтиланилином.

Антрацен растворен в толуоле, концентрация диэтиланилина 0,2 М. (С разреше-
ния авторов работы ] 17| И North Holland Publishing По.)
РИС. 12.17. Разделение спектров мономера и эксиплекса антрацена.

Спектры рассчитаны с использованием уравнений (12.59) — (12.62) и данных
рис. 12.16. (С разрешения авторов работы [ 17] и North Holland Publishing Со.)

парного состояния на два спектра, которые суммируются с образованием ста-
ционарного спектра, показывает, что в этом случае справедлива модель двух
состояний. Если присутствуют еще какие-то излучающие частицы, разложеыи о
не может быть успешно проведено.

12.6.2.	'Измерение и $ для 2-йафтопа методом фазочувствительной
регистрации фпуоресценции

Если известны стационарные спектры состояний F и R, с помощью мето-
да фазовой флуорометрии можно также определить фазовые углы и не-
зависимо от перекрывания спектров. Мы продемонстрируем применимость мо-
тода, используя данные, полученные для 2-нафтола [ 32]. В возбужденном со-
стоянии рКд нафтола уменьшается до 2,0 по сравнению с 9,2 в основном со-
стоянии. Максимумы испускания находятся при 356 и 410 нм соответственно.
Как было показано в гл. 4, используя метод фазочувствительной регистра-
ции, можно подавить испускание любой из частиц. В частности, фазовый угол
детектора можно выбрать таким образом, чтобы подавить флуоресценцию ли-
бо нафтола, либо нафтолята. В том случае, когда фазочувствительный спектр
перекрывается со стационарным спектром нафтола, фазы детектора и испус-
кания нафтолята не совпадают. Следовательно, можно определить фазовый
угол для нафтола, когда в фазочувствителыюм спектре виден,стационарный
спектр нафтолята (рис. 12.18). Фазовый угол нафтолята можно определить
подбором фазового угла, при котором фазочувствительный спектр совпадает
со стационарным спектром нафтола. Если известны стационарные спектры
компонентов, этот способ дает индивидуальные значения фазовых углов неза-
висимо от перекрывания спектров. Конечно, стационарные спектры не должны
быть одинаковы. 13 противном случае эту методику применять нельзя.

Графические зависимости для фазовых углов нафтола (cpF) и нафтолята
(<рд) представлены на рис. 12.19. <рр уменьшается при увеличении pH, поскольку
при pH > 3 скорость депротонирования растет [уравнение (12.33)]. <pR умень-
шается при увеличении pH, поскольку этот угол определяется суммой tpF и
<poR [уравнение (12.39)]. Собственное время жизни (тоД или <p0R) нафтоля-
та практически не зависит от pH. При низких pH (< 3) фазовый угол нафтоля-
та уменьшается из-за обратной реакции. Выражение для <pR в присутствии об-
ратной реакции сложное (табл. 12.1), однако анализ значительно упрощается
при рассмотрении разности фаз Дер между нафтолом и нафтолятом [ уравне-
ние (12.41)]. Из этого уравнения видно, что Дер будет уменьшаться, если про-

РИС. 12.16. Стационарные и фазочувствительные спектры 2-нафтола Г 32].

Штриховыми линиями показаны стационарные спектры нафтола (pH 0,5) и нафто-
пята (pH 12). Все остальные спектры в о,08 М ацетате натрия. Соответствующие
значения <pR совпадают.
РИС. 12.19. Зависимость фазовых углов флуоресценции нафтола (<pF) и нафтолята
(<Рй)отрН[32].

Фд определен при подавлении флуоресценции нафтолята с помощью фазового
детектора, что вытекает из перекрывания фазочувствительного спектра со стацио-
нарным спектром нафтола, <pF определен подавлением флуоресценции нафтола.

текает обратная реакция. Это иллюстрирует рис» 12.20, где изображена зави-
симость Дф от pH: при pH < 4 обратная реакция вызывает уменьшение разно-
сти фаз. Полученные результаты показывают возможности фазочувствитель-
ной регистрации для определения индивидуальных фазовых углов, что в свою
очередь позволяет измерить скорость обратной реакции.

РИС. 12.20. Зависимость разности фаз между <pR и cpF от рИ [ 32].

Разность фаз (Д<р=	-<pF) -мера собственного времени затухания для наф-
толята; Tofi = (Гк +	) —1 _
12.8.3.	Детальное изучение образования эксиплексов с помощью
метода фазово-модуляционной флуорометрии

В предыдущих примерах были показаны спектральные свойства систем,
подвергающихся реакциям с участием двух возбужденных состояний, а также
потенциальные возможности фазово-модуляционной флуорометрии для анализа
таких реакций. В следующих разделах мы приведем детальное описание ре -
зультатов, полученных Вмюловой и др. [ 12] и служащих примерами использо-
вания фазово-модуляционной флуорометрии для подобных исследований. Реак-
ции в возбужденных состояниях, изученные этой группой исследователей, бы-
ли обратимыми,и путем тщательных измерений и анализа в них было зарегист-
рировано более двух видов излучающих частиц.

Авторы работы [12] изучали образование эксиплексов между тетраметил-
диамиподифэпилметаном (ТМ) и некоторыми производными фталимида. В ка-
честве последних были выбраны З-амипо-М-метилфталимид и 4-диэтиламино-М-
метилфталимид (4-DEAMP), структуры которых изображены на рис. 12.21. Ме-
тод фазочувствителыюй регистрации флуоресценции был использован для по-

РИС. 12.21. Спектры флуоресценции и фазочувствитепьные спектры эксиплек-
сов производных фталимида (4- диэтиламино-М-метилфталимида и З-амино-М-метил-
фталимида) [ 12).

1	- стационарные спектры; 2, 3 - фазочувствительные спектры (1-3 сняты
в гексане в отсутствие и в присутствии тушителя тетраметилдиаминодифенилмета-
на); 4 - спектр получен вычитанием нормированного спектра без тушителя из
спектра, снятого в присутствии тушителя ТМ.
давления коротко- и длинноволновых частей спектра испускания и тем самым
для выделения предполагаемых спектров испускания эксиплекса и мономера
соответственно. Для 4-DEAMP выделенный спектр мономера (рис. 12.21, б,
кривая 2) совпадает с тем, который наблюдался в отсутствие тушителя (кри-
вая 1). Удаление одной из компонент испускания методом фазового подавле-
ния дало спектр, ожидаемый для второй компоненты. Если бы присутствовал
третий вид излучающих частиц, их испускание не подавлялось бы и не иска-
жало предполагаемый фазочувствительный спектр мономера, препятствуя
точному совпадению этого спектра со спектром 4-DEAMP в отсутствие ТМ.
Если предположить, что фазовый угол для любого третьего вида частиц не
равен углу для эксиплекса 4-DEAMP—ТМ, то этот результат доказывает,
что реакцию ТМ с 4-DEAMP в возбужденном состоянии можно адекватно опи-
сать двумя спектральными распределениями, каждое из которых имеет свое
время затухания, не зависящее от длины волны.

Противоположные результаты были получены для реакции ТМ с 3-АР
(рис. 12.21, а). В этом случае подавление испускания при малых волновых
числах (кривая 2) не дало спектра, который совпадал бы со стационарным
спектром флуоресценции мономера (кривая Z). При промежуточных волновых
числах наблюдали добавочную интенсивность, которая была приписана сущест-
вованию промежуточных испускающих частиц. Веселова с соавторами пред-
положили, что эта третья спектральная компонента обусловлена возбуждением
комплексов в основном состоянии между 3-АР и ТМ, что будет детально об-
суждено ниже. Однако независимо от природы наблюдаемого явления очевид-
но, что метод ФЧРФ можно использовать для того, чтобы сделать выбор меж-
ду реакцией с участием двух состояний и более сложными явлениями.

Некоторый особенный, но важный момент иллюстрируется сравнением
спектра испускания эксиплексов, полученного методом фазового подавления
испускания мономера (рис. 12.21, кривая 3), с тем же спектром, рассчитан-
ным как разность между спектрами стационарного состояния в присутствии
и в отсутствие ТМ (кривая 4). Для эксиплекса 4-DEAMP—ТМ эти спектры
хорошо совпадают, как и следует ожидать для реакции с участием двух сос-
тояний. Такого совпадения нет в случае эксиплекса 3-АР—ТМ. Спектр 4,
рассчитанный по разности спектров стационарной флуоресценции, свидетель-
ствует о присутствии промежуточных частиц, тогда как в спектре 3, получен-
ном подавлением фазы испускания мономера, этого не наблюдается. Таким
образом, на фазочувствительный спектр эксиплекса 3-АР—ТМ не
влияет присутствие промежуточных испускающих частиц. Это, вероятно,
связано с тем, что времена жизни промежуточных частиц и мономера пример-
но одинаковы. Следовательно, подавляя испускание мономера, мы тем самым
подавляем флуоресценцию и этих промежуточных частиц.
Тщательное исследование эксиплексов фталимида, проведенное Весело-
вой с. соавторами, дало ряд дополнительных поучительных примеров спектраль-
ных свойств систем, участвующих в реакциях в возбужденных состояниях»
Особенно много информации можно получить из зависимостей Штерна - Фоль-
мера для тушения флуоресценции мономера, поскольку они содержат данные
об образовании комплексов в основном состоянии и об обратимости реакции
образования эксиплекса (рис. 12.22). Из результатов, представленных на
рис. 12.21, можно сделать вывод о присутствии промежуточных частиц для
3-ЛР, существование которых частично можно объяснить образованием комп-
лекса в возбужденном состоянии. Зависимость Штерна - Фольмера подтверж-
дает это предположение. Выло найдено, что при увеличении концентрации
ТМ квантовые выходы флуоресценции мономеров уменьшаются быстрее, чем
времена затухания. Это обусловлено статическим тушением, или образовани-
ем комплексов в основном состоянии. Такие данные можно проанализировать,
рассматривая уравнения Штерна - Фольмера, в которых относительные выхо-
ды оцениваются либо по измеренным значениям времен затухания т, либо по
квантовым выходам F:

I , к т ITM)	(12.67)

□	г\ Cl Л\ и

т /т =5 1 » k тЛТМ]	(12.68)

о'	<1 о

Индексом 0 обозначены величины, полученные в отсутствие тушителя. Наибо-
лее интересным аспектом данных, полученных для 3-АР, является численное
значение константы тушения &каж, рассчитанной из измерений квантовых

РИС. 12.22. Зависимости Штерна - Фольмера для тушения 3-АР и 4-ОЕАМРтет.
р а мет и п ди амин о ди фен и л мет ан ом.

28*4X3
выходов. Это значение (18,5 - Ю10 М~1 • с"1) превышает то, которое можно
получить на основании известных скоростей диффузии малых молекул в жид-
ких растворах (самое большее, 2- Ю10 М~1  с-1). Из спектральных харак-
теристик флуорофора и тушителя очевидно, что тушение не может быть обу-
словлено безызлучательным переносом энергии. Единственное остающееся
объяснение большой величины константы тушения - то, что еще до процесса
возбуждения молекула тушителя локализована вблизи молекулы флуорофора .
Вероятно, это происходит из-за взаимодействия с образованием водородных
связей, когда молекулы растворены в неполярном растворителе типа гекса-
на. Напротив, константа тушения, полученная из наклона начального участ-
ка на графике для времен затухания 3,9 • 1010 М-1 • с-1, - более приемлемая
величина. Она, правда, все еще несколько больше ожидаемой, что может сви-
детельствовать об ассоциации 3-АР и ТМ в основном состоянии и о том, что
в возбужденном состоянии взаимодействие усиливается.

В отличие от АР 4-DEAMP ведет себя подобно системе двух состояний,
о чем можно судить по фазочувствительным спектрам. В этом случав накло-
ны начальных участков зависимостей Штерна - Фольмера одинаковы для кван-
товых выходов и для времен затухания, что доказывает отсутствие взаимо-
действия в основном состоянии.

Было найдено, что как для 3-АР, так и для' 4-DEAMP зависимости Штер-
на - Фольмера для времен затухания отклоняются вниз от линейности при
больших концентрациях тушителя (рис. 12.22). В гл. 9 было отмечено, что
причиной таких результатов должно быть наличие двух типов флуорофоров,
один из которых не подвергается влиянию тушителя. Для жидких растворов
это мало вероятно, и отрицательное отклонение от линейности при образова-
нии эксиплексов, возможно, связано с обратимостью реакции. В предыдущих
разделах этой главы обсуждались случаи двухэкспопепциальных законов за-
тухания для "первоначально возбужденных" частиц, если реакция обратима.
Вторая компонента в затухании флуоресценции из состояния F имеет большее
время затухания, сравнимое, но пе равное времени жизни эксиплекса [20].
Времена затухания, представленные на рис. 12.22, были измерены методом фа-
зового сдвига, который приводит к взвешенному усреднению этих спектраль-
ных компонент. При увеличении концентрации ТМ вклад долгоживущего ис-
пускания в затухание флуоресценции из состояния F увеличивается, приводя
к тому, что средние значения времен затухания становятся больше ожидае-
мых. Далее, обратная реакция уменьшает собственное время жизни частиц,
образовавшихся в результате реакции [уравнение (12.41)], и Веселова с со-
авторами обнаружили, что собственное время жизни эксиплекса уменьшается
при больших концентрациях ТМ. Этот факт подтверждает данную ими интер-
претацию отрицательного отклонения зависимости т /т, причина которого,
по их мнению, заключается в протекании обратной реакции.

Следующим интересным моментом, на котором останавливаются Весело-
ва и др. [12], является то, что им не удалось зарегистрировать образования
комплексов в основном состоянии для 3-АР с ТМ при записи спектров поглоще-
ния. Как это обычно делают для таких систем, были записаны спектры погло-
щения флуорофоров в присутствии и в отсутствие ТМ. Можно было ожидать,
что взаимодействия в основном состоянии скажутся па спектре поглощения,
а взаимодействие, протекающее только в возбужденном состоянии, не должно
влиять на этот спектр. Как и ожидалось, присутствие ТМ не влияло на спектр
поглощения 4-DEAMP, но удивительно то, что спектр поглощения 3-АР также
не изменился в присутствии ТМ, хотя описанные выше результаты свидетель-
ствуют о наличии взаимодействия в основном состоянии. Очевидно, эти взаи-
модействия слишком слабы, чтобы оказывать влияние на спектр поглощения.
Может быть, неустойчивый комплекс в основном состоянии подвергается
быстрой перегруппировке в возбужденном состоянии. Важно запомнить, что
отсутствие измеряемой па опыте разницы в спектрах поглощения флуорофора
не обязательно свидетельствует, что на его усредненное окружение не оказы-
вают влияния некоторые добавки.

Задачи

12-1. Протонирование акридина в возбужденном состоянии изучали, измеряя ки-
нетику затухания флуоресценции. Как было описано более детально в разд. 12.5, ней-
тральный акридин протонируется в возбужденном состоянии ионами аммония. В
табл. 12.3 приведены полученные импульсные функции отклика для акридина в 0,2 М

при pH 8,3.

Ответьте на следующие вопросы, касающиеся кинетики затухания флуоресцен-
ции акридина:

а)	Если бы в вашем распоряжении были спектры поглощения акридина в
0,05 М Na ОН, 0,05 М HjSO и 0,2 М NII4NO30 как бы вы могли их использовать для
того, чтобы различить процессы протонирования акридина в основном и в возбужден-
ном состояниях?

б)	Какие характеристики экспериментальных данных наиболее четко свидетель-
ствуют о протекании реакции в возбужденном состоянии? Могут ли эти данные дока-
зывать, что е реакции участвуют два состояния или что имеют место какие-то более
сложные процессы?

в)	Каковы времена затухания акридина и акридиния в 0,2 М Nil NOg?

г)	Используйте данные по затуханию флуоресценции, приведенные в табл. 12,3,
для расчета спектров испускания акридина и акридиния. Для удобства приведены чис-
ленные значения для стационарного спектра в 0,2 М NII^NO (табл. 12.3).

12-2. Диссоциацию 2-нафтола в возбужденном состоянии при pH 6,6 исследова-
ли с помощью фазово-модуляционного флуорометра. В табп. 12.4 приведены кажу-
Таблица 12.3. Параметры кинетики затухания флуоресценции акридина в

0,2 М NIINO
'	4	3

Свертка с функцией вспышки					Свертка с функцией испускания				
X, нм	а1	т , нс	а2	т2, нс	“ 1	при 400 нм			
						тр нс		т2, нс	1(Х)а
400	0,503	3,94	-0,001	33,96	21,91	0,026	43,71	0,022	7,3
410	0,220	4,00	——	—	23,67	0,030	—•	—	7,6
420	0,491	3,88	0,002	25,20	50,00	0,001	0,001	28,97	8,5
430	0,189	4,25	0,007	31,08	9,62	0,117	0,010	28,56	11,0
440	0,134	3,93	0,026	30,39	17,73	0,018	0,011	30,80	16,0
450	0,067	3,90	0,028	30,05	25,93	0,020	0,033	30,15	18,0
460	0,042	4,27	0,027	30,01	10,83	0,020	0,019	30,14	17,3
470	0,019	4,04	0,027	30,43	23,04	0,011	0,033	30,45	17,3
480	0,008	4,68	0,045	29,31	10,00	0,017	0,030	24,62	15,6
490	0,001	8,66	0,028	30,40	6,69	0,023	0,034	30,30	12,4
500	-0,010	4,91	0,082	29,13	22,86	0,010	0,034	30,33	10,0
510	-0,009	3,42	0,028	30,39	4,34	0,024	0,034	30,33	7,8
520	-0,019	3,62	0,039	29,60	10,00	0,007	0,027	29,86	5,5
530	-0,045	3,38	0,087	30,23 '	1,04	0,076	0,032	30,20	3,6
540	-0,036	3,76	0,064	29,83	6,42	0,010	0,030	30,01	2,0
550	-0,036	3,56	0,058	29,94	10,0	0,007	0,031	30,14	1,2
560	-0,029	3,86	0,046	29,90	10,0	0,021	0,021	30,11	0,8

а Спектр стационарной люминесценции в 0,2 М NH NO3.

щиеся значения фазового и модуляционного времен затухания, а в табл. 12.5 — зави-
симость времен затухания первоначально возбужденного состояния от pH.

а)	Какие характеристики экспериментальных данных наиболее четко свидетель-
ствуют о протекании реакции в возбужденном состоянии? Обратима или нет эта реак-
ция?

б)	Прокомментируйте степень перекрывания спектров испускания нафтола и на-
фтолята на коротковолновом и на длинноволновом краях спектра.

в)	Предскажите влияние уменьшения частоты модуляции w на величины т^,
тт и m/cos<р для больших длин волн. В частности, рассмотрите данные, полученные
при pH 6,6 для частоты модуляции <х> = 2п • 6 МГц и длины волны 420 нм, Предполо -
жим', что время затухания флуоресценции нафтолята (т равно 8,9 нс. Каковы экспе-
риментальные следствия использования более низкой частоты модуляции?
Таблица 12.4. Кажущиеся значения фазовых и модуляционных времен затухания
(30 МГц) для 2-нафтола при pH 6,6 в 0,08 М ацетате натрия

А, нм	тт, нс	т^, нс	т	COS Ф	m/cos
350	2,32	2,39	0,916	0,912	1,004
360	2,39	2,52	0,912	0,903	1,016
370	3,74	2,98	0,818	0,872	0,938
380	6,75	5,63	0,618	0,686	0,901
390	9,57	13,03	0,485	0,377	1,286
400	9,80	24,95	0,476	0,208	2,288
410	10,16	30,20	0,463	0,173	2,676
420	10,21	41,77й	0,461	0,126	3,659
430	10,21	61,46а	0,461	0,086	5,360
440	10,07	62,93а	0,466	0,084	5,548
450	9,88	54,44а	0,473	0,097'	4,876
460	10,62	100,ооа	0,447	0,042	10,643

Эти значения получены с большой случайной погрешностью из-за того, что
фазовый угол близок к 90°

Таблица 12.5. Кажущиеся значения фазовых и модуляционных времен затухания
(30 МГц) 2-нафтола (состояние F, 350 нм) при различных pH

pH	Л нс	т^,нс	m	СОЯф	т/ cos
0,54	6,54	8,46	0,630	0,635	0,992
1,07	7,39	6,57	0,583	0,629	0,928
1,61	7,79	7,14	0,563	0,597	0,994
2,01	7,45	6,45	0,580	0,634	0,915
2,60	6,53	5,42	0,630	0,649	0,902
2,93	5,54	5,23	0,692	0,712	0,972
3,95	4,17	3,81	0,786	0,812	0,968
4,53	3,17	3,49	0,858	0,835	1,028
4,80	3,19	3,03	0,857	0,868	0,987
5,13	2,90	2,96	0,878	0,874	1,005
5,61	3,18	2,70	0,858	0,891	0,962
6,11	2,64	2,63	0,845	0,896	0,999
6,67	2,83	2,52	0,882	0,903	0,977
Ответы на задачи

Г лава 3

3-1. Фазовые углы и коэффициенты демодуляции связаны с временами
затухания флуоресценции соотношениями

<р = tg 1 (сот); т - [ 1 + сЛ21

(3.57), (3.58)

где ы=2тг, умноженное на частоту модуляции. Можно оценить погрешности в
значениях т? при изменении фазового угла на 1°, т. е.

тР = (1 /ы) [ t g(<р — 1) ] или (1 /со) [ t g (<р + 1)]

(3.59)

где ф — фазовый угол, получающийся по уравнению (3.57). Аналогично модуляци
онные времена затухания можно оценить из выражения



(3.60)

где т отличается на +0,01 от значения, рассчитанного по уравнению (3.58). При
этом получаются следующие результаты (табл. 3.3), из которых видно, что для
коротких времен затухания (2нс) наименьшие погрешности в тР, возникающие
при неточностях в значениях фазовых углов, получаются при больших частотах
модуляции. Например, при увеличении частоты от 1 до 100 МГц и при погрешнос-
ти для ф, равной 1°, погрешность для тР уменьшается от 3 до 0,1 нс. Кроме то-
го, очевидно, что при измерении времен затухания порядка 2 нс модуляционные
измерения вообще нельзя проводить на частотах 1 и 10 МГц.

Для образца с временем затухания 20 нс удовлетворительные значения вре-
мен затухания можно получить как фазовыми, так и модуляционными методами,
используя частоту 10 МГц. Для этого образца время затухания все еще слишком
короткое, чтобы его можно было измерить модуляционным методом при частоте
1 МГц. При частоте модуляции 100 МГц наблюдается большой разброс в значени-
ях фазовых времен затухания, связанный с большой величиной фазового угла.

Для образца с временем затухания 100 нс наиболее надежные данные можно
получить, используя частоту модуляции 1 МГц. При 100 МГц фазовый угол слиш-
ком велик, а степень демодуляции слишком мала для того, чтобы можно было
надежно рассчитать время затухания тем или иным способом.

3-2. а) Величины <<р'> и <т> можно рассчитать по уравнениям (3.39) —(3.42).
В этом случае , обусловленная рассеянием, равна 0,1, а /2 • обусловленная
флуоресценцией, равна 0,9. Поскольку время затухания рассеянного света равно
нулю, ф, = 0. Фазовый угол флуоресценции, не возмущенной рассеянием, равен
37,02°. Подставляя эти значения в уравнения (3.41) и (3.43), получаем N- 0,433
Таблица 3.3, Результаты вычислений фазовых углов и
коэффициентов демодуляции

Погрешности вычислений для

Частота МГц	t g <Р	<р/-рад	тп	тГ(<р ± 1°), нс	тт(т + 0,01), нс
		2 нс			
1	0,0126	0,72	0,9999	1,77 — 4,77	- до 22,8а
10	0,1257	7,16	0,9922	1,72 — 2,28	— до 3,04
100	1,2566	51,49	0,6227	1,93 - 2,07	1,95 - 2,05

20 нс

1  10	0,1257  1,256	7,16  51,48	0,9922  0,6227	17,1 - 22,8  19,3-20,7	— до 30,4  19,5-20,5
100	12,57	85,45	0,0793	16,4-25,6	17,75-22,91
			200	нс	
1	1,256	51,48	0,6227	193 - 207	205-195
10	12,57	85,45	0,0793	164-256	229-177
100	125,7	89,54	0,0080	— др 62,4	— ДО 84

а Тире обозначает решения, лишенные физического
смысла. Подчеркнуты результаты, относящиеся к наибо-
лее надежной для каждого образца частоте.

и D = 0,673 соответственно. Отсюда можно рассчитать тР = 3,41 нс и тт = 3,98нс.
Среднее время затухания можно найти из уравнения (3.53), полагая ajTj = 0,1 для
рассеянного света и а2т2 = 0,9 для компоненты 0,4 нс. Следовательно, <т> = 3,6 нс.
Заметим, что тР короче, а т"* дольше, чем < т > .

б)	Для времен затухания порядка 4 нс большее влияние рассеянного света про-
является в фазовом методе.

в)	Гетерогенность образца может исказить значения фазового и модуляцион-
ного времен затухания.

г)	Напомним, что, согласно уравнению (3.2.1), вклады интенсивностей (/ ) свя-
заны с предэкспоненциальными множителями. Можем принять apj + а2т2 х 1. Сле-
довательно, «iTj х /j = 0,1 и а2т2 = /2 = 0,9. Используя эту нормировку, полу-
чаем

F(t) = 1,0	1 + 0,25 е~ t/4’ 0

(3.61)

При выводе этого уравнения мы предположили, что компонента с нулевым временем
затухания, обусловленная рассеянным светом, должна была бы проявляться как ко-
роткоживущая компонента с кажущимся временем затухания, близким к разреше-
нию прибора. Произведение не может быть больше 0,1, но при этом отдельные
значения ос г или Tj могут быть меньше или больше 0,1. В нашем случае т, * 0,1 нс.
Интересно отметить, что даже небольшие количества рассеянного света (1 О*/о) мо-
Таблица 3.4. Результаты расчета фазовых
и модуляционных времен зату-
хания

Частота, МГц	т, нс	Ф, град sin ф	cos ф
10	4,2	14,78 0,255	0,967
	11,8	36,55 0,596	0,803
30	4,2	38,37 0,621	0,784
	11,8	65,79 0,912	0,410
Частота, МГц	N	D т^нс	t”J нс
10	0,363	0,790 7,31	9,04
30	0,430	0,391 5,83	7,43

гут проявиться в виде преобладающей компоненты в кинетике затухания флуорес-
ценции, если забыть о том, что реальный вклад этой компоненты составляет а^.

3-3. а)Для того чтобы определить лредэкспоненциальные множители в законе за-
тухания, можно принять, что (XjTj = 0,5 = а2т2; тогда закон затухания запишется в
виде

F(t) = 0,119 е” 4/42 + 0,042 е~1/1Х’8	(3.62)

б) Для получения фазовых и модуляционных времен затухания можно использо-
вать уравнения (3.39) - (3.42), где = f2 = 0,5. Рассчитанные значения приведены в
табл. 3.4.

Среднее время затухания, определяемое по уравнению (3.53), равно 8 нс. Оба зна-
чения фазовых времен затухания меньше среднего времени, а оба значения модуляци-
онных времен затухания - больше среднего времени. Гетерогенность влияет сильнее
при больших частотах модуляции.

Г пава 4

4-1. Фазочувствительный спектр может совпасть со стационарным спектром TNS,
когда <рп = 102,8° = 12,8° +90°, т.е. когда детектор находится в противофазе с ком-
понентой (PRODAN), имеющей фазовый угол 12,8°. При 10 МГц этот фазовый угол со-
ответствует времени затухания 3,6 нс - времени затухания флуоресценции PRODAN.
Наоборот, фазочувствительный спектр аналогичен фазочувствительному спектру PRODAN,
когда фр =-53,5°. Такое значение получается при вычитании 90° из 36,5°. Этот фазо-
вый угол компонента, флуоресценция которого подавлена (TNS), соответствует време-
ни затухания 1108 нс.

4-2. Фазовые углы детектора» равные 17,4 + 9СР и 32»1 — 90°» относятся к тем
положениям, когда детектор находится в противофазе с DNS - BSA и DNS соответст-
венно. Эгс следует из того, что при фр = 17,4 + 90° наблюдается только флуоресцен-
ция DNS - BSA, а при фр = 32»'1 - 90° - только флуоресценция DNS. В смеси DNS—BSA
интенсивность фазочувствительной флуоресценции DNS уменьшена на 50%,. Следова-
тельно, 50% молекул DNS связано с BSA. Аналогично при фр = 17,4 + 90° наблюдает-
ся только флуоресценция комплекса. По отношению к раствору, в котором DNS полностью
связана, интенсивность составляет 50%. Следовательно, связано только 50% молекул DNS.
Интенсивности фазочувствительных спектров первых двух растворов можно объяс-
нить следующим образом. При добавлении насыщающих количеств BSA все молекулы DNS
оказываются связанными. Таким образом,, их вклад в сигнал при = 32,1 — 90° лик-
видируется. Интенсивность увеличивается в два раза, и теперь можно наблюдать флуо-
ресценцию при = 17,4 + 90°. Однако увеличение интенсивности в два раза реально
не наблюдается, поскольку сигнал от связанной DNS демодулирован сильнее, чем от
свободной DNS „ Точнее, эти значения равны 0,954 и 0,847 для 5 и 10 нс соответствен-
но f уравнение (4,2)]. Следовательно, ожидаемое увеличение интенсивности в два раза
уменьшается на коэффициент 0,847/0,954 = 0,888.

Г пава 5

5-1. В соответствии с уравнениями (5.48) и (5.51)

(5.65)

где d — фактор деполяризации, связанный с сегментальной подвижностью зонда:

2

(7 " --—

3 cos 2₽ - 1

(5.66)

Следовательно, график зависимости (1/1* - 1/3) от Г/д дает (1/^0 — 1/3)</ и
(1//*0 — 1/3) </Ят/И в виде отсекаемого отрезка и наклона соответственно. Из данных
рис, 5.15 получаем следующее:

Отсекаемый отрезок Наклон, Наклон/отсекаемый от-
Т,°С 1/Р 1/Р-1/3 Ю-’кЧг^см-с резок, 10-6 К-1-г4 см.с

10	2,51	2,18	1,20	5,50
20	2,59	2,26	1,18	5,22
35	2,73	2,43	1,12	4,61
45	2,85	2,52	1,08	4,30

При делении наклона на отсекаемый отрезок d сокращается и получаем выражение:

Наклон

Отсекаемый отрезок

Ят

V

(5.67)

Следовательно, может быть вычислен объем молекулы IgG:

Т, °C	10	20	35	45

V, см3/моль 151000 159 000 180000 193 000

Принимая молекулярную массу равной 150000 и плотность 1,2 г/см3, получаем объем
125000 см3/моль. Так как молекула IgG не имеет сферической формы, то представля-
ется разумным, что ее кажущийся объем должен быть больше, чем вычисленный. Более
того, при вычислении объема не учтена гидратация.
Мы предположили, что при Ю°С дансильная область не обладает избыточной по-
движностью, кроме той, которая связана с общим вращением белка. Следовательно,
при этой температуре отсекаемый отрезок равен (1/Р0 — 1/3). Отношение отсекаемого
отрезка при более высокой температуре к отсекаемому отрезку при 10°С равно d. Пре-
образование уравнения (5.66) дает

cos2 р = {2d -*1 + 1 )/3

(5.68)

и, следовательно, значение р. Таким образом, видно, что степень внутренней подвиж-
ности возрастает на 18° при увеличении температуры от 10 до 45°С:

Т, °C	Отношение отсекаемых отрезков	Cos2 [3	
10	1,0	1,00	0
20	1,037	0,976	8,87
35	1,115	0,931	15,20
45	1,156	0,910	17,5

5-2 Наблюдаемую поляризацию можно перевести в единицы анизотропии, исполь-
зуя г = 2/|7(3 — Р). Последнее удобнее, поскольку

т ~ Азвобгсвоб +Азвязгсвяз

(5.69)

где индексами отмечены свободная и связанная формы флуорофора, а /. — доля флу-
оресценции, соответствующая каждой форме зонда. Когда [ BSA] = 0, регистрируется
гСВ0б’ а ко™а [BSAb> Кдисс’ Регистрируется гС0ЯЗ:

[ BS А] Регистриру-

емый параметр

0	гсвоб	0,010
2-10“5М	г	0,200
»Kd	гсвяз	0,300

Используя уравнение (5.69), получаем

“20= 4во6<адп +<1 -Гсвоб)

(5.70)

и, следовательно, Усво6 = 0,345, a fCBft3 = 0,655. Так как концентрация DNS намного
меньше, чем BSA, можно принять, что концентрация несвязанного BSA не зависит от
связывания с DNS. Отношение свободной DNS к связанной равно 0,345/0,655. Следова-
тельно, из уравнения (5.63) находим

К
дисс

(2-10“5М) (0,345)

(0,655)

= 1,О5-1О~5М

(5.71)
б)	При использовании уравнения (5.69) предполагалось, что вычисленные доли ин-
тенсивности каждой формы соответствуют доле связанной или свободной DNS. Однако
если относительный квантовый выход связанного зонда в два раза больше, чем свобод-
ного, то ясно, что концентрация связанной формы в два раза ниже. Следовательно,

(2.10-^1(0,345) = 211.10-,м

Д (0,655)/2

(5.72)

в)	Изменение квантового выхода может быть легко обнаружено при сравнении ин-
тенсивности раствора DNS в присутствии и в отсутствие BSA . Так как концентрации
DNS идентичны, относительные интенсивности соответствуют относительным кванто-
вым выходам.

г)	Используя данные, приведенные для вычисления времени вращательной корреля-
ции BSA, находим, что оно равно 20 нс. Анизотропия DNS будет затухать слишком быст-
ро, для того чтобы можно было ее измерить на обычном оборудовании. Для растворов, со-
держащих BSA в концентрациях, достаточных для связывания всей DNS, предполагаем,
что

г(«) = 0,20 e“t/20

Для раствора с концентрацией 2’10~5М

гС>=/свЯэго'’_,/2° = о'131'‘'/2°

(5.73)

(5.74)

5-3. Используя условие задачи 5-3, можно составить таблицу (табл. 5.4), в которой
перечисляются времена корреляции для каждого мономера и димера и предполагаемые
анизотропии для каждого маркированного белка. И флуоресцеин, и дансил подходят для
количественной оценки димеризации рибонуклеазы, так как следует ожидать приблизи-
тельно одинаковых изменений в анизотропии (0,05). Видно, что процентное изменение
для рибонуклеазы, маркированной пиренбутиратом, больше (89%), но фактическое изме-
нение анизотропии при димеризации мало (от 0,008 до 0,016). По тем же соображениям
флуоресцеин или дансил должны подходить для измерения димеризации химотрипсина.
Для IgG максимальная чувствительность к димеризации должна наблюдаться с белка-
ми, маркированными пиренбутиратом.

5-4. а) Долю лумазина, связанного при 4°С, можно найти, используя значения ани-
зотропии из уравнения (5.58) с г = 0,039, гсвяз = 0,153; говоб= 0,003 и R = 1,5. По-
лучаем fCBB3 = 0,179. Подстановка в уравнение (5.59) дает Хдисс = 0,343 мкМ.

б)	Время вращательной корреляции можно рассчитать по уравнению (5.33). Исполь-
зуя уравнение (5.4), вычисляем, что значение PQ = 0,45 соответствует г0 = 0,353. Под-
ставляя г - 0,153 при 4°С, находим время вращательной корреляции, равное 9,4 нс.

в)	Если весь лумазин был связан с белком, следует ожидать

r(t)= roft_Z/<P	<б-75)

где rQ = 0,353 и <р = 9,4 нс. Однако для этого раствора ранее было вычислено, что толь-
ко 17,9% лумазина связано с белком (/связ = 0,179). Время затухания анизотропии сво-
бодного лумазина значительно меньше, чем 1 нс, и, таким образом, ненаблюдаемо. Кине-
тика затухания будет отражать только вращательную диффузию белка как целого:
Таблица 5.4. Вычисленные значения к задаче 5O3U

Белок	<р, нс		
	Мономер (М)	Димер (Д)	
Рибонуклеаза	6,81		11,6
Химотрипсин	10,4		20,8
IgG	68,9		137,7
		Анизотропии	а
	Флуоресцеин	Дансил	Пиренбутирил
Рибонуклеаза М	0,213 (1,26)	0,110(1,46)	0,008(1,89)
Д	0,268	0,161	0,016
Химотрипсин М	0,260(1,16)	0,153(1,33)	0,014(1,80)
Д	0,302	0,203	0,025
IgG	1 0,340(1,03)	0,262(1,07)	0,061 (1,42)
Д	I 0,350	0,280	0,087

а Числа в скобках - отношение анизотропии димера к ани»
зотролии мономера.

r(t) = (0,179) (0,353) е-*79,4

(5.76)

Присутствие свободного лумазина приводит к понижению кажущейся анизотропии при
t = 0 от 0,353 до 0,063.

5-5. Для а2 £ О

г°а* + г0«2
1+(т/<Р1)	1+(т/<р2)

(5.77)

Г пава 6

6-1. а) Поправочный коэффициент /ц /1\ равен 1,35/0,45 = 2,95. Следовательно, ис-
пользуя уравнение (5.33), находим rQ = 0,394. Уравнение (5.3) дает Ро = 0,494.

б)	Угол между диполями поглощения и испускания может быть вычислен из уравне-
ния (5.20):

2 /3cos2a -1

5 '	2
Подстановка г() = 0,394 дает а = 5,7' .

в)	Для О РН в DMPC анизотропия равна 0,190. Для незатрудненной модели эта ани-
зотропия связана со скоростью вращения выражением

rn/r=1+6/?T	(6.48)

Подстановка г{) = 0,394, г - 0,190 и т 10нс в (6.48) дает А = 1,8-Ю" с. Используя

<р = (бЛ)”1, вычисляем <р - 9,3 нс. Среднее угловое смещение флуорофора определяет-
ся уравнением (5.45). Подстановка г() ~ 0,394 и г = 0,190 дает у = 36°.

г)	Уравнение (6.46) пригодно для случая затрудненного флуирофора. После преоб-
разования получаем

(г,, - г)/(г - гч I к/,	(6.49)

Следовательно, А ~ 5,ь-Ю с и ip - о нс. Угол у один и ют же независимо от приня-
той модели. Вычисление у является просто интерпретацией измеренной анизотро-
пии.

д)	Используя уравнение и приведенные данные для незатрудненной модели, вычис-
ляем вязкость, которая равна 2,4 П ~ 240 сП. И наоборот, можно использовать скорость
вращения затрудненной модели с ц = СТ/6Н = 0,76 П = 76 сП.

6-2. а) Угол а между диполями поглощения и испускания можно вычислить, исполь-
зуя уравнение (5.20). Подстановка данных из табл. 6.1 дает а = 43" при 292 нм и
о •• 26° при 300 нм. Угол между диполями поглощения может быть вычислен по урав-
нении

(6.50)

где q и г 2 — анизотропии при 292 и 300 нм соответственно. Следовательно, е = 37,5°.
б) График зависимости г”1 от т имеет наклон (г 0 ср)”1 и отсекаемый отрезок (г0)-1.

Используя данные табл. 6.1, получаем <р = 1,6 нс. Этот график не вполне линеен (изгиба-
ется вниз при больших временах затухания и не экстраполируется к измеряемому зна-
чению гп при коротких временах затухания (рис. 6.16). Эго показывает, что затухание

РИС. 6.16. Зависимость анизотропии
флуоресценции N-ацетил-с-триптофанамида
в пропиленгликоле при 25°С от времени за-
тухания 1371.

Времена затухания изменялись с по-
мощью тушения кислородом. (С оазпешения
\nierican Chemical .Society.
РИС. 6.1/.Зависимость анизотропии флуоресценции перилена в пропиленглико-
ле от времени затухания при 25°С [ Зв].

r(t), по-видимому, подчиняется многоэкспоненциальному закону. Время вращательной
корреляции можно вычислить по уравнению <р = д V/RT. Используя значение молекуляр-
ного объема, равное 204 мл/моль, получаем <р = 2,6 нс. Измеренное значение <р меньше,
чем вычисленное, что может быть следствием малых размеров NATA по сравнению с
пропиленгликолем и/или движения индольного кольца независимо от остальной части мо-
лекулы NATA.	_

в)	Средняя скорость вращения /? может быть найдена_из графика зависимости

г0/г от т (рис. 6.17). При 435 нм наклон этого графика (6Я) равен приблизительно 2нс- •
При 320 нм наклон ~ 0,7 нс "Л При 435 нм R - % (Апл + Авл), а при 320 нм /?я /?вп. Сле-
довательно, Явп - 0,12нс-1 и /?пл = 0,555нс"1. Плоскостное вращение приблизительно
в пять раз быстрее, чем внеплоскостное.

г)	Используя молекулярную массу и плотность лерилена, можно вычислить его мо-
лекулярный объем, который равен 187 мл/моль. Эффективный объем может быть вычис-
лен из V - <р/?Т/г]. Используя среднюю скорость вращения 0,33dО9 с"1 (435 нм) и

ц = 0,32 П, находим объем, равный 39 мл/моль. Ясно, что перилен вращается быстрее
(эффективный объем меньше), чем ожидается для молекулы такого размера.

I&-3. Данные табл. 6.3 могут быть использованы для вычисления анизотропии г и
общей интенсивности I = /ц + 2 при каждом давлении кислорода. Для того чтобы най-
ти время затухания при каждом давлении, нужно определить долю динамического туше-
ния в наблюдаемом тушении. Это делается путем вычисления кажущейся константы туше-
ния ^каж в соответствии с уравнением

(/0 // ) - 1

^каж ~	" *ст + *дин + Лст 7<Дин Р0,	(6-51)

0л	2
где I и I — интенсивности флуоресценции в отсутствие и в присутствие кислорода. По
графику зависимости К от рп можно вычислить К и К .... Полагая, что большее
каж и	ст дин

значение имеет ^дин» получим следующие результаты:

Т,°С К • 102,р-1 К • 104. р"1
дин • ' ст

19	0,81	1,0

45	1,62	14,50

Время затухания флуоресценции при каждом давлении может быть вычислено ло
уравнению

т ' V<1 + Кдинро >	<6-52)

2

Используя эти значения, а также вычисленные значения анизотропии, строим график
зависимости г от (г0-'’)/т (рис. 6.15). Отсекаемый по оси у отрезок представляет
собой г^а наклон (б/?)"1 = ф. По графику находим при 19°С г^- 0,28 и ф = 2,8 нс, а
при 45°С -	0,02 и ф = 1,0 нс.

Г лава 7

7-1. Используя данные, приведенные в условии задачи, взятые из справочника зна-
чения показателей преломления и диэлектрических постоянных, а также уравнение (7.7),
можно составить следующую таблицу:

N» п/п	Стоксов сдвиг, см”"1	△У
1	4302	0,001
2	4416	0,002
3	4523	0,102
4	4992	0,143
5	5284	0,185
6	6448	0,287
7	6477	0,276
8	6926	0,304
9	7249	0,274
10	7419	0,270
11	7616	0,298
12	8206	0,308
13	8646	0,302

Зависимость △? от △/ приведена на рис. 7.20. Очевидно, что спектральные сдвиги
для протонных растворителей (1) несколько больше, чем для апротонных (2). Изменение
дипольного момента лучше всего оценивать из тех данных, на которые не оказывают вли-
яния специфические взаимодействия с растворителем.'Эти точки пожаться примерно на
прямую линию с наклоном:
u _ (6700 - 4300) см-4	,

Наклон -2------------------- = 8000см'4

0,3

(7-20)

Наклон выражается как 2(р* - р)2 /hca 3 . Предположив, что радиус равен~8,4А,
получим

,	8 000

(Р* - р)"	-------

2

8 000	9. п

—------- (6.626-10-'7) х (ЗЛО1 °) (8,4-10"8)3 -

4,71’10~3''

(7.21)

Размерность величины (р* — р)2 — (см-4) (эрг-с) (см/с) (см3).	(7.22)

Поскольку эрг = г-см2/с2, получаем г-см2-см3/с2	(7.23)

Извлечение квадратного корня дает г1//2- см32"2 • см/с	(7.24)

1 ед. СГСЭ ~ г^-'-см^-с-4, следовательно, (р* — р) измеряется в ед. СГСЭ-см или
в дебаях. Итак, (р* - р) = 21,7-10“18 ед. СГСЭ'См = 221). Оценка показывает, что
дипольный момент РНODAN изменяется при возбуждении на 221). Электрону и лоло-

0,2
At

0,3

РИС. 7.20. Зависимость Липперта для стоксовых сдвигов PRODAN [ 14].
(С разрешения American Chemical Society.)
житепьному единичному заряду, разделенным расстоянием в 1 Д, соответствует ди-
польный момент, равный 4,8 D. Таким образом, изменение в 22 D сравнимо с переносом
единичного заряда на расстояние, равное 4,6 А.

Видно, что специфические взаимодействия оказывают меньшее влияние на PRODAN,
чем на 2-анилинонафтапин и 2-ацетилантрацен, когда спектральные сдвиги в случае спе-
цифических взаимодействий почти в 4 раза больше, чем для общих взаимодействий. На
молекулы PRODAN эти два типа взаимодействий оказывают примерно одинаковое вли-
яние.

Г лава 8

8-1. а) Температурная зависимость типична для любого чувствительного к раст-
ворителю фпуорофора в полярном растворителе. Наибольшая температурная зависимость
обнаруживается в промежуточной области, где тя«т. В этом диапазоне при понижении
температуры наблюдается коротковолновый сдвиг. При более низких температурах мак-
симум спектра испускания остается примерно на месте. При высоких температурах так-
же наблюдается коротковолновый сдвиг, вероятнее всего из-за нарушения взаимодейст-
вий фпуорофора с растворителем при увеличении тепловой энергии.

б)	Разность фаз между коротко- и длинноволновой частями спектра испускания об-
наружена лишь в ограниченном интервале температур, где тяа;т. При более высоких
и более низких температурах разность фаз становится меньше. В высоко- и низкотем-
пературных областях наблюдается меньший фазовый сдвиг, поскольку преобладает ис-
пускание из релаксированного и нерепаксированного состояний соответственно. Раз-
ность фаз при — — 5°С связана с релаксацией растворителя. По отношению к возбужда-
ющему свету фазовый угол в коротковолновой части спектра испускания уменьшается
при релаксации, а на длинноволновом краю спектра — увеличивается, поскольку соот-
ветствующие частицы могут образовываться в результате процесса в возбужденном
состоянии. Следовательно, разность фаз максимальна в этой области температур. Важ-
но также отметить, что △<₽ максимален, когда vm сильнее всего зависит от темпера-
туры. Это можно рассматривать как доказательство одинаковой природы обоих эффек-
тов.

в)	При выполнении условий, когда испускание на коротко- и длинноволновом краях
спектра обусловлено только релаксированной и нерелаксированной формами, Дф свя-
зан с временем жизни релаксированных частиц соотношением

igAcp = tg (<pR -	= wt0R	(8.10)

При 12,6 МГц Д<р = 28° соответствует времени затухания 6,7 нс.

8-2. Предположим, что затухание подчиняется одноэкслоненциальному закону. Тог-
да время затухания флуоресценции — это время, за которое интенсивность уменьшится
до 37% первоначальной величины: т^ = 1 нс при 390 нм и т = 5 нс при 435 нм. Время
жизни состояния F можно определить из соотношения 1/т^ = 1/т + 1/т$. Следователь-
но, т^ - 1,25 нс.

Г лава 9

9-1. На рис. 9.27 приведен график зависимости FQ/F от [/ “] • По изгибу графика
кверху можно предположить, что происходит и статическое, и динамическое тушение
для одной и той же популяции фпуорофоров. Динамическая (ХДин) и статическая (Кст)
константы тушения могут быть вычислены из графика зависимости кажущейся кон-
станты тушения Ккаж от концентрации тушителя [ I Кажущуюся константу туше-
ния находят по уравнению Ккаж = [(FQ/F) — 1 J/[I “]:
[ KI М 0	0,04	0,10	0,20	0,30	0,5	0,8

-	91	96	1Ю	121	135	170

РИС. 9.27. Графическое представление тушения акридона иодидом | 43|.

РИС. 9.28. Г рафик для расчета ста-
тической и динамической констант
тушения акридона [ 43].

Эти результаты нанесены на график (рис. 9.28). Отсекаемый отрезок на оси

У(Лпиы + 7<гт) = 89 М -1, а наклон КПИНКГТ = 101 М"2. Для вычисления /<’ u и
<ЦИп и	ДИп ui	ЦИН

Ксг нужно решить квадратное уравнение. Принимая, что большее значение соответ-
ствует КДин, получаем /<дин = 87,8 М"1 и /<ст = 1,15 М~~х. Бимолекулярная констан-
та тушения составляет Кдин/т0 = к = 4,99-Ю9-М-1’ с”1. Частота столкновений
может быть вычислена независимо из уравнения Смопуховского. Принимая радиус
столкновения равным 4 А, с учетом преобладания диффузии тушителя получаем
Л 0 = 4тт/?Ж/103 =

„ 4тт(4-10)“8 см (2,065-10~5см2/с)(6,02-1023 моль“1)

1О3см3-л 1

= 0,625-101 °М-1-с“1

(9.46)

Это значение соответствует константе тушения при. 100%-ной эффективности столкно-
вений в тушении. Следовательно, эффективность тушения X " kq/k0 ' °'8-

Радиус сферы действия можно вычислить, используя любое значение P’q/'F , Для
которого есть избыточное тушение. При 0,8 М [ предполагаемое отношение
связанное только с динамическим тушением, равно

= 1 + 87>8 (0,8) = 71, 24

(9.47)

Это показано штриховой линией на рис. 9.27. Наблюдаемое значение равно 137. Исполь-
зуя уравнение

(1 + Кдин [ Q]) <“хр([ CI /Vv/ЮОО )	(9.48)

получаем <*хр([ (l]/Vv/1000) = 1,92 или [(Л /Vn/ЮОО = 0,654. Из найденных результа-
тов можно вычислить, что объем сферы действия v = 1,37-Ю”21 см3 • Используя
v " 4/Зтгг3, где г — радиус, получаем г = 6,9 А. В соответствии с этими вычисле-
ниями вероятность тушения молекулы акридона равна единице независимо от того,
где находится 1“ внутри сферы с радиусом 6,9 А.

Статическая константа тушения довольно мала, как и радиус сферы действия. Вид-
но, что в этом случае комплекс в действительности не образуется. Скорее, статичес-
кая компонента является простым следствием вероятности того, что флуорофор в мо-
мент возбуждения приближен к тушителю.

9-2. Используя условие задачи 9-2, можно вычислить следующие величины:

[ АМР], мМ	т(/т
0,0	1.0
1,75	1,265
3,50	1,502
5,25	1,741
7,0	1,935

(^/Р)/(т0/т)

1,0	1,0

1,40	1,106

1,80	1,198

2,35	1,35

3,00	1,55

Константа тушения при столкновениях, или динамическая константа, может быть вы-
числена из графика зависимости т0/т от [ АМР], приведенного на рис. 9.29. Дина-
мическая константа тушения равна 136 М""1. Используя время затухания в отсутст-
вие тушителя, вычисляем /с ~ А'дин/тп = 4,1-109 М-1 с”1, которая типична для диф-
фузионно-контролируемой реакции, происходящей с высокой чувствительностью.

В предыдущей задаче мы находили /<ст и Л.'дин из графика зависимости кажу-
щейся константы тушения от концентрации тушителя (рис. 9.28). В данном случае из-
вестны значения и времени затухания, и квантовых выходов, поэтому можно исполь-
зовать более простой метод ~ вычисление отношения (FQ/F )/(т0/т). Из уравнений
(9.8) и (9.19) видно, что эта величина отражает только статическую компоненту ту-
шения:

---- = 1 + К„[ АМР]
т0/т

РИС. 9.29. Графическое представление тушения хлорида метипакридиния адено-
зин монофосфатом [ зо].

Наклон прямой на графике зависимости (/^/Р )/(т0/т) от [ АМР] дает константу ас-
социации (рис. 9.29).

По сравнению с кажущейся константой ассоциации для "комплекса" акридон—ио-
дид это значение (72,9 М~х) значительно больше, поэтому вполне вероятно реальное
существование комплекса в основном состоянии. Это было доказано эксперименталь-
но при изучении спектра поглощения МАС, который, как было найдено, изменяется
в присутствии АМР. Если комплекс МАС—АМР не флуоресцирует, то наблюдается
испускание только не связанного в комплекс МАС. Так как эти молекулы не образу-
ют комплекса, спектр возбуждения МАС в присутствии АМР будет таким же, как и для
одного МАС.

9-3. Чувствительность флуорофора к тушению пропорциональна времени затуха-
ния флуоресценции. Флуорофоры с ббпьшими временами затухания более чувстви-
тельны к тушению. Для того чтобы определить верхний предел времен затухания,
выше которых тушение кислородом становится заметным, вычисляют время затуха-
ния фпуорофора, флуоресценция которого будет потушена на 3% растворенным кис-
лородом воздуха. Это эквивалентно предположению, что FQ / F = т0/т = 1,03. Так
как в атмосфере только 20% 02 , то концентрация кислорода из атмосферы состав-
ляет 1/5 его общей растворимости. Для водных растворов

Fo/F = то/т= 1-03 = 1 + кч т0[ 02]	(9.50)

Используя информацию, приведенную для водного раствора, находим
_ 0,03	_	0,03(5)

О I Гп 1	Го	~ 11нс

(1'1010) (0,001275)

Дпя этанольного раствора

0,03(5)

0 =------17--------------- =1,2 нс

(2 «Ю10) (0,001275) (5)

(9.51)

(9.52)

Если незатушенное время жизни больше 1,2 нс в этаноле или 11,7 нс в воде, то
растворенный кислород из воздуха может приводить к значительному тушению(>3%)
Это тушение может быть в случае необходимости минимизировано продуванием инерт-
ного газа (азота или аргона).

9-4. Скорость дезактивации при столкновениях может быть вычислена из умень-
шения времени затухания, вызванного столкновениями с адениновым кольцом,. Вре-
мя затухания в отсутствие (т0) и в присутствии (т) адениновой части равно т0 = I 1
и т = (Г + А)”1. Следовательно,

к =_!-----— = 2,0'Ю8 с"1

т	То

(9.53)

Квантовый выход FAD уменьшается за счет как динамического, так и статического
тушения:

F =	-г т	/9=41

Fo Q(FMN) т0

где f — доля флуорофора, не связанного в комплекс Следовательно,

/ =	O'(FAD)'. ±^.0,17	(9.55;

т Q(FMN) 2,4-1,0

Итак, 83% FAD присутствует в виде нефлуоресцирующего комплекса.

9-5. Используя данные, приведенные в условии задачи, можно вычислить следу-
ющие величины, необходимые для построения графика Штерна — Фольмера:

[ 1~], м	f0/f	△F	F0/AF '	//[I"]
0,0	1,000	0	—	MW
0,01	1,080	0,074	13,51	ТОО
0,03	1,208	0,172	5,814	33,3
0,05	1,304	0,233	4,292	20,0
0,10	1,466	0,318	3,145	10,0
0,20	1,637	0,389	2,571	5,0
0,40	1,776	0,437	2,288	2,5
Изгиб книзу графика Штерна — Фольмера (рис. 9.30) указывает на существова-
ние недоступной для тушения части молекул. Из отсекаемого отрезка на модифи-
цированном графике Штерна — Фольмера вычисляем = 0,5. Следовательно, один
триптофановый остаток на субъединицу доступен для тушения иодидом. Наклон в мо-
дифицированном графике Штерна — Фобьмера равен (/j К )-1. Таким образом,
К = 17.4 М”1. По предположению, константа тушения недоступной фракции равна ну-
лю. Используя эти результаты, можно построить предполагаемые графики тушения
для каждого триптофанового остатка:

[I-]	. м	[ I -] -1, М”1		Ио/Л?		(F^/kFfi
0,0		0	1,0	1,0	ОО	-
0,01		100	1,0	1,174	СК)	6,747
0,03		33,3	1.0	1,522	ОО	2,916
0,05		20,0	1,0	1,870	00	2,149
0,10		10,0	1,0	2,740	00	1,575
0,20		5,0	1,0	4,480	ОО	1,287
0,40		2,5	1,0	7,96	ОО	1,144

Примечание: авычислено из FQ/F - 1 + 17,4 [ I ];
$ вычислено из FQ/kF ~ 1/(К[ (?]) + 1.

РИС. 9.30. Обычный (а) и модифицированный (б) графики Штерна — Фольмзра
для тушения иодид-ионами.

Для доступной фракции график Штерна — Фольмера линеен и кажущееся значение
/1=1 (рис. 9.31). Следовательно, если данные по тушению были получены при воз-
буждении на 300 нм, где возбуждаются только доступные остатки, то, по-видимому,
вся флуоресценция должна быть подвержена тушению. Так как недоступная фрак-
ция не тушится, для нее FQ/F = 1. Для этой фракции невозможно построить моди-
фицированный график Штерна — Фольмзра, так как kF ~ 0.
РИС. 9.31. Предполагаемые графики Штерна - Фольмера для доступных и недос-
тупных для тушения триптофановых остатков.

9-6. Используя исходные данные и метод Отмера и Такара (рис. 9.25), получа-
ем коэффициенты диффузии D {см2/с) при 37°С:

N-Этилкарбазол Линдан

В этаноле	0,76-10“5	0,84-Ю-5

В циклогексано	0,87-Ю-5	0,98-Ю-5

Зная данные по временам затухания, можно найти бимолекулярные константы ту-
шения. Вычисленные из данных по молекулярным объемам и плотностям молеку-
лярные радиусы равны 3,9 А для линдана и 4,2 А для N-этипкарбазола. Коэффици-
енты диффузии и молекулярные радиусы могут быть использованы в уравнении
Смопуховского для вычисления бимолекулярных констант тушения, ожидаемых для
100%-ной эффективности тушения. Деление наблюдаемой константы л на вычислен-
ное значение дает эффективность тушения у:	4

к М“- с-1 кп, с”1 У

В этаноле	1,3-Ю9	1,0-Ю10	0,13
В циклогексане	2,0-109	1,1-Ю10	0,18

Г лава 10

10-1. Обозначим время затухания флуоресценции соединения I rrfa , а время
затухания соединения II — т^. Соединение II служит для контроля влияния раство-
рителя на время затухания индола в отсутствие переноса энергии. Константа ско-
рости переноса энергии к у = т”^ — т^1 . Из уравнения (10.3) следует ожидать, что

/с у. = С

где С— константа. Следовательно, график зависимости к? от должен быть ли-
неен. Простейший график зависимости Л у от / приведен на рис. 10.26. Наклон ра-
вен 1,10. Если ввести поправку на влияние растворителя в кинетику затухания индо-
ла, то вычисленный наклон равен 0,96. Для того чтобы ввести эту поправку, нужно
рассчитать , используя квантовые выходы каждого производного индола. Эти
данные не приведены. Полученные результаты подтверждают предполагаемую зави-
симость к у от интеграла перекрывания,,

Интеврал спектрального перекрывания,
смв/ммоль

РИС. 10.26. Зависимость константы скорости переноса энергии от величины
интеграла перекрывания J.

(С разрешения авторов работы [ 1з].)

10-2. а) Эффективность переноса энергии может быть получена из равенства
(10.11):

Е = 1 - 4,1/20,5 = 0,80	(10.33)

б) Предполагаемое время затухания в присутствии DNP вычисляют ло уравнению
(10.10) при Td = 5,0 и Е = 0,80:

rda = Td(1“£)= 1 НС	(10.34)

bj константу скорости переноса энергии кт можно найти по уравнению (10.9)
при Е = 0,80 и = 5 нс:

Г Е

кт=------- = 8-108с“1	(Ю.’Зб)

1	- Е

г)	Расстояние может быть вычислено по уравнению (10.1£). Подстановка и пре-
образование дают г6 = 0,25 Rq и, следовательно, г = 39,7 А.
о

д)	Предполагаемую интенсивность флуоресценции для г = 20 А можно найти из
уравнения (10.11), поскольку эффективность переноса0энергии известна. Эффектив-
ность, вычисленная по уравнению (10.12) при г = 20 А, равна 0,9959, и из уравне-
ния (10.11) интенсивность флуоресценции следует ожидать равной 0,0832.

е)	1% примеси давал бы вклад 1% от 20,4 или 0,204 общей интенсивности. Вклад
от этого меньшего компонента должен был бы быть в два раза интенсивнее, чем сиг-
нал от связывающего DNP белка, и это делало бы недействительной любую интерпре-
тацию интенсивности в присутствии DNP.

ж)	Время затухания образца должно было бы определяться примесью и, следо-
вательно, составлять'''5 нс. Такой результат свидетельствует о наличии примеси.
Более того, выход понижается до 0,0041 первоначального значения, а время затуха-
ния относительно неизменно. Когда получаются такие результаты, следует иметь в
виду присутствие второго компонента.

Г лава 11

11-1. а) рК0 фенола уменьшается до 2 в возбужденном состоянии. Следова-
тельно, длинноволновое испускание на краю спектра испускания фенола, вероятно,
принадлежит феноляту. В присутствии акцепторов протонов (непротонированный трис)
фенольный протон переносится на акцептор, что приводит к уменьшению интенсив-
ности флуоресценции фенола.

б)	Кажется вероятным, что испускание при 300 нм связано только с фенолом, Зна-
чения интенсивности при этой длине волны могут быть использованы для вычисления
бимолекулярной константы тушения:

/^/F=1 + /c„t0 [акцептор протона]	(11-7)

।	I

Так как pH = рК0 , то концентрация непротонированного триса равна 0,05 М. Исполь-
зуя т0 = 5 нс, получаем = 2-109 М"1- с-1.

Глава 12

12-1, а) Разумно предположить, что акридин и акридиний будут иметь различные
спектры поглощения. Ив спектра испускания в 0,2 М NH4NO3 (рис. 12.23) видно, что
испускают как акридин, так и.акридиний. Следовательно, если бы в основном состо-
янии присутствовали обе частицы, спектр поглощения должен бы был представлять со-
бой суперпозицию спектров акридина и акридиния. Наоборот, если бы акридиний обра-
зовывался только в возбужденном состоянии, спектр поглощения в 0,2 М NH^NOj был
бы почти идентичен спектру нейтрального акридина.

б)	Из рассмотрения экспериментальных данных видно, что есть два времени за-
тухания, не зависящих от длины волны испускания (рис. 12.24). Это говорит о наличии
двух видов испускающих частиц, скорости дезактивации которых не зависят от длины
волны испускания. На коротковолновом краю спектра затухание одноэкспоненциально.
Это указывает на то, что реакция необратима и что измеренные дпя других длин волн
времена затухания соответствуют акридину и акридинию.

Доказать существование реакции в возбужденном состоянии можно, наблюдая от-
рицательный предэкспоненциапьный множитель. При увеличении длины волны наблюде-
ния этот член становится больше. Обнаруживается, что при самых больших длинах волн
предэкспоненциальные множители становятся почти равными по величине, но противо-
положными по знаку. Такое примерное их равенство свидетельствует о том, что при
560 нм преобладает испускание частиц, образовавшихся в результате реакции [ урав-
нения (12.13) и (12.17)]. Из того факта, что а2 несколько больше ар следует, что
все еще есть некоторый вклад испускания нейтрального акридина при длине волны
560 нм.
РИС. 12.23. Спектр стационарной люминесценции акридина в 0,2 М Nil .NO.. при
рИ 8,3.

Штриховая линия - разделение спектров, полученное с помощью методики обрат-
ной свертки при разных длинах волн. (С разрешения авторов работы [201 и North Hol-
land Publishing Со.)

в)	Поскольку реакция необратима, измеряемые значения времени затухания пред-
ставляют собой истинные времена затухания акридина и акридиния. По некоторым при-
чинам время затухания 4 нс можно приписать акридину, а 30 нс — акридинию. Во-пер-
вых, в областях 400 — 420 нм присутствует только компонента со временем затуха-
ния 4 нс, а в этой области испускает только акридин. Во-вторых, при анализе мето-
дом обратной свертки при разных длинах волн остается компонента 30 нс, которая со-
ответствует времени затухания флуоресценции частиц, образовавшихся в результате
реакции (рис. 12.24). И наконец, из рис. 12.14 очевидно, что времена затухания для ак-
ридина и акридиния равны примерно Юи 32 нс соответственно. При реакции протониро-
вания время затухания для акридина укорачивается.

г)	Спектры отдельных частиц можно рассчитать, используя либо импульсные функ-
ции отклика, полученные обратной сверткой с функцией вспышки лампы, либо те же
функции, полученные обратной сверткой с сигналом фпуоресценции состояния F. Сна-
чала следует рассмотреть данные, полученные с использованием вспышки пампы. Ког-
да реакция в возбужденном состоянии необратима, /с2 = 0, и из уравнения (12.14) на-
ходим

У1 = YR> У2 = YF

(12.69)

Поскольку скорости дезактивации состояний F и R входят в выражения дпя импульсных
функций отклика, эти функции можно измерить непосредственно. Уравнения (12.26) и
(12.27)	упрощаются до следующих выражений:

^1(Л) + Я2(Л)

//?(*) = Y1 . •	. “

А1У1 +Л2У1

fRW =

V 2 " Y1

и1(А) = ----------------

^1 (Х)у2 + А 2 (Х)у2

(12.70)

(12.71)

Акридин 6 0,2 М NH4NO3,
pHS,3

30
%
$20
§

I»

& о

О

Относительно Л пышки
лампы



Я—.....й у-Ж-уЖ.

Относительно
испускания при 400нм

б

J_______—L______I________I____

400	450	500	550	400	450	500	550

Длина волны, нм

РИС. 12.24. Зависимость времен затухания флуоресценции акридина от длины
волны.

Данные взяты из табл. 12.3. Времена затухания получены сверткой с функцией
вспышки лампы (а) и с функцией испускания при 400 нм (б). (С разрешения авторов
работы I 20] И North Holland Publishing Со.)	’

где волновое число заменено на длину волны Л. Подставляя в эти уравнения измерен-
ные параметры и умножая на распределение интенсивности в спектре стационарного
состояния I уравнения (12.28) и (12.29)1, получаем спектральные распределения, пока-
занные на рис. 12.23. Уравнения (12.26) и (12.27) можно использовать для разложения
на индивидуальные спектры только для тех длин волн, где затухание двухэкопоненциапьно» Од-
нако при некоторых длинах волн в области перекрывания спектров затухание 1(Л, t)
является практически одноэкспоненциальным 02«О) и экспериментально найденные
значения т2 лишены смысла. Эго выполняется для акридина вблизи 490 нм, о.
чем можно судить по большим экспериментальным погрешностям в данных, получен-
ных для этой длины волны. Индивидуальные спектры испускания можно также полу-
чить методом обратной свертки при различных длинах волн. В этом случае использу-
ют более простые выражения, а именно уравнения (12.30) и (12.31). Рассчитанные спект-
ры приведены на рис. 12.23. Отметим, что ненадежность данных вблизи 490 нм исчеза-
ет при использовании этого метода.

12-2. а) Одной из безусловных характеристик процесса в возбужденном состоянии
является выполнение соотношений тР > tw или т/сожр>1 на длинноволновом краю
спектра (">390 нм). Найдено, что это условие выполняется при рП 6,6. Из данных
табл. 12.4 и 12.5 видно, что реакция необратима при-высоких pH и обратима при низ-
ких значениях pH. Для необратимой реакции состояния F ожидается, что тр = тт .
Флуоресценцию первоначально возбужденного нафтола можно отдельно наблюдать при
350 нм. При этой длине волны тр»тт для pH > 5 и тР < тт для pH 1 — 3. Напом-
ним, что на основании модельных расчетов (рис. 12.10) мы получили для обратимой
реакции тР < тт, поскольку в этом случае затухание флуоресценции из состояния F
будет двухэкспоненциапьным.

Отметим, что интерпретировать такие данные надо очень осторожно; они могут
быть более или менее надежными в зависимости от произведения сот для данного об-
разца. Например, при частоте модуляции 30 МГц коэффициент демодуляции для вре-
мени затухания нафтола 4 нс равен 0,798 [ уравнение (12.38)]. В этом случае, чтобы
зарегистрировать соотношение тр < тт , модуляционные времена затухания должны
быть измерены с точностью ± 0,5 нс. Для этого в свою очередь необходимо, чтобы
точность коэффициента модуляции составляла ±0,03. Если бы время затухания наф-
тола было короче или если бы частота модуляции была меньше, требуемая точность
была бы еще выше.

б)	При коротких длинах волн (табл. 12,4) кажущиеся времена затухания пример-
но постоянны, тогда как при больших длинах волн они увеличиваются с ростом длины
волны. На коротковолновом краю спектра испускания наблюдаются постоянные значе-
ния, поскольку при этих длинах волн испускает только нейтральный нафтол. Напротив,
при всех используемых больших длинах волн наблюдается испускание как нафтола, так
и нафтолята. Если бы наблюдалось только испускание нафтолята, тогда длинноволно-
вые фазовые углы были бы постоянны и характеризовали бы этот вид испускающих
частиц.

в)	Легче всего предсказать, чему буду равны	и ш^/созф^, по уравне-

ниям (12.45), (12.47) и (12.49) соответственно. Величина тр известна из измерений
на коротковолновом краю спектра испускания (2.4 нс). Используя эту величину и
той = 8,9 нс' можно рассчитать следующие величины:

Рассчитано для состояния R (30 МГц)	7$,НС  46,8	7д,НС 10,06	т/cos <р  4,15
Наблюдалось при X = 420 нм (30 МГц)	41,8	10,2	3,66
Рассчитано для состояния R (6 МГц)	11,65	9,25	1,03

Рассчитанные значения (30 МГц) несколько больше измеренных, поскольку на
последние может оказывать влияние перекрывание спектров. Наиболее важным момен-
том при сравнении данных для 30 и 6 МГц является то, что одни и те же соотношения
(тр > т"1 и m/cos<p> 1) сильно зависят от частоты модуляции. Уменьшение частоты
модуляции от 30 до 6 МГц приводит к уменьшению т^/созф^ от 4,15 до 1,03, Кроме
того, при 6 МГц и близки. Следовательно, даже если и протекает реакция в
возбужденном состоянии, невозможно доказать этот факт до тех пор, пока в распоря-
жении не будет аппаратуры с подходящей частотой модуляции.
Литература

Г лава 1

1.	Martin B.R., Richardson F , Lanthanides as probes for calcium in biological
systems, Quart. Rev. Biophys., 12, 181 (1979).

2.	Bertman 1.В., Handbook, of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules. 2nd
ed., Academic Press, New York, 1971.

3.	Jablonski A.t Uber den Mecbanismus des Photolumineszenz von Farbstoffphos-
pboren, Z. Phys., 94, 38 (1935).

4.	Stokes G<iG., On the change of refrangibility of light, Phil. Trans. R.Soc. Lon-
don, 142, 463 (1852).

5.	Birks J.B., Photophysics of Aromatic Molecules. John Wiley and Sons, New
York, 1970.

6.	Soutar A.K., Pownall H.J., Hu A.S., Smith L.C., Phase transitions in bilamel-
lar vesicles. Measurement by pyrene excimer formation and effect on transacy-
lation by lecithin^ cholesterol acyltransferase, Biochemistry, 13, 2828 (1974).

7.	Chen R.F., Fluorescent protein-dye conjugation II. Gamma globulin conjugated
with various dyes, Arch. Biochem. Biophys., 133, 265X1969).

8.	Weber G., Polarization of the fluorescence of macromolecules 2. Fluorescent
conjugated of ovalbumin and bovine scrum albumin, Biochem. J., 51, 155 (1952).

9.	Lakowicz J.R., Bevan D.R., Cherek II., 1982, неопубликованные Данные.

10.	Sims P.J., Waggoner A.S., Wang C.H., Hoffman J.F., Studies on the mechanism
by which cyanine dyes measure membrane potential in red blood cells and phos-
phatidylcholine, vesicles, Biochemistry, 13, 3315 (1974).

11.	Leow L.M., Scully S., Simpson L., Waggoner A.S., Evidence for a charge-shift
electrochromic mechanism in a probe of membrane potential, Nature, 281, 497
(1979).

12.	Secrist J.A., Barrio J.R., Leonard N.J., A fluorescent modification of adeno-
sine triphosphate with activity in enzyme synthesis! 1, N6-ethenoadenosine tri-
phosphate, Science, 175, 646 (1972).

13.	Scopes D.I.C., Barrio J.R., Leonard N.J., Defined dimensional changes in
enzyme cofactors! fluorescent ”stretched-out” analogues of adenine nucleo-
tides, Science, 195, 296 (1977).

14.	Prendergast F.G., Haugland R.P., Callahan P.J., l*[4-(trimethylamino)phenyl]“
6-phenylhexa-l,3,5-triene'! synthesis, fluorescence properties, and use as a
fluorescence probe of lipid bilayers, Biochemistry, 20, 7333 (1981).

Г лава 2

1.	Meljiuish W.H., Calibration of spectrofluorometers for measuring corrected
emission spectra, J. Opt. Soc. Amer., 52, 1256 (1962).

2.	Lippert E., Nagelle W., Seibold- Blakenstein L, Staiger (J., Voss W., Messung
von Fluoreszenzspektrenmil Rilfe von Spektralphotometern und Vergleichs-
standards, Z. Analyt. Chern., 17, 1 (1959).

3.	Schmillen A., Legler R., Lando lt-Bf>rnste in, Volume 3; Lumineszenz organi-
scher Substanzen. Springer-Ver lag, New York, 1967, pp. 228—229.
4.	Argauer R.J., White C.E., Fluorescent compounds for calibration of excitation
and emission units of spectrofluorometer, Anal. Chern., 36 , 368 (1964).

5.	Melhuish W.H,, A standard fluorescence spectrum for calibrating spectrofluo-
rometers, J. Phys. Chern., 64, 762 (i960).

6.	Eisinger ]•, Flores ]•, Front-face fluorometry of liquid samples, Anal. Biochem.,
94, 15 (1979).

7.	Lakowicz J.R>, Bevan D.R., Effects of asbestos, iron oxide, silica, and car-
bon black oh the microsomal availability of benzofa]pyrene, Biochemistry, 18,
5170 (1979).

8.	Berlman LB., Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd
ed., Academic Press, New York, 1971.

9.	Laczko G., Lakowicz J.R., неопубликованные данные.

Г лава 3

I.	Ware W.R., Transient luminescence measurements, ini Creation and detection
of the excited state (ed. A.A. Lamola), Vol. 1Л, Marcel Dekker, New York,
1971, pp. 213-302.

2.	Badea M.G., Brand L., Time'-resolved fluorescence measurements, Methods
Enzymol., 61, 378 (1979).

3.	Bennett R.G., Instrument to measure lifetimes in the micromillisecond region,
Rev. Sci. Instrum., 31, 1275 (I960).

4.	Ware W.R., Lee S.K., Brant'G.J., Chow P.O., Nanosecond time-resolved emis-
sion spectroscopytSpectral shifts due to solvent-excited solute relaxation,
J. Phys. Chern., 54, 4729 (1970).

•5. Мазуренко Ю.Т., Удальцов B.C. Спектральные релаксации флуоресценции.
Кинетика реакций переноса протона. - Оптика и спектроок., 1980, т. 49,
№ 2, с. 304.

6.	Easter J.М., DeToma R.P., Brand L., Nanosecond time-resolved emission
spectroscopy of a fluorescence probe adsorbed to c-a-egg lecithin vesicles,
Biophys. J., 16, 571 (1976).

7.	O’Connor D.P.O., Ware W.R., Andre J.C., Deconvolution of fluorescence de-
cay curves. A critical comparison of techtiques, J. Phys. Chern., 83, 1333
(1979).

8.	Grinvald A., Steinberg I.Z., On the analysis of fluorescence decay kinetics by
the method of least-squares, Anal. Biochem., 59, 583 (1974).

9.	Gafni A., Modlin R.L., Brand L., Analysis of fluorescence decay curves by
means of the Laplace transformation, Biophys. J., 15, 263 (1975).

10.	Gaviola Z., Ein Fluorometer. Apparat zur Messung von Fluoreszenzabklingungs-
zeiten, Z. Phys., 42, 853 (1926).

11.	Birks J.B., Dyson D.J., Phase and modulation fluorometer, J. Sci., Instrum.,
38, 282 (1961).

12.	Pon Resewitz E.P., Lippert E., Ein neuartiges Phasenfluorometer, Her. Bun-
senges., 78, 1227 (1974).
13.	Bailey Е.А., Rollefson G.K., The determination of the fluorescence lifetimes
of dissolved substances by a phase shift method, J. Chern. Phys., 21, 1315
(1953).

14.	Muller A., Lumry R., Kokubun H., High-performance phase fluorometer con-
structed from commercial subunits, Rev. Sci. Instrum., 36, 1214 (1965).

15.	Бонч-Бруевич A.M., Казарин И.М., Молчанов В.А., Широков И.В, Экспери-
ментальный образец фазового флуорометра. - Приборы и техника экспе-
римента, 1959, № 2, с. 53.

16.	Bauer R.K., Rozwadawski М., Л new type of fluorometer. Measurements of
decay periods of fluorescence of acridine yellow solutions as a function of
concentration, Bull. Acad. Pol. Sci., Ser. Sci. Math. Astr. Phys., 8, 365 (1959).

17.	Spencer R.D., Weber G., Measurement of subnanosecond fluorescence lifetimes
with a cross-correlation phase fluorometer, Ann. N.Y. Acad. Sci, 158, 361
(1969).

18.	Debye P., Sears F.W., On the scattering of light by supersonic waves, Proc.
Natl. Acad. Sci., 18, 409 (1932).

19.	ITeber G., Resolution of the fluorescence lifetimes in a heterogeneous sys-
tem by phase and modulation measurements, J. Phys. Chern., 85, 949 (1981).

20.	Jameson D.M., Weber G., .Resolution of the рП-dependent heterogeneous
fluorescence decay of tryptophan by phase and modulation measurements,
J. Phys. Chern., 85, 953 (1981).

21.	Hauser M., Ileidt G., Phase fluorometer with a continuously variable frequency,
Rev. Sci. Instrum., 46, 470 (1975).

22.	Lytle IGE., Eng J.F., Harris J.M., Harris T.M., Santini R.E., Spectroscopic
excitation source with variable frequencies and shapes of modulation, Anal.
Chern., 47, 571 (1975).

23.	Matayoshi E.D., Distribution of shape-changing compounds across the red cell
membrane, Biochemistry, 19, 3414 (1980).

24.	IFeber G., Theory of differential phase fluorometry! Detection of anisotropic
molecular motion, J. Chern. Phys., 66, 4081 (1977).

25.	Solodovnikov Р.И., Introduction to the Statistical Dynamics of Automatic Con-
trol Systems. Dover Publications, New York, 1960.

26.	Bauer R.K., Balter A., A method of avoiding wavelength-dependent errors in
decay-time measurements, Opt. Commun., 28, 91 (1979).

27.	Lakowicz J.R., Cherek H., Balter A,, Correction of timing errors in photomul-
tiplier tubes used in phase-modulation fluorometry, J. Biochem. Biophys. Me-
thods, 5, 131 (1981).

28.	Visser A.J.W.G., Van Hoek A.г The fluorescence decay of reduced nicotin-
amides in aqueous solution after excitation with a UV-mode-locked Ar-ion laser,
Photochem. Photobiol., 33, 35 (1981).

2	9. Rayner D.M., McKinnon A.E., Szabo A.G., Hackett P.A., Confidence in fluo-
rescence lifetime determinations! A ratio correction for the photomultiplier
time response variation with wavelength, Can. J. Chern., 54, 3246 (1974).

30.	Rayner D.M., McKinnon A.E., Szabo A.G., Correction of instrumental time res-
ponse variation with wavelength in fluorescence lifetime determinations in the
ultraviolet region, Rev. Sci. Instrum., 48, 1050 (1977).

31.	Brand L,, частное сообщение.

32.	Ross J,A,B,t Rousslang K.W., Brand L,, Time-resolved fluorescence and ani-
sotropy decay of the tryptophan in adrenocorticotropin (1 — 2 4), Biochemistry,
20, 4361 (1981).

33.	Grinvald A., Steinberg LZ., The fluorescence decay of tryptophan residues in
native and denatured proteins, Biochim. Biophys. Acta, 427, 663 (1976).

34.	Chen R.F., Fluorescence lifetime reference standards for the range 0,189 — 115
nanoseconds, Anal. Biochem., 57, 593 (1974).

35.	Chen L,A,, Ph. D. thesis, The Johns Hopkins University, Baltimore, 1978.

36.	Herron Voss E.W. Characterization of fluorescent 2-dimethylaminonaptha-
lene-5-sulfonyl-immunoglobulin G conjugated for application in fluorescence po-
larization studies, Biochem. Biophys. Methods, 5, 1 (1981).

37.	Weber G., Teale F,W.]., Determination of the absolute quantum yield from flu-
orescent solutions, Trans. Faraday Soc., 53, 644 (1956 — 57).

38.	Y guerabide J., Nanosecond fluorescence spectroscopy of macromolecules, Me-
thods Enzymol., 26, 498 (1972).

39.	Handly L., Cobum T., Garwin E>, Stryer L., Nanosecond fluorometer, Rev. Sci.
Instrum., 38, 488 (1967).

40.	Docchio F., Longoni A,, Zeraga A,, Subnanosecond fluorescence waveform
measurements with a dual time-scale microprocessor-controlled averager, Rev.
Sci. Instrum., 52, 1671 (1981).

41.	Munro /., Pecht I., Stryer L., Subnanosecond motions of tryptophan residues
in proteins, Proc. Natl. Acad. Sci., 76, 56 (1979).

42.	Lakowicz J.R., Bevan D.R., неопубликованные данные.

43.	Spencer R.F., Ph. D. thesis, University of Illinois at Urbana-Champaign, 1970.

44.	Knutson J>R>, Walbridge D.G., Brand L», Decay-associated fluorescence spect-
ra and the heterogeneous emission of alcohol dehydrogenase, Biochemistry,
21» 4671 (1982).

45.	Gratton E., Limkeman M>, A continuously variable frequency cross-correlation
phase fluorometer with picosecond resolution, Biophys. J. (1983).

46.	Barrow D.A., Lentz B.R., частное сообщение; см. также Landolt - Born-
stein, -Mol. Acoustics, p. 191.

Г лава 4

1.	Lakowicz J,R>, Cherek H., Phase-sensitive fluorescence spectroscopy. A new
method to resolve fluorescence lifetimes or emission spectra of components in
a mixture of fluorophores,. J. Biochem. Biophys. Methods, 5, 19 (1981).

2.	Lakowicz J„R., Cherek H>, Resolution of heterogeneous fluorescence from pro-
teins and aromatic amino acids by phase-sensitive detection of fluorescence,
J. Biol. Chern., 256, 6348 (1981).

3.	Knutson J*R; Walbridge D.G., Brand L., Decay-associated fluorescence spect-
ra and the heterogeneous emission of alcohol dehydrogenase, Biochemistry,
21,4671 (1982).
4.	Haar Н.Р,, Hauser М. Rev. Sci- Instrum., 49, 632 (1978).

5.	Badea M»G,, Brand L., Time-resolved fluorescence measurements, Methods
Enzymol., 61, 378 (1979).

6.	Meech S.R,, O'Connor D.V*, Roberts A.J,f Phillips D,, On the construction of
nanosecond time-resolved emission spectra, Photochem. Photobiol., 38, 159
(1981).

7.	Lakowicz J.R., Cherek H., Dipolar relaxation in proteins on the nanosecond
timescale observed by wavelength-resolved phase fluorometry of tryptophryi flu-
orescence, J. Biol. Chern., 255, 831 (1'980).

8.	Ross J.B.A., Schmidt C.J., Brand L., Time-resolved fluorescence of the two
tryptophans in horse liver alcohole dehydrogenase, Biochemistry, 20,4369
(1981).

9.	Grinvald Atf Steinberg J.Zt, The fluorescence decay of tryptophan residues in
native and denatured proteins, Biochim. Biophys. Acta, 427 , 663 (1976).

10.	Rayner D,M., Szabo A.f Time-resolved fluorescence of aqueous tryptophan, Can.
J. Chern., 56, 743 (1978).

11.	Lakowicz J.R,, Keatings S», Binding of an indole derivative to micelles as
quantified by phase sensitive detection of fluorescence, J. Biol. Chern. (1983).

Г пава 5

1.	Jablonski Л., On the notion of emission anisotropy, Bull. Acad. Pol. Sci., 8,
259 (1960).

2.	Weber G., Polarization of the fluorescence of macromolecules I. Theory and
experimental method, Biochem. J., 51, 145 (1952).

3.	Weber G*, Polarization of the fluorescence of solutions, in: Fluorescence and
Phosphorescence Analysis (ed., D.M. Hercules). John Wiley & Sons, N.Y., 1966
p. 217.

4.	Shinitzky №•, Dianoux A.C,f Gitler C., Weber G.f Microviscosity and order in
the hydrocarbon region of micelles and membranes determined with fluorescen-
ce probes I. Synthetic micelles, Biochemistry, 10, 2106 (1971).

5.	Valeur B., Weber G,, Resolution of the fluorescence excitation spectrum of in-
dole into the lLa and lL^ excitation bands, Photochem. Photobiol., 25, 441
(1977).

6.	Teale F.W.J., Fluorescence depolarization by light scattering in turbid solu-
tions, Photochem. Photobiol., 10, 363 (1969).

7.	Lentz B.R,, Light scattering effects in the measurement of membrane micro-
viscosity with diphenylhexatriene,, Biophys. J., 25, 489 (1979).

8.	Weber G*, Rotational Brownian motion and polarization of the fluorescence of
solutions, Adv. Protein Chern., 8, 415 (1953).

9.	JFefeer G., Fluorescence-polarization spectrum and electronic-energy transfer
in tyrosine, tryptophan and related compounds, Biochem. J., 75, 335 (I960).

10.	Weber G., Use of fluorescence in biophysics: Some recent developments, Ann.
Rev. Biophys. Bioeng., 1, 553 (1972).

11.	Weber G., Theory of fluorescence depolarization by anisotropic Brownian ro-
tations. Discontinious distribution approach, J. Chern. Phys., 55, 2399 (1971).
12.	Cogen U., Shinitzky М., Weber G., Nishida To, Microviseosily and order in
the hydrocarbon region of phospholipid and phospholipid -cholesterol disper-
sions determined with fluorescent probes, Biochemistry, 12, 521 (1973).

13.	Shinitzky M., Barenholz У., Dynamics of the hydrocarbon layer in liposomes
of lecithin and sphingomyelin containing diacetylphosphate, J. Biol. Chern.,
249, 2652 (1974).

14.	Ware F>, Lussan Go, Variations in microviseosily values induced by different
rotational behavior of fluorescent probes in some aliphatic solvents, Bioehim.
Biophys. Acta, 467, 262 (1977).

15.	Lentz В., Barenholz У., Thompson T.E., Fluorescence depolarization studies
of phase transitions and fluidity in phospholipid bilayers I. Single component
phosphatidylcholine liposomes, Biochemistry, 15, 4521 (1976).

16.	Weber Go, Polarization of the fluorescence of macromolecules П. Fluorescence
conjugates of ovalbumin and bovine serum albumin, Biochem. J., 51, 155 (1952).

17.	Уguerabide. J., Epstein Ho, Strver L., Segmental flexibility of an antibody mo-
lecule, J. Mol. Biol., 51, 573 (1970).

18.	Weltman JoKo, Edelman GoMo, Fluorescence polarization of human yG-immuno-
globulin, Biochemistry, 6, 1437 (1967).

19.	Lakowicz JoR., Weber Go, Nanosecond segmental mobilities of tryptophan re-
sidues in proteins observed by lifetime-resolved fluorescence anisotropies,
Biophys. J., 32, 591 (1980).

20.	Lakowicz J.R., Maliwal Bo, Cherek H., Balter A., Rotational freedom of tryp-
tophan residues in proteins and peptides quantified by lifetime -resolved ani-
sotropies, Biochemistry, 22, 1741 (1983).

21.	Levison S.A., Fluorescence polarization kinetic studies of macromolecular
reactions, in'! Biochemical Fluorescence Concepts (eds. R.F. Chen, lI.Edel-
hoch). Vol. 1, Marcel Dekker, N.Y., 1975, p- 375.

22.	Rawitch A.Bo, Weber Go, The reversible association of lysozyme and thyro-
globulin, J. Biol. Chern., 10, 680 (1972).

23.	Visser A, J,W,Go, Lee J,, Lumazine protein from the bioluminescent bacterium
Photobacterium phosphoreumo A fluorescence study of the protein — ligand
equilibrium, Biochemistry, 19, 4366 (1980).

24.	Ellerton NoR., Isenberg L, Fluorescence polarization study of DNA — pro-
flavin complexes, Biopolymers, 8, 767 (1969).

Глава 6

1.	Belford GoG., Belford R.Lo, Weber Go, Dynamics of fluorescence polariza-
tion on macromolecules, Proc. Natl. Acad. Sci., 69, 1392 (1972).

2.	Chuang Tojo, Eisenthal Ko Bo, Theory of fluorescence depolarization by ani-
sotropic rotational diffusion, J. Chern. Phys., 57, 5094 (1972).

3.	Ehrenberg Mo, Rigler Ro, Polarized fluorescence and rotational Brownian ro-
tation, Chem. Phys. Lett., 14, 539 (1972).

4.	Tao To, Time-dependent fluorescence depolarization and Brownian rotational
diffusion of macromolecules, Biopolymers, 8, 609 (1969).
5.	Lombardi J.R., Daffom G.A., Anisotropic rotational relaxation in rigid media
by polarized photoselection, J. Chern. Phys., 44, 3882 (1966).

6.	Weber С», Theory of fluorescence depolarization by anisotropic Brownian ro-
tations. Discontinuous distribution approach, J. Chem. Phys., 5Б, 2399
(1971).

7.	Kinosita K., Kawato S., Ikegami A., A theory of fluorescence polarization
decay in membranes, Biophys. J., 20, 289 (1977).

8.	Wallach D,, Effects of internal rotation on angular correlation functions, J.

, Chem. Phys., 47, 5258 (1967).

9.	Gottlieb У.У., Wahl P>, Etude theorique de la polarization de fluorescence
des macromolecules portant un groupe emetteur mobile autourd’un axe de ro-
tation, J. Chim. Phys., 60, 849 (1963).

10.	Lapari G>, Szabo A., Effect of librational motion on fluorescence depolariza-
tion and nuclear magnetic resonance relaxation in macromolecules and memb-
ranes, Biophys. J., 30, 489 (1980).

11.	Dale R.E., Chen L.A., Brand L,, Rotational relaxation of the ” microviscosity"
probe diphenylhexatriene in paraffin oil and egg lecithin vesicles, J. Biol. Chepi.,
252, 7500 (1977).

12.	Chen L.A., Dale R.E,, Roth S., Brand L., Nanosecond time-dependent fluores-
cence depolarization of diphenylhexatriene in dimyristoyllecithin vesicles and
the determination of ’’microviscosity" , J. Biol. Chem., 252, 2163 (1977).

13.	Kawato S., Kinosita K., Ikegami A.t Dynamic structure of lipid bilayers stu-
died by nanosecond fluorescence techniques, Biochemistry, 16, 2319 (1977).

14.	Veatch W.R., Stryer L., Effect of cholesterol on rotational mobility of diphe-
nylhexatriene in liposomes! A nanosecond fluorescence anisotropy study, J.
Mol. Biol., 177, 1109 (1977).

15.	Badea M*G., DeToma R,P.t Brand L»r Nanosecond relaxation processes in
liposomes, Biophys. J., 24, 197 (1979).

16.	Kinosita K„ Jr», Mitaku S., Ikegami A,, Ohbo N*, Kinus T,L*t Construction of
nanosecond fluorometric system for applications to biological samples at cell
or tissue levels, Japan J.Appl. Phys., 15, 2433 (1976).

17.	Jahnig F,t Structural order of lipids and proteins in membranes! Evaluation of
fluorescence anisotropy data, Proc. Natl. Acad. Sci., 76,6361 (1979).

18.	lleyn M'P,, Determination of lipid order parameters and rotational correlati-
on times from fluorescence depolarization experiments, FEBS Lett., 108, 359
(1979).

19.	Y guerabide J., Epstein H-F., Stryer L., Segmental mobility in an antibody mo-
lecule, J. Mol. Biol., 51, 573 (1970).

20.	Hanson D.C., Yguerabide J., Schumaker F.A., Segmental flexibility of immu-
noglobulin G antibody molecules in solution'! A new interpretation, Bioche-
mistry, 20, 6842 (1981).

21.	Beardsley K., Tao T; CantorC,R», Studies on the conformation of the anti-
codon loop of phenylalanine transfer ribonucleic acid. Effect of environment
on the fluorescence of the Y-base, Biochemistry, 18, 3542 (1970).

22.	Weber G., Theory of differential phase fluorometry! detection of anisotropic
molecular rotations, J. Chem. Phys., 66, 4081 (1977).

23.	Mantulin 1F.1F., Weber G., Rotational anisotropy and solvent-fluorophore bonds;
an investigation by differential polarized phase fluorometry, J. Chem. Phys.,
66, 4092 (1977).

24.	JFeber G., Limited rotational motion! Recognition by differential phase fluo-
rometry, Acta Phys. Pol., A54, 859 (1978).

25.	HaarH.P., Klein U.K.A., Hafner F.W., Hauser M., Determination of rotational
diffusion by a picosecond phase fluorometer, Chem. Phys. Lett., 49, 563 (1977).

26.	Merkelo H., Hammond H., Hartman S.R., Derzko Z.L, Measurement of the tem-
perature dependence of depolarization time of luminescence, J. Luminescence,
1, 2, 507 (1970).

27.	Spencer Rd)., Weber G., Influence of Brownian rotations and energy transfer
upon the measurement of fluorescence lifetimes, J. Chem. Phys., 52, 1654
(1970).

28.	Szymanowski JL,’Einfluss der Rotation der Molekule auf die Messungen der
Abklingzert des Fluoreszenzstrahlung, Z. Phys., 95, 466 (1935).

29.	Кудряшов П.И., Свешников Б.Я., Широков В.И. Кинетика концентрацион-
ной деполяризации люминесценции и межмолекулярного переноса энергии
возбуждения. - Оптика и спектроск., 1960, т. 9, с. 314.

30.	Bauer R.K., Polarization and decay of fluorescence of solution, Z.Naturforsch.,
18A, 718 (1963).

31.	HeldtJ., Influence of thermal motions on depolarization of fluorescence of
dye molecules in solution, Acta Phys. Pol., 30, 3 (1966).

32.	Lakowicz J.R., Prendergast F.G., Detection of hindered rotations of 1,6-di-
phenyl-l,3,5-hexatriene in lipid bilayers by differential polarized phase fluo-
rometry, Biophys. J., 24, 213 (1978).

33.	Lacowicz J.R,, Prendergast F.G., Hogen D., Differential polarized phase
fluorometric investigations of diphenylhexatriene in lipid bilayers; quantita-
tion of hindered depolarizing rotations, Biochemistry, 18, 508 (1979).

34.	Lakowicz J.R., Prendergast F.G., Quantitation of hindered rotations of di-
phenylhexatriene in lipid bilayers by differential polarized phase fluoromet-
ry, Science, 200, 1399 (1978).

35.	Kettle G.J., Soutar L, Fluorescence depolarization studies of micro-Browni-
an relaxation of poly(methyl metacrylate) in rotation, Eur. Polym. J., 14, 895
(1978).

36.	Lakowicz J.R., Prendergast F.G., Hogen D., Fluorescence anisotropy measu-
rements under oxygen quenching conditions as a method to quantify the de-
polarizing rotations of fluorophores! Application to diphenylhexatriene in iso-
tropic solvents and in lipid bilayers, Biochemistry, 18, 520 (1979).

37.	Lakowicz J.R,, Weber G,, Nanosecond segmental mobilities of tryptophan re-
sidues in protein observed by lifetime-resolved fluorescence anisotropies, Bio-
phys. J., 32, 591 (1980).

38.	Lakowicz J.R., Weber G., неопубликованные результаты.

39.	Barkley M.D., Kowalczyk A,A,, Brand L., Fluorescence decay studies of ani-
sotropic rotations of small molecules, J. Chem. Phys., 75, 3581 (1978).
Г лава 7

I.	Von Lippert Е., Spektroskopische Beslimmung des Dipolomomentes aroma-
tischer Verbindungen ini ersten angeregten Singluettzustand, Z. Electrochem.,
61, 962 (1957).

2.	Kawski A., Zur Lfisungsmittelabhangigkeit der Wellenzahl von Elektronenban-
den lumineszierender Molekiile, und uber die Beslimmung der elektrischen Di-
polomomente im Anregungszustand, Aeta Phys. Pol., 29, 507 (1966).

3.	Malaga N., Kaifu Y>, Koizumi Mt, Solvent effects upon fluorescence spectra and
the dipole moments of excited molecules. Bull. Chem. Soc. Japan-, 29, 465 (1966).

4.	Liptay IF., Die Losungsinittel-abhangigkeitder Wellenzahl von elektronenban-
den und die chemisch-physikalisehen Grundlagen, Z. Naturforsch., 20A, 1441
(1965).

5.	Bilot L,, Kawski Л., Zur Theorie des Einflusses von Lb'sungsmitteln auf die
Electronenspektren der Molekiile, Z. Naturforsch., 18A, 621 (1962).

6.	Бахшиев НЛ. Универсальные межмолекулярные взаимодействия и их вли-
яние на положение электронных спектров молекул в двухкомпонентных раст-
ворах. 1. Теория (жидкие растворы). - Оптика и спектроск., 1961, т. 10,
№ 6, с. 717.

7.	Бахшиев Н.Г. Универсальные межмолекулярные взаимодействия и их вли-
яние на положение электронных спектров молекул в двухкомпонентных
растворах. - Оптика и спектроск., 1962, т. 12, № 3, с. 350.

8.	Бахшиев ПЛ. Универсальные межмолокулярпые взаимодействия и их вли-
яние на положение электронных спектров молекул в двухкомпонентных раст-
ворах. — Оптика и спектроск., 1962, т. 13, М 1, с. 43.

9.	Seliskar C.J., Brand L., Electronic spectra of 2-aminonaphthalene~6-sulfonate
and related molecules П. Effects of solvent medium on the absorption and flu-
orescence spectra, J. Amer. Chem. Soc., 93, 5414 (1971).

10.	Перов АЛ. Энергия парных межмолекулярпых взаимодействий как характе-
ристика их природы. К теории сольвато(флуоро)хромии трехкомпонептпых
растворов. - Оптика и спектроск., 1980, т. 49, № 4, с. 681.

11.	Sun Mt, Song P.S., Solvent effects on the fluorescence states of indole deri-
vatives - dipole moments, Photochem. Photobiol., 25, 3 (1977).

12.	Weber Gt, Laurence D.JtRt, Fluorescent indicators of absorption in aqueous
solution and on the solid phase, Biochem. J., 51, xxxi (1954).

13.	McClure WtO,, Edelman GtMt, Fluorescent probes for conformational states of
proteins I. Mechanism of fluorescence of 2-p-toluidinylnaphthalene-6-sulfo*
nate, a hydrophobic probe, Biochemistry, 5, 1908 (1966).

14.	IPe/jer G., Earris FtJ., Synthesis and spectral properties of a hydrophobic fluo-
rescence-probe1! 6-propionyl-2-(dimethylamino)naphthalene, Biochemistry,, 18,
3075 (1979).

15.	MacGregor ILBt, Weber Gt, Fluorophores in polar media. Spectral effects of
the Langevin distribution of electrostatic interactions, Proc. N.Y. Acad. Sci.,
366, 140 (1981).
16.	Lakowicz J.R., Fluorescent spectroscopic investigations of the dynamic pro-
perties of proteins, membranes and nucleic acids, J. Biochem. Biophys. Me-
thods, 2, 91 (1980).

17.	Brand L., Seliskar C.J., Turner D.C., The effects of chemical environment on
fluorescence probes, in! Probes of Structure and Function of Macromolecules
and Membranes (eds. B. Chance, C.P. Lee, J.K.;Blaisie). Academic Press, New
York, 1971, pp. 17-39.

18.	Непорент Б.С., Бахшиев H.F. О роли универсальных и специфических меж-
молекулярных взаимодействий во влиянии растворителя на электронные
спектры молекул. - Оптика и спектроск., 1960, т. 8, № 6, с. 777.

19.	Черкасов A.G. О влиянии растворителя на спектры флуоресценции ацетил-
антраЧенов. - Изв. АН СССР, сер физич., I960, т. 24, № 5 с. 591.

20.	Rosenberg Н.М., Eimutus Е., Solvent shifts in electronic spectra I. Stokes’
shift in a series of homologous aromatic amines, Spectrochim. Acta, 22, 1751
(1966).

21.	WemenT.C., Hoffman R.M., Relation between an excited stale geometry change
and the solvent dependence of 9-methyl anthroate fluorescence, J. Phys. Chem.,
77, 1611 (1973).

22.	Thulbom K*R>, Sawyer JF./7., Properties and the locations of a set of fluores-
cent probes sensitive to the fluidity gradient of the lipid bilayer, Biochim.
Biophys. Acta, 511, 125 (1978).

23.	Badea M»G>, De. Toma R.P., Brand L., Nanosecond relaxation processes in li-
posomes, Biophys. J., 24, 197 (1978).

24.	Debye P., Polish Molecules. Dover Publications, Inc., New York, 1929.

25.	Waggoner A.S., Stryer L., Fluorescent probes of biological membranes, Proc.
Natl. Acad. Sci., 67, 579 (1970).

26.	Stryer L.S., The interactions of a napthalene dye with apomyoglobin and apo-
hemoglobin: A fluorescent probe of nonpolar binding sites, J. Mol. Biol., 13,
482 (1965).

Diaea 8

1.	Hercules D.M., Rodgers L.B., Luminescence spectra of naphthols and naph-
thalenediols: Low-temperature phenomena, J. Phys. Chem., 64,397 (1960).

2.	Пикулик Л.Е.,' Соломахо M.A. О влиянии температуры на электронные
спектры сложных молекул. - Оптика и спектроск., I960, т. 8, # 3, с. 338.

3.	Гладченко Л.Ф., Пикулик Л.Е. Определение постоянных дипольных момен-
тов возбужденного состояния индола и триптофана. - Ж. лрикл. спектр.,
1967, т. 6, № 3, с. 355.

4.	Lakowicz J.R,,., Fluorescence spectroscopic investigations of the dynamic
properties of proteins, membranes and nucleic acids, J. Biochem. Biophys.
Methods, 2, 91 (1980).

5.	Badea M.G., Brand L., Time-resolved fluorescence measurements, Methods
Enzymol., 61, 378 (1979).
6.	Lakowicz J.R.,, Balter A., Direct recording of the initially- excited and the sol-
vent-relaxed fluorescence emission of a tryptophan derivative in viscous so-
lution, by phase sensitive detection of fluorescence, Photochem. Photobiol.,
36, 125 (1982).

7.	Walker M.S,, Bednar T.W., Lumry R., Exciplex formation in the exited state
of indole, J. Chem. Phys., 45, 3455 (1966).

8.	Sun M., Song P.S., Solvent effects on the fluorescent states of indole-deriva-
tives — Dipole-moments, Photochem. Photobiol., 25, 3 (1977).

9.	Черкасов A.Q., Драгнева Г.И. Влияние вязкости растворителя на спектры
флуоресценции некоторых органических соединений. - Оптика и спектроск.,
1961, т. 10, № 4, с. 466.

10.	Питерская И.В.,' Бахшиев H.F. Количественное исследование зависимости
спектров поглощения и флуоресценции сложных молекул в растворах от
температуры. - Изв. АН СССР, сер. физич., 1963, т. 27, № 5, с. 623.

11.	Бахшиев Н.Г.,'Питерская И.В. Универсальные межмолекулярные взаимо-
действия и их влияние на положение электронных спектров молекул в двух-
компопентных растворах. X. - Оптика и спектроск., 1965, т. 19, № 5, с. 698.

12.	Macgregor R.B., Weber С», Fluorophores in polar media. Spectral effects of the
Langevin distribution of electrostatic interactions. Proc. N.Y. Acad. Sci., 366,
140 (1981).

13.	Lakowicz /.R., Cherek П., 1980, неопубликованные данные.

14..	Бахшиев H.F., Мазуренко Ю.Т., Питерская И.В. О затухании свечения в раз-
ных участках спектра люминесценции молекул в вязких растворах. — Опти-
ка и спектроск., 1966, т. 21, № 5, с. 550.

15.	Мазуренко Ю.Т.,'Бахшиев H.F. Влияние ориентационной дипольной релак-
сации па спектральные, временные и поляризационные характеристики лю-
минесценции растворов. - Оптика и спектроск., 1970, т. 28, № 5, с. 905.

16.	Бахшиев Н.П.,' Мазуренко Ю.Т.,' Питерская И.В. Проявление релаксацион-
ных процессов в характеристиках люминесценции вязких растворов. — Изв.
АН СССР, сер. физич., 1968, т. 32, № 8, с. 1360.

17.	DeToma R.P., Easter J.H., Brand L., Dynamic interactions of fluorescence

'•'* probes with the solvent environment, J. Amer. Chem. Soc., 98, 5001 .(1976).

18.	Веселова T,B.,< Лимарев а Л. А., Черкасов A. G., Широков В.И. Флуоромет-
рическое изучение влияния растворителя на спектр флуоресценции 3-ами-
no-N-метилфталимида. - Оптика и спектроск., 1965, т. 19, № 1, с. 78.

19.	Rapp IF., Klingenberg Н.П,, Lessing Н.Е., A kinetic model for fluorescence
solvatochromism,, Ber. Busengcs., 75, 883 (1971).

20.	Lakowicz J.R., Cherek Н», Balter A., Correction of timing errors in photomul-
tiplier tubes used in phase-modulation fluorometry, J. Biochem. Biophys. Me-
thods, 5, 131 (1981).

21.	Черкасов A.G. О роли донорно-акцепторных взаимодействий во влиянии
растворителя на спектры флуоресценции некоторых производных антраце-
на и фталимида. - Оптика и спектроск., 1962, т. 12, № 1, с. 73.

22.	Ware W.R., Lee S.K., Brant G.J., Chow P.P., Nanosecond time-resolved emis-
sion spectroscopy: Spectral shifts due to solvent-excited relaxation, J. Chem.
Phys., 54, 4729 (1970).

23.	Бахшиев Н.Г. Универсальные межмолекулярные взаимодействия и их вли*
яние на положение электронных спектров молекул в двухкомпонентных раст-
ворах. VIL Теория (общий случай изотропного раствора). - Оптика и спек-
троск., 1964, т. 16, № 5, с. 821.

24.	Мазуренко Ю.Т. О температурной зависимости спектров люминесценции
вязких растворов. - Оптика и спектроск., 1973, т. 34, № 5, с. 917.

25.	Мазуренко Ю.Т./Удалъцов B.G. Спектральные релаксации флуоресценции.
I „ Кинетика спектров, связанная с ориентационной релаксацией раствори-
теля. - Оптика и спектроск., 1978, т. 44, № 4, с. 714.

26.	Gard SoKt, Smyth С'Р», Microwave absorption and molecular structure in li-
quids LXIL The three dielectric dispersion regions of the normal primary al-
cohols, J. Phys. Chem., 69, 1294 (1965).

27.	DeToma R.P., Brand L., Excited state solvation dynamics of 2-anilinonaphtha-
lene, Chem. Phys. Lett., 47, 231 (1977).

28.	Badea M.G., DeToma R.P., Brand L,r Nanosecond relaxation processes in li-
posomes, Biophys. J., 24, 197 (1978).

29.	Weber G.f Lakowicz J»R; Subnanosecond solvent relaxation studies by oxy-
gen quenching of fluorescence, Chem. Phys. Lett., 22, 419 (1973).

30.	Rotkiewicz K., Grabowski Z.R», Jasny J., Picosecond isomerization kinetics
of excited p-dimethylaminobenzonitriles studied by oxygen quenching of fluo-
rescence, Chem. Phys. Lett., 34, 55 (1975).

31.	Laws W.R., Brand L., Analysis of the two-state excited state reactions. The
fluorescence decay of 2-naphthol, J. Phys. Chem., 83, 795 (1979).

32.	Easter JoH*, DeToma R.P*, Brand L,, Nanosecond time-resolved emission spect-
roscopy of a fluorescence probe adsorbed to L-a-egg lecithin vesicles, Biophys.
J., 16, 571 (1976).

33.	Lakowicz J.R., Cherek H., Bevan D.R., Demonstration of nanosecond dipolar
relaxation in biopolymers by inversion of apparent fluorescence phase shift
and demodulation lifetimes, J. Biol. Chem., 255, 4403 (1980).

34.	Lakowicz J,R*, Hogen D.r Dynamic properties of lipid — water interface of mo-
del membranes as revealed by lifetime-resolved fluorescence emission spectra,
Biochemistry, 20, 1366 (1981).

35.	Brand Lo, Gohlke J»R», Nanosecond time-resolved fluorescence spectra of a
protein-dye complex, J. Biol. Chem., 246, 2317 (1971).

36.	Gafni Л., DeToma R.P., Manrow R„E,, Brand L.t Nanosecond decay studies of
a fluorescence probe bound to apomyoglobin, Biophys. J., 17, 155 (1977).

37.	Stryer L,, The interactions of a naphthalene dye with apomyoglobin and apo-
hemoglobin. A fluorescent probe of nonpolar binding sites, J. Mol. Biol., 13,
482 (1965).

38.	Lakowicz J,Rt, Cherek Н», Proof of nanosecond timescale relaxation in apo-
myoglobin by phase fluorometry, Biochem. Biophys. Res. Commun., 99, 1173
(1981).
39.	Клочков ВЛ., Коротков G.M. Зависимость структурных спектров поглоще-
ния и флуоресценции растворов ароматических соединений от температуры. -
Оптика и спектроск., - 1964, т. 16, с. 833.

40.	Lakowicz J.R., Balter A., Theory of phase-modulation fluorometry for exci-
ted state processes, Biophys. Chem., 16, 99 (1982).

Г лава 9

1.	Kautsky H., Quenching of luminescence by oxygen, Trans. Faraday Soc., 35,
216 (1939).

2.	Knibbe H., Rehm D., Weller A., Intermediates and kinetics of fluorescence
quenching by electron transfer, Ber. Bunsenges., 72, 257 (1968).

3.	Horrocks A.R., Kearvell A., Tickle K., Wilkinson F., Mechanism of fluores-
cence quenching in solution II. Quenching by xenon and intersystem crossing
efficiencies, Trans.Faraday Soc., 62, 3393 (1966).

4.	Cavatorta P., Favikka R.} Mazzini A., Fluorescence quenching of tryptophan
and related compounds by hydrogen peroxide, Biochim, Biophys. Acta, 578,
• 541 (1979).

5.	Eftink M.R., Chiron C.A., Fluorescence quenching of indole and model micelle
systems, J. Phys. Chem., 80, 486 (1976).

6.	Winkler МЛ., A fluorescence quenching technique for the investigation of the
configurations of binding sites for small molecules, Biochemistry, 8, 2586
(1969).

7.	Lehrer S.S., Solute perturbation of protein fluorescence. The quenching of the
tryptophan fluorescence of model compounds and of Ivsozyme by iodide ion,
Biochemistry, 10, 3254 (1971).

8.	Dreeskamp H., Koch E., Zander M., On the fluorescence quenching of polycyc-
lic aromatic hydrocarbons by nitromethane,, Z. Naturforsch., 30a, 1311 (1975).

9.	Bieri V.G., Wallach D.F.H., Fluorescence quenching in lecithin*, cholesterol
liposomes by paramagnetic lipid analogues; Introduction of new probe approach,
Biochim. Biophys. Acta, 389, 413 (1975).

10.	Green J.A., Singer L.A., Parks J.H., Fluorescence quenching by the stable-free
radical di-fr-butylnitroxide, J. Chem. Phys., 58, 2690 (1973).

11.	O’Connor D.V., Ware W.R., Exciplex photophysics III. Kinetics of fluorescence
quenching of a-cyanonaphthalene by dimelhylcyclopentone-1,2 in hexane, J. Amer.
Chem. Soc., 98, 4706 (1976).

12.	Ware W.R., Watt D., Holmes J.D., Exciplex photophysics I. The a-cyanonaphtha-
lene — olefin system, J. Amer. Chem. Soc., 96, 7853 (1974).

13.	Taylor G.N., Emission from aromatic hydrocarbon — diene and olefin exciplexes,
Chem. Phys. Lett., 10, 355 (1971).

14.	Gassman P.G., Olson K.D., Walter L., Yamaguchi R., Photoexcitation of non-
conjugated, strained, and saturated hydrocarbons. Relationship between ease
of oxidation and quenching of naphthalene fluorescence by saturated hydrocar-
bons, J. Amer. Chem. Soc., 103, 4977 (1981).

15.	Eftink M.R>, Zajicek J.L., Chiron C.A., A hydrophobic quenchenr of protein fluo-
rescence: 2,2,2-trichloroethanol, Biochim. Biophys. Acta., 491, 473 (1977).
16.	Medinger Т., Wilkinson F., Mechanism of fluorescence quenching in solution I.
Quenching by bromobenzene, Trans. Faraday Soc., 61, 620 (1965).

17.	Lakowicz J.R«, Anderson C.J», Permeability of lipid bilayers to methylmercu-
ric chloride: Quantification by fluorescence quenching of a carbazole-labeled
phospholipid, Chem. Biol. Interactions, 30, 309 (1980).

18.	Lakowicz J.R., Hogen D., Chlorinated hydrocarbon-cell membrane interactions
studied by the fluorescence quenching of carbazole-labeled phospholipids! Probe
svnthesis and characterization of the quenching methodology, Chem. Phys. Li-
pids, 26, 1 (1980).

19.	Kaska M., Collisional perturbation of spin-orbital coupling and the mechanism
of fluorescence quenching. A visual demonstration of the perturbation, J. Chem.
Phys., 20, 71 (1952).

20.	Steiner R,F», Kirby E,P,t The interaction of the ground and excited states of
indole derivatives with electron scavengers, J. Phys. Chem., 73, 4130 (1969).

21.	Eftink M.R,, Ghiron C., Fluorescence quenching studies with proteins, Anal.
Biochem., 114, 199 (1981).

22.	Scott T.G., Spencer R.D., Leonard N.J., Weber G., Emission properties of NADH.
Studies of fluorescence lifetimes and quantum efficiencies of NADH, AcPyADH,
and simplified synthetic models, J. Amer. Chem. Soc.,92, 687 (1970).

23.	Spencer R.D,, Weber G., Thermodynamics and kinetics of the intramolecular
complex in flavin — adenine dinucleotide, in: Structure and Function of Oxi-
dation Reduction Enzymes (eds. A. Ake son, A. Ehrenberg). Pergamon Press,
N.Y., 1972, p. 393.

24.	Davis G.A,, Quenching of aromatic hydrocarbons by alkylpyridinium halides,
J. C.S.Chem. Commun., 728 (1973).

25.	Shinitzky M., Rivnay B. Degree of exposure of membrane proteins determined
by fluorescence quenching, Biochemistry, 16, 982 (1977).

26.	Ware W.R., Oxygen quenching of fluorescence in solution: An experimental
study of the diffusion process, J. Phys. Chem., 66, 455 (1962).

27.	Othmer D.F., Thakar M.S., Correlating diffusion coefficient in liquids, Ind.

Eng. Chem., 45, 589 (1953).

28.	Lakowicz J.R., Weber G., Quenching of fluorescence by oxygen. A probe for
structural fluctuation in macromolecules, Biochemistry, 12, 4161 (1973).

29.	Chen R.Fo, Fluorescence quenching due to mercuric ion. Interaction with aro-
matic amino acids and proteins, Arch. Biochem. Biophys., 142, 552 (1971).

30.	Kubota У., Motoda У., Shigemune У., Fujisaki У., Fluorescence quenching of
10-methylacridinium chloride by nucleotides, Photochem. Photobiol., 29, 1099
(1979).

31.	Frank I.M., Vavilov S.I., Uber die Wirkungssphare der Auslb'schungsvorgange
in den fluoreszierenden Fliissigkeiten, Z. Phys., 69, 100 (1931).

32.	Collins F.C., Kimball G.E,, Diffusion-controlled reaction rates, J. Colloid.
Sci., 4, 425 (1949).

33.	Lakowicz J.R., Weber G., Quenching of protein fluorescence by oxygen. De-
tection of structural fluctuations in proteins on the nanosecond timescale,
Biochemistry, 12, 4171 (1973).
34.	Lakowicz J*R*, Diffusive transport of oxygen through proteins and membranes
quantified by fluorescence quenching, in: Hemoglobin and Oxygen (eds. C.Ho,
et al.). Vol. 1. 1982, p. 443.

35.	Thulbom K.R., Sawyer W.H., Properties and the location of a set of fluorescent
probes sensitive to the fluidity gradient of the lipid bilayer> Biochim. Biophys.
Acta, 511, 125 (1978).

36.	Lakowicz J.R., Hogen /)., Omann G*, Diffusion and partitioning of a pesticide
(lindane) into phosphatidylcholine bilayer! A new fluorescence quenching method
to study chlorinated hydro carbon-membrane interactions, Biochim. Biophys. Ac-
ta, 471, 401 (1977).

37.	Hui M.N», Ware W.R>, Exciplex photophysics IV. Effects of diffusion-control-
led quenching on exciplex photokinetics, J. Amer. Chem. Soc., 98, 4712 (1976).

38.	Lewis C., Ware W.R., Estimation of lifetimes and binding energies of nonfluo-
rescent exciplexes present during fluorescence quenching, Mol. Photochem.,
8, 261 (1973).

39.	Sveshnikoff B*, On the theory of photochemical reactions and chemilumines-
cence in solutions, Acta Physicochim, U.R.S.S., 3, 257 (1935).

40.	O’Connor D. V>, H are W.R*, Exciplex photophysics III. Kinetics of fluorescence
quenching of a-cyanonaphthalene-by dimethylcyclopentene-1,2 in hexane, J.
Amer. Chem. Soc., 98, 4706 (1976).

41.	Fleming P*J., Rappel D*E., Law A.L.Y*, Strittmatter P., Intramembrane posi-
tion of the fluorescent tryptophanyl residue in membrane-bound cytochrome b-,
Biochemistry, 18, 5458 (1979).

42.	Leto T.L., Roseman Л/.Л., Holloway P.W., Mechanism of exchange of cyto-
chrome b. between phosphatidylcholine vesicles, Biochemistry, 19, 1911
(1980).

43.	Boaz H*, Rollefson G*K*, The quenching of fluorescence. Deviations from the
Stern — Volmer law, J. Amer. Chem. Soc., 72, 3425 (1950).

44.	Lakowicz J*R>, Maliwal B., Cherek H>, Ralter A., Rotational freedom of tryp-
tophan residues in proteins and peptides quantified by lifetime-resolved fluo-
rescence anisotropies, Biochemistry, 220 1741 (1983).

45.	Lakowicz J.R*, Fluorescence spectroscopic investigations of the dynamic pro-
perties of proteins, membranes, and nucleic acids, J. Biochem. Biophys. Me-
thods., 2, 90 (1980).

46.	Handbook of Chemistry and Physics (ed. C.D. Hodgman). Chemical Rubber
Publ. Co,., Cleveland, 1955.

47,	Physical Chemistry, 3rd Ed., Daniels and Alberty (Wiley, 1967).

48.	International Critical Tables and Physical Chemistry.

Г лава 10

1.	Forster Th*, Intermolekular energy migration and fluorescence. Ann. Phys. (Leip-
zig), 2, 55 (1948).

2.	Stryer Lu, Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler, Ann. Rev.
Biochem., 47, 819 (1978).
3.	Steinberg EZ., Long-range nonradiative transfer of electronic excitation energy-
in proteins and polypeptides, Ann. Rev. Biochem., 40, 83 (1971).

4.	Katchalski-Katzir E,, Steinberg LZ., Study of conformation and intramolecular
mobility of polypeptides in solution by a novel fluorescence method, Ann. N.Y.
Acad. Sci., 366O 44 (1981).

5.	Thomas D.D., Carlsen RLF., Stryer L., Fluorescence energy transfer in the rapid-
diffusion limit, Proc. f'JatL Acad. Sci., 75, 5746 (1978).

6.	Berman H.A,, Yguerabide J., Taylor Po, Fluorescence energy transfer On ace-
tylcholinesterase! Spatial relationships between peripheral site and active cen-
ter, Biochemistry, 19, 2226 (1980).

7.	Fung B,K,K., Stryer L>, Surface density determination in>membranes by fluores-
cence energy transfer, Biochemistry, 17, 5241 (1978).

8.	Dale R.E», Eisinger J», Blumberg W»E,r The orientational freedom of molecular
probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer, Biophys. J.,
26, 161 (1979).

9.	Dale R.E„, Eisinger J; Polarized excitation energy transfer, in! Biochemical
Fluorescence Concepts (eds. R.,F. Chen, H. Edelhoch). Marcel Dekker Inc., N.Y.,
1975, p. 115.

10.	Haas E., Katchalski- Katzir E., Steinberg I.Z», Effect of the orientation of donor
and acceptor on the probability of energy transfer involving electronic transitions of
mixed polarization, Biochemistry, 17, 5064 (1978).

11.	Stryer L», Haugland R.P., Energy transfer! A spectroscopic ruler, Proc. Natl. Acad.
Sci., Б8, 719 (1967).

12.	Gabor Go, Radiationless energy transfer through a polypeptide chain, Biopoly-
mers, 6, 809 (1968).

13.	Haugland R.P>, Yguerabide J., Stryer L., Dependence of the kinetics of sin-
glet-singlet energy transfer on spectral overlap, Proc. Natl. Acad. Sci., 63,
23 (1969).

14.	Wu C.W., Stryer L,, Proximity relationship in rhodopsin, Proc. Natl. Acad. Sci.,
69, 1104 (1972).

15.	Vanderkooi J.M», Lerokomar A., Nakamura H>, Martinosi A., Fluorescence ener-
gy transfer between Ca2+ transport AT Paso molecules in artificial membranes,
Biochemistry, 16, 1262 (1977).

16.	Veatch IF., Stryer Lo, The dimeric nature of the Gramicidin A transmembrane
channel: Conductance and fluorescence energy transfer studies of hybrid chan-
nels, J. Mol. Biol., 113, 89 (1977).

17.	Shaklai N*, Yguerabide /•, Ranney H»M», Interaction of hemoglobin with red
blood cell membranes as shown by a fluorescent chromophore, Biochemistry,
16, 5585 (1977).

18.	Dewey T.G., Hammes G.G., Calculation of fluorescence, resonance energy
transfer on surfaces, Biophys. J., 32, 1023 (1980).

19.	Estep T.N., Thompson T.E., Energy transfer in lipid bilayers, Biophys. J.,
26, 195 (1979).

20.	Wolber PoK>, Hudson B>S,t An analytical solution to the Forster energy trans-
fer problem in two dimensions, Biophys. J., 28, 197 (1979).
21.	Haas Е., Wilchek М., Katchalski-Katzir Е., Steinberg I.Z., Distribution of end-
to-end distances of oligopeptides in solution as estimated by energy transfer,
Proc. Acad. Sci., 72, 1807 (1975).

Grinvald .4., Haas Е», Steinberg l»Z,f Evaluation of the distribution of distan-
ces between energy donors and acceptors by fluorescence decay, Proc. Natl.
Acad. Sci., 69. 2273 (1972).

23.	Haas E., Katchalski-Katzir E., Steinberg l,Z.} Brownian motion of the ends of
oligopeptide chains in solution as estimated by energy transfer between chain
ends, Biopolymers, 17. 11 (1978).

24.	Bennett R,G.r Radiationless iulerniolecular energy transfer I. Singlet-singlet
transfer, J. Chem. Phys., 41„ 3037 (1964).

25.	Eizenthal K.B., Siegel S,, Influence of resonance transfer on luminescence
decay, J. Chem. Phys., 41. 652 (1964).

26.	Birks J о Bo, Ge.orghiou S., Energy transfer in organic systems VII. Effect of dif-
fusion on fluorescence decay, Proc. R.Soc. (J. Phys. B), 1. 958 (1968).

Глава 11

1.	Eftink M.R,, Ghiron C.A., Fluorescence quenching studies with proteins, Anal.
Biochem., 114. 199 (1981).

2.	Steiner R.F,, Kirby E.P., The interaction of the ground and excited state of
indole derivatives with electron scavengers, J. Phys. Chem., 73. 4130 (1969).

3.	Конев C.B. Электронно-возбужденные состояния биополимеров. - Минск:
Наука и техника, 1965.

4.	Excited States of protein and Nucleic Acids (eds. I Weinryb, R.F. Steiner). Ple^
num Press, N.Y., 1971.

5.	Biochemical Fluorescence Concepts (eds. R.F. Chen, H.Edelhoch). Vol. 2,
Marcel Dekker, N.Y., 1976.

6.	Wetlaufer D.B,, Ultraviolet absorption spectra of proteins and amino acids,
Advan. Protein Chem., 17,, 303 (1962).

7.	Teale F.IF.J., Weber G., Ultraviolet fluorescence of the aromatic amino acids,
Biochem. J., 65. 476 (1957).

8.	Weber G., Fluorescence-polarization spectrum and electronic-energy transfer
in tyrosine, tryptophan, and related compounds, Biochem. J., 75„ 335 (I960).

9,	Valeur В», Weber G., Resolution of the fluorescence excitation spectrum of in-
dole into the and *L, excitation band, Photochem. Photobiol., 25„ 441
(1977).	°

10.	Strickland E.H., Horwitz J., Kay E., Shannon L.M., Wilchek M., Billups L.,
Near-ultraviolet absorption i bands of tryptophan. Studies using horseradish per-
oxidase. isoenzymes, bovine and horse heart cytochrome c, and N-stearoyl-L-
tryptophan n-hexyl ester, Biochemistry, 1Oo 2631 (1971).

11.	Walker M.S,, Bednar T.W., Lumpy R., Exciplex formation in the excited state,
J. Chem. Phys., 45, 3455 (1966).

12.	Hershberger M.V., Lumry R., Verral R., The 3-methylindole/n-butanol exci-
plex’. Evidence for two exciplex sites in indole compounds, Photochem. Pho-
tobiol., 33,, 609 (1981).
13.	Владимиров Ю.А., Бурштейн Э.А. Спектры люминесценции ароматических
аминокислот и белков. - Биофизика, 1960, т. 5, с. 385.

14.	Eisinger J., Intramolecular energy transfer in adrenocorticotropin,Biochemistry,
8„ 3902 (1969).

15.	Teale F.W.J», The ultraviolet fluorescence of proteins in neutral solution,
Biochem. J., 76, 381 (i960).

16.	Edelhoch H>, Perlman R>L>, Wilchek M., Fluorescence studies with tyrosyl
peptides, Biochemistry, 7, 3893 (1968).

17.	Weber G., Rosenheck K., Proton-transfer effects in the quenching of fluores-
cence of tyrosine copolymers, Biopolymers Symp., 1, 333 (1964).

18.	Cowgill R.W., Tyrosyl fluorescence in proteins and model peptides, in'.' Bioche-
mical Fluorescence Concepts (eds. R.F. Chon, II.Edelhoch). Marcel Dekker,
N Y., 1976, p. 441.

19.	Saito У., Tachibana Н», Hayashi IL, Wada A., Excitation energy transfer between
tyrosine and tryptophan in proteins evaluated by the simultaneous measurement
of fluorescence and absorbance, Photochem. Photobiol., 33, 289 (1981).

20.	Longworth J.W., Chiron C.A., Transfer of singlet energy within trypsin, Bioche-
mistry, 18, 3828 (1979).

21.	Kronman M.L, Holmes L.G., The fluorescence of native, denatured, and reduced
denatured protein, Photochem. Photobiol., 14, 113 (1971).

22.	Eftink M.R., Chiron C.A., Exposure of tryptophanyl residues in proteins. Quan-
titative determination by fluorescence quenching studies, Biochemistry, 15„
672 (1976).

23.	Burstein E,A,, P ermyakov E.A., Yashion И.Л., Burkhanov S.4., Finazz Agro A.,
The fine structure of luminescence spectra of aznrin, Biochim. Biophys. Acta,
491, 155 (1977).

24.	Brand LG., Cagen R.IL, Fluorescence characteristics of native and denatured
monellin, Biochim. Biophys. Acta, 493, 178 (1977).

25.	Cagen R.H., Brand J.G., Morris J.A., Morris R.W., Monellin a sweet-tasting
protein, Sweetness Dental Caries, 311 (1978).

26.	Talbot J.C., Dufourcq J., de Bong J., Faucon J.R., Lurson C., Conformational
change and self association of monomeric meliltin, FEBS Lett, 102, 191 (1979).

27.	Faucon J.F., Dufourcq J., Lussan C., The self association of me liltin and
its binding to lipids, FEBS Lett., 102, 187 (1979).

28.	Georghiou S., Thompson M., Mukhopadhyay A.K., Mcliltin-phospholipid interac-
tions. Evidence for melittin aggregation, Biochim. Biophys. Acta, 642, 429
(1981).

29.	Shimizu 0., Imakuvo K., New emission band-of tyrosine induced by interaction
with phosphate ion, Photochem. Photobiol., 26, 541 (1977).

30.	Behmaarai T.A., Toulme J.J., Helene C., Quenching of tyrosine fluorescence
by phosphate ions. A model study for protein — nucleic acid complexes, Pho-
tochem. Photobil., 30, 533 (1979).

31.	Szabo A.f Lynn K.R>,, Krajcarski D.7., Rayner D.M., Tyrosinate fluorescence
maxima at 345 nm in proteins lacking tryptophan at pH 7, FEBS Lett., 94, 249
(1978).
32.	Grinvald A., Steinberg I.Z>, The fluorescence decay of tryptophan residues in
native and denatured proteins, Biochim. Biophys. Acta, 427„ 663 (1976).

33.	Rayner l)»M., Szabo A.G., Time-resolved fluorescence of aqueous tryptophan,
Can. J. Chem., 56., 743 (1978).

34.	Szabo A.G., Rayner D.M., Eluorescence decay of tryptophan conformers in
aqueous solution, J. Amer. Chem. Soc., 102„ 554 (1980).

35.	Ross J.A.B., Rousslang A’.ff., Brand L., Time-resolved fluorescence and aniso-
tropy decay of the tryptophan in adrenocorticotropin (1—24), Biochemistry, 20,.
1361 (1981).

36.	Cockle 5./1., Szabo Л.6., Time-resolved fluorescence spectra of tryptophan in
monomeric glucagon, Photochcm. Photohiol. 34„ 23 (1981).	,

37.	Lakowicz J.R., Cherek IE, Dipolar relaxation in proteins on the nanosecond
timescale observed hy wavelength-resolved phase fluorometry of tryptophan
fluorescence, J. Biol. Chem., 255,831 (1980).

38.	Lakowicz J.R., Balter A,, Resolution of initially excited and relaxed states
of tryptophan fluorescence by differential-wavelength deconvolution of time-re-
solved fluorescence decays, Biophys. Chem., 15„ 353 (1982).

39.	A’ox.s J.A., Schmidt C.J., Brand L., Time-resolved fluorescence of the two tryp-
tophans in horse liver alcohol dehydrogenase, Biochemistry, 20„ 43б9 (1981).

40.	Brochon J.C., Wahl P., Charlier М», Maurizat J.C., Helene C., Time-resolved
spectroscopy of the tryplophany 1 fluorescence of the E.Coli. Eac repressor,
Biochem. Biophys. Res. Common., 79„ 1261 (1977).

41.	Privat J.P., Wahl P-, Auchct J.C., Pain R.H., Time-resolved spectroscopy of
tryptophanyl fluorescence of yeast 3-phosphoglyceralc kinase, Biophys. Chem.,
11„ 239 (1980).

42.	Lakowicz J.R., Maliwal IL, 1980, неопубликованные данные-

43.	DeLauder W.B., Wahl P., Effect ol solvent upon the fluorescence decay of
indole, Biochim. Biophys. Acta, 243,, 153 (1971).

44.	Privat J.P., Wahl P., Auchct J.C., Rates of deactivation processes of indole
in water — organic solvent mixtures: Application to tryptophanyl fluorescence
of proteins, Biophys. Chem., 9„ 223 (1979).

45.	Burstein ILA., Vedenkina N.S», Ivkova M.N., Eluorescencc and the location
of tryptophan residues in protein molecules, Photochem. Photobiol., 18„ 263
(1973).

46.	Richards F.M., The interpretation of protein structure: Total volume, group
volume distribution, and packing density, J. Mol. Biol., 82„ 1 (1974).

47.	Laktfwicz J.R., WeberG., Quenching of protein fluorescence by oxygen. Detec-
tion of structural fluctuations in proteins on the nanosecond timescale, Bio-
chemistry, 12„ 4171 (1973).

48.	We.ber G., Shinitzky M., Eailure of energy transfer between identical aromatic
molecules on excitation at long wavelength edge of the absorption spectrum,
Proc. Nail. Acad. Sci., 65„ 823 (1970).

49.	Eftink M.R., Chiron C.A., Exposure of tryptophanyl residues and protein dyna-
mics, Biochemistry, 16„ 5546 (1977).
50.	Munro 1., Pecht L, Stryer L., Subnanosecond motions of tryptophan residues in
proteins, Proc. Natl. Acad. Sci., 76, 56 (1979).

51.	Lakowicz J.F., Maliwal B.t Cherek H., Balter A,, Dynamics of tryptophan re-
sidues in proteins quantified by lifetime-resolved anisotropies, Biochemistry,
в печати.

52.	Mantulin BLIP., Weber G»} Rotational anisotropy and solvent — fluorophore bonds!
An investigation by differential polarized phase fluorometry, J. Chem. Phys.,
66, 4092 (1977).

53.	Grinvald A., Steinberg I.Z., Fast relaxation processes in a protein revealed
by the decay kinetics of tryptophan fluorescence, Biochemistry, 13, 5170 (1974).

Глава 12

1.	Birks J.B., Photophysics of Aromatic Molecules. John Wiley and Sons, New
York, 1970.

2.	Organic Molecular Photophysics (ed. J.B. Birks). Vol. 1, 2,. John Wiley and Sons,
New York, 1973.

3.	Ireland J.F., Wyatt P.A.H., Acid-base properties of electronically excited states
of organic molecules, Adv. Org. Chem.».,. 12, 131 (1976).

4.	Badea M.G., Brand L., Time-resolved fluorescence measurements, Methods En-
zymol., 61, 378 (1979).

5.	Lakowicz J.R., Fluorescence-spectroscopic investigations of the dynamic pro-
perties of proteins, membranes, and nucleic acids, J. Biochem. Biophys. Methods,
20.91 (1980).

6.	Galla H.J., Hartmann IF., Excimer-forming lipids in membrane research, Chem.
Phys. Lipids, 27, 199 (1980).

7.	Vanderkooi J.M., Callis J.B., Pyrene A probe of lateral diffusion in the hydro-
phobic region of membranes, Biochemistry, 13, 4000 (1974).

8.	Steinberg I.Z., Long-range nonradiative transfer of electronic excitation energy
in proteins and polypeptides, Ann. Rev. Biochem., 40, 83 (1971).

9.	Stryer Lt, Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler, Ann. Rev.
Biochem., 47, 819 (1978).

10.	Thomas D.D., Carlsen W.F., Stryer L., Fluorescence energy transfer in the ra-
- pid diffusion limit, Proc. Natl. Acad. Sci., 75, 5746 (1978).

11.	Katchalski-Katzir Et, Steinberg I.Z., Study of conformational and intramolecu-
lar mobility of polypeptides in solution by a novel fluorescence method, Ann.
N.Y. Acad. Sci., 361, 44 (1981).

12.	Веселова T.B., Черкасов A.G.,< Широков В.И. Люминесцентные свойства эк-
сиплексов производных фталимида с тетраметилдиаминодифенилметаном. —
Оптика и спектроск., 1977, т. 42, ,№ 1, с. 71.

13.	Lakowicz J.R., Batler A., Theory of phase-modulation fluorescence spectrosco-
py for excited state processes, Biophys. Chem., 16a, 99 (1982).

14.	Черкасов A.C., Базилевскал H.G. Возбужденные димеры (эксимеры) произ-
водных антрацена и концентрационное тушение флуоресценции. - Изв.

АН СССР, сер. физич*, 1965, т. 29, № 8, с. 1284.
15.	Laws J.R., Brand L., Analysis of two-state excited-state reactions. The fluo-
rescence decay of 2-naphthol, J. Phys. Chem., 83, 795 (1979).

16.	Gafni A,, Brand L., Excited state proton transfer reactions of acridine studied
by nanosecond fluorometry, Chem. Phys. Lett., 58, 346 (1978).

17.	Lakowicz J.R., Balter A., Analysis of excited state processes by phase-modu-
lation fluorescence spectroscopy, Biophys. Chem., 16, 117 (1982).

18.	Бахшиев fl.Г., Мазуренко Ю.Т., Питерская И.В. О затухании свечения в раз-
ных участках спектра люминесценции молекул в вязких растворах. — Опти-
ка и спектроск., 1966, т. 21, V 5, с. 550.

19.	Rapp IF., Klingenberg Н.Н., Lessing H»E., A kinetic model for fluorescence; sol-
vatochromism, Ber. Bunsenges, 75, 883 (1971).

20.	Lakowicz J.R., Balter A., Differential- wavelength deconvolution of time-resolved
fluorescence intensities! A new method for the analysis of excited state proces-
ses, Biophys. Chem., 16, 223 (1982).

21.	fshie T., Handa T., Matsunagd'S., A study on the mechanism of excimer forma-
. tion through fluorescence quenching of isotactic and atactic polystyrenes and
poly(p-methylstyrenes) in solution, Makromol. Chem., 178, 2351 (1977).

22.	Masuhara If., Maeda Y., Nakajo IL, Matoga N., Tomita K., Tatcmitsu IL, Sokota
Misumi S., Exciplex emission of intra- and inlermolecular benzophenone and N,N-
dimethylaniline systems, J. Amer. Chem. Soc., 103, 634 (1981).

23.	Chandross E.A., Thomas Ц.Т., Intramolecular exciplex formation in napththyla-
mines, Chem. Phys. Lett., 9, 393 (1971).

24.	Kuzmin M.G., Guseva L.N., Donor-acceptor complexes of singlet-excited states
of aromatic hydrocarbons with aliphatic amines, Chem. Phys. Lett., 3, 71 (1969).

25.	Ware W.R., Richter H»?», Fluorescence quenching via charge transfer! The pe-
rylenc-N,N-dimethylaniline system, J.Chem. Phys., 48, 1595 (1968).

26.	Knible IL, Rehm Th, Weller A., Intermediates and kinetics of fluorescence quen-
ching by electron transfer, Ber. Bunsenges, 72, 257 (1968).

27.	Ware. W.R., Doemeny L.T., Nemzek T.L., Deconvolution of fluorescence and phosp-
horescence decay curves by a least-squares method, J. Phys. Chem., 77, 2038
(1973).

28.	O’Connor D.V., Ware JF.f?., Andre J.C., Deconvolution of fluorescence decay
curves. A critical comparision of techniques. J.Phys. Chem., 83, 1333 (1979).

29.	Spencer R.D., Weber G., Measurement of subuanosccond fluorescence lifetimes
with a cross-correlation phase fluorometer, Ann. N.Y. Acad. Sci., 158, 361
(1969).

30.	Lakowicz JaRa, Cherek Ha, Phase-sensitive fluorescence spectroscopy ! A
new method to resolve fluorescence lifetimes or emission spectra of components in a
mixture of fluorophores, J. Biophys. Methods, 5, 19 (1981).

31.	Lakowicz J.R., Cherek IL, Resolution of heterogeneous fluorescence from
proteins and amino acids by phase-sensitive detection of fluorescence, J. Biol.
Chem., 246, 6248(1981).

32.	Lakowicz J.l ., Balter A., Detection of reversibility of a excited state reac-
tion by phase-modulation fluorometry, Chem. Phys. Lett., 92, 117 (1982).
33.	Weber G., ini Excited States of Biological Molecules (ed. J.B.Birks). John
Wiley and Sons, New York, 1976, pp. 363 — 374.

34.	Базилевская H.G,, Лимарева Л.А., Черкасов А.С., Широков В.И. Флуоромет-
рическое определение длительности возбужденного состояния возбужденных
димеров (эксимеров) производных антрацена. - Оптика и спектроск., 1965,
т. 18, № 2, с. 354.

35.	Веселова Т.В., Лимарева Л,А., Черкасов А.С., Широков В.И., Флуоромет-
рическое изучение влияния растворителя на спектр флуоресценции 3-ами-
но-N-метилфталимида. - Оптика и спектроск., 1965, т. 19, № 1, с. 78.

36.	Lakowicz J.R., Cherek Н., Dipolar relaxation in proteins on the nanosecond
timescale observed by wavelength-resolved phase fluorometry of tryptophan
fluorescence, J. Biol. Chem., 225c 831 (1980).

37.	Ross J.B.A., Schmidt C.J., Brand L., Time-resolved fluorescence of the two
tryptophans in horse liver alcohol dehydrogenase, Biochemistry, 20, 4369 (1981).

38.	Cockle S.A., Szabo A.G., Time-resolved fluorescence spectra of tryptophan in
monomeric glucagon, Photochem. Photobiol., 34, 23 (1981).
Предметный указатель

Аденозинмонофосфат 28, 302
Аденозинтрифосфат 27, 28
Аденозинтрифосфатаза 290, 321-322
Адренокортикотропный гормон 353-354,
359, 379-380

Азурин 359, 379-380

Акридин 422-426, 435-436

Акридиния ион 422-426, 435—436

Акридон, тушение иодидом 301

Акриламид как тушитепь 264, 269,
273-275, 345, 377-381

Альбумин

бычий сывороточный 120, 121, 161,
206, 220-221, 234, 260, 359,
377, 378-380

человеческий сывороточный 350, 378,
379-385

Альдолаза 377-380

Алкогольдегидрогеназа 357—358
из печени лошади 373-375 , 385

З-Амино-Н-метилфталимид 235—237,
239-248, 431-435

1-Аминонафталин 211-212
Аминофталимид 52, 83, 242-248, 291
Анализ

затухания флуоресценции методом
наименьших квадратов 78—81, 104
--- — преобразования Лапласа 81—82
фазовых и модуляционных данных мето-
дом моделирования 91—92
--- непосредственным расчетом
“г- и Tf 92

-------по сдвигу фаз и степени моду-
ляции 93—94

электронных состояний 134—136
Аналоговое детектирование 48—50
Ангидрид пиренмасляной кислоты 161

Анизотропия флуоресценции 21—22, 44,
45, 122-141, 162, 376
измерения двухлучевым методом
139-142

-	однолучевым методом 136—139

-	при изменении времении затухания
188-191

-	стационарные 122

кинетика затухания 159—162, 163-193,
381-385

предельная 175, 187-190

Анилинонафталин 85, 198, 201, 209,
213-215, 246-248, 255

2-Анилино-6»нафталинсульфоновая кисло -
та 198, 206-208

1-Анилино-8-нафталинсульфоновая кисло-
та 26, 27, 151, 194, 206-207 , 209,
219-221

Антрацен 11, 57-59, 81, 82, 229 , 263,
388-391, 427-428

Антраценкарбоновая киспота, метиловый
эфир 212-213

12-(9-Антроилокси)стеариновая кислота
151, 215-219, 230, 291-292, 324-326

Апомиоглобин 27, 194, 219—221

Аппаратура (флуориметры и флуорометры)
29-60, 102-103

Ацетилантрацен 210-214, 226-228, 238,
260

N-Ацетил-L-тирозинамид 115—116

N-Ацетил-ь-триптофанамид 38, 39, 41,
102-103, 115-116, 191-192, 224-226,
251-252 , 273-275 , 370-373 , 380,
385-386

Ацетон как растворитель 210, 212, 221

Ацетонитрил 212, 221
Белки 22-27, 4и, 103-105, 111, 119,122,
143-144, 158, 162, 194, 200, 206 , 263,
283-290, 307, 345-387, 390
вращательная диффузия 152—156
денатурация 358—362, 369, 383
модельные 253 , 259—260
реакции ассоциации 156-160
связывание с субстратом 363—365

Бензол как растворитель 215—219, 221
Бензонитрил 212

1,2-Бис(9, 10-дибромостеароил)глицерол-
-3-фосфорилхолин 299-301

1,4-Бис[ 2-(4-метил-5-фенипоксазолил)]-
бензол 101

л-Бис[ 2-(5-фенилоксазолип)]бензол 11,
101

Бромбензол как тушитель 264
Бутанол как растворитель 217—219,
227-228, 235, 239, 241-242, 349-351

N-трет-Бутилоксикарбонилтриптофан
274-275

Взаимодействия с растворителем
общие 196, 198, 226-231
специфические 195-196, 208—215,
224-231

9-Винилантрацен 26, 27, 133, 149-151,
229

Вода как растворитель 143, 200—203,
212, 218-219, 220- 221,346

Возбуждение флуорофоров 129—130
Время

вращательной корреляции 22, 177—178,
• 180

жизни возбужденного состояния 10,
20, 61, 223—224, 263, 313, 406-410
затухания флуоресценции 10, 19—20,.

61-104, 258-261, 263, 400-405
----белков 367—373

---влияние дипольной релаксации
370-373

— зависимость от длины волны
385-386

---модуляционное 63, 91-92, 94—98,
102-104, 256-257, 406-426

---при изучении релаксации раст-
ворителя 248—250

—--------фазовое 63, 91-92, 94-98, 100,

• Ю2-104, 256-257, 371, 406-426
Время-амплитудный преобразователь 75
Гексан как растврритель 198-200, 203,
210, 211, 215-219 , 226-229 , 235-237,
239-241, 349, 434

Гемоглобин 324—326

Гептан как растворитель 343

Гетерогенность испускания 85, 90-97,
104, 105, 110—120, 236-237, 238, 351,
371-373, 396, 405, 408-410, 415-422

N5-(2-Гидроксиэтил)-L-глутамат 329-331

Г пикоген 39, 41

Гпицерин как растворитель 215, 224-230,
234, 238, 243-244, 247-248, 257,
329-336

у-Глобупин 26, 161. См. также Иммуно-
глобулины

Глюкагон 359, 370, 380

Грамицидин 322-324

Гуанидингидрохлорид 287, 359—362, 384

Гуанозин-5'-монофосфат как тушитель
275-277

Дансил-лизин 176-178

Дансил-L-полигидразид 313—314

Дансил(1.-пролил)п-а нафтил 313-314
Дансилхлорид 25, 26, 160-161

Дезоксирибонуклеиновая кислота 155—158,
281-282
денатурация 160

Демодуляция 86-90. См. также Модуля-
ция
коэффициент 107—110, 408, 412—413,
419-422

степень 63-66, 90-98, 100, 102, 103,
410—413

Деполяризация флуоресценции 142—145,
151, 179-180, 185

Дибензо[а,л]антрацен 117

Дибензо[с, §]карбазол 117

Димеры 18, 161,322-324. См. также Эк-
симеры

N.N- Диметил-2-аминонафталин-6-суль-
фонат 208

- (5-Диметиламинонафталин-1-супьфонил)-
гаптен 176
1-Диметиламино-5-нафталинсульфоновая '
кислота 103, 120-121, 154, 161

4-Диметиламино-4-нитростильбен 52

Диметиланилин как тушитель 292

Диметилиндол 111-115

N,N- Диметил формамид 201, 212, 221

Димиристоил-L -а- фосфатидилхолин 152,
173-174, 187, 189-193, 213-214,
258-259, 292-297

Динитрофенол 343—344

Диоксан как растворитель 200, 211, 212,
257 , 343

Диолеил- L-а-фосфатидилхолин 256—257

Дипальмитоилфосфатидилхолин 150-152,
292-294

Дипиколиний, комплексе ТЪ3+ 338—339

9, 10-Дифенилантрацен 57, 58, 229
1,6-Дифен ил гексатриен 26 , 27, 127, 131,
149-151, 172-175, 185-187, 189-193,
293

2,5-Дифенил-1,3,4-оксадиазол 101

2,5-Дифенилоксазол 11, 101

Диффузия вращательная 21, 23, 69, 122,
126, 142-149, 185-186
поступательная 23, 263, 336-339

4-Диэтиламино-М-метилфталимид 431-435

2-Диэтиламино-5-нафталинсульфоновая
кислота 102-103

4-(Диэтиламино)фенилазобензол-4-сульфо-
нил 323-324

Диэтиланилин 263-264, 388-391, 427-428

Затухание флуоресценции

двухэкслоненциальное 80, 81, 92, 95,
107, 177, 395-398

для обратимой реакции с участием
двух состояний 313-405

кинетика 328-331, 370-372, 373-375,
394-396

кривые 76-82, 85, 87

- обратная свертка 398—403

многоэкспоненциальное 61, 65, 69, 92,
102, 107, 119, 253-256, 369

неэкспоненциальное 68, 334, 394
одноэкспоненциальное 20, 65, 80, 81,
145, 146, 159, 166-167, 176, 182,
188-189, 332, 405, 415, 423

Иммуноглобулины 27, 154, 175-179, 377,
378. См. также у-Гпобул ин

Импульсные измерения времен затухания
61-63, 66-76, 102-103, 118-119,421
изучение релаксации растворителя
242-248

метод счета фотонов 48—50, 67, 68,
74-76, 82-84

стробоскопический метод 67, 73-74,
82-84

Импульсный многоканальный анализатор
амплитуды импульсов 75—76

Индол 111-115, 134-136 , 200 , 226,
249-250, 264, 349-359

Иодацетамидофлуоресцеин 321-322

5-[2-(Иодацетил)аминоэтил]-5-аминонафта-
пин-1-сульфокислота 321—322

Иодид-ион как тушитель 268, 282—285,
287-289, 301, 345

Ионы металлов как тушители 264,
274-275, 345

Источники света 34—36. См. также лазе-
ры, Лампы, Синхротроны

Карбазол 294

₽ -11-(9-Карбазол)ундеканоилфосфатидил-
хопин 296—297

Карбоангидраза 378

Карбоксилелтидаза 378

Квантовые выходы 19-20, 51, 157-158,
206, 219-220, 226, 339-340, 346,
350-357, 380, 413-414

Кислород как тушитель 21, 23, 249-250,
269, 273, 277-279, 281-285, 289,
292-294, 302-304

Комплексы с переносом заряда ом. Эксип-
лексы

Конверсия

внутренняя 13, 14

интеркомбинационная 13, 15

Кофакторы 24

Красные кровяные тельца см.

Эритроциты

Ксенон как тушитель 264

Лазеры 71, 72. См. также Источники
света, лампы, Синхротроны

Ламберта - Бера закон 58-60
Лампы» См. также Источники света, Ла-
зеры, Синхротроны
азотные 71, 72
вольфрамовые стандартные 52
дейтериевые 71
импульсные 70
ксеноновые 34—35
модулированные 88
ртутно-ксеноновые 36

Лапласа преобразование 81-82
6-Лауроил-2=(диметиламино)нафталин 97
Лецитин яичный 254—256
Лизоцим 287-288, 363, 378
Линдан 296-297, 303-305

Липиды 27, 151, 311-313, 365. См, также
Мембраны биологические
бислои 171-175, 187-188, 293-294,
322-324 , 326-328

Липопротеины 27

Липперта

графики 211-212
уравнение 196-206

Лумазин 158-161

Люминесценция, определение 10

Мелиттин 363-365 , 385

Мембраны биологические 23, 27, 104, 105,
122, 144, 149-152, 174, 194, 200 . 206,
213-219, 263, 307, 321-322, 324-328,
363—365, 390. См. также Белки
модельные 173, 253-260

Метанол как растворитель 198-200 , 210,
211, 217-219, 222, 228, 343
10-Метилакридиния хлорид 275-277 , 302
2-Метилантрацен 149-151, 292-294
2“Метил-4»диметиламинобензонитрил 250
З-Метилиндол 350-351
№-Метил-4“Пиколиний как тушитель 290
Метилформиат как растворитель 212
Метилциклогексан как растворитель

350-351

Миелина щелочной белок 381-385
Микровязкость 149-152, 172-175, 191.

См. также Анизотропия предельная,
Мембраны биологические

Модуляторы 87-89

Модуляция 86-89, 95, 106-110. См также
Демодуляция

степень 93-94, 107-110, 237-238, 406
Монеллин 359-361, 379-380, 384
Монохроматоры 30-33, 36-46,
градуировка 42—43

Нафталин 229

2-Нафтол 52, 82, 400—405, 428—431,
435-437

Никотинамидадениндинуклеотид 24, 71,
102-103, 264-265

м-Нитродиметиланилин 52
Нуклеаза 359, 380, 381
Нуклеиновые кислоты 24, 27
Нуклеотиды 24, 28

М-Октадецилнафтил-2-амино-б-сульфоно..
вая кислота 215—219

Октанол как растворитель 219-220,
247-248

Олефины как тушители 264
Олигопептиды 328—336
Освещение образца 54—58
Y-Основание 24,179-180

Пальмитоилолеоилфосфатидилхолин

299-301

Пары донорно-акцепторные 306-342,
355-358

Пепсин 289, 378, 380

Пепсиноген 386

Перенос энергии безызлучательный
142-144, 306-344, 390
в белках 351-358

в приближении быстрой диффузии
336-339

в реакциях ассоциации 321-322
измерение расстояний 316—320
интеграл перекрывания 309 -311, 342
константа скорости 306—311
фактор ориентационный 311
эффективность 310—316, 336—337,
340-342

Перилен 11, 12, 14, 27, 132, 133, 145,
147-151, 185, 192, 277-279

Пероксид водорода как тушитель 264,
345

Перрена

графики 153-156
Уравнение 145-149, 172. См. также
Диффузия вращательная

Пирен 18, 294

Пиридин как растворитель 236-237, 239
Поглощение света 58—59
Подвижность

макромолекул 328-336

сегментальная 169-170, 175-180,
328-336

Поли-ь-пролин 313—314, 329
Поляризация

света 21, 38-39, 41, 69, 122-126,
136-142, 360. См. также рассеяние
света

флуоресценции 122-162, 164-167,
174-176, 180-189» См. также
Микровязкость, Реакции ассоциа-
ции, G-фактор

Поляризуемость ориентационная 202-208
Правило зеркальной симметрии 16-19,
132

н-Пропанол как растворитель 211, 219,
228, 243-248

Пропиленгпиколь как растворитель
132-135, 143, 185, 191-192, 221,
224-226, 229, 243-244, 251-252,
346-347, 372, 386

6-Пропионил-2-(диметиламино)нафталин
200-201, 209, 220-221, 228, 234

Профлавин 155—158

2,4-Птериндол см. лумазин

Разностная поляризационно-фазовая флу-
орометрия 168, 180-191

Рассеяние света 40, 41, 43-45, 59, 100,
104, 144-145

Растворители, влияние на спектры флу-
оресценции 194—200» См, также Аце-
тон, Бензол, Бутанол, Взаимодей-
ствия с растворителем, Вода, Гексан,
Гептан, Глицерин,Диоксан, Липперта
уравнение, Метанол, Метилформиат,
Пиридин, Поляризуемость ориентацион-
ная, н-Пропанол, пропиленгпиколь,
Релаксация растворителя, Толуол, Фор-
мамид, Хлорбензол, Хлороформ, Цикло-
гексан, Этанол, Этилацетат, Этилен-
гликоль, Эфир диэтиловый

Растворы в стеклообразном состоянии
126-130, 131, 147, 222

Реабсорбция флуоресценции 144-145

Реакции

ассоциации 120, 156-160, 321-322,
361-363

в возбужденных состояниях 18, 105,
388-435

диффузионно-контролируемые 388—437
с участием двух состояний 388—405

Релаксация растворителя 14-19, 23,
82-83, 105, 132, 195-196, 222-261.
См. также Липперта уравнение
континуальная модель Бахшиева
231-235, 241-248

модель двух состояний 222, 232—235,
240-248, 415, 427-428
11-цис-Ретиналь 316-320

Рибонуклеаза 161, 359 , 379-380

Рибонуклеиновая кислота 24, 179-180

Рибофлавин 25

Родамин 11, 25, 51

Родопсин 316—320

Связи водородные 230-231, 235, 247
в белках 353-354

Сдвиг фаз 86-88, 100, 107-110, 405-413,
424-426, 430

Синхротроны 71—73, См. также Источни-
ки света, лазеры, Лампы

Смолуховского уравнение 269, 277,
279-280, 293

Слектрофлуориметр идеальный 33

Спектры

влияние релаксации растворителя
224-230, 253-256

возбуждения 29-30, 51
индивидуальные, расчет из законов
затухания 396-400 , 411, 427
искажения 31-33, 73-74

исправленные 29-30, 34, 35, 50-54
испускания 12, 13. 29-30, 52-54,
82-86 , 248-250, 253-256

мгновенные 82-86, 118-120, 214, 234,
246-248

модифицированные 17
поляризации 130—136
разделение 106-110, 115-120, 238-241,
372-375, 404, 411-413
сдвиг 194, 220, 222-230, 246-248,
255-256 , 351, 359, 364-368 , 374,
420-425

фазочувствительные 105-121
М-Стеароил-ь-триптофан, н-гексиловый
эфир 350-351

Стокса - Эйнштейна уравнение 145, 180,
268, 278, 293

Стоксов сдвиг 15—16, 195-201, 206

Сфера тушения 279

Сцинтилляторы 20

л=Терфенил 101, 371

Тетраметилдиаминодифенилметан как
тушитель 431-435

Тирозин 18, 24, 346-349, 351-362,
366-369

2-Толуи дин ил-6-н афтал ин сульфон о вая
кислота 27, 76, 77, 86, 97, 120-121,
198, 200- 201, 234, 253-261

К-(Толуил)-2-аминонафталин-6-сульфо-
нат 208

Толуол как растворитель 245-246

Трипсин 378, 380

Трипсиноген 283—285, 378

Триптофан 24, 92, 119, 200, 264 , 269,
273-275, 282-283, 287, 343-344,
345-365, 369-386

Тушение. См, также Сфера тушения,
Тушители
влияние заряда 282—283
динамическое (при столкновениях)
188-191, 248- 250, 262-305,
376-381

константа скорости тушения бимоле-
кулярная 267-269, 277, 292-294,
297-298, 301, 376-379

статическое 262-263, 266, 269-277
флуоресценции белков 349—354
эффективность 297-298

Тушители 263-265. См. также Акриламид,
Гуанозин-б’-монофосфат, Иодид-ион,
Ионы металлов, Кислород, М-Метил-4-

пиколиний, Олефины, Пероксид водорода, Формамид как растворитель 211

Сфера тушения, Тетраметилдиаминоди- Фосфатидилхолин яичный 150, 217-219
фенилметан, Хлорид метилртути, Хлоро- Фосфатидилэтанопамин, маркированный
форм	дансилом 215—219, 311-313

распределение в одной из фаз 295—296
— между водой и везикулами DMPC
296-297

Углы фазовые 63-66 , 91-94, 100-104,
107-110, 111-121, 236-238, 242-251,
406-413, 419-425, 428-431
измерение методом РПФ 180—189

Фазово-модуляционный метод измерения
61-66, 87, 90-103
изучение релаксации растворителя
235- 243, 256—257

Фазочувствительный метод регистрации
флуоресценции 88, 105—121, 406,
428-435
в режиме взаимной корреляции 90
при изучении релаксации растворителя
251-252
G-фактор 40, 138-141
Фенилаланин 346-347, 355-356
№-фенил-2-аминонафталин 208
К-Фенил-Н«метил-2-аминонафталин-6-суль-
фонат 207, 208
Н-Фенил-1-нафтиламин 151
Фенол 18, 82, 386, 387
Фёрстера перенос энергии 306-307
Фильтры оптические 43-45
Флавинадениндинуклеотид 25, 264-265,
302

Фпавинмононуклеотид 264 , 302
Флуоресцеин 11, 25, 26, 51, 161
Флуоресценция, определение 10
Флуорометр
разностный 180-189
фазовый 106-110

Флуорофоры. См. также Фотоотбор флу-
орофоров
искусственные 25-28
несимметричные 167—168
природные 24—25
связанные с биополимером 169-170
с затрудненным вращением 168—169,
185-188
смеси 170-172	<
Фосфолипиды 77, 150-151, 173-174,
253-256

Фосфоресценция 10, 14, 15, 226

Фотоотбор флуорофоров 21—22, 129-130

Фотоумножители 45—48, 50

цветовой эффект 98-103

Франка - Кондона

принцип 14, 18, 17, 22, 195, 197 , 202,
205

факторы 16-19

Фталимиды 235-243, 431—435

Химотрипсин 161,377,378

Хинин 11, 15, 102

Хининбисупьфат 12, 51, 52, 55, 56, 103

Холестерин 150-152, 258-259

Хлорбензол как растворитель 201, 221

Хлорид метипртути как тушитель 264,
274-275, 294

Хлороформ

как растворитель 221

как тушитель 264

9-Цианоантрацен 79-80, 81, 103, 104

а-Цианонафталин 264

Циклогексан как растворитель 200-201,
221, 246-248, 255, 303-305

М-Циклогексил-2-аминонафталин-6-суль-

фон ат 208

Цитотоксины 368-369

Цитохром 299-301

Штерна - Фольмера уравнение 265—269,
271-279, 285-287

З^естин 378

Эйнштейна уравнение 23

Эксимеры 18, 27, 294, 394

Эксиплексы 226, 263-265, 388-393, 394,
427-428, 431-435

Эозинфосфатидилэтаноламин 311—3.13,
' 338-339

Эритроциты 324—326

Этанол как растворитель 79, 97, 103,
143, 201, 203, 209, 213-214, 217-219,
221,228, 246-248, 249-250, 257,
303-305, 343

Этидийбромид 281—282

Этилацетат 343

Этиленгликоль как растворитель 219,
221

N-Этилкарбазол 303—305

Эфир диэтиловый как растворитель 203,
212, 343

Эффект внутреннего фильтра 55

Юстировка поляризаторов 141-142

Яблонского диаграмма 13, 19, 195

DOPC 152

DSPC 152 

М-9-А 291-292

PATMAN 27 , 28, 120
Оглавление

Предисловие редактора перевода.............................5

Предисловие................................................7

Глава 1. Введение в флуоресценцию........................10

1.1.	Диаграмма Яблонского........................13

1.2.	Характеристики испускания флуоресценции.....15

1.2.1.	Стоксов сдвиг.........................15

Глава 2.

1.2.2.	Независимость спектра испускания от длины
волны возбуждения...........................16

1.2.3.	Правило зеркальной симметрии.........16

1.3.	Времена затухания и квантовые выходы
флуоресценции...................................19

1.4.	Анизотропия флуоресценции..................21

1.5.	Временная шкала молекулярных процессов в раст-
воре ...........................................22

1.6.	Флуорофоры.................................24

1.6.1.	Природные флуорофоры.................24

1.6.2.	Искусственные флуорофоры.............25

Аппаратура для флуоресцентной спектроскопии.....29

2.1.	Спектры возбуждения	и	испускания...........29

2.1.1.	Идеальный спектрофлуориметр..........32

2.1.2.	Искажения спектров возбуждения и
испускания..................................33

2.2.	Источники света............................34

2.3.	Монохроматоры..............................36

2.4.	Оптические фильтры.........................43

2.5.	Фотоумножители...........................  45

2.6.	Сравнение методов счета фотонов и аналогового
детектирования флуоресценции....................48

2.7.	Исправленные спектры флуоресценции.........50

2.7.1.	Исправленные спектры возбуждения.....51

2.7.2.	Исправленные спектры испускания......52

2.8.	Влияние условий освещения образца..........54

2.9.	Поглощение света и отклонения от закона
Ламберта — Бера.................................58

2.9.1.	Поглощение света.....................58

2.9.2.	Отклонения от закона Бера............59

Глава 3. Измерение времен затухания флуоресценции.......61

' 3.1. Импульсные измерения времени затухания....61

3.2.	Фазовые и модуляционные измерения времен
затухания флуоресценции.........................63

3.3.	Импульсные измерения времени затухания и
используемая аппаратура.........................66

3.3.1.	Импульсные лампы.....................70

3.3.2.	Импульсный стробоскопический
метод.......................................73

3.3.3.	Метод счета единичных фотонов........74

3.4.	Анализ кривых затухания флуоресценции......76

3.4.1.	Анализ затухания флуоресценции
методом наименьших квадратов................78

3.4.2.	Метод преобразования Лапласа.........81

3.5.	Мгновенные спектры испускания..............82

3.6.	Измерение времен затухания флуоресценции по
фазовым сдвигам и демодуляции...................86

3.6.1.	Модуляторы света.....................88
Глава 4.

Глава 5.

3.6.2.	Регистрация в режиме взаимной
корреляции....................................90

3.7.	Анализ фазовых и модуляционных
данных............................................90

3.7.1.	Анализ фазовых и модуляционных
данных методом моделирования..................91

3.7.2.	Непосредственный расчет величин
а.- и Т;......................................92

3.7.3.	Анализ данных по сдвигу фаз и степени
модуляции, полученных при варьируемой
частоте.......................................93

3.7.4.	Влияние гетерогенности в основном
состоянии на кажущиеся фазовые и
модуляционные времена затухания...............94

3.8.	Цветовой эффект фотоумножителей...............98

3.8.1.	Введение поправок на цветовой и/или
геометрический эффекты при измерении
времен затухания..............................99

3.9.	Оценка характеристик аппаратуры для измерения
времен затухания.................................102

Задачи ...........................................103

Фазочувствительный метод регистрации
флуоресценции.....................................105

4.1.	Теория фазочувствительного метода регистрации
флуоресценции.....................................106

4.2.	Анализ гетерогенной флуоресценции с помощью
метода фазочувствительной регистрации.............110

4.3.	Перспективы применения метода ФЧРФ для
разделения гетерогенной флуоресценции.............118

Задачи...........................................120

Поляризация флуоресценции.........................122

5.1.	Определения поляризации и анизотропии........122

5.2.	Теория поляризации для разбавленных

растворов, находящихся в стеклообразном
состоянии....................................126

5.3.	Спектры поляризации флуорофоров..............130

5.4.	Измерение анизотропии флуоресценции..........136

V	5.4.1. Однолучевой метод, или Л-формат......136

5.4.2.	Двухлучевой метод, или Т-формат.......139

5.4.3.	Сравнение одно- и двухлучевого
методов...................................'.	.141

5.4,4.	Юстировка поляризаторов...............141

5.4.5.	Устранение влияния поляризации на
интенсивность флуоресценции и измере-
ние времен затухания. Условия для
магического угла поляризатора................142

5.5.	Внешние причины деполяризации
флуоресценции....................................142

5.6.	Влияние вращательной диффузии на анизотропию
флуоресценции. Уравнение Перрена . . . .*........145

5.7.	Применения измерений анизотропии
в биохимии........................................149

5.7.1.	Оценка микровязкости клеточных
мембран.......................................149
Глава 6.

Глава 7.

5.7.2.	Вращательная диффузия белков...........162

5.7.3.	Реакции ассоциации.....................156

5.7.4.	Денатурация DNA......................160

Задачи...........................................160

Кинетика затухания анизотропии флуоресценции.....163

6.1.	Теория кинетики затухания анизотропии
флуоресценции....................................163

. 6.1.1. Несимметричные флуорофоры............167

6.1.2.	Флуорофоры с затрудненным
вращением....................................168

**" 6.1.3. Сегментальная подвижность флуорофора,
связанного с биополимером..........................169

6.1.4.	Кинетика затухания анизотропии для
смеси флуорофоров............................170

6.2.	Использование измерений кинетики затухания
анизотропии в биохимии...........................172

6.2.1,	Липидные бислои, маркированные
дифенилгексатриеном..........................172

6.2.2.	Сегментальная подвижность молекул
антител......................................175

6.2.3.	Деполяризация Y-основания в дрожжевой
tRNA фенилаланина...........................179

6.3.	Разностная поляризационно-фазовая
флуорометрия.....................................180

6.3.1.	Измерение разностных фазовых углов....180

6.3.2.	Теория разностной поляризационно-фа-
зовой флуорометрии...........................181

6.3.3.	Влияние анизотропных вращений на
tgA..........................................185

6.3.4.	Влияние затрудненных вращений на
разностные тангенсы..........................186

6.4.	Измерения анизотропии при изменении времени
затухания флуоресценции..........................188

Задачи...........................................191

Влияние растворителей на спектры флуорес-
ценции ...........................................194

7.1.	Стоксовы сдвиги и релаксация растворителя....195

7.2.	Общие влияния растворителей на спектры
флуоресценции. Уравнение Липперта................196

7.3.	Вывод уравнения Липперта....................201

7.4.	Специфические влияния растворителя..........208

7.5.	Практическое применение влияния растворителей
в биохимических исследованиях.....................215

7.5.1.	Локализация связанных с мембранами
флуорофоров..................................215

7.5.2.	Локализация связанных с белками
флуорофоров..................................218

Задачи...........................................221

Глава 8. Механизмы и динамика процессов релаксации

растворителей.......................................222

8.1.	Влияние релаксации растворителя на спектры
испускания в стационарном состоянии. . . . '.......224

8.2.	Теории зависящей от времени релаксации
растворителя........................................230
8.2.1.	Континуальная модель релаксации
растворителя.................................231

8.2.2.	Модель двух состояний для релаксации
растворителя.................................233

8.2.3.	Проявление различий континуальной модели
и модели двух состояний в эксперименте . . .234

8.3.	Изучение релаксации растворителя фазово-
модуляционными методами .........................235

8.3.1.	Доказательство протекания процессов в
возбужденном состоянии по данным о фазо-
вых углах и степени модуляции................238

8.3.2.	Разделение на индивидуальные спектры с по-
мощью фазово-модуляционных данных............239

8.3.3.	Применение фазовой флуорометрии для
установления различия процессов релаксации,
описываемых моделью двух состояний,
от процессов, описываемых континуальной
моделью......................................241

8.4/	Изучение процессов релаксации растворителя с
помощью импульсного метода измерения
флуоресценции....................................242

8.5.	Исследование релаксации растворителя методом
изменения времени затухания флуоресценции........248

8.6.	Анализ релаксации растворителя методом
фазочувствительнои регистрации флуоресценции . . .251

8.7.	Анализ спектральной релаксации в модельных
мембранах и белках...............................253

8.7.1.	Мгновенные спектры испускания меченых
мембран......................................253

8.7.2.	Фазово-модуляционные измерения спектраль-
ной релаксации в мембранах...................256

8.7.3.	Спектры испускания с различными временами
затухания флуоресценции, полученные для
меченых	мембран.........................258

8.7.4.	Спектральная релаксация в меченых
белках.......................................259

Задачи...........................................260

Глава 9. Тушение флуоресценции...........................262

9.1.	Тушители флуоресценции......................263

9.2.	Теория динамического тушения................265

9.2.1.	Вывод уравнения Штерна — Фольмера....266

9.2.2.	Интерпретация бимолекулярной
константы скорости тушения...................267

9.3.	Теория статического’тушения.................269

9.4.	Смешанное динамическое и статическое
тушение..........................................271

9.5.	Примеры статического и динамического
тушения..........................................272

9.6.	Отклонения от уравнения Штерна — Фольмера. Сфера
тушения..........................................277

9.7.	Уравнение Смолуховского.....................279

9.8.	Применение тушения в биохимии...............280

9.8.1.	Влияние стерических факторов на тушение.
Комплекс DNA - этидийбромид..................281
9.8.2.	Влияние заряда на тушение
флуоресценции................................282

9.8.3.	Проникновение заряженных и нейтральных
тушителей в белки............................283

9.8.4.	Определение поверхностной доступности
триптофановых остатков в белках по тушению
флуоресценции иодид-ионами..................285

9.8.5.	Установление поверхностной доступности
мембранно-связанных белков производными
пиколиния...................................289

9.8.6.	Применение тушения для выявления
локализации мембранно-связанных флуорофо-
ров .........................................290

9.8.7.	Тушение мембранно-связанных флуорофоров
кислородом...................................292

9.8.8.	Метод определения диффузии и коэффициентов
распределения тушителей по тушению
мембранно-связанных флуорофоров..............294

9.8.9.	Влияние вязкости на эффективность
тушения.....................................297

9.8.10.	Обмен цитохромом Ь$ между мембрана-
ми..........................................299

Задачи..........................................301

, Глава 10. Перенос энергии..............................306

410.1. Теория переноса энергии для донорно-акцептор-
ных пар.....................................308

40.2.	Измерение расстояний методом переноса
энергии..........................................316

10.3.	Обнаружение реакций ассоциации макромолекул
по переносу энергии.............................321

10.3.1.	Ассоциация молекул АТРазы в липидных
везикулах..................................321

10.3.2.	Димеризация грамицидина в липидных

бислоях.............................322

10.3.3.	Связывание гемоглобина с мембранами
кровяных телец............................324

10.3.4.	Латеральная организация мембран...326

10.4.	Статическая и динамическая подвижность

макромолекул, выявляемая по кинетике
затухания флуоресценции донора.............328

10.5.	Перенос в приближении быстрой диффузии....336

10.6.	Перенос энергии в растворе................339

10.7.	Анализ эффективности переноса энергии при

наличии недипольных механизмов тушения.....340

Задачи........................................  342

Глава 11. Флуоресценция белков............................345

11.1.	Спектральные свойства ароматических амино-
кислот .........................................346

11.1.1.	Поляризационные спектры возбуждения
тирозина и триптофана......................348

11.1.2.	Влияние растворителя на спектры испус-
кания производных триптофана...............349

11.2.	Общая характеристика флуоресценции белков . . .351

11.2.1.	Испускание тирозина и триптофана...351
11.2.2.	Перенос энергии от тирозина к трип-
тофану ...................................354

11.3.	Факторы, влияющие на спектры испускания

белков....................................358

11.3.1.	Трехмерная структура..............358

11.3.2.	Связывание белков с субстратами и

другими макромолекулами.............363

11.3.3.	Возможное испускание тирозината в

белках..............................366

11.4.	Времена затухания флуоресценции белков...369

11.5.	Распознавание индивидуальных аминокислотных
остатков в белках по кинетике затухания
флуоресценции..................................373

11.6.	Динамика белков, регистрируемая флуоресцент-
ными методами...................................375

11.6.1.	Динамика белков, регистрируемая по ту-
шению флуоресценции белков.................376

11.6.2.	Кинетика затухания анизотропии флуорес-
ценции ...................................381

11.6.3.	Зависимость времен затухания флуорес-
ценции триптофана от длины волны..........385

Задачи.........................................387

Глава 12. Спектральные характеристики систем, в которых
протекают обратимые реакции с участием двух
состояний................................................388

12.1.	Обратимая реакция с участием двух
состояний.......................................391

12.1.1.	Стационарная флуоресценция при
протекании обратимой реакции в
возбужденном состоянии.....................391

12.2.	Затухание флуоресценции для обратимой

реакции с участием двух состояний..........393

12.2.1.	Расчет индивидуальных спектров испуска-
ния из законов затухания флуоресценции .396

12.2.2.	Обратная свертка кривых затухания при
различных длинах волн.....................398

12.2.3.	Диссоциация 2-нафтола в возбужденном
состоянии. Пример обратимой реакции
в возбужденном состоянии..................400

12.3.	Анализ реакций в возбужденных состояниях с
помощью фазово-модуляционной
флуорометрии....................................405

12.3.1.	Фазовые углы и степени демодуляции
при перекрывании спектров.................410

12.3.2.	Разделение спектров испускания из
нерелаксированного и релаксированного
состояний по данным о ф (у) и т(р).........411

12.4.	Модельные расчеты в фазово-модуляционной
флуорометрии...................................413

12.5.	Протонирование акридина в возбужденном
состоянии.......................................422

12.6.	Изучение реакций в возбужденных состояниях
фазово-модуляционными методами..................426
12.6.1.	Разделение спектров испускания антрацена
и его эксиплекса с диэтиланилином..........427

12.6.2.	Измерение ф р и ф д для 2-нафтола
методом фазочувствительной регистра-
ции флуоресценции.........................428

12.6.3.	Детальное изучение образования
эксиплексов с помощью метода
фазово-модуляционной флуорометрии . . .431

Задачи...................,.....................435

Ответы на задачи........................................438

Литература..............................................461

Предметный указатель....................................483